| 19.3.2014 | SL | Uradni list Evropske unije | L 81/1 | 19.3.2014 | EN | Official Journal of the European Union | L 81/1 |
| UREDBA KOMISIJE (EU) št. 260/2014 | COMMISSION REGULATION (EU) No 260/2014 |
| z dne 24. januarja 2014 | of 24 January 2014 |
| o spremembi Uredbe (ES) št. 440/2008 o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) zaradi njene prilagoditve tehničnemu napredku | amending, for the purpose of its adaptation to technical progress, Regulation (EC) No 440/2008 laying down test methods pursuant to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council on the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) |
| (Besedilo velja za EGP) | (Text with EEA relevance) |
| EVROPSKA KOMISIJA JE – | THE EUROPEAN COMMISSION, |
| ob upoštevanju Pogodbe o delovanju Evropske unije, | Having regard to the Treaty on the Functioning of the European Union, |
| ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 1907/2006 Evropskega Parlamenta in Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) ter o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije in o spremembi Direktive 1999/45/ES ter o razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES (1) ter zlasti člena 13(3) Uredbe, | Having regard to Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC (1), and in particular Article 13(3) thereof, |
| ob upoštevanju naslednjega: | Whereas: |
| (1) | Uredba Komisije (ES) št. 440/2008 (2) določa preskusne metode za ugotavljanje fizikalno-kemijskih lastnosti, strupenosti in strupenosti za okolje snovi, ki jih je treba uporabiti za namene Uredbe (ES) št. 1907/2006. | (1) | Commission Regulation (EC) No 440/2008 (2) contains the test methods for the purposes of the determination of the physico-chemical properties, toxicity and eco-toxicity of substances to be applied for the purposes of Regulation (EC) No 1907/2006. |
| (2) | Uredbo (ES) št. 440/2008 je treba posodobiti tako, da se vanjo prednostno vključijo nove in posodobljene alternativne preskusne metode, ki jih je pred kratkim sprejel OECD, da se zmanjša število preskusnih živali v skladu z Direktivo 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (3), in Direktivo Sveta 86/609/EGS z dne 24. novembra 1986 o približevanju zakonov in drugih predpisov držav članic o varstvu živali, ki se uporabljajo za poskusne in druge znanstvene namene (4). | (2) | It is necessary to update Regulation (EC) No 440/2008 to include with priority new and updated alternative test methods recently adopted by the OECD, in order to obtain a reduction of the number of animals to be used for experimental purposes, in accordance with Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (3) and Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes (4). |
| (3) | Prilagoditev vsebuje dve metodi za določanje fizikalno-kemijskih lastnosti, vključno s posodobitvijo preskusne metode za določanje topnosti v vodi in novo preskusno metodo za določanje porazdelitvenega koeficienta, ki se uporabljata pri ocenjevanju obstojnih snovi, snovi, ki se kopičijo v organizmih, in strupenih snovi (PBT); štiri nove in eno posodobljeno metodo za določanje strupenosti za okolje ter končnega stanja in obnašanja v okolju; devet metod za določanje strupenosti in drugih učinkov na zdravje, vključno s štirimi preskusnimi metodami za določanje strupenosti pri vdihavanju, ki obsegajo tri posodobljene metode in eno novo metodo za zmanjšanje števila preskusnih živali in izboljšanje ocen učinkov, posodobitev metode 28-dnevnega preskusa oralne strupenosti za vključitev parametrov za oceno endokrine dejavnosti, posodobitev metode za preskus toksikokinetike, ki je pomembna za zasnovo in razumevanje toksikoloških raziskav, in posodobitve metod za preskus kronične strupenosti, rakotvornosti ter kombinacije kronične strupenosti in rakotvornosti. | (3) | The adaptation contains two methods for the determination of physicochemical properties including an update of the water solubility test method and a new partition coefficient test method relevant for the persistent, bioaccumulative and toxic (PBT) assessment; four new and one updated method for the determination of ecotoxicity and environmental fate and behaviour; nine methods for the determination of toxicity and other health effects including four inhalation toxicity test methods, which include an update of three methods and one new method to reduce the number of animals used and to improve assessment of effects, an update of the repeat dose 28-day oral toxicity test method to include parameters for assessment of endocrine activity, an update of the toxicokinetics test method relevant for the design and understanding of toxicological studies and an update of chronic, carcinogenicity and combined chronic and carcinogenicity test methods. |
| (4) | Uredbo (ES) št. 440/2008 bi bilo zato treba ustrezno spremeniti. | (4) | Regulation (EC) No 440/2008 should therefore be amended accordingly. |
| (5) | Ukrepi iz te uredbe so v skladu z mnenjem odbora, ustanovljenega v skladu s členom 133 Uredbe (ES) št. 1907/2006 – | (5) | The measures provided for in this Regulation are in accordance with the opinion of the Committee established under Article 133 of Regulation (EC) No 1907/2006, |
| SPREJELA NASLEDNJO UREDBO: | HAS ADOPTED THIS REGULATION: |
| Člen 1 | Article 1 |
| Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni v skladu s Prilogo k tej uredbi. | The Annex to Regulation (EC) No 440/2008 is amended in accordance with the Annex to this Regulation. |
| Člen 2 | Article 2 |
| Ta uredba začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije. | This Regulation shall enter into force on the third day following that of its publication in the Official Journal of the European Union. |
| Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah. | This Regulation shall be binding in its entirety and directly applicable in all Member States. |
| V Bruslju, 24. januarja 2014 | Done at Brussels, 24 January 2014. |
| Za Komisijo | For the Commission |
| Predsednik | The President |
| José Manuel BARROSO | José Manuel BARROSO |
| (1) UL L 396, 30.12.2006, str. 1. | (1)
OJ L 396, 30.12.2006, p. 1. |
| (2) UL L 142, 31.5.2008, str. 1. | (2)
OJ L 142, 31.5.2008, p. 1. |
| (3) UL L 276, 20.10.2010, str. 33. | (3)
OJ L 276, 20.10.2010, p. 33. |
| (4) UL L 358, 18.12.1986, str. 1. | (4)
OJ L 358, 18.12.1986, p. 1. |
| PRILOGA | ANNEX |
| Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni: | The Annex to Regulation (EC) No 440/2008 is amended as follows: |
| 1. | poglavje A.6 se nadomesti z naslednjim: | „A.6 TOPNOST V VODI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 105 (1995). Je revidirana različica prvotne TG 105, ki je bila sprejeta leta 1981. Med sedanjo različico in tisto iz leta 1981 ni vsebinskih razlik, temveč je spremenjena predvsem oblika. Revizija je temeljila na preskusni metodi EU ‚Topnost v vodi‘ (1). | ZAČETNI PREUDARKI | 2. | Na topnost snovi v vodi lahko znatno vpliva prisotnost nečistot. S to preskusno metodo se določa topnost v vodi za v glavnem čiste snovi, ki so stabilne v vodi in niso hlapne. Pred določanjem topnosti v vodi je koristno imeti nekatere predhodne informacije o preskusni snovi, kot so strukturna formula, parni tlak, disociacijska konstanta in hidroliza v odvisnosti od pH. | 3. | V tej preskusni metodi sta opisani dve metodi, in sicer metoda z izpiranjem kolone in metoda z bučko, ki se uporabljata za topnost pod 10–2 g/l oziroma nad njo. Opisan je tudi preprost predhodni preskus. Ta omogoča določitev približne količine vzorca, ki bo uporabljena v končnem preskusu, in časa, potrebnega za dosego nasičenja. | OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE | 4. | Topnost snovi v vodi je masna koncentracija nasičene raztopine te snovi v vodi pri določeni temperaturi. | 5. | Topnost v vodi je izražena v masi topljenca na volumen raztopine. Enota SI je kg/m3, lahko pa se uporablja tudi g/l. | REFERENČNE KEMIKALIJE | 6. | Pri preiskovanju preskusne snovi ni treba uporabiti referenčnih kemikalij. | OPIS METOD | Preskusni pogoji | 7. | Preskus se po možnosti opravi pri 20 ± 0,5 °C. Izbrana temperatura mora biti konstantna v vseh bistvenih delih opreme. | Predhodni preskus | 8. | Približno 0,1 g vzorca (trdne preskusne snovi je treba uprašiti) v 10-mililitrskem merilnem valju s steklenim zamaškom se postopno dodajajo vse večje količine vode sobne temperature. Po vsakem dodatku določene količine vode se zmes 10 minut stresa, nato pa se vizualno preveri, ali so v njej prisotni neraztopljeni delci vzorca. Če po dodanih 10 ml vode vzorec ali del vzorca ostane neraztopljen, se preskus nadaljuje v 100-mililitrskem merilnem valju. Približna topnost je navedena v preglednici 1 pod tisto količino vode, v kateri se je vzorec popolnoma raztopil. Kadar je topnost nizka, je lahko za raztopitev preskusne snovi potrebnega veliko časa, počakati pa je treba najmanj 24 ur. Če preskusna snov po 24 urah še vedno ni raztopljena, je treba počakati dlje (do 96 ur) ali jo dodatno razredčiti, da se ugotovi, ali je treba uporabiti metodo z izpiranjem kolone ali metodo z bučko. | Preglednica 1 | ml vode za 0,1 g topne snovi | 0,1 | 0,5 | 1 | 2 | 10 | 100 | > 100 | približna topnost v g/l | > 1 000 | 1 000 do 200 | 200 do 100 | 100 do 50 | 50 do 10 | 10 do 1 | < 1 | Metoda z izpiranjem kolone | Načelo | 9. | Ta metoda temelji na izpiranju preskusne snovi z vodo iz mikrokolone, ki je napolnjena z inertnim nosilcem, na katerega se predhodno nanese prebitna količina preskusne snovi (2). Topnost v vodi se določi, ko masna koncentracija eluata doseže konstantno raven v odvisnosti od časa. | Aparatura | 10. | Aparaturo sestavlja mikrokolona (slika 1), v kateri se ohranja konstantna temperatura in ki je povezana bodisi z recirkulacijsko črpalko (slika 2) bodisi z nivojsko posodo (slika 3). Mikrokolona vsebuje inertni nosilec, katerega uhajanje preprečuje majhen čep iz steklene volne, ki se uporablja tudi za filtracijo delcev. Kot nosilec je mogoče uporabiti steklene kroglice, diatomejsko zemljo ali druge inertne materiale. | 11. | Mikrokolona na sliki 1 je primerna za postavitev z recirkulacijsko črpalko. Ima nadprostor s petkratnim volumnom polnitve (pet volumnov polnitve se na začetku preskusa zavrže) in volumen petih vzorcev (ki se med preskusom vzamejo za analizo). Lahko je tudi manjša, če je mogoče v sistem med preskusom dodajati vodo za nadomestitev začetnih petih volumnov polnitve, ki se zavržejo skupaj z nečistotami. Kolona je s cevjo iz inertnega materiala povezana z recirkulacijsko črpalko z zmogljivostjo približno 25 ml/h. Recirkulacijska črpalka je lahko na primer peristaltična ali membranska črpalka. Paziti je treba, da material cevi ne povzroči onesnaženja in/ali adsorpcije. | 12. | Shema postavitve z nivojsko posodo je prikazana na sliki 3. Pri tej postavitvi je mikrokolona opremljena z enosmernim petelinčkom. Povezavo z nivojsko posodo sestavljata spojka iz brušenega stekla in cev iz inertnega materiala. Pretok iz nivojske posode mora biti približno 25 ml/h. | Slika 1 | Mere v mm | A. | Priključek za spojko iz brušenega stekla | B. | Nadprostor | C. | Notranjost 5 | D. | Zunanjost 19 | E. | Čep iz steklene volne | F. | Petelinček | Slika 2 | A. | Atmosfersko uravnoteževanje | B. | Merilnik pretoka | C. | Mikrokolona | D. | Termostatirana cirkulacijska črpalka | E. | Recirkulacijska črpalka | F. | Dvosmerni ventil za vzorčenje | Slika 3 | A. | Nivojska posoda (npr. 2,5-litrska laboratorijska steklenica) | B. | Kolona | C. | Zbiralnik frakcij | D. | Termostat | E. | Teflonska cev | F. | Spojka iz brušenega stekla | G. | Dovod vode (med termostatom in kolono, notranji premer: približno 8 mm) | 13. | Približno 600 mg nosilca se prenese v 50-mililitrsko bučko z okroglim dnom. Primerna količina preskusne snovi se raztopi v analitsko čistem hlapnem topilu, nato pa se ustrezna količina te raztopine doda nosilcu. Topilo se popolnoma upari, npr. z rotacijskim uparjalnikom, sicer se nosilec med izpiranjem ne bo nasitil z vodo zaradi porazdelitve na površini. Nosilec z naneseno preskusno snovjo se dve uri namaka v približno 5 ml vode, nato pa se suspenzija prelije v mikrokolono. Druga možnost je, da se v mikrokolono, napolnjeno z vodo, strese suh nosilec z naneseno preskusno snovjo in se nato pusti približno dve uri, da se vzpostavi ravnotežje. | 14. | Nanašanje na nosilec lahko povzroči težave, ki lahko privedejo do napačnih rezultatov, npr. če se preskusna snov poseda kot olje. Take težave je treba preučiti in o tem poročati. | Postopek z recirkulacijsko črpalko | 15. | Tok se požene skozi kolono. Priporočljivo je, da se uporabi pretok približno 25 ml/h, ki ustreza 10 volumnom polnitve na uro za opisano kolono. Najmanj prvih pet volumnov polnitve se zavrže, da se odstranijo v vodi topne nečistote. Zatem naj črpalka deluje do vzpostavitve ravnotežja, ki je opredeljeno s petimi zaporednimi vzorci, katerih koncentracije se med seboj ne razlikujejo za več kot ± 30 %. Časovni intervali med temi vzorci morajo ustrezati prehodu najmanj deset volumnov polnitve. Glede na uporabljeno analitsko metodo je morda priporočljivo izdelati krivuljo koncentracija-čas, ki prikazuje vzpostavitev ravnotežja. | Postopek z nivojsko posodo | 16. | Zaporedne frakcije eluata se zberejo in analizirajo z izbrano metodo. Za določitev topnosti se uporabijo frakcije eluata iz srednjega območja, kjer so koncentracije pri najmanj petih zaporednih frakcijah konstantne v območju ± 30 %. | 17. | Najprimernejši eluent je dvakrat destilirana voda. Uporabi se lahko tudi deionizirana voda z upornostjo nad 10 megaomov/cm, in vsebnostjo organskega ogljika pod 0,01 %. | 18. | Pri obeh postopkih se druga meritev opravi pri polovičnem pretoku prve meritve. Če so rezultati obeh meritev skladni, je preskus zadovoljiv. Če je pri manjšem pretoku izmerjena topnost večja, je treba pretok razpolavljati, dokler ni topnost pri dveh zaporednih meritvah enaka. | 19. | Pri obeh postopkih je treba s preverjanjem Tyndallovega efekta preveriti, ali frakcije vsebujejo koloidne delce. Ob prisotnosti delcev je treba preskus razveljaviti in ga ponoviti, ko se izboljša filtracija v koloni. | 20. | Izmeriti je treba pH vsakega vzorca, po možnosti s posebnimi merilnimi lističi. | Metoda z bučko | Načelo | 21. | Preskusna snov (trdne snovi je treba uprašiti) se raztopi v vodi pri temperaturi, ki je nekoliko višja od temperature preskusa. Ko se doseže nasičenost, se zmes ohladi in ohranja na temperaturi preskusa. Meritev se lahko izvede tudi neposredno pri temperaturi preskusa, če se z ustreznim vzorčenjem zagotovi, da je dosežena točka nasičenja. Nato se z ustrezno analitsko metodo (3) določi masna koncentracija preskusne snovi v vodni raztopini, ki ne sme vsebovati neraztopljenih delcev. | Aparatura | 22. | Potrebna je naslednja oprema: | — | običajna laboratorijska steklovina in instrumentarij, | — | naprava za stresanje ali mešanje raztopin pri nadzorovani konstantni temperaturi, | — | če je potrebna za emulzije, centrifuga (po možnosti termostatirana) in | — | analitska oprema. | Postopek | 23. | S predhodnim preskusom se oceni količina preskusne snovi, potrebna za nasičenje želenega volumna vode. Približno petkratnik te količine se zatehta v vsako od treh steklenih posod s steklenimi zamaški (npr. centrifugirke, bučke). V vsako posodo se doda volumen vode, izbran glede na analitsko metodo in območje topnosti. Posode se tesno zamašijo in pretresejo pri 30 °C. Uporabiti je treba napravo za stresanje ali mešanje, ki lahko deluje pri konstantni temperaturi, npr. napravo za magnetno mešanje v termostatirani vodni kopeli. Po enem dnevu se v eni od posod 24 ur vzpostavlja ravnotežje pri temperaturi preskusa, pri čemer se posoda občasno pretrese. Vsebina posode se pri temperaturi preskusa centrifugira, nato pa se z ustrezno analitsko metodo določi koncentracija preskusne snovi v bistri vodni fazi. S preostalima posodama se ravna podobno po začetnem vzpostavljanju ravnotežja pri 30 °C, ki traja pri eni dva in pri drugi tri dni. Če se izmerjene koncentracije v vsaj zadnjih dveh posodah ne razlikujejo za več kot 15 %, je preskus zadovoljiv. Če se pri rezultatih, izmerjenih v posodah 1, 2 in 3, kaže težnja k naraščanju vrednosti, je treba celoten preskus ponoviti z daljšimi časi za vzpostavljanje ravnotežja. | 24. | Preskus se lahko opravi tudi brez predhodne inkubacije pri 30 °C. Da se oceni hitrost doseganja točke nasičenja, se vzorci jemljejo, dokler čas mešanja ne vpliva več na izmerjene koncentracije. | 25. | Izmeriti je treba pH vsakega vzorca, po možnosti s posebnimi merilnimi lističi. | Analitsko določanje | 26. | Po možnosti se uporabi metoda, specifična za posamezno snov, saj lahko majhne količine topnih nečistot povzročijo velike napake pri izmerjeni topnosti. Primeri takih metod so: plinska ali tekočinska kromatografija, titracija, fotometrija, voltametrija. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | Metoda z izpiranjem kolone | 27. | Za vsako ponovitev je treba izračunati srednjo vrednost in standardni odklon za najmanj pet zaporednih vzorcev, vzetih pri točki nasičenja. Srednje vrednosti, dobljene pri dveh preskusih z različnimi pretoki, se ne smejo razlikovati za več kot 30 %. | Metoda z bučko | 28. | Za vsako od treh bučk se izračuna povprečna vrednost rezultatov, ki se ne smejo razlikovati za več kot 15 %. | Poročilo o preskusu | Metoda z izpiranjem kolone | 29. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | — | rezultate predhodnega preskusa, | — | kemijsko identiteto in nečistote (predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno), | — | koncentracije, pretoke in pH za vsak vzorec, | — | srednje vrednosti in standardne odklone za najmanj pet vzorcev, vzetih pri točki nasičenja vsake ponovitve, | — | povprečje najmanj dveh zaporednih ponovitev, | — | temperaturo vode med procesom nasičenja, | — | analitsko metodo, | — | vrsto nosilca, | — | nanašanje na nosilec, | — | uporabljeno topilo, | — | dokaze o kakršni koli kemijski nestabilnosti snovi med preskusom, | — | vse informacije, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja preskusne snovi. | Metoda z bučko | 30. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | — | rezultate predhodnega preskusa, | — | kemijsko identiteto in nečistote (predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno), | — | posamezne analitske določitve in povprečje, če je bilo za posamezno bučko določenih več vrednosti, | — | pH vsakega vzorca, | — | povprečje vrednosti za različne bučke, pri katerih so bili rezultati skladni, | — | temperaturo preskusa, | — | analitsko metodo, | — | dokaze o kakršni koli kemijski nestabilnosti snovi med preskusom, | — | vse informacije, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja preskusne snovi. | VIRI: | (1) | Direktiva Komisije 92/69/EGS z dne 31. julija 1992 o sedemnajsti prilagoditvi tehničnemu napredku Direktive Sveta 67/548/EGS o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi (UL L 383, 29.12.1992, str. 54). | (2) | NF T 20-045 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. | (3) | NF T 20-046 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.“; | (1) | Chapter A.6 is replaced by the following: | ‘A.6. WATER SOLUBILITY | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 105 (1995). This Test Method is a revised version of the original TG 105 which was adopted in 1981. There is no difference of substance between the current version and that from 1981. Mainly the format has been changed. The revision was based on the EU Test Method “Water Solubility” (1). | INITIAL CONSIDERATIONS | 2. | The water solubility of a substance can be considerably affected by the presence of impurities. This Test Method addresses the determination of the solubility in water of essentially pure substances which are stable in water and not volatile. Before determining water solubility, it is useful to have some preliminary information on the test substance, like structural formula, vapour pressure, dissociation constant and hydrolysis as a function of pH. | 3. | Two methods, the column elution method and the flask method which cover respectively solubilities below and above 10–2 g/l are described in this Test Method. A simple preliminary test is also described. It allows the determination of approximately the appropriate amount of sample to be used in the final test, as well as the time necessary to achieve saturation. | DEFINITIONS AND UNITS | 4. | The water solubility of a substance is the saturation mass concentration of the substance in water at a given temperature. | 5. | Water solubility is expressed in mass of solute per volume of solution. The SI unit is kg/m3 but g/l may also be used. | REFERENCE CHEMICALS | 6. | Reference chemicals do not need to be employed when investigating a test substance. | DESCRIPTION OF THE METHODS | Test conditions | 7. | The test is preferably run at 20 ± 0,5 °C. The chosen temperature should be kept constant in all relevant parts of the equipment. | Preliminary test | 8. | In a stepwise procedure, increasing volumes of water are added at room temperature to approximately 0,1 g of the sample (solid test substances must be pulverized) in a 10 ml glass-stoppered measuring cylinder. After each addition of an amount of water, the mixture is shaken for 10 minutes and is visually checked for any undissolved parts of the sample. If, after addition of 10 ml of water, the sample or parts of it remain undissolved, the experiment is continued in a 100 ml measuring cylinder. The approximate solubility is given in Table 1 below under that volume of water in which complete dissolution of the sample occurs. When the solubility is low, a long time may be required to dissolve a test substance and at least 24 hours should be allowed. If, after 24 hours, the test substance is still not dissolved, more time (up to 96 hours) should be allowed or further dilution should be attempted to ascertain whether the column elution method or flask method should be used. | Table 1 | ml of water for 0,1 g soluble | 0,1 | 0,5 | 1 | 2 | 10 | 100 | > 100 | approximate solubility in g/l | > 1 000 | 1 000 to 200 | 200 to 100 | 100 to 50 | 50 to 10 | 10 to 1 | < 1 | Column elution method | Principle | 9. | This method is based on the elution of a test substance with water from a micro-column which is charged with an inert support material, previously coated with an excess of the test substance (2). The water solubility is given by the mass concentration of the eluate when this has reached a plateau as a function of time. | Apparatus | 10. | The apparatus consists of a microcolumn (Figure 1), maintained at constant temperature. It is connected either to a recirculating pump (Figure 2) or to a levelling vessel (Figure 3). The microcolumn contains an inert support held in place by a small plug of glasswool which also serves to filter out particles. Possible materials which can be employed for the support are glass beads, diatomaceous earth, or other inert materials. | 11. | The microcolumn shown in Figure 1 is suitable for the set-up with recirculating pump. It has a head space providing for five bed volumes (discarded at the start of the experiment) and the volume of five samples (withdrawn for analysis during the experiment). Alternatively, the size can be reduced if water can be added to the system during the experiment to replace the initial five bed volumes removed with impurities. The column is connected with tubing made of an inert material to the recirculating pump, capable of delivering approximately 25 ml/h. The recirculating pump can be, for example, a peristaltic or membrane pump. Care must be taken that no contamination and/or adsorption occur with the tube material. | 12. | A schematic arrangement using a levelling vessel is shown in Figure 3. In this arrangement the microcolumn is fitted with a one way stopcock. The connection to the levelling vessel consists of a ground glass joint and tubing made of an inert material. The flow rate from the levelling vessel should be approximately 25 ml/h. | Figure 1 | Figure 2 | Figure 3 | 13. | Approximately 600 mg of support material is transferred to a 50 ml round-bottom flask. A suitable amount of test substance is dissolved in a volatile solvent of analytical reagent quality and an appropriate amount of this solution is added to the support material. The solvent is completely evaporated, e.g. using a rotary evaporator, as otherwise water saturation of the support will not be achieved during the elution step because of partitioning on the surface. The loaded support material is soaked for two hours in approximately 5 ml of water and the suspension is poured into the microcolumn. Alternatively, dry loaded support material may be poured into the water-filled microcolumn and two hours are allowed for equilibrating. | 14. | The loading of the support material may cause problems, leading to erroneous results, e.g. when the test substance is deposited as an oil. These problems should be examined and the details reported. | Procedure using a recirculating pump | 15. | The flow through the column is started. It is recommended that a flow rate of approximately 25 ml/h, corresponding to 10 bed volumes per hour for the column described, be used. At least the first five bed volumes are discarded to remove water soluble impurities. Following this, the pump is allowed to run until equilibrium is established, as defined by five successive samples whose concentrations do not differ by more than ± 30 % in a random fashion. These samples should be separated from each other by time intervals corresponding to the passage of at least ten bed volumes. Depending on the analytical method used, it may be preferable to establish a concentration/time curve to show that equilibrium is reached. | Procedure using a levelling vessel | 16. | Successive eluate fractions should be collected and analysed by the chosen method. Fractions from the middle eluate range, where the concentrations are constant within ± 30 % in at least five consecutive fractions, are used to determine the solubility. | 17. | Double distilled water is the preferred eluent. Deionized water with a resistivity above 10 megohms/cm and total organic carbon content below 0,01 % can also be used. | 18. | Under both procedures, a second run is performed at half the flow rate of the first. If the results of the two runs are in agreement, the test is satisfactory. If the measured solubility is higher with the lower flow rate, then the halving of the flow rate must continue until two successive runs give the same solubility. | 19. | Under both procedures, the fractions should be checked for the presence of colloidal matter by examination of the Tyndall effect. The presence of particles invalidates the test and the test should be repeated after improvement of the filtering action of the column. | 20. | The pH of each sample should be measured, preferably by using special indicator strips. | Flask method | Principle | 21. | The test substance (solids must be pulverized) is dissolved in water at a temperature somewhat above the test temperature. When saturation is achieved, the mixture is cooled and kept at the test temperature. Alternatively, and if it is assured by appropriate sampling that the saturation equilibrium is reached, the measurement can be performed directly at the test temperature. Subsequently, the mass concentration of the test substance in the aqueous solution, which must not contain any undissolved particles, is determined by a suitable analytical method (3). | Apparatus | 22. | The following materials are needed: | — | normal laboratory glassware and instrumentation; | — | a device for the agitation of solutions under controlled constant temperature; | — | if required for emulsions, a centrifuge (preferably thermostated); and | — | analytical equipment. | Procedure | 23. | The quantity of test substance necessary to saturate the desired volume of water is estimated from the preliminary test. About five times that quantity is weighed into each of three glass vessels fitted with glass stoppers (e.g. centrifuge tubes, flasks). A volume of water, chosen in function of the analytical method and solubility range, is added to each vessel. The vessels are tightly stoppered and then agitated at 30 °C. A shaking or stirring device capable of operating at constant temperature should be used, e.g. magnetic stirring in a thermostated water bath. After one day, one of the vessels is equilibrated for 24 hours at the test temperature with occasional shaking. The contents of the vessel are then centrifuged at the test temperature and the concentration of the test substance in the clear aqueous phase is determined by a suitable analytical method. The other two flasks are treated similarly after initial equilibration at 30 °C for two and three days respectively. If the concentrations measured in at least the two last vessels do not differ by more than 15 %, the test is satisfactory. If the results from vessels 1, 2 and 3 show a tendency of increasing values, the whole test should be repeated using longer equilibration times. | 24. | The test can also be performed without pre-incubation at 30 °C. In order to estimate the rate of establishment of the saturation equilibrium, samples are taken until the stirring time no longer influences the concentrations measured. | 25. | The pH of each sample should be measured, preferably by using special indicator strips. | Analytical determinations | 26. | A substance-specific method is preferred since small amounts of soluble impurities can cause large errors in the measured solubility. Examples of such methods are: gas or liquid chromatography, titration, photometry, voltametry. | DATA AND REPORTING | Data | Column elution method | 27. | For each run, the mean value and standard deviation from at least five consecutive samples taken from the saturation plateau should be calculated. The mean values obtained from two tests with different flows should not differ by more than 30 %. | Flask method | 28. | The individual results from each of the three flasks, which should not differ by more than 15 %, are averaged. | Test Report | Column elution method | 29. | The test report must include the following information: | — | the results of the preliminary test | — | chemical identity and impurities (preliminary purification step, if any) | — | the concentrations, flow rates and pH for each sample | — | the means and standard deviations from at least five samples from the saturation plateau of each run | — | the average of at least two successive runs | — | the temperature of the water during the saturation process | — | the method of analysis | — | the nature of the support material | — | loading of the support material | — | solvent used | — | evidence of any chemical instability of the substance during the test | — | all information relevant for the interpretation of the results, in particular with regard to impurities and physical state of the test substance. | Flask method | 30. | The test report must include the following information: | — | the results of the preliminary test | — | chemical identity and impurities (preliminary purification step, if any) | — | the individual analytical determinations and the average where more than one value was determined for each flask | — | the pH of each sample | — | the average of the values for different flasks which were in agreement | — | the test temperature | — | the analytical method | — | evidence of any chemical instability of the substance during the test | — | all information relevant for the interpretation of the results, in particular with regard to impurities and physical state of the test substance. | LITERATURE: | (1) | Commission Directive 92/69/EEC of 31 July 1992 adapting to technical progress for the seventeenth time Council Directive 67/548/EEC on the approximation of laws, regulations and administrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances (OJ L 383, 29.12.1992, p. 113). | (2) | NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. | (3) | NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method’. |
| 2. | doda se poglavje A.23: | „A.23 PORAZDELITVENI KOEFICIENT (1-OKTANOL/VODA): METODA POČASNEGA MEŠANJA | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 123 (2006). Vrednosti porazdelitvenega koeficienta 1-oktanol/voda (POW) do log POW 8,2 so bile natančno določene z metodo počasnega mešanja (1). Zato gre za primeren preskusni pristop k neposrednemu določanju POW zelo hidrofobnih snovi. | 2. | Preostali metodi za določanje porazdelitvenega koeficienta 1-oktanol/vode (POW) sta metoda ‚stresanja bučke‘ (2) in določanje POW na podlagi retencijskega vedenja pri tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo (3). Pri metodi ‚stresanja bučke‘ so pogosti artefakti zaradi prenosa mikrokapljic oktanola v vodno fazo. S povečevanjem vrednosti POW prisotnost teh kapljic v vodni fazi vodi do povečanega precenjevanja koncentracije preskusne snovi v vodi. Zato je uporaba te metode omejena na snovi z log POW < 4. Pri drugi metodi se z opiranjem na zanesljive podatke iz neposredno določenih vrednosti POW umeri razmerje med retencijskim vedenjem pri HPLC in izmerjenimi vrednostmi POW. Na voljo je bil tudi osnutek smernice OECD za določanje porazdelitvenih koeficientov 1-oktanol/voda za snovi, ki lahko ionizirajo (4), ki pa se ne uporablja več. | 3. | Ta preskusna metoda je bila razvita na Nizozemskem. Natančnost metod, opisanih v tem dokumentu, je bila validirana in optimizirana v primerjalni validacijski študiji, v kateri je sodelovalo 15 laboratorijev (5). | ZAČETNI PREUDARKI | Pomen in uporaba | 4. | Za inertne organske snovi so bila ugotovljena zelo pomembna razmerja med porazdelitvenimi koeficienti 1-oktanol/voda (POW) in njihovo bioakumulacijo v ribah. Poleg tega je bilo dokazano, da je POW povezan s strupenostjo za ribe, pa tudi s sorpcijo kemikalij na trdne snovi, kot so prsti in usedline. Obsežen pregled razmerij je naveden v viru (6). | 5. | Ugotovljena so bila najrazličnejša razmerja med porazdelitvenim koeficientom 1-oktanol/voda in drugimi lastnostmi snovi, pomembnimi za okoljsko toksikologijo in kemijo. Porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda je zato postal ključni parameter pri ocenjevanju tveganja kemikalij za okolje, pa tudi pri napovedovanju vpliva kemikalij v okolju. | Področje uporabe | 6. | S preskusom s počasnim mešanjem naj bi se zmanjševala tvorba mikrokapljic iz kapljic 1-oktanola v vodni fazi. Posledično ne pride do precenjevanja vodne koncentracije zaradi molekul preskusne snovi, ki so združene s takimi kapljicami. Zato je metoda počasnega mešanja posebej primerna za ugotavljanje POW za snovi s pričakovanimi vrednostmi log POW 5 in več, za katere metoda stresanja bučke pogosto da napačne rezultate (2). | OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE | 7. | Porazdelitveni koeficient snovi med vodo in lipofilnim topilom (1-oktanolom) označuje ravnotežno porazdelitev kemikalije med obema fazama. Porazdelitveni koeficient med vodo in 1-oktanolom (POW) je opredeljen kot razmerje ravnotežnih koncentracij preskusne snovi v 1-oktanolu, nasičenem z vodo (CO), in vodi, nasičeni z 1-oktanolom (CW). | Kot razmerje koncentracij je porazdelitveni koeficient brez razsežnosti. Najpogosteje je podan kot desetiški logaritem (log POW). Odvisen je od temperature, sporočeni podatki pa morajo vključevati temperaturo merjenja. | NAČELO METODE | 8. | Za določitev porazdelitvenega koeficienta se voda, 1-oktanol in preskusna snov medsebojno uravnotežijo pri konstantni temperaturi. Potem se določijo koncentracije preskusne snovi v obeh fazah. | 9. | Težave pri preskušanju, povezane s tvorbo mikrokapljic med preskusom stresanja bučke, se lahko zmanjšajo z uporabo preskusa s počasnim mešanjem, ki je predlagan v tem dokumentu. V njem se voda, 1-oktanol in preskusna snov uravnotežijo v termostatiranem mešalnem reaktorju. Izmenjava med fazama se pospeši z mešanjem. To povzroči omejeno turbulenco, kar pospeši izmenjavo med 1-oktanolom in vodo, ne da bi se pri tem tvorile mikrokapljice (1). | UPORABNOST PRESKUSA | 10. | Ker lahko prisotnost snovi, ki niso preskusna snov, vpliva na koeficient aktivnosti preskusne snovi, je treba preskusno snov preskušati v čistem stanju. Za preskus porazdelitve 1-oktanol/voda je treba uporabiti najvišjo tržno dostopno čistost. | 11. | Ta metoda se uporablja za čiste snovi, ki ne disociirajo ali asociirajo in ne kažejo bistvene medfazne aktivnosti. Uporablja se lahko za ugotavljanje porazdelitvenega razmerja 1-oktanol/voda takih snovi in zmesi. Kadar se metoda uporablja za zmesi, so ugotovljena porazdelitvena razmerja 1-oktanol/voda pogojna ter odvisna od kemijske sestave preskušane zmesi in elektrolitske sestave, uporabljene za vodno fazo. Če se izvedejo dodatni koraki, je metoda uporabna tudi za spojine, ki disociirajo ali asociirajo (odstavek 12). | 12. | Ker porazdelitev 1-oktanol/voda pri snoveh, ki disociirajo – kot so organske kisline in fenoli, organske baze ter organokovinske snovi –, vključuje več ravnotežij v vodi in 1-oktanolu, je porazdelitveno razmerje 1-oktanol/voda pogojna konstanta, ki je močno odvisna od elektrolitske sestave (7) (8). Zato je treba pri določanju porazdelitvenega razmerja 1-oktanol/voda pri preskusu nadzirati vrednost pH in elektrolitsko sestavo ter o njiju poročati. Pri ocenjevanju teh porazdelitvenih razmerij je potrebna strokovna presoja. Z uporabo vrednosti disociacijskih konstant je treba izbrati ustrezne vrednosti pH, tako da se porazdelitveno razmerje določi za vsako ionizacijsko stanje. Kadar se preskušajo organokovinske spojine, je treba uporabiti nekompleksirajoče pufre (8). Ob upoštevanju sedanjega znanja o vodni kemiji (kompleksacijske konstante, disociacijske konstante) je treba preskusne pogoje izbrati tako, da se lahko oceni speciacija preskusne snovi v vodni fazi. Ionska moč mora biti v vseh preskusih enaka, kar se doseže z uporabo osnovnega elektrolita. | 13. | Kadar se preskus opravlja za snovi z nizko topnostjo v vodi ali visokim POW, se lahko pojavijo težave, saj koncentracije v vodi postanejo zelo nizke, kar oteži njihovo natančno določanje. Ta preskusna metoda vsebuje napotke, kako to težavo odpraviti. | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 14. | Kemijski reagenti morajo biti analitsko čisti ali še kakovostnejši. Priporoča se uporaba neoznačenih preskusnih snovi z znano kemijsko sestavo in po možnosti vsaj 99-odstotno čistostjo ali izotopsko označenih preskusnih spojin z znano kemijsko sestavo in radiokemijsko čistostjo. Pri sledilih s kratko razpolovno dobo je treba uporabiti popravke razpada. Pri izotopsko označenih preskusnih spojinah je treba uporabiti analitsko metodo, specifično za dano kemikalijo, da se zagotovi, da se izmerjena radioaktivnost nanaša neposredno na preskusno snov. | 15. | Oceno log POW je mogoče dobiti s tržno dostopno programsko opremo za ocenjevanje log POW ali z uporabo razmerja topnosti v obeh topilih. | 16. | Pred izvedbo preskusa s počasnim mešanjem za določitev POW morajo biti na voljo naslednje informacije o preskusni snovi: | (a) | strukturna formula; | (b) | ustrezne analitske metode za ugotavljanje koncentracije snovi v vodi in 1-oktanolu; | (c) | disociacijske konstante snovi, ki lahko ionizirajo (Smernica OECD 112 (9)); | (d) | topnost v vodi (10); | (e) | abiotska hidroliza (11); | (f) | dobra biorazgradljivost (12); | (g) | parni tlak (13). | OPIS METODE | Oprema in aparatura | 17. | Potrebna je standardna laboratorijska oprema, zlasti: | — | za mešanje vodne faze se uporabljajo magnetna mešala in magnetne mešalne palice, prevlečene s teflonom, | — | analitski instrumenti, primerni za ugotavljanje koncentracije preskusne snovi pri pričakovanih koncentracijah, | — | mešalna posoda s pipo pri dnu. Glede na oceno log POW in mejo zaznavnosti (LOD) preskusne spojine je treba razmisliti o uporabi reakcijske posode, ki ima enako geometrijo in je večja od enega litra, da se lahko zagotovi zadosten volumen vode za kemijsko ekstrakcijo in analizo. To privede do višjih koncentracij v vodnem ekstraktu in s tem do zanesljivejšega analitskega določanja. Dodatek 1 vsebuje preglednico, v kateri so navedene ocene najmanjšega potrebnega volumna, LOD spojine, njen ocenjeni log POW in njena topnost v vodi. Preglednica temelji na razmerju med log POW ter razmerjem topnosti v oktanolu in vodi, kot so ga predstavili Pinsuwan idr. (14): | — | — | kjer je | — | (v molih), | ter na razmerju, ki ga je podal Lyman (15) za napovedovanje topnosti v vodi. Topnosti v vodi, izračunane z enačbo, kot je navedena v Dodatku 1, je treba obravnavati kot prvo oceno. Opozoriti je treba, da lahko uporabnik pripravi oceno topnosti v vodi tudi z uporabo katerega koli razmerja, za katero se šteje, da bolje predstavlja razmerje med hidrofobnostjo in topnostjo. Priporoča se na primer, naj se za trdne spojine v napovedovanje topnosti vključi tališče. Če se uporabi spremenjena enačba, se je treba prepričati, da enačba za izračun topnosti v oktanolu še vedno velja. V Dodatku 2 je prikazana shema mešalne posode s stekleno oblogo, katere prostornina znaša približno en liter. Razmerja med merami posode, prikazane v Dodatku 2, so se izkazala za ugodna in jih je treba ohraniti, kadar se uporabi aparatura druge velikosti, | — | bistveno je sredstvo za ohranjanje konstantne temperature med preskusom s počasnim mešanjem. | 18. | Posode morajo biti izdelane iz inertnega materiala, tako da je adsorpcija na površine posode zanemarljiva. | Priprava preskusnih raztopin | 19. | POW je treba določiti z najčistejšim 1-oktanolom, ki je na voljo na trgu (vsaj + 99-odstotnim). Priporoča se prečiščenje 1-oktanola z ekstrakcijo s kislino, bazo in vodo ter poznejšim sušenjem. Poleg tega se lahko 1-oktanol prečisti z destilacijo. Prečiščeni 1-oktanol se uporabi za pripravo standardnih raztopin preskusnih snovi. Voda, ki bo uporabljena pri določanju POW, mora biti destilirana v stekleni ali kremenčevi aparaturi ali pridobljena iz prečiščevalnega sistema, lahko pa se uporablja tudi voda HPLC-čistosti. Za destilirano vodo je potrebno filtriranje skozi filter z velikostjo por 0,22 μm. Vključiti je treba slepe vzorce, s čimer se zagotovi, da v koncentriranih ekstraktih ni nečistot, ki lahko interferirajo s preskusno snovjo. Če se uporablja filter iz steklenih vlaken, ga je treba očistiti s triurnim segrevanjem v peči pri 400 °C. | 20. | Pred preskusom se topili medsebojno nasitita z uravnoteženjem v dovolj veliki posodi. To se doseže tako, da se dvofazni sistem dva dneva počasi meša. | 21. | Izbrana ustrezna koncentracija preskusne snovi se raztopi v 1-oktanolu (nasičenem z vodo). Porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda je treba določiti v razredčenih raztopinah v 1-oktanolu in vodi. Zato koncentracija preskusne snovi ne sme presegati 70 % njene topnosti z največjo koncentracijo 0,1 M v kateri koli fazi (1). V raztopinah z 1-oktanolom, uporabljenih za preskus, ne sme biti suspendirane trdne preskusne snovi. | 22. | Ustrezna količina preskusne snovi se raztopi v 1-oktanolu (nasičenem z vodo). Če ocena log POW presega vrednost 5, je treba poskrbeti, da v raztopinah z 1-oktanolom, uporabljenih za preskus, ni suspendirane trdne preskusne snovi. V ta namen se upošteva postopek za kemikalije z ocenjeno vrednostjo log POW > 5: | — | preskusna snov se raztopi v 1-oktanolu (nasičenem z vodo), | — | raztopina se pusti dovolj dolgo, da se suspendirana trdna snov posede. Med posedanjem se spremlja koncentracija preskusne snovi, | — | ko izmerjene koncentracije v raztopini z 1-oktanolom dosežejo stabilne vrednosti, se osnovna raztopina razredči z ustreznim volumnom 1-oktanola, | — | izmeri se koncentracija razredčene osnovne raztopine. Če je izmerjena koncentracija v skladu z razredčitvijo, se lahko razredčena osnovna raztopina uporabi v preskusu s počasnim mešanjem. | Ekstrakcija in analiza vzorcev | 23. | Za analizo preskusne snovi je treba uporabiti validirano analitsko metodo. Raziskovalci morajo zagotoviti dokaze, da so koncentracije v fazi 1-oktanola, nasičenega z vodo, in fazi vode, nasičene z 1-oktanolom, med preskusom nad mejo določljivosti uporabljenih analitskih postopkov. V primerih, v katerih so potrebne ekstrakcijske metode, je treba analitske izkoristke preskusne snovi iz vodne faze in faze 1-oktanola določiti pred preskusom. Analitski signal je treba popraviti za slepe vzorce in paziti, da prenos analita iz enega vzorca v drugega ni mogoč. | 24. | Pred analizo bosta zaradi dokaj nizkih koncentracij hidrofobnih preskusnih snovi v vodni fazi verjetno potrebna ekstrakcija iz vodne faze z organskim topilom in predkoncentriranje ekstrakta. Iz istega razloga je treba znižati morebitne koncentracije slepih vzorcev. V ta namen je treba uporabiti topila visoke čistosti, po možnosti topila za analizo ostankov. Poleg tega lahko navzkrižno kontaminacijo pomaga preprečiti delo s steklovino, ki se predhodno skrbno očisti (npr. s pomivanjem v topilu ali segrevanjem v peči pri zvišani temperaturi). | 25. | Ocena log POW se lahko pridobi s programom za ocenjevanje ali s strokovno presojo. Če je vrednost višja od 6, je treba skrbno spremljati popravke za slepe vzorce in prenos analita. Če ocena log POW presega 6, je obvezna uporaba nadomestnega standarda za popravek izkoristka, da je mogoče doseči visoke faktorje predkoncentracije. Na trgu so na voljo številni računalniški programi za ocenjevanje log POW (1), npr. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) in ACD log P (19). Opisi pristopov k ocenjevanju so na voljo v virih (20–22). | 26. | Meje določljivosti (LOQ) za ugotavljanje preskusne snovi v 1-oktanolu in vodi je treba določiti s sprejetimi metodami. Načeloma se lahko meja določljivosti metode določi kot koncentracija v vodi ali 1-oktanolu, katere razmerje med signalom in hrupom znaša 10. Izbrati je treba ustrezno metodo ekstrakcije in predkoncentriranja ter opredeliti analitske izkoristke. Izbere se ustrezen predkoncentracijski faktor, da se pri analitskem določanju dobi signal potrebne intenzivnosti. | 27. | Na podlagi parametrov analitske metode in pričakovanih koncentracij se določi približna velikost vzorca, ki je potrebna za natančno določitev koncentracije spojine. Izogibati se je treba uporabi vzorcev vode, ki so premajhni za doseganje zadostnega analitskega signala. Prav tako se je treba izogibati prevelikim vzorcem vode, saj sicer lahko ostane premalo vode za najmanjše število zahtevanih analiz (n = 5). V Dodatku 1 so navedeni minimalni volumni vzorcev v odvisnosti od prostornine posode, LOD preskusne snovi in topnosti preskusne snovi. | 28. | Količinska določitev preskusnih snovi se izvede s primerjavo z umeritvenimi krivuljami zadevne spojine. Koncentracije v analiziranih vzorcih je treba razvrstiti glede na koncentracije standardov. | 29. | Za preskusne snovi z oceno log POW, višjo od 6, je treba vzorcu vode pred ekstrakcijo primešati nadomestni standard, da se ugotovijo izgube, ki se pojavijo med ekstrakcijo in predkoncentriranjem vzorcev vode. Za natančen popravek izkoristka morajo imeti nadomestki lastnosti, ki so zelo podobne ali celo enake lastnostim preskusne snovi. Po možnosti se za ta namen uporabljajo (stabilni) izotopno označeni analogi preiskovanih snovi (na primer devterirani analogi ali analogi, označeni z izotopom 13C). Če uporaba označenih stabilnih izotopov, tj. 13C ali 2H, ni mogoča, je treba z opiranjem na zanesljive podatke v literaturi dokazati, da so fizikalno-kemijske lastnosti nadomestka zelo podobne lastnostim preskusne snovi. Med tekočinsko-tekočinsko ekstrakcijo vodne faze se lahko tvorijo emulzije. Njihovo nastajanje je mogoče zmanjšati tako, da se doda sol, emulzija pa pusti čez noč mirovati. O metodah, ki se uporabijo za ekstrahiranje in predkoncentriranje vzorcev, je treba poročati. | 30. | Vzorci, odvzeti iz faze 1-oktanola, se lahko pred analizo po potrebi razredčijo z ustreznim topilom. Poleg tega je uporaba nadomestnih standardov za popravek izkoristka priporočljiva za snovi, za katere so se v preskusih izkoristka pokazala velika odstopanja (relativni standardni odklon > 10 %). | 31. | O podrobnostih analitske metode je treba poročati. To vključuje metodo ekstrakcije, predkoncentracijske faktorje in faktorje redčenja, parametre instrumentov, postopek umerjanja, umeritveno območje, analitski izkoristek preskusne snovi iz vode, dodajanje nadomestnih standardov za popravek izkoristka, vrednosti slepih vzorcev, meje zaznavnosti in meje določljivosti. | Izvedba preskusa | Optimalna razmerja volumnov 1-oktanol/voda | 32. | Pri izbiri volumnov vode in 1-oktanola je treba upoštevati LOQ v 1-oktanolu in vodi, predkoncentracijske faktorje, uporabljene za vzorce vode, vzorčene volumne v 1-oktanolu in vodi ter pričakovane koncentracije. Za namene preskusa je treba volumen 1-oktanola v sistemu počasnega mešanja izbrati tako, da je plast 1-oktanola dovolj debela (> 0,5 cm), da omogoča vzorčenje faze 1-oktanola brez povzročanja motenj v njej. | 33. | Običajna fazna razmerja, uporabljena za določitve spojin, katerih log POW znaša 4,5 in več, so 20 do 50 ml 1-oktanola in 950 do 980 ml vode v litrski posodi. | Preskusni pogoji | 34. | Med preskusom je reakcijska posoda termostatirana, da se temperaturne spremembe zmanjšajo pod 1 °C. Analizo je treba opraviti pri 25 °C. | 35. | Preskusni sistem je treba zaščititi pred dnevno svetlobo, bodisi tako, da se preskus izvaja v temnem prostoru, bodisi tako, da se reakcijska posoda pokrije z aluminijasto folijo. | 36. | Preskus je treba izvajati v brezprašnem okolju (kolikor je to mogoče). | 37. | Sistem 1-oktanol-voda se meša, dokler ni doseženo ravnotežje. V pilotnem preskusu se dolžina obdobja za vzpostavljanje ravnotežja oceni z izvedbo preskusa s počasnim mešanjem ter rednim vzorčenjem vode in 1-oktanola. Intervali vzorčenja morajo znašati najmanj pet ur. | 38. | POW je treba vsakič določiti z vsaj tremi neodvisnimi preskusi s počasnim mešanjem. | Določanje časa do vzpostavitve ravnotežja | 39. | Domneva se, da je ravnotežje doseženo, ko regresija razmerja koncentracij 1-oktanol/voda glede na čas v obdobju štirih časovnih točk da naklon, ki ne odstopa bistveno od nič pri vrednosti p = 0,05. Najkrajši čas do vzpostavitve ravnotežja je en dan pred začetkom vzorčenja. Načeloma se lahko vzorčenje snovi, katerih log POW je ocenjen na manj kot 5, opravi drugi in tretji dan. Pri bolj hidrofobnih spojinah bo morda treba vzpostavljanje ravnotežja podaljšati. Za spojino z log POW 8,23 (dekaklorobifenil) je bilo za uravnoteženje potrebnih 144 ur. Ravnotežje se oceni z večkratnim vzorčenjem v isti posodi. | Začetek preskusa | 40. | Na začetku preskusa se reakcijska posoda napolni z vodo, nasičeno z 1-oktanolom. Dopustiti je treba dovolj časa, da se doseže termostatirana temperatura. | 41. | Želena količina preskusne snovi (raztopljene v zahtevanem volumnu 1-oktanola, nasičenega z vodo) se pazljivo doda v reakcijsko posodo. To je ključni korak v preskusu, saj se je treba izogniti turbulentnemu mešanju obeh faz. V ta namen je treba fazo 1-oktanola s pipeto počasi dodajati na steno preskusne posode blizu vodne površine. Tako bo zadevna faza tekla stekla po steni in ustvarila film nad vodno fazo. Vedno se je treba izogibati odlivanju 1-oktanola neposredno v posodo; kapljice 1-oktanola ne smejo padati neposredno v vodo. | 42. | Po začetku mešanja je treba njegovo hitrost počasi povečevati. Če mešalnih motorjev ni mogoče ustrezno prilagoditi, je treba razmisliti o uporabi transformatorja. Hitrost mešanja je treba nastaviti tako, da se na prehodu med vodo in 1-oktanolom ustvari vrtinec, globok 0,5 do največ 2,5 cm. Hitrost mešanja je treba zmanjšati, če globina vrtinca preseže 2,5 cm; v nasprotnem primeru se lahko iz kapljic 1-oktanola v vodni fazi tvorijo mikrokapljice, kar privede do precenjevanja koncentracije preskusne snovi v vodi. Največja hitrost mešanja 2,5 cm se priporoča na podlagi ugotovitev primerjalne validacijske študije (5). Je kompromis med hitrim vzpostavljanjem ravnotežja in omejevanjem tvorbe mikrokapljic 1-oktanola. | Vzorčenje in obdelava vzorcev | 43. | Pred vzorčenjem je treba mešalo izključiti in počakati, da se tekočine umirijo. Po končanem vzorčenju se mešalo počasi znova zažene, kot je opisano zgoraj, zatem pa se hitrost mešanja postopno povečuje. | 44. | Vodna faza se vzorči z uporabo petelinčka na dnu reakcijske posode. Mrtvi volumen vode, ki ga vsebuje pipica (pri posodi, prikazani v Dodatku 2, je to približno 5 ml), se vedno zavrže. Voda v pipici ni premešana in zato ni uravnotežena z glavnino. Volumen vzorcev vode je treba zabeležiti, paziti pa je treba, da se pri določanju masne bilance upošteva količina preskusne snovi v zavrženi vodi. Izgube zaradi izhlapevanja je treba čim bolj zmanjšati, tako da se pusti voda mirno teči v lij ločnik, ne da bi prišlo do motenj v plasti vode/1-oktanola. | 45. | Vzorci 1-oktanola se pridobijo tako, da se s 100-mikrolitrsko stekleno-kovinsko brizgo iz plasti 1-oktanola odvzame majhen alikvot (približno 100 μl). Paziti je treba, da se ne povzročijo motnje na prehodu faz. Volumen vzorčene tekočine se zabeleži. Zadošča že majhen alikvot, saj bo vzorec 1-oktanola razredčen. | 46. | Izogibati se je treba nepotrebnim korakom pri prenosu vzorcev. V ta namen je treba volumen vzorca določiti gravimetrično. Pri vzorcih vode se to lahko doseže tako, da se vzorec vode zbere v liju ločniku, ki že vsebuje zahtevani volumen topila. | PODATKI IN POROČANJE | 47. | V skladu s to preskusno metodo se POW določi tako, da se v enakih pogojih opravijo trije preskusi s počasnim mešanjem (tri preskusne enote) s preiskovano spojino. Regresija, ki se uporabi za dokaz doseženega ravnotežja, mora temeljiti na rezultatih vsaj štirih določitev CO/CW v zaporednih časovnih točkah. S tem se omogoči izračun variance kot merila nezanesljivosti povprečne vrednosti, dobljene v vsaki preskusni enoti. | 48. | POW se lahko označuje z varianco v dobljenih podatkih za vsako preskusno enoto. Ta podatek se uporabi za izračun POW kot tehtanega povprečja rezultatov posameznih preskusnih enot. V ta namen se kot utež uporabi obratna vrednost variance rezultatov preskusnih enot. Posledično imajo podatki z velikim odstopanjem (izraženim kot varianca) in torej manjšo zanesljivostjo manjši vpliv na rezultat kot podatki z majhno varianco. | 49. | Podobno se izračuna tehtani standardni odklon. Ta označuje ponovljivost merjenja POW. Nizka vrednost tehtanega standardnega odklona kaže, da je bilo določanje POW v okviru enega laboratorija zelo ponovljivo. Formalna statistična obdelava podatkov je opisana v nadaljevanju. | Obdelava rezultatov | Dokaz doseženega ravnotežja | 50. | Logaritem razmerja koncentracij preskusne snovi v 1-oktanolu in vodi (log (CO/Cw)) se izračuna za vsak čas vzorčenja. Doseženo kemijsko ravnotežje se dokaže z grafičnim prikazom tega razmerja glede na čas. Konstantna raven v tem grafičnem prikazu, ki temelji na vsaj štirih zaporednih časovnih točkah, kaže, da je bilo ravnotežje doseženo in da je spojina popolnoma raztopljena v 1-oktanolu. V nasprotnem primeru je treba preskus nadaljevati, dokler štiri zaporedne časovne točke ne dajo naklona, ki ne odstopa bistveno od nič pri vrednosti p = 0,05, kar kaže, da je log Co/Cw neodvisen od časa. | Izračun log POW | 51. | Vrednost log POW preskusne enote se izračuna kot tehtana povprečna vrednost log Co/Cw za tisti del krivulje log Co/Cw v odvisnosti od časa, za katerega je bilo prikazano ravnotežje. Tehtano povprečje se izračuna z uteževanjem podatkov z obratno vrednostjo variance, tako da je vpliv podatkov na končni rezultat obratno sorazmeren z nezanesljivostjo podatkov. | Povprečni log POW | 52. | Povprečna vrednost log POW različnih preskusnih enot se izračuna kot povprečje rezultatov posameznih preskusnih enot, uteženih z njihovimi posameznimi variancami. | Izračun se opravi tako: | kjer je | log POW,i | = | vrednost log POW posamezne preskusne enote i; | log POW,Av | = | tehtana povprečna vrednost posameznih določitev log POW; | wi | = | statistična utež, dodeljena vrednosti log POW preskusne enote i. | Obratna vrednost variance log POW,i se uporabi kot wi ( | ). | 53. | Napaka povprečne vrednosti log POW se oceni kot ponovljivost log Co/Cw, določenega med fazo vzpostavljanja ravnotežja v posameznih preskusnih enotah. Izražena je kot tehtani standardni odklon log POW,Av (σlog Pow,Av), ki je merilo napake, povezane s POW,Av. Tehtani standardni odklon se lahko izračuna iz tehtane variance (varlog Pow,Av) tako: | Simbol n predstavlja število preskusnih enot. | Poročilo o preskusu | 54. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna snov | — | splošno ime, kemijsko ime, številko CAS, strukturno formulo (v kateri je naveden položaj označevalca, kadar je uporabljena izotopsko označena snov) in zadevne fizikalno-kemijske lastnosti (glej odstavek 17), | — | čistost (nečistote) preskusne snovi, | — | čistost označevalca označenih kemikalij in molarno aktivnost (kjer je ustrezno), | — | predhodno oceno log POW in metodo, uporabljeno za izpeljavo vrednosti. | | Preskusni pogoji | — | datume izvajanja študij, | — | temperaturo med preskusom, | — | volumne 1-oktanola in vode na začetku preskusa, | — | volumne odvzetih vzorcev 1-oktanola in vode, | — | volumne 1-oktanola in vode, ki so preostali v preskusnih posodah, | — | opis uporabljenih preskusnih posod in pogojev mešanja (geometrija mešalne palice in preskusne posode, globina vrtinca v mm in, kadar je na voljo, hitrost mešanja), | — | uporabljene analitske metode za določanje preskusne snovi in meje določljivosti metod, | — | čase vzorčenja, | — | pH vodne faze in uporabljene pufre, kadar se pH prilagodi za molekule, ki lahko ionizirajo, | — | število ponovitev. | | Rezultati | — | ponovljivost in občutljivost uporabljenih analitskih metod, | — | ugotovljene koncentracije preskusne snovi v 1-oktanolu in vodi v odvisnosti od časa, | — | prikaz masne bilance, | — | temperaturo in standardni odklon ali temperaturno območje med preskusom, | — | regresijo razmerja koncentracij v odvisnosti od časa, | — | povprečno vrednost log POW,Av in njeno standardno napako, | — | razpravo in razlago rezultatov, | — | primere surovih podatkov reprezentativne analize (vse surove podatke je treba shraniti v skladu s standardi dobre laboratorijske prakse), vključno z izkoristki nadomestkov, številom ravni, uporabljenih v umerjanju (skupaj z merili za korelacijski koeficient umeritvene krivulje), in rezultate zagotavljanja/nadzora kakovosti (QA/QC), | — | kadar je na voljo, validacijsko poročilo o postopku analize (ki se navede med viri). | VIRI: | (1) | De Bruijn, J. H. M., Busser, F., Seinen, W., Hermens, J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ‚slow-stirring‘ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499–512. | (2) | Poglavje A.8 te priloge, Porazdelitveni koeficient. | (3) | Poglavje A.8 te priloge, Porazdelitveni koeficient. | (4) | OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Pariz. | (5) | Tolls, J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01. | (6) | Boethling, R. S., Mackay, D. (ur.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, ZDA. | (7) | Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. | (8) | Arnold, C. G., Widenhaupt, A., David, M. M., Müller, S. R., Haderlein, S. B., Schwarzenbach, R. P. (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596–2602. | (9) | OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Pariz. | (10) | Poglavje A.6 te priloge, Topnost v vodi. | (11) | Poglavje C.7 te priloge, Razgradnja – abiotska razgradnja: hidroliza kot funkcija pH. | (12) | Poglavje C.4 – deli II–VII (metode A do F) te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti. | (13) | Poglavje A.4 te priloge, Parni tlak. | (14) | Pinsuwan, S., Li, A., in Yalkowsky, S. H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623–626. | (15) | Lyman, W. J. (1990). Solubility in water. V: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H., (ur.) American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 do 2-52. | (16) | Leo, A., Weininger, D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA. | (17) | Meylan, W. (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. | (18) | Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budimpešta. | (19) | ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Kanada, 2001. | (20) | Lyman, W. J. (1990). Octanol/water partition coefficient. V: Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H. (ur.). Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C. | (21) | Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479–488. | (22) | Jübermann, O. (1958). Houben-Weyl (ur.), Methoden der Organischen Chemie: 386–390. | Dodatek 1 | Preglednice za izračun najmanjših volumnov vode, potrebnih za zaznavanje preskusnih snovi z različnimi vrednostmi log Pow v vodni fazi | Predpostavke: | — | največji volumen posameznih alikvotov = 10 % skupnega volumna; 5 alikvotov = 50 % skupnega volumna, | — | . V primeru nižjih koncentracij so potrebni večji volumni, | — | volumen, uporabljen za določitev LOD = 100 ml, | — | log POW v odvisnosti od log SW in log POW v odvisnosti od SR (SOKT/SW) smiselno predstavljata razmerja za preskusne snovi. | Ocena Sw | log Pow | enačba | log Sw | Sw (mg/l) | 4 | 0,496 | 3,133E+00 | 4,5 | 0,035 | 1,084E+00 | 5 | –0,426 | 3,750E-01 | 5,5 | –0,887 | 1,297E-01 | 6 | –1,348 | 4,487E-02 | 6,5 | –1,809 | 1,552E-02 | 7 | –2,270 | 5,370E-03 | 7,5 | –2,731 | 1,858E-03 | 8 | –3,192 | 6,427E-04 | Ocena Sokt | log Pow | enačba | Sokt (mg/l) | 4 | 3,763E+04 | 4,5 | 4,816E+04 | 5 | 6,165E+04 | 5,5 | 7,890E+04 | 6 | 1,010E+05 | 6,5 | 1,293E+05 | 7 | 1,654E+05 | 7,5 | 2,117E+05 | 8 | 2,710E+05 | Skupna masa preskusne snovi | (mg) | masaokt/masavoda | masaH2O | (mg) | koncH2O | (mg/l) | masaokt | (mg) | koncokt | (mg/l) | 1 319 | 526 | 2,5017 | 2,6333 | 1 317 | 26 333 | 1 686 | 1 664 | 1,0127 | 1,0660 | 1 685 | 33 709 | 2 158 | 5 263 | 0,4099 | 0,4315 | 2 157 | 43 149 | 2 762 | 16 644 | 0,1659 | 0,1747 | 2 762 | 55 230 | 3 535 | 52 632 | 0,0672 | 0,0707 | 3 535 | 70 691 | 4 524 | 1664 36 | 0,0272 | 0,0286 | 4 524 | 90 480 | 5 790 | 5263 16 | 0,0110 | 0,0116 | 5 790 | 115 807 | 7 411 | 1 664 357 | 0,0045 | 0,0047 | 7 411 | 148 223 | 9 486 | 5 263 158 | 0,0018 | 0,0019 | 9 486 | 189 713 | Izračun volumnov | Najmanjši potrebni volumen za fazo H2O pri vsaki koncentraciji LOD | log Kow | LOD (mikrogrami/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | | 0,04 | 0,38 | 3,80 | 38 | 380 | 4,5 | | 0,09 | 0,94 | 9,38 | 94 | 938 | 5 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 232 | 2 318 | 5,5 | | 0,57 | 5,73 | 57,26 | 573 | 5 726 | 6 | | 1,41 | 14,15 | 141 | 1 415 | 14 146 | 6,5 | | 3,50 | 34,95 | 350 | 3 495 | 34 950 | 7 | | 8,64 | 86,35 | 864 | 8 635 | 86 351 | 7,5 | | 21,33 | 213 | 2 133 | 21 335 | 213 346 | 8 | | 52,71 | 527 | 5 271 | 52 711 | 527 111 | Volumen, uporabljen za LOD (I) | 0,1 | | | | | | Ključ za izračune | Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, litrska posoda za vzpostavljanje ravnotežja. | Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 2-litrska posoda za vzpostavljanje ravnotežja. | Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 5-litrska posoda za vzpostavljanje ravnotežja. | Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 10-litrska posoda za vzpostavljanje ravnotežja. | Presega 10 % celo 10-litrske posode za vzpostavljanje ravnotežja. | Pregled potrebnih volumnov v odvisnosti od topnosti v vodi in log POW | Najmanjši potrebni volumen za fazo H2O pri vsaki koncentraciji LOD (ml) | log Pow | Sw (mg/l) | LOD (mikrogrami/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | 10 | | 0,01 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | | 5 | | 0,02 | 0,24 | 2,38 | 23,80 | 237,97 | | 3 | | 0,04 | 0,40 | 3,97 | 39,66 | 396,62 | | 1 | | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | 1 189,86 | 4,5 | 5 | | 0,02 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | | 2 | | 0,05 | 0,51 | 5,08 | 50,84 | 508,42 | | 1 | | 0,10 | 1,02 | 10,17 | 101,68 | 1 016,83 | | 0,5 | | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | 2 033,67 | 5 | 1 | | 0,09 | 0,87 | 8,69 | 86,90 | 869,01 | | 0,5 | | 0,17 | 1,74 | 17,38 | 173,80 | 1 738,02 | | 0,375 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 231,75 | 2 317,53 | | 0,2 | | 0,43 | 4,35 | 43,45 | 434,51 | 4 345,05 | 5,5 | 0,4 | | 0,19 | 1,86 | 18,57 | 185,68 | 1 856,79 | | 0,2 | | 0,37 | 3,71 | 37,14 | 371,36 | 3 713,59 | | 0,1 | | 0,74 | 7,43 | 74,27 | 742,72 | 7 427,17 | | 0,05 | | 1,49 | 14,85 | 148,54 | 1 485,43 | 14 854,35 | 6 | 0,1 | | 0,63 | 6,35 | 63,48 | 634,80 | 6 347,95 | | 0,05 | | 1,27 | 12,70 | 126,96 | 1 269,59 | 12 695,91 | | 0,025 | | 2,54 | 25,39 | 253,92 | 2 539,18 | 25 391,82 | | 0,0125 | | 5,08 | 50,78 | 507,84 | 5 078,36 | 50 783,64 | 6,5 | 0,025 | | 2,17 | 21,70 | 217,02 | 2 170,25 | 21 702,46 | | 0,0125 | | 4,34 | 43,40 | 434,05 | 4 340,49 | 43 404,93 | | 0,006 | | 9,04 | 90,43 | 904,27 | 9 042,69 | 90 426,93 | | 0,003 | | 18,09 | 180,85 | 1 808,54 | 18 085,39 | 180 853,86 | 7 | 0,006 | | 7,73 | 77,29 | 772,89 | 7 728,85 | 77 288,50 | | 0,003 | | 15,46 | 154,58 | 1 545,77 | 15 457,70 | 154 577,01 | | 0,0015 | | 23,19 | 231,87 | 2 318,66 | 23 186,55 | 231 865,51 | | 0,001 | | 46,37 | 463,73 | 4 637,31 | 46 373,10 | 463 731,03 | 7,5 | 0,002 | | 19,82 | 198,18 | 1 981,77 | 19 817,73 | 198 177,33 | | 0,001 | | 39,64 | 396,35 | 3 963,55 | 39 635,47 | 396 354,66 | | 0,0005 | | 79,27 | 792,71 | 7 927,09 | 79 270,93 | 792 709,32 | | 0,00025 | | 158,54 | 1 585,42 | 15 854,19 | 158 541,86 | 1 585 418,63 | 8 | 0,001 | | 33,88 | 338,77 | 3 387,68 | 33 876,77 | 338 767,72 | | 0,0005 | | 67,75 | 677,54 | 6 775,35 | 67 753,54 | 677 535,44 | | 0,00025 | | 135,51 | 1 355,07 | 13 550,71 | 135 507,09 | 1 355 070,89 | | 0,000125 | | 271,01 | 2 710,14 | 27 101,42 | 271 014,18 | 2 710 141,77 | Volumen, uporabljen za LOD (I) | 0,1 | | | | | | Dodatek 2 | Primer preskusne posode s stekleno oblogo za preskus s počasnim mešanjem za določanje POW | “ | (2) | Chapter A.23 is added: | ‘A.23 PARTITION COEFFICIENT (1-OCTANOL/WATER): SLOW-STIRRING METHOD | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 123 (2006). 1-octanol/water partition coefficient (POW) values up to a log POW of 8,2 have been accurately determined by the slow-stirring method (1). Therefore it is a suitable experimental approach for the direct determination of POW of highly hydrophobic substances. | 2. | Other methods for the determination of the 1-octanol/water partition coefficient (POW) are the “shake-flask” method (2), and the determination of the POW from reversed phase HPLC-retention behaviour (3). The “shake-flask” method is prone to artifacts due to transfer of octanol micro-droplets into the aqueous phase. With increasing values of POW the presence of these droplets in the aqueous phase leads to an increasing overestimation of the concentration of the test substance in the water. Therefore, its use is limited to substances with log POW < 4. The second method relies on solid data of directly determined POW values to calibrate the relationship between HPLC-retention behaviour and measured values of POW. A draft OECD guideline was available for determining 1-octanol/water partition coefficients of ionisable substances (4) but shall no longer be used. | 3. | This Test Method has been developed in The Netherlands. The precision of the methods described here has been validated and optimized in a ring-test validation study in which 15 laboratories participated (5). | INITIAL CONSIDERATIONS | Significance and use | 4. | For inert organic substances highly significant relationships have been found between 1-octanol/water partition coefficients (POW) and their bioaccumulation in fish. Moreover, POW has been demonstrated to be correlated to fish toxicity as well as to sorption of chemicals to solids such as soils and sediments. An extensive overview of the relationships has been given in reference (6). | 5. | A wide variety of relationships between the 1-octanol/water partition coefficient and other substance properties of relevance to environmental toxicology and chemistry have been established. As a consequence, the 1-octanol/water partition coefficient has evolved as a key parameter in the assessment of the environmental risk of chemicals as well as in the prediction of fate of chemicals in the environment. | Scope | 6. | The slow-stirring experiment is thought to reduce the formation of micro-droplets from 1-octanol droplets in the water phase. As a consequence, overestimation of the aqueous concentration due to test substance molecules associated to such droplets does not occur. Therefore, the slow-stirring method is particularly suitable for the determination of POW for substances with expected log POW values of 5 and higher, for which the shake-flask method (2) is prone to yield erroneous results. | DEFINITION AND UNITS | 7. | The partition coefficient of a substance between water and a lipophilic solvent (1-octanol) characterizes the equilibrium distribution of the chemical between the two phases. The partition coefficient between water and 1-octanol (POW) is defined as the ratio of the equilibrium concentrations of the test substance in 1-octanol saturated with water (CO) and water saturated with 1-octanol (CW). | As a ratio of concentrations it is dimensionless. Most frequently it is given as the logarithm to the base 10 (log POW). POW is temperature dependent and reported data should include the temperature of the measurement. | PRINCIPLE OF THE METHOD | 8. | In order to determine the partitioning coefficient, water, 1-octanol, and the test substance are equilibrated with each other at constant temperature. Then the concentrations of the test substance in the two phases are determined. | 9. | The experimental difficulties associated with the formation of micro-droplets during the shake-flask experiment can be reduced in the slow-stirring experiment proposed here. In the slow-stirring experiment, water, 1-octanol and the test substance are equilibrated in a thermostated stirred reactor. Exchange between the phases is accelerated by stirring. The stirring introduces limited turbulence which enhances the exchange between 1-octanol and water without micro-droplets being formed (1). | APPLICABILITY OF THE TEST | 10. | Since the presence of substances other than the test substance might influence the activity coefficient of the test substance, the test substance should be tested as a pure substance. The highest purity commercially available should be employed for the 1-octanol/water partition experiment. | 11. | The present method applies to pure substances that do not dissociate or associate and that do not display significant interfacial activity. It can be applied to determine the 1-octanol/water partition ratio of such substances and of mixtures. When the method is used for mixtures, the 1-octanol/water partition ratios determined are conditional and depend on the chemical composition of the mixture tested and on the electrolyte composition employed as aqueous phase. Provided additional steps are taken, the method is also applicable to dissociating or associating compounds (paragraph 12). | 12. | Due to the multiple equilibria in water and 1-octanol involved in the 1-octanol/water partitioning of dissociating substances such as organic acids and phenols, organic bases, and organometallic substances, the 1-octanol/water partition ratio is a conditional constant strongly dependent on electrolyte composition (7)(8). Determination of the 1-octanol/water partition ratio therefore requires that pH and electrolyte composition be controlled in the experiment and reported. Expert judgement has to be employed in the evaluation of these partition ratios. Using the value of dissociation constant(s), suitable pH-values need to be selected, such that a partitioning ratio is determined for each ionization state. Non-complexing buffers must be used when testing organometallic compounds (8). Taking the existing knowledge on the aqueous chemistry (complexation constants, dissociation constants) into account, the experimental conditions should be chosen in such a manner that the speciation of the test substance in the aqueous phase can be estimated. The ionic strength should be identical in all experiments by employing a background electrolyte. | 13. | Difficulties in the test may arise in conducting the test for substances with low water solubility or high POW, due to the fact that the concentrations in the water become very low such that their accurate determination is difficult. This Test Method provides guidance on how to deal with this problem. | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 14. | Chemical reagents should be of analytical grade or of higher purity. The use of non-labelled test substances with known chemical composition and preferably at least 99 % purity, or of radiolabelled test substances with known chemical composition and radiochemical purity, is recommended. In the case of short half-life tracers, decay corrections should be applied. In the case of radiolabelled test substances, a chemical specific analytical method should be employed to ensure that the measured radioactivity is directly related to the test substance. | 15. | An estimate of log POW may be obtained by using commercially available software for estimation of log POW, or by using the ratio of the solubilities in both solvents. | 16. | Before carrying out a slow-stirring experiment for determination of POW, the following information on the test substance should be available: | (a) | structural formula | (b) | suitable analytical methods for determination of the concentration of the substance in water and 1-octanol | (c) | dissociation constant(s) of ionisable substances (OECD Guideline 112 (9)) | (d) | aqueous solubility (10) | (e) | abiotic hydrolysis (11) | (f) | ready biodegradability (12) | (g) | vapour pressure (13). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Equipment and apparatus | 17. | Standard laboratory equipment is required, in particular, the following: | — | magnetic stirrers and Teflon coated magnetic stir bars are employed to stir the water phase; | — | analytical instrumentation, suitable for determination of the concentration of the test substance at the expected concentrations; | — | stirring-vessel with a tap at the bottom. Dependent on the estimate of log POW and the Limit of Detection (LOD) of the test compound, the use of a reaction vessel of the same geometry larger than one litre has to be considered, so that a sufficient volume of water can be obtained for chemical extraction and analysis. This will result in higher concentrations in the water extract and thus a more reliable analytical determination. A table giving estimates of the minimum volume needed, the LOD of the compound, its estimated log POW and its water solubility is given in Appendix 1. The table is based on the relationship between log POW and the ratio between the solubilities in octanol and water, as presented by Pinsuwan et al. (14): | where | (in molarity); | and the relationship given by Lyman (15) for predicting water solubility. Water solubilities calculated with the equation given in Appendix 1 must be seen as a first estimate. It should be noted that the user is free to generate an estimate of water solubility by means of any relationship that is considered to better represent the relationship between hydrophobicity and solubility. For solid compounds, inclusion of melting point in the prediction of solubility is for instance recommended. In case a modified equation is used, it should be ascertained that the equation for calculation of solubility in octanol is still valid. A schematic drawing of a glass-jacketed stirring-vessel with a volume of ca. one litre is given in Appendix 2. The proportions of the vessel shown in Appendix 2 have proven favourable and should be maintained when apparatus of a different size is used; | — | a means for keeping the temperature constant during the slow-stirring experiment is essential. | 18. | Vessels should be made from inert material such that adsorption to vessel surfaces is negligible. | Preparation of the test solutions | 19. | The POW determination should be carried out with the highest purity 1-octanol that is commercially available (at least + 99 %). Purification of 1-octanol by extraction with acid, base and water and subsequent drying is recommended. In addition, distillation can be used to purify 1-octanol. Purified 1-octanol is to be used to prepare standard solutions of the test substances. Water to be used in the POW determination should be glass or quartz distilled, or obtained from a purification system, or HPLC-grade water may be used. Filtration through a 0,22 μm filter is required for distilled water, and blanks should be included to check that no impurities are in the concentrated extracts that may interfere with the test substance. If a glass fibre filter is used, it should be cleaned by baking for at least three hours at 400 °C. | 20. | Both solvents are mutually saturated prior to the experiment by equilibrating them in a sufficiently large vessel. This is accomplished by slow-stirring the two-phase system for two days. | 21. | An appropriate concentration of test substance is selected and dissolved in 1-octanol (saturated with water). The 1-octanol/water partition coefficient needs to be determined in dilute solutions in 1-octanol and water. Therefore the concentration of the test substance should not exceed 70 % of its solubility with a maximum concentration of 0,1 M in either phase (1). The 1-octanol solutions used for the experiment must be devoid of suspended solid test substance. | 22. | The appropriate amount of test substance is dissolved in 1-octanol (saturated with water). If the estimate of log POW exceeds five, care has to be taken that the 1-octanol solutions used for the experiment are devoid of suspended solid test substance. To that end, the following procedure for chemicals with an estimated value of log POW > 5 is followed: | — | the test substance is dissolved in 1-octanol (saturated with water); | — | the solution is given sufficient time for the suspended solid substance to settle out. During the settling period, the concentration of the test substance is monitored; | — | after the measured concentrations in the 1-octanol-solution have attained stable values, the stock solution is diluted with an appropriate volume of 1-octanol; | — | the concentration of the diluted stock solution is measured. If the measured concentration is consistent with the dilution, the diluted stock solution can be employed in the slow-stirring experiment. | Extraction and analysis of samples | 23. | A validated analytical method should be used for the assay of test substance. The investigators have to provide evidence that the concentrations in the water saturated 1-octanol as well as in the 1-octanol saturated water phase during the experiment are above the method limit of quantification of the analytical procedures employed. Analytical recoveries of the test substance from the water phase and from the 1-octanol phase need to be established prior to the experiment in those cases for which extraction methods are necessary. The analytical signal needs to be corrected for blanks and care should be taken that no carry-over of analyte from one sample to another can occur. | 24. | Extraction of the water phase with an organic solvent and preconcentration of extract are likely to be required prior to analysis, due to rather low concentrations of hydrophobic test substances in the water phase. For the same reason it is necessary to reduce eventual blank concentrations. To that end, it is necessary to employ high purity solvents, preferably solvents for residue analysis. Moreover, working with carefully pre-cleaned (e.g. solvent washing or baking at elevated temperature) glassware can help to avoid cross-contamination. | 25. | An estimate of log POW may be obtained from an estimation program or by expert judgment. If the value is higher than six then blank corrections and analyte carry-over need to be monitored closely. Similarly, if the estimate of log POW exceeds six, the use of a surrogate standard for recovery correction is mandatory, so that high preconcentration factors can be reached. A number of software programs for the estimation of log POW are commercially available (1), e.g. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) and ACD log P (19). Descriptions of the estimation approaches can be found in references (20-22). | 26. | The limits of quantification (LOQ) for determination of the test substance in 1-octanol and water are established using accepted methods. As a rule of thumb, the method limit of quantification can be determined as the concentration in water or 1-octanol that produces a signal to noise ratio of ten. A suitable extraction and pre-concentration method should be selected and analytical recoveries should also be specified. A suitable pre-concentration factor is selected in order to obtain a signal of the required size upon analytical determination. | 27. | On the basis of the parameters of the analytical method and the expected concentrations, an approximate sample size required for an accurate determination of the compound concentration is determined. The use of water samples that are too small to obtain a sufficient analytical signal should be avoided. Also, the use of excessively large water samples should be avoided, since otherwise there might be too little water left for the minimum number of analyses required (n = 5). In Appendix 1, the minimum sample volume is indicated as a function of the vessel volume, the LOD of the test substance and the solubility of the test substance. | 28. | Quantification of the test substances occurs by comparison with calibration curves of the respective compound. The concentrations in the samples analysed must be bracketed by concentrations of standards. | 29. | For test substances with a log POW estimate higher than six a surrogate standard has to be spiked to the water sample prior to extraction in order to register losses occurring during extraction and pre-concentration of the water samples. For accurate recovery correction, the surrogates must have properties that are very close to, or identical with, those of the test substance. Preferably, (stable) isotopically-labelled analogues of the substances of interest (for example, perdeuterated or 13C-labelled) are used for this purpose. If the use of labelled stable isotopes, i.e. 13C or 2H, is not possible it should be demonstrated from reliable data in the LITERATURE that the physical-chemical properties of the surrogate are very close to those of the test substance. During liquid-liquid extraction of the water phase emulsions can form. They can be reduced by addition of salt and allowing the emulsion to settle overnight. Methods used for extracting and pre-concentrating the samples need to be reported. | 30. | Samples withdrawn from the 1-octanol phase may, if necessary, be diluted with a suitable solvent prior to analysis. Moreover, the use of surrogate standards for recovery correction is recommended for substances for which the recovery experiments demonstrated a high degree of variation in the recovery experiments (relative standard deviation > 10 %). | 31. | The details of the analytical method need to be reported. This includes the method of extraction, pre-concentration and dilution factors, instrument parameters, calibration routine, calibration range, analytical recovery of the test substance from water, addition of surrogate standards for recovery correction, blank values, detection limits and limits of quantification. | Performance of the Test | Optimal 1-octanol/water volume ratios | 32. | When choosing the water and 1-octanol volumes, the LOQ in 1-octanol and water, the pre-concentration factors applied to the water samples, the volumes sampled in 1-octanol and water, and the expected concentrations should be considered. For experimental reasons, the volume of 1-octanol in the slow-stirring system should be chosen such that the 1-octanol layer is sufficiently thick (> 0,5 cm) in order to allow for sampling of the 1-octanol phase without disturbing it. | 33. | Typical phase ratios used for the determinations of compounds with log POW of 4,5 and higher are 20 to 50 ml of 1-octanol and 950 to 980 ml of water in a one litre vessel. | Test conditions | 34. | During the test the reaction vessel is thermostated to reduce temperature variation to below 1 °C. The assay should be performed at 25 °C. | 35. | The experimental system should be protected from daylight by either performing the experiment in a dark room or by covering the reaction vessel with aluminium foil. | 36. | The experiment should be performed in a dust-free (as far as possible) environment. | 37. | The 1-octanol-water system is stirred until equilibrium is attained. In a pilot experiment the length of the equilibration period is assessed by performing a slow-stirring experiment and sampling water and 1-octanol periodically. The sampling time points should be interspersed by a minimum period of five hours. | 38. | Each POW determination has to be performed employing at least three independent slow-stirring experiments. | Determination of the equilibration time | 39. | It is assumed that the equilibrium is achieved when a regression of the 1-octanol/water concentration ratio against time over a time span of four time points yields a slope that is not significantly different from zero at a p-level of 0,05. The minimum equilibration time is one day before sampling can be started. As a rule of thumb, sampling of substances with a log POW estimate of less than five can take place during days two and three. The equilibration might have to be extended for more hydrophobic compounds. For a compound with log POW of 8,23 (decachlorobiphenyl) 144 hours were sufficient for equilibration. Equilibrium is assessed by means of repeated sampling of a single vessel. | Starting the experiment | 40. | At the start of the experiment the reaction vessel is filled with 1-octanol-saturated water. Sufficient time should be allowed to reach the thermostated temperature. | 41. | The desired amount of test substance (dissolved in the required volume of 1-octanol saturated with water) is carefully added to the reaction vessel. This is a crucial step in the experiment, since turbulent mixing of the two phases has to be avoided. To that end, the 1-octanol phase can be pipetted slowly against the wall of the experimental vessel, close to the water surface. It will subsequently flow along the glass wall and form a film above the water phase. The decantation of 1-octanol directly into the flask should always be avoided; drops of 1-octanol should not be allowed to fall directly into the water. | 42. | After starting the stirring, the stirring rate should be increased slowly. If the stirring motors cannot be appropriately adjusted the use of a transformer should be considered. The stirring rate should be adjusted so that a vortex at the interface between water and 1-octanol of 0,5 to maximally 2,5 cm depth is created. The stirring rate should be reduced if the vortex depth of 2,5 cm is exceeded; otherwise micro-droplets may be formed from 1-octanol droplets in the water phase, leading to an overestimation of the concentration of the test substance in the water. The maximum stirring rate of 2,5 cm is recommended on the basis of the findings in the ring-test validation study (5). It is a compromise between achieving a rapid rate of equilibration, while limiting the formation of 1-octanol micro-droplets. | Sampling and Sample Treatment | 43. | The stirrer should be turned off prior to sampling and the liquids should be allowed to stop moving. After sampling is completed, the stirrer is started again slowly, as described above, and then the stirring rate is increased gradually. | 44. | The water phase is sampled from a stopcock at the bottom of the reaction vessel. Always discard the dead volume of water contained in the taps (approximately 5 ml in the vessel shown in the Appendix 2). The water in the taps is not stirred and therefore not in equilibrium with the bulk. Note the volume of the water samples, and make sure that the amount of test substance present in the discarded water is taken into account when setting up a mass balance. Evaporative losses should be minimized by allowing the water to flow quiescently into the separatory funnel, such that there is no disturbance of the water/1-octanol layer. | 45. | 1-Octanol samples are obtained by withdrawing a small aliquot (ca. 100 μl) from the 1-octanol layer with a 100 microlitre all glass-metal syringe. Care should be taken not to disturb the boundary. The volume of the sampled liquid is recorded. A small aliquot is sufficient, since the 1-octanol sample will be diluted. | 46. | Unnecessary sample transfer steps should be avoided. To that end the sample volume should be determined gravimetrically. In case of water samples this can be achieved by collecting the water sample in a separatory funnel that contains already the required volume of solvent. | DATA AND REPORTING | 47. | According to the present Test Method, POW is determined by performing three slow-stirring experiments (three experimental units) with the compound under investigation employing identical conditions. The regression used to demonstrate attainment of equilibrium should be based on the results of at least four determinations of CO/CW at consecutive time points. This allows for calculating variance as a measure of the uncertainty of the average value obtained by each experimental unit. | 48. | The POW can be characterized by the variance in the data obtained for each experimental unit. This information is employed to calculate the POW as the weighted average of the results of the individual experimental units. To do so, the inverse of the variance of the results of the experimental units is employed as weight. As a result, data with a large variation (expressed as the variance) and thus with lower reliability have less influence on the result than data with a low variance. | 49. | Analogously, the weighted standard deviation is calculated. It characterizes the repeatability of the POW measurement. A low value of the weighted standard deviation indicates that the POW determination was very repeatable within one laboratory. The formal statistical treatment of the data is outlined below. | Treatment of the results | Demonstration of attainment of equilibrium | 50. | The logarithm of the ratio of the concentration of the test substance in 1-octanol and water (log (CO/Cw)) is calculated for each sampling time. Achievement of chemical equilibrium is demonstrated by plotting this ratio against time. A plateau in this plot that is based on at least four consecutive time points indicates that equilibrium has been attained, and that the compound is truly dissolved in 1-octanol. If not, the test needs to be continued until four successive time points yield a slope that is not significantly different from 0 at a p-level of 0,05, indicating that log Co/Cw is independent of time. | Log POW-calculation | 51. | The value of log POW of the experimental unit is calculated as the weighted average value of log Co/Cw for the part of the curve of log Co/Cw vs. time, for which equilibrium has been demonstrated. The weighted average is calculated by weighting the data with the inverse of the variance so that the influence of the data on the final result is inversely proportional to the uncertainty in the data. | Average log POW | 52. | The average value of log POW of different experimental units is calculated as the average of the results of the individual experimental units weighted with their respective variances. | The calculation is performed as follows: | where: | log POW,i | = | the log POW value of the individual experimental unit i; | log POW,Av | = | the weighted average value of the individual log POW determinations; | wi | = | the statistical weight assigned to the log POW value of the experimental unit i. | The reciprocal of the variance of log POW,i is employed as wi ( | ) | 53. | The error of the average of log POW is estimated as the repeatability of log Co/Cw determined during the equilibrium phase in the individual experimental units. It is expressed as the weighted standard deviation of log POW,Av (σlog Pow,Av) which in turn is a measure of the error associated with log POW,Av. The weighted standard deviation can be computed from the weighted variance (varlog Pow,Av) as follows: | The symbol n stands for the number of experimental units. | Test Report | 54. | The test report should include the following information: | | Test substance: | — | common name, chemical name, CAS number, structural formula (indicating position of label when radiolabelled substance is used) and relevant physical-chemical properties (see paragraph 17) | — | purity (impurities) of test substance | — | label purity of labelled chemicals and molar activity (where appropriate) | — | the preliminary estimate of log Pow, as well as the method used to derive the value. | | Test conditions: | — | dates of the performance of the studies | — | temperature during the experiment | — | volumes of 1-octanol and water at the beginning of the test | — | volumes of withdrawn 1-octanol and water samples | — | volumes of 1-octanol and water remaining in the test vessels | — | description of the test vessels and stirring conditions (geometry of the stirring bar and of the test vessel, vortex height in mm, and when available: stirring rate) used | — | analytical methods used to determine the test substance and the method limit of quantification | — | sampling times | — | the aqueous phase pH and the buffers used, when pH is adjusted for ionizable molecules | — | number of replicates. | | Results: | — | repeatability and sensitivity of the analytical methods used | — | determined concentrations of the test substance in 1-octanol and water as a function of time | — | demonstration of mass balance | — | temperature and standard deviation or the range of temperature during the experiment | — | the regression of concentration ratio against time | — | the average value log Pow,Av and its standard error | — | discussion and interpretation of the results | — | examples of raw data figures of representative analysis (all raw data have to be stored in accordance with GLP standards), including recoveries of surrogates, and the number of levels used in the calibration (along with the criteria for the correlation coefficient of the calibration curve), and results of quality assurance/quality control (QA/QC) | — | when available: validation report of the assay procedure (to be indicated among references). | LITERATURE: | (1) | De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the “slow-stirring” method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512. | (2) | Chapter A.8 of this Annex, Partition Coefficient. | (3) | Chapter A.8 of this Annex, Partition Coefficient. | (4) | OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris. | (5) | Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01. | (6) | Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA. | (7) | Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. | (8) | Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602. | (9) | OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris. | (10) | Chapter A.6 of this Annex, Water Solubility. | (11) | Chapter C.7 of this Annex, Degradation – Abiotic Degradation Hydrolysis as a Function of pH. | (12) | Chapter C.4 — Part II – VII (Method A to F) of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability. | (13) | Chapter A.4 of this Annex, Vapour Pressure. | (14) | Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626. | (15) | Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52. | (16) | Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA. | (17) | Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. | (18) | Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest. | (19) | ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001. | (20) | Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C. | (21) | Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488. | (22) | Jübermann O (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390. | Appendix 1 | Spreadsheet for computation of minimum volumes of water required for detection of test substances of different log POW values in aqueous phase | Assumptions: | — | Maximum volume of individual aliquots = 10 % of total volume; 5 aliquots = 50 % of total volume. | — | . In case of lower concentrations, larger volumes would be required. | — | Volume used for LOD determination = 100 ml. | — | log Pow vs. log Sw and log Pow vs. SR (Soct/Sw) are reasonable representations of relationships for test substances. | Estimation of Sw | log Pow | Equation | log Sw | Sw (mg/l) | 4 | 0,496 | 3,133E+00 | 4,5 | 0,035 | 1,084E+00 | 5 | –0,426 | 3,750E-01 | 5,5 | –0,887 | 1,297E-01 | 6 | –1,348 | 4,487E-02 | 6,5 | –1,809 | 1,552E-02 | 7 | –2,270 | 5,370E-03 | 7,5 | –2,731 | 1,858E-03 | 8 | –3,192 | 6,427E-04 | Estimation of Soct | log Pow | Equation | Soct (mg/l) | 4 | 3,763E+04 | 4,5 | 4,816E+04 | 5 | 6,165E+04 | 5,5 | 7,890E+04 | 6 | 1,010E+05 | 6,5 | 1,293E+05 | 7 | 1,654E+05 | 7,5 | 2,117E+05 | 8 | 2,710E+05 | Total Mass test substance | (mg) | Massoct/Masswater | MassH2O | (mg) | ConcH2O | (mg/l) | Massoct | (mg) | Concoct | (mg/l) | 1 319 | 526 | 2,5017 | 2,6333 | 1 317 | 26 333 | 1 686 | 1 664 | 1,0127 | 1,0660 | 1 685 | 33 709 | 2 158 | 5 263 | 0,4099 | 0,4315 | 2 157 | 43 149 | 2 762 | 16 644 | 0,1659 | 0,1747 | 2 762 | 55 230 | 3 535 | 52 632 | 0,0672 | 0,0707 | 3 535 | 70 691 | 4 524 | 1664 36 | 0,0272 | 0,0286 | 4 524 | 90 480 | 5 790 | 5263 16 | 0,0110 | 0,0116 | 5 790 | 115 807 | 7 411 | 1 664 357 | 0,0045 | 0,0047 | 7 411 | 148 223 | 9 486 | 5 263 158 | 0,0018 | 0,0019 | 9 486 | 189 713 | Computation of volumes | Minimum volume required for H2O phase at each LOD concentration | log Kow | LOD (micrograms/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | | 0,04 | 0,38 | 3,80 | 38 | 380 | 4,5 | | 0,09 | 0,94 | 9,38 | 94 | 938 | 5 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 232 | 2 318 | 5,5 | | 0,57 | 5,73 | 57,26 | 573 | 5 726 | 6 | | 1,41 | 14,15 | 141 | 1 415 | 14 146 | 6,5 | | 3,50 | 34,95 | 350 | 3 495 | 34 950 | 7 | | 8,64 | 86,35 | 864 | 8 635 | 86 351 | 7,5 | | 21,33 | 213 | 2 133 | 21 335 | 213 346 | 8 | | 52,71 | 527 | 5 271 | 52 711 | 527 111 | Volume used for LOD (l) | 0,1 | | | | | | Key to Computations | Represents < 10 % of total volume of aqueous phase, 1 litre equilibration vessel. | Represents < 10 % of total volume of aqueous phase, 2 litre equilibration vessel. | Represents < 10 % of total volume of aqueous phase, 5 litre equilibration vessel. | Represents < 10 % of total volume of aqueous phase, 10 litre equilibration vessel. | Exceeds 10 % of even the 10 liter equilibration vessel. | Overview of volumes required, as a function of water solubility and Log Pow | Minimum volume required for H2O phase at each LOD concentration (ml) | log Pow | Sw (mg/l) | LOD (micrograms/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | 10 | | 0,01 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | | 5 | | 0,02 | 0,24 | 2,38 | 23,80 | 237,97 | | 3 | | 0,04 | 0,40 | 3,97 | 39,66 | 396,62 | | 1 | | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | 1 189,86 | 4,5 | 5 | | 0,02 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | | 2 | | 0,05 | 0,51 | 5,08 | 50,84 | 508,42 | | 1 | | 0,10 | 1,02 | 10,17 | 101,68 | 1 016,83 | | 0,5 | | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | 2 033,67 | 5 | 1 | | 0,09 | 0,87 | 8,69 | 86,90 | 869,01 | | 0,5 | | 0,17 | 1,74 | 17,38 | 173,80 | 1 738,02 | | 0,375 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 231,75 | 2 317,53 | | 0,2 | | 0,43 | 4,35 | 43,45 | 434,51 | 4 345,05 | 5,5 | 0,4 | | 0,19 | 1,86 | 18,57 | 185,68 | 1 856,79 | | 0,2 | | 0,37 | 3,71 | 37,14 | 371,36 | 3 713,59 | | 0,1 | | 0,74 | 7,43 | 74,27 | 742,72 | 7 427,17 | | 0,05 | | 1,49 | 14,85 | 148,54 | 1 485,43 | 14 854,35 | 6 | 0,1 | | 0,63 | 6,35 | 63,48 | 634,80 | 6 347,95 | | 0,05 | | 1,27 | 12,70 | 126,96 | 1 269,59 | 12 695,91 | | 0,025 | | 2,54 | 25,39 | 253,92 | 2 539,18 | 25 391,82 | | 0,0125 | | 5,08 | 50,78 | 507,84 | 5 078,36 | 50 783,64 | 6,5 | 0,025 | | 2,17 | 21,70 | 217,02 | 2 170,25 | 21 702,46 | | 0,0125 | | 4,34 | 43,40 | 434,05 | 4 340,49 | 43 404,93 | | 0,006 | | 9,04 | 90,43 | 904,27 | 9 042,69 | 90 426,93 | | 0,003 | | 18,09 | 180,85 | 1 808,54 | 18 085,39 | 180 853,86 | 7 | 0,006 | | 7,73 | 77,29 | 772,89 | 7 728,85 | 77 288,50 | | 0,003 | | 15,46 | 154,58 | 1 545,77 | 15 457,70 | 154 577,01 | | 0,0015 | | 23,19 | 231,87 | 2 318,66 | 23 186,55 | 231 865,51 | | 0,001 | | 46,37 | 463,73 | 4 637,31 | 46 373,10 | 463 731,03 | 7,5 | 0,002 | | 19,82 | 198,18 | 1 981,77 | 19 817,73 | 198 177,33 | | 0,001 | | 39,64 | 396,35 | 3 963,55 | 39 635,47 | 396 354,66 | | 0,0005 | | 79,27 | 792,71 | 7 927,09 | 79 270,93 | 792 709,32 | | 0,00025 | | 158,54 | 1 585,42 | 15 854,19 | 158 541,86 | 1 585 418,63 | 8 | 0,001 | | 33,88 | 338,77 | 3 387,68 | 33 876,77 | 338 767,72 | | 0,0005 | | 67,75 | 677,54 | 6 775,35 | 67 753,54 | 677 535,44 | | 0,00025 | | 135,51 | 1 355,07 | 13 550,71 | 135 507,09 | 1 355 070,89 | | 0,000125 | | 271,01 | 2 710,14 | 27 101,42 | 271 014,18 | 2 710 141,77 | Volume used for LOD (l) | 0,1 | | | | | | Appendix 2 | An example of glass-jacketed test vessel for the slow-stirring experiment for determination of POW | ’ |
| 3. | poglavje B.2 se nadomesti z naslednjim: | „B.2 AKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 403 (2009) (1). Prvotna Smernica za preskušanje 403 v zvezi z akutno strupenostjo pri vdihavanju (TG 403) je bila sprejeta leta 1981. Ta revidirana preskusna metoda B.2 (ki ustreza revidirani TG 403) je bila zasnovana tako, da omogoča večjo prožnost, zmanjšuje uporabo živali in izpolnjuje zakonodajne potrebe. V revidirani preskusni metodi sta predstavljeni dve vrsti študij: tradicionalni protokol LC50 in protokol koncentracija × čas (C × t). Glavni značilnosti te preskusne metode sta, da je z njo mogoče dobiti razmerje koncentracija-odziv, ki se giblje od nesmrtnih do smrtnih rezultatov, za določitev srednje smrtne koncentracije (LC50), nesmrtne mejne koncentracije (npr. LC01) in naklona, ter opredeliti morebitno občutljivost glede na spol. Protokol C × t je treba uporabiti v primeru posebne zakonodajne ali znanstvene potrebe po preskušanju živali v več časovnih obdobjih, na primer za namene načrtovanja odzivanja v nujnih primerih (npr. določanja orientacijskih ravni pri akutni izpostavljenosti (AEGL), smernic za načrtovanje zaščite in reševanja (ERPG) ali vrednosti mejnih ravni pri akutni izpostavljenosti (AETL)) ali načrtovanja rabe tal. | 2. | Napotke glede izvedbe in razlage študij te preskusne metode je mogoče najti v Dokumentu s smernicami za preskušanje akutne strupenosti pri vdihavanju (GD 39) (2). | 3. | Pojmi, ki se uporabljajo v tej preskusni metodi, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v GD 39 (2). | 4. | Ta preskusna metoda omogoča opredelitev lastnosti in kvantitativno oceno tveganja preskusnih kemikalij ter njihovo razvrščanje v skladu z Uredbo (ES) št. 1272/2008 (3). GD 39 (2) zagotavlja napotke za izbiro primerne metode za preskušanje akutne strupenosti. Kadar so potrebne samo informacije o razvrščanju in označevanju, se navadno priporoča poglavje B.52 te priloge (4) (glej GD 39 (2)). Ta preskusna metoda B.2 ni posebej namenjena preskušanju posebnih materialov, kot so slabo topni izometrični ali vlaknati materiali ali proizvedeni nanomateriali. | ZAČETNI PREUDARKI | 5. | Da se čim bolj zmanjša uporaba živali, mora preskuševalni laboratorij pred razmislekom o preskušanju v skladu s to preskusno metodo preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, vključno z obstoječimi študijami (npr. poglavje B.52 te priloge (4)), katerih podatki bi omogočili izognitev dodatnemu preskušanju. Informacije, ki lahko pomagajo pri izbiri najprimernejše vrste, seva, spola, načina izpostavljenosti in ustreznih preskusnih koncentracij, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh (glej GD 39 (2)). | 6. | Preskušanju jedkih in/ali dražilnih preskusnih kemikalij pri koncentracijah, za katere se pričakuje, da bodo povzročile hude bolečine in/ali trpljenje, se je treba čim bolj izogibati. Jedki/dražilni potencial je treba oceniti s strokovno presojo ob uporabi dokazov, kot so izkušnje pri ljudeh in živalih (npr. iz študij s ponavljajočimi se odmerki, opravljenih pri nejedkih/nedražilnih koncentracijah), obstoječi podatki in vitro (npr. iz poglavij B.40 (5) in B.40 bis (6) te priloge ali iz OECD TG 435 (7)), vrednosti pH, informacije o podobnih snoveh ali kateri koli drugi pomembni podatki, da se razišče, ali je mogoče nadaljnje preskušanje opustiti. Za posebne zakonodajne potrebe (npr. pri načrtovanju odzivanja v nujnih primerih) se lahko ta preskusna metoda uporabi za izpostavljanje živali tem snovem, ker vodji ali glavnemu raziskovalcu študije zagotavlja nadzor nad izbiro ciljnih koncentracij. Ciljne koncentracije ne smejo povzročiti resnih dražilnih/jedkih učinkov, morajo pa biti zadostne za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, ki izpolnjuje zakonodajni in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je treba izbrati za vsak primer posebej in utemeljiti njihovo izbiro (glej GD 39 (2)). | NAČELO PRESKUSA | 7. | Ta revidirana preskusna metoda B.2 je bila zasnovana za pridobitev zadostnih informacij o akutni strupenosti preskusne kemikalije, da se omogoči njena razvrstitev in zagotovijo podatki o smrtnosti (npr. LC50, LC01 in naklon) za enega ali oba spola – kot je potrebno za kvantitativne ocene tveganja. Ta preskusna metoda vključuje dve metodi. Prva je tradicionalni protokol, pri katerem so skupine živali izpostavljene mejni koncentraciji (mejni preskus) ali seriji koncentracij v postopnem postopku za vnaprej določeno obdobje, običajno 4 ure. Za izpolnitev posebnih zakonodajnih namenov se lahko uporabijo tudi druga obdobja izpostavljenosti. Druga metoda je protokol C × t, pri katerem so skupine živali izpostavljene eni (mejni) koncentraciji ali seriji koncentracij skozi več obdobij. | 8. | Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo bolečine ali kažejo znake hudega in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti ter jih pri razlagi rezultatov preskusa upoštevati enako kot živali, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejem odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o humanih končnih točkah (8). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 9. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih vrst pa je treba utemeljiti. | Priprava živali | 10. | Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan izpostavljenosti morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 8–12 tednov in tehtajo ± 20 % srednje teže za posamezni spol vseh predhodno izpostavljenih živali iste starosti. Živali se izberejo naključno in označijo za posamično prepoznavanje. Pred začetkom preskusa so najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. Poleg tega jih je treba pred preskušanjem krajše obdobje privajati na preskusno aparaturo, saj se tako zmanjša stres, ki ga povzroči uvedba v novo okolje. | Oskrba živali | 11. | Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogoče, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posamično, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja običajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena količina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna z zaporedjem 12 ur svetlobe/12 ur teme. | Inhalacijske komore | 12. | Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemikalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot način izpostavljenosti uporabi izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave oziroma smrčka). Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije tekočih ali trdnih aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogoče je, da bo posebne cilje študije lažje doseči z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpostavljanje celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in pomanjkljivosti so opisani v GD 39 (2). | POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI | Dajanje koncentracij | 13. | Izpostavljenost nosu lahko pri podganah traja do 6 ur. Če se uporabljajo miši, izpostavljenost nosu navadno ne sme biti daljša od 4 ur. Če so potrebne dolgoročnejše študije, je treba to utemeljiti (glej GD 39 (2)). Živali, ki so izpostavljene aerosolom v komorah za izpostavljanje celega telesa, morajo biti nastanjene posamično, da se prepreči zaužitje preskusne kemikalije ob medsebojnem čiščenju primerkov v kletki. V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko ves čas uživajo vodo. | 14. | Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetneje prisotna med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemično reaktivne preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozračju. Paziti je treba, da ne nastanejo eksplozivne koncentracije. | Porazdelitev velikosti delcev | 15. | Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba določiti velikost delcev. Da se omogoči izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, so priporočeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) znaša 1–4 μm z geometričnim standardnim odklonom (σg) 1,5–3,0 (2) (9) (10). Prizadevanje za izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogoče izpolniti, je treba zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci, vlakna in higroskopne snovi (katerih velikost se v vlažnem okolju dihal poveča) pa presegajo navedene vrednosti. | Priprava preskusne kemikalije v nosilcu | 16. | Za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije v atmosferi se lahko uporabi nosilec. Praviloma je treba prednostno uporabiti vodo. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko uporabijo mehanski postopki, da se doseže zahtevana porazdelitev velikosti delcev, vendar je treba paziti, da preskusna kemikalija ne razpade ali se spremeni. Kadar se zdi, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije (npr. ob zelo visokih temperaturah, nastalih zaradi trenja pri pretiranem mletju), je treba sestavo te preskusne kemikalije analitsko preveriti. Skrbno je treba paziti, da se preskusna kemikalija ne kontaminira. Nekrušljivih granulatov, ki so namenoma formulirani tako, da jih ni mogoče vdihniti, ni treba preskušati. Uporabiti je treba preskus drobljivosti, da se dokaže, da pri ravnanju z granulatom ne nastajajo delci, ki jih je mogoče vdihniti. Če pri preskusu drobljivosti nastanejo snovi, ki jih je mogoče vdihniti, je treba opraviti preskus strupenosti pri vdihavanju. | Kontrolne živali | 17. | Sočasna negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna. Kadar se v pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporablja nevodni nosilec, je treba kontrolno skupino z nosilcem uporabiti samo, če niso na voljo pretekli podatki o strupenosti pri vdihavanju. Če študija strupenosti preskusne kemikalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec pri preskušeni koncentraciji ni strupen; kontrola z nosilcem torej ni potrebna. | SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI | Pretok zraka v komori | 18. | Pretok zraka skozi komoro je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Spremljanje koncentracije (ali stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je neločljivo povezana z vsemi dinamičnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri ustvarjanja atmosfere. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja v primerih, v katerih pretok zraka skozi sistem izpostavljanja ni zadosten za zagotovitev dinamičnega toka atmosfere s preskusno kemikalijo. Za dokazovanje, da v izbranih pogojih postopka ni ponovnega vdihavanja, so na voljo predpisane metodologije (2) (11). Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstaja razlog za domnevo, da teh standardov ni mogoče izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. | Temperatura in relativna vlažnost v komori | 19. | Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti celega telesa spremljati ter jo zabeležiti najmanj trikrat, če izpostavljenost traja do 4 ure, medtem ko se pri krajših časih izpostavljenosti ta meritev zabeleži vsako uro. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi nemerljivo zaradi interference preskusne kemikalije s preskusno metodo. | Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija | 20. | Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izračunati in zabeležiti nazivno koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pač pa pri primerjavi z dejansko koncentracijo pokaže, kako učinkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri tem ustvarjanju. | Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija | 21. | Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije v območju dihanja živali v inhalacijski komori. Meri se s specifičnimi metodami (npr. z neposrednim vzorčenjem, adsorpcijskimi ali kemičnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifičnimi metodami, kot je gravimetrična analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetrične analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole tekočin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifičnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetrično analizo se lahko določi tudi koncentracija večkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. V poročilu o študiji je treba navesti ciljne, nazivne in dejanske koncentracije, vendar se v statističnih analizah za izračun vrednosti smrtnih koncentracij uporabljajo samo dejanske koncentracije. | 22. | Po možnosti je treba uporabiti eno serijo preskusne kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred začetkom študije je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vključno z njeno čistostjo ter, če je to tehnično izvedljivo, identiteto in količinami ugotovljenih kontaminantov in nečistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj delno potrdi naročnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). | 23. | Atmosfera v komori za izpostavljanje naj bo konstantna, kolikor je to izvedljivo, ter naj se glede na analitsko metodo spremlja stalno in/ali v rednih intervalih. Kadar se uporablja vzorčenje v intervalih, je treba v štiriurni študiji vzorce atmosfere v komori vzeti najmanj dvakrat. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, se lahko v celotnem obdobju izpostavljenosti vzame en vzorec. Če se med posameznimi vzorci pojavijo izrazita nihanja, je treba pri preskušanju naslednjih koncentracij uporabiti štiri vzorce na izpostavljenost. Posamezni vzorci koncentracije v komori od srednje koncentracije ne smejo odstopati za več kot ± 10 % za pline in hlape oziroma za več kot ± 20 % za tekoče ali trdne aerosole. Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori (t95). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije, pri tem pa je upoštevan čas, potreben za dosego t95. Napotki za ocenjevanje t95 so na voljo v GD 39 (2). | 24. | Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov (npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša drugače, zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), ki je navadno glavna aktivna snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za zmes in ne le za aktivno snov ali sestavino (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (2). | Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev | 25. | Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba med vsako 4-urno izpostavljenostjo določiti vsaj dvakrat s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instrumentom, kot je aerodinamični merilnik delcev. Če je mogoče prikazati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetrični filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost mogoče prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se čim bolj zmanjša količina pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba izpostavljanje ponoviti. Za hlape je treba velikost delcev določiti, če obstaja možnost, da se bodo hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogoče mešane faze, zaznajo delci (glej odstavek 15). | POSTOPEK | 26. | V nadaljevanju sta opisani dve vrsti študij: tradicionalni protokol in protokol C × t. Oba lahko vključujeta opazovalno študijo, glavno študijo in/ali mejni preskus (tradicionalni protokol) oziroma preskušanje pri mejni koncentraciji (C × t). Če je znano, da je en spol občutljivejši, se lahko vodja študije odloči te študije izvesti samo z njim. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se čim bolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Pred začetkom je treba preučiti vse razpoložljive podatke, da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Tako se lahko na primer s podatki, pridobljenimi na podlagi poglavja B.52 te priloge (4), odpravi potreba po opazovalni študiji in dokaže večja občutljivost enega spola (glej GD 39 (2)). | TRADICIONALNI PROTOKOL | Splošni preudarki: tradicionalni protokol | 27. | Pri tradicionalni študiji se skupine živali za točno določen čas (običajno 4 ure) izpostavijo preskusni kemikaliji bodisi v komori za izpostavljanje nosu bodisi v komori za izpostavljanje celega telesa. Živali se izpostavijo bodisi mejni koncentraciji (mejni preskus) bodisi najmanj trem koncentracijam v postopnem postopku (glavna študija). Pred glavno študijo se lahko izvede opazovalna študija, razen če so že na voljo nekatere informacije o preskusni kemikaliji, kot je predhodno izvedena študija B.52 (glej GD 39 (2)). | Opazovalna študija: tradicionalni protokol | 28. | Opazovalna študija se uporablja za ocenjevanje moči preskusne kemikalije, opredelitev razlik med spoloma glede občutljivosti in pomoč pri izbiri koncentracij izpostavljenosti za glavno študijo ali mejni preskus. Pri izbiri koncentracij za opazovalno študijo je treba uporabiti vse informacije, ki so na voljo, vključno z razpoložljivimi podatki (Q)SAR in podatki za podobne kemikalije. Vsaki koncentraciji se izpostavi največ tri samce in tri samice (3 živali/spol so lahko potrebne, da se ugotovi razlika med spoloma). Opazovalna študija lahko zajema eno samo koncentracijo, po potrebi pa se jih lahko preskusi tudi več. Opazovalna študija ne sme vključevati toliko živali in koncentracij, da je podobna glavni študiji. Namesto opazovalne študije se lahko uporabi predhodno izvedena študija B.52 (4) (glej GD 39 (2)). | Mejni preskus: tradicionalni protokol | 29. | Mejni preskus se uporabi, kadar je znano ali se pričakuje, da je preskusna kemikalija praktično nestrupena, tj. da povzroči toksično reakcijo samo nad zakonsko predpisano mejno koncentracijo. Pri mejnem preskusu se ena skupina treh samcev in treh samic izpostavi preskusni kemikaliji pri mejni koncentraciji. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije se lahko pridobijo na podlagi znanja o podobnih preskušenih kemikalijah ob upoštevanju identitete in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko pomembne. Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih ni ali kadar se pričakuje, da je kemikalija strupena, je treba opraviti glavni preskus. | 30. | Izbira mejnih koncentracij je navadno odvisna od zakonodajnih zahtev. Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l (ali najvišje dosegljive koncentracije) (3). Ustvarjanje mejnih koncentracij nekaterih preskusnih kemikalij, zlasti kemikalij v obliki hlapov in aerosolov, je lahko tehnično zahtevno. Pri preskušanju aerosolov mora biti glavni cilj ustvariti delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (MMAD 1–4 μm). To je mogoče z večino preskusnih kemikalij pri koncentraciji 2 mg/l. Preskušanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (glej GD 39 (2)). V Uredbi (ES) št. 1272/2008 se zaradi dobrobiti živali (3) preskušanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Tako preskušanje se lahko predvidi samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo rezultati takega preskusa neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi (3), poleg tega pa je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. V primeru potencialno eksplozivnih preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je treba pred mejnim preskusom opraviti preskus brez živali in tako zagotoviti, da je v komori mogoče doseči pogoje za mejni preskus. | 31. | Če se pri mejni koncentraciji opazi smrtnost ali umiranje, se lahko rezultati mejnega preskusa uporabijo kot opazovalna študija za nadaljnje preskušanje pri drugih koncentracijah (glej glavno študijo). Kadar zaradi fizikalnih ali kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ni mogoče doseči mejne koncentracije, je treba preskusiti najvišjo dosegljivo koncentracijo. Če ta povzroči manj kot 50-odstotno smrtnost, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Kadar mejne koncentracije ni mogoče doseči, je treba v poročilu o študiji navesti pojasnilo in podporne podatke. Če najvišja dosegljiva koncentracija hlapov ne izzove strupenih učinkov, bo morda treba preskusno kemikalijo pripraviti v obliki tekočega aerosola. | Glavna študija: tradicionalni protokol | 32. | Glavna študija se običajno opravlja s petimi samci in petimi samicami (ali petimi živalmi občutljivejšega spola, če je znan) na koncentracijo, pri čemer se uporabijo najmanj tri različne koncentracije. Za zanesljivo statistično analizo je treba uporabiti zadostne koncentracije. Časovni interval med skupinami za izpostavljanje je določen glede na nastop, trajanje in resnost znakov zastrupitve. Z izpostavljanjem živali naslednji stopnji koncentracije je treba počakati, dokler ni mogoče z razumno gotovostjo sklepati o preživetju predhodno preskušenih živali. Tako lahko vodja študije prilagodi ciljno koncentracijo za naslednjo skupino za izpostavljanje. Zaradi odvisnosti od kompleksnih tehnologij to pri inhalacijskih študijah morda ni vedno praktično, zato mora izpostavljanje živali naslednji stopnji koncentracije temeljiti na predhodnih izkušnjah in znanstveni presoji. Pri preskušanju zmesi je treba upoštevati GD 39 (2). | PROTOKOL KONCENTRACIJA × ČAS (C × T) | Splošni preudarki: protokol C × t | 33. | Postopna študija C × t se lahko obravnava kot alternativa tradicionalnemu protokolu, kadar se preskuša strupenost pri vdihavanju (12) (13) (14). Ta pristop omogoča, da se živali izpostavijo preskusni kemikaliji pri več koncentracijah in ob različnih obdobjih izpostavljenosti. Celotno preskušanje se izvaja v komori za izpostavljanje nosu (komore za izpostavljanje celega telesa za protokol C × t niso praktične). Ta protokol je ponazorjen v diagramu poteka v Dodatku 1. Simulacijska analiza je pokazala, da je mogoče s tradicionalnim protokolom in protokolom C × t dobiti zanesljive vrednosti LC50, vendar je protokol C × t na splošno boljši pri zagotavljanju zanesljivih vrednosti LC01 in LC10 (15). | 34. | Simulacijska analiza je pokazala, da lahko uporaba dveh živali na interval C × t (po ena žival vsakega spola, če se uporabljata oba spola, ali dve živali občutljivejšega spola) na splošno zadošča, kadar se v glavni študiji preskušajo štiri koncentracije in pet obdobij izpostavljenosti. V nekaterih okoliščinah se lahko vodja študije odloči uporabiti po dve podgani vsakega spola na interval C × t (15). Uporaba dveh živali vsakega spola na koncentracijo in časovno točko lahko zmanjša izkrivljenost in spremenljivost ocen, poveča stopnjo uspešnosti ocenjevanja ter izboljša obseg intervala zaupanja. Vendar lahko v primeru nezadostnega ujemanja s podatki za ocenjevanje (ob uporabi ene živali vsakega spola ali dveh živali občutljivejšega spola) zadošča tudi peta koncentracija izpostavljenosti. Več napotkov o številu živali in koncentracij, ki jih je treba uporabiti v študiji C × t, je na voljo v GD 39 (2). | Opazovalna študija: protokol C × t | 35. | Opazovalna študija se uporablja za ocenjevanje moči preskusne kemikalije in pomoč pri izbiri koncentracij izpostavljenosti za glavno študijo. Da se izbere primerna začetna koncentracija za glavno študijo in čim bolj zmanjša število uporabljenih živali, je lahko potrebna opazovalna študija z do tremi živalmi/spol/koncentracijo (za podrobnosti glej Dodatek III k GD 39 (2)). Za ugotavljanje razlike med spoloma bo morda treba uporabiti tri živali na spol. Te živali je treba izpostaviti za eno samo obdobje, ki navadno traja 240 min. Izvedljivost ustvarjanja ustreznih preskusnih atmosfer je treba oceniti med predhodnimi tehničnimi preskusi brez živali. Če so na voljo podatki o smrtnosti iz študije B.52 (4), opazovalne študije običajno ni treba opraviti. Vodja študije mora pri izbiri začetne ciljne koncentracije v študiji B.2 upoštevati vzorce smrtnosti, opažene v kateri koli razpoložljivi študiji B.52 (4) za oba spola in vse preskušene koncentracije (glej GD 39 (2)). | Začetna koncentracija: protokol C × t | 36. | Začetna koncentracija (izpostavitev I) (Dodatek 1) je bodisi mejna koncentracija bodisi koncentracija, ki jo vodja študije izbere na podlagi opazovalne študije. Skupine s po 1 živaljo/spol se tej koncentraciji izpostavijo za več obdobij (v trajanju npr. 15, 30, 60, 120 ali 240 minut), tako da je vseh živali skupaj 10 (celotni postopek imenujemo izpostavitev I) (Dodatek 1). | 37. | Izbira mejnih koncentracij je navadno odvisna od zakonodajnih zahtev. Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l (ali najvišje dosegljive koncentracije) (3). Ustvarjanje mejnih koncentracij nekaterih preskusnih kemikalij, zlasti kemikalij v obliki hlapov in aerosolov, je lahko tehnično zahtevno. Pri preskušanju aerosolov mora biti cilj ustvariti delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (tj. MMAD 1–4 μm), pri mejni koncentraciji 2 mg/l. To je mogoče pri večini preskusnih kemikalij. Preskušanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (glej GD 39 (2)). V Uredbi (ES) št. 1272/2008 se zaradi dobrobiti živali preskušanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Tako preskušanje se lahko predvidi samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo rezultati takega preskusa neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi (3), poleg tega pa je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. V primeru potencialno eksplozivnih preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je treba pred preskušanjem pri začetni koncentraciji opraviti preskus brez živali in tako zagotoviti, da je v komori mogoče doseči pogoje za to koncentracijo. | 38. | Če se pri začetni koncentraciji opazi smrtnost ali umiranje, se lahko rezultati, dobljeni pri tej koncentraciji, uporabijo kot izhodišče za nadaljnje preskušanje pri drugih koncentracijah (glej glavno študijo). Kadar zaradi fizikalnih ali kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ni mogoče doseči mejne koncentracije, je treba preskusiti najvišjo dosegljivo koncentracijo. Če ta povzroči manj kot 50-odstotno smrtnost, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Kadar mejne koncentracije ni mogoče doseči, je treba v poročilu o študiji navesti pojasnilo in podporne podatke. Če najvišja dosegljiva koncentracija hlapov ne izzove strupenih učinkov, bo morda treba preskusno kemikalijo pripraviti v obliki tekočega aerosola. | Glavna študija: protokol C × t | 39. | Začetna koncentracija (izpostavitev I) (Dodatek 1), preskušena v glavni študiji, je bodisi mejna koncentracija bodisi koncentracija, ki jo vodja študije določi na podlagi opazovalne študije. Če je bila med izpostavitvijo I ali po njej opažena smrtnost, se minimalna izpostavljenost (C × t), ki povzroči smrtnost, upošteva kot smernica za določitev koncentracije in obdobij izpostavljenosti za izpostavitev II. Vsaka naslednja izpostavitev je odvisna od prejšnje izpostavitve (glej Dodatek 1). | 40. | Za številne preskusne kemikalije rezultati, dobljeni pri začetni koncentraciji, skupaj s tremi dodatnimi izpostavitvami v okviru drobnejše časovne mreže (tj. geometrične razmaknjenosti obdobij izpostavljenosti, kot jo določa faktor med zaporednimi obdobji, običajno √2) zadoščajo za določitev razmerja smrtnosti C × t (15), čeprav lahko uporaba 5. koncentracije izpostavljenosti prinese nekatere koristi (glej Dodatek 1 in GD 39 (2)). Za matematično obdelavo rezultatov pri protokolu C × t glej Dodatek 1. | OPAZOVANJA | 41. | Med obdobjem izpostavljenosti je treba živali pogosto klinično opazovati. Po izpostavljenosti je treba klinična opazovanja izvajati skupno 14 dni, in sicer na dan izpostavljenosti najmanj dvakrat ali pogosteje, če to nakazuje odziv živali na tretiranje, nato pa najmanj enkrat na dan. Dolžina obdobja opazovanja ni točno določena, pač pa jo je treba določiti glede na naravo in čas nastopa kliničnih znakov ter dolžino obdobja okrevanja. Časi pojava in izginotja pokazateljev strupenosti so pomembni, zlasti če se ti znaki nagibajo k zapoznelosti. Vsa opažanja se sistematično zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za vsako žival posebej. Umirajoče živali ter živali, ki kažejo znake hude bolečine in/ali trajnega in hudega trpljenja, je treba zaradi njihove dobrobiti humano usmrtiti. Pri pregledih za kliničnimi pokazatelji strupenosti je treba paziti, da se začetni slab videz in prehodne spremembe v dihanju, ki so posledica postopka izpostavljanja, ne zamenjajo za strupenost, povezano s preskusno kemikalijo, ki bi zahtevala predčasno usmrtitev živali. Upoštevati je treba načela in merila, povzeta v Dokumentu s smernicami o humanih končnih točkah (GD 19) (7). Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti zabeležiti čim natančneje. | 42. | Opazovanja v kletkah morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, v dihalih, obtočilih, avtonomnem in osrednjem živčevju ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Kadar je to mogoče, je treba zabeležiti vsa razlikovanja med lokalnimi in sistemskimi učinki. Pozorno je treba opazovati tremorje, krče, slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. | Telesna teža | 43. | Težo posameznih živali je treba zabeležiti enkrat v obdobju prilagajanja na okolje, na dan izpostavljenosti pred izpostavljenostjo (dan 0) ter vsaj 1., 3. in 7. dan (nato pa tedensko), poleg tega pa še ob poginu ali evtanaziji, če ta nastopi po 1. dnevu. Telesna teža se priznava kot bistveni kazalnik strupenosti, tako da je treba živali, pri katerih se v primerjavi z vrednostmi pred študijo opazi trajen upad za ≥ 20 %, skrbno spremljati. Preživele živali se ob koncu obdobja po izpostavljenosti stehtajo in humano usmrtijo. | Patologija | 44. | Na vseh preskusnih živalih, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so evtanazirane in odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba opraviti makroskopsko obdukcijo. Če je ni mogoče opraviti takoj po odkritju poginule živali, je treba žival ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza čim bolj zmanjša. Obdukcijo je treba opraviti čim prej, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. | 45. | Za razširitev razlagalne vrednosti študije se lahko razmisli o dodatnih samoumevno vključenih pregledih, kot sta tehtanje pljuč preživelih podgan in/ali zagotavljanje dokazov o dražilnosti z mikroskopskim pregledom dihal. Med pregledanimi organi so lahko tudi tisti, ki kažejo makroskopske patološke znake pri živalih, ki so preživele 24 ur ali več, in organi, za katere je znano ali se pričakuje, da so prizadeti. Mikroskopski pregled celotnih dihal lahko zagotovi koristne informacije za preskusne kemikalije, ki reagirajo z vodo, kot so kisline in higroskopne preskusne kemikalije. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 46. | Zagotoviti je treba podatke o telesni teži in ugotovitvah obdukcije posameznih živali. Podatke o kliničnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifične znake zastrupitve, število živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije. | Poročilo o preskusu | 47. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno: | | Preskusne živali in oskrba | — | opis pogojev v kletkah, vključno s številom (ali spremembo števila) živali na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, | — | uporabljeno vrsta/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana, | — | število, starost in spol živali, | — | metodo randomizacije, | — | podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom hrane in virom vode), | — | opis morebitne priprave živali pred preskusom, vključno s hrano, karanteno in zdravljenjem. | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo), | — | identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), če je znana. | | Nosilec | — | utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda), | — | pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na rezultat študije. | | Inhalacijska komora | — | opis inhalacijske komore, vključno z merami in prostornino, | — | izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje atmosfere, | — | opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske koncentracije, | — | vir zraka in obdelavo dovajanega/odvajanega zraka ter sistem za klimatiziranje, | — | metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene preskusne atmosfere, | — | razliko v tlaku (pozitivna ali negativna), | — | izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v sistemu (izpostavljanje celega telesa), | — | časovno homogenost/stabilnost preskusne atmosfere, | — | položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzorčenja preskusne atmosfere v komori, | — | stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino (izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega telesa), | — | informacije o opremi, uporabljeni za merjenje kisika in ogljikovega dioksida, če se uporablja, | — | čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t95), | — | število zamenjav volumna zraka na uro, | — | merilne naprave (če se uporabljajo). | | Podatki o izpostavljenosti | — | utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, | — | nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), | — | dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v območju dihanja živali, za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira ločeno, | — | vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (npr. mg/l, mg/m3 itd.); v oklepajih se lahko navedejo tudi prostorninske enote (npr. ppm, ppb itd.), | — | porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) in geometrični standardni odklon (σg), vključno z metodami za njihov izračun. Poročati je treba o posameznih analizah velikosti delcev. | | Preskusni pogoji | — | podatke o pripravi preskusne kemikalije, vključno s podrobnostmi o postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije. Kadar obstaja možnost, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije, je treba vključiti rezultate analiz za preverjanje sestave te preskusne kemikalije, | — | opis (ki po možnosti vključuje diagram) opreme, uporabljene za ustvarjanje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, | — | podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji (vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzorčenje), | — | utemeljitev določitve preskusnih koncentracij. | | Rezultati | — | preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, | — | preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, | — | preglednice s podatki o velikosti delcev, vključno s podatki o analitskem vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izračuni MMAD in σg, | — | preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za živali, ki kažejo znake zastrupitve, vključno s smrtnostjo ter naravo, resnostjo, časom nastopa in trajanjem učinkov), | — | telesne teže posameznih živali, izmerjene med študijo; datum in čas smrti, če je ta nastopila pred predvideno evtanazijo; časovni potek nastopa znakov zastrupitve in ali so bili ti reverzibilni za vsako žival, | — | izsledke obdukcije in histopatološke preiskave za vsako žival, če so na voljo, | — | ocene smrtnosti (npr. LC50, LD01), vključno s 95-odstotnimi mejami zaupanja in naklonom (če tako določa ocenjevalna metoda), | — | statistično povezanost, vključno z oceno eksponenta n (protokol C × t). Navesti je treba ime uporabljene statistične programske opreme. | | Razprava in razlaga rezultatov | — | poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpolnitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, | — | z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogoče izpolniti, | — | če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o humanih končnih točkah (8) humano žrtvovati živali, ki so trpele bolečine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, | — | če je bilo preskušanje na podlagi poglavja B.52 te priloge (4) prekinjeno v korist te preskusne metode B.2, je treba to utemeljiti, | — | v splošno oceno študije je treba vključiti doslednost metod, uporabljenih za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, | — | obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujoči način delovanja (sistemski ali lokalni). | VIRI: | (1) | OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (3) | Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spremembi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). | (4) | Poglavje B.52 te priloge, Akutna strupenost pri vdihavanju – metoda razredov akutne strupenosti. | (5) | Poglavje B.40 te priloge, Jedkost za kožo in vitro: preskus transkutane električne upornosti (TER). | (6) | Poglavje B.40 bis te priloge, Jedkost za kožo in vitro: preskus z modelom človeške kože. | (7) | OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (9) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327. | (10) | Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2. izdaja) Informa Healthcare, New York. | (11) | Pauluhn, J. in Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167. | (12) | Zwart, J. H. E., Arts, J. M., ten Berge, W. F., Appelman, L. M. (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290. | (13) | Zwart, J. H. E., Arts, J. M., Klokman-Houweling, E. D., Schoen, E. D. (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117. | (14) | Ten Berge, W. F. in Zwart, A. (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71. | (15) | OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (16) | Finney, D. J. (1977). Probit Analysis, 3. izdaja, Cambridge University Press, London/New York. | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 1 | Protokol C × t | 1. | Postopna študija koncentracija × čas (C × t) se lahko obravnava kot alternativa tradicionalnemu protokolu, kadar se preskuša strupenost pri vdihavanju (12) (13) (14). Po možnosti jo je treba uporabljati ob posebni zakonodajni ali znanstveni potrebi po preskušanju živali v več različno dolgih časovnih obdobjih, na primer za načrtovanje odzivanja v nujnih primerih ali načrtovanje rabe tal. Ta pristop se običajno začne s preskušanjem pri mejni koncentraciji (izpostavitev I), ko se živali izpostavijo preskusni kemikaliji za pet časovnih obdobij (v trajanju npr. 15, 30, 60, 120 in 240 min), tako da se v eni izpostavitvi pridobijo podatki za več časovnih obdobij (glej sliko 1). Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l. Te koncentracije se smejo preseči samo ob zakonodajni ali znanstveni potrebi po preskušanju pri višjih koncentracijah (glej odstavek 37 glavnega dela poglavja B.2). | 2. | Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih ni, je treba opraviti opazovalno študijo, v kateri se skupine največ 3 živali na spol izpostavijo ciljnim koncentracijam, ki jih določi vodja študije, navadno za 240 min. | 3. | Če se med izpostavitvijo I preskusi mejna koncentracija in se opazi manj kot 50-odstotna smrtnost, dodatno preskušanje ni potrebno. Če obstaja zakonodajna ali znanstvena potreba po določitvi razmerja koncentracija/čas/odziv pri višjih koncentracijah od opredeljene mejne, je treba naslednjo izpostavitev izvesti pri višji koncentraciji, npr. dvakratniku mejne koncentracije (tj. 2L na sliki 1). | 4. | Če se pri mejni koncentraciji ugotovi strupenost, je potrebno dodatno preskušanje (glavna študija). To dodatno izpostavljanje se izvede bodisi pri nižjih koncentracijah (na sliki 1: izpostavitve II, III ali IV’) bodisi pri višjih koncentracijah za krajša obdobja (na sliki 1: izpostavitev IV), ki so prilagojena in nekoliko manj razmaknjena. | 5. | Preskus (začetna in dodatne koncentracije) se opravi z 1 živaljo/spol na koncentracijo/časovno točko ali 2 živalma občutljivejšega spola na koncentracijo/časovno točko. V nekaterih okoliščinah se lahko vodja študije odloči uporabiti 2 podgani/spol na koncentracijo/časovno točko (ali 4 živali občutljivejšega spola na koncentracijo/časovno točko) (15). Uporaba 2 živali na spol na koncentracijo/časovno točko na splošno zmanjša pristranskost in spremenljivost ocen, poveča stopnjo uspešnosti ocenjevanja ter izboljša pokritost intervala zaupanja v primerjavi s protokolom, kot je opisan tukaj. Več podrobnosti je na voljo v GD 39 (2). | 6. | Po možnosti se vsaka izpostavitev izvede v enem dnevu. Tako se lahko z naslednjo izpostavitvijo počaka, dokler ni mogoče z razumno gotovostjo sklepati o preživetju, vodja študije pa lahko prilagodi ciljno koncentracijo in obdobja za naslednjo izpostavitev. Vsako izpostavitev je priporočljivo začeti s skupino, ki bo izpostavljena najdlje, npr. s skupino za 240-minutno izpostavljanje, tej sledi skupina za 120-minutno izpostavljanje itn. Če na primer živali v 240-minutni skupini po 90 minutah umirajo ali kažejo resne znake zastrupitve (npr. velike spremembe v vzorcu dihanja, kot je oteženo dihanje), izpostavljanje skupine za 120 minut ne bi bilo smiselno, ker bi bila smrtnost verjetno 100-odstotna. Zato mora vodja študije za zadevno koncentracijo izbrati krajša obdobja izpostavljenosti (npr. 90, 65, 45, 33 in 25 minut). | 7. | Koncentracijo v komori je treba pogosto meriti, da se določi časovno tehtana povprečna koncentracija za vsako obdobje izpostavljenosti. Kadar koli je to mogoče, je treba v statistični analizi uporabiti čas smrti za vsako žival (namesto obdobja izpostavljenosti). | 8. | Rezultate prvih štirih izpostavitev je treba preučiti, da se opredeli podatkovna vrzel v krivulji koncentracija-čas (glej sliko 1). V primeru nezadostnega ujemanja se lahko izvede dodatna izpostavitev (5. koncentracija). Koncentracijo in obdobja izpostavljenosti za 5. izpostavitev je treba izbrati tako, da se zapolni ta vrzel. | 9. | Vse izpostavitve (vključno s prvo) se uporabijo za izračun razmerja koncentracija-čas-odziv s statistično analizo (16). Če je to mogoče, je treba za vsak interval C × t uporabiti časovno tehtano povprečno koncentracijo in obdobje izpostavljenosti do smrti (če ta nastopi med izpostavljenostjo). | Slika 1 | Hipotetični prikaz razmerja koncentracija-čas-smrtnost pri podganah | Prazni simboli = preživele živali; polni simboli = poginule živali | Trikotniki = samice; krožci = samci | Neprekinjena črta = vrednosti LC50 (razpon 7,5–240 min) za samce pri n = 1 | Črtkana črta = vrednosti LC50 (razpon 7,5–240 min) za samice pri n = 1 | Pikčasta črta = hipotetične vrednosti LC50 za samce in samice, če bi veljalo n = 2 (12) | Glosar | Koncentracija: | Čas izpostavljenosti: | 10. | V nadaljevanju je predstavljen primer postopnega postopka: | Izpostavitev I – preskušanje pri mejni koncentraciji (glej sliko 1) | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali (2) | — | Ciljna koncentracija (3) = mejna koncentracija. | — | Pet skupin živali se tej ciljni koncentraciji izpostavi za 15, 30, 60, 120 oziroma 240 minut. | ↓ | Izpostavitev II (4) – glavna študija | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali. | — | Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (5) (1/2 L) z malce daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1). | ↓ | Izpostavitev III – glavna študija | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali. | — | Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (5) (1/4 L) z malce daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1). | ↓ | Izpostavitev IV’ – glavna študija | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali. | — | Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (5) (1/8 L) z malce daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1). | ↓ali | Izpostavitev IV – glavna študija | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali. | — | Pet skupin živali se izpostavi višji koncentraciji (6) (2 L) z malce krajšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1). | Matematična obdelava rezultatov za protokol C × t | 11. | Postopek C × t, ki zajema 4 ali 5 koncentracij izpostavljenosti in pet obdobij, da 20 oziroma 25 podatkovnih točk. S temi podatkovnimi točkami se lahko razmerje C × t izračuna s statistično analizo (16): | Enačba 1 | kjer je C = koncentracija; t = obdobje izpostavljenosti, ali | Enačba 2 | kjer je | Z enačbo 1 se lahko izračuna vrednost LC50 za dano časovno obdobje (npr. 4 ure, 1 uro, 30 minut ali katero koli časovno obdobje v razponu preskuševanih časovnih obdobij) z uporabo P = 5 (50-odstotni odziv). Opozoriti je treba, da Haberjevo pravilo velja samo, kadar je n = 1. Vrednost LC01 se lahko izračuna z uporabo P = 2,67. | “ | (3) | Chapter B.2 is replaced by the following: | ‘B.2. ACUTE INHALATION TOXICITY | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline 403 (2009) (1). The original acute inhalation Test Guideline 403 (TG 403) was adopted in 1981. This revised Test Method B.2 (as equivalent to the revised TG 403) has been designed to be more flexible, to reduce animal usage, and to fulfil regulatory needs. The revised Test Method features two study types: a Traditional LC50 protocol and a Concentration × Time (C × t) protocol. Primary features of this Test Method are the ability to provide a concentration-response relationship ranging from non-lethal to lethal outcomes in order to derive a median lethal concentration (LC50), non-lethal threshold concentration (e.g. LC01), and slope, and to identify possible sex susceptibility. The C × t protocol should be used when there is a specific regulatory or scientific need that calls for the testing of animals over multiple time durations, such as for purposes of emergency response planning [e.g. deriving Acute Exposure Guideline Levels (AEGL), Emergency Response Planning Guidelines (ERPG), or Acute Exposure Threshold Levels (AETL) values], or for land-use planning. | 2. | Guidance on the conduct and interpretation of this Test Method studies can be found in the Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39) (2). | 3. | Definitions used in the context of this Test Method are provided at the end of this chapter and in GD 39 (2). | 4. | This Test Method enables test chemical characterisation and quantitative risk assessment, and allows test chemicals to be ranked and classified according to Regulation (EC) No 1272/2008 (3). GD 39 (2) provides guidance in the selection of the appropriate Test Method for acute testing. When information on classification and labelling only is required, chapter B.52 of this Annex (4) is generally recommended [see GD 39 (2)]. This Test Method B.2 is not specifically intended for the testing of specialised materials, such as poorly soluble isometric or fibrous materials or manufactured nanomaterials. | INITIAL CONSIDERATIONS | 5. | Before considering testing in accordance with this Test Method all available information on the test chemical, including existing studies (e.g. chapter B.52 of this Annex (4)) whose data would support not doing additional testing should be considered by the testing laboratory in order to minimise animal usage. Information that may assist in the selection of the most appropriate species, strain, sex, mode of exposure and appropriate test concentrations include the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated uses and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally related substances [see GD 39 (2)]. | 6. | Testing corrosive and/or irritating test chemicals at concentrations that are expected to cause severe pain and/or distress should be avoided to the extent possible. The corrosive/irritating potential should be evaluated by expert judgment using such evidence as human and animal experience (e.g. from repeat dose studies performed at non-corrosive/irritant concentrations), existing in vitro data (e.g. from chapters B.40, (5), B.40bis (6) of this Annex or OECD TG 435 (7)), pH values, information from similar substances or any other pertinent data, for the purpose of investigating whether further testing can be waived. For specific regulatory needs (e.g. for emergency planning purposes), this Test Method may be used for exposing animals to these materials because it provides the study director or principal investigator with control over the selection of target concentrations. However, the targeted concentrations should not induce severe irritation/corrosive effects, yet sufficient to extend the concentration-response curve to levels that reach the regulatory and scientific objective of the test. These concentrations should be selected on a case-by-case basis and justification for concentration selection should be provided [see GD 39 (2)]. | PRINCIPLE OF THE TEST | 7. | This revised Test Method B.2 has been designed to obtain sufficient information on the acute toxicity of a test chemical to enable its classification and to provide lethality data (e.g. LC50, LC01 and slope) for one or both sexes as needed for quantitative risk assessments. This Test Method offers two methods. The first method is a traditional protocol in which groups of animals are exposed to a limit concentration (limit test) or a series of concentrations in a stepwise procedure for a predetermined duration of usually 4 hours. Other durations of exposure may apply to serve specific regulatory purposes. The second method is a (C × t) protocol in which groups of animals are exposed to one (limit concentration) or a series of multiple concentrations over multiple durations. | 8. | Moribund animals or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress should be humanely killed and are considered in the interpretation of the test result in the same way as animals that died on test. Criteria for making the decision to kill moribund or severely suffering animals, and guidance on the recognition of predictable or impending death, are the subject of an OECD Guidance Document No 19 on Humane Endpoints (8). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 9. | Healthy young adult animals of commonly used laboratory strains should be used. The preferred species is the rat and justification should be provided if other species are used. | Preparation of animals | 10. | Females should be nulliparous and non-pregnant. On the exposure day, animals should be young adults 8 to 12 weeks of age, and body weights should be within ± 20 % of the mean weight for each sex of any previously exposed animals of the same age. The animals are randomly selected and marked for individual identification. The animals are kept in their cages for at least 5 days prior to the start of the test to allow for acclimatisation to laboratory conditions. Animals should also be acclimatised to the test apparatus for a short period prior to testing, as this will lessen the stress caused by introduction to the new environment. | Animal husbandry | 11. | The temperature of the experimental animal maintenance room should be 22 ± 3 °C. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, though this may not be possible when using water as a vehicle. Before and after exposures, animals generally should be caged in groups by sex and concentration, but the number of animals per cage should not interfere with clear observation of each animal and should minimise losses due to cannibalism and fighting. When animals are to be exposed nose-only, it may be necessary for them to be acclimated to the restraining tubes. The restraining tubes should not impose undue physical, thermal, or immobilisation stress on the animals. Restraint may affect physiological endpoints such as body temperature (hyperthermia) and/or respiratory minute volume. If generic data are available to show that no such changes occur to any appreciable extent, then pre-adaptation to the restraining tubes is not necessary. Animals exposed whole-body to an aerosol should be housed individually during exposure to prevent them from filtering the test aerosol through the fur of their cage mates. Conventional and certified laboratory diets may be used, except during exposure, accompanied with an unlimited supply of municipal drinking water. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light/12 hours dark. | Inhalation chambers | 12. | The nature of the test chemical and the objective of the test should be considered when selecting an inhalation chamber. The preferred mode of exposure is nose-only (which term includes head-only, nose-only or snout-only). Nose-only exposure is generally preferred for studies of liquid or solid aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. Special objectives of the study may be better achieved by using a whole-body mode of exposure, but this should be justified in the study report. To ensure atmosphere stability when using a whole-body chamber, the total volume of the test animals should not exceed 5 % of the chamber volume. Principles of the nose-only and whole body exposure techniques and their particular advantages and disadvantages are described in GD 39 (2). | EXPOSURE CONDITIONS | Administration of concentrations | 13. | Nose-only exposures may be any duration up to 6 hours in rats. If mice are exposed nose-only, exposures generally should not exceed 4 hours. Justification should be provided if longer duration studies are needed [see GD 39 (2)]. Animals exposed to aerosols in whole-body chambers should be housed individually to prevent ingestion of test chemical due to grooming of cage mates. Feed should be withheld during the exposure period. Water may be provided throughout a whole-body exposure. | 14. | Animals are exposed to the test chemical as a gas, vapour, aerosol, or a mixture thereof. The physical state to be tested depends on the physico-chemical properties of the test chemical, the selected concentration, and/or the physical form most likely present during the handling and use of the test chemical. Hygroscopic and chemically reactive test chemicals should be tested under dry air conditions. Care should be taken to avoid generating explosive concentrations. | Particle-size distribution | 15. | Particle sizing should be performed for all aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. To allow for exposure of all relevant regions of the respiratory tract, aerosols with mass median aerodynamic diameters (MMAD) ranging from 1 to 4 μm with a geometric standard deviation (σg) in the range of 1,5 to 3,0 are recommended (2) (9) (10). Although a reasonable effort should be made to meet this standard, expert judgment should be provided if it cannot be achieved. For example, metal fumes may be smaller than this standard, and charged particles, fibres, and hygroscopic materials (which increase in size in the moist environment of the respiratory tract) may exceed this standard. | Test chemical preparation in a vehicle | 16. | A vehicle may be used to generate an appropriate concentration and particle size of the test chemical in the atmosphere. As a rule, water should be given preference. Particulate material may be subjected to mechanical processes to achieve the required particle size distribution, however, care should be taken to not decompose or alter the test chemical. In cases where mechanical processes are believed to have altered test chemical composition (e.g. extreme temperatures from excessive milling due to friction), the composition of the test chemical should be verified analytically. Adequate care should be taken to not contaminate the test chemical. It is not necessary to test non-friable granular materials which are purposefully formulated to be un-inhalable. An attrition test should be used to demonstrate that respirable particles are not produced when the granular material is handled. If an attrition test produces respirable substances, an inhalation toxicity test should be performed. | Control animals | 17. | A concurrent negative (air) control group is not necessary. When a vehicle other than water is used to assist in generating the test atmosphere, a vehicle control group should only be used when historical inhalation toxicity data are not available. If a toxicity study of a test chemical formulated in a vehicle reveals no toxicity, it follows that the vehicle is non-toxic at the concentration tested; thus, there is no need for a vehicle control. | MONITORING OF EXPOSURE CONDITIONS | Chamber airflow | 18. | The flow of air through the chamber should be carefully controlled, continuously monitored, and recorded at least hourly during each exposure. The monitoring of test atmosphere concentration (or stability) is an integral measurement of all dynamic parameters and provides an indirect means to control all relevant dynamic atmosphere generation parameters. Special consideration should be given to avoiding re-breathing in nose-only chambers in cases where airflow through the exposure system are inadequate to provide dynamic flow of test chemical atmosphere. There are prescribed methodologies that can be used to demonstrate that re-breathing does not occur under the selected operation conditions (2) (11). Oxygen concentration should be at least 19 % and carbon dioxide concentration should not exceed 1 %. If there is reason to believe that these standards cannot be met, oxygen and carbon dioxide concentrations should be measured. | Chamber temperature and relative humidity | 19. | Chamber temperature should be maintained at 22 ± 3 °C. Relative humidity in the animals’ breathing zone, for both nose-only and whole-body exposures, should be monitored and recorded at least three times for durations of up to 4 hrs, and hourly for shorter durations. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, but this may either be unattainable (e.g. when testing water based mixtures) or not measurable due to test chemical interference with the test method. | Test chemical: Nominal concentration | 20. | Whenever feasible, the nominal exposure chamber concentration should be calculated and recorded. The nominal concentration is the mass of generated test chemical divided by the total volume of air passed through the chamber system. The nominal concentration is not used to characterise the animals’ exposure, but a comparison of the nominal concentration and the actual concentration gives an indication of the generation efficiency of the test system, and thus may be used to discover generation problems. | Test chemical: Actual concentration | 21. | The actual concentration is the test chemical concentration at the animals’ breathing zone in an inhalation chamber. Actual concentrations can be obtained by specific methods (e.g. direct sampling, adsorptive or chemical reactive methods, and subsequent analytical characterisation) or by non-specific methods such as gravimetric filter analysis. The use of gravimetric analysis is acceptable only for single component powder aerosols or aerosols of low volatility liquids and should be supported by appropriate pre-study test chemical-specific characterisations. Multi-component powder aerosol concentration may also be determined by gravimetric analysis. However, this requires analytical data which demonstrate that the composition of airborne material is similar to the starting material. If this information is not available, a reanalysis of the test chemical (ideally in its airborne state) at regular intervals during the course of the study may be necessary. For aerosolised agents that may evaporate or sublimate, it should be shown that all phases were collected by the method chosen. The target, nominal, and actual concentrations should be provided in the study report, but only actual concentrations are used in statistical analyses to calculate lethal concentration values. | 22. | One lot of the test chemical should be used, if possible, and the test sample should be stored under conditions that maintain its purity, homogeneity, and stability. Prior to the start of the study, there should be a characterisation of the test chemical, including its purity and, if technically feasible, the identity, and quantities of identified contaminants and impurities. This can be demonstrated by, but is not limited to, the following data: retention time and relative peak area, molecular weight from mass spectroscopy or gas chromatography analyses, or other estimates. Although the test sample’s identity is not the responsibility of the test laboratory, it may be prudent for the test laboratory to confirm the sponsor’s characterisation at least in a limited way (e.g. colour, physical nature, etc.). | 23. | The exposure atmosphere shall be held as constant as practicable and monitored continuously and/or intermittently depending on the method of analysis. When intermittent sampling is used, chamber atmosphere samples should be taken at least twice in a four hour study. If not feasible due to limited air flow rates or low concentrations, one sample may be collected over the entire exposure period. If marked sample-to-sample fluctuations occur, the next concentrations tested should use four samples per exposure. Individual chamber concentration samples should not deviate from the mean concentration by more than ± 10 % for gases and vapours or ± 20 % for liquid or solid aerosols. Time to chamber equilibration (t95) should be calculated and recorded. The duration of an exposure spans the time that the test chemical is generated and this takes into account the times required to attain t95. Guidance for estimating t95 can be found in GD 39 (2). | 24. | For very complex mixtures consisting of gases/vapours, and aerosols (e.g. combustion atmospheres and test chemicals propelled from purpose-driven end-use products/devices), each phase may behave differently in an inhalation chamber so at least one indicator substance (analyte), normally the principal active substance in the mixture, of each phase (gas/vapour and aerosol) should be selected. When the test chemical is a mixture, the analytical concentration should be reported for the mixture and not just for the active substance or the component (analyte). Additional information regarding actual concentrations can be found in GD 39 (2). | Test chemical: Particle size distribution | 25. | The particle size distribution of aerosols should be determined at least twice during each 4 hour exposure by using a cascade impactor or an alternative instrument such as an aerodynamic particle sizer. If equivalence of the results obtained by a cascade impactor or an alternative instrument can be shown, then the alternative instrument may be used throughout the study. A second device, such as a gravimetric filter or an impinger/gas bubbler, should be used in parallel to the primary instrument to confirm the collection efficiency of the primary instrument. The mass concentration obtained by particle size analysis should be within reasonable limits of the mass concentration obtained by filter analysis [see GD 39 (2)]. If equivalence can be demonstrated in the early phase of the study, then further confirmatory measurements may be omitted. For animal welfare reasons, measures should be taken to minimise inconclusive data which may lead to a need to repeat an exposure. Particle sizing should be performed for vapours if there is any possibility that vapour condensation may result in the formation of an aerosol, or if particles are detected in a vapour atmosphere with potential for mixed phases (see paragraph 15). | PROCEDURE | 26. | Two study types are described below: the Traditional protocol, and the C × t protocol. Both protocols may include a sighting study, a main study, and/or a limit test (Traditional protocol) or testing at a limit concentration (C × t). If one sex is known to be more susceptible, the study director may choose to perform these studies using only the susceptible sex. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. Before commencing, all available data should be considered in order to minimise animal usage. For example, data generated using chapter B.52 of this Annex (4) may eliminate the need for a sighting study, and may also demonstrate whether one sex is more susceptible [see GD 39 (2)]. | TRADITIONAL PROTOCOL | General considerations: Traditional protocol | 27. | In a Traditional study, groups of animals are exposed to a test chemical for a fixed period of time (generally 4 hours) in either a nose-only or whole-body exposure chamber. Animals are exposed to either a limit concentration (limit test), or to at least three concentrations in a stepwise procedure (main study). A sighting study may precede a main study unless some information about the test chemical already exists, such as a previously performed B.52 study [see GD 39 (2)]. | Sighting study: Traditional protocol | 28. | A sighting study is used to estimate test chemical potency, identify sex differences in susceptibility, and assist in selecting exposure concentration levels for the main study or limit test. When selecting concentration levels for the sighting study, all available information should be used including available (Q)SAR data and data for similar chemicals. No more than three males and three females should be exposed at each concentration (3 animals/sex may be needed to establish a sex difference). A sighting study may consist of a single concentration, but more concentrations may be tested if necessary. A sighting study should not test so many animals and concentrations that it resembles a main study. A previously performed B.52 study (4) may be used instead of a sighting study [see GD 39 (2)]. | Limit test: Traditional protocol | 29. | A limit test is used when the test chemical is known or expected to be virtually non-toxic, i.e. eliciting a toxic response only above the regulatory limit concentration. In a limit test, a single group of three males and three females is exposed to the test chemical at a limit concentration. Information about the toxicity of the test chemical can be gained from knowledge about similar tested chemicals, taking into consideration the identity and percentage of components known to be of toxicological significance. In those situations where there is little or no information about its toxicity, or the test chemical is expected to be toxic, the main test should be performed. | 30. | The selection of limit concentrations usually depends on regulatory requirements. When Regulation (EC) No 1272/2008 is used, the limit concentrations for gases, vapours, and aerosols are 20 000 ppm, 20 mg/l and 5 mg/l, respectively (or the maximum attainable concentration) (3). It can be technically challenging to generate limit concentrations of some test chemicals, especially as vapours and aerosols. When testing aerosols, the primary goal should be to achieve a respirable particle size (MMAD of 1-4 μm). This is possible with most test chemicals at a concentration of 2 mg/l. Aerosol testing at greater than 2 mg/l should only be attempted if a respirable particle size can be achieved [see GD 39 (2)]. Regulation (EC) No 1272/2008 discourages testing in excess of a limit concentration for animal welfare reasons (3). The limit concentration should only be considered when there is a strong likelihood that results of such a test would have direct relevance for protecting human health (3), and justification provided in the study report. In the case of potentially explosive test chemicals, care should be taken to avoid conditions favourable for an explosion. To avoid an unnecessary use of animals, a test run without animals should be conducted prior to the limit test to ensure that the chamber conditions for a limit test can be achieved. | 31. | If mortality or moribundity is observed at the limit concentration, the results of the limit test can serve as a sighting study for further testing at other concentrations (see main study). If a test chemical’s physical or chemical properties make it impossible to attain a limit concentration, the maximum attainable concentration should be tested. If less than 50 % lethality occurs at the maximum attainable concentration, no further testing is necessary. If the limit concentration could not be attained, the study report should provide an explanation and supportive data. If the maximum attainable concentration of a vapour does not elicit toxicity, it may be necessary to generate the test chemical as a liquid aerosol. | Main study: Traditional protocol | 32. | A main study is typically performed using five males and five females (or 5 animals of the susceptible sex, if known) per concentration level, with at least three concentration levels. Sufficient concentration levels should be used to obtain a robust statistical analysis. The time interval between exposure groups is determined by the onset, duration, and severity of toxic signs. Exposure of animals at the next concentration level should be delayed until there is reasonable confidence of survival for previously tested animals. This allows the study director to adjust the target concentration for the next exposure group. Due to the dependence on sophisticated technologies, this may not always be practical in inhalation studies, so the exposure of animals at the next concentration level should be based on previous experience and scientific judgement. GD 39 (2) should be consulted when testing mixtures. | CONCENTRATION × TIME (C × T) PROTOCOL | General considerations: C × t protocol | 33. | A step-wise C × t study may be considered as an alternative to a Traditional protocol when assessing inhalation toxicity (12) (13) (14). This approach allows animals to be exposed to a test chemical at several concentration levels and for multiple time durations. All testing is performed in a nose-only chamber (whole-body chambers are not practical for this protocol). A flow diagram in Appendix 1 illustrates this protocol. A simulation analysis has shown that the Traditional protocol and the C × t protocol are both capable of yielding robust LC50 values, but the C × t protocol is generally better at yielding robust LC01 and LC10 values (15). | 34. | A simulation analysis has demonstrated that using two animals per C × t interval (one per sex using both sexes, or two of the more susceptible sex) may generally be adequate when testing 4 concentrations and 5 exposure durations in a main study. Under some circumstances, the study director may elect to use two rats per sex per C × t interval (15). Using 2 animals per sex per concentration and time point may reduce bias and variability of the estimates, increase the estimation success rate, and improve confidence interval coverage. However, in case of an insufficient close fit to the data for estimation (when using one animal per sex or two animals of the more susceptible sex) a 5th exposure concentration may also suffice. Further guidance on the number of animals and concentrations to be used in a C × t study can be found in GD 39 (2). | Sighting study: C × t protocol | 35. | A sighting study is used to estimate test chemical potency and to assist in selecting exposure concentration levels for the main study. A sighting study using up to three animals/sex/concentration [for details see Appendix III of GD 39 (2)] may be needed to choose an appropriate starting concentration for the main study and to minimise the number of animals used. It may be necessary to use three animals per sex to establish a sex difference. These animals should be exposed for a single duration, generally 240 min. The feasibility of generating adequate test atmospheres should be assessed during technical pre-tests without animals. It is generally not necessary to perform a sighting study if mortality data are available from a B.52 study (4). When selecting the initial target concentration in a B.2 study, the study director should consider the mortality patterns observed in any available B.52 studies (4) for both sexes and for all concentrations tested [see GD 39 (2)]. | Initial Concentration: C × t protocol | 36. | The initial concentration (Exposure Session I) (Appendix 1) will either be a limit concentration or a concentration selected by the study director based on the sighting study. Groups of 1 animal/sex are exposed to this concentration for multiple durations (e.g. 15, 30, 60, 120, or 240 minutes), resulting in a total number of 10 animals (called Exposure Session I) (Appendix 1). | 37. | The selection of limit concentrations usually depends on regulatory requirements. When Regulation (EC) No 1272/2008 is used, the limit concentrations for gases, vapours, and aerosols are 20 000 ppm, 20 mg/l and 5 mg/l, respectively (or the maximum attainable concentration) (3). It can be technically challenging to generate limit concentrations of some test chemicals, especially as vapours and aerosols. When testing aerosols, the goal should be to achieve a respirable particle size (i.e. an MMAD of 1-4 μm) at a limit concentration of 2 mg/l. This is possible with most test chemicals. Aerosol testing at greater than 2 mg/l should only be attempted if a respirable particle size can be achieved [see GD 39 (2)]. Regulation (EC) No 1272/2008 discourages testing in excess of a limit concentration for animal welfare reasons (3). Testing in excess of the limit concentration should only be considered when there is a strong likelihood that results of such a test would have direct relevance for protecting human health (3), justification should be provided in the study report. In the case of potentially explosive test chemicals, care should be taken to avoid conditions favourable for an explosion. To avoid an unnecessary use of animals, a test run without animals should be conducted prior to testing at the initial concentration to ensure that the chamber conditions for this concentration can be achieved. | 38. | If mortality or moribundity is observed at the initial concentration, the results at this concentration can serve as a starting point for further testing at other concentrations (see main study). When a test chemical’s physical or chemical properties make it impossible to attain a limit concentration, the maximum attainable concentration should be tested. If less than 50 % lethality occurs at the maximum attainable concentration, no further testing is necessary. If the limit concentration could not be attained, the study report should provide an explanation and supportive data. If the maximum attainable concentration of a vapour does not elicit toxicity, it may be necessary to generate the test chemical as a liquid aerosol. | Main study: C × t protocol | 39. | The initial concentration (Exposure Session I) (Appendix 1) tested in the main study will either be a limit concentration or a concentration selected by the study director based on the sighting study. If mortality has been observed during or following Exposure Session I, the minimum exposure (C × t) which results in mortality will be taken as a guide to establish the concentration and periods of exposure for Exposure Session II. Each subsequent exposure session will depend on the previous session (see Appendix 1). | 40. | For many test chemicals the results obtained at the initial concentration, together with three additional exposure sessions with a smaller time grid (i.e. the geometric spacing of exposure periods as indicated by the factor between successive periods, generally √2), will be sufficient to establish the C × t mortality relationship (15), but there may be some benefit to using a 5th exposure concentration [see Appendix 1 and GD 39 (2)]. For mathematical treatment of results for the C × t protocol, see Appendix 1. | OBSERVATIONS | 41. | The animals should be clinically observed frequently during the exposure period. Following exposure, clinical observations should be made at least twice on the day of exposure, or more frequently when indicated by the response of the animals to treatment, and at least once daily thereafter for a total of 14 days. The length of the observation period is not fixed, but should be determined by the nature and time of onset of clinical signs and length of the recovery period. The times at which signs of toxicity appear and disappear are important, especially if there is a tendency for signs of toxicity to be delayed. All observations are systematically recorded with individual records being maintained for each animal. Animals found in a moribund condition and animals showing severe pain and/or enduring signs of severe distress should be humanely killed for animal welfare reasons. Care should be taken when conducting examinations for clinical signs of toxicity that initial poor appearance and transient respiratory changes, resulting from the exposure procedure, are not mistaken for test chemical-related toxicity that would require premature killing of the animals. The principles and criteria summarised in the Guidance Document on Humane Endpoints (GD 19) should be taken into consideration (7). When animals are killed for humane reasons or found dead, the time of death should be recorded as precisely as possible. | 42. | Cage-side observations should include changes in the skin and fur, eyes and mucous membranes, and also respiratory, circulatory, autonomic and central nervous systems, and somatomotor activity and behaviour patterns. When possible, any differentiation between local and systemic effects should be noted. Attention should be directed to observations of tremors, convulsions, salivation, diarrhoea, lethargy, sleep and coma. The measurement of rectal temperature may provide supportive evidence of reflex bradypnea or hypo/hyperthermia related to treatment or confinement. | Body weights | 43. | Individual animal weights should be recorded once during the acclimatization period, on the day of exposure prior to exposure (day 0), and at least on days 1, 3 and 7 (and weekly thereafter), and at the time of death or euthanasia if exceeding day 1. Body weight is recognised as a critical indicator of toxicity so animals exhibiting a sustained decrement of ≥ 20 %, compared to pre-study values, should be closely monitored. Surviving animals are weighed and humanely killed at the end of the post-exposure period. | Pathology | 44. | All test animals, including those which die during the test or are euthanised and removed from the study for animal welfare reasons, should be subjected to gross necropsy. If necropsy cannot be performed immediately after a dead animal is discovered, the animal should be refrigerated (not frozen) at temperatures low enough to minimise autolysis. Necropsies should be performed as soon as possible, normally within a day or two. All gross pathological changes should be recorded for each animal with particular attention to any changes in the respiratory tract. | 45. | Additional examinations included a priori by design may be considered to extend the interpretive value of the study, such as measuring lung weight of surviving rats, and/or providing evidence of irritation by microscopic examination of the respiratory tract. Examined organs may also include those showing evidence of gross pathology in animals surviving 24 or more hours, and organs known or expected to be affected. Microscopic examination of the entire respiratory tract may provide useful information for test chemicals that are reactive with water, such as acids and hygroscopic test chemicals. | DATA AND REPORTING | Data | 46. | Individual animal data on body weights and necropsy findings should be provided. Clinical observation data should be summarised in tabular form, showing for each test group the number of animals used, the number of animals displaying specific signs of toxicity, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons, time of death of individual animals, a description and time course of toxic effects and reversibility, and necropsy findings. | Test report | 47. | The test report should include the following information, as appropriate: | | Test animals and husbandry | — | Description of caging conditions, including: number (or change in number) of animals per cage, bedding material, ambient temperature and relative humidity, photoperiod, and identification of diet | — | Species/strain used and justification for using a species other than the rat | — | Number, age and sex of animals | — | Method of randomisation | — | Details of food and water quality (including diet type/source, water source) | — | Description of any pre-test conditioning including diet, quarantine, and treatment for disease; | | Test chemical | — | Physical nature, purity and, where relevant, physico-chemical properties (including isomerisation) | — | Identification data and Chemical Abstract Services (CAS) Registry Number, if known; | | Vehicle | — | Justification for use of vehicle and justification for choice of vehicle (if other than water) | — | Historical or concurrent data demonstrating that the vehicle does not interfere with the outcome of the study; | | Inhalation chamber | — | Description of the inhalation chamber including dimensions and volume | — | Source and description of equipment used for the exposure of animals as well as generation of atmosphere | — | Equipment for measuring temperature, humidity, particle-size, and actual concentration | — | Source of air and treatment of air supplied/extracted and system used for conditioning | — | Methods used for calibration of equipment to ensure a homogeneous test atmosphere | — | Pressure difference (positive or negative) | — | Exposure ports per chamber (nose-only); location of animals in the system (whole-body) | — | Temporal homogeneity/stability of test atmosphere | — | Location of temperature and humidity sensors and sampling of test atmosphere in the chamber | — | Air flow rates, air flow rate/exposure port (nose-only), or animal load/chamber (whole-body) | — | Information about the equipment used to measure oxygen and carbon dioxide, if applicable | — | Time required to reach inhalation chamber equilibrium (t95) | — | Number of volume changes per hour | — | Metering devices (if applicable); | | Exposure data | — | Rationale for target concentration selection in the main study | — | Nominal concentrations (total mass of test chemical generated into the inhalation chamber divided by the volume of air passed through the chamber) | — | Actual test chemical concentrations collected from the animals’ breathing zone; for mixtures that produce heterogeneous physical forms (gases, vapours, aerosols), each may be analysed separately | — | All air concentrations should be reported in units of mass (e.g. mg/l, mg/m3, etc.); units of volume (e.g. ppm, ppb, etc.) may also be reported parenthetically | — | Particle size distribution, mass median aerodynamic diameter (MMAD), and geometric standard deviation (σg), including their methods of calculation. Individual particle size analyses should be reported; | | Test conditions | — | Details of test chemical preparation, including details of any procedures used to reduce the particle size of solid materials or to prepare solutions of the test chemical. In cases where mechanical processes may have altered test chemical composition, include the results of analyses to verify the composition of the test chemical | — | A description (preferably including a diagram) of the equipment used to generate the test atmosphere and to expose the animals to the test atmosphere | — | Details of the chemical analytical method used and method validation (including efficiency of recovery of test chemical from the sampling medium) | — | The rationale for the selection of test concentrations; | | Results | — | Tabulation of chamber temperature, humidity, and airflow | — | Tabulation of chamber nominal and actual concentration data | — | Tabulation of particle size data including analytical sample collection data, particle size distribution and calculations of the MMAD and σg | — | Tabulation of response data and concentration level for each animal (i.e. animals showing signs of toxicity including mortality, nature, severity, time of onset and duration of effects) | — | Individual body weights of animals collected on study; date and time of death if prior to scheduled euthanasia, time course of onset of signs of toxicity and whether these were reversible for each animal | — | Necropsy findings and histopathological findings for each animal, if available | — | Lethality estimates (e.g. LC50, LD01) including 95 % confidence limits, and slope (if provided by the evaluation method) | — | Statistical relation, including estimate for the exponent n (C × t protocol). The name of the statistical software used should be provided; | | Discussion and interpretation of results | — | Particular emphasis should be made to the description of methods used to meet this Test Method’s criteria, e.g. the limit concentration or the particle size | — | The respirability of particles in light of the overall findings should be addressed, especially if the particle-size criteria could not be met | — | An explanation should be provided if there was a need to humanely sacrifice animals in pain or showing signs of severe and enduring distress, based on the criteria in the OECD Guidance Document on Humane Endpoints (8) | — | If testing with chapter B.52 of this Annex (4) was discontinued in favour of this Test Method B.2, justifications should be provided | — | The consistency of methods used to determine nominal and actual concentrations, and the relation of actual concentration to nominal concentration should be included in the overall assessment of the study | — | The likely cause of death and predominant mode of action (systemic versus local) should be addressed. | LITERATURE: | (1) | OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 403, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (3) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC and amending Regulation (EC) No 1907/2006 (OJ L 353, 31.12.2008, p. 1). | (4) | Chapter B.52 of this Annex, Acute Inhalation Toxicity — Acute Toxic Class (ATC) Method. | (5) | Chapter B.40 of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER). | (6) | Chapter B.40bis of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test. | (7) | OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (8) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (9) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. | (10) | Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. | (11) | Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167. | (12) | Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290. | (13) | Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117. | (14) | Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71. | (15) | OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 104, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (16) | Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, London/New York. | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 1 | C × t Protocol | 1. | A step-wise Concentration × Time (C × t) study may be considered as an alternative to the Traditional protocol for assessing inhalation toxicity (12) (13) (14). It should be performed preferentially when there is a specific regulatory or scientific need that calls for the testing of animals over multiple time durations such as for emergency response planning or land use planning. This approach usually begins with testing at a limit concentration (Exposure Session I) in which animals are exposed to a test chemical for five time durations (e.g. 15, 30, 60, 120 and 240 min) so that multiple durations of time will be obtained within one exposure session (see Figure 1). When Regulation (EC) No 1272/2008 is used, the limit concentrations for gases, vapours, and aerosols are 20 000 ppm, 20 mg/l, and 5 mg/l, respectively. These levels may only be exceeded if there is a regulatory or scientific need for testing at these levels (see paragraph 37 in the B.2 main text). | 2. | In situations where there is little or no information about the toxicity of a test chemical, a sighting study should be performed in which groups of no more than 3 animals per sex are exposed to target concentrations selected by the study director, generally for 240 min. | 3. | If a limit concentration is tested during Exposure Session I and less than 50 % mortality is observed, no additional testing is needed. If there is a regulatory or scientific need to establish the concentration/time/response relationship at higher levels than the indicated limit concentration, the next exposure should be carried out at a higher level such as at two times the limit concentration (i.e. 2L in Figure 1). | 4. | If toxicity is observed at the limit concentration, additional testing (main study) is necessary. These additional exposures are carried out either at lower concentrations (in Figure 1: Exposure Sessions II, III or IV') or at higher concentrations using shorter durations (in Figure 1: Exposure Session IV) using durations that are adapted and not as widely spaced. | 5. | The test (initial concentration and additional concentrations) is carried out using 1 animal/sex per concentration/time point or with 2 animals of the more susceptible sex per concentration/time point. Under some circumstances, the study director may elect to utilise 2 rats per sex per concentration/time point (or 4 animals of the susceptible sex per concentration/time point) (15). Using 2 animals per sex per concentration/time point generally reduces bias and variability of the estimates, increases the estimation success rate, and improves confidence interval coverage relative to the protocol as described here. Further details are provided in GD 39 (2). | 6. | Ideally, each exposure session is carried out on one day. This gives the opportunity to delay the next exposure until there is reasonable confidence of survival, and it allows the study director to adjust the target concentration and durations for the next exposure session. It is advised to start each exposure session with the group that will be exposed the longest, e.g. the 240-min exposure group, followed by the 120 minute exposure group, and so on. If, for example, animals in the 240 minute group are dying after 90 minutes or showing severe signs of toxicity (e.g. extreme changes in breathing pattern such as laboured breathing), it would not make sense to expose a group for 120 minutes because mortality would likely be 100 %. Thus the study director should select shorter exposure durations for that concentration (e.g. 90, 65, 45, 33 and 25 minutes). | 7. | The chamber concentration should be measured frequently to determine the time-weighted-average concentration for each exposure duration. Whenever possible, the time of death for each animal (rather than the exposure duration) should be used in the statistical analysis. | 8. | The results of the first four exposure sessions should be examined to identify a data gap in the concentration-time curve (see Figure 1). In case of an insufficient fit, an additional exposure (5th concentration) may be performed. Concentration and exposure durations for the 5th exposure should be chosen to cover this gap. | 9. | All exposure sessions (including the first Exposure Session) will be used to calculate the concentration-time-response relationship using Statistical Analysis (16). If possible, for each C × t interval, the time-weighted average concentration and the duration of exposure until death (if death occurs during the exposure) should be used. | Figure 1 | Hypothetical illustration of a concentration-time-mortality relationship in rats | Open symbols = survivors; closed symbols = dead animals | Triangles = females; circles = males | Solid line = LC50 values (range 7,5-240 min) for males with n = 1 | Dashed line = LC50 values (range 7,5-240 min) for females with n = 1 | Dotted lines = hypothetical LC50 values line for males and females if n had been equal to 2 (12). | Glossary | Concentration: | Time of exposure: | 10. | Below is an example of the stepwise procedure: | Exposure Session I — Testing at the limit concentration (see Figure 1) | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals in total (1) | — | Target concentration (2) = limit concentration. | — | Expose five groups of animals at this target concentration for durations of 15, 30, 60, 120 and 240 minutes, respectively. | ↓ | Exposure Session II (3) — Main Study | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals in total. | — | Expose five groups of animals at a lower concentration (4) (1/2L) with slightly longer exposure durations (factor √2 spaced; see Figure 1). | ↓ | Exposure Session III — Main Study | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals total. | — | Expose five groups of animals at a lower concentration (4) (1/4L) with slightly longer exposure durations (factor √2 spaced; see Figure 1). | ↓ | Exposure Session IV’ — Main Study | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals total. | — | Expose five groups of animals at a lower concentration (4) (1/8L) with slightly longer exposure durations (factor √2 spaced; see Figure 1). | ↓ or | Exposure Session IV — Main Study | — | 1 animal/sex per concentration/time point; 10 animals total. | — | Expose five groups of animals at a higher concentration (5) (2L) with slightly shorter exposure durations (factor √2 spaced; see Figure 1). | Mathematical treatment of results for the C × t protocol | 11. | A C × t procedure with 4 or 5 exposure concentrations and five durations will yield 20 or 25 data points, respectively. With these data points, the C × t relationship can be calculated using statistical analysis (16): | Equation 1: | where C = concentration; t = exposure duration, or | Equation 2: | where | Using equation 1, the LC50 value can be calculated for a given time period (e.g. 4 hour, 1 hour, 30 minutes, or any time period within the range of time periods tested) using P = 5 (50 % response). Note that Haber’s rule is only applicable when n = 1. The LC01 can be calculated using P = 2,67. | ’ |
| 4. | poglavji B.7 in B.8 se nadomestita z naslednjima: | „B.7 28-DNEVNA ŠTUDIJA ORALNE STRUPENOSTI S PONAVLJAJOČIMI SE ODMERKI NA GLODAVCIH | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 407 (2008). Prvotna Smernica za preskušanje 407 je bila sprejeta leta 1981. Leta 1995 je bila sprejeta revidirana različica, da bi se z živalmi, uporabljenimi v študiji, pridobile dodatne informacije, zlasti o nevrotoksičnosti in imunotoksičnosti. | 2. | OECD se je leta 1998 lotila prednostne naloge revidiranja obstoječih smernic za preskušanje ter priprave novih smernic za presejalne preskuse in preskušanje potencialnih povzročiteljev endokrinih motenj (8). Eden od elementov te naloge je bil posodobitev obstoječe smernice OECD za ‚28-dnevno študijo oralne strupenosti s ponavljajočimi se odmerki na glodavcih‘ (TG 407) s parametri, ki so primerni za odkrivanje endokrinega delovanja preskusnih kemikalij. Ta postopek je bil predmet obsežnega mednarodnega programa za preskušanje pomena in uporabnosti dodatnih parametrov, učinkovitosti teh parametrov pri kemikalijah z (anti)estrogenim, (anti)androgenim in (proti)ščitničnim delovanjem, ponovljivosti v enem ali več laboratorijih ter interference novih parametrov s parametri, zahtevanimi v prejšnji smernici TG 407. Velika količina podatkov, ki je bila pri tem pridobljena, je bila zbrana in podrobno ocenjena v izčrpnem poročilu OECD (9). Ta posodobljena preskusna metoda B.7 (ki ustreza smernici TG 407) je plod izkušenj in rezultatov, pridobljenih med mednarodnim preskusnim programom. Z njo se lahko nekateri z endokrinim sistemom posredovani učinki obravnavajo skupaj z drugimi toksikološkimi učinki. | ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE | 3. | Pri ocenjevanju in vrednotenju strupenih lastnosti kemikalije se lahko metoda s ponavljanjem odmerkov uporabi za določitev oralne strupenosti, potem ko se s preskusi akutne strupenosti že pridobijo začetne informacije o strupenosti. Cilj te preskusne metode je preučiti učinke na zelo različne možne tarče strupenosti. Z njo se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki lahko nastanejo pri ponavljajoči se izpostavljenosti v razmeroma omejenem obdobju, vključno z učinki na živčni, imunski in endokrini sistem. V zvezi s temi končnimi točkami bi se s to metodo morale identificirati kemikalije, ki imajo nevrotoksični potencial, zaradi katerega je morda upravičena dodatna poglobljena raziskava tega vidika, in kemikalije, ki vplivajo na fiziologijo ščitnice. Z njo se lahko pridobijo tudi podatki o kemikalijah, ki vplivajo na razmnoževalne organe mladih odraslih živali moškega in/ali ženskega spola, nakaže pa lahko tudi imunološke učinke. | 4. | Rezultate te preskusne metode B.7 je treba uporabiti za opredeljevanje nevarnosti in oceno tveganja. Rezultate, ki se dobijo s parametri, povezanimi z endokrinim sistemom, je treba obravnavati ob upoštevanju dokumenta OECD z naslovom ‚Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals‘ (11). Metoda obsega osnovno študijo strupenosti s ponavljajočimi se odmerki, ki se lahko uporabi za kemikalije, za katere ni upravičena 90-dnevna študija (npr. če obseg proizvodnje ne presega določenih mej), ali kot predhodna študija za dolgoročno študijo. Izpostavljenost mora trajati 28 dni. | 5. | Mednarodni program za validacijo parametrov, primernih za morebitno odkrivanje endokrinega delovanja preskusne kemikalije, je pokazal, da je kakovost podatkov, pridobljenih s to preskusno metodo B.7, precej odvisna od izkušenj preskuševalnega laboratorija. To se nanaša zlasti na histopatološko odkrivanje cikličnih sprememb pri razmnoževalnih organih samic ali določanje teže malih, hormonsko odvisnih organov, ki jih je težko secirati. Napotki o histopatologiji so bili pripravljeni (19). Na voljo so na javni spletni strani OECD s smernicami za preskušanje. Njihov namen je pomagati patologom pri preiskavah in pripomoči k povečanju občutljivosti analize. V to preskusno metodo je bilo vključenih več parametrov, za katere je bilo ugotovljeno, da so kazalniki endokrine strupenosti. Parametri, za katere ni bilo na voljo dovolj podatkov, ki bi dokazovali njihovo uporabnost, ali za katere se je v validacijskem programu izkazalo, da je njihova zmožnost odkrivanja povzročiteljev endokrinih motenj slaba, so predlagani kot neobvezne končne točke (glej Dodatek 2). | 6. | Glede na podatke, pridobljene v validacijskem postopku, je treba poudariti, da ta analiza ni dovolj občutljiva za identifikacijo vseh snovi z (anti)androgenim ali (anti)estrogenim načinom delovanja (9). Ta preskusna metoda se ne izvaja v fazi življenja, ki je najbolj občutljiva za endokrine motnje. Kljub temu pa so bile pri tej preskusni metodi med validacijskim postopkom identificirane snovi, ki šibko in močno vplivajo na delovanje ščitnice, ter snovi z močnim in zmernim endokrinim delovanjem, ki delujejo prek estrogenih ali androgenih receptorjev, v le redkih primerih pa so bile identificirane snovi z endokrinim delovanjem, ki šibko vplivajo na estrogene ali androgene receptorje. Zato te metode ni mogoče opisati kot presejalno analizo za endokrino delovanje. | 7. | Neobstoj učinkov, povezanih s temi načini delovanja, se zato ne sme obravnavati kot dokaz o neobstoju učinkov na endokrini sistem. Kar zadeva z endokrinim sistemom posredovane učinke, se snovi torej ne smejo opredeliti samo na podlagi rezultatov te preskusne metode, temveč je treba za označitev potencialnega endokrinega delovanja uporabiti pristop, ki temelji na zanesljivosti dokazov in vključuje vse obstoječe podatke o kemikaliji. Zato mora sprejetje regulativne odločitve o endokrinem delovanju (opredelitev snovi) temeljiti na široko zasnovanem pristopu, in ne samo na rezultatih te preskusne metode. | 8. | Priznano je, da morajo vsi postopki z živalmi izpolnjevati lokalne standarde, ki veljajo za oskrbo živali; spodaj opisana oskrba živali in ravnanje z njimi pomenita minimalne standarde izvajanja, nad katerimi prevladajo lokalni predpisi, če so strožji. OECD je določila dodatne napotke o humanem ravnanju z živalmi (14). | 9. | Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 10. | Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih oralno daje več skupinam preskusnih živali, in sicer po ena velikost odmerka na skupino v obdobju 28 dni. V obdobju dajanja odmerkov je treba živali vsak dan pozorno opazovati, ali kažejo znake zastrupitve. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so evtanazirane, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se preživele živali evtanazirajo, nato pa se na njih opravi obdukcija. Z 28-dnevno študijo se pridobijo informacije o učinkih ponavljajoče se oralne izpostavljenosti, poleg tega pa lahko ta študija nakaže potrebo po dodatnih dolgoročnejših študijah. Prav tako lahko pomaga pridobiti informacije o izbiri koncentracij za dolgoročnejše študije. S podatki, pridobljenimi na podlagi preskusne metode, mora biti mogoče opredeliti strupenost preskusne kemikalije, nakazati razmerje med odmerkom in odzivom ter določiti raven brez opaženih škodljivih učinkov (NOAEL). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 11. | Priporočena vrsta glodavca je podgana, čeprav se lahko uporabijo tudi druge vrste glodavcev. Če se parametri, določeni pri tej preskusni metodi B.7, preiskujejo na drugi vrsti glodavcev, je treba to podrobno utemeljiti. Čeprav je biološko verjetno, da se druge vrste na strupene snovi odzivajo podobno kot podgane, je pri manjših vrstah mogoča večja spremenljivost zaradi tehničnih izzivov pri seciranju manjših organov. V mednarodnem validacijskem programu za odkrivanje povzročiteljev endokrinih motenj je bila podgana edina uporabljena vrsta. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Odmerke je treba začeti dajati čim prej po odstavitvi od sesanja, vsekakor pa preden so živali stare 9 tednov. Na začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali čim manjše in ne smejo presegati ± 20 % povprečne teže za vsak spol. Če se študija s ponavljajočimi se oralnimi odmerki izvaja kot predhodna študija dolgoročnejše študije, je zaželeno, da se v obeh študijah uporabijo živali istega seva in istega izvora. | Nastanitev in hranjenje | 12. | Vsi postopki morajo biti v skladu z lokalnimi standardi oskrbe laboratorijskih živali. Temperatura prostora s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna s fotoperiodo 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije, če se daje po tej metodi. Živali morajo biti nastanjene v majhnih skupinah istega spola; posamično so lahko nastanjene, če je to znanstveno utemeljeno. Pri skupinski nastanitvi je lahko v kletki največ pet živali. | 13. | Hrano je treba redno analizirati, da ne vsebuje kontaminantov. Vzorec hrane je treba hraniti, dokler poročilo ni končano. | Priprava živali | 14. | Zdrave mlade odrasle živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi položaja kletk čim manjši. Živali se označijo z edinstvenimi oznakami in so pred začetkom tretiranja najmanj pet dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. | Priprava odmerkov | 15. | Preskusna kemikalija se daje z gavažo ali s hrano ali pitno vodo. Metoda oralnega dajanja odmerkov je odvisna od namena študije in fizikalnih/kemijskih/toksikokinetičnih lastnosti preskusne kemikalije. | 16. | Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/suspenzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Določiti je treba stabilnost preskusne kemikalije v nosilcu. | POSTOPEK | Število in spol živali | 17. | Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti vsaj 10 živali (pet samic in pet samcev). Če je načrtovana evtanazija med študijo, je treba to število povečati za toliko živali, kolikor se jih namerava evtanazirati pred zaključkom študije. Razmisliti je treba o dodatni satelitski skupini desetih živali (pet vsakega spola) v kontrolni skupini in skupini, tretirani z največjim odmerkom, na katerih bi se vsaj 14 dni po tretiranju opazovalo reverzibilnost, obstojnost ali zapoznelost nastopa strupenih učinkov. | Odmerjanje | 18. | Na splošno je treba uporabiti najmanj tri preskusne skupine in kontrolno skupino, če pa se na podlagi ocene drugih podatkov pri odmerku 1 000 mg/kg telesne teže/dan učinki ne pričakujejo, se lahko izvede mejni preskus. Če ustrezni podatki niso na voljo, se lahko opravi študija za ugotavljanje območja (na živalih istega seva in izvora), s pomočjo katere se določijo odmerki, ki bodo uporabljeni. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da niso deležne tretiranja s preskusno kemikalijo. Če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec, mora kontrolna skupina prejeti največjo uporabljeno količino nosilca. | 19. | Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse podatke o strupenosti in (toksiko)kinetične podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne kemikalije. Izbrati je treba največjo velikost odmerka, da se povzročijo strupeni učinki, ne pa tudi smrt ali hudo trpljenje. Nato je treba izbrati padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se pokažejo vsi odzivi, ki so odvisni od velikosti odmerka, in ugotovi najmanjša velikost odmerka, pri kateri ni opaženih škodljivih učinkov (NOAEL). Za določanje padajočih velikosti odmerkov je velikokrat najbolje uporabiti dva- do štirikratne intervale, namesto zelo velikih intervalov (npr. večjih od desetkratnika) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati 4. preskusno skupino. | 20. | Če se ugotovijo splošna strupenost (npr. zmanjšana telesna teža, učinki na jetra, srce, pljuča ali ledvice itd.) ali druge spremembe, ki morda niso toksične reakcije (npr. zmanjšan vnos hrane, povečanje jeter), je potrebna previdnost pri razlagi ugotovljenih učinkov na imunske, nevrološke ali endokrine občutljive končne točke. | Mejni preskus | 21. | Če preskus pri odmerku, velikem najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, ali pri enakovrednem deležu v hrani ali pitni vodi pri vnosu s hrano ali pitno vodo (na podlagi telesne teže), pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, ne povzroči opaznih strupenih učinkov in če na podlagi podatkov o strukturno sorodnih kemikalijah strupenost ni pričakovana, popolna študija s tremi velikostmi odmerkov morda ni potrebna. Mejni preskus se uporabi, razen če izpostavljenost človeka nakazuje potrebo po uporabi večjega odmerka. | Dajanje odmerkov | 22. | Preskusna kemikalija se daje živalim vsak dan 7 dni na teden v obdobju 28 dni. Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, jo je treba dajati v enkratnem odmerku z uporabo želodčne cevke ali ustrezne intubacijske kanile. Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. Količina ne sme presegati 1 ml/100 g telesne teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi 2 ml/100 g telesne teže. Razen pri dražilnih ali jedkih kemikalijah, ki pri večjih koncentracijah navadno povzročijo močnejše učinke, je treba s prilagajanjem koncentracije čim bolj zmanjšati spremenljivost preskusne količine, da se zagotovi stalna količina pri vseh velikostih odmerkov. | 23. | Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalen vnos hrane ali porabo vode. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali; uporabljeni način je treba navesti. Če se kemikalija daje z gavažo, je treba odmerke dajati vsak dan ob približno istem času in jih ustrezno prilagajati, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali. Če se študija s ponavljajočimi se odmerki izvaja kot predhodna študija dolgoročne študije, je treba v obeh študijah uporabiti podobno hrano. | Opazovanja | 24. | Obdobje opazovanja mora trajati 28 dni. Živali iz satelitske skupine, ki so bile izbrane za opazovanja po koncu tretiranja, je treba pustiti vsaj 14 dni brez kakršnega koli tretiranja, da se odkrije zapoznel nastop, obstojnost ali izginotje strupenih učinkov. | 25. | Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Podatke o zdravstvenem stanju živali je treba zabeležiti. Živali je treba vsaj dvakrat na dan opazovati za odkrivanje obolevnosti in smrtnosti. | 26. | Enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogočanje primerjav na istem osebku) in nato vsaj enkrat na teden je treba opraviti natančna klinična opazovanja vseh živali. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj kletk, v katerih živali bivajo, na standardnem mestu in po možnosti vedno ob istem času. Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti z uporabo sistemov točkovanja, ki jih izrecno določi preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, da se preskusni pogoji čim manj spreminjajo in da opazovanja po možnosti opravijo opazovalci, ki s tretiranjem niso seznanjeni. Pozornost je med drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, očeh in sluznicah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živčevja (npr. solzenju, piloerekciji, velikosti zenic, nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z živalmi, pa tudi prisotnost kloničnih ali toničnih gibov, stereotipij (npr. prekomernega čiščenja, ponavljajočega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (2). | 27. | V četrtem tednu izpostavljenosti je treba oceniti senzorične reakcije na različne vrste dražljajev (2) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) (3) (4) (5), moč oprijema (6) in motorično aktivnost (7). Nadaljnje podrobnosti glede možnih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je mogoče tudi druge postopke, ki niso opisani v navedenih virih. | 28. | Funkcionalna opazovanja, ki se izvajajo v četrtem tednu izpostavljenosti, se lahko izpustijo, če se študija izvaja kot predhodna študija poznejše (90-dnevne) študije subkronične strupenosti. V takem primeru je treba funkcionalna opazovanja vključiti v to dopolnilno študijo. Po drugi strani pa lahko podatki o funkcionalnih opazovanjih, pridobljeni v študiji s ponavljajočimi se odmerki, pomagajo pri določanju velikosti odmerkov za poznejšo študijo subkronične strupenosti. | 29. | Izjemoma se lahko funkcionalna opazovanja izpustijo tudi za skupine, ki sicer kažejo znake zastrupitve v tolikšnem obsegu, da bi to močno oviralo izvedbo funkcionalnega preskusa. | 30. | Pri obdukciji se lahko z vaginalnim brisom določi cikel estrusa vseh samic (ni obvezno). Ta opazovanja zagotovijo informacije o fazi cikla estrusa ob žrtvovanju in pomagajo pri histološki oceni tkiv, občutljivih na estrogen (glej napotke o histopatologiji (19)). | Telesna teža in poraba hrane/vode | 31. | Vse živali je treba stehtati vsaj enkrat na teden. Porabo hrane je treba meriti najmanj tedensko. Če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba vsaj enkrat na teden izmeriti tudi porabo vode. | Hematologija | 32. | Ob koncu preskusnega obdobja je treba opraviti naslednje hematološke preiskave: hematokrit, koncentracija hemoglobina, število eritrocitov, retikulociti, skupno in diferencialno število levkocitov, število trombocitov ter čas/zmožnost koagulacije. Druge preiskave, ki jih je treba opraviti, če imajo preskusna kemikalija ali njeni domnevni metaboliti oksidativne lastnosti oziroma če obstaja sum, da jih imajo, vključujejo koncentracijo methemoglobina in Heinzeva telesca. | 33. | Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu neposredno pred postopkom evtanazije živali ali med njim in jih hraniti v ustreznih pogojih. Živali je treba pred evtanazijo čez noč postiti (7). | Klinična biokemija | 34. | Klinične biokemične preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih učinkov na tkiva, zlasti na ledvice in jetra, je treba opraviti na vzorcih krvi, ki so bili vsem živalim odvzeti neposredno pred postopkom njihove evtanazije ali med njim (razen živalim, ki so bile najdene umirajoče in/ali so bile evtanazirane pred koncem študije). Preiskave plazme ali seruma vključujejo določanje natrija, kalija, glukoze, skupnega holesterola, sečnine, kreatinina, skupnih beljakovin in albumina, najmanj dveh encimov, ki sta kazalnika hepatoceličnih učinkov (kot so alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, alkalna fosfataza, γ-glutamil transpeptidaza in glutamat-dehidrogenaza), ter žolčnih kislin. Meritve dodatnih encimov (jetrnega ali drugega izvora) in bilirubina lahko v nekaterih okoliščinah zagotovijo koristne informacije. | 35. | Po izbiri se lahko v zadnjem tednu študije izvedejo naslednje analize urina, dobljenega z zbiranjem v določenih časovnih obdobjih: videz, količina, osmolalnost ali specifična teža, pH, beljakovine, glukoza in kri/krvne celice. | 36. | Poleg tega je treba razmisliti o študijah za preiskovanje plazemskih ali serumskih označevalcev splošnih poškodb tkiva. Druge preiskave, ki jih je treba opraviti, če lahko znane lastnosti preskusne kemikalije vplivajo na povezane presnovne profile ali če obstaja sum, da lahko vplivajo nanje, vključujejo določanje kalcija, fosfatov, trigliceridov, posebnih hormonov in holinesteraze. Te je treba opredeliti pri kemikalijah določenih razredov oziroma za vsak primer posebej. | 37. | Čeprav v mednarodni oceni z endokrinim sistemom povezanih končnih točk ni bilo mogoče dokazati nedvomne koristi določanja ščitničnih hormonov (T3 in T4) in TSH, je lahko koristno obdržati vzorce plazme ali seruma za merjenje T3, T4 in TSH (ni obvezno), če obstaja znak o učinku na hipofizno-ščitnično os. Ti vzorci se lahko hranijo zamrznjeni pri –20 °C. Na spremenljivost in absolutne koncentracije pri določanju hormonov lahko vplivajo naslednji dejavniki: | — | čas žrtvovanja zaradi spreminjanja koncentracij hormonov preko dneva, | — | način žrtvovanja, da se prepreči nepotreben stres pri živalih, ki lahko vpliva na koncentracije hormonov, | — | preskusni kompleti, ki se uporabljajo za določanje hormonov in se lahko razlikujejo po standardnih krivuljah. | Dokončno identifikacijo kemikalij, ki vplivajo na ščitnico, je zanesljiveje opraviti s histopatološko analizo kot z ravnmi hormonov. | 38. | Vzorce plazme, ki so predvideni posebej za določanje hormonov, je treba odvzeti ob primerljivih urah dneva. Priporočljivo je, da se razmisli o določanju ravni T3, T4 in TSH, sproženih s histopatološkimi spremembami ščitnice. Številčne vrednosti, pridobljene pri analiziranju koncentracij hormonov, so pri različnih kompletih za analize, ki so na voljo na trgu, različne. Zato morda ne bo mogoče določiti izvedbenih meril, ki temeljijo na enotnih preteklih podatkih. Druga možnost pa je, da si laboratoriji prizadevajo za kontrolne koeficiente variacije, ki so nižji od 25 za T3 in T4 ter nižji od 35 za TSH. Vse koncentracije morajo biti zabeležene v ng/ml. | 39. | Če pretekli izhodiščni podatki niso ustrezni, je treba razmisliti o določitvi hematoloških in kliničnih biokemičnih spremenljivk pred začetkom dajanja odmerkov ali po možnosti pri sklopu živali, ki niso vključene v preskusne skupine. | PATOLOGIJA | Makroskopska obdukcija | 40. | Na vseh živalih v študiji se opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Z jeter, ledvic, nadledvičnih žlez, mod, nadmodka, prostate in semenskih mešičkov s celotnimi koagulacijskimi žlezami, priželjca, vranice, možganov in srca vseh živali (razen živali, ki so bile najdene umirajoče in/ali so bile evtanazirane pred koncem študije) je treba, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva in nato izmeriti njihovo mokro težo čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. Pri prostati in vseh delih, ki spadajo k njej, je potrebna previdnost pri odstranjevanju priraščenih tkiv, da se ne prebodejo semenski mešički, ki so napolnjeni s tekočino. Lahko pa se semenski mešički in prostata obrežejo in stehtajo po fiksaciji. | 41. | Poleg tega se lahko čim prej po disekciji, da se ne izsušita, stehtata tudi naslednji tkivi: oba jajčnika (mokra teža) in maternica, vključno z vratom (napotki za odstranitev in pripravo materničnih tkiv za tehtanje so na voljo v OECD TG 440 (18)). | 42. | Teža ščitnice (ni obvezno) se lahko določi po fiksaciji. Pri odstranjevanju priraščenih tkiv je prav tako potrebna velika previdnost, opravi pa se lahko šele po fiksaciji, da se preprečijo poškodbe tkiv, ki lahko ogrozijo histopatološko analizo. | 43. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (glej odstavek 47): vse vidne lezije, možgane (reprezentativne regije, vključno z velikimi in malimi možgani ter mostom), hrbtenjačo, oko, želodec, tanko in debelo črevo (vključno s Peyerjevimi ploščami), jetra, ledvice, nadledvične žleze, vranico, srce, priželjc, ščitnico, sapnik in pljuča (shranijo se tako, da se napihnejo s fiksativom in nato potopijo), spolne žleze (moda in jajčnike), pomožne spolne organe (maternico in vrat, nadmodek, prostato in semenske mešičke s koagulacijskimi žlezami), vagino, sečni mehur, bezgavke (poleg najbližje drenažne bezgavke je treba vzeti še eno bezgavko v skladu z izkušnjami laboratorija (15)), periferni živec (ishiadični ali tibialni), po možnosti v neposredni bližini mišice, skeletno mišico in kost s kostnim mozgom (rezina ali sveže prepariran punktat kostnega mozga). Priporočljivo je, da se moda fiksirajo s potopitvijo v Bouinov ali prilagojen Davidsonov fiksativ (16) (17). Tunico albugineo je treba nežno in plitvo punktirati na obeh polih organa z iglo, da lahko fiksativ hitro prodre v tkivo. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. | 44. | Z naslednjimi tkivi je mogoče pridobiti koristne informacije o endokrinih učinkih: spolnimi žlezami (jajčniki in modi), pomožnimi spolnimi organi (maternico, vključno z vratom, nadmodkom, semenskimi mešički s koagulacijskimi žlezami ter dorzolateralno in ventralno prostato), vagino, hipofizo, mlečno žlezo samcev, ščitnico in nadledvično žlezo. Spremembe v mlečnih žlezah samcev niso bile zadostno dokumentirane, vendar je lahko ta parameter zelo občutljiv za snovi z estrogenim delovanjem. Opazovanja organov/tkiv, ki niso našteti v odstavku 43, niso obvezna (glej Dodatek 2). | 45. | Več informacij o disekciji, fiksaciji, sekciji in histopatologiji endokrinih tkiv je na voljo v napotkih o histopatologiji (19). | 46. | V mednarodnem preskusnem programu je bilo pridobljenih nekaj dokazov, da se lahko manj opazni endokrini učinki kemikalij z majhno zmožnostjo za vplivanje na homeostazo spolnih hormonov lažje odkrijejo z motnjami sinhronizacije cikla estrusa v različnih tkivih kot z očitnimi histopatološkimi spremembami spolnih organov samic. Čeprav ni dokončnega dokaza o takih učinkih, je priporočljivo, da se dokazi o možni asinhronosti cikla estrusa upoštevajo pri razlagi histopatologije jajčnikov (folikularne celice ter celice teke in granuloze), maternice, materničnega vratu in vagine. V to primerjavo se lahko, če se ocenjuje, vključi tudi faza cikla, ugotovljena z vaginalnimi brisi. | Histopatologija | 47. | Popolno histopatološko preiskavo je treba opraviti na shranjenih organih in tkivih vseh živali iz kontrolne skupine ter živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom. Te preiskave je treba razširiti na živali iz skupin, tretiranih z vsemi drugimi odmerki, če se v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opazijo spremembe, povezane s tretiranjem. | 48. | Pregledati je treba vse vidne lezije. | 49. | Če se uporablja satelitska skupina, je treba opraviti histopatološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so bili opaženi učinki v tretiranih skupinah. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 50. | Podatke je treba navesti za vsako žival. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile evtanazirane iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali evtanazije, število živali, ki kažejo znake zastrupitve, opis opaženih znakov zastrupitve, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih učinkov, število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in njihova resnost ter odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. | 51. | Če je mogoče, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Pri primerjavah učinka vzdolž odmernega območja se je treba izogibati večkratnim preskusom t. Statistične metode je treba izbrati med zasnovo študije. | 52. | Za nadzor kakovosti se predlaga zbiranje preteklih kontrolnih podatkov in izračun koeficientov variacije za številčne podatke, zlasti za parametre, povezane z odkrivanjem povzročiteljev endokrinih motenj. Ti podatki se lahko uporabijo za primerjave, ko se ocenjujejo aktualne študije. | Poročilo o preskusu | 53. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijske podatke. | | Nosilec (če je ustrezno) | — | utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda. | | Preskusne živali | — | uporabljeno vrsta/sev, | — | število, starost in spol živali, | — | vir, nastanitvene pogoje, hrano itd., | — | težo vsake živali na začetku preskusa, | — | utemeljitev vrste, če to ni podgana. | | Preskusni pogoji | — | utemeljitev izbire velikosti odmerkov, | — | podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, | — | podatke o dajanju preskusne kemikalije, | — | preračunavanje koncentracije preskusne kemikalije v hrani ali vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), če je ustrezno, | — | podatke o kakovosti hrane in vode. | | Neobvezne končne točke, ki se preiskujejo | — | seznam neobveznih končnih točk, ki se preiskujejo. | | Rezultati | — | telesno težo/spremembe telesne teže, | — | porabo hrane in, če je ustrezno, porabo vode, | — | podatke o toksičnih reakcijah glede na spol in velikosti odmerka, vključno z znaki zastrupitve, | — | vrsto, resnost in trajanje kliničnih opažanj (ali so reverzibilna ali ne), | — | ocene senzorične aktivnosti, moči oprijema in motorične aktivnosti, | — | hematološke preskuse z ustreznimi referenčnimi vrednostmi, | — | klinične biokemijske preskuse z ustreznimi referenčnimi vrednostmi, | — | telesno težo ob evtanaziji in podatke o teži organov, | — | izsledke obdukcije, | — | podroben opis vseh ugotovitev histopatoloških preiskav, | — | podatke o absorpciji, če so na voljo, | — | statistično obdelavo rezultatov, kjer je to primerno. | | Razprava o rezultatih. | | Sklepi. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | | Androgenost je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni androgeni hormon (npr. testosteron) v sesalskem organizmu. | | Antiandrogenost je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega androgenega hormona (npr. testosterona) v sesalskem organizmu. | | Antiestrogenost je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega estrogenega hormona (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu. | | Protiščitnično delovanje je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega ščitničnega hormona (npr. T3) v sesalskem organizmu. | | Odmerjanje je splošni izraz, ki obsega odmerek ter pogostnost in trajanje dajanja odmerka. | | Odmerek je količina dane preskusne kemikalije. Izražen je kot masa preskusne kemikalije na enoto telesne teže preskusne živali na dan (npr. mg/kg telesne teže/dan) ali kot konstantna koncentracija v hrani. | | Očitna strupenost je splošni izraz, ki opisuje jasne znake zastrupitve po dajanju preskusne kemikalije. Ti morajo zadostovati za oceno nevarnosti in biti takšni, da bi povečanje danega odmerka najverjetneje povzročilo razvoj resnih znakov zastrupitve in verjetno smrt. | | NOAEL je kratica za raven brez opaženih škodljivih učinkov (no-observed-adverse-effect level). To je največji odmerek, pri katerem ni opaženih škodljivih učinkov zaradi tretiranja. | | Estrogenost je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni estrogeni hormon (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu. | | Preskusna kemikalija je vsaka snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | | Ščitnično delovanje je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni ščitnični hormon (npr. T3) v sesalskem organizmu. | | Validacija je znanstveni proces, s katerim se določijo delovne zahteve in omejitve preskusne metode ter pokažeta njena zanesljivost in ustreznost za določeni namen. | Dodatek 2 | Končne točke, priporočene za odkrivanje povzročiteljev endokrinih motenj v tej preskusni metodi B.7 | Obvezne končne točke | Neobvezne končne točke | Teža | — | moda | — | nadmodek | — | nadledvične žleze | — | prostata in semenski mešički s koagulacijskimi žlezami | — | jajčniki | — | maternica, vključno z vratom | — | ščitnica | Histopatologija | — | spolne žleze: | — | moda in | — | jajčniki | — | pomožni spolni organi: | — | nadmodek | — | prostata in semenski mešički s koagulacijskimi žlezami | — | maternica, vključno z vratom | — | nadledvične žleze | — | ščitnica | — | vagina | — | vaginalni brisi | — | mlečne žleze samcev | — | hipofiza | Meritve hormonov | | — | raven T3 in T4 v obtoku | — | raven TSH v obtoku | VIRI: | (1) | OECD (Pariz, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity. | (2) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria. Dokument št. 60. | (3) | Tupper, D. E., Wallace R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. | (4) | Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704. | (5) | Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. | (6) | Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. | (7) | Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609. | (8) | OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. marec 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. | (9) | OECD (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. | (10) | OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. | (11) | OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html. | (12) | OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. | (13) | OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. | (14) | OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7. | (15) | Haley, P., Perry, R., Ennulat, D., Frame, S., Johnson, C., Lapointe, J.-M., Nyska, A., Snyder, P. W., Walker, D., Walter, G. (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404–407. | (16) | Hess, R. A., Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. V: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin, R. E., in Heindel, J. J. (ur.). Academic Press: San Diego, Kalifornija, str. 52–85. | (17) | Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. (2002). Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533. | (18) | OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. | (19) | OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. ENV/JM/Mono(2009)11. | B.8 SUBAKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU: 28-DNEVNA ŠTUDIJA | POVZETEK | Ta revidirana preskusna metoda B.8 je bila zasnovana za celovito opredelitev strupenosti preskusne kemikalije pri vdihavanju po ponavljajoči se izpostavljenosti v omejenem časovnem obdobju (28 dni) in zagotavljanje podatkov za kvantitativne ocene tveganja pri vdihavanju. Skupine najmanj 5 samcev in 5 samic glodavcev se 28 dni po 6 ur na dan izpostavljajo a) trem ali več različnim koncentracijam preskusne kemikalije, b) filtriranemu zraku (negativna kontrola) in/ali c) nosilcu (kontrola z nosilcem). Navadno se živali izpostavljajo 5 dni na teden, dovoljeno pa je tudi izpostavljanje 7 dni na teden. Vedno se preskušajo samci in samice, vendar se lahko izpostavljajo različnim koncentracijam, če je znano, da je en spol občutljivejši na določeno preskusno kemikalijo. Ta metoda vodji študije omogoča prožnost za vključitev satelitskih skupin (skupin za reverzibilnost), bronhoalveolarne lavaže (BAL), nevroloških preskusov ter dodatnih kliničnih patoloških in histopatoloških ocen, da se bolje opredeli strupenost preskusne kemikalije. | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 412 (2009). Prvotna smernica za preskušanje 412 v zvezi s subakutno strupenostjo pri vdihavanju (TG 412) je bila sprejeta leta 1981 (1). Ta preskusna metoda B.8 (ki ustreza revidirani TG 412) je bila posodobljena, da upošteva trenutno stanje v znanosti ter izpolnjuje sedanje in prihodnje zakonodajne potrebe. | 2. | Ta metoda omogoča opredeljevanje škodljivih učinkov po ponavljajoči se dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji z vdihavanjem, pri čemer preskušanje traja 28 dni. Podatki, pridobljeni z 28-dnevnimi študijami subakutne strupenosti pri vdihavanju, se lahko uporabljajo za kvantitativne ocene tveganja (če taki študiji ne sledi 90-dnevna študija subkronične strupenosti pri vdihavanju (poglavje B.29 te priloge)). Ti podatki lahko tudi zagotovijo informacije o izbiri koncentracij za dolgoročnejše študije, kot je 90-dnevna študija subkronične strupenosti pri vdihavanju. Ta preskusna metoda ni posebej namenjena preskušanju nanomaterialov. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 39 (2). | ZAČETNI PREUDARKI | 3. | Da se poveča kakovost študije in kar najbolj zmanjša uporaba živali, mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji. Informacije, ki pomagajo pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij, lahko vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah ter podatke, pridobljene s preskušanjem akutne strupenosti pri vdihavanju. Če se med študijo pričakuje ali opazi nevrotoksičnost, se lahko vodja študije odloči vključiti ustrezne ocene, kot sta sklop funkcionalnih opazovanj (FOB) in merjenje motorične aktivnosti. Čeprav je lahko čas izpostavitve odločilen za posebne preglede, izvajanje teh dodatnih dejavnosti ne sme posegati v osnovno zasnovo študije. | 4. | Razredčine jedkih ali dražilnih preskusnih kemikalij se lahko preskušajo pri koncentracijah, ki bodo zagotovile želeno stopnjo strupenosti (glej GD 39 (2)). Pri izpostavljanju živali tem snovem morajo biti ciljne koncentracije dovolj nizke, da ne povzročijo očitnih bolečin in trpljenja, vendar zadostne za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, ki izpolnjuje zakonodajni in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je treba izbrati za vsak primer posebej, po možnosti na podlagi ustrezno zasnovane študije za ugotavljanje območja, s katero se pridobijo informacije o kritičnih končnih točkah, morebitnem pragu draženja in času nastopa (glej odstavke 11–13). Izbrane koncentracije je treba utemeljiti. | 5. | Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo bolečine ali kažejo znake hudega in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti. Umirajoče živali se upoštevajo enako kot tiste, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami OECD o humanih končnih točkah (3). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 6. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle glodavce običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana. Uporabo drugih vrst je treba utemeljiti. | Priprava živali | 7. | Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan randomizacije morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 7 do 9 tednov in katerih telesna teža ne odstopa za več kot ± 20 % od povprečne teže za vsak spol. Živali se naključno izberejo, označijo za posamično prepoznavanje in so pred začetkom preskusa najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. | Oskrba živali | 8. | Živali je treba posamično identificirati, po možnosti s podkožnimi transponderji, da se olajšajo opazovanja in prepreči zmeda. Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogoče, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posamično, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja običajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena količina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe/12 ur teme. | Inhalacijske komore | 9. | Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemikalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot način izpostavljenosti uporabi izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smrčka). Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije tekočih ali trdnih aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogoče je, da bo posebne cilje študije lažje doseči z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpostavljenost celega telesa, skupni ‚volumen‘ preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in pomanjkljivosti so obravnavani v GD 39 (2). | ŠTUDIJE STRUPENOSTI | Mejne koncentracije | 10. | V nasprotju s študijami akutne strupenosti, za 28-dnevne študije subakutne strupenosti pri vdihavanju ni opredeljenih mejnih koncentracij. Pri določanju najvišje koncentracije, ki bo preskušena, je treba upoštevati: 1. najvišjo dosegljivo koncentracijo, 2. stopnjo izpostavljenosti ljudi ‚v najslabšem primeru‘, 3. potrebo po ohranjanju zadostne oskrbe s kisikom in/ali 4. preudarke v zvezi z dobrobitjo živali. Če ni mej, ki temeljijo na podatkih, se lahko uporabijo meje za akutno strupenost iz Uredbe (ES) št. 1272/2008 (13) (tj. do najvišje koncentracije 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za hlape in 20 000 ppm za pline) (glej GD 39 (2)). Če je treba pri preskušanju plinov ali lahko hlapnih preskusnih kemikalij (npr. hladil) te meje preseči, je to treba utemeljiti. Mejna koncentracija mora povzročiti nedvomno strupenost, ne da bi živalim povzročila nepotreben stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3). | Študija za ugotavljanje območja | 11. | Pred začetkom glavne študije je morda treba opraviti študijo za ugotavljanje območja. Ta je obsežnejša od opazovalne študije, saj ni omejena z izbiro koncentracij. Spoznanja, pridobljena v njej, lahko zagotovijo uspešnost glavne študije. S študijo za ugotavljanje območja se lahko na primer zagotovijo tehnične informacije o analitskih metodah, določanju velikosti delcev in odkrivanju mehanizmov strupenosti, klinični patološki in histopatološki podatki ter ocene, kolikšne so lahko koncentracije NOAEL in MTC v glavni študiji. Vodja študije se lahko študijo za ugotavljanje območja odloči uporabiti za določitev pragu draženja dihal (npr. s histopatološko preiskavo dihal, preskusom pljučne funkcije ali bronhoalveolarno lavažo), zgornje koncentracije, ki jo živali prenesejo brez nepotrebnega stresa, in parametrov, s katerimi bo mogoče najbolje opredeliti strupenost preskusne kemikalije. | 12. | Študija za ugotavljanje območja lahko zajema eno ali več koncentracij. Vsaki od njih se izpostavi največ tri samce in tri samice. Študija za ugotavljanje območja mora trajati vsaj 5 dni in običajno največ 14 dni. V poročilu o študiji je treba utemeljiti izbrane koncentracije za glavno študijo. Cilj glavne študije je dokazati razmerje koncentracija-odziv na podlagi pričakovanja o tem, katera bo najobčutljivejša končna točka. Nizka koncentracija mora biti po možnosti koncentracija brez opaznih škodljivih učinkov, medtem ko mora visoka koncentracija povzročiti nedvomne strupene učinke, ne da bi živalim povzročila nepotrebni stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3). | 13. | Pri izbiri koncentracij za študijo za ugotavljanje območja je treba upoštevati vse razpoložljive informacije, vključno z razmerji struktura-aktivnost in podatki o podobnih kemikalijah (glej odstavek 3). S študijo za ugotavljanje območja se lahko potrdijo/zavrnejo pričakovanja o najobčutljivejših končnih točkah po mehanističnih merilih, npr. o inhibiciji holinesteraze z organofosfati, nastajanju methemoglobina zaradi eritrocitotoksičnih snovi, ščitničnih hormonih (T3, T4) v primeru tirotoksičnih snovi ter o beljakovinah, LDH ali nevtrofilcih pri bronhoalveolarni lavaži v primeru neškodljivih slabo topnih delcev ali aerosolov, ki dražijo pljuča. | Glavna študija | 14. | Glavna študija subakutne strupenosti običajno zajema tri različne koncentracije ter po potrebi tudi sočasno negativno kontrolo (z zrakom) in/ali kontrolo z nosilcem (glej odstavek 17). Pri izbiri primernih stopenj izpostavljenosti si je treba pomagati z vsemi razpoložljivimi podatki, vključno z rezultati študij sistemske strupenosti, presnovo in kinetiko (poseben poudarek je treba nameniti izogibanju visokim koncentracijam, ki nasitijo kinetične procese). Vsaka preskusna skupina vsebuje najmanj 10 glodavcev (5 samcev in 5 samic), ki se 4 tedne po 5 dni na teden 6 ur na dan izpostavljajo preskusni kemikaliji (skupno študija traja 28 dni). Živali se lahko izpostavljajo tudi 7 dni na teden (npr. pri preskušanju farmacevtskih izdelkov, ki se vdihavajo). Če je znano, da je en spol občutljivejši na določeno preskusno kemikalijo, se lahko spola izpostavljata različnim koncentracijam, da se zagotovi optimalen odziv na koncentracijo, kot je opisano v odstavku 15. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Kadar se uporabi obdobje izpostavljenosti, krajše od 6 ur/dan, ali kadar je treba opraviti študijo izpostavljenosti celega telesa z dolgimi obdobji (npr. 22 ur/dan), je treba to utemeljiti (glej GD 39 (2)). V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano, razen če je to obdobje daljše od 6 ur. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko živali ves čas uživajo vodo. | 15. | Z izbranimi ciljnimi koncentracijami je treba opredeliti ciljne organe in prikazati jasen odziv na koncentracijo: | — | visoka koncentracija mora imeti strupene učinke, vendar ne sme povzročiti dolgotrajnih znakov ali smrtnosti, ki bi preprečili smiselno oceno, | — | vmesne koncentracije morajo biti razporejene tako, da se doseže stopnjevanje med strupenimi učinki nizke in visoke koncentracije, | — | nizka koncentracija mora povzročiti šibke znake strupenosti oziroma takih znakov ne sme povzročiti. | Satelitska študija (študija reverzibilnosti) | 16. | Satelitska študija (študija reverzibilnosti) se lahko uporabi za opazovanje reverzibilnosti, obstojnosti ali zapoznelega pojava zastrupitve v ustrezno dolgem obdobju po tretiranju, ki pa ne sme bili krajše od 14 dni. Satelitske skupine (skupine za reverzibilnost) so sestavljene iz petih samcev in petih samic, ki se izpostavijo sočasno s preskusnimi živalmi v glavni študiji. Skupine za satelitsko študijo (študijo reverzibilnosti) je treba preskusni kemikaliji izpostaviti pri najvišji koncentraciji, pri čemer se po potrebi uporabi sočasna kontrola z zrakom in/ali kontrola z nosilcem (glej odstavek 17). | Kontrolne živali | 17. | Z živalmi za sočasno negativno kontrolo (z zrakom) je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da se namesto preskusni kemikaliji izpostavijo filtriranemu zraku. Kadar se za pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporabi voda ali druga snov, je treba v študijo namesto negativne kontrolne skupine (z zrakom) vključiti kontrolno skupino z nosilcem. Če je le mogoče, je treba kot nosilec uporabiti vodo. Kadar se kot nosilec uporabi voda, morajo biti kontrolne živali izpostavljene zraku z enako relativno vlažnostjo kot pri preskusnih skupinah. Izbira ustreznega nosilca mora temeljiti na primerno izvedeni predhodni študiji ali preteklih podatkih. Če o strupenosti nosilca ni veliko znanega, se lahko vodja študije odloči uporabiti negativno kontrolo (z zrakom) in kontrolo z nosilcem, vendar se to močno odsvetuje. Kadar pretekli podatki razkrijejo, da nosilec ni strupen, negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna in je treba uporabiti samo kontrolo z nosilcem. Če predhodna študija preskusne kemikalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec ni strupen pri preskušeni koncentraciji, tako da je treba uporabiti to kontrolo z nosilcem. | POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI | Dajanje koncentracij | 18. | Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetnejša med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemično reaktivne preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozračju. Paziti je treba, da se ne ustvarijo eksplozivne koncentracije. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko zaradi zmanjšanja velikosti delcev uporabijo mehanski postopki. Več napotkov je na voljo v GD 39 (2). | Porazdelitev velikosti delcev | 19. | Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba določiti velikost delcev. Da se omogoči izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, so priporočeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) znaša 1–3 μm z geometričnim standardnim odklonom (σg) 1,5–3,0 (4). Prizadevanje za izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogoče izpolniti, je treba zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci in vlakna pa lahko presegajo navedene vrednosti. | Priprava preskusne kemikalije v nosilcu | 20. | Preskusno kemikalijo je treba po možnosti preskušati brez nosilca. Če je uporaba nosilca nujna za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije, je treba prednostno uporabiti vodo. Vedno, kadar se preskusna kemikalija raztopi v nosilcu, je treba dokazati njeno stabilnost. | SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI | Pretok zraka v komori | 21. | Pretok zraka skozi komoro za izpostavljanje je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Sprotno spremljanje koncentracije (ali časovne stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je neločljivo povezana z vsemi dinamičnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri vdihavanja. Če se koncentracija spremlja sproti, se lahko pogostnost merjenja pretoka zraka zmanjša na eno meritev na izpostavljenost na dan. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja. Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstaja razlog za domnevo, da tega standarda ni mogoče izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. Če meritve prvi dan izpostavljenosti pokažejo, da sta ravni teh plinov ustrezni, nadaljnje merjenje ni potrebno. | Temperatura in relativna vlažnost v komori | 22. | Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti celega telesa stalno spremljati ter jo med vsako izpostavljenostjo vsako uro zabeležiti, če je to mogoče. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi nemerljivo zaradi interference preskusne kemikalije s preskusno metodo. | Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija | 23. | Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izračunati in zabeležiti nazivno koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem inhalacijske komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pač pa pri primerjavi z dejansko koncentracijo pokaže, kako učinkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri ustvarjanju. | Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija | 24. | Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije, vzorčena v območju dihanja živali v inhalacijski komori. Dejanske koncentracije se merijo s specifičnimi metodami (npr. z neposrednim vzorčenjem, adsorpcijskimi ali kemičnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifičnimi metodami, kot je gravimetrična analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetrične analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole tekočin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifičnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetrično analizo se lahko določi tudi koncentracija večkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. | 25. | Po možnosti je treba v celotni študiji uporabljati eno serijo preskusne kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred začetkom študije je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vključno z njeno čistostjo ter, če je to tehnično izvedljivo, identiteto in količinami ugotovljenih kontaminantov in nečistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj delno potrdi naročnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). | 26. | Atmosfera v komori za izpostavljanje mora biti konstantna, kolikor je to izvedljivo. Za dokazovanje stabilnosti pogojev izpostavljenosti se lahko uporabi naprava za sprotno spremljanje, kot je aerosolni fotometer za aerosole ali analizator skupnih ogljikovodikov za hlape. Dejansko koncentracijo v komori je treba izmeriti najmanj trikrat vsak dan izpostavljenosti za vsako stopnjo izpostavljenosti. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, zadostuje, da se v vsakem obdobju izpostavljenosti vzame le en vzorec. V tem primeru se vzorec po možnosti zbira prek celotnega obdobja izpostavljenosti. Posamezni vzorci koncentracije v komori lahko od srednje koncentracije v komori odstopajo za največ ± 10 % za pline in hlape oziroma za največ ± 20 % za tekoče ali trdne aerosole. Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori (t95). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije. Pri tem sta upoštevana čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v komori (t95), in čas upadanja. Napotki za ocenjevanje t95 so na voljo v GD 39 (2). | 27. | Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov (npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša drugače. Zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), navadno glavno aktivno snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno sestavino ali indikatorsko snov (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (2). | Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev | 28. | Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba določiti najmanj vsak teden za vsako koncentracijo s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instrumentom, kot je aerodinamični merilnik delcev (APS). Če je mogoče prikazati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. | 29. | Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetrični filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost pri vseh preskušenih koncentracijah mogoče prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se kar najbolj zmanjša količina pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba študijo ponoviti. | 30. | Velikost delcev za hlape je treba določiti, če obstaja možnost, da se bodo hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogoče mešane faze, zaznajo delci. | OPAZOVANJA | 31. | Živali je treba klinično opazovati pred obdobjem izpostavljenosti ter med njim in po njem. Pogostejša opazovanja so lahko indicirana glede na odziv živali med izpostavljenostjo. Kadar opazovanje živali ovirajo uporaba zadrževalnih cevi za živali, slabo osvetljene komore za izpostavljanje celega telesa ali motne atmosfere, je treba živali pozorno opazovati po izpostavljenosti. Z opazovanji živali, preden so te izpostavljene naslednjega dne, je mogoče oceniti reverzibilnost ali okrepitev strupenih učinkov. | 32. | Vsa opažanja se sistematično zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za vsako žival posebej. Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti navesti čim natančneje. | 33. | Opazovanja v kletkah morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, v dihalih, obtočilih in živčevju ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Pozorno je treba opazovati tremorje, krče, slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. V protokol študije se lahko vključijo dodatne ocene, kot so kinetika, biomonitoring, pljučna funkcija, retencija slabo topnih snovi, ki se kopičijo v pljučnem tkivu, in vedenjske spremembe. | TELESNA TEŽA | 34. | Težo posameznih živali je treba zabeležiti malo pred prvo izpostavljenostjo (dan 0), zatem pa dvakrat na teden (na primer ob petkih in ponedeljkih, da se prikaže okrevanje čez konec tedna, ko se živali ne izpostavljajo, ali na podlagi časovnega intervala, da se omogoči ocena sistemske strupenosti) ter ob poginu ali evtanaziji. Če v prvih 2 tednih ni učinkov, se lahko do konca študije telesna teža meri tedensko. Živali v satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), če se uporabljajo, je treba tedensko tehtati prek celotnega obdobja okrevanja. Ob koncu študije je treba malo pred žrtvovanjem vse živali stehtati, da se omogoči nepristranski izračun razmerij med težo organov in telesno težo. | PORABA HRANE IN VODE | 35. | Porabo hrane je treba meriti tedensko. Meri se lahko tudi poraba vode. | KLINIČNA PATOLOGIJA | 36. | Klinične patološke ocene je treba opraviti za vse živali, vključno s tistimi v kontrolni skupini in satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), ko se žrtvujejo. Navesti je treba časovni interval med koncem izpostavljenosti in odvzemom krvi, zlasti kadar se obravnavana končna točka hitro vrne v prvotno stanje. Vzorčenje po koncu izpostavljenosti je indicirano za tiste parametre, ki imajo kratko plazemsko razpolovno dobo (npr. COHb, CHE in MetHb). | 37. | V preglednici 1 so našteti klinični patološki parametri, ki se navadno zahtevajo za vse toksikološke študije. Analiza urina se ne zahteva vedno, vendar se lahko opravi, kadar se zdi koristna na podlagi pričakovane ali opažene strupenosti. Vodja študije se lahko za boljšo opredelitev strupenosti preskusne kemikalije odloči oceniti dodatne parametre (npr. holinesterazo, lipide, hormone, kislinsko-bazno ravnovesje, methemoglobin ali Heinzeva telesca, kreatin-kinazo, razmerje med mieloidnimi in eritroidnimi celicami, troponine, pline v arterijski krvi, laktat-dehidrogenazo, sorbitol-dehidrogenazo ter γ-glutamiltranspeptidazo). | Preglednica 1 | Standardni klinični patološki parametri | Hematologija | število eritrocitov | hematokrit | koncentracija hemoglobina | povprečna količina hemoglobina v eritrocitih | povprečni volumen eritrocitov | povprečna koncentracija hemoglobina v eritrocitih | retikulociti | skupno število levkocitov | diferencialno število levkocitov | število trombocitov | zmožnost koagulacije (izberite eno): | — | protrombinski čas | — | čas koagulacije | — | parcialni tromboplastinski čas | Klinična kemija | glukoza (8) | skupni holesterol | trigliceridi | sečninski dušik v krvi | skupni bilirubin | kreatinin | skupne beljakovine | albumin | globulin | alanin-aminotransferaza | aspartat-aminotransferaza | alkalna fosfataza | kalij | natrij | kalcij | fosfor | klorid | Analiza urina (ni obvezno) | videz (barva in motnost) | količina | specifična teža ali osmolalnost | pH | skupne beljakovine | glukoza | kri/krvne celice | 38. | Kadar obstajajo dokazi, da je spodnji predel dihalnih poti (tj. alveole) primarno mesto odlaganja in retencije, je lahko bronhoalveolarna lavaža (BAL) najprimernejša tehnika za kvantitativno analizo na hipotezi temelječih parametrov razmerij med odmerkom in učinkom s poudarkom na alveolitisu, vnetju pljuč in fosfolipidozi. Tako je mogoče ustrezno preiskati spremembe v odzivu na odmerek in časovnem poteku alveolarne okvare. Bronhoalveolarni izpirek se lahko uporabi za analizo skupnega in diferencialnega števila levkocitov, skupnih beljakovin ter laktat-dehidrogenaze. Drugi parametri, ki se lahko obravnavajo, so tisti, ki nakazujejo lizosomske poškodbe, fosfolipidozo, fibrozo in dražilno ali alergijsko vnetje – pri slednjem se lahko vključi določitev vnetnih citokinov/kemokinov. Meritve BAL navadno dopolnjujejo rezultate histopatoloških preiskav, ne morejo pa jih nadomestiti. Napotki o tem, kako opraviti lavažo pljuč, so na voljo v GD 39 (2). | MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA IN TEŽA ORGANOV | 39. | Vse preskusne živali, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba popolnoma eksangvinirati (če je to izvedljivo) in na njih opraviti makroskopsko obdukcijo. Navesti je treba čas med koncem zadnje izpostavljenosti vsake živali in njenim žrtvovanjem. Če obdukcije ni mogoče opraviti nemudoma po odkritju poginule živali, jo je treba ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza kar najbolj zmanjša. Obdukcije je treba opraviti takoj, ko je mogoče, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. | 40. | V preglednici 2 so našteti organi in tkiva, ki jih je treba med makroskopsko obdukcijo shraniti v ustreznem mediju za histopatološke preiskave. O shranjevanju organov in tkiv [v oglatih oklepajih] ter vseh drugih organov in tkiv odloča vodja študije. Z organov v krepki pisavi je treba odstraniti priraščena tkiva in navedene organe stehtati čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. Ščitnico in nadmodek je treba stehtati samo, če je to potrebno, ker lahko ostanki obrezovanja otežijo histopatološko oceno. Tkiva in organe je treba takoj po obdukciji in najmanj 24–48 ur (odvisno od uporabljenega fiksativa) pred obrezovanjem fiksirati v 10-odstotnem puferiranem formalinu ali drugem ustreznem fiksativu. | Preglednica 2 | Organi in tkiva, ki se shranijo med makroskopsko obdukcijo | nadledvične žleze | kostni mozeg (in/ali svež punktat) | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | [oči (mrežnica, vidni živec) in veke] | srce | ledvice | grlo (3 ravni, 1 raven naj vključuje spodnji del poklopca) | jetra | pljuča (vsi režnji na eni ravni, vključno z glavnima sapnicama) | Hilusne bezgavke, zlasti za slabo topne preskusne kemikalije, ki jih tvorijo delci. Za bolj poglobljene preiskave in/ali študije z imunološkim poudarkom se lahko razmisli o dodatnih bezgavkah, npr. iz medpljučnega, vratnega/podčeljustnega in/ali ušesnega predela. | nazofaringealna tkiva (vsaj 4 ravni, 1 raven naj vključuje nazofaringealni vod in z nosom povezano limfatično tkivo (NALT)) | požiralnik | [vohalni betič] | Jajčniki | semenski mešički | hrbtenjača (vratni, prsni in ledveni del) | vranica | želodec | moda | priželjc | ščitnica | sapnik (vsaj 2 ravni, ki vključujeta 1 vzdolžni prerez skozi karino in 1 prečni prerez) | [sečni mehur] | maternica | vse vidne lezije | 41. | Pljuča je treba odstraniti nepoškodovana, jih stehtati in napolniti z ustreznim fiksativom pri tlaku 20–30 cm vode, da se ohrani njihova struktura (5). Rezine je treba zbrati za vse režnje na eni ravni, vključno z glavnima sapnicama, če pa se opravi lavaža pljuč, je treba iz neizpranega režnja vzeti rezine na treh ravneh (ki niso zaporedne). | 42. | Pregledati je treba najmanj 4 ravni nazofaringealnih tkiv, od katerih mora ena vključevati nazofaringealni vod (5, 6, 7, 8, 9), da se omogoči ustrezna preiskava ploščatega, prehodnega (neciliarnega respiratornega), respiratornega (ciliarnega respiratornega) in vohalnega epitelija, ter drenažno limfatično tkivo (NALT; 10, 11). Preiskati je treba tri ravni grla, od katerih mora ena vključevati spodnji del poklopca (12). Pregledati je treba vsaj dve ravni sapnika, kar vključuje en vzdolžni prerez skozi karino razcepišča glavnih sapnic in en prečni prerez. | HISTOPATOLOGIJA | 43. | Histopatološko oceno vseh organov in tkiv iz preglednice 2 je treba opraviti pri kontrolni skupini in skupini, tretirani z visoko koncentracijo, ter pri vseh živalih, ki poginejo ali so žrtvovane med študijo. Posebno pozornost je treba nameniti dihalom, ciljnim organom in vidnim lezijam. Organe in tkiva, ki imajo lezije v skupini, tretirani z visoko koncentracijo, je treba pregledati v vseh skupinah. Vodja študije se lahko odloči izvesti histopatološke ocene za dodatne skupine, da se prikaže jasen odziv na koncentracijo. Če se uporablja satelitska skupina (skupina za reverzibilnost), je treba opraviti histopatološko oceno za vsa tkiva in organe, na katerih so bili opaženi učinki v tretiranih skupinah. Če se v skupini, izpostavljeni visoki koncentraciji, pojavijo čezmerno število zgodnjih smrti ali druge težave, ki ogrožajo pomen podatkov, je treba skupino, tretirano z najbližjo nižjo koncentracijo, histopatološko pregledati. Makroskopska opažanja in mikroskopske ugotovitve je treba poskusiti povezati. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 44. | Za posamezne živali je treba navesti podatke o telesni teži, porabi hrane, klinični patologiji, makroskopski patologiji, teži organov in histopatologiji. Podatke o kliničnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifične znake zastrupitve, število živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije. Vse rezultate, kvantitativne in naključne, je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabi se lahko katera koli splošno priznana statistična metoda, izbrati pa jo je treba med zasnovo študije. | Poročilo o preskusu | 45. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno: | | Preskusne živali in oskrba | — | opis pogojev v kletkah, vključno s številom (ali spremembo števila) živali na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana. Podatki o izvoru in preteklosti se lahko navedejo, če se nanašajo na živali, za katere so bili uporabljeni podobni pogoji izpostavljenosti, nastanitveni pogoji in pogoji postenja, | — | število, starost in spol živali, | — | metodo randomizacije, | — | opis morebitne priprave živali pred preskusom, vključno s hrano, karanteno in zdravljenjem. | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo), | — | identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), če je znana. | | Nosilec | — | utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda), | — | pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na rezultat študije. | | Inhalacijska komora | — | podroben opis inhalacijske komore, vključno s prostornino in diagramom, | — | izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje atmosfere, | — | opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske koncentracije, | — | vir zraka in uporabljeni sistem za klimatiziranje, | — | metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene preskusne atmosfere, | — | razliko v tlaku (pozitivno ali negativno), | — | izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v komori (izpostavljanje celega telesa), | — | stabilnost preskusne atmosfere, | — | položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzorčenja preskusne atmosfere v komori, | — | obdelavo dovajanega/odvajanega zraka, | — | stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino (izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega telesa), | — | čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t95), | — | število zamenjav volumna zraka na uro, | — | merilne naprave (če se uporabljajo). | | Podatki o izpostavljenosti | — | utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, | — | nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), | — | dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v območju dihanja živali; za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira ločeno, | — | vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (mg/l, mg/m3 itd.) in ne v prostorninskih enotah (ppm, ppb itd.), | — | porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) in geometrični standardni odklon (σg), vključno z metodami za njihov izračun. Poročati je treba o posameznih analizah velikosti delcev. | | Preskusni pogoji | — | podatke o pripravi preskusne kemikalije, vključno s podrobnostmi o postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije, | — | opis (ki po možnosti vključuje diagram) opreme, uporabljene za ustvarjanje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, | — | podatke o opremi, uporabljeni za spremljanje temperature, vlažnosti in pretoka zraka v komori (tj. pripravo umeritvene krivulje), | — | podatke o opremi, uporabljeni za jemanje vzorcev za določanje koncentracije in porazdelitve velikosti delcev v komori, | — | podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji (vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzorčenje), | — | metodo randomizacije pri dodeljevanju živali preskusnim in kontrolnim skupinam, | — | podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom hrane in virom vode), | — | utemeljitev določitve preskusnih koncentracij. | | Rezultati | — | preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, | — | preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, | — | preglednice s podatki o velikosti delcev, vključno s podatki o analitskem vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izračuni MMAD in σg, | — | preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za živali, ki kažejo znake zastrupitve, vključno s smrtnostjo ter naravo, resnostjo, časom nastopa in trajanjem učinkov), | — | preglednice s težami posameznih živali, | — | preglednice o porabi hrane, | — | preglednice s kliničnimi patološkimi podatki, | — | ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, če so na voljo, | — | preglednice z drugimi izmerjenimi parametri. | | Razprava in razlaga rezultatov | — | poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpolnitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, | — | z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogoče izpolniti, | — | v splošno oceno študije je treba vključiti doslednost metod, uporabljenih za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, | — | obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujoči način delovanja (sistemski ali lokalni), | — | če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o humanih končnih točkah (3) humano žrtvovati živali, ki so trpele bolečine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, | — | opredeliti je treba ciljne organe, | — | določiti je treba vrednosti NOAEL in LOAEL. | VIRI: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. | (4) | Whalan, J. E. in Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (poglavje 9). V: Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H. P. in Brain, J. D. (ur.), Springer Verlag Heidelberg, str. 229–258. | (6) | Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312. | (7) | Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231–238. | (8) | Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. V: Waalkes, M. P. in Ward, J. M. (ur.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263. | (9) | Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372. | (10) | Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224. | (11) | Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285. | (12) | Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419–428. | (13) | Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spremembi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode.; | “ | (4) | Chapters B.7 and B.8 are replaced by the following: | ‘B.7. REPEATED DOSE 28-DAY ORAL TOXICITY STUDY IN RODENTS | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline 407 (2008). The original Test Guideline 407 was adopted in 1981. In 1995 a revised version was adopted, to obtain additional information from the animal used in the study, in particular on neurotoxicity and immunotoxicity. | 2. | In 1998, the OECD initiated a high-priority activity, to revise existing Test Guidelines and to develop new Test Guidelines for the screening and testing of potential endocrine disruptors (8). One element of the activity was to update the existing OECD guideline for “repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents” (TG 407) by parameters suitable to detect endocrine activity of test chemicals. This procedure underwent an extensive international program to test for the relevance and practicability of the additional parameters, the performance of these parameters for chemicals with (anti)oestrogenic, (anti)androgenic, and (anti)thyroid activity, the intra- and inter-laboratory reproducibility, and the interference of the new parameters with those required by the prior TG 407. The large amount of data thereby obtained has been compiled and evaluated in detail in a comprehensive OECD report (9). This updated Test Method B.7 (as equivalent to TG 407) is the outcome of the experience and results gained during the international test program. This Test Method allows certain endocrine mediated effects to be put into context with other toxicological effects. | INITIAL CONSIDERATIONS AND LIMITATIONS | 3. | In the assessment and evaluation of the toxic characteristics of a chemical, the determination of oral toxicity using repeated doses may be carried out after initial information on toxicity has been obtained by acute toxicity testing. This Test Method is intended to investigate effects on a very broad variety of potential targets of toxicity. It provides information on the possible health hazards likely to arise from repeated exposure over a relatively limited period of time, including effects on the nervous, immune and endocrine systems. Regarding these particular endpoints, it should identify chemicals with neurotoxic potential, which may warrant further in-depth investigation of this aspect, and chemicals that interfere with thyroid physiology. It may also provide data on chemicals that affect the male and/or female reproductive organs in young adult animals and may give an indication of immunological effects. | 4. | The results from this Test Method B.7 should be used for hazard identification and risk assessment. The results obtained by the endocrine related parameters should be seen in the context of the “OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (11). The method comprises the basic repeated dose toxicity study that may be used for chemicals on which a 90-day study is not warranted (e.g. when the production volume does not exceed certain limits) or as a preliminary to a long-term study. The duration of exposure should be 28 days. | 5. | The international program conducted on the validation of parameters suitable to potentially detect endocrine activity of a test chemical showed that the quality of data obtained by this Test Method B.7 will depend much on the experience of the test laboratory. This relates specifically to the histopathological determination of cyclic changes in the female reproductive organs and to the weight determination of the small hormone dependent organs which are difficult to dissect. Guidance on histopathology has been developed (19). It is available on the OECD public website on Test Guidelines. It is intended to assist pathologists in their examinations and help increase the sensitivity of the assay. A variety of parameters were found to be indicative of endocrine-related toxicity and have been incorporated in the Test Method. Parameters for which insufficient data were available to prove usefulness or which showed only weak evidence in the validation programme of their ability to help in detection of endocrine disrupters are proposed as optional endpoints (see Appendix 2). | 6. | On the basis of data generated in the validation process, it must be emphasised that the sensitivity of this assay is not sufficient to identify all substances with (anti)androgenic or (anti)oestrogenic modes of action (9). The Test Method is not performed in a life-stage that is most sensitive to endocrine disruption. The Test Method nevertheless, during the validation process identified substances weakly and strongly affecting thyroid function, and strong and moderate endocrine active substances acting through oestrogen or androgen receptors, but in most cases failed to identify endocrine active substances that weakly affect oestrogen or androgen receptors. Thus it cannot be described as a screening assay for endocrine activity. | 7. | Consequently, the lack of effects related to these modes of action can not be taken as evidence for the lack of effects on the endocrine system. Regarding endocrine mediated effects, substance characterisation should not therefore be based on the results of this Test Method alone but should be used in a weight of evidence approach incorporating all existing data on a chemical to characterise potential endocrine activity. For this reason, regulatory decision making on endocrine activity (substance characterisation) should be a broadly based approach, not solely reliant on results from application of this test method. | 8. | It is acknowledged that all animal-based procedures will conform to local standards of animal care; the descriptions of care and treatment set forth below are minimal performance standards, and will be superseded by local regulations where more stringent. Further guidance of the humane treatment of animals is given by the OECD (14). | 9. | Definitions used are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 10. | The test chemical is orally administered daily in graduated doses to several groups of experimental animals, one dose level per group for a period of 28 days. During the period of administration the animals are observed closely, each day for signs of toxicity. Animals that die or are euthanised during the test are necropsied and at the conclusion of the test surviving animals are euthanised and necropsied. A 28 day study provides information on the effects of repeated oral exposure and can indicate the need for further longer term studies. It can also provide information on the selection of concentrations for longer term studies. The data derived from using the Test Method should allow for the characterisation of the test chemical toxicity, for an indication of the dose response relationship and the determination of the No-Observed Adverse Effect Level (NOAEL). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 11. | The preferred rodent species is the rat, although other rodent species may be used. If the parameters specified within this Test Method B.7 are investigated in another rodent species a detailed justification should be given. Although it is biologically plausible that other species should respond to toxicants in a similar manner to the rat, the use of smaller species may result in increased variability due to technical challenges of dissecting smaller organs. In the international validation program for the detection of endocrine disrupters, the rat was the only species used. Young healthy adult animals of commonly used laboratory strains should be employed. Females should be nulliparous and non pregnant. Dosing should begin as soon as feasible after weaning, and, in any case, before the animals are nine weeks old. At the commencement of the study the weight variation of animals used should be minimal and not exceed ± 20 % of the mean weight of each sex. When a repeated oral dose is conducted as a preliminary to a longer-term study, it is preferable that animals from the same strain and source should be used in both studies. | Housing and feeding | 12. | All procedures should conform to local standards of laboratory animal care. The temperature in the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C). Although the relative humidity should be at least 30 % and preferably not to exceed 70 % other than during room cleaning, the aim should be 50-60 %. Lighting should be artificial, the photoperiod being 12 hours light, 12 hours dark. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. The choice of diet may be influenced by the need to ensure a suitable admixture of a test chemical when administered by this method. Animals should be group housed in small groups of the same sex; animals may be housed individually if scientifically justified. For group caging, no more than five animals should be housed per cage. | 13. | The feed should be regularly analysed for contaminants. A sample of the diet should be retained until finalisation of the report. | Preparation of animals | 14. | Healthy young adult animals are randomly assigned to the control and treatment groups. Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimised. The animals are identified uniquely and kept in their cages for at least five days prior to the start of the treatment study to allow for acclimatisation to the laboratory conditions. | Preparation of doses | 15. | The test chemical is administered by gavage or via the diet or drinking water. The method of oral administration is dependent on the purpose of the study, and the physical/chemical/toxico-kinetic properties of the test chemical. | 16. | Where necessary, the test chemical is dissolved or suspended in a suitable vehicle. It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solution/suspension be considered first, followed by consideration of a solution/suspension in oil (e.g. corn oil) and then by possible solution in other vehicles. For vehicles other than water the toxic characteristics of the vehicle must be known. The stability of the test chemical in the vehicle should be determined. | PROCEDURE | Number and sex of animals | 17. | At least 10 animals (five female and five male) should be used at each dose level. If interim euthanasia are planned, the number should be increased by the number of animals scheduled to be euthanised before the completion of the study. Consideration should be given to an additional satellite group of ten animals (five per sex) in the control and in the top dose group for observation of reversibility, persistence, or delayed occurrence of toxic effects, for at least 14 days post treatment. | Dosage | 18. | Generally, at least three test groups and a control group should be used, but if from assessment of other data, no effects would be expected at a dose of 1 000 mg/kg bw/d, a limit test may be performed. If there are no suitable data available, a range finding study (animals of the same strain and source) may be performed to aid the determination of the doses to be used. Except for treatment with the test chemical, animals in the control group should be handled in an identical manner to the test group subjects. If a vehicle is used in administering the test chemical, the control group should receive the vehicle in the highest volume used. | 19. | Dose levels should be selected taking into account any existing toxicity and (toxico-) kinetic data available for the test chemical or related chemicals. The highest dose level should be chosen with the aim of inducing toxic effects but not death or severe suffering. Thereafter, a descending sequence of dose levels should be selected with a view to demonstrating any dosage related response and no-observed-adverse effects at the lowest dose level (NOAEL). Two to four fold intervals are frequently optimal for setting the descending dose levels and addition of a fourth test group is often preferable to using very large intervals (e.g. more than a factor of 10) between dosages. | 20. | In the presence of observed general toxicity (e.g. reduced body weight, liver, heart, lung or kidney effects, etc.) or other changes that may not be toxic responses (e.g. reduced food intake, liver enlargement), observed effects on immune, neurological or endocrine sensitive endpoints should be interpreted with caution. | Limit test | 21. | If a test at one dose level of at least 1 000 mg/kg body weight/day or, for dietary or drinking water administration, an equivalent percentage in the diet, or drinking water (based upon body weight determinations), using the procedures described for this study, produces no observable toxic effects and if toxicity would not be expected based upon data from structurally related chemicals, then a full study using three dose levels may not be considered necessary. The limit test applies except when human exposure indicates the need for a higher dose level to be used. | Administration of doses | 22. | The animals are dosed with test chemical daily 7 days each week for a period of 28 days. When the test chemical is administered by gavage, this should be done in a single dose to the animals using a stomach tube or a suitable intubation cannula. The maximum volume of liquid that can be administered at one time depends on the size of the test animal. The volume should not exceed 1 ml/100 g body weight except in the case of aqueous solutions where 2 ml/100 g body weight may be used. Except for irritating or corrosive chemicals, which will normally reveal exacerbated effects with higher concentrations, variability in test volume should be minimized by adjusting the concentration to ensure a constant volume at all dose levels. | 23. | For chemicals administered via the diet or drinking water it is important to ensure that the quantities of the test chemical involved do not interfere with normal nutrition or water balance. When the test chemical is administered in the diet either a constant dietary concentration (ppm) or a constant dose level in terms of the animals’ body weight may be used; the alternative used must be specified. For a chemical administered by gavage, the dose should be given at similar times each day, and adjusted as necessary to maintain a constant dose level in terms of animal body weight. Where a repeated dose study is used as a preliminary to a long term study, a similar diet should be used in both studies. | Observations | 24. | The observation period should be 28 days. Animals in a satellite group scheduled for follow-up observations should be kept for at least 14 days without treatment to detect delayed occurrence, or persistence of, or recovery from toxic effects. | 25. | General clinical observations should be made at least once a day, preferably at the same time(s) each day and considering the peak period of anticipated effects after dosing. The health condition of the animals should be recorded. At least twice daily, all animals are observed for morbidity and mortality. | 26. | Once before the first exposure (to allow for within-subject comparisons), and at least once a week thereafter, detailed clinical observations should be made in all animals. These observations should be made outside the home cage in a standard arena and preferably at the same time of day on each occasion. They should be carefully recorded, preferably using scoring systems, explicitly defined by the testing laboratory. Effort should be made to ensure that variations in the test conditions are minimal and that observations are preferably conducted by observers unaware of the treatment. Signs noted should include, but not be limited to, changes in skin, fur, eyes, mucous membranes, occurrence of secretions and excretions and autonomic activity (e.g. lacrimation, piloerection, pupil size, unusual respiratory pattern). Changes in gait, posture and response to handling as well as the presence of clonic or tonic movements, stereotypies (e.g. excessive grooming, repetitive circling) or bizarre behaviour (e.g. self-mutilation, walking backwards) should also be recorded (2). | 27. | In the fourth exposure week sensory reactivity to stimuli of different types (2) (e.g. auditory, visual and proprioceptive stimuli) (3)(4)(5), assessment of grip strength (6) and motor activity assessment (7) should be conducted. Further details of the procedures that could be followed are given in the respective references. However, alternative procedures than those referenced could be used. | 28. | Functional observations conducted in the fourth exposure week may be omitted when the study is conducted as a preliminary study to a subsequent subchronic (90-day) study. In that case, the functional observations should be included in this follow-up study. On the other hand, the availability of data on functional observations from the repeated dose study may enhance the ability to select dose levels for a subsequent subchronic study. | 29. | As an exception, functional observations may also be omitted for groups that otherwise reveal signs of toxicity to an extent that would significantly interfere with the functional test performance. | 30. | At necropsy, the oestrus cycle of all females could be determined (optional) by taking vaginal smears. These observations will provide information regarding the stage of oestrus cycle at the time of sacrifice and assist in histological evaluation of estrogen sensitive tissues [see guidance on histopathology (19)]. | Body weight and food/water consumption | 31. | All animals should be weighed at least once a week. Measurements of food consumption should be made at least weekly. If the test chemical is administered via the drinking water, water consumption should also be measured at least weekly. | Haematology | 32. | The following haematological examinations should be made at the end of the test period: haematocrit, haemoglobin concentrations, erythrocyte count, reticulocytes, total and differential leucocyte count, platelet count and a measure of blood clotting time/potential. Other determinations that should be carried out, if the test chemical or its putative metabolites have or are suspected to have oxidising properties include methaemoglobin concentration and Heinz bodies. | 33. | Blood samples should be taken from a named site just prior to or as part of the procedure for euthanasia of the animals, and stored under appropriate conditions. Animals should be fasted overnight prior to euthanasia (2). | Clinical biochemistry | 34. | Clinical biochemistry determinations to investigate major toxic effects in tissues and, specifically, effects on kidney and liver, should be performed on blood samples obtained of all animals just prior to or as part of the procedure for euthanasia of the animals (apart from those found moribund and/or euthanised prior to the termination of the study). Investigations of plasma or serum shall include sodium, potassium, glucose, total cholesterol, urea, creatinine, total protein and albumin, at least two enzymes indicative of hepatocellular effects (such as alanin aminotransferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase, γ-glutamyl trans-peptidase and glutamate dehydrogenase), and bile acids. Measurements of additional enzymes (of hepatic or other origin) and bilirubin may provide useful information under certain circumstances. | 35. | Optionally, the following urinalysis determinations could be performed during the last week of the study using timed urine volume collection; appearance, volume, osmolality or specific gravity, pH, protein, glucose and blood/blood cells. | 36. | In addition, studies to investigate plasma or serum markers of general tissue damage should be considered. Other determinations that should be carried out, if the known properties of the test chemical may, or are suspected to, affect related metabolic profiles include calcium, phosphate, triglycerides, specific hormones, and cholinesterase. These need to be identified for chemicals in certain classes or on a case-by-case basis. | 37. | Although in the international evaluation of the endocrine related endpoints a clear advantage for the determination of thyroid hormones (T3, T4) and TSH could not be demonstrated, it may be helpful to retain plasma or serum samples to measure T3, T4 and TSH (optional) if there is an indication for an effect on the pituitary-thyroid axis. These samples may be frozen at – 20° for storage. The following factors may influence the variability and the absolute concentrations of the hormone determinations: | — | time of sacrifice because of diurnal variation of hormone concentrations | — | method of sacrifice to avoid undue stress to the animals that may affect hormone concentrations | — | test kits for hormone determinations that may differ by their standard curves. | Definitive identification of thyroid-active chemicals is more reliable by histopathological analysis rather than hormone levels. | 38. | Plasma samples specifically intended for hormone determination should be obtained at a comparable time of the day. It is recommended that consideration should be given to T3, T4 and TSH determinations triggered based upon alterations of thyroid histopathology. The numerical values obtained when analysing hormone concentrations differ with various commercial assay kits. Consequently, it may not be possible to provide performance criteria based upon uniform historical data. Alternatively, laboratories should strive to keep control coefficients of variation below 25 for T3 and T4 and below 35 for TSH. All concentrations are to be recorded in ng/ml. | 39. | If historical baseline data are inadequate, consideration should be given to determination of haematological and clinical biochemistry variables before dosing commences or preferably in a set of animals not included in the experimental groups. | PATHOLOGY | Gross necropsy | 40. | All animals in the study shall be subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. The liver, kidneys, adrenals, testes, epididymides, prostate + seminal vesicles with coagulating glands as a whole, thymus, spleen, brain and heart of all animals (apart from those found moribund and/or euthanised prior to the termination of the study) should be trimmed of any adherent tissue, as appropriate, and their wet weight taken as soon as possible after dissection to avoid drying. Care must be exercised when trimming the prostate complex to avoid puncture of the fluid filled seminal vesicles. Alternatively, seminal vesicles and prostate may be trimmed and weighed after fixation. | 41. | In addition, two other tissues could be optionally weighed as soon as possible after dissection, to avoid drying: paired ovaries (wet weight) and uterus, including cervix (guidance on removal and preparation of the uterine tissues for weight measurement is provided in OECD TG 440 (18)). | 42. | The thyroid weight (optional) could be determined after fixation. Trimming should also be done very carefully and only after fixation to avoid tissue damage. Tissue damage could compromise histopathology analysis. | 43. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (see paragraph 47): all gross lesions, brain (representative regions including cerebrum, cerebellum and pons), spinal cord, eye, stomach, small and large intestines (including Peyer’s patches), liver, kidneys, adrenals, spleen, heart, thymus, thyroid, trachea and lungs (preserved by inflation with fixative and then immersion), gonads (testis and ovaries), accessory sex organs (uterus and cervix, epididymides, prostate + seminal vesicles with coagulating glands), vagina, urinary bladder, lymph nodes [besides the most proximal draining node another lymph node should be taken according to the laboratory’s experience (15)], peripheral nerve (sciatic or tibial) preferably in close proximity to the muscle, skeletal muscle and bone, with bone marrow (section or, alternatively, a fresh mounted bone marrow aspirate). It is recommended that testes be fixed by immersion in Bouin’s or modified Davidson’s fixative (16) (17). The tunica albuginea must be gently and shallowly punctured at the both poles of the organ with a needle to permit rapid penetration of the fixative. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. | 44. | The following tissues may give valuable indication for endocrine-related effects: Gonads (ovaries and testes), accessory sex organs (uterus including cervix, epididymides, seminal vesicles with coagulation glands, dorsolateral and ventral prostate), vagina, pituitary, male mammary gland, the thyroid and adrenal gland. Changes in male mammary glands have not been sufficiently documented but this parameter may be very sensitive to substances with oestrogenic action. Observation of organs/tissues that are not listed in paragraph 43 is optional (see Appendix 2). | 45. | The Guidance on histopathology (19) details extra information on dissection, fixation, sectioning and histopathology of endocrine tissues. | 46. | In the international test program some evidence was obtained that subtle endocrine effects by chemicals with a low potency for affecting sex hormone homeostasis may be identified by disturbance of the synchronisation of the oestrus cycle in different tissues and not so much by frank histopathological alterations in female sex organs. Although no definitive proof was obtained for such effects, it is recommended that evidence of possible asynchrony of the oestrus cycle should be taken into account in interpretation of the histopathology of the ovaries (follicular, thecal, and granulosa cells), uterus, cervix and vagina. If assessed, the stage of cycle as determined by vaginal smears could be included in this comparison as well. | Histopathology | 47. | Full histopathology should be carried out on the preserved organs and tissues of all animals in the control and high dose groups. These examinations should be extended to animals of all other dosage groups, if treatment-related changes are observed in the high dose group. | 48. | All gross lesions shall be examined. | 49. | When a satellite group is used, histopathology should be performed on tissues and organs identified as showing effects in the treated groups. | DATA AND REPORTING | Data | 50. | Individual data should be provided. Additionally, all data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals at the start of the test, the number of animals found dead during the test or euthanised for humane reasons and the time of any death or euthanasia, the number showing signs of toxicity, a description of the signs of toxicity observed, including time of onset, duration, and severity of any toxic effects, the number of animals showing lesions, the type of lesions, their severity and the percentage of animals displaying each type of lesion. | 51. | When possible, numerical results should be evaluated by an appropriate and generally acceptable statistical method. Comparisons of the effect along a dose range should avoid the use of multiple t-tests. The statistical methods should be selected during the design of the study. | 52. | For quality control it is proposed that historical control data are collected and that for numerical data coefficients of variation are calculated, especially for the parameters linked with endocrine disrupter detection. These data can be used for comparison purposes when actual studies are evaluated. | Test report | 53. | The test report must include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature, purity and physicochemical properties; | — | identification data. | | Vehicle (if appropriate): | — | justification for choice of vehicle, if other than water. | | Test animals: | — | species/strain used; | — | number, age and sex of animals; | — | source, housing conditions, diet, etc.; | — | individual weights of animals at the start of the test. | — | justification for species if not rat | | Test conditions: | — | rationale for dose level selection; | — | details of test chemical formulation/diet preparation, achieved concentration, stability and homogeneity of the preparation; | — | details of the administration of the test chemical; | — | conversion from diet/drinking water test chemical concentration (ppm) to the actual dose (mg/kg body weight/day), if applicable; | — | details of food and water quality. | | Optional endpoints investigated | — | list of optional endpoints investigated | | Results: | — | body weight/body weight changes; | — | food consumption, and water consumption, if applicable; | — | toxic response data by sex and dose level, including signs of toxicity; | — | nature, severity and duration of clinical observations (whether reversible or not); | — | sensory activity, grip strength and motor activity assessments; | — | haematological tests with relevant base-line values; | — | clinical biochemistry tests with relevant base-line values; | — | body weight at euthanasia and organ weight data; | — | necropsy findings; | — | a detailed description of all histopathological findings; | — | absorption data if available; | — | statistical treatment of results, where appropriate. | | Discussion of results | | Conclusions | Appendix 1 | DEFINITIONS | Androgenicity is the capability of a chemical to act like a natural androgenic hormone (e.g. testosterone) in a mammalian organism. | Antiandrogenicity is the capability of a chemical to suppress the action of a natural androgenic hormone (e.g. testosterone) in a mammalian organism. | Antioestrogenicity is the capability of a chemical to suppress the action of a natural oestrogenic hormone (e.g. oestradiol 17ß) in a mammalian organism. | Antithyroid activity is the capability of a chemical to suppress the action of a natural thyroid hormone (e.g. T3) in a mammalian organism. | Dosage is a general term comprising of dose, its frequency and the duration of dosing. | Dose is the amount of test chemical administered. The dose is expressed as weight of test chemical per unit body weight of test animal per day (e.g. mg/kg body weight/day), or as a constant dietary concentration. | Evident toxicity is a general term describing clear signs of toxicity following administration of test chemical. These should be sufficient for hazard assessment and should be such that an increase in the dose administered can be expected to result in the development of severe toxic signs and probable mortality. | NOAEL is the abbreviation for no-observed-adverse-effect level. This is the highest dose level where no adverse treatment-related findings are observed due to treatment. | Oestrogenicity is the capability of a chemical to act like a natural oestrogenic hormone (e.g. oestradiol 17ß) in a mammalian organism. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Thyroid activity is the capability of a chemical to act like a natural thyroid hormone (e.g. T3) in a mammalian organism. | Validation is a scientific process designed to characterise the operational requirements and limitations of a test method and to demonstrate its reliability and relevance for a particular purpose. | Appendix 2 | Endpoints recommended for the detection of endocrine disrupters (EDs) in this Test Method B.7 | Mandatory endpoints | Optional endpoints | Weight | — | Testes | — | Epididymides | — | Adrenals | — | Prostate + seminal vesicles with coagulating glands | — | Ovaries | — | Uterus, including cervix | — | Thyroid | Histopathology | — | Gonads: | — | Testes and | — | Ovaries | — | Accessory sex organs: | — | Epididymides, | — | Prostate + seminal vesicle with coagulating glands | — | Uterus, including cervix | — | Adrenal | — | Thyroid | — | Vagina | — | Vaginal smears | — | Male mammary glands | — | Pituitary | Hormones measurement | | — | Circulating levels of T3, T4 | — | Circulating levels of TSH | LITERATURE: | (1) | OECD (Paris, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity. | (2) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60. | (3) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (4) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691-704. | (5) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (6) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. | (7) | Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. | (8) | OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11 March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. | (9) | OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. | (10) | OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. | (11) | OECD (2012).Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html | (12) | OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. | (13) | OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. | (14) | OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7. | (15) | Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404-407. | (16) | Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85. | (17) | Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533. | (18) | OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. | (19) | OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11. | B.8. SUBACUTE INHALATION TOXICITY: 28-DAY STUDY | SUMMARY | This revised Test Method B.8 has been designed to fully characterise test chemical toxicity by the inhalation route following repeated exposure for a limited period of time (28 days), and to provide data for quantitative inhalation risk assessments. Groups of at least 5 male and 5 female rodents are exposed 6 hours per day for 28 days to a) the test chemical at three or more concentration levels, b) filtered air (negative control), and/or c) the vehicle (vehicle control). Animals are generally exposed 5 days per week but exposure for 7 days per week is also allowed. Males and females are always tested, but they may be exposed at different concentration levels if it is known that one sex is more susceptible to a given test chemical. This method allows the study director the flexibility to include satellite (reversibility) groups, bronchoalveolar lavage (BAL), neurologic tests, and additional clinical pathology and histopathological evaluations in order to better characterise the toxicity of a test chemical. | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline 412 (2009). The original subacute inhalation Test Guideline 412 (TG 412) was adopted in 1981 (1). This Test Method B.8 (as equivalent to the revised TG 412) has been updated to reflect the state of science and to meet current and future regulatory needs. | 2. | This method enables the characterisation of adverse effects following repeated daily inhalation exposure to a test chemical for 28 days. The data derived from 28-day sub-acute inhalation toxicity studies can be used for quantitative risk assessments [if not followed by a 90-day subchronic inhalation toxicity study (Chapter B.29 of this Annex)]. The data can also provide information on the selection of concentrations for longer term studies such as the 90-day subchronic inhalation toxicity study. This test method is not specifically intended for the testing of nanomaterials. Definitions used in the context of this Test Method are provided at the end of this chapter and in the Guidance Document 39 (2). | INITIAL CONSIDERATIONS | 3. | All available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study in order to enhance the quality of the study and minimize animal usage. Information that will assist in the selection of appropriate test concentrations might include the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally related chemicals; and data derived from acute inhalation toxicity testing. If neurotoxicity is expected or is observed in the course of the study, the study director may choose to include appropriate evaluations such as a functional observational battery (FOB) and measurement of motor activity. Although the timing of exposures relative to specific examinations may be critical, the performance of these additional activities should not interfere with the basic study design. | 4. | Dilutions of corrosive or irritating test chemicals may be tested at concentrations that will yield the desired degree of toxicity [refer to GD 39 (2)]. When exposing animals to these materials, the targeted concentrations should be low enough to not cause marked pain and distress, yet sufficient to extend the concentration-response curve to levels that reach the regulatory and scientific objective of the test. These concentrations should be selected on a case-by-case basis, preferably based upon an adequately designed range-finding study that provides information regarding the critical endpoint, any irritation threshold, and the time of onset (see paragraphs 11-13). The justification for concentration selection should be provided. | 5. | Moribund animals or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress should be humanely killed. Moribund animals are considered in the same way as animals that die on test. Criteria for making the decision to kill moribund or severely suffering animals, and guidance on the recognition of predictable or impending death, are the subject of an OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of Animal Species | 6. | Healthy young adult rodents of commonly used laboratory strains should be employed. The preferred species is the rat. Justification should be provided if other species are used. | Preparation of Animals | 7. | Females should be nulliparous and non-pregnant. On the day of randomisation, animals should be young adults 7 to 9 weeks of age. Body weights should be within ± 20 % of the mean weight for each sex. The animals are randomly selected, marked for individual identification, and kept in their cages for at least 5 days prior to the start of the test to allow for acclimatisation to laboratory conditions. | Animal Husbandry | 8. | Animals should be individually identified, if possible with subcutaneous transponders, to facilitate observations and avoid confusion. The temperature of the experimental animal maintenance room should be 22 ± 3 °C. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, though this may not be possible when using water as a vehicle. Before and after exposures, animals generally should be caged in groups by sex and concentration, but the number of animals per cage should not interfere with clear observation of each animal and should minimise losses due to cannibalism and fighting. When animals are to be exposed nose-only, it may be necessary for them to be acclimated to the restraining tubes. The restraining tubes should not impose undue physical, thermal, or immobilisation stress on the animals. Restraint may affect physiological endpoints such as body temperature (hyperthermia) and/or respiratory minute volume. If generic data are available to show that no such changes occur to any appreciable extent, then pre-adaptation to the restraining tubes is not necessary. Animals exposed whole-body to an aerosol should be housed individually during exposure to prevent them from filtering the test aerosol through the fur of their cage mates. Conventional and certified laboratory diets may be used, except during exposure, accompanied with an unlimited supply of municipal drinking water. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light/12 hours dark. | Inhalation Chambers | 9. | The nature of the test chemical and the object of the test should be considered when selecting an inhalation chamber. The preferred mode of exposure is nose-only (which term includes head-only, nose-only, or snout-only). Nose-only exposure is generally preferred for studies of liquid or solid aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. Special objectives of the study may be better achieved by using a whole-body mode of exposure, but this should be justified in the study report. To ensure atmosphere stability when using a whole-body chamber, the total “volume” of the test animals should not exceed 5 % of the chamber volume. Principles of the nose-only and whole-body exposure techniques and their particular advantages and disadvantages are addressed in GD 39 (2). | TOXICITY STUDIES | Limit Concentrations | 10. | Unlike with acute studies, there are no defined limit concentrations in 28-day sub-acute inhalation toxicity studies. The maximum concentration tested should consider: (1) the maximum attainable concentration, (2) the “worst case” human exposure level, (3) the need to maintain an adequate oxygen supply, and/or (4) animal welfare considerations. In the absence of data-based limits, the acute limits of the Regulation (EC) No 1272/2008 (13) may be used (i.e. up to a maximum concentration of 5 mg/l for aerosols, 20 mg/l for vapours and 20 000 ppm for gases); refer to GD 39 (2). Justification should be provided if it is necessary to exceed these limits when testing gases or highly volatile test chemicals (e.g. refrigerants). The limit concentration should elicit unequivocal toxicity without causing undue stress to the animals or affecting their longevity (3). | Range-Finding Study | 11. | Before commencing with the main study, it may be necessary to perform a range-finding study. A range-finding study is more comprehensive than a sighting study because it is not limited to concentration selection. Knowledge learned from a range-finding study can lead to a successful main study. A range-finding study may, for example, provide technical information regarding analytical methods, particle sizing, discovery of toxic mechanisms, clinical pathology and histopathological data, and estimations of what may be NOAEL and MTC concentrations in a main study. The study director may choose to use the range-finding study to identify the threshold of respiratory tract irritation (e.g. with histopathology of the respiratory tract, pulmonary function testing, or bronchoalveolar lavage), the upper concentration which is tolerated without undue stress to the animals, and the parameters that will best characterise a test chemical’s toxicity. | 12. | A range-finding study may consist of one or more concentration levels. No more than three males and three females should be exposed at each concentration level. A range-finding study should last a minimum of 5 days and generally no more than 14 days. The rationale for the selection of concentrations for the main study should be provided in the study report. The objective of the main study is to demonstrate a concentration-response relationship based on what is anticipated to be the most sensitive endpoint. The low concentration should ideally be a no-observed-adverse effect concentration while the high concentration should elicit unequivocal toxicity without causing undue stress to the animals or affecting their longevity (3). | 13. | When selecting concentration levels for the range-finding study, all available information should be considered including structure-activity relationships and data for similar chemicals (see paragraph 3). A range-finding study may verify/refute what are considered to be the most sensitive mechanistically based endpoints, e.g. cholinesterase inhibition by organophosphates, methaemoglobin formation by erythrocytotoxic agents, thyroidal hormones (T3, T4) for thyrotoxicants, protein, LDH, or neutrophils in brochoalveolar lavage for innocuous poorly soluble particles or pulmonary irritant aerosols. | Main Study | 14. | The main sub-acute toxicity study generally consists of three concentration levels, and also concurrent negative (air) and/or vehicle controls as needed (see paragraph 17). All available data should be utilised to aid selection of appropriate exposure levels, including the results of systemic toxicity studies, metabolism and kinetics (particular emphasis should be given to avoiding high concentration levels which saturate kinetic processes). Each test group contains at least 10 rodents (5 male and 5 female) that are exposed to the test chemical for 6 hours per day on a 5 day per week basis for a period of 4 weeks (total study duration of 28 days). Animals may also be exposed 7 days per week (e.g. when testing inhaled pharmaceuticals). If one sex is known to be more susceptible to a given test chemical, the sexes may be exposed at different concentration levels in order to optimise the concentration-response as described in paragraph 15. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration less than 6 hours/day, or when it is necessary to conduct a long duration (e.g. 22 hours/day) whole-body exposure study [refer to GD 39 (2)]. Feed should be withheld during the exposure period unless exposure exceeds 6 hours. Water may be provided throughout a whole-body exposure. | 15. | The target concentrations selected should identify the target organ(s) and demonstrate a clear concentration-response: | — | The high concentration level should result in toxic effects but not cause lingering signs or lethality which would prevent a meaningful evaluation. | — | The intermediate concentration level(s) should be spaced to produce a gradation of toxic effects between that of the low and high concentration. | — | The low concentration level should produce little or no evidence of toxicity. | Satellite (Reversibility) Study | 16. | A satellite (reversibility) study may be used to observe reversibility, persistence, or delayed occurrence of toxicity for a post-treatment period of an appropriate length, but no less than 14 days. Satellite (reversibility) groups consist of five males and five females exposed contemporaneously with the experimental animals in the main study. Satellite (reversibility) study groups should be exposed to the test chemical at the highest concentration level and there should be concurrent air and/or vehicle controls as needed (see paragraph 17). | Control Animals | 17. | Concurrent negative (air) control animals should be handled in a manner identical to the test group animals except that they are exposed to filtered air rather than test chemical. When water or another substance is used to assist in generating the test atmosphere, a vehicle control group, instead of a negative (air) control group, should be included in the study. Water should be used as the vehicle whenever possible. When water is used as the vehicle, the control animals should be exposed to air with the same relative humidity as the exposed groups. The selection of a suitable vehicle should be based on an appropriately conducted pre-study or historical data. If a vehicle’s toxicity is not well known, the study director may choose to use both a negative (air) control and a vehicle control, but this is strongly discouraged. If historical data reveal that a vehicle is non-toxic, then there is no need for a negative (air) control group and only a vehicle control should be used. If a pre-study of a test chemical formulated in a vehicle reveals no toxicity, it follows that the vehicle is non-toxic at the concentration tested and this vehicle control should be used. | EXPOSURE CONDITIONS | Administration of Concentrations | 18. | Animals are exposed to the test chemical as a gas, vapour, aerosol, or a mixture thereof. The physical state to be tested depends on the physico-chemical properties of the test chemical, the selected concentration, and/or the physical form most likely present during the handling and use of the test chemical. Hygroscopic and chemically reactive test chemicals should be tested under dry air conditions. Care should be taken to avoid generating explosive concentrations. Particulate material may be subjected to mechanical processes to decrease the particle size. Further guidance is provided in GD 39 (2). | Particle-Size Distribution | 19. | Particle sizing should be performed for all aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. To allow for exposure of all relevant regions of the respiratory tract, aerosols with mass median aerodynamic diameters (MMAD) ranging from 1 to 3 μm with a geometric standard deviation (σg) in the range of 1,5 to 3,0 are recommended (4). Although a reasonable effort should be made to meet this standard, expert judgement should be provided if it cannot be achieved. For example, metal fume particles may be smaller than this standard, and charged particles and fibres may exceed it. | Test chemical Preparation in a Vehicle | 20. | Ideally, the test chemical should be tested without a vehicle. If it is necessary to use a vehicle to generate an appropriate test chemical concentration and particle size, water should be given preference. Whenever a test chemical is dissolved in a vehicle, its stability should be demonstrated. | MONITORING OF EXPOSURE CONDITIONS | Chamber Airflow | 21. | The flow of air through the exposure chamber should be carefully controlled, continuously monitored, and recorded at least hourly during each exposure. The real-time monitoring of the test atmosphere concentration (or temporal stability) is an integral measurement of all dynamic parameters and provides an indirect means to control all relevant dynamic inhalation parameters. If the concentration is monitored real-time, the frequency of measurement of air flows may be reduced to one single measurement per exposure per day. Special consideration should be given to avoiding re-breathing in nose-only chambers. Oxygen concentration should be at least 19 % and carbon dioxide concentration should not exceed 1 %. If there is reason to believe that this standard cannot be met, oxygen and carbon dioxide concentrations should be measured. If measurements on the first day of exposure show that these gases are at proper levels, no further measurements should be necessary. | Chamber Temperature and Relative Humidity | 22. | Chamber temperature should be maintained at 22 ± 3 °C. Relative humidity in the animals’ breathing zone, for both nose-only and whole-body exposures, should be monitored continuously and recorded hourly during each exposure where possible. The relative humidity should preferably be maintained in the range of 30 to 70 %, but this may either be unattainable (e.g. when testing water based mixtures) or not measurable due to test chemical interference with the Test Method. | Test chemical: Nominal Concentration | 23. | Whenever feasible, the nominal exposure chamber concentration should be calculated and recorded. The nominal concentration is the mass of generated test chemical divided by the total volume of air passed through the inhalation chamber system. The nominal concentration is not used to characterise the animals’ exposure, but a comparison of the nominal concentration and the actual concentration gives an indication of the generation efficiency of the test system, and thus may be used to discover generation problems. | Test chemical: Actual Concentration | 24. | The actual concentration is the test chemical concentration as sampled at the animals’ breathing zone in an inhalation chamber. Actual concentrations can be obtained either by specific methods (e.g. direct sampling, adsorptive or chemical reactive methods, and subsequent analytical characterisation) or by non-specific methods such as gravimetric filter analysis. The use of gravimetric analysis is acceptable only for single component powder aerosols or aerosols of low volatility liquids and should be supported by appropriate pre-study test chemical-specific characterisations. Multi-component powder aerosol concentration may also be determined by gravimetric analysis. However, this requires analytical data which demonstrate that the composition of airborne material is similar to the starting material. If this information is not available, a reanalysis of the test chemical (ideally in its airborne state) at regular intervals during the course of the study may be necessary. For aerosolised agents that may evaporate or sublimate, it should be shown that all phases were collected by the method chosen. | 25. | One lot of the test chemical should be used throughout the duration of the study, if possible, and the test sample should be stored under conditions that maintain its purity, homogeneity, and stability. Prior to the start of the study, there should be a characterisation of the test chemical including its purity and, if technically feasible, the identity, and quantities of identified contaminants and impurities. This can be demonstrated but is not limited by the following data: retention time and relative peak area, molecular weight from mass spectroscopy or gas chromatography analyses, or other estimates. Although the test sample’s identity is not the responsibility of the test laboratory, it may be prudent for the test laboratory to confirm the sponsor’s characterisation at least in a limited way (e.g. colour, physical nature, etc.). | 26. | The exposure atmosphere should be held as constant as practicable. A real-time monitoring device, such as an aerosol photometer for aerosols or a total hydrocarbon analyser for vapours may be used to demonstrate the stability of the exposure conditions. Actual chamber concentration should be measured at least 3 times during each exposure day for each exposure level. If not feasible due to limited air flow rates or low concentrations, one sample per exposure period is acceptable. Ideally, this sample should then be collected over the entire exposure period. Individual chamber concentration samples should deviate from the mean chamber concentration by no more than ± 10 % for gases and vapours, and by no more than ± 20 % for liquid or solid aerosols. Time to attain chamber equilibration (t95) should be calculated and reported. The duration of an exposure spans the time that the test chemical is generated. This takes into account the times required to attain chamber equilibration (t95) and decay. Guidance for estimating t95 can be found in GD 39 (2). | 27. | For very complex mixtures consisting of gases/vapours and aerosols (e.g. combustion atmospheres and test chemicals propelled from purpose-driven end-use products/devices), each phase may behave differently in an inhalation chamber. Therefore, at least one indicator substance (analyte), normally the principal active substance in the mixture, of each phase (gas/vapour and aerosol) should be selected. When the test chemical is a mixture, the analytical concentration should be reported for the total mixture, and not just for the active ingredient or the indicator substance (analyte). Additional information regarding actual concentrations can be found in GD 39 (2). | Test chemical: Particle Size Distribution | 28. | The particle size distribution of aerosols should be determined at least weekly for each concentration level by using a cascade impactor or an alternative instrument, such as an aerodynamic particle sizer (APS). If equivalence of the results obtained by a cascade impactor and the alternative instrument can be shown, then the alternative instrument may be used throughout the study. | 29. | A second device, such as a gravimetric filter or an impinger/gas bubbler, should be used in parallel to the primary instrument to confirm the collection efficiency of the primary instrument. The mass concentration obtained by particle size analysis should be within reasonable limits of the mass concentration obtained by filter analysis [see GD 39 (2)]. If equivalence can be demonstrated at all concentrations tested in the early phase of the study, then further confirmatory measurements may be omitted. For the sake of animal welfare, measures should be taken to minimise inconclusive data which may lead to a need to repeat a study. | 30. | Particle sizing should be performed for vapours if there is any possibility that vapour condensation may result in the formation of an aerosol, or if particles are detected in a vapour atmosphere with potential for mixed phases. | OBSERVATIONS | 31. | The animals should be clinically observed before, during and after the exposure period. More frequent observations may be indicated depending on the response of the animals during exposure. When animal observation is hindered by the use of animal restraint tubes, poorly lit whole body chambers, or opaque atmospheres, animals should be carefully observed after exposure. Observations before the next day’s exposure can assess any reversibility or exacerbation of toxic effects. | 32. | All observations are recorded with individual records being maintained for each animal. When animals are killed for humane reasons or found dead, the time of death should be recorded as precisely as possible. | 33. | Cage-side observations should include changes in the skin and fur, eyes, and mucous membranes; changes in the respiratory and circulatory systems, changes in the nervous system, and changes in somatomotor activity and behaviour patterns. Attention should be directed to observations of tremors, convulsions, salivation, diarrhoea, lethargy, sleep, and coma. The measurement of rectal temperatures may provide supportive evidence of reflex bradypnea or hypo/hyperthermia related to treatment or confinement. Additional assessments may be included in the study protocol such as kinetics, biomonitoring, lung function, retention of poorly soluble materials that accumulate in lung tissue, and behavioural changes. | BODY WEIGHTS | 34. | Individual animal weights should be recorded shortly before the first exposure (day 0), twice weekly thereafter (for example: on Fridays and Mondays to demonstrate recovery over an exposure-free weekend or at a time interval to allow assessment of systemic toxicity), and at the time of death or euthanasia. If there are no effects in the first 2 weeks, body weights may be measured weekly for the remainder of the study. Satellite (reversibility) animals (if used) should continue to be weighed weekly throughout the recovery period. At study termination, all animals should be weighed shortly before sacrifice to allow for an unbiased calculated of organ to body weight ratios. | FOOD AND WATER CONSUMPTION | 35. | Food consumption should be measured weekly. Water consumption may also be measured. | CLINICAL PATHOLOGY | 36. | Clinical pathology assessments should be made for all animals, including control and satellite (reversibility) animals, when they are sacrificed. The time interval between the end of exposure and blood collection should be recorded, particularly when the reconstitution of the addressed endpoint is rapid. Sampling following the end of exposure is indicated for those parameters with a short plasma half-time (e.g. COHb, CHE, and MetHb). | 37. | Table 1 lists the clinical pathology parameters that are generally required for all toxicology studies. Urinalysis is not required on a routine basis, but may be performed when deemed useful based on expected or observed toxicity. The study director may choose to assess additional parameters in order to better characterise a test chemical’s toxicity (e.g. cholinesterase, lipids, hormones, acid/base balance, methaemoglobin or Heinz bodies, creatine kinase, myeloid/erythroid ratio, troponins, arterial blood gases, lactate dehydrogenase, sorbitol dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, and gamma glutamyl transpeptidase). | Table 1 | Standard Clinical Pathology Parameters | Haematology | Erythrocyte count | Haematocrit | Haemoglobin concentration | Mean corpuscular haemoglobin | Mean corpuscular volume | Mean corpuscular haemoglobin concentration | Reticulocytes | Total leukocyte count | Differential leukocyte count | Platelet count | Clotting potential (select one): | — | Prothrombin time | — | Clotting time | — | Partial thromboplastin time | Clinical Chemistry | Glucose (*1) | Total cholesterol | Triglycerides | Blood urea nitrogen | Total bilirubin | Creatinine | Total protein | Albumin | Globulin | Alanine aminotransferase | Aspartate aminotransferase | Alkaline phosphatase | Potassium | Sodium | Calcium | Phosphorus | Chloride | Urinalysis (optional) | Appearance (colour and turbidity) | Volume | Specific gravity or osmolality | pH | Total protein | Glucose | Blood/blood cells | 38. | When there is evidence that the lower respiratory tract (i.e., the alveoli) is the primary site of deposition and retention, then bronchoalveolar lavage (BAL) may be the technique of choice to quantitatively analyse hypothesis-based dose-effect parameters focusing on alveolitis, pulmonary inflammation, and phospholipidosis. This allows for dose-response and time-course changes of alveolar injury to be suitably probed. The BAL fluid may be analysed for total and differential leukocyte counts, total protein, and lactate dehydrogenase. Other parameters that may be considered are those indicative of lysosomal injury, phospholipidosis, fibrosis, and irritant or allergic inflammation which may include the determination of pro-inflammatory cytokines/chemokines. BAL measurements generally complement the results from histopathology examinations but cannot replace them. Guidance on how to perform lung lavage can be found in GD 39 (2). | GROSS PATHOLOGY AND ORGAN WEIGHTS | 39. | All test animals, including those which die during the test or are removed from the study for animal welfare reasons, should be subjected to complete exsanguination (if feasible) and gross necropsy. The time between the end of each animal’s last exposure and their sacrifice should be recorded. If a necropsy cannot be performed immediately after a dead animal is discovered, the animal should be refrigerated (not frozen) at a temperature low enough to minimise autolysis. Necropsies should be performed as soon as possible, normally within a day or two. All gross pathological changes should be recorded for each animal with particular attention to any changes in the respiratory tract. | 40. | Table 2 lists the organs and tissues that should be preserved in a suitable medium during gross necropsy for histopathological examination. The preservation of the [bracketed] organs and tissues and any other organs and tissues is at the discretion of the study director. The bolded organs should be trimmed and weighed wet as soon as possible after dissection to avoid drying. The thyroid and epididymides should only be weighed if needed because trimming artefacts may hinder histopathological evaluation. Tissues and organs should be fixed in 10 % buffered formalin or another suitable fixative as soon as necropsy is performed, and no less than 24-48 hours prior to trimming depending on the fixative to be used. | Table 2 | Organs and Tissues Preserved During Gross Necropsy | Adrenals | Bone marrow (and/or fresh aspirate) | Brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | [Eyes (retina, optic nerve) and eyelids] | Heart | Kidneys | Larynx (3 levels, 1 level to include the base of the epiglottis) | Liver | Lung (all lobes at one level, including main bronchi) | Lymph nodes from the hilar region of the lung, especially for poorly soluble particulate test chemicals, For more in depth examinations and/or studies with immunological focus, additional lymph nodes may be considered, e.g. those from the mediastinal, cervical/submandibular and/or auricular regions. | Nasopharyngeal tissues (at least 4 levels; 1 level to include the nasopharyngeal duct and the Nasal Associated Lymphoid Tissue(NALT) | Oesophagus | [Olfactory bulb] | Ovaries | Seminal vesicles | Spinal cord (cervical, mid-thoracic, and lumbar) | Spleen | Stomach | Testes | Thymus | Thyroid | Trachea (at least 2 levels including 1 longitudinal section through the carina and 1 transverse section) | [Urinary bladder] | Uterus | All gross lesions | 41. | The lungs should be removed intact, weighed, and instilled with a suitable fixative at a pressure of 20-30 cm of water to ensure that lung structure is maintained (5). Sections should be collected for all lobes at one level, including main bronchi, but if lung lavage is performed, the unlavaged lobe should be sectioned at three levels (not serial sections). | 42. | At least 4 levels of the nasopharyngeal tissues should be examined, one of which should include the nasopharyngeal duct, (5, 6, 7, 8, 9) to allow adequate examination of the squamous, transitional (non-ciliated respiratory), respiratory (ciliated respiratory) and olfactory epithelium, and the draining lymphatic tissue (NALT; 10, 11). Three levels of the larynx should be examined, and one of these levels should include the base of the epiglottis (12). At least two levels of the trachea should be examined including one longitudinal section through the carina of the bifurcation of the extrapulmonary bronchi and one transverse section. | HISTOPATHOLOGY | 43. | A histopathological evaluation of all the organs and tissues listed in Table 2 should be performed for the control and high concentration groups, and for all animals which die or are sacrificed during the study. Particular attention should be paid to the respiratory tract, target organs, and gross lesions. The organs and tissues that have lesions in the high concentration group should be examined in all groups. The study director may choose to perform histopathological evaluations for additional groups to demonstrate a clear concentration response. When a satellite (reversibility) group is used, histopathological evaluation should be performed for all tissues and organs identified as showing effects in the treated groups. If there are excessive early deaths or other problems in the high exposure group that compromise the significance of the data, the next lower concentration should be examined histopathologically. An attempt should be made to correlate gross observations with microscopic findings. | DATA AND REPORTING | Data | 44. | Individual animal data on body weights, food consumption, clinical pathology, gross pathology, organ weights, and histopathology should be provided. Clinical observation data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals used, the number of animals displaying specific signs of toxicity, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons, time of death of individual animals, a description and time course of toxic effects and reversibility, and necropsy findings. All results, quantitative and incidental, should be evaluated by an appropriate statistical method. Any generally accepted statistical method may be used and the statistical methods should be selected during the design of the study. | Test Report | 45. | The test report should include the following information, as appropriate: | | Test animals and husbandry | — | Description of caging conditions, including: number (or change in number) of animals per cage, bedding material, ambient temperature and relative humidity, photoperiod, and identification of diet. | — | Species/strain used and justification for using a species other than the rat. Source and historical data may be provided, if they are from animals exposed under similar exposure, housing, and fasting conditions. | — | Number, age, and sex of animals. | — | Method of randomisation. | — | Description of any pre-test conditioning including diet, quarantine, and treatment for disease. | | Test chemical | — | Physical nature, purity, and, where relevant, physico-chemical properties (including isomerisation). | — | Identification data and Chemical Abstract Services (CAS) Registry Number, if known. | | Vehicle | — | Justification for use of vehicle and justification for choice of vehicle (if other than water). | — | Historical or concurrent data demonstrating that the vehicle does not interfere with the outcome of the study. | | Inhalation chamber | — | Detailed description of the inhalation chamber including volume and a diagram. | — | Source and description of equipment used for the exposure of animals as well as generation of the atmosphere. | — | Equipment for measuring temperature, humidity, particle-size, and actual concentration. | — | Source of air and system used for conditioning. | — | Methods used for calibration of equipment to ensure a homogeneous test atmosphere. | — | Pressure difference (positive or negative). | — | Exposure ports per chamber (nose-only); location of animals in the chamber (whole-body). | — | Stability of the test atmosphere. | — | Location of temperature and humidity sensors and sampling of test atmosphere in the chamber. | — | Treatment of air supplied/extracted. | — | Air flow rates, air flow rate/exposure port (nose-only), or animal load/chamber (whole-body). | — | Time to inhalation chamber equilibrium (t95). | — | Number of volume changes per hour. | — | Metering devices (if applicable). | | Exposure data | — | Rationale for target concentration selection in the main study. | — | Nominal concentrations (total mass of test chemical generated into the inhalation chamber divided by the volume of air passed through the chamber). | — | Actual test chemical concentrations collected from the animals’ breathing zone; for mixtures that produce heterogeneous physical forms (gases, vapours, aerosols), each may be analysed separately. | — | All air concentrations should be reported in units of mass (mg/l mg/m3, etc.) rather than in units of volume (ppm, ppb, etc.). | — | Particle size distribution, mass median aerodynamic diameter (MMAD), and geometric standard deviation (σg), including their methods of calculation. Individual particle size analyses should be reported. | | Test conditions | — | Details of test chemical preparation, including details of any procedures used to reduce the particle size of solids or to prepare solutions of the test chemical. | — | A description (preferably including a diagram) of the equipment used to generate the test atmosphere and to expose the animals to the test atmosphere. | — | Details of the equipment used to monitor chamber temperature, humidity, and chamber airflow (i.e. development of a calibration curve). | — | Details of the equipment used to collect samples for determination of chamber concentration and particle size distribution. | — | Details of the chemical analytical method used and method validation (including efficiency of recovery of test chemical from the sampling medium). | — | Method of randomisation in assigning animals to test and control groups. | — | Details of food and water quality (including diet type/source, water source). | — | The rationale for the selection of test concentrations. | | Results | — | Tabulation of chamber temperature, humidity, and airflow. | — | Tabulation of chamber nominal and actual concentration data. | — | Tabulation of particle size data including analytical sample collection data, particle size distribution, and calculations of the MMAD and σg. | — | Tabulation of response data and concentration level for each animal (i.e. animals showing signs of toxicity including mortality, nature, severity, time of onset, and duration of effects). | — | Tabulation of individual animal weights. | — | Tabulation of food consumption | — | Tabulation of clinical pathology data | — | Necropsy findings and histopathological findings for each animal, if available. | — | Tabulation of any other parameters measured | | Discussion and interpretation of results | — | Particular emphasis should be made to the description of methods used to meet the criteria of this Test Method, e.g. the limit concentration or the particle size. | — | The respirability of particles in light of the overall findings should be addressed, especially if the particle-size criteria could not be met. | — | The consistency of methods used to determine nominal and actual concentrations, and the relation of actual concentration to nominal concentration should be included in the overall assessment of the study. | — | The likely cause of death and predominant mode of action (systemic versus local) should be addressed. | — | An explanation should be provided if there was a need to humanely sacrifice animals in pain or showing signs of severe and enduring distress, based on the criteria in the OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3). | — | The target organ(s) should be identified. | — | The NOAEL and LOAEL should be determined. | LITERATURE: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (4) | Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258. | (6) | Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. | (7) | Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238. | (8) | Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. | (9) | Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. | (10) | Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. | (11) | Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. | (12) | Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428. | (13) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006 (OJ L 353, 31.12.2008, p. 1). | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | ’ |
| 5. | poglavji B.29 in B.30 se nadomestita z naslednjima: | „B.29 SUBKRONIČNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU: 90-DNEVNA ŠTUDIJA | POVZETEK | Ta revidirana preskusna metoda B.29 je bila zasnovana za celovito opredelitev strupenosti preskusne kemikalije pri vdihavanju v subkroničnem obdobju (90 dni) in zagotavljanje podatkov za kvantitativne ocene tveganja pri vdihavanju. Skupine 10 samcev in 10 samic glodavcev se 90 dni (13 tednov) po 6 ur na dan izpostavljajo a) trem ali več različnim koncentracijam preskusne kemikalije, b) filtriranemu zraku (negativna kontrola) in/ali c) nosilcu (kontrola z nosilcem). Navadno se živali izpostavljajo 5 dni na teden, dovoljeno pa je tudi izpostavljanje 7 dni na teden. Vedno se preskušajo samci in samice, vendar se lahko izpostavljajo različnim koncentracijam, če je znano, da je en spol občutljivejši za določeno preskusno kemikalijo. Ta metoda vodji študije omogoča prožnost za vključitev satelitskih skupin (skupin za reverzibilnost), vmesnih žrtvovanj, bronhoalveolarne lavaže (BAL), nevroloških preskusov ter dodatnih kliničnih patoloških in histopatoloških ocen, da se bolje opredeli strupenost preskusne kemikalije. | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 413 (2009). Prvotna smernica za preskušanje 413 v zvezi s subkronično strupenostjo pri vdihavanju (TG 413) je bila sprejeta leta 1981 (1). Ta preskusna metoda B.29 (ki ustreza revidirani TG 413 (2009)) je bila posodobljena, da upošteva trenutno stanje v znanosti ter izpolnjuje sedanje in prihodnje zakonodajne potrebe. | 2. | Študije subkronične strupenosti pri vdihavanju se uporabljajo predvsem za določanje zakonsko predpisanih koncentracij za ocenjevanje tveganj za delavce v delovnem okolju. Uporabljajo se tudi za ocenjevanje tveganj za ljudi v njihovem bivalnem okolju in med prevozom ter okoljskih tveganj. Ta metoda omogoča opredelitev škodljivih učinkov po ponavljajoči se dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji z vdihavanjem, pri čemer preskušanje traja 90 dni (približno 10 % življenjske dobe podgane). Podatki, pridobljeni s študijami subkronične strupenosti pri vdihavanju se lahko uporabijo za kvantitativne ocene tveganja in izbiro koncentracij za študije kronične strupenosti. Ta preskusna metoda ni posebej namenjena preskušanju nanomaterialov. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami (GD) št. 39 (2). | ZAČETNI PREUDARKI | 3. | Da se poveča kakovost študije in kar najbolj zmanjša uporaba živali, mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji. Informacije, ki pomagajo pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij, lahko vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajočo se izpostavljenostjo. Če se med študijo pričakuje ali opazi nevrotoksičnost, se lahko vodja študije odloči vključiti ustrezne ocene, kot sta sklop funkcionalnih opazovanj (FOB) in merjenje motorične aktivnosti. Čeprav je lahko čas izpostavitve odločilen za posebne preglede, izvajanje teh dodatnih dejavnosti ne sme posegati v osnovno zasnovo študije. | 4. | Razredčine jedkih ali dražilnih preskusnih kemikalij se lahko preskušajo pri koncentracijah, ki bodo zagotovile želeno stopnjo strupenosti. Več informacij je na voljo v GD 39 (2). Pri izpostavljanju živali tem snovem morajo biti ciljne koncentracije dovolj nizke, da ne povzročijo očitnih bolečin in trpljenja, vendar zadostne za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, ki izpolnjuje zakonodajni in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je treba izbrati za vsak primer posebej, po možnosti na podlagi ustrezno zasnovane študije za ugotavljanje območja, s katero se pridobijo informacije o kritičnih končnih točkah, morebitnem pragu draženja in času nastopa (glej odstavke 11–13). Izbrane koncentracije je treba utemeljiti. | 5. | Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo bolečine ali kažejo znake hudega in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti. Umirajoče živali se upoštevajo enako kot tiste, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami OECD o humanih končnih točkah (3). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 6. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle glodavce običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih vrst je treba utemeljiti. | Priprava živali | 7. | Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan randomizacije morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 7 do 9 tednov. Njihova telesna teža ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže za vsak spol. Živali se naključno izberejo, označijo za posamično prepoznavanje in so pred začetkom preskusa najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. | Oskrba živali | 8. | Živali je treba posamično identificirati, po možnosti s podkožnimi transponderji, da se olajšajo opazovanja in prepreči zmeda. Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogoče, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posamično, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja običajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena količina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe/12 ur teme. | Inhalacijske komore | 9. | Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemikalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot način izpostavljenosti uporabi izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smrčka). Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije tekočih ali trdnih aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogoče je, da bo posebne cilje študije lažje doseči z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpostavljenost celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in pomanjkljivosti so obravnavani v GD 39 (2). | ŠTUDIJE STRUPENOSTI | Mejne koncentracije | 10. | V nasprotju s študijami akutne strupenosti, za študije subkronične strupenosti pri vdihavanju ni opredeljenih mejnih koncentracij. Pri določanju najvišje koncentracije, ki bo preskušena, je treba upoštevati: 1. najvišjo dosegljivo koncentracijo, 2. stopnjo izpostavljenosti ljudi ‚v najslabšem primeru‘, 3. dobrobitjo živali. Če ni mej, ki temeljijo na podatkih, se lahko uporabijo meje za akutno strupenost iz Uredbe (ES) št. 1272/2008 (13) (tj. do najvišje koncentracije 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za hlape in 20 000 ppm za pline) (glej GD 39 (2)). Če je treba pri preskušanju plinov ali lahko hlapnih preskusnih kemikalij (npr. hladil) te meje preseči, je to treba utemeljiti. Mejna koncentracija mora povzročiti nedvomno strupenost, ne da bi živalim povzročila nepotrebni stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3). | Študija za ugotavljanje območja | 11. | Pred začetkom glavne študije je navadno treba opraviti študijo za ugotavljanje območja. Ta je obsežnejša od opazovalne študije, saj ni omejena z izbiro koncentracij. Spoznanja, pridobljena v njej, lahko zagotovijo uspešnost glavne študije. S študijo za ugotavljanje območja se lahko na primer zagotovijo tehnične informacije o analitskih metodah, določanju velikosti delcev in odkrivanju mehanizmov strupenosti, klinični patološki in histopatološki podatki ter ocene, kolikšne so lahko koncentracije NOAEL in MTC v glavni študiji. Vodja študije se lahko študijo za ugotavljanje območja odloči uporabiti za določitev pragu draženja dihal (npr. s histopatološko preiskavo dihal, preskusom pljučne funkcije ali bronhoalveolarno lavažo), zgornje koncentracije, ki jo živali prenesejo brez nepotrebnega stresa, in parametrov, s katerimi bo mogoče najbolje opredeliti strupenost preskusne kemikalije. | 12. | Študija za ugotavljanje območja lahko zajema eno ali več koncentracij. Glede na izbrane končne točke je treba vsaki koncentraciji izpostaviti tri do šest samcev in tri do šest samic. Študija za ugotavljanje območja mora trajati vsaj 5 dni in navadno največ 28 dni. V poročilu o študiji je treba utemeljiti izbrane koncentracije za glavno študijo. Cilj glavne študije je dokazati razmerje koncentracija-odziv na podlagi pričakovanja o tem, katera bo najobčutljivejša končna točka. Nizka koncentracija mora biti po možnosti koncentracija brez opaznih škodljivih učinkov, medtem ko mora visoka koncentracija povzročiti nedvomno strupenost, ne da bi živalim povzročila nepotrebni stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3). | 13. | Pri izbiri koncentracij za študijo za ugotavljanje območja je treba upoštevati vse razpoložljive informacije, vključno z razmerji struktura-aktivnost in podatki o podobnih kemikalijah (glej odstavek 3). S študijo za ugotavljanje območja se lahko potrdijo/zavrnejo pričakovanja o najobčutljivejših končnih točkah po mehanističnih merilih, npr. o inhibiciji holinesteraze z organofosfati, nastajanju methemoglobina zaradi eritrocitotoksičnih snovi, ščitničnih hormonih (T3, T4) v primeru tirotoksičnih snovi ter o beljakovinah, LDH ali nevtrofilcih pri bronhoalveolarni lavaži v primeru neškodljivih slabo topnih delcev ali aerosolov, ki dražijo pljuča. | Glavna študija | 14. | Glavna študija subkronične strupenosti običajno zajema tri različne koncentracije ter po potrebi tudi sočasno negativno kontrolo (z zrakom) in/ali kontrolo z nosilcem (glej odstavek 18). Pri izbiri primernih stopenj izpostavljenosti si je treba pomagati z vsemi razpoložljivimi podatki, vključno z rezultati študij sistemske strupenosti, presnovo in kinetiko (poseben poudarek je treba nameniti izogibanju visokim koncentracijam, ki nasitijo kinetične procese). Vsaka preskusna skupina vsebuje 10 samcev in 10 samic glodavcev, ki se 13 tednov (skupno študija traja vsaj 90 dni) po 5 dni na teden 6 ur na dan izpostavljajo preskusni kemikaliji. Živali se lahko izpostavljajo tudi 7 dni na teden (npr. pri preskušanju farmacevtskih izdelkov, ki se vdihavajo). Če je znano, da je en spol občutljivejši na določeno preskusno kemikalijo, se lahko spola izpostavljata različnim koncentracijam, da se zagotovi optimalen odziv na koncentracijo, kot je opisano v odstavku 15. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Kadar se uporabi obdobje izpostavljenosti, krajše od 6 ur/dan, ali kadar je treba opraviti študijo izpostavljenosti celega telesa z dolgimi obdobji (npr. 22 ur/dan), je treba to utemeljiti (glej GD 39 (2)). V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano, razen če je to obdobje daljše od 6 ur. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko živali ves čas uživajo vodo. | 15. | Z izbranimi ciljnimi koncentracijami je treba opredeliti ciljne organe in prikazati jasen odziv na koncentracijo: | — | visoka koncentracija mora imeti strupene učinke, vendar ne sme povzročiti dolgotrajnih znakov ali smrtnosti, ki bi preprečili smiselno oceno, | — | vmesne koncentracije morajo biti razporejene tako, da se doseže stopnjevanje med strupenimi učinki nizke in visoke koncentracije, | — | nizka koncentracija mora povzročiti šibke znake strupenosti oziroma takih znakov ne sme povzročiti. | Vmesna žrtvovanja | 16. | Če se načrtujejo vmesna žrtvovanja, je treba število živali pri vsaki stopnji izpostavljenosti povečati za toliko, kolikor se jih namerava žrtvovati pred zaključkom študije. Uporabo vmesnih žrtvovanj je treba utemeljiti in žrtvovane živali ustrezno upoštevati v statističnih analizah. | Satelitska študija (študija reverzibilnosti) | 17. | Satelitska študija (študija reverzibilnosti) se lahko uporabi za opazovanje reverzibilnosti, obstojnosti ali zapoznelega nastopa zastrupitve v ustrezno dolgem obdobju po tretiranju, ki pa ne sme bili krajše od 14 dni. Satelitske skupine (skupine za reverzibilnost) so sestavljene iz 10 samcev in 10 samic, ki se izpostavijo sočasno s preskusnimi živalmi v glavni študiji. Skupine za satelitsko študijo (študijo reverzibilnosti) je treba preskusni kemikaliji izpostaviti pri najvišji koncentraciji, pri čemer se po potrebi uporabi sočasna kontrola z zrakom in/ali kontrola z nosilcem (glej odstavek 18). | Kontrolne živali | 18. | Z živalmi za sočasno negativno kontrolo (z zrakom) je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da se namesto preskusni kemikaliji izpostavijo filtriranemu zraku. Kadar se za pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporabi voda ali druga snov, je treba v študijo namesto negativne kontrolne skupine (z zrakom) vključiti kontrolno skupino z nosilcem. Če je le mogoče, je treba kot nosilec uporabiti vodo. Kadar se kot nosilec uporabi voda, morajo biti kontrolne živali izpostavljene zraku z enako relativno vlažnostjo kot pri preskusnih skupinah. Izbira ustreznega nosilca mora temeljiti na primerno izvedeni predhodni študiji ali preteklih podatkih. Če o strupenosti nosilca ni veliko znanega, se lahko vodja študije odloči uporabiti negativno kontrolo (z zrakom) in kontrolo z nosilcem, vendar se to močno odsvetuje. Kadar pretekli podatki razkrijejo, da nosilec ni strupen, negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna in je treba uporabiti samo kontrolo z nosilcem. Če predhodna študija preskusne kemikalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec ni strupen pri preskušeni koncentraciji, tako da je treba uporabiti to kontrolo z nosilcem. | POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI | Dajanje koncentracij | 19. | Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbranih koncentracij in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetnejša med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemično reaktivne preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozračju. Paziti je treba, da se ne ustvarijo eksplozivne koncentracije. Za snovi, ki jih tvorijo delci, se lahko zaradi zmanjšanja velikosti delcev uporabijo mehanski postopki. Več napotkov je na voljo v GD 39 (2). | Porazdelitev velikosti delcev | 20. | Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba določiti velikost delcev. Da se omogoči izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, so priporočeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) znaša 1–3 μm z geometričnim standardnim odklonom (σg) 1,5–3,0 (4). Prizadevanje za izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogoče izpolniti, je treba zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci in vlakna pa lahko presegajo navedene vrednosti. | Priprava preskusne kemikalije v nosilcu | 21. | Preskusno kemikalijo je treba po možnosti preskušati brez nosilca. Če je uporaba nosilca nujna za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije, je treba prednostno uporabiti vodo. Vedno, kadar se preskusna kemikalija raztopi v nosilcu, je treba dokazati njeno stabilnost. | SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI | Pretok zraka v komori | 22. | Pretok zraka skozi komoro za izpostavljanje je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Sprotno spremljanje koncentracije (ali časovne stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je neločljivo povezana z vsemi dinamičnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri vdihavanja. Če se koncentracija spremlja sproti, se lahko pogostnost merjenja pretoka zraka zmanjša na eno meritev na izpostavljenost na dan. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja. Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstaja razlog za domnevo, da tega standarda ni mogoče izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. Če meritve prvi dan izpostavljenosti pokažejo, da sta ravni teh plinov ustrezni, nadaljnje merjenje ni potrebno. | Temperatura in relativna vlažnost v komori | 23. | Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti celega telesa stalno spremljati ter jo med vsako izpostavljenostjo vsako uro zabeležiti, kadar je to mogoče. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi neizmerljivo zaradi interference preskusne kemikalije s preskusno metodo. | Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija | 24. | Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izračunati in zabeležiti nazivno koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem inhalacijske komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pač pa pri primerjavi z dejansko koncentracijo nakaže, kako učinkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri ustvarjanju. | Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija | 25. | Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije, vzorčena v območju dihanja živali v inhalacijski komori. Dejanske koncentracije se merijo s specifičnimi metodami (npr. z neposrednim vzorčenjem, adsorpcijskimi ali kemičnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifičnimi metodami, kot je gravimetrična analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetrične analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole tekočin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifičnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetrično analizo se lahko določi tudi koncentracija večkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. | 26. | Po možnosti je treba v celotni študiji uporabljati eno serijo preskusne kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred začetkom študije je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vključno z njeno čistostjo ter, če je to tehnično izvedljivo, identiteto in količinami ugotovljenih kontaminantov in nečistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj v omejenem obsegu potrdi naročnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). | 27. | Atmosfera v komori za izpostavljanje mora biti konstantna, kolikor je to izvedljivo. Za dokazovanje stabilnosti pogojev izpostavljenosti se lahko uporabi naprava za sprotno spremljanje, kot je aerosolni fotometer za aerosole ali analizator skupnih ogljikovodikov za hlape. Dejansko koncentracijo v komori je treba izmeriti najmanj trikrat vsak dan izpostavljenosti za vsako stopnjo izpostavljenosti. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, zadostuje, da se v vsakem obdobju izpostavljenosti vzame le en vzorec. V tem primeru se vzorec po možnosti zbira prek celotnega obdobja izpostavljenosti. Posamezni vzorci koncentracije v komori lahko od srednje koncentracije v komori odstopajo za največ ± 10 % za pline in hlape oziroma za največ ± 20 % za tekoče ali trdne aerosole. Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori (t95). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije. Pri tem sta upoštevana čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v komori (t95), in čas padanja. Napotki za ocenjevanje t95 so na voljo v GD 39 (2). | 28. | Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov (npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša drugače. Zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), po navadi glavno aktivno sestavino v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno sestavino ali indikatorsko snov (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (2). | Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev | 29. | Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba določiti najmanj vsak teden za vsako koncentracijo s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instrumentom, kot je aerodinamični merilnik delcev (APS). Če je mogoče prikazati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. | 30. | Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetrični filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost pri vseh preskušenih koncentracijah mogoče prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se kar najbolj zmanjša količina pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba študijo ponoviti. | 31. | Velikost delcev za hlape je treba določiti, če je mogoče, da se bodo hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogoče mešane faze, zaznajo delci. | OPAZOVANJA | 32. | Živali je treba klinično opazovati pred obdobjem izpostavljenosti ter med njim in po njem. Pogostejša opazovanja so lahko indicirana glede na odziv živali med izpostavljenostjo. Kadar opazovanje živali ovirajo uporaba zadrževalnih cevi za živali, slabo osvetljene komore za izpostavljanje celega telesa ali motne atmosfere, je treba živali pozorno opazovati po izpostavljenosti. Z opazovanji živali, preden so te izpostavljene naslednjega dne, je mogoče oceniti reverzibilnost ali okrepitev strupenih učinkov. | 33. | Vsa opažanja se sistematično zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za vsako žival posebej. Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti navesti čim natančneje. | 34. | Opazovanja v kletkah morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, v dihalih, obtočilih in živčevju ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Pozorno je treba opazovati tremorje, krče, slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. V protokol študije se lahko vključijo dodatne ocene, kot so kinetika, biomonitoring, pljučna funkcija, zadrževanje slabo topnih snovi, ki se kopičijo v pljučnem tkivu, in vedenjske spremembe. | TELESNA TEŽA | 35. | Težo posameznih živali je treba zabeležiti malo pred prvo izpostavljenostjo (dan 0), zatem pa dvakrat na teden (na primer ob petkih in ponedeljkih, da se prikaže okrevanje čez konec tedna, ko se živali ne izpostavljajo, ali na podlagi časovnega intervala, da se omogoči ocena sistemske strupenosti) ter ob poginu ali evtanaziji. Če v prvih 4 tednih ni učinkov, se lahko do konca študije telesna teža meri tedensko. Živali v satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), če se uporabljajo, je treba tedensko tehtati prek celotnega obdobja okrevanja. Ob koncu študije je treba malo pred žrtvovanjem vse živali stehtati, da se omogoči nepristranski izračun razmerij med težo organov in telesno težo. | PORABA HRANE IN VODE | 36. | Porabo hrane je treba meriti tedensko. Meri se lahko tudi poraba vode. | KLINIČNA PATOLOGIJA | 37. | Klinične patološke ocene je treba opraviti za vse živali, vključno s tistimi v kontrolnih skupinah in satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), ko se žrtvujejo. Navesti je treba časovni interval med koncem izpostavljenosti in jemanjem krvi, zlasti kadar se obravnavana končna točka hitro vrne v prvotno stanje. Vzorčenje po koncu izpostavljenosti je indicirano za tiste parametre, ki imajo kratko plazemsko razpolovno dobo (npr. COHb, CHE in MetHb). | 38. | V preglednici 1 so našteti klinični patološki parametri, ki se navadno zahtevajo za vse toksikološke študije. Analiza urina se ne zahteva redno, vendar se lahko opravi, kadar se zdi koristna na podlagi pričakovane ali opažene strupenosti. Vodja študije se lahko za boljšo opredelitev strupenosti preskusne kemikalije odloči oceniti dodatne parametre (npr. holinesterazo, lipide, hormone, kislinsko-bazno ravnovesje, methemoglobin ali Heinzeva telesca, kreatin-kinazo, razmerje med mieloidnimi in eritroidnimi celicami, troponine, pline v arterijski krvi, laktat-dehidrogenazo, sorbital-dehidrogenazo ter γ-glutamiltranspeptidazo). | Preglednica 1 | Standardni klinični patološki parametri | Hematologija | število eritrocitov | hematokrit | koncentracija hemoglobina | povprečna količina hemoglobina v eritrocitih | povprečni volumen eritrocitov | povprečna koncentracija hemoglobina v eritrocitih | retikulociti | skupno število levkocitov | diferencialno število levkocitov | število trombocitov | zmožnost koagulacije (izberite eno): | — | protrombinski čas | — | čas koagulacije | — | parcialni tromboplastinski čas | Klinična kemija | glukoza (9) | skupni holesterol | trigliceridi | sečninski dušik v krvi | skupni bilirubin | kreatinin | skupne beljakovine | albumin | globulin | alanin-aminotransferaza | aspartat-aminotransferaza | alkalna fosfataza | kalij | natrij | kalcij | fosfor | klorid | Analiza urina (ni obvezno) | videz (barva in motnost) | količina | specifična teža ali osmolalnost | pH | skupne beljakovine | glukoza | kri/krvne celice | 39. | Kadar obstajajo dokazi, da je spodnji del dihalnih poti (tj. alveole) primarno mesto odlaganja in retencije, je lahko bronhoalveolarna lavaža (BAL) najprimernejša tehnika za kvantitativno analizo na hipotezi temelječih parametrov razmerij med odmerkom in učinkom s poudarkom na alveolitisu, vnetju pljuč in fosfolipidozi. Tako je mogoče ustrezno preiskati spremembe v odzivu na odmerek in časovnem poteku alveolarne okvare. Bronhoalveolarni izpirek se lahko uporabi za analizo skupnega in diferencialnega števila levkocitov, skupnih beljakovin ter laktat-dehidrogenaze. Drugi parametri, ki se lahko obravnavajo, so tisti, ki nakazujejo lizosomske poškodbe, fosfolipidozo, fibrozo in dražilno ali alergijsko vnetje – pri slednjem se lahko vključi določitev vnetnih citokinov/kemokinov. Meritve BAL navadno dopolnjujejo rezultate histopatoloških preiskav, ne morejo pa jih nadomestiti. Napotki o tem, kako opraviti lavažo pljuč, so na voljo v GD 39 (2). | OFTALMOLOŠKE PREISKAVE | 40. | Z oftalmoskopom ali enakovredno napravo je treba opraviti oftalmološke preiskave očesnega ozadja, optičnih medijev, šarenice in veznice, in sicer pred dajanjem preskusne kemikalije na vseh živalih ter ob prenehanju tretiranja na vseh skupinah, tretiranih z visoko koncentracijo, in kontrolnih skupinah. Če se v očeh zaznajo spremembe, je treba pregledati tudi vse živali iz drugih skupin, vključno s satelitsko skupino (skupino za reverzibilnost). | MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA IN TEŽA ORGANOV | 41. | Vse preskusne živali, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba popolnoma eksangvinirati (če je to izvedljivo) in na njih opraviti makroskopsko obdukcijo. Navesti je treba čas med koncem zadnje izpostavljenosti vsake živali in njenim žrtvovanjem. Če obdukcije ni mogoče opraviti nemudoma po odkritju poginule živali, jo je treba ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza kar najbolj zmanjša. Obdukcije je treba opraviti takoj, ko je mogoče, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. | 42. | V preglednici 2 so našteti organi in tkiva, ki jih je treba med makroskopsko obdukcijo shraniti v ustreznem mediju za histopatološke preiskave. O shranjevanju organov in tkiv [v oglatih oklepajih] ter vseh drugih organov in tkiv odloča vodja študije. Z organov v krepki pisavi je treba odstraniti priraščena tkiva in navedene organe stehtati čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. Ščitnico in nadmodek je treba stehtati samo, če je to potrebno, ker lahko ostanki obrezovanja ogrozijo histopatološko oceno. Tkiva in organe je treba takoj po obdukciji in najmanj 24–48 ur (odvisno od uporabljenega fiksativa) pred obrezovanjem fiksirati v 10-odstotnem puferiranem formalinu ali drugem ustreznem fiksativu. | Preglednica 2 | Organi in tkiva, ki se shranijo med makroskopsko obdukcijo | nadledvične žleze | aorta | kostni mozeg (in/ali svež punktat) | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | slepo črevo | debelo črevo | dvanajsternik | [nadmodek] | [oči (mrežnica, vidni živec) in veke] | stegnenica in kolenski sklep | žolčnik (če je) | [Harderjeve žleze] | srce | vito črevo | tešče črevo | ledvice | [solzne žleze (zunaj očesne votline)] | grlo (3 ravni, vključno s spodnjim delom poklopca) | jetra | pljuča (vsi režnji na eni ravni, vključno z glavnima sapnicama) | Hilusne bezgavke, zlasti za slabo topne preskusne kemikalije, ki jih tvorijo delci. Za bolj poglobljene preiskave in/ali študije z imunološkim poudarkom se lahko razmisli o dodatnih bezgavkah, npr. iz medpljučnega, vratnega/podčeljustnega in/ali ušesnega predela. | bezgavke (oddaljene od vstopnega mesta) | mlečna žleza (samičina) | mišica (stegenska) | nazofaringealna tkiva (vsaj 4 ravni, 1 raven naj vključuje nazofaringealni vod in z nosom povezano limfatično tkivo (NALT)) | požiralnik | [vohalni betič] | jajčniki | trebušna slinavka | obščitnice | periferni živec (ishiadični ali tibialni, po možnosti v bližini mišice) | hipofiza | prostata | rektum | žleze slinavke | semenski mešički | koža | hrbtenjača (vratni, prsni in ledveni del) | vranica | prsnica | želodec | zobje | moda | priželjc | ščitnica | [jezik] | sapnik (vsaj 2 ravni, ki vključujeta 1 vzdolžni prerez skozi karino in 1 prečni prerez) | [sečevod] | [sečnica] | sečni mehur | maternica | ciljni organi | vse vidne lezije in skupki tkiv | 43. | Pljuča je treba odstraniti nepoškodovana, jih stehtati in napolniti z ustreznim fiksativom pri tlaku 20–30 cm vode, da se ohrani njihova struktura (5). Rezine je treba zbrati za vse režnje na eni ravni, vključno z glavnima sapnicama, če pa se opravi lavaža pljuč, je treba iz neizpranega režnja vzeti rezine na treh ravneh (ki niso zaporedne). | 44. | Pregledati je treba najmanj 4 ravni nazofaringealnih tkiv, od katerih mora ena vključevati nazofaringealni vod (5) (6) (7) (8) (9), da se omogoči ustrezna preiskava ploščatega, prehodnega (neciliarnega respiratornega), respiratornega (ciliarnega respiratornega) in vohalnega epitelija, ter drenažno limfatično tkivo (NALT) (10) (11). Preiskati je treba tri ravni grla, od katerih mora ena vključevati spodnji del poklopca (12). Pregledati je treba vsaj dve ravni sapnika, kar vključuje en vzdolžni prerez skozi karino razcepišča glavnih sapnic in en prečni prerez. | HISTOPATOLOGIJA | 45. | Histopatološko oceno vseh organov in tkiv iz preglednice 2 je treba opraviti pri kontrolni skupini in skupini, tretirani z visoko koncentracijo, ter pri vseh živalih, ki poginejo ali so žrtvovane med študijo. Posebno pozornost je treba nameniti dihalom, ciljnim organom in vidnim lezijam. Organe in tkiva, ki imajo lezije v skupini, tretirani z visoko koncentracijo, je treba pregledati v vseh skupinah. Vodja študije se lahko odloči izvesti histopatološke ocene za dodatne skupine, da se prikaže jasen odziv na koncentracijo. Če se uporablja satelitska skupina (skupina za reverzibilnost), je treba opraviti histopatološko oceno za vsa tkiva in organe, na katerih so bili opaženi učinki v tretiranih skupinah. Če se v skupini, izpostavljeni visoki koncentraciji, pojavijo čezmerno število zgodnjih smrti ali druge težave, ki ogrožajo pomen podatkov, je treba skupino, tretirano z najbližjo nižjo koncentracijo, histopatološko pregledati. Makroskopska opažanja in mikroskopske ugotovitve je treba poskusiti povezati. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 46. | Za posamezne živali je treba navesti podatke o telesni teži, porabi hrane, klinični patologiji, makroskopski patologiji, teži organov in histopatologiji. Podatke o kliničnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifične znake zastrupitve, število živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije. Vse rezultate, kvantitativne in naključne, je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabi se lahko katera koli splošno priznana statistična metoda, izbrati pa jo je treba med zasnovo študije. | Poročilo o preskusu | 47. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno: | | Preskusne živali in oskrba | — | opis pogojev v kletkah, vključno s številom (ali spremembo števila) živali na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana. Podatki o izvoru in preteklosti se lahko navedejo, če se nanašajo na živali, za katere so bili uporabljeni podobni pogoji izpostavljenosti, nastanitveni pogoji in pogoji postenja, | — | število, starost in spol živali, | — | metodo randomizacije, | — | opis morebitne priprave živali pred preskusom, vključno s hrano, karanteno in zdravljenjem. | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo), | — | identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), če je znana. | | Nosilec | — | utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda), | — | pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na rezultat študije. | | Inhalacijska komora | — | podroben opis inhalacijske komore, vključno s prostornino in diagramom, | — | izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje atmosfere, | — | opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske koncentracije, | — | vir zraka in uporabljeni sistem za klimatiziranje, | — | metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene preskusne atmosfere, | — | razliko v tlaku (pozitivno ali negativno), | — | izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v komori (izpostavljanje celega telesa), | — | stabilnost preskusne atmosfere, | — | položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzorčenja preskusne atmosfere v komori, | — | obdelavo dovajanega/odvajanega zraka, | — | stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino (izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega telesa), | — | čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t95), | — | število zamenjav volumnov zraka na uro, | — | merilne naprave (če se uporabljajo). | | Podatki o izpostavljenosti | — | utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, | — | nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), | — | dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v območju dihanja živali; za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira ločeno, | — | vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (mg/l, mg/m3 itd.), in ne v prostorninskih enotah (ppm, ppb itd.), | — | porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) in geometrični standardni odklon (σg), vključno z metodami za njihov izračun. Poročati je treba o posameznih analizah velikosti delcev. | | Preskusni pogoji | — | podatke o pripravi preskusne kemikalije, vključno s podrobnostmi o postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije, | — | opis (ki po možnosti vključuje diagram) opreme, uporabljene za ustvarjanje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, | — | podatke o opremi, uporabljeni za spremljanje temperature, vlažnosti in pretoka zraka v komori (tj. pripravo umeritvene krivulje), | — | podatke o opremi, uporabljeni za jemanje vzorcev za določanje koncentracije in porazdelitve velikosti delcev v komori, | — | podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji (vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzorčenje), | — | metodo randomizacije pri dodeljevanju živali preskusnim in kontrolnim skupinam, | — | podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom hrane in virom vode), | — | utemeljitev določitve preskusnih koncentracij. | | Rezultati | — | preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, | — | preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, | — | preglednice s podatki o velikosti delcev, vključno s podatki o analitskem vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izračuni MMAD in σg, | — | preglednice s podatki o odzivu in koncentracijo za vsako žival (tj. za živali, ki kažejo znake zastrupitve, vključno s smrtnostjo ter naravo, resnostjo, časom nastopa in trajanjem učinkov), | — | preglednice o teži posameznih živali, | — | preglednice o porabi hrane, | — | preglednice s kliničnimi patološkimi podatki, | — | ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, če so na voljo. | | Razprava in razlaga rezultatov | — | poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpolnitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, | — | z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogoče izpolniti, | — | v splošno oceno študije je treba vključiti doslednost metod, uporabljenih za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, | — | obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujoči način delovanja (sistemski ali lokalni), | — | če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o humanih končnih točkah (3) humano žrtvovati živali, ki so trpele bolečine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, | — | opredeliti je treba ciljne organe, | — | določiti je treba vrednosti NOAEL in LOAEL. | VIRI: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. | (4) | Whalan, J. E. in Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (poglavje 9). V: Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H. P. in Brain, J. D. (ur.), Springer Verlag Heidelberg, str. 229–258. | (6) | Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312. | (7) | Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231–238. | (8) | Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. V: Waalkes, M. P. in Ward, J. M. (ur.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263. | (9) | Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372. | (10) | Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224. | (11) | Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285. | (12) | Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419–428. | (13) | Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spremembi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | B.30 ŠTUDIJE KRONIČNE STRUPENOSTI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 452 (2009). Prvotna TG 452 je bila sprejeta leta 1981. Priprava te revidirane preskusne metode B.30 je bila ocenjena kot nujna zaradi upoštevanja nedavnega razvoja na področju dobrobiti živali in zakonodajnih zahtev (1) (2) (3) (4). Ta preskusna metoda B.30 je bila posodobljena vzporedno z revizijama poglavja B.32 te priloge z naslovom ‚Študije rakotvornosti‘ in poglavja B.33 te priloge z naslovom ‚Kombinirane študije kronične strupenosti/rakotvornosti‘, da bi se z uporabo živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo več podatkov o izbiri odmerkov. Ta preskusna metoda je zasnovana za preskušanje zelo različnih kemikalij, vključno s pesticidi in industrijskimi kemikalijami. | 2. | Večina študij kronične strupenosti se opravi na glodavcih, zato je ta preskusna metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso glodavci, se lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo načela in postopki, opisani v tej metodi, ter načela in postopki iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodavcih‘ (5), kot je navedeno v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (6). | 3. | Glavni trije načini dajanja, ki se uporabljajo v študijah kronične strupenosti, so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira načina dajanja je odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prevladujočega načina izpostavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri načina izpostavljenosti so na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 (6). | 4. | Ta preskusna metoda je osredotočena na oralno izpostavljenost, ki se v študijah kronične strupenosti uporablja najpogosteje. Dolgoročne študije kronične strupenosti, ki vključujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavljenost, so lahko prav tako potrebne za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena načina izpostavljenosti tehnično precej zapletena. Take študije je treba zasnovati za vsak primer posebej, je pa mogoče preskusno metodo za ocenjevanje in vrednotenje kronične strupenosti z oralnim načinom dajanja, opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo za protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporočila glede obdobij tretiranja, kliničnih in patoloških parametrov itd. Za inhalacijski (6) (7) in dermalni način dajanja (6) preskusnih kemikalij so na voljo napotki OECD. Pri zasnovi dolgoročnejših študij z inhalacijsko izpostavljenostjo je treba podrobno preučiti predvsem poglavji B.8 (8) in B.29 te priloge (9) ter Dokument s smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdihavanju (7). V primeru preskušanja z dermalnim načinom dajanja je treba upoštevati poglavje B.9 te priloge (10). | 5. | S študijo kronične strupenosti se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki se lahko pojavijo ob ponavljajoči se izpostavljenosti prek znatnega dela življenjske dobe uporabljene vrste. Z njo se pridobijo informacije o strupenih učinkih preskusne kemikalije ter nakažejo ciljni organi in možnost kopičenja. Poleg tega se lahko s študijo oceni vrednost brez opaženega škodljivega učinka, ki se lahko uporabi za določitev varnostnih meril za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi potreba po skrbnem kliničnem opazovanju živali, da se pridobi kar največ informacij. | 6. | Cilji študij, na katere se nanaša ta preskusna metoda, vključujejo: | — | opredelitev kronične strupenosti preskusne kemikalije, | — | opredelitev ciljnih organov, | — | opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom, | — | opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega učinka (NOAEL) ali izhodiščne točke za določitev primerjalnega odmerka (benchmark dose – BMD), | — | napoved učinkov kronične strupenosti pri stopnjah izpostavljenosti ljudi, | — | zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede načina delovanja (6). | ZAČETNI PREUDARKI | 7. | Pri ocenjevanju in vrednotenju toksikoloških lastnosti preskusne kemikalije mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, da se zasnova študije osredotoči na učinkovitejše preskušanje potenciala kronične strupenosti in da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; vse informacije o načinu delovanja; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh; razpoložljive toksikokinetične podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem odmerku in tudi pri ponavljajočih se odmerkih, če so na voljo) ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajočo se izpostavljenostjo. Kronično strupenost je treba ugotavljati šele po pridobitvi začetnih informacij o strupenosti na podlagi 28- in/ali 90-dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajočimi se odmerki. V okviru splošne ocene potencialnih škodljivih učinkov določene preskusne kemikalije na zdravje je treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju kronične strupenosti (11) (12) (13) (14). | 8. | Pred začetkom študije je treba določiti najprimernejše statistične metode za analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, ki jih je treba preučiti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vključevati prilagoditev glede na preživetje in analizo v primeru predčasnega prenehanja tretiranja ene ali več skupin. Napotki o primernih statističnih analizah in ključne reference mednarodno priznanih statističnih metod so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6) ter v Dokumentu s smernicami št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (15). | 9. | Pri izvajanju študije kronične strupenosti je treba vedno upoštevati vodilna načela in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o prepoznavanju, ocenjevanju in uporabi kliničnih znakov kot humanih končnih točk za preskusne živali pri oceni varnosti (16), zlasti odstavek 62 navedenega dokumenta. V tem odstavku je navedeno: ‚Pri študijah, ki vključujejo ponavljajoče se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odločitev, ali naj se žival humano usmrti ali ne, če kaže klinične znake, ki se stopnjujejo in vodijo v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odločitev mora vključevati razmislek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranitvijo zadevne živali v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme odločitev, da se žival ohrani v preskusu, je treba po potrebi povečati pogostnost opazovanj. Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa začasno prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bolečine ali trpljenje, ali da se zmanjša preskusni odmerek.‘ | 10. | Podrobni napotki in razprava o načelih izbire odmerkov za študije kronične strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (17) (18). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glavnega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni ter opredeljevanjem učinkov majhnih odmerkov in njihovim pomenom na drugi strani. To je zlasti pomembno, kadar bo izvedena kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) (odstavek 11). | 11. | Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto ločene izvedbe študije kronične strupenosti (ta preskusna metoda B.30) in študije rakotvornosti (poglavje B.32 te priloge) izvede kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge). S kombiniranim preskusom se v primerjavi z izvedbo dveh ločenih študij zagotovi večja učinkovitost v smislu časa in stroškov, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost podatkov v fazi v zvezi s kronično strupenostjo ali v fazi v zvezi z rakotvornostjo. Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) skrbno upoštevati načela izbire odmerkov (odstavki 9 in 20–25), poleg tega pa se tudi priznava, da se na podlagi nekaterih zakonodajnih okvirov lahko zahteva ločena izvedba študij. | 12. | Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). | NAČELO PRESKUSA | 13. | Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih daje več skupinam preskusnih živali, pri čemer preskus navadno traja 12 mesecev, čeprav se lahko glede na zakonodajne zahteve izberejo tudi daljša ali krajša obdobja (glej odstavek 33). Izbrano obdobje mora biti dovolj dolgo, da se lahko pokažejo učinki kumulativne strupenosti, ne pa tudi zavajajoči učinki sprememb, povezanih s staranjem. Odstopanja od 12-mesečnega obdobja izpostavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Preskusna kemikalija se navadno daje oralno, čeprav je lahko primerno tudi preskušanje z inhalacijskim ali dermalnim načinom dajanja. Zasnova študije lahko vključuje tudi eno ali več vmesnih usmrtitev, npr. pri 3 ali 6 mesecih, zaradi česar se lahko vključijo dodatne skupine živali (glej odstavek 19). V obdobju dajanja odmerkov je treba pozorno opazovati, ali živali kažejo znake zastrupitve. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih opravi obdukcija. | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 14. | Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju kronične strupenosti na glodavcih (glej odstavek 2), čeprav se priznava, da se lahko z nekaterimi zakonodajnimi ureditvami zahtevajo podobne študije na vrstah, ki niso glodavci. Izbiro živalske vrste je treba utemeljiti. Kadar se zahtevajo študije kronične strupenosti na vrstah, ki niso glodavci, morata zasnova in izvajanje takih študij morata temeljiti na načelih, opisanih v tej preskusni metodi, ter na tistih iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodavcih‘ (5). Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). | 15. | V tej preskusni metodi je priporočena vrsta podgana, uporabijo pa se lahko tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Podgane in miši so najprimernejši preskusni modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razširjene uporabe v farmakoloških in toksikoloških študijah, občutljivosti za indukcijo tumorjev ter razpoložljivosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi teh lastnosti je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. V študiji kronične strupenosti je treba uporabiti isti sev in izvor živali kot v predhodnih krajših študijah strupenosti. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. | Nastanitveni in prehranjevalni pogoji | 16. | Živali se lahko nastanijo posamično ali dajo v kletke v manjših skupinah istega spola; posamična nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno utemeljena (19) (20) (21). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi mora biti 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontaminantov v hranilih in hrani, vsaj na začetku študije in kadar se zamenja serija uporabljane kemikalije, ter jih vključiti v končno poročilo. Prav tako je treba zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju prehranskih potreb živali. | Priprava živali | 17. | Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale laboratorijskim razmeram in še niso bile vključene v preskusne postopke. V primeru glodavcev je treba odmerke začeti dajati čim prej po odstavitvi od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupinami v okviru vsakega spola ne sme biti večjih razlik v povprečni telesni teži. Če obstajajo statistično pomembne razlike, je treba fazo randomizacije ponoviti, če je to mogoče. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identifikacijsko številko in jo trajno označiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo mikročipa ali drugo ustrezno metodo. | POSTOPEK | Število in spol živali | 18. | Uporabiti je treba oba spola. Število živali mora biti zadostno, da je ob koncu študije v vsaki skupini dovolj živali za temeljito biološko in statistično ocenjevanje. Pri glodavcih je treba običajno uporabiti najmanj 20 živali na spol za vsako velikost odmerka, medtem ko se pri vrstah, ki niso glodavci, priporočajo najmanj 4 živali na spol na skupino. V študijah, ki vključujejo miši, so lahko potrebne dodatne živali v vsaki odmerni skupini, da je mogoče opraviti vse zahtevane hematološke preiskave. | Uporaba vmesnih usmrtitev, satelitskih skupin in opozorilnih živali | 19. | Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne usmrtitve (vsaj 10 živali/spol/skupino), npr. pri 6 mesecih, da se zagotovijo informacije o napredovanju toksikoloških sprememb in mehanistične informacije. Kadar so take informacije že na voljo iz prejšnjih študij strupenosti s ponavljajočimi se odmerki v zvezi z zadevno preskusno kemikalijo, vmesne usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Vključijo se lahko tudi satelitske skupine za spremljanje reverzibilnosti morebitnih toksikoloških sprememb, ki jih povzroči preiskovana preskusna kemikalija; te preiskave so navadno omejene na največji odmerek v študiji in kontrolo. Poleg tega se lahko po potrebi predvidi dodatna skupina opozorilnih živali (navadno 5 živali na spol) za spremljanje patološkega stanja med študijo (22). Če se načrtujejo vmesne usmrtitve ali vključitev satelitskih ali opozorilnih skupin, je treba število živali v zasnovi študije povečati za toliko, kolikor se jih namerava usmrtiti pred zaključkom študije. Za te živali so običajno potrebna enaka opazovanja kot za živali v fazi študije v zvezi s kronično strupenostjo, vključno s telesno težo, porabo hrane/vode, hematološkimi in kliničnimi biokemičnimi meritvami ter patološkimi preiskavami, čeprav se lahko predvidi tudi (za skupine za vmesno usmrtitev), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksičnost ali imunotoksičnost. | Odmerne skupine in odmerjanje | 20. | Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih velikosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in sočasno kontrolo, razen če se opravi mejni preskus (glej odstavek 27). Velikosti odmerkov navadno temeljijo na rezultatih kratkoročnejših študij s ponavljajočimi se odmerki ali študij za ugotavljanje območja, pri njihovem določanju pa je treba upoštevati vse obstoječe toksikološke in toksikokinetične podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. | 21. | Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških učinkov preskusne kemikalije to ni mogoče, je navadno treba največjo velikost odmerka izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih učinkov, pri čemer se je treba izogibati povzročanju trpljenja, hude zastrupitve, obolevnosti ali smrti. Ob upoštevanju dejavnikov, navedenih v odstavku 22 spodaj, je treba največji odmerek izbrati tako, da se izzovejo znaki strupenosti, na primer upočasnitev pridobivanja telesne teže (približno 10-odstotna). | 22. | Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi največji odmerek, manjši od odmerka, ki povzroča znake zastrupitve, npr. če odmerek izzove škodljiv učinek, ki vzbuja zaskrbljenost, ne vpliva pa bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. Največji odmerek ne sme presegati 1 000 mg/kg telesne teže/dan (mejni odmerek, glej odstavek 27). | 23. | Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za določanje odziva v odvisnosti od odmerka in vrednosti NOAEL ali drugega želenega izida študije, npr. BMD (glej odstavek 25) pri najmanjšem odmerku. Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri določitvi manjših odmerkov, vključujejo pričakovani naklon krivulje odmerek-odziv, odmerke, pri katerih se lahko pojavijo pomembne spremembe v presnovi ali načinu strupenega delovanja, velikost, pri kateri se pričakuje prag, ali velikost, pri kateri se pričakuje izhodiščna točka za ekstrapolacijo majhnih odmerkov. | 24. | Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od lastnosti preskusne kemikalije in je v tej preskusni metodi ni mogoče predpisati, vendar dva- do štirikratni intervali velikokrat zagotovijo visoko učinkovitost preskusa, kadar se uporabijo za določitev padajočih velikosti odmerkov, namesto uporabe zelo velikih intervalov (npr. večjih od faktorja približno 6–10) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati četrto preskusno skupino. Na splošno se je treba izogibati uporabi faktorjev, večjih od 10, če se uporabijo, pa je to treba utemeljiti. | 25. | Kot je nadalje navedeno v Dokumentu s smernicami št. 116 (6), je treba pri izbiri odmerkov upoštevati: | — | znane ali domnevne nelinearnosti ali točke pregiba na krivulji odmerek-odziv, | — | toksikokinetiko in odmerna območja, v katerih se pojavljajo ali ne pojavljajo presnovna indukcija, nasičenje ali nelinearnost med zunanjimi in notranjimi odmerki, | — | prekurzorske lezije, označevalce učinka ali kazalnike delovanja ključnih temeljnih bioloških procesov, | — | ključne (ali domnevne) vidike načina delovanja, kot so odmerki, pri katerih se začne pojavljati citotoksičnost, so ravni hormonov motene, homeostatični mehanizmi preobremenjeni itd., | — | predele krivulje odmerek-odziv, pri katerih je potrebna posebno zanesljiva ocena, npr. v območju pričakovanega BMD ali predvidenega praga, | — | preudarke v zvezi s pričakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi. | 26. | Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora kontrolna skupina prejeti največjo količino nosilca, ki je bila uporabljena med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem zaradi njene manjše okusnosti povzroči bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja kot primernejša kontrola. | 27. | Če je mogoče na podlagi informacij iz predhodnih študij predvideti, da preskus pri eni velikosti odmerka, enakovredni najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, verjetno ne bo povzročil škodljivih učinkov, in če glede na podatke o strukturno sorodnih kemikalijah strupenost ni pričakovana, popolna študija s tremi velikostmi odmerkov morda ne bo potrebna. Lahko se uporabi meja 1 000 mg/kg telesne teže/dan, razen če izpostavljenost ljudi nakazuje potrebo po večjem odmerku. | Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije | 28. | Preskusna kemikalija se običajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo oziroma z gavažo. Dodatne informacije o načinih in metodah dajanja so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). Način in metoda dajanja sta odvisna od namena študije, fizikalnih/kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujočega načina in metode izpostavljenosti ljudi. Izbrani način in metodo dajanja je treba utemeljiti. Zaradi dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri tistih snoveh, pri katerih sta ta način in metoda dajanja razumno reprezentativna za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). Prehranske in okoljske kemikalije, vključno s pesticidi, se navadno dajejo s hrano ali pitno vodo. V nekaterih scenarijih, npr. pri izpostavljenosti na delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi načini dajanja. | 29. | Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, kot je ustrezno: učinke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo preskusne kemikalije, učinke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter učinke na porabo hrane ali vode ali na prehranjenost živali. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homogenosti raztopin ali hrane, ki se bodo uporabljale v preskusu (kot je ustrezno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). | 30. | Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehranjevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoročnih študijah strupenosti, pri katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se preprečijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg telesne teže), ki se izračuna vsak teden. Uporabljeni način je treba navesti. | 31. | V primeru oralnega dajanja živali dobijo odmerek preskusne kemikalije vsak dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa navadno traja 12 mesecev (glej tudi odstavek 33), čeprav so lahko glede na zakonodajne zahteve potrebna tudi daljša obdobja. Vsak drugačen režim odmerjanja, npr. pet dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali s preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na teden, kot je navedeno v poglavju B.9 te priloge (10), prek obdobja 12 mesecev. Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, uporabiti pa je mogoče tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. Obdobje izpostavljenosti praviloma traja 12 mesecev. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljši časi izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na dan, je treba utemeljiti. Glej tudi poglavje B.8 te priloge (8). | 32. | Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem uporabljati želodčno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko dnevno odmerjena količina ohranja tudi z dajanjem polovičnih odmerkov (dvakrat na dan). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. To količino je treba ohranjati tako majhno, kot je praktično, praviloma pa pri glodavcih ne sme preseči 1 ml/100 g telesne teže (22). Spremenljivost preskusne količine je treba kar najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali dražilne kemikalije, ki jih je treba razredčiti, da se preprečijo resni lokalni učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati. | Trajanje študije | 33. | Čeprav je ta preskusna metoda primarno zasnovana kot 12-mesečna študija kronične strupenosti, je zasnovana tako, da se lahko uporablja tudi za kratkoročnejše (npr. 6- ali 9-mesečne) ali dolgoročnejše (npr. 18- ali 24-mesečne) študije, glede na zahteve konkretnih zakonodajnih ureditev ali za posebne mehanistične namene. Odstopanja od 12-mesečnega obdobja izpostavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Satelitske skupine, vključene za spremljanje reverzibilnosti toksikoloških sprememb, ki jih povzroči preiskovana preskusna kemikalija, se s preskusno kemikalijo ne tretirajo najmanj 4 tedne in največ eno tretjino celotnega trajanja študije po koncu izpostavljenosti. Več napotkov, vključno s preudarki o preživetju v študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). | OPAZOVANJA | 34. | Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, običajno na začetku in koncu vsakega dne, vključno s konci tedna in prazniki. Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka, če gre za dajanje z gavažo. | 35. | Podrobna klinična opazovanja je treba opraviti na vseh živalih vsaj enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogočanje primerjav na istem osebku), ob koncu prvega tedna študije, zatem pa mesečno. Protokol za opazovanja je treba določiti tako, da so razlike med posameznimi opazovalci čim manjše in neodvisne od preskusne skupine. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj kletk, v katerih živali bivajo, po možnosti na standardnem mestu in vedno ob istem času. Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti z uporabo sistemov točkovanja, ki jih izrecno določi preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, da se pogoji opazovanja čim manj spreminjajo. Pozornost je med drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, očeh in sluznicah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živčevja (npr. solzenju, piloerekciji, velikosti zenic in nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z živalmi, pa tudi prisotnost kloničnih ali toničnih gibov, stereotipij (npr. prekomernega čiščenja, ponavljajočega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (24). | 36. | Na vseh živalih je treba pred prvim dajanjem preskusne kemikalije z oftalmoskopom ali drugo primerno opremo opraviti oftalmološko preiskavo. Ob koncu študije je treba to preiskavo po možnosti opraviti na vseh živalih, vsekakor pa vsaj pri skupini, tretirani z velikim odmerkom, in kontrolni skupini. Če se v očeh zaznajo spremembe, povezane s tretiranjem, je treba pregledati vse živali. Če strukturna analiza ali druge informacije kažejo na strupenost za oči, je treba pogostnost preiskav oči povečati. | 37. | Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus strupenosti s ponavljajočimi se odmerki nakazal potencial za povzročanje nevrotoksičnih učinkov, se lahko po izbiri ocenijo senzorične reakcije na različne vrste dražljajev (24) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) (25) (26) (27), moč oprijema (28) ter motorična aktivnost (29), in sicer pred začetkom študije ter vsake 3 mesece po začetku študije do 12. meseca in vključno z njim, pa tudi ob koncu študije (če je daljša od 12 mesecev). Nadaljnje podrobnosti glede možnih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je mogoče tudi druge postopke, ki v njih niso opisani. | 38. | Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus strupenosti s ponavljajočimi se odmerki nakazal potencial za povzročanje imunotoksičnih učinkov, se lahko nadaljnje preiskave te končne točke po izbiri opravijo ob koncu študije. | Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane | 39. | Vse živali je treba stehtati na začetku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja. | Hematologija in klinična biokemija | 40. | V študijah z glodavci je treba hematološke preiskave opravljati na vsaj 10 samcih in 10 samicah na skupino, in sicer pri 3, 6 in 12 mesecih, pa tudi ob koncu študije (če je daljša od 12 mesecev), pri čemer je treba za te preiskave v vsej študiji uporabljati iste živali. Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih hematoloških preiskav potrebne satelitske živali (glej odstavek 18). V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritve pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki na hematološke parametre. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. | 41. | Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (30): skupno in diferencialno število levkocitov, število eritrocitov, število trombocitov, koncentracijo hemoglobina, hematokrit (volumen stisnjenih eritrocitov), povprečni volumen eritrocitov (MCV), povprečno količino hemoglobina v eritrocitih (MCH), povprečno koncentracijo hemoglobina v eritrocitih (MCHC), protrombinski čas in aktivirani parcialni tromboplastinski čas. Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi hematološki parametri, kot so Heinzeva telesca ali druge netipične morfološke oblike eritrocitov ali methemoglobin. Na splošno je treba sprejeti prožni pristop glede na opažene in/ali pričakovane učinke dane preskusne kemikalije. Če preskusna kemikalija učinkuje na krvotvorni sistem, sta lahko indicirana tudi meritev števila retikulocitov in citološka preiskava kostnega mozga, čeprav teh ni treba izvajati redno. | 42. | Klinične biokemične preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih učinkov na tkiva ter zlasti ledvice in jetra je treba opravljati na vzorcih krvi, odvzetih najmanj 10 samcem in 10 samicam na skupino v istih časovnih intervalih, kot so določeni za hematološke preiskave, ter pri tem prek celotne študije uporabljati iste živali. Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih kliničnih biokemičnih preiskav potrebne satelitske živali. V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki na klinične biokemične parametre. Pred odvzemom vzorcev krvi je priporočljivo živali čez noč postiti (kar pa ne velja za miši). Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (30): glukozo, sečnino (sečninski dušik), kreatinin, skupne beljakovine, albumin, kalcij, natrij, kalij, skupni holesterol, najmanj dva ustrezna preskusa za hepatocelularno oceno (alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, glutamat-dehidrogenaza, skupne žolčne kisline) (31) in najmanj dva ustrezna preskusa za hepatobiliarno oceno (alkalna fosfataza, γ-glutamil transferaza, 5’-nukleotidaza, skupni bilirubin, skupne žolčne kisline) (31). Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi klinični kemični parametri, kot so vrednost trigliceridov na tešče, specifični hormoni in holinesteraza. Na splošno je potreben prožni pristop glede na opažene in/ali pričakovane učinke dane preskusne kemikalije. | 43. | Analize urina je treba opraviti na najmanj 10 samcih in 10 samicah na skupino na vzorcih, zbranih v istih časovnih intervalih kot pri hematoloških in kliničnih kemičnih preiskavah. Meritev pri 3 mesecih ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki pri analizi urina. V strokovno priporočilo glede kliničnih patoloških študij (30) je bil vključen naslednji seznam parametrov: videz, količina, osmolalnost ali specifična teža, pH, skupne beljakovine in glukoza. Druge določitve vključujejo keton, urobilinogen, bilirubin in okultno kri. Če je treba preiskavo opaženih učinkov razširiti, se lahko uporabijo dodatni parametri. | 44. | Na splošno se šteje, da je treba izhodiščne hematološke in klinične biokemične spremenljivke določiti pred tretiranjem v študijah s psi, ne pa tudi v študijah z glodavci (30). Če pa so pretekli izhodiščni podatki (glej odstavek 50) nezadostni, je treba razmisliti o pripravi takih podatkov. | Patologija | Makroskopska obdukcija | 45. | Praviloma se na vseh živalih v študiji opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Lahko pa se tudi predvidi (za skupine za vmesno usmrtitev ali satelitske skupine), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksičnost ali imunotoksičnost (glej odstavek 19). Obdukcija in poznejši postopki, opisani v naslednjih odstavkih, pri teh živalih niso potrebni. Za opozorilne živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odloča vodja študije. | 46. | Stehtati je treba organe vseh živali, razen tistih, ki se izključijo na podlagi zadnjega dela odstavka 45. Z nadledvičnih žlez, možganov, nadmodka, srca, ledvic, jeter, jajčnikov, vranice, mod, ščitnice (stehtane po fiksaciji skupaj z obščitnicami) in maternice vseh živali (razen živali, ki so bile najdene umirajoče in/ali so bile usmrčene med študijo) je treba, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva in nato izmeriti njihovo mokro težo čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. V študijah z mišmi tehtanje nadledvičnih žlez ni obvezno. | 47. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (32) (tkiva v oglatih oklepajih niso obvezna): | vse vidne lezije | srce | trebušna slinavka | želodec (predželodec, žlezni želodec) | nadledvična žleza | vito črevo | obščitnica | [zobje] | aorta | tešče črevo | periferni živec | modo | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | ledvica | hipofiza | priželjc | slepo črevo | solzna žleza (zunaj očesne votline) | prostata | ščitnica | maternični vrat | jetra | rektum | [jezik] | koagulacijska žleza | pljuča | žleza slinavka | sapnik | debelo črevo | bezgavke (povrhnje in globoke) | semenski mešiček | sečni mehur | dvanajsternik | mlečna žleza (obvezna za samice, in če jo je mogoče secirati s prostim očesom, za samce) | skeletna mišica | maternica (vključno z materničnim vratom) | nadmodek | [zgornja dihala, vključno z nosom, nosnimi školjkami in obnosnimi votlinami] | koža | [sečevod] | oko (vključno z mrežnico) | požiralnik | hrbtenjača (na treh ravneh: vratni, prsni in ledveni) | [sečnica] | [stegnenica s sklepom] | [vohalni betič] | vranica | vagina | žolčnik (pri vrstah, ki niso podgane) | jajčnik | [prsnica] | rezina in/ali svež punktat kostnega mozga | Harderjeva žleza | | | | Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba shraniti oba organa. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim načinom dajanja je treba shraniti iste organe, kot so določeni na seznamu za oralni način, bistveno pa je posebno vzorčenje in shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporočilom iz poglavij B.8 (8) in B.29 te priloge (9). Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preučiti seznam organov, določen za oralni način dajanja. | Histopatologija | 48. | Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patoloških študij (32). Histopatološke preiskave morajo obsegati vsaj: | — | vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne skupine, | — | vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmrčene med študijo, | — | vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, | — | ciljna tkiva ali tkiva, pri katerih so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretiranjem povezane spremembe, vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, | — | pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba pregledati oba organa. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 49. | Navesti je treba podatke za posamezne živali in za vse ocenjevane parametre. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake zastrupitve, opis opaženih znakov zastrupitve, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih učinkov, ter število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi podatki je treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni učinki ali lezije, ter razvrstitev lezij. | 50. | Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s sočasnimi kontrolami, bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija ter se nanašati na živali iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih pred zadevno študijo. | 51. | Če je ustrezno, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Statistične metode in podatke, ki bodo analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 8). V izbiri je treba predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne. | Poročilo o preskusu | 52. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijske podatke, | — | izvor kemikalije, | — | številko serije, | — | potrdilo o kemijski analizi. | | Nosilec (če je ustrezno) | — | utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda). | | Preskusne živali | — | uporabljeno vrsta/sev in utemeljitev izbire, | — | število, starost in spol živali ob začetku preskusa, | — | izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., | — | težo vsake živali ob začetku preskusa. | | Preskusni pogoji | — | utemeljitev načina dajanja in izbire odmerkov, | — | če je ustrezno, uporabljene statistične metode za analizo podatkov, | — | podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, | — | analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, | — | način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, | — | za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost nosu ali izpostavljenost celega telesa, | — | dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v dejanski odmerek, če je ustrezno, | — | podatke o kakovosti hrane in vode. | | Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za posamezne živali) | — | podatke o preživetju, | — | telesno težo/spremembe telesne teže, | — | porabo hrane, izračune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo vode, če je ustrezno, | — | podatke o toksični reakciji glede na spol in velikost odmerka, vključno z znaki zastrupitve, | — | vrsto, pogostnost (in če se ocenjuje, resnost) in trajanje kliničnih opažanj (prehodnih ali trajnih), | — | oftalmološko preiskavo, | — | hematološke preskuse, | — | klinične biokemične preskuse, | — | analize urina, | — | rezultat morebitnih preiskav nevrotoksičnosti ali imunotoksičnosti, | — | terminalno telesno težo, | — | težo organov (in razmerja med težami organov, če je ustrezno), | — | izsledke obdukcije, | — | podroben opis ugotovitev vseh s tretiranjem povezanih histopatoloških preiskav, | — | podatke o absorpciji, če so na voljo. | | Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno | | Razprava o rezultatih | — | razmerja med odmerkom in odzivom, | — | preučitev vseh informacij o načinu delovanja, | — | razpravo o morebitnih pristopih modeliranja, | — | določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, | — | pretekle kontrolne podatke, | — | pomembnost za ljudi. | | Sklepi. | VIRI: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. | (3) | Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191. | (4) | Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. | (5) | Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkronične oralne toksičnosti: 90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodalcih. | (6) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druga izdaja. Series on Testing and Assessment No. 116, na voljo na javni spletni strani OECD o smernicah za preskušanje na naslovu www.oecd.org/env/testguidelines. | (7) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (8) | Poglavje B.8 te priloge, Subakutna strupenost pri vdihavanju: 28-dnevna študija. | (9) | Poglavje B.29 te priloge, Subkronična strupenost pri vdihavanju: 90-dnevna študija. | (10) | Poglavje B.9 te priloge, Strupenost (v stiku s kožo) pri ponavljajočem se odmerku (28 dni). | (11) | Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R., idr. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7. | (12) | Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T., idr. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35. | (13) | Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A., idr. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68. | (14) | Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M., idr. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98. | (15) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz. | (16) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. | (17) | Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729– 837. | (18) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (ur.). ILSI Press, Washington, DC. | (19) | Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 20.10.2010, str. 33). | (20) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (21) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (22) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (23) | Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23. | (24) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. | (25) | Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. | (26) | Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health 9: 691–704. | (27) | Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. | (28) | Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. | (29) | Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609. | (30) | Weingand, K., Brown, G., Hall, R., idr. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198–201. | (31) | (Osnutek) dokumenta agencije EMEA z naslovom ‚Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity‘ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). | (32) | Crissman, J. W., Goodman, D. G., Hildebrandt, P. K., idr. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode.; | “ | (5) | Chapters B.29 and B.30 are replaced by the following: | ‘B.29. SUBCHRONIC INHALATION TOXICITY: 90-DAY STUDY | SUMMARY | This revised Test Method B.29 has been designed to fully characterise test chemical toxicity by the inhalation route for a subchronic duration (90 days), and to provide robust data for quantitative inhalation risk assessments. Groups of 10 male and 10 female rodents are exposed 6 hours per day during a 90 day (13 week) period to a) the test chemical at three or more concentration levels, b) filtered air (negative control), and/or c) the vehicle (vehicle control). Animals are generally exposed 5 days per week but exposure for 7 days per week is also allowed. Males and females are always tested, but they may be exposed at different concentration levels if it is known that one sex is more susceptible to a given test chemical. This method allows the study director the flexibility to include satellite (reversibility) groups, interim sacrifices, bronchoalveolar lavage (BAL), neurologic tests, and additional clinical pathology and histopathological evaluations in order to better characterise the toxicity of a test chemical. | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline 413 (2009). The original subchronic inhalation Test Guideline 413 (TG 413) was adopted in 1981 (1). This Test Method B.29 (as equivalent to the revised TG 413 (2009)) has been updated to reflect the state of the science and to meet current and future regulatory needs. | 2. | Subchronic inhalation toxicity studies are primarily used to derive regulatory concentrations for assessing worker risk in occupation settings. They are also used to assess human residential, transportation, and environmental risk. This method enables the characterisation of adverse effects following repeated daily inhalation exposure to a test chemical for 90 days (approximately 10 % of the lifespan of a rat). The data derived from subchronic inhalation toxicity studies can be used for quantitative risk assessments and for the selection of concentrations for chronic studies. This test method is not specifically intended for the testing of nanomaterials. Definitions used in the context of this Test Method are provided at the end of this chapter and in the Guidance Document (GD) 39 (2). | INITIAL CONSIDERATIONS | 3. | All available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study in order to enhance the quality of the study and minimise animal usage. Information that will assist in the selection of appropriate test concentrations might include the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally related chemicals; and data derived from other repeated exposure studies. If neurotoxicity is expected or is observed in the course of the study, the study director may choose to include appropriate evaluations such as a functional observational battery (FOB) and measurement of motor activity. Although the timing of exposures relative to specific examinations may be critical, the performance of these additional activities should not interfere with the basic study design. | 4. | Dilutions of corrosive or irritating test chemicals may be tested at concentrations that will yield the desired degree of toxicity. Please refer to GD 39 (2) for further information. When exposing animals to these materials, the targeted concentrations should be low enough to not cause marked pain and distress, yet sufficient to extend the concentration-response curve to levels that reach the regulatory and scientific objective of the test. These concentrations should be selected on a case-by-case basis, preferably based upon an adequately designed range-finding study that provides information regarding the critical endpoint, any irritation threshold, and the time of onset (see paragraphs 11-13). The justification for concentration selection should be provided. | 5. | Moribund animals or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress should be humanely killed. Moribund animals are considered in the same way as animals that die on test. Criteria for making the decision to kill moribund or severely suffering animals, and guidance on the recognition of predictable or impending death, are the subject of an OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of Animal Species | 6. | Healthy young adult rodents of commonly used laboratory strains should be employed. The preferred species is the rat. Justification should be provided if other species are used. | Preparation of Animals | 7. | Females should be nulliparous and non-pregnant. On the day of randomisation, animals should be young adults 7 to 9 weeks of age. Body weights should be within ± 20 % of the mean weight for each sex. The animals are randomly selected, marked for individual identification, and kept in their cages for at least 5 days prior to the start of the test to allow for acclimatization to laboratory conditions. | Animal Husbandry | 8. | Animals should be individually identified, preferably with subcutaneous transponders, to facilitate observations and avoid confusion. The temperature of the experimental animal maintenance room should be 22 ± 3 °C. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, though this may not be possible when using water as a vehicle. Before and after exposures, animals generally should be caged in groups by sex and concentration, but the number of animals per cage should not interfere with clear observation of each animal and should minimise losses due to cannibalism and fighting. When animals are to be exposed nose-only, it may be necessary for them to be acclimated to the restraining tubes. The restraining tubes should not impose undue physical, thermal, or immobilisation stress on the animals. Restraint may affect physiological endpoints such as body temperature (hyperthermia) and/or respiratory minute volume. If generic data are available to show that no such changes occur to any appreciable extent, then pre-adaptation to the restraining tubes is not necessary. Animals exposed whole-body to an aerosol should be housed individually during exposure to prevent them from filtering the test aerosol through the fur of their cage mates. Conventional and certified laboratory diets may be used, except during exposure, accompanied with an unlimited supply of municipal drinking water. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light/12 hours dark. | Inhalation Chambers | 9. | The nature of the test chemical and the object of the test should be considered when selecting an inhalation chamber. The preferred mode of exposure is nose-only (which term includes head-only, nose-only, or snout-only). Nose-only exposure is generally preferred for studies of liquid or solid aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. Special objectives of the study may be better achieved by using a whole-body mode of exposure, but this should be justified in the study report. To ensure atmosphere stability when using a whole-body chamber, the total volume of the test animals should not exceed 5 % of the chamber volume. Principles of the nose-only and whole body exposure techniques and their particular advantages and disadvantages are addressed in GD 39 (2). | TOXICITY STUDIES | Limit Concentrations | 10. | Unlike with acute studies, there are no defined limit concentrations in subchronic inhalation toxicity studies. The maximum concentration tested should consider: 1) the maximum attainable concentration, 2) the “worst case” human exposure level, 3) the need to maintain an adequate oxygen supply, and/or 4) animal welfare considerations. In the absence of data-based limits, the acute limits of Regulation (EC) No 1272/2008 (13) may be used (i.e. up to a maximum concentration of 5 mg/l for aerosols, 20 mg/l for vapours, and 20 000 ppm for gases); refer to GD 39 (2). Justification should be provided if it is necessary to exceed these limits when testing gases or highly volatile test chemicals (e.g. refrigerants). The limit concentration should elicit unequivocal toxicity without causing undue stress to the animals or affecting their longevity (3). | Range-Finding Study | 11. | Before commencing with the main study, it is generally necessary to perform a range-finding study. A range-finding study is more comprehensive than a sighting study because it is not limited to concentration selection. Knowledge learned from a range-finding study can lead to a successful main study. A range-finding study may, for example, provide technical information regarding analytical methods, particle sizing, discovery of toxic mechanisms, clinical pathology and histopathological data, and estimations of what may be NOAEL and MTC concentrations in a main study. The study director may choose to use the range-finding study to identify the threshold of respiratory tract irritation (e.g. with histopathology of the respiratory tract, pulmonary function testing, or bronchoalveolar lavage), the upper concentration which is tolerated without undue stress to the animals, and the parameters that will best characterise a test chemical’s toxicity. | 12. | A range-finding study may consist of one or more concentration levels. Depending on the endpoints chosen, three to six males and three to six females should be exposed at each concentration level. A range-finding study should last a minimum of 5 days and generally no more than 28 days. The rationale for the selection of concentrations for the main study should be provided in the study report. The objective of the main study is to demonstrate a concentration-response relationship based on what is anticipated to be the most sensitive endpoint. The low concentration should ideally be a no-observed-adverse effect concentration while the high concentration should elicit unequivocal toxicity without causing undue stress to the animals or affecting their longevity (3). | 13. | When selecting concentration levels for the range-finding study, all available information should be considered including structure-activity relationships and data for similar chemicals (see paragraph 3). A range-finding study may verify/refute what are considered to be the most sensitive mechanistically based endpoints, e.g. cholinesterase inhibition by organophosphates, methaemoglobin formation by erythrocytotoxic agents, thyroidal hormones (T3, T4) for thyrotoxicants, protein, LDH, or neutrophils in bronchoalveolar lavage for innocuous poorly soluble particles or pulmonary irritant aerosols. | Main Study | 14. | The main subchronic toxicity study generally consists of three concentration levels, and also concurrent negative (air) and/or vehicle controls as needed (see paragraph 18). All available data should be utilised to aid selection of appropriate exposure levels, including the results of systemic toxicity studies, metabolism and kinetics (particular emphasis should be given to avoiding high concentration levels which saturate kinetic processes). Each test group contains 10 male and 10 female rodents that are exposed to the test chemical for 6 hours per day on a 5 day per week basis for a period of 13 weeks (total study duration of at least 90 days). Animals may also be exposed 7 days per week (e.g. when testing inhaled pharmaceuticals). If one sex is known to be more susceptible to a given test chemical, the sexes may be exposed at different concentration levels in order to optimise the concentration-response as described in paragraph 15. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration less than 6 hours/day, or when it is necessary to conduct a long duration (e.g. 22 hours/day) whole-body exposure study (refer to GD 39) (2). Feed should be withheld during the exposure period unless exposure exceeds 6 hours. Water may be provided throughout a whole-body exposure. | 15. | The target concentrations selected should identify the target organ(s) and demonstrate a clear concentration-response: | — | The high concentration level should result in toxic effects but not cause lingering signs or lethality which would prevent a meaningful evaluation. | — | The intermediate concentration level(s) should be spaced to produce a gradation of toxic effects between that of the low and high concentration. | — | The low concentration level should produce little or no evidence of toxicity. | Interim Sacrifices | 16. | If interim sacrifices are planned, the number of animals at each exposure level should be increased by the number to be sacrificed before study completion. The rationale for using interim sacrifices should be provided, and statistical analyses should properly account for them. | Satellite (Reversibility) Study | 17. | A satellite (reversibility) study may be used to observe reversibility, persistence, or delayed occurrence of toxicity for a post-treatment period of an appropriate length, but no less than 14 days. Satellite (reversibility) groups consist of 10 males and 10 females exposed contemporaneously with the experimental animals in the main study. Satellite (reversibility) study groups should be exposed to the test chemical at the highest concentration level and there should be concurrent air and/or vehicle controls as needed (see paragraph 18). | Control Animals | 18. | Concurrent negative (air) control animals should be handled in a manner identical to the test group animals except that they are exposed to filtered air rather than test chemical. When water or another substance is used to assist in generating the test atmosphere, a vehicle control group, instead of a negative (air) control group, should be included in the study. Water should be used as the vehicle whenever possible. When water is used as the vehicle, the control animals should be exposed to air with the same relative humidity as the exposed groups. The selection of a suitable vehicle should be based on an appropriately conducted pre-study or historical data. If a vehicle’s toxicity is not well known, the study director may choose to use both a negative (air) control and a vehicle control, but this is strongly discouraged. If historical data reveal that a vehicle is non-toxic, then there is no need for a negative (air) control group and only a vehicle control should be used. If a pre-study of a test chemical formulated in a vehicle reveals no toxicity, it follows that the vehicle is non-toxic at the concentration tested and this vehicle control should be used. | EXPOSURE CONDITIONS | Administration of Concentrations | 19. | Animals are exposed to the test chemical as a gas, vapour, aerosol, or a mixture thereof. The physical state to be tested depends on the physico-chemical properties of the test chemical, the selected concentrations, and/or the physical form most likely present during the handling and use of the test chemical. Hygroscopic and chemically reactive test chemicals should be tested under dry air conditions. Care should be taken to avoid generating explosive concentrations. Particulate materials may be subjected to mechanical processes to decrease the particle size. Further guidance is provided in GD 39 (2). | Particle-Size Distribution | 20. | Particle sizing should be performed for all aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. To allow for exposure of all relevant regions of the respiratory tract, aerosols with mass median aerodynamic diameters (MMAD) ranging from 1 to 3 μm with a geometric standard deviation (σg) in the range of 1,5 to 3,0 are recommended (4). Although a reasonable effort should be made to meet this standard, expert judgement should be provided if it cannot be achieved. For example, metal fume particles will be smaller than this standard, and charged particles and fibres may exceed it. | Test chemical Preparation in a Vehicle | 21. | Ideally, the test chemical should be tested without a vehicle. If it is necessary to use a vehicle to generate an appropriate test chemical concentration and particle size, water should be given preference. Whenever a test chemical is dissolved in a vehicle, its stability should be demonstrated. | MONITORING OF EXPOSURE CONDITIONS | Chamber Airflow | 22. | The flow of air through the exposure chamber should be carefully controlled, continuously monitored, and recorded at least hourly during each exposure. The real-time monitoring of the test atmosphere concentration (or temporal stability) is an integral measurement of all dynamic parameters and provides an indirect means to control all relevant dynamic inhalation parameters. If the concentration is monitored real-time, the frequency of measurement of air flows may be reduced to one single measurement per exposure per day. Special consideration should be given to avoiding rebreathing in nose-only chambers. Oxygen concentration should be at least 19 % and carbon dioxide concentration should not exceed 1 %. If there is reason to believe that this standard cannot be met, oxygen and carbon dioxide concentrations should be measured. If measurements on the first day of exposure show that these gases are at proper levels, no further measurements should be necessary. | Chamber Temperature and Relative Humidity | 23. | Chamber temperature should be maintained at 22 ± 3 °C. Relative humidity in the animals’ breathing zone, for both nose-only and whole-body exposures, should be monitored continuously and recorded hourly during each exposure where possible. The relative humidity should preferably be maintained in the range of 30 to 70 %, but this may either be unattainable (e.g. when testing water based mixtures) or not measurable due to test chemical interference with the Test Method. | Test chemical: Nominal Concentration | 24. | Whenever feasible, the nominal exposure chamber concentration should be calculated and recorded. The nominal concentration is the mass of generated test chemical divided by the total volume of air passed through the inhalation chamber system. The nominal concentration is not used to characterise the animals’ exposure, but a comparison of the nominal concentration and the actual concentration gives an indication of the generation efficiency of the test system, and thus may be used to discover generation problems. | Test chemical: Actual Concentration | 25. | The actual concentration is the test chemical concentration as sampled at the animals’ breathing zone in an inhalation chamber. Actual concentrations can be obtained either by specific methods (e.g. direct sampling, adsorptive or chemical reactive methods, and subsequent analytical characterisation) or by non-specific methods such as gravimetric filter analysis. The use of gravimetric analysis is acceptable only for single component powder aerosols or aerosols of low volatility liquids and should be supported by appropriate pre-study test chemical-specific characterisations. Multi-component powder aerosol concentration may also be determined by gravimetric analysis. However, this requires analytical data which demonstrate that the composition of airborne material is similar to the starting material. If this information is not available, a reanalysis of the test chemical (ideally in its airborne state) at regular intervals during the course of the study may be necessary. For aerosolised agents that may evaporate or sublimate, it should be shown that all phases were collected by the method chosen. | 26. | One lot of the test chemical should be used throughout the duration of the study, if possible, and the test sample should be stored under conditions that maintain its purity, homogeneity, and stability. Prior to the start of the study, there should be a characterisation of the test chemical, including its purity and, if technically feasible, the identity, and quantities of identified contaminants and impurities. This can be demonstrated by, but is not limited to, the following data: retention time and relative peak area, molecular weight from mass spectroscopy or gas chromatography analyses, or other estimates. Although the test sample’s identity is not the responsibility of the test laboratory, it may be prudent for the test laboratory to confirm the sponsor’s characterisation at least in a limited way (e.g. colour, physical nature, etc.). | 27. | The exposure atmosphere should be held as constant as practicable. A real-time monitoring device, such as an aerosol photometer for aerosols or a total hydrocarbon analyser for vapours, may be used to demonstrate the stability of the exposure conditions. Actual chamber concentration should be measured at least 3 times during each exposure day for each exposure level. If not feasible due to limited air flow rates or low concentrations, one sample per exposure period is acceptable. Ideally, this sample should then be collected over the entire exposure period. Individual chamber concentration samples should deviate from the mean chamber concentration by no more than ± 10 % for gases and vapours, and by no more than ± 20 % for liquid or solid aerosols. Time to attain chamber equilibration (t95) should be calculated and reported. The duration of an exposure spans the time that the test chemical is generated. This takes into account the times required to attain chamber equilibration (t95) and decay. Guidance for estimating t95 can be found in GD 39 (2). | 28. | For very complex mixtures consisting of gases/vapours and aerosols (e.g. combustion atmospheres and test chemicals propelled from purpose-driven end-use products/devices), each phase may behave differently in an inhalation chamber. Therefore, at least one indicator substance (analyte), normally the principal active ingredient in the mixture, of each phase (gas/vapour and aerosol) should be selected. When the test chemical is a mixture, the analytical concentration should be reported for the total mixture, and not just for the active ingredient or the indicator substance (analyte). Additional information regarding actual concentrations can be found in GD 39 (2). | Test chemical: Particle Size Distribution | 29. | The particle size distribution of aerosols should be determined at least weekly for each concentration level by using a cascade impactor or an alternative instrument such as an aerodynamic particle sizer (APS). If equivalence of the results obtained by a cascade impactor and the alternative instrument can be shown, then the alternative instrument may be used throughout the study. | 30. | A second device, such as a gravimetric filter or an impinger/gas bubbler, should be used in parallel to the primary instrument to confirm the collection efficiency of the primary instrument. The mass concentration obtained by particle size analysis should be within reasonable limits of the mass concentration obtained by filter analysis [see GD 39 (2)]. If equivalence can be demonstrated at all concentrations tested in the early phase of the study, then further confirmatory measurements may be omitted. For the sake of animal welfare, measures should be taken to minimise inconclusive data which may lead to a need to repeat a study. | 31. | Particle sizing should be performed for vapours if there is any possibility that vapour condensation may result in the formation of an aerosol, or if particles are detected in a vapour atmosphere with potential for mixed phases. | OBSERVATIONS | 32. | The animals should be clinically observed before, during, and after the exposure period. More frequent observations may be indicated depending on the response of the animals during exposure. When animal observation is hindered by the use of animal restraint tubes, poorly lit whole body chambers, or opaque atmospheres, animals should be carefully observed after exposure. Observations before the next day’s exposure can assess any reversibility or exacerbation of toxic effects. | 33. | All observations are recorded with individual records being maintained for each animal. When animals are killed for humane reasons or found dead, the time of death should be recorded as precisely as possible. | 34. | Cage-side observations should include changes in the skin and fur, eyes, and mucous membranes; changes in the respiratory and circulatory systems; changes in the nervous system; and changes in somatomotor activity and behaviour patterns. Attention should be directed to observations of tremors, convulsions, salivation, diarrhoea, lethargy, sleep, and coma. The measurement of rectal temperatures may provide supportive evidence of reflex bradypnea or hypo/hyperthermia related to treatment or confinement. Additional assessments may be included in the study protocol such as kinetics, biomonitoring, lung function, retention of poorly soluble materials that accumulate in lung tissue, and behavioural changes. | BODY WEIGHTS | 35. | Individual animal weights should be recorded shortly before the first exposure (day 0), twice weekly thereafter (for example: on Fridays and Mondays to demonstrate recovery over an exposure-free weekend, or at a time interval to allow assessment of systemic toxicity), and at the time of death or euthanasia. If there are no effects in the first 4 weeks, body weights may be measured weekly for the remainder of the study. Satellite (reversibility) animals (if used) should continue to be weighed weekly throughout the recovery period. At study termination, all animals should be weighed shortly before sacrifice to allow for an unbiased calculated of organ to body weight ratios. | FOOD AND WATER CONSUMPTION | 36. | Food consumption should be measured weekly. Water consumption may also be measured. | CLINICAL PATHOLOGY | 37. | Clinical pathology assessments should be made for all animals, including controls and satellite (reversibility) animals, when they are sacrificed. The time interval between the end of exposure and blood collection should be recorded, particularly when the reconstitution of the addressed endpoint is rapid. Sampling following the end of exposure is indicated for those parameters with a short plasma half-time (e.g. COHb, CHE, and MetHb). | 38. | Table 1 lists the clinical pathology parameters that are generally required for all toxicology studies. Urinalysis is not required on a routine basis, but may be performed when deemed useful based on expected or observed toxicity. The study director may choose to assess additional parameters in order to better characterise a test chemical’s toxicity (e.g. cholinesterase, lipids, hormones, acid/base balance, methaemoglobin or Heinz bodies, creatine kinase, myeloid/erythroid ratio, troponins, arterial blood gases, lactate dehydrogenase, sorbital dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, and gamma glutamyl transpeptidase). | Table 1 | Standard Clinical Pathology Parameters | Haematology | Erythrocyte count | Haematocrit | Haemoglobin concentration | Mean corpuscular haemoglobin | Mean corpuscular volume | Mean corpuscular haemoglobin concentration | Reticulocytes | Total leukocyte count | Differential leukocyte count | Platelet count | Clotting potential (select one): | — | Prothrombin time | — | Clotting time | — | Partial thromboplastin time | Clinical Chemistry | Glucose (*2) | Total cholesterol | Triglycerides | Blood urea nitrogen | Total bilirubin | Creatinine | Total protein | Albumin | Globulin | Alanine aminotransferase | Aspartate aminotransferase | Alkaline phosphatase | Potassium | Sodium | Calcium | Phosphorus | Chloride | Urinalysis (optional) | Appearance (colour and turbidity) | Volume | Specific gravity or osmolality | pH | Total protein | Glucose | Blood/blood cells | 39. | When there is evidence that the lower respiratory tract (i.e. the alveoli) is the primary site of deposition and retention, then bronchoalveolar lavage (BAL) may be the technique of choice to quantitatively analyse hypothesis-based dose-effect parameters focusing on alveolitis, pulmonary inflammation, and phospholipidosis. This allows for dose-response and time-course changes of alveolar injury to be suitably probed. The BAL fluid may be analysed for total and differential leukocyte counts, total protein, and lactate dehydrogenase. Other parameters that may be considered are those indicative of lysosomal injury, phospholipidosis, fibrosis, and irritant or allergic inflammation which may include the determination of pro-inflammatory cytokines/chemokines. BAL measurements generally complement the results from histopathology examinations but cannot replace them. Guidance on how to perform lung lavage can be found in GD 39 (2). | OPHTHALMOLOGICAL EXAMINATION | 40. | Using an ophthalmoscope or an equivalent device, ophthalmological examinations of the fundus, refractive media, iris, and conjunctivae should be performed for all animals prior to the administration of the test chemical, and for all high concentration and control groups at termination. If changes in the eyes are detected, all animals in the other groups should be examined including the satellite (reversibility) group. | GROSS PATHOLOGY AND ORGAN WEIGHTS | 41. | All test animals, including those which die during the test or are removed from the study for animal welfare reasons, should be subjected to complete exsanguination (if feasible) and gross necropsy. The time between the end of each animal’s last exposure and its sacrifice should be recorded. If a necropsy cannot be performed immediately after a dead animal is discovered, the animal should be refrigerated (not frozen) at a temperature low enough to minimise autolysis. Necropsies should be performed as soon as possible, normally within a day or two. All gross pathological changes should be recorded for each animal with particular attention to any changes in the respiratory tract. | 42. | Table 2 lists the organs and tissues that should be preserved in a suitable medium during gross necropsy for histopathological examination. The preservation of the [bracketed] organs and tissues and any other organs and tissues is at the discretion of the study director. The bolded organs should be trimmed and weighed wet as soon as possible after dissection to avoid drying. The thyroid and epididymides should only be weighed if needed because trimming artefacts may hinder histopathological evaluation. Tissues and organs should be fixed in 10 % buffered formalin or another suitable fixative as soon as necropsy is performed, and no less than 24-48 hours prior to trimming depending on the fixative to be used. | Table 2 | Organs and Tissues Preserved During Gross Necropsy | Adrenals | Aorta | Bone marrow (and/or fresh aspirate) | Brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | Caecum | Colon | Duodenum | [Epididymides] | [Eyes (retina, optic nerve) and eyelids] | Femur and stifle joint | Gallbladder (where present) | [Harderian glands] | Heart | Ileum | Jejunum | Kidneys | [Lacrimal glands (extraorbital)] | Larynx (3 levels including the base of the epiglottis) | Liver | Lung (all lobes at one level, including main bronchi) | Lymph nodes from the hilar region of the lung, especially for poorly soluble particulate test chemicals. For more in depth examinations and/or studies with immunological focus, additional lymph nodes may be considered, e.g. those from the mediastinal, cervical/submandibular and/or auricular regions. | Lymph nodes (distal from the portal-of-entry) | Mammary gland (female) | Muscle (thigh) | Nasopharyngeal tissues (at least 4 levels; 1 level to include the nasopharyngeal duct and the Nasal Associated Lymphoid Tissue (NALT)) | Oesophagus | [Olfactory bulb] | Ovaries | Pancreas | Parathyroids | Peripheral nerve (sciatic or tibial, preferably close to muscle) | Pituitary | Prostate | Rectum | Salivary glands | Seminal vesicles | Skin | Spinal cord (cervical, mid-thoracic, and lumbar) | Spleen | Sternum | Stomach | Teeth | Testes | Thymus | Thyroids | [Tongue] | Trachea (at least 2 levels including 1 longitudinal section through the carina and 1 transverse section) | [Ureter] | [Urethra] | Urinary bladder | Uterus | Target organs | All gross lesions and masses | 43. | The lungs should be removed intact, weighed, and instilled with a suitable fixative at a pressure of 20-30 cm of water to ensure that lung structure is maintained (5). Sections should be collected for all lobes at one level, including main bronchi, but if lung lavage is performed, the unlavaged lobe should be sectioned at three levels (not serial sections). | 44. | At least 4 levels of the nasopharyngeal tissues should be examined, one of which should include the nasopharyngeal duct (5) (6) (7) (8) (9) to allow adequate examination of the squamous, transitional (non-ciliated respiratory), respiratory (ciliated respiratory) and olfactory epithelium, and the draining lymphatic tissue (NALT) (10) (11). Three levels of the larynx should be examined, and one of these levels should include the base of the epiglottis (12). At least two levels of the trachea should be examined including one longitudinal section through the carina of the bifurcation of the extrapulmonary bronchi and one transverse section. | HISTOPATHOLOGY | 45. | A histopathological evaluation of all the organs and tissues listed in Table 2 should be performed for the control and high concentration groups, and for all animals which die or are sacrificed during the study. Particular attention should be paid to the respiratory tract, target organs, and gross lesions. The organs and tissues that have lesions in the high concentration group should be examined in all groups. The study director may choose to perform histopathological evaluations for additional groups to demonstrate a clear concentration response. When a satellite (reversibility) group is used, histopathological evaluation should be performed for all tissues and organs identified as showing effects in the treated groups. If there are excessive early deaths or other problems in the high exposure group that compromise the significance of the data, the next lower concentration should be examined histopathologically. An attempt should be made to correlate gross observations with microscopic findings. | DATA AND REPORTING | Data | 46. | Individual animal data on body weights, food consumption, clinical pathology, gross pathology, organ weights, and histopathology should be provided. Clinical observation data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals used, the number of animals displaying specific signs of toxicity, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons, time of death of individual animals, a description and time course of toxic effects and reversibility, and necropsy findings. All results, quantitative and incidental, should be evaluated by an appropriate statistical method. Any generally accepted statistical method may be used and the statistical methods should be selected during the design of the study. | Test Report | 47. | The test report should include the following information, as appropriate: | | Test animals and husbandry | — | Description of caging conditions, including: number (or change in number) of animals per cage, bedding material, ambient temperature and relative humidity, photoperiod, and identification of diet. | — | Species/strain used and justification for using a species other than the rat. Source and historical data may be provided, if they are for animals exposed under similar exposure, housing, and fasting conditions. | — | Number, age, and sex of animals. | — | Method of randomisation. | — | Description of any pre-test conditioning including diet, quarantine, and treatment for disease. | | Test chemical | — | Physical nature, purity, and, where relevant, physico-chemical properties (including isomerisation). | — | Identification data and Chemical Abstract Services (CAS) Registry Number, if known. | | Vehicle | — | Justification for use of vehicle and justification for choice of vehicle (if other than water). | — | Historical or concurrent data demonstrating that the vehicle does not interfere with the outcome of the study. | | Inhalation chamber | — | Detailed description of the inhalation chamber including volume and a diagram. | — | Source and description of equipment used for the exposure of animals as well as generation of atmosphere. | — | Equipment for measuring temperature, humidity, particle-size, and actual concentration. | — | Source of air and system used for conditioning. | — | Methods used for calibration of equipment to ensure a homogeneous test atmosphere. | — | Pressure difference (positive or negative). | — | Exposure ports per chamber (nose-only); location of animals in the chamber (whole-body). | — | Stability of the test atmosphere. | — | Location of temperature and humidity sensors and sampling of test atmosphere in the chamber. | — | Treatment of air supplied/extracted. | — | Air flow rates, air flow rate/exposure port (nose-only), or animal load/chamber (whole-body). | — | Time to inhalation chamber equilibrium (t95). | — | Number of volume changes per hour. | — | Metering devices (if applicable). | | Exposure data | — | Rationale for target concentration selection in the main study. | — | Nominal concentrations (total mass of test chemical generated into the inhalation chamber divided by the volume of air passed through the chamber). | — | Actual test chemical concentrations collected from the animals’ breathing zone; for mixtures that produce heterogeneous physical forms (gases, vapours, aerosols), each may be analysed separately. | — | All air concentrations should be reported in units of mass (mg/l, mg/m3, etc.) rather than in units of volume (ppm, ppb, etc.). | — | Particle size distribution, mass median aerodynamic diameter (MMAD), and geometric standard deviation (σg), including their methods of calculation. Individual particle size analyses should be reported. | | Test conditions | — | Details of test chemical preparation, including details of any procedures used to reduce the particle size of solid materials or to prepare solutions of the test chemical. | — | A description (preferably including a diagram) of the equipment used to generate the test atmosphere and to expose the animals to the test atmosphere. | — | Details of the equipment used to monitor chamber temperature, humidity, and chamber airflow (i.e. development of a calibration curve). | — | Details of the equipment used to collect samples for determination of chamber concentration and particle size distribution. | — | Details of the chemical analytical method used and method validation (including efficiency of recovery of test chemical from the sampling medium). | — | Method of randomisation in assigning animals to test and control groups. | — | Details of food and water quality (including diet type/source, water source). | — | The rationale for the selection of test concentrations. | | Results | — | Tabulation of chamber temperature, humidity, and airflow. | — | Tabulation of chamber nominal and actual concentration data. | — | Tabulation of particle size data including analytical sample collection data, particle size distribution, and calculations of the MMAD and σg. | — | Tabulation of response data and concentration level for each animal (i.e. animals showing signs of toxicity including mortality, nature, severity, time of onset, and duration of effects). | — | Tabulation of individual animal weights. | — | Tabulation of food consumption | — | Tabulation of clinical pathology data | — | Necropsy findings and histopathological findings for each animal, if available. | | Discussion and interpretation of results | — | Particular emphasis should be made to the description of methods used to meet the criteria of this Test Method, e.g. the limit concentration or the particle size. | — | The respirability of particles in light of the overall findings should be addressed, especially if the particle-size criteria could not be met. | — | The consistency of methods used to determine nominal and actual concentrations, and the relation of actual concentration to nominal concentration should be included in the overall assessment of the study. | — | The likely cause of death and predominant mode of action (systemic versus local) should be addressed. | — | An explanation should be provided if there was a need to humanely sacrifice animals in pain or showing signs of severe and enduring distress, based on the criteria in the OECD Guidance Document on Humane Endpoints (3). | — | The target organ(s) should be identified. | — | The NOAEL and LOAEL should be determined. | LITERATURE: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (4) | Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pp. 229-258. | (6) | Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. | (7) | Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238. | (8) | Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. | (9) | Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. | (10) | Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. | (11) | Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. | (12) | Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428. | (13) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006 (OJ L 353, 31.12.2008, p. 1). | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | B.30. CHRONIC TOXICITY STUDIES | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 452 (2009). The original TG 452 was adopted in 1981. Development of this revised Test Method B.30 was considered necessary in order to reflect recent developments in the field of animal welfare and regulatory requirements (1) (2) (3) (4). The updating of this Test Method B.30 has been carried out in parallel with revisions of Chapter B.32 of this Annex, Carcinogenicity Studies, and Chapter B.33 of this Annex, Combined Chronic Toxicity/Carcinogenicity studies, with the objective of obtaining additional information from the animals used in the study and providing further detail on dose selection. This Test Method is designed to be used in the testing of a broad range of chemicals, including pesticides and industrial chemicals. | 2. | The majority of chronic toxicity studies are carried out in rodent species, and this Test Method is intended therefore to apply primarily to studies carried out in these species. Should such studies be required in non-rodent species, the principles and procedures outlined in this Test Method, together with those outlined in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (5), may also be applied, with appropriate modifications, as outlined in the OECD Guidance Document No 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (6). | 3. | The three main routes of administration used in chronic toxicity studies are oral, dermal and inhalation. The choice of the route of administration depends on the physical and chemical characteristics of the test chemical and the predominant route of exposure of humans. Additional information on choice of route of exposure is provided in the OECD Guidance Document No 116 (6). | 4. | This Test Method focuses on exposure via the oral route, the route most commonly used in chronic toxicity studies. While long–term chronic toxicity studies involving exposure via the dermal or inhalation routes may also be necessary for human health risk assessment and/or may be required under certain regulatory regimes, both routes of exposure involve considerable technical complexity. Such studies will need to be designed on a case-by-case basis, although the Test Method outlined here for the assessment and evaluation of chronic toxicity by oral administration could form the basis of a protocol for inhalation and/or dermal studies, with respect to recommendations for treatment periods, clinical and pathology parameters, etc. OECD Guidance is available on the administration of test chemicals by the inhalation (6) (7) and dermal routes (6). Chapter B.8 of this Annex (8) and Chapter B.29 of this Annex (9), together with the OECD Guidance Document on acute inhalation testing (7), should be specifically consulted in the design of longer term studies involving exposure via the inhalation route. Chapter B.9 of this Annex (10) should be consulted in the case of testing carried out by the dermal route. | 5. | The chronic toxicity study provides information on the possible health hazards likely to arise from repeated exposure over a considerable part of the lifespan of the species used. The study will provide information on the toxic effects of the test chemical; indicate target organs and the possibility of accumulation. It can also provide an estimate of the no-observed-adverse effect level which can be used for establishing safety criteria for human exposure. The need for careful clinical observations of the animals, so as to obtain as much information as possible, is also stressed. | 6. | The objectives of studies covered by this Test Method include: | — | The identification of the chronic toxicity of a test chemical; | — | The identification of target organs; | — | Characterisation of the dose-response relationship; | — | Identification of a no-observed-adverse-effect level (NOAEL) or point of departure for establishment of a Benchmark Dose (BMD); | — | The prediction of chronic toxicity effects at human exposure levels; | — | Provision of data to test hypotheses regarding mode of action (6). | INITIAL CONSIDERATIONS | 7. | In the assessment and evaluation of the toxicological characteristics of a test chemical, all available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study, in order to focus the design of the study to more efficiently test for chronic toxicity potential and to minimize animal usage. Information that will assist in the study design includes the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; any information on the mode of action; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally-related chemicals; available toxicokinetic data (single dose and also repeat dose kinetics where available) and data derived from other repeated exposure studies. The determination of chronic toxicity should only be carried out after initial information on toxicity has been obtained from repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests. A phased testing approach to chronic toxicity testing should be considered as part of the overall assessment of the potential adverse health effects of a particular test chemical (11) (12) (13) (14). | 8. | The statistical methods most appropriate for the analysis of results, given the experimental design and objectives, should be established before commencing the study. Issues to consider include whether the statistics should include adjustment for survival and analysis in the event of premature termination of one or more groups. Guidance on the appropriate statistical analyses and key references to internationally accepted statistical methods are given in Guidance Document No 116 (6), and also in Guidance Document No 35 on the analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (15). | 9. | In conducting a chronic toxicity study, the guiding principles and considerations outlined in the OECD Guidance Document No 19 on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (16), in particular paragraph 62 thereof, should always be followed. This paragraph states that “In studies involving repeated dosing, when an animal shows clinical signs that are progressive, leading to further deterioration in condition, an informed decision as to whether or not to humanely kill the animal should be made. The decision should include consideration as to the value of the information to be gained from the continued maintenance of that animal on study relative to its overall condition. If a decision is made to leave the animal on test, the frequency of observations should be increased, as needed. It may also be possible, without adversely affecting the purpose of the test, to temporarily stop dosing if it will relieve the pain or distress, or reduce the test dose.” | 10. | Detailed guidance on and discussion of the principles of dose selection for chronic toxicity and carcinogenicity studies can be found in Guidance Document No 116 (6), as well as two International Life Sciences Institute publications (17) (18). The core dose selection strategy is dependent on the primary objective or objectives of the study (paragraph 6). In selecting appropriate dose levels, a balance should be achieved between hazard screening on the one hand and characterisation of low-dose responses and their relevance on the other. This is particularly relevant in the situation where a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex) is to be carried out (paragraph 11). | 11. | Consideration should be given to carrying out a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex), rather than separate execution of a chronic toxicity study (this Test Method B.30) and carcinogenicity study (Chapter B.32 of this Annex). The combined test provides greater efficiency in terms of time and cost compared to conducting two separate studies, without compromising the quality of the data in either the chronic phase or the carcinogenicity phase. Careful consideration should however be given to the principles of dose selection (paragraphs 9 and 20-25) when undertaking a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex), and it is also recognised that separate studies may be required under certain regulatory frameworks. | 12. | Definitions used in the context of this Test Method can be found at the end of this chapter and in the Guidance Document No 116 (6). | PRINCIPLE OF THE TEST | 13. | The test chemical is administered daily in graduated doses to several groups of experimental animals, normally for a period of 12 months, although longer or shorter durations may also be chosen depending on regulatory requirements (see paragraph 33). This duration is chosen to be sufficiently long to allow any effects of cumulative toxicity to become manifest, without the confounding effects of geriatric changes. Deviations from exposure duration of 12 months should be justified, particularly in the case of shorter durations. The test chemical is normally administered by the oral route although testing by the inhalation or dermal route may also be appropriate. The study design may also include one or more interim kills, e.g. at 3 and 6 months, and additional groups of animals may be included to accommodate this (see paragraph 19). During the period of administration the animals are observed closely for signs of toxicity. Animals which die or are killed during the test are necropsied and, at the conclusion of the test, surviving animals are killed and necropsied. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 14. | This Test Method primarily covers assessment and evaluation of chronic toxicity in rodents (see paragraph 2) although it is recognised that similar studies in non-rodents may be required under certain regulatory regimes. The choice of species should be justified. The design and conduct of chronic toxicity studies in non-rodent species, when required, should be based on the principles outlined in this Test Method together with those in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (5). Additional information on choice of species and strain is provided in Guidance Document No 116 (6). | 15. | In this Test Method, the preferred rodent species is the rat, although other rodent species, e.g. the mouse, may be used. Rats and mice have been preferred experimental models because of their relatively short life span, their widespread use in pharmacological and toxicological studies, their susceptibility to tumour induction, and the availability of sufficiently characterised strains. As a consequence of these characteristics, a large amount of information is available on their physiology and pathology. Young healthy adult animals of commonly used laboratory strains should be employed. The chronic toxicity study should be carried out in animals from the same strain and source as those used in preliminary toxicity study(ies) of shorter duration. The females should be nulliparous and non-pregnant. | Housing and feeding conditions | 16. | Animals may be housed individually, or be caged in small groups of the same sex; individual housing should be considered only if scientifically justified (19) (20) (21). Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimised. The temperature in the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C). Although the relative humidity should be at least 30 % and preferably not exceed 70 % other than during room cleaning, the aim should be 50-60 %. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light, 12 hours dark. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. The diet should meet all the nutritional requirements of the species tested and the content of dietary contaminants including but not limited to pesticide residues, persistent organic pollutants, phytoestrogens, heavy metals and mycotoxins, that might influence the outcome of the test, should be as low as possible. Analytical information on the nutrient and dietary contaminant levels should be generated periodically, at least at the beginning of the study and when there is a change in the batch used, and should be included in the final report. Analytical information on the drinking water used in the study should similarly be provided. The choice of diet may be influenced by the need to ensure a suitable admixture of a test chemical and to meet the nutritional requirements of the animals when the test chemical is administered by the dietary route. | Preparation of animals | 17. | Healthy animals, which have been acclimated to laboratory conditions for at least 7 days and have not been subjected to previous experimental procedures, should be used. In the case of rodents, dosing of the animals should begin as soon as possible after weaning and acclimatisation and preferably before the animals are 8 weeks old. The test animals should be characterised as to species, strain, source, sex, weight and age. At the commencement of the study, the weight variation for each sex of animals used should be minimal and not exceed ± 20 % of the mean weight of all the animals within the study, separately for each sex. Animals should be randomly assigned to the control and treatment groups. After randomisation, there should be no significant differences in mean body weights between groups within each sex. If there are statistically significant differences, then the randomisation step should be repeated, if possible. Each animal should be assigned a unique identification number, and permanently marked with this number by tattooing, microchip implant, or other suitable method. | PROCEDURE | Number and sex of animals | 18. | Both sexes should be used. A sufficient number of animals should be used so that at the end of the study enough animals in every group are available for thorough biological and statistical evaluation. For rodents, at least 20 animals per sex per group should normally be used at each dose level, while for non-rodents a minimum of 4 per sex per group is recommended. In studies involving mice, additional animals may be needed in each dose group to conduct all required haematological determinations. | Provision for interim kills, satellite groups and sentinel animals | 19. | The study may make provision for interim kills (at least 10 animals/sex/group), e.g. at 6 months, to provide information on progression of toxicological changes and mechanistic information, if scientifically justified. Where such information is already available from previous repeat dose toxicity studies on the test chemical, interim kills may not be scientifically justified. Satellite groups may also be included to monitor the reversibility of any toxicological changes induced by the test chemical under investigation; these will normally be restricted to the highest dose level of the study plus control. An additional group of sentinel animals (typically 5 animals per sex) may also be included for monitoring of disease status, if necessary, during the study (22). If interim kills or inclusion of satellite or sentinel groups are planned, the number of animals included in the study design should be increased by the number of animals scheduled to be killed before the completion of the study. These animals should normally undergo the same observations, including body weight, food/water consumption, haematological and clinical biochemistry measurements and pathological investigations as the animals in the chronic toxicity phase of the main study, although provision may also be made (in the interim kill groups) for measurements to be restricted to specific, key measures such as neurotoxicity or immunotoxicity. | Dose groups and dosage | 20. | Guidance on all aspects of dose selection and dose level spacing is provided in Guidance Document No 116 (6). At least three dose levels and a concurrent control should be used, except where a limit test is conducted (see paragraph 27). Dose levels will generally be based on the results of shorter-term repeated dose or range finding studies and should take into account any existing toxicological and toxicokinetic data available for the test chemical or related chemicals. | 21. | Unless limited by the physical-chemical nature or biological effects of the test chemical, the highest dose level should normally be chosen to identify the principal target organs and toxic effects while avoiding suffering, severe toxicity, morbidity, or death. While taking into account the factors outlined in paragraph 22 below, the highest dose level should be chosen to elicit evidence of toxicity, as evidenced by, for example, depression of body weight gain (approximately 10 %). | 22. | However, dependent on the objectives of the study (see paragraph 6), a top dose lower than the dose providing evidence of toxicity may be chosen, e.g. if a dose elicits an adverse effect of concern that nonetheless has little impact on lifespan or body weight. The top dose should not exceed 1 000 mg/kg body weight/day (limit dose, see paragraph 27). | 23. | Dose levels and dose level spacing may be selected to establish a dose-response and a NOAEL or other intended outcome of the study, e.g. a BMD (see paragraph 25) at the lowest dose level. Factors that should be considered in the placement of lower doses include the expected slope of the dose–response curve, the doses at which important changes may occur in metabolism or mode of toxic action, where a threshold is expected, or where a point of departure for low-dose extrapolation is expected. | 24. | The dose level spacing selected will depend on the characteristics of the test chemical, and cannot be prescribed in this Test Method, but two to four fold intervals frequently provide good test performance when used for setting the descending dose levels and addition of a fourth test group is often preferable to using very large intervals (e.g. more than a factor of about 6-10) between dosages. In general the use of factors greater than 10 should be avoided, and should be justified if used. | 25. | As outlined further in Guidance Document No 116 (6), points to be considered in dose selection include: | — | Known or suspected nonlinearities or inflection points in the dose–response; | — | Toxicokinetics, and dose ranges where metabolic induction, saturation, or nonlinearity between external and internal doses does or does not occur; | — | Precursor lesions, markers of effect, or indicators of the operation of key underlying biological processes; | — | Key (or suspected) aspects of mode of action, such as doses at which cytotoxicity begins to arise, hormone levels are perturbed, homeostatic mechanisms are overwhelmed, etc.; | — | Regions of the dose–response curve where particularly robust estimation is needed, e.g. in the range of the anticipated BMD or a suspected threshold; | — | Consideration of anticipated human exposure levels. | 26. | The control group shall be an untreated group or a vehicle-control group if a vehicle is used in administering the test chemical. Except for treatment with the test chemical, animals in the control group should be handled in an identical manner to those in the test groups. If a vehicle is used, the control group shall receive the vehicle in the highest volume used among the dose groups. If a test chemical is administered in the diet, and causes significantly reduced dietary intake due to the reduced palatability of the diet, an additional pair-fed control group may be useful, to serve as a more suitable control. | 27. | If it can be anticipated, based on information from preliminary studies, that a test at one dose level, equivalent to at least 1 000 mg/kg body weight/day, using the procedures described for this study, is unlikely to produce adverse effects and if toxicity would not be expected based upon data from structurally related chemicals, then a full study using three dose levels may not be considered necessary. A limit of 1 000 mg/kg body weight/day may apply except when human exposure indicates the need for a higher dose level to be used. | Preparation of doses and administration of test chemical | 28. | The test chemical is normally administered orally, via the diet or drinking water, or by gavage. Additional information on routes and methods of administration is provided in Guidance Document No 116 (6). The route and method of administration is dependent on the purpose of the study, the physical/chemical properties of the test chemical, its bioavailability and the predominant route and method of exposure of humans. A rationale should be provided for the chosen route and method of administration. In the interests of animal welfare, oral gavage should normally be selected only for those agents for which this route and method of administration reasonably represent potential human exposure (e.g. pharmaceuticals). For dietary or environmental chemicals including pesticides, administration is typically via the diet or drinking water. However, for some scenarios, e.g. occupational exposure, administration via other routes may be more appropriate. | 29. | Where necessary, the test chemical is dissolved or suspended in a suitable vehicle. Consideration should be given to the following characteristics of the vehicle and other additives, as appropriate: effects on the absorption, distribution, metabolism, or retention of the test chemical; effects on the chemical properties of the test chemical which may alter its toxic characteristics; and effects on the food or water consumption or the nutritional status of the animals. It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solution/suspension be considered first, followed by consideration of a solution/emulsion in oil (e.g. corn oil) and then by possible solution in other vehicles. For vehicles other than water, the toxic characteristics of the vehicle should be known. Information should be available on the stability of the test chemical and the homogeneity of dosing solutions or diets (as appropriate) under the conditions of administration (e.g. diet). | 30. | For chemicals administered via the diet or drinking water it is important to ensure that the quantities of the test chemical involved do not interfere with normal nutrition or water balance. In long-term toxicity studies using dietary administration, the concentration of the test chemical in the feed should not normally exceed an upper limit of 5 % of the total diet, in order to avoid nutritional imbalances. When the test chemical is administered in the diet, either a constant dietary concentration (mg/kg diet or ppm) or a constant dose level in terms of the animal’s body weight (mg/kg body weight), calculated on a weekly basis, may be used. The alternative used should be specified. | 31. | In the case of oral administration, the animals are dosed with the test chemical daily (seven days each week), normally for a period of 12 months (see also paragraph 33), although a longer duration may be required depending on regulatory requirements. Any other dosing regime, e.g. five days per week, needs to be justified. In the case of dermal administration, animals are normally treated with the test chemical for at least 6 hours per day, 7 days per week, as specified in Chapter B.9 of this Annex (10), for a period of 12 months. Exposure by the inhalation route is carried out for 6 hours per day, 7 days per week, but exposure for 5 days per week may also be used, if justified. The period of exposure will normally be for a period of 12 months. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration of less than 6 hours per day. See also Chapter B.8 of this Annex (8). | 32. | When the test chemical is administered by gavage to the animals this should be done using a stomach tube or a suitable intubation cannula, at similar times each day. Normally a single dose will be administered once daily, where for example a chemical is a local irritant, it may be possible to maintain the daily dose-rate by administering it as a split dose (twice a day). The maximum volume of liquid that can be administered at one time depends on the size of the test animal. The volume should be kept as low as practical, and should not normally exceed 1 ml/100 g body weight for rodents (22). Variability in test volume should be minimised by adjusting the concentration to ensure a constant volume at all dose levels. Potentially corrosive or irritant chemicals are the exception, and need to be diluted to avoid severe local effects. Testing at concentrations that are likely to be corrosive or irritant to the gastrointestinal tract should be avoided. | Duration of study | 33. | While this Test Method primarily is designed as a 12 month chronic toxicity study, the study design also allows for and can be applied to either shorter (e.g. 6 or 9 months) or longer (e.g. 18 or 24 months) duration studies, depending on the requirements of particular regulatory regimes or for specific mechanistic purposes. Deviations from an exposure duration of 12 months should be justified, particularly in the case of shorter durations. Satellite groups included to monitor the reversibility of any toxicological changes induced by the test chemical under investigation should be maintained without dosing for a period not less than 4 weeks and not more than one third of the total study duration after cessation of exposure. Further guidance, including consideration of survival in the study, is provided in Guidance Document No 116 (6). | OBSERVATIONS | 34. | All animals should be checked for morbidity or mortality, usually at the beginning and end of each day, including at weekends and holidays. General clinical observations should be made at least once a day, preferably at the same time(s) each day, taking into consideration the peak period of anticipated effects after dosing in the case of gavage administration. | 35. | Detailed clinical observations should be made on all animals at least once prior to the first exposure (to allow for within-subject comparisons), at the end of the first week of the study and monthly thereafter. The protocol for observations should be arranged such that variations between individual observers are minimised and independent of test group. These observations should be made outside the home cage, preferably in a standard arena and at similar times on each occasion. They should be carefully recorded, preferably using scoring systems, explicitly defined by the testing laboratory. Efforts should be made to ensure that variations in the observation conditions are minimal. Signs noted should include, but not be limited to, changes in skin, fur, eyes, mucous membranes, occurrence of secretions and excretions and autonomic activity (e.g. lacrimation, piloerection, pupil size, and unusual respiratory pattern). Changes in gait, posture and response to handling as well as the presence of clonic or tonic movements, stereotypies (e.g. excessive grooming, repetitive circling) or bizarre behaviour (e.g. self-mutilation, walking backwards) should also be recorded (24). | 36. | Ophthalmological examination, using an ophthalmoscope or other suitable equipment, should be carried out on all animals prior to the first administration of the test chemical. At the termination of the study, this examination should be preferably conducted in all animals but at least in the high dose and control groups. If treatment-related changes in the eyes are detected, all animals should be examined. If structural analysis or other information suggests ocular toxicity, then the frequency of ocular examination should be increased. | 37. | For chemicals where previous repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests indicated the potential to cause neurotoxic effects, sensory reactivity to stimuli of different types (24) (e.g. auditory, visual and proprioceptive stimuli) (25), (26), (27), assessment of grip strength (28) and motor activity assessment (29) may optionally be conducted before commencement of the study and at 3 month periods after study initiation up to and including 12 months, as well as at study termination (if longer than 12 months). Further details of the procedures that could be followed are given in the respective references. However, alternative procedures than those referenced could also be used. | 38. | For chemicals where previous repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests indicated the potential to cause immunotoxic effects, further investigations of this endpoint may optionally be conducted at termination. | Body weight, food/water consumption and food efficiency | 39. | All animals should be weighed at the start of treatment, at least once a week for the first 13 weeks, and at least monthly thereafter. Measurements of food consumption and food efficiency should be made at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Water consumption should be measured at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter when the chemical is administered in drinking water. Water consumption measurements should also be considered for studies in which drinking activity is altered. | Haematology and clinical biochemistry | 40. | In studies involving rodents, haematological examinations should be carried out in at least 10 male and 10 female animals per group, at 3, 6, and 12 months, as well as at study termination (if longer than 12 months), using the same animals throughout. In mice, satellite animals may be needed in order to conduct all required haematological determinations (see paragraph 18). In non-rodent studies, samples will be taken from smaller numbers of animals (e.g. 4 animals per sex and per group in dog studies), at interim sampling times and at termination as described for rodents. Measurements at 3 months, either in rodents or non-rodents, need not be conducted if no effect was seen on haematological parameters in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. Blood samples should be taken from a named site, for example by cardiac puncture or from the retro-orbital sinus, under anaesthesia. | 41. | The following list of parameters should be investigated (30): Total and differential leukocyte count, erythrocyte count, platelet count, haemoglobin concentration, haematocrit (packed cell volume), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular haemoglobin (MCH), mean corpuscular haemoglobin concentration (MCHC), prothrombin time, and activated partial thromboplastin time. Other hematology parameters such as Heinz bodies or other atypical erythrocyte morphology or methaemoglobin may be measured as appropriate depending on the toxicity of the test chemical. Overall, a flexible approach should be adopted, depending on the observed and/or expected effect from a given test chemical. If the test chemical has an effect on the haematopoietic system, reticulocyte counts and bone marrow cytology may also be indicated, although these need not be routinely conducted. | 42. | Clinical biochemistry determinations to investigate major toxic effects in tissues and, specifically, effects on kidney and liver, should be performed on blood samples obtained from at least 10 male and 10 female animals per group at the same time intervals as specified for the haematological investigations, using the same animals throughout. In mice, satellite animals may be needed in order to conduct all required clinical biochemistry determinations. In non-rodent studies, samples will be taken from smaller numbers of animals (e.g. 4 animals per sex and per group in dog studies), at interim sampling times and at termination as described for rodents. Measurements at 3 months, either in rodents or non-rodents, need not be conducted if no effect was seen on clinical biochemistry parameters in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. Overnight fasting of the animals (with the exception of mice) prior to blood sampling is recommended The following list of parameters should be investigated (30): glucose, urea (urea nitrogen), creatinine, total protein, albumin, calcium, sodium, potassium, total cholesterol, at least two appropriate tests for hepatocellular evaluation (alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, glutamate dehydrogenase, total bile acids) (31), and at least two appropriate tests for hepatobiliary evaluation (alkaline phosphatase, gamma glutamyl transferase, 5’-nucleotidase, total bilirubin, total bile acids) (31). Other clinical chemistry parameters such as fasting triglycerides, specific hormones and cholinesterase may be measured as appropriate, depending on the toxicity of the test chemical. Overall, there is a need for a flexible approach, depending on the observed and/or expected effect from a given test chemical. | 43. | Urinalysis determinations should be performed on at least 10 male and 10 female animals per group on samples collected at the same intervals as for haematology and clinical chemistry. Measurements at 3 months need not be conducted if no effect was seen on urinalysis in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. The following list of parameters was included in an expert recommendation on clinical pathology studies (30): appearance, volume, osmolality or specific gravity, pH, total protein, and glucose. Other determinations include ketone, urobilinogen, bilirubin, and occult blood. Further parameters may be employed where necessary to extend the investigation of observed effect(s). | 44. | It is generally considered that baseline haematological and clinical biochemistry variables are needed before treatment for dog studies, but need not be determined in rodent studies (30). However, if historical baseline data (see paragraph 50) are inadequate, consideration should be given to generating such data. | Pathology | Gross necropsy | 45. | All animals in the study shall normally be subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. However provision may also be made (in the interim kill or satellite groups) for measurements to be restricted to specific, key measures such as neurotoxicity or immunotoxicity (see paragraph 19). These animals need not be subjected to necropsy and the subsequent procedures described in the following paragraphs. Sentinel animals may require necropsy on a case-by-case basis, at the discretion of the study director. | 46. | Organ weights should be collected from all animals, other than those excluded by the latter part of paragraph 45. The adrenals, brain, epididymides, heart, kidneys, liver, ovaries, spleen, testes, thyroid (weighed post-fixation, with parathyroids), and uterus of all animals (apart from those found moribund and/or intercurrently killed) should be trimmed of any adherent tissue, as appropriate, and their wet weight taken as soon as possible after dissection to prevent drying. In a study using mice, weighing of the adrenal glands is optional. | 47. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (32) (tissues in square brackets are optional): | all gross lesions | heart | pancreas | stomach (forestomach, glandular stomach) | adrenal gland | ileum | parathyroid gland | [teeth] | aorta | jejunum | peripheral nerve | testis | brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | kidney | pituitary | thymus | caecum | lacrimal gland (exorbital) | prostate | thyroid | cervix | liver | rectum | [tongue] | coagulating gland | lung | salivary gland | trachea | colon | lymph nodes (both superficial and deep) | seminal vesicle | urinary bladder | duodenum | mammary gland (obligatory for females and, if visibly dissectable, from males) | skeletal muscle | uterus (including cervix) | epididymis | [upper respiratory tract, including nose, turbinates, and paranasal sinuses] | skin | [ureter] | eye (including retina) | oesophagus | spinal cord (at three levels: cervical, mid-thoracic, and lumbar) | [urethra] | [femur with joint] | [olfactory bulb] | spleen | vagina | gall bladder (for species other than rat) | ovary | [sternum], | section of bone marrow and/or a fresh bone marrow aspirate | Harderian gland | | | | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be preserved. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. In studies involving the dermal route of administration, the list of organs as set out for the oral route should be preserved, and specific sampling and preservation of the skin from the site of application is essential. In inhalation studies, the list of preserved and examined tissues from the respiratory tract should follow the recommendations of Chapters B.8 of this Annex (8) and Chapter B.29 of this Annex (9). For other organs/tissues (and in addition to the specifically preserved tissues from the respiratory tract) the list of organs as set out for the oral route should be examined. | Histopathology | 48. | Guidance is available on best practices in the conduct of toxicological pathology studies (32). The minimum histopathological examinations should be: | — | all tissues from the high dose and control groups; | — | all tissues from animals dying or killed during the study; | — | all tissues showing macroscopic abnormalities; | — | target tissues, or tissues which showed treatment-related changes in the high dose group, from all animals in all other dose groups; | — | in the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be examined. | DATA AND REPORTING | Data | 49. | Individual animal data should be provided for all parameters evaluated. Additionally, all data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals at the start of the test, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons and the time of any death or humane kill, the number showing signs of toxicity, a description of the signs of toxicity observed, including time of onset, duration, and severity of any toxic effects, the number of animals showing lesions, the type of lesions and the percentage of animals displaying each type of lesion. Summary data tables should provide the means and standard deviations (for continuous test data) of animals showing toxic effects or lesions, in addition to the grading of lesions. | 50. | Historical control data may be valuable in the interpretation of the results of the study, e.g. in the case when there are indications that the data provided by the concurrent controls are substantially out of line when compared to recent data from control animals from the same test facility/colony. Historical control data, if evaluated, should be submitted from the same laboratory and relate to animals of the same age and strain generated during the five years preceding the study in question. | 51. | When applicable, numerical results should be evaluated by an appropriate and generally acceptable statistical method. The statistical methods and the data to be analysed should be selected during the design of the study (paragraph 8). Selection should make provision for survival adjustments, if needed. | Test Report | 52. | The test report should include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature, purity, and physicochemical properties; | — | identification data; | — | source of chemical; | — | batch number; | — | certificate of chemical analysis | | Vehicle (if appropriate): | — | justification for choice of vehicle (if other than water). | | Test animals: | — | species/strain used and justification for choice made; | — | number, age, and sex of animals at start of test; | — | source, housing conditions, diet, etc.; | — | individual weights of animals at the start of the test. | | Test conditions: | — | rationale for route of administration and dose selection; | — | when applicable, the statistical methods used to analyse the data; | — | details of test chemical formulation/diet preparation; | — | analytical data on achieved concentration, stability and homogeneity of the preparation; | — | route of administration and details of the administration of the test chemical; | — | for inhalation studies, whether nose only or whole body; | — | actual doses (mg/kg body weight/day), and conversion factor from diet/drinking water test chemical concentration (mg/kg or ppm) to the actual dose, if applicable; | — | details of food and water quality. | | Results (summary tabulated data and individual animal data should be presented): | — | survival data; | — | body weight/body weight changes; | — | food consumption, calculations of food efficiency, if made, and water consumption if applicable; | — | toxic response data by sex and dose level, including signs of toxicity; | — | nature, incidence (and, if scored, severity), and duration of clinical observations ((whether transitory or permanent); | — | ophthalmological examination; | — | haematological tests; | — | clinical biochemistry tests; | — | urinalysis tests; | — | outcome of any investigations of neurotoxicity or immunotoxicity; | — | terminal body weight; | — | organ weights (and their ratios, if applicable); | — | necropsy findings; | — | a detailed description of all treatment-related histopathological findings; | — | absorption data if available; | | Statistical treatment of results, as appropriate | | Discussion of results including: | — | Dose: response relationships | — | Consideration of any mode of action information | — | Discussion of any modelling approaches | — | BMD, NOAEL or LOAEL determination | — | Historical control data | — | Relevance for humans | | Conclusions | LITERATURE: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208. | (3) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191. | (4) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. | (5) | Chapter B.27 of this Annex, Sub-chronic Oral Toxicity Test Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents. | (6) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (7) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (8) | Chapter B.8 of this Annex, Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study. | (9) | Chapter B.29 of this Annex, Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study. | (10) | Chapter B.9 of this Annex, Repeated Dose (28 Days) Toxicity (Dermal). | (11) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. | (12) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (13) | Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68. | (14) | Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98. | (15) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No 35 and Series on Pesticides No 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. | (16) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (17) | Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 - 837. | (18) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. | (19) | Directive 2010/63/EU of the European parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (OJ L 276, 20.10.2010, p. 33). | (20) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (21) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (22) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (23) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. | (24) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60. | (25) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (26) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. | (27) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (28) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. | (29) | Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. | (30) | Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (31) | EMEA (draft) document “Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). | (32) | Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | ’ |
| 6. | poglavji B.32 in B.33 se nadomestita z naslednjima: | „B.32 ŠTUDIJE RAKOTVORNOSTI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 451 (2009). Prvotna TG 451 v zvezi s študijami rakotvornosti je bila sprejeta leta 1981. Priprava te revidirane preskusne metode B.32 je bila ocenjena kot nujna zaradi upoštevanja nedavnega razvoja na področju dobrobiti živali in zakonodajnih zahtev (2) (3) (4) (5) (6). Ta preskusna metoda B.32 je bila posodobljena vzporedno z revizijama poglavja B.30 te priloge z naslovom ‚Študije kronične strupenosti‘ in poglavja B.33 te priloge z naslovom ‚Kombinirane študije kronične strupenosti/rakotvornosti‘, da bi se z uporabo živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo več podatkov o izbiri odmerkov. Ta preskusna metoda B.32 je zasnovana za preskušanje zelo različnih kemikalij, vključno s pesticidi in industrijskimi kemikalijami. Vendar je treba opozoriti, da so lahko nekatere podrobnosti in zahteve za farmacevtske izdelke drugačne (glej Smernico Mednarodne konference o usklajevanju (ICH) S1B o preskušanju rakotvornosti farmacevtskih izdelkov). | 2. | Večina študij rakotvornosti se opravi na glodavcih, zato je ta preskusna metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso glodavci, se lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo načela in postopki, opisani v tej preskusni metodi, ter načela in postopki iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodavcih‘ (6). Več napotkov je na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (7). | 3. | Glavni trije načini dajanja, ki se uporabljajo v študijah rakotvornosti, so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira načina dajanja je odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prevladujočega načina izpostavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri načina izpostavljenosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 4. | Ta preskusna metoda je osredotočena na oralno izpostavljenost, ki se v študijah rakotvornosti uporablja najpogosteje. Študije rakotvornosti, ki vključujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavljenost, so lahko prav tako potrebne za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena načina izpostavljenosti tehnično precej zapletena. Take študije je treba zasnovati za vsak primer posebej, je pa mogoče preskusno metodo za ocenjevanje in vrednotenje rakotvornosti z oralnim načinom dajanja, opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo za protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporočila glede obdobij tretiranja, kliničnih in patoloških parametrov itd. Za dermalni (7) in inhalacijski način dajanja (7) (8) preskusnih kemikalij so na voljo napotki OECD. Pri zasnovi dolgoročnejših študij z inhalacijsko izpostavljenostjo je treba podrobno preučiti poglavji B.8 (9) in B.29 te priloge (10) ter Dokument s smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdihavanju (8). V primeru preskušanja z dermalnim načinom dajanja je treba upoštevati poglavje B.9 te priloge (11). | 5. | S študijo rakotvornosti se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki se lahko pojavijo ob ponavljajoči se izpostavljenosti v obdobju, ki obsega največ celotno življenjsko dobo uporabljene vrste. Z njo se pridobijo informacije o strupenih učinkih preskusne kemikalije, vključno s potencialno rakotvornostjo, lahko pa se nakažejo tudi ciljni organi in možnost kopičenja. S študijo se lahko oceni vrednost brez opaženega škodljivega učinka za strupene učinke in – v primeru rakotvornih snovi, ki niso genotoksične – za tumorske odzive, ki se lahko uporabi za določitev varnostnih meril za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi potreba po skrbnem kliničnem opazovanju živali, da se pridobi kar največ informacij. | 6. | Cilji študij rakotvornosti, na katere se nanaša ta preskusna metoda, vključujejo: | — | opredelitev rakotvornih lastnosti preskusne kemikalije, ki v primerjavi s sočasnimi kontrolnimi skupinami privedejo do povečane pojavnosti novotvorb, povečanega deleža malignih novotvorb ali skrajšanja časa do pojava novotvorb, | — | opredelitev ciljnih organov rakotvornosti, | — | opredelitev časa do pojava novotvorb, | — | opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom za tumorje, | — | opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega učinka (NOAEL) ali izhodiščne točke za določitev primerjalnega odmerka (benchmark dose – BMD), | — | ekstrapolacijo rakotvornih učinkov na stopnje izpostavljenosti ljudi pri majhnih odmerkih, | — | zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede načina delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15). | ZAČETNI PREUDARKI | 7. | Pri ocenjevanju in vrednotenju potencialne rakotvornosti preskusne kemikalije mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, da se zasnova študije osredotoči na učinkovitejše preskušanje rakotvornega potenciala in da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Informacije o načinu delovanja domnevne rakotvorne snovi in upoštevanje njenega načina delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15) so posebej pomembni, saj se lahko optimalna zasnova študije razlikuje glede na to, ali je preskusna kemikalija znana ali domnevna genotoksična rakotvorna snov. Več napotkov o preudarkih v zvezi z načinom delovanja je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 8. | Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo, vključno s preskusi genotoksičnosti; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR, podatke o mutagenosti/genotoksičnosti in rakotvornosti ter druge toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh; razpoložljive toksikokinetične podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem odmerku in tudi pri ponavljajočih se odmerkih, če so na voljo) ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajočo se izpostavljenostjo. Rakotvornost je treba ocenjevati šele po pridobitvi začetnih informacij o strupenosti na podlagi 28-dnevnega in/ali 90-dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajočimi se odmerki. Koristne informacije se lahko zagotovijo tudi s kratkoročnimi preskusi iniciacije/spodbujanja razvoja raka. V okviru splošne ocene potencialnih škodljivih učinkov določene preskusne kemikalije na zdravje je treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju rakotvornosti (16) (17) (18) (19). | 9. | Pred začetkom študije je treba določiti najprimernejše statistične metode za analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, o katerih je treba razmisliti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vključevati prilagoditev glede na preživetje, analizo kumulativnih tveganj tumorjev glede na trajanje preživetja, analizo časa do pojava tumorjev in analizo v primeru predčasnega prenehanja tretiranja ene ali več skupin. Napotki o primernih statističnih analizah in ključne reference mednarodno priznanih statističnih metod so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v Dokumentu s smernicami št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (20). | 10. | Pri izvajanju študije rakotvornosti je treba vedno upoštevati vodilna načela in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o prepoznavanju, ocenjevanju in uporabi kliničnih znakov kot humanih končnih točk za preskusne živali v oceni varnosti (21), zlasti odstavek 62 navedenega dokumenta. V tem odstavku je navedeno: ‚Pri študijah, ki vključujejo ponavljajoče se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odločitev, ali naj se žival humano usmrti ali ne, če kaže klinične znake, ki se stopnjujejo in vodijo v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odločitev mora vključevati razmislek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranitvijo zadevne živali v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme odločitev, da se žival ohrani v preskusu, je treba po potrebi povečati pogostnost opazovanj. Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa začasno prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bolečine ali trpljenje, ali da se zmanjša preskusni odmerek.‘ | 11. | Podrobni napotki in razprava o načelih izbire odmerkov za študije kronične strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (22) (23). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glavnega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni ter opredeljevanjem učinkov majhnih odmerkov in njihovim pomenom na drugi strani. To je zlasti pomembno, kadar bo izvedena kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) (odstavek 12). | 12. | Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto ločene izvedbe študije kronične strupenosti (poglavje B.30 te priloge) in študije rakotvornosti (ta preskusna metoda B.32) izvede kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge). S kombiniranim preskusom se v primerjavi z izvedbo dveh ločenih študij zagotovi večja učinkovitost v smislu časa in stroškov, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost podatkov v fazi v zvezi s kronično strupenostjo ali fazi v zvezi z rakotvornostjo. Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) skrbno upoštevati načela izbire odmerkov (odstavki 11 in 22–25), poleg tega pa se tudi priznava, da se na podlagi nekaterih zakonodajnih okvirov lahko zahteva ločena izvedba študij. | 13. | Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | NAČELO PRESKUSA | 14. | Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih daje več skupinam preskusnih živali, pri čemer preskus traja večino njihove življenjske dobe, način dajanja pa je navadno oralni. Primerno je lahko tudi preskušanje z inhalacijskim ali dermalnim načinom dajanja. Živali je treba pozorno opazovati, da se odkrijejo znaki strupenosti in nastanek neoplastičnih lezij. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih opravi obdukcija. | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 15. | Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju rakotvornosti pri glodavcih (odstavek 2). O uporabi vrst, ki niso glodavci, se lahko razmisli, kadar razpoložljivi podatki kažejo, da so ustreznejše za napovedovanje učinkov na zdravje ljudi. Izbiro živalske vrste je treba utemeljiti. Priporočena vrsta glodavca je podgana, uporabijo pa se lahko tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Čeprav je uporabnost miši pri preskušanju rakotvornosti lahko omejena (24) (25) (26), se lahko z nekaterimi veljavnimi zakonodajnimi ureditvami še vedno zahteva preskušanje rakotvornosti na miših, razen če se ugotovi, da taka študija z znanstvenega vidika ni nujna. Podgane in miši so najprimernejši preskusni modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razširjene uporabe v farmakoloških in toksikoloških študijah, občutljivosti za indukcijo tumorjev ter razpoložljivosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi teh lastnosti je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 16. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Po možnosti je treba v študiji rakotvornosti uporabiti isti sev in izvor živali kot v predhodnih krajših študijah strupenosti, čeprav je treba – če je znano, da se pri živalih zadevnega seva in izvora pojavljajo težave pri doseganju običajno sprejetih meril preživetja za dolgoročne študije (glej Dokument s smernicami št. 116 (7)) – razmisliti o uporabi seva živali, katerega stopnja preživetja je sprejemljiva za dolgoročno študijo. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. | Nastanitev in hranjenje | 17. | Živali se lahko nastanijo posamično ali dajo v kletke v manjših skupinah istega spola; posamična nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno utemeljena (27) (28) (29). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura prostora s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontaminantov v hranilih in hrani, vsaj na začetku študije in kadar se zamenja serija uporabljane kemikalije, ter jih vključiti v končno poročilo. Prav tako je treba zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju prehranskih potreb živali. | Priprava živali | 18. | Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale laboratorijskim razmeram in še niso bile vključene v preskusne postopke. V primeru glodavcev je treba odmerke začeti dajati čim prej po odstavitvi od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupinami v okviru vsakega spola ne sme biti večjih razlik v povprečni telesni teži. Če obstajajo statistično pomembne razlike, je treba fazo randomizacije ponoviti, če je to mogoče. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identifikacijsko številko in jo trajno označiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo mikročipa ali drugo ustrezno metodo. | POSTOPEK | Število in spol živali | 19. | Uporabiti je treba oba spola. Živali mora biti dovolj za temeljito biološko in statistično ocenjevanje. Zato mora vsaka odmerna skupina in sočasna kontrolna skupina vsebovati najmanj 50 živali vsakega spola. Glede na namen študije je mogoče povečati statistično moč ključnih ocen z neenakim dodeljevanjem živali različnim odmernim skupinam, tako da je v skupinah, tretiranih z majhnimi odmerki, več kot 50 živali, npr. za ocenjevanje rakotvornega potenciala pri majhnih odmerkih. Vendar se je treba zavedati, da je ob zmernem povečanju velikosti skupine povečanje statistične moči študije razmeroma majhno. Več informacij o statistični zasnovi študije in izbiri velikosti odmerkov za čim obsežnejše povečanje statistične moči je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | Uporaba vmesnih usmrtitev in satelitskih (opozorilnih) skupin | 20. | Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne usmrtitve, npr. pri 12 mesecih, da se zagotovijo informacije o napredovanju neoplastičnih sprememb in mehanistične informacije. Kadar so take informacije že na voljo iz prejšnjih študij strupenosti s ponavljajočimi se odmerki v zvezi z zadevno preskusno kemikalijo, vmesne usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Če se v zasnovo študije vključijo vmesne usmrtitve, število živali v vsaki odmerni skupini, za katere se načrtuje vmesna usmrtitev, navadno znaša 10 živali na spol, skupno število živali v zasnovi študije pa je treba povečati za toliko, kolikor se jih namerava usmrtiti pred zaključkom študije. Poleg tega se lahko po potrebi predvidi dodatna skupina opozorilnih živali (običajno 5 živali vsakega spola) za spremljanje patološkega stanja med študijo (30). Več napotkov je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | Odmerne skupine in odmerjanje | 21. | Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih velikosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in sočasno kontrolo. Velikosti odmerkov navadno temeljijo na rezultatih kratkoročnejših študij s ponavljajočimi se odmerki ali študij za ugotavljanje območja, pri njihovem določanju pa je treba upoštevati vse obstoječe toksikološke in toksikokinetične podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. | 22. | Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških učinkov preskusne kemikalije to ni mogoče, je treba največjo velikost odmerka izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih učinkov, pri čemer se je treba izogibati povzročanju trpljenja, hude zastrupitve, obolevnosti ali smrti. Ob upoštevanju dejavnikov, navedenih v odstavku 23 spodaj, je treba največji odmerek praviloma izbrati tako, da se izzovejo znaki strupenosti, na primer upočasnitev pridobivanja telesne teže (približno 10-odstotna). Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi največji odmerek, manjši od odmerka, ki povzroča znake strupenosti, npr. če odmerek izzove škodljiv učinek, ki vzbuja zaskrbljenost, ne vpliva pa bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. | 23. | Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za določanje odziva v odvisnosti od odmerka in – glede na način delovanja preskusne kemikalije – vrednosti NOAEL ali drugega želenega rezultata študije, npr. BMD (glej odstavek 25) pri najmanjšem odmerku. Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri določitvi manjših odmerkov, vključujejo pričakovani naklon krivulje odmerek-odziv, odmerke, pri katerih se lahko pojavijo pomembne spremembe v presnovi ali načinu strupenega delovanja, velikost, pri kateri se pričakuje prag, ali velikost, pri kateri se pričakuje izhodiščna točka za ekstrapolacijo majhnih odmerkov. | 24. | Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od lastnosti preskusne kemikalije in je v tej preskusni metodi ni mogoče predpisati, vendar dva- do štirikratni intervali velikokrat zagotovijo visoko učinkovitost preskusa pri določanju padajočih velikosti odmerkov, namesto uporabe zelo velikih intervalov (npr. večjih od faktorja približno 6–10) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati četrto preskusno skupino. Na splošno se je treba izogibati uporabi faktorjev, večjih od 10, če se uporabijo, pa je to treba utemeljiti. | 25. | Kot je nadalje opisano v Dokumentu s smernicami št. 116 (7), je treba pri izbiri odmerkov upoštevati: | — | znane ali domnevne nelinearnosti ali točke pregiba na krivulji odmerek-odziv, | — | toksikokinetiko in odmerna območja, v katerih se pojavljajo ali ne pojavljajo presnovna indukcija, nasičenje ali nelinearnost med zunanjimi in notranjimi odmerki, | — | prekurzorske lezije, označevalce učinka ali kazalnike delovanja ključnih temeljnih bioloških procesov, | — | ključne (ali domnevne) vidike načina delovanja, kot so odmerki, pri katerih se začne pojavljati citotoksičnost, so ravni hormonov motene, homeostatični mehanizmi preobremenjeni itd., | — | predele krivulje odmerek-odziv, v katerih je potrebna posebno zanesljiva ocena, npr. v območju pričakovanega BMD ali predvidenega praga, | — | preudarke v zvezi s pričakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi. | 26. | Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusnih skupinah, le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora kontrolna skupina prejeti največjo količino nosilca, ki je bila uporabljena med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem zaradi njene manjše okusnosti povzroči bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja kot primernejša kontrola. | Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije | 27. | Preskusna kemikalija se običajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo oziroma z gavažo. Dodatne informacije o načinih in metodah dajanja so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Način in metoda dajanja sta odvisna od namena študije, fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujočega načina in metode izpostavljenosti ljudi. Izbrani način in metodo dajanja je treba utemeljiti. Zaradi dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri tistih snoveh, pri katerih sta ta način in metoda dajanja razumno reprezentativna za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). Prehranske in okoljske kemikalije, vključno s pesticidi, se navadno dajejo s hrano ali pitno vodo. Pri nekaterih scenarijih, npr. izpostavljenosti na delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi načini dajanja. | 28. | Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, kot je ustrezno: učinke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo preskusne kemikalije, učinke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter učinke na porabo hrane ali vode ali na prehranjenost živali. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homogenosti raztopin ali hrane, ki se bodo uporabljale v preskusu (kot je ustrezno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). | 29. | Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehranjevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoročnih študijah strupenosti, pri katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se preprečijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg telesne teže), ki se izračuna vsak teden. Uporabljeni način je treba navesti. | 30. | V primeru oralnega dajanja živali dobivajo odmerek preskusne kemikalije vsak dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa pri glodavcih navadno traja 24 mesecev (glej tudi odstavek 32). Vsak drugačen režim odmerjanja, npr. pet dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali s preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na teden, kot je navedeno v poglavju B.9 te priloge (11), prek obdobja 24 mesecev. Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, uporabiti pa je mogoče tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. Obdobje izpostavljenosti praviloma traja 24 mesecev. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na dan, je treba utemeljiti. Glej tudi poglavje B.8 te priloge (9). | 31. | Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem uporabljati želodčno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko dnevno odmerjena količina ohranja tudi z dajanjem polovičnih odmerkov (dvakrat na dan). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. To količino je treba ohranjati tako majhno, kot je praktično, praviloma pa pri glodavcih ne sme preseči 1 ml/100 g telesne teže (31). Spremenljivost preskusne količine je treba kar najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali dražilne kemikalije, ki jih je treba razredčiti, da se preprečijo resni lokalni učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati. | Trajanje študije | 32. | Študija pri glodavcih navadno traja 24 mesecev, kar ustreza večini normalne življenjske dobe živali, ki bodo uporabljene. Glede na življenjsko dobo in sev živalske vrste v študiji se lahko uporabijo tudi krajša ali daljša obdobja študije, vendar je treba to utemeljiti. Za nekatere seve miši, npr. AKR/J, C3H/J ali C57BL/6J, je lahko primernejše 18-mesečno obdobje. V nadaljevanju je nekaj napotkov o trajanju in zaključku študije ter preživetju; več napotkov, vključno s preudarki o sprejemljivosti negativnih rezultatov študije rakotvornosti glede na preživetje v študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (7). | — | Kadar število preživelih živali v skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, ali kontrolni skupini pade pod 25 %, je treba razmisliti o zaključku študije. | — | Kadar zaradi strupenosti prezgodaj poginejo samo živali v skupini, tretirani z velikim odmerkom, to ne sme biti razlog za zaključek študije. | — | Preživetje je treba obravnavati ločeno za vsak spol. | — | Študija se ne sme podaljševati prek točke, ko razpoložljivi podatki iz študije ne zadoščajo več za statistično veljavno oceno. | OPAZOVANJA | 33. | Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, običajno na začetku in koncu vsakega dne, vključno s konci tedna in prazniki. Poleg tega je treba živali pregledati enkrat na dan za odkrivanje konkretnih toksikološko pomembnih znakov, ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka, če gre za dajanje z gavažo. Posebno pozornost je treba nameniti nastanku tumorjev ter zabeležiti čas nastopa, mesto, mere, videz in progresijo vsakega makroskopsko vidnega ali otipljivega tumorja. | Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane | 34. | Vse živali je treba stehtati na začetku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja. | Hematološke, klinične biokemične in druge meritve | 35. | Da bi se s študijo pridobilo kar največ informacij, zlasti kar zadeva razmisleke o načinu delovanja, se lahko jemljejo vzorci krvi za hematološke in klinične biokemične preiskave, o čemer odloči vodja študije. Primerna je lahko tudi analiza urina. Več napotkov o vrednosti jemanja takih vzorcev v okviru študije rakotvornosti je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Če se štejeta za primerna, se lahko odvzem vzorcev krvi za hematološke in klinične kemične preiskave ter analiza urina opravita kot del vmesne usmrtitve (odstavek 20) ter ob zaključku študije na najmanj 10 živalih na spol na skupino. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji, in jih shraniti, če je ustrezno, v primernih pogojih. Za pregled se lahko pripravijo tudi krvni razmazi, zlasti če kaže, da je ciljni organ kostni mozeg, čeprav so bili izraženi dvomi o vrednosti takega pregleda za ocenjevanje rakotvornega/onkogenega potenciala (32). | PATOLOGIJA | Makroskopska obdukcija | 36. | Na vseh živalih v študiji, razen na opozorilnih (glej odstavek 20) in drugih satelitskih živalih, se opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Za opozorilne in druge satelitske živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odloča vodja študije. Tehtanje organov navadno ni del študije rakotvornosti, saj je zaradi sprememb, povezanih s staranjem, v poznejših fazah pa zaradi nastanka tumorjev, lahko motena koristnost podatkov o teži organov. So pa lahko ti podatki odločilni za oceno zanesljivosti dokazov in zlasti za preudarke v zvezi z načinom delovanja. Če je teža organov del satelitske študije, jo je treba izmeriti najpozneje 1 leto po začetku študije. | 37. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (33) (tkiva v oglatih oklepajih niso obvezna): | vse vidne lezije | srce | trebušna slinavka | želodec (predželodec, žlezni želodec) | nadledvična žleza | vito črevo | obščitnica | [zobje] | aorta | tešče črevo | periferni živec | modo | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | ledvica | hipofiza | priželjc | slepo črevo | solzna žleza (zunaj očesne votline) | prostata | ščitnica | maternični vrat | jetra | rektum | [jezik] | koagulacijska žleza | pljuča | žleza slinavka | sapnik | debelo črevo | bezgavke (povrhnje in globoke) | semenski mešiček | sečni mehur | dvanajsternik | mlečna žleza (obvezna za samice, in če jo je mogoče secirati s prostim očesom, za samce) | skeletna mišica | maternica (vključno z vratom) | nadmodek | [zgornja dihala, vključno z nosom, nosnimi školjkami in obnosnimi votlinami] | koža | [sečevod] | oko (vključno z mrežnico) | požiralnik | hrbtenjača (na treh ravneh: vratni, prsni in ledveni) | [sečnica] | [stegnenica s sklepom] | [vohalni betič] | vranica | vagina | žolčnik (pri vrstah, ki niso podgane) | jajčnik | [prsnica] | rezina in/ali svež punktat kostnega mozga | Harderjeva žleza | | | | Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba shraniti oba organa. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim načinom dajanja je treba shraniti iste organe, kot so določeni na seznamu za oralni način, bistveno pa je posebno vzorčenje in shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporočilom iz poglavij B.8 in B.29 te priloge. Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preučiti seznam organov, določen za oralni način dajanja. | Histopatologija | 38. | Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patoloških študij (33). Pregledati je treba vsaj naslednja tkiva: | — | vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne skupine, | — | vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmrčene med študijo, | — | vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, vključno s tumorji, | — | kadar so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretiranjem povezane histopatološke spremembe, je treba pregledati ista tkiva vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, | — | pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba pregledati oba organa. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 39. | Navesti je treba podatke za posamezne živali za vse ocenjevane parametre. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake zastrupitve, opis opaženih znakov zastrupitve, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih učinkov, ter število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi podatki je treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni učinki ali lezije, ter razvrstitev lezij. | 40. | Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s sočasnimi kontrolami, bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija ter se nanašati na živali iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih pred zadevno študijo. | 41. | Če je ustrezno, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Statistične metode in podatke, ki bodo analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 9). V izbiri je treba predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne. | Poročilo o preskusu | 42. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijske podatke, | — | izvor kemikalije, | — | številko serije, | — | potrdilo o kemijski analizi. | | Nosilec (če je ustrezno) | — | utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda). | | Preskusne živali | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev izbire, | — | število, starost in spol živali na začetku preskusa, | — | izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., | — | težo vsake živali ob začetku preskusa. | | Preskusni pogoji | — | utemeljitev načina dajanja in izbire odmerkov, | — | če je ustrezno, uporabljene statistične metode za analizo podatkov, | — | podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, | — | analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, | — | način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, | — | za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost nosu ali izpostavljenost celega telesa, | — | dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v dejanski odmerek, če je ustrezno, | — | podatke o kakovosti hrane in vode. | | Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za posamezne živali) | | Splošno | — | podatke o preživetju, | — | telesno težo/spremembe telesne teže, | — | porabo hrane, izračune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo vode, če je ustrezno, | — | toksikokinetične podatke (če so na voljo), | — | oftalmoskopiranje (če so podatki na voljo), | — | hematologijo (če so podatki na voljo), | — | klinično kemijo (če so podatki na voljo). | | Klinični izsledki | — | znake zastrupitve, | — | pojavnost (in resnost, če se ocenjuje) vseh abnormalnosti, | — | vrsto, resnost in trajanje kliničnih opažanj (prehodnih ali trajnih). | | Obdukcijski podatki | — | terminalno telesno težo, | — | težo organov in razmerja med težami organov, če je ustrezno, | — | izsledke obdukcije; pojavnost in resnost abnormalnosti. | | Histopatologija | — | neneoplastične ugotovitve histopatoloških preiskav, | — | neoplastične ugotovitve histopatoloških preiskav, | — | povezanost makroskopskih in mikroskopskih ugotovitev, | — | podroben opis vseh s tretiranjem povezanih ugotovitev histopatoloških preiskav, vključno z razvrstitvami resnosti, | — | navedbo morebitnih medsebojnih strokovnih pregledov mikroskopskih preparatov. | | Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno | | Razprava o rezultatih | — | razpravo o pristopih modeliranja, | — | razmerja med odmerkom in odzivom, | — | pretekle kontrolne podatke, | — | preučitev vseh informacij o načinu delovanja, | — | določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, | — | pomembnost za ljudi. | | Sklepi. | VIRI: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. | (3) | Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. | (4) | Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191. | (5) | Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. | (6) | Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkronične oralne toksičnosti: 90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodalcih. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druga izdaja. Series on Testing and Assessment No. 116, na voljo na javni spletni strani OECD o smernicah za preskušanje na naslovu www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (9) | Poglavje B.8 te priloge, Subakutna strupenost pri vdihavanju: 28-dnevna študija. | (10) | Poglavje B.29 te priloge, Subkronična strupenost pri vdihavanju: 90-dnevna študija. | (11) | Poglavje B.9 te priloge, Strupenost (v stiku s kožo) pri ponavljajočem se odmerku (28 dni). | (12) | Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793–801. | (13) | Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., in Fenner-Crisp, P. A. (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589. | (14) | Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51–56. | (15) | Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton, D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591–653. | (16) | Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R., idr. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7. | (17) | Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T., idr. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35. | (18) | Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A., idr. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68. | (19) | Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M., idr. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98. | (20) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz. | (21) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. | (22) | Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837. | (23) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (ur.). ILSI Press, Washington, DC. | (24) | Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., in Lumley, C. E. (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214. | (25) | Usui, T., Griffiths, S. A., in Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. V: D’Arcy POF & Harron DWG (ur.). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. str. 279–284. | (26) | Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203. | (27) | Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 20.10.2010, str. 33). | (28) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23. | (32) | Weingand, K., idr. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201. | (33) | Crissman, J., Goodman, D., Hildebrandt, P., idr. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | B.33 KOMBINIRANE ŠTUDIJE KRONIČNE STRUPENOSTI/RAKOTVORNOSTI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 453 (2009). Prvotna TG 453 je bila sprejeta leta 1981. Priprava te posodobljene preskusne metode B.33 je bila ocenjena kot nujna zaradi upoštevanja nedavnega razvoja na področju dobrobiti živali in zakonodajnih zahtev (1) (2) (3) (4) (5). Ta preskusna metoda B.33 je bila posodobljena vzporedno z revizijama poglavja B.32 te priloge z naslovom ‚Študije rakotvornosti‘ in poglavja B.30 te priloge z naslovom ‚Študije kronične strupenosti‘, da bi se z uporabo živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo več podatkov o izbiri odmerkov. Ta preskusna metoda je zasnovana za preskušanje zelo različnih kemikalij, vključno s pesticidi in industrijskimi kemikalijami. Vendar je treba opozoriti, da so lahko nekatere podrobnosti in zahteve za farmacevtske izdelke drugačne (glej Smernico Mednarodne konference o usklajevanju (ICH) S1B o preskušanju rakotvornosti farmacevtskih izdelkov). | 2. | Večina študij kronične strupenosti in rakotvornosti se opravi na glodavcih, zato je ta preskusna metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso glodavci, se lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo načela in postopki, opisani v tej metodi, ter načela in postopki iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodavcih‘ (6), kot je navedeno v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (7). | 3. | Glavni trije načini dajanja, ki se uporabljajo v študijah kronične strupenosti/rakotvornosti, so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira načina dajanja je odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prevladujočega načina izpostavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri načina izpostavljenosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 4. | Ta preskusna metoda je osredotočena na oralno izpostavljenost, ki se v študijah kronične strupenosti in rakotvornosti uporablja najpogosteje. Dolgoročne študije, ki vključujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavljenost, so lahko prav tako lahko potrebne za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena načina izpostavljenosti tehnično precej zapletena. Take študije je treba zasnovati za vsak primer posebej, je pa mogoče preskusno metodo za ocenjevanje in vrednotenje kronične strupenosti in rakotvornosti z oralnim načinom dajanja, opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo za protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporočila glede obdobij tretiranja, kliničnih in patoloških parametrov itd. Za inhalacijski (7) (8) in dermalni način dajanja (7) preskusnih kemikalij so na voljo napotki OECD. Pri zasnovi dolgoročnejših študij z inhalacijsko izpostavljenostjo je treba podrobno preučiti poglavji B.8 (9) in B.29 te priloge (10) ter Dokument s smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdihavanju (8). V primeru preskušanja z dermalnim načinom dajanja je treba upoštevati poglavje B.9 te priloge (11). | 5. | S kombinirano študijo kronične strupenosti/rakotvornosti se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki se lahko pojavijo ob ponavljajoči se izpostavljenosti v obdobju, ki obsega največ celotno življenjsko dobo uporabljene vrste. Z njo se pridobijo informacije o strupenih učinkih preskusne kemikalije, vključno s potencialno rakotvornostjo, nakažejo se ciljni organi in možnost kopičenja. S študijo se lahko oceni vrednost brez opaženega škodljivega učinka za strupene učinke in – v primeru rakotvornih snovi, ki niso genotoksične – za tumorske odzive, ki se lahko uporabi za določitev varnostnih meril za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi potreba po skrbnem kliničnem opazovanju živali, da se pridobi kar največ informacij. | 6. | Cilji študij kronične strupenosti/rakotvornosti, na katere se nanaša ta preskusna metoda, vključujejo: | — | opredelitev rakotvornih lastnosti preskusne kemikalije, ki v primerjavi s sočasnimi kontrolnimi skupinami privedejo do povečane pojavnosti novotvorb, povečanega deleža malignih novotvorb ali skrajšanja časa do pojava novotvorb, | — | opredelitev časa do pojava novotvorb, | — | opredelitev kronične strupenosti preskusne kemikalije, | — | opredelitev ciljnih organov kronične strupenosti in rakotvornosti, | — | opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom, | — | opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega učinka (NOAEL) ali izhodiščne točke za določitev primerjalnega odmerka (benchmark dose – BMD), | — | ekstrapolacijo rakotvornih učinkov na stopnje izpostavljenosti ljudi pri majhnih odmerkih, | — | napoved učinkov kronične strupenosti pri stopnjah izpostavljenosti ljudi, | — | zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede načina delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15). | ZAČETNI PREUDARKI | 7. | Pri ocenjevanju in vrednotenju potencialne rakotvornosti in kronične strupenosti preskusne kemikalije mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, da se zasnova študije osredotoči na učinkovitejše preskušanje toksikoloških lastnosti te kemikalije in da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Informacije o načinu delovanja domnevne rakotvorne snovi in upoštevanje njenega načina delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15) so posebej pomembni, saj se lahko optimalna zasnova študije razlikuje glede na to, ali je preskusna kemikalija znana ali domnevna genotoksična rakotvorna snov. Več napotkov o preudarkih v zvezi z načinom delovanja je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 8. | Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; vse informacije o načinu delovanja; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo, vključno s preskusi genotoksičnosti; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR, podatke o mutagenosti/genotoksičnosti in rakotvornosti ter druge toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh; razpoložljive toksikokinetične podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem odmerku in tudi pri ponavljajočih se odmerkih, če so na voljo) ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajočo se izpostavljenostjo. Kronično strupenost/rakotvornost je treba ugotavljati šele po pridobitvi začetnih informacij o strupenosti na podlagi 28-dnevnega in/ali 90-dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajočimi se odmerki. Koristne informacije se lahko zagotovijo tudi s kratkoročnimi preskusi iniciacije/spodbujanja razvoja raka. V okviru splošne ocene potencialnih škodljivih učinkov določene preskusne kemikalije na zdravje je treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju rakotvornosti (16) (17) (18) (19). | 9. | Pred začetkom študije je treba določiti najprimernejše statistične metode za analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, ki jih je treba preučiti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vključevati prilagoditev glede na preživetje, analizo kumulativnih tveganj tumorjev glede na trajanje preživetja, analizo časa do pojava tumorjev in analizo v primeru predčasnega prenehanja tretiranja ene ali več skupin. Napotki o primernih statističnih analizah in ključne reference mednarodno priznanih statističnih metod so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v Dokumentu s smernicami št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (20). | 10. | Pri izvajanju študije rakotvornosti je treba vedno upoštevati vodilna načela in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD o prepoznavanju, ocenjevanju in uporabi kliničnih znakov kot humanih končnih točk za preskusne živali v oceni varnosti (21), zlasti odstavek 62 navedenega dokumenta. V tem odstavku je navedeno: ‚Pri študijah, ki vključujejo ponavljajoče se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odločitev, ali naj se žival humano usmrti ali ne, če kaže klinične znake, ki se stopnjujejo in vodijo v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odločitev mora vključevati razmislek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranitvijo zadevne živali v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme odločitev, da se žival ohrani v preskusu, je treba po potrebi povečati pogostnost opazovanj. Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa začasno prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bolečine ali trpljenje, ali da se zmanjša preskusni odmerek.‘ | 11. | Podrobni napotki in razprava o načelih izbire odmerkov za študije kronične strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (22) (23). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glavnega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni strani ter opredeljevanjem učinkov majhnih odmerkov in njihovim pomenom na drugi. To je zlasti pomembno v primeru te kombinirane študije kronične strupenosti in rakotvornosti. | 12. | Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto ločene izvedbe študije kronične strupenosti (poglavje B.30 te priloge) in študije rakotvornosti (poglavje B.32 te priloge) izvede ta kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti. S kombiniranim preskusom se v primerjavi z izvedbo dveh ločenih študij zagotovi večja učinkovitost v smislu časa in stroškov ter se nekoliko zmanjša uporaba živali, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost podatkov v fazi v zvezi s kronično strupenostjo ali fazi v zvezi z rakotvornostjo. Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kronične strupenosti in rakotvornosti skrbno upoštevati načela izbire odmerkov (odstavki 11 in 22–26), poleg tega pa se tudi priznava, da se na podlagi nekaterih zakonodajnih okvirov lahko zahteva ločena izvedba študij. Več napotkov o tem, kako zasnovati kombinirano študijo kronične strupenosti in rakotvornosti, da bo mogoče z njo kar najbolj zmanjšati število uporabljenih živali in racionalizirati različne preskusne postopke, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 13. | Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | NAČELO PRESKUSA | 14. | Študija je zasnovana z dvema vzporednima fazama – fazo v zvezi s kronično strupenostjo in fazo v zvezi z rakotvornostjo (glede trajanja glej odstavek 34 oziroma odstavek 35). Preskusna kemikalija se navadno daje oralno, čeprav je lahko primerno tudi preskušanje z inhalacijskim ali dermalnim načinom dajanja. V fazi v zvezi s kronično strupenostjo se preskusna kemikalija dnevno v stopnjevanih odmerkih daje več skupinam preskusnih živali, in sicer ena velikost odmerka na skupino, pri čemer preskus običajno traja 12 mesecev, čeprav se lahko glede na zakonodajne zahteve izberejo tudi daljša ali krajša obdobja (glej odstavek 34). Izbrano obdobje mora biti dovolj dolgo, da se lahko pokažejo morebitni učinki kumulativne strupenosti, ne pa tudi zavajajoči učinki sprememb, povezanih s staranjem. Zasnova študije lahko vključuje tudi eno ali več vmesnih usmrtitev, npr. pri 3 ali 6 mesecih, zaradi česar se lahko vključijo dodatne skupine živali (glej odstavek 20). V fazi v zvezi z rakotvornostjo se preskusna kemikalija dnevno daje več skupinam preskusnih živali, pri čemer preskus traja večino njihove življenjske dobe. Živali je treba v obeh fazah skrbno opazovati, da se odkrijejo znaki strupenosti in nastanek neoplastičnih lezij. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih opravi obdukcija. | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 15. | Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju kronične strupenosti in rakotvornosti pri glodavcih (odstavek 2). O uporabi vrst, ki niso glodavci, se lahko razmisli, kadar razpoložljivi podatki kažejo, da so ustreznejše za napovedovanje učinkov na zdravje ljudi. Izbiro živalske vrste je treba utemeljiti. Priporočena vrsta glodavca je podgana, čeprav se lahko uporabijo tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Čeprav je uporabnost miši pri preskušanju rakotvornosti lahko omejena (24) (25) (26), se lahko z nekaterimi veljavnimi zakonodajnimi ureditvami še vedno zahteva preskušanje rakotvornosti na miših, razen če se ugotovi, da taka študija z znanstvenega vidika ni nujna. Podgane in miši so najprimernejši preskusni modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razširjene uporabe v farmakoloških in toksikoloških študijah, občutljivosti za indukcijo tumorjev ter razpoložljivosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi teh lastnosti je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Kadar se zahtevajo študije kronične strupenosti/rakotvornosti na vrstah, ki niso glodavci, morata zasnova in izvajanje takih študij temeljiti na načelih, opisanih v tej preskusni metodi, ter na načelih iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodalcih‘ (6). Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 16. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Po možnosti je treba v kombinirani študiji kronične strupenosti/rakotvornosti uporabiti isti sev in izvor živali kot v predhodnih krajših študijah strupenosti, čeprav je treba – če je znano, da se pri živalih zadevnega seva in izvora pojavljajo težave pri doseganju običajno sprejetih meril preživetja za dolgoročne študije (glej Dokument s smernicami št. 116 (7)) – razmisliti o uporabi seva živali, katerega stopnja preživetja je sprejemljiva za dolgoročno študijo. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. | Nastanitveni in prehranjevalni pogoji | 17. | Živali se lahko nastanijo posamično ali dajo v kletke v manjših skupinah istega spola; posamična nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno utemeljena (27) (28) (29). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura prostora s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontaminantov v hranilih in hrani, vsaj na začetku študije in kadar se zamenja serija uporabljane kemikalije, ter jih vključiti v končno poročilo. Prav tako je treba zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju prehranskih potreb živali. | Priprava živali | 18. | Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale laboratorijskim razmeram in še niso bile vključene v preskusne postopke. V primeru glodavcev je treba odmerke začeti dajati čim prej po odstavitvi od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupinami v okviru vsakega spola ne sme biti večjih razlik v povprečni telesni teži. Če obstajajo statistično pomembne razlike, je treba fazo randomizacije ponoviti, če je to mogoče. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identifikacijsko številko in jo trajno označiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo mikročipa ali drugo ustrezno metodo. | POSTOPEK | Število in spol živali | 19. | Uporabiti je treba oba spola. Živali mora biti dovolj za temeljito biološko in statistično ocenjevanje. Pri glodavcih mora zato vsaka odmerna skupina (kot je navedeno v odstavku 22) in sočasna kontrolna skupina, namenjena fazi študije v zvezi z rakotvornostjo, vsebovati najmanj 50 živali vsakega spola. Glede na namen študije je mogoče povečati statistično moč ključnih ocen z neenakim dodeljevanjem živali različnim odmernim skupinam, tako da je v skupinah, tretiranih z majhnimi odmerki, več kot 50 živali, npr. za ocenjevanje rakotvornega potenciala pri majhnih odmerkih. Vendar se je treba zavedati, da je ob zmernem povečanju velikosti skupine povečanje statistične moči študije razmeroma majhno. Vsaka odmerna skupina (kot je navedeno v odstavku 22) in sočasna kontrolna skupina, namenjena fazi študije v zvezi s kronično strupenostjo, mora v primeru glodavcev vsebovati najmanj 10 živali vsakega spola. Opozoriti je treba, da je to število manjše kot v študiji kronične strupenosti (poglavje B.30 te priloge). Vendar bo razlaga podatkov, pridobljenih z manjšim številom živali na skupino v fazi te kombinirane študije v zvezi s kronično strupenostjo, podkrepljena s podatki, pridobljenimi z večjim številom živali v fazi študije v zvezi z rakotvornostjo. V študijah, ki vključujejo miši, bodo v vsaki odmerni skupini za fazo v zvezi s kronično strupenostjo morda potrebne dodatne živali, da bo mogoče opraviti vse zahtevane hematološke preiskave. Več informacij o statistični zasnovi študije in izbiri velikosti odmerkov za čim obsežnejše povečanje statistične moči je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | Uporaba vmesnih usmrtitev, satelitske skupine in opozorilnih živali | 20. | Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne usmrtitve, npr. pri 6 mesecih za fazo v zvezi s kronično strupenostjo, da se zagotovijo informacije o napredovanju ne-neoplastičnih sprememb in mehanistične informacije. Kadar so take informacije že na voljo iz prejšnjih študij strupenosti s ponavljajočimi se odmerki v zvezi z zadevno preskusno kemikalijo, vmesne usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Z živalmi, uporabljenimi v fazi študije v zvezi s kronično strupenostjo, ki običajno traja 12 mesecev (odstavek 34), se pridobijo podatki v zvezi z vmesnimi usmrtitvami za fazo študije v zvezi z rakotvornostjo, s čimer se zmanjša skupno število uporabljenih živali. V fazo študije v zvezi s kronično strupenostjo se lahko vključijo tudi satelitske skupine za spremljanje reverzibilnosti morebitnih toksikoloških sprememb, ki jih povzroči preiskovana preskusna kemikalija. Te preiskave so lahko omejene na največji odmerek v študiji in kontrolo. Po potrebi se lahko predvidi dodatna skupina opozorilnih živali (navadno 5 živali na spol) za spremljanje patološkega stanja med študijo (30). Več napotkov o tem, kako zasnovati študijo, da se vključijo vmesne usmrtitve ter satelitske in opozorilne živali, hkrati pa kar najbolj zmanjša skupno število uporabljenih živali, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 21. | Če se v zasnovo študije vključijo satelitske živali in/ali vmesne usmrtitve, število živali v vsaki odmerni skupini, vključenih v ta namen, navadno znaša 10 živali na spol, skupno število živali v zasnovi študije pa je treba povečati za toliko, kolikor se jih namerava usmrtiti pred zaključkom študije. Za živali za vmesno usmrtitev in satelitske živali so običajno potrebna enaka opazovanja kot za živali v fazi glavne študije v zvezi s kronično strupenostjo, vključno s telesno težo, porabo hrane/vode, hematološkimi in kliničnimi biokemičnimi meritvami ter patološkimi preiskavami, čeprav se lahko predvidi tudi (pri skupinah za vmesno usmrtitev), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksičnost ali imunotoksičnost. | Odmerne skupine in odmerjanje | 22. | Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih velikosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Za fazo v zvezi s kronično strupenostjo in fazo v zvezi z rakotvornostjo je treba uporabiti najmanj tri velikosti odmerkov in sočasno kontrolo. Velikosti odmerkov navadno temeljijo na rezultatih kratkoročnejših študij s ponavljajočimi se odmerki ali študij za ugotavljanje območja, pri njihovem določanju pa je treba upoštevati vse obstoječe toksikološke in toksikokinetične podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. | 23. | Za fazo študije v zvezi s kronično strupenostjo se lahko oceni, da celotna študija s tremi velikostmi odmerkov ni potrebna, če je mogoče predvideti, da preskus pri eni velikosti odmerka, enakovredni najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, verjetno ne bo povzročil škodljivih učinkov. To predvidevanje mora temeljiti na informacijah iz predhodnih študij in preudarku, da na podlagi podatkov o strukturno sorodnih kemikalijah strupenost ni pričakovana. Lahko se uporabi meja 1 000 mg/kg telesne teže/dan, razen če izpostavljenost ljudi nakazuje potrebo po uporabi večjega odmerka. | 24. | Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških učinkov preskusne kemikalije to ni mogoče, je treba največjo velikost odmerka izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih učinkov, pri čemer se je treba izogibati povzročanju trpljenja, hude zastrupitve, obolevnosti ali smrti. Največjo velikost odmerka je praviloma treba izbrati tako, da se izzovejo znaki strupenosti, na primer upočasnitev pridobivanja telesne teže (približno 10-odstotna). Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi največji odmerek, manjši od odmerka, ki povzroča znake strupenosti, npr. če odmerek izzove škodljiv učinek, ki vzbuja zaskrbljenost, ne vpliva pa bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. | 25. | Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za določanje odziva v odvisnosti od odmerka in – glede na način delovanja preskusne kemikalije – vrednosti NOAEL ali drugega želenega rezultata študije, npr. BMD (glej odstavek 27). Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri določitvi manjših odmerkov, vključujejo pričakovani naklon krivulje odmerek-odziv, odmerke, pri katerih se lahko pojavijo pomembne spremembe v presnovi ali načinu strupenega delovanja, velikost, pri kateri se pričakuje prag, ali velikost, pri kateri se pričakuje izhodiščna točka za ekstrapolacijo majhnih odmerkov. Glavni cilj kombinirane študije rakotvornosti/kronične strupenosti je pridobiti informacije za oceno tveganja za rakotvornost, informacije o kronični strupenosti pa so navadno podrejen cilj. To je treba upoštevati pri izbiri velikosti odmerkov in razporeditve med njimi za študijo. | 26. | Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od ciljev študije in lastnosti preskusne kemikalije ter je v tej preskusni metodi ni mogoče natančno predpisati, vendar dva- do štirikratni intervali velikokrat zagotovijo visoko učinkovitost preskusa pri določanju padajočih velikosti odmerkov, namesto uporabe zelo velikih intervalov (npr. večjih od faktorja približno 6–10) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati četrto preskusno skupino. Na splošno se je treba izogibati uporabi faktorjev, večjih od 10, če se uporabijo, pa je to treba utemeljiti. | 27. | Kot je nadalje opisano v Dokumentu s smernicami št. 116 (7), je treba pri izbiri odmerkov upoštevati: | — | znane ali domnevne nelinearnosti ali točke pregiba na krivulji odmerek-odziv, | — | toksikokinetiko in odmerna območja, v katerih se pojavljajo ali ne pojavljajo presnovna indukcija, nasičenje ali nelinearnost med zunanjimi in notranjimi odmerki, | — | prekurzorske lezije, označevalce učinka ali kazalnike delovanja ključnih temeljnih bioloških procesov, | — | ključne (ali domnevne) vidike načina delovanja, kot so odmerki, pri katerih se začne pojavljati citotoksičnost, so ravni hormonov motene, homeostatični mehanizmi preobremenjeni itd., | — | predele krivulje odmerek-odziv, v katerih je potrebna posebno zanesljiva ocena, npr. v območju pričakovanega BMD ali predvidenega praga, | — | preudarke v zvezi s pričakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi, zlasti pri izbiri srednjih in majhnih odmerkov. | 28. | Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusnih skupinah, le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora kontrolna skupina prejeti največjo količino nosilca, ki je bila uporabljena med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem zaradi njene manjše okusnosti povzroči bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja kot primernejša kontrola. | Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije | 29. | Preskusna kemikalija se običajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo oziroma z gavažo. Dodatne informacije o načinih in metodah dajanja so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Način in metoda dajanja sta odvisna od namena študije, fizikalnih/kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujočega načina in metode izpostavljenosti ljudi. Izbrani način in metodo dajanja je treba utemeljiti. Zaradi dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri tistih snoveh, pri katerih sta ta način in metoda dajanja razumno reprezentativna za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). Prehranske in okoljske kemikalije, vključno s pesticidi, se navadno dajejo s hrano ali pitno vodo. Pri nekaterih scenarijih, npr. izpostavljenosti na delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi načini dajanja. | 30. | Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, kot je ustrezno: učinke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo preskusne kemikalije, učinke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter učinke na porabo hrane ali vode ali na prehranjenost živali. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homogenosti raztopin ali hrane (kot je ustrezno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). | 31. | Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehranjevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoročnih študijah strupenosti, pri katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se preprečijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg telesne teže), ki se izračuna vsak teden. Uporabljeni način je treba navesti. | 32. | V primeru oralnega dajanja živali dobivajo odmerek preskusne kemikalije vsak dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa traja 12 mesecev (faza v zvezi s kronično strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakotvornostjo) – glej tudi odstavka 33 in 34. Vsak drugačen režim odmerjanja, npr. pet dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali s preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na teden, kot je navedeno v poglavju B.9 te priloge (11), prek obdobja 12 mesecev (faza v zvezi s kronično strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakotvornostjo). Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, uporabiti pa je mogoče tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. Obdobje izpostavljenosti praviloma traja 12 mesecev (faza v zvezi s kronično strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakotvornostjo). Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na dan, je treba utemeljiti. Glej tudi poglavje B.8 te priloge (9). | 33. | Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem uporabljati želodčno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko dnevno odmerjena količina ohranja tudi z dajanjem polovičnih odmerkov (dvakrat na dan). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. To količino je treba ohranjati tako majhno, kot je praktično, praviloma pa pri glodavcih ne sme preseči 1 ml/100 g telesne teže (31). Spremenljivost preskusne količine je treba kar najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali dražilne kemikalije, ki jih je treba razredčiti, da se preprečijo resni lokalni učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati. | Trajanje študije | 34. | Obdobje odmerjanja in faza te študije v zvezi s kronično strupenostjo običajno trajata 12 mesecev, je pa ta zasnova študije taka, da se lahko uporablja tudi za kratkoročnejše (npr. 6- ali 9-mesečne) ali dolgoročnejše (npr. 18- ali 24-mesečne) študije, glede na zahteve konkretnih zakonodajnih ureditev ali za posebne mehanistične namene. Odstopanja od 12-mesečnega obdobja izpostavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Vse odmerne skupine, dodeljene tej fazi, se ob določenem času prenehajo tretirati, da se ocenijo kronična strupenost in ne-neoplastične patološke spremembe. Satelitske skupine, vključene za spremljanje reverzibilnosti toksikoloških sprememb, ki jih povzroči preiskovana preskusna kemikalija, se s preskusno kemikalijo ne tretirajo najmanj 4 tedne in največ eno tretjino celotnega trajanja študije po koncu izpostavljenosti. | 35. | Faza te študije v zvezi z rakotvornostjo pri glodavcih običajno traja 24 mesecev in ustreza večini normalne življenjske dobe živali, ki bodo uporabljene. Glede na življenjsko dobo in sev živalske vrste v študiji se lahko uporabijo tudi krajša ali daljša obdobja študije, vendar je treba to utemeljiti. Za nekatere seve miši, npr. AKR/J, C3H/J ali C57BL/6J, je lahko primernejše 18-mesečno obdobje. V nadaljevanju je nekaj napotkov o trajanju in zaključku študije ter preživetju; več napotkov, vključno s preudarki o sprejemljivosti sprejemljivosti negativnih rezultatov študije rakotvornosti glede na preživetje v študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | — | Kadar število preživelih živali v skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, ali kontrolni skupini pade pod 25 %, je treba razmisliti o zaključku študije. | — | Kadar zaradi strupenosti prezgodaj poginejo samo živali v skupini, tretirani z velikim odmerkom, to ne sme biti razlog za zaključek študije. | — | Preživetje je treba obravnavati ločeno za vsak spol. | — | Študija se ne sme podaljševati prek točke, ko razpoložljivi podatki iz študije ne zadoščajo več za statistično veljavno oceno. | OPAZOVANJA (FAZA V ZVEZI S KRONIČNO STRUPENOSTJO) | 36. | Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, običajno na začetku in koncu vsakega dne, vključno s konci tedna in prazniki. Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka, če gre za dajanje z gavažo. | 37. | Podrobna klinična opazovanja je treba opraviti na vseh živalih vsaj enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogočanje primerjav na istem osebku), ob koncu prvega tedna študije, zatem pa mesečno. Protokol za opazovanja je treba določiti tako, da so razlike med posameznimi opazovalci čim manjše in neodvisne od preskusne skupine. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj kletk, v katerih bivajo živali, po možnosti na standardnem mestu in vedno ob istem času. Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti s sistemi točkovanja, ki jih izrecno določi preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, da se pogoji opazovanja čim manj spreminjajo. Pozornost je med drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, očeh in sluznicah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živčevja (npr. solzenju, piloerekciji, velikosti zenic, nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z živalmi, pa tudi prisotnost kloničnih ali toničnih gibov, stereotipij (npr. prekomernega čiščenja, ponavljajočega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (32). | 38. | Na vseh živalih je treba pred prvim dajanjem preskusne kemikalije z oftalmoskopom ali drugo primerno opremo opraviti oftalmološko preiskavo. Ob koncu študije je treba to preiskavo po možnosti opraviti na vseh živalih, vsekakor pa vsaj pri skupini, tretirani z velikim odmerkom, in kontrolni skupini. Če se v očeh zaznajo spremembe, povezane s tretiranjem, je treba pregledati vse živali. Če strukturna analiza ali druge informacije kažejo na strupenost za oči, je treba pogostnost preiskav oči povečati. | 39. | Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus strupenosti s ponavljajočimi se odmerki nakazal potencial za povzročanje nevrotoksičnih učinkov, se lahko po izbiri ocenijo senzorične reakcije na različne vrste dražljajev (32) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) (33) (34) (35), moč oprijema (36) ter motorična aktivnost (37), in sicer pred začetkom študije ter vsake 3 mesece po začetku študije do 12. meseca in vključno z njim, pa tudi ob koncu študije (če je daljša od 12 mesecev). Nadaljnje podrobnosti glede mogočih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je mogoče tudi druge postopke, ki v njih niso opisani. | 40. | Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus strupenosti s ponavljajočimi se odmerki nakazal potencial za povzročanje imunotoksičnih učinkov, se lahko nadaljnje preiskave te končne točke po izbiri opravijo ob koncu študije. | Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane | 41. | Vse živali je treba stehtati na začetku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja. | Hematologija in klinična biokemija | 42. | V študijah z glodavci je treba hematološke preiskave opravljati na vseh živalih v študiji (10 samcih in 10 samicah na skupino), in sicer pri 3, 6 in 12 mesecih, pa tudi ob koncu študije (če je daljša od 12 mesecev). Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih hematoloških preiskav potrebne satelitske živali (glej odstavek 19). V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki na hematološke parametre. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. | 43. | Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (38): skupno in diferencialno število levkocitov, število eritrocitov, število trombocitov, koncentracijo hemoglobina, hematokrit (volumen stisnjenih eritrocitov), povprečni volumen eritrocitov (MCV), povprečno količino hemoglobina v eritrocitih (MCH), povprečno koncentracijo hemoglobina v eritrocitih (MCHC), protrombinski čas in aktivirani parcialni tromboplastinski čas. Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi hematološki parametri, kot so Heinzeva telesca ali druge netipične morfološke oblike eritrocitov ali methemoglobin. Na splošno je treba sprejeti prožni pristop glede na opažene in/ali pričakovane učinke dane preskusne kemikalije. Če preskusna kemikalija učinkuje na krvotvorni sistem, sta lahko indicirana tudi meritev števila retikulocitov in citološka preiskava kostnega mozga, čeprav teh ni treba izvajati redno. | 44. | Klinične biokemične preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih učinkov na tkiva ter zlasti ledvice in jetra je treba opravljati na vzorcih krvi, odvzetih vsem živalim v študiji (10 samcem in 10 samicam na skupino) v istih časovnih intervalih, kot so določeni za hematološke preiskave. Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih kliničnih biokemičnih preiskav potrebne satelitske živali. V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki na klinične biokemične parametre. Pred odvzemom vzorcev krvi je priporočljivo živali čez noč postiti (kar pa ne velja za miši) (10). Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (38): glukozo, sečnino (sečninski dušik), kreatinin, skupne beljakovine, albumin, kalcij, natrij, kalij, skupni holesterol, najmanj dva ustrezna preskusa za hepatocelularno oceno (alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, glutamat-dehidrogenaza, skupne žolčne kisline) (39) in najmanj dva ustrezna preskusa za hepatobiliarno oceno (alkalna fosfataza, γ-glutamil transferaza, 5’-nukleotidaza, skupni bilirubin, skupne žolčne kisline) (39). Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi klinični kemični parametri, kot so vrednost trigliceridov na tešče, specifični hormoni in holinesteraza. Na splošno je potreben prožni pristop glede na opažene in/ali pričakovane učinke dane preskusne kemikalije. | 45. | Analize urina je treba opravljati na vseh živalih v študiji (10 samcih in 10 samicah na skupino) na vzorcih, zbranih v istih časovnih intervalih kot pri hematoloških in kliničnih kemičnih preiskavah. Meritev pri 3 mesecih ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki pri analizi urina. V strokovno priporočilo glede kliničnih patoloških študij (38) je bil vključen naslednji seznam parametrov: videz, količina, osmolalnost ali specifična teža, pH, skupne beljakovine in glukoza. Druge določitve vključujejo keton, urobilinogen, bilirubin in okultno kri. Če je treba preiskavo opaženih učinkov razširiti, se lahko uporabijo dodatni parametri. | 46. | Na splošno se šteje, da je v študijah s psi pred tretiranjem treba določiti izhodiščne hematološke in klinične biokemične spremenljivke, v študijah z glodavci pa to ni potrebno (38). Če pa so pretekli izhodiščni podatki (glej odstavek 58) nezadostni, je treba razmisliti o pripravi takih podatkov. | PATOLOGIJA | Makroskopska obdukcija | 47. | Praviloma se na vseh živalih v študiji opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Lahko pa se tudi predvidi (za skupine za vmesno usmrtitev ali satelitske skupine), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksičnost ali imunotoksičnost (glej odstavek 21). Obdukcija in poznejši postopki, opisani v naslednjih odstavkih, pri teh živalih niso potrebni. Za opozorilne živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odloča vodja študije. | 48. | Stehtati je treba organe vseh živalih, razen tistih, ki se izključijo na podlagi zadnjega dela odstavka 47. Z nadledvičnih žlez, možganov, nadmodka, srca, ledvic, jeter, jajčnikov, vranice, mod, ščitnice (stehtane po fiksaciji skupaj z obščitnicami) in maternice vseh živali (razen živali, ki so bile najdene umirajoče in/ali so bile usmrčene med študijo) je treba, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva in nato izmeriti njihovo mokro težo čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. | 49. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (40) (tkiva v oglatih oklepajih niso obvezna): | vse vidne lezije | srce | trebušna slinavka | želodec (predželodec, žlezni želodec) | nadledvična žleza | vito črevo | obščitnica | [zobje] | aorta | tešče črevo | periferni živec | modo | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | ledvica | hipofiza | priželjc | slepo črevo | solzna žleza (zunaj očesne votline) | prostata | ščitnica | maternični vrat | jetra | rektum | [jezik] | koagulacijska žleza | pljuča | žleza slinavka | sapnik | debelo črevo | bezgavke (povrhnje in globoke) | semenski mešiček | sečni mehur | dvanajsternik | mlečna žleza (obvezna za samice, in če jo je mogoče secirati s prostim očesom, za samce) | skeletna mišica | maternica (vključno z vratom) | nadmodek | [zgornja dihala, vključno z nosom, nosnimi školjkami in obnosnimi votlinami] | koža | [sečevod] | oko (vključno z mrežnico) | požiralnik | hrbtenjača (na treh ravneh: vratni, prsni in ledveni) | [sečnica] | [stegnenica s sklepom] | [vohalni betič] | vranica | vagina | žolčnik (pri vrstah, ki niso podgane) | jajčnik | [prsnica] | rezina in/ali svež punktat kostnega mozga | Harderjeva žleza | | | | Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba shraniti oba organa. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim načinom dajanja je treba pregledati iste organe, kot so določeni na seznamu za oralni način, potrebno pa je posebno vzorčenje in shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporočilom iz poglavij B.8 (9) in B.29 te priloge (10). Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preučiti seznam organov, določen za oralni način dajanja. | Histopatologija | 50. | Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patoloških študij (40). Histopatološke preiskave morajo obsegati vsaj: | — | vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne skupine, | — | vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmrčene med študijo, | — | vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, | — | ciljna tkiva ali tkiva, pri katerih so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretiranjem povezane spremembe, vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, | — | pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba pregledati oba organa. | OPAZOVANJA (FAZA V ZVEZI Z RAKOTVORNOSTJO) | 51. | Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, običajno na začetku in koncu vsakega dne, vključno s konci tedna in prazniki. Poleg tega je treba živali pregledati enkrat na dan za odkrivanje konkretnih toksikološko pomembnih znakov. Pri študijah, v katerih se uporabi gavaža, je treba živali pregledati takoj po vnosu odmerka. Posebno pozornost je treba nameniti nastanku tumorjev ter zabeležiti čas nastopa, mesto, mere, videz in progresijo vsakega makroskopsko vidnega ali otipljivega tumorja. | 52. | Vse živali je treba stehtati na začetku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja. | Hematološke, klinične biokemične in druge meritve | 53. | Da bi se s študijo pridobilo kar največ informacij, zlasti kar zadeva razmisleke o načinu delovanja, se lahko jemljejo vzorci krvi za hematološke in klinične biokemične preiskave, čeprav o tem odloča vodja študije. Primerna je lahko tudi analiza urina. Informacije o teh parametrih se zagotovijo s podatki, ki so bili pridobljeni z živalmi, uporabljenimi v fazi študije v zvezi s kronično strupenostjo, ki običajno traja 12 mesecev (odstavek 34). Več napotkov o vrednosti jemanja takih vzorcev v okviru študije rakotvornosti je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Če se odvzamejo vzorci krvi, je treba to storiti ob koncu preskusnega obdobja, tik pred postopkom usmrtitve živali ali v okviru tega postopka. Odvzeti jih je treba na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. Za pregled se lahko pripravijo tudi krvni razmazi, zlasti če kaže, da je ciljni organ kostni mozeg, čeprav so bili izraženi dvomi o vrednosti takega pregleda krvnih razmazov v fazi v zvezi z rakotvornostjo za ocenjevanje rakotvornega/onkogenega potenciala (38). | PATOLOGIJA | Makroskopska obdukcija | 54. | Na vseh živalih v študiji, razen na opozorilnih in drugih satelitskih živalih (glej odstavek 20), se opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Za opozorilne in druge satelitske živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odloča vodja študije. Tehtanje organov navadno ni del študije rakotvornosti, saj je zaradi sprememb, povezanih s staranjem, v poznejših fazah pa zaradi nastanka tumorjev, lahko motena koristnost podatkov o teži organov. So pa lahko ti podatki odločilni za oceno zanesljivosti dokazov in zlasti za preudarke v zvezi z načinom delovanja. Če je teža organov del satelitske študije, jo je treba izmeriti najpozneje eno leto po začetku študije. | 55. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (40) (tkiva v oglatih oklepajih niso obvezna): | vse vidne lezije | srce | trebušna slinavka | želodec (predželodec, žlezni želodec) | nadledvična žleza | vito črevo | obščitnica | [zobje] | aorta | tešče črevo | periferni živec | modo | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | ledvica | hipofiza | priželjc | slepo črevo | solzna žleza (zunaj očesne votline) | prostata | ščitnica | maternični vrat | jetra | danka | [jezik] | koagulacijska žleza | pljuča | žleza slinavka | sapnik | debelo črevo | bezgavke (povrhnje in globoke) | semenski mešiček | sečni mehur | dvanajsternik | mlečna žleza (obvezna za samice, in če jo je mogoče secirati s prostim očesom, za samce) | skeletna mišica | maternica (vključno z vratom) | nadmodek | [zgornja dihala, vključno z nosom, nosnimi školjkami in obnosnimi votlinami] | koža | [sečevod] | oko (vključno z mrežnico) | požiralnik | hrbtenjača (na treh ravneh: vratni, prsni in ledveni) | [sečnica] | [stegnenica s sklepom] | [vohalni betič] | vranica | vagina | žolčnik (pri vrstah, ki niso podgane) | jajčnik | [prsnica] | rezina in/ali svež punktat kostnega mozga | Harderjeva žleza | | | | Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba shraniti oba organa. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim načinom dajanja je treba pregledati iste organe, kot so določeni na seznamu za oralni način, potrebno pa je posebno vzorčenje in shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporočilom iz poglavij B.8 (8) in B.29 te priloge (9). Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preučiti seznam organov, določen za oralni način dajanja. | Histopatologija | 56. | Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patoloških študij (40). Pregledati je treba vsaj naslednja tkiva: | — | vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne skupine, | — | vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmrčene med študijo, | — | vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, vključno s tumorji, | — | kadar so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretiranjem povezane histopatološke spremembe, je treba pregledati ista tkiva vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, | — | pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba pregledati oba organa. | PODATKI IN POROČANJE (FAZA V ZVEZI Z RAKOTVORNOSTJO IN FAZA V ZVEZI S KRONIČNO STRUPENOSTJO) | Podatki | 57. | Navesti je treba podatke za posamezne živali za vse ocenjevane parametre. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake strupenosti, opis opaženih znakov zastrupitve, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih učinkov, ter število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi podatki je treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni učinki ali lezije, ter razvrstitev lezij. | 58. | Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s sočasnimi kontrolami, bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija, se nanašati na živali iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih pred zadevno študijo. | 59. | Če je ustrezno, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Statistične metode in podatke, ki bodo analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 9). V izbiri je treba predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne. | 60. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijske podatke, | — | izvor kemikalije, | — | številko serije, | — | potrdilo o kemijski analizi. | | Nosilec (če je ustrezno) | — | utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda). | | Preskusne živali | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev izbire, | — | število, starost in spol živali na začetku preskusa, | — | izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., | — | težo vsake živali ob začetku preskusa. | | Preskusni pogoji | — | utemeljitev načina dajanja in izbire odmerkov, | — | če je ustrezno, uporabljene statistične metode za analizo podatkov, | — | podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, | — | analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, | — | način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, | — | za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost nosu ali izpostavljenost celega telesa, | — | dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v dejanski odmerek, če je primerno, | — | podatke o kakovosti hrane in vode. | | Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za posamezne živali) | | Splošno | — | podatke o preživetju, | — | telesno težo/spremembe telesne teže, | — | porabo hrane, izračune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo vode, če je ustrezno, | — | toksikokinetične podatke, če so na voljo, | — | oftalmoskopiranje (če so podatki na voljo), | — | hematologijo (če so podatki na voljo), | — | klinično kemijo (če so podatki na voljo). | | Klinični izsledki | — | znake zastrupitve, | — | pojavnost (in resnost, če se ocenjuje) vseh abnormalnosti, | — | vrsto, resnost in trajanje kliničnih opažanj (prehodnih ali trajnih). | | Obdukcijski podatki | — | terminalno telesno težo, | — | težo organov in razmerja med težami organov, če je ustrezno, | — | izsledke obdukcije; pojavnost in resnost abnormalnosti. | | Histopatologija | — | neneoplastične ugotovitve histopatoloških preiskav, | — | neoplastične ugotovitve histopatoloških preiskav, | — | povezanost makroskopskih in mikroskopskih ugotovitev, | — | podroben opis vseh s tretiranjem povezanih ugotovitev histopatoloških preiskav, vključno z razvrstitvami resnosti, | — | navedbo morebitnih medsebojnih strokovnih pregledov mikroskopskih preparatov. | | Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno | | Razprava o rezultatih | — | razpravo o pristopih modeliranja, | — | razmerja med odmerkom in odzivom, | — | pretekle kontrolne podatke, | — | preučitev vseh informacij o načinu delovanja, | — | določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, | — | pomembnost za ljudi. | | Sklepi. | VIRI: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. | (3) | Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. | (4) | Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191. | (5) | Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. | (6) | Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkronične oralne toksičnosti: 90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodalcih. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druga izdaja. Series on Testing and Assessment No. 116, na voljo na javni spletni strani OECD o smernicah za preskušanje na naslovu www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (9) | Poglavje B.8 te priloge, Subakutna strupenost pri vdihavanju: 28-dnevna študija. | (10) | Poglavje B.29 te priloge, Subkronična strupenost pri vdihavanju: 90-dnevna študija. | (11) | Poglavje B.9 te priloge, Strupenost (v stiku s kožo) pri ponavljajočem se odmerku (28 dni). | (12) | Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793–801. | (13) | Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., Fenner-Crisp, P. A. (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589. | (14) | Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51–56. | (15) | Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton, D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591–653. | (16) | Carmichael, N. G., Barton, H. A., Boobis, A. R., idr. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1–7. | (17) | Barton, H. A., Pastoor, T. P., Baetcke, T., idr. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9–35. | (18) | Doe, J. E., Boobis, A. R., Blacker, A., idr. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37–68. | (19) | Cooper, R. L., Lamb, J. S., Barlow, S. M., idr. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69–98. | (20) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz. | (21) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. | (22) | Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837. | (23) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (ur.). ILSI Press, Washington, DC. | (24) | Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., in Lumley, C. E. (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214. | (25) | Usui, T., Griffiths, S. A., in Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. V: D’Arcy POF & Harron DWG (ur.). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. str. 279–284. | (26) | Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203. | (27) | Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 20.10.2010, str. 33). | (28) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, december, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21: 15–23. | (32) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. | (33) | Tupper, D. E., Wallace, R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. | (34) | Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health 9: 691–704. | (35) | Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. | (36) | Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. | (37) | Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609. | (38) | Weingand, K., Brown, G., Hall, R., idr. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198–201. | (39) | (Osnutek) dokumenta agencije EMEA z naslovom ‚Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity‘ (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). | (40) | Crissman, J. W., Goodman, D. G., Hildebrandt, P. K., idr. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode.; | “ | (6) | Chapters B.32 and B.33 are replaced by the following: | ‘B.32. CARCINOGENICITY STUDIES | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 451 (2009). The original TG 451 on Carcinogenicity Studies was adopted in 1981. Development of this revised Test Method B.32 was considered necessary, in order to reflect recent developments in the field of animal welfare and regulatory requirements (2) (3) (4) (5) (6). The updating of this Test Method B.32 has been carried out in parallel with revisions of Chapter B.30 of this Annex, Chronic Toxicity Studies, and Chapter B.33, of this Annex, Combined Chronic Toxicity\Carcinogenicity Studies, and with the objective of obtaining additional information from the animals used in the study and providing further detail on dose selection. This Test Method B.32 is designed to be used in the testing of a broad range of chemicals, including pesticides and industrial chemicals. It should be noted however that some details and requirements may differ for pharmaceuticals (see International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals). | 2. | The majority of carcinogenicity studies are carried out in rodent species, and this Test Method is intended therefore to apply primarily to studies carried out in these species. Should such studies be required in non-rodent species, the principles and procedures outlined in this Test Method together with those outlined in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (6), should be applied, with appropriate modifications. Further guidance is available in the OECD Guidance Document No 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7). | 3. | The three main routes of administration used in carcinogenicity studies are oral, dermal and inhalation. The choice of the route of administration depends on the physical and chemical characteristics of the test chemical and the predominant route of exposure of humans. Additional information on choice of route of exposure is provided in Guidance Document No 116 (7). | 4. | This Test Method focuses on exposure via the oral route, the route most commonly used in carcinogenicity studies. While carcinogenicity studies involving exposure via the dermal or inhalation routes may also be necessary for human health risk assessment and/or may be required under certain regulatory regimes, both routes of exposure involve considerable technical complexity. Such studies will need to be designed on a case-by-case basis, although the Test Method outlined here for the assessment and evaluation of carcinogenicity by oral administration could form the basis of a protocol for inhalation and/or dermal studies, with respect to recommendations for treatment periods, clinical and pathology parameters, etc. OECD Guidance is available on the administration of test chemicals by the dermal (7), and inhalation routes (7) (8). Chapter B.8 of this Annex (9) and Chapter B.29 of this Annex (10), together with the OECD Guidance Document on acute inhalation testing (8), should be specifically consulted in the design of longer term studies involving exposure via the inhalation route. Chapter B.9 of this Annex (11) should be consulted in the case of testing carried out by the dermal route. | 5. | The carcinogenicity study provides information on the possible health hazards likely to arise from repeated exposure for a period lasting up to the entire lifespan of the species used. The study will provide information on the toxic effects of the test chemical including potential carcinogenicity, and may indicate target organs and the possibility of accumulation. It can provide an estimate of the no-observed-adverse effect level for toxic effects and, in the case of non-genotoxic carcinogens, for tumour responses, which can be used for establishing safety criteria for human exposure. The need for careful clinical observations of the animals, so as to obtain as much information as possible, is also stressed. | 6. | The objectives of carcinogenicity studies covered by this Test Method include: | — | The identification of the carcinogenic properties of a test chemical, resulting in an increased incidence of neoplasms, increased proportion of malignant neoplasms or a reduction in the time to appearance of neoplasms, compared with concurrent control groups; | — | The identification of target organ(s) of carcinogenicity; | — | The identification of the time to appearance of neoplasms; | — | Characterisation of the tumour dose-response relationship; | — | Identification of a no-observed-adverse-effect level (NOAEL) or point of departure for establishment of a Benchmark Dose (BMD); | — | Extrapolation of carcinogenic effects to low dose human exposure levels; | — | Provision of data to test hypotheses regarding mode of action (2) (7) (12) (13) (14) (15). | INITIAL CONSIDERATIONS | 7. | In the assessment and evaluation of the potential carcinogenicity of a test chemical, all available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study, in order to focus the design of the study to more efficiently test for carcinogenic potential and to minimise animal usage. Information on, and consideration of, the mode of action of a suspected carcinogen (2) (7) (12) (13) (14) (15) is particularly important, since the optimal design may differ depending on whether the test chemical is a known or suspected genotoxic carcinogen. Further guidance on mode of action considerations can be found in Guidance Document No 116 (7). | 8. | Information that will assist in the study design includes the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests including genotoxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data, mutagenicity/genotoxicity, carcinogenicity and other toxicological data on structurally-related chemicals; available toxicokinetic data (single dose and also repeat dose kinetics where available) and data derived from other repeated exposure studies. Assessment of carcinogenicity should be carried out after initial information on toxicity has been obtained from repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests. Short-term cancer initiation-promotion tests could also provide useful information. A phased testing approach to carcinogenicity testing should be considered as part of the overall assessment of the potential adverse health effects of a particular test chemical (16) (17) (18) (19). | 9. | The statistical methods most appropriate for the analysis of results, given the experimental design and objectives, should be established before commencing the study. Issues to consider include whether the statistics should include adjustment for survival, analysis of cumulative tumour risks relative to survival duration, analysis of the time to tumour and analysis in the event of premature termination of one or more groups. Guidance on the appropriate statistical analyses and key references to internationally accepted statistical methods are given in Guidance Document No 116 (7), and also in Guidance Document No 35 on the analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (20). | 10. | In conducting a carcinogenicity study, the guiding principles and considerations outlined in the OECD Guidance Document No 19 on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (21), in particular paragraph 62 thereof, should always be followed. This paragraph states that “In studies involving repeated dosing, when an animal shows clinical signs that are progressive, leading to further deterioration in condition, an informed decision as to whether or not to humanely kill the animal should be made. The decision should include consideration as to the value of the information to be gained from the continued maintenance of that animal on study relative to its overall condition. If a decision is made to leave the animal on test, the frequency of observations should be increased, as needed. It may also be possible, without adversely affecting the purpose of the test, to temporarily stop dosing if it will relieve the pain or distress, or reduce the test dose.” | 11. | Detailed guidance on and discussion of the principles of dose selection for chronic toxicity and carcinogenicity studies can be found in Guidance Document No 116 (7) as well as two International Life Sciences Institute publications (22) (23). The core dose selection strategy is dependent on the primary objective or objectives of the study (paragraph 6). In selecting appropriate dose levels, a balance should be achieved between hazard screening on the one hand and characterisation of low-dose responses and their relevance on the other. This is particularly relevant in the situation where a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex) is to be carried out (paragraph 12). | 12. | Consideration should be given to carrying out a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex), rather than separate execution of a chronic toxicity study (Chapter B.30 of this Annex) and carcinogenicity study (this Test Method B.32). The combined test provides greater efficiency in terms of time and cost compared to conducting two separate studies, without compromising the quality of the data in either the chronic phase or the carcinogenicity phase. Careful consideration should however be given to the principles of dose selection (paragraphs 11 and 22-25) when undertaking a combined chronic toxicity and carcinogenicity study (Chapter B.33 of this Annex), and it is also recognised that separate studies may be required under certain regulatory frameworks. | 13. | Definitions used in the context of this Test Method can be found at the end of this chapter and in the Guidance Document No 116 (7). | PRINCIPLE OF THE TEST | 14. | The test chemical is administered daily in graduated doses to several groups of test animals for the majority of their life span, normally by the oral route. Testing by the inhalation or dermal route may also be appropriate. The animals are observed closely for signs of toxicity and for the development of neoplastic lesions. Animals which die or are killed during the test are necropsied and, at the conclusion of the test, surviving animals are killed and necropsied. | DESCRIPTION OF METHOD | Selection of animal species | 15. | This Test Method primarily covers assessment and evaluation of carcinogenicity in rodents (paragraph 2). The use of non-rodent species may be considered when available data suggest that they are more relevant for the prediction of health effects in humans. The choice of species should be justified. The preferred rodent species is the rat, although other rodent species, e.g. the mouse, may be used. Although the use of the mouse in carcinogenicity testing may have limited utility (24) (25) (26), under some current regulatory programmes carcinogenicity testing in the mouse is still required unless it is determined that such a study is not scientifically necessary. Rats and mice have been preferred experimental models because of their relatively short life span, their widespread use in pharmacological and toxicological studies, their susceptibility to tumour induction, and the availability of sufficiently characterised strains. As a consequence of these characteristics, a large amount of information is available on their physiology and pathology. Additional information on choice of species and strain is provided in Guidance Document No 116 (7). | 16. | Young healthy adult animals of commonly used laboratory strains should be employed. The carcinogenicity study should preferably be carried out in animals from the same strain and source as those used in preliminary toxicity study(ies) of shorter duration although, if animals from this strain and source are known to present problems in achieving the normally accepted criteria of survival for long-term studies [see Guidance Document No 116 (7)], consideration should be given to using a strain of animal that has an acceptable survival rate for the long-term study. The females should be nulliparous and non-pregnant. | Housing and feeding | 17. | Animals may be housed individually, or be caged in small groups of the same sex; individual housing should be considered only if scientifically justified (27) (28) (29). Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimised. The temperature in the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C). Although the relative humidity should be at least 30 % and preferably not exceed 70 % other than during room cleaning, the aim should be 50-60 %. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light, 12 hours dark. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. The diet should meet all the nutritional requirements of the species tested and the content of dietary contaminants, including but not limited to pesticide residues, persistent organic pollutants, phytoestrogens, heavy metals and mycotoxins, that might influence the outcome of the test, should be as low as possible. Analytical information on the nutrient and dietary contaminant levels should be generated periodically, at least at the beginning of the study and when there is a change in the batch used, and should be included in the final report. Analytical information on the drinking water used in the study should similarly be provided. The choice of diet may be influenced by the need to ensure a suitable admixture of a test chemical and to meet the nutritional requirements of the animals when the test chemical is administered by the dietary route. | Preparation of animals | 18. | Healthy animals, which have been acclimated to laboratory conditions for at least 7 days and have not been subjected to previous experimental procedures, should be used. In the case of rodents, dosing of the animals should begin as soon as possible after weaning and acclimatisation and preferably before the animals are 8 weeks old. The test animals should be characterised as to species, strain, source, sex, weight and age. At the commencement of the study, the weight variation for each sex of animal used should be minimal and not exceed ± 20 % of the mean weight of all the animals within the study, separately for each sex. Animals should be randomly assigned to the control and treatment groups. After randomisation, there should be no significant differences in mean body weights between groups within each sex. If there are statistically significant differences, then the randomisation step should be repeated, if possible. Each animal should be assigned a unique identification number, and permanently marked with this number by tattooing, microchip implant, or other suitable method. | PROCEDURE | Number and sex of animals | 19. | Both sexes should be used. A sufficient number of animals should be used so that a thorough biological and statistical evaluation is possible. Each dose group and concurrent control group should therefore contain at least 50 animals of each sex. Depending on the aim of the study, it may be possible to increase the statistical power of the key estimates by differentially allocating animals unequally to the various dose groups, with more than 50 animals in the low dose groups; e.g. to estimate the carcinogenic potential at low doses. However it should be recognised that a moderate increase in group size will provide relatively little increase in statistical power of the study. Further information on statistical design of the study and choice of dose levels to maximise statistical power is provided in Guidance Document No 116 (7). | Provision for interim kills and satellite (sentinel) groups | 20. | The study may make provision for interim kills, e.g. at 12 months, to provide information on progression of neoplastic changes and mechanistic information, if scientifically justified. Where such information is already available from previous repeat dose toxicity studies on the test chemical, interim kills may not be scientifically justified. If interim kills are included in the study design, the number of animals in each dose group scheduled for an interim kill will normally be 10 animals per sex, and the total number of animals included in the study design should be increased by the number of animals scheduled to be killed before the completion of the study. An additional group of sentinel animals (typically 5 animals per sex) may be included for monitoring of disease status, if necessary, during the study (30). Further guidance is provided in Guidance Document No 116 (7). | Dose groups and dosage | 21. | Guidance on all aspects of dose selection and dose level spacing is provided in Guidance Document No 116 (7). At least three dose levels and a concurrent control should be used. Dose levels will generally be based on the results of shorter-term repeated dose or range finding studies and should take into account any existing toxicological and toxicokinetic data available for the test chemical or related chemicals. | 22. | Unless limited by the physical-chemical nature or biological effects of the test chemical, the highest dose level should be chosen to identify the principal target organs and toxic effects while avoiding suffering, severe toxicity, morbidity, or death. While taking into account the factors outlined in paragraph 23 below, the highest dose level should normally be chosen to elicit evidence of toxicity, as evidenced by, for example, depression of body weight gain (approximately 10 %). However, dependent on the objectives of the study (see paragraph 6), a top dose lower than the dose providing evidence of toxicity may be chosen, e.g. if a dose elicits an adverse effect of concern that nonetheless has little impact on lifespan or body weight. | 23. | Dose levels and dose level spacing may be selected to establish a dose-response and, depending on the mode of action of the test chemical, a NOAEL or other intended outcome of the study, e.g. a BMD (see paragraph 25) at the lowest dose level. Factors that should be considered in the placement of lower doses include the expected slope of the dose–response curve, the doses at which important changes may occur in metabolism or mode of toxic action, where a threshold is expected, or where a point of departure for low-dose extrapolation is expected. | 24. | The dose level spacing selected will depend on the characteristics of the test chemical, and cannot be prescribed in this Test Method, but two to four fold intervals frequently provide good test performance for setting the descending dose levels and addition of a fourth test group is often preferable to using very large intervals (e.g. more than a factor of about 6-10) between dosages. In general, the use of factors greater than 10 should be avoided, and should be justified if used. | 25. | As discussed further in Guidance Document No 116 (7), points to be considered in dose selection include: | — | Known or suspected nonlinearities or inflection points in the dose–response; | — | Toxicokinetics, and dose ranges where metabolic induction, saturation, or nonlinearity between external and internal doses does or does not occur; | — | Precursor lesions, markers of effect, or indicators of the operation of key underlying biological processes; | — | Key (or suspected) aspects of mode of action, such as doses at which cytotoxicity begins to arise, hormone levels are perturbed, homeostatic mechanisms are overwhelmed, etc.; | — | Regions of the dose–response curve where particularly robust estimation is needed, e.g. in the range of the anticipated BMD or a suspected threshold; | — | Consideration of anticipated human exposure levels. | 26. | The control group shall be an untreated group or a vehicle-control group if a vehicle is used in administering the test chemical. Except for treatment with the test chemical, animals in the control group should be handled in an identical manner to those in the test groups. If a vehicle is used, the control group shall receive the vehicle in the highest volume used among the dose groups. If a test chemical is administered in the diet, and causes significantly reduced dietary intake due to the reduced palatability of the diet, an additional pair-fed control group may be useful, to serve as a more suitable control. | Preparation of doses and administration of test chemical | 27. | The test chemical is normally administered orally, via the diet or drinking water, or by gavage. Additional information on routes and methods of administration is provided in Guidance Document No 116 (7). The route and method of administration is dependent on the purpose of the study, the physical-chemical properties of the test chemical, its bioavailability and the predominant route and method of exposure of humans. A rationale should be provided for the chosen route and method of administration. In the interest of animal welfare, oral gavage should normally be selected only for those agents, for which this route and method of administration reasonably represent potential human exposure (e.g. pharmaceuticals). For dietary or environmental chemicals including pesticides, administration is typically via the diet or drinking water. However, for some scenarios, e.g. occupational exposure, administration via other routes may be more appropriate. | 28. | Where necessary, the test chemical is dissolved or suspended in a suitable vehicle. Consideration should be given to the following characteristics of the vehicle and other additives, as appropriate: effects on the absorption, distribution, metabolism, or retention of the test chemical; effects on the chemical properties of the test chemical which may alter its toxic characteristics; and effects on the food or water consumption or the nutritional status of the animals. It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solution/suspension be considered first, followed by consideration of a solution/emulsion in oil (e.g. corn oil) and then by possible solution in other vehicles. For vehicles other than water, the toxic characteristics of the vehicle should be known. Information should be available on the stability of the test chemical and the homogeneity of dosing solutions or diets (as appropriate) under the conditions of administration (e.g. diet). | 29. | For chemicals administered via the diet or drinking water it is important to ensure that the quantities of the test chemical involved do not interfere with normal nutrition or water balance. In long-term toxicity studies using dietary administration, the concentration of the test chemical in the feed should not normally exceed an upper limit of 5 % of the total diet, in order to avoid nutritional imbalances. When the test chemical is administered in the diet, either a constant dietary concentration (mg/kg diet or ppm) or a constant dose level in terms of the animal’s body weight (mg/kg body weight), calculated on a weekly basis, may be used. The alternative used should be specified. | 30. | In the case of oral administration, the animals are dosed with the test chemical daily (seven days per week), normally for a period of 24 months for rodents (see also paragraph 32). Any other dosing regime, e.g. five days per week, needs to be justified. In the case of dermal administration, animals are normally treated with the test chemical for at least 6 hours per day, 7 days per week, as specified in Chapter B.9 of this Annex (11), for a period of 24 months. Exposure by the inhalation route is carried out for 6 hours per day, 7 days per week, but exposure for 5 days per week may also be used, if justified. The period of exposure will normally be for a period of 24 months. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration of less than 6 hours per day. See also Chapter B.8 of this Annex (9). | 31. | When the test chemical is administered by gavage to the animals, this should be done using a stomach tube or a suitable intubation cannula, at similar times each day. Normally a single dose will be administered once daily; where for example a chemical is a local irritant, it may be possible to maintain the daily dose-rate by administering it as a split dose (twice a day). The maximum volume of liquid that can be administered at one time depends on the size of the test animal. The volume should be kept as low as practical, and should not normally exceed 1 ml/100g body weight for rodents (31). Variability in test volume should be minimised by adjusting the concentration to ensure a constant volume at all dose levels. Potentially corrosive or irritant chemicals are the exception, and need to be diluted to avoid severe local effects. Testing at concentrations that are likely to be corrosive or irritant to the gastrointestinal tract should be avoided. | Duration of study | 32. | The duration of the study will normally be 24 months for rodents, representing the majority of the normal life span of the animals to be used. Shorter or longer study durations may be used, dependent on the lifespan of the strain of the animal species in the study, but should be justified. For specific strains of mice, e.g. AKR/J, C3H/J or C57BL/6J strains a duration of 18 months may be more appropriate. The following provides some guidance on duration, termination of the study and survival; further guidance, including consideration of the acceptability of a negative carcinogenicity relative to survival in the study, is provided in the OECD Guidance Document No 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7). | — | Termination of the study should be considered when the number of survivors in the lower dose groups or the control group falls below 25 per cent. | — | In the case where only the high dose group dies prematurely due to toxicity, this should not trigger termination of the study. | — | Survival of each sex should be considered separately. | — | The study should not be extended beyond the point when the data available from the study are no longer sufficient to enable a statistically valid evaluation to be made. | OBSERVATIONS | 33. | All animals should be checked for morbidity or mortality, usually at the beginning and the end of each day, including at weekends and holidays. Animals should additionally be checked once a day for specific signs of toxicological relevance, taking into consideration the peak period of anticipated effects after dosing in the case of gavage administration. Particular attention should be paid to tumour development; and the time of tumour onset, location, dimensions, appearance, and progression of each grossly visible or palpable tumour should be recorded. | Body weight, food/water consumption and food efficiency | 34. | All animals should be weighed at the start of treatment, at least once a week for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Measurements of food consumption and food efficiency should be made at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Water consumption should be measured at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter when the test chemical is administered in drinking water. Water consumption measurements should also be considered for studies in which drinking activity is altered. | Haematology, clinical biochemistry and other measurements | 35. | In order to maximise the information obtained from the study, especially for mode of action considerations, blood samples may be taken for haematology and clinical biochemistry, and this at the discretion of the study director. Urinalysis may also be appropriate. Further guidance on the value of taking such samples as part of a carcinogenicity study is provided in Guidance Document No 116 (7). If considered appropriate, blood sampling for haematological and clinical chemistry determinations and urinalysis may be conducted as part of an interim kill (paragraph 20) and at study termination on a minimum of 10 animals per sex per group. Blood samples should be taken from a named site, for example by cardiac puncture or from the retro-orbital sinus under anaesthesia, and stored, if applicable, under appropriate conditions. Blood smears may also be prepared for examination, particularly if bone marrow appears to be the target organ, although the value of such examination for the assessment of carcinogenic/oncogenic potential has been questioned (32). | PATHOLOGY | Gross necropsy | 36. | All animals in the study except sentinel animals (see paragraph 20) and other satellite animals should be subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. Sentinel animals and other satellite animals may require necropsy on a case-by-case basis, at the discretion of the study director. Organ weights are not normally part of a carcinogenesis study, since geriatric changes and, at later stages, the development of tumours confounds the usefulness of organ weight data. They may, however, be critical to performing a weight of evidence evaluation and especially for mode of action considerations. If they are part of a satellite study, they should be collected at no later than one year after initiation of the study. | 37. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (33) (tissues in square brackets are optional): | all gross lesions | heart | pancreas | stomach (forestomach, glandular stomach) | adrenal gland | ileum | parathyroid gland | [teeth] | aorta | jejunum | peripheral nerve | testis | brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | kidney | pituitary | thymus | caecum | lacrimal gland (exorbital) | prostate | thyroid | cervix | liver | rectum | [tongue] | coagulating gland | lung | salivary gland | trachea | colon | lymph nodes (both superficial and deep) | seminal vesicle | urinary bladder | duodenum | mammary gland (obligatory for females and, if visibly dissectable, from males) | skeletal muscle | uterus (including cervix) | epididymis | [upper respiratory tract, including nose, turbinates, and paranasal sinuses] | skin | [ureter] | eye (including retina) | oesophagus | spinal cord (at three levels: cervical, mid-thoracic, and lumbar) | [urethra] | [femur with joint] | [olfactory bulb] | spleen | vagina | gall bladder (for species other than rat) | ovary | [sternum], | section of bone marrow and/or a fresh bone marrow aspirate | Harderian gland | | | | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be preserved. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also, any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. In studies involving the dermal route of administration, the list of organs as set out for the oral route should be preserved, and specific sampling and preservation of the skin from the site of application is essential. In inhalation studies, the list of preserved and examined tissues from the respiratory tract should follow the recommendations of Chapters B.8 and B.29 of this Annex. For other organs/tissues (and in addition to the specifically preserved tissues from the respiratory tract) the list of organs as set out for the oral route should be examined. | Histopathology | 38. | Guidance is available on best practices in the conduct of toxicological pathology studies (33). The minimum tissues examined should be: | — | All tissues from the high dose and control groups; | — | All tissues of animals dying or killed during the study; | — | All tissues showing macroscopic abnormalities including tumours; | — | When treatment-related histopathological changes are observed in the high dose group, those same tissues are to be examined from all animals in all other dose groups; | — | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be examined. | DATA AND REPORTING | Data | 39. | Individual animal data should be provided for all parameters evaluated. Additionally, all data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals at the start of the test, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons and the time of any death or humane kill, the number showing signs of toxicity, a description of the signs of toxicity observed, including time of onset, duration, and severity of any toxic effects, the number of animals showing lesions, the type of lesions and the percentage of animals displaying each type of lesion. Summary data tables should provide the means and standard deviations (for continuous test data) of animals showing toxic effects or lesions, in addition to the grading of lesions. | 40. | Historical control data may be valuable in the interpretation of the results of the study, e.g. in the case when there are indications that the data provided by the concurrent controls are substantially out of line when compared to recent data from control animals from the same test facility/colony. Historical control data, if evaluated, should be submitted from the same laboratory and relate to animals of the same age and strain generated during the five years preceding the study in question. | 41. | When applicable, numerical results should be evaluated by an appropriate and generally acceptable statistical method. The statistical methods and the data to be analysed should be selected during the design of the study (paragraph 9). Selection should make provision for survival adjustments, if needed. | Test report | 42. | The test report should include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature, purity, and physicochemical properties; | — | identification data; | — | source of chemical; | — | batch number; | — | certificate of chemical analysis; | | Vehicle (if appropriate): | — | justification for choice of vehicle (if other than water); | | Test animals: | — | species/strain used and justification for choice made; | — | number, age, and sex of animals at start of test; | — | source, housing conditions, diet, etc.; | — | individual weights of animals at the start of the test; | | Test conditions: | — | rationale for route of administration and dose selection; | — | when applicable, the statistical methods used to analyse the data; | — | details of test chemical formulation/diet preparation. | — | analytical data on achieved concentration, stability and homogeneity of the preparation; | — | route of administration and details of the administration of the test chemical; | — | for inhalation studies, whether nose only or whole body; | — | actual doses (mg/kg body weight/day), and conversion factor from diet/drinking water test chemical concentration (mg/kg or ppm) to the actual dose, if applicable; | — | details of food and water quality; | | Results (summary tabulated data and individual animal data should be presented) | | General | — | survival data; | — | body weight/body weight changes; | — | food consumption, calculations of food efficiency, if made, and water consumption, if applicable; | — | toxicokinetic data (if available); | — | opthalmoscopy (if available); | — | haematology (if available); | — | clinical chemistry (if available); | | Clinical findings | — | Signs of toxicity; | — | Incidence (and, if scored, severity) of any abnormality; | — | Nature, severity, and duration of clinical observations (whether transitory or permanent); | | Necropsy data | — | Terminal body weight; | — | Organ weights and their ratios, if applicable; | — | Necropsy findings; Incidence and severity of abnormalities; | | Histopathology | — | Non neoplastic histopathological findings,; | — | Neoplastic histopathological findings; | — | Correlation between gross and microscopic findings; | — | Detailed description of all treatment-related histopathological findings including severity gradings; | — | Report of any peer review of slides; | | Statistical treatment of results, as appropriate | | Discussion of results including | — | Discussion of any modelling approaches; | — | Dose-response relationships; | — | Historical control data; | — | Consideration of any mode of action information; | — | BMD, NOAEL or LOAEL determination; | — | Relevance for humans; | | Conclusions | LITERATURE: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. | (3) | Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208. | (4) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191. | (5) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. | (6) | Chapter B.27 of this Annex, Sub-chronic Oral Toxicity Test Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Chapter B.8 of this Annex, Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study. | (10) | Chapter B.29 of this Annex, Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study. | (11) | Chapter B.9 of this Annex, Repeated Dose (28 Days) Toxicity (Dermal). | (12) | Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801. | (13) | Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, and Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581-589. | (14) | Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51-56. | (15) | Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591-653. | (16) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. | (17) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (18) | Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68. | (19) | Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98. | (20) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No 35 and Series on Pesticides No 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. | (21) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (22) | Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West, W, Olin S(2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. | (23) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. | (24) | Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214. | (25) | Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284. | (26) | Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of 10 Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203. | (27) | Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (OJ L 276, 20.10.2010, p. 33). | (28) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. | (32) | Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (33) | Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | B.33. COMBINED CHRONIC TOXICITY/CARCINOGENICITY STUDIES | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 453 (2009). The original TG 453 was adopted in 1981. Development of this updated Test Method B.33 was considered necessary, in order to reflect recent developments in the field of animal welfare and regulatory requirements (1) (2) (3) (4) (5). The updating of this Test Method B.33 has been carried out in parallel with revisions of Chapter B.32 of this Annex, Carcinogenicity Studies, and Chapter B.30 of this Annex, Chronic Toxicity Studies, with the objective of obtaining additional information from the animals used in the study and providing further detail on dose selection. This Test Method is designed to be used in the testing of a broad range of chemicals, including pesticides and industrial chemicals. It should be noted however that some details and requirements may differ for pharmaceuticals [see International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals]. | 2. | The majority of chronic toxicity and carcinogenicity studies are carried out in rodent species and this Test Method is intended therefore to apply primarily to studies carried out in these species. Should such studies be required in non-rodent species, the principles and procedures outlined may also be applied, with appropriate modifications, together with those outlined in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (6), as outlined in the OECD Guidance Document No 116 on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7). | 3. | The three main routes of administration used in chronic toxicity/carcinogenicity studies are oral, dermal and inhalation. The choice of the route of administration depends on the physical and chemical characteristics of the test chemical and the predominant route of exposure of humans. Additional information on choice of route of exposure is provided in Guidance Document No 116 (7). | 4. | This Test Method focuses on exposure via the oral route, the route most commonly used in chronic toxicity and carcinogenicity studies. While long–term studies involving exposure via the dermal or inhalation routes may also be necessary for human health risk assessment and/or may be required under certain regulatory regimes, both routes of exposure involve considerable technical complexity. Such studies will need to be designed on a case-by-case basis, although the Test Method outlined here for the assessment and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity by oral administration could form the basis of a protocol for inhalation and/or dermal studies, with respect to recommendations for treatment periods, clinical and pathology parameters, etc. OECD Guidance is available on the administration of test chemicals by the inhalation (7) (8) and dermal routes (7). Chapter B.8 of this Annex (9) and Chapter B.29 of this Annex (10), together with the OECD Guidance Document on acute inhalation testing (8), should be specifically consulted in the design of longer term studies involving exposure via the inhalation route. Chapter B.9 of this Annex (11) should be consulted in the case of testing carried out by the dermal route. | 5. | The combined chronic toxicity/carcinogenicity study provides information on the possible health hazards likely to arise from repeated exposure for a period lasting up to the entire lifespan of the species used. The study will provide information on the toxic effects of the test chemical, including potential carcinogenicity, indicate target organs and the possibility of accumulation. It can provide an estimate of the no-observed-adverse effect level for toxic effects and, in the case of non-genotoxic carcinogens, for tumour responses, which can be used for establishing safety criteria for human exposure. The need for careful clinical observations of the animals, so as to obtain as much information as possible, is also stressed. | 6. | The objectives of chronic toxicity/carcinogenicity studies covered by this Test Method include: | — | The identification of the carcinogenic properties of a test chemical, resulting in an increased incidence of neoplasms, increased proportion of malignant neoplasms or a reduction in the time to appearance of neoplasms, compared with concurrent control groups; | — | The identification of the time to appearance of neoplasms; | — | The identification of the chronic toxicity of the test chemical; | — | The identification of target organ(s) of chronic toxicity and carcinogenicity, | — | Characterisation of the dose:response relationship, | — | Identification of a no-observed-adverse-effect level (NOAEL) or point of departure for establishment of a Benchmark Dose (BMD), | — | Extrapolation of carcinogenic effects to low dose human exposure levels, | — | Prediction of chronic toxicity effects at human exposure levels, | — | Provision of data to test hypotheses regarding mode of action (2) (7) (12) (13) (14) (15). | INITIAL CONSIDERATIONS | 7. | In the assessment and evaluation of the potential carcinogenicity and chronic toxicity of a test chemical, all available information on the test chemical should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study, in order to focus the design of the study to more efficiently test for its toxicological properties and to minimise animal usage. Information on, and consideration of, the mode of action of a suspected carcinogen (2) (7) (12) (13) (14) (15) is particularly important, since the optimal design may differ depending on whether the test chemical is a known or suspected genotoxic carcinogen. Further guidance on mode of action considerations can be found in Guidance Document No 116 (7). | 8. | Information that will assist in the study design includes the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; any information on the mode of action; results of any in vitro or in vivo toxicity tests including genotoxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data, mutagenicity/genotoxicity, carcinogenicity and other toxicological data on structurally-related chemicals; available toxicokinetic data (single dose and also repeat dose kinetics where available) and data derived from other repeated exposure studies. The determination of chronic toxicity/carcinogenicity should only be carried out after initial information on toxicity has been obtained from repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests. Short-tem cancer initiation-promotion tests could also provide useful information. A phased testing approach to carcinogenicity testing should be considered as part of the overall assessment of the potential adverse health effects of a particular test chemical (16) (17) (18) (19). | 9. | The statistical methods most appropriate for the analysis of results, given the experimental design and objectives, should be established before commencing the study. Issues to consider include whether the statistics should include adjustment for survival, analysis of cumulative tumour risks relative to survival duration, analysis of the time to tumour and analysis in the event of premature termination of one or more groups. Guidance on the appropriate statistical analyses and key references to internationally accepted statistical methods are given in Guidance Document No 116 (7), and also in Guidance Document No 35 on the analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (20). | 10. | In conducting a carcinogenicity study, the guiding principles and considerations outlined in the OECD Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (21), in particular paragraph 62 thereof, should always be followed. This paragraph states that “In studies involving repeated dosing, when an animal shows clinical signs that are progressive, leading to further deterioration in condition, an informed decision as to whether or not to humanely kill the animal should be made. The decision should include consideration as to the value of the information to be gained from the continued maintenance of that animal on study relative to its overall condition. If a decision is made to leave the animal on test, the frequency of observations should be increased, as needed. It may also be possible, without adversely affecting the purpose of the test, to temporarily stop dosing if it will relieve the pain or distress, or reduce the test dose.” | 11. | Detailed guidance on and discussion of the principles of dose selection for chronic toxicity and carcinogenicity studies can be found in Guidance Document No 116 (7), as well as two International Life Sciences Institute publications (22) (23). The core dose selection strategy is dependent on the primary objective or objectives of the study (paragraph 6). In selecting appropriate dose levels, a balance should be achieved between hazard screening on the one hand and characterisation of low-dose responses and their relevance on the other. This is particularly relevant in the case of this combined chronic toxicity and carcinogenicity study. | 12. | Consideration should be given to carrying out this combined chronic toxicity and carcinogenicity study, rather than separate execution of a chronic toxicity study (Chapter B.30 of this Annex) and carcinogenicity study (Chapter B.32 of this Annex). The combined test provides greater efficiency in terms of time and cost, and some reduction in animal use, compared to conducting two separate studies, without compromising the quality of the data in either the chronic phase or the carcinogenicity phase. Careful consideration should however be given to the principles of dose selection (paragraphs 11 and 22-26) when undertaking a combined chronic toxicity and carcinogenicity study, and it is also recognised that separate studies may be required under certain regulatory frameworks. Further guidance on the design of the combined chronic toxicity and carcinogenicity study in order to achieve maximum efficiency of the study in terms of possibilities for reduction in numbers of animals used as well as via the streamlining of the various experimental procedures can be found in Guidance Document No 116 (7). | 13. | Definitions used in the context of this Test Method can be found at the end of this chapter and in Guidance Document No 116 (7). | PRINCIPLE OF THE TEST | 14. | The study design consists of two parallel phases, a chronic phase and a carcinogenicity phase (for duration see paragraphs 34 and 35, respectively). The test chemical is normally administered by the oral route although testing by the inhalation or dermal route may also be appropriate. For the chronic phase, the test chemical is administered daily in graduated doses to several groups of test animals, one dose level per group, normally for a period of 12 months, although longer or shorter durations may also be chosen depending on regulatory requirements (see paragraph 34). This duration is chosen to be sufficiently long to allow any effects of cumulative toxicity to become manifest, without the confounding effects of geriatric changes. The study design may also include one or more interim kills, e.g. at 3 and 6 months, and additional groups of animals may be included to accommodate this (see paragraph 20). For the carcinogenicity phase, the test chemical is administered daily to several groups of test animals for a major portion of their life span. The animals in both phases are observed closely for signs of toxicity and for the development of neoplastic lesions. Animals which die or are killed during the test are necropsied and, at the conclusion of the test, surviving animals are killed and necropsied. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 15. | This Test Method primarily covers assessment and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity in rodents (paragraph 2). The use of non-rodent species may be considered when available data suggest that they are more relevant for the prediction of health effects in humans. The choice of species should be justified. The preferred rodent species is the rat, although other rodent species, e.g. the mouse, may be used. Although the use of the mouse in carcinogenicity testing may have limited utility (24) (25) (26), under some current regulatory programmes carcinogenicity testing in the mouse is still required unless it is determined that such a study is not scientifically necessary. Rats and mice have been preferred experimental models because of their relatively short life span, their widespread use in pharmacological and toxicological studies, their susceptibility to tumour induction, and the availability of sufficiently characterised strains. As a consequence of these characteristics, a large amount of information is available on their physiology and pathology. The design and conduct of chronic toxicity/carcinogenicity studies in non-rodent species, when required, should be based on the principles outlined in this Test Method together with those in Chapter B.27 of this Annex, Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (6). Additional information on choice of species and strain is provided in Guidance Document No 116 (7). | 16. | Young healthy adult animals of commonly used laboratory strains should be employed. The combined chronic toxicity/carcinogenicity study should be carried out in animals from the same strain and source as those used in preliminary toxicity study(ies) of shorter duration, although, if animals from this strain and source are known to present problems in achieving the normally accepted criteria of survival for long-term studies [see Guidance Document No 116 (7)], consideration should be given to using a strain of animal that has a acceptable survival rate for the long-term study. The females should be nulliparous and non-pregnant. | Housing and feeding conditions | 17. | Animals may be housed individually, or be caged in small groups of the same sex; individual housing should be considered only if scientifically justified (27) (28) (29). Cages should be arranged in such a way that possible effects due to cage placement are minimised. The temperature in the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C). Although the relative humidity should be at least 30 % and preferably not exceed 70 % other than during room cleaning, the aim should be 50-60 %. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light, 12 hours dark. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. The diet should meet all the nutritional requirements of the species tested and the content of dietary contaminants, including but not limited to pesticide residues, persistent organic pollutants, phytoestrogens, heavy metals and mycotoxins, that might influence the outcome of the test, should be as low as possible. Analytical information on the nutrient and dietary contaminant levels should be generated periodically, at least at the beginning of the study and when there is a change in the batch used, and should be included in the final report. Analytical information on the drinking water used in the study should similarly be provided. The choice of diet may be influenced by the need to ensure a suitable admixture of a test chemical and to meet the nutritional requirements of the animals when the test chemical is administered by the dietary route. | Preparation of animals | 18. | Healthy animals, which have been acclimated to laboratory conditions for at least 7 days and have not been subjected to previous experimental procedures, should be used. In the case of rodents, dosing of the animals should begin as soon as possible after weaning and acclimatisation and preferably before the animals are 8 weeks old. The test animals should be characterised as to species, strain, source, sex, weight and age. At the commencement of the study, the weight variation for each sex of animals used should be minimal and not exceed ± 20 % of the mean weight of all the animals within the study, separately for each sex. Animals should be randomly assigned to the control and treatment groups. After randomisation, there should be no significant differences in mean body weights between groups within each sex. If there are statistically significant differences, then the randomisation step should be repeated, if possible. Each animal should be assigned a unique identification number, and permanently marked with this number by tattooing, microchip implant, or other suitable method. | PROCEDURE | Number and sex of animals | 19. | Both sexes should be used. A sufficient number of animals should be used so that a thorough biological and statistical evaluation is possible. For rodents, each dose group (as outlined in paragraph 22) and concurrent control group intended for the carcinogenicity phase of the study should therefore contain at least 50 animals of each sex. Depending on the aim of the study, it may be possible to increase the statistical power of the key estimates by differentially allocating animals unequally to the various dose groups, with more than 50 animals in the low dose groups, e.g. to estimate the carcinogenic potential in low doses. However it should be recognised that a moderate increase in group size will provide relatively little increase in statistical power of the study. Each dose group (as outlined in paragraph 22) and concurrent control group intended for the chronic toxicity phase of the study should contain at least 10 animals of each sex, in the case of rodents. It should be noted that this number is lower than in the chronic toxicity study (Chapter B.30 of this Annex). The interpretation of the data from the reduced number of animals per group in the chronic toxicity phase of this combined study will however be supported by the data from the larger number of animals in the carcinogenicity phase of the study. In studies involving mice, additional animals may be needed in each dose group of the chronic toxicity phase, to conduct all required haematological determinations. Further information on statistical design of the study and choice of dose levels to maximise statistical power is provided in Guidance Document No 116 (7). | Provision for interim kills, satellite group and sentinel animals | 20. | The study may make provision for interim kills, e.g. at 6 months for the chronic toxicity phase, to provide information on progression of non-neoplastic changes and mechanistic information, if scientifically justified. Where such information is already available from previous repeat dose toxicity studies on the test chemical, interim kills may not be scientifically justified. The animals used in the chronic toxicity phase of the study, normally of 12 months duration (paragraph 34) provide interim kill data for the carcinogenicity phase of the study, thus achieving a reduction in the number of animals used overall. Satellite groups may also be included in the chronic toxicity phase of the study, to monitor the reversibility of any toxicological changes induced by the test chemical under investigation. These may be restricted to the highest dose level of the study plus control. An additional group of sentinel animals (typically 5 animals per sex) may be included for monitoring of disease status, if necessary, during the study (30). Further guidance on study design to include interim kills, satellite and sentinel animals, while minimising the number of animals used overall is provided in Guidance Document No 116 (7). | 21. | If satellite animals and/or interim kills are included in the study design, the number of animals in each dose group included for this purpose will normally be 10 animals per sex, and the total number of animals included in the study design should be increased by the number of animals scheduled to be killed before the completion of the study. Interim kill and satellite animals should normally undergo the same observations, including body weight, food/water consumption, haematological and clinical biochemistry measurements and pathological investigations as the animals in the chronic toxicity phase of the main study, although provision may also be made (in the interim kill groups) for measurements to be restricted to specific, key measures such as neurotoxicity or immunotoxicity. | Dose groups and dosage | 22. | Guidance on all aspects of dose selection and dose level spacing is provided in Guidance Document No 116 (7). At least three dose levels and a concurrent control should be used, for both the chronic and carcinogenicity phases. Dose levels will generally be based on the results of shorter-term repeated dose or range finding studies and should take into account any existing toxicological and toxicokinetic data available for the test chemical or related chemicals. | 23. | For the chronic toxicity phase of the study, a full study using three dose levels may not be considered necessary, if it can be anticipated that a test at one dose level, equivalent to at least 1 000 mg/kg body weight/day, is unlikely to produce adverse effects. This should be based on information from preliminary studies and a consideration that toxicity would not be expected, based upon data from structurally related chemicals. A limit of 1 000 mg/kg body weight/day may apply except when human exposure indicates the need for a higher dose level to be used. | 24. | Unless limited by the physical-chemical nature or biological effects of the test chemical, the highest dose level should be chosen to identify the principal target organs and toxic effects while avoiding suffering, severe toxicity, morbidity, or death. The highest dose level should be normally chosen to elicit evidence of toxicity, as evidenced by, for example, depression of body weight gain (approximately 10 %). However, dependent on the objectives of the study (see paragraph 6), a top dose lower than the dose providing evidence of toxicity may be chosen, e.g. if a dose elicits an adverse effect of concern, which nonetheless has little impact on lifespan or body weight. | 25. | Dose levels and dose level spacing may be selected to establish a dose-response and, depending on the mode of action of the test chemical, a NOAEL or other intended outcome of the study, e.g. a BMD (see paragraph 27). Factors that should be considered in the placement of lower doses include the expected slope of the dose–response curve, the doses at which important changes may occur in metabolism or mode of toxic action, where a threshold is expected, or where a point of departure for low-dose extrapolation is expected. In conducting a combined carcinogenicity/chronic toxicity study, the primary objective will be to obtain information for carcinogenicity risk assessment purposes, and information on chronic toxicity will normally be a subsidiary objective. This should be borne in mind when selecting dose levels and dose level spacing for the study. | 26. | The dose level spacing selected will depend on the objectives of the study and the characteristics of the test chemical, and cannot be prescribed in detail in this Test Method, but two to four fold intervals frequently provide good test performance when used for setting the descending dose levels and addition of a fourth test group is often preferable to using very large intervals (e.g. more than a factor of about 6-10) between dosages. In general the use of factors greater than 10 should be avoided, and should be justified if used. | 27. | As outlined further in Guidance Document No 116 (7), points to be considered in dose selection include: | — | Known or suspected nonlinearities or inflection points in the dose–response; | — | Toxicokinetics, and dose ranges where metabolic induction, saturation, or nonlinearity between external and internal doses does or does not occur; | — | Precursor lesions, markers of effect, or indicators of the operation of key underlying biological processes; | — | Key (or suspected) aspects of mode of action, such as doses at which cytotoxicity begins to arise, hormone levels are perturbed, homeostatic mechanisms are overwhelmed, etc.; | — | Regions of the dose–response curve where particularly robust estimation is needed, e.g. in the range of the anticipated BMD or a suspected threshold; | — | Consideration of anticipated human exposure levels, especially in the choice of mid and low doses. | 28. | The control group shall be an untreated group or a vehicle-control group if a vehicle is used in administering the test chemical. Except for treatment with the test chemical, animals in the control group should be handled in an identical manner to those in the test groups. If a vehicle is used, the control group shall receive the vehicle in the highest volume used among the dose groups. If a test chemical is administered in the diet, and causes significantly reduced dietary intake due to the reduced palatability of the diet, an additional pair-fed control group may be useful, to serve as a more suitable control. | Preparation of doses and administration of test chemical | 29. | The test chemical is normally administered orally, via the diet or drinking water, or by gavage. Additional information on routes and methods of administration is provided in Guidance Document No 116 (7). The route and method of administration is dependent on the purpose of the study, the physical/chemical properties of the test chemical, its bioavailability, and the predominant route and method of exposure of humans. A rationale should be provided for the chosen route and method of administration. In the interests of animal welfare, oral gavage should normally be selected only for those agents for which this route and method of administration reasonably represent potential human exposure (e.g. pharmaceuticals). For dietary or environmental chemicals including pesticides, administration is typically via the diet or drinking water. However, for some scenarios, e.g. occupational exposure, administration via other routes may be more appropriate. | 30. | Where necessary, the test chemical is dissolved or suspended in a suitable vehicle. Consideration should be given to the following characteristics of the vehicle and other additives, as appropriate: effects on the absorption, distribution, metabolism, or retention of the test chemical; effects on the chemical properties of the test chemical which may alter its toxic characteristics; and effects on the food or water consumption or the nutritional status of the animals. It is recommended that, wherever possible, the use of an aqueous solution/suspension be considered first, followed by consideration of a solution/emulsion in oil (e.g. corn oil) and then by possible solution in other vehicles. For vehicles other than water, the toxic characteristics of the vehicle should be known. Information should be available on the stability of the test chemical and the homogeneity of dosing solutions or diets (as appropriate) under the conditions of administration (e.g. diet). | 31. | For chemicals administered via the diet or drinking water it is important to ensure that the quantities of the test chemical involved do not interfere with normal nutrition or water balance. In long-term toxicity studies using dietary administration, the concentration of the test chemical in the feed should not normally exceed an upper limit of 5 % of the total diet, in order to avoid nutritional imbalances. When the test chemical is administered in the diet, either a constant dietary concentration (mg/kg diet or ppm), or a constant dose level in terms of the animal’s body weight (mg/kg body weight), calculated on a weekly basis, may be used. The alternative used should be specified. | 32. | In the case of oral administration, the animals are dosed with the test chemical daily (seven days each week) for a period of 12 months (chronic phase) or 24 months (carcinogenicity phase), see also paragraphs 33 and 34. Any other dosing regime, e.g. five days per week, needs to be justified.. In the case of dermal administration, animals are normally treated with the test chemical for at least 6 hours per day, 7 days per week, as specified in Chapter B.9 of this Annex (11), for a period of 12 months (chronic phase) or 24 months (carcinogenicity phase). Exposure by the inhalation route is carried out for 6 hours per day, 7 days per week, but exposure for 5 days per week may also be used, if justified. The period of exposure will normally be for a period of 12 months (chronic phase) or 24 months (carcinogenicity phase). If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. A rationale should be provided when using an exposure duration of less than 6 hours per day. See also Chapter B.8 of this Annex (9). | 33. | When the test chemical is administered by gavage to the animals this should be done using a stomach tube or a suitable intubation cannula, at similar times each day. Normally a single dose will be administered once daily, where for example a chemical is a local irritant, it may be possible to maintain the daily dose-rate by administering it as a split dose (twice a day). The maximum volume of liquid that can be administered at one time depends on the size of the test animal. The volume should be kept as low as practical, and should not normally exceed 1 ml/100g body weight for rodents (31). Variability in test volume should be minimised by adjusting the concentration to ensure a constant volume at all dose levels. Potentially corrosive or irritant chemicals are the exception, and need to be diluted to avoid severe local effects. Testing at concentrations that are likely to be corrosive or irritant to the gastrointestinal tract should be avoided. | Duration of study | 34. | The period of dosing and duration of the chronic phase of this study is normally 12 months, although the study design also allows for and can be applied to either shorter (e.g. 6 or 9 months) or longer (e.g. 18 or 24 months) duration studies, depending on the requirements of particular regulatory regimes or for specific mechanistic purposes. Deviations from an exposure duration of 12 months should be justified, particularly in the case of shorter durations. All dose groups allocated to this phase will be terminated at the designated time for evaluation of chronic toxicity and non-neoplastic pathology. Satellite groups included to monitor the reversibility of any toxicological changes induced by the test chemical under investigation should be maintained without dosing for a period not less than 4 weeks and not more than one third of the total study duration after cessation of exposure. | 35. | The duration of the carcinogenicity phase of this study will normally be 24 months for rodents, representing the majority of the normal life span of the animals to be used. Shorter or longer study durations may be used, dependent on the lifespan of the strain of the animal species in the study, but should be justified. For specific strains of mice, e.g. AKR/J, C3H/J or C57BL/6J strains a duration of 18 months may be more appropriate. The following provides some guidance on duration, termination of the study and survival; further guidance, including consideration of the acceptability of a negative carcinogenicity study relative to survival in the study, is provided in Guidance Document No 116 (7): | — | Termination of the study should be considered when the number of survivors in the lower dose groups or the control group falls below 25 per cent. | — | In the case where only the high dose group dies prematurely due to toxicity, this should not trigger termination of the study. | — | Survival of each sex should be considered separately. | — | The study should not be extended beyond the point when the data available from the study are no longer sufficient to enable a statistically valid evaluation to be made. | OBSERVATIONS (CHRONIC TOXICITY PHASE) | 36. | All animals should be checked for morbidity or mortality, usually at the beginning and end of each day, including at weekends and holidays. General clinical observations should be made at least once a day, preferably at the same time(s) each day, taking into consideration the peak period of anticipated effects after dosing in the case of gavage administration. | 37. | Detailed clinical observations should be made on all animals at least once prior to the first exposure (to allow for within-subject comparisons), at the end of the first week of the study and monthly thereafter. The protocol for observations should be arranged such that variations between individual observers are minimised and independent of test group. These observations should be made outside the home cage, preferably in a standard arena and at similar times on each occasion. They should be carefully recorded, preferably using scoring systems, explicitly defined by the testing laboratory. Efforts should be made to ensure that variations in the observation conditions are minimal. Signs noted should include, but not be limited to, changes in skin, fur, eyes, mucous membranes, occurrence of secretions and excretions and autonomic activity (e.g. lacrimation, piloerection, pupil size, unusual respiratory pattern). Changes in gait, posture and response to handling as well as the presence of clonic or tonic movements, stereotypies (e.g. excessive grooming, repetitive circling) or bizarre behaviour (e.g. self-mutilation, walking backwards) should also be recorded (32). | 38. | Ophthalmological examination, using an ophthalmoscope or other suitable equipment, should be carried out on all animals prior to the first administration of the test chemical. At the termination of the study, this examination should be preferably conducted in all animals but at least in the high dose and control groups. If treatment-related changes in the eyes are detected, all animals should be examined. If structural analysis or other information suggests ocular toxicity, then the frequency of ocular examination should be increased. | 39. | For chemicals where previous repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests indicated the potential to cause neurotoxic effects, sensory reactivity to stimuli of different types (32) (e.g. auditory, visual and proprioceptive stimuli) (33) (34) (35), assessment of grip strength (36) and motor activity assessment (37) may optionally be conducted before commencement of the study and at 3 month periods after study initiation up to and including 12 months, as well as at study termination (if longer than 12 months). Further details of the procedures that could be followed are given in the respective references. However, alternative procedures than those referenced could also be used. | 40. | For chemicals where previous repeated dose 28-day and/or 90-day toxicity tests indicated the potential to cause immunotoxic effects, further investigations of this endpoint may optionally be conducted at termination. | Body weight, food/water consumption and food efficiency | 41. | All animals should be weighed at the start of treatment, at least once a week for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Measurements of food consumption and food efficiency should be made at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Water consumption should be measured at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter when the test chemical is administered in drinking water. Water consumption measurements should also be considered for studies in which drinking activity is altered. | Haematology and clinical biochemistry | 42. | In studies involving rodents, haematological examinations should be carried out on all study animals (10 male and 10 female animals per group) at 3, 6, and 12 months, as well as at study termination (if longer than 12 months). In mice, satellite animals may be needed in order to conduct all required haematological determinations (see paragraph 19). In non-rodent studies, samples will be taken from smaller numbers of animals (e.g. 4 animals per sex and per group in dog studies), at interim sampling times and at termination as described for rodents. Measurements at 3 months, either in rodents or non-rodents, need not be conducted if no effect was seen on haematological parameters in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. Blood samples should be taken from a named site, for example by cardiac puncture or from the retro-orbital sinus, under anaesthesia. | 43. | The following list of parameters should be investigated (38): total and differential leukocyte count, erythrocyte count, platelet count, haemoglobin concentration, haematocrit (packed cell volume), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular haemoglobin (MCH), mean corpuscular haemoglobin concentration (MCHC), prothrombin time, and activated partial thromboplastin time. Other hematology parameters such as Heinz bodies or other atypical erythrocyte morphology or methaemoglobin may be measured as appropriate depending on the toxicity of the test chemical. Overall, a flexible approach should be adopted, depending on the observed and/or expected effect from a given test chemical. If the test chemical has an effect on the haematopoietic system, reticulocyte counts and bone marrow cytology may also be indicated, although these need not be routinely conducted. | 44. | Clinical biochemistry determinations to investigate major toxic effects in tissues and, specifically, effects on kidney and liver, should be performed on blood samples obtained from all study animals (10 male and 10 female animals per group), at the same time intervals as specified for the haematological investigations. In mice, satellite animals may be needed in order to conduct all required clinical biochemistry determinations. In non-rodent studies, samples will be taken from smaller numbers of animals (e.g. 4 animals per sex and per group in dog studies), at interim sampling times and at termination as described for rodents. Measurements at 3 months, either in rodents or non-rodents, need not be conducted if no effect was seen on clinical biochemistry parameters in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. Overnight fasting of the animals (with the exception of mice) prior to blood sampling is recommended (3). The following list of parameters should be investigated (38): glucose, urea (urea nitrogen), creatinine, total protein, albumin, calcium, sodium, potassium, total cholesterol, at least two appropriate tests for hepatocellular evaluation (alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, glutamate dehydrogenase, total bile acids) (39), and at least two appropriate tests for hepatobiliary evaluation (alkaline phosphatase, gamma glutamyl transferase, 5’-nucleotidase, total bilirubin, total bile acids) (39). Other clinical chemistry parameters such as fasting triglycerides, specific hormones and cholinesterase may be measured as appropriate, depending on the toxicity of the test chemical. Overall, there is a need for a flexible approach, depending on the observed and/or expected effect from a given test chemical. | 45. | Urinalysis determinations should be performed on all study animals (10 male and 10 female animals per group), on samples collected at the same intervals as for haematology and clinical chemistry. Measurements at 3 months need not be conducted if no effect was seen on urinalysis in a previous 90 day study carried out at comparable dose levels. The following list of parameters was included in an expert recommendation on clinical pathology studies (38): appearance, volume, osmolality or specific gravity, pH, total protein, and glucose. Other determinations include ketone, urobilinogen, bilirubin, and occult blood. Further parameters may be employed where necessary to extend the investigation of observed effect(s). | 46. | It is generally considered that baseline haematological and clinical biochemistry variables need be determined before treatment for dog studies, but need not be determined in rodent studies (38). However, if historical baseline data (see paragraph 58) are inadequate, consideration should be given to generating such data. | PATHOLOGY | Gross necropsy | 47. | All animals in the study shall be normally subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. However provision may also be made (in the interim kill or satellite groups) for measurements to be restricted to specific, key measures such as neurotoxicity or immunotoxicity (see paragraph 21). These animals need not be subjected to necropsy and the subsequent procedures described in the following paragraphs. Sentinel animals may require necropsy on a case-by-case basis, at the discretion of the study director. | 48. | Organ weights should be collected from all animals, other than those excluded by the latter part of paragraph 47. The adrenals, brain, epididymides, heart, kidneys, liver, ovaries, spleen, testes, thyroid (weighed post-fixation, with parathyroids), and uterus of all animals (apart from those found moribund and/or intercurrently killed) should be trimmed of any adherent tissue, as appropriate, and their wet weight taken as soon as possible after dissection to prevent drying. | 49. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (40) (tissues in square brackets are optional): | all gross lesions | heart | pancreas | stomach (forestomach, glandular stomach) | adrenal gland | ileum | parathyroid gland | [teeth] | aorta | jejunum | peripheral nerve | testis | brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | kidney | pituitary | thymus | caecum | lacrimal gland (exorbital) | prostate | thyroid | cervix | liver | rectum | [tongue] | coagulating gland | lung | salivary gland | trachea | colon | lymph nodes (both superficial and deep) | seminal vesicle | urinary bladder | duodenum | mammary gland (obligatory for females and, if visibly dissectable, from males) | skeletal muscle | uterus (including cervix) | epididymis | [upper respiratory tract, including nose, turbinates, and paranasal sinuses] | skin | [ureter] | eye (including retina) | oesophagus | spinal cord (at three levels: cervical, mid-thoracic, and lumbar) | [urethra] | [femur with joint] | [olfactory bulb] | spleen | vagina | gall bladder (for species other than rat) | ovary | [sternum], | section of bone marrow and/or a fresh bone marrow aspirate | Harderian gland | | | | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be preserved. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. In studies involving the dermal route of administration, the list of organs as set out for the oral route should be examined, and specific sampling and preservation of the skin from the site of application is necessary. In inhalation studies, the list of preserved and examined tissues from the respiratory tract should follow the recommendations of Chapters B.8 of this Annex (9) and Chapter B.29 of this Annex (10). For other organs/tissues (and in addition to the specifically preserved tissues from the respiratory tract) the list of organs as set out for the oral route should be examined. | Histopathology | 50. | Guidance is available on best practices in the conduct of toxicological pathology studies (40). The minimum histopathological examinations should be: | — | all tissues from the high dose and control groups; | — | all tissues from animals dying or killed during the study; | — | all tissues showing macroscopic abnormalities; | — | target tissues, or tissues which showed treatment-related changes in the high dose group, from all animals in all other dose groups, | — | in the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be examined. | OBSERVATIONS (CARCINOGENICITY PHASE) | 51. | All animals should be checked for morbidity or mortality, usually at the beginning and the end of each day, including at weekends and holidays. Animals should additionally be checked once a day for specific signs of toxicological relevance. In the case of gavage studies, animals should be checked in the period immediately following dosing. Particular attention should be paid to tumour development; and the time of tumour onset, location, dimensions, appearance, and progression of each grossly visible or palpable tumour should be recorded. | 52. | All animals should be weighed at the start of treatment, at least once a week for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Measurements of food consumption and food efficiency should be made at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter. Water consumption should be measured at least weekly for the first 13 weeks and at least monthly thereafter when the test chemical is administered in drinking water. Water consumption measurements should also be considered for studies in which drinking activity is altered. | Haematology, clinical biochemistry and other measurements | 53. | In order to maximise the information obtained from the study, especially for mode of action considerations, blood samples may be taken for haematology and clinical biochemistry, although this is at the discretion of the study director. Urinalysis may also be appropriate. Data on the animals used in the chronic toxicity phase of the study, normally of 12 months duration (paragraph 34) will provide information on these parameters. Further guidance on the value of taking such samples as part of a carcinogenicity study is provided in Guidance Document No 116 (7). If blood samples are taken, these should be collected at the end of the test period, just prior to or as part of the procedure for killing the animals. They should be taken from a named site, for example by cardiac puncture or from the retro-orbital sinus, under anaesthesia. Blood smears may also be prepared for examination, particularly if bone marrow appears to be the target organ, although the value of such examination of blood smears in the carcinogenicity phase for the assessment of carcinogenic/oncogenic potential has been questioned (38). | PATHOLOGY | Gross necropsy | 54. | All animals in the study except sentinel animals and other satellite animals (see paragraph 20) shall be subjected to a full, detailed gross necropsy which includes careful examination of the external surface of the body, all orifices, and the cranial, thoracic and abdominal cavities and their contents. Sentinel animals and other satellite animals may require necropsy on a case-by-case basis, at the discretion of the study director. Organ weights are not normally part of a carcinogenesis study, since geriatric changes and, at later stages, the development of tumours confounds the usefulness of organ weight data. They may, however, be critical to performing a weight of evidence evaluation and especially for mode of action considerations. If they are part of a satellite study, they should be collected at no later than one year after initiation of the study. | 55. | The following tissues should be preserved in the most appropriate fixation medium for both the type of tissue and the intended subsequent histopathological examination (40) (tissues in square brackets are optional): | all gross lesions | heart | pancreas | stomach (forestomach, glandular stomach) | adrenal gland | ileum | parathyroid gland | [teeth] | aorta | jejunum | peripheral nerve | testis | brain (including sections of cerebrum, cerebellum, and medulla/pons) | kidney | pituitary | thymus | caecum | lacrimal gland (exorbital) | prostate | thyroid | cervix | liver | rectum | [tongue] | coagulating gland | lung | salivary gland | trachea | colon | lymph nodes (both superficial and deep) | seminal vesicle | urinary bladder | duodenum | mammary gland (obligatory for females and, if visibly dissectable, from males) | skeletal muscle | uterus (including cervix) | epididymis | [upper respiratory tract, including nose, turbinates, and paranasal sinuses] | skin | [ureter] | eye (including retina) | oesophagus | spinal cord (at three levels: cervical, mid-thoracic, and lumbar) | [urethra] | [femur with joint] | [olfactory bulb] | spleen | vagina | gall bladder (for species other than rat) | ovary | [sternum], | section of bone marrow and/or a fresh bone marrow aspirate | Harderian gland | | | | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be preserved. The clinical and other findings may suggest the need to examine additional tissues. Also, any organs considered likely to be target organs based on the known properties of the test chemical should be preserved. In studies involving the dermal route of administration, the list of organs as set out for the oral route should be examined, and specific sampling and preservation of the skin from the site of application is necessary. In inhalation studies, the list of preserved and examined tissues from the respiratory tract should follow the recommendations of Chapters B.8 of this Annex (8) and Chapter B.29 of this Annex (9). For other organs/tissues (and in addition to the specifically preserved tissues from the respiratory tract) the list of organs as set out for the oral route should be examined. | Histopathology | 56. | Guidance is available on best practices in the conduct of toxicological pathology studies (40). The minimum tissues examined should be: | — | All tissues from the high dose and control groups; | — | All tissues of animals dying or killed during the study; | — | All tissues showing macroscopic abnormalities including tumours; | — | When treatment-related histopathological changes are observed in the high dose group, those same tissues are to be examined from all animals in all other dose groups, | — | In the case of paired organs, e.g. kidney, adrenal, both organs should be examined. | DATA AND REPORTING (CARCINOGENICITY AND CHRONIC TOXICITY) | Data | 57. | Individual animal data should be provided for all parameters evaluated. Additionally, all data should be summarised in tabular form showing for each test group the number of animals at the start of the test, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons and the time of any death or humane kill, the number showing signs of toxicity, a description of the signs of toxicity observed, including time of onset, duration, and severity of any toxic effects, the number of animals showing lesions, the type of lesions and the percentage of animals displaying each type of lesion. Summary data tables should provide the means and standard deviations (for continuous test data) of animals showing toxic effects or lesions, in addition to the grading of lesions. | 58. | Historical control data may be valuable in the interpretation of the results of the study, e.g, in the case when there are indications that the data provided by the concurrent controls are substantially out of line when compared to recent data from control animals from the same test facility/colony. Historical control data, if evaluated, should be submitted from the same laboratory, relate to animals of the same age and strain, generated during the five years preceding the study in question. | 59. | When applicable, numerical results should be evaluated by an appropriate and generally acceptable statistical method. The statistical methods and the data to be analysed should be selected during the design of the study (paragraph 9). Selection should make provision for survival adjustments, if needed. | 60. | The test report should include the following information: | | Test chemical: | — | physical nature, purity, and physicochemical properties; | — | identification data; | — | source of chemical; | — | batch number; | — | certificate of chemical analysis. | | Vehicle (if appropriate): | — | justification for choice of vehicle (if other than water). | | Test animals: | — | species/strain used and justification for choice made; | — | number, age, and sex of animals at start of test; | — | source, housing conditions, diet, etc.; | — | individual weights of animals at the start of the test. | | Test conditions: | — | rationale for route of administration and dose selection; | — | when applicable, the statistical methods used to analyse the data; | — | details of test chemical formulation/diet preparation; | — | analytical data on achieved concentration, stability and homogeneity of the preparation; | — | route of administration and details of the administration of the test chemical; | — | for inhalation studies, whether nose only or whole body; | — | actual doses (mg/kg body weight/day), and conversion factor from diet/drinking water test chemical concentration (mg/kg or ppm) to the actual dose, if applicable; | — | details of food and water quality. | | Results (summary tabulated data and individual animal data should be presented): | | General | — | Survival data; | — | Body weight/body weight changes; | — | Food consumption, calculations of food efficiency, if made, and water consumption if applicable; | — | Toxicokinetic data if available; | — | Opthalmoscopy (if available) | — | Haematology (if available) | — | Clinical chemistry (if available) | | Clinical findings | — | Signs of toxicity; | — | Incidence (and, if scored, severity) of any abnormality; | — | Nature, severity, and duration of clinical observations (whether transitory or permanent); | | Necropsy data | — | Terminal body weight; | — | Organ weights and their ratios, if applicable; | — | Necropsy findings; Incidence and severity of abnormalities. | | Histopathology | — | Non neoplastic histopathological findings, | — | Neoplastic histopathological findings, | — | Correlation between gross and microscopic findings | — | Detailed description of all treatment-related histopathological findings including severity gradings; | — | Report of any peer review of slides | | Statistical treatment of results, as appropriate | | Discussion of results including: | — | Discussion of any modelling approaches | — | Dose:response relationships | — | Historical control data | — | Consideration of any mode of action information | — | BMD, NOAEL or LOAEL determination | — | Relevance for humans | | Conclusions | LITERATURE: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. | (3) | Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208 | (4) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191 | (5) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445 | (6) | Chapter B.27 of this Annex, Sub-Chronic Oral Toxicity Test Repeated Dose 90 — Day Oral Toxicity Study In Non-Rodents. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — Second edition. Series on Testing and Assessment No 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Chapter B.8 of this Annex. Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study. | (10) | Chapter B.29 of this Annex, Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study. | (11) | Chapter B.9 of this Annex, Repeated Dose (28 Days) Toxicity (Dermal). | (12) | Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793-801. | (13) | Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581-589. | (14) | Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51-56. | (15) | Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591-653. | (16) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7. | (17) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36: 9-35. | (18) | Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 37-68. | (19) | Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36: 69-98. | (20) | OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No 35 and Series on Pesticides No 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. | (21) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (22) | Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729 – 837. | (23) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. | (24) | Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214. | (25) | Usui T, Griffiths SA and Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D’Arcy POF & Harron DWG (eds). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. pp 279-284. | (26) | Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of 10 Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:1196-1203. | (27) | Directive 2010/63/EU of the European parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes (OJ L 276, 20.10.2010, p. 33). | (28) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21: 15-23. | (32) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No 60. | (33) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (34) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. | (35) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (36) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233-236. | (37) | Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599-609. | (38) | Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (39) | EMEA (draft) document “Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity” (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006). | (40) | Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | ’ |
| 7. | poglavje B.36 se nadomesti z naslednjim: | „B.36 TOKSIKOKINETIKA | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza OECD TG 417 (2010). Študije, s katerimi se preučuje toksikokinetika (TK) preskusne kemikalije, se izvajajo za pridobitev zadostnih informacij o njeni absorpciji, porazdelitvi, biotransformaciji (tj. presnovi) in izločanju, za pomoč pri povezovanju koncentracije ali odmerka z opaženo strupenostjo ter za razumevanje mehanizma strupenosti te kemikalije. TK lahko pomaga razumeti toksikološke študije z dokazovanjem, da so preskusne živali sistemsko izpostavljene preskusni kemikaliji, in razkrivanjem, kateri deli kemikalije krožijo (izhodiščna kemikalija/metaboliti). Osnovni toksikokinetični parametri, določeni v teh študijah, zagotavljajo tudi informacije o potencialu za kopičenje preskusne kemikalije v tkivih in/ali organih ter potencialu za indukcijo biotransformacije, ki je posledica izpostavljenosti preskusni kemikaliji. | 2. | Toksikokinetični podatki lahko pomagajo oceniti, ali so podatki o strupenosti za živali ustrezni in uporabni za ekstrapolacijo v oceno nevarnosti in/ali tveganja za ljudi. Poleg tega se lahko s toksikokinetičnimi študijami pridobijo koristne informacije za določanje velikosti odmerkov pri toksikoloških študijah (linearna/nelinearna kinetika) ter za ugotavljanje učinkov načina dajanja, biološke dostopnosti in vidikov, povezanih z zasnovo študije. Nekatere vrste toksikokinetičnih podatkov je mogoče uporabiti pri zasnovi toksikokinetičnih modelov, temelječih na fiziologiji (PBTK). | 3. | Podatki o metabolitih/toksikokinetični podatki imajo pomembne uporabe, kot je nakazovanje morebitnih strupenosti in načinov delovanja ter njihove povezanosti z velikostjo odmerka in načinom izpostavljenosti. Poleg tega se lahko s podatki o presnovi pridobijo informacije, ki so uporabne pri ocenjevanju toksikološkega pomena izpostavljenosti eksogeno ustvarjenim metabolitom preskusne kemikalije. | 4. | Ustrezni toksikokinetični podatki lahko pomagajo dodatno podkrepiti sprejemljivost in uporabnost kvantitativnih razmerij med strukturo in aktivnostjo ter pristopov navzkrižnega branja ali združevanja v skupine pri ocenjevanju varnosti kemikalij. Poleg tega se lahko kinetični podatki uporabljajo tudi za ocenjevanje toksikološkega pomena drugih študij (npr. in vivo/in vitro). | 5. | Če niso navedeni drugi načini dajanja (glej zlasti odstavke 74–78), se ta preskusna metoda uporablja za oralno dajanje preskusne kemikalije. | ZAČETNI PREUDARKI | 6. | Zakonodajni sistemi imajo za različne razrede kemikalij (npr. pesticide, biocide, industrijske kemikalije) različne zahteve in potrebe glede merjenja končnih točk in parametrov, povezanih s toksikokinetiko. V nasprotju z večino preskusnih metod je v tej preskusni metodi opisano toksikokinetično preskušanje, ki vključuje več meritev in končnih točk. V prihodnosti bo morda pripravljenih več novih preskusnih metod in/ali dokumentov s smernicami, v katerih bo podrobneje opisana vsaka končna točka posebej. V primeru te preskusne metode je odločitev o tem, kateri preskusi ali ocene se izvedejo, odvisna od zahtev in/ali potreb posameznega zakonodajnega sistema. | 7. | Za ocenjevanje toksikokinetičnega vedenja preskusne kemikalije za zakonodajne namene se lahko izvedejo številne študije. Vendar glede na posebne zakonodajne potrebe ali okoliščine za ocenjevanje preskusne kemikalije vse morda niso potrebne. Pri zasnovi toksikokinetičnih študij sta potrebna prožnost in upoštevanje lastnosti preiskovane preskusne kemikalije. Včasih je morda treba preiskati samo določen sklop vprašanj, da se odpravijo pomisleki glede nevarnosti in tveganj, povezani s preskusno kemikalijo. V nekaterih okoliščinah se lahko toksikokinetični podatki zbirajo v okviru ocenjevanja v drugih toksikoloških študijah. Spet v drugih primerih so lahko – odvisno od zakonodajnih potreb in/ali če se pri ocenjevanju preskusne kemikalije pojavijo nova vprašanja – potrebne dodatne in/ali obsežnejše toksikokinetične študije. | 8. | Da se poveča kakovost študije in v izogib nepotrebni uporabi živali mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji ter zadevnih metabolitih in analogih. To lahko vključuje podatke iz drugih ustreznih preskusnih metod (študij in vivo, študij in vitro in/ali ocen in silico). Za načrtovanje študije in razlago rezultatov so lahko koristne fizikalno-kemijske lastnosti, kot so porazdelitveni koeficient oktanol/voda (izražen kot log POW), pKa, topnost v vodi, parni tlak in molekulska masa kemikalije. Te lastnosti se lahko ugotovijo z ustreznimi metodami, opisanimi v zadevnih preskusnih metodah. | OMEJITVE | 9. | Ta preskusna metoda ni zasnovana za obravnavanje posebnih okoliščin, kot so breje ali doječe živali in zarod, ali ocenjevanje morebitnih ostankov v izpostavljenih živalih, ki so namenjene proizvodnji hrane. Vendar pa lahko podatki, pridobljeni s študijo B.36, zagotovijo splošne osnovne informacije, ki se uporabijo za usmerjanje zasnove posebnih študij za take preiskave. Ta preskusna metoda ni namenjena preskušanju nanomaterialov. Kot je navedeno v poročilu o predhodnem pregledu smernic za preskušanje OECD, namenjenemu oceni njihove uporabnosti za nanomateriale, se TG 417 (ki ustreza tej preskusni metodi B.36) za nanomateriale ne sme uporabljati (1). | OPREDELITEV POJMOV | 10. | Pojmi, ki se uporabljajo v tej preskusni metodi, so opredeljeni v Dodatku. | PREUDARKI V ZVEZI Z DOBROBITJO ŽIVALI | 11. | Napotki o humanem ravnanju z živalmi so na voljo v Dokumentu s smernicami OECD (GD) 19 (2). Priporoča se, naj se GD 19 uporablja za vse študije in vivo ter in vitro, opisane v tej preskusni metodi. | OPIS METOD | Pilotne študije | 12. | Uporaba pilotnih študij se priporoča in spodbuja za izbiro preskusnih parametrov toksikoloških študij (npr. presnove, masne bilance, analitskih postopkov, odmernega območja, izdihovanja CO2 itd.). Za opredelitev nekaterih od teh parametrov uporaba izotopsko označenih kemikalij morda ni potrebna. | Izbira živali | Vrsta | 13. | Živalska vrsta (in sev) v toksikokinetičnem preskušanju mora biti po možnosti ista, kot se uporablja v drugih toksikoloških študijah, izvedenih s preiskovano preskusno kemikalijo. Praviloma je treba uporabiti podgano, saj se v toksikoloških študijah obširno uporablja. Uporaba drugih ali dodatnih vrst je lahko upravičena, če je iz pomembnih toksikoloških študij razvidna precejšnja strupenost za te vrste ali če se pokaže, da je strupenost/toksikokinetika pri njih bolj relevantna za ugotavljanje strupenosti/toksikokinetike pri ljudeh. Izbiro živalske vrste in njenega seva je treba utemeljiti. | 14. | Če ni navedeno drugače, se pri tej preskusni metodi kot preskusna vrsta uporablja podgana. Za uporabo drugih preskusnih vrst morda je treba nekatere elemente metode morda treba prilagoditi. | Starost in sev | 15. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali (v času odmerjanja navadno stare 6–12 tednov) (glej tudi odstavka 13 in 14). Uporabo živali, ki niso mladi odrasli osebki, je treba utemeljiti. Na začetku študije morajo biti vse živali podobne starosti. Teža posameznih živali ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže v preskusni skupini. Po možnosti je treba uporabiti isti sev, ki je bil uporabljen pri pripravi toksikološke zbirke podatkov za preskusno kemikalijo. | Število in spol živali | 16. | Za vsak preskušeni odmerek je treba uporabiti najmanj štiri živali enega spola. Spol uporabljenih živali je treba utemeljiti. O uporabi obeh spolov (štirih samcev in štirih samic) je treba razmisliti, če obstajajo dokazi o pomembnih razlikah v strupenosti glede na spol. | Nastanitveni in prehranjevalni pogoji | 17. | V splošnem morajo biti živali v preskusnem obdobju nastanjene posamično. Skupinska nastanitev je lahko utemeljena v posebnih okoliščinah. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C), relativna vlažnost pa 30–70 %. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. | Preskusna kemikalija | 18. | Za vse vidike študije v zvezi z masno bilanco in identifikacijo metabolitov je treba uporabljati preskusno kemikalijo, ki je označena z izotopom 14C. Če pa se lahko dokaže, da: | — | je mogoče masno bilanco primerno oceniti in metabolite ustrezno identificirati z neoznačeno preskusno kemikalijo, | — | sta analitska specifičnost in občutljivost metode ob uporabi neradioaktivne preskusne kemikalije enaki tistima, ki bi se lahko zagotovili z izotopsko označeno preskusno kemikalijo, ali večji od njiju, | izotopsko označene preskusne kemikalije ni treba uporabiti. Poleg tega se lahko uporabijo tudi drugi radioaktivni in stabilni izotopi, zlasti če je zadevni element razlog za strupenost ali je udeležen v strupenem delu preskusne kemikalije. Če je mogoče, mora biti radioaktivni označevalec v osrednjem delu molekule, ki je presnovno stabilen (ni izmenljiv, se ne izloči s presnovo kot CO2 in ne postane del skupin z enim ogljikovim atomom v organizmu). Za spremljanje presnovne poti preskusne kemikalije je lahko potrebno označevanje več mest ali specifičnih regij molekule. | 19. | Izotopsko označene preskusne kemikalije in tiste, ki niso izotopsko označene, je treba analizirati z ustreznimi metodami za ugotavljanje čistosti in identitete. Radiokemijska čistost radioaktivne preskusne kemikalije mora biti najvišja dosegljiva za dano preskusno kemikalijo (po možnosti mora biti višja od 95 %), razumno pa si je treba tudi prizadevati za identifikacijo nečistot z vsaj 2-odstotnim deležem. Poročati je treba o čistosti ter identiteti in deležu vseh nečistot, ki so bile identificirane. V posameznih zakonodajnih ureditvah so lahko zagotovljeni dodatni napotki v pomoč pri opredeljevanju in določanju preskusnih kemikalij, sestavljenih iz zmesi, ter metode za določanje čistosti. | Izbira odmerkov | Pilotna študija | 20. | Navadno za pilotno študijo zadošča enkraten oralni odmerek. Ta ne sme biti strupen, mora pa biti dovolj velik za identifikacijo metabolitov v izločkih (in, če je primerno, plazmi) in izpolnitev opredeljenega namena pilotne študije, kot je navedeno v odstavku 12 te preskusne metode. | Glavne študije | 21. | Za glavne študije sta priporočljiva najmanj dva odmerka, saj lahko informacije, zbrane na podlagi vsaj dveh odmernih skupin, pomagajo pri določitvi odmerkov v drugih študijah strupenosti in pri ocenjevanju odziva v odvisnosti od odmerka v že razpoložljivih preskusih strupenosti. | 22. | Kadar se data dva odmerka, morata biti oba dovolj velika, da je mogoče identificirati metabolite v izločkih (in če je primerno, plazmi). Pri izbiri odmerkov je treba upoštevati informacije iz razpoložljivih podatkov o strupenosti. Če te niso na voljo (npr. iz študij akutne oralne strupenosti, v katerih se preiskujejo klinični znaki strupenosti, ali iz študij strupenosti s ponavljajočimi se odmerki), se lahko za večji odmerek predvidi vrednost, ki je nižja od ocene LD50 (za oralni in dermalni način dajanja) ali LC50 (za inhalacijski način dajanja) ali od nižje vrednosti ocene območja akutne strupenosti. Večji odmerek mora biti eden od večkratnikov manjšega odmerka. | 23. | Če se preiskuje samo ena velikost odmerka, mora biti ta po možnosti dovolj velik, da je mogoče identificirati metabolite v izločkih (in, če je primerno, plazmi), vendar ne sme povzročiti očitne strupenosti. Nevključitev druge velikosti odmerka je treba utemeljiti. | 24. | Če je treba ugotoviti učinek odmerka na kinetične procese, dva odmerka morda ne bosta zadoščala, vsaj en odmerek pa mora biti dovolj velik, da se ti procesi nasitijo. Če območje pod krivuljo plazemska koncentracija-čas (AUC) med dvema velikostma odmerkov, ki se uporabljata v glavni študiji, ni linearna, je to dober znak, da se nekje med obema velikostma odmerkov pojavlja nasičenost enega ali več kinetičnih procesov. | 25. | Za preskusne kemikalije z nizko strupenostjo je treba uporabiti največji odmerek 1 000 mg/kg telesne teže (pri oralnem in dermalnem dajanju; če je način dajanja inhalacijski, so napotki v poglavju B.2 te priloge, običajno pa ta odmerek ne presega 2 mg/l). V skladu z zakonodajnimi potrebami je lahko zaradi lastnosti, specifične za obravnavano kemikalijo, potreben večji odmerek. Izbiro odmerkov je treba vedno utemeljiti. | 26. | Podatki o toksikokinetiki in porazdelitvi v tkivih, pridobljeni z enkratnim odmerkom, lahko zadoščajo za določitev potenciala za kopičenje in/ali obstojnost. Vendar je v nekaterih okoliščinah lahko potrebno dajanje s ponavljajočimi se odmerki, (i) da se celoviteje obravnavajo potencial za kopičenje in/ali obstojnost ali spremembe v TK (npr. indukcija in inhibicija encimov) ali (ii) če se to zahteva v veljavni zakonodajni ureditvi. Čeprav v študijah s ponavljajočimi se odmerki običajno zadošča dajanje ponavljajočih se majhnih odmerkov, je v nekaterih okoliščinah lahko potrebno tudi dajanje ponavljajočih se velikih odmerkov (glej tudi odstavek 57). | Dajanje preskusne kemikalije | 27. | Preskusno kemikalijo je treba raztopiti ali homogeno suspendirati v enakem nosilcu, kot se uporablja v drugih študijah strupenosti z oralno gavažo, izvedenih z zadevno preskusno kemikalijo, če so take informacije o nosilcu na voljo. Izbiro nosilca je treba utemeljiti. Nosilec in velikost odmerkov je treba predvideti v zasnovi študije. Običajna metoda dajanja je z gavažo, vendar je lahko v določenih okoliščinah primernejše dajanje z želatinastimi kapsulami ali v prehranskih mešanicah (v obeh primerih je treba navesti utemeljitev). Potrditi je treba dejanski odmerek, dan vsaki živali. | 28. | Največja količina tekočine, ki bo dana naenkrat z oralno gavažo, je odvisna od velikosti preskusnih živali, vrste nosilca za odmerke in tega, ali se živalim pred dajanjem preskusne kemikalije hrana odreka ali ne. Hranjenje ali omejevanje hrane pred dajanjem odmerkov je treba utemeljiti. Praviloma je treba količino ohranjati tako majhno, kot je praktično, kar velja tako za vodne kot nevodne nosilce. Velikosti odmerkov pri glodavcih navadno ne smejo presegati 10 ml/kg telesne teže. Količine nosilcev, ki se uporabijo za bolj lipofilne preskusne kemikalije, se lahko začnejo pri 4 ml/kg telesne teže. Za ponavljajoče se odmerjanje, pri katerem je dnevno postenje kontraindicirano, je treba predvideti manjše velikosti odmerkov (npr. 2–4 ml/kg telesne teže). Kadar je mogoče, je treba razmisliti o uporabi količin odmerkov, ki so v skladu s tistimi, ki so bili uporabljeni v drugih študijah z oralno gavažo v zvezi s preskusno kemikalijo. | 29. | Intravenozno (IV) dajanje preskusne kemikalije in merjenje njene prisotnosti v krvi in/ali izločkih se lahko uporabita za ugotavljanje biološke dostopnosti ali relativne oralne absorpcije. V IV-študiji se z uporabo ustreznega nosilca da enkraten odmerek preskusne kemikalije (ki je navadno enak manjšemu oralnemu odmerku, ne sme pa ga presegati – glej odstavke o izbiri odmerkov). To snov je treba dati v ustrezni količini (npr. 1 ml/kg telesne teže) na izbranem mestu dajanja najmanj štirim živalim primernega spola (uporabita se lahko oba spola, če je to upravičeno – glej odstavek 16). Za IV-dajanje preskusne kemikalije je potreben popolnoma raztopljen ali suspendiran pripravek z odmerkom. Nosilec za IV-dajanje ne sme vplivati na celovitost ali pretok krvi. Če se preskusna kemikalija daje z infuzijo, je treba o hitrosti infuzije poročati in jo uskladiti za vse živali, če se uporablja infuzijska črpalka. Kadar se izvede kanilacija jugularne vene (za dajanje preskusne kemikalije in/ali odvzem krvi) ali se za dajanje uporabi stegenska arterija, je treba uporabiti anestezijo. O vrsti anestezije je treba skrbno razmisliti, saj lahko vpliva na toksikokinetiko. Preden se živalim da preskusna kemikalija z nosilcem, jim je treba omogočiti, da si dovolj opomorejo. | 30. | Za nekatere preskusne kemikalije se glede na njihove fizikalno-kemijske lastnosti in pričakovano uporabo ali izpostavljenost ljudi lahko uporabijo drugi načini dajanja, npr. dermalni in inhalacijski (glej odstavke 74–78). | Meritve | Masna bilanca | 31. | Masna bilanca se določi s seštetjem deleža danega (radioaktivnega) odmerka, ki se izloči v urinu, iztrebkih in izdihanem zraku, ter deleža, prisotnega v tkivih, preostanku trupa in tekočini od izpiranja kletke (glej odstavek 46). Na splošno se šteje, da ustrezna skupna rekuperacija znaša > 90 % dane preskusne kemikalije (radioaktivnosti). | Absorpcija | 32. | Začetno oceno absorpcije je mogoče dobiti z izključitvijo deleža odmerka v prebavnem traktu in/ali iztrebkih iz določanja masne bilance. Za izračun deleža absorpcije glej odstavek 33. Za preiskovanje izločkov glej odstavke 44–49. Če natančnega obsega absorpcije po oralnem dajanju odmerka ni mogoče ugotoviti iz študij masne bilance (npr. kadar je v iztrebkih več kot 20 % danega odmerka), so morda potrebne dodatne preiskave. Te študije lahko zajemajo bodisi (1) oralno dajanje preskusne kemikalije in merjenje njene prisotnosti v žolču bodisi (2) oralno in IV-dajanje preskusne kemikalije ter merjenje njene neto količine v urinu, izdihanem zraku in trupu za vsakega od obeh načinov dajanja. V kateri koli od obeh zasnov študij se merjenje radioaktivnosti uporabi kot nadomestna metoda za analizo, specifično za kemikalijo, preskusne kemikalije in metabolitov. | 33. | Če se izvaja študija žolčnega izločanja, se navadno uporabi oralni način dajanja. V tej študiji je treba izvesti kanilacijo žolčnih vodov pri najmanj štirih živalih ustreznega spola (ali obeh spolov, če je to upravičeno) in jim dati enkratni odmerek preskusne kemikalije. Po dajanju preskusne kemikalije je treba izločanje radioaktivnosti/preskusne kemikalije v žolču spremljati tako dolgo, kolikor je potrebno za oceno deleža danega odmerka, ki se izloči na ta način, s tem podatkom pa se lahko neposredno izračuna obseg oralne absorpcije, in sicer z enačbo: | 34. | Pri nekaterih razredih preskusnih kemikalij se lahko pojavi neposredna sekrecija absorbiranega odmerka skozi črevesne sluznice. V takih primerih se šteje, da merjenje deleža odmerka v iztrebkih po oralnem dajanju pri podgani, pri kateri je bila izvedena kanilacija žolčnega voda, ni reprezentativno za neabsorbirani odmerek. Če se zdi, da se pojavlja sekrecija v črevesju, je priporočljivo, da delež absorbiranega odmerka temelji na absorpciji, izračunani s primerjavo med izločanjem po oralnem in izločanjem po IV-dajanju (nedotaknjena podgana ali podgana, na kateri je bila izvedena kanilacija žolčnega voda) (glej odstavek 35). Kadar se šteje, da je potrebna količinska opredelitev sekrecije v črevesju, je priporočljivo tudi izmeriti izločanje po IV-dajanju odmerka pri podgani, na kateri je bila izvedena kanilacija žolčnega voda. | Biološka dostopnost | 35. | Biološka dostopnost se lahko določi na podlagi plazemske/krvne kinetike skupine, tretirane z oralnim dajanjem, in skupine, tretirane z IV-dajanjem, kot je opisano v odstavkih 50–52, s posebno kemijsko analizo preskusne kemikalije in/ali zadevnih metabolitov, tako da izotopsko označena preskusna kemikalija ni potrebna. Nato se izračuna biološka dostopnost (F) preskusne kemikalije ali zadevnih metabolitov, in sicer z enačbo: | , | pri čemer je AUC območje pod krivuljo plazemska koncentracija-čas, exp pa način dajanja pri preskusu (oralni, dermalni ali inhalacijski). | 36. | Pri ocenjevanju tveganja sistemskih učinkov je uporaba biološke dostopnosti strupene sestavine navadno ustreznejša od uporabe deleža absorpcije, če se sistemske koncentracije iz študij na živalih primerjajo s podobnimi podatki o biomonitoringu, pridobljenimi s študijami izpostavljenosti delavcev. Okoliščine pa lahko postanejo bolj zapletene, če so odmerki v nelinearnem območju, zato je pomembno, da se s toksikokinetičnim presejalnim preskusom določijo odmerki v linearnem območju. | Porazdelitev v tkivih | 37. | Poznavanje porazdelitve preskusne kemikalije in/ali njenih metabolitov v tkivih je pomembno za opredelitev ciljnih tkiv, razumevanje osnovnih mehanizmov strupenosti ter pridobivanje informacij o potencialu za kopičenje in obstojnost preskusne kemikalije in metabolitov. Delež celotnega (radioaktivnega) odmerka v tkivih in preostanku trupa je treba izmeriti vsaj ob koncu preskusa z izločanjem (npr. navadno do 7 dni po odmerku ali prej, odvisno od posebnega obnašanja preskusne kemikalije). Če se ob koncu študije v tkivih preskusne kemikalije ne odkrije (npr. ker se je zaradi kratke razpolovne dobe izločila pred koncem študije), je treba paziti, da se podatki ne razlagajo napačno. V takem primeru je treba preiskavo porazdelitve v tkivih opraviti v času najvišje plazemske/krvne koncentracije (Tmax) ali najvišje stopnje izločanja preskusne kemikalije (in/ali metabolitov) z urinom, kot je ustrezno (glej odstavek 38). Poleg tega je morda treba tkiva zbirati tudi v dodatnih časovnih točkah, in sicer za ugotavljanje porazdelitve preskusne kemikalije in/ali njenih metabolitov v tkivih, ocenjevanje odvisnosti od časa (po potrebi), v pomoč pri določanju masne bilance in/ali če to zahteva pristojni organ. Tkiva, ki jih je treba zbrati, so med drugim jetra, maščoba, prebavni trakt, ledvice, vranica, polna kri, preostanek trupa, tkiva ciljnih organov in vsa druga tkiva (npr. ščitnica, eritrociti, razmnoževalni organi, koža, oko (zlasti pri pigmentiranih živalih)), ki so lahko pomembna pri toksikološki oceni preskusne kemikalije. Razmisliti je treba o analiziranju dodatnih tkiv, zbranih v istih časovnih točkah, da se živali kar najbolj izkoristijo ter če se v študijah subkronične ali kronične strupenosti opazi strupenost za ciljni organ. Poročati je treba tudi o koncentraciji (radioaktivnega) ostanka in razmerjih tkivo-plazma (kri). | 38. | Mogoče je tudi, da je treba porazdelitev v tkivih oceniti še v dodatnih časovnih točkah, na primer ob najvišji koncentraciji v plazmi/krvi (npr. Tmax) ali najvišji stopnji izločanja z urinom, določenih na podlagi ustreznih preskusih plazemske/krvne kinetike ali preskusih z izločanjem, ali pa da to zahteva pristojni organ. Te informacije so lahko koristne za razumevanje strupenosti ter potenciala za kopičenje in obstojnost preskusne kemikalije in metabolitov. Izbiro vzorca je treba utemeljiti; vzorci za analizo so navadno enaki zgoraj navedenim (glej odstavek 37). | 39. | Za študije porazdelitve v tkivih je količino radioaktivnosti mogoče določiti z disekcijo organov, homogenizacijo, sežigom in/ali solubilizacijo, čemur sledi tekočinsko scintilacijsko štetje (LSC) zajetih ostankov. Nekatere tehnike, ki so trenutno na različnih stopnjah razvoja, npr. kvantitativna avtoradiografija celega telesa in receptorska mikroskopska avtoradiografija, se lahko izkažejo kot koristne pri določanju porazdelitve preskusne kemikalije v organih in/ali tkivih (3) (4). | 40. | Pri načinih izpostavljenosti, ki niso oralni, je treba zbrati in analizirati specifična tkiva, kot so pljuča pri inhalacijskih študijah in koža pri dermalnih študijah. Glej odstavke 74–78. | Presnova | 41. | Izločke (in po potrebi plazmo) je treba zbrati, da se identificirajo nespremenjena preskusna kemikalija in metaboliti ter določijo njihove količine, kot je opisano v odstavkih 44–49. Sprejemljivo je združevanje izločkov, da se olajša identifikacija metabolitov v določeni odmerni skupini. Priporočljivo je določiti profile metabolitov iz vsakega časovnega obdobja. Če to zaradi pomanjkanja vzorcev in/ali radioaktivnosti ni mogoče, je sprejemljivo združevanje urina in iztrebkov, zbranih v različnih časovnih točkah, vendar morajo ti biti od živali istega spola in iz iste odmerne skupine. Za analiziranje urina, iztrebkov, izdihane radioaktivnosti tretiranih živali in po potrebi žolča je treba uporabiti ustrezne kvalitativne in kvantitativne metode. | 42. | Razumno si je treba prizadevati, da se identificirajo vsi metaboliti z vsaj 5-odstotnim deležem danega odmerka in pripravi shema presnove za preskusno kemikalijo. Identificirati je treba preskusne kemikalije, za katere je bilo pri analizi izločkov ugotovljeno, da obsegajo 5 % danega odmerka ali več. Identifikacija pomeni točno določanje strukture sestavin. Navadno se izvede z dodatno kromatografijo metabolita z znanimi standardi z dvema različnima sistemoma ali tehnikami, ki omogočajo pozitivno strukturno identifikacijo, kot so masna spektrometrija, jedrska magnetna resonanca (NMR) itd. Pri dodatni kromatografiji kromatografske tehnike, pri katerih se uporablja ista stacionarna faza z dvema različnima topilnima sistemoma, niso ustrezne za potrjevanje identitete metabolita, ki temelji na dveh metodah, saj metodi nista neodvisni. Za identifikacijo z dodatno kromatografijo je treba uporabiti dva različna in analitsko neodvisna sistema, kot sta tankoplastna kromatografija (TLC) z reverzno in normalno fazo ter tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC). Če je kromatografsko ločevanje ustrezne kakovosti, dodatno potrjevanje s spektroskopskimi metodami ni potrebno. Nedvoumna identifikacija pa je mogoča tudi z metodami, s katerimi se pridobivajo strukturne informacije, kot so: tekočinska kromatografija z masno spektrometrija (LC-MS) ali tekočinska kromatografija s tandemsko masno spektrometrijo (LC-MS/MS), plinska kromatografija z masno spektrometrijo (GC-MS) in spektroskopija z jedrsko magnetno resonanco. | 43. | Če metabolitov z vsaj 5-odstotnim deležem danega odmerka ni mogoče identificirati, je treba v končnem poročilu to utemeljiti/pojasniti. Morda je ustrezno identificirati metabolite, ki predstavljajo manj kot 5 % danega odmerka, da se izboljša razumevanje presnovne poti za oceno nevarnosti in/ali tveganja preskusne kemikalije. Če je to mogoče, je treba navesti potrditev strukture. Za to je morda treba določiti profile metabolitov v plazmi, krvi ali drugih tkivih. | Izločanje | 44. | Stopnjo in obseg izločanja danega odmerka je treba določiti tako, da se izmeri delež (radioaktivnega) odmerka, pridobljen iz urina, iztrebkov in izdihanega zraka. Ti podatki pomagajo tudi pri določanju masne bilance. Količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti), izločene z urinom, iztrebki in izdihanim zrakom, je treba določati v ustreznih časovnih intervalih (glej odstavke 47–49). Preskusi s ponavljajočimi se odmerki morajo biti ustrezno zasnovani, da je mogoče zbirati podatke o izločanju za izpolnitev ciljev iz odstavka 26. S tem se omogoči primerjave s preskusi z enkratnim odmerkom. | 45. | Če pilotna študija pokaže, da v izdihanem zraku ni pomembne količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti) (v skladu z odstavkom 49), v končni študiji izdihanega zraka ni treba zbirati. | 46. | Za zbiranje izločkov (urina, iztrebkov in izdihanega zraka) se vsaka žival namesti v ločeno enoto za preiskave presnove. Ob koncu vsakega obdobja zbiranja (glej odstavke 47–49) je treba te enote sprati z ustreznim topilom (ta postopek se imenuje ‚izpiranje kletke‘), da se zagotovi kar največja rekuperacija preskusne kemikalije (radioaktivnosti). Izločki se nehajo zbirati po 7 dneh ali po tem, ko je bilo pridobljenih vsaj 90 % danega odmerka, kar od tega je prej. | 47. | Skupne količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti) v urinu je treba prvi dan zbiranja določati vsaj dvakrat, od tega enkrat 24 ur po odmerku, nato pa enkrat na dan do konca študije. Priporočljivo je, da se za prvi dan izbereta več kot dve časovni točki vzorčenja (npr. 6, 12 in 24 ur po odmerku). Rezultate pilotnih študij je treba analizirati, da se pridobijo informacije o drugih ali dodatnih časovnih točkah zbiranja. Razpored zbiranja je treba utemeljiti. | 48. | Skupne količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti) v iztrebkih je treba ugotavljati dnevno, prvič 24 ur po dajanju odmerka, do konca študije, razen če pilotne študije kažejo, da so za zbiranje potrebne druge ali dodatne časovne točke. Drugačne razporede zbiranja je treba utemeljiti. | 49. | Zbiranje izdihanega CO2 in drugih hlapnih snovi se lahko v določenem preskusu v študiji prekine, ko se v 24-urnem obdobju zbiranja izdihanega zraka v njem ugotovi manj kot 1 % danega odmerka. | Študije časovnega poteka | Plazemska/krvna kinetika | 50. | Namen teh študij je oceniti osnovne toksikokinetične parametre (npr. Cmax, Tmax, razpolovno dobo (t1/2), AUC) preskusne kemikalije. Opravijo se lahko pri enem odmerku, navadno pa pri dveh ali več odmerkih. Odmerek je treba določiti glede na vrsto preskusa in/ali vidik, obravnavan v študiji. Kinetični podatki so lahko potrebni za reševanje vprašanj, kot je biološka dostopnost preskusne kemikalije, in/ali za pojasnitev učinka odmerka na izčistek (npr. ali je nasičenost izčistka odvisna od odmerka). | 51. | Za te študije je treba uporabiti najmanj štiri živali istega spola na odmerno skupino. Spol uporabljenih živali je treba utemeljiti. O uporabi obeh spolov (štirih samcev in štirih samic) je treba razmisliti, če obstajajo dokazi o pomembnih razlikah v strupenosti glede na spol. | 52. | Potem ko se živalim da preskusna kemikalija (izotopsko označena), je treba vsaki živali v ustreznih časovnih točkah z ustrezno metodo odvzeti vzorce krvi. Velikost in število vzorcev krvi, ki se lahko odvzamejo eni živali, sta lahko omejena zaradi možnih učinkov večkratnega jemanja vzorcev na zdravje/fiziologijo živali in/ali občutljivosti analitske metode. Vzorce je treba analizirati za vsako posamezno žival. V nekaterih primerih (npr. pri opredeljevanju lastnosti metabolitov) je mogoče treba združiti vzorce več živali. Združene vzorce je treba jasno identificirati, združitev pa utemeljiti. Če se uporabi izotopsko označena preskusna kemikalija, je morda ustrezno analizirati skupno prisotnost radioaktivnosti. V tem primeru je treba skupno radioaktivnost analizirati v polni krvi in plazmi ali plazmi in rdečih krvničkah, da se lahko izračuna razmerje kri-plazma. V drugih primerih so morda potrebne bolj specifične preiskave, za katere je treba identificirati izhodiščno spojino in/ali metabolite, ali ocena vezave na beljakovine. | Kinetika drugih tkiv | 53. | Namen teh študij je pridobiti informacije o časovnem poteku ter z določitvijo količine preskusne kemikalije v različnih tkivih ugotoviti parametre, kot so način strupenega delovanja, kopičenje v organizmih in biološka obstojnost. Izbira tkiv in število časovnih točk, ki bodo ocenjene, so odvisni od obravnavanega vidika in toksikološke zbirke podatkov za preskusno kemikalijo. Pri zasnovi teh kinetičnih študij na drugih tkivih je treba upoštevati informacije, zbrane v skladu z odstavki 37–40. Pri njih se lahko uporabijo enkratni odmerki ali ponavljajoči se odmerki. Uporabljeni pristop je treba natančno utemeljiti. | 54. | Razlogi za izvajanje kinetičnih študij na drugih tkivih so lahko: | — | dokazana podaljšana razpolovna doba v krvi, kar kaže na možnost kopičenja preskusne kemikalije v različnih tkivih, ali | — | želja ugotoviti, ali je bila v določenih tkivih dosežena stabilna raven koncentracije (na primer pri študijah s ponavljajočimi se odmerki je bila morda raven dinamičnega ravnotežja preskusne kemikalije v krvi očitno dosežena, vseeno pa se želi preveriti, da je bila dosežena tudi v ciljnih tkivih). | 55. | Pri teh vrstah študij časovnega poteka je treba ustrezni oralni odmerek preskusne kemikalije dati vsaj štirim živalim na odmerek in časovno točko, nato pa je treba spremljati časovni potek porazdelitve v izbranih tkivih. Uporabijo se lahko živali samo enega spola, razen če je ugotovljeno, da je strupenost odvisna od spola. Od obravnavanega vidika je odvisno tudi, ali se analizirajo celotna radioaktivnost ali izhodiščna kemikalija in/ali metaboliti. Porazdelitev v tkivih je treba oceniti z ustreznimi tehnikami. | Indukcija/inhibicija encimov | 56. | V enem ali več naslednjih primerih so lahko potrebne študije možnih učinkov indukcije/inhibicije encimov ali biotransformacije preučevane preskusne kemikalije: | 1. | razpoložljivi dokazi kažejo povezavo med biotransformacijo preskusne kemikalije in povečano strupenostjo; | 2. | razpoložljivi podatki o strupenosti kažejo nelinearno razmerje med odmerkom in presnovo; | 3. | rezultati študij za identifikacijo metabolitov kažejo obstoj potencialno strupenega metabolita, ki je morda rezultat encimske poti, ki jo je povzročila preskusna kemikalija; | 4. | pri pojasnjevanju učinkov, za katere se domneva povezava s pojavom indukcije encimov; | 5. | če se pri preskusih in vitro ali in vivo na različnih vrstah ali v različnih pogojih ugotovijo za strupenost pomembne spremembe presnovnega profila preskusne kemikalije, je morda potrebna opredelitev lastnosti udeleženih encimov (npr. encimi faze I, kot so izoencimi od citokroma P450 odvisnega monooksigenaznega sistema, encimi faze II, kot so izoencimi sulfotransferaze ali uridin difosfat glukuronozil transferaze. ali kateri koli drugi pomembni encimi). Te informacije se lahko uporabijo za oceno primernosti ekstrapolacij ene živalske vrste na drugo. | 57. | Za ocenjevanje sprememb v toksikokinetiki, povezanih s preskusno kemikalijo, je treba uporabiti primerne protokole študij, ki so ustrezno validirani in utemeljeni. Zasnove študij lahko na primer obsegajo ponavljajoče se odmerke neoznačene preskusne kemikalije, čemur 14. dan sledi enkraten izotopsko označen odmerek, ali ponavljajoče se odmerke izotopsko označene preskusne kemikalije in vzorčenje na 1., 7. in 14. dan za določitev presnovnih profilov. S ponavljajočimi se odmerki izotopsko označene preskusne kemikalije se lahko pridobijo tudi informacije o kopičenju v organizmih (glej odstavek 26). | DODATNI PRISTOPI | 58. | Z dodatnimi pristopi poleg preskusov in vivo, opisanih v tej preskusni metodi, se lahko pridobijo koristne informacije o absorpciji, porazdelitvi, presnovi ali izločanju preskusne kemikalije pri nekaterih vrstah. | Uporaba informacij iz preskusov in vitro | 59. | S študijami in vitro, v katerih so uporabljeni ustrezni preskusni sistemi, je mogoče dobiti odgovore na več vprašanj o presnovi preskusne kemikalije. Za preučevanje mogočih metabolitov se lahko uporabijo sveže izolirani ali kultivirani hepatociti in podcelične frakcije (npr. mikrosomi in citosolska frakcija ali frakcija S9) iz jeter. Za oceno tveganja je lahko zanimiva lokalna presnova v ciljnem organu, npr. pljučih. Za te namene so lahko koristne mikrosomske frakcije ciljnih tkiv. Študije z mikrosomi so lahko koristne za obravnavanje morebitnih razlik med spoloma in glede na fazo življenja ter za opredelitev encimskih parametrov (Km in Vmax), ki so lahko v pomoč pri ocenjevanju odvisnosti presnove od odmerka v povezavi s stopnjami izpostavljenosti. Poleg tega so lahko mikrosomi v pomoč pri identifikaciji posebnih mikrosomskih encimov, ki sodelujejo pri presnovi preskusne kemikalije, kar je lahko pomembno pri ekstrapolaciji ene živalske vrste na drugo (glej tudi odstavek 56). Prav tako se lahko preuči potencial za indukcijo biotransformacije, in sicer s podceličnimi frakcijami (npr. mikrosomi in citosoli) iz jeter živali, predhodno tretiranih s preiskovano preskusno kemikalijo, in vitro v študijah indukcije hepatocitov, ali na podlagi določenih celičnih linij, v katerih so izraženi ustrezni encimi. V nekaterih okoliščinah in ustreznih pogojih se lahko za določanje možnih razlik pri biotransformaciji med vrstami predvidi uporaba podceličnih frakcij iz človeških tkiv. Rezultati iz preiskav in vitro se lahko uporabijo tudi pri izdelavi modelov PBTK (5). | 60. | S študijami dermalne absorpcije in vitro se lahko pridobijo dodatne informacije za opredelitev absorpcije (6). | 61. | Primarne celične kulture iz jetrnih celic in rezin svežega tkiva se lahko uporabijo za obravnavo podobnih vprašanj kot pri jetrnih mikrosomih. V nekaterih primerih je mogoče na konkretna vprašanja odgovoriti s celičnimi linijami z opredeljenimi izraženimi ustreznimi encimi ali spremenjenimi celičnimi linijami. V nekaterih primerih je lahko koristno preučevati inhibicijo in indukcijo posebnih izoencimov citokroma P450 (npr. CYP1A1, 2E1, 1A2 in drugih) in/ali encimov faze II z izhodiščno spojino v okviru študij in vitro. Pridobljene informacije so lahko koristne za spojine s podobno strukturo. | Uporaba toksikokinetičnih podatkov iz študij strupenosti kot dodatnih informacij | 62. | Analiza vzorcev krvi, tkiva in/ali izločkov, pridobljenih med izvajanjem drugih študij strupenosti, lahko zagotovi podatke o biološki dostopnosti, spremembah plazemske koncentracije v odvisnosti od časa (AUC, Cmax), potencialu za kopičenje v organizmih, stopnjah izčistkov ter spremembah v presnovi in kinetiki glede na spol ali fazo življenja. | 63. | Zasnova študije se lahko prilagodi, da se poiščejo odgovori na vprašanja v zvezi z: nasičenostjo absorpcije, potmi biotransformacije ali izločanja pri večjih odmerkih; delovanjem novih presnovnih poti pri večjih odmerkih in omejenostjo strupenih metabolitov na večje odmerke. | 64. | Drugi vidiki ocene nevarnosti bi lahko bili na primer: | — | s starostjo povezana občutljivost zaradi razlik v stanju krvno-možganske pregrade, ledvic in/ali zmožnosti razstrupljanja, | — | občutljivost podpopulacij zaradi razlik v zmožnostih biotransformacije ali drugih toksikokinetičnih razlik, | — | stopnja izpostavljenosti fetusa pri transplacentarnem prenosu kemikalij ali novorojene živali prek laktacije. | Uporaba toksikokinetičnega modeliranja | 65. | Toksikokinetični modeli lahko prispevajo k različnim vidikom ocenjevanja nevarnosti in tveganja, na primer pri napovedovanju sistemske izpostavljenosti in odmerka za notranje tkivo. Poleg tega se lahko z njimi obravnavajo konkretna vprašanja o načinu delovanja, lahko pa so tudi osnova za ekstrapolacijo na druge vrste, načine izpostavljenosti in vzorce dajanja odmerkov ter ocenjevanje tveganja za ljudi. Podatki, koristni za izdelavo modelov PBTK za preskusno kemikalijo za dano vrsto, vključujejo 1. porazdelitvene koeficiente, 2. biokemične konstante in fiziološke parametre, 3. parametre absorpcije pri različnih načinih izpostavljenosti in 4. kinetične podatke in vivo za ovrednotenje modela (npr. parametri izčistkov za ustrezne poti izločanja (> 10 %), Km in Vmax za presnovo). Preskusne podatke, uporabljene pri izdelavi modela, je treba pridobiti z znanstveno utemeljenimi metodami, rezultate modela pa validirati. Parametri, specifični za preskusno kemikalijo in vrsto, kot so stopnje absorpcije, porazdelitev med krvjo in tkivom ter konstante hitrosti presnove, se pogosto določajo, da bi se olajšala izdelava nerazdelčnih modelov ali modelov, ki temeljijo na fiziologiji (7). | PODATKI IN POROČANJE | 66. | Priporočljivo je, da poročilo o študiji vsebuje kazalo. | Osrednji del poročila | 67. | V osrednjem delu poročila morajo biti predstavljene informacije, ki jih obsega ta preskusna metoda. Razčlenjeno mora biti na oddelke in odstavke, kot je navedeno v nadaljevanju. | Povzetek | 68. | Ta oddelek poročila o študiji mora vsebovati povzetek zasnove študije in opis uporabljenih metod. V njem morajo biti poudarjene ključne ugotovitve v zvezi z masno bilanco, lastnostmi in pomembnostjo metabolitov, ostanki tkiv, stopnjo izčistkov, potencialom za kopičenje v organizmih, razlikami glede na spol itd. Povzetek mora biti dovolj podroben, da omogoča oceno ugotovitev. | Uvod | 69. | Ta del poročila mora vsebovati cilje študije, razloge zanjo, njeno zasnovo ter ustrezne vire in pretekle podatke o področju. | Materiali in metode | 70. | V tem oddelku poročila morajo biti podrobno navedene vse ustrezne informacije, vključno z naslednjimi: | (a) | Preskusna kemikalija | V tem pododdelku je treba identificirati preskusno kemikalijo in navesti: kemijsko ime, molekulsko strukturo, kvalitativno in kvantitativno opredelitev kemijske sestave, kemijsko čistost ter po možnosti vrsto in količino nečistot. Vključiti je treba tudi informacije o fizikalnih/kemijskih lastnostih, vključno z agregatnim stanjem, barvo, bruto koeficientom topnosti in/ali porazdelitvenim koeficientom, stabilnostjo in po potrebi jedkostjo. Če je ustrezno, je treba navesti informacije o izomerih. Če je preskusna kemikalija izotopsko označena, je treba v ta poddel vključiti naslednje informacije: vrsto radionuklida, položaj oznake, specifično aktivnost in radiokemijsko čistost. | Opisati je trebe vse nosilce, redčila, snovi za upočasnitev sedimentacije v suspenziji, emulgatorje ali druge snovi, uporabljene pri dajanju preskusne kemikalije. | (b) | Preskusne živali | V tem pododdelku je treba navesti informacije o preskusnih živalih, vključno z izbranimi vrstami in razlogi za njihovo uporabo, sevom in starostjo ob začetku študije, spolom in telesno težo, zdravstvenim stanjem in oskrbo živali. | (c) | Metode | V tem poddelu je treba navesti podrobne informacije o zasnovi študije in uporabljeni metodologiji. Vsebovati mora naslednje informacije: | 1. | utemeljitev spremembe načina izpostavljenosti in pogojev izpostavljenosti, če je ustrezno; | 2. | utemeljitev izbranih velikosti odmerkov; | 3. | opis pilotnih študij, uporabljenih za preskusno zasnovo nadaljnjih študij, če je ustrezno. Predložiti je treba podporne podatke pilotne študije; | 4. | opis priprave raztopin za odmerjanje z navedbo vrste topila ali nosilca, če je bil uporabljen; | 5. | število tretiranih skupin in število živali na skupino; | 6. | velikosti in količino odmerkov (in specifična aktivnost odmerka, če se uporabi radioaktivnost); | 7. | načine in metode dajanja odmerkov; | 8. | pogostnost dajanja odmerkov; | 9. | obdobje postenja (če se uporabi); | 10. | skupno radioaktivnost na žival; | 11. | opis ravnanja z živalmi; | 12. | opis jemanja vzorcev in ravnanja z njimi; | 13. | analitske metode, uporabljene za ločevanje, določanje količine in identifikacijo metabolitov; | 14. | mejo zaznavnosti za uporabljene metode; | 15. | druge uporabljene preskusne meritve in postopke (vključno z validacijo metod za analizo metabolitov). | (d) | Statistična analiza | Če se za analizo ugotovitev študije uporabi statistična analiza, je treba vključiti zadostne informacije o metodi analize in uporabljenem računalniškem programu, da lahko neodvisni ocenjevalec/statistik analizo znova oceni in ponovi. | Če se uporabijo študije sistemskega modeliranja, kot je PBTK, je treba v predstavitev modelov vključiti popoln opis modela, da se lahko izvedeta neodvisna ponovitev in validacija modela (glej odstavek 65 in Dodatek: opredelitev pojmov). | Rezultati | 71. | Vse podatke je treba povzeti in predstaviti v preglednicah z ustrezno statistično oceno ter jih opisati v tem delu. Podatke, pridobljene pri merjenju radioaktivnosti, je treba povzeti in predstaviti, kot je ustrezno za študijo, navadno v ekvivalentih mikrogramov ali miligramov na maso vzorca, lahko pa se uporabijo tudi druge enote. Ta del mora vključevati grafične ponazoritve ugotovitev, izvode reprezentativnih kromatografskih in spektrometričnih podatkov, identifikacijo/količinsko opredelitev metabolitov in predlagane presnovne poti, vključno z molekulsko strukturo metabolitov. Poleg tega je treba po potrebi v ta del vključiti naslednje informacije: | 1. | količino in delež rekuperacije radioaktivnosti v urinu, iztrebkih, izdihanem zraku ter v urinu in iztrebkih ob izpiranju kletk; | — | pri dermalnih študijah je treba vključiti tudi podatke o rekuperaciji preskusne kemikalije iz tretirane kože in ob umivanju kože, ostanku radioaktivnosti na aparaturi, ki pokriva kožo, in v enoti za preiskave presnove ter rezultate študije z umivanjem kože. Za več podrobnosti glej odstavke 74–77, | — | pri inhalacijskih študijah je treba vključiti tudi podatke o rekuperaciji preskusne kemikalije iz pljuč in nosnih tkiv (8). Za več podrobnosti glej odstavek 78; | 2. | porazdelitev v tkivih, izraženo kot delež danega odmerka in koncentracija (ekvivalenti mikrogramov na gram tkiva), in razmerja tkivo-kri ali tkivo-plazma; | 3. | materialno bilanco, izdelano na podlagi vsake študije, ki vključuje analizo telesnih tkiv in izločkov; | 4. | plazemske koncentracije in toksikokinetične parametre (biološka dostopnost, AUC, Cmax, Tmax, izčistek, razpolovna doba) po tem, ko je bil dan odmerek preskusne kemikalije v skladu z ustreznimi načini izpostavljenosti; | 5. | stopnjo in obseg absorpcije preskusne kemikalije po tem, ko je bil dan odmerek v skladu z ustreznimi načini izpostavljenosti; | 6. | količine preskusne kemikalije in metabolitov (izražene kot delež danega odmerka), zbranih v izločkih; | 7. | sklicevanje na podatke iz dodatka, ki vsebujejo podatke o posamezni živali za vse končne točke meritev (npr. dajanje odmerka, delež rekuperacije, koncentracije, toksikokinetični parametri itd.); | 8. | grafično predstavitev predlaganih presnovnih poti in molekulskih struktur metabolitov. | Razprava in sklepi | 72. | Avtorji morajo v tem oddelku: | 1. | na podlagi rezultatov v zvezi s presnovo in izločanjem preskusne kemikalije predlagati presnovno pot; | 2. | preučiti morebitne razlike glede na vrsto in spol v zvezi z izločanjem in/ali biotransformacijo preskusne kemikalije; | 3. | v preglednici predstaviti in preučiti identifikacijo in pomembnost metabolitov, stopnje izčistkov, potencial za kopičenje v organizmih, ravni ostankov tkiv izhodiščne snovi in/ali metabolitov ter morebitne od odmerka odvisne spremembe toksikokinetičnih parametrov, kot je ustrezno; | 4. | v ta del vključiti vse ustrezne toksikokinetične podatke, pridobljene med izvajanjem študij strupenosti; | 5. | oblikovati jedrnat sklep, ki ga je mogoče podpreti z ugotovitvami študije; | 6. | (po potrebi ali kot je ustrezno) dodati oddelke. | 73. | Za vključitev podpornih bibliografskih informacij, preglednic, grafičnih predstavitev, dodatkov itd. je treba uporabiti dodatne oddelke. | DRUGI NAČINI IZPOSTAVLJENOSTI | Dermalni način | Dermalno tretiranje | 74. | Ta oddelek vsebuje posebne informacije o preiskovanju toksikokinetike preskusne kemikalije pri dermalnem načinu dajanja. Več o dermalni absorpciji je na voljo v poglavju B.44 te priloge (Absorpcija skozi kožo: metoda in vivo (9)). Za druge končne točke, kot sta porazdelitev in presnova, se lahko uporabi ta preskusna metoda B.36. Za dermalno tretiranje je treba uporabiti eno ali več velikosti odmerkov preskusne kemikalije. Preskusna kemikalija (npr. čista, razredčena ali formulirana snov, ki vsebuje preskusno kemikalijo in se nanese na kožo) mora biti enaka (ali realističen nadomestek) tisti, ki so ji lahko izpostavljeni ljudje ali druge potencialne ciljne vrste. Velikosti odmerkov je treba določiti v skladu z odstavki 20–26 te preskusne metode. Med dejavniki, ki bi jih bilo mogoče upoštevati pri izbiri dermalnega odmerka, so pričakovana izpostavljenost človeka in/ali odmerki, pri katerih je bila v drugih študijah dermalne strupenosti ugotovljenost strupenost. Dermalne odmerke je treba po potrebi raztopiti v ustreznem nosilcu in nanesti v količini, ustrezni za nanos odmerka. Tik pred začetkom preskusa je treba preskusnim živalim ostriči dlako s hrbtnega dela trupa. Dlaka se lahko tudi obrije, vendar je treba to opraviti približno 24 ur pred preskusom. Med striženjem ali britjem dlake je treba paziti, da se koža ne odrgne, kar bi lahko spremenilo njeno prepustnost. Za nanos preskusne kemikalije je treba ostriči oziroma obriti približno 10 % površine telesa. Pri zelo strupenih kemikalijah je lahko površina pokritosti manjša od 10 %, vendar mora biti s tanko in enakomerno plastjo pokrite čim več površine. Površina tretiranja mora biti enaka v vseh preskusnih skupinah z dermalnim tretiranjem. Površine, ki se tretirajo, je treba pokriti z ustrezno zaščito, ki bo ostala na mestu. Živali morajo biti nastanjene posamično. | 75. | Študijo z umivanjem kože je treba opraviti, da se oceni, koliko nanesenega odmerka preskusne kemikalije se lahko odstrani s kože z umivanjem tretirane kožne površine z blagim milom in vodo. Ta študija je lahko tudi v pomoč pri določanju masne bilance pri dermalnem načinu dajanja preskusne kemikalije. Pri tej študiji z umivanjem kože je treba na dve živali nanesti enkraten odmerek preskusne kemikalije. Velikost odmerka se izbere v skladu z odstavkom 23 te preskusne metode (glej tudi odstavek 76 o trajanju stika s kožo). Določiti je treba, koliko preskusne kemikalije se pridobi iz vode z milom, s katero se je umivala koža, da se oceni učinkovitost njenega odstranjevanja z umivanjem. | 76. | Preskusno kemikalijo je treba nanesti na kožo in jo na njej pustiti vsaj 6 ur, razen če to ni mogoče zaradi jedkosti. Ko se zaščita odstrani, je treba tretirano površino umiti v skladu s postopkom, opisanim v študiji z umivanjem kože (glej odstavek 75). Zaščito in vodo z milom, s katero je bila umita koža, je treba analizirati, da se ugotovi prisotnost ostankov preskusne kemikalije. Ob koncu študij je treba vsako žival humano usmrtiti v skladu z virom (2), tretirano kožo pa odstraniti. Ustrezen del tretirane kože je treba analizirati, da se določijo ostanki preskusne kemikalije (radioaktivnosti). | 77. | Za toksikokinetično oceno farmacevtskih izdelkov so v skladu z ustrezno zakonodajno ureditvijo morda potrebni drugačni postopki. | Inhalacijski način | 78. | Uporabiti je treba eno samo koncentracijo preskusne kemikalije (ali po potrebi več). Koncentracije je treba določiti v skladu z odstavki 20–26 te preskusne metode. Tretiranje z vdihavanjem je treba izvajati z aparaturo z nosnim stožcem ali aparaturo za izpostavljanje glave, da se prepreči absorpcija prek drugih načinov izpostavljenosti (8). Če se uporabijo drugi pogoji izpostavljenosti z vdihavanjem, je treba to izbiro utemeljiti in dokumentirati. Trajanje izpostavljenosti z vdihavanjem je treba opredeliti; navadno traja 4–6 ur. | VIRI: | (1) | OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Pariz. | (2) | OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Pariz. | (3) | Solon, E. G., Kraus, L. (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81. | (4) | Stumpf, W. E. (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25–40. | (5) | Loizou, G., Spendiff, M., Barton, H. A., Bessems, J., Bois, F. Y., d’Yvoire, M. B., Buist. H., Clewell, H. J. 3., Meek, B., Gundert-Remy, U., Goerlitz, G., Schmitt, W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411. | (6) | Poglavje B.45 te priloge, Absorpcija skozi kožo: metoda in vitro. | (7) | IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (9) | Poglavje B.44 te priloge, Absorpcija skozi kožo: metoda in vivo. | (10) | Barton, H. A., idr. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35. | (11) | Gibaldi, M., in Perrier, D., (1982), Pharmacokinetics, 2. izdaja, Marcel Dekker, Inc., New York. | Dodatek | OPREDELITEV POJMOV | Absorpcija: procesi sprejemanja kemikalij v tkiva ali skozi tkiva. Nanaša se na izhodiščno spojino in vse njene metabolite. Ne sme se mešati z ‚biološko dostopnostjo‘. | Kopičenje v organizmih (bioakumulacija): povečanje količine preskusne kemikalije skozi čas v tkivih (navadno maščobnih tkivih po ponavljajoči se izpostavljenosti); če je stopnja vnosa preskusne kemikalije v telo višja od stopnje njenega izločanja, se preskusna kemikalija kopiči v organizmu in lahko doseže strupene koncentracije. | ADME: kratica za ‚absorpcija, porazdelitev, presnova in izločanje‘. | AUC: (območje pod krivuljo plazemska koncentracija-čas): območje pod krivuljo na grafičnem prikazu, ki predstavlja koncentracijo preskusne kemikalije v plazmi v odvisnosti od časa. Predstavlja skupno količino preskusne kemikalije, ki jo telo absorbira v vnaprej določenem obdobju. V linearnih pogojih je AUC (od časa nič do neskončnosti) sorazmerna s skupno količino preskusne kemikalije, ki jo telo absorbira, ne glede na stopnjo absorpcije. | Avtoradiografija: (avtoradiografija celega telesa): pri tej tehniki, s katero se kvalitativno in/ali kvantitativno določa mesto radioaktivne preskusne kemikalije v tkivu, se uporablja rentgensko slikanje, v zadnjem času pa tudi digitalno slikanje s fosforno ploščo, pri čemer se slika oddano sevanje v notranjosti predmeta študije, s tem pa izotopsko označene molekule ali njihovi deli postanejo vidni. Kvantitativna avtoradiografija celega telesa ima lahko v primerjavi z disekcijo organov nekatere prednosti pri ocenjevanju porazdelitve preskusne kemikalije, skupne rekuperacije in ločljivosti radioaktivne snovi v tkivih. Ena od pomembnih prednosti je na primer, da se lahko ta tehnika pri modelu s pigmentiranimi živalmi uporabi za oceno morebitne asociacije preskusne kemikalije z melaninom, ki lahko veže nekatere molekule. Čeprav lahko z njo dobimo koristne preglede veznih mest z visoko zmogljivostjo in nizko afiniteto na ravni celega telesa, je lahko omejena pri prepoznavanju konkretnih ciljnih mest, kot so receptorska vezna mesta, kjer sta za zaznavanje potrebni razmeroma visoka ločljivost in velika občutljivost. Če se uporabi avtoradiografija, je treba preskuse za določanje masne bilance dane spojine opraviti na skupini ali v študiji, ločeni od preskusa določanja porazdelitve v tkivu, pri katerih se vsi izločki (ki lahko vključujejo tudi izdihan zrak) in celotni trupi homogenizirajo in analizirajo s tekočinskim scintilacijskim štetjem. | Žolčno izločanje: izločanje prek žolčnih vodov. | Bioakumulacija: glej ‚kopičenje v organizmih‘. | Biološka dostopnost: del danega odmerka, ki doseže sistemski obtok ali je na voljo na mestu fiziološke aktivnosti. Navadno se biološka dostopnost preskusne kemikalije nanaša na izhodiščno spojino, lahko pa tudi na njene metabolite. Pri tem se upošteva samo ena kemijska oblika. Opomba: biološka dostopnost in absorpcija nista sopomenki. Razlika med, na primer, oralno absorpcijo (tj. prisotnost v črevesni steni in portalnem obtoku) in biološko dostopnostjo (tj. prisotnost v sistemskem krvnem obtoku in tkivih) lahko med drugim izhaja iz kemijske razgradnje, ki je posledica presnove v črevesni steni, ali prenosa odtoka nazaj v črevesno svetlino, ali predsistemske presnove v jetrih (10). Biološka dostopnost strupene sestavine (izhodiščne spojine ali metabolita) je bistveni parameter pri oceni tveganja za ljudi (ekstrapolacija velikega na majhen odmerek, ekstrapolacija na druge načine dajanja), da se iz zunanjega NOAEL ali BMD (uporabljeni odmerek) izpelje notranja vrednost. Za učinke na jetra po oralnem dajanju zadošča oralna absorpcija. Za vse učinke, razen učinkov na vstopnem mestu, pa je biološka dostopnost v primerjavi z absorpcijo navadno zanesljivejši parameter za nadaljnjo uporabo v oceni tveganja. | Biološka obstojnost: glej ‚obstojnost‘. | Biotransformacija: (navadno encimska) kemična pretvorba preiskovane preskusne kemikalije v telesu v drugo kemikalijo. Sopomenka za ‚presnovo‘. | Cmax : bodisi najvišja (plazemska/serumska) koncentracija v krvi po dajanju odmerka bodisi največje izločanje (v urinu ali iztrebkih) po dajanju odmerka. | Stopnja izčistka: kvantitativno merilo stopnje odstranjevanja preskusne kemikalije iz krvi, plazme ali določenih tkiv na enoto časa. | Razdelek: strukturni ali biokemični del (ali enota) telesa, tkiva ali celice, ki je ločen od preostanka. | Načini razstrupljanja: vrsta korakov, ki vodi do odstranitve strupenih kemikalij iz telesa, bodisi s presnovno spremembo bodisi z izločanjem. | Porazdelitev: razpršenost preskusne kemikalije in njenih derivatov po organizmu. | Encimi/izoencimi: beljakovine, ki pospešujejo kemične reakcije. Izoencimi so encimi, ki pospešujejo podobne kemične reakcije, vendar imajo drugačno zaporedje aminokislin. | Encimski parametri: Km: Michaelisova konstanta in Vmax: največja hitrost. | Izločanje: procesi, s katerimi se dana preskusna kemikalija in/ali njeni metaboliti odstranijo iz telesa. | Eksogeno: izvirajoče ali ustvarjeno zunaj organizma ali sistema. | Ekstrapolacija: sklepanje o eni ali več neznanih vrednostih na podlagi tega, kar je znano ali opaženo. | Razpolovna doba (t1/2): čas, ki je potreben, da se koncentracija preskusne kemikalije v razdelku zmanjša za polovico. Navadno se nanaša na plazemsko koncentracijo ali količino preskusne kemikalije v celem telesu. | Indukcija/indukcija encimov: sinteza encimov kot odziv na okoljski dražljaj ali induktor. | Linearnost/linearna kinetika: pri kinetiki je proces linearen, ko so vse stopnje prenosa med razdelki sorazmerne s prisotnimi količinami ali koncentracijami, tj. proces prvega reda. Količine izčistkov in porazdelitev so zato konstantne, kar velja tudi za razpolovne dobe. Dosežena koncentracija je sorazmerna z velikostjo odmerka (izpostavljenostjo), kopičenje pa je lažje napovedati. Ali gre za linearnost ali nelinearnost, se lahko oceni s primerjanjem ustreznih parametrov, npr. AUC, po različnih odmerkih ali po enkratni in ponavljajoči se izpostavljenosti. Če se ne ugotovi odvisnost od velikosti odmerka, je to lahko znak nasičenosti encimov, ki sodelujejo pri presnovi spojine, povečanje AUC po ponavljajoči se izpostavljenosti v primerjavi z enkratno izpostavljenostjo je lahko znak inhibicije presnove, zmanjšanje AUC pa znak indukcije presnove (glej tudi vir (11)). | Masna bilanca: količinska razlika med preskusno kemikalijo, ki vstopa v sistem, in preskusno kemikalijo, ki zapušča sistem. | Materialna bilanca: glej ‚masna bilanca‘. | Mehanizem (način) strupenosti/mehanizem (način) delovanja: mehanizem delovanja se nanaša na konkretno biokemično interakcijo, s katero preskusna kemikalija povzroči učinek. Način delovanja se nanaša na splošnejše poti, ki vodijo k strupenosti preskusne kemikalije. | Presnova: sopomenka za ‚biotransformacijo‘. | Metaboliti: produkti presnove ali presnovnih procesov. | Oralna absorpcija: delež odmerka preskusne kemikalije, ki se absorbira z mesta dajanja (npr. iz prebavnega trakta). Ta ključni parameter se lahko uporabi za razumevanje dela dane preskusne kemikalije, ki doseže portalno veno, nato pa jetra. | Porazdelitveni koeficient: imenovan tudi distribucijski koeficient; merilo različne topnosti kemikalije v dveh topilih. | Najvišja (plazemska/serumska) raven v krvi: najvišja (plazemska/serumska) koncentracija v krvi po dajanju odmerka (glej tudi ‚Cmax‘). | Obstojnost (biološka obstojnost): dolgoročna prisotnost kemikalije (v biološkem sistemu) zaradi odpornosti na razgradnjo/izločanje. | Navzkrižno branje: informacije o končnih točkah za eno ali več kemikalij se uporabijo za napovedovanje končne točke za ciljno kemikalijo. | Receptorska mikroskopska avtoradiografija (ali receptorska mikroavtoradiografija): ta tehnika se lahko uporabi za preiskovanje ksenobiotične interakcije s konkretnimi tkivnimi mesti ali celičnimi populacijami, na primer pri študijah receptorske vezave ali posebnega načina delovanja, pri katerih sta lahko potrebni visoka ločljivost in velika občutljivost, ki pa morda nista mogoči z drugimi tehnikami, kakršna je na primer avtoradiografija celega telesa. | Način dajanja (oralni, IV, dermalni, inhalacijski itd.): nanaša se na način, kako se kemikalije vnašajo v telo (npr. oralno z gavažo, oralno s hrano, dermalno, z vdihavanjem, intravenozno itd.). | Nasičenost: stanje, pri katerem eden ali več kinetičnih procesov (npr. absorpcija, presnova ali čiščenje) poteka najintenzivneje (procesi so ‚nasičeni‘). | Občutljivost: zmožnost metode ali instrumenta, da razlikuje med meritvenimi odzivi, ki predstavljajo različne stopnje preiskovane spremenljivke. | (Plazemska) raven dinamičnega ravnotežja v krvi: neravnotežno stanje odprtega sistema, v katerem vse sile, ki delujejo na sistem, natančno izenačujejo nasprotne sile, tako da koncentracije vseh sestavnih delov ostajajo nespremenjene, čeprav snov teče skozi sistem. | Sistemsko modeliranje (na fiziologiji temelječe toksikokinetično, na farmakokinetiki temelječe, na fiziologiji temelječe farmakokinetično, na biologiji temelječe itd.): abstraktni model, ki uporablja matematični jezik za opisovanje vedenja sistema. | Ciljno tkivo: tkivo, v katerem se kaže glavni škodljivi učinek strupene snovi. | Preskusna kemikalija: kemikalija ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Porazdelitev v tkivih: reverzibilno gibanje preskusne kemikalije z enega mesta v telesu na drugo. Porazdelitev v tkivih se lahko preiskuje z disekcijo organov, homogenizacijo, sežigom in tekočinskim scintilacijskim štetjem ali s kvalitativno in/ali kvantitativno avtoradiografijo celega telesa. Prva metoda je primerna za pridobivanje podatkov o koncentraciji in deležu rekuperacije iz tkiv in preostankov trupov istih živali, vendar ima lahko nezadostno ločljivost za vsa tkiva in morda ne zagotavlja najboljše možne ravni skupne rekuperacije (< 90 %). Za opredelitev druge metode glej zgoraj. | Tmax : čas, potreben za dosego Cmax. | Toksikokinetika (farmakokinetika): področje, ki preučuje absorpcijo, porazdelitev, presnovo in izločanje kemikalij skozi čas. | Validacija modelov: postopek ocenjevanja, ali model ustrezno in dosledno opisuje vse razpoložljive toksikokinetične podatke. Modeli se lahko ocenjujejo s statistično in vizualno primerjavo napovedi modela s preskusnimi vrednostmi glede na skupno neodvisno spremenljivko (npr. čas). Obseg ocene mora biti utemeljen glede na predvideno uporabo modela.; | “ | (7) | Chapter B.36 is replaced by the following: | ‘B.36. TOXICOKINETICS | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD TG 417 (2010). Studies examining the toxicokinetics (TK) of a test chemical are conducted to obtain adequate information on its absorption, distribution, biotransformation (i.e. metabolism) and excretion, to aid in relating concentration or dose to the observed toxicity, and to aid in understanding its mechanism of toxicity. TK may help to understand the toxicology studies by demonstrating that the test animals are systemically exposed to the test chemical and by revealing which are the circulating moieties (parent chemical/metabolites). Basic TK parameters determined from these studies will also provide information on the potential for accumulation of the test chemical in tissues and/or organs and the potential for induction of biotransformation as a result of exposure to the test chemical. | 2. | TK data can contribute to the assessment of the adequacy and relevance of animal toxicity data for extrapolation to human hazard and/or risk assessment. Additionally, toxicokinetic studies may provide useful information for determining dose levels for toxicity studies (linear vs. non-linear kinetics), route of administration effects, bioavailability, and issues related to study design. Certain types of TK data can be used in physiologically based toxicokinetic (PBTK) model development. | 3. | There are important uses for metabolite/TK data such as suggesting possible toxicities and modes of action and their relation to dose level and route of exposure. In addition, metabolism data can provide information useful for assessing the toxicological significance of exposures to exogenously produced metabolites of the test chemical. | 4. | Adequate toxicokinetic data will be helpful to support the further acceptability and applicability of quantitative structure-activity relationships, read-across or grouping approaches in the safety evaluation of chemicals. Kinetics data may also be used to evaluate the toxicological relevance of other studies (e.g. in vivo/in vitro). | 5. | Unless another route of administration is mentioned (see in particular paragraphs 74-78), this Test Method is applicable to oral administration of the test chemical. | INITIAL CONSIDERATIONS | 6. | Regulatory systems have different requirements and needs regarding the measurement of endpoints and parameters related to toxicokinetics for different classes of chemicals (e.g. pesticides, biocides, industrial chemicals). Unlike most Test Methods this Test Method describes toxicokinetics testing, which involves multiple measurements and endpoints. In the future, several new Test Methods, and/or guidance document(s), may be developed to describe each endpoint separately and in more detail. In the case of this Test Method, which tests or assessments are conducted is specified by the requirements and/or needs of each regulatory system. | 7. | There are numerous studies that might be performed to evaluate the TK behaviour of a test chemical for regulatory purposes. However, depending on particular regulatory needs or situations, not all of these possible studies may be necessary for the evaluation of a test chemical. Flexibility, taking into consideration the characteristics of the test chemical being investigated, is needed in the design of toxicokinetic studies. In some cases, only a certain set of questions may need to be explored in order to address test chemical-associated hazard and risk concerns. In some situations, TK data can be collected as part of the evaluation in other toxicology studies. For other situations, additional and/or more extensive TK studies may be necessary, depending on regulatory needs and/or if new questions arise as part of test chemical evaluation. | 8. | All available information on the test chemical and relevant metabolites and analogues should be considered by the testing laboratory prior to conducting the study in order to enhance study quality and avoid unnecessary animal use. This could include data from other relevant Test Methods (in vivo studies, in vitro studies, and/or in silico evaluations). Physicochemical properties, such as octanol-water partition coefficient (expressed as log POW), pKa, water solubility, vapour pressure, and molecular weight of a chemical may be useful for study planning and interpretation of results. They can be determined using appropriate methods as described in the relevant Test Methods. | LIMITATIONS | 9. | This Test Method is not designed to address special circumstances, such as the pregnant or lactating animal and offspring, or to evaluate potential residues in exposed food-producing animals. However, the data obtained from a B.36 study can provide background information to guide the design of specific studies for these investigations. This Test Method is not intended for the testing of nanomaterials. A report on preliminary review of OECD Test Guidelines for their applicability to nanomaterials indicates that TG 417 (equivalent to this Test Method B.36) may not apply to nanomaterials (1). | DEFINITIONS | 10. | Definitions used for the purpose of this Test Method are provided in Appendix. | ANIMAL WELFARE CONSIDERATIONS | 11. | Guidance on humane treatment of animals is available in OECD Guidance Document (GD) 19 (2). It is recommended that OECD GD 19 be consulted for all in vivo and in vitro studies described in this Test Method. | DESCRIPTION OF THE METHODS | Pilot Studies | 12. | The use of pilot studies is recommended and encouraged for the selection of experimental parameters for the toxicokinetics studies (e.g. metabolism, mass balance, analytical procedures, dose-finding, exhalation of CO2, etc.). Characterisation of some of these parameters may not necessitate the use of radiolabelled chemicals. | Animal Selection | Species | 13. | The animal species (and strain) used for TK testing should preferably be the same as that used in other toxicological studies performed with the test chemical of interest. Normally, the rat should be used as it has been used extensively for toxicological studies. The use of other or additional species may be warranted if critical toxicology studies demonstrate evidence of significant toxicity in these species or if their toxicity/toxicokinetics is shown to be more relevant to humans. Justification should be provided for the selection of the animal species and its strain. | 14. | Unless mentioned otherwise, this Test Method refers to the rat as the test species. Certain aspects of the method might have to be modified for the use of other test species. | Age and Strain | 15. | Young healthy adult animals (normally 6-12 weeks at the time of dosing) should be used (see also paragraphs 13 and 14). Justification should be provided for the use of animals that are not young adults. All animals should be of similar age at the outset of the study. The weight variation of individual animals should not exceed ± 20 % of the mean weight of the test group. Ideally, the strain used should be the same as that used in deriving the toxicological database for the test chemical. | Number and Sex of Animals | 16. | A minimum of four animals of one sex should be used for each dose tested. Justification should be provided for the sex of the animals used. The use of both sexes (four males and four females) should be considered if there is evidence to support significant sex-related differences in toxicity. | Housing and feeding conditions | 17. | Animals should generally be housed individually during the testing period. Group housing might be justified in special circumstances. Lighting should be artificial, the sequence being 12 h light/12 h dark. The temperature of the experimental animal room should be 22 °C (± 3 °C) and the relative humidity 30-70 %. For feeding, conventional laboratory diets may be used with an unlimited supply of drinking water. | Test Chemical | 18. | A radiolabelled test chemical using 14C should be used for all mass balance and metabolite identification aspects of the study; however, if it can be demonstrated that: | — | mass balance and metabolite identification can be adequately evaluated using the unlabelled test chemical, | — | the analytical specificity and sensitivity of the method used with non-radioactive test chemical is equal to or greater than that which could be obtained with the radiolabelled test chemical, | then a radiolabelled test chemical does not need to be used. Furthermore, other radioactive and stable isotopes may be used, particularly if the element is responsible for or is a part of the toxic portion of the test chemical. If possible, the radiolabel should be located in a core portion of the molecule which is metabolically stable (it is not exchangeable, is not removed metabolically as CO2, and does not become part of the one-carbon pool of the organism). Labelling of multiple sites or specific regions of the molecule may be necessary to follow the metabolic fate of the test chemical. | 19. | The radiolabelled and non-radiolabelled test chemicals should be analysed using appropriate methods to establish purity and identity. The radio-purity of the radioactive test chemical should be the highest attainable for a particular test chemical (ideally it should be greater than 95 %) and reasonable effort should be made to identify impurities present at or above 2 %. The purity, along with the identity and proportion of any impurities which have been identified, should be reported. Individual regulatory programmes may choose to provide additional guidance to assist in the definition and specifications of test chemicals composed of mixtures and methods for determination of purity. | Dose Selection | Pilot Study | 20. | Usually a single oral dose is sufficient for the pilot study. The dose should be non-toxic, but high enough to allow for metabolite identification in excreta (and plasma, if appropriate) as well as to meet the stated purpose of the pilot study as noted in paragraph 12 of this Test Method. | Main Studies | 21. | For the main studies, a minimum of two doses is preferred since information gathered from at least two dose groups may aid in dose setting in other toxicity studies, and help in the dose-response assessment of already available toxicity tests. | 22. | Where two doses are administered, both doses should be high enough to allow for metabolite identification in excreta (and plasma, if appropriate). Information from available toxicity data should be considered for dose selection. If information is not available (e.g. from acute oral toxicity studies recording clinical signs of toxicity, or from repeated dose toxicity studies) a value for the higher dose that is below the LD50 (oral and dermal routes) or LC50 (inhalation route) estimate or below the lower value of the acute toxicity range estimate may be considered. The lower dose should be some fraction of the higher dose. | 23. | If only one dose level is investigated, ideally the dose should be high enough to allow for metabolite identification in excreta (and plasma, if appropriate), while not producing apparent toxicity. A rationale should be provided as to why no second dose level has been included. | 24. | If the effect of dose on kinetic processes needs to be established, two doses may not be sufficient and at least one dose should be high enough so as to saturate these processes. If the area under the plasma concentration-time curve (AUC) is not linear between two dose levels used in the main study, this is a strong indication that saturation of one or more of the kinetic processes is occurring somewhere between the two dose levels. | 25. | For test chemicals of low toxicity, a maximum dose of 1 000 mg/kg body weight (oral and dermal routes) should be used (if administration is by the inhalation route, refer to Chapter B.2 of this Annex for guidance; typically this dose would not exceed 2 mg/l). Chemical-specific considerations may necessitate a higher dose depending on regulatory needs. Dose selection should always be justified. | 26. | Single dose toxicokinetic and tissue distribution data may be adequate to determine the potential for accumulation and/or persistence. However in some circumstances repeated dose administration may be needed (i) to address more fully the potential for accumulation and/or persistence or changes in TK (i.e. for instance, enzyme induction and inhibition), or (ii) as required by the applicable regulatory system. In studies involving repeated dosing, while repeated low dose administration is usually sufficient, under certain circumstances repeated high dose administration may also be necessary (see also paragraph 57). | Administration of Test Chemical | 27. | The test chemical should be dissolved or suspended homogeneously in the same vehicle employed for the other oral gavage toxicity studies performed with the test chemical, if such vehicle information is available. Rationale for the choice of vehicle should be provided. The choice of the vehicle and the volume of dosing should be considered in the design of the study. The customary method of administration is by gavage; however, administration by gelatine capsule or as a dietary mixture may be advantageous in specific situations (in both cases, justification should be given). Verification of the actual dose administered to each animal should be provided. | 28. | The maximum volume of liquid to be administered by oral gavage at one time depends on the size of the test animals, the type of dose vehicle, and whether or not feed is withheld prior to administration of the test chemical. The rationale for administering or restricting food prior to dosing should be provided. Normally the volume should be kept as low as practical for either aqueous or non-aqueous vehicles. Dose volumes should not normally exceed 10 ml/kg body weight for rodents. Volumes of vehicles used for more lipophilic test chemicals might start at 4 ml/kg body weight. For repeated dosing, when daily fasting would be contraindicated, lower dose volumes (e.g. 2-4 ml/kg body weight) should be considered. Where possible, consideration may be given to the use of a dose volume consistent with that administered in other oral gavage studies for a test chemical. | 29. | Intravenous (IV) administration of the test chemical and measurement of the test chemical in blood and/or excreta may be used to establish bioavailability or relative oral absorption. For the IV study, a single dose (usually equivalent to but not to exceed the lower oral dose – see dose selection) of test chemical is administered using an appropriate vehicle. This material should be administered in a suitable volume (e.g. 1 ml/kg bw) at the chosen site of administration to at least four animals of the appropriate sex (both sexes might be used, if warranted, see paragraph 16). A fully dissolved or suspended dose preparation is necessary for IV administration of the test chemical. The vehicle for IV administration should not interfere with blood integrity or blood flow. If the test chemical is infused, the infusion rate should be reported and standardised between animals, provided an infusion pump is used. Anaesthesia should be used if one cannulates the jugular vein (for administration of test chemical and/or collection of blood) or if one uses the femoral artery for administration. Due consideration should be given to the type of anaesthesia as it may have effects on toxicokinetics. Animals should be allowed to recover adequately before administration of the test chemical plus the vehicle. | 30. | Other routes of administration, such as dermal and inhalation, (see paragraphs 74-78) may be applicable for certain test chemicals, considering their physico-chemical properties and the expected human use or exposure. | Measurements | Mass Balance | 31. | Mass balance is determined by summation of the percent of the administered (radioactive) dose excreted in urine, faeces, and expired air, and the percent present in tissues, residual carcass, and cage wash (see paragraph 46). Generally, total recoveries of administered test chemical (radioactivity) in the order of > 90 % are considered to be adequate. | Absorption | 32. | An initial estimation of absorption can be achieved by excluding the percentage of dose in the gastro-intestinal (GI) tract and/or faeces from the mass balance determination. For the calculation of percent absorption, see paragraph 33. For investigation of excreta, see paragraphs 44-49. If the exact extent of absorption following oral dosing cannot be established from mass balance studies (e.g. where greater than 20 % of the administered dose is present in faeces), further investigations might be necessary. These studies could comprise either 1) oral administration of test chemical and measurement of test chemical in bile or 2) oral and IV administration of test chemical and measurement of net test chemical present in urine plus expired air plus carcass by each of the two routes. In either study design, measurement of radioactivity is conducted as a surrogate method for chemical-specific analysis of test chemical plus metabolites. | 33. | If a biliary excretion study is undertaken, the oral route of administration is typically used. In this study, the bile ducts of at least four animals of the appropriate sex (or of both sexes, if warranted) should be cannulated and a single dose of the test chemical should be administered. Following administration of the test chemical, excretion of radioactivity/test chemical in bile should be monitored as long as necessary to estimate the percentage of the administered dose that is excreted via this route, which can be used to directly calculate the extent of oral absorption, as follows: | 34. | With some classes of test chemical, direct secretion of the absorbed dose can occur across intestinal membranes. In such cases the measurement of % dose in faeces following an oral dose in the bile duct cannulated rat is not considered to be representative of the unabsorbed dose. It is recommended that where intestinal secretion is thought to occur then the % dose absorbed be based on the absorption calculated from a comparison of the excretion following the oral versus IV route (intact or bile duct cannulated rat) (see paragraph 35). It is also recommended that where quantification of the intestinal secretion is considered necessary, excretion in the bile duct cannulated rat following IV dose administration be measured. | Bioavailability | 35. | Bioavailability can be determined from plasma/blood kinetics of the oral and IV groups, as described in paragraphs 50-52, by specific chemical analysis of the test chemical and/or relevant metabolite(s), therefore not requiring radiolabelled test chemical. The calculation of bioavailability (F) of the test chemical or relevant metabolite(s) can then be made as follows: | where AUC is the area under the plasma concentration-time curve, and exp is the experimental route (oral, dermal or via inhalation). | 36. | For use in risk assessment of systemic effects, bioavailability of the toxic component is in general preferred over the percent absorption when comparing systemic concentrations from animal studies with analogous biomonitoring data from worker exposure studies. The situation may become more complex if doses are in the non-linear range so it is important that toxicokinetic screening determines doses in the linear range. | Tissue Distribution | 37. | Knowledge of tissue distribution of a test chemical and/or its metabolites is important for the identification of target tissues, and understanding of the underlying mechanisms of toxicity, and in order to get information on the potential for test chemical and metabolite accumulation and persistence. The percent of the total (radioactive) dose in tissues as well as residual carcass should at a minimum be measured at the termination of the excretion experiment (e.g. typically up to 7 days post dose or less depending on test chemical specific behaviour). When no test chemical is detected in tissues at study termination (e.g. because the test chemical might have been eliminated before study termination due to a short half-life), care should be taken in order to prevent misinterpretation of the data. In this type of situation, tissue distribution should be investigated at the time of test chemical (and/or metabolite) peak plasma/blood concentration (Tmax) or peak rate of urinary excretion, as appropriate (see paragraph 38). Furthermore, tissue collection at additional time points may be needed to determine tissue distribution of the test chemical and/or its metabolites, to evaluate time dependency (if appropriate), to aid in establishing mass balance, and/or as required by a competent authority. Tissues that should be collected include liver, fat, GI tract, kidney, spleen, whole blood, residual carcass, target organ tissues and any other tissues (e.g. thyroid, erythrocytes, reproductive organs, skin, eye (particularly in pigmented animals) of potential significance in the toxicological evaluation of the test chemical. Analysis of additional tissues at the same time points should be considered to maximise utilisation of animals and in the event that target organ toxicity is observed in sub-chronic or chronic toxicity studies. The (radioactive) residue concentration and tissue-to-plasma (blood) ratios should also be reported. | 38. | The evaluation of tissue distribution at additional time points such as the time of peak plasma/blood concentration (e.g. Tmax) or the peak rate of urinary excretion, obtained from the respective plasma/blood kinetic or excretion experiments, may also be needed or required by a competent authority. This information can be useful for understanding toxicity and the potential for test chemical and metabolite accumulation and persistence. Justification for sample selection should be provided; samples for analysis generally should be the same as those above (see paragraph 37). | 39. | Quantification of radioactivity for tissue distribution studies can be performed using organ dissection, homogenisation, combustion and/or solubilisation, followed by liquid scintillation counting (LSC) of trapped residues. Certain techniques, currently at various stages of development, e.g. Quantitative whole-body autoradiography and receptor microscopic autoradiography, may prove useful in determining the distribution of a test chemical in organs and/or tissues (3) (4). | 40. | For routes of exposure other than oral, specific tissues should be collected and analysed, such as lungs in inhalation studies and skin in dermal studies. See paragraphs 74-78. | Metabolism | 41. | Excreta (and plasma, if appropriate) should be collected for identification and quantitation of unchanged test chemical and metabolites as described under paragraphs 44-49. Pooling of excreta to facilitate metabolite identification within a given dose group is acceptable. Profiling of metabolites from each time period is recommended. However, if lack of sample and/or radioactivity precludes this, pooling of urine and faeces across several time points is acceptable but pooling across sexes or doses is not acceptable. Appropriate qualitative and quantitative methods should be used to assay urine, faeces, expired radioactivity from treated animals, and bile if appropriate. | 42. | Reasonable efforts should be made to identify all metabolites present at 5 % or greater of the administered dose and to provide a metabolic scheme for the test chemical. Test chemicals which have been characterised in excreta as comprising 5 % or greater of the administered dose should be identified. Identification refers to the exact structural determination of components. Typically, identification is accomplished either by co-chromatography of the metabolite with known standards using two dissimilar systems or by techniques capable of positive structural identification such as mass spectrometry, nuclear magnetic resonance (NMR), etc. In the case of co-chromatography, chromatographic techniques utilising the same stationary phase with two different solvent systems are not considered to be an adequate two-method verification of metabolite identity, since the methods are not independent. Identification by co-chromatography should be obtained using two dissimilar, analytically independent systems such as reverse and normal phase thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Provided that the chromatographic separation is of suitable quality, then additional confirmation by spectroscopic means is not necessary. Alternatively, unambiguous identification can also be obtained using methods providing structural information such as: liquid chromatography/mass spectrometry (LC-MS), or liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gas chromatography/mass spectrometry (GC-MS), and NMR spectrometry. | 43. | If identification of metabolites at 5 % or greater of the administered dose is not possible, a justification/explanation should be provided in the final report. It might be appropriate to identify metabolites representing less than 5 % of the administered dose to gain a better understanding of the metabolic pathway for hazard and/or risk assessment of the test chemical. Structural confirmation should be provided whenever possible. This may include profiling in plasma or blood or other tissues. | Excretion | 44. | The rate and extent of excretion of the administered dose should be determined by measuring the percent recovered (radioactive) dose from urine, faeces and expired air. These data will also assist in establishing mass balance. The quantities of test chemical (radioactivity) eliminated in the urine, faeces, and expired air should be determined at appropriate time intervals (see paragraphs 47-49). Repeated dose experiments should be properly designed to allow for collection of excretion data to meet the objectives described in the paragraph 26. This will allow for comparison to single dose experiments. | 45. | If a pilot study has shown that no significant amount of test chemical (radioactivity) (according to paragraph 49) is excreted in expired air, then expired air does not need to be collected in the definitive study. | 46. | Each animal is to be placed in a separate metabolic unit for collection of excreta (urine, faeces and expired air). At the end of each collection period (see paragraphs 47-49), the metabolic units should be rinsed with appropriate solvent (this is known as the “cage wash”) to ensure maximum recovery of the test chemical (radioactivity). Collection of excreta should be terminated at 7 days, or after at least 90 % of the administered dose has been recovered, whichever occurs first. | 47. | The total quantities of test chemical (radioactivity) in urine are to be determined for at least two time points on day 1 of collection, one of which should be at 24 h post dosing, and daily thereafter until study termination. The selection of more than two sampling points on day one (e.g. at 6, 12 and 24 h) is encouraged. The results of pilot studies should be analysed for information on alternate or additional time points for collection. A rationale should be provided for the collection schedules. | 48. | The total quantities of test chemical (radioactivity) in faeces should be determined on a daily basis beginning at 24 h post-dosing until study termination, unless pilot studies suggest alternate or additional time points for collection. A rationale should be provided for alternative collection schedules. | 49. | The collection of expired CO2 and other volatile materials may be discontinued in a given study experiment when less than 1 % of the administered dose is found in the exhaled air during a 24-h collection period. | Time Course Studies | Plasma/Blood Kinetics | 50. | The purpose of these studies is to obtain estimates of basic TK parameters [e.g. Cmax, Tmax, half-life (t1/2), AUC] for the test chemical. These studies may be conducted at one dose or, more likely, at two or more doses. Dose setting should be determined by the nature of the experiment and/or the issue being addressed. Kinetic data may be needed to resolve issues such as test chemical bioavailability and/or to clarify the effect of dose on clearance (e.g. to clarify whether clearance is saturated in a dose-dependent fashion). | 51. | For these studies a minimum of four animals of one sex per dose group should be used. Justification should be provided for the sex of the animals used. The use of both sexes (four males and four females) should be considered if there is evidence to support significant sex-related differences in toxicity. | 52. | Following administration of the test chemical (radiolabelled), blood samples should be obtained from each animal at suitable time points using appropriate sampling methodology. The volume and number of blood samples which can be obtained per animal might be limited by potential effects of repeated sampling on animal health/physiology and/or the sensitivity of the analytical method. Samples should be analysed for each individual animal. In some circumstances (e.g. metabolite characterisation), it might be necessary to pool samples from more than one animal. Pooled samples should be clearly identified and an explanation for pooling provided. If a radiolabelled test chemical is used, analysis of total radioactivity present might be adequate. If so, total radioactivity should be analyzed in whole blood and plasma or plasma and red blood cells to allow calculation of the blood/plasma ratio. In other circumstances, more specific investigations requiring the identification of parent compound and/or metabolites, or to assess protein binding might be necessary. | Other Tissue Kinetics | 53. | The purpose of these studies is to obtain time course information to address questions related to issues such as toxic mode of action, bioaccumulation and bio-persistence via determination of levels of test chemical in various tissues. The selection of tissues and the number of time points evaluated will depend on the issue to be addressed and the toxicological database for the test chemical. The design of these additional tissue kinetics studies should take into account information gathered as described in paragraphs 37-40. These studies might involve single or repeated dosing. A detailed rationale for the approach used should be provided. | 54. | Reasons for performing other tissue kinetic studies might include: | — | Evidence of extended blood half-life, suggesting possible accumulation of test chemical in various tissues, or | — | interest in seeing if a steady state level has been achieved in specific tissues (e.g. in repeated dosing studies, even though an apparent blood steady state level of test chemical may have been achieved, there may be interest in ascertaining that a steady state level has also been attained in target tissues). | 55. | For these types of time-course studies, an appropriate oral dose of test chemical should be administered to a minimum of four animals per dose per time point and the time course of distribution monitored in selected tissues. Only one sex may be used, unless gender specific toxicity is observed. Whether total radioactivity or parent chemical and/or metabolites are analysed will also depend on the issue being addressed. Assessment of tissue distribution should be made using appropriate techniques. | Enzyme Induction/Inhibition | 56. | Studies addressing the possible effects of enzyme induction/inhibition or biotransformation of test chemical under study may be needed under one or more of the following cases: | (1) | Available evidence indicates a relationship between biotransformation of test chemical and enhanced toxicity; | (2) | The available toxicity data indicate a non-linear relationship between dose and metabolism; | (3) | The results of metabolite identification studies show identification of a potentially toxic metabolite that might have been produced by an enzyme pathway induced by the test chemical; | (4) | In explaining effects which are postulated to be linked to enzyme induction phenomena; | (5) | If toxicologically significant alterations in the metabolic profile of the test chemical are observed through either in vitro or in vivo experiments with different species or conditions, characterisation of the enzyme(s) involved may be needed (e.g. Phase I enzymes such as isoenzymes of the Cytochrome P450-dependent mono-oxygenase system, Phase II enzymes such as isoenzymes of sulfotransferase or uridine diphosphate glucuronosyl transferase, or any other relevant enzymes). This information might be used to evaluate the pertinence of species to species extrapolations. | 57. | Appropriate study protocols to evaluate test chemical related changes in TK, suitably validated and justified should be used. Example study designs consist of repeated dosing with unlabelled test chemical, followed by a single radiolabelled dose on day 14, or repeated dosing with radiolabelled test chemical and sampling at days 1, 7 and 14 for determination of metabolite profiles. Repeated dosing with radiolabelled test chemical may also provide information on bioaccumulation (see paragraph 26). | SUPPLEMENTAL APPROACHES | 58. | Supplemental approaches beyond the in vivo experiments described in this Test Method may provide useful information on the absorption, distribution, metabolism or elimination of a test chemical in certain species. | Use of in vitro information | 59. | Several questions concerning the metabolism of the test chemical may be addressed in in vitro studies using appropriate test systems. Freshly isolated or cultured hepatocytes and subcellular fractions (e.g. microsomes and cytosol or S9 fraction) from liver may be used to study possible metabolites. Local metabolism in the target organ, e.g. lung, may be of interest for risk assessment. For these purposes, microsomal fractions of target tissues may be useful. Studies with microsomes may be useful to address potential gender and life-stage differences and characterise enzyme parameters (Km and Vmax) which can aid in the assessment of dose dependency of metabolism in relation to exposure levels. In addition microsomes may be useful to identify the specific microsomal enzymes involved in the metabolism of the test chemical which can be relevant in species extrapolation (see also paragraph 56). The potential for induction of biotransformation can also be examined by using liver subcellular fractions (e.g. microsomes and cytosol) of animals pre-treated with the test chemical of interest, in vitro via hepatocyte induction studies or from specific cell lines expressing relevant enzymes. In certain circumstances and under appropriate conditions, subcellular fractions coming from human tissues might be considered for use in determining potential species differences in biotransformation. The results from in vitro investigations may also have utility in the development of PBTK models (5). | 60. | In vitro dermal absorption studies may provide supplemental information to characterise absorption (6). | 61. | Primary cell cultures from liver cells and fresh tissue slices may be used to address similar questions as with liver microsomes. In certain cases, it may be possible to answer specific questions using cell lines with defined expression of the relevant enzyme or engineered cell lines. In certain cases, it may be useful to study the inhibition and induction of specific cytochrome P450 isozymes (e.g. CYP1A1, 2E1, 1A2, and others) and/or phase II enzymes by the parent compound using in vitro studies. Information obtained may have utility for similarly structured compounds. | Use of Toxicokinetic Data from Toxicity Studies as Complementary Information | 62. | Analysis of blood, tissue and/or excreta samples obtained during the conduct of any other toxicity studies can provide data on bioavailability, changes in plasma concentration in time (AUC, Cmax), bioaccumulation potential, clearance rates, and gender or life-stage changes in metabolism and kinetics. | 63. | Consideration of the study design can be used to answer questions relating to: saturation of absorption, biotransformation or excretion pathways at higher dose levels; the operation of new metabolic pathways at higher doses and the limitation of toxic metabolites to higher doses. | 64. | Other hazard assessment considerations could include issues such as: | — | Age-related sensitivity due to differences in the status of the blood-brain barrier, the kidney and/or detoxification capacities; | — | Sub-population sensitivity due to differences in biotransformation capacities or other TK differences; | — | Extent of exposure of the foetus by transplacental transfer of chemicals or of the newborn through lactation. | Use of Toxicokinetic Modelling | 65. | Toxicokinetic models may have utility for various aspects of hazard and risk assessment as for example in the prediction of systemic exposure and internal tissue dose. Furthermore specific questions on mode of action may be addressed, and these models can provide a basis for extrapolation across species, routes of exposure, dosing patterns, and for human risk assessment. Data useful for developing PBTK models for a test chemical in any given species include (1) partition coefficients, (2) biochemical constants and physiological parameters, (3) route-specific absorption parameters and 4) in vivo kinetic data for model evaluation [e.g. clearance parameters for relevant (> 10 %) excretion pathways, Km and Vmax for metabolism]. The experimental data used in model development should be generated with scientifically sound methods and the model results validated. Test chemical- and species-specific parameters such as absorption rates, blood-tissue partitioning and metabolic rate constants are often determined to facilitate development of non-compartmental or physiologically-based models (7). | DATA AND REPORTING | 66. | It is recommended that the study report include a table of contents. | Body of the Report | 67. | The body of the report should include information covered by this Test Method organised into sections and paragraphs as follows: | Summary | 68. | This section of the study report should include a summary of the study design and a description of methods used. It should also highlight the key findings regarding mass balance, the nature and magnitude of metabolites, tissue residue, rate of clearance, bioaccumulation potential, sex differences, etc. The summary should be presented in sufficient detail to permit evaluation of the findings. | Introduction | 69. | This section of the report should include the study objectives, rationale and design, as well as, appropriate references and any background history. | Materials and Methods | 70. | This section of the report should include detailed descriptions of all pertinent information including: | (a) | Test Chemical | This subsection should include identification of the test chemical: chemical name, molecular structure, qualitative and quantitative determination of its chemical composition, chemical purity and whenever possible, type and quantities of any impurities. It should also include information on physical/chemical properties including physical state, colour, gross solubility and/or partition coefficient, stability, and if appropriate, corrosivity. If applicable, information on isomers should be provided. If the test chemical is radiolabelled, information on the following should be included in this subsection: the type of radionuclide, position of label, specific activity, and radiochemical purity. | The type or description of any vehicle, diluents, suspending agents, and emulsifiers or other materials used in administering the test chemical should be stated. | (b) | Test Animals | This subsection should include information on the test animals, including selection and justification for species, strain, and age at study initiation, sex as well as body weight, health status, and animal husbandry. | (c) | Methods | This subsection should include details of the study design and methodology used. It should include a description of: | (1) | Justification for any modification of route of exposure and exposure conditions, if applicable; | (2) | Justification for selection of dose levels; | (3) | Description of pilot studies used in the experimental design of the follow-up studies, if applicable. Pilot study supporting data should be submitted; | (4) | How the dosing solution was prepared and the type of solvent or vehicle, if any, used; | (5) | Number of treatment groups and number of animals per group; | (6) | Dosage levels and volume (and specific activity of the dose when radioactivity is used); | (7) | Route(s) and methods of administration; | (8) | Frequency of dosing; | (9) | Fasting period (if used); | (10) | Total radioactivity per animal; | (11) | Animal handling; | (12) | Sample collection and handling; | (13) | Analytical methods used for separation, quantitation and identification of metabolites; | (14) | Limit of detection for the employed methods; | (15) | Other experimental measurements and procedures employed (including validation of methods for metabolite analysis). | (d) | Statistical Analysis | If statistical analysis is used to analyse the study findings, then sufficient information on the method of analysis and the computer program employed should be included, so that an independent reviewer/statistician can re-evaluate and reconstruct the analysis. | In the case of systems modelling studies such as PBTK, presentation of models should include a full description of the model to allow independent reconstruction and validation of the model (see paragraph 65 and Appendix: Definitions). | Results | 71. | All data should be summarised and tabulated with appropriate statistical evaluation and described in the text of this section. Radioactivity counting data should be summarised and presented as appropriate for the study, typically as microgram or milligram equivalents per mass of sample, although other units may be used. This section should include graphic illustrations of the findings, reproduction of representative chromatographic and spectrometric data, metabolite identification/quantification and proposed metabolic pathways including molecular structure of metabolites. In addition the following information is to be included in this section, if applicable: | (1) | Quantity and percent recovery of radioactivity in urine, faeces, expired air, and urine and faeces cage wash. | — | For dermal studies, also include data on test chemical recovery from treated skin, skin washes, and residual radioactivity in the skin covering apparatus and metabolic unit as well as results of the dermal washing study. For further discussion, see paragraphs 74-77. | — | For inhalation studies, also include data on recovery of test chemical from lungs and nasal tissues (8). For further discussion, see paragraph 78. | (2) | Tissue distribution reported as percent of administered dose and concentration (microgram equivalents per gram of tissue), and tissue-to-blood or tissue-to-plasma ratios; | (3) | Material balance developed from each study involving the assay of body tissues and excreta; | (4) | Plasma concentrations and toxicokinetic parameters (bioavailability, AUC, Cmax, Tmax, clearance, half-life) after administration by the relevant route(s) of exposure; | (5) | Rate and extent of absorption of the test chemical after administration by the relevant route(s) of exposure; | (6) | Quantities of the test chemical and metabolites (reported as percent of the administered dose) collected in excreta; | (7) | Reference to appendix data which contain individual animal data for all measurement endpoints (e.g. dose administration, percent recovery, concentrations, TK parameters, etc.); | (8) | A figure with the proposed metabolic pathways and the molecular structures of the metabolites. | Discussion and Conclusions | 72. | In this section the author(s) should: | (1) | Provide a proposed metabolic pathway based on the results of the metabolism and disposition of the test chemical; | (2) | Discuss any potential species and sex differences regarding the disposition and/or biotransformation of the test chemical; | (3) | Tabulate and discuss the identification and magnitude of metabolites, rates of clearance, bioaccumulation potential, and level of tissue residues of parent, and/or metabolite(s), as well as possible dose-dependent changes in TK parameters, as appropriate; | (4) | Integrate into this section any relevant TK data obtained in the course of conducting toxicity studies; | (5) | Provide a concise conclusion that can be supported by the findings of the study; | (6) | Add Sections (as needed or appropriate). | 73. | Additional sections should be used to include supporting bibliographic information, tables, figures, appendices, etc. | ALTERNATIVE ROUTES OF EXPOSURE | Dermal | Dermal Treatment | 74. | This section provides specific information on the investigation of the toxicokinetics of the test chemical by the dermal route. For dermal absorption, chapter B.44 of this Annex [Skin absorption: in vivo method (9)] should be consulted. For other endpoints such as distribution and metabolism, this Test Method B.36 can be used. One or more dose levels for the test chemical should be used in the dermal treatment. The test chemical (e.g. neat, diluted or formulated material containing the test chemical which is applied to the skin) should be the same (or a realistic surrogate) as that to which humans or other potential target species might be exposed. The dose level(s) should be selected in accordance with paragraphs 20-26 of this Test Method. Factors that could be taken into consideration in dermal dose selection include expected human exposure and/or doses at which toxicity was observed in other dermal toxicity studies. The dermal dose(s) should be dissolved, if necessary, in a suitable vehicle and applied in a volume adequate to deliver the doses. Shortly before testing, fur should be clipped from the dorsal area of the trunk of the test animals. Shaving may be employed, but it should be carried out approximately 24 h before the test. When clipping or shaving the fur, care should be taken to avoid abrading the skin, which could alter its permeability. Approximately 10 % of the body surface should be cleared for application of the test chemical. With highly toxic chemicals, the surface area covered may be less than approximately 10 %, but as much of the area as possible is to be covered with a thin and uniform film. The same treatment surface area should be used for all dermal test groups. The dosed areas are to be protected with a suitable covering which is secured in place. The animals should be housed separately. | 75. | A dermal washing study should be conducted to assess the amount of the applied dose of the test chemical that may be removed from the skin by washing the treated skin area with a mild soap and water. This study can also aid in establishing mass balance when the test chemical is administered by the dermal route. For this dermal washing study, a single dose of the test chemical should be applied to two animals. Dose level selection is in accordance with paragraph 23 of this Test Method (also see paragraph 76 for discussion of skin contact time). The amounts of test chemical recovered in the washes should be determined to assess the effectiveness of removal of the test chemical by the washing procedure. | 76. | Unless precluded by corrosiveness, the test chemical should be applied and kept on the skin for a minimum of 6 h. At the time of removal of the covering, the treated area should be washed following the procedure as outlined in the dermal washing study (see paragraph 75). Both covering and the washes should be analysed for residual test chemical. At the termination of the studies, each animal should be humanely killed in accordance with (2), and the treated skin removed. An appropriate section of treated skin should be analysed to determine residual test chemical (radioactivity). | 77. | For the toxicokinetic assessment of pharmaceuticals, different procedures, in accordance with the appropriate regulatory system, may be needed. | Inhalation | 78. | A single concentration (or more if needed) of test chemical should be used. The concentration(s) should be selected in accordance with paragraphs 20-26 of this Test Method. Inhalation treatments are to be conducted using a “nose-cone” or “head-only” apparatus to prevent absorption by alternate routes of exposure (8). If other inhalation exposure conditions are used, justification for the modification should be documented. The duration of exposure by inhalation should be defined; a typical exposure is 4-6 h. | LITERATURE: | (1) | OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris. | (2) | OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris. | (3) | Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81. | (4) | Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40. | (5) | Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411. | (6) | Chapter B.45 of this Annex, Skin Absorption: In Vitro Method. | (7) | IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-Based Pharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Chapter B.44 of this Annex, Skin Absorption: In Vivo Method. | (10) | Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (11) | Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York. | Appendix | DEFINITIONS | Absorption : Process(es) of uptake of chemicals into or across tissues. Absorption refers to parent compound and all its metabolites. Not to be confused with “bioavailability”. | Accumulation (Bioaccumulation): Increase of the amount of a test chemical over time within tissues (usually fatty tissues, following repeated exposure); if the input of a test chemical into the body is greater than the rate at which it is eliminated, the organism accumulates the test chemical and toxic concentrations of a test chemical might be achieved. | ADME : Acronym for “Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion”. | AUC : (Area under the plasma concentration-time curve): Area under the curve in a plot of concentration of test chemical in plasma over time. It represents the total amount of test chemical absorbed by the body within a predetermined period of time. Under linear conditions, the AUC (from time zero to infinity) is proportional to the total amount of a test chemical absorbed by the body, irrespective of the rate of absorption. | Autoradiography : (Whole-body autoradiography): Used to determine qualitatively and/or quantitatively the tissue localisation of a radioactive test chemical, this technique uses X-ray film or more recently digital phosphorimaging to visualize radioactively labelled molecules or fragments of molecules by recording the radiation emitted within the object under study. Quantitative whole-body autoradiography, compared to organ dissection, may have some advantages for the evaluation of test chemical distribution and the assessment of overall recovery and resolution of radioactive material in tissues. One significant advantage, for example, is it can be used in a pigmented animal model to assess possible association of the test chemical with melanin, which can bind certain molecules. However, while it may provide convenient whole body overviews of the high-capacity-low-affinity binding sites, this technique might be limited in recognising specific target sites such as receptor-binding sites where relatively high-resolution and high-sensitivity are needed for detection. When autoradiography is used, experiments intended to determine mass balance of administered compound should be conducted as a separate group or in a separate study from the tissue distribution experiment, where all excreta (which may also include expired air) and whole carcasses are homogenised and assayed by liquid scintillation counting. | Biliary excretion : Excretion via the bile ducts. | Bioaccumulation : See “Accumulation”. | Bioavailability : Fraction of an administered dose that reaches the systemic circulation or is made available at the site of physiological activity. Usually, bioavailability of a test chemical refers to the parent compound, but it could refer to its metabolite. It considers only one chemical form. Nota Bene: bioavailability and absorption are not the same. The difference between e.g. oral absorption (i.e. presence in gut wall and portal circulation) and bioavailability (i.e. presence in systemic blood and in tissues) can arise from chemical degradation due to gut wall metabolism or efflux transport back to the intestinal lumen or presystemic metabolism in the liver, among other factors (10). Bioavailability of the toxic component (parent compound or a metabolite) is a critical parameter in human risk assessment (high-to-low dose extrapolation, route-to-route extrapolation) for derivation of an internal value from the external NOAEL or BMD (applied dose). For liver effects upon oral administration, it is the oral absorption that suffices. However, for every effect other than at the portal of entry, it is the bioavailability that is in general a more reliable parameter for further use in risk assessment, not the absorption. | Biopersistence : See “Persistence”. | Biotransformation : (Usually enzymatic) chemical conversion of a test chemical of interest into a different chemical within the body. Synonymous with “metabolism”. | Cmax : Either maximal (peak) concentration in blood (plasma/serum) after administration or maximal (peak) excretion (in urine or faeces) after administration. | Clearance rate : Quantitative measure of the rate at which a test chemical is removed from the blood, plasma or a certain tissue per unit time. | Compartment : Structural or biochemical portion (or unit) of a body, tissue or cell, that is separate from the rest. | Detoxification pathways : Series of steps leading to the elimination of toxic chemicals from the body, either by metabolic change or excretion. | Distribution : Dispersal of a test chemical and its derivatives throughout an organism. | Enzymes/Isozymes : Proteins that catalyse chemical reactions. Isozymes are enzymes that catalyse similar chemical reactions but differ in their amino acid sequence. | Enzymatic Parameters : Km: Michaelis constant and Vmax: maximum velocity. | Excretion : Process(es) by which an administered test chemical and/or its metabolites are removed from the body. | Exogenously : Introduced from or produced outside the organism or system. | Extrapolation : Inference of one or more unknown values on the basis of that which is known or has been observed. | Half-life (t1/2) : The time taken for the concentration of the test chemical to decrease by one-half in a compartment. It typically refers to plasma concentration or the amount of the test chemical in the whole body. | Induction/Enzyme induction : Enzyme synthesis in response to an environmental stimulus or inducer molecule. | Linearity/linear kinetics : A process is linear in terms of kinetics when all transfer rates between compartments are proportional to the amounts or concentrations present, i.e. first order. Consequently, clearance and distribution volumes are constant, as well as half-lives. The concentrations achieved are proportional to the dosing rate (exposure), and accumulation is more easily predictable. Linearity/Non-linearity can be assessed by comparing the relevant parameters, e.g. AUC, after different doses or after single and repeated exposure. Lack of dose dependency may be indicative of saturation of enzymes involved in the metabolism of the compound, an increase of AUC after repeated exposure as compared to single exposure may be an indication for inhibition of metabolism and a decrease in AUC may be an indication for induction of metabolism [see also (11)]. | Mass balance : Accounting of test chemical entering and leaving the system. | Material balance : See “mass balance”. | Mechanism (Mode) of toxicity/Mechanism (Mode) of action : Mechanism of action refers to specific biochemical interactions through which a test chemical produces its effect. Mode of action refers to more general pathways leading to the toxicity of a test chemical. | Metabolism : Synonymous with “biotransformation”. | Metabolites : Products of metabolism or metabolic processes. | Oral Absorption : The percentage of the dose of test chemical absorbed from the site of administration (i.e. GI tract). This critical parameter can be used to understand the fraction of the administered test chemical that reaches the portal vein, and subsequently the liver. | Partition coefficient : Also known as the distribution coefficient, it is a measure of the differential solubility of a chemical in two solvents. | Peak blood (plasma/serum) levels : Maximal (peak) blood (plasma/serum) concentration after administration (see also “Cmax”). | Persistence (biopersistence) : Long-term presence of a chemical (in a biological system) due to resistance to degradation/elimination. | Read-across : The endpoint information for one or more chemicals is used to make a prediction of the endpoint for the target chemical. | Receptor Microscopic Autoradiography (or Receptor Microautoradiography): This technique may be used to probe xenobiotic interaction with specific tissue sites or cell populations as for instance in receptor binding or specific mode of action studies that may require high-resolution and high sensitivity which may not be feasible with other techniques such as whole-body autoradiography. | Route of administration (oral, IV, dermal, inhalation, etc.): Refers to the means by which chemicals are administered to the body (e.g. orally by gavage, orally by diet, dermal, by inhalation, intravenously, etc.). | Saturation : State whereby one or more of the kinetic (e.g. absorption, metabolism or clearance) process(es) are at a maximum (read “saturated”). | Sensitivity : Capability of a method or instrument to discriminate between measurement responses representing different levels of a variable of interest. | Steady-state blood (plasma) levels : Non-equilibrium state of an open system in which all forces acting on the system are exactly counter-balanced by opposing forces, in such a manner that all its components are stationary in concentration although matter is flowing through the system. | Systems Modelling (Physiologically-based Toxicokinetic, Pharmacokinetic-based, Physiologically-based Pharmacokinetic, Biologically-based, etc.): Abstract model that uses mathematical language to describe the behaviour of a system. | Target tissue : Tissue in which a principal adverse effect of a toxicant is manifested. | Test chemical : Any chemical or mixture tested using this Test Method. | Tissue distribution : Reversible movement of a test chemical from one location in the body to another. Tissue distribution can be studied by organ dissection, homogenisation, combustion and liquid scintillation counting or by qualitative and/or quantitative whole body autoradiography. The former is useful to obtain concentration and percent of recovery from tissues and remaining carcass of the same animals, but may lack resolution for all tissues and may have less than ideal overall recovery (< 90 %). See definition for the latter above. | Tmax : Time to reach Cmax. | Toxicokinetics (Pharmacokinetics): Study of the absorption, distribution, metabolism, and excretion of chemicals over time. | Validation of models : Process of assessing the adequacy of a model to consistently describe the available toxicokinetic data. Models may be evaluated via statistical and visual comparison of model predictions with experimental values against a common independent variable (e.g. time). The extent of evaluation should be justified in relation to the intended use of the model. | ’ |
| 8. | doda se poglavje B.52: | „B.52 AKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU – METODA RAZREDOV AKUTNE STRUPENOSTI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 436 (2009). Prvotna TG 403 v zvezi z akutno strupenostjo pri vdihavanju je bila sprejeta leta 1981 in je bila odtlej revidirana (glej poglavje B.2 te priloge (1)). Priprava metode razredov akutne strupenosti (ATC) pri vdihavanju (2) (3) (4) je bila ocenjena kot ustrezna po sprejetju revidirane oralne metode ATC (poglavje B.1 tris te priloge) (5). Retrospektivna ocena učinkovitosti preskusne metode ATC za akutno strupenost pri vdihavanju je pokazala, da je primerna za namene razvrščanja in označevanja (6). Preskusna metoda ATC pri vdihavanju bo omogočila uporabo zaporednih faz točno določenih ciljnih koncentracij za zagotovitev razvrstitve strupenosti preskusne kemikalije. Kot ključna končna točka se uporablja smrtnost, vendar je treba živali, ki doživljajo hude bolečine ali muke oziroma ki trpijo ali katerih smrt je neizbežna, humano usmrtiti, da se njihovo trpljenje čim bolj zmanjša. Napotki o humanih končnih točkah so na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 (7). | 2. | Napotki glede izvedbe in razlage te preskusne metode so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 39 za preskušanje akutne strupenosti pri vdihavanju (GD 39) (8). | 3. | Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni v Dodatku 1 in v GD 39 (8). | 4. | S to preskusno metodo se pridobivajo informacije o nevarnih lastnostih in omogoča razvrstitev preskusne kemikalije v skladu z Uredbo (ES) št. 1272/2008 za razvrščanje kemikalij, ki povzročajo akutno strupenost (9). Če so potrebne ocenjene vrednosti LC50 ali analize odziva na koncentracijo, je primerno uporabiti preskusno metodo iz poglavja B.2 te priloge (1). Več napotkov o izbiri preskusne metode je na voljo v GD 39 (8). Ta preskusna metoda ni posebej namenjena preskušanju posebnih materialov, kot so slabo topni izometrični ali vlaknati materiali ali proizvedeni nanomateriali. | ZAČETNI PREUDARKI | 5. | Da se uporaba živali kar najbolj zmanjša, mora preskuševalni laboratorij pred razmislekom o preskušanju v skladu s to preskusno metodo preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, vključno z obstoječimi študijami, katerih podatki bi omogočili izognitev dodatnemu preskušanju. Informacije, ki lahko pomagajo pri izbiri najprimernejše vrste, seva, spola, načina izpostavljenosti in ustreznih preskusnih koncentracij, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah. S to preskusno metodo se ne smejo preskušati koncentracije, za katere se pričakuje, da bodo zaradi jedkega (11) ali izrazito dražilnega delovanja povzročile hude bolečine in trpljenje (glej GD 39 (8)). | NAČELO PRESKUSA | 6. | Preskus temelji na načelu, da se s postopnim postopkom med 4-urno izpostavljenostjo pridobi dovolj informacij o akutni strupenosti pri vdihavanju preskusne kemikalije, da je mogoče to kemikalijo razvrstiti. Za izpolnitev posebnih zakonodajnih namenov se lahko uporabijo tudi druga obdobja izpostavljenosti. V vseh točno določenih fazah koncentracij se preskusijo po 3 živali vsakega spola. Glede na smrtnost in/ali umirajoče stanje živali lahko za presojo akutne strupenosti preskusne kemikalije zadoščata 2 fazi. Če se zagotovijo dokazi, da je en spol občutljivejši od drugega, se lahko preskus nadaljuje samo z občutljivejšim spolom. Od rezultata predhodne faze je odvisna naslednja faza, na primer: | (a) | nadaljnje preskušanje ni potrebno; | (b) | preskušanje s tremi živalmi na spol ali | (c) | preskušanje s 6 živalmi izključno občutljivejšega spola, tj. morajo ocene spodnje meje razreda strupenosti temeljiti na 6 živalih na skupino za preskusno koncentracijo, ne glede na spol. | 7. | Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo bolečine ali kažejo znake hudega in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti ter jih pri razlagi rezultatov preskusa upoštevati enako kot živali, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami št. 19 o humanih končnih točkah (7). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 8. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih vrst pa je treba utemeljiti. | Priprava živali | 9. | Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan izpostavljenosti morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 8 do 12 tednov, njihova teža pa ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže za vsak spol vseh predhodno izpostavljenih živali pri isti starosti. Živali se naključno izberejo in označijo za posamično prepoznavanje. Pred začetkom preskusa so najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. Poleg tega jih je treba pred preskušanjem krajše obdobje privajati na preskusno aparaturo, saj se tako zmanjša stres, ki ga povzroči uvedba v novo okolje. | Oskrba živali | 10. | Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogoče, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posamično, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja običajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena količina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe/12 ur teme. | Inhalacijske komore | 11. | Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemikalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot način izpostavljenosti uporabi izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smrčka). Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije tekočih ali trdnih aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogoče je, da bo posebne cilje študije lažje doseči z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpostavljenost celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune posamezne prednosti in pomanjkljivosti so opisani v GD 39 (8). | POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI | Dajanje koncentracij | 12. | Priporoča se, da se določi štiriurna izpostavljenost, pri čemer ta čas ne vključuje časa za vzpostavljanje ravnotežja. Za izpolnitev posebnih zahtev je lahko potrebno drugačno obdobje, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji (glej GD 39 (8)). Živali, ki so izpostavljene v komorah za izpostavljanje celega telesa, morajo biti nastanjene posamično, da se prepreči zaužitje preskusne kemikalije ob medsebojnem čiščenju primerkov v kletki. V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko ves čas uživajo vodo. | 13. | Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetneje prisotna med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemično reaktivne preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozračju. Paziti je treba, da se ne ustvarijo eksplozivne koncentracije. | Porazdelitev velikosti delcev | 14. | Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba določiti velikost delcev. Da se omogoči izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, so priporočeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) znaša 1–4 μm z geometričnim standardnim odklonom (σg) 1,5–3,0 (8) (13) (14). Prizadevanje za izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogoče izpolniti, je treba zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci, vlakna in higroskopne snovi (katerih velikost se v vlažnem okolju dihal poveča) pa lahko presegajo navedene vrednosti. | Priprava preskusne kemikalije v nosilcu | 15. | Za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije v atmosferi se lahko uporabi nosilec. Praviloma je treba prednostno uporabiti vodo. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko uporabijo mehanski postopki, da se doseže zahtevana porazdelitev velikosti delcev, vendar je treba paziti, da preskusna kemikalija ne razpade ali se spremeni. Kadar se zdi, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije (npr. ob zelo visoki temperaturi, nastali zaradi trenja pri pretiranem mletju), je treba sestavo te preskusne kemikalije analitsko preveriti. Skrbno je treba paziti, da se preskusna kemikalija ne onesnaži. Nekrušljivih granulatov, ki so namenoma formulirani tako, da jih ni mogoče vdihniti, ni treba preskušati. Uporabiti je treba preskus drobljivosti, da se dokaže, da pri ravnanju z granulatom ne nastajajo delci, ki jih je mogoče vdihniti. Če v preskusu drobljivosti nastanejo snovi, ki jih je mogoče vdihniti, je treba opraviti preskus strupenosti pri vdihavanju. | Kontrolne živali | 16. | Sočasna negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna. Kadar se v pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporablja nevodni nosilec, je treba kontrolno skupino z nosilcem uporabiti samo, če niso na voljo pretekli podatki o strupenosti pri vdihavanju. Če študija strupenosti preskusne kemikalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec pri preskušeni koncentraciji ni strupen; kontrola z nosilcem torej ni potrebna. | SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI | Pretok zraka v komori | 17. | Pretok zraka skozi komoro je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Spremljanje koncentracije (ali stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je neločljivo povezana z vsemi dinamičnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri ustvarjanja atmosfere. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja v primerih, v katerih pretok zraka skozi sistem izpostavljanja ni zadosten za zagotovitev dinamičnega toka atmosfere s preskusno kemikalijo. Za dokazovanje, da v izbranih pogojih postopka ne prihaja do ponovnega vdihavanja, so na voljo predpisane metodologije (8) (15). Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstajajo razlogi za mnenje, da teh standardov ni mogoče izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. | Temperatura in relativna vlažnost v komori | 18. | Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti celega telesa spremljati ter jo zabeležiti najmanj trikrat, če izpostavljenost traja do 4 ure, medtem ko se pri krajših časih izpostavljenosti ta meritev zabeleži vsako uro. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi neizmerljivo zaradi interference preskusne kemikalije s preskusno metodo. | Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija | 19. | Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izračunati in zabeležiti nazivno koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pač pa pri primerjavi z dejansko koncentracijo pokaže, kako učinkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri tem ustvarjanju. | Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija | 20. | Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije v območju dihanja živali v inhalacijski komori. Meri se s specifičnimi metodami (npr. z neposrednim vzorčenjem, adsorpcijskimi ali kemičnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifičnimi metodami, kot je gravimetrična analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetrične analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole tekočin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifičnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetrično analizo se lahko določi tudi koncentracija večkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. V poročilu o študiji je treba navesti ciljne, nazivne in dejanske koncentracije, vendar se v statističnih analizah za izračun vrednosti smrtnih koncentracij uporabljajo samo dejanske koncentracije. | 21. | Po možnosti je treba uporabiti eno serijo preskusne kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred začetkom študije je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vključno z njeno čistostjo ter, če je to tehnično izvedljivo, identiteto in količinami ugotovljenih kontaminantov in nečistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj deloma potrdi naročnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). | 22. | Atmosfera v komori za izpostavljanje naj bo konstantna, kolikor je to izvedljivo, ter naj se glede na analitsko metodo spremlja stalno in/ali v rednih intervalih. Kadar se uporablja vzorčenje v intervalih, je treba v štiriurni študiji vzorce atmosfere v komori vzeti najmanj dvakrat. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, se lahko v celotnem obdobju izpostavljenosti vzame en vzorec. Če se med posameznimi vzorci pojavijo izrazita nihanja, je treba pri preskušanju naslednjih koncentracij uporabiti štiri vzorce na izpostavljenost. Posamezni vzorci koncentracije v komori od srednje koncentracije ne smejo odstopati za več kot ± 10 % za pline in hlape oziroma za več kot ± 20 % za tekoče ali trdne aerosole. Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori (t95). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije, pri tem pa je upoštevan čas, potreben za dosego t95. Napotki za ocenjevanje t95 so na voljo v GD 39 (8). | 23. | Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz hlapov/plinov in aerosolov (npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša drugače, zato je treba za vsako fazo (hlape/plin in aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), ki je navadno glavna aktivna snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno snov ali sestavino (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (8). | Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev | 24. | Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba med vsako 4-urno izpostavljenostjo določiti vsaj dvakrat s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instrumentom, kot je aerodinamični merilnik delcev. Če je mogoče prikazati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetrični filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (8)). Če je enakovrednost mogoče prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, da se čim bolj zmanjša količina pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba izpostavljanje ponoviti. Za hlape je treba velikost delcev določiti, če obstaja možnost, da se bodo hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogoče mešane faze, zaznajo delci (glej odstavek 14). | POSTOPEK | Glavni preskus | 25. | V vsaki fazi se uporabijo tri živali na spol ali šest živali občutljivejšega spola. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Koncentracija, ki bo uporabljena kot začetni odmerek, se izbere med štirimi točno določenimi koncentracijami, začetna koncentracija pa mora biti tista, ki bo najverjetneje povzročila zastrupitev pri nekaterih od živali, ki bodo prejele odmerek. Sheme preskušanja za pline, hlape in aerosole (vključene v dodatke 2–4) ponazarjajo preskušanje z mejnimi vrednostmi kategorij 1–4 iz Uredbe (ES) št. 1272/2008 (9) za pline (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (Dodatek 2), hlape (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (Dodatek 3) in aerosole (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (Dodatek 4). Kategorija 5, ki se v navedeni uredbi ne izvaja, se nanaša na koncentracije nad zadevnimi mejnimi koncentracijami. Za vsako začetno koncentracijo se uporablja zadevna shema preskušanja. Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku sledi prikazanim puščicam, dokler ni mogoča razvrstitev v kategorijo. | 26. | Časovni interval med skupinami za izpostavljanje je določen glede na nastop, trajanje in resnost strupenih znakov. Z izpostavljanjem živali naslednji stopnji koncentracije je treba počakati, dokler ni mogoče z razumno gotovostjo sklepati o preživetju predhodno preskušenih živali. Med izpostavljanji naslednji stopnji koncentracije je priporočljivo počakati tri ali štiri dni, da se omogoči opazovanje zapoznele strupenosti. Časovni interval se lahko ustrezno prilagodi, npr. pri neopredeljivih odzivih. | Mejni preskus | 27. | Mejni preskus se uporabi, kadar je znano ali se pričakuje, da je preskusna kemikalija praktično nestrupena, tj. da povzroči toksično reakcijo samo nad zakonsko predpisano mejno koncentracijo. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije se lahko pridobijo na podlagi znanja o podobnih preskušenih snoveh ali podobnih zmeseh ob upoštevanju identitete in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko pomembne. Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih ni ali kadar se pričakuje, da je strupena, je treba opraviti glavni preskus (več napotkov je na voljo v GD 39 (8)). | 28. | Z običajnim postopkom se tri živali na spol ali šest živali občutljivejšega spola izpostavi koncentraciji 20 000 ppm za pline, 20 mg/l za hlape oziroma 5 mg/l za prah/meglice (če so te koncentracije dosegljive), kar se uporabi kot mejni preskus za to preskusno metodo. Pri preskušanju aerosolov mora biti glavni cilj ustvariti delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (tj. MMAD 1–4 μm). To je mogoče z večino preskusnih kemikalij pri koncentraciji 2 mg/l. Preskušanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (glej GD 39 (8)). V skladu z globalno usklajenim sistemom za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS) (16) se zaradi dobrobiti živali preskušanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Preskušanje v kategoriji 5 v skladu z GHS (16), ki se v Uredbi (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja, se sme predvideti samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo rezultati takega preskusa neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi, poleg tega pa je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. V primeru potencialno eksplozivnih preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je treba pred mejnim preskusom opraviti preskus brez živali in tako zagotoviti, da je v komori mogoče doseči pogoje za mejni preskus. | OPAZOVANJA | 29. | Med obdobjem izpostavljenosti je treba živali pogosto klinično opazovati. Po izpostavljenosti je treba klinična opazovanja izvajati skupno 14 dni, in sicer na dan izpostavljenosti najmanj dvakrat ali pogosteje, če to nakazuje odziv živali na tretiranje, nato pa najmanj enkrat na dan. Dolžina obdobja opazovanja ni točno določena, pač pa jo je treba določiti glede na naravo in čas nastopa kliničnih znakov ter dolžino obdobja okrevanja. Časi pojava in izginotja pokazateljev strupenosti so pomembni, zlasti če se ti znaki nagibajo k zapoznelosti. Vsa opažanja se sistematično zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za vsako žival posebej. Umirajoče živali ter živali, ki kažejo znake hude bolečine in/ali trajnega in hudega trpljenja, je treba zaradi njihove dobrobiti humano usmrtiti. Pri pregledih za kliničnimi pokazatelji strupenosti je treba paziti, da se začetni slab videz in prehodne spremembe v dihanju, ki so posledica postopka izpostavljanja, ne zamenjajo za učinke, povezane s tretiranjem. Upoštevati je treba načela in merila, povzeta v Dokumentu s smernicami o humanih končnih točkah (7). Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti zabeležiti čim natančneje. | 30. | Opazovanja v kletkah morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, v dihalih, obtočilih, avtonomnem in osrednjem živčevju ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Kadar je to mogoče, je treba zabeležiti vsa razlikovanja med lokalnimi in sistemskimi učinki. Pozorno je treba opazovati tremorje, krče, slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. | Telesna teža | 31. | Težo posameznih živali je treba zabeležiti enkrat v obdobju prilagajanja na okolje, na dan izpostavljenosti pred izpostavljenostjo (dan 0) ter vsaj 1., 3. in 7. dan (nato pa tedensko), poleg tega pa še ob poginu ali evtanaziji, če ta nastopi po 1. dnevu. Telesna teža se priznava kot bistveni kazalnik strupenosti, tako da je treba živali, pri katerih se v primerjavi z vrednostmi pred študijo opazi trajen upad za ≥ 20 %, skrbno spremljati. Preživele živali se ob koncu obdobja po izpostavljenosti stehtajo in humano usmrtijo. | Patologija | 32. | Na vseh preskusnih živalih, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so evtanazirane in odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba opraviti makroskopsko obdukcijo. Če je ni mogoče opraviti takoj po odkritju poginule živali, je treba žival ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza čim bolj zmanjša. Obdukcijo je treba opraviti čim prej, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. | 33. | Za razširitev razlagalne vrednosti študije se lahko razmisli o dodatnih samoumevno vključenih pregledih, kot sta tehtanje pljuč preživelih podgan in/ali zagotavljanje dokazov o dražilnosti z mikroskopskim pregledom dihal. Med pregledanimi organi so lahko tudi tisti, ki kažejo makroskopske patološke znake pri živalih, ki so preživele 24 ur ali več, in organi, za katere je znano ali se pričakuje, da so prizadeti. Mikroskopski pregled celotnih dihal lahko zagotovi koristne informacije za preskusne kemikalije, ki reagirajo z vodo, kot so kisline in higroskopne preskusne kemikalije. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 34. | Zagotoviti je treba podatke o telesni teži in ugotovitvah obdukcije posameznih živali. Podatke o kliničnih opazovanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifične znake zastrupitve, število živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije. | Poročilo o preskusu | 35. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno: | | Preskusne živali in oskrba | — | opis pogojev v kletkah, vključno s številom (ali spremembo števila) živali na kletko, nastiljem, temperaturo prostora in relativno vlažnostjo, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana, | — | število, starost in spol živali, | — | metodo randomizacije, | — | podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom hrane in virom vode), | — | opis morebitne priprave živali pred preskusom, vključno s hrano, karanteno in zdravljenjem. | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo), | — | identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), če je znana. | | Nosilec | — | utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda), | — | pretekle ali tekoče podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na rezultat študije. | | Inhalacijska komora | — | opis inhalacijske komore, vključno z merami in prostornino, | — | izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje atmosfere, | — | opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske koncentracije, | — | vir zraka, obdelavo dovajanega/odvajanega zraka in sistem za klimatiziranje, | — | metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene preskusne atmosfere, | — | razliko v tlaku (pozitivna ali negativna), | — | izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v sistemu (izpostavljanje celega telesa), | — | časovno homogenost/stabilnost preskusne atmosfere, | — | položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzorčenja preskusne atmosfere v komori, | — | stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino (izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega telesa), | — | informacije o opremi, uporabljeni za merjenje kisika in ogljikovega dioksida, če je ustrezno, | — | čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t95), | — | število zamenjav volumnov zraka na uro, | — | merilne naprave (če je ustrezno). | | Podatki o izpostavljenosti | — | utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, | — | nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), | — | dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v območju dihanja živali; za preskusne zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira ločeno, | — | vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (npr. mg/l, mg/m3 itd.); v oklepajih se lahko navedejo tudi prostorninske enote (npr. ppm, ppb), | — | porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) in geometrični standardni odklon (σg), vključno z metodami za njihov izračun. Poročati je treba o posameznih analizah velikosti delcev. | | Preskusni pogoji | — | podatke o pripravi preskusne kemikalije, vključno s podrobnostmi o postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije. Kadar obstaja možnost, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije, je treba vključiti rezultate analiz za preverjanje sestave te preskusne kemikalije, | — | opis (ki po možnosti vključuje diagram) opreme, uporabljene za ustvarjanje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, | — | podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji (vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzorčenje), | — | utemeljitev določitve preskusnih koncentracij. | | Rezultati | — | preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, | — | preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah, | — | preglednice s podatki o velikosti delcev, vključno s podatki o analitskem vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izračuni MMAD in σg, | — | preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za živali, ki kažejo znake strupenosti, vključno s smrtnostjo ter naravo, resnostjo in trajanjem učinkov), | — | telesne teže posameznih živali, izmerjene med študijo, datum in čas smrti, če je ta nastopila pred predvideno evtanazijo; časovni potek nastopa znakov zastrupitve in ali so bili ti reverzibilni za vsako žival, | — | izsledke obdukcije in histopatološke preiskave za vsako žival, če so na voljo, | — | razvrstitev kategorij po Uredbi (ES) št. 1272/2008 in mejno vrednost LC50. | | Razprava in razlaga rezultatov | — | poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpolnitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, | — | z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogoče izpolniti, | — | v splošno oceno študije je treba vključiti doslednost metod, uporabljenih za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, | — | obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujoči način delovanja (sistemski ali lokalni), | — | če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o humanih končnih točkah (7) humano žrtvovati živali, ki so trpele bolečine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti. | VIRI: | (1) | Poglavje B.2 te priloge, Akutna strupenost pri vdihavanju. | (2) | Holzhütter, H.-G., Genschow, E., Diener, W., in Schlede, E. (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243–254. | (3) | Diener, W., Kayser, D., in Schlede, E. (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537–549. | (4) | Diener, W., in Schlede, E. (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129–134. | (5) | Poglavje B.1 tris te priloge, Akutna oralna toksičnost – metoda razredov akutne toksičnosti. | (6) | OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (7) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (9) | Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spremembi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). | (10) | Poglavje B.40 te priloge, Jedkost za kožo in vitro: preskus transkutane električne upornosti (TER). | (11) | Poglavje B.40 bis te priloge, Jedkost za kožo in vitro: preskus z modelom človeške kože. | (12) | OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (13) | Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2. izdaja) Informa Healthcare, New York. | (14) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327. | (15) | Pauluhn, J., in Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167. | (16) | OZN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, OZN New York in Ženeva. Na voljo na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki začetni koncentraciji za pline (ppM/4 H) | Splošne opombe (12) | Za vsako začetno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vključenih v ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. | Dodatek 2a: začetna koncentracija je 100 ppm | Dodatek 2b: začetna koncentracija je 500 ppm | Dodatek 2c: začetna koncentracija je 2 500 ppm | Dodatek 2d: začetna koncentracija je 20 000 ppm | Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku sledi prikazanim puščicam. | Dodatek 2a | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 100 ppm/4 h za pline | Dodatek 2b | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 500 ppm/4 h za pline | Dodatek 2c | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 2 500 ppm/4 h za pline | Dodatek 2d | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 20 000 ppm/4 h za pline | Dodatek 3 | Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki začetni koncentraciji za hlape (mg/L/4 H) | Splošne opombe (13) | Za vsako začetno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vključenih v ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. | Dodatek 3a: začetna koncentracija je 0,5 mg/l | Dodatek 3b: začetna koncentracija je 2,0 mg/l | Dodatek 3c: začetna koncentracija je 10 mg/l | Dodatek 3d: začetna koncentracija je 20 mg/l | Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku sledi prikazanim puščicam. | Dodatek 3a | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 0,5 mg/L/4 h za hlape | Dodatek 3b | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 2 mg/L/4 h za hlape | Dodatek 3c | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentraci jo 10 mg/L/4 h za hlape | Dodatek 3d | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 20 mg/L/4 h za hlape | Dodatek 4 | Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki začetni koncentraciji za aerosole (mg/L/4 H) | Splošne opombe (14) | Za vsako začetno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vključenih v ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. | Dodatek 4a: začetna koncentracija je 0,05 mg/l | Dodatek 4b: začetna koncentracija je 0,5 mg/l | Dodatek 4c: začetna koncentracija je 1 mg/l | Dodatek 4d: začetna koncentracija je 5 mg/l | Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku sledi prikazanim puščicam. | Dodatek 4a | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentraci jo 0,05 mg/L/4 h za aerosole | Dodatek 4b | Akutna strupenost privdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 0,5 mg/L/4 h za aerosole | Dodatek 4c | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 1 mg/L/4 h za aerosole | Dodatek 4d | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 5 mg/L/4 h za aerosole | “ | (8) | Chapter B.52 is added: | ‘B.52. ACUTE INHALATION TOXICITY — ACUTE TOXIC CLASS METHOD | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 436 (2009). The first acute inhalation TG 403 was adopted in 1981, and has since been revised (see chapter B.2 of this Annex (1)). Development of an Inhalation Acute Toxic Class (ATC) method (2) (3) (4) was considered appropriate following the adoption of the revised oral ATC method (chapter B.1 tris of this Annex) (5). A retrospective performance assessment of the ATC test method for acute inhalation toxicity showed that the method is suitable for being used for Classification and Labelling purposes (6). The inhalation ATC Test Method will allow the use of serial steps of fixed target concentrations to provide a ranking of test chemical toxicity. Lethality is used as key endpoint, however, animals in severe pain or distress, suffering or impending death should be humanely killed to minimise suffering. Guidance on humane endpoints is available in the OECD Guidance Document No 19 (7). | 2. | Guidance on the conduct and interpretation of this Test Method can be found in the Guidance Document No 39 on Acute Inhalation Toxicity Testing (GD 39) (8). | 3. | Definitions used in the context of this Test Method are provided in Appendix 1 and in GD 39 (8). | 4. | The Test Method provides information on the hazardous properties and allows the test chemical to be ranked and classified according to the Regulation (EC) No 1272/2008 for the classification of chemicals that cause acute toxicity (9). In case point estimates of LC50-values or concentration-response analyses are required, chapter B.2 of this Annex (1) is the appropriate Test Method to use. Further guidance on Test Method selection can be found in GD 39 (8). This Test Method is not specially intended for the testing of specialized materials, such as poorly soluble isometric or fibrous materials or manufactured nanomaterials. | INITIAL CONSIDERATIONS | 5. | Before considering testing in accordance with this Test Method, all available information on the test chemical, including existing studies whose data would support not doing additional testing should be considered by the testing laboratory in order to minimize animal usage. Information that may assist in the selection of the most appropriate species, strain, sex, mode of exposure and appropriate test concentrations include the identity, chemical structure, and physico-chemical properties of the test chemical; results of any in vitro or in vivo toxicity tests; anticipated use(s) and potential for human exposure; available (Q)SAR data and toxicological data on structurally related chemicals. Concentrations that are expected to cause severe pain and distress, due to corrosive (4) or severely irritant actions, should not be tested with this Test Method [see GD 39 (8)]. | PRINCIPLE OF THE TEST | 6. | It is the principle of the test that based on a stepwise procedure, sufficient information is obtained on the acute inhalation toxicity of the test chemical during an exposure period of 4 hours to enable its classification. Other durations of exposure may apply to serve specific regulatory purposes. At any of the defined concentration steps, 3 animals of each sex are tested. Depending on the mortality and/or the moribund status of the animals, 2 steps may be sufficient to allow judgement on the acute toxicity of the test chemical. If evidence is provided that one sex is more susceptible than the other, then the test may be continued with the more susceptible sex only. The outcome of the previous step will determine the following step such that: | a) | No further testing is needed, | b) | Testing of three animals per sex, or | c) | Testing with 6 animals of the more susceptible sex only i.e. the lower boundary estimates of the toxic class should be based on 6 animals per test concentration group, regardless of sex. | 7. | Moribund animals or animals obviously in pain or showing signs of severe and enduring distress should be humanely killed, and are considered in the interpretation of the test results in the same way as animals that died on test. Criteria for making the decision to kill moribund or severely suffering animals, and guidance on the recognition of predictable or impending death, are the subject of Guidance Document No 19 on Humane Endpoints (7). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Selection of animal species | 8. | Healthy young adult animals of commonly used laboratory strains should be used. The preferred species is the rat and justifications should be provided if other species are used. | Preparation of animals | 9. | Females should be nulliparous and non-pregnant. On the exposure day, animals should be young adults 8 to 12 weeks of age, and body weights should be within ± 20 % of the mean weight for each sex of any previously exposed animals at the same age. The animals are randomly selected, marked for individual identification. The animals are kept in their cages for at least 5 days prior to the start of the test to allow for acclimatisation to laboratory conditions. Animals should also be acclimatised to the test apparatus for a short period prior to testing, as this will lessen the stress caused by introduction to the new environment. | Animal husbandry | 10. | The temperature of the experimental animal maintenance room should be 22 ± 3 °C. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, though this may not be possible when using water as a vehicle. Before and after exposures, animals generally should be caged in groups by sex and concentration, but the number of animals per cage should not interfere with clear observation of each animal and should minimise losses due to cannibalism and fighting. When animals are to be exposed nose-only, it may be necessary for them to be acclimated to the restraining tubes. The restraining tubes should not impose undue physical, thermal, or immobilisation stress on the animals. Restraint may affect physiological endpoints such as body temperature (hyperthermia) and/or respiratory minute volume. If generic data are available to show that no such changes occur to any appreciable extent, then pre-adaptation to the restraining tubes is not necessary. Animals exposed whole-body to an aerosol should be housed individually during exposure to prevent them from filtering the test aerosol through the fur of their cage mates. Conventional and certified laboratory diets may be used, except during exposure, accompanied with an unlimited supply of municipal drinking water. Lighting should be artificial, the sequence being 12 hours light/12 hours dark. | Inhalation chambers | 11. | The nature of the test chemical and the objective of the test should be considered when selecting an inhalation chamber. The preferred mode of exposure is nose-only (which term includes head-only, nose-only or snout-only). Nose-only exposure is generally preferred for studies of liquid or solid aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. Special objectives of the study may be better achieved by using a whole-body mode of exposure, but this should be justified in the study report. To ensure atmosphere stability when using a whole-body chamber, the total volume of the test animals should not exceed 5 % of the chamber volume. Principles of the nose-only and whole body exposure techniques and their particular advantages and disadvantages are described in GD 39 (8). | EXPOSURE CONDITIONS | Administrations of concentrations | 12. | A fixed duration of exposure for four hours, excluding equilibration time, is recommended. Other durations may be needed to meet specific requirements, however, justification should be provided in the study report [see GD 39 (8)]. Animals exposed in whole-body chambers should be housed individually to prevent ingestion of test chemical due to grooming of cage mates. Feed should be withheld during the exposure period. Water may be provided throughout a whole-body exposure. | 13. | Animals are exposed to the test chemical as a gas, vapour, aerosol, or a mixture thereof. The physical state to be tested depends on the physico-chemical properties of the test chemical, the selected concentration, and/or the physical form most likely present during the handling and use of the test chemical. Hygroscopic and chemically reactive test chemicals should be tested under dry air conditions. Care should be taken to avoid generating explosive concentrations. | Particle-size distribution | 14. | Particle sizing should be performed for all aerosols and for vapours that may condense to form aerosols. To allow for exposure of all relevant regions of the respiratory tract, aerosols with mass median aerodynamic diameters (MMAD) ranging from 1 to 4 μm with a geometric standard deviation (σg) in the range of 1,5 to 3,0 are recommended (8) (13) (14). Although a reasonable effort should be made to meet this standard, expert judgment should be provided if it cannot be achieved. For example, metal fumes may be smaller than this standard, and charged particles, fibres, and hygroscopic materials (which increase in size in the moist environment of the respiratory tract) may exceed this standard. | Test chemical preparation in a vehicle | 15. | A vehicle may be used to generate an appropriate concentration and particle size of the test chemical in the atmosphere. As a rule, water should be given preference. Particulate material may be subjected to mechanical processes to achieve the required particle size distribution, however, care should be taken not to decompose or alter the test chemical. In cases where mechanical processes are believed to have altered test chemical composition (e.g. extreme temperature from excessive milling due to friction), the composition of the test chemical should be verified analytically. Adequate care should be taken to not contaminate the test chemical. It is not necessary to test non-friable granular materials which are purposefully formulated to be un-inhalable. An attrition test should be used to demonstrate that respirable particles are not produced when the granular material is handled. If an attrition test produces respirable particles, an inhalation toxicity test should be performed. | Control animals | 16. | A concurrent negative (air) control group is not necessary. When a vehicle other than water is used to assist in generating the test atmosphere, a vehicle control group should only be used when historical inhalation toxicity data are not available. If a toxicity study of a test chemical formulated in a vehicle reveals no toxicity, it follows that the vehicle is non-toxic at the concentration tested; thus, there is no need for a vehicle control. | MONITORING OF EXPOSURE CONDITIONS | Chamber airflow | 17. | The flow of air through the chamber should be carefully controlled, continuously monitored, and recorded at least hourly during each exposure. The monitoring of test atmosphere concentration (or stability) is an integral measurement of all dynamic parameters and provides an indirect means to control all relevant dynamic atmosphere generation parameters. Special consideration should be given to avoiding re-breathing in nose-only chambers in cases where airflow through the exposure system are inadequate to provide dynamic flow of test chemical atmosphere. There are prescribed methodologies that can be used to demonstrate that re-breathing does not occur under the selected operation conditions (8) (15). Oxygen concentration should be at least 19 % and carbon dioxide concentration should not exceed 1 %. If there is reason to believe that these standards cannot be met, oxygen and carbon dioxide concentrations should be measured. | Chamber temperature and relative humidity | 18. | Chamber temperature should be maintained at 22 ± 3 °C. Relative humidity in the animals’ breathing zone, for both nose-only and whole-body exposures, should be monitored and recorded at least three times for durations up to 4 hrs, and hourly for shorter durations. The relative humidity should ideally be maintained in the range of 30 to 70 %, but this may either be unattainable (e.g. when testing water based mixtures) or not measurable due to test chemical interference with the test method. | Test chemical: nominal concentration | 19. | Whenever feasible, the nominal exposure chamber concentration should be calculated and recorded. The nominal concentration is the mass of generated test chemical divided by the total volume of air passed through the chamber system. The nominal concentration is not used to characterise the animals’ exposure, but a comparison of the nominal and the actual concentration gives an indication of the generation efficiency of the test system, and thus may be used to discover generation problems. | Test chemical: actual concentration | 20. | The actual concentration is the test chemical concentration at the animals’ breathing zone in an inhalation chamber. Actual concentrations can be obtained either by specific methods (e.g. direct sampling, adsorptive or chemical reactive methods, and subsequent analytical characterisation) or by non-specific methods such as gravimetric filter analysis. The use of gravimetric analysis is acceptable only for single component powder aerosols or aerosols of low volatility liquids and should be supported by appropriate pre-study test chemical-specific characterisations. Multi-component powder aerosol concentration may also be determined by gravimetric analysis. However, this requires analytical data which demonstrate that the composition of airborne material is similar to the starting material. If this information is not available, a reanalysis of the test chemical (ideally in its airborne state) at regular intervals during the course of the study may be necessary. For aerosolised agents that may evaporate or sublimate, it should be shown that all phases were collected by the method chosen. The target, nominal, and actual concentrations should be provided in the study report, but only actual concentrations are used in statistical analyses to calculate lethal concentration values. | 21. | One lot of the test chemical should be used, if possible, and the test sample should be stored under conditions that maintain its purity, homogeneity, and stability. Prior to the start of the study, there should be a characterisation of the test chemical, including its purity and, if technically feasible, the identity, and quantities of identified contaminants and impurities. This can be demonstrated by, but is not limited to, the following data: retention time and relative peak area, molecular weight from mass spectroscopy or gas chromatography analyses, or other estimates. Although the test sample’s identity is not the responsibility of the test laboratory, it may be prudent for the test laboratory to confirm the sponsor’s characterisation at least in a limited way (e.g. colour, physical nature, etc.). | 22. | The exposure atmosphere shall be held as constant as practicable and monitored continuously and/or intermittently depending on the method of analysis. When intermittent sampling is used, chamber atmosphere samples should be taken at least twice in a four hour study. If not feasible due to limited air flow rates or low concentrations, one sample may be collected over the entire exposure period. If marked sample-to-sample fluctuations occur, the next concentrations tested should use four samples per exposure. Individual chamber concentration samples should not deviate from the mean chamber concentration by more than ± 10 % for gases and vapours, and by no more than ± 20 % for liquid or solid aerosols. Time to chamber equilibration (t95) should be calculated and recorded. The duration of an exposure spans the time that the test chemical is generated and this takes into account the times required to attain t95. Guidance for estimating t95 can be found in GD 39 (8). | 23. | For very complex mixtures consisting of vapours/gases, and aerosols (e.g. combustion atmospheres and test chemicals propelled from purpose-driven end-use products/devices), each phase may behave differently in an inhalation chamber so at least one indicator substance (analyte), normally the principal active substance in the mixture, of each phase (vapour/gas and aerosol) should be selected. When the test chemical is a mixture, the analytical concentration should be reported for the total mixture and not just for the active ingredient or the component (analyte). Additional information regarding actual concentrations can be found in GD 39 (8). | Test chemical: particle size distribution | 24. | The particle size distribution of aerosols should be determined at least twice during each 4 hour exposure by using a cascade impactor or an alternative instrument such as an aerodynamic particle sizer. If equivalence of the results obtained by a cascade impactor or an alternative instrument can be shown, then the alternative instrument may be used throughout the study. A second device, such as a gravimetric filter or an impinger/gas bubbler, should be used in parallel to the primary instrument to confirm the collection efficiency of the primary instrument. The mass concentration obtained by particle size analysis should be within reasonable limits of the mass concentration obtained by filter analysis [see GD 39 (8)]. If equivalence can be demonstrated in the early phase of the study, then further confirmatory measurements may be omitted. For animal welfare reasons, measures should be taken to minimize inconclusive data which may lead to a need to repeat an exposure. Particle sizing should be performed for vapours if there is any possibility that vapour condensation may result in the formation of an aerosol, or if particles are detected in a vapour atmosphere with potential for mixed phases (see paragraph 14). | PROCEDURE | Main test | 25. | Three animals per sex, or six animals of the more susceptible sex, are used for each step. If rodent species other than rats are exposed nose-only, maximum exposure durations may be adjusted to minimise species-specific distress. The concentration level to be used as the starting dose is selected from one of four fixed levels and the starting concentration level should be that which is most likely to produce toxicity in some of the dosed animals. The testing schemes for gases, vapours and aerosols (included in Appendixes2-4) represent the testing with the cut-off values of the CLP categories 1-4 (9) for gases (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (Appendix 2), for vapours (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4h) (Appendix 3) and for aerosols (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4h) (Appendix 4). Category 5, which is not implemented in Regulation (EC) No 1272/2008 (9) relates to concentrations above the respective limit concentrations. For each starting concentration, the respective testing scheme applies. Depending on the number of humanely killed or dead animals, the test procedure follows the indicated arrows until a categorisation can be made. | 26. | The time interval between exposure groups is determined by the onset, duration, and severity of toxic signs. Exposure of animals at the next concentration level should be delayed until there is reasonable confidence in the survival of the previously tested animals. A period of three or four days between the exposures at each concentration level is recommended to allow for the observation of delayed toxicity. The time interval may be adjusted as appropriate, e.g. in case of inconclusive responses. | Limit test | 27. | The limit test is used when the test chemical is known or expected to be virtually non-toxic, i.e. eliciting a toxic response only above the regulatory limit concentration. Information about the toxicity of the test chemical can be gained from knowledge about similar tested substances or similar mixtures, taking into consideration the identity and percentage of components known to be of toxicological significance. In those situations where there is little or no information about its toxicity, or the test chemical is expected to be toxic, the main test should be performed [further guidance can be found in GD 39 (8)]. | 28. | Using the normal procedure, three animals per sex, or six animals of the more susceptible sex, are exposed at concentrations of 20 000 ppm for gases, 20 mg/l for vapours and 5 mg/l for dusts/mists, respectively (if achievable), which serves as the limit test for this Test Method. When testing aerosols, the primary goal should be to achieve a respirable particle size (i.e. an MMAD of 1-4 μm). This is possible with most test chemicals at a concentration of 2 mg/l Aerosol testing at greater than 2 mg/l should only be attempted if a respirable particle size can be achieved [see GD 39 (8)]. In accordance with GHS (16), testing in excess of a limit concentration is discouraged for animal welfare reasons. Testing in GHS Category 5 (16), which is not implemented in Regulation (EC) No 1272/2008 (9), should only be considered when there is a strong likelihood that results of such a test would have direct relevance for protecting human health, and justification provided in the study report. In the case of potentially explosive test chemicals, care should be taken to avoid conditions favourable for an explosion. To avoid an unnecessary use of animals, a test run without animals should be conducted prior to the limit test to ensure that the chamber conditions for a limit test can be achieved. | OBSERVATIONS | 29. | The animals should be clinically observed frequently during the exposure period. Following exposure, clinical observations should be made at least twice on the day of exposure, or more frequently when indicated by the response of the animals to treatment, and at least once daily thereafter for a total of 14 days. The length of the observation period is not fixed, but should be determined by the nature and time of onset of clinical signs and length of the recovery period. The times at which signs of toxicity appear and disappear are important, especially if there is a tendency for signs of toxicity to be delayed. All observations are systematically recorded with individual records being maintained for each animal. Animals found in a moribund condition and animals showing severe pain and/or enduring signs of severe distress should be humanely killed for animal welfare reasons. Care should be taken when conducting examinations for clinical signs of toxicity that initial poor appearance and transient respiratory changes, resulting from the exposure procedure, are not mistaken for treatment-related effects. The principles and criteria summarised in the Humane Endpoints Guidance Document should be taken into consideration (7). When animals are killed for humane reasons or found dead, the time of death should be recorded as precisely as possible. | 30. | Cage-side observations should include changes in the skin and fur, eyes and mucous membranes, and also respiratory, circulatory, autonomic and central nervous systems, and somato-motor activity and behaviour patterns. When possible, any differentiation between local and systemic effects should be noted. Attention should be directed to observations of tremors, convulsions, salivation, diarrhoea, lethargy, sleep and coma. The measurement of rectal temperatures may provide supportive evidence of reflex bradypnea or hypo/hyperthermia related to treatment or confinement. | Body weights | 31. | Individual animal weights should be recorded once during the acclimatisation period, on the day of exposure prior to exposure (day 0) and at least on days 1, 3 and 7 (and weekly thereafter), and at the time of death or euthanasia if exceeding day 1. Body weight is recognised as a critical indicator of toxicity and animals exhibiting a sustained decrement of ≥ 20 %, compared to pre-study values, should be closely monitored. Surviving animals are weighed and humanely killed at the end of the post-exposure period. | Pathology | 32. | All test animals, including those which die during the test or are euthanised and removed from the study for animal welfare reasons, should be subjected to gross necropsy. If necropsy cannot be performed immediately after a dead animal is discovered, the animal should be refrigerated (not frozen) at temperatures low enough to minimize autolysis. Necropsies should be performed as soon as possible, normally within a day or two. All gross pathological changes should be recorded for each animal with particular attention to any changes in the respiratory tract. | 33. | Additional examinations included a priori by design may be considered to extend the interpretive value of the study, such as measuring lung weight of surviving rats and/or providing evidence of irritation by microscope examination of the respiratory tract. Examined organs may include those showing evidence of gross pathology in animals surviving 24 or more hours, and organs known or expected to be affected. Microscopic examination of the entire respiratory tract may provide useful information for test chemicals that are reactive with water, such as acids and hygroscopic test chemicals. | DATA AND REPORTING | Data | 34. | Individual animal data on body weights and necropsy findings should be provided. Clinical observation data should be summarised in tabular form, showing for each test group the number of animals used, the number of animals displaying specific signs of toxicity, the number of animals found dead during the test or killed for humane reasons, time of death of individual animals, a description and time course of toxic effects and reversibility, and necropsy findings. | Test report | 35. | The test report should include the following information, as appropriate: | | Test animals and husbandry | — | Description of caging conditions, including: number (or change in number) of animals per cage, bedding material, ambient temperature and relative humidity, photoperiod, and identification of diet; | — | Species/strain used and justification for using a species other than the rat; | — | Number, age, and sex of animals; | — | Method of randomisation; | — | Details of food and water quality (including diet type/source, water source); | — | Description of any pre-test conditioning including diet, quarantine, and treatment for disease; | | Test chemical | — | Physical nature, purity, and, where relevant, physico-chemical properties (including isomerisation); | — | Identification data and Chemical Abstract Services (CAS) Registry Number, if known; | | Vehicle | — | Justification for use of vehicle and justification for choice of vehicle (if other than water); | — | Historical or concurrent data demonstrating that the vehicle does not interfere with the outcome of the study; | | Inhalation chamber | — | Description of the inhalation chamber including dimensions and volume; | — | Source and description of equipment used for the exposure of animals as well as generation of atmosphere; | — | Equipment for measuring temperature, humidity, particle-size, and actual concentration; | — | Source of air, treatment of air supplied/extracted and system used for conditioning; | — | Methods used for calibration of equipment to ensure a homogeneous test atmosphere; | — | Pressure difference (positive or negative); | — | Exposure ports per chamber (nose-only); location of animals in the system (whole-body); | — | Temporal homogeneity/stability of test atmosphere; | — | Location of temperature and humidity sensors and sampling of test atmosphere in the chamber; | — | Air flow rates, air flow rate/exposure port (nose-only), or animal load/chamber (whole-body); | — | Information about the equipment used to measure oxygen and carbon dioxide, if applicable; | — | Time required to reach inhalation chamber equilibrium (t95); | — | Number of volume changes per hour; | — | Metering devices (if applicable); | | Exposure data | — | Rationale for target concentration selection in the main study; | — | Nominal concentrations (total mass of test chemical generated into the inhalation chamber divided by the volume of air passed through the chamber); | — | Actual test chemical concentrations collected from the animals’ breathing zone; for test mixtures that produce heterogeneous physical forms (gases, vapours, aerosols), each may be analysed separately; | — | All air concentrations should be reported in units of mass (e.g. mg/l, mg/m3, etc.), units of volume (e.g. ppm, ppb) may also be reported parenthetically; | — | Particle size distribution, mass median aerodynamic diameter (MMAD), and geometric standard deviation (σg), including their methods of calculation. Individual particle size analyses should be reported; | | Test conditions | — | Details of test chemical preparation, including details of any procedures used to reduce the particle size of solid substances or to prepare solutions of the test chemical. In cases where mechanical processes may have altered test chemical composition, include the results of analyses to verify the composition of the test chemical; | — | A description (preferably including a diagram) of the equipment used to generate the test atmosphere and to expose the animals to the test atmosphere; | — | Details of the chemical analytical method used and method validation (including efficiency of recovery of test chemical from the sampling medium); | — | The rationale for the selection of test concentrations; | | Results | — | Tabulation of chamber temperature, humidity, and airflow; | — | Tabulation of chamber nominal and actual concentration data; | — | Tabulation of particle size data including analytical sample collection data, particle size distribution, and calculations of the MMAD and σg; | — | Tabulation of response data and concentration level for each animal (i.e. animals showing signs of toxicity including mortality, nature, severity, and duration of effects); | — | Individual body weights of animals collected on study days, date and time of death if prior to scheduled euthanasia; time course of onset of signs of toxicity, and whether these were reversible for each animal; | — | Necropsy findings and histopathological findings for each animal, if available; | — | The CLP category classification and the LC50 cut-off value; | | Discussion and interpretation of results | — | Particular emphasis should be made to the description of methods used to meet this Test Method’s criteria, e.g. the limit concentration or the particle size; | — | The respirability of particles in light of the overall findings should be addressed, especially if the particle-size criteria could not be met; | — | The consistency of methods used to determine nominal and actual concentrations, and the relation of actual concentration to nominal concentration should be included in the overall assessment of the study; | — | The likely cause of death and predominant mode of action (systemic versus local) should be addressed; | — | An explanation should be provided if there was a need to humanely sacrifice animals in pain or showing signs of severe and enduring distress, based on the criteria in the OECD Guidance Document on Humane Endpoints (7). | LITERATURE: | (1) | Chapter B.2 of this Annex, Acute Toxicity (Inhalation). | (2) | Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254. | (3) | Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549. | (4) | Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134. | (5) | Chapter B.1 tris of this Annex, Acute Oral Toxicity — Acute Toxic Class Method. | (6) | OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 105, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (7) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 39, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (9) | Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directives 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No 1907/2006 (OJ L 353, 31.12.2008, p. 1). | (10) | Chapter B.40 of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER). | (11) | Chapter B.40 bis of this Annex, In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test. | (12) | OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No 435, OECD, Paris. Available at: [http://www.oecd.org/env/testguidelines] | (13) | Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. | (14) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327. | (15) | Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167 | (16) | UN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Available: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html] | Appendix 1 | DEFINITION | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Procedure to be followed by each of the starting concentrations for gases (ppm/4h) | General remarks (5) | For each starting concentration, the respective testing schemes as included in this Appendix outline the procedure to be followed. | Appendix 2a: Starting concentration is 100 ppm | Appendix 2b: Starting concentration is 500 ppm | Appendix 2c: Starting concentration is 2 500 ppm | Appendix 2d: Starting concentration is 20 000 ppm | Depending on the number of humanely killed or dead animals, the test procedure follows the indicated arrows. | Appendix 2a | Acute Inhalation Toxicity: | Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4h for gases | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at ≥ 20000 ppm/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 2b | Acute Inhalation Toxicity: | Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at ≥ 20000 ppm/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 2c | Acute Inhalation Toxicity: | Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at ≥ 20000 ppm/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 2d | Acute Inhalation Toxicity: | Test Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at ≥ 20000 ppm/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 3 | Procedure to be followed by each of the starting concentrations for vapour (mg/l/4h) | General remarks (6) | For each starting concentration, the respective testing schemes as included in this Appendix outline the procedure to be followed. | Appendix 3a: Starting concentration is 0,5 mg/l | Appendix 3b: Starting concentration is 2,0 mg/l | Appendix 3c: Starting concentration is 10 mg/l | Appendix 3d: Starting concentration is 20 mg/l | Depending on the number of humanely killed or dead animals, the test procedure follows the indicated arrows. | Appendix 3a | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for vapours | - 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | - 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | - GHS: Globally Harmonized Classification System | - ∞: unclassified | - Testing at 50 mg/L/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 3b | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 50 mg/L4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 3c | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used pers step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 50 mg/L/4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 3d | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 50 mg/L/4h: see Guidance Document 39(8) | Appendix 4 | Procedure to be followed by each of the starting concentrations for aerosols (mg/l/4h) | General remarks (7) | For each starting concentration, the respective testing schemes as included in this Appendix outline the procedure to be followed. | Appendix 4a: Starting concentration is 0,05 mg/l | Appendix 4b: Starting concentration is 0,5 mg/l | Appendix 4c: Starting concentration is 1 mg/l | Appendix 4d: Starting concentration is 5 mg/l | Depending on the number of humanely killed or dead animals, the test procedure follows the indicated arrows. | Appendix 4a | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 0,05 mg/L/4h for aerosols | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 12.5 mg/L4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 4b | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for aerosols | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 12.5 mg/L4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 4c | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6: Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 12.5 mg/L4h: see Guidance Document 39 (8) | Appendix 4d | Acute Inhalation Toxicity: | Test procedure with a starting concentration of 5 mg/L/4h for_aerosols | 3 ♂ + 3 ♀, or 6 animals of the more susceptible sex are used per step | 0-6 : Number of moribund or dead animals/tested concentraion | GHS: Globally Harmonized Classification System | ∞: unclassified | Testing at 12.5 mg/L/4h: see Guidance Document 39 (8) | ’ |
| 9. | poglavje C.10 se nadomesti z naslednjim: | „C.10: SIMULACIJSKI PRESKUS ZA AEROBNO ČIŠČENJE ODPADNE VODE: C.10-A: ENOTE Z AKTIVNIM BLATOM – C.10-B: BIOFILMI | C.10-A: Enote z aktivnim blatom | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 303 (2001). V petdesetih letih prejšnjega stoletja so spoznali, da na novo uvedene površinsko aktivne snovi povzročajo čezmerno penjenje v čistilnih napravah in rekah. Te snovi z aerobnim čiščenjem niso bile v celoti odstranjene, v nekaterih primerih pa so tudi omejevale odstranjevanje drugih organskih snovi. To je sprožilo številne raziskave o tem, kako bi bilo mogoče površinsko aktivne snovi odstraniti iz odpadnih voda in ali se nove kemikalije, ki jih proizvaja industrija, pri čiščenju odpadne vode odstranijo. Za to so bili uporabljeni modeli enot, ki so predstavljali dve glavni vrsti aerobnega biološkega čiščenja odpadne vode (z aktivnim blatom in precejanjem). Zelo nepraktično in drago bi bilo, če bi vsako novo kemikalijo razširili po velikih čistilnih napravah in jo spremljali pri njih, tudi če bi se to izvajalo na lokalni ravni. | ZAČETNI PREUDARKI | Enote z aktivnim blatom | 2. | V opisih modelov enot z aktivnim blatom je navedena velikost od 300 ml do približno 2 000 ml. Nekateri modeli so bili natančni posnetki naprav v naravni velikosti z usedalniki blata, pri katerih se usedeno blato črpa nazaj v prezračevalni bazen, medtem ko so bili drugi brez usedalnikov, npr. Swisher (1). Velikost naprave je kompromis; biti mora dovolj velika za uspešno mehansko delovanje in zagotovitev zadostne količine vzorcev, ne da bi to vplivalo na delovanje, ne sme pa biti tako velika, da bi bilo potrebnega preveč prostora in materiala. | 3. | Dve obliki naprav, ki se obsežno in zadovoljivo uporabljata, sta Husmannova naprava (2) in naprava s poroznimi posodami (3) (4), ki sta se najprej uporabljali pri preučevanju površinsko aktivnih snovi in sta opisani v tej preskusni metodi. Zadovoljivo so se uporabljale tudi druge, npr. Eckenfelderjeva naprava (5). Zaradi razmeroma visokih stroškov in velikega truda pri uporabi tega simulacijskega preskusa so se vzporedno raziskovali preprostejši in cenejši presejalni preskusi, ki so zdaj vključeni v poglavje C.4, A–F, te priloge (6). Izkušnje s številnimi površinsko aktivnimi snovmi in drugimi kemikalijami so pokazale, da so se tiste, ki so uspešno opravile presejalne preskuse (dobra biološka razgradljivost), razgradile tudi pri simulacijskem preskusu. Nekatere od tistih, ki presejalnih preskusov niso uspešno opravile, so uspešno opravile preskuse inherentne biološke razgradljivosti (poglavji C.12 (7) in C.19 (8) te priloge), vendar so se samo nekatere iz zadnje skupine razgradile pri simulacijskem preskusu, medtem ko se kemikalije, ki niso uspešno opravile preskusov inherentne biološke razgradljivosti, pri simulacijskih preskusih niso razgradile (9) (10) (11). | 4. | Za nekatere namene zadostujejo simulacijski preskusi, opravljeni na podlagi enega samega niza obratovalnih pogojev; rezultati so izraženi kot odstotni delež odstranitve preskusne kemikalije ali raztopljenega organskega ogljika (DOC). Tak preskus je opisan v tej preskusni metodi. Vendar v nasprotju s prejšnjo različico tega poglavja, v kateri je bila opisana samo ena vrsta naprave za čiščenje sintetične odpadne vode v sistemu spojenih enot, pri katerem se je uporabljala razmeroma preprosta metoda odvajanja blata, to besedilo ponuja vrsto različnih možnosti. Opisane so različne možnosti glede na vrsto naprave, način delovanja, odpadno vodo in način odvajanja blata. To besedilo natančno sledi besedilu standarda ISO 11733 (12), ki je bil med njegovo pripravo natančno pregledan, čeprav metoda ni bila predmet krožnega testa. | 5. | Za druge namene mora biti koncentracija preskusne kemikalije v iztoku natančneje znana; za kar pa je potrebna celovitejša metoda. Na primer, hitrost odvajanja blata je treba natančneje kontrolirati ves dan in skozi celoten preskus, naprave pa morajo obratovati pri različnih hitrostih odvajanja blata. Vsestransko celovita metoda zahteva, da se preskusi izvedejo tudi pri dveh ali treh različnih temperaturah: tako metodo je opisal Birch (13) (14) in je povzeta v Dodatku 6. Vendar sedanje znanje ne zadostuje za odločitev, kateri od kinetičnih modelov so uporabni za biološko razgradnjo kemikalij pri čiščenju odpadnih voda in v vodnem okolju na splošno. Uporaba Monodove kinetike, ki je v Dodatku 6 navedena kot primer, je omejena na kemikalije, katerih koncentracija je vsaj 1 mg/l, vendar je po mnenju nekaterih celo to še treba utemeljiti. Preskusi pri koncentracijah, ki so bolj podobne tistim iz odpadnih voda, so navedeni v Dodatku 7, vendar so taki preskusi in preskusi v Dodatku 6 vključeni v dodatke in niso obravnavani kot ločene preskusne metode. | Filtri | 6. | Mnogo manj pozornosti je bilo namenjene modelom precejalnih filtrov, morda zato, ker so bolj nerodni in manj kompaktni kot modeli čistilnih naprav z aktivnim blatom. Gerike idr. so razvili enote s precejalniki in jih uporabili v sistemu spojenih enot (15). Ti filtri so bili razmeroma veliki (višina 2 m; prostornina 60 l), tako da sta bila za vsakega potrebna kar 2 l/h odpadne vode. Baumann idr. (16) so precejalne filtre simulirali tako, da so trakove iz poliestrske ‚volne‘ najprej za 30 minut namočili v koncentrirano aktivno blato, nato pa jih vstavili v enometrske cevi (z notranjim premerom 14 mm). Preskusna kemikalija je bila kot edini vir ogljika v raztopini mineralnih snovi spuščena po navpični cevi, biološka razgradnja pa je bila ocenjena na podlagi meritev DOC v iztoku in CO2 v nastalem plinu. | 7. | Biofiltri so bili simulirani drugače (15); skozi vrteče se cevi, nagnjene pod majhnim kotom glede na vodoravno ploskev, je bila spuščena odpadna voda (približno 250 ml/h) s preskusno kemikalijo in brez nje, v zbranih iztokih pa sta bila analizirana DOC in/ali določena preskusna kemikalija. | NAČELO PRESKUSA | 8. | Ta metoda je zasnovana za določitev odstranitve ter primarne in/ali končne biološke razgradnje vodotopnih organskih kemikalij z aerobnimi mikroorganizmi v kontinuirano delujočem preskusnem sistemu, ki simulira proces z aktivnim blatom. Lahko biološko razgradljiv organski medij in organska preskusna kemikalija sta vira ogljika in energije za mikroorganizme. | 9. | Dve kontinuirano delujoči preskusni enoti (napravi z aktivnim blatom ali porozni posodi) obratujeta vzporedno v enakih pogojih, ki so izbrani glede na namen preskusa. Običajno je srednji hidravlični zadrževalni čas 6 h, srednja starost blata (zadrževalni čas blata) pa 6 do 10 dni. Blato se odvaja po eni od dveh metod, preskusna kemikalija pa se običajno doda v koncentraciji 10 mg/l do 20 mg/l raztopljenega organskega ogljika (DOC) v pritok (organskemu mediju) ene od enot. Druga enota se uporablja kot kontrolna enota za določitev biološke razgradnje organskega medija. | 10. | V pogosto vzetih vzorcih iztokov se s specifično analizo določi po možnosti DOC ali kemijska potreba po kisiku (KPK) ter koncentracija preskusne kemikalije (po potrebi) v iztoku iz enote, v katero se dovaja preskusna kemikalija. Domneva se, da razlika med koncentracijama DOC ali KPK v iztoku iz preskusne in kontrolne enote nastane zaradi preskusne kemikalije ali njenih organskih metabolitov. Ta razlika se primerja s koncentracijo DOC ali KPK v pritoku zaradi dodane preskusne kemikalije, da se ugotovi odstranitev preskusne kemikalije. | 11. | Biološko razgradnjo je običajno mogoče ločiti od biološke adsorpcije s skrbno preučitvijo časovne krivulje odstranitve in jo je običajno mogoče potrditi s preskusom dobre biološke razgradljivosti, pri katerem se uporabi aklimatizirani inokulum iz naprave, v katero se dovaja preskusna kemikalija. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 12. | Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani čistost, vodotopnost, hlapnost in adsorpcijske lastnosti preskusne kemikalije. Hlapnih in netopnih kemikalij običajno ni mogoče preskusiti, če se ne sprejmejo posebni previdnostni ukrepi (glej Dodatek 5). Za izračun teoretičnih vrednosti in/ali preverjanje izmerjenih vrednosti parametrov, npr. teoretične potrebe po kisiku (TPK), raztopljenega organskega ogljika (DOC) in kemijske potrebe po kisiku (KPK), je treba poznati kemično strukturo ali vsaj empirično formulo. | 13. | Informacije o strupenosti preskusne kemikalije za mikroorganizme (glej Dodatek 4) so lahko uporabne za izbiro primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgradljivosti. | RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA | 14. | Pri prvotni uporabi tega simulacijskega (potrditvenega) preskusa za primarno biološko razgradnjo površinsko aktivnih snovi se zahteva več kot 80-odstotna odstranitev določene kemikalije, preden se lahko površinsko aktivna snov da na trg. Če 80-odstotna vrednost ni dosežena, se ta simulacijski (potrditveni) preskus lahko uporabi, površinsko aktivna snov pa se lahko da na trg samo, če je odstranjenih več kot 90 % določene kemikalije. Pri kemikalijah na splošno ni dvoma o uspešno ali neuspešno opravljenem preskusu, dobljena vrednost deleža odstranitve v odstotkih pa se lahko uporabi v približnih izračunih verjetne okoljske koncentracije, ki bo uporabljena pri ocenah nevarnosti, ki jo pomenijo kemikalije. Rezultati navadno sledijo vzorcu vse ali nič. V vrsti raziskav čistih kemikalij je bilo ugotovljeno, da je bil delež odstranitve DOC > 90-odstotni pri več kot treh četrtinah in > 80-odstotni pri več kot 90 % kemikalij, ki so pokazale kakršno koli značilno stopnjo biološke razgradljivosti. | 15. | V odpadnih vodah je razmeroma malo kemikalij (npr. površinsko aktivnih snovi) prisotnih v koncentracijah (približno 10 mg C/l), uporabljenih pri tem preskusu. Nekatere kemikalije so lahko pri teh koncentracijah zaviralne, medtem ko je lahko kinetika odstranjevanja drugih pri nizkih koncentracijah drugačna. Natančnejša ocena razgradnje bi bila mogoča s spremenjenimi metodami, pri katerih bi se uporabile realno nizke koncentracije preskusne kemikalije, zbrani podatki pa bi se lahko uporabili za izračun kinetičnih konstant. Vendar potrebne poskusne tehnike še niso bile v celoti potrjene niti niso bili vzpostavljeni kinetični modeli, ki opisujejo biološko razgradne reakcije (glej Dodatek 7). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 16. | Za zagotovitev pravilnega izvajanja poskusnega postopka je koristno, da se hkrati s preučevanjem preskusnih kemikalij občasno preskusijo kemikalije, katerih obnašanje je znano. Med takimi kemikalijami so adipinska kislina, 2-fenilfenol, 1-naftol, difenil-2,2-dikarboksilna kislina in 1-karboksi naftalenska kislina (9) (10) (11). | OBNOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA | 17. | O raziskavah simulacijskih preskusov je veliko manj poročil kot o preskusih lahke biološke razgradljivosti. Ponovljivost pri (sočasnih) ponovitvah je dobra (med 10- in 15-odstotna) pri preskusnih kemikalijah, katerih razgradnja je 80- ali več odstotna, vendar pa je pri kemikalijah, pri katerih razgradnja ni tako dobra, variabilnost večja. Prav tako so bili pri nekaterih mejnih kemikalijah dobljeni zelo različni rezultati (npr. 10 %, 90 %) ob različnih časih v obdobju devetih tednov, ki je dopuščeno za preskus. | 18. | Pri rezultatih, pridobljenih z dvema vrstama naprave, so bile razlike majhne, vendar pa so se nekatere kemikalije bolj in dosledneje razgrajevale pri gospodinjski odpadni vodi kot pri sintetični odpadni vodi OECD. | OPIS PRESKUSNE METODE | Naprava | Preskusni sistem | 19. | Preskusni sistem za eno preskusno kemikalijo sestavljata preskusna in kontrolna enota; če se izvajajo samo specifične analize (primarna biološka razgradnja), je potrebna samo preskusna enota. Ena kontrolna enota se lahko uporablja za več preskusnih enot, ki prejemajo enake ali različne preskusne kemikalije. V primeru sistema spojenih enot (Dodatek 3) mora imeti vsaka preskusna enota svojo kontrolno enoto. Preskusni sistem je lahko model čistilne naprave z aktivnim blatom, Husmannova naprava (Dodatek 1, slika 1) ali porozna posoda (Dodatek 1, slika 2). V obeh primerih so potrebne dovolj velike posode za shranjevanje pritokov in iztokov ter črpalke za odmerjanje pritoka, bodisi zmešanega z raztopino preskusne kemikalije bodisi ločenega. | 20. | Vsako čistilno napravo z aktivnim blatom sestavljata prezračevalna posoda z znano prostornino približno 3 litrov aktivnega blata in usedalnik (sekundarni bistrilnik) s prostornino približno 1,5 litra; prostornini se lahko deloma spremenita z nastavitvijo višine usedalnika. Dopustne so posode drugačnih velikosti, če delujejo s primerljivimi hidravličnimi obremenitvami. Če temperature v preskusnem prostoru ni mogoče ohranjati v želenem razponu, se priporoča uporaba posod z vodnim plaščem z nadzorovano temperaturo. Za recikliranje aktivnega blata iz usedalnika v prezračevalno posodo, bodisi kontinuirano bodisi v rednih presledkih, se uporablja črpalka ‚airlift‘ ali dozirna črpalka. | 21. | Sistem poroznih posod je sestavljen iz notranjega poroznega valja s stožčastim dnom, ki stoji v nekoliko večji posodi enake oblike, narejeni iz neprepustnega plastičnega materiala. Primeren material za porozno posodo je porozni polietilen z največjo velikostjo por 90 μm in debelino 2 mm. Blato se iz obdelanega organskega medija se ločuje z diferencialnim prehodom skozi porozno steno. Iztoki se zbirajo v krožnem prostoru, od koder se prelivajo v zbiralnik. Usedanja ni, zato se blato ne vrača. Celotni sistem se lahko namesti v vodno kopel, nadzorovano s termostatom. Porozne posode se zamašijo, zato lahko v začetnih fazah pride do razlivanja. V takem primeru je treba porozni vložek zamenjati s čistim, pri čemer se blato najprej izčrpa iz posode v čisto vedro, nato pa se odstrani zamašeni vložek. Ko je neprepustni zunanji valj očiščen, se vstavi čist vložek, blato pa se vrne v posodo. Prav tako je treba skrbno postrgati in prenesti blato, ki se je prijelo ob straneh zamašenega vložka. Zamašene posode se najprej očistijo s tankim curkom vode, da se odstrani preostalo blato, zatem se namočijo v razredčeno raztopino natrijevega hipoklorita in nato v vodo, nazadnje pa se temeljito sperejo z vodo. | 22. | Za prezračevanje blata v prezračevalnih posodah obeh sistemov so potrebne primerne tehnike, na primer sintrane kocke (difuzorji) in stisnjen zrak. Zrak se po potrebi očisti tako, da prehaja skozi primeren filter in nato opere. Skozi sistem mora prehajati zadostna količina zraka, da se vzdržujejo aerobni pogoji in da se kosmi blata ves čas preskusa ohranjajo v suspenziji. | Naprava za filtriranje ali centrifuga | 23. | Naprava za filtriranje vzorcev z membranskimi filtri ustrezne poroznosti (nazivni premer odprtine 0,45 μm), ki adsorbirajo topne organske kemikalije in sprostijo čim manj organskega ogljika. Če se uporabljajo filtri, ki sproščajo organski ogljik, jih je treba skrbno sprati z vročo vodo, da se odstrani izlužljivi organski ogljik. Namesto tega se lahko uporabi centrifuga, ki lahko doseže 40 000 m/s2. | Analitska oprema | 24. | Naprava, potrebna za določitev: | — | DOC (raztopljenega organskega ogljika) in TOC (celotnega organskega ogljika) ali KPK (kemijske potrebe po kisiku), | — | določene kemikalije, če se to zahteva, | — | suspendiranih trdnih snovi, vrednosti pH, koncentracije kisika v vodi, | — | temperature, kislosti in bazičnosti, | — | amonija, nitrita in nitrata, če se preskus izvaja v nitrifikacijskih pogojih. | Voda | 25. | Vodovodna voda, ki vsebuje manj kot 3 mg/l DOC. Če bazičnost še ni znana, jo je treba določiti. | 26. | Deionizirana voda, ki vsebuje manj kot 2 mg/l DOC. | Organski medij | 27. | Kot organski medij so dovoljene sintetične odpadne vode, gospodinjske odpadne vode ali oboje. Izkazalo se je (11) (14), da je pri uporabi samo gospodinjske odpadne vode delež odstranitve DOC pogosto večji ter da celo omogoča odstranitev in biološko razgradnjo nekaterih kemikalij, ki se biološko ne razgradijo, kadar se uporabi sintetična odpadna voda OECD. Prav tako stalno ali občasno dodajanje gospodinjske odpadne vode pogosto stabilizira aktivno blato, vključno z bistveno zmožnostjo dobrega usedanja. Zato se priporoča uporaba gospodinjske odpadne vode. Koncentracijo DOC ali KPK je treba izmeriti v vsaki novi šarži organskega medija. Poznati je treba njegovo kislost ali bazičnost. Pri nizki kislosti ali bazičnosti mu je morda treba dodati primeren pufer (natrijev hidrogen karbonat ali kalijev dihidrogen fosfat), da se med preskusom vrednost pH v prezračevalni posodi ohranja pri približno 7,5 ± 0,5. O količini puferja, ki jo je treba dodati, in času, ko ga je treba dodati, je treba odločiti v vsakem primeru posebej. Kadar se bodisi redno bodisi občasno uporabljajo zmesi, je treba ohranjati približno konstantno vrednost DOC (ali KPK) v zmesi, npr. z redčenjem z vodo. | Sintetična odpadna voda | 28. | V vsakem litru vodovodne vode je treba raztopiti: 160 mg peptona; 110 mg mesnega ekstrakta; 30 mg sečnine; 28 mg brezvodnega dikalijevega hidrogen fosfata (K2HPO4); 7 mg natrijevega klorida (NaCl); 4 mg kalcijevega klorid dihidrata (CaCl2.2H2O) in 2 mg magnezijevega sulfat heptahidrata (Mg2SO4.7H20). Ta sintetična odpadna voda OECD je primer in predstavlja srednjo koncentracijo DOC v pritoku, ki znaša približno 100 mg/l. Uporabijo se lahko tudi druge sestave s približno enako koncentracijo DOC, ki so bolj podobne pravi odpadni vodi. Če je potreben manj koncentriran pritok, je treba sintetično odpadno vodo razredčiti z vodovodno vodo, na primer v razmerju 1 : 1, da nastane koncentracija približno 50 mg/l. Tak šibkejši pritok bo omogočal boljšo rast nitirifikacijskih organizmov, zato je treba to spremembo uporabiti pri simulacijskem preskušanju čistilnih naprav z nitrifikacijo. Ta sintetična odpadna voda se lahko pripravi v destilirani vodi v koncentrirani obliki in shranjuje največ en teden pri približno 1 °C. Po potrebi se razredči z vodovodno vodo. (Ta medij je nezadovoljiv, npr. koncentracija dušika je zelo visoka, vsebnost ogljika je razmeroma nizka, vendar ni bilo predlaganega nič boljšega, razen naj se doda več fosfata kot puferja in dodatni pepton.) | Gospodinjska odpadna voda | 29. | Uporabiti je treba svežo usedeno odpadno vodo, ki se dnevno zbira iz čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno gospodinjska odpadna voda. Pred primarnim usedanjem jo je treba odvzeti iz prelivnega kanala primarnega usedalnika ali vtoka v čistilno napravo z aktivnim blatom, biti pa mora večinoma brez grobih delcev. Odpadna voda se lahko uporabi po večdnevnem shranjevanju (ki na splošno ne sme trajati več kot 7 dni) pri približno 4 °C, če je dokazano, da se DOC (ali KPK) med shranjevanjem ni bistveno zmanjšal (tj. za manj kot 20 %). Da se omejijo motnje v sistemu, je treba DOC (ali KPK) vsake nove šarže pred uporabo uravnati na ustrezno konstantno vrednost, npr. z redčenjem z vodovodno vodo. | Aktivno blato | 30. | Aktivno blato za inokulacijo je treba zbrati iz prezračevalnega bazena dobro delujoče čistilne naprave ali laboratorijske enote z aktivnim blatom, v kateri se čistijo predvsem gospodinjske odpadne vode. | Založne raztopine preskusne kemikalije | 31. | Za kemikalije z ustrezno topnostjo je treba pripraviti osnovne raztopine z ustreznimi koncentracijami (npr. 1 do 5 g/l) v deionizirani vodi ali mineralnem deležu sintetične odpadne vode (za netopne in hlapne kemikalije glej Dodatek 5). Določiti je treba DOC in celotni organski ogljik (TOC) osnovne raztopine, meritve pa ponoviti za vsako novo šaržo. Če je razlika med DOC in TOC večja od 20 %, je treba preveriti vodotopnost preskusne kemikalije. DOC ali koncentracijo preskusne kemikalije, izmerjeno s specifično analizo osnovne raztopine, je treba primerjati z nazivno vrednostjo, da se ugotovi, ali je izkoristek dovolj dober (običajno je mogoče pričakovati > 90-odstotni izkoristek). Zlasti za disperzije je treba ugotoviti, ali je mogoče DOC uporabiti kot analitski parameter ali ne oziroma ali je mogoče uporabiti samo analitsko tehniko, specifično za preskusno kemikalijo. Za disperzije je potrebno centrifugiranje vzorcev. Pri vsaki novi šarži je treba s specifično analizo izmeriti DOC, KPK ali preskusno kemikalijo. | 32. | Določiti je treba pH osnovne raztopine. Skrajne vrednosti kažejo, da lahko dodatek kemikalije vpliva na pH aktivnega blata v preskusnem sistemu. V takem primeru je treba osnovno raztopino nevtralizirati z majhnimi količinami anorganske kisline ali baze, da se doseže vrednost pH 7 ± 0,5, vendar pa je treba preprečiti obarjanje preskusne kemikalije. | POSTOPEK | 33. | Opisan je postopek za naprave z aktivnim blatom; za sistem s poroznimi posodami ga je treba nekoliko prilagoditi. | Priprava inokuluma | 34. | Na začetku preskusa je treba preskusni sistem inokulirati bodisi z aktivnim blatom bodisi z inokulumom, ki vsebuje nizko koncentracijo mikroorganizmov. Inokulum je treba do začetka uporabe prezračevati pri sobni temperaturi in ga uporabiti v 24 urah. V prvem primeru se vzorec aktivnega blata vzame iz prezračevalnega bazena učinkovito delujoče biološke čistilne naprave ali laboratorijske čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno gospodinjska odpadna voda. Če je treba simulirati nitrifikacijske pogoje, se blato vzame iz čistilne naprave, v kateri poteka nitrifikacija. Določiti je treba koncentracijo suspendiranih trdnih snovi in po potrebi blato zgostiti z usedanjem, tako da je količina, ki se doda v preskusni sistem, minimalna. Zagotoviti je treba, da je začetna koncentracija suhe snovi približno 2,5 g/l. | 35. | V drugem primeru se kot inokulum uporabi 2 ml/l do 10 ml/l iztoka iz biološke čistilne naprave za gospodinjske odpadne vode. Da bi dobili čim več različnih vrst bakterij, je lahko koristno, če se dodajo inokulumi iz različnih drugih virov, na primer iz površinske vode. V tem primeru se bo aktivno blato razvijalo in raslo v preskusnem sistemu. | Odmerjanje organskega medija | 36. | Zagotoviti je treba, da so posode za pritok in iztok ter cevi, ki vodijo iz posod za pritok in v posode za iztok, povsem čiste, da se prepreči rast mikrobov na začetku in med celotnim preskusom. Preskusne sisteme je treba sestaviti v prostoru z nadzorovano temperaturo (običajno 20 do 25 °C) ali pa je treba uporabiti preskusne enote z vodnim plaščem. Pripraviti je treba zadostno količino potrebnega organskega medija (odstavki 27 do 29). Najprej se z organskim medijem napolnita prezračevalna posoda in usedalnik, nato se doda inokulum (odstavka 34 in 35). Začne se prezračevanje, tako da se blato ohranja v suspenziji in v aerobnem stanju; nato se začne odmerjanje pritoka in recikliranje usedenega blata. Organski medij se odmerja iz posod za shranjevanje v prezračevalne posode (odstavka 20 in 21) preskusne in kontrolne enote, ustrezni iztoki pa se zbirajo v podobne posode za shranjevanje. Da bi dobili običajni hidravlični zadrževalni čas 6 h, se organski medij črpa s pretokom 0,5 l/h. Za potrditev tega pretoka je treba izmeriti dnevno količino odmerjenega organskega medija, tako da se zapiše zmanjšanje prostornine medija v posodah za shranjevanje. Za določitev učinkov občasnega spuščanja ali ‚udarne‘ obremenitve s kemikalijami bi bili potrebni drugi načini odmerjanja. | 37. | Če je organski medij pripravljen za uporabo več kot 1 dan, je potrebno hlajenje pri približno 4 °C ali druge ustrezne metode ohranjanja, da se preprečita rast mikrobov in biološka razgradnja zunaj preskusnih enot (odstavek 29). Če se uporablja sintetična odpadna voda, je mogoče pripraviti koncentrirano osnovno raztopino (npr. 10-kratnik običajne koncentracije, odstavek 28) in jo shranjevati pri približno 4 °C. Ta osnovna raztopina se lahko pred uporabo dobro zmeša z ustrezno količino vodovodne vode, lahko pa se tudi črpa neposredno, medtem ko se ustrezna količina vodovodne vode črpa ločeno. | Odmerjanje preskusne kemikalije | 38. | Ustrezna količina osnovne raztopine preskusne kemikalije (odstavek 31) se doda v posodo za shranjevanje pritoka ali pa se s posebno črpalko odmeri neposredno v prezračevalno posodo. Običajna srednja preskusna koncentracija v pritoku mora biti med 10 mg/l in 20 mg/l DOC, zgornja koncentracija pa ne sme presegati 50 mg/l. Če je preskusna kemikalija slabo topna v vodi ali če obstaja velika možnost za nastanek strupenih učinkov, je treba koncentracijo zmanjšati na 5 mg/l DOC ali celo manj, vendar samo če je na voljo in izvedena primerna specifična analitska metoda (s posebnimi tehnikami odmerjanja se lahko dodajo dispergirane preskusne kemikalije, ki so slabo topne v vodi, glej Dodatek 5). | 39. | Potem ko se sistem stabilizira in učinkovito odstranjuje DOC organskega medija (približno 80 %), se začne dodajati preskusna kemikalija. Pred tem je treba preveriti, ali vse enote delujejo enako učinkovito; če ne, običajno pomaga, če se posamezna blata zmešajo in se v posamezne enote znova razdelijo enake količine. Kadar se uporabi inokulum iz (približno) 2,5 g/l (suhe teže) aktivnega blata, se lahko preskusna kemikalija dodaja od začetka preskusa, saj neposredno dodajanje vedno večjih količin od začetka omogoča, da se lahko aktivno blato bolje prilagodi preskusni kemikaliji. Ne glede na način dodajanja preskusne kemikalije je priporočljivo, da se v rednih presledkih merijo ustrezni pretok in/ali prostornine v posodah za shranjevanje. | Ravnanje z aktivnim blatom | 40. | Koncentracija trdnih snovi v aktivnem blatu se med preskusom običajno stabilizira znotraj omejitev ne glede na uporabljeni inokulum, in sicer znaša 1 do 3 g/l (suhe teže), odvisno od kakovosti in koncentracije organskega medija, obratovalnih pogojev, narave prisotnih mikroorganizmov in vpliva preskusne kemikalije. | 41. | Treba je bodisi vsaj tedensko določiti suspendirane trdne snovi v prezračevalnih posodah in odstraniti odvečno blato, da se ohrani koncentracija 1 do 3 g/l (suhe teže), bodisi vzdrževati srednjo starost blata pri konstantni vrednosti, običajno v razponu 6 do 10 dni. Če je na primer izbran zadrževalni čas blata 8 dni, je treba vsak dan odstraniti 1/8 aktivnega blata v prezračevalni posodi in ga zavreči. To je treba izvajati vsak dan, po možnosti s samodejno črpalko, ki deluje v presledkih. Z vzdrževanjem konstantne koncentracije suspendiranih trdnih snovi ali vzdrževanjem te koncentracije v ozkih mejah se ne vzdržuje konstantni zadrževalni čas blata (SRT), ki je obratovalna spremenljivka, ki določa vrednost koncentracije preskusne kemikalije v iztoku. | 42. | Med celotnim preskusom je treba vsaj enkrat na dan odstraniti vse blato, ki se prime na stene prezračevalne posode in usedalnika, tako da se znova suspendira. Redno je treba preverjati in čistiti vse cevi, da se prepreči rast biofilma. Usedeno blato iz usedalnika je treba reciklirati v prezračevalno posodo, po možnosti s črpanjem v presledkih. V sistemu poroznih posod recikliranja ni, vendar je treba zagotoviti, da se vstavijo čiste notranje posode, preden se prostornina v posodi znatno poveča (odstavek 21). | 43. | V Husmannovih enotah lahko pride do slabega usedanja in izgube blata. To je mogoče popraviti z enim ali več spodaj navedenimi ukrepi, ki se izvedejo sočasno v preskusni in kontrolni enoti: | — | v rednih presledkih, npr. tedensko, se lahko dodaja sveže blato ali flokulant (na primer 2 ml/posodo 50 g/l FeCl3), vendar se je treba prepričati, da ne pride do reakcije ali obarjanja preskusne kemikalije s FeCl3, | — | črpalka ‚airlift‘ se lahko nadomesti s peristaltično črpalko, s čimer se omogočita pretok reciklata, ki je približno enak pretoku pritoka, ki ga je treba uporabiti, in razvoj anaerobnega območja v usedenem blatu (geometrija črpalke ‚airlift‘ omejuje minimalni pretok povratnega blata na približno 12-kratnik pretoka pritoka), | — | blato se lahko v presledkih črpa iz usedalnika v prezračevalno posodo (npr. 5 minut vsake 2,5 h, da se reciklira od 1 l/h do 1,5 l/h), | — | za preprečitev izgube zaradi penjenja se lahko uporabi nestrupeno sredstvo proti penjenju v minimalni koncentraciji (npr. silikonsko olje), | — | skozi blato v usedalniku se lahko v kratkih udarnih curkih spušča zrak (npr. 10 sekund vsako uro), | — | organski medij se lahko v prezračevalno posodo odmerja v presledkih (npr. od 3 do 10 minut vsako uro). | Vzorčenje in analiza | 44. | V rednih presledkih je treba meriti koncentracijo raztopljenega kisika, temperaturo in vrednost pH aktivnega blata v prezračevalnih posodah. Zagotoviti je treba, da je vedno na voljo dovolj kisika (> 2 mg/l) in da se temperatura vzdržuje v zahtevanem obsegu (običajno 20 do 25 °C). Vrednost pH je treba vzdrževati pri 7,5 ± 0,5 z odmerjanjem majhnih količin anorganske baze ali kisline v prezračevalno posodo ali pritok ali s povečevanjem puferske sposobnosti organskega medija (glej odstavek 27). Pri nitrifikaciji nastane kislina, pri čemer pri oksidaciji 1 mg N nastane ekvivalent približno 7 mg CO3 –. Pogostost meritev je odvisna od parametra, ki ga je treba izmeriti, in stabilnosti sistema, lahko pa se izvajajo dnevno ali tedensko. | 45. | Izmeriti je treba DOC ali KPK v pritokih v kontrolne in preskusne posode. S specifično analizo je treba izmeriti koncentracijo preskusne kemikalije v preskusnem pritoku ali jo oceniti na podlagi koncentracije v osnovni raztopini (odstavek 31), uporabljene količine in količine odpadne vode, odmerjene v preskusno enoto. Priporočljivo je, da se koncentracija preskusne kemikalije izračuna, da se zmanjša variabilnost podatkov o koncentraciji. | 46. | Iz zbranega iztoka je treba vzeti primerne vzorce (npr. 24-urne sestavljene vzorce) in jih filtrirati skozi membrano z velikostjo por 0,45 μm ali jih približno 15 minut centrifugirati pri približno 40 000 m/s2. Centrifugiranje je treba uporabiti, če je filtriranje težavno. DOC ali KPK je treba določiti vsaj v dveh ponovitvah, da se s specifično analizo za preskusno kemikalijo izmeri končna biološka razgradnja in po potrebi primarna biološka razgradnja. | 47. | Uporaba KPK lahko pri nizkih koncentracijah povzroči analitične težave, zato se priporoča samo, če je uporabljena dovolj visoka preskusna koncentracija (približno 30 mg/l). Prav tako se za kemikalije, ki se močno adsorbirajo, priporoča, da se količina adsorbirane kemikalije v blatu izmeri z analitsko tehniko, specifično za preskusno kemikalijo. | 48. | Pogostost vzorčenja je odvisna od pričakovanega trajanja preskusa. Priporoča se vzorčenje trikrat na teden. Ko enote učinkovito delujejo, je treba omogočiti prilagajanje, ki traja od 1 do največ 6 tednov po vnosu preskusne kemikalije, da se doseže stabilno stanje. Po možnosti je treba za oceno rezultata preskusa pridobiti najmanj 15 veljavnih vrednosti v fazi konstantne ravni (odstavek 59), ki običajno traja 3 tedne. Preskus se lahko konča, če je dosežena zadostna stopnja odstranitve (npr. > 90-odstotna) in je na voljo teh 15 vrednosti, ki predstavljajo analize, ki so se 3 tedne izvajale vsak delovni dan. Običajno preskus ne sme trajati več kot 12 tednov po tem, ko je bila dodana preskusna kemikalija. | 49. | Če se v blatu začne nitrifikacija in je treba preučiti učinke preskusne kemikalije na nitrifikacijo, je treba vzorce iz iztoka preskusne in kontrolne enote vsaj enkrat tedensko analizirati za določitev amonija in/ali nitrita in nitrata. | 50. | Vse analize je treba izvesti čim prej, zlasti določitve dušika. Če je treba analize odložiti, je treba vzorce shraniti v temnem prostoru v polnih in tesno zaprtih steklenicah pri približno 4 °C. Če je treba vzorce shraniti za več kot 48 h, jih je treba globoko zamrzniti, acidificirati (npr. 10 ml/l raztopine 400 g/l žveplove kisline) ali dodati primerno strupeno snov (npr. 20 ml/l raztopine 10 g/l živosrebrovega (II) klorida). Zagotoviti je treba, da tehnika shranjevanja ne vpliva na rezultate analize. | Spajanje preskusnih enot | 51. | Če bodo uporabljene spojene enote (Dodatek 3), je treba dnevno izmenjati enako količino aktivnega blata (150 ml do 1 500 ml za prezračevalne posode, ki vsebujejo 3 litre suspenzije) med prezračevalnimi posodami preskusne enote in njene kontrolne enote. Če se preskusna kemikalija močno adsorbira na blato, je treba zamenjati samo supernatant iz usedalnikov. V obeh primerih je treba za izračun rezultatov preskusa uporabiti korekcijski faktor (odstavek 55). | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 52. | Za vsako časovno določeno oceno se izračuna delež odstranitve DOC ali KPK preskusne kemikalije, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | Dt | = | odstotni delež odstranitve DOC ali KPK v času t, | Cs | = | DOC ali KPK v pritoku zaradi preskusne kemikalije, po možnosti ocenjen na podlagi osnovne raztopine (mg/l), | E | = | izmerjena vrednost DOC ali KPK v preskusnem iztoku v času t (mg/l), | Eo | = | izmerjena vrednost DOC ali KPK v kontrolnem iztoku v času t (mg/l). | 53. | Stopnja odstranitve DOC ali KPK organskega medija v kontrolni enoti je koristna informacija pri oceni biorazgradne dejavnosti aktivnega blata med preskusom. Delež odstranitve se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | DB | = | odstotni delež odstranitve DOC ali KPK organskega medija v kontrolni enoti v času t, | CM | = | DOC ali KPK organskega medija v kontrolnem pritoku (mg/l). | Po želji se lahko izračuna tudi delež odstranitve DOC ali KPK zaradi organskega medija in preskusne kemikalije v preskusni enoti, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | DT | = | odstotni delež odstranitve DOC ali KPK celotnega preskusnega pritoka, | CT | = | DOC ali KPK celotnega preskusnega pritoka ali izračunan na podlagi osnovnih raztopin (mg/l). | 54. | Pri vsaki časovno določeni oceni se izračuna odstranitev preskusne kemikalije, če je bila izmerjena s specifično analitsko metodo, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | DST | = | odstotni delež primarne odstranitve preskusne kemikalije v času t, | Si | = | izmerjena ali ocenjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem pritoku (mg/l), | Se | = | izmerjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem iztoku v času t (mg/l). | 55. | Če je bil uporabljen sistem spojenih enot, je treba razredčenje preskusne kemikalije v prezračevalni posodi zaradi izmenjave blata izravnati s korekcijskim faktorjem (glej Dodatek 3). Če sta bila uporabljena srednji hidravlični zadrževalni čas 6 h in izmenjava polovice količine aktivnega blata v prezračevalni posodi, je treba določene vrednosti dnevne odstranitve (Dt, odstavek 52) popraviti, da se izračuna dejanska stopnja odstranitve, Dtc, preskusne kemikalije, za kar se uporabi enačba: | Izražanje rezultatov preskusa | 56. | Delež odstranitve Dt (ali Dtc) in Dst, če je na voljo, se prikaže grafično v odvisnosti od časa (glej Dodatek 2). Na podlagi oblike krivulje odstranitve preskusne kemikalije (per se ali kot DOC) se lahko izpeljejo nekatere ugotovitve o procesu odstranjevanja. | Adsorpcija | 57. | Če se velika odstranitev DOC pri preskusni kemikaliji opazi na začetku preskusa, se preskusna kemikalija verjetno odstranjuje z adsorpcijo na trdne snovi aktivnega blata. To je mogoče dokazati z določitvijo adsorbirane preskusne kemikalije s specifično analizo. Odstranitev DOC pri kemikalijah, ki se adsorbirajo, redko ostane visoka med celotnim preskusom; po navadi je stopnja odstranitve visoka na začetku, nato postopoma pade na ravnotežno vrednost. Če pa bi lahko preskusna kemikalija, ki se adsorbira, tako ali drugače povzročila aklimatizacijo mikrobne populacije, bi se odstranitev DOC pri preskusni kemikaliji povečala in dosegla visoko vrednost konstantne ravni. | Faza prilagajanja | 58. | Kot pri statičnih presejalnih preskusih je pri številnih preskusnih kemikalijah pred popolno biološko razgradnjo potrebna faza prilagajanja. V njej se bakterije, ki razgrajujejo, aklimatizirajo ali prilagodijo skoraj brez odstranjevanja preskusne kemikalije; nato nastopi začetna rast teh bakterij. Ta faza se konča, za fazo razgradnje pa se šteje, da se je začela, ko je odstranjenih približno 10 % začetne količine preskusne kemikalije (po dopuščeni adsorpciji, če se zgodi). Faza prilagajanja je pogosto zelo spremenljiva in težko ponovljiva. | Faza konstantne ravni | 59. | Faza konstantne ravni krivulje odstranjevanja v kontinuiranem preskusu je opredeljena kot faza, v kateri je razgradnja največja. Trajati mora vsaj 3 tedne in imeti približno 15 izmerjenih veljavnih vrednosti. | Srednja stopnja odstranitve preskusne kemikalije | 60. | Izračuna se srednja vrednost na podlagi vrednosti odstranitve (Dt) preskusne kemikalije v fazi konstantne ravni. Ta stopnja, ki je zaokrožena na najbližje celo število (1 %), je stopnja odstranitve preskusne kemikalije. Priporoča se tudi, da se izračuna 95-odstotni interval zaupanja za srednjo vrednost. | Odstranitev organskega medija | 61. | Delež odstranitve DOC ali KPK organskega medija v kontrolni enoti (DB) se prikaže grafično v odvisnosti od časa. Srednja stopnja odstranitve se navede enako kot pri preskusni kemikaliji (odstavek 60). | Znak biološke razgradnje | 62. | Če se preskusna kemikalija ne adsorbira znatno na aktivno blato in ima krivulja odstranitve značilno obliko krivulje biološke razgradnje s fazo prilagajanja, fazo razgradnje in fazo konstantne ravni (odstavka 58 in 59), je mogoče izmerjeno odstranitev zanesljivo pripisati biološki razgradnji. Če se veliko preskusne kemikalije odstrani že na začetku, simulacijski preskus ne more razlikovati med biološkim in abiotskim procesom odstranitve. V takih in drugih primerih, v katerih obstaja dvom o biološki razgradnji (npr. pri ločevanju (stripping)), je treba analizirati adsorbirane preskusne kemikalije ali opraviti dodatne statične preskuse biološke razgradnje na podlagi parametrov, ki jasno nakazujejo biološke procese. Taki preskusi so metode porabe kisika (poglavje C.4-D, E in F te priloge (6)), ali preskus z merjenjem nastajanja ogljikovega dioksida (poglavje C.4-C te priloge (6)), ali metoda nadprostora ISO (18), pri kateri se uporabi predhodno izpostavljeni inokulum iz simulacijskega preskusa. Če sta bili izmerjeni odstranitev DOC in odstranitev specifične kemikalije, velike razlike med odstranjenimi deleži (pri čemer je prva vrednost nižja od druge) kažejo, da so bili v iztokih vmesni organski produkti, ki se morda težje razgradijo kot matična kemikalija. | Veljavnost rezultatov preskusa | 63. | Informacije o običajnem biorazgradnem obnašanju inokuluma se pridobijo, če je določena stopnja odstranitve organskega medija (odstavek 53) v kontrolni enoti. Preskus je treba šteti za veljaven, če je stopnja odstranitve DOC ali KPK v kontrolnih enotah po dveh tednih > 80-odstotna in če ni bilo opaženega nič nenavadnega. | 64. | Če je bila uporabljena lahko biološko razgradljiva (referenčna) kemikalija, mora biti stopnja biološke razgradnje (Dt, odstavek 52) > 90-odstotna. | 65. | Če preskus poteka v nitrifikacijskih pogojih, mora biti srednja koncentracija v iztokih < 1 mg/l amonijevega dušika in < 2 mg/l nitritnega dušika. | 66. | Če ta merila (odstavki 63 do 65) niso izpolnjena, je treba preskus ponoviti z inokulumom iz drugega vira, preskusiti referenčno kemikalijo in pregledati vse poskusne postopke. | Poročilo o preskusu | 67. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | identifikacijski podatki, | — | fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti. | | Preskusni pogoji: | — | vrsta preskusnega sistema; spremembe za preskuse netopnih in hlapnih kemikalij, | — | vrsta organskega medija, | — | delež in vrsta industrijskih odplak v odpadni vodi, če sta znana, | — | inokulum, vrsta in mesta vzorčenja, koncentracija in predobdelava, | — | založna raztopina preskusne kemikalije: vsebnost DOC in TOC; kako je pripravljena, če je suspenzija; uporabljena preskusna koncentracija; razlogi za odstopanje od razpona 10–20 mg/l DOC; metoda dodajanja; datum prvega dodajanja; spremembe, | — | srednja starost blata in srednji hidravlični zadrževalni čas; metoda odstranjevanja odvečnega blata; metode za preprečevanje kopičenja, izgube blata itd., | — | uporabljene analitske tehnike, | — | temperatura med preskusom, | — | lastnosti kopičenja blata, volumski indeks blata (VIB), koncentracija aktivnega blata (MLSS), | — | odstopanja od standardnih postopkov in okoliščine, ki bi lahko vplivale na rezultate. | | Rezultati preskusa: | — | vsi izmerjeni podatki (DOC, KPK, specifične analize, pH, temperatura, koncentracija kisika, suspendirane trdne snovi, dušikove snovi, če je ustrezno), | — | vse izračunane vrednosti Dt (ali Dtc), DB, DSt v tabelarni obliki in krivuljah odstranitve, | — | informacije o fazi prilagajanja in fazi konstantne ravni, trajanju preskusa, stopnji odstranitve preskusne kemikalije in organskega medija v kontrolni enoti, statistične informacije ter izjave o biološki razgradljivosti in veljavnosti preskusa, | — | obravnava rezultatov. | VIRI: | (1) | Swisher, R. D. (1987). ‚Surfactant Biodegradation‘, 2. izdaja, Marcel Dekker Inc. New York, 1085 str. | (2) | Nemška vlada (1962). Uredba o razgradljivosti detergentov v pralnih in čistilnih sredstvih. Bundesgesetzblatt, Pt. 1, št. 49: 698–706. | (3) | Painter, H. A., in King, E. F. (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, Združeno kraljestvo. | (4) | Painter, H. A., in King, E. F. (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909–915. | (5) | Eckenfelder, W. W. (19), US EPA. | (6) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti. | (7) | Poglavje C.12 te priloge, Biorazgradnja – Spremenjeni SCAS preskus. | (8) | Poglavje C.19 te priloge, Ocenjevanje adsorpcijskega koeficienta (K OC ) tal in odpadnega blata (blata iz čistilnih naprav) s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). | (9) | Gerike, P., in Fischer, W. K. (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3: 157–173. | (10) | Gerike, P., in Fischer, W. K. (1981), kot (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55. | (11) | Painter, H. A., in Bealing, D. (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test, str. 113–138, V: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Ur. Jacobsen, B. N., Muntau, H., Angeletti, G. | (12) | ISO 11733 (1995; revidiran 2004). Vrednotenje odstranjevanja in biorazgradljivosti organskih snovi v vodi – simulacijski preskus z aktivnim blatom. | (13) | Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33–48. | (14) | Birch, R. R. (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340–343. | (15) | Gerike, P., Fischer, W. K., in Holtmann, W. (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat. Res. 14: 753–758. | (16) | Baumann, U., Kuhn, G., in Benz, M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220. | (17) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials, str. 91–98 ISBN 011 751661 9. | (18) | ISO 14593 (1998). Kakovost vode – Vrednotenje končne biorazgradljivosti organskih spojin v vodi. Metoda z analizo anorganskega ogljika v zaprtih posodah. | Dodatek 1 | Slika 1 | Oprema za ocenjevanje biološke razgradljivosti | Husmannova enota | A. | Posoda za shranjevanje | B. | Dozirna črpalka | C. | Prezračevalna komora (prostornina 3 l) | D. | Usedalnik | E. | Črpalka ‚airlift‘ | F. | Zbiralna posoda | G. | Prezračevalo | H. | Merilnik pretoka zraka | Slika 2 | Oprema za ocenjevanje biološke razgradljivosti | Porozna posoda | A. | Posoda za shranjevanje | B. | Dozirna črpalka | C. | Porozna prezračevalna posoda | D. | Zunanja neprepustna posoda | E. | Zbiralna posoda | F. | Difuzor | G. | Merilnik pretoka zraka | Slika 3 | Podrobnosti o 3-litrski porozni prezračevalni posodi | Dodatek 2 | Primer krivulje odstranjevanja | Dodatek 3 | [INFORMATIVNO] | SPAJANJE PRESKUSNIH ENOT | Da bi poskušali izenačiti populacije mikrobov v blatu v preskusni enoti, v katero priteka odpadna voda s preskusno kemikalijo, in kontrolni enoti, v katero priteka samo odpadna voda, je bila uvedena dnevna izmenjava blata (1). Postopek je bil poimenovan spajanje, metoda pa je znana kot spojene enote. Spajanje se je sprva izvajalo s Husmannovimi enotami z aktivnim blatom, vendar pa se je izvajalo tudi z enotami poroznih posod (2) (3). Med rezultati nespojenih in spojenih enot ni bilo ugotovljenih bistvenih razlik, najsi so bile uporabljene Husmannove enote ali porozne posode, zato čas in energija, vložena v spajanje enot, ne prinašata nobenih koristi. | Izmenjave blata lahko ustvarijo videz precej velike odstranitve, ker se del preskusne snovi prenese in se koncentracije preskusne kemikalije v preskusnem in kontrolnem iztoku skoraj izenačijo. Zato je treba uporabiti korekcijske faktorje, ki so odvisni od izmenjanega deleža in srednjega hidravličnega zadrževalnega časa. Objavljenih je bilo več podrobnosti o izračunu (1). | Izračuna se popravljena stopnja odstranitve DOC ali KPK, za kar se uporabi splošna formula: | pri čemer je: | Dtc | = | popravljeni odstotni delež odstranitve DOC ali KPK, | Dt | = | določeni odstotni delež odstranitve DOC ali KPK, | a | = | delež izmenjane količine med enotami z aktivnim blatom, | r | = | srednji hidravlični zadrževalni čas (h). | Če se na primer izmenja polovica količine aktivnega blata v prezračevalnem bazenu (a = 0,5) in je srednji hidravlični zadrževalni čas 6 h, je korekcijska formula naslednja: | VIRI: | (1) | Fischer, W., Gerike, P., Holtmann, W. (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135. | (2) | Painter, H. A., Bealing, D. J. (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test, str. 113–138. V: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Ur. Jacobsen, B. N., Muntau, H., Angeletti, G. | (3) | Painter, H. A., King, E. F. (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, Združeno kraljestvo. | Dodatek 4 | VREDNOTENJE ZAVIRANJA AKTIVNEGA BLATA | Postopek s preskusnimi kemikalijami | 1. | Lahko se zgodi, da se kemikalija (ali odpadna voda) pri simulacijskem preskusu ne razgradi ali odstrani ter ima celo zaviralni učinek na mikroorganizme v blatu. Druge kemikalije se biološko razgradijo pri nizkih koncentracijah, pri višjih koncentracijah pa so zaviralne (hormeza). Zaviralni učinki se lahko pokažejo v zgodnejši fazi ali pa se določijo s preskusom strupenosti, pri katerem se uporabi inokulum, ki je podoben ali enak inokulumu, uporabljenemu pri simulacijskem preskusu (1). Take metode so zaviranje porabe kisika (poglavje C.11 te priloge (2) in ISO 8192 (3)) ali zaviranje rasti mikroorganizmov v blatu (ISO 15522 (4)). | 2. | Pri simulacijskem preskusu se zaviranje pokaže tako, da je razlika v raztopljenem organskem ogljiku (DOC) ali kemijski potrebi po kisiku (KPK) med iztokom iz preskusne posode in iztokom iz kontrolne enote večja od DOC, ki je dodan kot preskusna kemikalija. Z drugimi besedami, delež odstranitve DOC (in biokemijske potrebe po kisiku (BPK), kemijske potrebe po kisiku (KPK) in/ali NH+ 4) obdelanega organskega medija se zaradi preskusne kemikalije zmanjša. Če se to zgodi, je treba preskus ponavljati z zniževanjem koncentracije preskusne kemikalije, dokler ni dosežena raven, na kateri ni zaviranja, in morda z nadaljnjim zniževanjem koncentracije, dokler ni preskusna kemikalija biološko razgrajena. Če pa preskusna kemikalija (ali odpadna voda) negativno vpliva na proces pri vseh preskušenih koncentracijah, to nakazuje, da je kemikalijo težko, če ne celo nemogoče biološko obdelati, vendar pa bi bilo morda koristno preskus ponoviti z aktivnim blatom iz drugega vira in/ali omogočiti postopnejšo aklimatizacijo blata. | 3. | V nasprotnem primeru, če je preskusna kemikalija biološko odstranjena pri prvem poskusu v simulacijskem preskusu, je treba njeno koncentracijo povišati, če je treba vedeti, ali bi lahko bila zaviralna. | 4. | Ko se poskušajo določiti stopnje zaviranja, je treba upoštevati, da se lahko populacija aktivnega blata spreminja, tako da lahko sčasoma mikroorganizmi postanejo odporni proti zaviralni kemikaliji. | 5. | Izračun stopnje zaviranja: | Skupni delež odstranitve Ro, BPK, DOC, KPK itd. za preskusno in kontrolno enoto se lahko izračuna z enačbo: | pri čemer je: | I | = | koncentracija BPK, DOC, KPK itd. v pritoku za preskusno ali kontrolno posodo (mg/l), | E | = | zadevne koncentracije v iztoku (mg/l). | I in E je treba popraviti za DOC zaradi preskusne kemikalije v preskusnih enotah, sicer bodo izračuni deleža zaviranja nepravilni. | Stopnja zaviranja, ki jo povzroči preskusna kemikalija, se lahko izračuna z enačbo: | pri čemer je: | Rc | = | delež odstranitve v kontrolnih posodah, | Rt | = | delež odstranitve v preskusnih posodah. | VIRI: | (1) | Reynolds, L., idr. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259. | (2) | Poglavje C.11 te priloge, Biorazgradnja – Preskus zaviranja dihanja aktivnega blata. | (3) | ISO 8192 (2007) Kakovost vode – Preskus inhibicije porabe kisika z aktivnim blatom za oksidacijo ogljika in amonija. | (4) | ISO 15522 (1999) Kakovost vode – Določanje zaviralnega učinka sestavin vode na rast mikroorganizmov aktivnega blata. | Dodatek 5 | Slabo vodotopne preskusne kemikalije – hlapne kemikalije | Slabo vodotopne kemikalije | V zvezi z uporabo slabo vodotopnih in netopnih kemikalij v preskusih za simulacijo čiščenja odpadne vode je bilo objavljenih le malo poročil (1) (2) (3). | Ne obstaja ena sama metoda za dispergiranje preskusne kemikalije, ki bi se uporabljala za vse netopne kemikalije. Za poskus dispergiranja preskusnih kemikalij pri simulacijskem preskušanju bi se zdeli primerni dve od štirih metod, opisanih v ISO 10634 (4): uporaba emulgatorjev in/ali ultrazvoka. Ugotoviti je treba vsaj 24-urno stabilnost nastale disperzije. Primerno stabilizirane disperzije, ki se hranijo v zbiralniku s stalnim mešanjem (odstavek 38), se nato odmerijo v prezračevalni bazen ločeno od gospodinjske (ali sintetične) odpadne vode. | Če so disperzije stabilne, je treba preučiti, kako se lahko preskusna kemikalija določi v dispergirani obliki. DOC verjetno ne bo primeren, zato bo treba določiti posebno analitsko metodo za preskusno kemikalijo, ki jo bo mogoče uporabiti za iztoke, trdne snovi v iztoku in aktivno blato. Usoda preskusne kemikalije pri simulaciji procesa z aktivnim blatom bo nato določena v tekoči in trdni fazi. Določi se torej ‚masna bilanca‘, na podlagi katere se ugotavlja, ali je bila preskusna kemikalija biološko razgrajena. Vendar bo to pomenilo samo primarno biološko razgradnjo. Končno biološko razgradnjo je treba poskusiti dokazati z respirometričnim preskusom za dobro biološko razgradljivost (poglavje C.4 te priloge (5), C, F ali D), pri katerem se kot inokulum uporabi blato, izpostavljeno preskusni kemikaliji v simulacijskem preskusu. | Hlapne kemikalije | Uporaba simulacij čiščenja odpadne vode za hlapne kemikalije je sporna in problematična. Podobno, kot pri slabo vodotopnih preskusnih kemikalijah, je bilo tudi o simulacijskih preskusih s hlapnimi kemikalijami objavljenih zelo malo poročil. Klasična naprava s popolnim premešanjem je prilagojena z zatesnitvijo prezračevalnega bazena in usedalnika, pri čemer se pretok zraka meri in nadzoruje z merilniki pretoka, izhodni plin pa prehaja skozi lovilnike za zbiranje hlapnih organskih snovi. V nekaterih primerih vakuumska črpalka usmeri izhodni plin skozi ‚hladni‘ lovilnik ali lovilnik ‚izpihni in ujemi‘, ki vsebuje Tenax ali silikagel za analize s plinsko kromatografijo. Preskusno kemikalijo v lovilniku je mogoče določiti analitično. | Preskus se izvaja v dveh delih. Enote najprej delujejo brez blata, vendar s sintetično odpadno vodo in preskusno kemikalijo, ki se črpa v prezračevalni bazen. Nekaj dni se zbirajo in analizirajo vzorci pritoka, iztoka in izhodnega plina, da se določi preskusna kemikalija. Na podlagi zbranih podatkov se lahko izračuna delež (Rvs) preskusne kemikalije, izločene iz sistema. | Nato se opravi običajni biološki preskus (z blatom) pri enakih obratovalnih pogojih kot pri raziskavi izločanja. Izmerita se tudi DOC ali KPK, s čimer se preveri učinkovitost delovanja enot. Opravijo se občasne analize, s katerimi se določi preskusna kemikalija v pritoku, iztoku in izhodnem plinu v prvem delu preskusa; po aklimatizaciji se analize izvajajo pogosteje. Tudi tu se lahko na podlagi podatkov v stabilnem stanju izračuna delež odstranitve preskusne kemikalije iz tekoče faze z vsemi procesi (RT) (fizikalnimi in biološkimi) in tudi delež (RV), izločen iz sistema. | Izračun: | (a) | Pri nebiološkem preskusu se lahko delež (RVP) preskusne snovi, izločene iz sistema, izračuna z enačbo: | pri čemer je: | RVP | = | odstranitev preskusne kemikalije s hlapenjem (%), | SVP | = | preskusna kemikalija, zbrana v lovilniku, izražena kot ekvivalent koncentracije v tekoči fazi (mg/l), | SIP | = | koncentracija preskusne kemikalije v pritoku (mg/l). | (b) | Pri biološkem preskusu se lahko delež (RV) preskusne snovi, izločene iz sistema, izračuna z enačbo: | pri čemer je: | RV | = | odstranitev preskusne kemikalije sz uplinjanjem pri biološkem preskusu (%), | SV | = | preskusna kemikalija, zbrana v lovilniku pri biološkem preskusu, izražena kot ekvivalent koncentracije v tekočem pritoku (mg/l), | SI | = | koncentracija preskusne kemikalije v pritoku (mg/l). | (c) | Pri biološkem preskusu je delež (RT) preskusne kemikalije, odstranjene z vsemi procesi, podan z enačbo: | pri čemer je: | SE= koncentracija preskusne kemikalije v (tekočem) iztoku (mg/l). | (d) | Delež (RBA), odstranjen z biološko razgradnjo in adsorpcijo, se torej lahko izračuna z enačbo: | Opraviti je treba ločene preskuse, da bi ugotovili, ali je preskusna kemikalija adsorbirana; če je, se lahko izvede nadaljnji popravek. | (e) | Primerjava med deležem preskusne kemikalije, izločene iz sistemov biološkega (Rv) in nebiološkega preskusa (Rvp), kaže splošni učinek, ki ga je biološka obdelava imela na emisijo preskusne kemikalije v ozračje. | Primer: | benzen | Zadrževalni čas blata = 4 dni | Sintetična odpadna voda; zadrževalni čas = 8 ur | SIP | = | SI = 150 mg/l | SVP | = | 150 mg/l (SEP = 0) | SV | = | 22,5 mg/l | SE | = | 50 μg/l | Torej: | RVP | = | 100 %, RV = 15 % | RT | = | 100 % in RBA = 85 %. | Za benzen se je domnevalo, da se ne adsorbira na blato. | VIRI: | (1) | Horn, J. A., Moyer, J. E., Hale, J. H. (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854. | (2) | Pitter, P., Chudoba, J. (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, ZDA. | (3) | Stover, E. L., Kincannon, D. F (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97. | (4) | ISO 10634 (1995) Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgradljivosti v vodi. | (5) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti. | Dodatek 6 | Učinki zadrževalnega časa blata (SRT) na možnost obdelave kemikalij | UVOD | 1. | Metoda, opisana v glavnem besedilu, je bila zasnovana za ugotovitev, ali se lahko preskusne kemikalije (običajno tiste, za katere je znano, da so inherentno, vendar ne dobro biološko razgradljive) biološko razgradijo v okvirih, določenih v čistilnih napravah. Rezultati so izraženi v deležu odstranitve in deležu biološke razgradnje. Pogoji delovanja enot z aktivnim blatom in izbira pritoka omogočajo precej različne koncentracije preskusne kemikalije v iztoku. Preskusi se izvajajo pri samo eni nazivni koncentraciji trdnih snovi v blatu ali enem nazivnem zadrževalnem času blata (SRT), opisani sistemi odstranjevanja odvečnega blata pa lahko povzročijo velika nihanja vrednosti SRT med preskusom, in sicer od enega do drugega dne in tudi v enem dnevu. | 2. | V tej različici (1) (2) se SRT v celotnem 24-urnem obdobju vzdržuje v veliko ožjih mejah (tako, kot pri velikih sistemih), kar vodi do bolj konstantne koncentracije v iztokih. Priporoča se gospodinjska odpadna voda, ker omogoča doslednejše in večje deleže odstranitve. Preučijo se tudi učinki vrste vrednosti SRT, s podrobnejšim preučevanjem pa se lahko določijo učinki različnih temperatur na koncentracijo v iztoku. | 3. | Ni še splošnega soglasja o tem, kateri kinetični modeli delujejo pri biološki razgradnji kemikalij v pogojih čistilne naprave za odpadne vode. Za zbrane podatke je bil izbran Monodov model rasti bakterij in uporabe substrata (1) (2), saj je bila metoda namenjena samo uporabi za kemikalije, ki se proizvajajo v velikih količinah in so tako v odpadnih vodah prisotne v koncentracijah, višjih od 1 mg/l. Veljavnost poenostavljenega modela in izdelanih predpostavk je bila določena z nizom alkoholnih etoksilatov, ki imajo različne stopnje primarne biološke razgradljivosti (2) (3). | Opomba: | v tej različici se večinoma natančno upošteva besedilo preskusne metode C.10-A, zato so v nadaljevanju navedene samo tiste podrobnosti, ki se razlikujejo. | NAČELO PRESKUSA | 4. | Enote poroznih posod z aktivnim blatom, zasnovane za olajšanje (skoraj) kontinuiranega odstranjevanja suspenzije aktivnega blata, ki omogoča zelo natančen nadzor nad zadrževalnim časom blata (SRT ali θs), obratujejo v nespojenem načinu pri različnih SRT in lahko tudi pri različnih temperaturah. Zadrževalni čas je običajno 2 do 10 dni, temperatura pa 5 do 20 °C. Odpadna voda, po možnosti gospodinjska, in raztopina preskusne kemikalije se ločeno odmerjata v enote s hitrostjo, s katero se dosežeta zahtevani zadrževalni čas odpadne vode (3 do 6 ur) in zahtevana koncentracija preskusne kemikalije v pritoku. Kontrolne enote, v katere se preskusna kemikalija ne dovaja, zaradi primerjave obratujejo vzporedno. | 5. | Uporabijo se lahko druge vrste naprav, vendar je treba zelo paziti, da se doseže dober nadzor nad SRT. Na primer, pri uporabi naprav, ki vključujejo usedalnik, bo morda treba upoštevati izgubo trdnih snovi prek iztoka iz naprave. Poleg tega je treba predvideti tudi posebne previdnostne ukrepe, da se preprečijo napake zaradi spreminjanja količine blata v usedalniku. | 6. | Enote obratujejo pri vsakem izbranem nizu pogojev, in ko je doseženo ravnotežje, se v približno treh tednih dobijo povprečne koncentracije preskusne kemikalije v iztokih v stacionarnem stanju in (neobvezno) DOC. Poleg ocene deleža odstranitve preskusne kemikalije in (neobvezno) DOC je v grafični obliki izraženo razmerje med obratovalnimi pogoji naprave in koncentracijo v iztoku. Na podlagi tega poskusa se lahko izračunajo okvirne kinetične konstante in napovejo pogoji, v katerih se lahko preskusna kemikalija obdela. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 7. | Uporabljata se odstavka 12 in 13 poglavja C.10-A. | RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA | 8. | Uporabljata se odstavka 14 in 15 poglavja C.10-A. | REFERENČNA PRESKUSNA KEMIKALIJA | 9. | Uporablja se odstavek 16 poglavja C.10-A. | PONOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA | 10. | Uporabljata se odstavka 17 in 18 poglavja C.10-A. | OPIS METODE | Naprava | 11. | Primerna enota je modificirani sistem poroznih posod (Dodatek 6.1). Sestavlja ga notranja posoda (ali vložek), narejena iz poroznega polipropilena debeline 3,2 mm in z velikostjo por približno 90 μm, stik pa je soležno čelno zvarjen. (Enota je tako bolj robustna kot tista, opisana v odstavku 21 tega poglavja C.10-A.) Vložek je vstavljen v neprepustno zunanjo posodo iz polietilena, ki je sestavljena iz dveh delov: krožnega podnožja, v katero so izvrtane luknje za dva voda za zrak in vod za odstranjevanje odvečnega blata, ter zgornjega valja, ki je z vijaki pritrjen na podnožje in ima odvod nameščen tako, da omogoča znano prostornino (3 l) v porozni posodi. Eden od vodov za zrak je opremljen z difuzorjem, drugi pa je odprt in postavljen pravokotno na difuzor v posodi. Ta sistem proizvaja potrebno vrtinčenje za zagotovitev, da je vsebina posode popolnoma premešana in da so zagotovljene koncentracije raztopljenega kisika, ki so večje od 2 mg/l. | 12. | Ustrezno število enot se vzdržuje pri nadzorovani temperaturi v razponu 5 do 20 °C (± 1 °C) bodisi v vodnih kopelih bodisi v prostorih s stalno temperaturo. Potrebni sta črpalki za odmerjanje raztopine preskusne kemikalije in usedenega blata v prezračevalne posode s potrebnim pretokom (0–1,0 ml/min oziroma 0–25 ml/min) ter tretja črpalka za odstranjevanje odpadnega blata iz prezračevalnih posod. Potreben zelo majhen pretok odpadnega blata se doseže s črpalko, ki je nastavljena na večji pretok in deluje v presledkih z uporabo časovnega stikala, npr. delovanje 10 sekund na minuto, pretok črpalke 3 ml/min, s čimer se doseže pretok odvečnega blata 0,5 ml/min. | Naprava za filtriranje ali centrifuga | 13. | Uporablja se odstavek 23 poglavja C.10-A. | Analitska oprema | 14. | Uporablja se odstavek 24 poglavja C.10-A. | Voda | 15. | Uporabljata se odstavka 25 in 26 poglavja C.10-A. | Organski medij | 16. | Uporablja se odstavek 27 poglavja C.10-A. | Sintetična odpadna voda | 17. | Uporablja se odstavek 28 poglavja C.10-A. | Gospodinjska odpadna voda | 18. | Uporablja se odstavek 29 poglavja C.10-A. | Aktivno blato | 19. | Uporablja se odstavek 30 poglavja C.10-A. | Založne raztopine preskusne kemikalije | 20. | Uporabljata se odstavka 31 in 32 poglavja C.10-A. | POSTOPEK | Priprava inokuluma | 21. | Uporablja se samo odstavek 34 poglavja C.10-A – uporaba aktivnega blata (približno 2,5 g/l). | Število preskusnih enot | 22. | Pri preprostem preskusu, pri katerem se izmeri delež odstranitve, je potreben samo en SRT, da pa bi dobili podatke, potrebne za izračun okvirnih kinetičnih konstant, pa so potrebne 4 ali 5 vrednosti SRT. Običajno se izberejo vrednosti od 2 do 10 dni. Pripravno je izvesti preskus pri 4 ali 5 SRT sočasno pri eni temperaturi; pri obsežnejših raziskavah se iste vrednosti SRT ali morda različen razpon vrednosti uporabijo pri drugih temperaturah v razponu od 5 do 20 °C. Za primarno biološko razgradnjo (glavna uporaba) je običajno potrebna samo ena enota na niz pogojev. Vendar je za končno biološko razgradljivost za vsak niz pogojev potrebna kontrolna enota, v katero se dovaja odpadna voda, ne pa tudi preskusna kemikalija. Če se domneva, da je v uporabljeni odpadni vodi preskusna kemikalija, je treba pri oceni primarne biološke razgradnje uporabiti kontrolne enote in opraviti potrebne popravke v izračunih. | Odmerjanje organskega medija in preskusne kemikalije | 23. | Uporabljajo se odstavki 36 do 39 poglavja C.10-A, vendar je treba upoštevati, da se raztopina preskusne kemikalije odmerja ločeno in da se uporabljajo različni pretoki odvečnega blata. Pogosto je treba tudi spremljati in po potrebi prilagoditi – za ± 10 % – pretok pritokov, iztokov in odstranjevanja odvečnega blata, npr. dvakrat na dan. Če se pri uporabi gospodinjske odpadne vode pojavijo težave pri analitskih metodah, je treba preskus izvesti s sintetično odpadno vodo, vendar je treba zagotoviti, da različni mediji dajejo primerljive kinetične podatke. | Ravnanje z enotami z aktivnim blatom | 24. | Uporabljajo se odstavki 40 do 43 poglavja C.10-A, vendar je treba SRT nadzorovati samo s ‚konstantnim‘ pretokom odvečnega blata. | Vzorčenje in analiza | 25. | Uporabljajo se odstavki 44 do 50 poglavja C.10-A, le da je treba določiti koncentracijo preskusne kemikalije, poljubno pa tudi DOC; KPK naj se ne bi uporabljal. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 26. | Uporabljajo se odstavki 52 do 54 poglavja C.10-A. | Izražanje rezultatov preskusa | 27. | Uporabljajo se odstavki 56 do 62 poglavja C.10-A. | Izračun kinetičnih konstant | 28. | Realneje je navesti srednjo koncentracijo preskusne kemikalije v iztoku v stacionarnem stanju in opisati, kako se spreminja glede na obratovalne pogoje v napravi, kot navesti delež primarne biološke razgradnje. To se lahko stori z enačbo (6) iz Dodatka 6.2, s katero lahko dobimo vrednosti za KS, μm in θSC, kritični zadrževalni čas blata. | (Približne vrednosti KS in μm se lahko dobijo tudi s preprostim računalniškim programom, ki teoretično krivuljo, izračunano z enačbo 2 (Dodatek 6.2), prilagodi dobljenim poskusnim vrednostim. Čeprav nobena dana rešitev ne bo edinstvena, je mogoče dobiti razumen približek KS in μm.) | Variabilnost rezultatov | 29. | Iz izkušenj je znano, da se za posamezne kemikalije dobijo variabilne vrednosti kinetičnih parametrov. Domneva se, da pogoji, v katerih je bilo blato gojeno, in pogoji, ki vladajo pri uporabljenem preskusu (kot v odstavku 5 in pri drugih preskusih), zelo vplivajo na dobljene vrednosti. En vidik te variabilnosti so obravnavali Grady idr. (4), ki so predlagali, da je treba za dvoje skrajnih stanj, ki predstavljata meje fiziološkega stanja, ki ga kultura lahko doseže med kinetičnim poskusom, uporabiti izraza ‚obstoječe‘ in ‚intrinzično‘ uporabiti za dvoje skrajnih pogojev, Če se stanje med preskusom ne sme spremeniti, vrednosti kinetičnega parametra izražajo pogoje v okolju, iz katerega so bili mikroorganizmi vzeti; te vrednosti se imenujejo ‚obstoječe‘ ali trenutne. V drugem skrajnem primeru, če so pogoji pri preskusu taki, da omogočajo popoln razvoj sistema za sintezo beljakovin, ki omogoča največjo mogočo hitrost rasti, se za dobljene kinetične parametre šteje, da so ‚intrinzični‘, ter so odvisni samo od narave substrata in vrst bakterij v kulturi. Na primer, obstoječe vrednosti bodo dobljene z ohranjanjem nizkega razmerja med koncentracijo substrata in kompetentnimi mikroorganizmi (So/Xo), npr. 0,025, intrinzične vrednosti pa nastopajo, ko je to razmerje visoko, npr. vsaj 20. V obeh primerih mora biti So enak ustrezni vrednosti konstante polovičnega nasičenja Ks ali jo presegati. | 30. | Variabilnost in druge plati kinetike biološke razgradnje so bile obravnavane na nedavni delavnici SETAC (5). Iz takih raziskav, objavljenih in načrtovanih, bi moral izhajati jasnejši pogled na kinetiko, ki deluje v čistilnih napravah, da bi bilo mogoče bolje razlagati podatke in predlagati ustreznejše načrte za prihodnje preskusne metode. | VIRI: | (1) | Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33–48. | (2) | Birch, R. R. (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340–343. | (3) | Birch, R. R. (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422. | (4) | Grady, C. P. L, Smets, B. F., in Barbeau, D. S. (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742–748. | (5) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Delavnica v Port Sunlightu, ZK. Ur. Hales, S. G., Feitjel, T., King, H., Fox, K., Verstraete, W., 4.–6. sept. 1996. SETAC Europe, Bruselj. | Dodatek 6.1 | Porozna posoda z nadzorom SRT | Dodatek 6.2 | Izračun kinetičnih konstant | 1. | Ob predpostavki, da se uporablja Monodova kinetika, in ob upoštevanju masne bilance aktivnih trdnih snovi in substrata v sistemu z aktivnim blatom (1) je mogoče dobiti naslednji enačbi, ki opisujeta stacionarno stanje: | [1] | ali | [2] | pri čemer je: | S1 | = | koncentracija substrata v iztoku (mg/l), | KS | = | konstanta polovičnega nasičenja, koncentracija, pri kateri μ = μm/2 (mg/l), | μ | = | specifična hitrost rasti (d–1), | μm | = | največja vrednost μm(d–1), | Kd | = | specifična hitrost odmiranja aktivnih trdnih snovi (d–1), | θS | = | srednji zadrževalni čas blata, SRT (d). | Preučitev te enačbe vodi do naslednjih ugotovitev: | (i) | koncentracija v iztoku je neodvisna od koncentracije v pritoku (S0); zato se delež biološke razgradnje spreminja s koncentracijo v pritoku S0; | (ii) | edini parameter nadzora naprave, ki vpliva na S1, je zadrževalni čas blata θS; | (iii) | za dano koncentracijo v pritoku S0 obstaja kritični zadrževalni čas blata, tako da velja: | [3] | pri čemer je: | θSC= kritični zadrževalni čas blata, pred potekom katerega so mikroorganizmi odplaknjeni iz naprave; | (iv) | ker so drugi parametri v enačbi (2) povezani s kinetiko rasti, temperatura verjetno vpliva na raven substrata v iztoku in kritično starost blata, tj. zadrževalni čas blata, potreben za dosego določene stopnje obdelave, bi se z zniževanjem temperature povečeval. | 2. | Iz masne bilance trdnih snovi v sistemu poroznih posod in ob predpostavki, da je koncentracija trdnih snovi v iztoku iz naprave X2 nizka v primerjavi s koncentracijo v prezračevalni posodi X1, je zadrževalni čas blata: | [4] | in | pri čemer je: | V | = | prostornina prezračevalne posode (l), | X1 | = | koncentracija trdnih snovi v prezračevalni posodi (mg/l), | X2 | = | koncentracija trdnih snovi v iztoku (mg/l), | Q0 | = | pretok pritoka (l/d), | Q1 | = | pretok odpadnega blata (l/d). | Zadrževalni čas blata je torej pri kateri koli predhodno izbrani vrednosti mogoče nadzorovati z nadzorom nad pretokom odvečnega blata Q1. | Sklepne ugotovitve | 3. | Glavni namen preskusa je torej omogočiti napovedovanje koncentracije v iztoku in s tem ravni preskusne kemikalije v vodi, v katero se dovaja. | 4. | Z grafičnim prikazom S1 v odvisnosti od θS je mogoče včasih takoj oceniti kritični zadrževalni čas blata θSC, npr. krivulja 3 na sliki 1. Če to ni mogoče, se θSC, skupaj s približnima vrednostma μm in KS, lahko izračuna z grafičnim prikazom S1 v odvisnosti od S1•θS. | Enačba (1) se preoblikuje takole: | [5] | Če je Kd majhen, potem 1 + θs • Kd ~ 1 in [5] se spremeni v naslednjo enačbo: | [6] | Grafični prikaz bi torej moral biti ravna črta (glej sliko 2) z naklonom 1/μm in sečiščem KS/μm; tudi θS ~1/μm. | Slika 1 | Tri temperature; pet SRT | Slika 2 | Regresijska premica SRT · S1 v odvisnosti od S1 pri T = 5 °C | Glosar: | Koncentracija v iztoku | Krivulja | Dodatek 7 | PRESKUS PRI NIZKIH KONCENTRACIJAH (μg/l) | 1. | Številne kemikalije so običajno v vodnem okolju in celo v odpadnih vodah v zelo nizkih koncentracijah (μg/l). Pri takih koncentracijah verjetno ne delujejo kot primarni substrati za rast, ampak se verjetneje razgradijo kot sekundarni substrati, ki ne posredujejo pri rasti, sočasno z vrsto naravno prisotnih ogljikovih snovi. Posledično razgradnja takih kemikalij ni primerna za model, opisan v Dodatku 6. Uporabiti bi bilo mogoče številne modele, v pogojih, ki vladajo v sistemih za čiščenje odpadnih voda, pa lahko sočasno deluje več kot en model. Za osvetlitev te težave bo potrebnih veliko več raziskav. | 2. | Medtem se lahko uporablja postopek, naveden v glavnem besedilu (poglavje C.10-A), vendar samo za primarno biološko razgradljivost, pri čemer se uporabijo primerno nizke koncentracije (< 100 μg/l) in potrjen analitski postopek. Delež biološke razgradnje se lahko izračuna (glej odstavek 54 preskusne metode), če se upoštevajo abiotični procesi (adsorpcija, hlapnost itd.). Primer je raziskava Nyholma in njegovih sodelavcev (1) (2), pri kateri je bil uporabljen 4-urni ciklus v sistemu ‚napolni in izprazni‘. Poročali so o konstantah psevdo prvega reda za 5 kemikalij, dodanih v sintetično odpadno vodo pri koncentraciji 5 do 100 μg/l. (Za dokončno biološko razgradljivost se lahko uporabijo preskusne kemikalije, označene s 14C.) Opis tega presega obseg uporabe te preskusne metode, saj za zdaj še ni dogovorjenih postopkov, čeprav predlagana metoda za standard ISO 14592 (3) vsebuje navodilo za uporabo kemikalij, označenih s 14C. | Preskus SCAS | 3. | Pozneje je bil predlagan preprostejši dvostopenjski preskus (4) (5) (6); metodi polkontinuiranega aktivnega blata (SCAS) sledijo kratkoročni kinetični preskusi na vzorcih, odvzetih iz enot SCAS. Sistem SCAS deluje z znanimi hitrostmi odstranjevanja odvečnega blata (v nasprotju s prvotno preskusno metodo iz poglavja C.12), vanj pa se dovaja spremenjena sintetična odpadna voda OECD ali gospodinjska odpadna voda. Sintetična odpadna voda je bila spremenjena (zaradi spremenljive vrednosti pH in slabe usedljivosti blata) z dodatkom fosfata kot puferja, kvasnega ekstrakta, železovega (III) klorida in soli elementov v sledovih, njen COD pa je bil povečan na približno 750 mg/l s povečanjem koncentracije peptona in mesnega ekstrakta. Enote so delovale v 24-urnem ciklu: prezračevanje 23 ur, odstranjevanje odvečnega blata, usedanje, odvzem supernatanta (iztok), ki jim sledi dodajanje sintetične odpadne vode in preskusne kemikalije do 100 μg/l (tj. pri približno enaki koncentraciji kot pri kratkoročnem preskusu). Enkrat tedensko je bilo 10 % vsega blata nadomeščenih s svežim blatom, da se je ohranila uravnotežena mikrobna populacija. | 4. | Koncentracije preskusne kemikalije se izmerijo na začetku in koncu prezračevanja, preskus pa se nadaljuje, dokler ni doseženo konstantno odstranjevanje preskusne kemikalije; to traja od enega tedna do več mesecev. | Kratkoročni preskus | 5. | Kratkoročni preskus (npr. 8 ur) se uporabi za določitev konstante kinetike (psevdo) prvega reda za razgradnjo preskusne kemikalije v aktivnem blatu znanega, a različnega izvora in razvoja. Zlasti se vzorci blata vzamejo iz reaktorjev SCAS – ob koncu prezračevalnega obdobja, ko je koncentracija organskega substrata nizka – med potekom poskusa aklimatizacije (odstavka 3 in 4). Blato se za primerjavo lahko vzame tudi iz vzporedne enote SCAS, ki ni bila izpostavljena preskusni kemikaliji. Mešanice blata in preskusne kemikalije, dodane pri dveh ali več koncentracijah v razponu 1–50 μg/l, se prezračijo, ne da bi se dodala sintetična odpadna voda ali drug organski substrat. Preskusna kemikalija, ki ostane v raztopini, se določa v rednih presledkih, npr. vsako uro, odvisno od razgradljivosti kemikalije, vendar ne več kot 24 ur. Vzorci se pred ustrezno analizo centrifugirajo. | Izračuni | 6. | Podatki iz enot SCAS se uporabijo za izračun deleža odstranitve preskusne kemikalije (odstavek 54). Izračuna se lahko tudi povprečna hitrostna konstanta K1 (normalizirana za koncentracijo suspendiranih trdnih snovi), za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | t | = | čas prezračevanja (23h), | Ce | = | koncentracija ob koncu prezračevalnega obdobja (μg/l), | Ci | = | koncentracija na začetku prezračevanja (μg/l), | SS | = | koncentracija trdnih snovi v aktivnem blatu (g/l). | 7. | Pri kratkoročnem preskusu se log% preostale koncentracije grafično prikaže v odvisnosti od časa, naklon začetnega dela (10–50-odstotna razgradnja) krivulje pa je enak K1, konstanti (psevdo) prvega reda. Konstanta se normalizira glede na koncentracijo trdnih snovi v blatu z delitvijo naklona s koncentracijo trdnih snovi v blata. Prikazani rezultat mora vključevati tudi podrobnosti o začetnih koncentracijah preskusne kemikalije in trdnih snovi, zadrževalnem času blata, nalaganju blata in viru ter podrobnosti o (morebitni) predhodni izpostavljenosti preskusni kemikaliji. | Variabilnost rezultatov | 8. | Variabilnost in druge plati kinetike biološke razgradnje so bile obravnavane na nedavni delavnici SETAC (7). Iz takih raziskav, objavljenih in načrtovanih, bi moral izhajati jasnejši pogled na kinetiko, ki deluje v čistilnih napravah, da bi bilo mogoče bolje razlagati podatke in predlagati ustreznejše načrte za prihodnje preskusne metode. | VIRI: | (1) | Nyholm, N., Jacobsen, B. N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., Dambourg, A., in Schultz, B. (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353. | (2) | Jacobsen, B. N., Nyholm, N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., in Ostfeldt, P. (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510. | (3) | ISO 14592 (ISO/TC 147/ SC5/ WG4, N264) (1998). Kakovost vode – Vrednotenje aerobne biorazgradljivosti organskih spojin pri nizkih koncentracijah v vodi. | (4) | Nyholm, N., Ingerslev, F., Berg, U. T., Pedersen, J. P., in Frimer-Larsen, H. (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864. | (5) | Berg, U. T., in Nyholm, N. (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735. | (6) | Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N., Berg, U. T., Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Köbenhavn. | (7) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Delavnica v Port Sunlightu, Združeno kraljestvo. Ur. Hales, S. G, Feitjel, T., King, H., Fox, K., in Verstraete, W., 4.–6. sept. 1996. SETAC Europe, Bruselj. | C.10-B: Biofilmi | UVOD | 1. | Simulacijski preskusi se običajno uporabljajo za kemikalije, ki niso uspešno opravile presejalnega preskusa za dobro biološko razgradljivost (poglavje C.4-A do F te priloge (9)), vendar so uspešno opravile preskus za inherentno biološko razgradljivost. Simulacijski preskusi se izjemoma uporabijo tudi za kemikalijo, o kateri je potrebnih več informacij, zlasti za kemikalije, ki se proizvajajo v velikih količinah; običajno se uporabi preskus z aktivnim blatom (C.10-A). Vendar pa so v nekaterih okoliščinah potrebne posebne informacije o odzivanju kemikalije na metode čiščenja odpadne vode, ki vključujejo biofilme, to so precejalniki, rotirajoči biološki kontaktorji in reaktorji s tehnologijo vrtinčnih plasti. Za izpolnitev te potrebe so bile razvite različne naprave. | 2. | Gerike idr. (1) so uporabili velike precejalnike v pilotnem merilu, ki so delovali v spojenem načinu. Ti filtri so zavzeli veliko prostora in zahtevali razmeroma veliko odpadne vode ali sintetične odpadne vode. Truesdale idr. (2) so opisali manjše filtre (premer 1,83 × 1,83 metra), v katere so dovajali naravno odpadno vodo brez površinsko aktivnih snovi, vendar so bile še vedno potrebne razmeroma velike količine. Za nastanek ‚zrelega‘ biofilma je bilo potrebnih kar 14 tednov, dodatnih 4 do 8 tednov pa je bilo potrebnih za začetek aklimatizacije po prvem vnosu preskusne površinsko aktivne snovi. | 3. | Baumann idr. (3) so razvili mnogo manjši filter, za katerega so kot nosilni inertni medij uporabili umetno volno iz poliestra, predhodno namočeno v aktivno blato. Preskusna kemikalija je bila uporabljena kot edini vir ogljika, biološka razgradljivost pa je bila ocenjena na podlagi meritev raztopljenega organskega ogljika (DOC) v pritoku in iztoku ter količine CO2 v izhodnem plinu. | 4. | Precej drugačen pristop so uporabili Gloyna idr. (4), ki so izumili rotirajoči cevni reaktor. Na notranji površini rotirajoče cevi so na znani površini vzgojili biofilm, tako da so z vrha cevi, ki je bila pod majhnim kotom nagnjena glede na vodoravno površino, spuščali pritok. Reaktor se je uporabljal za preučevanje biološke razgradljivosti površinsko aktivnih snovi (5), pa tudi za preučevanje optimalne debeline biofilma in difuzije prek njega (6). Slednji avtorji so reaktor razvijali dalje, med drugim so ga spremenili tako, da je mogoče določiti CO2 v izhodnem plinu. | 5. | Stalni odbor analitikov (Združeno kraljestvo) je rotirajoči cevni reaktor sprejel kot standardno metodo za oceno biološke razgradljivosti kemikalij (7), možnosti čiščenja odpadnih voda in njihove strupenosti (8). Prednosti opisane metode so preprostost, pripravnost, ponovljivost in potrebne razmeroma majhne količine organskega medija. | NAČELO PRESKUSA | 6. | Sintetična ali gospodinjska odpadna voda in preskusna kemikalija se v mešanici ali posamezno naneseta na notranjo površino počasi rotirajoče nagnjene cevi. Na notranji površini se ustvari plast mikroorganizmov, podobnih mikroorganizmom na mediju biološkega filtra. Izberejo se pogoji delovanja reaktorja, da se doseže ustrezna odstranitev organske snovi in po potrebi oksidacija amonija. | 7. | Iztok iz cevi se zbere in pusti, da se usede, in/ali filtrira pred analizo za določitev raztopljenega organskega ogljika (DOC) in/ali preskusne kemikalije s posebno metodo. Kontrolne enote, v katere se preskusna kemikalija ne dovaja, zaradi primerjave obratujejo vzporedno v enakih pogojih. Domneva se, da razlika med koncentracijami DOC v iztoku iz preskusne in kontrolne enote nastane zaradi preskusne kemikalije in njenih organskih metabolitov. Ta razlika se primerja s koncentracijo dodane preskusne kemikalije (kot DOC), da se izračuna odstranitev preskusne kemikalije. | 8. | Biološko razgradnjo je običajno mogoče ločiti od biološke adsorpcije s skrbno preučitvijo časovne krivulje odstranitve. Običajno jo je mogoče potrditi s preskusom dobre biološke razgradljivosti (poraba kisika ali nastajanje ogljikovega dioksida), pri katerem se uporabi aklimatizirani inokulum, ob koncu preskusa vzet iz reaktorjev, v katere se dovaja preskusna kemikalija. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 9. | Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani čistost, vodotopnost, hlapnost in adsorpcijske lastnosti preskusne kemikalije. | 10. | Običajno hlapnih in slabo topnih kemikalij ni mogoče preskusiti, če se ne sprejmejo posebni previdnostni ukrepi (glej Dodatek 5 k poglavju C.10-A). Za izračun teoretičnih vrednosti in/ali preverjanje izmerjenih vrednosti parametrov, npr. teoretične potrebe po kisiku (TPK) in DOC, je treba poznati tudi kemično strukturo ali vsaj empirično formulo. | 11. | Informacije o strupenosti preskusne kemikalije za mikroorganizme (glej Dodatek 4 k poglavju C.10-A) so lahko uporabne za izbiro primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgradljivosti. | RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA | 12. | Prvotno se je zahtevalo, da primarna biološka razgradnja površinsko aktivnih snovi doseže 80 % ali več, preden se lahko kemikalija da na trg. Če 80-odstotna vrednost ni dosežena, se lahko uporabi ta simulacijski (potrditveni) preskus, površinsko aktivna snov pa se lahko da na trg samo, če je odstranjenih več kot 90 % določene kemikalije. Pri kemikalijah na splošno ni dvoma o uspešno ali neuspešno prestanem preskusu, dobljena vrednost odstranjenega odstotnega deleža pa se lahko uporabi v približnih izračunih verjetne okoljske koncentracije, ki se uporablja pri ocenah nevarnosti, ki jo pomenijo kemikalije. V vrsti raziskav čistih kemikalij je bilo ugotovljeno, da je bil delež odstranitve DOC > 90-odstotni pri več kot treh četrtinah in > 80-odstotni pri več kot 90 % kemikalij, ki so pokazale kakršno koli pomembno stopnjo biološke razgradljivosti. | REFERENČNE KEMIKALIJE | 13. | Za zagotovitev pravilnega izvajanja poskusnega postopka je občasno koristno preskusiti referenčne kemikalije, katerih obnašanje je znano. Med takimi kemikalijami so adipinska kislina, 2-fenilfenol, 1-naftol, difenil-2,2-dikarboksilna kislina, 1-karboksi naftalenska kislina itd. (9) (10) (11). | PONOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA | 14. | Po ugotovitvah laboratorija iz Združenega kraljestva je relativni standardni odklon v preskusih 3,5-odstotni, med preskusi pa 5-odstotni (7). | OPIS METODE | Naprava | Rotirajoči cevni reaktorji | 15. | Naprava (glej sliki 1 in 2 v Dodatku 8) je sestavljena iz niza akrilnih cevi z dolžino 30,5 cm in notranjim premerom 5 cm, oprtih na kolesca z gumijastim robom v kovinskem nosilnem okvirju. Vsaka cev ima zunanji rob, globok približno 0,5 cm, ki jo drži na kolescih, notranja površina je bila hrapavljena z grobo žičnato volno, na zgornjem (dovodnem) koncu pa je 0,5 cm globok notranji rob, ki zadržuje tekočino. Cevi so nagnjene pod kotom približno 1 stopinje glede na vodoravno površino, da se doseže potrebni kontaktni čas, ko je preskusni medij vnesen v čisto cev. Kolesca z gumijastim robom poganja motor s počasno spremenljivo hitrostjo. Temperatura cevi se nadzoruje s postavitvijo v prostor s konstantno temperaturo. | 16. | Z vstavitvijo vsakega cevnega reaktorja v nekoliko večjo cev, zaprto s pokrovom, ter zagotovitvijo, da so stiki neprepustni za plin, je mogoče v bazični raztopini zbrati izhodni CO2 za nadaljnje meritve (6). | 17. | 24-urna zaloga organskega medija z dodano preskusno kemikalijo, če je ustrezno, za vsako cev je shranjena v 20-litrski posodi za shranjevanje (A) (glej sliko 2). Raztopina preskusne kemikalije se po potrebi lahko odmerja ločeno. Pri dnu vsake posode za shranjevanje je izhod, ki je s cevjo iz primernega materiala, npr. silikonske gume, prek peristaltične črpalke (B) povezan s stekleno ali akrilno dovodno cevjo, ki je potisnjena 2–4 cm v notranjost višjega (dovodnega) konca nagnjene cevi (C). Iztok kaplja iz spodnjega konca nagnjene cevi in se zbira v drugi posodi za shranjevanje (D). Pred analizo se usede ali filtrira. | Naprava za filtriranje ali centrifuga | 18. | Naprava za filtriranje vzorcev z membranskimi filtri ustrezne poroznosti (nazivni premer odprtine 0,45 μm), ki adsorbirajo organske kemikalije ali sprostijo čim manj organskega ogljika. Če se uporabljajo filtri, ki sproščajo organski ogljik, jih je treba skrbno sprati z vročo vodo, da se odstrani izlužljivi organski ogljik. Namesto tega se lahko uporabi centrifuga, ki lahko doseže 40 000 m/s2. | 19. | Analitska oprema za določanje: | — | DOC/celotnega organskega ogljika (TOC) ali kemijske potrebe po kisiku (KPK), | — | določene kemikalije (HPLC, GC itd.), če se to zahteva, | — | vrednosti pH, temperature, kislosti, bazičnosti, | — | amonija, nitrita, nitrata, če se preskus izvaja v nitrifikacijskih pogojih. | Voda | 20. | Vodovodna voda, ki vsebuje manj kot 3 mg/l DOC. | 21. | Destilirana ali deionizirana voda, ki vsebuje manj kot 2 mg/l DOC. | Organski medij | 22. | Kot organski medij so lahko uporabijo sintetične odpadne vode, gospodinjske odpadne vode ali mešanica obojih. Izkazalo se je, da je pri uporabi samo gospodinjske odpadne vode delež odstranitve DOC pogosto večji (v enotah z aktivnim blatom) in da celo omogoča biološko razgradnjo nekaterih kemikalij, ki se biološko ne razgradijo, kadar se uporabi sintetična odpadna voda OECD. Zato se priporoča uporaba gospodinjske odpadne vode. Koncentracijo DOC (ali KPK) je treba izmeriti v vsaki novi šarži organskega medija. Kislost ali bazičnost organskega medija mora biti znana. Mediju bo morda treba dodati primeren pufer (natrijev hidrogen karbonat ali kalijev hidrogen fosfat), če je njegova kislost ali bazičnost nizka, da se med preskusom vrednost pH v reaktorju ohranja pri približno 7,5 ± 0,5. O količini puferja, ki jo je treba dodati, in času, ko ga je treba dodati, je treba odločiti v vsakem primeru posebej. | Sintetična odpadna voda | 23. | V vsakem litru vodovodne vode je treba raztopiti: 160 mg peptona; 110 mg mesnega ekstrakta; 30 mg sečnine; 28 mg brezvodnega dikalijevega hidrogen fosfata (K2HPO4); 7 mg natrijevega klorida (NaCl); 4 mg kalcijevega klorid dihidrata (CaCl2.2H2O) in 2 mg magnezijevega sulfat heptahidrata (Mg2SO4.7H20). Ta sintetična odpadna voda OECD je primer in predstavlja srednjo koncentracijo DOC v pritoku, tj. približno 100 mg/l. Uporabijo se lahko tudi druge sestave s približno enakimi koncentracijami DOC, ki so bolj podobne pravi odpadni vodi. Ta sintetična odpadna voda se lahko pripravi v destilirani vodi v koncentrirani obliki in shranjuje največ en teden pri približno 1 °C. Po potrebi se razredči z vodovodno vodo. (Ta medij je nezadovoljiv, npr. koncentracija dušika je zelo visoka, vsebnost ogljika je razmeroma nizka, vendar ni bilo boljšega predloga, razen, naj se doda več fosfata kot puferja in več peptona.) | Gospodinjska odpadna voda | 24. | Uporabiti je treba svežo usedeno odpadno vodo, ki se dnevno zbira iz čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno gospodinjska odpadna voda. Zbrati jo je treba iz prelivnega kanala primarnega usedalnika ali vtoka v čistilno napravo z aktivnim blatom, biti pa mora večinoma brez grobih delcev. Odpadna voda se lahko uporabi po večdnevnem shranjevanju pri približno 4 °C, če je dokazano, da se DOC (ali KPK) med shranjevanjem ni bistveno zmanjšal (tj. za manj kot 20 %). Da se omejijo motnje v sistemu, je treba DOC (ali KPK) vsake nove šarže pred uporabo uravnati na ustrezno konstantno vrednost, npr. z redčenjem z vodovodno vodo. | Mazivo | 25. | Za mazanje valjčkov peristaltične črpalke se lahko uporablja glicerol ali oljčno olje: oba sta primerna za uporabo pri ceveh iz silikonske gume. | Založne raztopine preskusne kemikalije | 26. | Za kemikalije z ustrezno topnostjo je treba pripraviti osnovne raztopine z ustreznimi koncentracijami (npr. 1 do 5 g/l) v deionizirani vodi ali mineralnem deležu sintetične odpadne vode. Za netopne kemikalije glej Dodatek 5 v poglavju C.10-A. Ta metoda brez sprememb cevnih reaktorjev ni primerna za hlapne kemikalije (odstavek 16). Določiti je treba DOC in TOC osnovne raztopine, meritve pa ponoviti za vsako novo šaržo. Če je razlika med DOC in TOC večja od 20 %, je treba preveriti vodotopnost preskusne kemikalije. DOC ali koncentracijo preskusne kemikalije, izmerjeno s specifično analizo osnovne raztopine, je treba primerjati z nazivno vrednostjo, da se ugotovi, ali je izkoristek dovolj dober (običajno je mogoče pričakovati > 90-odstotnega). Zlasti za disperzije je treba ugotoviti, ali je mogoče DOC uporabiti kot analitski parameter ali ne oziroma ali je mogoče uporabiti samo analitsko tehniko, specifično za preskusno kemikalijo. Za disperzije je potrebno centrifugiranje vzorcev. Pri vsaki novi šarži je treba s specifično analizo izmeriti DOC, KPK ali koncentracijo preskusne kemikalije. | 27. | Določiti je treba pH osnovne raztopine. Skrajne vrednosti kažejo, da dodatek kemikalije lahko vpliva na pH aktivnega blata v preskusnem sistemu. V takem primeru je treba osnovno raztopino nevtralizirati z majhnimi količinami anorganske kisline ali baze, da se doseže vrednost pH 7 ± 0,5, vendar pa je treba preprečiti obarjanje preskusne kemikalije. | POSTOPEK | Priprava organskega medija za odmerjanje | 28. | Zagotoviti je treba, da so vsi vsebniki pritoka in iztoka ter cevi, ki vodijo iz posod za pritok in vanje, povsem čisti, da se prepreči rast mikrobov na začetku in med celotnim preskusom. | 29. | Vsak dan je treba pripraviti svežo sintetično odpadno vodo (odstavek 23), bodisi iz trdnih snovi bodisi iz koncentrirane osnovne raztopine z ustreznim redčenjem z vodovodno vodo. Potrebno količino je treba izmeriti v valju in dodati v čisto posodo za pritok. Po potrebi se sintetični odpadni vodi pred razredčenjem doda tudi potrebna količina osnovne raztopine preskusne kemikalije ali referenčne kemikalije. Če je bolj pripravno ali potrebno, da se prepreči izguba preskusne kemikalije, se pripravi ločena razredčena raztopina preskusne kemikalije v ločenem zbiralniku in se prek druge dozirne črpalke vnese v nagnjene cevi. | 30. | Alternativno (in prednostno) se uporabi usedena gospodinjska odpadna voda (odstavek 24), po možnosti sveža, zbrana vsak dan. | Delovanje rotirajočih cevnih reaktorjev | 31. | Za oceno ene preskusne kemikalije sta potrebna dva enaka cevna reaktorja, ki se namestita v prostoru s konstantno temperaturo, ki običajno znaša 22 ± 2 °C. | 32. | Peristaltične črpalke je treba nastaviti tako, da dovajajo 250 ± 25 ml/h organskega medija (brez preskusne kemikalije) v nagnjene cevi, ki se vrtijo pri 18 ± 2 vrtljajih na minuto. Cevi črpalke je treba na začetku preskusa in med samim preskusom namazati (odstavek 25), da se podaljša njihova življenjska doba in zagotovi pravilno delovanje. | 33. | Kot naklona cevi glede na vodoravno površino je treba nastaviti tako, da se zagotovi zadrževalni čas vtoka v čisti cevi 125 ± 12,5 s. Zadrževalni čas se oceni tako, da se v vtok doda nebiološki marker (npr. NaCl, inertno barvilo): čas, potreben za doseganje najvišje koncentracije v iztoku, se šteje za srednji zadrževalni čas (ko je film največji, se lahko zadrževalni čas poveča do približno 30 min). | 34. | Za te pretoke, hitrosti in čase je bilo ugotovljeno, da zagotavljajo ustrezno odstranitev (> 80-odstotno) DOC (ali KPK) in proizvajajo nitrificirane iztoke. Hitrost pretoka je treba spremeniti, če odstranitev ni zadostna ali če je treba simulirati delovanje določene čistilne naprave. V tem primeru je treba hitrost odmerjanja organskega medija prilagajati, dokler se delovanje reaktorja ne ujema z delovanjem čistilne naprave. | Inokulacija | 35. | Kadar se uporabi sintetična odpadna voda, lahko za začetek rasti mikroorganizmov zadostuje inokulacija z izpostavitvijo zraku, sicer je treba vtoku za 3 dni dodati 1 ml/l usedene odpadne vode. | Meritve | 36. | V rednih presledkih je treba preverjati, ali so stopnje odmerjanja in hitrosti rotiranja v okviru zahtevanih meja. Izmeriti je treba tudi pH iztoka, zlasti če se pričakuje nitrifikacija. | Vzorčenje in analiza | 37. | Metoda, vzorec in pogostost vzorčenja se izberejo glede na namen preskusa. Na primer, vzamejo se enkratni (ali zajemni) vzorci pritoka in iztoka ali pa se vzorci zbirajo dlje, npr. 3 do 6 ur. V prvem obdobju brez preskusne kemikalije je treba vzorce jemati dvakrat tedensko. Treba jih je filtrirati skozi membrane ali jih približno 15 minut centrifugirati pri približno 40 000 m/s2 (odstavek 18). Morda jih bo treba pred filtriranjem skozi membrano pustiti, da se usedejo, in/ali jih prefiltirati skozi grobi filter. DOC (ali KPK) je treba določiti vsaj v dveh ponovitvah, po potrebi pa tudi BPK, amonij in nitrit/nitrat. | 38. | Vse analize je treba izvesti čim prej po zbiranju in pripravi vzorcev. Če je treba analize odložiti, je treba vzorce shraniti v temnem prostoru v polnih in tesno zaprtih steklenicah pri približno 4 °C. Če je treba vzorce shraniti za več kot 48 h, jih je treba globoko zamrzniti, acidificirati ali dodati primerno strupeno kemikalijo (npr. 20 ml/l raztopine 10 g/l živosrebrovega (II) klorida). Zagotoviti je treba, da tehnika shranjevanja ne vpliva na rezultate analize. | Pripravljalno obdobje | 39. | V tem obdobju biofilm na površini raste, da doseže optimalno debelino. To obdobje običajno traja približno 2 tedna, vendar ne sme preseči 6 tednov. Odstranitev (odstavek 44) DOC (ali KPK) se poveča in doseže vrednost konstantne ravni. Ko je v obeh ceveh dosežena podobna vrednost konstantne ravni, se za preostanek preskusa ena cev izbere za kontrolno. V tem času mora njuno delovanje ostati skladno. | Vnos preskusne kemikalije | 40. | Na tej stopnji se v drugi reaktor doda preskusna kemikalija pri potrebni koncentraciji, ki je običajno 10–20 mg C/l. V kontrolno enoto se še naprej dovaja samo organski medij. | Obdobje aklimatizacije | 41. | Še naprej je treba dvakrat na teden izvajati analize za določitev DOC (ali KPK), in če je treba oceniti primarno biološko razgradljivost, s specifično analizo izmeriti tudi koncentracijo preskusne kemikalije. Za aklimatizacijo je potrebnih od 1 do 6 tednov (ali več v posebnih pogojih) po prvem vnosu preskusne kemikalije. Ko delež odstranitve (odstavki 43 do 45) doseže najvišjo vrednost, je treba dobiti 12 do 15 veljavnih vrednosti v fazi konstantne ravni v približno 3 tednih, da se oceni srednji delež odstranitve. Preskus se šteje za končan, če je dosežena dovolj visoka stopnja odstranitve. Običajno preskus ne sme trajati več kot 12 tednov po tem, ko je bila prvič dodana preskusna kemikalija. | Luščenje filma | 42. | Nenadno odstranjevanje velikih količin presežnega filma iz cevi ali luščenje poteka v razmeroma rednih presledkih. Za zagotovitev, da to ne vpliva na primerljivost rezultatov, je treba omogočiti, da preskusi zajemajo vsaj dva polna cikla rasti in luščenja. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 43. | Za vsako časovno določeno oceno se izračuna delež odstranitve DOC (ali KPK) preskusne kemikalije, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | Dt | = | delež odstranitve DOC (ali KPK) pri času t, | Cs | = | koncentracija DOC (ali KPK) v pritoku zaradi preskusne kemikalije, po možnosti ocenjena na podlagi koncentracije v osnovni raztopini in dodane količine (mg/l), | E | = | izmerjena vrednost DOC (ali KPK) v preskusnem iztoku v času t (mg/l), | Eo | = | izmerjena vrednost DOC (ali KPK) v kontrolnem iztoku v času t (mg/l). | Izračun se ponovi za referenčno kemikalijo, če se preskuša. | Delovanje kontrolnega reaktorja | 44. | Delež odstranitve DOC (ali KPK) (DB) organskega medija v kontrolnem reaktorju je koristna informacija pri oceni biorazgradne dejavnosti biofilma med preskusom. Delež odstranitve se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | Cm= DOC (ali KPK) organskega medija v kontrolnem pritoku (mg/l). | 45. | Pri vsaki časovno določeni oceni se izračuna odstranitev (DST) preskusne kemikalije, če je bila izmerjena s specifično analitsko metodo, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | Si | = | izmerjena ali raje ocenjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem pritoku (mg/l), | Se | = | izmerjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem iztoku v času t (mg/l). | Če je z analitsko metodo dobljena pozitivna vrednost v nespremenjeni odpadni vodi enaka S c mg/l, se delež odstranitve (DSC) izračuna z enačbo: | Izražanje rezultatov preskusa | 46. | Delež odstranitve D t in DST (ali DSC), če je na voljo, se prikaže grafično v odvisnosti od časa (glej Dodatek 2 k poglavju C.10-A). Vzame se srednji (zaokrožen na najbližje celo število) in standardni odklon 12–15 vrednosti za DT (in za DST, če je na voljo), pridobljenih v fazi konstantne ravni kot delež odstranitve preskusne kemikalije. Na podlagi krivulje odstranitve se lahko izpeljejo nekatere ugotovitve o procesu odstranjevanja. | Adsorpcija | 47. | Če se velika odstranitev DOC preskusne kemikalije opazi na začetku preskusa, se preskusna kemikalija verjetno odstranjuje z adsorpcijo na biofilm. To je mogoče dokazati z določitvijo adsorbirane preskusne kemikalije na trdnih snoveh, odluščenih s filma. Odstranitev DOC kemikalij, ki se adsorbirajo, redko ostane visoka med celotnim preskusom; po navadi je stopnja odstranitve visoka na začetku, nato pa postopoma pade na ravnotežno vrednost. Če pa bi adsorbirana preskusna kemikalija lahko povzročila aklimatizacijo mikrobne populacije, bi se odstranitev DOC preskusne kemikalije povečala in dosegla visoko vrednost konstantne ravni. | Faza prilagajanja | 48. | Kot pri statičnih presejalnih preskusih je pri številnih preskusnih kemikalijah pred popolno biološko razgradnjo potrebna faza prilagajanja. V njej se kompetentne bakterije aklimatizirajo (ali prilagodijo) skoraj brez odstranitve preskusne kemikalije; nato nastopi začetna rast teh bakterij. Ta faza se konča, za fazo razgradnje pa se poljubno šteje, da se je začela, ko je odstranjenih približno 10 % začetne količine preskusne kemikalije (po dopuščeni adsorpciji, če se zgodi). Faza prilagajanja je pogosto zelo spremenljiva in slabo ponovljiva. | Faza konstantne ravni | 49. | Faza konstantne ravni krivulje odstranjevanja v kontinuiranem preskusu je opredeljena kot faza, v kateri je razgradnja največja. Trajati mora vsaj 3 tedne in imeti približno 12–15 izmerjenih veljavnih vrednosti. | Srednja stopnja odstranitve preskusne kemikalije | 50. | Izračuna se srednja vrednost na podlagi vrednosti odstranitve Dt (in Dst, če je na voljo) preskusne kemikalije v fazi konstantne ravni. Ta stopnja, ki je zaokrožena na najbližje celo število (1 %), je stopnja odstranitve preskusne kemikalije. Priporoča se tudi, da se izračuna 95-odstotni interval zaupanja za srednjo vrednost. Podobno se izračuna tudi srednja stopnja (DB) odstranitve organskega medija v kontrolni posodi. | Znak biološke razgradnje | 51. | Če se preskusna kemikalija ne adsorbira znatno na biofilm in ima krivulja odstranitve značilno obliko krivulje biološke razgradnje s fazo prilagajanja, fazo razgradnje in fazo konstantne ravni (odstavka 48 in 49), je mogoče izmerjeno odstranitev zanesljivo pripisati biološki razgradnji. Če se veliko preskusne kemikalije odstrani že na začetku, simulacijski preskus ne more razlikovati med biološkim in abiotskim procesom odstranitve. V takih in drugih primerih, v katerih obstaja dvom o biološki razgradnji (npr. pri ločevanju (stripping)), je treba analizirati adsorbirano preskusno kemikalijo na vzorcih filma ali opraviti dodatne statične (presejalne) preskuse biološke razgradljivosti na podlagi parametrov, ki jasno nakazujejo biološke procese. Taki preskusi so metode porabe kisika (poglavje C.4-D, E in F te priloge) (9) ali preskus, pri katerem se meri nastajanje CO2 (poglavje C.4-C te priloge ali metoda nadprostora) (10); kot inokulum se uporabi predhodno izpostavljeni biofilm iz ustreznega reaktorja. | 52. | Če sta bili izmerjeni odstranitev DOC in odstranitev specifične kemikalije, velike razlike med odstranjenimi deleži (pri čemer je prva vrednost nižja od druge) kažejo, da so bili v iztokih vmesni organski produkti, ki se morda težje razgradijo; to je treba raziskati. | Veljavnost rezultatov preskusa | 53. | Preskus je treba šteti za veljaven, če je stopnja odstranitve DOC (ali KPK) (DB) v kontrolnih enotah po 2 tednih delovanja > 80-odstotna in če ni bilo opaženega nič nenavadnega. | 54. | Če se je preskušala dobro razgradljiva (referenčna) kemikalija, mora biti stopnja biološke razgradnje > 90-odstotna, razlika med vrednostmi ponovitev pa ne sme biti večja od 5 %. Če ti merili nista izpolnjeni, je treba pregledati poskusne postopke in/ali dobiti gospodinjsko odpadno vodo iz drugega vira. | 55. | Razlike med vrednostmi biološke razgradnje iz podvojenih enot (če se uporabljajo), v katerih se obdeluje preskusna kemikalija, prav tako ne smejo biti večje od 5 %. Če to merilo ni izpolnjeno, vendar so odstranitve visoke, je treba analizo nadaljevati še 3 tedne. Če je odstranitev nizka, je treba preučiti zaviralne učinke preskusne kemikalije, če niso znani, in preskus ponoviti pri nižji koncentraciji preskusne kemikalije, če je to izvedljivo. | Poročilo o preskusu | 56. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | identifikacijski podatki, | — | fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti. | | Preskusni pogoji: | — | spremembe preskusnega sistema, zlasti če se preskušajo netopne ali hlapne snovi, | — | vrsta organskega medija, | — | delež in vrsta industrijskih odpadkov v odpadni vodi, če se uporabljata in sta znana, | — | metoda inokulacije, | — | založna raztopina preskusne kemikalije – vsebnost DOC (raztopljenega organskega ogljika) in TOC (celotnega organskega ogljika); kako je pripravljena, če je suspenzija; uporabljene preskusne koncentracije; razlogi za odstopanje od razpona 10–20 mg/l DOC; metoda dodajanja; datum prvega dodajanja; spremembe v koncentraciji, | — | srednji hidravlični zadrževalni čas (brez rasti); rotacijska hitrost cevi; približen kot naklona, če je mogoče, | — | podrobnosti o luščenju; čas in intenzivnost, | — | preskusna temperatura in razpon, | — | uporabljene analitske tehnike. | | Rezultati preskusa: | — | vsi izmerjeni podatki DOC, KPK, specifične analize, pH, temperatura, dušikove snovi, če je ustrezno, | — | vsi izračunani podatki Dt (ali Dtc), DB, DSt v tabelarni obliki in krivuljah odstranitve, | — | informacije o fazi prilagajanja in fazi konstantne ravni, trajanju preskusa, stopnji odstranitve preskusne kemikalije, referenčne kemikalije (če se preskuša) in organskega medija (v kontrolni enoti), statistični podatki ter izjave o biološki razgradljivosti in veljavnosti preskusa, | — | obravnava rezultatov. | VIRI: | (1) | Gerike, P., Fischer, W., Holtmann, W. (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753–758. | (2) | Truesdale, G. A., Jones, K., Vandyke, K. G. (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material. Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444. | (3) | Baumann, U., Kuhn, G., in Benz, M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220. | (4) | Gloyna, E. F., Comstock, R. F., Renn, C. E. (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357. | (5) | Kumke, G. W., Renn, C. E. (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92–94. | (6) | Tomlinson, T. G., Snaddon, D. H. M. (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int. J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881. | (7) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London. | (8) | Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London. | (9) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti. | (10) | ISO 14593 (1998). Kakovost vode – Vrednotenje končne biorazgradljivosti organskih snovi v vodi. Metoda z analizo sproščenega anorganskega ogljika v zaprtih posodah. | Dodatek 8 | Slika 1 | Rotirajoče cevi | Glosar: | Tloris | Pogled A/B | Gnana kolesa | Negnana kolesa | Pogonski motor | Reduktor | Notranja prirobnica | Nagibni mehanizem | Stožčasti zobnik | Slika 2 | Diagram pretoka | A: Rezervoar | B: Peristaltična črpalka | C: Rotirajoča cev | D: Zbiralnik iztoka | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Kemikalije: ‚Opozoriti je treba, da se izraz ‚kemikalija‘ v sporazumih UNCED in nadaljnjih dokumentih uporablja v širokem pomenu ter vključuje snovi, proizvode, zmesi, pripravke ali vse druge izraze, ki se lahko v obstoječih sistemih uporabijo za označevanje vključenosti.‘ | ‘ | (9) | Chapter C.10 is replaced by the following: | ‘C.10. SIMULATION TESTAEROBIC SEWAGE TREATMENT: C.10-A: ACTIVATED SLUDGE UNITS — C.10-B: BIOFILMS | C.10-A: Activated Sludge Units | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 303 (2001). In the 1950s it was realised that the newly introduced surfactants caused excessive foaming in waste water treatment plants and in rivers. They were not fully removed in the aerobic treatment and in some cases limited the removal of other organic matter. This instigated many investigations into how surfactants could be removed from waste waters and whether new chemicals produced by industry were amenable to waste water treatment. In order to do this, model units were used representing the two main types of aerobic biological waste water treatment (activated sludge and percolating, or trickling, filtration). It would have been impractical and very costly to distribute each new chemical and to monitor large-scale treatment plants, even on a local basis. | INITIAL CONSIDERATIONS | Activated sludge units | 2. | Model activated sludge units have been described ranging in size from 300 ml up to about 2 000 ml. Some closely mimicked full-scale plants, having sludge settlement tanks with settled sludge being pumped back to the aeration tank, while others provided no settlement facilities e.g. Swisher (1). The size of the apparatus is a compromise; on the one hand, it must be large enough for successful mechanical operation and for the provision of sufficient volume of samples without affecting the operation, while on the other hand it should not be so large that it demands excessive space and materials. | 3. | Two forms of apparatus which have been extensively and satisfactorily used are the Husmann units (2) and Porous Pot units (3)(4), first used in the study of surfactants; these are described in this Test Method. Others have also been used satisfactorily, e.g. Eckenfelder (5). Because of the relatively high cost and effort of applying this simulation test, simpler and cheaper screening tests, now embodied in chapter C.4 A-F of this Annex (6) were investigated in parallel. Experience with many surfactants and other chemicals has shown that those which passed the screening tests (readily biodegradable) also degraded in the simulation test. Some of those failing the screening tests passed the inherent biodegradability tests (chapters C.12 (7) and C.19 (8) of this Annex) but only some of this latter group were degraded in the simulation test, while those chemicals which failed tests for inherent biodegradability did not degrade in the simulation tests (9)(10)(11). | 4. | For some purposes simulation tests carried out under a single set of operating conditions are sufficient; the results are expressed as a percentage removal of the test chemical or of dissolved organic carbon (DOC). A description of such a test is given in this test method. However, unlike the previous version of this chapter, which described only one type of apparatus treating synthetic sewage in the coupled mode using a relatively crude method of sludge wastage, this text offers a number of variations. Alternatives to the type of apparatus, mode of operation, sewage and sludge wastage removal are described. This text closely follows that of ISO 11733 (12), which was carefully scrutinised during its preparation, though the method has not been subject to a ring test. | 5. | For other purposes the concentration of the test chemical in the effluent is required to be known more accurately and for this a more extensive method is needed. For example, the sludge wastage rate must be more precisely controlled throughout each day and throughout the period of the test, and units have to be run at a number of wastage rates. For a fully comprehensive method, tests should also be run at two or three different temperatures: such a method is described by Birch (13)(14) and summarised in Appendix 6. However, present knowledge is insufficient to decide which of the kinetic models are applicable to the biodegradation of chemicals in waste water treatment and in the aquatic environment generally. The application of Monod kinetics, given in Appendic 6 as an example, is limited to chemicals present at 1 mg/l and above, but in the opinion of some even this remains to be substantiated. Tests at concentrations more truly reflecting those found in waste waters are indicated, in Appendix 7, but such tests, and those in Appendix 6, are included in Appendices instead of being issued as separate Test Methods. | Filters | 6. | Much less attention has been given to model percolating filters, perhaps because they are more cumbersome and less compact than activated sludge plant models. Gerike et al developed trickling filter units and operated them in the coupled mode ((15). These filters were relatively large (height 2 m; volume 60 l) and each required as much as 2 l/h of sewage. Baumann et al (16), simulated trickling filters by inserting polyester “fleece” strips into 1 m tubes (14 mm int. diameter) after the strips had been immersed in concentrated activated sludge for 30 min. The test chemical as sole C source in a mineral salts solution was fed down the vertical tube and biodegradation was assessed from measurements of DOC in the effluent and CO2 in the issuing gas. | 7. | Biofilters have been simulated in another way (15); the inner surfaces of rotating tubes, inclined at a small angle to the horizontal, were fed with sewage (about 250 ml/h) with and without the test chemical, and the collected effluents analysed for DOC and/or the specific test chemical. | PRINCIPLE OF THE TEST | 8. | This method is designed to determine the elimination and the primary and/or ultimate biodegradation of water-soluble organic chemicals by aerobic micro-organisms in a continuously operated test system simulating the activated sludge process. An easily biodegradable organic medium and the organic test chemical are the sources of carbon and energy for the micro-organisms. | 9. | Two continuously operated test units (activated sludge plants or porous pots) are run in parallel under identical conditions which are chosen to suit the purpose of the test. Normally the mean hydraulic retention time is 6 h and the mean sludge age (sludge retention time) is 6 to 10 days. Sludge is wasted by one of two methods, the test chemical is normally added at a concentration of between 10 mg/l dissolved organic carbon (DOC) and 20 mg/l DOC, to the influent (organic medium) of only one of the units. The second unit is used as a control unit to determine the biodegradation of the organic medium. | 10. | In frequently taken samples of the effluents, the DOC, preferably, or chemical oxygen demand (COD) is determined, together with the concentration of the test chemical (if required) by specific analysis, in the effluent from the unit receiving the test chemical. The difference between the effluent concentrations of DOC or COD in the test and control units is assumed to be due to the test chemical or its organic metabolites. This difference is compared with the influent concentration of DOC or COD due to the added test chemical in order to determine the elimination of the test chemical. | 11. | Biodegradation may normally be distinguished from bioadsorption by careful examination of the elimination-time curve and may usually be confirmed by applying a test for ready biodegradation using an acclimatised inoculum from the unit receiving the test chemical. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 12. | The purity, water solubility, volatility and adsorption characteristics of the test chemical should be known to enable correct interpretation of results to be made. Normally volatile and insoluble chemicals cannot be tested unless special precautions are taken (see Appendix 5). The chemical structure, or at least the empirical formula, should also be known in order to calculate theoretical values and/or to check measured values of parameters, e.g. theoretical oxygen demand (ThOD), dissolved organic carbon (DOC) and chemical oxygen demand (COD). | 13. | Information on the toxicity of the test chemical to micro-organisms (see Appendix 4) may be useful for selecting appropriate test concentrations and may be essential for the correct interpretation of low biodegradation values. | PASS LEVELS | 14. | In the original application of this simulation (confirmatory) test to the primary biodegradation of surfactants, a removal of more than 80 % of the specific chemical is required before the surfactant may be marketed. If the value of 80 % is not attained, this simulation (confirmatory) test may be applied and the surfactant may be marketed only if more than 90 % of the specific chemical is removed. With chemicals in general there is no question of pass/fail and the value of percentage removal obtained can be used in proximate calculations of the probable environmental concentration to be used in hazard assessments posed by chemicals. Results tend to follow an all or nothing pattern. In a number of studies of pure chemicals the percentage removal of DOC was found to be > 90 % in more than three quarters and > 80 % in over 90 % of chemicals which showed any significant degree of biodegradability. | 15. | Relatively few chemicals (e.g. surfactants) are present in sewage at the concentrations (about 10 mg C/l) used in this test. Some chemicals may be inhibitory at these concentrations, while the kinetics of removal of others may be different at low concentrations. A more accurate assessment of the degradation could be made by using modified methods, using realistically low concentrations of the test chemical, and the data collected could be used to calculate kinetic constants. However, the necessary experimental techniques have not yet been fully validated and neither have the kinetic models, which describe the biodegradation reactions, been established (see Appendix 7). | REFERENCE CHEMICALS | 16. | To ensure that the experimental procedure is being carried out correctly, it is useful occasionally to test chemicals whose behaviour is known simultaneously when test chemicals are investigated. Such chemicals include adipic acid, 2-phenyl phenol, 1-naphthol, diphenic acid, 1-naphthoic acid, etc. (9)(10)(11). | REPRODUCIBILITY OF TEST RESULTS | 17. | There have been far fewer reports of studies of simulation tests than of tests for ready biodegradability. Reproducibility between (simultaneous) replicates is good (within 10-15 %) for test chemicals degraded by 80 % or more but for less well degraded chemicals variability is greater. Also, with some borderline chemicals widely disparate results (e.g. 10 %, 90 %) have been recorded on different occasions within the 9 weeks allowed in the test. | 18. | Little difference has been found in results obtained with the two types of apparatus, but some chemicals have been more extensively and consistently degraded in the presence of domestic sewage than with OECD synthetic sewage. | DESCRIPTION OF THE TEST METHOD | Apparatus | Test system | 19. | The test system for one test chemical consists of a test unit and a control unit; but when only specific analyses are performed (primary biodegradation) only a test unit is required. One control unit can be used for several test units receiving either the same or different test chemicals. In the case of coupling (Appendix 3) each test unit must have its own control unit. The test system may be either an activated sludge plant model, Husmann unit (Appendx 1, Figure 1) or a porous pot (Appendix 1, Figure 2). In both cases storage vessels of sufficient size for the influents and effluents are needed, as well as pumps to dose the influent, either mixed with solution of the test chemical or separately. | 20. | Each activated sludge plant unit consists of an aeration vessel with a known capacity of about 3 litres of activated sludge and a separator (secondary clarifier) which holds about 1,5 litres; the volumes can, to some extent, be changed by adjusting the height of the separator. Vessels of different sizes are permissible if they are operated with comparable hydraulic loads. If it is not possible to keep the temperature in the test room in the desired range, the use of water-jacketed vessels with temperature controlled water is recommended. An airlift pump or a dosing pump is used to recycle the activated sludge from the separator to the aeration vessel, either continuously or intermittently at regular intervals. | 21. | The porous pot system consists of an inner, porous cylinder with a conical bottom held in a slightly larger vessel of the same shape, but made of an impervious plastic material. A suitable material for the porous vessel is porous polyethylene of maximum pore size 90 μm and 2 mm thickness. Separation of the sludge from the treated organic medium is effected by differential passage through the porous wall. Effluents collect in the annular space from where it overflows into the collecting vessel. No settlement occurs and hence there is no sludge return. The whole system may be mounted in a thermostatically controlled water-bath. Porous pots become blocked and could overflow in the initial stages. In such a case, replace the porous liner with a clean one by first siphoning the sludge from the pot into a clean bucket and removing the blocked liner. After wiping out the impervious outer cylinder insert a clean liner and return the sludge to the pot. Any sludge adhering to the sides of the blocked liner is also carefully scraped off and transferred. Clean blocked pots first by using a fine jet of water to remove remaining sludge and by soaking in dilute sodium hypochlorite solution, then in water, followed by thoroughly rinsing with water. | 22. | For aeration of the sludge in the aeration vessels of both systems, suitable techniques are required, for example sintered cubes (diffuser stones) and compressed air. The air shall be cleaned, if necessary, by passing through a suitable filter and washed. Sufficient air must pass through the system to maintain aerobic conditions and to keep sludge flocs in suspension at all times during the test. | Filtration apparatus or centrifuge | 23. | Device for filtration of samples with membrane filters of suitable porosity (nominal aperture diameter 0,45 μm) which adsorb soluble organic chemicals and release organic carbon to a minimum degree. If filters are used which release organic carbon, wash the filters carefully with hot water to remove leachable organic carbon. Alternatively, a centrifuge capable of producing 40 000 m/s2 may be used. | Analytical equipment | 24. | Apparatus required to determine: | — | DOC(dissolved organic carbon) and TOC (total organic carbon), or COD (chemical oxygen demand); | — | specific chemical, if required; | — | suspended solids, pH, oxygen concentration in water; | — | temperature, acidity and alkalinity; | — | ammonium, nitrite and nitrate, if the test is performed under nitrifying conditions. | Water | 25. | Tap water, containing less than 3 mg/l DOC. Determine the alkalinity if not already known. | 26. | Deionised water, containing less than 2 mg/l DOC. | Organic medium | 27. | Synthetic sewage, domestic sewage or a mixture of both is permissible as the organic medium. It has been shown (11)(14) that the use of domestic sewage alone often gives increased percentage DOC removal and even allows the removal and biodegradation of some chemicals which are not biodegraded when OECD synthetic sewage is used. Also, the constant or intermittent addition of domestic sewage often stabilises the activated sludge, including the crucial ability to settle well. Thus, the use of domestic sewage is recommended. Measure the DOC or COD concentration in each new batch of organic medium. The acidity or alkalinity of the organic medium should be known. The organic medium may require the addition of a suitable buffer (sodium hydrogen carbonate or potassium dihydrogen phosphate) if it is of low acidity or alkalinity, to maintain a pH of about 7,5 ± 0,5 in the aeration vessel during the test. The amount of buffer to be added, and when to add it, has to be decided in each individual case. When mixtures are used either continuously or intermittently, the DOC (or COD) of the mixture must be kept at an approximately constant value, e.g. by dilution with water. | Synthetic sewage | 28. | Dissolve in each litre of tap water: peptone, 160 mg; meat extract, 110 mg; urea, 30 mg; anhydrous dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4), 28 mg; sodium chloride (NaCl), 7 mg; calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O), 4 mg; magnesium sulphate heptahydrate (Mg2SO4.7H20), 2 mg. This OECD synthetic sewage is an example and gives a mean DOC concentration in the influent of about 100 mg/l. Alternatively, use other compositions, with about the same DOC concentration, which are closer to real sewage. If a less concentrated influent is required, dilute the synthetic sewage, for example 1:1, with tap water to obtain a concentration of about 50 mg/l. Such a weaker influent will allow better growth of nitrifying organisms and this modification should be used if the simulation of nitrifying waste water plants is to be investigated. This synthetic sewage may be made up in distilled water in a concentrated form and stored at about 1 °C for up to one week. When needed, dilute with tap water. (This medium is unsatisfactory e.g. nitrogen concentration is very high, relatively low carbon content, but nothing better has been suggested, except to add more phosphate as buffer and extra peptone). | Domestic sewage | 29. | Use fresh settled sewage collected daily from a treatment works receiving predominantly domestic sewage. It should be collected, prior to primary sedimentation, from the overflow channel of the primary sedimentation tank, or from the feed to the activated sludge plant, and be largely free from coarse particles. The sewage can be used after storage for several days (but generally should not exceed seven days) at about 4 °C, if it is proved that the DOC (or COD) has not significantly decreased (i.e. by less than 20 %) during storage. In order to limit disturbances to the system, the DOC (or COD) of each new batch should be adjusted before use to an appropriate constant value, e.g. by dilution with tap water. | Activated sludge | 30. | Collect activated sludge for inoculation from the aeration tank of a well operated waste water treatment plant or from a laboratory — scale activated sludge unit, treating predominantly domestic sewage. | Stock solutions of test chemical | 31. | For chemicals of adequate solubility, prepare stock solutions at appropriate concentrations (e.g. 1 to 5 g/l) in deionised water, or in the mineral portion of the synthetic sewage. (for insoluble and volatile chemicals, see Appendix 5). Determine the DOC and total organic carbon (TOC) of the stock solution and repeat the measurements for each new batch. If the difference between the DOC and TOC is greater than 20 %, check the water-solubility of the test chemical. Compare the DOC or the concentration of the test chemical measured by specific analysis of the stock solution with the nominal value, to ascertain whether recovery is good enough (normally > 90 % can be expected). Ascertain, especially for dispersions, whether or not DOC can be used as an analytical parameter or if only an analytical technique specific for the test chemical can be used. Centrifugation of the samples is required for dispersions. For each new batch, measure the DOC, COD or the test chemical with specific analysis. | 32. | Determine the pH of the stock solution. Extreme values indicate that the addition of the chemical may have an influence on the pH of the activated sludge in the test system. In this case neutralise the stock solution to obtain a pH of 7 ± 0,5 with small amounts of inorganic acid or base, but avoid precipitation of the test chemical. | PROCEDURE | 33. | The procedure is described for the activated sludge plant units; it has to be slightly adapted for the porous pot system. | Preparation of the inoculum | 34. | Inoculate the test system at the beginning of the test with either activated sludge or an inoculum containing a low concentration of micro-organisms. Keep the inoculum aerated at room temperature until it is used and use it within 24 h. In the first case, take a sample of activated sludge from the aeration tank of an efficiently operated biological waste water treatment plant, or a laboratory treatment plant, which receives predominantly domestic sewage. If nitrifying conditions are to be simulated, take sludge from a nitrifying waste water treatment plant. Determine the concentration of suspended solids and, if necessary, concentrate the sludge by settling so that the volume added to the test system is minimal. Ensure that the starting concentration of dry matter is about 2,5 g/l. | 35. | In the second case, use 2 ml/l to 10 ml/l of an effluent from a domestic biological waste water treatment plant as an inoculum. To get as many different species of bacteria as possible, it may be helpful to add inocula from various other sources, for example surface water. In this case, the activated sludge will develop and grow in the test system. | Dosage of organic medium | 36. | Ensure that influent and effluent containers and tubing from influent vessels and to effluent vessels are thoroughly cleaned to remove microbial growths initially and throughout the test. Assemble the test systems in a room where the temperature is controlled (normally in the range 20-25 °C) or use water-jacketed test units. Prepare a sufficient volume of the required organic medium (paragraphs 27-29). Initially fill the aeration vessel and the separator with the organic medium and add the inoculum (paragraphs 34, 35). Start the aeration such that the sludge is kept in suspension and in an aerobic state and begin dosing the influent and recycling the settled sludge. Dose organic medium out of storage vessels into the aeration vessels (paragraphs 20, 21) of the test and control units and collect the respective effluents in similar storage vessels. To get the normal hydraulic retention time of 6 h, the organic medium is pumped at 0,5 l/h. To confirm this rate, measure the daily amount of organic medium dosed by noting the reduction in volumes of the medium in the storage vessels. Other modes of dosing would be necessary for determining the effects of intermittent release and “shock” loading of chemicals. | 37. | If the organic medium is prepared for use for a period longer than 1 day, cooling at about 4 °C, or other appropriate methods of conservation are necessary to prevent microbial growth and biodegradation outside the test units (paragraph 29). If synthetic sewage is used, it is possible to prepare, and store at about 4 °C, a concentrated stock solution (e.g. 10-fold the normal concentration, paragraph 28). This stock solution can be well mixed with the appropriate volume of tap water before use; alternatively, it can be pumped directly while the appropriate amount of tap water is pumped separately. | Dosage of test chemical | 38. | Add an appropriate volume of the stock solution of the test chemical (paragraph 31) to the storage vessel of the influent or dose it directly with a separate pump into the aeration vessel. The normal mean test concentration in the influent should be between 10 mg/l and 20 mg/l DOC, with an upper concentration of no more than 50 mg/l. If the water-solubility of the test chemical is low or if toxic effects are likely to occur, reduce the concentration to 5 mg/l DOC or even less, but only if a suitable specific analytical method is available and performed (dispersed test chemicals which are poorly soluble in water may be added using special dosing techniques, see Appendix 5). | 39. | Start adding the test chemical after a period in which the system has stabilised and is removing DOC of the organic medium efficiently (about 80 %). It is important to check that all units are working equally efficiently before the addition of test chemical; if they are not, it usually helps to mix the individual sludges and to re-dispense equal volumes to individual units. When an inoculum of (about) 2,5 g/l (dry weight) activated sludge is used, the test chemical may be added from the start of the test since directly adding increasing amounts from the beginning has the advantage that the activated sludge may be better able to adapt to the test chemical. In whatever manner the test chemical is added, it is recommended that the relevant flow rate and/or the volumes in the storage vessel(s) are measured at regular intervals. | Handling of activated sludge | 40. | The concentration of activated sludge solids normally stabilises between limits during the test, independent of the inoculum used, in the range 1 to 3 g/l (dry weight) depending on the quality and concentration of the organic medium, operating conditions, the nature of the micro-organisms present and the influence of the test chemical. | 41. | Either determine the suspended solids in the aeration vessels at least weekly and discard surplus sludge to maintain the concentration at 1 g/l to 3 g/l (dry weight), or control the mean sludge age at a constant value usually in the range 6 days to 10 days. If, for example, a sludge retention time of 8 days is chosen, remove daily 1/8 of the volume of the activated sludge in the aeration vessel and discard it. Carry this out on a daily basis or, preferably, by means of an automatic intermittently operating pump. Maintaining the concentration of suspended solids constant, or within narrow limits, does not maintain a constant sludge retention time (SRT), which is the operating variable that determines the value of the concentration of test chemical in the effluent. | 42. | Throughout the test, remove, at least daily, any sludge adhering to the walls of the aeration vessel and the separator so that it is resuspended. Check and clean regularly all tubes and tubing to prevent growth of biofilm. Recycle the settled sludge from the separator to the aeration vessel, preferably by intermittent pumping. No recycling takes place in the porous pot system but ensure that clean inner pots are inserted before the volume in the vessel rises significantly (paragraph 21). | 43. | Poor settlement and loss of sludge may occur in the Husmann plant units. These may be rectified by employing one or more of the actions, listed below, in parallel in test and control units: | — | fresh sludge or flocculant (for example 2 ml/vessel of 50 g/l FeCl3) could be added at regular intervals, e.g. weekly, but ascertain that no reaction or precipitation of the test chemical occurs with FeCl3; | — | the air-lift pump could be replaced by a peristaltic pump, thus enabling a sludge recirculation flow which about equals the influent flow to be used and allowing development of an anaerobic zone in the settled sludge (the geometry of the air-lift pump limits the minimum flow rate of returned sludge to be about 12-fold that of the influent); | — | sludge could be pumped intermittently from the separator to the aeration vessel (e.g. 5 min. every 2,5 h to recycle 1 l/h to 1,5 l/h; | — | a non-toxic, anti-foaming agent at minimal concentration could be used to prevent loss by foaming (e.g. silicone oil); | — | air could be passed through the sludge in the separator in short, shock bursts (e.g. 10 sec. every hour); | — | the organic medium may be dosed at intervals into the aeration vessel (e.g. 3 min. to 10 min. every hour). | Sampling and analysis | 44. | At regular intervals measure the dissolved oxygen concentration, the temperature and the pH value of the activated sludge in the aeration vessels. Ensure that sufficient oxygen is always available (> 2 mg/l) and that the temperature is kept in the required range (normally 20 °C to 25 °C). Keep the pH at 7,5 ± 0,5 by dosing small amounts of inorganic base or acid into the aeration vessel or into the influent, or by increasing the buffering capacity of the organic medium (see paragraph 27). When nitrification occurs acid is produced, the oxidation of 1 mg N producing the equivalent of about 7 mg CO3 –. The frequency of measuring depends on the parameter to be measured and the stability of the system, and may vary between daily and weekly measurements. | 45. | Measure the DOC or COD in the influents to the control and test vessels. Measure the test chemical concentration in the test influent by specific analysis or estimate it from the concentration in the stock solution (paragraph 31), the volume used and the amount of sewage dosed into the test unit. It is recommended that the concentration of the test chemical be calculated in order to reduce the variability of the concentration data. | 46. | Take suitable samples from the collected effluent (e.g. 24 h composites) and filter through a membrane of pore size 0,45 μm or centrifuge them at about 40,000 m/s2 for about 15 min. Centrifuging should be used if filtering is difficult. Determine DOC or COD at least in duplicate to measure ultimate biodegradation and, if required, primary biodegradation by an analysis specific for the test chemical. | 47. | The use of COD may give rise to analytical problems at low concentrations and is therefore recommended only if a sufficiently high test concentration (about 30 mg/l) is used. Also, for strongly adsorbing chemicals, it is recommended that the amount of adsorbed chemical in the sludge be measured using an analytical technique specific for the test chemical. | 48. | The frequency of sampling depends on the expected duration of the test. A recommended frequency is three times per week. Once the units are operating efficiently, allow from 1 week to a maximum of 6 weeks after the test chemical has been introduced, for adaptation to reach a steady state. Preferably obtain at least 15 valid values in the plateau phase (paragraph 59), normally lasting 3 weeks, for the evaluation of the test result. The test may be completed if a sufficient degree of elimination is reached (e.g. > 90 %) and these 15 values, which represent analyses carried out each weekday over 3 weeks, are available. Normally, do not exceed a test duration of more than 12 weeks after addition of the test chemical. | 49. | If the sludge nitrifies and if the effects of the test chemical on nitrification are to be studied, analyse samples from the effluent of the test and control units at least once per week for ammonium and/or nitrite plus nitrate. | 50. | All analyses should be performed as soon as possible, especially the nitrogen determinations. If analyses have to be postponed, store the samples at about 4 °C in the dark in full, tightly stopped bottles. If samples have to be stored for more than 48 h, preserve them by deep-freezing, acidification (e.g. 10 ml/l of a 400 g/l solution of sulphuric acid) or by addition of a suitable toxic substance (e.g. 20 ml/l of a 10 g/l solution of mercury (II) chloride). Ensure that the preservation technique does not influence results of analysis. | Coupling of test units | 51. | If coupling is to be used (Appendix 3), daily exchange the same amount of activated sludge (150 ml to 1 500 ml for aeration vessels containing 3 litres of liquor) between the aeration vessels of the test unit and its control unit. If the test chemical adsorbs strongly onto the sludge, change only the supernatant of the separators. In both cases use a correction factor to calculate the test results (paragraph 55). | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 52. | Calculate the percentage of DOC or COD elimination of the test chemical for each timed assessment, using the equation: | where | Dt | = | % elimination of DOC or COD at time t | Cs | = | DOC or COD in the influent due to the test chemical, preferably estimated from the stock solution (mg/l) | E | = | measured DOC or COD value in the test effluent at time t (mg/l) | Eo | = | measured DOC or COD value in the control effluent at time t (mg/l) | 53. | The degree of DOC or COD elimination of the organic medium in the control unit is helpful information in assessing the biodegradative activity of the activated sludge during the test. Calculate the percentage elimination from the equation: | where | DB | = | % elimination of DOC or COD of the organic medium in the control unit at time t | CM | = | DOC or COD of the organic medium in the control influent (mg/l) | Optionally, calculate the percentage elimination DOC or COD due to the organic medium plus test chemical in the test unit from the equation: | where | DT | = | % elimination of total test influent DOC or COD | CT | = | DOC or COD of total test influent or calculated from stock solutions (mg/l) | 54. | Calculate the removal of the test chemical if measured with a specific analytical method at each time assessment from equation: | where | DST | = | % primary elimination of test chemical at time t | Si | = | measured or estimated test chemical concentration in the test influent (mg/l) | Se | = | measured test chemical concentration in test effluent at time t (mg/l) | 55. | If the coupling mode has been used, compensate the dilution of the test chemical in the aeration vessel by the sludge exchange using a correction factor (see Appendix 3). If a mean hydraulic retention time of 6 h and an exchange of half of the volume of the activated sludge in the aeration vessel have been used, the determined daily elimination values (Dt, paragraph 52) have to be corrected to obtain the true degree of elimination, Dtc, of the test chemical from the equation: | Expression of test results | 56. | Plot the percentage elimination Dt (or Dtc) and Dst, if available, versus time (see Appendic 2). From the shape of the elimination curve of the test chemical (per se or as DOC) some conclusions may be drawn about the removal process. | Adsorption | 57. | If a high DOC elimination of the test chemical is observed from the beginning of the test, the test chemical is probably eliminated by adsorption onto the activated sludge solids. It is possible to prove this by determining the adsorbed test chemical by specific analysis. It is not usual for the elimination of DOC of adsorbable chemicals to remain high throughout the test; normally, there is a high degree removal initially which gradually falls to an equilibrium value. If, however, the adsorbable test chemical was able to cause acclimation of the microbial population in some way or other, the DOC elimination of the test chemical would subsequently increase and reach a high plateau value. | Lag phase | 58. | As in static, screening tests, many test chemicals require a lag phase before full biodegradation occurs. In the lag phase, acclimation or adaptation of the degrading bacteria takes place with almost no removal of the test chemical; then the initial growth of these bacteria occurs. This phase ends and the degradation phase is taken to begin when about 10 % of the initial amount of test chemical is removed (after allowing for adsorption, if it occurs). The lag phase is often highly variable and poorly reproducible. | Plateau phase | 59. | The plateau phase of an elimination curve in a continuous test is defined as that phase in which the maximum degradation takes place. The plateau phase should be at least 3 weeks and have about 15 measured valid values. | Mean degree of elimination of test chemical | 60. | Calculate the mean value from the elimination values (Dt) of the test chemical at the plateau phase. Rounded to the nearest whole number (1 %), it is the degree of elimination of the test chemical. It is also recommended to calculate the 95 % confidence interval of the mean value. | Elimination of organic medium | 61. | Plot the percentage of elimination of the DOC or COD of the organic medium in the control unit (DB) versus time. Indicate the mean degree of elimination in the same way as for the test chemical (paragraph 60). | Indication of biodegradation | 62. | If the test chemical does not adsorb significantly on to activated sludge and the elimination curve has a typical shape of a biodegradation curve with lag, degradation and plateau phases (paragraphs 58, 59), the measured elimination can safely be attributed to biodegradation. If a high initial removal has taken place, the simulation test cannot differentiate between biological and abiotic elimination processes. In such cases, and in other cases where there is any doubt about biodegradation (e.g. if stripping takes place), analyse adsorbed test chemicals or perform additional static biodegradation tests based on parameters clearly indicating biological processes. Such tests are the oxygen uptake methods (chapter C.4 D, E and F of this Annex (6)) or a test with measurement of carbon dioxide production (chapter C.4 C of this Annex (6)) or the ISO Headspace method (18), using a pre-exposed inoculum from the simulation test. If both the DOC removal and specific chemical removal have been measured, significant differences (the former being lower than the latter) between the percentages removed indicate the presence in the effluents of intermediate organic products which may be more difficult to degrade than the parent chemical. | Validity of test results | 63. | Information on the normal biodegradation behaviour of the inoculum is achieved if the degree of elimination of the organic medium (paragraph 53) in the control unit is determined. Consider the test to be valid if the degree of DOC or COD elimination in the control unit(s) is > 80 % after two weeks and no unusual observations have been made. | 64. | If a readily biodegradable (reference) chemical has been used, the degree of biodegradation (Dt, paragraph 52) should be > 90 %. | 65. | If the test is performed under nitrifying conditions, the mean concentration in the effluents should be < 1 mg/l ammonia-N and < 2 mg/l nitrite-N. | 66. | If these criteria (paragraphs 63-65) are not met, repeat the test using an inoculum from a different source, test a reference chemical, and review all experimental procedures. | Test Report | 67. | The test report must include the following: | | Test chemical: | — | identification data; | — | physical nature and, where relevant, physical-chemical properties. | | Test conditions: | — | type of test system; any modifications for testing insoluble and volatile chemicals; | — | type of organic medium; | — | proportion and nature of industrial waste waters in sewage, if known; | — | inoculum, nature and sampling site(s), concentration and any pre-treatment; | — | test chemical stock solution: DOC and TOC content; how prepared, if suspension; test concentration used; reasons if outside range of 10-20 mg/l DOC; method of addition; date first added; any changes; | — | mean sludge age and mean hydraulic retention time; method of sludge wastage; methods of overcoming bulking, loss of sludge, etc.; | — | analytical techniques employed; | — | test temperature; | — | qualities of the sludge-bulking, sludge volume index (SVI), mixed liquor suspended solids (MLSS); | — | any deviations from standard procedures and any circumstances which may have affected results. | | Test results: | — | all measured data (DOC, COD, specific analyses, pH, temperature, oxygen concentration, suspended solids, N chemicals, if relevant; | — | all calculated values of Dt (or Dtc), DB, DSt obtained in tabular form and the elimination curves; | — | information on lag and plateau phases, test duration, the degree of elimination of the test chemical and that of the organic medium in the control unit, together with statistical information and statements of biodegradability and validity of the test; | — | discussion of results. | LITERATURE: | (1) | Swisher RD (1987). “Surfactant Biodegradation”, 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp. | (2) | German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No 49: 698-706. | (3) | Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No 70, Water Research Centre, Medmenham, UK. | (4) | Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915. | (5) | Eckenfelder, W.W (19) US EPA. | (6) | Chapter C.4 of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability. | (7) | Chapter C.12 of this Annex, Biodegradation — Modified SCAS Test. | (8) | Chapter C.19 of this Annex, Estimation of the Adsorption Coefficient (K OC ) on Soil and on Sewage Sludge Using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). | (9) | Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173. | (10) | Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55. | (11) | Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp. 113-138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. | (12) | ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biodegradability of organic substances in an aqueous medium — activated sludge simulation test. | (13) | Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48. | (14) | Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340-343. | (15) | Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758. | (16) | Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. | (17) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pp. 91-98 ISBN 0117516619. | (18) | ISO 14593 (1998). Water Quality — Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels. | Appendix 1 | Figure 1 | Equipment used for assessment of biodegradability | Husmann unit | Figure 2 | Equipment used for assessment of biodegradability | Porous pot | Figure 3 | Details of 3 litre porous pot aeration vessel | Appendix 2 | Example of an elimination curve | Polyethylene glycol 400 Test Concentration 20 mg/l DOC | Appendix 3 | [INFORMATIVE] | COUPLING OF THE TEST UNITS | In order to try to equalise the microbial populations in sludges in a test unit, receiving sewage plus a test chemical, and in a control unit, receiving only sewage, a daily interchange of sludge was introduced (1). The procedure was called coupling and the method is known as coupled units. Coupling was initially performed using Husmann activated sludge units but it has also been done with Porous Pot units (2)(3). No significant differences in results were found as between non-coupled and coupled units, whether Husmann or Porous Pot so there is no advantage in expending the time and energy needed in coupling the units. | Sludge exchanges can give the appearance of quite a considerable removal, since some of the test chemical in transferred and the concentrations of test chemical in the test and control effluents become more nearly equal. Thus, correcting factors have to be used, which depend on the fraction exchanged and the mean hydraulic retention time. More details of the calculation have been published (1). | Calculate the corrected DOC or COD elimination degree using the general formula: | where | Dtc | = | corrected % DOC or COD elimination | Dt | = | determined % DOC or COD elimination | a | = | interchange fraction of the volume of the activated sludge units | r | = | mean hydraulic retention time (h) | If, for example, half of the volume of the aeration tank is exchanged (a = 0,5) and the mean hydraulic retention time is 6 h, the correction formula is: | LITERATURE: | (1) | Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135. | (2) | Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pp. 113-138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. | (3) | Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK. | Appendix 4 | EVALUATION OF INHIBITION OF THE ACTIVATED SLUDGE | Process by test chemicals | 1. | A chemical (or a waste water) may not be degraded or removed in the simulation test and may even have an inhibitory effect on the sludge micro-organisms. Other chemicals are biodegraded at low concentrations but are inhibitory at higher concentration (hormesis). Inhibitory effects may have been revealed at an earlier stage or may be determined by applying a toxicity test, using an inoculum similar to or identical with that used in the simulation test (1). Such methods are inhibition of oxygen uptake (chapter C.11 of this Annex (2) and ISO 8192(3)) or inhibition of growth of sludge organisms (ISO 15522 (4)). | 2. | In the simulation test any inhibition will be manifest by the difference in dissolved organic carbon (DOC) or chemical oxygen demand COD between the effluent from the test vessel and that from the control being greater than the DOC added as test chemical. Expressed in another way, the percentage removal of DOC (and biochemical oxygen demand BOD, chemical oxygen demand COD, and/or NH+ 4) of the organic medium on treatment will be decreased by the presence of the test chemical. If this occurs, the test should be repeated reducing the concentration of the test chemical until a level is reached at which no inhibition occurs and perhaps further reducing the concentration until the test chemical is biodegraded. However, if the test chemical (or waste water) has adverse effects on the process at all concentrations tested, the indications are that the chemical is difficult, if not impossible, to treat biologically, but it may be worth repeating the test with activated sludge from a different source and/or subjecting the sludge to a more gradual acclimation. | 3. | Conversely, if the test chemical is bioeliminated at the first attempt in the simulation test, its concentration should be increased if it is required to be known whether the chemical could be inhibitory. | 4. | It should be remembered in trying to determine degrees of inhibition that the activated sludge population can change, so that with time the micro-organisms may develop a tolerance towards an inhibitory chemical. | 5. | Calculation of degree of inhibition: | The overall percentage removals Ro, of BOD, DOC, COD etc., for the test and control units can be calculated from: | where: | I | = | influent concentration of BOD, DOC, COD etc., for test or control vessels (mg/l) | E | = | respective effluent concentrations (mg/l). | I and E must be corrected for the DOC due to the test chemical in the test units, otherwise the calculations of percentage inhibition will be incorrect. | The degree of inhibition caused by the presence of the test chemical can be calculated from: | where: | Rc | = | percentage removal in the control vessels | Rt | = | percentage removal in the test vessels | LITERATURE: | (1) | Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259. | (2) | Chapter C.11 of this Annex, Biodegradation — Activated Sludge Respiration Inhibition Test. | (3) | ISO 8192 (2007) Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation. | (4) | ISO 15522 (1999) Water Quality — Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms. | Appendix 5 | Poorly water-soluble test chemicals — volatile chemicals | Poorly water-soluble chemicals | Few reports seem to have been published on subjecting poorly water-soluble and insoluble chemicals to tests simulating waste water treatment (1)(2)(3). | There is no single method of dispersal of the test chemical which is applicable to all insoluble chemicals. Two of the four types of method described in ISO 10634 (4) would seem to be suitable for attempting to disperse test chemicals for simulation testing; they are the use of emulsifying agents and/or of ultrasonic energy. The stability over at least 24h periods of the resulting dispersion should be established. Suitably stabilised dispersions, contained in a constantly stirred reservoir (paragraph 38), would then be dosed to the aeration tank separately from the domestic (or synthetic) sewage. | If the dispersions are stable, investigate how the test chemical can be determined in the dispersed form. It is unlikely that DOC will be suitable, so that a specific analytical method for the test chemical would have to be established which could be applied to effluents, effluent solids and activated sludge. The fate of the test chemical in the simulation of the activated sludge process would then be determined in liquid and solid phases. Thus, a “mass balance” would be established to decide whether the test chemical had been biodegraded. However, this would indicate only primary biodegradation. Demonstration of ultimate biodegradation should be attempted by applying a respirometric test for ready biodegradability (chapter C.4 of this Annex (5) C, F or D) using as inoculum sludge exposed to the test chemical in the simulation test. | Volatile chemicals | The application of waste water treatment simulations to volatile chemicals is both debatable and problematic. As with poorly water-soluble test chemicals, very few reports seem to have been published describing simulation tests using volatile chemicals. A conventional type of complete-mixing apparatus is adapted by sealing the aeration and settling tanks, measuring and controlling the air flow using flow-meters and passing the exit gas through traps to collect volatile organic matter. In some cases, a vacuum pump is used to draw the exit gas through a “cold” trap or a purge-trap containing Tenax and silica gel for gas-chromatographic analyses. The test chemical present in the trap can be determined analytically. | The test is carried out in two parts. The units are first operated without sludge but with the synthetic waste water plus test chemical being pumped into the aeration tank. Influent, effluent and exit gas samples are collected and analysed for the test chemical for a few days. From the data collected, the percentage (Rvs) of the test chemical stripped from the system may be calculated. | Then the normal biological test (with sludge) is performed under operating conditions identical to those in the stripping study. DOC or COD measurements are also made to check that the units are performing efficiently. Occasional analyses are made to determine the test chemical in the influent, effluent and exit gas in the first part of the test; after acclimation more frequent analyses are made. Again, from the data in the steady state, the percentage of removal of the test chemical from the liquid phase by all processes (RT) (physical and biological) may be calculated, as well as the proportion (RV) stripped from the system. | Calculation: | (a) | In the non-biological test, the percentage (RVP) of the test material stripped from the system may be calculated from: | where | RVP | = | removal of test chemical by volatilisation (%), | SVP | = | test chemical collected in trap expressed as equivalent concentration in liquid phase (mg/l), | SIP | = | test chemical concentration in influent (mg/l). | (b) | In the biological test, the percentage (RV) of the test material stripped from the system may be calculated from: | where | RV | = | removal of test chemical by volatilisation in biological test (%), | SV | = | test chemical collected in trap in biological test, expressed as equivalent concentration in liquid influent (mg/l), | SI | = | test chemical concentration in influent (mg/l). | (c) | In the biological test, the percentage (RT) of the test chemical removed by all processes is given by: | where | SE = concentration of test chemical in the (liquid) effluent (mg/l). | (d) | Thus, the percentage (RBA) removed by biodegradation plus adsorption can be calculated from: | Separate tests should be carried out to determine whether the test chemical is adsorbed; if it is, then a further correction may be made. | (e) | A comparison between the proportion of test chemical stripped from the biological (Rv) and non-biological test (Rvp) systems indicates the overall effect that biological treatment has had on the emission of the test chemical into the atmosphere. | Example: | Benzene | Sludge retention time = 4 days | A synthetic sewage; retention time = 8 h. | SIP | = | SI = 150 mg/l | SVP | = | 150 mg/l (SEP = 0) | SV | = | 22,5 mg/l | SE | = | 50 μg/l | Thus, | RVP | = | 100, RV = 15 | RT | = | 100 and RBA = 85. | Benzene was assumed not to be adsorbed onto sludge. | LITERATURE: | (1) | Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854. | (2) | Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA. | (3) | Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97. | (4) | ISO 10634 (1995) Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. | (5) | Chapter C.4 of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability. | Appendix 6 | Effects of sludge retention time (SRT) on treatability of chemicals | INTRODUCTION | 1. | The method described in the main text was designed to ascertain whether the chemicals tested (usually those known to be inherently, but not readily, biodegradable) can be biodegraded within the limits imposed in waste water treatment plants. The results are expressed in terms of percentage removal and percentage biodegradation. The conditions of operation of the activated sludge units and choice of influent allow rather wide variations in concentration of the test chemical in the effluent. Tests are carried out at only one nominal concentration of sludge solids or one nominal sludge retention time (SRT) and the sludge wastage regimes described can cause the value of SRT to vary considerably during the test, both from day to day and during a day. | 2. | In this variant (1)(2) the SRT is controlled within much narrower limits throughout each 24h period (just as happens on the large-scale) which results in a more constant concentration in effluents. Domestic sewage is recommended since it gives more consistent and higher percentage removals. Also, the effects of a number of SRT values are investigated and in a more detailed study the effects of a range of temperatures on effluent concentration may be determined. | 3. | There is no general agreement yet on which kinetic models operate when chemicals bio-degrade under conditions in waste water treatment. The Monod model of bacterial growth and substrate utilisation was chosen (1)(2) to be applied to the data collected, since the method was intended to be applied only to chemicals produced in high tonnages, resulting in concentrations in sewage of above 1 mg/l. The validity of the simplified model and the assumptions made was established using a series of alcohol ethoxylates having varying degrees of primary biodegradability (2)(3). | Note: | This variant method follows closely much of the text of this test method C.10-A and only those details which differ are given hereafter. | PRINCIPLE OF THE TEST | 4. | Activated sludge porous-pot units, designed to facilitate the (almost) continuous wastage of mixed liquor allowing very precise control of the sludge retention time (SRT, or θs), are operated in the non-coupled mode over a range of SRTs and, optionally, over a range of temperatures. The retention time is usually 2 to 10 days and the temperature between 5 and 20 °C. Sewage, preferably domestic, and a solution of the test chemical are dosed separately to the units at rates to give the required sewage retention time (3 to 6 hours) and the required concentration of test chemical in the influent. Control units receiving no test chemical are operated in parallel for comparative purposes. | 5. | Other types of apparatus can be used but great care should be exercised to ensure that good control of SRT is achieved. For example, when using plants, which incorporate a settler, allowance for loss of solids via the plant effluent may be necessary. Further, special precautions to avoid errors due to variation in the quantity of sludge in the settler should also be taken. | 6. | The units are operated at each selected set of conditions and, after equilibrium has been reached, the average steady state concentrations in the effluents of test chemical and, optionally, DOC are obtained over a period of about three weeks. Besides assessing the percentage removal of test chemical and, optionally, DOC, the relationship between plant-operating conditions and the concentration in the effluent is expressed in graphical form. From this tentative kinetic constants may be calculated and the conditions under which the test chemical can be treated may be predicted. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 7. | Chapter C.10 A, paragraphs 12 and 13 apply. | PASS LEVELS | 8. | Chapter C.10 A, paragraphs 14 and 15 apply. | REFERENCE TEST CHEMICAL | 9. | Chapter C.10 A, paragraph 16 applies. | REPRODUCIBILITY OF TEST RESULTS | 10. | Chapter C.10 A, paragraphs 17 and 18 apply. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | 11. | A suitable unit is the modified porous pot system (Appendix 6.1). It consists of an inner vessel (or liner) constructed from porous polypropylene of 3,2 mm thickness and pore size of approximately 90 μm, the joint being butt-welded. (This makes a more robust unit than that described in paragraph 21 of this chapter, C.10 A). The liner is fitted into an impervious polyethylene outer vessel, which consists of two parts: a circular base in which holes are bored to accommodate two air lines and a sludge-wastage line, and an upper cylinder which screws on to the base and which has an outlet placed so as to give a known volume (3 l) in the porous pot vessel. One of the air lines is fitted with a diffuser stone and the other is open-ended and set at right-angles to the stone in the pot. This system produces the necessary turbulence to ensure that the contents of the pot are completely mixed, as well as providing concentrations of dissolved oxygen greater than 2 mg/l. | 12. | The appropriate number of units are maintained at controlled temperatures in the range of 5 to 20 °C (± 1 °C), either in water baths or in constant temperature rooms. Pumps are required to dose to the aeration vessels the solution of the test chemical and settled sewage at the required rates (0-1,0 ml/min and 0-25 ml/min, respectively) and a third pump to remove waste sludge from the aeration vessels. The necessary very low flow-rate of waste sludge is achieved by using a pump set at a higher rate and operated intermittently by the use of a timer-switch, e.g. operating for 10 seconds per min, pump delivery rate of 3ml/min yielding a wastage rate of 0,5 ml/min. | Filtration apparatus or centrifuge | 13. | Chapter C10 A, paragraph 23 applies. | Analytical equipment | 14. | Chapter C.10 A, paragraph 24 applies. | Water | 15. | Chapter C.10 A, paragraphs 25 and 26 apply. | Organic medium | 16. | Chapter C.10 A, paragraph 27 applies. | Synthetic sewage | 17. | Chapter C.10 A, paragraph 28 applies. | Domestic sewage | 18. | Chapter C.10 A, paragraph 29 applies. | Activated sludge | 19. | Chapter C10 A, paragraph 30 applies. | Stock solutions of test chemical | 20. | Chapter C.10 A, paragraphs 31 and 32 apply. | PROCEDURE | Preparation of the inoculum | 21. | Chapter C.10 A, paragraph 34 applies only — use activated sludge (about 2,5 g/l). | Number of test units | 22. | For a simple test, ie. to measure percentage removal, only a single SRT is required, but in order to acquire data necessary to calculate tentative kinetic constants 4 or 5 SRT values are required. Values between 2 and 10 days are usually chosen. Practically, it is convenient to perform a test at 4 or 5 SRTs simultaneously at one temperature; in extended studies the same SRT values, or perhaps a different range of values, are used at other temperatures within the range 5 to 20 °C. For primary biodegradation (the main use), only one unit per set of conditions is normally required. However, for ultimate biodegradability a control unit is required, for each set of conditions, which receives sewage but not test chemical. If the test chemical is thought to be present in the sewage used, it would be necessary to use control units when assessing primary biodegradation, and making the necessary correction in the calculations. | Dosage of organic medium and test chemical | 23. | Chapter C.10 A, paragraphs 36 to 39 apply, but note that the test chemical solution is dosed separately and that various sludge wastage rates are used. Also monitor and adjust, if necessary, to within ± 10 %, the flow-rates of influents, effluents and sludge wastage frequently, e.g. twice per day. If difficulties are encountered in the analytical methods when domestic sewage is used, carry out the test with synthetic sewage, but it must be assured that different media give comparable kinetic data. | Handling of activated sludge units | 24. | Chapter C.10 A, paragraphs 40 to 43 apply, but control SRT only by “constant” wastage of sludge. | Sampling and analysis | 25. | Chapter C.10 A, paragraphs 44 to 50 apply, except that the concentration of the test chemical is to be determined and DOC determined optionally; COD should not be used. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 26. | Chapter C.10 A, paragraphs 52 to 54 apply. | Expression of test results | 27. | Chapter C.10 A, paragraphs 56 to 62 apply. | Calculation of kinetic constants | 28. | It is more realistic to quote the mean steady — state concentration of the test chemical in the effluent and to describe how this varies with plant-operating conditions than to quote percentage primary biodegradation. This can be done by consideration of equation (6) in Appendix 6.2, which can yield values for KS, μm and θSC, the critical sludge retention time. | (Alternatively, approximate values of KS and μm may be obtained using a simple computer program to fit the theoretical curve calculated from equation 2 (Appendix 6.2) to the experimental values obtained. Although any given solution will not be unique, a reasonable approximation of KS and μm can be obtained.) | Variability of results | 29. | It is common experience that variable values of kinetic parameters for individual chemicals are obtained. It is thought that the conditions under which the sludge has been grown, as well as the conditions prevailing in the test used (as in paragraph 5 and in other tests), have a large effect on the resulting values. One aspect of this variability has been discussed by Grady et al (4), who have suggested that the terms “extant” and “intrinsic” should be applied to two extreme conditions representing the limits of physiological state a culture may attain during a kinetic experiment. If the state is not allowed to change during the test, the kinetic parameter values reflect the conditions in the environment from which the micro-organisms were taken; these values are called “extant” or currently existing. At the other extreme, if conditions in the test are such as to permit the full development of the protein-synthesizing system allowing maximum possible growth rate, the kinetic parameters obtained are said to be “intrinsic”, and are dependent only on the nature of the substrate and the types of bacteria in the culture. As a guide, extant values will be obtained by keeping the ratio of concentration of substrate to competent micro-organisms (So/Xo) low, e.g. 0,025, and intrinsic values arise when the ratio is high e.g. at least 20. In both cases, So should equal or exceed the relevant value of Ks, the half-saturation constant. | 30. | Variability and other facets of biodegradation kinetics were discussed at a recent SETAC workshop (5). From such studies, reported and projected, a clearer view of kinetics operating in waste water treatment plants should be forth-coming to enable a better interpretation of existing data to be made, as well as to suggest more relevant designs for future Test Methods. | LITERATURE: | (1) | Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33-48. | (2) | Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340-343. | (3) | Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422. | (4) | Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742-748. | (5) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels. | Appendix 6.1 | Porous Pot with SRT Control | Appendix 6.2 | Calculation of Kinetic Constants | 1. | By assuming Monod kinetics apply and considering a mass balance of active solids and substrate across the activated sludge system (1), the following steady state expressions can be obtained: | [1] | or | [2] | where: | S1 | = | concentration of substrate in effluent, (mg/l) | KS | = | half-saturation constant, the concentration at which μ = μm/2 (mg/l) | μ | = | specific growth rate (d–1) | μm | = | maximum value of μm(d–1) | Kd | = | specific decay rate of active solids (d–1) | θS | = | sludge mean retention time, SRT (d) | Examination of this equation leads to the following conclusions: | (i) | The effluent concentration is independent of that in the influent (S0); hence, the percentage biodegradation varies with the influent concentration, S0. | (ii) | The only plant-control parameter affecting S1 is the sludge retention time, θS. | (iii) | For a given concentration in the influent, S0, there will be a critical sludge retention time, such that: | [3] | where: | θSC = critical sludge retention time, below which the competent micro-organisms will be washed out of the plant. | (iv) | Since the other parameters in equation (2) are associated with growth kinetics, temperature is likely to affect the effluent substrate level and the critical sludge age, ie. the sludge retention time needed to obtain a certain degree of treatment would increase with decreasing temperature. | 2. | From a mass balance of solids in the porous pot system, and assuming that the solids concentration in the plant effluent, X2 is low compared with that in the aeration vessel, X1, the sludge retention time | [4] | and | where: | V | = | volume of the aeration vessel (l) | X1 | = | concentration of solids in aeration vessel (mg/l) | X2 | = | concentration of solids in effluent (mg/l) | Q0 | = | flow rate of influent (l/d) | Q1 | = | flow rate of waste sludge (l/d) | Thus, it is possible to control the sludge retention time at any pre-selected value by the control of the waste sludge flow rate, Q1. | Conclusions: | 3. | The main purpose of the test is thus to allow the effluent concentration, and hence the levels of test chemical in the receiving waters, to be predicted. | 4. | By plotting S1, vs. θS, the critical sludge retention time, θSC, can sometimes be readily evaluated, eg. curve 3 in Figure 1. When this is not possible, θSC may be calculated, together with approximate values of μm and KS, by plotting S1, vs. S1•θS. | Rearrangement of equation (1) gives | [5] | If Kd is small, then 1 + θs · Kd ~ 1 and [5] becomes: | [6] | Thus, the plot should be a straight line (see Figure 2) of slope 1/μm and intercept KS/μm; also θS ~1/μm. | Figure 1 | Three temperatures; five SRTs | Figure 2 | Regression Line SRT · S1 vs S1 at T = 5 °C | Glossary: | Effluent concentration: | Curve: | Appendix 7 | TEST AT LOW (μg/l) CONCENTRATION RANGE | 1. | Many chemicals are normally present in the aquatic environment, even in waste waters, at very low concentrations (μg/l). At such concentrations, they probably do not serve as primary substrates resulting in growth, but are more likely to degrade as non-growth, secondary substrates, concurrent with a variety of naturally occurring carbon chemicals. Consequently the degradations of such chemicals will not fit the model described in Appendic 6. There are many models which could be applied and, under the conditions prevailing in waste water treatment systems, more than one may be simultaneously operative. Far more research will be necessary to elucidate this problem. | 2. | Meanwhile the procedure given in the main text (chapter C.10 A) can be followed, but only for primary biodegradability, using suitably low concentrations (< 100 μg/l) and a validated analytical procedure. The percentage biodegradation may be calculated (see para. 54 of the Test Method) provided that abiotic processes (adsorption, volatility, etc.) are taken into account. An example is the study by Nyholm and his associates (1)(2) using a 4 h cycle in a fill and draw system. They reported pseudo first-order constants for 5 chemicals added in a synthetic sewage at 5 to 100 μg/l. (For ultimate biodegradability 14C-labelled test chemicals may be used. A description of this is beyond the scope of this Test Method since there are as yet no agreed procedures, though a proposed method for ISO 14592 (3) contains guidance on the use of 14C-labelled chemicals. | SCAS test | 3. | Later, a simpler two-stage test was proposed (4)(5)(6); the semi-continuous activated sludge (SCAS) method is followed by short-term kinetic tests on samples withdrawn from the SCAS units. The SCAS system is operated with known sludge wastage rates (unlike the original C.12 test method) and is fed a modified OECD synthetic sewage or domestic sewage. The synthetic sewage was modified (because of changing pH value and poor sludge settleability) by addition of phosphate as buffer, yeast extract, iron (III) chloride and trace element salts, and its COD was increased to about 750 mg/l by increasing the concentration of peptone and meat extract. The units were operated on a 24 h cycle: aeration for 23 h, wastage of sludge, settlement, withdrawal of supernatant (effluent) followed by addition of synthetic sewage plus test chemical, up to 100 μg/l, (i.e. at about the same concentration used in the short term test). Once per week 10 % of the total sludge was replaced by fresh sludge in order to maintain a balanced microbial population. | 4. | The concentrations of test chemical initially and at the end of aeration are measured and the test is continued until a constant removal of test chemical is attained; this takes from one week to several months. | Short-term test | 5. | A short test (e.g. 8 hours) is applied to determine the (pseudo) first order kinetic rate constant for the decay of the test chemical in activated sludge of known but different origins and histories. In particular, sludge samples are taken from the SCAS reactors — at the end of an aeration period when the concentration of organic substrate is low — during the course of an acclimatisation experiment (paragraphs 3, 4). Sludge may also be taken from a parallel SCAS unit not exposed to the test chemical, for comparison. Mixtures of sludge and the test chemical added at two or more concentrations in the range 1-50 μg/l are aerated, without the addition of synthetic sewage or other organic substrate. The test chemical remaining in solution is determined at regular intervals e.g. hourly depending on the degradability of the chemical, for a period not longer than 24h. Samples are centrifuged before appropriate analysis. | Calculations | 6. | Data from the SCAS units are used to calculate the percentage removal of test chemical (paragraph 54). Also, an average rate constant, K1, (normalised for concentration of suspended solids) can be calculated from: | where: | t | = | aeration time (23h) | Ce | = | concentration at end of aeration period (μg/l) | Ci | = | concentration at beginning of aeration (μg/l) | SS | = | concentration of activated sludge solids (g/l) | 7. | In the short term test the log % concentration remaining is plotted against time and the slope of the initial part (10-50 % degradation) of the plot is equivalent to K1, the (pseudo) first order constant. The constant is normalised with respect to the concentration of sludge solids by dividing the slope by the concentration of sludge solids. The reported result must also include details of initial concentrations of the test chemical and suspended solids, sludge retention time, sludge loading and source, and details of pre-exposure (if any) to the test chemical. | Variability of results | 8. | Variability and other facets of biodegradation kinetics were discussed at a recent SETAC workshop (7). From such studies, reported and projected, a clearer view of kinetics operating in waste water treatment plants should be forth-coming to enable a better interpretation of existing data to be made, as well as to suggest more relevant designs for future Test Methods. | LITERATURE: | (1) | Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353. | (2) | Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510. | (3) | ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality — Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water. | (4) | Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864. | (5) | Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735. | (6) | Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen. | (7) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels. | C.10-B: Biofilms | INTRODUCTION | 1. | Simulation tests are normally applied to chemicals which have failed a screening test for ready biodegradability (Chapter C.4 A to F of this Annex (9)), but have passed a test for inherent biodegradability. Exceptionally simulation tests are also applied to any chemical about which more information is required, especially high-tonnage chemicals, and normally the activated sludge test is applied (C.10 A). In some circumstances, however, specific information is required relating the behaviour of a chemical to methods of waste water treatment involving biofilms, namely, percolating or trickling filters, rotating biological contactors, fluidised beds. To meet this need various devices have been developed. | 2. | Gerike et al. (1) used large, pilot-scale trickling filters which they used in the coupled mode. These filters took up much space and required relatively large volumes of sewage or synthetic sewage. Truesdale et al. (2) described smaller filters (6 ft × 6 in. diameter) which were fed surfactant-free natural sewage but still required rather large volumes. As many as 14 weeks were required for the development of a “mature” biofilm and an additional 4-8 weeks were needed after first introduction of the test surfactant before acclimatisation took place. | 3. | Baumann et al. (3) developed a much smaller filter which used polyester “fleece” previously steeped in activated sludge as the inert medium supporting the biofilm. The test chemical was used as the sole source of carbon and biodegradability was assessed from measurements of dissolved organic carbon (DOC) in the influent and effluent, and from the amount of CO2 in the exit gas. | 4. | A quite different approach was made by Gloyna et al. (4) who invented the rotating tubular reactor. On the internal surface of the rotating tube a biofilm was grown on the known surface area by passage of influent introduced at the top end of the tube, inclined at a small angle to the horizontal. The reactor has been used to study the biodegradability of surfactants (5), as well as to investigate the optimal thickness of biofilm and diffusion through the film (6). These latter authors further developed the reactor, including modifying it to be able to determine CO2 in the exit gas. | 5. | The rotating tubular reactor has been adopted by the Standing Committee of Analysts (UK) as a standard method for assessing both the biodegradability of chemicals (7) and the treatability and toxicity of waste waters (8). The method described here has the advantages of simplicity, compactness, reproducibility and the need for relatively small volumes of organic medium. | PRINCIPLE OF THE TEST | 6. | Synthetic or domestic sewage, and the test chemical, in admixture or alone, are applied to the internal surface of a slowly rotating inclined tube. A layer of microorganisms, similar to those present on bio-filter media, is built up on the internal surface. The conditions of operation of the reactor are chosen to give adequate elimination of organic matter and, if required, oxidation of ammonium. | 7. | Effluent from the tube is collected and either settled and/or filtered before analysis for dissolved organic carbon (DOC) and/or the test chemical by a specific method. Control units receiving no test chemical are operated in parallel under the same conditions for comparative purposes. The difference between the concentrations of DOC in the effluent from the test and control units is assumed to be due to the test chemical and its organic metabolites. This difference is compared with the concentration of the added test chemical (as DOC) to calculate the elimination of the test chemical. | 8. | Biodegradation may normally be distinguished from bio-adsorption by careful examination of the elimination-time curve. Confirmation may usually be obtained by applying a test for ready biodegradation (oxygen uptake or carbon dioxide production) using an acclimated inoculum taken at the end of the test from the reactors receiving the test chemical. | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 9. | The purity, water solubility, volatile and adsorption characteristics of the test chemical should be known to enable correct interpretation of results to be made. | 10. | Normally, volatile and poorly soluble chemicals cannot be tested unless special precautions are taken (see Appendix 5 to chapter C.10 A). The chemical structure, or at least the empirical formula, should also be known in order to calculate theoretical values and/or to check measured values of parameters, e.g. theoretical oxygen demand (ThOD), DOC. | 11. | Information on the toxicity of the test chemical to micro-organisms (see Appendix 4 to chapter C.10 A) may be useful for selecting appropriate test concentrations and may be essential for the correct interpretation of low biodegradation values. | PASS LEVELS | 12. | Originally, the primary biodegradation of surfactants was required to reach 80 % or more before the chemical could be marketed. If the value of 80 % is not attained, this simulation (confirmatory) test may be applied and the surfactant may be marketed only if more than 90 % of the specific chemical is removed. With chemicals in general there is no question of a pass/fail level and the value of percentage removed can be used in proximate calculations of the probable environmental concentration to be used in hazard assessments posed by chemicals. In a number of studies of pure chemicals the percentage removal of DOC was found to be > 90 % in more than three-quarters, and > 80 % in over 90 %, of chemicals which showed any significant degree of biodegradability. | REFERENCE CHEMICALS | 13. | To ensure that the experimental procedure is being carried out correctly, it is useful occasionally to test reference chemicals whose behaviour is known. Such chemicals include adipic acid, 2-phenyl phenol, 1-naphthol, diphenic acid and 1-naphthoic acid. | REPRODUCIBILITY OF TEST RESULTS | 14. | The relative standard deviation within tests was found by a laboratory in the UK to be 3,5 % and between tests to be 5 % (7). | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | Rotating tubular reactors | 15. | The apparatus (see figures 1 and 2 in the Appendix 8 consists of a bank of acrylic tubes each 30,5 cm long and 5 cm internal diameter, supported on rubber-rimmed wheels contained within a metal supporting frame. Each tube has an outside lip, approximately 0,5 cm deep, to retain it on the wheels, the internal surface is roughened with coarse wire wool and there is a 0,5 cm deep internal lip at the upper (feed) end to retain the liquid. The tubes are inclined at an angle of approximately one degree to the horizontal to achieve the required contact time when the test medium is applied to a clean tube. The rubber-tyred wheels are rotated using a slow, variable-speed motor. The temperature of the tubes is controlled by installation in a constant temperature room. | 16. | By enclosing each tube reactor inside a slightly larger, capped tube and ensuring that connections were gas-tight, exit CO2 gas could be collected in an alkaline solution for subsequent measurement (6). | 17. | A 24h supply, for each tube, of organic medium with added test chemical if applicable, is contained in a 20 l storage vessel (A)(see Figure 2). If required, the test chemical solution may be dosed separately. Near the bottom of each storage vessel there is an outlet which is connected by suitable tubing, e.g. silicone rubber, via a peristaltic pump (B) to a glass or acrylic delivery tube which enters 2-4 cm into the higher (feed) end of the inclined tube (C). Effluent is allowed to drip from the lower end of the inclined tube to be collected in another storage vessel (D). The effluent is settled or filtered before analysis. | Filtration apparatus-centrifuge | 18. | Device for filtration of samples with membranes filter of suitable porosity (nominal aperture diameter 0,45 μm) which adsorb organic chemicals or release organic carbon to a minimum degree. If filters are used which release organic carbon, wash them carefully with hot water to remove leachable organic carbon. Alternatively a centrifuge capable of achieving 40 000 m/sec2 may be used. | 19. | Analytical equipment for determining: | — | DOC/total organic carbon (TOC), or chemical oxygen demand (COD); | — | specific chemical (HPLC, GC etc.) if required; | — | pH, temperature, acidity, alkalinity; | — | ammonium, nitrite, nitrate, if the tests are performed under nitrifying conditions. | Water | 20. | Tap water, containing less than 3 mg/l DOC. | 21. | Distilled or deionised water, containing less than 2 mg/l DOC. | Organic medium | 22. | Synthetic sewage, domestic sewage or a mixture of both may be used as the organic medium. It has been shown that the use of domestic sewage alone often gives increased percentage removed of DOC (in activated sludge units) and even allows the biodegradation of some chemicals, which are not biodegraded when OECD synthetic sewage is used. Thus, the use of domestic sewage is recommended. Measure the DOC (or COD) concentration in each new batch of organic medium. The acidity or alkalinity of the organic medium should be known. The medium may require the addition of a suitable buffer (sodium hydrogen carbonate or potassium hydrogen phosphate), if it is of low acidity or alkalinity, to maintain a pH of about 7,5 ± 0,5 in the reactor during the test. The amount of buffer, and when to add it, has to be decided in each individual case. | Synthetic sewage | 23. | Dissolve in each 1 litre of tap water: peptone, 160 mg; meat extract, 110 mg; urea, 30 mg; anhydrous dipotassium hydrogen phosphate, (K2HPO4), 28 mg; sodium chloride, (NaCl), 7 mg; calcium chloride dihydrate, (CaCl2.2H2O), 4 mg; magnesium sulphate heptahydrate, (MgSO4.7H2O), 2 mg. This OECD synthetic sewage is an example and gives a mean DOC concentration in the influent of about 100 mg/l. Alternatively, use other compositions, with about the same DOC concentrations, which are closer to real sewage. This synthetic sewage may be made up in distilled water in a concentrated form and stored at about 1 °C for up to one week. When needed, dilute with tap water. (This medium is unsatisfactory e.g. nitrogen concentration is very high, relatively low carbon content, but nothing better has been suggested, except to add more phosphate, as buffer, and extra peptone). | Domestic sewage | 24. | Use fresh settled sewage collected daily from a treatment works receiving predominantly domestic sewage. It should be collected from the overflow channel of the primary sedimentation tank, or from the feed to activated sludge plant, and be largely free from coarse particles. The sewage can be used after storage for several days at about 4 °C, if it is proved that the DOC (or COD) has not significantly decreased (i.e. by less than 20 %) during storage. In order to limit disturbances to the system, the DOC (or COD) of each new batch should be adjusted before use to an appropriate constant value, e.g. by dilution with tap water. | Lubricant | 25. | Glycerol or olive oil may be used for lubricating the peristaltic pump rollers: both are suitable for use on silicone-rubber tubing. | Stocks solutions of test chemical | 26. | For chemicals of adequate solubility prepare stock solutions at appropriate concentrations (e.g. 1 to 5 g/l) in deionised water or in the mineral portion of the synthetic sewage. For insoluble chemicals, see Appendix 5 in chapter C.10-A. This method is not suitable for volatile chemicals without modifications to the tubular reactors (paragraph 16). Determine the DOC and TOC of the stock solution and repeat the measurements for each new batch. If the difference between the DOC and TOC is greater than 20 %, check the water-solubility of the test chemical. Compare the DOC or the concentration of the test chemical measured by specific analysis of the stock solution with the nominal value to ascertain whether recovery is good enough (normally > 90 % can be expected). Ascertain, especially for dispersions, whether or not DOC can be used as an analytical parameter or if only an analytical technique specific for the test chemical can be used. Centrifugation of the samples is required for dispersions. For each new batch, measure the DOC, COD or the test chemical with specific analysis. | 27. | Determine the pH of the stock solution. Extreme values indicate that the addition of the chemical may have an influence on the pH of the activated sludge in the test system. In this case neutralise the stock solution to obtain a pH of 7 ± 0,5 with small amounts of inorganic acid or base, but avoid precipitation of the test chemical. | PROCEDURE | Preparation of organic medium for dosing | 28. | Ensure that all influent and effluent containers and tubing from influent vessels and to effluent vessels are thoroughly cleaned to remove microbial growths, initially and throughout the test. | 29. | Prepare the synthetic sewage (paragraph 23) freshly each day either from the solids or from the concentrated stock solution by appropriate dilution with tap water. Measure the required amount in a cylinder and add to a clean influent vessel. Also, where necessary, add the required amount of the stock solution of the test chemical or reference chemical to the synthetic sewage before dilution. If it is more convenient or necessary to avoid loss of the test chemical, prepare a separate diluted solution of the test chemical in a separate reservoir and deliver this to the inclined tubes via a different dosing pump. | 30. | Alternatively (and preferably), use settled domestic sewage (paragraph 24) collected freshly each day if possible. | Operation of rotating tubular reactors | 31. | Two identical tubular reactors are required for the assessment of one test chemical, and they are assembled in a constant temperature room normally at 22 ± 2 °C. | 32. | Adjust the peristaltic pumps to deliver 250 ± 25 ml/h of the organic medium (without test chemical) into the inclined tubes, which are rotated at 18 ± 2 rpm. Apply the lubricant (paragraph 25) to the pump tubes initially and periodically through the test to ensure proper functioning and to prolong the life of the tubing. | 33. | Adjust the angle of inclination of the tubes to the horizontal to produce a residence time of 125 ± 12,5 sec. for the feed in a clean tube. Estimate the retention time by adding a non-biological marker (e.g. NaCl, inert dye) to the feed: the time taken to reach peak concentration in the effluent is taken to be the mean retention time (when maximum film is present, the retention time can increase up to about 30 min.). | 34. | These rates, speeds and times have been found to give adequate removals (> 80 %) of DOC (or COD) and to produce nitrified effluents. The rate of flow should be changed if removal is insufficient or if the performance of a particular treatment plant is to be simulated. In the latter case, adjust the rate of dosing the organic medium until the performance of the reactor matches that of the treatment plant. | Inoculation | 35. | Airborne inoculation may be sufficient to start the growth of micro-organisms when synthetic sewage is used, but otherwise add 1 ml/l of settled sewage to the feed for 3 days. | Measurements | 36. | At regular intervals check that the dose-rates and rotating speeds are within the required limits. Also, measure the pH of the effluent, especially if nitrification is expected. | Sampling and analysis | 37. | The method, pattern and frequency of sampling are chosen to suit the purpose of the test. For example, take snap (or grab) samples of influent and effluent, or collect samples over a longer period e.g. 3-6 h. In the first period, without test chemical, take samples twice per week. Filter the samples through membranes or centrifuge at about 40 000 m/sec2 for about 15 min (paragraph 18). It may be necessary to settle and/or coarse-filter the samples before membrane filtration. Determine DOC (or COD) at least in duplicate and if required BOD, ammonium and nitrite/nitrate. | 38. | All analyses should be performed as soon as possible after collection and preparation of the samples. If analyses have to be postponed, store the samples at about 4 °C in the dark in full, tightly stoppered bottles. If samples have to be stored for more than 48h, preserve them by deep-freezing, acidification or by addition of a suitable toxic chemical (e.g. 20 ml/l of a 10 g/l solution of mercury (II) chloride). Ensure that the preservation technique does not influence the results of analysis. | Running-in period | 39. | In this period, the surface biofilm grows to reach an optimal thickness, usually taking about 2 weeks and should not exceed 6 weeks. The removal (paragraph 44) of DOC (or COD) increases and reaches a plateau value. When the plateau has been reached at a similar value in both tubes, one is selected to be a control in the remainder of the test, during which their performance should remain consistent. | Introduction of test chemical | 40. | At this stage add the test chemical to the other reactor at the required concentration, usually 10-20 mg C/l. The control continues to receive the organic medium alone. | Acclimation period | 41. | Continue the twice weekly analyses for DOC (or COD) and, if primary biodegradability is to be assessed, also measure the concentration of the test chemical by specific analysis. Allow from one to six weeks (or longer under special conditions) after the test chemical has first been introduced for acclimation to occur. When the percentage removal (paragraphs 43-45) reaches a maximum value, obtain 12-15 valid values in the plateau phase over about 3 weeks for evaluation of the mean percentage removal. The test is considered completed if a sufficiently high degree of elimination is reached. Normally, do not exceed a test duration of more than 12 weeks after the first addition of the test chemical. | Sloughing of the film | 42. | The sudden removal of large quantities of excess film from the tubes, or sloughing, takes place at relatively regular intervals. To ensure that the comparability of results is unaffected, allow tests to cover at least two full cycles of growing and sloughing. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 43. | Calculate the percentage DOC (or COD) elimination of the test chemical for each timed assessment using the equation: | where: | Dt | = | percentage elimination of DOC (or COD) at time t; | Cs | = | concentration of DOC (or COD) in the influent due to the test chemical, preferably estimated from the concentration in, and volume added, of the stock solution (mg/l); | E | = | measured DOC (or COD) in the test effluent at time t (mg/l); | Eo | = | measured DOC (or COD) in the control effluent at time t (mg/l). | Repeat the calculation for the reference chemical, if tested. | Performance of the control reactor | 44. | The degree of DOC (or COD) elimination (DB) of the organic medium in the control reactors is helpful information in assessing the biodegradative activity of the biofilm during the test. Calculate the percentage elimination from the equation: | where: | Cm= DOC (or COD) of the organic medium in the control influent (mg/l). | 45. | Calculate the removal (DST) of the test chemical, if measured, by a specific analytical method at each time assessment from the equation: | where: | Si | = | measured or, preferably, estimated concentration of test chemical in the test influent (mg/l) | Se | = | measured test chemical concentration in the test effluent at time t (mg/l) | If the analytical method gives a positive value in unamended sewage equivalent to S c mg/l, calculate the percentage removal (DSC) from: | Expression of test results | 46. | Plot the percentage elimination D t and DST (or DSC), if available, versus time (see Appendix 2 in chapter C.10- A). Take the mean (expressed to the nearest whole number) and standard deviation of the 12-15 values for DT (and for DST, if available) obtained in the plateau phase as the percentage removal of the test chemical. From the shape of the elimination curve, some conclusions may be drawn about the removal processes. | Adsorption | 47. | If a high DOC elimination of the test chemical is observed at the beginning of the test, the test chemical is probably eliminated by adsorption on to the biofilm. It may be possible to prove this by determining the adsorbed test chemical on solids sloughed from the film. It is not usual for the elimination of the DOC of adsorbable chemicals to remain high throughout the test; normally, there is an initial high degree of removal which gradually falls to an equilibrium value. If, however, the adsorbed test chemical was able to cause acclimation of the microbial population, the elimination of the test chemical DOC would subsequently increase and reach a high, plateau level. | Lag phase | 48. | As in static, screening tests many test chemicals require a lag phase before full biodegradation occurs. In the lag phase, acclimation (or adaptation) of the competent bacteria takes place with almost no removal of the test chemical; then the initial growth of these bacteria occurs. This phase ends and the degradation phase is arbitrarily taken to begin when about 10 % of the initial amount of test chemical is removed (after allowing for adsorption, if it occurs). The lag phase is often highly variable and poorly reproducible. | Plateau phase | 49. | The plateau phase of an elimination curve in a continuous test is defined as that phase in which the maximum degradation takes place. This phase should last at least 3 weeks and have about 12-15 measured valid values. | Mean degree of elimination of the test chemical | 50. | Calculate the mean value from the elimination values Dt (and Dst, if available) of the test chemical at the plateau phase. Rounded to the nearest whole number (1 %), it is the degree of elimination of the test chemical. It is also recommended to calculate the 95 % confidence interval of the mean value. In a similar way calculate the mean degree (DB) of elimination of the organic medium in the control vessel. | Indication of biodegradation | 51. | If the test chemical does not adsorb significantly on to the biofilm and the elimination curve has a typical shape of a biodegradation curve with lag, degradation and plateau phases (paragraphs 48, 49), the measured elimination can safely be attributed to biodegradation. If a high initial removal has taken place, the simulation test cannot differentiate between biological and abiotic elimination processes. In such cases, and in other cases where there is any doubt about biodegradation (e.g. if stripping takes place), analyse adsorbed test chemical on samples of the film or perform additional static (screening) tests for biodegradability based on parameters clearly indicating biological processes. Such tests are the oxygen uptake methods (Chapter C.4 of this Annex D, E and F) (9) or a test which measures CO2 production (Chapter C.4-C of this Annex or the Headspace method) (10); use as inoculum pre-exposed biofilm from the appropriate reactor. | 52. | If both the DOC removal and specific chemical removal have been measured, significant differences (the former being lower than the latter) between the percentages removed indicate the presence in the effluents of intermediate organic products, which may be more difficult to degrade; these should be investigated. | Validity of test results | 53. | Consider the test to be valid if the degree of DOC (or COD) elimination (DB) in the control units is > 80 % after 2 weeks operation and no unusual observations have been made. | 54. | If a readily biodegradable (reference) chemical has been tested, the degree of biodegradation should be > 90 % and the difference between duplicate values should not be greater than 5 %. If these two criteria are not met, review the experimental procedures and/or obtain domestic sewage from another source. | 55. | Similarly, differences between biodegradation values from duplicate units (if used) treating a test chemical should not differ by more than 5 %. If this criterion is not met but the removals are high, continue analysis for a further three weeks. If removal is low, investigate the inhibitory effects of the test chemical if not known and repeat the test at a lower concentration of test chemical, if that is feasible. | Test Report | 56. | The test report must include the following: | | Test chemical: | — | identification data; | — | physical nature and, where relevant, physico-chemical properties. | | Test conditions: | — | any modifications to test system, especially if insolubles or volatiles tested; | — | type of organic medium; | — | proportion and nature of industrial wastes in sewage, if used and if known; | — | method of inoculation; | — | test chemical stock solution — DOC (dissolved organic carbon) and TOC (total organic carbon) content; how prepared, if suspension; test concentration(s) used, reasons if outside range 10-20 mg/l DOC; method of addition; date first added; any changes in concentration; | — | mean hydraulic retention time (with no growth); rotational speed of tube; approximate angle of inclination, if possible; | — | details of sloughing; time and intensity; | — | test temperature and range; | — | analytical techniques employed. | | Test results: | — | all measured data DOC, COD, specific analyses, pH, temperature, N chemicals, if relevant; | — | all calculated date of Dt (or Dtc), DB, Ds obtained in tabular form and elimination curves; | — | information on lag and plateau phases, test duration, the degree of elimination of the test chemical, of the reference chemical (if tested) and of the organic medium (in the control unit), together with statistical data and statements of biodegradability and validity of the test; | — | discussion of results. | LITERATURE: | (1) | Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758. | (2) | Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444. | (3) | Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. | (4) | Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357. | (5) | Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94. | (6) | Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881. | (7) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London. | (8) | Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London. | (9) | Chapter C.4 of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability A-F. | (10) | ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels. | Appendix 8 | Figure 1 | Rotating tubes | Figure 2 | Flow diagram | DEFINITIONS: | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Chemicals: “It should be noted that the term ‘chemical’ is used broadly in the UNCED agreements and subsequent documents to include substances, products, mixtures, preparations, or any other terms that may be used in existing systems to denote coverage”. | ’ |
| 10. | dodajo se poglavja C.27, C.28, C.29 in C.30: | „C.27 PRESKUS STRUPENOSTI S TRZAČAMI V SISTEMU VODE IN USEDLINE Z UPORABO USEDLINE S PRIMEŠANO PRESKUSNO SNOVJO | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 218 (2004). Zasnovana je za oceno učinkov daljše izpostavljenosti kemikalijam na ličinke sladkovodne trzače Chironomus sp., ki živijo v usedlinah. Temelji na obstoječih protokolih za preskušanje strupenosti za Chironomus riparius in Chironomus tentans, ki so bili razviti v Evropi (1) (2) (3) in Severni Ameriki (4) (5) (6) (7) (8) ter krožno preskušeni (1) (6) (9). Uporabijo se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trzače, npr. Chironomus yoshimatsui (10) (11). | 2. | Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje preskusne snovi v usedlino. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je odvisna od namena uporabe preskusa. Namen primešanja snovi v usedlino je simulirati nakopičene ravni kemikalij, ki ostajajo v usedlini. Ta sistem izpostavljenosti vključuje primešanje snovi v usedlino v preskusnem sistemu vode in usedline. | 3. | Snovi, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, živečimi v usedlinah, se običajno v tem delu zelo dolgo obdržijo. Organizmi, živeči v usedlinah, so lahko izpostavljeni na številne načine. Relativni pomen vsakega načina izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim učinkom, sta odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije. Pri snoveh, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snoveh, ki se kovalentno vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben način izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih snovi, se lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne snovi. Da bi se upoštevali vsi morebitni načini izpostavljenosti, je ta preskusna metoda osredotočena na dolgoročno izpostavljenost. Preskus za C. riparius in C. yoshimatsui traja 20 do 28 dni, za C. tentans pa 28 do 65 dni. Če so za določen namen potrebni kratkoročni podatki, na primer da se raziščejo učinki nestabilne kemikalije, se lahko dodatne ponovitve umaknejo po 10 dneh. | 4. | Izmerjene končne točke so skupno število preobraženih odraslih osebkov in čas do preobrazbe. Če so potrebni dodatni kratkoročni podatki, je priporočljivo, da se preživetje in rast ličink izmerita šele po 10-dnevnem obdobju, po potrebi z dodatnimi ponovitvami. | 5. | Priporoča se uporaba formulirane usedline. Ta ima pred naravnimi usedlinami več prednosti: | — | variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni ponovljivo ‚standardizirano matrico‘, poleg tega ni več treba iskati nekontaminiranih in čistih virov usedlin, | — | preskusi se lahko začnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno obdelati, da bi se odstranila domorodna favna; s formulirano usedlino se tudi znižajo stroški, povezani z zbiranjem zadostne količine usedline na terenu za rutinsko preskušanje, | — | uporaba formulirane usedline omogoča primerjave strupenosti in ustrezno razvrstitev snovi. | 6. | Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 7. | Ličinke trzače prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije preskusne kemikalije v sistemih vode in usedline. Preskusna snov se primeša v usedlino, ličinke prvega stadija pa se nato vnesejo v preskusne čaše, v katerih so bile koncentracije usedline in vode stabilizirane. Hitrost preobrazbe in razvoja trzač se izmeri ob koncu preskusa. Preživetje in teža ličink se lahko izmerita tudi po 10 dneh, če je to potrebno (z dodatnimi ponovitvami, kot je ustrezno). Ti podatki se analizirajo bodisi z regresijskim modelom, da se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje preobrazbe, ali preživetja, ali rasti ličink (npr. EC15, EC50 itd.), bodisi s preskušanjem statističnih domnev za določitev NOEC/LOEC. Slednje zahteva primerjavo vrednosti učinkov s kontrolnimi vrednostmi, za kar se uporabijo statistični preskusi. | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 8. | Znani morajo biti vodotopnost preskusne snovi, njen parni tlak, izmerjeni ali izračunani koeficient porazdelitve v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. Za določitev količine preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpričano natančnostjo ter mejo zaznave. Koristni informaciji sta tudi strukturna formula in čistost preskusne snovi. Prav tako je koristno poznati obnašanje preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja itd.). Dodatne smernice za preskušanje snovi s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskus otežen, so navedene v (12). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 9. | Redno se lahko preskušajo referenčne kemikalije, da se tako zagotavlja zanesljivost protokola za preskušanje in preskusnih pogojev. Primeri referenčnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in potrditvenih raziskavah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (2) (5) (6) (13). | VELJAVNOST PRESKUSA | 10. | Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: | — | preobrazba v kontrolnih posodah ob koncu preskusa mora biti vsaj 70-odstotna (1) (6), | — | C. riparius in C. yoshimatsui v kontrolnih posodah se morajo v odrasle osebke preobraziti med 12. in 23. dnem po vnosu v posode; C. tentans potrebujejo 20 do 65 dni, | — | ob koncu preskusa je treba v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasičenosti zraka (ASV) pri uporabljeni temperaturi, pH vode nad usedlino pa mora biti v vseh preskusnih posodah med 6 in 9, | — | temperatura vode se ne sme razlikovati za več kot ± 1,0 °C; temperaturo vode bi bilo mogoče nadzorovati z izotermalnim prostorom; v takem primeru je treba temperaturo v prostoru potrjevati v ustreznih časovnih presledkih. | OPIS METODE | Preskusne posode | 11. | Raziskava se izvaja v steklenih 600-mililitrskih čašah z 8-centimetrskim premerom. Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno globino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm2 na ličinko. Razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo mora biti 1 : 4. Preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. teflona). | Izbira vrst | 12. | Če je mogoče, naj se v preskusu uporabi vrsta Chironomus riparius. Chironomus tentans je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva daljše preskusno obdobje. Uporabi se lahko tudi Chironomus yohimatsui. Podrobnosti o metodah gojenja za Chironomus riparius so navedene v Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja so na voljo tudi za druge vrste, npr. Chironomus tentans (4) in Chironomus yoshimatsui (11). Identifikacijo vrst je treba potrditi pred preskusom, ni pa to potrebno pred vsakim preskusom, če organizmi prihajajo iz internega gojišča. | Usedlina | 13. | Če je mogoče, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina). Če se uporabi naravna usedlina, je treba določiti njene lastnosti (vsaj pH in vsebnost organskega ogljika, priporoča se tudi določitev drugih parametrov, kot sta razmerje C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebovati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s trzačami ali jih požrli. Prav tako se priporoča, naj se naravna usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Za uporabo v tem preskusu (1) (15) (16) se priporoča naslednja formulirana usedlina, ki temelji na umetni zemljini, uporabljeni v preskusni metodi C.8 (14): | (a) | 4–5 % (suhe teže) šote: čim bližje vrednosti pH 5,5 do 6,0; pomembno je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno samo na zraku; | (b) | 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %); | (c) | 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, pri katerem je več kot 50 % delcev velikih 50 do 200 μm); | (d) | doda se deionizirana voda, tako da je v končni mešanici vsebnost vlage 30- do 50-odstotna; | (e) | doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO3), da se pH v končni mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5. Vsebnost organskega ogljika v končni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %), uravnava pa se z ustreznimi količinami šote in peska v skladu s točkama (a) in (c). | 14. | Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da sestavine usedline niso kemično onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih kovin, organoklornih spojin, organofosfornih spojin itd.). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad usedlino ne začnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali usedlina zadostno kondicionirana. | Voda | 15. | Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim značilnostim sprejemljive vode za redčenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, naravna voda (površinska ali podzemna voda), obdelana voda (glej Dodatek 2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in preskušanja v njej preživijo brez znakov stresa. Na začetku preskusa mora biti pH preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti višja od 400 mg/l kot CaCO3. Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). Ves čas raziskave je treba uporabljati isto vrsto vode. Lastnosti vode, navedene v Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se morda te lastnosti bistveno spremenile. | Založne raztopine – usedline s primešano preskusno snovjo | 16. | Usedline s primešano preskusno snovjo izbrane koncentracije se običajno pripravijo z dodatkom raztopine preskusne snovi neposredno v usedlino. osnovna raztopina preskusne snovi, raztopljene v deionizirani vodi, se zmeša s formulirano usedlino z valjčnim mlinom, mešalnikom za krmo ali ročno. Če je preskusna snov slabo topna v vodi, se lahko raztopi v čim manjši količini ustreznega organskega topila (npr. heksana, acetona ali kloroforma). Ta raztopina se nato zmeša z 10 g finega kremenovega peska za eno preskusno posodo. Topilo je treba pustiti, da izhlapi, in mora biti v celoti odstranjeno iz peska; pesek se nato zmeša z ustrezno količino usedline na preskusno čašo. Za raztapljanje, razpršitev ali emulgiranje preskusne snovi se lahko uporabijo samo tista sredstva, ki hitro izhlapijo. Ne smemo pozabiti, da je treba pri pripravi usedline upoštevati količino peska, prinesenega z mešanico preskusne snovi in peska (tj. usedlino je torej treba pripraviti z manj peska). Paziti je treba, da je preskusna snov, dodana usedlini, v njej temeljito in enakomerno razporejena. Po potrebi se lahko analizirajo podvzorci, da se ugotovi stopnja homogenosti. | NAČRT PRESKUSA | 17. | Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število ličink na posodo. Opisani so načrti za točkovno oceno EC, oceno NOEC in izvedbo mejnega preskusa. | Načrt za regresijsko analizo | 18. | S koncentracijami, vključenimi v preskus, bi morala biti zajeta efektivna koncentracija (npr. EC15, EC50) in razpon koncentracije, v katerem je zanimiv vpliv preskusne snovi. Na splošno se natančnost in zlasti veljavnost, ki ju je mogoče doseči pri ocenah efektivnih koncentracij (ECx), izboljšata, kadar je efektivna koncentracija v okviru preskušanega razpona koncentracij. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo pozitivno koncentracijo ali veliko nad najvišjo koncentracijo. Kot pomoč pri izbiri razpona koncentracij, ki bo uporabljen (glej odstavek 27), se lahko izvede predhodni preskus za ugotavljanje razpona. | 19. | Če je treba oceniti ECx, je treba preskusiti vsaj 5 koncentracij in izvesti 3 ponovitve za vsako koncentracijo. Vsekakor je priporočljivo uporabiti dovolj preskusnih koncentracij, da se omogoči dobra ocena modela. Faktor med koncentracijami ne sme biti večji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon krivulje odmerek-učinek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s preskusno snovjo se lahko zmanjša, če se poveča število preskusnih koncentracij z različnimi učinki. Povečanje števila ponovitev ali zmanjšanje velikosti razmikov med preskusnimi koncentracijami običajno vodi do ožjih intervalov zaupanja za preskus. Dodatne ponovitve so potrebne, če se ocenjujeta 10-dnevno preživetje in rast ličink. | Načrt za oceno NOEC/LOEC | 20. | Če je treba oceniti LOEC ali NOEC, bi bilo treba uporabiti pet preskusnih koncentracij in izvesti vsaj štiri ponovitve, faktor med koncentracijami pa ne sme biti večji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi ustrezna statistična vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Pri hitrosti razvoja je običajno ustrezna analiza variance (ANOVA), kot sta Dunnettov preskus in Williamsov preskus (17) (18) (19) (20). Pri koeficientu preobrazbe se lahko uporabijo Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov preskus. | Mejni preskus | 21. | Če v predhodnem preskusu za ugotavljanje razpona ni bilo opaženih učinkov, se lahko opravi mejni preskus (ena preskusna koncentracija in kontrolna enota). Namen mejnega preskusa je izvesti preskus pri dovolj visoki koncentraciji, da lahko nosilci odločanja izključijo mogoče strupene učinke preskusne snovi, meja pa je določena pri koncentraciji, za katero ni pričakovati, da bi se pojavila v katerem koli primeru. Priporoča se 1 000 mg/kg (suhe teže). Običajno je potrebnih vsaj šest ponovitev za preskusne in kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statistično vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Kar zadeva učinek na hitrost razvoja in težo, je t-test primerna statistična metoda, če podatki izpolnjujejo zahteve za ta preskus (normalnost, homogenost varianc). Če te zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance ali neparametrični preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus. | POSTOPEK | Pogoji izpostavljenosti | Priprava sistema vode in usedline, v katerem je preskusna snov primešana v usedlino | 22. | Za uporabo preskusne snovi (14) se priporoča postopek primešanja, opisan v preskusni metodi C.8: Strupenost za deževnike. Usedline s primešano preskusno snovjo se vnesejo v posode, nad usedlino pa se doda voda, da nastane volumensko razmerje med usedlino in vodo 1 : 4 (glej odstavka 11 in 15). Plast usedline mora biti debela 1,5 do 3 cm. Da se prepreči ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med točenjem vode prekrije s plastičnim pokrovom, ki se takoj nato odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva. | 23. | Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploščami). Po potrebi se med raziskavo voda dotoči do prvotne količine, da se nadomesti izhlapela voda. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se prepreči kopičenje soli. | Stabilizacija | 24. | Ko je usedlina s primešano preskusno snovjo in vodo nad njo pripravljena, je zaželeno, da se omogoči porazdelitev preskusne snovi iz vodne faze v usedlino (3) (4) (6) (13). To je po možnosti treba storiti v temperaturnih in prezračevalnih pogojih, ki bodo uporabljeni v preskusu. Ustrezen čas za vzpostavitev ravnotežja je odvisen od usedline in kemikalije, lahko pa traja od več ur do več dni in v redkih primerih do več tednov (4 do 5 tednov). Ker bi bil tako na voljo čas za razgradnjo številnih kemikalij, se na vzpostavitev ravnotežja ne sme čakati, ampak se za to priporoča 48-urno obdobje. Po koncu tega dodatnega obdobja za vzpostavitev ravnotežja je treba izmeriti koncentracijo preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini vsaj pri najvišji in nižji koncentraciji (glej odstavek 38). Te analitske določitve preskusne snovi omogočajo izračun masne bilance in izražanje rezultatov na podlagi izmerjenih koncentracij. | Dodajanje preskusnih organizmov | 25. | Od 4 do 5 dni pred vnosom preskusnih organizmov v preskusne posode je treba iz gojišč vzeti jajčna legla in jih vstaviti v majhne posode v gojitvenem mediju. Uporabi se lahko starejši medij iz osnovne kulture ali sveže pripravljeni medij. Če se uporabi slednji, je treba v gojitveni medij dodati majhno količino hrane, npr. zelenih alg in/ali nekaj kapljic filtrata suspenzije iz fino mlete ribje hrane v kosmičih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba samo sveže odložena jajčna legla. Običajno se ličinke izležejo nekaj dni po tem, ko so bila jajčeca odložena (2 do 3 dni za Chironomus riparius pri 20 °C ter 1 do 4 dni za Chironomus tentans pri 23 °C in Chironomus yoshimatsui pri 25 °C), rast ličink pa poteka v 4 stadijih, od katerih vsak traja 4 do 8 dni. V preskusu je treba uporabiti ličinke prvega stadija (2 do 3 ali 1 do 4 dni po tem, ko se izležejo). Stadij trzač se lahko po možnosti preveri z merjenjem širine glave (6). | 26. | 20 ličink prvega stadija se s topo pipeto naključno vnese v vsako preskusno posodo, ki vsebuje usedlino s primešano preskusno snovjo in vodo. Med dodajanjem ličink v preskusne posode je treba ustaviti prezračevanje vode, ki se ne sme izvajati še 24 ur potem, ko so bile ličinke dodane (glej odstavka 25 in 32). Glede na uporabljeni načrt preskusa (glej odstavka 19 in 20) se za točkovno oceno EC uporabi vsaj 60 ličink na koncentracijo, za določitev NOEC pa 80. | Preskusne koncentracije | 27. | Preskus za ugotavljanje razpona je lahko koristen za določitev razpona koncentracij za končni preskus. Za ta namen se uporabi niz široko razmaknjenih koncentracij preskusne snovi. Da se zagotovi enaka gostota površine na trzačo, kot bo uporabljena za končni preskus, se trzače izpostavijo vsaki koncentraciji preskusne snovi za obdobje, ki omogoča oceno ustreznih preskusnih koncentracij, pri čemer ponovitve niso potrebne. | 28. | Preskusne koncentracije za končni preskus se določijo na podlagi rezultata preskusa za ugotavljanje razpona. Izbrati in uporabiti je treba vsaj pet koncentracij, kot je opisano v odstavkih 18 do 20. | Kontrolne enote | 29. | V preskus je treba vključiti kontrolne posode, v katerih ni preskusne snovi, toda ki vsebujejo usedlino, z ustreznim številom ponovitev (glej odstavka 19 in 20). Če je bilo za aplikacijo preskusne snovi uporabljeno topilo (glej odstavek 16), je treba dodati kontrolno posodo, katere usedlina vsebuje tudi topilo. | Preskusni sistem | 30. | Uporabljajo se statični sistemi. Polstatični ali pretočni sistemi z občasnim ali kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino se lahko uporabijo v izjemnih primerih, na primer če specifikacije kakovosti vode postanejo neprimerne za preskusni organizem ali vplivajo na kemijsko ravnotežje (npr. ravni raztopljenega kisika se preveč znižajo, koncentracija izločkov se preveč poviša ali minerali iztekajo iz usedline in vplivajo na pH in/ali trdoto vode). Vendar za izboljšanje kakovosti vode nad usedlino običajno zadoščajo in se prednostno uporabljajo druge metode, kot je prezračevanje. | Hrana | 31. | Ličinke je treba hraniti, po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Za mlade ličinke v prvih desetih dneh ustreza 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za C. yoshimatsui) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. TetraMin ali TetraPhyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na ličinko na dan. Nekoliko več hrane bodo morda potrebovale starejše ličinke: za preostanek preskusa mora zadostovati 0,5–1 mg na ličinko na dan. Obrok hrane je treba zmanjšati v vseh preskusnih in kontrolnih posodah, če se opazi rast glivic ali smrtnost v kontrolnih posodah. Če razvoja glivic ni mogoče ustaviti, je treba preskus ponoviti. Kadar se preskušajo snovi, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snovi, ki se kovalentno vežejo na usedlino, se lahko količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravne rasti organizmov, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije. Za to je treba namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodatek 0,5 % (suhe teže) fino mletih listov npr. velike koprive (Urtica dioica), bele murve (Morus alba), plazeče detelje (Trifolium repens), špinače (Spinacia oleracea) ali drugega rastlinskega materiala (Cerophyl ali alfa celuloza). | Pogoji inkubacije | 32. | Zagotovi se rahlo prezračevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah, po možnosti 24 ur po vnosu ličink, in se izvaja ves čas preskusa (paziti je treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, pritrjene 2 do 3 cm nad plastjo usedline (tj. 1 ali nekaj mehurčkov/s). Kadar se preskušajo hlapne kemikalije, je mogoče razmisliti o tem, da se sistem vode in usedline ne bi prezračeval. | 33. | Preskus se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans in C. yoshimatsui sta priporočeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti 500 do 1 000 lux. | Trajanje izpostavljenosti | 34. | Izpostavljenost se začne z vnosom ličink v posode s primešano preskusno snovjo in kontrolne posode. Najdaljši čas izpostavljenosti za C. riparius in C. yoshimatsui je 28 dni, za C. tentans pa 65 dni. Če se ličinke v odrasle osebke preobrazijo prej, se lahko preskus konča najmanj pet dni po preobrazbi zadnjega odraslega osebka v kontrolni posodi. | Opažanja | Preobrazba | 35. | Določita se čas razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. | 36. | Preskusne posode je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se ugotovi kakršno koli neobičajno obnašanje (npr. zapuščanje usedline, nenavadno plavanje) v primerjavi s kontrolno posodo. V obdobju pričakovane preobrazbe je potrebno dnevno štetje preobraženih trzač. Spol in število v celoti preobraženih trzač se zapišeta dnevno. Po identifikaciji se trzače odstranijo iz posod. Vsa jajčna legla, odložena pred zaključkom preskusa, je treba evidentirati in nato odstraniti, da se prepreči vnovični vnos ličink v usedlino. Evidentira se tudi število vidnih bub, ki se niso preobrazile. Napotek za spremljanje preobrazbe je v Dodatku 5. | Rast in preživetje | 37. | Če je treba zagotoviti podatke o 10-dnevnem preživetju in rasti ličink, je treba na začetku vključiti dodatne preskusne posode, ki se lahko uporabijo pozneje. Usedlina iz teh dodatnih posod se preseje skozi sito z 250 μm velikimi luknjicami, da se zadržijo ličinke. Merili za pogin sta negibnost ali neodzivnost na mehanske dražljaje. Ličinke, ki ostanejo v usedlini, je prav tako treba šteti za mrtve (ličinke, ki so poginile na začetku preskusa, so morda razgradili mikrobi). Določi se suha teža (brez pepela) preživelih ličink na preskusno posodo in izračuna srednja suha teža posamezne ličinke na posodo. Koristno je določiti, v kateri stadij spadajo preživele ličinke; za to se lahko izmeri širina glave vsakega osebka. | Analitske meritve | Koncentracija preskusne snovi | 38. | Pred začetkom preskusa (tj. dodatkom ličink) se za analitsko določitev koncentracije preskusne snovi v usedlini odvzamejo vzorci usedline vsaj iz ene posode na posamezno obdelavo. Priporoča se, da se na začetku in koncu preskusa analizirajo vsaj vzorci vode nad usedlino, porne vode in usedline (glej odstavek 24), in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. Te določitve koncentracije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev preskusne snovi v sistemu vode in usedline. | 39. | Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. 7. dan) in če so za analize potrebni veliki vzorci, ki jih ni mogoče vzeti iz preskusnih posod, ne da bi to vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske določitve izvesti na vzorcih iz dodatnih preskusnih posod, ki se obdelujejo enako (vključno s prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne uporabljajo. | 40. | Za izolacijo intersticijske vode se priporoča 30-minutno centrifugiranje pri npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno snov izkaže, da se ne adsorbira na filtre, je lahko sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca morda ne bo mogoče analizirati. | Fizikalno-kemijski parametri | 41. | Vrednost pH in temperaturo v preskusnih posodah je treba ustrezno meriti (glej odstavek 10). Trdoto in amonij je treba izmeriti v kontrolnih posodah in eni preskusni posodi pri najvišji koncentraciji na začetku in koncu preskusa. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 42. | Namen tega preskusa je določiti učinek preskusne snovi na hitrost razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače oziroma, pri 10-dnevnem preskusu, učinke na preživetje in težo ličink. Če ni znakov o statistično različni občutljivosti spolov, se lahko rezultati za samce in samice za statistične analize združijo. Razlike v občutljivosti med spoloma je mogoče statistično oceniti, na primer s preskusom χ2-r × 2. Po potrebi je treba po 10 dneh določiti preživetje ličink in srednjo suho težo posamezne ličinke na posodo. | 43. | Če je mogoče, se efektivne koncentracije, ki so izražene in temeljijo na suhi teži, izračunajo na podlagi izmerjenih koncentracij v usedlini na začetku preskusa (glej odstavek 38). | 44. | Za točkovno oceno EC50 ali druge ECx se lahko statistični podatki po posodah uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izračunu intervala zaupanja za ECx je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa dokazati, da je ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših kvadratov, je treba statistične podatke po posameznih posodah transformirati, da se izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti ECx izračunati po tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vrednost. | 45. | Kadar je namen statistične analize določiti NOEC/LOEC s preskušanjem domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, npr. z vgnezdeno ANOVO. Alternativno se lahko uporabijo robustnejši preskusi (21), kadar so običajne predpostavke ANOVE kršene. | Koeficient preobrazbe | 46. | Koeficient preobrazbe da odgovor ‚vse ali nič‘ in se lahko analizira s Cochran-Armitageevim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in so ti podatki v skladu s tem pričakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravljenimi p-vrednostmi. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v okviru iste koncentracije večja, kot bi kazala binomska porazdelitev (pogosto imenovana ‚ekstra-binomska‘ variacija), potem je treba uporabiti robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je predlagano v (21). | Vsota preobraženih trzač na posodo ne se določi in deli s številom vnesenih ličink na: | pri čemer je: | ER | = | koeficient preobrazbe, | ne | = | število preobraženih trzač na posodo, | na | = | število vnesenih ličink na posodo. | 47. | Druga možnost, ki je najprimernejša za velike vzorce, kadar obstaja ekstra binomska varianca, je, da se koeficient preobrazbe obravnava kot zvezni odgovor in se uporabijo postopki, kot je Williamsov preskus, kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in kadar je to v skladu s temi podatki o koeficientu preobrazbe. Dunettov preskus je primeren, kadar monotonost ne drži. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobraženih osebkov in število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih več kot pet. | 48. | Za uporabo metod ANOVA je treba vrednosti ER najprej transformirati z arkus sinus-korensko transformacijo ali Freeman-Tukeyevo transformacijo, da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izenačijo. Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabijo, kadar se uporabljajo absolutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izračuna arkus sinus (sin-1) kvadratnega korena ER. | 49. | Za koeficiente preobrazbe se vrednosti ECx izračunajo z regresijsko analizo (ali npr. probit (22), logit, Weibull, ustrezno programsko opremo itd.). Če regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), se uporabijo druge neparametrične metode, kot sta drseče povprečje ali linearna interpolacija. | Hitrost razvoja | 50. | Srednji čas razvoja pomeni srednji časovni razpon med vnosom ličink (dan 0 preskusa) in preobrazbo poskusne kohorte trzač. (Za izračun dejanskega časa razvoja je treba upoštevati starost ličink ob vnosu.) Hitrost razvoja je obratna času razvoja (enota: 1/dan) in predstavlja tisti delež razvoja ličink, ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primernejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homogena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato so učinkoviti parametrični preskusi primernejši za hitrost razvoja kot za čas razvoja.Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odgovor, se lahko vrednosti ECx ocenijo z regresijsko analizo (npr. (23), (24)). | 51. | Za naslednje statistične preskuse se za število trzač, opaženih na dan opazovanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med dnevom × in dnevom x – 1 (l = dolžina intervala opazovanja, običajno 1 dan). Srednja hitrost razvoja na posodo (x) se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | : | srednja hitrost razvoja za posodo, | i | : | indeks intervala opazovanja, | m | : | največje število intervalov opazovanja, | : | število trzač, preobraženih v intervalu opazovanja i, | ne | : | skupno število preobraženih trzač ob koncu poskusa, (= | ) | xi | : | hitrost razvoja trzač, preobraženih v intervalu i. | pri čemer je: | dayi | : | dan opazovanja (dnevi od vnosa), | li | : | dolžina intervala opazovanja i (dnevi, običajno 1 dan). | Poročilo o preskusu | 52. | V poročilu o preskusu morajo biti navedene vsaj naslednje informacije: | | Preskusna snov: | — | fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vodotopnost, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je na voljo), stabilnost v vodi itd.), | — | kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna formula, številka CAS itd.), vključno s čistostjo in analitsko metodo za količinsko določanje preskusne snovi. | | Preskusne vrste: | — | uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji razmnoževanja, | — | informacije o ravnanju z jajčnimi legli in ličinkami, | — | starost preskusnih živali ob vnosu v preskusne posode. | | Preskusni pogoji: | — | uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana, | — | za naravno usedlino lokacija in opis mesta vzorčenja usedline, vključno, če je mogoče, s preteklim onesnaženjem; značilnosti: pH, vsebnost organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija (če je ustrezno), | — | priprava formulirane usedline: sestavine in značilnosti (vsebnost organskega ogljika, pH, vlaga itd. na začetku preskusa), | — | priprava preskusne vode (če se uporablja obdelana voda) in značilnosti (koncentracija kisika, pH, prevodnost, trdota itd. na začetku preskusa), | — | globina usedline in vode nad njo, | — | količina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno vodo in brez nje, | — | preskusne posode (material in velikost), | — | metoda primešanja preskusne snovi v usedlino: uporabljene preskusne koncentracije, število ponovitev in uporaba topila, če je bilo uporabljeno, | — | faza stabilizacije za vzpostavitev ravnotežja sistema vode in usedline: trajanje in pogoji, | — | pogoji inkubacije: temperatura, svetlobni ciklus in jakost svetlobe, prezračevanje (pogostost in jakost), | — | podrobne informacije o hranjenju, vključno z vrsto hrane, pripravo, količino in načinom. | | Rezultati: | — | nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za določitev koncentracije preskusne snovi v preskusni posodi, | — | kakovost vode v preskusnih posodah, tj. pH, temperatura, raztopljeni kisik, trdota in amonij, | — | morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode, | — | število preobraženih samcev in samic trzače na posodo in na dan, | — | število ličink, ki se niso preobrazile v trzače, na posodo, | — | srednja suha teža posamezne ličinke na posodo in po stadijih, če je ustrezno, | — | delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni samci in samice trzače), | — | srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih trzač na ponovitev in stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trzače), | — | ocene strupenih končnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali zaupanja), NOEC in/ali LOEC, ter statistične metode, uporabljene za njihovo določitev, | — | obravnava rezultatov, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode. | VIRI: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Končno poročilo za Evropsko komisijo. Poročilo št.: EC 3738. Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Z delavnice WOSTA, ki je potekala na Nizozemskem. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, str. 1125–1241. V ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druga izdaja. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Sprememba prve izdaje iz junija 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., in Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. | (10) | Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. | (11) | Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. | (12) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Preskusna metoda C.8 iz te priloge, Strupenost za deževnike. | (15) | Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. | (16) | Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. | (17) | Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121. | (18) | Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491. | (19) | Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117. | (20) | Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531. | (21) | Rao, J. N. K., in Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. | (22) | Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. | (23) | Bruce in Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. | (24) | Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov: | | formulirana usedlina ali rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline; | | voda nad usedlino je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi; | | intersticijska voda ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline in zemljine; | | usedlina s primešano snovjo je usedlina, ki ji je bila dodana preskusna snov; | | preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Priporočila za gojenje Chironomus riparius | 1. | Ličinke Chironomus se lahko gojijo v kristalizirkah ali večjih vsebnikih. Na dno vsebnika se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselguhr (npr. Merck, Art 8117) (zadošča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato se doda primerna voda do globine več cm. Vodo je treba po potrebi dotočiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepreči izsušitev. Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezračevanje. Posode, v katerih se gojijo ličinke, morajo biti v primerni kletki, ki bo preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s stalnim ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem svetlobe (jakost približno 1 000 lux) in 8-urno temo. Po poročilih lahko manj kot 60-odstotna relativna vlažnost zraka ovira razmnoževanje. | Voda za redčenje | 3. | Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sintetična voda. Običajno se uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji (npr. medij Elendt ‚M4‘ ali ‚M7‘, glej spodaj). Vodo je treba pred uporabo prezračiti. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se uporabljena voda iz gojitvenih posod skrbno pretoči ali izsesa, ne da bi pri tem uničili ovoj ličink. | Hranjenje ličink | 4. | Ličinke Chironomus je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v kosmičih (TetraMin®, TetraPhyll® ali druga podobna zaščitena znamka ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmičih se doda 20 ml vode za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko daje v količini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba pretresti). Starejše ličinke lahko dobijo več hrane. | 5. | Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojitveni medij postane ‚moten‘, je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. Premalo hrane bo povzročilo selitev ličink v vodni stolpec, preveč hrane pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje lahko privede do počasnejše rasti. | 6. | Ko se pripravijo nove gojitvene posode, se lahko dodajo tudi celice nekaterih zelenih alg (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). | Hranjenje preobraženih odraslih osebkov | 7. | Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namočena v nasičeno raztopino saharoze. | Preobrazba | 8. | Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje ličink začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. | Jajčna legla | 9. | Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za gojenje ličink trikrat tedensko preveriti zaradi morebitnih odloženih želatinastih jajčnih legel, ki jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jajčna legla se uporabijo za pripravo nove gojitvene posode (npr. 2 do 4 jajčna legla/posodo) ali za preskuse strupenosti. | 10. | Ličinke prvega stadija bi se morale izleči po 2 ali 3 dneh. | Priprava novih gojitvenih posod | 11. | Ko so gojišča vzpostavljena, bi moralo biti mogoče novo gojitveno posodo za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev preskušanja, stare posode pa odstraniti, ko se ličinke preobrazijo v odrasle osebke. S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi osebki. | Priprava preskusnih raztopin ‚M4‘ in ‚M7‘ | 12. | Elendt (1990) je opisal medij ‚M4‘. Medij ‚M7‘ se pripravi kot medij ‚M4‘, z izjemo snovi, navedenih v preglednici 1, za katere so koncentracije pri ‚M7‘ štirikrat nižje kot pri ‚M4‘. Publikacija o mediju ‚M7‘ je v pripravi (Elendt, osebno sporočilo). Preskusna raztopina se ne sme pripraviti po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 in K2HPO4, navedene za pripravo osnovnih raztopin, niso ustrezne. | Priprava medija ‚M7‘ | 13. | Vsaka osnovna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena osnovna raztopina (II) pa se pripravi iz teh osnovnih raztopin (I) (glej preglednico 1). V 50 ml sestavljene osnovne raztopine (II), ki ji je dodana količina vsake osnovne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v preglednici 2, se dolije deionizirana voda do 1 litra, da se pripravi medij ‚M7‘. Založna raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deionizirano vodo, kot je navedeno v preglednici 3, 0,1 ml sestavljene osnovne raztopine vitaminov pa se doda končnemu mediju ‚M7‘ malo pred uporabo. (Založna raztopina vitaminov se shranjuje zamrznjena v majhnih alikvotih.) Medij se prezračuje in stabilizira. | VIRI: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. | Preglednica 1 | Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7 | Založne raztopine (I) | Količina (mg) za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | Za pripravo sestavljene osnovne raztopine (II): zmešajte naslednje količine (ml) osnovnih raztopin (I) in dopolnite do 1 litra z deionizirano vodo | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (15) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (15) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (15) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (15) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (15) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (15) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (15) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (15) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (15) (16) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Preglednica 2 | Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7 | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina osnovnih raztopin makrohranilnih snovi za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Preglednica 3 | Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7. Vse tri raztopine vitaminov so združene v eno. | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina dodane osnovne raztopine vitaminov za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | Tiamin hidroklorid | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianokobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotin | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | VIRI: | Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. | Elendt, B. P. in Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. | Dodatek 3 | PRIPRAVA FORMULIRANE USEDLINE | Sestava usedline | Sestava formulirane usedline mora biti naslednja: | Sestavina | Značilnosti | Delež suhe | teže usedline v % | Šota | Šotni mah, čim bližje pH 5,5 do 6,0, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 1 mm) in sušen na zraku. | 4–5 | Kremenov pesek | Velikost zrn: > 50 % delcev mora biti velikih 50–200 μm. | 75–76 | Kaolinska glina | Vsebnost kaolinita ≥ 30 %. | 20 | Organski ogljik | Uravnava se z dodatkom šote in peska. | 2 (± 0,5) | Kalcijev karbonat | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. | 0,05–0,1 | Voda | Prevodnost ≤ 10 μS/cm. | 30–50 | Priprava | Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva naprava za homogenizacijo. pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj 2 dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sestavinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 do 50 % suhe teže usedline. pH končne mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO3. Vzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. | Shranjevanje | Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava konča. | VIRI: | Poglavje C.8 te priloge. Strupenost za deževnike. | Meller, M., Egeler, P., Rombke, J., Schallnass, H., Nagel, R., Streit, B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. | Dodatek 4 | Kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje | Snov | Koncentracije | Delci | < 20 mg/l | Celotni organski ogljik | < 2 mg/l | Neionizirani amoniak | < 1 μg /l | Trdota kot CaCO3 | < 400 mg/l (17) | Ostanek klora | < 10 μg /l | Skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/1 | Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/1 | Skupni organski klor | < 25 ng/1 | Dodatek 5 | Napotek za spremljanje preobrazbe ličink trzače | Na preskusne čaše se namestijo lovilniki za preobražene osebke. Potrebni so od 20. dne do konca preskusa. Primer lovilnika je narisan spodaj: | A: najlonska mrežica | B: obrnjen plastični lonček | C: poskusna čaša brez ustja | D: mrežasti okenci za izmenjavo vode | E: voda | F: usedlina | C.28 PRESKUS STRUPENOSTI S TRZAČAMI V SISTEMU VODE IN USEDLINE Z UPORABO VODE S PRIMEŠANO PRESKUSNO SNOVJO | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD TG 219 (2004). Zasnovana je za oceno učinkov daljše izpostavljenosti kemikalijam na ličinke sladkovodne trzače Chironomus sp., ki živijo v usedlinah. Temelji predvsem na smernici BBA, v kateri je scenarij izpostavljenosti uporaba sistema vode in usedline, sestavljenega iz umetne zemljine in vodnega stolpca (1). Upošteva tudi obstoječe protokole za preskušanje strupenosti za Chironomus riparius in Chironomus tentans, ki so bili razviti v Evropi in Severni Ameriki (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) ter krožno preskušeni (1) (6) (9). Uporabijo se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trzače, npr. Chironomus yoshimatsui (10) (11). | 2. | Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje preskusne snovi v vodo. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je odvisna od namena uporabe preskusa. Scenarij izpostavljenosti, ki vključuje primešanje preskusne snovi v vodni stolpec, je namenjen simulaciji pojava zanašanja pesticidov in zajema začetne najvišje koncentracije v porni vodi. Uporaben je tudi za druge vrste izpostavljenosti (vključno z razlitji kemikalij), razen za procese kopičenja, ki trajajo dlje od preskusnega obdobja. | 3. | Snovi, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, živečimi v usedlinah, se običajno v tem delu zelo dolgo obdržijo. Organizmi, živeči v usedlinah, so lahko izpostavljeni na številne načine. Relativni pomen vsakega načina izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim učinkom, sta odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije. Pri snoveh, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snoveh, ki se kovalentno vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben način izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih snovi, se lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne snovi. Da bi se upoštevali vsi morebitni načini izpostavljenosti, je ta preskusna metoda osredotočena na dolgoročno izpostavljenost. Preskus za C. riparius in C. yoshimatsui traja 20 do 28 dni, za C. tentans pa 28 do 65 dni. Če so za določen namen potrebni kratkoročni podatki, na primer da se raziščejo učinki nestabilne kemikalije, se lahko dodatne ponovitve umaknejo po 10 dneh. | 4. | Izmerjene končne točke so skupno število preobraženih odraslih osebkov in čas do preobrazbe. Če so potrebni dodatni kratkoročni podatki, je priporočljivo, da se preživetje in rast ličink izmerita šele po 10-dnevnem obdobju, po potrebi z dodatnimi ponovitvami. | 5. | Priporoča se uporaba formulirane usedline. Ta ima pred naravnimi usedlinami več prednosti: | — | variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni ponovljivo ‚standardizirano matrico‘, poleg tega ni več treba iskati nekontaminiranih in čistih virov usedlin, | — | preskusi se lahko začnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno obdelati, da bi se odstranila domorodna favna; s formulirano usedlino se tudi znižajo stroški, povezani z zbiranjem zadostne količine usedline na terenu za rutinsko preskušanje, | — | uporaba formulirane usedline omogoča primerjave strupenosti in ustrezno razvrstitev snovi: podatki o strupenosti iz preskusov z naravnimi in umetnimi usedlinami so bili primerljivi za več kemikalij (2). | 6. | Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 7. | Ličinke trzače prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije preskusne kemikalije v sistemih vode in usedline. Preskus se začne z vnosom ličink prvega stadija v preskusne čaše, ki vsebujejo sistem vode in usedline, nato pa se preskusna snov primeša v vodo. Hitrost preobrazbe in razvoja trzač se izmerita ob koncu preskusa. Preživetje in teža ličink se lahko izmerita tudi po 10 dneh, če je to potrebno (z dodatnimi ponovitvami, kot je ustrezno). Ti podatki se analizirajo bodisi z regresijskim modelom, da se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje preobrazbe, preživetja ali rasti ličink (npr. EC15, EC50 itd.), bodisi s preskušanjem statističnih domnev za določitev NOEC/LOEC. Slednje zahteva primerjavo vrednosti učinkov s kontrolnimi vrednostmi, za kar se uporabijo statistični preskusi. | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 8. | Znani morajo biti vodotopnost preskusne snovi, njen parni tlak, izmerjeni ali izračunani koeficient porazdelitve v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. Za določitev količine preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpričano natančnostjo in mejo zaznave. Med Koristni informaciji sta tudi strukturna formula in čistost preskusne snovi. Prav tako je koristno poznati obnašanje preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja itd.). Dodatne smernice za preskušanje snovi s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskušanje oteženo, so navedene v (12). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 9. | Redno se lahko preskušajo referenčne kemikalije, da se tako zagotavlja zanesljivost protokola za preskušanje in preskusnih pogojev. Primeri referenčnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in potrditvenih raziskavah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (2) (5) (6) (13). | VELJAVNOST PRESKUSA | 10. | Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: | — | preobrazba v kontrolnih posodah ob koncu preskusa mora biti vsaj 70-odstotna (1) (6), | — | C. riparius in C. yoshimatsui v kontrolnih posodah se morajo v odrasle osebke preobraziti med 12. in 23. dnem po vnosu v posode; C. tentans potrebujejo 20 do 65 dni, | — | ob koncu preskusa je treba v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasičenosti zraka (ASV) pri uporabljeni temperaturi, pH vode nad usedlino pa mora biti v vseh preskusnih posodah med 6 in 9, | — | temperatura vode se ne sme razlikovati za več kot ± 1,0 °C. Temperaturo vode bi bilo mogoče nadzorovati z izotermalnim prostorom; v takem primeru je treba temperaturo v prostoru potrjevati v ustreznih časovnih presledkih. | OPIS METODE | Preskusne posode | 11. | Raziskava se izvaja v steklenih 600-mililitrskih čašah z 8-centimetrskim premerom. Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno globino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm2 na ličinko. Razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo mora biti 1 : 4. Preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. teflona). | Izbira vrst | 12. | Če je mogoče, naj se v preskusu uporabi vrsta Chironomus riparius. Chironomus tentans je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva daljše preskusno obdobje. Uporabi se lahko tudi Chironomus yohimatsui. Podrobnosti o metodah gojenja za Chironomus riparius so navedene v Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja so na voljo tudi za druge vrste, npr. Chironomus tentans (4) in Chironomus yoshimatsui (11). Identifikacijo vrst je treba potrditi pred preskusom, ni pa to potrebno pred vsakim preskusom, če organizmi prihajajo iz internega gojišča. | Usedlina | 13. | Če je mogoče, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina). Če se uporabi naravna usedlina, je treba določiti njene lastnosti (vsaj pH in vsebnost organskega ogljika, priporoča se tudi določitev drugih parametrov, kot sta razmerje C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebovati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s trzačami ali jih požrli. Prav tako se priporoča, naj se naravna usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Za uporabo v tem preskusu (1) (15) (16) se priporoča naslednja formulirana usedlina, ki temelji na umetni zemljini, uporabljeni v preskusni metodi C.8 (14): | (a) | 4–5 % (suhe teže) šote: čim bližje vrednosti pH 5,5 do 6,0; pomembno je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno samo na zraku; | (b) | 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %); | (c) | 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, pri katerem je več kot 50 % delcev velikih 50 do 200 μm); | (d) | doda se deionizirana voda, tako da je v končni mešanici vlaga 30- do 50-odstotna; | (e) | doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO3), da se pH v končni mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5; | (f) | vsebnost organskega ogljika v končni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %), uravnava pa se z ustreznimi količinami šote in peska v skladu s točkama (a) in (c). | 14. | Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da sestavine usedline niso kemično onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih kovin, organoklornih spojin, organofosfornih spojin itd.). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad usedlino ne začnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali usedlina zadostno kondicionirana. | Voda | 15. | Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim značilnostim sprejemljive vode za redčenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, naravna voda (površinska ali podzemna voda), obdelana voda (glej Dodatek 2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in preskušanja v njej preživijo brez znakov stresa. Na začetku preskusa mora biti pH preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti višja od 400 mg/l kot CaCO3. Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). Ves čas raziskave je treba uporabljati isto vrsto vode. Lastnosti vode, navedene v Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se morda te lastnosti bistveno spremenile. | Založne raztopine – voda s primešano preskusno snovjo | 16. | Preskusne koncentracije se izračunajo na podlagi koncentracij v vodnem stolpcu, tj. vodi nad usedlino. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se običajno pripravijo z redčenjem osnovne raztopine. Založne raztopine je po možnosti treba pripraviti tako, da se preskusna snov raztopi v preskusnem mediju. V nekaterih primerih bo morda treba uporabiti topila ali disperzijska sredstva, da se pripravi primerno koncentrirana osnovna raztopina. Primerna topila so na primer aceteon, etanol, metanol, etilen glikol monoetil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetil formamid in trietilen glikol. Disperzijska sredstva, ki se lahko uporabijo, so Cremaphor RH40, Tween 80, metil celuloza 0,01 % in HCO-40. Koncentracija topila v končnem preskusnem mediju mora biti minimalna (tj. ≤ 0,1 ml/l) in mora biti enaka v vseh posodah s preskusno snovjo. Kadar se uporabi topilo, to ne sme bistveno vplivati na preživetje ličink trzače ali imeti vidnih škodljivih učinkov nanje, kar se pokaže s kontrolno enoto, v kateri je le topilo. Vendar si je treba čim bolj prizadevati, da se taki materiali ne uporabijo. | NAČRT PRESKUSA | 17. | Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število ličink na posodo. Opisani so načrti za točkovno oceno EC, oceno NOEC in izvedbo mejnega preskusa. Regresijska analiza je primernejša od pristopa s preskušanjem domnev. | Načrt preskusa za regresijsko analizo | 18. | S koncentracijami, vključenimi v preskus, bi morala biti zajeta efektivna koncentracija (npr. EC15, EC50) in razpon koncentracije, v katerem je zanimiv vpliv preskusne snovi. Na splošno se natančnost in zlasti veljavnost, ki ju je mogoče doseči pri ocenah efektivnih koncentracij (ECx), izboljšata, kadar je efektivna koncentracija v okviru preskušanega razpona koncentracij. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo pozitivno koncentracijo ali veliko nad najvišjo koncentracijo. Kot pomoč pri izbiri razpona koncentracij, ki bo uporabljen (glej odstavek 27), se lahko izvede predhodni preskus za ugotavljanje razpona. | 19. | Če je treba oceniti ECx, je treba preskusiti vsaj 5 koncentracij in izvesti 3 ponovitve za vsako koncentracijo. Vsekakor je priporočljivo uporabiti dovolj preskusnih koncentracij, da se omogoči dobra ocena modela. Faktor med koncentracijami ne sme biti večji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon krivulje odmerek-učinek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s preskusno snovjo se lahko zmanjša, če se poveča število preskusnih koncentracij z različnimi učinki. Povečanje števila ponovitev ali zmanjšanje velikosti razmikov med preskusnimi koncentracijami običajno vodi do ožjih intervalov zaupanja za preskus. Dodatne ponovitve so potrebne, če se ocenjujeta 10-dnevno preživetje in rast ličink. | Načrt za oceno NOEC/LOEC | 20. | Če je treba oceniti LOEC/NOEC, bi bilo treba uporabiti pet preskusnih koncentracij in izvesti vsaj štiri ponovitve, faktor med koncentracijami pa ne sme biti večji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi ustrezna statistična vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Pri hitrosti razvoja je običajno ustrezna analiza variance (ANOVA), kot sta Dunnettov preskus in Williamsov preskus (17) (18) (19) (20). Pri koeficientu preobrazbe se lahko uporabijo Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov preskus. | Mejni preskus | 21. | Če v predhodnem preskusu za ugotavljanje razpona ni bilo opaženih učinkov, se lahko opravi mejni preskus (ena preskusna koncentracija in kontrolna enota). Namen mejnega preskusa je pokazati, da je toksična vrednost preskusne snovi večja od preskušene mejne koncentracije. Pri tej preskusni metodi priporočene koncentracije ni mogoče predlagati; to je prepuščeno presoji regulatorjev. Običajno je potrebnih vsaj šest ponovitev za preskusne in kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statistično vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Kar zadeva učinek na hitrost razvoja in težo, je t-preskus primerna statistična metoda, če podatki izpolnjujejo zahteve tega preskusa (normalnost, homogenost varianc). Če te zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance ali neparametrični preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus. | POSTOPEK | Pogoji izpostavljenosti | Priprava sistema vode in usedline, v katerem je preskusna snov primešana v vodo | 22. | V preskusne posode se dodajo ustrezne količine formulirane usedline (glej odstavka 13 in 14 ter Dodatek 3), da nastane plast, debela vsaj 1,5 cm. Doda se voda do globine 6 cm (glej odstavek 15). Razmerje med debelino usedline in globino vode ne sme biti večje od 1 : 4, usedlina pa ne sme biti debelejša od 3 cm. Sistem vode in usedline je treba sedem dni rahlo prezračevati, preden se dodajo preskusni organizmi (glej odstavek 14 in Dodatek 3). Da se prepreči ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med točenjem vode prekrije s plastičnim pokrovom, ki se takoj nato odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva. | 23. | Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploščami). Po potrebi se med raziskavo voda dotoči do prvotne količine, da se nadomesti izhlapela voda. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se prepreči kopičenje soli. | Dodajanje preskusnih organizmov | 24. | Od 4 do 5 dni pred vnosom preskusnih organizmov v preskusne posode je treba iz gojišč vzeti jajčna legla in jih vstaviti v majhne posode v gojitvenem mediju. Uporabi se lahko starejši medij iz osnovne kulture ali sveže pripravljeni medij. Če se uporabi slednji, je treba v gojitveni medij dodati majhno količino hrane, npr. zelenih alg in/ali nekaj kapljic filtrata suspenzije iz fino mlete ribje hrane v kosmičih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba samo sveže odložena jajčna legla. Običajno se ličinke izležejo nekaj dni po tem, ko so bila jajčeca odložena (2 do 3 dni za Chironomus riparius pri 20 °C ter 1 do 4 dni za Chironomus tentans pri 23 °C in Chironomus yoshimatsui pri 25 °C), rast ličink pa poteka v 4 stadijih, od katerih vsak traja 4 do 8 dni. V preskusu je treba uporabiti ličinke prvega stadija (2 do 3 ali 1 do 4 dni po tem, ko se izležejo). Stadij trzač se lahko po možnosti preveri z merjenjem širine glave (6). | 25. | 20 ličink prvega stadija se s topo pipeto naključno vnese v vsako preskusno posodo, ki vsebuje usedlino in vodo s primešano preskusno snovjo. Med dodajanjem ličink v preskusne posode je treba ustaviti prezračevanje vode, ki se ne sme izvajati še 24 ur po tem, ko so bile ličinke dodane (glej odstavka 24 in 32). Glede na uporabljeni načrt preskusa (glej odstavka 19 in 20) se za točkovno oceno EC uporabi vsaj 60 ličink na koncentracijo, za določitev NOEC pa 80. | 26. | 24 ur po vnosu ličink se preskusna snov vmeša v vodni stolpec nad usedlino, znova se zagotovi prezračevanje. Pod površino vodnega stolpca se s pipeto vnesejo majhne količine raztopine preskusne snovi. Vodo nad usedlino je nato treba premešati, pri čemer je treba paziti, da se ne premeša še usedlina. | Preskusne koncentracije | 27. | Preskus za ugotavljanje razpona je lahko koristen za določitev razpona koncentracij za končni preskus. Za ta namen se uporabi niz široko razmaknjenih koncentracij preskusne snovi. Da se zagotovi enaka gostota površine na trzačo, kot bo uporabljena za končni preskus, se trzače izpostavijo vsaki koncentraciji preskusne snovi za obdobje, ki omogoča oceno ustreznih preskusnih koncentracij, pri čemer ponovitve niso potrebne. | 28. | Preskusne koncentracije za končni preskus se določijo na podlagi rezultata preskusa za ugotavljanje razpona. Izbrati in uporabiti je treba vsaj pet koncentracij, kot je opisano v odstavkih 18 do 20. | Kontrolne enote | 29. | V preskus je treba vključiti kontrolne posode, v katerih ni preskusne snovi, toda ki vsebujejo usedlino, z ustreznim številom ponovitev (glej odstavka 19 in 20). Če je bilo za aplikacijo preskusne snovi uporabljeno topilo (glej odstavek 16), je treba dodati kontrolno posodo, katere usedlina vsebuje tudi topilo. | Preskusni sistem | 30. | Uporabljajo se statični sistemi. Polstatični ali pretočni sistemi z občasnim ali kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino se lahko uporabijo v izjemnih primerih, na primer če specifikacije kakovosti vode postanejo neprimerne za preskusni organizem ali vplivajo na kemijsko ravnotežje (npr. ravni raztopljenega kisika se preveč znižajo, koncentracija izločkov se preveč poviša ali minerali iztekajo iz usedline in vplivajo na pH in/ali trdoto vode). Vendar za izboljšanje kakovosti vode nad usedlino običajno zadoščajo in se prednostno uporabljajo druge metode, kot je prezračevanje. | Hrana | 31. | Ličinke je treba hraniti, po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Za mlade ličinke v prvih desetih dneh ustreza 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za C. yoshimatsui) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. TetraMin ali TetraPhyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na ličinko na dan. Nekoliko več hrane bodo morda potrebovale starejše ličinke: za preostanek preskusa mora zadostovati 0,5–1 mg na ličinko na dan. Obrok hrane je treba zmanjšati v vseh preskusnih in kontrolnih posodah, če se opazi rast glivic ali smrtnost v kontrolnih posodah. Če razvoja glivic ni mogoče ustaviti, je treba preskus ponoviti. Kadar se preskušajo snovi, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snovi, ki se kovalentno vežejo na usedlino, se lahko količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravne rasti organizmov, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije. Za to je treba namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodatek 0,5 % (suhe teže) fino mletih listov npr. velike koprive (Urtica dioica), bele murve (Morus alba), plazeče detelje (Trifolium repens), špinače (Spinacia oleracea) ali drugega rastlinskega materiala (Cerophyl ali alfa celuloza). | Pogoji inkubacije | 32. | Zagotovi se rahlo prezračevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah, po možnosti 24 ur po vnosu ličink, in se izvaja ves čas preskusa (paziti je treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, pritrjene 2 do 3 cm nad plastjo usedline (tj. 1 ali nekaj mehurčkov/s). Kadar se preskušajo hlapne kemikalije, je mogoče razmisliti o tem, da se sistem vode in usedline ne bi prezračeval. | 33. | Preskus se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans in C. yoshimatsui sta priporočeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti 500 do 1 000 lux. | Trajanje izpostavljenosti | 34. | Izpostavljenost se začne z vnosom ličink v posode s primešano preskusno snovjo in kontrolne posode. Najdaljši čas izpostavljenosti za C. riparius in C. yoshimatsui je 28 dni, za C. tentans pa 65 dni. Če se ličinke v odrasle osebke preobrazijo prej, se lahko preskus konča najmanj pet dni po preobrazbi zadnjega odraslega osebka v kontrolni posodi. | OPAŽANJA | Preobrazba | 35. | Določita se čas razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. | 36. | Preskusne posode je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se ugotovi kakršno koli neobičajno obnašanje (npr. zapuščanje usedline, nenavadno plavanje) v primerjavi s kontrolno posodo. V obdobju pričakovane preobrazbe je potrebno dnevno štetje preobraženih trzač. Spol in število v celoti preobraženih trzač se zapišeta dnevno. Po identifikaciji se trzače odstranijo iz posod. Vsa jajčna legla, odložena pred zaključkom preskusa, je treba evidentirati in nato odstraniti, da se prepreči vnovični vnos ličink v usedlino. Evidentira se tudi število vidnih bub, ki se niso preobrazile. Napotek za spremljanje preobrazbe je v Dodatku 5. | Rast in preživetje | 37. | Če je treba zagotoviti podatke o 10-dnevnem preživetju in rasti ličink, je treba na začetku vključiti dodatne preskusne posode, ki se lahko uporabijo pozneje. Usedlina iz teh dodatnih posod se preseje skozi sito z 250 μm velikimi luknjicami, da se zadržijo ličinke. Merili za pogin sta negibnost ali neodzivnost na mehanske dražljaje. Ličinke, ki ostanejo v usedlini, je prav tako treba šteti za mrtve (ličinke, ki so poginile na začetku preskusa, so morda razgradili mikrobi). Določi se suha teža (brez pepela) preživelih ličink na preskusno posodo in izračuna srednja suha teža posamezne ličinke na posodo. Koristno je določiti, v kateri stadij spadajo preživele ličinke; za to se lahko izmeri širina glave vsakega osebka. | Analitske meritve | Koncentracija preskusne snovi | 38. | Na začetku (po možnosti 1 uro po vnosu preskusne snovi) in koncu preskusa je treba analizirati vsaj vzorce vode nad usedlino, porne vode in usedline, in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. Te določitve koncentracije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev preskusne snovi v sistemu vode in usedline. Vzorčenje usedline na začetku preskusa lahko vpliva na preskusni sistem (npr. odstranitev preskusnih ličink), zato je treba za analitske določitve na začetku preskusa in med njim po potrebi uporabiti dodatne preskusne posode (glej odstavek 39). Meritve v usedlini morda ne bodo potrebne, če je bila porazdelitev preskusne snovi med vodo in usedlino jasno določena z raziskavo vode/usedline v primerljivih pogojih (npr. razmerje usedline in vode, vrsta uporabe, vsebnost organskega ogljika v usedlini). | 39. | Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. sedmi dan) in če so za analize potrebni veliki vzorci, ki jih ni mogoče vzeti iz preskusnih posod, ne da bi to vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske določitve izvesti na vzorcih iz dodatnih preskusnih posod, ki se obdelujejo enako (vključno s prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne uporabljajo. | 40. | Za izolacijo intersticijske vode se priporoča 30-minutno centrifugiranje pri npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno snov izkaže, da se ne adsorbira na filtre, je sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih morda koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca ne bo mogoče analizirati. | Fizikalno-kemijski parametri | 41. | Vrednost pH, raztopljeni kisik v preskusni vodi in temperaturo preskusnih posod je treba ustrezno meriti (glej odstavek 10). Trdoto in amonij je treba izmeriti v kontrolnih posodah in eni preskusni posodi pri najvišji koncentraciji na začetku in koncu preskusa. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 42. | Namen tega preskusa je določiti učinek preskusne snovi na hitrost razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače oziroma, pri 10-dnevnem preskusu, učinke na preživetje in težo ličink. Če ni znakov o statistično različni občutljivosti spolov, se lahko rezultati za samce in samice za statistične analize združijo. Razlike v občutljivosti med spoloma je mogoče statistično oceniti, na primer s preskusom χ2-r × 2. Po potrebi je treba po 10 dneh določiti preživetje ličink in srednjo suho težo posamezne ličinke na posodo. | 43. | Če je mogoče, se efektivne koncentracije, izražene kot koncentracije v vodi nad usedlino, izračunajo na podlagi izmerjenih koncentracij na začetku preskusa (glej odstavek 38). | 44. | Za točkovno oceno EC50 ali druge ECx se lahko statistični podatki po posameznih posodah uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izračunu intervala zaupanja za ECx je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa dokazati, da je ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših kvadratov, je treba statistične podatke po posameznih posodah transformirati, da se izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti ECx izračunati po tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vrednost. | 45. | Kadar je namen statistične analize določiti NOEC/LOEC s preskušanjem domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, npr. z vgnezdeno ANOVO. Alternativno se lahko uporabijo robustnejši preskusi (21), kadar so običajne predpostavke ANOVE kršene. | Koeficient preobrazbe | 46. | Koeficient preobrazbe da odgovor ‚vse ali nič‘ in se lahko analizira s Cochran-Armitageevim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in so ti podatki v skladu s tem pričakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravljenimi p-vrednostmi. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v okviru iste koncentracije večja, kot bi kazala binomska porazdelitev (pogosto imenovana ‚ekstra-binomska‘ variacija), potem je treba uporabiti robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je predlagano v (21). | 47. | Vsota preobraženih trzač na posodo ne se določi in deli s številom vnesenih ličink na: | pri čemer je: | ER | = | koeficient preobrazbe, | ne | = | število preobraženih trzač na posodo, | na | = | število vnesenih ličink na posodo. | 48. | Druga možnost, ki je najprimernejša za velike vzorce, kadar obstaja ekstra binomska varianca, je, da se koeficient preobrazbe obravnava kot zvezni odgovor in se uporabijo postopki, kot je Williamsov preskus, kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in kadar podatki ER potrjujejo to predpostavko. Dunettov preskus je primeren, kadar monotonost ne drži. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobraženih osebkov in število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih več kot pet. | 49. | Za uporabo metod ANOVA je treba vrednosti ER najprej transformirati z arkus sinus-korensko transformacijo ali Freeman-Tukeyevo transformacijo, da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izenačijo. Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabijo, kadar se uporabljajo absolutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izračuna arkus sinus (sin–1) kvadratnega korena ER. | 50. | Za koeficiente preobrazbe se vrednosti ECx izračunajo z regresijsko analizo (ali npr. probit (22), logit, Weibull, ustrezno programsko opremo itd.). Če regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), se uporabijo druge neparametrične metode, kot sta drseče povprečje ali linearna interpolacija. | Hitrost razvoja | 51. | Srednji čas razvoja pomeni srednji časovni razpon med vnosom ličink (dan 0 preskusa) in preobrazbo poskusne kohorte trzač. (Za izračun dejanskega časa razvoja je treba upoštevati starost ličink ob vnosu.) Hitrost razvoja je obratna času razvoja (enota: 1/dan) in predstavlja tisti delež razvoja ličink, ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primernejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homogena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato so učinkoviti parametrični preskusi primernejši za hitrost razvoja kot za čas razvoja. Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odgovor, se lahko vrednosti ECx ocenijo z regresijsko analizo (npr. (23) (24)). | 52. | Za naslednje statistične preskuse se za število trzač, opaženih na dan opazovanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med dnevom × in dnevom x – 1 (l = dolžina intervala opazovanja, običajno 1 dan). Srednja hitrost razvoja na posodo (x) se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | : | srednja hitrost razvoja na posodo, | i | : | indeks intervala opazovanja, | m | : | največje število intervalov opazovanja, | : | število trzač, preobraženih v intervalu opazovanja i, | ne | : | skupno število preobraženih trzač ob koncu poskusa, (= | ) | x | : | hitrost razvoja trzač, preobraženih v intervalu i. | pri čemer je: | dayi | : | dan opazovanja (dnevi od vnosa), | li | : | dolžina intervala opazovanja i (dnevi, običajno 1 dan). | Poročilo o preskusu | 53. | V poročilu o preskusu morajo biti vsaj naslednje informacije: | | Preskusna snov: | — | fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vodotopnost, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je na voljo), stabilnost v vodi itd.), | — | kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna formula, številka CAS itd.), vključno s čistostjo in analitsko metodo za količinsko določanje preskusne snovi. | | Preskusne vrste: | — | uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji razmnoževanja, | — | informacije o ravnanju z jajčnimi legli in ličinkami, | — | starost preskusnih živali ob vnosu v preskusne posode. | | Preskusni pogoji: | — | uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana, | — | za naravno usedlino lokacija in opis mesta vzorčenja usedline, vključno, če je mogoče, s preteklim onesnaženjem, značilnosti: pH, vsebnost organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija (če je ustrezno), | — | priprava formulirane usedline: sestavine in značilnosti (vsebnost organskega ogljika, pH, vlaga itd. na začetku preskusa), | — | priprava preskusne vode (če se uporablja obdelana voda) in značilnosti (koncentracija kisika, pH, prevodnost, trdota itd. na začetku preskusa), | — | globina usedline in vode nad njo, | — | količina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno vodo in brez nje, | — | preskusne posode (material in velikost), | — | način priprave osnovnih raztopin in preskusnih koncentracij, | — | uporaba preskusne snovi: uporabljene preskusne koncentracije, število ponovitev in uporaba topila, če je bilo uporabljeno, | — | pogoji inkubacije: temperatura, svetlobni ciklus in jakost svetlobe, prezračevanje (pogostost in jakost), | — | podrobne informacije o hranjenju, vključno z vrsto hrane, pripravo, količino in načinom. | | Rezultati: | — | nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za določitev koncentracije preskusne snovi v preskusni posodi, | — | kakovost vode v preskusnih posodah, tj. pH, temperatura, raztopljeni kisik, trdota in amonij, | — | morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode, | — | število preobraženih samcev in samic trzače na posodo in na dan, | — | število ličink, ki se niso preobrazile v trzače, na posodo, | — | srednja suha teža posamezne ličinke na posodo in po stadijih, če je ustrezno, | — | delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni samci in samice trzače), | — | srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih trzač na ponovitev in stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trzače), | — | ocene strupenih končnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali zaupanja), NOEC in/ali LOEC, ter statistične metode, uporabljene za njihovo določitev, | — | obravnava rezultatov, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode. | VIRI: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Končno poročilo za Evropsko komisijo. Poročilo št.: EC 3738. Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Z delavnice WOSTA, ki je potekala na Nizozemskem. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. V ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druga izdaja. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Sprememba prve izdaje iz junija 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. | (10) | Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. | (11) | Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. | (12) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. | (15) | Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. | (16) | Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. | (17) | Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121. | (18) | Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491. | (19) | Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103–117. | (20) | Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531. | (21) | Rao, J. N. K., in Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. | (22) | Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. | (23) | Bruce in Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. | (24) | Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Za to metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov: | | formulirana usedlina ali rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline; | | voda nad usedlino je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi; | | intersticijska voda ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline in zemljine; | | voda s primešano snovjo je preskusna voda, ki ji je bila dodana preskusna snov; | | preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Priporočila za gojenje Chironomus riparius | 1. | Ličinke Chironomus se lahko gojijo v kristalizirkah ali večjih vsebnikih. Na dno vsebnika se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselguhr (npr. Merck, Art 8117) (zadošča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato se doda primerna voda do globine več cm. Vodo je treba po potrebi dotočiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepreči izsušitev. Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezračevanje. Posode, v katerih se gojijo ličinke, morajo biti v primerni kletki, ki bo preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s stalnim ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem svetlobe (jakost približno 1 000 lux) in 8-urno temo. Po poročilih lahko manj kot 60-odstotna relativna vlažnost zraka ovira razmnoževanje. | Voda za redčenje | 3. | Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sintetična voda. Običajno se uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji (npr. medij Elendt ‚M4‘ ali ‚M7‘, glej spodaj). Vodo je treba pred uporabo prezračiti. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se uporabljena voda iz gojitvenih posod skrbno pretoči ali izsesa, ne da bi pri tem uničili ovoj ličink. | Hranjenje ličink | 4. | Ličinke Chironomus je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v kosmičih (TetraMin®, TetraPhyll® ali druga podobna zaščitena znamka ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmičih se doda 20 ml vode za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko daje v količini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba pretresti). Starejše ličinke lahko dobijo več hrane. | 5. | Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojitveni medij postane ‚moten‘, je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. Premalo hrane bo povzročilo selitev ličink v vodni stolpec, preveč hrane pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje lahko privede do počasnejše rasti. | 6. | Ko se pripravijo nove gojitvene posode, se lahko dodajo tudi celice nekaterih zelenih alg (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). | Hranjenje preobraženih odraslih osebkov | 7. | Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namočena v nasičeno raztopino saharoze. | Preobrazba | 8. | Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje ličink začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. | Jajčna legla | 9. | Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za gojenje ličink trikrat tedensko preveriti zaradi morebitnih odloženih želatinastih jajčnih legel, ki jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jajčna legla se uporabijo za pripravo nove gojitvene posode (npr. 2 do 4 jajčna legla/posodo) ali za preskuse strupenosti. | 10. | Ličinke prvega stadija bi se morale izleči po 2 ali 3 dneh. | Priprava novih gojitvenih posod | 11. | Ko so gojišča vzpostavljena, bi moralo biti mogoče novo gojitveno posodo za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev preskušanja, stare posode pa odstraniti, ko se ličinke preobrazijo v odrasle osebke. S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi osebki. | Priprava preskusnih raztopin ‚M4‘ in ‚M7‘ | 12. | Elendt (1990) je opisal medij ‚M4‘. Medij ‚M7‘ se pripravi kot medij ‚M4‘, razen za snovi, navedene v preglednici 1, za katere so koncentracije pri ‚M7‘ štirikrat nižje kot pri ‚M4‘. Publikacija o mediju ‚M7‘ je v pripravi (Elendt, osebno sporočilo). Preskusna raztopina se ne sme pripraviti po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 in K2HPO4, navedene za pripravo osnovnih raztopin, niso ustrezne. | Priprava medija ‚M7‘ | 13. | Vsaka osnovna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena osnovna raztopina (II) pa se pripravi iz teh osnovnih raztopin (I) (glej preglednico 1). V 50 ml sestavljene osnovne raztopine (II), ki ji je dodana količina vsake osnovne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v preglednici 2, se dolije do 1 litra deionizirana voda, da se pripravi medij ‚M7‘. Založna raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deionizirano vodo, kot je navedeno v preglednici 3, 0,1 ml sestavljene osnovne raztopine vitaminov pa se doda končnemu mediju ‚M7‘ malo pred uporabo. (Založna raztopina vitaminov se shranjuje zamrznjena v majhnih alikvotih.) Medij se prezračuje in stabilizira. | Preglednica 1 | Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7 | Založne raztopine (I) | Količina (mg) za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | Za pripravo sestavljene osnovne raztopine (II): zmešajte naslednje količine (ml) osnovnih raztopin (I) in dopolnite do 1 litra z deionizirano vodo | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (18) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (18) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (18) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (18) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (18) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (18) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (18) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (18) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (18) (19) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (18) (19) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Preglednica 2 | Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7 | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina osnovnih raztopin makrohranilnih snovi za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Preglednica 3 | Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7 | Vse tri raztopine vitaminov so združene v eno. | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina dodane osnovne raztopine vitaminov za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | Tiamin hidroklorid | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianokobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotin | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | VIRI: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. | Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. | Elendt, B. P., in Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. | Dodatek 3 | PRIPRAVA FORMULIRANE USEDLINE | Sestava usedline | Sestava formulirane usedline mora biti naslednja: | Sestavina | Značilnosti | Delež suhe | teže usedline v % | Šota | Šotni mah, čim bližje pH 5,5 do 6,0, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 1 mm) in sušen na zraku. | 4–5 | Kremenov pesek | Velikost zrn: > 50 % delcev mora biti velikih 50–200 μm. | 75–76 | Kaolinska glina | Vsebnost kaolinita ≥ 30 %. | 20 | Organski ogljik | Uravnava se z dodatkom šote in peska. | 2 (± 0,5) | Kalcijev karbonat | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. | 0,05–0,1 | Voda | Prevodnost ≤ 10 μS/cm. | 30–50 | Priprava | Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva naprava za homogenizacijo. pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj 2 dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sestavinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 do 50 % suhe teže usedline. pH končne mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO3. Vzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. | Shranjevanje | Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava konča. | VIRI: | Poglavje C.8 te priloge. Strupenost za deževnike. | Meller, M., Egeler, P., Rombke, J., Schallnass, H., Nagel, R., Streit, B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. | Dodatek 4 | Kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje | Snov | Koncentracije | Delci | < 20 mg/l | Celotni organski ogljik | < 2 mg/l | Neionizirani amoniak | < 1 μg /l | Trdota kot CaCO3 | < 400 mg/l (20) | Ostanek klora | < 10 μg /l | Skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/1 | Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/1 | Skupni organski klor | < 25 ng/1 | Dodatek 5 | Napotek za spremljanje preobrazbe ličink trzače | Na preskusne čaše se namestijo lovilniki za preobražene osebke. Potrebni so od 20. dne do konca preskusa. Primer lovilnika je narisan spodaj: | A | : | najlonska mrežica | B | : | obrnjen plastični lonček | C | : | poskusna čaša brez ustja | D | : | mrežasti okenci za izmenjavo vode | E | : | voda | F | : | usedlina | C.29. DOBRA BIORAZGRADLJIVOST – CO2 V ZAPRTIH POSODAH (PRESKUS NADPROSTORA) | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 310 (2006). Je presejalna metoda za ocenjevanje dobre biološke razgradljivosti kemikalij in daje podobne informacije kot šest preskusnih metod, opisanih v poglavju C.4, A–F, te priloge. Zato se lahko kemikalija, pri kateri so rezultati te preskusne metode pozitivni, šteje za dobro biološko razgradljivo in zato hitro razgradljivo v okolju. | 2. | Uveljavljena metoda z ogljikovim dioksidom (CO2) (1), ki temelji na izvirnem Sturmovem preskusu (2) za ocenjevanje biološke razgradljivosti organskih kemikalij z merjenjem ogljikovega dioksida, ki je nastal zaradi mikrobne dejavnosti, je običajno prva izbira za preskušanje slabo topnih in močno adsorptivnih kemikalij. Izbere se tudi za topne (vendar ne hlapne) kemikalije, ker številni menijo, da je nastajanje ogljikovega dioksida edini nedvoumni dokaz mikrobne dejavnosti. Raztopljeni organski ogljik se lahko odstrani s fizikalno-kemijskimi procesi (adsorpcija, izhlapevanje, obarjanje, hidroliza) in mikrobno dejavnostjo, pri številnih nebioloških reakcijah pa se porablja kisik; CO2 redko nastane abiotsko iz organskih kemikalij. Pri izvirnem in prilagojenem Sturmovem preskusu (1) (2) se CO2 odstrani iz tekoče faze v posode za absorpcijo s prepihovanjem (tj. uvajanjem mehurčkov obdelanega zraka za odstranitev CO2 prek tekočega medija), pri Larsonovi različici (3) (4) pa se CO2 prenese iz reakcijske posode v absorberje s spuščanjem zraka brez CO2 skozi nadprostor in dodatno z nenehnim stresanjem preskusne posode. Reaktorska posoda se stresa samo pri prilagojeni Larsonovi različici; v ISO 9439 (5) in izvirni ameriški različici (6), ki oba določata prepihovanje in ne zamenjave v nadprostoru, je mešanje predpisano samo za netopne snovi. Pri drugi uradni metodi Agencije za varstvo okolja Združenih držav (US EPA) (7), ki temelji na Gledhillovi metodi (8), je reakcijska posoda, ki se stresa, zaprta za ozračje, nastali CO2 pa se zbira v notranjem alkalnem lovilniku neposredno iz plinske faze kot pri klasičnih Warburgovih/Barcroftovih respirometrih. | 3. | Toda pokazalo se je, da se pri uporabi standardnega prilagojenega Sturmovega preskusa pri številnih kemikalijah (9) v mediju nabira anorganski ogljik (IC). Pri razgradnji 20 mg C/l anilina je bila ugotovljena koncentracija IC kar 8 mg/l. Zato zbiranje CO2 v alkalnih lovilnikih ni pravilno pokazalo količine mikrobiološko nastalega CO2 pri vmesnih časih med razgradnjo. Zato pogoja, da je treba za uvrstitev preskusne kemikalije med dobro biološko razgradljive v ‚10-dnevnem obdobju‘ (10 dneh, ki neposredno sledijo dosegu 10-odstotne biološke razgradljivosti) nabrati > 60 % teoretično največje količine nastalega CO2 (ThCO2), ne izpolnjujejo nekatere kemikalije, ki bi se med dobro biološko razgradljive uvrstile ob odstranjevanju raztopljenega organskega ogljika (DOC). | 4. | Kadar je delež razgradnje manjši, kot je bilo pričakovano, se v preskusni raztopini morda nabira IC. V takem primeru se lahko razgradljivost oceni z drugimi preskusi dobre biološke razgradljivosti. | 5. | Zaradi drugih pomanjkljivosti Sturmove metodologije (okornost, dolgotrajnost, nagnjenost k eksperimentalnim napakam in neuporabnost za hlapne kemikalije) se je že prej poleg Gledhillove metode iskala tehnika z zaprtimi posodami, in ne s pretokom plina. Boatman idr. (12) so pregledali prejšnje metode in uporabili zaprt sistem z nadprostorom, pri čemer je bil CO2 sproščen v nadprostor ob koncu inkubacije z zakisanjem medija. CO2 se je meril z analizo s plinsko kromatografijo (GC)/IC v samodejno odvzetih vzorcih iz nadprostora, a se pri tem ni upošteval raztopljeni anorganski ogljik (DIC) v tekoči fazi. Poleg tega so bile uporabljene posode zelo majhne (20 ml) in so vsebovale samo 10 ml medija, kar je povzročalo težave, npr. pri dodajanju nujno zelo majhnih količin netopnih preskusnih kemikalij in/ali pa v inokuliranem mediju ni bilo (dovolj) mikroorganizmov, ki so sposobni razgraditi preskusne kemikalije. | 6. | Te težave so v neodvisnih raziskavah premagali Struijs in Stoltenkamp (13) ter Birch in Fletcher (14), pri čemer so slednja navdihnile njune izkušnje z napravo, ki se uporablja pri preskusu anaerobne biološke razgradnje (15). Pri prvi metodi (13) se CO2 meri v nadprostoru po zakisanju in uravnoteženju, pri drugi (14) pa je bil DIC izmerjen v plinski in tekoči fazi, brez obdelave; več kot 90 % nastalega IC je bilo v tekoči fazi. Obe metodi imata prednosti pred Sturmovim preskusom, ker je preskusni sistem bolj priročen in lažje obvladljiv, ker je mogoče preskusiti hlapne kemikalije in ker je preprečena možnost zakasnitve pri merjenju nastalega CO2. | 7. | Pristopa sta bila združena v standard ISO za CO2 v nadprostoru (16), ki je bil krožno preskušen (17), na njem pa temelji tudi ta preskusna metoda. Podobno sta pristopa uporabljena v metodi US EPA (18). Priporočeni sta dve metodi merjenja CO2, in sicer CO2 v nadprostoru po zakisanju (13) in IC v tekoči fazi po dodajanju presežne baze. Drugo metodo je uvedel Peterson pri krožnem preskusu CONCAWE (19) te metode z nadprostorom, prilagojene za merjenje inherentne biološke razgradljivosti. Spremembe iz revizije teh metod iz leta 1992 (20) v poglavju C.4 te priloge za dobro biološko razgradljivost so bile vključene v to preskusno metodo, tako da so pogoji (medij, trajanje itd.) sicer enaki kot pri revidiranem Sturmovem preskusu (20). Birch in Fletcher (14) sta pokazala, da ta preskus nadprostora daje zelo podobne rezultate, kot so bili za iste kemikalije ugotovljeni v krožnem preskusu OECD (21) revidiranih preskusnih metod. | NAČELO PRESKUSA | 8. | Preskusna kemikalija, običajno 20 mg C/l, se kot edini vir ogljika in energije inkubira v pufrskem mediju z mineralnimi solmi, ki je inokuliran z mešano populacijo mikroorganizmov. Preskus se opravi v zaprtih steklenicah z nadprostorom, v katerem je zrak, ki predstavlja zalogo kisika za aerobno biološko razgradnjo. Nastajanje CO2 zaradi popolne aerobne biološke razgradnje preskusne kemikalije se določi z merjenjem nastalega IC v preskusnih steklenicah, ki presega IC, ki nastane v posodah s slepim vzorcem, ki vsebujejo samo inokuliran medij. Obseg biološke razgradnje se izrazi kot delež teoretično največje količine nastalega IC (ThIC) na podlagi prvotno dodane količine preskusne kemikalije (kot organski ogljik). | 9. | Merita se lahko tudi odstranitev DOC in/ali obseg primarne biološke razgradnje preskusne kemikalije (2). | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 10. | Za izračun deleža razgradnje je treba poznati vsebnost organskega ogljika (% w/w) v preskusni kemikaliji, ki se določi na podlagi njene kemične strukture ali z merjenjem. Pri hlapnih preskusnih kemikalijah je izmerjena ali izračunana Henryjeva konstanta koristna za določanje ustreznega volumskega razmerja med nadprostorom in tekočino. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije za mikroorganizme so koristne pri izbiri ustrezne preskusne koncentracije in za razlago rezultatov, ki kažejo slabo biološko razgradljivost. Priporoča se vključitev kontrole zaviranja, razen če je znano, da preskusna kemikalija ne zavira mikrobne dejavnosti (glej odstavek 24). | UPORABA METODE | 11. | Preskus se uporablja za vodotopne in netopne preskusne kemikalije, vendar je treba zagotoviti njihovo dobro porazdelitev. S priporočenim volumskim razmerjem med nadprostorom in tekočino 1 : 2 se lahko preskusijo hlapne kemikalije s Henryjevo konstanto do 50 Pa.m3.mol-1, saj delež preskusne kemikalije v nadprostoru ne preseže 1 % (13). Pri preskušanju bolj hlapnih kemikalij se lahko uporabi manjša prostornina nadprostora, vendar je lahko njihova biološka razpoložljivost omejujoča, zlasti če so slabo topne v vodi. Toda uporabniki morajo zagotoviti, da sta volumsko razmerje med nadprostorom in tekočino ter koncentracija preskusne kemikalije taka, da je na voljo dovolj kisika za popolno aerobno biološko razgradnjo (npr. treba se je izogibati visoki koncentraciji substrata in majhni prostornini nadprostora). Navodila glede tega so na voljo v (13) (23). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 12. | Za preverjanje preskusnega postopka je treba vzporedno preskusiti referenčno kemikalijo z znano biološko razgradljivostjo. Za ta namen se lahko pri preskušanju vodotopnih preskusnih kemikalij uporabijo anilin, natrijev benzoat ali etilen glikol, pri preskušanju slabo topnih preskusnih kemikalij pa 1-oktanol (13). Biološka razgradnja teh kemikalij mora v 14 dneh doseči > 60 % ThIC. | PONOVLJIVOST | 13. | Pri krožnem preskusu metode po ISO (17) so bili pri priporočenih pogojih, vključno z 20 mg C preskusne kemikalije/l, dobljeni spodnji rezultati. | Preskusna kemikalija | Povprečni delež biološke razgradnje v % | (28d) | Koeficient variacije | (%) | Število laboratorijev | Anilin | 90 | 16 | 17 | 1-oktanol | 85 | 12 | 14 | Variabilnost znotraj preskusa (ponovljivost) pri uporabi anilina je bila majhna, pri čemer koeficienti variacije niso presegli 5 % v skoraj nobeni izvedbi preskusa. V dveh primerih, v katerih je bila ponovljivost slabša, je bilo za večjo variabilnost verjetno krivo večje nastajanje IC v slepih vzorcih. Pri 1-oktanolu je bila ponovljivost slabša, vendar je bila še vedno manjša od 10 % pri 79 % izvedenih preskusov. Za to večjo variabilnost znotraj preskusa so lahko krive napake pri odmerjanju, saj je treba v zaprte preskusne steklenice vbrizgati majhno količino 1-oktanola (3 do 4 μl). Višji koeficienti variacije nastanejo pri nižjih koncentracijah preskusne kemikalije, zlasti pri koncentracijah pod 10 mg C/l. Temu se je mogoče delno izogniti z znižanjem koncentracije skupnega anorganskega ogljika (TIC) v inokulumu. | 14. | Pri krožnem preskusu EU (24) petih površinsko aktivnih snovi, dodanih v 10 mg C/l, so bili dobljeni naslednji rezultati: | Preskusna kemikalija | Povprečni delež biološke razgradnje v % | (28d) | Koeficient variacije | (%) | Število laboratorijev | Tetrapropilen | benzen sulfonat | 17 | 45 | 10 | Diizooktilsulfo-sukcinat | (anionski) | 72 | 22 | 9 | Heksadecil-trimetil (21) | amonijev klorid | (kationski) | 75 | 13 | 10 | Izononilfenol-(etoksilat)9 | (neionski) | 41 | 32 | 10 | Kokoamidopropil | dimetilhidroksi | sulfobetain | (amfoteričen) | 60 | 23 | 11 | Rezultati kažejo, da je bila na splošno variabilnost večja pri slabše razgrajenih površinsko aktivnih snoveh. Variabilnost znotraj poskusa je bila manjša od 15 % v 90 % primerov, dosegla pa je največ 30–40 %. | OPOMBA: | večine površinsko aktivnih snovi ne sestavlja ena sama molekulska vrsta, temveč so mešanica izomerov, homologov itd., ki se razgradijo po različnih značilnih časih prilagajanja in z različno kinetično hitrostjo, zaradi česar nastanejo ‚zabrisane‘ oslabele krivulje, tako da v 10-dnevnem obdobju ni mogoče doseči praga 60 %, čeprav bi vsaka posamezna molekulska vrsta v 10 dneh dosegla > 60 %, če bi se preskušala sama. To je bilo ugotovljeno tudi pri drugih kompleksnih mešanicah. | OPIS METODE | Oprema | 15. | Običajna laboratorijska oprema in: | (a) | steklene serumske steklenice, zatesnjene z zamaški iz butilne gume in stisnjenimi aluminijskimi tesnili. Priporočena velikost je ‚125 ml‘, pri čemer je celotna prostornina takih steklenic 160 ml (v tem primeru bi moralo biti znano, da je prostornina posamezne steklenice 160 ± 1 ml). Manjše steklenice se lahko uporabijo, kadar rezultati izpolnjujejo pogoje iz odstavkov 66 in 67; | (b) | analizator ogljika ali drug instrument (npr. plinski kromatograf) za merjenje anorganskega ogljika; | (c) | zelo natančne brizge za plinaste in tekoče vzorce; | (d) | krožni stresalnik v temperaturno nadzorovanem okolju; | (e) | dotok zraka brez CO2 – pripravi se lahko s spuščanjem zraka skozi zrnca zmesi natrijevega in kalcijevega hidroksida ali z uporabo plinske mešanice 80 % N2 / 20 % 02 (neobvezno) (glej odstavek 28); | (f) | naprava za membransko filtracijo poroznosti od 0,20 do 0,45 μm (neobvezno); | (g) | analizator organskega ogljika (neobvezno). | Reagenti | 16. | Ves čas se uporabljajo analitsko čisti reagenti. | Voda | 17. | Uporabljati je treba destilirano ali deionizirano vodo, ki vsebuje ≤ 1 mg/l skupnega organskega ogljika. To predstavlja ≤ 5 % začetne vsebnosti organskega ogljika, uvedene s priporočenim odmerkom preskusne kemikalije. | Založne raztopine za medij z mineralnimi solmi | 18. | Založne raztopine in medij z mineralnimi solmi so podobni kot pri preskusih ISO 14593 (16) in C.4 ‚dobra biološka razgradljivost‘ (20). Večja koncentracija amonijevega klorida (2,0 g/l namesto 0,5 g/l) bi morala biti potrebna samo v zelo izjemnih primerih, npr. kadar je koncentracija preskusne kemikalije > 40 mg C/l. Založne raztopine je treba hraniti na hladnem in jih zavreči po šestih mesecih ali prej, če se pokažejo znaki obarjanja ali mikrobne rasti. Pripravijo se naslednje osnovne raztopine: | (a) | kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) 8,50 g | dikalijev hidrogen fosfat (K2HPO4) 21,75 g | dinatrijev hidrogen fosfat dihidrat (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g | amonijev klorid (NH4Cl) 0,50 g | Raztopijo se v vodi in dopolnijo do 1 litra. pH te raztopine mora biti 7,4 (± 0,2). Če ni, je treba pripraviti novo raztopino. | (b) | kalcijev klorid dihidrat (CaCl2.2H2O) 36,40 g | Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra. | (c) | magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO4.7H2O) 22,50 g | Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra. | (d) | železov (III) klorid heksahidrat (FeCl3.6H20) 0,25 g | Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra ter doda kapljica koncentrirane HCl. | Priprava mineralnega medija | 19. | Zmeša se 10 ml raztopine (a) in približno 800 ml vode (odstavek 17), nato se doda po 1 ml raztopin (b), (c) in (d) ter dopolni z vodo do 1 litra (odstavek 17). | Drugi reagenti | 20. | Koncentrirana ortofosforna kislina (H3PO4) (> 85 % mase na volumen). | Raztopina natrijevega hidroksida 7M | 21. | 280 g natrijevega hidroksida (NaOH) se raztopi v 1 litru vode (odstavek 17). Določi se koncentracija DIC za to raztopino, ta vrednost pa se upošteva pri izračunu rezultata preskusa (glej odstavka 55 in 61), zlasti ob upoštevanju merila veljavnosti iz odstavka 66(b). Če je koncentracija DIC previsoka, se pripravi sveža raztopina. | Preskusna kemikalija | 22. | Pripravi se osnovna raztopina preskusne kemikalije, ki se dovolj dobro topi v vodi (odstavek 17) ali preskusnem mediju (odstavek 19), s koncentracijo, ki je po možnosti 100-krat višja od končne koncentracije, ki bo uporabljena v preskusu; morda bo treba pH osnovne raztopine prilagoditi. Založno raztopino je treba dodati mineralnemu mediju, da nastane končna koncentracija organskega ogljika, ki znaša med 2 in 40 mg C/l, po možnosti 20 mg C/l. Če se uporabijo nižje koncentracije, se lahko natančnost poslabša. V posode se lahko neposredno z zelo natančnimi brizgami dodajo topne in netopne tekoče kemikalije. Pri slabo topnih in netopnih preskusnih kemikalijah je lahko potrebna posebna obdelava (25). Na izbiro so: | (a) | neposredno dodajanje znanih tehtanih količin; | (b) | ultrazvočno dispergiranje pred dodajanjem; | (c) | dispergiranje z emulgatorji; pred dodajanjem je treba ugotoviti, ali imajo zaviralne ali spodbujevalne učinke na mikrobno dejavnost; | (d) | adsorpcija tekočih preskusnih kemikalij ali raztopine v primernem hlapnem topilu na inertni medij ali nosilec (npr. filter iz steklenih vlaken), ki ji sledi izhlapevanje topila, če je uporabljeno, in neposredno dodajanje znanih količin; | (e) | dodajanje znanih količin raztopine preskusne kemikalije v lahko hlapnem topilu v prazno preskusno posodo, ki mu sledi izhlapevanje topila. | Preskusiti je treba spodbujevalni ali zaviralni učinek sredstev in topil, uporabljenih v (c), (d) in (e), na mikrobno dejavnost (glej odstavek 42(b)). | Referenčna kemikalija | 23. | Pripravi se osnovna raztopina (topne) referenčne kemikalije v vodi (odstavek 17) s koncentracijo, ki je po možnosti 100-krat višja od končne koncentracije, ki bo uporabljena v preskusu (20 mg C/l). | Preverjanje zaviranja | 24. | Preskusne kemikalije pogosto ne pokažejo znatne razgradnje v pogojih, uporabljenih pri ocenjevanjih dobre biološke razgradljivosti. Eden od mogočih vzrokov je ta, da preskusna kemikalija zavira inokulum pri koncentraciji, ki je uporabljena v preskusu. V načrt preskusa se lahko vključi preverjanje zaviranja, da se omogoči ugotavljanje (za nazaj) zaviranja kot mogočega vzroka ali prispevajočega dejavnika. S preverjanjem zaviranja je mogoče tudi ovreči take motnje in pokazati, da se lahko nična ali rahla razgradnja pripiše izključno nedovzetnosti za napad mikrobov v pogojih preskusa. Za pridobitev informacij o strupenosti preskusne kemikalije za (aerobne) mikroorganizme se pripravi raztopina v preskusnem mediju, ki vsebuje enako koncentracijo preskusne kemikalije in referenčne kemikalije (odstavek 19), kot je bila dodana (glej odstavka 22 in 23). | Inokulum | 25. | Inokulum se lahko pridobi iz različnih virov: aktivnega blata, komunalnih odplak (nekloriranih), površinskih voda in tal ali zmesi teh sestavin (20). Biorazgradno aktivnost vira je treba preveriti z referenčno kemikalijo. Ne glede na vir se ne smejo uporabiti mikroorganizmi, ki so bili že prej izpostavljeni preskusni kemikaliji, če se postopek uporablja kot preskus dobre biološke razgradljivosti. | Opozorilo: | aktivno blato, odpadne vode in komunalne odplake vsebujejo patogene organizme, zato je treba z njimi ravnati previdno. | 26. | Glede na izkušnje je optimalna količina inokuluma taka, ki: | — | zadostuje za primerno biološko razgradno aktivnost, | — | razgradi predpisani delež referenčne kemikalije (glej odstavek 66), | — | daje 102 do 105 enot, ki tvorijo kolonije, na mililiter končne mešanice, | — | pri uporabi aktivnega blata običajno daje koncentracijo 4 mg/l neraztopljenih trdnih snovi v končni mešanici; uporabijo se lahko koncentracije do 30 mg/l, vendar lahko te znatno povečajo nastajanje CO2 v slepih vzorcih (26), | — | prispeva manj kot 10 % začetne koncentracije organskega ogljika, uvedenega s preskusno kemikalijo, | — | običajno znaša 1–10 ml inokuluma za 1 liter preskusne raztopine. | Aktivno blato | 27. | Iz prezračevalnega bazena čistilne naprave ali laboratorijske enote, v kateri se čistijo predvsem gospodinjske odplake, se vzame svež vzorec aktivnega blata. Po potrebi se grobi delci odstranijo s presejanjem (npr. s sitom z 1 mm2 velikimi luknjicami), blato pa je treba do uporabe ohranjati v aerobnem stanju. | 28. | Po odstranitvi grobih delcev se lahko tudi pusti, da se usede, ali se centrifugira (npr. 10 minut pri 1 100 × g). Supernatantna tekočina se zavrže. Blato se lahko spere v mineralni raztopini. Koncentrirano blato se suspendira v mineralnem mediju tako, da bo koncentracija neraztopljenih trdnih snovi 3–5 g/l. Nato se prezračuje do uporabe. | 29. | Blato je treba odvzeti iz pravilno delujoče konvencionalne čistilne naprave. Če ga je bilo treba odvzeti iz čistilne naprave z visoko stopnjo čiščenja ali če se domneva, da vsebuje zaviralce, ga je treba sprati. Resuspendirano blato se po temeljitem mešanju pusti, da se usede, ali se centrifugira, supernatantna tekočina se zavrže, sprano blato pa znova suspendira v dodatni količini mineralnega medija. Postopek se ponavlja, dokler se ne šteje, da je blato brez presežnega substrata ali zaviralcev. | 30. | Tik pred uporabo popolnoma resuspendiranega ali neobdelanega blata se odvzame vzorec za določitev suhe teže neraztopljenih trdnih snovi. | 31. | Dodatna možnost je, da se aktivno blato homogenizira (3–5 g neraztopljenih trdnih snovi/l). Blato se 2 minuti obdeluje z Waringovim mešalnikom pri srednji hitrosti. Zmešano blato se mora usedati 30 minut, če je potrebno, pa tudi dlje, nato pa se odlije tekočina, ki se uporabi kot inokulum v koncentraciji približno 10 mg/l mineralnega medija. | 32. | Nastajanje CO2 v slepih vzorcih je mogoče dodatno zmanjšati, če se blato čez noč prezračuje z zrakom brez CO2. Kot koncentracija inokuluma pri tem preskusu (13) se uporabi 4 mg/l aktivnega blata v obliki trdnih snovi. | Sekundarni komunalni iztok | 33. | Inokulum se lahko pridobi tudi iz sekundarnega iztoka iz čistilne naprave ali laboratorijske enote, v katero priteka predvsem gospodinjska odpadna voda. Vzorec se hrani v aerobnih pogojih in uporabi na dan odvzema ali pa se po potrebi aklimatizira. Iztok je treba filtrirati skozi grobi filter, da se odstranijo večji delci, in izmeriti vrednost pH. | 34. | Za zmanjšanje vsebnosti IC se filtrat 1 uro prepihuje z zrakom brez CO2 (odstavek 15(e)) ob ohranjanju vrednosti pH 6,5 z ortofosforno kislino (odstavek 20). Vrednost pH se vrne na prvotno vrednost z natrijevim hidroksidom (odstavek 21). Po približno 1-urnem usedanju se vzame primerna količina supernatanta za inokulacijo. Ta postopek prepihovanja zmanjša vsebnost IC v inokulumu. Ko je bila na primer kot inokulum uporabljena največja priporočena količina filtriranega prepihanega iztoka (100 ml) na liter, je bilo v posodah s slepim kontrolnim vzorcem med 0,4 in 1,3 mg/l IC (14), kar je predstavljalo 2–6,5 % C iz preskusne kemikalije pri 20 mg C/l in 4–13 % pri 10 mg C/l. | Površinske vode | 35. | Vzame se vzorec primerne površinske vode. Hrani se v aerobnih pogojih in uporabi na dan odvzema. Po potrebi se koncentrira s filtriranjem ali centrifugiranjem. Količina inokuluma, ki se uporabi v posamezni preskusni posodi, mora izpolnjevati merila iz odstavka 26. | Tla | 36. | V globini do 20 cm pod površino se vzame vzorec ustreznih tal. Iz njega je treba pred presejanjem skozi sito z 2 mm velikimi luknjicami odstraniti kamne, ostanke rastlin in nevretenčarje (če je vzorec prevlažen za takojšnje presejanje, se za lažje presejanje delno posuši na zraku). Hraniti ga treba v aerobnih pogojih in uporabiti na dan jemanja (če se vzorec prevaža v ohlapno zavezani polietilenski vrečki, se lahko največ en mesec hrani v vrečki pri 2 do 4 °C). | Aklimatizacija inokuluma | 37. | Inokulum se lahko aklimatizira na preskusne pogoje, ne sme pa se prilagoditi na preskusno kemikalijo. Z aklimatizacijo je mogoče zmanjšati nastajanje CO2 v slepem vzorcu. Aklimatizacija vključuje prezračevanje aktivnega blata po razredčitvi v preskusnem mediju na 30 m/l z vlažnim zrakom brez CO2 5–7 dni pri temperaturi preskusa. | PRESKUSNI POSTOPEK | Število steklenic | 38. | Število steklenic (odstavek 15(a)), potrebnih za preskus, je odvisno od pogostosti analize in trajanja preskusa. | 39. | Priporoča se, da se po zadostnem številu časovnih intervalov analizirajo po tri steklenice, tako da je mogoče določiti 10-dnevno obdobje. Ob koncu preskusa se analizira tudi vsaj pet preskusnih steklenic (odstavek 15(a)) iz skupin (a), (b) in (c) (glej odstavek 42), da je mogoče izračunati 95-odstotne intervale zaupanja za srednjo vrednost deleža biološke razgradnje. | Inokulirani medij | 40. | Inokulum se uporabi v koncentraciji 4 mg/l aktivnega blata v obliki suhih trdnih snovi. Tik pred uporabo se pripravi dovolj inokuliranega medija tako, da se na primer 1 litru medija z mineralnimi solmi (odstavek 19) doda 2 ml ustrezno obdelanega aktivnega blata (odstavki 27 do 32) pri 2 000 mg/l. Pri uporabi sekundarnega komunalnega iztoka se v 900 ml medija z mineralnimi solmi (odstavek 19) doda do 100 ml iztoka (odstavek 33) in z medijem razredči na 1 liter. | Priprava steklenic | 41. | Alikvoti inokuliranega medija se odmerijo v ponovitvene steklenice, da nastane razmerje med nadprostorom in tekočino 1 : 2 (npr. v 160-mililitrske steklenice se da 107 ml). Uporabijo se lahko tudi druga razmerja, vendar je treba upoštevati opozorilo iz odstavka 11. Pri uporabi katere koli vrste inokuluma je treba poskrbeti za to, da je inokulirani medij primerno zmešan, tako da se zagotovi njegova enakomerna porazdeljenost po preskusnih steklenicah. | 42. | Pripravijo se skupine steklenic (odstavek 15(a)), ki vsebujejo naslednje: | (a) | preskusne posode (označene s FT), ki vsebujejo preskusno kemikalijo; | (b) | slepe kontrolne vzorce (označene s FB), ki vsebujejo samo preskusni medij in inokulum; dodati je treba tudi vse kemikalije, topila, sredstva ali filtre iz steklenih vlaken, ki se uporabljajo za uvajanje preskusne kemikalije v preskusne posode; | (c) | posode (označene s FC) za preverjanje postopka, ki vsebujejo referenčno kemikalijo; | (d) | po potrebi posode (označene s FI) za preverjanje morebitnega zaviralnega učinka preskusne kemikalije, ki vsebujejo enako koncentracijo preskusne kemikalije in referenčne kemikalije (odstavek 24) kot v steklenicah FT oziroma FC; | (e) | posode (označene s FS) za preverjanje morebitne abiotske razgradnje, enako kot (a) z dodatkom 50 mg/l HgCl2 ali se sterilizirajo drugače (npr. z avtoklaviranjem). | 43. | Vodotopne preskusne kemikalije in referenčne kemikalije se dodajo kot vodne osnovne raztopine (odstavki 22, 23 in 24), da nastane koncentracija 10 do 20 mg C/l. | 44. | Netopne preskusne kemikalije in netopne referenčne kemikalije se dodajo v steklenice na različne načine (glej odstavek 22(a–e)), glede na naravo preskusne kemikalije bodisi pred dodatkom inokuliranega medija ali po njem, odvisno od načina obdelave preskusne kemikalije. Če se uporabi eden od postopkov iz odstavka 22(a–e), je treba s steklenicami FB s slepim vzorcem (odstavek 42(b)) ravnati podobno, vendar brez preskusne kemikalije in referenčne kemikalije. | 45. | Hlapne preskusne kemikalije je treba vbrizgati v zaprte posode (odstavek 47) z mikrobrizgo. Odmerek se izračuna iz vbrizgane količine in gostote preskusne kemikalije. | 46. | Po potrebi je treba v posode dodati vodo, da je v vsaki posodi enaka količina tekočine. Treba je zagotoviti, da sta razmerje med nadprostorom in tekočino (običajno 1 : 2) ter koncentracija preskusne kemikalije taka, da je v nadprostoru na voljo dovolj kisika za popolno biološko razgradnjo. | 47. | Vse steklenice se nato zatesnijo, na primer s septumi iz butilne gume in aluminijastimi pokrovčki. V tej fazi je treba dodati hlapne preskusne kemikalije (odstavek 45). Če je treba spremljati zniževanje koncentracije DOC v preskusni raztopini in če je treba za začetno koncentracijo IC (sterilni kontrolni vzorci, odstavek 42(e)) ali druge determinante opraviti analizo ob času nič, se iz preskusne posode odvzame ustrezni vzorec. Preskusna posoda in njena vsebina se nato zavržeta. | 48. | Zaprte posode se položijo na rotacijski stresalnik (odstavek 15(d)), pri čemer mora biti hitrost stresanja zadostna, da vsebina steklenic ostaja dobro premešana in v obliki suspenzije (npr. 150 do 200 vrtljajev na minuto), ter se inkubirajo v temi pri 20 °C, pri čemer se temperatura ohranja v razponu ± 1 °C. | Vzorčenje | 49. | Način vzorčenja je odvisen od časa prilagajanja in kinetične hitrosti biološke razgradnje preskusne kemikalije. Steklenice se za analizo žrtvujejo na dan vzorčenja, kar bi moralo biti vsaj tedensko ali pogosteje (npr. dvakrat tedensko), če je potrebna popolna krivulja razgradnje. Iz stresalnika se vzame potrebno število ponovitvenih steklenic, ki predstavljajo FT, FB in FC ter FI in FS, če sta uporabljena (glej odstavek 42). Preskus običajno traja 28 dni. Če krivulja biološke razgradnje kaže, da je bila konstantna raven dosežena pred 28. dnem, se lahko preskus konča prej kot v 28 dneh. Vzamejo se vzorci iz petih steklenic, prihranjenih za 28. dan preskusa za analizo, rezultati pa se uporabijo za izračun intervala zaupanja ali koeficienta variacije deleža biološke razgradnje. Steklenic, ki se uporabljajo za preverjanje zaviranja in abiotske razgradnje, ni treba vzorčiti tako pogosto kot druge steklenice; zadostuje vzorčenje 1. in 28. dan. | Analiza anorganskega ogljika (IC) | 50. | Nastajanje CO2 v steklenicah se določi z merjenjem povečanja koncentracije anorganskega ogljika (IC) med inkubacijo. Za merjenje količine IC, ki nastane pri preskusu, sta na voljo dve priporočeni metodi, ki sta opisani spodaj. Ker se lahko njuni rezultati med seboj nekoliko razlikujejo, naj se v posameznem preskusu uporabi samo ena od njiju. | 51. | Metoda (a) je priporočena, če medij verjetno vsebuje ostanke, na primer, filtrirnega papirja iz steklenih vlaken in/ali netopne preskusne kemikalije. Ta analiza se lahko izvede s plinskim kromatografom, če ni na voljo analizator organskega ogljika. Pomembno je, da imajo steklenice pri analizi plina v nadprostoru preskusno temperaturo ali da je njihova temperatura blizu preskusne temperature. Metoda (b) je morda lažja za laboratorije, ki za merjenje IC uporabljajo analizator ogljika. Pomembno je, da je raztopina natrijevega hidroksida (odstavek 21), ki se uporablja za pretvorbo CO2 v karbonat, bodisi sveže pripravljena ali pa je znana vsebnost IC v njej, tako da se ta lahko upošteva pri izračunavanju preskusnih rezultatov (glej odstavek 66(b)). | Metoda (a): zakisanje na pH < 3 | 52. | Pred vsako serijo analiz se analizator IC umeri z ustreznim standardom za IC (npr. 1 % w/w CO2 v N2). Koncentrirana ortofosforna kislina (odstavek 20) se vbrizga skozi septum posamezne vzorčene steklenice, da se pH medija zniža na < 3 (npr. 107 ml preskusnega medija dodamo 1 ml). Steklenice se vrnejo na stresalnik. Po enournem stresanju pri preskusni temperaturi se odstranijo s stresalnika, iz nadprostora posamezne steklenice pa se odvzamejo alikvoti (npr. 1 ml) plina in vbrizgajo v analizator IC. Izmerjene koncentracije IC se zapišejo kot mg C/l. | 53. | Načelo te metode je, da je po zakisanju na pH < 3 in uravnoteženju pri 20 °C konstanta ravnotežja za porazdelitev CO2 med tekočinsko in plinsko fazo v preskusnih steklenicah 1,0, če je merjena kot koncentracija (13). To je treba za preskusni sistem dokazati vsaj enkrat na naslednji način: | Pripravijo se steklenice, ki vsebujejo 5 in 10 mg/l IC, tako da se uporabi raztopina brezvodnega natrijevega karbonata (Na2CO3) v vodi brez CO2, ki se pripravi z zakisanjem vode na pH 6,5 s koncentrirano ortofosforno kislino (odstavek 20), prepihovanjem z zrakom brez CO2 čez noč in povišanjem pH na nevtralno vrednost z bazo. Zagotovi se, da je razmerje med prostornino nadprostora in količino tekočine enako kot pri preskusih (npr. 1 : 2). Tekočina se zakisa in uravnoteži, kot je opisano v odstavku 52, nato se izmerijo koncentracije IC v nadprostoru in tekoči fazi. Preveri se, da sta koncentraciji enaki znotraj preskusne napake. Če nista, bi moral izvajalec pregledati postopke. Porazdelitve IC med tekočo in plinasto fazo ni treba preverjati vsakokrat, ko se izvaja preskus; verjetno se lahko preveri pri umerjanju. | 54. | Če je treba izmeriti odstranjeni DOC (samo pri vodotopnih preskusnih kemikalijah), je treba iz ločenih (nezakisanih) steklenic vzeti vzorce tekoče faze, jih filtrirati skozi membranski filter in vbrizgati v analizator DOC. Te steklenice se lahko po potrebi uporabijo za druge analize za merjenje primarne biološke razgradnje. | Metoda (b): pretvorba CO2 v karbonat | 55. | Pred vsako serijo analiz se analizator IC umeri z ustreznim standardom, na primer raztopino natrijevega bikarbonata (NaHCO3) v vodi brez CO2 (glej odstavek 53) v razponu od 0 do 20 mg/l kot IC. Skozi septum posamezne vzorčene steklenice se vbrizga raztopina natrijevega hidroksida (7M, odstavek 21) (npr. 1 ml se doda 107 ml medija), nato se steklenice eno uro stresajo pri preskusni temperaturi. Pri vseh steklenicah, žrtvovanih na določeni dan, se uporabi enaka raztopina NaOH, ni pa nujno, da se enaka raztopina uporabi pri vsakem vzorčenju v preskusu. Če so pri vseh vzorčenjih potrebne absolutne vrednost IC v slepem vzorcu, je treba ob vsaki uporabi raztopine NaOH v njej določiti IC. Steklenice se odstranijo s stresalnika, da se vsebina usede. Z brizgo se iz vsake posode odvzame ustrezna količina (npr. 50 do 1 000 μl) tekoče faze. Vzorci se vbrizgajo v analizator IC, nato se zapišejo koncentracije IC. Treba je zagotoviti, da je uporabljeni analizator ustrezno opremljen za uporabo bazičnih vzorcev, ki nastanejo pri tej metodi. | 56. | Načelo te metode je, da je koncentracija IC v nadprostoru po dodajanju baze in stresanju zanemarljiva. To je treba za preskusni sistem preveriti vsaj enkrat s standardi za IC, dodajanjem baze in uravnoteženjem ter merjenjem koncentracije IC v nadprostoru in tekoči fazi (glej odstavek 53). Koncentracija v nadprostoru bi morala biti blizu nič. Tega preverjanja skoraj popolne absorpcije CO2 ni treba opravljati pri vsakem preskusu. | 57. | Če je treba izmeriti odstranitev DOC (samo pri vodotopnih preskusnih kemikalijah), je treba iz ločenih steklenic (ki ne vsebujejo dodane baze) vzeti vzorce tekoče faze, jih filtrirati skozi membranski filter in vbrizgati v analizator DOC. Te steklenice se lahko po potrebi uporabijo pri drugih analizah za merjenje primarne biološke razgradljivosti. | PODATKI IN POROČANJE | Izračun rezultatov | 58. | Ob predpostavki, da je mineralizacija preskusne kemikalije v CO2 100-odstotna, je presežni ThIC, ki nastane v slepih kontrolnih vzorcih, enak TOC, dodanemu posamezni preskusni steklenici na začetku preskusa, in sicer: | . | Skupna masa (mg) anorganskega ogljika (TIC) v posamezni steklenici je: | enačba [1], | pri čemer je: | VL | = | količina tekočine v steklenici (l), | CL | = | koncentracija IC v tekočini (ogljik v mg/l), | VH | = | prostornina nadprostora (l), | CH | = | koncentracija IC v nadprostoru (ogljik v mg/l). | Izračuni TIC za dve analitični metodi, uporabljeni za merjenje IC v tem preskusu, so opisani spodaj v odstavkih 60 in 61. Delež biološke razgradnje (% D) v posameznem primeru se dobi na naslednji način: | enačba [2], | pri čemer je: | TICt | = | mg TIC v preskusni steklenici ob času t, | TICb | = | srednja vrednost mg TIC v steklenicah s slepim vzorcem ob času t, | TOC | = | mg TOC, dodanega v preskusno posodo na začetku. | Delež biološke razgradnje % D se izračuna za preskusne steklenice (FT), referenčne steklenice (FC) in kontrolne steklenice za spremljanje zaviranja (FI), če so vključene, iz zadevnih količin TIC, nastalega do posameznega časa vzorčenja. | 59. | Če se je v sterilnih kontrolnih vzorcih (FS) vsebnost TIC v preskusnem obdobju znatno povečala, je mogoče sklepati o abiotski razgradnji preskusne kemikalije, kar je treba upoštevati pri izračunu D v enačbi [2]. | Zakisanje na pH < 3 | 60. | Ker se z zakisanjem na pH < 3 in uravnoteženjem koncentracije TIC v tekoči in plinasti fazi izenači, je treba izmeriti samo koncentracijo IC v plinasti fazi. Tako iz enačbe [1] sledi | , pri čemer je VB = prostornina serumske steklenice. | Pretvorba CO2 v karbonat | 61. | Pri tej metodi se izračuni izvedejo kot pri enačbi [1], vendar se zanemarljiva količina IC v plinasti fazi zanemari, tako da je | , | . | Prikaz rezultatov | 62. | Krivulja biološke razgradnje se dobi z grafičnim prikazom deleža biološke razgradnje D v odvisnosti od časa inkubacije, po možnosti pa se prikažejo faza prilagajanja, faza biološke razgradnje, 10-dnevno obdobje in faza konstantne ravni, ki je faza, v kateri je dosežena največja razgradnja, krivulja biološke razgradnje pa se zravna. Če se za vzporedne preskusne posode FT dobijo primerljivi rezultati (< 20-odstotna razlika), se grafično prikaže srednja krivulja (glej Dodatek 2, slika 1); če ne, se krivulje prikažejo za vsako posamezno posodo. Določi se srednja vrednost deleža biološke razgradnje v fazi konstantne ravni ali oceni najvišja vrednost (npr. kadar krivulja v fazi konstantne vrednosti pada), vendar je pomembno oceniti, da vrednost v slednjem primeru ni izjema. V poročilu o preskusu se ta najvišja raven biološke razgradnje navede kot ‚stopnja biološke razgradnje preskusne kemikalije‘. Če je bilo število preskusnih posod nezadostno za označitev faze konstantne ravni, se za izračun srednje vrednosti uporabijo izmerjeni podatki za zadnji dan preskusa. Ta zadnja vrednost, srednja vrednost petih ponovitev, se uporabi za označitev natančnosti, s katero je bil določen delež biološke razgradnje. Poroča se tudi o vrednosti, dobljeni na koncu 10-dnevnega obdobja. | 63. | Enako se grafično prikaže krivulja za referenčno kemikalijo FC ter preverjanje abiotskega izločanja FS in kontrola zaviranja FI, če sta vključena. | 64. | Količine TIC v slepih kontrolnih vzorcih (FB) in bučkah FS (abiotsko preverjanje) se zapišejo, če so te posode vključene v preskus. | 65. | Na podlagi teoretično nastalega IC, pričakovanega samo glede na referenčno sestavino mešanice, se izračuna D za posode FI. Če je 28. dan [(DFC (22) – DFI (23))/DFC] × 100 > 25 %, je mogoče sklepati, da je preskusna kemikalija zavrla aktivnost inokuluma, kar je lahko razlog za nizke vrednosti DFT, dobljene v pogojih preskusa. V tem primeru se lahko preskus ponovi pri nižji preskusni koncentraciji ter po možnosti z zmanjšanjem DIC v inokulumu in TIC, ki nastane v slepih kontrolnih vzorcih, saj se bo sicer zaradi nižje koncentracije zmanjšala natančnost metode. Uporabiti pa je mogoče tudi drug inokulum. Če je v bučki FS (abiotski) opaženo bistveno povečanje (> 10-odstotno) količine TIC, je morda prišlo do procesa abiotske razgradnje. | Veljavnost rezultatov | 66. | Šteje se, da je preskus veljaven, če: | (a) | je srednji delež razgradnje v posodah FC, ki vsebujejo referenčno kemikalijo, > 60-odstoten do 14. dneva inkubacije, in | (b) | če je srednja količina TIC v slepih kontrolnih vzorcih FB ob koncu preskusa > 3 mg C/l. | Če so te omejitve presežene, je treba preskus ponoviti z inokulumom iz drugega vira in/ali pregledati postopke. Če je na primer težava velika količina nastajanja IC v slepem vzorcu, je treba uporabiti postopek iz odstavkov 27 do 32. | 67. | Če preskusna kemikalija ne doseže 60 % ThIC in zanjo ni dokazan zaviralni učinek (odstavek 65), je mogoče preskus ponoviti s povečano koncentracijo inokuluma (do 30 mg/l aktivnega blata in 100 ml iztoka/l) ali z inokulumi iz drugih virov, zlasti če je bila razgradnja 20- do 60-odstotna. | Razlaga rezultatov | 68. | Če je pri tem preskusu v 10-dnevnem obdobju biološka razgradnja ThIC > 60-odstotna, to pomeni, da je preskusna kemikalija v aerobnih pogojih dobro razgradljiva. | 69. | Če prag 60 % ThIC ni dosežen, se določi vrednost pH v medijih v steklenicah, ki niso bile zakisane ali alkalizirane; vrednost pod 6,5 lahko nakazuje, da je prišlo do nitrifikacije. V tem primeru se preskus ponovi s pufrsko raztopino z višjo koncentracijo. | Poročilo o preskusu | 70. | Oblikuje se preglednica, ki prikazuje odstotni delež D za vsako preskusno steklenico (FT), referenčno steklenico (FC) in steklenico za kontrolo zaviranja (FI), če je vključena, za vsak dan vzorčenja. Če so za ponovitvene steklenice rezultati primerljivi, se grafično prikaže krivulja srednjega odstotnega deleža D v odvisnosti od časa. Zapišejo se količina TIC v slepih vzorcih (FB) in sterilnih kontrolnih vzorcih (FS), DOC in/ali drugi determinanti ter njihov delež odstranitve. | 71. | Določi se srednja vrednost deleža D v fazi konstantne ravni ali uporabi največja vrednost, če krivulja biološke razgradnje v fazi konstantne ravni pada, ter se navede kot ‚stopnja biološke razgradnje preskusne kemikalije‘. Pomembno je zagotoviti, da v slednjem primeru najvišja vrednost ni izjema. | 72. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednji podatki: | | Preskusna kemikalija: | — | splošno ime, kemijsko ime, številka CAS, strukturna formula in pomembne fizikalno-kemijske lastnosti, | — | čistost (nečistote) preskusne kemikalije. | | Preskusni pogoji: | — | sklicevanje na to preskusno metodo, | — | opis uporabljenega preskusnega sistema (npr. prostornina posode, razmerje med nadprostorom in tekočino, način mešanja itd.), | — | uporaba preskusne in referenčne kemikalije v preskusnem sistemu: uporabljena preskusna koncentracija in količina ogljika, odmerjena v posamezno preskusno steklenico, ter morebitna uporaba topil, | — | podrobnosti o uporabljenem inokulumu, morebitna predobdelava in aklimatizacija, | — | inkubacijska temperatura, | — | validacija načela analize IC, | — | glavne značilnosti uporabljenega analizatorja IC (in drugih uporabljenih analitičnih metod), | — | število ponovitev. | | Rezultati: | — | neobdelani podatki in izračunane vrednosti biološke razgradljivosti v obliki preglednice, | — | graf odstotnega deleža razgradnje v odvisnosti od časa za preskusne in referenčne kemikalije, faza prilagajanja, faza razgradnje, 10-dnevno obdobje in naklon, | — | odstotni delež odstranitve v fazi konstantne ravni, ob koncu preskusa in po 10-dnevnem obdobju, | — | razlogi za morebitno zavrnitev rezultatov preskusa, | — | drugi dejavniki, ki so pomembni za uporabljeni postopek, | — | razprava o rezultatih. | VIRI: | (1) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti – preskus razvijanja CO2 (metoda C.4-C) | (2) | Sturm, R. N. (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,. Oil Chem Soc. 50: 159–167. | (3) | Larson, R. J. (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161. | (4) | Larson, R. J., Hansmann, M. A. in Bookland, E. A. (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210. | (5) | ISO 9439 (1990; revidiran leta 1999). Kakovost vode – Vrednotenje popolne aerobne biološke razgradljivosti organskih snovi v vodi – Preskus z merjenjem sproščenega ogljikovega dioksida (Sturm) | (6) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (7) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (8) | Gledhill, W. E. (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929. | (9) | Weytjens, D., Van Ginneken, I., in Painter, H. A. (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812. | (10) | Ennis, D. M., in Kramer, A. (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185. | (11) | Ennis, D. M., Kramer, A., Jameson, C. W., Mazzoccki, P. H., in Bailey, P. H. (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53. | (12) | Boatman, R. J., Cunningham, S. L., in Ziegler, D. A. (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243. | (13) | Struijs, J., in Stoltenkamp, J. (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204–211. | (14) | Birch, R. R., in Fletcher, R. J. (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507–524. | (15) | Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H., in Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527–1550. | (16) | ISO 14593 (1999). Kakovost vode – Vrednotenje popolne aerobne biorazgradljivosti organskih spojin v aerobnem mediju – Metoda z analizo anorganskega ogljika v zaprtih posodah (preskus CO2 v nadprostoru). | (17) | Battersby, N. S. (1997). The ISO headspace CO2 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813–1822. | (18) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC. | (19) | Battersby, N. S., Ciccognani, D., Evans, M. R., King, D., Painter, H.A., Peterson, D. R. in Starkey, M. (1999). An ‚inherent‘ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219–3235. | (20) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biološke razgradljivosti. | (21) | OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano in M. Takatsuki; CITI). Pariz. | (22) | Poglavje C.11 te priloge, Preskus zaviranja dihanja aktivnega blata. | (23) | Struijs, J., Stoltenkamp-Wouterse, M. J., in Dekkers, A. L. M. (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319–327. | (24) | EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, maj 1999, Medmenham, SL7 2HD, Združeno kraljestvo. | (25) | ISO 10634 (1996). Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgradljivosti v vodi. | Dodatek 1 | OKRAJŠAVE IN OPREDELITEV POJMOV | IC: anorganski ogljik; | ThCO2: teoretični ogljikov dioksid (mg) je količina ogljikovega dioksida, izračunana iz znane ali izmerjene vsebnosti ogljika v preskusni kemikaliji, ki se proizvede ob njeni popolni mineralizaciji; izražena tudi v mg ogljikovega dioksida, nastalega na mg preskusne kemikalije; | DOC: raztopljeni organski ogljik je organski ogljik, ki je prisoten v raztopini, ali gre skozi 0,45-mikrometrski filter, ali ostane v supernatantu po 15-minutnem centrifugiranju pri približno 4 000 g (40 000 m s-2); | DIC: raztopljeni anorganski ogljik; | ThIC: teoretični anorganski ogljik; | TIC: skupni anorganski ogljik; | dobro biološko razgradljivo: arbitrarna razvrstitev kemikalij, ki so uspešno opravile nekatere specifične presejalne preskuse za popolno biološko razgradljivost; ker so ti preskusi dovolj strogi, se predpostavlja, da se bodo take kemikalije v vodnem okolju in aerobnih pogojih hitro in povsem biološko razgradile; | 10-dnevno obdobje: obdobje 10 dni, ki se začne takoj, ko je dosežena 10-odstotna biološka razgradnja; | inherentna biološka razgradljivost: razvrstitev snovi, za katere obstajajo nedvoumni dokazi biološke razgradljivosti (primarni ali popolni) iz katerega koli preskusa biološke razgradljivosti; | popolna aerobna biološka razgradnja: raven biološke razgradnje, ki je dosežena, ko mikroorganizmi povsem porabijo preskusno kemikalijo, pri čemer nastanejo ogljikov dioksid, voda, mineralne soli in nove mikrobne celične sestavine (biomasa); | mineralizacija: popolna razgradnja organske kemikalije v CO2 in H2O v aerobnih pogojih oziroma CH4, CO2 in H2O v anaerobnih pogojih; | faza prilagajanja: čas, ki preteče od začetka preskusa do aklimatizacije in/ali prilagoditve razgradnih mikroorganizmov in do povišanja stopnje biološke razgradnje preskusne kemikalije ali organske snovi do zaznavne ravni (npr. 10 % največje teoretične biološke razgradnje ali manj, odvisno od točnosti merilne tehnike); | faza razgradnje: čas od konca obdobja prilagajanja do trenutka, ko se doseže 90 % najvišje ravni razgradnje; | faza konstantne ravni: faza, v kateri se doseže največja razgradnja, krivulja biološke razgradnje pa se zravna; | preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Primer krivulje biološke razgradnje | Slika 1 | Biološka razgradnja 1-oktanola v preskusu CO2 v nadprostoru | Glosar: | Biološka razgradnja | Faza razgradnje | Najvišja stopnja biološke razgradnje | Faza konstantne ravni | 10-dnevno obdobje | Čas preskusa (dnevi) | C.30 BIOAKUMULACIJA V KOPENSKIH MALOŠČETINCIH | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 317 (2010). Med preskusnimi metodami, ki se nanašajo na okoljsko usodo, je bila leta 1996 objavljena Biokoncentracija: pretočni preskus na ribah (poglavje C.13 te priloge (49)), leta 2008 pa Bioakumulacija v bentoških maloščetincih, ki živijo v usedlinah (53). Ekstrapolacija podatkov o bioakumulaciji v vodnih organizmih na kopenske organizme, kot so deževniki, je zahtevna, če je sploh mogoča. Za ocenjevanje bioakumulacije kemikalij v tleh se trenutno uporabljajo modelni izračuni na podlagi lipofilnosti preskusne kemikalije, npr. (14) (37), kot na primer v tehničnih smernicah EU (19). Potreba po preskusni metodi za posamezna področja se je že začela obravnavati, npr. (55). Taka metoda je zlasti pomembna za ocenjevanje sekundarne zastrupitve v kopenskih prehranjevalnih verigah (4). Več nacionalnih preskusnih metod se ukvarja z vprašanjem bioakumulacije v organizmih, ki niso ribe, npr. (2) in (72). Ameriško združenje za preskušanje in materiale (American Society for Testing and Materials) je razvilo metodo za merjenje bioakumulacije v deževnikih (Eisenia fetida, Savigny) in enhitrejih iz kontaminiranih tal (3). Mednarodno priznana metoda za določanje bioakumulacije v tleh s primešano preskusno snovjo bo izboljšala ocenjevanje tveganja kemikalij v kopenskih ekosistemih, npr. (25) (29). | 2. | Nevretenčarji, ki jedo prst, so izpostavljeni kemikalijam v tleh. Med temi živalmi imajo kopenski maloščetinci pomembno vlogo pri strukturi in funkciji tal (15) (20). Živijo v tleh in delno ob površju (zlasti v plasti rastlinskega odpada); pogosto so najštevilnejša vrsta v biomasi (54). Z bioturbacijo tal in kot plen lahko te živali močno vplivajo na biološko razpoložljivost kemikalij za druge organizme, kot so nevretenčarji (npr. plenilske pršice in hrošči; npr. (64)) ali plenilski vretenčarji (npr. lisice in galebi) (18) (62). Nekatere vrste kopenskih maloščetincev, ki se trenutno uporabljajo pri ekotoksikološkem preskušanju, so opisane v Dodatku 5. | 3. | V Standardnih smernicah ASTM za izvajanje laboratorijskih preskusov strupenosti tal ali bioakumulacije z deževniki Eisenia fetida (Lumbricidae) in enhitrejev Enchytraeus albidus (Enchytraeidae) (3) so navedene številne bistvene in koristne podrobnosti za izvajanje te preskusne metode za bioakumulacijo v tleh. Nadaljnja dokumenta, ki sta navedena v tej preskusni metodi, sta poglavje C.13 te priloge Biokoncentracija: pretočni preskus na ribah (49) in Smernica za preskušanje OECD št. 315: Bioakumulacija v bentoških maloščetincih, ki živijo v usedlinah (53). Za to preskusno metodo so pomembni viri informacij tudi praktične izkušnje iz raziskav o bioakumulaciji v tleh in objave iz virov, npr. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79). | 4. | Ta preskusna metoda se v glavnem uporablja za stabilne nevtralne organske kemikalije, ki se rade adsorbirajo na zemljino. S to preskusno metodo je mogoče preskušanje bioakumulacije stabilnih organokovinskih spojin, vezanih v tleh. Uporabi se lahko tudi za kovine in druge elemente v sledeh. | OSNOVNI POGOJ | 5. | Preskusi za merjenje bioakumulacije kemikalije v kopenskih maloščetincih se izvajajo s težkimi kovinami (glej npr. (63)) in obstojnimi organskimi kemikalijami z vrednostmi log Kow med 3,0 in 6,0, npr. (40). Uporabljajo se tudi za: | — | kemikalije, pri katerih je vrednost log Kow večja od 6,0 (superhidrofobne kemikalije), | — | kemikalije, ki spadajo v razred organskih kemikalij, za katere je znano, da se lahko kopičijo v živih organizmih, npr. površinsko aktivne ali močno adsorptivne kemikalije, | — | kemikalije, katerih strukturne značilnosti kažejo na možnost bioakumulacije, npr. analogi kemikalij z znanim bioakumulacijskim potencialom, in | — | kovine. | 6. | Pred začetkom raziskave je treba pridobiti informacije o preskusni kemikaliji, kot so splošno ime, kemijsko ime (po možnosti ime IUPAC), strukturna formula, registrska številka CAS, čistost, varnostni ukrepi, ustrezni pogoji shranjevanja in analitske metode. Poleg tega bi bilo treba poznati naslednje podatke: | (a) | topnost v vodi; | (b) | koeficient porazdelitve oktanol/voda, Kow; | (c) | koeficient porazdelitve zemljina/voda, izražen kot Koc; | (d) | parni tlak; | (e) | razgradljivost (npr. v tleh, vodi); | (f) | znani metaboliti. | 7. | Uporabiti je mogoče tudi radioaktivno označene in neoznačene preskusne kemikalije. Za lažjo analizo se priporoča uporaba radioaktivno označene preskusne kemikalije. Odločitev se sprejme na podlagi meja zaznavnosti ali zahteve glede merjenja matične preskusne kemikalije in metabolitov. Če se uporabi radioaktivno označena preskusna kemikalija in merijo skupni radioaktivni ostanki, je pomembno, da se radioaktivno označeni ostanki v tleh in preskusnih organizmih opredelijo glede deležev matične preskusne kemikalije in tiste, ki je označena za nematično, npr. v vzorcih, vzetih v stabilnem stanju ali ob koncu faze absorpcije, da je mogoče izračunati bioakumulacijski faktor (BAF) za matično preskusno kemikalijo in zadevne metabolite v tleh (glej odstavek 50). Za merjenje radioaktivno neoznačenih organskih preskusnih kemikalij ali kovin je tu opisano metodo morda treba prilagoditi, npr. za zagotovitev zadostne biomase. Pri merjenju skupnih radioaktivnih ostankov (s tekočinskim scintilacijskim štetjem po ekstrakciji, sežigu ali omogočitvi topnosti tkiva) bioakumulacijski faktor temelji na matični preskusni kemikaliji in metabolitih. Izračun BAF mora po možnosti temeljiti na koncentraciji matične preskusne kemikalije v organizmih in skupnih radioaktivnih ostankov. Nato je treba za primerljivost rezultatov iz različnih preskusov bioakumulacije iz BAF izračunati faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF), normaliziran na vsebnost lipidov v črvih in vsebnost organskega ogljika (OC) v tleh. | 8. | Znana mora biti strupenost preskusne kemikalije za vrsto, uporabljeno v preskusu, npr. koncentracija z učinkom (ECx) ali smrtna koncentracija (LCx) v fazi absorpcije (npr. (19)). Izbrana koncentracija preskusne kemikalije mora biti po možnosti približno 1 % njenega akutnega asimptotičnega LC50 in vsaj desetkrat višja kot meja njenega zaznavanja v tleh z uporabljeno analitsko metodo. Prednost je treba dati vrednostim strupenosti, ki izhajajo iz dolgotrajnih raziskav subletalnih končnih točk, če so na voljo (51) (52). Če taki podatki niso na voljo, je koristne informacije mogoče dobiti s preskusom akutne strupenosti (glej npr. (23)). | 9. | Na voljo mora biti ustrezna analitska metoda znane točnosti, natančnosti in občutljivosti za količinsko opredelitev kemikalije v preskusnih raztopinah, tleh in biološkem materialu, pa tudi podrobnosti o pripravi in shranjevanju vzorcev ter varnostni listi za snov. Znane morajo biti tudi analitske meje zaznavnosti preskusne snovi v tleh in tkivu črvov. Pri uporabi preskusne kemikalije, označene s 14C, je treba poznati specifično radioaktivnost (tj. Bq mol-1) in delež radioaktivnosti, povezan z nečistotami. Specifična radioaktivnost preskusne kemikalije mora biti dovolj visoka, da omogoča analizo, uporabljene preskusne koncentracije pa ne smejo sprožiti strupenih učinkov. | 10. | Preskus se lahko izvaja z umetnimi ali naravnimi zemljinami. Pred začetkom preskusa je treba poznati informacije o značilnostih uporabljene naravne zemljine, npr. izvor zemljine ali njenih sestavin, pH, vsebnost organskega ogljika, velikostno porazdelitev delcev (delež peska, mulja in gline) in zmogljivost zadrževanja vode (WHC) (3) (48). | NAČELO PRESKUSA | 11. | Med parametri, ki so značilni za bioakumulacijo preskusne kemikalije, so bioakumulacijski faktor (BAF), konstanta hitrosti absorpcije (ks) in konstanta hitrosti izločanja (ke). Opredelitve so navedene v Dodatku 1. | 12. | Preskus sestavljata dve fazi: faza absorpcije (izpostavljenosti) in faza izločanja (po izpostavljenosti). V fazi absorpcije so ponovitvene skupine črvov izpostavljene zemljini, ki ji je dodana preskusna kemikalija. Poleg preskusnih živali so v enakih pogojih kontrolne skupine črvov, le brez preskusne kemikalije. Izmerita se suha teža preskusnih organizmov in vsebnost lipidov v njih. Pri tem je mogoče uporabiti črve iz kontrolne skupine. Analitske vrednosti ozadja (slepi vzorec) je mogoče dobiti z analizo kontrolnih vzorcev črvov in tal. Za fazo izločanja se črvi prenesejo v tla, v katerih ni preskusne kemikalije. Faza izločanja je vedno potrebna, razen če je absorpcija preskusne kemikalije v fazi izpostavljenosti zanemarljiva. Faza izločanja zagotavlja informacije o hitrosti, s katero se preskusna kemikalija izloča iz preskusnih organizmov (npr. (27)). Če v fazi absorpcije stabilno stanje ni doseženo, mora določitev kinetičnih parametrov – kinetičnega bioakumulacijskega faktorja BAFk, konstante hitrosti absorpcije in konstante hitrosti izločanja – po možnosti temeljiti na hkratnem prilagajanju rezultatov iz faze absorpcije in faze izločanja. Koncentracija preskusne kemikalije v/na črvih se spremlja ves čas trajanja obeh faz preskusa. | 13. | V fazi absorpcije se meritve opravljajo ob časih vzorčenja do največ 14 dni (enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki), dokler ni doseženo stabilno stanje (11) (12) (67). Stabilno stanje je vzpostavljeno, ko je krivulja koncentracije v črvih v odvisnosti od časa vzporedna s časovno osjo in se tri zaporedne analize koncentracije vzorcev, vzetih v vsaj dvodnevnih intervalih, med seboj ne razlikujejo za več kot ± 20 % glede na statistične primerjave (npr. analiza variance, regresijska analiza). | 14. | V fazi izločanja se preskusni organizmi prenesejo v posode z istim substratom brez preskusne kemikalije. V fazi izločanja se meritve opravljajo 14 dni (enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki) ob časih vzorčenja, razen če je prejšnje analitsko določanje pokazalo 90-odstotno zmanjšanje ostankov preskusne kemikalije v črvih. O koncentraciji preskusne kemikalije v črvih ob koncu faze izločanja se poroča kot o neizločenih ostankih. Bioakumulacijski faktor stabilnega stanja (BAFss) se izračuna po možnosti kot razmerje med koncentracijo v črvih (ca) in tleh (Cs) v očitnem stabilnem stanju ter kot kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK) oziroma razmerje med konstanto hitrosti absorpcije iz tal (ks) in konstanto hitrosti izločanja (ke) (za opredelitve glej Dodatek 1) ob predpostavki kinetike prvega reda (za izračune glej Dodatek 2). Če kinetika prvega reda očitno ni ustrezna, je treba uporabiti druge modele. | 15. | Konstanta hitrosti absorpcije, konstanta hitrosti izločanja (ali konstante pri uporabi drugih modelov), kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK), in kjer je to mogoče, intervali zaupanja za vse te parametre se izračunajo po računalniških modelnih enačbah (za navodila glej Dodatek 2). Ustreznost prileganja modela je mogoče ugotoviti na primer na podlagi korelacijskega koeficienta ali determinacijskega koeficienta (koeficienti blizu ena pomenijo dobro prileganje) ali hi-kvadrata. Kažeta jo lahko tudi velikost standardne napake ali interval zaupanja za ocenjene parametre. | 16. | Za zmanjšanje variabilnosti rezultatov preskusa za preskusne kemikalije z visoko lipofilnostjo je treba bioakumulacijske faktorje izraziti v odvisnosti od vsebnosti lipidov in vsebnosti organskega ogljika (vsebnost organskega ogljika (OC) v kg zemljine, vsebnost lipidov v kg-1 črvov). Ta pristop temelji na dejstvu, da pri nekaterih razredih kemikalij obstaja jasna povezanost med potencialom bioakumulacije in lipofilnostjo; to je že dobro dokazano pri ribah (47). Obstaja povezanost med vsebnostjo lipidov v ribah in bioakumulacijo takih kemikalij. Podobna medsebojna odvisno je bila ugotovljena pri bentoških organizmih, npr. (30) (44), dokazana pa je tudi za kopenske maloščetince, npr. (5) (6) (7) (14). Če je na voljo dovolj črvjega tkiva, je mogoče vsebnost lipidov v preskusnih živalih določiti z uporabo istega biološkega materiala kot za določanje koncentracije preskusne kemikalije. Sicer se lahko za meritev vsebnosti lipidov uporabijo kontrolne živali. | VELJAVNOST PRESKUSA | 17. | Da je preskus veljaven, morajo kontrolni in tretirani vzorci izpolnjevati naslednja merila: | — | ob koncu preskusa skupna smrtnost v fazah absorpcije in izločanja ne sme presegati 10 % (deževniki) oziroma 20 % (enhitreji) skupnega števila uporabljenih črvov, | — | pri Eisenia fetida in Eisenia andrei srednja izguba teže, merjena ob koncu faze absorpcije in ob koncu faze izločanja, ne sme presegati 20 % v primerjavi z začetno svežo težo (f.w.) na začetku posamezne faze. | OPIS METODE | Preskusne vrste | 18. | Za preskušanje bioakumulacije je priporočenih več vrst kopenskih maloščetincev. Največkrat uporabljene vrste Eisenia fetida, ali Eisenia andrei (Lumbricidae), ali Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, ali Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae) so opisane v Dodatku 5. | Oprema | 19. | Pri vseh delih opreme se je treba izogibati uporabi materialov, ki se lahko raztopijo, adsorbirajo preskusno kemikalijo ali iz katerih se lahko izlužijo druge kemikalije in ki škodljivo učinkujejo na preskusne živali. Uporabiti je mogoče standardne pravokotne ali valjaste posode iz kemijsko inertne snovi in s primerno prostornino, ki ustrezajo stopnji obremenitve, tj. številu preskusnih črvov. Za opremo, ki je v stiku s preskusnimi mediji, se lahko uporabijo nerjavno jeklo, plastika ali steklo. Preskusne posode je treba ustrezno pokriti, da se prepreči uhajanje črvov, hkrati pa omogoči zadosten dotok zraka. Pri kemikalijah z visokimi adsorpcijskimi koeficienti, kot so sintetični piretroidi, je lahko potrebno silanizirano steklo. V teh primerih je treba opremo po uporabi zavreči (49). Preprečiti je treba uhajanje radioaktivno označenih preskusnih snovi in hlapnih kemikalij. Uporabiti je treba lovilnike (npr. steklene plinske izpiralke), ki vsebujejo ustrezne absorbente za zadrževanje morebitnih ostankov, ki izparijo iz preskusnih posod. | Tla | 20. | Tla morajo biti take kakovosti, ki omogoča preživetje in po možnosti razmnoževanje preskusnih organizmov med aklimatizacijo in preskušanjem, ne da bi bili pri tem videti nenormalno ali bi se nenormalno obnašali. Črvi se morajo zariti v tla. | 21. | Umetna zemljina, opisana v poglavju C.8 te priloge (48), je priporočena za uporabo kot substrat v preskusih. V Dodatku 4 so podani opis priprave umetne zemljine za uporabo pri preskusu bioakumulacije in priporočila za shranjevanje umetne zemljine. Na zraku posušena umetna zemljina se lahko do uporabe hrani pri sobni temperaturi. | 22. | Za preskusna tla in/ali tla za gojenje je mogoče uporabiti tudi naravno zemljino z neonesnaženih območij. Pri naravni zemljini je treba opredeliti vsaj izvor (mesto odvzema), pH, vsebnost organskega ogljika, velikostno porazdelitev delcev (delež peska, mulja in gline), največjo zmogljivost zadrževanja vode (WHCmax) in delež vsebnosti vode (3). Analiza tal ali njihovih sestavin, kar zadeva mikro onesnaževala, pred uporabo bi morala dati koristne informacije. Če se uporabi zemljina s kmetijskih zemljišč, se že vsaj eno leto pred vzorčenjem ne smejo obdelovati z izdelki za zaščito pridelka ali gnojem tretiranih živali kot gnojili, z organskimi gnojili pa že vsaj šest mesecev pred vzorčenjem (50). Postopki ravnanja z naravno zemljino pred uporabo v ekotoksikoloških preskusih z maloščetinci v laboratoriju so opisani v (3). Pri naravni zemljini mora biti čas shranjevanja v laboratoriju čim krajši. | Uporaba preskusne kemikalije | 23. | Preskusna kemikalija se vnese v tla. Pri tem je treba upoštevati njene fizikalno-kemijske lastnosti. Preskusno kemikalijo, ki se topi v vodi, je treba pred mešanjem z zemljino povsem raztopiti v vodi. Priporočeni postopek dodajanja preskusnih kemikalij, ki se slabo topijo v vodi, vključuje prekrivanje ene ali več sestavin (umetne) zemljine s preskusno kemikalijo. Kremenov pesek ali del kremenovega peska je mogoče na primer namočiti v raztopini preskusne kemikalije v primernem organskem topilu ter jo nato počasi izpariti do suhega. Prekriti del se lahko nato vmeša v vlažna tla. Velika prednost tega postopka je, da se v tla ne vnese topilo. Pri uporabi naravne zemljine je mogoče preskusno kemikalijo dodati s primešanjem k delu na zraku posušene zemljine, kot je opisano zgoraj za umetno zemljino, ali z vmešanjem preskusne kemikalije v vlažno zemljino, z naknadnim izparevanjem, če je uporabljeno topilo. Na splošno se je treba čim bolj izogibati stiku vlažne zemljine s topili. Treba je upoštevati naslednje (3): | — | če se uporabi topilo, ki ni voda, mora biti tako, da se lahko meša z vodo in/ali da ga je mogoče odstraniti (na primer upariti), tako da v tleh ostane samo preskusna kemikalija, | — | če se uporabi kontrolni vzorec s topilom, negativna kontrola ni potrebna. Kontrolni vzorec s topilom mora vsebovati največjo koncentracijo topila, dodano zemljini, uporabiti pa je treba topilo iz iste šarže kot za osnovno raztopino. Strupenost in hlapnost topila ter topnost preskusne kemikalije v izbranem topilu bi morale biti glavna merila za izbiro primernega topila. | 24. | Pri kemikalijah, ki so slabo topne v vodi in organskih topilih, je mogoče 2,0–2,5 g drobno mletega kremenovega peska na preskusno posodo zmešati z določeno količino preskusne kemikalije, npr. s terilnico in pestilom, da nastane želena preskusna koncentracija. Ta mešanica kremenovega peska in preskusne kemikalije se lahko doda predhodno navlaženi zemljini in temeljito zmeša z ustrezno količino deionizirane vode, da nastane potrebna vsebnost vlage. Končna mešanica se porazdeli v preskusne posode. Postopek se ponovi za vsako preskusno koncentracijo in pripravi tudi ustrezni kontrolni vzorec z 2,0–2,5 g drobno mletega kremenovega peska na preskusno posodo. | 25. | Koncentracijo preskusne kemikalije v tleh je treba določiti po primešanju. Pred uvedbo preskusnih organizmov je treba preveriti homogeno porazdelitev preskusne kemikalije v tleh. Poročati je treba o metodi, uporabljeni za primešanje, in razlogih za izbiro posebnega postopka primešanja (24). | 26. | Idealno je, če se pred dodajanjem organizmov vzpostavi ravnotežje med zemljino in fazo porne vode; priporočeno je štiridnevno obdobje pri 20 °C. Pri številnih organskih kemikalijah, ki so slabo topne v vodi, se lahko čas, potreben za vzpostavitev resničnega ravnotežja med adsorbiranimi in raztopljenimi delci, šteje v dnevih ali mesecih. Glede na namen raziskave, na primer pri posnemanju razmer v okolju, se lahko zemljina s primešano preskusno snovjo ‚stara‘ dlje, npr. pri kovinah tri tedne pri 20 °C (22). | Gojenje preskusnih organizmov | 27. | Črvi se po možnosti gojijo v trajni laboratorijski kulturi. Navodila o metodah laboratorijskega gojenja za vrste Eisenia fetida in Eisenia andrei ter Enchytraeid so podana v Dodatku 5 (glej tudi (48) (51) (52)). | 28. | Črvi, uporabljeni v preskusih, morajo biti brez ugotovljivih bolezni, bolezenskih sprememb in zajedavcev. | IZVEDBA PRESKUSA | 29. | Preskusni organizmi so preskusni kemikaliji izpostavljeni v fazi absorpcije. Ta mora trajati 14 dni (enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki), razen če se dokaže, da je bilo vzpostavljeno stabilno stanje. | 30. | Za fazo izločanja se črvi prenesejo v tla, v katerih ni preskusne kemikalije. Prvi vzorec je treba vzeti 4–24 h po začetku faze izločanja. Primeri časovnih razporedov vzorčenja za 21-dnevno fazo absorpcije in 21-dnevno fazo izločanja so podani v Dodatku 3. | Preskusni organizmi | 31. | Pri številnih vrstah kopenskih enhitrejev je teža posameznih osebkov zelo majhna (npr. 5–10 mg mokre teže na posamezno žival vrste Enchytraeus albidus in manj pri vrstah Enchytraeus crypticus ali Enchytraeus luxuriosus); za meritev teže in kemično analizo je včasih treba združevati črve iz ponovitvenih preskusnih posod (tj. uporabijo se vsi črvi iz ponovitvene posode, da se dobi en analitski rezultat za tkivo). Vsaki ponovitvi se doda 20 posameznih enhitrejev, uporabiti pa je treba vsaj tri ponovitve. Če je analitska meja zaznavnosti preskusne kemikalije visoka, je lahko potrebnih več črvov. Pri preskusnih vrstah z večjo težo posameznega osebka (Eisenia fetida in Eisenia andrei) je mogoče uporabiti ponovitvene posode z enim osebkom. | 32. | Deževniki, uporabljeni v preskusu, morajo imeti podobno težo (npr. posamezne živali vrst Eisenia fetida in Eisenia andrei bi morale tehtati 250–600 mg). Enhitreji (npr. Enchytraeus albidus) morajo biti dolgi približno 1 cm. Vsi črvi, uporabljeni v posameznem preskusu, morajo biti iz istega vira in biti odrasle živali s klitelumom (glej Dodatek 5). Ker lahko teža in starost živali vplivata na vrednosti BAF (npr. zaradi različnih vsebnosti lipidov in/ali prisotnosti jajčec), je treba te parametre natančno zapisovati in jih upoštevati pri razlagi rezultatov. Poleg tega lahko živali v obdobju izpostavljenosti odložijo kokone, kar tudi vpliva na vrednosti BAF. Priporočeno je pred preskusom stehtati podvzorec preskusnih črvov, da se ocenita srednja mokra in suha teža. | 33. | Uporabiti je treba visoko razmerje med zemljino in črvi, da se v fazi absorpcije čim bolj zmanjša zniževanje koncentracije preskusne kemikalije v tleh. Za vrsti Eisenia fetida in Eisenia andrei je priporočenih najmanj 50 g suhe teže (d.w.) zemljine na črva, za enhitreje pa najmanj 10–20 g d.w. zemljine na preskusno posodo. Posode morajo vsebovati 2–3-centimetrski (enhitreji) oziroma 4–5-centimetrsko plast zemljine (deževniki). | 34. | Črvi, uporabljeni v preskusu, se odstranijo iz gojišča (npr. enhitreji se odstranijo s pinceto z zaobljeno konico). Odrasle živali se prestavijo v neobdelana preskusna tla za aklimatizacijo in nahranijo (glej odstavek 36). Če se preskusni pogoji razlikujejo od pogojev gojenja, bi morala aklimatizacijska faza, ki traja 24–72 h, zadostovati za prilagoditev črvov na preskusne pogoje. Po aklimatizaciji se deževniki s premestitvijo sperejo v steklene posode (npr. petrijevke), ki vsebujejo čisto vodo, nato pa se stehtajo, preden se dodajo v preskusna tla. Pred tehtanjem je treba odstraniti odvečno vodo s črvov tako, da se nežno pritisnejo ob rob posode ali pa se voda previdno popivna z njih z rahlo navlaženo papirnato brisačo. | 35. | Opazovati in zapisovati je treba obnašanje preskusnih organizmov v zvezi z zarivanjem. Pri preskusih z deževniki se živali (kontrolni in tretirani vzorci) običajno zarijejo v tla v nekaj urah; to je treba preveriti najpozneje 24 h po tem, ko se črvi dajo v preskusne posode. Če se deževniki ne zarijejo v tla (npr. več kot 10 % v več kot polovici faze absorpcije), to pomeni, da preskusni pogoji niso ustrezni ali da preskusni organizmi niso zdravi. V takem primeru je treba preskus ustaviti in ponoviti. Enhitreji večinoma živijo v intersticijskih porah v tleh, njihov integument pa je pogosto samo delno v stiku s substratom v okolju; izpostavljenost enhitrejev, ki se zarijejo v tla, in tistih, ki se ne, se šteje za enakovredno, če se enhitreji ne zarijejo v tla, pa to ne pomeni nujno, da je treba preskus ponoviti. | Hranjenje | 36. | Pri uporabi zemljine z majhno vsebnostjo skupnega organskega ogljika je treba predvideti hranjenje. Pri uporabi umetne zemljine je za deževnike priporočena tedenska količina hrane (črvi naj se hranijo enkrat tedensko), ki znaša 7 mg posušenih iztrebkov na g suhe teže zemljine, za enhitreje pa tedenska količina 2–2,5 mg mletih ovsenih kosmičev na g suhe teže zemljine (11). Prvi obrok hrane je treba primešati v zemljino tik pred dodajanjem preskusnih organizmov. Po možnosti se uporabi ista vrsta hrane kot v gojiščih (glej Dodatek 5). | Svetloba in temperatura | 37. | Preskuse je treba izvajati v kontroliranem ciklusu 16 ur svetlobe in 8 ur teme, po možnosti pri 400–800 lux na mestu s preskusnimi posodami (3). Preskusna temperatura mora biti ves čas preskusa 20 ± 2 °C. | Preskusne koncentracije | 38. | Uporabi se samo ena koncentracija. Uporabo dodatnih koncentracij je treba utemeljiti. Če je strupenost (ECx) preskusne kemikalije blizu analitski meji zaznavnosti, je priporočena uporaba radioaktivno označene preskusne kemikalije z visoko specifično radioaktivnostjo. Pri kovinah mora biti koncentracija nad ravnjo ozadja v tkivu in tleh. | Ponovitve | 39. | Za kinetične meritve (fazi absorpcije in izločanja) morajo biti najmanj tri ponovitvene posode s tretiranim vzorcem na točko vzorčenja. Skupno število pripravljenih ponovitev mora zadostovati za vse čase vzorčenja v fazi absorpcije in fazi izločanja. | 40. | Za biološka opazovanja in meritve (npr. razmerje med suho in mokro težo, vsebnost lipidov) ter analizo koncentracij ozadja v črvih in tleh je treba zagotoviti vsaj 12 ponovitvenih posod z negativnim kontrolnim vzorcem (štiri, vzorčene na začetku, štiri na koncu absorpcije in štiri na koncu izločanja), če se ne uporablja drugo topilo kot voda. Če se za dodajanje preskusne kemikalije uporabi drugo topilo, je treba poleg tretiranih ponovitev pripraviti tudi kontrolni vzorec s topilom (štiri ponovitvene posode je treba vzorčiti na začetku, štiri na koncu faze absorpcije in štiri na koncu faze izločanja), ki vsebuje vse sestavine, razen preskusne snovi. V tem primeru je mogoče uporabiti tudi štiri dodatne ponovitvene posode z negativnim kontrolnim vzorcem (brez topila) za neobvezno vzorčenje na koncu faze absorpcije. Te ponovitve je mogoče biološko primerjati s kontrolnim vzorcem s topilom, da se dobijo informacije o morebitnem vplivu topila na preskusne organizme. Priporočeno je pripraviti zadostno število dodatnih rezervnih ponovitvenih posod (npr. osem) za tretirane in kontrolne vzorce. | Pogostost meritev kakovosti tal | 41. | Na začetku in koncu faz absorpcije in izločanja je treba izmeriti vrednost pH tal, vsebnost vlage v tleh in temperaturo (stalno) v sobi, v kateri se izvaja preskus. Enkrat tedensko je treba preveriti vsebnost vlage v tleh s tehtanjem preskusnih posod in primerjanjem dejanskih tež z začetnimi težami na začetku preskusa. Izgubo vode je treba nadomestiti z dodajanjem deionizirane vode. | Vzorčenje in analiza črvov in tal | 42. | Primer časovne razporeditve faz absorpcije in izločanja v preskusih bioakumulacije v deževnikih in enhitrejih je podan v Dodatku 3. | 43. | Vzorci tal se odvzamejo iz preskusnih posod za določitev koncentracije preskusne kemikalije pred vnosom črvov ter v fazah absorpcije in izločanja. Med preskusom se določajo koncentracije preskusne kemikalije v črvih in tleh. Na splošno se merijo skupne koncentracije v tleh. Mogoče je meriti tudi koncentracije v porni vodi; v takem primeru je treba pred začetkom raziskave podati razloge za to in zagotoviti ustrezne metode ter jih vključiti v poročilo. | 44. | Črvi in tla se vzorčijo vsaj šestkrat v fazah absorpcije in izločanja. Če se dokaže stabilnost preskusne kemikalije, je lahko analiz tal manj. Priporočeno je analizirati vsaj tri ponovitve na začetku in koncu faze absorpcije. Če koncentracija v tleh, izmerjena na koncu faze absorpcije, odstopa od začetne koncentracije za več kot za 30 %, je treba analizirati tudi vzorce tal, vzete v drugih dneh. | 45. | Ob vsakem času vzorčenja se črvi iz ponovitve odstranijo iz tal (npr. ko se zemljina iz ponovitve razporedi na plitev pladenj, se črvi poberejo z mehko pinceto z zaobljeno konico) in na hitro sperejo z vodo v plitvem steklenem ali jeklenem pladnju. Odvečna voda se odstrani (glej odstavek 34). Črvi se pazljivo premestijo v predhodno stehtano posodo in takoj stehtajo, vključno z vsebino prebavil. | 46. | Deževnikom (Eisenia sp.) je nato treba omogočiti, da čez noč praznijo prebavila, npr. na vlažnem filtrirnem papirju v pokriti petrijevki (glej odstavek 34). Po tem je treba določiti težo črvov, da se oceni morebitno zmanjšanje biomase med preskusom (glej merila veljavnosti v odstavku 17). Tkiva enhitrejev se tehtajo in analizirajo brez praznjenja prebavil, saj je to tehnično zahtevno, ker so ti črvi tako majhni. Po določitvi končne teže jih je treba takoj ubiti z najprimernejšo metodo (npr. s tekočim dušikom ali zamrznjenjem pri temperaturi pod –18 °C). | 47. | Črvi v fazi izločanja nadomestijo kontaminirano vsebino prebavil s čisto zemljino. To pomeni, da meritve pri črvih z neizpraznjenimi prebavili (v tem primeru enhitrejih), vzorčenih tik pred fazo izločanja, vključujejo kontaminirano zemljino v prebavilih. Pri vodnih maloščetincih se predpostavlja, da se po začetnih 4–24 h faze izločanja večina kontaminirane vsebine prebavil nadomesti s čistim sedimentom, npr. (46). O podobnih ugotovitvah se je poročalo v zvezi z deževniki v raziskavah o kopičenju radioaktivno označenega kadmija in cinka (78). Pri enhitrejih z neizpraznjenimi prebavili se lahko koncentracija tega prvega vzorca v fazi izločanja šteje za koncentracijo v tkivu po praznjenju prebavil. Da bi upoštevali razredčenje koncentracije preskusne snovi z nekontaminirano zemljino v fazi izločanja, je mogoče oceniti težo vsebnosti prebavil iz razmerja med mokro težo črvov in težo pepela črvov ali razmerja med suho težo črvov in težo pepela črvov. | 48. | Vzorci tal in črvov se po možnosti analizirajo takoj po odstranitvi (tj. v 1–2 dneh), da se preprečijo razgradnja ali druge izgube. Priporočljivo je že med izvajanjem preskusa izračunati približne hitrosti absorpcije in izločanja. Če se analiza odloži, je treba vzorce ustrezno shraniti, npr. z globokim zamrzovanjem (≤ –18 °C). | 49. | Preveriti je treba, ali so natančnost in ponovljivost kemijske analize ter rekuperacija preskusne kemikalije iz vzorcev tal in črvov zadovoljivi za zadevno metodo; poročati je treba o učinkovitosti ekstrakcije, meji zaznavnosti (LOD) in meji količinske opredelitve (LOQ). Poleg tega je treba preveriti, da preskusna kemikalija v kontrolnih posodah ni zaznavna v koncentracijah, ki so višje kot v ozadju. Če je pri kontrolnih črvih koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem organizmu Ca > 0, je to treba vključiti v izračun kinetičnih parametrov (glej Dodatek 2). V celotnem preskusu je treba z vsemi vzorci ravnati tako, da se kontaminacija in izguba čim bolj zmanjšata (npr. zaradi adsorpcije preskusne kemikalije na napravo za vzorčenje). | 50. | Pri delu z radioaktivno označenimi preskusnimi kemikalijami je mogoče analizirati matične snovi in metabolite. Količinska opredelitev matične preskusne kemikalije in metabolitov v stabilnem stanju ali na koncu faze absorpcije vsebuje pomembne informacije. Vzorce je nato treba ‚očistiti‘, da je mogoče matično preskusno kemikalijo količinsko ločeno opredeliti. Če posamezni metaboliti presegajo 10 % skupne radioaktivnosti v analiziranih vzorcih, se priporoča identifikacija teh metabolitov. | 51. | Navesti je treba skupno rekuperacijo ter rekuperacijo preskusne kemikalije v črvih, tleh in lovilnikih, ki vsebujejo absorbente za zadrževanje uparjene preskusne kemikalije, če se uporabijo, in poročati o njiju. | 52. | Združevanje posameznih vzorčenih živali iz dane preskusne posode je sprejemljivo pri enhitrejih, ki so manjši od deževnikov. Če združevanje vključuje zmanjševanje števila ponovitev, to omejuje statistične postopke, ki jih je mogoče uporabiti za podatke. Če sta potrebna posebna statistični postopek in vrednost, je treba v preskus vključiti primerno število ponovitvenih preskusnih posod za prilagoditev želenemu združevanju, postopku in vrednosti. | 53. | Priporoča se, naj se BAF izrazi v odvisnosti od skupne suhe teže, in kadar je to potrebno (tj. pri močno hidrofobnih kemikalijah), v odvisnosti od vsebnosti lipidov. Za določanje vsebnosti lipidov je treba uporabiti primerne metode (za ta namen je treba prilagoditi nekatere obstoječe metode, npr. (31) (58)), pri katerih se uporablja tehnika ekstrakcije s kloroformom/metanolom. Da bi se izognili uporabi kloriranih topil, pa je treba uporabiti prilagojeno metodo Bligha in Dyerja (9), kot je opisana v (17). Ker različne metode ne dajo nujno enakih vrednosti, je pomembno navesti podrobnosti o uporabljeni metodi. Kadar je to mogoče, tj. če je na voljo dovolj črvjega tkiva, je analizo lipidov najbolje opraviti na istem vzorcu ali ekstraktu, na katerem je bila analizirana preskusna kemikalija, ker je treba lipide pogosto odstraniti iz ekstrakta, preden ga je mogoče kromatografsko analizirati (49). Sicer je mogoče za merjenje vsebnosti lipidov uporabiti kontrolne živali, kar je mogoče nato uporabiti za normalizacijo vrednosti BAF. Pri slednjem pristopu se zmanjša kontaminacija opreme s preskusno kemikalijo. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 54. | Krivulja absorpcije preskusne kemikalije se dobi tako, da se njena koncentracija v/na črvih v fazi absorpcije grafično prikaže v odvisnosti od časa na aritmetični lestvici. Ko krivulja doseže konstantno raven ali stabilno stanje (glej opredelitve v Dodatku 1), se bioakumulacijski faktor stabilnega stanja BAFss izračuna iz: | Ca je koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem organizmu, | Cs je koncentracija preskusne kemikalije v tleh. | 55. | Kadar stabilno stanje ni doseženo, je treba namesto BAFss določiti BAFK na podlagi konstant hitrosti, kot je opisano spodaj: | — | akumulacijski faktor (BAFK) se določi kot razmerje med ks in ke, | — | hitrosti absorpcije in izločanja se po možnosti izračunata hkrati (glej enačbo 11 v Dodatku 2), | — | konstanta hitrosti izločanja (ke) se običajno določi na podlagi krivulje izločanja (tj. grafičnega prikaza koncentracije preskusne snovi v črvih v fazi izločanja). Konstanta hitrosti absorpcije ks se nato izračuna iz ke in vrednosti Ca, ki se dobi iz krivulje absorpcije – za opis teh metod glej Dodatek 2. Za izračun faktorja BAFK in konstant hitrosti ks in ke je najbolje uporabiti računalniške metode za ocenjevanje nelinearnih parametrov. Če izločanje očitno ni prvega reda, je treba uporabiti kompleksnejše modele. | Poročilo o preskusu | 56. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | vse razpoložljive informacije o akutni ali dolgotrajni strupenosti (npr. ECx, LCx“ NOEC) preskusne kemikalije za maloščetince, ki živijo v tleh, | — | čistost, fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti, npr. log Kow, vodotopnost, | — | kemijski identifikacijski podatki, vir preskusne snovi, identiteta in koncentracija uporabljenega topila, | — | če je uporabljena radioaktivno označena preskusna kemikalija, točen položaj označenih atomov, specifična radioaktivnost in radiokemijska čistost. | | Preskusna vrsta: | — | znanstveno ime, sev, vir, morebitna predobdelava, aklimatizacija, starost, red velikosti itd. | | Preskusni pogoji: | — | uporabljeni preskusni postopek, | — | tip in lastnosti uporabljene svetlobe in obdobja osvetljenosti, | — | načrt preskusa (npr. število in velikost preskusnih posod, teža zemljine in debelina plasti tal, število ponovitev, število črvov na ponovitev, število preskusnih koncentracij, trajanje faz absorpcije in izločanja, pogostost vzorčenja), | — | razlogi za izbiro materiala, iz katerega so preskusne posode, | — | metoda priprave in dodajanja preskusne snovi ter razlogi za izbiro metode, | — | nazivne preskusne koncentracije, srednje izmerjene vrednosti in njihovi standardni odkloni v preskusnih posodah ter metoda, s katero so bile te vrednosti pridobljene, | — | vir sestavin umetne zemljine ali – pri uporabi naravnih medijev – izvor zemljine, opis morebitne predobdelave, rezultati kontrol (preživetje, razvoj biomase, razmnoževanje), lastnosti tal (pH, vsebnost skupnega organskega ogljika, velikostna porazdelitev delcev (odstotni delež peska, mulja in gline), WHCmax, odstotni delež vsebnosti vode na začetku in koncu preskusa ter druge opravljene meritve), | — | podrobne informacije o obdelavi vzorcev tal in črvov, vključno s podrobnostmi o pripravi, shranjevanju, postopkih dodajanja snovi, ekstrakciji in analitskih postopkih (in natančnosti) za preskusno snov v črvih in tleh ter o vsebnosti lipidov (če je bila izmerjena) in rekuperaciji preskusne snovi. | | Rezultati: | — | smrtnost kontrolnih črvov in črvov v vsaki preskusni posodi ter opaženo nenormalno obnašanje (npr. izogibanje tlom, slabo razmnoževanje pri preskusu bioakumulacije v enhitrejih), | — | razmerje med suho in mokro težo zemljine in preskusnih organizmov (koristno za normalizacijo), | — | mokre teže črvov ob vsakem času vzorčenja; za deževnike mokre teže na začetku preskusa ter ob vsakem času vzorčenja pred praznjenjem prebavil in po njem, | — | vsebnost lipidov v preskusnih organizmih (če je bila določena), | — | krivulje, ki prikazujejo kinetiko absorpcije in izločanja preskusne kemikalije pri črvih ter čas do vzpostavitve stabilnega stanja, | — | Ca in Cs (s standardnim odklonom in razponom, če je ustrezno) za vse čase vzorčenja (Ca izražen v g·kg-1 mokre in suhe teže celega telesa, Cs izražen v g·kg-1 mokre in suhe teže zemljine). Če je potreben faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF) (npr. za primerjavo rezultatov dveh ali več preskusov, opravljenih z živalmi z različno vsebnostjo lipidov), je lahko Ca dodatno izražen v g·kg-1 vsebnosti lipidov v organizmu, Cs pa je lahko izražen v g·kg-1 organskega ogljika (OC) v tleh, | — | BAF (izražen v kg zemljine·kg-1 črvov), konstanta hitrosti absorpcije zemljine ks (izražena v g zemljine kg-1 črvov dan-1) in konstanta hitrosti izločanja ke (izražena v dan-1); v poročilu je lahko dodatno naveden BSAF (izražen v kg zemljine OC kg-1 vsebnosti lipidov v črvih), | — | če so bili izmerjeni: odstotni deleži matične kemikalije, metabolitov in vezanih ostankov (tj. odstotni delež preskusne kemikalije, ki ga ni mogoče ekstrahirati z običajnimi metodami ekstrakcije), zaznani v tleh in preskusnih živalih, | — | metode, uporabljene za statistično analizo podatkov. | | Vrednotenje rezultatov: | — | skladnost rezultatov z merili veljavnosti, navedenimi v odstavku 17, | — | nepričakovani ali nenavadni rezultati, npr. nepopolno izločanje preskusne kemikalije iz preskusnih živali. | VIRI: | (1) | Amorim, M. (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra. | (2) | ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688–00a. | (3) | ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676–04: str. 26. | (4) | Beek, B., Boehling, S., Bruckmann, U., Franke, C., Joehncke, U., Studinger, G. (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (urednik), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (urednik zvezka: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276. | (5) | Belfroid, A., Sikkenk, M., Seinen, W., Van Gestel, C., Hermens, J. (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99. | (6) | Belfroid, A., Van Wezel, A., Sikkenk, M., Van Gestel, C., Seinen, W. & Hermens, J. (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154–165. | (7) | Belfroid, A., Meiling, J., Drenth, H., Hermens, J., Seinen, W., Van Gestel, C. (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191. | (8) | Bell, A. W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13. | (9) | Bligh, E. G., in Dyer, W. J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917. | (10) | Bouche, M. (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, str. 671. | (11) | Bruns, E., Egeler, Ph., Moser, T., Römbke, J., Scheffczyk, A., Spörlein, P. (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 298 64 416. | (12) | Bruns, E., Egeler, Ph., Römbke, J. Scheffczyk, A., Spörlein, P. (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196. | (13) | Conder, J. M., in Lanno, R. P. (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13–20. | (14) | Connell, D. W., in Markwell, R. D. (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91–100. | (15) | Didden, W. A. M. (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2–29. | (16) | Didden, W. (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (ur.). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, str. 555–576. | (17) | De Boer, J., Smedes, F., Wells, D., Allan, A. (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme. | (18) | Dietrich, D. R., Schmid, P., Zweifel, U., Schlatter, C., Jenni-Eiermann, S., Bachmann, H., Bühler, U., Zbinden, N. (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140–145. | (19) | Uredba (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH), o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije ter spremembi Direktive 1999/45/ES ter razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES (UL L 396, 30.12.2006, str. 1). | (20) | Edwards, C. A., in Bohlen, P. J. (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, str. 426. | (21) | OECD (2008), Bioakumulacija v bentoških maloščetincih, ki živijo v usedlinah, Smernica za preskušanje št. 315, Smernice za preskušanje kemikalij, OECD, Pariz. | (22) | Egeler, Ph., Gilberg, D., Scheffczyk, A., Moser, Th., in Römbke, J. (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D No.: 204 67 458: str. 149. Na voljo za prenos na: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf. | (23) | Elmegaard, N., in Jagers op Akkerhuis, G. A. J. M. (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: str. 57. | (24) | Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. | (25) | EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195–208. | (26) | Franke, C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897–1905. | (27) | Franke, C., Studinger, G., Berger, G., Böhling, S., Bruckmann, U., Cohors-Fresenborg, D., Jöhncke, U. (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501–1514. | (28) | Füll, C. (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, str. 156. | (29) | Füll, C., Schulte, C., Kula, C. (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78–84. | (30) | Gabric, A. J., Connell, D. W., Bell, P. R. F. (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231. | (31) | Gardner, W. S., Frez, W. A., Cichocki, E. A., Parrish, C. C. (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105. | (32) | Hawker, D. W., in Connell, D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701–707. | (33) | Hund-Rinke, K., in Wiechering, H. (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15–20. | (34) | Hund-Rinke, K., Römbke, J., Riepert, F., Achazi, R. (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (ur.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81. | (35) | ISO 11268-2 (1998). Kakovost tal – Vpliv onesnaževal na deževnike (Eisenia fetida). Del 2: Določanje vplivov na razmnoževanje. | (36) | Jaenike, J. (1982). ‚Eisenia foetida‘ is two biological species. Megadrilogica 4: 6–8. | (37) | Jager, T. (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090. | (38) | Jager, T., Sanchez, P. A., Muijs, B., van der Welde, E., Posthuma, L. (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961. | (39) | Jager, T., Baerselman, R., Dijkman, E., De Groot, A. C., Hogendoorn, E. A., DeJong, A., Kruitbosch, J. A. W., Peijnenburg, W. J. G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767–775. | (40) | Jager, T., Fleuren, R. L. J., Hoogendoorn, E., de Korte, G. (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404. | (41) | Janssen, M. P. M., Bruins, A., De Vries, T. H., Van Straalen, N. M. (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312. | (42) | Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232. | (43) | Khalil, A. M. (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, str. 137. | (44) | Landrum, P. F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595. | (45) | Marinussen, M. P. J. C., Van der Zee, S. E. A. T. M., De Haan, F. A. (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26. | (46) | Mount, D. R., Dawson, T. D., Burkhard, L. P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249. | (47) | Nendza, M. (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim. | (48) | Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. | (49) | Poglavje C.13 te priloge, Biokoncentracija: pretočni preskus na ribah. | (50) | Poglavje C.21 te priloge, Talni mikroorganizmi: preskus transformacije dušika. | (51) | OECD (2004a), Preskus razmnoževanja enhitrejev, Smernica za preskušanje št. 220, Smernice za preskušanje kemikalij, OECD, Pariz. | (52) | OECD (2004b), Preskus razmnoževanja deževnikov (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Smernica za preskušanje št. 222, Smernice za preskušanje kemikalij, OECD, Pariz. | (53) | OECD (2008), Bioakumulacija v bentoških maloščetincih, ki živijo v usedlinah, Smernica za preskušanje št. 315, Smernice za preskušanje kemikalij, OECD, Pariz. | (54) | Petersen, H., in Luxton, M. (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388. | (55) | Phillips, D. J. H. (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ur.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396. | (56) | Pflugmacher, J. (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81. | (57) | Posthuma, L., Weltje, L., Anton-Sanchez, F. A. (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven. | (58) | Randall, R. C., Lee, II. H., Ozretich, R. J., Lake, J. L., Pruell, R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436. | (59) | Römbke, J., Egele, P., Füll, C. (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S. | (60) | Römbke, J. in Moser, Th. (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: str. 373. | (61) | Römbke, J., Riepert, F., Achazi, R. (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (ur.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129. | (62) | Romijn, C. A. F. M., Luttik, R., Van De Meent, D., Slooff, W., Canton, J. H. (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127. | (63) | Sample, B. E., Suter, D. W., Beauchamp, J. J., Efroymson, R. A. (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120. | (64) | Schlosser, H.-J., in Riepert, F. (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413–433. | (65) | Schmelz, R., in Collado, R. (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93–100. | (66) | Sims, R. W., in Gerard, B. M. (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr. W. Backhuys. | (67) | Sousa, J. P., Loureiro, S., Pieper, S., Frost, M., Kratz, W., Nogueira, A. J. A., Soares, A. M. V. M. (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563. | (68) | Spacie, A. in Hamelink, J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320. | (69) | Stephenson, G. L., Kaushik, A., Kaushik, N. K., Solomon, K. R., Steele, T., Scroggins, R. P. (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (ur.). Setac Press, Pensacola, 67–81. | (70) | Sterenborg, I., Vork, N. A., Verkade, S. K., Van Gestel, C. A. M., Van Straalen, N. M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167–1171. | (71) | UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin. | (72) | US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marec 2000. | (73) | Van Brummelen, T. C. in Van Straalen, N. M. (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277–285. | (74) | Van Gestel, C. A. M. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ur. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB). | (75) | Van Gestel, C. A., in Ma, W.-C. (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023–1033. | (76) | Van Straalen, N. M., Donker, M. H., Vijver, M. G., van Gestel, C. A. M. (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409–417. | (77) | Venter, J. M. in Reinecke, A. J. (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165. | (78) | Vijver, M. G., Vink, J. P. M., Jager, T., Wolterbeek, H. T., van Straalen, N. M., van Gestel, C. A. M. (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851. | (79) | Widianarko, B., in Van Straalen, N. M. (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | | Bioakumulacija je povečanje koncentracije preskusne kemikalije v organizmu ali na njem, glede na koncentracijo preskusne kemikalije v okoliškem mediju. Izhaja iz procesov biokoncentracije in biomagnifikacije (glej spodaj); | | biokoncentracija je povečanje koncentracije preskusne kemikalije v organizmu ali na njem zaradi absorpcije kemikalije izključno iz okoliškega medija (tj. prek telesne površine in z zaužitjem), ki je odvisna od koncentracije preskusne kemikalije v okoliškem mediju; | | biomagnifikacija je povečanje koncentracije preskusne kemikalije v organizmu ali na njem predvsem zaradi absorpcije iz kontaminirane hrane ali plena, ki je odvisna od koncentracije preskusne kemikalije v hrani ali plenu. Biomagnifikacija lahko vodi do prenosa ali kopičenja preskusne snovi v prehranjevalnem spletu; | | izločanje preskusne kemikalije je odstranitev te kemikalije iz tkiva preskusnega organizma z aktivnimi ali pasivnimi procesi, ki se pojavijo neodvisno od prisotnosti ali odsotnosti preskusne snovi v okoliškem mediju; | | bioakumulacijski faktor (BAF) ob katerem koli času v fazi absorpcije tega preskusa bioakumulacije je koncentracija preskusne kemikalije v/na preskusnem organizmu (Ca v g·kg-1 suhe teže črva), deljena s koncentracijo kemikalije v okoliškem mediju (Cs v g·kg-1 suhe teže zemljine); BAF se izrazi v enotah kg zemljine·kg-1 črvov; | | bioakumulacijski faktor stabilnega stanja (BAFss) je BAF v stabilnem stanju in se ne spreminja znatno v daljšem časovnem obdobju, saj je koncentracija preskusne kemikalije v okoliškem mediju (Cs v g·kg-1 suhe teže zemljine) v tem obdobju konstantna; | | bioakumulacijski faktorji, izračunani neposredno iz razmerja med konstanto hitrosti absorpcije tal in konstanto hitrosti izločanja (ks in ke, glej spodaj), se imenujejo kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK); | | faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF) je na lipide normalizirana koncentracija preskusne kemikalije v/na preskusnem organizmu, deljena s koncentracijo preskusne kemikalije v tleh v stabilnem stanju, normalizirano na organski ogljik. Ca se tako izrazi kot g·kg-1 vsebnosti lipidov v organizmu, Cs pa kot g·kg-1 vsebnosti organskega ogljika v tleh; BSAF se izrazi v enotah kg OC·kg-1 lipidov; | | konstantna raven ali stabilno stanje je opredeljeno kot ravnotežje med procesoma absorpcije in izločanja, ki potekata hkrati v fazi izpostavljenosti. Stabilno stanje je v grafičnem prikazu BAF v odvisnosti od časa doseženo, ko krivulja postane vzporedna s časovno osjo in se tri zaporedne analize BAF na vzorcih, vzetih v razmiku najmanj dveh dni, druga od druge ne razlikuje za več kot 20 % ter ni statistično značilnih razlik med tremi obdobji vzorčenja. Za preskusne kemikalije, ki se počasi absorbirajo, so primernejši sedemdnevni razmiki (49); | | koeficient porazdelitve organski ogljik/voda (Koc) je razmerje med koncentracijo kemikalije v/na delu tal z organskim ogljikom in koncentracijo kemikalije v vodi v ravnotežju; | | koeficient porazdelitve oktanol/voda (Kow) je uravnoteženo razmerje topnosti kemikalije v n-oktanolu in vodi, včasih izraženo tudi kot Pow. Logaritem Kow (log Kow) se uporablja kot kazalnik potenciala kemikalije za kopičenje v vodnih organizmih; | | faza absorpcije ali izpostavitve je čas, v katerem so preskusni organizmi izpostavljeni preskusni kemikaliji; | | konstanta hitrosti absorpcije tal (ks) je numerična vrednost, ki opredeljuje stopnjo povišanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnem organizmu zaradi absorpcije iz talne faze. Konstanta ks se izrazi v g zemljine kg-1 črvov d-1; | | faza izločanja je čas po prenosu preskusnih organizmov iz kontaminiranega medija v medij brez preskusne snovi, v katerem se preučuje izločanje (ali neto izguba) kemikalije iz preskusnih organizmov; | | konstanta hitrosti izločanja (ke) je numerična vrednost, ki opredeljuje stopnjo znižanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnih organizmih po prenosu preskusnih organizmov iz medija s preskusno snovjo v medij brez kemikalije; ke se izrazi v d-1; | | preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Izračun parametrov absorpcije in izločanja | Glavni cilj preskusa bioakumulacije je določitev bioakumulacijskega faktorja BAF. Izmerjeni BAF je mogoče izračunati z deljenjem koncentracije v preskusnem organizmu Ca s koncentracijo v tleh Cs v stabilnem stanju. Če v fazi absorpcije stabilno stanje ni doseženo, se BAFK izračuna iz konstant hitrosti namesto iz BAFss. Vendar je treba navesti, ali BAF temelji na koncentracijah v stabilnem stanju ali ne. | Kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK), konstanta hitrosti absorpcije tal (ks) in konstanta hitrosti izločanja (ke) se običajno dobijo z računalniškimi metodami za ocenjevanje nelinearnih parametrov, npr. na podlagi modelov, opisanih v (68). Na podlagi skupine podatkov o zaporednih koncentracijah v odvisnosti od časa in modelnih enačb: | 0 < t < tc | [enačba 1] | ali | t > tc | [enačba 2] | pri čemer je: | Ca | = | koncentracija kemikalije v črvih [g·kg-1 mokre ali suhe teže], | ks | = | konstanta hitrosti absorpcije v tkivu [g zemljine kg-1 črvov d-1], | Cs | = | koncentracija kemikalije v tleh [g·kg-1 mokre ali suhe teže], | ke | = | konstanta hitrosti izločanja [d-1], | tc | = | čas na koncu faze absorpcije, | ti računalniški programi izračunajo vrednosti BAFK, ks in ke. | Kadar se koncentracija ozadja pri neizpostavljenih črvih, npr. na dan 0, znatno razlikuje od nič (tako je lahko na primer pri kovinah), mora biti ta koncentracija ozadja (Ca,0) vključena v te enačbe, tako da se glasijo: | 0 < t < tc | [enačba 3] | in | t > tc | [enačba 4] | Kadar se v fazi absorpcije ugotovi znatno zmanjšanje koncentracije preskusne kemikalije v tleh v odvisnosti od časa, je mogoče uporabiti naslednje modele, npr. (67) (79): | [enačba 5] | pri čemer je: | Cs | = | koncentracija kemikalije v tleh [g·kg-1 mokre ali suhe teže], | k0 | = | konstanta hitrosti razgradnje v tleh [d-1], | C0 | = | začetna koncentracija kemikalije v tleh [g·kg-1 mokre ali suhe teže]. | 0 < t < tc | [enačba 6] | t > tc | [enačba 7] | pri čemer je: | Ca | = | koncentracija kemikalije v črvih [g·kg-1 mokre ali suhe teže], | ks | = | konstanta hitrosti absorpcije v tkivu [g zemljine kg-1 črvov d-1], | k0 | = | konstanta hitrosti razgradnje v tleh [d-1], | ke | = | konstanta hitrosti izločanja [d-1], | tc | = | čas na koncu faze absorpcije. | Kadar je v fazi absorpcije doseženo stabilno stanje (tj. t = ∞), je mogoče enačbo 1 | 0 < t < tc | [enačba 1] | skrajšati na: | ali | [enačba 8] | Nato je ks/ke x Cs pristop za ugotavljanje koncentracije preskusne snovi v črvjem tkivu v stabilnem stanju (Ca,ss). | Faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF) je mogoče izračunati na naslednji način: | [enačba 9] | pri čemer je foc del organskega ogljika v tleh, flip pa del lipidov v črvih, pri čemer sta oba po možnosti določena na vzorcih, vzetih v preskusu, ter temeljita na suhi teži oziroma mokri teži. | Model kinetike izločanja je mogoče oblikovati na podlagi podatkov iz faze izločanja ter z uporabo spodnje modelne enačbe in računalniške metode za ocenjevanje nelinearnih parametrov. Če podatkovne točke, grafično prikazane v odvisnosti od časa, nakazujejo konstantno eksponentno padanje koncentracije preskusne snovi v živalih, je mogoče za opis časovnega poteka izločanja uporabiti enodelni model (enačba 9). | [enačba 10] | Procesi izločanja so včasih videti dvofazni, pri čemer v zgodnjih fazah Ca hitro upada, kar se v poznejših fazah izločanja spremeni v počasnejšo izgubo preskusnih snovi, npr. (27) (68). Dve fazi je mogoče razložiti s predpostavko, da sta v organizmu dva različna dela, iz katerih se preskusna snov izloča z različno hitrostjo. V takih primerih je treba preučiti posebne vire, npr. (38) (39) (40) (78). | Z zgornjimi modelnimi enačbami je mogoče kinetična parametra (ks in ke) izračunati tudi naenkrat z modelom kinetike prvega reda za vse podatke iz faz absorpcije in izločanja hkrati. Opis metode, ki lahko omogoča tak združeni izračun konstant hitrosti absorpcije in izločanja, je na voljo v virih (191), (223) in (220). | [enačba 11] | Opomba: | kadar se parametra absorpcije in izločanja ocenjujeta hkrati iz združenih podatkov o absorpciji in izločanju, je ‚m‘, kot je prikazan v enačbi 11, deskriptor, ki računalniškemu programu omogoča, da podizraze v enačbi pripiše skupinam podatkov iz zadevne faze in da pravilno izvede ocenjevanje (m = 1 za fazo absorpcije; m = 2 za fazo izločanja). | Vseeno je treba te modelne enačbe uporabljati previdno, zlasti kadar se med preskusom pojavijo spremembe v biološki razpoložljivosti preskusne kemikalije ali (biološki) razgradnji (glej npr. (79)). | Dodatek 3 | PRIMERI ČASOVNIH RAZPOREDOV ZA PRESKUSE BIOAKUMULACIJE V TLEH | Preskus z deževniki | (a) | Faza absorpcije z 8 datumi vzorčenja za izračun kinetike | Dan | Dejavnost | – 6 | 48-urno kondicioniranje pripravljene zemljine; | – 4 | dodajanje raztopine preskusne kemikalije v del zemljine; izparevanje morebitnega topila; mešanje sestavin zemljine; razporejanje zemljine v preskusne posode; 4-dnevno vzpostavljanje ravnotežja v preskusnih pogojih (3 tedne za zemljine s primešano kovino); | – 3 do – 1 | izločevanje preskusnih organizmov iz gojišča za aklimatizacijo; priprava in vlaženje sestavin zemljine; | 0 | merjenje temperature in vrednosti pH tal; odstranjevanje vzorcev tal iz tretiranih posod in kontrolnih vzorcev s topilom za določitev koncentracije preskusne kemikalije; dodajanje obroka hrane; tehtanje in naključna razporeditev črvov v preskusne posode; zadržanje zadostnih podvzorcev črvov za določanje analitskih vrednosti ozadja, mokre in suhe teže ter vsebnosti lipidov; tehtanje vseh preskusnih posod za kontrolo vlage v tleh; kontrola dotoka zraka, če se uporabi zaprt preskusni sistem; | 1 | kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in temperature; jemanje vzorcev tal in črvov za določitev koncentracije preskusne snovi; | 2 | enako kot 1. dan; | 3 | kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; | 4 | enako kot 1. dan; | 5–6 | enako kot 3. dan; | 7 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 8–9 | enako kot 3. dan; | 10 | enako kot 1. dan; | 11–13 | enako kot 3. dan; | 14 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 15–16 | enako kot 3. dan; | 17 | enako kot 1. dan; | 18–20 | enako kot 3. dan; | 21 | enako kot 1. dan; merjenje temperature in vrednosti pH tal; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod; konec faze absorpcije; premestitev črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto zemljino za fazo izločanja (brez praznjenja prebavil); vzorčenje tal in črvov iz kontrolnih vzorcev s topilom. | | Dejavnosti pred izpostavljenostjo (faza uravnoteženja) je treba časovno načrtovati ob upoštevanju lastnosti preskusne kemikalije. | | Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob delovnikih). | (b) | Faza izločanja | Dan | Dejavnost | – 6 | Priprava in vlaženje sestavin zemljine; 48-urno kondicioniranje pripravljene zemljine; | – 4 | mešanje sestavin zemljine; razporejanje zemljine v preskusne posode; 4-dnevna inkubacija v preskusnih pogojih; | 0 (konec faze absorpcije) | merjenje temperature in vrednosti pH tal; tehtanje in naključna razporeditev črvov v preskusne posode; dodajanje obroka hrane; premestitev črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto zemljino; jemanje vzorcev tal in črvov po 4–6 urah za določitev koncentracije preskusne kemikalije; | 1 | kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in temperature; jemanje vzorcev tal in črvov za določitev koncentracije preskusne kemikalije; | 2 | enako kot 1. dan; | 3 | kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; | 4 | enako kot 1. dan; | 5–6 | enako kot 3. dan; | 7 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 8–9 | enako kot 3. dan; | 10 | enako kot 1. dan; | 11–13 | enako kot 3. dan; | 14 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 15–16 | enako kot 3. dan; | 17 | enako kot 1. dan; | 18–20 | enako kot 3. dan; | 21 | enako kot 1. dan; merjenje temperature in vrednosti pH tal; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod; vzorčenje tal in črvov iz kontrolnih vzorcev s topilom. | | Tla pred začetkom faze izločanja je treba pripraviti enako kot pred fazo absorpcije. | | Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob delovnikih). | Preskus z enhitreji | (a) | Faza absorpcije z 8 datumi vzorčenja za izračun kinetike | Dan | Dejavnost | – 6 | 48-urno kondicioniranje pripravljene zemljine; | – 4 | dodajanje raztopine preskusne kemikalije v del zemljine; izparevanje morebitnega topila; mešanje sestavin zemljine; razporejanje zemljine v preskusne posode; 4-dnevno vzpostavljanje ravnotežja v preskusnih pogojih (3 tedne za zemljinela s primešano kovino); | –3 do –1 | izločevanje preskusnih organizmov iz gojišča za aklimatizacijo; priprava in vlaženje sestavin zemljine; | 0 | merjenje temperature in vrednosti pH tal; odstranjevanje vzorcev tal iz tretiranih posod in kontrolnih vzorcev s topilom za določitev koncentracije preskusne kemikalije; dodajanje obroka hrane v tla; tehtanje in naključna razporeditev črvov v preskusne posode; zadržanje zadostnih podvzorcev črvov za določanje analitskih vrednosti ozadja, mokre in suhe teže ter vsebnosti lipidov; tehtanje vseh preskusnih posod za kontrolo vlage v tleh; kontrola dotoka zraka, če se uporabi zaprt preskusni sistem; | 1 | kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in temperature; jemanje vzorcev tal in črvov za določitev koncentracije preskusne snovi; | 2 | enako kot 1. dan; | 3 | kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; | 4 | enako kot 1. dan; | 5–6 | enako kot 3. dan; | 7 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane v tla; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 9 | enako kot 1. dan; | 10 | enako kot 3. dan; | 11 | enako kot 1. dan; | 12–13 | enako kot 3. dan; | 14 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane v tla; merjenje temperature in vrednosti pH tal; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod; konec faze absorpcije; premestitev črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto zemljino za fazo izločanja (brez praznjenja prebavil); vzorčenje tal in črvov iz kontrolnih vzorcev s topilom. | | Dejavnosti pred izpostavljenostjo (faza uravnoteženja) je treba časovno načrtovati ob upoštevanju lastnosti preskusne kemikalije. | | Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob delovnikih). | Dodatek 4 | Umetna zemljina – priporočila glede priprave in shranjevanja | Ker naravna zemljina iz določenega vira ni nujno na voljo vse leto in ker lahko domorodni organizmi in prisotna mikroonesnaževala vplivajo na preskus, se za ta preskus priporoča umetni substrat – umetna zemljina v skladu s poglavjem C.8 te priloge, Strupenost za deževnike (48). V takih tleh lahko preživi, raste in se razmnožuje več preskusnih vrst, zagotovljeni pa so tudi največja mogoča standardizacija ter primerljivost preskusnih pogojev in pogojev gojenja znotraj laboratorija in med laboratoriji. | Sestavine zemljine | Šota: | 10 % | Šotni mah, v skladu s smernico OECD 207 (48). | Kremenov pesek: | 70 % | Industrijski kremenov pesek (sušen na zraku); velikost zrnc: več kot 50 % delcev mora biti velikih 50 do 200 μm, vsi delci pa morajo biti ≤ 2 mm. | Kaolinska glina: | 20 % | Vsebnost kaolinita ≥ 30-odstotna. | Kalcijev karbonat: | ≤ 1 % | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. | Lahko se tudi zmanjša vsebnost organskega ogljika v umetni zemljini, npr. z zmanjšanjem vsebnosti šote na 4–5 % suhe zemljine in ustreznim povečanjem vsebnosti peska. S takim zmanjšanjem vsebnosti organskega ogljika se lahko zmanjšajo možnosti adsorpcije preskusne kemikalije na zemljino (organski ogljik), razpoložljivost preskusne kemikalije za črve pa se lahko poveča (74). Dokazano je, da lahko Enchytraeus albidus in Eisenia fetida izpolnjujeta merila veljavnosti v zvezi z razmnoževanjem, če se preskus izvaja z naravno zemljino z manjšo vsebnostjo organskega ogljika, npr. 2,7 % (33), (211), izkušnje pa kažejo, da je to mogoče doseči tudi pri umetni zemljini s 5 % šote. | Priprava | Suhe sestavine zemljine se temeljito premešajo (npr. v velikem laboratorijskem mešalniku). To je treba storiti približno en teden pred začetkom preskusa. Zmešane suhe sestavine zemljine je treba navlažiti z deionizirano vodo vsaj 48 h pred primešanjem preskusne snovi, da se kislost uravnoteži/stabilizira. Za določitev pH se uporabi mešanica zemljine in 1 M raztopine KCl v razmerju 1 : 5. Če vrednost pH ni znotraj zahtevanega obsega (6,0 ± 0,5), se zemljini doda zadostna količina CaCO3 ali pripravi nova šarža zemljine. | Največja zmogljivost zadrževanja vode (WHC) v umetni zemljini se določi v skladu z ISO 11268-2 (35). Vsaj dva dneva pred začetkom preskusa se suha umetna zemljina navlaži z dovolj deionizirane ali rekonstituirane vode, da nastane približno polovica končne vsebnosti vode. Končna vsebnost vode mora biti med 40 in 60 % največje WHC. Na začetku preskusa se predhodno navlažena zemljina razdeli na toliko šarž, kot je preskusnih koncentracij in kontrolnih vzorcev, uporabljenih v preskusu, vsebnost vlage pa se prilagodi na 40–60 % WHCmax z raztopino preskusne snovi in/ali dodajanjem deionizirane ali rekonstituirane vode. Vsebnost vlage se določi na začetku in koncu preskusa (pri 105 °C). Biti mora optimalna za potrebe uporabljenih vrst živali (vsebnost vlage je mogoče preveriti tudi na naslednji način: če se zemljina nežno stisne v roki, se morajo med prsti pojaviti majhne kapljice vode). | Shranjevanje | Suhe sestavine umetne zemljine se lahko do uporabe hranijo pri sobni temperaturi. Pripravljena predhodno navlažena zemljina se lahko hrani na hladnem do tri dni pred primešanjem preskusne kemikalije; paziti je treba, da je izhlapevanje vode čim manjše. Zemljino s primešano preskusno snovjo je treba uporabiti takoj, razen če obstajajo podatki o tem, da je mogoče določeno zemljino shranjevati, ne da bi to vplivalo na strupenost in biološko razpoložljivost preskusne snovi. Vzorci zemljine s primešano preskusno snovjo se lahko nato do analize hranijo v pogojih, priporočenih za zadevno preskusno snov. | Dodatek 5 | Vrste kopenskih maloščetincev, priporočene za preskušanje bioakumulacije iz tal | Deževniki | Priporočena preskusna vrsta je Eisenia fetida (Savigny 1826), ki spada v družino Lumbricidae. Od leta 1972 se deli na dve podvrsti (Eisenia fetida in Eisenia andrei (10)). Jaenike trdi (36), da sta to pravi ločeni vrsti. Vrsto Eisenia fetida je mogoče brez težav prepoznati po svetlih rumenih črtah med kolobarji, Eisenia andrei pa je enotne temno rdeče barve. Izvirajo verjetno iz črnomorske regije, danes pa so razširjeni po vsem svetu, zlasti v antropogeno prilagojenih habitatih, kot so kompostni kupi. Obe podvrsti je mogoče uporabljati za ekotoksikološke in bioakumulacijske preskuse. | Eisenia fetida in Eisenia andrei sta komercialno dostopni vrsti, npr. kot vaba za ribe. V primerjavi z drugimi deževniki iz družine Lumbricidae imajo kratek življenjski ciklus in dosežejo zrelost pri približno 2–3 mesecih (pri sobni temperaturi). Njihova optimalna temperatura je približno 20–24 °C. Najraje imajo razmeroma vlažne substrate s skoraj nevtralno vrednostjo pH in visoko vsebnostjo organske snovi. Ker se ti vrsti zelo pogosto uporabljata v standardiziranih ekotoksikoloških preskusih že približno 25 let, je njuno gojenje dobro uveljavljeno (48) (77). | Obe vrsti je mogoče gojiti v zelo različnih živalskih odpadkih. Medij za gojenje, priporočen v ISO (35), je mešanica konjskega ali govejega gnoja in šote v razmerju 50: 50. Medij mora imeti vrednost pH približno 6–7 (uravnavano s kalcijevim karbonatom), majhno ionsko prevodnost (manj kot 6 mS/cm ali manj kot 0,5-odstotna koncentracija soli) in ne sme biti pretirano kontaminiran z amonijem ali živalskim urinom. Uporabiti je mogoče tudi komercialno vrtno prst brez aditivov ali umetno zemljino v skladu z OECD (48) ali mešanico obeh v razmerju 50: 50. Substrat mora biti vlažen, vendar ne preveč moker. Primerne so škatle za gojenje s prostornino 10 do 50 litrov. | Za črve standardne starosti in teže je gojenje najbolje začeti s kokoni. Zato se v škatle za gojenje s svežim substratom dajo odrasli črvi, da naredijo kokone. Praktične izkušnje so pokazale, da so pri gostoti populacije približno 100 odraslih črvov na kg substrata (mokra teža) dobre stopnje razmnoževanja. Po 28 dneh se odrasli črvi odstranijo. Deževniki, ki se izležejo iz kokonov, se uporabijo za preskušanje, ko so zreli, po vsaj 2 mesecih, vendar prej kot v 12 mesecih. | Črve zgoraj opisanih vrst je mogoče šteti za zdrave, če se premikajo skozi substrat, ga ne poskušajo zapustiti in se stalno razmnožujejo. Zelo počasno premikanje ali rumen zadnji del (pri vrsti Eisenia fetida) kaže na izčrpanje substrata. V tem primeru se priporoča svež substrat in/ali manjše število živali na škatlo. | Dodatni izbrani viri | Gerard, B. M. (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1–58. | Graff, O. (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1–81. | Römbke, J., Egeler, P., Füll, C. (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S. | Rundgren, S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49–55. | Satchell, J. E. (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180–201. | Sims, R. W., in Gerard, B. M. (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1–171. | Tomlin, A. D. (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ur.), Chapman & Hall, London. str. 331–338. | Enhitreji | Priporočena preskusna vrsta je Enchytraeus albidus Henle 1837 (enhitrej). Enchytraeus albidus je ena od največjih (do 15 mm) vrst maloščetinarjev kolobarnikov iz družine Enchytraeidae in je razširjena po vsem svetu, npr. (8). Živi v morskih, sladkovodnih in kopenskih habitatih, večinoma v razpadajoči organski snovi (morske alge, kompost), redko pa na travnikih (42). Ta široka ekološka toleranca in nekatere morfološke variacije kažejo na to, da morda obstajajo različne podvrste te vrste. | Enchytraeus albidus je komercialno dostopna vrsta in se prodaja kot hrana za ribe. Treba je preveriti, ali je kultura kontaminirana z drugimi, običajno manjšimi vrstami (60). Ob kontaminaciji je treba vse črve oprati z vodo v petrijevki. Nato se (s stereomikroskopom) izberejo veliki odrasli osebki vrste Enchytraeus albidus, da se iz njih vzgoji nova kultura. Vsi drugi črvi se zavržejo. Življenjski ciklus enhitrejev je kratek, saj zrelost dosežejo v starosti med 33 dnevi (pri 18 °C) in 74 dnevi (pri 12 °C). Za preskus se uporabijo samo kulture, ki so bile v laboratoriju brez težav že vsaj 5 tednov (ena generacija). | Primerne so tudi druge vrste rodu Enchytraeus, zlasti Enchytraeus luxuriosus. Ta vrsta je pravi prebivalec tal, ki je bil na novo opisan v (65). Če se uporabijo druge vrste Enchytraeus, jih je treba jasno identificirati in poročati o razlogih za izbiro. | Enchytraeus crypticus (Westheide in Graefe 1992) je vrsta, ki spada v isto skupino kot Enchytraeus luxuriosus. Ni bilo nedvomno ugotovljeno, da obstaja v naravnem okolju, saj je bila opisana samo v kulturah deževnikov in kompostnih kupih (Römbke 2003). Njene izvirne ekološke potrebe zato niso znane. Toda nedavne laboratorijske raziskave z različnimi naravnimi zemljinami so potrdile, da ta vrsta dobro prenaša različne lastnosti tal, kot so pH in tekstura (Jänsch idr. 2005). V zadnjih letih se ta vrsta pogosto uporablja v ekotoksikoloških raziskavah, ker jo je preprosto gojiti in preskušati, npr. Kuperman idr. 2003. Vendar so te živali majhne (3–12 mm; povprečno 7 mm (Westheide in Müller 1996)), zato je z njimi težje ravnati kot z vrsto Enchytraeus albidus. Če se uporablja ta vrsta namesto vrste Enchytraeus albidus, je lahko preskusna posoda manjša, ni pa to nujno. Poleg tega je treba upoštevati, da se ta vrsta zelo hitro razmnožuje in da je obdobje ene generacije krajše od 20 dni pri 20 ± 2 °C (Achazi idr. 1999), pri višjih temperaturah pa še krajše. | Enchytraeidae vrste Enchytraeus albidus (in druge vrste roda Enchytraeus) je mogoče gojiti v velikih plastičnih škatlah (npr. 30 × 60 × 10 cm ali 20 × 12 × 8 cm, kar je primerno za kulturo majhnih črvov), napolnjenih z mešanico umetne zemljine in komercialne dostopne nekontaminirane vrtne prsti brez aditivov. Kompostnemu materialu se je treba izogibati, saj lahko vsebuje strupene kemikalije, kot so težke kovine. Živali je treba pred uporabo odstraniti iz zemljine za gojenje s trikratnim globokim zamrzovanjem. Uporabiti je mogoče tudi čisto umetno zemljino, vendar je lahko razmnoževanje počasnejše v primerjavi z mešanimi substrati. Substrat mora imeti pH 6,0 ± 0,5. Kultura se goji v inkubatorju pri temperaturi 15 ± 2 °C brez svetlobe. Vsekakor se je treba izogibati temperaturi, višji od 23 °C. Umetna/naravna zemljina mora biti vlažna, vendar ne mokra. Če se nežno stisne v roki, bi se morale pojaviti samo majhne kaplje vode. Vsekakor se je treba izogibati anoksičnim pogojem (npr. če se uporabi pokrov, mora število lukenj v pokrovu zadostovati za zadostno izmenjavo zraka). Tla za gojenje je treba enkrat tedensko prezračevati s pazljivim mešanjem. | Črve je treba vsaj enkrat tedensko hraniti ad libitum z ovsenimi kosmiči, položenimi v luknjo na površini tal in pokritimi s prstjo. Če hrana, dodana na zadnji datum hranjenja, ostane v posodi, je treba količino hrane ustrezno prilagoditi. Če na preostali hrani zrasejo glive, jo je treba nadomestiti z novo količino ovsenih kosmičev. Za spodbujanje razmnoževanja se lahko ovsenim kosmičem vsaka dva tedna doda komercialno dostopen proteinski prah, obogaten z vitamini. Po treh mesecih se živali premestijo v sveže pripravljeno gojišče ali substrat za gojenje. Ovsene kosmiče, ki morajo biti shranjeni v zatesnjenih posodah, je treba pred uporabo avtoklavirati ali segreti, da se preprečijo okužbe s pršicami iz moke (npr. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) ali predatorskimi pršicami (npr. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Ko je hrana razkužena, jo je treba zmleti, da jo je mogoče z lahkoto potresti po površini tal. Vir hrane je lahko tudi pekovski kvas ali hrana za ribe TetraMin®. | Na splošno so pogoji gojenja zadovoljivi, če črvi ne poskušajo zapustiti substrata, se skozi tla hitro gibljejo, imajo bleščečo zunanjo površino brez delcev zemljine, ki bi se je držali, in so bolj ali manj belkaste barve ter če so vidni črvi različnih starosti. Dejansko je mogoče črve šteti za zdrave, če se stalno razmnožujejo. | Dodatni izbrani viri | Achazi, R. K., Fröhlich, E., Henneken, M., Pilz, C. (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126. | Jänsch, S., Amorim, M. J. B., Römbke, J. (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83. | Kuperman, R. G., Checkai, R. T., Simini, M., Phillips, C. T., Kolakowski, J. E., Kurnas, C. W., Sunahara, G. I. (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656. | Römbke, J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607–616. | Westheide, W., in Graefe, U. (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488. | Westheide, W., in Müller, M. C. (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267. | “ | (10) | Chapters C.27, C.28, C.29 and C.30 are added: | ‘C.27 SEDIMENT-WATER CHIRONOMID TOXICITY TEST USING SPIKED SEDIMENT | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 218 (2004). This Test Method is designed to assess the effects of prolonged exposure of chemicals to the sediment-dwelling larvae of the freshwater dipteran Chironomus sp. It is based on existing toxicity test protocols for Chironomus riparius and Chironomus tentans which have been developed in Europe (1)(2)(3) and North America (4)(5)(6)(7)(8) and ring-tested (1)(6)(9). Other well documented chironomid species may also be used, e.g. Chironomus yoshimatsui (10)(11). | 2. | The exposure scenario used in this Test Method is spiking of sediment with the test substance. The selection of the appropriate exposure scenario depends on the intended application of the test. The scenario of spiking sediment is intended to simulate accumulated levels of chemicals persisting in the sediment. This exposure system involves spiking sediment of a sediment-water test system. | 3. | Substances that need to be tested towards sediment-dwelling organisms usually persist in this compartment over long time periods. The sediment-dwelling organisms may be exposed via a number of routes. The relative importance of each exposure route, and the time taken for each to contribute to the overall toxic effects, is dependent on the physical-chemical properties of the chemical concerned. For strongly adsorbing substances (e.g. with log Kow > 5) or for substances covalently binding to sediment, ingestion of contaminated food may be a significant exposure route. In order not to underestimate the toxicity of highly lipophilic substances, the use of food added to the sediment before application of the test substance may be considered. In order to take all potential routes of exposure into account the focus of this Test Method is on long-term exposure. The test duration is in the range of 20-28 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and 28-65 days for C. tentans. If short-term data are required for a specific purpose, for example to investigate the effects of an unstable chemical, additional replicates may be removed after a 10-day period. | 4. | The measured endpoints are the total number of adults emerged and the time to emergence. It is recommended that measurements of larval survival and growth should only be made after a 10-day period if additional short-term data are required, using additional replicates as appropriate. | 5. | The use of formulated sediment is recommended. Formulated sediment has several advantages over natural sediments: | — | the experimental variability is reduced because it forms a reproducible “standardised matrix” and the need to find uncontaminated and clean sediment sources is eliminated; | — | the tests can be initiated at any time without encountering seasonal variability in the test sediment and there is no need to pre-treat the sediment to remove indigenous fauna; the use of formulated sediment also reduces the cost associated with the field collection of sufficient amounts of sediment for routine testing; | — | the use of formulated sediment allows for comparisons of toxicity and ranking substances accordingly. | 6. | Definitions used are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 7. | First instar chironomid larvae are exposed to a concentration range of the test chemical in sediment — water systems. The test substance is spiked into the sediment and first instar larvae are subsequently introduced into test beakers in which the sediment and water concentrations have been stabilised. Chironomid emergence and development rate is measured at the end of the test. Larval survival and weight may also be measured after 10 days if required (using additional replicates as appropriate). These data are analysed either by using a regression model in order to estimate the concentration that would cause × % reduction in emergence or larval survival or growth (e.g. EC15, EC50 etc.), or by using statistical hypothesis testing to determine a NOEC/LOEC. The latter requires comparison of effect values with control values using statistical tests. | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 8. | The water solubility of the test substance, its vapour pressure, measured or calculated partitioning into sediment and stability in water and sediment should be known. A reliable analytical method for the quantification of the test substance in overlying water, pore water and sediment with known and reported accuracy and limit of detection should be available. Useful information includes the structural formula and purity of the test substance. Chemical fate of the test substance (e.g. dissipation, abiotic and biotic degradation, etc.) also is useful information. Further guidance for testing substances with physical-chemical properties that make them difficult to perform the test is provided in (12) | REFERENCE CHEMICALS | 9. | Reference chemicals may be tested periodically as a means of assuring that the test protocol and test conditions are reliable. Examples of reference toxicants used successfully in ring-tests and validation studies are: lindane, trifluralin, pentachlorophenol, cadmium chloride and potassium chloride (1)(2)(5)(6)(13). | VALIDITY OF THE TEST | 10. | For the test to be valid the following conditions apply: | — | the emergence in the controls must be at least 70 % at the end of the test. (1)(6); | — | C. riparius and C. yoshimatsui emergence to adults from control vessels should occur between 12 and 23 days after their insertion into the vessels; for C. tentans, a period of 20 to 65 days is necessary. | — | at the end of the test, pH and the dissolved oxygen concentration should be measured in each vessel. The oxygen concentration should be at least 60 per cent of the air saturation value (ASV) at the temperature used, and the pH of overlying water should be in the 6-9 range in all test vessels; | — | the water temperature should not differ by more than ± 1,0 °C. The water temperature could be controlled by isothermal room and in that case the room temperature should be confirmed in an appropriate time interval. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test vessels | 11. | The study is conducted in glass 600 ml beakers measuring 8 cm in diameter. Other vessels are suitable, but they should guarantee a suitable depth of overlying water and sediment. The sediment surface should be sufficient to provide 2 to 3 cm2 per larvae. The ratio of the depth of the sediment layer to the depth of the overlying water should be 1:4. Test vessels and other apparatus that will come into contact with the test system should be made entirely of glass or other chemically inert material (e.g. Teflon). | Selection of species | 12. | The species to be used in the test is preferably Chironomus riparius. Chironomus tentans is also suitable but more difficult to handle and requires a longer test period. Chironomus yohimatsui may also be used. Details of culture methods are given in Appendix 2 for Chironomus riparius. Information on culture conditions is also available for other species, i.e. Chironomus tentans (4) and Chironomus yoshimatsui (11). Identification of species must be confirmed before testing but is not required prior to every test if organisms come from an in-house culture. | Sediment | 13. | Formulated sediment (also called reconstituted, artificial or synthetic sediment) should preferably be used. However, if natural sediment is used, it should be characterised (at least pH, organic carbon content, determination of other parameters such as C/N ratio and granulometry are also recommended), and it should be free from any contamination and other organisms that might compete with, or consume the chironomids. It is also recommended that, before it is used in a chironomid toxicity test, the natural sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. The following formulated sediment, based on the artificial soil used in Test Method C.8 (14), is recommended for use in this test (1)(15)(16): | (a) | 4-5 % (dry weight) peat: as close to pH 5,5 to 6,0 as possible; it is important to use peat in powder form, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and only air dried. | (b) | 20 % (dry weight) kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %). | (c) | 75-76 % (dry weight) quartz sand (fine sand should predominate with more than 50 per cent of the particles between 50 and 200 μm). | (d) | Deionised water is added to obtain moisture content of the final mixture in a range of 30-50 %. | (e) | Calcium carbonate of chemically pure quality (CaCO3) is added to adjust the pH of the final mixture of the sediment to 7,0 ± 0,5. Organic carbon content of the final mixture should be 2 % (± 0,5 %) and is to be adjusted by the use of appropriate amounts of peat and sand, according to (a) and (c). | 14. | The source of peat, kaolin clay and sand should be known. The sediment components should be checked for the absence of chemical contamination (e.g. heavy metals, organochlorine compounds, organophosphorous compounds, etc.). An example for the preparation of the formulated sediment is described in Appendix 3. Mixing of dry constituents is also acceptable if it is demonstrated that after addition of overlying water a separation of sediment constituents (e.g. floating of peat particles) does not occur, and that the peat or the sediment is sufficiently conditioned. | Water | 15. | Any water which conforms to the chemical characteristics of acceptable dilution water as listed in Appendices 2 and 4 is suitable as test water. Any suitable water, natural water (surface or ground water), reconstituted water (see Appendix 2) or dechlorinated tap water are acceptable as culturing water and test water if chironomids will survive in it for the duration of the culturing and testing without showing signs of stress. At the start of the test, the pH of the test water should be between 6 and 9 and the total hardness not higher than 400 mg/l as CaCO3. However, if there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 must not be used in this situation). The same type of water should be used throughout the whole study. The water quality characteristics listed in Appendix 4 should be measured at least twice a year or when it is suspected that these characteristics may have changed significantly. | Stock solutions — Spiked sediments | 16. | Spiked sediments of the chosen concentration are usually prepared by addition of a solution of the test substance directly to the sediment. A stock solution of the test substance dissolved in deionised water is mixed with the formulated sediment by rolling mill, feed mixer or hand mixing. If poorly soluble in water, the test substance can be dissolved in as small a volume as possible of a suitable organic solvent (e.g. hexane, acetone or chloroform). This solution is then mixed with 10 g of fine quartz sand for one test vessel. The solvent is allowed to evaporate and it has to be totally removed from sand; the sand is then mixed with the suitable amount of sediment per test beaker. Only agents which volatilise readily can be used to solubilise, disperse or emulsify the test substance. It should be born in mind that the sand provided by the test substance and sand mixture, has to be taken into account when preparing the sediment (i.e. the sediment should thus be prepared with less sand). Care should be taken to ensure that the test substance added to sediment is thoroughly and evenly distributed within the sediment. If necessary, subsamples can be analysed to determine degree of homogeneity. | TEST DESIGN | 17. | The test design relates to the selection of the number and spacing of the test concentrations, the number of vessels at each concentration and the number of larvae per vessel. Designs for EC point estimation, for estimation of NOEC, and for conducting a limit test are described. | Design for analysis by regression | 18. | The effect concentration (e.g. EC15, EC50) and the concentration range, over which the effect of the test substance is of interest, should be spanned by the concentrations included in the test. Generally, the accuracy and especially validity, with which estimates of effect concentrations (ECx) can be made, is improved when the effect concentration is within the range of concentrations tested. Extrapolating much below the lowest positive concentration or above the highest concentration should be avoided. A preliminary range-finding test is helpful for selecting the range of concentrations to be used (see paragraph 27). | 19. | If the ECx is to be estimated, at least five concentrations and three replicates for each concentration should be tested. In any case, it is advisable that sufficient test concentrations are used to allow good model estimation. The factor between concentrations should not be greater than two (an exception could be made in cases when the dose response curve has a shallow slope). The number of replicates at each treatment can be reduced if the number of test concentrations with different responses is increased. Increasing the number of replicates or reducing the size of the test concentration intervals tends to lead to narrower confidence intervals for the test. Additional replicates are required if 10-day larval survival and growth are to be estimated. | Design for estimation of a NOEC/LOEC | 20. | If the LOEC or NOEC are to be estimated, five test concentrations with at least four replicates should be used and the factor between concentrations should not be greater than two. The number of replicates should be sufficient to ensure adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (p = 0,05). With the development rate, an Analysis of Variance (ANOVA) is usually appropriate, such as Dunnett-test and Williams-test (17)(18)(19)(20). In the emergence ratio the Cochran-Armitage, Fisher’s exact (with Bonferroni correction), or Mantel-Haenszel tests may be used. | Limit test | 21. | A limit test may be performed (one test concentration and control) if no effects were seen in the preliminary range-finding test. The purpose of the limit test is to perform a test at a concentration sufficiently high to enable decision makers to exclude possible toxic effects of the test substance, and the limit is set at a concentration which is not expected to appear in any situation. 1 000 mg/kg (dry weight) is recommended. Usually, at least six replicates for both the treatment and control are necessary. Adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (p = 0,05) should be demonstrated. With metric response (development rate and weight), the t-test is a suitable statistical method if data meet the requirements of this test (normality, homogeneous variances). The unequal-variance t-test or a non parametric test, such as the Wilcoxon-Mann-Whithey test may be used, if these requirements are not fulfilled. With the emergence ratio, the Fisher exact test is appropriate. | PROCEDURE | Conditions of exposure | Preparation of spiked sediment — water system | 22. | The spiking procedure described in Test Method C.8: Toxicity for Earthworms is recommended for application of the test substance (14). The spiked sediments are placed in the vessels and overlying water is added to produce a sediment-water volume ratio of 1:4 (see paragraphs 11 and 15). The depth of the sediment layer should be in the range of 1,5-3 cm. To avoid separation of sediment ingredients and re-suspension of fine material during addition of test water in the water column, the sediment can be covered with a plastic disc while water is poured onto it, and the disc removed immediately afterwards. Other devices may also be appropriate. | 23. | The test vessels should be covered (e.g. by glass plates). If necessary, during the study the water levels will be topped to the original volume in order to compensate for water evaporation. This should be performed using distilled or deionised water to prevent build-up of salts. | Stabilisation | 24. | Once the spiked sediment with overlying water has been prepared, it is desirable to allow partitioning of the test substance from the aqueous phase to the sediment (3)(4)(6)(13). This should preferably be done under the conditions of temperature and aeration used in the test. Appropriate equilibration time is sediment and chemical specific, and can be in the order of hours to days and in rare cases up to several weeks (4-5 weeks). As this would leave time for degradation of many chemicals, equilibrium is not awaited but an equilibration period of 48 hours is recommended. At the end of this further equilibration period, the concentration of the test substance should be measured in the overlying water, the pore water and the sediment, at least at the highest concentration and a lower one (see paragraph 38). These analytical determinations of the test substance allow for calculation of mass balance and expression of results based on measured concentrations. | Addition of test organisms | 25. | Four to five days before adding the test organisms to the test vessels, egg masses should be taken from the cultures and placed in small vessels in culture medium. Aged medium from the stock culture or freshly prepared medium may be used. If the latter is used, a small amount of food e.g. green algae and/or a few droplets of filtrate from a finely ground suspension of flaked fish food should be added to the culture medium (see Appendix 2). Only freshly laid egg masses should be used. Normally, the larvae begin to hatch a couple of days after the eggs are laid (2 to 3 days for Chironomus riparius at 20 °C and 1 to 4 days for Chironomus tentans at 23 °C and Chironomus yoshimatui at 25 °C) and larval growth occurs in four instars, each of 4-8 days duration. First instar larvae (2-3 or 1-4 days post hatching) should be used in the test. The instar of midges can possibly be checked using head capsule width (6). | 26. | Twenty first instar larvae are allocated randomly to each test vessel containing the spiked sediment and water, using a blunt pipette. Aeration of the water has to be stopped while adding the larvae to test vessels and remain so for another 24 hours after addition of larvae (see paragraphs 25 and 32). According to the test design used (see paragraphs 19 and 20), the number of larvae used per concentration is at least 60 for the EC point estimation and 80 for determination of NOEC. | Test concentrations | 27. | A range-finding test may be helpful to determine the range of concentrations for the definitive test. For this purpose a series of widely spaced concentrations of the test substance are used. In order to provide the same density of surface per chironomids, which is to be used for the definitive test, chironomids are exposed to each concentration of the test substance for a period which allows estimation of appropriate test concentrations, and no replicates are required. | 28. | The test concentrations for the definitive test are decided based on the result of the range-finding test. At least five concentrations should be used and selected as described in paragraphs 18 to 20. | Controls | 29. | Control vessels without any test substance but including sediment should be included in the test with the appropriate number of replicates (see paragraphs 19-20). If a solvent has been used for application of test substance (see paragraph 16), a sediment solvent control should be added. | Test system | 30. | Static systems are used. Semi-static or flow-through systems with intermittent or continuous renewal of overlying water might be used in exceptional cases as for instance if water quality specifications become inappropriate for the test organism or affect chemical equilibrium (e.g. dissolved oxygen levels fall too low, the concentration of excretory products rises too high or minerals leach from sediment and affect pH and/or water hardness). However, other methods for ameliorating the quality of overlying water, such as aeration, will normally suffice and be preferable. | Food | 31. | It is necessary to feed the larvae, preferably daily or at least three times per week. Fish-food (a suspension in water or finely ground food, e.g. TetraMin or TetraPhyll; see details in Appendix 2) in the amount of 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg for C. yoshimatui) per larvae per day seems adequate for young larvae for the first 10 days. Slightly more food may be necessary for older larvae: 0,5-1 mg per larvae per day should be sufficient for the rest of the test. The food ration should be reduced in all treatments and control if fungal growth is seen or if mortality is observed in controls. If fungal development cannot be stopped the test is to be repeated. When testing strongly adsorbing substances (e.g. with log Kow > 5), or substances covalently binding to sediment, the amount of food necessary to ensure survival and natural growth of the organisms may be added to the formulated sediment before the stabilisation period. For this, plant material must be used instead of fish food, e.g. addition of 0,5 % (dry weight) finely ground leaves of e.g. stinging nettle (Urtica dioica), mulberry (Morus alba), white clover (Trifolium repens), spinach (Spinacia oleracea) or of other plant material (Cerophyl or alpha-cellulose) may be used. | Incubation conditions | 32. | Gentle aeration of the overlying water in test vessels is supplied preferably 24 hours after addition of the larvae and is pursued throughout the test (care should be taken that dissolved oxygen concentration does not fall below 60 per cent of ASV). Aeration is provided through a glass Pasteur pipette fixed 2-3 cm above the sediment layer (i.e. one or few bubbles/sec). When testing volatile chemicals, consideration may be given not to aerate the sediment-water system. | 33. | The test is conducted at a constant temperature of 20 °C (± 2 °C). For C. tentans and C. yoshimatui recommended temperatures are 23 °C and 25 °C (± 2 °C), respectively. A 16 hours photoperiod is used and the light intensity should be 500 to 1 000 lux. | Exposure duration | 34. | The exposure commences with the addition of larvae to the spiked and control vessels. The maximum exposure duration is 28 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and 65 days for C. tentans. If midges emerge earlier, the test can be terminated after a minimum of five days after emergence of the last adult in the control. | Observations | Emergence | 35. | The development time and the total number of fully emerged male and female midges are determined. Males are easily identified by their plumose antennae. | 36. | The test vessels should be observed at least three times per week to make visual assessment of any abnormal behaviour (e.g. leaving sediment, unusual swimming), compared with the control. During the period of expected emergence a daily count of emerged midges is necessary. The sex and number of fully emerged midges are recorded daily. After identification the midges are removed from the vessels. Any egg masses deposited prior to the termination of the test should be recorded and then removed to prevent re-introduction of larvae into the sediment. The number of visible pupae that have failed to emerge is also recorded. Guidance on measurement of emergence is provided in Appendix 5. | Growth and survival | 37. | If data on 10-day larval survival and growth are to be provided, additional test vessels should be included at the start, so that they may be used subsequently. The sediment from these additional vessels is sieved using a 250 μm sieve to retain the larvae. Criteria for death are immobility or lack of reaction to a mechanical stimulus. Larvae not recovered should also be counted as dead (larvae which have died at beginning of the test may have been degraded by microbes). The (ash free) dry weight of the surviving larvae per test vessel is determined and the mean individual dry weight per vessel calculated. It is useful to determine which instar the surviving larvae belong to; for that measurement of the width of the head capsule of each individual can be used. | Analytical measurements | Concentration of the test substance | 38. | Prior to test commencement (i.e. addition of larvae), samples of bulk sediment are removed from at least one vessel per treatment for the analytical determination of the test substance concentration in the sediment. It is recommended that, as a minimum, samples of the overlying water, the pore water and the sediment be analysed at the start (see paragraph 24) and at the end of the test, at the highest concentration and a lower one. These determinations of test substance concentration inform about the behaviour/partitioning of the test substance in the water-sediment system. | 39. | When intermediate measurements are made (e.g. at day 7) and if the analysis needs large samples which cannot be taken from test vessels without influencing the test system, analytical determinations should be performed on samples from additional test vessels treated in the same way (including the presence of test organisms) but not used for biological observations. | 40. | Centrifugation at e.g. 10 000 g and 4 °C for 30 min. is the recommended procedure to isolate interstitial water. However, if the test substance is demonstrated not to adsorb to filters, filtration may also be acceptable. In some cases it might not be possible to analyse concentrations in the pore water as the sample size is too small. | Physical-chemical parameters | 41. | pH and temperature of the test vessels should be measured in an appropriate manner (see paragraph 10). Hardness and ammonia should be measured in the controls and one test vessel at the highest concentration at the start and the end of the test. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 42. | The purpose of this test is to determine the effect of the test substance on the development rate and the total number of fully emerged male and female midges, or in the case of the 10-day test effects on survival and weight of the larvae. If there are no indications of statistically different sensitivities of sexes, male and female results may be pooled for statistical analyses. The sensitivity differences between sexes can be statistically judged by e.g. a χ2-r × 2 table test. Larval survival and mean individual dry weight per vessel must be determined after 10 days where required. | 43. | Effect concentrations expressed and based on dry weight, are calculated preferably based on measured sediment concentrations at the beginning of the test (see paragraph 38). | 44. | To compute a point estimate for the EC50 or any other ECx, the per-vessel statistics may be used as true replicates. In calculating a confidence interval for any ECx the variability among vessels should be taken into account, or it should be shown that this variability is so small that it can be ignored. When the model is fitted by Least Squares, a transformation should be applied to the per-vessel statistics in order to improve the homogeneity of variance. However, ECx values should be calculated after the response is transformed back to the original value. | 45. | When the statistical analysis aims at determining the NOEC/LOEC by hypothesis testing, the variability among vessels needs to be taken into account, e.g. by a nested ANOVA. Alternatively, more robust tests (21) can be appropriate in situations where there are violations of the usual ANOVA assumptions. | Emergence ratio | 46. | Emergence ratios are quantal data, and can be analyzed by the Cochran-Armitage test applied in step-down manner where a monotonic dose-response is expected and these data are consistent with this expectation. If not, a Fisher’s exact or Mantel-Haenszel test with Bonferroni-Holm adjusted p-values can be used. If there is evidence of greater variability between replicates within the same concentration than a binomial distribution would indicate (often referenced as “extra-binomial” variation), then a robust Cochran-Armitage or Fisher exact test such as proposed in (21), should be used. | The sum of midges emerged per vessel, ne, is determined and divided by the number of larvae introduced, na: | where: | ER | = | emergence ratio | ne | = | number of midges emerged per vessel | na | = | number of larvae introduced per vessel | 47. | An alternative that is most appropriate for large sample sizes, when there is extra binomial variance, is to treat the emergence ratio as a continuous response and use procedures such as William’s test when a monotonic dose-response is expected and is consistent with these ER data. Dunnett’s test would be appropriate where monotonicity does not hold. A large sample size is defined here as the number emerged and the number not emerging both exceeding five, on a per replicate (vessel) basis. | 48. | To apply ANOVA methods values of ER should first be transformed by the arcsin-sqrt-transformation or Freeman-Tukey transformation to obtain an approximate normal distribution and to equalise variances. The Cochran-Armitage, Fisher’s exact (Bonferroni), or Mantel-Haenszel tests can be applied when using the absolute frequencies. The arcsin-sqrt transformation is applied by taking the inverse sine (sin-1) of the square root of ER. | 49. | For emergence ratios, ECx-values are calculated using regression analysis (or e.g. probit (22), logit, Weibull, appropriate commercial software etc.). If regression analysis fails (e.g. when there are less than two partial responses), other non-parametric methods such as moving average or simple interpolation are used. | Development rate | 50. | The mean development time represents the mean time span between the introduction of larvae (day 0 of the test) and the emergence of the experimental cohort of midges. (For the calculation of the true development time, the age of larvae at the time of introduction should be considered). The development rate is the reciprocal of the development time (unit: 1/day) and represents that portion of larval development which takes place per day. The development rate is preferred for the evaluation of these sediment toxicity studies as its variance is lower, and it is more homogeneous and closer to normal distribution as compared to development time. Hence, powerful parametric test procedures may be used with development rate rather than with development time. For development rate as a continuous response, ECx-values can be estimated by using regression analysis (e.g. (23), (24)). | 51. | For the following statistical tests, the number of midges observed on inspection day × are assumed to be emerged at the mean of the time interval between day x and day x – l (l = length of the inspection interval, usually 1 day). The mean development rate per vessel (x) is calculated according to: | where: | : | mean development rate per vessel | i | : | index of inspection interval | m | : | maximum number of inspection intervals | : | number of midges emerged in the inspection interval i | ne | : | total number of midges emerged at the end of experiment (= | ) | xi | : | development rate of the midges emerged in interval i | where: | dayi | : | inspection day (days since application) | li | : | length of inspection interval i (days, usually 1 day) | Test report | 52. | The test report must at least provide the following information: | | Test substance: | — | physical nature and, where relevant, physical-chemical properties (water solubility, vapour pressure, partition coefficient in soil (or in sediment if available), stability in water, etc.); | — | chemical identification data (common name, chemical name, structural formula, CAS number, etc.) including purity and analytical method for quantification of test substance. | | Test species: | — | test animals used: species, scientific name, source of organisms and breeding conditions; | — | information on handling of egg masses and larvae; | — | age of test animals when inserted into test vessels. | | Test conditions: | — | sediment used, i.e. natural or formulated sediment; | — | for natural sediment, location and description of sediment sampling site, including, if possible, contamination history; characteristics: pH, organic carbon content, C/N ratio and granulometry (if appropriate). | — | preparation of the formulated sediment: ingredients and characteristics (organic carbon content, pH, moisture, etc. at the start of the test); | — | preparation of the test water (if reconstituted water is used) and characteristics (oxygen concentration, pH, conductivity, hardness, etc. at the start of the test); | — | depth of sediment and overlying water; | — | volume of overlying and pore water; weight of wet sediment with and without pore water; | — | test vessels (material and size); | — | method of spiking sediment: test concentrations used, number of replicates and use of solvent if any; | — | stabilisation equilibrium phase of the spiked sediment-water system: duration and conditions; | — | incubation conditions: temperature, light cycle and intensity, aeration (frequency and intensity); | — | detailed information on feeding including type of food, preparation, amount and feeding regime. | | Results: | — | the nominal test concentrations, the measured test concentrations and the results of all analyses to determine the concentration of the test substance in the test vessel; | — | water quality within the test vessels, i.e. pH, temperature, dissolved oxygen, hardness and ammonia; | — | replacement of evaporated test water, if any; | — | number of emerged male and female midges per vessel and per day; | — | number of larvae which failed to emerge as midges per vessel; | — | mean individual dry weight of larvae per vessel, and per instar, if appropriate; | — | percent emergence per replicate and test concentration (male and female midges pooled); | — | mean development rate of fully emerged midges per replicate and treatment rate (male and female midges pooled); | — | estimates of toxic endpoints e.g. ECx (and associated confidence intervals), NOEC and/or LOEC,, and the statistical methods used for their determination; | — | discussion of the results, including any influence on the outcome of the test resulting from deviations from this Test Method. | LITERATURE: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. | (10) | Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. | (11) | Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. | (12) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Test Method C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms. | (15) | Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. | (16) | Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. | (17) | Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. | (18) | Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. | (19) | Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. | (20) | Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. | (21) | Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. | (22) | Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. | (23) | Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. | (24) | Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. | Appendix 1 | DEFINITIONS | For the purpose of this Test Method the following definitions are used: | Formulated sediment or reconstituted, artificial or synthetic sediment, is a mixture of materials used to mimic the physical components of a natural sediment. | Overlying water is the water placed over sediment in the test vessel. | Interstitial water or pore water is the water occupying space between sediment and soil particles. | Spiked sediment is sediment to which test substance has been added. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Recommendations for culture of Chironomus riparius | 1. | Chironomus larvae may be reared in crystallising dishes or larger containers. Fine quartz sand is spread in a thin layer of about 5 to 10 mm deep over the bottom of the container. Kieselguhr (e.g. Merck, Art 8117) has also been shown to be a suitable substrate (a thinner layer of up to a very few mm is sufficient). Suitable water is then added to a depth of several cm. Water levels should be topped up as necessary to replace evaporative loss, and prevent desiccation. Water can be replaced if necessary. Gentle aeration should be provided. The larval rearing vessels should be held in a suitable cage which will prevent escape of the emerging adults. The cage should be sufficiently large to allow swarming of emerged adults, otherwise copulation may not occur (minimum is ca. 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Cages should be held at room temperature or in a constant environment room at 20 ± 2 °C with a photo period of 16 hour light (intensity ca. 1 000 lux), 8 hours dark. It has been reported that air humidity of less than 60 % RH can impede reproduction. | Dilution water | 3. | Any suitable natural or synthetic water may be used. Well water, dechlorinated tap water and artificial media (e.g. Elendt “M4” or “M7” medium, see below) are commonly used. The water has to be aerated before use. If necessary, the culture water may be renewed by pouring or siphoning the used water from culture vessels carefully without destroying the tubes of larvae. | Feeding larvae | 4. | Chironomus larvae should be fed with a fish flake food (TetraMin® TetraPhyll® or other similar brand of proprietary fish food), at approximately 250 mg per vessel per day. This can be given as a dry ground powder or as a suspension in water: 1,0 g of flake food is added to 20 ml of dilution water and blended to give a homogenous mix. This preparation may be fed at a rate of about 5 ml per vessel per day (shake before use). Older larvae may receive more. | 5. | Feeding is adjusted according to the water quality. If the culture medium becomes “cloudy”, the feeding should be reduced. Food additions must be carefully monitored. Too little food will cause emigration of the larvae towards the water column, and too much food will cause increased microbial activity and reduced oxygen concentrations. Both conditions can result in reduced growth rates. | 6. | Some green algae (e.g. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) cells may also be added when new culture vessels are set up. | Feeding emerged adults | 7. | Some experimenters have suggested that a cotton wool pad soaked in a saturated sucrose solution may serve as a food for emerged adults. | Emergence | 8. | At 20 ± 2 °C adults will begin to emerge from the larval rearing vessels after approximately 13-15 days. Males are easily distinguished by having plumose antennae. | Egg masses | 9. | Once adults are present within the breeding cage, all larval rearing vessels should be checked three times weekly for deposition of the gelatinous egg masses. If present, the egg masses should be carefully removed. They should be transferred to a small dish containing a sample of the breeding water. Egg masses are used to start a new culture vessel (e.g. 2-4 egg masses/vessel) or are used for toxicity tests. | 10. | First instar larvae should hatch after 2-3 days. | Set-up of new culture vessels | 11. | Once cultures are established it should be possible to set up a fresh larval culture vessel weekly or less frequently depending on testing requirements, removing the older vessels after adult midges have emerged. Using this system a regular supply of adults will be produced with a minimum of management. | Preparation of test solutions “M4” and “M7” | 12. | Elendt (1990) has described the “M4” medium. The “M7” medium is prepared as the “M4” medium except for the substances indicated in Table 1, for which concentrations are four times lower in “M7” than in “M4”. A publication on the “M7” medium is in preparation (Elendt, personal communication). The test solution should not be prepared according to Elendt and Bias (1990) for the concentrations of NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 and K2HPO4 given for the preparation of the stock solutions are not adequate. | Preparation of the “M7”-medium | 13. | Each stock solution (I) is prepared individually and a combined stock solution (II) is prepared from these stock solutions (I) (see Table 1). Fifty ml from the combined stock Solution (II) and the amounts of each macro nutrient stock solution which are given in Table 2 are made up to 1 litre of deionised water to prepare the “M7” medium. A vitamin stock solution is prepared by adding three vitamins to deionised water as indicated in Table 3, and 0,1 ml of the combined vitamin stock solution are added to the final “M7” medium shortly before use. (The vitamin stock solution is stored frozen in small aliquots). The medium is aerated and stabilised. | LITERATURE: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. | Table 1 | Stock solutions of trace elements for medium M4 and M7 | Stock solutions (I) | Amount (mg) made up to 1 litre of deionised water | To prepare the combined stock solution (II): mix the following amounts (ml) of stock solutions (I) and make up to 1 litre of deionised water | Final concentrations in test solutions (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (8) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (8) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (8) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (8) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (8) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (8) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (8) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (8) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (8) (9) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (8) (9) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Table 2 | Macro nutrient stock solutions for medium M4 and M7 | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of macro nutrient stock solutions added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Table 3 | Vitamin stock solution for medium M4 and M7. All three vitamin solutions are combined to make a single vitamin stock solution | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of vitamin stock solution added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | Thiamine hydrochloride | 750 | 0,1 | 0,075 | Cyanocobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotine | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | LITERATURE: | Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. | Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. | Appendix 3 | PREPARATION OF FORMULATED SEDIMENT | Sediment composition | The composition of the formulated sediment should be as follows: | Constituent | Characteristics | % of sediment | dry weight | Peat | Sphagnum moss peat, as close to pH 5,5-6,0 as possible, no visible plant remains, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and air dried | 4-5 | Quartz sand | Grain size: > 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm | 75-76 | Kaolinite clay | Kaolinite content ≥ 30 % | 20 | Organic carbon | Adjusted by addition of peat and sand | 2 (± 0,5) | Calcium carbonate | CaCO3, pulverised, chemically pure | 0,05-0,1 | Water | Conductivity ≤ 10 μS/cm | 30-50 | Preparation | The peat is air dried and ground to a fine powder. A suspension of the required amount of peat powder in deionised water is prepared using a high-performance homogenising device. The pH of this suspension is adjusted to 5,5 ± 0,5 with CaCO3. The suspension is conditioned for at least two days with gentle stirring at 20 ± 2 °C, to stabilise pH and establish a stable microbial component. pH is measured again and should be 6,0 ± 0,5. Then the peat suspension is mixed with the other constituents (sand and kaolin clay) and deionised water to obtain a homogeneous sediment with a water content in a range of 30-50 per cent of dry weight of the sediment. The pH of the final mixture is measured once again and is adjusted to 6,5 to 7,5 with CaCO3 if necessary. Samples of the sediment are taken to determine the dry weight and the organic carbon content. Then, before it is used in the chironomid toxicity test, it is recommended that the formulated sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. | Storage | The dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored in a dry and cool place at room temperature. The formulated (wet) sediment should not be stored prior to its use in the test. It should be used immediately after the 7 days conditioning period that ends its preparation. | LITERATURE: | Chapter C.8 of this Annex. Toxicity for Earthworms. | Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. | Appendix 4 | Chemical Characteristics of an Acceptable Dilution Water | Substance | Concentrations | Particulate matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2 mg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Hardness as CaCO3 | < 400 mg/l (*3) | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorus pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | Appendix 5 | Guidance for monitoring emergence of chironomid larvae | Emergence traps are placed on the test beakers. These traps are needed from day 20 to the end of the test. Example of trap used is drawn below: | C. 28. SEDIMENT-WATER CHIRONOMID TOXICITY TEST USING SPIKED WATER | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD TG 219 (2004). This Test Method is designed to assess the effects of prolonged exposure of chemicals to the sediment-dwelling larvae of the freshwater dipteran Chironomus sp. It is mainly based on the BBA guideline using a sediment-water test system with artificial soil, and water column exposure scenario (1). It also takes into account existing toxicity test protocols for Chironomus riparius and Chironomus tentans which have been developed in Europe and North America (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) and ring-tested (1)(6)(9). Other well documented chironomid species may also be used, e.g. Chironomus yoshimatsui (10)(11). | 2. | The exposure scenario used in this Test Method is water spiking. The selection of the appropriate exposure scenario depends on the intended application of the test. The water exposure scenario, involving spiking of the water column, is intended to simulate a pesticide spray drift event and covers the initial peak of concentrations in pore water. It is also useful for other types of exposure (including chemical spills) except accumulation processes lasting longer than the test period. | 3. | Substances that need to be tested towards sediment-dwelling organisms usually persist in this compartment over long time periods. The sediment-dwelling organisms may be exposed via a number of routes. The relative importance of each exposure route, and the time taken for each to contribute to the overall toxic effects, is dependent on the physical-chemical properties of the chemical concerned. For strongly adsorbing substances (e.g. with log Kow > 5) or for substances covalently binding to sediment, ingestion of contaminated food may be a significant exposure route. In order not to underestimate the toxicity of highly lipophilic substances, the use of food added to the sediment before application of the test substance may be considered. In order to take all potential routes of exposure into account the focus of this Test Method is on long-term exposure. The test duration is in the range of 20-28 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and 28-65 days for C. tentans. If short-term data are required for a specific purpose, for example to investigate the effects of unstable chemicals, additional replicates may be removed after a 10-day period. | 4. | The measured endpoints are the total number of adults emerged and the time to emergence. It is recommended that measurements of larval survival and growth should only be made after a 10-day period if additional short-term data are required, using additional replicates as appropriate. | 5. | The use of formulated sediment is recommended. Formulated sediment has several advantages over natural sediments: | — | the experimental variability is reduced because it forms a reproducible “standardised matrix” and the need to find uncontaminated and clean sediment sources is eliminated; | — | the tests can be initiated at any time without encountering seasonal variability in the test sediment and there is no need to pre-treat the sediment to remove indigenous fauna; the use of formulated sediment also reduces the cost associated with the field collection of sufficient amounts of sediment for routine testing; | — | the use of formulated sediment allows for comparisons of toxicity and ranking substances accordingly: toxicity data from tests with natural and artificial sediments were comparable for several chemicals (2). | 6. | Definitions used are given in Appendix 1. | PRINCIPLE OF THE TEST | 7. | First instar chironomid larvae are exposed to a concentration range of the test substance in sediment-water systems. The test starts by placing first instar larvae into the test beakers containing the sediment-water system and subsequently spiking the test substance into the water. Chironomid emergence and development rate is measured at the end of the test. Larval survival and weight may also be measured after 10 days if required (using additional replicates as appropriate). These data are analysed either by using a regression model in order to estimate the concentration that would cause x % reduction in emergence, larvae survival or growth (e.g. EC15, EC50, etc.), or by using statistical hypothesis testing to determine a NOEC/LOEC. The latter requires comparison of effect values with control values using statistical tests. | INFORMATION ON THE TEST SUBSTANCE | 8. | The water solubility of the test substance, its vapour pressure, measured or calculated partitioning into sediment and stability in water and sediment should be known. A reliable analytical method for the quantification of the test substance in overlying water, pore water and sediment with known and reported accuracy and limit of detection should be available. Useful information includes the structural formula and purity of the test substance. Chemical fate of the test substance (e.g. dissipation, abiotic and biotic degradation, etc.) also is useful information. Further guidance for testing substances with physical-chemical properties that make them difficult to perform the test is provided in (12). | REFERENCE CHEMICALS | 9. | Reference chemicals may be tested periodically as a means of assuring that the test protocol and test conditions are reliable. Examples of reference toxicants used successfully in ring-tests and validation studies are: lindane, trifluralin, pentachlorophenol, cadmium chloride and potassium chloride. (1)(2)(5)(6)(13). | VALIDITY OF THE TEST | 10. | For the test to be valid the following conditions apply: | — | the emergence in the controls must be at least 70 % at the end of the test. (1)(6); | — | C. riparius and C. yoshimatsui emergence to adults from control vessels should occur between 12 and 23 days after their insertion into the vessels; for C. tentans, a period of 20 to 65 days is necessary. | — | at the end of the test, pH and the dissolved oxygen concentration should be measured in each vessel. The oxygen concentration should be at least 60 % of the air saturation value (ASV) at the temperature used, and the pH of overlying water should be in the 6-9 range in all test vessels; | — | the water temperature should not differ by more than ± 1,0 °C. The water temperature could be controlled by isothermal room and in that case the room temperature should be confirmed in an appropriate time intervals. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test vessels | 11. | The study is conducted in glass 600 ml beakers measuring 8 cm in diameter. Other vessels are suitable, but they should guarantee a suitable depth of overlying water and sediment. The sediment surface should be sufficient to provide 2 to 3 cm2 per larvae. The ratio of the depth of the sediment layer to the depth of the overlying water should be 1:4. Test vessels and other apparatus that will come into contact with the test system should be made entirely of glass or other chemically inert material (e.g. Teflon). | Selection of species | 12. | The species to be used in the test is preferably Chironomus riparius. Chironomus tentans is also suitable but more difficult to handle and requires a longer test period. Chironomus yohimatsui may also be used. Details of culture methods are given in Appendix 2 for Chironomus riparius. Information on culture conditions is also available for other species, i.e. Chironomus tentans (4) and Chironomus yoshimatsui (11). Identification of species must be confirmed before testing but is not required prior to every test if organisms come from an in-house culture. | Sediment | 13. | Formulated sediment (also called reconstituted, artificial or synthetic sediment) should preferably be used. However, if natural sediment is used, it should be characterised (at least pH, organic carbon content, determination of other parameters such as C/N ratio and granulometry are also recommended), and it should be free from any contamination and other organisms that might compete with, or consume the chironomids. It is also recommended that, before it is used in a chironomid toxicity test, the natural sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. The following formulated sediment, based on the artificial soil used in Test Method C.8 (14), is recommended for use in this test (1)(15)(16): | a) | 4-5 % (dry weight) peat: as close to pH 5,5 to 6,0 as possible; it is important to use peat in powder form, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and only air dried. | b) | 20 % (dry weight) kaolin clay (kaolinite content preferably above 30 %). | c) | 75-76 % (dry weight) quartz sand (fine sand should predominate with more than 50 % of the particles between 50 and 200 μm). | d) | Deionised water is added to obtain moisture of the final mixture in a range of 30-50 %. | e) | Calcium carbonate of chemically pure quality (CaCO3) is added adjust the pH of the final mixture of the sediment to 7,0 ± 0,5. | f) | Organic carbon content of the final mixture should be 2 % (± 0,5 %) and is to be adjusted by the use of appropriate amounts of peat and sand, according to (a) and (c). | 14. | The source of peat, kaolin clay and sand should be known. The sediment components should be checked for the absence of chemical contamination (e.g. heavy metals, organochlorine compounds, organophosphorous compounds, etc.). An example for the preparation of the formulated sediment is described in Appendix 3. Mixing of dry constituents is also acceptable if it is demonstrated that after addition of overlying water a separation of sediment constituents (e.g. floating of peat particles) does not occur, and that the peat or the sediment is sufficiently conditioned. | Water | 15. | Any water which conforms to the chemical characteristics of acceptable dilution water as listed in Appendices 2 and 4 is suitable as test water. Any suitable water, natural water (surface or ground water), reconstituted water (see Appendix 2) or dechlorinated tap water are acceptable as culturing water and test water if chironomids will survive in it for the duration of the culturing and testing without showing signs of stress. At the start of the test, the pH of the test water should be between 6 and 9 and the total hardness not higher than 400 mg/l as CaCO3. However, if there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 must not be used in this situation). The same type of water should be used throughout the whole study. The water quality characteristics listed in Appendix 4 should be measured at least twice a year or when it is suspected that these characteristics may have changed significantly. | Stock solutions — Spiked water | 16. | Test concentrations are calculated on the basis of water column concentrations, i.e. the water overlying the sediment. Test solutions of the chosen concentrations are usually prepared by dilution of a stock solution. Stock solutions should preferably be prepared by dissolving the test substance in test medium. The use of solvents or dispersants may be required in some cases in order to produce a suitably concentrated stock solution. Examples of suitable solvents are acetone, ethanol, methanol, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol dimethyl ether, dimethylformamide and triethylene glycol. Dispersants which may be used are Cremophor RH40, Tween 80, methylcellulose 0,01 % and HCO-40. The solubilising agent concentration in the final test medium should be minimal (i.e. ≤ 0,1 ml/l) and should be the same in all treatments. When a solubilising agent is used, it must have no significant effects on survival or no visible adverse effect on the chironomid larvae as revealed by a solvent-only control. However, every effort should be made to avoid the use of such materials. | TEST DESIGN | 17. | The test design relates to the selection of the number and spacing of the test concentrations, the number of vessels at each concentration and the number of larvae per vessel. Designs for EC point estimation, for estimation of NOEC, and for conducting a limit test are described. The analysis by regression is preferred to the hypothesis testing approach. | Design for analysis by regression | 18. | The effect concentration (e.g. EC15, EC50) and the concentration range, over which the effect of the test substance is of interest, should be spanned by the concentrations included in the test. Generally, the accuracy and especially validity, with which estimates of effect concentrations (ECx) can be made, is improved when the effect concentration is within the range of concentrations tested. Extrapolation much below the lowest positive concentration or above the highest concentration should be avoided. A preliminary range-finding test is helpful for selecting the range of concentrations to be used (see paragraph 27). | 19. | If the ECx is to be estimated, at least five concentrations and three replicates for each concentration should be tested. In any case, it is advisable that sufficient test concentrations are used to allow a good model estimation. The factor between concentrations should not be greater than two (an exception could be made in cases when the dose response curve has a shallow slope). The number of replicates at each treatment can be reduced if the number of test concentrations with different responses is increased. Increasing the number of replicates or reducing the size of the test concentration intervals tends to lead to narrower confidence intervals for the test. Additional replicates are required if 10-day larval survival and growth are to be estimated. | Design for estimation of a NOEC/LOEC | 20. | If the LOEC/NOEC are to be estimated, five test concentrations with at least four replicates should be used and the factor between concentrations should not be greater than two. The number of replicates should be sufficient to ensure adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (p = 0,05). With the development rate, an Analysis of Variance (ANOVA) is usually appropriate, such as Dunnett-test and Williams-test (17)(18)(19)(20). In the emergence ratio the Cochran-Armitage, Fisher’s exact (with Bonferroni correction), or Mantel-Haenszel tests may be used. | Limit test | 21. | A limit test may be performed (one test concentration and control) if no effects were seen in the preliminary range-finding test. The purpose of the limit test is to indicate that the toxic value of the test substance is greater than the limit concentration tested. No suggestion for a recommended concentration can be made in this Test Method; this is left to the regulators’ judgement. Usually, at least six replicates for both the treatment and control are necessary. Adequate statistical power to detect a 20 % difference from the control at the 5 % level of significance (p = 0,05) should be demonstrated. With metric response (development rate and weight), the t-test is a suitable statistical method if data meet the requirements of this test (normality, homogeneous variances). The unequal-variance t-test or a non parametric test, such as the Wilcoxon-Mann-Whithey test may be used, if these requirements are not fulfilled. With the emergence ratio, the Fisher exact test is appropriate. | PROCEDURE | Conditions of exposure | Preparation of spiked water-sediment system | 22. | Appropriate amounts of formulated sediment (see paragraphs 13-14 and Appendix 3) are added in the test vessels to form a layer of at least 1,5 cm. Water is added to a depth of 6 cm (see paragraph 15). The ratio of the depth of the sediment layer and the depth of the water should not exceed 1:4 and the sediment layer should not be deeper than 3 cm. The sediment-water system should be left under gentle aeration for seven days prior to addition of test organisms (see paragraph 14 and Appendix 3). To avoid separation of sediment ingredients and re-suspension of fine material during addition of test water in the water column, the sediment can be covered with a plastic disc while water is poured onto it, and the disc is removed immediately afterwards. Other devices may also be appropriate. | 23. | The test vessels should be covered (e.g. by glass plates). If necessary, during the study the water levels will be topped to the original volume in order to compensate for water evaporation. This should be performed using distilled or deionised water to prevent build-up of salts. | Addition of test organisms | 24. | Four to five days before adding the test organisms to the test vessels, egg masses should be taken from the cultures and placed in small vessels in culture medium. Aged medium from the stock culture or freshly prepared medium may be used. If the latter is used, a small amount of food e.g. green algae and/or a few droplets of filtrate from a finely ground suspension of flaked fish food should be added to the culture medium (see Appendix 2). Only freshly laid egg masses should be used. Normally, the larvae begin to hatch a couple of days after the eggs are laid (2 to 3 days for Chironomus riparius at 20 °C and 1 to 4 days for Chironomus tentans at 23 °C and Chironomus yoshimatui at 25 °C) and larval growth occurs in four instars, each of 4-8 days duration. First instar larvae (2-3 or 1-4 days post hatching) should be used in the test. The instar of midges can possibly be checked using head capsule width (6). | 25. | Twenty first instar larvae are allocated randomly to each test vessel containing the spiked sediment and water, using a blunt pipette. Aeration of the water has to be stopped while adding the larvae to test vessels and remain so for another 24 hours after addition of larvae (see paragraphs 24 and 32). According to the test design used (see paragraphs 19 and 20), the number of larvae used per concentration is at least 60 for the EC point estimation and 80 for determination of NOEC. | 26. | Twenty-four hours after adding the larvae, the test substance is spiked into the overlying water column, and slight aeration is again supplied. Small volumes of test substance solutions are applied below the surface of the water using a pipette. The overlying water should then be mixed with care not to disturb the sediment. | Test concentrations | 27. | A range-finding test may be helpful to determine the range of concentrations for the definitive test. For this purpose a series of widely spaced concentrations of the test substance are used. In order to provide the same density of surface per chironomids, which is to be used for the definitive test, chironomids are exposed to each concentration of the test substance for a period which allows estimation of appropriate test concentrations, and no replicates are required. | 28. | The test concentrations for the definitive test are decided based on the result of the range-finding test. At least five concentrations should be used and selected as described in paragraphs 18 to 20. | Controls | 29. | Control vessels without any test substance but including sediment should be included in the test with the appropriate number of replicates (see paragraphs 19-20). If a solvent has been used for application of test substance (see paragraph 16), a sediment solvent control should be added. | Test system | 30. | Static systems are used. Semi-static or flow-through systems with intermittent or continuous renewal of overlying water might be used in exceptional cases as for instance if water quality specifications become inappropriate for the test organism or affect chemical equilibrium (e.g. dissolved oxygen levels fall too low, the concentration of excretory products rises too high or minerals leach from sediment and affect pH and/or water hardness). However, other methods for ameliorating the quality of overlying water, such as aeration, will normally suffice and be preferable. | Food | 31. | It is necessary to feed the larvae, preferably daily or at least three times per week. Fish-food (a suspension in water or finely ground food, e.g. TetraMin or TetraPhyll; see details in Appendix 2) in the amount of 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg for C. yoshimatui) per larvae per day seems adequate for young larvae for the first 10 days. Slightly more food may be necessary for older larvae: 0,5-1 mg per larvae per day should be sufficient for the rest of the test. The food ration should be reduced in all treatments and control if fungal growth is seen or if mortality is observed in controls. If fungal development cannot be stopped the test is to be repeated. When testing strongly adsorbing substances (e.g. with log Kow > 5), or substances covalently binding to sediment, the amount of food necessary to ensure survival and natural growth of the organisms may be added to the formulated sediment before the stabilisation period. For this, plant material must be used instead of fish food, e.g. addition of 0,5 % (dry weight) finely ground leaves of e.g. stinging nettle (Urtica dioica), mulberry (Morus alba), white clover (Trifolium repens), spinach (Spinacia oleracea) or of other plant material (Cerophyl or alpha-cellulose) may be used. | Incubation conditions | 32. | Gentle aeration of the overlying water in test vessels is supplied preferably 24 hours after addition of the larvae and is pursued throughout the test (care should be taken that dissolved oxygen concentration does not fall below 60 %of ASV). Aeration is provided through a glass Pasteur pipette fixed 2-3 cm above the sediment layer (i.e. one or few bubbles/sec). When testing volatile chemicals, consideration may be given not to aerate the sediment-water system. | 33. | The test is conducted at a constant temperature of 20 °C (± 2 °C). For C. tentans and C. yoshimatui, recommended temperatures are of 23 °C and 25 °C (± 2 °C), respectively. A 16 hours photoperiod is used and the light intensity should be 500 to 1 000 lux. | Exposure duration | 34. | The exposure commences with the addition of larvae to the spiked and control vessels. The maximum exposure duration is 28 days for C. riparius and C. yoshimatsui, and 65 days for C. tentans. If midges emerge earlier, the test can be terminated after a minimum of five days after emergence of the last adult in the control. | OBSERVATIONS | Emergence | 35. | The development time and the total number of fully emerged male and female midges are determined. Males are easily identified by their plumose antennae. | 36. | The test vessels should be observed at least three times per week to make visual assessment of any abnormal behaviour (e.g. leaving sediment, unusual swimming), compared with the control. During the period of expected emergence a daily count of emerged midges is necessary. The sex and number of fully emerged midges are recorded daily. After identification the midges are removed from the vessels. Any egg masses deposited prior to the termination of the test should be recorded and then removed to prevent re-introduction of larvae into the sediment. The number of visible pupae that have failed to emerge is also recorded. Guidance on measurement of emergence is provided in Appendix 5. | Growth and survival | 37. | If data on 10-day larval survival and growth are to be provided, additional test vessels should be included at the start, so that they may be used subsequently. The sediment from these additional vessels is sieved using a 250 μm sieve to retain the larvae. Criteria for death are immobility or lack of reaction to a mechanical stimulus. Larvae not recovered should also be counted as dead (larvae which have died at beginning of the test may have been degraded by microbes). The (ash free) dry weight of the surviving larvae per test vessel is determined and the mean individual dry weight per vessel calculated. It is useful to determine which instar the surviving larvae belong to; for that measurement of the width of the head capsule of each individual can be used. | Analytical measurements | Concentration of the test substance | 38. | As a minimum, samples of the overlying water, the pore water and the sediment must be analysed at the start (preferably one hour after application of test substance) and at the end of the test, at the highest concentration and a lower one. These determinations of test substance concentration inform on the behaviour/partitioning of the test substance in the water-sediment system. Sampling of sediment at the start of the test may influence the test system (e.g. removing test larvae), thus additional test vessels should be used to perform analytical determinations at the start and during the test if appropriate (see paragraph 39). Measurements in sediment might not be necessary if the partitioning of the test substance between water and sediment has been clearly determined in a water/sediment study under comparable conditions (e.g. sediment to water ratio, type of application, organic carbon content of sediment). | 39. | When intermediate measurements are made (e.g. at day 7) and if the analysis needs large samples which cannot be taken from test vessels without influencing the test system, analytical determinations should be performed on samples from additional test vessels treated in the same way (including the presence of test organisms) but not used for biological observations. | 40. | Centrifugation at e.g. 10 000 g and 4 °C for 30 min. is the recommended procedure to isolate interstitial water. However, if the test substance is demonstrated not to adsorb to filters, filtration may also be acceptable. In some cases it might not be possible to analyse concentrations in the pore water as the sample size is too small. | Physical-chemical parameters | 41. | The pH, dissolved oxygen in the test water and temperature of the test vessels should be measured in an appropriate manner (see paragraph 10). Hardness and ammonia should be measured in the controls and one test vessel at the highest concentration at the start and the end of the test. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 42. | The purpose of this test is to determine the effect of the test substance on the development rate and the total number of fully emerged male and female midges, or in the case of the 10-day test effects on survival and weight of the larvae. If there are no indications of statistically different sensitivities of sexes, male and female results may be pooled for statistical analyses. The sensitivity differences between sexes can be statistically judged by e.g. a χ2-r × 2 table test. Larval survival and mean individual dry weight per vessel must be determined after 10 days where required. | 43. | Effect concentrations expressed as concentrations in the overlaying water, are calculated preferably based on measured concentrations at the beginning of the test (see paragraph 38). | 44. | To compute a point estimate for the EC50 or any other ECx, the per-vessel statistics may be used as true replicates. In calculating a confidence interval for any ECx the variability among vessels should be taken into account, or it should be shown that this variability is so small that it can be ignored. When the model is fitted by Least Squares, a transformation should be applied to the per-vessel statistics in order to improve the homogeneity of variance. However, ECx values should be calculated after the response is transformed back to the original value. | 45. | When the statistical analysis aims at determining the NOEC/LOEC by hypothesis testing, the variability among vessels needs to be taken into account, e.g. by a nested ANOVA. Alternatively, more robust tests (21) can be appropriate in situations where there are violations of the usual ANOVA assumptions. | Emergence ratio | 46. | Emergence ratios are quantal data, and can be analyzed by the Cochran-Armitage test applied in step-down manner where a monotonic dose-response is expected and these data are consistent with this expectation. If not, a Fisher’s exact or Mantel-Haenszal test with Bonferroni-Holm adjusted p-values can be used. If there is evidence of greater variability between replicates within the same concentration than a binomial distribution would indicate (often referenced as “extra-binomial” variation), then a robust Cochran-Armitage or Fisher exact test such as proposed in (21), should be used. | 47. | The sum of midges emerged per vessel, ne, is determined and divided by the number of larvae introduced, na: | where: | ER | = | emergence ratio | ne | = | number of midges emerged per vessel | na | = | number of larvae introduced per vessel | 48. | An alternative that is most appropriate for large sample sizes, when there is extra binomial variance, is to treat the emergence ratio as a continuous response and use procedures such as William’s test when a monotonic dose-response is expected and is consistent with these ER data. Dunnett’s test would be appropriate where monotonicity does not hold. A large sample size is defined here as the number emerged and the number not emerging both exceeding five, on a per replicate (vessel) basis. | 49. | To apply ANOVA methods values of ER should first be transformed by the arcsin square roottransformation or Freeman-Tukey transformation to obtain an approximate normal distribution and to equalise variances. The Cochran-Armitage, Fisher’s exact (Bonferroni), or Mantel-Haenszel tests can be applied when using the absolute frequencies. The arcsin square root transformation is applied by taking the inverse sine (sine–1) of the square root of ER. | 50. | For emergence ratios, ECx-values are calculated using regression analysis (or e.g. probit (22), logit, Weibull, appropriate commercial software etc.). If regression analysis fails (e.g. when there are less than two partial responses), other non-parametric methods such as moving average or simple interpolation are used. | Development rate | 51. | The mean development time represents the mean time span between the introduction of larvae (day 0 of the test) and the emergence of the experimental cohort of midges. (For the calculation of the true development time, the age of larvae at the time of introduction should be considered). The development rate is the reciprocal of the development time (unit: 1/day) and represents that portion of larval development which takes place per day. The development rate is preferred for the evaluation of these sediment toxicity studies as its variance is lower, and it is more homogeneous and closer to normal distribution as compared to development time. Hence, powerful parametric test procedures may be used with development rate rather than with development time. For development rate as a continuous response, ECx-values can be estimated by using regression analysis (e.g. (23)(24)). | 52. | For the following statistical tests, the number of midges observed on inspection day x are assumed to be emerged at the mean of the time interval between day x and day x – l (l = length of the inspection interval, usually 1 day). The mean development rate per vessel (x) is calculated according to: | where: | : | mean development rate per vessel | i | : | index of inspection interval | m | : | maximum number of inspection intervals | : | number of midges emerged in the inspection interval i | ne | : | total number of midges emerged at the end of experiment (= | ) | xi | : | development rate of the midges emerged in interval i | where: | dayi | : | inspection day (days since application) | li | : | length of inspection interval i (days, usually 1 day) | Test report | 53. | The test report must at least provide the following information: | | Test substance: | — | physical nature and, where relevant, physical-chemical properties (water solubility, vapour pressure, partition coefficient in soil (or in sediment if available), stability in water, etc.); | — | chemical identification data (common name, chemical name, structural formula, CAS number, etc.) including purity and analytical method for quantification of test substance. | | Test species: | — | test animals used: species, scientific name, source of organisms and breeding conditions; | — | information on handling of egg masses and larvae; | — | age of test animals when inserted into test vessels. | | Test conditions: | — | sediment used, i.e. natural or formulated sediment; | — | for natural sediment, location and description of sediment sampling site, including, if possible, contamination history; characteristics: pH, organic carbon content, C/N ratio and granulometry (if appropriate). | — | preparation of the formulated sediment: ingredients and characteristics (organic carbon content, pH, moisture, etc. at the start of the test); | — | preparation of the test water (if reconstituted water is used) and characteristics (oxygen concentration, pH, conductivity, hardness, etc. at the start of the test); | — | depth of sediment and overlying water; | — | volume of overlying and pore water; weight of wet sediment with and without pore water; | — | test vessels (material and size); | — | method of preparation of stock solutions and test concentrations; | — | application of test substance: test concentrations used, number of replicates and use of solvent if any; | — | incubation conditions: temperature, light cycle and intensity, aeration (frequency and intensity); | — | detailed information on feeding including type of food, preparation, amount and feeding regime. | | Results: | — | the nominal test concentrations, the measured test concentrations and the results of all analyses to determine the concentration of the test substance in the test vessel; | — | water quality within the test vessels, i.e. pH, temperature, dissolved oxygen, hardness and ammonia; | — | replacement of evaporated test water, if any; | — | number of emerged male and female midges per vessel and per day; | — | number of larvae which failed to emerge as midges per vessel; | — | mean individual dry weight of larvae per vessel, and per instar, if appropriate; | — | percent emergence per replicate and test concentration (male and female midges pooled); | — | mean development rate of fully emerged midges per replicate and treatment rate (male and female midges pooled); | — | estimates of toxic endpoints e.g. ECx (and associated confidence intervals), NOEC and/or LOEC, and the statistical methods used for their determination; | — | discussion of the results, including any influence on the outcome of the test resulting from deviations from this Test Method. | LITERATURE: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. | (10) | Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. | (11) | Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. | (12) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms, | (15) | Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. | (16) | Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. | (17) | Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. | (18) | Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. | (19) | Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. | (20) | Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. | (21) | Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. | (22) | Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. | (23) | Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. | (24) | Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. | Appendix 1 | DEFINITIONS | For the purpose of this method the following definitions are used: | Formulated sediment or reconstituted, artificial or synthetic sediment, is a mixture of materials used to mimic the physical components of a natural sediment. | Overlying water is the water placed over sediment in the test vessel. | Interstitial water or pore water is the water occupying space between sediment and soil particles. | Spiked water is the test water to which test substance has been added. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Recommendations for culture of Chironomus riparius | 1. | Chironomus larvae may be reared in crystallising dishes or larger containers. Fine quartz sand is spread in a thin layer of about 5 to 10 mm deep over the bottom of the container. Kieselguhr (e.g. Merck, Art 8117) has also been shown to be a suitable substrate (a thinner layer of up to a very few mm is sufficient). Suitable water is then added to a depth of several cm. Water levels should be topped up as necessary to replace evaporative loss, and prevent desiccation. Water can be replaced if necessary. Gentle aeration should be provided. The larval rearing vessels should be held in a suitable cage which will prevent escape of the emerging adults. The cage should be sufficiently large to allow swarming of emerged adults, otherwise copulation may not occur (minimum is ca. 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Cages should be held at room temperature or in a constant environment room at 20 ± 2 °C with a photo period of 16 hour light (intensity ca. 1 000 lux), 8 hours dark. It has been reported that air humidity of less than 60 % RH can impede reproduction. | Dilution water | 3. | Any suitable natural or synthetic water may be used. Well water, dechlorinated tap water and artificial media (e.g. Elendt “M4” or “M7” medium, see below) are commonly used. The water has to be aerated before use. If necessary, the culture water may be renewed by pouring or siphoning the used water from culture vessels carefully without destroying the tubes of larvae. | Feeding larvae | 4. | Chironomus larvae should be fed with a fish flake food (TetraMin®, TetraPhyll® or other similar brand of proprietary fish food), at approximately 250 mg per vessel per day. This can be given as a dry ground powder or as a suspension in water: 1,0 g of flake food is added to 20 ml of dilution water and blended to give a homogenous mix. This preparation may be fed at a rate of about 5 ml per vessel per day (shake before use.) Older larvae may receive more. | 5. | Feeding is adjusted according to the water quality. If the culture medium becomes “cloudy”, the feeding should be reduced. Food additions must be carefully monitored. Too little food will cause emigration of the larvae towards the water column, and too much food will cause increased microbial activity and reduced oxygen concentrations. Both conditions can result in reduced growth rates. | 6. | Some green algae (e.g. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) cells may also be added when new culture vessels are set up. | Feeding emerged adults | 7. | Some experimenters have suggested that a cotton wool pad soaked in a saturated sucrose solution may serve as a food for emerged adults. | Emergence | 8. | At 20 ± 2 °C adults will begin to emerge from the larval rearing vessels after approximately 13-15 days. Males are easily distinguished by having plumose antennae. | Egg masses | 9. | Once adults are present within the breeding cage, all larval rearing vessels should be checked three times weekly for deposition of the gelatinous egg masses. If present, the egg masses should be carefully removed. They should be transferred to a small dish containing a sample of the breeding water. Egg masses are used to start a new culture vessel (e.g. 2-4 egg masses/vessel) or are used for toxicity tests. | 10. | First instar larvae should hatch after 2-3 days. | Set-up of new culture vessels | 11. | Once cultures are established it should be possible to set up a fresh larval culture vessel weekly or less frequently depending on testing requirements, removing the older vessels after adult midges have emerged. Using this system a regular supply of adults will be produced with a minimum of management. | Preparation of test solutions “M4” and “M7” | 12. | Elendt (1990) has described the “M4” medium. The “M7” medium is prepared as the “M4” medium except for the substances indicated in Table 1, for which concentrations are four times lower in “M7” than in “M4”. A publication on the “M7” medium is in preparation (Elendt, personal communication). The test solution should not be prepared according to Elendt and Bias (1990) for the concentrations of NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 and K2HPO4 given for the preparation of the stock solutions are not adequate. | Preparation of the “M7”-medium | 13. | Each stock solution (I) is prepared individually and a combined stock solution (II) is prepared from these stock solutions (I) (see Table 1). 50 ml from the combined stock Solution (II) and the amounts of each macro nutrient stock solution which are given in Table 2 are made up to 1 l of deionised water to prepare the “M7” medium. A vitamin stock solution is prepared by adding three vitamins to deionised water as indicated in Table 3, and 0,1 ml of the combined vitamin stock solution are added to the final “M7” medium shortly before use. (The vitamin stock solution is stored frozen in small aliquots). The medium is aerated and stabilised. | Table 1 | Stock solutions of trace elements for medium M4 and M7 | Stock solutions (I) | Amount (mg) made up to 1 litre of deionised water | To prepare the combined stock solution (II): mix the following amounts (ml) of stock solutions (I) and make up to 1 litre of deionised water | Final concentrations in test solutions (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (10) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (10) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (10) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (10) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (10) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (10) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (10) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (10) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (10) (11) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (10) (11) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Table 2 | Macro nutrient stock solutions for medium M4 and M7 | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of macro nutrient stock solutions added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Table 3 | Vitamin stock solution for medium M4 and M7 | All three vitamin solutions are combined to make a single vitamin stock solution. | | Amount made up to 1 litre of deionised water | (mg) | Amount of vitamin stock solution added to prepare medium M4 and M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | Thiamine hydrochloride | 750 | 0,1 | 0,075 | Cyanocobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotine | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | LITERATURE: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. | Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. | Appendix 3 | PREPARATION OF FORMULATED SEDIMENT | Sediment composition | The composition of the formulated sediment should be as follows: | Constituent | Characteristics | % of sediment | dry weight | Peat | Sphagnum moss peat, as close to pH 5,5-6,0 as possible, no visible plant remains, finely ground (particle size ≤ 1 mm) and air dried | 4-5 | Quartz sand | Grain size: > 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm | 75-76 | Kaolinite clay | Kaolinite content ≥ 30 % | 20 | Organic carbon | Adjusted by addition of peat and sand | 2 (± 0,5) | Calcium carbonate | CaCO3, pulverised, chemically pure | 0,05-0,1 | Water | Conductivity ≤ 10 μS/cm | 30-50 | Preparation | The peat is air dried and ground to a fine powder. A suspension of the required amount of peat powder in deionised water is prepared using a high-performance homogenising device. The pH of this suspension is adjusted to 5,5 ± 0,5 with CaCO3. The suspension is conditioned for at least two days with gentle stirring at 20 ± 2 °C, to stabilise pH and establish a stable microbial component. pH is measured again and should be 6,0 ± 0,5. Then the peat suspension is mixed with the other constituents (sand and kaolin clay) and deionised water to obtain a homogeneous sediment with a water content in a range of 30-50 per cent of dry weight of the sediment. The pH of the final mixture is measured once again and is adjusted to 6,5 to 7,5 with CaCO3 if necessary. Samples of the sediment are taken to determine the dry weight and the organic carbon content. Then, before it is used in the chironomid toxicity test, it is recommended that the formulated sediment be conditioned for seven days under the same conditions which prevail in the subsequent test. | Storage | The dry constituents for preparation of the artificial sediment may be stored in a dry and cool place at room temperature. The formulated (wet) sediment should not be stored prior to its use in the test. It should be used immediately after the 7 days conditioning period that ends its preparation. | LITERATURE: | Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms | Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R and Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. | Appendix 4 | Chemical Characteristics of Acceptable Dilution Water | Substance | Concentrations | Particulate matter | < 20 mg/l | Total organic carbon | < 2 mg/l | Unionised ammonia | < 1 μg/l | Hardness as CaCO3 | < 400 mg/l (*4) | Residual chlorine | < 10 μg/l | Total organophosphorus pesticides | < 50 ng/l | Total organochlorine pesticides plus polychlorinated biphenyls | < 50 ng/l | Total organic chlorine | < 25 ng/l | Appendix 5 | Guidance for monitoring emergence of chironomid larvae | Emergence traps are placed on the test beakers. These traps are needed from day 20 to the end of the test. Example of trap used is drawn below: | C.29. READY BIODEGRADABILITY — CO2 IN SEALED VESSELS (HEADSPACE TEST) | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 310 (2006). This Test Method is a screening method for the evaluation of ready biodegradability of chemicals and provides similar information to the six test methods described in chapter C.4 of this Annex A to F. Therefore, a chemical that shows positive results in this Test Method can be considered readily biodegradable and consequently rapidly degradable in the environment. | 2. | The well established carbon dioxide (CO2) method (1), based on Sturm’s original test (2) for assessing biodegradability of organic chemicals, by the measurement of the carbon dioxide produced by microbial action, has normally been the first choice for testing poorly soluble chemicals and those which strongly adsorb. It is also chosen for soluble (but not volatile) chemicals, since the evolution of carbon dioxide is considered by many to be the only unequivocal proof of microbial activity. Removal of dissolved organic carbon can be effected by physico-chemical processes — adsorption, volatilisation, precipitation, hydrolysis — as well as by microbial action and many non-biological reactions consume oxygen; rarely is CO2 produced from organic chemicals abiotically. In the original and modified Sturm test (1)(2) CO2 is removed from the liquid phase to the absorbing vessels by sparging (i.e. bubbling air treated to remove CO2 through the liquid medium), while in the version of Larson (3)(4) CO2 is transferred from the reaction vessel to the absorbers by passing CO2-free air through the headspace and, additionally, by shaking the test vessel continuously. Only in the Larson modification is the reaction vessel shaken; stirring is specified only for insoluble substances in ISO 9439 (5) and in the original US version (6), both of which specify sparging rather than headspace replacement. In another official US EPA method (7) based on Gledhill’s method (8), the shaken reaction vessel is closed to the atmosphere and CO2 produced is collected in an internal alkaline trap directly from the gaseous phase, as in classical Warburg/Barcroft respirometer flasks. | 3. | However, inorganic carbon (IC) has been shown to accumulate in the medium during the application of the standard, modified Sturm test to a number of chemicals (9). A concentration of IC as high as 8 mg/l was found during the degradation of 20 mg C/l of aniline. Thus, the collection of CO2 in the alkaline traps did not give a true reflection of the amount of CO2 produced microbiologically at intermediate times during the degradation. As a result, the specification that > 60 % theoretical maximum CO2 production (ThCO2) must be collected within a “10-d window” (the 10 days immediately following the attainment of 10 % biodegradation) for a test chemical to be classified as readily biodegraded will not be met for some chemicals which would be so classified using dissolved organic carbon (DOC) removal. | 4. | When the percentage degradation is a lower value than expected, IC is possibly accumulated in the test solution. Then, the degradability may be assessed with the other ready biodegradability tests. | 5. | Other drawbacks of the Sturm methodology (cumbersome, time-consuming, more prone to experimental error and not applicable to volatile chemicals) had earlier prompted a search for a sealed vessel technique, other than Gledhill’s, rather than gas flow-through (10)(11). Boatman et al (12) reviewed the earlier methods and adopted an enclosed headspace system in which the CO2 was released into the headspace at the end of incubation by acidifying the medium. CO2 was measured by gas chromatography (GC)/IC analysis in automatically taken samples of the headspace but dissolved inorganic carbon (DIC) in the liquid phase was not taken into account. Also, the vessels used were very small (20 ml) containing only 10 ml of medium, which caused problems e.g. when adding the necessarily very small amounts of insoluble test chemicals, and/or there may be insufficient or no microorganisms present in the inoculated medium that are competent to degrade the test chemicals. | 6. | These difficulties have been overcome by the independent studies of Struijs and Stoltenkamp (13) and of Birch and Fletcher (14), the latter being inspired by their experience with apparatus used in the anaerobic biodegradation test (15). In the former method (13) CO2 is measured in the headspace after acidification and equilibration, while in the latter (14) DIC in both the gaseous and liquid phases was measured, without treatment; over 90 % of the IC formed was present in the liquid phase. Both methods had advantages over the Sturm test in that the test system was more compact and manageable, volatile chemicals can be tested and the possibility of delay in measuring CO2 produced is avoided. | 7. | The two approaches were combined in the ISO Headspace CO2 Standard (16), which was ring-tested (17) and it is this Standard which forms the basis of the present Test Method. Similarly, the two approaches have been used in the US EPA method (18). Two methods of measuring CO2 have been recommended, namely CO2 in headspace after acidification (13) and IC in the liquid phase after the addition of excess alkali. The latter method was introduced by Peterson during the CONCAWE ring test (19) of this headspace method modified to measure inherent biodegradability. The changes made in the 1992 (20) revision of the methods in chapter C.4 of this Annex for Ready Biodegradability have been incorporated into this Test Method, so that the conditions (medium, duration etc.) are otherwise the same as those in the revised Sturm test (20). Birch and Fletcher (14) have shown that very similar results were obtained with this headspace test as were obtained with the same chemicals in the OECD Ring Test (21) of the revised Test Methods. | PRINCIPLE OF THE TEST | 8. | The test chemical, normally at 20 mg C/l, as the sole source of carbon and energy, is incubated in a buffer-mineral salts medium which has been inoculated with a mixed population of micro-organisms. The test is performed in sealed bottles with a headspace of air, which provides a reservoir of oxygen for aerobic biodegradation. The CO2 evolution resulting from the ultimate aerobic biodegradation of the test chemical is determined by measuring the IC produced in the test bottles in excess of that produced in blank vessels containing inoculated medium only. The extent of biodegradation is expressed as a percentage of the theoretical maximum IC production (ThIC), based on the quantity of test chemical (as organic carbon) added initially. | 9. | The DOC removal and/or the extent of primary biodegradation of the test chemical can also be measured (20). | INFORMATION ON THE TEST CHEMICAL | 10. | The organic carbon content (% w/w) of the test chemical needs to be known, either from its chemical structure or by measurement, so that the percentage degradation may be calculated. For volatile test chemicals, a measured or calculated Henry’s law constant is helpful for determining a suitable headspace to liquid volume ratio. Information on the toxicity of the test chemical to micro-organisms is useful in selecting an appropriate test concentration and for interpreting results showing poor biodegradability: it is recommended to include the inhibition control unless it is known that the test chemical is not inhibitory to microbial activities (see paragraph 24). | APPLICABILITY OF THE METHOD | 11. | The test is applicable to water-soluble and insoluble test chemicals, though good dispersion of the test chemical should be ensured. Using the recommended headspace to liquid volume ratio of 1:2, volatile chemicals with a Henry’s law constant of up to 50 Pa.m3.mol–1 can be tested as the proportion of test chemical in the headspace will not exceed 1 % (13). A smaller headspace volume may be used when testing chemicals, which are more volatile, but their bioavailability may be limiting especially if they are poorly soluble in water. However, users must ensure that the headspace to liquid volume ratio and the test chemical concentration are such that sufficient oxygen is available to allow complete aerobic biodegradation to occur (e.g. avoid using a high substrate concentration and a small headspace volume). Guidance on this matter can be found in (13)(23). | REFERENCE CHEMICALS | 12. | In order to check the test procedure, a reference chemical of known biodegradability should be tested in parallel. For this purpose, aniline, sodium benzoate or ethylene glycol may be used when testing water-soluble test chemicals and 1-octanol for poorly soluble test chemicals (13). Biodegradation of these chemicals must reach > 60 % ThIC within 14 days. | REPRODUCIBILITY | 13. | In the ISO ring test of the method (17), the following results were obtained using the recommended conditions, including 20 mg C test chemical/l. | Test Chemical | Mean Percentage Biodegradation | (28d) | Coefficient of variation | (%) | Number of Laboratories | Aniline | 90 | 16 | 17 | 1-Octanol | 85 | 12 | 14 | Within-test variability (replicability), using aniline, was low with coefficients of variability not greater than 5 % in nearly all test runs. In the two cases in which the replicability was worse, the greater variability was probably due to high IC production in the blanks. Replicability was worse with 1-octanol but was still less than 10 % for 79 % of test runs. This greater within-test variability may have been due to dosing errors, as a small volume (3 to 4 μl) of 1-octanol had to be injected into sealed test bottles. Higher coefficients of variation would result when lower concentrations of test chemical are used, especially at concentrations lower than 10 mg C/l. This could be partially overcome by reducing the concentration of total inorganic carbon (TIC) in the inoculum. | 14. | In an EU ring-test (24) of five surfactants added at 10 mg C/l, the following results were obtained: | Test Chemical | Mean Percentage biodegradation | (28d) | Coefficient of variation | (%) | Number of laboratories | Tetrapropylene | Benzene sulphonate | 17 | 45 | 10 | Di-iso-octylsulpho-Succinate | (anionic) | 72 | 22 | 9 | Hexadecyl-trimethyl (*5) | Ammonium chloride | (cationic) | 75 | 13 | 10 | Iso-Nonylphenol - (ethoxylate)9 | (non-ionic) | 41 | 32 | 10 | Coco-amide-propyl | Dimethylhydroxy | Sulphobetaine | (amphoteric) | 60 | 23 | 11 | The results show that generally, the variability was higher for the less well-degraded surfactants. Within-test variability was less than 15 % for over 90 % of cases, the highest reaching 30-40 %. | NOTE: | Most surfactants are not single molecular species but are mixtures of isomers, homologues, etc. which degrade after different characteristic lag periods and at different kinetic rates resulting in “blurred”, extenuated curves, so that the 60 % pass value may not be reached within “the 10-d window”, even though each individual molecular species would reach > 60 % within 10 days if tested alone. This may be observed with other complex mixtures as well. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Apparatus | 15. | Normal laboratory apparatus and: | (a) | Glass serum bottles, sealed with butyl rubber stoppers and crimp-on aluminium seals. The recommended size is “125 ml” which have a total volume of around 160 ml (in this case the volume of each bottle should be known to be 160 ± 1 ml). A smaller size of vessel may be used when the results fulfil the conditions described in paragraph 66 and 67; | (b) | Carbon analyser or other instrument (e.g. gas chromatograph) for measuring inorganic carbon; | (c) | Syringes of high precision for gaseous and liquid samples; | (d) | Orbital shaker in a temperature-controlled environment; | (e) | A supply of CO2 free air — this can be prepared by passing air through soda lime granules or by using an 80 % N2/20 % 02 gas mixture (optional) (see paragraph 28); | (f) | Membrane-filtration device of 0,20–0,45 μm porosity (optional); | (g) | Organic carbon analyser (optional). | Reagents | 16. | Use analytical grade reagents throughout. | Water | 17. | Distilled or de-ionised water should be used containing ≤ 1 mg/l as total organic carbon. This represents ≤ 5 % of the initial organic carbon content introduced by the recommended dose of the test chemical. | Stock solutions for the mineral salts medium | 18. | The stock solutions and the mineral salts medium are similar to those in ISO 14593 (16) and C.4 “ready biodegradability” tests (20). The use of a higher concentration of ammonium chloride (2,0 g/l instead of 0,5 g/l) should only be necessary in very exceptional cases, e.g. when the test chemical concentration is > 40 mg C/l. Stock solutions should be stored under refrigeration and disposed of after six months, or earlier if there is evidence of precipitation or microbial growth. Prepare the following stock solutions: | (a) | Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 8,50 g | Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 21,75 g | Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g | Ammonium chloride (NH4Cl) 0,50 g | Dissolve in water and make up to 1 litre. The pH of this solution should be 7,4 (± 0,2). If this is not the case, then prepare a new solution. | (b) | Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) 36,40 g | Dissolve in water and make up to 1 litre. | (c) | Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H2O) 22,50 g | Dissolve in water and make up to 1 litre. | (d) | Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3.6H20) 0,25 g | Dissolve in water and make up to 1 litre and add one drop of concentrated HCl. | Preparation of mineral medium | 19. | Mix 10 ml of solution (a) with approximately 800 ml water (paragraph 17), then add 1 ml of solutions (b), (c) and (d) and make up to 1 litre with water (paragraph 17). | Other reagents | 20. | Concentrated ortho-phosphoric acid (H3PO4) (> 85 % mass per volume). | Sodium hydroxide solution 7M | 21. | Dissolve 280 g of sodium hydroxide (NaOH) in 1 litre of water (paragraph 17). Determine the concentration of DIC of this solution and consider this value when calculating the test result (see paragraphs 55 and 61), especially in the light of the validity criterion in paragraph 66 (b). Prepare a fresh solution if the concentration of DIC is too high. | Test chemical | 22. | Prepare a stock solution of a sufficiently water-soluble test chemical in water (paragraph 17) or in the test medium (paragraph 19) at a concentration preferably 100-fold greater than the final concentration to be used in the test; it may be necessary to adjust the pH of the stock solution. The stock solution should be added to the mineral medium to give a final organic carbon concentration of between 2 and 40 mg C/l, preferably 20 mg C/l. If concentrations lower than these are used, the precision obtained may be impaired. Soluble and insoluble liquid chemicals may be added to the vessels directly using high precision syringes. Poorly soluble and insoluble test chemicals may require special treatment (25). The choices are: | (a) | direct addition of known weighed amounts; | (b) | ultrasonic dispersion before addition; | (c) | dispersion with the aid of emulsifying agents to be required to establish whether they have any inhibitory or stimulatory effects on microbial activity before addition; | (d) | adsorption of liquid test chemicals, or a solution in a suitable volatile solvent, on to an inert medium or support (e.g. glass fibre filter), followed by evaporation of the solvent, if used, and direct addition of known amounts; | (e) | addition of known volume of a solution of the test chemical in an easily volatile solvent to an empty test vessel, followed by evaporation of the solvent. | Agents or solvents used in (c), (d) and (e) have to be tested for any stimulatory or inhibitory effect on microbial activity (see paragraph 42(b).) | Reference chemical | 23. | Prepare a stock solution of the (soluble) reference chemical in water (paragraph 17) at a concentration preferably 100-fold greater than the final concentration to be used (20 mg C/l) in the test. | Inhibition check | 24. | Test chemicals frequently show no significant degradation under the conditions used in ready biodegradation assessments. One possible cause is that the test chemical is inhibitory to the inoculum at the concentration at which it is applied in the test. An inhibition check may be included in the test design to facilitate identification (in retrospect) of inhibition as a possible cause or contributory factor. Alternatively, the inhibition check may rule out such interferences and show that zero or slight degradation is attributable solely to non-amenability to microbial attack under the conditions of the test. In order to obtain information on the toxicity of the test chemical to (aerobic) micro-organisms, prepare a solution in the test medium containing the test chemical and the reference chemical (paragraph 19), each at the same concentrations as added, respectively (see paragraph 22 and 23). | Inoculum | 25. | The inoculum may be derived from a variety of sources: activated sludge; sewage effluent (non-chlorinated); surface waters and soils; or from a mixture of these (20). The biodegradative activity of the source should be checked by using a reference chemical. Whatever the source, micro-organisms previously exposed to the test chemical should not be used if the procedure is to be used as a test for ready biodegradability. | Warning: | Activated sludge, sewage and sewage effluent contain pathogenic organisms and must be handled with caution. | 26. | Based on experience, the optimal volume for the inoculum is that which: | — | is sufficient to give adequate biodegradative activity; | — | degrades the reference chemical by the stipulated percentage (see paragraph 66); | — | gives 102 to 105 colony-forming units per millilitre in the final mixture; | — | normally gives a concentration of 4 mg/l suspended solids in the final mixture when activated sludge is used, concentrations up to 30 mg/l may be used but may significantly increase CO2 production of the blanks (26); | — | contributes less than 10 % of the initial concentration of organic carbon introduced by the test chemical; | — | is generally 1-10 ml of inoculum for 1 litre of test solution. | Activated sludge | 27. | Activated sludge is freshly collected from the aeration tank of a sewage treatment plant or laboratory-scale unit treating predominantly domestic sewage. If necessary, coarse particles should be removed by sieving (e.g. using a 1 mm2 mesh sieve) and the sludge should be kept aerobic until used. | 28. | Alternatively, after removal of any coarse particles, settle or centrifuge (e.g. 1 100 × g for 10 minutes). Discard the supernatant liquid. The sludge may be washed in the mineral solution. Suspend the concentrated sludge in mineral medium to yield a concentration of 3-5 g suspended solids/l. Thereafter aerate until required. | 29. | Sludge should be taken from a properly working conventional treatment plant. If sludge has to be taken from a high rate treatment plant, or is thought to contain inhibitors, it should be washed. Settle or centrifuge the re-suspended sludge after thorough mixing, discard the supernatant liquid and again suspend the washed sludge in a further volume of mineral medium. Repeat this procedure until the sludge is considered to be free from excess substrate or inhibitor. | 30. | After complete re-suspension is achieved, or with untreated sludge, withdraw a sample just before use for the determination of the dry weight of the suspended solids. | 31. | A further alternative is to homogenise activated sludge (3-5 g suspended solids/l). Treat the sludge in a Waring blender for 2 minutes at medium speed. Settle the blended sludge for 30 minutes or longer if required and decant liquid for use as inoculum at the rate of about 10 mg/l of mineral medium. | 32. | Still further reduction of the blank CO2 evolution can be achieved by aerating the sludge overnight with CO2-free air. Use 4 mg/l activated sludge solids as the concentration of the inoculum in this test (13). | Secondary sewage effluent | 33. | Alternatively, the inoculum can be derived from the secondary effluent of a treatment plant or laboratory-scale unit receiving predominantly domestic sewage. Maintain the sample under aerobic conditions and use on the day of collection, or pre-condition if necessary. The effluent should be filtered through a coarse filter to remove gross particulate matter and the pH value is measured. | 34. | To reduce its IC content, the filtrate is sparged with CO2-free air (paragraph 15-e) for 1 h while maintaining the pH at 6,5 using orthophosphoric acid (paragraph 20). The pH value is restored to its original value with sodium hydroxide (paragraph 21) and after settling for about 1 h a suitable volume of the supernatant is taken for inoculation. This sparging procedure reduces the IC content of the inoculum. For example, when the maximum recommended volume of filtered sparged effluent (100 ml) per litre was used as inoculum, the amount of IC present in blank control vessels was in the range 0,4 to 1,3 mg/l (14), representing 2-6,5 % of test chemical C at 20 mg C/l and 4-13 % at 10 mg C/l. | Surface waters | 35. | A sample is taken of an appropriate surface water. It should be kept under aerobic conditions and used on the day of collection. The sample should be concentrated, if necessary, by filtration or centrifugation. The volume of inoculum to be used in each test vessel should meet the criteria given in paragraph 26. | Soils | 36. | A sample is taken of an appropriate soil, collected to a depth of up to 20 cm below the soil surface. Stones, plant remains and invertebrates should be removed from the sample of soil before it is sieved through a 2 mm mesh (if the sample is too wet to sieve immediately, then partially air dry to facilitate sieving). It should be kept under aerobic conditions and used on the day of collection (If the sample is transported in a loosely-tied black polythene bag, it can be stored at 2 to 4 °C in the bag for up to one month). | Preconditioning of inoculum | 37. | Inoculum may be pre-conditioned to the experimental conditions, but not pre-adapted to the test chemical. Pre-conditioning can reduce the blank CO2 evolution. Pre-conditioning consists of aerating activated sludge after diluting in test medium to 30 mg/l with moist CO2-free air for up to 5-7 days at the test temperature. | TEST PROCEDURE | Number of bottles | 38. | The number of bottles (paragraph 15-a) needed for a test will depend on the frequency of analysis and the test duration. | 39. | It is recommended that triplicate bottles be analysed after a sufficient number of time intervals such that the 10-d window may be identified. Also at least five test bottles (paragraph 15-a) from sets (a), (b) and (c) (see paragraph 42) are analysed at the end of the test, to enable 95 % confidence intervals to be calculated for the mean percentage biodegradation value. | Inoculated medium | 40. | The inoculum is used at a concentration of 4 mg/l activated sludge dry solids. Prepare immediately before use sufficient inoculated medium by adding, for example, 2 ml suitably treated activated sludge (paragraphs 27 to 32) at 2 000 mg/l to 1 litre of mineral salts medium (paragraph 19). When secondary sewage effluent is to be used add up to 100 ml effluent (paragraph 33) to 900 ml mineral salts medium (paragraph 19) and dilute to 1 litre with medium. | Preparation of bottles | 41. | Aliquots of inoculated medium are dispensed into replicate bottles to give a headspace to liquid ratio of 1:2 (e.g. add 107 ml to 160 ml-capacity bottles). Other ratios may be used, but see the warning given in paragraph 11. When using either type of inoculum, care must be taken to ensure that the inoculated medium is adequately mixed to ensure that it is uniformly distributed to the test bottles. | 42. | Sets of bottles (paragraph 15a) are prepared to contain the following: | (a) | Test vessels (denoted FT) containing the test chemical; | (b) | Blank controls (denoted FB) containing only the test medium plus inoculum; any chemicals, solvents, agents or glass fibre filters used to introduce the test chemical into the test vessels must also be added; | (c) | Vessels (denoted FC) for checking the procedure containing the reference chemical; | (d) | If needed, vessels (denoted FI) for checking a possible inhibitory effect of the test chemical containing both the test chemical and reference chemical at the same concentrations (paragraph 24) as in bottles FT and FC, respectively; | (e) | Vessels (denoted FS) for checking a possible abiotic degradation as (a) plus 50 mg/l HgCl2 or sterilised by some other means (e.g. by autoclaving). | 43. | Water-soluble test chemicals and reference chemicals are added as aqueous stock solutions (paragraphs 22, 23 and 24) to give a concentration of 10 to 20 mg C/l. | 44. | Insoluble test chemicals and insoluble reference chemicals are added to bottles in a variety of ways (see paragraph 22a-e) according to the nature of the test chemical, either before or after addition of the inoculated medium, depending on the method of treatment of the test chemical. If one of the procedures given in paragraph 22a-e is used, then the blank bottles FB (paragraph 42b) should be treated in a similar fashion but excluding the test chemical or reference chemical. | 45. | Volatile test chemicals should be injected into sealed bottles (paragraph 47) using a micro syringe. The dose is calculated from the volume injected and the density of the test chemical. | 46. | Water should be added to vessels, where necessary, to give the same liquid volume in each vessel. It must be ensured that the headspace to liquid ratio (usually 1:2) and concentration of the test chemical are such that sufficient oxygen is available in the headspace to allow for complete biodegradation. | 47. | All bottles are then sealed for example, with butyl rubber septa and aluminium caps. Volatile tests chemicals should be added at this stage (paragraph 45). If the decrease in DOC concentration of the test solution is to be monitored and for time zero analyses to be performed for initial IC concentration (sterile controls, paragraph 42e) or other determinands, remove an appropriate sample from the test vessel. The test vessel and its contents are then discarded. | 48. | The sealed bottles are placed on a rotary shaker (paragraph 15d), with a shaking rate sufficient to keep the bottle contents well mixed and in suspension (e.g. 150 to 200 rpm), and incubated in the dark at 20 °C, to be kept within ± 1 °C. | Sampling | 49. | The pattern of sampling will depend on the lag period and kinetic rate of biodegradation of the test chemical. Bottles are sacrificed for analysis on the day of sampling, which should be at least weekly or more frequently (e.g. twice per week) if a complete degradation curve is required. The requisite number of replicate bottles is taken from the shaker, representing FT, FB and FC and, if used FI and FS (see paragraph 42). The test normally runs for 28d. If the biodegradation curve indicates that a plateau has been attained before 28d, the test may be concluded earlier than 28d. Take samples from the five bottles reserved for the 28th day of the test for analysis and use the results to calculate the confidence limits or coefficient of variation of percentage biodegradation. Bottles representing the checks for inhibition and for abiotic degradation need not be sampled as frequently as the other bottles; day 1 and day 28 would be sufficient. | Inorganic carbon (IC) analysis | 50. | CO2 production in the bottles is determined by measuring the increase in the concentration of inorganic carbon (IC) during incubation. There are two recommended methods available for measuring the amount of IC produced in the test, and these are described immediately below. Since the methods can give slightly different results only one should be used in a test run. | 51. | Method (a) is recommended if the medium is likely to contain remnants of, for example, a glass-filter paper and/or insoluble test chemical. This analysis can be performed using a gas chromatograph if a carbon analyser is not available. It is important that the bottles should be at or close to the test temperature when the headspace gas is analysed. Method (b) can be easier for laboratories using carbon analysers to measure IC. It is important that the sodium hydroxide solution (paragraph 21) used to convert CO2 to carbonate is either freshly prepared or its IC content is known, so that this can be taken into account when calculating the test results (see paragraph 66-b.) | Method (a): acidification to pH < 3 | 52. | Before each batch of analyses, the IC analyser is calibrated using an appropriate IC standard (e.g. 1 % w/w CO2 in N2). Concentrated orthophosphoric acid (paragraph 20) is injected through the septum of each bottle sampled to lower the pH of the medium to < 3 (e.g. add 1 ml to 107 ml test medium). The bottles are placed back on the shaker. After shaking for one hour at the test temperature the bottles are removed from the shaker, aliquots (e.g. 1 ml) of gas are withdrawn from the headspace of each bottle and injected into the IC analyser. The measured IC concentrations are recorded as mg C/l. | 53. | The principle of this method is that after acidification to pH < 3 and equilibration at 20 °C, the equilibrium constant for the distribution of CO2 between the liquid and gaseous phases in the test bottles is 1,0 when measured as a concentration (13). This should be demonstrated for the test system at least once as follows: | Set up bottles containing 5 and 10 mg/l as IC using a solution of anhydrous sodium carbonate (Na2 CO3) in CO2-free water prepared by acidifying water to pH 6,5 with concentrated ortho-phosphoric acid (paragraph 20), sparging overnight with CO2-free air and raising the pH to neutrality with alkali. Ensure that the ratio of the headspace volume to the liquid volume is the same as in the tests (e.g. 1:2). Acidify and equilibrate as described in paragraph 52, and measure the IC concentrations of both the headspace and liquid phases. Check that the two concentrations are the same within experimental error. If they are not, the operator should review the procedures. This check on the distribution of IC between liquid and gaseous phases need not be made every time the test is performed; it could presumably be made while performing the calibration. | 54. | If DOC removal is to be measured (water-soluble test chemicals only), samples should be taken of the liquid phase from separate (non-acidified) bottles, membrane-filtered and injected into the DOC analyser. These bottles can be used for other analyses as necessary, to measure primary biodegradation. | Method (b): conversion of CO2 to carbonate | 55. | Before each batch of analyses, the IC analyser is calibrated using an appropriate standard — for example, a solution of sodium bicarbonate (NaHCO3) in CO2 free water (see paragraph 53) in the range 0 to 20 mg/l as IC. Sodium hydroxide solution (7M, paragraph 21) (e.g. 1 ml to 107 ml medium) is injected through the septum of each bottle sampled and the bottles are shaken for 1 h at the test temperature. Use the same NaOH solution on all bottles sacrificed on a particular day, but not necessarily on all sampling occasions throughout a test. If absolute blank IC values are required at all sampling occasions, IC determinations of the NaOH solution will be required each time it is used. The bottles are removed from the shaker and allowed to settle. Suitable volumes (e.g. 50 to 1 000 μl) of the liquid phase in each vessel are withdrawn by syringe. The samples are injected into the IC analyser and the concentrations of IC are recorded. It should be ensured that the analyser used is equipped properly to deal with the alkaline samples produced in this method. | 56. | The principle of this method is that after the addition of alkali and shaking, the concentration of IC in the headspace is negligible. This should be checked for the test system at least once by using IC standards, adding alkali and equilibrating, and measuring the concentration of IC in both the headspace and liquid phases (see paragraph 53). The concentration in the headspace should approach zero. This check on the virtually complete absorption of CO2 need not be made every time the test is performed. | 57. | If DOC removal is to be measured (water-soluble test chemicals only), samples should be taken of the liquid phase from separate bottles (containing no added alkali), membrane filtered and injected into the DOC analyser. These bottles can be used for other analyses, as necessary, to measure primary biodegradability. | DATA AND REPORTING | Calculating of results | 58. | Assuming 100 % mineralisation of the test chemical to CO2, the ThIC in excess of that produced in the blank controls equals the TOC added to each test bottle at the start of the test, that is: | The total mass (mg) of inorganic carbon (TIC) in each bottle is: | Equation [1] | where: | VL | = | volume of liquid in the bottle (litre); | CL | = | concentration of IC in the liquid (mg/l as carbon); | VH | = | volume of the headspace (litre); | CH | = | concentration of IC in the headspace (mg/l as carbon). | The calculations of TIC for the two analytical methods used for measuring IC in this test are described below in paragraphs 60 and 61. Percentage biodegradation (% D) in each case is given by: | Equation [2] | where: | TICt | = | mg TIC in test bottle at time t; | TICb | = | mean mg TIC in blank bottles at time t; | TOC | = | mg TOC added initially to the test vessel. | The percentage biodegradation % D is calculated for the test (FT), reference (FC) and, if included inhibition monitoring control (FI) bottles from the respective amounts of TIC produced up to each sampling time. | 59. | If there has been a significant increase in the TIC content of the sterile controls (FS) over the test period, then it may be concluded that abiotic degradation of the test chemical has occurred and this must be taken into account in the calculation of D in Equation [2]. | Acidification to pH < 3 | 60. | Since acidification to pH < 3 and equilibration results in the equalisation of the concentration of TIC in the liquid and gaseous phases, only the concentration of IC in the gas phase needs to be measured. Thus, from Equation [1] , where VB = volume of the serum bottle. | Conversion of CO2 to carbonate | 61. | In this method calculations are performed as in Equation [1], but the negligible amount of IC in the gaseous phase is ignored, that is , and. | Expression of Results | 62. | A biodegradation curve is obtained by plotting percentage biodegradation, D, against time of incubation and if possible, the lag phase, biodegradation phase, 10-d window and plateau phase, that is the phase in which the maximal degradation has been reached and the biodegradation curve has levelled out, are indicated. If comparable results are obtained for parallel test vessels FT (< 20 % difference), a mean curve is plotted (see Appendix 2, Fig.1); if not, curves are plotted for each vessel. The mean value of the percentage biodegradation in the plateau phase is determined or the highest value is assessed (e.g. when the curve decreases in the plateau phase), but it is important to assess that in the latter case the value is not an outlier. Indicate this maximum level of biodegradation as “degree of biodegradation of the test chemical” in the test report. If the number of test vessels was insufficient to indicate a plateau phase, the measured data of the last day of the test are used to calculate a mean value. This last value, the mean of five replicates, serves to indicate the precision with which the percentage biodegradation was determined. Also report the value obtained at the end of the 10-d window. | 63. | In the same way, a curve for the reference chemical, FC, is plotted and, if included, for the abiotic elimination check, FS and the inhibition control, FI. | 64. | The amounts of TIC present in the blank controls (FB) are recorded as are those in flasks FS (abiotic check), if these vessels were included in the test. | 65. | Calculate D for the FI vessels, based on the theoretical IC yield anticipated from only the reference component of the mixture. If, at day 28, [(DFC (12) – DFI (13)/DFC] × 100 > 25 %, it may be assumed that the test chemical inhibited the activity of the inoculum, and this may account for low values of DFT obtained under the conditions of the test. In this case the test could be repeated using a lower test concentration and preferably reducing the DIC in the inoculum and TIC formed in the blank controls, since the lower concentration will otherwise reduce the precision of the method. Alternatively, another inoculum may be used. If in flask FS (abiotic) a significant increase (> 10 %) in the amount of TIC is observed, abiotic degradation processes may have occurred. | Validity of results | 66. | A test is considered valid if: | (a) | the mean percentage degradation in vessels FC containing the reference chemical is > 60 % by the 14th day of incubation; and | (b) | the mean amount of TIC present in the blank controls FB at the end of the test is > 3 mg C/l. | If these limits are not met, the test should be repeated with an inoculum from another source and/or the procedures used should be reviewed. For example, if high blank IC production is a problem the procedure given in paragraphs 27 to 32 should be followed. | 67. | If the test chemical does not reach 60 % ThIC and was shown not to be inhibitory (paragraph 65), the test could be repeated with increased concentration of inoculum (up to 30 mg/l activated sludge and 100 ml effluent/l) or inocula from other sources, especially if degradation had been in the range 20 to 60 %. | Interpretation of results | 68. | Biodegradation > 60 % ThIC within the 10-d window in this test demonstrates that the test chemical is readily biodegradable under aerobic conditions. | 69. | If the pass value of 60 % ThIC is not attained, determine the pH value in media in bottles which have not been made acid or alkaline; a value of less than 6,5 could indicate that nitrification had occurred. In such a case repeat the test with a buffer solution of higher concentration. | Test Report | 70. | Compile a table of % D for each test (FT), reference (FC) and, if included, inhibition control bottle (FI) for each day sampled. If comparable results are obtained for replicate bottles, plot a curve of mean % D against time. Record the amount of TIC in the blanks (FB) and in the sterile controls (FS) DOC and/or other determinands, and their percentage removal. | 71. | Determine the mean value of % D in the plateau phase, or use the highest value if the biodegradation curve decreases in the plateau phase, and report this as the “degree of biodegradation of the test chemical”. It is important to ensure that in the latter case the highest value is not an outlier. | 72. | The test report must include the following information: | | Test chemical: | — | common name, chemical name, CAS number, structural formula and relevant physical-chemical properties; | — | purity (impurities) of test chemical. | | Test conditions: | — | reference to this Test Method; | — | description of the test system used (e.g. volume of the vessel, head space to liquid ratio, method of stirring, etc.); | — | application of test chemical and reference chemical to test system: test concentration used and amount of carbon dosed into each test bottle, any use of solvents; | — | details of the inoculum used, any pre-treatment and pre-conditioning; | — | incubation temperature; | — | validation of the principle of IC analysis; | — | main characteristics of the IC analyser employed (and any other analytical methods used); | — | number of replicates. | | Results: | — | raw data and calculated values of biodegradability in tabular form; | — | the graph of percentage degradation against time for the test and reference chemicals, the lag phase, degradation phase, 10-d window and slope; | — | percentage removal at plateau, at end of test, and after 10-d window; | — | reasons for any rejection of the test results; | — | any other facts that are relevant to the procedure followed; | — | discussion of results. | LITERATURE: | (1) | Chapter C.4 of this Annex Determination of “Ready” Biodegradability — CO2 Evolution Test (Method C.4-C). | (2) | Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167. | (3) | Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161. | (4) | Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210. | (5) | ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution Test (Sturm). | (6) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835.3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (7) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (8) | Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929. | (9) | Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812. | (10) | Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185. | (11) | Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53. | (12) | Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243. | (13) | Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211. | (14) | Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524. | (15) | Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550. | (16) | ISO 14593, (1999) Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (CO2 headspace test). | (17) | Battersby NS (1997). The ISO headspace CO2 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822. | (18) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC. | (19) | Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An “inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235. | (20) | Chapter C.4 of this Annex, Determination of “Ready” Biodegradability. | (21) | OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris. | (22) | Chapter C.11 of this Annex, Activated sludge respiration inhibition test. | (23) | Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327. | (24) | EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK. | (25) | ISO 10634 (1996) Water Quality — Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. | Appendix 1 | ABBREVIATIONS AND DEFINITIONS | IC: Inorganic carbon | ThCO2 : Theoretical carbon dioxide (mg) is the quantity of carbon dioxide calculated to be produced from the known or measured carbon content of the test chemical when fully mineralised; also expressed as mg carbon dioxide evolved per mg test chemical. | DOC: Dissolved organic carbon is the organic carbon present in solution or that which passes through a 0,45 micrometre filter or remains in the supernatant after centrifuging at approx. 4 000 g (about 40 000 m sec-2) for 15 min. | DIC: Dissolved inorganic carbon | ThIC: Theoretical inorganic carbon | TIC: Total inorganic carbon | Readily biodegradable: An arbitrary classification of chemicals which have passed certain specified screening tests for ultimate biodegradability; these tests are so stringent that it is assumed that such chemicals will rapidly and completely biodegrade in aquatic environments under aerobic conditions. | 10-d window: The 10 days immediately following the attainment of 10 % biodegradation. | Inherent biodegradability: A classification of chemicals for which there is unequivocal evidence of biodegradation (primary or ultimate) in any test of biodegradability. | Ultimate aerobic biodegradation: The level of degradation achieved when the test chemical is totally utilised by micro-organisms resulting in the production of carbon dioxide, water, mineral salts and new microbial cellular constituents (biomass). | Mineralisation: Mineralisation is the complete degradation of an organic chemical to CO2 and H2O under aerobic conditions, and CH4, CO2 and H2O under anaerobic conditions. | Lag phase: The time from the start of a test until acclimatization and/or adaptation of the degrading microorganisms is achieved and the biodegradation degree of a test chemical or organic matter has increased to a detectable level (e.g. 10 % of the maximum theoretical biodegradation, or lower, dependent on the accuracy of the measuring technique). | Degradation phase: The time from the end of the lag period to the time when 90 % of the maximum level of degradation has been reached. | Plateau phase: Plateau phase is the phase in which the maximal degradation has been reached and the biodegradation curve has levelled out. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Example of a biodegradation curve | Figure 1 | Biodegradation of 1-octanol in the CO2 headspace test | Glossary | Biodegradation: | Degradation phase: | Maximum level of biodegradation: | Plateau phase: | 10-d(ay) window: | Test time (days): | C. 30. BIOACCUMULATION IN TERRESTRIAL OLIGOCHAETES | INTRODUCTION | 1. | This Test Method is equivalent to OECD Test Guideline (TG) 317 (2010). Among the Test Methods relating to environmental fate, the Bioconcentration: Flow-through Fish Test (chapter C.13 of this Annex (49)) and the Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochaetes (53) were published in 1996 and 2008 respectively. The extrapolation of aquatic bioaccumulation data to terrestrial organisms like earthworms is difficult, if possible at all. Model calculations based on a test chemical’s lipophilicity, e.g. (14) (37), are currently used for the assessment of bioaccumulation of chemicals in soil, as e.g. in the EU Technical Guidance Document (19). The need for a compartment-specific test method has already been addressed, e.g. (55). Such a method is especially important for the evaluation of secondary poisoning in terrestrial food chains (4). Several national test methods address the issue of bioaccumulation in organisms other than fish e.g. (2) and (72). A method on the measurement of bioaccumulation from contaminated soils in earthworms (Eisenia fetida, Savigny) and potworms has been developed by the American Society for Testing and Materials (3). An internationally accepted method for the determination of bioaccumulation in spiked soil will improve the risk assessment of chemicals in terrestrial ecosystems e.g. (25) (29). | 2. | Soil-ingesting invertebrates are exposed to soil bound chemicals. Among these animals, terrestrial oligochaetes play an important role in the structure and function of soils (15) (20). Terrestrial oligochaetes live in soil and partly at the soil surface (especially the litter layer); they frequently represent the most abundant species in terms of biomass (54). By bioturbation of the soil and by serving as prey these animals can have a strong influence on the bioavailability of chemicals to other organisms like invertebrates (e.g. predatory mites and beetles; e.g. (64)) or vertebrate (e.g. foxes and gulls) predators (18) (62). Some species of terrestrial oligochaetes currently used in ecotoxicological testing are described in Appendix 5. | 3. | The ASTM Standard Guide for Conducting Laboratory Soil Toxicity or Bioaccumulation Tests with the Lumbricid Earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid Potworm Enchytraeus albidus (3) provides many essential and useful details for the performance of the present soil bioaccumulation Test Method. Further documents that are referred to in this Test Method are chapter C.13 of this Annex, Bioconcentration: Flow-through Fish Test (49) and OECD TG 315: Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates (53). Practical experience with soil bioaccumulation studies and publications from LITERATURE e.g. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79) are also major sources of information for this Test Method. | 4. | This Test Method is mostly applicable to stable, neutral organic chemicals, which tend to adsorb to soils. Testing for bioaccumulation of soil-associating, stable metallo-organic compounds may be possible with this Test Method. It is also applicable to metals and other trace elements. | PRE-REQUISITE | 5. | Tests for measuring the bioaccumulation of a chemical in terrestrial oligochaetes have been performed with heavy metals (see e.g. (63)) and persistent, organic chemicals having log Kow values between 3,0 and 6,0, e.g. (40). Such tests also apply to: | — | Chemicals that show a log Kow of more than 6,0 (super-hydrophobic chemicals); | — | Chemicals which belong to a class of organic chemicals known to have the potential to bioaccumulate in living organisms, e.g. surface active or highly adsorptive chemicals; | — | Chemicals that indicate the potential for bioaccumulation from structural features, e.g. analogues of chemicals with known bioaccumulation potential; and | — | Metals. | 6. | Information on the test chemical such as common name, chemical name (preferably IUPAC name), structural formula, CAS registry number, purity, safety precautions, proper storage conditions and analytical methods should be obtained before beginning the study. In addition, the following information should be known: | (a) | solubility in water; | (b) | octanol-water partition coefficient, Kow; | (c) | soil-water partition coefficient, expressed as Koc; | (d) | vapour pressure; | (e) | degradability (e.g. in soil, water); | (f) | known metabolites. | 7. | Radiolabelled or non-radiolabelled test chemicals can be used. However, to facilitate analysis it is recommended to use a radiolabelled test chemical. The decision will be made based on the detection limits or a requirement to measure parent test chemical and metabolites. If a radiolabelled test chemical is used and total radioactive residues are measured, it is important that the radiolabelled residues in both the soil and the test organisms are characterised for percentages of parent test chemical and labelled non-parent, e.g. in samples taken at steady state or at the end of the uptake phase, to allow a bioaccumulation factor (BAF) calculation for the parent test chemical and for the soil metabolites of concern (see paragraph 50). The method described here may have to be modified, e.g. to provide sufficient biomass, for measuring non-radiolabelled organic test chemical or metals. When total radioactive residues are measured (by liquid scintillation counting following extraction, combustion or tissue solubilisation), the bioaccumulation factor is based on the parent test chemical and metabolites. The BAF calculation should preferably be based on the concentration of the parent test chemical in the organisms and total radioactive residues. Subsequently, the biota-soil accumulation factor (BSAF), normalized to the lipid content of worm and organic carbon content (OC) of soil should be calculated from the BAF for reasons of comparability between results from different bioaccumulation tests. | 8. | Toxicity of the test chemical to the species used in the test should be known, e.g. an effect concentration (ECx) or lethal concentration (LCx) for the time of the uptake phase (e.g. (19)). The selected concentration of the test chemical should preferably be about 1 % of its acute asymptotic LC50, and at least 10-fold higher than its detection limit in soil by the analytical method used. If available, preference should be given to toxicity values derived from long-term studies on sublethal endpoints (51) (52). If such data are not available, an acute toxicity test will provide useful information (see e.g. (23)). | 9. | An appropriate analytical method of known accuracy, precision, and sensitivity for the quantification of the chemical in the test solutions, in the soil, and in the biological material should be available, together with details of sample preparation and storage as well as material safety data sheets. Analytical detection limits of the test item in soil and worm tissue should also be known. If a 14C-labelled test chemical is used, the specific radioactivity (i.e. Bq mol-1) and the percentage of radioactivity associated with impurities should be known. The specific radioactivity of the test chemical should be high enough to facilitate analysis, and the test concentrations used should not elicit toxic effects. | 10. | The test can be performed with an artificial soil or with natural soils. Information on characteristics of the natural soil used, e.g. origin of soil or its constituents, pH, organic carbon content, particle size distribution (percent sand, silt, and clay), and water holding capacity (WHC), should be known before the start of the test (3) (48). | PRINCIPLE OF THE TEST | 11. | The parameters which characterise the bioaccumulation of a test chemical include the bioaccumulation factor (BAF), the uptake rate constant (ks) and the elimination rate constant (ke). Definitions are provided in Appendix 1. | 12. | The test consists of two phases: the uptake (exposure) phase and the elimination (post-exposure) phase. During the uptake phase, replicated groups of worms are exposed to soil, which has been spiked with the test chemical. In addition to the test animals, groups of control worms are held under identical conditions without the test chemical. The dry weight and lipid content of the test organisms are measured. This can be done using worms of the control group. Analytical background values (blank) can be obtained by analysing samples of the control worms and soil. For the elimination phase, the worms are transferred to a soil free of the test chemical. An elimination phase is always required unless uptake of the test chemical during the exposure phase has been insignificant. An elimination phase provides information on the rate at which the test chemical is excreted by the test organisms (e.g. (27)). If a steady state has not been reached during the uptake phase, the determination of the kinetic parameters – kinetic bioaccumulation factor BAFk, uptake and elimination rate constant(s) – should preferably be based on simultaneous fitting of the results of the uptake and elimination phases. The concentration of the test chemical in/on the worms is monitored throughout both phases of the test. | 13. | During the uptake phase, measurements are made at sampling times up to 14 days (enchytraeids) or 21 days (earthworms) until the steady state is reached (11) (12) (67). The steady state occurs when a plot of the concentration in worms against time is parallel to the time axis, and three successive concentration analyses made on samples taken at intervals of at least two days do not vary more than ± 20 % of each other based on statistical comparisons (e.g. analysis of variance, regression analysis). | 14. | The elimination phase consists of transferring the test organisms to vessels containing the same substrate without the test chemical. During the elimination phase, measurements are made at sampling times during 14 days (enchytraeids) or 21 days (earthworms) unless earlier analytical determination showed 90 % reduction of the test chemical residues in worms. The concentration of the test chemical in the worms at the end of the elimination phase is reported as non-eliminated residues. The steady state bioaccumulation factor (BAFss) is calculated preferably both as the ratio of the concentration in worms (Ca) and in the soil (Cs) at apparent steady state, and as a kinetic bioaccumulation factor, BAFK, as the ratio of the rate constant of uptake from soil (ks) and the elimination rate constant (ke) (see Appendix 1 for definitions) assuming first-order kinetics (see Appendix 2 for calculations). If first-order kinetics is obviously not applicable, other models should be employed. | 15. | The uptake rate constant, the elimination rate constant (or constants, where other models are involved), the kinetic bioaccumulation factor (BAFK), and where possible, the confidence limits of each of these parameters are calculated from computerised model equations (see Appendix 2 for guidance). The goodness of fit of any model can be determined from e.g. the correlation coefficient or the coefficient of determination (coefficients close to one indicate a good fit) or chi-squared. Also the size of the standard error or confidence limit around the estimated parameters may be indicative of the goodness of fit of the model. | 16. | To reduce variability in test results for test chemicals with high lipophilicity, bioaccumulation factors should be expressed in relation to lipid content and organic carbon content (kg soil organic carbon (OC) kg-1 worm lipid content). This approach is based on the fact that for some chemical classes, there is a clear relationship between the potential for bioaccumulation and lipophilicity; this has been well established for fish (47). There is a relationship between the lipid content of fish and the bioaccumulation of such chemicals. For benthic organisms, similar correlations have been found e.g. (30) (44). Likewise for terrestrial oligochaetes this correlation has been demonstrated e.g. (5) (6) (7) (14). If sufficient worm tissue is available, the lipid content of the test animals can be determined on the same biological material as the one used to determine the concentration of the test chemical. Alternatively, control animals can be used to measure the lipid content. | VALIDITY OF THE TEST | 17. | For a test to be valid the following criteria should be fulfilled for both controls and treatments: | — | At the end of the test, the overall mortality during uptake and elimination phase should not exceed 10 % (earthworms) or 20 % (enchytraeids) of the total number of the introduced worms. | — | For Eisenia fetida and Eisenia andrei, the mean mass loss as measured at the end of the uptake and at the end of the elimination phase should not exceed 20 % compared to the initial fresh weight (f.w.) at start of each phase. | DESCRIPTION OF THE METHOD | Test species | 18. | Several species of terrestrial oligochaetes are recommended for bioaccumulation testing. The most commonly used species Eisenia fetida or Eisenia andrei (Lumbricidae), or Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, or Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae)) are described in Appendix 5. | Apparatus | 19. | Care should be taken to avoid the use of materials, for all parts of the equipment, which can dissolve, adsorb the test chemical or leach other chemicals, and have an adverse effect on the test animals. Standard rectangular or cylindrical vessels, made of chemically inert material and of suitable capacity can be used in compliance with the loading rate, i.e. the number of test worms. Stainless steel, plastic or glass may be used for any equipment having contact with the test media. The test vessels should be appropriately covered to prevent escaping of the worms, while allowing sufficient air supply. For chemicals with high adsorption coefficients, such as synthetic pyrethroids, silanised glass may be required. In these situations the equipment will have to be discarded after use (49). Radiolabelled test items and volatile chemicals should be prevented from escaping. Traps (e.g. glass gas washing bottles) should be employed containing suitable absorbents to retain any residues evaporating from the test vessels. | Soil | 20. | The test soil should be of a quality that will allow the survival and preferably the reproduction of the test organisms for the duration of the acclimation and test periods without them showing any abnormal appearance or behaviour. The worms should burrow in the soil. | 21. | The artificial soil described in the chapter C.8 of this Annex (48) is recommended for use as the substrate in the tests. Preparation of the artificial soil for use in the bioaccumulation tests and recommendations for the storage of artificial soil are given in Appendix 4. Air-dried artificial soil may be stored at room temperature until use. | 22. | However, natural soils from unpolluted sites may serve as test and/or culture soil. Natural soils should be characterised at least by origin (collection site), pH, organic carbon content, particle size distribution (percent sand, silt, and clay), maximum water holding capacity (WHCmax), and percent water content (3). Analysis of the soil or its constituents for micro-pollutants prior to use should provide useful information. If field soil from agricultural land is used, it should not have been treated with crop protection products or with manure from treated animals as fertilizers for at least one year and with organic fertilizers for at least six months prior to sampling (50). Manipulation procedures for natural soils prior to use in ecotoxicological tests with oligochaetes in the laboratory are described in (3). For natural soils the storage time in the laboratory should be kept as short as possible. | Application of the test chemical | 23. | The test chemical is incorporated into the soil. The physicochemical properties of the test chemical should be taken into consideration. A water-soluble test chemical should be completely dissolved in water before it be mixed with the soil. The recommended spiking procedure for poorly water-soluble test chemical involves coating of one or more of the (artificial) soil constituents with the test chemical. For example, the quartz sand, or a portion thereof, can be soaked with a solution of the test chemical in a suitable organic solvent, which is then slowly evaporated to dryness. The coated fraction can then be mixed into the wet soil. The major advantage of this procedure is that no solvent is introduced into the soil. When a natural soil is used, the test chemical may be added by spiking an air-dried portion of the soil as described above for the artificial soil, or by stirring the test chemical into the wet soil, with subsequent evaporating step if a solubilising agent is used. In general, the contact of wet soil with solvents should be avoided as far as possible. The following should be considered (3): | — | If a solvent other than water is used, it should be one that is water-miscible and/or can be driven off (for example, evaporated), leaving only the test chemical on the soil. | — | If a solvent control is used, there is no need for negative control. The solvent control should contain the highest concentration of solvent added to the soil and should use solvent from the same batch used to make the stock solution. Toxicity and volatility of the solvent, and solubility of the test chemical in the chosen solvent should be the main criteria used for the selection of a suitable solubilising agent. | 24. | For chemicals that are poorly soluble in water and in organic solvents, 2,0-2,5 g of finely ground quartz sand per test vessel can be mixed with the quantity of test chemical, e.g. using mortar and pestle, to obtain the desired test concentration. This mixture of quartz sand and test chemical is added to the pre-moistened soil and thoroughly mixed with an appropriate amount of de-ionised water to obtain the required moisture content. The final mixture is distributed to the test vessels. The procedure is repeated for each test concentration, and an appropriate control with 2,0-2,5 g of finely ground quartz sand per test vessel is also prepared. | 25. | The concentration of the test chemical in the soil should be determined after spiking. The homogenous distribution of the test chemical into the soil should be verified before introducing the test organisms. The method used for spiking, and the reasons for choosing a specific spiking procedure should be reported (24). | 26. | Equilibrium between the soil and the pore-water phase should ideally be established before adding the organisms; a time period of four days at 20 °C is recommended. For many poorly water-soluble organic chemicals the time required to reach a true equilibrium between adsorbed and dissolved fractions can be counted in days or months. Depending on the purpose of the study, for example when the environmental conditions are to be mimicked, the spiked soil may be “aged” for a longer period, e.g. for metals three weeks at 20 °C (22). | Culturing of the test organisms | 27. | Worms should be preferably kept in permanent laboratory culture. Guidance on laboratory culture methods for Eisenia fetida and Eisenia andrei, and Enchytraeid species, is provided in Appendix 5 (see also (48) (51) (52)). | 28. | The worms used in the tests should be free from observable diseases, abnormalities and parasites. | PERFORMANCE OF THE TEST | 29. | The test organisms are exposed to the test chemical during the uptake phase. The uptake phase should be of 14 days (enchytraeids) or 21 days (earthworms) unless it is demonstrated that steady state has been reached. | 30. | For the elimination phase, the worms are transferred to a soil free of test chemical. The first sample should be taken at 4-24 h after the start of elimination phase. Examples of sampling schedules for a 21-day uptake phase and a 21-day elimination phase are given in Appendix 3. | Test organisms | 31. | For many species of terrestrial enchytraeids the individual weight is very low (e.g. 5-10 mg wet weight per individual for Enchytraeus albidus and less for Enchytraeus crypticus or Enchytraeus luxuriosus); in order to perform the weight measurements and chemical analysis, it may be necessary to pool the worms of the replicate test vessels (i.e. all the worms of a replicate vessel will be used for obtaining one analytical tissue result). 20 individual enchytraeids are added to each replicate, and at least three replicates should be used. If the analytical detection limit of the test chemical is high, more worms may be necessary. For test species with higher individual weight (Eisenia fetida and Eisenia andrei), replicate vessels containing one individual can be used. | 32. | The earthworms used in a test should be of similar weight (e.g. Eisenia fetida and Eisenia andrei should have an individual weight of 250-600 mg). Enchytraeids (e.g. Enchytraeus albidus) should have a length of approximately 1 cm. All worms used in a particular test should come from the same source, and should be adult animals with clitellum (see Appendix 5). Since the weight and age of an animal might have an effect on the BAF-values (e.g. due to varying lipid content and/or presence of eggs), these parameters should be recorded accurately and taken into account in the interpretation of results. In addition, cocoons can be deposited during the exposure period, which will also have an impact on the BAF values. It is recommended that a sub-sample of the test worms be weighed before the test in order to estimate the mean wet and dry weights. | 33. | A high soil-to-worm ratio should be used in order to minimise the decrease of the test chemical concentration in the soil during the uptake phase. For Eisenia fetida and Eisenia andrei a minimum amount of 50 g dry weight (d.w.) of soil per worm, and for enchytraeids, a minimum of 10-20 g d.w. of soil per test vessel are recommended. The vessels should contain a soil layer of 2-3 cm (enchytraeids) or 4-5 cm (earthworms). | 34. | The worms used in a test are removed from the culture (e.g. enchytraeids by using jeweller’s tweezers). Adult animals are transferred to non-treated test soil for acclimation, and fed (see paragraph 36). If the test conditions differ from the culture conditions, an acclimation phase of 24-72 h should be sufficient to adapt the worms to the test conditions. After acclimation, earthworms are rinsed by transfer to glass dishes (e.g. petri dishes) containing clean water, and subsequently weighed before they are added to the test soil. Prior to weighing, excess water should be removed from the worms by gently touching them against the edge of the dish or by blotting them cautiously dry by using a slightly moistened paper towel. | 35. | Burrowing behaviour of the test organisms should be observed and recorded. In tests with earthworms, the animals (control and treatments) normally burrow in the soil within a period of a few hours; this should be checked no later than 24 h after addition of the worms to the test vessels. If the earthworms fail to burrow in the soil (e.g. more than 10 % over more than half of the uptake phase), this indicates that either the test conditions are not appropriate or the test organisms are not healthy. In such a case the test should be stopped and repeated. Enchytraeids mainly live in the interstitial pores of the soil, and frequently their integument may be only partly in contact with the surrounding substrate; exposure of burrowing and non-burrowing enchytraeids is assumed to be equivalent and non-burrowing of the enchytraeids does not necessarily require the repetition of the test. | Feeding | 36. | Feeding should be envisaged when a soil with low total organic carbon content is used. When an artificial soil is used, a weekly feeding rate (i.e. the worms should be fed once a week) of 7 mg of dried dung per g soil dry weight is recommended for earthworms, and a weekly rate of 2-2,5 mg of ground oat flakes per g soil dry weight is recommended for enchytraeids (11). The first food ration should be mixed with the soil immediately before the test organisms are added. Preferably the same type of food like in the cultures should be used (see Appendix 5). | Light and temperature | 37. | The tests should be carried out under a controlled 16/8 hours light/dark cycle, preferably 400 to 800 lx in the area of the test vessels (3). The test temperature should be 20 ± 2 °C throughout the test. | Test concentrations | 38. | A single concentration is used. Situations where additional concentration(s) is(are) required should be justified. If toxicity (ECx) of the test chemical is close to the analytical detection limit, the use of radiolabelled test chemical with high specific radioactivity is recommended. For metals, the concentration should be above the background level in tissue and soil. | Replicates | 39. | For the kinetic measurements (uptake and elimination phase), the minimum number of treated replicate vessels should be three per sampling point. The total number of replicates prepared should be sufficient to cover all sampling times during the uptake and the elimination phase. | 40. | For the biological observations and measurements (e.g. dry-to-wet weight ratio, lipid content) and for the analysis of background concentrations in worms and soil, at least 12 replicate vessels of a negative control (four sampled at start, four at end of uptake, and four at end of elimination) should be provided if no solvent other than water is used. If any solubilising agent is used for application of the test chemical, a solvent control (four replicate vessels should be sampled at start, four at the end of the uptake phase, and four at the end of the elimination phase) containing all constituents except for test item should be run in addition to the treated replicates. In this case, four additional replicate vessels of a negative control (no solvent) may also be provided for optional sampling at the end of the uptake phase. These replicates can be compared biologically with the solvent control in order to gain information on a possible influence of the solvent on the test organisms. It is recommended establishing a sufficient number of additional reserve replicate vessels (e.g. eight) for treatment and control(s). | Frequency of soil quality measurements | 41. | Soil pH, soil moisture content and the temperature (continuously) in the test room should be measured at the start and end of the uptake and elimination phases. Once per week the soil moisture content should be controlled by weighing the test vessels and comparing actual weights with initial weights at test start. Water losses should be compensated by adding deionised water. | Sampling and analysis of worms and soil | 42. | An example of schedule for the uptake and elimination phases in earthworm and enchytraeid bioaccumulation tests is given in Appendix 3. | 43. | The soil is sampled from the test vessels for the determination of test chemical concentration before inserting the worms, and during the uptake and elimination phases. During the test the concentrations of test chemical are determined in the worms and the soil. In general, total soil concentrations are measured. As an option, concentrations in pore water may be measured; in such case, rationale and appropriate methods should be provided prior to initiation of a study, and included in the report. | 44. | The worms and soil are sampled at least at six occasions during the uptake and the elimination phases. If the stability of a test chemical is demonstrated, the number of soil analyses can be reduced. It is recommended analysing at least three replicates at the beginning and at the end of the uptake phase. If the concentration in soil measured at the end of the uptake phase deviates from the initial concentration by more than 30 %, the soil samples taken at other dates should also be analysed. | 45. | Remove the worms of a given replicate from the soil at each sampling time (e.g. after spreading the soil of the replicate on a shallow tray and picking the worms using soft jewellers’ tweezers), rinse them quickly with water in a shallow glass or steel tray. Remove excess water (see paragraph 34). Transfer the worms carefully to a pre-weighed vessel, weigh them instantly, including gut content. | 46. | The earthworms (Eisenia sp.) should then be allowed to purge their gut overnight e.g. on a moist filter paper in a covered petri dish (see paragraph 34). After purging, the weight of the worms should be determined in order to assess a possible decrease in biomass during the test (see validity criteria in paragraph 17). Weighing and tissue analysis of Enchytraeids is carried out without purging, as this is technically difficult due to the small size of these worms. After final weight determination, the worms should be killed immediately, using the most appropriate method (e.g. using liquid nitrogen, or freezing at temperatures below – 18 °C). | 47. | During the elimination phase, the worms replace contaminated gut contents with clean soil. This means, measurements in un-purged worms (enchytraeids in this context) sampled immediately before the elimination phase include contaminated gut soil. For aquatic oligochaetes it is assumed that after the initial 4-24 h of the elimination phase, most of the contaminated gut content has been replaced by clean sediment e.g. (46). Similar findings have been reported for earthworms in studies on the accumulation of radiolabelled cadmium and zinc (78). In the non-purged enchytraeids, the concentration of this first sample of the elimination phase may be considered as the tissue concentration after gut purge. To account for dilution of the test item concentration by uncontaminated soil during the elimination phase, the weight of the gut content may be estimated from worm wet weight/worm ash weight or worm dry weight/worm ash weight ratios. | 48. | The soil and worm samples should be preferably analysed immediately after removal (i.e. within 1-2 days) in order to prevent degradation or other losses, and it is recommended calculating the approximate uptake and elimination rates as the test proceeds. If the analysis is delayed, the samples should be stored by an appropriate method, e.g. by deep-freezing (≤ – 18 °C). | 49. | It should be checked that the precision and reproducibility of the chemical analysis, as well as the recovery of the test chemical from soil and worm samples are satisfactory for the given method; the extraction efficiency, the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) should be reported. Likewise it should be checked that the test chemical is not detectable in the control vessels in concentrations higher than background. When the concentration of the test chemical in the test organism Ca is > 0 in the control worms, this should be included in the calculation of the kinetic parameters (see Appendix 2). All samples should be handled throughout the test to minimise contamination and loss (e.g. resulting from adsorption of the test chemical on the sampling device). | 50. | When working with radiolabelled test chemicals, it is possible to analyse parent and metabolites. Quantification of parent test chemical and metabolites at steady state or at the end of the uptake phase provides important information. The samples should then be “cleaned up” so that the parent test chemical can be quantified separately. If single metabolites exceed 10 % of total radioactivity in the analysed sample(s), the identification of these metabolites is recommended. | 51. | The overall recovery, and the recovery of test chemical in worms, soil, and if used, in traps containing absorbents to retain evaporated test chemical, should be recorded and reported. | 52. | Pooling of the individuals sampled from a given test vessel is acceptable for enchytraeid worms which are smaller than earthworms. If pooling involves the reduction of the number of replicates, this limits the statistical procedures which can be applied to the data. If a specific statistical procedure and power are required, then an adequate number of replicate test vessels should be included in the test to accommodate the desired pooling, procedure and power. | 53. | It is recommended that the BAF be expressed both as a function of total dry weight and, when required (i.e. for highly hydrophobic chemicals), as a function of the lipid content. Suitable methods should be used for determination of lipid content (some existing methods – e.g. (31) (58) – should be adapted for this purpose). These methods use a chloroform/methanol extraction technique. However, to avoid the use of chlorinated solvents, a modification of the Bligh and Dyer method (9) as described in (17) should be used. Since the various methods may not give identical values, it is important to give details of the method used. When possible, i.e. if sufficient worm tissue is available, the lipid analysis should ideally be made on the same sample or extract as the one used for analysis of the test chemical, since the lipids often have to be removed from the extract before it can be analysed chromatographically (49). Alternatively, control animals may be used to measure the lipid content, which can then be used to normalise BAF values. This latter approach reduces the contamination of equipment with the test chemical. | DATA AND REPORTING | Treatment of results | 54. | The uptake curve of the test chemical is obtained by plotting its concentration in/on the worms during the uptake phase against time on arithmetic scales. When the curve has reached a plateau, or steady state (see definitions in Appendix 1), the steady state bioaccumulation factor BAFss is calculated from: | Ca is the concentration of test chemical in the test organism | Cs is the concentration of test chemical in the soil | 55. | When no steady state is reached, the BAFK, based on the rate constants, should be determined instead of BAFss, as described below: | — | Determine the accumulation factor (BAFK) as the ratio ks/ke. | — | Uptake and elimination rates are preferably calculated simultaneously (see Equation 11 in Appendix 2) | — | The elimination rate constant (ke) is usually determined from the elimination curve (i.e. a plot of the concentration of the test item in the worms during the elimination phase). The uptake rate constant ks is then calculated given ke and a value of Ca which is derived from the uptake curve – See Appendix 2 for a description of these methods. The preferred method for obtaining BAFK and the rate constants, ks, and ke, is to use non-linear parameter estimation methods on a computer. If the elimination is obviously not first-order, then more complex models should be employed. | Test report | 56. | The test report should include the following information: | | Test chemical: | — | Any available information on acute or long term toxicity (e.g. ECx, LCx„ NOEC) of the test chemical towards soil-dwelling oligochaetes; | — | purity, physical nature and, physicochemical properties e.g. log Kow, water solubility; | — | chemical identification data; source of the test item, identity and concentration of any solvent used; | — | if radiolabelled test chemical is used, the precise position of the labelled atoms, the specific radioactivity, and the radiochemical purity. | | Test species: | — | scientific name, strain, source, any pre-treatment, acclimation, age, size-range, etc.. | | Test conditions: | — | test procedure used; | — | type and characteristics of illumination used and photoperiod(s); | — | test design (e.g. number and size of test vessels, soil mass and height of soil layer, number of replicates, number of worms per replicate, number of test concentrations, duration of uptake and elimination phases, sampling frequency); | — | rationale for the choice of test vessel material; | — | method of test item preparation and application as well as reasons for choosing a specific method; | — | the nominal test concentrations, the means of the measured values and their standard deviations in the test vessels, and the method by which these values were obtained; | — | source of the constituents of the artificial soil or – if natural media are used – origin of the soil, description of any pre-treatment, results of the controls (survival, biomass development, reproduction), soil characteristics (pH, total organic carbon content, particle size distribution (percent sand, silt, and clay), WHCmax, percent water content at start and at end of the test, and any other measurements made); | — | detailed information on the treatment of soil and worm samples, including details of preparation, storage, spiking procedures, extraction, and analytical procedures (and precision) for the test item in worms and soil, and lipid content (if measured), and recoveries of the test item. | | Results: | — | mortality of the control worms and the worms in each test vessel and any observed abnormal behaviour (e.g. soil avoidance, lack of reproduction in a bioaccumulation test with enchytraeids); | — | the dry weight to wet weight ratio of the soil and the test organisms (useful for normalisation); | — | the wet weights of the worms at each sampling time; for earthworms, the wet weights at start of the test, and at each sampling time before and after gut purging; | — | the lipid content of the test organisms (if determined); | — | curves, showing the uptake and elimination kinetics of the test chemical in the worms, and the time to steady state; | — | Ca and Cs (with standard deviation and range, if appropriate) for all sampling times (Ca expressed in g kg–1 wet and dry weight of whole body, Cs expressed in g kg–1 wet and dry weight of soil). If a biota-soil accumulation factor (BSAF) is required (e.g. for comparison of results from two or more tests performed with animals of differing lipid content), Ca may additionally be expressed as g kg–1 lipid content of the organism, and Cs may be expressed as g kg–1 organic carbon (OC) of the soil; | — | BAF (expressed in kg soil·kg–1 worm), soil uptake rate constant ks (expressed in g soil kg–1 of worm day–1), and elimination rate constant ke (expressed in day–1); BSAF (expressed in kg soil OC kg–1 worm lipid content) may be reported additionally; | — | if measured: percentages of parent chemical, metabolites, and bound residues (i.e. the percentage of test chemical that cannot be extracted with common extraction methods) detected in soil and test animals; | — | methods used for the statistical analyses of data. | | Evaluation of results: | — | compliance of the results with the validity criteria as listed in paragraph 17; | — | unexpected or unusual results, e.g. incomplete elimination of the test chemical from the test animals. | LITERATURE: | (1) | Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Master thesis, University Coimbra. | (2) | ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. American Society for Testing and Materials, E 1688-00a. | (3) | ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 pp. | (4) | Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. In Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (Vol. editor: B. Beek): Bioaccumulation — New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276. | (5) | Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99. | (6) | Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154-165. | (7) | Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191. | (8) | Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13. | (9) | Bligh EG and Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917. | (10) | Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 p. | (11) | Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R & D No.: 29864416. | (12) | Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196. | (13) | Conder JM and Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13-20. | (14) | Connell DW and Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100. | (15) | Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2-29. | (16) | Didden W (2003). Oligochaeta, In: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (eds.). Elsevier Science Ltd, The Netherlands, pp. 555-576. | (17) | De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme. | (18) | Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145. | (19) | Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC (OJ L 396, 30.12.2006, p. 1). | (20) | Edwards CA and Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. Third Edition, Chapman & Hall, London, 426 pp. | (21) | OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris | (22) | Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th and Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R & D No.: 20467458: 149 pp. Available for download at: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf. | (23) | Elmegaard N and Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 pp. | (24) | Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30. | (25) | EPPO (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208. | (26) | Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897-1905. | (27) | Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501-1514. | (28) | Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Dissertation University Mainz, 156 pp. | (29) | Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF — Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78-84. | (30) | Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231. | (31) | Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099-1105. | (32) | Hawker DW and Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707. | (33) | Hund-Rinke K and Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20. | (34) | Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81. | (35) | ISO 11268-2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction. | (36) | Jaenike J (1982). “Eisenia foetida” is two biological species. Megadrilogica 4: 6-8. | (37) | Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090. | (38) | Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961. | (39) | Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775. | (40) | Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404. | (41) | Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312. | (42) | Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232. | (43) | Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Dissertation University München, 137 pp. | (44) | Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595. | (45) | Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26. | (46) | Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249. | (47) | Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, In: R. Nagel and R. Loskill (eds.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim. | (48) | Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms | (49) | Chapter C.13 of this Annex, Bioconcentration: flow-through fish test. | (50) | Chapter C.21 of this annex, Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test. | (51) | OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris. | (52) | OECD (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris. | (53) | OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paris. | (54) | Petersen H and Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287-388. | (55) | Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378-396. | (56) | Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser-Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81. | (57) | Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No 607506001, Bilthoven. | (58) | Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436. | (59) | Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 S. | (60) | Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 pp. | (61) | Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129. | (62) | Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W, Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127. | (63) | Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). LITERATURE-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120. | (64) | Schlosser H-J and Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433. | (65) | Schmelz R and Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93–100. | (66) | Sims R W and Gerard BM (1985). Earthworms, In: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No 31.171 S. London: E. J. Brill/Dr W. Backhuys. | (67) | Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563. | (68) | Spacie A and Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320. | (69) | Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. In: Advances in earthworm ecotoxicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (eds.). Setac Press, Pensacola, 67-81. | (70) | Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171. | (71) | UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation — Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin. | (72) | US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000. | (73) | Van Brummelen TC and Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285. | (74) | Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, In: Ecotoxicology of Earthworms (Ed. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB). | (75) | Van Gestel CA and Ma W-C (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023-1033. | (76) | Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409-417. | (77) | Venter JM and Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165. | (78) | Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851. | (79) | Widianarko B and Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406. | Appendix 1 | DEFINITIONS | Bioaccumulation is the increase in concentration of the test chemical in or on an organism relative to the concentration of the test chemical in the surrounding medium. Bioaccumulation results from both bioconcentration and biomagnification processes (see below). | Bioconcentration is the increase in concentration of the test chemical in or on an organism, resulting from the uptake of the chemical exclusively from the surrounding medium (i.e. via the body surface and ingested soil), relative to the concentration of the test chemical in the surrounding medium. | Biomagnification is the increase in concentration of the test chemical in or on an organism, resulting mainly from uptake from contaminated food or prey, relative to the concentration of the test chemical in the food or prey. Biomagnification can lead to a transfer or accumulation of the test item within food webs. | The elimination of a test chemical is the loss of this chemical from the test organism tissue by active or passive processes that occurs independently of presence or absence of the test item in the surrounding medium. | The bioaccumulation factor (BAF) at any time during the uptake phase of this bioaccumulation test is the concentration of test chemical in/on the test organism (Ca in g·kg-1 dry weight of worm) divided by the concentration of the chemical in the surrounding medium (Cs as g·kg-1 of dry weight of soil); the BAF has the units of kg soil·kg-1 worm. | The steady state bioaccumulation factor (BAFss) is the BAF at steady state and does not change significantly over a prolonged period of time, the concentration of the test chemical in the surrounding medium (Cs as g.kg-1 of dry weight of soil) being constant during this period of time. | Bioaccumulation factors calculated directly from the ratio of the soil uptake rate constant and the elimination rate constant (ks and ke, see below) are termed kinetic bioaccumulation factor (BAFK). | The biota-soil accumulation factor (BSAF) is the lipid-normalised concentration of the test chemical in/on the test organism divided by the organic carbon-normalised concentration of the test chemical in the soil at steady state. Ca is then expressed as g·kg-1 lipid content of the organism, and Cs as g·kg-1 organic content of the soil; the BSAF has the units of kg OC·kg-1 lipid. | A plateau or steady state is defined as the equilibrium between the uptake and elimination processes that occur simultaneously during the exposure phase. The steady state is reached in the plot of BAF against time when the curve becomes parallel to the time axis and three successive analyses of BAF made on samples taken at intervals of at least two days are within 20 % of each other, and there are no statistically significant differences among the three sampling periods. For test chemicals which are taken up slowly, more appropriate intervals would be seven days (49). | The organic carbon-water partitioning coefficient (Koc) is the ratio of a chemical’s concentration in/on the organic carbon fraction of a soil and the chemical's concentration in water at equilibrium. | The octanol-water partitioning coefficient (Kow) is the ratio of a chemical’s solubility in n-octanol and water at equilibrium, also sometimes expressed as Pow. The logarithm of Kow (log Kow) is used as an indication of a chemical's potential for bioaccumulation by aquatic organisms. | The uptake or exposure phase is the time during which the test organisms are exposed to the test chemical. | The soil uptake rate constant (ks) is the numerical value defining the rate of increase in the concentration of the test item in/on the test organism resulting from uptake from the soil phase. ks is expressed in g soil kg-1 of worm d-1. | The elimination phase is the time, following the transfer of the test organisms from a contaminated medium to a medium free of the test item, during which the elimination (or the net loss) of the chemical from the test organisms is studied. | The elimination rate constant (ke) is the numerical value defining the rate of reduction in the concentration of the test item in/on the test organism, following the transfer of the test organisms from a medium containing the test item to a chemical-free medium; ke is expressed in d-1. | Test chemical: Any substance or mixture tested using this Test Method. | Appendix 2 | Calculation of uptake and elimination parameters | The main endpoint of a bioaccumulation test is the bioaccumulation factor, BAF. The measured BAF can be calculated by dividing the concentration in the test organism, Ca, by the concentration in the soil, Cs, at steady state. If the steady state is not reached during the uptake phase, the BAFK is calculated from the rate constants instead of BAFss. However, it should be noted if the BAF is based on steady state concentrations or not. | The usual means for obtaining the kinetic bioaccumulation factor (BAFK), the soil uptake rate constant (ks) and the elimination rate constant (ke) is to use non-linear parameter estimation methods on a computer, e.g. based on the models described in (68). Given a set of sequential time concentration data and the model equations: | 0 < t < tc | [equation 1] | or | t > tc | [equation 2] | where: | Ca | = | concentration of chemical in worms [g kg-1 wet or dry weight] | ks | = | uptake rate constant in tissue [g soil kg-1 of worm d-1] | Cs | = | concentration of chemical in soil [g kg-1 of wet or dry weight] | ke | = | elimination rate constant [d-1] | tc | = | time at the end of the uptake phase, | these computer programs calculate values for BAFK, ks and ke. | When the background concentration in the non-exposed worms e.g. on day 0 differs significantly from zero (this may e.g. be the case for metals), this background concentration (Ca,0) should be included in these equations, to make them read: | 0 < t < tc | [equation 3] | and | t > tc | [equation 4] | In cases where a significant decrease of the test chemical concentration in the soil is observed over time during the uptake phase, the following models can be used e.g. (67) (79): | [equation 5] | where: | Cs | = | concentration of chemical in the soil [g kg-1 wet or dry weight] | k0 | = | degradation rate constant in soil [d-1] | C0 | = | initial concentration of chemical in soil [g kg-1 of wet or dry weight] | 0 < t < tc | [equation 6] | t > tc | [equation 7] | where: | Ca | = | concentration of chemical in worms [g kg-1 wet or dry weight] | ks | = | uptake rate constant in tissue [g soil kg-1 of worm d-1] | k0 | = | degradation rate constant in soil [d-1] | ke | = | elimination rate constant [d-1] | tc | = | time at the end of the uptake phase. | When steady state is reached during the uptake phase (i.e. t = ∞), equation 1 | 0 < t < tc | [equation 1] | may be reduced to: | or | [equation 8] | Then ks/ke x Cs is an approach to the concentration of the test item in the worm tissue at steady state (Ca,ss). | The biota-soil accumulation factor (BSAF) can be calculated as follows: | [equation 9] | where foc is the fraction of soil organic carbon, and flip is the fraction of worm lipid, both preferably determined on samples taken from the test, and based either on dry weight or on wet weight, respectively. | The elimination kinetics can be modelled using the data from the elimination phase and applying the following model equation and a computer-based non-linear parameter estimation method. If the data points plotted against time indicate a constant exponential decline of the test item concentration in the animals, a one-compartment model (equation 9) can be used to describe the time course of elimination. | [equation 10] | Elimination processes sometimes appear to be biphasic, showing a rapid decline of Ca during the early phases, that changes to a slower loss of test items in the later phases of the elimination, e.g. (27) (68). The two phases can be interpreted by the assumption, that there are two different compartments in the organism, from which the test item is lost with different velocities. In these cases, specific LITERATURE should be studied e.g. (38) (39) (40) (78). | Using the model equations above, the kinetic parameters (ks and ke) may also be calculated in one run by applying the first order kinetics model to all data from both the uptake and elimination phase simultaneously. For a description of a method that may allow for such a combined calculation of uptake and elimination rate constants, references (41), (73) and (70) may be consulted. | [equation 11] | Note: | When uptake and elimination parameters are estimated simultaneously from the combined uptake and the elimination data, “m” as shown in equation 11 is a descriptor that allows the computer program to assign the equation’s sub-terms to the data sets of the respective phase and to perform the evaluation correctly (m = 1 for uptake phase; m = 2 for elimination phase). | Nevertheless, these model equations should be used with caution, especially when changes in the test chemical's bioavailability, or (bio)degradation occur during the test (see e.g. (79)). | Appendix 3 | EXAMPLES OF SCHEDULES FOR SOIL BIOACCUMULATION TESTS | Earthworm test | (a) | Uptake phase with 8 sampling dates used for calculation of kinetics | Day | Activity | – 6 | Conditioning of the prepared soil for 48 h; | – 4 | Spiking of the soil fraction with the test chemical solution; evaporating of any solvent; mixing of the soil constituents; distributing the soil to the test vessels; equilibration at test conditions for 4 days (3 weeks for metal-spiked soil); | – 3 to – 1 | Separation of the test organisms from the culture for acclimation; preparation and moisturising of the soil constituents; | 0 | Measuring temperature, and soil pH; removing soil samples from treated vessels and solvent controls for determination of test chemical concentration; addition of food ration; weighing and randomised distribution of the worms to the test vessels; retaining of sufficient subsamples of worms for determination of analytical background values, wet and dry weight, and lipid content; weighing of all test vessels to control soil moisture; controlling air supply, if closed test system is used; | 1 | Controlling air supply, recording worm behaviour and temperature; taking soil and worm samples for determination of test item concentration; | 2 | Same as day 1; | 3 | Controlling air supply, worm behaviour and temperature; | 4 | Same as day 1; | 5-6 | Same as day 3; | 7 | Same as day 1; addition of food ration; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 8-9 | Same as day 3; | 10 | Same as day 1; | 11-13 | Same as day 3; | 14 | Same as day 1; addition of food ration; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 15-16 | Same as day 3; | 17 | Same as day 1; | 18-20 | Same as day 3; | 21 | Same as day 1; measuring temperature and soil pH; control soil moisture by re-weighing the test vessels; end of uptake phase; transfer worms from remaining exposed replicates to vessels containing clean soil for elimination phase (no gut-purging); sampling of soil and worms from solvent controls. | | Pre-exposure activities (equilibration phase) should be scheduled taking into account the properties of the test chemical. | | Activities described for day 3 should be performed daily (at least on workdays). | (b) | Elimination phase | Day | Activity | – 6 | Preparation and moisturising of the soil constituents; conditioning of the prepared soil for 48 h; | – 4 | Mixing of the soil constituents; distributing the soil to the test vessels; incubation at test conditions for 4 days; | 0 (end of uptake phase) | Measuring temperature and soil pH; weighing and randomised distribution of the worms to the test vessels; addition of food ration; transfer worms from remaining exposed replicates to vessels containing clean soil; taking soil and worm samples after 4-6 h for determination of test chemical concentration; | 1 | Controlling air supply, recording worm behaviour and temperature; taking soil and worm samples for determination of test chemical concentration; | 2 | Same as day 1; | 3 | Controlling air supply, worm behaviour and temperature; | 4 | Same as day 1; | 5-6 | Same as day 3; | 7 | Same as day 1; addition of food ration; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 8-9 | Same as day 3; | 10 | Same as day 1; | 11-13 | Same as day 3; | 14 | Same as day 1; addition of food ration; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 15-16 | Same as day 3; | 17 | Same as day 1; | 18-20 | Same as day 3; | 21 | Same as day 1; measuring temperature and soil pH; control soil moisture by re-weighing the test vessels; sampling of soil and worms from solvent controls. | | Preparation of the soil prior to start of elimination phase should be done in the same manner as before the uptake phase. | | Activities described for day 3 should be performed daily (at least on workdays). | Enchytraeid test | (a) | Uptake phase with 8 sampling dates used for calculation of kinetics | Day | Activity | – 6 | Conditioning of the prepared soil for 48 h; | – 4 | Spiking of the soil fraction with the test chemical solution; evaporating of any solvent; mixing of the soil constituents; distributing the soil to the test vessels; equilibration at test conditions for 4 days (3 weeks for metal-spiked soil); | – 3 to – 1 | Separation of the test organisms from the culture for acclimation; preparation and moisturising of the soil constituents; | 0 | Measuring temperature, and soil pH; removing soil samples from treated vessels and solvent controls for determination of test chemical concentration; addition of food ration to soil; weighing and randomised distribution of the worms to the test vessels; retaining of sufficient subsamples of worms for determination of analytical background values, wet and dry weight, and lipid content; weighing of all test vessels to control soil moisture; controlling air supply, if closed test system is used; | 1 | Controlling air supply, recording worm behaviour and temperature; taking soil and worm samples for determination of test item concentration; | 2 | Same as day 1; | 3 | Controlling air supply, worm behaviour and temperature; | 4 | Same as day 1; | 5-6 | Same as day 3; | 7 | Same as day 1; addition of food ration to soil; control soil moisture by re-weighing the test vessels and compensate evaporated water; | 9 | Same as day 1; | 10 | Same as day 3; | 11 | Same as day 1; | 12-13 | Same as day 3; | 14 | Same as day 1; addition of food ration to soil; measuring temperature and soil pH; control soil moisture by re-weighing the test vessels; end of uptake phase; transfer worms from remaining exposed replicates to vessels containing clean soil for elimination phase (no gut-purging); sampling of soil and worms from solvent controls. | | Pre-exposure activities (equilibration phase) should be scheduled taking into account the properties of the test chemical. | | Activities described for day 3 should be performed daily (at least on workdays). | Appendix 4 | Artificial soil – preparation and storage recommendations | Since natural soils from a particular source may not be available throughout the year, and indigenous organisms as well as the presence of micro-pollutants can influence the test, an artificial substrate, the artificial soil according to Chapter C.8 of this Annex, Toxicity for Earthworms (48), is recommended for use in this test. Several test species can survive, grow, and reproduce in this soil, and maximum standardisation as well as intra- and interlaboratory comparability of test and culture conditions are provided. | Soil constituents: | Peat: | 10 % | Sphagnum-peat, in accordance with the OECD Guideline 207 (48); | Quartz sand: | 70 % | Industrial quartz sand (air dried); grain size: more than 50 % of the particles should be in the range of 50-200 μm, but all particles should be ≤ 2 mm; | Kaolinite clay: | 20 % | Kaolinite content ≥ 30 %; | Calcium carbonate: | ≤ 1 % | CaCO3, pulverised, chemically pure. | As an option, the organic carbon content of the artificial soil may be reduced, e.g. by lowering the peat content to 4-5 % of dry soil and increasing the sand content accordingly. By such a reduction in organic carbon content, the possibilities of adsorption of test chemical to the soil (organic carbon) may be decreased, and the availability of the test chemical to the worms may increase (74). It has been demonstrated that Enchytraeus albidus and Eisenia fetida can comply with the validity criteria on reproduction when tested in field soils with lower organic carbon content, e.g. 2,7 % (33), (61), and there is experience that this can also be achieved in artificial soil with 5 % peat. | Preparation | The dry constituents of the soil are mixed thoroughly (e.g. in a large-scale laboratory mixer). This should be done about one week before starting the test. The mixed dry soil constituents should be moistened with deionised water at least 48 h before application of the test item in order to equilibrate/stabilise the acidity. For the determination of pH a mixture of soil and 1 M KCl solution in a 1:5 ratio is used. If the pH value is not within the required range (6,0 ± 0,5), a sufficient amount of CaCO3 is added to the soil, or a new batch of soil is prepared. | The maximum water holding capacity (WHC) of the artificial soil is determined according to ISO 11268-2 (35). At least two days before starting the test, the dry artificial soil is moistened by adding enough deionised or reconstituted water to obtain approximately half of the final water content. The final water content should be 40 % to 60 % of the maximum WHC. At the start of the test, the pre-moistened soil is divided into as many batches as the number of test concentrations and controls used for the test, and the moisture content is adjusted to 40-60 % of WHCmax by using the solution of the test item and/or by adding deionised or reconstituted water. The moisture content is determined at the beginning and at the end of the test (at 105 °C). It should be optimal for the species’ requirements (the moisture content can also be checked as follows: when the soil is gently squeezed in the hand, small drops of water should appear between the fingers). | Storage | The dry constituents of the artificial soil may be stored at room temperature until use. The prepared, pre-moistened soil may be stored in a cool place for up to three days prior to spiking; care should be taken to minimise evaporation of water. Soil spiked with the test item should be used immediately unless there is information indicating that the particular soil can be stored without affecting the toxicity and bioavailability of the test item. Samples of spiked soil may then be stored under the conditions recommended for the particular test item until analysis. | Appendix 5 | Species of terrestrial oligochaetes recommended for testing bioaccumulation from soil | Earthworms | The recommended test species is Eisenia fetida (Savigny 1826), belonging to the family Lumbricidae. Since 1972 it is divided into two subspecies (Eisenia fetida and Eisenia andrei (10)). According to Jaenike (36), they are true, separate species. Eisenia fetida is easily recognised by its bright intersegmental yellow stripes whereas Eisenia andrei has a uniform, dark red colour. Originating probably from the region of the Black Sea, they are distributed worldwide today, especially in anthropogenically modified habitats like compost heaps. Both can be used for ecotoxicological as well as bioaccumulation tests. | Eisenia fetida and Eisenia andrei are commercially available, e.g. as fish bait. In comparison to other lumbricid earthworms, they have a short life-cycle, reaching maturity within ca. 2-3 months (at room temperature). Their optimum temperature is approximately at 20-24 °C. They prefer relatively moist substrates with a nearly neutral pH and a high content of organic material. Since these species have been widely used in standardised ecotoxicological tests for about 25 years, their culturing is well established (48) (77). | Both species can be bred in a wide range of animal wastes. The breeding medium recommended by ISO (35) is a 50:50 mixture of horse or cattle manure and peat. The medium should have a pH value of about 6 to 7 (regulated with calcium carbonate), a low ionic conductivity (less than 6 mS/cm or less than 0,5 % salt concentration) and should not be contaminated excessively with ammonia or animal urine. Also, a commercial gardening soil free of additives, or artificial soil according to OECD (48), or a 50:50 mixture of both can be used. The substrate should be moist but not too wet. Breeding boxes of 10 litre to 50 litre volume are suitable. | To obtain worms of standard age and mass, it is best to start the culture with cocoons. Therefore, adult worms are added to a breeding box containing fresh substrate to produce cocoons. Practical experience has shown that a population density of approximately 100 adult worms per kg substrate (wet weight) leads to good reproduction rates. After 28 days, the adult worms are removed. The earthworms hatched from the cocoons are used for testing when mature after at least 2 months but less than 12 months. | Worms of the species described above can be considered healthy if they move through the substrate, do not try to leave the substrate, and reproduce continuously. Very slow motioning or a yellow posterior end (in the case of Eisenia fetida) indicates substrate exhaustion. In this case, fresh substrate and/or a lower number of animals per box is recommended. | Additional selected references | Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58. | Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81. | Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S. | Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55. | Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201. | Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171. | Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology — from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp. | Enchytraeids | The recommended test species is Enchytraeus albidus Henle 1837 (white potworm). Enchytraeus albidus is one of the biggest (up to 15 mm) species of the annelid oligochaete family Enchytraeidae and it is worldwide distributed e.g. (8). Enchytraeus albidus is found in marine, limnic and terrestrial habitats, mainly in decaying organic matter (seaweed, compost) and rarely in meadows (42). This broad ecological tolerance and some morphological variations indicate that there might be different races for this species. | Enchytraeus albidus is commercially available, sold as food for fish. It should be checked whether the culture is contaminated by other, usually smaller species (60). If contamination occurs, all worms should be washed with water in a Petri dish. Large adult specimens of Enchytraeus albidus are then selected (by using a stereomicroscope) to start a new culture. All other worms are discarded. Its life cycle is short as maturity is reached between 33 days (at 18 °C) and 74 days (at 12 °C). Only cultures which have been kept in the laboratory for at least 5 weeks (one generation) without problems should be used for a test. | Other species of the Enchytraeus genus are also suitable, especially Enchytraeus luxuriosus. This species is a true soil inhabitant, which has been newly described in (65). If other species of Enchytraeus are used, they should be clearly identified and the rationale for the selection of the species should be reported. | Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) is a species belonging to the same group as Enchytraeus luxuriosus. It has not been found to exist with certainty in the field, having only been described from earthworm cultures and compost heaps (Römbke 2003). Its original ecological requirements are therefore not known. However, recent laboratory studies in various field soils have confirmed that this species has a broad tolerance towards soil properties like pH and texture (Jänsch et al. 2005). In recent years, this species has often been used in ecotoxicological studies because of the simplicity of its breeding and testing, e.g. Kuperman et al. 2003). However, it is small (3-12 mm; 7 mm on average (Westheide & Müller 1996), and this makes handling more difficult compared with Enchytraeus albidus. When using this species instead of Enchytraeus albidus, the size of the test vessel can but needs not to be smaller. In addition, it should be considered that this species reproduces very rapidly having a generation time of less than 20 days at 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) and even quicker at higher temperatures. | Enchytraeids of the species Enchytraeus albidus (as well as other Enchytraeus species) can be bred in large plastic boxes (e.g. 30 × 60 × 10 cm or 20 × 12 × 8 cm which is suitable for culture of worms of small size) filled with a mixture of artificial soil and commercially available, uncontaminated garden soil free of additives. Compost material should be avoided since it could contain toxic chemicals like heavy metals. Fauna should be removed from the breeding soil before use by three times deep-freezing. Pure artificial soil can also be used but the reproduction rate could be slower compared to that obtained with mixed substrates. The substrate should have a pH of 6,0 ± 0,5. The culture is kept in an incubator at a temperature of 15 ± 2 °C without light. In any case, a temperature higher than 23 °C should be avoided. The artificial/natural soil moisture should be moist but not wet. When the soil is gently pressed by hand, only small drops of water should appear. In any case, anoxic conditions should be avoided (e.g. if a lid is used, the number of lid holes should be high enough to provide sufficient exchange of air). The breeding soil should be aerated by carefully mixing it once per week. | The worms should be fed at least once per week ad libitum with rolled oats which are placed into a cavity on the soil surface and covered with soil. If food from the last feeding date remains in the container, the amount of food given should be adjusted accordingly. If fungi grow on the remaining food, it should be replaced by a new quantity of rolled oats. In order to stimulate reproduction, the rolled oats may be supplemented with commercially available, vitamin amended protein powder every two weeks. After three months, the animals are transferred to a freshly prepared culture or breeding substrate. The rolled oats, which have to be stored in sealed vessels, should be autoclaved or heated before use in order to avoid infections by flour mites (e.g. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) or predacious mites (e.g. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). After disinfecting, the food is ground up so that it can easily be strewn on the soil surface. Another possible food source is baker’s yeast or the fish food TetraMin®. | In general, the culturing conditions are sufficient if worms do not try to leave the substrate, move quickly through the soil, exhibit a shiny outer surface without soil particles clinging to it, are more or less whitish coloured, and if worms of different ages are visible. Actually, worms can be considered healthy if they reproduce continuously. | Additional selected references | Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126. | Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83. | Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656. | Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616. | Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479-488. | Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267. | ’ |
| (1) Te informacije so navedene samo za usmerjanje uporabnikov. Uporabijo se lahko tudi drugi enakovredni računalniški programi, če je mogoče dokazati, da dajejo enake rezultate. | (1) This information is only given for the convenience of users. Other equivalent computer programmes may be used if they can be shown to produce the same results. |
| (2) Če informacije o občutljivosti glede na spol niso na voljo, se uporabijo podgane obeh spolov, tj. 1 žival/spol na koncentracijo. Na podlagi obstoječih informacij ali če se med to izpostavitvijo izkaže, da je en spol občutljivejši, se v nadaljnjem preskušanju uporabi 10 živali občutljivejšega spola (2 živali na koncentracijo/časovno točko) pri vsaki koncentraciji. | (1) If no sex susceptibility information is available, rats of both sexes will be used, i.e. 1 animal/sex per concentration. Based on existing information, or if it becomes apparent during this exposure session that one sex is more susceptible, 10 animals of the susceptible sex will be used (2 animals per concentration/time point) at each concentration level during subsequent testing. |
| (3) Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l. Nižje začetne koncentracije je treba izbrati, če se pričakuje strupenost ali na podlagi rezultatov opazovalne študije. V primeru zakonodajnih ali znanstvenih potreb se lahko uporabijo višje koncentracije. | (2) When Regulation (EC) No 1272/2008 is used, the limit concentrations for gases, vapours, and aerosols are 20 000 ppm, 20 mg/l, and 5 mg/l, respectively. In case of expected toxicity or based on the results of the sighting study, lower starting concentrations should be chosen. In case of regulatory or scientific needs, higher concentrations may be used. |
| (4) Po možnosti je treba z izpostavljanjem živali naslednji ravni koncentracije počakati, dokler ni mogoče z razumno gotovostjo sklepati o preživetju predhodno tretiranih živali. Tako lahko vodja študije prilagodi ciljno koncentracijo in obdobja za naslednjo izpostavitev. | (3) Ideally, exposure of animals at the next concentration level should be delayed until there is reasonable confidence of survival for previously treated animals. This allows the study director to adjust the target concentration and durations for the next exposure session. |
| (5) Minimalni odmerek (koncentracija × čas), ki je povzročil smrtnost med preskušanjem pri začetni koncentraciji (prva izpostavitev), se upošteva kot smernica za določitev naslednje kombinacije koncentracije in obdobij izpostavljenosti. Običajno se koncentracija prepolovi (1/2 L), živali pa se izpostavijo v novem časovnem razponu z drobnejšo mrežo, ki vključuje geometrično razporeditev obdobij izpostavljenosti glede na faktor 1,4 (√2; glej vir (11)) okoli časa v skladu z minimalno smrtno velikostjo odmerka (čas × koncentracija), opaženo pri prvi izpostavitvi. Na zgornji sliki (slika 1) je bila smrtnost pri izpostavitvi I najprej opažena pri 15 min, zato se obdobja v izpostavitvi II razporedijo okoli 30 min, tako da znašajo 15, 21, 30, 42 in 60 min. Po prvih dveh izpostavitvah se močno priporoča, da se podatki prikažejo v podobnem diagramu, kot je prikazan na zgornji sliki, ter da se preveri, ali ima razmerje med koncentracijo in časom kót 45 stopinj (n = 1) oziroma ali je razmerje koncentracija-čas-odziv manj strmo (npr. n = 2) oziroma strmejše (npr. n = 0,8). V zadnjih dveh primerih se močno priporoča, naj se naslednje koncentracije in obdobja ustrezno prilagodijo. | (4) The minimum dose (concentration x time) which resulted in mortality during testing at initial concentration (first exposure session) will be taken as a guide to establish the next combination of concentration and exposure durations. Typically, the concentration will be decreased two-fold (1/2L) and animals will be exposed over a new time range with a finer grid using a geometric division of exposure periods with a factor 1,4 (√2; see reference 11) around the time according to the minimum lethal dose level (time x concentration) observed during the first exposure. In this figure (Figure 1), mortality in Exposure session I was first observed at 15 min; the durations during session II are therefore centred around 30 min, and are 15, 21 30, 42 and 60 min. After the first two exposures, it is strongly advised to plot the data in a similar figure as indicated above, and to check whether the relationship between concentration and time has an angle of 45 degrees (n = 1) or if the concentration-time-response relationship is less steep (e.g. n = 2) or steeper (e.g. n = 0,8). In the latter cases it is strongly advised to adapt the next concentrations and durations accordingly. |
| (6) V nekaterih primerih je morda treba povečati koncentracijo (2 L) v novem časovnem razponu s še drobnejšo mrežo, ki vključuje geometrično razporeditev obdobij izpostavljenosti glede na faktor 1,4 (√2) okoli časa v skladu z minimalno smrtno koncentracijo, opaženo v prvi izpostavitvi. Po možnosti mora biti najkrajše obdobje izpostavljenosti daljše od 5 minut, najdaljše obdobje izpostavljenosti pa ne sme presegati 8 ur.; | (5) In certain cases it may be necessary to increase the concentration (2L) over a new time range with a still finer grid using a geometric division of exposure periods with a factor 1,4 (√2) around the time according to the minimum lethal concentration level observed during the first exposure. The minimum exposure duration should preferably exceed 5 minutes; the maximum exposure duration should not exceed 8 hours. |
| (7) Za številne preiskave seruma in plazme, zlasti za določanje glukoze, se priporoča postenje čez noč. Glavni razlog za to je, da bi povečana spremenljivost, ki bi se zagotovo pojavila, če se žival ne bi postila, lahko prikrila manj opazne učinke in otežila razlago. Po drugi strani pa lahko postenje čez noč spremeni splošni metabolizem živali in lahko zlasti pri študijah prehranjevanja povzroči motnje v dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji. Če se uporabi postenje čez noč, je treba klinične biokemične preiskave izvesti po zaključku funkcionalnih opazovanj v četrtem tednu študije. | (2) For a number of measurements in serum and plasma, most notably for glucose, overnight fasting would be preferable. The major reason for this preference is that the increased variability which would inevitably result from non-fasting, would tend to mask more subtle effects and make interpretation difficult. On the other hand, however, overnight fasting may interfere with the general metabolism of the animals and, particularly in feeding studies, may disturb the daily exposure to the test chemical. If overnight fasting is adopted, clinical biochemical determinations should be performed after the conduct of functional observations in week 4 of the study. |
| (8) Ker lahko dolgotrajno obdobje postenja vpliva na meritve glukoze pri tretiranih živalih glede na kontrolne živali, mora vodja študije odločiti, ali je živali primerno postiti. Če se uporabi obdobje postenja, mora to ustrezati uporabljeni živalski vrsti; za podgane lahko traja 16 h (postenje čez noč). Določanje glukoze na tešče se lahko izvede po postenju čez noč v zadnjem tednu izpostavljenosti ali po postenju čez noč pred obdukcijo (v zadnjem primeru skupaj z vsemi drugimi kliničnimi patološkimi parametri). | (*1) Because a lengthy fasting period can introduce bias in glucose measurements for the treated versus control animals, the study director should determine whether it is appropriate to fast the animals. If a fasting period is used, it should be appropriate to the species used; for the rat this may be 16 h (overnight fasting). Determination of fasting glucose may be carried out after overnight fasting during the last exposure week, or after overnight fasting prior to necropsy (in the latter case together with all other clinical pathology parameters). |
| (9) Ker lahko dolgotrajno obdobje postenja vpliva na meritve glukoze pri tretiranih živalih glede na kontrolne živali, mora vodja študije odločiti, ali je živali primerno postiti. Če se uporabi obdobje postenja, mora to ustrezati uporabljeni živalski vrsti; za podgane lahko traja 16 h (postenje čez noč). Določanje glukoze na tešče se lahko izvede po postenju čez noč v zadnjem tednu izpostavljenosti ali po postenju čez noč pred obdukcijo (v zadnjem primeru skupaj z vsemi drugimi kliničnimi patološkimi parametri). | (*2) Because a lengthy fasting period can introduce bias in glucose measurements for the treated versus control animals, the study director should determine whether it is appropriate to fast the animals. If a fasting period is used, it should be appropriate to the species used; for the rat this may be 16 h (overnight fasting). Determination of fasting glucose may be carried out after overnight fasting during the last exposure week, or after overnight fasting prior to necropsy (in the latter case together with all other clinical pathology parameters). |
| (10) Za številne preiskave seruma in plazme, zlasti za določanje glukoze, se priporoča postenje čez noč. Glavni razlog za to je, da bi povečana spremenljivost, ki bi se zagotovo pojavila, če se žival ne bi postila, lahko prikrila manj opazne učinke in otežila razlago. Vendar je treba opozoriti, da lahko postenje čez noč spremeni splošni metabolizem živali in lahko zlasti pri študijah prehranjevanja povzroči motnje v dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji. Vse živali je treba ocenjevati v enakem fiziološkem stanju, zato se podrobne ali nevrološke ocene po možnosti izvedejo drug dan kot jemanje vzorcev za klinične biokemične preiskave. | (3) For a number of measurements in serum and plasma, most notably for glucose, overnight fasting is preferable. The major reason for this preference is that the increased variability which would inevitably result from non-fasting, would tend to mask more subtle effects and make interpretation difficult. However it should be noted that overnight fasting may interfere with the general metabolism of the animals and, particularly in feeding studies, may disrupt the daily exposure to the test chemical. All animals should be assessed in the same physiological condition and preferably detailed or neurological assessments should therefore be scheduled for a different day than clinical biochemistry sampling. |
| (11) Ocena jedkosti lahko temelji na strokovni presoji, v kateri se uporabijo dokazi, kot so: izkušnje pri ljudeh in živalih, obstoječi podatki (in vitro), npr. poglavji B.40 (10) ali B.40 bis te priloge (11) ali Smernica za preskušanje OECD št. 435 (12), vrednosti pH, informacije o podobnih kemikalijah ali drugi ustrezni podatki. | (4) The corrosivity evaluation could be based on expert judgment using such evidence as: human and animal experience, existing (in vitro) data, e.g. chapter B.40 (10), B.40 bis (11) of this annex or OECD TG 435 (12), pH values, information from similar chemicals or any other pertinent data. |
| (12) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5. | (5) In the following tables reference is made to GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). The EU equivalent is Regulation (EC) No 1272/2008. In the case of Acute Inhalation Toxicity, the Regulation (EC) No 1272/2008 (9) does not implement Category 5. |
| (13) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5. | (6) In the following tables reference is made to GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). The EU equivalent is Regulation (EC) No 1272/2008. In the case of Acute Inhalation Toxicity, the Regulation (EC) No 1272/2008 (9) does not implement Category 5. |
| (14) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5. | (7) In the following tables reference is made to GHS (Globally Harmonised System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). The EU equivalent is Regulation (EC) No 1272/2008. In the case of Acute Inhalation Toxicity the Regulation (EC) No 1272/2008 (9) does not implement Category 5. |
| (15) Te snovi se pri M4 in M7 razlikujejo, kot je navedeno zgoraj. | (8) These substances differ in M4 and M7, as indicated above. |
| (16) Te raztopine se pripravijo posamezno, nato zlijejo skupaj in takoj avtoklavirajo. | (9) These solutions are prepared individually, then poured together and autoclaved immediately. |
| (17) Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). | (*3) However, it should be noted that if there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 must not be used in this situation). |
| (18) Te snovi se pri M4 in M7 razlikujejo, kot je navedeno zgoraj. | (10) These substances differ in M4 and M7, as indicated above. |
| (19) Te raztopine se pripravijo posamezno, nato zlijejo skupaj in takoj avtoklavirajo. | (11) These solutions are prepared individually, then poured together and autoclaved immediately. |
| (20) Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). | (*4) However, it should be noted that if there is an interaction suspected between hardness ions and the test substance, lower hardness water should be used (and thus, Elendt Medium M4 must not be used in this situation). |
| (21) SiO2 je bil dodan za nevtralizacijo strupenosti. | (*5) SiO2 was added to neutralize toxicity. |
| (22) Odstotni delež razgradnje v posodah FC, ki vsebujejo referenčno snov. | (12) The percentage degradation in Vessels FC containing the reference substance. |
| (23) Odstotni delež razgradnje v posodah FI. | (13) The percentage degradation in Vessels FI. |
