1991R2568 — SK — 09.08.2012 — 024.001

---

Tento dokument slúži čisto na potrebu dokumentácie a inštitúcie nenesú nijakú zodpovednosť za jeho obsah

►B	NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91 z 11. júla 1991, o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvyškov a o príslušných analytických metódach (Ú. v. ES L 248, 5.9.1991, p.1)

Zmenené a doplnené:

		Úradný vestník
		No	page	date
►M1	Nariadenie Komisie (EHS) č. 3682/91 zo 17. decembra 1991,	L 349	36	18.12.1991
►M2	Nariadenie Komisie (EHS) č. 1429/92 z 26. mája 1992,	L 150	17	2.6.1992
M3	Commission Regulation (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	Commission Regulation (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	Nariadenie Rady (EHS) č. 3288/92 z 12. novembra 1992,	L 327	28	13.11.1992
►M6	Nariadenie Komisie (EHS) č. 183/93 z 29. januára 1993,	L 22	58	30.1.1993
M8	Commission Regulation (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
M9	Nariadenie Komisie (ES) č. 177/94 z 28. januára 1994,	L 24	33	29.1.1994
M10	Commission Regulation (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	Nariadenie Komisie (ES) č. 656/95 z 28. marca 1995,	L 69	1	29.3.1995
M12	Commission Regulation (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
►M13	Commission Regulation (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
►M14	Nariadenie Komisie (ES) č. 282/98 z 3. februára 1998,	L 28	5	4.2.1998
M15	Commission Regulation (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	Nariadenie Komisie (EHS) č. 379/1999 z 19 februára 1999,	L 46	15	20.2.1999
►M17	Commission Regulation (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	Commission Regulation (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	Commission Regulation (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	Nariadenie Komisie (ES) č. 1989/2003 zo 6. novembra 2003,	L 295	57	13.11.2003
►M21	Nariadenie Komisie (ES) č. 702/2007 z 21. júna 2007,	L 161	11	22.6.2007
►M22	Nariadenie Komisie (ES) č. 640/2008 zo 4. júla 2008,	L 178	11	5.7.2008
►M23	Nariadenie Komisie (EÚ) č. 61/2011 z 24. januára 2011,	L 23	1	27.1.2011
M24	Vykonávacie nariadenie Komisie (EÚ) č. 661/2012 z 19. júla 2012,	L 192	3	20.7.2012

(*)	Tento akt nebol zatiaľ uverejnený v slovenčine.

---

▼B

NARIADENIE KOMISIE (EHS) č. 2568/91

z 11. júla 1991,

o charakteristikách olivového oleja a oleja z olivových zvyškov a o príslušných analytických metódach

▼M20

Článok 1

1.  Oleje, ktorých charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bodoch 1 a 2 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považujú za panenské olivové oleje v zmysle bodu 1 písm. a) a b) prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

2.  Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 3 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za lampantový olivový olej v zmysle bodu 1 písm. c) prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

3.  Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 4 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný olivový olej v zmysle bodu 2 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

4.  Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 5 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za olivový olej zmiešaný z rafinovaných olivových olejov a panenských olivových olejov v zmysle bodu 3 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

5.  Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 6 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za surový zvyškový olivový olej v zmysle bodu 4 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

6.  Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 7 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za rafinovaný zvyškový olivový olej v zmysle bodu 5 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

7.  Olej, ktorého charakteristiky sa zhodujú s údajmi uvedenými v bode 8 prílohy I k tomuto nariadeniu, sa považuje za zvyškový olivový olej v zmysle bodu 6 prílohy k nariadeniu č. 136/66/EHS.

▼B

Článok 2

1.  Vlastnosti olejov, ustanovené v prílohe I, sa budú stanovovať v súlade s nižšie uvedenými metódami analýzy:

▼M19

▼B

▼M21

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M23

▼M19

2.  Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3.  When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

▼M17

4.   ►M20  Na účely overenia stanoveného v odseku 3 sa analýzy uvedené v prílohách II, III, IX, X a XII a akékoľvek krížové analýzy požadované podľa vnútroštátnych zákonov, ak také sú, vykonávajú pred uplynutím minimálnej doby trvanlivosti. Pokiaľ sa odber vzoriek vykoná viac ako štyri mesiace pred uplynutím minimálnej doby trvanlivosti, analýza by sa mala vykonať najneskôr po uplynutí štyroch mesiacov nasledujúcich po mesiaci odberu vzorky. Na iné analýzy stanovené v tomto nariadení sa neuplatňujú žiadne časové obmedzenia. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5.  For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Článok 2a

Vnútroštátne orgány alebo ich zástupcovia môžu overiť či je vzorka v súlade s deklarovanou kategóriou:

▼M19 —————

▼M5

Článok ►M19  3 ◄

Ak sa zistí, že organoleptické charakteristiky určitého oleja nezodpovedajú jeho opisu, tak dotknutý členský štát uplatňuje bez toho, aby boli dotknuté akékoľvek iné pokuty, administratívne peňažné pokuty, ktoré treba stanoviť vzhľadom na závažnosť zistených nezrovnalostí.

Pri hodnotení nezrovnalosti sa musí venovať pozornosť najmä prirodzeným zmenám charakteristík oleja uchovávaného za normálnych podmienok.

Členské štáty informujú Komisiu na začiatku každého polroku o počte a druhu zistených nezrovnalostí a o pokutách uplatnených v priebehu predchádzajúceho polroku.

▼M5

Článok 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Ak členské štáty narazia pri ustanovovaní degustačných porôt na svojom území na ťažkosti, môžu sa obrátiť na degustačnú porotu schválenú v inom členskom štáte.

3.  Každý členský štát vypracuje zoznam degustačných porôt ustanovených odbornými alebo medziodvetvovými organizáciami v súlade s podmienkami uvedenými v odseku 1 a zabezpečí dosiahnutie súladu s týmito podmienkami.

▼M19 —————

▼B

Článok 6

1.  Obsah oleja v pokrutinách a ostatných olejových zvyškov, ktoré vznikajú pri extrakcii olivového oleja (číselné znaky KN 2306 90 11 a 2306 90 19), sa stanoví použitím metódy uvedenej v prílohe XV.

2.  Obsah oleja uvedený v odseku 1 sa vyjadrí ako percento hmotnosti oleja ku hmotnosti sušiny.

▼M20

Článok 7

Uplatňujú sa ustanovenia spoločenstva týkajúce sa prítomnosti nečistôt.

Pokiaľ ide o halogénované rozpúšťadlá, pre všetky kategórie olivových olejov platia nasledovné limity:

▼B

Článok 8

1.  Členské štáty budú Komisiu informovať o prijatých opatreniach pri zavádzaní tohto nariadenia.

2.  Členský štát na začiatku každého polroka zašle Komisii prehľad analytických údajov o uskutočnených testoch za predchádzajúci polrok.

Výsledky bude posudzovať Riadiaci výbor pre oleje a tuky v súlade s postupmi uvedenými v článku 39 nariadenia č. 136/66/EHS.

Článok 9

Nariadenie EHS č. 1058/77 sa týmto zrušuje.

Článok 10

1.  Táto smernica nadobúda účinnosť tretí deň od jej uverejnenia v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev.

Postup uvedený v prílohe XII sa však bude uplatňovať od ►M1  1. novembra 1992 ◄ , okrem postupov týkajúcich sa systému intervencie.

▼M5

Daná metóda sa neuplatňuje na panenský olivový olej pripravený na trh pred 1. novembrom 1992.

▼B

2.  Toto nariadenie sa nebude uplatňovať na olivový olej a olej z olivových zvyškov naplnený do obalov pred tým, ako toto nariadenie nadobudlo účinnosť, a na oleje predávané do 31. októbra 1992.

Toto nariadenie je záväzné vo svojej celistvosti a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.

---

PRÍLOHY

Obsah

▼M23

---

PRÍLOHA I

VLASTNOSTI OLIVOVÝCH OLEJOV

▼M20

---

PRÍLOHA Ia

ODBOR VZORIEK OLIVOVÉHO OLEJA A ZVYŠKOVÉHO OLIVOVÉHO OLEJA V PRIAMOM OBALE DO 100 LITROV

Táto metóda odberu vzoriek sa uplatňuje na dodávky olivového oleja alebo zvyškového olivového oleja nepresahujúce 125 000 litrov, umiestneného v priamom obale do 100 litrov.

Ak dodávka prekračuje 125 000 litrov, musí sa rozdeliť na dávky v objeme najviac 125 000 litrov. Ak je dodávka menšia ako 125 000 litrov, tvorí jednu dávku. Táto metóda sa potom uplatňuje na každú dávku.

Minimálny počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať, je určený na základe veľkosti dávky v súlade s tabuľkou uvedenou v bode 1.

Veľkosť primárnej vzorky je určená na základe objemu priameho obalu, podľa tabuľky uvedenej v bode 2.1.

Termíny dodávka, primárna vzorka a laboratórna vzorka majú význam podľa definícií uvedených v norme EN ISO 5555.

„Dávka“ znamená sadu predajných jednotiek, ktoré sa vytvárajú, vyrábajú a označujú v príslušných podmienkach tak, aby sa olej, nachádzajúci sa v konkrétnej predajnej jednotke mohol posudzovať ako homogénny, pokiaľ ide o všetky analytické charakteristiky.

1.   POČET PRIMÁRNYCH VZORIEK NA ODBER

Minimálny počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať, je určený na základe veľkosti dávky v súlade s touto tabuľkou:

Priame obaly vybrané na vytvorenie primárnej vzorky musia byť v rámci dávky susediace.

V prípade pochybnosti, členské štáty zvyšujú počet primárnych vzoriek, ktoré sa majú odobrať.

2.   OBSAH PRIMÁRNYCH VZORIEK

2.1

Primárne vzorky musia obsahovať: Pokiaľ má priamy obal objem: Primárna vzorka sa skladá z oleja z: a)  aspoň 5 litrov a)  3 priamych obalov b)  aspoň 3 litre, ale menej ako 5 litrov b)  3 priamych obalov c)  aspoň 2 litre, ale menej ako 3 litre c)  3 priamych obalov d)  aspoň 1 liter, ale menej ako 2 litre d)  6 priamych obalov e)  aspoň 0,75 litra, ale menej ako 1 liter e)  6 priamych obalov f)  menej ako 0,75 litra f)  trojnásobku množstva oleja z minimálneho počtu obalov s celkovým objemom viac ako 1,5 litra

2.2	Primárne vzorky sa do doby analýzy uchovávajú v priamych obaloch. Olej v primárnej vzorke sa potom ďalej rozdeľuje, pokiaľ je to možné, do troch laboratórnych vzoriek s cieľom: a) analýz spomínaných v prílohách II, III, IX a X; b) analýz spomínaných v prílohách XII; c) iných analýz.

2.3	Balenia, ktoré tvoria primárnu vzorku sa rozdeľujú na menšie časti v súlade s kontrolnými postupmi ustanovenými vo vnútroštátnych právnych predpisoch.

3.   ANALÝZA A VÝSLEDKY

▼M20

---

PRÍLOHA Ib

ROZHODOVACÍ STROM NA OVERENIE SÚLADU VZORKY S DEKLAROVANOU KATEGÓRIOU

Analýzu na overenie súladu olivového oleja alebo zvyškového olivového oleja s deklarovanou kategóriou je možné vykonať:

Analýzy týkajúce sa nečistôt, požadované na overenie súladu s normami Európskeho spoločenstva, sa vykonávajú samostatne.

Rozhodovací strom sa uplatňuje na všetky kategórie olivového oleja a zvyškového olivového oleja. Skladá sa z tabuliek očíslovaných od 1 do 11, ku ktorým sa musí pristupovať na základe deklarovanej kategórie príslušného oleja v poradí stanovenom vo všeobecnej tabuľke.

Kľúč k všeobecným tabuľkám 1 až 11:

---

Doplnok 1

Tabuľka rovnocennosti medzi prílohami k tomuto nariadeniu a analýzami špecifikovanými v rozhodovacom strome

---

Doplnok 2

Tabuľka 1

Tabuľka 2

Tabuľka 3

Tabuľka 4

Tabuľka 7

Tabuľka 8

Tabuľka 11

▼B

---

PRÍLOHA II

▼M21

STANOVENIE VOĽNÝCH MASTNÝCH KYSELÍN, STUDENÁ METÓDA

▼B

1.   STANOVENIE KYSLOSTI

Stanovenie voľných mastných kyselín v olivových olejoch. Obsah voľných mastných kyselín sa vyjadrí ako kyslosť vypočítaná obvyklým spôsobom.

1.1.   Princíp

Vzorka sa rozpustí v zmesi rozpúšťadiel a prítomné voľné mastné kyseliny sa stitrujú etanolickým roztokom hydroxidu draselného.

1.2.   Činidlá

Všetky činidlá (reagenty) by mali byť schválenej analytickej kvality a mala by sa použiť buď destilovaná voda, alebo voda rovnakej čistoty.

1.2.1.

Dietyléter; 95 % etanol (v/v), zmes rovnakých objemov. Poznámka:Dietyléter je vysoko horľavý a môže tvoriť výbušné peroxidy. Je potrebné s ním narábať opatrne. Počas použitia ho neutralizujte roztokom hydroxidu draselného (1.2.2), na 100 ml zmesi pridajte 0,3 ml roztoku fenolftaleínu (1.2.3). Poznámka: Ak sa nedá použiť dietyléter, je ho možné nahradiť zmesou rozpúšťadiel obsahujúcou etanol a toluén. Ak je vhodné, etanol môžete nahradiť 2-propanolom(izo-propanolom).

1.2.2.

Hydroxid draselný; titrovaný etanolový roztok, c(KOH) približne 0,01 mol/l alebo, ak je vhodné, c(KOH) približne 0,5 mol/l. Musí byť známa presná koncentrácia etanolového roztoku a je potrebné ju skontrolovať bezprostredne pred použitím. Používajte roztok pripravený najmenej päť dní pred termínom použitia, uschovaný v tmavej sklenenej fľaši s gumovou zátkou. Roztok by mal byť bezfarebný alebo vo farbe slamy. Poznámka: Stabilný bezfarebný etanolický roztok hydroxidu draselného je možné pripraviť nasledovne. Priveďte do varu 1 000 ml etanolu a 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkových hoblín a nechajte vrieť pod spätným chladičom po dobu jednej hodiny. Ihneď oddestilujte. V destiláte rozpustite požadované množstvo hydroxidu draselného. Nechajte niekoľko dní odstáť a zlejte čistú kalovú kvapalinu z usadeniny uhličitanu draselného. Roztok môže byť rovnako pripravený aj bez destilácie a to nasledovne: do 1 000 ml etanolu pridajte 4 ml „aluminium butylate“ a nechajte zmes odležať na niekoľko dní. Odlejte tekutý supernatant a rozpustite požadované množstvo hydroxidu draselného. Roztok je pripravený na použitie.

1.2.3.

Fenolftaleín, 10 g/l rozpustiť v 95 až 96 % etanole (v/v) alebo alkalická modrá, (v prípade silne sfarbených tukov) 20g/l rozpustiť v 95 až 96 % etanole (v/v).

1.3.   Prístrojové vybavenie

Bežné laboratórne vybavenie zahŕňajúce:

1.3.1.

analytické váhy;

1.3.2.

250 ml kónickú banku;

1.3.3.

10 ml byretu, delenú po 0,05 ml.

1.4.   Postup

1.4.1.

Príprava vzorky na testovanie (Vykonajte test na prefiltrovanej vzorke. Ak je obsah vlhkosti a nečistôt spolu menší ako 1 %, vzorku použite bez ďalšej úpravy. Ak presahuje 1 %, je potrebné vzorku prefiltrovať.)

1.4.2.

Odoberanie vzorky (vzorkovanie) Odoberte vzorku v závislosti od predpokladaného čísla kyslosti v súlade s nasledujúcou tabuľkou: Predpokladané číslo kyslosti Hmotnosť vzorky (g) Presnosť váženia (g) < 1 20 0,05 1 až 4 10 0,02 4 až 15 2,5 0,01 15 až 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Vzorku odvážte v kónickej banke (1.3.2).

1.4.3.

Stanovenie Vzorku (1.4.2) rozpustite v 50 až 150 ml predtým zneutralizovanej zmesi dietyléteru a etanolu (1.2.1). Titrujte počas zmiešania s 0,1 mol/l roztokom hydroxidu draselného (1.2.2) (pozri pozn. 2) až do zmeny zafarbenia indikátora (ružová farba fenolftaleínu vydrží aspoň 10 sekúnd). Poznámka 1. Titrovaný etanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) je možné nahradiť vodným roztokom hydroxidu draselného alebo sodného pod podmienkou, že vnesený objem vody nevyvolá rozdelenie fáz. Poznámka 2. Ak spotrebované množstvo 0,1 mol/l roztoku hydroxidu draselného presiahne 10 ml, použite 0,5 ml/l roztok. Poznámka 3.Ak sa roztok počas titrácie zakalí, pridajte dostatočné množstvo rozpúšťadiel (1.2.1), aby sa roztok vyčíril.

1.5.   Kyslosť: vyjadrená ako percento kyseliny olejovej

Kyslosť vyjadrená v hmotnostných percentách sa rovná:

kde:

V

=

objem použitého titračného roztoku hydroxidu draselného, v ml;

c

=

presná koncentrácia použitého titračného roztoku hydroxidu draselného v mol/l;

M

=

mólová hmotnosť v g/mol kyseliny použitej na vyjadrenie výsledku (M =282 g/mol);

m

=

hmotnosť vzorky v g.

Za výsledok sa považuje aritmetický ►M6  dvoch výpočtov ◄ stanovení.

---

PRÍLOHA III

STANOVENIE PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1.   OBLASŤ

Táto technická norma opisuje metódu stanovenia peroxidového čísla v olejoch a tukoch.

2.   POUŽITIE

Táto technická norma sa vzťahuje na živočíšne a rastlinné oleje a tuky.

3.   DEFINÍCIA

Peroxidové číslo je množstvo tých zložiek vo vzorke, ktoré sú vyjadrené ako miliekvivalent aktívneho kyslíka na kilogram a ktoré oxidujú jodid draselný za uvedených prevádzkových podmienok.

4.   PRINCÍP

Úprava roztoku, ktorý tvorí odobratá časť vzorky, kyselina octová a chloroform, roztokom jodidu draselného. Titrácia uvoľneného jódu štandardizovaným roztokom tiosíranu sodného.

5.   PRÍSTROJOVÉVYBAVENIE

Všetky použité prístroje nesmú obsahovať redukujúce alebo oxidujúce látky.

Poznámka: Nemastite zábrusové povrchy.

5.1.	3 ml sklenená navažovacia lodička

5.2.	Banky so zábrusovými hrdlami a zátkami, približne 250 ml objemu, predsušené a naplnené čistým suchým inertným plynom (dusíkom alebo, pokiaľ možno, oxidom uhličitým).

5.3.	25 alebo 50 ml byreta, delená po 0,1 ml

6.   ČINIDLÁ

6.1.	Chloroform, p.a., zbavený kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého inertného plynu

6.2.	Ľadová kyselina octová, p.a., zbavená kyslíka prebublávaním prúdom čistého, suchého inertného plynu

6.3.	Jodid draselný, nasýtený vodný roztok, čerstvo pripravený, neobsahujúci jód a jodičnany

6.4.	Tiosíran sodný (sírnatan), 0,01 alebo 0,002 mol/N presný štandardizovaný vodný roztok, štandardizovaný tesne pred použitím

6.5.	Roztok škrobu, vodná disperzia o koncentrácii 10 g/l, čerstvo pripravená z prírodného rozpustného škrobu

7.   VZORKA

Dbajte o to, aby vzorka bola odoberaná a skladovaná bez prístupu svetla, udržiavajte ju v chlade a v úplne (až povrch) naplnených sklenených zásobníkoch (dózach), hermeticky uzavretých zábrusnými alebo korkovými zátkami.

8.   POSTUP

Test vykonajte pri rozptýlenom dennom svetle alebo pri umelom svetle. V sklenenej navažovačke (5.1) alebo prípadne v banke (5.2) odvážte s presnosťou na 0,001 g množstvo vzorky v súlade s nasledujúcou tabuľkou a podľa predpokladaného peroxidového čísla:

Odzátkujte banku (5.2) a vložte sklenenú navažovačku s odváženou časťou testovanej vzorky. Pridajte 10 ml chloroformu (6.1). Miešaním rýchlo rozpustite testovanú vzorku. Pridajte 15 ml kyseliny octovej (6.2), potom 1 ml roztoku jodidu draselného (6.3). Rýchlo zazátkujte, pretrepávajte 1 minútu a nechajte 5 minúť stáť v tme pri teplote 15 až 25 oC.

Pridajte približne 75 ml destilovanej vody. Uvoľnený jód stitrujte roztokom tiosíranu sodného (6.4) (0,002 mol/N roztok na predpokladané hodnoty nižšie ako 12 a 0,01 mol/N roztok pre predpokladané čísla vyššie ako 12), dôkladne pretrepávajte, ako indikátor použite roztok škrobu.

Vykonajte dve zistenia z jednej testovanej vzorky.

Zároveň vykonajte slepý pokus. Ak výsledok slepého pokusu prekročí 0,05 ml, 0,01mol/N roztoku tiosíranu sodného (6.4), vymeňte znečistené činidlá.

9.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Peroxidové číslo (PV), vyjadrené v miliekvivalentoch aktívneho kyslíka na kilogram, sa udáva podľa vzorca:

kde:

V

=

objem (vyjadrený v ml) štandardizovaného roztoku tiosíranu sodného (6.4), použitého pri teste, korigovaného výsledkom slepého pokusu;

T

=

presná molarita použitého roztoku tiosíranu sodného (6.4);

m

=

hmotnosť navážky vzorky, v (g).

Za výsledok sa bude považovať aritmetický priemer z dvoch výpočtov.

▼M21

---

PRÍLOHA IV

STANOVENIE OBSAHU VOSKOV POMOCOU KAPILÁRNEJ PLYNOVEJ CHROMATOGRAFIE

1.   PREDMET

Táto metóda opisuje postup stanovenia obsahu voskov v olivových olejoch. Vosky sa separujú v závislosti od počtu atómov uhlíka. Môže sa používať najmä na rozlíšenie medzi olivovým olejom získaným lisovaním a olejom získaným extrakciou (olej z výliskov).

2.   PRINCÍP

Pridanie vhodného vnútorného štandardu k tuku alebo oleju, potom frakcionácia chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie frakcie eluovanej pri testovacích podmienkach ako prvej (ktorej polarita je nižšia ako polarita frakcie triglyceridov), potom priama analýza kapilárnou plynovou chromatografiou.

3.   MATERIÁL

3.1.	25 ml Erlenmeyerova banka.

3.2.	Sklená kolóna na plynovú chromatografiu, s vnútorným priemerom 15,0 mm, výškou 30 až 40 cm a vybavená kohútikom.

3.3.

Plynový chromatograf vhodný na fungovanie s kapilárnou kolónou, vybavený systémom na priame zavádzanie do kolóny s týmito zložkami: 3.3.1. Termostatická komora pre kolóny, vybavená teplotným programátorom. 3.3.2. Studený injektor na priame zavedenie do kolóny. 3.3.3. Plameňovoionizačný detektor a prevodník-zosilňovač. 3.3.4. Zapisovač-integrátor schopný pracovať s prevodníkom-zosilňovačom (3.3.3), rýchlosť odozvy nižšia ako 1 sekunda, s meniteľnou rýchlosťou posunu papiera. (Takisto je možné používať informatizované systémy, ktoré sú založené na získaní údajov z plynovej chromatografie prostredníctvom osobného počítača). 3.3.5. Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s dĺžkou 8 až 12 metrov, vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, z vnútornej strany pokrytá kvapalnou fázou, s rovnomernou hrúbkou 0,10 – 0,30 μm. (Kvapalné fázy vhodné na použitie, v obchodnej sieti ako typ SE52 alebo SE54).

3.4.	Mikrostriekačka s kapacitou 10 μl na priamy nástrek do kolóny, vybavená cementovanou ihlou.

3.5.	Elektrický vibrátor.

3.6.	Rotačná odparka.

3.7.	Mufľová pec.

3.8.	Analytické váhy s garantovanou presnosťou merania na ± 0,1 mg.

3.9.	Bežné laboratórne sklené pomôcky.

4.   CHEMICKÉ ČINIDLÁ

4.1.	Silikagél s granulometriou medzi 60 a 200 μm. Silikagél vložte do pece aspoň na štyri hodiny pri teplote 500 °C. Po vychladnutí pridajte 2 % vody vzhľadom na množstvo odobraného silikagélu. Dobre pretrepte, aby sa hmota homogenizovala. Najmenej 12 hodín pred použitím uchovávajte v tme.

4.2.	n-hexán na chromatografiu.

4.3.	Etyléter na chromatografiu.

4.4.	n-heptán na chromatografiu.

4.5.	Štandardný roztok laurylarašidátu, 0,1 % (hm/obj) v hexáne (vnútorný štandard). [Je tiež možné použiť palmityl-palmitát (hexadecyl-palmitát) alebo myristyl-stearát (teradecyl-oktadekanoát)]. 4.5.1. Sudán 1 (1-fenyl-azo-2-naftol).

4.6.	Nosný plyn: vodík alebo čisté hélium na plynovú chromatografiu.

4.7.	Pomocné plyny: — čistý vodík na plynovoú chromatografiu, — čistý vzduch na plynovú chromatografiu.

5.   POSTUP

5.1.   Príprava chromatografickej kolóny

Suspenzujte 15 g silikagélu (4.1) v n-hexáne (4.2) a zaveďte do kolóny (3.2). Spontánne usadzovanie dokončite pomocou elektrickej trepačky (3.5) s cieľom dosiahnuť homogénnejšiu chromatografickú vrstvu. Perkolujte 30 ml n-hexánu s cieľom eliminovať všetky prípadné nečistoty. Presne odvážte pomocou váh (3.8). Vložte 500 mg vzorky do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1), pridajte primerané množstvo vnútorného štandardu (4.5) vzhľadom na predpokladaný obsah voskov. Napríklad: v prípade olivového oleja pridajte 0,1 mg laurylarašidátu a v prípade oleja z olivových výliskov 0,25 až 0,5 mg. Takto pripravenú vzorku preneste do chromatografickej kolóny s pomocou dvoch 2 ml dielov n-hexánu (4.2).

Napustite rozpúšťadlo až do výšky 1 mm nad hornú úroveň absorbentu, potom perkolujte ďalších 70 ml n-hexánu, aby sa eliminovali prirodzene prítomné n-alkány. Začnite chromatografickú elúciu zozbieraním 180 ml zmesi n-hexánu/etyléteru v pomere 99:1 pri zachovaní prietoku približne 15 kvapiek každých 10 sekúnd. Elúcia vzorky sa má uskutočniť pri okolitej teplote 22 °C ± 4 °C.

Poznámky:

Takto získanú frakciu sušte v rotačnej odparke (3.6) až do takmer úplnej eliminácie rozpúšťadla. Posledné 2 ml rozpúšťadla eliminujte pomocou slabého prúdu azotu; potom pridajte 2 – 4 ml n-heptánu.

5.2.   Analýza plynovou chromatografiou

5.2.1.   Predbežné úkony

Namontujte kolónu do plynového chromatografu (3.3), pričom vstupný port sa pripojí k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skontrolujte bežným spôsobom prístrojové vybavenie na plynovú chromatografiu (činnosť uzavretých plynových obvodov, účinnosť detektora a zapisovača atď.).

Pokiaľ sa kolóna používa po prvý raz, je potrebné ju kondicionovať. Zaveďte do kolóny mierny prietok plynu, potom zapnite prístroj na plynovú chromatografiu. Postupne zahrievajte, až kým sa približne po 4 hodinách dosiahne teplota 350 °C. Túto teplotu udržiavajte najmenej počas dvoch hodín, potom prístroj nastavte na prevádzkové podmienky [nastavte prietok plynu, zapáľte plamienok, pripojte k elektrickému zapisovaču (3.3.4), nastavte teplotu komory pre kolónu, nastavte detektor atď.]. Zaznamenajte signál pri citlivosti najmenej dvakrát vyššej, ako sa vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná čiara musí byť lineárna, nesmie obsahovať píky akéhokoľvek druhu a nesmie vykazovať žiadnu odchýlku.

Negatívna priamočiara odchýlka ukazuje, že kolóna je nesprávne pripojená; pozitívna odchýlka znamená, že kolóna nebola dostatočne kondicionovaná.

5.2.2.   Voľba prevádzkových podmienok

Prevádzkové podmienky, ktoré treba pozorovať, sú spravidla tieto:

Uvedené podmienky môžu byť upravené v závislosti od vlastností kolóny a prístroja na plynovú chromatografiu tak, aby sa dosiahla separácia všetkých voskov, postačujúce rozlíšenie píkov (pozri obrázok) a retenčný čas vnútorného štandardu C32 bol 18 ± 3 minúty. Najreprezentatívnejší pík vosku by mal dosahovať aspoň 60 % rozsahu stupnice.

Parametre integrácie píkov sa stanovia takým spôsobom, aby sa dosiahlo správne vyhodnotenie príslušných plôch píkov.

Poznámka:Vzhľadom na vysokú konečnú teplotu sa pripúšťa kladná odchýlka, ktorá nesmie prekročiť 10 % rozsahu stupnice.

5.3.   Vykonanie analýzy

Naberte 1 μl roztoku pomocou 10 μl mikrostriekačky; natiahnite piestik dozadu, až kým ihla nebude prázdna. Ihlu zaveďte do injekčného systému a po uplynutí jednej až dvoch sekúnd rýchlo vstreknite; po uplynutí asi piatich sekúnd ihlu pomaly vytiahnite.

Záznam nechajte prebiehať dovtedy, až kým neprebehne úplná elúcia voskov.

Základná čiara musí vždy zodpovedať požadovaným podmienkam.

5.4.   Identifikácia píkov

Jednotlivé píky identifikujte z retenčných časov a porovnaním so zmesami voskov so známymi retenčnými časmi, analyzovanými pri rovnakých podmienkach.

Na obrázku je znázornený chromatogram voskov panenského olivového oleja.

5.5.   Kvantitatívne hodnotenie

Integrátorom vypočítajte plochy píkov interného štandardu a alifatických esterov od C40 do C46.

Vypočítajte obsah voskov každého esteru v mg/kg tuku podľa príslušného vzorca:

kde:

Ax

=

plocha píku každého esteru v milimetroch štvorcových;

As

=

plocha píku vnútorného štandardu v milimetroch štvorcových,

ms

=

množstvo pridaného vnútorného štandardu v miligramoch;

m

=

množstvo vzorky odobratej na stanovenie v gramoch.

6.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Uveďte celkové obsahy jednotlivých voskov od C40 do C46 v mg/kg tuku (ppm).

Poznámka:Zložky, ktoré treba kvantifikovať, sa stanovujú vzhľadom na susediace píky esterov s počtom uhlíkov medzi C40 a C46 podľa príkladu chromatogramu voskov olivového oleja znázorneného na nasledujúcom obrázku. Ak sa ester C46 ukáže dvojmo, odporúča sa analyzovať na jeho identifikáciu frakciu voskov oleja z olivových výliskov, v ktorom je pík esteru C46 ľahko identifikovateľný, pretože výrazne prevažuje.

Výsledky sa uvádzajú na jedno desatinné miesto.

Obrázok

Chromatogram voskov istého olivového oleja ( 5 )

Vysvetlivky:

I.S.

=

laurylarašidát

1.

=

diterpénové estery

2 + 2′

=

estery C40

3 + 3′

=

estery C42

4 + 4′

=

estery C44

5.

=

estery C46

6.

=

sterol-estery a triterpénový alkohol.

---

Dodatok

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Vstreknite do prístroja na plynovú chromatografiu nastaveného na bežné prevádzkové podmienky 1 až 3 μl metánu (alebo propánu). Odmerajte čas, ktorý potrebuje plyn na prechod cez kolónu od momentu jeho zavedenia až dovtedy, kým sa neobjaví pík (tM).

Lineárna rýchlosť v cm/sek je daná vzorcom L/tM, pričom L je dĺžka kolóny v cm a tM je čas nameraný v sekundách.

▼B

---

PRÍLOHA V

STANOVENIE ZLOŽENIA A OBSAHU STEROLOV PLYNOVOU CHROMATOHRAFIOU NA KAPILÁRNYCH KOLÓNACH

1.   OBLASŤ

Metóda opisuje postup stanovenia obsahu jednotlivých sterolov a celkového obsahu sterolov v tukoch.

2.   PRINCÍP METÓDY

Tuk s pridaným α — cholesterolom ako vnútorným štandardom, je zmydelnený etanolickým roztokom hydroxidu draselného a látky nepodliehajúce zmydelneniu sa extrahujú dietyléterom.

Sterolová frakcia sa chromatografiou na silikagélových platniach oddelí od extraktu nezmydeliteľných látok. Steroly získané zo silikagélu sa prevedú na trimetylsilylétery a analyzujú sa metódou plynovej chromatografie na kapilárnych kolónach.

3.   PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

3.1.	250 ml banka s guľatým dnom so spätným chladičom a zábrusovými spojkami

3.2.	500 ml oddeľovacie lieviky.

3.3.	250 ml banky

3.4.	Kompletné zariadenie na analýzu tenkovrstvovou chromatografiou, používajúca sklenené platne rozmerov 20 × 20 cm

3.5.	UV lampa s vlnovou dĺžkou 366 alebo 254 nm, na skúmanie TLC platní

3.6.	100 μl a 500 μl mikrostriekačky

3.7.	Valcovitý filtračný lievik s G3 poréznou fritou (pórozita 15-40 μm) s priemerom približne 2 cm a výškou 5 cm, s pripojením vhodným na vákuovú filtráciu a s vonkajším zábrusom 12/21

3.8.	50 ml vákuová banka s 12/21 skleneným vnútorným zábrusom na použitie s filtračným lievikom (3.7)

3.9.	10 ml skúmavka s kónickým dnom a tesniacou zátkou

3.10.

Plynový chromatograf vhodný na použitie s kapilárnou kolónou, vybavený deliacim systémom pozostávajúci z: 3.10.1. termostatickej komory pre kolóny (kolónová pec), ktorá udrží požadovanú teplotu presnosťou na ± 1 oC; 3.10.2. teplotne nastaviteľnej splyňovacej jednotky (nástrek) so silanizovaným skleneným splyňovacím elementom (linerom); 3.10.3. plameňovoionizačného detektora a konvertora — zosilňovača; 3.10.4. zapisovača — integrátora pre operácie s prevodníkom — zosilňovačom (3.10.3), s časovou odozvou nepresahujúcou jednu sekundu a s rôznymi rýchlosťami posunu papiera.

3.11.

Kapilárna kolóna sklenená alebo z taveného kremeňa, dĺžky 20-30 m, o vnútornom priemere 0,25 až 0.32 mm, s kvapalnou fázou SE-52 alebo SE-54 alebo inou ekvivalentnou fázou, s hrúbkou filmu medzi 0,10 a 0,30 μm

3.12.

Mikrostriekačka na plynovú chromatografiu, s objemom 10 μl a s vytvrdenou ihlou

4.   ČINIDLÁ

4.1.	Hydroxid draselný; približne 2 mol/l etanolický roztok: 130 g hydroxidu draselného (minimálna koncentrácia 85 %) sa rozpustí za chladenia v 200 ml destilovanej vody a potom sa doplní etanolom do objemu 1 litra. Roztok by sa mal skladovať v dobre uzatvorenej fľaši z tmavého skla.

4.2.	Dietyléter, čistý na analýzu

4.3.	Bezvodý tiosíran sodný, čistý na analýzu

4.4.	Silikagélové TLC sklenené platne, bez fluorescenčného detektora, hrúbky 0,25 mm (na komerčné použitie, vhodné na okamžité použitie)

4.5.	Hydroxid draselný, približne 0,2 2 mol/l etanolický roztok; 13 g hydroxidu draselného sa rozpustí v 20 ml destilovanej vody a doplní sa do etanolom do objemu 1 litra.

4.6.	Benzén, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.7.	Acetón, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.8.	Hexán, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.9.	Dietyléter, na chromatografiu (pozri 5.2.2)

4.10.

Chloroform, na chromatografiu

4.11.

Referenčný roztok na tenkovrstvovú chromatografiu: zmes cholesterol alebo fytosteroly, ►M6  2 % ◄ roztok v chloroforme

4.12.

2,7 — dichlórfluoresceín, 0,2 % etanolický roztok. Slabo alkalický roztok získame pridaním niekoľkých kvapiek 2 N roztoku hydroxidu draselného.

4.13.

Bezvodý pyridín; na chromatografiu

4.14.

Hexametyldisilazán

4.15.

Trimetylchlórsilán

4.16.

Referenčný roztok trimetylsilylových éterov sterolu. Pripraví sa priamo pred použitím z čistých sterolov získaných z olejov, ktoré ho obsahujú.

4.17.

α — cholestanol, 0,2 % roztok (m/V) v chloroforme (vnútorný štandard)

4.18.

Nosný plyn: vodík a hélium, čistoty na plynovú chromatografiu

4.19.

Pomocné plyny: — vodík, čistoty na plynovú chromatografiu, — vzduch, čistoty na plynovú chromatografiu.

5.   POSTUP

5.1.

Príprava látky nepodliehajúcej zmydelneniu. 5.1.1. Do 250 ml destilačnej banky dajte pomocou 500 μl mikrostriekačky taký objem 0,2 % roztoku α — cholestanolu v chloroforme (4.17), obsahujúceho množstvo α — cholestanolu zodpovedajúcemu približne 10 % obsahu sterolu v alikvotnej čiastke vzorky, ktorá sa odobrala na analýzu. Napr. k 5 g vzorky pridajte 500μl 0,2 % roztoku α– cholestanolu, ak sa analyzuje olivový olej alebo olej zo semien, a 1 500 μl, ak sa jedná o rastlinný ►M6  ————— ◄ olej z olivových výliskov. Odparte dosucha pod prúdom dusíka a potom do tej istej banky privážte 5 g suchej prefiltrovanej vzorky. ►M6  Oleje ◄ s obsahom zistiteľných množstiev cholesterolu môžu vykazovať píky s retenčným časom identickým s cholestanolom. Pokiaľ sa tak stane, sterolová frakcia by sa mala opakovane analyzovať s alebo bez vnútorného štandardu ►M6  alebo sa namiesto cholestanolu bude musieť použiť betulinol ◄ . 5.1.2. Pridajte 50 ml 2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného, nasaďte spätný chladič a zariadenie zahrievajte vo vodnom kúpeli do mierneho varu a za stáleho silného miešania, až kým sa zmydelňovanie neukončí (roztok sa vyčíri). Zahrievajte ešte ďalších 20 minút a potom cez spätný chladič prilejte 50 ml destilovanej vody, spätný chladič odpojte a banku ochlaďte na teplotu približne 30 oC. 5.1.3. Obsah banky kvantitatívne preneste do 500 ml oddeľovacieho lievika pomocou viacnásobného opláchnutia destilovanou vodou (celkovo sa jej použije asi 50 ml). Pridajte približne 80 ml dietyléteru, všetko riadne pretrepávajte 30 sekúnd a potom nechajte usadiť (pozn.1). Oddeľte spodnú vodnú vrstvu do druhého oddeľovacieho lievika. Rovnakým spôsobom vykonáme dve ďalšie extrakcie z vodnej fázy, pri každej sa použije 60-70 ml dietyléteru. Poznámka 1.Akákoľvek emulzia sa dá odstrániť pridaním malých množstiev etyl- alebo metylalkoholu vo forme spreja. 5.1.4. Vložte dietyléterové extrakty do jedného oddeľovacieho lievika a prepierajte destilovanou vodou (50 ml každý raz), až kým voda nevykazuje neutrálnu reakciu. Odstráňte vypieraciu vodu, zostávajúcu vrstvu vysušte bezvodým tiosíranom sodným a prefiltrujte cez bezvodý tiosíran sodný do predtým odváženej 250 ml banky, lievik a filter opláchnite malým množstvom dietyléteru. 5.1.5. Oddestilujte éter na niekoľko ml a potom pod slabým vákuom alebo pod prúdom dusíka vysušte, sušenie dokončite v sušičke pri 100 oC asi štvrťhodinu a zvyšok odvážte po ochladení v exsikátore.

5.2.

Oddelenie sterolovej frakcie 5.2.1. Príprava základných platní. Silikagélové platne (4.4.) úplne ponorte na 10 sekúnd do 0,2 mol/l etanolického roztoku hydroxidu draselného (4.5) a potom ich nechajte dve hodiny sušiť v digestóriu a nakoniec ich dosušte v sušičke jednu hodinu pri teplote 100 oC. Vyberte platne zo sušičky a uložte ich až do ďalšieho použitia do exsikátora s chloridom vápenatým (takto ošetrené platne sa musia použiť do dvoch týždňov). Poznámka 2. Ak sa na separáciu sterolovej frakcie použijú základné silikagélové platne, látky, ktoré nepodliehajú zmydelneniu, nie je potrebné upravovať oxidom hlinitým. Takýmto spôsobom sa všetky zlúčeniny kyslého charakteru zložky (mastné kyseliny a iné) zachytia na začiatku a skupina sterolov sa zreteľne oddelí od skupiny alifatických a triterpénových alkoholov. 5.2.2. Zmes benzénu a acetónu v pomere objemov 95:5 (v/v) vložte do vyvíjacej komory v hrúbke vrstvy cca 1 cm. Alternatívne je možné použiť zmes hexán/dietyléter v pomere objemov 65:35 hexánu. Komoru uzatvorte vhodným krytom a nechajte ju stáť asi pol hodiny, aby sa ustálila rovnováha medzi parami a kvapalinou. Na vnútorné steny komory sa môžu pripevniť pásy filtračného papiera namočené vo vyvíjacej zmesi, čím sa skráti čas vyvíjania asi o jednu tretinu a získa sa rovnomernejšia a pravidelnejšia elúcia zložiek. Poznámka 3. Po každej analýze sa musí vymeniť vyvíjací roztok, aby sa úplne zabezpečili reprodukovateľné podmienky vyvíjania. 5.2.3. V chloroforme pripravte približne 5 % roztok látok nepodliehajúcich zmydelneniu (5.1.5.) a pomocou 100 μl mikrostriekačky naneste na chromatografickú platňu 0,3 ml roztoku v rovnomernom pásiku minimálnej hrúbky, približne 2 cm od spodku platne. V línii s pásikom naneste 2 až 3 μl referenčného roztoku sterolov (4.11) na jeden koniec tak, že sterolová skupina môže byť po vyvolaní identifikovaná. 5.2.4. Umiestnite platňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa uvádza v bode 5.2.2. Udržujte izbovú teplotu v rozmedzí 15 až 20 oC. Komoru ihneď uzatvorte krytom a vzorku nechajte eluovať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne vzdialenosť približne 1 cm od hornej hrany platne. Potom platňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpúšťadlo odparte prúdom horúceho vzduchu alebo dosku nechajte krátko prikrytú krytom. 5.2.5. Platňu mierne a pravidelne postriekajte roztokom 2,7- dichlórfluoresceínu. Keď sa platňa pozoruje pod ultrafialovým svetlom, sterolová skupina sa dá identifikovať podľa škvŕn získaných z referenčného roztoku, zoskupených v rade. Označte hranice skupiny čiernou ceruzkou pozdĺž okrajov fluorescencie. 5.2.6. Pomocou kovovej škrabky (kopistky) zoškrabte silikagél z označenej plochy. Umiestnite jemne rozotretý materiál do filtračného lievika (3.7). Pridajte 10 ml horúceho chloroformu, opatrne premiešajte kovovou kopistkou a prefiltrujte za vákua, filtrát pozbierajte do banky (3.8), pripojenej k filtračnému lieviku. Spláchnite zvyšok v lieviku dietyléterom (asi 10 ml každý raz), zbierajte filtrát do tej jednej banky pripojenej k filtračnému lieviku. Odparte filtrát na objem 4 až 5 ml a zvyšný roztok prelejte do vopred odváženej 10 ml skúmavky (3.9), odparte dosucha stredným zahrievaním pod slabým prúdom dusíka, znovu rozpustite v niekoľkých kvapkách acetónu, opäť odparte, na 10 minút vložte do sušičky pri teplote 105 oC a nechajte ochladiť v exsikátore a odvážte. Zvyšok vo vnútri skúmavky pozostáva zo sterolovej frakcie.

5.3.

Príprava trimetylsilylových esterov 5.3.1. Pridajte silanizačné činidlo, pozostávajúce zo zmesi objemov 9.3.1 (v/v/v) pyridínu/hexametyldisilazánu/trimetylsilánu (pozn.4) v pomere 50 μl na každý miligram sterolov, do skúmavky obsahujúcej sterolovú frakciu tak, aby sa zabránilo akejkoľvek absorpcii vlhkosti (pozn.5). Poznámka 4. Roztoky na priame použitie sú dostupné v obchodnej sieti. Prípustné sú tiež silanizačné činidlá, ako napr. bis-trimetylsilyl, triflúoroacetamid + 1 % trimetylchlórsilán, ktoré sa riedia rovnakým objemom bezvodého pyridínu. 5.3.2. Skúmavku zazátkujte a opatrne pretrepávajte bez pretáčania, až kým nie sú steroly úplne rozpustené. Potom nechajte skúmavku stáť aspoň 15 minút pri izbovej teplote a následne niekoľko minút odstreďujte. Číry roztok je pripravený na plynovú chromatografickú analýzu. Poznámka 5. Možný vznik slabej opalescencie je bežný a nespôsobuje žiadne interferencie. Vznik bielych vločiek alebo objavenie sa ružového zafarbenia sú znaky prítomnosti alebo znečistenia činidla. V takomto prípade je potrebné test zopakovať.

5.4.

Plynovochromatografická analýza 5.4.1. Prípravné postupy a kondiciovanie kolón 5.4.1.1. Kapilárna kolóna sa zachytí vo vnútri plynového chromatografu, pripojte vstup kolóny na odparovač, ktorý je spojený s deliacim systémom a výstup kolóny na detektor. Vykonajte celkovú kontrolu plynového chromatografu (netesnosť v plynových okruhu, výkonnosť detektora, výkonnosť deliaceho systému a zapisovača, atď.). 5.4.1.2. Kapilárnu kolónu, ktorá ešte nebola použitá, je potrebné kondiciovať. Nastavte malý prietok nosného plynu cez kapilárnu kolónu a potom zapnite plynový chromatograf, postupne vyhrievajte, až kým nedosiahnete teplotu minimálne 20 oC nad pracovnú teplotu (pozn. 6). Udržujte túto teplotu aspoň dve hodiny a potom sa zariadenie nastaví na pracovný chod [nastavenie prietokov plynov a deliaceho pomeru (odfuku), zapálenie plameňa, pripojenie na elektronický zapisovač, nastavenie teploty termostatu, detektora a nástreku, atď.] a potom zosnímajte signál pri citlivosti aspoň dvojnásobne vyššej ako pri analýze. Základná línia má byť lineárna, bez špičiek akéhokoľvek pôvodu, a nemala by vykazovať žiadne znaky výkyvov (driftov). Negatívny priamočiary drift základnej línie indikuje nedokonalú tesnosť kolónových spojov, kým pozitívny driftv indikuje nedostatočné kondiciovanie kolóny. Poznámka 6. Teplota kondiciovania má byť aspoň o 20 oC nižšia, ako je maximálna pracovná teplota predpokladaná na používanú kvapalnú fázu. 5.4.2. Výber pracovných podmienok 5.4.2.1. Hlavné pracovné podmienky sú nasledujúce: — teplota kolóny: 260 oC ± 5 oC — teplota odparovača: 280 oC, — teplota detektora: 290 oC, — lineárna rýchlosť nosného plynu: hélium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — deliaci pomer: 1: 50 a 1: 100, — citlivosť prístroja: 4 až 16 násobok minimálneho zoslabenia, — rozsah zapisovača: 1 až 2 mV na celý rozsah (celá škála — fs), — rýchlosť posunu papiera: 30 až 60 cm/h, — množstvo dávkovanej látky: 0,5 až 1 μl TMSE roztoku. Tieto podmienky sa môžu líšiť podľa vlastností kolóny a plynového chromatografu tak, aby sa získali chromatogramy spĺňajúce nasledujúce podmienky: — retenčný čas ß — sitosterolu má byť 20 ± 5 minút, — vrchol (pík) kampasterolu má byť: pre olivový olej (priemerný obsah 3 %) 15 ± 5 % hodnoty celkového rozsahu; pre sójový olej (priemerný obsah 20 %) 80 ± 10 % hodnoty celkového rozsahu, — všetky prítomné steroly musia byť rozdelené. Okrem toho, aby sa píky mohli rozdeliť, musia byť úplne rozlíšené, t. j. stopový pík by sa mal vrátiť na základnú líniu pred vylúhovaním ďalšieho píku. Neúplné rozlíšenie je avšak tolerované, ale s podmienkou, že pík v TRR 1,02 je možné kvantifikovať použitím kolmice 5.4.3. Vykonanie analýzy 5.4.3.1. Do 10 μl mikrostriekačky natiahnite 1 μl hexánu, potom natiahnite 0,5 μl vzduchu a následne 0,5 až 1 μl roztoku vzorky. Vytiahnite piest mikrostriekačky tak, aby bola ihla prázdna. Ihlu zaveďte cez septum (tesnenie) do dávkovacieho zariadenia (nástreku) a po jednej až dvoch sekundách roztok rýchlo nadávkujte a ihlu približne po piatich sekundách pomaly vytiahnite. 5.4.3.2. Pokračujte v zaznamenávaní chromatogramu, až kým sa všetky prítomné steroly úplne nevylúhujú. Základná línia bude vždy v súlade s požiadavkami v bode 5.4.1.2. 5.4.4. Identifikácia píkov (vrcholov) Identifikácia jednotlivých píkov sa vykoná podľa retenčných časov a porovnaním so zmesou TMSE sterolov, analyzovanou za rovnakých podmienok. Steroly eluujú v nasledujúcom poradí: Cholesterol, brassikasterol, 24-metylén cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7 — kampesterol, Δ 5,23- stigmastadienol, klerosterol, β — sistosterol, sitostanol, Δ 5 — avenasterol, Δ 5,24 — stigmastadienol, Δ 7 — stigmastenol, Δ 7 — avenastenol. Retenčné časy sitosterolu pre kolóny SE — 52 a SE– 54 sú v tabuľke 1. Obr.1 a 2 ukazujú typické chromatografy niektorých olejov. 5.4.5. Kvantitatívny odhad 5.4.5.1. Plochy píkov α — cholestanolu a sterolov vypočítajte použitím elektronického integrátora. Neuvádzajte píky zložiek, ktoré nie sú zahrnuté v zozname v tab.1. Odozvový faktor pre α — cholestanol sa rovná 1. 5.4.5.2. Obsahy všetkých alkoholov, vyjadrených v mg/100 g tukových látok, sa vypočítajú nasledovne: kde: Ax = plocha píku sterolu x ►M6  ————— ◄ (mm2), As = plocha píku α — cholestanolu ►M6  ————— ◄ (mm2), ms = hmotnosť pridaného α — cholestanolu, v miligramoch (mg), m = hmotnosť vzorky odobratej na stanovenie, v gramoch (g)

6.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1.	Uvedú sa jednotlivé koncentrácie sterolov ako v mg/100 g tukových látok a ich sumu ako „celkové steroly“.

6.2.	Vypočítajte percento každého jednotlivého sterolu z pomeru plochy daného píku k celkovej ploche sterolov: kde: Ax = plocha píku sterolu x; A = celková plocha sterolov.

---

DODATOK

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Nadávkujte 1 až 3 μl metánu (alebo propánu) do plynového chromatografu za obvyklých pracovných podmienok a stopkami zmerajte čas, za ktorý prejde plyn kolónou od momentu nástreku až po čas, kedy sa objaví (vylúhuje) pík (tM).

Lineárna rýchlosť v (cm/s) je daná L/tM, kde L je dĺžka kolóny v centimetroch (cm) a tM je čas nameraný v sekundách (s).

Obrázok 1

Chromatografický záznam sterolovej frakcie nerafinovaného olivového oleja

Obrázok 2

Chromatografický záznam sterolovej frakcie rafinovaného olivového oleja

---

PRÍLOHA VI

STANOVENIE ERYTRODIOLU A UVAOLU

ÚVOD

Erytrodiol (bežne chápaný ako erytrodiolové glykoly a uvaol spolu) tvorí podstatnú časť nezmydlovateľnej frakcie charakteristickej pre niektoré druhy tukov. Nachádza sa v oveľa vyšších koncentráciách rozpúšťadlovo extrahovaného olivového oleja ako sú koncentrácie iných olejov, napr. lisovaný olivový olej a olej z hroznových zrniečok, v ktorých je taktiež obsiahnutý, a tak jeho prítomnosť môže dokázať prítomnosť rozpúšťadlovo extrahovaného olivového oleja.

1.   OBLASŤ

Metóda opisuje postup detekcie erytrodiolu v tukoch

2.   PODSTATA

Tuk sa zmydelní metanolicko-etanolickým roztokom hydroxidu draselného. Nezmydelniteľná frakcia sa potom extrahuje dietyléterom a prečistí sa prechodom cez kolónu z oxidu hlinitého.

Nezmydelniteľné látky sa pri tenkovrstvovej chromatografii na silikagélovej platni rozdelia na skupiny zodpovedajúce sterolovej a erytrodiolovej frakcii. Steroly a erytrodiol, získaný z platní, sa prevedú na trimetylsilylové estery a zmes sa analyzuje plynovou chromatografiou.

Výsledok sa vyjadrí ako percento erytrodiolu v zmesi erytrodiolu a sterolov.

3.   PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

3.1.	Vybavenie uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).

4.   ČINIDLÁ

4.1.	Činidlá uvedené v prílohe V (stanovenie obsahu sterolov).

4.2.	Referenčný roztok erytrodiolu, 0,5 % roztok v chloroforme.

5.   POSTUP

5.1.   Príprava nezmydelniteľných látok

Ako je popísané v odseku 5.1.2. prílohy V.

5.2.   Oddelenie erytrodiolu a sterolov

5.2.1.

Pozri odstavec 5.2.1 prílohy V.

5.2.2.

Pozri odstavec 5.2.2 prílohy V.

5.2.3.

Pripravte 5 % roztok nezmydelniteľných látok v chloroforme. Pomocou 0,1 ml mikrostriekačky naneste na chromatografickú platňu čo najtenší a najrovnomernejší pásik 0,3 ml roztoku približne 1,5 cm od spodného okraja platne. Na jeden koniec platne umiestnite niekoľko mikrolitrov roztokov cholesterolu a erytrodiolu, ktoré budú slúžiť ako etalóny (na porovnanie).

5.2.4.

Umiestnite platňu dovnútra vyvíjacej komory pripravenej tak, ako sa uvádza v bode 5.2.1. Okolitá teplota by mala byť asi 20 oC. Komoru ihneď uzatvorte krytom a vzorku nechajte eluovať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne vzdialenosť približne 1 cm od horného okraja platne. Potom platňu z vyvíjacej komory vyberte a rozpúšťadlo odparte prúdom horúceho vzduchu.

5.2.5.

Platňu mierne a pravidelne postriekajte alkoholovým roztokom 2,7- dichlórfluoresceínu. Keď platňu pozorujete pod ultrafialovým svetlom, sterolová a erytrodiolová skupina sa dá identifikovať podľa toho, že sa zoskupujú v rade so štandardami. Bodmi označte iba vonkajšie okraje fluorescencie.

5.2.6.

Pomocou kovovej škrabky /kopistky/ zoškrabte silikagél z označenej plochy. Preneste materiál z platne do 50 ml banky. Pridajte 15 ml horúceho chloroformu, dobre pretrepte a prefiltrujte cez filtračný lievik so sintrovaným skleneným diskom tak, aby sa silikagél preniesol na filter. Trikrát premyte horúcim chloroformom (asi 10 ml každý raz), filtrát zbierajte do 100 ml banky. Odparte filtrát na objem 4 až 5 ml, preneste ho do kalibrovanej 10 ml centrifugačnej skúmavky s kužeľovým dnom, vysušte slabým zahrievaním pod prúdom dusíka a odvážte.

5.3.   Príprava trimetylsilylových esterov

Ako je popísané v odseku 5.3 prílohy V.

5.4.   Plynovochromatografická analýza

Ako je popísané v odseku 5.4 prílohy V. Pracovné podmienky pre plynový chromatograf musia byť také, aby bolo možné vykonať analýzu sterolov a oddeliť TMSE od erytrodiolu a uvaolu.

Ak ste už vykonali nástrek vzorky, pokračujte v zaznamenávaní, kým nie sú prítomné steroly a kým sa erytrodiol a uvaol nevyelujú. Potom identifikujte píky (retenčné časy erytrodiolu a uvaolu pre β- sitosterol sú 1,45 a 1,55, v tomto poradí) a vypoČítajte plochy tak, ako pri steroloch.

6.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

kde:

A1

=

plocha píku erytrodiolu ►M6  ————— ◄ (mm2);

A2

=

plocha píku uvaolu ►M6  ————— ◄ (mm2),

Asterolov

=

celková plocha píkov pre steroly ►M6  ————— ◄ (mm2).

Výsledok sa udáva na jedno desatinné miesto

▼M21

---

PRÍLOHA VII

STANOVENIE PERCENTUÁLNEHO OBSAHU 2-GLYCERIL MONOPALMITÁTU

1.   ÚČEL A OBLASŤ POUŽITIA

Touto metódou sa popisuje analytický postup na stanovenie percentuálneho obsahu kyseliny palmitovej v pozícii 2 triglyceridov prostredníctvom hodnotenia 2-glyceril monopalmitátu.

Táto metóda je použiteľná na tekuté rastlinné oleje pri temperovanej okolitej teplote (20 °C).

2.   PRINCÍP

Po príprave sa vzorka oleja podrobí procesu pankreatickej lipázy: čiastočná a špecifická hydrolýza v pozíciách 1 a 3 molekuly triglyceridu vyvolá objavenie sa monoglyceridov v pozícii 2. Percentuálny obsah 2-glyceril monopalmitátu v monoglyceridovej frakcii sa stanovuje po silanizácii kapilárnou plynovou chromatografiou.

3.   PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE A BEŽNÝ LABORATÓRNY MATERIÁL

3.1.	25 ml Erlenmeyerova banka

3.2.	100, 250 a 300 ml kadičky

3.3.	Sklená kolóna na chromatografiu, s vnútorným priemerom 21 – 23 mm, dĺžkou 400 mm, vybavená fritovým kotúčom a kohútikom

3.4.	Odmerné valce s objemom 10, 50, 100 a 200 ml

3.5.	100 a 250 ml banky

3.6.	Rotačná odparka

3.7.	10 ml centrifugačná skúmavka s kónickým dnom so zábrusovou zátkou

3.8.	Odstredivka pre 10 a 100 ml skúmavky

3.9.	Termostat s možnosťou udržiavania teploty na 40 °C ± 0,5 °C

3.10.

Odmerné pipety s objemom 1 a 2 ml

3.11.

1 ml podkožná striekačka

3.12.

100 μl mikrostriekačka

3.13.

1 000 ml lievik

3.14.

Plynový chromatograf pre kapilárne kolóny, vybavený injekčným systémom „on column“ za studena na priame zavedenie vzorky do kolóny a pecou umožňujúcou udržiavať nastavenú teplotu s presnosťou na 1 °C

3.15.

Studený injektor „on column“ na priame zavedenie vzorky do kolóny

3.16.

Plameňovoionizačný detektor a elektrometer

3.17.

Zapisovač-integrátor prispôsobený elektrometru s rýchlosťou odozvy najviac 1 sekundu a s meniteľnou rýchlosťou posunu papiera

3.18.

Kapilárna kolóna sklená alebo silikagélová, s dĺžkou 8 až 12 metrov, vnútorným priemerom 0,25 až 0,32 mm, pokrytá metylpolysiloxánom alebo 5 % fenyl metylpolysiloxánom, s hrúbkou 0,10 – 0,30 μm, použiteľná pri teplote 370 °C

3.19.

10 μl mikrostriekačka vybavená cementovou ihlou dlhou aspoň 7,5 cm na priame vstreknutie na kolónu.

4.   ČINIDLÁ

4.1.

Silikagél s granulometriou medzi 0,063 a 0,200 mm (70/280 mesh) pripravený takto: Silikagél vložte do porcelánovej kapsule, sušte aspoň štyri hodiny v peci pri teplote 160 °C. Nechajte vychladnúť v exsikátore pri temperovanej teplote. Pridajte objem vody, ktorý zodpovedá 5 % hmotnosti silikagélu, takto: odvážte 152 g silikagélu do Erlenmeyerovej banky, pridajte 8 g destilovanej vody, zazátkujte a jemne pretrepte, aby sa voda rovnomerne rozdelila. Pred použitím nechajte aspoň 12 hodín stáť.

4.2.	n-hexán (na chromatografiu)

4.3.	Izopropanol

4.4.	Izopropanol, vodný roztok v objemovom pomere 1/1

4.5.	Pankreatická lipáza. Použitá lipáza má mať aktivitu medzi 2,0 a 10 jednotkami lipázy na mg (V obchodnej sieti dostať pankreatické lipázy s aktivitou medzi 2 a 10 jednotkami na mg enzýmu.)

4.6.	Tlmiaci roztok tri-hydroxy-metylaminometánu: vodný roztok 1 M upravený až na pH = 8 (kontrolované potenciometrom) pridaním koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (v objemovom pomere 1/1)

4.7.	Cholát sodný enzymatickej kvality, 0,1 % vodný roztok (tento roztok sa musí použiť do 15 dní od jeho prípravy)

4.8.	Chlorid vápenatý, 22 % vodný roztok

4.9.	Dietyléter na chromatografiu

4.10.

Vyvíjacie rozpúšťadlo: zmes n-hexánu/dietyléteru (v objemovom pomere 87/13)

4.11.

12 % hmotnostných roztoku hydroxidu sodného

4.12.

Fenolftaleín, 1 % roztok v etanole

4.13.

Nosný plyn: vodík alebo hélium na plynovú chromatografiu

4.14.

Pomocné plyny: vodík, minimálne 99 %, zbavený vlhkosti a organických látok – a vzduch rovnakej čistoty na plynovú chromatografiu

4.15.

Činidlá na silanizáciu: zmes pyridínu/hexametyldisilazánu, trimetylchlórsilánu v objemovom pomere 9/3/1 (Hotové roztoky dostať v obchodnej sieti. Na silanizáciu sa môžu použiť aj ďalšie činidlá, konkrétne bis-trimetylsilyl trifluóracetamid + 1 % trimetylchlorosilán, zriedené rovnakým objemom bezvodého pyridínu.)

4.16.

Referenčné vzorky: čisté monoglyceridy alebo zmesi monoglyceridov so známym percentuálnym zložením podobným vzorke.

5.   POSTUP

5.1.   Príprava vzorky

5.1.1.

Oleje s obsahom voľných kyselín menej ako 3 % sa nemusia pred chromatografiou na silikagélovej kolóne neutralizovať. Oleje s obsahom voľných kyselín viac ako 3 % sa musia neutralizovať v súlade s bodom 5.1.1.1. 5.1.1.1. Do 1 000 ml lievika (3.13) dajte 50 g oleja a 200 ml n-hexánu. Pridajte 100 ml izopropanolu a taký objem roztoku 12 % hydroxidu sodného (4.11), aký zodpovedá obsahu voľných kyselín v oleji s 5 % navýšením. Dôkladne pretrepávajte počas 1 minúty. Pridajte 100 ml destilovanej vody, znova pretrepte a nechajte stáť. Po dekantácii eliminujte spodnú vrstvu obsahujúcu mydlá. Eliminujte prípadné stredné vrstvy (sliz a nerozpustné látky). Premyte hexánový roztok neutralizovaného oleja postupnými dávkami 50 – 60 ml roztoku izopropanolu/vody v objemovom pomere 1/1 (4.4) až do vymiznutia ružového sfarbenia fenolftaleínu. Eliminujte najväčšiu časť hexánu vákuovou destiláciou (napríklad s použitím rotačnej odparky) a preneste olej do 100 ml banky (3.5). Vysúšajte olej vo vákuu až do úplnej eliminácie rozpúšťadla. Po skončení tejto procedúry má byť acidita oleja nižšia ako 0,5 %.

5.1.2.

Vložte 1,0 g oleja pripraveného podľa vyššie uvedených indikácií do 25 ml (3.1) Erlenmeyerovej banky a rozpustite v 10 ml vyvíjacej zmesi (4.10). Nechajte roztok postáť aspoň 15 minút pred chromatografiou na silikagélovej kolóne. Ak je roztok zakalený, odstreďte ho, aby boli zabezpečené optimálne podmienky na chromatografiu. (Môžu sa použiť aj už hotové 500 g silikagélové patróny SPE – na extrakciu na tuhých fázach).

5.1.3.

Príprava chromatografickej kolóny Nalejte do kolóny (3.3) približne 30 ml vyvíjacieho rozpúšťadla (4.10), pomocou sklenenej tyčinky vložte do spodnej časti kolóny kúsok bavlny; stlačte, aby sa odstránil vzduch. V kadičke pripravte suspenziu z 25 g silikagélu (4.1) v približne 80 ml vyvíjacieho rozpúšťadla a pomocou lievika ju vlejte do kolóny. Skontrolujte, či bol do kolóny zavedený všetok silikagél; premyte vyvíjacím rozpúšťadlom (4.10), otvorte kohútik a nechajte, aby hladina tekutiny dosiahla približne 2 mm nad vrchnou úrovňou silikagélu.

5.1.4.

Chromatografia na kolóne Do 25 ml Erlenmeyerovej banky (3.1) odvážte presne 1,0 g vzorky pripravenej podľa bodu 5.1. Rozpustite vzorku v 10 ml vyvíjacieho roztoku (4.10). Nalejte roztok do chromatografickej kolóny pripravenej podľa bodu 5.1.3. Nepohnite povrchom kolóny. Otvorte kohútik a nechajte roztok vzorky tiecť, až kým nedosiahne úroveň silikagélu. Vyvíjajte so 150 ml vyvíjacieho rozpúšťadla. Upravte prietok na 2 ml/min (tak, aby 150 ml pretieklo do kolóny približne za 60 – 70 minút). Odoberte eluát do 250 ml banky, ktorú ste predtým odvážili. Odparte rozpúšťadlo vo vákuu a odstráňte jeho posledné stopy pod prúdom dusíka. Odvážte banku a vypočítajte množstvo získaného extrátu. [V prípade použitia už hotových silikagélových patrónov SPE postupujte takto: zaveďte 1 ml roztoku (5.1.2) do vopred pripravených patrónov s 3 ml n-hexánu.] Po perkolovaní roztoku vyvíjajte so 4 ml n-hexánu/dietyléteru v objemovom pomere 9/1. Odoberte eluát do 10 ml skúmavky a odparujte pod prúdom dusíka až do vysušenia. Suché rezíduum podrobte pankreatickej lipáze (5.2). Základom je overiť zloženie mastných kyselín pred a po prechode patrónom SPE.

5.2.   Hydrolýza pankreatickou lipázou

5.2.1.

Do centrifugačnej skúmavky odvážte 0,1 g oleja pripraveného podľa bodu 5.1. Pridajte 2 ml tlmiaceho roztoku (4.6), 0,5 ml roztoku cholátu sodného (4.7) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého, pričom po každom pridaní riadne pretrepte. Uzatvorte skúmavku zábrusovou zátkou a umiestnite ju do termostatu pri teplote 40 ± 0,5 °C.

5.2.2.

Pridajte 20 mg lipázy, opatrne pretrepte (tak, aby ste nezmáčali zátku) a dajte skúmavku do termostatu presne na 2 minúty, potom ju vyberte, počas 1 minúty dôkladne pretrepávajte a nechajte vychladnúť.

5.2.3.

Pridajte 1 ml dietyléteru, zazátkujte a dôkladne pretrepte, potom odstreďte a pomocou mikrostriekačky preneste éterový roztok do čistej a suchej skúmavky.

5.3.   Príprava silanizovaných derivátov a plynová chromatografia

5.3.1.

Pomocou mikrostriekačky zaveďte 100 μl roztoku (5.2.3) do 10 ml skúmavky s kónickým dnom.

5.3.2.

Eliminujte rozpúšťadlo pod miernym prúdom dusíka, pridajte 200 μl činidla na silanizáciu (4.15), uzavrite skúmavku a nechajte 20 minút odstáť.

5.3.3.

Po 20 minútach pridajte 1 až 5 ml n-hexánu (v závislosti od chromatografických podmienok): výsledný roztok je pripravený na plynovú chromatografiu.

5.4.   Plynová chromatografia

Hlavné operačné podmienky sú tieto:

5.4.1.   Identifikácia píkov

Jednotlivé monoglyceridy sa identifikujú v závislosti od získaných retenčných časov a vzhľadom na tie, ktoré boli získané so štandardami zmesí monoglyceridov analyzovaných pri rovnakých podmienkach.

5.4.2.   Kvantitatívne hodnotenie

Plocha každého píku sa vypočíta pomocou elektronického integrátora.

6.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Percentuálny obsah glyceryl monopalmitátu sa vypočíta na základe vzťahu medzi plochou zodpovedajúceho píku a súčtom plôch píkov všetkých monoglyceridov (pozri obrázok 2) podľa vzorca:

glycéryl monopalmitate (%):

kde:

Ax

=

plocha píku, ktorý zodpovedá glyceril monopalmitátu,

ΣA

=

súčet plôch všetkých píkov, ktoré zodpovedajú monoglyceridom.

Výsledok sa uvádza s presnosťou na jedno desatinné miesto.

7.   SPRÁVA O ANALÝZE

V správe z analýzy sa má konkrétne uviesť:

Obrázok 1

Chromatogram výsledných produktov reakcie silanizácie, ktoré sa získali lipázou na rafinovanom olivovom oleji s pridaním 20 % esterifikovaného oleja (100 %)

Vysvetlivky:„acides gras libres“ = voľné mastné kyseliny; „huile d’olive rafinée + 20 % huile estérifiée“ = rafinovaný olivový olej s pridaním 20 % esterifikovaného oleja; „1-2 monopalmitoléine“ = 1-2 monopalmitín; „1-2 mono C18 insat.“ = nesaturovaný 1-2 mono C18

Obrázok 2

Chromatogram:

A)

neesterifikovaného olivového oleja, po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko potom. Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekročiť 15 %. Vysvetlivky: 1 = Voľné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitín ** = Triglycerid C54

Chromatogram:

B)

esterifikovaného oleja po lipáze; po silanizácii; za týchto podmienok (kapilárna kolóna 8 – 12 m) je vosková frakcia eluovaná v rovnakom čase ako frakcia diglyceridu alebo krátko potom. Po lipáze by obsah triglyceridov nemal prekročiť 15 %. Vysvetlivky: 1 = Voľné mastné kyseliny 2 = Monoglyceridy 3 = Diglyceridy 4 = Triglyceridy * = 2-monopalmitín ** = Triglycerid C54

8.   POZNÁMKY

PRÍPRAVA LIPÁZY

V obchodnej sieti sú k dispozícii lipázy s dostatočnou aktivitou. V laboratóriu sa tiež dajú pripraviť takto:

5 kg čerstvých pankreasov z ošípaných ochlaďte na 0 °C. Odstráňte tuhý okolitý tuk a spojivové tkanivo a rozomeľte v mlynčeku s lamelami tak, aby ste získali tekutú hmotu. Pretrepávajte túto hmotu 4 až 6 hodín spolu s 2,5 litra bezvodého acetónu a potom odstreďte. Ešte trikrát extrahujte zvyšok s rovnakým objemom bezvodého acetónu, potom ďalších dvakrát so zmesou acetónu/dietyléteru v objemovom pomere (1/1) a dvakrát s dietyléterom.

Sušte zvyšok 48 hodín vo vákuu, aby ste získali stabilný prášok, ktorý bude dlhodobo uskladniteľný v chladničke chránený pred vlhkosťou.

KONTROLA AKTIVITY LIPÁZY

Pripravte emulziu olivového oleja takto:

Počas 10 minút pretrepávajte v miešači zmes zloženú zo 165 ml roztoku arabskej gumy s koncentráciou 100g/l, 15 g roztlčeného ľadu a 20 ml vopred zneutralizovaného oleja.

Postupne zaveďte do 50 ml banky 10 ml tejto emulzie, ďalej 0,3 ml roztoku cholátu sodného s koncentráciou 0,2 g/ml a 20 ml destilovanej vody.

Umiestnite banku do termostatu nastaveného na 37 °C; zaveďte elektródy pH-metra a špirálové miešadlo.

Pomocou byrety pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného 0,1 N, až kým nedosiahnete pH 8,3.

Pridajte objem suspenzie prášku lipázy vo vode (0,1 g/ml lipázy). Keď pH-meter ukáže pH 8,3, uveďte chronometer do činnosti a pridávajte po kvapkách roztok hydroxidu sodného takým tempom, aby sa hodnota pH udržiavala na 8,3. Zaznamenajte každú minútu objem spotrebovaného roztoku.

Preneste údaje do grafového systému súradníc tak, že os nezávisle premenných (x-ová os) ponesie časové údaje a na osi závisle premenných (y-ová os) uvediete počet mililitrov alkalického roztoku 0,1 N spotrebovaného na udržanie konštantného pH. Mali by ste získať lineárny graf.

Aktivita lipázy meraná v jednotkách lipázy na mg sa vypočíta na základe vzorca:

kde:

A	je aktivita vyjadrená v jednotkách lipázy/mg

V	je počet mililitrov roztoku hydroxidu sodného 0,1 N za minútu (vypočítané na základe grafu)

N	je molarita roztoku hydroxidu sodného

m	je množstvo testovacej lipázy v mg.

Jednotka lipázy je definovaná ako množstvo enzýmu, ktoré uvoľní 10 mikro-ekvivalentov kyseliny za minútu.

▼M20 —————

▼B

---

PRÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÉ SKÚMANIE V ULTRAFIALOVEJ OBLASTI

ÚVOD

Spektrofotometrické skúmanie v ultrafialovej oblasti môže poskytnúť informácie o kvalite tuku, jeho stave uchovania a o zmenách, ktoré v ňom nastali počas technologických procesov.

Absorpcia pri vlnových dĺžkach špecifikovaných v metóde je spôsobená prítomnosťou konjugovaných diénových a triénových systémov. Tieto absorpcie sú vyjadrené ako špecifické extinkcie E1 % 1 cm (extinkcia 1 % roztoku tuku v špecifikovanom rozpúšťadle, v kyvete hrúbej 1 cm) obvykle určená ako K (tiež vyjadrovaná ako „extinkčný koeficient“).

1.   OBLASŤ

Metóda opisuje postup vykonania spektrofotometrického testovania olivového oleja v ultrafialovej oblasti.

2.   PODSTATA

Testovaný tuk sa rozpustí v požadovanom rozpúšťadle a extinkcia roztoku sa potom stanoví pri určenej vlnovej dĺžke so zreteľom na čisté rozpúšťadlo. Určité extinkcie sa vypočítavajú zo spektrofotometrických údajov.

3.   PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

3.1.	Spektrometer na meranie extinkcie v ultrafialovej oblasti medzi 220 a 360 mm, s možnosťou odčítavania jednotlivých nanometrických jednotiek.

3.2.	Pravouhlé kremenné kyvety, s krytom, s optickou dĺžkou 1 cm. Keď sa kyvety naplnia vodou alebo iným vhodným rozpúšťadlom, nemali by medzi sebou vykazovať rozdiel väčšií ako 0,01 jednotky extinkcie.

3.3.	25 ml odmerná banka

▼M6

3.4.	Chromatografická kolóna s hornou časťou o dĺžke 270 mm a o priemere 35 mm a so spodnou časťou o dĺžke 270 mm a priemere približne 10 mm.

▼B

4.   ČINIDLÁ

4.1.

Spektrofotometricky čistý izo-oktán (2,2,4-trimetypentán) — Pokiaľ ide o destilovanú vodu, mal by mať transmitanciu nie menej ako 60 % pri 220 nm a nie menej ako 95 % pri 250 nm alebo spektrofotometricky čistý cyklohexán, pokiaľ ide o destilovanú vodu, mal by mať transmitanciu nie menej ako 40 % pri 220 nm a nie menej ako 95 % pri 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2.	Základný oxid hlinitý pre chromatografické kolóny pripravený a skontrolovaný tak, ako je opísané v prílohe 1.

4.3.	n-hexán, na chromatografiu

5.   POSTUP

5.1.	Skúmaná vzorka musí byť dokonale homogénna a bez podozrivých nečistôt. Oleje kvapalné pri izbovej teplote sa prefiltrujú cez papier pri teplote približne 30 oC, tuhé tuky sa zhomogenizujú a prefiltrujú sa pri teplote najviac 10 oC nad bodom topenia.

5.2.	Presne odvážte približne 0,25 g takto pripravenej vzorky do 25 ml odmernej banky, doplňte určeným rozpúšťadlom po značku a zhomogenizujte. Výsledný roztok musí byť úplne priezračný. Ak je prítomná opalescencia alebo zákal, rýchlo roztok prefiltrujte cez papier.

5.3.

Získaným roztokom naplňte kyvetu a za použitia rozpúšťadla na porovnanie zmerajte extinkciu pri vhodnej vlnovej dĺžke medzi 232 až 276 nm. Namerané hodnoty sa musia nachádzať v rozsahu od 0,1 do 0,8. Ak nie, merania sa musia zopakovať za použitia koncentrovanejších alebo zriedenejších roztokov, ak je to vhodné.

5.4.

Ak je stanovenie určitej extinkcie požadované po prechode vzorky cez oxid hlinitý, postup je nasledujúci: Do chromatografickej kolóny dajte 30 g základného oxidu hlinitého v suspenzii v hexáne. Po usadení adsorbentu stiahnite nadbytočný hexán dole na približne 1 cm nad horným okrajom oxidu hlinitého. V 100 ml hexánu rozpustite 10 g tuku, zhomogenizujte ho a prefiltrujte podľa opisu v 5.1. a nalejte roztok do kolóny. Zozbierajte eluát a za vákua odparte všetko rozpúšťadlo pri teplote pod 25 oC. S takto získaným tukom hneď pokračujte podľa postupu uvedeného v 5.2.

6.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

6.1.

Zaznamenajte špecifické extinkcie (extinkčné koeficienty) pri rôznych vlnových dĺžkach, ktoré sa vypočítajú takto: kde: Kλ = špecifická extinkcia pri vlnovej dĺžke λ; Eλ = nameraná extinkcia pri vlnovej dĺžke λ; c = koncentrácia roztoku v g/100ml; s = hrúbka kyvety v cm. Výsledky sa uvádzajú na dve desatinné miesta.

6.2.

Spektrografická analýza olivového oleja súlade s oficiálnou metódou v nariadeniach EHS ustanovuje stanovenie extinkcie v izo-oktánovom roztoku pri vlnových dĺžkach 232 a 270 nm a stanovenie K, ktoré je vyjadrené vzorcom: kde Km je špecifická extinkcia pri vlnovej dĺžke m, vlnová dĺžka pre maximálnu absorpciu je okolo 270 nm.

---

DOPLNOK I

Príprava oxidu hlinitého a testovanie jeho aktivity

A.1.1.   Príprava oxidu hlinitého

Do hermeticky uzatvárateľnej nádoby vložte oxid hlinitý, ktorý ste predtým sušili v peci po dobu troch hodín pri teplote 380 až 400 oC, pridajte destilovanú vodu v pomere 5 ml na 100 g oxidu hlinitého, nádobu ihneď uzatvorte, opakovane pretrepávajte a potom nechajte odstáť aspoň 12 hodín pred použitím.

A.1.2.   Kontrola aktivity oxidu hlinitého

Pripravte chromatografickú kolónu s 30 g oxidu hlinitého. Postupujte podľa odseku 5.4., nasledujúcu zmes:

nechajte prejsť cez kolónu.

Ak má zmes pri prechode kolónou špecifickú extinkciu väčšiu ako 0,11 pri 268 nm, je oxid uhličitý vyhovujúci, ak nie, úroveň dehydrácie sa musí zvýšiť.

---

DODATOK II

Kalibrácia spektrofotometra

A.2.	Prístroj sa musí kontrolovať v intervaloch (najmenej každých šesť mesiacov) pri obidvoch vlnových dĺžkach a na presnosť odozvy.

A.2.1.

Vlnovú dĺžku je možné kontrolovať pomocou použitia pár ortuťovej lampy alebo pomocou vhodných filtrov.

A.2.2.

Pri kontrole odozvy fotocely a fotonásobiča postupujte takto: Odvážte 0,2000 g čistého chrómanu draselného pre spektrofotometriu a rozpustite v 0, 05N roztoku hydroxidu sodného v 1 000 ml odmernej banke a doplňte po značku. Odoberte presne 25 ml získaného roztoku, preneste do 500 ml odmernej banky a zrieďte doplnením po značku tým istým roztokom hydroxidu draselného. Zmerajte extinkciu takto získaného roztoku pri 275 nm použitím roztoku hydroxidu draselného ako porovnávacieho roztoku. Extinkcia meraná v 1 cm kyvete by mala byť 0,200 ± 0, 005.

---

PRÍLOHA X A

PLYNOVOCHROMATOGRAFICKÁ ANALÝZA METYL ESTEROV MASTNÝCH KYSELÍN

1.   OBLASŤ

Táto metóda podáva všeobecný návod na použitie plynovej chromatografie využívajúcej náplňové kolóny alebo kapilárne kolóny na stanovenie kvantitatívneho a kvalitatívneho zloženia zmesi metyl esterov mastných kyselín, získaných v súlade s metódou uvedenou v prílohe X B.

Metóda sa nedá použiť na polymerizované mastné kyseliny.

2.   ČINIDLÁ

2.1.   Nosný plyn

Inertný plyn (dusík, hélium, argón, vodík, atď.), dokonale vysušený a s obsahom kyslíka menším ako 10 mg/kg.

Poznámka 1:

Vodík, ktorý sa používa ako nosný plyn iba pre kapilárne kolóny, môže dvojnásobne urýchliť analýzu, ale je nebezpečný. Sú k dispozícii bezpečnostné zariadenia.

2.2.   Pomocné plyny.

2.2.1.

Vodík (čistoty ≥ 99,9 %), bez organických nečistôt

2.2.2.

Vzduch alebo kyslík, bez organických nečistôt

2.3.   Porovnávací (referenčný) štandard

Zmes metyl esterov čistých mastných kyselín alebo metyl esterov tuku známeho zloženia, najlepšie podobného zloženia ako tuková látka na analýzu

Je potrebné dbať na to, aby sa zabránilo oxidácii polynenasýtených mastných kyselín.

3.   PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

Uvedené pokyny týkajúce sa bežného vybavenia používaného v plynovej chromatografii, využívajúce náplňové a/alebo kapilárne kolóny a plameňovoionizačný detektor. Je vhodné každé zariadenie s účinnosťou a rozlíšením uvedené v 4.1.2.

3.1.   Plynový chromatograf

3.1.1.   Dávkovací (injekčný) systém

Použite niektorý z uvedených injekčných systémov:

Poznámka 2:

Pri neprítomnosti mastných kyselín s menej ako 16 uhlíkovými atómami sa môže použiť injektor s pohyblivou ihlou.

3.1.2   Pec

Pec by mala byť schopná vyhrievať kolónu na teplotu aspoň 260 oC a udržiavať požadovanú teplotu v rozmedzí 1 oC v prípade náplňovej kolóny a 0,1 oC pri kapilárnej kolóne. Táto druhá požiadavka je obzvlášť dôležitá pri kolónach z taveného kremeňa.

Vo všetkých prípadoch sa odporúča teplotne-programovateľné vyhrievanie a to najmä pre mastné kyseliny s menej ako 16 uhlíkovými atómami.

3.1.3   Náplňová kolóna

3.1.3.1.

Kolóna, vyhotovená z materiálov odolných voči analyzovaným látkam (napr. sklené alebo z nerezová ocele), s nasledujúcim rozmermi: a) dĺžka: 1 až 3 m. Ak sú vo vzorke prítomné mastné kyseliny s dlhým reťazcom (nad C20), dajú sa použiť relatívne krátke kolóny. Ak analyzujeme kyseliny so 4 až uhlíkovými atómami, odporúča sa použiť kolónu dlhú 2 m. b) vnútorný priemer: 2 až 4 mm. Poznámka 3. Aksú prítomné polynenasýtené zložky s viac ako tromi dvojitými väzbami, tieto sa môžu rozložiť v kolóne z nerezovej ocele. Poznámka 4. Je možné použiť aj systém s dvojicou náplňových kolón.

3.1.3.2.

Plnenie pozostávajúce z nasledujúcich častí: a)  nosič: kyslo-praná alebo silanizovaná kremelina alebo iný vhodný inertný nosič s úzkym rozmedzím veľkosti zŕn (25 μm rozmedzie medzi hranicami 125 až 200 μm); priemerná veľkosť častíc závisí od vnútorného priemeru a dĺžky kolóny; b)  stacionárna fáza: polyesterový typ polárnej kvapaliny (t. j. dietylénglykol polysukcinát, butándiol polysukcinát, etylénglykol polyadipát, atď.), kyanosilikóny alebo každé iné kvapaliny umožňujúce chromatografickú separáciu (pozri odsek 4). Stacionárna fáza by mala činiť 5 až 20 % (m/m) náplne nosiča. Pri určitých separáciách je možné použiť nepolárne stacionárne fázy.

3.1.3.3.

Kondiciovanie kolóny Pec postupne vyhrievajte až do 185 oC, ak je v hodné, pripravenú kolónu odpojte od detektora a pri tejto teplote nechajte cez ňu aspoň 16 hodín prúdiť inertný plyn tempom 20 až 60 ml/min a potom ďalšie 2 hodiny pri teplote 195 oC.

3.1.4.   Kapilárna kolóna

3.1.4.1.

Trubica vyrobená z materiálu odolného voči analyzovaným (obvykle zo skla alebo z taveného kremeňa). Vnútorný priemer 0,2 až 0,8 mm. Vnútorný povrch prešiel pred nanesením stacionárnej fázy patričnou úpravou (napr. preparáciou povrchu, dezaktiváciou). Dĺžka 25 mm vyhovuje vo väčšine prípadov.

3.1.4.2.

Stacionárna fáza, obvykle typu polyglykolu (polyetylénglykol 20 000), polyesteru (butándiol polysukcinát) alebo polárneho polysiloxánu (kyanosilikóny). Vhodné sú aj kolóny s krížom viazanými väzbami (cross-linked bonded). Poznámka 5.Pri použití polárnych polyxilánov sa sťažuje identifikácia a separácia kyseliny linoleovej a C20 kyselín. Nanesená vrstva by mala byť tenká, t. j. od 0,1 do 0,2 μm.

3.1.4.3.

Montáž a kondiciovanie kolóny Pri montáži kapilárnych kolón dodržte obvyklé opatrenia, t. j. umiestnenie kolóny v peci (držiak), výber a montáž spojov (tesnosť), umiestnenie koncov kolóny v injektore a detektore (redukcia mŕtvych objemov). Uložte kolónu pod prietok nosného plynu [napr. 0,3 bar (30 kPa), v prípade kolóny dĺžky 25 mm a s vnútorným priemerom 0,3 mm]. Kondiciujte kolónu v peci s teplotou nastavovanou na 3 oC/min od teploty prostredia až na teplotu 10o C pod limitom dekompozície stacionárnej fázy. Udržujte pec na tejto teplote jednu hodinu až do stabilizácie základu. Vráťte teplotu na 180 oC, aby ste pracovali v izotermálnych podmienkach. Poznámka 6.Vhodné pre-kondiciované kolóny sú dostupné v obchodnej sieti

3.1.5.

Detektor, lepšie ak je s vyhrievaním na teplotu vyššiu ako teplota danej kolóny.

3.2.   Pipeta

Pipeta by mala byť s maximálnym objemom 10 μm a delená na 0,1 μm dieliky.

3.3.   Zapisovač

Ak sa na výpočet zloženia analyzovanej zmesi použije krivka zo zapisovača, je potrebný presný elektronický zapisovač, kompatibilný s použitým prístrojom. Zapisovač by mal mať:

3.4.   Integrátor

Pomocou elektronického integrátora je možné vykonať rýchly a presný výpočet. Tento podáva lineárnu odozvu s adekvátnou citlivosťou a dostatočnú korekciu odchýlky základnej línie.

4.   POSTUP

Postupy uvedené v 4.1 až 4.3. sa vzťahujú aj na plameňovoionizačný detektor.

Alternatívne sa môže použiť plynový chromatograf využívajúci katarometrový detektor (pracujúci na princípe zmien tepelnej vodivosti). Pracovné podmienky sa upravia tak, ako je opísane v odseku 6.

4.1.   Podmienky testovania

4.1.1.

Výber optimálnych pracovných podmienok 4.1.1.1. Náplňové kolóny Pri výbere podmienok testovania je potrebné vziať do úvahy nasledujúce premenné: a) dĺžku a priemer kolóny; b) druh a množstvo stacionárnej fázy; c) teplotu kolóny; d) prietok nosného plynu; e) požadované rozlíšenie; f) veľkosť testovanej navážky vybranej takým spôsobom, aby detektor a elektrometer dávali lineárnu odozvu; g) dĺžka analýzy. Vo všeobecnosti, hodnoty uvedené v tabuľke 1 a 2 povedú k požadovaným výsledkom, t. j. aspoň 2 000 teoretických priehradiek na meter dĺžky kolóny pre metylstearát a jeho elúcie v rozmedzí 15 minút. Ak to zariadenie dovoľuje, injektor by mal byť nastavený na teplotu okolo 200 oC a detektor na teplotu rovnú alebo vyššiu ako je teplota kolóny. Ako pravidlo, pomer prietoku vodíka privádzaného do plameňovoionizačného detektora ku prietoku nosného plynu sa mení od 1:2 do 1:1 v závislosti od priemeru kolóny. Prietok kyslíka je 5 až 10 krát väčší ako prietok vodíka. Tabuľka 1 Vnútorný priemer kolóny (v mm) Prietok nosného plynu (v ml/min) 2 15 až 25 3 20 až 40 4 40 až 60 Tabuľka 2 Koncentrácia stacionárnej fázy % (m/m) Teplota kolóny oC 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kapilárna kolóna Vlastnosti ako účinnosť a priepustnosť kapilárnych kolón znamenajú, že separácia medzi zložkami a dĺžkou trvania analýzy sú vo veľkej miere závislé od prietoku nosného plynu cez kolónu. Preto je potrebné optimalizovať pracovné podmienky pôsobením na tento parameter (alebo jednoduchšie na straty na hlave kolóny) podľa toho, či si želáte zlepšiť separáciu alebo urýchliť analýzu.

4.1.2.

Stanovenie počtu teoretických priehradiek (účinnosť) a rozlíšenia (pozri obrázok 1) Vykonajte analýzu zmesi metyl stearátu a metyl oleátu v ekvivalentných množstvách (napríklad metyl estery z kakaového masla). Zvoľte teplotu kolóny a prietok nosného plynu tak, aby maximálna hodnota píku metyl stearátu bola zaznamenaná asi 15 minút po píku rozpúšťadla. Použite dostatočné množstvo zmesi metyl esterov, aby pík metyl stearátu zabral približne tri štvrtiny celkového rozsahu. Vypočítajte počet teoretických priehradiek, n (účinnosť) podľa vzorca: a rozlíšenie R podľa vzorca: kde: dr1 je retenčná vzdialenosť v milimetroch od štartu chromatogramu po maximum píku metyl stearátu; ω1 a ω2 sú šírky v milimetroch píkov metyl stearátu, merané medzi bodmi priesečníkov tangentov a interflexnými bodmi krivky so základnou líniou; Δ je vzdialenosť v milimetroch medzi maximami píkov metyl stearátu a metyl oleátu, ▼M2 a index rozpustnosti 1r pri použití vzorca kde: a = výška najmenšieho píku meraná od základnej čiary; b = výška najnižšieho bodu priehlbiny medzi dvoma priľahlými píkmi meraná od základnej čiary. ▼B Obrázok 1 Chromatogram na stanovenie počtu teoretických priehradiek (účinnosť) a rozlíšenie Vybrané pracovné podmienky sú také, ktoré umožnia aspoň 2 000 teoretických priehradiek na meter dĺžky kolóny a rozlíšenie aspoň 1,25.

4.2.   Veľkosť navážky

Pomocou mikropipety (3.2) vezmite 0,1 až 2 μl roztoku metyl esterov pripraveného podľa prílohy X B a nadávkujte ho do kolóny.

Ak sa estery nenachádzajú v roztoku, pripravte ich približne 100 mg/ml roztok v heptáne chromatografickej kvality a nadávkujte od 0,1 do 1 ml tohto roztoku.

Ak sú zložky prítomné iba v stopových množstvách, veľkosť navážky môžete zvýšiť (až 10 násobne).

4.3.   Analýza

Pracovné podmienky boli všeobecne definované v 4.1.1.

Napriek tomu je možné pracovať pri nižšej teplote kolóny, ak sa požaduje stanovenie mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka alebo pri vyššej teplote, ak sa analyzujú kyseliny s viac ako 20 atómami uhlíka. V prípade potreby je možné využiť programovanú teplotu v oboch prípadoch. Napríklad, ak vzorka obsahuje metyl estery mastných kyselín s menej ako 12 atómami uhlíka, nadávkujte vzorku pri 100 oC (alebo od 50 do 60 oC, ak je prítomná kyselina butyrová) a ihneď zvýšte teplotu s gratientom 4 až 8 oC/min do optimálnej teploty. V niektorých prípadoch sa môžu kombinovať obidva postupy.

Po programovom vyhrievaní pokračujte v elúcii pri konštantnej teplote, až kým sa všetky zložky nevyelujú. Ak prístroj nemá programové vyhrievanie, použite ho pri dvoch fixných teplotách medzi 100 a 195 oC.

Ak je vhodné, odporúča sa vykonať analýzu na dvoch ukotvených fázach rôznej polarity a tým sa overí neprítomnosť prekrytých píkov, napríklad v prípade kontinuálnej prítomnosti konjugovaných C18:3 a C20:0 alebo C 18:3 a C18:2.

4.4.   Príprava porovnávacieho chromatogramu a porovnávacích grafov

Zanalyzujte porovnávaciu zmes štandardov (2.3) za rovnakých pracovných podmienok, aké boli použité pri vzorkách a zmerajte retenčné časy alebo retenčné vzdialenosti zložiek mastných kyselín. Na semi-logaritmický papier zhotovte, na každý stupeň nenasýtenia, grafy ukazujúce logaritmus retenčného času alebo vzdialenosti ako funkciu počtu uhlíkových atómov. Pri izotermických podmienkach by mali byť grafy pre nerozvetvené kyseliny s rovnakým stupňom nenasýtenia rovnobežné.

Je nevyhnutné predísť takému kondiciovaniu, po ktorom sa objavujú „maskované píky“, t. j. kde je nedostatočné rozlíšenie na rozdelenie dvoch zložiek.

5.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

5.1.   Kvalitatívna analýza

Identifikujte píky metylesterov pre vzorku z grafov uvedených v 4.4, interpoláciou, ak je vhodné.

5.2.   Kvantitatívna analýza

5.2.1.   Stanovenie zloženia

Okrem výnimočných prípadov použite metódu vnútornej normalizácie, t. j. predpokladajme, že všetky zložky vzorky sú zastúpené na chromatografe, takže celková plocha pod píkmi prestavuje 100 % zložiek (úplná elúcia).

Ak je v zariadení aj integrátor, použite jeho zaznamenané hodnoty. Ak sa v prístroji nenachádza, určite plochu pod každým píkom vynásobením výšky píku šírkou píku v polovičnej výške, a keď je to vhodné, zoberte do úvahy rôzne zoslabenia počas zápisu.

5.2.2   Metóda výpočtu

5.2.2.1.

Ilustračný (všeobecný) prípad Vypočítajte obsah danej zložky i, vyjadrený ako percento hmotnosti metylesterov, stanovením percenta predstavujúceho plochu príslušného píku vzťahujúceho sa k sume plôch všetkých píkov, pomocou nasledujúceho vzorca: kde: Ai je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke i, ΣA je suma plôch pod všetkými píkmi. Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo. Poznámka 7. V tomto ilustračnom prípade je výsledok výpočtu založený na v pomerných plochách sa považuje za hmotnostné percento. Pre prípady, v ktorých tento predpoklad nie je možný, pozri 5.2.2.2.

5.2.2.2.

Použitie korekčných faktorov V niektorých prípadoch, napríklad za prítomnosti mastných kyselín s menej ako 8 atómami uhlíka alebo kyselín so sekundárnou skupinou, ak sa použije tepelnovodivostný detektor alebo sa požaduje predovšetkým vyšší stupeň presnosti, by sa mali použiť korekčné faktory na prevedenie plošných percent na hmotnostné percentá zložiek. Stanovte korekčné faktory pomocou chromatografu odvodeného z analýzy porovnávacej zmesi metylesterov známeho zloženia, vykonanej za rovnakých pracovných podmienok ako pri vzorke. Pri tejto porovnávacej zmesi je hmotnostné percento zložky i vyjadrené vzorcom: kde: mi je hmotnosť zložky i v porovnávacej zmesi; Am je celková hmotnosť rôznych zložiek v referenčnej zmesi (porovnávacom roztoku). Z chromatogram porovnávacieho roztoku (4.4) vypočítajte percento (plocha/plocha) pre zložku i takto: kde: Ai je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke i, A je suma plôch pod všetkými píkmi. Korekčný faktor sa potom vypočíta: Bežnejšie sa korekčné faktory vyjadrujú podľa ich vzťahu k KC16, takže relatívnymi faktormi sa stávajú: Pre vzorku, obsah každej vzorky i, vyjadrený ako hmotnostné percento metyl esterov je: Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo.

5.2.2.3.

Použitie vnútorného štandardu Pri niektorých analýzach (napr. ak nie sú kvantifikované všetky mastné kyseliny, ako keď sú vedľa kyselín so 16 alebo 18 uhlíkmi prítomné kyseliny so štyrmi alebo šiestimi uhlíkmi alebo keď je potrebné vo vzorke určiť absolútne množstvo mastnej kyseliny) je nevyhnutné použiť vnútorný štandard. Mal by sa určiť korekčný faktor (ak je nejaký ) pre vnútorný štandard. Hmotnostné percento zložky i, vyjadrené ako metylester, je potom vyjadrené vzorcom: kde: Ai je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá zložke i; As je plocha pod píkom, ktorý zodpovedá vnútornému štandardu; K′i je korekčný faktor zložky i (vzťahujúci sa na KC1); K′s je korekčný faktor vnútorného štandardu (vzťahujúci sa na KC16); m je hmotnosť navážky vzorky, v miligramoch; ms je hmotnosť vnútorného štandardu, v miligramoch. Výsledok udávajte na jedno desatinné číslo.

▼M2

6.   OSOBITNÝ PRÍPAD — STANOVENIE TRANS-IZOMÉROV

Je možné stanoviť obsah trans-izomérov v mastných kyselinách s počtom atómov uhlíka od 10 do 24 oddelením metylesterov s použitím plynových chromatografických kapilárnych kolón so špecifickou polaritou.

6.1	Kapilárna kolóna vyrobená z oxidu kremičitého s vnútorným priemerom 0,25 mm až 0,32 mm a s dĺžkou 50 m s nanesenou vrstvou kyanopropysilikónu, pričom hrúbka vrstvy bude od 0,1 do 0,3 μm (typ SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 a podobné druhy).

▼M21

6.2.	Metyl-estery sa pripravia podľa postupu B uvedenom v ďalšej prílohe X „B“. Tuky alebo oleje s obsahom voľných kyselín viac ako 3 % musia byť vopred neutralizované v súlade s bodom 5.1.1 prílohy VII.

▼M2

6.3

Pracovné podmienky pre plynovú chromatografiu sú takéto: — teplota kolóny nastavená na hodnotu od 150 °C do 230 °C (napríklad 165 °C počas 15 minút a následné zvyšovanie rýchlosťou 5 °C za minútu na 200 °C); — teplota injektora: 250 °C, pokiaľ sa používa systém s deličom, alebo začiatočná teplota kolóny, ak sa používa systém na kolóne; — teplota detektora: 260 °C; — prietok nosného plynu (hélium a vodík): 1,2 ml za minútu. Vstreknuté množstvo musí byť také, aby za použitých podmienok citlivosti výška píku zodpovedajúceho metylesteru kyseliny arašidovej bola rovnaká alebo väčšia ako 20 % spodnej časti stupnice.

6.4

Identifikácia rôznych metylesterov sa vykoná na základe retenčných časov, ktoré sa porovnajú s retenčnými časmi referenčných zmesí (ako je uvedené v bode 2.3). Estery trans-mastných kyselín sa eluujú pred zodpovedajúcimi cis-izomérmi. Príklad chromatogramu je uvedený na obrázku 2. Obrázok 2: Plynový chromatogram trans-izomérov mastnej kyseliny s použitím kapilárnej kolóny

6.5	Účinnosť kolóny stanovená v súlade s bodom 4.1.2 musí byť taká, aby umožnila oddelenie určitých kritických dvojíc, napríklad dvojice tvorenej masívom píku trans-izoolejových kyselín a kyseliny olejovej, trans C18:1/cis C18:1 s indexom rozlíšenia vyšším ako 2.

6.6

Percento rôznych trans-mastných kyselín sa vypočíta na základe pomeru medzi plochou príslušného píku a súčtom plôch všetkých prítomných píkov. Percentá: — trans-oktadekénových kyselín (T 18:1) uvedených v prílohe I k nariadeniu ako suma trans-olejových izomérov; — cis-trans a trans-cis kyselín oktadekandiénových [(CT/TC) 18: 2] uvedených v prílohe I k tomuto nariadeniu ako suma trans-linolových izomérov; — trans–cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, kyselín oktadekantriénových [(TCT + CCC + CTC;TCC) 18: 3] uvedených v prílohe I k tomuto nariadeniu ako suma trans-linolénových izomérov sa berú do úvahy. Poznámka 8:Berúc do úvahy osobitné charakteristiky tejto metódy, uvádzajte prosím výsledky na dve desatinné miesta.

▼B

7.   ŠPECIÁLNY PRÍPAD — POUŽITIE KATAROMETRA AKO DETEKTORA (PRACUJÚCEHO NA PRINCÍPE ZMIEN TEPELNEJ VODIVOSTI)

Na stanovenie kvalitatívneho a kvantitatívneho zloženia zmesi metylesterov mastných kyselín sa dá taktiež použiť plynový chromatograf využívajúci detektor pracujúci na princípe sledovania zmien tepelnej vodivosti (katarometer). V prípade jeho použitia, podmienky uvedené v odseku 3 a 4 sa upravia podľa tabuľky 3.

Pri kvantitatívnej analýze použite korekčné faktory uvedené v 5.2.2.2.

8.   SPRÁVA O VÝSLEDKU TESTU

Správa o výsledku testu vymedzuje metódy používané na prípravu metyl esterov a na plynovo chromatografickú analýzu a dosiahnuté výsledky. Uvedú sa v nej všetky podrobnosti o pracovnom postupe, ktoré neboli spomenuté v tejto medzinárodnej technickej norme alebo sa nepovažovali sa povinné, spolu s podrobnosťami o akomkoľvek sprievodnom jave, ktorý by mohol ovplyvniť výsledky.

Správa o výsledku testu bude zahŕňať všetky informácie potrebné pre úplnú identifikáciu vzorky.

▼M19

---

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A

:

Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B

:

Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1.   Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1.   Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2.   Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3.   Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4.   Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5.   Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2.   Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1.   Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2.   Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3.   Reagents

2.4.   Apparatus

2.5.   Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6.   Alternatives to methylation Method B

2.6.1.   Method C

2.6.1.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2.   Apparatus

2.6.1.3.   Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4.   Procedure

2.6.2.   Method D

2.6.2.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2.   Apparatus

2.6.2.3.   Reagents

2.6.2.4.   Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

Note 2: To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3.   Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1.   Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2.   Calculations

2.1.

For the calculation of the fatty acid composition and ΔECN42, all the following fatty acids will be taken into account: Myristic (C14:0). Palmitic (C16:0). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters. Palmitoleic (C16:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester. Margaric (C17:0). Margaroleic (C17:1). Stearic (C18:0). Oleic (C18:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester, ethyl ester, and trans-isomers of the methyl ester. Linoleic (C18:2). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters, and the trans-isomers of the methyl ester. Arachidic (C20:0). Linolenic (C18:3). Sum of the areas of the methyl ester and the trans-isomers of the methyl ester. Eicosenoic (C20:1). Behenic (C22:0). Lignoceric (C24:0). Squalene will not be taken into account for the calculation of the total area.

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17). The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula: Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

---

PRÍLOHA XI

STANOVENIE OBSAHU PRCHAVÝCH HALOGENOVANÝCH ROZPÚŠŤADIEL V OLIVOVOM OLEJI

1.   METÓDA

Analýza plynovou chromatografiou s použitím head space techniky.

2.   ZARIADENIE

2.1.	Plynový chromatograf vybavený detektorom elektrónového záchytu (ECD)

2.2.	Head space zariadenie

2.3.	Plynovochromatografická kolóna, sklenená, 2 m dlhá a s priemerom 2 mm, so stacionárnou fázou. OV 101 10 % alebo ekvivalent, impregnovaná kalcinovaná rozsievková zemina, kyslo praná a silanizovaná s časticami veľkosti od 80 do 100 mesh

2.4.	Nosný a pomocný plyn: dusík na plynovú chromatografiu, vhodný na detekciu elektrónovým záchytom

2.5.	Sklenené banky, od 10 do 15 ml, potiahnuté teflónom a s hliníkovou zátkou s otvormi pre striekačku

2.6.	Hermeticky uzatvárateľné svorky

2.7.	Plynotesné striekačky 0,5 až 2ml

3.   ČINIDLÁ

Štandard: halogenované rozpúšťadlá, stupňa čistoty vyhovujúceho plynovej chromatografii

4.   POSTUP

4.1.

Presne odvážte 3 g oleja, dajte do sklenenej banky (nepoužitej) a hermeticky ju uzatvorte. Vložte ju do termostatu nastaveného na 70 oC na jednu hodinu. Opatrne pomocou striekačky odoberte 0,2 až 0,5 ml horného priestoru (head space). Nadávkujte do kolóny plynového chromatografu nastaveného nasledujúco: — teplota injektora: 150 oC, — teplota kolóny: 70 až 80 oC, — detektor teploty: 200 až 250 oC. Môžu sa použiť aj iné teploty za predpokladu, že sa s tým nezmenia výsledky.

4.2.	Porovnávacie roztoky: pripravte roztoky štandardov pomocou rafinovaného olivového oleja so stopami rozpúšťadla v koncentráciách v rozsahu 0.05 až do 1 ppm (mg/kg), zodpovedajúce odhadovanému obsahu vo vzorke. Halogenované rozpúšťadlá sa dajú zriediť a pentánom.

4.3.

Kvantitatívne vyhodnotenie: uveďte do vzájomného vzťahu plochy alebo výšky píkov vzorky a štandartného roztoku s najbližšou predpokladanou. Ak je odchýlka väčšia ako 10 %, analýza sa musí zopakovať štandartným spôsobom, až kým odchýlka nie je do 10 %. Obsah je stanovený na základe priemeru jednotlivých analýz.

4.4.	Vyjadrenie výsledkov: v ppm (mg/kg). Detekčný limit pre túto metódu je 0,01 mg/kg.

▼M22

---

PRÍLOHA XII

METÓDA MEDZINÁRODNEJ RADY PRE OLIVOVÝ OLEJ NA ORGANOLEPTICKÉ HODNOTENIE PANENSKÝCH OLIVOVÝCH OLEJOV

1.   PREDMET A OBLASŤ POUŽITIA

Táto metóda sa zakladá na rozhodnutí Medzinárodnej rady pre olivový olej č. DEC-21/95-V/2007 zo 16. novembra 2007, ktoré sa týka upravenej metódy na organoleptické hodnotenie panenských olivových olejov. Jej cieľom je stanoviť postup hodnotenia organoleptických vlastností panenských olivových olejov v zmysle bodu 1 prílohy XVI k nariadeniu (ES) č. 1234/2007 a stanoviť metódu ich zatriedenia na základe týchto vlastností. Metóda obsahuje aj pokyny týkajúce sa nepovinného označovania na etiketách.

Opísaná metóda sa vzťahuje iba na panenské olivové oleje a na ich zatriedenie alebo ich označovanie etiketami podľa intenzity vnímaných nedostatkov, ovocnosti a ostatných pozitívnych atribútov, ktorú stanoví skupina vybraných vyškolených a odskúšaných ochutnávačov tvoriacich porotu.

2.   VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE

Pokiaľ ide o všeobecný základný slovník, testovaciu miestnosť, pohár na ochutnávanie olejov a všetky ďalšie otázky spojené s touto metódou, odporúča sa dodržiavanie predpisov stanovených Medzinárodnou radou pre olivový olej, najmä rozhodnutia č. DEC-21/95-V/2007 zo 16. novembra 2007, ktoré sa týka upravenej metódy na organoleptické hodnotenie panenských olivových olejov.

3.   ŠPECIFICKÝ SLOVNÍK

3.1.   Pozitívne atribúty

Ovocný :

všetky čuchové vnemy charakteristické pre olej (v závislosti od druhu olív), získaný zo zdravých a čerstvých plodov, zelených alebo zrelých, ktoré vnímame priamo a/alebo retronazálne.

Ovocnosť sa označuje za zelenú, ak čuchové vnemy pripomínajú zelené plody, čo je charakteristické pre olej získaný zo zelených plodov.

Ovocnosť sa označuje za zrelú, ak čuchové vnemy pripomínajú zrelé plody, čo je charakteristické pre olej získaný zo zelených a zrelých plodov.

Horký : základná charakteristická chuť oleja získaného zo zelených alebo dozrievajúcich olív, ktorú vnímame ohradenými jazykovými papilami zoskupenými v tvare písmena V.

Pikantný : hmatový vnem štípania charakteristický pre oleje vyrobené na začiatku sezóny, najmä z olív, ktoré ešte nedozreli; možno ho vnímať v celej ústnej dutine a hlavne v hrdle.

3.2.   Negatívne atribúty

Zatuchnutý/kalový : charakteristická aróma oleja získaného z olív, ktoré sa hromadili alebo skladovali v takých podmienkach, že sa dostali do pokročilého stavu anaeróbnej fermentácie, alebo oleja, ktorý sa ponechal v kontakte s kalmi z dekantácie v kadiach a nádržiach, ktoré takisto prešli anaeróbnou fermentáciou.

Plesnivý-vlhký : charakteristická aróma oleja získaného z olív napadnutých plesňou a kvasinkami následkom skladovania plodov počas viacerých dní vo vlhkom prostredí.

Vínový-octový/kyslý-ostrokyslý : charakteristická aróma niektorých olejov, ktorá pripomína víno alebo ocot. Je spôsobená hlavne aeróbnou fermentáciou olív alebo zvyškov olivovej hmoty na lisovacích diskoch, ktoré neboli dobre umyté, v dôsledku čoho dochádza k tvorbe kyseliny octovej, etylacetátu a etanolu.

Kovový : aróma pripomínajúca kovy. Je charakteristická pre olej, ktorý bol dlho v kontakte s kovovým povrchom počas procesu drvenia, miešania, lisovania alebo skladovania.

Zatuchnutý : aróma olejov, ktoré prešli procesom silnej oxidácie.

Prehriaty alebo spálený : charakteristická aróma olejov, ktorá je dôsledkom príliš veľkého a/alebo dlhého zahriatia oleja počas jeho získavania, a najmä počas miešania olivovej hmoty za tepla, ak sa toto miešanie vykonáva za nevhodných teplotných podmienok.

Seno-drevo : charakteristická aróma niektorých olejov vyrobených zo suchých olív.

Ťažký : hustý a glejovitý pocit v ústach, ktorý vyvolávajú niektoré staré oleje.

Mastný : aróma oleja, ktorá pripomína arómu nafty, masti alebo minerálneho oleja.

Rastlinná šťava : aróma, ktorú olej získa po dlhšom kontakte s rastlinnou šťavou, ktorá prešla procesom fermentácie.

Slaný : aróma oleja získaného z olív konzervovaných v slanom náleve.

Esparto : charakteristická aróma oleja získaného z olív, ktoré sa vylisovali v nových diskoch z esparta. Môže byť rôzna v závislosti od toho, či ide o disky vyrobené zo zeleného esparta, alebo zo suchého esparta.

Zemitý : aróma oleja z olív, ktoré boli pozbierané spolu s hlinou alebo boli zablatené a neumyté.

Červivý : aróma oleja z olív, ktoré boli silne napadnuté larvami olivovej mušky (Bactrocera Oleae).

Uhorkový : charakteristická aróma oleja, ktorý bol príliš dlho hermeticky skladovaný najmä v nádobách z bieleho plechu; táto aróma sa pripisuje procesu tvorby nona-2,6-dienalu.

Vlhké drevo : charakteristická aróma olejov získaných z olív, ktoré boli na strome poškodené mrazom.

3.3.   Nepovinná terminológia na účely označovania etiketami

Predseda poroty môže na požiadanie potvrdiť, že hodnotené oleje spĺňajú definície a intervaly zodpovedajúce ďalej uvedeným pojmom a prívlastkom v závislosti od intenzity a vnímania atribútov:

4.   POROTA

Porota sa skladá z predsedu poroty a z ôsmich až dvanástich ochutnávačov.

Predseda poroty musí mať kvalitnú odbornú prípravu a musí byť znalcom a dobre informovaným expertom na rôzne druhy olejov. Zodpovedá za porotu, za jej organizáciu a fungovanie, prípravu, kodifikáciu a prezentáciu vzoriek ochutnávačom, ako aj za zhromažďovanie údajov a ich štatistické spracovanie.

Predseda poroty vyberie ochutnávačov a dohliada na ich prípravu a kontrolu ich výkonov s cieľom zabezpečiť, aby si udržali primeranú úroveň spôsobilosti.

Ochutnávači pre organoleptické kontroly olivového oleja sa vyberú a vyškolia v závislosti od ich schopnosti rozlíšiť podobné vzorky v súlade s príručkou Medzinárodnej rady pre olivový olej pre výber, prípravu a kontrolu kvalifikovaných ochutnávačov panenského olivového oleja.

Poroty sa zaväzujú na účasť na organoleptických hodnoteniach plánovaných na vnútroštátnej a medzinárodnej úrovni alebo na úrovni Spoločenstva s cieľom umožniť pravidelnú kontrolu a zosúladenie percepčných kritérií. Okrem toho, ak ide o poroty schválené v súlade s ustanoveniami článku 4 ods. 1 tohto nariadenia, musia každoročne poskytovať príslušnému členskému štátu všetky informácie o svojom zložení a o počte hodnotení, ktoré vykonali ako akreditovaná porota.

5.   POSTUP PRE ORGANOLEPTICKÉ HODNOTENIE A ZATRIEDENIE

5.1.   Použitie profilového hárka ochutnávačom

Profilový hárok, ktorý má použiť každý ochutnávač, sa nachádza v dodatku A k tejto metóde.

Každý ochutnávač, ktorý je súčasťou poroty, musí ovoňať a následne ochutnať testovaný olej. Potom musí na 10 cm stupnici v profilovom hárku, ktorý má k dispozícii, uviesť intenzitu, s akou vníma každý z negatívnych a pozitívnych atribútov ( 6 ). V prípade, že ochutnávač vníma zelenosť alebo zrelosť ovocného atribútu, zaškrtne v profilovom hárku príslušný rámček.

V prípade, že ochutnávač vníma také negatívne atribúty, ktoré sa na profilovom hárku neuvádzajú, musí ich zaznamenať do riadku „iné“, použijúc niektorý alebo niektoré z vymedzených pojmov, ktorými sa opíšu s čím najväčšou presnosťou.

5.2.   Využitie údajov predsedom poroty

Predseda poroty musí zozbierať profilové hárky vyplnené každým jedným ochutnávačom; musí skontrolovať jednotlivé intenzity pridelené rôznym atribútom; ak zistí nejakú anomáliu, požiada ochutnávača, aby skontroloval svoj profilový hárok a v prípade potreby zopakoval test.

Predseda poroty môže informácie od všetkých ochutnávačov vložiť do počítačového programu, ktorý zodpovedá metóde štatistického výpočtu mediánu uvedenej v dodatku B. Vkladanie informácií za danú vzorku treba uskutočniť prostredníctvom matrice zloženej z 9 stĺpcov, ktoré zodpovedajú 9 zmyslovým atribútom, a z počtu riadkov, ktorý zodpovedá počtu ochutnávačov poroty.

Ak aspoň 50 % poroty vnímalo istý negatívny atribút a uviedlo to v riadku „iné“, vypočíta sa medián tohto nedostatku a olej sa podľa toho zatriedi.

Pokiaľ ide o pojmy „zelený“ a „zrelý“, predseda poroty môže potvrdiť, že testovaný olej spĺňa podmienky uvedené v bode 3.3.a iba v tom prípade, ak minimálne 50 % poroty upozornilo na vnímanie zrelosti alebo zelenosti ovocného atribútu.

V prípade analýz, ktoré sa vykonávajú v rámci kontrol zhody, sa musí vykonať skúška. V prípade protichodných analýz musí predseda poroty zabezpečiť, aby sa analýza zopakovala. V prípade neplatných analýz sa hodnotenie musí vykonať tretíkrát. V týchto prípadoch sa medián atribútov vypočíta na základe priemeru mediánov. Všetky opakovania týchto analýz sa musia vykonať počas odlišných zasadnutí.

5.3.   Zatriedenie olejov

Olej sa zaradí do niektorej z ďalej uvedených kategórií podľa mediánu nedostatkov a mediánu atribútu ovocnosti. Medián nedostatkov sa vymedzuje ako medián nedostatku vnímaného s najväčšou intenzitou. Medián nedostatkov a medián ovocnosti sú vyjadrené s presnosťou na jedno desatinné miesto a hodnota hrubého variačného koeficientu, ktorý ich vyjadruje, musí byť nižšia alebo sa rovnať 20 %.

Triedenie olejov sa vykonáva porovnávaním hodnoty mediánu nedostatkov a mediánu ovocnosti s ďalej opísanými referenčnými intervalmi. Pri stanovovaní hraníc týchto rozpätí sa zohľadnila chybnosť metódy, a preto sa tieto hranice považujú sa absolútne. Počítačové programy umožňujú vizualizované zatriedenie v tabuľke štatistických údajov alebo v grafe.

a)	Extra panenský olivový olej : medián nedostatkov sa rovná 0 a medián ovocnosti je vyšší ako 0.

b)	Panenský olivový olej : medián nedostatkov je vyšší ako 0 a rovná sa 3,5 alebo je nižší a medián ovocnosti je vyšší ako 0.

c)	Lampový olivový olej : medián nedostatkov je vyšší ako 3,5; alebo medián nedostatkov sa rovná 3,5 alebo je nižší a medián ovocnosti sa rovná 0.

5.4.   Osobitné prípady

Ak je medián iného pozitívneho atribútu ako ovocnosť vyšší ako 5,0, predseda poroty to zaznamená na osvedčení o analýze oleja.

---

Dodatok A

Profilový hárok panenského olivového oleja

---

Dodatok B

METÓDA VÝPOČTU MEDIÁNU A INTERVALOV SPOĽAHLIVOSTI

Medián

Medián je reálne číslo Xm, ktoré charakterizuje skutočnosť, že pravdepodobnosť (P), že hodnoty distribúcie (X) budú nižšie ako toto číslo (Xm), je nižšia alebo sa rovná 0,5, a že zároveň pravdepodobnosť (P), že hodnoty distribúcie (X) budú nižšie alebo sa rovnať Xm, je vyššia alebo sa rovná 0,5. V inej definícii medián predstavuje 50. percentil distribúcie čísel v rastúcom poradí. Inými slovami, medián predstavuje strednú hodnotu série usporiadanej z nepárnych čísel alebo priemer obidvoch centrálnych hodnôt série usporiadanej z párnych čísel.

Hrubá smerodajná odchýlka

Na získanie spoľahlivého odhadu variability, ktorá vzniká okolo mediánu, sa treba odvolať na odhad hrubej smerodajnej odchýlky podľa Stuarta a Kendalla. Nasledujúci vzorec udáva asymptotickú smerodajnú odchýlku, t. j. hrubý odhad variability zvažovaných údajov, kde N je počet pozorovaní a IQR medzikvartilový interval, ktorý zahŕňa presne 50 % prípadov distribúcie akejkoľvek pravdepodobnosti.

Pri výpočte medzikvartilového intervalu sa vypočíta rozsah odchýlky medzi 75. a 25. percentilom.

IQR = 75. percentil – 25. percentil

Percentil je hodnota Xpc, ktorú charakterizuje skutočnosť, že pravdepodobnosť (P), že hodnoty distribúcie budú nižšie ako Xpc, je nižšia alebo sa rovná určenej stotine, a že zároveň pravdepodobnosť (P), že hodnoty distribúcie budú nižšie alebo sa rovnať Xpc, je vyššia alebo sa rovná uvedenej stotine. Stotina udáva zlomok vybranej distribúcie. V prípade mediánu sa rovná 50/100.

V praxi to znamená, že percentil je hodnota distribúcie zodpovedajúca stanovenej ploche načrtnutej podľa krivky distribúcie alebo hustoty. Napríklad 25. percentil predstavuje hodnotu distribúcie, ktorá zodpovedá ploche rovnajúcej sa 0,25 alebo 25/100.

Hrubý variačný koeficient v % (CVr)

CVr % predstavuje bezrozmerné číslo, ktoré udáva percentuálny podiel variability analyzovanej série čísel. Z tohto dôvodu je tento koeficient veľmi užitočný na overenie spoľahlivosti členov poroty.

95 % intervaly spoľahlivosti pre medián

95 % intervaly spoľahlivosti (hodnota chyby prvého druhu sa rovná 0,05 alebo 5 %) predstavujú interval, v ktorom by hodnota mediánu mohla kolísať za predpokladu, že by bolo možné opakovať skúšanie nekonečne veľa ráz. V praxi tento interval udáva interval variability skúšky za daných operačných podmienok za predpokladu, že skúšku možno viackrát opakovať. Interval slúži na hodnotenie spoľahlivosti skúšky ako v prípade CVR %.

ICsup = Me + (c.S*)

ICinf = Me – (c.S*)

Pričom „c“ sa v prípade intervalu spoľahlivosti 0,95 rovná 1,96.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

PRÍLOHA XV

1.   OBSAH OLEJA V OLIVOVÝCH ZVYŠKOCH

1.1.   Prístrojové vybavenie

1.2.   Činidlo

Normálny technický hexán, po ktorom musí po kompletnom odparení zostať zvyšok menej ako 0,002 g na 100 ml.

2.   POSTUP

2.1.   Príprava testovanej vzorky

Ak je to nutné, použite mechanický mlyn, ktorý ste predtým dokonale vyčistili, na rozomletie laboratórnej vzorky, aby sa zmenšila veľkosť častíc tak, že úplne prejdú sitom.

Použite jednu dvadsatinu vzorky na úplné vyčistenie mlynu, odhoďte zomletý materiál, zvyšok vzorky zomeľte a zozbierajte, opatrne zmiešajte a analyzujte bez odkladu.

2.2.   Veľkosť navážky

Hneď po skončení mletia odvážte asi 10 g vzorky s presnosťou na 0,01 g na vykonanie testu.

2.3.   Príprava extrakčnej patróny

Naváženú vzorku vložte do patróny, zazátkujte vatou. Ak použijete filtračný papier, navážku vzorky zabaľte do neho.

2.4.   Predsušenie

Ak sú olivové zvyšky veľmi vlhké (t. j. obsah vlhkosti a prchavých látok je viac ako 10 %), vykonajte predsušenie tak, že vložíte naplnenú patrónu (alebo filtračný papier) do pece zahriatej na potrebný čas pri teplote nie viac ako 80 oC, aby sa znížil obsah vlhkosti a prchavých látok na menej ako 10 %.

2.5.   Príprava banky s okrúhlym dnom

Banku obsahujúcu jeden alebo dva kúsky pemzy odvážte s presnosťou na 1 mg, ktorú ste predtým vysušili v peci pri teplote 103 ± 2 oC a chladili v exsikátore aspoň jednu hodinu.

2.6.   Prvotná extrakcia

Do extrakčného prístroja zasuňte extrakčnú patrónu (alebo filtračný papier) s naváženou vzorkou. Do banky vlejte požadované množstvo hexánu. Upevnite banku na extrakčný prístroj a celú ju ponorte do elektricky vyhrievaného kúpeľa. Nastavte vyhrievanie tak, aby nebol refluxný pomer viac ako tri kvapky za sekundu (mierny, nie búrlivý var). Po štyroch hodinách extrahovania nechajte vychladnúť. Vyberte patrónu z extrakčného prístroja a dajte ju do prúdu vzduchu, aby sa odstránila väčšina nasiaknutého rozpúšťadla.

2.7.   Druhá extrakcia

Vyprázdnite obsah patróny do mikromlyna a zomeľte čo najjemnejšie. Vráťte zomletú zmes do patróny a umiestnite ju späť do extrakčného prístroja.

Pokračujte v extrakcii ďalšie dve hodiny, použite takú istú banku s guľatým dnom, obsahujúcu prvý extrakt.

Výsledný roztok v extrakčnej banke musí byť číry. Ak nie je, prefiltrujte ho cez filtračný papier a niekoľkokrát vymyte pôvodnú banku a filtračný papier hexánom. Zbierajte filtrát a rozpúšťadlo použité na oplachovanie v druhej banke s okrúhlym dnom, ktorú ste predtým vysušili a odvážili s presnosťou na 1 mg.

2.8.   Odstránenie rozpúšťadla a váženie extraktu

Odstráňte väčšiu časť rozpúšťadla oddestilovaním v elektricky vyhrievanom kúpeli. Posledné stopy rozpúšťadla odstráňte zahrievaním banky v peci pri teplote 103 ± 2 oC po dobu 20 minút. Procesu eliminácie rozpúšťadla napomôžte buď privádzaním vzduchu, alebo lepšie inertného plynu, alebo použitím zníženého tlaku.

Nechajte banku chladiť v exsikátore aspoň jednu hodinu a potom ju odvážte s presnosťou na 1 mg.

Znova ju za rovnakých podmienok zahrejte na 10 minút, vychlaďte v exsikátore a prevážte.

Rozdiel medzi dvomi váženiami by nemal presiahnuť 10 mg. Ak je rozdiel vyšší, znova zahrejte po dobu 10 minút, potom ďalej ochladzujte a odvážte, kým nie je rozdiel 10 g alebo nižší.

Vykonajte paralelné stanovenia testovanej vzorky.

3.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

3.1.   Metóda výpočtu a vzorec:

3.2.   Opakovateľnosť

Rozdiel medzi dvomi paralelnými stanoveniami vykonanými naraz alebo v rýchlom slede za sebou jedným pracovníkom nesmie prekročiť 0,2 g hexánového extraktu na 100 g vzorky.

Ak táto podmienka nie je splnená, zopakujte analýzu na dvoch ďalších navážkach vzorky. Ak aj v tomto prípade rozdiel presiahne 0,2 g, ako výsledok sa zoberie aritmetický priemer všetkých štyroch stanovení.

---

PRÍLOHA XVI

STANOVENIE JÓDOVÉHO ČÍSLA

1.   OBLASŤ

Táto medzinárodná technická norma špecifikuje metódu stanovenia jódového čísla živočíšnych a rastlinných tukov a olejov, neskôr uvádzaných ako tuky.

2.   DEFINÍCIA

Na účely tejto medzinárodnej technickej normy platia nasledujúce definície:

2.1.	jódové číslo: hmotnosť jódu absorbovaná vzorkou za pracovných podmienok špecifikovaných v tejto medzinárodnej technickej norme. Jódové číslo sa vyjadruje v gramoch jódu na 100 g vzorky.

3.   PODSTATA

Rozpustite navážku vzorky v rozpúšťadle a pridajte činidlo podľa Wijsa. Po určitej dobe pridajte roztok jodidu draselného a vodu a uvoľnený jód stitrujte roztokom tiosíranu sodného.

4.   ČINIDLÁ

Všetky činidlá by mali mať známu čistotu:

4.1.	voda, spĺňajúca požiadavky normy ISO 3696, stupeň 3;

4.2.	jodid draselný, roztok 100 g/l, neobsahujúci jodičnany alebo voľný jód;

4.3.	škrob, roztok. Rozmiešajte 5 g rozpustného škrobu v 30 ml vody a pridajte túto zmes do 1 000 ml vriacej vody, povarte 3 minúty a nechajte vychladnúť;

4.4.	tiosíran sodný, štandardný odmerný roztok c(Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l, štandardizovaný (ofaktorovaný) nie skôr ako sedem dní pred použitím;

4.5.	rozpúšťadlo: pripravené zmiešaním rovnakých objemov cyklohexánu a kyseliny octovej;

4.6.	Wijsove činidlo: obsahujúce chlorid jodný v kyseline octovej. Je možné použiť aj obchodne dostupné Wijsove činidlo.

5.   PRÍSTROJOVÉ VYBAVENIE

Obvyklé laboratórne zariadenia, najmä tieto:

5.1.	sklenené navažovacie lodičky, vhodné na navážku a vsunutie do banky (6.2);

5.2.	kužeľové banky, 500 ml objemu, vybavené zábrusnými zátkami a úplne suché.

6.   PRÍPRAVA TESTOVANEJ VZORKY

Zhomogenizovaná vzorka sa vysuší tiosíranom sodným a prefiltruje.

7.   POSTUP

7.1

Veľkosť navážky Hmotnosť navážky vzorky sa mení podľa predpokladaného jódového čísla uvedeného v tabuľke 1. Tabuľke 1 Predpokladané jódové číslo Hmotnosť testovanej navážky menej ako 5 3,00 5 až 20 1,00 21 až 50 0,40 51 až 100 0,20 101 až 150 0,15 150 až 200 0,10 V sklenenej navažovacej lodičke (5.1) odvážte navážku vzorky s presnosťou na 0,1 mg.

7.2.

Stanovenie Navážku vložte do 500 ml banky (6.2). Pridajte 20 ml rozpúšťadla, aby sa rozpustil tuk. Pridajte presne 25 ml Wijsovho činidla, banku zazátkujte, premiešajte jej obsah a uložte ju do tmy. Nepipetujte Wijsovo činidlo ústami. Podobne pripravte slepý pokus s rozpúšťadlom a činidlom, ale vynechajte navážku vzorky. Banky obsahujúce vzorky s jódovým číslom pod 150 ponechajte v tme jednu hodinu a banky so vzorkami s jódovým číslom nad 150 a s polymerizovanými produktmi alebo produktmi oxidovanými do vysokého stupňa, ponechajte v tme dve hodiny. Po uplynutí tohto času do každej banky pridajte 20 ml roztoku jodidu draselného (4.2) a 150 ml vody (4.1). Titrujte štandardným odmerným roztokom tiosíranu sodného (4.4), až kým sa takmer úplne nestratí žlté zafarbenie spôsobené jódom. Poznámka: Potenciometrické stanovenie konca titrácie je prípustné.

7.3.	Počet stanovení Vykonajte dve stanovania na tej istej vzorke.

8.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

Jódové číslo je vyjadrené výrazom:

kde:

c

=

je číselná hodnota presnej koncentrácie v móloch na liter použitého štandardizovaného odmerného roztoku tiosíranu sodného (4.4)

V1

=

je číselná hodnota objemu štandardizovaného odmerného roztoku tiosíranu sodného (4.4), použitého na slepý pokus, v mililitroch

V2

=

je číselná hodnota objemu štandardizovaného odmerného roztoku tiosíranu sodného (4.4), použitého pri stanovení, v mililitroch

m

=

je číselná hodnota hmotnosti navážky vzorky (7.1), v gramoch.

Za výsledok sa bude považovať aritmetický priemer dvoch stanovení, za predpokladu, že opakovateľnosť (9.2) je uspokojivá.

▼M11

---

PRÍLOHA XVII

METÓDY STANOVENIA STIGMASTADIÉNOV V RASTLINNÝCH OLEJOCH

1.   ÚČEL

Stanovenie stigmastadiénov v rastlinných olejoch obsahujúcich nízke koncentrácie týchto uhľovodíkov, a to najmä v panenskom olivovom oleji a v surovom oleji z olivových zvyškov.

2.   ROZSAH

Norma sa môže uplatňovať na všetky rastlinné oleje, hoci merania sú spoľahlivé iba v prípade, keď obsah týchto uhľovodíkov sa pohybuje v rozmedzí 0,01 až 4,0 mg/kg. Táto metóda je obzvlášť vhodná na zistenie prítomnosti rafinovaných rastlinných olejov (olivový olej, olej z olivových zvyšky, slnečnicový olej, palmový olej atď.) v panenskom olivovom oleji, nakoľko rafinované oleje obsahovali stigmastadiény a panenské oleje ich neobsahujú.

3.   POSTUP

Izolácia nezmydelniteľnej látky. Oddelenie frakcie steroidných uhľovodíkov pomocou stĺpcovej chromatografie na silikagély a analyzovanie pomocou kapilárnej plynovej chromatografie.

4.   APARATÚRA

4.1.	250 ml banky vhodné na použitie so spätným chladičom.

4.2.	Oddeľovacie lieviky o objeme 500 ml.

4.3.	100 ml banky s guľatým dnom.

4.4.	Rotačná odparka.

4.5.

Sklená chromatografická kolóna (vnútorný priemer 1,5 až 2,0 cm, dĺžka 50 cm) s teflónovým kohútikom a so zátkou z vlákien sklenej vlny alebo s fritovým kotúčom na dne. S cieľom pripraviť silikagélovú kolónu nalejte do chromatografickej kolóny hexán do výšky približne 5 cm a potom ju naplňte suspenziou silikagélu v hexáne (15 g v 40 ml) pomocou dávok hexánu. Nechajte usadiť a usadzovanie ukončite aplikovaním slabých vibrácií. Pridajte bezvodý síran sodný do výšky približne 0,5 cm a nakoniec prebytočný hexán eluujte.

4.6.	Plynový chromatograf s plameňovým ionizačným detektorom, deleným alebo studeným injektorom na kolóne a pecou programovateľnou s presnosťou ± 1 °C.

4.7.	Kapilárna kolóna z taveného kremeňa určená na plynovú chromatografiu (vnútorný priemer 0,25 alebo 0,32 mm a dĺžka 25 m) potiahnutá fázou 5 % fenylmetylsilikónu, s hrúbkou filmu 0,25 mm. Poznámka 1: Môžu sa používať aj iné kolóny s podobnou alebo nižšou polaritou.

4.8.	Integrátor-zapisovač s možnosťou pracovať v integračnom režime údolie-údolie.

4.9.	5 až 10 ml mikrostriekačka na plynovú chromatografiu s cementovanou ihlou.

4.10.

Plášť s elektrickým ohrevom alebo zahrievacia platnička.

5.   ČINIDLÁ

Všetky činidlá musia mať analytickú kvalitu, pokiaľ nie je stanovené inak. Musí sa používať destilovaná voda alebo voda minimálne ekvivalentnej čistoty.

5.1.	Hexán alebo zmes alkánov s rozmedzím bodov varu 65 až 70 °C, destilované v rektifikačnej kolóne. Poznámka 2: Rozpúšťadlo sa musí kvôli odstráneniu nečistôt destilovať.

5.2.	etanol 96 obj /obj.

5.3.	Bezvodý síran sodný.

5.4.

Alkoholický roztok hydroxidu draselného s koncentráciou 10 %. Pridajte 10 ml vody k 50 g hydroxidu draselného, zamiešajte a zmes potom rozpustite v etanole na celkový objem 500 ml. Poznámka 3: Alkoholický hydroxid draselný pri státí hnedne. Musí sa pripravovať čerstvý každý deň a uchovávať v tesne zazátkovaných fľašiach z tmavého skla.

5.5.

Silikagél 60 pre stĺpcovú chromatografiu, 70 až 230 meš (Merck, referencia 7734 alebo podobne). Poznámka 4: Silikagél sa môže obvykle použiť priamo z kontejnera bez akejkoľvek ďalšej úpravy. Niektoré šarže silikagélu môžu vykazovať nízku aktivitu, čo bude mať za následok zlé chromatografické oddelenie. Za takýchto okolností sa musí silikagél upraviť nasledujúcim spôsobom: Aktivujte silikagél zahrievaním po dobu najmenej štyroch hodín pri teplote 550 °C. Po zahriatí vložte silikagél do exsikátora, pričom sa silikagél ochladí a potom ho preneste do zazátkovanej fľaše. Pridajte 2 % vody a trepte dovtedy, až kým nebudú viditeľné žiadne hrudky a prášok bude voľne prúdiť. Ak niektoré šarže silikagélu budú mať za následok chromatogramy s interferujúcimi píkmi, tak silikagél sa musí upraviť spôsobom opísaným vyššie. Alternatívou môže byť použitie extra čistého silikagélu 60 (Merck, referencia 7754).

5.6.	Zásobný roztok (200 ppm) cholesta-3, 5-diénu (Sigma, čistota 99 %) v hexáne (10 mg v 50 ml).

5.7.	Štandardný roztok cholesta-3, 5-diénu v hexáne pri koncentrácii 20 ppm, získaný zriedením roztoku uvedeného vyššie. Poznámka 5: Roztoky 5.6 a 5.7 sú stále po dobu najmenej štyroch mesiacov, ak sa uchovávajú pri teplote nižšej ako 4 °C.

5.8.	Roztok n-nonakozánu v hexáne pri koncentrácii približne100 ppm.

5.9.	Nosný plyn pre chromatografiu: hélium alebo vodík o čistote 99,9990 %.

5.10.

Pomocné plyny pre plameňový ionizačný detektor: vodík o čistote 99,9990 % a čistený vzduch.

6.   POSTUP

6.1.   Prípravanezmydelniteľnej látky

6.1.1.

Navážte 20 ± 0, 1 g oleja do 250 ml banky (4.1), pridajte 1 ml štandardného roztoku cholesta-3, 5-diénu (20 mg) a 75 ml 10 % alkoholického hydroxidu draselného, namontujte spätný chladič a zahrievajte do mierneho varu po dobu 30 minút. Vyberte banku obsahujúcu vzorku zo zdroja tepla a nechajte roztok trochu ochladnúť (nenechajte roztok úplne vychladnúť, nakoľko vzorka by stuhla). Pridajte 100 ml vody a preneste roztok do oddeľovacieho lievika (4.2) pomocou 100 ml hexánu. Zmesou 30 sekúnd intenzívne trepte a potom ju nechajte oddeliť sa. Poznámka 6: Pokiaľ by sa vytvorila emulzia, ktorá by sa rýchle nerozplynula, tak pridajte etanol v malom množstve.

6.1.2.

Preneste spodnú vodnú fázu do druhého oddeľovacieho lievika a znovu extrahujte s použitím 100 ml hexánu. Spodnú fázu znovu vypustite a hexánové extrakty premyte (spojené v ďalšom oddeľovacom lieviku) trikrát, pričom zakaždým použijete 100 ml zmesi etanol-voda (1:1), až kým sa nedosiahne neutrálne pH.

6.1.3.

Nechajte prejsť roztok hexánu cez bezvodý síran sodný (50 g), premyte s 20 ml hexánu a nechajte odparovať v rotačnej odparke pri 30 °C pri zníženom tlaku až do vysušenia.

6.2.   Oddeleniefrakcie steroidných uhľovodíkov

6.2.1.

Preneste zvyšok do frakcionačnej kolóny pomocou dvoch 1-ml dávok hexánu, nechajte vzorku pretekať kolónou a umožnite, aby hladina roztoku poklesla k hornej časti síranu sodného, a začnite chromatografické eluovanie pomocou hexánu s rýchlosťou prietoku približne 1 ml/min. Prvých 25 až 30 ml eluátu vyraďte a nasledujúcich 40 ml frakcie zachyťte. Po zachytení preneste túto frakciu do 100-ml banky s guľatým dnom. (4.3) Poznámka 7: Prvá frakcia obsahuje nasýtené uhľovodíky (obr. 1 a) a druhá frakcia steroidné uhľovodíky. Ďalšie eluovanie poskytne skvalen a príbuzné zlúčeniny. Ak sa má dosiahnuť dobré oddelenie nasýtených a steroidných uhľovodíkov, tak sa vyžaduje optimalizácie objemov frakcie. Za týmto účelom sa musí objem prvej frakcie upraviť tak, aby pri analýze druhej frakcie, píky predstavujúce nasýtené uhľovodíky boli nízke (pozri obr. 1 c); ak sa neobjavia, ale intenzita štandardného píku je pritom nízka, objem sa musí znížiť. V každom prípade, úplné oddelenie zložiek prvej a druhej frakcie nie je nevyhnutné, nakoľko počas GC (plynovo-chromatografickej) analýzy nedochádza k prekrývaniu píkov, pokiaľ sú podmienky plynovej chromatografie upravené tak, ako je uvedené v 6.3.1. Optimalizácia objemu druhej frakcie nie je spravidla potrebná, nakoľko dochádza k dobrému oddeleniu od ostatných komponentov. Tak či onak, prítomnosť veľkého píku pri približne o 1,5 minútu kratšom retenčnom čase v porovnaní so štandardom je zapríčinená skvalénom a svedčí o zlom oddelení.

6.2.2.

Odparujte druhú frakciu v rotačnej odparke pri 30 °C pri zníženom tlaku až do vysušenia a zvyšok ihneď rozpustite v 0,2 ml hexánu. Roztok uchovávajte až do analýzy v chladničke. Poznámka 8: Zvyšky 6.1.3 a 6.2.2 sa nesmú držať na suchom mieste a pri izbovej teplote. Ihneď po ich získaní sa musí pridať rozpúšťadlo a roztoky sa musia uchovávať v chladničke.

6.3.   Plynová chromatografia

6.3.1.

Pracovné podmienky deleného vstrekovania — teplota injektora: 300 °C, — teplota detektora: 320 °C, — integrátor-zapisovač: parametre integrácie sa musia stanoviť tak, aby sa dosiahlo správne vyhodnotenie plôch. Odporúča sa integračný režim údolie-údolie. — citlivosť: približne 16 násobok minimálneho tlmenia, — množstvo vstreknutého roztoku: 1 ml, — teploty programovania pece: spočiatku 235 °C po dobu šesť minút a následné zvyšovanie rýchlosťou 2 °C/minúta na teplotu 285 °C, — injektor s deličom prietoku 1: 15, — nosný plyn: hélium alebo vodík pri tlaku približne 120 kPa. Tieto podmienky sa môžu upravovať v súlade s charakteristikami chromatografu a kolóny tak, aby sa získali chromatogramy spĺňajúce nasledujúce požiadavky: pík vnútorného štandardu do približne 5 minút času uvedeného v 6.3.2; pík vnútorného štandardu musí predstavovať aspoň 80 % rozsahu stupnice. Systém na plynovú chromatografiu sa musí skontrolovať vstreknutím zmesi zásobného roztoku cholestadiénu (5.6) a roztoku n- nonakozánu (5.8). Pík cholesta-3, 5-diénu sa musí objaviť pred píkom n-nonakozánu (obr. 1c); pokiaľ sa neobjaví, tak možno vykonať dva kroky: znížiť teplotu pece a/alebo menej polárnu kolónu.

6.3.2.

Identifikácia píku Pík vnútorného štandardu sa objaví približne za 19 minút a pík 3,5-stigmastadiénu s relatívnym retenčným časom približne 1,29 (pozri obr. 1b). 3,5-stigmastadién sa vyskytuje s malými množstvami izoméru a obvykle sa obidva eluujú spolu ako jeden chromatografický pík. Ak však bude kolóna príliš polárna alebo sa bude vyznačovať vysokou rozlišovacou schopnosťou, izomér sa môže objaviť ako malý pík skôr tesne pred píkom stigmasta-3, 5-diénu (obr. 2). S cieľom zabezpečiť, aby sa stigmastadiény eluovali ako jeden pík, je rozumné nahradiť kolónu kolónou, ktorá je buď menej polárna, alebo má väčší vnútorný priemer. Poznámka 9: Stigmastadiény určené ako referencia sa môžu získať analýzou rafinovaného rastlinného oleja s použitím menšieho množstva vzorky (1až 2 g). Stigmastadiény vytvárajú prominentný a ľahko identifikovateľný pík.

6.3.3.

Kvantitatívna analýza Obsah stigmastadiénov sa stanoví podľa vzorca: mg/kg stigmastadiénov = pričom: As = plocha píku stigmastadiénov (ak je pík rozložený na dva izoméry, tak súčet plôch týchto dvoch píkov), Ac = plocha vnútorného štandardu (cholestadién), Mc = hmotnosť pridaného štandardu v mikrogramoch, Mo = hmotnosť použitého oleja v gramoch. Hranica postrehu: približne 0,01 mg/kg.

Obrázok 1

Plynové chromatogramy získané zo vzoriek olivového oleja analyzovaných na kremennej kapilárnej kolóne (vnútorný priemer 0,25 mm a dĺžka 25 m), potiahnutej 5 % fenylmetylsilikónom s hrúbkou filmu 0,25 mm.

Obrázok 2

Plynový chromatogram získaný zo vzorky rafinovaného olivového oleja analyzovaného na DB-5-kolóne vykazujúci izomér 3,5-stigmastadiénu.

▼M13

---

ANNEX XVIII

DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42 (DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL CONTENT)

1.   Scope

Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between the analytical results obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from the fatty acid composition.

2.   Field application

The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleic acid) in every class of olive oils.

3.   Principle

The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42 (calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition) correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger than the values stated in the Regulation for each type of oil points out that the oil contains seed oils.

4.   Method

The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one essentially is made by the coordination of analytical data obtained by means of other methods: it is possible to distinguish three phases: determination of fatty acid composition by capillary gas chromatography, calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42, HPLC determination of ECN42 triacylglycerols

4.1.   Apparatus

4.1.1.

Round bottom flasks, 250 and 500 ml.

4.1.2.

Beakers 100 ml.

4.1.3.

Glass chromatographic column, 21 mm internal diameter, 450 mm length, with cock and normalized cone (female) at the top.

4.1.4.

Separator funnels, 250 ml, with normalized cone (male) at the bottom, suitable to be connected with the top of the column.

4.1.5.

Glass rod, 600 mm length.

4.1.6.

Glass funnel, 80 mm diameter.

4.1.7.

Volumetric flasks, 50 ml.

4.1.8.

Volumetic flasks, 20 ml.

4.1.9.

Rotative evaporator.

4.1.10.

High performance liquid chromatography, allowing thermostatic control of column temperature.

4.1.11.

Injection units for 10 μl delivery.

4.1.12.

Detector: differential refractometer. The full scale sensitivity should be at least 10-4 units of refractive index.

4.1.13.

Column: stainless steel tube 250 mm length and 4,5 mm internal diameter packed with 5 μm diameter particles of slica with 22 to 23 % carbon in the form of octadecylsilane (note 2).

4.1.14.

Recorder and/or integrator.

4.2.   Reagents

The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be de-gassed, and may be recycled several times without effect on the separations.

4.2.1.

Petroleum ether 40 to 60 °C chromatographic grade.

4.2.2.

Ethil ether, peroxides free, freshly distilled.

4.2.3.

Glass chromatographic elution solvent: mixture petroleum ether/ethil ether 87/13 (v/v).

4.2.4.

Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, with water content standardized at 5 % (w/w).

4.2.5.

Glass wool.

4.2.6.

Acetone.

4.2.7.

Acetonitrile.

4.2.8.

HPLC elution solvent: acetonitrile + acetone (proportions to be adjusted to obtain the desired separation; begin with 50:50 mixture).

4.2.9.

Solubilization solvent: acetone.

4.2.10.

Reference triglycerides commercial triglycerides tripalmitin, triolein, etc.) may be used and the retention times thence plotted in accordance with the equivalent carbon number, or alternatively reference chromatograms obtained from soya oil, mixture 30:70 soya oil/olive oil and pure olive oil (see notes 3 and 4 and figure 1, 2, 3, 4).

4.3.   Sample preparation

As a number of interfering substances can rise false positive results, the sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used for determination of polar substances in oxidised oils.

4.3.1.   Chromatographic column preparation

Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to the bottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).

In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glass funnel (4.1.6).

To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside the column, too.

Open the cock and let solvent elute from the column until its level is about 1 cm over the silicagel.

4.3.2.   Column chromatography

Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volumetric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at room temperature and adjust the volume with elution solvent.

By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute to the silicagel layer level.

Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to pass through the column).

The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent at reduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used to prepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.

The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum of 80 % for lampante and residue olive oils.

4.4.   HPLC analysis

4.4.1.   Preparation of the samples for chromatographic analysis

A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).

4.4.2.   Procedure

Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.

4.4.3.   Calculation and expression of results

Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equal to 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using the formula:

% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.

The results are to be given to within at least two decimal places.

Note 1: The elution order can be determined by calculating the equivalent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, where CN is the carbon number and n is the number of double bounds, it can be calculated more precisely by taking into account the origin of the double bond. If no, nl and nln are the numbers of double bonds attributed to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbon number can be calculated by means of the relation of the formula:

where the coefficient do, dl and dln can be calculated by means of the reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, the relation obtained will be close in:

Note 2:

Note 3: With several reference triglycerides, it is also possible to calculate the resolution with respect to triolein:

by use of the reduced retention time RT' = RT - RT solvent.

The graph of log α against f (number of double bonds) enables the retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acids contained in the reference triglycerides — see figure 2.

Note 4: The efficiency of the column should permit clear separation of the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.

Note 5: A correct measure of the areas of all peaks of interest for the present determination is ensured if the second peak corresponding to ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.

4.5.   Calculation of triacylglycerols composition

4.5.1.   Determination of fatty acid composition

Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chromatographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No 2568/91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solution).

4.5.2.   Fatty acids for calculation

Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking into account the following equivalencies between ECN and fatty acids. Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in consideration, because only these are important for olive oil.

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

The result gives the percentage of each fatty acid in moles % in the overall (1,2,3-) position of the TAGs.

Then the sum of the saturated fatty acids P and S (SFA) and the unsaturated fatty acids Po, O, L and Ln (UFA) are calculated:

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of TAGs

The fatty acids are distributed to three pools as follows: two identical for 1- and 3- positions and one for 2- position, with different coefficients for the saturated (P and S) and unsaturated acids (Po, O, L and Ln).

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06 (4) moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 2- position [Po(2), O(2), L(2) and Ln(2)]: moles % Po2 =moles % Po1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 (5) moles % O2 =moles % O1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - mol % S2 moles % L2 =moles % L1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 moles % Ln2 = moles % Ln1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)]: moles % P1,3 =moles % P1,2,3 - moles % P22 + moles % P1,2,3 (6) moles % S1,3 =moles % S1,2,3 - moles % S22 + moles % S1,2,3 moles % Po1,3 =moles % Po1,2,3 - moles % Po22 + moles % Po1,2,3 moles % O1,3 =moles % O1,2,3 - moles % O22 + moles % O1,2,3 moles % L1,3 =moles % L1,2,3 - moles % L22 + moles % L1,2,3 moles % Ln1,3 =moles % Ln1,2,3 - moles % Ln22 + moles % Ln1,2,3

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols

4.5.6.1.

TAGs with one fatty acid (AAA, here LLL, PoPoPo) moles % AAA = moles % A1,3 * moles % A2 * moles % A1,310 000 (7)

4.5.6.2.

TAGs with two fatty acids (AAB, here PoPoL, PoLL) moles % AAB = moles % A1,3 * moles % A2 * moles % B1,3 * 210 000 (8) moles % ABA = moles % A1,3 * moles % B2 * moles % A1,310 000

4.5.6.3.

TAGs with three different fatty acids (ABC, here OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) moles % ABC = moles % A1,3 * moles % B2 * moles % C1,3 * 210 000 (9) moles % BCA = moles % B1,3 * moles % C2 * moles % A1,3 * 210 000 moles % CAB = moles % C1,3 * moles % A2 * moles % B1,3 * 210 000

4.5.6.4.

Triacylglycerides with ECN42 The following triglycerides with ECN42 are calculated according equation 7, 8 and 9 in order of expected elution in HPLC (normally only three peaks). LLL PoLL and the positional isomer LPoL OLLn and the positional isomers OLnL and LnOL PoPoL and the positional isomer PoLPo PoOLn and the positional isomers OPoLn and OLnPo PLLn and the positional isomers LLnP and LnPL PoPoPo SLnLn and the positional isomer LnSLn PPoLn and the positional isomers PLnPo and PoPLn The triacylglycerides with ECN42 are given by the sum of the nine triacylglycerols including their positional isomers. The results to be given with at least two decimal places.

5.   Evaluation of the results

The calculated theoretical content and the content determined by the HPLC analysis are compared. If the difference between HLPC data minus theoretical data is greater than the values states for the appropriate oil category in the Regulation, the sample contains seed oil.

Note:Results are given to within one decimal figure.

6.   Example (The numbers refer to the sections in the text of the method)

4.5.1.   Calculation of moles % fatty acids from GLC data (area %)

The following data are obtained for the fatty acid composition by GLC:

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

Sum of the saturated and unsaturated fatty acids in the 1,2,3- position of TAGs

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of the TAGs

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 moles % See formula (4) moles % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 moles % See formula (4)

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 1,3-position [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)] moles % Po2 =1,097 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 1,263 moles % See formula (5) moles % O2 =74,113 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 85,295 moles % See formula (5) moles % L2 =9,956 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 11,458 moles % See formula (5) moles % Ln2 =1,003 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 1,154 moles % See formula (5)

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)] moles % P1,3 =10,888 - 0,6592 10,888 = 16,005 moles % See formula (6) moles % S1,3 = 2,944 - 0,1772 2,944 = 4,327 moles % See formula (6) moles % Po1,3 = 1,097 - 1,2632 1,097 = 1,015 moles % See formula (6) moles % O1,3 = 74,113 - 85,2952 74,113 = 68,522 moles % See formula (6) moles % L1,3 =9,956 - 11,4582 9,956 = 9,205 moles % See formula (6) moles % Ln1,3 =1,003 - 1,1542 1,003 = 0,927 moles % See formula (6)

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols

From the calculated fatty acid composition in sn-2- and sn-1,3- positions (see above):

the following triacylglycerols are calculated:

4.5.6.1.

TAGs with one fatty acid (LLL, PoPoPo) See formula (7) mol % LLL = 9,205 % * 11,458 % * 9,205 %10 000 = 0,09708 mol LLL mol % PoPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 1,015 %10 000 = 0,00013 mol PoPoPo

4.5.6.2.

TAGs with two fatty acids (PoLL, SLnLn, PoPoL) See formula (8) mol % PoLL + LLPo = 1,015 % * 11,458 % * 9,205 % * 210 000 = 0,02141 mol % LPoL = 9,205 % * 1,263 % * 9,205 %10 000 = 0,01070   0,03211 mol PoLL mol % SLnLn + LnLnS = 4,327 % * 1,154 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00093 mol % LnSLn = 0,927 % * 0,177 % * 0,927 %10 000 = 0,00002   0,00095 mol SLnLn mol % PoPoL + LPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00236 mol % PoLPo = 1,015 % * 11,458 % * 1,015 %10 000 = 0,00118   0,00354 mol PoPoL

4.5.6.3.

TAGs with three different fatty acids (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) See formula (9) mol % PPoLn = 16,005 % * 1,263 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00375 mol % LnPPo = 0,927 % * 0,653 % * 1,015 % * 210 000 = 0,00012 mol % PoLnP = 1,015 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,00375   0,00762 mol PPoLn mol % OLLn = 68,522 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,14577 mol % LnOL = 0,927 % * 85,295 % * 9,205 % * 210 000 = 0,14577 mol % LLnO = 9,205 % * 1,154 % * 68,522 % * 210 000 = 0,14577   0,43671 mol OLLn mol % PLLn = 16,005 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,03400 mol % LnPL = 0,927 % * 0,653 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00111 mol % LLnP = 9,205 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,03400   0,06911 mol PLLn mol % PoOLn = 1,015 % * 85,295 % * 0,927 % * 210 000 = 0,01605 mol % LnPoO = 0,927 % * 1,263 % * 68,522 % * 210 000 = 0,01605 mol % OLnPo = 68,522 % * 1,154 % * 1,015 % * 210 000 = 0,01605   0,04815 mol PoOLn ECN42 = 0,69540 mol TAGs

▼M14

Obr. 1: Graf log α voči f (počet dvojitých väzieb)

Poznámka:

La = kyselina laurová; L = kyselina linolová; My = kyselina myristová; Ln = kyselina linolenová; P = kyselina palmitová; St = kyselina stearová; O = kyselina olejová.

Obr. 2: sójový olej

Obr. 3: Sójový olej/olivový olej 30/70

Obr. 4: Olivový olej

▼M19

---

ANNEX XIX

DETERMINATION OF ALIPHATIC ALCOHOLS CONTENT BY CAPILLARY GAS CHROMATOGRAPHY

1.   OBJECT

The procedure describes a method for the determination of aliphatic alcohols content in oils and fats.

2.   PRINCIPLE OF THE METHOD

The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is saponified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethylsilyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.

3.   EQUIPMENT

4.   REAGENTS

5.   PROCEDURE

5.1.   Preparation of the unsaponifiables

5.1.1.

Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil. Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 5 g of the dry filtered sample into the same flask.

5.1.2.

Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to approximately 30 °C.

5.1.3.

The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle (Note 1). Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether. Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.

5.1.4.

The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives a neutral reaction. Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed beforehand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl ether which are added to the total.

5.1.5.

Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling in a desiccator.

5.2.   Separation of alcoholic fractions

5.2.1.

Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally placed in an oven at 100 °C for one hour. Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until required for use (plates treated in this way must be used within 15 days). Note 2: When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic fraction there is no need to treat the unsaponifiables with alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated distinctly from the sterol band.

5.2.2.

Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-developing chamber to a depth of approximately 1 cm ( 7 ). Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components. Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in order to obtain reproducible developing conditions.

5.2.3.

An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chloroform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution (4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.

5.2.4.

Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Immediately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate. The plate is then removed from the development chamber and the solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.

5.2.5.

The plate is sprayed lightly and evenly with the solution of 2', 7'-dichlorofluorescein when the plate is observed under ultra violet light. The aliphatic alcohols band can be identified through being aligned with the stain obtained from the reference solution: mark the limits of the band with a black pencil; outlining the band of aliphatic alcohols and the band immediately above that, which is the terpenic alcohols band, together. Note 4: The aliphatic alcohols band and the terpenic alcohols band are to be grouped together in view of the possible migration of some aliphatic alcohols into the triterpenic alcohols band.

5.2.6.

Using a metal spatula scrape off the silica gel in the marked area. Place the finely comminuted material removed into the filter funnel (3.7). Add 10 ml of hot chloroform, mix carefully with the metal spatula and filter under vacuum, collecting the filtrate in the conical flask (3.8) attached to the filter funnel. Wash the pomace in the flask three times with ethyl ether (approximately 10 ml each time) collecting the filtrate in the same flask attached to the funnel. Evaporate the filtrate to a volume of 4 to 5 ml, transfer the residual solution to the previously weighed 10 ml test tube (3.9), evaporate to dryness by mild heating in a gentle flow of nitrogen, make up again using a few drops of acetone, evaporate again to dryness, place in an oven at 105 °C for approximately 10 minutes and then allow to cool in a desiccator and weigh. The pomace inside the test tube is composed of the alcoholic fraction.

5.3.   Preparation of the trimethylsilyl ethers

5.3.1.

The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume (Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption of moisture (Note 6). Note 5: Solutions which are ready for use are available commercially. Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethylsilyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available. Note 6: The slight opalescence which may form is normal and does not cause any interference. The formation of a white floc or the appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.

5.3.2.

Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.

5.4.   Gas chromatography analysis

5.4.1.   Preliminary operations, column packing

5.4.1.1.

Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly (tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the splitting system and of the recording system, etc.).

5.4.1.2.

If the column is being used for the first time it is recommended that it should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through the capillary column and then the gas chromatography assembly is switched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That temperature is held for not less than two hours and then the assembly is brought to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connections; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column. Note 7: The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than the maximum temperature contemplated for the liquid phase employed.

5.4.2.   Choice of operating conditions

5.4.3.   Analytical procedure

5.4.4.   Peak identification

The identification of individual peaks is effected according to the retention times and by comparison with the standard TMSE mixture, analysed under the same conditions.

A chromatogram of the alcoholic fraction of a virgin olive oil is shown in Figure 1.

5.4.5.   Quantitative evaluation

6.   EXPRESSION OF THE RESULTS

The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty substance and the sum of the ‘total aliphatic alcohols’ are reported.

---

APPENDIX

Determination of the linear velocity of the gas

1 to 3 μl of methane or propane are injected into the gas chromatograph set at normal operating conditions and the time taken for the methane or propane to flow through the column from the instant of injection to the instant the peak elutes (tM) is measured using a stop clock.

The linear velocity in cm/s is given by L/tM, where L is the length of the column in centimetres and tM is the measured time in seconds.

Figure 1 — Chromatogram of the alcoholic fraction of virgin oil

1

=

Eicosanol

2

=

Decosanol

3

=

Tricosanol

4

=

Tetracosanol

5

=

Pentacosanol

6

=

Hexacosanol

7

=

Heptacosanol

8

=

Octacosanol

▼M23

---

PRÍLOHA XX

Metóda na stanovenie obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín a etylesterov mastných kyselín kapilárnou plynovou chromatografiou

1.   ÚČEL

Účelom tejto metódy je stanovenie obsahu voskov, metylesterov mastných kyselín a etylesterov mastných kyselín v olivových olejoch. Jednotlivé vosky a alkylestery sa oddelia podľa počtu atómov uhlíka. Metóda sa odporúča ako nástroj na rozlíšenie olivového oleja a oleja z olivových výliskov, ako aj kvalitatívny parameter extra panenských olivových olejov, ktorým sa umožňuje detekcia falšovanej zmesi extra panenských olivových olejov s olejmi nižšej kvality, či už sú to panenské, lampantové oleje alebo niektoré oleje zbavené zápachu.

2.   PRINCÍP METÓDY

Pridanie vhodného vnútorného štandardu k oleju a následná frakcionácia chromatografiou na kolóne s hydratovaným silikagélom. Získanie frakcie eluovanej za skúšobných podmienok (ktorej polarita je nižšia ako polarita triglyceridov) a následná priama analýza kapilárnou plynovou chromatografiou.

3.   PRÍSTROJE

3.1.	Erlenmeyerova banka, 25 ml.

3.2.	Sklená kolóna na kvapalinovú chromatografiu, s vnútorným priemerom 15 mm, dĺžkou 30 až 40 cm vybavená vhodným kohútikom.

3.3.

Plynový chromatograf vhodný na použitie s kapilárnou kolónou, vybavený systémom priamej injektáže na kolónu (tzv. technika on-column), ktorého súčasťou sú: 3.3.1. Pec regulovaná termostatom s programovateľnou teplotou. 3.3.2. Studený injektor na priamu injektáž na kolónu. 3.3.3. Plameňový ionizačný detektor a zariadenie na prevod a zosilnenie signálu. 3.3.4. Zapisovač-integrátor (poznámka 1) na použitie so zariadením na prevod a zosilnenie signálu (bod 3.3.3), s časovou odozvou nepresahujúcou 1 sekundu a s rôznymi rýchlosťami posunu papiera. Poznámka 1:  Môžu sa používať aj automatizované systémy, ktoré umožňujú zadávanie údajov z plynovej chromatografie prostredníctvom osobného počítača. 3.3.5. Kapilárna kolóna, tavený kremeň (na analýzu voskov a metyl- a etylesterov), dĺžka 8 až 12 m, vnútorný priemer 0,25 až 0,32 mm, z vnútornej strany pokrytá kvapalnou fázou (poznámka 2) s homogénnou hrúbkou 0,10 až 0,30 μm. Poznámka 2:  Na tieto účely sú dostupné vhodné komerčné kvapalné fázy ako SE52, SE54 atď.

3.4.	Mikrostriekačka s kapacitou 10 μl na priamu injektáž na kolónu, vybavená cementovanou ihlou.

3.5.	Elektrická miešačka.

3.6.	Rotačná odparka.

3.7.	Mufľová pec.

3.8.	Analytické váhy s presnosťou merania na ± 0,1 mg.

3.9.	Bežné laboratórne sklo.

4.   ČINIDLÁ

4.1.	Silikagél, veľkosť zrna 60 až 200 μm. Vložte silikagél do mufľovej pece na 500 °C aspoň na 4 hodiny. Po vychladnutí pridajte 2 % vody vzhľadom na množstvo použitého silikagélu. Dobre pretrepte, aby sa hmota homogenizovala, a pred použitím uchovávajte v sušičke najmenej počas 12 hodín.

4.2.

n-hexán, na chromatografiu alebo analýzu zvyškov (čistota musí byť overená). VAROVANIE – Výpary sa môžu vznietiť. Chráňte pred zdrojom tepla, iskrami alebo otvoreným ohňom. Uistite sa, že fľaše sú vždy dobre uzatvorené. Počas použitia zaistite riadnu ventiláciu. Zabráňte hromadeniu výparov a odstráňte všetky príčiny možného vzniku požiaru, ako sú ohrievacie telesá alebo elektrické zariadenia, ktoré nie sú vyrobené z nehorľavého materiálu. Vdýchnutie je škodlivé, lebo môže spôsobiť poškodenie nervových buniek. Zabráňte vdýchnutiu výparov. V prípade potreby použite vhodný dýchací prístroj. Zabráňte kontaktu s očami a pokožkou.

4.3.

Dietyléter, na chromatografiu. VAROVANIE – Vysokohorľavý a mierne toxický. Dráždi pokožku. Vdýchnutie je škodlivé. Môže spôsobiť poškodenie očí. Môže mať oneskorené účinky. Môže vytvárať výbušné peroxidy. Výpary sa môžu vznietiť. Chráňte pred zdrojom tepla, iskrami alebo otvoreným ohňom. Uistite sa, že fľaše sú vždy dobre uzatvorené. Počas použitia zaistite riadnu ventiláciu. Zabráňte hromadeniu výparov a odstráňte všetky príčiny možného vzniku požiaru, ako sú ohrievacie telesá alebo elektrické zariadenia, ktoré nie sú vyrobené z nehorľavého materiálu. Neodparujete dosucha ani takmer dosucha. Pridaním vody alebo vhodného redukčného činidla možno znížiť tvorbu peroxidov. Nepite. Zabráňte vdýchnutiu výparov. Zabráňte dlhotrvajúcemu alebo opakovanému kontaktu s pokožkou.

4.4.

n-heptán, na chromatografiu alebo izo-oktán. VAROVANIE – Vznetlivý. Vdýchnutie je škodlivé. Chráňte pred zdrojom tepla, iskrami alebo otvoreným ohňom. Uistite sa, že fľaše sú vždy dobre uzatvorené. Počas použitia zaistite riadnu ventiláciu. Zabráňte vdýchnutiu výparov. Zabráňte dlhotrvajúcemu alebo opakovanému kontaktu s pokožkou.

4.5.	Štandardný roztok laurylarašidátu (poznámka 3) s koncentráciou 0,05 % (m/V) v heptáne (vnútorný štandard pre vosky). Poznámka 3:  Možno použiť aj palmityl-palmitát, myristyl-stearát alebo aršidyl-laureát.

4.6.	Štandardný roztok metyl-heptadekanoátu s koncentráciou 0,02 % (m/V) v heptáne (vnútorný štandard pre metyl- a etylestery).

4.7.	Sudán 1 [1-(fenyldiazenyl)naftalén-2-ol].

4.8.

Nosný plyn: vodík alebo hélium, čistý, na plynovú chromatografiu. VAROVANIE Vodík. Vysokohorľavý, pod tlakom. Chráňte pred zdrojom tepla, iskrami, otvoreným ohňom alebo elektrickými zariadeniami, ktoré nie sú vyrobené z nehorľavého materiálu. Uistite sa, že ventil fľaše je uzavretý, keď sa nepoužíva. Vždy používajte s redukčným ventilom. Uvoľnite napätie redukčnej pružiny pred otvorením ventilu fľaše. Pri otváraní ventilu nestojte pred výpustným otvorom fľaše. Počas použitia zaistite riadnu ventiláciu. Neprepúšťajte vodík z jednej fľaše do druhej. Nemiešajte plyn vo fľaši. Uistite sa, že fľaše sa nemôžu prevrhnúť. Chráňte ich pred slnečným žiarením a zdrojmi tepla. Skladujte v nekorozívnom prostredí. Nepoužívajte poškodené alebo neoznačené fľaše. Hélium. Vysokostlačený plyn. Znižuje množstvo kyslíka, ktoré je k dispozícii na dýchanie. Fľaše udržiavajte uzatvorené. Počas použitia zaistite riadnu ventiláciu. Nevstupujte do skladovacích priestorov, ak nie sú riadne vetrané. Vždy používajte s redukčným ventilom. Uvoľnite napätie redukčnej pružiny pred otvorením ventilu fľaše. Neprepúšťajte plyn z jednej fľaše do druhej. Uistite sa, že fľaše sa nemôžu prevrhnúť. Pri otváraní ventilu nestojte pred výpustným otvorom fľaše. Chráňte ich pred slnečným žiarením a zdrojmi tepla. Skladujte v nekorozívnom prostredí. Nepoužívajte poškodené alebo neoznačené fľaše. Nevdychujte. Používajte výhradne na technické účely.

4.9.

Pomocné plyny: — Vodík, čistý, na plynovú chromatografiu. — Vzduch, čistý, na plynovú chromatografiu. VAROVANIE Vzduch. Vysokostlačený plyn. V prítomnosti horľavých látok používajte opatrne, keďže teplota samovznietenia väčšiny organických zložiek vzduchu je výrazne nižšia pod vysokým tlakom. Uistite sa, že ventil fľaše je uzavretý, keď sa nepoužíva. Vždy používajte s redukčným ventilom. Uvoľnite napätie redukčnej pružiny pred otvorením ventilu fľaše. Pri otváraní ventilu nestojte pred výpustným otvorom fľaše. Neprepúšťajte plyn z jednej fľaše do druhej. Nemiešajte plyn vo fľaši. Uistite sa, že fľaše sa nemôžu prevrhnúť. Chráňte ich pred slnečným žiarením a zdrojmi tepla. Skladujte v nekorozívnom prostredí. Nepoužívajte poškodené alebo neoznačené fľaše. Vzduch na technické účely sa nesmie používať na vdychovanie ani v dýchacích prístrojoch.

5.   POSTUP

5.1.    Príprava chromatografickej kolóny

Preveďte do suspenzie 15 g silikagélu (bod 4.1) v n-hexáne (bod 4.2) a zaveďte do kolóny (bod 3.2). Nechajte samovoľne usadiť. Usadzovanie dokončite pomocou elektrickej trepačky s cieľom dosiahnuť homogénnejšiu chromatografickú vrstvu. Premyte 30 ml n-hexánu s cieľom odstrániť všetky prípadné nečistoty. Analytickými váhami (bod 3.8) navážte presne 500 mg vzorky do 25 ml banky (bod 3.1) a pridajte vhodné množstvo vnútorného štandardu (bod 4.5) v závislosti od predpokladaného obsahu vosku, napríklad pridajte 0,1 mg laurylarašidátu v prípade olivového oleja, 0,25 až 0,50 mg v prípade oleja z olivových výliskov a 0,05 mg metyl-heptadekanoátu v prípade olivových olejov (bod 4.6).

Pripravenú vzorku preneste do chromatografickej kolóny pomocou dvoch 2-ml dávok n-hexánu (bod 4.2).

Napustite rozpúšťadlo do výšky 1 mm nad hornou úrovňou absorbentu. Premyte ďalším roztokom n-hexánu/dietyléteru v pomere 99:1 a zachyťte 220 ml roztoku pri prietoku približne 15 kvapiek každých 10 sekúnd. (Táto frakcia obsahuje metyl- a etylestery a vosky). (Poznámka 4) (Poznámka 5).

Sušte výslednú frakciu v rotačnej odparke až do odstránenia takmer celého rozpúšťadla. Odstráňte posledné 2 ml pomocou slabého prúdu dusíka. Frakcia obsahujúca metyl- a etylestery sa zachytáva v 2 až 4 ml n-heptánu alebo izo-oktánu ako rozpúšťadla.

5.2.    Plynová chromatografická analýza

5.2.1.    Postup prípravy

Namontujte kolónu do plynového chromatografu (bod 3.3), pričom vstupný port sa pripojí k systému na kolóne a výstupný port k detektoru. Skontrolujte prístroj na plynovú chromatografiu (činnosť uzavretých plynových obvodov, účinnosť detektora a zapisovača atď.).

Pokiaľ sa kolóna používa po prvýkrát, je potrebné ju kondicionovať. Zaveďte mierny prietok plynu cez kolónu a potom zapnite prístroj na plynovú chromatografiu. Postupne zahrievajte, až kým sa približne po 4 hodinách dosiahne teplota 350 °C.

Túto teplotu udržiavajte najmenej počas 2 hodín, potom prístroj nastavte na prevádzkové podmienky [nastavte prietok plynu, zapáľte plamienok, pripojte k elektrickému zapisovaču (bod 3.3.4), nastavte teplotu pece pre kolónu, nastavte detektor atď.]. Zapíšte signál pri citlivosti najmenej dvakrát vyššej, ako sa vyžaduje na vykonanie analýzy. Základná línia by mala byť lineárna, nesmie obsahovať píky žiadneho druhu a nesmie vykazovať žiadnu nestabilitu (drift).

Záporný priamočiary drift indikuje nedokonalú tesnosť spojov kolóny, kým kladný drift indikuje nedostatočné kondiciovanie kolóny.

5.2.2.    Výber prevádzkových podmienok v prípade voskov a metyl- a etylesterov (poznámka 6)

Prevádzkové podmienky sú spravidla tieto:

—	Teplota kolóny : 20 °C/min 5 °C/min 80 °C počiatočná teplota (1′) 140 °C 335 °C (20)

—	Teplota detektora : 350 °C.

—	Injektované množstvo : 1 μl roztoku n-heptánu (2 až 4 ml).

—	Nosný plyn : hélium alebo vodík s optimálnou lineárnou rýchlosťou pre zvolený plyn (pozri dodatok A).

—	Citlivosť prístroja : vhodná na splnenie uvedených podmienok.

Uvedené podmienky možno upraviť tak, aby vyhovovali charakteristikám kolóny a prístroju na plynovú chromatografiu, a to s cieľom oddeliť všetky vosky a metylestery mastných kyselín a etylestery mastných kyselín, ako aj získať uspokojivú separáciu píkov (pozri obrázky 2, 3 a 4) a retenčný čas 18 ± 3 min. pre vnútorný štandard laurylarašidátu. Najreprezentatívnejší pík voskov sa musí nachádzať nad 60 % rozsahu stupnice, zatiaľ čo pík metyl-heptadekanoátu – vnútorný štandard pre metyl- a etylestery musí dosiahnuť plný rozsah stupnice.

Parametre integrácie píku by sa mali určiť tak, aby sa dosiahlo správne vyhodnotenie príslušných plôch píkov.

5.3.    Vykonanie analýzy

Pomocou 10 μl mikrostriekačky naberte 10 μl roztoku, pričom piestik ťahajte dozadu až dovtedy, kým ihla nebude prázdna. Ihlu zaveďte do injekčného systému a po uplynutí 1 až 2 sekúnd rýchlo vstreknite. Po asi 5 sekundách ihlu jemne vytiahnite.

Zápis nechajte prebiehať dovtedy, kým vosky alebo stigmastadiény nebudú úplne eluované v závislosti od analyzovanej frakcie.

Základná línia musí vždy zodpovedať požadovaným podmienkam.

5.4.    Identifikácia píku

Píky identifikujte z retenčných časov ich porovnaním so zmesami voskov so známymi retenčnými časmi analyzovanými za rovnakých podmienok. Alkylestery sa stanovujú zo zmesí metylesterov a etylesterov hlavných mastných kyselín v olivových olejoch (palmitovej a olejovej).

Na obrázku 1 je znázornený chromatogram voskov panenského olivového oleja. Na obrázkoch 2 a 3 sú znázornené chromatogramy dvoch maloobchodne predávaných extra panenských olivových olejov, jedného s metylestermi a etylestermi a druhého bez nich. Na obrázku 4 sú znázornené chromatogramy v prípade extra panenského olivového oleja najvyššej kvality a toho istého oleja, ku ktorému sa primiešalo 20 % oleja zbaveného zápachu.

5.5.    Kvantitatívna analýza voskov

Pomocou integrátora určíte plochy píkov zodpovedajúce vnútornému štandardu laurylarašidátu a alifatickým esterom od C40 do C46.

Určíte obsah všetkých voskov pripočítaním každého jednotlivého vosku v mg/kg tuku podľa tohto vzorca:

kde:

Ax

=

plocha zodpovedajúca píku pre jednotlivé estery, vypočítaná pomocou počítača

As

=

plocha zodpovedajúca píku pre vnútorný štandard laurylarašidátu, vypočítaná pomocou počítača

ms

=

hmotnosť pridaného vnútornému štandardu laurylarašidátu, v miligramoch

m

=

hmotnosť vzorky odobratej na stanovenie, v gramoch.

5.5.1.    Kvantitatívna analýza metylesterov a etylesterov

Pomocou integrátora určíte plochy píkov zodpovedajúce vnútornému štandardu metyl-heptadekanoátu, metylesterov mastných kyselín C16 a C18 a etylesterov mastných kyselín C16 a C18.

Obsah alkylesterov v mg/kg tuku určíte takto:

kde:

Ax

=

plocha zodpovedajúca píku pre jednotlivé estery C16 a C18, vypočítaná pomocou počítača

As

=

plocha zodpovedajúca píku pre vnútorný štandard metyl-heptadekanoátu, vypočítaná pomocou počítača

ms

=

hmotnosť pridaného vnútornému štandardu metyl-heptadekanoátu, v miligramoch

m

=

hmotnosť vzorky odobratej na stanovenie, v gramoch.

6.   VYJADRENIE VÝSLEDKOV

V správe uveďte súčet obsahov rôznych voskov od C40 do C46 (poznámka 7) v miligramoch na kilogram tuku.

V správe uveďte súčet obsahov metylesterov a etylesterov od C16 do C18 a celkový súčet oboch.

Výsledky by sa mali vyjadriť v najbližších mg/kg.

V správe uveďte pomer obsahov etylesterov a metylesterov

Obrázok 1

Príklad plynového chromatogramu frakcie voskov v olivovom oleji ( 8 )

Píky s retenčným časom 5 až 8 min. metyl- a etylesterov mastných kyselín

Legenda:

I.S.

=

(vnútorný štandard – V.S.) laurylarašidát

1

=

diterpénové estery

2+2′

=

estery C40

3+3′

=

estery C42

4+4′

=

estery C44

5

=

estery C46

6

=

sterol-estery a triterpénové alkoholy

Obrázok 2

Metylestery, etylestery a vosky v panenskom olivovom oleji

Legenda:

1

–

Metyl C16

2

–

Etyl C16

3

–

Metyl-heptadekanoát V.S.

4

–

Metyl C18

5

–

Etyl C18

6

–

Skvalén

7

–

Laurylarašidát V.S.

A

–

Diterpénové estery

B

–

Vosky

C

–

Sterol-estery a triterpénové estery

Obrázok 3

Metylestery, etylestery a vosky v extra panenskom olivovom oleji

Legenda:

1

–

Metyl-heptadekanoát V.S.

2

–

Metyl C18

3

–

Etyl C18

4

–

Skvalén

5

–

Laurylarašidát V.S.

A

–

Diterpénové estery

B

–

Vosky

C

–

Sterol-estery a triterpénové estery

Obrázok 4

Časť chromatogramu extra panenského olivového oleja a toho istého oleja, ku ktorému sa primiešal olej zbavený zápachu

Legenda:

1

–

Metyl-myristát V.S.

2

–

Metyl-palmitát

3

–

Etyl-palmitát

4

–

Metyl-heptadekanoát V.S.

5

–

Metyl-linoleát

6

–

Metyl-oleát

7

–

Metyl-stearát

8

–

Etyl-linoleát

9

–

Etyl oleát

10

–

Etyl-stearát

---

Dodatok A

Stanovenie lineárnej rýchlosti plynu

Vstreknite 1:3 μl metánu (alebo propánu) do plynového chromatografu po jeho nastavení na bežné prevádzkové podmienky. Odmerajte čas, ktorý potrebuje plyn na prechod cez kolónu od momentu jeho vstreknutia až do času, keď sa objaví pík (tM).

Lineárna rýchlosť v cm/s je daná vzorcom L/tM, kde L je dĺžka kolóny v cm a tM je čas nameraný v sekundách.

---

( 1 ) Ú. v. ES 172, 30.9.1966, s. 3025/66.

( 2 ) Ú. v. ES L 353, 17.12.1990, s. 23.

( 3 ) Ú. v. ES L 128, 24.5.1977, s. 6.

( 4 ) Ú. v. ES L 166, 1.7.1988, s. 10.

( 5 ) Po elúcii sterol-esterov sa na chromatografickom zázname nemajú ukázať výrazné píky (triglyceridy).

( 6 ) Ochutnávač môže odmietnuť ochutnávanie oleja, pokiaľ pri priamom ovoniavaní zaznamená, že niektorý z negatívnych atribútov je extrémne intenzívny. Na profilovom hárku sa zmieni o tejto výnimočnej okolnosti.

( 7 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be used to obtain distinct band separation.

( 8 ) Po elúcii sterol-esterov by chromatografický záznam nemal vykazovať žiadne významné píky (triglyceridy).