►B

DRUHÁ SMERNICA KOMISIE

zo 14. mája 1982

o aproximácii právnych predpisov členských štátov, ktorá sa týka metód analýzy, ktoré sú potrebné na kontrolu zloženia kozmetických výrobkov

(82/434/EHS)

(Ú. v. ES L 185, 30.6.1982, p.1)

Úradný vestník

  No

page

date

►M1

Smernica Komisie 90/207/EHS zo 4. apríla 1990,

  L 108

92

28.4.1990

2.1.

0,5 % (hmotn.) vodné referenčné roztoky nasledovných zlúčenín:

2.2.

Vyvíjacie rozpúšťadlo A, 80 % (obj.) etanol.

2.3.

Vyvíjacie rozpúšťadlo B, benzén – metanol – 3-metylbután-1-ol – voda (v obj. pomere 34:38:18:10)

2.4.

Detekčné činidlo A, 10 % (hmotn.) vodný roztok jodidu draselného.

2.5.

Detekčné činidlo B, 1 % (hmotn.) vodný roztok škrobu.

2.6.

Detekčné činidlo C, 10 % (hmotn.) roztok kyseliny chlorovodíkovej.

2.7.

4 M roztok kyseliny chlorovodíkovej.

3.1.

Chromatografický papier (Whatman č. 3 a č. 4 alebo ich ekvivalent)

3.2.

Mikropipeta, 1μl.

3.3.

Odmerné banky, 100 ml.

3.4.

Skladané filtre.

3.5.

Vyvíjacia komora na zostupnú papierovú chromatografiu.

4.2.1.

Naváži sa 1 g a 5 g vzorky a disperguje sa v 50 ml vody, doplní sa v každom prípade vodou do 100 ml a premieša sa. Obe disperzie sa prefiltrujú cez skladaný filter (3.4.) a na uskutočnenie papierovej chromatografie opísanej v oddieli 5 sa použije 1 μl každého z filtrátov.

4.2.2.

Ešte raz sa pripravia dve disperzie z každej vzorky dispergovaním 1 g a 5 g v 50 ml vody, okyslí sa zriedenou kyselinou chlorovodíkovou (2.7), doplní sa vodou do 100 ml a premieša sa. Disperzie sa prefiltrujú cez skladaný filter (3.4) a na uskutočnenie papierovej chromatografie opísanej v oddieli 5 sa použije po 1 μl dvoch filtrátov.

5.1.

Primerané množstvo rozpúšťadiel A (2.2) a B (2.3.) sa dá do dvoch samostatných chromatografických vyvíjacích komôr na uskutočnenie zostupnej papierovej chromatografie.

5.2.

Na štartovaciu čiaru pásu chromatografického papiera (Whatman č. 3 alebo jeho ekvivalent), dlhého 40 cm a širokého 20 cm (3.1.) alebo inej vhodnej veľkosti, sa nanesie 1 μl jedného roztoku vzorky a jedného referenčného roztoku.

5.3.

Tento pás chromatografického papiera (5.2) sa umiestni do chromatografickej vyvíjacej komory naplnenej rozpúšťadlom A (5.1) a nechá sa vyvíjať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne 35 cm (asi 15 hodín).

5.4.

S použitím ďalšieho pásu chromatografického papiera (Whatman č. 4 alebo jeho ekvivalent) (3.1) a vyvíjacieho rozpúšťadla B sa zopakuje postup opísaný v oddieloch 5.2 a 5.3. Chromatogram sa nechá vyvíjať, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne 35 cm (asi päť hodín).

5.5.

Po vyvíjaní sa chromatogramy vyberú a vysušia sa na vzduchu.

5.6.

Škvrny na chromatograme sa zviditeľnia ich postriekaním postupne s:

5.7.

Za vyššie uvedených podmienok vzťahujúcich sa na vyvíjacie rozpúšťadlá A (2.2) a B (2.3) sú Rf hodnoty referenčných látok (2.1) približne nasledovné:

2.1.

Metanol.

2.2.

36 % (hmotn.) koncentrovaná kyselina chlorovodíková.

2.3.

6 M kyselina chlorovodíková.

2.4.

2 M kyselina chlorovodíková.

2.5.

Disodná soľ kyseliny rodizónovej.

2.6.

Chlorid bárnatý (BaCl2. 2H2O).

2.7.

Bezvodý uhličitan sodný.

2.8.

1 % (hmotn.) vodný roztok chloridu bárnatého.

2.9.

Vyvíjacie rozpúšťadlo pozostávajúce z metanolu, koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (36 % hmotn.) a vody (obj. pomer 80: 10: 10).

2.10.

Detekčné činidlo, 0,1 % (hmotn.) vodný roztok disodnej soli kyseliny rodizónovej, čerstvo pripravený pred použitím.

3.1.

Mikropipeta, 5 μl.

3.2.

Platinové tégliky.

3.3.

Odmerné banky, 100 ml.

3.4.

Chromatografický papier Schleicher and Schull 2043 b alebo jeho ekvivalent. Papier sa prečistí vyvíjaním cez noc vo vyvíjacej zostupnej chromatografickej komore (A.3.5) obsahujúcej vyvíjacie rozpúšťadlo (B.2.9) a potom sa vysuší.

3.5.

Skladaný filtračný papier.

3.6.

Bežné zariadenie pre uskutočnenie vzostupnej papierovej chromatografie.

4.1.1.

2 g výrobku sa dispergujú v 50 ml vody a pH disperzie sa upraví kyselinou chlorovodíkovou (B.2.3) na približne 1.

4.1.2.

Vodná disperzia sa prenesie do 100 ml odmernej banky, doplní sa vodou po značku a premieša sa. Táto disperzia sa použije na papierovú chromatografickú analýzu opísanú v oddieli 5 a na dôkaz bária vyzrážaním síranu.

4.2.1.

2 g výrobku sa dispergujú v 100 ml vody a prefiltrujú sa.

4.2.2.

K vysušenému zvyšku sa pridá sedem až 10-násobok jeho hmotnosti uhličitanu sodného (B.2.7), premieša sa a zmes sa taví v platinovom tégliku (B.3.2) počas pol hodiny.

4.2.3.

Tavenina sa ochladí sa na laboratórnu teplotu a rozpustí sa v 50 ml vody a prefiltruje sa (B.3.5).

4.2.4.

Zvyšok sa znova rozpustí v kyseline chlorovodíkovej (B.2.3) a doplní sa vodou do 100 ml. Tento roztok sa použije na papierovú chromatografickú analýzu opísanú v oddieli 5 a na dôkaz bária vyzrážaním síranu.

5.1.

Primerané množstvo vyvíjacieho rozpúšťadla (B2.9) sa umiestni do vyvíjacej komory pre vzostupnú papierovú chromatografiu a nádoba sa nechá nasýtiť parami rozpúšťadla aspoň počas 15 hodín.

5.2.

Na kus chromatografického papiera – predupraveného, ako je opísané v oddieli B.3.4 – sa nanesie po 5 μl každého z roztokov pripravených podľa oddielov B.4.1.2 a B.4.2.4 a referenčného roztoku B.2.8 na tri body na štartovacej čiare.

5.3.

Škvrny vzorky a štandardu sa vysušia na vzduchu. Chromatogram sa vyvíja, kým čelo rozpúšťadla nevystúpi 30 cm.

5.4.

Chromatogram sa vyberie z vyvíjacej nádoby a vysuší sa na vzduchu.

5.5.

Škvrny na chromatograme sa zviditeľnia postriekaním papiera detekčným činidlom B.2.10. V prítomnosti bária sa na chromatograme objavia červené škvrny s Rf hodnotou okolo 0,10.

3.1.

1 M kyselina sírová.

3.2.

Jodid draselný.

3.3.

Molybdénan amónny.

3.4.

0,1 M roztok tiosíranu sodného.

3.5.

10 % (hmotn.) roztok jodidu draselného, pripravený tesne pred použitím.

3.6.

20 % (hmotn.) roztok molybdénanu amónneho.

3.7.

1 % (hmotn.) roztok škrobu.

4.1.

Kadičky, 100 ml.

4.2.

Byreta, 50 ml.

4.3.

Odmerné banky, 250 ml.

4.4.

Odmerné valce, 25 a 100 ml.

4.5.

Nedelené pipety, 10 ml.

4.6.

Kužeľovité banky, 250 ml.

5.1.

Do 100 ml kadičky sa naváži 10 g (m gramov) výrobku, obsahujúceho približne 0,6 g peroxidu vodíka. Obsah sa s vodou prenesie do 250 ml odmernej banky, doplní sa vodou po značku a premieša sa.

5.2.

Do 250 ml kužeľovitej banky (4.6) sa napipetuje 10 ml roztoku vzorky (5.1) a jeden po druhom sa pridá 100 ml 1 M kyseliny sírovej (3.1), 20 ml roztoku jodidu draselného (3.5) a tri kvapky roztoku molybdénanu amónneho (3.6).

5.3.

Vzniknutý jód sa ihneď titruje 0,1 M roztokom tiosíranu sodného (3.4) a tesne pred dosiahnutím koncového bodom titrácie sa pridá niekoľko mililitrov roztoku škrobu (3.7) ako indikátora. Zaznamená sa spotreba 0,1 M roztoku tiosíranu sodného (3.4) v mililitroch (V).

5.4.

Spôsobom opísaným v oddieloch 5.2 a 5.3 sa uskutoční slepý pokus, kde sa 10 ml roztoku vzorky nahradí 10 ml vody. Zaznamená sa spotreba 0,1 M roztoku tiosíranu sodného na slepú titráciu (V0 ml).

m

=

množstvo analyzovaného výrobku v gramoch (5.1),

V0

=

spotreba 0,1 M roztoku tiosíranu sodného pri slepom pokuse v mililitroch (5.4),

V

=

spotreba 0,1 M roztoku tiosíranu sodného pri titrácii roztoku vzorky v mililitroch (5.3).

3.1.

Etanol, bezvodý.

3.2.

Acetón.

3.3.

Etanol, 96 % obj.

3.4.

3.5.

Kyselina L-(+)-askorbová.

3.6.

Chloroform.

3.7.

Cyklohexán.

3.8.

Dusík, technický.

3.9.

Toluén.

3.10.

Benzén.

3.11.

Bután-1-ol.

3.12.

Bután-2-ol.

3.13.

Kyselina fosforná, 50 % obj. roztok.

3.14.

Diazóniové činidlo. Buď:

alebo ich ekvivalent.

3.15.

Dusičnan strieborný.

3.16.

4-(Dimetylamino)benzaldehyd.

3.17.

2,5-Dimetylfenol.

3.18.

Hexahydrát chloridu železitého.

3.19.

Kyselina chlorovodíková, 10 % hmotn. roztok.

3.20.

Referenčné látky sú tie, ktoré sú uvedené v odstavci 1 „Účel a oblasť použitia“. V prípade aminozlúčenín, referenčné látky musia byť vo forme ich hydrochloridu (mono- alebo di-) alebo ako voľné zásady.

3.21.

Pripravia sa 0,5 % (hmotn./objem) roztoky každej z referenčných látok v oddieli 3.20.

Do 10 ml odmernej banky sa naváži 50 mg ± 1 mg referenčnej látky.

Pridá sa 5 ml 96 % etanolu (3.3) a 250 mg kyseliny askorbovej (3.5).

Roztok sa pridaním roztoku amoniaku (3.4) upraví na alkalický s pH 10 (overí sa indikátorovým papierikom).

Pridá sa 10 ml 96 % etanolu (3.3) a premieša sa.

Roztoky môžu byť uchovávané jeden týždeň v chlade a bez prístupu svetla.

V niektorých prípadoch po pridaní kyseliny askorbovej a amoniaku môže dôjsť k vzniku zrazeniny. V tom prípade sa má pred pokračovaním nechať usadiť.

3.22.

3.23.

3.23.1.   Diazóniové činidlo

Pripraví sa 5 % (hmotn.) vodný roztok vybraného činidla (3.16) v 100 ml 10 % (hmotn.) vodného kyseliny chlorovodíkovej (3.19). Tento roztok sa musí vždy čerstvo pripraviť tesne pred použitím.

3.23.2.   Ehrlichovo činidlo

2 g p-(dimetylamino)benzaldehydu (3.16) sa rozpustia v 100 ml 10 % (hmotn.) vodného kyseliny chlorovodíkovej (3.19).

3.23.3.   2,5-Dimetyfenol – hexahydrát chloridu železitého

Roztok 1: 1 g 2,5-dimetyfenolu (3.17) v 100 ml 96 % etanolu (3.3).

Roztok 2: 4 g hexahydrátu chloridu železitého (3.18) sa rozpustia v 100 ml 96 % etanolu (3.3).

Na zviditeľnenie škvŕn sa týmito roztokmi postrekuje postupne, najprv roztokom 1, potom roztokom 2.

3.23.4.   Amoniakálny dusičnan strieborný

25 % amoniak (3.4) sa pridáva do 5 % (hmotn.) vodného roztoku dusičnanu strieborného (3.15), kým sa zrazenina práce nerozpustí. Toto činidlo sa musí pripraviť tesne pred použitím.

Neuchováva sa.

4.1.

Bežné laboratórne vybavenie pre tenkovrstvovú chromatografiu.

4.2.

Centrifúga, 4 000 ot./min.

4.3.

Centrifugačné kyvety, 10 ml s PTFE vyloženými skrutkovacími uzávermi alebo ich ekvivalenty.

6.1.1.

Naftalén-2-ol (β-N).

6.1.2.

2-Aminofenol (OAP).

6.1.3.

3-Aminofenol (MAP).

6.1.4.

4-Aminofenol (PAP).

6.1.5.

2-Nitro-1,4-fenyléndiamín (2-NPPD).

6.1.6.

4-Nitro-1,2-fenyléndiamín (2-NPPD).

Pripravia sa 0,5 % (hmotn.) roztoky každej z prídavných referenčných látok spôsobom opísaným v 3.21.

6.2.1.

Etyl-acetát – cyklohexán – 25 % roztok amoniaku (obj. diely 65: 30: 0,5).

6.4.1.

Na povrch adsorbentu tenkovrstvovej platne (4.1.3) sa nakreslia dve čiary, ako je zobrazené na obr. 1.

6.4.2.

Pod dusíkovou atmosférou (4.1.1) sa na základný bod 1 (obr. 1), asi 2 cm od oboch okrajov, nanesú 1 až 4 μl extraktu (5.1) Množstvo extraktu závisí od intenzity škvŕn na chromatogramoch 5.2.

6.4.3.

Medzi body 2 a 3 (obr. 1) rozdelia oxidujúce sa farbivá, indentifikované alebo predpokladane identifikované v bode 5.2 (so vzdialenosťou medzi bodmi 1,5 cm). Nanesú sa 2 μl príslušných referenčných roztokov – okrem DAP, ktorého sa musí naniesť 6 μl. Táto operácia sa robí pod dusíkom (6.4.2).

6.4.4.

Operácia v 6.4.3 sa zopakuje na základných bodoch 4 a 5 (obr. 1) a platňa sa uchováva pod dusíkom až do chvíle, kým sa bude vyvíjať (vzdialenosť medzi bodmi 1,5 cm).

6.4.5.

Chromatografická vyvíjacia komora sa prefúkne dusíkom (3.8) a naleje sa do nej primerané množstvo vyvíjacieho rozpúšťadla 3.22.2. Platňa (6.4.4) sa umiestni do vyvíjacej komory a nechá sa vyvíjať v prvom elučnom smere (obr. 1) v tme.

Eluuje sa, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne čiaru vyznačenú na platni (približne 13 cm).

6.4.6.

Platňa sa vyberie z vyvíjacej komory a umiestni sa do chromatografickej vyvíjacej komory dopredu prefúknutej dusíkom, aby sa odparilo rozpúšťadlo a to aspoň na 60 minút.

6.4.7.

Pomocou delenej skúmavky sa do vyvíjacej komory prefúknutej dusíkom (3.8) sa umiestni primerané množstvo elučného rozpúšťadla (6.2), do vyvíjacej komory (6.4.6) sa umiestni platňa pootočená o 90° a nechá sa vyvíjať druhým elučným smerom (tiež v tme), kým čelo rozpúšťadla nedosiahne čiaru nakreslenú na povrchu adsorbentu. Platňa sa vyberie z vyvíjacej komory a elučné rozpúšťadlo sa nechá odpariť na vzduchu.

6.4.8.

Platnička sa na 10 minút umiestni do chromatografickej vyvíjacej komory s parami jódu (6.3) a dvojrozmerný chromatogram sa interpretuje na základe Rf hodnôt a farby škvŕn súčasne chromatografovaných referenčných látok (tab. 2 udáva prehľad Rf hodnôt a farieb).

Poznámka

Na získanie maximálneho vyfarbenia škvŕn sa chromatogram nechá na vzduchu pol hodiny po vyvolaní.

6.4.9.

Prítomnosť oxidujúcich sa farbív zistených v 6.4.8 môže byť definitívne potvrdená zopakovaním operácií opísaných v 6.4.1 až 6.4.8 a pridaním na základný bod 1 na škvrnu množstva extraktu uvedeného v 6.4.2 ešte 1 μl referenčnej látky identifikovanej v 6.4.8. Ak sa pri porovnaní s chromatogramom získaným v 6.4.8 nenájde žiadna ďalšia škvrna, interpretácia chromatogramu 6.4.8 je správna.

3.1.

3.2.

3.3.

Metanol.

3.4.

Roztok 2-aminobenzaldehyd-fenylhydrazónu (činidla Nitrin ®) v metanole.

Naváži sa 2,0 g Nitrinu ® a kvantitatívne sa prenesie do 100 ml odmernej banky. Po kvapkách sa pridajú 4 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (3.2) a premieša sa. Doplní sa metanolom po značku a mieša sa, kým sa roztok úplne nevyčíri. Roztok sa uschová vo fľaši z tmavého skla.

4.1.

Kadičky, 50 ml.

4.2.

Odmerná banka, 100 ml.

4.3.

Fľaša z tmavého skla, 125 ml.

4.4.

Sklená platnička, 10 × 10 cm.

4.5.

Plastová špachtľa.

4.6.

Filtračný papier, 10 × 10 cm.

5.1.

Časť vzorky určená na analýzu sa rovnomerne rozmiestni na povrchu sklenej platničky (4.4) tak, aby pokryla plochu vrstvou s hrúbkou nepresahujúcou 1 cm.

5.2.

Filtračný papier sa (4.6) sa namočí destilovanou vodou. Položí sa na vzorku a filtračný papier sa popritláča plastovou špachtľou (4.5).

5.3.

Počká sa asi jednu minútu a do stredu filtračného papiera sa nanesú:

5.4.

Po piatich až desiatich sekundách sa filtračný papier sníme a preskúma sa na dennom svetle. Prítomnosť dusitanov sa prejaví červenkastopurpurovým sfarbením.

V prípade nízkeho obsahu dusitanov sa červenkastopurpurové sfarbenie zmení po piatich až 15 sekundách na žlté. K tejto farbenej zmene dôjde až po jednej až dvoch minútach, ak bol obsah dusitanov vysoký.

4.1.

Číriace činidlá: tieto činidlá nemôžu byť použité dlhšie ako jeden týždeň od ich prípravy.

4.2.

Roztok dusitanu sodného:

V 1 000 ml odmernej banke sa v destilovanej vode rozpustí 0,500 g dusitanu sodného sa a zriedi sa vodou po značku. 10,0 ml tohto zásobného štandardného roztoku sa zriedi do 500 ml; 1 ml takéhoto roztoku = 10 mikrogramov NaNO2.

4.3.

1 M roztok hydroxidu sodného.

4.4.

0,2 % roztok hydrochloridu sulfanilamidu.

Za tepla sa rozpustí 2,0 g sulfanilamidu v 800 ml vody. Ochladí sa a za miešania pridá sa 100 ml koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej. Zriedi sa vodou do 1 000 ml.

4.5.

5 M kyselina chlorovodíková.

4.6.

N-1-naftylové činidlo

Tento roztok musí byť pripravený v deň jeho použitia. 0,1 g dihydrochloridu N-(1-naftyl)etyléndiamínu sa rozpustí vo vode a zriedi sa vodou do 100 ml.

5.1.

Analytické váhy.

5.2.

100, 250, 500 a 1 000 ml odmerné banky.

5.3.

Nedelené alebo delené pipety.

5.4.

100 ml odmerné valce.

5.5.

Skladané filtračné papiere, bez dusitanov, s priemerom 15 cm.

5.6.

Vodný kúpeľ.

5.7.

Spektrofotometer s kyvetami s optickou dráhou dlhou 1 cm.

5.8.

pH meter.

5.9.

10 ml mikrobyreta.

5.10.

250 ml kadičky.

6.1.

S presnosťou na 0,1 mg sa naváži približne 0,5 g (m gramov) homogenizovanej vzorky, s horúcou destilovanou vodou sa kvantitatívne prenesie do 250 ml kadičky (5.10) a objem sa doplní horúcou destilovanou vodou približne na 150 ml. Kadička (5.10) sa umiestni vodného kúpeľa (5.6) pri 80 °C na pol hodiny. Počas zahrievania sa občas pretrepe.

6.2.

Ochladí sa na laboratórnu teplotu a jeden po druhom sa za miešania pridajú 2 ml Carrezovho činidla I (4.1.1) a 2 ml Carrezovho činidla II (4.1.2).

6.3.

Na úpravu pH na 8.3 sa pridá 1 M roztok hydroxidu sodného (4.3) (s použitím pH metra (5.8)). Obsah sa kvantitatívne prenesie do 250 ml odmernej banky a doplní sa destilovanou vodou po značku.

6.4.

Obsah sa premieša a prefiltruje cez skladaný filtračný papier (5.5).

6.5.

Do 100 ml odmernej banky (5.2) sa pipetou (5.3) prenesie primeraný podiel (V ml) číreho filtrátu, ale nie viac ako 25 ml a pridá sa destilovaná voda do objemu 60 ml.

6.6.

Po premiešaní sa pridá 10,0 ml roztoku hydrochloridu sulfanilamidu (4.4) a potom 6,0 ml 5 M kyseliny chlorovodíkovej (4.5). Premieša sa a nechá sa stáť päť minút. Pridajú sa 2,0 ml N-1-naftylového činidla (4.6), premieša sa a nechá sa stáť tri minúty. Zriedi sa vodou po značku a premieša sa.

6.7.

Zopakovaním operácií 6.5 a 6.6 bez pridania N-1-naftylového činidla (4.6) sa pripraví slepý pokus.

6.8.

Pri 538 nm sa zmeria (5.7) absorbancia roztoku získaného pod 6.6 s použitím slepého pokusu (6.7) ako štandardu.

6.9.

Z kalibračného grafu (6.10) sa odčíta obsah dusitanu sodného v mikrogramoch na 100 ml roztoku (m1 mikrogramov), ktorý zodpovedá absorbancii nameranej v 6.8.

6.10.

S použitím roztoku obsahujúceho 10 μg dusitanu sodného na 100 ml (4.2) sa pripraví kalibračný graf s koncentráciami 0, 20, 40, 60, 80 a 100 μg dusitanu sodného na 100 ml.

m

=

hmotnosť vzorky v gramoch, vzatej na analýzu (6.1),

m1

=

obsah dusitanu sodného v mikrogramoch, zisteného v 6.9,

V

=

počet mililitrov filtrátu použitého na meranie (6.5).

3.2.1.

Fuchsín.

3.2.2

Heptahydrát siričitanu sodného.

3.2.3.

Koncentrovaná kyselina chlorovodíková (d = 1,19).

3.2.4.

Kyselina sírová, približne 1 M.

3.2.5.

Do kadičky sa naváži 100 mg fuchsínu (3.2.1) a rozpustí sa v 75 ml vody pri 80 °C. Po ochladení sa pridá 2,5 g siričitanu sodného (3.2.2). Doplní sa do 100 ml.

Používa sa do dvoch týždňov.

3.3.1.

Do 10 ml kadičky sa navážia 2 g vzorky.

3.3.2.

Pridajú sa dve kvapky kyseliny sírovej (3.2.4) a 2 ml Schiffovho činidla (3.2.5). Toto činidlo musí byť pred pridaním úplne bezfarebné.

Pretrepe sa a nechá stáť päť minút.

3.3.3.

Ak sa do piatich minút pozoruje ružové alebo svetlofialové sfarbenie, obsah formaldehydu je vyšší ako 0,01 % a stanoví sa všeobecnou metódou (4), a ak je to potrebné, podľa postupu (5).

4.2.1.

Bezvodý octan amónny.

4.2.2.

Koncentrovaná kyselina octová, ρ20 = 1,05 g/ml.

4.2.3.

Pentán-2,4-dión, čerstvo predestilovaný za zníženého tlaku 25 mm Hg 25° – nemá vykazovať akúkoľvek absorbanciu pri 410 nm.

4.2.4.

Bután-1-ol.

4.2.5.

Kyselina chlorovodíková, 1 M.

4.2.6.

Kyselina chlorovodíková, približne 0,1 M.

4.2.7.

Hydroxid sodný, 1 M.

4.2.8.

Roztok škrobu, čerstvo pripravený podľa European Pharmacopoeia (1 g/50 ml vody), 2. vydanie, časť I-VII-1-1.

4.2.9.

37 až 40 % (m/V) formaldehyd.

4.2.10.

Štandardný roztok jódu, 0,05 M.

4.2.11.

Štandardný roztok tiosíranu sodného, 0,1 M.

4.2.12.

V 1 000 ml odmernej banke sa rozpustí:

Doplní sa vodou do 1 000 ml (pH roztoku okolo 6,4).

Toto činidlo sa musí pripravovať čerstvé.

4.2.13.

Činidlo (4.2.12) bez pentán-2,4-diónu.

4.2.14.

5 g formaldehydu (4.2.9) sa vleje do 1 000 ml odmernej banky a doplní sa vodou do 1 000 ml.

Obsah formaldehydu v tomto roztoku sa stanoví takto:

Odoberie sa 10,00 ml; pridá sa 25,00 ml štandardného roztoku jódu (4.2.10) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (4.2.7).

Nechá sa stáť päť minút.

Okyslí sa 11,00 ml HCl (4.2.5) a nadbytok jódu sa stanoví štandardným roztokom tiosíranu sodného (4.2.11) s použitím roztoku škrobu (4.2.8) ako indikátora.

1 ml spotrebovaného 0,05 M roztoku jódu (4.2.10) zodpovedá 1,5 mg formaldehydu.

4.2.15.

Zásobný roztok formaldehydu sa postupne zriedi vodou najprv v pomere 1: 20 a potom 1: 100.

1 ml tohto roztoku obsahuje približne 1 μg formaldehydu.

Vypočíta sa presný obsah formaldehydu.

4.3.1.

Bežné laboratórne vybavenie.

4.3.2.

Filtračný papier na oddelenie fáz, Whatman 1 PS (alebo jeho ekvivalent).

4.3.3.

Centrifúga.

4.3.4.

Vodný kúpeľ nastavený na 60 °C.

4.3.5.

Spektrofotometer.

4.3.6.

Sklené kyvety s optickou dráhou dlhou 1 cm.

4.4.4.1.

Zmesi zo 4.4.1, 4.4.2 a 4.4.3 sa pretrepú. Erlenmeyerove banky sa ponoria do vodného kúpeľa zahriateho na 60 °C presne na 10 minút. Počas dvoch minút sa nechajú ochladiť v kúpeli z ľadovej vody.

4.4.4.2.

Ich obsah sa prenesie do 50 ml oddeľovacích lievikov obsahujúcich 10 ml bután-1-olu (4.2.4). Každá banka sa opláchne 3 až 5 ml vody. Zmesi sa intenzívne pretrepú presne 30 sekúnd. Nechajú sa oddeliť.

4.4.4.3.

Cez filtračný papier na oddelenie fáz sa bután-1-olové fázy prefiltrujú do meracích kyviet (4.3.2). Tiež sa môže použiť odstreďovanie v centrifúge (3 000g n na päť minút).

4.4.4.4.

Pri 410 nm sa zmeria absorbancia A1 extraktu roztoku vzorky zo 4.4.1 oproti extraktu referenčného roztoku 4.4.2.

4.4.4.5.

Podobne sa zmeria absorbancia A2 extraktu slepého pokusu z 4.4.3 oproti bután-1-olu.

Poznámka: Všetky tieto operácie sa musia uskutočniť do 25 minút od momentu umiestnenia Erlenmeyerových baniek do vodného kúpeľa pri 60 °C.

4.4.5.1.

Do 50 ml Erlenmeyerovej banky sa umiestni:

4.4.5.2.

Pokračuje sa, ako je opísané v 4.4.4 a zmeria sa absorbancia oproti bután-1-olu (4.2.4).

4.4.5.3.

Postup sa zopakuje s 10, 15, 20 a 25 ml zriedeného štandardného roztoku (4.2.15).

4.4.5.4.

Na získanie nulovej hodnoty (zodpovedajúcej sfarbeniu činidiel) sa postupuje ako v 4.4.4.5.

4.4.5.5.

Po odčítaní nulovej hodnoty od každej z absorbancií získaných v 4.4.5.1 a 4.4.5.3 sa zostrojí kalibračná krivka. Beerov zákon platí do 30 μg formaldehydu.

4.5.1.

Od A1 sa odpočíta A2 a z kalibračnej krivky (4.4.5.5) sa odčíta množstvo C formaldehydu v roztoku vzorky (4.4.1), v μg.

4.5.2.

Obsah formaldehydu vo vzorke (% hmotn.) sa vypočíta pomocou nasledujúceho vzorca:

kde:

5.2.1.

Voda čistoty pre HPLC alebo rovnocennej kvality.

5.2.2.

Bezvodý octan amónny.

5.2.3.

Koncentrovaná kyselina octová.

5.2.4.

Pentán-2,4-dión (uskladnený pri 4 °C).

5.2.5.

Bezvodý hydrogenfosforečnan sodný.

5.2.6.

85 % kyselina trihydrogenfosforečná (ρ20 = 1,7 g/ml).

5.2.7.

Metanol čistoty pre HPLC.

5.2.8.

Dichlórmetán.

5.2.9.

37 až 40 % (m/V) formaldehyd.

5.2.10.

Hydroxid sodný, 1 M.

5.2.11.

Kyselina chlorovodíková, 1 M.

5.2.12.

Kyselina chlorovodíková, 0,002 M.

5.2.13.

Roztok škrobu, čerstvo pripravený podľa European Pharmacopoeia (pozri 4.2.8).

5.2.14.

Štandardný roztok jódu, 0,05 M.

5.2.15.

Štandardný roztok tiosíranu sodného, 0,1 M.

5.2.16.

0,006 M vodný roztok hydrogenfosforečnanu sodného (5.2.5), upravený na pH 2,1 kyselinou trihydrogenfosforečnou (5.2.6).

5.2.17.

V 1 000 ml odmernej banke sa rozpustí:

Doplní sa vodou (5.2.1) do 1 000 ml.

Toto činidlo sa uschová v tme.

Doba skladovania: maximálne tri dni pri 25 °C.

Nemá byť pozorovaná zmena sfarbenia.

5.2.18.

10 g formaldehydu (5.2.9) sa vleje do 1 000 ml odmernej banky a doplní sa vodou do 1 000 ml.

Obsah formaldehydu v tomto roztoku sa stanoví takto:

Odoberie sa 5,00 ml; pridá sa 25,00 ml štandardného roztoku jódu (5.2.14) a 10,00 ml roztoku hydroxidu sodného (5.2.10).

Nechá sa stáť päť minút.

Okyslí sa 11,00 ml HCl (5.2.11) a nadbytok štandardného roztoku jódu (5.2.14) sa titruje štandardným roztokom tiosíranu sodného (5.2.15) s použitím roztoku škrobu (5.2.13) ako indikátora.

1 ml roztoku jódu (5.2.14) zodpovedá 1,5 mg formaldehydu.

5.2.19.

Zásobný roztok sa zriedi mobilnou fázou (5.2.16) na 1/100 jeho pôvodnej koncentrácie.

1 ml tohto roztoku obsahuje približne 37 mg formaldehydu.

Vypočíta sa jeho presný obsah.

5.3.1.

Bežné laboratórne vybavenie.

5.3.2.

HPLC pumpa, bezpulzná.

5.3.3.

Nízkotlaková bezpulzná pumpa pre činidlo (alebo druhá HPLC pumpa).

5.3.4.

Dávkovací ventil s 10 μl slučkou.

5.3.5.

Reaktor na zaradenie za kolónu z nasledujúcich súčastí:

5.3.6.

Membránový filter, veľkosť pórov 0,45 μm.

5.3.7.

Náplň SEP-PAK® C18 alebo ekvivalent.

5.3.8.

Hotové komerčné kolóny:

5.3.9.

Bischoff K1 hypersil RP 18 (katalógové číslo K1 G 6301 1805)

(5 μm, dĺžka = 10 mm alebo ekvivalent).

5.3.10.

Kolóna a predkolóna sa spoja prostredníctvom systému Ecotube (katalógové číslo A 15020508 Bischoff) alebo ekvivalentu.

5.3.11.

Aparatúra (5.3.5) sa zostaví podľa blokovej schémy v dodatku 2.

Prepojenia za dávkovacím ventilom musia byť čo najkratšie. V tomto prípade je rúrka z nehrdzavejúcej ocele medzi výstupom z reaktora a vstupom detektora určená na ochladenie zmesi pred detekciou a teplota detektora nie je známa, ale je konštantná.

5.3.12.

UV-VIS detektor.

5.3.13.

Zapisovač.

5.3.14.

Centrifúga.

5.3.15.

Ultrazvukový kúpeľ.

5.3.16.

Vibračné miešadlo (vortex alebo ekvivalent).

m

=

hmotnosť analyzovanej vzorky v g (5.4.2.1),

C

=

koncentrácia formaldehydu odčítaná z kalibračnej krivky (5.4.1) v μg/100 ml.

4.1.

25 % (hmotn.) kyselina chlorovodíková.

4.2.

Metanol.

4.3.

96 % (obj.) etanol.

4.4.

Hotové komerčné silikagélové TLC platne (na plastovom alebo hliníkovom podklade) s fluorescenčným indikátorom. Deaktivujú sa nasledovne: Platne potiahnuté silikagélom sa postriekajú vodou do lesklého vzhľadu. Platne sa nechajú vysušiť na vzduchu pri laboratórnej teplote jednu až tri hodiny.

Poznámka

Ak platne nie sú deaktivované, môže dochádzať k ireverzibilnej adsorpcii rezorcinolu na silikagél.

4.5.

Vyvíjacie rozpúšťadlo: acetón – chloroform – kyselina octová (obj. diely 20: 75: 5).

4.6.

Referenčný roztok rezorcinolu: 400 mg rezorcinolu sa rozpustí v 100 ml 96 % etanolu (4.3) (1 ml zodpovedá 4 000 μg rezorcinolu).

4.7.

Roztok vnútorného štandardu: 400 mg 3,5-dihydroxytoluénu (DHT) sa rozpustí v 100 ml 96 % etanolu (4.3) (1 ml zodpovedá 4 000 μg DHT).

4.8.

Štandardná zmes: v 100 ml odmernej banke sa zmieša 10 ml roztoku 4.6 a 10 ml roztoku 4.7, doplní sa 96 % etanolom po značku (4.3) a premieša sa (1 ml zodpovedá 400 μg rezorcinolu a 400 μg DHT).

4.9.

Silylačné činidlá:

5.1.

Bežné zariadenie na tenkovrstvovú a plynovú chromatografiu.

5.2.

Laboratórne sklo.

6.1.1.

Do 150 ml kadičky sa presne naváži časť výrobku (m gramov), ktorá obsahuje približne 20 až 50 mg rezorcinolu.

6.1.2.

Okyslí sa kyselinou chlorovodíkovou (4.1), kým zmes nie je kyslá (potrebné sú približne 2 až 4 ml), pridá sa 10 ml (40 mg DHT) roztoku vnútorného štandardu (4.7) a premieša sa. S etanolom (4.3) sa prenesie do 100 ml odmernej banky, etanolom sa doplní po značku a premieša sa.

6.1.3.

250 μl roztoku (6.1.2) sa nanesie na deaktivovanú silikagélovú platňu (4.4) vo forme súvislej čiary dlhej približne 8 cm. Treba si dať pozor, aby bola čiara čo najtenšia.

6.1.4.

Na tú istú platňu sa rovnakým spôsobom (6.1.3) nanesie 250 μl referenčného roztoku (4.8).

6.1.5.

Na dva body štartovacej čiary sa nanesie po 5 μl z každého z roztokov 4.6 a 4.7 na uľahčenie lokalizácie po vyvinutí platne.

6.1.6.

Platňa sa nechá vyvinúť v parami nenasýtenej vyvíjacej komore naplnenej vyvíjacím rozpúšťadlom 4.5, kým čelo rozpúšťadla nedosiahne úroveň 12 cm od štartovacej čiary; to zvyčajne trvá 45 minút. Platňa sa vysuší na vzduchu a oblasť rezorcinolu/DHT sa lokalizuje pod krátkovlnným UV žiarením (254 nm). Tieto dve zlúčeniny majú približne rovnaké Rf hodnoty. Škvrny sa označia ceruzkou vo vzdialenosti 2 mm od vonkajšej tmavej línie ohraničujúcej škvrny. Označené oblasti sa zoškrabú a adsorbent z každej škvrny sa zozbiera do 10 ml fľaše.

6.1.7.

Adsorbent obsahujúci vzorku a adsorbent obsahujúci referenčnú zmes sa extrahuje nasledovným spôsobom:

pridajú sa 2 ml metanolu (4.2) a extrahuje sa jednu hodinu za stáleho miešania. Prefiltruje sa a extrakcia sa opakuje s 2 ml metanolu ďalších 15 minút.

6.1.8.

Extrakty sa spoja a rozpúšťadlo sa odparí do sucha cez noc vo vákuovom exsikátore naplnenom vhodným sušidlom. Nesmie sa použiť nijaký zdroj tepla.

6.1.9.

Zvyšok (6.1.8) sa silyluje spôsobom uvedeným pod 6.1.9.1 a 6.1.9.2.

r1 a r2

=

retenčné časy dvoch píkov v minútach,

r1 a r2

=

šírka tých istých píkov v polovičnej výške v mm,

d’

=

rýchlosť zapisovača v mm za minútu.

6.2.2.

Do plynového chromatografu sa vstrekne 1 až 3 μl roztoku získaného v 6.1.9. Pre každý roztok (6.1.9) sa uskutoční päť nástrekov; meria sa plocha píkov, vypočíta sa priemerná hodnota a vypočíta sa pomer plochy píkov: S = plocha píku rezorcinolu/plocha píku DHT.

M

=

testovaný podiel výrobku v gramoch (6.1.1),

Svzorky

=

priemerný pomer plochy píkov podľa 6.2.2 pre roztok vzorky,

Sštandardnej zmesi

=

priemerný pomer plochy píkov podľa 6.2.2 pre štandardnú zmes.

4.1.

Metanol.

4.2.

Absolútny etanol.

4.3.

Propán-2-ol.

4.4.

Chloroform, zbavený alkoholov premytím vodou.

5.1.

Plynový chromatograf:

5.2.

Odmerné banky. 100 ml.

5.3.

Pipety, 2 ml, 20 ml, 0 až 1 ml.

5.4.

Mikrostriekačky 0 až 100 μl a 0 až 5 μl

a (iba pre aerosólové vzorky) špeciálna vzduchotesná striekačka so zasúvacím ventilom (pozri postup prípravy vzorky na obr. 5 ( 9 ).

6.1.1.

Z aerosólových vzoriek sa pripravujú vzorky podľa II. kapitoly prílohy smernice Komisie 80/1335/EHS z 22. decembra 1980 ( 10 ) a potom sa analyzujú plynovou chromatografiou za podmienok v 6.2.1..

6.1.2.

Z neaerosólových vzoriek sa pripravujú vzorky podľa vyššie uvedenej II. kapitoly, zriedia sa vodou na hladinu 1 až 2 % etanolu alebo propán-2-olu a potom sa analyzujú plynovou chromatografiou za podmienok v 6.2.2.

6.2.1.

Pre aerosólové vzorky sa používa tepelnovodivostný detektor (katarometer).

6.2.2.

Pre neaerosólové vzorky:

7.1.

Pri postupe pre plynovú chromatografiu 6.2.1 (kolóna Hallcomid M18) sa použijú nasledovné referenčné zmesi. Tieto zmesi sa pripravia meraním s pipetami, ale presné množstvo sa zistí okamžitým vážením pipety alebo banky po každom pridaní.

Do chromatografu sa nastreknú 2 až 3 μl za podmienok v 6.2.1.

Vypočíta sa pomer plôch píkov (metanol/etanol alebo metanol/propán-2-ol) pre každú zmes. Zostrojí sa kalibračný graf, kde sa vynesie na:

7.2.

Pri postupe pre plynovú chromatografiu 6.2.2 (Porapak QS alebo Chromosorb 105) sa použijú nasledovné referenčné zmesi. Tieto zmesi sa pripravia meraním mikrostriekačkou a pipetou, ale presné množstvo sa zistí okamžitým vážením pipety alebo banky po každom pridaní.

Do chromatografu sa nastreknú 2 až 3 μl za podmienok v 6.2.2.

Vypočíta sa pomer plôch píkov (metanol/etanol alebo metanol/propán-2-ol) pre každú zmes. Zostrojí sa kalibračný graf, kde sa vynesie na:

7.3.

Kalibračný graf musí byť priamka.

1

=

HPLC pumpa

2

=

dávkovací ventil

3

=

kolóna s predkolónou

4

=

pumpa na činidlo

5

=

T-spojka bez mŕtveho objemu

5′

=

T-spojka (Vortex)

6-6′

=

spojka bez mŕtveho objemu

7

=

„francúzske háčkovanie“

7′

=

reaktor

8

=

trojhrdlová banka s vriacou vodou

9

=

vyhrievacie hniezdo

10

=

chladivo

11

=

rúrka z nehrdzavejúcej ocele na výmenu tepla

11′

=

výmenník tepla

12

=

UV-VIS detektor

13

=

jedna súprava PCRS 520 na zaradenie za kolónu