ANEXA I

METODE DE EȘANTIONARE

1.   OBIECTIV ȘI DOMENIU DE APLICARE

Eşantioanele destinate controlului oficial al furajelor se prelevează în conformitate cu metodele descrise în continuare. Eşantioanele astfel prelevate se consideră reprezentative pentru loturile eşantionate.

2.   PERSONALUL CARE EFECTUEAZĂ EȘANTIONAREA

Eşantioanele se prelevează de către personal autorizat în acest sens de statele membre.

3.   DEFINIȚII

Lot eşantionat: o cantitate de produs care constituie o unitate şi care are caracteristici presupuse a fi uniforme.

Eşantion elementar: o cantitate prelevată dintr-un punct al lotului eşantionat.

Eşantion colectiv: o colecţie de eşantioane elementare prelevate din acelaşi lot eşantionat.

Eşantion redus: o parte reprezentativă a eşantionului colectiv, obţinută din acesta printr-un proces de reducere.

Eşantion final: o parte din eşantionul redus sau din eşantionul colectiv omogenizat.

4.   APARATURĂ

4.1.	Aparatura de prelevare de eşantioane trebuie să fie realizată din materiale care nu contaminează produsele de eşantionat. Această aparatură poate fi omologată de către statele membre.

4.2.   Aparatura recomandată pentru prelevarea eşantioanelor din furaje solide

4.2.1.   Prelevarea manuală

4.2.1.1.

Lopată plată cu margini verticale.

4.2.1.2.

Sondă de eşantionare cu o fantă lungă sau compartimentată. Dimensiunile sondei de eşantionare trebuie să fie adecvate caracteristicilor lotului eşantionat (adâncimea recipientului, dimensiunile sacului etc.) şi dimensiunilor particulelor furajului.

4.2.2.   Prelevarea mecanică

Pentru prelevarea de eşantioane din furajele în mişcare poate fi utilizată aparatură mecanică omologată.

4.2.3.   Separatorul

Aparatura destinată divizării eşantionului în părţi aproximativ egale poate fi folosită pentru prelevări de eşantioane elementare şi pentru prepararea eşantioanelor reduse şi finale.

5.   CERINȚE CANTITATIVE

5.A.	În relaţie cu controlul substanţelor sau produselor uniform distribuite în furaje
5.A.1.	Lotul eşantionat Mărimea lotului eşantionat trebuie să permită eşantionarea fiecărei părţi constituente.
5.A.2.	Eşantioane elementare
5.A.2.1.	Furaje vrac:	Număr minim de eşantioane elementare:
5.A.2.1.1.	loturile eşantionate nu depăşesc 2,5 tone metrice	şapte
5.A.2.1.2.	loturile eşantionate depăşesc 2,5 tone metrice	√ 20 înmulţit cu numărul de tone metrice care compune lotul eşantionat (1), până la un maximum de 40 de eşantioane elementare
5.A.2.2.	Furaje ambalate:	Numărul minim de ambalaje de eşantionat (2):
5.A.2.2.1.	Ambalaje care depăşesc 1 kg:
5.A.2.2.1.1.	loturi eşantionate reprezentând unul până la patru ambalaje	toate ambalajele
5.A.2.2.1.2.	loturi eşantionate reprezentând cinci până la 16 ambalaje	patru
5.A.2.2.1.3.	loturi eşantionate reprezentând mai mult de 16 ambalaje	√ numărul de ambalaje care compun lotul eşantionat (1), până la un maximum de 20 de ambalaje
5.A.2.2.2.	Ambalaje care nu depăşesc 1 kg	patru
5.A.2.3.	Furaje lichide sau semilichide:	Numărul minim de recipiente de eşantionat (2):
5.A.2.3.1.	Recipiente care depăşesc un litru:
5.A.2.3.1.1.	loturi eşantionate de unul până la patru recipiente	toate recipientele
5.A.2.3.1.2.	loturi eşantionate de cinci până la 16 recipiente	patru
5.A.2.3.1.3.	loturi eşantionate reprezentând mai mult de 16 recipiente	√ numărul de recipiente care compune lotul eşantionat (1), până la un maximum de 20 de recipiente
5.A.2.3.2.	Recipiente care nu depăşesc un litru	patru
5.A.2.4.	Blocuri de furaje şi brichete minerale	Numărul minim de blocuri sau brichete de eşantionat (2): un bloc sau o brichetă per lot eşantionat de 25 de unităţi, până la un maximum de patru blocuri sau brichete
5.A.3.	Eşantion colectiv Se cere un singur eşantion colectiv per lot eşantionat. Cantitatea totală de eşantioane elementare care constituie eşantionul colectiv nu poate fi mai mică decât cantităţile de mai jos:
5.A.3.1.	Furaje vrac	4 kg
5.A.3.2.	Furaje ambalate
5.A.3.2.1.	ambalaje care depăşesc 1 kg	4 kg
5.A.3.2.2.	ambalaje care nu depăşesc 1 kg	greutatea conţinutului a patru ambalaje originale
5.A.3.3.	Furaje lichide sau semilichide:
5.A.3.3.1.	recipiente care depăşesc un litru:	patru litri
5.A.3.3.2.	recipiente care nu depăşesc un litru	volumul conţinutului a patru recipiente originale
5.A.3.4.	Blocuri de furaje sau brichete minerale:
5.A.3.4.1.	cântărind mai mult de 1 kg fiecare	4 kg
5.A.3.4.2.	cântărind cel mult 1 kg fiecare	greutatea a patru blocuri sau brichete originale
5.A.4.	Eşantioane finale Dacă este cazul, eşantionul final provine din eşantionul colectiv, prin reducere. Se cere analiza a cel puţin un eşantion final. Cantitatea din eşantionul final de analizat nu poate fi mai mică decât cantităţile de mai jos:
	Furaje solide	500 g
	Furaje lichide sau semilichide	500 ml
5.B.	În funcţie de controlul substanţelor sau produselor nedorite care pot fi distribuite neuniform în masa de furaje, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul şi crotalaria din materiile prime furajere (3)
5.B.1.	Lot eşantionat: a se vedea 5.A.1.
5.B.2.	Eşantioane elementare
5.B.2.1.	Furaje vrac: a se vedea 5.A.2.1.
5.B.2.2.	Furaje ambalate:	Numărul minim de ambalaje de eşantionat:
5.B.2.2.1.	loturi eşantionate numărând unul până la patru ambalaje	toate ambalajele
5.B.2.2.2.	loturi eşantionate de cinci până la 16 ambalaje	patru
5.B.2.2.3.	loturi eşantionate numărând mai mult de 16 ambalaje	√ numărul de ambalaje care compun lotul eşantionat (1), până la un maximum de 40 de ambalaje
5.B.3.	Eşantioane colective Numărul de eşantioane colective va varia în funcţie de mărimea lotului eşantionat. Numărul minim de eşantioane colective per lot eşantionat este redat mai jos. Greutatea totală a eşantioanelor elementare care constituie eşantionul colectiv nu poate fi mai mică de 4 kg
5.B.3.1.	Furaje vrac
	Greutatea lotului eşantionat în tone metrice:	Numărul minim de eşantioane colective per lot eşantionat:
	până la 1	1
	mai mult de 1 şi până la 10	2
	mai mult de 10 şi până la 40	3
	mai mult de 40	4
5.B.3.2.	Furaje ambalate
	Mărimea loturilor eşantionate pentru furajele ambalate, în număr de ambalaje:	Numărul minim de eşantioane colective per lot eşantionat:
	1 până la 16	1
	17 până la 200	2
	201 până la 800	3
	mai mult de 800	4
5.B.4.	Eşantioane finale Eşantionul final provine din fiecare eşantion colectiv, prin reducere. Se cere analiza a cel puţin un eşantion final per eşantion colectiv. Greutatea eşantionului final de analizat nu poate fi mai mică de 500 g.

6.   INSTRUCȚIUNI PENTRU PRELEVAREA, PREPARAREA ȘI AMBALAREA EȘANTIOANELOR

6.1.   Aspecte generale

Eşantioanele se prelevează şi se prepară cât mai rapid posibil, luând în considerare precauţiile necesare pentru a asigura că produsul nu este nici modificat, nici contaminat. Instrumentele, suprafeţele de lucru şi recipientele destinate eşantionării trebuie să fie curate şi uscate.

6.2.   Eşantioane elementare

6.2.A.   În relaţie cu controlul substanţelor sau produselor uniform distribuite în furaje

Eşantioanele elementare trebuie prelevate în mod aleatoriu din întregul lot eşantionat, iar dimensiunile lor trebuie să fie aproximativ egale.

6.2.A.1.   Furaje vrac

Lotul eşantionat se împarte în mod imaginar în mai multe părţi aproximativ egale. În mod aleator, se selectează un număr de părţi corespunzător numărului de eşantioane elementare necesare, în conformitate cu punctul 5.A.2, şi se prelevează cel puţin un eşantion din fiecare din aceste părţi.

Dacă este cazul, eşantionarea poate fi efectuată atunci când lotul este în mişcare (încărcare sau descărcare).

6.2.A.2.   Furaje ambalate

După selectarea pentru eşantionare a numărului necesar de ambalaje, conform indicaţiilor de la punctul 5.A.2, o parte a conţinutului fiecărui ambalaj se scoate folosind o sondă sau o lopată. Dacă este cazul, eşantioanele se prelevează după ce ambalajele au fost golite separat. Orice aglomerări se destramă, dacă este cazul prin separarea lor de eşantion, urmată de reîncorporare în eşantion, pentru fiecare eşantion colectiv în parte.

6.2.A.3.   Furaje lichide sau semilichide, omogene sau omogenizabile

După selectarea pentru eşantionare a numărului necesar de recipiente, în conformitate cu indicaţiile de la punctul 5.A.2, conţinutul lor se omogenizează, dacă este necesar, şi se prelevează o cantitate din fiecare recipient.

Eşantioanele elementare pot fi prelevate la descărcarea conţinutului.

6.2.A.4.   Furaje lichide sau semilichide, neomogenizabile

După selectarea pentru eşantionare a numărului necesar de containere, în conformitate cu indicaţiile de la punctul 5.A.2, eşantioanele se prelevează de la diferite niveluri.

Eşantioanele se pot preleva şi în timpul descărcării conţinutului, dar primele fracţiuni se îndepărtează.

În oricare dintre cazuri, volumul total prelevat nu trebuie să fie mai mic de 10 litri.

6.2.A.5.   Blocuri de furaje şi brichete minerale

După selectarea pentru eşantionare a numărului necesar de blocuri sau brichete, conform indicaţiilor de la punctul 5.A.2, se prelevează o parte din fiecare bloc sau brichetă.

6.2.B.   În relaţie cu controlul substanţelor sau al produselor nedorite care ar putea fi distribuite neuniform în masa de furaje, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul şi crotalaria din materiile prime furajere

Lotul eşantionat se împarte în mod imaginar în mai multe părţi aproximativ egale, corespunzătoare numărului de eşantioane colective prevăzute la punctul 5.B.3. Dacă acest număr este mai mare decât 1, numărul total de eşantioane elementare prevăzute la punctul 5.B.2 se distribuie aproximativ egal între diferitele părţi. În continuare se prelevează eşantioane cu mărimi aproximativ egale (4), astfel încât cantitatea totală a eşantioanelor provenite din fiecare parte să nu fie mai mică decât cantitatea minimă de 4 kg necesară pentru fiecare eşantion colectiv. Eşantioanele elementare prelevate din diferite părţi nu se consideră colective.

6.3.   Prepararea eşantioanelor colective

6.3.A.   În relaţie cu controlul substanţelor produselor cu distribuţie uniformă în masa de furaje

Eşantioanele elementare se amestecă pentru a forma un singur eşantion colectiv.

6.3.B.   În relaţie cu controlul substanţelor sau produselor nedorite care ar putea fi distribuite neuniform în masa de furaje, cum ar fi aflatoxinele, cornul-secarei, ricinul şi crotalaria din materii prime furajere

Eşantioanele elementare prelevate din fiecare parte a lotului eşantionat se amestecă şi se constituie numărul de eşantioane colective prevăzute la punctul 5.B.3, avându-se grijă să se noteze provenienţa fiecărui eşantion colectiv.

6.4.   Prepararea eşantioanelor finale

Materialul din fiecare eşantion colectiv se amestecă cu grijă pentru a se obţine un eşantion omogenizat (5). Dacă este necesar, eşantionul colectiv se reduce mai întâi la cel puţin 2 kg sau doi litri (eşantion redus), fie prin utilizarea unui separator mecanic sau automat, fie prin metoda sferturilor.

Se prepară apoi cel puţin trei eşantioane finale având aproximativ aceeaşi cantitate, în conformitate cu cerinţele cantitative prevăzute la punctul 5.A.4 sau 5.B.4. Fiecare eşantion se pune într-un recipient corespunzător. Se iau toate precauţiile necesare pentru evitarea oricărei modificări de compoziţie a eşantionului, a contaminării sau a falsificării, care ar putea avea loc în timpul transportării sau depozitării.

6.5.   Ambalarea eşantioanelor finale

Recipientele sau ambalajele se sigilează şi se etichetează (eticheta completă se încorporează în sigiliu) astfel încât ele să nu poată fi deschise fără a deteriora sigiliul.

7.   PROCESUL-VERBAL DE EȘANTIONARE

Pentru fiecare eşantionare se întocmeşte un proces-verbal, care permite identificarea fără ambiguităţi a lotului eşantionat.

8.   DESTINAȚIA EȘANTIOANELOR

Pentru fiecare eşantion colectiv se trimite, cât mai repede posibil, către laboratorul de analize autorizat, cel puţin un eşantion final, împreună cu informaţiile necesare specialistului.

---

(1)  În cazul în care numărul obţinut este o fracţie, aceasta se rotunjeşte la numărul întreg imediat superior.

(2)  În cazul ambalajelor sau recipientelor care nu depăşesc 1 kg sau un litru şi în cazul blocurilor sau brichetelor de sare care nu cântăresc mai mult de 1 kg fiecare, un eşantion elementar este reprezentat de conţinutul unui ambalaj sau recipient original, un bloc sau o brichetă de sare.

(3)  Metodele menţionate în 5.A sunt destinate a fi utilizate în controlul aflatoxinelor, cornului-secarei, ricinului şi crotalariei din furajele complete şi complementare.

(4)  Pentru furajele ambalate, o parte a conţinutului ambalajelor de eşantionat se prelevează prin utilizarea unei sonde sau a unei lopeţi, după golirea separată a ambalajelor, dacă este cazul.

(5)  Orice aglomerări se destramă (dacă este cazul prin separarea lor de eşantion urmată de reîncorporarea lor în eşantion), pentru fiecare eşantion colectiv în parte.

ANEXA II

DISPOZIȚII GENERALE PRIVIND METODELE DE ANALIZĂ A FURAJELOR

A.   PREPARAREA EȘANTIOANELOR ÎN VEDEREA ANALIZĂRII

1.   Obiectiv

Procedurile descrise mai jos privesc prepararea pentru analizarea eşantioanelor finale, trimise laboratoarelor de control după eşantionare conform dispoziţiilor menţionate în anexa I.

Prepararea acestor eşantioane trebuie astfel efectuată încât cantităţile prelevate, în conformitate cu dispoziţiile din metoda de analiză, să fie omogene şi reprezentative pentru eşantioanele finale.

2.   Precauţiile ce trebuie luate

Procedura de preparare a eşantioanelor care trebuie urmată este dependentă de metodele de analiză utilizate. De aceea, este de importanţă majoră a se asigura ca procedura de preparare a eşantioanelor urmată să fie adecvată metodei de analiză utilizate.

Toate operaţiunile necesare se efectuează astfel încât să se evite, pe cât posibil, contaminarea eşantionului şi modificarea compoziţiei acestuia.

Măcinarea, amestecarea şi cernerea se efectuează cât mai repede posibil în condiţiile unei expuneri minime a eşantionului la aer şi la lumină. Nu se utilizează râşniţe sau aparate de măcinat care ar putea cauza încălzirea semnificativă a eşantionului.

Se recomandă ca furajele foarte sensibile la căldură să fie măcinate manual. De asemenea, aparatura folosită nu trebuie să constituie o sursă de contaminare cu oligoelemente.

Dacă prepararea nu poate fi efectuată fără modificări semnificative ale conţinutului umed al eşantionului, se determină conţinutul umed înainte şi după pregătire, în conformitate cu metoda menţionată în partea A din anexa III.

3.   Procedura

Se divide eşantionul în subeşantioane adecvate, în vederea analizării şi trimiterii, prin utilizarea unor tehnici adecvate de separare, cum ar fi eşantionarea alternativă cu ajutorul lopeţii sau eşantionarea în condiţii staţionare sau rotative. Formarea unui con şi selectarea de sferturi nu este recomandată deoarece ar putea să se formeze subeşantioane care să dea naştere la erori de separare mari. Eşantionul de trimis se păstrează într-un recipient adecvat, curat şi uscat, prevăzut cu un capac ermetic, iar subeşantioanele de analizat, cu greutate de cel puţin 100 g, se prepară în modul indicat mai jos.

3.1.   Furaje care pot fi măcinate ca atare

Dacă nu se specifică altfel în metodele de analiză, se cerne întregul eşantion printr-o sită cu orificii pătrate cu latura de 1 mm (în conformitate cu recomandarea ISO R565), după măcinare, dacă este cazul. Se evită măcinarea exagerată.

Se amestecă eşantionul trecut prin sită şi se pune într-un recipient adecvat, curat şi uscat, dotat cu un capac ermetic. Se amestecă din nou, imediat înainte de a preleva eşantionul pentru analiză.

3.2.   Furaje care pot fi măcinate după uscare

Dacă nu se specifică altfel în metodele de analiză, eşantionul se deshidratează astfel încât umiditatea sa să se reducă la 8-12 %, în conformitate cu procedura de preuscare, descrisă la punctul 4.3, din metoda de determinare a umidităţii, menţionată în partea A din anexa III. În continuare, se procedează astfel cum se indică în secţiunea 3.1.

3.3.   Furaje lichide sau semilichide

Eşantioanele se recoltează într-un recipient adecvat, curat şi uscat, dotat cu un capac ermetic. Se amestecă minuţios, imediat înainte de prelevarea eşantionului de analizat.

3.4.   Alte furaje

Eşantioanele care nu pot fi preparate conform unei proceduri indicate anterior se tratează prin orice altă procedură prin care se asigură că eşantioanele prelevate în vederea analizării sunt omogene şi reprezentative pentru eşantioanele finale.

4.   Depozitarea eşantioanelor

Eşantioanele trebuie păstrate la o temperatură care să nu le altereze compoziţia. Eşantioanele destinate analizării prezenţei vitaminelor sau substanţelor foarte sensibile la lumină se păstrează în recipiente de sticlă brună.

B.   DISPOZIȚII PRIVIND REACTIVII ȘI APARATURA UTILIZATE ÎN METODELE DE ANALIZĂ

1.

Dacă nu se specifică altfel în metodele de analiză, toţi reactivii destinaţi analizelor trebuie să fie puri din punct de vedere analitic (p.a.). Pentru analiza prezenţei oligoelementelor, puritatea reactivilor se controlează printr-un test martor. În funcţie de rezultatele obţinute, poate fi necesară o purificare suplimentară a reactivilor.

2.

Pentru orice operaţie care implică prepararea soluţiilor, diluţia, clătirea sau spălarea, menţionate în metodele de analiză şi pentru care nu există indicaţii referitoare la natura solventului sau diluantului, se utilizează apa. Ca regulă generală, se utilizează apă demineralizată sau distilată. În cazuri speciale, care sunt indicate în metodele de analiză, apa trebuie supusă unor proceduri de purificare speciale.

3.	Având în vedere dotarea uzuală a laboratoarelor de control, în metodele de analiză se menţionează doar instrumentele şi aparatura speciale sau care au utilizări specifice. Ele trebuie să fie curate, în special în cazul determinării unor cantităţi foarte mici de substanţe.

C.   APLICAREA METODELOR DE ANALIZĂ ȘI EXPRIMAREA REZULTATELOR

1.   Procedura de extracţie

O serie de metode determină o procedură de extracţie specifică. Ca regulă generală, se pot aplica alte proceduri de extracţie decât cea la care se face referire în metodă dacă s-a dovedit că procedura de extracţie utilizată are, pentru matricea analizată, o eficienţă de extracţie echivalentă cu procedura menţionată în metodă.

2.   Procedura de purificare

O serie de metode determină o procedură de purificare specifică. Ca regulă generală, se pot aplica alte proceduri de purificare decât cea la care se face referire în metodă dacă s-a dovedit că procedura de purificare utilizată determină, pentru matricea analizată, rezultate analitice echivalente cu procedura menţionată în metodă.

3.   Raportarea metodei de analiză utilizate

În general, pentru determinarea fiecărei substanţe în furaje se stabileşte o singură metodă de analiză. În cazul în care sunt indicate mai multe metode, în buletinul de analiză se specifică metoda aplicată de laboratorul de control.

4.   Numărul determinărilor

Rezultatul menţionat în buletinul de analiză reprezintă valoarea medie obţinută în urma a cel puţin două determinări, efectuate pe porţiuni distincte ale eşantionului, cu repetabilitate satisfăcătoare.

Totuşi, în cazul analizelor de detectare a substanţelor indezirabile, dacă rezultatul primei determinări este semnificativ (> 50 %) mai mic decât specificaţia de control, nu sunt necesare alte determinări, cu condiţia să fie aplicate procedurile calitative adecvate.

În cazul controlului privind conţinutul declarat pentru o anumită substanţă sau un anumit ingredient, dacă rezultatul primei determinări confirmă conţinutul declarat, adică rezultatul analizei se situează în interiorul intervalului de variaţie acceptat, nu sunt necesare alte determinări, cu condiţia să fie aplicate procedurile calitative adecvate.

În unele cazuri, intervalul de variaţie acceptabil respectiv este definit în legislaţie, de exemplu în Directiva 79/373/CEE a Consiliului (1).

5.   Raportarea rezultatului analitic

Rezultatul analitic se exprimă în maniera indicată în metoda de analiză, printr-un număr adecvat de cifre semnificative şi se ajustează, dacă este cazul, la conţinutul de umiditate al eşantionului final înainte de preparare.

6.   Incertitudinea de măsurare şi rata de recuperare în cazul analizelor de detectare a substanţelor indezirabile

În ce priveşte substanţele indezirabile, în sensul Directivei 2002/32/CE, inclusiv dioxina şi PCB asemănători dioxinei, un produs destinat utilizării în furaje se consideră neconform în ce priveşte conţinutul maxim acceptat dacă rezultatul analitic este considerat că depăşeşte conţinutul maxim, ţinând cont de incertitudinea de măsurare extinsă şi ajustarea pentru recuperare. Pentru a evalua conformitatea, concentraţia analizată se utilizează după ce a fost corectată pentru recuperare şi după deducerea incertitudinii de măsurare extinse. Această procedură este aplicabilă doar în cazurile în care metoda de analiză permite estimarea incertitudinii de măsurare şi ajustarea pentru recuperare (de exemplu, imposibilă în cazul analizelor la microscop).

Rezultatul analitic se raportează în modul următor (în măsura în care metoda de analiză utilizată permite estimarea incertitudinii de măsurare şi a ratei de recuperare):

(a)	ajustat pentru recuperare, nivelul de recuperare fiind indicat. Ajustarea pentru recuperare nu este necesară în cazul în care rata de recuperare este între 90 şi 110 %.

(b)	ca „x +/– U”, unde x este rezultatul analitic şi U este incertitudinea de măsurare extinsă, folosind un factor de acoperire 2, care dă un nivel de încredere de aproximativ 95 %.

Totuşi, dacă rezultatul analizei este semnificativ (> 50 %) mai mic decât specificaţia de control şi cu condiţia ca procedurile calitative corespunzătoare să fie aplicate şi ca analiza să servească doar verificării conformităţii cu prevederile legale, rezultatul analitic ar putea fi raportat fără ajustare pentru recuperare, iar raportarea ratei de recuperare şi a incertitudinii de măsurare ar putea fi omisă în aceste cazuri.

---

(1)  JO L 86, 6.4.1979, p. 30.

ANEXA III

METODE DE ANALIZĂ DE CONTROL AL COMPOZIȚIEI MATERIILOR PRIME FURAJERE ȘI AL FURAJELOR COMBINATE

A.   DETERMINAREA UMIDITĂȚII

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conţinutului de umiditate al furajelor. În cazul furajelor care conţin substanţe volatile, cum sunt acizii organici, este de notat că o dată cu determinarea conţinutului de umiditate se determină şi cantităţi semnificative de substanţe volatile.

Metoda nu se aplică în cazul analizei produselor lactate utilizate ca materii prime furajere, analizei substanţelor minerale şi a mixturilor compuse în principal din substanţe minerale, analizei grăsimilor şi uleiurilor de origine animală şi vegetală sau analizei seminţelor şi a fructelor oleaginoase.

2.   Principiu

Eşantionul se deshidratează în condiţii specificate, care variază în funcţie de natura furajelor. Scăderea greutăţii se determină prin cântărire. Este necesar să se efectueze o uscare prealabilă atunci când se analizează furaje solide cu conţinut ridicat de umiditate.

3.   Aparatură

3.1.

Moară construită dintr-un material care nu absoarbe umiditatea, uşor de curăţat, care permite o zdrobire rapidă şi uniformă, fără a provoca încălzire semnificativă, care evită pe cât posibil contactul cu aerul exterior şi care corespunde cerinţelor menţionate la punctele 4.1.1 şi 4.1.2 (de exemplu, micro-mori cu ciocane sau răcite cu apă, mori conice pliabile sau mori cu mecanism lent sau cu discuri dinţate).

3.2.	Balanţă analitică, cu toleranţă de 1 mg.

3.3.	Recipiente uscate din metal care nu se corodează sau din sticlă cu capace ermetice; suprafaţa de lucru permite împrăştierea eşantionului până la aproximativ 0,3 g/cm2.

3.4.	Cuptor izoterm cu încălzire electrică (± 2 oC), ventilat corespunzător şi care asigură o reglare rapidă a temperaturii (1).

3.5.	Cuptor vidat cu încălzire electrică, reglabil, dotat cu o pompă de ulei şi cu: fie un mecanism de introducere a aerului fierbinte uscat, fie un agent de desicare (de exemplu, oxid de calciu).

3.6.	Desicator cu o placă din metal sau porţelan, groasă, perforată, conţinând un agent de desicare eficient.

4.   Procedura

N.B.	Operaţiile descrise în această secţiune se efectuează imediat după deschiderea ambalajelor care conţin eşantioanele. Analizele trebuie să fie efectuate cel puţin în duplicat.

4.1.   Preparare

4.1.1.   Furaje care nu sunt menţionate la punctele 4.1.2 şi 4.1.3

Se prelevează cel puţin 50 g de eşantion. Dacă este necesar, se zdrobeşte sau se divizează astfel încât să se evite orice variaţie a conţinutului de umiditate (a se vedea punctul 6).

4.1.2.   Cereale şi tărâţe

Se prelevează cel puţin 50 g de eşantion. Se macină în particule din care cel puţin 50 % trec printr-o sită cu orificii de 0,5 mm şi care nu determină un reziduu mai mare de 10 % în cazul folosirii unei site cu orificii rotunde cu diametru de 1 mm.

4.1.3.   Furaje lichide sau păstoase, furaje constituite în mod predominant din uleiuri şi grăsimi

Se prelevează aproximativ 25 g din eşantion, se cântăreşte cu o abatere de 10 mg, se adaugă o cantitate adecvată de nisip anhidru cântărită cu o abatere de 10 mg şi se amestecă până la obţinerea unui produs omogen.

4.2.   Uscare

4.2.1.   Furaje care nu sunt menţionate la punctele 4.1.2 şi 4.1.3

Se cântăreşte un recipient (3.3) împreună cu capacul său, cu o abatere de 1 mg. În recipientul respectiv se cântăreşte, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de 5 g de eşantion şi se împrăştie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul încălzit în prealabil la 103 oC. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil. Se lasă la uscat timp de patru ore, calculate din momentul în care temperatura din cuptor revine la 103 oC. Se pune capacul pe recipient, acesta din urmă se scoate din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (3.6) şi se cântăreşte cu o abatere de 1 mg.

În cazul furajelor constituite în mod predominant din uleiuri şi grăsimi, uscarea în cuptor se prelungeşte cu 30 de minute, la 103 oC. Diferenţa între cele două cântăriri nu trebuie să depăşească 0,1 % în umiditate.

4.2.2.   Cereale, făină fină, tărâţe şi făină grunjoasă

Se cântăreşte un recipient (3.3) împreună cu capacul său, cu o abatere de 0,5 mg. În recipientul respectiv se cântăreşte, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eşantion măcinat şi se împrăştie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul încălzit în prealabil la 130 oC. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil. Se lasă la uscat timp de două ore, considerate din momentul în care temperatura din cuptor revine la 130 oC. Se pune capacul pe recipient, acesta din urmă se scoate din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (3.6) şi se cântăreşte cu o abatere de 1 mg.

4.2.3.

Furaje combinate conţinând peste 4 % zaharoză sau lactoză: materii prime furajere precum seminţele de roşcove, produsele cerealiere hidrolizate, seminţele de malţ, bucăţi de sfeclă uscată, solubilizate de peşte şi zaharuri; furaje combinate conţinând peste 25 % săruri minerale care înglobează apă de cristalizare. Se cântăreşte un recipient (3.3) împreună cu capacul său, cu o abatere de 0,5 mg. În recipientul respectiv se cântăreşte, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eşantion şi se împrăştie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul vidat (3.5) încălzit în prealabil la o temperatură cuprinsă între 80 şi 85 oC. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cât mai rapid posibil. Se aduce presiunea la 100 Torr şi se lasă la uscat, la această presiune, timp de patru ore, fie într-un curent de aer uscat şi cald, fie cu ajutorul unui agent de desicare (aproximativ 300 g pentru 20 de eşantioane). În al doilea caz, pompa de vid se deconectează după ce se obţine presiunea recomandată. Durata de uscare se calculează din momentul în care temperatura în cuptor revine la o valoare cuprinsă între 80 şi 85 oC. Presiunea cuptorului se readuce cu grijă până la nivelul presiunii atmosferice. Se deschide cuptorul, se aşează imediat capacul pe recipient, se scoate recipientul din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator (3.6) şi se cântăreşte cu o abatere de 1 mg. Uscarea în cuptorul vidat se prelungeşte cu încă 30 de minute la o temperatură cuprinsă între 80 şi 85 oC şi se recântăreşte. Diferenţa între cele două cântăriri nu trebuie să depăşească 0,1 % în umiditate.

4.3.   Uscarea prealabilă

4.3.1.   Furaje care nu sunt menţionate la punctul 4.3.2

Furajele solide al căror conţinut de umiditate este ridicat, făcând dificilă zdrobirea, trebuie să fie supuse uscării prealabile, după cum urmează:

Se cântăresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de eşantion nemăcinat (dacă este cazul, furajele comprimate sau aglomerate pot fi divizate cu aproximaţie) într-un recipient corespunzător (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 × 12 cm cu bordură de 0,5 cm). Se lasă la uscat într-un cuptor la o temperatură cuprinsă între 60 şi 70 oC, până ce conţinutul de umiditate s-a redus la o valoare cuprinsă între 8 şi 12 %. Se scoate din cuptor, se lasă să se răcească, neacoperit, în laborator, timp de o oră şi se cântăreşte cu o abatere de 10 mg. Se zdrobeşte imediat conform indicaţiilor de la punctul 4.1.1 şi se usucă conform indicaţiilor de la punctul 4.2.1 sau 4.2.3, în funcţie de natura furajului.

4.3.2.   Cereale

Grăunţele cu un conţinut de umiditate mai mare de 17 % trebuie să fie supuse uscării prealabile, după cum urmează:

Se cântăresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de grăunţe nemăcinate într-un recipient corespunzător (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 × 12 cm cu bordură de 0,5 cm). Se lasă la uscat într-un cuptor, timp de 5-7 minute, la temperatura de 130 oC. Se scot din cuptor, se lasă să se răcească, neacoperit, în laborator, timp de două ore şi se cântăresc cu o abatere de 10 mg. Se macină imediat conform indicaţiilor de la punctul 4.1.2 şi se usucă conform indicaţiilor de la punctul 4.2.2.

5.   Calculul rezultatelor

Conţinutul de umiditate (X) al eşantionului, în procente, se calculează prin utilizarea formulelor următoare:

5.1.   Uscare fără uscare prealabilă

unde:

m	=	greutatea iniţială, în grame, a eşantionului de testat;
m0	=	greutatea, în grame, a eşantionului de testat uscat.

5.2.   Uscare cu uscare prealabilă

unde:

m	=	greutatea iniţială, în grame, a eşantionului de testat;
m1	=	greutatea, în grame, a eşantionului de testat după uscare prealabilă;
m2	=	greutatea, în grame, a eşantionului de testat după zdrobire sau măcinare;
m0	=	greutatea, în grame, a eşantionului de testat uscat.

5.3.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu depăşeşte 0,2 % din valoarea absolută pentru umiditate.

6.   Observaţie

Dacă zdrobirea se dovedeşte a fi necesară şi dacă această acţiune poate modifica conţinutul de umiditate al produsului, rezultatele analizei referitoare la componentele furajelor trebuie ajustate în funcţie de conţinutul de umiditate al eşantionului în starea lui iniţială.

B.   DETERMINAREA UMIDITĂȚII DIN GRĂSIMILE ȘI ULEIURILE ANIMALE ȘI VEGETALE

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conţinutului în apă şi substanţe volatile din grăsimile şi uleiurile animale şi vegetale.

2.   Principiu

Eşantionul se usucă până la atingerea greutăţii constante (pierderea de greutate între două cântăriri succesive este mai mică sau egală cu 1 mg) la 103 oC. Pierderea de greutate se determină prin cântărire.

3.   Aparatură

3.1.	Vas cu fund plat, din material rezistent la coroziune, cu diametru de 8-9 cm şi adâncime de aproximativ 3 cm.

3.2.	Termometru cu bulb întărit şi cu tub de expansiune la capătul superior, gradat de la aproximativ 80 oC până la cel puţin 110 oC şi lung de aproximativ 10 cm.

3.3.	Cuvă cu nisip sau plită.

3.4.	Desicator, conţinând un agent de uscare eficient.

3.5.	Balanţă analitică.

4.   Procedura

Se cântăresc, cu o abatere de 1 mg, aproximativ 20 g din eşantionul omogenizat, în recipientul uscat şi cântărit (3.1), conţinând termometrul (3.2). Se încălzeşte pe cuva cu nisip sau pe plită (3.3), amestecând continuu cu termometrul, astfel încât temperatura să ajungă la 90 oC în aproximativ 7 minute.

Se reduce intensitatea căldurii, urmărind frecvenţa cu care bulele se ridică de pe fundul vasului. Temperatura nu trebuie să depăşească 105 oC. Se continuă amestecarea, răzuind fundul vasului, până când bulele încetează să se mai formeze.

Pentru a asigura eliminarea completă a umidităţii, se reîncălzeşte de câteva ori la 103 ± 2 oC, răcind la 93 oC între încălziri succesive. În continuare se lasă să se răcească la temperatura camerei în desicator (3.4) şi se cântăreşte. Se repetă această operaţie până când pierderea de greutate dintre două încălziri succesive nu depăşeşte 2 mg.

N.B.	O creştere a greutăţii eşantionului după încălzire repetată indică oxidarea grăsimilor, caz în care rezultatul se calculează prin cântărirea imediat înainte ca greutatea să înceapă să crească.

5.   Calculul rezultatelor

Conţinutul de umiditate (X), ca procentaj din eşantion, este dat de următoarea formulă:

unde:

m	=	greutatea, în grame, a eşantionului de testat;
m1	=	greutatea, în grame, a vasului împreună cu conţinutul său înainte de încălzire;
m2	=	greutatea, în grame, a vasului împreună cu conţinutul său după încălzire.

Rezultatele mai mici de 0,05 % se înregistrează ca fiind „sub 0,05 %”.

Repetabilitate

Diferenţa de umiditate dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 0,05 %, în valoare absolută.

C.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE PROTEINE BRUTE

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de proteine brute din furaje pe baza conţinutului de azot, determinat conform metodei Kjeldahl.

2.   Principiu

Eşantionul se dizolvă cu acid sulfuric în prezenţa unui catalizator. Soluţia acidă se alcalinizează cu soluţie de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distilează şi se colectează într-o cantitate măsurată de acid sulfuric, al cărei exces se titrează cu o soluţie etalon de hidroxid de sodiu.

Ca alternativă, amoniacul eliberat se distilează într-o soluţie de acid boric în exces, urmat de titrare cu o soluţie de acid clorhidric sau acid sulfuric.

3.   Reactivi

3.1.	Sulfat de potasiu.

3.2.	Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru (II) pentahidrat, CuSO4 5H2O.

3.3.	Zinc granulat.

3.4.	Acid sulfuric, ρ 20 = 1,84 g/ml.

3.5.	Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6.	Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,1 mol/l.

3.7.	Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8.	Indicator roşu de metil; se dizolvă 300 mg de roşu de metil în 100 ml de etanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9.	Soluţie de hidroxid de sodiu (se poate utiliza soluţie de calitate tehnică) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10.

Hidroxid de sodiu, soluţie volumetrică standard, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11.

Hidroxid de sodiu, soluţie volumetrică standard, c(NaOH) = 0,1 mol/l.

3.12.

Piatră ponce granulată, spălată în acid clorhidric şi calcinată.

3.13.

Acetanilidă (m.p. = 114 oC, conţinutul în N = 10,36 %).

3.14.

Zaharoză (fără azot).

3.15.

Acid boric (H3BO3).

3.16.

Soluţie indicator de roşu de metil: se dizolvă 100 mg de roşu de metil în 100 ml de etanol sau metanol.

3.17.

Soluţie de verde de bromocrezol: se dizolvă 100 mg de verde de bromocrezol în 100 ml de etanol sau metanol.

3.18.

Soluţie de acid boric (10-40 g/l, în funcţie de aparatura utilizată). Când se aplică detectarea prin colorimetrie a punctului final, indicatorii roşu de metil şi bromocrezol trebuie adăugaţi la soluţiile de acid boric. Dacă se prepară 1 litru de soluţie de acid boric, înainte de ajustarea de volum, se adaugă 7 ml de soluţie de indicator roşu de metil (3.16) şi 10 ml de soluţie verde de bromocrezol (3.17). În funcţie de apa utilizată, pH-ul soluţiei de acid boric poate diferi de la lot la lot. Adesea este necesară o ajustare cu ajutorul unui mic volum de substanţă alcalină pentru a obţine un martor pozitiv. Notă: Adăugarea a aproximativ 3-4 ml de NaOH (3.11) în 1 litru de acid boric 10 g/l boric oferă, de obicei, ajustări bune. Soluţia se păstrează la temperatura camerei şi, pe durata păstrării, se protejează de lumină şi de surse de vapori de amoniac.

3.19.

Acid clorhidric, soluţie volumetrică standard, c(HCl) = 0,1 mol/l. Notă: Dacă în calcule se fac ajustările necesare, se pot folosi alte concentraţii de soluţii volumetrice (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 şi 3.19). Concentraţiile se exprimă întotdeauna cu patru zecimale.

4.   Aparatură

Aparatură adecvată pentru efectuarea dizolvării, distilării şi titrării conform procedurii Kjeldahl.

5.   Procedură

5.1.   Dizolvarea

Se cântăreşte 1 g de eşantion cu o abatere de 0,001 g şi se transferă eşantionul în vasul aparatului de dizolvare. Se adaugă 15 g de sulfat de potasiu (3.1), o cantitate adecvată de catalizator (3.2) [0,3-0,4 g oxid de cupru (II) sau 0,9-1,2 g sulfat de cupru (II) pentahidrat], 25 ml de acid sulfuric (3.4) şi, dacă este necesar, câteva granule de piatră ponce (3.12), apoi se amestecă.

Se încălzeşte vasul, la început moderat, agitând circular din când, dacă este cazul, până când materia s-a carbonizat şi spuma a dispărut; apoi se încălzeşte mai intens, până când lichidul fierbe constant. Încălzirea este adecvată dacă acidul aflat în fierbere se condensează pe peretele vasului. Se previne supraîncălzirea marginilor şi lipirea particulelor organice de acestea.

Când soluţia devine limpede şi de culoare verde deschis, se continuă fierberea timp de încă două ore, apoi se lasă să se răcească.

5.2.   Distilarea

Se adaugă cu atenţie apă suficientă pentru a asigura dizolvarea completă a sulfaţilor. Se lasă la răcit şi apoi se adaugă, dacă este cazul, câteva granule de zinc (3.3). Se procedează ca la punctul 5.2.1 sau 5.2.2.

5.2.1.   Distilarea în acid sulfuric

În vasul de colectare al aparatului de distilare se introduce o cantitate de 25 ml de acid sulfuric (3.5) sau (3.7), măsurată cu exactitate, în funcţie de conţinutul estimat de azot. Se adăugă câteva picături de indicator roşu de metil (3.8).

Se conectează vasul de dizolvare la condensatorul aparatului de distilare şi se scufundă capătul condensatorului în lichidul din vasul de colectare până la o adâncime de cel puţin 1 cm (a se vedea observaţia 8.3). Se toarnă încet 100 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (3.9) în vasul de dizolvare, fără pierderi de amoniac (a se vedea observaţia 8.1). Se încălzeşte vasul până la distilarea completă a amoniacului.

5.2.2.   Distilarea în acid boric

În cazul în care titrarea amoniacului conţinut în distilat se face manual, se aplică procedura de mai jos. În cazul în care unitatea de distilare este complet automatizată, inclusiv titrarea amoniacului conţinut în distilat, se urmează instrucţiunile de operare a unităţii de distilare puse la dispoziţie de fabricant.

Sub orificiul de evacuare al condensatorului se aşează un vas de colectare conţinând 25-30 ml de soluţie de acid boric (3.18), astfel încât tubul de evacuare se află sub nivelul suprafeţei soluţiei de acid boric în exces. Se reglează unitatea de distilare astfel încât să elibereze 50 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (3.9). Unitatea de distilare se operează în conformitate cu instrucţiunile fabricantului, distilându-se complet amoniacul eliberat prin adăugarea de soluţie de hidroxid de sodiu. Distilatul se colectează în soluţia de acid boric receptoare. Cantitatea de distilat (timpul de distilare în vapori) depinde de cantitatea de azot din eşantion. Se urmează instrucţiunile fabricantului.

Notă:

În cazul unei unităţi de distilare semiautomate, adăugarea hidroxidului de sodiu în exces şi distilarea în vapori se efectuează automat.

5.3.   Titrarea

Se procedează ca la punctul 5.3.1 sau 5.3.2.

5.3.1.   Acid sulfuric

Se titrează excesul de acid sulfuric în vasul de colectare cu soluţie de hidroxid de sodiu (3.10 sau 3.11), în funcţie de concentraţia acidului sulfuric utilizat, până se atinge punctul final.

5.3.2.   Acid boric

Cu ajutorul unei biurete se titrează conţinutul vasului de colectare cu soluţie volumetrică standard de acid clorhidric (3.19) sau cu soluţie volumetrică standard de acid sulfuric (3.6) şi se citeşte cantitatea de soluţie de titrare utilizată.

Când se aplică detectarea colorimetrică a punctului final, acesta este atins la prima apariţie în conţinut a culorii roz. Citirea biuretei se estimează cu o abatere de 0,05 ml. Vizualizarea punctului final poate fi facilitată de o placă de agitator magnetic iluminat sau de un detector fotometric.

Aceasta poate fi efectuată automat prin utilizarea unui aparat de distilare cu vapori cu titrare automată.

Operarea specifică a aparatului de distilare sau a celui de distilare/titrare se face conform instrucţiunilor fabricantului.

Notă:

În cazul în care se utilizează un sistem automat de titrare, aceasta începe imediat după începerea distilării şi se utilizează soluţia de acid boric 1 % (3.18). În cazul care se utilizează o unitate de distilare complet automată, titrarea automată a amoniacului poate fi efectuată, de asemenea, prin detectarea punctului final cu ajutorul unui sistem pH potenţiometric. În acest caz, se utilizează un aparat de titrare automat, cu pH-metru. pH-metrul se calibrează corespunzător în intervalul de pH 4-7, folosindu-se proceduri de laborator normale de calibrare a pH-ului. Punctul final al titrării exprimat în pH este atins la valoarea de 4,6, reprezentând punctul cel mai de jos al curbei de titrare (punctul de inflexiune).

5.4.   Testul martor

Pentru a confirma faptul că reactivii nu conţin azot, se efectuează un test martor (dizolvare, distilare şi titrare), folosind 1 g de zaharoză (3.14) în locul eşantionului.

6.   Calculul rezultatelor

Calcularea se efectuează în conformitate cu punctul 6.1 sau 6.2.

6.1.   Calcularea titrării în conformitate cu punctul 5.3.1

Conţinutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

V0	=	volumul (ml) de NaOH (3.10 sau 3.11) folosit în testul martor;
V1	=	volumul (ml) de NaOH (3.10 sau 3.11) folosit în titrarea eşantionului;
c	=	concentraţia (mol/l) a hidroxidului de sodiu (3.10 sau 3.11);
m	=	greutatea (g) a eşantionului.

6.2.   Calcularea titrării în conformitate cu punctul 5.3.2

6.2.1.   Titrare cu acid clorhidric

Conţinutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

m	=	greutatea (g) a părţii de testat;
c	=	concentraţia (mol/l) a soluţiei volumetrice standard de acid clorhidric (3.19);
V0	=	volumul (în ml) de acid clorhidric utilizat în testul martor;
V1	=	volumul (în ml) de acid clorhidric utilizat în partea de testat.

6.2.2.   Titrare cu acid sulfuric

Conţinutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:

unde:

m	=	greutatea (g) a părţii de testat;
c	=	concentraţia (mol/l) a soluţiei volumetrice standard de acid sulfuric (3.6);
V0	=	volumul (în ml) de acid sulfuric (3.6) utilizat în testul martor;
V1	=	volumul (în ml) de acid sulfuric (3.6) utilizat în testul martor.

7.   Verificarea metodei

7.1.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:

—	0,2 % în valoare absolută, pentru un conţinut de proteine brute mai mic de 20 %;

—	1 % relativ la valoarea mai mare, pentru un conţinut de proteine brute cuprins între 20 şi 40 %;

—	0,4 % în valoare absolută, pentru un conţinut de proteine brute mai mare de 40 %.

7.2.   Acurateţea

Analiza (dizolvare, distilare şi titrare) se efectuează pe 1,5-2 g acetanilidă (3.13), în prezenţa a 1 g zaharoză (3.14); 1 g de acetanilidă consumă 14,8 ml de acid sulfuric (3.5). Recuperarea trebuie să fie de cel puţin 99 %.

8.   Observaţii

8.1.

Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dacă aparatura necesită un transfer între etapele de dizolvare şi distilare, acest transfer trebuie realizat fără pierderi. Dacă vasul aparatului de distilare nu este prevăzut cu o pâlnie de picurare, se adaugă hidroxidul de sodiu imediat înainte de conectarea vasului la condensator, turnând încet lichidul pe marginea vasului.

8.2.	Dacă produsul de dizolvare se solidifică, se reîncepe determinarea folosind o cantitate mai mare de acid sulfuric (3.4) decât cea menţionată anterior.

8.3.	Pentru produsele cu conţinut scăzut de azot, volumul de acidul sulfuric (3.7) care trebuie introdus în vasul de colectare poate fi redus, dacă este cazul, la 10 sau 15 ml şi completat până la 25 ml cu apă.

8.4.

Pentru analizele curente, în vederea determinării conţinutului de proteine brute se pot aplica metode alternative de analiză, dar metoda Kjeldahl descrisă în prezenta parte C este metoda de referinţă. Echivalenţa dintre rezultatele obţinute cu metoda alternativă (de exemplu DUMAS) şi cele obţinute prin metoda de referinţă trebuie demonstrată pentru fiecare matrice în mod individual. Întrucât rezultatele obţinute cu o metodă alternativă, chiar şi după verificarea echivalenţei, pot devia uşor faţă de rezultatele obţinute cu metoda de referinţă, este necesar a menţiona în raportul analitic metoda de analiză utilizată pentru determinarea conţinutului de proteine brute.

D.   DETERMINAREA UREEI

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conţinutului de uree din furaje.

2.   Principiu

Eşantionul este pus în suspensie în apă, în care s-a adăugat un produs de limpezire. Suspensia se filtrează. Conţinutul în uree al filtratului este determinat după adăugarea de 4-dimetilaminobenzaldehidă (4-DMAB), prin măsurarea densităţii optice la o lungime de undă de 420 nm.

3.   Reactivi

3.1.	Soluţie de 4-dimetilaminobenzaldehidă: se dizolvă 1,6 g de 4-DMAB în 100 ml de etanol 96 % şi se adaugă 10 ml de acid clorhidric (ρ201,19 g/ml). Acest reactiv se conservă timp de maximum două săptămâni.

3.2.	Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)22H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.3.	Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4Fe(CN)63H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4.	Cărbune activ care nu absoarbe ureea (de controlat).

3.5.	Uree, soluţie 0,1 % (greutate/volum).

4.   Aparatură

4.1.	Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

4.2.	Eprubete: 160 × 16 mm cu dopuri de sticlă şlefuită.

4.3.	Spectrofotometru.

5.   Procedură

5.1.   Analiza eşantionului

Se cântăresc 2 g de eşantion cu abatere de 1 mg şi se introduc împreună cu 1 g de cărbune activ (3.4) într-un balon gradat de 500 ml. Se adaugă 400 ml de apă şi 5 ml de soluţie Carrez I (3.2), se amestecă timp de aproximativ 30 secunde şi se adaugă 5 ml de soluţie Carrez II (3.3). Se amestecă timp de treizeci de minute în agitator. Se completează volumul cu apă, se agită şi se filtrează.

Se îndepărtează 5 ml de filtrat transparent şi incolor, se introduc în eprubete cu dop de sticlă şlefuită, se adaugă 5 ml de soluţie de 4-DMAB (3.1) şi se amestecă. Se introduc eprubetele într-o baie de apă la 20 oC (± 4 oC). După cincisprezece minute se măsoară densitatea optică a soluţiei de eşantion cu spectrofotometrul la 420 nm. Se compară cu soluţia de reactivi pentru testul martor.

5.2.   Curba de calibrare

Se îndepărtează volume de 1, 2, 4, 5 şi 10 ml din soluţia de uree (3.5), se introduc în baloanele gradate de 100 ml şi se completează volumul cu apă. Se îndepărtează 5 ml din fiecare soluţie, se adaugă în fiecare 5 ml de soluţie 4-DMAB (3.1), se omogenizează şi se măsoară densitatea optică conform indicaţiilor de mai sus cu o soluţie martor care conţine 5 ml de 4-DMAB şi 5 ml de apă în care nu există uree. Se trasează curba de calibrare.

6.   Calculul rezultatelor

Se determină cantitatea de uree din eşantion cu ajutorul curbei de calibrare.

Se exprimă rezultatul ca procent din eşantion.

7.   Observaţii

7.1.	În cazul unui conţinut de uree care depăşeşte 3 %, se reduce greutatea eşantionului la 1 g sau se diluează soluţia iniţială astfel încât să nu fie mai mult de 50 mg de uree în 500 ml.

7.2.	În cazul unui conţinut mic în uree, se creşte greutatea eşantionului atâta timp cât filtratul rămâne transparent şi incolor.

7.3.	Dacă eşantionul conţine compuşi de azot simpli cum ar fi aminoacizii, densitatea optică se măsoară la 435 nm.

E.   DETERMINAREA BAZELOR AZOTATE VOLATILE

I.   PRIN MICRODIFUZIE

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinare conţinutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, din furaje.

2.   Principiu

Eşantionul este supus extracţiei cu apă, iar soluţia este limpezită şi filtrată. Bazele azotate volatile sunt dislocate prin microdifuzie cu ajutorul unei soluţii de carbonat de potasiu, colectate într-o soluţie de acid boric şi titrate cu acid sulfuric.

3.   Reactivi

3.1.	Acid tricloracetic, soluţie 20 % (greutate/volum).

3.2.	Indicator: se dizolvă 33 mg de verde de bromocrezol şi 65 mg de roşu de metil în 100 ml de alcool etilic 95-96 % (v/v).

3.3.

Soluţie de acid boric: într-un balon gradat de 1 l se dizolvă 10 g de acid boric în 200 ml de alcool etilic 95-96 % (v/v) şi 700 ml de apă. Se adaugă 10 ml de indicator (3.2). Se amestecă şi, dacă este necesar, se ajustează coloraţia soluţiei la roşu deschis prin adăugarea unei soluţii de hidroxid de sodiu. 1 ml din această soluţie permite fixarea a maximum 300 μg de NH3.

3.4.	Soluţie saturată de carbonat de potasiu: se dizolvă 100 g de carbonat de sodiu în 100 ml de apă la temperatura de fierbere. Se lasă să se răcească şi se filtrează.

3.5.	Acid sulfuric 0,01 mol/litru.

4.   Aparatură

4.1.	Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

4.2.	Celule Conway (a se vedea diagrama) din sticlă sau din material plastic.

4.3.	Microbiurete gradate la 1/100 ml.

5.   Procedură

Se cântăresc 10 g de eşantion cu abatere de 1 mg şi se introduc împreună cu 100 ml de apă într-un balon gradat de 200 ml. Se amestecă sau se agită în agitator timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluţie de acid tricloracetic (3.1), se completează volumul cu apă, se agită cu putere şi se filtrează printr-un un filtru cutat.

Cu ajutorul unei pipete se introduce 1 ml de soluţie de acid boric (3.3) în partea centrală a celulei Conway şi 1 ml de filtrat de eşantion în coroana celulei. Se acoperă parţial cu ajutorul unui capac lubrifiat. Se picură cu rapiditate 1 ml de soluţie saturată de carbonat de potasiu (3.4) în coroană şi se închide capacul astfel încât celula este ermetizată. Se întoarce celula cu precauţie, rotind-o în plan orizontal, astfel încât cei doi reactivi se amestecă. Se lasă la incubat fie timp de cel puţin patru ore la temperatura camerei, fie timp de o oră la 40 oC.

Cu ajutorul unei microbiurete (4.3), se titrează bazele volatile din soluţia de acid boric cu acid sulfuric (3.5).

Se efectuează un test martor aplicând aceeaşi procedură, dar fără a analiza un eşantion.

6.   Calculul rezultatelor

1 ml de H2SO40,01 mol/litru corespunde la 0,34 mg de amoniac.

Se exprimă rezultatul ca procent din eşantion.

Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu depăşeşte:

—	10 %, în valoare relativă, pentru un conţinut în amoniac mai mic de 1 %;

—	0,1 %, în valoare absolută, pentru un conţinut în amoniac de 1 % sau mai mare.

7.   Observaţie

Dacă conţinutul în amoniac al eşantionului depăşeşte 0,6 %, se diluează filtratul iniţial.

CELULA CONWAY

Scara 1/1

II.   PRIN DISTILARE

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conţinutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, a făinii din peşte care practic nu conţine deloc uree. Ea este aplicabilă doar în cazul unui conţinut în amoniac mai mic de 0,25 %.

2.   Principiu

Eşantionul este supus extracţiei cu apă, iar soluţia este limpezită şi filtrată. Bazele azotate volatile sunt dislocate la punctul de fierbere prin adăugare de oxid de magneziu şi colectate într-o cantitate determinată de acid sulfuric, al cărui exces este retitrat cu o soluţie de hidroxid de sodiu.

3.   Reactivi

3.1.	Acid tricloracetic, soluţie 20 % (greutate/volum).

3.2.	Oxid de magneziu.

3.3.	Emulsie antispumantă (de exemplu, silicon).

3.4.	Acid sulfuric 0,05 mol/litru.

3.5.	Soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.

3.6.	Soluţie de roşu de metil 0,3 % în etanol 95-96 % (v/v).

4.   Aparatură

4.1.	Mixer (agitator): aproximativ 35-40 de rpm.

4.2.	Aparat de distilat de tip Kjeldahl.

5.   Procedură

Se cântăresc 10 g de eşantion cu abatere de 1 mg şi se introduc împreună cu 100 ml de apă într-un balon gradat de 200 ml. Se amestecă sau se agită în agitator timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluţie de acid tricloracetic (3.1), se completează volumul cu apă, se agită cu putere şi se filtrează printr-un un filtru cutat.

Se prelevează o cantitate de filtrat limpede adecvată pentru conţinutul în baze azotate volatile presupus (100 ml este de obicei suficient). Se diluează la 200 ml şi se adaugă 2 g de oxid de magneziu (3.2), precum şi câteva picături de emulsie antispumantă (3.3). Soluţia trebuie să fie alcalină la testul cu turnesol; dacă nu este, se adaugă oxid de magneziu (3.2). Se continuă ca la punctul 5.2 şi 5.3 al metodei de analiză pentru determinarea conţinutului de proteine brute (partea C a prezentei anexe).

Se efectuează un test martor aplicând aceeaşi procedură, dar fără a analiza un eşantion.

6.   Calculul rezultatelor

1 ml de H2SO40,05 mol/litru corespunde la 1,7 mg de amoniac.

Se exprimă rezultatul ca procent din eşantion.

Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu depăşeşte, în valoare relativă, 10 % amoniac.

F.   DETERMINAREA AMINOACIZILOR (CU EXCEPȚIA TRIPTOFANULUI)

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea aminoacizilor liberi (sintetici şi naturali) şi totali (legaţi în peptide şi liberi) din furaje, folosind un analizator de aminoacizi. Ea este aplicabilă următorilor aminoacizi: cist(e)ină, metionină, lizină, treonină, alanină, arginină, acid aspartic, acid glutamic, glicină, histidină, izoleucină, leucină, fenilalanină, prolină, serină, tirozină şi valină.

Metoda nu deosebeşte sărurile aminoacizilor şi nu permite diferenţierea între formele D şi L ale aminoacizilor. Ea nu este valabilă pentru determinarea triptofanului sau a analogilor hidroxilaţi ai aminoacizilor.

2.   Principiu

2.1.   Aminoacizi liberi

Aminoacizii liberi se extrag cu acid clorhidric diluat. Macromoleculele azotate coextrase se precipită cu acid sulfosalicilic şi se îndepărtează prin filtrare. Soluţia filtrată se ajustează la pH-ul de 2,2. Aminoacizii se separă prin cromatografie cu schimb de ioni şi se determină prin reacţie cu ninhidrină cu detecţie fotometrică la 570 nm.

2.2.   Aminoacizi totali

Procedura aleasă depinde de aminoacizii care sunt analizaţi. Cist(e)ina şi metionina trebuie oxidate la acid cisteic şi, respectiv, metionin sulfonă înainte de hidroliză. Tirozina trebuie determinată în hidrolizate de eşantioane neoxidate. Toţi ceilalţi aminoacizi enumeraţi la punctul 1 se pot determina fie în eşantionul oxidat, fie în eşantionul neoxidat.

Oxidarea se realizează la 0 oC cu ajutorul unui amestec de acid performic şi fenol. Reactivul de oxidare în exces se descompune cu disulfit de sodiu. Eşantionul oxidat sau neoxidat se hidrolizează cu acid clorhidric (3.20) timp de 23 de ore. Hidrolizatul se ajustează la pH-ul de 2,2. Aminoacizii se separă prin cromatografie cu schimb de ioni şi se determină prin reacţie cu ninhidrină folosind detecţia fotometrică la 570 nm (440 nm pentru prolină).

3.   Reactivi

Trebuie utilizată apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS).

3.1.	Peroxid de hidrogen, g (g/g) = 30 %.

3.2.	Acid formic, g (g/g) = 98-100 %.

3.3.

Fenol.

3.4.	Disulfit de sodiu.

3.5.	Hidroxid de sodiu.

3.6.	Acid 5-sulfosalicilic dihidrat.

3.7.	Acid clorhidric, cu densitate de aproximativ 1,18 g/ml.

3.8.	Citrat trisodic dihidrat.

3.9.	2,2'-tiodietanol (tiodiglicol).

3.10.

Clorură de sodiu.

3.11.

Ninhidrină.

3.12.

Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 oC.

3.13.

Norleucină sau alt compus adecvat pentru a fi utilizat ca etalon intern.

3.14.

Azot, gaz (< 10 ppm oxigen).

3.15.

1-octanol.

3.16.

Aminoacizi.

3.16.1.

Substanţe standard enumerate la punctul 1. Compuşi puri care nu conţin deloc apă de cristalizare. Înainte de utilizare, se usucă în vid cu ajutorul P2O5 sau al H2SO4, timp de 1 săptămână.

3.16.2.

Acid cisteic.

3.16.3.

Metionin sulfonă.

3.17.

Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 7,5 mol/l Se dizolvă 300 g de NaOH (3.5) în apă şi se completează până la 1 litru.

3.18.

Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l Se dizolvă 40 g de NaOH (3.5) în apă şi se completează până la 1 litru.

3.19.

Soluţie de acid formic-fenol: Se amestecă 889 g de acid formic (3.2) cu 111 g de apă şi se adaugă 4,73 g de fenol (3.3).

3.20.

Mixtură de hidroliză, c = 6 mol HCl/l conţinând 1 g de fenol/l: Se adaugă 1 g de fenol (3.3) la 492 ml de HCl (3.7) şi se completează cu apă până la 1 litru.

3.21.

Mixtură de extracţie, c = 0,1 mol HCl/l conţinând 2 % tiodiglicol: se iau 8,2 ml de HCl (3.7), se diluează cu aproximativ 900 ml de apă, se adaugă 20 ml de tiodiglicol (3.9) şi se completează cu apă până la 1 litru (nu se amestecă direct 3.7 şi 3.9).

3.22.

Acid 5-sulfosalicilic dihidrat, ß = 6 %: se dizolvă 60 g de acid 5-sulfosalicilic (3.6) în apă şi se completează cu apă până la 1 litru.

3.23.

Mixtură de oxidare (acid performic-fenol): Se amestecă 0,5 ml de peroxid de hidrogen (3.1) cu 4,5 ml soluţie de acid formic-fenol (3.19) într-un mic pahar de laborator. Se incubează la 20-30 oC timp de 1 oră pentru a se forma acid performic, apoi se răceşte în baie de apă cu gheaţă (15 minute) înainte de a se adăuga la eşantion. Atenţie: a se evita contactul cu pielea şi a se purta îmbrăcăminte protectoare.

3.24.

Soluţie tampon de citrat, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,2: Se dizolvă 19,61 g de citrat de sodiu (3.8), 5 ml de tiodiglicol (3.9), 1 g de fenol (3.3) şi 16,5 ml de HCl (3.7) în aproximativ 800 ml de apă. Se ajustează pH-ul la 2,2. Se completează cu apă până la 1 litru.

3.25.

Soluţii tampon de eluţie, preparate în conformitate cu condiţiile pentru analizorul utilizat (4.9).

3.26.

Reactiv ninhidrină, preparat în conformitate cu condiţiile pentru analizorul utilizat (4.9).

3.27.

Soluţii etalon de aminoacizi. Aceste soluţii se păstrează la o temperatură sub 5 oC.

3.27.1.

Soluţie etalon stoc de aminoacizi (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml pentru fiecare, în acid clorhidric. Se pot obţine din surse comerciale.

3.27.2.

Soluţie etalon stoc de acid cisteic şi metionin sulfonă, c = 1,25 μmol/ml. Se dizolvă 0,2115 g de acid cisteic (3.16.2) şi 0,2265 g de metionin sulfonă (3.16.3) în soluţie tampon de citrat (3.24) într-un balon gradat de 1 litru şi se completează până la semn cu soluţie tampon de citrat. Se păstrează la o temperatură sub 5 oC, nu mai mult de 12 luni. Această soluţie nu se utilizează dacă soluţia etalon stoc (3.27.1) conţine acid cisteic şi metionin sulfonă.

3.27.3.

Soluţie etalon stoc de etalon intern, de exemplu, norleucină, c = 20 μmol/ml. Se dizolvă 0,656 g de norleucină (3.13) în soluţie tampon de citrat (3.24) într-un balon gradat şi se completează cu soluţie tampon de citrat până la 250 ml. Se păstrează la o temperatură sub 5 oC, nu mai mult de 6 luni.

3.27.4.

Soluţie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate, c = 5 nmol/50 μl de acid cisteic şi metionin sulfonă şi c = 10 nmol/50 μl din ceilalţi aminoacizi. Se dizolvă 2,2 g de clorură de sodiu (3.10) într-un pahar de laborator de 100 ml care conţine 30 ml soluţie tampon de citrat (3.24). Se adaugă 4 ml de soluţie etalon stoc de aminoacizi (3.27.1), 4 ml soluţie etalon stoc de acid cisteic şi metionin sulfonă (3.27.2) şi 0,5 ml soluţie etalon stoc de etalon intern (3.27.3), dacă este cazul. Se ajustează pH-ul la valoarea 2,2 cu hidroxid de sodiu (3.18). Se transferă cantitativ într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu soluţie tampon de citrat (3.24) şi se amestecă. Se păstrează la o temperatură sub 5 oC, nu mai mult de 3 luni. A se vedea şi observaţia de la punctul 9.1.

3.27.5.

Soluţie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate preparată în conformitate cu punctul 5.3.3.1 şi pentru utilizare cu extracte (5.2). Soluţia de calibrare se prepară în conformitate cu 3.27.4 dar omiţând clorura de sodiu. Se păstrează la o temperatură sub 5 oC, nu mai mult de 3 luni.

4.   Aparatură

4.1.	Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml dotat cu un condensator cu reflux.

4.2.	Sticlă din borosilicat, de 100 ml, cu un dop filetat cu căptuşeală de cauciuc/teflon (de exemplu, Duran, Schott) pentru utilizare în cuptor.

4.3.	Cuptor cu ventilaţie forţată şi un regulator de temperatură cu precizie mai mare de ± 2 oC.

4.4.	pH-metru (cu trei zecimale).

4.5.	Filtru cu membrană (0,22 μm).

4.6.	Centrifugă.

4.7.	Evaporator rotativ cu vid.

4.8.	Agitator mecanic sau magnetic.

4.9.

Analizor de aminoacizi sau echipament HPLC cu coloană schimbătoare de ioni, dispozitiv pentru ninhidrină, derivare post-coloană şi detector fotometric. Coloana este umplută cu răşini de polistiren sulfonat capabile să separe aminoacizii unul de altul, precum şi de materiale care conţin ninhidrină. Fluxul din liniile cu soluţie tampon şi ninhidrină este asigurat de pompe care au o stabilitate a fluxului de ±0,5 % în perioada care include atât funcţionarea în vederea calibrării standardului, cât şi analiza eşantionului. În cazul unor analizori de aminoacizi se pot utiliza proceduri de hidrolizare în care hidrolizatul are o concentraţie de sodiu de c = 0,8 mol/l şi conţine întreaga cantitate de acid formic rezidual din etapa de oxidare. Alţi analizori nu oferă o separare satisfăcătoare a anumitor aminoacizi dacă hidrolizatul conţine exces de acid formic şi/sau concentraţii mari de ioni de sodiu. În acest caz, volumul de acid se reduce prin evaporare la aproximativ 5 ml după hidroliză şi înainte de ajustarea pH-ului. Evaporarea se face sub vid, la o temperatură maximă de 40 oC.

5.   Procedură

5.1.   Prepararea eşantionului

Se macină eşantionul astfel încât poate trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm. Eşantioanele cu un conţinut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer, la o temperatură de maximum 50 oC, fie liofilizate înainte de măcinare. Eşantioanele cu un conţinut ridicat de substanţe grase se extrag cu eter de petrol (3.12) înainte de măcinare.

5.2.   Determinarea aminoacizilor liberi în furaje şi în premixuri

Se cântăreşte cu o abatere de 0,2 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eşantionul preparat (5.1), într-un flacon tip Erlenmeyer şi se adaugă 100 ml de extract de mixtură (3.21). Se agită mixtura timp de 60 minute cu ajutorul agitatorului mecanic sau magnetic (4.8). Se lasă să se decanteze sedimentul şi se pipetează 10 ml din soluţia supernatantă într-un pahar de laborator de 100 ml.

Se adaugă 5 ml de soluţie de acid sulfosalicilic (3.22) în cursul agitării şi se continuă agitarea cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtrează sau se centrifughează supernatantul pentru a se îndepărta orice precipitat. Se introduc 10 ml din soluţia rezultată într-un pahar de laborator de 100 ml şi se ajustează pH-ul la valoarea de 2,2 cu ajutorul soluţiei de hidroxid de sodiu (3.18), se transferă într-un balon gradat de volum adecvat utilizându-se soluţie tampon de citrat (3.24) şi se completează până la semn cu soluţia tampon (3.24).

Dacă se utilizează etalon intern, se adaugă 1 ml de etalon intern (3.27.3) pentru fiecare 100 ml de soluţie finală şi se completează până la semn cu soluţie tampon (3.24).

Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4.

Dacă extractele nu se examinează în aceeaşi zi, trebuie păstrate la o temperatură sub 5 oC.

5.3.   Determinarea conţinutului total în aminoacizi

5.3.1.   Oxidare

Se cântăresc cu o abatere de 0,2 mg între 0,1 şi 1 g de eşantion preparat (5.1) într-un (într-o):

—	balon cu fund rotund de 100 ml (4.1) pentru hidroliză în mediu deschis (5.3.2.3); sau

—	balon cu fund rotund de 250 ml (4.1) dacă este necesară o concentraţie mică de sodiu (5.3.3.1); sau

—	sticlă de 100 ml dotată cu un dop filetat (4.2) pentru hidroliză în mediu închis (5.3.2.4).

Porţia de eşantion cântărită are un conţinut de azot de aproximativ 10 mg şi un conţinut de umiditate de maximum 100 mg.

Se introduce balonul/sticla într-o baie de apă cu gheaţă şi se răceşte la 0 oC, se adaugă 5 ml de mixtură de oxidare (3.23) şi se amestecă cu ajutorul unei spatule de sticlă cu vârf încovoiat. Se etanşeizează balonul/sticla conţinând spatula cu ajutorul unei pelicule ermetizante, se introduce baia de apă cu gheaţă conţinând recipientul etanşeizat într-un frigider la 0 oC şi se lasă timp de 16 ore. După 16 ore, se scoate din frigider, iar excesul de reactiv de oxidare se descompune prin adăugarea a 0,84 g de disulfit de sodiu (3.4).

Se trece la 5.3.2.1.

5.3.2.   Hidroliza

5.3.2.1.    Hidroliza eşantioanelor oxidate

La eşantioanele oxidate preparate în conformitate cu punctul 5.3.1 se adaugă 25 ml de mixtură hidrolizată (3.20) având grijă să se spele orice reziduu de eşantion de pe pereţii vasului şi de pe spatulă.

În funcţie de procedura de hidrolizare utilizată, se trece la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Hidroliza eşantioanelor neoxidate

Se cântăresc 0,1-1 g de eşantion preparat (5.1), cu o abatere de 0,2 mg, fie într-un balon cu fund rotund de 100 ml sau 250 ml (4.1), fie într-o sticlă de 100 ml dotată cu dop filetat (4.2). Porţia de eşantion cântărit trebuie să aibă un conţinut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaugă cu grijă 25 ml de mixtură hidrolizată (3.20) şi se amestecă cu eşantionul. Se procedează ca la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Hidroliza în mediu deschis

Se adaugă 3 mărgele de sticlă în mixtura din balon (preparată conform menţiunilor de la punctul 5.3.2.1 sau 5.3.2.2) şi se fierbe în clocot continuu sub reflux timp de 23 de ore. La încheierea hidrolizei, se spală condensatorul cu 5 ml de soluţie tampon de citrat (3.24). Se deconectează balonul şi se răceşte într-o baie de apă cu gheaţă.

Se procedează ca la punctul 5.3.3.

5.3.2.4.    Hidroliza în mediu închis

Sticla conţinând mixtura preparată conform punctului 5.3.2.1 sau 5.3.2.2 se introduce în cuptor (4.3) la 110 oC. În timpul primei ore, pentru a se preveni o creştere progresivă a presiunii (datorată expansiunii substanţelor gazoase) şi pentru a se evita o explozie, se plasează dopul filetat la nivelul extremităţii superioare a vasului. A nu se închide vasul cu dopul respectiv. După o oră, se închide vasul cu dopul respectiv şi se lasă în cuptor (4.3) timp de 23 de ore. La încheierea hidrolizei, se îndepărtează sticla din cuptor, se scoate cu grijă dopul de la nivelul sticlei, iar aceasta se introduce într-o baie de apă cu gheaţă. Se lasă să se răcească.

În funcţie de procedura de ajustare a pH-ului (5.3.3), se transferă cantitativ conţinutul sticlei într-un pahar de laborator de 250 de ml sau într-un balon cu fund rotund, utilizând soluţie tampon de citrat (3.24).

Se procedează ca la punctul 5.3.3.

5.3.3.   Ajustarea pH-ului

În funcţie de toleranţa la sodiu a analizorului de aminoacizi (4.9), pentru ajustarea pH-ului se procedează ca la punctul 5.3.3.1 sau 5.3.3.2.

5.3.3.1.    Pentru sistemele cromatografice (4.9) necesitând o concentraţie de sodiu mică

Este recomandabil să se utilizeze o soluţie etalon stoc internă (3.27.3) în cazul în care se folosesc analizori de aminoacizi necesitând o concentraţie mică de sodiu (în cazul în care volumul de acid trebuie redus).

În acest caz, la hidrolizat se adaugă 2 ml de soluţie etalon stoc internă (3.27.3) înainte de evaporare.

La hidrolizatul obţinut conform punctului 5.3.2.3 sau 5.2.3.4 se adaugă 2 picături de 1-octanol (3.15).

Utilizând un evaporator rotativ (4.7) se reduce volumul la 5-10 ml în condiţii de vid la 40 oC. Dacă volumul este redus accidental la mai puţin de 5 ml, hidrolizatul trebuie aruncat, iar analiza trebuie repetată.

Se ajustează pH-ul la 2,2 cu ajutorul soluţiei de hidroxid de sodiu (3.18) şi se procedează ca la punctul 5.3.4.

5.3.3.2.    Pentru toţi ceilalţi analizori de aminoacizi (4.9)

Hidrolizatele obţinute ca la punctul 5.3.2.3 sau 5.3.2.4 se neutralizează parţial prin adăugarea cu grijă, în condiţii de agitare continuă, a 17 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (3.17), asigurându-se că temperatura este menţinută sub 40 oC.

Se ajustează pH-ul la valoarea de 2,2 la temperatura camerei prin utilizarea soluţiei de hidroxid de sodiu (3.17) şi în cele din urmă a soluţiei de hidroxid de sodiu (3.18) Se trece la punctul 5.3.4.

5.3.4.   Soluţia de eşantion pentru cromatografie

Se transferă cantitativ hidrolizatul cu pH ajustat (5.3.3.1 sau 5.3.3.2) cu soluţie tampon de citrat (3.24) într-un balon gradat de 200 ml şi se completează până la semn cu soluţie tampon (3.24).

Dacă nu s-a utilizat deja un etalon intern, se adaugă 2 ml de etalon intern (3.27.3) şi se completează până la semn cu soluţie tampon de citrat (3.24). Se amestecă minuţios.

Se trece la etapa cromatografică (5.4).

Dacă soluţiile de eşantion nu se examinează în aceeaşi zi, ele se păstrează la o temperatură sub 5 oC.

5.4.   Cromatografia

Înainte de cromatografie se aduce extractul (5.2) sau hidrolizatul (5.3.4) la temperatura camerei. Se agită mixtura şi se filtrează o cantitate potrivită printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,22 μm (4.5). Soluţia limpede rezultată se supune cromatografiei prin schimb ionic, utilizând un analizor de aminoacizi (4.9).

Injectarea poate fi efectuată manual sau automat. Este important ca aceeaşi cantitate de soluţie ±0,5 % să fie adăugată în coloană pentru analizarea etaloanelor şi a eşantioanelor cu excepţia situaţiilor în care se utilizează un etalon intern şi ca raporturile sodiu:aminoacizi în soluţiile de etalon şi în cele de eşantion să fie cât mai similare posibil.

În general, frecvenţa manevrelor de calibrare depinde de stabilitatea reactivului ninhidrină şi a sistemului analitic. Etalonul sau eşantionul se diluează cu soluţie tampon de citrat (3.24) pentru a genera o arie a vârfului pentru etalon de 30-200 % din aria vârfului pentru eşantionul de aminoacid.

Cromatografia aminoacizilor va varia uşor în funcţie de tipul analizorului şi de răşina utilizate. Sistemul ales trebuie să fie capabil să separe aminoacizii unul de altul, precum şi de materiale care conţin ninhidrină. În cursul operaţiilor, sistemul cromatografic generează un răspuns linear la modificările cantităţilor de aminoacizi adăugaţi la coloană.

În cursul etapei cromatografice se aplică rapoartele înălţimii corespunzătoare punctului minim:vârfului menţionate mai jos, în cazul în care se analizează o soluţie echimolară (de aminoacizi analizaţi). Această soluţie echimolară trebuie să conţină cel puţin 30 % din cantitatea maximă de aminoacizi care poate fi măsurată cu precizie cu ajutorul sistemului analizor de aminoacizi (4.9).

Pentru separarea treoninei-serinei, în cazul suprapunerii a doi aminoacizi, raportul punct minim/vârf corespunzător aminoacidului situat mai jos pe cromatogramă nu trebuie să depăşească 2:10. [dacă se determină doar cist(e)ina, metionina, treonina şi lizina, separarea insuficientă a vârfurilor învecinate va influenţa în mod negativ determinarea]. Pentru toţi ceilalţi aminoacizi, separarea trebuie să fie mai bună de 1:10.

Sistemul trebuie să asigure că lizina se separă de „artefactele de lizină” şi de ornitină.

6.   Calculul rezultatelor

Aria vârfului pentru eşantion şi etalon se măsoară pentru fiecare aminoacid în parte, iar cantitatea (X) se măsoară în g de aminoacid per kg de eşantion.

Dacă se utilizează un etalon intern se multiplică cu:

A	=	aria vârfului, hidrolizat sau extract;
B	=	aria vârfului, soluţia etalon de calibrare;
C	=	aria vârfului, etalon intern în hidrolizat sau extract;
D	=	aria vârfului, etalon intern, soluţia etalon de calibrare;
M	=	greutatea molară a aminoacidului determinat;
c	=	concentraţia de standard în μmol/ml;
m	=	greutatea eşantionului (g) (corectată pentru a obţine greutatea originală dacă produsul este uscat sau degresat);
V	=	total hidrolizat în ml (5.3.4) sau volumul de diluţie total calculat pentru extract, în ml (6.1).

Cistina şi cisteina se determină amândouă ca acid cisteic în hidrolizate de eşantion oxidat, dar se calculează ca cistină (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) folosind M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionina se determină ca metionin sulfonă în hidrolizate de eşantion oxidat, dar se calculează ca metionină folosind M pentru metionină: 149,21 g/mol.

Metionina liberă adăugată se determină după extracţie ca metionină, pentru calculare folosindu-se aceeaşi M.

6.1.	Volumul total de diluţie al extractelor (F) pentru determinarea aminoacizilor liberi (5.2) se calculează după cum urmează: V = volumul extractului final.

7.   Evaluarea metodei

Metoda a fost testată prin comparaţii la nivel internaţional în 1990 utilizând patru furaje diferite (furaj mixt pentru porc, mixtură pentru pui de carne, concentrat proteic, premixuri). Rezultatele, după eliminarea valorilor extreme, exprimate ca medie şi deviaţie standard sunt prezentate în tabelele de la acest punct:

Medii în g/kg

Material de referinţă	Aminoacid
	Treonină	Cist(e)ină	Metionină	Lizină
Furaj mixt pentru porci	6,94 n = 15	3,01 n = 17	3,27 n = 17	9,55 n = 13
Compoziţie pentru pui de carne	9,31 n = 16	3,92 n = 18	5,08 n = 18	13,93 n = 16
Concentrat proteic	22,32 n = 16	5,06 n = 17	12,01 n = 17	47,74 n = 15
Premixuri	58,42 n = 16	—	90,21 n = 16	98,03 n = 16
n = număr de laboratoare participante.

7.1.   Repetabilitate

Repetabilitatea exprimată ca „deviaţie standard intra-laborator” a comparaţiei între laboratoare menţionată mai sus este redată în tabelele de mai jos:

Deviaţia standard intra-laborator (Sr) în g/kg

Material de referinţă	Aminoacid
	Treonină	Cist(e)ină	Metionină	Lizină
Furaj mixt pentru porci	0,13 n = 15	0,10 n = 17	0,11 n = 17	0,26 n = 13
Compoziţie pentru pui de carne	0,20 n = 16	0,11 n = 18	0,16 n = 18	0,28 n = 16
Concentrat proteic	0,48 n = 16	0,13 n = 17	0,27 n = 17	0,99 n = 15
Premixuri	1,30 n = 16	—	2,19 n = 16	2,06 n = 16
n = număr de laboratoare participante.

Coeficient de variaţie (%) al deviaţiei standard intra-laborator (Sr)

Material de referinţă	Aminoacid
	Treonină	Cist(e)ină	Metionină	Lizină
Furaj mixt pentru porci	1,9 n = 15	3,3 n = 17	3,4 n = 17	2,8 n = 13
Compoziţie pentru pui de carne	2,1 n = 16	2,8 n = 18	3,1 n = 18	2,1 n = 16
Concentrat proteic	2,7 n = 16	2,6 n = 17	2,2 n = 17	2,4 n = 15
Premixuri	2,2 n = 16	—	2,4 n = 16	2,1 n = 16
n = număr de laboratoare participante.

7.2   Reproductibilitate

Rezultatele pentru deviaţia standard inter-laboratoare pentru comparaţia între laboratoare menţionată mai sus sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Deviaţia standard inter-laboratoare (SR) în g/kg

Material de referinţă	Aminoacid
	Treonină	Cist(e)ină	Metionină	Lizină
Furaj mixt pentru porci	0,28 n = 15	0,30 n = 17	0,23 n = 17	0,30 n = 13
Compoziţie pentru pui de carne	0,48 n = 16	0,34 n = 18	0,55 n = 18	0,75 n = 16
Concentrat proteic	0,85 n = 16	0,62 n = 17	1,57 n = 17	1,24 n = 15
Premixuri	2,49 n = 16	—	6,20 n = 16	6,62 n = 16
n = număr de laboratoare participante.

Coeficient de variaţie (%) al deviaţiei standard inter-laboratoare (SR)

Material de referinţă	Aminoacid
	Treonină	Cist(e)ină	Metionină	Lizină
Furaj mixt pentru porc	4,1 n = 15	9,9 n = 17	7,0 n = 17	3,2 n = 13
Compoziţie pentru pui de carne	5,2 n = 16	8,8 n = 18	10,9 n = 18	5,4 n = 16
Concentrat proteic	3,8 n = 16	12,3 n = 17	13,0 n = 17	3,0 n = 15
Premixuri	4,3 n = 16	—	6,9 n = 16	6,7 n = 16
n = număr de laboratoare participante.

8.   Utilizarea materialelor de referinţă

Aplicarea corectă a metodei se verifică prin repetarea măsurătorilor pentru materialele de referinţă certificate, atunci când acestea sunt disponibile. Se recomandă calibrarea cu soluţie de calibrare pentru aminoacid certificată.

9.   Observaţii

9.1.

Din cauza diferenţelor dintre analizorii de aminoacizi, concentraţiile finale ale soluţiilor de calibrare pentru aminoacizii standard (a se vedea 3.27.4 şi 3.27.5) şi pentru hidrolizat (vezi 5.3.4) se consideră orientative. Intervalul răspunsului liniar al aparatului trebuie verificat pentru toţi aminoacizii. Soluţia etalon se diluează cu soluţie tampon de citrat pentru a genera arii de vârf situate la mijlocul intervalului.

9.2.	În cazul în care pentru analizarea hidrolizatelor se foloseşte aparatură de cromatografie lichidă de înaltă performanţă, condiţiile experimentale trebuie optimizate în conformitate cu recomandările fabricantului.

9.3.	Prin aplicarea metodei la furajele care conţin peste 1 % clorură (concentrat, furaje minerale, furaje suplimentare) poate apărea o subestimare a metioninei, ceea ce necesită un tratament special.

G.   DETERMINAREA TRIPTOFANULUI

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea în furaje a triptofanului total şi liber. Ea nu face distincţie între formele D şi L.

2.   Principiu

Pentru determinarea triptofanului total, eşantionul se hidrolizează în mediu bazic cu o soluţie de hidroxid de bariu saturată şi se încălzeşte la 110 oC timp de 20 de ore. După hidroliză, se adaugă etalon intern.

Pentru determinarea triptofanului liber, eşantionul se extrage în mediu uşor acid în prezenţa etalonului intern.

Triptofanul şi etalonul intern din hidrolizat sau din extract se determină prin HPLC prin detectarea fluorescenţei.

3.   Reactivi

3.1.	Se utilizează apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS/cm).

3.2.	Substanţă etalon: triptofan (puritate/conţinut ≥ 99 %), uscat sub vid pe pentoxid fosforic.

3.3.	Substanţă etalon intern: α-metil-triptofan (puritate/conţinut ≥ 99 %), uscat sub vid pe pentoxid fosforic.

3.4.	Hidroxid de bariu octahidratat (se evită expunerea excesivă la aer a Ba(OH)2 · 8 H2O pentru a se evita formarea de BaCO3, care ar putea perturba determinarea) (a se vedea observaţia de la punctul 9.3).

3.5.	Hidroxid de sodiu.

3.6.	Acid ortofosforic, g (g/g) = 85 %.

3.7.	Acid clorhidric, ρ201,19 g/ml.

3.8.	Metanol, de calitate HPLC.

3.9.	Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 oC.

3.10.

Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l: Se dizolvă 40 g de NaOH (3.5) în apă şi se completează până la 1 litru cu apă (3.1).

3.11.

Acid clorhidric, c = 6 mol/l: Se iau 492 ml HCl (3.7) şi se completează până la 1 litru cu apă.

3.12.

Acid clorhidric, c = 1 mol/l: Se iau 82 ml HCl (3.7) şi se completează până la 1 litru cu apă.

3.13.

Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l: Se iau 8,2 ml HCl (3.7) şi se completează până la 1 litru cu apă.

3.14.

Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l: Se iau 34 ml de acid ortofosforic (3.6) şi se completează până la 1 litru cu apă (3.1).

3.15.

Soluţie concentrată de triptofan (3.2), c = 2,50 μmol/ml: Într-un balon gradat de 500 ml se dizolvă 0,2553 g de triptofan (3.2) în acid clorhidric (3.13) şi se completează până la semn cu acid clorhidric (3.13). Se păstrează la – 18 oC timp de maximum 4 săptămâni.

3.16.

Soluţie de etalon intern concentrată, c = 2,50 μmol/ml: Într-un balon gradat de 500 ml se dizolvă 0,2728 g de α-metil-triptofan (3.3) în acid clorhidric (3.13) şi se completează până la semn cu acid clorhidric (3.13). Se păstrează la – 18 oC timp de maximum 4 săptămâni.

3.17.

Soluţie etalon de calibrare pentru triptofan şi etalon intern: Se iau 2 ml din soluţia concentrată de triptofan (3.15) şi 2 ml din soluţia concentrată de etalon intern (α-metil-triptofan) (3.16). Se diluează cu apă (3.1) şi metanol (3.8) până se ajunge la un volum aproximativ egal şi la aproximativ aceeaşi concentraţie de metanol (10-30 %) ca şi hidrolizatul final. Această soluţie trebuie proaspăt preparată înainte de fiecare utilizare. În timpul preparării se protejează de lumina solară directă.

3.18.

Acid acetic.

3.19.

1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol.

3.20.

Etanolamină g (g/g) > 98 %.

3.21.

1 g de soluţie de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol (3.19) în 100 ml de metanol (3.8).

3.22.

Fază mobilă pentru HPLC: 3 g de acid acetic (3.18) + 900 ml apă (3.1) + 50 ml soluţie (3.21) de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol (3.19) în metanol (3.8) (1 g/100 ml). Se ajustează pH-ul la valoarea 5 cu ajutorul etanolaminei (3.20). Se completează până la 1 000 ml cu apă (3.1).

4.   Aparatură

4.1.	Echipament de HPLC cu detector spectrofluorometric.

4.2.	Coloană pentru cromatografie lichidă, 125 mm × 4 mm, C18, particule de 3 μm sau echivalent.

4.3.

pH-metru.

4.4.	Vas de polipropilenă, cu capacitate de 125 ml, cu gât larg şi dop filetat.

4.5.	Filtru cu membrană, 0,45 μm.

4.6.	Autoclavă, 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar.

4.7.	Agitator mecanic sau amestecător magnetic.

4.8.	Mixer Vortex.

5.   Procedură

5.1.   Prepararea eşantioanelor

Eşantionul se macină astfel încât poate trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm. Înainte de măcinare, eşantioanele cu un conţinut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer la o temperatură de maximum 50 oC, fie liofilizate. Înainte de măcinare, eşantioanele cu un conţinut ridicat de substanţe grase se extrag cu eter de petrol (3.9).

5.2.   Determinarea triptofanului liber (extract)

Se cântăreşte cu o abatere de 1 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eşantionul preparat (5.1) într-un flacon tip Erlenmeyer. Se adaugă 100 ml de acid clorhidric (3.13) şi 5 ml din soluţia etalon intern concentrată (3.16). Se agită sau se amestecă timp de 60 minute cu ajutorul unui agitator mecanic sau al unui amestecător magnetic (4.7). Se lasă să se decanteze sedimentul şi se pipetează 10 ml din soluţia supernatantă într-un pahar de laborator. Se adaugă 5 ml de acid ortofosforic (3.14). Se ajustează pH-ul la valoarea 3 utilizând hidroxid de sodiu (3.10). Se adaugă suficient metanol (3.8) pentru a obţine o concentraţie de metanol în volumul final de 10-30 %. Se transferă într-un balon gradat de volum corespunzător şi se diluează cu apă până la un volum necesar pentru cromatografie (aproximativ acelaşi volum ca şi soluţia etalon de calibrare (3.17).

Se filtrează câţiva ml de soluţie printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,45 μm (4.5) înainte de a se injecta în coloana de HPLC. Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4.

Soluţia etalon şi extractele se protejează de lumina solară directă. Dacă analizarea extractelor nu este posibilă în aceeaşi zi, ele pot fi depozitate la 5 oC, cel mult 3 zile.

5.3.   Determinarea triptofanului total (hidrolizat)

Se cântăresc cu o abatere de 0,2 mg între 0,1 şi 1 g din eşantionul preparat (5.1) într-un vas de polipropilenă (4.4). Porţia de eşantion cântărit are un conţinut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaugă 8,4 g de hidroxid de bariu octahidrat (3.4) şi 10 ml de apă. Se amestecă într-un mixer Vortex (4.8) sau într-un amestecător magnetic (4.7). Magnetul învelit în teflon se lasă în amestec. Se spală pereţii vasului cu 4 ml de apă. Se pune dopul filetat şi se închide vasul neermetic. Se transferă într-o autoclavă (4.6) cu apă clocotită şi se expun la vapori de apă timp de 30-60 minute. Se închide autoclava şi se autoclavează la 110 (± 2) oC timp de 20 de ore.

Înainte de a deschide autoclava se reduce temperatura la o valoare imediat sub 100 oC. Pentru a se evita cristalizarea Ba(OH)2·8H2O, se adaugă la amestecul cald 30 ml apă la temperatura camerei. Se agită sau se amestecă uşor. Se adaugă 2 ml din soluţia concentrată de etalon intern (α-metil-triptofan) (3.16). Se răcesc vasele într-o baie de apă/gheaţă timp de 15 minute.

Apoi, se adaugă 5 ml de acid ortofosforic (3.14). Se menţine vasul în baia de răcire şi se neutralizează cu HCl (3.11) amestecând continuu, apoi se ajustează pH-ul la valoarea 3 utilizând HCl (3.12). Se adaugă suficient metanol pentru a obţine o concentraţie de metanol în volumul final de 10-30 %. Se transferă într-un balon gradat de volum corespunzător şi se diluează cu apă până la volumul definit necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adăugarea de metanol nu provoacă precipitare.

Se filtrează câţiva ml de soluţie printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,45 μm (4.5) înainte de a se injecta în coloana HPLC. Se trece la etapa de cromatografie conform punctului 5.4.

Soluţia etalon şi hidrolizatele se protejează de lumina solară directă. Dacă analizarea hidrolizatelor nu este posibilă în aceeaşi zi, ele pot fi depozitate la 5 oC, cel mult 3 zile.

5.4.   Determinarea prin HPLC

Următoarele condiţii pentru eluţia izocratică sunt oferite în scop orientativ; se pot aplica alte condiţii cu condiţia ca acestea să determine rezultate echivalente (a se vedea, de asemenea, observaţiile de la punctele 9.1 şi 9.2):

Coloană pentru cromatografie lichidă (4.2):	125 mm × 4 mm, C18, particule de 3 μm sau echivalent
Temperatura coloanei:	Temperatura camerei
Faza mobilă (3.22):	3 g acetic acid (3.18) + 900 ml apă (3.1) + 50 ml soluţie (3.21) de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol (3.19) în metanol (3.8) (1 g/100 ml). Se ajustează pH-ul la valoarea 5 utilizând etanolamină (3.20). Se completează până la 1 000 ml cu apă (3.1)
Rata fluxului:	1 ml/minut
Timpul total de desfăşurare:	aproximativ 34 min
Lungimea undei de detecţie:	excitare: 280 nm, emisie: 356 nm.
Volum de injectare	20 μl

6.   Calculul rezultatelor

Se calculează cantitatea de triptofan (X), în g per 100 g de eşantion.

A	=	aria vârfului etalonului intern, soluţia etalon de calibrare (3.17);
B	=	suprafaţa vârfului pentru triptofan, extract (5.2) sau hidrolizat (5.3);
V1	=	volumul în ml (2 ml) al soluţiei concentrate de triptofan (3.15) adăugată la soluţia de calibrare (3.17);
c	=	concentraţia în μmol/ml (= 2,50) a soluţiei concentrate de triptofan (3.15) adăugată la soluţia de calibrare (3.17);
V2	=	volumul în ml al soluţiei etalon intern concentrate (3.16) adăugată la extract (5.2) (= 5 ml) sau la hidrolizat (5.3) (= 2 ml);
C	=	aria vârfului etalonului intern, extract (5.2) sau hidrolizat (5.3);
D	=	aria vârfului pentru triptofan, soluţia etalon de calibrare (3.17);
V3	=	volumul în ml (= 2 ml) al soluţiei de etalon intern concentrate (3.16) adăugată la soluţia etalon de calibrare (3.17);
m	=	greutatea eşantionului în g (corectată pentru a obţine greutatea originală dacă produsul este uscat şi/sau degresat);
M	=	masa molară a triptofanului (= 204,23 g/mol).

7.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 10 % din rezultatul cel mai mare.

8.   Rezultatele unui studiu colaborativ

S-a efectuat un studiu comunitar colaborativ (a 4-a comparaţie între laboratoare) în care au fost analizate trei eşantioane de către 12 laboratoare pentru a certifica metoda de hidroliză. Fiecare eşantion a fost supus la cinci analize. Rezultatele sunt prezentate în tabelul următor:

	Eşantion 1 Furaje pentru porci	Eşantion 2 Furaje pentru porci suplimentate cu L-triptofan	Eşantion 3 Furaje concentrate pentru porci
L	12	12	12
n	50	55	50
Medie (g/kg)	2,42	3,40	4,22
sr (g/kg)	0,05	0,05	0,08
r (g/kg)	0,14	0,14	0,22
CVr (%)	1,9	1,6	1,9
SR (g/kg)	0,15	0,20	0,09
R (g/kg)	0,42	0,56	0,25
CVR (%)	6,3	6,0	2,2

L	=	numărul de laboratoare care au transmis rezultate;
n	=	numărul de rezultate individuale reţinute după eliminarea extremelor (identificate prin testele Cochran, Dixon pentru extreme);
sr	=	devierea standard a repetabilităţii;
SR	=	devierea standard a reproductibilităţii;
r	=	repetabilitate;
R	=	reproductibilitate;
CVr	=	coeficientul de variaţie al repetabilităţii, %;
CVR	=	coeficientul de variaţie al reproductibilităţii, %.

S-a efectuat un alt studiu comunitar colaborativ (a 3-a comparaţie între laboratoare) în care au fost analizate două eşantioane de către 13 laboratoare pentru a certifica metoda de extracţie a triptofanului liber. Fiecare eşantion a fost supus la cinci analize. Rezultatele sunt prezentate în tabelul următor:

	Eşantion 4 Amestec de grâu cu soia	Eşantion 5 Amestec de grâu cu soia (= eşantion 4) adăugat cu triptofan (0,457 g/kg)
L	12	12
n	55	60
Medie (g/kg)	0,391	0,931
sr (g/kg)	0,005	0,012
r (g/kg)	0,014	0,034
CVr (%)	1,34	1,34
SR (g/kg)	0,018	0,048
R (g/kg)	0,050	0,134
CVR (%)	4,71	5,11

L	=	numărul de laboratoare care au transmis rezultate;
n	=	numărul de rezultate individuale reţinute după eliminarea extremelor (identificate prin testele Cochran, Dixon pentru extreme);
sr	=	devierea standard a repetabilităţii;
SR	=	devierea standard a reproductibilităţii;
r	=	repetabilitate;
R	=	reproductibilitate;
CVr	=	coeficientul de variaţie al repetabilităţii, %;
CVR	=	coeficientul de variaţie al reproductibilităţii, %.

S-a efectuat un alt studiu comunitar de comparaţie între laboratoare în care au fost analizate patru eşantioane de către 7 laboratoare cu scopul de a certifica metoda de hidroliză pentru triptofan. Rezultatele sunt prezentate mai jos. Fiecare eşantion a fost supus la cinci analize.

	Eşantion 1 Furaje mixte pentru porci (CRM 117)	Eşantion 2 Făină de peşte cu conţinut mic de grăsimi (CRM 118)	Eşantion 3 Făină din soia (CRM 119)	Eşantion 4 Lapte praf degresat (CRM 120)
L	7	7	7	7
n	25	30	30	30
Medie (g/kg)	2,064	8,801	6,882	5,236
sr (g/kg)	0,021	0,101	0,089	0,040
r (g/kg)	0,059	0,283	0,249	0,112
CVr (%)	1,04	1,15	1,30	0,76
SR (g/kg)	0,031	0,413	0,283	0,221
R (g/kg)	0,087	1,156	0,792	0,619
CVR (%)	1,48	4,69	4,11	4,22

L	=	numărul de laboratoare care au transmis rezultate;
n	=	numărul de rezultate individuale reţinute după eliminarea extremelor (identificate prin testele Cochran, Dixon pentru extreme);
sr	=	devierea standard a repetabilităţii;
SR	=	devierea standard a reproductibilităţii;
r	=	repetabilitate;
R	=	reproductibilitate;
CVr	=	coeficientul de variaţie al repetabilităţii, %;
CVR	=	coeficientul de variaţie al reproductibilităţii, %.

9.   Observaţii

9.1.

Respectarea următoarelor condiţiile speciale de cromatografie poate conduce la o mai bună separare a triptofanului de α-metil-triptofan. Eluţie izocratică urmată de curăţarea coloanei prin gradient: Coloană pentru cromatografie lichidă: 125 mm × 4 mm, C18, particule de 5 μm sau echivalent Temperatura coloanei: 32 oC Faza mobilă: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V + V). B: Metanol Programul gradientului: 0 minute 100 % A 0 % B   15 minute 100 % A 0 % B   17 minute 60 % A 40 % B   19 minute 60 % A 40 % B   21 minute 100 % A 0 % B   33 minute 100 % A 0 % B Rata fluxului: 1,2 ml/minut Timpul total de desfăşurare: aproximativ 33 minute.

9.2.

Cromatografia variază în funcţie de tipul de HPLC şi de materialul utilizat la umplerea coloanei. Sistemul ales trebuie să fie capabil să stabilească o separare iniţială de referinţă între triptofan şi etalonul intern. În plus, este important ca produşii de degradare să fie bine separaţi de triptofan şi de etalonul intern. Se efectuează o operaţie de probă pe hidrolizate fără etalon intern pentru a verifica prezenţa impurităţilor la nivelul liniei de bază corespunzătoare etalonului intern. Este important ca durata eluţiei pentru toţi produşii de degradare să fie suficient de lungă, altfel prezenţa unor vârfuri de eluţie întârziate poate interfera cu operaţiile ulterioare de cromatografie. În cursul operaţiilor, sistemul cromatografic oferă un răspuns linear. Acest răspuns linear se măsoară în condiţii de concentraţie constantă (normalul) a etalonului intern şi de concentraţii variabile a triptofanului. Este important că înălţimea vârfurilor pentru triptofan şi pentru etalonul intern să se situeze în gama lineară a sistemului HPLC/fluorescenţă. Dacă vârfurile pentru triptofan şi/sau pentru etalonul intern sunt prea joase sau prea înalte, analiza se repetă cu un eşantion de o altă dimensiune şi/sau un volum final modificat.

9.3.	Hidroxid de bariu Cu timpul, hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat. Aceasta generează o soluţie lipsită de limpezime pentru determinarea HPLC, ceea ce poate duce la rezultate slabe pentru triptofan.

H.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE ULEIURI ȘI GRĂSIMI BRUTE

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Prezenta metodă este destinată determinării în furaje a conţinutului de uleiuri şi grăsimi brute. Ea nu este aplicabilă analizării seminţelor şi fructelor oleaginoase.

Utilizarea celor două proceduri descrise mai jos depinde de natura şi compoziţia furajului şi de motivul efectuării analizei.

1.1.   Procedura A – Uleiuri şi grăsimi brute care pot fi extrase direct

Această metodă este aplicabilă materiilor prime furajere de origine vegetală, cu excepţia celor incluse în sfera de aplicare a procedeului B.

1.2.   Procedura B – Uleiuri şi grăsimi brute totale

Această metodă este aplicabilă materiilor prime furajere de origine animală şi tuturor furajelor combinate. Ea trebuie folosită pentru toate materiile din care uleiurile şi grăsimile nu pot fi extrase complet fără hidroliză prealabilă (de exemplu, gluten, drojdie, proteine din cartofi şi produse supuse unor procese cum ar fi extrudarea, transformarea în fulgi şi încălzirea).

1.3.   Interpretarea rezultatelor

În toate cazurile în care se obţine un rezultat superior folosind procedura B comparativ cu cel obţinut prin folosirea procedurii A, rezultatul obţinut prin procedura B se acceptă ca valoarea reală.

2.   Principiu

2.1.   Procedura A

Eşantionul se extrage cu eter de petrol. Solventul se îndepărtează prin distilare, iar reziduul se usucă şi se cântăreşte.

2.2.   Procedura B

Eşantionul se tratează la cald cu acid clorhidric. Amestecul se răceşte şi se filtrează. Reziduul se spală şi se usucă, apoi se supune determinării în conformitate cu procedura A.

3.   Reactivi

3.1.	Eter de petrol, interval de fierbere: 40-60 oC. Indicele de brom trebuie să fie mai mic de 1, iar reziduul după evaporare sub 2 mg/100 ml.

3.2.	Sulfat de sodiu, anhidru.

3.3.	Acid clorhidric, c = 3 mol/l.

3.4.	Agent de filtrare, de exemplu Kieselguhr, Hyflo-supercel.

4.   Aparatură

4.1.	Aparat de extracţie. Dacă este dotat cu un sifon (aparat Soxhlet), rata refluxului este astfel încât să producă aproximativ 10 cicluri pe oră; dacă aparatul este de tip fără sifon, rata refluxului este de aproximativ 10 ml pe minut.

4.2.	Cartuşe de extracţie, lipsite de materie solubilă în eter de petrol şi cu o porozitate compatibilă cu cerinţele de la punctul 4.1.

4.3.	Cuptor de uscare, fie cu vid reglat la 75 ± 3 oC, fie cu aer reglat la 100 ± 3 oC.

5.   Procedură

5.1.   Procedura A (a se vedea punctul 8.1)

Se cântăresc 5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg, se transferă într-un cartuş de extracţie (4.2) şi se acoperă cu un tampon de vată lipsit de grăsimi.

Cartuşul se introduce într-un extractor (4.1) şi se extrage timp de şase ore cu eter de petrol (3.1). Se colectează extractul de eter de petrol într-un vas uscat şi cântărit, care conţine fragmente de piatră ponce (2).

Solventul se îndepărtează prin distilare. Se usucă reziduul, păstrând vasul timp de o oră şi jumătate în cuptorul de uscare (4.3). Se lasă să se răcească într-un desicator şi se cântăreşte. Se usucă din nou timp de 30 minute pentru a asigura că greutatea uleiurilor şi grăsimilor rămâne constantă (pierderea de greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 1 mg).

5.2.   Procedura B

Se cântăresc 2,5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg (a se vedea punctul 8.2), se introduc într-un pahar de laborator de 400 ml sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 300 ml şi se adaugă 100 ml de acid clorhidric (3.3) şi fragmente de piatră ponce. Se acoperă paharul de laborator cu o sticlă de ceas sau se conectează un condensator cu reflux la flaconul tip Erlenmeyer. Se aduce amestecul la fierbere uşoară deasupra unei flăcări mici sau pe o plită şi se păstrează în această stare timp de o oră. Trebuie să se împiedice lipirea produsului de părţile laterale ale recipientului.

Se răceşte şi se adaugă o cantitate de adjuvant de filtrare (3.4) suficientă pentru a evita orice pierdere de ulei şi grăsime în timpul filtrării. Se filtrează printr-un filtru de hârtie dublă, umezită şi lipsită de grăsimi. Se spală reziduul în apă rece până se obţine un filtrat neutru. Se verifică filtratul ca să nu conţină deloc uleiuri şi grăsimi. Prezenţa acestora indică faptul că eşantionul trebuie extras cu eter de petrol, folosind procedura A, înainte de hidroliză.

Se aşează filtrul de hârtie dublă care conţine reziduul pe o sticlă de ceas şi se usucă timp de o oră şi jumătate în cuptorul cu aer (4.3) la 100 ± 3 oC.

Se aşează filtrul de hârtie dublă care conţine reziduul uscat într-un cartuş de extracţie (4.2) şi se acoperă cu un tampon de vată lipsit de grăsimi. Cartuşul se introduce într-un extractor (4.1) şi se procedează astfel cum se indică la paragrafele doi şi trei de la punctul 5.1.

6.   Exprimarea rezultatului

Greutatea reziduului se exprimă ca procent din eşantion.

7.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion de acelaşi laborant nu depăşesc:

—	0,2 % în valoare absolută, pentru un conţinut în uleiuri şi grăsimi brute mai mic de 5 %;

—	4 % relativ la rezultatul cel mai mare pentru un conţinut cuprins între 5 şi 10 %;

—	0,4 % în valoare absolută, pentru un conţinut mai mare de 10 %.

8.   Observaţii

8.1.

Pentru produse cu un conţinut mare de uleiuri şi grăsimi, care sunt dificil de măcinat sau care sunt improprii prelevării unui eşantion de testare redus omogen, se procedează după cum urmează. Se cântăresc 20 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se amestecă cu o cantitate de 10 g sau mai mare de sulfat de sodiu anhidru (3.2). Se extrage cu eter de petrol (3.1) astfel cum se indică la punctul 5.1. Se completează extractul obţinut până la 500 ml cu eter de petrol (3.1) şi se amestecă. Se iau 50 ml de soluţie şi se introduc într-un vas mic, uscat şi cântărit, care conţine fragmente de piatră ponce. Se elimină solventul prin distilare, se usucă şi se procedează astfel cum se indică la ultimul paragraf al punctului 5.1. Se elimină solventul din reziduul de extracţie rămas în cartuş, se macină reziduul până la o fineţe de 1 mm, se reintroduce în cartuşul de extracţie (nu se adaugă sulfat de sodiu) şi se procedează astfel cum se indică la punctul 5.1, paragrafele doi şi trei. Conţinutul de uleiuri şi grăsimi se calculează ca procent din eşantion folosind următoarea formulă: (10 m1 + m2) × 5 unde: m1 = greutatea în grame a reziduului după prima extracţie (parte alicotă din extract); m2 = greutatea în grame a reziduului după a doua extracţie.

8.2.	Pentru produsele cu conţinut mic de uleiuri şi grăsimi, masa eşantionului de testat se poate mări la 5 g.

8.3.	Este posibil ca, înainte de hidroliză şi extracţie, hrana pentru animalele de companie cu conţinut mare de apă să trebuiască să fie amestecată cu sulfat de sodiu anhidru, conform procedurii B.

8.4.	La punctul 5.2, poate fi mai eficientă folosirea apei calde în locul apei reci pentru spălarea reziduului după filtrare.

8.5.	Este posibil ca timpul de uscare de 1,5 h să necesite a fi prelungit pentru unele furaje. Uscarea excesivă se evită, întrucât acest fapt poate determina rezultate slabe. Se poate folosi, de asemenea, un cuptor cu microunde.

8.6.	Preextracţia prin procedura A înainte de hidroliză şi de reextracţie prin procedura B se recomandă în cazul în care conţinutul de uleiuri/grăsimi brute este mai mare de 15 %. Într-o anumită măsură, acest fapt depinde de natura furajului şi de natura uleiurilor/grăsimilor din furaj.

I.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE FIBRE BRUTE

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a substanţelor organice lipsite de grăsimi care sunt insolubile în mediu acid şi alcalin şi care sunt descrise în mod convenţional ca fibre brute.

2.   Principiu

Eşantionul, degresat la nevoie, se tratează succesiv cu soluţii de acid sulfuric şi hidroxid de potasiu, de concentraţii specifice, în stare de fierbere. Reziduul se separă prin filtrare printr-un filtru de sticlă sinterizată spălat, uscat, cântărit şi calcinat la o temperatură cuprinsă între 475 şi 500 oC. Pierderea de greutate rezultată prin calcinare corespunde fibrelor brute din eşantionul testat.

3.   Reactivi

3.1.	Acid sulfuric, c = 0,13 mol/l.

3.2.	Agent antispumant (de exemplu n-octanol).

3.3.	Agent de filtrare (Celite 545 sau echivalent), încălzit la 500 oC timp de patru ore (8.6).

3.4.

Acetonă.

3.5.	Eter de petrol cu interval de fierbere între 40 şi 60 oC.

3.6.	Acid clorhidric, c = 0,5 mol/l.

3.7.	Soluţie de hidroxid de potasiu, c = 0,23 mol/l.

4.   Aparatură

4.1.

Unitate de încălzire pentru dizolvare cu acid sulfuric şi soluţie de hidroxid de potasiu, echipată cu un suport pentru creuzetul filtrant (4.2) şi dotată cu un tub de evacuare prevăzut cu un dop la orificiul de ieşire pentru lichide şi de creare de vid, posibil şi cu aer comprimat. Înainte de fiecare utilizare zilnică, unitatea se preîncălzeşte cu apă aflată în stare de fierbere, timp de 5 minute.

4.2.	Creuzet filtrant de sticlă cu placă filtrantă de sticlă sinterizată fuzionată, cu pori de 40-90 μm. Înainte de prima utilizare se încălzeşte la 500 oC timp de câteva minute, iar apoi se răceşte (8.6).

4.3.	Cilindru de cel puţin 270 ml cu condensator cu reflux, care poate fi supus fierberii.

4.4.	Cuptor de uscare, cu termostat.

4.5.	Cuptor cu muflă, cu termostat.

4.6.	Unitate de extracţie compusă dintr-o placă de sprijin pentru creuzetul filtrant (4.2) şi cu o ţeavă de evacuare prevăzută cu un dop la orificiul de creare de vid şi de ieşire a lichidelor.

4.7.	Inele de conectare utilizate pentru a asambla unitatea de încălzire (4.1), creuzetul (4.2) şi cilindrul (4.3), precum şi pentru a conecta unitatea de extracţie la rece (4.6) cu creuzetul.

5.   Procedură

Se cântăreşte 1 g de eşantion preparat cu o abatere de 1 mg şi se introduce în creuzet (4.2), (a se vedea observaţiile 8.1, 8.2 şi 8.3) şi se adaugă 1 g de adjuvant de filtrare (3.3).

Se asamblează unitatea de încălzire (4.1) şi creuzetul filtrant (4.2), apoi se ataşează cilindrul (4.3) la creuzet. Se toarnă 150 ml de acid sulfuric aflat în stare de fierbere (3.1) în ansamblul cilindru-creuzet şi, dacă este necesar, se adaugă câteva picături de agent antispumant (3.2).

Se aduce lichidul la fierbere în decurs de 5 ± 2 minute şi se fierbe viguros exact 30 de minute.

Se deschide dopul ţevii de evacuare (4.1) şi, în condiţii de vid, se filtrează acidul sulfuric prin creuzetul filtrant, apoi se spală reziduul cu trei porţii consecutive de 30 ml de apă aflată în stare de fierbere, asigurându-se că reziduul se filtrează uscat după fiecare spălare.

Se închide dopul orificiului de evacuare şi se toarnă 150 ml de soluţie de hidroxid de potasiu aflată în stare de fierbere (3.7) în ansamblul cilindru-creuzet, apoi se adaugă câteva picături de agent antispumant (3.2). Se aduce lichidul la punctul de fierbere în decurs de 5 ± 2 minute şi se fierbe viguros exact 30 de minute. Se filtrează şi se repetă procedura de spălare utilizată în etapa cu acid sulfuric.

După spălarea şi uscarea finală, se deconectează creuzetul împreună cu conţinutul său şi se reconectează la unitatea de extracţie la rece (4.6). Se creează vidul, iar reziduul se spală în creuzet cu trei porţii consecutive de acetonă de 25 ml (3.4), asigurându-se că reziduul se filtrează în starea uscată după fiecare spălare.

Creuzetul se usucă în cuptor la 130 oC până se ajunge la o greutate constantă. După fiecare uscare, se răceşte în desicator şi se cântăreşte rapid. Se introduce creuzetul într-un cuptor cu muflă şi se calcinează până se atinge o greutate constantă (pierderea de greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 2 mg) la o temperatură cuprinsă între 475 oC şi 500 oC timp de cel puţin 30 de minute.

După fiecare încălzire, înainte de cântărire se răceşte mai întâi în cuptor, iar apoi în desicator.

Se efectuează un test martor fără eşantion. Pierderea de greutate rezultată din calcinare nu trebui să depăşească 4 mg.

6.   Calculul rezultatelor

Conţinutul de fibre brute exprimat ca procent din eşantion este dat de formula:

unde:

m	=	greutatea eşantionului în g;
m0	=	pierderea de greutate după calcinare în cursul determinării, în g;
m1	=	pierderea de greutate după calcinare în cursul testului martor, în g.

7.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:

—	0,6 % în valoare absolută pentru un conţinut de fibre brute mai mic de 10 %;

—	6 % relativ la rezultatul mai mare, pentru un conţinut de fibre brute egal sau mai mare de 10 %.

8.   Observaţii

8.1.

Furajele care au conţinut de grăsimi brute mai mare de 10 % trebuie să fie degresate înainte de a fi supuse analizei cu eter de petrol (3.5). Creuzetul filtrant (4.2) împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de extracţie la rece (4.6) şi se creează vidul, apoi se spală reziduul cu trei porţii consecutive de eter de petrol de 30 ml, asigurându-se că reziduul este uscat. Creuzetul împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de încălzire (4.1) şi se continuă astfel cum se descrie la punctul 5.

8.2.

Furajele care conţin grăsimi care nu pot fi extrase direct cu eter de petrol (3.5) trebuie degresate astfel cum se indică la punctul 8.1 şi degresate încă o dată după fierbere cu acid. După fierbere cu acid şi spălare consecutivă, creuzetul împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de extracţie la rece (4.6), apoi se spală de trei ori cu 30 ml acetonă, urmat de trei spălări suplimentare cu porţii de eter de petrol de 30 ml. Se filtrează sub vid până la uscare, iar analizarea se continuă astfel cum se descrie la punctul 5, începând cu tratamentul cu hidroxid de potasiu.

8.3.

Dacă furajul conţine mai mult de 5 % carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu, se conectează creuzetul (4.2) împreună cu eşantionul cântărit la unitatea de încălzire (4.1). Eşantionul se spală de trei ori cu 30 ml acid clorhidric (3.6). După fiecare adăugare, se lasă eşantionul să stea timp de aproximativ 1 minut înainte de filtrare. Se spală o singură dată cu 30 ml apă, iar apoi se continuă astfel cum se descrie la punctul 5.

8.4.	Dacă se utilizează aparatură în formă de stativ (o serie de creuzete ataşate la aceeaşi unitate de încălzire) nu se efectuează două determinări individuale pe acelaşi eşantion de analizat în aceeaşi serie.

8.5.	Dacă după fierbere este dificil să se filtreze soluţiile acide şi alcaline, se utilizează aer comprimat introdus prin ţeava de evacuare a unităţii de încălzire şi apoi se continuă filtrarea.

8.6.	Temperatura de calcinare nu depăşeşte 500 oC pentru a se putea prelungi timpul de utilizare a sticlei creuzetului filtrant. Trebuie acordată atenţie pentru a se evita şocurile termice excesive în cursul ciclurilor de încălzire şi răcire.

J.   DETERMINAREA ZAHARURILOR

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea cantităţii de zaharuri reductoare şi a zaharurilor totale după inversie, exprimate ca glucoză sau, acolo unde este cazul, ca zaharoză, prin conversie cu factorul 0,95. Ea este aplicabilă furajelor combinate. Pentru alte tipuri de furaje există metode specifice. Dacă este necesar, lactoza se determină separat, ţinându-se cont de aceasta la calcularea rezultatelor.

2.   Principiu

Zaharurile se extrag în etanol diluat; soluţia se limpezeşte cu soluţii Carrez I şi II. După eliminarea etanolului, cantităţile pre- şi post-inversie se determină prin metoda Luff-Schoorl.

3.   Reactivi

3.1.	Soluţie de etanol cu concentraţie de 40 % (v/v): 0,948 g/ml la 20 oC, neutralizată cu fenolftaleină.

3.2.	Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2·2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.3.	Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4Fe(CN)6·3H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4.	Metiloranj, soluţie 0,1 % (greutate/volum).

3.5.	Acid clorhidric 4 mol/litru.

3.6.	Acid clorhidric 0,1 mol/litru.

3.7.	Soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.

3.8.

Reactiv Luff-Schoorl: Amestecând cu grijă, se toarnă soluţia de acid citric (3.8.2) în soluţia de carbonat de sodiu (3.8.3). Se adaugă soluţia de sulfat de cupru (3.8.1) şi se completează până la 1 litru cu apă. Se lasă la decantare peste noapte şi se filtrează. Se verifică concentraţia reactivului obţinut astfel (Cu 0,05 mol/litru; Na2CO3 1 mol/litru), a se vedea (5.4) ultimul paragraf. ph-ul soluţiei este aproximativ 9,4.

3.8.1.

Soluţie de sulfat de cupru: se dizolvă 25 g de sulfat de cupru, CuSO4·5 H2O, lipsită de fier, în 100 ml de apă.

3.8.2.

Soluţie de acid citric: se dizolvă 50 g de acid citric, C6H8O7·H2O, în 50 ml de apă.

3.8.3.

Soluţie de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru în aproximativ 300 ml de apă caldă. Se lasă să se răcească.

3.9.	Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.

3.10.

Soluţie de amidon: se adaugă un amestec de 5 g de amidon solubil cu 30 ml de apă la un litru de apă în stare de fierbere. Se fierbe timp de 3 minute, se lasă să se răcească şi, dacă este necesar, se adaugă 10 mg de iodură de mercur ca agent de conservare.

3.11.

Acid sulfuric 3 mol/litru.

3.12.

Iodură de potasiu, soluţie 30 % (greutate/volum).

3.13.

Granule de piatră ponce fierte în acid clorhidric, spălate în apă şi uscate.

3.14.

3-metilbutan-l-ol.

4.   Aparatură

Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

5.   Procedură

5.1.   Extracţia eşantionului

Se cântăresc 2,5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se introduc într-un balon gradat de 250 ml. Se adaugă 200 ml etanol (3.1) şi se amestecă timp de o oră în agitator. Se adaugă 5 ml de soluţie Carrez I (3.2) şi se amestecă timp de aproximativ 30 de secunde. Se adaugă aproximativ 5 ml de soluţie Carrez II (3.3) şi se amestecă din nou timp de un minut. Se completează până la volum cu etanolul (3.1), se omogenizează şi se filtrează. Se îndepărtează 200 ml de filtrat şi se evaporă până la aproximativ jumătate din volum în scopul eliminării majorităţii etanolului. Reziduul rămas după evaporare se transferă cantitativ într-un balon gradat de 200 ml cu ajutorul apei calde, se răceşte, se completează până la volum cu apă, se omogenizează şi, dacă este necesar, se filtrează. Această soluţie se va utiliza pentru determinarea cantităţii zaharurilor reductoare şi, după inversie, a zaharurilor totale.

5.2.   Determinarea zaharurilor reductoare

Cu ajutorul unei pipete se îndepărtează maximum 25 ml din soluţia care conţine mai puţin de 60 mg de zaharuri reductoare exprimate ca glucoză. Dacă este necesar, se completează până la 25 ml cu apă distilată şi se determină conţinutul în zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul se exprimă sub formă de conţinut procentual de glucoză în eşantion.

5.3.   Determinarea zaharurilor totale după inversie

Cu ajutorul unei pipete se recoltează 50 ml de soluţie şi se transferă într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă câteva picături de soluţie de metiloranj (3.4), apoi, amestecând continuu, se adaugă cu grijă acid clorhidric (3.5) până când lichidul virează într-un roşu bine definit. Se adaugă 15 ml de acid clorhidric (3.6), se scufundă balonul într-o baie de apă clocotindă şi se menţine acolo timp de 30 de minute. Se răceşte rapid la aproximativ 20 oC şi se adaugă 15 ml de soluţie de hidroxid de sodiu (3.7). Se completează cu apă până la 100 ml şi se omogenizează. Se îndepărtează maximum 25 ml din soluţia care conţine mai puţin de 60 mg de zaharuri reductoare exprimate ca glucoză. Dacă este necesar, se completează până la 25 de ml cu apă distilată şi se determină conţinutul în zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul se exprimă în procente de glucoză sau, dacă este cazul, de zaharoză, prin multiplicare cu factorul 0,95.

5.4.   Titrare prin metoda Luff-Schoorl

Cu ajutorul unei pipete se recoltează 25 ml de reactiv Luff-Schoorl (3.8) şi se transferă într-un flacon Erlenmeyer de 300 ml; se adaugă exact 25 ml din soluţia de zaharuri limpezită. Se adaugă 2 granule de piatră ponce (3.13), se încălzeşte, amestecând manual, deasupra unei flăcări libere cu înălţime medie, aducându-se lichidul la fierbere în aproximativ 2 minute. Flaconul Erlenmeyer se aşează imediat pe o plasă de sârmă acoperită cu azbest având un orificiu cu diametru de aproximativ 6 cm sub care există o flacără aprinsă. Flacăra se reglează astfel încât să se încălzească doar baza flaconului Erlenmeyer. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux. Se fierbe exact zece minute. Se răceşte imediat în apă rece şi, după aproximativ 5 minute, se titrează după cum urmează:

Se adaugă 10 ml de soluţie de iodură de potasiu (3.12) şi, imediat după aceea (cu grijă, din cauza riscului formării unei spume abundente), se adaugă 25 ml de acid sulfuric (3.11). Se titrează în continuare cu soluţie de tiosulfat de sodiu (3.9) până la apariţia unei coloraturi galben şters, adăugând ca indicator soluţia de amidon (3.10) şi încheind titrarea.

Se efectuează aceeaşi titrare pe un amestec de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl (3.8) cu 25 ml de apă, măsurat cu precizie, după ce s-au adăugat 10 ml de soluţie de iodură de potasiu (3.12) şi 25 ml de acid sulfuric (3.11), fără a se fierbe.

6.   Calculul rezultatelor

Utilizând tabelul, se stabileşte cantitatea de glucoză în mg care corespunde diferenţei dintre valorile celor două titrări, exprimate în mg de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru. Rezultatele se exprimă ca procent din eşantion.

7.   Proceduri speciale

7.1.

În cazul furajelor bogate în melase şi al altor furaje care nu sunt în mod particular omogene, se cântăresc 20 g şi se introduc, împreună cu 500 ml de apă, într-un balon gradat de 1 litru. Se amestecă timp de o oră în agitator. Se limpezeşte cu ajutorul reactivilor Carrez I (3.2) şi II (3.3) astfel cum se descrie la punctul 5.1, utilizând, de data aceasta, o cantitate de patru ori mai mare din fiecare reactiv. Se completează până la volum cu etanol 80 % (v/v). Se omogenizează şi se filtrează. Se elimină etanolul astfel cum se descrie la punctul 5.1. În absenţa amidonului dextrinizat, se completează până la volum cu apă distilată.

7.2.

În cazul melaselor şi al materiilor prime pentru furaje bogate în zaharuri şi cvasi lipsite de amidon (roşcove, fulgi de rădăcină de sfeclă uscaţi etc.), se cântăresc 5 g, se introduc într-un balon gradat de 250 ml, se adaugă 200 ml apă distilată şi se amestecă în agitator timp de o oră sau, dacă este necesar, mai mult. Se limpezeşte cu ajutorul reactivilor Carrez I (3.2) şi II (3.3) astfel cum se descrie la punctul 5.1. Se completează până la volum cu apă rece, se omogenizează şi se filtrează. Pentru determinarea cantităţii totale de zaharuri, se continuă astfel cum se descrie la punctul 5.3.

8.   Observaţii

8.1.	În scopul prevenirii formării de spumă este recomandabil să se adauge (indiferent de volum) aproximativ 1 ml de 3-metilbutan-l-ol (3.14) înainte de fierbere cu reactiv Luff-Schoorl.

8.2.	Diferenţa dintre conţinutul total de zaharuri după inversie exprimat ca glucoză şi conţinutul de zaharuri reductoare exprimat ca glucoză, multiplicată cu 0,95, reprezintă conţinutul procentual de zaharoză.

8.3.	Pentru a determina conţinutul de zaharuri reductoare, cu excepţia lactozei, se pot adopta două metode:

8.3.1.

Pentru un calcul aproximativ, conţinutul de lactoză stabilit printr-o metodă de analiză diferită se multiplică cu 0,675, iar rezultatul obţinut se scade din conţinutul de zaharuri reductoare.

8.3.2.

Pentru un calcul precis al zaharurilor reductoare, cu excepţia lactozei, se utilizează acelaşi eşantion în cele două determinări finale. Una dintre analize se efectuează pe o parte din soluţia obţinută în conformitate cu punctul 5.1, alta pe o parte din soluţia obţinută în cursul determinării lactozei prin metoda stabilită în acest sens (după fermentarea celorlalte tipuri de zaharuri şi limpezire). În ambele cazuri, cantitatea de zaharuri prezentă se determină prin metoda Luff-Schoorl şi se calculează în mg de glucoză. Una dintre valori se scade din cealaltă, iar diferenţa se exprimă ca procent din eşantion. Exemplu Cele două volume considerate corespund, pentru fiecare determinare, unui eşantion de 250 mg. În primul caz, se consumă 17 ml de soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru, ceea ce corespunde la 44,2 mg de glucoză; în al doilea, 11 ml, ceea ce corespunde la 27,6 mg de glucoză. Diferenţa este 16,6 mg de glucoză. Prin urmare, conţinutul de zaharuri reductoare (cu excepţia lactozei), calculat ca glucoză, este:

Tabel de valori pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl

ml de Na2S2O30,1 mol/litru, două minute încălzire, zece minute fierbere

Na2S2O3 0,1 mol/litru	Glucoză, fructoză zaharuri invertite C6H12O6		Lactoză C12H22O11		Maltoză C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/litru
ml	mg	diferenţă	mg	diferenţă	mg	diferenţă	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

K.   DETERMINAREA LACTOZEI

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea conţinutului de lactoză în furajele care au un conţinut de lactoză mai mare de 0,5 %.

2.   Principiu

Zaharurile se dizolvă în apă. Soluţia este supusă fermentaţiei de către drojdia Saccharomyces cerevisiae care nu descompune lactoza. După limpezire şi filtrare, conţinutul de lactoză al filtratului se determină prin metoda Luff-Schoorl.

3.   Reactivi

3.1.	Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: se suspendă 25 g de drojdie proaspătă în 100 ml de apă. Suspensia se păstrează în frigider o perioadă de maximum o săptămână.

3.2.	Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)2·2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.3.	Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN)6×3H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4.

Reactiv Luff-Schoorl: Amestecând cu grijă, se toarnă soluţie de acid citric (3.4.2) în soluţia de carbonat de sodiu (3.4.3). Se adaugă soluţia de sulfat de cupru (3.4.1) şi se completează până la 1 litru cu apă. Se lasă la decantare peste noapte şi se filtrează. Se verifică concentraţia reactivului obţinut astfel (Cu 0,05 mol/litru; Na2CO3 1 mol/litru). ph-ul soluţiei este aproximativ 9,4.

3.4.1.

Soluţie de sulfat de cupru: se dizolvă 25 de g de sulfat de cupru, CuSO4·5H2O, lipsită de fier, în 100 ml apă.

3.4.2.

Soluţie de acid citric: se dizolvă 50 de g de acid citric, C6H8O7·H2O, în 50 ml de apă.

3.4.3.

Soluţie de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru în aproximativ 300 ml de apă caldă. Se lasă să se răcească.

3.5.	Granule de piatră ponce fierte în acid clorhidric, spălate în apă şi uscate.

3.6.	Iodură de potasiu, soluţie 30 % (greutate/volum).

3.7.	Acid sulfuric 3 mol/litru.

3.8.	Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.

3.9.	Soluţie de amidon: se adaugă un amestec de 5 g de amidon solubil cu 30 ml de apă la un litru de apă în stare de fierbere. Se fierbe timp de 3 minute, se lasă să se răcească şi, dacă este necesar, se adaugă 10 mg de iodură de mercur ca agent de conservare.

4.   Aparatură

Baie de apă cu termostat reglat la 38-40 oC.

5.   Procedură

Se cântăreşte 1 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se introduce într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă 25-30 ml de apă. Balonul se introduce într-o baie de apă aflată la temperatura de fierbere, timp de 30 de minute, apoi se răceşte la aproximativ 35 oC. Se adaugă 5 ml de suspensie de drojdie (3.1) şi se omogenizează. Balonul se lasă să stea timp de două ore într-o baie de apă la temperatura de 38-40 oC. Se răceşte la aproximativ 20 oC.

Se adaugă 2,5 ml de soluţie Carrez I (3.2) şi se amestecă timp de treizeci de secunde, apoi se adaugă 2,5 ml de soluţie Carrrez II (3.3) şi se amestecă din nou timp de treizeci de secunde. Se completează cu apă până la 100 ml, se amestecă şi se filtrează. Cu ajutorul unei pipete, se îndepărtează o cantitate de filtrat care nu depăşeşte 25 ml şi care conţine, de preferinţă, 40-80 mg de lactoză, apoi se transferă într-un flacon Erlenmeyer de 300 ml. Dacă este necesar, se completează cu apă până la 25 ml.

Se efectuează un test martor în acelaşi mod cu 5 ml de suspensie de drojdie (3.1). Se determină conţinutul de lactoză prin metoda Luff-Schoorl, după cum urmează: se adaugă exact 25 ml de reactiv Luff-Schoorl (3.4) şi două granule de piatră ponce (3.5). Se amestecă manual concomitent cu încălzirea deasupra unei flăcări libere de înălţime medie, iar lichidul se aduce la fierbere în aproximativ două minute. Flaconul Erlenmeyer se aşează imediat pe o plasă de sârmă acoperită cu azbest având un orificiu cu diametru de aproximativ 6 cm sub care există o flacără aprinsă. Flacăra se reglează astfel încât să se încălzească doar baza flaconului Erlenmeyer. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux. Se fierbe exact zece minute. Se răceşte imediat în apă rece şi, după aproximativ 5 minute, se titrează după cum urmează:

Se adaugă 10 ml de soluţie de iodură de potasiu (3.6) şi, imediat după aceea (cu grijă, din cauza riscului formării unei spume abundente), se adaugă 25 ml acid sulfuric (3.7). Se titrează cu soluţie de tiosulfat de sodiu (3.8) până la apariţia unei culori galben şters, se adaugă soluţia de amidon (3.9) şi se finalizează titrarea.

Se efectuează aceeaşi titrare pe un amestec de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl (3.4) cu 25 ml de apă, măsurat cu precizie, după ce s-au adăugat 10 ml de soluţie de iodură de potasiu (3.6) şi 25 ml de acid sulfuric (3.7), fără a se fierbe.

6.   Calculul rezultatelor

Utilizând tabelul ataşat, se stabileşte cantitatea de lactoză în mg care corespunde diferenţei dintre rezultatele celor două titrări, exprimate în ml de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.

Rezultatul pentru lactoza anhidră se exprimă ca procent din eşantion.

7.   Observaţie

Pentru produsele care conţin mai mult de 40 % zahăr fermentescibil, se utilizează mai mult de 5 ml de suspensie de drojdie (3.1).

Tabel de valori pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl

ml de Na2S2O30,1 mol/litru, două minute încălzire, zece minute fierbere

Na2S2O3 0,1 mol/litru	Glucoză, fructoză zaharuri invertite C6H12O6		Lactoză C12H22O11		Maltoză C12H22O11		Na2S2O3 0,1 mol/litru
ml	mg	diferenţă	mg	diferenţă	mg	diferenţă	ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23	2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2	2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1	3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0	3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1	3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6	3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6	1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

L.   DETERMINAREA AMIDONULUI

METODA POLARIMETRICĂ

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a conţinutului de amidon şi a produselor de degradare a amidonului cu masă moleculară mare cu scopul de a se verifica conformitatea cu valoarea energetică declarată (prevederile din anexa VII) şi cu Directiva 96/25/CE a Consiliului (3).

2.   Principiu

Metoda cuprinde două determinări. În prima, eşantionul este tratat cu acid clorhidric diluat. După limpezire şi filtrare, se măsoară rotaţia optică a soluţiei prin polarimetrie.

În cea de-a doua, eşantionul este extras cu etanol 40 %. După acidificarea filtratului cu acid clorhidric, limpezire şi filtrare, se măsoară rotaţia optică la fel ca în prima determinare.

Diferenţa dintre cele două măsurători, multiplicată cu un factor cunoscut, oferă conţinutul de amidon al eşantionului.

3.   Reactivi

3.1.	Acid clorhidric, soluţie cu concentraţie 25 % (g/g): 1,126 g/ml.

3.2.	Acid clorhidric, soluţie 1,13 % (greutate/volum) Concentraţia se verifică prin titrare folosind o soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru în prezenţa roşului de metil 0,1 % (greutate/volum) în etanol 94 % (v/v). Pentru neutralizarea a 10 ml sunt necesari 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/litru.

3.3.	Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2·2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.4.	Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN)6·3H2O în apă Se completează cu apă până la 100 ml.

3.5.	Etanol, soluţie cu concentraţie de 40 % (v/v): 0,948 g/ml la 20 oC.

4.   Aparatură

4.1.	Flacon Erlenmeyer de 250 ml cu îmbinare de sticlă şlefuită standard şi cu condensator cu reflux.

4.2.	Polarimetru sau zaharimetru.

5.   Procedură

5.1.   Prepararea eşantionului

Eşantionul se zdrobeşte până când devine suficient de fin pentru a trece complet printr-o sită cu orificii rotunde de 0,5 mm.

5.2.   Determinarea rotaţiei optice totale (P sau S) (a se vedea observaţia de la punctul 7.1)

Se cântăresc 2,5 g din eşantionul zdrobit cu abatere de 1 mg şi se introduc într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă 25 ml de acid clorhidric (3.2), se agită pentru a obţine o distribuţie uniformă a eşantionului de testat şi se adaugă încă 25 ml de acid clorhidric (3.2). Se scufundă balonul într-o baie de apă care fierbe, agitându-se cu putere şi în mod constant în primele trei minute pentru a preveni formarea de aglomerări. Cantitatea de apă din baia de apă trebuie să fie suficientă pentru ca baia să rămână la punctul de fierbere atunci când balonul este introdus în ea. Balonul nu trebuie să fie scos din baie în timp ce este agitat. După exact 15 minute, se scoate din baie, se adaugă 30 ml de apă rece şi se răceşte imediat la 20 oC.

Se adaugă 5 ml de soluţie Carrez I (3.3) şi se agită timp de aproximativ 30 de secunde. Apoi se adaugă 5 ml de soluţie Carrez II (3.4) şi se agită din nou timp de aproximativ 30 de secunde. Se completează cu apă până la volum, se amestecă şi se filtrează. Dacă filtratul nu este perfect limpede (ceea ce se întâmplă rar), se repetă determinarea folosind o cantitate mai mare din soluţiile Carrez I şi II, de exemplu 10 ml.

Se măsoară rotaţia optică a soluţiei într-un tub de 200 mm cu polarimetrul sau cu zaharimetrul.

5.3.   Determinarea rotaţiei optice (P' sau S') a substanţelor solubile în etanol 40 %

Se cântăresc 5 g din eşantion cu abatere de 1 mg, se introduc într-un balon gradat de 100 ml şi se adaugă aproximativ 80 ml de etanol (3.5) (a se vedea observaţia de la punctul 7.2). Se lasă balonul să stea timp de o oră la temperatura camerei; în acest timp, se agită cu putere de şase ori astfel încât eşantionul de testat să se amestece complet cu etanolul. Se completează până la volum cu etanol (3.5), se amestecă şi se filtrează.

Se pipetează 50 ml de filtrat (corespunde la 2,5 g de eşantion) întrun flacon Erlenmeyer de 250 ml, se adaugă 2,1 ml de acid clorhidric (3.1) şi se agită puternic. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux, iar vasul se scufundă într-o baie de apă în fierbere. După exact 15 minute, se scoate flaconul Erlenmeyer din baie, se transferă conţinutul întrun balon gradat de 100 ml, clătind cu puţină apă rece şi se răceşte la 20 oC.

Se limpezeşte folosind soluţiile Carrez I (3.3) şi II (3.4), se completează până la volum cu apă, se amestecă, se filtrează şi se măsoară rotaţia optică astfel cum se indică la punctul 5.2 paragrafele doi şi trei.

6.   Calculul rezultatelor

Conţinutul de amidon (%) se calculează după cum urmează:

6.1.   Măsurare cu polarimetrul

P	=	rotaţia optică totală în grade unghiulare;
P'	=	rotaţia optică în grade unghiulare a substanţelor solubile în etanol 40 % (V/V);
	=	rotaţia optică specifică a amidonului pur. Valorile numerice acceptate în mod convenţional pentru acest factor sunt următoarele: + 185,9o: amidon din orez + 185,7o: amidon din cartofi + 184,6o: amidon din porumb + 182,7o: amidon din grâu + 181,5o: amidon din orz + 181,3o: amidon din ovăz + 184,0o: alte tipuri de amidon şi amestecuri de amidon în furaje combinate.

6.2.   Măsurare cu zaharimetrul

S	=	rotaţia optică totală în grade zaharimetrice;
S'	=	rotaţia optică în grade zaharimetrice a substanţelor solubile în etanol 40 % (v/v);
N	=	greutatea (g) a zaharozei în 100 ml de apă determinând o rotaţie optică de 100 grade zaharimetrice măsurată cu un tub de 200 mm 16,29 g pentru zaharimetrele franceze 26 g pentru zaharimetrele germane 20 g pentru zaharimetrele mixte;
	=	rotaţia optică specifică a amidonului pur (a se vedea punctul 6.1).

6.3.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 0,4 în valoare absolută pentru un conţinut de amidon mai mic de 40 % şi 1 % în valoare relativă în cazul conţinutului de amidon egal sau mai mare de 40 %.

7.   Observaţii

7.1.	În cazul în care eşantionul conţine mai mult de 6 % carbonaţi, calculaţi sub formă de carbonat de calciu, aceştia trebuie distruşi prin tratare cu o cantitate perfect adecvată de acid sulfuric diluat înaintea determinării rotaţiei optice totale.

7.2.

În cazul produselor cu un conţinut mare de lactoză, cum ar fi zerul praf sau laptele praf degresat, se procedează după cum urmează după adăugarea a 80 ml etanol (3.5). La balon se fixează un condensator cu reflux, iar balonul se scufundă într-o baie de apă la 50 oC timp de 30 minute. Se lasă să se răcească şi se continuă analiza astfel cum se indică la punctul 5.3.

7.3.

În cazul în care sunt prezente în cantităţi semnificative în furaje, următoarele materii prime furajere sunt cunoscute ca dând naştere la interferenţe atunci când conţinutul de amidon se determină prin metoda polarimetrică şi, din acest motiv, se pot obţine rezultate incorecte: — produse din sfeclă (de zahăr), precum pulpă de sfeclă (de zahăr), melasă de sfeclă (de zahăr), pulpă melasată de sfeclă (de zahăr), vinasă de sfeclă (de zahăr), zahăr (din sfeclă); — pulpă de citrice; — seminţe de in; şrot de seminţe de in; şrot de seminţe de in rezultat după extracţie; — seminţe de rapiţă; şrot de seminţe de rapiţă; şrot de seminţe de rapiţă rezultat după extracţie; coji de seminţe de rapiţă; — seminţe de floarea soarelui; şrot de seminţe de floarea soarelui rezultat după extracţie; seminţe de floarea soarelui parţial decorticate, rezultate după extracţie; — şrot de copra; şrot de copra rezultat după extracţie; — pulpă de cartofi; — drojdie deshidratată; — produse bogate în inulină (de exemplu, fulgi şi făină de topinambur); — jumări.

M.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CENUȘĂ BRUTĂ

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a conţinutului de cenuşă brută.

2.   Principiu

Eşantionul se calcinează la 550 oC; reziduul se cântăreşte.

3.   Reactivi

Nitrat de amoniu, soluţie 20 % (greutate/volum).

4.   Aparatură

4.1.

Plită.

4.2.	Cuptor electric cu muflă, dotat cu termostat.

4.3.	Creuzete pentru calcinare fabricate din silice, porţelan sau platină, de formă rectangulară (aproximativ 60 × 40 × 25 mm) sau circulară (diametru: 60-75 mm, înălţime: 20-40 mm).

5.   Procedură

Se cântăresc aproximativ 5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg (2,5 g pentru produsele cu tendinţă de umflare) şi se introduc într-un creuzet pentru calcinare, care în prealabil a fost încălzit la 550 oC, răcit şi tarat. Se aşează creuzetul pe plită şi se încălzeşte progresiv până la carbonizarea materialului. Se calcinează în conformitate cu menţiunile de la punctul 5.1 sau 5.2.

5.1.

Se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă calibrat, reglat la 550 oC. Se menţine la această temperatură până la obţinerea unei cenuşi albe, gri deschis sau roşiatice, aparent lipsită de particule carbonizate. Se introduce creuzetul într-un desicator, se lasă să se răcească şi se cântăreşte imediat.

5.2.

Se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă calibrat, reglat la 550 oC. Se calcinează timp de 3 ore. Se introduce creuzetul într-un desicator, se lasă să se răcească şi se cântăreşte imediat. Se calcinează din nou timp de 30 minute pentru a asigura că greutatea cenuşii rămâne constantă (pierderea de greutate între două cântăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 1 mg).

6.   Calculul rezultatelor

Greutatea reziduului se calculează prin deducerea tarei.

Rezultatul se exprimă ca procent din eşantion.

7.   Observaţii

7.1.

Cenuşa substanţelor dificil de calcinat trebuie supusă unei calcinări iniţiale timp de cel puţin trei ore, urmată de răcire şi de adăugarea câtorva picături de soluţie de nitrat de amoniu 20 % sau de apă (cu grijă, pentru a evita dispersarea cenuşii şi formarea de aglomerări). Se continuă calcinarea după uscarea în cuptor. Operaţia se repetă până când calcinarea este completă.

7.2.

În cazul substanţelor rezistente la tratamentul descris la punctul 7.1, se procedează în felul următor: după calcinare timp de trei ore, se introduce cenuşa în apă caldă şi se filtrează printr-un filtru mic, lipsit de cenuşă. Filtrul şi conţinutul său se calcinează în creuzetul iniţial. Filtratul se introduce în creuzetul răcit, se evaporă până la uscare, se calcinează şi se cântăreşte.

7.3.

În cazul uleiurilor şi grăsimilor, se cântăresc cu precizie 25 g de eşantion într-un creuzet de dimensiuni adecvate. Se carbonizează prin aprinderea materialului cu ajutorul unei benzi de filtru de hârtie, lipsit de cenuşă. După combustie, se umectează cu cât mai puţină apă. Se usucă şi se calcinează astfel cum se descrie la punctul 5.

N.   DETERMINAREA CENUȘII INSOLUBILE ÎN ACID CLORHIDRIC

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a conţinutului de substanţe minerale insolubile în acid clorhidric. Se pot utiliza două metode, în funcţie de natura eşantionului.

1.1.	Metoda A: aplicabilă materiilor prime furajere organice furaje şi majorităţii furajelor combinate.

1.2.	Metoda B: aplicabilă compuşilor şi amestecurilor minerale, precum furajelor combinate al căror conţinut de substanţe insolubile în acid clorhidric, determinat conform metodei A, este mai mare de 1 %.

2.   Principiu

2.1.	Metoda A: eşantionul se calcinează, cenuşa se fierbe în acid clorhidric, iar reziduul insolubil se filtrează şi se cântăreşte.

2.2.	Metoda B: eşantionul se tratează cu acid clorhidric. Soluţia se filtrează, reziduul se calcinează, iar cenuşa astfel obţinută se tratează conform metodei A.

3.   Reactivi

3.1.	Acid clorhidric 3 mol/litru.

3.2.	Acid tricloracetic, soluţie 20 % (greutate/volum).

3.3.	Acid tricloracetic, soluţie 1 % (greutate/volum).

4.   Aparatură

4.1.

Plită.

4.2.	Cuptor electric cu muflă, dotat cu termostat.

4.3.	Creuzete pentru calcinare fabricate din silice, porţelan sau platină, de formă rectangulară (aproximativ 60 × 40 × 25 mm) sau circulară (diametru: 60-75 mm, înălţime: 20-40 mm).

5.   Procedură

5.1.   Metoda A:

Eşantionul se calcinează prin metoda descrisă la determinarea cenuşii brute. Se poate utiliza şi cenuşă obţinută din analiza respectivă.

Se introduce cenuşa într-un pahar de laborator de 250-400 ml, utilizând 75 ml de acid clorhidric (3.1). Se aduce lent la fierbere şi se fierbe încet timp de cincisprezece minute. Soluţia caldă se filtrează printr-un filtru de hârtie lipsit de cenuşă, iar reziduul se spală cu apă caldă până când reacţia acidă nu mai este vizibilă. Filtrul care conţine reziduul se usucă şi se calcinează într-un creuzet tarat, la o temperatură de minimum 550 oC şi maximum 700 oC. Se răceşte într-un desicator şi se cântăreşte.

5.2.   Metoda B

Se cântăresc 5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se introduc într-un pahar de laborator de 250-400 ml. Se adaugă succesiv 25 ml apă şi 25 ml acid clorhidric (3.1), se amestecă şi se aşteaptă ca efervescenţa să înceteze. Se adaugă încă 50 ml de acid clorhidric (3.1). Se aşteaptă ca degajarea de gaz să înceteze, apoi se introduce paharul de laborator într-o baie de apă la temperatura de fierbere şi se menţine acolo timp de 30 de minute sau, dacă este necesar, mai mult, pentru ca amidonul eventual prezent să se hidrolizeze complet. Se filtrează până este încă cald, printr-un filtru lipsit de cenuşă, iar filtrul se spală în 50 ml de apă caldă (a se vedea observaţia 7). Se introduce filtrul care conţine reziduul într-un creuzet pentru calcinare, se usucă şi se calcinează la o temperatură de minimum 550 oC şi maximum 700 oC. Se introduce cenuşa într-un pahar de laborator de 250-400 ml, utilizând 75 ml de acid clorhidric (3.1); se continuă astfel cum se descrie la punctul 5.1, al doilea paragraf.

6.   Calculul rezultatelor

Se calculează greutatea reziduului prin deducerea tarei. Rezultatul se exprimă ca procent din eşantion.

7.   Observaţie

Dacă filtrarea se dovedeşte dificilă, se reia analiza, înlocuind cei 50 ml de acid clorhidric (3.1) cu 50 ml de acid tricloracetic 20 % (3.2) şi spălând filtrul într-o soluţie caldă de acid tricloracetic 1 % (3.3).

O.   DETERMINAREA CARBONAȚILOR

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în majoritatea furajelor a cantităţii de carbonaţi, exprimaţi în mod convenţional ca şi carbonat de calciu.

Totuşi, în anumite cazuri (cum ar fi carbonatul de fier), se utilizează o metodă specială.

2.   Principiu

Carbonaţii se descompun în acidul clorhidric; dioxidul de carbon eliberat se colectează într-un tub gradat, iar volumul său se compară cu cel eliberat în aceleaşi condiţii de o cantitate cunoscută de carbonat de calciu.

3.   Reactivi

3.1.	Acid clorhidric, concentraţie 1,10 g/ml.

3.2.	Carbonat de calciu.

3.3.	Acid sulfuric, aproximativ 0,05 mol/litru, colorat cu roşu de metil.

4.   Aparatură

Aparat Scheibler-Dietrich (vezi schema) sau aparatură echivalentă.

5.   Procedură

În conformitate cu conţinutul de carbonaţi al eşantionului, se cântăreşte o porţie de eşantion conform indicaţiilor de mai jos:

—	0,5 g pentru produsele care conţin 50-100 % carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu;

—	1 g pentru produsele care conţin 40-50 % carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu;

—	2-3 g pentru alte produse.

Porţia de eşantion se introduce în flaconul special (4) al aparatului, dotat cu un mic tub din material indestructibil care conţine 10 ml acid clorhidric (3.1), apoi se conectează flaconul la aparat. Se răsuceşte robinetul cu trei căi (5) astfel încât tubul (1) să comunice cu exteriorul. Cu ajutorul tubului mobil (2), care este umplut cu acid sulfuric colorat (3.3) şi conectat la tubul gradat (1), se aduce nivelul lichidului la gradaţia zero. Se răsuceşte robinetul (5) astfel încât să se conecteze tuburile (1) şi (3) şi se verifică nivelul pentru a fi la zero.

Se toarnă lent acidul clorhidric (3.1) peste porţia de eşantion, înclinând flaconul (4). Se egalizează presiunea prin coborârea tubului (2). Se agită flaconul (4) până la încetarea completă a eliberării de dioxid de carbon.

Se restabileşte presiunea prin readucerea lichidului la acelaşi nivel în tuburile (1) şi (2). După câteva minute, când volumul de gaz a devenit constant, se face citirea.

Se efectuează un test de control, în aceleaşi condiţii, cu 0,5 g de carbonat de calciu (3.2).

6.   Calculul rezultatelor

Conţinutul de carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu, se calculează prin utilizarea următoarei formule:

unde:

X	=	% (g/g) de carbonaţi în eşantioane, exprimaţi ca şi carbonat de calciu;
V	=	ml de CO2 eliberat de porţia de eşantion;
V1	=	ml de CO2 eliberat de 0,5 g de CaCO3;
m	=	greutatea, în grame, a porţiei de eşantion.

7.   Observaţii

7.1.	În cazul în care porţia de eşantion este mai mare de 2 g, se introduc mai întâi 15 ml de apă distilată în flaconul (4) şi se amestecă înainte de începerea testului. În testul de control se utilizează acelaşi volum de apă.

7.2.	Dacă aparatul utilizat are un volum diferit de cel al aparatului Scheibler-Dietrich, porţiile prelevate din eşantion şi din substanţa de control, precum şi calcularea rezultatelor, trebuie adaptate corespunzător.

P.   DETERMINAREA FOSFORULUI TOTAL

METODA FOTOMETRICĂ

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea în furaje a conţinutului de fosfor total. Ea este indicată în special pentru analiza produselor sărace în fosfor. În anumite cazuri (produs bogat în fosfor), se poate utiliza o metodă gravimetrică.

2.   Principiu

Eşantionul se mineralizează, fie prin combustie uscată (în cazul furajelor organice), fie prin dizolvare în mediu acid (în cazul furajelor combinate conţinând minerale şi al celor lichide), iar apoi se introduce în soluţie acidă. Soluţia se tratează cu reactivul molibdovanadat. Densitatea optică a soluţiei galbene astfel formate se măsoară cu un spectrofotometru la 430 nm.

3.   Reactivi

3.1.	Carbonat de calciu.

3.2.	Acid clorhidric, ρ20 = 1,10 g/ml (aproximativ 6 mol/litru).

3.3.	Acid azotic, ρ20 = 1,045 g/ml.

3.4.	Acid azotic, ρ20 = 1,38-1,42 g/ml.

3.5.	Acid sulfuric, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.6.	Reactiv molibdovanadat: se amestecă 200 ml de soluţie de heptamolibdat de amoniu (3.6.1), 200 ml de soluţie de monovanadat de amoniu (3.6.2) şi 134 ml de acid azotic (3.4) într-un balon gradat de 1 litru. Se completează până la volum cu apă.

3.6.1.

Soluţie de heptamolibdat de amoniu: se dizolvă în apă fierbinte 100 g de heptamolibdat de amoniu (NH4) 6Mo7O24·4H2O. Se adaugă 10 ml de amoniac (concentraţie 0,91 g/ml) şi se completează cu apă până la 1 litru.

3.6.2.

Soluţie de monovanadat de amoniu: se dizolvă 2,35 g de monovanadat de amoniu NH4VO3 în 400 ml de apă fierbinte. Amestecând constant, se adaugă lent 20 ml de acid azotic diluat [7 ml de HNO3 (3.4) + 13 ml de H2O] şi se completează cu apă până la 1 litru.

3.7.	Soluţie etalon de 1 mg de fosfor per ml: se dizolvă 4,387 g de fosfat diacid de potasiu KH2PO4 în apă. Se completează cu apă până la 1 litru.

4.   Aparatură

4.1.	Creuzete pentru calcinare din silice, porţelan sau platină.

4.2.	Cuptor cu muflă electric, dotat cu termostat reglat la 550 oC.

4.3.	Flacon Kjeldahl de 250 ml.

4.4.	Baloane gradate şi pipete de precizie.

4.5.	Spectrofotometru.

4.6.	Eprubete cu diametru de aproximativ 16 mm, cu dopuri gradate la un diametru de 14,5 mm; capacitate: 25-30 ml.

5.   Procedură

5.1.   Prepararea soluţiei

În funcţie de natura eşantionului, soluţia se prepară astfel cum se indică la punctul 5.1.1 sau 5.1.2.

5.1.1.   Procedura uzuală

Se cântăreşte 1 g de eşantion, sau mai mult, cu o abatere de 1 mg. Se introduce eşantionul de testat într-un flacon Kjeldahl, se adaugă 20 ml de acid sulfuric (3.5), se agită pentru a impregna complet substanţa cu acid şi pentru a preveni ca substanţa să adere pe pereţii flaconului, se încălzeşte şi se menţine la punctul de fierbere timp de 10 minute. Se lasă să se răcească uşor, se adaugă 2 ml de acid azotic (3.4), se încălzeşte uşor, se lasă să se răcească uşor, se mai adaugă puţin acid azotic (3.4) şi se readuce la punctul de fierbere. Se repetă această procedură până se obţine o soluţie incoloră. Se răceşte, se adaugă puţină apă, se decantează lichidul într-un balon gradat de 500 ml clătind flaconul Kjeldahl cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează până la volum cu apă, se omogenizează şi se filtrează.

5.1.2.   Eşantioane care conţin substanţe organice şi sunt lipsite de fosfaţi diacizi de calciu şi magneziu

Se cântăresc aproximativ 2,5 g de eşantion cu abatere de 1 mg într-un creuzet de calcinare. Se amestecă eşantionul de testat cu 1 g de carbonat de calciu (3.1) până când se obţine un amestec complet omogen. Se calcinează în cuptor la 550 oC până se obţine o cenuşă albă sau gri (o cantitate mică de cărbune se ignoră). Se transferă cenuşa într-un pahar de laborator de 250 ml. Se adaugă 20 ml de apă şi acid clorhidric (3.2) până când efervescenţa încetează. Se adaugă încă 10 ml de acid clorhidric (3.2). Se aşează paharul de laborator pe o baie de nisip şi se evaporă până la uscare, pentru a face silicea insolubilă. Se redizolvă reziduul în 10 ml de acid azotic (3.3) şi se fierbe pe baia de nisip sau pe o plită timp de 5 minute, fără a se evapora până la uscare. Se decantează lichidul într-un balon gradat de 500 ml, clătind paharul de mai multe ori cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează până la volum cu apă, se omogenizează şi se filtrează.

5.2.   Apariţia coloraţiei şi măsurarea densităţii optice

Se diluează o parte alicotă de filtrat obţinut ca la punctul 5.1.1 sau 5.1.2 pentru a obţine o concentraţie de fosfor de maximum 40 μg/ml. Se introduc 10 ml din această soluţie într-o eprubetă (4.6) şi se adaugă 10 ml de reactiv molibdovanadat (3.6). Se omogenizează şi se lasă să stea timp de cel puţin 10 minute la 20 oC. Densitatea optică se măsoară cu un spectrofotometru la 430 nm, prin comparaţie cu o soluţie obţinută prin adăugarea de 10 ml de reactiv molibdovanadat (3.6) la 10 ml de apă.

5.3.   Curba de calibrare

Din soluţia etalon (3.7) se prepară soluţii care conţin 5, 10, 20, 30 şi 40 μg de fosfor per ml, respectiv. Se iau 10 ml din fiecare din aceste soluţii şi se adaugă la 10 ml de reactiv molibdovanadat (3.6). Se omogenizează şi se lasă să stea timp de cel puţin 10 minute la 20 oC. Densitatea optică se măsoară astfel cum se indică la punctul 5.2. Se trasează curba de calibrare prin înscrierea grafică a densităţilor optice în raport cu cantităţile corespunzătoare de fosfor. Pentru concentraţii cuprinse între 0 şi 40 μg/ml, curba va fi liniară.

6.   Calculul rezultatelor

Cantitatea de fosfor din eşantionul de testat se determină prin utilizarea curbei de calibrare.

Rezultatul se exprimă ca procent din eşantion.

Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu depăşesc:

—	3 %, relativ la rezultatul mai mare, pentru un conţinut de fosfor mai mic de 5 %;

—	0,15 % în valoare absolută, pentru un conţinut de fosfor egal sau mai mare de 5 %.

Q.   DETERMINAREA CLORULUI DIN CLORURI

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea cantităţii de clor din clorurile solubile în apă, exprimate convenţional ca clorură de sodiu. Este aplicabilă tuturor furajelor.

2.   Principiu

Clorurile se dizolvă în apă. Dacă produsul conţine materii organice, se limpezeşte. Soluţia se acidifică uşor cu acid azotic, iar clorurile precipită sub formă de clorură de argint cu ajutorul unei soluţii de nitrat de argint. Excesul de nitrat de argint se titrează cu o soluţie de tiocianat de amoniu, prin metoda Volhard.

3.   Reactivi

3.1.	Soluţie de tiocianat de amoniu 0,1 mol/litru.

3.2.	Soluţie de nitrat de argint 0,1 mol/litru.

3.3.	Soluţie saturată de sulfat feric de amoniu (NH4)Fe(SO4)2.

3.4.	Acid azotic, concentraţie: 1,38 g/ml.

3.5.	Eter dietilic.

3.6.

Acetonă.

3.7.	Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2·2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.8.	Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN)6·3H2O în apă. Se completează cu apă până la 100 ml.

3.9.	Cărbune activ, lipsit de cloruri şi fără a le absorbi.

4.   Aparatură

Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.

5.   Procedură

5.1.   Prepararea soluţiei

În funcţie de natura eşantionului, se prepară o soluţie conform indicaţiilor de la punctul 5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3.

În acelaşi timp, se efectuează un test martor fără eşantionul de analizat.

5.1.1.   Eşantioane fără materii organice

Se cântăresc maximum 10 g de eşantion cu o abatere de 1 mg, care conţin maximum 3 g de clor sub formă de cloruri. Se introduc, împreună cu 400 ml de apă, într-un balon gradat de 500 ml la aproximativ 20 oC. Se amestecă timp de treizeci de minute în agitator, se aduce la volum, se omogenizează şi se filtrează.

5.1.2.   Eşantioane care conţin materii organice, exceptând produsele menţionate la punctul 5.1.3

Se cântăresc aproximativ 5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se introduc, împreună cu 1 g de cărbune activ, într-un balon gradat de 500 ml. Se adaugă 400 ml apă la aproximativ 20 oC şi 5 ml de soluţie Carrez I (3.7), se amestecă timp de 30 de secunde, apoi se adaugă 5 ml de soluţie Carrez II (3.8). Se amestecă timp de treizeci de minute în agitator, se aduce la volum, se omogenizează şi se filtrează.

5.1.3.   Furaje preparate termic, turte şi făină de in, produse bogate în făină de in şi alte produse bogate în mucilagii sau în substanţe coloidale (de exemplu amidon dextrinat)

Se prepară soluţia astfel cum se descrie la punctul 5.1.2, dar nu se filtrează. Se decantează (dacă este necesar, se centrifughează), se îndepărtează 100 ml lichid supernatant şi se transferă într-un flacon de măsurare de 200 ml. Se amestecă cu acetonă (3.6) şi se aduce la volum cu acest solvent, se omogenizează şi se filtrează.

5.2.   Titrarea

Cu ajutorul unei pipete, se transferă într-un flacon Erlenmeyer o cantitate cuprinsă între de 25 şi 100 ml de filtrat (în funcţie de conţinutul anticipat de clor), obţinut astfel cum se descrie la punctul 5.1.1, 5.1.2 sau 5.1.3. Porţia alicotă nu trebuie să conţină mai mult de 150 mg de clor (Cl). Dacă este necesar, se diluează cu maximum 50 ml de apă, se adaugă 5 ml acid azotic (3.4), 20 ml de soluţie saturată de sulfat feric de amoniu (3.3) şi două picături de soluţie de tiocianat de amoniu (3.1) transferată cu ajutorul unei biurete umplute până la gradaţia zero. Cu ajutorul unei biurete, se transferă soluţia de nitrat de argint (3.2) astfel încât să se obţină un exces de 5 ml. Se adaugă 5 ml de eter dietilic (3.5) şi se agită puternic pentru a coagula precipitatul. Excesul de nitrat de argint se titrează cu soluţia de tiocianat de amoniu (3.1) până când coloraţia maro-roşcat a persistat timp de un minut.

6.   Calculul rezultatelor

Cantitatea de clor (X), exprimată ca % de clorură de sodiu, se calculează cu ajutorul următoarei formule:

unde:

V1	=	ml de soluţie de nitrat de argint 0,1 mol/l adăugată;
V2	=	ml de soluţie de tiocianat de amoniu 0,1 mol/l utilizată la titrare;
m	=	greutatea eşantionului.

Dacă testul martor indică un consum de soluţie de nitrat de argint 0,1 mol/l, se deduce această valoare din volum (V1 - V2).

7.   Observaţii

7.1.	Titrarea se poate face şi prin potenţiometrie.

7.2.	În cazul produselor foarte bogate în uleiuri şi grăsimi, se procedează mai întâi la o degresare cu eter dietilic sau cu eter de petrol.

7.3.	În cazul făinii de peşte, titrarea se poate efectua prin metoda Mohr.

---

(1)  Pentru uscarea cerealelor, a făinii fine, a tărâţelor şi a făinii grunjoase, cuptorul trebuie să aibă o capacitate termică astfel încât, atunci când este prestabilită la 131 oC, va reveni la temperatura respectivă în mai puţin de 45 de minute după ce în interior a fost plasat un număr maxim de eşantioane de testat, în vederea uscării simultane. Ventilaţia trebuie să fie astfel încât, atunci când un număr cât mai mare de eşantioane de grâu comun pe care le poate conţine sunt supuse uscării timp de două ore, rezultatele diferă de cele obţinute după patru ore de uscare cu mai puţin de 0,15 %.

(2)  În cazul în care uleiurile sau grăsimile trebuie supuse unor teste de calitate ulterioare, fragmentele de piatră ponce se înlocuiesc cu mărgele de sticlă.

(3)  JO L 125, 23.5.1996, p. 35.

ANEXA IV

METODE DE ANALIZĂ PENTRU CONTROLAREA NIVELULUI AUTORIZAT DE ADITIVI DIN FURAJE

A.   DETERMINAREA VITAMINEI A

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea nivelului de vitamină A (retinol) din furaje şi premixuri. Vitamina A include alcoolul all-trans-retinil şi izomerii săi cis, care se determină prin această metodă. Conţinutul de vitamină A se exprimă în unităţi internaţionale (UI) per kg. O UI corespunde activităţii a 0,3 μg de alcool all-trans-vitamină A sau a 0,344 μg all-trans-vitamină A acetat sau 0,550 μg all-trans-vitamină A palmitat.

Limita de cuantificare este 2 000 UI de vitamină A/kg.

2.   Principiu

Eşantionul se hidrolizează cu o soluţie de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina A se extrage cu eter de petrol. Solventul se îndepărtează prin evaporare, iar reziduul se dizolvă în metanol şi, dacă este cazul, se diluează până la concentraţia necesară. Conţinutul de vitamină A se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC) cu ajutorul unui detector de UV sau de fluorescenţă. Parametrii cromatografiei se aleg astfel încât să nu existe separaţie între alcoolul all-trans-vitamina A şi izomerii săi cis.

3.   Reactivi

3.1.	Etanol, σ = 96 %.

3.2.	Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 oC.

3.3.

Metanol.

3.4.	Soluţie de hidroxid de potasiu, c = 50 g/100 ml.

3.5.	Soluţie de ascorbat de sodiu, c = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la punctul 7.7).

3.6.	Sulfură de sodiu, Na2S·xH2O (x = 7-9).

3.6.1.

Soluţie de sulfură de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, β = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la punctul 7.8).

3.7.	Soluţie de fenolftaleină, c = 2 g/100 ml în etanol (3.1).

3.8.	2-propanol.

3.9.	Fază mobilă pentru HPLC: amestec de metanol (3.3) şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v). Proporţia exactă este determinată de caracteristicile coloanei folosite.

3.10.

Azot, lipsit de oxigen

3.11.

All-trans-vitamină A acetat, extra pură, cu activitate certificată, de exemplu 2,80 × 106 UI/g

3.11.1.

Soluţie stoc de all-trans-vitamină A acetat: se cântăresc 50 mg de vitamină A acetat (3.11) cu o abatere de 0,1 mg într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol (3.8) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 1 400 UI vitamină A per ml. Conţinutul exact se determină în conformitate cu indicaţiile de la punctul 5.6.3.1.

3.12.

All-trans-vitamină A palmitat, extra pură, cu activitate certificată, de exemplu 1,80 × 106 UI/g

3.12.1.

Soluţie stoc de all-trans-vitamină A palmitat: se cântăresc 80 mg de vitamină A palmitat (3.12) cu o abatere de 0,1 mg într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol (3.8) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 1 400 UI vitamină A per ml. Conţinutul exact se determină în conformitate cu indicaţiile de la punctul 5.6.3.2.

3.13.

2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la punctul 7.5).

4.   Aparatură

4.1.	Evaporator rotativ cu vid.

4.2.	Sticlărie laborator brună.

4.2.1.

Baloane cu fund plat sau flacoane tip Erlenmeyer, 500 ml, cu orificiu din sticlă şlefuită.

4.2.2.

Baloane gradate cu dopuri de sticlă şlefuită, cu gât îngust, de 10, 25, 100 şi 500 ml.

4.2.3.

Pâlnii de separare, conice, 1 000 ml, cu dopuri de sticlă şlefuită.

4.2.4.

Flacoane piriforme, 250 ml, cu orificiu din sticlă şlefuită.

4.3.	Condensator Allihn, cu lungime a mantalei de 300 mm, cu îmbinare de sticlă şlefuită şi cu adaptor pentru conductă de alimentare cu gaz.

4.4.	Filtru de hârtie plisată pentru separarea fazelor, cu diametru de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4.5.	Echipament HPLC cu sistem de injecţie

4.5.1.

Coloană pentru cromatografie lichidă, 250 mm × 4 mm, C18, cu particule de 5 sau 10 μm, sau echivalent (criteriu de performanţă: un singur vârf pentru toţi izomerii de retinol în condiţiile HPLC).

4.5.2.

Detector de UV sau de fluorescenţă, cu ajustare variabilă a lungimii de undă.

4.6.	Spectrofotometru cu celule de cuarţ de 10 mm.

4.7.	Baie de apă cu agitator magnetic.

4.8.	Aparat de extracţie (vezi figura 1) compus din:

4.8.1.

Cilindru din sticlă cu capacitate de 1 l prevăzut cu gât şi dop de sticlă şlefuite.

4.8.2.

Piesă din sticlă şlefuită echipată cu o tijă laterală şi un tub reglabil care trece prin centru. Tubul ajustabil are un capăt inferior în formă de „U” şi o duză la capătul opus, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru să poată fi transferat într-o pâlnie de separare.

5.   Procedură

Notă:

Vitamina A este sensibilă la lumină (UV) şi la oxidare. Toate operaţiunile se efectuează în absenţa luminii (utilizând sticlărie brună sau protejată cu o folie de aluminiu) şi a oxigenului (alimentare cu azot). În timpul extracţiei, aerul de deasupra lichidului se înlocuieşte cu azot (a se evita excesul de presiune slăbind din când în când dopul).

5.1.   Prepararea eşantionului

Se macină eşantionul astfel încât să poată trece printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, evitându-se producerea de căldură. Măcinarea se efectuează imediat înainte de cântărire şi saponificare, altfel pot exista pierderi de vitamină A.

5.2.   Saponificarea

În funcţie de conţinutul de vitamină A, se cântăresc 2-25 g de eşantion cu o abatere de 1 mg într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml (4.2.1). Se adaugă, agitând circular, 130 ml de etanol (3.1), aproximativ 100 mg de BHT (3.13), 2 ml de soluţie de ascorbat de sodiu (3.5) şi 2 ml de soluţie de sulfură de sodiu (3.6). Se montează un condensator (4.3) la balon şi acesta se scufundă într-o baie de apă cu agitator magnetic (4.7). Se încălzeşte până la fierbere şi se lasă să reflueze timp de 5 minute. Apoi se adaugă 25 ml de soluţie de hidroxid de potasiu (3.4) prin condensator (4.3) şi se lasă să reflueze timp de încă 25 min, amestecând continuu sub un jet slab de azot. Apoi se clăteşte condensatorul cu aproximativ 20 ml de apă, iar conţinutul balonului se lasă să se răcească la temperatura camerei.

5.3.   Extracţia

Se transferă cantitativ prin decantare soluţia de saponificare clătind cu un volum total de 250 ml de apă într-o pâlnie de separare de 1 000 ml (4.2.3) sau în aparatul de extracţie (4.8). Se clăteşte balonul utilizat la saponificare succesiv cu 25 ml de etanol (3.1) şi 100 ml de eter de petrol (3.2), iar lichidul de clătire se transferă în pâlnia de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apă şi etanol în soluţiile combinate trebuie să fie de aproximativ 2:1. Se agită energic timp de 2 minute şi se lasă la decantat timp de 2 minute.

5.3.1.   Extracţia cu ajutorul unei pâlnii de separare (4.2.3)

Când straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la punctul 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de separare (4.2.3). Se repetă de două ori această extracţie cu 100 ml de eter de petrol (3.2), apoi de încă două ori cu 50 ml de eter de petrol (3.2).

Se spală de două ori extractele combinate în pâlnia de separare agitând circular uşor (pentru a se evita formarea de emulsii) cu porţii de 100 ml de apă şi repetând agitarea cu alte porţii de apă de 100 ml până când apa rămâne incoloră la adăugarea de soluţie de fenolftaleină (3.7) (patru spălări sunt de obicei suficiente). Se filtrează extractul spălat cu un filtru plisat uscat pentru separarea fazelor (4.4) cu scopul de a se îndepărta apa suspendată într-un balon gradat de 500 ml (4.2.2). Se clăteşte pâlnia de separare şi filtrul cu 50 ml de eter de petrol (3.2), se completează până la semn cu eter de petrol (3.2) şi se amestecă bine.

5.3.2.   Extracţia cu ajutorul unui aparat de extracţie (4.8)

Când straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la punctul 7.3), se înlocuieşte dopul cilindrului de sticlă (4.8.1) cu piesa din sticlă şlefuită (4.8.2) şi se amplasează capătul inferior în formă de „U” a tubului reglabil astfel încât să se afle exact deasupra nivelului interfeţei. Aplicând o presiune din linia de azot asupra tijei laterale, se transferă stratul superior de eter de petrol într-o pâlnie de separare de 1 000 ml (4.2.3). Se adaugă 100 ml de eter de petrol (3.2) în cilindrul de sticlă, se pune dopul şi se agită energic. Se lasă straturile să se separe şi se transferă stratul superior în pâlnia de separare la fel ca înainte. Se repetă procedura de extracţie cu încă 100 ml de eter de petrol (3.2), apoi de două ori cu porţii de 50 ml de eter de petrol (3.2) şi se adaugă straturile de eter de petrol în pâlnia de separare.

Se spală extractele combinate de eter de petrol astfel cum se descrie la punctul 5.3.1 şi se procedează astfel cum se descrie la punctul respectiv.

5.4.   Prepararea soluţiei eşantion pentru HPLC

Se pipetează o porţie alicotă din soluţia de eter de petrol (de la punctul 5.3.1 sau 5.3.2) într-un flacon piriform de 250 ml (4.2.4). Se evaporă solventul aproape până la uscare în evaporatorul rotativ (4.1) cu presiune redusă la o temperatură a băii care să nu depăşească 40 oC. Se restabileşte presiunea atmosferică prin admisia azotului (3.10) şi se îndepărtează flaconul din evaporatorul rotativ. Se elimină restul de solvent cu un jet de azot (3.10), iar reziduul se dizolvă imediat într-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (3.3) (concentraţia de vitamină A trebuie să fie cuprinsă în intervalul 5-30 UI/ml).

5.5.   Determinarea prin HPLC

Vitamina A se separă pe o coloană cu fază inversată C18 (4.5.1), iar concentraţia se măsoară cu un detector de UV (325 nm) sau un detector de fluorescenţă (excitaţie: 325 nm, emisie: 475 nm) (4.5.2).

Se injectează o porţie alicotă (de exemplu 20 μl) din soluţia metanolică obţinută la punctul 5.4 şi se eluează cu faza mobilă (3.9). Se calculează înălţimea medie a vârfului (aria) mai multor injectări ale aceleiaşi soluţii de eşantion şi înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor mai multor injectări ale soluţiilor de calibrare (5.6.2).

Condiţii HPLC

Următoarele condiţii se oferă cu titlu orientativ; se pot aplica alte condiţii cu condiţia ca ele să genereze rezultate echivalente.

Coloană pentru cromatografie lichidă (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, particule de 5 sau 10 μm sau echivalent
Faza mobilă (3.9):	Mixtură de metanol (3.3) şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v).
Rata fluxului:	1-2 ml/minut
Detector (4.5.2):	detector de UV (325 nm) sau detector de fluorescenţă (excitaţie: 325 nm/emisie: 475 nm).

5.6.   Calibrarea

5.6.1.   Prepararea soluţiilor etalon de lucru

Se pipetează 20 ml de soluţie stoc de vitamină A acetat (3.11.1) sau 20 ml de soluţie stoc de vitamină A palmitat (3.12.1) într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml (4.2.1) şi se hidrolizează astfel cum se descrie la punctul 5.2, dar fără a se adăuga BHT. În continuare se extrage cu eter de petrol (3.2) conform punctului 5.3 şi se completează până la 500 ml cu eter de petrol (3.2). Se evaporă 100 ml din acest extract în evaporatorul rotativ (a se vedea punctul 5.4) aproape până la uscare, se îndepărtează solventul care rămâne cu un jet de azot (3.10) şi se redizolvă reziduul în 10 ml de metanol (3.3). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 560 UI vitamină A per ml. Conţinutul exact se determină în conformitate cu indicaţiile de la punctul 5.6.3.3. Soluţia etalon de lucru trebuie proaspăt preparată înainte de utilizare.

Se pipetează 2 ml din această soluţie etalon de lucru într-un balon gradat de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (3.3) şi se amestecă. Concentraţia nominală a acestei soluţii etalon de lucru diluate este de 56 UI de vitamină A per ml.

5.6.2.   Prepararea soluţiilor de calibrare şi curba de calibrare

Se transferă 1, 2, 5 şi 10 ml din soluţia etalon de lucru diluată într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (3.3) şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt de 2,8, 5,6, 14 şi respectiv 28 UI de vitamină A per ml.

Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluţie de calibrare şi se determină înălţimile medii (ariile) ale vârfurilor. Utilizând înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor, se trasează o curbă de calibrare ţinând cont de rezultatele obţinute cu soluţia de control UV (5.6.3.3).

5.6.3.   Standardizarea UV a soluţiilor etalon

5.6.3.1.    Soluţia stoc de vitamină A acetat

Se pipetează 2 ml din soluţia stoc de vitamină A acetat (3.11.1) într-un balon gradat de 50 ml (4.2.2) şi se completează până la semn cu 2-propanol (3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 56 UI de vitamină A per ml. Se pipetează 3 ml din această soluţie diluată de vitamină A acetat într-un balon gradat de 25 ml şi se completează până la semn cu 2-propanol (3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluţii comparativ cu cel al soluţiei de 2-propanol (3.8), în spectrofotometru (4.6), în intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincţie trebuie să fie între 325 şi 327 nm.

Calculul conţinutului de vitamină A:

UI vitamină A/ml = E326 × 19

( pentru vitamină A acetat = 1 530 la 326 nm în 2-propanol)

5.6.3.2.    Soluţia stoc de vitamină A palmitat

Se pipetează 2 ml de soluţie stoc de vitamină A palmitat (3.12.1) într-un balon gradat de 50 ml (4.2.2) şi se completează până la gradaţie cu propanol-2 (3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 56 UI de vitamină A per ml. Se pipetează 3 ml din această soluţie diluată de vitamină A palmitat într-un balon gradat de 25 ml şi se completează până la semn cu 2-propanol (3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluţii comparativ cu cel al soluţiei de 2-propanol (3.8), în spectrofotometru (4.6), în intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincţie trebuie să fie între 325 şi 327 nm.

Calculul conţinutului de vitamină A:

UI vitamină A/ml = E326 × 19

( pentru vitamină A palmitat = 957 la 326 nm în 2-propanol)

5.6.3.3.    Soluţia etalon de lucru de vitamină A

Se pipetează 3 ml din soluţia etalon de lucru nediluată de vitamină A, preparată conform punctului 5.6.1, într-un balon gradat de 50 ml (4.2.2) şi se completează până la semn cu 2-propanol (3.8). Se pipetează 5 ml din această soluţie într-un balon gradat de 25 ml şi se completează până la semn cu 2-propanol (3.8). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluţii comparativ cu cel al soluţiei de 2-propanol (3.8), în spectrofotometru (4.6), în intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincţie trebuie să fie între 325 şi 327 nm.

Calculul conţinutului de vitamină A:

UI vitamină A/ml = E326 × 18,3

( pentru vitamină A alcool = 1 821 la 325 nm în 2-propanol)

6.   Calculul rezultatelor

Din înălţimea (aria) medie a vârfurilor de vitamină A ale soluţiei de eşantion se determină concentraţia soluţiei de eşantion în UI/ml prin referire la curba de calibrare (5.6.2).

Conţinutul w de vitamină A al eşantionului, în UI/kg, este dat de următoarea formulă:

[UI/kg]

în care:

c	=	concentraţia de vitamină A a soluţiei de eşantion (5.4), în UI/ml;
V1	=	volumul soluţiei de eşantion (5.4), în ml;
V2	=	volumul de alicotă prelevat la punctul 5.4, în ml;
m	=	greutatea porţiei de testat, în g.

7.   Observaţii

7.1.	Pentru eşantioanele cu concentraţii mici de vitamină A poate fi utilă combinarea extractelor cu eter de petrol provenite din două operaţii de saponificare (cantitate cântărită: 25 g) într-o soluţie de eşantion pentru determinare prin HPLC.

7.2.	Greutatea eşantionului prelevat pentru analiză nu conţine mai mult de 2 g de grăsimi.

7.3.	Dacă separarea fazelor nu are loc, se adaugă aproximativ 10 ml de etanol (3.1) pentru a fragmenta emulsia.

7.4.	În cazul uleiului din ficat de cod şi al altor grăsimi pure, timpul de saponificare se prelungeşte la 45-60 minute.

7.5.	Hidrochinona poate fi folosită în locul BHT.

7.6.	Utilizându-se o coloană cu fază normală, separarea izomerilor de retinol este posibilă. Dar în acest caz, înălţimile (ariile) vârfurilor izomerilor all-cis şi all-trans trebuie însumate pentru a face calcule.

7.7.	Se pot folosi aproximativ 150 mg de soluţie de acid ascorbic în locul soluţiei de ascorbat de sodiu.

7.8.	Se pot folosi aproximativ 50 mg de EDTA în locul soluţiei de sulfură de sodiu.

7.9.

În cazul analizării vitaminei A în înlocuitorii de lapte, se acordă o atenţie deosebită la: — saponificare (5.2): din cauza cantităţii de grăsimi prezente în eşantion, poate fi necesară creşterea cantităţii de soluţie de hidroxid de potasiu (3.4); — extracţie (5.3): din cauza prezenţei emulsiilor, poate fi necesară adaptarea valorii raportului de 2:1 pentru apă/etanol. Pentru a verifica dacă metoda de analizare aplicată generează rezultate fiabile pentru această matrice specifică (înlocuitor de lapte), se aplică un test de recuperare pe o porţie suplimentară de testat. Dacă rata de recuperare este mai mică de 80 %, rezultatul analitic trebuie corectat în funcţie de recuperare.

8.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 15 % relativ la rezultatul mai mare.

9.   Rezultatele unui studiu colaborativ  (1)

	Premix	Furaje tip premix	Concentrate minerale	Furaje proteice	Furaje pentru purcei
L	13	12	13	12	13
n	48	45	47	46	49
medie (UI/kg)	17,02 × 106	1,21 × 106	537 100	151 800	18 070
sr (UI/kg)	0,51 × 106	0,039 × 106	22 080	12 280	682
r (UI/kg)	1,43 × 106	0,109 × 106	61 824	34 384	1 910
CVr (%)	3,0	3,5	4,1	8,1	3,8
SR (UI/kg)	1,36 × 106	0,069 × 106	46 300	23 060	3 614
R (UI/kg)	3,81 × 106	0,193 × 106	129 640	64 568	10 119
CVR(%)	8,0	6,2	8,6	15	20

L	=	număr de laboratoare;
n	=	număr de valori individuale;
sr	=	devierea standard a repetabilităţii;
SR	=	devierea standard a reproductibilităţii;
r	=	repetabilitate;
R	=	reproductibilitate;
CVr	=	coeficientul de variaţie al repetabilităţii;
CVR	=	coeficientul de variaţie al reproductibilităţii.

B.   DETERMINAREA VITAMINEI E

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Această metodă permite determinarea nivelului de vitamină E din furaje şi premixuri. Conţinutul de vitamină E se exprimă ca mg DL-α-tocoferol acetat per kg. 1 mg DL-α-tocoferol acetat corespunde la 0,91 mg DL-α-tocoferol (vitamină E).

Limita de cuantificare este 2 mg de vitamină E/kg. Această limită de cuantificare se obţine doar cu detectorul de fluorescenţă. Cu un detector de UV, limita de cuantificare este 10 mg/kg.

2.   Principiu

Eşantionul se hidrolizează cu o soluţie etanolică de hidroxid de potasiu, iar vitamina E se extrage cu eter de petrol. Solventul se îndepărtează prin evaporare, iar reziduul se dizolvă în metanol şi, dacă este necesar, se diluează până la concentraţia necesară. Conţinutul de vitamina E se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC), utilizând un detector de fluorescenţă sau de UV.

3.   Reactivi

3.1.	Etanol, σ = 96 %.

3.2.	Eter de petrol, interval de fierbere 40-60 oC.

3.3.

Metanol.

3.4.	Soluţie de hidroxid de potasiu, c = 50 g/100 ml.

3.5.	Soluţie de ascorbat de sodiu, c = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la punctul 7.7).

3.6.	Sulfură de sodiu, Na2S·xH2O (x = 7-9).

3.6.1.

Soluţie de sulfură de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, β = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la punctul 7.8).

3.7.	Soluţie de fenolftaleină, c = 2 g/100 ml în etanol (3.1).

3.8.	Fază mobilă pentru HPLC: amestec de metanol (3.3) şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v). Proporţia exactă este determinată de caracteristicile coloanei folosite.

3.9.	Azot, lipsit de oxigen.

3.10.

DL-α-tocoferol acetat, extra pur, cu activitate certificată

3.10.1.

Soluţie stoc de DL-α-tocoferol acetat: se cântăresc 100 mg de DL-α-tocoferol acetat (3.10) cu o abatere de 0,1 mg într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în etanol (3.1) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. 1 ml din această soluţie conţine 1 mg de DL-α-tocoferol acetat. (pentru control UV vezi 5.6.1.3; pentru stabilizare a se vedea observaţiile de la punctul 7.4).

3.11.

DL-α-tocoferol, extra pur, cu activitate certificată

3.11.1.

Soluţia stoc de DL-α-tocoferol: se cântăresc 100 mg de DL-α-tocoferol (3.11) cu o abatere de 0,1 mg într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în etanol (3.1) şi se completează până la semn cu acelaşi solvent. 1 ml din această soluţie conţine 1 mg de DL-α-tocoferol. (Pentru control UV a se vedea 5.6.2.3; pentru stabilizare a se vedea observaţiile de la punctul 7.4).

3.12.

2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la punctul 7.5).

4.   Aparatură

4.1.	Evaporator rotativ cu generare de film.

4.2.	Sticlărie laborator brună.

4.2.1.

Baloane cu fund plat sau flacoane tip Erlenmeyer, 500 ml, cu orificiu din sticlă şlefuită.

4.2.2.

Baloane gradate cu dopuri de sticlă şlefuită, cu gât îngust, de 10, 25, 100 şi 500 ml.

4.2.3.

Pâlnii de separare, conice, 1 000 ml, cu dopuri de sticlă şlefuită.

4.2.4.

Flacoane piriforme, 250 ml, cu orificiu din sticlă şlefuită.

4.3.	Condensator Allihn, cu lungime a mantalei de 300 mm, cu îmbinare de sticlă şlefuită şi cu adaptor pentru conductă de alimentare cu gaz.

4.4.	Filtru de hârtie plisată pentru separarea fazelor, cu diametru de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).

4.5.	Echipament HPLC cu sistem de injecţie

4.5.1.

Coloană pentru cromatografie lichidă, 250 mm × 4 mm, C18, particule de 5 sau 10 μm, sau echivalent.

4.5.2.

Detector de fluorescenţă sau de UV, cu ajustare variabilă a lungimii de undă.

4.6.	Spectrofotometru cu celule de cuarţ de 10 mm.

4.7.	Baie de apă cu agitator magnetic.

4.8.	Aparat de extracţie (a se vedea figura 1) compus din:

4.8.1.

Cilindru din sticlă cu capacitate de 1 l prevăzut cu gât şi dop de sticlă şlefuite.

4.8.2.

Piesă din sticlă şlefuită echipată cu o tijă laterală şi un tub reglabil care trece prin centru. Tubul ajustabil are un capăt inferior în formă de „U” şi o duză la capătul opus, astfel încât stratul superior de lichid din cilindru să poată fi transferat într-o pâlnie de separare.

5.   Procedura

Notă:

Vitamina E este sensibilă la lumină (UV) şi la oxidare. Toate operaţiunile se efectuează în absenţa luminii (în recipiente de sticlă brună sau protejate cu folie de aluminiu) şi în absenţa oxigenului (se expune unui flux de azot). În timpul extracţiei, aerul de deasupra lichidului se înlocuieşte cu azot (a se evita excesul de presiune slăbind din când în când dopul).

5.1.   Pregătirea eşantionului

Se macină eşantionul pentru a trece printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, evitându-se producerea de căldură. Măcinarea trebuie efectuată imediat înainte de cântărire şi saponificare, în caz contrar riscându-se pierderi de vitamina E.

5.2.   Saponificarea

În funcţie de greutatea conţinutului de vitamina E, se cântăresc, cu o abatere de 0,01 g, 2-25 g de eşantion într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer, de 500 ml (4.2.1). Se adaugă succesiv, agitând circular, 130 ml de etanol (3.1), cca 100 mg de BHT (3.12), 2 ml de soluţie de ascorbat de sodiu (3.5) şi 2 ml de soluţie de sulfură de sodiu (3.6). Se montează un condensator (4.3) la vas şi se introduce vasul într-o baie de apă cu agitator magnetic (4.7). Se încălzeşte până la fierbere şi se lasă să reflueze timp de 5 minute. Apoi se adaugă 25 ml de soluţie de hidroxid de potasiu (3.4) prin condensator (4.3) şi se lasă să reflueze timp de încă 25 min, amestecând sub un flux uşor de azot. Apoi se clăteşte condensatorul cu circa 20 ml de apă şi se răceşte conţinutul vasului la temperatura camerei.

5.3.   Extracţie

Se transferă cantitativ prin decantare soluţia saponificată, prin clătire cu un volum total de 250 ml de apă într-o pâlnie de separare de 1 000 ml (4.2.3) sau în aparatul de extracţie (4.8). Se clăteşte succesiv vasul de saponificare cu 25 ml de etanol (3.1) şi 100 ml de eter de petrol (3.2) şi se transferă lichidul de clătire în pâlnia de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apă şi etanol în soluţiile combinate trebuie să fie de cca 2:1. Se agită energic timp de 2 minute. şi se lasă să se sedimenteze timp de 2 minute.

5.3.1.   Extracţia folosind o pâlnie de separare (4.2.3)

Când straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la punctul 7.3), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pâlnie de separare (4.2.3). Se repetă această extracţie de două ori cu 100 ml eter de petrol (3.2) şi de două ori cu 50 ml eter de petrol (3.2).

Se spală de două ori extractele combinate în pâlnia de separare amestecând uşor (pentru a se evita formarea de emulsii) cu cantităţi de 100 ml de apă şi din nou, prin agitare repetată cu alte cantităţi de apă de 100 ml până când apa rămâne incoloră după adăugarea unei soluţii de fenolftaleină (3.7) (patru spălări sunt în general suficiente). Se filtrează extractul spălat cu un filtru cutat uscat pentru separarea fazelor (4.4) pentru a se elimina apa în suspensie şi se transferă într-un balon gradat de 500 ml (4.2.2). Se clătesc pâlnia de separare şi filtrul cu 50 ml eter de petrol (3.2), se completează până la semn cu eter de petrol (3.2) şi se amestecă bine.

5.3.2.   Extracţia folosind un aparat de extracţie (4.8)

Când straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la punctul 7.3), se înlocuieşte dopul cilindrului de sticlă (4.8.1) prin inserţie de sticlă şlefuită (4.8.2) şi se amplasează extremitatea inferioară în formă de „U” a tubului reglabil astfel încât să se afle exact deasupra nivelului interfeţei. Aplicând o presiune de la generatorul de azot prin braţul lateral, se transferă stratul superior de eter de petrol într-o pâlnie de separare de 1 000 ml (4.2.3). Se adaugă 100 ml de eter de petrol (3.2) în cilindrul de sticlă, se pune dopul şi se agită energic. Se lasă straturile să se separe şi se transferă stratul superior în pâlnia de separare, la fel ca înainte. Se repetă procedura de extracţie cu încă 100 ml eter de petrol (3.2), apoi de două ori cu cantităţi de 50 ml eter de petrol (3.2) şi se adaugă straturile de eter de petrol în pâlnia de separare.

Se spală extractele combinate de eter de petrol conform procedurii descrise la punctul 5.3.1 şi se procedează conform punctului menţionat.

5.4.   Prepararea soluţiei de eşantion pentru HPLC

Se pipetează o parte alicotă din soluţia de eter de petrol (de la 5.3.1 sau 5.3.2) într-un balon piriform de 250 ml (4.2.4). Se evaporă solventul aproape în totalitate pe evaporatorul rotativ (4.1), cu presiune redusă, la o temperatură a băii de apă de maximum 40 oC. Se restabileşte presiunea atmosferică prin admisie de azot (3.9) şi se îndepărtează balonul de pe evaporatorul rotativ. Se elimină restul de solvent cu un curent de azot (3.9) şi se dizolvă imediat reziduul într-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (3.3) (concentraţia de DL-α-tocoferol trebuie să fie de ordinul a 5-30 μg/ml).

5.5.   Determinarea prin HPLC

Vitamina E se separă pe o coloană C18 cu fază inversată (4.5.1), iar concentraţia se măsoară cu un detector de fluorescenţă (excitaţie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau cu un detector de UV (292 nm) (4.5.2).

Se injectează o parte alicotă (de exemplu 20 μl) din soluţia metanolică obţinută conform punctului 5.4 şi se eluează cu faza mobilă (3.8). Se calculează înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor pentru mai multe injectări ale aceleiaşi soluţii eşantion şi înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor pentru mai multe injectări ale soluţiilor de calibrare (5.6.2).

Condiţii HPLC

Următoarele condiţii sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea duc la rezultate echivalente.

Coloană pentru cromatografie lichidă (4.5.1):	250 mm × 4 mm, C18, particule de 5 sau 10 μm sau echivalent
Faza mobilă (3.8):	Amestec de metanol (3.3) şi apă de exemplu 980 + 20 (v + v).
Debit:	1-2 ml/minut
Detector (4.5.2)	Detector de fluorescenţă (excitaţie: 295 nm/emisie: 330 nm) sau detector de UV (292 nm)

5.6.   Calibrare (acetat de DL-α-tocoferol sau DL-α-tocoferol)

5.6.1.   Etalon de acetat de DL-α-tocoferol

5.6.1.1.    Prepararea soluţiei etalon de lucru

Se picură din pipetă 25 ml din soluţia stoc de acetat de DL-α-tocoferol (3.10.1) într-un balon cu fundul plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer, de 500 ml (4.2.1) şi se hidrolizează conform procedurii descrise la punctul 5.2. Se realizează apoi extracţia cu eter de petrol (3.2) conform punctului 5.3 şi se completează până la 500 ml cu eter de petrol. Se lasă să se evapore 25 ml din acest extract aproape în totalitate în evaporatorul rotativ (a se vedea 5.4), se îndepărtează solventul rămas într-un curent de azot (3.9) şi se dizolvă din nou reziduul în 25 ml de metanol (3.3). Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 45,5 μg DL-α-tocoferol per ml, echivalent cu 50 μg acetat de DL-α-tocoferol per ml. Soluţia etalon de lucru trebuie să fie preparată imediat înainte de utilizare.

5.6.1.2.    Prepararea soluţiilor de calibrare şi a curbei de calibrare

Se transferă 1, 2, 4 şi 10 ml din soluţia etalon de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (3.3) şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt 2,5, 5, 10 şi 25 μg/ml acetat de DL-α-tocoferol, echivalent cu 2,28, 4,55, 9,1 μg/ml şi 22,8 μg/ml DL-α-tocoferol.

Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluţie de calibrare şi se determină înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor. În funcţie de înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor, se trasează o curbă de calibrare.

5.6.1.3.    Standardizarea UV a soluţiei stoc de acetat de DL-α-tocoferol (3.10.1)

Se diluează 5 ml din soluţia stoc de acetat de DL-α-tocoferol (3.10.1) în 25 ml de etanol şi se măsoară spectrul UV al acestei soluţii faţă de etanol (3.1) în spectrofotometru (4.6), între 250 nm şi 320 nm.

Absorbţia maximă este de 284 nm:

= 43,6 la 284 nm în etanol

La această diluţie trebuie să se obţină o valoare de extincţie între 0,84 şi 0,88.

5.6.2.   Etalonul de DL-α-tocoferol

5.6.2.1.    Prepararea soluţiei etalon de lucru

Se pun cu pipeta 2 ml din soluţia stoc de DL-α-tocoferol (3.11.1) într-un balon gradat de 50 ml, se dizolvă în metanol (3.3) şi se completează până la semn cu metanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 40 μg DL-α-tocoferol per ml, echivalent cu 44 μg acetat DL-α-tocoferol per ml. Soluţia etalon de lucru trebuie să fie preparată imediat înainte de utilizare.

5.6.2.2.    Prepararea soluţiilor de calibrare şi a curbei de calibrare

Se transferă 1, 2, 4 şi 10 ml din soluţia etalon de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează până la semn cu metanol (3.3) şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sunt 2, 4, 8 şi 20 μg/ml DL-α-tocoferol, echivalent cu 2,24,4, 8,79 μg/ml şi 22 μg/ml acetat de DL-α-tocoferol.

Se injectează de mai multe ori câte 20 μl din fiecare soluţie de calibrare şi se determină înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor. În funcţie de înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor, se trasează o curbă de calibrare.

5.6.2.3.    Standardizarea UV a soluţiei stoc de DL-α-tocoferol (3.11.1)

Se diluează 2 ml din soluţia stoc de DL-α-tocoferol (3.11.1) în 25 ml de etanol şi se măsoară spectrul UV al acestei soluţii faţă de etanol (3.1) în spectrofotometru (4.6) între 250 nm şi 320 nm. Absorbţia maximă este de 292 nm:

= 75,8 la 292 nm în etanol

La această diluţie trebuie să se obţină o valoare de extincţie de 0,6.

6.   Calculul rezultatelor

Pornindu-se de la înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor de vitamina E ale soluţiei de eşantion, se determină concentraţia soluţiei de eşantion în μg/ml (calculată ca acetat de α-tocoferol) prin referire la curba de calibrare (punctul 5.6.1.2 sau 5.6.2.2).

Conţinutul w de vitamina E al eşantionului, exprimat în mg/kg, este dat de următoarea formulă:

[mg/kg]

unde:

c	=	concentraţia de vitamina E (ca acetat de α-tocoferol) al soluţiei de eşantion (5.4) în μg/ml;
V1	=	volumul soluţiei de eşantion (5.4), în ml;
V2	=	volumul părţii alicote luate conform punctului 5.4, în ml;
m	=	greutatea porţiunii de testat, în g.

7.   Observaţii

7.1.	Pentru eşantioanele cu o concentraţie redusă de vitamina E, poate fi utilă combinarea extractelor în eter de petrol provenite din două saponificări (cantitate cântărită: 25 g) într-o soluţie de eşantion pentru determinarea prin HPLC.

7.2.	Eşantionul prelevat pentru analiză nu conţine mai mult de 2 g de grăsime.

7.3.	Dacă nu are loc separaţia fazelor, se adaugă cca 10 ml de etanol (3.1) pentru a fragmenta emulsia.

7.4.	Odată efectuată măsurătoarea spectrofotometrică a soluţiei de acetat de DL-α-tocoferol sau de DL-α-tocoferol, conform punctului 5.6.1.3 sau 5.6.2.3, se adaugă cca 10 mg de BHT (3.12) la soluţie (3.10.1 sau 3.10.2) şi se conservă soluţia la frigider (durata maximă de stocare patru săptămâni).

7.5.	BHT poate fi înlocuit cu hidrochinonă.

7.6.	Utilizându-se o coloană în fază normală este posibilă separarea tocoferolilor α, β, γ şi δ.

7.7.	Soluţia de ascorbat de sodiu poate fi înlocuită cu cca 150 mg de acid ascorbic.

7.8.	Soluţia de sulfură de sodiu poate fi înlocuită cu cca 50 mg de EDTA.

7.9.

Acetatul de vitamina E hidrolizează foarte rapid în condiţii alcaline fiind, prin urmare, foarte sensibil la oxidare, mai ales în prezenţa oligoelementelor, cum ar fi fierul sau cuprul. Determinarea vitaminei E în premixuri la niveluri de peste 5 000 mg/kg ar avea drept consecinţă o degradare a vitaminei E. Prin urmare, pentru confirmare se recomandă o metodă HPLC care include o formulă pentru dizolvarea enzimatică a vitaminei E în absenţa fazei de saponificare alcalină.

8.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 15 % din rezultatul superior.

9.   Rezultatele unui studiu colaborativ  (2)

	Premix	Furaje cu premix	Concentrat mineral	Furaje proteice	Hrană pentru purcei
L	12	12	12	12	12
n	48	48	48	48	48
medie (mg/kg)	17 380	1 187	926	315	61,3
sr (mg/kg)	384	45,3	25,2	13,0	2,3
r (mg/kg)	1 075	126,8	70,6	36,4	6,4
CVr (%)	2,2	3,8	2,7	4,1	3,8
SR (mg/kg)	830	65,0	55,5	18,9	7,8
R (mg/kg)	2 324	182,0	155,4	52,9	21,8
CVR (%)	4,8	5,5	6,0	6,0	12,7

L	=	număr de laboratoare;
n	=	număr de valori individuale;
sr	=	deviaţia standard a repetabilităţii;
SR	=	deviaţia standard a reproductibilităţii;
r	=	repetabilitate;
R	=	reproductibilitate;
CVr	=	coeficientul de variaţie a repetabilităţii;
CVR	=	coeficientul de variaţie a reproductibilităţii.

C.   DETERMINAREA OLIGOELEMENTELOR FIER, CUPRU, MANGAN ȘI ZINC

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea oligoelementelor fier, cupru, mangan şi zinc din furaje. Limitele de cuantificare sunt:

—	fier (Fe): 20 mg/kg

—	cupru (Cu): 10 mg/kg

—	mangan (Mn): 20 mg/kg

—	zinc (Zn): 20 mg/kg

2.   Principiu

Eşantionul este pus în soluţie de acid clorhidric după distrugerea materiei organice, dacă aceasta este prezentă. Se determină elementele fier, cupru, mangan şi zinc, după o diluare corespunzătoare, cu ajutorul spectrometriei de absorbţie atomică.

3.   Reactivi

Comentarii introductive

Pentru prepararea reactivilor şi a soluţiilor analitice se foloseşte apă fără cationii care urmează să fie determinaţi, obţinută fie prin distilarea dublă a apei într-un distilator din sticlă borosilicat sau din cuarţ, fie prin dublu tratament cu răşină schimbătoare de ioni.

Reactivii trebuie să fie cel puţin de calitate analitică. Absenţa elementului care urmează să fie determinat trebuie verificată într-un experiment martor. Dacă este necesar, reactivii trebuie să fie purificaţi în continuare.

În locul soluţiilor etalon descrise mai jos pot fi folosite soluţii etalon din comerţ, cu condiţia ca ele să fie garantate şi să fi fost verificate înainte de utilizare.

3.1.	Acid clorhidric (d: 1,19 g/ml).

3.2.	Acid clorhidric (6 mol/litru).

3.3.	Acid clorhidric (0,5 mol/litru).

3.4.	Acid fluorhidric 38-40 % (v/v) cu un conţinut de fier (Fe) de mai puţin de 1 mg/litru şi un reziduu după evaporare de mai puţin de 10 mg (ca sulfat)/litru.

3.5.	Acid sulfuric (d: 1,84 g/ml).

3.6.	Peroxid de hidrogen [circa 100 volume de oxigen (30 % în greutate)].

3.7.	Soluţie etalon de fier (1 000 μg Fe/ml) preparată conform indicaţiilor de mai jos sau o soluţie echivalentă din comerţ: se dizolvă 1 g de sârmă de fier în 200 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (3.2), se adaugă 16 ml de peroxid de hidrogen (3.6) şi se completează până la un litru cu apă.

3.7.1.

Soluţie etalon de lucru de fier (100 μg Fe/ml) preparată diluând o parte din soluţia etalon (3.7) cu 9 părţi de apă.

3.8.	Soluţie etalon de cupru (1 000 μg Cu/ml) preparată conform indicaţiilor de mai jos sau o soluţie echivalentă din comerţ: — se dizolvă 1 g de praf de cupru în 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (3.2), se adaugă 5 ml de peroxid de hidrogen (3.6) şi se completează până la un litru cu apă.

3.8.1.

Soluţie etalon de cupru de lucru (10 μg Cu/ml) preparată diluând o parte din soluţia standard (3.8) cu 9 părţi de apă şi apoi diluând o parte din soluţia rezultată cu 9 părţi de apă.

3.9.	Soluţie etalon de mangan (1 000 μg Mn/ml) preparată conform indicaţiilor de mai jos sau o soluţie echivalentă din comerţ: — se dizolvă 1 g de praf de mangan în 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (3.2) şi se completează până la un litru cu apă.

3.9.1.

Soluţie etalon de lucru de mangan (10 μg Mn/ml) preparată diluând o parte din soluţia etalon (3.9) cu 9 părţi de apă şi apoi diluând o parte din soluţia rezultată cu 9 părţi de apă.

3.10.

Soluţie etalon de zinc (1 000 μg Zn/ml) preparată conform indicaţiilor de mai jos sau o soluţie echivalentă din comerţ: — se dizolvă 1 g de zinc sub formă de benzi sau folii în 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (3.2) şi se completează până la un litru cu apă.

3.10.1.

Soluţie etalon de lucru de zinc (10 μg Zn/ml) preparată diluând o parte din soluţia etalon (3.10) cu 9 părţi de apă şi apoi diluând o parte din soluţia rezultată cu 9 părţi de apă.

3.11.

Soluţie de clorură de lantan: se dizolvă 12 g de oxid de lantan în 150 ml de apă, se adaugă 100 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (3.2) şi se completează până la un litru cu apă.

4.   Aparatură

4.1.	Cuptor cu muflă cu reglare de temperatură şi, preferabil, cu dispozitiv de înregistrare.

4.2.	Sticlăria trebuie să fie de tip borosilicat rezistent şi se recomandă folosirea aparaturii rezervate exclusiv pentru determinarea oligoelementelor.

4.3.	Spectrofotometru de absorbţie atomică care îndeplineşte cerinţele metodei cu privire la sensibilitatea şi precizia în intervalul necesar.

5.   Procedură  (3)

5.1.   Eşantioane care conţin materie organică

5.1.1.   Arderea şi prepararea soluţiei pentru analiză  (4)

5.1.1.1.

Se introduc 5-10 g de eşantion cântărit cu o abatere de 0,2 mg într-un creuzet de cuarţ sau platină [a se vedea nota (b)], se usucă într-un cuptor la 105 oC şi se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă neîncălzit (4.1). Se închide cuptorul [a se vedea nota (c)] şi se măreşte treptat temperatura până la 450-475 oC, timp de circa 90 minute. Se menţine temperatura timp de 4-16 ore (de exemplu peste noapte) pentru a îndepărta materialul carbonic şi apoi se deschide cuptorul şi se lasă să se răcească [a se vedea nota (d)]. Se umezeşte cenuşa cu apă şi se transferă substanţa obţinută într-un pahar de laborator de 250 ml. Se spală creuzetul cu o cantitate totală de circa 5 ml de acid clorhidric (3.1) şi se adaugă acesta din urmă încet şi cu atenţie în paharul de laborator (poate apărea o reacţie puternică din cauza formării de CO2). Se adaugă acid clorhidric (3.1), picătură cu picătură, agitându-se, până când efervescenţa încetează. Se evaporă până la uscare, agitându-se din când în când cu o baghetă de sticlă. Se adaugă apoi 15 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (3.2) la reziduu, apoi circa 120 ml de apă. Se amestecă cu bagheta de sticlă, care se lasă în paharul de laborator, şi se acoperă paharul cu o sticlă de ceas. Se aduce încet la fierbere şi se menţine la punctul de fierbere până când cenuşa se dizolvă complet. Se filtrează cu hârtie de filtru lipsită de cenuşă şi se colectează filtratul într-un balon gradat de 250 ml. Se spală paharul de laborator şi se filtrează cu 5 ml de acid clorhidric 6 mol/litru fierbinte (3.2) şi de două ori cu apă fiartă. Se umple balonul gradat cu apă până la semn (concentraţia de HCl: circa 0,5 mol/litru).

5.1.1.2.

Dacă reziduul din filtru este negru (cărbune), se reintroduce în cuptor şi se calcinează din nou la 450-475 oC. Calcinarea, care necesită numai câteva ore (circa 3-5 ore), este completă când cenuşa este albă sau aproape albă. Se dizolvă reziduul cu aproximativ 2 ml de acid clorhidric (3.1), se evaporă până la uscare şi se adaugă 5 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (3.2). Se încălzeşte, se filtrează soluţia în balonul gradat şi se umple cu apă până la semn (concentraţia HCl: circa 0,5 mol/litru). Note: (a) Este important ca atunci când se măsoară oligoelementele să se ţină cont de riscul de contaminare, în special cu zinc, cupru şi fier. Din acest motiv, echipamentul folosit în cursul preparării eşantioanelor trebuie să nu conţină aceste metale. Pentru reducerea riscului general de contaminare, se lucrează într-o atmosferă fără praf, folosind un echipament curăţat cu mare atenţie şi o sticlărie spălată cu grijă. Determinarea zincului este în mod special sensibilă la multe tipuri de contaminare, de exemplu prin intermediul sticlăriei, al reactivilor, al prafului etc. (b) Greutatea eşantionului care urmează să fie calcinat rezultă din cantitatea aproximativă de oligoelemente din furaje în raport cu sensibilitatea spectrofotometrului folosit. Pentru anumite tipuri de furaje, sărace în oligoelemente, poate fi necesar să se înceapă cu un eşantion de 10-20 g şi să se completeze soluţia finală numai până la 100 ml. (c) Arderea trebuie efectuată într-un cuptor închis fără injectare de aer sau de oxigen. (d) Temperatura indicată de pirometru nu trebuie să depăşească 475 oC.

5.1.2.   Determinarea spectrofotometrică

5.1.2.1.    Pregătirea soluţiilor de calibrare

Pentru fiecare dintre elementele care urmează să fie determinate se prepară din soluţiile etalon de lucru de la punctele 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 şi 3.10.1 o gamă de soluţii de calibrare, fiecare soluţie de calibrare având o concentraţie de HCl de aproximativ 0,5 mol/litru şi (în cazul fierului, manganului şi zincului) o concentraţie de clorură de lantan echivalentă cu 0,1 % La (g/v).

Concentraţiile de oligoelemente selectate trebuie să se situeze în intervalul sensibilităţii spectrofotometrului utilizat. Tabelele prezentate în continuare indică, de exemplu, compoziţiile unor seturi tipice de soluţii de calibrare; totuşi, în funcţie de tipul şi sensibilitatea spectrofotometrului folosit, poate fi necesar să se selecteze alte concentraţii.

Fier

μg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml de soluţie etalon de lucru (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml de soluţie de clorură de lantan (3.11) şi se completează până la 100 ml cu apă

Cupru

μg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1
ml de soluţie etalon de lucru (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8

Mangan

μg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1
ml de soluţie etalon de lucru (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml de soluţie de clorură de lantan (3.11) şi se completează până la 100 ml cu apă

Zinc

μg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml de soluţie etalon de lucru (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
ml HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml de soluţie de clorură de lantan (3.11) şi se completează până la 100 ml cu apă

5.1.2.2.    Prepararea soluţiei pentru analiză

Pentru determinarea cuprului, soluţia preparată la punctul 5.1.1 poate fi, în mod normal, folosită direct. Dacă este necesar să se obţină o concentraţie situată în intervalul soluţiilor de calibrare, o parte alicotă poate fi pipetată într-un balon gradat de 100 ml şi completată până la semn cu acid clorhidric 0,5 mol/litru (3.3).

Pentru determinarea fierului, manganului şi zincului, se pipetează o parte alicotă din soluţia preparată la punctul 5.1.1 într-un balon gradat de 100 ml, se adaugă 10 ml de soluţie de clorură de lantan (3.11) şi se completează până la semn cu acid clorhidric 0,5 mol/litru (3.3) (a se vedea şi punctul 8, „Observaţii”).

5.1.2.3.    Experiment martor

Experimentul martor trebuie să includă toate etapele prevăzute în procedură, cu excepţia faptului că materialul de eşantion este omis. Soluţia de calibrare „0” nu trebuie să fie folosită ca martor.

5.1.2.4.    Măsurarea absorbţiei atomice

Se măsoară absorbţia atomică a soluţiilor de calibrare şi a soluţiei care urmează să fie analizată folosind o flacără aer-acetilenă oxidantă, la următoarele lungimi de undă:

Fe: 248,3 nm

Cu: 324,8 nm

Mn: 279,5 nm

Zn: 213,8 nm

Fiecare măsurătoare se realizează de patru ori.

5.2.   Furaje minerale

Dacă eşantionul nu conţine materie organică, calcinarea prealabilă nu este necesară. Se procedează conform descrierii de la punctul 5.1.1.1, începând de la al doilea paragraf. Evaporarea cu acid fluorhidric poate fi omisă.

6.   Calculul rezultatelor

Folosind o curbă de calibrare, se calculează concentraţia de oligoelemente în soluţia care urmează să fie analizată şi se exprimă rezultatul în mg de oligoelemente per kg de eşantion (ppm).

7.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion de către acelaşi laborant nu depăşeşte:

—	5 mg/kg, în valoare absolută, pentru conţinutul de oligoelement în cauză până la 50 mg/kg;

—	10 % din valoarea superioară, pentru un conţinut de oligoelement în cauză de la 50 până la 100 mg/kg;

—	10 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conţinut de oligoelement în cauză de la 100 până la 200 mg/kg;

—	5 % din valoarea superioară, pentru un conţinut de oligoelement în cauză mai mare de 200 mg/kg.

8.   Observaţie

Prezenţa de cantităţi mari de fosfaţi ar putea interfera cu determinarea fierului, manganului şi zincului. Astfel de interferenţe trebuie să fie corectate adăugând soluţie de clorură de lantan (3.11). Dacă, însă, în eşantion, raportul de greutate Ca + Mg/P este > 2, adăugarea soluţiei de clorură de lantan (3.11) la soluţia de analizat şi la soluţiile de calibrare poate fi omisă.

D.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE HALOFUGINONĂ

DL-trans-7-brom-6-clor-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-(3H)-onă-hidrobromid

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conţinutului de halofuginonă din furaje. Limita de cuantificare este de 1 mg/kg.

2.   Principiu

După tratarea cu apă fierbinte, halofuginona se extrage ca bază liberă în acetat de etil şi ulterior se separă ca hidroclorid, într-o soluţie apoasă de acid. Extractul se purifică prin cromatografie prin schimb ionic. Conţinutul de halofuginonă se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC), prin utilizarea unui detector de raze UV.

3.   Reactivi

3.1.	Acetonitril, de calitate HPLC.

3.2.	Răşină Amberlit XAD-2.

3.3.	Acetat de amoniu.

3.4.	Acetat de etil.

3.5.	Acid acetic glacial.

3.6.	Substanţa etalon halofuginonă (DL-trans-7-brom-6-clor-3-[3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]chinazolin-4-(3H)-onă hidrobromid, E 764)

3.6.1.

Soluţie etalon stoc de halofuginonă, 100 μg/ml Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de halofuginonă (3.6) într-un balon gradat de 500 ml, apoi se dizolvă în soluţie tampon de acetat de amoniu (3.18), se completează până la semn cu soluţie tampon şi se amestecă. Această soluţie este stabilă timp de trei săptămâni, la 5 oC, dacă este depozitată la întuneric.

3.6.2.

Soluţii de calibrare Se transferă 1, 2, 3, 4 şi 6 ml de soluţie etalon stoc (3.6.1) într-o serie de baloane gradate de 100 ml. Se completează până la semn cu fază mobilă (3.21) şi se amestecă. Soluţiile au concentraţii de 1, 2, 3, 4 şi 6 μg/ml de halofuginonă. Aceste soluţii se prepară imediat înainte de utilizare.

3.7.	Acid clorhidric (ρ20 aproximativ 1,16 g/ml).

3.8.

Metanol.

3.9.	Nitrat de argint.

3.10.

Ascorbat de sodiu.

3.11.

Carbonat de sodiu.

3.12.

Clorură de sodiu.

3.13.

EDTA (acid etilendiaminotetraacetic, sare disodică).

3.14.

Apă, de calitate HPLC.

3.15.

Soluţie de carbonat de sodiu, c = 10 g/100 ml.

3.16.

Soluţie de carbonat de sodiu saturată cu clorură de sodiu, c = 5 g/100 ml Se dizolvă 50 g de carbonat de sodiu (3.11) în apă, se diluează până la 1 litru şi se adaugă clorură de sodiu (3.12) până la saturarea soluţiei.

3.17.

Acid clorhidric, aproximativ 0,1 mol/l Se diluează 10 ml de HCl (3.7) în apă până la 1 litru.

3.18.

Soluţie tampon de acetat de amoniu, aproximativ 0,25 mol/l Se dizolvă 19,3 g de acetat de amoniu (3.3) şi 30 ml de acid acetic (3.5) în apă (3.14) şi se diluează până la 1 litru.

3.19.

Prepararea răşinii de Amberlit XAD-2 Se spală cu apă o cantitate corespunzătoare de Amberlit (3.2), până la îndepărtarea tuturor ionilor de clor, după cum indică testul cu nitrat de argint (3.20) efectuat pe faza apoasă eliminată. Apoi se spală răşina cu 50 ml de metanol (3.8), se elimină metanolul şi se depozitează răşina în metanol proaspăt.

3.20.

Soluţie de nitrat de argint, aproximativ 0,1 mol/l Se dizolvă 0,17 g de nitrat de argint (3.9) în 10 ml de apă.

3.21.

Fază mobilă HPLC Se amestecă 500 ml de acetonitril (3.1) cu 300 ml soluţie tampon de acetat de amoniu (3.18) şi 1 200 ml de apă (3.14). Se aduce pH-ul la valoarea 4,3 folosind acid acetic (3.5). Se trece printr-un filtru de 0,22 μm (4.8) şi se degazează soluţia (de exemplu prin ultrasonare timp de 10 minute). Această soluţie este stabilă timp de o lună dacă este depozitată într-un recipient închis, la întuneric.

4.   Aparatură

4.1.	Baie cu ultrasunete.

4.2.	Evaporator rotativ cu generare de film.

4.3.	Centrifugă.

4.4.	Echipament HPLC cu detector de raze UV cu lungimi de undă variabile sau detector cu grup de diode

4.4.1.

Coloană pentru cromatografie lichidă, 300 mm × 4 mm, C18, particule de 10 μm sau o coloană echivalentă.

4.5.	Coloană de sticlă (300 mm × 10 mm) prevăzută cu filtru de sticlă sinterizată şi cu robinet de închidere.

4.6.	Filtre din fibră de sticlă, cu diametru de 150 mm.

4.7.	Filtre cu membrană de 0,45 μm.

4.8.	Filtre cu membrană de 0,22 μm.

5.   Procedură

Notă:

Halofuginona ca bază liberă este instabilă în soluţii alcaline sau de acetat de etil. Ea nu trebuie să rămână în acetat de etil mai mult de 30 de minute.

5.1.   Aspecte generale

5.1.1.

Se analizează un furaj martor pentru a verifica absenţa halofuginonei şi a substanţelor interferente.

5.1.2.

Se efectuează un test de recuperare prin analiza furajului martor care a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de halofuginonă, similară cu cea prezentă în eşantion. Pentru a obţine o concentraţie de 3 mg/kg se adaugă 300 μl din soluţia etalon stoc (3.6.1) la 10 g de furaj martor, se amestecă şi se aşteaptă 10 minute înainte de a se începe etapa de extracţie (5.2). Notă: Conform acestei metode, furajul martor este similar, ca tip, cu eşantionul, iar la analiză nu se detectează halofuginonă.

5.2.   Extracţie

Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 g, 10 g de eşantion preparat, într-un tub de centrifugă de 200 ml, se adaugă 0,5 g de ascorbat de sodiu (3.10), 0,5 g de EDTA (3.13) şi 20 ml de apă, apoi se amestecă. Se plasează tubul într-o baie de apă timp de 5 minute (80 oC). După răcire la temperatura camerei se adaugă 20 ml soluţie de carbonat de sodiu (3.15) şi se amestecă. Se adaugă imediat 100 ml de acetat de etil (3.4) şi se agită energic cu mâna timp de 15 secunde. Apoi tubul se aşează într-o baie cu ultrasunete (4.1) timp de 3 minute şi se slăbeşte dopul. Se centrifughează timp de 2 minute şi se decantează faza de acetat de etil printr-un filtru de fibră de sticlă (4.6), într-o pâlnie de separare de 500 ml. Se repetă extracţia eşantionului cu o a doua cantitate de 100 ml acetat de etil. Se spală extractele combinate timp de 1 minut cu 50 ml de soluţie de carbonat de sodiu saturată cu clorură de sodiu (3.16) şi se îndepărtează stratul apos.

Se extrage stratul organic timp de 1 minut cu 50 ml de acid clorhidric (3.17). Se trece stratul inferior de acid printr-o pâlnie de separare de 250 ml. Se extrage din nou stratul organic timp de 1,5 minute, cu o altă cantitate de 50 ml acid clorhidric, apoi se combină cu primul extract. Se spală extractele de acid combinate prin agitare circulară timp de aproximativ 10 secunde cu 10 ml de acetat de etil (3.4).

Se transferă cantitativ stratul apos într-un balon cu fund rotund de 250 ml şi se îndepărtează faza organică. Se evaporă din soluţia acidă tot acetatul de etil rămas utilizând un evaporator rotativ cu generare de film (4.2). Temperatura băii de apă trebuie să nu depăşească 40 oC. În condiţiile unei presiuni de aproximativ 25 mbar întreaga cantitate de acetat de etil rezidual se îndepărtează în 5 minute la 38 oC.

5.3.   Curăţare

5.3.1.   Pregătirea coloanei de Amberlit

Pentru fiecare extract de eşantion se pregăteşte câte o coloană XAD-2. Se transferă 10 g de Amberlit preparat (3.19) într-o coloană de sticlă (4.5) cu metanol (3.8). Se adaugă un dop mic de vată de sticlă deasupra patului de răşină. Se scurge metanolul din coloană şi se spală răşina cu 100 ml de apă, oprind fluxul pe măsură ce lichidul ajunge la partea superioară a patului de răşină. Se lasă coloana să se echilibreze timp de 10 minute înainte de utilizare. Niciodată nu se lasă coloana să se usuce.

5.3.2.   Curăţarea eşantionului

Se transferă cantitativ extractul (5.2) în partea superioară a coloanei de Amberlit preparată (5.3.1) şi se eluează, îndepărtând apoi eluatul. Rata de eluare nu trebuie să depăşească 20 ml/minut. Se clăteşte balonul cu fund rotund cu 20 ml de acid clorhidric (3.17), apoi acesta se foloseşte pentru spălarea coloanei de răşină. Se suflă orice urmă de soluţie acidă rămasă cu ajutorul unui curent de aer. Se îndepărtează lichidele de spălare. Se adaugă 100 ml de metanol (3.8) în coloană şi se eluează 5-10 ml; se colectează eluatul într-un balon cu fundul rotund de 250 ml. Se lasă metanolul rămas timp de 10 minute să se echilibreze cu răşina şi se continuă eluarea la o rată care să nu depăşească 20 ml/minut, colectând eluatul în acelaşi balon cu fundul rotund. Se evaporează metanolul pe evaporatorul rotativ cu generare de film (4.2); temperatura băii de apă trebuie să nu depăşească 40 oC. Se transferă cantitativ reziduul într-un balon gradat de 10 ml, utilizând faza mobilă (3.21). Se completează până la semn cu ajutorul fazei mobile şi se amestecă. Se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană (4.7). Această soluţie se păstrează pentru determinarea prin HPLC (5.4).

5.4.   Determinarea prin HPLC

5.4.1.   Parametri

Următoarele condiţii sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea duc la rezultate echivalente.

Coloană pentru cromatografie lichidă (4.4.1)

Fază mobilă HPLC (3.21)

Debit: 1,5-2 ml/minut

Lungimea undei de detecţie: 243 nm

Volum de injecţie: 40-100 μl.

Stabilitatea sistemului cromatografic se verifică prin injectarea de mai multe ori a soluţiei de calibrare (3.6.2) conţinând 3 μg/ml, până la obţinerea de înălţimi (sau de arii) ale vârfurilor şi de timpi de retenţie constanţi.

5.4.2.   Curba de calibrare

Se injectează fiecare soluţie de calibrare (3.6.2) de mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) vârfurilor pentru fiecare concentraţie. Se trasează o curbă de calibrare utilizând înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor soluţiilor de calibrare ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.

5.4.3.   Soluţia de eşantion

Se injectează extractul de eşantion (5.3.2) de mai multe ori, utilizând acelaşi volum ca cel utilizat pentru soluţiile de calibrare şi se determină înălţimea (aria) medie a vârfurilor pentru vârfurile de halofuginonă.

6.   Calculul rezultatelor

Concentraţia soluţiei de eşantion în μg/ml se determină plecând de la înălţimea (aria) medie a vârfurilor de halofuginonă a soluţiei de eşantion prin referire la curba de calibrare (5.4.2).

Conţinutul de halofuginonă w (mg/kg) al eşantionului este dat de formula următoare:

unde:

c	=	concentraţia de halofuginonă din soluţia de eşantion, în μg/ml;
m	=	greutatea porţiunii de testat, în grame.

7.   Validarea rezultatelor

7.1.   Identitatea

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode cu care se compară spectrul extractului de eşantion cu cel al soluţiei de calibrare (3.6.2), care conţine 6 μg/ml.

7.1.1.   Co-cromatografie

Un extract de eşantion este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare de soluţie de calibrare (3.6.2). Cantitatea de halofuginonă adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea estimată de halofuginonă găsită în extractul de eşantion.

După luarea în considerare atât a cantităţii adăugate, cât şi a diluţiei extractului, creşte numai înălţimea vârfului de halofuginonă. Lărgimea vârfului, la jumătate din înălţimea sa maximă, trebuie să se încadreze într-o variaţie de ± 10 % din lărgimea originală.

7.1.2.   Detecţie cu grup de diode

Rezultatele se evaluează după următoarele criterii:

(a)

Lungimea de undă a absorbţiei maxime a spectrelor eşantionului şi a etalonului, înregistrată la vârful cel mai înalt al cromatogramei, trebuie să fie aceeaşi într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detecţia cu grup de diode, aceasta este de obicei de ± 2 nm;

(b)

între 225 şi 300 nm, spectrele eşantionului şi ale etalonului, înregistrate la vârful cel mai înalt al cromatogramei, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când deviaţia dintre două spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15 % din absorbanţa analitului etalon;

(c)

între 225 şi 300 nm, spectrele curbei ascendente, ale punctului maxim şi ale curbei descendente ale vârfului produs de extractul de eşantion nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când deviaţia dintre două spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15 % din absorbanţa spectrului punctului maxim.

Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa analitului nu a fost confirmată.

7.2.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 0,5 mg/kg pentru un conţinut de halofugiononă de până la 3 mg/kg.

7.3.   Recuperare

Pentru eşantionul martor îmbogăţit se realizează o recuperare de minimum 80 %.

8.   Rezultatele unui studiu colaborativ

A fost organizat un studiu colaborativ (5) în cadrul căruia trei eşantioane au fost analizate de opt laboratoare.

Rezultate

	Eşantionul A (martor) La primire	Eşantionul B (făină)		Eşantionul C (pelete)
		La primire	După două luni	La primire	După două luni
Medie (mg/kg)	ND	2,8	2,42	2,89	2,45
SR (mg/kg)	—	0,45	0,43	0,4	0,42
CVR (%)	—	16	18	14	17
Rec. (%)		86	74	88	75

ND	=	nedetectat;
SR	=	deviaţia standard a reproductibilităţii;
CVR	=	coeficientul de variaţie a reproductibilităţii (%);
Rec.	=	recuperare (%).

E.   DETERMINAREA ROBENIDINEI

Clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorbenziliden)amino]guanidin

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conţinutului de robenidină din furaje. Limita de cuantificare este de 5 mg/kg.

2.   Principiu

Eşantionul se extrage cu metanol acidifiat. Extractul se usucă şi o parte alicotă se curăţă într-o coloană de oxid de aluminiu. Robenidina se eluează din coloană cu metanol, se concentrează şi se completează până la un volum adecvat cu fază mobilă. Conţinutul de robenidină se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC), utilizând un detector de radiaţii UV.

3.   Reactivi

3.1.

Metanol.

3.2.	Metanol acidifiat Se transferă 4 ml de acid clorhidric (ρ20 = 1,18 g/ml) într-un balon gradat de 500 ml, se completează până la semn cu metanol (3.1) şi se amestecă. Soluţia se prepară imediat înainte de utilizare.

3.3.	Acetonitril, de calitate HPLC.

3.4.	Sită moleculară Tip 3A, 8-12 noduri ale sitei (noduri de 1,6-2,5 mm, aluminosilicat cristalin, diametrul porilor 0,3 mm).

3.5.	Oxid de aluminiu, activitate acidă grad I pentru cromatografia pe coloană Se transferă 100 g de oxid de aluminiu într-un recipient adecvat şi se adaugă 2 ml de apă. Se închide şi se agită timp de aproximativ 20 de minute. Se păstrează într-un recipient bine închis.

3.6.	Soluţie de fosfat diacid de potasiu, c = 0,025 mol/l Se dizolvă 3,4 g de fosfat diacid de potasiu în apă (de calitate HPLC), într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn şi se amestecă.

3.7.	Soluţie de fosfat acid disodic, c = 0,025 mol/l Se dizolvă 3,55 g de fosfat acid disodic anhidru (sau 4,45 g de dihidrat sau 8,95 g de dodecahidrat) în apă (de calitate HPLC), într-un balon gradat de 1 litru, se completează până la semn şi se amestecă.

3.8.

Fază mobilă HPLC Se amestecă următorii reactivi:   650 ml de acetonitril (3.3),   250 ml apă (de calitate HPLC),   50 ml soluţie de fosfat diacid de potasiu (3.6),   50 ml soluţie de fosfat acid disodic (3.7). Se trece printr-un filtru de 0,22 μm (4.6) şi se degazează soluţia (de exemplu, prin ultrasonare timp de 10 minute).

3.9.	Substanţa etalon Robenidină pură: clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorobenziliden)amino]guanidin.

3.9.1.

Soluţia etalon stoc de robenidină: 300 μg/ml Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 30 mg de substanţă etalon de robenidină (3.9). Se dizolvă în metanol acidifiat (3.2) într-un balon gradat de 100 ml, se completează până la semn cu acelaşi solvent şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu şi se păstrează la întuneric.

3.9.2.

Soluţie etalon intermediară de robenidină: 12 μg/ml Se transferă 10 ml din soluţia etalon stoc (3.9.1) într-un balon gradat de 250 ml, se completează până la semn cu faza mobilă (3.8) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu şi se păstrează la întuneric.

3.9.3.

Soluţii de calibrare Se transferă 5, 10, 15, 20 şi 25 ml de soluţie etalon intermediară (3.9.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se completează până la semn cu fază mobilă (3.8) şi se amestecă. Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 şi 6 μg/ml de robenidină. Soluţiile se prepară imediat înainte de a fi utilizate.

3.10.

Apă de calitate HPLC.

4.   Aparatură

4.1.	Coloană de sticlă Construită din sticlă brună, prevăzută cu robinet de închidere şi un rezervor cu capacitatea de aproximativ 150 ml, diametru interior 10-15 mm, lungime 250 mm.

4.2.	Agitator mecanic sau magnetic.

4.3.	Evaporator rotativ cu generare de film.

4.4.	Echipament HPLC cu detector de radiaţii UV cu lungimi de undă variabile sau cu detector cu grup de diode care funcţionează în intervalul 250-400 nm

4.4.1.

Coloană pentru cromatografie lichidă: 300 mm × 4 mm, C18, particule de 10 μm sau echivalent.

4.5.	Hârtie de filtru din fibră de sticlă (Whatman GF/A sau echivalentă).

4.6.	Filtre cu membrană, 0,22 μm.

4.7.	Filtre cu membrană, 0,45 μm.

5.   Procedură

Notă:

Robenidina este sensibilă la lumină. Pentru toate operaţiile se foloseşte sticla brună.

5.1.   Aspecte generale

5.1.1.

Se analizează un furaj martor pentru a verifica absenţa robenidinei şi a substanţelor interferente.

5.1.2.

Se efectuează un test de recuperare prin analizarea furajului martor (5.1.1) care a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de robenidină, similară cu cea prezentă în eşantion. Pentru a obţine o concentraţie de 60 mg/kg, se transferă 3 ml din soluţia etalon stoc (3.9.1) într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml. Se evaporă soluţia până la cca 0,5 ml într-un curent de azot. Se adaugă 15 g din furajul martor, se amestecă şi se aşteaptă 10 minute înainte de a se începe etapa de extracţie (5.2). Notă: Pentru această metodă, furajul martor este similar, ca tip, cu eşantionul, iar la analiză nu se detectează robenidină.

5.2.   Extracţie

Se cântăresc cu o abatere de 0,01 g, aproximativ 15 g de eşantion preparat. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml şi se adaugă 100 ml metanol acidifiat (3.2), se închide şi se agită timp de 1 oră în agitator (4.2). Se filtrează soluţia prin hârtie de filtru din fibră de sticlă (4.5) şi se colectează întregul filtrat într-un flacon tip Erlenmeyer de 150 ml. Se adaugă 7,5 g de sită moleculară (3.4), se închide şi se agită timp de 5 minute. Se filtrează imediat prin hârtie de filtru din fibră de sticlă. Se conservă această soluţie pentru etapa de purificare (5.3).

5.3.   Purificare

5.3.1.   Pregătirea coloanei de oxid de aluminiu

Se introduce un tampon mic de vată de sticlă în capătul inferior al coloanei de sticlă (4.1) şi se împinge utilizând o baghetă de sticlă. Se cântăresc 11 g din oxidul de aluminiu preparat (3.5) şi se transferă în coloană. Pe parcursul acestei etape este important ca expunerea la aer să fie redusă la minimum. Se loveşte uşor coloana încărcată în partea inferioară pentru a permite stabilizarea oxidului de aluminiu.

5.3.2.   Purificarea eşantionului

Se transferă în coloană cu pipeta 5 ml de extract de eşantionul preparat în (5.2). Vârful pipetei se menţine aproape de peretele coloanei şi se permite ca soluţia să fie absorbită de oxidul de aluminiu. Se eluează robenidina din coloană folosind 100 ml metanol (3.1), cu un debit de 2-3 ml/minut şi se colectează eluatul într-un balon cu fundul rotund de 250 ml. Se evaporă soluţia de metanol până la uscare sub presiune redusă la 40 oC, prin intermediul unui evaporator rotativ cu generare de film (4.3). Se redizolvă reziduul în 3-4 ml de fază mobilă (3.8) şi se transferă cantitativ într-un balon gradat de 10 ml. Se clăteşte balonul de mai multe ori cu cantităţi de 1-2 ml de fază mobilă şi se transferă lichidul de clătire în balonul gradat. Se completează până la semn cu acelaşi solvent şi se amestecă. Se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm (4.7). Această soluţie se păstrează pentru determinarea prin HPLC (5.4).

5.4.   Determinarea prin HPLC

5.4.1.   Parametri

Următoarele condiţii sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea duc la rezultate echivalente:

Coloană pentru cromatografie lichidă (4.4.1).

Fază mobilă HPLC (3.8).

Debit: 1,5-2 ml/minut.

Lungimea de undă a detectorului: 317 nm.

Volum de injecţie: 20-50 μl.

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, prin injectarea de mai multe ori a soluţiei de calibrare (3.9.3) care conţine 3,6 μg/ml, până la obţinerea de valori de vârf şi de timpi de retenţie constanţi.

5.4.2.   Curba de calibrare

Fiecare soluţie de calibrare (3.9.3) se injectează de mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) vârfurilor pentru fiecare concentraţie. Se trasează o curbă de calibrare utilizând înălţimile sau ariile medii ale vârfurilor soluţiilor de calibrare ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.

5.4.3.   Soluţia de eşantion

Se injectează de mai multe ori extractul de eşantion (5.3.2) folosind acelaşi volum ca şi în cazul soluţiilor de calibrare şi se determină înălţimea (aria) medie a vârfurilor pentru vârfurile de robenidină.

6.   Calculul rezultatelor

Din înălţimea (aria) medie a vârfurilor robenidinei din soluţia de eşantion se determină concentraţia în μg/ml a soluţiei de eşantion prin referire la curba de calibrare (5.4.2).

Conţinutul de robenidină w (mg/kg) din eşantion este dat de formula următoare:

unde:

c	=	concentraţia de robenidină din soluţia de eşantion, în μg/ml;
m	=	greutatea porţiunii de testat, în grame.

7.   Validarea rezultatelor

7.1.   Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau prin folosirea unui detector cu grup de diode, prin intermediul căruia se compară spectrul extractului de eşantion şi cel al soluţiei de calibrare (3.9.3) conţinând 6 μg/ml.

7.1.1.   Co-cromatografie

Un extract de eşantion se îmbogăţeşte prin adăugarea unei cantităţi adecvate de soluţie de calibrare (3.9.3). Cantitatea de robenidină adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea estimată de robenidină constatată în extractul de eşantion.

Numai înălţimea vârfului de robenidină creşte după luarea în considerare a cantităţii adăugate şi a diluţiei extractului. Lărgimea vârfului la jumătatea înălţimii sale maxime trebuie să se încadreze într-o variaţie de aproximativ 10 % din lărgimea iniţială.

7.1.2.   Detecţie cu grup de diode

Rezultatele se evaluează după următoarele criterii:

(a)

Lungimea de undă a absorbţiei maxime a spectrelor eşantionului şi a etalonului, înregistrată la vârful cel mai înalt al cromatogramei, trebuie să fie aceeaşi, într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detectarea cu grup de diode, aceasta este în mod normal de aproximativ 2 nm;

(b)

între 225 şi 400 nm, spectrele eşantionului şi ale etalonului, înregistrate la vârful cel mai înalt al cromatogramei, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când deviaţia dintre două spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15 % din absorbanţa analitului etalon;

(c)

între 225 şi 400 nm, spectrele curbei ascendente, ale punctului maxim şi ale curbei descendente ale vârfului produs de extractul de eşantion nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când deviaţia dintre spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15 % din absorbanţa spectrului punctului maxim.

Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa analitului nu a fost confirmată.

7.2.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 10 % din valoarea superioară, pentru un conţinut de robenidină mai mare de 15 mg/kg.

7.3.   Recuperare

Pentru un eşantion martor îmbogăţit, recuperarea este de cel puţin 85 %.

8.   Rezultatele unui studiu colaborativ

A fost organizat un studiu prin colaborare la nivelul CE, în cursul căruia au fost analizate de către 12 laboratoare patru eşantioane, sub formă de făină sau de pelete, de hrană pentru păsări de crescătorie şi pentru iepuri. Fiecare eşantion a făcut obiectul unei duble analize. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos:

	Păsări de crescătorie		Iepuri
	Făină	Pelete	Făină	Pelete
Medie (mg/kg)	27	27,99	43,6	40,1
sr (mg/kg)	1,46	1,26	1,44	1,66
CVr (%)	5,4	4,5	3,3	4,1
SR (mg/kg)	4,36	3,36	4,61	3,91
CVR (%)	16,1	12	10,6	9,7
Recuperare (%)	90	93,3	87,2	80,2

sr	=	deviaţia standard a repetabilităţii;
CVr	=	coeficientul de variaţie a repetabilităţii, %;
SR	=	deviaţia standard a reproductibilităţii;
CVR	=	coeficientul de variaţie a reproductibilităţii, %.

F.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE DICLAZURIL

(+)-4-clorfenil [2,6-diclor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2yl)fenil]-acetonitril

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conţinutului de diclazuril din furaje şi premixuri. Limita de detecţie este de 0,1 mg/kg, iar limita de cuantificare este de 0,5 mg/kg.

2.   Principiu

După adăugarea unui standard intern, eşantionul este extras cu metanol acidifiat. Pentru furaje, o parte alicotă a extractului este purificată pe un cartuş C18 pentru extracţie în fază solidă. Diclazurilul este eluat din cartuş cu un amestec de metanol acidifiat şi apă. După evaporare, reziduul se dizolvă într-un amestec DMF/apă. Pentru premixuri, extractul se evaporă şi reziduul se dizolvă într-un amestec DMF/apă. Conţinutul de diclazuril se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC) cu gradient ternar şi cu fază inversată, prin utilizarea unui detector UV.

3.   Reactivi

3.1.	Apă, de calitate HPLC.

3.2.	Acetat de amoniu.

3.3.	Sulfat acid de tetrabutilamoniu (TBHS).

3.4.	Acetonitril, de calitate HPLC.

3.5.	Metanol, de calitate HPLC.

3.6.	N,N-dimetilformamidă (DMF).

3.7.	Acid clorhidric, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8.	Substanţă etalon: diclazuril II-24: (+)-4-clorfenil [2,6 diclor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-il) fenil] acetonitril, cu puritate garantată, E771

3.8.1.

Soluţie etalon stoc de diclazuril, 500 μg/ml Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 25 mg de substanţă etalon de diclazuril (3.8) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (3.6), se completează până la semn cu DMF (3.6) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4 oC, soluţia este stabilă timp de o lună.

3.8.2.

Soluţia etalon de diclazuril, 50 μg/ml Se transferă 5 ml din soluţia etalon stoc (3.8.1) într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu DMF (3.6) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4 oC, soluţia este stabilă timp de o lună.

3.9.	Substanţă etalon internă: 2,6 diclor-α-(4-clorfenil)-4-[4,5-dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazină-2 (3H)-il]α-metilbenzen-acetonitril

3.9.1.

Soluţie etalon stoc internă de diclazuril, 500 μg/ml Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 25 mg de substanţă etalon internă (3.9) într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în DMF (3.6), se completează până la semn cu DMF (3.6) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4 oC, soluţia este stabilă timp de o lună.

3.9.2.

Soluţie etalon internă, 50 μg/ml Se transferă 5 ml din soluţia etalon stoc internă de etalon intern (3.9.1) într-un balon gradat de 50 ml, se completează până la semn cu DMF (3.6) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4 oC, soluţia este stabilă timp de o lună.

3.9.3.

Soluţie etalon internă pentru premixuri, p/1 000 mg/ml (p = conţinut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg) Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, p/10 mg de substanţă etalon internă într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în DMF (3.6) într-o baie cu ultrasunete (4.6), se completează până la semn cu DMF şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4 oC, soluţia este stabilă timp de o lună.

3.10.

Soluţie de calibrare, 2 μg/ml Se pipetează 2 ml din soluţia etalon de diclazuril (3.8.2) şi 2 ml din soluţia etalon internă (3.9.2) într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 16 ml de DMF (3.6), se completează până la semn cu apă şi se amestecă. Soluţia trebuie preparată imediat înainte de utilizare.

3.11.

Cartuş C18 pentru extracţie în fază solidă, de exemplu Bond Elut, mărime: 1 cc, greutatea absorbentului: 100 mg.

3.12.

Solvent de extracţie: metanol acidifiat Se pipetează 5 ml de acid clorhidric (3.7) în 1 000 ml de metanol (3.5) şi se amestecă.

3.13.

Fază mobilă pentru HPLC

3.13.1.

Eluent A: acetat de amoniu – soluţie de sulfat acid de tetrabutilamoniu. Se dizolvă 5 g de acetat de amoniu (3.2) şi 3,4 g de TBHS (3.3) în 1 000 ml de apă (3.1) şi se amestecă.

3.13.2.

Eluent B: acetonitril (3.4).

3.13.3.

Eluent C: metanol (3.5).

4.   Aparatură

4.1.	Agitator mecanic.

4.2.	Echipament pentru HPLC cu gradient ternar

4.2.1.

Coloană pentru cromatografie lichidă, Hypersil ODS, particule de 3 μm, 100 mm × 4,6 mm sau echivalent.

4.2.2.

Detector UV cu ajustare variabilă a lungimii de undă sau detector cu grup de diode.

4.3.	Evaporator rotativ cu generare de film.

4.4.	Filtru cu membrană, 0,45 μm.

4.5.	Distribuitor în vid.

4.6.	Baie cu ultrasunete.

5.   Procedură

5.1.   Aspecte generale

5.1.1.   Furaj martor

Se analizează un furaj martor pentru a verifica absenţa diclazurilului şi a substanţelor interferente. Furajul martor este similar, ca tip, cu eşantionul, iar prin analiză nu se detectează nici diclazuril, nici substanţe interferente.

5.1.2.   Test de recuperare

Se efectuează un test de recuperare prin analiza furajului martor îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de diclazuril, similară cu cea prezentă în eşantion. Pentru a obţine o concentraţie de 1 mg/kg, se adaugă 0,1 ml din soluţia etalon stoc (3.8.1) la 50 g din furajul martor, se amestecă bine şi se lasă timp de 10 minute, amestecând din nou de mai multe ori înainte de a continua (5.2).

Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor similar, ca tip, cu eşantionul (a se vedea 5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat prin metoda standard de adăugare a etalonului. În acest caz, eşantionul de analizat se îmbogăţeşte adăugând o cantitate de diclazuril similară celei deja prezente în eşantion. Acest eşantion este analizat împreună cu eşantionul neîmbogăţit, iar recuperarea poate fi calculată prin scădere.

5.2.   Extracţie

5.2.1.   Furaje

Se cântăresc, cu o abatere de 0,01 g, aproximativ 50 g de eşantion. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml, se adaugă 1 ml din soluţia etalon internă (3.9.2), 200 ml din solventul de extracţie (3.12) şi se astupă flaconul. Se agită amestecul în agitator (4.1) pe parcursul nopţii. Se lasă să se sedimenteze timp de 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 20 ml din supernatant într-un recipient de sticlă adecvat şi se diluează în 20 ml apă. Se transferă această soluţie într-un cartuş de extracţie (3.11) şi se trece prin acesta prin aplicare de vid (4.5). Se spală cartuşul cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracţie (3.12) şi apă, 65 + 35 (V + V). Se elimină fracţiunile colectate şi se eluează compuşii cu ajutorul a 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracţie (3.12) şi apă, 80 + 20 (V + V). Se evaporă această fracţiune până la uscare prin intermediul evaporatorului rotativ (3.1) la 60 oC. Se dizolvă reziduul în 1 ml DMF (3.6), se adaugă 1,5 ml de apă (3.1) şi se amestecă. Se filtrează cu un filtru cu membrană (4.4). Se continuă cu determinarea prin HPLC (5.3).

5.2.2.   Premixuri

Se cântăresc, cu o abatere de 0,001 g, aproximativ 1 g de eşantion. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml, se adaugă 1 ml din soluţia etalon internă (3.9.3) şi 200 ml din solventul de extracţie (3.12) şi se astupă flaconul. Se agită amestecul în agitator (4.1) pe parcursul nopţii. Se lasă să se sedimenteze timp de 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 10 000/p ml (p = conţinutul nominal în diclazuril al premixului în mg/kg) din supernatant într-un balon cu fund rotund de dimensiuni adecvate. Se evaporă acest amestec până la uscare, la presiune scăzută şi la 60 oC, cu ajutorul unui evaporator rotativ (4.3). Se dizolvă din nou reziduul în 10 ml de DMF (3.6), se adaugă 15 ml de apă (3.1) şi se amestecă. Se continuă cu determinarea prin HPLC (5.3).

5.3.   Determinarea prin HPLC

5.3.1.   Parametri

Următoarele condiţii sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea duc la rezultate echivalente.

Coloană pentru cromatografie lichidă (4.2.1):	100 mm × 4,6 mm Hypersil ODS, particule de 3 μm sau echivalent
Fază mobilă:	Eluent A (3.13.1):	Soluţie apoasă de acetat de amoniu şi sulfat acid de tetrabutilamoniu
	Eluent B (3.13.2):	acetonitril
	Eluent C (3.13.3):	metanol
Mod de eluţie:	— gradient linear — condiţii iniţiale: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V) — după 10 min, eluţia prin gradient timp de 30 min la: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). Se clăteşte cu B timp de 10 minute.
Debit:	1,5-2 ml/minut
Volum de injecţie:	20 μl
Lungimea de undă a detectorului:	280 nm

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic injectându-se de mai multe ori soluţia de calibrare (3.10) care conţine 2 μg/ml, până când se obţin valori de vârf şi timpi de retenţie constanţi.

5.3.2.   Soluţia de calibrare

Se injectează 20 μl din soluţia de calibrare (3.10) de mai multe ori şi se determină înălţimea (aria) medie a vârfurilor de diclazuril şi a vârfurilor etalonului intern.

5.3.3.   Soluţia de eşantion

Se injectează 20 μl din soluţia de eşantion (5.2.1 sau 5.2.2) de mai multe ori şi se determină înălţimea (aria) medie a vârfului de diclazuril şi a vârfurilor etalonului intern.

6.   Calculul rezultatelor

6.1.   Furaje

Conţinutul în diclazuril w (în mg/kg) al eşantionului este dat de următoarea formulă:

[mg/kg]

unde:

hd,s	=	înălţimea (aria) vârfului de diclazuril din soluţia de eşantion (5.2.1);
hi,s	=	înălţimea (aria) vârfului etalonului intern din soluţia de eşantion (5.2.1);
hd,c	=	înălţimea (aria) vârfului de diclazuril din soluţia de calibrare (3.10);
hi,c	=	înălţimea (aria) vârfului etalonului intern din soluţia de calibrare (3.10);
cd,c	=	concentraţia de diclazuril din soluţia de calibrare în μg/ml (3.10);
m	=	greutatea porţiunii de testat, în g;
V	=	volumul extractului de eşantion conform 5.2.1 (adică 2,5 ml).

6.2.   Premixuri

Conţinutul în diclazuril w (în mg/kg) al eşantionului este dat de următoarea formulă:

[mg/kg]

unde:

hd,c	=	înălţimea (aria) vârfului de diclazuril din soluţia de calibrare (3.10);
hi,c	=	înălţimea (aria) vârfului etalonului intern din soluţia de calibrare (3.10);
hd,s	=	înălţimea (aria) vârfului de diclazuril din soluţia de eşantion (5.2.2);
hi,s	=	înălţimea (aria) vârfului etalonului intern din soluţia de eşantion (5.2.2);
cd,c	=	concentraţia în diclazuril a soluţiei de calibrare în μg/ml (3.10);
m	=	greutatea porţiunii de test, în g;
V	=	volumul extractului de eşantion conform 5.2.2 (adică 25 ml);
p	=	conţinutul nominal de diclazuril al premixului în mg/kg.

7.   Validarea rezultatelor

7.1.   Identitate

Identitatea analitului poate fi confirmată prin co-cromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode care permite compararea spectrelor extractului de eşantion (5.2.1 sau 5.2.2) şi ale soluţiei de calibrare (3.10).

7.1.1.   Co-cromatografie

Un extract de eşantion (5.2.1 sau 5.2.2) este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi adecvate din soluţia de calibrare (3.10). Cantitatea de diclazuril adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea de diclazuril constatată în extractul de eşantion.

Numai înălţimea vârfului de diclazuril şi a vârfului etalonului intern creşte după luarea în considerare atât a cantităţii adăugate, cât şi a diluţiei extractului. Lărgimea vârfului, la jumătatea înălţimii sale, trebuie să se încadreze în ± 10 % din lărgimea iniţială a vârfului de diclazuril sau a vârfului etalonului intern al extractului de eşantion neîmbogăţit.

7.1.2.   Detecţie cu grup de diode

Rezultatele se evaluează în funcţie de următoarele criterii:

(a)

lungimea de undă a absorbţiei maxime a spectrelor eşantionului şi etalonului, înregistrată la vârful cel mai înalt al cromatogramei, trebuie să fie aceeaşi, într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detecţia cu grup de diode, acest interval este în general de ± 2 nm;

(b)

între 230 şi 320 nm, spectrele eşantionului şi etalonului înregistrate la vârful cel mai înalt al cromatogramei nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când deviaţia dintre spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15 % din absorbanţa analitului etalon;

(c)

între 230 şi 320 nm, spectrele curbei ascendente, ale punctului maxim şi ale curbei descendente ale vârfului produs de extractul de eşantion nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100 % din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci când sunt prezente aceleaşi maxime şi când deviaţia dintre spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15 % din absorbanţa spectrului celui mai înalt vârf al cromatogramei.

Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa analitului nu a fost confirmată.

7.2.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:

—	30 % din valoarea superioară pentru un conţinut în diclazuril situat între 0,5 şi 2,5 mg/kg;

—	0,75 mg/kg pentru un conţinut în diclazuril situat între 2,5 şi 5 mg/kg;

—	15 % din valoarea superioară pentru un conţinut de diclazuril mai mare de 5 mg/kg.

7.3.   Recuperare

Pentru un eşantion (martor) îmbogăţit, recuperarea este de cel puţin 80 %.

8.   Rezultatele unui studiu colaborativ

S-a realizat un studiu colaborativ în cursul căruia au fost analizate cinci eşantioane de către 11 laboratoare. Aceste eşantioane au constat din două premixuri; unul a fost amestecat cu o matrice organică (O 100), iar celălalt cu o matrice anorganică (A 100). Conţinutul teoretic este de 100 mg de diclazuril pe kg. Cele trei furaje amestecate pentru păsări de crescătorie erau fabricate de trei producători diferiţi (NL) (L1/Z1/K1). Conţinutul teoretic este de 1 mg de diclazuril pe kg. Laboratoarele au primit instrucţiuni să analizeze fiecare eşantion o singură dată sau în duplicat. (Informaţii detaliate privind acest studiu colaborativ figurează în Journal of AOAC International, vol. 77, nr. 6, 1994, p. 1 359-1 361). Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos.

	Eşantion 1 A 100	Eşantion 2 O 100	Eşantion 3 L1	Eşantion 4 Z1	Eşantion 5 K1
L	11	11	11	11	6
n	19	18	19	19	12
Medie	100,8	103,5	0,89	1,15	0,89
sr (mg/kg)	5,88	7,64	0,15	0,02	0,03
CVr (%)	5,83	7,38	17,32	1,92	3,34
SR (mg/kg)	7,59	7,64	0,17	0,11	0,12
CVR (%)	7,53	7,38	18,61	9,67	13,65
Conţinut nominal (mg/kg)	100	100	1	1	1

L	=	număr de laboratoare;
n	=	număr de valori unice;
sr	=	deviaţie standard a repetabilităţii;
CVr	=	coeficientul de variaţie a repetabilităţii;
SR	=	deviaţie standard a reproductibilităţii;
CVR	=	coeficientul de variaţie a reproductibilităţii.

9.   Observaţie

Trebuie să se demonstreze în prealabil că reacţia diclazurilului este liniară pentru toată gama de concentraţii măsurate.

G.   DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE LASALOCID SODIC

Sare sodică a unui acid monocarboxilic polieter, produsă de Streptomyces lasaliensis

1.   Obiectiv şi domeniu de aplicare

Metoda permite determinarea conţinutului în lasalocid sodic din furaje şi premixuri. Limita de detecţie este de 5 mg/kg, iar limita de cuantificare este de 10 mg/kg.

2.   Principiu

Lasalocidul sodic este extras din eşantion cu metanol acidifiat şi dozat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC) cu ajutorul unui detector spectrofluorimetric.

3.   Reactivi

3.1.	Fosfat diacid de potasiu (KH2PO4).

3.2.	Acid ortofosforic, g (g/g) = 85 %.

3.3.	Soluţie de acid ortofosforic, c = 20 %. Se diluează 23,5 ml acid ortofosforic (3.2) în 100 ml de apă.

3.4.	6-metil-2-heptilamin (1,5-dimetilhexilamină), g (g/g) = 99 %.

3.5.	Metanol, de calitate HPLC.

3.6.	Acid clorhidric, densitate = 1,19 g/ml.

3.7.

Soluţie tampon de fosfat, c = 0,01 mol/1 Se dizolvă 1,36 g de KH2PO4 (3.1) în 500 ml de apă (3.11), se adaugă 3,5 ml de acid ortofosforic (3.2) şi 10 ml de 6-metil-2-heptilamină (3.4). Se ajustează pH-ul la 4 cu ajutorul soluţiei de acid ortofosforic (3.3) şi se diluează cu apă completându-se până la 1 000 ml (3.11).

3.8.	Metanol acidifiat Se transferă 5 ml de acid clorhidric (3.6) într-un balon gradat de 1 000 ml, se completează până la semn cu metanol (3.5) şi se amestecă. Soluţia trebuie preparată imediat înainte de utilizare.

3.9.	Fază mobilă HPLC, soluţie tampon de fosfat şi metanol 5 + 95 (V + V) Se amestecă 5 ml de soluţie tampon de fosfat (3.7) cu 95 ml de metanol (3.5).

3.10.

Substanţă etalon de lasalocid sodic cu puritate garantată, C34H53O8Na (sare sodică a unui acid monocarboxilic polieter, produsă de Streptomyces lasaliensis), E 763

3.10.1.

Soluţie etalon stoc de lasalocid sodic, 500 μg/ml Se cântăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de lasalocid sodic (3.10) într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în metanol acidifiat (3.8), se completează până la semn cu acelaşi solvent şi se amestecă. Soluţia se prepară imediat înainte de utilizare.

3.10.2.

Soluţie etalon intermediară de lasalocid sodic, 50 μg/ml Se pipetează 10 ml din soluţia etalon stoc (3.10.1) într-un balon gradat de 100 ml, se completează până la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amestecă. Soluţia se prepară imediat înainte de utilizare.

3.10.3.

Soluţii de calibrare Se transferă 1, 2, 4, 5 şi 10 ml de soluţie etalon intermediară (3.10.2) într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se completează până la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amestecă. Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 1, 2, 4, 5 şi 10 μg de lasalocid sodic pe ml. Ele se prepară imediat înainte de utilizare.

3.11.

Apă, de calitate HPLC.

4.   Aparatură

4.1.	Baie cu ultrasunete (sau baie de apă cu agitare) cu reglaj de temperatură

4.2.	Filtre cu membrană, 0,45 μm

4.3.	Echipament HPLC cu sistem de injecţie, permiţând injectarea de volume de 20 μl

4.3.1.

Coloană pentru cromatografie lichidă de 125 mm × 4 mm, fază inversată C18, particule de 5 μm sau echivalent

4.3.2.

Spectrofluorimetru cu ajustare variabilă a lungimii de undă pentru excitaţie şi emisie

5.   Procedură

5.1.   Aspecte generale

5.1.1.   Furaj martor

Pentru a efectua testul de recuperare (5.1.2), se analizează un furaj martor pentru a verifica absenţa lasalocidului sodic şi a substanţelor interferente. Furajul martor este similar, ca tip, cu eşantionul; nu se detectează nici lasalocid sodic, nici substanţe interferente.

5.1.2.   Test de recuperare

Se efectuează un test de recuperare prin analiza furajului martor îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de lasalocid sodic, similară cu cea prezentă în eşantion. Pentru a obţine o concentraţie de 100 mg/kg, se transferă 10 ml de soluţie etalon stoc (3.10.1) într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml şi se evaporă soluţia până la aproximativ 0,5 ml. Se adaugă 50 g de furaj martor, se amestecă bine şi se lasă timp de 10 minute, amestecând din nou de mai multe ori înainte de a trece la etapa de extracţie (5.2).

Alternativ, dacă nu este disponibil un furaj martor similar, ca tip, cu eşantionul (vezi 5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat prin metoda standard de adăugare a etalonului. În acest caz, eşantionul de analizat este îmbogăţit cu o cantitate de lasalocid sodic asemănătoare celei deja prezente în eşantion. Acesta este analizat împreună cu eşantionul neîmbogăţit, iar recuperarea se poate calcula prin diferenţă.

5.2.   Extracţie

5.2.1.   Furaje

Se cântăresc cu o abatere de 0,01 g, de la 5 la 10 g de eşantion într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml cu dop. Se picură cu pipeta 100 ml de metanol acidifiat (3.8). Se închide uşor şi se agită circular pentru a se dispersa. Flaconul se plasează într-o baie cu ultrasunete (4.1) la aproximativ 40 oC timp de 20 de minute, se scoate şi se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se lasă în repaus timp de aproximativ o oră, până la decantarea materiilor în suspensie, apoi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm (4.2) într-un recipient adecvat. Se continuă cu determinarea prin HPLC (5.3).

5.2.2.   Premixuri

Se cântăresc, cu o abatere de 0,001 g, 2 g de premix nemăcinat într-un balon gradat de 250 ml. Se adaugă 100 ml de metanol acidifiat (3.8) şi se agită circular pentru a se dispersa. Se pune balonul şi conţinutul acestuia într-o baie cu ultrasunete (4.1) la aproximativ 40 oC timp de 20 de minute, apoi se scoate şi se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se completează până la semn cu metanol acidifiat (3.8) şi se amestecă bine. Se lasă în repaus timp de aproximativ o oră, până la decantarea materiilor în suspensie, apoi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm (4.2). Se diluează un volum adecvat de filtrat limpede cu metanol acidifiat (3.8), pentru a produce o soluţie de testat finală care să conţină aproximativ 4 μg/ml de lasalocid sodic. Se continuă cu determinarea prin HPLC (5.3).

5.3.   Determinarea prin HPLC

5.3.1.   Parametri

Următoarele condiţii sunt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea duc la rezultate echivalente:

Coloană pentru cromatografie lichidă (4.3.1)	125 mm × 4 mm, fază inversată C18, particule de 5 μm sau echivalent
Fază mobilă (3.9):	amestec de soluţie tampon de fosfat (3.7) şi metanol (3.5), 5 + 95 (V + V)
Debit:	1,2 ml/minut
Lungimea undelor de detecţie:
Excitaţie:	310 nm
Emisie:	419 nm
Volum de injecţie:	20 μl

Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, injectând de mai multe ori soluţia de calibrare (3.10.3) conţinând 4 μg/ml, până la obţinerea de înălţimi (arii) ale vârfurilor şi de timpi de retenţie constanţi.

5.3.2.   Curba de calibrare

Se injectează fiecare soluţie de calibrare (3.10.3) de mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor pentru fiecare concentraţie. Se trasează o curbă de calibrare utilizând valorile (ariile) medii ale vârfurilor ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.

5.3.3.   Soluţia de eşantion

Se injectează extractul de eşantion (5.2.1 sau 5.2.2) de mai multe ori utilizând acelaşi volum cu cel reţinut pentru soluţia de calibrare şi se determină înălţimile (ariile) medii ale vârfurilor de lasalocid sodic.

6.   Calculul rezultatelor

Plecând de la înălţimea (aria) medie a vârfurilor soluţiei de eşantion (5.3.3), se determină concentraţia de lasalocid sodic (μg/ml) prin referire la curba de calibrare.

6.1.   Furaje

Conţinutul de lasalocid sodic w (în mg/kg) al eşantionului este dat de următoarea formulă:

[mg/kg]

unde:

c	=	concentraţia de lasalocid sodic a soluţiei de eşantion (5.2.1) în μg/ml;
V1	=	volumul extractului de eşantion conform 5.2.1 în ml (adică 100);
m	=	greutatea porţiunii de testat, în g.

6.2.   Premixuri

Conţinutul de lasalocid sodic w (în mg/kg) al eşantionului este dat de următoarea formulă:

[mg/kg]

unde:

c	=	concentraţia de lasalocid sodic a soluţiei de eşantion (5.2.2), în μg/ml;
V2	=	volumul extractului de eşantion conform 5.2.2, în ml (adică 250);
f	=	factorul de diluţie conform 5.2.2;
m	=	greutatea porţiunii de testat, în g.

7.   Validarea rezultatelor

7.1.   Identitate

Metodele bazate pe spectrofluorimetrie sunt mai puţin supuse interferenţelor decât cele care utilizează un detector UV. Identitatea analitului poate fi confirmată de către co-cromatografie.

7.1.1.   Co-cromatografie

Un extract de eşantion (5.2.1 sau 5.2.2) este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare de soluţie de calibrare (3.10.3). Cantitatea de lasalocid sodic adăugată trebuie să fie asemănătoare cantităţii de lasalocid sodic constatată în extractul de eşantion. Numai înălţimea vârfului corespunzător lasalocidului sodic se măreşte după ce s-a luat în calcul cantitatea de lasalocid sodic adăugată şi diluţia extractului. Lărgimea vârfului, la jumătatea înălţimii, trebuie să se încadreze între ± 10 % din lărgimea iniţială a vârfului produs de extractul de eşantion neîmbogăţit.

7.2.   Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:

—	15 % din valoarea superioară pentru un conţinut de lasalocid sodic situat între 30 şi 100 mg/kg;

—	15 mg/kg pentru un conţinut de lasalocid sodic situat între 100 şi 200 mg/kg;

—	7,5 % din valoarea superioară pentru un conţinut de lasalocid sodic mai mare de 200 mg/kg.

7.3.   Recuperare

Pentru un eşantion de furaj (martor) îmbogăţit, recuperarea este de cel puţin 80 %. Pentru eşantioanele de premixuri îmbogăţite, recuperarea este de cel puţin 90 %.

8.   Rezultatele unui studiu colaborativ

S-a realizat un studiu colaborativ (6) în cursul căruia au fost analizate 2 premixuri (eşantioanele 1 şi 2) şi 5 furaje (eşantioanele 3-7) de către 12 laboratoare. Fiecare eşantion a făcut obiectul unei duble analize. Rezultatele studiului sunt prezentate în tabelul de mai jos:

	Eşantion 1 Premix pentru pui	Eşantion 2 Premix pentru curcani	Eşantion 3 Pelete pentru curcani	Eşantion 4 Sfărâmături pentru pui	Eşantion 5 Hrană pentru curcani	Eşantion 6 Hrană A pentru pui	Eşantion 7 Hrană B pentru pui
L	12	12	12	12	12	12	12
n	23	23	23	23	23	23	23
Medie (mg/kg)	5 050	16 200	76,5	78,4	92,9	48,3	32,6
sr (mg/kg)	107	408	1,71	2,23	2,27	1,93	1,75
CVr (%)	2,12	2,52	2,24	2,84	2,44	4	5,37
SR (mg/kg)	286	883	3,85	7,32	5,29	3,47	3,49
CVR (%)	5,66	5,45	5,03	9,34	5,69	7,18	10,7
Conţinut nominal (mg/kg)	5 000 (7)	16 000 (7)	80 (7)	105 (7)	120 (7)	50 (8)	35 (8)

L	=	număr de laboratoare;
n	=	număr de valori unice;
sr	=	deviaţie standard a repetabilităţii;
SR	=	deviaţie standard a reproductibilităţii;
CVr	=	coeficientul de variaţie a repetabilităţii, %;
CVR	=	coeficientul de variaţie a reproductibilităţii, %.

---

(1)  Realizat de Grupul de lucru pentru furaje al Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2)  Studiu realizat de Grupul de lucru pentru furaje Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(3)  Se pot folosi alte metode de dizolvare, cu condiţia ca acestea să fi fost demonstrate şi să aibă rezultate similare (cum ar fi dizolvarea sub presiune cu microunde).

(4)  Furajul verde (proaspăt sau uscat) poate conţine cantităţi mari de silice vegetală, care ar putea reţine oligoelemente şi trebuie eliminată. Prin urmare, pentru eşantioane din aceste furaje trebuie urmată următoarea procedură modificată. Se efectuează operaţia 5.1.1.1 până la filtrare. Hârtia de filtru care conţine reziduul insolubil se spală de două ori cu apă clocotită şi se aşază într-un creuzet de cuarţ sau platină. Se încălzeşte în cuptorul cu muflă (4.1) la o temperatură sub 550 oC, până când materialul carbonic a dispărut complet. Se lasă să se răcească, se adaugă câteva picături de apă urmate de 10-15 ml de acid fluorhidric (3.4) şi se evaporează până la uscare la circa 150 oC. Dacă reziduul încă mai conţine silice, aceasta se dizolvă din nou în câţiva mililitri de acid fluorhidric (3.4) şi se evaporă până la uscare. Se adaugă câteva picături de acid sulfuric (3.5) şi se încălzeşte până când emisiile de fum alb încetează. După ce se adaugă 5 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (3.2) şi circa 30 ml de apă, se încălzeşte, se filtrează soluţia într-un balon gradat de 250 ml şi se completează până la semn cu apă (concentraţie a HCl circa 0,5 mol/l). Se trece apoi la determinarea de la punctul 5.1.2.

(5)  The Analyst 108, 1983, p. 1 252-1 256.

(6)  Analyst, 1995, 120, p. 2 175-2 180.

(7)  Conţinutul declarat de producător.

(8)  Furaj preparat în laborator.