„B.53.   STUDIU DE NEUROTOXICITATE ASUPRA DEZVOLTĂRII

INTRODUCERE

1.   Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE nr. 426 privind testarea (2007). În iunie 1995, la Copenhaga, un grup de lucru al OCDE privind toxicitatea pentru reproducere și dezvoltare a discutat despre necesitatea actualizării orientărilor OCDE existente privind testarea toxicității pentru reproducere și dezvoltare și despre elaborarea de noi orientări pentru obiectivele care nu sunt încă reglementate (1). Grupul de lucru a recomandat elaborarea unor orientări privind testarea în domeniul neurotoxicității pentru dezvoltare pe baza unei orientări US EPA, care a fost ulterior revizuită (2). În iunie 1996, la Copenhaga a fost organizată o a doua reuniune de consultare pentru a oferi secretariatului îndrumare cu privire la elaborarea unor noi orientări privind testarea neurotoxicității pentru dezvoltare, inclusiv elementele principale, de exemplu, detalii cu privire la alegerea speciilor de animale, perioada de dozare, perioada de testare, parametrii care trebuie să fie evaluați, precum și criteriile pentru evaluarea rezultatelor. În 1998 s-a publicat o orientare americană privind evaluarea riscurilor de neurotoxicitate (3). În octombrie 2000 au avut loc concomitent o reuniune consultativă a experților OCDE și un atelier al Institutului de științe privind riscurile al ILSI, iar în 2005 s-a organizat la Tokyo o reuniune consultativă a experților. Reuniunile au fost organizate pentru a discuta aspecte științifice și tehnice legate de actualele orientări privind testarea, iar recomandările formulate în urma reuniunilor (4) (5) (6) (7) au fost luate în considerare în elaborarea prezentei metode de testare. În documentele de orientare OCDE nr. 43 privind «Evaluarea și testele de toxicitate pentru reproducere» (8) și nr. 20 privind «Testele de neurotoxicitate» se pot consulta informații suplimentare cu privire la efectuarea, interpretarea și terminologia utilizată pentru prezenta metodă de testare (9).

CONSIDERAȚII INIȚIALE

2.   Există o serie de produse chimice despre care se știe că produc efecte neurotoxice pentru dezvoltare la oameni și la alte specii (10) (11) (12) (13). Pentru a analiza și a evalua caracteristicile toxice ale unui produs chimic, poate fi necesară determinarea potențialului de neurotoxicitate pentru dezvoltare. Studiile privind neurotoxicitatea pentru dezvoltare sunt concepute pentru a oferi date, inclusiv caracterizări ale relației doză-răspuns, cu privire la potențialele efecte funcționale și morfologice asupra dezvoltării sistemului nervos al descendenților care ar putea rezulta din expunerea intrauterină și la începutul vieții.

3.   Un studiu de neurotoxicitate pentru dezvoltare poate fi realizat ca studiu separat, poate fi încorporat într-un studiu privind toxicitatea asupra reproducerii și/sau neurotoxicitatea asupra adulților [de exemplu, metodele de testare B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)] sau poate fi adăugat la un studiu privind toxicitatea asupra dezvoltării prenatale [de exemplu, metoda de testare B.31 (17)]. În cazul în care un studiu privind neurotoxicitatea asupra dezvoltării este încorporat într-un alt studiu sau atașat la acesta, este necesar să se păstreze integritatea ambelor tipuri de studii. Toate testele trebuie să respecte legislația aplicabilă sau orientările guvernamentale și instituționale privind utilizarea animalelor de laborator în cercetare (de exemplu, 18).

4.   Laboratorul de testare ia în considerare toate informațiile disponibile cu privire la substanța de testat înainte de efectuarea studiului. Informațiile vor include identitatea și structura produsului chimic; proprietățile sale fizico-chimice; rezultatele oricăror alte teste de toxicitate in vitro sau in vivo efectuate pe substanța chimică în cauză; datele toxicologice privind substanțele chimice înrudite structural; și utilizarea (utilizările) anticipată (anticipate) ale substanței chimice. Astfel de informații sunt necesare pentru a dovedi tuturor celor interesați că testul este relevant pentru protecția sănătății oamenilor și vor contribui la selectarea unei doze inițiale adecvate.

PRINCIPIUL TESTULUI

5.   Substanța de testat se administrează animalelor în timpul gestației și alăptării. Femelele sunt testate pentru a evalua efectele la femelele gestante și în perioada lactației și pot, de asemenea, să ofere informații comparative (femele vs. pui). Puii sunt selectați aleatoriu dintre toți puii pentru evaluarea neurotoxicității. Evaluarea constă în observații pentru a detecta tulburările neurologice și de comportament globale, inclusiv evaluarea dezvoltării fizice, a ontogenezei comportamentului, a activității motorii, a funcției motorii și senzoriale și a învățării și memoriei; precum și evaluarea greutății și neuropatologiei creierului în timpul dezvoltării postnatale și la maturitate.

6.   În cazul în care metoda de testare se aplică independent, animalele suplimentare disponibile din fiecare grup ar putea fi utilizate pentru anumite proceduri neurocomportamentale, neuropatologice, neurochimice sau electrofiziologice care să completeze datele obținute din examinările recomandate de prezenta metodă de testare (16) (19) (20) (21). Procedurile suplimentare pot fi deosebit de utile în cazurile în care observațiile empirice, efectele anticipate sau mecanismul/modul de acțiune sugerează un anumit tip de neurotoxicitate. Examinările suplimentare pot fi utilizate atât în cazul femelelor, cât și în cazul puilor. De asemenea, se pot utiliza proceduri ex vivo sau in vitro, atât timp cât astfel de proceduri nu modifică integritatea procedurilor in vivo.

PREGĂTIRI PENTRU TESTE

Selectarea speciei de animale

7.   Specia preferată pentru test este șobolanul; alte specii pot fi utilizate atunci când este cazul. De reținut, cu toate acestea, că zilele de gestație și după fătare specificate în prezenta metodă de testare sunt proprii pentru speciile de șobolani utilizate în mod obișnuit, iar în cazul în care se utilizează o specie diferită sau o sușă neobișnuită, se selectează zile comparabile. Utilizarea unei alte specii trebuie justificată pe bază de date toxicologice, farmacocinetice și/sau alte date. Justificarea va include disponibilitatea unor evaluări postnatale neurocomportamentale și neuropatologice specifice speciei. Dacă a existat un test anterior care a pus probleme, trebuie să se țină cont de specia/sușa pentru care s-au exprimat preocupări. Date fiind atributele de performanță diferite ale diverselor sușe de șobolani, trebuie să existe dovezi că sușa selectată în vederea utilizării are un nivel adecvat de fertilitate și de capacitate de reacție. Trebuie să se documenteze fiabilitatea și sensibilitatea altor specii pentru a detecta neurotoxicitatea asupra dezvoltării.

Condiții de adăpostire și de hrănire

8.   Se recomandă ca temperatura încăperii în care se află animalele utilizate pentru experimente să fie de 22 ± 3 °C. Deși se recomandă ca umiditatea relativă să fie de cel puțin 30 % și de preferat să nu depășească 70 %, exceptând operațiunile de curățare a sălii, ar trebui menținută o umiditate de 50-60 %. Iluminatul trebuie să fie artificial, alternând 12 ore de lumină cu 12 ore de întuneric. De asemenea, este posibil să se inverseze ciclul de lumină înainte de împerechere și pe durata studiului, pentru efectuarea evaluărilor parametrilor funcționali și de comportament în timpul perioadei de întuneric (în condiții de lumină roșie), și anume, în perioada în care animalele sunt în mod normal active (22). Orice modificări ale ciclului lumină-întuneric trebuie să cuprindă o perioadă de aclimatizare pentru a permite animalelor să se adapteze la noul ciclu. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Se raportează tipul de alimente și de apă și ambele trebuie să fie analizate pentru contaminanți.

9.   Animalele pot fi adăpostite individual sau în cuști în grupuri mici de același sex. Procedurile de împerechere se desfășoară în cuști adecvate acestui scop. După constatarea copulației sau nu mai târziu de ziua 15 de gestație, animalele împerecheate se plasează în cuști speciale de fătare sau de maternitate. Cuștile se aranjează astfel încât posibilele efecte cauzate de amplasarea acestora să fie reduse la minimum. Femelelor împerecheate li se oferă materiale adecvate și determinate pentru construirea cuibului atunci când se apropie momentul fătării. Este bine cunoscut faptul că manipularea inadecvată și stresul în timpul sarcinii pot conduce la rezultate negative, inclusiv pierderi de sarcină și dezvoltare fetală și postnatală modificată. Pentru a evita pierderea fătului din cauza unor factori care nu sunt corelați cu tratamentul, animalele se manipulează cu grijă în timpul sarcinii și se evită stresul cauzat de factori externi, cum ar fi zgomotul exterior excesiv.

Pregătirea animalelor

10.   Se utilizează animale sănătoase, care au fost aclimatizate la condițiile de laborator și care nu au fost supuse anterior altor proceduri de testare, cu excepția cazului în care studiul este încorporat într-un alt studiu (a se vedea punctul 3). Animalele de experiență sunt descrise precizând specia, sușa, sursa, sexul, greutatea și vârsta. Fiecărui animal i se atribuie un număr de identificare unic, cu care este marcat. Se recomandă ca animalele din toate grupurile testate să aibă, pe cât posibil, greutăți și vârste apropiate și trebuie să se situeze în intervalul normal de specie și sușă aflate în studiu. La fiecare nivel al dozei se utilizează femele adulte tinere, nulipare. Nu se împerechează animale consangvine, o atenție deosebită trebuind acordată pentru a garanta acest lucru. Ziua 0 de gestație este ziua în care se observă un dop vaginal și/sau spermă. Atunci când se achiziționează animale gestante de la un furnizor, se acordă timp suficient pentru aclimatizare (de exemplu, 2-3 zile). Femelele se distribuie aleatoriu în grupurile martor și de tratament și, pe cât posibil, acestea ar trebui să fie distribuite uniform în toate grupurile (de exemplu, se recomandă o procedură aleatorie stratificată pentru a asigura o distribuție uniformă în toate grupurile, cum ar fi cea în funcție de greutatea corporală). Femelele inseminate de același mascul se distribuie în mod egal în toate grupurile.

PROCEDURĂ

Numărul și sexul animalelor

11.   Fiecare grup tratat și grup martor trebuie să conțină un număr suficient de femele gestante care să fie expuse la produsul chimic testat pentru a se asigura că se produce un număr adecvat de descendenți pentru evaluarea neurotoxicității. Pentru fiecare nivel de doză se recomandă un total de 20 de cuiburi. Modelele de dozare duplicată și fragmentată de grup sunt permise în cazul în care se atinge numărul total de cuiburi pentru fiecare grup și se utilizează modele statistice adecvate pentru lua în considerare duplicatele.

12.   În sau înainte de ziua 4 după fătare (postnatal day, PND) (ziua de fătare este PND 0), dimensiunea fiecărui cuib se ajustează eliminând surplusul de pui în mod aleatoriu pentru a obține o dimensiune uniformă a cuibului pentru toate cuiburile (23). Dimensiunea cuibului nu depășește mărimea medie a cuibului pentru sușa de rozătoare utilizate (8-12). Cuibul cuprinde, în cea mai mare măsură posibil, un număr egal de pui masculi și femele. Eliminarea selectivă a puilor, de exemplu, pe baza greutății corporale, nu este adecvată. După standardizarea cuiburilor (sacrificare) și înainte de testarea în continuare a parametrilor funcționali, puii individuali care sunt programați pentru testare înainte de înțărcare sau după înțărcare trebuie să fie identificați în mod unic, utilizând orice metodă adecvată cu suferințe minime pentru identificarea puilor (de exemplu, 24).

Repartizarea animalelor pentru teste funcționale și de comportament, greutăți ale creierului și evaluări neuropatologice

13.   Metoda de testare permite abordări diferite cu privire la repartizarea animalelor expuse intrauterin și în perioada de alăptare pentru teste funcționale și de comportament, maturizare sexuală, determinarea greutății creierului și evaluare neuropatologică (25). Alte teste privind funcția neurocomportamentală (de exemplu, comportamentul social), neurochimia sau neuropatologia pot fi adăugate de la caz la caz, atât timp cât nu se compromite integritatea testelor necesare inițial.

14.   Sunt selectați pui din fiecare grup tratat și sunt repartizați pentru evaluările obiectivelor în sau după PND 4. Selecția puilor se efectuează astfel încât, în măsura posibilului, ambele sexe din fiecare cuib din fiecare grup tratat să fie reprezentate în mod egal în toate testele. Pentru testarea activității motorii, aceeași pereche de pui masculi și femele se testează la fiecare vârstă înainte de înțărcare (a se vedea punctul 35). Pentru toate celelalte teste, aceeași pereche sau perechi separate de masculi și de femele pot fi repartizate pentru diferite teste de comportament. Ar putea fi necesar să se repartizeze pui diferiți pentru testele pe pui înțărcați vs. adulți ale funcției cognitive pentru a evita confuzia efectelor vârstei și ale dresajului prealabil asupra măsurătorilor (26) (27). La înțărcare (PND 21), puii care nu au fost selectați pentru testare pot fi eutanasiați. Se raportează orice modificări ale repartizării puilor. Unitatea statistică de măsură ar trebui să fie cuibul (sau femela), nu și puiul.

15.   Există diferite modalități de repartizare a puilor pentru examinarea înainte de înțărcare și după înțărcare, teste cognitive, examene patologice etc. (a se vedea figura 1 pentru conceptul general și anexa 1 pentru exemple de repartizare). Numărul minim de animale recomandat în fiecare grup tratat și pentru examinările înainte de înțărcare și după înțărcare este după cum urmează:

Observații clinice și greutate corporală	Toate animalele
Observații clinice detaliate	20/sex (1/sex/cuib)
Greutatea creierului (după fixare) PND 11-22	10/sex (1/cuib)
Greutatea creierului (nefixat) ~ PND 70	10/sex (1/cuib)
Neuropatologie (fixare prin imersie sau perfuzare) PND 11-22	10/sex (1/cuib)
Neuropatologie (fixare prin perfuzare) ~ PND 70	10/sex (1/cuib)
Maturizare sexuală	20/sex (1/sex/cuib)
Alte repere de dezvoltare (opțional)	Toate animalele
Ontogeneza comportamentului	20/sex (1/sex/cuib)
Activitatea motorie	20/sex (1/sex/cuib)
Funcția motorie și senzorială	20/sex (1/sex/cuib)
Învățare și memorie	10/sex (1) (1/cuib)

Dozare

16.   Se utilizează cel puțin trei doze și un martor paralel. Nivelurile dozei sunt distanțate pentru a produce o gradare a efectelor toxice. Cu excepția cazului în care doza este limitată de natura fizico-chimică și biologică a substanței chimice, se alege cea mai ridicată doză cu scopul de a induce o oarecare toxicitate maternă [de exemplu, semne clinice, încetinirea creșterii în greutate (nu mai mult de 10 %) și/sau dovezi de toxicitate de limitare a dozei într-un organ țintă]. Doza ridicată poate fi limitată la 1 000 mg/kg greutate corporală/zi, cu unele excepții. De exemplu, expunerea umană așteptată ar putea indica necesitatea utilizării unei doze mai ridicate. Alternativ, se efectuează studii pilot sau studii preliminare de stabilire a dozei pentru a determina cea mai ridicată doză de utilizat, care să producă un grad minim de toxicitate maternă. Dacă substanța de testat s-a dovedit a fi toxică pentru dezvoltare, fie într-un studiu standard de toxicitate asupra dezvoltării, fie într-un studiu pilot, cea mai ridicată doză ar trebui să fie doza maximă care nu va induce toxicitate excesivă la urmași sau deces intrauterin sau neonatal sau malformații, suficientă pentru a exclude o evaluare semnificativă a neurotoxicității. Doza cea mai mică nu trebuie să producă niciun efect toxic asupra mamei sau asupra dezvoltării, inclusiv neurotoxicitate. Se selectează o serie descrescătoare de doze, în scopul de a demonstra o eventuală relație doză-efect și nivelul dozei fără efecte adverse vizibile (NOAEL) sau doze aproape de limita de detecție care ar permite stabilirea unei doze de referință. În mod frecvent, pentru stabilirea seriei descrescătoare a dozelor, intervalul optim este un factor de 2 sau 4 și deseori este preferabil să se adauge un al patrulea grup de tratament, în loc să se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, un factor mai mare decât 10) între doze.

17.   Pentru selectarea nivelurilor dozelor se ține seama de toate datele existente privind toxicitatea, precum și de informațiile suplimentare privind metabolismul și toxicocinetica substanței de testat sau a materialelor cu o structură analogă. Informațiile respective se utilizează, de asemenea, pentru a demonstra caracterul adecvat al regimului de dozare. Ar trebui să se ia în considerare dozarea directă a puilor pe baza expunerii și a informațiilor farmacocinetice (28) (29). Înainte de a efectua studii de dozare directă, se realizează o examinare atentă a avantajelor și a dezavantajelor (30).

18.   Grupul martor paralel este un grup martor supus unui tratament simulat sau unui tratament exclusiv cu vehicul, în cazul în care pentru administrarea substanței chimice testate se utilizează un vehicul. În mod normal, tuturor animalelor li se administrează același volum de substanță testată sau de vehicul în funcție de greutatea corporală. Dacă se folosește un vehicul sau un alt aditiv pentru a facilita administrarea dozei, se iau în considerare următoarele caracteristici: efectele asupra absorbției, circulației, metabolizării sau retenției substanței testate; efectele asupra proprietăților chimice ale substanței chimice testate care pot să altereze caracteristicile sale toxice, precum și efectele asupra consumul de hrană sau apă ori asupra stării de nutriție a animalelor. Vehiculul nu ar trebui să producă efecte care ar putea să interfereze cu interpretarea studiului și trebuie să nu fie toxic din punct de vedere neurocomportamental și să nu aibă efecte asupra reproducerii sau dezvoltării. Pentru substanțele noi utilizate ca vehicul, trebuie să se includă un grup martor supus unui tratament simulat în plus față de un grup martor pentru vehicul. Animalele din grupul/grupurile martor se manipulează la fel cu animalele din grupul tratat.

Administrarea dozelor

19.   Substanța chimică testată sau vehiculul se administrează pe calea cea mai relevantă pentru expunerea umană potențială și pe baza informațiilor privind metabolizarea și circulația la animalele de experiență. Calea de administrare va fi, în general, orală (de exemplu, gavaj, prin alimentație, în apa de băut), dar pot fi utilizate și alte căi (de exemplu, inhalare) în funcție de caracteristicile și de căile de expunere cunoscute sau anticipate la om [precizări suplimentare sunt furnizate în documentul de orientare nr. 43 (8)]. Trebuie să se ofere o justificare pentru calea de administrare aleasă. Substanța chimică testată se administrează aproximativ la aceeași oră în fiecare zi.

20.   Doza administrată fiecărui animal se calculează în mod normal în funcție de greutatea corporală individuală la cea mai recentă cântărire. Cu toate acestea, în ultimul trimestru al gestației, doza se calculează cu prudență. Dacă se observă o toxicitate excesivă la mame, animalele în cauză sunt eutanasiate.

21.   Substanța chimică testată sau vehiculul se administrează, ca un minim, zilnic la femelele care s-au împerecheat din momentul implantării (ziua 6 de gestație) pe parcursul alăptării (PND 21), astfel încât puii să fie expuși la substanța testată în timpul dezvoltării neurologice prenatale și postnatale. Vârsta la care începe tratamentul, precum și durata și frecvența administrării pot fi adaptate în cazul în care dovezile sprijină un concept experimental mai relevant pentru expunerile umane. Duratele de dozare se adaptează pentru alte specii cu scopul de a asigura expunerea în timpul tuturor stadiilor timpurii de dezvoltare a creierului (și anume, echivalentul dezvoltării prenatale și postnatale timpurii a creierului uman). Tratamentul poate începe de la inițierea gestației (ziua 0 de gestație), deși ar trebui să se țină seama de eventualitatea ca substanța chimică de testat să provoace pierdere în faza de preimplantare. Administrarea care pornește din ziua 6 de gestație ar evita acest risc, dar nu ar fi tratate etapele de dezvoltare între ziua 0 și ziua 6 de gestație. Atunci când un laborator achiziționează animale împerecheate anterior, nu este posibil să se înceapă administrarea dozelor în ziua 0 de gestație, prin urmare, ziua 6 de gestație ar fi o zi adecvată de pornire. Laboratorul de testare stabilește regimul de dozare în funcție de informațiile relevante cu privire la efectele substanței chimice de testat, experiența prealabilă și considerentele logistice; acesta poate include prelungirea administrării dincolo de înțărcare. Tratamentul nu se va administra la data fătării în cazul animalelor care nu au încheiat fătarea puilor. În general, se presupune că expunerea puilor va avea loc prin laptele matern; cu toate acestea, în cazurile în care există o lipsă a dovezilor de expunere continuă la pui, trebuie să se ia în considerare dozarea directă a puilor. Dovezile de expunere continuă pot fi obținute, de exemplu, din informațiile farmacocinetice, toxicitatea la nivelul puilor sau modificările la nivelul biomarkerilor (28).

OBSERVAȚII

Observații privind femelele

22.   Toate femelele se observă cu atenție cel puțin o dată pe zi în ceea ce privește starea de sănătate a acestora, inclusiv pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea.

23.   În timpul perioadelor de tratament și de observație, se efectuează în mod periodic observații clinice mai detaliate (cel puțin de două ori pe parcursul perioadei de administrare în timpul gestației și de două ori în timpul perioadei de administrare în timpul alăptării) utilizând cel puțin zece femele pentru fiecare nivel de doză. Animalele se observă în afara cuștii de către tehnicieni calificați care nu sunt informați cu privire la tratamentul administrat animalelor, utilizând proceduri standardizate pentru a reduce stresul animalelor, pentru a asigura un nivel maxim de imparțialitate din partea observatorului și pentru a maximiza fiabilitatea datelor provenite de la observatori diferiți. În cazul în care este posibil, se recomandă ca observațiile dintr-un anumit studiu să fie făcute de același tehnician.

24.   Prezența semnelor observate se consemnează. Ori de câte ori este posibil, se consemnează, de asemenea, magnitudinea semnelor observate. Observațiile clinice vizează, dar nu se limitează la, modificări la nivelul pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apariția unor secreții și activitatea reflexă (de exemplu, lăcrimare, erecție piloasă, dimensiunea pupilei, respirație anormală și/sau respirație pe gură și orice semne neobișnuite de urinare sau defecație).

25.   Se consemnează, de asemenea, toate reacțiile neobișnuite legate de poziția corpului, nivelul de activitate (de exemplu, explorarea mai intensă sau mai redusă a zonei standard) și coordonarea mișcărilor. Se înregistrează, de asemenea, modificările mersului (de exemplu, mers legănat, ataxie), modificările posturii corpului (de exemplu, cocoașe) și reacțiile la manipulare, la locul în care se află și la alți stimuli din mediu, precum și prezența unor mișcări clonice sau tonice, a convulsiilor sau a tremorului, comportamente stereotipe (de exemplu, curățarea excesivă, mișcări neobișnuite ale capului, mișcări circulare repetate), precum și comportamentele bizare (de exemplu, mușcături sau lins excesiv, automutilare, mers înapoi, emiterea de sunete) sau agresivitatea.

26.   Se notează semnele de toxicitate, inclusiv data apariției, momentul zilei, gradul și durata.

27.   Animalele se cântăresc la momentul administrării cel puțin săptămânal pe parcursul studiului, la data sau aproape de data administrării, precum și la PND 21 (înțărcare). Pentru studiile efectuate prin gavaj, femelele trebuie cântărite cel puțin de două ori pe săptămână. Dozele se ajustează în mod corespunzător la momentul fiecărei determinări a greutății corporale. Consumul de hrană se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în timpul gestației și alăptării. Consumul de apă se măsoară cel puțin o dată pe săptămână în cazul în care expunerea se face prin intermediul apei.

Observații asupra puilor

28.   Toți puii sunt observați cu atenție cel puțin zilnic pentru a consemna simptomele de toxicitate și pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea.

29.   În timpul perioadelor de tratament și de observație, se efectuează observații clinice mai detaliate a puilor. Puii (cel puțin un pui/sex/cuib) sunt observați de către tehnicieni calificați care nu sunt informați cu privire la tratamentul administrat animalelor, utilizând proceduri standardizate pentru a asigura un nivel maxim de imparțialitate și pentru a maximiza fiabilitatea datelor obținute de observatori diferiți. În cazul în care este posibil, se recomandă ca observațiile dintr-un anumit studiu să fie făcute de același tehnician. Trebuie să se monitorizeze cel puțin caracteristicile descrise la punctele 24 și 25, după cum este adecvat pentru etapa de dezvoltare observată.

30.   Se notează toate simptomele de toxicitate la pui, inclusiv data apariției, momentul zilei, gradul și durata.

Repere fizice și de dezvoltare

31.   Modificările la nivelul reperelor de dezvoltare înainte de înțărcare (de exemplu, desfășurarea pavilionului urechii, deschiderea ochilor, erupția incisivilor) sunt corelate în mare măsură cu greutatea corporală (30) (31). Greutatea corporală poate fi cel mai bun indicator de dezvoltare fizică. Prin urmare, se recomandă măsurarea reperelor de dezvoltare doar în cazul în care există dovezi prealabile care atestă că respectivele criterii de evaluare vor furniza informații suplimentare. Calendarul pentru evaluarea parametrilor este indicat în tabelul 1. În funcție de efectele anticipate, precum și de rezultatele măsurătorilor inițiale, ar putea fi recomandabil să se adauge intervale de timp suplimentare sau să se efectueze măsurătorile în alte etape de dezvoltare.

32.   Atunci când se evaluează dezvoltarea fizică, este recomandabil să se utilizeze vârsta postcoitală, în loc de vârsta postnatală (33). Dacă puii sunt testați în ziua de înțărcare, se recomandă ca testarea să fie efectuată înainte de înțărcarea efectivă pentru a evita un efect de confuzie provocat de stresul asociat înțărcării. În plus, trebuie să se asigure că orice testare a puilor după înțărcare nu are loc în cele două zile după înțărcare.

Tabelul 1

Calendarul evaluării reperelor fizice și de dezvoltare, precum și a criteriilor de evaluare funcțională/comportamentală  (2)

Perioade de vârstă Criterii de evaluare	Înainte de înțărcare (3)	Adolescență (3)	Adulți tineri (3)
Repere fizice și de dezvoltare
Greutatea corporală și observații clinice	Săptămânal (4)	cel puțin o dată la două săptămâni	cel puțin o dată la două săptămâni
Greutatea creierului	PND 22 (5)		la sacrificare
Neuropatologia	PND 22 (5)		la sacrificare
Maturizarea sexuală	—	după caz	—
Alte repere de dezvoltare (6)	după caz	—	—
Criteriile de evaluare funcțională/comportamentală
Ontogeneza comportamentului	Cel puțin două măsurători
Activitatea motorie (inclusiv de acomodare)	1-3 ori (7)	—	o singură dată
Funcțiile motorie și senzorială	—	o singură dată	o singură dată
Învățare și memorie	—	o singură dată	o singură dată

33.   Se numără și se stabilește sexul puilor vii, de exemplu, prin inspecție vizuală sau prin măsurarea distanței ano-genitale (34) (35), iar fiecare pui dintr-un cuib se cântărește individual, la fătare sau imediat după aceea, cel puțin săptămânal pe parcursul alăptării și, ulterior, cel puțin o dată la fiecare două săptămâni. Atunci când se evaluează maturitatea sexuală, se determină vârsta și greutatea corporală a animalului la momentul în care are loc permeabilitatea vaginală (36) și separarea prepuțială (37) cel puțin la un mascul și o femelă per cuib.

Ontogeneza comportamentului

34.   Ontogeneza anumitor comportamente se măsoară la cel puțin un pui/sex/cuib pe parcursul perioadei de vârstă corespunzătoare, aceiași pui fiind utilizați în toate zilele de testare pentru toate comportamentele evaluate. Zilele de măsurare trebuie să fie distanțate pe parcursul perioadei, pentru a defini modificarea, normală sau corelată cu tratamentul, a ontogenezei comportamentului respectiv (38). Următoarele sunt câteva exemple de comportamente a căror ontogeneză ar putea fi evaluată: reflexul de redresare, geotaxia negativă și activitatea motorie (38) (39) (40).

Activitatea motorie

35.   Activitatea motorie se monitorizează (41) (42) (43) (44) (45) în cursul perioadelor dinainte de înțărcare și la vârsta adultă. Pentru testare la momentul înțărcării, a se vedea punctul 32. Sesiunea de testare trebuie să fie suficient de lungă pentru a demonstra acomodarea intrasesiune pentru grupul martor netratat. Se recomandă utilizarea activității motorii pentru a evalua ontogeneza comportamentului. În cazul în care se utilizează ca test al ontogenezei comportamentului, atunci testarea trebuie să utilizeze aceleași animale, pentru toate sesiunile de testare înainte de înțărcare. Testarea trebuie să fie suficient de frecventă pentru a evalua ontogeneza acomodării intrasesiune (44). Acest lucru poate necesita trei sau mai multe perioade de timp înainte de și, inclusiv, în ziua de înțărcare (de exemplu, PND 13, 17, 21). Testarea acelorași animale sau pui din același cuib trebuie să aibă loc, de asemenea, la o vârstă adultă aproape de sacrificare (de exemplu, PND 60-70). După caz, se poate efectua testare în zile suplimentare. Activitatea motorie se monitorizează prin intermediul unui dispozitiv automat de înregistrare a activității care poate detecta atât intensificarea, cât și reducerea activității (de exemplu, activitatea bazală măsurată de dispozitiv nu trebuie să fie atât de scăzută, încât să împiedice detectarea reducerii, nici atât de mare, încât să împiedice detectarea intensificării activității). Fiecare dispozitiv trebuie să fie testat prin metode standard pentru a se asigura, în măsura în care este posibil, fiabilitatea funcționării tuturor dispozitivelor și în toate zilele. În măsura în care este posibil, grupurile de tratament se distribuie în mod echilibrat pe toate dispozitivele. Fiecare animal trebuie să fie testat în mod individual. Grupurile de tratament trebuie să fie compensate în toate intervalele de testare pentru a evita interpretări eronate provocate de ritmul circadian de activitate. Ar trebui depuse eforturi pentru a garanta că variațiile condițiilor de testare sunt minime și că acestea nu sunt legate în mod sistematic de tratament. Printre variabilele care pot afecta numeroase măsurători ale comportamentului, inclusiv activitatea motorie, se numără nivelul de zgomot, dimensiunea și forma cuștii experimentale, temperatura, umiditatea relativă, condițiile de lumină, mirosurile, utilizarea cuștii sau a unei noi cuști experimentale și distragerile de mediu.

Funcțiile motorie și senzorială

36.   Funcțiile motorie și senzorială se examinează în detaliu cel puțin o dată în perioada de adolescent și o dată în perioada de adult tânăr (de exemplu, PND 60-70). Pentru testarea la momentul înțărcării, a se vedea punctul 32. Trebuie să se realizeze o testare suficientă pentru a asigura o eșantionare cantitativă adecvată de modalități senzoriale (de exemplu, somato-senzoriale, vestibulare) și funcții motorii (de exemplu, forță, coordonare). Câteva exemple de teste ale funcțiilor motorii și senzoriale sunt răspunsul de împingere al extensorului (46), reflexul de redresare (47) (48), acomodarea reacției auditive (40) (49) (50) (51) (52) (53) (54) și potențialele evocate (55).

Teste de învățare și de memorie

37.   Testul de învățare și de memorie asociativă trebuie să se desfășoare după înțărcare (de exemplu, 25 ± 2 zile) și pentru adulții tineri (PND 60 și mai mult). Pentru testarea la momentul înțărcării, a se vedea punctul 32. Pot fi utilizate același test sau teste separate în cele două etape de dezvoltare. Este permisă o anumită flexibilitate în selectarea testului (testelor) de învățare și de memorie în cazul șobolanilor înțărcați și adulți. Cu toate acestea, testul (testele) ar trebui să fie conceput(e) astfel încât să îndeplinească două criterii. În primul rând, învățarea se evaluează fie ca o modificare observată în timpul mai multor studii sau sesiuni repetate de învățare, fie prin intermediul unor teste care implică un singur studiu, cu referire la o condiție care verifică existența unor efecte neasociative ale experienței de învățare. În al doilea rând, testul (testele) trebuie să includă unele măsurători ale memoriei (pe termen scurt sau pe termen lung) în plus față învățarea inițială (achiziție), dar măsurarea memoriei nu poate fi raportată în absența unei măsurări a achiziției obținute prin intermediul aceluiași test. În cazul în care testul (testele) de învățare și de memorie arată un efect al substanței de testat, se pot lua în considerare teste suplimentare pentru a se exclude interpretările alternative bazate pe modificări ale capacităților senzoriale, motivaționale și/sau motorii. În plus față de cele două criterii de mai sus, se recomandă ca testul de învățare și de memorie să fie selectat pe baza sensibilității dovedite la clasa substanței chimice care face obiectul investigației, în cazul în care astfel de informații sunt disponibile în literatura de specialitate. În absența unor astfel de informații, exemplele de teste care pot fi efectuate pentru a îndeplini criteriile de mai sus includ: evitarea pasivă (43) (56) (57), potrivire-întârziată-la-poziție în cazul șobolanului adult (58) și în cazul șobolanului copil (59), condiționarea olfactivă (43) (60), labirintul de apă Morris (61) (62) (63), labirintul Biel sau Cincinnati (64) (65), labirintul brațului radial (66), labirintul-T (43), precum și achiziția și fixarea comportamentului controlat de program (26) (67) (68). În literatura de specialitate sunt descrise teste suplimentare pentru șobolanii înțărcați (26) (27) și șobolanii adulți (19) (20).

Examinarea post-mortem

38.   Mamele pot fi eutanasiate după înțărcarea puilor.

39.   Evaluarea neuropatologică a puilor se va efectua utilizând țesuturi de la animalele eutanasiate la PND 22 sau mai devreme, între PND 11 și PND 22, precum și la încheierea studiului. Pentru puii sacrificați până la PND 22, se evaluează țesuturile cerebrale; pentru animalele sacrificate la încheierea studiului, se evaluează atât țesuturile sistemului nervos central (SNC), cât și țesuturile sistemului nervos periferic (SNP). Animalele sacrificate la PND 22 sau mai devreme pot fi fixate prin imersiune sau perfuzare. Animalele sacrificate la încheierea studiului se fixează prin perfuzare. Toate aspectele legate de pregătirea probelor de țesut, de la perfuzarea animalelor la disecția probelor de țesuturi, prelucrarea țesuturilor și impregnarea lamelelor, utilizează un concept compensat, astfel că fiecare grup va conține eșantioane reprezentative din fiecare grup tratat. Orientări suplimentare privind neuropatologia pot fi consultate în documentul de orientare nr. 20 al OCDE (9), a se vedea, de asemenea, punctul 103.

Prelucrarea probelor de țesut

40.   Se notează toate anomaliile macroscopice aparente la momentul autopsiei. Probele de țesut prelevate trebuie să reprezinte toate regiunile importante ale sistemului nervos. Probele de țesut prelevate se păstrează într-un fixator adecvat și se prelucrează în conformitate cu protocoalele histologice publicate standardizate (69) (70) (71) (103). Încorporarea în parafină este acceptabilă pentru țesuturi ale SNC și SNP, dar utilizarea osmiului în procedura de postfixare, împreună cu încorporarea epoxi, ar putea fi adecvată atunci când este necesar un grad mai mare de rezoluție (de exemplu, pentru nervii periferici, atunci când se suspectează o neuropatie periferică și/sau pentru analiza morfometrică a nervilor periferici). Țesutul cerebral colectat pentru analiza morfometrică se încorporează în medii adecvate la toate nivelurile dozei în același timp pentru a evita contracția artefactelor care poate fi asociată cu depozitarea prelungită în fixator (6).

Examinarea neuropatologică

41.   Obiectivele examinării calitative sunt:

(i)	identificarea regiunilor din sistemul nervos care prezintă semne de modificări neuropatologice;

(ii)	identificarea tipurilor de modificări neuropatologice rezultate din expunerea la substanța de testat; și

(iii)

determinarea intervalului de severitate a modificărilor neuropatologice.

Secțiunile histologice reprezentative din eșantioanele de țesut se examinează la microscop de către un patolog instruit în mod corespunzător pentru a constata modificările neuropatologice. Pentru toate modificările neuropatologice se atribuie o notă subiectivă care indică severitatea. O colorație cu hematoxilină-eozină poate fi suficientă pentru evaluarea secțiunilor de creier de la animalele eutanasiate la PND 22 sau mai devreme. Cu toate acestea, pentru secțiunile de țesut de la nivelul SNC și SNP prelevate de la animalele sacrificate la încheierea studiului se recomandă o colorație cu mielină (de exemplu, luxol fast blue/violet de crezil) și colorație cu argint (de exemplu, colorațiile Bodian sau Bielschowsky). În funcție de aprecierea profesională a patologului și de tipul modificărilor observate, pot fi considerate adecvate alte metode de colorație pentru a identifica și a caracteriza anumite tipuri de modificări [de exemplu, proteină acidă fibrilară glială (GFAP) sau teste histochimice ale lectinei pentru a evalua modificările gliale și microgliale (72), fluoro-jad pentru a detecta necroza (73) (74) sau metode de impregnare cu argint specifice pentru degenerarea neuronală (75)].

42.   Se efectuează evaluarea morfometrică (cantitativă), întrucât datele pot contribui la detectarea unor efecte corelate cu tratamentul și sunt importante pentru interpretarea diferențelor corelate cu tratamentul constatate în ceea ce privește greutatea sau morfologia creierului (76) (77). Țesuturile nervoase se eșantionează și se pregătesc pentru a permite evaluarea morfometrică. Evaluările morfometrice pot include, de exemplu, măsurători liniare sau zonale ale unor regiuni specifice ale creierului (78). Măsurătorile liniare sau zonale implică utilizarea de secțiuni omoloage atent selecționate pe baza unor repere microscopice fiabile (6). Stereologia poate fi utilizată pentru a identifica efecte corelate cu tratamentul asupra unor parametri cum ar fi volumul sau numărul de celule pentru anumite regiuni neuroanatomice (79) (80) (81) (82) (83) (84).

43.   Se examinează creierul pentru a constata orice semne de modificări neuropatologice corelate cu tratamentul și, pentru a asigura o examinare aprofundată, se prelevează eșantioane adecvate din toate regiunile majore ale creierului (de exemplu, bulbii olfactivi, cortexul cerebral, hipocamp, ganglionii bazali, talamus, hipotalamus, mezencefal [tectum, tegmentum și pedunculii cerebrali), punte (lat. pons), bulb rahidian (lat. medulla oblongata), cerebel]. Este important ca la toate animalele secțiunile să fie prelevate în același plan. La adulții eutanasiați la încheierea studiului, se prelevează secțiuni reprezentative din măduva spinării și SNP. Zonele examinate trebuie să includă ochiul cu nervul optic și retina, măduva spinării la nodurile cervical și lombar, fibrele rădăcinii dorsale și ventrale, nervul sciatic proximal, nervul tibial proximal (la nivelul genunchiului) și ramurile nervului tibial al mușchiului gambei. Secțiunile din măduva spinării și din nervii periferici trebuie să includă secțiuni atât transversale, cât și longitudinale.

44.   Evaluarea neuropatologică trebuie să includă o examinare care vizează indicii de leziuni legate de dezvoltare la nivelul sistemului nervos (6) (85) (86) (87) (88) (89), în plus față de modificările celulare (de exemplu, vacuolizare neuronală, degenerare, necroză) și modificările tisulare (de exemplu, glioza, infiltrarea cu leucocite, formarea de chisturi). În acest sens, este important să se distingă între efectele corelate cu tratamentul și evenimentele de dezvoltare normală care au loc într-o etapă de dezvoltare care corespunde momentului eutanasierii (90). Exemple de modificări semnificative care indică defecte de dezvoltare includ, dar nu se limitează la:

—	modificări ale dimensiunii sau ale formei macroscopice a bulbilor olfactivi, a creierului mare sau a cerebelului;

—

modificări ale dimensiunii relative a diferitelor regiuni ale creierului, inclusiv scăderi sau creșteri ale dimensiunii regiunilor care rezultă din pierderea sau persistența unor populații de celule sau proiecții axonale care sunt în mod normal tranzitorii (de exemplu, stratul germinal extern al cerebelului, corpul calos);

—

modificări la nivelul proliferării, al migrației și al diferențierii, astfel cum sunt acestea indicate de zone de apoptoză sau necroză excesivă, aglomerații sau populații dispersate de neuroni ectopici, dezorientați sau malformați sau modificări ale dimensiunii relative a diferitelor straturi de structuri corticale;

—	modificări ale structurii de mielinizare, inclusiv o reducere generală a dimensiunii sau o colorație modificată a structurilor mielinizate;

—	dovezi de hidrocefalie, în special extinderea ventriculelor, stenoza apeductului cerebral și subțierea emisferelor cerebrale.

Analiza relației doză-răspuns a modificărilor neurologice

45.   Pentru analizele calitative și cantitative neuropatologice se recomandă următoarea procedură din punct de vedere al etapelor. În primul rând, secțiunile prelevate de la grupul tratat cu doza maximă sunt comparate cu cele ale grupului martor. În cazul în care nu se constată semne de modificări neurologice la animalele din grupul tratat cu doza maximă, nu este necesară o analiză suplimentară. În cazul în care se constată dovezi ale alterărilor neurologice la grupul tratat cu doza maximă, se examinează animalele din grupurile tratate cu dozele intermediare și, respectiv, doza cea mai scăzută. În cazul în care grupul tratat cu doza maximă este eliminat din cauza decesului sau a altor factorii asociați cu toxicitatea, se analizează modificările neurologice corespunzătoare dozei maxime și medii. În cazul în care există vreun indiciu de neurotoxicitate în grupurile tratate cu doze mai scăzute, se efectuează analiza neuropatologică a grupurilor respective. Dacă în examinările calitative sau cantitative se constată vreo modificare neurologică asociată tratamentului, se stabilește dependența de doză a incidenței, a frecvenței și a gradului de severitate a leziunilor sau a modificărilor morfometrice pe baza unei evaluări a tuturor animalelor din toate grupurile tratate. În evaluare trebuie să fie incluse toate regiunile creierului care prezintă vreo dovadă de modificare neuropatologică. Pentru fiecare tip de leziune, sunt descrise caracteristicile utilizate pentru definirea fiecărui grad de severitate, indicând caracteristicile utilizate pentru diferențierea fiecărui grad. Se notează frecvența fiecărui tip de leziune și nivelul de severitate a acesteia și se efectuează o analiză statistică pentru a evalua caracterul unei relații doză-răspuns. Se recomandă utilizarea unor lamele codificate (91).

DATE ȘI RAPORTARE

Data

46.   Datele se raportează în mod individual și se sistematizează într-un tabel care indică, pentru fiecare grup de experiență, tipurile de schimbări și numărul de femele, puii în funcție de sex și cuiburile care prezintă fiecare tip de modificare. În cazul în care s-a efectuat expunerea postnatală directă a puilor, se raportează calea, durata și perioada de expunere.

Evaluarea și interpretarea rezultatelor

47.   Un studiu de neurotoxicitate pentru dezvoltare va oferi informații cu privire la efectele expunerii repetate la o substanță chimică în timpul dezvoltării intrauterine și postnatale timpurii. Întrucât accentul este plasat atât pe efectele de toxicitate generală, cât și pe efectele de neurotoxicitate pentru dezvoltare, rezultatele studiului vor permite distingerea între efectele de neurodezvoltare care se produc în absența toxicității materne generale și cele care se manifestă doar la niveluri care sunt toxice, de asemenea, pentru femela gestantă. Din cauza relațiilor complexe de interdependență între conceptul studiului, analiza statistică și semnificația biologică a datelor, interpretarea adecvată a datelor privind neurotoxicitatea pentru dezvoltare va implica expertiză (107) (109). Interpretarea rezultatelor testelor ar trebui să utilizeze o abordare bazată pe forța probantă a dovezilor (20) (92) (93) (94). Se discută modelele de comportament sau constatările morfologice, în cazul în care acestea sunt prezente, precum și dovezile vizând relația doză-efect. În caracterizare sunt incluse datele de la toate studiile relevante pentru evaluarea neurotoxicității pentru dezvoltare, inclusiv studii epidemiologice umane sau rapoarte de caz și studii experimentale pe animale (de exemplu, date toxicocinetice, informații privind relația structură-activitate, date de la alte studii de toxicitate). Aceasta include relația dintre dozele de substanță de testat și prezența sau absența, incidența și amploarea oricăror efecte neurotoxice pentru fiecare sex (20) (95).

48.   Evaluarea datelor trebuie să includă o analiză atât a semnificației biologice, cât și a celei statistice. Analiza statistică este considerată un instrument de orientare, mai degrabă decât de stabilire a interpretării datelor. Lipsa de semnificație statistică nu trebuie să fie singurul motiv pentru a conchide lipsa unui efect asociat tratamentului, la fel cum semnificația statistică nu trebuie să fie singura justificare pentru a constata prezența unui efect asociat tratamentului. Pentru a preîntâmpina eventuale constatări fals-negative și dificultățile inerente în a «dovedi un negativ», se analizează datele pozitive disponibile și datele martor istorice, în special atunci când nu se observă efecte corelate cu tratamentul (102) (106). Se analizează probabilitatea unor rezultate fals-pozitive luând în considerare evaluarea statistică integrală a datelor (96). Evaluarea va include relația, dacă există, între modificările neuropatologice și comportamentale observate.

49.   Toate rezultatele sunt analizate cu ajutorul unor modele statistice adecvate conceptului experimental (108). Alegerea unei analize parametrice sau neparametrice se justifică prin luarea în considerare a unor factori cum ar fi natura datelor (transformate sau nu) și distribuția acestora, precum și soliditatea relativă a analizei statistice selectate. Scopul și conceptul studiului ar trebui să ghideze alegerea analizelor statistice pentru a reduce la minimum erori de rezultate de tip I (fals pozitive) și de tip II (fals negative) (96) (97) (104) (105). Studiile de dezvoltare care utilizează specii multipare în cadrul cărora sunt testați mai mulți pui per cuib ar trebui să includă cuibul în modelul statistic pentru a evita creșterea ratelor de eroare de tip I (98) (99) (100) (101). Unitatea statistică de măsurare ar trebui să fie cuibul, și nu puiul. Experimentele trebuie concepute astfel încât ceilalți pui din cuib să nu fie tratați ca observații independente. Orice parametru măsurat în mod repetat pe același subiect trebuie analizat cu ajutorul unor modele statistice care determină lipsa caracterului independent al măsurătorilor.

Raport de testare

50.   Raportul de testare va conține următoarele informații:

Produsul chimic de testat:

—	natura fizică și, dacă este cazul, proprietățile fizico-chimice;

—	date de identificare, inclusiv sursa;

—	puritatea preparatului și impuritățile cunoscute și/sau anticipate.

Vehicul (dacă este cazul):

—	justificarea alegerii vehiculului, dacă acesta este altul decât apa sau serul fiziologic.

Animale de testare:

—	speciile și sușa utilizată și o justificare dacă specia este alta decât șobolanul;

—	furnizorul animalelor de testare;

—	numărul, vârsta la începutul studiului și sexul animalelor;

—	sursa, condițiile de adăpost, regimul alimentar, apa etc.;

—	greutatea fiecărui animal la începutul testului.

Condiții de testare:

—	justificarea alegerii dozelor utilizate;

—	justificarea căii de administrare și a perioadei de timp;

—	specificații privind dozele administrate, inclusiv detalii cu privire la vehiculul, volumul și starea de agregare a substanței administrate;

—	detalii privind prepararea substanței de testat/prepararea hranei, concentrația obținută, stabilitatea și omogenitatea preparatului;

—	metoda utilizată pentru identificarea unică a femelelor și a puilor;

—	o descriere detaliată a procedurii/procedurilor de randomizare utilizată/utilizate pentru a repartiza femelele în grupurile de tratament, pentru a selecta puii pentru sacrificare și pentru a repartiza puii în grupurile testate;

—	detalii cu privire la administrarea substanței de testat;

—	conversia de la administrarea prin hrană/apă potabilă sau prin inhalare a concentrației substanței chimice de testare (ppm) în doză efectivă (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;

—	condițiile de mediu;

—	detalii cu privire la calitatea hranei și a apei (de exemplu, apă de la robinet, apă distilată);

—	datele de început și de încheiere a studiului.

Observații și proceduri de testare:

—	o descriere detaliată a procedurilor utilizate pentru a standardiza observațiile și procedurile, precum și definițiile operaționale pentru punctarea observațiilor;

—	o listă cu toate metodele de testare utilizate și justificarea utilizării acestora;

—	detalii privind procedurile comportamentale/funcționale, patologice, neurochimice sau electrofiziologice utilizate, inclusiv informații și detalii privind dispozitivele automatizate;

—	procedurile de calibrare și de garantare a echivalenței dispozitivelor și echilibrarea grupurilor de tratament în procedurile de testare;

—	o scurtă justificare care să explice orice decizii care implică un raționament profesional.

Rezultate (individuale și rezumatul acestora, inclusiv media și varianța, atunci când este cazul):

—	numărul de animale la începutul studiului și numărul acestora la încheierea studiului;

—	numărul de animale și de cuiburi utilizate pentru fiecare metodă de testare;

—	numărul de identificare al fiecărui animal, precum și cuibul din care provine;

—	mărimea cuibului și greutatea medie la fătare pe sexe;

—	date privind greutatea corporală și modificarea greutății corporale, inclusiv greutatea corporală la deces pentru femele și pui;

—	date privind consumul de alimente, precum și date privind consumul de apă, dacă este cazul (de exemplu, în cazul în care substanța chimică testată este administrată prin intermediul apei);

—	date privind reacția toxică, în funcție de sex și de nivelul dozelor, inclusiv simptomele de toxicitate sau mortalitate, inclusiv ora și cauza decesului, dacă este cazul;

—	natura, gravitatea, durata, data apariției, momentul din zi și evoluția observațiilor clinice detaliate;

—	punctajul obținut pentru fiecare reper de dezvoltare (greutatea, maturizarea sexuală și ontogeneza comportamentului) la fiecare observare;

—	o descriere detaliată a tuturor constatărilor comportamentale, funcționale, neuropatologice, neurochimice, electrofiziologice în funcție de sex, inclusiv creșteri și scăderi în raport cu grupurile martor;

—	rezultatele autopsiei;

—	greutatea creierului;

—	orice diagnostice derivate din simptome și leziuni neurologice, inclusiv boli sau afecțiuni care apar în mod natural;

—	imagini ale constatărilor exemplare;

—	imagini cu putere redusă pentru a evalua omologia secțiunilor utilizate pentru morfometrie;

—	date privind absorbția și metabolismul, inclusiv date suplimentare de la un studiu toxicocinetic separat, dacă sunt disponibile;

—	tratarea statistică a rezultatelor, inclusiv modelele statistice utilizate pentru analizarea rezultatelor și rezultatele, indiferent dacă acestea au fost sau nu semnificative;

—	lista personalului implicat în studiu, inclusiv formarea profesională.

Discutarea rezultatelor:

—	informații privind relația doză-răspuns, în funcție de sex și de grup;

—	legătura dintre orice alte efecte toxice și concluzia privind potențialul neurotoxic al substanței chimice testate, în funcție de sex și de grup;

—	impactul oricărei informații toxicocinetice asupra concluziilor;

—	asemănările cu efectele oricăror substanțe neurotoxice cunoscute;

—	datele care susțin fiabilitatea și sensibilitatea metodei de testare (de exemplu, date pozitive și date martor istorice);

—	relații, în cazul în care există, între efectele neuropatologice și funcționale;

—	NOAEL sau doza de referință pentru femele și pui, în funcție de sex și de grup.

Concluzii:

—	o discuție privind interpretarea generală a datelor pe baza rezultatelor, inclusiv o concluzie dacă substanța chimică de testat a cauzat sau nu neurotoxicitate pentru dezvoltare și NOAEL.

BIBLIOGRAFIE

(1)

OECD (1995). Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Copenhagen, Denmark, 13-14 June 1995.

(2)

US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239. Disponibil la: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3)

US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Disponibil la: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4)

Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

(5)

Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

(6)

Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

(7)

OECD (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000.

(8)

OECD (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paris. July 2008. Disponibil la: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

(9)

OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paris, September 2003. Disponibil la: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10)

Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

(11)

Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

(12)

Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

(13)

Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1 st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

(14)

Capitolul B.34 din prezenta anexă, Studiu de toxicitate asupra reproducerii la o generație.

(15)

Capitolul B.35 din prezenta anexă, Studiu de toxicitate asupra reproducerii pe durata a două generații.

(16)

Capitolul B.43 din prezenta anexă, Studiu de neurotoxicitate pe rozătoare.

(17)

Capitolul B.31 din prezenta anexă, Studiu de toxicitate asupra dezvoltării prenatale.

(18)

Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33).

(19)

WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Disponibil la: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20)

WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Geneva. Disponibil la: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21)

Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1 st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

(22)

De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

(23)

Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

(24)

Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

(25)

Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

(26)

Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27)

Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

(28)

Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

(29)

Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

(30)

Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

(31)

ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

(32)

Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

(33)

Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

(34)

Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

(35)

Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

(36)

Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

(37)

Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

(38)

Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

(39)

Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

(40)

Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100.

(41)

Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

(42)

Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, pp. 37-82.

(43)

Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3′-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

(44)

Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

(45)

Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

(46)

Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

(47)

Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

(48)

Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

(49)

Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287-351

(50)

Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

(51)

Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.

(52)

Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

(53)

Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res.,80:25-30.

(54)

Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437-445.

(55)

Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125-145.

(56)

Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3′-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

(57)

Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

(58)

Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

(59)

Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

(60)

Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

(61)

Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

(62)

Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

(63)

D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

(64)

Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

(65)

Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

(66)

Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

(67)

Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

(68)

Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338-341.

(69)

Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

(70)

Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84-107.

(71)

Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

(72)

Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

(73)

Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

(74)

Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

(75)

De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

(76)

De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

(77)

De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

(78)

Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129-135.

(79)

Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

(80)

Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

(81)

Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

(82)

Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

(83)

West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

(84)

Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813–831.

(85)

Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

(86)

Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

(87)

Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.

(88)

Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

(89)

Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056-1060.

(90)

Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

(91)

House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

(92)

Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

(93)

US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

(94)

US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

(95)

Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96)

Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

(97)

Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

(98)

Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

(99)

Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

(100)

Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

(101)

Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

(102)

Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

(103)

Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A «best practices» approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

(104)

Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

(105)

Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

(106)

Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

(107)

Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

(108)

Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

(109)

Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

Figura 1

Program general de testare pentru teste funcționale/comportamentale, evaluarea neuropatologiei, precum și greutățile creierului. Diagrama se bazează pe descrierea de la punctele 13-15 (PND = ziua după fătare). Exemple de repartizare a animalelor sunt prezentate în apendicele 1.

B.54.   BIOTESTUL UTEROTROFIC LA ROZĂTOARE: UN TEST DE DEPISTARE PE TERMEN SCURT PENTRU SUBSTANȚE CU PROPRIETĂȚI ESTROGENICE

INTRODUCERE

1.   Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (OT) nr. 440 (2007). OCDE a inițiat în 1998 o activitate cu un nivel ridicat de prioritate pentru a revizui orientările existente și a elabora noi orientări pentru depistarea și testarea posibililor perturbatori endocrini (1). Un element al activității a fost elaborarea de orientări privind testarea referitoare la biotestul uterotrofic la rozătoare. Ulterior, biotestul uterotrofic la rozătoare a fost supus unui amplu program de validare, inclusiv compilarea unui document de referință detaliat (2) (3) și desfășurarea de ample studii intra- și interlaboratoare pentru a demonstra relevanța și reproductibilitatea biotestului cu un estrogen de referință puternic, cu agoniști slabi ai receptorului de estrogen, cu un antagonist puternic al receptorului de estrogen, precum și cu o substanță chimică de referință (4) (5) (6) (7) (8) (9). Prezenta metodă de testare B.54 este rezultatul experienței dobândite în timpul programului de testare pentru validare și a rezultatelor astfel obținute cu agoniști cu efect estrogenic.

2.   Biotestul uterotrofic este un test de depistare pe termen scurt care a început în anii 1930 (27) (28) și a fost standardizat mai întâi pentru depistare de către un comitet de experți în 1962 (32) (35). Acesta se bazează pe creșterea greutății uterine sau a răspunsului uterotrofic (pentru prezentare, a se vedea punctul 29). Testul evaluează capacitatea unei substanțe chimice de a obține activități biologice compatibile cu agoniști sau antagoniști estrogenici naturali (de exemplu, 17ß-estradiol); cu toate acestea, utilizarea sa pentru detectarea antagoniștilor este mult mai puțin frecventă decât pentru agoniști. Uterul răspunde la estrogeni în două moduri. Un răspuns inițial este o creștere în greutate datorată acumulării de apă. Acest răspuns este urmat de un câștig în greutate din cauza creșterii țesutului (30). Răspunsurile uterului la șobolani și la șoareci sunt comparabile din punct de vedere calitativ.

3.   Biotestul uterotrofic servește ca test de depistare in vivo și aplicarea acestuia ar trebui să fie considerată în contextul «Cadrului conceptual OCDE pentru testarea și evaluarea perturbatorilor endocrini» (apendicele 2). În cadrul conceptual, biotestul uterotrofic este limitat la nivelul 3 ca un test in vivo care furnizează date cu privire la un singur mecanism endocrin, și anume estrogenicitatea.

4.   Biotestul uterotrofic este destinat să fie inclus într-o baterie de teste in vitro și in vivo pentru a identifica substanțele chimice cu potențial de a interacționa cu sistemul endocrin, conducând în cele din urmă la evaluări de risc pentru sănătatea umană sau pentru mediu. Programul de validare al OCDE a utilizat agoniști estrogenici atât puternici, cât și slabi pentru a evalua performanța testului pentru a identifica substanțe chimice cu efect estrogenic (4) (5) (6) (7) (8). Astfel, sensibilitatea procedurii de test pentru agoniștii estrogenici a fost bine demonstrată, pe lângă o bună reproductibilitate intra- și interlaboratoare.

5.   În ceea ce privește substanțele chimice negative, doar o substanță chimică «negativă» de referință raportată deja negativ de testul uterotrofic, precum și de testele de receptori și testele in vitro de legare a receptorului a fost inclusă în programul de validare, însă date de testare suplimentare, care nu sunt legate de programul de validare al OCDE, au fost evaluate, sprijinind în continuare specificitatea biotestului uterotrofic pentru depistarea agoniștilor estrogenici (16).

CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE

6.   Agoniștii și antagoniștii estrogenici acționează ca liganzi pentru receptorii de estrogen a și b și pot activa sau, respectiv, inhiba acțiunea transcripțională a receptorilor. Aceasta poate avea potențialul de a conduce la pericole pentru sănătate, inclusiv efecte asupra reproducerii și dezvoltării. Prin urmare, există necesitatea de a evalua și a analiza rapid o substanță chimică ca un posibil agonist sau antagonist estrogenic. Deși informativă, afinitatea unui ligand pentru un receptor de estrogen sau activarea transcripției genelor reporter in vitro este doar unul dintre mai mulți factori determinanți de posibil pericol. Alți factori determinanți pot include activarea și dezactivarea metabolică la intrarea în corp, distribuția către țesuturile țintă și eliminarea din corp, depinzând, cel puțin în parte, de calea de administrare și de produsul chimic testat. Acest lucru conduce la necesitatea de a depista posibila activitate a unei substanțe chimice in vivo, în condiții corespunzătoare, cu excepția cazului în care caracteristicile substanței chimice referitoare la absorbție — distribuție — metabolism — eliminare (ADME) oferă deja informații adecvate. Țesuturile uterine răspund cu o creștere rapidă și energică la stimulare prin estrogeni, în special la rozătoarele de laborator, la care ciclul estral durează aproximativ 4 zile. Speciile de rozătoare, în special șobolanul, sunt utilizate, de asemenea, pe scară largă în studiile de toxicitate, în vederea caracterizării riscurilor. Prin urmare, uterul rozătoarelor este un organ țintă adecvat pentru depistarea in vivo a agoniștilor și antagoniștilor estrogenici.

7.   Prezenta metodă de testare se bazează pe protocoalele utilizate în studiul de validare al OCDE, care s-au dovedit a fi fiabile și repetabile în studii intra- și interlaboratoare (5) (7). În prezent, sunt disponibile două metode, și anume, metoda femelelor adulte ovariectomizate (metoda adult-ovx) și metoda imaturelor neovariectomizate (metoda imatură). S-a demonstrat, în cadrul programului de teste de validare al OCDE, că ambele metode prezintă o sensibilitate și o reproductibilitate comparabile. Cu toate acestea, exemplarele imature, deoarece au un ax hipotalamo-pituitar-gonadal (HPG) intact, sunt oarecum mai puțin specifice, dar acoperă un domeniu de investigație mai extins decât animalele ovariectomizate, deoarece pot răspunde la substanțe chimice care interacționează cu axa HPG mai degrabă decât numai cu receptorul de estrogen. La șobolani, axa HPG este funcțională la aproximativ 15 zile. Înainte de această vârstă, pubertatea nu poate fi accelerată cu tratamente precum GnRH. Pe măsură ce femelele se apropie de pubertate, înainte de deschiderea vaginului, femela va avea mai multe cicluri silențioase care nu au drept rezultat deschiderea vaginului sau ovulația, dar există unele fluctuații hormonale. În cazul în care o substanță chimică stimulează axa HPG în mod direct sau indirect, rezultă pubertate precoce, ovulație timpurie și deschiderea accelerată a vaginului. Nu numai substanțele chimice care acționează asupra axei HPG au acest efect, ci și anumite tipuri de hrană cu niveluri mai ridicate de energie metabolizabilă decât altele stimulează creșterea și accelerează deschiderea vaginului, fără a fi substanțe cu efect estrogenic. Astfel de substanțe chimice nu ar determina un răspuns uterotrofic în animalele adulte OVX, deoarece axa HPG a acestora nu funcționează.

8.   Din motive de bunăstare a animalelor, ar trebui să se acorde prioritate metodei care utilizează șobolani imaturi, evitând tratarea chirurgicală prealabilă a animalelor și o eventuală neutilizare a animalelor care dau semne că ar intra în ciclul estral (a se vedea punctul 30).

9.   Răspunsul uterotrofic nu este în întregime de origine estrogenică, însemnând că substanțe chimice altele decât agoniștii sau antagoniștii estrogenici pot, de asemenea, să provoace o reacție. De exemplu, doze relativ mari de progesteron, testosteron sau diferite tipuri sintetice de progestin pot conduce la o reacție stimulativă (30). Orice reacție poate fi analizată din punct de vedere histologic pentru cheratinizarea și cornificarea vaginului (30). Indiferent de originea posibilă a reacției, un rezultat pozitiv al unui biotest uterotrofic ar trebui, în mod normal, să inițieze acțiuni pentru clarificare suplimentară. Dovezi suplimentare de estrogenicitate ar putea proveni din teste in vitro, cum ar fi testele de legare ER și testele de activare transcripțională, sau din alte teste in vivo, precum testarea femelelor la pubertate.

10.   Luând în considerare faptul că biotestul uterotrofic servește ca test de depistare in vivo, abordarea de validare adoptată a servit atât considerentelor de bunăstare a animalelor, cât și unei strategii de testare secvențială. În acest scop, efortul s-a concentrat asupra validării riguroase a reproductibilității și a sensibilității pentru estrogenicitate — principala preocupare pentru multe substanțe chimice, în timp ce puține eforturi au fost direcționate către componenta de antiestrogenicitate a testului. A fost testat doar un singur antiestrogen cu activitate puternică, având în vedere faptul că numărul de produse chimice cu un profil antiestrogenic clar (neacoperite de o anumită activitate estrogenică) este foarte limitat. Astfel, metoda de testare este dedicată protocolului estrogenic, în timp ce protocolul care descrie modul antagonist al testării este inclus într-un document de orientare (37). Reproductibilitatea și sensibilitatea testului pentru substanțele chimice cu activitate pur antiestrogenică vor fi definite mai clar ulterior, după ce procedura de testare este în funcțiune pentru o anumită perioadă de timp și sunt identificate mai multe substanțe chimice cu această modalitate de acțiune.

11.   Este recunoscut faptul că toate procedurile bazate pe animale trebuie să fie în conformitate cu standardele locale de îngrijire a animalelor de laborator; descrierile îngrijirii și ale tratamentului prezentate mai jos sunt standarde minime de performanță și sunt prevalate de reglementările locale, cum ar fi Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (38). OCDE oferă orientări suplimentare privind tratamentul uman al animalelor de laborator (25).

12.   Precum în toate testele care utilizează animale vii, este esențial să se asigure că datele sunt într-adevăr necesare, înainte de începerea testului. De exemplu, datele pot fi necesare în următoarele două condiții:

—	potențial ridicat de expunere (nivelul 1 al cadrului conceptual, apendicele 2) sau indicații pentru estrogenicitate (nivelul 2), pentru a investiga dacă efectele pot să apară in vivo;

—	efecte care indică estrogenicitate în testele in vivo de nivelul 4 sau 5 susținând ipoteza că efectele au fost legate de un mecanism estrogenic care nu poate fi elucidat utilizând un test in vitro.

13.   Definițiile utilizate în prezenta metodă de testare sunt prezentate în apendicele 1.

PRINCIPIUL TESTULUI

14.   Biotestul uterotrofic se bazează pentru sensibilitatea sa pe un sistem de testare pe animale la care axul hipotalamo-pituitar-ovarian nu este funcțional, ceea ce generează niveluri endogene scăzute de estrogen aflat în circulație. Acest fapt va asigura un nivel de referință scăzut al greutății uterului și o limită maximă de răspuns la estrogenii administrați. Două stări sensibile la estrogen în rândul rozătoarelor femele îndeplinesc această cerință:

(i)	femele imature după înțărcare și înainte de pubertate; și

(ii)	femele adulte tinere după ovariectomie cu suficient timp pentru ca țesuturile uterine să regreseze.

15.   Substanța de testat se administrează zilnic, prin gavaj oral sau prin injectare subcutanată. Se administrează doze gradate de substanță de testat la un minim de două grupuri de tratament (a se vedea punctul 33 pentru orientare) de animale de experiență, utilizând un singur nivel de doză pe grup și o perioadă de administrare de trei zile consecutive pentru metoda imaturilor sau o perioadă de administrare minimă de trei zile consecutive pentru metoda adulți OVX. Animalele sunt supuse autopsiei la aproximativ 24 de ore după ultima administrare. Pentru agoniștii estrogenici, media greutății uterului la grupurile de animale tratate în raport cu grupul tratat cu vehicul este evaluată pentru o creștere semnificativă din punct de vedere statistic. O creștere semnificativă din punct de vedere statistic a mediei greutății uterului la un grup de tratament indică un răspuns pozitiv la biotest.

DESCRIEREA METODEI

Selectarea speciilor de animale

16.   Se pot utiliza sușe de rozătoare folosite în mod normal în laborator. De exemplu, în timpul validării s-au utilizat sușele de șobolani Sprague-Dawley și Wistar. Nu se utilizează sușe cu utere cunoscute sau suspectate a fi mai puțin receptive. Laboratorul trebuie să demonstreze sensibilitatea sușei utilizate, astfel cum se specifică la punctele 26 și 27.

17.   Șobolanul și șoarecele au fost utilizați în mod obișnuit în biotestul uterotrofic încă din anii 1930. Studiile de validare ale OCDE au fost realizate numai cu șobolani, pe baza unei înțelegeri a faptului că este de așteptat ca ambele specii să fie echivalente și, prin urmare, o specie ar trebui să fie suficientă pentru validare la nivel mondial în vederea economisirii resurselor și a animalelor. Șobolanul este specia aleasă în majoritatea studiilor de toxicitate asupra reproducerii și dezvoltării. Luând în considerare faptul că există o vastă bază de date istorice pentru șoareci și, prin urmare, pentru a extinde sfera metodei biotestului uterotrofic la rozătoare la utilizarea șoarecilor ca specie de testare, s-a efectuat un studiu limitat de validare suplimentar la șoareci (16). S-a selectat o abordare comparativă cu un număr limitat de substanțe chimice de testat, laboratoare participante și fără testare prin eșantionare codificată, în conformitate cu intenția inițială de a economisi resurse și animale. Studiul de validare comparativ arată pentru biotestul uterotrofic la șoareci femele adulte tinere ovariectomizate că, din punct de vedere calitativ și cantitativ, datele obținute la șobolani și la șoareci corespund unele cu altele. Deși rezultatul biotestului uterotrofic poate fi preliminar unui studiu pe termen lung, acesta permite ca animale din aceeași sușă și din aceeași sursă să fie utilizate în ambele studii. Abordarea comparativă s-a limitat la șoareci OVX și raportul nu furnizează un set solid de date pentru a valida modelul imatur, prin urmare, modelul imatur la șoareci nu este considerat în domeniul de aplicare a prezentei metode de testare.

18.   În consecință, în anumite cazuri se pot utiliza șoareci în locul șobolanilor. Trebuie oferită o justificare pentru utilizarea acestei specii, pe baza unor criterii toxicologice, farmacocinetice și/sau de alt tip. Pentru șoareci, ar putea fi necesare modificări ale protocolului. De exemplu, consumul de hrană al șoarecilor în funcție de greutatea corporală este mai mare decât cel al șobolanilor și, prin urmare, conținutul de fitoestrogen din hrană ar trebui să fie mai mic pentru șoareci decât pentru șobolani (9) (20) (22).

Condiții de adăpostire și hrănire

19.   Toate procedurile trebuie să fie în conformitate cu standardele locale de îngrijire a animalelor de laborator. Descrierile îngrijirii și ale tratamentului sunt standarde minime și sunt prevalate de reglementări locale, cum ar fi Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (38). În spațiul pentru adăpostirea animalelor de experiență se asigură o temperatură de 22 °C (cu un interval aproximativ ± 3 °C). Se asigură o umiditate relativă cu valoarea minimă de 30 % și cu valoarea maximă de 70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul. Obiectivul ar fi o umiditate relativă de 5060 %. Iluminatul trebuie să fie artificial. Alternanța zilnică a iluminatului trebuie să fie de 12 ore de lumină, 12 ore de întuneric.

20.   Hrana de laborator și apa potabilă se furnizează ad libitum. Animalele adulte tinere pot fi adăpostite individual sau în cuști în grupuri de până la trei animale. Din cauza vârstei fragede a animalelor imature, se recomandă adăpostirea în grup social.

21.   Se știe că nivelurile ridicate de fitoestrogeni în hrana de laborator au ca efect creșterea greutății uterului la rozătoare într-o măsură suficient de mare pentru a interfera cu biotestul uterotrofic (13) (14) (15). Nivelurile ridicate de fitoestrogeni și de energie metabolizabilă în tipurile de hrană de laborator pot conduce, de asemenea, la pubertate prematură, în cazul în care sunt utilizate animale imature. Prezența fitoestrogenilor rezultă, în principal, din includerea de produse din soia și lucernă în tipurile de hrană de laborator și s-a dovedit că concentrațiile de fitoestrogeni variază de la un lot la altul de hrană standard de laborator (23). Greutatea corporală este o variabilă importantă deoarece cantitatea de hrană consumată este legată de greutatea corporală. Prin urmare, nivelul real al dozei de fitoestrogen consumat din aceeași hrană poate varia în funcție de specie și de vârstă (9). Pentru șobolanii femele imature, consumul de hrană în funcție de greutatea corporală poate fi aproximativ dublu față de cel al femelelor adulte tinere ovariectomizate. Pentru șoarecii adulți tineri, consumul de hrană în funcție de greutatea corporală poate fi de aproximativ patru ori cel al femelelor șobolan adulte tinere ovariectomizate.

22.   Cu toate acestea, rezultatele biotestului uterotrofic (9) (17) (18) (19) arată că anumite cantități limitate de fitoestrogeni alimentari sunt acceptabile și nu reduc sensibilitatea biotestului. Ca orientare, nivelurile alimentare ale fitoestrogenilor nu trebuie să depășească 350 μg de echivalente de genistein/gram de hrană de laborator pentru femelele imature de șobolani Sprague Dawley și Wistar (6) (9). Regimurile alimentare trebuie, de asemenea, să fie adecvate atunci când testarea are loc pe femele de șobolani ovariectomizate adulte tinere, întrucât consumul alimentar în funcție de greutatea corporală este mai mic la tinerii adulți decât la animalele imature. Dacă se utilizează șoareci ovariectomizați sau șobolani mai sensibili la fitoestrogen, se analizează reducerea proporțională a nivelurilor de fitoestrogen alimentar (20). De asemenea, diferențele între energia metabolică disponibilă din diferite regimuri alimentare pot conduce la schimbări temporale privind începerea pubertății (21) (22).

23.   Înainte de studiu, este necesară selecția atentă a unui regim alimentar fără un nivel ridicat de fitoestrogeni [pentru orientări, a se vedea (6) (9)] sau de energie metabolizabilă, care pot afecta rezultatele (15) (17) (19) (22) (36). Asigurarea respectării corespunzătoare a sistemului de testare utilizat de laborator, astfel cum este specificat la punctele 26 și 27, este o metodă importantă de îndeplinire a ambilor factori. Ca măsură de protecție, în conformitate cu bunele practici de laborator (BPL), se realizează prelevarea de probe reprezentative din fiecare lot de hrană administrată în timpul studiului pentru eventuala analiză a conținutului de fitoestrogen (de exemplu, în cazul unei greutăți uterine ridicate în raport cu datele istorice privind grupurile martor sau un răspuns inadecvat la estrogenul de referință, 17 alfa-etinilestradiol). Alicotele se analizează ca parte a studiului sau congelate la – 20 °C sau astfel încât să se împiedice descompunerea probei înainte de analiză.

24.   Unele materiale de așternut pot conține substanțe cu efect estrogenic care apar în mod natural sau substanțe chimice cu efect antiestrogenic (de exemplu, se știe că știuletele de porumb afectează ciclicitatea șobolanilor și pare să aibă efect antiestrogenic). Materialele de așternut selectate trebuie să conțină un nivel minim de fitoestrogeni.

Pregătirea animalelor

25.   Animalele de laborator fără semne de boală sau anormalități fizice se distribuie în mod aleatoriu în grupuri martor și grupuri de tratament. Cuștile se aranjează astfel încât să se reducă la minimum posibilele efecte datorate amplasării acestora. Animalele trebuie identificate individual. De preferință, animalele imature se plasează în cuști cu mame sau mame adoptive până la înțărcare în timpul aclimatizării. Perioada de aclimatizare înainte de începerea studiului ar trebui să fie de aproximativ 5 zile pentru animalele adulte tinere și pentru animalele imature livrate cu mame sau mame adoptive. În cazul în care animalele imature sunt obținute ca pui înțărcați fără mame, este posibil să fie necesară o perioadă de aclimatizare mai scurtă, întrucât administrarea trebuie să înceapă imediat după înțărcare (a se vedea punctul 29).

PROCEDURĂ

Verificarea competenței laboratorului

26.   Pentru a verifica competența laboratorului, se pot utiliza două opțiuni diferite:

—

verificarea periodică, pe baza unui studiu inițial de control pozitiv cu valori de referință (a se vedea punctul 27). Cel puțin o dată la 6 luni și de fiecare dată când are loc o modificare care poate influența performanța testării (de exemplu, o nouă formulare a regimului alimentar, modificări la nivelul personalului care efectuează disecțiile, schimbarea sușei sau a furnizorului de animale etc.), se verifică capacitatea de reacție a sistemului de testare (modelul animal) utilizând o doză corespunzătoare (pe baza studiului de martor pozitiv de referință descris la punctul 27) a unui estrogen de referință: 17a-etinilestradiol (CAS nr. 57-63-6) (EE);

—	utilizarea de controale simultane, prin includerea unui grup căruia i se administrează o doză corespunzătoare de estrogen de referință în fiecare test.

În cazul în care sistemul nu reacționează astfel cum se preconizează, condițiile de experiență sunt examinate și modificate în consecință. Se recomandă ca doza de estrogen de referință care va fi utilizată în cadrul ambelor metode să fie aproximativ ED 70-80.

27.   Studiul de martor pozitiv de referință — Înainte ca un laborator să efectueze un studiu utilizând pentru prima dată prezenta metodă de testare, trebuie să se demonstreze competența laboratorului prin testarea reactivității modelului animal, stabilind răspunsul la o doză de estrogen de referință: 17a-etinilestradiol (CAS nr. 57-63-6) (EE) cu un număr minim de patru doze. Reacția legată de greutatea uterului se va compara cu datele istorice [a se vedea referința bibliografică (5)]. În cazul în care studiul de martor pozitiv de referință nu produce rezultatele anticipate, sunt examinate și modificate condițiile experimentale.

Numărul și starea animalelor

28.   Fiecare grup tratat și fiecare grup martor trebuie să includă cel puțin 6 animale (atât pentru protocoalele metodei imature, cât și pentru metoda adult-OVX).

Vârsta animalelor imature

29.   Pentru biotestul uterotrofic cu animale imature, se specifică ziua fătării. Administrarea trebuie să înceapă suficient de devreme pentru a se asigura că, la sfârșitul administrării substanței chimice de testat, nu a avut încă loc creșterea fiziologică a estrogenilor endogeni asociată cu pubertatea. Pe de altă parte, există dovezi că animalele foarte tinere pot fi mai puțin sensibile. Pentru definirea vârstei optime, fiecare laborator trebuie să ia în considerare propriile date generale privind maturarea.

De regulă, administrarea tratamentului la șobolani poate începe imediat după înțărcarea prematură în ziua 18 după fătare (ziua fătării fiind ziua 0 după fătare). La șobolani, este preferabil ca administrarea să se efectueze în ziua 21 după fătare, dar, în orice caz, înainte de ziua 25 după fătare, întrucât, după această vârstă, axul hipotalamo-pituitar-ovarian devine funcțional, iar nivelurile de estrogen endogen pot începe să crească, cu o creștere concomitentă a greutății de referință a uterului și o creștere a deviațiilor standard ale grupului (2) (3) (10) (11) (12).

Procedura pentru ovariectomie

30.   Pentru femele ovariectomizate de șobolani și de șoareci (grupurile martor și de tratament), ovariectomia se efectuează între 6 și 8 săptămâni. Pentru șobolani, trebuie să existe un interval de minimum 14 de zile între ovariectomie și prima zi de administrare pentru a permite uterului să se retragă până la un nivel de referință stabil minim. Pentru șoareci, trebuie să treacă cel puțin 7 zile între ovariectomie și prima zi de administrare. Întrucât cantități mici de țesut ovarian sunt suficiente pentru a produce niveluri semnificative de estrogeni aflate în circulație (3), animalele sunt testate înainte de utilizare prin observarea celulelor epiteliale prelevate prin tamponare din vagin pe parcursul a cel puțin cinci zile consecutive (de exemplu, pentru șobolani, zilele 10-14 după ovariectomie). În cazul în care animalele manifestă semne că ar intra în ciclul estral, acestea nu sunt utilizate. De asemenea, în momentul autopsiei, se examinează resturile ovariene pentru orice dovadă a existenței de țesut ovarian. În acest caz, animalul nu se utilizează în calcule (3).

31.   Începerea procedurii de ovariectomie se face cu animalul în poziție culcată ventrală, după ce acesta a fost anesteziat în mod corespunzător. Incizia de deschidere de aproximativ 1 cm a peretelui abdominal dorso-lateral se realizează longitudinal, la mijlocul distanței dintre marginea inferioară costală și creasta iliacă și câțiva milimetri lateral de marginea laterală a mușchiului lombar. Ovarul se îndepărtează din cavitatea abdominală pe un câmp aseptic. Ovarul se separă la joncțiunea dintre oviduct și organismul uterin. După ce se confirmă că nu există o sângerare masivă, peretele abdominal se închide prin suturi și pielea este închisă cu autoclipsuri sau sutură corespunzătoare. Punctele de ligatură sunt prezentate schematic în figura 1. Se utilizează analgezice postoperatorii adecvate, conform recomandării unui medic veterinar cu experiență în îngrijirea rozătoarelor.

Greutatea corporală

32.   În metoda adult-OVX, greutatea corporală și greutatea uterului nu sunt corelate, deoarece greutatea uterului este afectată de hormoni precum estrogenii, dar nu și de factori de creștere care reglementează dimensiunea corporală. Dimpotrivă, greutatea corporală este legată de greutatea uterului în modelul imatur, în timp ce acesta se maturizează (34). Astfel, la începutul studiului, diferențele de greutate între animalele utilizate în modelul imatur trebuie să fie minime și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie. Aceasta înseamnă că dimensiunea cuibului trebuie să fie standardizată de crescător, pentru a se asigura că puii de la diferite animale materne vor fi hrăniți aproximativ la fel. Animalele trebuie distribuite în grupuri (atât grupuri martor, cât și grupuri tratate) prin distribuirea aleatorie a greutății, astfel încât greutatea medie a fiecărui grup să nu fie diferită din punct de vedere statistic de cea a oricărui alt grup. Ar trebui să se acorde atenție pentru a evita, pe cât posibil, atribuirea unor pui din același cuib în același grup de tratament, fără a crește numărul de cuiburi care urmează să fie utilizate pentru investigație.

Dozare

33.   Pentru a stabili dacă o substanță chimică de testat poate avea efect estrogenic in vivo, două grupuri de tratament și un grup martor sunt în mod normal suficiente și, prin urmare, acest concept este preferat, din motive de bunăstare a animalelor. În cazul în care scopul este de a obține o curbă doză-răspuns sau pentru a extrapola la doze mai mici, sunt necesare cel puțin 3 grupuri de tratament. În cazul în care sunt necesare mai multe informații în afară de identificarea activității estrogenice (cum ar fi o estimare a potenței), ar trebui să fie luat în considerare un regim de administrare diferit. Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din grupul martor trebuie tratate în mod identic cu animalele din grupurile tratate. Dacă se folosește un vehicul la administrarea substanței de testat, grupul martor trebuie să primească aceeași cantitate de vehicul utilizată la grupurile tratate (sau cel mai mare volum utilizat la grupurile tratate, dacă acesta diferă între grupuri).

34.   Obiectivul în cazul biotestului uterotrofic este selectarea de doze care să garanteze supraviețuirea animalelor și care nu prezintă toxicitate semnificativă sau suferință pentru animale după trei zile consecutive de administrare a substanței chimice până la o doză maximă de 1 000 mg/kg/zi. Toate dozele se propun și se selecționează ținându-se cont de toate datele existente privind toxicitatea și datele (toxico)cinetice disponibile pentru substanța testată sau materialele asociate. Nivelul cel mai ridicat de doză trebuie să țină seama, în primul rând, de informații privind LD50 și/sau toxicitatea acută pentru a evita decesul, suferințe grave sau stresarea animalelor (24) (25) (26). Cea mai mare doză reprezintă doza maximă tolerată (DMT); s-ar accepta, de asemenea, un studiu efectuat la un nivel al dozei care a indus o reacție uterotrofică pozitivă. Ca partajare, sunt în general acceptabile intervale mari (de exemplu, o semiunitate logaritmică corespunzătoare unei progresii a dozei de 3,2 sau chiar până la o unitate logaritmică) între doze. Dacă nu există informații relevante disponibile, se poate realiza un studiu preliminar pentru stabilirea nivelurilor dozelor cu scopul de a contribui la stabilirea dozelor de administrat.

35.   Alternativ, în cazul în care potența estrogenică a unui agonist poate fi estimată utilizând date in vitro (sau in silico), acestea pot fi luate în considerare pentru selectarea dozei. De exemplu, cantitatea de substanță de testat care ar produce reacții uterotrofice echivalente cu agonistul de referință (etinilestradiol) este estimată prin potențialele sale relative in vitro la etinilestradiol. Cea mai mare doză de test ar fi obținută prin multiplicarea dozei echivalente cu un factor corespunzător, de exemplu 10 sau 100.

Considerații privind stabilirea nivelurilor dozelor

36.   În cazul în care este necesar, se poate efectua un studiu preliminar pentru stabilirea nivelurilor dozelor pe câteva animale. În acest sens, se poate utiliza documentul de orientare nr. 19 al OCDE (25) care definește semnele clinice care indică toxicitate sau suferința animalelor. În cazul în care este posibil în cadrul studiului de stabilire a nivelurilor dozelor, după trei zile de administrare, uterele pot fi excizate și cântărite aproximativ la 24 de ore după administrarea ultimei doze. Datele pot fi utilizate ulterior pentru a contribui la conceperea studiului principal (selectarea dozelor maxime acceptabile și a dozelor scăzute și recomandarea numărului de grupuri tratate).

Administrarea dozelor

37.   Substanța de testat se administrează prin gavaj oral sau prin injectare subcutanată. La alegerea căii de administrare, se ține seama de considerente legate de bunăstarea animalelor, precum și de aspecte toxicologice, cum ar fi relevanța pentru calea de expunere umană la substanța chimică (de exemplu, oral prin gavaj la modelul de ingerare, injectare subcutanată la modelul de inhalare sau adsorbție cutanată), proprietățile fizice și chimice ale substanței de testat și, în special, informațiile toxicologice existente și datele cu privire la metabolism și cinetică (de exemplu, necesitatea de a evita primul pasaj metabolic, o mai bună eficiență prin utilizarea unei anumite căi).

38.   Se recomandă ca, acolo unde este posibil, să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei soluții/suspensii apoase. Cu toate acestea, deoarece majoritatea liganzilor estrogenului sau precursorii lor metabolici tind să fie hidrofobi, cea mai comună abordare este de a utiliza o soluție/suspensie în ulei (de exemplu, ulei de porumb, de arahide, de susan sau de măsline). Cu toate acestea, astfel de uleiuri au conținuturi calorice și de grăsime diferite, astfel că vehiculul ar putea afecta energia metabolizabilă (EM) totală, ceea ce ar putea afecta obiectivele măsurate, cum ar fi greutatea uterului, în special în cadrul metodei imature (33). Prin urmare, înainte de studiu, orice vehicul care va fi utilizat se testează în comparație cu grupuri martor fără vehicule. Substanțele chimice de testat se pot dizolva într-o cantitate minimă de etanol 95 % sau alți solvenți adecvați și pot fi diluate la concentrații de lucru finale în vehiculul testat. Trebuie să se cunoască caracteristicile toxice ale solventului și acesta se testează într-un grup martor separat numai cu solvent. În cazul în care substanța de testat este considerată stabilă, se poate utiliza o încălzire ușoară și acțiune mecanică viguroasă pentru a contribui la dizolvarea substanței de testat. Trebuie să se determine stabilitatea substanței de testat în vehicul. În cazul în care substanța de testat este stabilă pe durata studiului, se poate prepara o alicotă de pornire din substanța de testat, iar diluțiile de dozare specificate se prepară zilnic.

39.   Calendarul de dozare va depinde de modelul utilizat (a se vedea punctul 29 pentru modelul imatur și punctul 30 pentru modelul adult-OVX). Șobolanilor femele imature li se administrează substanța de testat zilnic timp de trei zile consecutive. Un tratament de trei zile se recomandă, de asemenea, pentru șobolanii femele ovariectomizate, dar expuneri mai lungi sunt acceptabile și pot îmbunătăți detectarea substanțelor chimice slab active. La șoarecii femele ovariectomizate, perioada de aplicare de 3 zile este suficientă, fără un avantaj semnificativ al unei extinderi de până la șapte zile pentru agoniști estrogenici puternici; cu toate acestea, o astfel de relație nu a fost demonstrată pentru estrogenii slabi în studiul de validare (16), prin urmare, administrarea ar trebui prelungită până la 7 zile consecutive la șoarecii adulți-OVX. Doza se administrează aproximativ în același moment al zilei. Aceasta trebuie să se ajusteze, după cum este necesar, pentru a menține un nivel de doză constant în raport cu greutatea corporală a animalului (de exemplu, mg de substanță chimică de testat per kg de greutate corporală pe zi). În ceea ce privește volumul probei, caracterul variabil al acesteia, în funcție de greutatea corporală, ar trebui să fie redus la minimum prin ajustarea concentrației soluției de tratament pentru a se asigura un volum constant în funcție de greutatea corporală la toate nivelurile dozei și pentru toate căile de administrare.

40.   În cazul în care substanța de testat se administrează prin gavaj, aceasta ar trebui să se administreze animalelor într-o singură doză zilnică, utilizând o sondă gastrică sau o canulă de intubare adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat odată depinde de dimensiunea animalului de laborator. Trebuie să se urmeze orientările locale privind îngrijirea animalelor, dar volumul nu trebuie să depășească 5 ml/kg masă corporală, cu excepția cazului soluțiilor apoase, în care se pot utiliza 10 ml/kg masă corporală.

41.   În cazul în care substanța de testat se administrează prin injectare subcutanată, acest lucru se realizează într-o singură doză zilnică. Dozele se administrează în regiunile dorso-scapulare sau lombare cu un ac steril (de exemplu, cu grosimea 23 sau 25) și o seringă pentru tuberculină. Raderea zonei de injectare este opțională. Se notează eventualele pierderi, scurgeri la punctul de injectare sau administrarea incompletă. Volumul total injectat per șobolan pe zi nu trebuie să depășească 5 ml/kg greutate corporală, împărțit în două locuri de injectare, cu excepția cazului soluțiilor apoase, în care pot fi utilizate 10 ml/kg greutate corporală.

Observații

Observații clinice și generale

42.   Se recomandă realizarea de observații clinice generale cel puțin o dată pe zi și chiar mai frecvent în cazul în care se observă semne de toxicitate. Observațiile se efectuează, de preferință, la aceeași oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare. Toate animalele sunt observate pentru simptome de mortalitate, morbiditate și semne clinice generale, cum ar fi schimbări la nivelul comportamentului, al pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apariția unor secreții și excreții și activitatea reflexă (de exemplu, lăcrimarea, erecția piloasă, respirația anormală).

Greutatea corporală și consumul de hrană

43.   Toate animalele se cântăresc zilnic cu o precizie de 0,1 g, începând chiar înainte de inițierea tratamentului, și anume, atunci când animalele sunt distribuite în grupuri. Ca măsurare opțională, se poate cântări cantitatea de alimente consumate per cușcă în perioada tratamentului prin cântărirea alimentatoarelor. Rezultatele consumului alimentar se exprimă în grame pe șobolan pe zi.

Disecția și măsurarea greutății uterului

44.   Șobolanii sunt eutanasiați la douăzeci și patru de ore de la ultimul tratament. În mod ideal, ordinea autopsiei va fi aleatorie între grupuri pentru a evita progresia directă în sus sau în jos în grupurile tratate care ar putea afecta datele în mod subtil. Obiectivul biotestului este de a măsura greutatea uterului atât umed, cât și tamponat. Greutatea umedă include uterul și conținutul de fluid luminal. Greutatea tamponată este măsurată după ce conținutul luminal al uterului a fost exprimat și îndepărtat.

45.   Înainte de disecție, vaginul va fi examinat pentru detectarea nivelului de deschidere la animalele imature. Procedura de disecție începe prin deschiderea peretelui abdominal începând de la simfiza pubiană. Ulterior, cornul și ovarele uterine, dacă sunt prezente, sunt desprinse de peretele abdominal dorsal. Vezica urinară și ureterele sunt îndepărtate de pe partea ventrală și laterală a uterului și a vaginului. Adeziunea fibroasă dintre rect și vagin se desprinde până când se pot identifica joncțiunea orificiului vaginal și pielea perineală. Uterul și vaginul sunt desprinse din corp prin incizia peretelui vaginal chiar deasupra joncțiunii dintre pielea perineală, astfel cum se arată în figura 2. Uterul se desprinde de peretele corpului prin tăierea cu grijă a mezenterului uterin la punctul de fixare a acestuia pe întreaga lungime a părții dorso-laterale a fiecărui corn uterin. După îndepărtarea din organism, manipularea uterului trebuie să fie suficient de rapidă pentru a evita deshidratarea țesuturilor. Pierderea de greutate datorată uscării devine mai importantă la țesuturile mici precum uterul (23). În cazul în care sunt prezente, ovarele sunt eliminate la nivelul oviductului, evitând pierderea de fluid luminal din cornul uterin. În cazul în care animalul a fost ovariectomizat, resturile se examinează pentru detectarea prezenței oricăror țesuturi ovariene. Se îndepărtează excesul de grăsime și țesut conjunctiv. Vaginul este îndepărtat din uter chiar sub colul uterin, astfel încât colul uterin să rămână cu corpul uterin, astfel cum se arată în figura 2.

46.   Fiecare uter ar trebui transferat într-un recipient cântărit și marcat în mod unic (de exemplu, un vas petri sau din material plastic), acordându-se atenție în continuare pentru a evita deshidratarea înainte de cântărire (de exemplu, în recipient se poate plasa hârtie de filtru ușor umezită cu soluție salină). Uterul cu fluid luminal se cântărește cu o precizie de 0,1 mg (greutatea uterului umed).

47.   Fiecare uter va fi prelucrat apoi în mod individual pentru a elimina fluidul luminal. Ambele coarne uterine vor fi perforate sau tăiate longitudinal. Uterul va fi amplasat pe hârtie de filtru ușor umezită (de exemplu, Whatman nr. 3) și apăsat ușor cu o a doua bucată de hârtie de filtru umezită pentru a elimina complet fluidul luminal. Uterul fără conținutul luminal se cântărește cu o precizie de 0,1 mg (greutatea uterului tamponat).

48.   Greutatea uterului la sacrificare poate fi utilizată pentru a se asigura că nu s-a depășit vârsta corespunzătoare la șobolanul intact imatur, cu toate acestea, datele istorice ale sușei de șobolan utilizate de laborator sunt decisive în acest sens (a se vedea punctul 56 pentru interpretarea rezultatelor).

Investigații opționale

49.   După cântărire, uterul poate fi fixat în formol 10 % tamponat neutru pentru a fi examinat histopatologic după colorarea cu hematoxilină și eozină (HE). Vaginul poate fi examinat în consecință (a se vedea punctul 9). În plus, se poate realiza măsurarea morfometrică a epiteliului endometrial pentru comparație cantitativă.

DATE ȘI RAPORT

Date

50.   Datele studiului ar trebui să includă:

—	numărul de animale la începutul testului;

—	numărul și identitatea animalelor găsite moarte în timpul testului sau sacrificate pentru a nu suferi, precum și data și ora fiecăror decese și eutanasieri;

—	numărul și identitatea animalelor care prezintă semne de toxicitate, precum și o descriere a semnelor de toxicitate observate, inclusiv momentul declanșării, durata și severitatea oricăror efecte toxice; și

—	numărul și identitatea animalelor care prezintă vreo leziune și o descriere a tipului de leziuni.

51.   Se consemnează datele individuale ale animalelor în ceea ce privește greutatea corporală, greutatea uterului umed și greutatea uterului tamponat. Se utilizează analizele statistice unilaterale ale agoniștilor pentru a determina dacă administrarea unui produs chimic de testare a condus la o creștere semnificativă statistic (p < 0,05) a greutății uterine. Se efectuează analize statistice corespunzătoare pentru a studia modificările legate de tratament la nivelul greutății uterului umed și tamponat. De exemplu, datele pot fi evaluate printr-o abordare de analiză de covarianță (ANCOVA), cu greutatea corporală la autopsie drept covariabilă. Se poate efectua o transformare logaritmică de stabilizare a varianței asupra datelor uterine înainte de analiza datelor. Testul Dunnett și Hsu este adecvat pentru efectuarea de comparații între perechi ale fiecărui grup tratat raportat la grupul martor pentru vehicul și pentru calcularea intervalelor de încredere. Reprezentarea grafică a rezidualelor studentizate pot fi utilizate pentru detectarea eventualelor valori aberante și pentru evaluarea omogenității varianțelor. Procedurile respective au fost aplicate în cadrul programului de validare al OCDE, utilizând PROC GLM în SAS (Statistical Analysis System) (Institutul SAS, Cary, NC), versiunea 8 (6) (7).

52.   Un raport final va include:

Unitatea de testare:

—	personalul responsabil și responsabilitățile acestuia în cadrul studiului;

—	datele de la testul cu martor pozitiv de referință și datele martor pozitiv periodice (a se vedea punctele 26 și 27).

Substanța chimică de testat:

—	caracterizarea substanțelor de testat;

—	natura fizică și, acolo unde este cazul, proprietățile fizico-chimice;

—	metoda și frecvența de preparare a diluțiilor;

—	toate informațiile obținute cu privire la stabilitate;

—	toate analizele soluțiilor de dozare.

Vehicul:

—	caracterizarea vehiculului de testare (natura, furnizorul și lotul);

—	justificarea alegerii vehiculului (dacă este altul decât apa).

Animale de laborator:

—	specia și sușa și justificarea alegerii acestora;

—	furnizorul și unitatea specifică furnizorului;

—	vârsta la furnizare cu data fătării;

—	în cazul animalelor imature, dacă sunt furnizate cu sau fără mamă sau mamă adoptivă și data înțărcării;

—	detalii privind procedura de aclimatizare a animalelor;

—	numărul animalelor per cușcă;

—	detalii și metoda de identificare a fiecărui animal și a grupului.

Condiții de testare:

—	detalii privind procesul de selecție aleatorie (și anume, metoda utilizată);

—	justificarea alegerii dozei;

—	detalii privind prepararea substanței de testat, concentrația obținută, stabilitatea și omogenitatea;

—	detalii privind administrarea substanței de testat și justificarea alegerii căii de expunere;

—	hrana (denumirea, tipul, furnizorul, conținutul și, dacă se cunosc, nivelurile de fitoestrogen);

—	sursa de apă (de exemplu, apă de la robinet sau apă filtrată) și furnizare (prin tuburi de la un container mare, în sticle etc.);

—	așternutul (denumirea, tipul, furnizorul, conținutul);

—	evidența condițiilor de plasare în cuști, intervalul de iluminat, temperatura și umiditatea spațiului, curățarea spațiului;

—	descrierea detaliată a procedurilor de autopsie și de cântărire a greutății uterine;

—	descrierea procedurilor statistice.

Rezultate

Pentru fiecare animal:

—	toate greutățile corporale individuale zilnice (de la distribuirea în grupuri până la autopsie) (cu o precizie de 0,1 g);

—	vârsta fiecărui animal (în zile, ziua fătării fiind considerată ziua 0) atunci când începe administrarea substanței de testat;

—	data și ora fiecărei administrări a dozei;

—	volumul calculat și dozajul administrat și observațiile cu privire la orice pierderi de dozaj în timpul sau ulterior administrării dozei;

—	înregistrarea zilnică a stării animalelor, inclusiv simptome și observații relevante;

—	presupusa cauză a decesului (în cazul în care animalul este descoperit în timpul studiului în stare muribundă sau mort);

—	data și ora eutanasierii cu intervalul de timp până la ultima administrare a dozei;

—	greutatea uterului umed (cu o precizie de 0,1 mg) și eventualele observații privind pierderile de fluid luminal în timpul disecției și a pregătirii pentru cântărire;

—	greutatea uterului tamponat (cu o precizie de 0,1 mg).

Pentru fiecare grup de animale:

—	greutatea corporală medie zilnică (cu o precizie de 0,1 g) și deviații standard (de la distribuirea în grupuri până la autopsie);

—	greutatea medie a uterului umed și greutatea medie a uterului tamponat (cu o precizie de 0,1 mg) și deviațiile standard;

—	în cazul în care se măsoară, consumul alimentar zilnic (calculat în grame de hrană consumată per animal);

—	rezultatele analizelor statistice de comparare a greutății uterului umed și a greutății uterului tamponat la grupurile tratate în raport cu aceleași măsurători la grupurile martor pentru vehicul;

—	rezultatele analizei statistice de comparare a greutății corporale totale și a creșterii în greutate la grupurile tratate în raport cu aceleași măsurători la grupurile martor pentru vehicul.

53.   Rezumat al elementelor de orientare importante ale metodei de testare

	Șobolan	Șoareci
Animale
Sușa	Sușa de rozătoare de laborator utilizată în mod obișnuit
Număr de animale	Cel puțin 6 animale în fiecare grup tratat
Număr de grupuri	Cel puțin 2 grupuri de testare (a se vedea punctul 33 pentru orientare) și un grup martor negativ Pentru îndrumări cu privire la grupurile martor pozitiv, a se vedea punctele 26 și 27
Condiții de adăpostire și de hrănire
T° în încăperea în care se află animalele	22 °C ± 3 °C
Umiditatea relativă	50-60 % și nu mai mică de 30 % sau mai mare de 70 %
Alternanța zilnică a iluminatului	12 ore de lumină, 12 ore de întuneric
Alimentația și apa potabile	Ad libitum
Adăpost	Individual sau în grupuri de până la trei animale (pentru animalele imature se recomandă adăpostirea în grup social)
Alimentația și așternutul	Se recomandă un nivel scăzut de fitoestrogeni în alimentație și așternut
Protocol
Metodă	Metoda imatură neovariectomizată (opțiunea preferată) Metoda femelelor adulte ovariectomizate	Metoda femelelor adulte ovariectomizate
Vârsta administrării pentru animalele imature	Cel mai devreme, PND 18. Tratarea trebui să se finalizeze înainte de PND 25	Nu este relevantă în domeniul de aplicare al prezentei metode de testare.
Vârsta ovariectomiei	Între 6 și 8 săptămâni.
Vârsta administrării pentru animalele ovariectomizate	Între ovariectomie și prima zi de administrare trebuie să treacă cel puțin 14 zile.	Între ovariectomie și prima zi de administrare trebuie să treacă cel puțin 7 zile.
Greutatea corporală	Variația greutății corporale trebuie să fie minimă și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie.
Administrare
Calea de administrare	Gavaj oral sau injectare subcutanată
Frecvența administrării	Doză zilnică unică
Volumul pentru gavaj și injectare	≤ 5ml/kg greutate corporală (sau până la 10 ml/kg greutate corporală în cazul soluțiilor apoase) (în 2 două locuri de injectare pentru calea subcutanată)
Durata administrării	3 zile consecutive pentru modelul imatur Cel puțin 3 zile consecutive pentru modelul OVX	7 zile consecutive pentru modelul OVX
Momentul autopsiei	Aproximativ 24 de ore după ultima administrare
Rezultate
Răspuns pozitiv	Creștere semnificativă din punct de vedere statistic a greutății medii a uterului (umed și/sau tamponat)
Estrogen de referință	17α-etinilestradiol

ORIENTĂRI PENTRU INTERPRETAREA ȘI ACCEPTAREA REZULTATELOR

54.   În general, un test pentru detectarea estrogenicității este considerat pozitiv în cazul în care există o creștere semnificativă din punct de vedere statistic a greutății uterului (p < 0,05) cel puțin la niveluri mari de doze în comparație cu grupul martor pentru solvent. Un rezultat pozitiv este susținut, de asemenea, prin demonstrarea unei relații plauzibile din punct de vedere biologic și de magnitudinea răspunsului, având în vedere că activitățile estrogenice și antiestrogenice care se suprapun ale substanței chimice de testat pot afecta forma curbei doză-răspuns.

55.   Trebuie să se acorde o atenție deosebită pentru a nu se depăși doza maximă tolerată, cu scopul de a permite o interpretare semnificativă a datelor. În acest sens, se analizează cu atenție reducerea greutății corporale, semnele clinice și alte constatări.

56.   Un aspect important pentru acceptarea datelor din biotestul uterotrofic este greutatea uterină la animalele din grupul martor tratat cu vehicul. Valorile martor ridicate ar putea compromite capacitatea de reacție a biotestului și capacitatea de a detecta agoniștii estrogenici foarte slabi. Analiza literaturii de specialitate și datele obținute în cursul validării biotestului uterotrofic sugerează că, în special la animalele imature, cazurile unor valori medii martor ridicate nu apar spontan (2) (3) (6) (9). Întrucât greutatea uterului la șobolanii imaturi depinde de o serie de variabile, cum ar fi sușa sau greutatea corporală, nu se poate prevedea nicio limită superioară definitivă pentru greutatea uterului. Ca orientare, dacă greutatea uterului tamponat la șobolanii martor imaturi este cuprinsă între 40 și 45 mg, rezultatele ar trebui să fie considerate suspecte, iar greutatea uterului de peste 45 mg poate conduce la reluarea testului. Acest aspect se examinează însă de caz la caz (3) (6) (8). La testarea șobolanilor adulți, ovariectomia incompletă va lăsa țesuturi ovariene care pot produce estrogen endogen și pot întârzia regresia greutății uterului.

57.   Greutatea uterului tamponat al grupului martor pentru vehicul sub 0,09 % din greutatea corporală pentru șobolanii femele imature și sub 0,04 % pentru femele adulte tinere ovariectomizate pare să producă rezultate acceptabile [a se vedea tabelul 31 (2)]. În cazul în care greutatea uterului are valori mai mari la grupul martor decât cifrele respective, se examinează diverși factori, inclusiv vârsta animalelor, ovariectomia corespunzătoare, fitoestrogeni alimentari etc., iar un rezultat negativ la test (niciun semn de activitate estrogenică) ar trebui utilizat cu prudență.

58.   Datele istorice pentru grupurile martor se păstrează în laborator. Datele istorice pentru reacții la estrogeni de referință pozitivi, cum ar fi 17a-etinilestradiol, se păstrează, de asemenea, în laborator. Laboratoarele pot testa, de asemenea, reacția la agoniști estrogenici slabi cunoscuți. Toate datele obținute pot fi comparate cu datele disponibile (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) pentru a se asigura că metodele laboratorului furnizează suficientă sensibilitate.

59.   Valorile greutății uterului tamponat au manifestat mai puțină variabilitate în cursul studiului de validare al OCDE decât valorile greutății uterului umed (6) (7). Cu toate acestea, un răspuns semnificativ pentru oricare dintre măsurători ar indica faptul că substanța de testat este pozitivă pentru activitate estrogenică.

60.   Răspunsul uterotrofic nu este în întregime de origine estrogenică; cu toate acestea, un rezultat pozitiv al biotestului uterotrofic este, în general, interpretat ca o dovadă de potențial estrogenic in vivo și, în mod normal, ar trebui să inițieze acțiuni pentru clarificări suplimentare (a se vedea punctul 9 și «Cadrul conceptual al OCDE pentru testarea și evaluarea perturbatorilor endocrini», anexa 2).

Figura 1

Reprezentare schematică ilustrând îndepărtarea chirurgicală a ovarelor

Procedura începe prin deschiderea peretelui dorso-lateral abdominal la mijlocul distanței dintre marginea inferioară costală și creasta iliacă și câțiva milimetri lateral de marginea laterală al mușchiului lombar. În cavitatea abdominală, se localizează ovarele. Ulterior, ovarele sunt îndepărtate fizic din cavitatea abdominală pe un câmp aseptic, se realizează o ligatură între ovare și uter pentru a controla sângerarea, iar ovarul este detașat prin incizie deasupra ligaturii la joncțiunea dintre oviduct și fiecare corn uterin. După ce se confirmă absența unei sângerări semnificative, peretele abdominal este închis prin suturi, iar pielea este închisă, de exemplu, prin autoclipsuri sau sutură. Trebuie să se permită ca animalele să își revină și greutatea uterului să regreseze timp de cel puțin 14 zile înainte de utilizare.

Figura 2

Îndepărtarea și pregătirea țesuturilor uterine pentru măsurarea greutății

Procedura începe prin deschiderea peretelui abdominal la simfiza pubiană. Ulterior, fiecare ovar, dacă sunt prezente, și cornul uterin sunt desprinse de peretele abdominal dorsal. Vezica urinară și ureterele sunt îndepărtate de pe partea ventrală și laterală a uterului și a vaginului. Adeziunea fibroasă dintre rect și vagin se desprinde până când se pot identifica joncțiunea orificiului vaginal și pielea perineală. Uterul și vaginul sunt desprinse din corp prin incizia peretelui vaginal chiar deasupra joncțiunii dintre pielea perineală, astfel cum se arată în figură. Uterul se desprinde de peretele corpului, prin tăierea cu grijă a mezenterului uterin la punctul de fixare a acestuia pe întreaga lungime a părții dorso-laterale a fiecărui corn uterin. După scoaterea din organism, se îndepărtează excesul de grăsime și țesutul conjunctiv. În cazul în care sunt prezente, ovarele se îndepărtează la nivelul oviductului, evitând pierderea de fluid luminal din cornul uterin. În cazul în care animalul a fost ovariectomizat, resturile sunt examinate pentru detectarea prezenței oricăror țesuturi ovariene. Se îndepărtează excesul de grăsime și de țesut conjunctiv. Vaginul este îndepărtat din uter chiar sub colul uterin, astfel încât colul uterin să rămână cu corpul uterin, astfel cum se arată în figură. Uterul poate fi apoi cântărit.

NOTE LA CADRU:

Nota 1:

Intrarea la toate nivelurile și ieșirea la toate nivelurile sunt posibile și depind de natura nevoilor de informații existente în scopul evaluării riscurilor și a pericolelor.

Nota 2:

La nivelul 5, ecotoxicologia trebuie să includă parametri care să indice mecanisme de efecte adverse și eventuala vătămare a populației.

Nota 3:

În cazul în care un model multimodal acoperă mai multe teste cu parametru unic, modelul respectiv ar înlocui utilizarea testelor cu parametru unic în cauză.

Nota 4:

Evaluarea fiecărei substanțe chimice se efectuează de la caz la caz, ținând cont de toate informațiile disponibile, având în vedere funcția nivelurilor cadrului.

Nota 5:

Nu trebuie să se considere că în prezent cadrul include toate testele. La nivelurile 3, 4 și 5, acesta include teste care sunt disponibile sau care sunt în curs de validare. Acestea din urmă sunt incluse cu titlu provizoriu. După dezvoltarea și validarea lor, acestea vor fi adăugate în mod oficial în cadru.

Nota 6:

Nu trebuie să se considere că nivelul 5 include doar teste definitive. Se consideră că testele incluse la acest nivel contribuie la evaluarea generală a riscurilor și a pericolelor.

BIBLIOGRAFIE

(1)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(2)

OECD (2003). Detailed Background Review of the Uterotrophic Bioassay: Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic Bioassay. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 38. ENV/JM/MONO(2003)1.

(3)

Owens JW, Ashby J. (2002). Critical Review and Evaluation of the Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic Protocols for the Laboratory Rodent. Crit. Rev. Toxicol. 32:445-520.

(4)

OECD (2006). OECD Report of the Initial Work Towards the Validation of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 65. ENV/JM/MONO(2006)33.

(5)

Kanno, J, Onyon L, Haseman J, Fenner-Crisp P, Ashby J, Owens W. (2001). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1. Environ Health Perspect. 109:785-94.

(6)

OECD (2006). OECD Report of the Validation of the Rodent Uterotrophic Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 66. ENV/JM/MONO(2006)34.

(7)

Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies. Environ. Health Persp.111:1530-1549.

(8)

Kanno J, Onyon L, Peddada S, Ashby J, Jacob E, Owens W. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Coded Single Dose Studies. Environ. Health Persp.111:1550-1558.

(9)

Owens W, Ashby J, Odum J, Onyon L. (2003). The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoestrogen analyses. Environ. Health Persp. 111:1559-1567.

(10)

Ogasawara Y, Okamoto S, Kitamura Y, Matsumoto K. (1983). Proliferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neonatally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of [I125]iododeoxyuridine. Endocrinology 113:582-587.

(11)

Branham WS, Sheehan DM, Zehr DR, Ridlon E, Nelson CJ. (1985). The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b-estradiol. Endocrinology 117:2229-2237.

(12)

Schlumpf M, Berger L, Cotton B, Conscience-Egli M, Durrer S, Fleischmann I, Haller V, Maerkel K, Lichtensteiger W. (2001). Estrogen active UV screens. SÖFW-J. 127:10-15.

(13)

Zarrow MX, Lazo-Wasem EA, Shoger RL. (1953). Estrogenic activity in a commercial animal ration. Science 118:650-651.

(14)

Drane HM, Patterson DSP, Roberts BA, Saba N. (1975). The chance discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake. Fd. Cosmet. Toxicol. 13:425-427.

(15)

Boettger-Tong H, Murphy L, Chiappetta C, Kirkland JL, Goodwin B, Adlercreutz H, Stancel GM, Makela S. (1998). A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on in vivo responses to exogenously administered estrogens. Environ. Health Perspec.106:369-373.

(16)

OECD (2007). Additional data supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in rodents. OECD Environmental Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment No. 67.

(17)

Degen GH, Janning P, Diel P, Bolt HM. (2002). Estrogenic isoflavones in rodent diets. Toxicol. Lett. 128:145-157.

(18)

Wade MG, Lee A, McMahon A, Cooke G, Curran I. (2003). The influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats. Food Chem. Toxicol. 41:1517-1525.

(19)

Yamasaki K, Sawaki M, Noda S, Wada T, Hara T, Takatsuki M. (2002). Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats given different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide. Arch. Toxicol. 76:613-620.

(20)

Thigpen JE, Haseman JK, Saunders HE, Setchell KDR, Grant MF, Forsythe D. (2003). Dietary phytoestrogens accelerate the time of vaginal opening in immature CD-1 mice. Comp. Med. 53:477-485.

(21)

Ashby J, Tinwell H, Odum J, Kimber I, Brooks AN, Pate I, Boyle CC. (2000). Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development. J. Appl. Toxicol.20:343-347.

(22)

Thigpen JE, Lockear J, Haseman J, Saunders HE, Caviness G, Grant MF, Forsythe DB. (2002). Dietary factors affecting uterine weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays. Cancer Detect. Prev. 26:381-393.

(23)

Thigpen JE, Li L-A, Richter CB, Lebetkin EH, Jameson CW. (1987). The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay. Lab. Anim. Sci.37:596-601.

(24)

OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.

(25)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(26)

OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.

(27)

Bulbring, E., and Burn, J.H. (1935). The estimation of oestrin and of male hormone in oily solution. J. Physiol. 85: 320-333.

(28)

Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. and Koch, F.C (1936). The nature of the estrogenic substance in human male urine and bull testis. Endocrinology 19: 33-41.

(29)

Reel, J.R., Lamb IV, J.C. and Neal, B.H. (1996). Survey and assessment of mammalian estrogen biological assays for hazard characterization. Fundam. Appl. Toxicol. 34: 288-305.

(30)

Jones, R.C. and Edgren, R.A. (1973). The effects of various steroid on the vaginal histology in the rat. Fertil. Steril. 24: 284-291.

(31)

OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development — Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 92-64-12367-9, Paris.

(32)

Dorfman R.I. (1962). Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: Standard Methods Adopted by Official Organization. New York, Academic Press.

(33)

Thigpen J. E. et al. (2004). Selecting the appropriate rodent diet for endocrine disruptor research and testing studies. ILAR J 45(4): 401416.

(34)

Gray L.E. and Ostby J. (1998). Effects of pesticides and toxic substances on behavioral and morphological reproductive development: endocrine versus non-endocrine mechanism. Toxicol Ind Health. 14 (12): 159-184.

(35)

Booth AN, Bickoff EM and Kohler GO. (1960). Estrogen-like activity in vegetable oils and mill by-products. Science 131:1807-1808.

(36)

Kato H, Iwata T, Katsu Y, Watanabe H, Ohta Y, Iguchi T (2004). Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using in vitro assay. J. Agric Food Chem. 52, 1410-1414.

(37)

OECD (2007). Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Procedure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment. No. 71.

(38)

Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33).

B.55.   BIOTESTUL HERSHBERGER LA ȘOBOLANI: UN TEST DE DEPISTARE PE TERMEN SCURT PENTRU SUBSTANȚE CU PROPRIETĂȚI (ANTI)ANDROGENICE

INTRODUCERE

1.   Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (OT) nr. 441 (2009). OCDE a inițiat în 1998 o activitate cu un nivel ridicat de prioritate pentru a revizui orientările existente și a elabora noi orientări pentru depistarea și testarea posibililor perturbatori endocrini (1). Un element al activității a fost elaborarea de orientări privind testarea referitoare la biotestul Hershberger la șobolani. După mai multe decenii de utilizare de către industria farmaceutică, testul a fost standardizat de către un comitet oficial de experți în 1962 ca instrument de depistare a substanțelor chimice androgenice (2). În perioada 2001-2007, biotestul Hershberger la șobolani a fost supus unui amplu program de validare, inclusiv generarea unui document de revizuire a fondului (23), elaborarea unei lucrări detaliate privind metodele (3), dezvoltarea unui ghid de disecție (21) și desfășurarea de ample studii intra- și interlaboratoare pentru a demonstra fiabilitatea și reproductibilitatea biotestului. Studiile de validare au fost efectuate cu un androgen de referință puternic [propionat de testosteron (PT)], doi androgeni sintetici puternici (acetat de trenbolon și metil testosteron), un medicament antiandrogenic puternic (flutamida), un inhibitor puternic (finasterida) al sintezei androgenului natural (dihidrotestosteron-DHT), mai multe pesticide slab antiandrogenice (linuron, vinclozolin, procimidon, p,p' DDE), un inhibitor puternic al 5a reductazei (finasterida) și două substanțe chimice negative cunoscute (dinitrofenol și nonilfenol) (4) (5) (6) (7) (8). Prezenta metodă de testare este rezultatul îndelungatei experiențe istorice a biotestelor, precum și a experienței dobândite în timpul programului de validare a testului și a rezultatelor astfel obținute.

2.   Biotestul Hershberger este un test de depistare in vivo pe termen scurt care utilizează țesuturi aferente tractului reproducător masculin. Testul își are originea în anii 1930 și a fost modificat în anii 1940 pentru a include mușchii sensibili la androgeni din tractul genital masculin (2) (9-15). În anii 1960, peste 700 de posibili androgeni au fost evaluați utilizând o versiune standardizată a protocolului (2) (14), iar utilizarea testului pentru androgeni și antiandrogeni a fost considerată o metodă standard în anii 1960 (2) (15). Biotestul actual se bazează pe modificările în greutate a cinci țesuturi dependente de androgeni la șobolanul mascul peripubertal castrat. Acesta evaluează capacitatea unei substanțe chimice de a provoca activități biologice în concordanță cu agoniștii sau antagoniștii de androgen sau inhibitorii de 5α-reductază. Cele cinci țesuturi țintă dependente de androgeni incluse în prezenta metodă de testare sunt prostata ventrală (PV), veziculele seminale (VS) (plus fluide și glande coagulante), mușchiul levator ani bulbocavernosus (LABC), glandele pereche Cowper (COW) și glandul penisului (GP). La șobolanul mascul peripubertal castrat, cele cinci țesuturi răspund toate la androgeni cu o creștere în greutate în termeni absoluți. În cazul în care aceleași țesuturi sunt stimulate să crească în greutate prin administrarea unui androgen de referință puternic, cele cinci țesuturi răspund la antiandrogeni cu o scădere în greutate în termeni absoluți. Principalul model pentru biotestul Hershberger a fost masculul peripubertal castrat prin metode chirurgicale, care a fost validat pentru fazele 1, 2 și 3 din programul de validare Hershberger.

3.   Biotestul Hershberger servește ca un test mecanicist de depistare in vivo pentru detectarea de agoniști de androgeni, antagoniști de androgeni și inhibitori de 5a-reductază și aplicarea acestuia trebuie văzută în contextul «Cadrului conceptual al OCDE de testare și evaluare a perturbatorilor endocrini» (apendicele 2). Cadrul conceptual conține biotestul Hershberger la nivelul 3 ca un test in vivo care furnizează date cu privire la un singur mecanism endocrin, și anume, (anti)androgenicitatea. Acesta este destinat să fie inclus într-o baterie de teste in vitro și in vivo pentru a identifica substanțele chimice cu potențial de a interacționa cu sistemul endocrin, conducând în cele din urmă la evaluări de risc și de pericol pentru sănătatea umană sau pentru mediu.

4.   Datorită preocupărilor pentru bunăstarea animalelor legate de procedura de castrare, s-a căutat masculul înțărcat stimulat (necastrat) ca model alternativ pentru biotestul Hershberger pentru a evita etapa castrării. Metoda de testare la animale înțărcate stimulate a fost validată (24); cu toate acestea, în studiile de validare, versiunea cu animale înțărcate a biotestului Hershberger nu părea capabilă să detecteze în mod constant efectele asupra valorilor greutății organelor dependente de androgeni de antiandrogenii slabi la dozele testate. Prin urmare, aceasta nu a fost inclusă în metoda de testare. Cu toate acestea, recunoscând că utilizarea sa poate oferi nu numai beneficii legate de bunăstarea animalelor, ci, de asemenea, poate să furnizeze informații privind alte moduri de acțiune, aceasta este disponibilă în documentul de orientare al OCDE nr. 115 (25).

CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE

5.   Agoniștii și antagoniștii de androgen acționează ca liganzi pentru receptorul de androgen și pot activa sau inhiba, respectiv, transcrierea genică controlată de receptor. În plus, unele substanțe chimice inhibă conversia testosteronului în androgenul natural mai puternic dihidrotestosteron în anumite țesuturi vizate de androgen (inhibitori de 5a-reductază). Astfel de produse chimice au potențialul de a conduce la pericole pentru sănătate, inclusiv efecte asupra reproducerii și dezvoltării. Prin urmare, există necesitatea de reglementare pentru testarea și evaluarea rapidă a unui produs chimic ca un posibil agonist sau antagonist de androgen sau inhibitor de 5a-reductază. Deși informativă, afinitatea unui ligand pentru un receptor de androgen, măsurată prin legarea receptorului sau activarea transcripției genelor reporter in vitro, nu este singurul factor determinant al unui posibil pericol. Alți factori determinanți includ activarea și dezactivarea metabolică la intrarea în corp, distribuția substanței chimice la țesuturile țintă și eliminarea din corp. Aceasta conduce la necesitatea de a depista posibila activitate a unei substanțe chimice in vivo în condiții și la o expunere relevante. Evaluarea in vivo este mai puțin critică în cazul în care sunt cunoscute caracteristicile substanței chimice referitoare la absorbție — distribuție — metabolism — eliminare (ADME). Țesuturile dependente de androgeni răspund cu o creștere rapidă și viguroasă la stimularea cu androgeni, în special la șobolanii masculi peripubertali castrați. Speciile de rozătoare, în special șobolanul, sunt utilizate, de asemenea, pe scară largă în studiile de toxicitate pentru caracterizarea riscurilor. Prin urmare, versiunea testului care utilizează șobolanul peripubertal castrat și cele cinci țesuturi țintă ale testului este adecvată pentru depistarea in vivo a agoniștilor și antagoniștilor de androgen și a inhibitorilor de 5a-reductază.

6.   Prezenta metodă de testare se bazează pe protocoalele utilizate în studiul de validare al OCDE, care s-au dovedit a fi fiabile și reproductibile în cadrul studiilor intra- și interlaboratoare (4) (5) (6) (7) (8). În cadrul metodei de testare sunt prezentate procedurile referitoare atât la androgeni, cât și la antiandrogeni.

7.   Deși au existat unele variații în doza de PT utilizată pentru a detecta antiandrogenii în programul de validare al OCDE pentru biotestul Hershberger efectuat de laboratoare diferite (0,2 față de 0,4 mg/kg/zi, injectare subcutanată), există o foarte mică diferență între cele două variații ale protocolului în ceea ce privește capacitatea de a detecta activitate antiandrogenică slabă sau puternică. Cu toate acestea, este clar că doza de PT nu trebuie să fie prea ridicată pentru a bloca efectele antagoniștilor receptorilor de androgen (RA) slabi, dar nici atât de scăzută încât țesuturile androgenice să prezinte un răspuns de creștere foarte scăzut chiar și fără coadministrare de antiandrogeni.

8.   Răspunsul de creștere al țesuturilor individuale dependente de androgeni nu este în totalitate de origine androgenică, însemnând că substanțe chimice altele decât agoniștii de androgen pot modifica greutatea anumitor țesuturi. Cu toate acestea, răspunsul de creștere al mai multor țesuturi în mod concomitent fundamentează un mecanism cu un specific androgenic mai ridicat. De exemplu, doze mari de estrogeni puternici pot provoca o creștere a greutății veziculelor seminale; cu toate acestea, celelalte țesuturi dependente de androgeni din cadrul testului nu răspund în mod similar. Substanțele chimice antiandrogenice pot acționa fie ca antagoniști ai receptorilor de androgen, fie ca inhibitori de 5a-reductază. Inhibitorii de 5areductază au un efect variabil, întrucât conversia la dihidrotestosteronul mai puternic variază în funcție de țesut. Antiandrogenii care inhibă 5a-reductaza, cum ar fi finasterida, au efecte mai pronunțate la nivelul prostatei ventrale decât la alte țesuturi, comparativ cu un antagonist RA puternic precum flutamida. Diferența la nivelul răspunsului țesutului poate fi utilizată pentru a diferenția între modurile de acțiune mediate de RA și cele mediate de 5a-reductază. În plus, receptorul de androgen este înrudit din punct de vedere evolutiv cu cel al altor hormoni steroizi, iar alte tipuri de hormoni, atunci când sunt administrate la niveluri de dozare ridicate, suprafiziologice, pot lega și antagoniza efectele de stimulare a creșterii ale PT (13). Mai mult, este plauzibil, de asemenea, că metabolismul steroid ridicat și o scădere ulterioară a nivelului de testosteron seric ar putea reduce creșterea țesutului dependent de androgeni. Prin urmare, orice rezultat pozitiv în cadrul biotestului Hershberger se evaluează în mod normal utilizând o abordare bazată pe forța probantă a dovezilor, inclusiv teste in vitro, cum ar fi testele de legare a RA și a receptorului de estrogen (RE) și testele de activare a transcripției genice corespunzătoare sau alte teste in vivo care examinează țesuturi similare vizate de androgeni, de exemplu, testul pe masculi puberali, testul pe masculi adulți intacți la 15 zile sau studii cu doze repetate la 28 de zile sau 90 de zile.

9.   Experiența arată că androgenii xenobiotici sunt mai rari decât antiandrogenii xenobiotici. Prin urmare, se așteaptă ca biotestul Hershberger să fie utilizat cel mai adesea pentru depistarea antiandrogenilor. Cu toate acestea, procedura de testare pentru detectarea androgenilor ar putea să fie recomandată pentru substanțe steroide sau similare steroizilor sau substanțe pentru care o indicație de posibile efecte androgenice rezultă din metodele incluse la nivelul 1 sau 2 din cadrul conceptual (apendicele 2). În mod similar, efectele nocive asociate cu profile (anti)androgenice pot fi observate la testele de nivel 5, ceea ce a condus la necesitatea de a se evalua dacă o substanță chimică funcționează pe baza unui mod de acțiune asupra sistemului endocrin.

10.   Este recunoscut faptul că toate procedurile bazate pe animale trebuie să fie în conformitate cu standardele locale de îngrijire a animalelor de laborator; descrierile îngrijirii și ale tratamentului prezentate mai jos sunt standardele minime de performanță și sunt prevalate de reglementările locale, cum ar fi Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (26). OCDE oferă orientări suplimentare privind tratamentul uman al animalelor de laborator (17).

11.   La fel precum în toate testele care utilizează animale de laborator, se analizează atent necesitatea efectuării studiului. În esență, pot exista două motive pentru o astfel de decizie:

—	potențial ridicat de expunere (nivelul 1 al cadrului conceptual) sau indicații de (anti)androgenicitate în testele in vitro (nivelul 2) care susțin necesitatea unor investigații pentru a verifica dacă astfel de efecte pot să apară in vivo;

—	efecte indicând (anti)androgenicitate în teste in vivo de la nivelul 4 sau 5 care susțin necesitatea unor investigații privind modul specific de acțiune, de exemplu, pentru a determina dacă efectele s-au datorat unui mecanism (anti)androgenic.

12.   Definițiile utilizate în prezenta metodă de testare sunt prezentate în apendicele 1.

PRINCIPIUL TESTULUI

13.   Biotestul Hershberger își atinge sensibilitatea utilizând masculi cu o producție minimă de androgen endogen. Acest lucru se realizează prin utilizarea de masculi castrați, cărora li s-a acordat un timp adecvat după castrare pentru ca țesuturile țintă să regreseze la o greutate de referință minimă și uniformă. Astfel, atunci când se efectuează un test de depistare a potențialului de activitate androgenică, există niveluri scăzute de androgeni endogeni în circulație, axul hipotalamo-pituitar-gonadal este pus în imposibilitatea de a compensa prin mecanisme de feedback, capacitatea de răspuns a țesuturilor este maximizată și variabilitatea greutății de pornire a țesutului este redusă la minimum. În cazul în care se efectuează un test de depistare a unei potențiale activități antiandrogenice, se poate atinge o creștere mai consistentă a greutății țesutului atunci când țesuturile sunt stimulate de un androgen de referință. Ca urmare, biotestul Hershberger necesită doar 6 animale per grup de doză, în timp ce alte teste cu masculi puberali sau adulți intacți sugerează utilizarea a 15 masculi per grup de doză.

14.   Castrarea șobolanilor masculi peripubertali se realizează în mod corespunzător utilizând o tehnică septică și anestezie aprobată. În primele zile în urma intervenției chirurgicale se administrează analgezice pentru a elimina disconfortul postchirurgical. Castrarea îmbunătățește precizia testării pentru detectarea androgenilor și a antiandrogenilor slabi prin eliminarea mecanismelor compensatorii de reacție ale sistemului endocrin prezente la animalele intacte care atenuează efectele androgenilor și ale antiandrogenilor administrați și prin eliminarea variabilității interindividuale ridicate la nivelul testosteronului seric. Prin urmare, castrarea reduce numărul de animale necesare pentru depistarea activităților respective la nivelul sistemului endocrin.

15.   Atunci când se efectuează un test de depistare a activității androgenice, substanța de testat se administrează zilnic prin gavaj oral sau injectare subcutanată (SC) timp de zece zile consecutive. Substanțele chimice de testat se administrează la cel puțin două grupuri de animale de experiență, cu un singur nivel de doză per grup. Animalele sunt supuse autopsiei la aproximativ 24 de ore după ultima administrare. O creștere semnificativă din punct de vedere statistic la două sau mai multe valori ale greutății organelor țintă pentru grupurile tratate cu substanța de testat comparativ cu grupul martor pentru vehicul indică faptul că substanța de testat este pozitivă pentru activitate androgenă potențială (a se vedea punctul 60). Androgenii, cum ar fi trenbolon, care nu pot fi reduși-5a, au efecte mai pronunțate asupra LABC și GP comparativ cu PT, dar toate țesuturile ar trebui să manifeste o creștere ridicată.

16.   Atunci când se efectuează un test de depistare a potențialei activități antiandrogenice, substanța de testat se administrează zilnic prin gavaj oral sau injectare subcutanată timp de zece zile consecutive în mod concertat cu doze zilnice de PT (0,2 sau 0,4 mg/kg/zi) prin injectare SC. În programul de validare s-a stabilit că se poate utiliza o doză de 0,2 sau 0,4 mg/kg/zi de PT, întrucât ambele au fost eficace în detectarea de antiandrogeni, în consecință, trebuie selectată doar o doză pentru a fi utilizată în testare. Doze gradate de substanță de testat se administrează la un minim de trei grupuri tratate de animale de experiență, utilizând un nivel de doză pe grup. Animalele sunt supuse autopsiei aproximativ la 24 de ore după ultima doză. O scădere semnificativă statistic la nivelul a două sau mai multe valori ale greutății organelor țintă pentru grupurile tratate cu substanța de testat plus PT comparativ cu grupul martor căruia i se administrează doar PT indică faptul că substanța de testat este pozitivă pentru o potențială activitate antiandrogenică (a se vedea punctul 61).

DESCRIEREA METODEI

Selectarea speciei și sușei de animale

17.   Șobolanul a fost utilizat în mod obișnuit în biotestul Hershberger încă din anii 1930. Deși este plauzibil din punct de vedere biologic că atât șobolanul, cât și șoarecele vor manifesta răspunsuri similare, pe baza a 70 de ani de experiență cu modelul pe șobolani, șobolanul este specia preferată pentru biotestul Hershberger. În plus, din moment ce datele biotestului Hershberger pot fi preliminare pentru un studiu pe mai multe generații pe termen lung, acest lucru permite utilizarea de animale din aceeași specie, sușă și sursă în ambele studii.

18.   Protocolul permite ca laboratoarele să selecteze sușa de șobolan care va fi utilizată și care trebuie, în general, să fie cea utilizată din punct de vedere istoric de laboratorul participant. Pot fi utilizate sușele de șobolan de laborator folosite în mod obișnuit; cu toate acestea, nu se utilizează sușele care se maturizează mult mai târziu de 42 de zile, deoarece castrarea masculilor la vârsta de 42 de zile poate exclude măsurarea valorilor greutății glandului penisului, care poate fi efectuată doar după separarea prepuțului de trunchiul penisului. Astfel, nu se utilizează sușe derivate de la șobolanul Fisher 344, cu excepția unor cazuri rare. Șobolanul Fisher 344 are un calendar diferit al dezvoltării sexuale comparativ cu alte sușe utilizate mai frecvent, cum ar fi sușele Sprague Dawley sau Wistar (16). În cazul în care se va utiliza o astfel de sușă, laboratorul trebuie să castreze animalele la o vârstă puțin mai mare și să poată demonstra sensibilitatea sușei utilizate. Laboratorul trebuie să prezinte clar justificarea pentru alegerea sușei de șobolan. În cazul în care testul de depistare ar putea preceda un studiu cu doză orală repetată, un studiu privind reproducerea și dezvoltarea sau un studiu pe termen lung, se utilizează de preferință animale din aceeași sușă și sursă în toate studiile.

Condiții de adăpostire și de hrănire

19.   Toate procedurile trebuie să fie în conformitate cu standardele locale de îngrijire a animalelor de laborator. Descrierile îngrijirii și ale tratamentului sunt standarde minime și vor fi prevalate de reglementări locale, cum ar fi Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (26). În spațiul pentru adăpostirea animalelor de experiență se asigură o temperatură de 22 °C (cu un interval aproximativ, ± 3 °C). Se asigură o umiditate relativă cu valoarea minimă de 30 % și valoarea maximă de 70 %, cu excepția momentelor în care se curăță spațiul. Obiectivul ar fi o umiditate relativă de 50-60 %. Iluminatul trebuie să fie artificial. Alternanța zilnică a iluminatului trebuie să fie de 12 ore de lumină, 12 ore de întuneric.

20.   Adăpostirea în grup este preferabilă izolării, din cauza vârstei tinere a animalelor și a faptului că șobolanii sunt animale sociale. Adăpostirea a două sau trei animale per cușcă evită aglomerarea și stresul asociat, care pot interfera cu controlul hormonal al dezvoltării țesutului aferent sexului. Cuștile trebuie să fie curățate cu grijă pentru a elimina eventualii contaminanți și aranjate astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minimum. Cuștile de dimensiuni adecvate (~ 2 000 cm2) vor preveni supraaglomerarea.

21.   Fiecare animal trebuie să fie identificat individual (de exemplu, prin marcarea sau etichetarea urechii) prin utilizarea unei metode fără suferință. Se consemnează metoda de identificare.

22.   Hrana de laborator și apa potabilă se furnizează ad libitum. Laboratoarele care efectuează biotestul Hershberger trebuie să utilizeze hrană de laborator utilizată în mod normal în activitatea lor de testare a substanțelor chimice. În studiile de validare ale biotestului nu s-au observat efecte sau variabilitate care au fost atribuite hranei. Hrana utilizată va fi notată și un eșantion din hrana de laborator se păstrează în vederea unei eventuale analize ulterioare.

Criterii de performanță pentru valorile greutății organului dependent de androgeni

23.   În timpul studiului de validare, nu a existat nicio dovadă că o scădere a greutății corporale a afectat creșterile și scăderile ratei de creștere a greutății țesutului pentru țesuturile țintă (și anume, care trebuie cântărite în cadrul studiului).

24.   Printre diferitele sușe de șobolan utilizate cu succes în programul de validare, valorile greutății organelor dependente de androgeni sunt mai mari la sușele de șobolan cu greutate mai mare decât la sușele mai ușoare. Prin urmare, criteriile de performanță ale biotestului Hershberger nu includ valori absolute preconizate ale greutății organelor pentru martori pozitivi și negativi.

25.   Deoarece coeficientul de variație (CV) pentru un țesut are o relație inversă cu puterea statistică, criteriile de performanță ale biotestului Hershberger se bazează pe valorile maxime ale CV pentru fiecare țesut (tabelul 1). Valorile CV sunt derivate din studiile de validare ale OCDE. În cazul unor rezultate negative, laboratoarele trebuie să examineze CV de la grupul martor și grupul tratat cu doze ridicate pentru a determina dacă au fost depășite criteriile de performanță maxime ale CV.

26.   Studiul se repetă atunci când: 1. trei sau mai multe din cele zece valori CV individuale posibile în grupurile martor și în grupurile tratate cu o doză ridicată depășesc limitele maxime desemnate pentru studiile referitoare la agoniști și antagoniști în tabelul 1; și 2. cel puțin două țesuturi țintă au fost marginal nesemnificative, și anume, cu valori r între 0,05 și 0,10.

Tabelul 1

Valorile CV maxime admisibile stabilite pentru țesuturile sexuale anexe țintă pentru modelul cu animale castrate în studiile de validare ale OCDE  (12)

Țesuturi	Efecte antiandrogenice	Efecte androgenice
Vezicule seminale	40 %	40 %
Prostata ventrală	40 %	45 %
LABC	20 %	30 %
Glandele Cowper	35 %	55 %
Glandul penisului	17 %	22 %

PROCEDURĂ

Verificarea respectării dispozițiilor de reglementare și de laborator

27.   Spre deosebire de testul uterotrofic (capitolul B.54 din prezenta anexă), pentru testul Hershberger nu este necesară o demonstrație a competenței laboratorului înainte de începerea studiului, întrucât se efectuează teste martor concomitent pozitive (propionat de testosteron și flutamidă) și negative ca parte integrantă a testului.

Numărul și starea animalelor

28.   Fiecare grup tratat și fiecare grup martor trebuie să includă cel puțin 6 de animale. Această măsură se aplică pentru protocoalele androgenice și antiandrogenice.

Castrarea

29.   Trebuie să existe o perioadă de aclimatizare inițială de câteva zile de la primirea animalelor pentru a se asigura că animalele sunt sănătoase și viguroase. Deoarece este posibil ca animalele castrate înainte de vârsta de 42 de zile sau în ziua 42 după fătare (PND 42) să nu prezinte separare prepuțială, animalele se castrează la PND 42 sau ulterior, nu înainte. Animalele sunt castrate sub anestezie prin efectuarea unei incizii la nivelul scrotului și îndepărtarea ambelor testicule și a tuburilor testiculare cu ligaturarea vaselor de sânge și a conductelor seminale. După ce se confirmă că nu există sângerare, scrotul se închide cu sutură sau autoclipsuri. Animalele se tratează cu analgezice în primele zile după intervenția chirurgicală pentru a atenua orice disconfort postchirurgical. În cazul în care animalele castrate sunt achiziționate de la un furnizor de animale, furnizorul garantează vârsta animalelor și stadiul de maturitate sexuală.

Aclimatizarea după castrare

30.   Animalele continuă adaptarea la condițiile de laborator pentru a permite regresarea valorilor greutății țesutului țintă timp de cel puțin 7 zile de la castrare. Animalele se observă zilnic și orice animale care manifestă semne de boală sau anomalii fizice sunt îndepărtate. Prin urmare, tratamentul cu începerea administrării (pe studiu) poate începe cel mai devreme la vârsta PND 49, dar nu mai târziu de PND 60. Vârsta la autopsie nu trebuie să depășească PND 70. Această flexibilitate permite unui laborator să programeze în mod eficient lucrările experimentale.

Greutatea corporală și distribuirea aleatorie a grupurilor

31.   Diferențele la nivelul valorilor greutății corporale individuale reprezintă o sursă de variabilitate la nivelul greutății țesutului atât în cadrul unui grup, cât și între grupurile de animale. Variabilitatea tot mai ridicată a greutății țesuturilor conduce la o creștere a coeficientului de variație (CV), reducând forța statistică a testului (numită uneori sensibilitatea testului). Prin urmare, variațiile la nivelul greutății corporale trebuie să fie controlate din punct de vedere experimental și statistic.

32.   Controlul experimental presupune producerea de mici variații ale greutății corporale în interiorul unui grup și între grupurile de studiu. În primul rând, se evită animalele neobișnuit de mici sau de mari, acestea nefiind incluse în cohorta de studiu. La începerea studiului, variația de greutate a animalelor utilizate nu trebuie să depășească ± 20 % din greutatea medie (de exemplu, 175 g ± 35 g pentru șobolani peripubertali castrați). În al doilea rând, animalele se distribuie în grupuri (atât martor, cât și tratat) prin distribuție aleatorie a greutății, astfel încât greutatea medie a fiecărui grup să nu fie statistic diferită de cea a oricărui alt grup. Se consemnează procedura de distribuire aleatorie în bloc.

33.   Deoarece toxicitatea poate diminua greutatea corporală la grupurile tratate în comparație cu grupul martor, se utilizează drept covariabilă statistică greutatea corporală în prima zi de administrare a substanței de testat, și nu greutatea corporală la autopsie.

Dozare

34.   Pentru a stabili dacă o substanță chimică de test poate avea efect androgenic in vivo, două grupuri tratate cu substanța chimică plus grupuri martor pozitiv și martor pentru vehicul (negativ) (a se vedea punctul 43) sunt în mod normal suficiente, prin urmare, acest concept este preferat din motive de bunăstare a animalelor. În cazul în care scopul este de a obține o curbă doză-răspuns sau pentru a extrapola la doze mai mici, sunt necesare cel puțin 3 grupuri de tratament. În cazul în care sunt necesare mai multe informații în afară de identificarea activității androgenice (precum o estimare a potenței), ar trebui să fie luat în considerare un regim de administrare diferit. Pentru a studia activitatea antiandrogenilor, substanța de testat se administrează împreună cu un agonist androgen de referință. Se utilizează cel puțin 3 grupuri tratate cu diferite doze de substanță de testat, un martor pozitiv și un martor negativ (a se vedea punctul 44). Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din grupul martor trebuie tratate în mod identic cu animalele din grupurile tratate. Dacă se folosește un vehicul la administrarea substanței de testat, grupul martor trebuie să primească vehiculul în cantitatea cea mai mare utilizată la grupurile tratate.

35.   Toate nivelurile de doză se propun și se selectează ținând cont de orice date existente privind toxicitatea și datele (toxico)cinetice disponibile pentru substanța de testat sau materialele asociate. Nivelul cel mai ridicat de doză trebuie, în primul rând, să țină seama de informațiile privind LD50 și/sau toxicitatea acută pentru a evita decesul, suferințele grave sau stresarea animalelor (17) (18) (19) (20) și, în al doilea rând, să ia în considerare informațiile disponibile cu privire la dozele utilizate în studiile cronice și subcronice. În general, doza maximă nu ar trebui să determine o reducere în greutatea corporală finală a animalelor mai mare de 10 % din greutatea martor. Doza maximă ar trebui să fie 1. cea mai mare doză care să garanteze supraviețuirea animalelor și care nu provoacă animalelor toxicitate semnificativă sau suferință după 10 zile consecutive de administrare, până la o doză maximă de 1 000 mg/kg/zi (a se vedea punctul 36); sau 2. o doză care induce efecte (anti)androgenice, oricare dintre valori este mai mică. Ca partajare, sunt în general acceptabile intervale mari, de exemplu o semiunitate logaritmică (corespunzătoare unei progresii a dozei de 3,2) sau chiar până la o unitate logaritmică între doze. Dacă nu există informații relevante disponibile, se poate realiza un studiu preliminar pentru stabilirea dozelor (a se vedea punctul 37) pentru a contribui la stabilirea dozelor de utilizat.

Nivelul dozei limită

36.   Dacă un test la doza limită de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi și o doză inferioară pe baza metodelor descrise pentru studiu nu produce o schimbare semnificativă din punct de vedere statistic la nivelul valorilor greutății organelor de reproducere, atunci se poate considera că nu sunt necesare niveluri de doze suplimentare. Doza limită se aplică cu excepția cazului în care datele referitoare la expunerea umană indică necesitatea unei doze mai ridicate.

Considerații privind stabilirea nivelurilor dozelor

37.   În cazul în care este necesar, se poate efectua un studiu preliminar de stabilire a dozelor pe câteva animale, pentru a selecta nivelurile adecvate de doză [utilizând metode de testare pentru toxicitatea acută [capitolele B.1 bis, B.1 tris din prezenta anexă (27), OT nr. 425 ale OCDE (19)]. Obiectivul în cazul biotestului Hershberger este selectarea de doze care să garanteze supraviețuirea animalelor și care sunt fără toxicitate semnificativă sau suferință pentru animale după zece zile consecutive de administrare a substanței chimice până la doza limită de 1 000 mg/kg/zi, astfel cum s-a specificat la punctele 35 și 36. În acest sens, se poate utiliza un document de orientare al OCDE (17) care definește semnele clinice care indică toxicitate sau suferința animalelor. În cazul în care este posibil în cadrul studiului de stabilire a dozelor, după zece zile de administrare, țesuturile țintă pot fi excizate și cântărite la aproximativ 24 de ore după administrarea ultimei doze. Datele pot fi utilizate ulterior pentru a contribui la selectarea dozelor în cadrul studiului principal.

Substanțele de referință și vehiculul

38.   Agonistul androgen de referință este propionatul de testosteron (PT), CAS nr. 57-82-5. Doza de referință de PT poate fi fie 0,2 mg/kg greutate corporală/zi, fie 0,4 mg/kg greutate corporală/zi. Antagonistul androgen de referință este flutamida (FT), CAS nr. 1311-84-7. Doza de referință de FT este de 3 mg/kg greutate corporală/zi, iar FT se coadministrează cu doza PT de referință.

39.   Se recomandă ca, acolo unde este posibil, să se ia în considerare în primul rând utilizarea unei soluții/suspensii apoase. Cu toate acestea, deoarece majoritatea liganzilor androgenului sau precursorii lor metabolici tind să fie hidrofobi, cea mai comună abordare este de a utiliza o soluție/suspensie în ulei (de exemplu, ulei de porumb, de arahide, de susan sau de măsline). Substanțele chimice de testat se pot dizolva într-o cantitate minimă de etanol 95 % sau alți solvenți adecvați și pot fi diluate la concentrații de lucru finale în vehiculul testat. Trebuie să se cunoască caracteristicile toxice ale solventului și se testează într-un grup martor separat numai cu solvent. În cazul în care substanța de testat este considerată stabilă, se poate utiliza o încălzire ușoară și acțiune mecanică viguroasă pentru a contribui la dizolvarea substanței de testat. Trebuie să se determine stabilitatea substanței de testat în vehicul. În cazul în care substanța de testat este stabilă pe durata studiului, se poate prepara o alicotă de pornire din substanța de testat, iar diluțiile de dozare specificate se prepară zilnic cu atenție pentru a evita contaminarea sau deteriorarea eșantioanelor.

Administrarea dozelor

40.   PT se administrează prin injectare subcutanată, iar FT prin gavaj oral.

41.   Substanța de testat se administrează prin gavaj oral sau prin injectare subcutanată. La alegerea căii de administrare, se ține seama de considerente legate de bunăstarea animalelor și de proprietățile fizice/chimice ale substanței de testat. În plus, trebuie luate în considerare aspecte toxicologice, precum relevanța pentru calea de expunere umană la substanța chimică (de exemplu, oral prin gavaj la modelul de ingerare, injectarea subcutanată la modelul de inhalare sau adsorbție cutanată), precum și informațiile toxicologice existente și datele cu privire la metabolism și cinetică (de exemplu, necesitatea de a evita primul pasaj metabolic, o mai bună eficiență prin utilizarea unei anumite căi) înainte de începerea unei testări extinse, pe termen lung, în cazul în care se obțin rezultate pozitive prin injectare.

42.   Animalele trebuie tratate în același mod și în aceeași ordine timp de zece zile consecutive la intervale de aproximativ 24 ore. Nivelul de dozare se ajustează zilnic pe baza măsurătorilor zilnice concomitente ale greutății corporale. Volumul dozei și momentul la care se administrează aceasta se notează în fiecare zi de expunere. Trebuie avut grijă să nu se depășească doza maximă specificată la punctul 35, pentru a permite o interpretare semnificativă a datelor. În acest sens, se analizează cu atenție reducerea greutății corporale, semnele clinice, precum și alte constatări. Pentru gavaj oral, se utilizează un tub stomacal sau o canulă de intubare adecvată. Volumul maxim de lichid care poate fi administrat odată depinde de dimensiunea animalului de laborator. Trebuie să se urmeze orientările locale privind îngrijirea animalelor, dar volumul nu trebuie să depășească 5 ml/kg masă corporală, cu excepția cazului soluțiilor apoase, în care se pot utiliza 10 ml/kg masă corporală. Pentru injectare subcutanată, dozele se administrează în regiunile dorso-scapulare sau lombare cu un ac steril (de exemplu, cu grosimea 23 sau 25) și o seringă tuberculină. Raderea zonei de injectare este opțională. Se notează eventualele pierderi, scurgeri la punctul de injectare sau administrarea incompletă. Volumul total injectat per șobolan pe zi nu trebuie să depășească 5 ml/kg greutate corporală.

Proceduri specifice pentru agoniștii de androgen

43.   Pentru testul privind agoniștii de androgen, vehiculul este martorul negativ și grupul tratat cu PT este martorul pozitiv. Activitatea biologică în concordanță cu agoniștii de androgen este testată prin administrarea unei substanțe de testat la grupurile de tratament în dozele selectate timp de 10 de zile consecutive. Greutățile celor cinci țesuturi sexuale anexe de la grupurile tratate cu substanța de testat sunt comparate cu grupul martor pentru vehicul pentru creșteri în greutate semnificative din punct de vedere statistic.

Proceduri specifice pentru antagoniștii de androgen și inhibitorii de 5α-reductază

44.   Pentru testarea privind antagoniștii de androgen și inhibitori de 5α-reductază, grupul tratat este martorul negativ și grupul coadministrat cu doze de referință de PT și FT este martorul pozitiv. Activitatea biologică în concordanță cu antagoniști de androgen și inhibitori de 5areductază este testată prin administrarea unei doze de referință de PT și administrarea substanței de testat timp de 10 zile consecutive. Valorile greutății celor cinci țesuturi sexuale anexe de la grupurile tratate cu substanța de testat plus PT se compară cu cele ale grupului de referință tratat doar cu PT pentru scăderi ale valorilor greutății semnificative din punct de vedere statistic.

OBSERVAȚII

Observații clinice

45.   Se recomandă realizarea de observații clinice generale cel puțin o dată pe zi și chiar mai frecvent în cazul în care se observă semne de toxicitate. Observațiile se efectuează, de preferință, la aceeași oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare. Toate animalele sunt observate pentru simptome de mortalitate, morbiditate și semne clinice generale, cum ar fi schimbări la nivelul comportamentului, al pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apariția unor secreții și excreții și activitate reflexă (de exemplu, lăcrimarea, erecția piloasă, dimensiunea pupilei, respirație anormală).

46.   Toate animalele găsite moarte se îndepărtează și se elimină fără o analiză suplimentară a datelor. Toate cazurile de mortalitate a animalelor înainte de autopsie se includ în notele studiului, împreună cu orice motive aparente pentru mortalitate. Toate animalele muribunde se eutanasiază. Toate animale muribunde și, ulterior, eutanasiate sunt incluse în notele studiului, împreună cu motivele aparente pentru morbiditate.

Greutatea corporală și consumul de hrană

47.   Toate animalele se cântăresc zilnic cu o precizie de 0,1 g, începând chiar înainte de inițierea tratamentului, și anume, atunci când animalele sunt distribuite în grupuri. Ca măsurare opțională, se poate cântări cantitatea de alimente consumate per cușcă în perioada tratamentului prin cântărirea alimentatoarelor. Rezultatele consumului alimentar se exprimă în grame pe șobolan pe zi.

Disecția și măsurarea greutății țesuturilor și a organelor

48.   La aproximativ 24 de ore după ultima administrare a substanței de testat, șobolanii se eutanasiază și exsanguinează în conformitate cu procedurile normale ale laboratorului executant și se efectuează autopsia. Metoda de eutanasiere se notează în raportul de laborator.

49.   În mod ideal, ordinea autopsiei va fi aleatorie între grupuri pentru a evita progresia directă în sus sau în jos în grupurile tratate care ar putea afecta datele. Orice constatare la autopsie, și anume, modificările patologice/leziunile macroscopice, se notează și se raportează.

50.   Se cântăresc cele cinci țesuturi dependente de androgeni (PV, VS, LABC, COW, GP). Țesuturile respective sunt excizate, curățate cu grijă de excesul de țesut și grăsime aderent și se determină valorile greutății lor proaspete (nefixat). Fiecare țesut se manipulează cu atenție deosebită pentru a evita pierderea de fluide și pentru a evita deshidratarea, care poate determina erori semnificative și variabilitate prin descreșterea greutății consemnate. Mai multe dintre țesuturi ar putea fi foarte mici sau dificil de disecat, iar acest aspect va introduce variabilitate. Prin urmare, este important ca persoanele care efectuează disecția țesuturilor sexuale anexe să fie familiarizate cu procedurile de disecție standard pentru țesuturile respective. OCDE pune la dispoziție un manual de procedură standard de operare (PSO) pentru disecție (21). Formarea atentă în conformitate cu Ghidul PSO va reduce la minimum o sursă potențială de variație în studiu. În mod ideal, același operator ar trebui să fie responsabil cu disecția unui anumit țesut pentru a elimina diferențele interindividuale de prelucrare a țesutului. În cazul în care acest lucru nu este posibil, autopsia trebuie să fie concepută astfel încât fiecare operator să disece un anumit țesut de la toate grupurile de tratament, spre deosebire de situația în care un individ disecă toate țesuturile prelevate de la un grup martor, în timp ce o altă persoană este responsabilă cu grupurile tratate. Fiecare țesut aferent sexului se cântărește fără a fi tamponat cu o precizie de 0,1 mg și se consemnează greutățile pentru fiecare animal.

51.   Mai multe dintre țesuturi ar putea fi foarte mici sau dificil de disecat, iar acest aspect va introduce variabilitate. Activitățile anterioare au indicat o serie de coeficienți de variație (CV), care par să difere în funcție de competența laboratorului. În câteva cazuri, s-au observat diferențe mari la nivelul valorilor absolute ale greutății unor țesuturi precum PV și COW în cadrul unui anumit laborator.

52.   Valorile greutății ficatului, a rinichilor pereche și a glandelor suprarenale pereche sunt măsurători opționale. Din nou, țesuturile se curăță de orice urmă de fascia și grăsime. Se cântărește ficatul și se consemnează valoarea cu o precizie de 0,1 g, iar rinichii pereche și glandele suprarenale pereche se cântăresc și se consemnează valorile cu o precizie de 0,1 mg. Ficatul, rinichii și glandele suprarenale nu sunt influențate numai de androgeni; acestea oferă, de asemenea, indicii utile de toxicitate sistemică.

53.   Măsurarea hormonului luteinizant (HL) seric, stimularea hormonului de stimulare foliculară (HSF) și a testosteronului (T) este facultativă. Nivelurile de T seric sunt utile pentru a determina dacă substanța de testat induce metabolismul testosteron în ficat, reducând nivelurile de ser. Fără datele referitoare la T, un astfel de efect ar putea apărea prin intermediul unui mecanism antiandrogenic. Nivelurile de HL oferă informații despre capacitatea unui antiandrogen nu numai de a reduce greutățile organelor, ci și de a afecta funcția hipotalamo-pituitară, ceea ce, în cadrul studiilor pe termen lung, poate cauza tumori testiculare. HSF reprezintă un hormon important pentru spermatogeneză. Nivelurile de T4 și T3 serice sunt, de asemenea, măsurători opționale care ar furniza informații suplimentare cu privire la capacitatea de a perturba homeostaza hormonilor tiroidieni. În cazul în care trebuie să se facă măsurători ale hormonilor, șobolanii sunt anesteziați înainte de autopsie și sângele este prelevat prin puncție cardiacă, iar metoda de anestezie se alege cu grijă astfel încât să nu afecteze măsurarea hormonilor. Se consemnează metoda de pregătire a serului, sursa de radioimunodozare sau alte truse de măsurare, procedurile analitice și rezultatele. Nivelurile de HL se raportează în ng/ml de ser, iar nivelurile de T se raportează, de asemenea, în ng/ml de ser.

54.   Disecția țesuturilor este descrisă după cum urmează, un ghid de disecție detaliat cu fotografii publicate ca materiale suplimentare făcând parte din programul de validare (21). O disecție video este, de asemenea, disponibilă pe pagina internet a Agenției Coreene pentru Alimente și Medicamente (Korea Food and Drug Administration) (22).

—	Cu suprafața ventrală a animalului în sus, se determină dacă prepuțul penisului s-a separat de glandul penisului. În caz afirmativ, se efectuează retracția prepuțului și se îndepărtează glandul penisului, se cântărește (cu o precizie de 0,1 mg) și se notează greutatea.

—

Se deschide pielea și peretele abdominal, expunând viscerele. În cazul în care organele opționale sunt cântărite, se îndepărtează și se cântărește ficatul cu o precizie de 0,1 g, se scot stomacul și intestinele, se scot și se cântăresc rinichii pereche și glandele suprarenale pereche cu o precizie de 0,1 mg. Această disecție expune vezica urinară și începe disecția țesuturilor sexuale anexe țintă.

—

Pentru a diseca PV, se separă vezica de mușchiul ventral prin tăierea țesutului conjunctiv de-a lungul liniei mediane. Se deplasează vezica anterior spre veziculele seminale (VS), dezvăluind lobul stâng și lobul drept al prostatei ventrale (acoperiți de un strat de grăsime). Se desprinde cu grijă grăsimea de pe lobul drept și lobul stâng al PV. Se îndepărtează ușor lobul drept al VP de uretră și se taie lobul de la uretră. În timp ce lobul drept al PV se ține în continuare cu mâna, se îndepărtează ușor lobul stâng al PV de uretră și apoi se disecă; se cântărește cu o precizie de 0,1 mg și se notează greutatea.

—

Pentru disecția VSGC, se deplasează vezica urinară caudal, expunând vasele deferente și lobii drept și stâng ai veziculelor seminale plus glande coagulante (VSGC). Se previn scurgerile de fluid prin prinderea unui hemostat la baza VSGC, în cazul în care vasele deferente se îmbină cu uretra. Se disecă cu atenție VSGC, cu hemostat aplicat, se îndepărtează grăsimea și organele anexe, se plasează într-un vas tarat de cântărit, se îndepărtează hemostatul și se cântărește cu o precizie de 0,1 mg, notându-se greutatea.

—

Pentru disecția mușchilor levatori ani plus bulbocavernosus (LABC), se expun mușchii și baza penisului. Mușchii LA sunt înfășurați în jurul colonului, în timp ce mușchii LA și BC anteriori sunt atașați la bulbii penisului. Se îndepărtează pielea și organele anexe din regiunea perianală care se întind de la baza penisului până la capătul anterior al anusului. Mușchii BC se îndepărtează treptat de bulbul penisului și țesuturi. Colonul este tăiat în două și întregul LABC poate fi disecat și îndepărtat. LABC se curăță de grăsime și de anexe, se cântărește cu o precizie de 0,1 mg și se notează greutatea.

—

După ce s-a îndepărtat LABC, glandele rotunde Cowper sau glandele bulbo-uretrale (COW) sunt vizibile la baza bulbilor penisului și ușor dorsal față de aceștia. Este necesară o disecție atentă pentru a evita crestarea capsulei subțiri, pentru a preveni scurgerea de fluid. Se cântăresc COW pereche cu o precizie de 0,1 mg și se notează greutatea.

—	În plus, în cazul în care se pierde fluid din oricare glandă în timpul autopsiei și disecției, aceasta trebuie să fie consemnată.

55.   În cazul în care evaluarea fiecărei substanțe chimice necesită autopsia mai multor animale decât este rezonabil pentru o singură zi, începutul studiului poate fi eșalonat pe două zile consecutive, ceea ce conduce la eșalonarea autopsiei și a activităților asociate pe parcursul a două zile. În cazul unei astfel de eșalonări, se utilizează o jumătate din animale per grup de tratament pe zi.

56.   Carcasele se elimină în mod corespunzător după autopsie.

RAPORT

Date

57.   Datele se raportează individual (și anume, greutatea corporală, greutatea țesuturilor sexuale anexe, măsurători opționale și alte răspunsuri și observații) și pentru fiecare grup de animale (media și deviația standard ale tuturor măsurătorilor efectuate). Acestea se sistematizează în tabele. Datele indică numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte pe parcursul testului sau care au prezentat semne de toxicitate, o descriere a semnelor de toxicitate observate, incluzând momentul apariției, durata și severitatea.

58.   Un raport final va include:

Unitatea de testare

—	denumirea unității, localizarea;

—	directorul studiului și alți membri ai personalului și responsabilitățile acestora în cadrul studiului;

—	datele de început și de sfârșit ale studiului, și anume, prima zi de administrare a substanței chimice de testat și, respectiv, ultima zi a autopsiei.

Substanța chimică de testat

—	sursa, numărul lotului, identitatea, puritatea, adresa completă a furnizorului și caracterizarea substanței/substanțelor de testat;

—	natura fizică și, acolo unde este cazul, proprietățile fizico-chimice;

—	condițiile de depozitare și metoda și frecvența pregătirii diluției;

—	toate datele obținute cu privire la stabilitate;

—	orice analize ale soluțiilor/suspensiilor de dozare.

Vehicul

—	caracterizarea vehiculului (identitate, furnizor și nr. lot);

—	justificarea alegerii vehiculului (dacă este altul decât apa).

Animale de laborator și proceduri de creștere a animalelor

—	specia și sușa și justificarea alegerii acestora;

—	sursa sau furnizorul de animale, inclusiv adresa completă;

—	numărul și vârsta animalelor livrate;

—	condițiile de adăpostire (temperatură, iluminat etc.);

—	hrana (denumirea, tipul, furnizorul, numărul lotului, conținutul și, dacă se cunosc, nivelurile de fitoestrogen);

—	așternut (denumirea, tipul, furnizorul, conținutul);

—	condițiile de plasare în cuști și numărul de animale per cușcă.

Condiții de testare

—	vârsta la castrare și durata aclimatizării după castrare;

—	greutatea fiecărui animal la începutul studiului (cu o precizie de 0,1 g);

—	procesul de selecție aleatorie, precum și consemnarea alocării în grupul pentru vehicul, grupul de referință, grupul tratat cu substanța de testat și pe cuști;

—	media și deviația standard a valorilor greutății corporale pentru fiecare grup pentru fiecare zi de cântărire pe tot parcursul studiului;

—	justificarea alegerii dozei;

—	calea de administrare a substanței de testat și justificarea alegerii căii de expunere;

—	în cazul unui test de antiandrogenicitate, tratamentul PT (doză și de volum);

—	administrarea substanței chimice de testat (doză și volum);

—	momentul administrării;

—	proceduri de autopsie, inclusiv mijloacele de exsanguinare și orice fel de anestezie;

—	în cazul în care se efectuează analize ale serului, se furnizează detalii ale metodei. De exemplu, în cazul în care se utilizează RIA, se raportează procedura RIA, sursa de truse RIA, datele de expirare ale truselor, procedura pentru numărătoarea scintilației și standardizarea.

Rezultate

—	observații zilnice pentru fiecare animal în timpul tratamentului, inclusiv:

—	greutățile corporale (cu o precizie de 0,1 g);

—	semnele clinice (în cazul în care există);

—	orice măsurătoare sau note privind consumul alimentar;

—	observațiile la autopsie pentru fiecare animal, inclusiv:

—	data autopsiei;

—	grupul animalelor tratate;

—	identitatea animalelor;

—	operatorul;

—	momentul din zi la care s-au efectuat autopsia și disecția;

—	vârsta animalelor;

—	greutatea corporală finală la autopsie, notând orice creștere sau scădere semnificativă din punct de vedere statistic;

—	ordinea exsanguinării și disecției animalelor în momentul autopsiei;

—	valorile greutății celor cinci țesuturi țintă dependente de androgeni:

—	prostata ventrală (cu o precizie de 0,1 mg);

—	veziculele seminale plus glandele coagulante, inclusiv fluidul (pereche, cu o precizie de 0,1 mg);

—	mușchiul complex levator ani plus bulbocavernosus (cu o precizie de 0,1 mg);

—	glandele Cowper (greutatea în stare proaspătă — pereche, cu o precizie de 0,1 mg);

—	glandul penisului (greutatea în stare proaspătă cu o precizie de 0,1 mg);

—	valorile greutății țesuturilor opționale, în cazul în care sunt determinate:

—	ficat (cu o precizie de 0,1 mg);

—	rinichi (pereche, cu o precizie de 0,1 mg);

—	glande suprarenale (pereche, cu o precizie de 0,1 mg);

—	observații generale și observații;

—	analize ale hormonilor serici, dacă se efectuează astfel de teste: — HL seric (opțional — ng/ml de ser); și — T seric (opțional — ng/ml de ser);

—	observații generale și comentarii.

Rezumatul datelor

Datele se sistematizează în tabele care conțin dimensiunea eșantionului pentru fiecare grup, valoarea medie și eroarea standard a mediei sau deviația standard. Tabelele includ greutatea corporală la autopsie, variații ale greutății corporale de la începutul testului până la autopsie, greutățile țesuturilor sexuale anexe țintă, precum și orice greutăți ale organelor analizate opțional.

Discutarea rezultatelor

Analiza rezultatelor

59.   Valorile greutății corporale și a organelor la autopsie se analizează din punct de vedere statistic pentru caracteristici precum omogenitatea varianței, cu transformări de date corespunzătoare, după caz. Grupurile de tratament se compară cu un grup martor, utilizând tehnici precum ANOVA, urmată de comparații pe perechi (de exemplu, testul unilateral Dunnett) și criteriul de diferență statistică, de exemplu, p ≤ 0,05. Se identifică grupurile care ating semnificație statistică. Cu toate acestea, se evită stabilirea greutăților «relative ale organelor» din cauza ipotezelor statistice incorecte care stau la baza unei astfel de manipulări a datelor.

60.   Pentru agonismul androgen, martorul ar trebui să fie grupul tratat doar cu vehicul. Caracteristicile referitoare la modul de acțiune al unei substanțe chimice de testat pot conduce la răspunsuri relative diferite între țesuturi, de exemplu, trenbolon, care nu poate fi redus 5 alfa, are efecte mai pronunțate asupra LABC și GP decât PT. O creștere semnificativă din punct de vedere statistic (p ≤ 0,05) la nivelul a două sau mai multe din greutățile celor cinci țesuturi țintă dependente de androgeni (PV, LABC, GP, GC și VSGC) se consideră ca fiind un rezultat agonist androgen pozitiv și toate țesuturile țintă ar trebui să manifeste un anumit grad de creștere a dezvoltării. Evaluarea combinată a tuturor răspunsurilor țesuturilor organelor sexuale anexe (OSA) se poate realiza prin analiza adecvată a datelor multivariate. Acest lucru ar putea îmbunătăți analiza, în special în cazurile în care doar un singur țesut oferă un răspuns semnificativ statistic.

61.   Pentru antagonismul androgen, martorul ar trebui să fie grupul tratat cu androgenul de referință (numai propionat de testosteron). Caracteristicile referitoare la modul de acțiune al unei substanțe chimice de testat pot conduce la răspunsuri relative diferite între țesuturi, de exemplu, inhibitorii de 5α-reductază, cum ar fi finasterida, au efecte mai pronunțate asupra prostatei ventrale decât asupra altor țesuturi în comparație cu antagoniști puternici RA precum flutamida. O reducere semnificativă din punct de vedere statistic (p < 0,05) la nivelul a două sau mai multe dintre greutățile celor cinci țesuturi țintă dependente de androgeni (PV, LABC, GP, GC și VSGC) asociată tratamentului numai cu PT se consideră un rezultat pozitiv al antagonistului de androgen și toate țesuturile țintă ar trebui să manifeste un anumit grad de reducere a dezvoltării. Evaluarea combinată a tuturor răspunsurilor țesuturilor OSA se poate realiza prin analiza adecvată a datelor multivariate. Acest lucru ar putea îmbunătăți analiza, în special în cazurile în care doar un singur țesut oferă un răspuns semnificativ statistic.

62.   Datele se sistematizează în tabele care conțin valoarea medie, eroarea standard a mediei (deviația standard ar fi, de asemenea, acceptabilă) și dimensiunea eșantionului pentru fiecare grup. Se includ, de asemenea, tabele cu date individuale. Se analizează valorile individuale, valorile medii, SE (SD) și CV pentru datele martor pentru a stabili dacă acestea îndeplinesc criterii acceptabile de consecvență cu valorile istorice preconizate. Valorile CV care depășesc valorile CV enumerate în tabelul 1 (a se vedea punctele 25 și 26) pentru greutatea fiecărui organ determină dacă există erori legate de înregistrarea sau introducerea datelor sau dacă laboratorul nu a dobândit încă expertiza pentru disecția țesuturilor dependente de androgeni și se impun cursuri de specializare/practică suplimentare. În general, valorile CV (deviația standard împărțită la greutatea medie a organelor) sunt reproductibile de la un laborator la altul și de la studiu la altul. Datele prezentate vor include cel puțin: greutatea pentru prostata ventrală, veziculele seminale, mușchiul levator ani plus bulbocavernosus, glandele Cowper, glandul penisului, ficatul și greutatea corporală, precum și modificarea greutății corporale de la începutul testului până la autopsie. De asemenea, datele pot fi prezentate după ajustarea covarianței pentru greutate corporală, dar aceasta nu înlocuiește prezentarea datelor neajustate. În plus, în cazul în care separarea prepuțială (SPP) nu apare în niciun grup, se consemnează incidența SPP și se compară din punct de vedere statistic cu grupul martor care utilizează testul Fisher Exact.

63.   Atunci când se verifică intrările de date electronice cu fișele de date originale pentru precizie, valorile greutății organelor care nu sunt plauzibile biologic sau variază cu mai mult de trei abateri standard de la mediile grupului de tratament se examinează cu atenție și ar putea fi necesar să fie eliminate, fiind probabil erori de înregistrare.

64.   Compararea rezultatelor studiului cu valorile CV ale OCDE (în tabelul 1) reprezintă adesea un pas important în interpretare, în ceea ce privește valabilitatea rezultatelor studiului. Datele istorice pentru grupurile martor se păstrează în laborator. Datele istorice pentru răspunsurile la substanțele de referință pozitive, cum ar fi PT și FT, se păstrează, de asemenea, în laborator. De asemenea, laboratoarele pot să testeze periodic reacția la agoniști și antagoniști androgenici slabi cunoscuți și să păstreze datele. Datele respective pot fi comparate cu datele OCDE disponibile pentru a se asigura că metodele laboratorului furnizează suficientă precizie și putere statistică.

NOTE LA CADRU

Nota 1:

Intrarea la toate nivelurile și ieșirea la toate nivelurile sunt posibile și depind de natura necesităților de informații existente în scopul evaluării riscurilor și a pericolelor.

Nota 2:

La nivelul 5, ecotoxicologia trebuie să includă parametri care să indice mecanisme de efecte adverse și eventuala vătămare a populației.

Nota 3:

În cazul în care un model multimodal acoperă mai multe teste cu parametru unic, modelul respectiv ar înlocui utilizarea testelor cu parametru unic în cauză.

Nota 4:

Evaluarea fiecărei substanțe chimice se efectuează de la caz la caz, ținând cont de toate informațiile disponibile, având în vedere funcția nivelurilor cadrului.

Nota 5:

Nu trebuie să se considere că în prezent cadrul include toate testele. La nivelurile 3, 4 și 5 acesta include teste care sunt disponibile sau care sunt în curs de validare. Acestea din urmă sunt incluse cu titlu provizoriu. După dezvoltarea și validarea lor, acestea vor fi adăugate în mod oficial în cadru.

Nota 6:

Nu trebuie să se considere că nivelul 5 include doar teste definitive. Se consideră că testele incluse la acest nivel contribuie la evaluarea generală a riscurilor și a pericolelor.

BIBLIOGRAFIE

(1)

OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.

(2)

Dorfman RI (1962). Standard methods adopted by official organization. Academic Press, NY.

(3)

Gray LE Jr, Furr J and Ostby JS (2005). Hershberger assay to investigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and antiandrogenic activity in castrate-immature male rats. In: Current Protocols in Toxicology 16.9.1-16.9.15. J Wiley and Sons Inc.

(4)

OECD (2006). Final OECD report of the initial work towards the validation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to testosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 62. ENV/JM/MONO(2006)30.

(5)

OECD (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Laboratories. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 86. ENV/JM/MONO(2008)3.

(6)

OECD (2007). Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol. Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment No 73. ENV/JM/MONO(2007)20.

(7)

Owens, W, Zeiger E, Walker M, Ashby J, Onyon L, Gray, Jr, LE (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269.

(8)

Owens W, Gray LE, Zeiger E, Walker M, Yamasaki K, Ashby J, Jacob E (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies. Environ Health Perspect. 115(5):671-8.

(9)

Korenchevsky V (1932). The assay of testicular hormone preparations. Biochem J26:413-422.

(10)

Korenchevsky V, Dennison M, Schalit R (1932). The response of castrated male rats to the injection of the testicular hormone. Biochem J26:1306-1314.

(11)

Eisenberg E, Gordan GS (1950). The levator ani muscle of the rat as an index of myotrophic activity of steroidal hormones. J Pharmacol Exp Therap 99:38-44.

(12)

Eisenberg E, Gordan GS, Elliott HW (1949). Testosterone and tissue respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity. Endocrinology 45:113-119.

(13)

Hershberger L, Shipley E, Meyer R (1953). Myotrophic activity of 19nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani muscle method. Proc Soc Exp Biol Med 83:175-180.

(14)

Hilgar AG, Vollmer EP (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic and myogenic. Washington DC: United States Public Health Service.

(15)

Dorfman RI (1969). Androgens and anabolic agents. In: Methods in Hormone Research, volume IIA. (Dorfman RI, ed.) New York:Academic Press, 151-220.

(16)

Massaro EJ (2002). Handbook of Neurotoxicology, volume I. New York: Humana Press, p. 38.

(17)

OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 19. ENV/JM/MONO(2000)7.

(18)

OECD (1982). Organization for Economic Co-operation and Development — Principles of Good Laboratory Practice, ISBN 926412367-9, Paris.

(19)

OECD (2008). Acute oral toxicity — up-and-down procedure. OECD Guideline for the testing of chemicals No 425.

(20)

OECD (2001). Guidance document on acute oral toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. ENV/JM/MONO(2001)4.

(21)

Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol. Env. Health Persp. 114:1265-1269. See, section II, The dissection guidance provided to the laboratories: Disponibil la: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf

(22)

Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hershberger assay procedure, including a dissection video. Disponibil la: http://rndmoa.kfda.go.kr/endocrine/reference/education_fr.html

(23)

OECD (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger Bioassay. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 90. ENV/JM/MONO(2008)17.

(24)

OECD (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.

(25)

OECD (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. Series on Testing and Assessment, Number 115.

(26)

Directiva 2010/63/UE a Parlamentului European și a Consiliului din 22 septembrie 2010 privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice (JO L 276, 20.10.2010, p. 33).

(27)

Următoarele capitole din prezenta anexă:   B.1 bis, Toxicitate orală acută — procedura cu doză fixă   B.1 tris, Toxicitate orală acută — metoda clasei toxice acute.

B.56.   STUDIU EXTINS DE TOXICITATE ASUPRA REPRODUCERII PE O GENERAȚIE

INTRODUCERE

1.   Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (OT) nr. 443 (2012). Metoda se bazează pe propunerea comitetului tehnic International Life Science Institute (ILSI) — Health and Environmental Sciences Institute (HESI), Agricultural Chemical Safety Assessment (ACSA) privind un studiu extins de reproducere efectuat pe o generație în etapa de viață F1, publicată în Cooper et al., 2006 (1). S-au realizat mai multe îmbunătățiri și clarificări ale conceptului studiului pentru a-i oferi flexibilitate și pentru a sublinia importanța de a porni de la cunoștințele existente, utilizând în același timp observații în-viață pentru a ghida și a adapta testarea. Prezenta metodă de testare oferă o descriere detaliată a desfășurării operaționale a unui studiu extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație. Metoda de testare descrie trei cohorte de animale F1:

cohorta 1: evaluează parametrii de reproducere/dezvoltare; cohorta se poate extinde pentru a include o generație F2;

cohorta 2: evaluează impactul potențial al expunerii la substanțe chimice asupra sistemului nervos în curs de dezvoltare;

cohorta 3: evaluează impactul potențial al expunerii la substanțe chimice asupra sistemului imunitar în curs de dezvoltare.

2.   Deciziile referitoare la evaluarea celei de a doua generații și la omiterea cohortei privind neurotoxicitatea pentru dezvoltare și/sau a cohortei privind imunotoxicitatea pentru dezvoltare trebuie să reflecte cunoștințele existente referitoare la substanța chimică evaluată, precum și nevoile specifice ale diferitelor autorități de reglementare. Scopul metodei de testare este de a furniza detalii cu privire la modul în care se poate efectua studiul și de a aborda modul în care trebuie să fie evaluată fiecare cohortă.

3.   Procedura privind decizia de declanșare internă pentru producerea unei a doua generații este descrisă în documentul de orientare al OCDE nr. 117 (39) pentru autoritățile de reglementare care utilizează declanșatori interni.

CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI OBIECTIVE

4.   Obiectivul principal al studiului extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație este de a evalua anumite etape ale ciclului de viață care nu sunt incluse în alte tipuri de studii de toxicitate și de a analiza efectele care pot apărea ca urmare a expunerii pre- și postnatale la o substanță chimică. Pentru obiective de reproducere, se are în vedere faptul că, atunci când sunt disponibile și ca un prim pas, informațiile din studii cu doze repetate [inclusiv studii de depistare a toxicității pentru reproducere, de exemplu OT nr. 422 ale OCDE (32)] sau teste pe termen scurt de depistare a perturbatorilor endocrini [de exemplu, testul uterotrofic — metoda de testare B.54 (36); și testul Hershberger — metoda de testare B.55 (37)] sunt utilizate pentru a detecta efectele asupra organelor de reproducere la masculi și femele. Acestea ar putea include spermatogeneza (histopatologie testiculară) pentru masculi, precum și ciclurile estrale, numărarea foliculilor/maturizarea ovocitelor și integritatea ovariană (histopatologie) pentru femele. Studiul extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație servește, în acest caz, ca un test pentru obiective de reproducere care necesită interacțiunea masculilor cu femele, femele gestante, precum și femele cu pui și generația F1 până la maturizarea sexuală [a se vedea documentul de orientare nr. 151 al OCDE care sprijină prezenta metodă de testare (40)].

5.   Metoda de testare este concepută să furnizeze o evaluare a efectelor pre- și postnatale ale substanțelor chimice asupra dezvoltării, precum și o evaluare aprofundată a toxicității sistemice la femelele gestante și femelele în lactație și la puii tineri și adulți. Se preconizează că examinarea detaliată a principalilor parametri pentru dezvoltare, cum ar fi viabilitatea puilor, sănătatea neonatală, statutul de dezvoltare la naștere, dezvoltarea fizică și funcțională până la vârsta adultă, va identifica organe țintă specifice la pui. În plus, studiul va oferi și/sau confirma informațiile cu privire la efectele unei substanțe chimice de testat asupra integrității și funcționării sistemelor de reproducere masculin și feminin la adulți. În mod special, dar nu exclusiv, se analizează parametrii următori: funcția gonadică, ciclul estral, maturarea spermei epididimale, comportamentul de împerechere, concepția, sarcina, nașterea și alăptarea. În plus, informațiile obținute din evaluările privind neurotoxicitatea pentru dezvoltare și din evaluările privind imunotoxicitatea pentru dezvoltare vor caracteriza efectele potențiale asupra sistemelor respective. Datele rezultate din teste vor permite determinarea dozei la care nu s-a observat nicio reacție adversă (No-Observed Adverse Effect Levels, NOAEL), nivelul cel mai scăzut pentru care este observat un efect advers (Lowest Observed Adverse Effect Levels, LOAEL) și/sau dozele de referință pentru diferiți parametri și/sau utilizate pentru caracterizarea efectelor constatate în studii anterioare cu doze repetate și/sau ca ghid pentru testări ulterioare.

6.   O schemă a protocolului este prezentată în figura 1. Substanța de testat se administrează în mod continuu, în doze crescătoare, mai multor grupuri de femele și masculi maturi din punct de vedere sexual. Generația parentală (P) este tratată pentru o perioadă de timp definită înainte de împerechere (selectată pe baza informațiilor disponibile pentru substanța de testat, dar timp de cel puțin două săptămâni) și o perioadă de două săptămâni de împerechere. Masculii P sunt tratați în continuare cel puțin până la înțărcarea F1. Aceștia ar trebui tratați timp de cel puțin 10 săptămâni. Masculii pot fi tratați o perioadă mai lungă de timp dacă este necesar să se clarifice efectele asupra reproducerii. Tratamentul femelelor P este continuat în timpul sarcinii și al alăptării până la sacrificare după înțărcarea puilor lor (și anume, 8-10 săptămâni de tratament). Puii F1 sunt tratați în continuare cu substanța de testat de la înțărcare până la vârsta adultă. Dacă este evaluată o a doua generație [a se vedea documentul de orientare nr. 117 al OCDE (39)], puii F1 sunt menținuți sub tratament până la înțărcarea F2 sau până la sacrificare.

7.   Se efectuează observații clinice și examinări patologice asupra tuturor animalelor în vederea notării simptomelor de toxicitate, cu un accent special asupra integrității și funcționării sistemelor de reproducere masculin și feminin și asupra sănătății, creșterii, dezvoltării și funcționării puilor. După înțărcare, puii selectați se distribuie în cohorte specifice (cohortele 1-3, a se vedea punctele 33 și 34 și figura 1) pentru mai multe investigații, inclusiv maturizarea sexuală, integritatea și funcția organelor de reproducere, parametrii neurologici și comportamentali și funcțiile imunitare.

8.   În desfășurarea studiului, se respectă principiile directoare și considerentele descrise în documentul de orientare nr. 19 al OCDE privind recunoașterea, evaluarea și utilizarea semnelor clinice ca parametri fără suferință pentru animalele de experiență utilizate în evaluări ale siguranței (34).

9.   Atunci când va fi disponibil un număr suficient de studii pentru a determina impactul noului concept de studiu, metoda de testare va fi examinată și, în cazul în care este necesar, revizuită, având în vedere experiența acumulată.

Figura 1

Schemă a studiului extins de toxicitate asupra reproducerii pe o generație

DESCRIEREA METODEI/PREPARATE PENTRU TEST

Animale

Selectarea speciei și sușei de animale

10.   Alegerea speciei pentru testul de toxicitate pentru reproducere se analizează cu atenție, ținând seama de toate informațiile disponibile. Cu toate acestea, din cauza amplorii informațiilor contextuale și a comparabilității testelor de toxicitate generală, în mod normal, specia preferată este șobolanul, iar criteriile și recomandările formulate în prezenta metodă de testare se referă la această specie. Dacă se utilizează altă specie, se va oferi o justificare și trebuie să se efectueze modificări corespunzătoare ale protocolului. Nu se utilizează sușe cu fertilitate scăzută sau cu o incidență ridicată bine-cunoscută a defectelor spontane de dezvoltare.

Vârsta, greutatea corporală și criteriile de includere

11.   Se utilizează animale parentale sănătoase, care nu au fost supuse anterior altor proceduri de testare. Se studiază atât masculi, cât și femele, iar femelele trebuie să fie nulipare și negestante. Animalele P trebuie să fie la maturitate sexuală, de aceeași greutate (în cadrul aceluiași sex) la începerea administrării, de vârstă similară (aproximativ 90 de zile) la împerechere și reprezentative pentru specia și sușa studiată. Animalele se aclimatizează timp de cel puțin 5 zile de la sosire. Animalele sunt atribuite în mod aleatoriu în grupuri martor și grupuri de tratament, într-un mod care conduce la valori medii comparabile ale greutății corporale între grupuri (și anume, ± 20 % din valoarea medie).

Condiții de adăpostire și de hrănire

12.   În spațiul pentru adăpostirea animalelor de experiență se asigură o temperatură de 22 °C (± 3 °C). Se asigură o umiditate relativă între 30-70 %, cu un interval ideal de 50-60 %. Se stabilește iluminare artificială cu 12 ore lumină, 12 ore întuneric. Se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu o sursă nelimitată de apă potabilă. Se acordă o atenție deosebită conținutului de fitoestrogen al hranei, întrucât un nivel ridicat de fitoestrogen în hrană ar putea afecta anumiți parametri de reproducere. Se recomandă hrană standardizată, cu formulă deschisă în care au fost reduse substanțele chimice estrogenice (2) (30). Alegerea hranei poate fi influențată de necesitatea de a asigura un amestec adecvat al unei substanțe de testat atunci când aceasta se administrează utilizând metoda de administrare prin hrană. Se verifică conținutul, omogenitatea și stabilitatea substanței de testat din hrană. Hrana și apa potabilă se analizează în mod regulat pentru detectarea contaminanților. Se păstrează probe din fiecare lot de hrană utilizat în timpul studiului în condiții adecvate (de exemplu, congelate la – 20 °C), până la finalizarea raportului, pentru eventualitatea în care rezultatele necesită o analiză suplimentară a ingredientelor hranei.

13.   Animalele se plasează în cuști în grupuri mici de același sex și din același grup de tratament. Acestea pot fi adăpostite individual pentru a evita posibilele accidente (de exemplu, masculii după perioada de împerechere). Procedurile de împerechere se efectuează în cuști adecvate. După constatarea copulației, femelele presupuse a fi gestante sunt adăpostite separat în cuști pentru fătare sau maternitate în care li se oferă materiale definite și adecvate pentru cuiburi. Puii sunt adăpostiți cu mamele lor până la înțărcare. Animalele F1 se adăpostesc în grupuri mici de același sex și din același grup de tratament de la înțărcare până la sacrificare. În cazul în care se justifică din punct de vedere științific, animalele pot fi adăpostite individual. Nivelul de fitoestrogeni conținut în materialul de așternut selectat trebuie să fie minim.

Numărul și identificarea animalelor

14.   În mod normal, fiecare grup tratat și grup martor trebuie să conțină un număr suficient de perechi de împerechere pentru a obține cel puțin 20 de femele gestante în fiecare grup de doză. Obiectivul este producerea unui număr suficient de sarcini pentru a asigura o evaluare semnificativă a potențialului substanței chimice de a afecta fertilitatea, sarcina și comportamentul matern al generației P, precum și creșterea și dezvoltarea puilor F1, de la concepție până la maturitate. Dacă nu se obține numărul dorit de animale gestante, aceasta nu implică în mod necesar invalidarea studiului și situația se evaluează de la caz la caz, luând în considerare o posibilă relație cauzală cu substanța de testat.

15.   Fiecărui animal P i se atribuie un număr unic de identificare înainte de începerea tratamentului. Dacă datele istorice de laborator sugerează că o proporție semnificativă de femele ar putea să nu aibă cicluri estrale regulate (de 4 sau 5 zile), atunci se recomandă o evaluare a ciclurilor estrale înainte de începerea tratamentului. În mod alternativ, se poate mări dimensiunea grupului pentru a asigura faptul că cel puțin 20 de femele din fiecare grup ar avea cicluri estrale regulate (de 4 sau 5 zile) la începutul tratamentului. Toți puii F1 sunt identificați în mod unic atunci când sunt nou-născuți și sunt examinați în ziua 0 sau 1 după fătare (PND). Se păstrează înregistrări privind originea cuibului pentru toate animalele F1 și animalele F2, după caz, pe tot parcursul studiului.

Substanța chimică de testat

Informațiile disponibile cu privire la substanța chimică de testat

16.   Revizuirea informațiilor existente este importantă pentru deciziile cu privire la calea de administrare, alegerea vehiculului, selectarea speciei de animale, selectarea dozelor și eventualele modificări ale schemei de tratament. Prin urmare, toate informațiile disponibile relevante privind substanța de testat, și anume, proprietățile fizico-chimice, toxicocinetice (inclusiv metabolismul specific speciei), toxicodinamice, relațiile structură-activitate (RSA), procesele metabolice in vitro, rezultatele studiilor de toxicitate anterioare și informațiile relevante pe analogii structurali trebuie luate în considerare în planificarea studiului extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație. Se pot obține informații preliminare privind absorbția, distribuția, metabolismul și eliminarea (ADME) și bioacumularea din structura substanței chimice, datele fizico-chimice, dimensiunea legăturii proteinei plasmatice și studiile toxicocinetice (TK), în timp ce rezultatele studiilor de toxicitate oferă informații suplimentare, de exemplu, privind NOAEL, metabolismul sau inducerea metabolismului.

Luarea în considerare a datelor toxicocinetice

17.   Deși nu sunt necesare, datele TK de la studiile efectuate anterior pentru stabilirea dozelor sau alte studii sunt extrem de utile pentru planificarea conceptului de studiu, selecția nivelurilor de doze și interpretarea rezultatelor. Deosebit de utile sunt datele care: 1. verifică expunerea fetușilor și a puilor în curs de dezvoltare la substanța de testat (sau la metaboliți relevanți); 2. oferă o estimare a dozimetriei interne; și 3. evaluează potențiala saturație dependentă de doză a proceselor cinetice. De asemenea, se iau în considerare date suplimentare TK, cum ar fi profiluri de metabolit, cursuri concentrație-timp etc., dacă sunt disponibile. În timpul studiului principal, se pot colecta, de asemenea, date suplimentare TK, cu condiția ca aceasta să nu interfereze cu colectarea și interpretarea principalilor parametri de studiu.

Ca un ghid general, următoarele date TK ar fi utile în planificarea studiului extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație:

—	în ultima parte a sarcinii (de exemplu, a 20-a zi de gestație) — sânge matern și sânge fetal;

—	la jumătatea perioadei de lactație (PND 10) — sânge matern, sânge de la pui și/sau lapte;

—	la începutul perioadei după înțărcare (de exemplu PND 28) — probe de sânge de la puii înțărcați.

Se păstrează flexibilitatea în determinarea analiților specifici (de exemplu, substanța chimică de bază și/sau metaboliți) și a schemei de eșantionare. De exemplu, numărul și calendarul de colectare a probelor într-o zi de eșantionare dată va depinde de calea de expunere și de cunoștințele anterioare privind proprietățile TK la animalele negestante. Pentru studii privind hrana, este suficientă prelevarea de probe la un singur moment din zi consecvent pentru fiecare dintre zilele de eșantionare, în timp ce administrarea prin gavaj poate impune repetări suplimentare ale prelevării de probe pentru a obține o mai bună estimare a intervalului de doze interne. Cu toate acestea, nu este necesar să se obțină concentrații în timp-curs complete în fiecare dintre zilele de eșantionare. Dacă este necesar, se colectează la comun probe de sânge în funcție de sex în cadrul cuiburilor pentru analize fetale și neonatale.

Calea de administrare

18.   Selectarea căii de administrare trebuie să ia în considerare calea (căile) cea (cele) mai relevantă (relevante) pentru expunerea umană. Cu toate că protocolul este conceput pentru administrarea substanței de testat prin hrană, acesta poate fi modificat pentru administrare pe alte căi (apă potabilă, gavaj, inhalare, cutanată), în funcție de caracteristicile substanței chimice și informațiile necesare.

Alegerea vehiculului

19.   Dacă este necesar, substanța de testat se dizolvă sau se suspendă într-un vehicul adecvat. Se recomandă ca, atunci când este posibil, să se utilizeze de preferat o soluție/suspensie apoasă, urmată de luarea în considerare a unei soluții/suspensii în ulei (de exemplu, ulei de porumb). Pentru vehicule altele decât apa, trebuie să se cunoască caracteristicile toxice ale vehiculului. Trebuie evitată utilizarea vehiculelor cu potențial de toxicitate intrinsecă (de exemplu, acetonă, DMSO). Se determină stabilitatea substanței de testat în vehicul. Se iau în considerare următoarele caracteristici, în cazul în care se utilizează un vehicul sau alt aditiv pentru a facilita administrarea: efectele asupra absorbției, distribuției, metabolismului sau reținerii în organism a substanței de testat; efectele asupra proprietăților chimice ale substanței de testat care pot modifica caracteristicile sale toxice; și efectele asupra consumului de hrană sau de apă sau asupra stării de nutriție a animalelor.

Selectarea dozei

20.   În mod normal, studiul trebuie să includă cel puțin trei niveluri de doză și un martor concomitent. La selectarea nivelurilor adecvate de doză, experimentatorul trebuie să ia în considerare toate informațiile disponibile, inclusiv informații de dozare din studii anterioare, date TK de la animalele gestante sau negestante, gradul de transfer de lactație și estimările expunerii umane. Dacă sunt disponibile date TK care indică o saturație dependentă de doză a proceselor TK, trebuie avut grijă să se evite niveluri ridicate de doze, care manifestă în mod clar saturație, bineînțeles, dacă se preconizează că expunerile umane vor fi mult sub punctul de saturație. În astfel de cazuri, cel mai înalt nivel de doză trebuie să fie la, sau doar puțin peste, punctul de inflexiune pentru trecerea la un comportament TK neliniar.

21.   În absența datelor TK relevante, nivelurile dozelor se bazează pe efectele toxice, cu excepția cazului în care acestea sunt limitate de natura fizică/chimică a substanței de testat. Dacă nivelurile dozelor se bazează pe toxicitate, se alege doza maximă cu scopul de a induce o anumită toxicitate sistemică, dar nu decesul sau suferința profundă a animalelor.

22.   Se selectează o secvență descrescătoare de doze pentru a demonstra existența oricărui efect asociat dozei și pentru a stabili NOAEL sau dozele aproape de limita de detectare care ar permite obținerea unei doze de referință pentru parametrul (parametrii) cel (cei) mai sensibil(i). Pentru a evita o distanțare mare a dozelor între NOAEL și LOAEL, intervalul optim este un factor de 2 sau 4. Deseori este preferabil să se adauge un al patrulea grup de tratament, în loc să se utilizeze intervale foarte mari (de exemplu, un factor mai mare decât 10) între doze.

23.   Cu excepția tratamentului cu substanța de testat, animalele din grupul martor sunt tratate în mod identic cu subiecții din grupul de tratament. Grupul martor este netratat sau tratat cu placebo sau este un grup martor pentru vehicul în cazul în care se utilizează un vehicul în administrarea substanței de testat. În cazul în care se folosește un vehicul, grupul martor primește cel mai mare volum utilizat de vehicul.

Testul-limită

24.   Dacă nu există semne de toxicitate la o doză de cel puțin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi în studiile cu doză repetată sau dacă se preconizează toxicitate pe baza datelor de la substanțe chimice înrudite din punct de vedere structural și/sau metabolic indicând o similitudine a proprietăților metabolice in vivo/in vitro, ar putea să nu fie necesar un studiu care utilizează mai multe doze. În astfel de cazuri, studiul extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație se poate realiza utilizând un grup martor și o singură doză de cel puțin 1 000 mg/kg greutate corporală/zi. Cu toate acestea, în cazul în care se constată existența unor semne de toxicitate pentru reproducere sau pentru dezvoltare la doza limită, sunt necesare studii suplimentare, la doze mai mici, pentru a identifica NOAEL. Aceste considerente privind testul-limită se aplică numai atunci când expunerea umană nu impune utilizarea unei doze mai mari.

PROCEDURI

Expunerea puilor

25.   Expunerea alimentară este metoda de administrare preferată. Dacă se efectuează studii prin gavaj, trebuie remarcat faptul că puii vor primi în mod normal substanța de testat numai în mod indirect, prin lapte, până se începe tratarea directă a acestora la înțărcare. În studiile realizate cu administrare prin intermediul hranei sau al apei potabile, puii vor primi în plus substanța de testat direct atunci când încep să mănânce singuri în ultima săptămână a perioadei de alăptare. Trebuie să se ia în considerare efectuarea unor modificări privind conceptul studiului atunci când excreția substanței de testat în lapte este slabă și în cazul în care nu se dovedește o expunere continuă a puilor. În astfel de cazuri, se ia în considerare tratarea directă a puilor în timpul perioadei de alăptare pe baza informațiilor TK disponibile, a toxicității la nivelul puilor sau a modificărilor la nivelul biomarkerilor (3) (4). Înainte de efectuarea unor studii de dozare directă asupra puilor care alăptează, ar trebui să se realizeze o analiză atentă a beneficiilor și a dezavantajelor (5).

Programul de administrare și administrarea dozelor

26.   Unele informații cu privire la ciclurile estrale, histopatologia tractului reproducător masculin și feminin și analiza spermei testiculare/epididimale pot fi disponibile din studii anterioare de toxicitate cu doze repetate având o durată corespunzătoare. Prin urmare, durata tratamentului înainte de împerechere în cadrul studiului extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație are drept scop depistarea efectelor asupra modificărilor funcționale care pot interfera cu comportamentul de împerechere și cu fertilizarea. Tratamentul înainte de împerechere trebuie să fie suficient de îndelungat pentru a obține condiții de expunere la o stare de echilibru la femele și masculi P. Un tratament de 2 săptămâni înainte de împerechere pentru ambele sexe este considerat suficient în majoritatea cazurilor. La femele, aceasta înseamnă 3-4 cicluri estrale complete și ar trebui să fie suficient pentru a detecta eventualele efecte adverse asupra ciclicității. La masculi, aceasta echivalează cu timpul necesar pentru tranzitul epididimal al spermatozoizilor în curs de maturizare și ar trebui să permită detectarea efectelor posttesticulare asupra spermei (în timpul etapelor finale ale generării spermei și al maturizării spermei epididimale) la împerechere. La momentul finalizării studiului, când sunt programate histopatologia testiculară și epididimală și analiza parametrilor spermei, masculii P și F1 vor fi fost expuși timp de cel puțin un întreg proces de spermatogeneză [(6) (7) (8) (9), a se vedea, de asemenea, documentul de orientare nr. 151 al OCDE (40)].

27.   Scenariile de expunere a masculilor înainte de împerechere pot fi adaptate, în cazul în care în studiile anterioare s-a constatat în mod clar toxicitate testiculară (afectarea spermatogenezei) sau efecte asupra integrității și funcției spermei. În mod similar, la femele, efectele cunoscute ale substanței de testat asupra ciclului estral și, prin urmare, asupra receptivității sexuale pot justifica diferite scenarii de expunere înainte de împerechere. În cazuri speciale, poate fi acceptabil ca tratarea femelelor P să fie inițiată numai după obținerea unui frotiu de spermă pozitiv [a se vedea documentul de orientare nr. 151 al OCDE (40)].

28.   Odată stabilită perioada de tratare înainte de împerechere, animalele se tratează cu substanța de testat continuu timp de 7 zile/săptămână până la autopsie. Toate animalele se tratează utilizând aceeași metodă. Administrarea este continuată în timpul perioadei de împerechere de 2 săptămâni și, la femelele P, pe parcursul gestației și alăptării până în ziua încheierii studiului după înțărcare. Masculii se tratează în același mod până la sacrificare, atunci când animalele F1 sunt înțărcate. Pentru autopsie, se acordă prioritate femelelor, care se autopsiază în aceeași zi/ziua similară de lactație. Autopsia masculilor se poate desfășura pe parcursul unui număr mai mare de zile, în funcție de dotările laboratorului. Cu excepția cazului în care este deja inițiată în timpul perioadei de alăptare, administrarea directă la masculi și la femelele selectate F1 ar trebui să înceapă la înțărcare și să continue până la momentul autopsiei programate, în funcție de alocarea în cohortă.

29.   Pentru substanțele chimice administrate în hrană sau în apa potabilă, este important să se asigure că respectivele cantități de substanță de testat implicate nu interferează cu nutriția normală sau cu echilibrul hidric. Atunci când substanța de testat se administrează prin intermediul hranei, se utilizează fie o concentrație dietetică constantă (ppm), fie o doză constantă în funcție de greutatea corporală a animalului; se specifică opțiunea aleasă.

30.   Atunci când substanța de testat se administrează prin gavaj, volumul de lichid administrat la un moment dat nu ar trebui să depășească, în mod normal, 1 ml/100 g greutate corporală (0,4 ml/100 g greutate corporală este maximul pentru ulei, de exemplu ulei de porumb). Cu excepția substanțelor chimice iritante sau corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentrații mai ridicate, variația volumului testat se reduce la minimum prin ajustarea concentrației, pentru a asigura un volum constant pentru toate dozele. Tratamentul se administrează aproximativ la aceeași oră în fiecare zi. Doza administrată fiecărui animal se bazează în mod normal pe cea mai recentă determinare a greutății corporale individuale și se ajustează cel puțin săptămânal la masculii adulți și femelele adulte negestante și la fiecare două zile la femelele gestante și animalele F1 atunci când se administrează înainte de înțărcare și în timpul celor 2 săptămâni după înțărcare. Dacă datele TK indică un transfer placentar scăzut al substanței de testat, doza de gavaj în ultima săptămână de gestație ar putea necesita o ajustare pentru a preveni administrarea unei doze excesiv de toxice femelei gestante. În ziua fătării, femelele nu trebuie tratate prin gavaj sau oricare altă cale de tratament în care animalul trebuie să fie manipulat; omiterea administrării substanței de testat în ziua respectivă este de preferat unei tulburări a procesului de fătare.

Împerechere

31.   Fiecare femelă P se plasează cu un singur mascul neconsangvin selectat aleatoriu din același grup de doză (cuplare 1:1), până când se observă semne de copulație sau au trecut două săptămâni. În cazul în care nu există un număr suficient de masculi, de exemplu, ca urmare a decesului masculului înainte de împerechere, atunci masculul/masculii care s-au împerecheat se poate/pot cupla (1:1) cu o a doua femelă/femele, astfel încât toate femelele să fie cuplate. Ziua 0 a gestației este definită ca fiind ziua în care se confirmă dovada împerecherii (se găsește un dop vaginal sau spermă). Animalele se separă cât mai curând posibil după ce se observă dovada copulației. În cazul în care împerecherea nu a avut loc după 2 săptămâni, animalele se separă fără o altă posibilitate de împerechere. Cuplurile împerecheate trebuie identificate în mod clar în date.

Dimensiunea cuibului

32.   În ziua 4 după fătare, se poate ajusta dimensiunea fiecărui cuib prin eliminarea puilor în plus prin selecție aleatoare pentru a se obține, pe cât posibil, cinci masculi și cinci femele per cuib. Eliminarea selectivă a puilor, de exemplu, pe baza greutății corporale, nu este adecvată. Ori de câte ori numărul de pui masculi sau femele împiedică obținerea unui număr de cinci exemplare din fiecare sex per cuib, este acceptabilă ajustarea parțială (de exemplu, șase masculi și patru femele).

Selecția puilor pentru studii după înțărcare (a se vedea figura 1)

33.   La înțărcare (în jur de PND 21), se selectează puii din toate cuiburile disponibile până la 20 per doză și grupul martor pentru examinări suplimentare și se păstrează până la maturizare sexuală (dacă nu este necesară testarea mai devreme). Puii sunt selectați aleatoriu, fără a include exemplarele evident mai mici decât normal (animale cu o greutate corporală cu mai mult de două deviații standard sub greutatea medie a puilor din cuibul respectiv), deoarece este puțin probabil ca acestea să fie reprezentative pentru grupul de tratament.

La PND 21, puii F1 selectați sunt repartizați aleatoriu în una dintre cele trei cohorte de animale, după cum urmează:

cohorta 1 (1A și 1B)= teste de toxicitate pentru reproducere/dezvoltare;

cohorta 2 (2A și 2B)= teste de neurotoxicitate pentru dezvoltare;

cohorta 3= teste de imunotoxicitate pentru dezvoltare.

Cohorta 1A: un mascul și o femelă/cuib/grup (20/sex/grup): selecție prioritară pentru evaluarea primară a efectelor asupra sistemelor de reproducere și a toxicității generale.

Cohorta 1B: un mascul și o femelă/cuib/grup (20/sex/grup): selecție prioritară pentru evaluarea de urmărire a performanței de reproducere prin împerecherea animalelor F1, atunci când este evaluată [a se vedea documentul de orientare nr. 117 al OCDE (39)] și pentru obținerea de date histopatologice suplimentare în cazuri de substanțe toxice cu efecte asupra reproducerii sau asupra glandelor endocrine sau atunci când rezultatele de la cohorta 1A sunt neclare.

Cohorta 2A: un total de 20 de pui per grup (10 masculi și 10 femele pentru fiecare grup; 1 mascul sau 1 femelă per cuib) alocați pentru testare neurocomportamentală, urmată de evaluare neurohistopatologică ca adulți.

Cohorta 2B: un total de 20 de pui per grup (10 masculi și 10 femele pentru fiecare grup; 1 mascul sau 1 femelă per cuib) alocați pentru evaluare neurohistopatologică la înțărcare (PND 21 sau PND 22). În cazul în care nu există un număr suficient de animale, se acordă prioritate alocării animalelor în cohorta 2A.

Cohorta 3: un total de 20 de pui per grup (10 masculi și 10 femele pentru fiecare grup; unul per cuib, acolo unde este posibil). Se pot solicita pui suplimentari de la grupul martor pentru a acționa ca animale martor pozitiv în testul de răspuns al anticorpilor dependent de celulele T (TDAR) la PND 56 ± 3.

34.   Dacă nu există un număr suficient de pui într-un cuib pentru a servi toate cohortele, cohorta 1 are prioritate, întrucât aceasta poate fi extinsă pentru a produce o generație F2. Se pot repartiza pui suplimentari în oricare dintre cohorte în caz de interes specific, de exemplu, în cazul unei substanțe suspectate de efecte neurotoxice, imunotoxice sau toxice pentru reproducere. Puii respectivi se pot utiliza pentru examinări la diferite momente în timp sau pentru evaluarea unor parametri suplimentari. Puii care nu au fost atribuiți în cohorte vor fi supuși la biochimie clinică (punctul 55) și autopsie macroscopică (punctul 68).

A doua împerechere a animalelor P

35.   În mod normal, nu se recomandă o a doua împerechere a animalelor P, deoarece aceasta implică pierderea unor informații importante cu privire la numărul de locuri de implantare (și, astfel, se pierd date postimplantare și date privind pierderile perinatale, indicatori ai unui posibil potențial teratogen) pentru primul cuib. Necesitatea de a verifica sau de a elucida un efect la femelele expuse ar fi satisfăcută mai bine prin extinderea studiului pentru a include o împerechere a generației F1. Cu toate acestea, o a doua împerechere a masculilor P cu femele netratate este întotdeauna o opțiune disponibilă pentru a clarifica concluziile neclare sau pentru o caracterizare suplimentară a efectelor asupra fertilității observate la prima împerechere.

OBSERVAȚII ÎN-VIAȚĂ

Observații clinice

36.   Pentru animalele P și animalele selectate F1, o observație clinică generală se realizează o dată pe zi. În cazul administrării prin gavaj, momentul observației clinice trebuie să fie înainte și după administrare (pentru a observa eventuale semne de toxicitate asociate cu concentrația plasmatică maximă). Se consemnează modificările comportamentale pertinente, semnele de fătare dificilă sau prelungită și orice semne de toxicitate. De două ori pe zi, iar în timpul weekend-ului o dată pe zi, se observă toate animalele pentru semne de toxicitate severă, morbiditate și mortalitate.

37.   În plus, săptămânal se efectuează o examinare mai atentă a tuturor animalelor P și F1 (după înțărcare), aceasta putând fi realizată, în mod convenabil, cu ocazia cântăririi animalului, ceea ce ar reduce la minimum stresul cauzat de manipulare. Observațiile se efectuează cu atenție și se consemnează cu ajutorul sistemelor de notare care au fost definite de către laboratorul de testare. Trebuie depuse eforturi pentru a se asigura că variațiile condițiilor de testare sunt minime. Simptomele urmărite includ, dar nu se limitează la, modificări la nivelul pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apariția unor secreții și excreții și activitatea reflexă (de exemplu, lăcrimarea, erecția piloasă, dimensiunea pupilei, respirație anormală). Se consemnează, de asemenea, modificări ale mersului, ale posturii corpului, reacția la manipulare, precum și prezența mișcărilor clonice sau tonice, stereotipie (de exemplu, curățare excesivă, mișcări circulare repetate) sau comportament bizar (de exemplu, automutilarea, mersul înapoi).

Greutatea corporală și consumul de hrană/apă

38.   Animalele P sunt cântărite în prima zi de tratament și cel puțin săptămânal după aceea. În plus, femelele P sunt cântărite în timpul alăptării, în aceleași zile când are loc cântărirea puilor din cuiburile lor (a se vedea punctul 44). Toate animalele F1 sunt cântărite individual la înțărcare (PND 21) și cel puțin săptămânal după aceea. Greutatea corporală se consemnează, de asemenea, în ziua în care puii ajung la pubertate (finalizarea separării prepuțului sau a permeabilității vaginale). Toate animalele sunt cântărite la sacrificare.

39.   Pe parcursul studiului, consumul de hrană și de apă (în cazul administrării substanței chimice în apa de băut) se consemnează cel puțin săptămânal în aceleași zile ca valorile greutății corporale a animalelor (cu excepția perioadei de coabitare). Consumul de hrană al fiecărei cuști cu animale F1 se consemnează săptămânal începând cu selectarea pentru o cohortă.

Ciclurile estrale

40.   Informații preliminare privind efectele asociate substanței de testat asupra ciclului estral pot fi deja disponibile din studii de toxicitate anterioare cu doze repetate și pot fi utilizate pentru elaborarea unui protocol specific substanței de testat pentru studiul extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație. În mod normal, evaluarea ciclicității estrale (prin citologie vaginală) începe la începutul perioadei de tratament și continuă până la confirmarea împerecherii sau până la sfârșitul perioadei de 2 săptămâni pentru împerechere. În cazul în care femelele au fost examinate cu privire la ciclurile estrale normale înainte de tratare, este util să se continue testarea ciclicității odată cu începerea tratamentului, însă, în cazul în care există preocupări cu privire la efecte nespecifice la începutul tratamentului (de exemplu, o scădere semnificativă a consumului de hrană inițial), animalelor li se permite să se adapteze la tratament timp de cel mult două săptămâni înainte de începerea perioadei de testare a ciclicității de 2 săptămâni care conduce la cuplare. În cazul în care perioada de tratament a femelelor este extinsă în acest fel (și anume, un tratament de 4 săptămâni înainte de împerechere), trebuie să se ia în considerare achiziționarea de animale mai tinere și extinderea perioadei de tratament a masculilor înainte de cuplare. Atunci când se obțin celule vaginale/cervicale, trebuie avut grijă să se evite orice perturbare a mucoasei și, ulterior, inducerea pseudogestației (10) (11).

41.   Frotiul vaginal se examinează zilnic pentru toate femelele F1 din cohorta 1A, după apariția permeabilității vaginale, până la consemnarea primului frotiu cornificat, pentru a determina intervalul de timp dintre cele două evenimente. De asemenea, se monitorizează ciclurile estrale pentru toate femelele F1 din cohorta 1A pentru o perioadă de două săptămâni, începând în jurul PND 75. În plus, dacă va fi necesară împerecherea generației F1, citologia vaginală în cohorta 1B va fi urmărită de la momentul cuplării până la identificarea de dovezi ale împerecherii.

Împerecherea și gestația

42.   Pe lângă parametrii standard (de exemplu, greutatea corporală, consumul de hrană, observațiile clinice, inclusiv controale de mortalitate/morbiditate), se consemnează datele cuplării, data inseminării și data fătării și se calculează intervalul precoital (de la cuplare la inseminare) și durata gestației (de la inseminare la fătare). Femelele P se examinează cu atenție în momentul preconizat al fătării pentru orice semne de distocie. Se consemnează orice anomalii în comportamentul de cuibărire sau în performanța alăptării.

43.   Ziua în care are loc fătarea este ziua de alăptare 0 (LD 0) pentru mamă și ziua 0 după fătare (PND 0) pentru pui. Alternativ, toate comparațiile se pot baza, de asemenea, pe momentul postcoital pentru a elimina confuzia datelor de dezvoltare postnatală, scăzând durata gestației; cu toate acestea, momentul raportat la fătare este, de asemenea, consemnat. Acesta este important mai ales atunci când substanța de testat exercită o influență asupra duratei gestației.

Parametrii puilor

44.   Fiecare cuib se examinează cât mai curând posibil după fătare (PND 0 sau PND 1), pentru a stabili numărul și sexul puilor, puii născuți morți, puii vii, precum și prezența anomaliilor macroscopice (anomalii vizibile din exterior, inclusiv palatoschizis, hemoragii subcutanate, culoare sau textură anormală a pielii, prezența cordonului ombilical, lipsa laptelui în stomac, prezența unor secreții uscate). În plus, primul examen clinic al nou-născuților trebuie să includă o evaluare calitativă a temperaturii corpului, starea de activitate și reacția la manipulare. Puii găsiți morți la PND 0 sau la o dată ulterioară se examinează pentru determinarea posibilelor defecte și a cauzei decesului. Puii vii se numără și se cântăresc individual la PND 0 sau PND 1 și în mod regulat după aceea, de exemplu, cel puțin la PND 4, 7, 14 și 21. Examenele clinice, după caz, pentru vârsta animalelor, se repetă la cântărirea puilor sau mai des, dacă la fătare s-au realizat constatări specifice cazului. Simptomele urmărite pot include, dar nu se limitează la, anomalii exterioare, modificări la nivelul pielii, blănii, ochilor, mucoaselor, apariția unor secreții și excreții și activitatea reflexă. Se consemnează, de asemenea, modificări ale mersului, ale posturii corpului, reacția la manipulare, precum și prezența mișcărilor clonice sau tonice, stereotipie sau comportament bizar.

45.   Distanța ano-genitală (DAG) la fiecare pui se măsoară cel puțin o dată de la PND 0 până la PND 4. Greutatea corporală a puilor se consemnează în ziua în care se măsoară DAG și DAG trebuie normalizată la o măsură în funcție de dimensiunea puiului, de preferință, rădăcina cub a greutății corporale (12). Prezența sfârcurilor/aureolelor la puii de sex masculin se verifică la PND 12 sau 13.

46.   Toate animalele F1 selectate sunt examinate zilnic pentru constatarea separării balano-prepuțiale sau a permeabilității vaginale pentru masculi și, respectiv, femele, care începe înainte de data preconizată pentru atingerea acestor obiective, pentru a detecta dacă maturizarea sexuală se produce mai devreme. Se consemnează orice anomalii ale organelor genitale, cum ar fi fir vaginal persistent, hipospadia sau penis despicat. Maturitatea sexuală a animalelor F1 se compară cu dezvoltarea fizică prin determinarea vârstei și a greutății corporale la separarea balano-prepuțială sau la deschiderea vaginală la masculi și, respectiv, la femele (13).

Evaluarea neurotoxicității potențiale pentru dezvoltare (cohortele 2A și 2B)

47.   Pentru testele de neurotoxicitate se utilizează 10 masculi și 10 femele din animalele din cohorta 2A și 10 masculi și 10 femele din animalele din cohorta 2B, din fiecare grup de tratament (pentru fiecare grup: 1 mascul sau 1 femelă per cuib; toate cuiburile sunt reprezentate de cel puțin 1 pui; selectate aleatoriu). Animalele din cohorta 2A trebuie să fie supuse la testul reacției auditive, o baterie de teste funcționale bazate pe observație, evaluări ale activității motorii (a se vedea punctele 48-50) și neuropatologice (a se vedea punctele 74-75). Trebuie depuse eforturi pentru a se asigura că variațiile condițiilor de testare sunt minime și nu sunt în mod sistematic legate de tratament. Printre variabilele care pot afecta comportamentul sunt nivelul sonor (de exemplu, zgomot intermitent), temperatură, umiditate, iluminat, mirosuri, ora din zi și distrageri de mediu. Rezultatele testelor de neurotoxicitate trebuie interpretate în relație cu intervalele istorice corespunzătoare de referință pentru martor. Animalele din cohorta 2B se utilizează pentru evaluarea neuropatologică la PND 21 sau PND 22 (a se vedea punctele 74-75).

48.   Un test al reacției auditive se efectuează la PND 24 (± 1 zi) utilizând animale din cohorta 2A. Ziua de testare ar trebui compensată între grupurile tratate și martor. Fiecare sesiune este formată din 50 de teste. În efectuarea testului reacției auditive, se determină amplitudinea răspunsului mediu la fiecare bloc de 10 teste (5 blocuri de 10 teste), cu condiții de testare optimizate pentru a produce acomodare intrasesiune. Procedurile trebuie să fie în concordanță cu metoda de testare B.53 (35).

49.   La un moment adecvat între PND 63 și PND75, animalele din cohorta 2A sunt supuse la o baterie de teste funcționale bazate pe observație și o testare automată a activității motorii. Procedurile trebuie să fie în concordanță cu metodele de testare B.43 (33) și B.53 (35). Bateria de teste funcționale bazate pe observație include o descriere amănunțită a aspectului, a comportamentului și a integrității funcționale a subiectului. Aceste aspecte sunt evaluate prin observații în cușca de adăpostire, după mutarea într-o arenă standard pentru observare (câmp deschis) unde animalul se mișcă în mod liber și prin teste de manipulare. Testarea ar trebui să pornească de la cel mai puțin activ la cel mai interactiv. O listă de măsuri este prezentată în apendicele 1. Toate animalele sunt urmărite cu atenție de către observatori instruiți, care au cunoștință de statutul de tratament al animalelor, utilizând proceduri standardizate pentru a reduce la minimum variabilitatea observatorului. Acolo unde este posibil, se recomandă ca același observator să evalueze animalele într-un anumit test. Dacă acest lucru nu este posibil, este necesar să se demonstreze fiabilitatea interobservatori. Pentru fiecare parametru din bateria de testare a comportamentului, se utilizează bareme și criterii de notare operaționale definite explicit. Dacă este posibil, se elaborează măsuri cantitative obiective pentru parametrii de observație, care implică un clasament subiectiv. Pentru activitatea motorie, fiecare animal este testat individual. Sesiunea de testare trebuie să fie suficient de lungă pentru a demonstra acomodarea intrasesiune pentru martori. Activitatea motorie se monitorizează prin intermediul unui dispozitiv automat de înregistrare a activității care poate detecta atât intensificarea, cât și reducerea activității (de exemplu, activitatea bazală măsurată de dispozitiv nu trebuie să fie atât de scăzută, încât să împiedice detectarea reducerii, nici atât de mare, încât să împiedice detectarea intensificării activității). Fiecare dispozitiv trebuie să fie testat prin metode standard pentru a se asigura, în măsura în care este posibil, fiabilitatea funcționării tuturor dispozitivelor în toate zilele. În măsura în care este posibil, grupurile de tratament se distribuie în mod echilibrat pe toate dispozitivele. Grupurile de tratament trebuie să fie compensate în toate intervalele de testare pentru a evita interpretări eronate provocate de ritmul circadian de activitate.

50.   În cazul în care informațiile existente indică necesitatea altor teste funcționale (de exemplu, senzoriale, sociale, cognitive), acestea trebuie să fie integrate fără a compromite integritatea altor evaluări efectuate în cadrul studiului. În cazul în care testarea se efectuează pe aceleași animale utilizate pentru reacție auditivă, bateria de teste funcționale bazate pe observație și testarea activității motorii, trebuie să se programeze teste diferite pentru a reduce la minimum riscul de a compromite integritatea testelor. Procedurile suplimentare pot fi deosebit de utile atunci când observația empirică, efectele anticipate sau modul de acțiune/mecanismul indică un anumit tip de neurotoxicitate.

Evaluarea imunotoxicității potențiale pentru dezvoltare (cohorta 3)

51.   La PND 56 (± 3 zile), 10 masculi și 10 femele din animalele din cohorta 3 din fiecare grup de tratament (1 mascul sau 1 femelă per cuib; toate cuiburile sunt reprezentate de cel puțin 1 pui; selectate aleatoriu) se utilizează pentru testul de răspuns al anticorpilor dependent de celulele T, și anume, răspunsul anticorpilor principali IgM la un antigen dependent de celulele T, cum ar fi celule eritrocitare (Sheep Red. Blood Cells, SRBC) sau hemocianină de Limulus (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH), în conformitate cu procedurile curente de testare a imunotoxicității (14) (15). Răspunsul poate fi evaluat prin numărarea celulelor specifice formatoare de placă (PFC) în splină sau prin determinarea titrului de anticorpi IgM specifici SRBC- sau KLH- în ser prin testul ELISA, în perioada de vârf a răspunsului. De regulă, există patru răspunsuri de vârf (răspuns PFC) sau cinci (test ELISA) de zile de la imunizarea intravenoasă. În cazul în care răspunsul anticorpilor primari este analizat prin numărarea celulelor care formează placa, se permite evaluarea unor subgrupuri de animale în zile separate, cu condiția ca: imunizarea subgrupului și sacrificarea să fie programate astfel încât PFC să fie numărate în perioada de vârf a răspunsului; subgrupurile să includă un număr egal de pui de sex masculin și de sex feminin de la toate grupurile de doze, inclusiv martori; și subgrupurile să fie evaluate aproximativ la aceeași vârstă după fătare. Expunerea la substanța de testat va continua până în ziua dinaintea colectării splinelor pentru răspunsul PFC sau a serului pentru testul ELISA.

Evaluarea de urmărire a toxicității potențiale pentru reproducere (cohorta 1B)

52.   Animalele din cohorta 1B se pot menține sub tratament după PND 90 și pot fi crescute pentru a obține o generație F2, dacă este necesar. Se plasează în coabitare masculi și femele din același grup de doză (evitând cuplarea între frați) timp de până la două săptămâni, începând de la PND 90, dar fără a depăși PND 120. Procedurile trebuie să fie similare cu cele pentru animalele P. Cu toate acestea, pe baza forței probante a dovezilor, ar putea fi suficientă eliminarea puilor la PND 4, mai degrabă decât urmărirea acestora până la înțărcare sau ulterior.

OBSERVAȚIILE FINALE

Biochimie clinică/hematologie

53.   Efectele sistemice se monitorizează la animalele P. Se prelevează probe de sânge după repaus alimentar dintr-o zonă definită de la zece masculi și femele P selectați aleatoriu, pe grup de doză la sacrificare, se depozitează în condiții adecvate și se supun unei analize hematologice parțiale sau complete de biochimie clinică de T4 și TSH sau alte examene sugerate de profilul de efect cunoscut al substanței de testat [a se vedea documentul de orientare nr. 151 al OCDE (40)]. Se examinează următorii parametri hematologici: hematocritul, concentrația hemoglobinei, numărul de eritrocite, numărul de leucocite diferențial și total, numărul de trombocite și timpul/potențialul de coagulare a sângelui. Investigațiile plasmei sau ale serului includ: glucoză, colesterol total, uree, creatinină, proteine totale, albumină și cel puțin două enzime care indică efectele hepatocelulare (cum ar fi alanin aminotransferaza, aspartat aminotransferaza, fosfataza alcalină, gama-glutamil transpeptidaza și sorbitol dehidrogenaza). Măsurători ale altor enzime și acizi biliari pot furniza informații utile în anumite circumstanțe. În plus, se poate preleva și depozita sânge de la toate animalele pentru o posibilă analiză la un moment ulterior cu scopul de a clarifica unele efecte neclare sau de a genera date de expunere internă. Dacă nu se intenționează o a doua împerechere a animalelor P, probele de sânge sunt obținute imediat înainte de procedura de sacrificare programată sau ca parte a acesteia. În cazul în care se păstrează animalele, probele de sânge se colectează cu câteva zile înainte ca animalele să fie împerecheate pentru a doua oară. Cu excepția cazului în care datele existente de la studii cu doze repetate arată că parametrul nu este afectat de substanța de testat, analiza urinei se efectuează înainte de sacrificare, analizându-se următorii parametri: aspect, volum, osmolaritate sau densitate specifică, pH, proteine, glucoză, sânge și celule sangvine, celulele deteriorate. De asemenea, urina se poate colecta în vederea monitorizării excreției de substanță chimică de testat și/sau metabolit/metaboliți.

54.   Efectele sistemice se monitorizează, de asemenea, la animalele F1. Se prelevează probe de sânge după repaus alimentar dintr-o zonă definită de la zece masculi și femele 1A selectați aleator, pe grup de doză la sacrificare, se depozitează în condiții adecvate și supun unei analize de biochimie clinică standard, inclusiv unei evaluări ale nivelului seric de hormoni tiroidieni (T4 și TSH), hematologice (leucocite diferențial și total plus numărul de eritrocite) și testul de urină.

55.   Surplusul de pui la PND 4 este supus autopsiei macroscopice, avându-se în vedere măsurarea concentrației de hormon tiroidian seric (T4). În cazul în care este necesar, se poate colecta în comun sânge neonatal (PND 4) pe cuiburi pentru analize biochimice/ale hormonilor tiroidieni. De asemenea, se colectează sânge pentru analiza T4 și TSH de la pui înțărcați supuși autopsiei macroscopice la PND 22 (pui F1 care nu au fost selectați pentru cohorte).

Parametrii de evaluare a spermei

56.   Parametrii de evaluare a spermei se măsoară pentru toți masculii din generația P, cu excepția cazului în care există date existente pentru a demonstra că parametrii de evaluare a spermei nu sunt afectați într-un studiu de 90 de zile. Examinarea parametrilor de evaluare a spermei se realizează la nivelul tuturor masculilor din cohorta 1A.

57.   La sacrificare, se consemnează valorile greutății testiculelor și a epididimului pentru toți masculii P și F1 (cohorta 1A). Cel puțin un testicul și un epididim sunt rezervate pentru examenul histopatologic. Restul de epididim se utilizează pentru inventarierea rezervelor de spermă din porțiunea caudală a epididimului (16) (17). În plus, sperma din porțiunea caudală a epididimului (sau vase deferente) se colectează prin metode care reduc la minimum daunele pentru evaluarea motilității și a morfologiei (18).

58.   Motilitatea spermatozoizilor poate fi evaluată imediat după sacrificare sau poate fi consemnată pentru o analiză ulterioară. Procentul de spermatozoizi cu motilitate progresivă ar putea fi determinat fie subiectiv, fie obiectiv prin analiza asistată de calculator a mișcării (19) (20) (21) (22) (23) (24). Pentru evaluarea morfologiei spermei, se examinează o probă de spermă din epididim (sau din vasele deferente) sub formă de preparate umede sau fixe (25) și cel puțin 200 de spermatozoizi per eșantion trebuie să se clasifice ca normali (atât capul, cât și partea mijlocie/coada par normale) sau anormali. Exemple de anomalii morfologice ale spermatozoizilor includ fuziunea, capete izolate și capete și/sau cozi diforme (26). Capetele de spermatozoizi mari sau diforme pot indica defecte de spermiație.

59.   În cazul în care eșantioanele sunt congelate, frotiuri fixe și imagini pentru analiza motilității spermei sunt înregistrate la momentul autopsiei (27), analiza ulterioară putând fi limitată la masculi din grupul martor și grupul tratat cu doze ridicate. Cu toate acestea, în cazul în care se observă efecte corelate cu tratamentul, se evaluează, de asemenea, grupurile tratate cu doze mai mici.

Autopsie macroscopică

60.   La momentul sacrificării sau al decesului prematur, toate animalele P și F1 sunt supuse autopsiei și sunt examinate macroscopic pentru orice anomalii structurale sau modificări patologice. Se acordă o atenție deosebită organelor sistemului de reproducere. Puii care sunt eutanasiați în stare muribundă și puii morți sunt înregistrați și, atunci când nu sunt macerați, sunt examinați pentru determinarea eventualelor defecte și/sau a cauzei decesului și sunt conservați.

61.   Pentru femelele adulte P și F1, se examinează un frotiu vaginal în ziua autopsiei pentru a determina stadiul ciclului estral și pentru a permite corelarea cu examenul histopatologic la nivelul organelor de reproducere. Uterele de la toate femelele P (și femelele F1, dacă este cazul) sunt examinate pentru a determina prezența și numărul locurilor de implantare, într-un mod care să nu compromită evaluarea histopatologică.

Greutatea organelor și conservarea țesuturilor — animale adulte P și F1

62.   La momentul sacrificării, se stabilesc valorile greutății corporale și ale greutății umede a organelor enumerate mai jos la toate animalele P și la toți adulții F1 din cohortele relevante (astfel cum se arată de mai jos), cât mai curând posibil după disecție, pentru a evita uscarea. Ulterior organele trebuie conservate în condiții corespunzătoare. Dacă nu se specifică altfel, organele pereche pot fi cântărite individual sau combinat, în concordanță cu practica obișnuită a laboratorului executant:

—	uterul (cu oviducte și col), ovarele;

—	testiculele, epididimidele (total și partea caudală pentru probele utilizate pentru numărarea spermatozoizilor);

—

prostata (părțile dorsolaterale și ventrale combinate). Trebuie să se procedeze cu atenție la curățarea complexului prostatei pentru a evita puncția veziculelor seminale umplute cu fluid. În cazul în care se constată efecte corelate tratamentului asupra greutății totale a prostatei, segmentele dorsolaterale și ventrale se disecă cu atenție după fixare și se cântăresc separat;

—	veziculele seminale cu glande coagulante și fluidele lor (ca o singură unitate);

—	creier, ficat, rinichi, inimă, splină, timus, glanda pituitară, glanda tiroidă (postfixare), glandele suprarenale și organe sau țesuturi țintă cunoscute.

63.   Pe lângă organele enumerate mai sus, probe de nerv periferic, mușchi, măduva spinării, ochi plus nervul optic, tract gastrointestinal, vezică urinară, plămân, trahee (cu tiroida și paratiroide atașate), măduvă osoasă, vase deferente (masculi), glande mamare (masculi și femele) și vagin sunt păstrate în condiții adecvate.

64.   La animalele din cohorta 1A, toate organele sunt cântărite și păstrate pentru efectuarea unui examen histopatologic.

65.   Pentru investigarea efectelor imunotoxice induse pre- și postnatal, 10 masculi și 10 femele dintre animalele din cohorta 1A din fiecare grup de tratament (1 mascul sau 1 femelă per cuib; toate cuiburile sunt reprezentate de cel puțin 1 pui; selectate aleatoriu), vor fi supuse la următoarele teste la sacrificare:

—	cântărirea ganglionilor limfatici asociați și îndepărtați de calea de expunere (pe lângă greutatea glandelor suprarenale, a timusului și a splinei, deja determinată la toate animalele din cohorta 1A);

—	analiza subpopulațiilor de limfocite splenice [limfocite CD4 + și CD8 + T, limfocite B și celule ucigașe (natural killer, NK)] utilizând o jumătate din splină, cealaltă jumătate a splinei fiind păstrată pentru evaluarea histopatologică.

Analiza subpopulațiilor de limfocite splenice la animale neimunizate (cohorta 1A) va stabili dacă expunerea este legată de o schimbare a distribuției stării echilibrate imunologice la limfocite «ajutor» (CD4 +) sau citotoxice (CD8 +) derivate din timus sau la celule ucigașe (NK) (răspunsuri rapide la celule neoplazice și la agenți patogeni).

66.   La animalele din cohorta 1B, următoarele organe sunt cântărite și țesuturile corespunzătoare sunt prelucrate în etapa bloc:

—	vaginul (nu a fost cântărit);

—	uterul cu colul uterin;

—

ovarele;

—	testiculele (cel puțin unul);

—	epididimele;

—	veziculele seminale și glandele coagulante;

—

prostata;

—	glanda pituitară;

—	organele țintă identificate.

Histopatologia în cohorta 1B se efectuează în cazul în care rezultatele de la cohorta 1A sunt neclare sau în cazul substanțelor suspectate de efecte toxice asupra reproducerii sau asupra glandelor endocrine.

67.   Cohortele 2A și 2B: teste de neurotoxicitate pentru dezvoltare (PND 21 sau PND 22 și pui adulți). Animalele din cohorta 2A sunt sacrificate după testarea comportamentului, cu consemnarea greutății creierului și neurohistopatologie completă în scopuri de evaluare a neurotoxicității. Animalele din cohorta 2B sunt sacrificate la PND 21 sau PND 22, cu consemnarea greutății creierului și examinarea microscopică a creierului în scopuri de evaluare a neurotoxicității. Este necesară fixarea prin perfuzie pentru animalele din cohorta 2A și opțional pentru animalele din cohorta 2B, astfel cum se specifică în metoda de testare B.53 (35).

Greutatea organelor și conservarea țesuturilor — puii înțărcați F1

68.   Puii care nu au fost selectați pentru cohorte, inclusiv puii mai mici decât normal, sunt sacrificați după înțărcare, la PND 22, cu excepția cazului în care rezultatele indică necesitatea mai multor investigații în-viață. Puii sacrificați sunt supuși autopsiei macroscopice, inclusiv o evaluare a organelor de reproducere, astfel cum este descris la punctele 62 și 63. Pentru până la 10 pui pe sex pe grup, din cât mai multe cuiburi posibil, creierul, splina și timusul se cântăresc și se păstrează în condiții adecvate. În plus, se pot păstra țesuturile mamare pentru puii de sex masculin și de sex feminin pentru mai multe analize microscopice suplimentare (13) [a se vedea documentul de orientare nr. 151 al OCDE (40)]. Anomaliile macroscopice și țesuturile țintă se păstrează pentru o eventuală examinare histologică.

Histopatologie — animalele P

69.   Se efectuează examenul histopatologic complet al organelor enumerate la punctele 62 și 63 pentru toate animalele martor P și animalele tratate cu doze ridicate. De asemenea, se examinează organele care prezintă modificări legate de tratament la toate animalele din grupurile de doze mai mici pentru a contribui la stabilirea NOAEL. În plus, organele de reproducere ale tuturor animalelor suspectate de fertilitate redusă, de exemplu, cele care nu s-au împerecheat, nu au conceput, nu au însămânțat sau nu au fătat pui sănătoși sau la care au fost afectate ciclicitatea estrală sau numărul, motilitatea sau morfologia spermatozoizilor, precum și toate leziunile macroscopice se supun evaluării histopatologice.

Histopatologie — animalele F1

Animale din cohorta 1

70.   Se efectuează examenul histopatologic complet al organelor enumerate la punctele 62 și 63 pentru toate animalele martor adulte și animalele tratate cu doze ridicate din cohorta 1A. Toate cuiburile trebuie să fie reprezentate de cel puțin 1 pui de fiecare sex. De asemenea, se examinează organele și țesuturile care prezintă modificări legate de tratament la toate animalele din grupurile de doze mai mici pentru a contribui la stabilirea NOAEL. Pentru evaluarea efectelor induse pre- și postnatal asupra organelor limfoide, se efectuează, de asemenea, examenul histopatologic pe ganglionii limfatici colectați și măduva osoasă de la 10 masculi și 10 femele dintre animalele din cohorta 1A, pe lângă evaluarea histopatologică a timusului, a splinei și a glandelor suprarenale deja efectuate la toate animalele 1A.

71.   Țesuturile de reproducere și endocrine de la toate animalele din cohorta 1B, prelucrate în etapa bloc, astfel cum este descris la punctul 66, se examinează pentru determinarea histopatologiei în cazul substanțelor suspectate de efecte toxice asupra reproducerii sau asupra sistemului endocrin. De asemenea, cohorta 1B se supune examenului histologic dacă rezultatele de la cohorta 1A sunt neclare.

72.   Ovarele de femele adulte trebuie să conțină foliculi primordiali și în creștere, precum și corpi galbeni; prin urmare, un examen histopatologic va viza realizarea unei evaluări cantitative a foliculilor primordiali și a foliculilor mici în creștere, precum și a corpilor galbeni la femelele F1; numărul de animale, selectarea secțiunii ovariene și mărimea secțiunii eșantion trebuie să fie adecvate statistic pentru procedura de evaluare utilizată. Enumerarea foliculară poate fi efectuată mai întâi pe animale martor și animale tratate cu doze mari, iar în cazul unui efect advers detectat la acestea din urmă, se examinează, de asemenea, animalele tratate cu doze mai mici. Examenul include numărarea foliculilor primordiali, care pot fi combinați cu foliculi mici în creștere, pentru compararea ovarelor tratate și a ovarelor martor [a se vedea documentul de orientare nr. 151 al OCDE (40)]. Evaluarea corpului galben se desfășoară în paralel cu testarea ciclului estral, astfel încât etapa ciclului să poată fi luată în considerare în cadrul evaluării. Oviductul, uterul și vaginul sunt examinate pentru determinarea dezvoltării corespunzătoare tipice a organelor.

73.   Se efectuează examene histopatologice testiculare detaliate la masculii F1 pentru a identifica efectele corelate tratamentului asupra diferențierii și dezvoltării testiculelor și asupra spermatogenezei (38). Atunci când este posibil, se examinează secțiuni ale rete testis. Capul, corpul și partea caudală a epididimului și vasele deferente sunt examinate pentru determinarea dezvoltării corespunzătoare tipice a organelor, precum și pentru determinarea parametrilor necesari pentru masculii P.

Animale din cohorta 2

74.   Se efectuează examenul neurohistopatologic pentru toate animalele martor și animalele tratate cu doze mari din cohorta 2A pe sexe după încheierea testelor neuro-comportamentale (după PND 75, dar fără a depăși PND 90). Se efectuează examenul histopatologic al creierului pentru toate animalele martor și animalele tratate cu doze mari din cohorta 2B pe sexe la PND 21 sau PND 22. De asemenea, se examinează organele și țesuturile care prezintă modificări legate de tratament la toate animalele din grupurile de doze mai mici pentru a contribui la stabilirea NOAEL. Organele sau țesuturile care demonstrează modificări legate de tratament ar trebui să fie, de asemenea, examinate pentru animalele din grupurile de doze mai mici pentru a contribui la determinarea NOAEL. Pentru animalele din cohorta 2A și 2B, se examinează mai multe secțiuni de creier pentru a permite examinarea bulbilor olfactivi, a cortexului cerebral, a hipocampului, a ganglionilor bazali, a talamusului, a hipotalamusului, a creierului mijlociu (thecum, tegmentum și pedunculi cerebrali), a trunchiului cerebral și a cerebelului. Doar pentru cohorta 2A, se examinează ochii (retina și nervul optic) și probe de nerv periferic, mușchi și măduva spinării. Toate procedurile neurohistologice trebuie să fie în concordanță cu metoda de testare B.53 (35).

75.   Evaluările morfometrice (cantitative) se efectuează pe zone reprezentative ale creierului (secțiunile omoloage atent selectate pe bază de repere microscopice fiabile) și pot include măsurători liniare și/sau areale ale unor regiuni specifice ale creierului. Trebuie să se preleveze cel puțin trei secțiuni consecutive la fiecare punct de reper (nivel), pentru a selecta secțiunea omoloagă cea mai reprezentativă pentru zona specifică a creierului care va fi evaluată. Neuropatologul trebuie să decidă dacă secțiunile pregătite pentru măsurare sunt omoloage cu altele în setul de probe și, prin urmare, dacă sunt potrivite pentru a fi incluse, întrucât măsurătorile liniare, în special, se pot schimba pe o distanță relativ scurtă (28). Nu trebuie utilizate secțiuni neomoloage. În timp ce obiectivul este de a preleva probe de la toate animalele rezervate pentru acest scop (10/sex/nivel de doză), un număr mai mic de probe poate fi totuși adecvat. Cu toate acestea, prelevarea de probe de la mai puțin de 6 animale/sex/nivel de doză ar putea, în general, să nu fie considerată suficientă în scopurile prezentei metode de testare. Se poate utiliza stereologia pentru a identifica efectele legate de tratament asupra unor parametri, cum ar fi volumul sau numărul de celule pentru regiuni neuroanatomice specifice. Toate aspectele legate de pregătirea probelor de țesuturi, de la fixarea țesuturilor, la disecția de probe de țesuturi, la prelucrarea țesuturilor și până la colorarea lamelelor, trebuie să utilizeze un concept compensat, astfel încât fiecare lot să conțină probe reprezentative de la fiecare grup de doză. Atunci când urmează să se utilizeze analize morfometrice sau stereologice, țesutul cerebral trebuie integrat în medii adecvate pentru toate dozele în același timp, pentru a evita contracția probelor asociată cu depozitarea prelungită în fixativ.

RAPORT

Date

76.   Datele se raportează individual și se sistematizează în tabele. Acolo unde este cazul, pentru fiecare grup de testare și pentru fiecare generație, se raportează următoarele: numărul de animale la începutul testului, numărul de animale găsite moarte pe parcursul testului sau sacrificate fără suferință, ora oricăror decese sau eutanasieri, numărul de animale fertile, numărul de femele gestante, numărul de femele care nasc pui și numărul de animale care prezintă semne de toxicitate. De asemenea, se raportează o descriere a toxicității, inclusiv momentul apariției, durata și severitatea.

77.   Rezultatele numerice sunt evaluate cu ajutorul unei metode statistice adecvate și acceptate. Metodele statistice se selectează ca parte a conceptului de studiu și abordează în mod corespunzător datele care nu au o distribuție normală (de exemplu, date de numărare), datele cenzurate (de exemplu, timp de observare limitat), nonindependența (de exemplu, efecte care țin de seria de pui și măsuri repetate) și varianțele inegale. Modelele mixte liniare generalizate și modelele doză-răspuns acoperă o clasă largă de instrumente analitice care ar putea fi necesare pentru datele generate în conformitate cu prezenta metodă de testare. Raportul trebuie să includă suficiente informații cu privire la metoda de analiză și programul computerizat utilizat, astfel încât un referent/statistician independent să poată evalua/reevalua analiza.

Evaluarea rezultatelor

78.   Constatările trebuie evaluate din punct de vedere al efectelor observate, inclusiv autopsia și observațiile microscopice. Evaluarea include relația, sau inexistența acesteia, între doză și prezența, incidența și severitatea anomaliilor, inclusiv leziuni macroscopice. De asemenea, trebuie să se evalueze organele țintă, fertilitatea, anomaliile clinice, performanța de reproducere și a puilor, variații ale greutății corporale, mortalitatea și alte efecte toxice și efectele de dezvoltare. Se acordă o atenție deosebită modificărilor specifice sexului. În evaluarea rezultatelor testelor, trebuie să se țină seama de proprietățile fizico-chimice ale substanței de testat și, dacă sunt disponibile, de datele TK, inclusiv transferul placentar și excreția de lapte.

Raportul de testare

79.   Raportul de testare trebuie să conțină următoarele informații obținute în cadrul studiului privind animalele P, F1 și F2 (dacă este cazul):

Substanța chimică de testat:

—	toate informațiile pertinente disponibile privind proprietățile chimice, toxicocinetice și toxicodinamice ale substanței chimice de testat;

—	datele de identificare;

—

puritate.

Vehicul (dacă este cazul):

—	justificarea alegerii vehiculului (dacă este altul decât apa).

Animale de laborator:

—	specia/sușa utilizată;

—	numărul, vârsta și sexul animalelor;

—	sursa, condițiile de adăpostire, hrană, materiale pentru cuibărire etc.;

—	greutatea fiecărui animal la începutul testului;

—	datele privind frotiul vaginal pentru femelele P înainte de începerea tratamentului (în cazul în care datele sunt colectate la acea dată);

—	înregistrări privind cuplarea referitoare la generația P, indicând partenerii de sex masculin și de sex feminin ai unei împerecheri și reușita împerecherii;

—	înregistrări privind cuibul de origine pentru animalele adulte din generația F1.

Condiții de testare:

—	justificarea alegerii dozei;

—	detalii privind prepararea substanței de testat/prepararea hranei, concentrațiile obținute;

—	stabilitatea și omogenitatea preparatului în vehicul sau purtător (de exemplu, hrană, apă potabilă), în sânge și/sau lapte, în condiții de utilizare și depozitare între utilizări;

—	detalii privind administrarea substanței de testat;

—	conversia de la concentrația substanței chimice de testat (ppm) în hrană/apă potabilă la doza obținută (mg/kg greutate corporală/zi), dacă este cazul;

—	detalii privind calitatea hranei și a apei (inclusiv compoziția hranei, dacă este disponibilă);

—	descrierea detaliată a procedurilor de randomizare pentru a selecta puii pentru sacrificare și pentru a distribui puii în grupurile de testare;

—	condiții de mediu;

—	lista personalului de studiu, inclusiv de formare profesională.

Rezultate (rezumat și date individuale pe sexe și doză):

—

consumul alimentar, consumul de apă în cazul în care este disponibil, eficiența alimentară (creștere în greutatea corporală per gram de alimente consumate, cu excepția perioadei de coabitare și în timpul alăptării) și consumul de substanță de testat (pentru administrarea prin hrană/apă potabilă) pentru animalele P și F1;

—	datele privind absorbția (dacă sunt disponibile);

—	informații cu privire la greutatea corporală a animalelor P;

—	informații cu privire la greutatea corporală a animalelor după înțărcare selectate în F1;

—	momentul decesului în timpul studiului sau dacă animalele au supraviețuit sau nu până la sacrificare;

—	natura, severitatea și durata efectelor clinice (eventual, reversibilitatea acestora);

—	datele privind hematologia, analiza urinei și chimia clinică, inclusiv TSH și T4;

—	analiza fenotipică a celulelor splenice (celulele T-, B-, NK-);

—	celularitatea măduvei osoase;

—	datele privind răspunsul toxic;

—	numărul de femele P și F1 cu ciclu estral normal sau anormal și durata ciclului;

—	intervalul de timp până la împerechere (interval precoital, numărul de zile între cuplare și împerechere);

—	efectele toxice sau de alt tip asupra reproducerii, inclusiv numărul și proporția de animale care realizează împerecherea, gestația, fătarea și lactația, de masculi care induc gestația, de femele cu simptome de distocie/fătare prelungită sau dificilă;

—	durata gestației și, dacă se cunoaște, a fătării;

—	numărul de implantări, mărimea cuibului și procentul de pui masculi;

—	numărul și procentajul de pierderi postimplantare, pui născuți vii și pui născuți morți;

—	datele privind greutatea cuibului și a puilor (masculi, femele și combinat), numărul de pui mai mici decât normal, dacă s-a determinat;

—	numărul de pui cu anomalii vizibile, macroscopice;

—	efectele toxice sau de alt tip asupra evoluției postnatale a puilor, viabilitatea acestora etc.;

—	datele privind reperele fizice la pui și alte date privind dezvoltarea postnatală;

—	datele privind maturizarea sexuală a animalelor F1;

—	datele privind observațiile funcționale la pui și adulți, după caz;

—	greutatea corporală la sacrificare și datele absolute și relative de greutate a organelor pentru animalele P și animalele adulte F1;

—	rezultatele autopsiei;

—	descrierea detaliată a tuturor observațiilor histopatologice;

—	numărul total de spermatozoizi din epididimul caudal, procentul de spermatozoizi cu motilitate progresivă, procentul de spermatozoizi normali morfologic și procentul de spermatozoizi cu fiecare anomalie identificată pentru masculii P și F1;

—	numerele și etapele de maturizare ale foliculilor din ovarele femelelor P și F1, acolo unde este cazul;

—	enumerarea de corpi galbeni din ovarele femelelor F1;

—	prelucrarea statistică a rezultatelor, dacă este cazul.

Parametrii cohortei 2:

—	descrierea detaliată a procedurilor utilizate pentru a standardiza observațiile și procedurile, precum și definițiile operaționale pentru notarea observațiilor;

—	lista tuturor metodelor de testare utilizate și justificarea utilizării acestora;

—	detaliile privind procedurile comportamentale/funcționale, neuropatologice și morfometrice utilizate, inclusiv informații și detalii privind dispozitivele automatizate;

—	procedurile de calibrare și de asigurare a echivalenței dispozitivelor și echilibrarea grupurilor de tratament în procedurile de testare;

—	scurtă justificare care să explice orice decizii care implică judecata profesională;

—	descrierea detaliată a tuturor constatărilor comportamentale/funcționale, neuropatologice și morfometrice pe sexe și pe grup de doză, inclusiv creșteri și scăderi față de martori;

—	greutatea creierului;

—	orice diagnostice derivate din simptome neurologice și leziuni, inclusiv boli sau afecțiuni care apar în mod natural;

—	radiografii ale unor constatări exemplare;

—	radiografii cu consum redus pentru a evalua omologia secțiunilor utilizate pentru morfometrie;

—	tratarea statistică a rezultatelor, inclusiv modele statistice utilizate la analizarea rezultatelor, precum și rezultatele, indiferent dacă acestea au fost sau nu semnificative;

—	relația dintre orice alte efecte toxice și concluzia privind potențialul neurotoxic al substanței de testat, pe sexe și pe grup de doză;

—	impactul oricăror informații toxicocinetice asupra concluziilor;

—	date care sprijină fiabilitatea și sensibilitatea metodei de testare (de exemplu, date de martor istoric și pozitiv);

—	relațiile, dacă este cazul, între efectele neuropatologice și cele funcționale;

—	NOAEL sau doza de referință pentru mame și pui, pe sexe și grup de doză;

—	discuții cu privire la interpretarea globală a datelor pe baza rezultatelor, inclusiv o concluzie dacă substanța chimică a provocat sau nu neurotoxicitate pentru dezvoltare și NOAEL.

Parametrii cohortei 3:

—	titrele anticorpilor IgM serici (sensibilizarea la SRBC sau KLH) sau unități IgM PFC splenice (sensibilizare la SRBC);

—	performanța metodei TDAR trebuie confirmată ca parte a procesului de optimizare prin inițierea de către laborator a analizei pentru prima dată și în mod periodic (de exemplu, anual) de toate laboratoarele;

—	discuții cu privire la interpretarea globală a datelor pe baza rezultatelor, inclusiv o concluzie dacă substanța chimică a provocat sau nu imunotoxicitate pentru dezvoltare și NOAEL.

Discutarea rezultatelor

Concluzii, inclusiv valorile NOAEL pentru efectele asupra părinților și asupra puilor

De asemenea, se furnizează toate informațiile care nu au fost obținute în timpul studiului, dar care sunt utile pentru interpretarea rezultatelor (de exemplu, asemănări cu efectele oricăror substanțe cunoscute cu efecte neurotoxice).

Interpretarea rezultatelor

80.   Un studiu extins de toxicitate pentru reproducere efectuat pe o generație va furniza informații privind efectele expunerii repetate la o substanță chimică în toate etapele ciclului de reproducere, după caz. În special, studiul furnizează informații cu privire la sistemul reproducător și la dezvoltarea, creșterea, supraviețuirea și parametrii funcționali ai puilor până la PND 90.

81.   Interpretarea rezultatelor studiului trebuie să ia în considerare toate informațiile disponibile cu privire la substanța chimică, inclusiv proprietățile fizico-chimice, TK și toxicodinamice, informațiile relevante disponibile cu privire la analogi structurali, precum și rezultatele studiilor de toxicitate efectuate anterior cu substanța de testat (de exemplu, toxicitate acută, toxicitate după aplicare repetată, studii mecaniciste și studii de evaluare în cazul în care există diferențe calitative și cantitative semnificative la nivelul speciei referitoare la proprietățile metabolice in vivo/in vitro). Rezultatele autopsiei macroscopice și cu privire la greutatea organelor trebuie să fie evaluate în corelație cu observațiile din alte studii cu doze repetate, atunci când acest lucru este fezabil. Scăderile la nivelul dezvoltării puilor ar putea fi considerate în relație cu o influență a substanței chimice de testat asupra compoziției laptelui (29).

Cohorta 2 (neurotoxicitatea pentru dezvoltare)

82.   Rezultatele neuropatologice și neurocomportamentale trebuie interpretate în contextul tuturor constatărilor, prin intermediul abordării axate pe forța probantă a dovezilor cu expertiză. Trebuie discutate modelele de constatări comportamentale sau morfologice, în cazul în care acestea sunt prezente, precum și dovezile referitoare la relația doză-efect. Evaluarea neurotoxicității pentru dezvoltare, inclusiv studii epidemiologice umane sau rapoarte de caz și studii experimentale pe animale (de exemplu, datele toxicocinetice, informații de structură-activitate, date de la alte studii de toxicitate), trebuie să fie cuprinsă în caracterizare. Evaluarea datelor trebuie să includă o discuție a semnificației biologice și statistice. Evaluarea trebuie să includă relația, dacă există, între modificările neuropatologice și comportamentale observate. Pentru orientări privind interpretarea rezultatelor de neurotoxicitate pentru dezvoltare, a se vedea metoda de testare B.53 (35) și Tyl et al., 2008 (31).

Cohorta 3 (imunotoxicitatea pentru dezvoltare)

83.   Suprimarea sau consolidarea funcției imunitare, astfel cum au fost evaluate cu ajutorul TDAR (răspunsul anticorpilor dependent de celulele T), trebuie evaluate în contextul tuturor observațiilor realizate. Semnificația rezultatului testului TDAR poate fi susținută de alte efecte asupra indicatorilor imunologici (de exemplu, celularitatea măduvei osoase, greutatea și histopatologia țesuturilor limfoide, distribuția subsetului de limfocite). Efectele stabilite de TDAR ar putea fi mai puțin semnificative în cazul altor fenomene toxice observate la concentrații de expunere mai mici.

84.   Documentul de orientare nr. 43 al OCDE ar trebui să fie consultat pentru ajutor în interpretarea rezultatelor privind reproducerea și neurotoxicitatea (26).

BIBLIOGRAFIE

(1)

Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment, Critical Reviews in Toxicology, 36, 69-98.

(2)

Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula Laboratory Animal Diets, Lab. Anim. Sci., 49, 530-536.

(3)

Zoetis, T. and I. Walls (2003), Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Washington, DC.

(4)

Moser, V.C., I. Walls and T. Zoetis (2005), Direct Dosing of Preweaning Rodents in Toxicity Testing and Research: Deliberations of an ILSI RSI Expert Working Group, International Journal of Toxicology, 24, 87-94.

(5)

Conolly, R.B., B.D. Beck, and J.I. Goodman (1999), Stimulating Research to Improve the Scientific Basis of Risk Assessment, Toxicological Sciences, 49, 1-4.

(6)

Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), Detection of Effects on Male Reproduction — a Literature Survey, Journal of the American College of Toxicologists, 14, 293-327.

(7)

Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), Some Aspects Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 37, 356-369.

(8)

Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. Mayahara and Y. Ohno (2000). Collaborative work to evaluate toxicity on male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies, Journal of Toxicological Sciences, 25, 1-21.

(9)

Creasy, D.M. (2003), Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxicologic Pathology, Birth Defects Research, Part B, 68, 408-415.

(10)

Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper (2007), The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.

(11)

Sadleir, R.M.F.S. (1979), Cycles and Seasons, in C.R. Auston and R.V. Short (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.

(12)

Gallavan, R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds (1999), Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.

(13)

Korenbrot, C.C., I.T. Huhtaniemi and R.I. Weiner (1977), Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat, Biological Reproduction, 17, 298-303.

(14)

Ladics, G.S. (2007), Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxicity Testing, Methods, 41, 9-19.

(15)

Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. Herzyk (2004), Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemocyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation, Toxicology, 197, 23-35.

(16)

Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat, Fundamental and Applied Toxicology, 12, 92-108.

(17)

Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), Daily Sperm Production and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats, Journal of Reproduction and Fertility,54, 103-107.

(18)

Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), The Method of Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Following Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat. Reproductive Toxicology,5, 39-44.

(19)

Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report, Reproductive Toxicology, 10, 237-244.

(20)

Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), Methods for Assessing Rat Sperm Motility, Reproductive Toxicology, 6, 267-273.

(21)

Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), Direct Effects of Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In Vitro Demonstration, Journal of Andrology, 13, 409-421.

(22)

Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), Rat Sperm Motility Analysis: Methodologic Considerations, Reproductive Toxicology, 5, 449-458.

(23)

Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), Computer-Assisted Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer, Methods in Toxicology, Part A, Academic, Orlando, Florida. pp. 319-333.

(24)

Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), The Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations, Journal of Andrology, 10, 401-415.

(25)

Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), Endpoints of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants, Reproductive Toxicology, 6, 491-505.

(26)

OECD (2008), Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment, Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/JM/MONO(2008)16, OECD, Paris.

(27)

Working, P.K., M. Hurtt (1987), Computerized Videomicrographic Analysis of Rat Sperm Motility, Journal of Andrology, 8, 330-337.

(28)

Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), A ’Best Practices’ Approach to Neuropathologic Assessment in Developmental Neurotoxicity Testing — for Today, Toxicological Pathology, 34, 296-313.

(29)

Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de Duffard, and R. Duffard (2006), Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of their Major Components, Food Chemicals Toxicology, 44, 8-16.

(30)

Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Caviness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), Variations in Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats, Environmental health perspectives, 115(12), 1717-1726.

(31)

Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. Sobotka (2008), Identification and Interpretation of Developmental Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoints, Neurotoxicology and Teratology, 30: 349-381.

(32)

OECD (1996), Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test, OECD Guideline for Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Paris.

(33)

Capitolul B.43 din prezenta anexă, Studiu de neurotoxicitate la rozătoare.

(34)

OECD (2000), Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations, Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.

(35)

Capitolul B.53 din prezenta anexă, Studiu de neurotoxicitate pentru dezvoltare.

(36)

Capitolul B.54 din prezenta anexă, Biotestul uterotrofic la rozătoare: un test de depistare pe termen scurt pentru substanțe cu proprietăți estrogenice.

(37)

Capitolul B.55 din prezenta anexă, Biotestul Hershberger la șobolani: un test de depistare pe termen scurt pentru substanțe cu proprietăți (anti)androgenice.

(38)

OECD (2009), Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine and Reproductive Test in Rodents, Series on Testing and Assessment, No. 106, OECD, Paris.

(39)

OECD (2011), Guidance Document on the Current Implementation of Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada, Series on Testing and Assessment, No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Paris.

(40)

OECD (2013), Guidance Document supporting TG 443: Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, Series on Testing and Assessment, No. 151, OECD, Paris.

B.57.   TESTUL DE STEROIDOGENEZĂ A H295R

INTRODUCERE

1.   Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (OT) nr. 456 (2011). În 1998, OCDE a inițiat o activitate cu un nivel ridicat de prioritate pentru a revizui orientările existente și a elabora noi orientări pentru depistarea și testarea posibililor perturbatori endocrini. Cadrul conceptual al OCDE pentru testarea și evaluarea perturbatorilor endocrini din 2002 cuprinde cinci niveluri, fiecare nivel corespunzând unui nivel diferit de complexitate biologică (1). Testul de steroidogeneză H295R in vitro (H295R) descris în prezenta metodă de testare utilizează o linie de celule adenocarcinom umane (celule NCI-H295R) și constituie un «test in vitro, furnizând date mecaniciste» de nivel 2, care se utilizează în scopuri de depistare și prioritizare. Dezvoltarea și standardizarea testului ca test de depistare a efectelor chimice asupra steroidogenezei, și anume, asupra producției de estradiol 17β (E2) și testosteron (T), s-a efectuat printr-un proces cu mai multe etape. Testul H295R a fost optimizat și validat (2) (3) (4) (5).

2.   Obiectivul testului de steroidogeneză H295R este depistarea substanțelor chimice care afectează producția de E2 și T. Testul H295R este destinat identificării substanțelor xenobiotice care au ca țintă (ținte) componentele endogene care alcătuiesc mecanismul biochimic intracelular începând cu secvența de reacții de la colesterol la producerea de E2 și/sau T. Testul H295R nu este destinat identificării substanțelor chimice care afectează steroidogeneza din cauza efectelor asupra axului hipotalamic-pituitar-gonadal (HPG). Scopul testului este de a oferi un răspuns DA/NU în ceea ce privește potențialul unei substanțe chimice de a induce sau a inhiba producerea de T și E2; cu toate acestea, în unele cazuri se pot obține rezultate cantitative (a se vedea punctele 53 și 54). Rezultatele testului sunt exprimate ca modificările relative la nivelul producției de hormoni în comparație cu martorii pentru solvent (MS). Testul nu este menit să furnizeze informații referitoare la mecanismul specific privind interacțiunea substanței de testat cu sistemul endocrin. Cercetările au fost efectuate utilizând linia celulară pentru a identifica efecte asupra unor enzime specifice și hormoni intermediari, cum ar fi progesteronul (2).

3.   Definițiile și abrevierile utilizate în prezenta metodă de testare sunt descrise în apendice. Un protocol detaliat, inclusiv instrucțiuni privind modul de elaborare a soluțiilor, cultivarea celulelor și efectuarea diferitelor aspecte ale testului, este disponibil ca apendicele I-III la documentul OCDE «Validarea interlaboratoare a testului de steroidogeneză H295R pentru a identifica modulatori ai producției de testosteron și estradiol» (4).

CONSIDERAȚII INIȚIALE ȘI LIMITE DE APLICARE

4.   Cinci enzime diferite care catalizează șase reacții distincte sunt implicate în biosinteza hormonilor steroizi sexuali. Conversia enzimatică a colesterolului la pregnenolon prin enzima (CYP11A) de disociere laterală a colesterolului citocrom P450 (CYP) constituie un prim pas într-o serie de reacții biochimice care se încheie cu sinteza de steroizi ca produse finite. În funcție de ordinea următoarelor două reacții, mecanismul steroidogenic se împarte în două: mecanismul Δ5-hidroxisteroid și mecanismul Δ4ketosteroid, care converg în producția de androstendion (figura 1).

5.   Androstenedionul este convertit în testosteron (T) de către dehidrogenaza 17βhidroxisteroidului (17β-HDS). Testosteronul este atât un produs intermediar, cât și un hormon produs final. La masculi, T poate fi convertit la dihidrotestosteron (DHT) de 5α-reductaza, care se găsește în membranele celulare, anvelopa nucleară și reticulul endoplasmic al țesuturilor vizate de acțiunile androgenice, cum ar fi prostata și veziculele seminale. DHT este semnificativ mai puternic ca androgen decât T și este, de asemenea, considerat un hormon produs finit. Testul H295R nu măsoară DHT (a se vedea punctul 10).

6.   Enzima din mecanismul steroidogenic care transformă substanțele chimice androgenice în substanțe chimice estrogenice chimice este aromataza (CYP19). CYP19 transformă T în 17β-estradiol (E2) și androstenedion în estron. E2 și T sunt considerați hormoni produși finali pe filieră steroidogenică.

7.   Specificitatea activității liazei diferă în cazul CYP17 pentru substraturile intermediare între specii. La om, enzima favorizează substraturi ale mecanismului Δ5-hidroxisteroid (pregnenolon), în timp ce substraturile din mecanismul Δ4-ketosteroid (progesteron) sunt favorizate la șobolan (19). Astfel de diferențe în activitatea liazei CYP17 pot explica unele diferențe dependente de specii, ca răspuns la substanțele chimice care modifică steroidogeneza in vivo (6). Celulele H295 s-au dovedit a reflecta mai îndeaproape expresia enzimei adrenale adulte umane și modelul de producere a steroizilor (20), dar se știe că acestea exprimă enzime atât pentru mecanismul Δ5hidroxisteroid, cât și pentru mecanismul Δ4-ketosteroid pentru sinteza de androgeni (7) (11) (13) (15).

Figura 1

Mecanismul steroidogenic în celulele H295R

Notă:

Enzimele sunt cu caractere italice, hormonii sunt cu caractere îngroșate și săgețile indică direcția de sinteză. Fundalul gri indică mecanisme/produse corticosteroide. Mecanismele/produsele steroide sexuale sunt încercuite. CYP = citocrom P450; HSD = dehidrogenaza hidroxisteroidului; DHEA = dehidroepiandrosteron.

8.   Linia de celule adenocarcinom umane H295R este un model in vitro util pentru investigarea efectelor asupra sintezei de hormoni steroizi (2) (7) (8) (9) (10). Linia de celule H295R exprimă gene care codifică pentru toate enzimele cheie pentru steroidogeneză precizate mai sus (11) (15) (figura 1). Aceasta este o proprietate unică, întrucât expresia in vivo a acestor gene este țesutul și este specifică etapei de dezvoltare, iar, de regulă, nu există un singur țesut sau o etapă de dezvoltare care să exprime toate genele implicate în steroidogeneză (2). Celulele H295R au caracteristicile fiziologice ale celulelor adrenale fetale umane nediferențiate zonal (11). Celulele reprezintă un sistem unic in vitro în care acestea au capacitatea de a produce toți hormonii steroizi găsiți în cortexul adrenal și gonade la adult, permițând testarea efectelor asupra sintezei de corticosteroizi și producerea de hormoni steroizi sexuali, cum ar fi androgeni și estrogeni, deși testul a fost validat doar pentru a detecta T și E2. Modificările înregistrate de sistemul de testare sub formă de alterare la nivelul producerii de T și E2 pot fi rezultatul unei multitudini de interacțiuni diferite ale substanțelor chimice de testat cu funcțiile steroidogene care sunt exprimate de celulele H295R. Acestea includ modularea expresiei, a sintezei sau a funcției enzimelor implicate în producerea, transformarea sau eliminarea hormonilor steroizi (12) (13) (14). Inhibarea producției de hormoni se poate datora legării concomitente de o enzimă din mecanism, impactului asupra unor cofactori precum NADPH (nicotinamida adenin dinucleotid fosfat) și AMP ciclic (adenozin monofosfat ciclic) și/sau creșterii metabolismului steroizilor sau eliminării expresiei genice a anumitor enzime implicate în steroidogeneză. În timp ce inhibarea poate fi o funcție a proceselor implicate direct sau indirect de producția de hormoni, inducția este, de regulă, de natură indirectă, de exemplu, prin afectarea unor cofactori, cum ar fi NADPH și AMP ciclic (cum este cazul forskolinului), scăderea metabolismului steroizilor (13) și reglarea în sens ascendent a expresiei steroidogenice a genei.

9.   Testul H295R are mai multe avantaje:

—	permite detectarea creșterilor și a scăderilor la nivelul producției de T și E2;

—

permite evaluare directă a impactului potențial al unei substanțe chimice asupra viabilității/citotoxicității celulare. Aceasta este o caracteristică importantă, deoarece permite discriminarea între efectele determinate de citotoxicitate de cele determinate de interacțiunea directă a substanțelor chimice cu mecanismele steroidogenice, ceea ce nu este posibil în sisteme de explanturi de țesut care constau în mai multe tipuri de celule de diferite niveluri de sensibilitate și funcționalități;

—	nu implică utilizarea animalelor;

—	linia de celule H295R este disponibilă în comerț.

10.   Principalele limitări ale testului sunt următoarele:

—	capacitatea sa metabolică este necunoscută, dar probabil destul de limitată; prin urmare, substanțele chimice care trebuie să fie activate metabolic vor fi probabil ratate în cadrul testului;

—	fiind derivat din țesut adrenal, H295R posedă enzimele capabile să producă gluco- și mineralocorticoizi, precum și hormoni sexuali; astfel, efectele asupra producției de gluco- și mineralocorticoizi ar putea influența nivelurile de T și E2 observate în test;

—	nu măsoară DHT și, prin urmare, nu este de așteptat să detecteze substanțele chimice care împiedică 5α-reductaza, caz în care poate fi utilizat testul Hershberger (16);

—	testul H295R nu va identifica substanțele chimice care interferează cu steroidogeneza prin afectarea axului hipotalamic-pituitar-gonadal (HPG), întrucât acest aspect poate fi studiat doar la animale intacte.

Principiul testului

11.   Scopul testului este de a detecta substanțele chimice care afectează producția de T și E2. T este, de asemenea, un intermediar în mecanismul de producere a E2. Testul poate detecta substanțele chimice care, de regulă, inhibă sau induc enzimele implicate în steroidogeneză.

12.   Testul se desfășoară în mod normal în condiții standard de cultură a celulelor pe plăci de cultură cu 24 de godeuri. Alternativ, se pot utiliza alte dimensiuni de plăci pentru efectuarea testului; cu toate acestea, condițiile de semănare și experimentale trebuie ajustate în consecință pentru a menține aderarea la criteriile de performanță.

13.   După o perioadă de aclimatizare de 24 de ore în plăci cu godeuri multiple, celulele se expun timp de 48 de ore la șapte concentrații ale substanței chimice de testat în cel puțin trei exemplare. Solventul, precum și un inhibitor și un inductor de producție de hormoni cunoscuți sunt utilizați la o concentrație fixă, ca martori negativi și pozitivi. La sfârșitul perioadei de expunere, mediul este îndepărtat din fiecare godeu. Viabilitatea celulară din fiecare godeu este analizată imediat după îndepărtarea mediului. Concentrațiile de hormoni din mediu se pot măsura utilizând diverse metode, inclusiv truse de măsurare a nivelurilor de hormoni disponibile în comerț și/sau tehnici instrumentale precum cromatografia lichidă cuplată cu spectrometrie de masă (LC-MS). Datele sunt exprimate ca multiplu de schimbare în raport cu martorul pentru solvent și concentrația cea mai mică cu efect observat (CMEO). În cazul în care testul este negativ, cea mai mare concentrație testată este raportată ca fiind concentrația fără efect observat (CFEO). Concluziile cu privire la capacitatea unei substanțe chimice de a afecta steroidogeneza trebuie să se bazeze pe cel puțin două serii de teste independente. Primul test aplicat poate funcționa ca un test de identificare a intervalului cu ajustare ulterioară a concentrațiilor pentru testele 2 și 3, dacă este cazul, în cazul în care există probleme de solubilitate sau de citotoxicitate sau activitatea substanței chimice pare a fi la sfârșitul intervalului de concentrații testate.

PROCEDURA DE CULTIVARE

Linie de celule

14.   Celulele NCI-H295R sunt disponibile comercial de la American Type Culture Collections (ATCC), la semnarea unui acord de transfer de material (MTA) (14).

Introducere

15.   Datorită schimbărilor intervenite la nivelul capacității celulelor de producție de E2 la îmbătrânire/reînsămânțare (2), celulele se cultivă urmând un protocol specific înainte ca acestea să fie utilizate și se notează numărul de reînsămânțări de când celulele au fost decongelate, precum și numărul reînsămânțării la care celulele au fost congelate și introduse în azot lichid pentru stocare. Primul număr indică numărul curent de reînsămânțare al celulelor și cel de-al doilea număr indică numărul de reînsămânțare la care celulele au fost congelate și stocate. De exemplu, celulele care au fost congelate după reînsămânțarea cinci și dezghețate, iar ulterior au fost separate de trei ori (4 reînsămânțări, numărând celulele proaspăt decongelate ca reînsămânțarea 1) după ce au fost cultivate din nou ar fi etichetate drept reînsămânțarea 4.5. Un exemplu de sistem de numerotare este ilustrat în apendicele I din raportul de validare (4).

16.   Se utilizează mediul stoc ca bază pentru mediile de completare și de congelare. Mediul de completare este o componentă necesară pentru cultivarea celulelor. Mediul de congelare este conceput anume pentru a permite congelarea celulelor fără impact asupra acestora, pentru stocare pe termen lung. Înainte de utilizare, Nu-serum [sau un ser comparabil ca proprietăți, care s-a demonstrat că produce date care satisfac performanța testelor și cerințele de control al calității (CC)], care este un element constitutiv al mediilor de completare, trebuie analizat pentru identificarea concentrațiilor de fond T și E2. Prepararea soluțiilor este descrisă în apendicele II la raportul de validare (4).

17.   După inițierea unei culturi de celule H295R pornind de la un lot inițial ATCC, celulele sunt cultivate pentru cinci însămânțări (și anume, celulele sunt separate de 4 ori). Celulele de însămânțare 5 sunt ulterior congelate în azot lichid pentru stocare. Înainte de congelarea celulelor, se aplică un eșantion de celule anterioare de reînsămânțarea 4 pe o placă CC (a se vedea punctele 36 și 37) pentru a verifica dacă producția bazală de hormoni și răspunsul la substanțele martor pozitive îndeplinesc criteriile de control ale testului calității, astfel cum sunt definite în tabelul 5.

18.   Celulele H295R trebuie să fie cultivate, congelate și stocate în azot lichid pentru a se asigura că există întotdeauna celule de reînsămânțarea/vârsta corespunzătoare disponibile pentru cultivare și utilizare. Numărul maxim de însămânțări după luarea unui lot nou (15) sau congelat (16) de celule în cultură care este acceptabil pentru utilizare în testul H295R nu trebuie să depășească 10. De exemplu, însămânțările acceptabile pentru culturile de celule dintr-un lot congelat la reînsămânțarea 5 ar urma să fie de 4.5 până la 10.5. Pentru inițierea celulelor din loturile congelate, se respectă procedura descrisă la punctul (19). Celulele se cultivă pentru cel puțin patru (4) însămânțări suplimentare (reînsămânțarea 4.5) înainte de a fi utilizate în test.

Celulele de plecare din rezerva congelată

19.   Procedura de inițiere a celulelor din rezerva congelată se utilizează atunci când un nou lot de celule este scos din depozitul de azot lichid pentru cultivare și testare. Detaliile procedurii sunt prevăzute în apendicele III la raportul de validare (4). Celulele se extrag din depozitul de azot lichid, se decongelează rapid, se introduc într-un mediu de completare într-un tub de centrifugă, sunt centrifugate la temperatura camerei, resuspendate în mediu de completare și transferate într-o balon de cultură. Mediul trebuie să fie schimbat în ziua următoare. Celulele H295R sunt cultivate într-un incubator la 37 °C în atmosfera de aer cu 5 % CO2 și mediul este reînnoit de 2-3 ori pe săptămână. Atunci când celulele sunt aproximativ 85-90 % confluente, acestea trebuie să fie divizate. Divizarea celulelor este necesară pentru a se asigura sănătatea și creșterea celulelor și pentru a păstra celule pentru efectuarea de bioteste. Celulele sunt clătite de trei ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS, fără Ca2+ Mg2+.) și se eliberează din balonul de cultură prin adăugarea unei enzime de detașare adecvate, de exemplu, tripsina, în PBS (fără Ca2+ Mg2+). Imediat ce celulele se desprind de balonul de cultură, acțiunea enzimei ar trebui să fie oprită prin adăugarea unui mediu de completare la un raport de 3 × volumul utilizat pentru tratamentul enzimatic. Celulele sunt introduse într-un tub de centrifugă, centrifugate la temperatura camerei, supernatantul se elimină, iar extractul concentrat de celule se resuspendă în mediu de completare. Cantitatea corespunzătoare de soluție de celule se introduce într-un nou vas de cultură. Cantitatea de soluție de celule se ajustează astfel încât celulele să fie confluente în 5-7 zile. Raportul recomandat de sub-cultivare este de 1: 3 și 1: 4. Placa se etichetează cu atenție. În această etapă celulele sunt gata pentru a fi utilizate la testare și celulele suplimentare trebuie să fie congelate în azot lichid, astfel cum se specifică la punctul 20.

Congelarea celulelor H 295R (prepararea celulelor pentru stocare în azot lichid)

20.   Pentru a prepara celulele H 295R pentru congelare, procedura descrisă mai sus pentru separarea celulelor trebuie urmată până la treapta pentru resuspendarea concentratului de celule din partea de jos a tubului de centrifugare. În această etapă, concentratul de celule se re-resuspendă în mediul de congelare. Soluția este transferată într-un flacon criogenic, etichetat în mod corespunzător și congelat la – 80°C timp de 24 h, după care flaconul de criogenie este transferat în azot lichid pentru stocare. Detaliile procedurii sunt prevăzute în apendicele III la raportul de validare (4).

Plasarea pe plăci și preincubarea celulelor pentru testare

21.   Numărul de plăci cu 24 de godeuri, preparate astfel cum s-a specificat la punctul 19, care vor fi necesare depinde de numărul de substanțe chimice care urmează să fie testate și de confluența celulelor în vasele de cultură. Ca regulă generală, un balon de cultură (75 cm2) cu 80-90 % celule confluente va furniza suficiente celule pentru una până la 1,5 plăci (cu 24 de godeuri), la o densitate țintă de 200 000 până la 300 000 celule/ml de mediu care rezultă în aproximativ 50-60 % confluență în godeuri la 24 de ore (figura 2). Aceasta este, în mod normal, densitatea celulară optimă pentru producția de hormoni în cadrul testului. La densități mai mari, modelele de producție ale T și E2 se modifică. Înainte de a efectua testul prima dată, se recomandă să se testeze diferite densități de însămânțare între 200 000 și 300 000 celule/ml și se recomandă selectarea densității care rezultă într-o confluență de 50-60 % în godeu la 24 de ore pentru experiențe suplimentare.

Figura 2

Fotomicrografie a celulelor H295R la o densitate de însămânțare de 50 % într-o placă de cultură cu 24 de godeuri și preluate la 24 de ore la marginea (A) și în centrul (B) al unui godeu.

22.   Mediul este pipetat din balonul de cultură, iar celulele sunt spălate de 3 ori cu PBS sterilă (fără Ca2+Mg2+). Se adaugă soluție enzimatică (în PBS) pentru desprinderea celulelor de balonul de cultură. După o perioadă adecvată pentru detașarea celulelor, acțiunea enzimei trebuie să fie oprită prin adăugarea unui mediu de completare într-un raport de 3× volumul utilizat pentru tratamentul enzimatic. Celulele sunt introduse într-un tub de centrifugă, centrifugate la temperatura camerei, supernatantul se elimină, iar extractul concentrat de celule se resuspendă în mediu de completare. Densitatea celulară se calculează utilizând, de exemplu, un hemocitometru sau un contor de celule. Soluția de celule se diluează până la densitatea dorită pentru placare și este amestecată cu atenție, pentru a asigura densitatea celulară omogenă. Celulele sunt dispuse pe placă cu 1 ml soluție de celule/godeu, iar plăcile și godeurile se etichetează. Plăcile însămânțate se incubează la 37 °C în atmosferă de aer cu sub 5 % CO2 timp de 24 de ore pentru a permite celulelor să se atașeze la godeuri.

CERINȚE DE CONTROL AL CALITĂȚII

23.   Este esențial ca în timpul administrării să se furnizeze volumele exacte ale soluțiilor și ale eșantioanelor în godeuri, întrucât volumele determină concentrațiile utilizate în calculele de analiză a rezultatelor.

24.   Înainte de a iniția cultura celulară și testarea ulterioară, fiecare laborator trebuie să demonstreze sensibilitatea sistemului său de măsurare a hormonilor (punctele 29-31).

25.   În cazul în care se vor utiliza teste de măsurare a hormonilor pe bază de anticorpi, substanțele chimice supuse testului trebuie analizate pentru a identifica potențialul acestora de a interfera cu sistemul de măsurare utilizat pentru a cuantifica T și E2, astfel cum se indică la punctul 32, înainte de începerea testării.

26.   DMSO este solventul recomandat pentru test. Dacă se utilizează un alt solvent, trebuie să se determine următoarele:

—	solubilitatea substanței chimice de testat, forskolin și procloraz în solvent; și

—	citotoxicitatea în funcție de concentrația de solvent.

Concentrația maximă admisibilă a solventului se recomandă să nu depășească o diluție 10 × din cea mai mică concentrație citotoxică a solventului.

27.   Înainte de a efectua testarea pentru prima dată, laboratorul trebuie să efectueze un experiment de calificare care să demonstreze faptul că acesta este în măsură să mențină și să obțină culturile celulare corespunzătoare și condițiile experimentale necesare pentru analize chimice, astfel cum se specifică la punctele 33-35.

28.   La începerea testării prin utilizarea unui nou lot, trebuie să se realizeze o placă de control înainte de a utiliza un nou lot de celule pentru a evalua performanța celulelor conform descrierii de la punctele 36 și 37.

Performanța sistemului de măsurare a hormonilor

Sensibilitatea, exactitatea, precizia și trans-reactivitatea metodei cu matrice eșantion

29.   Fiecare laborator poate utiliza un sistem de măsurare a hormonilor la alegerea sa pentru analiza producției de T și E2 de către celulele H295R, cu condiția ca acesta să îndeplinească criteriile de performanță, inclusiv limita de cuantificare (LC). Nominal, acestea sunt de 100 pg/ml pentru T și de 10 pg/ml pentru E2, valori care se bazează pe nivelurile bazale ale hormonilor observate în studiile de validare. Cu toate acestea, niveluri mai mari sau mai mici pot fi adecvate, în funcție de nivelurile bazale ale hormonilor înregistrate în laboratorul în care se efectuează studiul. Înainte de inițierea plăcii CC și a ciclurilor de teste, laboratorul trebuie să demonstreze că analiza hormonului de utilizat poate măsura concentrațiile de hormon în mediul de completare cu suficientă acuratețe și precizie, pentru a se îndeplini criteriile CC prevăzute în tabelele 1 și 5, analizând mediul de completare la care s-a adăugat un martor hormon intern. La mediul de completare se adaugă cel puțin trei concentrații din fiecare hormon (de exemplu, 100, 500 și 2 500 pg/ml de T; 10, 50 și 250 pg/ml de E2; sau se pot utiliza concentrațiile cele mai mici posibile bazate pe limitele de detectare ale sistemul ales de măsurare a hormonilor pentru cele mai mici variabilități ale concentrației de T și E2) și se analizează. Concentrațiile măsurate ale hormonilor în eșantioanele neextrase trebuie să fie în limita a 30 % din concentrațiile nominale, iar diferențele între măsurătorile duble pentru aceeași probă nu trebuie să depășească 25 % (a se vedea, de asemenea, tabelul 8 pentru noi criterii CC). În cazul în care sunt îndeplinite criteriile CC, se presupune că analiza testului selectat pentru măsurarea hormonilor este suficient de precisă și nu provoacă o reacție încrucișată cu componentele din mediu (matricea eșantion), astfel încât să fie preconizată o influență semnificativă asupra rezultatului testului. În acest caz, nu este necesară o extracție de eșantioane înainte de măsurarea hormonilor.

30.   În cazul în care nu sunt îndeplinite criteriile CC din tabelele 1 și 8, poate apărea un important efect de matrice și trebuie să se efectueze un experiment cu mediu extras contaminat. Un exemplu de procedură de extracție este descris în apendicele II la raportul de validare (4). Măsurarea concentrațiilor de hormoni în eșantioanele extrase se efectuează în trei exemplare (17). În cazul în care se poate dovedi că, după extracție, componentele mediului nu interferează cu metoda de depistare a hormonilor, astfel cum se definește în criteriile CC, orice alte experimente trebuie să se efectueze cu eșantioane extrase. În cazul în care criteriile CC nu pot fi îndeplinite după extragere, sistemul utilizat pentru măsurarea hormonilor nu este adecvat pentru scopul testului de steroidogeneză H295R și trebuie să se utilizeze o altă metodă de detectare a hormonilor.

Curba standard

31.   Concentrațiile de hormon ale probelor martor pentru solvent (MS) trebuie să se situeze în porțiunea liniară a curbei standard. De preferință, valorile MS ar trebui să fie în apropierea centrului porțiunii liniare pentru a garanta că se poate măsura inducerea și inhibarea sintezei de hormoni. Diluțiile de mediu (sau extras) de măsurat se selecționează în consecință. Relația liniară se determină printr-o abordare statistică adecvată.

Interferența substanței de testat

32.   În cazul în care se vor utiliza teste pe bază de anticorpi, cum ar fi testul de absorbție imunoenzimatică ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) și testele de radioimunodozare (Radio-Immuno Assays, RIA) pentru a măsura valorile hormonilor, fiecare substanță chimică trebuie să fie testată pentru o posibilă interferență cu sistemul de măsurare a hormonilor care va fi utilizat înainte de inițierea efectivă a substanțelor chimice [apendicele III la raportul de validare (4)], întrucât unele substanțe chimice pot interfera cu testele (17). Dacă apare interferența, și anume, ≥ 20 % din producția bazală de hormoni pentru T și/sau E2, astfel cum este stabilită de analiza hormonilor, testul de stabilire a interferenței asupra analizei hormonilor chimici [astfel cum este descris în apendicele III la raportul de validare (4), secțiunea 5.0] ar trebui să se aplice la toate diluțiile de soluție stoc ale substanței chimice testate pentru a identifica doza prag la care are loc o interferență semnificativă (≥ 20 %). În cazul în care interferența nu depășește 30 %, rezultatele pot fi corectate ținând cont de interferență. În cazul în care interferența depășește 30 %, datele nu sunt valabile și datele la concentrațiile respective trebuie să fie eliminate. În cazul în care are loc o interferență semnificativă a substanței chimice de testat cu un sistem de măsurare a hormonilor la nivelul mai multor concentrații necitotoxice, trebuie utilizat un alt sistem de măsurare a hormonilor. În vederea evitării interferenței unor substanțe chimice contaminante, se recomandă ca hormonii să fie extrași din mediu utilizând un solvent adecvat, metodele posibile putând fi consultate în raportul de validare (4).

Tabelul 1

Criterii de performanță pentru sistemele de măsurare a hormonilor

Parametru	Criteriu
Sensibilitatea metodei de măsurare	Limita de cuantificare (LC) T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (18)
Eficiența extracției hormonilor (numai în cazul în care extracția este necesară)	Ratele de recuperare medii (pe baza a trei măsurători duplicate) pentru cantitățile de hormoni îmbogățite nu trebuie să se abată cu mai mult de 30 % de la cantitatea care a fost adăugată.
Interferența substanței (numai sistemele bazate pe anticorpi)	Nu ar trebui să se manifeste nicio trans-reactivitate substanțială (≥ 30 % din producția bazală de hormoni a hormonului respectiv) cu oricare dintre hormonii produși de celule (19)  (20)

Testul de competență a laboratorului

33.   Înaintea testării unor substanțe chimice necunoscute, un laborator trebuie să demonstreze că poate să obțină și să mențină o cultură de celule adecvată și condițiile de testare necesare pentru desfășurarea cu succes a testului de competență a laboratorului. Întrucât performanța unei analize este direct legată de personalul de laborator care efectuează testul, procedurile ar trebui să fie parțial repetate în cazul în care apare o modificare a personalului de laborator.

34.   Testul de competență se va efectua în aceleași condiții enumerate la punctele 38-40, prin expunerea celulelor la 7 concentrații gradate de inductori și inhibitori puternici, moderați și slabi, precum și o substanță negativă (a se vedea tabelul 2). În mod specific, substanțele chimice de testat includ inductorul puternic forskolin (CAS nr. 66575-29-9); inhibitorul puternic procloraz (CAS nr. 67747-09-5); inductorul moderat atrazină (CAS nr. 1912-24-9); inhibitorul moderat aminoglutetimidă (CAS 125-84-8); inductorul slab (producție E2) și inhibitorul slab bisfenol A (producție T) (CAS nr. 80-05-7); și substanța chimică negativă gonadotropina corionică umană (HCG) (CAS nr. 9002-61-3) astfel cum se arată în tabelul 2. Se aplică plăci separate pentru toate substanțele chimice, utilizând formatul specificat în tabelul 6. O placă CC (tabelul 4, punctele 36-37) se include zilnic în testele pentru substanțele chimice de verificare.

Tabelul 2

Substanțe chimice de testat și concentrațiile de expunere

Substanțe chimice de verificare	Concentrațiile de testare [μM]
Procloraz	0 (21), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10
Forskolin	0 (21), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30
Atrazină	0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
Aminoglutetimidă	0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
Bisfenol A	0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100
HCG	0 (21), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100

Expunerea H295R la substanțele chimice de verificare trebuie realizată pe plăci de 24 de godeuri în timpul testului de competență a laboratorului. Stabilirea dozelor se realizează în μM pentru toate substanțele de testat. Dozele se administrează în DMSO la 0,1 % v/v în fiecare godeu. Toate concentrațiile trebuie să fie testate în trei godeuri duplicate (tabelul 6). Fiecare substanță chimică se testează pe plăci separate. O placă CC este inclusă în fiecare zi de desfășurare.

35.   Analizele de viabilitate celulară și a hormonilor se desfășoară astfel cum se prevede la punctele 42-46. Valoarea prag (CMEO) și decizia de clasificare ar trebui să fie raportate și comparate cu valorile din tabelul 3. Datele sunt considerate acceptabile în cazul în care acestea îndeplinesc CFEO și deciziile de clasificare din tabelul 3.

Tabelul 3

Valorile prag (CMEO) și deciziile de clasificare a substanțelor chimice de testat

	CAS nr.	CMEO [μM]		Decizie de clasificare
		T	E2	T	E2
Procloraz	67747-09-5	≤ 0,1	≤ 1,0	+ (22) (Inhibare)	+ (Inhibare)
Forskolin	66575-29-9	≤ 10	≤ 0,1	+ (Inducere)	+ (Inducere)
Atrazina	1912-24-9	≤ 100	≤ 10	+ (Inducere)	+ (Inducere)
Aminoglutetimida	125-84-8	≤ 100	≤ 100	+ (Inhibare)	+ (Inhibare)
Bisfenol A	80-05-7	≤ 10	≤ 10	+ (Inhibare)	+ (Inducere)
HCG	9002-61-3	n/a	n/a	Negativ	Negativ

Placa de control al calității

36.   Placa de control al calității (CC) este utilizată pentru a verifica performanța celulelor H295R în conformitate cu condițiile standardului de cultivare și pentru a stabili o bază de date istorice privind concentrațiile de hormoni în martorii pentru solvent, martorii pozitivi și martorii negativi, precum și alte măsuri de control al calității în timp.

—

performanța celulelor H295R trebuie să fie evaluată utilizând o placă CC pentru fiecare lot nou de la ATCC sau după utilizarea pentru prima dată a unei rezerve de celule congelată anterior, cu excepția cazului în care testul de competență a laboratorului (punctele 32-34) s-a efectuat pe lotul de celule respectiv;

—	o placă CC oferă o evaluare completă a condițiilor de testare (de exemplu, viabilitate celulară, martori pentru solvent, martori pozitivi și negativi, precum și variabilitate intra- și intertest) pentru testarea de substanțe chimice și trebuie să facă parte din fiecare ciclu de test.

37.   Testul CC este efectuat utilizând o placă cu 24 de godeuri și urmează aceleași proceduri de incubare, dozare, viabilitate/citotoxicitate celulară, extracție hormonală și analiză hormonală descrise la punctele 38-46 pentru testarea substanțelor chimice. Placa CC conține spații libere, martori pentru solvent și două concentrații ale unui inductor (forskolin, 1, 10 μM) și inhibitor cunoscut (procloraz, 0,1, 1 μM) al sintezei de E2 și T. În plus, în godeuri selectate se utilizează MeOH ca martor pozitiv pentru testul de viabilitate/citotoxicitate. În tabelul 4 se găsește o descriere detaliată a aspectului plăcii. În tabelul 5 sunt enumerate criteriile care trebuie îndeplinite cu privire la placa CC. Trebuie să se obțină producția minimă bazală de hormoni pentru T și E2 atât în martorul pentru solvent, cât și în godeurile libere.

Tabelul 4

Aspectul plăcii de control al calității pentru testarea competenței celulelor H295R neexpuse și a celulelor expuse la inhibitori (PRO = procloraz) și stimulatori cunoscuți (FOR = forskolin) ai producției de E2 și T. După încheierea experimentului de expunere și îndepărtarea mediului, se adaugă o soluție de metanol MeOH 70 % la toate godeurile pentru a servi ca martor pozitiv pentru citotoxicitate [a se vedea testul de citotoxicitate în apendicele III la raportul de validare (4)]

	1	2	3	4	5	6
A	spațiu liber (23)	spațiu liber (23)	spațiu liber (23)	spațiu liber (23) (+ MeOH) (24)	spațiu liber (23) (+ MeOH) (24)	spațiu liber (23) (+ MeOH) (24)
B	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)	DMSO (25) 1 μl (+ MeOH) (24)
C	FOR 1 μM	FOR 1 μM	FOR 1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM	PRO 0,1 μM
D	FOR 10 μM	FOR 10 μM	FOR 10 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM	PRO 1 μM

Tabelul 5

Criterii de performanță pentru placa de control al calității

	T	E2
Producția bazală de hormoni în martorul pentru solvent (MS)	≥ 5 ori limita de cuantificare (LC)	≥ 2,5 ori limita de cuantificare (LC)
Inducere (10 μM forskolin)	≥ 1,5 ori MS	≥ 7,5 ori MS
Inhibare (1 μM procloraz)	≤ 0,5 ori MS	≤ 0,5 ori MS

PROCEDURA DE EXPUNERE LA SUBSTANȚE CHIMICE

38.   Celulele preincubate sunt scoase din incubator (punctul 21) și se verifică la microscop pentru a se asigura că sunt în stare bună (fixare, morfologie) înainte de dozare.

39.   Celulele sunt plasate într-un dulap de biosecuritate, iar mediul de completare este eliminat și înlocuit cu un nou mediu de completare (1 ml/godeu). DMSO este solventul preferat pentru prezenta metodă de testare. Cu toate acestea, în cazul în care există motive pentru a folosi alți solvenți, se prezintă justificarea științifică pentru aceasta. Celulele sunt expuse la substanța de testat prin adăugarea a 1 μl de soluție stoc corespunzătoare în DMSO [a se vedea apendicele II la raportul de validare (4)] per 1 ml de mediu de completare (volumul godeului). Aceasta conduce la o concentrație finală de 0,1 % DMSO în godeuri. Pentru a asigura amestecarea adecvată, se preferă, în general, ca soluția stoc corespunzătoare de substanță de testat din DMSO să fie amestecată cu mediu de completare, astfel încât să se obțină concentrația finală dorită pentru fiecare doză, iar amestecul se adaugă în fiecare godeu imediat după îndepărtarea mediului vechi. Dacă se utilizează această opțiune, concentrația de DMSO (0,1 %) trebuie să fie consecventă în toate godeurile. Godeurile care conțin cele mai mari două concentrații sunt evaluate vizual, cu ajutorul unui microscop stereoscopic, pentru a verifica formarea de precipitate sau aspectul tulbure ca o indicație a solubilității incomplete a substanței de testat. În cazul în care se observă astfel de condiții (formarea de precipitate, aspect tulbure), se examinează, de asemenea, godeurile care conțin următoarele concentrații mai mici (și așa mai departe), iar concentrațiile care nu sunt complet dizolvate în soluție urmează să fie excluse de la evaluare și analiză suplimentară. Placa este pusă din nou în incubator la 37 °C în atmosferă de aer cu sub 5 % CO2 timp de 48 ore. În tabelul 6 se prezintă aspectul plăcii substanței de testat. Stocurile 1-7 indică plasarea de doze din ce în ce mai mari ale substanței de testat.

Tabelul 6

Schema dozării pentru expunerea celulelor H295R la substanțe chimice de testat într-o placă cu 24 de godeuri

	1	2	3	4	5	6
A	DMSO	DMSO	DMSO	Stoc 4	Stoc 4	Stoc 4
B	Stoc 1	Stoc1	Stoc 1	Stoc 5	Stoc 5	Stoc 5
C	Stoc 2	Stoc 2	Stoc 2	Stoc 6	Stoc 6	Stoc 6
D	Stoc 3	Stoc 3	Stoc 3	Stoc 7	Stoc 7	Stoc 7

40.   După 48 ore de expunere, plăcile sunt scoase din incubator și fiecare godeu este verificat la microscop pentru a determina starea celulelor (fixare, morfologie, grad de confluență) și semne de citotoxicitate. Mediul din fiecare godeu este împărțit în două părți egale (aproximativ 490 μl fiecare) și este transferat în două flacoane separate etichetate corespunzător (de exemplu, o alicotă pentru a furniza un eșantion de rezervă pentru fiecare godeu). Pentru a preveni uscarea celulelor, mediul este înlăturat câte un rând sau o coloană o dată și se înlocuiește cu mediul pentru testul de viabilitate/citotoxicitate celulară. Dacă viabilitatea/citotoxicitatea celulară nu se măsoară imediat, se adaugă 200 μl PBS cu Ca2+ și Mg2+ la fiecare godeu. Mediile sunt congelate la – 80 °C până la prelucrarea ulterioară pentru analizarea concentrațiilor de hormoni (a se vedea punctele 44-46). În timp ce T și E2 în mediu păstrat la – 80 °C sunt, în general, stabili timp de cel puțin 3 de luni, stabilitatea hormonilor în timpul stocării trebuie documentată în fiecare laborator.

41.   Imediat după înlăturarea mediului, se determină viabilitatea/citotoxicitatea celulară pentru fiecare placă de expunere.

Determinarea viabilității celulare

42.   Un test de viabilitate/citotoxicitate a celulelor la alegere poate fi utilizat pentru a determina impactul potențial al substanței de testat asupra viabilității celulelor. Testul trebuie să poată furniza o măsură reală a procentului de celule viabile prezente într-un godeu sau trebuie să se demonstreze că aceasta este direct comparabilă cu (o funcție liniară din) testul celule vii/moarte (Live/Dead® Assay) [a se vedea apendicele III la raportul de validare (4)]. O altă analiză care s-a dovedit că funcționează la fel de bine este testul MTT [bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil) tetrazoliu] (18). Evaluarea viabilității celulare prin metodele de mai sus reprezintă o măsurare relativă care nu prezintă neapărat relații liniare cu numărul absolut de celule dintr-un godeu. Prin urmare, analistul ar trebui să efectueze o evaluare vizuală paralelă subiectivă a fiecărui godeu, se fac fotografii digitale ale MS și primele două cele mai mari concentrații necitotoxice trebuie să fie prelevate și arhivate pentru a permite evaluări ulterioare ale densității celulare reale, dacă acest lucru este necesar. În cazul în care, prin inspecție vizuală sau astfel cum demonstrează testul de viabilitate/citotoxicitate, se pare că există o creștere a numărului de celule, creșterea aparentă trebuie să fie verificată. În cazul în care se confirmă o creștere a numărului de celule, acest lucru trebuie specificat în raportul testului. Viabilitatea celulară se exprimă în raport cu răspunsul mediu în MS, care se consideră a fi 100 % celule viabile, și se calculează în funcție de testul de viabilitate/citotoxicitate celulară care este utilizat. Pentru MTT, se poate utiliza următoarea formulă:

% celule viabile = (răspuns în godeu – răspunsul mediu în godeuri tratate cu MeOH [= 100 % moarte]) ÷ (răspunsul mediu în godeuri MS – răspunsul mediu în godeuri tratate cu MeOH [= 100 % moarte])

43.   Godeurile cu viabilitate mai mică de 80 % în raport cu viabilitatea medie în MS (= 100 %) nu ar trebui să fie incluse în analiza finală a datelor. Inhibarea steroidogenezei care se produce în prezența unui nivel de aproape 20 % citotoxicitate trebuie evaluată cu atenție pentru a se asigura că nu citotoxicitatea este cauza inhibării.

Analiza hormonilor

44.   Fiecare laborator poate utiliza un sistem de măsurare a hormonilor la alegerea sa pentru analiza T și E2. Se pot utiliza părți alicote de rezervă de mediu de la fiecare grup de tratament pentru a prepara diluții pentru a aduce concentrația în partea liniară a curbei standard. Astfel cum s-a menționat la punctul 29, fiecare laborator trebuie să demonstreze conformitatea sistemului său de măsurare hormonală (de exemplu, ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) cu criteriile CC prin analizarea mediului de completare la care se adaugă un martor hormon intern înainte de a efectua testele CC sau testarea substanțelor chimice. Pentru a se asigura că niciuna dintre componentele sistemului de testare nu interferează cu măsurarea hormonilor, ar putea fi necesar ca hormonii să fie extrași din medii înainte de măsurarea acestora (a se vedea punctul 30 pentru condițiile în care o extracție este sau nu necesară). Se recomandă să se efectueze extracția urmând procedurile specificate în apendicele III la raportul de validare (4).

45.   În cazul în care pentru măsurarea producției de hormoni se utilizează o trusă de testare comercială, analiza hormonală trebuie efectuată astfel cum se precizează în manualele furnizate de producătorul trusei de testare. Majoritatea producătorilor au o procedură unică prin care se efectuează analizele hormonale. Diluțiile de probe trebuie să fie ajustate astfel încât concentrațiile preconizate de hormoni la martorii pentru solvent să se afle în centrul intervalului liniar al curbei standard a testului individual [apendicele III la raportul de validare (4)]. Valorile care depășesc porțiunea liniară a curbei standard trebuie să fie respinse.

46.   Concentrațiile hormonale finale sunt calculate după cum urmează:

Exemplu:

Extrase:	450 μl mediu
Reconstituite în:	250 μl tampon de analiză
Diluare în test:	10:1 (pentru a aduce eșantionul la intervalul liniar al curbei standard)
Concentrația de hormoni în test:	150 pg/ml (adaptat deja la concentrația per ml de probă testată)
Redresare:	89 %
Concentrația hormonală finală =	Concentrația de hormoni (per ml) ÷ recuperare) (factorul de diluție)
Concentrația hormonală finală =	(150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 10 = 936,3 pg/ml

Selecția concentrațiilor de testare

47.   Ar trebui să se efectueze un minim de două serii de teste independente. Cu excepția cazului în care informații prealabile, cum ar fi informații cu privire la limitele de solubilitate sau citotoxicitate, oferă o bază pentru alegerea concentrațiilor de testare, se recomandă ca pentru testul inițial concentrațiile de testare să fie distanțate la intervale logaritmice de 10, 10–3 M fiind concentrația maximă. În cazul în care substanța chimică este solubilă și nu este citotoxică la niciuna dintre concentrațiile testate, iar primul test a fost negativ pentru toate concentrațiile, acest lucru trebuie să fie confirmat prin efectuarea încă a unui test în aceleași condiții în care s-a efectuat primul test (tabelul 7). În cazul în care rezultatele primului test sunt neclare (și anume, coeficientul de modificare este semnificativ statistic de la MS la o singură concentrație) sau pozitive (și anume, coeficientul de modificare la două sau mai multe concentrații adiacente este semnificativ statistic), testul trebuie repetat, astfel cum se indică în tabelul 7, prin rafinarea concentrațiilor de testare selectate. Concentrațiile de testare din ciclurile de teste doi și trei (dacă este cazul) trebuie să fie ajustate în funcție de rezultatele ciclului inițial de teste care au valori de o parte și de alta a concentrațiilor care au provocat un efect, utilizând o spațiere de concentrare de 1/2-log (de exemplu, dacă ciclul inițial de 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM a condus la induceri la 1 și 10 μM, concentrațiile testate în al doilea ciclu de teste trebuie să fie de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), cu excepția cazului în care trebuie să se utilizeze concentrații mai mici pentru obține CMEO. În acest din urmă caz, în cel de-al doilea ciclu de teste se vor utiliza cel puțin cinci concentrații sub cea mai mică concentrație testată în primul ciclu de teste, utilizând o scară de 1/2-log. În cazul în care al doilea ciclu de teste nu confirmă primul ciclu de teste (și anume, nu apare o semnificație statistică la concentrația testată anterior pozitiv ± 1 variație de concentrație), se va efectua un al treilea experiment utilizând condițiile inițiale de testare. Rezultatele neclare din primul ciclu de teste se consideră negative în cazul în care efectul observat nu a putut fi confirmat în oricare dintre cele două cicluri ulterioare. Rezultatele neclare sunt considerate răspunsuri (efect) pozitive atunci când răspunsul poate fi confirmat în cel puțin încă un ciclu de teste cu un interval de creștere a concentrației de ± 1 (a se vedea punctul 55 pentru procedura de interpretare a datelor].

Tabelul 7

Matrice de decizii pentru posibile scenarii de rezultat

Ciclul 1	Ciclul 2		Ciclul 3		Decizie
Scenariu	Decizie	Scenariu	Decizie	Scenariu	Pozitiv	Negativ
Negativ	De confirmat (26)	Negativ	Stop			X
Negativ	De confirmat (26)	Pozitiv	De perfecționat (27)	Negativ		X
Neclar (28)	De perfecționat (27)	Negativ	De confirmat (26)	Negativ		X
Neclar (28)	De perfecționat (27)	Negativ	De confirmat (26)	Pozitiv	X
Neclar (28)	De perfecționat (27)	Pozitiv			X
Pozitiv	De perfecționat (27)	Negativ	De confirmat (26)	Pozitiv	X
Negativ	De confirmat (26)	Pozitiv	De perfecționat (27)	Pozitiv	X
Pozitiv	De perfecționat (27)	Pozitiv	Stop		X

Controlul de calitate al plăcii de testare

48.   În plus față de respectarea criteriilor pentru placa CC, trebuie să se respecte și alte criterii de calitate, care se referă la variația acceptabilă între godeuri duplicate, experimente duplicate, liniaritatea și sensibilitatea sistemelor de măsurare hormonale, variabilitatea între măsurătorile hormonale duplicate ale aceleiași probe și recuperarea procentuală de vârfuri hormonale după extracția mediului (dacă este cazul; a se vedea punctul 30 în ceea ce privește cerințele de extracție), acestea fiind prezentate în tabelul 8. Datele trebuie să se încadreze în intervalele acceptabile definite pentru fiecare parametru care urmează să fie luat în considerare pentru o evaluare suplimentară. În cazul în care criteriile nu sunt îndeplinite, tabelul trebuie să menționeze că nu s-au îndeplinit criteriile de CC în eșantionul respectiv, iar eșantionul se analizează din nou sau se elimină din setul de date.

Tabelul 8

Intervale și/sau variație acceptabile (%) pentru parametrii plăcii de testare a testului H295R

(LC: limita de cuantificare a sistemului de măsurare hormonală. CV: coeficient de variație; MS: martor pentru solvent; DPM: dezintegrări pe minut)

	Comparație între	T	E2
Producția hormonală bazală în MS	Coeficient mai mare decât LC	≥ 5 ori	≥ 2,5 ori
Experimente de expunere — CV pentru aceeași placă pentru MS (godeuri duplicate)	Concentrații absolute	≤ 30 %	≤ 30 %
Experimente de expunere — CV între plăci pentru MS (experimente duplicate)	Coeficient de modificare	≤ 30 %	≤ 30 %
Sistemul de măsurare hormonală — sensibilitate	Scădere a coeficientului detectabilă în raport cu MS	≥ 5 ori	≥ 2,5 ori
Sistemul de măsurare hormonală — CV pentru măsurare duplicată pentru MS (29)	Concentrații absolute	≤ 25 %	≤ 25 %
Extracția mediului — recuperarea standardului intern 3H (dacă este cazul)	DPM	≥ 65 % nominal

ANALIZA DATELOR ȘI RAPORTARE

Analiza datelor

49.   Pentru a evalua creșterea/descreșterea relativă la nivelul producției hormonale modificate chimic, rezultatele ar trebui să fie normalizate la valoarea medie MS a fiecărei plăci de testare, iar rezultatele ar trebui să fie exprimate ca modificări față de MS în fiecare placă de testare. Toate datele sunt exprimate ca medie ± 1 deviație standard (DS).

50.   Numai datele privind hormonii din godeurile unde citotoxicitatea a fost sub 20 % ar trebui să fie incluse în analiza datelor. Modificările relative se calculează după cum urmează:

Schimbare relativă = (concentrația de hormoni din fiecare godeu) ÷ (concentrația de hormoni medie în toate godeurile martor pentru solvent).

51.   În cazul în care, prin inspectarea vizuală a godeului sau astfel cum demonstrează testul de viabilitate/citotoxicitate descris la punctul 42, se pare că nu există o creștere a numărului de celule, creșterea aparentă trebuie să fie confirmată. În cazul în care o creștere a numărului de celule este confirmată, acest lucru trebuie specificat în raportul de testare.

52.   Înainte de a efectua analize statistice, trebuie să se evalueze ipotezele de normalitate și de omogenitate a varianței. Normalitatea se evaluează utilizând reprezentări grafice standard ale probabilităților sau alte metode statistice adecvate (de exemplu, testul Shapiro-Wilk). În cazul în care datele (coeficientul de modificare) nu au o distribuție normală, se poate încerca transformarea datelor pentru a aproxima o distribuție normală. Dacă datele prezintă o distribuție normală sau aproximează o distribuție normală, trebuie să se analizeze diferențele dintre grupurile de concentrație a substanței chimice și MS cu ajutorul unui test parametric (de exemplu, testul Dunnett), concentrația fiind variabila independentă și răspunsul (coeficientul de modificare) fiind variabila dependentă. În cazul în care datele nu au o distribuție normală, se utilizează un test non-parametric adecvat (de exemplu, testul de clasificare mulți-unul Kruskal Wallis, Steel). Diferențele sunt considerate semnificative la p ≤ 0,05. Evaluările statistice sunt efectuate pe baza valorilor medii pentru fiecare godeu care reprezintă puncte de reper duplicate independent. Se preconizează că, datorită spațierii mari a dozelor în primul ciclu de teste (scară logaritmică log10), în multe cazuri nu va fi posibil să se descrie în mod clar relațiile concentrație-răspuns în care cele mai mari două doze se vor afla pe porțiunea liniară a curbei sigmoid. Prin urmare, pentru primul ciclu de teste sau alte seturi de date în care apare această situație (de exemplu, în cazul în care nu se poate estima o eficiență maximă), se aplică statistici variabile fixe de tip I, astfel cum sunt descrise mai sus.

53.   În cazul în care mai mult de două puncte de date se află pe porțiunea liniară a curbei și se pot calcula eficacități maxime — se anticipează pentru unele dintre ciclurile secunde de teste care sunt efectuate utilizând o spațiere semi-logaritmică a concentrațiilor de expunere — trebuie să se utilizeze un probit, logit sau alte modele de regresie corespunzătoare pentru a calcula concentrații efective (de exemplu, EC50 și EC20).

54.   Rezultatele trebuie să fie prezentate atât în forme grafice (histograme care reprezintă DS medie ± 1), cât și în tabele (CMEO/CFEO, direcția efectului și magnitudinea răspunsului maxim care face parte din porțiunea de date care prezintă o relație doză-răspuns) (pentru un exemplu, a se vedea figura 3). Evaluarea datelor este considerată valabilă doar în cazul în care aceasta s-a bazat pe cel puțin două cicluri de teste desfășurate în mod independent. Un experiment sau un ciclu de teste este considerat independent în cazul în care acesta a fost executat la o altă dată cu ajutorul unui nou set de soluții și martori. Intervalul de concentrații utilizat în ciclurile de teste 2 și 3 (în cazul în care este necesar) se poate adapta pe baza rezultatelor ciclului 1 pentru o mai bună definire a intervalului doză-efect care include CMEO (a se vedea punctul 47).

Figura 3

Exemplu de prezentare și evaluare a datelor obținute pe durata derulării testului H295R în format grafic și de tabel

[Asteriscurile indică diferențe semnificative statistic față de martorul pentru solvent (p < 0,05). CMEO: concentrația cea mai mică cu efect observabil; Modificare maximă: magnitudinea maximă a răspunsului observat la orice concentrație în raport cu răspunsul mediu al MS (= 1)]

Substanța chimică	CMEO	Modificare maximă
Forskolin	0,01	0,15 ori
Letrozol	0,001	29 ori

Procedura de interpretare a datelor

55.   O substanță chimică de testat se consideră a fi pozitivă în cazul în care coeficientul de inducție este diferit din punct de vedere statistic (p ≤ 0,05) față de martorul pentru solvent la două concentrații adiacente în cel puțin două cicluri independente de teste (tabelul 7). O substanță chimică de testat se consideră a fi negativă în urma a două cicluri independente de teste cu rezultat negativ, sau în urma a trei cicluri care cuprind două cicluri de teste negative și un ciclu neclar sau pozitiv. În cazul în care datele obținute în trei experimente independente nu îndeplinesc criteriile de decizie enumerate în tabelul 7, rezultatele experimentale nu sunt interpretabile. Rezultatele la concentrații care depășesc limitele de solubilitate sau la concentrații citotoxice nu trebuie să fie incluse în interpretarea rezultatelor.

Raportul de testare

56.   Raportul de testare trebuie să conțină următoarele informații:

Unitatea de testare

—	denumirea unității, localizarea;

—	directorul studiului și alți membri ai personalului și responsabilitățile acestora în cadrul studiului;

—	datele de început și de sfârșit ale studiului.

Substanța chimică de testat, reactivi și martori

—	identitatea (nume/nr. CAS, după caz), sursa, numărul lotului, puritatea, furnizorul și caracterizarea substanței chimice de testat, reactivi și martori;

—	natura fizică și proprietățile fizico-chimice relevante ale substanței de testat;

—	condițiile de stocare și metoda și frecvența preparării substanțelor de testare, a reactivilor și a martorilor;

—	stabilitatea substanței chimice de testat.

Celule

—	sursa și tipul de celule;

—	numărul de reînsămânțări (identificator de reînsămânțare celulară) ale celulelor utilizate în test;

—	descrierea procedurilor de păstrare a culturilor de celule.

Cerințe înainte de testare (dacă este cazul)

—	descrierea și rezultatele testului de interferență al testului hormon chimic;

—	descrierea și rezultatele măsurătorilor eficienței de extracție a hormonilor;

—	curbele standard și etalonare pentru toate testele analitice care trebuie efectuate;

—	limitele de detecție pentru testele analitice selectate.

Condiții de testare

—	compoziția mediilor de cultură;

—	concentrația substanței de testat;

—	densitatea celulară (concentrații celulare estimate sau măsurate la 24 de ore și la 48 de ore);

—	solubilitatea substanței de testat (limita de solubilitate, în cazul în care este stabilită);

—	durata și condițiile de incubație.

Rezultatele testului

—	datele neprelucrate pentru fiecare godeu pentru martori și substanțele chimice de testat — fiecare măsură duplicată sub forma datelor originale furnizate de instrumentul utilizat pentru a măsura producția de hormoni (de exemplu, OD, unități de fluorescență, DPM etc.);

—	validarea normalității sau explicațiile privind transformarea datelor;

—	răspunsurile medii ± 1 SD pentru fiecare godeu măsurat;

—	datele privind citotoxicitatea (concentrațiile de testare care au determinat citotoxicitate);

—	confirmarea faptului că au fost îndeplinite cerințele de control al calității;

—	modificarea relativă în comparație cu martorul pentru solvent rectificat pentru citotoxicitate;

—	un grafic care să indice modificarea relativă (coeficient de modificare) la fiecare concentrație, SD și semnificația statistică, astfel cum s-a precizat la punctele 4954.

Interpretarea datelor

—	se aplică procedura de interpretare a datelor la rezultate și se discută observațiile.

Discuție

—	Există indicații din studiu în ceea ce privește posibilitatea ca datele referitoare la T/E2 să fi fost influențate de efecte indirecte asupra mecanismelor gluco- și mineralocorticoizilor?

Concluzii

BIBLIOGRAFIE

(1)

OECD (2002), OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals, in Appendix 2 to Chapter B.54 of this Annex.

(2)

Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, R. and Giesy, J.P. (2006), Human adrenocarcinoma (H295R) cells for rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production, Toxicol. Appl. Pharmacol., 217, 114-124.

(3)

Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. P. (2007), The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies. Env. Sci. Pollut. Res., 14, 23-30.

(4)

OECD (2010), Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production, OECD Series of Testing and Assessment No. 132, ENV/JM/MONO(2010)31, Paris. Disponibil la [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html]

(5)

OECD (2010), Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for Steroidogenesis, OECD Series of Testing and Assessment No. 133, ENV/JM/MONO(2010)32, Paris. Disponibil la: [http://www.oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html]

(6)

Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis, Disponibil la: [http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05.pdf]

(7)

Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroidogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR, Toxicol. Sci., 81, 78-89.

(8)

Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. (2002), Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells, Toxicol. Appl. Pharmacol., 182, 44-54.

(9)

Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. (2010), Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model development for metyrapone, Environ. Health Perspect., 118: 265-272.

(10)

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R cell line, Environ. Sci. Poll. Res., 17:1137-1148.

(11)

Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid biosynthesis, Cancer Res., 50, 5488-5496.

(12)

He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), Ozonation attenuates the steroidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line, Chemosphere, 80:578-584.

(13)

Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell line, Environ. Sci. Technol., 39:2777-2785.

(14)

Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line, Environ. Sci. Pol. Res., 17:1137-1148.

(15)

Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids, J. Clin. Endocrinol. Metab., 77, 731-737.

(16)

Capitolul B.55 din prezenta anexă: Biotestul Hershberger la șobolani: un test de depistare pe termen scurt pentru substanțe cu proprietăți (anti)androgenice.

(17)

Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1-propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay, J. Lab. Clin. Med., 2, 222-231.

(18)

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods., 65, 55-63.

(19)

Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.

(20)

Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484492.

B.58.   TESTE DE MUTAȚIE GENETICĂ PRIVIND CELULELE GERMINALE ȘI SOMATICE LA ROZĂTOARE TRANSGENICE

INTRODUCERE

1.   Prezenta metodă de testare este echivalentă cu Orientarea OCDE privind testarea (OT) nr. 488 (2013). Metodele de testare UE sunt disponibile pentru o gamă largă de teste de mutație in vitro care sunt în măsură să detecteze mutații genetice și/sau cromozomiale. Există metode de testare pentru parametri in vivo (de exemplu, aberații cromozomiale și sinteza neprogramată a ADN-ului); totuși, acestea nu măsoară mutațiile genetice. Testele de mutație la rozătoare transgenice (RTG) răspund nevoii de teste in vivo practice și disponibile pe scară largă pentru mutații genetice.

2.   Testele de mutație RTG au fost examinate pe larg (24) (33). Acestea utilizează șobolani și șoareci transgenici care prezintă mai multe copii de plasmidă integrată cromozomial sau vectori de navetă. Transgenele conțin gene reporter pentru detectarea diferitelor tipuri de mutații induse in vivo cu ajutorul substanțelor chimice de testat.

3.   Mutațiile care apar la un rozător sunt marcate prin recuperarea transgenă și analizarea fenotipului genei reporter într-o gazdă bacteriană care nu prezintă gena reporter. Testele de mutație genică RTG măsoară mutațiile induse în gene neutre din punct de vedere genetic recuperate din aproape orice țesut al rozătoarelor. Prin urmare, astfel de teste ocolesc multe dintre limitările existente asociate cu studiul in vivo al mutației genetice în gene endogene (de exemplu, țesuturi limitate adecvate pentru analize, selecție negativă/pozitivă față de mutații).

4.   Datele existente sugerează că transgenele răspund la mutageni într-un mod similar cu genele endogene, în special în ceea ce privește detectarea substituțiilor de perechi de baze, a mutațiilor de secvențe și a unor mici deleții și inserții (24).

5.   Atelierele de lucru internaționale privind testarea genotoxicității (IWGT) au aprobat includerea testelor de mutație genică RTG pentru detectarea in vivo a mutațiilor genetice și au recomandat un protocol de punere în aplicare a acestora (15) (29). Prezenta metodă de testare se bazează pe recomandările respective. Analizele ulterioare în sprijinul utilizării prezentului protocol pot fi consultate la nota (16).

6.   Se estimează că, în viitor, ar putea fi posibil să se combine un test de mutație genică RTG cu un studiu de toxicitate cu doze repetate (capitolul B.57 din prezenta anexă). Cu toate acestea, sunt necesare date pentru a se asigura că sensibilitatea testelor de mutație genică RTG nu este afectată de perioada mai scurtă cu o zi dintre sfârșitul perioadei de administrare și data eșantionării, astfel cum este utilizată în studiul de toxicologie cu doze repetate, față de perioada 3 de zile utilizată în testele de mutație genică RTG. De asemenea, sunt necesare date pentru a indica faptul că performanța testului cu doze repetate nu este afectată negativ de utilizarea unei sușe de rozătoare transgenice, mai degrabă decât sușele de rozătoare tradiționale. Atunci când astfel de date vor fi disponibile, metoda de testare va fi actualizată.

7.   Definițiile principalilor termeni sunt prevăzute în apendice.

CONSIDERAȚII INIȚIALE

8.   Testele de mutație genică RTG pentru care sunt disponibile date suficiente pentru a sprijini utilizarea acestora în prezenta metodă de testare sunt: șoarecele bacteriofag lacZ (Muta™Mouse); șoarecele plasmidic lacZ; șoarecele și șobolanul gpt delta (gpt și Spi–); șoarecele și șobolanul lacI (Big Blue®), astfel cum este efectuat în condiții standard. În plus, testul de selecție pozitivă cII se poate utiliza pentru evaluarea mutațiilor în modelele Big Blue® și Muta™Mouse. Mutageneza în modelele RTG este evaluată în mod normal ca frecvență a genelor mutante; cu toate acestea, dacă este necesar, analiza moleculară a mutațiilor poate furniza informații suplimentare (a se vedea punctul 24).

9.   Testele de mutații genetice in vivo la rozătoare sunt deosebit de relevante pentru evaluarea riscului mutagen, întrucât răspunsurile testelor sunt dependente de metabolismul, farmacocinetica, procesele de reparare a ADN-ului și sinteza ADN-ului prin transleziune in vivo, deși acești parametri pot să varieze între specii, între țesuturi și între tipuri de daune asupra ADN-ului. Un test in vivo pentru mutații genetice este util pentru studierea ulterioară a unui efect mutagen detectat printr-un sistem in vitro și pentru urmărirea rezultatelor testelor utilizând alți parametri in vivo (24). Pe lângă faptul că este asociată cauzal cu inducerea cancerului, mutația genică este un parametru relevant pentru predicția bolilor necanceroase pe bază de mutații la nivelul țesuturilor somatice (12) (13), precum și a bolilor cu transmitere pe linia germinală.

10.   Dacă există dovezi că substanța de testat, sau un metabolit relevant, nu va afecta niciunul dintre țesuturile de interes, nu este necesar să se efectueze un test de mutație genică RTG.

PRINCIPIUL TESTULUI

11.   În testele descrise la punctul 8, gena țintă este de origine bacteriană sau bacteriofagă, iar mijloacele de recuperare din ADN-ul genomic al rozătoarelor sunt prin încorporarea transgenei într-un bacteriofag λ sau un vector de transfer plasmidic. Procedura implică extracția de ADN genomic din țesutul de interes al rozătoarelor, prelucrarea in vitro a ADN-ului genomic (și anume, asamblarea de vectori λ sau ligarea și electroporarea plasmidelor pentru a recupera vectorul de transfer) și detectarea ulterioară a mutațiilor în gazde bacteriene în condiții adecvate. Testele utilizează transgene neutre, care sunt ușor de recuperat din cele mai multe țesuturi.

12.   Experimentul de mutație genică RTG de bază implică tratarea rozătoarelor cu o substanță chimică pentru o perioadă de timp. Substanțele chimice pot fi administrate pe orice cale adecvată, inclusiv implantare (de exemplu, testarea unui dispozitiv medical). Perioada totală în care un animal este tratat este numită perioadă de administrare. Administrarea este urmată, de regulă, de o perioadă de timp înainte de sacrificare în care nu se administrează substanțe chimice și în timpul căreia leziunile ADN nereparate sunt fixate în mutații stabile. În literatura de specialitate, această perioadă a fost numită în diferite surse fie timp de manifestare, fie timp de fixare sau timp de exprimare; sfârșitul acestei perioade este momentul eșantionării (15) (29). După ce animalul este sacrificat, ADN-ul genomic este izolat din țesutul/țesuturile de interes și purificat.

13.   De regulă, se colectează date pentru un singur țesut pentru fiecare animal din asamblări/ligări multiple, iar frecvența mutantului se evaluează, în general, utilizând un total cuprins între 105 și 107 unități formatoare de plăci sau unități formatoare de colonii. Atunci când se utilizează metode de selecție pozitive, unitățile formatoare de plăci totale se determină cu un set separat de plăci neselective.

14.   S-au dezvoltat metode de selecție pozitive pentru a facilita detectarea mutațiilor atât în gena gpt [șoarece și șobolan gpt delta, fenotip gpt — (20) (22) (28)], cât și în gena lacZ [Muta™Mouse sau șoarece plasmidic lacZ (3) (10) (11) (30)]; dimpotrivă, mutațiile genetice lacI la animale Big Blue® sunt detectate utilizând o metodă neselectivă care identifică genele mutante prin generarea de plăci colorate (albastre). Metodologia de selecție pozitivă se aplică, de asemenea, pentru a detecta mutații punctuale care apar în gena cII a vectorului de transfer bacteriofag λ [șoarece sau șobolan Big Blue® și Muta™Mouse (17)] și mutațiile de ștergere in genele λ red și gam [selecție Spi– la șoarece și șobolan gpt delta (21) (22) (28)]. Frecvența genelor mutante se calculează prin împărțirea numărului de plachete/plasmide care conțin mutații în transgenă la numărul total de plachete/plasmide recuperate din aceeași probă de ADN. În studiile de mutație genică RTG, frecvența genelor mutante este parametrul raportat. În plus, frecvența mutației se poate determina, de asemenea, ca fracțiunea celulelor care prezintă mutații independente; calculul necesită corecție pentru expansiunea clonală prin secvențierea genelor mutante recuperate (24).

15.   Mutațiile marcate în testele de punct de mutație lacI, lacZ, cII și gpt constau, în principal, în mutații de substituție a perechilor de bază, mutații de secvențe și mici inserții/deleții. Proporția relativă a acestor tipuri de mutație în cadrul mutațiilor spontane este similară cu cea observată la gena Hptr endogenă. Deleții mari sunt detectate numai cu selecția Spi– și în testele de plasmide lacZ (24). Mutațiile de interes sunt mutații in vivo care apar la șoarece sau la șobolan. Mutațiile in vitro și ex vivo care pot apărea în timpul recuperării, al replicării sau al reparării fage/plasmidice sunt relativ rare, iar în unele sisteme acestea pot fi identificate în mod specific sau pot fi excluse de sistemul de selecție gazdă/pozitiv bacterian.

DESCRIEREA METODEI

Preparate

Selectarea speciilor de animale

16.   În prezent sunt disponibile o varietate de modele de detectare a mutațiilor genetice la șoareci transgenici, iar astfel de sisteme au fost utilizate pe scară mai largă decât modelele care utilizează șobolani transgenici. În cazul în care șobolanul este în mod clar un model mai adecvat decât șoarecele (de exemplu, atunci când se studiază mecanismul carcinogenezei pentru o tumoră observată doar la șobolani, pentru corelarea cu un studiu de toxicitate pe șobolan sau dacă se știe că metabolismul șobolanului este mai reprezentativ pentru metabolismul uman), trebuie să se ia în considerare utilizarea modelelor cu șobolani transgenici.

Condiții de adăpost și de hrănire

17.   În spațiul pentru adăpostirea animalelor de experiență se asigură o temperatură de 22 °C (± 3 °C). Deși umiditatea relativă trebuie să fie de cel puțin 30 % și să nu depășească, de preferință, 70 %, cu excepția perioadelor de curățare a sălii, obiectivul ar fi menținerea unei umidități relative de 50-60 %. Iluminatul trebuie să fie artificial, cu o alternanță zilnică de 12 ore de lumină, urmate de 12 de ore de întuneric. Pentru alimentație, se poate utiliza hrană convențională de laborator, cu furnizarea unei cantități nelimitate de apă potabilă. Alegerea tipului de hrană poate fi influențată de necesitatea de a asigura un amestec adecvat al substanței de testat, atunci când aceasta se administrează pe această cale. Animalele se adăpostesc în grupuri mici (cel mult cinci) de același sex, în cazul în care nu se preconizează un comportament agresiv. Animalele pot fi adăpostite individual, dacă acest lucru se justifică din punct de vedere științific.

Pregătirea animalelor

18.   Animale adulte, mature sexual, tinere și sănătoase (cu vârsta de 8-12 săptămâni la începutul tratamentului) sunt repartizate aleatoriu în grupurile de control și de tratament. Animalele sunt identificate individual. Animalele sunt aclimatizate la condițiile de laborator timp de cel puțin cinci zile. Cuștile trebuie aranjate astfel încât posibilele efecte datorate amplasării acestora să fie reduse la minimum. La începutul studiului, variația greutății animalelor ar trebui să fie minimă și să nu depășească ± 20 % din greutatea medie a fiecărui sex.

Prepararea dozelor

19.   Substanțele chimice de testat în stare solidă trebuie dizolvate sau suspendate în solvenții sau vehicule corespunzătoare sau amestecate în hrană sau în apă înainte de a fi administrate animalelor. Substanțele chimice de testat în formă lichidă se pot administra direct sau se pot dilua înainte de administrare. Pentru expunerile prin inhalare, substanțele chimice de testat pot fi administrate sub formă de gaz, vapori sau aerosol solid/lichid, în funcție de proprietățile lor fizico-chimice. Se utilizează preparate proaspete de substanță de testat, cu excepția cazului în care datele de stabilitate demonstrează caracterul acceptabil al stocării.

Condiții de testare

Solvent/vehicul

20.   Solventul/vehiculul nu ar trebui să producă efecte toxice la volumele de doză utilizate și nu ar trebui să existe suspiciunea reacției chimice a acestuia cu substanța de testat. Dacă se utilizează alți solvenți/vehiculi decât cei recunoscuți, includerea acestora trebuie să fie justificată cu date de referință care să le demonstreze compatibilitatea. Se recomandă ca, ori de câte ori este posibil, să se ia în considerare mai întâi un solvent/vehicul apos.

Martorii pozitivi

21.   În mod normal, trebuie să se utilizeze animale martori pozitivi concomitenți. Cu toate acestea, pentru laboratoarele care au demonstrat competență (a se vedea punctul 23) și care utilizează în mod obișnuit testele, ADN-ul de la animale tratate care au fost anterior martori pozitivi poate fi inclus în fiecare studiu pentru a confirma succesul metodei. ADN-ul de la experimentele anterioare trebuie să fie obținut de la aceleași specii și țesuturi de interes și să fie depozitat adecvat (a se vedea punctul 36). Atunci când se utilizează martori pozitivi concomitenți, nu este necesară administrarea pe aceeași cale ca și substanța de testat; cu toate acestea, controalele pozitive trebuie să fie cunoscute ca inducând mutații în unul sau mai multe țesuturi de interes pentru substanța de testat. Dozele de substanțe chimice martori pozitivi trebuie selectate astfel încât să producă efecte slabe sau moderate, care evaluează critic performanța și sensibilitatea testului. Exemple de substanțe chimice martori pozitivi și unele dintre țesuturile țintă pentru acestea sunt incluse în tabelul 1.

Tabelul 1

Exemple de substanțele martor pozitive și unele țesuturi țintă

Substanța chimică utilizată ca martor pozitiv și nr. CAS	Denumire Einecs și nr. Einecs	Caracteristici	Mutație țesut țintă
			Șobolan	Șoarece
N-etil-N-nitrozouree [CAS nr. 759-73-9]	N-etil-N-nitrozouree [212-072-2]	Mutagen cu acțiune directă	Ficat, plămân	Măduva osoasă, colon, epiteliul colonului, intestin, plămân, ficat, splină, rinichi, celule granuloase ovariene, celule germinale masculine
Carbamat de etil (uretan) [CAS nr. 51-79-6]	Uretan [200-123-1]	Mutagen, necesită metabolism, dar produce doar efecte slabe		Măduva osoasă, prestomac, intestin subțire, plămân, ficat, splină
2,4-Diaminotoluen [CAS nr. 95-80-7]	4-metil-m-fenilendiamină [202-453-1]	Mutagen, necesită metabolism, de asemenea pozitiv în testul Spi—	Ficat	Ficat
Benzo[a]piren [CAS nr. 50-32-8]	Benzo[def]crizen [200-028-5]	Mutagen, necesită metabolism	Ficat, omenta,	Măduva osoasă, sân, colon, prestomac, stomac glandular, inimă, ficat, plămân, celule germinale masculine

Martorii negativi

22.   Martorii negativi, tratați doar cu solvent sau vehicul, dar altfel tratați în același mod precum grupurile tratate, trebuie să fie incluși la fiecare prelevare de probe. În absența unor date anterioare sau publicate referitoare la martori care să ateste că solventul/vehiculul selectat nu prezintă efecte vătămătoare sau mutagene, martori netratați trebuie să fie, de asemenea, incluși pentru fiecare prelevare de probe, pentru a stabili acceptabilitatea martorilor pentru vehicul.

Verificarea competenței laboratorului

23.   Competența în astfel de teste se stabilește prin demonstrarea capacității de a reproduce rezultatele preconizate din datele publicate (24) pentru: 1. frecvențele genelor mutante cu substanțe chimice utilizate ca martori pozitivi (inclusiv răspunsuri slabe), cum ar fi cele enumerate în tabelul 1, nonmutageni și martori pentru vehicul; și 2. recuperarea transgenică din ADN genomic (de exemplu, eficiența de asamblare).

Secvențierea genelor mutante

24.   Pentru aplicații de reglementare, nu este necesară secvențierea ADN a genelor mutante, în special în cazul în care se obține un rezultat pozitiv sau negativ clar. Cu toate acestea, datele de secvențiere pot fi utile atunci când se observă o variabilitate ridicată între indivizi. În aceste cazuri, secvențierea poate fi utilizată pentru a exclude posibilitatea de jackpot-uri sau evenimente clonale prin identificarea proporției de gene mutante unice dintr-un anumit țesut. Secvențierea a aproximativ 10 gene mutante pe țesut pentru fiecare animal ar trebui să fie suficientă pentru a determina pur și simplu dacă genele mutante clonale contribuie la frecvența genelor mutante; pentru corectarea matematică a frecvenței mutante pentru clonalitate, ar putea fi necesară secvențierea a nu mai puțin de 25 de gene mutante. De asemenea, se poate lua în considerare secvențierea genelor mutante atunci când se constată creșteri mici ale frecvenței mutante (de exemplu, aceasta depășește cu puțin valorile martorilor netratate). Diferențele în spectrul mutant între coloniile mutante de la animalele tratate și netratate pot sprijini constatarea unui efect mutagen (29). De asemenea, spectrele de mutație pot fi utile pentru dezvoltarea de ipoteze mecaniciste. În cazul în care secvențierea trebuie să fie inclusă ca parte a protocolului de studiu, trebuie să se acorde o atenție deosebită conceperii unor astfel de studii, în special în ceea ce privește numărul de gene mutante secvențiate pe eșantion, pentru a obține puterea adecvată în funcție de modelul statistic (a se vedea punctul 43).

PROCEDURĂ

Numărul și sexul animalelor

25.   Numărul de animale pe grup trebuie predeterminat astfel încât să fie suficient pentru a furniza puterea statistică necesară pentru a detecta cel puțin o dublare a frecvenței mutante. Grupurile vor fi alcătuite din cel puțin cinci animale; cu toate acestea, dacă puterea statistică este insuficientă, ar trebui să se crească numărul de animale în funcție de necesități. În mod normal se utilizează masculi. Pot exista cazuri în care ar fi justificată testarea doar pe femele, de exemplu, atunci când se testează medicamente de uz uman pentru femei sau când se studiază metabolismul specific feminin. În cazul în care există diferențe semnificative între sexe în ceea ce privește toxicitatea sau metabolismul, vor fi necesari atât masculi, cât și femele.

Perioadă de administrare

26.   Pe baza observațiilor conform cărora mutațiile se acumulează cu fiecare tratament, este necesar un regim de doze repetate, cu tratamente zilnice, pentru o perioadă de 28 de zile. Aceasta perioadă este considerată, în general, acceptabilă atât pentru producerea unei acumulări suficiente de mutații produse de mutageni slabi, cât și pentru a acorda un timp adecvat de expunere pentru detectarea mutațiilor în organele care proliferează lent. Pentru anumite evaluări, pot fi adecvate regimuri alternative de tratament, iar schemele alternative de administrare trebuie să fie justificate în mod științific în protocol. Tratamentele nu trebuie să fie mai scurte decât timpul necesar pentru inducerea completă a tuturor enzimelor metabolizatoare relevante, iar tratamentele mai scurte pot necesita utilizarea mai multor momente de prelevare a probelor, care sunt potrivite pentru organe cu diferite rate de proliferare. În orice caz, trebuie să se utilizeze toate informațiile disponibile (de exemplu, cu privire la toxicitatea generală sau metabolism și farmacocinetică) atunci când se justifică un protocol, în special atunci când există abateri de la recomandările standard de mai sus. Deși ar putea ameliora sensibilitatea, durata de tratament mai lungă de opt săptămâni trebuie să fie explicată în mod clar și justificată, întrucât duratele lungi de tratament pot produce o creștere evidentă în frecvență a genelor mutante prin expansiune clonală (29).

Doze

27.   Nivelurile dozelor trebuie să se bazeze pe rezultatele unui studiu de stabilire a nivelurilor de doză care măsoară toxicitatea generală, realizat utilizând aceeași cale de expunere, sau pe baza rezultatelor studiilor anterioare de toxicitate sub-acută. Pentru determinarea nivelurilor de doză, se pot utiliza animale non-transgenice din aceeași sușă de rozătoare. În testul principal, pentru a obține informații de răspuns la doză, un studiu complet trebuie să includă un grup martor negativ (a se vedea punctul 22) și cel puțin trei niveluri de dozare distanțate corespunzător, cu excepția cazului în care s-a utilizat doza limită (a se vedea punctul 28). Doza maximă trebuie să fie doza maximă tolerată (DMT). DMT este definită ca doza care produce semne de toxicitate astfel încât se preconizează că doze mai mari, administrate în același regim de dozare, ar fi letale. Substanțele chimice cu activitate biologică specifică la doze netoxice mici (cum ar fi hormonii și mitogenii) și substanțele chimice care prezintă saturare de proprietăți toxicocinetice pot face excepție de la criteriile de stabilire a dozelor și trebuie să fie evaluate de la caz la caz. Dozele utilizate trebuie să acopere un interval de la toxicitate maximă la toxicitate mică sau absența oricărei toxicități.

Test limită

28.   În cazul în care experimentele de stabilire a nivelurilor de doză sau datele existente de la speciile de rozătoare conexe indică faptul că un regim de tratament cu cel puțin doza limită (a se vedea mai jos) nu produce efecte toxice detectabile și dacă nu s-ar preconiza genotoxicitate pe baza datelor de la substanțe chimice înrudite structural, atunci un studiu complet cu utilizarea a trei doze de mărimi diferite ar putea să nu fie considerat necesar. Pentru o perioadă de administrare de 28 de zile (de exemplu, 28 de tratamente zilnice), doza limită este de 1 000 mg/kg greutate corporală/zi. Pentru perioade de administrare de 14 zile sau mai puțin, doza limită este de 2 000 mg/kg greutate corporală/zi (regimurile de dozare care diferă de 28 de tratamente zilnice trebuie să fie justificate în mod științific în protocol, a se vedea punctul 26).

Administrarea dozelor

29.   Substanța de testat se administrează, de regulă, prin gavaj cu ajutorul unui tub stomacal sau al unei canule de intubație adecvate. În general, la conceperea unui test trebuie să se ia în considerare calea anticipată de expunere a omului. Prin urmare, se pot accepta alte căi de expunere (cum ar fi în apa potabilă, subcutanat, intravenos, local, prin inhalare, intratraheal, în hrană sau implantare), în cazul în care acestea pot fi justificate. Injectarea intraperitoneală nu este recomandată deoarece aceasta nu este o cale fiziologică relevantă de expunere a omului. Volumul maxim de lichid care se poate administra prin gavaj sau prin injecție într-o singură repriză depinde de dimensiunea animalului de laborator. Volumul nu trebuie să depășească 2 ml/100g greutate corporală. Utilizarea unor volume mai mari decât acesta trebuie să fie justificată. Cu excepția substanțelor chimice iritante și corozive, care vor prezenta în mod normal efecte exacerbate la concentrații mai mari, variația volumului testat trebuie să fie redusă la minimum prin ajustarea concentrației, pentru a asigura un volum constant pentru toate dozele.

Timpul de eșantionare

Celulele somatice

30.   Timpul de eșantionare este o variabilă esențială deoarece este determinată de perioada necesară pentru fixarea mutațiilor. Această perioadă este specifică țesutului și pare să fie legată de timpul de reînnoire al populației de celule, măduva osoasă și intestinul având răspuns rapid, iar ficatul fiind mult mai lent. Un compromis adecvat pentru măsurarea frecvențelor mutante în țesuturile cu proliferare rapidă și lentă este de 28 de tratamente zilnice consecutive (astfel cum este indicat la punctul 26) și prelevarea de probe la trei zile după tratamentul final, deși, în aceste condiții, frecvența maximă a genelor mutante ar putea să nu se manifeste în țesuturile cu proliferare lentă. În cazul în care țesuturile cu proliferare lentă sunt deosebit de importante, atunci ar putea fi mai adecvată o prelevare ulterioară la 28 de zile după perioada de administrare de 28 zile (16) (29). În astfel de cazuri, prelevarea ulterioară va înlocui prelevarea la 3 zile și ar necesita o justificare științifică.

Celulele germinale

31.   Testele RTG sunt adecvate studiului de inducție de mutații genetice pe celule germinale masculine (7) (8) (27), în care calendarul și cinetica spermatogenezei au fost bine definite (27). Numerele scăzut de ovule disponibile pentru analiză, inclusiv după super-ovulație și faptul că nu există o sinteză ADN în ovocit împiedică determinarea mutației în celulele germinale feminine utilizând teste transgenice (31).

32.   Timpii de prelevare a probelor de celule germinale masculine ar trebui să fie selectați astfel încât să se eșantioneze gama de tipuri de celule expuse de-a lungul dezvoltării celulelor germinale, iar etapa vizată în prelevarea de probe să fi primit expunere suficientă. Timpul necesar pentru progresia celulelor germinale în dezvoltare de la celule stem spermatogoniale la spermă matură care ajunge în vasele deferente/epididimul caudal este de ~ 49 de zile pentru șoarece (36) și ~ 70 zile de la șobolan (34) (35). După o expunere de 28 de zile, cu o perioadă ulterioară de eșantionare de trei zile, sperma acumulată colectată din vasele deferente/epididimul caudal (7) (8) va reprezenta o populație de celule expuse pe parcursul a aproximativ celei de-a doua jumătăți a spermatogenezei, care include perioada meiotică și perioada postmeiotică, dar nu și perioada spermatogonială sau a celulei stem. Pentru a preleva în mod adecvat celule din vasele deferente/epididimul caudal care erau celule stem spermatogoniale în timpul perioadei de expunere, este necesar un timp de eșantionare suplimentar de cel puțin 7 săptămâni (șoareci) sau 10 săptămâni (șobolan) după terminarea tratamentului.

33.   Celulele extrudate din tubii seminiferi după un regim de 28 + 3 zile cuprind o populație mixtă îmbogățită pentru toate etapele de dezvoltare a celulelor germinale (7) (8). Prelevarea celulelor respective pentru detectarea mutațiilor genetice nu oferă o evaluare la fel de precisă a etapelor în care sunt induse mutațiile celulelor germinale în comparație cu cele care pot fi obținute de la prelevarea de probe de spermatozoizi din vasele deferente/epididimul caudal (deoarece există o serie de tipuri de celule germinale prelevate de la nivelul tubilor și vor exista unele celule somatice care contaminează populația de celule). Cu toate acestea, prelevarea de probe de celule din tubii seminiferi pe lângă spermatozoizii din vasele deferente/epididimul caudal în urma doar a unui regim de eșantionare de 28 + 3 zile ar asigura o oarecare acoperire a celulelor expuse pe parcursul majorității fazelor de dezvoltare a celulelor germinale și poate fi utilă pentru detectarea unor mutageni ai celulelor embrionare.

Observații

34.   Se recomandă ca observațiile clinice generale să fie efectuate cel puțin o dată pe zi, de preferat la aceeași oră (aceleași ore) în fiecare zi, luând în considerare perioada de vârf a efectelor anticipate după administrare. Starea de sănătate a animalelor trebuie consemnată. Cel puțin de două ori pe zi, toate animalele sunt examinate pentru a se determina morbiditatea sau mortalitatea. Toate animalele trebuie cântărite cel puțin o dată pe săptămână și la sacrificare. Măsurarea consumului de hrană se face cel puțin săptămânal. În cazul în care substanța de testat se administrează în apa de băut, consumul de apă trebuie măsurat la fiecare schimbare a apei și cel puțin o dată pe săptămână. Animalele care prezintă indicatori neletali de toxicitate excesivă trebuie să fie eutanasiate înainte de finalizarea perioadei de testare (23).

Colectarea de țesuturi

35.   Justificarea pentru colectarea de țesuturi trebuie să fie clar definită. Întrucât este posibil să se studieze inducția mutației în aproape orice țesut, selecția țesuturilor colectate trebuie să se bazeze pe motivul pentru efectuarea studiului și pe orice date existente privind mutagenitatea, carcinogenitatea sau toxicitatea pentru substanța chimică care face obiectul studiului. Factorii importanți de luat în considerare trebuie să includă calea de administrare (pe baza căii/căilor de expunere probabilă/probabile la om), distribuția preconizată în țesuturi și eventuale mecanisme de acțiune. În absența oricăror informații de context, ar trebui să se colecteze mai multe țesuturi somatice, după cum pot fi de interes. Acestea ar trebui să reprezinte țesuturi cu proliferare rapidă, țesuturi cu proliferare lentă și țesuturi de la locul de contact. În plus, spermatozoizii din vasele deferente/epididimul caudal și celulele germinale în curs de dezvoltarea din tubii seminiferi (conform descrierii de la punctele 32 și 33) ar trebui să fie colectați și stocați în cazul în care ar putea fi necesară o viitoare analiză privind mutagenitatea celulelor germinale. Trebuie să se consemneze greutatea organelor, iar pentru organele mari, trebuie să se realizeze prelevări din aceeași zonă de la toate animalele.

Stocarea țesuturilor și a AND-ului

36.   Țesuturile (sau omogenatele tisulare) trebuie să fie păstrate la temperaturi sub – 70 °C și să fie utilizate pentru izolarea ADN-ului în termen de 5 ani. ADN-ul izolat, păstrat în frigider la 4 °C în tampon adecvat, ar trebui să fie utilizat în mod optim pentru analiza mutației în termen de 1 an.

Selecția țesuturilor pentru analiza genelor mutante

37.   Alegerea țesuturilor trebuie să se bazeze pe considerente precum: 1. calea de administrare sau locul primului contact (de exemplu, stomacul glandular, în cazul administrării orale, plămânul în cazul administrării prin inhalare sau pielea în cazul aplicării topice); și 2. parametrii farmacocinetici observați în studiile de toxicitate generală, care indică dispunerea, reținerea sau acumularea țesutului sau organele țintă pentru toxicitate. În cazul în care studiile sunt realizate pentru a urmări studiile de carcinogenitate, trebuie să se ia în considerare țesuturile țintă pentru carcinogenitatea. Alegerea țesuturilor pentru analiză ar trebui să maximizeze detectarea substanțelor chimice care sunt mutageni cu acțiune directă in vitro, metabolizați rapid, foarte reactivi sau slab absorbiți sau pentru care țesutul țintă este determinat de calea de administrare (6).

38.   În absența unor informații de bază și luând în considerare locul de contact datorat căii de administrare, ficatul și cel puțin un țesut cu divizare rapidă (de exemplu, stomacul glandular, măduva osoasă), trebuie să fie evaluate pentru mutagenitate. În cele mai multe cazuri, cerințele de mai sus pot fi îndeplinite prin analizarea a două țesuturi atent selectate, dar în unele cazuri ar putea fi necesare trei sau mai multe țesuturi. În cazul în care există motive de preocupare specifică privind efectele asupra celulelor germinale, inclusiv răspunsuri pozitive în celulele somatice, trebuie să se evalueze țesuturile celulelor germinale pentru determinarea mutațiilor.

Metode de măsurare

39.   Metodele standard de laborator sau metodele publicate pentru detectarea genelor mutante sunt disponibile pentru modelele transgenice recomandate: bacteriofag și plasmidă lambda lacZ (30); șoarece lacI (2) (18); șoarece delta gpt (22); șobolan delta gpt (28); cII (17). Modificările trebuie să fie justificate și documentate în mod corespunzător. Date din mai multe asamblări pot fi agregate și utilizate pentru a ajunge la un număr adecvat de plăci sau colonii. Cu toate acestea, necesitatea unui număr mare de reacții de asamblare pentru a ajunge la numărul adecvat de plachete poate fi un indiciu de ADN de proastă calitate. În astfel de cazuri, datele trebuie să fie luate în considerare cu atenție deoarece acestea ar putea să nu fie fiabile. Numărul total optim de plachete sau colonii per probă de ADN este guvernat de probabilitatea statistică de detectare a unui număr suficient de gene mutante, la o anumită frecvență spontană a genelor mutante. În general, sunt necesare cel puțin 125 000 — 300 000 de plachete dacă frecvența spontană a genelor mutante este de ordinul a 3 × 10–5 (15). Pentru testul Big Blue® lacI, este important să se demonstreze că întreaga serie de fenotipuri mutante de culoare poate fi detectată prin includerea unor martori corespunzători de culoare în același timp cu fiecare alcătuire de plăci. Țesuturile și probele rezultate (elemente) trebuie prelucrate și analizate utilizând un concept bloc, în care elemente de la grupul martor pentru vehicul/solvent, grupul martor pozitiv (dacă este utilizat) sau ADN martor pozitiv (dacă este cazul) și fiecare grup de tratament sunt prelucrate împreună.

DATE ȘI RAPORT

Prelucrarea rezultatelor

40.   Datele pentru fiecare animal trebuie să fie prezentate sub formă de tabel. Unitatea experimentală este animalul. Raportul trebuie să includă numărul total de unități formatoare de plăci (ufp) sau unități formatoare de colonii (ufc), numărul de gene mutante și frecvența genelor mutante pentru fiecare țesut de la fiecare animal. În cazul în care există mai multe reacții de asamblare/salvare, trebuie să se raporteze numărul de reacții per probă de ADN. Deși trebuie să se păstreze datele pentru fiecare reacție în parte, trebuie să se raporteze doar valorile totale ale ufp sau ufc. Trebuie să se raporteze datele cu privire la toxicitate și semne clinice în conformitate cu punctul 34. Orice rezultate de secvențiere trebuie să fie prezentate pentru fiecare mutant analizat și trebuie să se arate calculele de frecvență a mutației care rezultă pentru fiecare animal și țesut.

Evaluarea și interpretarea rezultatelor statistice

41.   Există o serie de criterii pentru determinarea unui rezultat pozitiv, cum ar fi o creștere dependentă de doză a frecvenței mutante sau o creștere clară a frecvenței mutante într-un singur grup de doză în comparație cu grupul martor pentru solvent/vehicul. Pentru a furniza date suficiente pentru analiza doză-răspuns, se analizează cel puțin trei grupuri de doze tratate. În timp ce relevanța biologică a rezultatelor trebuie să fie considerată primordială, se pot utiliza metode statistice adecvate ca instrument în evaluarea rezultatelor testelor (4) (14) (15) (25) (26). Testele statistice utilizate trebuie să ia în considerare animalul ca unitate experimentală.

42.   O substanță chimică de testat pentru care rezultatele nu îndeplinesc criteriile de mai sus, în orice tip de țesut, este considerată nemutagenă în cadrul testului. Pentru relevanța biologică a unui rezultat negativ, trebuie confirmată expunerea țesutului.

43.   Pentru analizele de secvențiere a ADN-ului, sunt disponibile o serie de abordări statistice pentru a contribui la interpretarea rezultatelor (1) (5) (9) (19).

44.   Analizarea faptului dacă valorile observate se situează în interiorul sau în afara intervalului martor istoric poate oferi orientare în evaluarea semnificației biologice a răspunsului (32).

Raportul de testare

45.   Raportul de testare trebuie să conțină următoarele informații:

Substanța chimică de testat:

—	date de identificare și nr. CAS, dacă se cunosc;

—	sursa, numărul lotului, dacă sunt disponibile;

—	natura fizică și puritatea;

—	proprietățile fizico-chimice relevante pentru desfășurarea studiului;

—	stabilitatea substanței de testat, dacă se cunoaște.

Solvent/vehicul:

—	justificarea alegerii vehiculului;

—	solubilitatea și stabilitatea substanței de testat în solvent/vehicul, dacă se cunosc;

—	prepararea formulărilor hranei, a apei potabile sau inhalărilor;

—	determinările analitice asupra formulărilor (de exemplu, stabilitatea, omogenitatea, concentrațiile nominale).

Animale de laborator:

—	specia/sușa utilizată și o justificare pentru alegerea acestora;

—	numărul, vârsta și sexul animalelor;

—	sursa, condițiile de adăpost, hrana etc.;

—	greutatea fiecărui animal la începutul testului, inclusiv intervalul de greutate, greutatea medie și deviația standard pentru fiecare grup.

Condiții de testare:

—	datele privind martorii pozitivi și negativi (solvent/vehicul);

—	datele din studiul de stabilire a intervalului dozelor;

—	justificarea alegerii dozelor utilizate;

—	detalii privind prepararea substanței de testat;

—	detalii privind administrarea substanței de testat;

—	justificarea căii de administrare alese;

—	metodele de măsurare a toxicității pentru animale, inclusiv, după caz, analize histopatologice sau hematologice și frecvența cu care s-au efectuat observațiile și cu care s-a măsurat greutatea corporală a animalelor;

—	metodele de verificare pentru a constata dacă substanța de testat a ajuns în țesutul țintă sau în circulația generală, în cazul în care se obțin rezultate negative;

—	doză efectivă (mg/kg greutate corporală/zi), calculată din concentrația substanței chimice de testat (ppm) în hrană/apă potabilă și consum, dacă este cazul;

—	detalii privind calitatea hranei și a apei;

—	descrierea detaliată a regimului de dozare și a metodelor de eșantionare și justificările pentru alegerile făcute;

—	metoda de eutanasiere;

—	metodele de izolare și conservare a țesuturilor;

—	metodele de izolare a ADN-ului genomic la rozătoare, salvarea transgenei din ADN-ul genomic și transferul ADN-ului transgenic la o gazdă bacteriană;

—	sursa și numărul lotului pentru toate celulele, trusele și reactivii (după caz);

—	metodele de numărare de mutanților;

—	metodele de analiză moleculară a mutanților și utilizarea acestora în corectarea clonalității și/sau calcularea frecvențelor mutațiilor, dacă este cazul.

Rezultate:

—	starea animalelor înaintea și pe întreaga durată a testului, inclusiv simptomele de toxicitate;

—	valorile greutății corporale și a organelor la sacrificare;

—	pentru fiecare țesut/animal, numărul genelor mutante, numărul de plăci sau colonii evaluate, frecvența genelor mutante;

—	pentru fiecare țesut/grup de animale, numărul de reacții de asamblare pe probă de ADN, numărul total de gene mutante, frecvența medie a genelor mutante, deviația standard;

—	relația doză-răspuns, dacă este posibil;

—	pentru fiecare țesut/animal, numărul de gene mutante independente și frecvența medie a mutațiilor, în cazul în care a fost efectuată analiza moleculară a mutațiilor;

—	date concomitente și date istorice privind martorii negativi cu intervale, valori medii și deviații standard;

—	date concomitente privind martorii pozitivi (sau date neconcomintente privind martorii pozitivi ADN);

—	determinări analitice, în cazul în care sunt disponibile (de exemplu, concentrațiile de ADN utilizate în asamblare, date privind secvențierea ADN-ului);

—	analizele statistice și metodele aplicate.

Discutarea rezultatelor

Concluzii

BIBLIOGRAFIE

(1)

Adams, W.T. and T.R. Skopek (1987), Statistical Test for the Comparison of Samples from Mutational Spectra, J. Mol. Biol., 194: 391-396.

(2)

Bielas, J.H. (2002), A more Efficient Big Blue® Protocol Improves Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measurement, Mutation Res., 518: 107-112.

(3)

Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen and J. Vijg (1995), Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying in vivo Mutations Nature, 377(6550): 657-659.

(4)

Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1995), Statistical Design and Analysis of Mutation Studies in Transgenic Mice, Environ. Mol. Mutagen, 25(3): 246-255.

(5)

Carr, G.J. and N.J. Gorelick (1996), Mutational Spectra in Transgenic Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency, Environ. Mol. Mutagen, 28: 405-413.

(6)

Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio and V. Thybaud (1999), Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing in vivo for the Detection of Site-of-contact Mutagens, Mutagenesis, 14(1): 141-151.

(7)

Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen and L.M. Soper(1995), Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethylnitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of lacZ Transgenic Mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7485-7489.

(8)

Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper and J. Jiao (1997), Toward an Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells, Mutation Res., 388(2-3): 197-212.

(9)

Dunson, D.B. and K.R. Tindall (2000), Bayesian Analysis of Mutational Spectra, Genetics, 156: 1411-1418.

(10)

Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. Lohman, D.L. Knook and J. Vijg(1989), Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20): 7971-7975.

(11)

Gossen, J.A. and J. Vijg (1993), A Selective System for lacZ-Phage using a Galactose-sensitive E. coli Host, Biotechniques, 14(3): 326, 330.

(12)

Erikson, R.P. (2003), Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer, Mutation Res., 543: 125-136.

(13)

Erikson, R.P. (2010), Somatic Gene Mutation and Human Disease other than Cancer: an Update, Mutation Res., 705: 96-106.

(14)

Fung, K.Y., G.R. Douglas and D. Krewski (1998), Statistical Analysis of lacZ Mutant Frequency Data from MutaTMMouse Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 13(3): 249-255.

(15)

Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall and N. Yajima (2000), In vivo Transgenic Mutation Assays, Environ. Mol. Mutagen., 35: 253-259.

(16)

Heddle, J.A., H.-J. Martus and G.R. Douglas (2003), Treatment and Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays, Environ. Mol. Mutagen., 41: 1-6.

(17)

Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya and S. Garges (1996), Analysis of Genetic Instability during Mammary Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for in vivo Mutations in a Bacteriophage λ Transgene Target, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(17): 9073-9078.

(18)

Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge and J.M. Short (1990), The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutagenicity Testing, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212-218.

(19)

Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott and P.A. Burns (2008), Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational Spectra using Multivariate Data Analysis, Carcinogenesis, 29(4): 772778.

(20)

Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda and T. Sofuni (1996), A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi– and 6-thioguanine Selections, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465-470.

(21)

Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda and T. Sofuni (1999), Spi– Selection: an Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice, Environ. Mol. Mutagen., 34(1): 9-15.

(22)

Nohmi, T., T. Suzuki and K.I. Masumura (2000), Recent Advances in the Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays, Mutation Res., 455(1–2): 191-215.

(23)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, No19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris.

(24)

OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 103, ENV/JM/MONO(2009)7, OECD, Paris.

(25)

Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, R.W. Tennant and K.R. Tindall (1995), Study Design and Sample Sizes for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay, Environ. Mol. Mutagen., 25(3): 231-245.

(26)

Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft and N.J. Gorelick (1997), Sources of Variability in Data from a Positive Selection lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study, Mutation. Res., 388(2–3): 249-289.

(27)

Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas and C.L. Yauk (2006), Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays, Mutation. Res., 598: 164-193.

(28)

Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawamura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa and T. Nohmi (2010), Integration of in vivo Genotoxicity and Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Structural Isomers, Toxicol. Sci., 114(1): 71-78.

(29)

Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki and N. Yajima (2003), In vivo Transgenic Mutation Assays, Mutation Res., 540: 141-151.

(30)

Vijg, J. and G.R. Douglas (1996), Bacteriophage λ and Plasmid lacZ Transgenic Mice for studying Mutations in vivo in: G. Pfeifer (ed.), Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II, Plenum Press, New York, NY, USA, pp. 391-410.

(31)

Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster and G.R. Douglas (2005), A lacZ Transgenic Mouse Assay for the Detection of Mutations in Follicular Granulosa Cells, Mutation Res., 578(1-2): 117-123.

(32)

Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud (2011), Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.

(33)

OECD (2011), Retrospective Performance Assessment of OECD Test Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays, Series on Testing and Assessment, No 145, ENV/JM/MONO(2011)20, OECD, Paris.

(34)

Clermont, Y. (1972), Kinetics of spermatogenesis in mammals seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiol. Rev. 52: 198-236.

(35)

Robaire, B., Hinton, B.T., and Oregbin-Crist, M.-C. (2006), The Epididymis, in Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, J.S., and P. M, Wassarman (eds.), Physiology of Reproduction, Elsevier, the Netherlands, pp. 1071-1148.

(36)

Russell, L.B. (2004), Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse, Genetica, 122: 25-36.

”