02021R0808 — PT — 10.06.2021 — 001.002

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REGULAMENTO DE EXECUÇÃO (UE) 2021/808 DA COMISSÃO de 22 de março de 2021 relativo ao desempenho dos métodos analíticos para os resíduos de substâncias farmacologicamente ativas utilizadas em animais produtores de géneros alimentícios e à interpretação dos resultados, bem como aos métodos a utilizar na amostragem, e que revoga as Decisões 2002/657/CE e 98/179/CE (Texto relevante para efeitos do EEE) (JO L 180 de 21.5.2021, p. 84)

Alterado por:

		Jornal Oficial
		n.°	página	data
►M1	REGULAMENTO DE EXECUÇÃO (UE) 2021/810 DA COMISSÃO de 20 de maio de 2021	L 180	112	21.5.2021

Retificado por:

C1	Rectificação, JO L 186, 27.5.2021, p.  33 (2021/810)

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REGULAMENTO DE EXECUÇÃO (UE) 2021/808 DA COMISSÃO

de 22 de março de 2021

relativo ao desempenho dos métodos analíticos para os resíduos de substâncias farmacologicamente ativas utilizadas em animais produtores de géneros alimentícios e à interpretação dos resultados, bem como aos métodos a utilizar na amostragem, e que revoga as Decisões 2002/657/CE e 98/179/CE

(Texto relevante para efeitos do EEE)

Artigo 1.o

Objeto e âmbito de aplicação

O presente regulamento estabelece regras para os métodos de análise utilizados na amostragem e nas análises laboratoriais no que se refere aos resíduos de substâncias farmacologicamente ativas em animais vivos produtores de géneros alimentícios, suas partes e fluidos, excrementos, tecidos, produtos de origem animal, subprodutos animais, alimentos para animais e água. Estabelece igualmente regras para a interpretação dos resultados analíticos dessas análises laboratoriais.

O presente regulamento aplica-se aos controlos oficiais destinados a verificar o cumprimento dos requisitos relativos à presença de resíduos de substâncias farmacologicamente ativas.

Artigo 2.o

Definições

Para efeitos do presente regulamento, são aplicáveis as definições constantes do artigo 2.o do Regulamento Delegado (UE) 2019/2090 da Comissão ( 1 ), do Regulamento (UE) 2019/1871 da Comissão ( 2 ), do artigo 2.o do Regulamento (CE) n.o 470/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 3 ) e do Regulamento (CEE) n.o 315/93 do Conselho ( 4 ).

São igualmente aplicáveis as seguintes definições:

Artigo 3.o

Métodos de análise

Os Estados-Membros devem assegurar que as amostras colhidas em conformidade com o artigo 34.o do Regulamento (UE) 2017/625 são analisadas utilizando métodos que satisfaçam os seguintes requisitos:

Artigo 4.o

Controlo da qualidade

Os Estados-Membros devem assegurar a qualidade dos resultados das análises efetuadas nos termos do Regulamento (UE) 2017/625, em especial através de ensaios de monitorização ou de resultados de calibração, em conformidade com a norma ISO/IEC 17025:2017 relativa aos requisitos gerais de competência para laboratórios de ensaio e calibração, e com os requisitos aplicáveis ao controlo da qualidade durante as análises de rotina estabelecidos no anexo I, capítulo 3, do presente regulamento.

Artigo 5.o

Interpretação dos resultados

Artigo 6.o

Métodos de amostragem

Os Estados-Membros devem assegurar que as amostras são colhidas, manipuladas e rotuladas em conformidade com os métodos de amostragem pormenorizados estabelecidos no anexo II do presente regulamento.

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Artigo 7.o

Revogações e medidas transitórias

As Decisões 2002/657/CE e 98/179/CE são revogadas a partir da data de entrada em vigor do presente regulamento.

No entanto, até 10 de junho de 2026, os requisitos estabelecidos nos pontos 2 e 3 do anexo I da Decisão 2002/657/CE continuam a aplicar-se aos métodos que tenham sido validados antes da data de entrada em vigor do presente regulamento.

Para os efeitos referidos no artigo 8.o, segundo parágrafo, do Regulamento (UE) 2019/1871, o anexo II da Decisão 2002/657/CE continua a aplicar-se até 27 de novembro de 2022.

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Artigo 8.o

Entrada em vigor

O presente regulamento entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e diretamente aplicável em todos os Estados-Membros.

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ANEXO I

CAPÍTULO 1

CRITÉRIOS DE DESEMPENHO E OUTROS REQUISITOS PARA OS MÉTODOS ANALÍTICOS

1.1.    Requisitos para os métodos de triagem

1.1.1.    Categorias de métodos de triagem adequados

Devem ser utilizados métodos qualitativos, semiquantitativos ou quantitativos como métodos de triagem adequados.

1.1.2.   Requisitos para os métodos de triagem biológicos, bioquímicos ou físico-químicos

Para as substâncias proibidas ou não autorizadas, a CCβ deve ser tão baixa quanto razoavelmente alcançável e, em qualquer caso, inferior ao valor de referência para a tomada de medidas (RTM), no que se refere às substâncias para as quais estão estabelecidos RTM nos termos do Regulamento (UE) 2019/1871.

Para as substâncias farmacologicamente ativas autorizadas, a CCβ deve ser inferior ao limite máximo de resíduos (LMR) ou ao limite máximo (LM).

Para efeitos de triagem, apenas se podem utilizar métodos analíticos em relação aos quais se possa demonstrar de forma documentada e reprodutível que estão validados e têm uma taxa de falsos resultados conformes inferior ou igual a 5% (erro ß). Em caso de suspeita de resultado não conforme, esse resultado deve ser confirmado através de um método de confirmação.

Os métodos de triagem quantitativos utilizados tanto para a triagem como para a confirmação devem satisfazer os mesmos requisitos de exatidão, intervalo e precisão descritos nos pontos 1.2.2.1 e 1.2.2.2.

1.2.    Requisitos para os métodos de confirmação

1.2.1.    Requisitos gerais para os métodos de confirmação

Para as substâncias proibidas ou não autorizadas, o CCα deve ser tão baixo quanto razoavelmente alcançável. Para as substâncias proibidas ou não autorizadas para as quais está estabelecido um RTM nos termos do Regulamento (UE) 2019/1871, o CCα deve ser inferior ou igual ao valor de referência para a tomada de medidas.

Para as substâncias autorizadas, o CCα deve ser superior, mas tão aproximado quanto possível do LMR ou do LM.

Para efeitos de confirmação, apenas se podem utilizar métodos analíticos em relação aos quais se possa demonstrar de forma documentada e reprodutível que estão validados e têm uma taxa de falsos resultados não conformes (erro α) inferior ou igual a 1% para as substâncias proibidas ou não autorizadas, ou inferior ou igual a 5% para as substâncias autorizadas.

Os métodos de confirmação devem fornecer informações sobre a composição química estrutural do analito. Consequentemente, os métodos de confirmação que utilizam apenas a análise cromatográfica, sem recurso a um sistema de deteção por espetrometria de massa, não são adequados para utilização isolada enquanto métodos de confirmação para as substâncias farmacologicamente ativas proibidas ou não autorizadas. No caso de a espetrometria de massa não ser adequada para as substâncias autorizadas, podem ser utilizados outros métodos, como HPLC-DAD e -FLD, ou uma combinação dos mesmos.

Quando necessário de acordo com o método de confirmação, deve ser adicionado um padrão interno apropriado à toma de ensaio, no início do processo de extração. Em função da disponibilidade, usar-se-ão quer formas estáveis isotopicamente marcadas do analito, particularmente adequadas para a deteção por espetrometria de massa, quer compostos análogos que apresentem uma relação estrutural próxima com o analito. Quando não for possível utilizar um padrão interno adequado, a identificação do analito deve ser confirmada, de preferência, através de cocromatografia ( 16 ). Neste caso, deve obter-se apenas um pico, cujo incremento na altura (ou área) deve ser equivalente à quantidade de analito adicionada. Se tal não for praticável, devem ser utilizados padrões ajustados em função da matriz ou padrões de matriz fortificada.

1.2.2.    Critérios gerais de desempenho para os métodos de confirmação

1.2.2.1.   Veracidade através da recuperação

Para as análises repetidas de um material de referência certificado, o desvio entre o valor médio da fração mássica determinado experimentalmente corrigido em função da recuperação e o valor certificado deve respeitar os intervalos mínimos de veracidade indicados no quadro 1.

Quando não estiverem disponíveis materiais de referência certificados, é aceitável que a veracidade das medições seja avaliada de outras formas, tais como a utilização de materiais com valores atribuídos de estudos interlaboratoriais ou através de adições de quantidades conhecidas do(s) analito(s) a uma matriz em branco.

1.2.2.2.   Precisão

O coeficiente de variação (CV) para as análises repetidas de um material de referência ou de um material fortificado, em condições de reprodutibilidade intralaboratorial, não deve exceder o nível calculado através da equação de Horwitz. A equação é:

CV = 2(1 – 0,5 log C)

em que C é a fração mássica expressa sob a forma de uma potência de 10 (por exemplo, 1 mg/g = 10-3). Para as frações mássicas inferiores a 120 μg/kg, a aplicação da equação de Horwitz resulta em valores inaceitavelmente elevados. Por conseguinte, o coeficiente de variação máximo permitido não deve ser superior aos valores apresentados no quadro 2.

Para as análises efetuadas em condições de repetibilidade, o coeficiente de variação em condições de repetibilidade deve ser igual ou inferior a dois terços dos valores indicados no quadro 2.

1.2.3.    Requisitos para a separação cromatográfica

Para a cromatografia líquida (LC) ou gasosa (GC), o tempo de retenção mínimo aceitável para o(s) analito(s) em estudo deve ser o dobro do tempo de retenção correspondente ao volume morto da coluna. O tempo de retenção do analito no extrato deve corresponder ao do padrão de calibração, de um padrão ajustado em função da matriz ou de um padrão de matriz fortificada, com uma tolerância de ± 0,1 minuto. Para a cromatografia rápida, em que o tempo de retenção é inferior a 2 minutos, é aceitável um desvio inferior a 5% do tempo de retenção. Caso se utilize um padrão interno, o rácio entre o tempo de retenção cromatográfica do analito e o do padrão interno, ou seja, o tempo de retenção relativa do analito, deve corresponder ao do padrão de calibração, do padrão ajustado em função da matriz ou do padrão de matriz fortificada, com um desvio máximo de 0,5% para a cromatografia gasosa e de 1% para a cromatografia líquida, para os métodos validados a partir da data de entrada em vigor do presente regulamento.

1.2.4.    Critérios de desempenho específicos para a espetrometria de massa

1.2.4.1.   Deteção por espetrometria de massa

A deteção por espetrometria de massa deve ser efetuada utilizando algumas das seguintes opções:

Tanto a espetrometria de massa de baixa resolução (LRMS, com uma resolução de uma unidade de massa) como a espetrometria de massa de alta resolução (HRMS), incluindo, por exemplo, instrumentação de setores de dupla focalização, tempo de voo (TOF) e Orbitrap, são adequadas.

Para confirmar a identidade de um analito em espetrometria de massa de alta resolução (HRMS), o desvio de massa de todos os iões de diagnóstico deve ser inferior a 5 ppm (ou, no caso de m/z < 200, abaixo de 1 mDa). Com base no que precede, a resolução efetiva deve ser selecionada em função da adequação à sua finalidade e a resolução deve normalmente ser superior a 10 000 para todo o intervalo de massas a 10% do vale ou a 20 000 à largura a meia altura (FWHM).

Quando a determinação por espetrometria de massa é efetuada através do registo de espetros de varrimento total (tanto LRMS como HRMS), só são adequados iões de diagnóstico com uma intensidade relativa superior a 10% no espetro de referência do padrão de calibração, do padrão ajustado em função da matriz ou do padrão de matriz fortificada. Os iões de diagnóstico devem incluir o ião molecular (se presente, a uma intensidade ≥ 10% do pico de base) e iões fragmentados característicos ou iões-produto.

Seleção de iões precursores: quando a determinação por espetrometria de massa é efetuada por fragmentação após seleção de iões precursores, a seleção de iões precursores é efetuada com uma resolução de uma unidade de massa ou superior. O ião precursor selecionado deve ser o ião molecular, os aductos característicos do ião molecular, os iões-produto característicos ou iões de um dos seus isótopos. Caso a seleção do precursor tenha uma janela de seleção mássica superior a um Dalton (por exemplo, no caso de aquisição independente de dados), a técnica é considerada uma análise de confirmação de varrimento total.

Iões fragmentados e iões-produto: os iões fragmentados ou iões-produto selecionados devem ser iões fragmentados de diagnóstico para o analito/produto medido. Sempre que possível, devem ser omitidas as transições não seletivas (por exemplo, o catião tropílio ou a perda de água). A abundância de iões de diagnóstico deve ser determinada a partir da área ou altura do pico de cromatogramas de iões extraídos integrados. O mesmo se aplica quando são utilizadas medições de varrimento total para efeitos de identificação. A razão sinal/ruído (S/N) de todos os iões de diagnóstico deve ser igual ou superior a três para um (3:1).

Intensidades relativas: as intensidades relativas dos iões de diagnóstico (razão entre iões) são expressas em percentagem da intensidade do ião ou da transição mais abundantes. A razão entre iões deve ser determinada comparando espetros ou integrando os sinais do traçado da massa do ião extraído. A razão entre iões do analito a confirmar deve corresponder à dos padrões ajustados em função da matriz, dos padrões de matriz fortificada ou das soluções padrão a concentrações comparáveis, medidas nas mesmas condições, com um desvio relativo de ± 40%.

Para todas as análises por espetrometria de massa, deve determinar-se pelo menos uma razão entre iões. Devem ser, de preferência, iões obtidos num único varrimento, mas os iões podem também ter origem em diferentes varrimentos na mesma injeção (ou seja, varrimento total e varrimento de fragmentação).

1.2.4.2.   Identificação

Deve ser utilizado um sistema de pontos de identificação para selecionar modos de aquisição e critérios de avaliação adequados. Para a confirmação da identidade de substâncias numa matriz para as quais está estabelecido um LMR (utilização autorizada), é necessário um mínimo de 4 pontos de identificação. Para as substâncias não autorizadas ou proibidas, são necessários 5 pontos de identificação. Um ponto pode ter origem na separação cromatográfica. O quadro 3 mostra o número de pontos de identificação que cada uma das técnicas produz. A fim de reunir os pontos de identificação exigidos para a confirmação, podem adicionar-se pontos de identificação obtidos a partir de diferentes técnicas.

1.2.5.    Critérios de desempenho específicos para a determinação de um analito por cromatografia líquida com técnicas de deteção que não a espetrometria de massa

Apenas no caso das substâncias autorizadas, podem ser utilizadas as seguintes técnicas em alternativa aos métodos baseados na espetrometria de massa, desde que sejam satisfeitos os critérios pertinentes para essas técnicas:

A técnica de cromatografia líquida com deteção por UV/VIS (comprimento de onda único) não é adequada para utilização isolada enquanto método de confirmação.

1.2.5.1.   Critérios de desempenho para a espetrofotometria de varrimento total com deteção por um sistema de díodos

Devem ser satisfeitos os critérios de desempenho para a separação cromatográfica incluídos no capítulo 1.2.3.

Os máximos de absorção no espetro UV do analito devem ocorrer aos mesmos comprimentos de onda que os do padrão de calibração em matriz, dentro de uma margem máxima que é determinada pela resolução do sistema de deteção. No caso de deteção com sistema de díodos, a margem máxima em causa é, em geral, de ± 2 nm. Acima de 220 nm, o espetro do analito não deve ser visivelmente diferente do espetro do padrão de calibração nas zonas dos dois espetros com uma absorvância relativa superior ou igual a 10%. Este critério é satisfeito quando, por um lado, se encontram presentes os mesmos máximos e, por outro, quando em nenhum dos pontos a diferença entre os dois espetros excede 10% da absorvância do padrão de calibração. Caso se utilize a pesquisa e a concordância de dados de referência assistidas por computador, a comparação dos dados do espetro das amostras oficiais com os da solução de calibração deve exceder um fator crítico de concordância. Este fator deve ser determinado durante o processo de validação para todos os analitos, com base nos espetros para os quais estejam satisfeitos os critérios descritos supra. Deve verificar-se a variabilidade dos espetros causada pela matriz da amostra e pelo desempenho do detetor.

1.2.5.2.   Critérios de desempenho para a espetrofotometria com deteção por fluorescência

Devem ser satisfeitos os critérios de desempenho para a separação cromatográfica incluídos no capítulo 1.2.3.

A seleção dos comprimentos de onda de excitação e de emissão combinada com as condições cromatográficas deve ser feita de forma a minimizar os efeitos de componentes interferentes em extratos da amostra em branco. Deve haver um mínimo de 50 nanómetros entre os comprimentos de onda de excitação e de emissão.

O valor máximo do pico mais próximo no cromatograma deve encontrar-se separado do pico correspondente ao analito por uma distância igual a, pelo menos, a largura total do pico do analito a 10% da sua altura máxima.

Tal aplica-se a moléculas que exibem fluorescência inata, bem como a moléculas que exibem fluorescência após transformação ou derivação.

CAPÍTULO 2

VALIDAÇÃO

2.1.    Características de desempenho a determinar para os métodos analíticos

Através da validação do método, deve demonstrar-se que o método analítico satisfaz os critérios aplicáveis às características de desempenho pertinentes. Diferentes objetivos de controlo exigem diferentes categorias de métodos. O quadro 5 determina as características de desempenho que devem ser verificadas para cada tipo de método, fornecendo o presente capítulo explicações mais pormenorizadas sobre cada parâmetro.

2.2.    Veracidade, repetibilidade e reprodutibilidade intralaboratorial

O presente capítulo fornece exemplos e referências para os procedimentos de validação. Podem utilizar-se outras abordagens para demonstrar que o método satisfaz os critérios de desempenho, desde que alcancem o mesmo nível e qualidade de informação.

2.2.1.    Validação convencional

O cálculo dos parâmetros de acordo com os métodos convencionais requer a realização de diversas experiências isoladas. Cada característica de desempenho deve ser determinada para cada alteração importante (ver secção 2.4). No que respeita aos métodos multianalitos, podem analisar-se vários analitos em simultâneo, desde que se tenham excluído possíveis interferências pertinentes. De modo semelhante, podem determinar-se diversas características do desempenho. Por conseguinte, para minimizar a carga de trabalho, aconselha-se, tanto quanto possível, combinar as experiências (por exemplo, a repetibilidade e a reprodutibilidade intralaboratorial com a especificidade, a análise das amostras em branco para determinar o limite de decisão para a confirmação e o controlo da especificidade).

2.2.1.1.   Veracidade com base num material de referência certificado

É preferível determinar a veracidade de um método analítico por meio de material de referência certificado (MRC). O procedimento encontra-se descrito na norma ISO 5725-4:1994 ( 17 ).

É apresentado o seguinte exemplo:

Veracidade (%) = (concentração média detetada corrigida com a recuperação) × 100/valor certificado.

2.2.1.2.   Veracidade com base em amostras fortificadas

Se não estiver disponível material de referência certificado, a veracidade do método deve ser determinada por experimentação utilizando uma matriz em branco reforçada, no mínimo de acordo com o seguinte esquema:

Veracidade (%) = (concentração média detetada corrigida com a recuperação) × 100/nível de fortificação.

No caso dos métodos para as substâncias autorizadas validados antes da data de aplicação do presente regulamento, é suficiente determinar a veracidade do método utilizando 6 alíquotas fortificadas a 0,5, 1,0 e 1,5 vezes o LMR ou o LM.

2.2.1.3.   Repetibilidade

No caso dos métodos para as substâncias autorizadas validados antes da data de entrada em vigor do presente regulamento, é suficiente determinar a repetibilidade com matrizes fortificadas em concentrações a 0,5, 1,0 e 1,5 vezes o LMR ou o LM.

Em alternativa, o cálculo da repetibilidade pode ser efetuado de acordo com a norma ISO 5725-2:2019 ( 22 ).

2.2.1.4.   Reprodutibilidade intralaboratorial

No caso dos métodos para as substâncias autorizadas validados antes da data de entrada em vigor do presente regulamento, é suficiente determinar a reprodutibilidade intralaboratorial com matrizes fortificadas em concentrações a 0,5, 1,0 e 1,5 vezes o LMR ou o LM.

Em alternativa, o cálculo da reprodutibilidade intralaboratorial/precisão intermédia pode também ser efetuado de acordo com as normas ISO 5725-2:2019, ISO 11843-1:1997 ( 23 ), Codex CAC/GL 59-2006 ( 24 ).

2.2.2.    Validação em conformidade com modelos alternativos

O cálculo dos parâmetros em conformidade com modelos alternativos exige a realização de um plano experimental. Deve ser concebido um plano experimental em função do número de espécies e fatores diferentes que estão a ser investigados. Assim, a primeira fase de todo o procedimento de validação é ter em conta as populações de amostras que, no futuro, serão analisadas no laboratório, a fim de determinar as espécies e os fatores mais importantes, que poderão influenciar os resultados das medições. A abordagem fatorial permite avaliar a incerteza de medição dos resultados dos ensaios, obtidos numa variedade de condições de ensaio num determinado laboratório, tais como diferentes analistas, instrumentação diferente, diferentes lotes de reagentes, matrizes diferentes, duração dos ensaios diferente e temperaturas diferentes. Subsequentemente, a gama de concentrações tem de ser escolhida de forma adaptada ao objetivo, de acordo com o LMR ou o LM para as substâncias autorizadas, ou o RTM ou o TMC para as substâncias proibidas ou não autorizadas.

A abordagem fatorial visa estabelecer dados de precisão e dados de medição fiáveis através de uma variação simultânea controlada dos fatores selecionados. Permite avaliar o impacto combinado dos efeitos fatoriais e dos efeitos aleatórios. A conceção experimental permite igualmente a investigação da robustez ( 25 ) do método analítico e a determinação do desvio-padrão da reprodutibilidade interna entre matrizes.

Segue-se um exemplo de abordagem alternativa que utiliza um plano de conceção experimental ortogonal.

Podem ser examinados até sete fatores (fatores de ruído). O estudo foi concebido de modo a que a precisão, a veracidade (com base em amostras fortificadas), a sensibilidade, a incerteza de medição e as concentrações críticas possam ser determinadas simultaneamente através da execução do plano experimental.

O cálculo das características do método deve ser efetuado conforme descrito por Jülicher et al. ( 26 ).

2.2.3.    Outras abordagens da validação

Podem usar-se outras abordagens para demonstrar que o método analítico satisfaz os critérios relativos às características de desempenho, desde que alcancem o mesmo nível e qualidade de informação. A validação pode também ser efetuada através da realização de um estudo interlaboratorial, tal como estabelecido pelo Codex Alimentarius, pela ISO ou pela IUPAC ( 27 ) ou em conformidade com métodos alternativos como os estudos unilaboratoriais ou a validação interna ( 28 ). Sempre que se aplicarem procedimentos de validação alternativos, devem ser estabelecidos no protocolo de validação o modelo e a estratégia subjacentes, juntamente com os respetivos pré-requisitos, pressupostos e fórmulas ou, pelo menos, devem ser fornecidas referências quanto à sua disponibilidade.

2.3.    Seletividade/Especificidade

Tanto quanto possível, deve determinar-se a capacidade de discriminação entre o analito e as substâncias estreitamente aparentadas. Deve determinar-se a interferência de homólogos, isómeros, produtos de degradação, substâncias endógenas, análogos, metabolitos do resíduo em causa, compostos da matriz ou qualquer outra substância potencialmente interferente e, se necessário, deve alterar-se o método a fim de evitar as interferências identificadas. Para determinar a especificidade do método, deve ser utilizada a seguinte abordagem:

2.4.    Robustez

O método analítico deve ser testado para determinar a continuidade do seu desempenho em diferentes condições experimentais, que incluem, por exemplo, condições de amostragem diferentes e pequenas alterações que podem ocorrer nos ensaios de rotina. Para testar a robustez do método, as alterações introduzidas nas condições experimentais devem ser menores. A importância destas alterações deve ser avaliada. Deve determinar-se cada característica de desempenho relativamente a todas as pequenas alterações que tenham comprovadamente um efeito significativo sobre o desempenho do ensaio.

2.5.    Estabilidade

Devem determinar-se a estabilidade do padrão de calibração, do padrão ajustado em função da matriz e/ou dos padrões de matriz fortificada e dos constituintes do analito ou da matriz na amostra durante o armazenamento ou a análise, uma vez que as instabilidades podem influenciar os resultados do ensaio.

Geralmente, a estabilidade do analito está bem caracterizada em várias condições de armazenamento. As experiências realizadas para monitorizar as condições de armazenamento de padrões e amostras, que foram realizadas no âmbito da acreditação laboratorial normal e do sistema de controlo da qualidade, podem fornecer as informações necessárias. Se estiverem disponíveis dados de estabilidade para os analitos na matriz (por exemplo, com base nas informações dos LRUE, dados publicados, etc.), estes dados não têm de ser determinados por cada laboratório. No entanto, as referências aos dados de estabilidade disponíveis de analitos em solução e numa matriz só são aceitáveis se se aplicarem condições idênticas.

Caso os dados de estabilidade necessários não estejam disponíveis, devem ser utilizadas as seguintes abordagens:

2.5.1.    Determinação da estabilidade do analito em solução

Analito restante (%) = Ci × 100/Cfresco

Ci = concentração no momento i

Cfresco = concentração da solução fresca

O valor médio de cinco soluções idênticas armazenadas não deve diferir mais de 15% do valor médio de cinco soluções idênticas recentemente preparadas. O valor médio das cinco soluções recentemente preparadas deve ser utilizado como base para o cálculo da diferença percentual.

2.5.2.    Determinação da estabilidade do(s) analito(s) na matriz

O valor médio de cinco soluções idênticas armazenadas não deve diferir mais do que a reprodutibilidade intralaboratorial do método em relação ao valor médio de cinco soluções idênticas recentemente preparadas. O valor médio das cinco soluções recentemente preparadas deve ser utilizado como base para o cálculo da diferença percentual.

2.6.    Limite de decisão para a confirmação (CCα)

Deve determinar-se o CCα para os métodos de confirmação. O CCα deve ser estabelecido em condições conformes com os requisitos de identificação ou identificação e quantificação definidos em «Critérios de desempenho e outros requisitos para os métodos analíticos», tal como estabelecido no capítulo 1.

Para o controlo da conformidade das amostras, a incerteza de medição-padrão combinada já foi tida em conta no valor CCα (limite de decisão para a confirmação).

2.7.    Capacidade de deteção para a triagem (CCβ)

Deve determinar-se a CCβ para os métodos de triagem. A CCβ deve ser estabelecida como definido em «Critérios de desempenho e outros requisitos para os métodos analíticos», tal como enunciado no capítulo 1 do presente anexo e em conformidade com os requisitos estabelecidos no quadro 5. No entanto, não é necessário aplicar os requisitos de identificação completos aos métodos de triagem (ver 1.2.3, 1.2.4 e 1.2.5).

2.8.    Curvas de calibração

Quando as curvas de calibração são usadas para quantificação:

No caso das curvas de calibração baseadas numa solução-padrão, devem ser indicadas gamas aceitáveis de padrões ajustados em função da matriz ou de padrões de matriz fortificada para os parâmetros da curva de calibração, que podem variar de série para série.

2.9.    Recuperação absoluta

A recuperação absoluta do método deve ser determinada, sempre que não for utilizado nenhum padrão interno ou nenhuma calibração de matriz fortificada.

Se estiverem satisfeitos os requisitos de veracidade estabelecidos no quadro 1, pode ser utilizado um fator de correção fixo. Caso contrário, deve ser utilizado o fator de recuperação obtido para esse lote específico. Em alternativa, deve utilizar-se o procedimento de adição ( 31 ) de padrão ou um padrão interno em vez de utilizar um fator de correção da recuperação.

A recuperação absoluta deve ser calculada para, pelo menos, seis lotes de matriz representativos.

Antes da extração, uma alíquota da matriz em branco deve ser fortificada com o analito e, após a preparação da amostra, uma segunda alíquota da matriz em branco deve ser fortificada a um nível de concentração pertinente, devendo determinar-se a concentração do analito.

A recuperação deve ser calculada do seguinte modo:

Rec (analito) = (padrão de matriz fortificada)/(padrão ajustado em função da matriz) × 100

2.10.    Efeitos de matriz relativos

O efeito de matriz relativo deve ser determinado em todos os casos. Tal pode ser efetuado quer como parte da validação quer em experiências separadas. O cálculo do efeito de matriz relativo deve ser efetuado para, pelo menos, 20 lotes em branco diferentes (matriz/espécie), de acordo com o âmbito do método, por exemplo, diferentes espécies a abranger.

Após a extração, a matriz em branco deve ser fortificada com o analito ao RTM, LMR ou LM e deve ser analisada juntamente com uma solução pura do analito.

O efeito de matriz relativo ou o fator de matriz (MF — matrix factor) é calculado do seguinte modo:

IS : padrão interno (internal standard)

MMS : padrão ajustado em função da matriz (matrix-matched standard)

O coeficiente de variação não deve ser superior a 20% para o MF (padrão normalizado para o IS).

CAPÍTULO 3

CONTROLO DA QUALIDADE DURANTE AS ANÁLISES DE ROTINA — VERIFICAÇÃO CONTÍNUA DO DESEMPENHO DO MÉTODO

Devem ser satisfeitos os requisitos que garantem a qualidade dos resultados analíticos constantes do capítulo 7.7 da norma ISO/IEC 17025:2017 ( 32 ).

Durante as análises de rotina, a análise de materiais de referência certificados (MRC) é a opção preferível para fornecer provas do desempenho do método. Uma vez que os MRC que contêm os analitos pertinentes aos níveis de concentração requeridos raramente estão disponíveis, também podem ser utilizados, em alternativa, materiais de referência fornecidos e caracterizados pelos LRUE ou pelos laboratórios que possuam uma acreditação ISO/IEC 17043:2010 ( 33 ). Em alternativa, podem ainda ser utilizados outros materiais de referência internos que sejam controlados regularmente.

A verificação contínua do desempenho do método durante as análises de rotina deve ser efetuada na fase de triagem e na fase de confirmação.

Recomenda-se a seguinte ordem para as amostras de controlo da qualidade: amostra de controlo da adequação do instrumento ao sistema, amostra de controlo conforme, amostra(s) a confirmar, novamente amostra de controlo conforme e amostra de controlo da qualidade fortificada (amostras de controlo não conformes).

No caso dos métodos quantitativos, para cada lote de amostras oficiais, deve ser analisada e medida uma curva de calibração antes ou depois das amostras acima elencadas.

Sempre que possível, deve avaliar-se a veracidade (com base em amostras fortificadas) de todos os analitos visados nas amostras de controlo não conformes por meio de gráficos de controlo da qualidade em conformidade com o capítulo 7.7 da norma ISO/IEC 17025:2017. Se tal exigir um número desproporcionadamente elevado de determinações da veracidade, o número de analitos pode ser reduzido a um número de analitos representativos.

CAPÍTULO 4

ALARGAMENTO DO ÂMBITO VALIDADO DE UM MÉTODO PREVIAMENTE VALIDADO

Por vezes, é necessário alargar o âmbito de um método que foi previamente validado de forma abrangente. Nestes casos, o alargamento do âmbito deve ser realizado de forma eficiente e analiticamente correta. Este objetivo pode ser alcançado mediante a validação de um número reduzido de amostras (por exemplo, metade do número de amostras) em comparação com uma validação completa.

No entanto, o tipo e número de alterações a validar num único sistema de validação reduzido devem basear-se sempre em conhecimentos especializados e em experiências anteriores, por exemplo, uma alteração na técnica de deteção exigiria, em qualquer caso, uma validação completa.

Em geral, a fim de assegurar que a validade do método se mantém, o seu desempenho deve ser monitorizado continuamente e comparado com os parâmetros de validação inicialmente obtidos. De preferência, este controlo contínuo do desempenho do método é concebido de modo a que os dados em falta para uma validação completa possam ser recolhidos ao longo do tempo (por exemplo, com alguns pontos de dados provenientes de amostras de controlo da qualidade em cada série analítica).

4.1.    Alargamentos dos métodos no que diz respeito à gama de concentrações

Devido a alterações dos LMR, dos LM e dos RTM, pode ser necessário ajustar a gama de concentração para a qual um método está validado. Nesse caso, a aplicação de um sistema de validação reduzido é aceitável.

As curvas de calibração para a gama alterada devem ser preparadas de acordo com o procedimento validado. Devem ser analisados diferentes lotes fortificados a diferentes níveis de concentração (ver 2.2.1, 2.2.2). A veracidade, a repetibilidade e a reprodutibilidade intralaboratorial/precisão intermédia deverão situar-se dentro de um intervalo aceitável em comparação com as do método inicialmente validado. Se for caso disso, deve efetuar-se um novo cálculo da CCβ (métodos de triagem) e do CCα (métodos de confirmação).

4.2.    Alargamentos dos métodos no que diz respeito a substâncias adicionais

De um modo geral, o alargamento do método a compostos adicionais só é possível para os analitos que são similares, em termos de estrutura e características, aos já incluídos no método analítico. Nesse caso, a aplicação de um sistema de validação reduzido é aceitável. Do mesmo modo, não é permitida qualquer divergência em relação à descrição do método.

As curvas de calibração das substâncias adicionais devem ser preparadas de acordo com o procedimento validado. Devem ser analisados diferentes lotes de matriz fortificada a diferentes níveis de concentração (ver 2.2.1, 2.2.2). A veracidade, a repetibilidade e a reprodutibilidade intralaboratorial/precisão intermédia devem situar-se dentro de um intervalo comparável em relação às dos outros analitos do método inicialmente validado e estar em conformidade com os requisitos estabelecidos no ponto 1.2.2. Deve ser efetuado um cálculo da CCβ (métodos de triagem) e do CCα (métodos de confirmação) para os novos analitos.

4.3.    Alargamentos dos métodos no que diz respeito a matrizes/espécies

A inclusão de novas matrizes ou espécies num método analítico já validado deve ser sempre uma decisão caso a caso, com base nos conhecimentos e na experiência adquirida até à data com o método e em experiências preliminares para avaliar os potenciais efeitos de matriz e as interferências. Em geral, tal só será possível para as matrizes que apresentem propriedades similares e para os analitos não críticos (estabilidade, detetabilidade).

As curvas de calibração (padrão ou matriz) devem ser preparadas de acordo com o procedimento validado. Devem ser analisados diferentes lotes de matriz fortificada a diferentes níveis de concentração (ver 2.2.1, 2.2.2). A veracidade, a repetibilidade e a reprodutibilidade intralaboratorial/precisão intermédia devem situar-se dentro de um intervalo aceitável em relação às do método inicialmente validado e estar em conformidade com os requisitos estabelecidos no ponto 1.2.2. Dependendo da abordagem de validação, poderá ser necessário um novo cálculo da CCβ (métodos de triagem) ou do CCα (métodos de confirmação).

Se os resultados não se situarem dentro de um intervalo aceitável em relação aos valores da matriz original, será necessária uma validação completa adicional, a fim de determinar os parâmetros de desempenho específicos da matriz/espécie.

Nos casos em que os LMR para uma determinada substância diferem para determinadas matrizes, será muito provavelmente difícil adaptar o âmbito do método à matriz/espécie e à concentração adicionais, uma vez que, neste caso, têm de ser consideradas duas alterações. Nesses casos, recomenda-se uma validação completa.

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ANEXO II

PROCEDIMENTOS DE AMOSTRAGEM E TRATAMENTO OFICIAL DAS AMOSTRAS

1.    Quantidade de amostra

As quantidades mínimas de amostra devem ser definidas no programa nacional de controlo de resíduos. As quantidades mínimas de amostra devem ser suficientes para permitir que os laboratórios aprovados realizem os procedimentos analíticos necessários para completar as análises de triagem e de confirmação. Especificamente para aves de capoeira, aquicultura, coelhos, caça de criação, répteis e insetos, a amostra consiste em um ou mais animais, dependendo dos requisitos dos métodos analíticos. No caso dos ovos, a dimensão da amostra será de, pelo menos, 12 ovos ou mais, em função dos métodos analíticos utilizados. Caso seja necessário analisar várias categorias de substâncias numa única amostra utilizando diferentes métodos analíticos, a dimensão da amostra deve ser aumentada em conformidade.

2.    Divisão em subamostras

Exceto se tal não for tecnicamente possível ou não for exigido pela legislação nacional, cada amostra deve ser dividida em, pelo menos, duas subamostras equivalentes, de forma que cada uma delas possa ser submetida ao procedimento analítico completo. A subdivisão das amostras pode ter lugar no ponto de colheita ou no laboratório.

3.    Rastreabilidade

Cada amostra deve ser colhida de modo a que seja sempre possível rastreá-la até à exploração de origem, ao lote de animais ou a cada animal, quando pertinente. Em especial, no caso do leite, de acordo com a escolha do Estado-Membro, as amostras podem ser colhidas num dos seguintes locais:

4.    Recipientes para as amostras

As amostras devem ser colocadas em recipientes adequados que permitam manter a sua integridade e identificar a sua origem. Em especial, os contentores devem impedir a substituição, a contaminação cruzada e a degradação. Os recipientes devem ser oficialmente selados.

5.    Relatório de amostragem

Será elaborado um relatório de todos os procedimentos de amostragem.

O inspetor insere nesse relatório, pelo menos, os seguintes elementos:

Em função do procedimento de amostragem, devem ser fornecidas cópias do relatório em papel ou em formato eletrónico. O relatório de amostragem e respetivas cópias devem ser preenchidos de forma a garantir a sua autenticidade e validade legal, o que pode exigir que esses documentos sejam assinados pelo inspetor. No caso de a amostragem ter lugar numa exploração, o criador ou seu representante poderá ser convidado a assinar o original do relatório.

O original do relatório de amostragem fica na posse da autoridade competente, que zelará por que pessoas não autorizadas a ele não tenham acesso.

Se necessário, o criador ou o proprietário do estabelecimento pode ser informado da amostragem efetuada.

6.    Relatório de amostragem para o laboratório

O relatório de amostragem para o laboratório estabelecido pelas autoridades competentes deve estar em conformidade com os requisitos estabelecidos no capítulo 7 da norma ISO/IEC 17025:2017 ( 34 ) e conter, pelo menos, as seguintes informações:

O relatório de amostragem para o laboratório deve acompanhar a amostra, quando esta for enviada ao laboratório.

7.    Transporte e armazenamento

Os planos de controlo de resíduos devem especificar as condições de transporte e armazenamento adequadas para cada combinação analito/matriz, de modo a garantir a estabilidade dos analitos e a integridade das amostras. O tempo de transporte deve ser o mais curto possível e a temperatura durante o transporte deve ser adequada para garantir a estabilidade do analito.

Deve ser dada uma atenção especial às caixas de transporte, à temperatura e ao prazo de entrega ao laboratório responsável.

Em caso de qualquer não conformidade com os requisitos do programa de controlo, o laboratório deve informar de imediato a autoridade competente.

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( 1 ) Regulamento Delegado (UE) 2019/2090 da Comissão, de 19 de junho de 2019, que complementa o Regulamento (UE) 2017/625 do Parlamento Europeu e do Conselho no que diz respeito aos casos de suspeita de incumprimento ou de incumprimento comprovado das regras da União aplicáveis à utilização ou aos resíduos de substâncias farmacologicamente ativas autorizadas em medicamentos veterinários ou como aditivos para a alimentação animal ou das regras da União aplicáveis à utilização ou aos resíduos de substâncias farmacologicamente ativas proibidas ou não autorizadas (JO L 317 de 9.12.2019, p. 28).

( 2 ) Regulamento (UE) 2019/1871 da Comissão, de 7 de novembro de 2019, relativo aos valores de referência para a tomada de medidas para substâncias farmacologicamente ativas não autorizadas presentes nos géneros alimentícios de origem animal e que revoga a Decisão 2005/34/CE (JO L 289 de 8.11.2019, p. 41).

( 3 ) Regulamento (CE) n.o 470/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 6 de maio de 2009, que prevê procedimentos comunitários para o estabelecimento de limites máximos de resíduos de substâncias farmacologicamente ativas nos alimentos de origem animal, que revoga o Regulamento (CEE) n.o 2377/90 do Conselho e que altera a Diretiva 2001/82/CE do Parlamento Europeu e do Conselho e o Regulamento (CE) n.o 726/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho (JO L 152 de 16.6.2009, p. 11).

( 4 ) Regulamento (CEE) n.o 315/93 do Conselho, de 8 de fevereiro de 1993, que estabelece procedimentos comunitários para os contaminantes presentes nos géneros alimentícios (JO L 37 de 13.2.1993, p. 1).

( 5 ) ISO 3534-1: 2006 Statistics — Vocabulary and symbols — Part 1: General statistical terms and terms used in probability (Chapter 1).

( 6 ) Diretiva 2001/82/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 6 de novembro de 2001, que estabelece um código comunitário relativo aos medicamentos veterinários (JO L 311 de 28.11.2001, p. 1).

( 7 ) JCGM 200:2008, International vocabulary of metrology — Basic and general concepts and associated terms (VIM), Third Edition 2008: https://www.iso.org/sites/JCGM/VIM-JCGM200.htm (Chapter 5, Measurement standards (Etalons)).

( 8 ) Regulamento (CE) n.o 124/2009 da Comissão, de 10 de fevereiro de 2009, que define limites máximos para a presença de coccidiostáticos ou histomonostáticos em géneros alimentícios resultante da contaminação cruzada inevitável destas substâncias em alimentos não visados para animais (JO L 40 de 11.2.2009, p. 7).

( 9 ) Regulamento (UE) n.o 37/2010 da Comissão, de 22 de dezembro de 2009, relativo a substâncias farmacologicamente ativas e respetiva classificação no que respeita aos limites máximos de resíduos nos alimentos de origem animal (JO L 15 de 20.1.2010, p. 1).

( 10 ) Comissão do Codex Alimentarius, Organização para a Alimentação e Agricultura das Nações Unidas/Organização Mundial da Saúde, Guidelines on analytical terminology (CAC/GL 72-2009).

( 11 ) ISO 5725-1:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 1: General principles and definitions (Chapter 3).

( 12 ) ISO 80000-1:2009 Quantities and units — Part 1: General (Introduction).

( 13 ) Diretiva 80/181/CEE do Conselho, de 20 de dezembro de 1979, relativa à aproximação das legislações dos Estados-Membros respeitantes às unidades de medida e que revoga a Diretiva 71/354/CEE (JO L 39 de 15.2.1980, p. 40).

( 14 ) ISO/IEC 17025:2017 Requisitos gerais de competência para laboratórios de ensaio e calibração (capítulo 3).

( 15 ) ISO 78-2: 1999 Chemistry — Layouts for standards — Part 2: Methods of chemical analysis (Annexes).

( 16 ) A cocromatografia é um processo em que, antes da execução da cromatografia, o extrato da amostra é dividido em duas partes. Uma das partes é submetida a cromatografia sem qualquer tratamento prévio. A outra parte é misturada com o padrão do analito a medir. Em seguida, procede-se também à cromatografia desta mistura. A quantidade adicionada de padrão de analito tem de ser semelhante à quantidade estimada de analito no extrato. A cocromatografia é utilizada para melhorar a identificação de um analito quando se utilizam métodos cromatográficos, especialmente quando não é possível utilizar um padrão interno adequado.

( 17 ) ISO 5725-4:2020 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results — Part 4: Basic methods for the determination of the trueness of a standard measurement method (Clause 3).

( 18 ) Se, para uma substância farmacologicamente ativa não autorizada, a validação de uma concentração de 0,5 vezes o RTM não for razoavelmente possível, a concentração de 0,5 vezes o RTM pode ser substituída pela concentração mais baixa entre 0,5 e 1,0 vezes o RTM, que seja razoável alcançar.

( 19 ) Se, para uma substância farmacologicamente ativa específica, a validação de uma concentração de 0,1 vezes o LMR não for razoavelmente possível, a concentração de 0,1 vezes o LMR pode ser substituída pela concentração mais baixa entre 0,1 e 0,5 vezes o LMR, que seja razoável alcançar.

( 20 ) Se, para uma substância farmacologicamente ativa não autorizada, a validação de uma concentração de 0,5 vezes o RTM não for razoavelmente possível, a concentração de 0,5 vezes o RTM pode ser substituída pela concentração mais baixa entre 0,5 e 1,0 vezes o RTM, que seja razoável alcançar.

( 21 ) Se, para uma substância farmacologicamente ativa específica, a validação de uma concentração de 0,1 vezes o LMR não for razoavelmente possível, a concentração de 0,1 vezes o LMR pode ser substituída pela concentração mais baixa entre 0,1 e 0,5 vezes o LMR, que seja razoável alcançar.

( 22 ) ISO 5725-2:2019 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results – Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method (Clause 3).

( 23 ) ISO 11843-1:1997 Capability of detection — Part 1: Terms and definitions.

( 24 ) Comissão do Codex Alimentarius, Organização para a Alimentação e Agricultura das Nações Unidas, Organização Mundial da Saúde, Guidelines on estimation of uncertainty of results (CAC/GL 59-2006).

( 25 ) As alterações das condições experimentais referidas neste contexto podem consistir em materiais da amostra, analitos, condições de armazenamento e condições ambientais e/ou de preparação das amostras. Relativamente a todas as condições experimentais que possam, na prática, estar sujeitas a variações (por exemplo, estabilidade dos reagentes, composição da amostra, pH, temperatura), devem ser indicadas quaisquer variações suscetíveis de afetar o resultado analítico.

( 26 ) Jülicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 120, 173.

( 27 ) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.

( 28 ) Gowik, P., Jülicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221.

( 29 ) ISO 11843-1:1997 Capability of detection — Part 1: Terms and definitions.

( 30 ) Regulamento de Execução (UE) 2018/470 da Comissão, de 21 de março de 2018, que estabelece regras pormenorizadas relativas aos limites máximos de resíduos a ter em conta para efeitos de controlo no caso dos géneros alimentícios derivados de animais tratados na UE nos termos do artigo 11.o da Diretiva 2001/82/CE (JO L 79 de 22.3.2018, p. 16).

( 31 ) A quantidade de padrão de analito adicionada pode ser, por exemplo, entre duas e cinco vezes a quantidade estimada de analito na amostra. Este procedimento destina-se a determinar o teor de um analito numa amostra, tendo em conta a recuperação do processo analítico.

( 32 ) ISO/IEC 17025:2017 Requisitos gerais de competência para laboratórios de ensaio e calibração (capítulo 7.7).

( 33 ) ISO/IEC 17043:2010 Avaliação da conformidade — Requisitos gerais para ensaios de aptidão.

( 34 ) ISO/IEC 17025:2017 Requisitos gerais de competência para laboratórios de ensaio e calibração (capítulo 7.7).