1991R2568 — PL — 04.08.2016 — 029.001

---

Dokument ten służy wyłącznie do celów informacyjnych i nie ma mocy prawnej. Unijne instytucje nie ponoszą żadnej odpowiedzialności za jego treść. Autentyczne wersje odpowiednich aktów prawnych, włącznie z ich preambułami, zostały opublikowane w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej i są dostępne na stronie EUR-Lex. Bezpośredni dostęp do tekstów urzędowych można uzyskać za pośrednictwem linków zawartych w dokumencie

►B	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 2568/91 z dnia 11 lipca 1991 r. w sprawie właściwości oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek oraz w sprawie odpowiednich metod analizy (Dz.U. L 248 z 5.9.1991, s. 1)

zmienione przez:

		Dziennik Urzędowy
		nr	strona	data
►M1	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 3682/91 z dnia 17 grudnia 1991 r.	L 349	36	18.12.1991
M2	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 1429/92 z dnia 26 maja 1992 r.	L 150	17	2.6.1992
M3	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 3288/92 z dnia 12 listopada 1992 r.	L 327	28	13.11.1992
M6	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 183/93 z dnia 29 stycznia 1993 r.	L 22	58	30.1.1993
M7	zmienione przez: ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 826/93 z dnia 6 kwietnia 1993 r.	L 87	6	7.4.1993
M8	COMMISSION REGULATION (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
M9	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 177/94 z dnia 28 stycznia 1994 r.	L 24	33	29.1.1994
M10	COMMISSION REGULATION (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 656/95 z dnia 28 marca 1995 r.	L 69	1	29.3.1995
M12	COMMISSION REGULATION (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
M13	COMMISSION REGULATION (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
M14	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 282/98 z dnia 3 lutego 1998 r.	L 28	5	4.2.1998
M15	COMMISSION REGULATION (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 379/1999 z dnia 19 lutego 1999 r.	L 46	15	20.2.1999
M17	COMMISSION REGULATION (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	COMMISSION REGULATION (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	COMMISSION REGULATION (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 1989/2003 z dnia 6 listopada 2003 r.	L 295	57	13.11.2003
►M21	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 702/2007 z dnia 21 czerwca 2007 r.	L 161	11	22.6.2007
M22	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 640/2008 z dnia 4 lipca 2008 r.	L 178	11	5.7.2008
►M23	ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) NR 61/2011 z dnia 24 stycznia 2011 r.	L 23	1	27.1.2011
M24	ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE KOMISJI (UE) NR 661/2012 z dnia 19 lipca 2012 r.	L 192	3	20.7.2012
►M25	ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE KOMISJI (UE) NR 299/2013 z dnia 26 marca 2013 r.	L 90	52	28.3.2013
►M26	ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE KOMISJI (UE) NR 1348/2013 z dnia 16 grudnia 2013 r.	L 338	31	17.12.2013
►M27	ROZPORZĄDZENIE DELEGOWANE KOMISJI (UE) 2015/1830 z dnia 8 lipca 2015 r.	L 266	9	13.10.2015
►M28	ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE KOMISJI (UE) 2015/1833 z dnia 12 października 2015 r.	L 266	29	13.10.2015
►M29	ROZPORZĄDZENIE WYKONAWCZE KOMISJI (UE) 2016/1227 z dnia 27 lipca 2016 r.	L 202	7	28.7.2016

sprostowane przez:

C1	Sprostowanie, Dz.U. L 078, 24.3.2011, s.  69 (61/2011)

(*)	Akt ten nie został nigdy opublikowany w języku polskim.

---

▼B

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 2568/91

z dnia 11 lipca 1991 r.

w sprawie właściwości oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek oraz w sprawie odpowiednich metod analizy

▼M20

Artykuł 1

1.  Oleje, których właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 1 i 2 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 1 lit. a) i b) Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawane są za oliwę z oliwek pierwszego tłoczenia.

2.  Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 3 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 1 lit. c) Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z oliwek typu lampante.

3.  Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 4 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 2 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za rafinowaną oliwę z oliwek.

4.  Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 5 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 3 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z oliwek złożoną z rafinowanej oliwy z oliwek.

5.  Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 6 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 4 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za surową oliwę z wytłoczyn oliwek.

6.  Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 7 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 5 rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za rafinowaną oliwę z wytłoczyn oliwek.

7.  Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 8 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 6 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z wytłoczyn oliwek.

▼M26

Artykuł 2

1.  Właściwości olejów wymienione w załączniku I określa się zgodnie z następującymi metodami analizy:

▼M28

▼M26

▼M28

▼M26

▼M28 —————

▼M26

2.  Weryfikacja właściwości organoleptycznych oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia prowadzona przez organy krajowe i ich przedstawicieli wykonywana jest przez zespoły degustatorów zatwierdzone przez państwa członkowskie.

Właściwości organoleptyczne oliwy, o których mowa w akapicie pierwszym, określa się jako zgodne ze zgłoszoną kategorią, jeżeli zespół degustatorów zatwierdzony przez państwo członkowskie potwierdzi taką klasyfikację.

W przypadku gdy zespół nie potwierdzi kategorii zgłoszonej w odniesieniu do właściwości organoleptycznych, na wniosek zainteresowanej strony organy krajowe lub ich przedstawiciele zapewniają niezwłoczne przeprowadzenie przez inne zatwierdzone zespoły dwóch ocen porównawczych, z których przynajmniej jedna wykonana jest przez zainteresowane państwo członkowskie będące producentem. Przedmiotowe właściwości określa się jako zgodne ze zgłoszonymi właściwościami, jeżeli co najmniej dwie z ocen porównawczych potwierdzą zgłoszoną klasyfikację. Jeżeli tak się nie stanie, zainteresowana strona ponosi koszty ocen porównawczych.

3.  W przypadku gdy organy krajowe lub ich przedstawiciele sprawdzają właściwości oliwy, jak przewidziano w ust. 1, próbki pobiera się zgodnie z normami międzynarodowymi: normą EN ISO 661 dotyczącą przygotowania próbek do badań oraz normą EN ISO 5555 dotyczącą pobierania próbek. Jednak niezależnie od przepisów pkt 6.8 normy EN ISO 5555, w przypadku partii takiej oliwy w opakowaniu bezpośrednim próbkę pobiera się zgodnie z załącznikiem Ia do niniejszego rozporządzenia. W przypadku oliwy luzem, której próbek nie można pobrać zgodnie z normą EN ISO 5555, pobieranie próbek wykonuje się zgodnie z instrukcjami opracowanymi przez właściwy organ państwa członkowskiego.

Bez uszczerbku dla normy EN ISO 5555 oraz rozdziału 6 normy EN ISO 661 pobrane próbki jak najszybciej umieszcza się w ciemnym miejscu, z dala od źródeł wysokiej temperatury i wysyła się do laboratorium w celu poddania analizie nie później niż piątego dnia roboczego po ich pobraniu, w przeciwnym razie próbki przechowuje się w taki sposób, aby nie uległy rozpadowi ani uszkodzeniu w czasie transportu lub przechowywania, zanim zostaną wysłane do laboratorium.

4.  Do celów weryfikacji przewidzianej w ust. 3, analizy, o których mowa w załącznikach II, III, IX i XX, oraz w stosownych przypadkach wszystkie analizy porównawcze wymagane na mocy prawa krajowego, wykonuje się przed upływem daty minimalnej trwałości w przypadku produktów pakowanych. W przypadku pobierania próbek oliwy luzem analizy te wykonuje się nie później niż po upływie sześciu miesięcy od miesiąca, w którym pobrano próbkę.

Nie stosuje się żadnych terminów w przypadku innych analiz przewidzianych w niniejszym rozporządzeniu.

Jeżeli wyniki analiz nie odpowiadają właściwościom zgłoszonej kategorii oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn z oliwek, zainteresowana strona powiadamiana jest nie później niż miesiąc przed końcem okresu określonego w akapicie pierwszym, chyba że próbkę pobrano później niż dwa miesiące przed upływem daty minimalnej trwałości.

5.  W celu oznaczenia właściwości różnych rodzajów oliwy z oliwek za pomocą metod przewidzianych w ust. 1 akapit pierwszy wyniki analiz porównuje się bezpośrednio z limitami określonymi w niniejszym rozporządzeniu.

▼M25

Artykuł 2a

1.  Do celów niniejszego artykułu „oliwa z oliwek wprowadzona do obrotu” oznacza całkowitą ilość oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn z oliwek odpowiedniego państwa członkowskiego konsumowanej w tym państwie członkowskim lub wywożonej z tego państwa członkowskiego.

2.  Państwa członkowskie zapewniają selektywne przeprowadzanie opartych o analizę ryzyka i odpowiednio częstych kontroli zgodności, tak aby zagwarantować, że oliwa z oliwek wprowadzona do obrotu jest zgodna ze zgłoszoną kategorią.

3.  Kryteria oceny ryzyka mogą obejmować:

4.  Państwa członkowskie z wyprzedzeniem ustanawiają:

Rocznie przeprowadza się co najmniej jedną kontrolę zgodności na tysiąc ton oliwy z oliwek wprowadzonej do obrotu w państwie członkowskim.

5.  Państwa członkowskie sprawdzają zgodność:

▼M19 —————

▼M25

Artykuł 3

W przypadku gdy stwierdzono, że oliwa nie odpowiada opisowi jej kategorii, zainteresowane państwo członkowskie stosuje, bez uszczerbku dla wszelkich innych kar, skuteczne, proporcjonalne i odstraszające kary, które są ustalane w świetle tego, jak poważna jest stwierdzona nieprawidłowość.

W przypadku gdy w ramach kontroli ujawnione zostają istotne nieprawidłowości, państwa członkowskie zwiększają częstotliwość kontroli w odniesieniu do etapu wprowadzania do obrotu, kategorii oliwy, pochodzenia lub innych kryteriów.

▼M5

Artykuł 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Jeżeli Państwa Członkowskie napotykają trudności w utworzeniu na swoim terytorium zespołów degustatorów, mogą wezwać zespół degustatorów zatwierdzony w innym Państwie Członkowskim.

3.  Każde Państwo Członkowskie sporządza wykaz zespołów degustatorów utworzonych przez organizacje zawodowe lub międzybranżowe zgodnie z warunkami ustanowionymi w ust. 1 i zapewnia przestrzeganie tych warunków.

▼M19 —————

▼B

Artykuł 6

1.  Zawartość oleju w makuchu i innych wytłokach powstających przy ekstrakcji oliwy z oliwek (kody CN 2306 90 11 i 2306 90 19 ) oznaczane są metodą przedstawioną w załączniku XV.

2.  Zawartość oleju, określona w ust. 1, wyrażana jest jako procent masy oleju w stosunku do masy suchej substancji.

▼M20

Artykuł 7

Przepisy wspólnotowe dotyczące zawartości zanieczyszczeń stosuje się.

W odniesieniu do rozpuszczalników chlorowcowanych limity dla wszystkich kategorii oliwy z oliwek są następujące:

▼M25

Artykuł 7a

Osoby fizyczne lub prawne oraz grupy osób, które posiadają oliwę z oliwek lub oliwę z wytłoczyn z oliwek od etapu ekstrakcji w tłoczni do etapu butelkowania włącznie, w dowolnych celach zawodowych bądź handlowych, muszą prowadzić rejestry wprowadzania i wycofywania w odniesieniu do każdej kategorii takiej oliwy.

Państwa członkowskie zapewniają należyte przestrzeganie obowiązku określonego w akapicie pierwszym.

▼M25

Artykuł 8

1.  Państwa członkowskie powiadamiają Komisję o środkach służących wprowadzeniu w życie niniejszego rozporządzenia. Państwa członkowskie powiadamiają Komisję o wszelkich późniejszych zmianach.

2.  Nie później niż do 31 maja każdego roku państwa członkowskie przekazują Komisji sprawozdanie dotyczące wdrażania niniejszego rozporządzenia w poprzednim roku kalendarzowym. Sprawozdanie zawiera przynajmniej wyniki kontroli zgodności przeprowadzonych w odniesieniu do oliwy z oliwek przedstawione zgodnie z szablonami określonymi w załączniku XXI.

3.  Powiadomienia, o których mowa w niniejszym rozporządzeniu, są dokonywane zgodnie z rozporządzeniem Komisji (WE) nr 792/2009 ( 1 ).

▼B

Artykuł 9

Niniejszym rozporządzenie (EWG) nr 1058/77 traci moc.

Artykuł 10

1.  Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie trzeciego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich.

Jednakże metodę określoną w załączniku XII stosuje się od ►M1  dnia 1 listopada 1992 r. ◄ , z wyjątkiem działań odnoszących się do systemu interwencyjnego.

▼M5

Metody tej nie stosuje się do oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia przygotowanej na rynek przed dniem 1 listopada 1992 r.

▼B

2.  Niniejsze rozporządzenie nie stosuje się do oliwy z oliwek i oleju z wytłoczyn z oliwek pakowanych przed wejściem w życie niniejszego rozporządzenia oraz wprowadzonych do obrotu do dnia 31 października 1992 r.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich Państwach Członkowskich.

---

ZAŁĄCZNIK I

Streszczenie

▼M27

---

ZAŁĄCZNIK I

WŁAŚCIWOŚCI OLIWY Z OLIWEK

Uwagi:

---

Dodatek

SCHEMAT PODEJMOWANIA DECYZJI

Schemat podejmowania decyzji dotyczących kampesterolu w przypadku oliwy z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia i oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia:

Pozostałe parametry są zgodne z wartościami dopuszczalnymi określonymi w niniejszym rozporządzeniu.

Schemat podejmowania decyzji dotyczących delta-7-stigmastenolu w przypadku:

Pozostałe parametry są zgodne z wartościami dopuszczalnymi określonymi w niniejszym rozporządzeniu.

▼M26

---

ZAŁĄCZNIK Ia

POBIERANIE PRÓBEK OLIWY Z OLIWEK LUB OLIWY Z WYTŁOCZYN Z OLIWEK DOSTARCZONYCH W OPAKOWANIU BEZPOŚREDNIM

Ta metoda pobierania próbek ma zastosowanie do partii oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn z oliwek umieszczonych w opakowaniu bezpośrednim. W zależności od tego, czy zawartość opakowania bezpośredniego przekracza 5 litrów czy też nie, zastosowanie mają różne metody pobierania próbek.

„Partia” oznacza zbiór opakowań detalicznych, które są produkowane, wytwarzane i pakowane w takich warunkach, w których oliwę zawartą w każdym opakowaniu detalicznym uważa się za jednorodną pod względem wszystkich właściwości analitycznych. Oznakowanie partii musi zostać przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady 2011/91/UE ( 2 ).

„Próbka jednostkowa” oznacza ilość oliwy zawartej w opakowaniu bezpośrednim, pobraną z dowolnego miejsca partii.

1.   ZAWARTOŚĆ PRÓBKI PIERWOTNEJ

1.1.    Opakowanie bezpośrednie nieprzekraczające 5 litrów

„Próbka pierwotna” w przypadku opakowania bezpośredniego nieprzekraczającego 5 litrów oznacza liczbę próbek jednostkowych pobranych w danej partii zgodnie z tabelą 1.

Liczba opakowań wymienionych w tabeli 1, które tworzą próbkę pierwotną, może być zwiększona przez każde państwo członkowskie, zgodnie z jego własnymi potrzebami (na przykład ocena organoleptyczna dokonana przez laboratorium inne niż to, które wykonało analizy chemiczne, analizy porównawcze itd.).

1.2.    Opakowanie bezpośrednie przekraczające 5 litrów

„Próbka pierwotna” w przypadku opakowań bezpośrednich przekraczających 5 litrów oznacza reprezentatywną część łącznych próbek jednostkowych, otrzymaną w procesie redukcyjnym zgodnie z tabelą 2. W skład próbki pierwotnej muszą wchodzić różne przykłady.

„Przykład” próbki pierwotnej oznacza każde opakowanie wchodzące w skład próbki pierwotnej.

W celu ograniczenia objętości próbkowanych opakowań bezpośrednich zawartość pobieranych próbek jednostkowych jest homogenizowana w celu przygotowania próbki pierwotnej. Części różnych próbek jednostkowych wlewane są do wspólnego pojemnika w celu poddania ich homogenizacji przez wymieszanie, aby jak najlepiej zabezpieczyć je przed dostępem powietrza.

Próbkę pierwotną należy wlać do kilku opakowań o minimalnej pojemności wynoszącej 1,0 litr, z których każde stanowi przykład próbki pierwotnej.

Liczba próbek pierwotnych może być zwiększana przez każde państwo członkowskie, zgodnie z jego własnymi potrzebami (na przykład ocena organoleptyczna dokonana przez laboratorium inne niż to, które wykonało analizy chemiczne, analizy kontrolne itd.).

Każde opakowanie należy napełnić w taki sposób, aby warstwa powietrza nad próbką była jak najmniejsza, a następnie odpowiednio zamknąć w celu zabezpieczenia produktu.

Przykłady te należy oznakować w celu zapewnienia prawidłowej identyfikacji.

2.   ANALIZY I WYNIKI

3.   WERYFIKACJA KATEGORII DANEJ PARTII

---

ZAŁĄCZNIK Ib

SCHEMAT PODEJMOWANIA DECYZJI, CZY PRÓBKA OLIWY Z OLIWEK JEST ZGODNA ZE ZGŁOSZONĄKATEGORIĄ

Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3

---

Dodatek 1

▼M29

---

ZAŁĄCZNIK II

OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH, METODA NA ZIMNO

1.   ZAKRES I DZIEDZINA STOSOWANIA

Niniejsza metoda opisuje sposób oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych w oliwie z oliwek i w oliwie z wytłoczyn z oliwek. Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych wyrażona jest w postaci kwasowości obliczonej jako procentowa część kwasu oleinowego.

2.   ZASADA

Próbkę rozpuszcza się w mieszaninie rozpuszczalników, a obecne w niej wolne kwasy tłuszczowe miareczkuje przy użyciu roztworu wodorotlenku potasu lub wodorotlenku sodu.

3.   ODCZYNNIKI

Stosować wyłącznie odczynniki o uznanej czystości analitycznej i wodę destylowaną lub o równoważnym stopniu czystości.

3.1.

Eter dietylowy; etanol 95 % (v/v), mieszanina jednakowych objętościowo części. Zobojętnić dokładnie w momencie stosowania za pomocą roztworu wodorotlenku potasu (3.2) z dodatkiem 0,3 ml roztworu fenoloftaleiny (3.3) na 100 ml mieszaniny. Uwaga 1:  Eter dietylowy jest wysoce łatwopalny i może tworzyć wybuchowe nadtlenki. Stosując tę substancję należy zachować szczególną ostrożność. Uwaga 2:  Jeśli zastosowanie eteru dietylowego jest niemożliwe, można zastosować mieszaninę rozpuszczalników zawierających etanol i toluen. Jeśli to konieczne, etanol można zastąpić 2-propanolem.

3.2.

Wodorotlenek potasu lub wodorotlenek sodu, mianowany roztwór etanolowy lub wodny, c(KOH) [lub c(NaOH)] o stężeniu 0,1 mol/l lub, jeśli konieczne, c(KOH) [lub c(NaOH)] o stężeniu 0,5 mol/l. Roztwory są dostępne w handlu. Przed zastosowaniem należy sprawdzić stężenie roztworu wodorotlenku potasu (lub roztworu wodorotlenku sodu). Stosować roztwór przygotowany co najmniej pięć dni przed użyciem i zdekantowany do butelki z brązowego szkła z gumowym korkiem. Roztwór powinien być bezbarwny lub mieć barwę słomkową. Jeśli doszło do rozdziału faz przy zastosowaniu wodnego roztworu wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu), należy zastąpić roztwór wodny roztworem etanolowym. Uwaga 3:  Stabilny bezbarwny roztwór wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) można przygotować w następujący sposób: doprowadzić do wrzenia 1 000  ml etanolu lub wody z 8 g wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) i 0,5 g opiłków aluminiowych i gotować pod chłodnicą zwrotną przez godzinę. Następnie poddać bezzwłocznie destylacji. Rozpuścić w destylacie wymaganą ilość wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu). Odstawić na kilka dni, a następnie zdekantować klarowną warstwę cieczy znad osadu węglanu potasu (lub węglanu sodu). Roztwór można także przygotować z pominięciem procesu destylacji w następujący sposób: do 1 000  ml etanolu (lub wody) dodać 4 ml butanolanu glinu i odstawić mieszaninę na kilka dni. Zdekantować znad osadu klarowną ciecz i rozpuścić w niej wymaganą ilość wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu). Roztwór jest gotowy do użycia.

3.3.	Fenoloftaleina, roztwór 10 g/l w 95–96 % etanolu (v/v) lub błękit alkaliczny 6B lub tymoloftaleina, roztwór 20 g/l w 95–96 % etanolu (v/v). W przypadku silnie zabarwionych olejów należy stosować błękit alkaliczny lub tymoloftaleinę.

4.   APARATURA

Normalnie stosowany sprzęt laboratoryjny, w tym:

5.   PROCEDURA

5.1.    Przygotowanie próbki do badań

Jeśli próbka jest mętna, należy ją przefiltrować.

5.2.    Porcja badana

W zależności od zakładanej kwasowości pobierać próbkę według poniższej tabeli:

Próbkę należy ważyć w kolbie stożkowej (4.2).

5.3.    Oznaczanie

Rozpuścić próbkę (5.2) w 50 do 100 ml poprzednio zobojętnionej mieszaniny eteru dietylowego i etanolu (3.1).

Miareczkować mieszając z 0,1 mol/l roztworem wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) (3.2) (zob. Uwaga 4), dopóki nie nastąpi zmiana barwy wskaźnika (zabarwienie wskaźnika utrzymuje się co najmniej przez 10 sekund).

Należy wykonać drugie oznaczenie jedynie wówczas, gdy rezultat pierwszego oznaczenia jest wyższy niż limit określony dla danej kategorii oliwy.

6.   PREZENTACJA WYNIKÓW

Kwasowość wyrażona jako procent masowy kwasu oleinowego wynosi:

gdzie:

V

=

objętość użytego do miareczkowania roztworu wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) w mililitrach;

c

=

dokładne stężenie molowe użytego do miareczkowania roztworu wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu);

M

=

282 g/mol, molowa masa w gramach na mol kwasu oleinowego;

m

=

masa próbki w gramach.

Kwasowość oleju podaje się następująco:

▼B

---

ZAŁĄCZNIK III

OZNACZENIE LICZBY NADTLENKOWEJ

1.   ZAKRES

Niniejsza norma zawiera opis metody oznaczania liczby nadtlenkowej olejów i tłuszczów.

2.   ZAKRES ZASTOSOWANIA

Niniejsza norma stosuje się w odniesieniu do olejów i tłuszczów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego.

3.   DEFINICJA

Liczba nadtlenkowa jest to wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram zawartość w próbce tych substancji, które utleniają jodek potasu w opisanych warunkach technologicznych.

4.   ZASADA

Poddanie Badanej części próbki, w roztworze kwasu octowego i chloroformu, działaniu roztworu jodku potasu. Miareczkowanie uwolnionego jodu znormalizowanym roztworem tiosiarczanu sodu.

5.   APARATURA

W użytym sprzęcie nie mogą występować substancje redukujące lub utleniające.

Uwaga: Nie pokrywać tłuszczem powierzchni szlifowanych.

5.1.	Łyżka szklana o pojemności 3 ml.

5.2.	Kolby stożkowe ze szlifowanymi szyjkami i korkami o pojemności około 250 ml, wysuszone i napełnione czystym, obojętnym gazem (azotem lub najlepiej ditlenkiem węgla).

5.3.	Biureta o pojemności 25 lub 50 ml wyskalowana co 0,1 ml.

6.   ODCZYNNIKI

6.1	Chloroform, którego jakość spełnia wymogi stawiane odczynnikom laboratoryjnym, pozbawiony tlenu poprzez przepuszczanie przezeń silnego strumienia czystego suchego gazu obojętnego.

6.2.	Kwas octowy lodowaty, którego jakość spełnia wymogi stawiane odczynnikom laboratoryjnym, pozbawiony tlenu poprzez przepuszczanie przezeń silnego strumienia czystego suchego gazu obojętnego.

6.3.	Jodek potasu w postaci nasyconego roztworu wodnego, świeżo przygotowany, niezawierający jodu i jodanów.

6.4.	Tiosiarczan sodu, 0,01 lub 0,002 mol/l z dokładnie nastawionym mianem tuż przed użyciem.

6.5.	Roztwór skrobi, rozproszenie wodne o stężeniu 10 g/l, świeżo przygotowany z naturalnej rozpuszczalnej skrobi.

7.   PRÓBKA

Należy zadbać, aby próbka była pobrana i składowana w ciemnym i chłodnym miejscu w całkowicie napełnionych szklanych pojemnikach, zamkniętych hermetycznie zatyczkami szlifowanymi szklanymi lub z korka.

8.   PROCEDURA

Badanie wykonuje się w rozproszonym świetle dziennym lub w świetle sztucznym. Odważyć szklaną łyżką (5.1) lub, w przypadku jej braku, w kolbie (5.2) z dokładnością do 0,001 g masę próbki według poniższej tabeli stosownie do oczekiwanej liczby nadtlenkowej:

Wyjąć korek z kolby (5.2) i wprowadzić do niej szklaną łyżkę z badaną częścią próbki. Dodać 10 ml chloroformu (6.1). Rozpuścić szybko badaną próbkę mieszając. Dodać 15 ml kwasu octowego (6.2), a następnie 1 ml roztworu jodku potasu (6.3). Szybko zakorkować kolbę, wstrząsać przez jedną minutę i pozostawić dokładnie na pięć minut w nieoświetlonym miejscu o temperaturze od 15 do 25 °C.

Dodać około 75 ml wody destylowanej. Miareczkować uwolniony jod roztworem tiosiarczanu sodu (6.4) (roztworem 0,002 mol/l dla przewidywanych wartości poniżej 12 i roztworem 0,01 mol/l dla przewidywanych wartości powyżej 12) intensywnie wstrząsając, stosując roztwór skrobi jako wskaźnik (6.5).

Przeprowadzić dwa oznaczenia tej samej próbki.

Jednocześnie przeprowadzić ślepą próbę. Jeżeli wynik ślepej próby przekracza 0,05 ml 0,01 mol/l roztworu tiosiarczanu sodu (6.4) należy wymienić zanieczyszczone odczynniki.

9.   PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

LICZBA NADTLenkowa (LN) wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram określana jest wzorem:

gdzie:

V

=

ilość ml nastawionego roztworu tiosiarczanu (6.4) użytego w badaniu, skorygowana w celu uwzględnienia ślepej próby

T

=

dokładna molarność użytego roztworu tiosiarczanu sodu (6.4)

m

=

masa badanej części próbki w gramach

Jako wynik przyjąć średnią arytmetyczną dwóch oznaczeń.

▼M21

---

ZAŁĄCZNIK IV

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WOSKÓW METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ Z UŻYCIEM KOLUMNY KAPILARNEJ

1.   CEL

Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości wosków w oliwie z oliwek. Woski rozdziela się w zależności od liczby atomów węgla. Metodę można w szczególności stosować do rozróżniania oliwy z oliwek uzyskanej z tłoczenia od oliwy z oliwek uzyskanej z ekstrakcji (oliwy z wytłoczyn).

2.   ZASADA

Dodanie odpowiedniego wzorca wewnętrznego do tłuszczu, następnie frakcjonowanie metodą chromatografii w kolumnie z uwodnionym żelem krzemionkowym, odzyskanie frakcji wymytej uprzednio w warunkach testowych (której biegunowość jest mniejsza niż w przypadku triglicerydów), następnie przeprowadzenie bezpośredniej analizy metodą chromatografii gazowej z użyciem kolumny kapilarnej.

3.   MATERIAŁY

3.1.	Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.

3.2.	Szklana kolumna do chromatografii gazowej, średnica wewnętrzna 15,0 mm, wysokość 30–40 cm, wyposażona w kranik.

3.3.

Odpowiedni chromatograf gazowy z kolumną kapilarną, wyposażony w system do bezpośredniego wprowadzania do kolumny, składający się z: 3.3.1. komory z termostatem do kolumn, wyposażonej w programator temperatury; 3.3.2. zimnego dozownika do bezpośredniego wprowadzania do kolumny; 3.3.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego i konwertera-wzmacniacza; 3.3.4. rejestrującego integratora współpracującego z konwerterem-wzmacniaczem (3.3.3), o szybkości odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru. (Można również zastosować systemy informatyczne przewidujące uzyskiwanie danych z chromatografii gazowej przy użyciu komputera osobistego); 3.3.5. Kolumny kapilarnej, ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8–12 m, średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokrytej od środka płynem rozdzielającym, o jednolitej grubości 010–0,30 μm. (Płyny rozdzielające nadające się do użycia typu SE52 lub SE 54, dostępne w handlu).

3.4.	Mikrostrzykawka umożliwiająca bezpośrednie wstrzyknięcie do kolumny porcji 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni.

3.5.	Wibrator elektryczny.

3.6.	Wyparka rotacyjna.

3.7.	Piec muflowy.

3.8.	Waga analityczna zapewniająca precyzję pomiaru ± 0,1 mg.

3.9.	Zwykłe szkło laboratoryjne.

4.   ODCZYNNIKI

4.1.

Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 60 do 200 μm. Żel krzemionkowy należy umieścić w piecu w temperaturze 500 °C na co najmniej 4 godziny. Schłodzić, następnie dodać 2 % wody względem ilości pobranego żelu krzemionkowego. Dobrze wstrząsnąć do otrzymania jednolitej zawiesiny. Trzymać w zaciemnionym miejscu przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.

4.2.	n-heksan, do chromatografii.

4.3.	Eter etylowy, do chromatografii.

4.4.	n-heptan, do chromatografii.

4.5.	Roztwór wzorca arachidynianu laurylowego o stężeniu 0,1 % (m/V) w heksanie (wzorzec wewnętrzny). (Można również zastosować palmitynian palmitylu lub stearynian mirystylu). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenylo-azo-2-naftol).

4.6.	Gaz nośny: czysty wodór lub hel, do chromatografii gazowej.

4.7.	Gazy pomocnicze: — czysty wodór, do chromatografii gazowej, — czyste powietrze, do chromatografii gazowej.

5.   SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1.   Przygotowanie kolumny chromatograficznej

Sporządzić zawiesinę 15 g żelu krzemionkowego (4.1) w n-heksanie (4.2) i wprowadzić do kolumny (3.2). Po spontanicznym wytrącaniu osadu zakończyć ten proces przy użyciu wytrząsarki elektrycznej (3.5), tak aby warstwa chromatograficzna była bardziej jednolita. Przesączyć 30 ml n-heksanu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Odważyć dokładnie, przy użyciu wagi (3.8), 500 mg próbki do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i dodać właściwą ilość wzorca wewnętrznego (4.5), zależnie od przypuszczalnej zawartości wosków. Dodać na przykład 0,1 mg arachidynianu laurylowego w przypadku oliwy z oliwek i 0,25–0,5 mg w przypadku oliwy z wytłoczyn oliwek. Do tak przygotowanej próbki dodać dwie porcje po 2 ml n-heksanu (4.2) i przenieść do kolumny chromatograficznej.

Wprowadzić próbkę, tak aby rozpuszczalnik napłynął do wysokości 1 mm powyżej górnego poziomu absorbentu, następnie przesączyć dodatkowych 70 ml n-heksanu, tak aby usunąć naturalnie obecne n-alkany. Rozpocząć wymywanie chromatograficzne, pobierając 180 ml mieszaniny n-heksanu/eteru etylowego w proporcji 99/1, przy przepływie około 15 kropli w ciągu 10 sekund. Wymywanie próbki należy prowadzić w temperaturze pokojowej 22 °C ± 4.

Uwagi:

Otrzymaną w ten sposób frakcję suszy się w wyparce rotacyjnej (3.6) aż do niemal całkowitego wyeliminowania rozpuszczalnika. Usuwa się ostatnie 2 ml rozpuszczalnika przy użyciu słabego strumienia azotu; a następnie dodaje 2–4 ml n-heptanu.

5.2.   Analiza metodą chromatografii gazowej

5.2.1.   Procedura wstępna

Umieścić kolumnę w chromatografie gazowym (3.3), łącząc szczelinę wlotową z systemem kolumnowym, a wylotową z detektorem. Wykonać ogólne kontrole aparatury do chromatografii gazowej (działanie pętli gazowych, sprawność detektora i systemu rejestracyjnego itp.).

Jeżeli kolumna używana jest po raz pierwszy, zaleca się jej kondycjonowanie. Przepuścić przez kolumnę gaz o małym natężeniu przepływu, następnie uruchomić aparaturę do chromatografii gazowej. Stopniowo podgrzewać do uzyskania, po około 4 godzinach, temperatury 350 °C. Utrzymać tę temperaturę przez co najmniej 2 godziny, a następnie ustawić aparaturę według zadanych warunków pracy (zadać natężenie przepływu gazu, zapalić płomień, podłączyć do elektronicznego przyrządu rejestrującego (3.3.4), ustawić temperaturę komory kolumny, detektora itd.) oraz rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwukrotnie wyższą niż czułość przewidziana do przeprowadzenia analizy. Przebieg linii podstawowej powinien mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików, i linia ta nie powinna wykazywać nachylenia.

Prostoliniowe, ujemne nachylenie linii wskazuje na to, że połączenia kolumn są nieprawidłowe; nachylenie dodatnie oznacza, że kolumna nie została poddana wystarczającemu kondycjonowaniu.

5.2.2.   Dobór warunków roboczych

Ogólnie należy przestrzegać następujących warunków roboczych:

Warunki te mogą być modyfikowane w sposób dostosowany do charakterystyk kolumn i aparatów do chromatografii gazowej, tak aby uzyskano oddzielenie wszystkich wosków i zadowalającą rozdzielczość pików (patrz: rysunek), przy czym czas retencji wzorca wewnętrznego C32 powinien wynosić 18 ± 3 minut. Pik najbardziej reprezentatywny dla wosków musi mierzyć co najmniej 60 % od dołu skali.

Ustalić parametry całkowania pików w taki sposób, by uzyskać dokładną wartość pól powierzchni rozpatrywanych pików.

Uwaga: Ze względu na wysoką temperaturę końcową przyjmuje się dodatnie nachylenie, które nie może przekraczać 10 % od dołu skali.

5.3.   Przeprowadzenie analizy

Pobrać 1 μl roztworu za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl; odciągnąć tłoczek, aż igła zostanie całkowicie opróżniona. Wprowadzić igłę do układu nastrzykowego i szybko wstrzyknąć po upływie jednej do dwóch sekund. Po upływie około 5 sekund powoli wyciągnąć igłę.

Przeprowadzić rejestrację danych aż do momentu całkowitego wymycia wosków.

Linia podstawowa musi przez cały czas spełniać ustalone wymagania.

5.4.   Identyfikacja pików

Zidentyfikować piki po czasach retencji, porównując je z mieszaninami wosków o znanych czasach retencji, analizowanymi w takich samych warunkach.

Rysunek przedstawia chromatogram wosków oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia.

5.5.   Analiza ilościowa

Ustalić za pomocą integratora pola powierzchni pików odpowiadające wzorcowi wewnętrznemu i estrom alifatycznym od C40 do C46.

Obliczyć zawartość wosków każdego z estrów, w mg/kg tłuszczu, zgodnie ze wzorem:

gdzie:

Ax

=

pole pod pikiem każdego estru, w milimetrach kwadratowych;

As

=

pole pod pikiem wzorca wewnętrznego, w milimetrach kwadratowych;

ms

=

masa dodanego wzorca wewnętrznego, w miligramach;

m

=

masa próbki pobranej do oznaczenia, w gramach.

6.   PREZENTACJA WYNIKÓW

Podać zawartość poszczególnych wosków od C40 do C46, w mg/kg tłuszczu (ppm).

Uwaga:Oznaczane składniki odpowiadają pikom o liczbie par węglowych zawartych pomiędzy estrami C40 a C46, zgodnie z przykładowym chromatogramem wosków oliwy z oliwek przedstawionym na rysunku poniżej. Jeżeli ester C46 pojawi się podwójnie, w celu jego identyfikacji zaleca się analizę frakcji wosków oliwy z wytłoczyn oliwek, gdzie C46 łatwo jest zidentyfikować, ponieważ wykazuje wyraźną przewagę ilościową.

Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

Rysunek

Chromatogram wosków oliwy z oliwek ( 3 )

Objaśnienie:

I.S.

=

Arachidynian laurylowy

1

=

Estry diterpenowe

2 + 2′

=

Estry C40

3 + 3′

=

Estry C42

4 + 4′

=

Estry C44

5.

=

Estry C46

6

=

Estry steroli i alkohole triterpenowe.

---

Dodatek

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki robocze wprowadzić 1–3 μl metanu (lub propanu). Mierzyć chronometrem czas potrzebny na przejście gazu przez kolumnę, począwszy od momentu wstrzyknięcia do spadku wartości szczytowej (tM).

Prędkość liniowa, w cm/s, jest określona na podstawie wzoru L/tM, gdzie L jest długością kolumny w centymetrach, a tM – czasem zmierzonym w sekundach.

▼M26

---

ZAŁĄCZNIK V

OZNACZENIA SKŁADU I ZAWARTOŚCI STEROLI I DIALKOHOLI TRITERPENOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ NA KOLUMNACH KAPILARNYCH

1.   ZAKRES

W ramach metody opisuje się sposoby oznaczania zawartości prostych i łącznych steroli oraz dialkoholi triterpenowych w oliwie z oliwek i oliwie z wytłoczyn z oliwek.

2.   ZASADA

Oliwa, do której dodano α-cholestanol, pełniąca rolę wewnętrznego wzorca, jest zmydlana roztworem wodorotlenku potasu w etanolu, a następnie substancja niezmydlająca się jest ekstrahowana eterem dietylowym.

Frakcje steroli i frakcja dialkoholi triterpenowych są oddzielane od substancji niezmydlającej się metodą chromatografii cienkowarstwowej na podstawowej płytce z żelu krzemionkowego. Frakcje uzyskane z żelu krzemionkowego przekształcane są w trimetylsilyletery i następnie poddawane analizie metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych.

3.   APARATURA

Typowe wyposażenie laboratoryjne, a w szczególności następujące urządzenia:

4.   ODCZYNNIKI

5.   PROCEDURA

5.1.

Przygotowanie substancji niezmydlającej się. 5.1.1. Do kolby o pojemności 250 ml (pkt 3.1) wprowadzić przy użyciu mikrostrzykawki o pojemności 500 μl (pkt 3.6) pewną ilość wewnętrznego roztworu wzorcowego α-cholestanolu (pkt 4.20) zawierającą ilość cholestanolu odpowiadającą w przybliżeniu 10 % steroli w próbce. Na przykład w przypadku próbki zawierającej 5 g oliwy z oliwek dodać 500 μl roztworu α-cholestanolu (pkt 4.20), a w przypadku oliwy z wytłoczyn z oliwek 1 500 μl. Odparować do wysuszenia pod słabym strumieniem azotu w łaźni wypełnionej ciepłą wodą, następnie po schłodzeniu kolby odważyć 5 ± 0,01 g suchej przefiltrowanej próbki w tej samej kolbie. Uwaga 1: w przypadku zwierzęcych lub roślinnych olejów i tłuszczów zawierających znaczne ilości cholesterolu może wystąpić pik o czasie retencji zbliżonym do cholestanolu. W takich sytuacjach należy dokonać analizy frakcji steroli z dodaniem wewnętrznego wzorca i bez dodawania go. 5.1.2. Dodać 50 ml 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w etanolu (pkt 4.2) i niewielką ilość kamienia pumeksowego, uruchomić chłodnicę zwrotną i podgrzać do momentu lekkiego wrzenia aż nastąpi zmydlenie (roztwór stanie się przejrzysty). Kontynuować podgrzewanie przez dalsze 20 minut, następnie wprowadzić 50 ml wody destylowanej od strony wylotu chłodnicy, odłączyć chłodnicę i schłodzić kolbę do temperatury około 30 °C. 5.1.3. Przenieść zawartość kolby ilościowo do rozdzielacza o pojemności 500 ml (pkt 3.2), używając kilku porcji wody destylowanej (50 ml). Dodać około 80 ml eteru dietylowego (pkt 4.10), mieszać energicznie przez około 60 sekund, obniżając okresowo ciśnienie przez przełączenie rozdzielacza i otwarcie zaworu odcinającego. Odstawić do całkowitego rozdzielenia się dwóch faz (uwaga 2). Następnie do drugiego rozdzielacza zebrać jak najdokładniej roztwór mydła. Przeprowadzić jeszcze dwie ekstrakcje na fazie wodno-alkoholowej w ten sam sposób przy użyciu 60–70 ml eteru dietylowego (pkt 4.10). Uwaga 2: emulsję można wyeliminować, dodając niewielkie ilości etanolu (pkt 4.11). 5.1.4. Połączyć wszystkie trzy eterowe ekstrakty w jednym rozdzielaczu zawierającym 50 ml wody. Przemywać nadal wodą (50 ml), aż woda przestanie barwić się na różowy kolor po dodaniu kropli roztworu fenoloftaleiny (pkt 4.21). Po usunięciu wody popłucznej przefiltrować przez bezwodny siarczan sodu (pkt 4.5) do wcześniej zważonej kolby o pojemności 250 ml, płucząc rozdzielacz i filtr niewielkimi ilościami eteru dietylowego (pkt 4.10). 5.1.5. Odparować rozpuszczalnik przez destylację przy użyciu wyparki obrotowej w temperaturze 30 °C w próżni. Dodać 5 ml acetonu i usunąć całkowicie lotny rozpuszczalnik pod delikatnym strumieniem powietrza. Suszyć pozostałość w piecu w temperaturze 103 ± 2 °C przez 15 minut. Schłodzić w eksykatorze i zważyć z dokładnością do 0,1 mg.

5.2.

Oddzielenie frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych (erytrodiol + uwaol) 5.2.1. Przygotowanie podstawowych płytek do chromatografii cienkowarstwowej Zanurzyć płytki z żelu krzemionkowego (pkt 4.6) na głębokość około 4 cm w 0,2 mol/l roztworze wodorotlenku potasu w etanolu (pkt 4.5) na 10 sekund, następnie suszyć je w dygestorium przez dwie godziny i na koniec umieścić w piecu nagrzanym do temperatury 100 °C na godzinę. Wyjąć z pieca i umieścić w eksykatorze z chlorkiem wapnia (pkt 3.13) aż do czasu ich użycia (płytki poddane takiej obróbce powinny być wykorzystane w ciągu 15 dni). Uwaga 3: w przypadku stosowania podstawowych płytek z żelu krzemionkowego do oddzielania frakcji steroli nie ma potrzeby poddawania frakcji niezmydlającej się działaniu tlenku glinu. W ten sposób wszystkie związki o charakterze kwasowym (kwasy tłuszczowe i inne) zatrzymują się na linii początkowej, a pasmo steroli jest wyraźnie oddzielone od pasma alkoholi alifatycznych i triterpenowych. 5.2.2. Napełnić komorę chromatograficzną mieszaniną heksanu i eteru dietylowego (pkt 4.24) (uwaga 4) do poziomu około 1 cm. Zamknąć komorę odpowiednią pokrywą i pozostawić na co najmniej godzinę w chłodnym miejscu w celu uzyskania równowagi układu ciecz-para; na wewnętrznych powierzchniach komory można umieścić paski bibuły filtracyjnej zanurzone w eluencie. Pozwala to skrócić o około jedną trzecią czas przemieszczenia linii cieczy i uzyskać bardziej jednorodną i regularną elucję składników. Uwaga 4: przy każdej analizie należy wymienić mieszaninę rozwijającą w celu uzyskania idealnie odtwarzalnych warunków elucji, zamiennie można stosować rozpuszczalnik w postaci mieszaniny n-heksanu i eteru dietylowego w proporcji 50:50 (V/V). 5.2.3. Przygotować roztwór substancji niezmydlającej się (pkt 5.1.5) w octanie etylu (pkt 4.12) o stężeniu około 5 % i za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 100 μl nanieść 0,3 ml roztworu w postaci wąskiego i jednolitego pasma na dolnej części płytki chromatograficznej (pkt 5.2.1) w odległości 2 cm od dolnej krawędzi. Na linii pasma nanieść 2–3 μl roztworu porównawczego (pkt 4.13) w celu identyfikacji pasma steroli i dialkoholi triterpenowych po rozwinięciu. 5.2.4. Umieścić płytkę w komorze chromatograficznej przygotowanej w sposób opisany w pkt 5.2.2. Temperaturę otoczenia należy utrzymywać w granicach 15–20 °C (uwaga 5). Bezzwłocznie zakryć komorę pokrywą i pozostawić w celu elucji składników aż do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze na odległość około 1 cm od górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytkę z komory chromatograficznej i odparować rozpuszczalnik w strumieniu gorącego powietrza lub umieścić w tym celu płytkę na chwilę w dygestorium. Uwaga 5: wyższa temperatura mogłaby utrudniać oddzielenie. 5.2.5. Spryskać płytkę lekko i równomiernie roztworem 2,7-dichlorofluorosceiny (pkt 4.14) i pozostawić do wyschnięcia. Obserwując płytkę w świetle ultrafioletowym, pasma steroli i dialkoholi triterpenowych można zidentyfikować, przyrównując je do plamek uzyskanych za pomocą roztworu porównawczego (pkt 4.13). Zaznaczyć czarnym ołówkiem granice pasm wzdłuż krawędzi fluoryzujących (zob. wykres 3 dotyczący płytki TLC). 5.2.6. Za pomocą metalowej szpatułki zeskrobać żel krzemionkowy z zaznaczonego obszaru. Usunięty i dokładnie rozdrobniony materiał przenieść do lejka do sączenia (pkt 3.7). Dodać 10 ml gorącego octanu etylu (pkt 4.12), ostrożnie wymieszać za pomocą metalowej szpatułki i przefiltrować w próżni, zbierając filtrat do kolby stożkowej (pkt 3.8) połączonej z lejkiem do sączenia. Pozostałość na filtrze przepłukać trzykrotnie eterem dietylowym (pkt 4.3) (około 10 ml przy każdym płukaniu), zbierając filtrat do tej samej kolby połączonej z lejkiem, odparować filtrat do objętości 4–5 ml, przelać pozostały roztwór do zważonej wcześniej probówki o pojemności 10 ml (pkt 3.9), wysuszyć poprzez lekkie podgrzewanie w delikatnym strumieniu azotu, rozpuścić jeszcze raz kilkoma kroplami acetonu (pkt 4.8), ponownie wysuszyć. Pozostałość znajdująca się w probówce to frakcje steroli i dialkoholi triterpenowych.

5.3.

Przygotowanie trimetylsilyloeterów 5.3.1. Do probówki zawierającej frakcje steroli i dialkoholi triterpenowych dodać odczynnik wywołujący reakcję sililowania (pkt 4.25) (uwaga 6) w ilości 50 μl na każdy miligram steroli i dialkoholi triterpenowych, w sposób pozwalający uniknąć wchłaniania wilgoci (uwaga 7). Uwaga 6: w handlu dostępne są gotowe roztwory. Inne odczynniki sililujące, takie jak na przykład bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylochlorosilanu, który musi zostać wymieszany z taką samą ilością bezwodnika pirydyny, również są dostępne. Pirydynę można zastąpić taką samą ilością acetonitrylu. 5.3.2. Zamknąć probówkę korkiem i ostrożnie wstrząsać (bez odwracania) aż do całkowitego rozpuszczenia się związków. Pozostawić na co najmniej 15 minut w temperaturze otoczenia, a następnie wirować przez kilka minut. Przejrzysty roztwór można poddać analizie metodą chromatografii gazowej. Uwaga 7: pojawienie się lekkiej opalizacji jest zjawiskiem normalnym i nie stanowi żadnej nieprawidłowości. Pojawienie się białej zawiesiny lub różowego koloru wskazuje na obecność wilgoci w odczynniku lub pogorszenie jego jakości. W takich przypadkach badanie należy powtórzyć (tylko w przypadku zastosowania heksametylodisilazanu/trimetylochlorosilanu).

5.4.

Analiza metodą chromatografii gazowej 5.4.1. Czynności wstępne, przygotowanie kolumn kapilarnych 5.4.1.1. Osadzić kolumnę (pkt 3.11) w chromatografie gazowym, podłączając końcówkę wlotową do dozownika z rozdziałem strumienia, a końcówkę wylotową do detektora. Dokonać ogólnych kontroli zespołu chromatografu gazowego (szczelność układu zasilania gazem, wydajność detektora, wydajność systemu dzielenia strumienia i systemu zapisu itd.) 5.4.1.2. Jeżeli kolumna zostaje użyta po raz pierwszy, zaleca się jej przygotowanie: przepuścić powoli przez kolumnę strumień gazu, następnie włączyć zespół chromatografu gazowego i rozpocząć stopniowe podgrzewanie do temperatury co najmniej 20 °C powyżej temperatury roboczej (uwaga 8). Utrzymywać taką temperaturę przez co najmniej dwie godziny, następnie ustawić zespół w trybie pracy (regulacja strumienia gazu i układu rozdzielania, zapalenie płomienia, połączenie z systemem obliczeniowymi, regulacja temperatury kolumny, detektora i dozownika itd.), a następnie rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwa razy większą niż przewidziana czułość analizy. Przebieg linii podstawowej musi mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików i bez przesunięcia. Ujemne przesunięcie prostej linii wskazuje na nieszczelność połączeń kolumn; przesunięcie dodatnie wskazuje na niedostateczne przygotowanie kolumny. Uwaga 8: temperatura przygotowania kolumn musi zawsze być co najmniej o 20 °C niższa niż maksymalna temperatura określona dla fazy stacjonarnej. 5.4.2. Dobór warunków roboczych 5.4.2.1. Warunki robocze są następujące: — temperatura kolumny: 260 ± 5 °C; — temperatura dozownika: 280–300 °C; — temperatura detektora: 280–300 °C; — prędkość liniowa gazu nośnego: hel 20–35 cm/s; wodór 30–50 cm/s; — stosunek rozdziału strumienia: 1:50–1:100; — czułość przyrządów: 4–16 razy minimalne tłumienie; — czułość rejestratora: 1–2 mV w pełnej skali; — ilość wprowadzonej substancji: 0,5–1 μl roztworu TMSE. Warunki te mogą być zmieniane zgodnie z charakterystyką kolumny i chromatografu gazowego w celu uzyskiwania chromatogramów spełniających następujące wymogi: — czas retencji w przypadku piku ß-sitosterolu powinien wynosić 20 ± 5 min; — pik kampesterolu powinien wynosić: w przypadku oliwy z oliwek (średnia zawartość 3 %) 20 ± 5 % w pełnej skali; w przypadku oleju sojowego (średnia zawartość 20 %) 80 ± 10 % w pełnej skali; — Należy oddzielić wszystkie występujące sterole. Oprócz całkowitego oddzielenia od siebie piki muszą także całkowicie rozdzielone, co oznacza, że wykres piku musi łączyć się z linią podstawową, zanim przejdzie w następny pik. Niepełna rozdzielczość jest jednak tolerowana, pod warunkiem że pik w punkcie RRT 1,02 (sitostanol) może zostać oznaczony ilościowo na podstawie linii prostopadłej. 5.4.3. Procedura analityczna 5.4.3.1. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl pobrać 1 μl heksanu, zassać 0,5 μl powietrza i następnie 0,5–1 μl roztworu próbki. Pociągnąć dalej tłoczek w celu opróżnienia igły. Wprowadzić igłę przez membranę dozownika i po jednej, dwóch sekundach szybko wstrzyknąć, a następnie powoli wyjąć igłę po około pięciu sekundach. Można zastosować także dozownik automatyczny. 5.4.3.2. Prowadzić rejestrację do całkowitego wyeluowania TMSE obecnych w próbce dialkoholi triterpenowych. Linia podstawowa powinna nadal spełniać wymogi (pkt 5.4.1.2). 5.4.4. Identyfikacja pików Zidentyfikować poszczególne piki na podstawie czasów retencji oraz przez porównanie z mieszaniną steroli i TMSE dialkoholi triterpenowych poddanych analizie w takich samych warunkach (zob. dodatek). Sterole i dialkohole triterpenowe podlegają elucji w następującej kolejności: cholesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metylen-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-awenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-awenasterol, erytrodiol i uwaol. Czasy retencji ß-sitosterolu na kolumnach SE-52 i SE-54 przedstawione są w tabeli 1. Na rysunkach 1 i 2 przedstawione są typowe chromatogramy niektórych rodzajów oliwy. 5.4.5. Ocena ilościowa 5.4.5.1. Obliczyć powierzchnie pików α-cholestanolu i steroli oraz dialkoholi triterpenowych za pomocą systemu obliczeniowego. Pominąć związki, które nie są ujęte w tabeli 1 (nie należy uwzględniać w obliczeniach ergosterolu). Współczynnik odpowiedzi w przypadku α-cholestanolu przyjmuje się jako równy 1. 5.4.5.2. Obliczyć stężenie każdego poszczególnego sterolu w mg/kg substancji tłuszczowej w następujący sposób: gdzie: Ax = powierzchnia piku w przypadku sterola x, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym As = powierzchnia piku α-cholestanolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym ms = masa dodanego α-cholestanolu, w miligramach m = masa próbki użytej do oznaczenia, w gramach

6.   PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

▼M28

▼M26

---

Dodatek

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki pracy wstrzyknąć 1–3 μl metanu (lub propanu) i zmierzyć czas, w jakim gaz przejdzie przez kolumnę od momentu wstrzyknięcia do momentu, w którym pojawi się pik (tM).

Prędkość liniowa w cm/s jest określona jako L/tM, gdzie L oznacza długość kolumny w centymetrach, a tM oznacza czas zmierzony w sekundach.

Rysunek 1

Chromatogram gazowy frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych oliwy z oliwek typu lampante (wzmocniony wewnętrznym wzorcem)

Rysunek 2

Chromatogram gazowy frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych rafinowanej oliwy z oliwek (wzmocniony wewnętrznym wzorcem)

Rysunek 3

Płytka TLC oliwy z wytłoczyn z oliwek ze strefą, którą musi zostać zeskrobana w celu oznaczenia steroli i dialkoholi triterpenowych

▼M26 —————

▼M21

---

ZAŁĄCZNIK VII

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI PROCENTOWEJ 2-MONOPALMITYNIANU GLICEROLU

1.   CEL I ZAKRES STOSOWANIA

Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości procentowej kwasu palmitynowego w pozycji 2 triglicerydów metodą oznaczania 2-monopalmitynianu glicerolu.

Niniejsza metoda dotyczy olejów roślinnych płynnych w temperaturze pokojowej (20 °C).

2.   ZASADA

Po przygotowaniu próbkę oleju poddaje się działaniu lipazy trzustkowej: częściowa i swoista hydroliza w pozycjach 1 i 3 cząsteczki triglicerydu powoduje pojawienie się monoglicerydów w pozycji 2. Zawartość procentowa 2-monopalmitynianu glicerolu we frakcji monoglicerydów jest oznaczana, po sililowaniu, metodą chromatografii gazowej na kolumnie kapilarnej.

3.   APARATURA I MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE

3.1.	Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.

3.2.	Zlewki o pojemności 100, 250 i 300 ml.

3.3.	Szklana kolumna chromatograficzna (wewnętrzna średnica: 21–23 mm, długość: 400 mm), wyposażona w płytkę ze spieku szklanego i kranik.

3.4.	Cylindry miarowe o pojemności 10, 50, 100 i 200 ml.

3.5.	Kolby o pojemności 100 i 250 ml.

3.6.	Wyparka obrotowa.

3.7.	Probówki do wirowania o pojemności 10 ml, ze szlifowanym korkiem.

3.8.	Wirówka do probówek o pojemności 10 i 100 ml.

3.9.	Termostat umożliwiający utrzymanie temperatury na poziomie 40 °C ± 0,5 °C.

3.10.

Biurety z podziałką co 1 i 2 ml.

3.11.

Strzykawka podskórna o pojemności 1 ml.

3.12.

Mikrostrzykawka o pojemności 100 μl.

3.13.

Lejek, 1 000 ml.

3.14.

Chromatograf gazowy do kolumn kapilarnych, wyposażony w dozownik do nastrzykiwania „na kolumnę” na zimno w celu bezpośredniego wprowadzania próbki do kolumny oraz w piecyk zapewniający utrzymanie wybranej temperatury z dokładnością do 1 °C.

3.15.

Układ nastrzykowy „na kolumnę” na zimno, w celu bezpośredniego wprowadzenia próbki do kolumny.

3.16.

Detektor płomieniowo-jonizacyjny i elektrometr.

3.17.

Rejestrujący integrator współpracujący z elektrometrem, z szybkością odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru.

3.18.

Kolumna kapilarna ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8–12 m i średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokryta 5 % polimetylosiloksanem lub polifenylo-metylosiloksanem, o grubości 0,10–0,30 μm, którą można stosować w temperaturze 370 °C.

3.19.

Mikrostrzykawka o pojemności 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni, o długości co najmniej 7,5 cm, przeznaczona do wykonywania bezpośrednich nastrzyków na kolumnę.

4.   ODCZYNNIKI

4.1.

Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 0,063 do 0,200 mm (70/280 mesh), przygotowany następująco: umieścić żel krzemionkowy w kapsule porcelanowej, suszyć w suszarce w temperaturze 160 °C przez 4 godziny, schłodzić do temperatury pokojowej w eksykatorze. Dodać objętość wody równoważną 5 % masy żelu krzemionkowego, w następujący sposób: do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml odważyć 152 g żelu krzemionkowego i dodać 8 g wody destylowanej, zatkać kolbę i delikatnie wstrząsać do uzyskania równomiernego rozprowadzenia wody. Odstawić na co najmniej 12 godzin przed użyciem.

4.2.	n-heksan (do chromatografii).

4.3.	Izopropanol.

4.4.	Izopropanol, roztwór wodny 1/1 (V/V).

4.5.	Lipaza trzustkowa. Użyta lipaza musi wykazywać aktywność w zakresie od 2,0 do 10 jednostek lipazy na mg (W handlu dostępne są lipazy trzustkowe o aktywności w zakresie od 2 do 10 jednostek na mg enzymu).

4.6.	Roztwór buforowy tris-hydroksymetyloaminometan: roztwór wodny 1 M doprowadzony do pH 8 (kontrola potencjometryczna) stężonym HCI (1/1 V/V).

4.7.	Cholan sodu, jakości enzymatycznej, roztwór wodny o stężeniu 0,1 % (roztwór ten należy wykorzystać w ciągu 15 dni od sporządzenia).

4.8.	Chlorek wapnia, 22 % roztwór wodny.

4.9.	Eter dietylowy do chromatografii.

4.10.

Rozpuszczalnik rozwijający: mieszanina n-heksanu/eteru dietylowego (87/13) (V/V).

4.11.

Wodorotlenek sodu, roztwór 12 % wagowo.

4.12.

Fenoloftaleina, roztwór 1 % w etanolu.

4.13.

Gaz nośny: wodór lub hel do chromatografii gazowej.

4.14.

Gazy pomocnicze: – wodór w stężeniu minimum 99 %, pozbawiony wilgoci i substancji organicznych – oraz powietrze do chromatografii gazowej o takiej samej czystości.

4.15.

Odczynnik wywołujący reakcję sililowania: mieszanina pirydyna/heksametylodisilazan/trimetylochlorosilan w proporcji 9/3/1 (V/V/V) (W handlu dostępne są roztwory gotowe do użycia. Można zastosować również inne odczynniki wywołujące reakcję sililowania, jak np. bis-trimetylosilyltrifluoraocetamid + 1 % trimetylochlorosilan, rozcieńczone taką samą objętością bezwodnika pirydyny).

4.16.

Próbki wzorcowe: czyste monoglicerydy lub mieszaniny monoglicerydów o znanym składzie procentowym podobnym do występującego w próbce badanej.

5.   PROCEDURA

5.1.   Przygotowanie próbki

5.1.1.

Oleje o wolnej kwasowości poniżej 3 % nie wymagają zobojętnienia przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Oleje o wolnej kwasowości powyżej 3 % muszą być zobojętnione zgodnie z ppkt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Do lejka o pojemności 1 000 ml (3.13) wlać 50 g oleju i 200 ml n-heksanu. Dodać 100 ml izopropanolu i ilość roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 12 % (4.11) odpowiadającą wolnej kwasowości oleju powiększonej o 5 %. Wstrząsać energicznie przez jedną minutę. Dodać 100 ml wody destylowanej, ponownie wstrząsnąć i odstawić. Po dekantacji usunąć dolną warstwę mydła. Usunąć także wszystkie pośrednie warstwy (śluzy, substancje nierozpuszczalne). Płukać roztwór heksanu i zobojętnionego oleju kolejnymi porcjami 50–60 ml roztworu izopropanol/woda w proporcji 1/1 (V/V) (4.4), aż zniknie różowa barwa fenoloftaleiny. Usunąć większość heksanu za pomocą destylacji w próżni (wykorzystać do tego celu na przykład wyparkę obrotową) i przenieść olej do kolby o pojemności 100 ml (3.5). Suszyć olej w próżni do całkowitego usunięcia rozpuszczalnika. Pod koniec tej czynności kwasowość oleju musi wynosić poniżej 0,5 %.

5.1.2.

Wprowadzić 1,0 g oleju przygotowanego w sposób wskazany powyżej do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i rozpuścić go w 10 ml mieszaniny rozwijającej (4.10). Odstawić roztwór na co najmniej 15 minut przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Jeżeli roztwór jest mętny, odwirować go w celu zapewnienia optymalnych warunków wykonywania chromatografii. (Można zastosować gotowe do użycia wkłady żelu krzemionkowego SPE o masie 500 mg).

5.1.3.

Przygotowanie kolumny chromatograficznej Nanieść na kolumnę (3.3) około 30 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10), za pomocą szklanej pałeczki wprowadzić wacik do dolnej części kolumny; przycisnąć w celu usunięcia powietrza. Przygotować w zlewce zawiesinę 25 g żelu krzemionkowego (4.1) w około 80 ml rozpuszczalnika rozwijającego i przelać ją do kolumny przy użyciu lejka. Sprawdzić, czy cały żel krzemionkowy został wprowadzony do kolumny; przemyć rozpuszczalnikiem rozwijającym (4.10), otworzyć kranik i poczekać, aż poziom płynu osiągnie wysokość około 2 mm poniżej górnego poziomu żelu krzemionkowego.

5.1.4.

Chromatografia na kolumnie Do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) odważyć dokładnie 1,0 g próbki przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1. Rozpuścić próbkę w 10 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10). Wlać roztwór do kolumny chromatograficznej przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1.3. Starać się nie poruszyć powierzchni kolumny. Otworzyć kranik i zlać roztwór próbki, aż osiągnie poziom żelu krzemionkowego. Rozwinąć poprzez dodanie 150 ml rozpuszczalnika rozwijającego. Ustawić szybkość przepływu na 2 ml/min (tak aby 150 ml przeszło przez kolumnę w ciągu około 60–70 minut). Zebrać odciek z kolumny do wcześniej wytarowanej kolby o pojemności 250 ml. Odparować rozpuszczalnik w próżni i usunąć jego resztkowe pozostałości pod strumieniem azotu. Zważyć kolbę i obliczyć ilość zebranego ekstraktu. (W przypadku korzystania z gotowych do użytku wkładów krzemionkowych SPE postępować następująco: wprowadzić 1 ml roztworu (5.1.2) do wkładów przygotowanych wcześniej przy użyciu 3 ml n-heksanu. Po perkolacji roztworu rozwinąć chromatogram poprzez dodanie 4 ml n-heksanu/eteru dietylowego w proporcji 9/1 (V/V). Zebrać odciek z kolumny do probówki o pojemności 10 ml i poddać go odparowywaniu do sucha pod strumieniem azotu. Poddać suchą pozostałość działaniu lipazy trzustkowej (5.2). Bezwzględnie konieczne jest sprawdzenie składu kwasów tłuszczowych przed przepuszczeniem i po przepuszczeniu przez wkład SPE).

5.2.   Hydroliza przez lipazę trzustkową

5.2.1.

Do probówki do wirowania odważyć 0,1 g oleju przygotowanego zgodnie z ppkt 5.1. Dodać 2 ml roztworu buforowego (4.6), 0,5 ml roztworu cholanu sodu (4.7) i 0,2 ml roztworu chlorku wapnia, dobrze wstrząsając po dodaniu każdej z tych substancji. Zamknąć probówkę szlifowanym korkiem i umieścić ją w termostacie o temperaturze 40 ± 0,5 °C.

5.2.2.

Dodać 20 mg lipazy, ostrożnie wstrząsać (nie dopuszczając do zwilżenia korka) i włożyć probówkę do termostatu na dokładnie 2 minuty, następnie wyjąć ją, wstrząsać energicznie i dokładnie przez 1 minutę i odstawić do schłodzenia.

5.2.3.

Dodać 1 ml eteru dietylowego, zatkać korkiem i wstrząsać energicznie, następnie odwirować i przenieść roztwór eteru do czystej i suchej probówki przy użyciu mikrostrzykawki.

5.3.   Przygotowanie pochodnych silanizowanych i chromatografii gazowej

5.3.1.

Przy użyciu mikrostrzykawki wprowadzić 100 μl roztworu (5.2.3) do probówki ze stożkowym dnem o pojemności 10 ml.

5.3.2.

Usunąć rozpuszczalnik pod słabym strumieniem azotu, dodać 200 μl odczynnika wywołującego reakcję sililowania (4.15), zatkać probówkę i odstawić na 20 minut.

5.3.3.

Po 20 minutach dodać od 1 do 5 ml n-heksanu (zależnie od warunków chromatografowania): uzyskany roztwór jest gotowy do chromatografii gazowej.

5.4.   Chromatografia gazowa

Warunki robocze są następujące:

5.4.1.   Identyfikacja pików

Poszczególne monoglicerydy są identyfikowane według czasów retencji oraz przez porównanie z pikami uzyskanymi ze standardowymi mieszaninami monoglicerydów analizowanymi w tych samych warunkach.

5.4.2.   Ocena ilościowa

Oblicza się pole pod każdym pikiem przy użyciu elektronicznego integratora.

6.   PREZENTACJA WYNIKÓW

Zawartość procentową monopalmitynianu glicerolu oblicza się na podstawie stosunku pola pod odpowiednim pikiem do sumy pól pod pikami wszystkich monoglicerydów (patrz: rysunek 2), na podstawie wzoru:

Glyceril monopalmitate (%):

gdzie:

Ax

=

pole pod pikiem odpowiadającym monopalmitynianowi glicerolu

ΣA

=

suma pól pod wszystkimi pikami monoglicerydów

Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

7.   SPRAWOZDANIE Z ANALAIZY

Sprawozdanie z testu powinno zawierać:

Rysunek 1

Chromatogram produktów reakcji sililowania uzyskanych po zadziałaniu lipazą na rafinowaną oliwę z oliwek, do której dodano 20 % zestryfikowanego oleju (100 %)

Objaśnienie: „Acides gras libres” = Wolne kwasy tłuszczowe; „Huile d’olive raffinée” = Rafinowana oliwa z oliwek – „+ 20 % huile estérifiée” = + 20 % oliwa z oliwek estryfikowana; „1-2 monopalmitine” = 1-2 monopalmityn – „1-2 monopalmitoléine” = 1-2 monopalmitoleina; „1-2 mono C18 insat.” = 1-2 mono C18 nenasyc.; Squalène = Skwalen

Rysunek 2

Chromatogram:

A)

nie estryfikowanej oliwy z oliwek, po zadziałaniu na nią lipazą; po sililowaniu; w podanych warunkach (kolumna kapilarna 8–12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później. Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %. Objaśnienie: 1 = Wolne kwasy tłuszczowe 2 = Monoglicerydy 3 = Diglicerydy 4 = Triglicerydy * = 2-monopalmityn ** = Trigliceryd C54

Chromatogram:

B)

oliwy estryfikowanej po zadziałaniu lipazą; po sililowaniu; w tych warunkach (kolumna kapilarna 8–12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później. Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %. Objaśnienie: 1 = Wolne kwasy tłuszczowe 2 = Monoglicerydy 3 = Diglicerydy 4 = Triglicerydy * = 2-monopalmityn ** = Trigliceryd C54

8.   UWAGI

PRZYGOTOWANIE LIPAZY

W handlu dostępne są lipazy o zadowalającej aktywności. Możliwe jest również ich przygotowanie w laboratorium w następujący sposób:

Schłodzić w 0 °C 5 kg świeżej trzustki wieprzowej. Usunąć tłuszcz stały i otaczającą go tkankę łączną i utrzeć w młynku do uzyskania płynnej pasty. Wymieszać tę pastę z 2,5 litra bezwodnego acetonu w czasie od 4 do 6 godzin, następnie odwirować. Poddać pozostałość jeszcze trzykrotnej ekstrakcji taką samą objętością bezwodnego acetonu, a następnie dwukrotnej ekstrakcji mieszaniną acetonu i eteru dietylowego w stosunku 1 do 1 (V/V) i dwukrotnej ekstrakcji eterem dietylowym.

Suszyć pozostałość w próżni przez 48 godzin w celu uzyskania stabilnego proszku nadającego się do przechowywania przez dłuższy czas w lodówce, w miejscu chronionym przed wilgocią.

KONTROLA DZIAŁANIA LIPAZY

Przygotować emulsję oliwy z oliwek w następujący sposób:

Wstrząsać przez 10 minut w mieszadle mieszaninę składającą się ze 165 ml roztworu gumy arabskiej o stężeniu 100 g/l, 15 g skruszonego lodu i 20 ml wcześniej zobojętnionej oliwy z oliwek.

Do zlewki o pojemności 50 ml wlać 10 ml tej emulsji, a następnie 0,3 ml roztworu cholanu sodu o stężeniu 0,2 g/ml i 20 ml wody destylowanej.

Umieścić zlewkę w termostacie, którego temperatura utrzymywana jest na poziomie 37 °C; umieścić w nim elektrody pH-metru i mieszadło spiralne.

Za pomocą biurety dodawać kroplami 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu, aż pH osiągnie wartość 8,3.

Dodać dostateczną objętość wodnej zawiesiny lipazy w proszku (0,1 g/ml lipazy). Z chwilą gdy pH-metr wskaże 8,3, włączyć stoper i rozpocząć wkraplanie roztworu wodorotlenku sodu z prędkością umożliwiającą utrzymanie pH na poziomie 8,3. Co minutę zapisywać objętość zużytego roztworu.

Nanieść zanotowane wartości na diagram, zaznaczając na osi odciętych czas, a na osi rzędnych liczby mililitrów 0,1 N roztworu zasadowego zużytego w celu utrzymania stałego pH. W wyniku tego powinno się otrzymać linię prostą.

Aktywność lipazy wyrażoną w jednostkach lipazowych na mg oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

A	oznacza aktywność w jednostkach lipazowych/mg

V	oznacza liczbę mililitrów 0,1 N roztworu wodorotlenku sodu na minutę (obliczoną na podstawie wykresu)

N	oznacza normalność roztworu wodorotlenku sodu

m	oznacza masę w mg oznaczanej lipazy.

Jednostkę lipazową definiuje się jako ilość enzymu uwalniającą 10 mikroekwiwalentów kwasu na minutę.

▼M20 —————

▼M28

---

ZAŁĄCZNIK IX

BADANIE SPEKTROFOTOMETRYCZNE W ULTRAFIOLECIE

WPROWADZENIE

Dzięki badaniu spektrofotometrycznemu w ultrafiolecie można uzyskać informacje o jakości substancji tłuszczowej, jej stanie zachowania i zmianach wywołanych procesami technologicznymi. Efekty absorpcji fal o długości ustalonej w tej metodzie wywołane są obecnością sprzężonych systemów dienowych i trienowych wynikającą z utleniania lub rafinacji. Wielkość takiej absorpcji jest wyrażana jako właściwa gęstość optyczna

(gęstość optyczna 1 % w/v roztworu substancji tłuszczowej w określonym rozpuszczalniku w ogniwie 10 mm) oznaczona zgodnie z konwencją jako K (zwana również „współczynnikiem ekstynkcji”).

1.   ZAKRES

W niniejszym załączniku opisuje się procedurę przeprowadzania badania spektrofotometrycznego oliwy z oliwek w zakresie ultrafioletu.

2.   PODSTAWOWA ZASADA METODY

Próbkę rozpuszcza się w wymaganym rozpuszczalniku, a następnie mierzy się absorbancję roztworu dla określonych długości fal w porównaniu z czystym rozpuszczalnikiem.

Właściwą gęstość optyczną oblicza się przy 232 nm i 268 nm w izooktanie lub przy 232 nm i 270 nm w cykloheksanie dla stężenia 1 % w/v w ogniwie 10 mm.

3.   URZĄDZENIA

3.1.

Spektrofotometr odpowiedni do pomiarów długości fal ultrafioletowych (220 nm do 360 nm) z możliwością odczytu pojedynczych jednostek nanometrycznych. Zaleca się regularną kontrolę dokładności i odtwarzalności skal absorbancji i długości fal, a także kontrolę światła rozproszonego. 3.1.1. Skala długości fal: Można ją sprawdzić poprzez zastosowanie materiału wzorcowego złożonego z filtra ze szkła optycznego zawierającego tlenek holmu lub roztwór tlenku holmu (zamkniętego hermetycznie lub niehermetycznie) o wyraźnych pasmach absorpcyjnych. Materiały wzorcowe służą do weryfikacji i kalibracji skali długości fal w spektrofotometrach w świetle widzialnym i ultrafiolecie o nominalnej spektralnej szerokości wiązki do 5 nm. Pomiary są wykonywane względem próbki wzorcowej z powietrzem otoczenia w zakresie długości fal od 640 do 240 nm, według instrukcji załączonej do materiałów wzorcowych. Przeprowadzana jest korekta bazowa przy pustym torze wiązki dla każdej zmiany szerokości szczeliny. Długości fal dla normy są wymienione w certyfikacie materiału wzorcowego. 3.1.2. Skala absorbancji: Można ją sprawdzić z użyciem dostępnych w sprzedaży hermetycznie zamkniętych materiałów wzorcowych złożonych z kwasowych roztworów dichromianu potasu o określonych stężeniach i certyfikowanych wartościach absorbancji przy λmax (4 roztwory dichromianu potasu w kwasie nadchlorowym szczelnie zamkniętych w czterech kwarcowych ogniwach ultrafioletowych do pomiaru wartości referencyjnej liniowości i dokładności fotometrycznej w ultrafiolecie). Pomiary roztworów dichromianu potasu są wykonywane względem próbki wzorcowej użytego kwasu, po dokonaniu korekty bazowej, według instrukcji załączonej do materiału wzorcowego. Wartości absorbancji są wymienione w certyfikacie materiału wzorcowego. Inną możliwością sprawdzenia reakcji ogniwa fotoelektrycznego i powielacza fotoelektrycznego jest następująca procedura: odważyć 0,2000 g czystego chromianu potasu do badań spektrofotometrycznych, rozpuścić w roztworze 0,05 N wodorotlenku potasu i dopełnić do kreski w kolbie o pojemności 1 000 ml. Następnie pobrać dokładnie 25 ml otrzymanego roztworu i przenieść do kolby miarowej o pojemności 500 ml, po czym uzupełnić do kreski tym samym roztworem wodorotlenku potasu. Zmierzyć gęstość optyczną otrzymanego w ten sposób roztworu dla długości fali 275 nm, używając roztworu wodorotlenku potasu jako wzorca. Gęstość optyczna zmierzona przy użyciu kuwety o grubości 1 cm powinna wynosić 0,200 ± 0,005.

3.2.	Prostokątne kuwety kwarcowe z pokrywą, odpowiednie do pomiarów przy długości fal ultrafioletowych (220–360 nm) o długości drogi optycznej 10 mm. Po napełnieniu ich wodą lub innym odpowiednim rozpuszczalnikiem kuwety nie powinny się różnić między sobą o więcej niż 0,01 jednostki gęstości optycznej.

3.3.	Kolby miarowe z miarką, pojemność 25 ml, klasa A.

3.4.	Waga analityczna z dokładnością odczytu do najbliższego 0,0001 g.

4.   ODCZYNNIKI

W trakcie analizy, jeżeli nie ma innych wskazań, stosuje się jedynie odczynniki o uznanej klasie analitycznej oraz wodę destylowaną lub demineralizowaną lub wodę o równorzędnej czystości.

Rozpuszczalnik: izooktan (2,2,4-trimetylopentan) do pomiarów przy 232 nm i 268 nm i cykloheksan do pomiarów przy 232 nm i 270 nm, przy czym absorbancja wynosi mniej niż 0,12 przy 232 nm i mniej niż 0,05 przy 270 nm w stosunku do wody destylowanej; pomiar w ogniwie 10 mm.

5.   PROCEDURA

5.1.	Próbka musi być całkowicie jednorodna i pozbawiona wszelkich zanieczyszczeń występujących w postaci zawiesiny. W przeciwnym razie musi zostać przefiltrowana przez filtr papierowy w temperaturze około 30 °C.

5.2.

Odważyć około 0,25 g (z dokładnością do najbliższego 1 mg) przygotowanej w ten sposób próbki w kolbie miarowej o pojemności 25 ml, uzupełnić wskazanym rozpuszczalnikiem do kreski i poddać homogenizacji. Uzyskany roztwór musi być idealnie przezroczysty. W razie wystąpienia opalizacji lub mętnienia przefiltrować szybko przez filtr papierowy. UWAGA: Zasadniczo próbka 0,25–0,30 g jest wystarczająca do pomiarów absorbancji oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia i oliwy z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia przy 268 nm i 270 nm. Dla pomiarów 232 nm zazwyczaj wymaga się próbki 0,05 g, przygotowuje się zatem dwa oddzielne roztwory. W pomiarach absorbancji oliwy z wytłoczyn z oliwek, rafinowanej oliwy z oliwek oraz fałszowanej oliwy z oliwek potrzebna jest zazwyczaj mniejsza próbka, np. 0,1 g, ze względu na większą absorbancję tych oliw.

5.3.

Jeżeli jest to konieczne, przeprowadzić korektę bazową (220–290 nm) rozpuszczalnikiem w obu ogniwach kwarcowych (próbka i materiał wzorcowy), a następnie wypełnić ogniwo kwarcowe próbki badanym roztworem i zmierzyć gęstość optyczną przy 232, 268 lub 270 nm względem rozpuszczalnika wzorcowego. Zarejestrowane wartości gęstości optycznej muszą mieścić się w przedziale od 0,1 do 0,8 lub w przedziale liniowości spektrofotometru, którą należy zweryfikować. Jeżeli się nie mieszczą, należy powtórzyć pomiary, stosując odpowiednio silniejsze lub słabsze roztwory.

5.4.

Po dokonaniu pomiaru absorbancji przy 268 lub 270 nm, zmierzyć absorbancję przy λmax, λmax+4 i λmax-4. Uzyskanych wartości absorbancji używa się do określenia zmienności właściwej gęstości optycznej (ΔΚ). UWAGA: λmax jest przyjmowane za 268 nm dla izooktanu używanego jako rozpuszczalnik i 270 nm dla cykloheksanu.

6.   PREZENTACJA WYNIKÓW

6.1.

Należy zarejestrować właściwe gęstości optyczne (współczynniki ekstynkcji) dla różnych długości fal, obliczając je w następujący sposób: gdzie: Kλ = właściwa gęstość optyczna przy długości fali λ; Eλ = gęstość optyczna zmierzona przy długości fali λ; c = stężenie roztworu w g/100 ml; s = droga optyczna ogniwa kwarcowego w cm; z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

6.2.

Zmienność właściwej gęstości optycznej (ΔΚ) Zmienność wartości bezwzględnej gęstości (ΔΚ) oblicza się według wzoru: gdzie Km oznacza właściwą gęstość optyczną przy długości fali dla maksymalnej absorpcji 270 nm i 268 nm w zależności od zastosowanego rozpuszczalnika. Wynik należy podać z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

---

ZAŁĄCZNIK X

OZNACZANIE ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1.   ZAKRES

Niniejszy załącznik zawiera wytyczne w zakresie oznaczania metodą chromatografii gazowej wolnych i związanych kwasów tłuszczowych w tłuszczach i olejach roślinnych po ich przekształceniu na estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME).

Związane kwasy tłuszczowe w formie triglicerydów (TAG) oraz – w zależności od metody estryfikacji – wolne kwasy tłuszczowe (FFA) są przekształcane na estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME), które oznacza się metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych.

Metoda opisana w niniejszym załączniku pozwala na oznaczanie FAME od C12 do C24, w tym estrów metylowych kwasów tłuszczowych nasyconych, cis- i trans-jednonienasyconych oraz cis- i trans-wielonienasyconych.

2.   ZASADA

Do analizy ilościowej FAME stosuje się chromatografię gazową (GC). FAME są przygotowywane zgodnie z częścią A. Następnie są wstrzykiwane do dozownika i odparowywane. Rozdział FAME przeprowadza się w kolumnach analitycznych o określonej polarności i długości. Do wykrywania FAME stosuje się detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID). Warunki badania określono w części B.

W chromatografii gazowej FAME z użyciem FID można użyć wodoru lub helu jako gazu nośnego (faza ruchoma). Wodór przyspiesza rozdział i daje wyraźniejsze piki. Fazą stacjonarną jest mikroskopijna warstwa cienkiego filmu cieczy naniesiona na obojętną powierzchnię z topionej krzemionki.

Podczas przejścia związków lotnych poddawanych analizie przez kolumnę kapilarną następuje ich oddziaływanie z fazą stacjonarną pokrywającą wewnętrzną powierzchnię kolumny. W wyniku różnych oddziaływań różnych związków elucja ma miejsce w różnym czasie – jest to tak zwany czas retencji związku chemicznego przy danym zbiorze parametrów analitycznych. Porównanie czasów retencji służy identyfikacji różnych związków chemicznych.

CZĘŚĆ A

PRZYGOTOWANIE ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Z OLIWY Z OLIWEK ORAZ OLIWY Z WYTŁOCZYN Z OLIWEK

1.   ZAKRES

W niniejszej części opisano przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Zawarto w niej metody przygotowania estrów metylowych kwasów tłuszczowych z oliw z oliwek oraz z oliw z wytłoczyn z oliwek.

2.   ZAKRES ZASTOSOWANIA

Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych z oliw z oliwek oraz z oliw z wytłoczyn z oliwek przeprowadza się w drodze transestryfikacji roztworem metanolowym wodorotlenku potasu w temperaturze pokojowej. Konieczność oczyszczania próbki przed transestryfikacją zależy od zawartości wolnych kwasów tłuszczowych w próbce oraz od oznaczanych parametrów analitycznych; metodę można wybrać zgodnie z następującą tabelą:

3.   METODOLOGIA

3.1.    Transestryfikacja roztworem metanolowym wodorotlenku potasu w temperaturze pokojowej

3.1.1.    Zasada

Estry metylowe powstają w wyniku transestryfikacji roztworem metanolowym wodorotlenku potasu na etapie pośrednim przed zmydlaniem.

3.1.2.    Odczynniki

3.1.2.1.

Metanol o zawartości wody nieprzekraczającej 0,5 % (m/m).

3.1.2.2.

Heksan, jakość chromatograficzna.

3.1.2.3.

Heptan, jakość chromatograficzna.

3.1.2.4.

Eter dietylowy do analizy, stabilizowany.

3.1.2.5.

Aceton, jakość chromatograficzna.

3.1.2.6.

Rozpuszczalnik elucyjny do oczyszczania oliwy metodą chromatografii kolumnowej/SPE, w mieszaninie heksanu z eterem dietylowym 87/13 (v/v).

3.1.2.7.

Wodorotlenek potasu, roztwór metanolowy ok. 2M: rozpuścić 11,2 g wodorotlenku potasu w 100 ml metanolu.

3.1.2.8.

Wkłady z żelem krzemionkowym, 1 g (6 ml), do ekstrakcji do fazy stałej.

3.1.3.    Aparatura

3.1.3.1.

Probówki zakręcane (objętość 5 ml), zakrętka z uszczelką PTFE.

3.1.3.2.

Pipety miarowe lub automatyczne, 2 ml i 0,2 ml.

3.1.4.    Oczyszczanie próbek oliwy

W razie potrzeby próbki można oczyścić przez przepuszczenie oliwy przez wkład z żelem krzemionkowym do ekstrakcji do fazy stałej. Wkład z żelem krzemionkowym (3.1.2.8) umieszcza się w elucyjnej aparaturze próżniowej i przemywa się 6 ml heksanu (3.1.2.2); przemywanie odbywa się bez próżni. Następnie do kolumny podaje się roztwór oliwy (około 0,12 g) w 0,5 ml heksanu (3.1.2.2). Roztwór przepuszcza się przez kolumnę, a następnie poddaje elucji mieszaniną 10 ml heksanu/eteru dietylowego (87:13 v/v) (3.1.2.6). Wszystkie eluaty są homogenizowane i dzielone na dwie podobne objętości. Podwielokrotność odparowuje się do suchości w wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej. Pozostałość rozpuszcza się w 1 ml heptanu i roztwór jest gotowy do analizy kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej. Drugą podwielokrotność odparowuje się, a pozostałość rozpuszcza się w 1 ml acetonu do analizy triglicerydów metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), jeśli jest to konieczne.

3.1.5.    Procedura

W zakręcanej probówce o pojemności 5 ml (3.1.3.1) odważyć ok. 0,1 g próbki oliwy. Dodać 2 ml heptanu (3.1.2.2) i wstrząsnąć. Dodać 0,2 ml roztworu metanolowego wodorotlenku potasu (3.1.2.7), zamknąć nakrętką z uszczelką PTFE, zacisnąć nakrętkę i wstrząsać energicznie przez 30 sekund. Pozostawić do rozwarstwienia, aż górna warstwa roztworu stanie się klarowna. Dekantować górną warstwę zawierającą estry metylowe. Roztwór heptanu jest gotowy do wstrzyknięcia do chromatografu gazowego. Zaleca się przechowywanie roztworu w chłodziarce do czasu analizy metodą chromatografii gazowej. Nie zaleca się przechowywania roztworu dłużej niż przez 12 godzin.

CZĘŚĆ B

ANALIZA ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1.   ZAKRES

Niniejsza część zawiera ogólne wytyczne stosowania chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych do oznaczania składu jakościowego i ilościowego mieszaniny estrów metylowych kwasów tłuszczowych uzyskanych zgodnie z metodą określoną w części A.

Niniejsza część nie stosuje się do spolimeryzowanych kwasów tłuszczowych.

2.   ODCZYNNIKI

2.1.    Gaz nośny

Gaz obojętny (hel lub wodór) dokładnie osuszony i zawierający mniej niż 10 mg/kg tlenu.

2.2.    Gazy pomocnicze

2.2.1.

Wodór (czystość ≥ 99,9 %) niezawierający zanieczyszczeń organicznych.

2.2.2.

Powietrze lub tlen niezawierające zanieczyszczeń organicznych.

2.2.3.

Azot (czystość > 99 %).

2.3.    Produkty wzorcowania

Mieszanina estrów metylowych czystych kwasów tłuszczowych lub estrów metylowych substancji tłuszczowej o znanym składzie, o ile to możliwe jak najbardziej zbliżonym do składu substancji tłuszczowej poddawanej analizie. Izomery cis i trans, oktadekanowe, oktadekadienowe i oktadekatrienowe estrów metylowych są przydatne w identyfikacji izomerów trans kwasów nienasyconych.

Należy przedsięwziąć wszelkie środki ostrożności, aby zapobiec utlenieniu kwasów tłuszczowych wielonienasyconych.

3.   APARATURA

Podane zalecenia dotyczą powszechnie stosowanego sprzętu do chromatografii gazowej z wykorzystaniem kolumn kapilarnych i detektora płomieniowo-jonizacyjnego.

3.1.    Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy składa się z następujących elementów:

3.1.1.    System dozowania

Należy korzystać z systemu dozowania z kolumnami kapilarnymi, przy czym system ten powinien być tak skonstruowany, aby można było go używać z takimi kolumnami. Może to być dozownik z rozdziałem strumienia lub dozownik typu on-column bez rozdziału strumienia.

3.1.2.    Piec

Piec musi być w stanie nagrzać kolumnę kapilarną do temperatury co najmniej 260 °C i utrzymać pożądaną temperaturę z dokładnością do 0,1 °C. Ten drugi wymóg jest szczególnie istotny w przypadku użycia rurki z topionej krzemionki.

Stosowanie urządzenia wyposażonego w programator temperatury jest zalecane we wszystkich przypadkach, w szczególności w przypadku kwasów tłuszczowych o liczbie atomów węgla mniejszej niż 16.

3.1.3.    Kolumna kapilarna

3.1.3.1.

Rurka z materiału obojętnego w stosunku do badanych substancji (na ogół ze szkła lub topionej krzemionki). Wewnętrzna średnica musi mieścić się w przedziale 0,20–0,32 mm. Powierzchnia wewnątrz musi być poddana odpowiedniej obróbce (np. przygotowanie powierzchni, dezaktywacja) przed nałożeniem warstwy fazy stacjonarnej. Długość 60 m jest wystarczająca dla kwasów tłuszczowych oraz izomerów cis i trans kwasów tłuszczowych.

3.1.3.2.

Odpowiednie są kolumny z fazą sieciowanych polisiloksanów polarnych (cyjanopropylosilikon). Uwaga 2:  Istnieje ryzyko, że polisiloksany polarne mogą spowodować trudności przy określaniu i rozdzielaniu kwasu linolenowego i kwasów C20. Warstwy powinny być cienkie, tj. 0,1–0,2 μm.

3.1.3.3.

Montaż i kondycjonowanie kolumny Należy przestrzegać normalnych środków ostrożności obowiązujących przy czynnościach montażu kolumn kapilarnych, takich jak umieszczenie kolumny w piecu (podłoże), dobór i montaż połączeń (szczelność), rozmieszczenie końcówek kolumny w dozowniku i detektorze (zmniejszenie martwych przestrzeni). Umieścić kolumnę pod strumieniem gazu nośnego (na przykład o ciśnieniu 0,3 bara (30 kPa) dla kolumny o długości 25 m i średnicy wewnętrznej 0,3 mm). Kondycjonować kolumnę, programując wzrost temperatury pieca na 3 °C/min od poziomu temperatury otoczenia aż do temperatury niższej o 10 °C od granicznej wartości temperatury, w której następuje rozpad fazy stacjonarnej. Utrzymywać tę temperaturę pieca przez jedną godzinę do momentu stabilizacji linii podstawowej. Obniżyć temperaturę do 180 °C, aby kontynuować pracę w warunkach stałej temperatury. Uwaga 3:  Odpowiednio prekondycjonowane kolumny są dostępne w handlu.

3.1.4.    Detektor płomieniowo-jonizacyjny i konwerter-wzmacniacz

3.2.    Strzykawka

Strzykawka musi mieć maksymalną pojemność 10 μl i być wyskalowana co 0,1 μl.

3.3.    System odbioru danych

System odbioru danych, połączony bezpośrednio z detektorami i używany wraz z oprogramowaniem odpowiednim do integracji i normalizacji piku.

4.   PROCEDURA

Szczegółowe zasady postępowania podane w pkt. 4.1–4.3 odnoszą się do stosowania detektora płomieniowo-jonizacyjnego.

4.1.    Warunki badania

4.1.1.    Dobór optymalnych warunków pracy dla kolumn kapilarnych

W związku ze sprawnością i drożnością kolumn kapilarnych rozdzielanie składników i czas trwania analizy zależą w bardzo dużym stopniu od natężenia przepływu gazu nośnego w kolumnie. Konieczne będzie zatem dokonanie optymalizacji warunków pracy przez dostosowanie tego parametru (lub spadku ciśnienia na wlocie kolumny) w zależności od tego, czy celem jest poprawa rozdzielania czy przyspieszenie analizy.

Poniższe warunki okazały się odpowiednie do rozdziału FAME (C4–C26). Przykładowe chromatogramy są zamieszczone w dodatku B:

4.1.2.    Określanie rozdzielczości (zob. dodatek A)

Obliczyć rozdzielczość R dwóch sąsiednich pików I i II, stosując wzór:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) lub R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia),

lub

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia))

gdzie:

Jeżeli ω(I) ≈ ω(II), należy obliczyć R, korzystając z następujących wzorów:

R = (dr ( II ) – d r(I))/ω = (dr ( II ) – d r(I))/4σ

gdzie:

σ to odchylenie standardowe (zob. dodatek A, rys. 1).

Jeżeli odległość dr pomiędzy dwoma pikami d r(II) – d r(I) jest równa 4σ, wówczas współczynnik rozdzielczości R = 1.

Jeżeli dwa piki nie są całkowicie oddzielone, styczne do punktów przegięcia tych dwóch pików przecinają się w punkcie C. Aby oddzielić całkowicie te dwa piki, odległość między nimi musi być równa:

d r(II) – d r(I) = 6 σ skąd R = 1,5 (zob. dodatek A, rys. 3).

5.   PREZENTACJA WYNIKÓW

5.1.    Analiza jakościowa

Należy określić piki estrów metylowych próby z chromatogramu w dodatku B, rys. 1 w razie potrzeby przez interpolację lub przez porównanie z pikami mieszanin wzorcowych estrów metylowych (jak określono w pkt 2.3).

5.2.    Analiza ilościowa

5.2.1.    Oznaczanie składu

Należy obliczyć ułamek masowy w i poszczególnych estrów metylowych kwasów tłuszczowych, wyrażony jako wartość procentowa masy estrów metylowych, w następujący sposób:

5.2.2.    Metoda obliczania

5.2.2.1.   Przypadek ogólny

Obliczyć zawartość danego składnika i, wyrażoną jako wartość procentowa masy estrów metylowych, określając wartość procentową powierzchni odpowiedniego piku do sumy powierzchni wszystkich pików, stosując wzór:

wi = (Ai/ΣA) × 100

gdzie:

Wyniki podaje się z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

5.2.2.2.   Stosowanie współczynników korygujących

W niektórych przypadkach, na przykład w obecności kwasów tłuszczowych o liczbie atomów węgla mniejszej niż osiem lub kwasów z grupami drugorzędowymi, powierzchnie koryguje się odpowiednimi współczynnikami korygującymi (Fci). Współczynniki te ustala się dla każdego instrumentu. W tym celu należy używać odpowiednich materiałów wzorcowych z certyfikowaną zawartością kwasów tłuszczowych w odpowiednim zakresie.

Dla tej mieszaniny wzorcowej ułamek masowy FAME i oblicza się zgodnie ze wzorem:

wi = (mi /Σm) × 100

gdzie:

Na podstawie chromatogramu mieszaniny wzorcowej, należy obliczyć wartość procentową według powierzchni dla FAME i w następujący sposób:

wi = (Ai/ΣA) × 100

gdzie:

Współczynnik korygujący Fc wynosi wówczas

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Dla próbki ułamek masowy każdego FAME i wynosi:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Wyniki podaje się z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

5.2.2.3.   Stosowanie wzorca wewnętrznego

W niektórych analizach (na przykład wówczas, gdy nie wszystkie kwasy tłuszczowe są oznaczane ilościowo i obok kwasów C16 i C18 występują kwasy C4 i C6, lub gdy zachodzi konieczność oznaczenia bezwzględnej ilości kwasów tłuszczowych w próbce), niezbędne jest zastosowanie wzorca wewnętrznego. Stosowane są często kwasy tłuszczowe z 5, 15 lub 17 atomami węgla. Należy wyznaczyć współczynnik korygujący wewnętrznego wzorca (jeżeli zachodzi taka potrzeba).

Procentowy udział masy składnika i wyrażony jako estry metylowe jest określany wzorem:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

gdzie:

Wyniki podaje się z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

6.   SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi określać metody zastosowane do przygotowania estrów metylowych i do analizy za pomocą chromatografii gazowej. Musi także ujmować wszystkie dane operacyjne niesprecyzowane w niniejszej metodzie normatywnej lub uznane za fakultatywne, łącznie z danymi dotyczącymi incydentów, które mogły wpłynąć na wyniki.

W sprawozdaniu z badania podaje się wszystkie informacje konieczne do pełnej identyfikacji próbki.

7.   PRECYZJA

7.1.    Wyniki badania międzylaboratoryjnego

Szczegółowe dane odnośnie do badania międzylaboratoryjnego dotyczącego precyzji metody podano w załączniku C do normy IOC/T.20/Doc. No 33. Wartości uzyskane w tym badaniu międzylaboratoryjnym nie mogą mieć zastosowania do zakresów stężeń i matryc innych niż podane.

7.2.    Powtarzalność

Różnica bezwzględna między dwoma niezależnymi wynikami oddzielnych badań uzyskanymi przy użyciu tej samej metody i materiału badanego, w tym samym laboratorium, przez tego samego operatora, na tym samym sprzęcie i w zbliżonym czasie, nie może być w więcej niż 5 % przypadków większa od „r” podanego w tabelach 1–14 w załączniku C do normy IOC/T.20/Doc. No 33.

7.3.    Odtwarzalność

Różnica bezwzględna między dwoma wynikami oddzielnych badań uzyskanymi przy użyciu tej samej metody i materiału badanego, w różnych laboratoriach, przez różnych operatorów korzystających z różnego sprzętu, nie może być w więcej niż 5 % przypadków większa od „R” podanego w tabelach 1–14 w załączniku C do normy IOC/T.20/Doc. No 33.

---

Dodatek A

Rysunek 1

ω0,5 – szerokość w połowie wysokości trójkąta (ABC) i b – szerokość w połowie wysokości trójkąta (NPM).

---

Dodatek B

Rysunek 1

Chromatogram gazowy otrzymany po metylacji na zimno z oliwy z wytłoczyn z oliwek

Piki chromatograficzne odpowiadają estrom metylowym i etylowym, o ile nie wskazano inaczej.

▼B

---

ZAŁĄCZNIK XI

OZNACZANIE LOTNYCH FLUOROWCOWANYCH ROZPUSZCZALNIKÓW OLIWY Z OLIWEK

1.   METODA

Analiza metodą chromatografii gazowej przeprowadzana techniką Analizy fazy gazowej nad roztworem.

2.   SPRZĘT

2.1.	Chromatograf gazowy wyposażony w detektor wychwytu elektronów (ecd).

2.2.	Aparatura do analizy fazy gazowej nad roztworem.

2.3.	Szklana kolumna chromatograficzna do chromatografii gazowej o wysokości 2 m i średnicy 2 mm, faza nieruchoma. OV101 do 10 % lub równoważnik, nasycający ziemię okrzemkową, przepłukaną kwasami i potraktowaną krzemometanem, o uziarnieniu odpowiadającym sitom 80-100.

2.4.	Gaz nośny i gaz pomocniczy: azot do chromatografii gazowej odpowiedni do wykrywania metodą wychwytywania elektronów.

2.5.	Kolby szklane o wielkości 10-15 ml z wykładziną teflonową i korkiem aluminiowym wyposażonym w system pozwalający pobierać zawartość za pomocą strzykawki.

2.6.	Szczypce z hermetycznym zamknięciem.

2.7.	Strzykawka do gazu o pojemności 0,5 lub 2 mm.

3.   ODCZYNNIKI

Standard: lotne rozpuszczalniki chlorowcowane charakteryzujące się stopniem czystości kwalifikującym je do chromatografii gazowej.

4.   PROCEDURA

4.1.

Odważy dokładnie 3 g oliwy w szklanej kolbie (jednorazowego użytku), zamknąć kolbę hermetycznie. Umieścić kolbę w termostacie na okres jednej godziny w temperaturze 70 °C. Pobrać dokładnie za pomocą strzykawki 0,2-0,5 ml fazy gazowej znad roztworu i wprowadzić do kolumny aparatu chromatograficznego do chromatografii gazowej wyregulowanego w następujący sposób: — temperatura iniektora: 150 °C, — temperatura kolumny: 70-80 oC — temperatura detektora: 200-250 oC Inne temperatury mogą być również stosowane pod warunkiem, że wyniki pozostaną równoważne.

4.2.	Roztwory wzorcowe: przygotować roztwory mianowane stosując rafinowaną oliwę z oliwek bez śladu rozpuszczalników, o stężeniach wahających się 0,05-1 ppm (mg/kg) i odpowiadających przewidywanej zawartości próbki. Ewentualne rozcieńczanie należy prowadzić za pomocą pentanu.

4.3.

Ocena ilościowa: powiązać powierzchnie lub wysokości wykresu dla największych wartości próbki i roztworu mianowanego o najbardziej zbliżonym zakładanym stężeniu. Jeżeli względna rozbieżność przekracza 10 % analiza wymaga powtarzania w porównaniu z innym roztworem mianowanym dopóki jego stężenie nie będzie się mieściło we wspomnianych granicach. Zawartość jest ustalona na podstawie średniej podstawowych wtrysków.

4.4.	Przedstawienie wyników: w mg/kg (ppm). Granica wykrywalności metody wynosi 0,01 mg/kg.

▼M26

---

ZAŁĄCZNIK XII

METODA MIĘDZYNARODOWEJ RADY DS. OLIWY SŁUŻĄCA DO ORGANOLEPTYCZNEJ OCENY OLIWY Z OLIWEK Z PIERWSZEGO TŁOCZENIA

▼M28

1.   CEL I ZAKRES

Celem międzynarodowej metody opisanej w niniejszym załączniku jest określenie procedury oceny organoleptycznych cech charakterystycznych oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia w rozumieniu pkt 1 w części VIII załącznika VII do rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1308/2013 ( 4 ) oraz ustanowienie metody jej klasyfikacji w oparciu o wspomniane cechy charakterystyczne. Metoda ta zawiera również wskazania w zakresie nieobowiązkowego etykietowania.

Opisywana metoda ma zastosowanie jedynie do oliw z oliwek z pierwszego tłoczenia oraz do klasyfikacji lub etykietowania takich rodzajów oliwy, uwzględniając intensywność dostrzeżonych wad oraz owocowości, określaną przez grupę wybranych, przeszkolonych i nadzorowanych degustatorów tworzących zespół.

Normy IOC wymienione w niniejszym załączniku stosowane są w ich najnowszej dostępnej wersji.

▼M26

2.   OGÓLNE SŁOWNICTWO PODSTAWOWE STOSOWANE DO CELÓW ANALIZY SENSORYCZNEJ

W celu uzyskania szczegółów zob. norma IOC/T.20/Doc. No 4 „Sensory Analysis: General Basic Vocabulary”.

3.   SŁOWNICTWO SPECJALNE

3.1.    Cechy negatywne

▼M28

3.1.1.    Pozostałe cechy negatywne

3.2.    Cechy pozytywne

▼M29

3.3.    Nieobowiązkowa terminologia stosowana do celów etykietowania

Na żądanie kierownik zespołu degustatorów może potwierdzić, że oceniane oliwy są zgodne z definicjami i przedziałami odpowiadającymi wyłącznie następującym określeniom, w zależności od stopnia intensywności i percepcji cech oliwy.

Cechy pozytywne (owocowy, gorzki i ostry): W odniesieniu do intensywności percepcji:

Owocowy

charakterystyczny dla oliwy ogół doznań węchowych, zależnych od odmiany oliwek, właściwych dla oliwy z oliwek uzyskanej ze zdrowych i świeżych oliwek, niezdominowanej zapachem ani zielonych, ani dojrzałych oliwek. Doznania te odbierane są bezpośrednio lub poprzez jamę nosowo-gardłową.

Owocowy niedojrzały

charakterystyczny dla oliwy ogół doznań węchowych przypominających zapach niedojrzałych owoców, zależnych od odmiany oliwek i właściwych dla oliwy z oliwek uzyskanej z zielonych, zdrowych i świeżych oliwek. Doznania te odbierane są bezpośrednio lub poprzez jamę nosowo-gardłową.

Owocowy dojrzały

charakterystyczny dla oliwy ogół doznań węchowych przypominających zapach dojrzałych owoców, zależnych od odmiany oliwek, właściwych dla oliwy z oliwek uzyskanej ze zdrowych i świeżych oliwek. Doznania te odbierane są bezpośrednio lub poprzez jamę nosowo-gardłową.

Oliwa zrównoważona

oliwa, która nie wykazuje braku równowagi, co oznacza wrażenie węchowo-smakowe i dotykowe, w którym mediana goryczy i mediana ostrego smaku są co najwyżej o dwa punkty wyższe od mediany owocowego smaku/zapachu.

Oliwa łagodna

oliwa, w odniesieniu do której mediana goryczy i ostrego smaku jest niższa lub równa 2.

Wykaz określeń w odniesieniu do intensywności percepcji:

▼M26

4.   POJEMNIK SZKLANY PRZEZNACZONY DO DEGUSTACJI OLIWY

W celu uzyskania szczegółów zob. norma IOC/T.20/Doc. No 5 „Glass for Oil Tasting”.

5.   POMIESZCZENIE DO BADANIA

W celu uzyskania szczegółów zob. norma IOC/T.20/Doc. No 6 „Guide for the Installation of a Test Room”.

6.   WYPOSAŻENIE

W każdej kabinie należy zapewnić następujące wyposażenie, niezbędne dla degustatorów, aby mogli poprawnie wykonywać swoje zadanie, oraz łatwy dostęp do tego wyposażenia:

7.   KIEROWNIK ZESPOŁU I DEGUSTATORZY

7.1.    Kierownik zespołu

Kierownik zespołu musi być osobą starannie wyszkoloną, posiadającą szczegółową wiedzę na temat różnych rodzajów oliwy, jakie będą poddawane ocenie w trakcie pracy zespołu. Kierownik jest najważniejszą osobą w zespole i jest on odpowiedzialny za jego organizację i funkcjonowanie.

Praca kierownika zespołu wymaga podstawowego szkolenia w zakresie narzędzi analizy sensorycznej, umiejętności sensorycznych, skrupulatności w przygotowywaniu, organizacji i przeprowadzaniu badań oraz umiejętności i cierpliwości niezbędnych do planowania i wykonywania badań w sposób naukowy.

Kierownik zespołu jest jedyną osobą odpowiedzialną za wybór, szkolenie i nadzorowanie degustatorów celem ustalenia poziomu ich zdolności. Jest on zatem odpowiedzialny za ocenę degustatorów, która zawsze musi być obiektywna i w odniesieniu do której musi on opracować szczegółowe procedury oparte na badaniach oraz rzetelne kryteria przyjmowania i odrzucania. Zob. norma IOC/T.20/Doc. No 14 „Guide for the selection, training and monitoring of skilled virgin olive oil tasters”.

Kierownicy zespołu są odpowiedzialni za efektywność pracy zespołu, a co za tym idzie za jej ocenę, której rzetelny i obiektywny dowód muszą przedstawić. W każdym przypadku muszą zawsze wykazać, że metoda i degustatorzy znajdują się pod kontrolą. Zaleca się okresowe dobieranie zespołu (IOC/T.20/Doc. No 14, § 5).

Ponoszą oni ostateczną odpowiedzialność za prowadzenie rejestrów zespołu. Rejestry te muszą zawsze być identyfikowalne. Kierownicy muszą przestrzegać wymogów w zakresie zapewnienia jakości, określonych w międzynarodowych normach dotyczących analizy sensorycznej oraz w każdym przypadku gwarantować anonimowość próbek.

Są oni odpowiedzialni za inwentaryzację i zapewnienie dokładnego czyszczenia i konserwacji aparatury i sprzętu niezbędnych do przestrzegania specyfikacji tej metody oraz przechowują pisemne dowody potwierdzające to oraz dowody zgodności z wymogami dotyczącymi analizy.

Są odpowiedzialni za odbiór i przechowywanie próbek po ich dostarczeniu do laboratorium oraz za ich przechowywanie po przeprowadzeniu badania. W ten sposób kierownicy zapewniają każdorazowo anonimowość i odpowiednie przechowywanie próbek, przy czym do tego celu muszą opracować pisemne procedury, aby zapewnić identyfikowalność procesu i gwarancje jego prawidłowości.

Ponadto są odpowiedzialni za przygotowywanie, kodowanie i podawanie próbek degustatorom, zgodnie z odpowiednim doświadczalnie ustalonym schematem dostosowanym do wcześniej ustanowionych protokołów oraz za gromadzenie danych uzyskanych przez degustatorów i ich statystyczne przetwarzanie.

Kierownicy odpowiadają za opracowywanie i sporządzanie projektów pozostałych procedur, które mogą być konieczne dla uzupełnienia tej normy oraz zapewnienia poprawnego funkcjonowania zespołu.

Muszą poszukiwać sposobów porównywania wyników zespołu z wynikami otrzymywanymi przez inne zespoły zajmujące się analizą oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia w celu ustalenia, czy zespół funkcjonuje poprawnie.

Obowiązkiem kierownika zespołu jest motywowanie jego członków poprzez stymulowanie ich zainteresowania, ciekawości i atmosfery konkurencyjności między nimi. W związku z tym zdecydowanie zaleca się kierownikom, aby zapewniali sprawny przepływ informacji między sobą a członkami zespołu, informując ich o wszystkich wykonywanych przez nich zadaniach i otrzymywanych wynikach. Ponadto kierownicy dbają, aby ich opinia nie była znana i nie dopuszczają, aby ewentualni kierownicy narzucali swoje kryteria pozostałym degustatorom.

Kierownicy wzywają degustatorów z odpowiednim wyprzedzeniem i udzielają im odpowiedzi na wszelkie pytania dotyczące przeprowadzania oceny, ale powstrzymują się od sugerowania swoich opinii na temat próbek.

▼M28

7.1.1.    Zastępca kierownika zespołu

Kierownik zespołu degustatorów może, w uzasadnionych przypadkach, być zastępowany przez zastępcę kierownika zespołu, który może zastępować go w obowiązkach związanych z przeprowadzaniem badań. Zastępca musi mieć wszystkie niezbędne umiejętności wymagane od kierownika zespołu.

▼M28

7.2.    Degustatorzy

Osoby pełniące funkcje degustatorów w ocenie organoleptycznych właściwości oliwy z oliwek wykonują swoje zadania dobrowolnie. Zaleca się zatem kandydatom składanie wniosków w formie pisemnej. Kandydaci są wybierani, szkoleni i nadzorowani przez kierownika zespołu, z uwzględnieniem ich umiejętności w zakresie rozróżniania podobnych próbek; należy pamiętać, że ich dokładność ulegnie poprawie dzięki szkoleniom.

Degustatorzy muszą zachowywać się jak prawdziwi obserwatorzy sensoryczni, odkładając na bok swoje osobiste gusty i przedstawiając jedynie wrażenia, jakie odbierają. W związku z tym muszą zawsze pracować w ciszy, w sposób nierestrykcyjny i bez pośpiechu, w pełni skupiając swoją sensoryczną uwagę na poddawanej degustacji próbce.

Każde badanie wymaga obecności 8–12 degustatorów, warto jest jednak mieć kilku dodatkowych degustatorów w rezerwie, w razie potrzeby zastąpienia nieobecnych degustatorów.

▼M26

8.   WARUNKI BADANIA

8.1.    Prezentacja próbki

Próbki oliwy poddawanej analizie podaje się w standardowych szklankach do degustacji spełniających wymagania normy IOC/T.20/Doc. No 5 „Glass for oil tasting”.

Szklanka zawiera 14–16 ml oliwy lub, jeżeli szklanki mają być ważone, 12,8–14,6 g oliwy i jest zakryta szkłem zegarkowym.

Każda szklanka oznaczona jest kodem składającym się z cyfr lub kombinacji losowo wybranych liter i cyfr. Oznaczenia kodem dokonuje się za pomocą bezwonnego systemu.

8.2.    Badanie i temperatura próbek

Podczas badania próbki oliwy przeznaczone do degustacji przechowywane są w szklankach w temperaturze 28 °C ± 2 °C. Temperaturę taką wybrano, ponieważ obserwowanie różnic organoleptycznych w tej temperaturze jest łatwiejsze niż w temperaturze otoczenia i ponieważ w niższych temperaturach związki aromatyczne charakterystyczne dla tych rodzajów oliwy są słabo uwalniane, natomiast wyższe temperatury prowadzą do powstawania substancji lotnych, charakterystycznych dla ogrzewanych olejów. W celu uzyskania informacji na temat metody, którą należy stosować do ogrzewania próbek w szklankach, zob. norma IOC/T.20/Doc. No 5 „Glass for Oil Tasting”.

Temperatura w pomieszczeniu, w którym odbywa się badanie, musi wynosić 20–25 °C (zob. norma IOC/T.20/Doc. No 6).

8.3.    Czas badania

Najlepszą porą na przeprowadzanie degustacji oliwy są godzinny ranne. Udowodniono, że w ciągu dnia występują optymalne okresy percepcji zmysłu smaku i zapachu. Posiłki są poprzedzone okresem, w którym wrażliwość zapachowo-smakowa wzrasta, natomiast po posiłku percepcja ta maleje.

Kryterium to nie powinno jednak być traktowane w sposób absolutny, ponieważ uczucie głodu może rozpraszać degustatorów, wpływając niekorzystnie na ich zdolność dyskryminacyjną; zaleca się zatem, aby degustacje odbywały się między godziną 10:00 rano a 12:00 w południe.

8.4.    Degustatorzy: ogólne zasady postępowania

Poniższe zalecenia mają zastosowanie do postępowania degustatorów podczas ich pracy.

W przypadku wezwania przez kierownika zespołu do uczestniczenia w ocenie organoleptycznej, degustatorzy powinni być w stanie stawić się w uprzednio ustalonym terminie oraz powinni uwzględnić następujące zalecenia:

9.   PROCEDURA OCENY ORGANOLEPTYCZNEJ I KLASYFIKACJA OLIWY Z OLIWEK Z PIERWSZEGO TŁOCZENIA

9.1.    Metoda degustacji

▼M29

▼M26

9.2.    Korzystanie z formularza oceny przez degustatorów

Na rys. 1 w niniejszym załączniku przedstawiono wzór formularza oceny przeznaczonego do użytku przez degustatorów.

Każdy degustator wchodzący w skład zespołu musi powąchać oliwę będącą przedmiotem badania, a następnie dokonać jej degustacji ( 5 ). Następnie musi zaznaczyć na dziesięciocentymetrowej skali udostępnionego formularza intensywność wrażeń doznanych w odniesieniu do cech negatywnych i pozytywnych.

Jeżeli doznane przez degustatorów wrażenie odnosi się do cechy negatywnej niewymienionej w sekcji 4, podają to w rubryce „inne” przy użyciu terminu lub terminów opisujących te cechy z jak największą precyzją.

▼M28

9.3.    Wykorzystanie danych przez kierowników zespołu degustatorów

Kierownik zespołu zbiera formularze wypełnione przez każdego z degustatorów i dokonuje przeglądu stopni intensywności przypisanych do różnych cech. W przypadku stwierdzenia jakiejkolwiek nieprawidłowości kierownicy zwracają się do degustatora z prośbą o wprowadzanie poprawek w jego formularzu oceny oraz, w razie potrzeby, o powtórzenie badania.

Kierownik zespołu wprowadza dane z oceny dostarczone przez każdego z degustatorów do programu komputerowego, takiego jak program przewidziany w normie (IOC/T.20/Doc. No 15) w celu statystycznego obliczenia wyników analizy w oparciu o obliczenie median tych wyników. Zob. pkt 9.4 i dodatek do niniejszego załącznika. Wprowadzenie danych dotyczących jednej próbki odbywa się przy pomocy matrycy składającej się z 9 kolumn odpowiadających 9 cechom sensorycznym i n linijek odpowiadających liczbie n członków zespołu.

Jeżeli co najmniej 50 % członków zespołu odbierze daną cechę negatywną i odnotuje ją w rubryce „inne”, kierownik zespołu oblicza medianę takiej wady i otrzymuje odpowiednią klasyfikację.

Wartość odpornego współczynnika zmienności określającego klasyfikację (wada, której cechą jest największa intensywność, i owocowy charakter) musi być niższa lub równa 20 %.

W przeciwnym wypadku kierownik zespołu musi powtórzyć ocenę danej próbki, przeprowadzając drugą degustację.

W przypadku częstego występowania takiej sytuacji zaleca się, aby kierownik zespołu przeprowadził wśród degustatorów dodatkowe szczegółowe szkolenie (IOC/T.20/Doc. No 14, § 5) oraz aby skorzystał ze wskaźnika powtarzalności i wskaźnika odchyleń w celu sprawdzenia efektywności zespołu (IOC/T.20/Doc. No 14, § 6).

▼M29

9.4.    Klasyfikacja oliwy

Oliwa klasyfikowana jest zgodnie z wymienionymi poniżej kategoriami, w zależności od mediany wad i mediany charakteru owocowego. Medianę wad określa się jako medianę wady odebranej z największą intensywnością. Mediana wad i mediana charakteru owocowego przedstawiane są z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

Klasyfikacji oliwy dokonuje się poprzez porównanie wartości mediany wad i mediany charakteru owocowego z przedstawionymi poniżej przedziałami odniesienia. Ponieważ przy ustalaniu poziomów przedziałów uwzględniono błąd metody, uznaje się, iż poziomy te są ostateczne. Pakiety oprogramowania umożliwiają przedstawienie klasyfikacji w formie tabeli danych statystycznych lub w formie wykresu.

▼M29

9.5.    Kryteria przyjmowania i odrzucania podwójnych oznaczeń

Zdefiniowany poniżej błąd znormalizowany należy wykorzystywać w celu ustalenia, czy dwa wyniki wykonanej dwa razy analizy są statystycznie jednorodne lub dopuszczalne:

Gdzie Me1 i Me2 to mediany otrzymane w wyniku dwóch analiz (odpowiednio pierwszej i drugiej) a U1 i U2 to niepewności rozszerzone uzyskane dla tych dwóch wartości, obliczone w sposób następujący, zgodnie z dodatkiem:

U 1 = c × s* and

Dla niepewności rozszerzonej, c = 1,96; stąd

U1 = 0,0196 × CVr × Me1

gdzie CVr jest odpornym współczynnikiem zmienności.

Aby można było stwierdzić, że dwie otrzymane wartości nie różnią się pod względem statystycznym, En nie może być większe od 1,0.

▼M26

---

Dodatek

Metoda obliczania mediany i przedziałów ufności

Mediana

Medianę określa się jako liczbę rzeczywistą Xm, scharakteryzowaną w ten sposób, że prawdopodobieństwo (p) przyjęcia przez zmienną losową o rozkładzie (X) wartości poniżej tej liczby (Xm) jest mniejsze lub równe 0,5 i jednocześnie prawdopodobieństwo (p) przyjęcia przez zmienną losową o rozkładzie (X) wartości mniejszej lub równej Xm jest równe lub większe niż 0,5. Bardziej praktyczna definicja określa medianę jako 50. percentyl rozkładu zestawu liczb uszeregowanych w porządku rosnącym. Ujmując prościej, mediana określa wartość środkową w uporządkowanym zbiorze liczb o nieparzystej ilości elementów lub wartość średnią dwóch wartości środkowych w uporządkowanym zbiorze liczb o parzystej ilości elementów.

Odporne odchylenie standardowe

Aby uzyskać wiarygodne oszacowanie zmienności wokół mediany, należy zastosować metodę szacowania odpornego odchylenia standardowego Stuarta i Kendalla (4). Przedstawiony poniżej wzór wskazuje asymptotyczne odchylenie standardowe, tj. odporną wartość szacunkową zmienności rozważanych danych, gdzie N jest liczbą obserwacji, a IQR przedziałem międzykwartylowym, który pokrywa dokładnie 50 % przypadków losowania z danego rozkładu prawdopodobieństwa:

Przedział międzykwartylowy oblicza się jako wielkość różnicy pomiędzy 75. a 25. percentylem.

gdzie percentyl to wartość Xpc określona w taki sposób, że prawdopodobieństwo (p) przyjęcia przez zmienną losową wartości poniżej Xpc jest nie większe niż określona setna część i jednocześnie prawdopodobieństwo (p) przyjęcia przez zmienną losową wartości niższej lub równej Xpc jest większe lub równe danej setnej części. Setna określa przyjęty stopień rozkładu. W przypadku mediany jest to 50/100.

Ze względów praktycznych percentyl jest wartością rozkładu odpowiadającą określonej powierzchni pod wykresem rozkładu lub jego funkcji gęstości. Na przykład 25. percentyl reprezentuje wartość rozkładu odpowiadającą polu równemu 0,25 lub 25/100.

W tej metodzie percentyle obliczane są na podstawie wartości rzeczywistych, które znajdują się w macierzy danych (procedura obliczania percentyli).

Odporny współczynnik zmienności (%)

Odporny współczynnik zmienności CVr% odpowiada wielkości niemianowanej, która wskazuje procentową zmienność zbioru analizowanych liczb. Z tego powodu jest wielkością bardzo użyteczną przy sprawdzaniu wiarygodności oceniających będących członkami zespołu.

Przedziały ufności mediany na poziomie 95 %

Przedziały ufności na poziomie 95 % (wartość błędu pierwszego rodzaju równa jest 0,05 lub 5 %) odpowiadają zakresowi, w którym wartość mediany mogłaby się zmieniać, gdyby było możliwe powtarzanie doświadczenia nieskończoną liczbę razy. W praktyce oznacza to zakres zmienności testu w przyjętych warunkach operacyjnych, wychodząc z założenia, że możliwe jest wielokrotne powtarzanie oceny. Przedział ufności pomaga ocenić wiarygodność oceny, tak jak w przypadku odpornego współczynnika zmienności.

gdzie C = 1,96, w przypadku przedziału ufności na poziomie 95 %.

Przykład zestawienia obliczeń przedstawiono w załączniku I do normy IOC/T 20/Doc. No 15.

Źródła

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

ZAŁĄCZNIK XV

ZAWARTOŚĆ OLEJU W POZOSTALOŚCI Z OLIWEK

1.   ZAWARTOŚĆ OLIWY W WYTŁOCZKACH OLIWKOWYCH

1.1.   Aparatura

1.2.   Odczynnik

Normalny heksan, czystości technicznej, po którym zostaje mniej niż 0,002 g pozostałości na 100 ml po pełnym odparowaniu.

2.   PROCEDURA

2.1.   Przygotowanie próbki do badania

W razie potrzeby wykorzystać młynek mechaniczny, który został uprzednio odpowiednio oczyszczony, do zmielenia próbki laboratoryjnej w celu rozdrobnienia jej do cząstek, które mogą całkowicie przejść przez sito.

Wykorzystać około jednej dwudziestej próbki, aby dokończyć proces czyszczenia młynka, odrzucić zmielony materiał, zemleć pozostałość i zebrać ją, starannie wymieszać i niezwłocznie poddać analizie.

2.2.   Badana porcja

Natychmiast po zakończeniu operacji mielenia odważyć około 10 g próbki do zbadania z dokładnością do 0,01 g.

2.3.   Przygotowanie gilzy do ekstrakcji

Umieścić porcję badaną w gilzie i zatkać tę ostatnią bawełną. W razie stosowania bibuły filtracyjnej owinąć nią porcję badaną.

2.4.   Wstępne suszenie

W przypadku, gdy wytłoczki oliwkowe są bardzo wilgotne (tj. ilość zawartej w nich wilgoci i substancji lotnych przekracza 10 %), przeprowadzić wstępne suszenie przez umieszczenie napełnionej gilzy do ekstrakcji (lub bibuły filtracyjnej) w piecu podgrzewanym przez odpowiedni czas do nie więcej niż 80 °C w celu zmniejszenia zawartości wilgoci i substancji lotnych do mniej niż 10 %.

2.5.   Przygotowanie kolby stożkowej z okrągłym dnem

Odważyć z dokładnością do 1 mg kolbę stożkową zawierającą jedną lub dwie cząstki pumeksu, wcześniej wysuszoną w piecu w temperaturze 103 ± 2 °C i schłodzoną w suszarce laboratoryjnej przez nie mniej niż jedną godzinę.

2.6.   Wstępna ekstrakcja

Do aparatury ekstrakcyjnej wprowadzić gilzę (lub bibułę filtracyjną) zawierającą porcję badaną. Wlać do kolby stożkowej wymaganą ilość heksanu. Podłączyć kolbę do aparatury ekstrakcyjnej i umieścić całość na elektrycznie podgrzewanej łaźni. Wyregulować szybkość podgrzewania w taki sposób, aby szybkość odcieku nie była niższa od trzech kropli na sekundę (umiarkowane, nie gwałtowne podgrzewanie). Po ekstrakcji przez cztery godziny pozostawić całość do schłodzenia. Usunąć gilzę z aparatury ekstrakcyjnej i umieścić ją w strumieniu powietrza, aby odprowadzić większość impregnującego rozpuszczalnika.

2.7.   Druga ekstrakcja

Wsypać zawartość gilzy do mikromłynka i zemleć jak najdrobniej. Zwrócić zmieloną mieszaninę do gilzy bez straty i umieścić ją z powrotem w aparaturze ekstrakcyjnej.

Kontynuować ekstrakcję przez następne dwie godziny przy użyciu tej samej okrągłodennej kolby stożkowej zawierającej wstępny ekstrakt.

Roztwór powstały w kolbie ekstrakcyjnej musi się sklarować. Jeżeli tak się nie stanie, należy go kilka razy przefiltrować przez bibułę filtracyjną i kilka razy wymyć pierwotną kolbę i bibułę filtracyjną kilka razy przy pomocy heksanu. Zebrać filtrat i rozpuszczalnik zastosowany do przemywania do drugiej okrągłodennej kolby stożkowej, która została uprzednio wysuszona i wytarowana z dokładnością do 1 mg.

2.8.   Usunięcie rozpuszczalnika i odważenie ekstraktu

Usunąć większą część rozpuszczalnika przez destylację na elektrycznie podgrzewanej łaźni. Usunąć ostatnie ślady rozpuszczalnika przez podgrzewanie kolby stożkowej w piecu w temperaturze 103 ± 2 °C przez 20 minut. Pomóc procesowi eliminacji przez wdmuchiwanie w pewnych odstępach czasu albo powietrza albo — w najkorzystniejszej sytuacji — gazu obojętnego, bądź też przy użyciu obniżonego ciśnienia.

Pozostawić kolbę stożkową w suszarce laboratoryjnej do schłodzenia, przez co najmniej jedną godzinę i zważyć z dokładnością do 1 mg.

Ponownie podgrzewać przez 10 minut na takich samych zasadach, schłodzić w suszarce laboratoryjnej i zważyć jeszcze raz.

Różnica między dwoma ważeniami nie może przekroczyć 10 mg. W razie takiego przekroczenia podgrzewać substancję ponownie przez okresy do 10 minut, po czym należy ją schłodzić i zważyć do uzyskania różnicy masy 10 mg lub mniejszej. Odnotować ostatnią masę kolby stożkowej.

Przeprowadzić dwa oznaczenia próbki badanej.

3.   PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

3.1.   Metoda obliczeń i wzór

3.2.   Powtarzalność

Różnica między dwoma oznaczeniami wykonanymi równocześnie lub szybko jedno po drugim przez tego samego analityka nie może przekraczać 0,2 g ekstraktu heksanu na 100 g próbki.

W razie niespełnienia tego warunku powtórzyć analizę na dwóch innych porcjach badanych. Jeżeli także w tym przypadku różnica przekracza 0,2 g, przyjąć wynik jako średnią arytmetyczną z czterech wykonanych oznaczeń.

---

ZAŁĄCZNIK XVI

OZNACZENIE LICZBY JODOWEJ

1.   ZAKRES

Niniejsza norma międzynarodowa określa metodę oznaczania liczby jodowej tłuszczów i olejów zwierzęcych i roślinnych, zwanych dalej tłuszczami.

2.   DEFINICJA

Do celów niniejszej normy międzynarodowej ma zastosowanie następująca definicja:

2.1.	liczba jodowa Masa jodu wchłonięta przez próbkę, w warunkach postępowania określonych w niniejszej normie międzynarodowej. Liczbę jodową wyraża się jako liczbę gramów jodu na 100 g próbki.

3.   ZASADA

Rozpuszczanie porcji badanej w rozpuszczalniku i dodanie odczynnika Wijsa. Po określonym czasie dodanie roztworu jodku potasu i wody oraz miareczkowanie uwolnionego jodu przy użyciu roztworu tiosiarczanu sodu.

4.   ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej czystości do analiz:

4.1.	woda spełniająca wymagania normy ISO 3696, stopień 3.

4.2.	jodek potasu, roztwór 100 g/l, niezawierający jodanu ani wolnego jodu.

4.3.	skrobia, roztwór. Zmieszać 5 g skrobi rozpuszczalnej z 30 ml wody, dodać tę mieszaninę do 1 000 ml wrzącej wody, gotować przez trzy minuty i odstawić do schłodzenia.

4.4.	tiosiarczan sodu, mianowany roztwór objętościowy c (Na2S2O3 · 5H2O) = 0,1 mol/l, standaryzowany nie wcześniej niż siedem dni przed użyciem.

4.5.	rozpuszczalnik, przygotowany przez zmieszanie równych ilości cykloheksanu i kwasu octowego.

4.6.	odczynnik Wijsa, zawierający monochlorek jodu w kwasie octowym. Należy zastosować odczynnik Wijsa dostępny w handlu.

5.   APARATURA

Zwykła aparatura laboratoryjna, w szczególności następująca:

5.1.	szklane szufelki do odważania substancji, nadające się do pobrania porcji badanej i wprowadzenia jej do kolb (6.2).

5.2.	kolby stożkowe, o pojemności 500 ml, wyposażone w szlifowane korki szklane i całkowicie suche.

6.   PRZYGOTOWANIE PRÓBKI BADANEJ

Homogenizowaną próbkę suszy się nad siarczanem sodowym i filtruje.

7.   PROCEDURA

7.1.

Porcja badana Masa porcji badanej zmienia się w zależności od spodziewanej liczby jodowej, jak przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1 Oczekiwana liczba jodowa Masa badanej próbki poniżej 5 3,00 5 do 20 1,00 21 do 50 0,40 51 do 100 0,20 101 to 150 0,13 151 do 200 0,10 Badaną próbkę należy odważyć z dokładnością do 0,1 mg na szklanej szalce (5.1).

7.2.

Oznaczanie Badaną próbkę umieścić w kolbie o pojemności 500 ml (6.2). Dodać 20 ml rozpuszczalnika (4.5), w celu rozpuszczenia tłuszczu. Dodać dokładnie 25 ml odczynnika Wijs’a (4.6), zakorkować, zawartość zawirować i umieścić kolbę w ciemni. Do odczynnika Wijs’a nie wolno używać pipety doustnej. Podobnie należy przygotować ślepą próbę z rozpuszczalnikiem i odczynnikiem, lecz z pominięciem badanej próbki. W przypadku próbek o liczbie jodowej poniżej 150, kolby należy pozostawić na godzinę w ciemni; próbki o liczbie jodowej powyżej 150 oraz produkty poddane polimeryzacji lub utlenione w znacznym stopniu należy pozostawić na dwie godziny. Pod koniec określonego czasu, do każdej kolby należy dodać 20 ml roztworu jodku potasu (4.2) oraz 150 ml wody (4.1). Miareczkować przy pomocy standardowego roztworu pomiarowego tiosiarczanu sodu (4.4) aż do momentu, kiedy żółte zabarwienie od jodyny stanie się prawie niewidoczne. Dodać kilka kropli roztworu skrobiowego (4.3) i kontynuować miareczkowanie do chwili, w której niebieskie zabarwienie zniknie po bardzo energicznym wstrząśnięciu. Uwaga: Dopuszczalne jest oznaczanie potencjometryczne punktu końcowego.

7.3.	Liczba oznaczeń Jedną próbkę analityczną oznacza się dwukrotnie.

8.   Wyrażanie wyników

Liczbę jodową podaje się za pomocą wzoru

gdzie:

c

=

wartość liczbowa dokładnego stężenia użytego standardowego roztworu pomiarowego tiosiarczanu sodu (4.4), wyrażona w molach na litr;

V1

=

wartość liczbowa objętości standardowego roztworu pomiarowego tiosiarczanu sodu (4.4) użytego do ślepej próby, wyrażona w mililitrach;

V2

=

wartość liczbowa objętości standardowego roztworu pomiarowego tiosiarczanu sodu (4.4) użytego do oznaczenia, wyrażona w mililitrach;

m

=

wartość liczbowa masy badanej próbki (7.1), wyrażona w gramach.

Wynik będzie średnią arytmetyczną z dwóch oznaczeń, pod warunkiem spełnienia wymogu w zakresie powtarzalności (9.2).

▼M11

---

ZAŁĄCZNIK XVII

METODA OZNACZANIA STIGMASTADIENÓW W OLEJACH ROŚLINNYCH

1.   CEL

oznaczanie stigmastadienów w olejach roślinnych o niskim stężeniu tych węglowodorów, w szczególności w oliwie z oliwek pierwszego tłoczenia i surowej oliwie z wytłoczyn oliwek.

2.   ZAKRES

norma może być stosowana do wszystkich olejów roślinnych, chociaż wyniki pomiarów są pewne tylko przy zawartości tych węglowodorów między 0.01 i 4.0 mg/kg. Metoda ta jest szczególnie przydatna do wykrywania obecności rafinowanych olejów roślinnych (z oliwek, wytłoczyn oliwek, słonecznika, palmy itd.) w oliwie z oliwek pierwszego tłoczenia, ponieważ oleje rafinowane zawierają stigmastadieny, a oliwy z pierwszego tłoczenia ich nie zawierają.

3.   ZASADA

wyodrębnienie substancji niezmydlających się. Oddzielenie steroidowej frakcji węglowodorowej przez chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym i analiza przez kapilarną chromatografię gazową.

4.   APARATURA

4.1.	Kolby 250 ml nadające się do użycia z chłodnicą zwrotną.

4.2.	Rozdzielacze o pojemności 200 ml.

4.3.	100 ml kolby okrągłodenne.

4.4.	Wyparka obrotowa.

4.5.

Szklana kolumna chromatograficzna (o średnicy wewnętrznej 1,5 do 2 cm na 50 cm długości) z teflonowym gwintownikiem oraz zatyczką z waty szklanej lub krążkiem ze spiekanego szkła na dnie. W celu przygotowania kolumny z żelu krzemionkowego wlać heksan do kolumny chromatograficznej na wysokość około 5 cm, a następnie wypełnić zawiesiną żelu krzemionkowego w heksanie (15 g w 40 ml) za pomocą heksanu podzielonego na części. Odstawić do opadnięcia i zakończyć osadzanie, stosując lekkie drgania. Dodać bezwodny siarczan sodowy do wysokości około 0,5 cm, na koniec wymyć nadmiar heksanu.

4.6.	Chromatograf gazowy z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym, nastrzyk z dzieleniem strumienia lub zimny nakolumnowy wtryskiwacz i piec programowalny z dokładnością do ± 1 C.

4.7.	Kolumna kapilarna ze stopionej krzemionki do chromatografii gazowej (o średnicy wewnętrznej 0,25 lub 0,32 mm na 25 cm długości pokryta 5 %-fenylometylosilikonową fazą, o grubości filmu 0,25 mm. Uwaga 1: Można użyć innych kolumn o podobnej lub niższej biegunowości.

4.8.	Integrator-rejestrator z trybem integracji dolina-dolina.

4.9.	5-10 μl mikrostrzykawka do chromatografii gazowej z umocowaną na stałe igłą.

4.10.

Elektryczny płaszcz grzejny lub gorące miejsce.

5.   ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki muszą być jakości analitycznej, chyba że określono inaczej. Używana woda musi być wodą destylowaną lub wodą o porównywalnym stopniu czystości.

5.1.	Heksan lub mieszanina alkanów o przedziale temperatury wrzenia 65 do 70 °C, destylowana w kolumnie rektyfikacyjnej. Uwaga 2: Rozpuszczalnik musi być przedestylowany w celu usunięcia zanieczyszczeń.

5.2.	96 % (procent objętościowy) alkoholu etylowego.

5.3.	Bezwodny siarczan sodu.

5.4.

10-procentowy alkoholowy roztwór wodorotlenku potasu. Dodać 10 ml wody do 50 g wodorotlenku potasu, wymieszać, a następnie rozpuścić mieszankę w etanolu do 500 ml. Uwaga 3: Alkoholowy potaż brązowieje przy przechowywaniu. Powinien być przygotowywany świeży każdego dnia i trzymany w dobrze zakorkowanych butelkach z ciemnego szkła.

5.5.

Żel krzemionkowy 60 do chromatografii kolumnowej, siatka 70 do 230 (Merck, nr referencyjny 7734 lub podobny). Uwaga 4: Zazwyczaj można używać żelu krzemionkowego prosto z pojemnika bez żadnej obróbki. Jednakże niektóre partie żelu krzemionkowego mogą wykazywać niską aktywność, która daje w rezultacie złe wyniki oddzielania chromatograficznego. W takich okolicznościach należy postąpić w następujący sposób: Aktywować żel krzemionkowy podgrzewając go, przez co najmniej cztery godziny w temp. 550 C. Po podgrzaniu umieścić żel krzemionkowy w eksykatorze na czas stygnięcia, a potem przenieść go do zakorkowanej kolby. Dodać 2 % wody i potrząsać, dopóki wszystkie grudki nie zostaną rozbite, a proszek będzie swobodnie pływał. Jeżeli któraś partia żelu krzemionkowego daje chromatogramy o interferujących pikach, należy z nim postąpić jak wyżej. Alternatywą może być użycie żelu krzemionkowego 60 o wyjątkowym stopniu czystości (Merck, nr 7754).

5.6.	Roztwór podstawowy (200 części na milion, ang. ppm) cholesta-3,5-dienu (Sigma, czystość 99 %) w heksanie (10 mg w 50 ml).

5.7.	Roztwór mianowany heksanu cholesta-3,5-dienu w stężeniu 20 części na milion (ppm), otrzymanym przez rozcieńczenie powyższego roztworu. Uwaga 5: Roztwory 5.6 i 5.7 są trwałe przez okres czterech miesięcy, jeżeli przechowuje się je w temperaturze niższej niż 4 ° C.

5.8.	Roztwór n-nonakozanu w heksanie w stężeniu około 100 części na milion.

5.9.	Gaz nośny do chromatografii: hel lub wodór o 99,9990 % czystości.

5.10.

Gazy pomocnicze do detektora płomieniowo-jonizacyjnego: wodór o 99,9990 % czystości i oczyszczone powietrze.

6.   PROCEDURA

6.1.   Przygotowanie substancji niezmydlającej się

6.1.1.

Odważyć 20 ± 0.1 g oliwy do 250-ml kolby (4.1), dodać 1 ml roztworu podstawowego cholesta-3,5-dienu (20 μg) i 75 ml 10-procentowego alkoholowego potażu, dopasować chłodnicę zwrotną, i podgrzewać do lekkiego wrzenia przez 30 minut. Zdjąć kolbę z próbką z ognia i odstawić, żeby nieco ostygła (nie wolno dopuścić do zupełnego ostygnięcia, ponieważ próbka zestali się). Dodać 100 ml wody i przenieść roztwór do rozdzielacza (4.2) przy pomocy 100 ml heksanu. Wstrząsać mieszaninę energicznie przez 30 sekund i odstawić do oddzielenia. Uwaga 6: Jeśli powstanie zawiesina, która nie zniknie w szybkim czasie, dodać małe ilości alkoholu etylowego.

6.1.2.

Przenieść fazę wodną do drugiego rozdzielacza i ponownie ekstrahować za pomocą 100 ml heksanu. Jeszcze raz zlać niższą fazę i wymyć ekstrakty heksanu (połączone w kolejnym rozdzielaczu) trzy razy używając 100 ml mieszaniny etanol-woda (1:1) za każdym razem, dopóki pH nie stanie się obojętne.

6.1.3.

Przepuścić roztwór heksanu przez bezwodny siarczan sodowy (50 g), wymyć 20 mililitrami heksanu i odparowywać w wyparce obrotowej w temperaturze 30 ° C pod zmniejszonym ciśnieniem aż do suchości.

6.2.   Oddzielenie sterydowej frakcji węglowodorowej

6.2.1.

Zebrać pozostałość do kolumny frakcjonującej przy pomocy dwóch 1-ml porcji heksanu, wprowadzić próbkę na kolumnę pozwalając, żeby poziom roztworu obniżył się do górnej powierzchni siarczanu sodowego i rozpocząć wymywanie chromatograficzne heksanem przy prędkości przepływu około 1 ml/min. Odrzucić pierwszych 25-30 ml eluatu, potem zebrać następnych 40 ml frakcji. Po zebraniu przenieść tę frakcję do 100-ml kolb okrągłodennych. Uwaga 7: Pierwsza frakcja zawiera węglowodory nasycone (rys 1a), a druga frakcja steroidowe. Dalsze wymywanie daje skwalen i pokrewne związki. W celu uzyskania dobrego oddzielenia węglowodorów nasyconych od steroidowych, niezbędna jest optymalizacja objętości frakcji. W tym celu należy dostosować objętość pierwszej frakcji tak, żeby przy analizowaniu drugiej frakcji piki reprezentujące węglowodory nasycone były niskie (patrz rys. 1c); jeżeli nie pojawiają się one, ale natężenie wzorcowego piku jest niskie, objętość powinna zostać zmniejszona. Zresztą całkowite oddzielenie komponentów pierwszej frakcji od drugiej nie jest potrzebne, ponieważ w czasie analizy przez chromatografię gazową piki nie nakładają się na siebie, jeżeli warunki chromatografii gazowej są takie, jak wskazano w ppkt 6.1.3. Optymalizacja objętości drugiej frakcji nie jest generalnie potrzebna, jako że istnieje dobra separacja z dalszymi składnikami. Niemniej jednak wystąpienie dużego piku przy około 1,5 minuty krótszym czasie retencji niż normalny jest spowodowane przez skwalen i jest oznaką złej separacji.

6.2.2.

Odparować drugą frakcję w wyparce obrotowej w temperaturze 30 ° C pod zmniejszonym ciśnieniem do suchości i natychmiast rozpuścić pozostałość w 0,2 ml heksanu. Przechowywać roztwór w lodówce do czasu analizy. Uwaga 8: Pozostałości ppkt 6.1.3 i 6.2.2 nie powinny być przechowywane na sucho i w temperaturze pokojowej. Zaraz po otrzymaniu należy dodać rozpuszczalnik, a roztwory przechowywać w lodówce

6.3.   Chromatografia gazowa

6.3.1.

Warunki pracy podzielonej iniekcji: — temperatura iniektora: 300 °C, — temperatura detektora: 320 °C, — integrator-rejestrator: parametry integracji powinny być ustalone tak, żeby oszacowanie pól było właściwe. Zalecany jest tryb integracji dolina-dolina. — czułość: około 16 razy większa od minimalnego tłumienia, — ilość wprowadzonego roztworu: 1 μl, — temperatury programowania pieca: na wstępie 235 °C przez sześć minut, potem zwiększanie o 2 °C na minutę do 285 °C, — iniektor z rozdzielaczem przepływu 1:15, — nośnik: hel lub wodór o ciśnieniu około 120 kPa. Warunki te muszą być dostosowane do właściwości chromatografu i kolumny, tak, żeby chromatogramy spełniały następujące wymagania: wewnętrzny pik standardowy w ciągu około pięciu minut od czasu podanego w ppkt 6.3.2., wewnętrzny pik standardowy powinien być w co najmniej 80 % pełnej skali. Układ chromatografii gazowej musi zostać sprawdzony przez wstrzyknięcie mieszanki podstawowego roztworu cholestadienu (5.6) i roztworu n-nonakozanu (5.8). Pik cholesta-3,5-dienu musi pojawić się przed pikiem n-nonakozanu (rys. 1c); jeżeli tak się nie dzieje, można podjąć dwa działania: zmniejszyć temperaturę pieca lub użyć mniej polarnej kolumny.

6.3.2.

Identyfikacja piku Wewnętrzny standardowy pik pojawia się w około 19 minucie, a 3,5-stigmastadien we względnym czasie retencji 1,29 (patrz rys. 1b). 3,5-stigmastadien pojawia się z małymi ilościami izomeru i zazwyczaj oba wymywają się razem jako pojedynczy pik chromatograficzny. Niemniej jednak, jeżeli kolumna jest zbyt polarna lub wykazuje dużą rozdzielczość, izomer może pojawić się jako mały pik przed pikiem stygmasta-3,5-dienu (rys. 2). Aby zagwarantować, że stigmastadieny będą eluowane jako jeden pik, należałoby kolumnę zastąpić kolumną albo mniej polarną albo kolumną o większej średnicy wewnętrznej. Uwaga 9: Stigmastadieny odniesienia mogą być otrzymane z analizy jakiegoś rafinowanego oliwy roślinnego przez użycie mniejszej ilości próbki (1 do 2 g). Stigmastadieny dają wystający i łatwo rozpoznawalny pik.

6.3.3.

Analiza ilościowa Zawartość stigmastadienów jest określana według wzoru: Dodaje się zał. XVII w brzmieniu: gdzie: As = pole piku stigmastadienów (jeżeli pik jest rozdzielony na dwa izomery, suma pól tych dwóch pików), Ac = pole wewnętrznego standardu (cholestadien), Mc = masa standardu dodanego, w mikrogramach, Mo = masa użytej oliwy, w gramach. Granica wykrycia: około 0,01 mg/kg.

Rysunek 1

Chromatogramy gazowe otrzymane z próbek oliwy z oliwek analizowanych na kapilarnej kolumnie ze stopionej krzemionki (o średnicy wewnętrznej 0.25 mm na 25 m długości) pokrytej 5 % fenylometylosilikonem, o grubości filmu 0,25 μm.

Rysunek 2

Chromatogram gazowy otrzymany z próbki rafinowanej oliwy z oliwek analizowanej w kolumnie DB-5, wykazujący obecność izomeru 3,5-stigmastadienu.

▼M25

---

ZAŁĄCZNIK XVIII

OZNACZENIE RÓŻNICY MIĘDZY RZECZYWISTĄ A TEORETYCZNĄ ZAWARTOŚCIĄ TRIGLICERYDÓW Z ECN 42

1.   ZAKRES

Oznaczenie różnicy bezwzględnej między wartościami doświadczalnymi triglicerydów (TAG) z równoważną liczbą atomów węgla 42 (ECN42HPLC) uzyskanymi poprzez oznaczenie ich zawartości w oliwie metodą wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC) a wartością teoretyczną TAG z równoważną liczbą atomów węgla 42 (ECN 42teoretyczny) obliczoną na podstawie składu kwasu tłuszczowego.

2.   DZIEDZINA ZASTOSOWANIA

Metoda ma zastosowanie do oliwy z oliwek. Metodę stosuje się do wykrywania obecności małych ilości olejów z nasion (zawierających dużo kwasu linolowego) we wszystkich klasach oliwy z oliwek.

3.   ZASADA

W przypadku czystej oliwy z oliwek zawartość triglicerydów z ECN 42 oznaczona metodą analizy HPLC oraz teoretyczna zawartość triglicerydów z ECN 42 (obliczona na podstawie oznaczenia składu kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowo-cieczowej (GLC)) są sobie równie w pewnych granicach. Różnice większe niż wartości przyjęte dla każdego rodzaju oliwy świadczą, że oliwa zawiera oleje z nasion.

4.   METODA

Metoda obliczania teoretycznej zawartości triglicerydów z ECN 42 oraz różnicy w stosunku do danych uzyskanych metodą HPLC polega w zasadzie na koordynacji danych analitycznych uzyskanych innymi metodami. Można wyróżnić trzy fazy: oznaczenie składu kwasów tłuszczowych metodą kapilarnej chromatografii gazowej, obliczenie teoretycznego składu triglicerydów z ECN 42, oznaczenie triglicerydów z ECN 42 metodą HPLC.

4.1.    Aparatura

4.1.1.

Kolby okrągłodenne o pojemności 250 i 500 ml.

4.1.2.

Zlewki 100 ml.

4.1.3.

Szklana kolumna chromatograficzna, o średnicy wewnętrznej 21 mm, długości 450 mm, z kranikiem i znormalizowanym szlifem górnym (żeńskim).

4.1.4.

Rozdzielacze, 250 ml, ze znormalizowanym szlifem dolnym (męskim), dopasowanym do połączenia z górą kolumny.

4.1.5.

Szklana pałeczka o długości 600 mm.

4.1.6.

Szklany lejek o średnicy 80 mm.

4.1.7.

Kolby miarowe, 50 ml.

4.1.8.

Kolby miarowe, 20 ml.

4.1.9.

Wyparka obrotowa.

4.1.10.

Wysokowydajny chromatograf cieczowy umożliwiający termostatyczną kontrolę temperatury kolumny.

4.1.11.

Zespoły iniekcyjne dla pojemności 10 μl.

4.1.12.

Detektor: refraktometr różnicowy. Czułość w pełnej skali powinna wynosić co najmniej 10–4 jednostek detekcji refraktometrycznej.

4.1.13.

Kolumna: rura ze stali nierdzewnej o długości 250 mm i wewnętrznej średnicy 4,5 mm, wypełniona cząsteczkami krzemionki o średnicy 5 μm zawierających 22-23 % węgla w postaci oktadecylosilanu.

4.1.14.

Oprogramowanie do przetwarzania danych.

4.1.15.

Fiolki, o objętości około 2 ml, z przegrodami z warstw teflonu i zakrętkami.

4.2.    Odczynniki

Odczynniki powinny charakteryzować się czystością analityczną. Rozpuszczalniki elucyjne należy odgazować i mogą one być ponownie użyte kilka razy bez wpływu na operacje oddzielania.

4.2.1.

Eter naftowy 40–60 °C o klasie czystości do chromatografii lub heksan.

4.2.2.

Eter etylowy, wolny od nadtlenków, świeżo destylowany.

4.2.3.

Rozpuszczalnik elucyjny do oczyszczania oliwy metodą chromatografii kolumnowej w mieszaninie eteru naftowego z eterem etylowym 87/13 (ułamek objętościowy).

4.2.4.

Żel krzemionkowy, sito 70–230, rodzaj Merck 7734, o znormalizowanej zawartości wilgoci na poziomie 5 % (wartość procentowa masy – w/w/).

4.2.5.

Wata szklana.

4.2.6.

Aceton do HPLC.

4.2.7.

Acetonitryl lub propionitryl do HPLC.

4.2.8.

Rozpuszczalnik elucyjny do HPLC: acetonitryl + aceton (proporcje należy dostosować w celu uzyskania pożądanego oddzielenia; zaczynając od mieszaniny 50:50) lub propionitryl.

4.2.9.

Rozpuszczalnik do rozpuszczania: aceton.

4.2.10.

Triglicerydy wzorcowe: można zastosować triglicerydy handlowe (tripalmitynian, trioleinian itp.) i wtedy czasy retencji można nanieść zgodnie z równoważną liczbą atomów węgla lub alternatywnie chromatogramy wzorcowe uzyskane z oleju sojowego, mieszaniny oleju sojowego i oliwy z oliwek w proporcji 30:70 oraz czystej oliwy z oliwek (zob. uwagi 1 i 2 oraz rysunki 1–4).

4.2.11.

Kolumienka do ekstrakcji do fazy stałej z zastosowaniem fazy krzemionki 1 g, 6 ml.

4.3.    Przygotowanie próbek

Jako że szereg substancji interferujących może mieć wpływ na wyniki fałszywie dodatnie, próbkę zawsze należy oczyścić zgodnie z metodą IUPAC 2.507, stosowaną do oznaczania związków jonowych w tłuszczach do smażenia.

4.3.1.    Przygotowanie kolumny chromatograficznej

Do kolumny (4.1.3) wlać około 30 ml rozpuszczalnika elucyjnego (4.2.3), następnie do kolumny wprowadzić watę szklaną (4.2.5), przeciskając ją na dno kolumny za pomocą szklanej pałeczki (4.1.5).

W zlewce 100 ml sporządzić zawiesinę 25 g żelu krzemionkowego (4.2.4) w 80 ml mieszaniny elucyjnej (4.2.3), następnie przenieść ją do kolumny za pomocą szklanego lejka (4.1.6).

Aby zapewnić całkowite przeniesienie żelu krzemionkowego do kolumny, opłukać zlewkę mieszaniną elucyjną i przenieść do kolumny również pozostałości po opłukaniu.

Otworzyć kranik i spuścić rozpuszczalnik z kolumny, aż osiągnie poziom około 1 cm powyżej żelu krzemionkowego.

4.3.2.    Chromatografia kolumnowa

Z dokładnością do 0,001 g odważyć 2,5 ± 0,1 g oliwy, uprzednio przefiltrowanej, homogenizowanej i odwodnionej, w razie konieczności, w kolbie miarowej 50 ml (4.1.7).

Rozpuścić ją w około 20 ml rozpuszczalnika elucyjnego (4.2.3). W razie konieczności podgrzać go nieco, aby ułatwić rozpuszczanie. Ochłodzić w temperaturze pokojowej i dostosować objętość rozpuszczalnikiem elucyjnym.

Pipetą miarową wprowadzić 20 ml roztworu do kolumny przygotowanej zgodnie z pkt 4.3.1, otworzyć kranik i spuścić rozpuszczalnik do poziomu warstwy żelu krzemionkowego.

Następnie zlać za pomocą 150 ml rozpuszczalnika elucyjnego (4.2.3), ustawiając szybkość przepływu rozpuszczalnika na około 2 ml/min (150 ml przejdzie przez kolumnę w ciągu około 60–70 minut).

Odciek zbiera się do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml (4.1.1) uprzednio wytarowanej w piecu i dokładnie zważonej. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w wyparce obrotowej (4.1.9) i zważyć pozostałość, która będzie wykorzystana do przygotowania roztworu do analizy HPLC oraz do przygotowania estru metylowego.

Poziom odzyskania próbki z kolumny musi wynosić co najmniej 90 % w przypadku kategorii oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia, oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia, oliwy rafinowanej zwyczajnie i oliwy z oliwek oraz co najmniej 80 % w przypadku oliwy z oliwek typu lampante i oliwy z wytłoczyn oliwek.

4.3.3.    Oczyszczanie SPE

Kolumna z wkładem krzemionkowym SPE jest aktywowana poprzez przepuszczenie 6 ml heksanu (4.2.3) w próżni, unikając suchości.

Z dokładności do 0,001 g odważyć 0,12 g w fiolce 2 ml (4.1.15) i rozpuścić w 0,5 ml heksanu (4.2.3).

Kolumnę SPE napełnić roztworem i zlać za pomocą 10 ml mieszaniny heksanu i eteru dietylowego (87:13 w proporcji objętościowej) (4.2.3) w próżni.

Zebraną frakcję należy odparować do suchości w wyparce obrotowej (4.1.9) pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze pokojowej. Pozostałość rozpuszcza się w 2 ml acetonu (4.2.6) na potrzeby analizy triglicerydów (TAG).

4.4.    Analiza HPLC

4.4.1.    Przygotowanie próbek do analizy chromatograficznej

Przygotować 5 % roztwór próbki przeznaczonej do analizy, odważając 0,5 ± 0,001 g próbki w kolbie miarowej o pojemności 10 ml i uzupełnić do 10 ml rozpuszczalnikiem do rozpuszczania (4.2.9).

4.4.2.    Procedura

Utworzyć układ chromatograficzny. Wpompować rozpuszczalnik elucyjny (4.2.8) w tempie 1,5 ml/min w celu oczyszczenia całego układu. Odczekać do uzyskania stabilnej linii podstawowej.

Wstrzyknąć 10 μl próbki przygotowanej zgodnie z pkt 4.3.

4.4.3.    Obliczanie i formułowanie wyników

Zastosować metodę normalizacji powierzchni (normalizacji wewnętrznej), to znaczy założyć, że suma powierzchni pików odpowiadających poszczególnym triglicerydom od ECN 42 do ECN 52 wynosi 100 %.

Obliczyć względny procentowy udział każdego triglicerydu, stosując następujący wzór:

.

Wyniki należy podawać co najmniej do dwóch miejsc po przecinku.

Zob. uwagi 1–4.

4.5.    Obliczenie składu triglicerydów (odsetka molowego [%]) na podstawie danych dotyczących składu kwasów tłuszczowych (procentowego udziału powierzchni [%])

4.5.1.    Oznaczenie składu kwasów tłuszczowych

Skład kwasów tłuszczowych oznacza się zgodnie z normą ISO 5508 za pomocą kolumny kapilarnej. Estry metylowe są przygotowywane zgodnie z COI/T.20/Doc. nr 24.

4.5.2.    Kwasy tłuszczowe przyjmowane do obliczeń

Glicerydy są grupowane według równoważnej liczby atomów węgla (ECN), przy uwzględnieniu poniższych ekwiwalencji między ECN a kwasami tłuszczowymi. Uwzględniono jedynie kwasy tłuszczowe z liczbą atomów węgla 16 i 18, ponieważ tylko one są istotne w odniesieniu do oliwy z oliwek. Kwasy tłuszczowe należy normalizować do 100 %.

4.5.3.    Przekształcenie procentowego udziału powierzchni (% pow.) w liczbę moli w odniesieniu do wszystkich kwasów tłuszczowych (1)

4.5.4.    Normalizacja liczby moli kwasów tłuszczowych do 100 % (2)

Uzyskuje się procentowy udział każdego kwasu tłuszczowego jako odsetek molowy (% molowy) w ogólnej (1, 2, 3–) pozycji triglicerydów.

Następnie oblicza się sumę nasyconych kwasów tłuszczowych P i S (SFA) oraz nienasycone kwasy tłuszczowe Po, O, L i Ln (UFA) (3):

4.5.5.    Obliczenie składu kwasów tłuszczowych w pozycjach 2- i 1,3- triglicerydów

Kwasy tłuszczowe rozkładają się na trzy grupy w następujący sposób: jedna na pozycję 2-, a dwie identyczne na pozycje 1- i 3-, przy czym do kwasów nasyconych (P i S) i nienasyconych (Po, O, L i Ln) odnoszą się różne współczynniki.

4.5.5.1.   Nasycone kwasy tłuszczowe w pozycji 2- [P(2) i S(2)] (4)

4.5.5.2.   Nienasycone kwasy tłuszczowe w pozycji 2- [Po(2), O(2), L(2) i Ln(2)] (5):

4.5.5.3.   Kwasy tłuszczowe w pozycjach 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) i Ln(1,3)] (6):

4.5.6.    Obliczenie triglicerydów

4.5.6.1.   Triglicerydy z jednym kwasem tłuszczowym (AAA, w tym przypadku LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2.   Triglicerydy z dwoma kwasami tłuszczowymi (AAB, w tym przypadku PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3.   Triglicerydy z trzema różnymi kwasami tłuszczowymi (ABC, w tym przypadku OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4.   Triglicerydy z ECN42

Triglicerydy z ECN42 oblicza się według wzorów 7, 8 i 9, a następnie podaje się je w kolejności przewidzianej elucji w HPLC (zazwyczaj jedynie trzy piki).

Triglicerydy z ECN42 podaje się w postaci sumy dziewięciu triglicerydów wraz z ich izomerami pozycyjnymi. Wyniki należy podawać z dokładnością co najmniej do dwóch miejsc po przecinku.

5.   OCENA WYNIKÓW

Porównuje się obliczoną zawartość teoretyczną z zawartością oznaczoną metodą analizy HPLC. Jeżeli różnica między wartością bezwzględną danych z HPLC a danymi teoretycznymi jest większa niż wskazane w normie wartości dla odpowiedniej kategorii oliwy, to próbka zawiera olej z nasion.

Wyniki podaje się z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

6.   PRZYKŁAD (DANE LICZBOWE ODNOSZĄ SIĘ DO SEKCJI TEKSTU DOTYCZĄCYCH OPISYWANEJ METODY)

— 4.5.1.    Obliczenie odsetka (%) molowego kwasów tłuszczowych na podstawie danych z GLC (znormalizowanego procentowego udziału [%] powierzchni)

Metodą GLC uzyskano następujące dane dotyczące składu kwasów tłuszczowych:

— 4.5.3    Przekształcenie % powierzchni w liczbę moli w odniesieniu do wszystkich kwasów tłuszczowych (zob. wzór (1))

liczba moli P

=

liczba moli S

=

liczba moli Po

=

liczba moli O

=

liczba moli L

=

liczba moli Ln

=

Łącznie

=

0,35821 mola triglicerydów

— 4.5.4    Normalizacja liczby moli kwasów tłuszczowych do 100 % (zob. wzór (2))

% molowy P(1,2,3)

=

% molowy S(1,2,3)

=

% molowy Po(1,2,3)

=

% molowy O(1,2,3)

=

% molowy L(1,2,3)

=

% molowy Ln(1,2,3)

=

Suma % molowych

=

100 %

Suma nasyconych i nienasyconych kwasów tłuszczowych w pozycjach 1,2,3- triglicerydów (zob. wzór (3)):

— 4.5.5    Obliczenie składu kwasów tłuszczowych w pozycjach 2- i 1,3- triglicerydów

— 4.5.5.1   Nasycone kwasy tłuszczowe w pozycji 2- [P(2) i S(2)] (zob. wzór (4))

— 4.5.5.2   Nienasycone kwasy tłuszczowe w pozycji 2- [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) i Ln(1,3)] (zob. wzór (5))

— 4.5.5.3   Kwasy tłuszczowe w pozycjach 1,3- [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) i Ln(1,3)] (zob. wzór (6))

— 4.5.6.    Obliczenie triglicerydów

Na podstawie obliczonego składu kwasów tłuszczowych w pozycjach sn-2- oraz sn-1,3-:

oblicza się następujące triglicerydy:

— 4.5.6.1.   Triglicerydy z jednym kwasem tłuszczowym (LLL, PoPoPo) (zob. wzór (7))

, = 0,09706 mola LLL

— 4.5.6.2   Triglicerydy z dwoma kwasami tłuszczowymi (PoLL, SLnLn, PoPoL) (zob. wzór (8))

0,03210 mola PoLL

0,00094 mola SLnLn

0,00354 moal PoPoL

— 4.5.6.3   Triglicerydy z trzema różnymi kwasami tłuszczowymi (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) zob. wzór (9)

0,00761 mola PPoLn

0,43655 mola OLLn

0,06907 mola PLLn

0,04812 mola PoOLn

ECN42 = 0,69512 mola TAG

Uwaga 1: Kolejność elucji można oznaczyć poprzez obliczenie równoważnej liczby atomów węgla, często określonej stosunkiem , gdzie CN oznacza liczbę atomów węgla, a n liczbę wiązań podwójnych; obliczenie może być dokładniejsze po uwzględnieniu pochodzenia wiązania podwójnego. Jeżeli no, nl i nln są liczbami wiązań podwójnych przypisanych, odpowiednio, kwasowi oleinowemu, kwasowi linolowemu i kwasowi linolenowemu, to równoważna liczba atomów węgla może być obliczona według wzoru:

gdzie współczynniki do, dl i dln można obliczyć na podstawie triglicerydów wzorcowych. Przy zachowaniu warunków określonych w tej metodzie uzyskany stosunek byłby zbliżony do poniższej postaci:

Uwaga 2: Za pomocą kilku triglicerydów wzorcowych można również obliczyć rozdzielczość w odniesieniu do trioleinianu:

trioleinianupoprzez zastosowania skróconego czasu retencji

Wykres log α w zależności od f (liczby wiązań podwójnych) umożliwia oznaczenie wartości retencji w odniesieniu do wszystkich triglicerydów kwasów tłuszczowych zawartych w triglicerydach wzorcowych – zob. rysunek 1.

Uwaga 3: Efektywność kolumny powinna umożliwić wyraźne oddzielenie piku trioleinianu od pików triglicerydów o zbliżonej wartości RT. Elucja jest przeprowadzana do piku ECN 52.

Uwaga 4: Prawidłowy pomiar powierzchni wszystkich pików istotnych z punktu widzenia przedmiotowego oznaczenia jest zapewniony, jeżeli drugi pik odpowiadający ECN 50 wynosi 50 % pełnej skali rejestratora.

Rysunek 1

Wykres log α w zależności od f (liczby wiązań podwójnych)

Liczba wiązań podwójnych

La: kwas laurynowy; My: kwas mirystynowy; P: kwas palmitynowy; S: kwas stearynowy; O: kwas oleinowy; L: kwas linolowy; Ln: kwas linolenowy

Rysunek 2

Oliwa z oliwek z niską zawartością kwasu linolowego

a

Z rozpuszczalnikiem: aceton/acetonitryl.

PROFIL a: Główne składowe pików chromatograficznych: ECN42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS.

b

Z rozpuszczalnikiem: propionitryl

PROFIL b: Główne składowe pików chromatograficznych: ECN42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS

Rysunek 3

Oliwa z oliwek z wysoką zawartością kwasu linolowego

a)

Z rozpuszczalnikiem: aceton/acetonitryl (50:50).

Profil a: Główne składowe pików chromatograficznych: ECN42: (1’) LLL + PoLL; (2’) OLLn + PoOLn; (3’) PLLn; ECN44: (4’) OLL + PoOL; (5’) OOLn + PLL; (6’) POLn + PPoPo; ECN46: (7’) OOL + PoOO; (8’) PLO + SLL + PoOP; (9’) PLP + PoPP; ECN48: (10’) OOO; (11’) POO + SLL + PPoO; (12’) POP + PLS; ECN50: (13’) SOO; (14’) POS + SLS

b)

Z rozpuszczalnikiem: propionitryl.

Profil b: Główne składowe pików chromatograficznych: ECN42: (1) LLL; (2 + 2’) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN52: (19) AOO.

▼M19

---

ANNEX XIX

▼M28

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI ALKOHOLI ALIFATYCZNYCH I TRITERPENOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ NA KOLUMNACH KAPILARNYCH

1.   PRZEDMIOT

Niniejszy załącznik opisuje metodę oznaczania zawartości alkoholi alifatycznych i triterpenowych w olejach i tłuszczach.

▼M19

2.   PRINCIPLE OF THE METHOD

The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is saponified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethylsilyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.

3.   EQUIPMENT

4.   REAGENTS

▼M28

▼M19

5.   PROCEDURE

5.1.   Preparation of the unsaponifiables

5.1.1.

Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil. Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 5 g of the dry filtered sample into the same flask.

5.1.2.

Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to approximately 30 °C.

5.1.3.

The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle (Note 1). Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether. Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.

5.1.4.

The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives a neutral reaction. Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed beforehand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl ether which are added to the total.

5.1.5.

Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling in a desiccator.

5.2.   Separation of alcoholic fractions

5.2.1.

Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally placed in an oven at 100 °C for one hour. Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until required for use (plates treated in this way must be used within 15 days). Note 2: When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic fraction there is no need to treat the unsaponifiables with alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated distinctly from the sterol band.

5.2.2.

Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-developing chamber to a depth of approximately 1 cm ( 6 ). Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components. Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in order to obtain reproducible developing conditions.

5.2.3.

An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chloroform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution (4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.

5.2.4.

Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Immediately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate. The plate is then removed from the development chamber and the solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.

▼M28

5.2.5.

Spryskać płytkę lekko i równomiernie roztworem 2′,7′-dichlorofluoresceiny, gdy płytka jest obserwowana w świetle ultrafioletowym. Pasmo alkoholi alifatycznych można zidentyfikować przez przyrównanie go do plamy uzyskanej z roztworu wzorcowego: zaznaczyć granicę pasma czarnym ołówkiem; obrysować pasmo alkoholi alifatycznych i pasmo bezpośrednio nad nim, które jest pasmem alkoholi terpenowych (uwaga 4). Uwaga 4: Pasma alkoholi alifatycznych i alkoholi terpenowych muszą być zgrupowane w związku z ewentualną migracją alkoholi alifatycznych do pasma alkoholi triterpenowych. Przykład rozdziału w TLC podano na rysunku 1 w dodatku.

5.2.6.

Należy zdrapać żel krzemionkowy umieszczony na zaznaczonym obszarze za pomocą metalowej szpatułki. Usunięty i dokładnie rozdrobniony materiał przenieść do lejka do sączenia (3.7). Dodać 10 ml gorącego chloroformu, ostrożnie wymieszać za pomocą metalowej szpatułki i przefiltrować w próżni, zbierając filtrat do kolby stożkowej (3.8) połączonej z lejkiem do sączenia. Żel krzemionkowy znajdujący się w kolbie należy przemyć trzykrotnie eterem etylowym (ok. 10 ml każdorazowo), a filtrat zebrać do tej samej kolby połączonej z lejkiem. Filtrat odparować do objętości 4–5 ml i pozostały roztwór przelać do uprzednio odważonej probówki o pojemności 10 ml (3.9); odparować do sucha przez lekkie podgrzewanie w słabym strumieniu azotu; pozostałość rozcieńczyć ponownie kilkoma kroplami acetonu, ponownie odparować do sucha, a następnie umieścić w piecu w temperaturze 105 °C na około 10 minut; wyjąć, schłodzić w eksykatorze i zważyć. Pozostałość w próbówce składa się z frakcji alkoholowej.

▼M19

5.3.   Preparation of the trimethylsilyl ethers

5.3.1.

The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume (Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption of moisture (Note 6). Note 5: Solutions which are ready for use are available commercially. Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethylsilyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available. Note 6: The slight opalescence which may form is normal and does not cause any interference. The formation of a white floc or the appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.

5.3.2.

Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.

5.4.   Gas chromatography analysis

5.4.1.   Preliminary operations, column packing

5.4.1.1.

Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly (tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the splitting system and of the recording system, etc.).

5.4.1.2.

If the column is being used for the first time it is recommended that it should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through the capillary column and then the gas chromatography assembly is switched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That temperature is held for not less than two hours and then the assembly is brought to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connections; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column. Note 7: The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than the maximum temperature contemplated for the liquid phase employed.

5.4.2.   Choice of operating conditions

5.4.3.   Analytical procedure

▼M28

5.4.4.    Wyznaczanie pików

Poszczególne piki wyznacza się w oparciu o czas retencji i porównanie ze standardową mieszaniną TMSE poddawaną analizie w tych samych warunkach.

Przykłady chromatogramu frakcji alkoholowej rafinowanej oliwy z oliwek przedstawiono na rysunkach 2 i 3 w dodatku.

▼M19

5.4.5.   Quantitative evaluation

6.   EXPRESSION OF THE RESULTS

The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty substance and the sum of the total aliphatic alcohols are reported.

▼M28

---

Dodatek

Przykład rozdziału w TLC i przykłady chromatogramów

Rysunek 1

Płytka do chromatografii cienkowarstwowej dla nieulegającej zmydleniu frakcji z oliwy z oliwek poddanej elucji heksanem/eterem etylowym (65/35)

Rysunek 2

Chromatogram frakcji alkoholowej rafinowanej oliwy z oliwek

Rysunek 3

Alkohole alifatyczne i triterpenowe w rafinowanej oliwie z oliwek i oliwie z oliwek z drugiego odwirowania oliwy z oliwek

▼M23

---

ZAŁĄCZNIK XX

Metoda oznaczania zawartości wosków, metylowych estrów kwasu tłuszczowego i etylowych estrów kwasu tłuszczowego metodą kapilarnej chromatografii gazowej

1.   CEL

Niniejsza metoda służy do oznaczania zawartości wosków, metylowych i etylowych estrów kwasu tłuszczowego w różnych rodzajach oliwy z oliwek. Poszczególne woski i estry alkilowe rozdziela się w zależności od liczby atomów węgla. Zaleca się stosowanie tej metody do rozróżnienia oliwy z oliwek od oliwy z wytłoczyn oliwek oraz jako wskaźnik jakości w przypadku oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia, który umożliwia wykrycie oszukańczych mieszanin oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia z rodzajami oliw o niższej jakości, takim jak oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia, oliwa z oliwek typu lampante lub niektóre rodzaje oleju dezodoryzowanego.

2.   ZASADA

Dodanie odpowiednich wzorców wewnętrznych do oleju, następnie frakcjonowanie z wykorzystaniem metody chromatografii w kolumnie z uwodnionym żelem krzemionkowym. Odzyskanie frakcji wymytej uprzednio w warunkach testowych (której biegunowość jest mniejsza niż w przypadku triglicerydów), następnie przeprowadzenie bezpośredniej analizy metodą kapilarnej chromatografii gazowej.

3.   APARATURA

3.1.	Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.

3.2.	Szklana kolumna do chromatografii cieczowej, średnica wewnętrzna 15 mm, wysokość 30–40 cm, wyposażona w odpowiedni kranik.

3.3.

Chromatograf gazowy, który można stosować razem z kolumną kapilarną, wyposażony w system do bezpośredniego wprowadzania do kolumny, składający się z: 3.3.1. kontrolowanego termostatem piecyka z możliwością programowania temperatury; 3.3.2. zimnego dozownika do bezpośredniego wprowadzania do kolumny; 3.3.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego i konwertera – wzmacniacza; 3.3.4. współpracującego ze wzmacniaczem-konwerterem (pkt. 3.3.3) rejestratora-integratora (Uwaga 1), którego czas reakcji nie przekracza jednej sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru; Uwaga 1:  można również zastosować systemy informatyczne w przypadku wprowadzania danych z chromatografii gazowej przy użyciu komputera osobistego 3.3.5. kolumny kapilarnej, z topionej krzemionki (dla celów analizy wosków oraz metylowych i etylowych estrów), o wysokości 8–12 m, średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokrytej od środka płynem rozdzielającym (Uwaga 2), o jednolitej grubości 0,10–0,30 μm; Uwaga 2:  ogólnodostępne, odpowiednie do tego celu płyny rozdzielające typu SE52 lub SE 54, dostępne w handlu, itp.

3.4.	Mikrostrzykawka umożliwiająca wstrzyknięcie do kolumny porcji 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni.

3.5.	Wstrząsarka elektryczna.

3.6.	Wyparka rotacyjna.

3.7.	Piec muflowy.

3.8.	Waga analityczna zapewniająca precyzję pomiaru ± 0,1 mg.

3.9.	Zwykłe szkło laboratoryjne.

4.   ODCZYNNIKI

4.1.

Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 60 do 200 μm. Umieścić żel krzemionkowy w piecu muflowym w temp. 500 °C na co najmniej 4 godziny. Po ostudzeniu dodać 2 % wody względem zastosowanej ilości żelu krzemionkowego. Dobrze wstrząsnąć do otrzymania jednolitej zawiesiny i umieścić w suszarce laboratoryjnej na nie mniej niż 12 godzin przed zastosowaniem.

4.2.

n-heksan o klasie czystości do chromatografii lub do wykrywania pozostałości (należy sprawdzić czystość). UWAGA – Opary mogą ulec samozapłonowi. Należy trzymać z daleka od źródeł ciepła, iskier lub nieosłoniętego płomienia. Należy upewnić się zawsze, że pojemniki są zawsze dobrze zamknięte. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Należy unikać nagromadzenia oparów i usunąć wszelkie możliwe źródła zagrożenia pożarowego takie jak grzejniki czy aparatura elektryczna wyprodukowana z materiałów innych niż materiały niepalne. Wdychanie oparów może mieć, szkodliwe skutki, ponieważ może prowadzić do uszkodzenia komórek nerwowych. Nie należy wdychać oparów. Należy w razie potrzeby zastosować odpowiednie urządzenia umożliwiające oddychanie. Chronić oczy i skórę przed kontaktem.

4.3.

Eter etylowy o klasie czystości do chromatografii. UWAGA – bardzo łatwopalny i umiarkowanie toksyczny. Podrażnia skórę. Wdychanie oparów może mieć, szkodliwe skutki, ponieważ może prowadzić do uszkodzenia komórek nerwowych. Może powodować uszkodzenia oczu. Skutki mogą być odczuwalne z opóźnieniem. Może tworzyć nadtlenki o właściwościach wybuchowych. Opary mogą ulec samozapłonowi. Należy trzymać z daleka od źródeł ciepła, iskier lub nieosłoniętego płomienia. Należy upewnić się każdorazowo, że pojemniki są zawsze dobrze zamknięte. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Należy unikać nagromadzenia oparów i usunąć wszelkie możliwe źródła zagrożenia pożarowego, takie jak grzejniki czy aparatura elektryczna wyprodukowana z materiałów innych niż materiały niepalne. Nie odparowywać do sucha lub prawie do sucha. Dodanie wody lub odpowiedniego czynnika redukującego może ograniczyć tworzenie nadtlenków. Nie pić. Nie należy wdychać oparów. Należy unikać przedłużonego lub powtarzalnego kontaktu ze skórą.

4.4.

n-heptan, do chromatografii, lub izooktan. UWAGA – łatwopalny. Wdychanie oparów może mieć, szkodliwe skutki, ponieważ może prowadzić do uszkodzenia komórek nerwowych. Należy trzymać z daleka od źródeł ciepła, iskier lub nieosłoniętego płomienia. Należy upewnić się każdorazowo, że pojemniki są zawsze dobrze zamknięte. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Nie należy wdychać oparów. Należy unikać przedłużonego lub powtarzalnego kontaktu ze skórą.

4.5.	Roztwór wzorca arachidynianu laurylowego (Uwaga 3) o stężeniu 0,05 % (m/V) w heptanie (wzorzec wewnętrzny dla wosków). Uwaga 3:  można również zastosować palmitynian palmitylu, stearynian mirystylu lub arachidynian laurylowy.

4.6.	Roztwór wzorca estru metylowego kwasu heptadekanowego o stężeniu 0,02 % (m/V) w heptanie (wzorzec wewnętrzny dla estrów metylowych i etylowych).

4.7.	Sudan 1 (1-fenylo-azo-2-naftol).

4.8.

Gaz nośny: czysty wodór lub hel, do chromatografii gazowej. UWAGA Wodór Bardzo łatwopalny, pod ciśnieniem. Należy trzymać z daleka od źródeł ciepła, iskier lub nieosłoniętego płomienia lub aparatury elektrycznej wyprodukowanej z materiałów innych niż niepalne. Należy upewnić się, że zawór butli jest zamknięty na czas przerwy w użytkowaniu. Stosować zawsze razem z reduktorem ciśnienia. Należy zmniejszyć nacisk na sprężynę reduktora przed otwarciem zaworu butli. Nie należy stać naprzeciw ujścia butli w momencie otwierania zaworu. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Nie należy przemieszczać wodoru z jednej butli do drugiej. Nie należy mieszać gazu w butli. Należy zapewnić stabilność butli. Należy przechowywać z dala od światła słonecznego i źródeł ciepła. Przechowywać w warunkach wolnych od czynników korozyjnych. Nie należy używać butli, jeśli są one uszkodzone lub pozbawione etykiet. Hel Gaz sprężony pod ciśnieniem. Zmniejsza ilość tlenu dostępnego do oddychania. Należy przechowywać butlę zamkniętą. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Nie należy przebywać w pomieszczeniach, w których przechowywane są butle, jeżeli pomieszczenia te nie są odpowiednio wentylowane. Stosować zawsze razem z reduktorem ciśnienia. Należy zmniejszyć nacisk na sprężynę reduktora przed otwarciem zaworu butli. Nie należy przemieszczać gazu z jednej butli do drugiej. Należy zapewnić stabilność butli. Nie należy stać naprzeciw ujścia butli w momencie otwierania zaworu. Należy przechowywać z dala od światła słonecznego i źródeł ciepła. Przechowywać w warunkach wolnych od czynników korozyjnych. Nie należy używać butli, jeśli są one uszkodzone lub pozbawione etykiet. Nie wdychać. Wykorzystywać jedynie do celów technicznych.

4.9.

Gazy pomocnicze: — Czysty wodór, w postaci gazowej, do chromatografii gazowej. — Czyste powietrze, w postaci gazowej, do chromatografii gazowej. UWAGA Powietrze Gaz sprężony pod ciśnieniem. Należy stosować przy zachowaniu środków ostrożności w obecności substancji palnych, ponieważ temperatura samozapłonu większości organicznych składników powietrza jest znacznie niższa w warunkach wysokiego ciśnienia. Należy upewnić się, że zawór butli jest zamknięty na czas przerwy w użytkowaniu. Stosować zawsze razem z reduktorem ciśnienia. Należy zmniejszyć nacisk na sprężynę reduktora przed otwarciem zaworu butli. Nie należy stać naprzeciw ujścia butli w momencie otwierania zaworu. Nie należy przemieszczać gazu z jednej butli do drugiej. Nie należy mieszać gazu w butli. Należy zapewnić stabilność butli. Należy przechowywać z dala od światła słonecznego i źródeł ciepła. Przechowywać w warunkach wolnych od czynników korozyjnych. Nie należy używać butli, jeśli są one uszkodzone lub pozbawione etykiet. Powietrze przeznaczone dla celów technicznych nie może być wykorzystywane do wdychania lub w urządzeniach umożliwiających oddychanie.

5.   SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1.    Przygotowanie kolumny chromatograficznej

Sporządzić zawiesinę 15 g żelu krzemionkowego (pkt. 4.1) w n-heksanie (pkt. 4.2) i wprowadzić do kolumny (pkt. 3.2). Po spontanicznym wytrąceniu osadu zakończyć ten proces przy użyciu wstrząsarki elektrycznej, tak aby warstwa chromatograficzna stała się bardziej jednolita. Przesączyć 30 ml n-heksanu, by usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Odważyć dokładnie 500 mg próbki do kolby 25-ml (pkt. 3.1) posługując się wagą analityczną (pkt. 3.8) i dodać odpowiednią ilość wzorca wewnętrznego (pkt. 4.5), w zależności od założonej zawartości wosku, np. dodać 0,1 mg arachidynianu laurylowego w przypadku oliwy z oliwek, 0,25-0,50 mg w przypadku oliwy z wytłoczyn z oliwek i 0,05 mg w przypadku estru metylowego kwasu heptadekanowego dla oliwy z oliwek (pkt. 4.6).

Do tak przygotowanej próbki dodać dwie porcje po 2 ml n-heksanu (pkt. 4.2) i przenieść do kolumny chromatograficznej.

Wprowadzić próbkę, tak aby rozpuszczalnik napłynął do wysokości 1 mm powyżej górnego poziomu absorbentu. Następnie przesączyć resztę n-heksanu/eteru etylowego (99:1) i pobrać 220 ml przy przepływie około 15 kropli w ciągu 10 sekund. (Ta frakcja zawiera estry metylowe i etylowe oraz woski). (Uwaga 4) (Uwaga 5).

Otrzymaną w ten sposób frakcję suszy się w wyparce rotacyjnej do niemal całkowitego wyeliminowania rozpuszczalnika. Usuwa się ostatnie 2 ml rozpuszczalnika przy użyciu słabego strumienia azotu. Frakcję zawierającą estry metylowe i etylowe pobiera się z wykorzystaniem 2-4 ml n-heptanu lub izooktanu jako rozpuszczalnika.

5.2.    Analiza metodą chromatografii gazowej

5.2.1.    Procedura wstępna

Umieścić kolumnę w chromatografie gazowym (pkt. 3.3), łącząc szczelinę wlotową z systemem kolumnowym, a wylotową z detektorem. Wykonać ogólne kontrole aparatury do chromatografii gazowej (działanie pętli gazowych, sprawność detektora i systemu rejestracyjnego itp.).

Jeżeli kolumna używana jest po raz pierwszy, zaleca się jej kondycjonowanie. Przepuścić przez kolumnę gaz o małym natężeniu przepływu, następnie uruchomić aparaturę do chromatografii gazowej. Stopniowo podgrzewać do uzyskania, po około 4 godzinach, temperatury 350 °C.

Utrzymać tę temperaturę przez co najmniej 2 godziny, a następnie ustawić aparaturę według zadanych warunków pracy (ustawić natężenie przepływu gazu, zapalić płomień, podłączyć do elektronicznego przyrządu rejestrującego (pkt. 3.3.4), ustawić temperaturę pieca kolumny, ustawić detektor itd.). Rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwukrotnie wyższą niż czułość wymagana do przeprowadzenia analizy. Przebieg linii podstawowej powinien mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików, i linia ta nie powinna wykazywać nachylenia.

Prostoliniowe, ujemne nachylenie linii wskazuje na to, że połączenia kolumn są nieprawidłowe; nachylenie dodatnie oznacza, że kolumna nie została poddana wystarczającemu kondycjonowaniu.

5.2.2.    Dobór warunków roboczych dla wosków i estrów metylowych i etylowych (Uwaga 6).

Ogólnie należy przestrzegać następujących warunków roboczych:

—	Temperatura kolumny : 20 °C/min 5 °C/min Początkowo 80 °C (1′) 140 °C 335 °C (20)

—	Temperatura detektora : 350 °C.

—	Porcja wstrzykiwana : 1 μl roztworu (2–4 ml) n-heptanu.

—	Gaz nośny : hel lub wodór z szybkością liniową optymalną dla wybranego gazu (patrz: dodatek A).

—	Czułość urządzenia : taka, aby były spełnione warunki określone powyżej.

Warunki te mogą być modyfikowane w sposób dostosowany do charakterystyk kolumny i aparatu do chromatografii gazowej, tak aby zostały oddzielone wszystkie woski i metylowe i etylowe estry kwasu tłuszczowego oraz aby uzyskać zadowalającą rozdzielczość pików (zob. rysunki 2, 3 i 4) oraz czas retencji 18 ± 3 minut dla wewnętrznego wzorca arachidynianu laurylowego. Najbardziej reprezentatywny pik dla wosków musi wynosić ponad 60 % wartości pełnego zakresu skali, a wewnętrzny wzorzec estru metylowego kwasu heptadekanowego dla estrów metylowych i etylowych musi osiągnąć górny zakres skali.

Należy ustalić parametry całkowania pików w taki sposób, by uzyskać dokładną wartość pola powierzchni rozpatrywanego piku.

5.3.    Przeprowadzenie analizy

Pobrać 10 μl roztworu za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl, odciągnąć tłoczek, aż igła zostanie całkowicie opróżniona. Wprowadzić igłę do układu nastrzykowego i szybko wstrzyknąć po upływie jednej do dwóch sekund. Po upływie około 5 sekund powoli wyciągnąć igłę.

Przeprowadzać rejestrację danych aż do momentu całkowitego wymycia wosków lub stigmastadienów, w zależności od analizowanej frakcji.

Linia podstawowa musi przez cały czas spełniać ustalone wymagania.

5.4.    Identyfikacja pików

Zidentyfikować piki po czasach retencji, porównując je z mieszaninami wosków o znanych czasach retencji, analizowanymi w takich samych warunkach. Estry alkilowe identyfikuje się po mieszaninach metylowych i etylowych estrów podstawowych kwasów tłuszczowych w oliwie z oliwek (palmitynowego i oleinowego).

Rysunek 1 przedstawia chromatogram wosków oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia. Rysunki 2 i 3 przedstawiają chromatogramy dwóch oferowanych w sprzedaży detalicznej rodzajów oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia, jeden z estrami metylowymi i etylowymi, a drugi bez nich. Rysunek 4 przedstawia chromatogram najwyżej jakości oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia oraz tej samej oliwy z dodatkiem 20 % oleju dezodoryzowanego.

5.5.    Analiza ilościowa wosków

Ustalić za pomocą integratora pola powierzchni pików odpowiadające wzorcowi wewnętrznemu arachidynianu laurylowego i estrom alifatycznym od C40 do C46.

Obliczyć zawartość całkowitą wosków dodając poszczególne woski, w mg/kg tłuszczu, zgodnie ze wzorem:

gdzie:

Ax

=

pole odpowiadające pikowi każdego z estrów, zgodnie z wyliczeniami programu komputerowego dostosowanego do obliczania pola powierzchni pod pikiem

As

=

pole odpowiadające pikowi wewnętrznego wzorca arachidynianu laurylowego, zgodnie z wyliczeniami programu komputerowego dostosowanego do obliczania pola powierzchni pod pikiem

ms

=

masa dodanego wewnętrznego wzorca arachidynianu laurylowego, w miligramach;

m

=

masa próbki pobranej do oznaczenia, w gramach.

5.5.1.    Analiza ilościowa estrów metylowych i etylowych

Ustalić za pomocą integratora pola powierzchni pików odpowiadające wewnętrznemu wzorcowi estru metylowego kwasu heptadekanowego, estrom metylowym kwasów tłuszczowych C16 i C18 oraz estrom etylowym kwasów tłuszczowych C16 i C18.

Obliczyć zawartość poszczególnych estrów alkilowych, w mg/kg, zgodnie ze wzorem:

gdzie:

Ax

=

pole odpowiadające pikowi poszczególnych estrów C16 i C18, zgodnie z wyliczeniami programu komputerowego dostosowanego do obliczania pola powierzchni pod pikiem

As

=

pole odpowiadające pikowi wewnętrznego wzorca estru metylowego kwasu heptadekanowego, zgodnie z wyliczeniami programu komputerowego dostosowanego do obliczania pola powierzchni pod pikiem

ms

=

masa dodanego wewnętrznego wzorca estru metylowego kwasu heptadekanowego, w miligramach;

m

=

masa próbki pobranej do oznaczenia, w gramach.

6.   PREZENTACJA WYNIKÓW

Podać sumę zawartości różnych wosków od C40 do C46 (Uwaga 7) w miligramach na kilogram tłuszczu.

Podać sumę zawartości estrów metylowych i estrów etylowych od C16 do C18 oraz wartość całkowitą obydwu.

Wynik należy podać z dokładnością do mg/kg.

Podać stosunek estrów etylowych do estrów metylowych.

Rysunek 1

Przykład chromatografii gazowej frakcji wosków oliwy z oliwek ( 7 )

Piki z czasem retencji od 5 do 8 minut metylowych i etylowych estrów kwasu tłuszczowego

Legenda:

I.S.	arachidynian laurylowy

1 =	estry diterpenowe

2+2′ =

estry C40

3+3′ =

estry C42

4+4′ =

estry C44

5 =

estry C46

6 =	estry steroli i alkohole triterpenowe

Rysunek 2

Estry metylowe, estry etylowe i woski w oliwie z oliwek z pierwszego tłoczenia

Legenda:

1 —

metyl C16

2 —

etyl C16

3 —	ester metylowy kwasu heptadekanowego I.S.

4 —

metyl C18

5 —

etyl C18

6 —

skwalen

7 —	arachidynian laurylowy I.S.

A —	estry diterpenowe

B —

woski

C —	estry steroli i estry triterpenowe

Rysunek 3

Estry metylowe, estry etylowe i woski w oliwie z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia

Legenda:

1 —	ester metylowy kwasu heptadekanowego I.S.

2 —

metyl C18

3 —

etyl C18

4 —

skwalen

5 —	arachidynian laurylowy I.S.

A —	estry diterpenowe

B —

woski

C —	estry steroli i estry triterpenowe

Rysunek 4

Część chromatogramu oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia oraz tej samej oliwy z dodatkiem oleju dezodoryzowanego

Legenda:

1

–

mirystynian metylu I.S.

2

–

palmitynian metylu

3

–

palmitynian etylu

4

–

ester metylowy kwasu heptadekanowego I.S.

5

–

linolenian metylu

6

–

oleinian metylu

7

–

stearynian metylu

8

–

linolenian etylu

9

–

oleinian etylu

10

–

stearynian etylu

---

Appendix A

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Wstrzyknąć 1:3 μl metanu (lub propanu) do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki robocze. Mierzyć czas potrzebny na przejście gazu przez kolumnę, począwszy od momentu wstrzyknięcia do momentu osiągnięcia wartości szczytowej (tM).

Prędkość liniową w cm/sek. oblicza się zgodnie ze wzorem L/tM, gdzie L jest wysokością kolumny w cm, a tM jest czasem mierzonym w sekundach.

▼M28 —————

▼M25

---

ZAŁĄCZNIK XXI

---

( 1 ) Dz.U. L 228 z 1.9.2009, s. 3.

( 2 ) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2011/91/UE w sprawie oznaczeń lub oznakowań identyfikacyjnych partii towaru, do której należy dany środek spożywczy (Dz.U. L 334 z 16.11.2011, s. 1).

( 3 ) Po wymyciu estrów steroli w zapisie chromatograficznym nie powinny być widoczne istotne piki (triglicerydy).

( 4 ) Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1308/2013 z dnia 17 grudnia 2013 r. ustanawiające wspólną organizację rynków produktów rolnych oraz uchylające rozporządzenia Rady (EWG) nr 922/72, (EWG) nr 234/79, (WE) nr 1037/2001 i (WE) nr 1234/2007 (Dz.U. L 347 z 20.12.2013, s. 671).

( 5 ) Degustator może powstrzymać się od degustacji oliwy, jeżeli na podstawie samego zapachu stwierdzi występowanie niezwykle intensywnej cechy negatywnej; w takim przypadku odnotowuje w formularzu oceny zaistnienie tej okoliczności nadzwyczajnej.

( 6 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be used to obtain distinct band separation.

( 7 ) Po wymyciu estrów steroli w zapisie chromatograficznym nie powinny być widoczne istotne piki (triglicerydy).