ANNESS

METODU ENŻIMATIKU GĦAD-DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TAL-LAMTU FIL-PREPARAZZJONIJIET UŻATI FL-GĦALF TA' L-ANNIMALI BL-UŻU TAL-KROMATOGRAFIJA TA' LIKWIDI BI PRESSJONI GĦOLJA (HPLC)

1.   Skop

Dan il-metodu jiddeskrivi l-kalkolu enżimatiku tal-kontenut tal-lamtu fl-għalf ta' l-annimali. Il-kontenut tal-lamtu hu mnissel mill-kalkolu kwantitattiv tal-glukows wara l-brejkdawn enżimatiku tal-lamtu preżenti fi glukows. Il-glukows kollu mkejjel hu kkunsidrat li jkun ġie mil-lamtu, li jkun hemm fil-kampjun.

2.   Definizzjonijiet

F'dan il-metodu, ikun determinat il-kontenut tal-lamtu u brejkdawn tal-prodotti b'massa molekolari għolja, li ma jinħallux f'40 % etanol. Il-kontenut tal-lamtu hu espress f'% (m/m).

3.   Prinċipju

Il-kampjuni huma omoġenizzati bit-tħin. Il-kampjun jinħasel b'40 % etanol biex ikunu eliminati zokkrijiet li jinħallu u prodotti li jinħallu tad-dekompożizzjoni tal-lamtu.

L-enżima termostabbli alfa-amilażi hija miżjuda mas-sospensjoni. Din l-enżima tkisser il-lamtu f'temperatura ta' 100 °Ċ fi ktajjen iżgħar, kemm jekk il-lamtu ikun qiegħed jinħall jew le. Ċapep kbar ta' lamtu jitkissru bil-mod ħafna.

Għalhekk hu neċessarju li l-kampjuni jinħallu għal kollox jew ikunu preżenti f'forma ta' sospensjoni li jkollha biċċiet sħaħ żgħar ħafna.

Imbagħad tiżdied it-tieni enżima amiloglukosidażi, li tidrolizza l-ktajjen iddegredati tal-glukows fi glukows f'temperatura ta' 60 °Ċ.

Wara li jiċċara l-likwidu fejn il-proteini, ix-xaħmijiet u l-fdalijiet preżenti jkunu twarrbu wara t-tisfija, tinkiseb soluzzjoni ċara li tkun tista' tintuża għall-HPLC.

Issir separazzjoni taz-zokkrijiet preżenti mill-HPLC.

4.   Reaġenti u materjali oħra

Uża reaġenti ta' grad analitiku rikonoxxut u ilma demineralizzat.

4.1.   Etanol 40 % vol. fl-ilma

4.2.   Glukows, min. 99 %.

4.3.   Soluzzjoni ta' Amiloglukosidażi (1,4-alfa-D-Glukan glukoidrolażi) mill-Aspergillus niger (attivita' enżimatika > 5 000 U/ml). Ħażna f'temperatura ta' madwar 4 °C

Alternattivament, jista' jintuża wkoll trab ta' l-amiloglukosidażi.

4.4.   Alfa-amilażi termostabbli (1,4-alfa-D-Glukan glukoidrolażi). Ħażna f'temperatura ta' madwar 4 °Ċ.

4.5.   Aċetat deidrat taż-żingu, p.a.

4.6.   Eksaċjanuferrat tal-potassju (II) (Potassium hexacyanoferrate (II) (K4[Fe(CN)]6.3H2O), ekstra pur.

4.7.   Aċetat tas-sodju anidru, p.a..

4.8.   Aċtu aċetiku glaċjali, 100 % (v/v).

4.9.   Bafer ta' l-aċetat tas-sodju (0,2 mol/l).

Iżen 16,4 gramma ta' aċetat tas-sodju (4.7) f'biker tal-ħġieġ. Ħoll fl-ilma u laħlaħ ġo flixkun volumetriku ta' 1 000 ml. Iddilwixxi bl-ilma sal-marka u rranġa l-pH għall-4,7 b’aċtu aċetiku (bl-użu ta' strument tal-pH (5.11)). Din is-soluzzjoni tista' tintuża sa massimu ta' 6 xhur f'temperatura tal-ħażna ta' 4 °Ċ .

4.10.   Soluzzjoni ta' l-amiloglukosidażi (attivita' enżimatika > 250 U/ml)

Ipprepara soluzzjoni ta' 5 ml ta' soluzzjoni ta' amiloglukosidażi (4.3) jew 660 mg ta' trab ta' amiloglukosidażi b'volum finali ta' 100 ml billi jintuża bafer ta' l-aċetat tas-sodju (4.9). Ipprepara mill-ewwel.

4.11.   Soluzzjoni ta' referenza.

Ipprepara soluzzjonijiet tal-glukows fl-ilma, kif użat konvenzjonalment fl-analiżi HPLC.

4.12.   Reaġent għat-tisfija/l-iċċarar (Carrez I).

Ħoll 219,5 gramma ta' aċetat taż-żingu (4.5) fl-ilma f'biker tal-ħġieġ. Laħlaħ ġo flixkun volumetriku ta' l-1 000 ml, żid 30 ml aċtu aċetiku (4.8). Ħawwad sew u żid bl-ilma. Din is-soluzzjoni tista' tintuża sa massimu ta' 6 xhur meta maħżuna f'temperatura ambjentali ta' ġewwa.

Reaġenti oħra tat-tisfija, ekwivalenti għal soluzzjoni ta' Carrez, jistgħu jintużaw.

4.13.   Reaġent għat-tisfija/l-iċċarar (Carrez II)

Ħoll 106,0 gramma Eksaferroċjanur tal-potassju (II) (4.6) (potassium hexacyanoferrate (II)) fl-ilma f'biker tal-ħġieġ. Laħlaħ ġo flixkun volumetriku ta' l-1 000 ml. Ħallat sew u żid bl-ilma. Din is-soluzzjoni tista' tintuża sa massimu ta' 6 xhur meta maħżuna f'temperatura ambjentali ta' ġewwa.

Reaġenti oħra tat-tisfija, ekwivalenti għal soluzzjoni ta' Carrez, jistgħu jintużaw.

4.14.   Fażi mobbli:

Hija ppreparata fażi mobbli li tkun tista' tintuża konvenzjonalment fl-analiżi HPLC taz-zokkor. Fil-każ ta' użu tal-kolonna bil-ġel tas-silika aminopropil eż., fażi mobbli komuni hi taħlita ta' ilma HPLC iggradat u aċetonitrile.

5.   Apparat

5.1.   Apparat tal-laboratorju standard tal-ħġieġ.

5.2.   Ċentrifuga li tagħti 1 000 g jew aktar (ikkalkulata fiċ-ċentru tat-tubu).

5.3.   Tubi tal-ħġieġ tal-100 ml għaċ-ċentrifuga.

5.4.   Aġitatur manjetiku.

5.5.   Vireg manjetiċi.

5.6.   Filtri skanalati, eż. 185 mm.

5.7.   Filtri tas-siringi, 0,45 μm, adattati għal soluzzjonijiet milwiema.

5.8.   Vjali għall-ikkampjunar adattati għall-kampjunatur awtomatiku HPLC.

5.9.   Fliexken volumetriċi tal-100 ml.

5.10.   Siringi tal-plastik, 5 u 10 ml.

5.11.   Miter tal-pH.

5.12.   Banju ta' l-ilma bit-termostat, li jista' jkun irregolat għal 60 °Ċ u 100 °Ċ.

5.13.   Pjanċi għat-tisħin bl-aġitaturi manjetiċi.

5.14.   Apparat ta' l-HPLC.

5.14.1.   Pompa, tajba għall-pulsazzjoni-żero.

5.14.2.   Kampjunatur awtomatiku.

5.14.3.   Kolonna u prekolonna, adattati għall-analiżi taz-zokkor.

5.14.4.   Forn vertikali, firxa ta' temperatura bejn dik ambjentali ta' ġewwa u l-40 °Ċ.

5.14.5.   Ditekter, tajjeb għall-analiżi taz-zokkor, eż., Ditekter għall-Indiċi Refrattiv.

5.14.6.   Sistema ta' integrazzjoni.

6.   Proċedura

6.1.   Ġenerali

Il-kampjuni huma analizzati wieħed wieħed.

6.2.   Preparazzjoni tal-kampjun għall-diversi tipi ta' prodotti

Il-prodott huwa omoġenizzat bit-tħin.

6.3.   Porzjon kampjun

Il-kontenut tal-lamtu hu stmat bl-għajnuna tad-dikjarazzjoni ta' l-ingredjenti. L-ammont tal-kampjun (miżun sa 0.1 mg eżatt) jista' jkun stmat minn:

6.4.   Id-determinazzjoni vojta

Il-vojt hu determinat billi ssirlu analiżi kompluta (kif deskritta f'6.5), mingħajr ma jiżdiedlu kampjun. Ir-riżultat tad-determinazzjoni vojta jintuża fil-kalkolu tal-kontenut tal-lamtu (7.1).

6.5.   L-analiżi

6.5.1.   It-tħejjija tal-kampjuni

Ħallat il-kampjun billi ċċaqilqu jew tħawdu. Il-porzjon magħżul għall-eżami (6.3) jintiżen f'tubu ċentrifugu (5.3) u jiżdiedu 50 ml etanol 40 % (4.1). Ħawwad fl-aġitatur manjetiku għall-20 minuta f'temperatura ambjentali ta' ġewwa. Ħalli l-virga manjetika fit-tubu u ċċentrifuga għal ħames minuti. Onfoħ bil-galbu u neħħi l-fażi likwida (eż., b'pipetta Pasteur). Irrepeti din il-proċedura ta' estrazzjoni b'25 ml etanol għal darbtejn (4.1). Ittrasferixxi r-residwu ġo flixkun volumetriku ta' 100 ml (5.9) b'madwar 70 ml ilma. Wara li tħoll jew tissospendi, żid 100 mikrolitru ta' alfa-amilażi termostabbli (4.4) u saħħan f'temperatura ta' 100 °Ċ għall-siegħa, eż. f'banju ta' l-ilma (5.12). Berred għal temperatura ta' 60 °Ċ f'banju ta' l-ilma, u żid 5 ml ta' soluzzjoni ta' amiloglukosidażi (4.10). Poġġi l-flixkun għall-30 min ġo banju ta' l-ilma f'temperatura ta' 60 °Ċ. Berred għal temperatura ambjentali ta' ġewwa, iċċara l-kampjun billi żżid 1 ml Carrez I (4.12), ħawwad u mbagħad żid 1 ml Carrez II (4.13). Carrez I u II jistgħu jkunu miżjuda qabel jew wara t-tberrid. Iddilwixxi bl-ilma sal-marka, omoġenizza u ffiltra s-soluzzjoni b'filtru skanalat (5.6). Iġbor l-estratt tal-kampjun.

6.5.2.   L-ipproċessar ta' l-estratti tal-kampjuni

Iffiltra l-estratti minn filtru tad-diska (5.7) b'siringa (5.10) li kienet imlaħalħa qabel bl-estratt. Iġbor il-filtrati ġo vjali (5.8).

Nota: Il-filtru tad-diska jista' jintuża ħafna drabi. Irid jitlaħlaħ bl-estratt li jmiss biex tkun evitata kontaminazzjoni ta' l-estratt ta' qabel.

6.6.   Il-kromatografija

L-HPLC hija magħmula konvenzjonalment għall-analiżi taz-zokkrijiet. Peress li l-kampjuni huma estratti bl-etanol/ilma, il-glukows hu z-zokkor prinċipali li jrid ikun analizzat. Jekk l-analiżi HPLC turi traċċi ta' maltosju, din tista' tindika konverżjoni mhux kompluta tal-lamtu.

7.   Kalkolu u tifsira tar-riżultati

7.1.   Il-kalkolu tar-riżultati HPLC

Mir-riżultati ta' l-analiżi HPLC, il-kontenut (%, m/m) tal-glukows hu kkalkulat. Is-soluzzjoni enżimatika ta' l-amiloglukosidażi (4.3) hi stabilizzata bil-glukows. Barra minn hekk, l-alfa-amilażi termostabbli (4.4) hi stabilizzata bis-sukrows, li tista' tkun parzjalment mibdula fi glukows b'attivita' ta' l-invertażi ta' l-amiloglukosidażi. Għalhekk, il-kejl tal-konċentrazzjoni tal-glukows (%, m/v) irid ikun ikkoreġut għall-konċentrazzjoni tal-glukows (%, m/v) fil-vojt. Il-kontenut tal-glukows (%, m/m) ikkoreġut għall-vojt huwa imbagħad ikkalkulat mill-korrezzjoni tal-konċentrazzjoni tal-glukows, il-piż tal-kampjun u l-ikkalibrar mas-soluzzjonijiet ta' referenza (4.11).

7.2.   Il-kalkolu tal-kontenut tal-lamtu

Il-kontenut tal-lamtu (%, m/m) hu kkalkulat mill-kontenut tal-glukows (%, m/m) wara l-korrezzjoni tal-vojt.

Kontenut tal-lamtu = 0,9 * korrezzjoni tal-glukows

8.   Preċiżjoni

8.1.   Test interlaboratorjali

Id-dettalji tat-test interlaboratorjali fuq il-preċiżjoni tal-metodu huma miġbura fil-qosor f'8.4.

8.2.   Ripetibbiltà

Id-differenza assoluta bejn żewġ riżultati tat-testijiet singoli indipendenti, miksuba bl-użu ta' l-istess metodu fuq materjal identiku għal test fl-istess laboratorju mill-istess operatur bl-użu ta' l-istess apparat f'perijodu qasir ta' żmien, tkun f'mhux aktar minn 5 % tal-każijiet akbar mil-limitu tar-ripetibbiltà ta' 1,1 % (m/m). Il-limitu ta' ripetibbilta' hu mnissel minn riżultati miġbura minn test interlaboratorjali (ara 8.4).

8.3.   Riproduċibilita'

Id-differenza assoluta bejn żewġ riżultati tat-testijiet singoli, miksuba bl-użu ta' l-istess metodu fuq materjal identiku fl-laboratorji differenti minn operaturi differenti bl-użu ta' apparat differenti, tkun f'mhux aktar minn 5 % tal-każijiet akbar mill-limitu tar-riproduċibbilita' ta' 3,7 % (m/m). Il-limitu ta' riproduċibbilita' hu mnissel minn riżultati miġbura minn test interlaboratorjali (ara 8.4).

8.4.   Riżultati tat-test interlaboratorjali

Test interlaboratorjali kien sar fl-2005 u l-2006 bil-parteċipazzjoni tal-laboratorji Ewropej tad-Dwana. Dan it-test twettaq skond l-ISO 5725 u l-protokoll IUPAC (W. Horwitz, Pure and Applied Chemistry, vol. 67, 1995, p. 331-343). Id-data ta' preċiżjoni mogħtija fit-tabella hawn taħt:

Riżultati ta' statistika mill-istudju interlaboratorjali

	Kampjun
	1	2	3	4	5
L-għadd ta' laboratorji wara l-eliminazzjoni ta' dawk barra l-limitu	25	26	26	25	24
L-għadd ta' riżultati aċċettati	50	52	52	50	48
Kontenut medju tal-lamtu (%, m/m)	31,2	14,4	25,1	12,9	27,8
Devjazzjoni standard ta’ ripetibbiltà sr (%, m/m)	0,4	0,3	0,6	0,2	0,3
Limitu ta' ripetibbilità r (%, m/m)	1,1	0,8	1,7	0,7	0,9
Devjazzjoni standard ta’ riproduċibiltà sR (%, m/m)	1,7	0,8	1,7	0,9	1,3
Limitu ta' riproduċibilità R (%, m/m)	4,8	2,2	4,7	2,5	3,7
Kampjuni 1 : għalf niexef tal-klieb 2 : għalf niexef tal-qtates 3 : għalf niexef tal-qtates (kampjun 2) biż-żjieda tal-lamtu 4 : għalf niexef tal-qtates (kampjun 2) biż-żjieda tal-polpa tal-pitravi 5 : għalf kummerċjali ta' annimali domestiċi