1991R2568 — MT — 09.08.2012 — 024.001

---

Dan id-dokument ġie magħmul bil-ħsieb li jintuża bħala għodda ta’ dokumentazzjoni u l-istituzzjonijiet ma jassumu l-ebda responsabbiltà għall-kontenut tiegħu

►B	IR-REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KEE) Nru 2568/91 tal-11 ta’ Lulju 1991 dwar il-karatteristiċi taż-żejt taż-żebbuġa u l-fdal taż-żejt taż-żebbuġa u dwar il-metodi ta’ analiżi rilevanti (ĠU L 248, 5.9.1991, p.1)

Emendat bi:

		Il-Ġurnal Uffiċjali
		No	page	date
►M1	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KEE) Nru 3682/91 tas-17 ta’ Diċembru 1991	L 349	36	18.12.1991
►M2	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KEE) Nru 1429/92 tas-26 ta’ Mejju 1992	L 150	17	2.6.1992
M3	Commission Regulation (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	Commission Regulation (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KEE) Nru 3288/92 tat-12 ta’ Novembru 1992	L 327	28	13.11.1992
►M6	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KEE) Nru 183/93 tad-29 ta’ Jannar 1993	L 22	58	30.1.1993
M8	Commission Regulation (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
M9	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KEE) Nru 177/94 tat-28 ta' Jannar 1994	L 24	33	29.1.1994
M10	Commission Regulation (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 656/95 tat-28 ta' Marzu 1995	L 69	1	29.3.1995
M12	Commission Regulation (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
►M13	Commission Regulation (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
►M14	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 282/98 tat-3 ta’ Frar 1998	L 28	5	4.2.1998
M15	Commission Regulation (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	Ir-Regolament tal-Kummissijoni (KE) Nru 379/1999 tad-19 ta’ Frar 1999	L 46	15	20.2.1999
►M17	Commission Regulation (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	Commission Regulation (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	Commission Regulation (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 1989/2003 tas-6 ta' Novembru 2003	L 295	57	13.11.2003
►M21	Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 702/2007 tal-21 ta’ Ġunju 2007	L 161	11	22.6.2007
►M22	Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 640/2008 ta’ l-4 ta’ Lulju 2008	L 178	11	5.7.2008
►M23	Regolament tal-Kummissjoni (UE) Nru 61/2011 tal-24 ta’ Jannar 2011	L 23	1	27.1.2011
M24	Regolament ta’ Implimentazzjoni tal-Kummissjoni (UE) Nru 661/2012 tad-19 ta’ Lulju 2012	L 192	3	20.7.2012

(*)	Dan l-att qatt ma ġie ppubblikat bil-Malti.

---

▼B

IR-REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (KEE) Nru 2568/91

tal-11 ta’ Lulju 1991

dwar il-karatteristiċi taż-żejt taż-żebbuġa u l-fdal taż-żejt taż-żebbuġa u dwar il-metodi ta’ analiżi rilevanti

▼M20

Artikolu 1

1.  Iż-żjut, li l-karatteristiċi tagħhom jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punti 1 u 2 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandhom jitqiesu bħala żjut verġni taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt 1(a) u (b) ta' l-Anness mar-Regolament Nru 136/66/KEE.

2.  Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 3 ta' l-Anness I ma' dan ir-Rgolament, għandu jitqies bħala żejt lampante taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt (ċ) ta' l-Anness mar-Regolament Nru 136/66/KEE.

3.  Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 4 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt irraffinat taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt 2 ta' l-Anness mar-Regolament Nru 136/66/KEE.

4.  Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 5 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt taż-żebbuġa kompost minn żjut irraffinati taż-żebbuġa u żjut verġni taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt 3 ta' l-Anness mar-Regolament 136/66/KEE.

5.  Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 6 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt krud taż-żebbuġa pomatika fit-tifsira tal-punt 4 ta' l-Anness mar-Rgolament 136/66/KEE.

6.  Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 7 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt irraffinat taż-żebbuġa pomatika fit-tifsira tal-punt 5 ta' l-Anness mar-Regolament 136/66/KEE.

7.  Iż-żejt, li l-karatteristiċi tiegħu jikkonformaw ma' dawk iddikjarati fil-punt 8 ta' l-Anness I ma' dan ir-Regolament, għandu jitqies bħala żejt taż-żebbuġa pomatika fit-tifsira tal-punt 6 ta' l-Anness mar-Regolament 136/66/KEE.

▼B

Artikolu 2

1.  Il-karatteristiċi taż-żjut stabbiliti f’Anness I għandhom jiġu determinati b’konformità mal-metodi ta’ analiżi mniżżla hawn taħt:

▼M19

▼B

▼M21

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M23

▼M19

2.  Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3.  When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

▼M17

4.   ►M20  Għall-għanijiet tal-verifika pprovvduta fil-paragrafu 3, l-analiżijiet riferiti fl-Annessi II, III, IX, X u XII u, meta japplika, kull kontro-analiżi meħtieġa skond il-liġijiet nazzjonali, għandhom jitwettqu qabel id-data minima tad-durabbiltà. Meta l-kampjunar isir iktar minn erba' xhur qabel id-data minima tad-durabbiltà, l-analiżijiet għandhom jitwettqu mhux iktar tard mir-raba' xahar li fih ikun ittieħed il-kampjun. Ma għandu japplika l-ebda limitu taż-żmien għall-analiżijiet l-oħra pprovvduti f'dan ir-Regolament. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5.  For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Artikolu 2a

L-awtoritajiet nazzjonali jew ir-rappreżentanti tagħhom jistgħu jivverifikaw jekk kampjun ikunx konsistenti mal-kategorija dikjarata:

▼M19 —————

▼M5

Artikolu ►M19  3 ◄

Meta jinstab li l-karatteristiċi organolettiċi ta’ xi żejt ma jaqblux mad-deskrizzjoni li tingħata, l-Istati Membri nteressati għandhom, mingħajr preġudizzju għal xi penalitajiet oħra, japplikaw penalitajiet finanzjarji amministrattivi, li jiġu stabbiliti fid-dawl tal-gravità ta’ l-irregolarità misjuba.

Meta ssir stima ta’ l-irregolarità, għandha tingħata l-attenzjoni b’mod partikolari għat-tibdil naturali fil-karatteristiċi ta’ żejt maħżun taħt kondizzjonijiet normali.

Fil-bidu ta’ kull nofs sena, l-Istati Membri għandhom jgħarrfu lill-Kummissjoni bin-numru u t-tip ta’ irregolaritajiet misjuba u l-penalitajiet applikati matul in-nofs sena ta’ qabel.

▼M5

Artikolu 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Meta xi Stati Membri jiltaqgħu ma’ tfixkil fit-twaqqif tal-panels fit-territorju tagħhom, dawn jistgħu isejħu lil xi panel ieħor ta’ dewwieqa approvat f’ xi Stat Membru ieħor.

3.  Kull Stat Membru għandu jagħmel lista ta’ panels ta’ dewwieqa mwaqqfa minn organizzazzjonijiet professjonali jew ta’ l-istess qasam skond il-kondizzjonijiet preskritti fil-paragrafu 1 u għandhom jaraw li dawk il-kondizzjonijiet jiġu mħarsa.

▼M19 —————

▼B

Artikolu 6

1.  Il-kontenut ta’ żejt tal-għaġna ta’ żejt u fdalijiet oħra miksuba mill-estrazzjoni taż-żejt taż-żebbuġa (Kodiċi NM 2306 90 11 u 2306 90 19) għandu jiġi determinat billi jintuża l-metodu stabbilit f’Anness XV.

2.  Il-kontenut ta’ żejt imsemmi fil-paragrafu 1 għandu jiġi espress bħala perċentwali tal-piż ta’ żejt għall-piż ta’ materjal niexef.

▼M20

Artikolu 7

Għandhom japplikaw id-dispożizzjonijiet Komunitarji li jirrigwardaw il-preżenza tal-kontaminanti.

Rigward is-solventi aloġenati, il-limiti għall-kategoriji kollha taż-żjut taż-żebbuġa huma kif ġej:

▼B

Artikolu 8

1.  L-Istati Membri għandhom jgħarrfu lill-Kummisjoni bil-miżuri meħuda għall-implimentazzjoni ta’ dan ir-Regolament.

2.  L-Istati Membri għandhom jibagħtu lill-Kummissjoni, fil-bidu ta’ kull nofs sena, prospett tat-tagħrif analitiku li jkollu x’jaqsam mat-testijiet imwettqa matul in-nofs sena ta’ qabel.

Ir-riżultati għandhom jitqiesu mill-Kumitat ta’ Ġestjoni għaż-Żjut u x-Xaħmijiet skond il-proċedura stabbilita f’Artikolu 39 tar-Regolament Nru 136/66/KEE.

Artikolu 9

Ir-Regolament (KEE) Nru 1058/77 huwa b’dan il-mezz revokat.

Artikolu 10

1.  Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fit-tielet jum wara l-pubblikazzjoni tiegħu fil-Ġurnal Uffiċjali ta l-Komunitajiet Ewropej.

Iżda, il-metodu stabbilit f’Anness XII għandu japplika ►M1  mill-1 ta’ Novembru 1992 ◄ , għajr sa fejn għandhom x’jaqsmu l-operazzjonijiet marbuta mas-sistema ta’ intervent.

▼M5

Dak il-metodu ma għandhux japplika għaż-żejt taż-żebbuġa verġni lest għas-suq qabel l-1 ta’ Novembru 1992.

▼B

2.  Dan ir-Regolament ma għandux japplika għaż-żejt taż-żebbuġa u għaż-żejt tal-fdal taż-żebbuġa ppakkjat qabel id-dħul fis-seħħ ta’ dan ir-Regolament u mpoġġi fis-suq sal-31 ta’ Ottubru 1992.

Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u għandu japplika direttament fl-Istati Membri kollha.

---

ANNESSI

Sommarju

▼M23

---

L-ANNESS I

KARATTERISTIĊI TAŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA

▼M20

---

ANNESS Ia

Il-Kampjunar taż-żejt taż-żebbuġa jew taż-żejt taż-żebbuġa pomace ikkunsinnati f'pakkeġġi immedjati li ma jaqbżux il-100 litru

Dan il-metodu ta' kampjunar japplika għall-kunsinni taż-żejt taż-żebbuġa jew taż-żejt taż-żebbuġa pomace li ma jaqbżux il-125000 litru, imqiegħda f'pakkeġġi li ma jaqbżux il-100 litru.

Jekk il-kunsinna taqbeż il-125000 litru, tiġi ssubdiviża f'lottjiet ta' 125000 litru jew taħthom. Jekk il-kunsinna tkun inqas minn 125000 litru, għandha tikkostitwixxi lott wieħed. TIl-metodu għandu mbagħad jiġi applikat għal kull lott.

In-numru minimu tal-kampjuni primarji li jrid jittieħed jiġi stabbilit mid-daqs tal-lott skond it-tabella ddikjarata fil-punt 1.

Id-daqs tal-kampjun primarju jiġi stabbilit fuq il-bażi tal-kapaċità tal-pakkeġġjar immedjat, skond it-tabella ddikjarati fil-punt

Il-kunsinna, il-kampjun primarju u l-kampjun tal-laboratorju għandhom ifissru d-definizzjonijiet mogħtija fl-istandard EN ISO 555.

“Lott” għandu jfisser sett ta' unitajiet tal-bejgħ li jiġu prodotti, iffabbrikati u ppakkjati f'ċirkostanzi hekk illi ż-żejt li jkun jinsab f'kull unita tal-bejgħ hija kkunsidrata li tkun omoġenja fit-termini tal-karatteristiċi analitiċi kollha.

1.   IN-NUMRU TAL-KAMPJUNI PRIMARJI LI JRID JITTIEĦED

In-numru minimu tal-kampjuni primarji li jrid jittieħed irid jiġi stabbilit mid-daqs tal-lott, skond it-tabella li ġejja:

Il-pakki immedjati magħżula għalbiex jagħmlu kampjun primarju jridu jkunu maġenb xulxin fil-lott.

F'każijiet ta' dubju, l-Istati Membri għandhom iżidu n-numru ta' kampjuni primarji li jridu jittieħdu.

2.   IL-KONTENUT TAL-KAMPJUNI PRIMARJI

2.1

Il-kampjuni primarji jrid ikun fihom dan li ġej: Meta l-pakkeġġjar immedjat ikollu kapaċità ta': Il-kampjun prinċipali għandu jinkludi żejt mill: a)  5 litri jew iktar a)  3 pakki immedjati b)  3 litri jew iktar imma inqas minn 5 litri b)  3 pakki immedjati c)  2 litri jew iktar imma inqas minn 3 litri c)  3 pakki immedjati d)  litru 1 jew iktar imma inqas minn 2 litri d)  6 pakki immedjati e)  0,75 ta' litru jew iktar imma inqas minn litru e)  6 pakki immeedjati f)  inqas minn 0,75 ta' litru f)  tliet darbiet iż-żejt min-numru minimu tal-pakki b'kapaċità totali ta' iktar minn 1,5 litri

2.2

Il-kampjuni primarji jridu jinżamu fil-pakkeġġjar immedjat sal-waqt ta' l-analiżi. Iż-żejt fil-kampjuni primarji għandu mbagħad, skond kif japplika, jiġi ssuddiviż fi tliet kampjuni tal-laboratorju sabiex jitwettqu: (a) l-analiżijiet riferiti fl-Annessi II, III, IX u X, (b) l-analiżi riferita fl-Anness XII, (ċ) l-analiżijiet l-oħra.

2.3	Il-pakki li jikkostitwixxu kampjun primarju għandhom jiġu ssuddiviżi skond il-roċeduri tal-kontroll ipprovvduti fil-liġijiet nazzjonali.

3.   L-ANALIŻIJIET U R-RIŻULTATI

▼M20

---

ANNESS Ib

IS-SIĠRA TAD-DEĊIŻJONIJIET GĦALBIEX JIĠI VVERIFIKAT JEKK KMPJUN TAŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA HUX KONSISTENTI MAL-KATEGORIJA DDIKJARATA

L-analiżi għalbiex jiġi vverifikat jekk żejt taż-żebbuġa jew żejt taż-żebbuġa pomace jkunux konsistenti mal-kategorija ddikjarata jista' jiġi midħul għalih:

L-analiżijiet li għandhom x'jaqsmu mal-kontaminati meħtieġa sabiex tiġi vverifikata l-konformità ma' l-istandards tal-Komunità Ewropea jridu jitwettqu separatament.

Is-siġra tad-deċiżjonijiet tapplika għall-kategoriji kollha taż-żejt taż-żebbuġa u taż-żejt taż-żebbuġa pomace. Tikkonsisti mit-tabelli enumerati minn 1 sa 11 li jridu jiġu avviċinati fuq il-bażi tal-kategorija ddikjarata taż-żejt interessat fl-ordni ddikjarata fit-tabella ġenerali.

Il-muftieħ għat-tabelli ġenerali sal-11:

---

Appendiċi 1

It-tabella ta' l-ekwivalenza bejn l-annessi ma' dan ir-Regolament u l-analiżijiet speċifikati fis-siġra tad-deċiżjonijiet

---

Appendiċi 2

It-Tabella 1

It-Tabella 2

It-Tabella 3

It-Tabella 4

It-Tabella 7

Tabella 8

Tabella 11

▼B

---

ANNESS II

▼M21

DETERMINAZZJONI TA’ L-AĊIDI GRASSI LIBERI, METODU FIL-KIESAĦ

▼B

1.   DETERMINAZZJONI TAL-AĊIDITÀ

Determinazzjoni tal-aċidi grassi liberi fiż-żjut taż-żebbuġa. Il-kontenut tal-aċidi grassi liberi jitkejjel bħala aċidità kkalkolata b’mod konvenzjonali.

1.1.   Prinċipju

Jiddewweb kampjun f’taħlita ta’ solventi u l-aċidi grassi liberi preżenti jiġu ttitrati billi tintuża soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju.

1.2.   Reaġenti

Ir-reaġenti kollha għandhom jkunu ta’ kwalità analitika magħrufa u l-ilma wżat għandu jkun jew iddistillat jew ta’ purità ekwivalenti.

1.2.1.

Eteri tad-Dijetill ether; 95 % etanol (v/v), taħlita ta’ partijiet ugwali bil-volum. Nota: L-eteru tad-dietill jieħu n-nar malajr u jista’ jifforma perossidi splussivi. Għandha tingħata attenzjoni speċjali matul l-użu tiegħu. Innewtralizza preċiżament fil-mument tal-użu b’soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju (1.2.2), biż-żjieda ta’ 0,3 ml ta’ soluzzjoni ta’ phenolpthalein (1.2.3) għal kull 100 ml ta’ taħlita. Nota: Jekk ma jkunx possibli li jintuża l-eteru tad-dietill, tista’ tintuża taħlita ta’ solventi bl-etanol u t-toluene. Jekk meħtieġ, l-etanol jista jiġi mibdul bi propanol-2.

1.2.2.

Soluzzjoni etanolika titrata tal-idrossidu tal-potassju, c(KOH) xi 0,1 mol/l jew, jekk meħtieġ, c(KOH) xi 0,5 mol/l. Il-konċentrazzjoni eżatta tas-soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju għandha tkun magħrufa u kkontrollata immedjatamement qabel tintuża. Uża soluzzjoni li għallinqas tkun ġiet ippreparata ħamest ijiem qabel l-użu u mferragħ ġewwa flixkun kannella tal-ħġieġ b’tapp tal-gomma. Is-soluzzjoni għandha tkun mingħajr kulur jew lewn it-tiben. Nota: Soluzzjoni stabbli mingħajr kulur tal-idrossidu tal-potassju tista’ tiġi ppreparata kif ġej. Agħlli 1 000 ml ta’ etanol flimkien ma’ 8 g tal-idrossidu tal-potassju u 0,5 g ta’ ċana tal-aluminju u kompli għalli taħt rifluss għal siegħa. Iddistilla minnufih. Dewweb il-kwantità meħtieġa tal-idrossidu tal-potassju fid-distillat. Ħallih għal ftit jiem u ferra’ l-likwidu ċar tal-wiċċ mid-depożitu ta’ karbont tal-potassju. Is-soluzzjoni tista’ tiġi ppreparata wkoll mingħajr distillazzjoni kif ġej: ma’ 1 000 ml ta’ etanol żid 4 ml ta’ aluminju butylate u ħalli t-taħlita toqgħod għal xi ftit jiem. Ferragħ il-likwidu tal-wiċċ u dewweb il-kwantità meħtieġa tal-idrossidu tal-potassju. Is-soluzzjoni hija lesta biex tintuża.

1.2.3.

Soluzzjoni ta’ 10 g/l ta’ phenolphthalein ġewwa 95 sa 96 % ta’ etanol (v/v) jew alkaline blue, (fil-każ ta’ grassi b’kulur qawwi) soluzzjoni ta’ 20 g/l ġewwa 95 sa 96 % ta’ etanol (v/v).

1.3.   Apparat

Tagħmir normali tal-laboratorju li jinkludi:

1.3.1.

miżien analitiku;

1.3.2.

flask koniku ta’ 250 ml;

1.3.3.

buretta ta’ 10 ml, gradata f’0,05 ml.

1.4.   Il-Proċedura

1.4.1.

Il-preparazzjoni tal-kampjun għall-ittestjar (Wettaq it-test fuq il-kampjun iffiltrat. Meta l-umdità u l-impuritajiet flimkien huma anqas minn 1 %, uża l-kampjun mingħajr trattament addizzjonali; meta jaqbżu l-1 %, dan għandu jiġi ffiltrat.)

1.4.2.

Teħid tal-kampjun Ħu kampjun skond in-numru aċidiku preżunt skond it-tabella li ġejja: Valur aċidiku mistenni Piż tal-kampjun (g) Preċiżjoni tal-użin (g) < 1 20 0,05 1 to 4 10 0,02 4 to 15 2,5 0,1 15 to 75 0,5 0,001 > 75 0,01 0,0002 Iżen il-kampjun fil-flask koniku (1.3.2).

1.4.3.

Determinazzjoni Dewweb il-kampjun (1.4.2) f’50 sa 150 ml tat-taħlita nnewtralizzata minn qabel tal-eteru tad-dietill u etanol (1.2.1). Ittitra filwaqt li tħawwad ma’ soluzzjoni 0,1 mol/l tal-idrossidu tal-potassju (1.2.2) (ara Nota 2) sakemm jinbidel l-indikatur (il-kulur roża tal-phenolphtalein jibqa’ għal mill-inqas għaxar minuti). Nota 1. Is-soluzzjoni etanolika ttitrata tal-idrossidu tal-potassju (1.2.2) tista’ tiġi sostitwita b’soluzzjoni milwiema tal-idrossidu tal-potassju jew tas-sodju sakemm il-volum ta’ ilma introdott ma jwassalx għas-separazzjoni tal-fażi. Nota 2. Jekk il-kwantità ta’ soluzzjoni 0,1 mol/l tal-idrossidu tal-potassju meħtieġa taqbeż 10 ml, uża s-soluzzjoni 0,5 mol/l. Nota 3.Jekk is-soluzzjoni ssir mċajpra matul it-titrazzjoni, żid biżżejjed solventi (1.2.1) biex tikseb soluzzjoni ċara.

1.5.   Aċidità: espressa bħala perċentwali tal-aċidu oleiku

L-aċidità bħala perċentwali bil-piż hija ugwali għal:

fejn:

V

=

il-volum tas-soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju ttitrata wżata, f’millimetri;

ċ

=

il-konċentrazzjoni eżatta f’moli għal kull litru tas-soluzzjoni ttitrata tal-idrossidu tal-potassju wżata;

M

=

il-piż molari fi grammi għal kull mol ta’ aċidu wżat biex tesprimi r-riżultat (= 282);

m

=

il-piż fi grammi tal-kampjun.

Ħu bħala r-riżultat, il-medja aritmetika ►M6  ta’ żewġ kalkulazzjonijiet ◄ imwettqa.

---

ANNESS III

DETERMINAZZJONI TAL-VALUR TAL-PEROSSIDU

1.   SKOP

Dan l-Istandard jiddeskrivi metodu għall-istabbilizzazzjoni tal-valur ta’ perossidu ta’ żjut u xaħmijiet

2.   QASAM TA’ APPLIKAZZJONI

Dan l-Istandard huwa applikabbli għaż-żjut u x-xaħmijiet tal-annimali u l-ħxejjex

3.   DEFINIZZJONI

Il-valur tal-perossidu huwa l-kwantità ta’ dawk is-sostanzi fil-kampjun, espressa f’termini ta’ milliekwivalenti ta’ ossiġenu attiv għal kull kilogramma, li jossidaw il-jodju tal-potassju taħt il-kondizzjonijiet ta’ operazzjoni deskritti.

4.   PRINĊIPJU

Trattament tal-porzjon tat-test, f’soluzzjoni fl-aċidu aċetiku u kloroforma, b’soluzzjoni ta’ jodju tal-potassju. Titrazzjoni tal-jodju meħlus b’soluzzjoni standardizzata ta’ sodium thiosulphate.

5.   APPARAT

It-tagħmir użat għandu jkun ħieles minn sostanzi ta’ riduzzjoni jew ossidanti.

Nota: Tidlikx l-uċuħ tal-qiegħ b’xi grass

5.1.	Mgħarfa tal-ħġieġ ta’ 3 ml.

5.2.	Flasks, bl-għonq u t-tapp immolati, ta’ kapaċità ta’ xi 250 ml, imnixxfin minn qabel u mimlija b’gass pur, xott u inerti (nitroġenu jew, jekk jista’ jkun, diossidu tal-karbonju).

5.3.	Buretta ta’ 25- jew 50-ml, gradata b’0,1 ml.

6.   REAĠENTI

6.1.	Kloroforma, kwalità ta’ reaġent analitiku, meħlus mill-ossiġenu billi jitbaqbaq minn ġewwa fih kurrent ta’ gass pur, xott u inerti.

6.2.	Aċidu aċetiku glaċjali, kwalità ta’ reaġent analitiku, meħlus mill-ossiġenu billi jitbaqbaq minn ġewwa fih kurrent ta’ gass pur, xott u inerti.

6.3.	Jodur tal-potassju, soluzzjoni milwiema saturata, ppreparata dan l-aħħar, ħielsa mill-jodju u mill-iodates

6.4.	Soluzzjoni milwiema standardizzata bi preċiżjoni ta’ sodium thiosulphate ta’ 0,01 jew 0,002 Mol/L, standardizzata eżatt qabel tintuża.

6.5.	Dispersjoni milwiema ta’ soluzzjoni ta’ lamtu ta’ 10 g/l, imħejjija riċentament minn lamtu naturali li jinħall.

7.   KAMPJUN

Ara li l-kampjun jitneħħa u jinżamm il-bogħod mid-dawl, jinżamm kiesaħ ġewwa reċipjenti tal-ħġieġ mimlijin għal kollox, issiġillati ermetikament b’tappijiet tal-ħġieġ immolati jew tas-sufra.

8.   PROĊEDURA

It-test għandu jsir f’dawl diffuż jew f’dawl artifiċjali. Iżen f’magħrfa tal-ħġieġ (5.1) jew, fin-nuqqas tagħha, fi flask (5.2), sa l-eqreb 0,001 g, piż tal-kampjun skond it-tabella li ġejja, skond il-valur ta’ perossidu mistenni:

Neħħi t-tapp ta’ flask (5.2) u daħħal l-imgħarfa tal-ħġieġ li jkun fiha l-porzjon għall-ittestjar. Żid 10 ml ta’ kloroforma (6.1). Dewweb malajr il-parti għall-ittestjar billi tħawwadha Żid 15 ml ta’ aċidu aċetiku (6.2), u mbagħad 1 ml ta’ soluzzjoni ta’ jodur tal-potassju (6.3). Daħħal malajr it-tapp, ħawwadha għal minuta, u ħalliha għal ħames minuti eżatt il-bogħod mid-dawl b’temperatura ta’ minn 15 sa 25 oC.

Żid bejn wieħed u ieħor 75 ml ta’ ilma ddistillat. Ittitra l-jodju meħlus bis-soluzzjoni ta’ sodium thiosulphate (6.4) (soluzzjoni ta’ 0,002 N għall-valuri mistennija ta’ inqas minn 12, u soluzzjoni ta’ 0,01 N għal valuri mistennija ’l fuq minn 12) filwaqt li tħawwad sewwa, billi tuża soluzzjoni ta’ lamtu (6.5) bħala indikatur.

Wettaq żewġ determinazzjonijiet fuq l-istess kampjun tat-test.

Wettaq blank test fl-istess waqt. Jekk ir-riżultat tal-blank test jaqbeż 0,05 ml ta’ soluzzjoni ta’ 0,01 ta’ sodium thiosulphate (6.4), ibdel ir-reaġenti impuri.

9.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI:

Il-valur tal-perossidu (PV), f’milliekwivalenti ta’ ossiġenu attiv għal kull kilogramma, jingħata bil-formula:

fejn:

V

=

in-numru ta’ ml ta’ soluzzjoni standardizzata ta’ sodium thiosulphate (6.4) użat għat-test, korrett sabiex jagħti kas tal-blank test;

T

=

il-molarità eżatta tas-soluzzjoni ta’ sodium thiosulphate (6.4) wżata;

m

=

il-piż fi g. tal-porzjon tat-test.

Ħu il-medja aritmetika taż-żewg determinazzjonijiet imwettqa bħala r-riżultat.

▼M21

---

ANNESS IV

DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TAX-XAMA’ PERMEZZ TAL-KROMATOGRAFIJA TAL-GASS B’KOLLONA KAPILLARI

1.   SKOP

Dan il-metodu jiddeskrivi proċedura għad-determinazzjoni tal-kontenut ta’ xama’ fiż-żjut taż-żebbuġa. Ix-xama’ jinfired skond l-għadd ta’ atomi tal-karbonju. Dan il-metodu jista’ jintuża partikularment biex issir distinzjoni bejn iż-żejt taż-żebbuġ miksub permezz tat-tagħsir u bejn dak miksub permezz ta’ l-estrazzjoni (żejt tal-fdal).

2.   PRINĊIPJU

Il-materja grassa, miżjuda b’livell standard intern xieraq, tiġi frazzjonata bil-kromatografija fuq kolonna ta’ ġell idratat tas-silika; l-ewwel frazzjoni miksuba fil-kondizzjonijiet ta’ prova (bil-polarità tiegħu tkun inqas minn dik tat-triglycerides) jiġi rkuprat, imbagħad jiġi analizzat direttament bil-kromatografija tal-gass fuq kolonna kapillari.

3.   APPARAT

3.1.	Flask Erlenmeyer ta’ 25 ml.

3.2.	Kolonna tal-ħġieġ għall-kromatografija tal-gass, ta’ diametru intern ta’ 15,0 mm, twila bejn 30 u 40 cm, u mgħammra b’vit.

3.3.

Apparat ta’ kromatografija tal-gass addattat għall-funzjonament bil-kolonna kapillari, mgħammar b’sistema għall-intoduzzjoni diretta fil-kolonna, u magħmul minn: 3.3.1. Kompartiment termostatiku għall-kolonni, mgħammar bi programmatur tat-temperatura. 3.3.2. Injettur kiesaħ għall-introduzzjoni diretta fil-kolonna. 3.3.3. Indikatur tal-jonizzazzjoni tal-fjamma u konvertitur-amplifikatur. 3.3.4. Reġistratur-integratur adattat għall-konvertitur-amplifikatur (3.3.3.), b’rata ta’ rispons ta’ mhux aktar minn sekonda, u b’velocità tal-karta varjabbli. (Wieħed jista’ juża wkoll sistemi informatiċi li jippermettu l-ġbir tad-dejta tal-kromatografija bil-gass permezz ta’ kompjuter.) 3.3.5. Kolonna kapillari tal-ħġieġ jew tas-silika mdewba, twila bejn 8 u 12 m, ta’ diametru intern ta’ bejn 0,25 u 0,32 mm, miksija minn ġewwa b’likwidu, u bi ħxuna uniformi ta’ bejn 0,10 u 0,30 μm. (Likwidi għat-tifrix adattati għall-użu, tat-tipi SE52 jew SE54 fis-suq.)

3.4.	Mikrosiringa għall-introduzzjoni diretta fil-kolonna ta’ 10 μl, mgħammra b’labra iebsa.

3.5.	Vibratur ta’ l-elettriku.

3.6.	Evaporatur ċirkolari.

3.7.	Muffle furnace.

3.8.	Miżien analitiku li jiggarantixxi preċiżjoni ta’ + 0,1 mg.

3.9.	L-apparat tal-ħġieġ normali tal-laboratorju.

4.   REAĠENTI

4.1.

Ġell tas-silika tad-daqs ta’ fraka ta’ bejn 60 u 200 μm. Poġġi l-ġell fil-forn f’temperatura ta’ 500 °C għal talanqas erba’ sigħat. Kessħu mill-ġdid, imbagħad żidlu l-ilma fi kwantità ta’ 2 % tal-ġell tas-silika mtella’. Ħawwad sew it-taħlita omoġenizzata. Ħalli fid-dlam għal talanqas 12-il siegħa qabel l-użu.

4.2.	n-hexane, għall-kromatografija.

4.3.	Eter etiliku, għall-kromatografija

4.4.	n-Heptane, għall-kromatografija.

4.5.	Soluzzjoni standard ta’ lauryl arachidate, f’0,1 % (m/V) fil-hexane (skond il-livell standard intern). (Wieħed jista’ juża wkoll palmitate tal-palmitil jew inkella methyl stearate) 4.5.1. Soudan 1 (1-phenyl-azo-2-naphthol)

4.6.	Gass portatur: idroġenu jew elju pur għall-kromatografija tal-gass.

4.7.	Gassijiet awżiljari: — idroġenu pur għall-kromatografija tal-gass; — arja safja, għall-kromatografija tal-gass.

5.   PROĊEDURA

5.1.   Tħejjija tal-kolonna kromatografika

Dendel 15 g ta’ ġell tas-silika (4.1) fl-n-hexane (4.2) u daħħlu fil-kolonna (3.2). Ħallih joqgħod spontanjament, u kompli t-tqegħid bl-għajnuna ta’ shaker elettroniku (3.5) biex is-saff kromatografiku jsir aktar omoġenju. Saffi 30 ml ta’ n-hexane biex tneħħi l-impuritajiet li jista’ jkun hemm. Iżen eżatt 500 mg mill-kampjun bl-għajnuna tal-miżien (3.8.) fl-Erlenmeyer ta’ 25 ml (3.1.), u żid il-kwantità meħtieġa ta’ standard intern (4.5.) skond il-kontenut previst ta’ xama’. Per eżempju, żid 0,1 mg ta’ lauryl arachidat fil-każ taż-żejt taż-żebbuġa, u minn 0,25 sa 0,5 mg fil-każ taż-żejt tal-fdal taż-żebbuġa. Ittrasferixxi l-kampjun hekk ippreparat għall-kolonna kromatografika bl-għajnuna ta’ żewġ porzjonijiet ta’ 2 ml ta’ n-hexane (4.2.).

Ħalli s-solvent inixxi sa 1 mm ’il fuq mill-ogħla livell ta’ l-assorbent, imbagħad saffi 70 ml addizzjonali ta’ n-hexane sabiex tneħħi l-n-alcanes li jkunu preżenti naturalment. Imbagħad ibda l-eluzzjoni kromatografika billi tiġbor 180 ml tat-taħlita n-hexane/eter etiliku, b’proporzjon 99:1, filwaqt li tinżamm rata ta’ madwar 15-il taqtira kull 10 sekondi. L-eluzzjoni tal-kampjun għandha ssir f’temperatura ta’ l-ambjent ta’ 22 °C + 4.

Noti:

Nixxef il-frazzjoni hekk miksuba fl-evaporatur ċirkolari (3.6.) sakemm is-solvent prattikament ikun tneħħa għalkollox. Neħħi l-aħħar 2 ml tas-solvent bl-għajnuna ta’ kurrent dgħajjef ta’ nitroġenu; imbagħad żid 2-4 ml ta’ n-heptane.

5.2.   Analiżi bil-kromatografija tal-gass

5.2.1.   Proċeduri preliminari

Waħħal il-kolonna mal-kromatografu tal-gass (3.3.) billi tqabbad it-terminal ta’ dħul fis-sistema on-column u t-terminal ta’ ħruġ ma’ l-indikatur. Agħmel verifika ġenerali ta’ l-apparat ta’ kromatografija bil-gass (l-operazzjoni taċ-ċirkwiti tal-gass, l-effiċjenza ta’ l-indikatur u tas-sistema ta’ reġistrazzjoni, eċċ.).

Jekk il-kolonna tkun qiegħda tintuża għall-ewwel darba, l-ewwel għandu jsir il-kondizzjonament tagħha. Għaddi nixxija rqiqa ta’ gass fil-kolonna, imbagħad ixgħel l-apparat tal-kromatografija tal-gass. Saħħanha bil-mod sakemm wara xi 4 sigħat tilħaq temperatura ta’ 350 °C. Żomm din it-temperatura għal talanqas sagħtejn, imbagħad għaddi għall-aġġustament ta’ l-apparat biex ikun jista’ jitħaddem (l-aġġustar tar-rata ta’ ċirkolazzjoni tal-gassijiet, it-tqabbid tal-fjamma, it-tqabbid mar-reġistratur elettroniku (3.3.4.), l-aġġustar tat-temperatura ta’ l-ambjent għall-kolonna, għall-indikatur, eċċ.) u rreġistra s-sinjal għal sensibbiltà talanqas darbtejn ikbar minn dik prevista għat-twettiq ta’ l-analiżi. Il-linja bażilari għandha tkun lineari, mingħajr l-ebda tip ta’ quċċata, u ma jista’ jkollha l-ebda sinjal ta’ devjazzjoni.

Devjazzjoni rettilineari negattiva tindika li l-konnessjonijiet tal-kolonna mhumiex sew; devjazzjoni pożittiva tindika li l-kolonna ma ġietx ikkondizzjonata kif suppost.

5.2.2.   Għażla tal-kondizzjonijiet tat-tħaddim

B’mod ġenerali, il-kundizzjonijiet tat-tħaddim li għandhom ikunu osservati huma dawn li ġejjin:

Dawn il-kundizzjonijiet jistgħu jkunu mmodifikati skond il-karatteristiċi tal-kolonna u ta’ l-apparat ta’ kromatografija tal-gass, bil-għan li jinfired ix-xama’ kollu u li jkun hemm riżoluzzjoni sodisfaċenti tal-qċaċet (ara l-figura); il-periodu ta’ retenzjoni ta’ l-standard intern C32 għandu jkun ta’ 18-il minuta + 3. L-aktar quċċata tax-xama’ rappreżentattiva għandha tidher f’talanqas 60 % ta’ l-iskala.

Il-parametri ta’ l-integrazzjoni tal-qċaċet għandhom jiġu ddeterminati b’tali mod li tinkiseb evalwazzjoni korretta tas-superfiċji tal-qċaċet ikkunsidrati.

Nota:Minħabba t-temperatura finali għolja, hija permessa devjazzjoni pożittiva ta’ mhux aktar minn 10 % ta’ l-iskala sħiħa.

5.3.   Eżekuzzjoni ta’ l-analiżi

Tella’ 1 μl mis-soluzzjoni bl-għajnuna tal-mikrosiringa ta’ 10 μl; neħħi l-plunger tas-siringa sabiex il-labra tibqa’ vojta. Daħħal il-labra fl-injettur, u wara sekonda jew tnejn, injetta malajr; wara madwar 5 sekondi, oħroġ il-labra bil-mod.

Agħmel ir-reġistrazzjoni sa l-eluzzjoni totali tax-xama’.

Il-linja bażilari għandha dejjem tissodisfa l-kundizzjonijiet stipulati.

5.4.   Identifikazzjoni tal-qċaċet

L-identifikazzjoni tal-qċaċet differenti għandha ssir abbażi tal-ħin ta’ retenzjoni, skond tqabbil ma’ taħlitiet ta’ xama’ b’ħinijiet ta’ retenzjoni magħrufin, analizzati fl-istess kundizzjonijiet.

Il-Figura turi kromatogramma tax-xama’ ta’ żejt taż-żebbuġa verġni.

5.5.   Evalwazzjoni kwantitattiva

Ikkalkola s-superfiċji tal-qċaċet ta’ l-istandard intern, kif ukoll ta’ l-esters alifatiċi minn C40 sa C46, bl-għajnuna ta’ l-integratur.

Ikkalkola l-kontenut tax-xama’ ta’ kull wieħed mill-esters, f’mg/kg ta’ xaħam, skond il-formula:

Fejn:

Ax

=

is-superfiċje tal-quċċata ta’ kull ester, f’millimetri kwadri;

As

=

is-superfiċje tal-quċċata ta’ l-istandard intern, f’millimetri kwadri;

ms

=

il-massa ta’ l-istandard intern miżjud, f’milligrammi;

m

=

il-massa tal-kampjun meħud għall-analiżi, fi grammi.

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

Indika t-total tal-kontenut tat-tipi differenti ta’ xama’ minn C40 sa C46, fi mg/kg ta’ materja grassa (ppm).

Nota:Il-komponenti li għandhom jiġu kkwantifikati jirreferu għall-qċaċet b’numru biż-żewġ tal-karbonju, bejn l-estri C40 u C46, skond l-eżempju tal-kromatogramma tax-xama’ taż-żejt taż-żebbuġa indikat fil-figura li ġejja. Jekk l-ester C46 jidher darbtejn, biex jiġi identifikat, jaqbel li ssir analiżi tal-frazzjoni tax-xama’ f’żejt tal-fdal taż-żebbuġa fejn il-quċċata C46 huwa faċilment identifikabbli għax għandha maġġoranza ċara.

Ir-riżultati għandhom ikunu espressi sa punt deċimali wieħed.

FIGURA

Kromatogramma tax-xama’ f’żejt taż-żebbuġa ( 5 )

Tifsir:

I.S.

=

Lauryl arachidate

1.

=

Diterpenic esters

2 + 2′

=

Esters C40

3 + 3′

=

Esters C42

4 + 4′

=

Esters C44

5.

=

Esters C46

6.

=

Sterol esters u alkoħol triterpenic

---

APPENDIĊI

Determinazzjoni tal-veloċità lineari tal-gass

Injetta minn 1 sa 3 μl metanu (jew propan) fl-apparat kromatografiku tal-gass, wara l-aġġustament tiegħu għall-kundizzjonijiet normali ta’ l-operazzjoni. Żomm kont tal-ħin li l-gass jieħu biex jgħaddi mill-kolonna, mill-mument li jiġi injettat sakemm tintlaħaq il-quċċata (tM).

Il-veloċità lineari f’ċm/sek. hija mogħtija bil-formula L/tM, fejn L huwa t-tul tal-kolonna f’ċm, u tM huwa l-ħin imkejjel f’sekondi.

▼B

---

L-ANNESS V

DETERMINAZZJONI TAL-KOMPOŻIZZJONI U L-KONTENUT TA’ STEROLI BIL-KROMATOGRAFIJA TAL-KOLONNA KAPILLARI TAL-GASS

1.   SKOP

Il-metodu jiddesskrivi proċedura għad-determinazzjoni ta’ kontenut ta’ steroli individwali u totali ta’ sostanzi grassi.

2.   PRINĊIPJU TAL-METODU

Is-sostanza grassa, bil-ß-cholestanol miżjud bħala standard intern, tiġi ssapunifikata bl-idrossidu tal-potassju f’soluzzjoni etanolika u s-sostanzi li ma jistgħux jiġu saponifikati jiġu estratti eteru tal-etill.

Il-frazzjoni tal-isteroli tiġi mifruda mill-estratt li ma jistax jiġi ssapunifikat bil-kromatografija fuq pjanċa talġell tas-silika bażika. L-isteroli rkuprati mill-ġell tas-silika jiġu ttrasformati f’ eteri tat-trimethyl-silyl u dawn jiġu analizzati bil-kromatografija ta’ kolonna kapillari tal-gass.

3.   APPARAT

3.1.	Flask ta’ 250ml b’kondensur ta’ rifluss b’ġonot tal-ħġieġ immolati.

3.2.	Njiebet ta’ separazzjoni ta’ 500 ml.

3.3.	Flasks ta’ 250 ml.

3.4.	Apparat komplut għall-analiżi bi kromatografija ta’ saff irqiq bl-użu ta’ pjanċi tal-ħġieġ 20 × 20 ċm.

3.5.	Lampa ultravjola b’tul ta’ mewġa ta’ 366 jew 254 nm.

3.6.	Mikrosiringi ta’ 100 ml u 500 ml.

3.7.	Filtru ċilindriku b’septum poruż G3 (porożità 15 sa 40 μm) ta’ djametru ta’ bejn wieħed u ieħor 2 ċm u fond ta’ xi 5 cm, bi tqabbid xieraq għall-filtrazzjoni taħt vakwu u ġonta tat-tip male 12/21 tal-ħġieġ immolat.

3.8.	Flask vakwu koniku ta’ 50 ml b’ġonta tat-tip female 12/21 ta’ ħġieġ immolat li tista’ titwaħħal fuq il-lembut filtru (3.7).

3.9.	Tubu tat-testijiet tal-ħġieġ ta’ 10 ml. b’bażi ġejja għax-xejn għax-xejn u tapp li jissiġilla.

3.10.

Kromatografija tal-gass addattata sabiex tintuża ma’ kolonna kapillari, ipprovduta b’sistema li tifred magħmula minn: 3.10.1. kompartiment termostatiku għall-kolonni li jifilħu jżommu t-temperatura mixtieqa bi preċiżjoni ta’ ± 1 oC; 3.10.2. unità ta’ vaporizzazzjoni bit-temperatura regolabbli b’element vaporizzanti tal-ħġieġ persilanizzat; 3.10.3. Didekter tal-jonizzazzjoni tal-fjamma u amplifier-converter; 3.10.4. rikorder-integrator addattat għall-użu ma’ l-amplifier-converter (3.10.3) li għandu ħin ta’ rispons ta’ mhux aktar minn sekonda u veloċità varjabbli tal-karta.

3.11.

Kolonna kapillari tal-ħġieġ jew tal-fused-silica twila 20 sa 30 m, dijametru intern ta’ 0,25 sa 0,32mm, miksija għal kollox b’likwidu SE-52 jew SE-54 jew ekwivalenti bi ħxuna uniformi ta’ bejn 0,10 u 0,30 mm.

3.12.

Mikrosiringa għall-kromatografija bil-gass ta’ 10 ml b’labra iebsa.

4.   REAĠENTI

4.1.	Idrossidu tal-potassju, bejn wieħed u ieħor soluzzjoni etanolika ta’ 2 mol/L. Dewweb 130 g ta’ idrossidu tal-potassju (konċentrazzjoni minima ta’ 85 %), bi ksieħ f’200 ml ta’ ilma ddistillat u mbagħad żid sa litru bl-etanol. Żomm is-soluzzjoni fi fliexken tal-ħġieġ skuri li jagħlqu sewwa.

4.2.	Eteru tad-dietill, purità analitika.

4.3.	Sulfat tas-sodju anidridu, purità analitika.

4.4.	Pjanċi tal-ħġieġ miksija bill-ġell tas-silika, mingħajr indikatur fluworexxenti, bi ħxuna ta’ 0,25 mm (disponibbli kummerċjalment u lesti għall-użu).

4.5.	Idrossidu tal-potassju, soluzzjoni etanolika ta’ 0,2 mol/L. Dewweb 13 g ta’ idrossidu tal-potassju f’20 ml ta’ ilma ddistillat u żid sa litru bl-etanol.

4.6.	Benzene, għall-kromatografija. (Ara 5.2.2).

4.7.	Aċetun, għall-kromatografija. (Ara 5.2.2).

4.8.	Hexane, għall-kromatografija. (Ara 5.2.2).

4.9.	Eteru dietill, għall-kromatografija. (Ara 5.2.2).

4.10.

Kloroforma, purità analitika. (Ara 5.2.2).

4.11.

Soluzzjoni ta’ referenza għal kromatografija ta’ saff irqiq: kolesterol jew phytosterols, soluzzjoni ta’ ►M6  2 % ◄ fil-kloroforma.

4.12.

2,7-dichlorofluorescein, soluzzjoni etanolika ta’ 0,2 %. Ġibha ftit bażika billi żżid xi qtar ta’ soluzzjoni alkoħolika ta’ 2 mol/L tal-idrossidu tal-potassju.

4.13.

Pyridine anidriduża, għall-kromatografija.

4.14.

Hexamethyl disilazane.

4.15.

Trimethylchlorosilane.

4.16.

Soluzzjonijiet ta’ referenza ta’ eteri sterol trimethylsilyl. Li għandhom jiġu mħejjija fil-ħin tal-użu minn steroli jew taħlitiet puri ta’ steroli minn żjut li fihom dawn l-isteroli.

4.17.

ß-cholestanol, 0,2 % soluzzjoni (m/V) fil-kloroforma (standard intern).

4.18.

Gass carrier: idroġenu u elju, purità tal-kromatografija tal-gass.

4.19.

Gassijiet awżiljarji: — idroġenu, purità tal-kromatografija tal-gass, — arja, purità tal-kromatografija tal-gass.

5.   PROĊEDURA

5.1.

Tħejjija ta’ materji li ma jistgħux jiġu ssaponifikati. 5.1.1. Permezz tal-mikrosiringa ta’ 500μl qiegħed fi flask ta’ 250 ml, volum ta’ soluzzjoni ta’ β-cholestanol ta’ 0,2 % fil-kloroforma (4.17) li fiha jinsab ammont ta’ kolestanol li jikkorrispondi għal bejn wieħed u ieħor 10 % tal-kontenut ta’ sterol tal-alikwota tal-kampjun li għandu jittieħed għad-determinazzjoni Eżempju, għal ħames grammi ta’ kampjun żid 500 μl tas-soluzzjoni 0,2 % α-cholestanol fil-każ ta’ xi żejt taż-żebbuġa u 1 500 μl għaż-żjut ►M6  ————— ◄ żejt taż-żebbuġa pomaca. Evapora sa ma jinxef f’kurrent ta’ nitroġenu u mbagħad iżen bi preċiżjoni 5 g tal-kampjun xott u ffiltrat u qegħedhom fl-istess flask. ►M6  Żjut ◄ li jkun fihom kwantitajiet apprezzabbli ta’ kolesterol jistgħu juru quċċata li jkollha ħin ta’ żamma identiku għal tal-kolestanol. Jekk jiġri dan, il-frazzjoni ta’ sterol tkun trid tiġi analizzata darbtejn bi u mingħajr standard intern ►M6  jew betulinol ikollu jintuża minflok cholestanol. ◄ . 5.1.2. Żid 50 ml ta’ soluzzjoni etanolika ta’ 2 mol/L tal-idrossidu tal-potassju, waħħal il-kondensur ta’ rifluss u saħħan banju Marija sakemm jagħli bil-mod filwaqt li tħawwad il-ħin kollu bis-saħħa sas-saponifikazzjoni (s-soluzzjoni issir ċara). Kompli saħħan għal 20 minuta oħra, mbagħad żid 50 ml ta’ ilma ddistillat għall-parti ta’ fuq tal-kondensur, aqla’ l-kondensur u kessaħ il-flask sa bejn wieħed u ieħor 30 oC. 5.1.3. Ferragħ il-kontenut tal-flask b’mod kwantitattiv f’lembut ta’ separazzjoni ta’ 500 ml filwaqt li tlaħħlaħ spiss bl-ilma ddistillat, li jammonta b’kollox għal bejn wieħed u ieħor 50 ml. Żid bejn wieħed u ieħor 80 ml ta’ eteru tad-dietill, ħawwad bis-saħħa għal bejn wieħed u ieħor 30 sekonda u ħallih joqgħod (Nota 1). Ifred il-parti l-milwiema ta’ isfel billi tiġborha ġewwa tieni lembut ta’ separazzjoni. Agħmel żewġ estrazzjonijiet oħra mill-fażi milwiema bl-istess mod billi tuża 60 sa 70 ml ta’ eteru tad-dietill kull darba. Nota 1. Kwalunkwe emulsjoni tista’ tiġi meqruda biż-żjieda ta’ kwantitajiet żgħar ta’ alkoħol tal-etill jew alkoħol tal-metill permezz ta’ sprej. 5.1.4. Iġbor l-estratti tal-eteru flimkien fl-lembut ta’ separazzjoni u aħsel b’ilma distillat (50 ml kull darba) sakemm l-ilma tal-ħasil jagħti reazzjoni newtrali. Meta jitneħħa l-ilma tal-ħasil, nixxef bis-sulfat tas-sodju anidridu u ffiltra mis-sulfat tas-sodju anidriduż ġewwa flask ta’ 250 ml li jkun intiżen minn qabel, filwaqt li taħsel il-lembut u l-filtru bi kwantitajiet żgħar ta’ eteru tad-dietill. 5.1.5. Iddistilla l-eteru sa ftit ml, u mbagħad nixxef taħt vakwu ħafif jew f’kurrent ta’ nitoġenu, u kompli nixxef ġewwa forn b’temperatura ta’ 100 oC għal bejn wieħed u ieħor kwarta, u mbagħad iżen wara li tkessaħ f’dessikatur.

5.2.

Separazzjoni tal-frazzjoni tal-isterol. 5.2.1. Tħejijja tal-pjanċi bażiċi. Għaddas il-pjanċi tal-ġell tas-silika (4.4) għal kollox fis-soluzzjoni etanolika ta’ 0,2 mol/L ta’ idrossidu tal-potassju (4.5) għal għaxar sekondi, mbagħad erħilhom jinxfu fi fume cupboard għal sagħtejn u fl-aħħar poġġihom f’forn b’temperatura 100 oC għal siegħa: Neħħihom mill-forn u żommhom f’dessikatur tal-klorur tal-kalċju sakemm terġa tiġi bżonnhom (il-pjanċi hekk ittrattati għandhom jintużaw fi żmien 15 il-ġurnata). Nota 2. Meta jintużaw pjanċi tal-ġell tas-silika bażiċi biex tifred il-frazzjoni tal-isterol ma hemmx għalfejn tittratta dawk li ma jissaponifikawx bl-alumina. B’dan il mod il-komposti kollha ta’ natura aċida (aċidi grassi u oħrajn) jinżammu fuq il-linja ta’ rilevament u l-faxxa ta’ steroli hija mifruda b’mod ċar mill-faxxa tal-alkoħol alifatiku u triterpeni. 5.2.2. Qiegħed taħlita ta’ 95:5 (v/v) ta’ benzene/aċetub fil-kompartiment tal-iżvilupp tal-pjanċi sa fond ta’ 1 ċm. Jew inkella tista’ tintuża taħlita ta’ 65:35 (v/v) ta’ hexane/eteru tal-etill. Agħlaq il-kamra b’għata xieraq u ħallihom hekk għal bejn wieħed u ieħor nofs siegħa sabiex jinkiseb l-ekwilibriju ta’ likwidu u fwar. Jistgħu jitpoġġew strippi ta’ filtri tal-karta mgħaddsa fl-eluent fuq il-wiċċ ġewwieni tal-kamra. Dan inaqqas il-ħin ta’ żvilupp bejn wieħed u ieħor b’terz u jġib l-elużjoni tal-komponenti aktar uniformi u regolari. Nota 3. It-taħlita tal-iżvilupp għandha tinbidel għal kull test sabiex jinkisbu kondizzjonijiet ta’ elużjoni perfettament riproduċibbli. 5.2.3. Ħejji soluzzjoni ta’ bejn wieħed u ieħor 5 % ta’ materji li ma jistgħux jiġu ssapunifikati (5.15) fil-kloroforma u, permezz tal-mikrosiringa ta’ 100 ml, irriga pjanċa kromatografika (5.2.1) b’bejn wieħed u ieħor 300 μl 2 ċm minn tarf wieħed f’riga irqieqa u uniformi kemm jista’ jkun. F’linja waħda mar-riga qiegħed 2 sa 3 ml tas-soluzzjoni ta’ referenza ta’ sterol (4.11) fuq tarf wieħed tal-pjanċa sabiex il-faxxa ta’ sterol tkun tista’ tiġi identifikata wara l-iżvilupp. 5.2.4. Qiegħed il-pjanċa fil-kamra tal-iżvilupp mħejjija kif speċifikat f’ 5.2.2. It-temperatura tal-ambjent għandha tinżamm bejn 15 u 20 oC. Agħlaq minnufih il-kamra bl-għatu u ħalli ssir l-elużjoni sakemm il-parti ta’ quddiem tas-solvent tilħaq bejn wieħed u ieħor 1 ċm mit-tarf ta’ fuq tal-pjanċa. Neħħi l-pjanċa mill-kamra tal-iżvilupp u evapora s-solvent f’kurrent ta’ arja sħuna jew billi tħalli l-pjanċa għal ftit ħin taħt għata. 5.2.5. Sprejja l-pjanċa fuq fuq u b’mod uniformi bis-soluzzjoni ta’ 2,7- dichlorofluoroscein. Meta l-pjanċa tiġi osservata taħt dawl ultravjola, l-faxxa ta’ sterol tista’ tiġi identifikata billi tiġi allineata mat-tebgħa miksuba mis-soluzzjoni ta’ referenza. Immarka l-limiti tal-faxxa matul t-truf tal-fluworexxenza b’lapes iswed. 5.2.6. Permezz ta’ spatula tal-metall obrox il-ġell tas-silika fil-parti mmarkata. Qiegħed il-materjal mneħħi imfarrak fin fil-lembut filtru (3.7). Żid 10 ml ta’ kloroforma sħuna, ħawwad bil-galbu bl-ispatula tal-metall u ffiltra taħt vakwu, filwaqt li tiġbor l-iffiltrat fil-flask koniku (3.8) mwaħħal mal-lembut. Aħsel il-fdal fil-lembut tliet darbiet bl —eteru tad-dietill (bejn wieħed u ieħor 10 ml kull darba) filwaqt li tiġbor l-iffiltrat fl-istess flask imwaħħal mal-lembut. Evapora l-iffiltrat għal volum ta’ 4 sa 5 ml, ferragħ is-soluzzjoni li tibqa’ fit-tubu tat-testijiet tal-ħġieġ ta’ 10 ml li tkun intiżnet minn qabel, evapora sa ma tinxef billi ssaħħan bil-mod f’kurrent ħafif ta’ nitroġenu, erġa’ żid bi ftit qtar ta’ aċetun, erġa’ evapora sa ma jinxef, qiegħed f’forn b’temperatura ta’ 105 oC għal bejn wieħed u ieħor 10 minuti u mbagħad ħallih jiksaħ ġewwa dessikatur u iżen. Il-fdal li jibqa fit-tubu tat-testijiet tal-ħġieġ huwa magħmul mill-frazzjoni tal-isterol.

5.3.

It-tħejjija tal-eteru trimethilsili. 5.3.1. Żid ir-reaġent silylation, li huwa magħmul minn taħlita 9:3:1 (v/v/v) ta’ pyridine/hexamethyl disilazane/trimethyl chlorosilane (Nota 4) fil-proporzjon ta’ 50 μl għal kull milligramma ta’ steroli fit-tubu tat-testijiet tal-ħġieġ li jkun fiha l-frazzjoni tal-isterol, mingħajr ma jassorbi umdità (Nota 5). Nota 4. Soluzzjonijiet lesti għall-użu huma disponibbli b’mod kummerċjali. Reaġenti oħra ta’ silanizzazjoni bħal, per eżempju, bis-trimethilsilil, aċetamide tat-trifluor ċ 1 % trimethyl chlorosilane, li għandhom jiġu dilwiti b’volum ugwali ta’ pyridine anidriduż, huma disponibbli wkoll. 5.3.2. Sodd it-tubu tat-testijiet tal-ħġieġ, ħawwad bil-galbu (mingħajr ma taqlibha rasha l-isfel) sakemm l-isteroli jinħallu kollha. Ħalliha toqgħod għal mill-inqas 15-il minuta f’temperatura tal-ambjent u mbagħad iċċentrifuga għal ftit minuti. Is-soluzzjoni ċara hija lesta għall-analiżi ta’ kromatografija tal-gass. Nota 5. L-opalexxenza ħafifa li tista’ tifforma hija normali u ma tikkawża ebda interferenza. Il-formazzjoni ta’ tajjar abjad jew id-dehra ta’ xi kulur roża huma sinjali tal-preżenza ta’ umdità jew ta’ deterjorament tar-reaġent. Jekk dan iseħħ, it-test għandu jerġa’ jsir.

5.4.

Analiżi bil-kromatografija tal-gass. 5.4.1. Operazzjonijiet preliminari, l-ippakkjar tal-kolonni. 5.4.1.1. Waħħal il-kolonna fil-kromatografu tal-gass, billi t-tarf tad-dħul jitwaħħal ma’ l-evaporatur ímwaħħal mas-sistema li tifred u t-tarf tal-ħruġ mad-didekter. Wettaq kontrolli ġenerali fuq l-unità tal-kromatografu tal-gass (tnixxijiet miċ-ċirkuwiti tal-gass, l-effiċjenza tad-didekter, l-effiċjenza tas-sistema ta’ separazzjoni u s-sistema ta’ recording, eċċ.). 5.4.1.2. Jekk il-kolonna tkun qegħda tintuża għall-ewwel darba huwa rrakkomandat li din tiġi soġġetta għal kondizzjonament. Għaddi kurrent ħafif ta’ gass minn ġewwa l-kolonna u mbagħad ixgħel l-unità ta’ kromatografija tal-gass u saħħan bil-mod sa temperatura ta’ mill-inqas 20 oC ogħla mit-temperatura ta’ operazzjoni (Nota 6). Żomm din it-temperatura għal mill-inqas sagħtejn, u mbagħad qiegħed l-unità kollha fil-kondizzjoni ta’ tħaddim (aġġustament tal-kurrenti u separazzjoni ta’ gass, it-tqabbid tal-fjamma, ir-rabta mar-rikorder elettroniku, aġġustament tal-kompartiment (chamber) tal-kolonna, it-temperatura tad-didekter u tal-injettur, eċċ.) u mbagħad irreġistra s-sinjal b’sensittività ta’ mill-inqas darbtejn akbar minn dik maħsuba għall-analiżi. Il-mogħdija tal-linja ta’ bażi għandha tkun lineari, mingħajr qċaċet ta’ kwalunkwe tip, u ma għandhiex toħroġ minn postha. Moviment negattiv mil-linja dritta juri tnixxija mit-tqabbid tal-kolonna; moviment pożittiv juri kondizzjonament mhux xieraq tal-kolonna. Nota 6. It-temperatura ta’ kondizzjonament għandha dejjem tkun ta’ mill-inqas 20 °C inqas mit-temperatura massima speċifikata għall-fażi stazzjonarja wżata. 5.4.2. Għażla ta’ kondizzjonijiet ta’ tħaddim. 5.4.2.1. Il-kondizzjonijiet ta’ tħaddim ta’ linji ta’ gwida huma dawn: — temperatura tal-kolonna: 260 ± 5 oC, — temperatura ta’l-evaporatur: 280 oC, — temperatura tad-didekter: 290 oC, — veloċità lineari tal-gass carrier: elju 20 sa 35 ċm/s, idroġenu 30 sa 50 ċm/s, — proporzjon ta’ separazzjoni: minn 1:50 sa 1:100, — sensittività tal-istrument: minn 4 sa 16-il darba l-attenwazzjoni minima, — sensittività tar-recording: 1 sa 2 mV fs, — veloċità tal-karta: 30 sa 60 ċm/siegħa, — ammont ta’ sostanza injettata: 0,5 sa 1 μl ta’ soluzzjoni TMSE. Dawn il-kondizzjonijiet jistgħu jinbidlu fid-dawl tal-karatteristiċi tal-kromatografija tal-kolonna u tal-gass sabiex jinkisbu kromatogrammi li jissodisfaw dawn il-kondizzjonijiet: — iż-żmien ta’ żamma għal β-sitosterol għandu jkun ta’ 20 ± 5 minuta, — il-quċċata tal-campesterol għandha tkun: għaż-żejt taż-żebbuġa (il-kontenut medju 3 %) 15 ± 5 % tal-iskala sħiħa; għaż-żejt tas-sojja (kontenut medju 20 %) 80 ± 10 % tal-iskala sħiħa, — l-isteroli kollha preżenti għandhom ikunu separati. Barra milli jkunu mifrudin, il-qċaċet għandhom jkunu wkoll maqtugħin għal kollox, i.e. il-linja tal-quċċata għandha tmur lura lejn il-linja bażi qabel ma titlaq għall-quċċata li jmiss. Iżda risoluzzjoni mhux sħiħa hija tollerata sakemm il-quċċata f’TRR 1,02 tkun tista’ tiġi kkwantifikata permezz tal-perpendikolari. 5.4.3. Proċedura analitika. 5.4.3.1. Permezz ta’ mikrosiringa ta’ 10 μl ħu 1 μl ta’ hexane, iġbed 0,5 μl ta’ arja u mbagħad 0,5 sa 1 μl tas-soluzzjoni kampjun. Għolli l-plunger tas-siringa aktar biex tiżvojta l-labra. Niffed il-labra fil-membrana tal-injection unit u wara sekonda jew tnejn injetta malajr, u mbagħad neħħi bil-mod il-labra wara xi ħames sekondi. 5.4.3.2. Kompli bir-recording sakemm it-TMSE tal-isteroli preżenti jiġu elużat għal kollox Il-linja bażi għandha tkompli tissodisfa l-kondizzjonijiet meħtieġa (5.4.1.2). 5.4.4. Identifikazzjoni tal-quċċata. Identifika l-qċaċet individwali fuq il-bażi taż-żmien ta’ żamma u bi tqabbel mat-taħlitiet ta’ TMSE ta’ steroli analizzati taħt l-istess kondizzjonijiet. L-isteroli jiġu elwiti fl-ordni li ġejja: cholesterol, brassicasterol, 24-metilin cholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, Δ 7-campesterol, Δ 5,23-stigmastadienol, chlerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ 5-avenasterol, Δ 5,24-stigmastadienol, Δ 7-stigmastenol, Δ 7-avenasterol. Il-ħinijiet ta’ żamma għas-sitosterol għal kolonni SE-52 u SE-54 jidhru f’Tabella 1. Il-Figuri 1 u 2 juru kromatogrammi tipiċi għal xi żjut. 5.4.5. Evalwazzjoni kwantitattiva. 5.4.5.1. Ikkalkola l-arei ta’ ß-cholestanol u l-qċaċet ta’ isterol permezz tal-integratur. Tagħtix kas tal-qċaċet għal kwalunkwe komposti li mhumiex inklużi fost dawk elenkati fit-Tabella 1. Il-koeffiċjent ta’ rispons għal a-cholestanol għandu jkun ugwali għal 1. 5.4.5.2. Ikkalkula l-konċentrazzjoni ta’ kull sterol individwali f’mg/100 g ta’ materjal grass kif ġej: fejn: Ax = area tal-quċċata għall-isterol × ►M6  ————— ◄ ; As = area tal-quċċata ta’ α-cholestanol ►M6  ————— ◄ ; ms = piż ta’ α-cholestanol miżjud, f’milligrammi; m = piż tal-kampjun użat għad-determinazzjoni, fi grammi.

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI:

6.1	Irreġistra l-konċentrazzjonijiet individwali tal-isterol bħala mg/100 g ta’ sostanza grassa u t-total tagħhom bħala “steroli totali”.

6.2	Ikkalkola l-perċentwali ta’ kull sterol individwali mill-proporzjon tal-area tal-quċċata rilevanti ma’ l-arja totali tal-quċċata għall-isteroli. fejn: Ax = area tal-quċċata għal x; ΣA = area totali tal-qċaċet għall-isteroli.

---

APPENDIĊI:

Determinazzjoni tal-veloċità lineari tal-gass

Bil-kromatografu tal-gass taħt kondizzjonijiet ta' operazzjoni normali injetta 1 sa 3 μl ta' metanu (jew propan) u kejjel il-ħin li jieħu l-gass biex jgħaddi mill-kolonna mill-ħin tal-injezzjoni sal-ħin li fih tidher il-quċċata (tM).

Il-veloċità lineari f'ċm/s toħroġ minn L/tM, fejn L huwa t-tul tal-kolonna f'ċentimetri u tM il-ħin mkejjel f'sekondi.

Figura 1

Kromatogramma tal-gass tal-frazzjoni ta’ sterol ta’ xi żejt taż-żebbuga mhux raffinat

Figura 2

Kromatogramma tal-gass tal-frazzjoni ta’ sterol ta’ żejt taż-żebbuġa raffinat

---

ANNESS VI

DETERMINAZZJONI TAL-ERYTHRODIOL U UVAOL

INTRODUZZJONI

Erythrodiol (mifhum b'mod komuni bħala l-glikoli erythrodiol u uvaol flimkien) huwa kostitwent tal-frazzjoni li ma jistax jiġi ssaponifikat, karatteristika ta' xi tipi ta' sostanzi grassi. Jinsab f'konċentrazzjonijiet konsiderevolment ogħla f'żejt taż-żebbuġa estratt b'solvent milli fi żjut oħra, bħal żejt taż-żebbuġa magħsur u żejt ta' żerriegħa tal-għenba, li jinsab fiha wkoll, u għalhekk il-preżenza tiegħu tfisser preżenza ta' żejt taż-żebbuġa estratt b'solvent.

1.   SKOP

Il-metodu jiddeskrivi proċedura għall-iskoperta tal-erythrodiol fis-sostanzi grassi.

2.   PRINĊIPJU TAL-METODU

Is-sostanza grassa tiġi ssaponifikata bl-idrossidu tal-potassju f'soluzzjoni etanolika. Il-frazzjoni mhux issaponifikata tiġi mbagħad estratta bi l-eteru tad-dietill u msaffija billi tiġi mgħoddija minn kolonna ta' alumina.

Materji li ma jistgħux jiġu ssaponifikati huma soġġetti għall-kromatografija ta' saff irqiq fuq pjanċa tal-ġell tas-silika sakemm il-faxex li jikkorrispondu għall-frazzjonijiet tal-isterol u l-erythrodiol jiġu sseparati. L-isteroli u l-erythrodiol miġbura mill-pjanċa jinbidlu f' eteri tat-trimetilsill u t-taħlita tiġi analizzata bil-kromatografija tal-gass.

Ir-riżultat jingħata bħala perċentwali ta' erythrodiol fit-taħlita ta' erythrodiol u steroli.

3.   APPARAT

3.1.	L-apparat deskritt f'Anness V (determinazzjoni tal-kontenut ta' steroli).

4.   REAĠENTI

4.1.	Ir-reaġenti deskritti f'Anness V (determinazzjoni tal-kontenut tal-isteroli).

4.2.	Soluzzjoni ta' referenza ta' erythrodiol, soluzzjoni ta' 0,5 % fil-kloroforma.

5.   PROĊEDURA

5.1.   Tħejjija ta' materji li ma jistgħux jiġu ssapunifikati.

Kif deskritt fil-paragrafu 5.1.2 t'Anness V.

5.2.   Separazzjoni tal-erythrodiol u l-isteroli.

5.2.1.

Ara l-paragrafu 5.2.1 t'Anness V.

5.2.2.

Ara l-paragrafu 5.2.2 t'Anness V.

5.2.3.

Ħejji soluzzjoni ta' 5 % tal-materji li ma jistgħux jiġu ssaponifikati fil-kloroforma. Bl-użu ta' mikrosiringa 0,1 ml, irriga pjanċa kromatografika b'soluzzjoni ta' 0,3 ml bejn wieħed u ieħor 1,5 ċm mit-tarf t'isfel f'riga li tkun kemm jista' jkun uniformi u rqiqa. Fit-tarf tal-pjanċa qiegħed xi ftit mikrolitri mis-soluzzjonijiet ta' kolesterol u erythrodiol biex iservu bħala referenza.

5.2.4.

Qiegħed il-pjanċa fil-kompartament tal-iżvilupp imħejji kif speċifikat f'5.2.1. It-temperatura tal-ambjent għandha tkun 20 oC. Minnufih għatti l-kompartament bl-għatu u ħalli l-elużjoni ssir sakem il-parti ta' quddiem tas-solvent tilħaq bejn wieħed u ieħor 1 ċm mit-tarf ta' fuq tal-pjanċa. Neħħi l-pjanċa mill-kamra tal-iżvilupp u evapora s-solvent f'kurrent ta' arja sħuna.

5.2.5.

Sprejja l-pjanċa fuq fuq u b'mod uniformi bis-soluzzjoni alkoħolika ta' 2,7- dikloroflorexxent. Meta l-pjanċa tiġi osservata taħt dawl ultravjola, il-faxex tal-isterol u erythrodiol jistgħu jiġu identifikati billi jiġu allineati mar-referenzi. Immarka b'tikka eżatt barra t-truf tal-fluworexxenza.

5.2.6.

Permezz ta' spatula tal-metall obrox il-ġell tas-silika fil-postijiet mmarkati. Qiegħed il-materjal mill-pjanċa fi flask ta' 50 ml. Żid 15 ml ta' kloroforma sħuna, ħawwad tajjeb u ffiltra minn lembut b'diska tal-ħġieġ sinterizzat biex il-ġell tas-silika jiġi ttrasferit fil-filtru. Aħsel tliett darbiet bi kloroforma sħuna (10 ml kull darba) filwqat li tiġbor l-iffiltrat fi flask ta' 100 ml. Evapora l-iffiltrat sa volum ta' 4 sa 5 ml, ferragħ ġewwa tubu tal-magna ċentrifuga bil-qiegħ koniku ta' 10 ml, nixxef bis-sħana bil-mod f'kurrent ta' nitroġenu u iżen.

5.3.   It-tħejjija ta' eteri tat-trimethlsili.

Kif deskritt fil-paragrafu 5.3 t'Anness V.

5.4.   Analiżi bil-kromatografija tal-gass.

Kif deskritt fil-paragrafu 5.4 tal-metodu hawn fuq. Il-kondizzjonijiet ta' tħaddim tal-kromatografu tal-gass fl-analiżi għandhom jkunu b'mod li jwettqu l-analiżi tal-isterol u jifirdu t-TMSE mill-erythrodiol u l-uvaol.

Meta l-kampjun jkun ġie injettat, kompli bir-recording sakemm l-isteroli preżenti, l-erythrodiol u l-uvaol jkunu ġew imnaddfa (elużat). Imbagħad identifika l-qċaċet (il-ħinijiet ta' żamma għall-erythrodiol u l-uvaol relattivi mal-b-sitosterol huma xi 1,45 u 1,55 rispettivament) u kkalkola l-areas fir-rigward tal-isteroli.

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI:

fejn:

A1

=

area tal-quċċata għall-erythrodiol ►M6  ————— ◄ ;

A2

=

area tal-quċċata għall-uvaol ►M6  ————— ◄ ;

Σ Asteroli

=

area tal-qċaċet totali għall-isteroli ►M6  ————— ◄ .

Ir-riżultat jingħata sa punt deċimali wieħed.

▼M21

---

ANNESS VII

DETERMINAZZJONI TAL-PERĊENTWAL TA’ 2-GLYCERYL MONOPALMITATE

1.   SKOP U QASAM TA’ APPLIKAZZJONI

Dan il-metodu jiddeskrivi l-proċedura analitika biex jiġi ddeterminat il-perċentwal ta’ l-aċidu palmitiku fit-2 pożizzjoni tat-triglycerides permezz ta’ l-evalwazzjoni tat-2-glyceryl monopalmitate.

Dan il-metodu huwa applikabbli għaż-żjut veġetali likwidi fit-temperatura ta’ l-ambjent (20 °C).

2.   PRINĊIPJU

Wara t-tħejjija, il-kampjun ta’ żejt huwa sottomess għall-azzjoni tal-lipażi pankreatiku: idroliżi parzjali u speċifiku fil-pożizzjonijiet 1 u 3 tal-molekula ta’ triglyceride ġġib magħha id-dehra tal-monoglycerides fil-pożizzjoni 2. Il-preċentwal ta’ 2-glyceril monopalmitate fil-frazzjoni ta’ monoglyceride jiġi ddeterminat, wara silylation, permezz ta’ kromatografija tal-gass fuq kolonna kapillari.

3.   APPARAT U TAGĦMIR

3.1.	Flask Erlenmeyer ta’ 25 ml.

3.2.	Bikers ta’ 100, 250 u 300 ml.

3.3.	Kolonna tal-ħġieġ għall-kromatografija, b’dijametru intern ta’ 21-23 mm, twila 400 mm, mgħammra bi pjanċa tal-ħġieġ sinterizzat u vit.

3.4.	Provetti ta’ 10, 50, 100 u 200 ml.

3.5.	Flaskijiet ta’ 100 u 250 ml.

3.6.	Evaporatur ċirkolari.

3.7.	Tubi għaċ-ċentrifuga bil-qiegħ koniku ta’ 10 ml, b’tapp immolat.

3.8.	Ċentrifuga għat-tubi ta’ 10 u 100 ml.

3.9.	Termostat biex it-temperatura tinżamm f’ 40 ± 0,5 °C

3.10.

Pipetti ggradwati ta’ 1 u 2 ml.

3.11.

Siringa ipodermika ta’ 1 ml.

3.12.

Mikrosiringa ta’ 100 μl.

3.13.

Lenbut ta’ 1 000 ml

3.14.

Kromatografu tal-gass għal kolonni kapillari, mgħammar b’injettur on column fil-kiesaħ għall-introduzzjoni diretta tal-kampjun fil-kolonna, u b’forn biex tinżamm temperatura ta’ madwar 1 °C.

3.15.

Injettur on column fil-kiesaħ għall-introduzzjoni diretta tal-kampjun fil-kolonna.

3.16.

Rilevatur tal-jonizzazzjoni tal-fjamma u elettrometru.

3.17.

Reġistratur-integratur adattat għall-elettrometru b’veloċità ta’ risposta ta’ mhux aktar minn sekonda, u b’veloċità tal-karta varjabbli.

3.18.

Kolonna kapillari tal-ħġieġ jew tas-silika mdewba ta’ bejn 8 u 12-il metru, b’dijametru intern ta’ bejn 0,25 u 0,32 mm, miksija b’methylpolysiloxane jew b’phenyl methylpolysiloxane 5 %, bi ħxuna ta’ bejn 0,10 u 0,30 μm, li tista’ tintuża f’temperatura ta’ 370 °C.

3.19.

Mikrosiringa ta’ 10 μl mgħammra b’labra iebsa, twila talanqas 7.5 cm, għall-injezzjoni diretta fuq il-kolonna.

4.   REAĠENTI

4.1.

Ġell tas-silika tad-daqs ta’ fraka ta’ bejn 0 063 u 0 200 mm (70/280 mesh), imħejji kif ġej: qiegħed il-ġell tas-silika ġewwa kapsula tal-porċellana, nixxef fil-forn f’temperatura ta’ 160 °C għal 4 sigħat, imbagħad kessaħ f’temperatura ta’ l-ambjent f’dessikatur. Żid volum ta’ ilma ewkivalent għal 5 % tal-piż tal-ġell tas-silika, kif ġej: ġewwa flask Erlenmeyer ta’ 500 ml, iżen 152 g ġell tas-silika u żidlu 8 g ta’ ilma distillat, sodd it-tubu u ħawwad bil-mod sabiex l-ilma jinfirex b’mod uniformi. Ħalli joqgħod għal talanqas 12-il siegħa qabel l-użu.

4.2.	n-hexane (għall-kromatografija).

4.3.	Isopropanol.

4.4.	Isopropanol, soluzzjoni milwiema 1/1 (V/V).

4.5.	Lipażi pankreatika. Il-lipażi li tintuża għandu jkollha attività ta’ bejn 2 u 10 unitajiet ta’ lipażi għal kull mg (fis-suq jeżistu lipażi pankreatiċi b’attività ta’ bejn 2 u 10 unitajiet għal kull mg ta’ enżima).

4.6.	Soluzzjoni stabbilizzanti ta’ trishydroxymethylaminomethane: soluzzjoni milwiema 1 M miġjuba sa pH 8 (kontroll potenzjometriku) permezz ta’ HCI kkonċentrat (1/1 V/V).

4.7.	Sodju kolat, ta’ kwalità enżimatika, soluzzjoni milwiema 0,1 % (din is-soluzzjoni għandha tintuża sa 15-il jum wara l-preparazzjoni tagħha).

4.8.	Klorur tal-kalċju, soluzzjoni milwiema 22 %.

4.9.	Eter djetiliku għall-kromatografija.

4.10.

Solvent ta l-iżvilupp: taħlita n-hexane/eter djetiliku (87/13) (V/V).

4.11.

Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni ta’ 12 % fil-piż.

4.12.

Phenolphthalein, soluzzjoni ta’ 1 % fl-etanol.

4.13.

Gass portatur: idroġenu jew elju, għall-kromatorgrafija tal-gass.

4.14.

Gassijiet awżiljari: – idroġenu, b’purità minima ta’ 99 %, mingħajr umidità jew sustanzi organiċi – u arja, għall-kromatografija tal-gass, bl-istess livell ta’ purità.

4.15.

Reaġent ta’ silanizzazzjoni: taħlita pyridine/hexamethyldisilazane, trimethylchlorosilane 9/3/1 (V/V/V) (Fis-suq jeżistu soluzzjonijiet lesti għall-użu). Jistgħu jintużaw reaġenti oħrajn ta’ silylation, partikolarment bit-trimethylsilyl trifluoracetamide + 1 % trimethylchlorosilane, dilwiti ma’ l-istess volum ta’ anhydrous pyridine).

4.16.

Kampjuni ta’ referenza: monoglycerides puri jew taħlitiet ta’ monoglycerides b’kompożizzjoni magħrufa tal-perċentwal, simili għal dik tal-kampjun.

5.   PROĊEDURA

5.1.   Tħejjija tal-kampjun

5.1.1.

Iż-żjut b’aċidità ħielsa ta’ inqas minn 3 % ma jeħtiġux jiġu newtralizzati qabel il-kromatografija tal-kolonna bil-ġell tas-silika. Iż-żjut b’aċidità ħielsa ta’ aktar minn 3 % għandhom ikunu sottomessi għan-newtralizzazzjoni skond il-punt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Ferra’ 50 g żejt u 200 ml n-hexane fil-lenbut ta’ 1 000 ml (3.13). Żid 100 ml isopropanol u kwantità tas-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 12 % (4.11) ekwivalenti għall-aċidità ħielsa taż-żejt, miżjuda b’5 %. Ħawwad sewwa għal minuta. Żid 100 ml ilma distillat, erġa’ ħawwad u ħalli joqgħod. Ferra’, imbagħad neħħi l-aħħar saff li fih is-sapun. Neħħi s-safef intermedji li jista’ jkun hemm (muċilaġni u sustanzi li ma jdubux). Aħsel is-soluzzjoni hexane taż-żejt newtralizzat b’porzjonijiet suċċessivi ta’ bejn 50 u 60 ml tas-soluzzjoni isopropanol/ilma 1/1 (V/V) (4.4) sakemm ma jibqax jidher il-kulur roża tal-phenolphthalein. Neħħi l-biċċa l-kbira mill-hexane permezz tad-distillazzjoni fil-vakwu (per eżempju, jista’ jintuża evaporatur ċirkolari) uttrasferixxi ż-żejt għal ġo flask ta’ 100 ml (3.5). Nixxef iż-żejt fil-vakwu sakemm is-solvent ikun tneħħa għal kollox. Fi tmiem din il-proċedura, l-aċidità taż-żejt għandha tkun inqas minn 0,5 %.

5.1.2.

Ferra’ 1 g ta’ żejt ippreparat kif deskritt hawn fuq, ġewwa flask Erlenmeyer ta’ 25 ml (3.1) u dewweb f’10 ml mit-taħlita ta’ l-iżvilupp (4.10). Ħalli s-soluzzjoni toqgħod għal talanqas kwarta qabel ma ssir il-kromatrografija fuq kolonna bil-ġell tas-silika. Jekk is-soluzzjoni tkun imċajpra, għaddiha miċ-ċentrifuga biex tiżgura l-aqwa kundizzjonijiet għall-kromatografija. (Jistgħu jintużaw skrataċ ta’ ġell tas-silika SPE ta’ 500 mg lesti għall-użu).

5.1.3.

Tħejjija tal-kolonna kromatografika Ferra’ fil-kolonna (3.3) madwar 30 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10), daħħal biċċa qoton fil-parti ta’ isfel tal-kolonna bl-għajnuna ta’ virga tal-ħġieġ; agħfas biex tneħħi l-arja. Ġo biker, ipprepara suspensjoni ta’ 25 g ġell tas-silika (4.1) f’madwar 80 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp, u ferragħ fil-kolonna bl-għajnuna ta’ lenbut. Iċċekkja li l-ġell kollu tas-silika jkun daħal fil-kolonna; aħsel bis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10), iftaħ il-vit u ħalli l-livell tal-likwidu jilħaq madwar 2 mm ‘il fuq mil-livell superjuri tal-ġell tas-silika.

5.1.4.

Kromatografija fuq kolonna Ġo flask Erlenmeyer ta’ 25 ml (3.1), iżen eżatt 1 g tal-kampjun imħejji skond il-punt 5.1. Dewweb il-kampjun f’10 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp (4.10). Ferragħ is-soluzzjoni fil-kolonna kromatografika mħejjija skond il-punt 5.1.3. Kemm jista’ jkun, tħarrikx is-superfiċje tal-kolonna. Iftaħ il-vit u ħalli s-soluzzjoni tal-kampjun tnixxi sakemm tilħaq il-livell tal-ġell tas-silika. Żviluppa b’150 ml mis-solvent ta’ l-iżvilupp. Aġġusta r-rata sa 2 ml/min (sabiex 150 ml inixxu fil-kolonna f’madwar 60-70 minuta). Irkupra l-eluzzjoni ġo flask ta’ 250 ml li jkun ġie mwieżen minn qabel. Evapora s-solvent fil-vakwu u neħħi l-aħħar traċċi tiegħu taħt kurrent ta’ nitroġenu. Iżen il-flask u ikkalkula l-estratt irkuprat. (Fil-każ li jkunu qed jintużaw skrataċ SPE tas-silika lesti għall-użu, ipproċedi kif ġej: Daħħal 1 ml mis-soluzzjoni (5.1.2.) ġo l-iskrataċ, imħejjija minn qabel b’3 ml ta’ n-hexane. Saffi s-soluzzjoni, u żviluppa b’4 ml ta’ n-hexane/eter djetiliku 1/1 (V/V). Irkupra s-soluzzjoni f’tubu ta’ 10 ml, u evapora taħt kurrent ta’ nitroġenu sakemm tkun nixfet. Esponi l-fdal niexef għal-lipażi pankreatika (5.2.). Huwa fondamentali li tivverifika l-kompożizzjoni ta’ aċidi grassi qabel u wara li jiġi mgħoddi mill-iskartoċċ SPE).

5.2.   Idroliżi bil-lipażi pankreatika

5.2.1.

Fit-tubu għaċ-ċentrifuga, iżen 0,1 g taż-żejt imħejji skond il-punt 5.1. Żid 2 ml mis-soluzzjoni stabbilizzanti (4.6.), 0,5 ml mis-soluzzjoni ta’ sodju kolat (4.7), u 0,2 ml mis-soluzzjoni ta’ klorur tal-kalċju, filwaqt li tħawwad sewwa wara kull żieda. Agħlaq it-tubu b’tapp li jissiġilla mħejji għal dan il-għan u qiegħdu fit-termostat f’temperatura ta’.

5.2.2.

Żid 20 mg lipażi, ħawwad bil-galbu (filwaqt li tevita li jixxarrab it-tapp), u qiegħed it-tubu fit-termostat għal eżatt 2 minuti, imbagħad aqilgħu, ħawdu sewwa għal eżatt minuta, u ħallih jiksaħ.

5.2.3.

Żid 1 ml ta’ eter djetiliku, agħlaq bit-tapp u ħawwad sew, imbagħad għaddi miċ-ċentrifuga, u ittrasferixxi s-soluzzjoni ta’ eter ġo tubu nadif u niexef, bl-għajnuna ta’ mikrosiringa.

5.3.   Tħejjija tad-derivattivi silanizzati u tal-kromatografija tal-gass

5.3.1.

Bl-għajnuna ta’ mikrosiringa, daħħal 100 μl mis-soluzzjoni (5.2.3.) ġo tubu bil-qiegħ koniku ta’ 10 ml.

5.3.2.

Neħħi s-solvent taħt kurrent dgħajjef ta’ nitroġenu, żid 200 μl ta’ reaġent ta’ silanizzazzjoni (4.15.), agħlaq bit-tapp u ħalli joqgħod għal 20 minuta.

5.3.3.

Wara 20 minuta, żid bejn 1 u 5 ml n-hexane (skond il-kundizzjonijiet kromatografiċi): is-soluzzjoni li tirriżulta hija lesta għall-kromatografija tal-gass.

5.4.   Kromatografija tal-gass

Il-kundizzjonijiet ta’ tħaddim huma dawn li ġejjin:

5.4.1.   Identifikazzjoni tal-qċaċet

Il-monoglycerides individwali jiġu identifikati skond il-ħinijiet ta’ retenzjoni miksuba, u b’relazzjoni ma’ dawk miksuba bit-taħlitiet standard ta’ monoglycerides analizzati fl-istess kundizzjonijiet.

5.4.2.   Evalwazzjoni kwantitattiva

Is-superfiċje ta’ kull quċċata tiġi kkalkulata permezz ta’ integratur elettroniku.

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI:

Il-perċentwal ta’ glyceryl monopalmitate jiġi kkalkulat abbażi tar-relazzjoni bejn is-superfiċje tal-quċċata u t-total tas-superfiċji tal-qċaċet tal-monoglycerides kollha (ara l-Figura 2), skond il-formula:

Glyceril monopalmitate (%):

Fejn:

Ax

=

is-superfiċje tal-quċċata li tikkorrispondi għall-glyceryl monopalmitate

ΣA

=

it-total tas-superfiċji tal-qċaċet kollha tal-monoglycerides

Ir-riżultat għandu jingħata b’ punt deċimali wieħed.

7.   RAPPORT TA’ L-ANALIŻI

Ir-rapport ta’ l-analiżi għandu jispeċifika:

Figura 1

Kromatogramma tal-prodotti tar-reazzjoni tas-silanizzazzjoni miksubin bl-azzjoni tal-lipażi fuq żejt taż-żebbuġa raffinat miżjud b’20 % ta’ żejt esterifikat (100 %).

Nota: “aċidi grassi liberi” = xaħmijiet ta' l-aċtu; “Żejt taż-żebbuġa raffinat + 20 % taż-żejt estratt” = żejt taż-żebbuġa raffinat + 20 % żejt esterifat; “1-2 monopalmitolein” = 1-2 monopalmitolein; “1-2 mono C18 insat.” = mhux saturat 1-2 mono C18

Figura 2

Kromatogramma ta’:

A)

Żejt taż-żebbuġa mhux esterifikat, wara l-lipażi; wara s-silanizzazzjoni; f’dawn il-kundizzjonijiet (kolonna kapillari 8-12 m), il-frazzjoni ta’ xama’ tiġi elwita fl-istess ħin bħall-frazzjoni ta’ diglyceride, jew ftit wara. Wara l-lipażi, il-kontenut ta’ triglycerides ma għandux jaqbeż 15 %. Tifsir: 1 = Aċidi grassi liberi 2 = Monoglycerides 3 = Diglycerides 4 = Triglycerides * = 2-monopalmitine ** = Triglycéride C54

Kromatogramma ta’:

B)

żejt esterifikat wara l-lipażi; wara s-silanizzazzjoni; f’dawn il-kundizzjonijiet (kolonna kapillari 8-12 m), il-frazzjoni ta’ xama’ tiġi elwita fl-istess ħin bħall-frazzjoni ta’ diglyceride, jew ftit wara. Wara l-lipażi, il-kontenut ta’ triglycerides ma għandux jaqbeż 15 %. Tifsir: 1 = Aċidi grassi liberi 2 = Monoglycerides 3 = Diglycerides 4 = Triglycerides * = 2-monopalmitine ** = Triglyceride C54

8.   NOTI

TĦEJJIJA TAL-LIPAŻI

Lipażi b’attività sodisfaċenti huma disponibbli fis-suq. Wieħed jista’ jippreparahom ukoll fil-laboratorju, kif ġej:

Kessaħ 5 kg ta’ frixa friska tal-majjal sa 0 °C. Neħħi x-xaħam solidu u t-tessut konnettiv ta’ madwarha, u itħan ġo blender sakemm issir pasta likwida. Ħawwad din il-pasta għal bejn 4 u 6 sigħat ma’ 2,5 litru ta’ anhydrous acetone, imbagħad għaddi miċ-ċentrifuga. Oħroġ il-fdal tliet darbiet oħra bl-istess volum ta’ anhydrous acetone, imbagħad darbtejn b’taħlita acetone/eter djetiliku (1/1) (V/V), u darbtejn bl-eter djetiliku.

Nixxef il-fdal matul 48 siegħa fil-vakwu biex jinkiseb trab stabbli li jżomm għal żmien twil fil-friġġ u protett mill-umdità.

KONTROLLAR TA’ L-ATTIVITA’ LIPAŻIKA

Ħejji emulsjoni ta’ żejt taż-żebbuġa kif ġej:

Ġo mikser, ħawwad għal 10 minuti taħlita magħmula minn 165 ml soluzzjoni ta’ gomma arabika f’100 g/l, 15 g silġ mitħun u 20 ml żejt taż-żebbuġa newtralizzat minn qabel.

Imbagħad daħħal 10 ml minn din l-emulsjoni f’biker ta’ 50 ml, imbagħad 0,3 ml minn soluzzjoni ta’ sodju kolat f’0,2 g/ml u 20 ml ilma distillat.

Qiegħed il-biker ġo termostat regolat għal 37 °C; daħħal l-elettrodi tal-miter tal-pH u l-aġitatur bl-iskrun.

Bl-għajnuna ta’ buretta, qattar soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 0,1 N sakemm jintlaħaq livell pH ta’ 8,3.

Żid kwantità ta’ sospensjoni ta’ trab tal-lipażi fl-ilma (0,1 g/ml ta’ lipażi). Malli l-miter tal-pH jindika livell pH ta’ 8.3, qabbad il-kronometru u żid is-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju billi tqattarha bir-ritmu meħtieġ biex il-livell pH jinżamm f’8.3. Innota kull minuta l-volum tas-soluzzjoni li jkun ġie kkunsmat.

Irreġistra din l-informazzjoni fi grafika x/y, bil-ħin fuq l-assi x, u l-millilitri ta’ soluzzjoni ta’ alkali 0,1 N ikkunsmati biex jinżamm livell kostanti tal-pH fuq l-assi y. B’hekk għandha tinkiseb grafika lineari.

L-attività tal-lipażi, imkejla f’unitajiet ta’ lipażi għal kull mg, tiġi kkalkolata bil-formula li ġejja:

Fejn:

A	hija l-attività f’unitajiet ta’ lipażi/mg;

V	hija l-għadd ta’ millilitri ta’ soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju 0,1 N kull minuta (ikkalkulat abbażi tal-grafika);

N	hija n-normalità tas-soluzzjoni ta’ idrossidu tas-sodju;

m	hija l-massa tal-lipażi tat-test f’mg.

L-unità ta’ lipażi hija ddefinita bħala l-kwantità ta’ enżimi li jeħilsu 10 mikro-ekwivalenti ta’ aċidu kull minuta.

▼M20 —————

▼B

---

L-ANNESS IX

INVESTIGAZZJONI SPETTROFOTOMETRIKA FL-ULTRAVJOLA

DAĦLA

Eżaminazzjoni spettrofotometrika fl-ultravjola tista’ tipprovdi tagħrif dwar il-kwalità ta’ xaħam, l-istat ta’ konservazzjoni u tibdiliet mwettqa fih bi proċessi teknologiċi.

L-assorbiment tal-wavelengths speċifikat fil-metodu huwa dovut għall-preżenza ta’ sistemi konjugati ta’ diene u triene. Dawn l-assorbimenti huma espressi bħala estinzjonijiet speċifiċi E1 %1 ċm (l-estinzjoni ta’ soluzzjoni ta’ 1 % tax-xaħam fis-solvent speċifikat, fi ħxuna ta’ 1ċm) konvenzjonalment indikata b’K (imsejħa wkoll “koeffiċjent ta’ estinzjoni”).

1.   SKOP

Il-metodu jiddeskrivi l-proċedura għat-twettieq ta’ eżaminazzjoni spettrofotometrika ta’ żejt taż-żebbuġa fl-ultravjola.

2.   PRINĊIPJU TAL-METODU

Ix-xaħam imsemmi jiġi mdewweb fis-solvent meħtieġ u l-estinzjoni tas-soluzzjoni tiġi mbagħad ikkalkolata fil-wavelengthsspeċifikati b’referenza għal solvent pur. Estinzjonijet speċifiċi huma kkalkolati mill-qari tal-ispettrofotometru.

3.   TAGĦMIR

3.1.	Spettrofotometru biex tkejjel l-estinzjoni fl-ultravjola bejn 220 u 360 nm, bil-possibilità li taqra unitajiet nanometrici individwali.

3.2.	Kuvetti rettangolari tal-quartz, bil-għotjien, li għandhom tul ottiku ta’ metru. Meta mimlija bl-ilma jew b’solventi oħra xierqa, il-kuvetti ma għandhomx juru xi differenza bejniethom ta’ aktar minn 0,01 unitajiet ta’ estinzjoni.

3.3.	Flasks gradati ta’ 25 ml.

▼M6

3.4.	Kolonna kromatografika li għandha l-parti ta’ fuq twila 270 mm u dijametru ta’ 35 mm u l-parti t’isfel twila 270 mm u dijametru ta’ madwar 10 mm.

▼B

4.   REAĠENTI

4.1.

Iso-octane spettrofotometrikament pur (2,2,4-trimethylpentan). B’referenza għall-ilma ddistillat dan għandu jkollu trasmittenza ta’ mhux anqas minn 60 % fuq 220 nm u mhux anqas minn 95 % fuq 250 nm, jew — cyclohexane spettrofotometrikament pur: b’referenza għall-ilma ddistillat dan għandu jkollu trasmittenza ta’ mhux anqas minn 40 % fuq 220 nm u mhux anqas minn 95 % fuq 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2.	Alumina bażika għall-kromatografija tal-kolonna mħejjija u kkontrollata kif deskritt f’Appendiċi I.

4.3.	n-hexane, għall-kromatografija.

5.   PROĊEDURA

5.1.

Il-kampjun imsemmi għandu jkun perfettament omoġenju u mingħajr suspett ta’ tniġġis. Żjut li huma likwidi f’temperatura ambjentali għandhom jiġu ffiltrati mill-karta f’temperatura ta’ madwar 30 oC, xaħmijiet iebsin għandhom jiġu omoġenizzati u ffiltrati f’temperatura ta’ mhux aktar minn 10 oC il-fuq mill-punt ta’ dewbin.

5.2.	Iżen bi preċiżjoni madwar 0.25 g tal-kampjun hekk imħejji fi flask gradat ta’ 25 ml, żid sal-marka bis-solvent speċifikat u omoġenizza. Is-soluzzjoni miksuba għandha tkun perfettament ċara. Jekk ikun hemm opalexxenza jew torbidezza ffiltra malajr mill-karta.

5.3.

Imla kuvetta bis-soluzzjoni miksuba u kejjel l-estinzjonijiet fuq wavelength xieraq bejn 232 u 276 nm, billi tuża s-solvent użat bħala referenza. Il-valuri ta’ estinzjoni rrekordjati għandhom jkunu fi ħdan medda ta’ bejn 0,1 sa 0,8. Jekk le għandu jerġa’ jsir il-kejl billi jintużaw soluzzjonijiet aktar konċentrati jew aktar dilwiti kif xieraq.

5.4.

Meta tkun tinħtieġ determinazzjoni ta’ estinzjoni speċifika wara l-mogħdija fuq l-alumina, kompli kif ġej. Qiegħed 30 g ta’ alumina bażika f’sospensjoni fil-hexane fil-kolonna kromatografika. Wara li l-assorbent ikun qagħad, neħħi l-hexane żejjed sa madwar 1ċm ’il fuq mit-tarf ta’ fuq tal-alumina. Dewweb 10 g tax-xaħam, omoġenizzat u ffiltrat kif deskritt f 5.1, f’100 ml ta’ hexane u ferragħ is-soluzzjoni ġol-kolonna. Iġbor l-elwit u evapora s-solvent kollu taħt vakwu b’temperatura taħt il- 25°C. Kompli minnufih kif speċifikat f’ 5.2 filwaqt li tuża x-xaħam hekk miksub.

6.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

6.1.

Żomm rekord tal-estinzjonijiet speċifiċi (koeffiċjenti ta’ estinzjonijiet) fuq il-bosta wavelengths ikkalkolati kif ġej: fejn: Kλ = estinzjoni speċifika fuq wavelength λ; Eλ = estinzjoni mkejla fuq wavelength λ; c = konċentrazzjoni tas-soluzzjoni fi g/100 ml; s = ħxuna tal-kuvetta f’ċm. Ir-riżultati għandhom jingħataw sa żewġ punti deċimali.

6.2.

L-analiżi spettrofotometrika taż-żejt taż-żebbuġa skond il-metodu uffiċjali fir-regolamenti tal-KEE tispeċifika d-determinazzjoni tal-estinzjoni speċifika f’soluzzjoni iso-octane fuq wavelengths ta’ 232 u 270 nm u d-determinazzjoni K, mogħtija bi: fejn Km hija l-estinzjoni speċifika fuq wavelength m, il-wavelength għall-assorbiment massimu madwar 270 nm.

---

APPENDIĊI I

Preparazzjoni tal-alumina u l-ittestjar tal-attività tagħha

A.1.1.   Preparazzjoni tal-alumina

Qiegħed l-alumina li tkun qabel ġiet imnixxfa fil-forn f’380 sa 400 °C għal tliet sigħat f’reċipjent issiġillat ermetikament, żid l-ilma ddistillat fi proporzjon ta’ 5 ml kull 100 g ta’ alumina, minnufih agħlaq ir-reċipjent, ħawwad ripetutament, imbagħad ħalliha għal mill-inqas 12-il siegħa qabel tużaha.

A.1.2.   Kontroll tal-attività tal-alumina

Ħejji kolonna kromatografika bi 30 g ta’ alumina. B’ħidma kif deskritta f’paragrafu 5,4 għaddi taħlita li tkun magħmula minn:

minn ġewwa l-kolonna.

Jekk wara l-mogħdija minn ġewwa l-kolonna, it-taħlita jkollha estinzjoni speċifika ta’ iżjed minn 0,11 ma’ 268 nm l-alumina hija aċċettabbli, jekk le il-livell ta’ tnixxif ta’ ilma għandu jiġi miżjud.

---

APPENDIĊI II

Kalibrar tal-ispettrofotometru

A.2.	It-tagħmir għandu jiġi kkontrollat kultant żmien (tal-inqas kull sitt xhur) kemm għar-rispons tal-wavelength kemm għall-preċiżjoni tar-rispons.

A.2.1.

Il-wavelength jista’ jiġi kkontrollat permezz ta’ lampa tal-fwar tal-merkurju jew permezz ta’ filtri xierqa.

A.2.2.

Sabiex tikkontrolla r-rispons tal-fotoċellula u l-fotomultiplikatur ipproċedi kif ġej: iżen 0,2000 g ta’ kromat tal-potassju pur għall-ispettrofotometrija u dewweb f’soluzzjoni ta’ 0,05 N tal-idrossidu tal-potassju fi flask gradat ta’ 1 000 ml u żid sal-marka. Ħu eżattament 25 ml tas-soluzzjoni miksuba, ferragħ fi flask gradat ta’ 500 ml u ddilwa sal-marka billi tuża l-istess soluzzjoni ta’ idrossidu tal-potassju. Kejjel l-estinzjoni tas-soluzzjoni hekk miksuba f’275 nm, billi tuża s-soluzzjoni ta’ idrossidu tal-potassju bħala referenza. L-estinzjoni mkejjla permezz ta’ kuvetta ta’ 1 ċm għandha tkun ta’ 0,200 ± 0, 005.

---

ANNESS X A

ANALIŻI BIL-KROMATOGRAFIJA TAL-GASS TA’ ESTERI TAL-METILL TA’ AĊIDI GRASSI

1.   SKOP

Dan il-metodu jipprovdi gwida ġenerali għall-applikazzjoni tal-kromatografija tal-gass, bl-użu ta’ kolonni ppakkjati jew kapillari, għad-determinazzjoni tal-kompożizzjoni kwalitattiva u kwantitattiva ta’ taħlita ta’ esteri tal-metill ta’ aċidu grass miksuba skond il-metodu speċifikat f’Anness X B.

Dan il-metodu mhuwiex applikabbli għall-aċidi grassi polimerizzati.

2.   REAĠENTI

2.1.   Gass carrier:

Gass inerti (nitroġenu, elju, argon, idroġenu, eċċ.), imnixxef sewwa u b’kontenut ta’ ossiġenu ta’ inqas minn10 mg/kg.

Nota 1.

L-idroġenu, li jintuża bħala gass carriermal-kolonni kapillari biss, jista’ jirdoppja l-veloċità ta’ analiżi iżda huwa perikoluż. Mezzi ta’ sigurtà huma disponibbli.

2.2.   Gassijiet awżiljarji:

2.2.1.

Idroġenu (purità ≥ 99,9 %), ħieles mit-tniġġis organiku.

2.2.2.

Arja jew ossiġenu, ħielsa mit-tniġġis organiku.

2.3.   Standard ta’ riferenza

Taħlita ta’ esteri tal-metill ta’ aċidi grassi puri, jew l-esteri tal-metill ta’ xi grass ta’ kompożizzjoni magħrufa, jekk jista’ jkun jixbah lil dak tal-materja grassa li tkun trid tiġi analizzata.

Wieħed għandu joqgħod attent li jimpedixxi l-ossidazzjoni ta’ aċidi grassi polyunsaturati.

3.   APPARAT

L-istruzzjonijiet mogħtija għandhom x’jaqsmu mat-tagħmir normali wżat għall-kromatografija tal-gass, bl-użu ta’ kolonni kapillari u/jew ippakkjati u didekter ta’ jonizzazzjoni tal-fjamma. Kull apparat li jipprovdi l-effiċjenza u r-riżoluzzjoni speċifikata f’4.1.2 huwa xieraq.

3.1.   Kromatografu tal-gass

Il-kromatografu tal-gass għandu jkollu dawn l-elementi.

3.1.1.   Sistema ta’ injezzjoni

Juża sistema ta’ injezzjoni jew:

Nota 2.Fin-nuqqas ta’ aċidi grassi b’inqas minn 16-il atomu ta’ karbonju, jista’ jintuża injettur bil-labra li tiċċaqlaq.

3.1.2.   Forn

Il-forn għandu jkun jista’ jsaħħan il-kolonna sa temperatura ta’ mill-inqas 260 °C u li jżomm it-temperatura mixtieqa sa 1 oC b’kolonna ppakkjata u sa 0,1 oC b’kolonna kapillari. L-aħħar ħtieġa hija b’mod partikolari importanti meta jintuża tubu tas-silika mġonġi.

L-użu tat-tisħin bit-temperatura pprogrammata huwa rrakkomandat fil-każijiet kollha, u b’mod partikolari għall-aċidi grassi b’inqas minn 16-il atomu tal-karbonju.

3.1.3.   Kolonna ppakkjata

3.1.3.1.

Kolonna, mibnija minn materjal inerti għas-sostanzi li għandhom jiġu analizzati (i.e. ħġieġ jew stainless steel) li għandha dawn id-daqsijiet: (a) tul: 1 sa 3 m. Għandha tintuża kolonna relattivament qasira meta jkunu preżenti aċidi grassi ta’ katina twila (’l fuq minn C20). Meta jiġu analizzati aċidi b’4 jew 6 atomi tal-karbonju, huwa rrakkommandat li tintuża kolonna twila 2 m; (b) djametru intern: 2 sa 4 mm. Nota 3. Jekk jkunu preżenti xi komponenti polyunsaturated b’aktar minn tlett bonds doppji, jistgħu jiġu dekomposti f’kolonna tal-istainless steel. Nota 4. Tista’ tintuża sistema b’kolonni tewmin ippakkjati.

3.1.3.2.

Ippakkjar, li jinkludi l-elementi li ġejjin: (a) support: ħamrija bid-diatomiji maħsula bl-aċidu u silanizzata, jew xi support inerti xieraq ieħor b’medda dejqa ta’ daqs tal-fraka (medda ta’ 25 mm bejn il-limiti 125 sa 200 mm) filwaqt li d-daqs medju tal-fraka jkollu x’jaqsam mad-djametru intern u t-tul tal-kolonna; (b) fażi stazzjonarja: tip ta’ likwidu polari polyester (e.g. diethylene glycol polysuccinate, butanediol polysuccinate, ethyleneglycol polyadipate, eċċ.) cyanosilicones jew xi likwidu ieħor li jippermetti s-separazzjoni kromatografika meħtieġa (ara l-klawsola 4). Il-fażi stazzjonarja għandha tkun 5 sa 20 % (m/m) tal-ippakkjar. Fażi stazzjonarja mhux polari tista’ tintuża għal ċerti separazzjonijiet.

3.1.3.3.

Kondizzjonament tal-kolonna Bil-kolonna mhux imqabbda mad-didekter, jekk ikun possibli, saħħan il-forn bil-mod sa 185 oC u għaddi kurrent ta’ gass inerti minn ġewwa l-kolonna ppreparata ftit qabel b’rata ta’ 20 sa 60 ml/min għal mill-inqas 16-il siegħa f’din it-temperatura, u għal sagħtejn oħra f’195 oC.

3.1.4.   Kolonna kapillari

3.1.4.1.

Tubu, magħmul minn materjal inerti għas-sostanzi li għandhom jiġu analizzati (ġeneralment ħġieġ jew fused silica). Id-djametru intern għandu jkun bejn 0,2 u 0,8 mm. Il-wiċċ intern għandu jiġi ttrattat b’mod xieraq (eż. tħejjija tal-wiċċ, disattivazzjoni) qabel ma jirċievi l-kisja tal-fażi stazzjonarja. F’bosta każijiet, tul ta’ 25 mm huwa biżżejjed.

3.1.4.2.

Fażi stazzjonarja, ġeneralment tat-tip polyglycol (poly(ethylene glycol) 20 000), polyester (butanediol polysuccinate) jew polysiloxane polari (cyanosilicones). Kolonni bonded (imsallbin) huma xierqa. Nota 5. Hemm riskju li l-polysiloxanes polari jagħtu lok għal xi diffikultajiet fl-identifikazzjoni u s-separazzjoni tal-aċidu linoleniku u l-aċidi C20. Il-kisjiet għandhom ikunu rqaq, i.e, 0,1 sa 0,2 μm.

3.1.4.3.

Assemblaġġ u kondizzjonament tal-kolonna Ħares il-prekawzjonijiet normali għall-assemblaġġ ta’ kolonni kapillari, i.e. it-tqegħid tal-kolonna fil-forn (support), l-għażla u l-assemblaġġ tal-ġonot (nuqqas ta’ tnixxijiet), it-tqassim tat-truf tal-kolonna fl-injettur u d-didekter (tnaqqis tal-ispazji moħlija). Qiegħed il-kolonna taħt kurrent ta’ gass carrier (eż. 0,3 bar (30 kPa) f’każ ta’ kolonna ta’ tul ta’ 25 mm u djametru intern ta’ 0,3 mm). Ikkondizzjona l-kolonna billi tipprogramma t-temperatura tal-forn fuq 3 oC/min mit-temperatura tal-ambjent sat-temperatura ta’ 10 oC taħt il-limiti ta’ dekomposizzjoni tal-fażi stazzjonarja. Żomm il-forn f’din it-temperatura għal siegħa sa l-istabbilizzazzjoni tal-linja bażi. Reġġa t-temperatura għal 180 oC biex taħdem taħt kondizzjonijiet isotermiċi. Nota 6. Kolonni kkondizzjonati minn qabel b’mod xieraq huma disponibbli kummerċjalment.

3.1.5.

Didekter, jekk jista’ jkun li jiflaħ għal tisħin għal temperatura ogħla minn dik tal-kolonna.

3.2.   Siringa

Is-siringa għandha jkollha kapaċità massima ta’ 10 μl, u tkun iggradata f’diviżjonijiet ta’ 0,1 μl.

3.3.   Rikorder

Jekk għandha tintuża l-kurva tar-rikorder biex tikkalkula l-kompożizzjoni tat-taħlita analizzata, ikun jinħtieġ rikorder elettroniku ta’ preċiżjoni għolja, kompatibbli ma’ l-apparat użat. Ir-rikorder għandu jkollu dawn il-karatteristiċi:

3.4.   Integratur

Tista’ ssir determinazzjoni mgħaġġla u preċiża bil-għajnuna ta’ integratur elettroniku. Dan għandu jagħti reazzjoni lineari b’sensittività adekwata, u l-korrezzjoni għad-devjazzjoni tal-linja bażi għandha tkun soddisfaċjenti.

4.   PROĊEDURA

L-operazzjonijiet deskritti f’4.1 sa 4.3 huma marbutin ma’ l-użu ta’ didekter tal-jonizzazzjoni tal-fjamma.

Bħala alternattiva tista’ tintuża kromatografija tal-gass li tħaddem catharometer didekter (li jaħdem fuq il-prinċipju ta’ tibdil fil-konduttività termika). Il-kondizzjonijiet ta’ tħaddim huma mbagħad mibdula kif deskritti fi klawsola 6.

4.1.   Kondizzjonijiet tat-test

4.1.1.

Għażla tal-aqwa kondizzjonijiet ta’ tħaddim 4.1.1.1. Kolonna ippakkjata Fl-għażla tal-kondizzjonijiet tat-test, għandhom jitqiesu l-varjabbli li ġejjin: (a) it-tul u d-djametru tal-kolonna; (b) in-natura u l-ammont tal-fażi stazzjonarja; (ċ) it-temperatura tal-kolonna; (d) iċ-ċirkolazzjoni tal-gass carrier; (e) ir-risoluzzjoni meħtieġa; (f) id-daqs tal-porzjon tat-test, magħżul b’mod li l-assemblaġġ tad-didekter u l-elettrometru jagħti reazzjoni lineari; (g) it-tul ta’ żmien tal-analiżi. B’mod ġenerali, il-valuri mogħtija fit-Tabella 1 u t-Tabella 2 jwasslu għar-riżultati mixtieqa, i.e. tal-inqas 2 000 pjanċa teoretika għal kull metru ta’ tul tal-kolonna għal stearat tal-metill u l-elużjoni tiegħu f’madwar 15-il minuta. Fejn l-apparat jippermetti, l-injettur għandu jkun f’temperatura ta’ madwar 200 oC u d-didekter f’temperatura daqs jew ogħla minn dik tal-kolonna. Bħala regola, l-proporzjon tar-rata ta’ ċirkolazzjoni tal-idroġenu mgħoddi lid-didekter ta’ jonizzazzjoni tal-fjamma għal dik tal-gass carrier tinbidel minn 1:2 għal 1:1 skond id-djametru tal-kolonna. Iċ-ċirkolazzjoni ta’ ossiġenu hija madwar 5 sa 10 darbiet dik tal-idroġenu. Tabella 1 Dijametru intern tal-kolonna mm Ċirkolazzjoni tal-gass carrier ml/mm 2 15 sa 25 3 20 sa 40 4 40 sa 60 Tabella 2 Konċentrazzjoni ta’ fażi stazzjonarja % (m/m) Temperatura tal-kolonna oC 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2. Kolonna kapillari Il-proprjetajiet ta’ effiċjenza u permeabilità tal-kolonni kapillari jfissru li s-separazzjoni bejn il-kostitwenti u t-tul ta’ żmien tal-analiżi huma bil-bosta dipendenti fuq ir-rata ta’ ċirkolazzjoni ta’ gass carrier fil-kolonna. Ikun għalhekk meħtieġ li l-kondizzjonijiet ta’ tħaddim jiġu magħmula l-aħjar possibbli billi ssir azzjoni fuq dan il-parametru (jew sempliċement fuq kemm jinżel il-livell tal-kolonna), skond kemm wieħed jixtieq li jtejjeb is-separazzjoni jew li jagħmel analiżi ta’ malajr.

4.1.2.

Determinazzjoni tan-numru ta’ pjanċi teoretiċi (effiċjenza) u riżoluzzjoni (Ara Figura 1) Wettaq l-analiżi ta’ taħlita ta’ stearat tal-metill u ta’ oleat tal-metill fi proporzjonijiet kważi ekwivalenti (per eżempju, esteri tal-metill mill-butir tal-kawkaw). Agħżel it-temperatura tal-kolonna u ċ-ċirkolazzjoni ta’ gass carrier sabiex tiġi rreġistrata l-ogħla quċċata ta’ stearat tal-metill madwar 15-il minuta wara l-quċċata tas-solvent. Uża kwantità suffiċjenti ta’ taħlita ta’ esteri tal-metill biex il-quċċata ta’ stearat tal-metill tokkupa madwar tliet kwarti tal-iskala sħiħa. Ikkalkula n-numru ta’ pjanċi teoretiċi, n (effiċjenza), billi tuża l-formula: u r-riżoluzzjoni, R, billi tuża l-formula: fejn: dr1 hija d-distanza ta’ żamma, f’millimetri, mill-bidu tal-kromatogramma sa l-ogħla tal-quċċata għal methyl stearate; ω1u ω2 huma l-wesgħat, f’millimetri, tal-qċaċet għal stearat tal-metillu methyl oleate rispettivament, mkejla bejn il-ponot ta’ intersezzjoni tat-tanġenti mal-ponot ta’ inflessjoni tal-kurva mal-linja bażi; Δ hija d-distanza, f’millimetri, bejn l-ogħla qċaċet tal-stearat tal-metillu l-methyl oleate; ▼M2 u l-indiċi tar-riżoluzzjoni, lr, bl-użu tal-formula fejn: a = l-għoli tal-inqas quċċata, imkejla mill-qiegħ; b = l-għoli tal-aktar ponta baxxa tal-wied bejn iż-żewġ quċċati ta’ ħdejn xulxin, imkejla mill-qiegħ. ▼B Figura 1 Kromatogramma għad-determinazzjoni tan-numru ta’ pjanċi teoretiċi (effiċjenza) u riżoluzzjoni. Il-kondizzjonijiet ta’ tħaddim li għandhom jintgħażlu huma dawk li jifilħu għal mill-inqas 2 000 pjanċa teoretika għal kull metru ta’ tul ta’ kolonna għal stearat tal-metill u riżoluzzjoni ta’ mill-inqas 1,25.

4.2.   Porzjon tat-test

Bl-użu tas-siringa (3.2) ħu 0,1 sa 2 μl tas-soluzzjoni ta’ esteri tal-metill mħejjija skond l-Anness X B u injetthom ġewwa l-kolonna.

Fil-każ ta’ esteri mhux f’soluzzjoni, ħejji soluzzjoni ta’ madwar 100 mg/ml fl-eptan ta’ kwalità kromatografika, u injetta 0,1 sa 1 ml minn din is-soluzzjoni.

Jekk l-analiżi hija għall-kostitwenti preżenti biss f’ammonti ta’ traċċi, d-daqs tal-porzjon tat-test jista’ jiżdied (sa 10 darbiet).

4.3.   Analażi

Ġeneralment, il-kondizzjonijiet ta’ tħaddim għandhom jkunu dawk definiti f’4.1.1.

Madanakollu, huwa possibbli li taħdem b’temperatura tal-kolonna aktar baxxa meta tkun meħtieġa d-determinazzjoni ta’ aċidi grassi b’inqas minn 12-il atomu tal-karbonju, jew b’temperatura ogħla meta jiġu kkalkolati aċidi grassi b’aktar minn 20 atomu tal-karbonju. Xi kultant, huwa possibbli li tuża programmazzjoni ta’ temperatura fiż-żewġ każijiet. Bħala eżempju, jekk il-kampjun fih il-esteri tal-metill ta’ aċidi grassi b’anqas minn 12-il atomu tal-karbonju, injetta l-kampjun b’temperatura ta’ 100 oC (jew 50 sa 60 oC jekk hemm l-aċidu butiriku) u għolli minnufih it-temperatura b’rata ta’ 4 sa 8 oC/min sa l-aqwa kondizzjoni. F’ċerti każijiet, iż-żewġ proċeduri jistgħu jiġu maqgħudin flimkien.

Wara s-sħana pprogrammata, kompli bl-elużjoni b’temperatura kostanti sakemm il-komponenti jiġu elwiti. Jekk l-istrument ma għandux sħana pprogrammata, użah f’ żewġ temperaturi fissi bejn 100 u 195 oC.

Jekk ikun hemm bżonn, huwa rrakkomandat li ssir analiżi fuq żewġ fażijiet fissi b’polaritaijiet differenti biex tivverifika n-nuqqas ta’ qċaċet moħbija, per eżempju fil-każ tal-preżenza simultanja ta’ C18:3 u C20:0, jew C18:3 u C18:2 konjugati.

4.4.   Tħejjija tal-kromatogramma ta’ referenza u l-graffs ta’ referenza

Analizza t-taħlita standard ta’ referenza (2.3) billi tuża l-istess kondizzjonijiet ta’ tħaddim li ntużaw għall-kampjun, u kejjel il-ħinijiet ta’ żamma jew id-distanzi ta’ żamma għall-aċidi grassi kostitwenti. Ibni fuq karta semi-logaritmika, għal kull grad ta’ nuqqas ta’ saturazzjoni, il-graffs li juru l-logaritmu taż-żmien jew distanza ta’ żamma bħala funżjoni tan-numru ta’ atomi tal-karbonju. F’kondizzjonijiet isotermali, l-graffs għall-aċidi ta’ katini dritti tal-istess grad ta’ nuqqas ta’ saturazzjoni għandhom ikunu linji dritti. Dawn il-linji għandhom ikunu bejn wieħed u ieħor paralleli.

Jeħtieġ li jiġu evitati kondizzjonijiet b’tali mod li jeżistu “qċaċet moħbija”, i.e. fejn ir-riżoluzzjoni mhiex biżżejjed sabiex tifred iż-żewġ kostitwenti.

5.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI:

5.1.   Analiżi kwalitattiva

Identifika l-qċaċet ta’ esteri tal-metill għall-kampjun mill-graffs imħejjija f’4,4, jekk meħtieġ permezz ta’ interpolazzjoni.

5.2.   Analiżi kwantitattiva

5.2.1.   Determinazzjoni tal-kompożizzjoni

Għajr f’każijiet eċċeżżjonali, uża l-metodu ta’ normalizzazzjoni interna, i.e. assumi li l-komponenti kollha tal-kampjun huma rrappreżentati fuq il-kromatogramma, sabiex it-total ta’ areas taħt il-qċaċet jirrapreżenta 100 % tal-kostitwenti (elużjoni totali)

Jekk it-tagħmir jinkludi integrator, uża l-figuri miksubin minnu. Jekk le, ikkalkula l-area taħt kull quċċata billi timmultiplika l-għoli tal-quċċata bil-wisa’ tagħha f’nofs tulha, u fejn jeħtieġ qis il-bosta attenwazzjonijiet użati waqt ir-recording.

5.2.2.   Metodu ta’ determinazzjoni

5.2.2.1.

Każ ġenerali Ikkalkola l-kontenut ta’ komponent partikolari i, imfissra bħala perċentwali skond il-piż tal-esteri tal-metill, billi tikkalkola l-perċentwali rrappreżentati mill-area tal-quċċata li tikkorrispondi relattiva għat-total tal-arei tal-qċaċet kollha, billi tuża l-formula li ġejja: fejn: Ai hija l-area taħt il-quċċata li tikkorrispondi għall-komponent i; ΣA hija s-somma tal-area taħt il-qċaċet kollha. Agħti r-riżultat sa punt deċimali wieħed. Nota 7: F’dan il-każ ġenerali, ir-riżultat tad-determinazzjoni bbażat fuq arei relattivi huwa kkunsidrat li jirrappreżenta perċentwali bil-piż. Għall-każijiet li fihom din l-ipoteżi mhiex permessa, ara 5.2.2.2.

5.2.2.2.

Użu ta’ fatturi ta’ korrezzjoni F’ċerti każijiet, per eżempju fil-preżenza ta’ aċidi grassi b’inqas minn tminn atomi tal-karbonju jew ta’ aċidi bi gruppi sekondarji, meta jintużaw didekters ta’ konduttività termali jew fejn huwa meħtieġ l-ogħla grad ta’ preċizjoni, għandhom jintużaw fatturi ta’ korrezzjoni sabiex jinbidlu l-perċentwali tal-arei tal-qċaċet f’perċentwali tal-piż tal-komponent i. Ikkalkola l-fatturi ta’ korrezzjoni bil-għajnuna ta’ kromatogramma miksuba mill-analiżi ta’ taħlita ta’ referenza ta’ esteri tal-metill ta’ kompożizzjoni magħrufa, mwettqa taħt kondizzjonijiet ta’ tħaddim identiċi għal dawk użati għall-kampjun. Għal din it-taħlita ta’ referenza, il-perċentwali bil-piż tal-komponent i tingħata bil-formula: fejn: mi huwa l-piż tal-komponenti fit-taħlita ta’ referenza; Σm hija it-total tal-piż tal-bosta komponenti tat-taħlita ta’ referenza. Mill-kromatogramma tat-taħlita ta’ referenza (4.4) ikkalkola l-perċentwali (area/area) għal komponent i kif ġej: fejn: Ai hija l-area taħt il-quċċata li tikkorrispondi għall-komponent i; ΣA hija t-total tal-arja taħt il-qċaċet kollha. Il-fattur ta’ korrezzjoni jiġi mbagħad ikkalkolat bħala: B’mod komuni, il-fatturi ta’ korrezzjoni huma espressi fir-rigward ta’ KC16, biex b’hekk il-fatturi relattivi jsiru: Għall-kampjun, il-kontenut ta’ kull komponenti i, espress bħala perċentwali bil-piż tal-esteri tal-metill, huwa: Agħti r-riżultati sa punt deċimali wieħed.

5.2.2.3.

Użu ta’ standard intern F’ċerti analiżi (per eżempju meta mhux l-aċidi grassi kollha huma kkwantifikati, bħal meta xi aċidi b’erba’ jew sitt karbonji huma preżenti flimkien ma’ aċidi b’16 u 18-il karbonju, jew meta jeħtieġ tikkalkola l-ammont assolut ta’ xi aċidu grass f’kampjun) għandu jiġi wżat l-Istandard Intern. Spiss jintużaw aċidi grassi b’ħamsa, 15 jew 17-il karbonju. Il-fattur ta’ korrezzjoni (jekk jkun hemm) għall-Istandard Intern għandu jiġi kkalkolat. Il-perċentwali bil-piż tal-komponent i, imfisser bħala esteri tal-metill, tingħata bil-formula: fejn: Ai hija l-area taħt il-quċċata li tikkorrispondi mal-komponenti i; As hija l-area taħt il-quċċata li tikkorrispondi ma’ l-Istandard Intern; K¢i huwa l-fattur ta’ korrezzjoni għall-komponent i (relattiv għall-KC1); K¢s huwa l-fattur ta’ korrezzjoni għall-Istandard Intern (relattiv għall-KC16); m huwa l-piż, f’milligrammi, tal-porzjon tat-test; ms huwa l-piż, f’milligrammi, tal-Istandard Intern; Agħti r-riżultati sa punt deċimali wieħed.

▼M2

6.   KAŻ SPEĊJALI — DETERMINAZZJONI TAT-TRANS-ISOMERS

Hu possibbli li jkun determinat il-kontenut tat-trans-isomers fl-aċti bix-xaħaM b’numru ta’ atomi tal-karbonju bejn 10 u 24 billi jkunu mifruda l-methyl esters permezz tal-gas chromatography capillary columns li jkollhom polarità speċifika.

6.1.	Capillary column magħmula mis-silica li jkollha dijametru intern ta’ bejn 0,25 mm u 0,32 mm u tul ta’ 50 m, miksi bil-cyanopropisilicon, il-ħxuna tal-kisi li tkun bejn 0,1 u 0,3 μm (tip SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 u tipi simili).

▼M21

6.2.	L-esters tal-metill jitħejjew skond il-metodu B deskritt fl-Anness X “B”. Is-sustanzi grassi b’aċidità libera ta’ aktar minn 3 % għandhom jiġu newtralizzati minn qabel, skond il-punt 5.1.1. ta’ l-Anness VII.

▼M2

6.3.

Il-kundizzjonijiet tal-ħidma għall-gas chromatography huma fuq kollox kif ġej: — temperatura tal-kolonna stabbilita bejn 150 oC and 230 oC (per eżempju 165 oC għal 15-il minuta mbagħad tiżdied b’5 oC kull minuta sa 200 oC); — temperatura tal-injettur: 250 oC jekk is-sistema ta’ qsim tintuża’ jew it-temperatura tal-bidu tal-kolonna jekk is-sistema ta’ fuq il-kolonna hi użata; — temperatura tad-detector: 260 oC; —  flow rate tal-carrier gas (helium u hydrogen): 1,2 ml kull minuta. L-ammont injettat irid ikun tali li fil-kundizzjonijiet tas-sensittivita użati l-qofol tal-quċċata li jaqbel mal-methyl ester tal-aċtu arachidic huwa ugwali għal jew akbar minn 20 % tal-qiegħ tal-iskala.

6.4.

L-identifikazzjoni tal-methyl esters differenti hi affettwata skond id-drabi ta’ ritensjoni li huma mqabbla ma’ dawk għat-taħlitiet ta’ riferenza (kif indikat f’punt 2.3). L-esters tal-aċti trans fatty huma maħruġa qabel il-cis-isomers korrispondenti. Eżempju ta’ chromatogram jidher fil-figura 2. Figura 2: Gas chromatogram tat-trans-isomers tal-aċtu tax-xaħam bl-użu tal-kolonna kapillari.

6.5.	L-effiċjenza tal-kolonna stabbilita skond punt 4.1.2 trid tkun tali li tħalli l-firda ta’ ċerti koppji kritiċi, per eżempju l-kopja ffurmata mill-massif ta’ aċti transisoleic u l-quċċata tal-aċtu oleiku, trans C18:1/cis C18:1, b’indiċi ta’ riżoluzzjoni akbar minn 2.

6.6.

Il-perċentwali tad-diversi aċti trans fatty hu kalkulat skond ir-relazzjoni li hemm bejn il-wiċċ tal-quċċata rilevanti u s-somma tal-uċuh tal-quċċati kollha preżenti. Il-peċentwali ta’: — l-aċti trans octadecenoic (T 18: 1) indikati f’Anness I għal dan ir-Regolament bħala s-somma tat-transoleic isomers; — l-aċti cis-trans u trans-cis octadecadienoic ((CT/TC) 18: 2) indikati f’Anness I għal dan ir-Regolament bħala t-total tat-translinoleic isomers; — l-aċti trans-cis-trans, cis-cis-trans, cis-trans-cis, trans-cis-cis, octadecatrienoic ((TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3), indikati f’Anness I ta’ dan ir-Regolament bħala t-total tat-translinolenic isomers huma kunsidrati. Nota 8:Meta jitqiesu l-karatteristiċi partikulari ta’ dan il-metodu, jekk jogħġobkom agħtu r-riżultati b’2 deċimali.

▼B

7.   KAŻ SPEĊJALI — UŻU TA’ DIDEKTER KATAROMETRU (IMĦADDEM FUQ IL-PRINĊIPJU TA’ TIBDIL FIL-KONDUTTIVITÀ TERMALI)

Kromatografu tal-gass li jħaddem didekter imħaddem fuq il-prinċipju ta’ tibdil fil-konduttività termali (katarometru) jista’ jintuża għad-determinazzjoni tal-kompożizzjoni kwalitattiva u kwantitattiva ta’ taħlita ta’ aċidi grassi ta’ methyl esters. Jekk jintuża, il-kondizzjonijiet speċifikati fi klawsola 3 u fi klawsola 4 għandhom jinbidlu kif muri fit-Tabella 3.

Għal analiżi kwantitattiva, uża l-fatturi ta’ korrezzjoni definiti f’5.2.2.2.

8.   RAPPORT TAT-TEST

Ir-rapport tat-test għandu jispeċifika l-metodi wżati għat-tħejjija tal-esteri tal-metillu għall-analiżi tal-kromatografija tal-gass, u r-riżultati miksuba. Għandu wkoll isemmi d-dettalji kollha ta’ tħaddim mhux speċifikati f’dan l-Istandard Internazzjonali, jew miqjusa bħala mhux obbligatorji, flimkien ma’ dettalji ta’ xi inċidenti li setgħu kellhom influwenza fuq ir-riżultati.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi t-tagħrif kollu meħtieġ għall-identifikazzjoni sħiħa tal-kampjun.

▼M19

---

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A

:

Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B

:

Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1.   Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1.   Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2.   Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3.   Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4.   Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5.   Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2.   Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1.   Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2.   Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3.   Reagents

2.4.   Apparatus

2.5.   Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6.   Alternatives to methylation Method B

2.6.1.   Method C

2.6.1.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2.   Apparatus

2.6.1.3.   Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4.   Procedure

2.6.2.   Method D

2.6.2.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2.   Apparatus

2.6.2.3.   Reagents

2.6.2.4.   Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

Note 2: To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3.   Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1.   Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2.   Calculations

2.1.

For the calculation of the fatty acid composition and ΔECN42, all the following fatty acids will be taken into account: Myristic (C14:0). Palmitic (C16:0). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters. Palmitoleic (C16:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester. Margaric (C17:0). Margaroleic (C17:1). Stearic (C18:0). Oleic (C18:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester, ethyl ester, and trans-isomers of the methyl ester. Linoleic (C18:2). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters, and the trans-isomers of the methyl ester. Arachidic (C20:0). Linolenic (C18:3). Sum of the areas of the methyl ester and the trans-isomers of the methyl ester. Eicosenoic (C20:1). Behenic (C22:0). Lignoceric (C24:0). Squalene will not be taken into account for the calculation of the total area.

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17). The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula: Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

---

ANNESS XI

DETERMINAZZJONI TAL-KONTENUT TA' SOLVENTI VOLATILI ALOĠINATI FIŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA

1.   METODU

Analiżi bil-kromatografija tal-gass bl-użu tat-teknika ta' spazju ta' arja.

2.   TAGĦMIR

2.1.	Apparat ta' kromatografija tal-gass mgħammar b'electron capture didekter (ECD).

2.2.	Apparat ta' spazju ta' arja.

2.3.	Kolonna tal-kromatografija tal-gass, tal-ħġieġ, twila 2 m u b'djametru ta' 2 mm, fażi stazzjonarja. OV101 10 % jew ekwivalenti, li timla ħamrija kalċinata diatomea, maħsula bl-aċidu u silanizzata u ta' daqs ta' partiċella ta' malja ta' 80 sa 100.

2.4.	Gass awżiljarju u carrier: nitroġenu għal kromatografija tal-gass, xieraq għal kxif bil-qbid tal-elettroni.

2.5.	Flasks tal-ħġieġ, 10 sa 15 ml, b'kisja ta' teflon u tapp tal-aluminju b'aċċessorju biex tidħol siringa.

2.6.	Moros li jagħlqu ermetikament.

2.7.	Siringa tal-gass 0,5 sa 2 ml.

3.   REAĠENTI

Standard: solventi aloġenati ta' grad ta' purità xieraq għal kromatografija tal-gass.

4.   PROĊEDURA

4.1.

Iżen eżattament madwar 3g ta' żejt fi flask tal-ħġieġ (mhux biex jerġa' jintuża); issiġġillah ermetikament. Qiegħdu f'termostat fuq 70 oC għal siegħa. Permezz ta' siringa neħħi bil-mod 0,2 sa 0,5 ml tal-ispazju ta' arja. Injettah fil-kolonna tal-apparat ta' kromatografija tal-gass irregolat kif ġej: — temperatura tal-injettur: 150 oC, — temperatura tal-kolonna: 70 sa 80 oC, — temperatura tad-didekter: 200 sa 250 oC. Jistgħu jintużaw ukoll temperaturi oħra sakemm ir-riżultati jibqgħu ekwivalenti.

4.2.

Soluzzjonijiet ta' riferenza: ħejji soluzzjonijiet standard billi tuża żejt taż-żebbuġa raffinat mingħajr traċċa ta' solventi b'konċentrazzjonijiet li jvarjaw bejn 0,05 sa 1 ppm (mg/kg) u li jikkorrispondu għall-kontenut maħsub tal-kampjun. Is-solventi aloġinati jistgħu jiġu dilwiti bl-użu tal-pentan.

4.3.

Stima kwantitattiva: ikkorrelata l-uċuħ jew l-elevazzjonijiet tal-qċaċet tal-kampjun u tas-soluzzjoni standard tal-konċentrazzjoni meqjusa l-eqreb. Jekk id-devjazzjoni tkun akbar minn 10 % l-analiżi trid terġa' ssir mqabbla ma' soluzzjoni oħra standard sakemm id-devjazzjoni tkun sa 10 %. Il-kontenut jiġi kkalkolat fuq il-bażi tal-medja tal-injezzjonijiet elementari.

4.4.	Espressjoni tar-riżultati: f'ppm (mg/kg). Il-limitu ta' kxif għall-metodu huwa ta' 0,01 mg/kg.

▼M22

---

ANNESS XII

IL-METODU TAL-KUNSILL INTERNAZZJONALI TAŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA GĦALL-EVALWAZZJONI ORGANOLETTIKA TAŻ-ŻJUT VERĠNI TAŻ-ŻEBBUĠA

1.   L-GĦAN U L-QASAM TA' APPLIKAZZJONI

Dan il-metodu jibbaża fuq id-deċiżjoni Nru DEC-21/95-V/2007 tas-16 ta' Novembru 2007 dwar il-metodu rivedut għall-evalwazzjoni organolettika taż-żejt verġni taż-żebbuġa tal-Kunsill Internazzjonali taż-Żejt taż-Żebbuġa. Għandha l-għan li tistabbilixxi l-proċedura għall-evalwazzjoni tal-karatteristiċi organolettiċi taż-żjut verġni taż-żebbuġa fit-tifsira tal-punt 1 ta' l-Anness XVI għar-Regolament (KE) Nru 1234/2007 u li jistabbilixxi l-metodu għall-klassifikazzjoni tagħhom abbażi ta' dawn il-karatteristiċi. Il-metodu fih ukoll indikazzjonijiet dwar it-tikkettar fakultattiv.

Il-metodu deskritt huwa applikabbli biss għaż-żjut verġni taż-żebbuġa, kif ukoll għall-klassifikazzjoni jew it-tikkettar tagħhom skond l-intensità tad-difetti perċepiti, tat-togħma fruttata u tal-karatteristiċi pożittivi oħra, kif deċiżi minn grupp ta' dewwieqa magħżula, mħarrġa u ttestjati, magħquda f'bord.

2.   ASPETTI ĠENERALI

Għall-vokabolarju bażiku ġenerali, is-sala tat-tegħim, it-tazza tat-tegħim taż-żjut taż-żebbuġa u kwalunkwe kwistjoni marbuta ma' dan il-metodu, huwa rrakkomandat li dak li jkun iżomm mal-proviżjonjiet tal-Kunsill Internazzjonali taż-Żejt taż-Żebbuġa, b'mod partikolari d-deċiżjoni Nru DEC-21/95-V/2007 tas-16 ta' Novembru 2007 dwar il-metodu rivedut għall-evalwazzjoni organolettika taż-żejt verġni taż-żebbuġa.

3.   VOKABOLARJU SPEĊIFIKU

3.1.   Attributi Pożittivi

Fruttat :

is-sensazzjonijiet olfattivi karatteristiċi taż-żejt miġmugħa flimkien, skond il-varjetà taż-żebbuġa, minn frott b'saħħtu u frisk, aħdar jew matur, perċepiti direttament jew /u bix-xamm.

L-attribut fruttat ikun kwalifikat bħala aħdar meta s-sensazzjonijiet olfattivi jkunu jixbhu lil dawk tal-frott aħdar, karatteristiċi ta' żejt li jkun ġej minn frott aħdar.

L-attribut fruttat ikun kwalifikat bħala matur meta s-sensazzjonijiet olfattivi jkunu jixbhu lil dawk tal-frott matur, karatteristiċi ta' żejt li jkun ġej minn frott aħdar u matur.

Morr : togħma elementari karatteristika taż-żejt miksub minn żebbuġ aħdar jew fl-istadju tal-maturazzjoni, perċepit bil-papilli kalċiformi li jiffurmaw iż-żona V ta' l-ilsien.

Punġenti : is-sensazzjoni tattili ta' tinġiż, karatteristika taż-żjut prodotti lejn il-bidu ta' l-istaġun, prinċipalment abbażi ta' żebbuġ għadu aħdar, li tista' tinħass fil-kavità kollha tal-ħalq, partikolarment fil-ġerżuma.

3.2.   Attributi negattivi

Imdardar/sediment : togħma karatteristika taż-żejt meħud minn żebbuġ mgħaffeġ fuq xulxin jew maħżun f'kundizzjonijiet b'tali mod li jinsab fi stat avvanzat ta' fermentazzjoni anerobika jew ta' żejt li jkun baqa' f'kuntatt mat-“tjun” li jkunu qagħdu, li huma wkoll ikunu għaddew minn proċess ta' fermentazzjoni anerobika fil-btieti u t-tankijiet.

Moffa-umdu : togħma karatteristika taż-żejt miksub minn żebbuġ attakkat mill-moffa u mill-ħmira wara li l-frott ikun inħażen fl-umdità għal diversi ġranet.

Togħma ta' nbid-ħall / aċidu-qares : togħma karatteristika ta' ċerti żjut li jfakkru fl-inbid jew il-ħall. Hija kkawżata fondamentalment minn proċess ta' fermentazzjoni aerobika taż-żebbuġ jew ta' fdalijiet ta' għaġna taż-żebbuġ li jkunu baqgħu f'mats li ma jkunux inħaslu sewwa, li jikkawża l-formazzjoni ta' l-aċidu aċetiku, l-l-aċetat ta' l-etil (ethyl acetate) u l-etanol.

Metalliku : togħma li tfakkar fil-metalli. Hija karatteristika taż-żejt li jkun ilu żmien fil-kuntatt ma' wċuħ tal-metall, waqt il-proċessi tat-tifrik, it-taħlit, il-pressjoni jew il-ħżin.

Imranġat : it-togħma taż-żjut li jkunu għaddew minn proċess intens ta' ossidazzjoni.

Imsajjar jew maħruq : togħma karatteristika taż-żjut li toriġina minn tisħin eċċessiv u/jew imtawwal waqt li jkunu qed jinkisbu, u partikolarment matul it-taħlit termali ta' l-għaġna, jekk dan isir f'kundizzjonijiet ta' sħana mhux xierqa.

Tiben-injam : togħma karatteristika ta' ċerti żjut miksuba minn żebbuġ niexef.

Raff : sensazzjoni bukkotattili densa u magħġuna li jħallu ċerti żjut qodma.

Lubrifikanti : togħma ta' żejt li tfakkar fid-diżil, il-griż tal-lubrikazzjoni jew iż-żejt minerali.

Ilma tal-ħxejjex : togħma li ż-żejt jeħodha wara kuntatt fit-tul ma' ilma tal-ħxejjex li jkun għadda minn proċess ta' fermentazzjoni.

Salmura : togħma taż-żejt miksub minn żebbuġ ippreservat fis-salmura.

Spartu : togħma karatteristika taż-żjut miksuba minn żebbuġ ippressat fil-mats ta' l-ispartu ġodda. Tista' tvarja skond jekk il-mats ikunux magħmulin minn spartu aħdar jew imnixxef.

Ħamrija : togħma ta' żejt miksub minn żebbuġ miġbur bi traċċi ta' ħamrija jew tajn u li ma jkunx inħasel.

Imdewwed : togħma ta' żejt miksub minn żebbuġ li jkun attakkat bil-qawwi mid-dud tad-dubbiena taż-żebbuġ (Bactrocera oleae).

Ħjar : togħma karatteristika ta' żejt li jkun inżamm wisq fit-tul f'kontenituri ssiġillati ermetikament, partikolarment fil-laned attribwit għall-formazzjoni ta' 2,6-nonadienal.

Injam umdu : togħma karatteristika taż-żjut miksuba minn żebbuġ li jkun għada minn proċess ta' ffriżar fuq il-fergħa.

3.3.   Terminoloġija fakultattiva għall-finijiet tat-tikkettar

Fuq talba, il-kap tal-bord jista' jiċċertifika li ż-żjut evalwati jilħqu d-definizzjonijiet u l-gradi li jikkorrispondu għall-espressjonijiet u l-aġġettivi li ġejjin, f'termini ta' l-intensità u l-perċezzjoni ta' l-attributi.

4.   IL-BORD

Il-bord għandu jkun magħmul minn kap tal-bord u minn tmien sa tnax-il dewwieq.

Il-kap tal-bord jeħtieġlu jkun ta' edukazzjoni soda, u jkun midħla tat-tipi differenti ta' żjut u espert rikonoxxut dwarhom. Il-kap ikun responsabbli għall-bord, l-organizzazzjoni u l-funzjonament tiegħu, għat-tħejjija, il-kodifikazzjoni u l-preżentazzjoni tal-kampjuni lid-dewwieqa, kif ukoll għall-ġbir tad-dejta u t-trattament statistiku tagħha.

Għandu jagħżel id-dewwieqa, u jieħu ħsieb it-taħriġ tagħhom u l-kontroll tal-prestazzjonijiet tagħhom, biex jiżgura li jżommu rwieħhom f'livell xieraq ta' ħila.

Jeħtieġ li d-dewwieqa għall-kontrolli organolettiċi taż-żjut taż-żebbuġa jintgħażlu u jitħarrġu skond il-ħila tagħhom li jiddistingwu bejn kampjuni simili, f'konformità mal-gwida tal-Kunsill Internazzjonali taż-Żejt taż-Żebbuġa dwar l-għażla, it-taħriġ u l-kontroll tad-dewwieqa kkwalifikati taż-żjut taż-żebbuġa.

Il-bordijiet jeħtiġilhom jimpenjaw irwieħhom li jieħdu sehem f'evalwazzjonijiet organolettiċi pprovduti fil-pjanijiet nazzjonali, Komunitarji jew internazzjonali għall-ittestjar perjodiku u l-armonizzazzjoni tal-kriterji ta' perċezzjoni. Barra minn hekk, fil-każ tal-bordijiet approvati skond id-dispożizzjonijiet ta’ l-Artikolu 4(1) ta’ dan ir-regolament, jeħtiġilhom jagħtu kull sena lill-Istat Membru kkonċernat l-informazzjoni kollha dwar il-kompożizzjoni tagħhom u l-għadd ta' evalwazzjonijiet li jkunu wettqu bħala bord approvat.

5.   IL-PROĊEDURA GĦALL-EVALWAZZJONI ORGANOLETTIKA U L-KLASSIFIKAZZJONI

5.1.   L-użu tal-formola ta' profil min-naħa tad-dewwieq

Il-formola tal-profil taż-żejt li għandha tintuża mid-dewwieq hija riprodotta fl-Appendiċi A.

Kull dewwieq li jkun membru ta' bord għandu jxomm, u mbagħad iduq iż-żejt imressaq għall-ittestjar. Wara għandu jniżżel fuq l-iskali ta' 10 cm tal-formola ta' profil li jkollu għad-dispożizzjoni tiegħu l-intensità li biha jipperċepixxi kull wieħed mill-attributi negattivi u pożittivi ( 6 ). Fil-każ ta' perċezzjoni ta' karattru aħdar jew matur ta' l-attribut fruttat, id-dewwieq għandu jimmarka l-kaxxa korrispondenti fil-formola ta' profil.

Fil-każ li jkunu perċepiti attributi negattivi mhux indikati fuq il-formola ta' profil, għandhom jitniżżlu taħt l-entrata “oħrajn”, bl-użu tat-terminu jew termini li jiddeskrivihom/uhom bl-akbar preċiżjoni minn fost dawk definiti.

5.2.   L-użu tad-dejta min-naħa tal-kap tal-bord

Il-kap tal-bord għandu jiġbor il-formoli ta' profil li jimla kull dewwieq; għandu jiċċekkja l-intensità assenjata għall-attributi differenti; fil-każ li jirriżultalu li jkun hemm anomalija, għandu jitlob lid-dewwieq biex jirrevedi l-formola ta' profil tiegħu, u, jekk ikun hemm bżonn, biex jirrepeti t-test.

Il-kap tal-bord jista' jdaħħal id-dejta ta' kull dewwieq permezz ta' programm tal-kompjuter konformi għall-metodu ta' kalkolu statistiku tal-medjan li jingħata fl-Appendiċi B. Ir-reġistrazzjoni tad-dejta għal kampjun għandha ssir permezz ta' matriċi komposta minn 9 kolonni li jikkorrispondu għad-9 attributi sensorjali, u minn n linja li jikkorrispondu għall-n dewwieqa fil-bord.

Meta attribut negattiv li jkun perċepit minn talanqas 50 % tal-bord jitniżżel taħt l-entrata “oħrajn”, għandu jiġi kkalkulat il-medjan ta' dan id-difett u ż-żejt jiġi kklasifikat skond dan.

Il-kap tal-bord ma jistax jiċċertifika li ż-żejt evalwat jilħaq il-kundizzjonijiet imsemmija fil-punt 3.3.a f'dak li jirrigwarda t-termini “aħdar” jew “matur” għajr meta talanqas 50 % tal-membri tal-bord ikunu indikaw li pperċepixxew il-karattru aħdar jew matur ta' l-attribut fruttat.

Fil-każ ta' l-analiżijiet imwettqa fil-kuntest ta' eżamijiet ta' konformità, għandu jsir test. Fil-każ ta' analiżijiet kontradittorji, il-kap tal-bord jeħtieġlu jara li l-analiżi titwettaq darbtejn. Fil-każ ta' analiżijiet li jinnullifikaw, l-evalwazzjoni jeħtiġilha ssir tliet darbiet. F'dan il-każ, il-medjan ta' l-attributi għandu jkun ikkalkulat abbażi tal-medja tal-medjani. Ir-replikazzjonijiet kollha ta' dawn it-testijiet ikunu jridu jitwettqu matul sessjonijiet differenti.

5.3.   Il-klassifikazzjoni taż-żjut

Iż-żejt għandu jkun ikklassifikat fil-kategoriji li ġejjin, skond il-medjan tad-difetti u l-medjan ta' l-attribut fruttat. Il-medjan tad-difetti huwa definit bħala l-medjan tad-difett li jkun ipperċepit bl-akbar intensità. Il-medjana tad-difetti u l-medjana tal-fruttat huma espressi b'ċifra deċimali waħda, u l-valur tal-koeffiċjent ta' varjazzjoni robusta li jiddefinixxihom jeħtieġlu jkun 20 % jew anqas.

Il-klassifikazzjoni taż-żjut għandha titwettaq bi tqabbil tal-valur tal-medjan tad-difetti u l-medjan tal-fruttat flimkien ma' l-intervalli ta' referenza mfissra hawn taħt. Ġaladarba l-limiti ta' dawn l-intervalli kienu stabbiliti bil-qies tal-marġni ta' l-iżball tal-metodu, jitqiesu bħala assoluti. Programmi tal-kompjuter jippermettu li ssir klassifika viżiva f'tabella ta' dejta statistika jew inkella grafikament.

a)	Żejt extra verġini taż-żebbuġa : il-medjan tad-difetti jkun 0 u l-medjan ta' l-attribut fruttat ikun ogħla minn 0;

b)	Żejt verġni taż-żebbuġa : il-medjan tad-difetti jkun ogħla minn 0 imma mhux aktar minn 3.5, u l-medjan ta' l-attribut fruttat ikun ogħla minn 0;

ċ)	Żejt taż-żebbuġa lampante : il-medjan tad-difetti jkun ogħla minn 3.5; jew il-medjan tad-difetti ma jkunx ogħla minn 3.5, u l-medjan ta' l-attribut fruttat ikun 0.

5.4.   Każ speċjali

Meta l-medjan ta' attribut pożittiv għajr dak fruttat ikun ogħla minn 5.0, il-kap tal-bord għandu jindika dan fiċ-ċertifikat ta' l-analiżi taż-żejt.

---

Appendiċi A

Formola ta' profil taż-żejt verġni taż-żebbuġa

---

Appendiċi B

METODU TAL-KALKOLU TAL-MEDJAN U TA' L-INTERVALLI TA' KUNFIDENZA

Il-medjan

Il-medjan huwa n-numru reali Xm ikkaratterizzat mill-fatt li l-probabbiltà (P) li l-valuri tad-distribuzzjoni (X) ikunu anqas minn dak in-numru (Xm) mhijiex aktar minn 0.5 u li, fl-istess waqt, il-probabbiltà (P) li l-valuri tad-distribuzzjoni (X) ikunu ugwali għal Xm jew anqas minnu tkun 0.5 jew aktar. Definizzjoni oħra tqis il-medjan bħala l-50 perċentil ta' distribuzzjoni ta' numri ordnati miż-żgħir sal-kbir. Fi kliem ieħor, il-medjan jirrappreżenta l-valur ċentrali ta' serje fard ordnata ta' numri, jew il-medja taż-żewġ valuri ċentrali ta' serje żewġ ordnata ta' numri.

Devjazzjoni standard robusta

Għal stima affidabbli tal-varjabbiltà madwar medjan, jeħtieġ l-użu ta' l-istima tad-devjazzjoni tat-tip robusta skond Stuart u Kendall. Il-formula li ġejja tindika d-devjazzjoni tat-tip asimptotika, jiġifieri l-istima robusta tad-devjazzjoni tad-dejta kkunsidrata, fejn N huwa l-għadd ta' osservazzjonijiet u IQR il-firxa interkwartali, li jiġbor fih preċiżament 50 % tal-każijiet ta' kwalunkwe distribuzzjoni ta' probabbiltà.

Il-kalkolu tal-firxa interkwartali jsir billi jitkejjel id-daqs tad-devjazzjoni bejn il-75 perċentil u l-25 perċentil.

IQR = il-75 perċentil — il-25 perċentil

Il-perċentil huwa l-valur Xpc ikkaratterizzat mill-fatt li l-probabbiltà (P) li l-valuri tad-distribuzzjoni jkunu anqas minn Xpc ma tkunx aktar minn parti determinata minn mija, u li, fl-istess waqt, il-probabbiltà (P) li l-valuri tad-distribuzzjoni ma jkunux aktar minn Xpc ma tkunx anqas minn dik il-parti minn mija msemmija. Il-parti minn mija tindika l-frazzjoni tad-distribuzzjoni użata. Fil-każ tal-medjan, din tkun 50/100.

Fil-prattika, il-perċentil huwa l-valur fid-distribuzzjoni li jikkorrispondi għal medda determinata taħt il-linja tad-distribuzzjoni jew tad-densità. Pereżempju, il-25 perċentil jirrappreżenta l-valur tad-distribuzzjoni li jikkorrispondi għal medda ugwali għal 0.25 jew 25/100.

Koeffiċjent robust ta' varjazzjoni %

L-RVC jirrappreżenta numru pur, jiġifieri mingħajr dimensjoni, li jindika l-perċentwal ta' varjabbiltà tas-serje ta' numri analizzata. Huwa għalhekk li dan il-koeffiċjent huwa daqshekk utli għall-verifika ta' l-affidabbiltà tal-membri tal-bord.

Intervalli ta' kunfidenza fuq 95 % fil-medjan

L-intervalli ta' kunfidenza f'95 % (il-valur ta' l-iżball ta' l-ewwel tip ugwali għal 0.05 jew 5 %) jirrappreżentaw il-firxa li fiha l-valur tal-medjan ikun jista' jvarja li kieku kien possibbli li l-esperiment jerġa' jsir għal għadd inifinit ta' drabi. Fil-prattika, dan l-intervall jindika l-firxa ta varjabbiltà tat-test fil-kundizzjonijiet operattivi magħżula, li kieku kien possibbli li t-test ikun ripetut għadd ta' drabi. Bħal fil-każ ta' l-RCV, l-intervall jgħin biex titkejjel l-affidabbiltà tat-test.

ICsup = Me + (c.S*)

ICinf = Me - (c.S*)

fejn c, fil-każ ta' intervall ta' kunfidenza ta' 0.95, huwa valur ugwali għal 1.96.

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

ANNESS XV

1.   KONTENUT TA’ ŻEJT TAL-FDAL TAŻ-ŻEBBUĠ

1.1.   Apparat

1.2.   Reaġent

Hexane normali, ta’ grad tekniku, li għandu jħalli fdal ta’ anqas minn 0,002 g kull 100 ml, meta jevapora kollu.

2.   PROĊEDURA

2.1.   Tħejjija tal-kampjun tat-test.

Jekk ikun hemm bżonn, uża l-mitħna mekkanika, li qabel tkun ġiet imnaddfa sew, biex tidħan il-kampjun tal-laboratorju sabiex tfarrku fi frak li jkun jista’ jgħaddi għal kollox mill-għarbiel.

Uża madwar waħda minn għoxrin biċċa tal-kampjun biex ittemm il-proċess tat-tindif tal-mitħna, armi l-materjal mitħun, itħan li jibqa’ u iġbor, ħallat bir-reqqa u analizza mingħajr dewmien.

2.2.   Porzjon tat-test

Malli tintemm l-operazzjoni tat-tħin, iżen madwar 10 g tal-kampjun sa l-eqreb 0,01 g għall-ittestjar.

2.3.   Tħejjija tat-tubu ta’ estrazzjoni

Qiegħed il-porzjon tat-test fit-tubu u sodd bit-tajjar. Jekk tiġi wżata karta filtru, qartas il-porzjon tat-test fiha.

2.4.   Tnixxif preliminari

Jekk il-fdal taż-żebbuġ huwa niedi ħafna (i.e., umdità u kontenut materjali volatili aktar minn 10 %), wettaq it-tnixxif preliminari billi tpoġġi l-ħolqa mgħobbija (jew karta filtru) fil-forn imsaħħan għal żmien xieraq f’temperatura ta’ mhux aktar minn 80 oC sabiex tnaqqas l-umdità u l-kontenut materjali volatili għal anqas minn 10 %.

2.5.   Tħejjija tal-flask bil-qiegħ tond

Iżen sa l-eqreb 1 mg il-flask li fih partikola waħda jew tnejn mill-ħaffiefa, imnixxfa minn qabel fil-forn f’103 ± 2 °C imbagħad mkessħa f’dessikatur għal mhux anqas minn siegħa.

2.6.   Estrazzjoni tal-bidu

Fl-apparat ta’ estrazzjoni deffes il-ħolqa (jew il-karta filtru) li fiha hemm il-porzjon tat-test. Ferragħ il-kwantita meħtieġa ta’ hexane fil-flask. Qiegħed il-flask fl-apparat ta’ estrazzjoni u qiegħed kollox fuq il-banju msaħħan b’mod elettriku. Irregola r-rata tas-sħana b’mod li r-rata ta’ rifluss ma tkunx anqas minn tliet qatriet kull sekonda (togħlija moderata, mhux bil-qawwa). Wara erba’ sigħat ta’ estrazzjoni, ħalliħ jiksaħ. Neħħi l-ħolqa mill-apparat ta’ estrazzjoni u qegħdha f’kurrent ta’ arja biex tneħħi ħafna mis-solvent li jkun ippenetra.

2.7.   It-tieni estrazzjoni

Aqleb il-kontenut tal-ħolqa fil-micro-grinder u itħan fin kemm jista’ jkun. Qiegħed lura t-taħlita mitħuna fil-ħolqa minngħajr ma twaqqa’ u poġġiha lura fl-apparat ta’ estrazzjoni.

Issokta bl-estrazzjoni għal sagħtejn oħra billi tuża l-istess flask bil-qiegħ tond li fih hemm l-estratt tal-bidu.

Is-soluzzjoni miksuba fil-flask ta’ estrazzjoni trid tkun ċara. Jekk le, iffiltra minn karta filtru u aħsel il-flixkun oriġinali u l-karta filtru għal bosta drabi bil-hexane. Iġbor il-filtrat u s-solvent tal-ħasil fi flask ieħor bil-qiegħ tond li jkun ġie mnixxef u ttarat sa l-eqreb 1 mg.

2.8.   Tneħijja tas-solvent u l-użin tal-estratt.

Neħħi l-parti l-kbira tas-solvent billi tiddistilla fuq banju imsaħħan bl-elettriku. Neħħi l-aħħar traċċi tas-solvent billi ssaħħan il-flask fil-forn f’103 ± 2 oC għal 20 minuta. Għin il-proċess ta’ eliminazzjoni jew billi tonfoħ l-arja fih, jew preferibbilment xi gass inerti, f’intervalli jew billi tuża pressjoni mnaqqsa

Ħalli l-flixkun f’dessikatur biex jiksaħ għal mill-inqas siegħa w iżen sa l-eqreb 1 mg.

Erġa’ saħħan għal 10 minuti taħt l-istess kondizzjonijiet, kessaħ f’dessikatur u erġa’ iżen.

Id-differenza bejn iż-żewġ piżijiet ma għandix taqbeż 10 mg. Jekk jiġri hekk, erġa’ saħħan għal perjodi ta’ 10 minuti u wara kessaħ u iżen sakemm id-differenza fil-piż tkun 10 mg jew inqas. Ħu nota tal-aħħar piż tal-flixkun.

Wettaq determinazzjonijiet doppji fuq il-kampjun tat-test.

3.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI:

3.1.   Metodu ta’ determinazzjoni u l-formula

3.2.   Ripetibilità

Id-differenza bejn il-determinazzjonijiet duplikati mwettqa fl-istess ħin jew eżatt wara xulxin mill-istess analista ma għandiex taqbeż 0,2 g ta’ estratt ta’ hexane għal kull 100 g ta’ kampjun.

Jekk din il-kondizzjoni ma tiġix sodisfatta, irrepeti l-analiżi fuq żewġ porzjonijiet oħra tat-test. Jekk, anki f’dan il-każ, id-differenza taqbeż 0,2 g, ħu bħala riżultat il-medja aritmetika tal-erba’ determinazzjonijiet.

---

ANNESS XVI

DETERMINAZZJONI TAL-VALUR TA’ JODJU

1.   SKOP

Dan l-Istandard Internazzjonali jispeċifika metodu għad-determinazzjoni tal-valur ta’ jodju tax-xaħmijiet u żjut tal-annimali u veġetali, minn issa ’l quddiem imsejjħin xaħmijiet.

2.   DEFINIZZJONI

Għall-għanijiet ta’ dan l-Istandard Internazzjonali, tapplika d-definizzjoni li ġejja:

2.1.	valur ta’ jodju. Il-piż ta’ jodju assorbit mill-kampjun taħt il-kondizzjonijiet ta’ tħaddim speċifikati f’dan l-I standard Internazzjonali. Il-valur ta’ jodju huwa mfisser bħala grammi ta’ jodju għal 100 g ta’ kampjun

3.   PRINĊIPJU

Dissoluzzjoni ta’ porzjon tat-test f’solvent u ż-żjieda tar-reaġent Wijs. Wara ħin speċifikat, żjieda ta’ soluzzjoni ta’ jodju tal-potassju w ilma, u titrazzjoni tal-jodju liberat b’soluzzjoni ta’ sodium thiosulfate.

4.   REAĠENTI

Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta’ grad analitiku magħruf:

4.1.	ilma, li jissodisfa l-kondizzjonijiet meħtieġa ta’ ISO 3696, Grad 3.

4.2.	jodur tal-potassju, soluzzjoni 100 g/l, li ma fihiex jodat jew jodju ħieles.

4.3.	lamtu, soluzzjoni. Ħallat 5 g ta’ lamtu li jinħall fi 30 ml ta’ ilma, żid din it-taħlita ma’ 1 000 ml ta’ ilma jagħli, agħalli għal tliet minuti u ħallih jiksaħ.

4.4.	soluzzjoni volumetrika standard c (Na2S2O3.5H2O) ta’ s odium thiosulfate = 0,1 mol/l, standardizzata mhux aktar minn sebat ijiem qabel l-użu.

4.5.	solvent, imħejji bit-taħlit ta’ volumi ugwali ta’ cyclohexane u aċidu aċetiku.

4.6.	Reaġent Wijs, li fih il-monoklorur tal-jodju fl-aċidu aċetiku. Għandu jintuża r-reaġent Wijs disponibbli kummerċjalment.

5.   APPARAT

Apparat tal-laboratorju tas-soltu u, b’mod partikolari, dan li ġej:

5.1.	sassla tal-ħġieġ għall-użin, xierqa għall-porzjon tat-test u biex tiddeffes fil-flasks (6.2).

5.2.	flasks koniċi li jesgħu 500 ml, b’tappijiet tal-ħġieġ immolat u xotti għal kollox.

6.   TĦEJJIJA TAL-KAMPJUN TAT-TEST

Il-kampjun omoġenizzat jitnixxef fuq is-sulfat tas-sodju u jiġi ffiltrat.

7.   PROĊEDURA

7.1.

Porzjon tat-test Il-piż tal-porzjon tat-test ivarja skond il-valur ta’ jodju mistenni kif muri fit-Tabella 1. Tabella 1. Várhat’ “j” 'dszám A vizsgált mennyiség tömege (ġ) kevesebb, mint 5 3,00 5-20 1,00 21-50 0,40 51-100 0,20 101-150 0,13 151-200 0,10 Iżen il-porzjon tat-test sa l-eqreb 0,1 mg f’sassla tal-użin tal-ħġieġ (5.1).

7.2.

Determinazzjoni Qiegħed il-porzjon tat-test fi flask ta’ 500 ml (6.2). Żid 20 ml tas-solvent (4.5) biex iddewweb ix-xaħam. Żid eżattament 25 ml tar-reaġent Wijs (4.6), poġġi t-tapp, għati dawra lill-kontenut u qiegħed il-flixkun fid-dlam. Tużax pipetta tal-ħalq għar-reaġent Wijs. Bl-istess mod, ħejji blank bis-solvent u r-reaġent iżda mingħajr il-porzjon tat-test. Għal kampjuni li għandhom valur ta’ jodju taħt il-150, ħalli l-flasks fid-dlam għal siegħa, għal dawk b’valur ta’ jodju ’l fuq minn 150 u għal prodotti polimerizzati jew prodotti ossidati sa ċertu punt, ħallihom għal sagħtejn. Meta jgħaddi l-ħin, żid 20 ml ta’ soluzzjoni (4.2) ta’ jodur tal-potassju u 150 ml ta’ ilma (4.1) f’kull flask Ittitra bis-soluzzjoni volumetrika standard (4.4) ta’ sodium thiosulfate sakemm l-isfar ta l-jodju kważi jisparixxi. Żid erba’ qatriet mis-soluzzjoni tal-lamtu (4.3) u ssokta bit-titrazzjoni sakemm l-ikħal jisparixxi wara taħwid bis-saħħa ħafna. Nota: Determinazzjoni potenzjometrika tal-punt aħħari hija permissibbli.

7.3.	Numru ta’ determinazzjonijiet Wettaq żewġ determinazzjonijiet fuq l-istess kampjun tat-test.

8.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI:

Il-valur tal-jodju jingħata bit-tifsira

fejn:

ċ

=

huwa l-valur numeriku tal-konċentrazzjoni eżatta, f’moli għal kull litru, tas-soluzzjoni volumetrika standard (4.4) ta’ sodium thiosulfate wżat;

V1

=

huwa l-valur numeriku tal-volum, f’millimetri, tas-soluzzjoni volumetrika standard (4.4) ta’ sodium thiosulfate wżat għall-blank test;

V2

=

huwa l-valur numeriku tal-volum, f’millimetri, tas-soluzzjoni volumetrika standard (4.4) ta’ sodium thiosulfate użat għad-determinazzjoni;

m

=

huwa l-valur numeriku tal-piż, fi grammi, tal-porzjon tat-test (7.1).

Ħu bħala riżultat il-medja aritmetika taż-żewġ determinazzjonijiet, sakemm il-ħtiġiet ta’ ripetibilità (9.2) jiġu sodisfatti.

▼M11

---

ANNESS XVII

METODU GĦAD-DETERMINAZZJONI TAS-STIGMASTADIENES FIŻ-ŻJUT TAL-ĦAXIX

1.   INTENZJONI

Determinazzjoni tas-stigmastadienes fiż-żjut tal-ħaxix li jkollhom konċentrazzjonijiet baxxi ta' dawn il-hydrocarbons, b'mod partikolari fiż-żejt verġni taż-żebbuġa u l-fdalijiet taż-żejt taż-żebbuġ mhux raffinati.

2.   GĦAN

L-istandard jista' jiġi applikat fiż-żjut kollha tal-ħaxix għalkemm il-kejl tista' toqgħod fuqu biss fejn il-kontenut ta' dawn il-hydrocarbons ikun bejn 0,01 u 4,0 mg/kg. Dan il-metodu hu partikolarment adattat biex tinstab il-preżenza taż-żejt tal-ħaxix raffinat (żebbuġ, fdalijiet taż-żebbuġa, fjuri tax-xemx, palmi, eċċ.) fiż-żejt verġni taż-żebbuġa peress li ż-żjut raffinati jkun fihom is-stigmastadienes u ż-żjut verġni ma jkollhomx.

3.   PRINĊIPJU

Iżolament ta' materja li m'hix saponifikata. Separazzjoni ta' steroidal hydrocarbon fraction permezz tal-kolonna kromatografika fuq silika ġel u analiżi permezz ta' gass kromatografiku kapillarju.

4.   APPARATUS

4.1.	Flasks tal-250 ml tajjeb biex tużah b'reflux condenser.

4.2.	Lembut li jissepara ta' kapaċità ta' 500 ml.

4.3.	Lembut b'qiegħ tond ta' 100 ml.

4.4.	Evaporatur li jdur.

4.5.

Kolonna kromatografika tal-ħġieġ (1,5 sa 2,0 ċm b'dijametru intern ta' 50 ċm tul) b'tap tat-Teflon u tappiera tal-ħġieġ suf tal-fibre jew disk tal-ħġieġ sintered fil-qiegħ. Biex tipprepara kolonna tas-silika ġel, itfa' hexane fil-kolonna kromatagrafika għal għoli ta' madwar 5 ċm u mbagħad imla' bi slurry ta' silika ġel fil-hexane (15 g f'40 ml) bil-għajnuna ta' porzjonijiet ta' hexane. Ħalli biex joqgħod u spiċċa l-qiegħa billi tapplika vibrazzjoni żgħira. Żid anhydrous sodium sulphate sa għoli ta' madwar 0,5 ċm, fl-aħħar ħallat il-hexane li tkun żejda.

4.6.	Kromatografu tal-gass bi flame ionization detector, maqsum jew on-column injector u forn ipprogrammat sa ± 1 °C.

4.7.	Kolonna kapillarja ta' silika fused għal kromatografija tal-gass (0,25 jew 0,32 mm b'dijametru intern ta' 25 m tul) miksi b'fażi ta' 5 %-phenylmethylsilicone, 0,25 mm film oħxon. Nota 1: Jistgħu jiġu użati kolonni oħrajn ta' polarità simili jew inqas.

4.8.	Integrator-recorder bil-possibilità ta' għamla ta' valley-valley integration.

4.9.	5 sa 10 ml microsyringe għal kromatografija tal-gass b'labra mkaħħla.

4.10.

Mantle ta' l-eletriku li jsaħħan jew post jaħraq.

5.   REAĠENTI

Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta' grad analitiku sakemm jiġi speċifikat mod ieħor. L-ilma użat għandu jkun ilma distillat, jew ilma ta' għall-inqas purità ekwivalenti.

5.1.	Hexane jew taħlita ta' alkanes b'intervall bp 65 sa 70 °C, distillat b' kolonna rettifikata. Nota 2: Is-solvent għandu jkun distillat biex jitineħħew l-impuritajiet.

5.2.	96 v/v ethanol.

5.3.	Anhydrous sodium sulphate.

5.4.

Soluzzjoni ta' potassium hydroxide alkolika f'10 %. Żid 10 ml ta' ilma ma' to 50 g potassium hydroxide, ħawwad, u mbagħad dewweb it-taħlita fl-ethanol sa 500 ml. Nota 3: Potash alkoliku isir kannella meta joqgħod. Għandu jkun ippraparat frisk kuljum u miżmum tajjeb fi fliexken tal-ħġieġ skuri magħluqin.

5.5.

Silika ġel 60 għal kolonna kromatografika, 70 sa 230 mesh, (Merck, riferenza 7734 jew simili). Nota 4: Normalment, silika ġel tista' tintuża direttament mill-kontenitur mingħajr ebda trattament. Madanakollu, xi gruppi ta' silika ġel jistgħu juru attività baxxa li tirriżulta f'separazzjonijiet ħżiena kromatografiċi. Taħt din iċ-ċirkustanza, is-silika ġel għandha tkun ittrattat b'dan il-mod: Attiva s-silika ġel billi ssaħħan għal mill-inqas erba' sigħat f'550 °C. Wara li ssaħħan, poġġi s-silika ġel f'dessikatur sakemm il-ġel ikun qed jiksaħ u mbagħad ittrasferixxi s-silika ġel fi flask magħluq. Żid 2 % ta' l-ilma u ħawwad sakemm l-ebda għoqiedi ma jkunu jidhru u t-trab jimxi liberalment. Jekk gruppi ta' silika ġel jirriżultaw f'kromatgrammi b'quċċati li jintervjenu, is-silika ġel għandha tkun ittrattata kif indikat fuq. Alternattiva tista' tkun l-użu ta' silika ġel aktar pura 60 (Merck, riferenza 7754).

5.6.	Ħażniet ta' soluzzjoni (200 ppm) ta' cholesta-3,5-diene (Sigma, 99 % purità) f'hexane (10 mg f'50 ml).

5.7.	Soluzzjoni standard ta' cholesta-3,5-diene hexane f'konċentrazzjoni ta' 20 ppm, miksuba permezz ta' diluzzjoni tas-soluzzjoni ta' fuq. Nota 5: Is-soluzzjonijiet 5.6 u 5.7 huma stabbli għal perjodu ta' mill-inqas erba' xhur jekk miżmuma fl-inqas minn 4 °C.

5.8.	Soluzzjoni ta' nonacosane f'hexane f'konċentrazzjoni ta' madwar 100 ppm.

5.9.	Carrier gass għall-kromatografija: helium jew idroġenu ta' 99,9990 % purità.

5.10.

Gassijiet awżiljarji għal flame ionization detector: idroġenu ta' 99,9990 % purità u arja ippurifikata.

6.   PROĊEDURA

6.1.   Preparazzjoni għall-materja li mhix saponifikata

6.1.1.

Iżen 20 ± 0, 1 g ta' żejt fi flask ta' 250-ml (4.1), żid 1 ml ta' soluzzjoni standard ta' cholesta-3,5-diene (20 μg) u 75 ml ta' potash alkoliku ta' 10 %, iffitja r-reflux condenser, u saħħan sakemm jagħli ftit għal 30 minuta. Neħħi l-flask li jkollu l-kampjun mis-sħana u ħalli s-soluzzjoni tiksaħ ftit (tħallix li tiksaħ kompletament għax inkella l-kampjun joqgħod). Żid 100 ml ta' ilma u ittrasferixxi s-soluzzjoni fl-lembut separanti (4.2) bil-għajnuna ta' 100 ml ta' hexane. Ħawwad din it-taħlita sew għal 30 sekonda u ħalliha tissepara. Nota 6: Jekk tkun prodotta l-emulsion li ma tisparixxix malajr, żid kwanitajiet żgħar ta' ethanol.

6.1.2.

Ittrasferixxi l-fażi aqueous taħt it-tieni lenbut separanti u neħħi għal darb'oħra b' 100 ml ta' hexane. Għal darb' oħra erġa' agħmel il-fażi t'isfel u aħsel l-estratti tal-hexane (kombinati f'lembut separanti ieħor) għal tliet darbiet b'100 ml kull darba b'taħlita ta' ilma-ethanol (1: 1) sakemm in-newtrali pH jiġi milħuq.

6.1.3.

Għaddi s-soluzzjoni hexane minn anhydrous sodium sulphate (50 g), aħsel b'20 ml hexane u evapora f'evaporatur li jdur f'30 °C taħt pressa mnaqqsa sa kemm jinxef.

6.2.   Separazzjoni ta' frazzjoni ta' steroidal hydrocarbon

6.2.1.

Ħu l-fdal tal-kolonna frazzjonata bil-għajnuna tal-porzjonijiet 1-ml ta' hexane, għaddi l-kampjun f'kolonna billi tħalli l-livell tas-soluzzjoni taqa' sa fuq is-sodium sulphate u jibda l-eluzzjoni kromatografika bil-hexane f'rata ta' flow ta' madwar1ml/min. Għarmi l-ewwel 25 sa 30 ml ta' eluate u mbagħad iġbor il-frazzjon ta' 40 ml li jmiss. Wara li tiġbor, ittrasferixxi din il-frazzjoni fi flask li jkollu qiegħ tond ta' 100-ml (4.3). Nota 7: L-ewwel frazzjoni jkollha hydrocarbons saturati (Figura 1 a) u t-tieni frazzjoni jkollha dawk steroidal. Iktar elution tipprovdi squalene u komposti relatati. Biex takkwista separazzjoni tajba bejn hydrocarbons saturati u steroidal, l-ottimtizazzjoni tal-volumi frazzjonati huma meħtieġa. Għal dan, il-volum ta' l-ewwel frazzjoni għandu jkun aġġustat sabiex meta t-tieni frazzjoni tkun analizzata l-quċċati li jirrapreżentaw il-hydrocarbons saturati jkunu baxxi (ara Figura 1ċ); jekk ma jidhrux iżda l-intensità tal-quċċata standard tkun baxxa, il-volum għandu jkun imnaqqas. Xorta waħda, separazzjoni kompleta bejn l-ewwel u t-tieni frazzjoni mhix meħtieġa; għax mhemmx soppravenzjoni ta' quċċati matul l-analiżi GC jekk il-kundizzjonijiet GC huma aġġustati kif indikat f'6.3.1. L-ottimatizazzjoni tal-volum tat-tieni frazzjoni jekk ġeneralment mhemmx bżonnha bħala separazzjoni tajba b'iżjed komponenti. Madanakollu, il-preżenza ta' quċċata kbira ta' madwar 1,5 minuta inqas mir-ritenzjoni tal-ħin indas mill-istandard minħabba squalene, u hi indikattiva ta' separazzjoni ħażina.

6.2.2.

Evapora t-tieni frazzjoni f'evaporatur li jdur f'30 °C taħt pressa ridotta sakemm jinxef, u minnufih iddisolvi l-fdal f'0,2 ml ta' hexane. Żomm is-soluzzjoni f'refriġeratur sakemm issir l-analiżi. Nota 8: Il-fdalijiet 6.1.3 u 6.2.2 m'għandhomx jinżammu nixfin u f'temparatura tal-kamra. Malli jkunu miksubin, is-solvent għandu jiżdied u s-soluzzjonijiet għandhom jinżammu f'refriġeratur.

6.3.   Il-kromatografija tal-gass

6.3.1.

Kondizzjonijiet tax-xogħol għal split injection: — temperatura ta' l-injettur: 300 °C, — temperatura tad-detector: 320 °C, —  integrator-recorder: il-parametri għall-integrazzjoni għandhom ikunu ffissati biex jagħtu stima tajba taż-żoni. Hija rakkomandata valley-valley integration mode, — sensitività: madwar 16-il darba l-attenwazzjoni minima, — ammont ta' soluzzjoni injettata: 1 μl, — programmar tat-temperaturi tal-forn: fil-bidu 235 °C għal sitt minuti mbagħad ogħlli sa 2 °C/minuta sa 285 °C, — injettur b'1: 15 flow divider, — kontenitur: helium jew hydrogen ta' pressa ta' madwar 120 kPa. Dawn il-kondizzjonijiet għandhom ikunu aġġustati skond il-karatteristiċi tal-kromatografu u l-kolonna biex tagħti l-kromatrogrammi tilħaq il-ħtiġijiet li ġejjin: standard tal-quċċata interna sa madwar ħames minuti tal-ħin mogħti f'6.3.2; u standard tal-quċċata interna għandha tkun ta' mill-inqas 80 % ta' l-iskala sħiħa. Is-sistema kromatografika tal-gass trid tkun iċċekjata billi tinjetta taħlita ta' ħażna tas-soluzzjoni ta' cholestadiene (5.6) u s-soluzzjoni nonacosane (5.8). Il-quċċata tal-cholesta-3,5-diene għandha tidher qabel n-nonacosane (Figura 1ċ); jekk ma jiġrix hekk għandhom jittieħdu żewġ azzjonijiet: naqqas it-temperatura tal-forn u/jew uża kolonna polari inqas.

6.3.2.

Identifikazzjoni tal-quċċata L-istandard tal-quċċata interna jidher għal madwar 19-il minuta u t-3,5-stigmastadiene fi żmien relattiv ta' ritensjoni ta' madwar 1,29 (ara Figura 1b). It-3,5-stigmastadiene tiġri fi kwantitajiet żgħar ta' isomer, u normalment, it-tnejn jitħaltu flimkien bħala quċċata kromatografika waħda. Madanakollu, jekk il-kolonna hi polari wisq jew turi qawwa għolja ta' riżoluzzjoni, l-isomer jista' jidher bħala quċċata żgħira qabel u viċin dik ta' stigmasta-3,5-diene (Figura 2). Biex tassigura li l-i stigmastadienes huma mħalltin f'quċċata waħda, hu rakkomandat li tbiddel il-kolonna b'waħda li hi jew inqas polari jew għandha dijametru intern iktar wiesa. Nota 9: Stigmastadienes għar-riferenza jistgħu jinkisbu mill-analiżi taż-żejt tal-ħaxix raffinat billi tuża' ammont inqas ta'kampjun (1 sa 2 g). Stigmastadienes joriġinaw quċċata prominenti u faċli li tkun identifikata.

6.3.3.

Analiżi kwantitattiva Il-kontenut stigmastadienes hu determinat skond il-formula: mg/kg ta’ stigmastadienes = fejn: As = iż-żona tal-quċċata stigmastadienes (jekk il-quċċata hija riżolta f'żewġt isomers, is-somma taż-żewġ żoni taż-żewġ quċċati), Ac = żona ta' l-istandard intern (cholestadiene), Mc = mass ta' l-istandard miżjud, f'mikrogrammi, Mo = massa taż-żejt meħud, fi grammi. Limitu ta' l-għarfien: xi 0,01 mg/kg. madwar 0,01 mg/kg.

Figura

Gas chromatograms miksuba minn kampjun taż-żejt taż-żebbuġ analizzati fuq kolonna kapillari tas-silika fused (0,25 mm dijametru intern b'25 m) miksi b'5 %-phenylmethylsilicone, 0,25 μm ħxuna tal-film.

Figura 2

Kromatogramm tal-gass miksub minn kampjun taż-żejt taż-żebbuġa raffinat analizzat fuq kolonna DB-5 li turi l-isomer ta' 3,5-stigmastadiene.

▼M13

---

ANNEX XVIII

DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42 (DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL CONTENT)

1.   Scope

Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between the analytical results obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from the fatty acid composition.

2.   Field application

The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleic acid) in every class of olive oils.

3.   Principle

The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42 (calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition) correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger than the values stated in the Regulation for each type of oil points out that the oil contains seed oils.

4.   Method

The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one essentially is made by the coordination of analytical data obtained by means of other methods: it is possible to distinguish three phases: determination of fatty acid composition by capillary gas chromatography, calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42, HPLC determination of ECN42 triacylglycerols

4.1.   Apparatus

4.1.1.

Round bottom flasks, 250 and 500 ml.

4.1.2.

Beakers 100 ml.

4.1.3.

Glass chromatographic column, 21 mm internal diameter, 450 mm length, with cock and normalized cone (female) at the top.

4.1.4.

Separator funnels, 250 ml, with normalized cone (male) at the bottom, suitable to be connected with the top of the column.

4.1.5.

Glass rod, 600 mm length.

4.1.6.

Glass funnel, 80 mm diameter.

4.1.7.

Volumetric flasks, 50 ml.

4.1.8.

Volumetic flasks, 20 ml.

4.1.9.

Rotative evaporator.

4.1.10.

High performance liquid chromatography, allowing thermostatic control of column temperature.

4.1.11.

Injection units for 10 μl delivery.

4.1.12.

Detector: differential refractometer. The full scale sensitivity should be at least 10-4 units of refractive index.

4.1.13.

Column: stainless steel tube 250 mm length and 4,5 mm internal diameter packed with 5 μm diameter particles of slica with 22 to 23 % carbon in the form of octadecylsilane (note 2).

4.1.14.

Recorder and/or integrator.

4.2.   Reagents

The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be de-gassed, and may be recycled several times without effect on the separations.

4.2.1.

Petroleum ether 40 to 60 °C chromatographic grade.

4.2.2.

Ethil ether, peroxides free, freshly distilled.

4.2.3.

Glass chromatographic elution solvent: mixture petroleum ether/ethil ether 87/13 (v/v).

4.2.4.

Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, with water content standardized at 5 % (w/w).

4.2.5.

Glass wool.

4.2.6.

Acetone.

4.2.7.

Acetonitrile.

4.2.8.

HPLC elution solvent: acetonitrile + acetone (proportions to be adjusted to obtain the desired separation; begin with 50:50 mixture).

4.2.9.

Solubilization solvent: acetone.

4.2.10.

Reference triglycerides commercial triglycerides tripalmitin, triolein, etc.) may be used and the retention times thence plotted in accordance with the equivalent carbon number, or alternatively reference chromatograms obtained from soya oil, mixture 30:70 soya oil/olive oil and pure olive oil (see notes 3 and 4 and figure 1, 2, 3, 4).

4.3.   Sample preparation

As a number of interfering substances can rise false positive results, the sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used for determination of polar substances in oxidised oils.

4.3.1.   Chromatographic column preparation

Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to the bottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).

In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glass funnel (4.1.6).

To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside the column, too.

Open the cock and let solvent elute from the column until its level is about 1 cm over the silicagel.

4.3.2.   Column chromatography

Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volumetric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at room temperature and adjust the volume with elution solvent.

By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute to the silicagel layer level.

Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to pass through the column).

The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent at reduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used to prepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.

The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum of 80 % for lampante and residue olive oils.

4.4.   HPLC analysis

4.4.1.   Preparation of the samples for chromatographic analysis

A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).

4.4.2.   Procedure

Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.

4.4.3.   Calculation and expression of results

Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equal to 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using the formula:

% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.

The results are to be given to within at least two decimal places.

Note 1: The elution order can be determined by calculating the equivalent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, where CN is the carbon number and n is the number of double bounds, it can be calculated more precisely by taking into account the origin of the double bond. If no, nl and nln are the numbers of double bonds attributed to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbon number can be calculated by means of the relation of the formula:

where the coefficient do, dl and dln can be calculated by means of the reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, the relation obtained will be close in:

Note 2:

Note 3: With several reference triglycerides, it is also possible to calculate the resolution with respect to triolein:

by use of the reduced retention time RT' = RT - RT solvent.

The graph of log α against f (number of double bonds) enables the retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acids contained in the reference triglycerides — see figure 2.

Note 4: The efficiency of the column should permit clear separation of the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.

Note 5: A correct measure of the areas of all peaks of interest for the present determination is ensured if the second peak corresponding to ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.

4.5.   Calculation of triacylglycerols composition

4.5.1.   Determination of fatty acid composition

Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chromatographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No 2568/91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solution).

4.5.2.   Fatty acids for calculation

Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking into account the following equivalencies between ECN and fatty acids. Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in consideration, because only these are important for olive oil.

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

The result gives the percentage of each fatty acid in moles % in the overall (1,2,3-) position of the TAGs.

Then the sum of the saturated fatty acids P and S (SFA) and the unsaturated fatty acids Po, O, L and Ln (UFA) are calculated:

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of TAGs

The fatty acids are distributed to three pools as follows: two identical for 1- and 3- positions and one for 2- position, with different coefficients for the saturated (P and S) and unsaturated acids (Po, O, L and Ln).

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06 (4) moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 2- position [Po(2), O(2), L(2) and Ln(2)]: moles % Po2 = moles % Po1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 (5) moles % O2 = moles % O1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - mol % S2 moles % L2 =moles % L1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2 moles % Ln2 =moles % Ln1,2,3moles % UFA * 100 - moles % P2 - moles % S2

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)]: moles % P1,3 =moles % P1,2,3 - moles % P22 + moles % P1,2,3 (6) moles % S1,3 =moles % S1,2,3 - moles % S22 + moles % S1,2,3 moles % Po1,3 =moles % Po1,2,3 - moles % Po22 + moles % Po1,2,3 moles % O1,3 =moles % O1,2,3 - moles % O22 + moles % O1,2,3 moles % L1,3 =moles % L1,2,3 - moles % L22 + moles % L1,2,3 moles % Ln1,3 = moles % Ln1,2,3 - moles % Ln22 + moles % Ln1,2,3

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols

4.5.6.1.

TAGs with one fatty acid (AAA, here LLL, PoPoPo) moles % AAA = moles % A1,3 * moles % A2 * moles % A1,310 000 (7)

4.5.6.2.

TAGs with two fatty acids (AAB, here PoPoL, PoLL) moles % AAB = moles % A1,3 * moles % A2 * moles % B1,3 * 210 000 (8) moles % ABA = moles % A1,3 * moles % B2 * moles % A1,310 000

4.5.6.3.

TAGs with three different fatty acids (ABC, here OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) moles % ABC = moles % A1,3 * moles % B2 * moles % C1,3 * 210 000 (9) moles % BCA = moles % B1,3 * moles % C2 * moles % A1,3 * 210 000 moles % CAB = moles % C1,3 * moles % A2 * moles % B1,3 * 210 000

4.5.6.4.

Triacylglycerides with ECN42 The following triglycerides with ECN42 are calculated according equation 7, 8 and 9 in order of expected elution in HPLC (normally only three peaks). LLL PoLL and the positional isomer LPoL OLLn and the positional isomers OLnL and LnOL PoPoL and the positional isomer PoLPo PoOLn and the positional isomers OPoLn and OLnPo PLLn and the positional isomers LLnP and LnPL PoPoPo SLnLn and the positional isomer LnSLn PPoLn and the positional isomers PLnPo and PoPLn The triacylglycerides with ECN42 are given by the sum of the nine triacylglycerols including their positional isomers. The results to be given with at least two decimal places.

5.   Evaluation of the results

The calculated theoretical content and the content determined by the HPLC analysis are compared. If the difference between HLPC data minus theoretical data is greater than the values states for the appropriate oil category in the Regulation, the sample contains seed oil.

Note:Results are given to within one decimal figure.

6.   Example (The numbers refer to the sections in the text of the method)

4.5.1.   Calculation of moles % fatty acids from GLC data (area %)

The following data are obtained for the fatty acid composition by GLC:

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

Sum of the saturated and unsaturated fatty acids in the 1,2,3- position of TAGs

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of the TAGs

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 moles % See formula (4) moles % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 moles % See formula (4)

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 1,3-position [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)] moles % Po2 =1,097 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 1,263 moles % See formula (5) moles % O2 =74,113 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 85,295 moles % See formula (5) moles % L2 =9,956 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 11,458 moles % See formula (5) moles % Ln2 =1,003 %86,169 %* 100 - - 0,659 - 0,177 = 1,154 moles % See formula (5)

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)] moles % P1,3 =10,888 - 0,6592 10,888 = 16,005 moles % See formula (6) moles % S1,3 =2,944 - 0,1772 2,944 = 4,327 moles % See formula (6) moles % Po1,3 =1,097 - 1,2632 1,097 = 1,015 moles % See formula (6) moles % O1,3 =74,113 - 85,2952 74,113 = 68,522 moles % See formula (6) moles % L1,3 =9,956 - 11,4582 9,956 = 9,205 moles % See formula (6) moles % Ln1,3 =1,003 - 1,1542 1,003 = 0,927 moles % See formula (6)

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols

From the calculated fatty acid composition in sn-2- and sn-1,3- positions (see above):

the following triacylglycerols are calculated:

4.5.6.1.

TAGs with one fatty acid (LLL, PoPoPo) See formula (7) mol % LLL = 9,205 % * 11,458 % * 9,205 %10 000 = 0,09708 mol LLL mol % PoPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 1,015 %10 000 = 0,00013 mol PoPoPo

4.5.6.2.

TAGs with two fatty acids (PoLL, SLnLn, PoPoL) See formula (8) mol % PoLL + LLPo = 1,015 % * 11,458 % * 9,205 % * 210 000 = 0,02141 mol % LPoL = 9,205 % * 1,263 % * 9,205 %10 000 = 0,01070   0,03211 mol PoLL mol % SLnLn + LnLnS = 4,327 % * 1,154 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00093 mol % LnSLn = 0,927 % * 0,177 % * 0,927 %10 000 = 0,00002   0,00095 mol SLnLn mol % PoPoL + LPoPo = 1,015 % * 1,263 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00236 mol % PoLPo = 1,015 % * 11,458 % * 1,015 %10 000 = 0,00118   0,00354 mol PoPoL

4.5.6.3.

TAGs with three different fatty acids (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) See formula (9) mol % PPoLn = 16,005 % * 1,263 % * 0,927 % * 210 000 = 0,00375 mol % LnPPo = 0,927 % * 0,653 % * 1,015 % * 210 000 = 0,00012 mol % PoLnP = 1,015 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,00375   0,00762 mol PPoLn mol % OLLn = 68,522 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,14577 mol % LnOL = 0,927 % * 85,295 % * 9,205 % * 210 000 = 0,14577 mol % LLnO = 9,205 % * 1,154 % * 68,522 % * 210 000 = 0,14577   0,43671 mol OLLn mol % PLLn = 16,005 % * 11,458 % * 0,927 % * 210 000 = 0,03400 mol % LnPL = 0,927 % * 0,653 % * 9,205 % * 210 000 = 0,00111 mol % LLnP = 9,205 % * 1,154 % * 16,005 % * 210 000 = 0,03400   0,06911 mol PLLn mol % PoOLn = 1,015 % * 85,295 % * 0,927 % * 210 000 = 0,01605 mol % LnPoO = 0,927 % * 1,263 % * 68,522 % * 210 000 = 0,01605 mol % OLnPo = 68,522 % * 1,154 % * 1,015 % * 210 000 = 0,01605   0,04815 mol PoOLn ECN42 = 0,69540 mol TAGs

▼M14

Figura 1: Graph ta’ log α kontra f (numru ta’ bonds doppji)

Nota:

La = aċtu lauric My = aċtu myristic P = aċtu palmitic St = aċtu stearic O = aċtu oleicL = aċtu linoleic Ln = aċtu linolenic.

Figura 2: Żejt ta’ Soyabean

Figura 3: Żejt tas-soyabean/żejt taż-żebbuġa 30/70

Figura 4: Żejt taż-żebbuġa

▼M19

---

ANNEX XIX

DETERMINATION OF ALIPHATIC ALCOHOLS CONTENT BY CAPILLARY GAS CHROMATOGRAPHY

1.   OBJECT

The procedure describes a method for the determination of aliphatic alcohols content in oils and fats.

2.   PRINCIPLE OF THE METHOD

The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is saponified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethylsilyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.

3.   EQUIPMENT

4.   REAGENTS

5.   PROCEDURE

5.1.   Preparation of the unsaponifiables

5.1.1.

Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil. Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 5 g of the dry filtered sample into the same flask.

5.1.2.

Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to approximately 30 °C.

5.1.3.

The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle (Note 1). Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether. Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.

5.1.4.

The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives a neutral reaction. Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed beforehand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl ether which are added to the total.

5.1.5.

Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling in a desiccator.

5.2.   Separation of alcoholic fractions

5.2.1.

Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally placed in an oven at 100 °C for one hour. Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until required for use (plates treated in this way must be used within 15 days). Note 2: When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic fraction there is no need to treat the unsaponifiables with alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated distinctly from the sterol band.

5.2.2.

Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-developing chamber to a depth of approximately 1 cm ( 7 ). Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components. Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in order to obtain reproducible developing conditions.

5.2.3.

An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chloroform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution (4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.

5.2.4.

Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Immediately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate. The plate is then removed from the development chamber and the solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.

5.2.5.

The plate is sprayed lightly and evenly with the solution of 2', 7'-dichlorofluorescein when the plate is observed under ultra violet light. The aliphatic alcohols band can be identified through being aligned with the stain obtained from the reference solution: mark the limits of the band with a black pencil; outlining the band of aliphatic alcohols and the band immediately above that, which is the terpenic alcohols band, together. Note 4: The aliphatic alcohols band and the terpenic alcohols band are to be grouped together in view of the possible migration of some aliphatic alcohols into the triterpenic alcohols band.

5.2.6.

Using a metal spatula scrape off the silica gel in the marked area. Place the finely comminuted material removed into the filter funnel (3.7). Add 10 ml of hot chloroform, mix carefully with the metal spatula and filter under vacuum, collecting the filtrate in the conical flask (3.8) attached to the filter funnel. Wash the pomace in the flask three times with ethyl ether (approximately 10 ml each time) collecting the filtrate in the same flask attached to the funnel. Evaporate the filtrate to a volume of 4 to 5 ml, transfer the residual solution to the previously weighed 10 ml test tube (3.9), evaporate to dryness by mild heating in a gentle flow of nitrogen, make up again using a few drops of acetone, evaporate again to dryness, place in an oven at 105 °C for approximately 10 minutes and then allow to cool in a desiccator and weigh. The pomace inside the test tube is composed of the alcoholic fraction.

5.3.   Preparation of the trimethylsilyl ethers

5.3.1.

The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume (Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption of moisture (Note 6). Note 5: Solutions which are ready for use are available commercially. Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethylsilyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available. Note 6: The slight opalescence which may form is normal and does not cause any interference. The formation of a white floc or the appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.

5.3.2.

Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.

5.4.   Gas chromatography analysis

5.4.1.   Preliminary operations, column packing

5.4.1.1.

Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly (tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the splitting system and of the recording system, etc.).

5.4.1.2.

If the column is being used for the first time it is recommended that it should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through the capillary column and then the gas chromatography assembly is switched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That temperature is held for not less than two hours and then the assembly is brought to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connections; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column. Note 7: The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than the maximum temperature contemplated for the liquid phase employed.

5.4.2.   Choice of operating conditions

5.4.3.   Analytical procedure

5.4.4.   Peak identification

The identification of individual peaks is effected according to the retention times and by comparison with the standard TMSE mixture, analysed under the same conditions.

A chromatogram of the alcoholic fraction of a virgin olive oil is shown in Figure 1.

5.4.5.   Quantitative evaluation

6.   EXPRESSION OF THE RESULTS

The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty substance and the sum of the total aliphatic alcohols are reported.

---

APPENDIX

Determination of the linear velocity of the gas

1 to 3 μl of methane or propane are injected into the gas chromatograph set at normal operating conditions and the time taken for the methane or propane to flow through the column from the instant of injection to the instant the peak elutes (tM) is measured using a stop clock.

The linear velocity in cm/s is given by L/tM, where L is the length of the column in centimetres and tM is the measured time in seconds.

Figure 1 — Chromatogram of the alcoholic fraction of virgin oil

1

=

Eicosanol

2

=

Decosanol

3

=

Tricosanol

4

=

Tetracosanol

5

=

Pentacosanol

6

=

Hexacosanol

7

=

Heptacosanol

8

=

Octacosanol

▼M23

---

ANNESS XX

Metodu biex jiġi determinat il-kontenut ta' xema', esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin, u esteri etiliċi tal-aċidi xaħmin permezz ta' kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari

1.   L-GĦAN

Dan il-metodu huwa biex jiddetermina l-kontenut ta' xema', esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin, u esteri etiliċi tal-aċidi xaħmin fiż-żjut taż-żebbuġa. Ix-xemgħat u l-esteri alkiliċi individwali huma separati skont l-għadd ta' atomi tal-karbonju. Il-metodu huwa rrakkomandat bħala għodda biex tiddistingwixxi bejn żejt taż-żebbuġa u żejt mir-residwi taż-żebbuġa u bħala parametru ta' kwalità għaż-żjut taż-żebbuġa extra verġni, billi jippermetti li jinstabu taħliliet frodulenti ta' żjut taż-żebbuġa extra verġni ma' żjut ta' kwalità inferjuri kemm jekk huma verġni, lampanti jew ċerti żjut deodorizzati.

2.   IL-PRINĊIPJU

Żieda ta’ standards interni addattati għaż-żejt u għall-frazzjonar permezz tal-kromatografija fuq kolonna idrata tal-ġell siliku. Irkuprar tal-frazzjoni miksub taħt il-kondizzjonijiet tal-eżaminar (li l-polarità tiegħu tkun inqas minn dik ta’ trijaċilgliċeroli), u analiżi diretta permezz ta' kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari.

3.   L-APPARAT

3.1.	Kontenitur Erlenmeyer, 25 ml.

3.2.	Kolonna tal-ħġieġ għal kromatografija likwida, dijametru intern ta' 15 mm, tul ta' 30-40 ċm, bi stopkokk adattat imwaħħal magħha.

3.3.

Kromatografija b'fażi gassuża adattata għall-użu ma' kolonna kapillari, mgħammra b'sistema għal injezzjoni diretta fuq il-kolonna li tikkonsisti minn: 3.3.1. Forn ikkontrollat termostatikament bi programmar tat-temperatura. 3.3.2. Injettur kiesaħ biex jagħti l-injezzjoni dirett fuq il-kolonna 3.3.3. Detettur u konvertur-amplifikatur tal-jonizzazzjoni bi fjamma. 3.3.4. Integratur-reġistratur (Nota 1) għall-użu mal-konvertur amplifikatur (punt 3.3.3), b'ħin ta' rispons ta' mhux aktar minn 1 s u b'veloċità varjabbli għal karta. Nota 1:  Jistgħu jintużaw ukoll sistemi kompjuterizzati meta d-dejta tal-kromatorgrafija b'fażi gassuża jiddaħħlu fil-kompjuter. 3.3.5. Kolonna kapillari, bis-silika fużjonata (għall-analiżi tax-xema' u l-esteri metiliċi/etiliċi tal-aċidi xaħmin), tul 8-12 m, dijametru intern 0.25-0.32 mm, miksija minn ġewwa b'fażi likwida (Nota 2) għal ħxuna uniformi ta' 0.10-0.30 μm. Nota 2:  Fażijiet likwidi kummerċjali adatti huma disponibbli għal dan il-għan, bħal SE52, SE54, eċċ.

3.4.	Siringa mikro, 10 μl, b'labra mwebbsa, biex tiġi injettata direttament fil-kolonna.

3.5.	Xejker tal-elettriku.

3.6.	Evaporatur rotatorju.

3.7.	Forn Muffle.

3.8.	Miżien analitiku b'eżattezza ta' ± 0.1 mg.

3.9.	Oġġetti normali tal-ħġieġ tal-laboratorju.

4.   REAĠENTI

4.1.

Ġell siliku, 60-200 μm qiesu xibka.. Poġġi l-ġell siliku fil-forn muffle f'temperatura ta' 500 C għal mill-inqas 4 siegħat. Ħalliħ jibred u mbagħad żid 2 % ilma relattivament mal-kwantità ta' ġell siliku użat. Ixxejkja sew biex it-taħlita tiġi omoġena u żomm fid-dessikatur għal mill-inqas 12-il siegħa qabel l-użu.

4.2.

n-essan, grad ta' kromatografija jew grad tal-fdal (trid tiġi vverifikata l-purità). TWISSIJA – Il-fwar jista' jieħu n-nar. Żomm ’il bogħod minn sorsi ta' sħana, xrarat jew fjammi mikxufa tan-nar. Kun ċert li l-flixken dejjem jingħalqu tajjeb. Matul l-użu, ara li jkun hemm ventilazzjoni tajba. Evita li jinġema' l-fwar u neħħi kull periklu possibbli ta' nar, bħal ħiters jew tagħmir elettriku mhux manifatturat minn materjal li ma jiħux nar. Jekk jittieħed man-nifs huwa perikuluż, għax jista' jikkawża ħsara fiċ-ċelloli tan-nervituri. Evita li tibla’ l-fwar. Uża apparat respiratorju adattat jekk hemm bżonn. Evita l-kuntatt mal-għajnejn jew mal-ġilda.

4.3.

Etere etiliku, grad ta' kromatografija. TWISSIJA – Fjammabbli ħafna u moderatament tossiku. Jirrita l-ġilda. Perikoluż jekk jittieħed man-nifs. Jista' jagħmel ħsara lill-għajnejn. L-effetti tiegħu jistgħu jdumu ma jinħassu. Jista' jifforma perossidi esplussivi. Il-fwar jista' jieħu n-nar. Żomm ’il bogħod minn sorsi ta' sħana, xrarat jew fjammi mikxufa tan-nar. Kun ċert li l-flixken dejjem jingħalqu tajjeb. Matul l-użu, ara li jkun hemm ventilazzjoni tajba. Evita li jinġema' l-fwar u neħħi kull periklu possibbli ta' nar, bħal ħiters jew tagħmir elettriku mhux manifatturat minn materjal li ma jiħux nar. Tħallix li jkun hemm evaporazzjoni san-nixfa jew kważi nixfa. Jekk iżżid l-ilma jew aġent adattat li jnaqqas l-effett tista' tnaqqas il-formazzjoni tal-perossidu. Tixorbux. Evita li tibla’ l-fwar. Evita kuntatt fit-tul, jew repetut, mal-ġilda.

4.4.

n-ettan, grad ta' kromatografija, jew iso-ottan. TWISSIJA – fjammabbli. Perikoluż jekk jittieħed man-nifs. Żomm ’il bogħod minn sorsi ta' sħana, xrarat jew fjammi mikxufa tan-nar. Kun ċert li l-flixken dejjem jingħalqu tajjeb. Matul l-użu, ara li jkun hemm ventilazzjoni tajba. Evita li tibla’ l-fwar. Evita kuntatt fit-tul, jew repetut, mal-ġilda.

4.5.	Soluzzjoni standard ta’ lawril araċidat (Nota 3), f’ 0.05 % (m/V) fil-ettan (standard intern għax-xema'). Nota 3:  Jistgħu jintużaw ukoll Palmitat tal-palmitil, stearat tal-miristil jew lawreat tal-araċidil.

4.6.	Soluzzjoni standard ta’ ettodeċanoat metiliku, f’0.02 % (m/V) fil-ettan (standard intern għal esteri metiliċi/etiliċi).

4.7.	Sudan 1 (1-fenilażo-2-naftol).

4.8.

Gass trasportatur: idroġenu jew elju, pur, gass grad tal-kromatografija. TWISSIJA Idroġenu. Fjammabbli ħafna meta taħt pressjoni. Żomm ’il bogħod minn sorsi ta' sħana, xrarat, fjammi mikxufa tan-nar jew apparat elettriku mhux manifatturat minn materjal li ma jiħux nar. Kun ċert li l-valv tal-flixkun jkun magħluq meta ma jkunx qed jintuża. Uża dejjem ma' apparat li jnaqqas il-pressjoni. Irrilaxxa t-tensjoni tal-molla tal-apparat li jnaqqas il-pressjoni qabel ma tiftaħ il-valv tal-flixkun. Toqgħodx quddiem l-għonq tal-flixkun meta tiftaħ il-valv. Matul l-użu, ara li jkun hemm ventilazzjoni tajba. Tittrasferix l-idroġenu minn flixkun għal ieħor. Tħallatx gass fil-flixkun. Kun ċert li l-flixken ma jkunux jinqelbu. Żommhom ’il bogħod mix-xemx jew sorsi ta' sħana. Aħżinhom f'ambjent mhux korrossiv. Tużax flixken li huma difettużi jew mingħajr tikketta. Elju. Gass ikkumpressat fi pressjoni għolja. Inaqqas l-ammont ta' ossiġnu disponibbli għan-nifs. Żomm il-flixkun magħluq. Matul l-użu, ara li jkun hemm ventilazzjoni tajba. Tidħolx fi mħażen ta' dan il-prodott jekk ma jkollhomx ventilazzjoni tajba. Uża dejjem apparat li jnaqqas il-pressjoni. Irrilaxxa t-tensjoni tal-molla tal-apparat li jnaqqas il-pressjoni qabel ma tiftaħ il-valv tal-flixkun. Titfrasferix l-gass minn flixkun għal ieħor. Kun ċert li l-fliexken ma jkunux jistgħu jinqalbu. Toqgħodx faċċata tal-għonq tal-flixkun meta tiftaħ il-valv. Żommhom ’il bogħod mix-xemx jew sorsi tas-sħana. Aħżinhom f'ambjent mhux korrossiv. Tużax fliexken li huma difettużi jew mingħajr tikketta. Tieħdux man-nifs. Użah biss għal għanijiet tekniċi.

4.9.

Gassijiet awżiljarji: — Idroġenu, pur, gass grad tal-kromatografija. — Arja, pura, gass grad tal-kromatografija. TWISSIJA Arja. Gass ikkumpressat fi pressjoni għolja. Fil-preżenza ta' sustanzi kombustibbli uża b'kawtela, għaliex it-temperatura li jieħdu n-nar minnhom infishom bosta mill-komposti organiċi fl-arja hija konsiderevolment aktar baxxa taħt pressjoni għolja. Kun ċert li l-valv tal-flixkun jkun magħluq meta ma jkunx qed jintuża. Uża dejjem apparat li jnaqqas il-pressjoni. Irrilaxxa t-tensjoni tal-molla tal-apparat li jnaqqas il-pressjoni qabel ma tiftaħ il-valv tal-flixkun. Toqgħodx faċċata tal-għonq tal-flixkun meta tiftaħ il-valv. Titfrasferix l-gass minn flixkun għal ieħor. Tħallatx gass fil-flixkun. Kun ċert li l-flixken ma jkunux jistgħu jinqalbu. Żommhom ’il bogħod mix-xemx jew sorsi tas-sħana. Aħżinhom f'ambjent mhux korrossiv. Tużax flixken li huma difettużi jew mingħajr tikketta. L-arja intenzjonata għal għanijiet tekniċi ma għandhiex tittieħed bin-nifs jew f'apparat respiratorju.

5.   IL-PROĊEDURA

5.1.    Preparazzjoni tal-kolonna kromatografika

Issospendi 15 g ta' ġell siliku (punt 4.1) fil-n-essan (punt 4.2) u introduċi fil-kolonna (punt 3.2). Ħallih joqgħod spontanjament. Kompli t-tqegħid bl-għajnuna ta’ xejker elettriku biex tagħmel il-qiegħ kromotografiku iktar omoġenu. Ipperkola 30 ml ta' n-essan biex tneħħi l-impuritajiet. Iżen eżattament madwar 500 mg tal-kampjun fi flask ta’ 25 ml (punt 3.1), permezz tal-miżien analitiku (punt 3.8), u żid ammont xieraq ta’ standard intern (punt 4.5), skont il-kontenut tax-xama ssopponut, eż. żid 0.1 mg ta' lawril araċidat fil-każ ta’ żejt taż-żebbuġa, 0.25 sa 0.50 mg fil-każ ta’ żejt mir-residwi taż-żebbuġ, u 0.05 mg ta' ettodeċanoat metiliku għaż-żejt taż-żebbuġa (punt 4.6).

Ittrasferixxi l-kampjun ippreparat għall-kolonna kromatografika bil-għajnuna ta’ żewġ porzjonijiet ta' 2-ml ta’ n-essan (punt 4.2).

Ħalli s-solvent inixxi sa 1 mm ’il fuq mill-ogħla livell tal-assorbent. Erġa’ pperkola l-n-essan/etere etiliku (99:1) u iġbor 220 ml bi tnixxija ta' madwar 15-il taqtira kull 10 sekondi. (Din il-frazzjoni fiha l-esteri metiliċi u etiliċi, u x-xema'). (Nota 4) (Nota 5).

Evapora l-frazzjonijiet riżultanti f'evaporatur rotatorju sakemm is-solvent jiġi kważi eliminat. Neħħi l-aħħar 2 ml taħt kurrent ħafif ta' nitroġenu. Iġbor il-frazzjoni li fiha l-esteri metiliċi u etiliċi u ħallatha b'2-4 ml ta' n-ettan jew iso-ottan.

5.2.    Analiżi bil-kromatografija b'fażi gassuża

5.2.1.    Proċedura preliminari

Waħħal il-kolonna mal-kromatografija b'fażi gassuża (punt 3.3), u għaqqad il-bokka mas-sistema ta' fuq il-kolonna u l-iżbokk mad-detettur. Iċċekkja l-apparat tal-kromatografija b'fażi gassuża (operazzjoni ta’ gass loops, effiċjenza ta' detettur u sistema ta' rikording, eċċ.).

Jekk il-kolonna tkun qed tintuża għall-ewwel darba, huwa aħjar tiġi kundizzjonata. Għaddi nixxija ħafifa ta’ gass mill-kolonna, imbagħad ixgħel l-apparat tal-kromatografija b'fażi gassuża. Saħħan bil-mod sakemm tintlaħaq temperatura ta' 350 C wara madwar 4 siegħat.

Żomm din it-temperatura għal mill-inqas sagħtejn, imbagħad irregola l-apparat għall-kundizzjonijiet operattivi (irregola l-fluss tal-gass, ixgħel fjamma, qabbad ma’ rikorder elettroniku (punt 3.3.4), irregola t-temperatura tal-forn għall-kolonna, irregola d-detettur, eċċ.). Irrekordja s-sinjal fi stat sensittiv mill-anqas darbtejn ogħla minn dak meħtieġ biex tagħmel l-analiżi. Il-linja bażi għandha tkun lineari, mingħajr ebda tip ta’ qċaċet, u ma jridx ikollha xi tip ta’ devjazzjoni.

Devjazzjoni negattiva f'linja dritta tindika li l-konnessjonijiet mal-kolonna mhumiex tajbin, waqt li devjazzjoni pożittiva tindika li l-kolonna ġietx ikkundizzjonata sew.

5.2.2.    Għażla ta' kundizzjonijiet ta' operar għax-xema', il-esteri metiliċi u etiliċi (Nota 6).

Il-kundizzjonijiet tal-operar ġeneralment huma kif ġej:

—	Temperatura tal-kolonna : 20 °C/min 5 °C/min 80 °C għall-ewwel (1′) 140 °C 335 °C (20)

—	Temperatura tad-detettur : 350 °C.

—	Ammont injettat : 1 μl ta' soluzzjoni n-ettan (2-4 ml).

—	Gass trasportatur : elju jew idroġenu bil-veloċità linjari ottima għall-gass magħżul (ara l-Appendiċi A).

—	Sensittività tal-istrument : adattat biex jilħaq il-kundizzjonijiet ta' hawn fuq.

Dawn il-kundizzjonijiet jistgħu jiġu mmodifikati skont il-karatteristiċi tal-kolonna u l-kromatografija b'fażi gassuża biex jiġu sseparati x-xemgħat u esteri metiliċi u etiliċi tal-aċidi xaħmin kollha, u biex tintlaħaq separazzjoni sodisfaċenti fil-quċċata (ara l-Grafiċi 2, 3 u 4), u ħin ta' retenzjoni ta' 18 ± 3 minuta għall-istandard intern tal-lawril araċidat. Il-quċċata l-iktar rappreżentattiva tax-xema' trid tkun iktar minnn 60 % tal-valur massimu tal-iskala, filwaqt li l-istandard intern tal-ettodeċanoat metiliku għall-esteri metiliċi u etiliċi jrid jilħaq il-valur massimu tal-iskala.

Il-parametri tal-integrazzjoni tal-qċaċet għandhom jiġu ddeterminati b’tali mod li tikseb evalwazzjoni korretta tal-erjas tal-qċaċet ikkunsidrati.

5.3.    Prestazzjoni tal-analiżi

Ħu 10 μl tas-soluzzjoni permezz ta' siringa mikro ta' 10 μl, waqt li tiġbed lura l-manku tas-siringa sakemm il-labbra titbattal kompletament. Introduċi l-labbra fis-sistema ta' injezzjoni u injetta malajr wara 1-2 sekondi. Wara għal xi 5 sekondi oħroġ il-labbra bil-mod.

Wettaq l-irrekordjar sakemm ix-xema' jew l-istigmastadeini jiġu elużi kompletament, skont il-frazzjoni li tkun qed tiġi analizzata.

Il-linja bażi trid dejjem tissodisfa l-kondizzjonijiet meħtieġa.

5.4.    Identifikazzjoni tal-qċaċet

Identifika l-qċaċet mill-ħinijiet tar-retenzjoni billi tikkomparahom mat-taħlit tax-xema' b'ħinijiet ta’ retenzjoni magħrufa, analizzati taħt l-istess kundizzjonijiet. L-esteri alkiliċi jiġu identifikati minn taħlitiet ta' esteri metiliċi u etiliċi tal-aċidi xaħmin ewlenin fiż-żjut taż-żebbuġa (palmitiċi u taż-żejt).

Il-Grafika 1 tagħti l-kromatogramma tax-xema' fiż-żejt taż-żebbuġa verġni. Il-Grafiċi 2 u 3 juru l-kromatogrammi ta' żewġ żjut taż-żebbuġa verġni għall-bejgħ bl-imnut, wieħed bl-esteri metiliċi u etiliċi u l-ieħor mingħajrhom. Il-Grafika 4 turi l-kromatogrammi għal żejt taż-żebbuġa extra verġni tal-ogħla kwalità, u l-istess żejt mħallat 20 % b'żejt deodorizzat.

5.5.    Analiżi kwantitattiva tax-xema'

Iddetermina l-erjas tal-qċaċet li jikkorrispondu mal-istandard intern tal-lawril araċidat, u l-esteri alifatiċi minn C40 sa C46 bl-għajnuna tal-integratur.

Iddetermina l-kontenut totali tax-xema' billi tgħodd kull xema' individwali, f'mg/kg ta' xaħam, kif ġej:

fejn:

Ax

=

erja li tikkorrispondi għall-quċċata tal-esteru individwali, fl-unità użata mill-kompjuter

As

=

erja li tikkorrispondi għall-quċċata tal-istandard intern tal-lawril araċidat, fl-unità użata mill-kompjuter

ms

=

massa miżjuda tal-istandard intern tal-lawril araċidat, f’milligrammi;

m

=

massa tal-kampjun meħud għad-determinazzjoni, fi grammi.

5.5.1.    Analiżi kwantitattiva tal-esteri metiliċi u etiliċi

Bl-għajnuna tal-integratur, iddetermina l-erjas tal-qċaċet li jikkorrispondu għall-istandard intern tal-ettodeċanoat metiliku, l-esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin C16 u C18, u l-esteri eteliċi tal-aċidi xaħmin C16 u C18.

Iddetermina l-kontenut ta' kull esteru alkiliku f'mg/kg ta' xaħam, kif ġej:

fejn:

Ax

=

erja li tikkorrispondi għall-quċċata tal-esteru individwali C16 u C18, fl-unità użata mill-kompjuter

As

=

l-erja li tikkorrispondi għall-quċċata tal-istandard intern tal-ettodeċanoat metiliku, fl-unità użata mill-kompjuter

ms

=

massa miżjuda tal-istandard intern tal-ettodeċanoat metiliku, f’milligrammi;

m

=

massa tal-kampjun meħud għad-determinazzjoni, fi grammi.

6.   L-ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

Irraporta s-somma tal-kontenuti tax-xemgħat differenti minn C40 sa C46 (Nota 7) f'milligrammi kull kilogramma ta' xaħam.

Irraporta s-somma tal-kontenuti tal-esteri metiliċ u l-esteri etiliċi minn C16 sa C18 u t-total tat-tnejn.

Ir-riżultati għandhom jiġu espressi għall-eqreb mg/kg.

Irraporta l-proporzjon bejn l-esteri etiliċi u l-esteri metiliċi.

Grafika 1

Eżempju ta' kromatogramma tal-ġass tal-frazzjoni tax-xema' ta' żejt taż-żebbuġa ( 8 )

Il-qċaċet b'ħin ta' retenzjoni minn 5 sa 8 minuti tal-esteri metiliċi u etiliċi tal-aċidi xaħmin

Elementi ewlenin:

I.S.

=

Lawril araċidat

1

=

Esteri diterpeniċi

2+2′

=

Esteri C40

3+3′

=

Esteri C42

4+4′

=

Esteri C44

5

=

Esteri C46

6

=

Esteri steroli u alkoħol triterpeniku

Grafika 2

Esteri metiliċi, esteri etiliċi u xema' fiż-żejt taż-żebbuġa verġni

Elementi ewlenin:

1

–

Metil C16

2

–

Etil C16

3

–

Standar intern tal-ettodeċanoat metiliku

4

–

Metil C18

5

–

Etil C18

6

–

Squalene

7

–

Standard intern tal-lawril araċidat

A

–

Esteri diterpeniċi

B

–

Xema'

C

–

Esteri steroli u esteri triterpeniċi

Grafika 3

Esteri metiliċ, esteri etiliċi u xema' fiż-żejt taż-żebbuġa extra verġni

Elementi ewlenin:

1

–

Standard intern tal-ettodeċanoat metiliku

2

–

Metil C18

3

–

Etil C18

4

–

Squalene

5

–

Standard intern tal-lawril araċidat

A

–

Esteri diterpeniċi

B

–

Xema'

C

–

Esteri steroli u esteri triterpeniċi

Grafika 4

Parti tal-kromatogrammi għal żejt extra verġni taż-żebbuġa u l-istess żejt mħallat b'żejt deodorizzat

Elementi ewlenin:

1

–

Standard intern tal-metil miristato

2

–

Metil palmitat

3

–

Etil palmitat

4

–

Standar intern tal-ettodeċanoat metiliku

5

–

Metil linoleat

6

–

Methyl oleate

7

–

Methyl stearate

8

–

Ethyl linoleate

9

–

Ethyl oleate

10

–

Ethyl stearate

---

Appendiċi A

Determinazzjoni tal-veloċità linjari tal-gass

Injetta 1:3 μl metan (jew propan) fl-apparat kromatografiku b'fażi gassuża, wara li tirregolah għall-kundizzjonijiet normali ta' operar. Ħu l-ħin li l-gass jieħu biex jgħaddi mill-kolonna mill-mument li jiġi injettat sakemm tidher l-quċċata (tM).

Il-veloċità lineari f’ċm/sekonda tinsab bil-formola L/tM fejn L huwa l-għoli tal-kolonna, f’ċm, u tM huwa l-ħin imkejjel f’sekondi.

---

( 1 ) ĠU Nru 172, 30.9.1966, p. 3025/66.

( 2 ) ĠU Nru L 353, 17.12.1990, p. 23.

( 3 ) ĠU Nru L 128, 24.5.1977, p. 6.

( 4 ) ĠU Nru L 166, 1.7.1988, p. 10.

( 5 ) Wara l-eluzzjoni ta’ l-isterol esters, il-linja kromatografika ma għandhiex ikollha qċaċet sinifikattivi (triglycerides)

( 6 ) Id-dewwieq jista'għa' joqgħod lura milli jduq żejt meta permezz tax-xamm dirett jipperċepixxi attribut negattiv b'intensità estrema. Fuq il-folja għandu jniżżel din iċ-ċirkustanza eċċezzjonali.

( 7 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be used to obtain distinct band separation.

( 8 ) Wara l-elużjoni tal-esteri steroli, il-kromatogramma ma għandha turi ebda quċċata sinifikanti (trijaċilgliċeroli).