Pielikums (1. daļa no 2)
LV
PIELIKUMS
Regulas (EK) Nr. 440/2008 pielikumu groza šādi:
1)
Pielikuma B daļā B.4. nodaļu aizstāj ar šādu:
“B.4. AKŪTS ĀDAS KAIRINĀJUMS/KOROZIJA (KODĪGA IEDARBĪBA UZ ĀDU)
IEVADS
1. Šī testēšanas metode ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 404 (2015) aprakstītajam. ESAO ķīmisko vielu testēšanas vadlīnijas tiek regulāri pārskatītas, lai nodrošinātu, ka tās atspoguļo zinātnes jaunākās atziņas. Pārskatot ESAO TG Nr. 404, īpaši uzmanīgi tika apsvērts, ko iespējams uzlabot dzīvnieku labturības aspektos, kā arī izvērtēta visa par testējamo ķimikāliju jau esošā informācija, lai nebūtu jāveic lieka testēšana ar laboratorijas dzīvniekiem. Atjauninātajā ESAO TG Nr. 404 (sākotnēji pieņemta 1981. gadā, pārstrādāta 1992., 2002. un 2015. gadā) ir atsauce uz Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion (IATA) (Norādījumu dokuments par integrētām pieejām testēšanai un novērtēšanai attiecībā uz ādas kairinājumu/koroziju) (1), kurā testēšanai attiecībā uz ādas kairinājumu un ādas koroziju ierosināta modulāra pieeja. IATA apraksta vairākus moduļus, kuros tiek grupēti informācijas avoti un analīzes rīki, un, pirmkārt, sniedz norādījumus par to, kā, novērtējot ķimikāliju potenciālu radīt ādas kairinājumu un ādas koroziju, integrēt un izmantot jau esošos testēšanā un citādi iegūtos datus, un, otrkārt, ierosina pieeju, ko izmantot, ja vajadzīga turpmāka testēšana (1). Bez tam attiecīgā gadījumā minētā vadlīnija ieteic sākotnējā in vivo testā trīs kompreses dzīvniekam aplicēt nevis vienlaikus, bet secīgi.
2. Ādas kairinājuma un korozijas definīcijas sniegtas šīs testēšanas metodes apraksta papildinājumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI
3.Tiklab zinātnes kā dzīvnieku labturības interesēs ir neveikt testēšanu in vivo, iekams visi dati, kas relevanti attiecībā uz testējamās ķimikālijas potenciālajām ādai kodīgajām/kairinošajām īpašībām, nav izvērtēti Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Corrosion and Irritation (Norādījumu dokumentā par integrētu pieeju ādas korozijas un kairinājuma testēšanu un novērtēšanu), proti, tā trijās daļās un attiecīgajos moduļos (1) aprakstītajā pierādījumsvara (WoE) analīzē. Īsumā — 1. daļā noteikts, ka esošos datus aplūko septiņos moduļos, kuri aptver datus par cilvēku, in vivo pētījumos iegūtos datus, attiecīgos in vitro datus, datus par fizikālķīmiskajām īpašībām (piem., pH, jo īpaši stiprs skābums vai sārmainums) un datus, kas iegūti ar metodēm, kuras neparedz testēšanu. 2. daļa nosaka, kā izdarāma WoE analīze. Ja WoE analīze joprojām nesniedz skaidrus rezultātus, jāveic 3. daļā aprakstītā papildu testēšana, sākot ar in vitro metodēm, bet in vivo testēšana jāizmanto kā pēdējā iespēja. Tātad šāda analīze mazina nepieciešamību veikt in vivo testēšanu attiecībā uz tādu testējamo ķimikāliju kodīgajām/kairinošajām īpašībām, attiecībā uz kurām par šiem diviem beigupunktiem pietiekami daudz datu jau iegūts citos pētījumos.
IN VIVO TESTA PRINCIPS
4.Uz eksperimenta dzīvnieku ādas aplicē vienu devu testējamās ķimikālijas. Par kontroli izmanto tā paša testā izmantotā dzīvnieka ādas neskartās daļas. Nosaka kairinājuma/korozijas pakāpi, ko ar noteiktiem starplaikiem nolasa, novērtē ar atzīmēm un ietekmes pilnīgai izvērtēšanai apraksta sīkāk. Pētījuma ilgumam jābūt tādam, lai varētu novērtēt novērotās ietekmes atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu.
5.Dzīvnieki, kuriem jebkurā testa posmā novērojamas pastāvīgas stipru ciešanu un/vai sāpju pazīmes, humāni jānonāvē, un testējamā ķimikālija attiecīgi jānovērtē. Kritēriji, pēc kuriem pieņem lēmumu humāni nonāvēt mirstošus dzīvniekus un dzīvniekus, kam ir smagas ciešanas, sniegti atsevišķā norādījumu dokumentā (2).
SAGATAVOŠANĀS IN VIVO TESTAM
Dzīvnieku sugas izraudzīšanās
6.Piemērotākais laboratorijas dzīvnieks ir albīnais trusis, un izmanto jaunus veselus pieaugušus dzīvniekus. Ja izmanto citu sugu dzīvniekus, tas attiecīgi jāpamato.
Dzīvnieku sagatavošana
7.Apmēram 24 stundas pirms testa dzīvniekiem ķermeņa mugurdaļā rūpīgi nocērpj apmatojumu. Jāraugās ādu nesaskrāpēt un jāizmanto tikai dzīvnieki ar veselu un nebojātu ādu.
8.Dažām trušu līnijām ir bieza apspalvojuma vietas, kas zināmos gadalaikos kļūst izteiktākas. Šādas vietas, kur apmatojums uz ķermeņa ir ļoti blīvs, testēšanai neizmanto.
Turēšanas un barošanas apstākļi
9.Dzīvnieki jātur atsevišķi. Eksperimenta trušu telpas temperatūra ir 20°C (± 3°C). Lai gan relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, izņemot telpu uzkopšanas laiku, vēlams nepārsniegt 70 %, jāorientējas uz 50–60 %. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas — tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzirdināmajam ūdenim.
TESTA PROCEDŪRA
Testējamās ķimikālijas aplicēšana
10.Testējamo ķimikāliju aplicē uz nelielas ādas virsmas platības (apmēram 6 cm2), kuru pārklāj ar marles kompresi, ko piestiprina ar nekairinošu plāksteri. Ja tieša aplicēšana nav iespējama (piem., šķidrumiem vai daļai pastu), testējamo ķimikāliju vispirms pārnes uz marles kompreses, kuru pēc tam aplicē uz ādas. Kompresei jāpieguļ ādai, taču ne blīvi, un to panāk, ekspozīcijas laikā izmantojot attiecīgu puspiegulošu pārsēju. Ja testējamo ķimikāliju pārnes uz kompresi, tā ādai jāpiestiprina tā, lai ķimikālijai ar ādu būtu laba saskare un tā uz ādas būtu sadalīta vienmērīgi. Jāpanāk, ka dzīvnieks kompresei nevar pieskarties, tādējādi izslēdzot iespēju, ka testējamā ķimikālija tiek ieēsta vai ieelpota.
11.Šķidras testējamās ķimikālijas parasti pārbauda neatšķaidītas. Testējot cietas vielas (kuras, ja uzskata par nepieciešamu, var saberzt pulverī), testējamā ķimikālija jāsamitrina ar mazāko daudzumu ūdens (vai, ja nepieciešams, cita piemērota nesēja), ar ko pietiek, lai panāktu labu saskari ar ādu. Ja ūdens vietā izmanto citus nesējus, testētās ķimikālijas izraisītā ādas kairinājumā nesēja ietekmei, ja tāda vispār ir, jābūt iespējami minimālai.
12.Ekspozīcijas perioda (parasti četras stundas) beigās testējamās ķimikālijas atliekas no ādas noņem, ja iespējams, ar ūdeni vai citu piemērotu šķīdinātāju, kas neietekmē izveidojušos atbildreakciju un nebojā epidermu.
Devas līmenis
13.Uz testa anatomiskās vietas aplicē 0,5 ml šķidruma vai 0,5 g cietas vielas vai pastas.
Sākotnējais tests (ādas kairinājuma/korozijas in vivo tests ar vienu dzīvnieku)
14.Ja uz pierādījumsvara analīzes vai agrākas in vitro testēšanas pamata par attiecīgo testējamo ķimikāliju nospriests, ka tā ir kodīga, kairinoša vai nav klasificēta, tālāka in vivo testēšana parasti nav vajadzīga. Tomēr, ja tiek uzskatīts, ka vajadzīgi papildu dati, in vivo testu sākotnēji parasti izdara ar vienu dzīvnieku, izmantojot šādu pieeju. Vienam dzīvniekam secīgi aplicē trīs testa kompreses. Pirmo kompresi noņem pēc trim minūtēm. Ja nopietnu ādas reakciju nenovēro, citā vietā aplicē otru kompresi, ko noņem pēc stundas. Ja novērojumi šajā testa posmā liecina, ka ekspozīciju iespējams humāni paildzināt līdz četrām stundām, uzliek trešo kompresi, ko noņem pēc četrām stundām, un novērtē atbildreakciju.
15.Ja pēc kādas no trim secīgām ekspozīcijām tiek novērota kodīga ietekme, testu nekavējoties beidz. Ja pēc pēdējās kompreses noņemšanas kodīgu ietekmi nenovēro, dzīvnieku novēro vēl 14 dienas, ja vien korozija neizveidojas jau pirms šā laika beigām.
16.Ja netiek gaidīts, ka testējamā ķimikālija būs kodīga, bet tā var būt kairinoša, vienam dzīvniekam uz četrām stundām aplicē vienu kompresi.
Apstiprinošs tests (ādas kairinājuma in vivo tests, kurā izmanto papildu dzīvniekus)
17.Ja sākotnējā testā kodīga ietekme nav novērota, kairinājuma atbildreakcija vai tās neesība jāapstiprina, izmantojot ne vairāk kā divus papilddzīvniekus, kuriem katram aplicē vienu kompresi, ko tur četras ekspozīcijas stundas. Ja sākotnējā testā novērota kairinoša ietekme, apstiprinājuma testu var veikt secīgi vai divus papildzīvniekus eksponējot vienlaicīgi. Izņēmuma gadījumā, kur sākotnējs tests netiek veikts, diviem vai trijiem dzīvniekiem aplicē vienu kompresi, ko noņem pēc četrām stundām. Ja izmanto divus dzīvniekus un atbildreakcija abiem ir vienāda, turpmāka testēšana nav nepieciešama. Pretējā gadījumā jāveic testi ar vēl vienu dzīvnieku. Neskaidru reakciju izvērtēšanai var būt nepieciešams izmantot papildu dzīvniekus.
Novērošanas periods
18.Ar novērošanas periodu jāpietiek, lai varētu pilnīgi izvērtēt novērotās ietekmes atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Taču eksperiments vienmēr jāpārtrauc jebkurā brīdī, kad dzīvniekiem parādās pastāvīgu smagu sāpju vai ciešanu pazīmes. Lai novērtētu ietekmes atgriezeniskumu, pēc komprešu noņemšanas dzīvnieki vēl līdz 14 dienas ilgi jānovēro. Ja iedarbības atgriezeniskumu konstatē pirms 14 dienu perioda beigām, eksperiments tajā brīdī jābeidz.
Klīniskie novērojumi un ādas reakciju pakāpes
19.Visiem dzīvniekiem eritēmas un tūskas pazīmes jāpārbauda un atbildreakcija ar atzīmi jānovērtē 60 minūtes pēc tampona noņemšanas un vēl pēc 24, 48 un 72 stundām. Sākotnējā testā ar vienu dzīvnieku tūlīt pēc kompreses noņemšanas apskata arī testa anatomisko vietu. Ādas reakcijas novērtē pa pakāpēm un reģistrē pēc zemāk dotās pakāpju tabulas. Ja ir ādas bojājums, ko pēc 72 stundām nevar identificēt par kairinājumu vai koroziju, tad, lai noteiktu, vai ietekme ir atgriezeniska, novērošana var būt jāturpina līdz 14. dienai. Papildus kairinājuma novērojumam pilnīgi jāraksturo un jāreģistrē arī jebkāda tāda lokāla toksiska ietekme kā ādas attaukošanās un jebkāda sistēmiski kaitīga ietekme (piem., ietekme uz toksiskuma klīniskajām pazīmēm un ķermeņa masas pārmaiņām). Jāapsver, vai neskaidru atbildreakciju precizēšanai neveikt histopatoloģiskus izmeklējumus.
20.Ādas reakciju iedalīšana pakāpēs neizbēgami ir subjektīva. Lai veicinātu ādas reakciju pakāpju saskaņošanu un palīdzētu testēšanas laboratorijām, novērojumu veicējiem un interpretētājiem, personālam, kas veic novērojumus, jābūt pietiekami apmācītam par izmantojamo atzīmju sistēmu (sk. tabulu zemāk). Var noderēt ilustrēti norādījumi par ādas kairinājuma un citu bojājumu pakāpēm (3).
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
21.Pētījuma rezultāti testēšanas galīgajā pārskatā jāapkopo tabulas veidā, aptverot visus 24. punkta sarakstā norādītos jautājumus.
Rezultātu izvērtēšana
22.Ādas kairinājuma novērtējuma atzīmes jāizvērtē kopsakarā ar bojājumu dabu un smagumu un to atgriezeniskumu vai neatgriezeniskumu. Konkrētās novērtējuma atzīmes nav absolūts materiāla kairinošo īpašību standarts, jo tiek novērtēta arī testējamā materiāla cita veida ietekme. Individuālās novērtējuma atzīmes būtu uzskatāmas par bāzesvērtībām, kuras jāizvērtē kombinācijā ar visiem citiem pētījumā veiktajiem novērojumiem.
23.Kairinājuma atbildreakcijas izvērtēšanā jāņem vērā, vai ādas bojājumi ir atgriezeniski. Ja tādas reakcijas kā apmatojuma zaudējums (ierobežotā platībā), hiperkeratoze (ādas pārragošanās), hiperplāzija un plaisāšana saglabājas līdz 14 dienu ilga novērošanas perioda beigām, testējamā ķimikālija jāuzskata par kairinošu.
Testēšanas pārskats
24.Testēšanas pārskatā jānorāda šāda informācija.
In vivo testēšanas pamatojums:
-jau esošu testēšanas datu, arī ar secīgas testēšanas stratēģiju iegūtu rezultātu pierādījumsvara analīze;
-relevantu agrākā testēšanā iegūtu datu apraksts;
-katrā testēšanas stratēģijas posmā iegūtie dati;
-izdarīto in vitro testu apraksts, arī detalizēta informācija par procedūrām un ar testējamajām vielām un standartvielām iegūtajiem rezultātiem;
-in vivo pētījuma veikšanai nepieciešamā pierādījumsvara analīze.
Testējamā ķimikālija:
-vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā un ja praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. c.;
-daudzkomponentu vielas, maisījumi un vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kuras ir kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli (UVCB): iespējami izsmeļoši raksturotas pēc to komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām;
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;
-avots, no kura dzīvnieki saņemti, sērijas numurs, ja zināms;
-testējamās ķimikālijas / kontrolvielas pirmstestēšanas apstrāde (piem., sildīšana, sasmalcināšana) ja tāda veikta;
-testējamās ķimikālijas stabilitāte, izmantošanas termiņš vai atkārtotas analīzes datums, ja tas zināms;
-glabāšanas apstākļi.
Nesējs:
-
identifikācija, koncentrācija (attiecīgā gadījumā), izmantotais tilpums;
-
nesēja izraudzīšanās pamatojums.
Testa dzīvnieks (dzīvnieki):
-
izmantotais celms/līnija, izraudzīšanās pamatojums gadījumos, kur neizmanto albīnos trušus;
-
katra dzimuma dzīvnieku skaits;
-
katra dzīvnieka masa testa sākumā un beigās;
-
vecums pētījuma sākumā;
-
avots, no kura dzīvnieki saņemti, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.
Testēšanas nosacījumi:
-
kompreses vietas sagatavošanas paņēmiens;
-
detalizēta informācija par izmantotajiem kompreses materiāliem un kompreses uzlikšanas paņēmienu;
-
detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas sagatavošanu, aplicēšanu un noņemšanu.
Rezultāti:
-tabulā apkopotas atzīmes par katram dzīvniekam novēroto kairinājuma/korozijas veida atbildreakciju visos mērītajos laika punktos;
-visu novēroto bojājumu apraksts;
-stāstījumveida apraksts par novērotā kairinājuma vai korozijas dabu un pakāpi un jebkādi histopatoloģiski konstatējumi;
-papildus ādas kairinājuma vai korozijas aprakstam — apraksts par vēl citu nelabvēlīgu vietēju (piem., ādas attaukošanās) vai sistēmisku ietekmi.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
Literatūra
(1)OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(2)OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.
(3)OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organistion for Economic Cooperation and Development, Paris.
TABULA. ĀDAS REAKCIJAS KLASIFICĒŠANA
Eritēmas un nekrotisku kreveļu veidošanās
Eritēmas nav.……………………………………………………………………………0
Ļoti neliela eritēma (tikko manāma).……………………………………………..1
Labi saskatāma eritēma.………………………………………………………………….2
Vidēja līdz smaga eritēma.…………………………………………………………...3
Smaga eritrēma (liellopa gaļas sarkanums) ar izveidojušos nekrotisku kreveli, kas liedz iespēju noteikt eritēmas pakāpi….…………………………………………………………...
4
Maksimālie iespējamie punkti: 4
Tūskas veidošanās
Tūskas nav.……………………………………………………………………………..0
Ļoti neliela tūska (tikko manāma).……………………………………………..1
Neliela tūska (skarto vietu viegli noteikt pēc izteikta pietūkuma)……………………….2
Vidēja tūska (pietūkums apm. 1 mm)………………………………………3
Smaga tūska (pietūkums vairāk nekā 1 mm, arī aiz eksponētā ādas laukuma)..4
Maksimālie iespējamie punkti: 4
Neskaidras atbildreakcijas var precizēt ar histopatoloģiskiem izmeklējumiem.
Papildinājums
Definīcijas
Ķimikālija ir viela vai maisījums.
Ādas kairinājums ir atgriezenisks ādas bojājums, kas rodas, testējamo ķimikāliju aplicējot uz laiku līdz četrām stundām.
Ādas korozija ir neatgriezenisku ādas bojājumu rašanās; proti, redzama nekroze, kas caur epidermu skar zemādu un rodas, testējamo ķimikāliju uz ādas aplicējot līdz četrām stundām. Reakcijām uz kodīgumu parasti ir raksturīgas čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērošanas perioda beigās — ādas izbalējuma radīta atkrāsošanās, ādas laukumi, kur izkritis apmatojums, un rētas. Neskaidros gadījumos bojājums jānovērtē histopatoloģiski.
Testējamā ķimikālija ir jebkura viela vai maisījums, ko testē ar šo testēšanas metodi.”;
(2) Pielikuma B daļā B.17. nodaļu aizstāj ar šādu:
“B.17. ZĪDĪTĀJU ŠŪNU GĒNU MUTĀCIJU IN VITRO TESTI AR GĒNIEM HPRT UN XPRT
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 476 (2016) aprakstītajam. Testēšanas metodes tiek pastāvīgi pārskatītas zinātnes sasniegumu, mainīgo regulatīvo prasību un dzīvnieku labturības apsvērumu gaismā. Šī pašreizējā pārstrādātā TM B.17 versija atspoguļo gandrīz trīsdesmitgadīgu pieredzi šā testa veikšanā un arī rezultātus, kas gūti, izstrādājot atsevišķu jaunu metodi zīdītāju šūnu gēnu mutāciju in vitro testiem, kuros izmanto timidīna kināzes gēnu. TM B.17 pieder pie ģenētiski toksikoloģiskās testēšanas metožu sērijas. ESAO izstrādājusi dokumentu, kas īsi informē par ģenētiski toksikoloģisko testēšanu un sniedz pārskatu par jaunākajiem ESAO genotoksicitātes testēšanas vadlīnijas grozījumiem (1).
2.Šā zīdītāju šūnu gēnu mutāciju in vitro testa nolūks ir detektēt ķimikāliju izraisītas gēnu mutācijas. Ar šajos testos izmantotajām šūnu līnijām mēra turpvērstas mutācijas, kas notiek ar reportiergēniem — endogēnisko hipoksantīna–gvanīna fosforiboziltransferāzes gēnu (grauzēju šūnu Hprt, cilvēka šūnu HPRT; šajā testēšanas metodes aprakstā tie apvienoti saukti par gēnu Hprt un HPRT testu) un ksantīna–gvanīna fosforiboziltransferāzes transgēnu (gpt) (tas saukts par XPRT testu). HPRT un XPRT mutāciju testi detektē dažāda spektra ģenētiskus notikumus. Papildus ar šo HPRT testu detektētajiem mutatīvajiem notikumiem (piem., bāzu pāra maiņas mutācijām, nolasīšanas fāzes nobīdēm, mazām delēcijām un insercijām) transgēna gtp autosomālā lokalizācija var dot iespēju detektēt mutācijas, kas radušās no lielām HRPT testā nedetektētām delēcijām un varbūt arī mitotiskām rekombinācijām, jo gēns Hprt atrodas X hromosomā (2) (3) (4) (5) (6) (7). Regulatīviem nolūkiem pašlaik XPRT izmanto mazāk nekā HPRT testu.
3.Izmantotās definīcijas ir sniegtas 1. pielikumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI
4.In vitro testos metaboliskai aktivācijai parasti jāizmanto eksogēnisks avots. Eksogēniskā metaboliskās aktivācijas sistēma in vivo apstākļus atdarina nepilnīgi.
5.Būtu jāraugās, lai nerodas tādi apstākļi (proti, varbūtēja mijiedarbība ar testēšanas sistēmu), kas novestu pie artefaktuāli pozitīviem rezultātiem, kurus nerada tieša testējamo ķimikāliju un šūnas ģenētiskā materiāla mijiedarbība; pie tādiem apstākļiem pieder arī pH vai osmolalitātes pārmaiņas (8) (9) (10), mijiedarbība ar barotnes komponentiem (11) (12) vai pārāk augsti citotoksicitātes līmeņi (13). HPRT testā par pārāk augstiem uzskata līmeņus, kas pārsniedz 19. punktā definētos ieteicamos augšējos citotoksicitātes līmeņus.
6.Pirms šo testēšanas metodi izmanto attiecībā uz maisījumu, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Ja pastāv normatīva prasība maisījumu testēt, tāda apsvēršana nav vajadzīga.
TESTA PRINCIPS
7.Mutantšūnas, kurām Hprt fermenta darbība HPRT testā vai xprt fermenta darbība XPRT testā neizpaužas, ir rezistentas pret purīna analoga 6-tiogvanīna (TG) citostatisko ietekmi. Hprt (HPRT testā) vai gpt (XPRT testā) standartšūnas ir jutīgas pret TG, kurš inhibē šūnu vielmaiņu un šūnām aptur tālāku dalīšanos. Tātad mutantšūnas TG klātbūtnē spēj proliferēt, turpretī normālas šūnas, kas satur Hprt (HPRT testā) vai gpt (XPRT testā) fermentu, to nespēj.
8.Šūnas, kas ir suspensijā vai vienslāņa kultūrās, uz piemērotu laiku (3–6 stundām) gan ar eksogēnisku metaboliskas aktivācijas avotu, gan bez tā (sk. 14. punktu) eksponē testējamajai ķimikālijai, bet pēc tam kultivē apakškultūrās, lai varētu noteikt citotoksicitāti un lai pirms mutantu atlasīšanas varētu notikt fenotipiskā ekspresija (14), (15), (16), (17). Citotoksicitāti nosaka pēc relatīvās izdzīvotības (RS), t. i., pēc klonēšanās efektivitātes, ko izmēra tūlīt pēc apstrādes un koriģē attiecībā uz jebkādiem apstrādes laikā notikušiem šūnu zudumiem salīdzinājumā ar negatīvo kontroli (18. punkts un 2. papildinājums). Kultūras, kas apstrādātas, barotnē tur pietiekami ilgu laiku (katra veida šūnām tas ir savs), lai būtu iespējama gandrīz optimāla izraisīto mutāciju fenotipiskā ekspresija (parasti vismaz 7–9 dienas). Kad notikusi fenotipiskā ekspresija, nosaka mutantu biežumu, noteiktu skaitu šūnu izsējot tādā barotnē, kas satur selektīvo līdzekli, ar kuru detektē mutantu kolonijas, un barotnē bez selektīvā līdzekļa, pēc kuras nosaka klonēšanās efektivitāti (dzīvotspēju). Pēc piemērota inkubēšanas laika kolonijas saskaita. Mutantu biežumu aprēķina pēc mutantu koloniju skaita, ko koriģē atbilstoši klonēšanās efektivitātei mutantu selekcijas laikā.
METODES APRAKSTS
Preparāti
Šūnas
9.HPRT un XPRT testiem jāizmanto tādu tipu šūnas, kam apliecināts jutīgums pret ķīmiskiem mutagēniem, augsta klonēšanās efektivitāte, stabils kariotips un stabils spontānu mutantu biežums. Pie HPRT testam visbiežāk izmantotajām šūnām pieder Ķīnas kāmja šūnu CHO, CHL un V79 līnija, peļu limfomas šūnas L5178Y un cilvēka limfoblastu šūnas TK6 (18) (19). No CHO atvasinātās šūnas AS52, kam ir transgēns gpt (bet gēns Hprt ir deletēts), izmanto XPRT testā (20) (21); HPRT testu ar šūnām AS52 nevar veikt, jo hprt gēni ir deletēti. Citu šūnu līniju izmantošana jāpamato un jāvalidē.
10.Šūnu līnijām regulāri jāpārbauda, vai modālais hromosomu skaits ir stabils un vai nav notikusi kontaminācija ar mikoplazmu (22) (23), un, ja konstatē mikoplazmu vai ja modālais hromosomu skaits ir mainījies, šūnas nav izmantojamas. Jānosaka, kāds ir testēšanas laboratorijā izmantoto šūnu normālais cikla ilgums, un tam jāsakrīt ar publicētajiem šūnu raksturlielumiem. Jāpārbauda arī spontāno mutantu biežums šūnu izejkultūrā, un, ja tas nav pieņemams, kultūra nav izmantojama.
11.Pirms kultūras izmanto šajā testā, tās var būt jāattīra no jau esošām mutantšūnām, piem., HPRT testa vajadzībām kultivējot HAT barotnē, bet XPRT testa vajadzībām — MPA barotnē (5) (24) (sk. 1. papildinājumu). Attīrītās šūnas iespējams saglabāt krioniski un pēc tam atkausēt, lai izmantotu par darba kultūrām. Tikko atkausētu darba kultūru var sākt testam izmantot, kad sasniegts parastais dubultošanās laiks. Izdarot XPRT testu, parastas šūnu AS52 kultūras gadījumā būtu jāizmanto apstākļi, kas garantē transgēna gpt saglabāšanos (20).
Barotne un kultivēšanas apstākļi
12.Kultūru uzturēšanai jāizmanto attiecīgas barotnes un attiecīgi inkubācijas apstākļi (kultivēšanas trauki, mitrināta atmosfēra ar CO2 koncentrāciju 5 %, inkubācijas temperatūra 37 °C). Šūnu kultūras vienmēr būtu jātur tādos apstākļos, lai būtu nodrošināts, ka augšana notiek eksponenciālā fāzē. Īpaši svarīgi ir izraudzīties tādu barotni un tādus kultivēšanas apstākļus, kuri nodrošina šūnu optimālu augšanu ekspresijas periodā un gan mutantšūnām, gan nemutējušām šūnām — optimālu klonēšanās efektivitāti.
Kultūru sagatavošana
13.Šūnu līnijas tiek pavairotas no izejkultūrām, ko kultūras barotnē iesēj tādā blīvumā, lai apstrādes periodā un ekspresijas periodā šūnas suspensijās vai vienslāņa kultūrās joprojām augtu eksponenciāli (piem., attiecībā uz šūnām vienslāņa kultūrās jāizvairās no konfluences).
Metaboliskā aktivācija
14.Ja strādā ar šūnām, kuru endogēniskā metaboliskā kapacitāte nav pietiekama, jāizmanto eksogēniskas metaboliskās aktivācijas sistēmas. Visplašāk izmantotā sistēma, kuru iesaka pēc noklusējuma, ja vien nav pamata izmantot citu, ir ar kofaktoru papildināta postmitohondriālā frakcija (S9) no grauzēju (parasti žurku) aknām, kas apstrādātas ar tādām fermentus inducējošām vielām kā Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) vai fenobarbitāls kombinācijā ar β-naftoflavonu (29) (30) (31) (32). Pēdējā minētā kombinācija nav pretrunā ar Stokholmas Konvenciju par noturīgajiem organiskajiem piesārņotājiem (33) un jauktas funkcijas oksidāžu inducēšanā izrādījusies tikpat iedarbīga kā Aroclor 1254 (29) (31). S9 frakciju parasti izmanto koncentrācijā 1–2 % (tilp./tilp.), bet galīgajā testa barotnē koncentrāciju var paaugstināt līdz 10 % (tilp./tilp.). To, kādu eksogēniskās metaboliskās aktivācijas sistēmas vai metaboliskā inducētāja veidu un koncentrāciju izraugās, var ietekmēt testējamo vielu klase (34) (35) (36).
Testējamās ķimikālijas sagatavošana
15.Cietas testējamās ķimikālijas jāsagatavo attiecīgos šķīdinātājos un attiecīgā gadījumā pirms šūnu apstrādes jāatšķaida (sk. 16. punktu). Šķidras testējamās ķimikālijas var testa sistēmai pievienot tieši un/vai pirms testa sistēmas apstrādes atšķaidīt. Gāzveida vai gaistošas testējamās ķimikālijas vēlams testēt pēc attiecīgām standarta protokolu modifikācijām, piemēram, apstrādi veicot hermētiski noslēgtos kultivēšanas traukos (37) (38). Testējamās ķimikālijas preparāti jāpagatavo tieši pirms apstrādes, ja vien dati par stabilitāti neliecina, ka tos var glabāt.
Testa apstākļi
Šķīdinātāji
16.Šķīdinātājs jāizvēlas tā, lai testējamo ķimikāliju šķīdību optimizētu, šķīdinātājam negatīvi neietekmējot testa norisi, piem., nemainot šūnu augšanu, neskarot testējamās ķimikālijas integritāti, nereaģējot ar kultivēšanas traukiem, nepasliktinot metaboliskās aktivācijas sistēmu. Ja vien iespējams, ieteicams vispirms apsvērt, vai neizmantot šķīdinātāju (vai kultūras barotni) uz ūdens bāzes. Plaši atzīti šķīdinātāji, piemēram, ir ūdens un dimetilsulfoksīds. Galīgajā apstrādes barotnē organiskajiem šķīdinātājiem parasti nevajadzētu pārsniegt 1 % (tilp./tilp.), bet šķīdinātājiem uz ūdens bāzes (sālsūdens vai ūdens) — 10 % (tilp./tilp.). Ja tiek izmantoti ne tik plaši atzīti šķīdinātāji (piem., etanols vai acetons), to izmantošana jāpamato ar datiem, kas apliecina, ka tie sader ar testējamo ķimikāliju un ar testa sistēmu un ka izmantotajā koncentrācijā tiem nepiemīt genotoksicitāte. Ja šādu apliecinošu datu nav, svarīgi ir izmantot arī neapstrādātas kontroles (sk. 1. papildinājumu), lai ar tām pierādītu, ka izraudzītais šķīdinātājs nerada nekādu deletējošu vai mutagēnisku ietekmi.
Citotoksicitātes mērīšana un ekspozīcijas koncentrāciju izraudzīšanās
17.Nosakot augstāko testējamās ķimikālijas koncentrāciju, neizraugās koncentrācijas, kas spēj izraisīt tādas artefaktuāli pozitīvas atbildreakcijas kā pārmērīga citotoksicitāte (sk. 20. punktu), nogulsnes barotnē (sk. 21. punktu) vai manāmas pH vai osmolalitātes pārmaiņas (sk. 5. punktu). Ja testējamā ķimikālija pievienošanas brīdī manāmi maina barotnes pH, lai nepieļautu artefaktuāli pozitīvus rezultātus un saglabātu pienācīgus kultivēšanas apstākļus, pH var koriģēt, galīgajā apstrādes barotnē pievienojot buferšķīdumu.
18.Koncentrācijas izraugās pēc citotoksicitātes un citiem apsvērumiem (sk. 20.–22. punktu). Kaut arī citotoksicitātes izvērtēšana sākotnējā testā var noderēt, lai sekmīgāk noteiktu galvenajā eksperimentā izmantojamās koncentrācijas, sākotnējais tests nav jāveic obligāti. Pat ja citotoksicitāte izvērtēta jau no sākuma, galvenajā eksperimentā tā joprojām jānosaka katrai kultūrai. Citotoksicitāti izvērtē pēc RS, proti, pēc to šūnu klonēšanās efektivitātes (CE), kuras tūlīt pēc apstrādes uzsētas uz platēm, CE koriģējot pēc negatīvo kontroļu (kurām izdzīvotība ir 100 %) klonēšanās efektivitātes, sk. formulu 2. papildinājumā.
19.Jāizvērtē vismaz četras testa koncentrācijas (nerēķinot šķīdinātāju un pozitīvās kontroles), kas atbilst pieņemamības kritērijiem (attiecīga citotoksicitāte, šūnu skaits u. c.). Lai gan ir ieteicams izmantot kultūru dublikātus, ar katru testa koncentrāciju var izmantot vai nu replikātus, vai atsevišķas apstrādātas kultūras. Ar vienas noteiktas koncentrācijas atsevišķajām replikātu kultūrām iegūtie rezultāti pārskatā būtu jāatspoguļo atsevišķi, bet datu analīzes vajadzībām tos drīkst apkopot (17). Attiecībā uz testējamām ķimikālijām, ar kurām tiek uzrādīta neliela citotoksicitāte vai tās nav, parasti noderēs koncentrācijas intervāli ar koeficientu aptuveni no 2 līdz 3. Citotoksicitātes gadījumā izraudzītajām testa koncentrācijām jāaptver gan koncentrācijas, kuras rada citotoksicitāti, gan koncentrācijas, ar kurām citotoksicitāte ir vidēja, neliela vai tās vispār nav. Daudzām testējamajām ķimikālijām ir novērojama stāva koncentrācijatkarīgās atbildreakcijas līkne, un, lai aptvertu visu citotoksicitātes diapazonu vai lai detalizēti izpētītu devas un atbildreakcijas sakarību, var būt nepieciešams izmantot koncentrācijas ar tuvākiem intervāliem un vairāk nekā četras koncentrācijas, jo īpaši situācijās, kur eksperiments jāatkārto (sk. 43. punktu). Izmantot vairāk nekā 4 koncentrācijas var būt īpaši svarīgi, ja jāizmanto atsevišķas kultūras.
20.Ja maksimālās koncentrācijas pamatā ir citotoksicitāte, ar augstāko koncentrāciju būtu jācenšas panākt RS diapazonā no 20–10 %. Piesardzīgi būtu jāinterpretē pozitīvi rezultāti, kas konstatēti tikai ar RS 10 % vai zemāku (43. punkts).
21.Kas attiecas uz mazšķīstošām testējamām ķimikālijām, kuras pie koncentrācijām, kas zemākas par zemāko nešķīstošās frakcijas koncentrāciju, nav citotoksiskas, pie augstākās analizētās koncentrācijas pēc apstrādes ar testējamo ķimikāliju jārodas ar neapbruņotu aci vai ar invertēto mikroskopu redzamai duļķainībai vai nogulsnēm. Pat ja citotoksicitāte novērojama pie koncentrācijas, kas pārsniedz zemāko nešķīstošās frakcijas koncentrāciju, ieteicams testēt tikai vienu koncentrāciju, pie kuras rodas duļķainība vai acīm redzamas nogulsnes, jo nogulsnes var rezultātus ietekmēt artefaktuāli. Darbojoties ar koncentrāciju, pie kuras rodas nogulsnes, būtu jācenšas nodrošināt, ka nogulsnes neietekmē testa izdarīšanu. Var būt lietderīgi pirms eksperimenta noteikt šķīdību kultūras barotnē.
22.Ja nogulsnes vai ierobežojoša citotoksicitāte netiek novēroti, augstākajai testa koncentrācijai jāatbilst 10 mM, 2 mg/ml vai 2 μl/ml atkarībā no tā, kura ir zemāka (39) (40). Ja testējamās ķimikālijas sastāvs nav noteikts, piem., tā ir viela, kuras sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, tā ir komplekss reakcijas produkts vai bioloģisks materiāls (t.i., ķīmiska viela, kuras sastāvs nav zināms vai ir mainīgs (UVCB)), (41), vides ekstrakti u. tml., gadījumos, kur netiek novērota pietiekama citotoksicitāte, augstākā koncentrācija var būt jāpalielina (piem, 5 mg/mL), lai būtu panākta augstāka katra komponenta koncentrācija. Tomēr jāpiebilst, ka attiecībā uz cilvēku zālēm šīs prasības var būt citādas (42).
Kontroles
23.Paralēlas negatīvās kontroles (sk. 16. punktu), proti, tikai šķīdinātājs apstrādes barotnē, ar ko rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādātajām kultūrām, ir ikviena eksperimenta nosacījums.
24.Lai varētu pierādīt laboratorijas spēju izmantotā testa protokola apstākļos identificēt mutagēnus un — attiecīgā gadījumā — eksogēniskās metaboliskās aktivācijas sistēmas efektivitāti, ir vajadzīgas paralēlas pozitīvās kontroles. Pozitīvo kontroļu piemēri sniegti zemāk 1. tabulā. Var izmantot alternatīvas pozitīvās kontrolvielas, ja tas pamatoti. Tā kā ģenētiski toksikoloģiskie zīdītāju šūnu in vitro testi ir pietiekami standartizēti, testus, kuros izmanto apstrādi ar eksogēnisku metabolisku aktivāciju un bez tās, drīkst izdarīt tikai ar pozitīvu kontroli, kas prasa metabolisku aktivāciju. Šajā gadījumā viena vienīga pozitīva kontroles atbildreakcija apliecinās gan metaboliskās aktivācijas sistēmas darbību, gan testa sistēmas reaģētspēju. Lai pierādītu testa sistēmas jutīgumu, katra pozitīvā kontrole būtu jāizmanto ar vienu vai vairākām tādām koncentrācijām, ar kurām gaidāma reproducējama un detektējama palielināšanās salīdzinājumā ar fonu, turklāt atbildreakciju nedrīkstētu kompromitēt citotoksicitāte, kas pārsniedz šai testēšanas metodei specificētās robežas (sk. 20. punktu).
1. tabula. References ķimikālijas, ko ieteicams izmantot laboratorijas kompetences novērtēšanai un pozitīvo kontroļu izraudzīšanās vajadzībām
|
Nosacījums attiecībā uz metabolisko aktivāciju
|
Lokuss
|
Viela un CAS numurs
|
|
Eksogēniska metaboliska aktivācija nenotiek
|
Hprt
|
Etilmetānsulfonāts [CAS Nr. 62-50-0]
Etilnitrozurea [CAS Nr. 759-73-9]
4-nitrohinolīna 1-oksīds [CAS Nr. 56-57-5]
|
|
|
xprt
|
Streptonigrīns [CAS Nr. 3930-19-6]
Mitomicīns C [CAS Nr. 50-07-7]
|
|
Ar eksogēnisku metabolisku aktivāciju
|
Hprt
|
3-metilholantrēns [CAS Nr. 56-49-5]
7,12-dimetilbenzantracēns [CAS Nr. 57-97-6]
Benz[a]pirēns [CAS Nr. 50-32-8]
|
|
|
xprt
|
Benz[a]pirēns [CAS Nr. 50-32-8]
|
PROCEDŪRA
Apstrāde ar testējamo ķimikāliju
25.Proliferējošas šūnas ar testējamo ķimikāliju apstrādā gan metaboliskās aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās. Ekspozīcijai jāilgst attiecīgu laiku (parasti pietiek ar 3–6 stundām).
26.Minimālais šūnu skaits, ko izmanto katrai testa kultūrai (gan kontrolkultūrai, gan apstrādātai kultūrai), katrā testa posmā jābalsta uz spontāno mutantu biežumu. Vispārīgs princips ir šūnas apstrādāt un pasāžām ņemt tādā skaitā, lai visās testa fāzēs katrā kultūrā saglabātos vismaz 10 spontāni mutanti (17). Parasti spontāno mutantu biežums ir 5–20 x 10-6. Lai spontāno mutantu biežums būtu 5 x 10-6 un lai pietiekams spontāno mutantu skaits (10 vai vairāk) saglabātos arī kultūrās, ko apstrādes laikā apstrādā ar koncentrācijām, kuras rada 90 % citotoksicitāti (10 % RS), jāapstrādā vismaz 20 x 106 šūnas. Turklāt pietiekamā skaitā (bet nekādā gadījumā mazāk par 2 miljoniem) jābūt arī šūnām, ko kultivē ekspresijas periodā un mutantu selekcijas nolūkā uzsēj uz platēm (17).
Fenotipiskās ekspresijas laiks un mutantu biežuma mērīšana
27.Pēc apstrādes perioda šūnas kultivē, lai izpaustos mutantu fenotips. Lai notiktu gandrīz optimāla jauninducētu Hprt un xprt mutantu fenotipiskā ekspresija, parasti pietiek ar minimālo laiku 7 līdz 9 dienas (43) (44). Šajā periodā pastāvīgi veido šūnu apakškultūras, lai visu laiku saglabātos eksponenciāla augšana. Kad fenotipiskā ekspresija notikusi, šūnas pārsēj barotnē ar selektīvo līdzekli (6-tiogvanīnu) un bez tā, lai attiecīgi varētu noteikt mutantu skaitu un klonēšanās efektivitāti selekcijas laikā. Šajā pārsēšanā vienslāņa kultūrām var izmantot trauciņus, bet šūnām suspensijā — mikroiedobju plates. Mutantu selekcijas vajadzībām šūnas jāuzsēj tādā blīvumā, lai būtu garantēta optimāla mutantu izguve (proti, lai nevarētu notikt metaboliska sadarbība) (17). Plates inkubē optimālai koloniju augšanai atbilstošu laiku (piem., 7–12 dienas) un kolonijas saskaita. Mutantu biežumu aprēķina pēc mutantu koloniju skaita, ko koriģē atbilstoši klonēšanās efektivitātei mutantu selekcijas laikā (formulas sk. 2. papildinājumā).
Laboratorijas kompetence
28.Lai pirms testa pastāvīgas izmantošanas iegūtu pietiekamu vajadzīgo pieredzi, laboratorijai jābūt veikušai eksperimentu sēriju ar pozitīvās kontroles references vielām, kam ir dažādi iedarbības mehānismi (tās izraugās no 1. tabulas saraksta un vismaz vienai no tām jābūt tādai, kas ir aktīva ar metabolisku aktivāciju, un vienai — aktīvai bez tās), un ar dažādām negatīvajām kontrolēm (izmantojot dažādus šķīdinātājus/nesējus). Šo pozitīvo un negatīvo kontroļu atbildreakcijām jāsaskan ar literatūras datiem. Tas neattiecas uz laboratorijām, kurām pieredze jau ir, t. i., kuru rīcībā ir vēsturiska datubāze, kāda aprakstīta 30.–33. punktā.
29.Lai varētu pierādīt, ka laboratorija ir kompetenta detektēt mutagēniskas ķimikālijas, noteikt metaboliskās aktivācijas sistēmas darbībspēju un pierādīt, ka šūnu augšanas apstākļi apstrādes laikā, fenotipiskā ekspresija un mutantu selekcija, kā arī atzīmju likšanas procedūras atbilst vajadzīgajam, pozitīvas kontroles vielu (sk. 1. tabulu 25. punktā) izlase jāpēta gan bez metaboliskas aktivācijas, gan ar to. Lai varētu pierādīt testa sistēmas jutību un dinamisko diapazonu, jāizraugās tāds izlases ķimikāliju koncentrāciju diapazons, kurā pieaugumi virs fona līmeņa būs reproducējami un ar koncentrāciju saistīti.
Vēsturisko kontroļu dati
30.Laboratorijai jānosaka:
-vēsturisks pozitīvo kontroļu diapazons un sadalījums,
-vēsturisks negatīvo (neapstrādātu, ar šķīdinātāju) kontroļu diapazons un sadalījums.
31.Pirmo reizi iegūstot datus par vēsturisku negatīvo kontroļu sadalījumu, paralēlām negatīvajām kontrolēm jāatbilst publicētajiem datiem par kontrolēm (22). Kontroļu sadalījumam tiekot papildinātam ar jauniem eksperimentu datiem, paralēlajām negatīvajām kontrolēm ideālā gadījumā jābūt minētā sadalījuma 95 % kontrolrobežās (17) (45) (46).
32.Laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datubāze sākotnēji jāveido ar vismaz 10 eksperimentiem, bet vēlams, lai tajā būtu vismaz 20 eksperimenti, kas veikti salīdzināmos eksperimentēšanas apstākļos. Lai varētu noteikt, cik mainīgi ir laboratorijas pozitīvo un negatīvo kontroļu dati, un parādīt, ka laboratorijā šī metodika “tiek kontrolēta” (46), laboratorijām jāizmanto tādas kvalitātes kontroles metodes kā kontroldiagrammas (piem., C diagrammas vai X joslu diagrammas (47)). Papildu ieteikumi par vēsturisko datu izveidi un izmantošanu (t. i., kritēriji datu iekļaušanai vēsturiskajos datos un izslēgšanai no tiem un konkrēta eksperimenta pieņemamības kritēriji) atrodami literatūrā (45).
33.Negatīvo kontroļu datiem vajadzētu būt mutantu biežumam atsevišķās vai, ieteicams, replikātu kultūrās; sk. aprakstu 23. punktā. Paralēlajām negatīvajām kontrolēm ideālā gadījumā jābūt laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datubāzes sadalījuma 95 % kontrolrobežās (17) (45) (46). Tādus paralēlo negatīvo kontroļu datus, kas ir ārpus 95 % kontrolrobežas, iekļaušanai vēsturiskajā kontroļu sadalījumā var pieņemt tikai tad, ja šie dati nav pārmērīgi anomālas vērtības un ja ir pierādījumi, ka testa sistēma “tiek kontrolēta” (sk. augstāk) un nav gadījusies ne tehniska kļūme, ne cilvēka kļūda.
34.Jebkādas eksperimenta protokola pārmaiņas jāapsver, ņemot vērā to atbilstību laboratorijas esošajām vēsturisko kontroļu datubāzēm. Jebkādu būtisku neatbilstību gadījumā jāveido jauna vēsturisko kontroļu datubāze.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Rezultātu izklāsts
35.Rezultātu izklāstā jāiekļauj visi citotoksicitātes aprēķināšanai vajadzīgie dati (izteikti kā RS). Gan datos par apstrādātajām kontrolēm, gan par kontrolkultūrām jāiekļauj šūnu skaits pēc apstrādes beigām, tūlīt pēc apstrādes uzsēto šūnu skaits un koloniju skaitīšanas rezultāti (vai attiecībā uz mikroiedobju metodi — tādu iedobju skaits, kurās koloniju nav). Katras kultūras RS ieteicams izteikt kā procentu attiecībā pret paralēlo šķīdinātāja kontroli (definīcijas sk. 1. papildinājumā).
36.Rezultātu izklāstā jāiekļauj visi mutantu biežuma aprēķināšanai vajadzīgie dati. Gan datos par apstrādātajām kultūrām, gan datos par kontrolkultūrām jāiekļauj: 1) gan ar selekcijas līdzekli, gan bez tā uz platēm uzsēto šūnu skaits (brīdī, kad šūnas uzsēj mutantu selekcijai) un 2) gan attiecībā uz platēm ar selektīvo līdzekli, gan platēm bez selektīvā līdzekļa — saskaitīto koloniju skaits (vai attiecībā uz mikroiedobju metodi, tādu iedobju skaits, kurās koloniju nav) Mutantu biežumu aprēķina pēc mutantu koloniju skaita (uz platēm ar selektīvu līdzekli), kas koriģēts atbilstoši klonēšanās efektivitātei (uz platēm bez selekcijas līdzekļa). Mutantu biežums būtu jāizteic kā mutantšūnu skaits uz miljonu dzīvotspējīgu šūnu (definīcijas sk. 1. papildinājumā).
37.Norāda datus par atsevišķām kultūrām. Turklāt visus datus apkopo tabulas veidā.
Pieņemamības kritēriji
38.Testa pieņemamības pamatā ir šādi kritēriji:
-paralēlā negatīvā kontrole tiek uzskatīta par pieņemamu iekļaušanai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datubāzē saskaņā ar 33. punktu;
-paralēlās pozitīvās kontroles (sk. 24. punktu) inducē atbildreakcijas, kas atbilst tām, kuras ģenerētas vēsturiskajā pozitīvo kontroļu datubāzē iekļautajās kontrolēs, un izsaka statistiski ievērojamu pieaugumu salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli;
-testēšana notikusi ar diviem eksperimentēšanas nosacījumiem (t.i., ar metabolisko aktivāciju un bez tās), ja vien vienā no tiem rezultāti nav bijuši pozitīvi (sk. 25. punktu);
-šūnas un koncentrācijas bijušas analizējamas pietiekamā skaitā (25., 26. un 19. punkts);
-maksimālās koncentrācijas izraudzīšanās kritēriji atbilst 20., 21. un 22. punktā aprakstītajam.
Rezultātu izvērtēšana un interpretēšana
39.Ja visi pieņemamības kritēriji ir izpildīti, testējamo ķimikāliju par viennozīmīgi pozitīvu uzskata tad, ja ar kādu no izvērtētajiem eksperimentēšanas nosacījumiem:
-vismaz vienai no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums;
-šo palielinājumu izvērtējot ar attiecīgu trenda testu, konstatējams, ka tas saistīts ar devu;
-kāds no rezultātiem ir ārpus vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma (piem., ārpus 95 % kontrolrobežām Puasona sadalījumā; sk. 33. punktu).
Ja visi šie kritēriji ir izpildīti, šajā testēšanas sistēmā uzskata, ka testējamā ķimikālija kultivētās zīdītāju šūnās spēj izraisīt gēnu mutācijas. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm atrodami literatūrā (46) (48).
40.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju par viennozīmīgi negatīvu uzskata tad, ja ne ar vieniem no izvērtētajiem eksperimentēšanas nosacījumiem:
-ne ar vienu no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli nav novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums;
-ar attiecīgu trenda testu nav konstatējams ar koncentrāciju saistīts palielinājums,
-visi rezultāti ir vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma robežās (piem., 95 % kontrolrobežās Puasona sadalījumā); sk. 33. punktu).
Tādā gadījumā šajā testa sistēmā uzskata, ka testējamā ķimikālija nespēj kultivētās zīdītāju šūnās izraisīt gēnu mutācijas.
41.Nepārprotami pozitīva vai negatīva atbildreakcija nav obligāti jāverificē.
42.Ja atbildreakcija nav atbilstoši iepriekš rakstītajam nedz nepārprotami negatīva, nedz nepārprotami pozitīva vai lai varētu labāk noteikt rezultāta bioloģisko relevantumu, šie dati jāizvērtē ekspertam un/vai jāturpina pētīt. Var būt lietderīgi izdarīt atkārtotu eksperimentu ar modificētiem nosacījumiem (piem., koncentrāciju intervāls, atšķirīgi metaboliskās aktivācijas nosacījumi (proti, S9 koncentrācija vai S9 avots]).
43.Retos gadījumos datu kopums pat pēc sīkākas izpētes neļauj izdarīt secinājumu par pozitīviem vai negatīviem rezultātiem. Tāpēc būtu jāsecina, ka testējamās ķimikālijas atbildreakcija bijusi neskaidra (to vienlīdz varbūtīgi ir interpretēt gan kā pozitīvu, gan kā negatīvu).
Testēšanas pārskats
44.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija:
-avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams;
-pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināms;
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināms;
-pH, osmolalitātes un nogulšņu mērījums barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota (attiecīgā gadījumā).
Vienkomponenta viela:
- izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;
-ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.
Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:
-iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
Šķīdinātājs:
-šķīdinātāja izraudzīšanās pamatojums;
-šķīdinātāja īpatsvars galīgajā kultūras barotnē.
Šūnas:
attiecībā uz laboratorijas pamatkultūrām:
-kultūru tips, šūnu līniju avots;
-pasāžu skaits, ja uzzināms, un to vēsture attiecīgajā laboratorijā;
-kariotipiskās īpašības un/vai modālais hromosomu skaits;
-šūnu kultūru audzēšanas metodes;
-mikoplazmas neesība;
-šūnu dubultošanās laiks.
Testa nosacījumi:
-koncentrāciju izvēles un kultūru skaita izraudzīšanās pamatojums, piem., citotoksicitātes dati un šķīdības ierobežojumi;
-barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija, mitruma līmenis;
-testējamās ķimikālijas koncentrācija, izteikta kā galīgā koncentrācija kultūras barotnē (piem., kultūras barotnes μg vai mg/ml vai mM);
-barotnē pievienotā šķīdinātāja un testējamās ķimikālijas koncentrācija (un/vai tilpums);
-inkubācijas temperatūra;
-inkubācijas laiks;
-apstrādes ilgums;
-šūnu blīvums apstrādes laikā;
-metaboliskās aktivācijas sistēmas veids un sastāvs (S9 avots, S9 maisījuma sagatavošanas metode, S9 maisījuma koncentrācija vai tilpums un S9 koncentrācija vai tilpums galīgajā barotnē, S9 kvalitātes kontroles);
-attiecībā uz katru no apstrādes nosacījumiem — pozitīvās un negatīvās kontroles vielas, galīgās koncentrācijas;
-fenotipiskās ekspresijas periods (norādot uzsēto šūnu skaitu, subkultūras un attiecīgā gadījumā barošanas grafiku);
-selektīvā līdzekļa identitāte un koncentrācija;
-testu pieņemamības kritēriji;
-dzīvotspējīgo šūnu un mutantšūnu skaitīšanas metodes;
-citotoksicitātes mērīšanas metodes;
-jebkāda citotoksicitātei un izmantotajai metodei relevanta papildinformācija;
-inkubācijas laiks pēc uzsēšanas;
-kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai pētījuma rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs;
-pH, osmolalitātes un izgulsnēšanās noteikšanai izmantotās metodes.
Rezultāti:
-par katru kultūru — apstrādāto šūnu un apakškultūrām izmantoto šūnu skaits;
-citotoksicitātes mērījumi un citi novērojumi, ja tādi ir;
-izgulsnēšanās pazīmes un noteikšanas laiks;
-selektīvā un neselektīvā barotnē uzsēto šūnu skaits;
-koloniju skaits neselektīvajā barotnē un rezistento koloniju skaits selektīvajā barotnē, saistītais mutantu biežums;
-ja iespējams, koncentrācijas–atbildreakcijas sakarība;
-paralēlās negatīvās (šķīdinātājs) un pozitīvās kontroles dati (koncentrācijas un šķīdinātāji);
-vēsturisko negatīvo (šķīdinātājs) un pozitīvo kontroļu dati ar diapazoniem, vidējām vērtībām, standartnovirzēm un ticamības intervālu (piem., 95 %), kā arī datu skaits;
-statistiskās analīzes (par atsevišķām kultūrām un attiecīgā gadījumā par apkopotiem replikātiem) un p-vērtības, ja tādas ir.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.
(2)Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.
(3)Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.
(4)Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.
(5)Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121-128.
(6)Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239.
(7)Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17-36.
(8)Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.
(9)Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.
(10)Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.
(11)Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.
(12)Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.
(13)Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 584 1–256.
(14)Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.
(15)Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.
(16)Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.
(17)Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101.
(18)Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.
(19)Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.
(20)Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.
(21)
Hsie
A. W.,
Recio
L.,
Katz
D. S.,
Lee
C. Q.,
Wagner
M., and
Schenley
R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.
(22)Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation).
(23)Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.
(24)Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.
(25)Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.
(26)Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.
(27)Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
(28)Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.
(29)Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.
(30)Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
(31)Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.
(32)Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.
(33)UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int.html].
(34)Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.
(35)O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.
(36)Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.
(37)Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.
(38)Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.
(39)OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Available upon request from the Organisation for Economic Cooperation and Development.
(40)Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.
(41)EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,
(42)USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Available at: [
https://federalregister.gov/a/2012-13774
].
(43)O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.
(44)
Chiewchanwit T
.,
Ma H
.,
El Zein R
.,
Hallberg L
., and
Au W.W
. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells.
Mutation, Res.
, 1335(2):121-8.
(45)Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.
(46)OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(47)Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
(48)Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.
1. papildinājums
DEFINĪCIJAS
Bāzu pāru maiņas mutagēni: ķimikālijas, kas izraisa DNS bāzu pāru maiņu.
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Klonēšanās efektivitāte: to zemā blīvumā uzsēto šūnu procents, no kurām var izaugt pieskaitāma kolonija.
Koncentrācijas: testējamās ķimikālijas galīgās koncentrācijas kultūras barotnē.
Citotoksicitāte: attiecībā uz testiem, ko aptver šī testēšanas metode, citotoksicitāte ir apstrādāto šūnu relatīvās izdzīvotības samazinājums salīdzinājumā ar negatīvo kontroli (sk. attiecīgo punktu).
Turpvērsta mutācija: tāda gēna mutācija no vecāktipa uz mutantformu, kura maina vai izdzēš iekodētā proteīna fermentatīvo darbību vai tā funkciju.
Nolasīšanas fāzes nobīdes mutagēni: ķimikālijas, kas DNS molekulā izraisa viena vai vairāku bāzu pāru pievienošanos vai izzušanu.
Genotoksisks: vispārīgs termins, kas aptver visu veidu bojājumus DNS vai hromosomās, arī DNS pārrāvumus, aduktus, pārkārtojumus, mutācijas, hromosomu aberācijas un aneiploīdiju. Ne visas genotoksiskās ietekmes rada mutācijas vai noturīgus hromosomu bojājumus.
HAT barotne: barotne, kuras sastāvā ir hipoksantīns, aminopterīns un timidīns un kuru izmanto Hprt mutantu attīrīšanai.
Mitotiska rekombinācija: mitozes laikā notiekoša homoloģisku hromatīdu rekombinācija, kuras rezultātā var inducēties DNS dubultpavedienu pārtraukumi vai zust heterozigotāte.
MPA barotne: barotne, kuras sastāvā ir ksantīns, adenīns, timidīns, aminopterīns un mikofenolskābe un kuru izmanto Xprt mutantu attīrīšanai.
Mutagēnisks: tāds, kas pārmantojami maina vienu vai vairākas DNS bāzu pāru sekvences gēnos vai hromosomu struktūru (hromosomu aberācijas).
Mutantu biežums (MF): konstatēto mutantu koloniju skaits, kas dalīts ar selektīvā barotnē uzsēto šūnu skaitu un pārrēķināts atbilstoši klonēšanās efektivitātei (vai dzīvotspējai) selekcijas laikā.
Fenotipiskās ekspresijas laiks: tas laiks pēc apstrādes, kad ģenētiskā pārmaiņa nostiprinās genomā un jebkādi līdzšinējie gēna produkti tiktāl izsīkst, ka mainās arī fenotipiskā pazīme.
Relatīvā izdzīvotība (RS): RS izmanto par apstrādes izraisītas citotoksicitātes mēru. RS ir tūlīt pēc apstrādes uzsētu šūnu klonēšanās efektivitāte (CE), kas pārrēķināta atbilstoši jebkādam šūnu zudumam apstrādes laikā, salīdzinājumā ar klonēšanās efektivitāti negatīvajās kontrolēs (tajās konstatēto izdzīvotību pieņem par 100 %).
Aknu S9 frakcijas: ar 9000g centrifugēta aknu homogenāta supernatants, t. i., jēlu aknu ekstrakts.
S9 maisījums: aknu S9 frakcijas un metaboliskajai fermentatīvajai darbībai nepieciešamo kofaktoru maisījums.
Šķīdinātāja kontrole: vispārīgs termins, ar ko definē kontroles kultūras, kuras saņem vienīgi testējamās ķimikālijas šķīdināšanai izmantoto šķīdinātāju.
Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
Neapstrādāta kontrole: kultūras, kuras neapstrādā (t. i., ne ar testējamo ķimikāliju, ne ar šķīdinātāju), bet ar kurām paralēli izdara tādas pašas manipulācijas kā ar kultūrām, kuras apstrādā ar testējamo ķimikāliju.
UVCB: ķīmiskas vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti un bioloģiski materiāli.
2. papildinājums
CITOTOKSICITĀTES UN MUTANTU BIEŽUMA NOTEIKŠANAS FORMULAS
Citotoksicitāti izvērtē pēc relatīvās izdzīvotības, proti, pēc to šūnu klonēšanās efektivitātes (CE), kuras tūlīt pēc apstrādes uzsētas uz platēm, CE koriģējot atbilstoši negatīvo kontroļu klonēšanās efektivitātei (kurām izdzīvotība ir 100 %), sk. RS formulu zemāk.
Koriģēto CE ar testējamo ķimikāliju apstrādātai kultūrai aprēķina šādi:
RS ar testējamo ķimikāliju apstrādātai kultūrai aprēķina šādi:
Mutantu biežums ir mutantu koloniju klonēšanās efektivitāte selektīvā barotnē, dalīta ar klonēšanās efektivitāti neselektīvā barotnē; abas efektivitātes mērītas vienai un tai pašai kultūrai selekcijas brīdī.
Ja klonēšanās efektivitātes noteikšanai izmanto plates:
CE = koloniju skaits / uz plates uzsēto šūnu skaits
Ja klonēšanās efektivitātes noteikšanai izmanto mikroiedobju plates:
Koloniju skaitu uz vienu mikroiedobju plates iedobi raksturo ar Puasona sadalījumu.
klonēšanās efektivitāte = -LnP(0) / vienā iedobē uzsēto šūnu skaits
-LnP(0) ir varbūtīgais tukšo iedobju skaits no apsēto iedobju skaita, un to apraksta ar formulu
LnP(0)= -Ln (tukšo iedobju skaits / apsēto iedobju skaits)”;
(3) Pielikuma B daļā B.22. nodaļu aizstāj ar šādu:
“B.22. GRAUZĒJU DOMINANTO LETĀLO MUTĀCIJU TESTS
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 478 (2016) aprakstītajam. Testēšanas metodes tiek pastāvīgi pārskatītas zinātnes sasniegumu, mainīgo regulatīvo prasību un dzīvnieku labturības apsvērumu gaismā. Šī modificētā testēšanas metodes versija atspoguļo vairāk nekā trīsdesmit gadu pieredzi šā testa veikšanā un šā testa potenciālu tikt integrētam vai kombinētam ar tādiem citiem toksiskuma testiem kā pētījumi par ontoģenētisko un reproduktīvo toksicitāti vai genotoksicitāti; tomēr šā testa ierobežojumu dēļ, kā arī tādēļ, ka tajā izmanto daudz dzīvnieku, to paredzēts izmantot nevis par primāru metodi, bet gan par papildu testēšanas metodi, kuru var izmantot tad, ja regulatīvās prasības neatstāj citu alternatīvu. Ja toksiskumu testē kombinēti, iespējams būtiski samazināt testos izlietoto dzīvnieku skaitu. ESAO nesen izstrādājusi dokumentu, kas īsi informē par ģenētiski toksikoloģisko testēšanu un sniedz pārskatu par jaunākajiem ESAO genotoksicitātes testēšanas vadlīnijas grozījumiem (1).
2.Dominanto letālo mutāciju (DL) testa nolūks ir izpētīt, vai ķimikālijas neizraisa mutācijas, kuru cēlonis ir hromosomu aberācijas dīgļšūnās. Dominanto letālo mutāciju tests genotoksicitātes novērtēšanai ir relevants arī tāpēc, ka, lai gan dažādām sugām in vivo metabolisms, farmakokinētika un DNS reparācijas procesi var atšķirties, šie faktori tomēr ir aktīvi un piedalās atbildreakcijā. DL mutācijas inducēšanās pēc tam, kad testa dzīvnieks eksponēts testējamai ķimikālijai, liecina, ka ķimikālija skārusi dīgļaudus.
3.DL mutācijas izraisa embrija vai augļa nāvi. DL mutācijas inducēšanās pēc tam, kad testa dzīvnieks eksponēts testējamai ķimikālijai, liecina, ka ķimikālija skārusi dīgļšūnas.
4.DL tests ir relevants beigupunkts cilvēka apdraudējuma un pa dīgļlīniju nodotu ģenētisku slimību riska prognozēšanā un noder tam, lai ar somatisku in vivo beigupunktu palīdzību apstiprinātu pozitīvus testu rezultātus. Tomēr šim testam vajag daudz dzīvnieku un tas ir darbietilpīgs; tāpēc tā veikšana ir ļoti dārga un patērē daudz laika. Tā kā dominantu letālu mutāciju spontānais biežums ir diezgan augsts, šā testa jutīgums nelielu mutāciju biežuma palielinājumu detektēšanā parasti ir ierobežots.
5.Galveno terminu definīcijas sniegtas 1. papildinājumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI
6.Šo testu visbiežāk izdara ar pelēm (2) (3) (4), taču dažos gadījumos, ja tas zinātniski pamatoti, var būt lietderīgi izmantot tādas citas sugas kā žurka (5) (6) (7) (8). Parasti DL ir lielu hromosomālu aberāciju (strukturālu un skaitlisku anomāliju) rezultāts (9) (10) (11), taču nevar izslēgt gēnu mutācijas. DL mutācija ir tāda tieši dīgļšūnā radusies vai agrīnā embrijā pēc apaugļošanas konstatēta mutācija, kura neizraisa gametas disfunkciju, bet ir apaugļotajai olšūnai vai augošajam embrijam letāla.
7.Atsevišķus tēviņus attiecīgos intervālos secīgi pāro ar iepriekš nepārotām mātītēm. Pēc apstrādes notikušo pārošanās reižu skaits ir atkarīgs no DL pētījuma galanolūka (23. punkts), un tam jābūt tādam, lai būtu drošība, ka attiecībā uz DL ir izvērtētas visas vīrišķo dīgļšūnu nobriešanas fāzes (12).
8.Ja ir pierādījumi, ka testējamā ķimikālija vai tās metabolīts vai metabolīti sēkliniekos nenokļūs, šo testu izmantot nav lietderīgi.
TESTA PRINCIPS
9.Parasti tēviņus attiecīgā ekspozīcijas ceļā eksponē testējamai ķimikālijai un pāro ar neapstrādātām iepriekš nepārotām mātītēm. Izmantojot secīgus pārošanas intervālus, var testēt dažādu tipu dīgļšūnas. Kad pēc pārošanas pagājis attiecīgs laiks, mātītes eitanazē un tām izpēta dzemdi, lai noteiktu implantējušos augļu un nedzīvo un dzīvo embriju skaitu. Testējamas ķimikālijas dominanto letalitāti nosaka, dzīvo implantējušos augļu skaitu uz vienu mātīti apstrādātajā grupā salīdzinot ar dzīvo implantējušos augļu skaitu uz vienu mātīti nesēja/šķīdinātāja kontrolgrupā. Pārsvars, kāds nedzīvo implantējušos augļu skaitam uz vienu mātīti apstrādātajā grupā ir pār nedzīvo implantējušos augļu skaitu uz vienu mātīti kontrolgrupā, atspoguļo testējamās ķimikālijas inducēto pēcimplantācijas zudumu. Pēcimplantācijas zudumu aprēķina, nosakot nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret implantējušos augļu kopskaitu apstrādātajā grupā un to salīdzinot ar nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret implantējušos augļu kopskaitu kontrolgrupā. Pirmsimplantācijas zudumu var aplēst, salīdzinot, kāds apstrādātajā grupā un kontrolgrupā ir dzelteno ķermeņu skaits mīnus implantējušos augļu kopskaits vai arī implantējušos augļu kopskaits uz vienu mātīti.
LABORATORIJAS KOMPETENCES VERIFICĒŠANA
10.Kompetence šā testa veikšanā jāpierāda, demonstrējot spēju reproducēt dominanto letālo mutāciju biežumu no publicētiem datiem (piem., (13) (14) (15) (16) (17) (18)) ar tādām pozitīvo kontroļu vielām (arī ja atbildreakcijas ir vājas) kā 1. tabulas sarakstā norādītās un ar nesēju kontrolēm un iegūstot negatīvo kontroļu biežumus, kas atbilst pieņemamam datu diapazonam 1 (sk. atsauces augstāk) vai laboratorijas vēsturisko kontroļu sadalījumam, ja tāds pieejams.
METODES APRAKSTS
Preparāti
Dzīvnieku sugas izraudzīšanās
11.Jāizmanto veseli dzimumnobrieduši tipisku laboratorijas celmu dzīvnieki. Parasti izmanto peles, bet var būt lietderīgi izmantot arī žurkas. Var izmantot arī jebkuras citas piemērotas sugas zīdītājus, ja vien pārskatā tas tiek zinātniski pamatots.
Dzīvnieku turēšanas un barošanas apstākļi
12.Attiecībā uz grauzējiem telpā, kurā tur eksperimenta dzīvniekus, jābūt 22 °C ( ± 3 °C) temperatūrai. Relatīvajam mitrumam ideālā gadījumā jābūt 50–60 %, bet katrā ziņā vismaz 40 % un, vēlams, ne augstākam par 70 %, izņemot telpu uzkopšanas laiku. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas — tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzirdināmajam ūdenim. Barības izvēli var ietekmēt vajadzība tai piemaisīt testējamo ķimikāliju, ja ķimikāliju ievada šādā ceļā. Pirms apstrādes vai pārošanas, ja netiek gaidīts vai novērots, ka grauzēji izturēsies agresīvi, tos ieteicams turēt mazās viendzimuma grupās (ne vairāk kā pa pieci), vēlams, būros ar cietu grīdu un ar attiecīgi bagātinātu vidi. Ja tas zinātniski pamatoti, dzīvniekus var turēt atsevišķi.
Dzīvnieku sagatavošana
13.Veselus un dzimumnobriedušus pieaugušus tēviņus un mātītes nejaušināti sadala kontrolgrupās un apstrādes grupās. Katru dzīvnieku unikālā veidā identificē, izmantojot humānu, minimāli invazīvu metodi (piem., apgredzenojot, izmantojot krotālijas, ievietojot mikroshēmu vai izmantojot biometrisko identificēšanu, bet ne apgriežot ausis vai pirkstus) un vismaz piecas dienas aklimatizē laboratorijas apstākļiem. Būrus izvieto tā, lai būru novietojuma varbūtējā ietekme būtu iespējami maza. Nedrīkst pieļaut pozitīvās kontroles un testējamās ķimikālijas šķērskontaminēšanos. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkst pārsniegt ±20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi.
Devu sagatavošana
14.Pirms dzīvniekiem dod devas, cietas testējamās ķimikālijas jāizšķīdina vai jāsuspendē attiecīgos šķīdinātājos vai nesējos vai jāpievieno uzturam vai dzirdināmajam ūdenim. Šķidras testējamās ķimikālijas var dot tādas pašas vai pirms devu došanas atšķaidīt. Inhalatīvas ekspozīcijas vajadzībām testējamās ķimikālijas atkarībā no to fizikālķīmiskajām īpašībām var būt gāzes, tvaiku vai cietu/šķidru daļiņu aerosola veidā. Ja vien dati par testējamās ķimikālijas preparātu stabilitāti neliecina, ka tos var uzglabāt, un nav noteikti pareizi glabāšanas nosacījumi, jāizmanto svaigi pagatavoti preparāti.
Testa nosacījumi
Šķīdinātājs/nesējs
15.Lietotajās devās šķīdinātājam vai nesējam nedrīkst būt toksiskas ietekmes un nedrīkst būt aizdomas, ka tas spēj reaģēt ar testējamo ķimikāliju. Citu, mazāk izplatītu šķīdinātāju vai nesēju izmantošana jāpamato ar atsauces datiem par to saderību. Ieteicams vienmēr, kad vien iespējams, vispirms apsvērt, vai neizmantot šķīdinātāju vai nesēju uz ūdens bāzes. Plaši izmantoti saderīgi šķīdinātāji/nesēji ir, piem., ūdens, fizioloģiskais šķīdums, metilcelulozes šķīdums, karboksimetilcelulozes nātrija sāls šķīdums, olīveļļa un kukurūzas eļļa.
Pozitīvās kontroles
16.Būtu vienmēr jāizmanto paralēlas pozitīvas kontroles dzīvnieki, ja vien laboratorija nav apliecinājusi kompetenci testa veikšanā un vēl nesen (piem., pēdējo piecu gadu laikā) testu izmantojusi regulāri. Tomēr pozitīvās kontroles dzīvnieki nav jāapstrādā tādā pašā apstrādes ceļā kā dzīvnieki, kas saņem testējamo ķimikāliju; nav arī jāņem paraugi no visiem pārošanas intervāliem. Pozitīvās kontroles vielām jābūt tādām, par kurām zināms, ka testam izmantotajos apstākļos tās rada DL. Izņemot apstrādi, ar kontrolgrupu dzīvniekiem jārīkojas tieši tāpat kā ar apstrādāto grupu dzīvniekiem.
17.Pozitīvās kontroles vielu devas jāizraugās tā, lai tās konsekventi radītu pozitīvu ietekmi, kura izpaužas kā dominantas letālas mutācijas, taču lai šī ietekme būtu vāja vai vidēja, tādējādi paverot iespēju kritiski izvērtēt testa veiktspēju un jutīgumu. Pozitīvās kontroles vielu un attiecīgu devu piemēri sniegti 1. tabulā.
1. tabula. Pozitīvās kontroles vielu piemēri
|
Viela [CAS Nr.]
(atsauces Nr.)
|
Iedarbīgo devu diapazons (mg/kg)
(grauzēju suga)
|
Devu došanas laiks (dienas)
|
|
Trietilēnmelamīns [51-18-3] (15)
|
0,25 (pelēm)
|
1
|
|
Ciklofosfamīds [50-18-0] (19)
|
50–150 (pelēm)
|
5
|
|
Ciklofosfamīds [50-18-0] (5)
|
25–100 (žurkām)
|
1
|
|
Etilmetānsulfonāts [62-50-0] (13)
|
100–300 (pelēm)
|
5
|
|
Monomērakrilamīds [79-06-1] (17)
|
50 (pelēm)
|
5
|
|
Hlorambucils [305-03-3] (14)
|
25 (pelēm)
|
1
|
Negatīvās kontroles
18.Katrā paraugošanas reizē jābūt arī negatīvās kontroles dzīvniekiem, ko apstrādā tikai ar šķīdinātāju vai nesēju, bet pārējās darbības izdara tāpat kā ar grupām, kam dotas devas (20). Ja nav vēsturisku vai publicētu kontroldatu, kas liecinātu, ka izraudzītais šķīdinātājs/nesējs neierosina DL vai citu kaitīgu iedarbību, katrā paraugošanas reizē jābūt arī neapstrādātiem kontroldzīvniekiem, lai varētu konstatēt, cik pieņemami ir nesēju izmantot par kontrolvielu.
PROCEDŪRA
Dzīvnieku skaits
19.Atsevišķus tēviņus attiecīgos iepriekš noteiktos intervālos (piem., ar nedēļas intervālu, 21. un 23. punkts) secīgi pāro ar, vēlams, vienu atsevišķu iepriekš nepārotu mātīti. Tēviņu skaits grupā būtu iepriekš jānosaka tā, lai ar to pietiktu (kombinācijā ar katrā pārošanas intervālā pāroto mātīšu skaitu) tādas statistiskas jaudas iegūšanai, kāda vajadzīga, lai detektētu, ka DL biežums vismaz dubultojas (44. punkts).
20.Ar statistiskās jaudas aprēķiniem būtu iepriekš jānosaka, ar kādu mātīšu skaitu uz vienu pārošanas intervālu būs iespējams detektēt, ka DL biežums vismaz dubultojas (proti, tikdaudz grūsnu mātīšu, lai būtu iegūti vismaz 400 implantējušies augļi) (20) (21) (22) (23) un lai būtu gaidāms vismaz viens nedzīvs implantējies auglis uz analizējamo vienību (t.i. vienai devai atbilstošo pārošanas grupu) (24).
Devu došanas periods un pārošanas intervāli
21.Pārošanas intervālu skaits pēc apstrādes ir atkarīgs no apstrādes grafika un ar to būtu jānodrošina, ka attiecībā uz DL inducēšanos jāizvērtē visas vīrišķo dīgļšūnu nobriešanas fāzes (12) (25). Kas attiecas uz vienu apstrādi, proti, līdz piecām devu došanas reizēm dienā, ir ieteicams, lai pēc pēdējās apstrādes ar nedēļu ilgiem intervāliem notiktu 8 (peļu) vai 10 (žurku) pārošanās. Ja devu došanas reizes ir vairākas, proporcionāli devu došanas perioda paildzināšanai var samazināt pārošanas intervālu skaitu, taču saglabājot mērķi izvērtēt visas spermatoģenēzes fāzes (piem., ja eksponēšana ilgusi 28 dienas, peļu gadījumā visu spermatoģenēzes fāžu izvērtēšanai pietiek tikai ar 4 pārošanas reizēm nedēļā). Visi apstrādes un pārošanas grafiki būtu zinātniski jāpamato.
22.Mātītes būtu jāatstāj kopā ar tēviņiem vismaz vienu estrālo ciklu (piem., gan pelēm, gan žurkām vienu estrālo ciklu aptver viena nedēļa). Mātītes, kas kādā nedēļu ilgā intervālā nav pārojušās, var izmantot vēlākam pārošanas intervālam. Tās var arī atstāt, līdz pārošanās notikusi, par ko liecina sperma vagīnā vai vagināla korķa esība.
23.Izmantotā ekspozīcija un pārošanas režīms ir atkarīgi no DL pētījuma galanolūka. Ja mērķis ir noteikt, vai kāda konkrēta ķimikālija pati par sevi inducē DL mutācijas, atzīts paņēmiens ir eksponēt dzīvniekus visā spermatoģenēzes ciklā (piem., pelei 7 nedēļas, 5–7 apstrādes nedēļā) un pārot tos vienreiz tā noslēgumā. Tomēr, ja mērķis ir apzināt pret DL inducēšanos jutīgo dīgļšūnu tipu, priekšroka dodama vienreizējai vai piecas dienas ilgai ekspozīcijai, kam seko pārošana reizi nedēļā.
Devu līmeņi
24.Iepriekšējs diapazona noteikšanas pētījums, kas jāizdara tāpēc, ka nav devas izvēlei piemērotu datu, jāveic tajā pašā laboratorijā, izmantojot to pašu sugu, celmu, dzimumu un apstrādes režīmu, kas tiks izmantoti galvenajā testā (26). Pētījuma mērķim jābūt noskaidrot maksimālo panesamo devu (MTD), kas ir lielākā pieļaujamā deva, kura pētījuma ilgumam atbilstošā laikā ir panesama bez pētījumu ierobežojošu toksiskuma pazīmju izraisīšanas (piem., inducē anormālu izturēšanos vai reakcijas, nelielu ķermeņa masas samazināšanos vai citotoksicitāti hematopoētiskajā sistēmā, bet neizraisa nāvi vai tādas sāpju, ciešanu vai diskomforta pazīmes, kā dēļ būtu humāni jāizdara eitanāzija (27)).
25.MTD arī nedrīkst nelabvēlīgi ietekmēt pārošanās rezultativitāti (21).
26.Testējamās ķimikālijas, kuras zemā netoksiskā devā iedarbojas bioloģiski specifiski (tādas kā hormoni un mitogēni), un ķimikālijas, kurām ir ļoti izteiktas toksikokinētiskās īpašības, var būt šo devu noteikšanas kritēriju izņēmumi un tātad attiecībā uz devām var būt jānovērtē atsevišķi.
27.Lai iegūtu informāciju par devas–atbildreakcijas sakarību, pilnīgā pētījumā jāiekļauj negatīva kontrolgrupa un vismaz trīs devu līmeņi, kuru atstatuma koeficients parasti ir 2, bet nepārsniedz 4. Ja testējamai ķimikālijai diapazona noteikšanas pētījumā toksiskums neizpaužas vai ķimikālijas toksiskums neizpaužas uz esošo datu pamata, lielākajai vienreizējai devai jābūt 2000 mg uz kg ķermeņa masas. Ja testējamai ķimikālijai toksiskums tomēr izpaužas, MTD jābūt augstākajai ievadītajai devai un izmantotajiem devu līmeņiem būtu jāaptver diapazons no maksimālās devas līdz devai, kas ir maztoksiska vai netoksiska. Attiecībā uz netoksiskām ķimikālijām robeždeva devu došanas periodam 14 dienas vai vairāk ir 100 mg uz kg ķermeņa masas dienā, bet devu došanas periodiem, kas nesasniedz 14 dienas, — 2000 mg uz kg ķermeņa masas dienā.
Devu došana
28.Testi jāplāno, ņemot vērā iespējamo cilvēka ekspozīcijas ceļu. Kā pamatotus var izraudzīties dažādus ekspozīcijas ceļus, piem., ar uzturu, ar dzirdināmo ūdeni, ievadīšanu zemādas audos, intravenozu ievadīšanu, vietēju aplikāciju, ieelpošanu, perorālu uzņemšanu (ar gavāžu) vai implantāciju. Jebkurā gadījumā ceļš jāizraugās tā, lai mērķaudiem nodrošinātu pietiekamu ekspozīciju. Parasti nav ieteicama intraperitoneāla injekcija, jo cilvēkam šāds ekspozīcijas ceļš nav raksturīgs, un tā būtu jāizmanto tikai ar konkrētu zinātnisko pamatojumu. Ja testējamo ķimikāliju piejauc barībai vai dzirdināmam ūdenim, jo īpaši vienreizējas devas gadījumā, jāgādā, lai starp pārtikas un ūdens patēriņu un pārošanu paietu pietiekami daudz laika, lai būtu iespējams detektēt ietekmes (sk. 31. punktu). Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt ar gavāžu vai injekciju, atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa masas, izņemot ūdens šķīdumus, kuru gadījumā var lietot ne vairāk kā 2 ml uz 100 g ķermeņa masas. Ja izmanto lielāku tilpumu (ja dzīvnieku labturības tiesību akti to atļauj), tas jāpamato. Testa tilpuma mainība būtu jāsamazina līdz minimumam, koncentrāciju koriģējot tā, lai visos devu līmeņos tilpuma attiecība pret ķermeņa masu saglabātos konstanta.
Novērojumi
29.Vismaz reizi dienā, vēlams — vienā un tajā pašā laikā vai laikos un ņemot vērā, kurā periodā pēc devu došanas gaidāms ietekmju maksimums, testa dzīvniekiem jāizdara vispārīgi klīniski novērojumi un jāreģistrē novērotās klīniskās pazīmes. Devas došanas periodā visus dzīvniekus vismaz divreiz dienā novēro attiecībā uz morbiditāti un mirstību. Visi dzīvnieki jānosver pētījuma sākumā, atkārtotas devas pētījumos pēc tam vismaz reizi nedēļā, kā arī eitanazēšanas brīdī. Vismaz reizi nedēļā jāmēra barības patēriņš. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar dzirdināmo ūdeni, ūdens patēriņš jāmēra katru reizi, kad ūdens tiek mainīts, un vismaz reizi nedēļā. Dzīvnieki, kam ar neletālām pazīmēm izpaužas pārlieks toksiskums, pirms testa perioda beigām būtu jāeitanazē (27).
Audu ievākšana un pārstrāde
30.Mātītes eitanazē otrajā grūtniecības pusē 13. grūsnības dienā (GD) pelēm un 14.–15. GD žurkām. Izmeklē dzemdi attiecībā uz dominantām letālām ietekmēm, nosakot implantējušos augļu skaitu, dzīvo un mirušo embriju skaitu un dzelteno ķermeņu skaitu.
31.Lai saskaitītu dzeltenos ķermeņus, atsedz dzemdes ragus un olnīcas; izņem, skaita un nosver augļus. Jāraugās, lai tiktu pamanītas rezorbcijas, ko var aizsegt dzīvi augļi; visas rezorbcijas jāuzskaita. Dokumentē augļu mirstību. Dokumentē arī veiksmīgi apaugļojušos mātīšu skaitu, kopējo implantāciju un pirmsimplantācijas zudumu skaitu, kā arī pēcimplantācijas mirstību (ieskaitot agrīnas un vēlīnas rezorbcijas gadījumus). Turklāt redzamos augļus var vismaz 2 nedēļas saglabāt Buina fiksācijas šķīdumā, fiksējot lielas ārējas kroplības (28) un tādējādi gūstot papildinformāciju par testējamā līdzekļa reproduktīvo un ontoģenētisko ietekmi.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Rezultātu apstrāde
32.Dati jāapkopo tabulā, norādot pāroto tēviņu skaitu, grūsno mātīšu skaitu, kā arī to mātīšu skaitu, kurām nav iestājusies grūtniecība. Katras pārošanās rezultāti līdz ar katra tēviņa un mātītes identitāti jāatspoguļo atsevišķi. Attiecībā uz katru mātīti jāreģistrē pārošanas intervāls, apstrādāto tēviņu devu līmenis un dzīvo un nedzīvo implantējušos augļu skaits.
33.Pēcimplantācijas zudumu aprēķina, nosakot nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret implantējušos augļu kopskaitu apstrādātajā grupā un to salīdzinot ar nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret augļu kopskaitu nesēja/šķīdinātāja kontrolgrupā.
34.Pirmsimplantācijas zudumu var aprēķināt pēc dzelteno ķermeņu un implantējušos augļu skaita starpības vai pēc implantējušos augļu vidējā skaita samazinājuma vienā dzemdē salīdzinājumā ar kontroles dzīvnieku pārošanās rezultātiem. Ja aplēš pirmsimplantācijas zudumu, tas jānorāda ziņojumā.
35.Dominanto letālo koeficientu aplēš šādi: (nāves gadījumi pēc implantācijas / kopējās implantācijas uz vienu mātīti) x 100.
36.Pārskatā jāatspoguļo 29. punktā minētie toksiskuma un klīnisko pazīmju dati.
Pieņemamības kritēriji
37.Testa pieņemamību nosaka, pamatojoties uz šādiem kritērijiem:
-paralēlā negatīvā kontrole atbilst publicētajām vēsturisko negatīvo kontroļu datu normām un laboratorijas vēsturiskajiem kontroļu datiem, ja tādi ir (sk. 10. un 18. punktu);
-paralēlās pozitīvās kontroles inducētā reakcija atbilst publicētajām vēsturisko pozitīvo kontroļu datu normām vai laboratorijas vēsturisko pozitīvo kontroļu datubāzei, ja tāda ir, un salīdzinājumā ar negatīvajām kontrolēm ir iegūts statistiski būtisks palielinājums (sk. 17. un 18. punktu);
-ir izanalizēts pietiekams kopējo implantējušos augļu un devu skaits (20. punkts);
-maksimālās devas izraudzīšanās kritēriji atbilst 24. un 27. punktā aprakstītajiem.
Rezultātu izvērtēšana un interpretēšana
38.Lai iegūtu devas un atbildreakcijas izanalizēšanai pietiekamus datus, jāizanalizē vismaz trīs grupas, kas saņēmušas devas.
39.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi pozitīvu, ja:
-vismaz vienai no testa devām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,
-attiecībā uz vismaz vienu no eksperimenta nosacījumiem (piem., pārošanas intervāls viena nedēļa) palielinājums, to attiecīgā testā izvērtējot, ir saistīts ar devu un
-kāds no iegūtajiem rezultātiem ir ārpus pieņemamā negatīvo kontroļu datu diapazona vai ārpus laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma (piem., ārpus 95 % kontrolrobežām Puasona sadalījumā), ja tāds pieejams.
Šajā gadījumā tiek uzskatīts, ka testējamā ķimikālija testa dzīvnieku dīgļšūnās spēj inducēt dominantas letālas mutācijas. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm sniegti 44. punktā, citas ieteicamas statistiskas pieejas var atrast arī literatūrā (20) (21) (22) (24) (29). Izmantotajos statistiskajos testos par eksperimenta vienību jāuzskata dzīvnieks.
40.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi negatīvu, ja:
-ne ar vienu no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli nav novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,
-ne ar vienu no eksperimenta nosacījumiem nav novērojams ar devu saistīts palielinājums un
-visi rezultāti ir pieņemamajā negatīvo kontroļu datu vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu (ja tādi pieejami) diapazonā (piem., 95 % kontrolrobežās Puasona sadalījumā).
Šajā gadījumā tiek uzskatīts, ka testējamā ķimikālija testa dzīvnieku dīgļšūnās nespēj inducēt dominantas letālas mutācijas.
41.Nepārprotami pozitīva vai nepārprotami negatīva atbildreakcija nav jāverificē.
42.Ja atbildreakcija nav viennozīmīgi negatīva vai viennozīmīgi pozitīva un lai varētu vieglāk noskaidrot kāda rezultāta bioloģisko nozīmīgumu (piem., neizteikts palielinājums vai robežgadījums), dati būtu jāizvērtē, izmantojot ekspertu spriedumus un/vai tālāku izmeklēšanu, kurā izmanto jau esošos eksperimentu datus, piem., spriež, vai pozitīvais rezultāts ir ārpus negatīvo kontroļu datu vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu pieņemamības diapazona (30).
43.Retos gadījumos pat pēc sīkākas izskatīšanas datu kopums neļauj secināt, vai testējamā ķimikālija rada pozitīvus vai negatīvus rezultātus, un tad uzskata, ka rezultāti ir neskaidri.
44.Izmantotajos statistiskajos testos par eksperimenta vienību ieteicams uzskatīt tēviņu. Lai gan skaitīšanas datu (piem., implantējušos augļu skaits uz vienu mātīti) sadalījums var būt pēc Puasona, un/vai īpatsvara (piem., nedzīvo implantējušos augļu procentuālās daļas) sadalījums var būt binomiāls, tomēr bieži gadās, ka šādiem datiem ir palielināta dispersija (31). Tātad statistiskajā analīzē vispirms, izmantojot tādus dispersijas testus kā Kokrana binomiālās mainības tests (32) vai Tarona C(α) tests binomiālās palielinātās dispersijas noteikšanai, vajadzētu testēt, vai dispersija nav palielināta / nepietiekama(31) (33). Ja nekonstatē novirzi no binomiālā sadalījuma, pa devu līmeņiem proporcionālas tendences var testēt ar Kokrana–Ārmitidža tendenčtestu (34), savukārt pārveida salīdzinājumus ar kontrolgrupu — ar Fišera precīzo testu (35). Līdzīgi, nekonstatējot novirzi no Puasona sadalījuma, var ar Puasona regresijas metodi (36) testēt skaitījuma tendences, bet pārveida salīdzinājumus ar kontrolgrupu — Puasona modeļa kontekstā, izmantojot pāru kontrastus (36). Ja konstatē būtiski palielinātu vai pazeminātu dispersiju, ieteicams izmantot neparametriskas metodes (23) (31). Pie tām pieder tādi ranžējoši testi kā Džonkhīra–Terpstras tendenčtests (37) un Manna–Vitnija testi (38) pārveida salīdzinājumiem ar nesēja/šķīdinātāja kontroles grupu, kā arī permutāciju testi, atkārtotu paraugošanu testi vai bootstrap testi tendenču konstatēšanai un pārveida salīdzinājumiem ar kontrolgrupu (31) (39).
45.Pozitīvi DL testa rezultāti liecina, ka testējamā ķimikālija devu saņēmuša testētās sugas tēviņa dīgļšūnām ir genotoksiska.
46.Apsverot, vai novērotās vērtības ir vēsturiskā kontroles diapazona robežās vai ārpus tām, var iegūt pieturas punktus atbildreakcijas bioloģiskā nozīmīguma izvērtēšanai (40).
Testēšanas pārskats
47.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Kopsavilkums
Testējamā ķimikālija:
-avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams;
-pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināma;
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināmas;
-pH, osmolalitātes un nogulšņu mērījums barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota (attiecīgā gadījumā).
Vienkomponenta viela:
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;
-ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.
Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:
-iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un sastāvdaļu relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
Testējamās ķimikālijas sagatavošana:
-nesēja izraudzīšanās pamatojums;
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināmas;
-barības, dzirdināmā ūdens vai inhalācijas preparātu sagatavošana;
-preparātu analītiska noteikšana (piem., stabilitāte, homogenitāte, nominālās koncentrācijas), ja tāda veikta.
Testa dzīvnieki:
-izmantotā suga/līnija un izraudzīšanās pamatojums;
-dzīvnieku skaits, vecums un dzimums;
-avots, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.;
-dzīvnieku unikālās identificēšanas metode;
-īslaicīgiem pētījumiem: tēviņu individuālā masa testa sākumā un beigās; par nedēļu ilgākiem pētījumiem: individuālā masa pētījuma laikā un barības patēriņš. Norāda katras grupas dzīvnieku ķermeņa masas diapazonu, vidējo vērtību un standartnovirzi.
Testēšanas nosacījumi:
-pozitīvās un negatīvās (nesēja/šķīdinātāja) kontroles dati;
-devu diapazona noteikšanas pētījuma dati;
-devu līmeņa izraudzīšanās pamatojums;
-detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas sagatavošanu;
-detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas devu došanu;
-ievadīšanas ceļa izraudzīšanās pamatojums;
-metodes, ar kādām mēra testējamās vielas toksiskumu dzīvniekiem, ja tādas ir, arī histopatoloģiskas vai hematoloģiskas analīzes un dzīvnieku novērošanas un svēršanas biežums;
-ja rezultāti ir negatīvi, ar kādām metodēm verificēts, ka testējamā ķimikālija nonākusi mērķaudos vai vispārējā asinsritē;
-faktiskā deva (mg uz kg ķermeņa masas dienā), kas aprēķināta pēc testējamās ķimikālijas koncentrācijas (ppm) barībā / dzirdināmajā ūdenī un pēc uzņemtā daudzuma (attiecīgā gadījumā);
-detalizēta informācija par barības un ūdens kvalitāti;
-detalizēta informācija par krātiņa vides bagātinājumu;
-detalizēts apstrādes un paraugošanas grafiku apraksts un izraudzīšanās pamatojums;
-atsāpināšanas metode;
-eitanāzijas metode;
-audu izolēšanas un saglabāšanas procedūras;
-visu komplektu un reaģentu avots un sērijas numuri (attiecīgā gadījumā);
-DL skaitīšanas metodes;
-pārošanas grafiks;
-pārošanas veiksmīguma noteikšanas metode;
-eitanazēšanas laiks;
-DL ietekmju novērtējuma atzīmju kritēriji, ieskaitot dzelteno ķermeni, implantācijas gadījumus, rezorpcijas gadījumus un pirmsimplantācijas zudumus, dzīvos implantējušos augļus, nedzīvos implantējušos augļus.
Rezultāti:
-dzīvnieka stāvoklis pirms testa perioda un tā laikā, arī toksiskuma pazīmes;
-tēviņu ķermeņa masa devu došanas un pārošanas periodos;
-pāroto mātīšu skaits;
-ja iespējams, devas–atbildreakcijas sakarība;
-tagadējie un vēsturiskie negatīvas kontroles dati ar diapazoniem, vidējām vērtībām un standartnovirzēm;
-tagadējie pozitīvās kontroles dati;
-tabulā apkopoti dati par katru mātīti, arī: dzelteno ķermeņu skaits katrai mātītei; implantāciju skaits katrai mātītei; resorpcijas gadījumu un pirmsimplantēšanās bojāejas gadījumu skaits katrai mātītei; dzīvo implantējušos augļu skaits katrai mātītei; nedzīvo implantējušos augļu skaits katrai mātītei; augļu svars;
-augstāk minēto datu summa par katru pārošanas periodu un devu, norādot dominanto letālo mutāciju biežumu;
-izmantotā statistiskā analīze un metodes.
Rezultātu iztirzājums
Secinājums.
LITERATŪRA
(1)OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.
(2)Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam
(3)Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J. , Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group “Dominant lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185
(4)Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167.
(5)Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.
(6)Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.
(7)Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.
(8)Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.
(9)Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.
(10)Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.
(11)Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.
(12)Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.
(13)Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27.
(14)Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.
(15)Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.
(16)James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.
(17)Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.
(18)Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.
(19)Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 129-156.
(20)Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.
(21)Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.
(22)Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.
(23)Haseman J.K. and Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.
(24)Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.
(25)Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417429.
(26)Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.
(27)OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(28)Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.
(29)Kirkland D.J., (Ed.)(1989) . Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.
(30)Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). “Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87-90.
(31)Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.
(32)Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.
(33)Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.
(34)Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York.
(35)Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).
(36)Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston
(37)Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.
(38)Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York
(39)Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.
(40)Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.
1. papildinājums
DEFINĪCIJAS
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Dzeltenais ķermenis: hormonus izdalošs veidojums, kas olnīcā izveidojies olšūnas pamesta folikula vietā. Dzelteno ķermeņu skaits olnīcās atbilst ovulējušo olšūnu skaitam.
Dominanta letāla mutācija: mutācija, kas notiek dīgļšūnā vai nostiprinās pēc apaugļošanās un izraisa embrija vai augļa nāvi.
Auglības koeficients: pāroto grūsno mātīšu skaits uz visu pāroto mātīšu skaitu.
Pārošanas intervāls: laiks starp ekspozīcijas beigām un apstrādātu tēviņu pārošanu. Kontrolējot šo intervālu, iespējams izvērtēt ķimikāliju ietekmi uz dažādu tipu dīgļšūnām. Pelēm, kuras pāro 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. un 8. nedēļā pēc ekspozīcijas beigām, tiek mērīta ietekme uz spermu, kondensētajiem spermatīdiem, apaļajiem spermatīdiem, pahitēnas spermatocītiem, agrīnajiem spermatocītiem, spermatogonijiem, kas diferencējušies, spermatogonijiem, kas diferencējas, un dīgļšūnu spermatogonijiem.
Pirmsimplantācijas zudums: dzelteno ķermeņu un implantējušos augļu skaita starpība. To var aplēst, arī salīdzinot kopējo implantējušos augļu skaitu uz vienu mātīti devu grupās un kontroles grupās.
Pēcimplantācijas zudums: nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecība apstrādātajā grupā salīdzinājumā ar nedzīvo implantējušos augļu skaita attiecību pret implantējušos augļu kopskaitu kontrolgrupā.
Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
UVCB: ķīmiska viela, kuras sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kura ir komplekss reakcijas produkts vai bioloģisks materiāls.
2. papildinājums
ZĪDĪTĀJU SPERMATOGENĒZES LAIKI
1. attēls: Peļu, žurku un cilvēka vīrišķo dīgļšūnu attīstības ilguma (dienās) salīdzinājums. Ar ēnojumu iezīmētajos periodos nenotiek DNS reparācija.
Augstāk sniegts peļu, žurku un cilvēka spermatogenēzes shematisks attēls (avots Adler, 1996). Pie spermatogonijiem, kas diferencējušies, pieder: A atsevišķie; A sapārotie; A sarindotie spermatogoniji (Hess and de Franca, 2008). Par īstajām cilmes šūnām uzskata A atsevišķos spermatogonijus; tāpēc, lai novērtētu ietekmi uz cilmes šūnām, no testējamās ķimikālijas pēdējās injekcijas līdz pārošanai jāpaiet vismaz 49 dienām.
Atsauces
Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.
Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.”;
(4) Pielikuma B daļā B.23. nodaļu aizstāj ar šādu:
“B.23. ZĪDĪTĀJU SPERMATOGONIJU HROMOSOMU ABERĀCIJU TESTS
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 483 (2016) aprakstītajam. Testēšanas metodes tiek pastāvīgi pārskatītas zinātnes sasniegumu, mainīgo regulatīvo prasību un dzīvnieku labturības apsvērumu gaismā. Šis modificētais testēšanas metodes variants atspoguļo ilggadēju pieredzi šā testa veikšanā un šā testa potenciālu tikt integrētam vai kombinētam ar citiem toksiskuma vai genotoksicitātes pētījumiem. Ja toksiskumu testē kombinēti, iespējams būtiski samazināt testos izlietoto dzīvnieku skaitu. Šī testēšanas metode pieder pie ģenētiski toksikoloģiskās testēšanas metožu sērijas. ESAO nesen izstrādājusi dokumentu, kas īsi informē par ģenētiski toksikoloģisko testēšanu un sniedz pārskatu par neseniem ESAO genotoksicitātes testēšanas vadlīnijas grozījumiem (1).
2.Zīdītāju spermatogoniju hromosomu aberāciju in vivo testā nosaka vielas, kas zīdītāju spermatogonijos rada strukturālas hromosomu aberācijas (1) (2) (3) (4) (5). Dominanto letālo mutāciju tests genotoksicitātes novērtēšanai ir relevants arī tāpēc, ka dažādām sugām in vivo metabolisms, farmakokinētika un DNS reparācijas procesi gan var atšķirties, tomēr šie faktori ir aktīvi un piedalās atbildreakcijā. Šī testēšanas metode nav izstrādāta skaitlisku anomāliju mērīšanai; šo testu tam parasti neizmanto.
3.Šis tests mēra strukturālas hromosomu aberācijas (gan hromosomtipa, gan hromatīdtipa) spermatogoniju dīgļšūnu dalīšanās procesā un tātad gaidāms, ka tas spēj prognozēt pārmantojamu mutāciju inducēšanos šajās dīgļšūnās.
4.Galveno terminu definīcijas sniegtas papildinājumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI
5.Šajā testā parasti izmanto grauzējus, bet dažos gadījumos ir lietderīgi izmantot citas sugas, ja tas ir zinātniski pamatoti. Grauzēju sēklinieku citoģenētiskos standartpreparātos tiek ģenerēta mitotiska (spermatogoniji) un mejotiska (spermatocīti) metafāze. Balstoties uz hromosomu morfoloģiju, identificē mitotisko un mejotisko metafāzi (4). Šis citoģenētiskais in vivo tests detektē strukturālas hromosomu aberācijas spermatogoniju mitozē. Šai metodei nav citu mērķšūnu.
6.Lai spermatogoniju šūnās varētu detektēt hromatīdtipa aberācijas, pirms nākamajās šūnu dalīšanās reizēs šīs aberācijas pārvēršas par hromosomtipa aberācijām, jāizpēta pirmā mitotiskā šūnu dalīšanās pēc apstrādes. Papildu informāciju par apstrādātiem spermatocītiem var iegūt, diakinēzes I metafāzē un II metafāzē attiecībā uz strukturālām aberācijām analizējot mejotiskas hromosomas.
7.Sēkliniekos atrodas vairāku paaudžu spermatogoniji (5), un šo dažādo tipu dīgļšūnām jutība pret apstrādi ar kādu ķimikāliju var izpausties individuālā diapazonā. Tātad detektētās aberācijas ir apstrādāto spermatogoniju šūnu populāciju agregēta atbildreakcija. Sēklinieku preparātos lielākā daļa mitotisko šūnu ir B spermatogoniji, kuriem šūnas cikls ir apmēram 26 h (3).
8.Ja ir pierādījumi, ka testējamā ķimikālija, tās metabolīts vai metabolīti sēkliniekos nenokļūs, šo testu izmantot nav lietderīgi.
TESTĒŠANAS METODES PRINCIPS
9.Dzīvniekus attiecīgā ekspozīcijas ceļā eksponē testējamai ķimikālijai un pēc apstrādes pienācīgā laikā eitanazē. Pirms eitanāzijas dzīvniekiem ievada metafāzi apturošu vielu (piem., kolhicīnu vai Colcemid®)). Tad no dzimumšūnām pagatavo hromosomu preparātus, ko iekrāso, un nosaka hromosomu aberācijas metafāzes šūnām.
LABORATORIJAS KOMPETENCES VERIFICĒŠANA
10.Šā testa izpildes kompetence būtu jāapliecina, pierādot spēju ar 1. tabulā norādītajām pozitīvajām kontrolvielām (arī ar tādām, uz kurām ir vāja atbildreakcija) reproducēt gaidāmo spermatogoniju strukturālo hromosomu aberāciju biežumu un iegūt tādu negatīvo kontroļu biežumu, kas atbilst pieņemtajam kontroldatu diapazonam publicētajā literatūrā (piem., (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) vai laboratorijas vēsturisko kontroļu sadalījumam, ja tāds ir.
METODES APRAKSTS
Preparāti
Dzīvnieku sugas izraudzīšanās
11.Jāizmanto veseli, jauni pieauguši tipisku laboratorijas celmu dzīvnieki. Parasti izmanto peļu tēviņus; tomēr var izmantot citu attiecīgu zīdītāju sugu tēviņus, ja tas zinātniski pamatoti un lai būtu iespējams šā testa izpildi apvienot ar citu testēšanas metodi. Ja grauzēju vietā izmanto citas sugas, to izmantošana pārskatā zinātniski jāpamato.
Dzīvnieku turēšanas un barošanas apstākļi
12.Attiecībā uz grauzējiem telpā, kurā tur eksperimenta dzīvniekus, jābūt 22 °C ( ± 3 °C) temperatūrai. Ideālā gadījumā relatīvajam mitrumam jābūt 50–60 %, bet katrā ziņā vismaz 40 % un, vēlams, ne augstākam par 70 %, izņemot telpu uzkopšanas laiku. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas — tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas uzturu ar neierobežotu piekļuvi dzirdināmajam ūdenim. Uztura izvēli var ietekmēt vajadzība tam piemaisīt testējamo ķimikāliju, ja ķimikāliju ievada šādā ceļā. Ja netiek gaidīts vai novērots, ka grauzēji izturēsies agresīvi, tos ieteicams turēt mazās viendzimuma grupās (ne vairāk kā pa pieci), vēlams, būros ar cietu grīdu un attiecīgi bagātinātu vidi. Ja tas zinātniski pamatoti, dzīvniekus var turēt atsevišķi.
Dzīvnieku sagatavošana
13.Veselīgus jaunus pieaugušus tēviņus (devu došanas sākumā 8–12 nedēļas vecus) nejaušināti iedala kontroles grupās un grupās, kas saņem devas. Katru dzīvnieku unikālā veidā identificē, izmantojot humānu, minimāli invazīvu metodi (piem., apgredzenojot, izmantojot krotālijas, ievietojot mikroshēmu vai izmantojot biometrisko identificēšanu, bet ne apgriežot ausis vai pirkstus) un vismaz piecas dienas aklimatizē laboratorijas apstākļiem. Būrus izvieto tā, lai būru novietojuma varbūtējā ietekme būtu iespējami maza. Nav pieļaujama pozitīvās kontroles un testējamās ķimikālijas šķērskontaminēšanās. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas individuālajām atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkst pārsniegt ±20 %.
Devu sagatavošana
14.Pirms dzīvniekiem dod devas, cietas testējamās ķimikālijas jāizšķīdina vai jāsuspendē attiecīgos šķīdinātājos vai nesējos vai jāpievieno uzturam vai dzirdināmajam ūdenim. Šķidras testējamās ķimikālijas var dot tādas pašas vai pirms devas došanas atšķaidīt. Inhalatīvas ekspozīcijas vajadzībām testējamās ķimikālijas atkarībā no fizikālķīmiskajām īpašībām var būt gāzes, tvaiku vai cietu/šķidru daļiņu aerosola veidā. Ja vien dati par testējamās ķimikālijas preparātu stabilitāti neliecina, ka tos var uzglabāt, un ja vien no tiem neizriet pareizie glabāšanas nosacījumi, jāizmanto svaigi pagatavoti preparāti.
Testa apstākļi — šķīdinātājs/nesējs
15.Lietotajās devās šķīdinātājam vai nesējam nedrīkst būt toksiskas ietekmes un tas nedrīkst būt spējīgs reaģēt ar testējamo ķimikāliju. Citu, mazāk izplatītu šķīdinātāju vai nesēju izmantošana jāpamato ar atsauces datiem par to saderību. Kad vien iespējams, vispirms ieteicams izmantot šķīdinātājus vai nesējus uz ūdens bāzes. Plaši izmantoti saderīgi šķīdinātāji/nesēji ir, piem., ūdens, fizioloģiskais šķīdums, metilcelulozes šķīdums, karboksimetilcelulozes nātrija sāls šķīdums, olīveļļa un kukurūzas eļļa. Ja nav pieejami vēsturiski vai publicēti kontroļu dati, kas apliecinātu, ka izvēlētais atipiskais šķīdinātājs/nesējs neinducē strukturālas hromosomu aberācijas un tam nav citādas kaitīgas ietekmes, jāveic sākotnējs pētījums, lai noteiktu šķīdinātāja/nesēja kontroles pieņemamību.
Pozitīvās kontroles
16.Būtu vienmēr jāizmanto paralēlas pozitīvas kontroles dzīvnieki, ja vien laboratorija nav apliecinājusi kompetenci testa veikšanā un vēl nesen (piem., pēdējo piecu gadu laikā) testu izmantojusi regulāri. Ja nav paralēlas pozitīvas kontrolgrupas, katrā eksperimentā jāparedz novērtēšanas kontroles (fiksēti un neiekrāsoti priekšmetstikliņi). To var panākt, pētījumā ar atzīmēm novērtējot arī attiecīgus etalonparaugus, kas saglabāti pēc iegūšanas kādā atsevišķā pozitīvās kontroles eksperimentā, ko testējošā laboratorija izdara regulāri (piem., ik 6–18 mēnešus), piem., kompetences testēšanā un pēc tam regulāri pēc vajadzības.
17.Pozitīvās kontroles vielām stabili jārada detektējams tādu šūnu biežuma pieaugums, kurās strukturālās hromosomu aberācijas pārsniedz spontāno līmeni. Pozitīvās kontroles devas izvēlas tā, lai to ietekme būtu skaidri redzama, tomēr vērtētājam nebūtu uzreiz redzama kodēto paraugu identitāte. Pozitīvās kontroles vielu piemēri norādīti 1. tabulā.
1. tabula. Pozitīvās kontroles vielu piemēri.
|
Vielas [CAS Nr.] (atsauces Nr.)
|
|
Ciklofosfamīds (monohidrāts) [CAS Nr. 50-18-0 (CAS Nr. 6055-19-2)] (9)
|
|
Streptonigrīns [CAS Nr. 108-91-8] (7)
|
|
Mitomicīns C [CAS Nr. 50-07-7] (6)
|
|
Monomērakrilamīds [CAS Nr. 79-06-1] (10)
|
|
Trietilēnmelamīns [CAS Nr. 51-18-3] (8)
|
Negatīvās kontroles
18.Katrā paraugošanas reizē jābūt arī negatīvās kontroles dzīvniekiem, ko apstrādā tikai ar šķīdinātāju vai nesēju, bet pārējās darbības izdara tāpat kā ar grupām, kam dotas devas. Ja nav vēsturisku vai publicētu kontroldatu, kas liecinātu, ka izraudzītais šķīdinātājs/nesējs neierosina hromosomu aberācijas un tam nav citādas kaitīgas ietekmes, katrā paraugošanas reizē jābūt arī neapstrādātiem kontroldzīvniekiem, lai varētu konstatēt, cik pieņemami ir nesēju izmantot par kontrolvielu.
PROCEDŪRA
Dzīvnieku skaits
19.Pētījuma sākumā būtu jānosaka grupu lielums tā, lai katrā grupā būtu vismaz 5 tēviņi. Šādu dzīvnieku skaitu uzskata par pietiekamu adekvātas statistiskās jaudas nodrošināšanai (proti, lai parasti būtu iespējams ar 80 % varbūtību nozīmīguma līmenī 0,05 detektēt vismaz hromosomu aberāciju biežuma dubultošanos pie negatīvās kontroles līmeņa 1 % vai augstāka.) (3) (11). Orientējošs piemērs parastām prasībām attiecībā uz dzīvnieku maksimālo skaitu: pētījumā ar divām paraugošanas reizēm izmanto trīs devu grupas un paralēlu negatīvo kontrolgrupu, kā arī pozitīvo kontrolgrupu (pieci viena dzimuma dzīvnieki katrā grupā); būtu nepieciešami 45 dzīvnieki.
Devu došanas grafiks
20.Testējamo ķimikāliju parasti dod vienreiz (proti, kā vienreizēju devu); var izmantot citus devu režīmus, ja vien tie ir zinātniski pamatoti.
21.No grupas, kurā pārbauda lielāko devu, paraugus pēc devas došanas ņem divās paraugošanas reizēs. Tā kā testējamās(-o) ķimikālijas(-u) uzņemšanai un metabolizēšanai, kā arī tās iedarbībai uz šūnas cikla kinētiku vajadzīgais laiks var ietekmēt hromosomu aberāciju noteikšanas optimālo laiku, ieteicama viena agrīna un viena vēla paraugošanas reize apmēram 24 un 28 stundas pēc devas došanas. Izņemot lielāko devu, paraugošanu ieteicams izdarīt agri, 24 stundas (par B spermatogonija šūnas cikla laiku īsāks vai ar to vienāds laiks, tāpēc optimizējas varbūtība, ka būs iespējams novērtēt pirmās pēcapstrādes metafāzes) pēc devas došanas, ja vien nav zināms cits, piemērotāks un pamatots paraugošanas laiks.
22.Var izmantot citus paraugošanas laikus. Piemēram, kas attiecas uz ķimikālijām, kuras rada no S neatkarīgu ietekmi, lietderīgs var būt agrāks paraugošanas laiks (t.i., agrāk nekā pēc 24 stundām).
23.Var izmantot tādu apstrādes režīmu ar atkārtotām devām, kāds rodas apvienojumā ar cita beigupunkta testu, kurā izmantots devu došanas periods 28 dienas (piem., TM B.58); tomēr, lai būtu iespējami atšķirīgi paraugošanas laiki, būtu vajadzīgas vēl citas dzīvnieku grupas. Tātad katrā gadījumā zinātniski jāpamato šāda grafika lietderība.
24.Pirms eitanazēšanas dzīvniekiem intraperitoniāli injicē attiecīgu devu metafāzi apturošas vielas (piem. Colcemid® vai kolhicīnu). Pēc tam ar attiecīgiem intervāliem no dzīvniekiem ņem paraugus. Pelēm un žurkām šis intervāls ir aptuveni 3 – 5 stundas.
Devu līmeņi
25.Ja veic iepriekšēju diapazona noteikšanas pētījumu, jo nav piemērotu datu, kas palīdzētu izraudzīties devu, tas jāveic tajā pašā laboratorijā, izmantojot to pašu sugu, celmu, dzimumu un devu došanas režīmu, kas tiks izmantots galvenajā pētījumā, un ievērojot ieteikumus par devu diapazona noteikšanas pētījumu izpildi (12). Šajā pētījumā būtu jāorientējas uz maksimālās panesamās devas (MTD) apzināšanu; MTD definē kā devu, kura pētījuma ilgumam atbilstošā laikā izraisa nelielu toksisku ietekmi (piem., anormāla izturēšanās vai reakcijas, neliels ķermeņa masas samazinājums vai citotoksicitāte hematopoētiskajā sistēmā), bet neizraisa nāvi vai tādas sāpju, ciešanu vai diskomforta pazīmes, kā dēļ dzīvnieki būtu jāeitanazē (13).
26.Augstāko devu var definēt arī kā devu, kura kaut kādā veidā liecina par toksiskumu spermatogoniju šūnām (piem., samazinās spermatogoniju mitožu attiecība pret pirmo un otro mejotisko metafāzi). Šim samazinājumam nevajadzētu pārsniegt 50 %.
27.Testējamās ķimikālijas, kuras zemā netoksiskā devā iedarbojas bioloģiski specifiski (tādas kā hormoni un mitogēni), un ķimikālijas, kurām ir ļoti izteiktas toksikokinētiskās īpašības, var būt šo devu noteikšanas kritēriju izņēmumi un tātad attiecībā uz devām var būt jānovērtē atsevišķi.
28.Lai iegūtu informāciju par atbildreakciju uz devu, pilnīgā pētījumā jābūt negatīvai kontrolgrupai (18. punkts) un vismaz trijiem devu līmeņiem, kuru atstatuma koeficients parasti ir 2, bet nepārsniedz 4. Ja diapazona noteikšanas pētījumā testējamā ķimikālija toksicitāti nerada vai to nerada saskaņā ar esošajiem datiem, lielākajai vienreizējai devai jābūt 2000 mg uz kg ķermeņa masas. Ja testējamai ķimikālijai toksiskums tomēr izpaužas, MTD jābūt augstākajai ievadītajai devai un izmantotajiem devu līmeņiem būtu jāaptver diapazons no maksimālās devas līdz devai, kas ir maztoksiska vai netoksiska. Ja pie visiem testētajiem devu līmeņiem tiek novērota toksiska ietekme uz mērķaudiem (t.i., sēkliniekiem), ieteicams veikt vēl vienu pētījumu ar netoksiskām devām. Pētījumos, kuros plānots pilnīgāk raksturot kvantitatīvo atbildreakciju uz devu, var būt nepieciešams izmantot papildu devu grupas. Atsevišķiem testējamo ķimikāliju veidiem (piem., cilvēku zālēm), uz kuriem attiecas konkrētas prasības, šīs robežas var būt mainīgas. Ja testējamā ķimikālija rada toksicitāti, būtu jāizraugās robeždeva plus divas zemākas devas (kā aprakstīts iepriekš). Robeždeva devu došanas periodam 14 dienas vai vairāk ir 100 mg uz kg ķermeņa masas dienā, bet devu došanas periodiem, kas nesasniedz 14 dienas, — 2000 mg uz kg ķermeņa masas dienā.
Devu došana
29.Testi jāplāno, ņemot vērā iespējamo cilvēka ekspozīcijas ceļu. Tāpēc kā pamatotus var izvēlēties tādus ekspozīcijas ceļus kā, piem., ar uzturu, ar dzirdināmo ūdeni, ievadīšanu zemādas audos, intravenozu ievadīšanu, perorālu uzņemšanu (ar gavāžu), inhalāciju vai implantāciju. Jebkurā gadījumā ceļš jāizraugās tā, lai mērķaudiem nodrošinātu pietiekamu ekspozīciju. Ja vien intraperitoneāla injekcija nav zinātniski pamatota, tā parasti nav ieteicama, jo cilvēkam šāds ekspozīcijas ceļš nav raksturīgs. Ja testējamo ķimikāliju piejauc barībai vai dzirdināmam ūdenim, jo īpaši vienreizējas devas gadījumā, jāgādā, lai starp pārtikas un ūdens patēriņu un paraugošanu paietu pietiekami daudz laika, lai būtu iespējams detektēt ietekmes (sk. 33. punktu). Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt ar gavāžu vai injekciju, atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Tilpums parasti nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa masas, izņemot ūdens šķīdumus, kuru gadījumā var lietot ne vairāk kā 2 ml uz 100 g ķermeņa masas. Ja izmanto lielāku tilpumu (ja dzīvnieku labturības tiesību akti to atļauj), tas jāpamato. Testa tilpuma mainība būtu jāsamazina līdz minimumam, koncentrāciju koriģējot tā, lai visos devu līmeņos tilpuma attiecība pret ķermeņa masu saglabātos konstanta.
Novērojumi
30.Vismaz reizi dienā, vēlams — vienā un tajā pašā laikā vai laikos un ņemot vērā, kurā periodā pēc devu došanas gaidāms ietekmju maksimums, testa dzīvniekiem jāizdara vispārīgi klīniski novērojumi un jāreģistrē novērotās klīniskās pazīmes. Vismaz divreiz dienā visus dzīvniekus novēro attiecībā uz morbiditāti un mirstību. Pētījuma sākumā, atkārtotas devas pētījumos vismaz reizi nedēļā un eitanāzijas laikā visi dzīvnieki jānosver. Pētījumos, kuri ilgst vismaz vienu nedēļu, vismaz reizi nedēļā jāmēra barības patēriņš. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar dzirdināmo ūdeni, ūdens patēriņš jāmēra katru reizi, kad ūdens tiek mainīts, un vismaz reizi nedēļā. Dzīvnieki, kam ar neletālām pazīmēm izpaužas pārlieks toksiskums, pirms testa perioda beigām būtu jāeitanazē (13).
Hromosomu preparātu sagatavošana
31.Tūlīt pēc eitanazēšanas no viena vai abiem sēkliniekiem iegūst dīgļšūnu suspensijas, ko apstrādā ar hipotonisku šķīdumu un fiksē saskaņā ar vispārpieņemtiem protokoliem (piem., (2) (14) (15)). Šūnas pēc tam uzklāj uz priekšmetstikliņiem un krāso (16) (17). Visi priekšmetstikliņi būtu jāapzīmē ar kodu, lai vērtētājam nebūtu pieejama to identitāte.
Analīze
32.Par katru dzīvnieku būtu jāsaskaita vismaz 200 izteikti izplatījušos metafāžu (3) (11). Ja vēsturiskās negatīvās kontroles biežums ir < 1%, statistiskās jaudas palielināšanai novērtēšanā par vienu dzīvnieku būtu jānovērtē vairāk nekā 200 šūnu (3). Būtu jāizmanto krāsošanas paņēmieni, ar kuriem iespējams identificēt centromēru.
33.Hromatīdtipa un hromosomtipa aberācijas jāreģistrē atsevišķi un jāklasificē pa apakštipiem (pārrāvumi, apmaiņas). Pārtraukumi būtu jāatspoguļo ziņojumā, bet nebūtu jāņem vērā, nosakot, vai kāda ķimikālija būtiski palielina tādu šūnu incidenci, kurām vērojamas hromosomu aberācijas. Laboratorijā izmantojamām procedūrām būtu jānodrošina, ka hromosomu aberācijas analizē labi apmācīti vērtētāji. Apzinoties, ka priekšmetstikliņu sagatavošanas procedūrā daļa metafāzes šūnu bieži vien tiek bojātas un hromosomas zaudē, centromēru skaitam novērtētajās šūnās jābūt vismaz 2n ± 2, kur n ir attiecīgās sugas haploidālais hromosomu skaits.
34.Testa nolūks gan ir detektēt strukturālas hromosomu aberācijas, tomēr, ja novēro tādus notikumus kā poliploidālas šūnas vai šūnas ar endoreduplicētām hromosomām, arī to biežumu ir svarīgi atspoguļot (sk. 44. punktu.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Rezultātu apstrāde
35.Datus par katru dzīvnieku apkopo tabulas veidā. Katram dzīvniekam nosaka šūnu skaitu, kurās ir strukturālas hromosomu aberācijas, kā arī hromosomu aberāciju skaitu uz vienu šūnu. Hromatīdtipa un hromosomtipa aberācijas, kas klasificētas pēc apakštipa (pārrāvumi, apmaiņas) sarakstā jānorāda atsevišķi, minot skaitu un biežumu eksperimenta grupās un kontrolgrupās. Atsevišķi dokumentē pārtraukumus. Ziņojumā pārtraukumu biežumu atspoguļo, tomēr strukturālo aberāciju kopējā biežuma analīzē to parasti neiekļauj. Ziņojumā atspoguļo gan poliploīdijas, gan/vai to šūnu īpatsvaru, kam ir endoreduplicētas hromosomas, ja šādas parādības ir.
36.Pārskatā jāatspoguļo 30. punktā minētie toksiskuma un klīnisko pazīmju dati.
Pieņemamības kritēriji
37.Testa pieņemamību nosaka, pamatojoties uz šādiem kritērijiem:
-paralēlā negatīvā kontrole atbilst publicētajām normām, kas attiecas uz vēsturisko negatīvo kontroļu datiem (parasti gaida, ka hromosomu aberācijas būs vērojamas > 0 % un ≤ 1,5 % šūnu) un laboratorijas vēsturiskajiem kontroļu datiem (sk. 10. un 18. punktu).
-paralēlās pozitīvās kontrolēs inducētā reakcija atbilst publicētajām vēsturisko pozitīvo kontroļu datu normām vai laboratorijas vēsturisko pozitīvo kontroļu datubāzei, ja tāda ir, un salīdzinājumā ar negatīvajām kontrolēm ir iegūts statistiski būtisks palielinājums (sk. 17. un 18. punktu);
-ir izanalizēts pietiekams šūnu un devu skaits (sk. 28. punktu un 32. punktu).
-maksimālās devas izraudzīšanās kritēriji atbilst 25. un 26. punktā aprakstītajiem.
38.Ja novēro gan mitozi, gan mejozi, par citotoksicitātes mēru visiem devu saņēmušajiem un negatīvās kontroles dzīvniekiem būtu jāizraugās spermatogoniju mitožu attiecība pret pirmo un otro mejotisko metafāzi apkopotā paraugā, kas ir 100 dalošās šūnas uz katru dzīvnieku. Ja novēro tikai mitozi, katram dzīvniekam nosaka mitotisko indeksu vismaz 1000 šūnām.
Rezultātu izvērtēšana un interpretēšana
39.Lai iegūtu devas un atbildreakcijas izanalizēšanai pietiekamus datus, jāizanalizē vismaz trīs grupas, kas saņēmušas devas.
40.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi pozitīvu, ja:
-vismaz vienai no testa devām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,
-vismaz vienā paraugošanas reizē palielinājums ir devatkarīgs un
-kāds no šiem rezultātiem ir ārpus pieņemamā negatīvo kontroļu datu diapazona vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma (piem., ārpus 95 % kontrolrobežām Puasona sadalījumā), ja tādas ir.
Šajā gadījumā tiek uzskatīts, ka testējamā ķimikālija testa dzīvnieku spermatogoniju šūnās spēj inducēt hromosomu aberācijas. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm atrodami arī literatūrā (11) (18). Izmantotajos statistiskajos testos par eksperimenta vienību jāuzskata dzīvnieks.
41.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi negatīvu, ja:
-ne ar vienu no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli nav novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,
-ne ar vienu no eksperimenta nosacījumiem nav novērojams ar devu saistīts palielinājums un
-visi rezultāti ir pieņemamajā negatīvo kontroļu datu vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu (ja tādi pieejami) diapazonā (piem., 95 % kontrolrobežās Puasona sadalījumā).
Testējamo ķimikāliju šajā testa sistēmā tad uzskata par nespējīgu inducēt hromosomu aberācijas kultivētās zīdītāju šūnās. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm atrodami arī literatūrā (11) (18). Negatīvs rezultāts neizslēdz iespējamību, ka ķimikālija varbūt inducē hromosomu aberācijas vēlākās, nepētītās ontoģenēzes fāzēs vai gēnu mutācijas.
42.Nepārprotami pozitīva vai nepārprotami negatīva atbildreakcija nav jāverificē.
43.Ja atbildreakcija nav nepārprotami negatīva vai pozitīva un lai varētu vieglāk noskaidrot kāda rezultāta bioloģisko nozīmīgumu (piem., neizteikts palielinājums vai robežgadījums), dati būtu jāizvērtē, izmantojot ekspertu slēdzienus un/vai tālāku izmeklēšanu, kurā izmanto jau esošos eksperimentu datus, piem., jāapsver, vai pozitīvais rezultāts ir ārpus negatīvās kontroles datu vai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datu pieņemamības diapazona (19).
44.Retos gadījumos pat pēc sīkākas izskatīšanas datu kopums neļauj secināt, vai testējamā ķimikālija rada pozitīvus vai negatīvus rezultātus, un tad uzskata, ka rezultāti ir neskaidri.
45.Poliploidālo šūnu skaita palielināšanās var norādīt, ka testējamai ķimikālijai ir potenciāls inhibēt mitotiskos procesus un inducēt skaitliskas hromosomu aberācijas (20). Ja palielinās tādu šūnu skaits, kam ir endoreduplicētas hromosomas, tas var liecināt, ka testējamajai ķimikālijai ir potenciāls inhibēt šūnu cikla norisi (21) (22); tas ir vēl cits, no mitotisku procesu inhibēšanas atšķirīgs mehānisms, kā hromosomās tiek inducētas skaitliskas pārmaiņas (sk. 2. punktu). Tāpēc poliploidālo šūnu incidence un tādu šūnu incidence, kam ir endoreduplicētas hromosomas, jādokumentē atsevišķi.
Testēšanas pārskats
46.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Kopsavilkums
Testējamā ķimikālija:
-avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams;
-pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināma;
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināmas;
-pH, osmolalitātes un nogulšņu mērījums barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota (attiecīgā gadījumā).
Vienkomponenta viela:
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;
-ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.
Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:
-iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un sastāvdaļu relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
Testējamās ķimikālijas sagatavošana:
-nesēja izraudzīšanās pamatojums;
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā;
-barības, dzirdināmā ūdens vai inhalācijas preparātu sagatavošana;
-preparātu analītiska noteikšana (piem., stabilitāte, homogenitāte, nominālās koncentrācijas), ja tāda veikta.
Testa dzīvnieki:
-izmantotā suga/celms un tā izmantošanas pamatojums;
-dzīvnieku skaits un vecums;
-avots, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.;
-dzīvnieku unikālās identificēšanas metode;
-īslaicīgiem pētījumiem: dzīvnieku individuālā masa testa sākumā un beigās; par nedēļu ilgākiem pētījumiem: individuālā masa pētījuma laikā un barības patēriņš. Norāda katras grupas dzīvnieku ķermeņa masas diapazonu, vidējo vērtību un standartnovirzi.
Testēšanas nosacījumi:
-pozitīvās un negatīvās (nesēja/šķīdinātāja) kontroles dati;
-diapazona noteikšanas testa rezultāti, ja tas veikts;
-devu līmeņa izraudzīšanās pamatojums;
-ievadīšanas ceļa izraudzīšanās pamatojums;
-detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas sagatavošanu;
-detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas devu došanu;
-nonāvēšanas laika pamatojums;
-metodes, ar kādām mēra testējamās vielas toksiskumu dzīvniekiem, ja tādas ir, arī histopatoloģiskas vai hematoloģiskas analīzes un dzīvnieku novērošanas un svēršanas biežums;
-ja rezultāti ir negatīvi, ar kādām metodēm verificēts, ka testējamā ķimikālija nonākusi mērķaudos vai vispārējā asinsritē;
-faktiskā deva (mg uz kg ķermeņa masas dienā), kas aprēķināta pēc testējamās ķimikālijas koncentrācijas (ppm) barībā / dzirdināmajā ūdenī un pēc uzņemtā daudzuma (attiecīgā gadījumā);
-detalizēta informācija par barības un ūdens kvalitāti;
-detalizēts apstrādes un paraugošanas grafiku apraksts un izraudzīšanās pamatojums;
-eitanāzijas metode;
-atsāpināšanas metode (ja tāda izmantota);
-audu izolēšanas procedūras;
-metafāzes apturēšanai izmantojamās ķimikālijas identifikācija, tās koncentrācija un apstrādes ilgums;
-priekšmetstikliņu sagatavošanas metodes;
-aberāciju atzīmju kritēriji;
-analizēto šūnu skaits uz vienu dzīvnieku;
-kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testa rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs.
Rezultāti
-dzīvnieka stāvoklis pirms testa perioda un tā laikā, arī toksiskuma pazīmes;
-ķermeņa un orgānu masa nonāvēšanas brīdī (ja devas dotas vairākreiz, ķermeņa masas fiksējumi devu došanas režīma laikā);
-toksiskuma pazīmes;
-mitotiskais indekss;
-spermatogoniju šūnu mitožu attiecība pret pirmo un otro mejotisko metafāzi vai citas mērķaudos vērojamas liecības par eksponētību;
-aberāciju veids un skaits, ko norāda katram dzīvniekam atsevišķi;
-kopējais aberāciju skaits katrā grupā, vidējās vērtības un standartnovirzes;
-to šūnu skaits katrā grupā, kam ir aberācijas, vidējās vērtības un standartnovirzes;
-ja iespējams, devas–atbildreakcijas sakarība;
-izmantotā statistiskā analīze un metodes;
-līdztekus veiktās negatīvās kontroles dati;
-vēsturiskie negatīvo kontroļu dati ar diapazoniem, vidējām vērtībām, standartonovirzēm un ticamības intervālu 95 % (kur tādi pieejami) vai publicētie vēsturiskie negatīvo kontroļu dati, kurus izmanto attiecībā uz šā testa rezultātu pieņemamību;
-paralēlās pozitīvās kontroles dati;
-ploīdijas pārmaiņas, ja tādas tiek novērotas, arī poliploidālo un/vai endoreduplicēto šūnu biežums.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris
(2)Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
(3)Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.
(4)Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.
(5)Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.
(6)Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.
(7)Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.
(8)Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.
(9)Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.
(10)Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313–324.
(11)Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G.,, Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.
(12)Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.
(13)OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(14)Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.
(15)Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.
(16)Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.
(17)Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
(18)Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
(19)Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.
(20)Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.
(21)Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.
(22)Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.
Papildinājums
Definīcijas
Aneiploīdija: novirze no normālā diploidālā (vai haploidālā) hromosomu skaita par vienu vai vairākām atsevišķām hromosomām, bet ne veselu hromosomu komplektu vai komplektiem (poliploīdija).
Centromēra: hromosomas rajons(-i), ar kuru(-iem) šūnas dalīšanās laikā saistās vārpstas šķiedras, nodrošinot meithromosomu pareizu pārvietošanos uz meitšūnu poliem.
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Hromosomu daudzveidība: hromosomu formu (piem., metacentriskas, akrocentriskas u. tml.) un lielumu daudzveidība.
Hromatīdtipa aberācija: strukturāls hromosomas bojājums, kas izpaužas kā atsevišķas hromatīdas pārrāvums vai hromatīdu pārrāvums un savienošanās.
Hromosomtipa aberācija: strukturāls hromosomas bojājums, kas izpaužas kā abu hromatīdu pārrāvums vai pārrāvums un savienošanās vienā un tajā pašā vietā.
Klastogēns: jebkura ķimikālija, kas izraisa strukturālas hromosomālas aberācijas šūnu vai organismu populācijās.
Pārtraukums: ahromatisks bojājums, kas mazāks par vienas hromatīdas platumu un saistīts ar ļoti nelielu hromatīdisku nobīdi.
Genotoksisks: vispārīgs termins, kas aptver visu veidu bojājumus DNS vai hromosomās, arī pārrāvumus, delēcijas, aduktus, nukleotīdu modifikācijas un sasaistes, pārkārtojumus, gēnu mutācijas, hromosomu aberācijas un aneiploīdiju. Ne visas genotoksiskās ietekmes rada mutācijas vai pastāvīgus hromosomu bojājumus.
Mitotiskais indekss (MI): metafāzē esošu šūnu skaita attiecība pret šūnu kopējo skaitu populācijā; raksturo attiecīgās populācijas proliferācijas pakāpi.
Mitoze: šūnas kodola dalīšanās process, kuru parasti sīkāk iedala šādās stadijās: profāze, prometafāze, metafāze, anafāze un telofāze.
Mutagēnisks: tāds, kas pārmantojami maina vienu vai vairākas DNS bāzu pāru sekvences gēnos vai hromosomu struktūru (hromosomu aberācijas).
Skaitliska anomālija: testam izmantojamajiem dzīvniekiem raksturīgā parastā hromosomu skaita pārmaiņas.
Poliploīdija: haploidālā hromosomu skaita (n) daudzkārtnis (t.i., 3n, 4n utt.), izņemot diploidālo skaitu.
Strukturālas pārmaiņas: hromosomas struktūras pārmaiņas, kas detektējamas, ar mikroskopu apskatot šūnas to dalīšanās metafāzē, un kas izpaužas kā delēcijas un fragmentācija.
Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
UVCB: Ķīmiskas vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kuras ir kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli”
(5) Pielikuma B daļā B.40. nodaļu aizstāj ar šādu:
“B.40. ĀDAS KOROZIJA IN VITRO: TRANSKUTĀNĀS ELEKTRISKĀS PRETESTĪBAS (TEP) TESTS
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 430 (2015) aprakstītajam. Ādas korozija ir nepārejošs ādas bojājums, kas izpaužas kā tāda redzama nekroze visā epidermā, kura ietiecas dermā un radusies pēc tam, kad uz ādas aplicēta testējamā ķimikālija [atbilstoši definīcijai, kas dota Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētajā sistēmā (GHS) (1) un Eiropas Savienības (ES) Regulā Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (CLP regula)
]. Šajā atjauninātajā testēšanas metodē B.40 aprakstīta in vitro procedūra, kas dod iespēju saskaņā ar ANO GHS (1) un ar CLP identificēt nekodīgas un kodīgas vielas.
2.Kodīgumu ādai parasti novērtē, izmantojot laboratorijas dzīvniekus (TM B.4, kas ekvivalenta ESAO TG Nr. 404, kura sākotnēji pieņemta 1981. gadā un pārstrādāta 1992., 2002. un 2015. gadā) (2). Papildus pašreizējai testēšanas metodei B.40, attiecībā uz to, kā testēt ķimikāliju potenciālu izraisīt ādas koroziju, validētas un kā TM B.40a (ekvivalenta ESAO TG 431) (3) un TM B.65 (ekvivalenta ESAO TG 435) (4) pieņemtas ir citas in vitro testēšanas metodes, ar kurām vajadzības gadījumā iespējams arī identificēt kodīgu ķimikāliju apakškategorijas. Vairākas tādas in vitro testēšanas metodes kā TM B.56 (ekvivalenta ESAO TG 439 (5)) ir pieņemtas izmantošanai ādas kairinājuma testēšanā. ESAO norādījumu dokuments par Integrētu testēšanas un novērtēšanas pieeju (IATA) attiecībā uz ādas koroziju un kairinājumu apraksta vairākus moduļus, kādos grupēti informācijas avoti un analīzes instrumenti, un, pirmkārt, sniedz norādījumus par to, kā, novērtējot ķimikāliju potenciālu radīt ādas kairinājumu un ādas koroziju, integrēt un izmantot jau esošos testēšanā un citādi iegūtos datus, un, otrkārt, ierosina pieeju, ko izmantot, ja vajadzīga turpmāka testēšana (6).
3.Šis testēšanas metodes apraksts pievēršas tādam cilvēkveselības beigupunktam kā ādas korozija. Metodes pamatā ir žurkas ādas transkutānās elektriskās pretestības (TEP) tests, kurā, izmantojot ādas diskus, kodīgas vielas tiek atpazītas pēc to spējas izraisīt stratum corneum normālā veseluma un barjerfunkcijas zudumu. Attiecīgā ESAO testēšanas vadlīnija sākotnēji pieņemta 2004. gadā un 2015. gadā atjaunināta, lai ietvertu atsauci uz IATA norādījumu dokumentu.
4.Lai izvērtētu regulatīvām vajadzībām veiktu ādas korozijas testēšanu in vitro, tika izdarīti pirmsvalidācijas pētījumi (7), pēc kuriem tika veikts oficiāls validācijas pētījums attiecībā uz tādu žurkas ādas TEP testēšanas metodi, ar ko novērtē kodīgumu ādai (8) (9) (10) (11). Šo pētījumu iznākums bija ieteikums TEP testēšanas metodi (kas ir noteikta par validēto references metodi, VRM) izmantot regulatīvām vajadzībām kodīguma ādai novērtēšanā in vivo (12) (13 (14).
5.Pirms kādu piedāvātu līdzīgu vai modificētu in vitro TEP testēšanas metodi, kas nav VRM, attiecībā uz ādas koroziju iespējams izmantot regulatīvām vajadzībām, saskaņā ar veiktspējas standartu (PS) (15) prasībām būtu jānosaka tās ticamība, relevantums (pareizība) un piedāvātā lietojuma ierobežojumi, lai būtu drošība par tās līdzību VRM. ESAO datu savstarpējā atzīšana (Mutual acceptance of data) būs garantēta tikai tad, kad jebkāda jauna ierosināta vai atjaunināta VS atbilstoša testēšanas metode būs pārskatīta un iekļauta attiecīgajā ESAO testēšanas vadlīnijā.
DEFINĪCIJAS
6.Izmantotās definīcijas sniegtas papildinājumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI
7.Validācijas pētījums (10) un citi publicēti pētījumi (16) (17) liecina, ka žurkas ādas TEP testēšanas metode spēj ādai kodīgas un nekodīgas vielas 122 vielu datubāzē atšķirt ar kopējo jutību 94 % (51/54) un specifiskumu 71% (48/68).
8.Šī testēšanas metode attiecas uz ādas koroziju in vitro. Ar tās palīdzību iespējams saskaņā ar ANO GHS / CLP identificēt nekodīgas un kodīgas testējamās ķimikālijas. Kā pierāda validācijas pētījumi (8) (9) (10) (11), viens šīs testēšanas metodes ierobežojums ir tāds, ka ar to nav iespējams kodīgas vielas un maisījumus sadalīt apakškategorijās atbilstoši ANO GHS vai CLP. Tāpēc šīs testēšanas metodes izmantošanas veids būs atkarīgs no piemērojamā tiesiskā regulējuma. Šī testēšanas metode gan pietiekami neinformē par ādas kairinājumu, taču jānorāda, ka tādai ietekmei uz veselību kā ādas kairinājums īpaši pievēršas TM B.46. Attiecībā uz to, kā pilnīgi izvērtēt lokālo ietekmi uz ādu pēc vienreizējas dermālas ekspozīcijas, jāizmanto ESAO norādījumu dokuments par integrētajām testēšanas un novērtēšanas pieejām (IATA) (6).
9.Validēšanā, kas ir pamatā šai testēšanas metodei, testēts daudz dažādu ķimikāliju, galvenokārt vielu, un validācijas pētījuma empīriskajā datubāzē bija pat 60 vielas, kas aptver daždažādas ķimikāliju klases (8)(9). Raugoties pēc kopējiem datiem, kas pieejami, šī testēšanas metode ir piemērojama plašam ķimikāliju klašu un agregātstāvokļu klāstam, ieskaitot šķidrumus, puscietas un cietas vielas, kā arī vaskus. Tomēr, tā kā attiecībā uz specifiskiem agregātstāvokļiem testējami objekti ar piemērotiem atsauces datiem nav viegli pieejami, jānorāda, ka validēšanā tikuši novērtēti samērā nedaudzi vaski un kodīgas cietas vielas. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumi; cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja pierādījumi liecina, ka šī testēšanas metode kādai konkrētai vielu kategorijai nav izmantojama, to attiecībā uz konkrēto minēto kategoriju neizmanto. Turklāt, balstoties uz šīs testēšanas metodes izmantojamību attiecībā uz vielām, tiek uzskatīts, ka tā izmantojama arī attiecībā uz maisījumiem. Tomēr maisījumi aptver plašu kategoriju un sastāvu spektru un patlaban par maisījumu testēšanu sevišķi daudz informācijas nav pieejams, tāpēc, ja var pierādīt, ka kādai konkrētai maisījumu kategorijai (piemēram, saskaņā ar stratēģiju, ko piedāvā Eskes u. c., 2012. g.) (18) attiecīgā testēšanas metode nav izmantojama, šo testēšanas metodi šai konkrētajai maisījumu kategorijai nevajag izmantot. Pirms attiecībā uz maisījumu izmanto šo testēšanas metodi, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Ja pastāv normatīva prasība maisījumu testēt, tāda apsvēršana nav vajadzīga. Validācijas pētījumos vēl nav vērtētas gāzes un aerosoli (8) (9). Kaut arī jādomā, ka vispār gāzes un aerosolus ar TEP tehnoloģiju testēt ir iespējams, ar pašreizējo testēšanas metodi tos testēt nevar.
TESTA PRINCIPS
10.Testēšanas sistēmā ar diviem nodalījumiem, kurus vienu no otra nodala ādas diski, testējamo vielu uz laiku līdz 24 stundām aplicē šo ādas disku epidermālajai virsmai. Ādas diskus ņem no humāni nonāvētām 28–30 dienas vecām žurkām. Kodīgas ķimikālijas identificē pēc to spējas izraisīt stratum corneum normālā veseluma un barjerfunkcijas zudumu, ko mēra kā TEP pazemināšanos zem sliekšņlīmeņa (16) (sk. 32. punktu). Žurkas ādas TEP vajadzībām ir izraudzīta robežvērtība 5kΩ, balstoties uz plašiem datiem par lielu ķīmisko vielu klāstu, kur lielākā daļa vērtību nepārprotami bijusi vai nu par šo vērtību krietni augstāka (bieži vien > 10 kΩ), vai krietni zemāka (parasti < 3 kΩΩ) (16). Testējamās ķimikālijas, kas dzīvniekiem nerada ādas koroziju, bet ir vai nav kairinošas, TEP vērtību parasti nepazemina zemāk par šo robežvērtību. Bez tam, ja izmanto citus ādas preparātus vai citu aparatūru, robežvērtība var mainīties, tāpēc var būt vajadzīga papildu validācija.
11.Testēšanas procedūrā, ar ko apstiprinoši testē pozitīvus TEP rezultātus, ieskaitot vērtības apΩ, tiek iekļauts krāsvielas saistīšanas solis. Krāsvielas saistīšanas solī tiek noteikts, vai jonu caurlaidības palielinājumu izraisījusi fiziska stratum corneum noārdīšanās. Ir apliecināts, ka TEP metode, kurā izmanto žurkas ādu, spēj prognozēt kodīgumu B.4. testēšanas metodē, ko in vivo īsteno ar trušiem (2).
KOMPETENCES PIERĀDĪŠANA
12.Pirms šai testēšanas metodei atbilstošo žurkas ādas TEP testēšanas metodi sākt izmantot regulāri, laboratorijām būtu jāpierāda tehniskā kompetence, pareizi saklasificējot 1. tabulā ieteiktās standartvielas. Gadījumos, kur kāda sarakstā norādīta viela nav pieejama vai kur tas attaisnojami, var izmantot citu vielu, par kuru pieejami pietiekami in vivo un in vitro references dati (piem., vielu no references ķimikāliju saraksta (16)), ja vien tiek izmantoti tie paši 1. tabulā aprakstītie izraudzīšanās kritēriji.
1. tabula. Standartvielu1 saraksts
|
Viela
|
CAS Nr.
|
Ķimikāliju klase2
|
ANO GHS/CLP
Kategorijas, kuru pamatā ir in vivo rezultāti3
|
VRM
Kategorijas, kuru pamatā ir in vitro rezultāti
|
Agregātstāvoklis
|
pH4
|
|
In vivo kodīgas vielas
|
|
N,N’-dimetil
dipropilēntriamīns
|
10563-29-8
|
organiska bāze
|
1.A
|
6 x K
|
Š
|
8,3
|
|
1,2-diaminopropāns
|
78-90-0
|
organiska bāze
|
1.A
|
6 x K
|
Š
|
8,3
|
|
sērskābe (10 %)
|
7664-93-9
|
neorganiska skābe
|
(1.A/)1.B/1.C
|
5 x K
1x NK
|
Š
|
1,2
|
|
kālija hidroksīds (10 % ūd.)
|
1310-58-3
|
neorganiska bāze
|
(1.A/)1.B/1.C
|
6 x K
|
Š
|
13,2
|
|
oktānskābe (kaprilskābe)
|
124-07-2
|
organiska skābe
|
1.B/1.C
|
4 x K
2 x NK
|
Š
|
3,6
|
|
2-terc-butilfenols
|
88-18-6
|
fenols
|
1.B/1.C
|
4 x K
2 x NK
|
Š
|
3,9
|
|
In vivo nekodīgas vielas
|
|
izostearīnskābe
|
2724-58-5
|
organiska skābe
|
NK:
|
6 x NK
|
Š
|
3,6
|
|
4-amino-1,2,4-triazols
|
584-13-4
|
organiska bāze
|
NK
|
6 x NK
|
KV
|
5,5
|
|
fenetilbromīds
|
103-63-9
|
elektrofīla viela
|
NK
|
6 x NK
|
Š
|
3,6
|
|
4-(metiltio)-benzaldehīds
|
3446-89-7
|
elektrofīla viela
|
NK
|
6 x NK
|
Š
|
6,8
|
|
1,9-dekadiēns
|
1647-16-1
|
neitrāla organiska viela
|
NK
|
6 x NK
|
Š
|
3,9
|
|
tetrahloretilēns
|
127-18-4
|
neitrāla organiska viela
|
NK
|
6 x NK
|
Š
|
4,5
|
Saīsinājumi: aq = uz ūdens bāzes; CAS Nr. = Chemical Abstracts Service reģistra numurs; VRM = validēta references metode; K = kodīga; NK = nekodīga.
1Standartvielas tika izraudzītas no vielām, kuras izmantotas žurkas ādas TEP testēšanas metodes ECVAM validācijas pētījumā, un šeit ir sagrupētas vispirms kodīgās un nekodīgās vielās, pēc tam pa kodīguma apakškategorijām un tad pa ķimikāliju klasēm (8) (9). Ja nav norādīts citādi, vielas testētas tīrības līmenī, kāds bijis pirkumā no komerciāla piegādātāja (8). Izlasē, cik vien iespējams, ietvertas vielas, kas: i) ir reprezentatīvas attiecībā uz tādu kodīguma atbildreakciju diapazonu (piem., nekodīgas; vāji līdz stipri kodīgas), ko iespējams mērīt vai prognozēt ar VRM; ii) ir reprezentatīvas attiecībā uz validācijas pētījumā izmantotajām ķimikāliju klasēm; iii) atspoguļo VRM veiktspējas raksturlielumus; iv) ir ar labi definētu ķīmisku struktūru; v) ar in vivo testēšanas references metodi inducē skaidrus rezultātus; vi) ir komerciāli pieejamas; un vii) nav saistītas ar augstām likvidēšanas izmaksām.
2 Ķimikāliju klase, ko piešķīruši Barratt et al. (8).
3 ANO GHS/CLP 1.A, 1.B un 1.C kategorijai attiecīgās ANO iepakojuma grupas ir I, II un III.
4pH vērtības iegūtas no Fentem et al. (9) un Barratt et al. (8).
PROCEDŪRA
13.Uz žurkas ādas TEP balstītās ādas korozijas testēšanas metodes sakarā ir pieejamas darba standartprocedūras (SOP) (19). Šīs testēšanas metodes aptvertajām uz žurkas ādas TEP ādas balstītajām korozijas testēšanas metodēm būtu jāatbilst šādiem nosacījumiem:
Dzīvnieki
14.Būtu jāizmanto žurka, jo tās ādas jutība pret vielām šajā testēšanas metodē ir jau iepriekš pierādīta (10) un žurka ir vienīgais oficiāli validētais ādas avots (8) (9). Sevišķi liela nozīme ir žurku vecumam (laikā, kad ņem ādu) un līnijai, lai būtu droši, ka apmatojuma folikulas ir snaudas fāzē, kāda ir pirms pieauguša dzīvnieka apmatojuma augšanas sākšanās.
15.Jauniem, apmēram 22 dienas veciem (atvasināti no Wistar vai līdzīga līnija) žurku vīrišķā vai sievišķā dzimuma īpatņiem uzmanīgi nocērp muguras un sānu apmatojumu. Pēc tam dzīvniekus, rūpīgi slaukot, mazgā, cirpto vietu iemērcot antibiotiku šķīdumā (kas satur, piemēram, streptomicīnu, penicilīnu, hloramfenikolu un amfotericīnu koncentrācijā, kura iedarbīgi inhibē baktēriju augšanu). Trešajā vai ceturtajā dienā pēc pirmās mazgāšanas dzīvniekus atkal mazgā ar antibiotikām, un tos izmanto triju dienu laikā pēc otrās mazgāšanas, kad pēc apmatojuma noņemšanas stratum corneum ir atjaunojies.
Ādas disku preparātu sagatavošana
16.28–30 dienu vecumā dzīvniekus humāni nonāvē; vecums ir kritiski svarīgs. Tad ņem katra dzīvnieka muguras un sānu ādu, no kuras atdala zemādas taukus, tos uzmanīgi atslāņojot. Izgriež ādas diskus ar diametru apm. 20 mm. Ja pierādīts, ka pozitīvo un negatīvo kontroļu dati ir līdzvērtīgi datiem, kas iegūti, izmantojot svaigu ādu, āda var būt glabāta līdz disku izmantošanas brīdim.
17.Ādas disku novieto uz viena PTFE (politetrafluoretilēna) caurulītes gala tā, lai epidermālā virsma būtu kontaktā ar caurulīti. Pāri caurulītes galam ādas fiksēšanai uzmauc gumijas gredzenu, liekos audus nogriež. Pēc tam gumijas gredzena piestiprinājuma vietu PTFE caurulītei hermetizē, rūpīgi apziežot ar vazelīnu. Caurulīti ar atsperīgu spaili nostiprina receptora kamerā, kurā ir MgSO4 šķīdums (154 mM) (1. attēls). Ādas diskam jābūt pilnīgi iegremdētam MgSO4 šķīdumā. No vienas žurkas ādas var iegūt 10–15 diskus. Caurulītes un gredzena izmēri norādīti 2. attēlā.
18.Pirms sākt testēšanu, katra dzīvnieka ādai izdara kvalitātes kontroles procedūru, proti, izmēra divu ādas disku TEP. Lai pārējos diskus varētu izmantot testēšanas metodes vajadzībām, abu disku pretestībai jāpārsniedz 10 kΩ. Ja pretestība nesasniedz 10 kΩ, šīs ādas diski nav derīgi.
Testējamās ķimikālijas un kontrolvielu aplicēšana
19.Katrā izpildes reizē (eksperimentā) jāizmanto paralēlas pozitīvas un negatīvas kontroles, lai būtu nodrošināta adekvāta eksperimenta modeļa veiktspēja. Katrā izpildes reizē (eksperimentā) jāizmanto tikai viena dzīvnieka ādas diski. Pozitīvai un negatīvai kontrolei ieteicams izmantot attiecīgi 10 M sālsskābes un ūdens.
20.Šķidras testējamās vielas (150 μl) vienmērīgi aplicē uz epidermālās virsmas caurulītes iekšpusē. Testējot cietus materiālus, uz diska vienmērīgi aplicē tikdaudz cietās vielas, lai visa epidermālā virsma būtu pārklāta. Uz cietās vielas virsmas pievieno dejonizētu ūdeni (150μl) un cauruli viegli sakrata. Lai panāktu maksimālu saskari ar ādu, cietas vielas var būt jāuzsilda līdz 30 0 C, lai testējamo ķimikāliju izkausētu, padarītu mīkstāku vai sasmalcinātu, iegūstot granulveida vai pulverveida materiālu.
21.Katrai testējamai ķimikālijai un kontrolķimikālijai katrā testa izpildes reizē (eksperimentā) izmanto trijus ādas diskus. Testējamās ķimikālijas aplicē uz 24 stundām 20–23 ºC temperatūrā. Testējamo ķimikāliju noņem ar ūdensvada ūdens strūklu, kura temperatūra nepārsniedz istabas temperatūru, skalošanu beidzot, kad vairāk materiāla nav noņemams.
TEP mērīšana
22.Ādas pretestību mēra kā TEP, izmantojot Vitstona tiltu zemsprieguma maiņstrāvas režīmā (18). Tilta vispārīgie parametri ir darba spriegums 1–3 V, sinusoīdas veida vai taisnstūrveida maiņstrāva ar frekvenci 50–1000 Hz un mērījumu diapazons vismaz 0,1–30 kΩ. Ar validēšanai izmantoto mērtiltu virknes vai paralēlajā slēgumā tika mērīta induktivitāte, kapacitāte un pretestība attiecīgi līdz 2000 H, 2000 μF un 2 MΩ pie frekvences 100 Hz vai 1 kHz. TEP kodīguma testa vajadzībām mērījumi tiek atspoguļoti virknes slēgumam kā pretestība pie frekvences 100 Hz. Pirms elektriskās pretestības mērīšanas samazina ādas virsmas spraigumu, pievienojot tādu tilpumu 70 % etanola, lai būtu pārklāta epiderma. Pēc dažām sekundēm etanolu no caurulītes izlej un audus hidratē, pievienojot 3 mL MgSO4 šķīduma (154 mM). Mērtilta elektrodus novieto abās ādas diska pusēs, lai izmērītu ādas disku pretestību kΩ (1. attēls). Elektroda izmēri un elektroda daļas garums zem turētāja spailes aplūkojami 2. attēlā. Iekšējā elektroda turētāja spaile pretestības mērīšanas laikā balstās uz PTFE caurules, lai nodrošinātu, ka MgSO4 šķīdumā pastāvīgi ir iegremdēts vienāds elektroda garums. Ārējais elektrods receptora kamerā tiek ievietots tādā veidā, ka elektrods balstās pret kameras dibenu. Attālums starp atsperes spaili un PTFE caurulītes apakšu nedrīkst mainīties (2. attēls), jo šis attālums ietekmē iegūto pretestības vērtību. Tātad attālumam starp iekšējo elektrodu un ādas disku jābūt nemainīgam un iespējami mazam (1–2 mm).
23.Par 20 kΩ augstāku izmērītās pretestības vērtību var radīt arī uz ādas diska epidermālās virsmas palikušas testējamās ķimikālijas paliekas. Šo pārklājumu pilnīgāk likvidēt var mēģināt, piemēram, PTFE caurulīti hermētiski aizspiežot ar cimdotu īkšķi un apm. 10 sekundes pakratot; MgSo4 šķīdumu izlej un pretestības mērīšanu atkārto ar svaigu MgSO4 šķīdumu.
24.Iegūtās TEP vērtības var būt ietekmējuši testēšanai izmantotās aparatūras raksturlielumi, izmēri un eksperimenta procedūra. Kodīguma slieksnis 5 kΩ atvasināts, izmantojot datus, kas iegūti ar šajā metodes aprakstā norādīto specifisko aparatūru un procedūru. Ja tiek grozīti testēšanas nosacījumi vai ja izmanto citu aparatūru, var būt piemērojamas citas sliekšņvērtības un kontrolvērtības. Tādējādi metodika un pretestības sliekšņvērtības jākalibrē, testējot virkni standartvielu, kuras izraugās no validācijas pētījumā izmantoto vielu klāsta (8) (9) vai pētāmajām vielām līdzīgu ķimikāliju klašu vielām. Piemērotu standartvielu komplekss ir norādīts 1. tabulā.
Krāsvielu saistīšanas metodes
25.Saskarē ar noteiktiem nekodīgiem materiāliem pretestība var samazināties zem robežvērtības 5 kΩ, paverot iespēju joniem izkļūt caur stratum corneum un vēl samazinot elektrisko pretestību (9). Piemēram, neitrālas organiskās vielas un virsmaktīvas vielas (deterģenti, emulgatori u. c.) var noņemt ādas lipīdus, palielinot membrānas joncaurlaidību. Tāpēc, ja ar šādām ķimikālijām iegūtās TEP vērtības ir apmēram 5 kΩ vai mazākas, bet saskatāma ādas bojājuma nav, kontrolaudiem un apstrādātajiem audiem jānoteic krāsvielas penetrācija, lai noskaidrotu, vai iegūtās TEP vērtības ir ādas caurlaidības paaugstināšanās vai ādas korozijas rezultāts (7) (9). Pēdējā gadījumā, ja ir stratum corneum pārrāvumi, audu slāni zem ādas virsmas ātri penetrē un nokrāso uz tās aplicēta krāsviela sulforodamīns B. Minētā krāsviela ir stabila pret ļoti daudzu ķīmisko vielu iedarbību, kā arī ir stabila turpmāk aprakstītajā ekstrakcijas procedūrā.
Krāsvielas sulforodamīna B aplicēšana un noņemšana
26.Pēc TEP noteikšanas magnija sulfāta šķīdumu no caurulītes izlej un uzmanīgi apskatās, vai ādai nav acīmredzamu bojājumu. Ja acīmredzama liela bojājuma (piem., perforācijas) nav, katra ādas diska epidermālajai virsmai uz divām stundām aplicē 150 μl 10 % (masa/tilp.) krāsvielas sulfurodamīna (skābais sarkanais 52; C.I. 45100; CAS numurs 3520-42-1) šķīduma destilētā ūdenī. Lai visu lieko/nesaistīto krāsvielu noņemtu, ādas diskus pēc tam apmēram 10 sekundes skalo ar ūdensvada ūdeni, kura temperatūra nepārsniedz istabas temperatūru. Katru ādas disku no PTFE caurulītes piesardzīgi izņem un ievieto mēģenē (piemēram, 20 mL stikla scintilācijas mēģenē) ar dejonizētu ūdeni (8 ml). Mēģenes uzmanīgi 5 minūtes krata, lai noņemtu vēl jebkādu nesaistītu krāsvielu. Pēc tam skalošanas procedūru atkārto, tad ādas diskus izņem un ievieto mēģenēs ar 5 ml nātrija dodecilsulfāta (NDS) 30 % šķīdumu destilētā ūdenī un 60 ºC temperatūrā inkubē līdz nākamajai dienai.
27.Pēc inkubācijas visus ādas diskus izņem un atmet, bet šķīdumu 8 minūtes centrifugē 21 ºC temperatūrā (relatīvais centrbēdzes spēks ~ 175 × g). Paraugu, kurā ir 1 mL supernatanta, 1:5 (tilp./tilp) (t. i., 1 mL + 4 mL) atšķaida ar 30 % (masa/tilp) NDS šķīdumu destilētā ūdenī. Mēra šķīduma optisko blīvumu (OB) pie 565 nm.
Krāsvielas satura aprēķināšana
28.Krāsvielas sulforodamīna B saturu diskā aprēķina pēc OB vērtībām (9) (sulforodamīna B krāsvielas molārās ekstinkcijas koeficients pie 565 nm = 8,7 × 104; molekulmasa = 580). Krāsvielas saturu katram ādas diskam nosaka, izmantojot attiecīgo kalibrēšanas līkni, un pēc tam replikātiem aprēķina krāsvielas vidējo saturu.
Pieņemamības kritēriji
29.Vidējie TEP rezultāti ir derīgi, ja paralēlās pozitīvās un negatīvās kontroles vērtības atbilst diapazoniem, kas attiecībā uz šo metodi ir pieņemami testēšanas laboratorijā. Pieņemamie pretestības diapazoni attiecībā uz iepriekš aprakstīto metodoloģiju un aparātu ir norādīti šajā tabulā:
|
Kontrole
|
Viela
|
Pretestības diapazons (KΩ)
|
|
pozitīvā
|
1 M sālsskābes
|
0,5–1,0
|
|
negatīvā
|
Destilēts ūdens
|
10–25
|
30.Vidējie krāsvielas saistīšanas rezultāti derīgi ar nosacījumu, ka paralēlo kontroļu vērtības atbilst diapazoniem, kas attiecībā uz šo metodi ir pieņemami. Ieteicamie pieņemamie krāsvielas satura diapazoni kontrolvielām, kuras izmanto ar augstāk aprakstīto metodoloģiju un aparatūru, norādīti šajā tabulā:
|
Kontrole
|
Viela
|
Krāsvielas satura diapazons (μg/disks)
|
|
pozitīvā
|
1 M sālsskābes
|
40–100
|
|
negatīvā
|
Destilēts ūdens
|
15–35
|
Rezultātu interpretēšana
31.Šo testēšanas metodi optimizējot, noteikta, pirmsvalidācijas fāzē testēta un oficiālā validācijas pētījumā apstiprināta tika TEP robežvērtība, pie kuras kodīgas ķimikālijas tiek nošķirtas no nekodīgām.
32.Ar ANO GHS / CLP asociētais prognozēšanas modelis attiecībā uz ādas korozijas testēšanas metodi, kas balstās uz žurkas ādas TEP ir sniegts zemāk:
Uzskatāms, ka testējamā ķimikālija uz ādu kodīgi neiedarbojas:
I)ja attiecībā uz testējamo ķimikāliju iegūtā vidējā TEP vērtība ir lielāka par (>) 5 kΩ vai
II)attiecībā uz testējamo ķimikāliju iegūtā vidējā TEP vērtība ir mazāka par vai vienāda ar (>) 5 kΩ un
-ādas diski nav acīmredzami bojāti (piem., perforēti) un
-vidējais krāsvielas saturs uz disku ir mazāks par (<) vidējo krāsvielas saturu uz disku, kāds ir paralēlajai 10 M HCl pozitīvajai kontrolei (attiecībā uz pozitīvās kontroles vērtībām sk. 30. punktu).
Uzskatāms, ka testējamā ķimikālija uz ādu iedarbojas kodīgi:
I)ja attiecībā uz šo testējamo ķimikāliju vidējā TEP vērtība ir mazāka par vai vienāda ar (≤) 5 kΩ un šie ādas diski ir acīmredzami bojāti (piem., perforēti) vai
II)attiecībā uz testējamo ķimikāliju iegūtā vidējā TEP vērtība ir mazāka par vai vienāda ar (>) 5 kΩ un
-ādas diski nav acīmredzami bojāti (piem., perforēti), bet
-vidējais krāsvielas saturs uz disku ir lielāks par vai vienāds ar (≥) vidējo krāsvielas saturu uz disku, kāds ir paralēlajai 10 M HCl pozitīvajai kontrolei (attiecībā uz pozitīvajām kontrolvērtībām sk. 30. punktu).
33.Vienai atsevišķai testēšanas reizei (eksperimentam) ar vismaz trim ādas disku replikātiem jābūt pietiekamai gadījumos, kur testējamās ķīmiskās vielas klasifikācija ir nepārprotama. Tomēr ja rezultāti ir uz robežas, piemēram, replikātu mērījumiem trūkst konkordances un/vai vidējais TEP ir 5 ± 0.5 kΩ, jāapsver, vai nav vajadzīga otrā testēšanas reize (eksperiments), kā arī vai nav vajadzīga trešā, ja abu pirmo divu testēšanas reižu (eksperimentu) rezultāti nesakrīt.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Dati
34.Attiecīgā gadījumā testējamās ķimikālijas pretestības vērtības (kΩ) un krāsvielas satura vērtības (µg uz disku) būtu jāatspoguļo tabulas veidā, ieskaitot datus par katru atsevišķo replikāta disku katrā testēšanas reizē (eksperimentā) un vidējās vērtības ± standartnovirze. Jāatspoguļo visi eksperimentu atkārtojumi. Attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju ziņojumā būtu jāatspoguļo novērotie ādas disku bojājumi.
Testēšanas pārskats
35.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija un kontroles ķimikālijas:
-vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā un ja praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. c.;
-daudzkomponentu vielas, UVCB un maisījumi iespējami izsmeļoši raksturotas pēc to komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām;
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;
-avots, no kura dzīvnieki saņemti, sērijas numurs, ja zināms;
-testējamās ķimikālijas / kontrolvielas pirmstestēšanas apstrāde (piem., sildīšana, sasmalcināšana), ja tāda veikta;
-testējamās ķimikālijas stabilitāte, izmantošanas termiņš vai atkārtotas analīzes datums, ja tas zināms;
-glabāšanas apstākļi.
Testa dzīvnieki:
-izmantotā līnija un dzimums;
-par donordzīvniekiem izmantoto dzīvnieku vecums;
-avots, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.;
-detalizēta informācija par ādas preparātu sagatavošanu.
Testēšanas nosacījumi:
-testēšanas iekārtu kalibrēšanas līknes;
-krāsvielas saistīšanas testa izpildes kalibrācijas līknes, OB mērīšanai izmantotās vērtības un attiecīgā gadījumā mērierīces (piem., spektrofotometra) OB linearitātes diapazons;
-detalizēta informācija par TEP mērīšanai izmantoto testēšanas procedūru;
-attiecīgā gadījumā — detalizēta informācija par krāsvielas saistīšanas noteikšanai izmantoto procedūru;
-testā izmantotās devas, ekspozīcijas perioda vai periodu ilgums un ekspozīcijas temperatūra vai temperatūras;
-detalizēta informācija par mazgāšanas procedūru, ko izmanto pēc ekspozīcijas perioda;
-uz vienu testējamo ķimikāliju un uz kontrolēm (pozitīvo un negatīvo kontroli) izmantoto replicēto ādas disku skaits;
-testa procedūras modifikāciju apraksts, ja tādas bijušas;
-norāde uz modeļa vēsturiskajiem datiem. No tiem jānorāda vismaz:
I) pozitīvās un negatīvās kontroles TEP vērtību (izteiktas kΩ) pieņemamība ar norādi uz pozitīvās un negatīvās kontroles pretestības diapazoniem,
II)
pozitīvās un negatīvās kontroles krāsvielas satura vērtību (izteiktas µg/disc) pieņemamība ar norādi uz pozitīvās un negatīvās kontroles krāsvielas satura diapazoniem,
III)testa rezultātu pieņemamība ar norādi uz ādas disku replikātu vēsturisko mainību;
-izmantoto lēmuma pieņemšanas kritēriju / prognozēšanas modeļa apraksts.
Rezultāti:
-tabulas veidā apkopoti TEP un krāsas saistīšanas testu (attiecīgā gadījumā) dati par atsevišķām testējamām ķimikālijām un kontrolēm, sniegti par katru testēšanas reizi (eksperimentu) un katru ādas diska replikātu (pa atsevišķiem dzīvniekiem un atsevišķiem ādas paraugiem, vidējās vērtības, standartnovirze un variācijas koeficients;
-apraksts par jebkādu novērotu ietekmi;
-atvasinātā klasifikācija ar norādi uz izmantoto prognozēšanas modeli un/vai lēmuma pieņemšanas kritēriju.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at: [
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
].
(2)Chapter B.4 of this Annex, Acute Dermal Irritation, Corrosion.
(3)Chapter B.40bis of this Annex, In Vitro Skin Model.
(4)Chapter B.65 of this Annex, In Vitro Membrane Barrier Test Method.
(5)Chapter B.46 of this Annex, In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.
(6)OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(7)Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.
(8)Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.
(9)Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.
(10)Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.
(11)ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.
(12)EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.
(13)ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
(14)ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDermTM (EPI-200), EPISKINTM (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.
(15)OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(16)Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol.24, 507-512.
(17)Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.
(18)Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D'Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.
(19)TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.
(20) OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Devlopment, Paris.
1. attēls. Žurkas ādas TEP testa aparāts
2. attēls. Politetrafluoretilēna (PFTE) caurulītes, receptora kameras un elektrodu izmēri.
Attēlotā aparāta darbības kritiskie faktori:
-PTFE caurulītes iekšējais diametrs,
-elektrodu garumam attiecībā pret PTFE caurulīti un receptora kameru jābūt tādam, lai elektrodi nepieskartos ādas diskam un lai elektroda standartgarums būtu saskarē ar MgSO4 šķīdumu,
-MgSO4 šķīduma līmenim receptora kamerā jābūt tādam, lai attiecībā uz šķidruma līmeni PTFE caurulītē līmenis būtu kā 1. attēlā,
-lai elektriskās pretestības mērījums patiesi atspoguļotu ādas īpašības, ādas diskam jābūt pietiekami labi fiksētam pie PTFE caurulītes.
Papildinājums
DEFINĪCIJAS
Pareizība: pakāpe, kādā testēšanas metodes rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas mērs un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pašā nozīmē kā terminu “konkordantums”, ar to saprotot testēšanas metodes pareizo iznākumu īpatsvaru (20).
K: kodīga.
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Konkordantums: tādas testēšanas metodes veiktspējas mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži vien izmanto tādā pašā nozīmē kā terminu “pareizība”, ar to saprotot visu to testēto ķimikāliju īpatsvaru, kas pareizi klasificētas kā pozitīvas vai negatīvas. Konkordantums lielā mērā ir atkarīgs no to pozitīvo rezultātu prevalences, kādi iegūti attiecībā uz pētāmajiem testējamo ķimikāliju veidiem (20).
GHS (Ķīmisko vielu klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētā sistēma): sistēma, kas piedāvā ķimikāliju (vielu un maisījumu) klasifikāciju pa standartizētiem fizisko apdraudējumu, veselības apdraudējumu un vidisko apdraudējumu tipiem un līmeņiem un izmanto tādus attiecīgus komunikācijas elementus kā piktogrammas, signālvārdi, bīstamības apzīmējumi, drošības prasību apzīmējumi un drošības datu lapas, lai sniegtu informāciju par ķimikāliju nelabvēlīgo ietekmi un tādējādi aizsargātu cilvēkus (arī darba devējus un darba ņēmējus, transporta darbiniekus, patērētājus un avārijas dienestu darbiniekus) un vidi (1).
IATA: integrētā testēšanas un novērtēšanas pieeja.
Maisījums: maisījums vai šķīdums, kas sastāv no divām vai vairākām vielām.
Vienkomponenta viela: tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vismaz 80 % (masa/masa) veido viena galvenā sastāvdaļa.
Daudzkomponentu viela: tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vairāk nekā viena no galvenajām sastāvdaļām ir koncentrācijā ≥ 10 % (masa/masa) un < 80 % (masa/masa). Daudzkomponentu vielas tiek iegūtas ražošanas procesā. Atšķirība starp maisījumu un daudzkomponentu vielu ir tāda, ka maisījumu iegūst, divas vai vairākas vielas sajaucot bez ķīmiskas reakcijas. Daudzkomponentu viela rodas ķīmiskā reakcijā.
NK: nekodīgs.
OD: optiskais blīvums.
PK: pozitīvā kontrole, replikāts, kurā ir visi testēšanas sistēmas komponenti un kurš apstrādāts ar vielu, par ko zināms, ka tā inducē pozitīvu atbildreakciju. Lai būtu iespējams novērtēt pozitīvās kontroles atbildreakcijas mainību laikā, pozitīvās atbildreakcijas intensitāte nedrīkstētu būt pārāk liela.
Veiktspējas standarti (VS): uz validētu testēšanas metodi bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Tajos ietilpst: ((i) nepieciešamie testēšanas metodes komponenti; (ii) minimāls tādu references ķimikāliju saraksts, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; kā arī iii), uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — tādi paši ticamības un pareizības līmeņi, kā būtu jāiegūst ar novērtējamo testēšanas metodi, to izvērtējot ar references vielām no minimālā saraksta.
Relevantums: parametrs, kas raksturo testēšanas metodes un interesējošās ietekmes sakarību un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Pakāpe, kādā ar testēšanas metodi var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testēšanas metodes pareizības (konkordantuma) aspektu (20).
Ticamība: parametrs, kas izsaka, kādā pakāpē, izmantojot vienu un to pašu protokolu, kādu testēšanas metodi vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās ilgākā laika nogrieznī var izmantot reproducējami. To novērtē, aprēķinot intralaboratorisko un interlaboratorisko reproducējamību (20).
Jutība: tas, cik liela daļa no visām pozitīvajām/aktīvajām ķimikālijām ar šo testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tas ir tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (20).
Ādas korozija in vivo: neatgriezenisku ādas bojājumu rašanās; proti, redzama nekroze, kas caur epidermu skar dermu un radusies pēc tam, kad testējamā viela uz ādas aplicēta līdz četrām stundām. Tipiskas reakcijas uz kodīgumu ir čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērošanas perioda beigās — ādas izbalējuma radīta atkrāsošanās, ādas laukumi, kur izkritis apmatojums, un rētas. Neskaidros gadījumos bojājums jānovērtē histopatoloģiski.
Specifiskums: tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām ķimikālijām ar testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (20).
Viela: ķīmisks elements un tā dabiski radušies vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, ieskaitot to stabilizācijai nepieciešamās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušos piejaukumus, bet izņemot šķīdinātājus, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu.
(Testēšanas) reize: atsevišķas testējamās ķimikālijas paralēla testēšana ar vismaz trijiem replicētiem ādas diskiem.
Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
Transkutānā elektriskā pretestība (TEP): ādas elektriskās pretestības mērs, kas izteikts kiloomos (kΩ). Vienkārša un robusta metode, kā novērtē barjerfunkciju, ar Vitstona tilta palīdzību reģistrējot jonu pāreju caur ādu.
UVCB: vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli. ”;
(6) pielikuma B daļas B.40a nodaļu aizstāj ar šādu:
“B.40.a ĀDAS KOROZIJA IN VITRO: REKONSTRUĒTAS CILVĒKA EPIDERMAS RhE TESTS
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 431 (2016) aprakstītajam. Ādas korozija ir nepārejošs ādas bojājums, kas izpaužas kā tāda redzama nekroze visā epidermā, kura ietiecas dermā un radusies pēc tam, kad uz ādas aplicēta testējamā ķimikālija [atbilstoši definīcijai, kas dota Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētajā sistēmā (GHS) (1) un Eiropas Savienības (ES) Regulā Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (CLP regula)
]. Šīs atjauninātās testēšanas metodes B.40a aprakstā raksturota in vitro procedūra, kas dod iespēju saskaņā ar ANO GHS (1) un ar CLP identificēt nekodīgas un kodīgas vielas. Ar tās palīdzību kodīgas vielas ir iespējams arī daļēji iedalīt apakškategorijās.
2.Ķimikāliju ādas korozijas radīšanas potenciāla novērtēšana parasti bijusi saistīta ar laboratorijas dzīvnieku izmantošanu (TM B.4, līdzvērtīga ESAO TG 404; sākotnēji pieņemta 1981. g. un pārskatīta 1992., 2002. un 2015. g. (2). Lai testētu ķimikāliju potenciālu izraisīt ādas koroziju, bez pašreizējās testēšanas metodes B.40a validētas un pieņemtas ir tādas citas in vitro testēšanas metodes kā TM B.40a (ekvivalenta ESAO TG 430) (3) un TM B.65 (ekvivalenta ESAO TG 435) (4). Turklāt ādas kairinājuma potenciāla testēšanai ir pieņemta in vitro TM B.46 (ekvivalenta ESAO TG 439) (5). ESAO norādījumu dokuments par integrētu testēšanas un novērtēšanas pieeju (IATA) attiecībā uz ādas koroziju un kairinājumu apraksta vairākus moduļus, kādos grupēti informācijas avoti un analīzes instrumenti, un pirmkārt, sniedz norādījumus par to, kā, novērtējot ķimikāliju potenciālu radīt ādas kairinājumu un ādas koroziju, integrēt un izmantot jau esošos testēšanā un citādi iegūtos datus, un otrkārt, ierosina pieeju, ko izmantot, ja vajadzīga turpmāka testēšana (6).
3.Šis testēšanas metodes apraksts pievēršas tādam cilvēkveselības beigupunktam kā ādas korozija. Tas paredz izmantot rekonstruētu cilvēka epidermu (RhE) (iegūta no nepārveidotiem no cilvēka atvasinātiem epidermas keratinocītiem), kura tuvu atdarina cilvēka ādas augšējo slāņu jeb epidermas, histoloģiskās, morfoloģiskās, bioķīmiskās un fizioloģiskās īpašības. Attiecīgā testēšanas vadlīnija sākotnēji pieņemta 2004. gadā, 2013. gadā atjaunināta, lai tajā iekļautu papildu testēšanas metodes, kurās izmantoti RhE modeļi un paredzēta iespēja šīs metodes izmantot, lai uz tām balstītu kodīgu ķimikāliju iedalīšanu apakškategorijās, kā arī 2015. gadā atjaunināta, lai ietvertu atsauci uz IATA norādījumu dokumentu un ieviestu alternatīvu procedūru, ko izmanto dzīvotspējas mērīšanai.
4.Šajā testēšanas metodē ir iekļauti četri validēti komerciāli pieejami RhE modeļi. Ir veikti pirmsvalidācijas pētījumi(7), pēc kuriem izdarīts oficiāls validācijas pētījums par ādas korozijas (8)(9)(10) novērtēšanu (11) (12) attiecībā uz diviem komerciāli pieejamiem testa modeļiem, EpiSkin™ Standard Model (SM) un EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (tālākajā tekstā saukti par validētajām references metodēm — VRM). Šo pētījumu iznākumā radās ieteikums, ka divas iepriekš minētās VRM varētu izmantot regulatīvām vajadzībām, lai kodīgas (C) vielas atšķirtu no nekodīgām (NC) vielām, un ka turklāt EpiSkinTM var izmantot par atbalstu kodīgu vielu iedalīšanā apakškategorijās (13) (14) (15). Saskaņā ar validāciju, kas balstās uz PS, līdzīgus rezultātus kā VRM EpiDerm™ ir uzrādījuši vēl divi citi komerciāli pieejami in vitro ādas korozijas RhE testa modeļi (16) (17) (18). Tie ir SkinEthic™ RHE
un epiCS® (agrākais nosaukums EST-1000), un arī tos var regulatīviem nolūkiem izmantot kodīgu vielu atšķiršanai no nekodīgām vielām (19)(20). Pēcvalidācijas pētījumi, ko RhE modeļa izstrādātāji 2012. līdz 2014. gadā izdarījuši ar precizētu protokolu, ar kura palīdzību tika koriģēta interference, ko rada testējamo ķimikāliju izraisīta nespecifiska MTT redukcija, uzlaboja gan C/NC atšķiršanas veiktspēju, gan atbalstu kodīgo vielu iedalīšanai apakškategorijās (21) (22). Ar EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE un EpiCS® iegūtie pēcvalidācijas dati ir tālāk statistiski izanalizēti, lai apzinātu alternatīvus prognozēšanas modeļus, kas uzlabojuši prognozētspēju attiecībā uz apakškategorizēšanu (23).
5.Pirms kādu piedāvātu līdzīgu vai modificētu in vitro RhE testēšanas metodi, kas nav VRM, attiecībā uz ādas koroziju iespējams izmantot regulatīvām vajadzībām, saskaņā ar veiktspējas standartu (PS) (24) prasībām, kuras aprakstītas saskaņā ar ESAO norādījumu dokumenta Nr. 34 (25) principiem būtu jānosaka tās ticamība, relevantums (pareizība) un piedāvātā lietojuma ierobežojumi, lai būtu drošība par tās līdzību VRM. Datu savstarpējā atzīšana (Mutual acceptance of data) būs garantēta tikai tad, ja visas jaunierosinātās vai atjauninātās VS atbilstošās testēšanas metodes būs pārskatītas un iekļautas attiecīgajā testēšanas vadlīnijā. Minētajā testēšanas vadlīnijā iekļautos testa modeļus var izmantot, lai, turklāt izmantojot datu savstarpējās atzīšanas priekšrocības, apmierinātu valstu prasības attiecībā uz testu rezultātiem, kas iegūti ar kādu in vitro testēšanas metodi ādas korozijas noteikšanai.
DEFINĪCIJAS
6.Izmantotās definīcijas ir sniegtas 1. pielikumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI
7.Ar šīs testēšanas palīdzību iespējams saskaņā ar ANO GHS / CLP identificēt nekodīgas un kodīgas vielas un maisījumus. Šī testēšanas metode tālāk atbalsta kodīgu vielu un maisījumu apakškategorizēšanu ANO GHS (1) atbilstošā izvēles 1.A apakškategorijā un 1.B un 1.C apakškategorijas kombinācijā (21) (22) (23). Šo testēšanas metodi ierobežo nelielais labi zināmu 1.C apakškategorijas in vivo ādai kodīgu ķimikāliju kopums, tāpēc ar tās palīdzību saskaņā ar ANO GHS un ar CLP savstarpēji nošķirt “kodīgs ādai” 1.B un 1.C apakškategoriju nav iespējams. Iedalīšana apakškategorijās ir iespējama ar testēšanas modeļiem EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE un epiCS® testa modeļiem (proti, 1.A apakškategorija attiecībā pret 1.B un 1.C apakškategoriju un attiecībā pret NK).
8.Validācijā, kas atbalsta šajā testēšanas metodes aprakstā ietvertos testēšanas modeļus, kuri tiek izmantoti nekodīgu un kodīgu vielu identificēšanai, ķimikālijas ir testētas plašā klāstā, kurā galvenokārt pārstāvētas atsevišķas vielas; validācijas pētījuma empīriskajā datubāzē bija 60 ķimikāliju un tā aptvēra plašu ķimikāliju klašu klāstu (8) (9) (10). Testēšanas metodes izstrādātāji izdarīja testēšanu, kurā tika pierādīta testa jutība, specifiskums, pareizība un intralaboratoriskā reproducējamība tādām vajadzībām kā iedalīšana apakškategorijās, un rezultātus pārskatīja ESAO (21) (22) (23). Raugoties pēc pieejamiem vispārējiem datiem, šī testēšanas metode ir piemērojama plašam ķimikāliju klašu un agregātstāvokļu klāstam, ieskaitot šķidrumus, puscietas un cietas vielas, kā arī vaskus. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumi; cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja iespējams, cietas vielas pirms aplicēšanas jāsamaļ smalkā pulverī; nekāda cita priekšapstrāde paraugam nav vajadzīga. Ja pierādījumi liecina, ka šie testa modeļi kādai konkrētai testēšanas metodes apraksta aptvertai testējamo ķimikāliju kategorijai nav izmantojama, to attiecībā uz minēto konkrēto kategoriju neizmanto. Turklāt, paplašinot šīs testēšanas metodes izmantojamību attiecībā uz vielām, tiek uzskatīts, ka tā izmantojama arī attiecībā uz maisījumiem. Tomēr, ņemot vērā, ka maisījumi aptver plašu kategoriju un sastāva spektru un patlaban pieejams tikai nedaudz informācijas par maisījumu testēšanu, tad, ja var pierādīt testēšanas metodes nepiemērojamību konkrētai maisījumu kategorijai (piemēram, saskaņā ar stratēģiju, kas piedāvāta (26)), attiecīgo testēšanas metodi minētajai konkrētajai maisījumu kategorijai neizmanto. Pirms attiecībā uz maisījumu izmanto šo testēšanas metodi, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Ja pastāv normatīva prasība maisījumu testēt, tāda apsvēršana nav vajadzīga. Validācijas pētījumos vēl nav vērtēti gāzes un aerosoli (8) (9) (10). Kaut arī jādomā, ka vispār gāzes un aerosolus ar RhE tehnoloģiju testēt ir iespējams, ar pašreizējo testēšanas metodi tos testēt nevar.
9.Testējamās ķimikālijas, kas gaismu absorbē tādā pašā diapazonā kā MTT formazāns, un testējamās ķimikālijas, kas vitālo krāsvielu MTT spēj tieši reducēt (līdz MTT formazānam), var ietekmēt audu dzīvotspējas mērījumus un tādēļ koriģēšanai var būt nepieciešams izmantot pielāgotas kontroles. Tas, kāda veida pielāgotas kontroles var būt vajadzīgas, var mainīties atkarībā no tā, kāda veida interferenci testējamā ķimikālija rada, un atkarībā no MTT formazāna mērīšanai izmantotās procedūras (sk. 25.–31. punktu).
10.Lai arī ar šo testēšanas metodi nevar iegūt pietiekamu informāciju par ādas kairinājumu, jānorāda, ka tādai ietekmei uz veselību kā ādas kairinājums in vitro īpaši pievēršas TM B.46, kura balstās uz to pašu RhE testēšanas sistēmu, lai gan tai ir cits protokols (5). Attiecībā uz to, kā pilnīgi izvērtēt lokālo ietekmi uz ādu pēc vienreizējas dermālas ekspozīcijas, jāizmanto ESAO norādījumu dokuments par integrētajām testēšanas un novērtēšanas pieejām (6). Šajā IATA pieejā, pirms apsver, vai neveikt testēšanu ar dzīviem dzīvniekiem, izdara in vitro testus uz kodīgumu ādai (tādus, kā doti šajā metodes aprakstā) un kairinājumu ādai, Ir atzīts, ka cilvēka ādas izmantošanai jāatbilst nacionālām un starptautiskām ētikas normām un nosacījumiem.
TESTA PRINCIPS
11.Testējamo ķimikāliju vietēji aplicē uz trīsdimensiju RhE modeļa, kuru veido nepārveidoti cilvēka epidermas keratinocīti, kas kultivēti tā, lai veidotos labi diferencēts daudzslāņains cilvēka epidermas modelis. Tai ir bazālais, spinālais un granulārais slānis, kā arī vairākslāņu stratum corneum ar lamelāriem lipīdu starpšūnu slāņiem, kuru uzbūve ir reprezentatīva galvenajām lipīdu klasēm in vivo.
12.RhE testēšanas metodes pamatā ir premisa, ka kodīgas ķimikālijas difūzijas vai erozijas ceļā spēj izkļūt cauri stratum corneum un ka tās ir citotoksiskas apakšā esošo slāņu šūnām. Šūnu dzīvotspēju mēra pēc vitālās krāsvielas MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds, tiazolila zilais tetrazolija bromīds; CAS Nr. 298-93-1] fermentatīvās pārvēršanās par zilas krāsas formazāna sāli, kura daudzumu kvantitatīvi nosaka audu ekstraktā (27). Kodīgas ķimikālijas identificē pēc to spējas šūnu dzīvotspēju samazināt zem noteiktām sliekšņvērtībām (sk. 35. un 36. punktu). Ir parādīts, ka uz RhE balstītā ādas korozijas testēšanas metode spēj prognozēt trušiem saskaņā ar TM B.4 novērtētu ādas korozijas ietekmi in vivo (2).
KOMPETENCES PIERĀDĪŠANA
13.Pirms kādu no četriem šai testēšanas metodei atbilstošajiem validētajiem RhE testa modeļiem sāk izmantot regulāri, laboratorijām ieteicams pierādīt tehnisko kompetenci, pareizi saklasificējot divpadsmit 1. tabulas sarakstā norādītās standartvielas. Ja izmanto metodi, kura paredzēta sīkākai klasificēšanai, jāpierāda arī, ka pareizi tiek veikta iedalīšana apakškategorijās. Gadījumos, kur kāda sarakstā norādīta viela nav pieejama vai kur tas attaisnojami, var izmantot citu vielu, par kuru pieejami pietiekami in vivo un in vitro references dati (piem., vielu no references ķimikāliju saraksta (24)), ja vien tiek izmantoti tie paši 1. tabulā aprakstītie izraudzīšanās kritēriji.
1. tabula. Standartvielu1 saraksts
|
Viela
|
CAS Nr.
|
Ķimikāliju klase2
|
ANO GHS/CLP kat. uz in vivo rezultātu bāzes3
|
VRM
kat. uz
in vitro rezultātu4 bāzes
|
MTT
Reducētājs5
|
Agregāt-
stāvoklis
|
|
1.A kategorija, In Vivo kodīgas vielas
|
|
brometiķskābe
|
79-08-3
|
organiska skābe
|
1.A
|
(3) 1.A
|
–
|
CV
|
|
bora trifluorīddihidrāts
|
13319-75-0
|
neorganiska skābe
|
1.A
|
(3) 1.A
|
–
|
Š
|
|
fenols
|
108-95-2
|
fenols
|
1.A
|
(3) 1.A
|
–
|
CV
|
|
dihloracetil-
hlorīds
|
79-36-7
|
elektrofīla viela
|
1.A
|
(3) 1.A
|
–
|
Š
|
|
Apakškategoriju 1B-un-1C kombinācija, In Vivo kodīgas vielas
|
|
glioksilskābes monohidrāts
|
563-96-2
|
organiska skābe
|
1B-un-1C
|
(3) 1B-un-1C
|
–
|
S
|
|
pienskābe
|
598-82-3
|
organiska skābe
|
1B-un-1C
|
(3) 1B-un-1C
|
–
|
L
|
|
etanolamīns
|
141-43-5
|
organiska bāze
|
1B
|
(3) 1B-un-1C
|
jā
|
viskoza viela
|
|
hlorūdeņražskābe (14,4 %)
|
7647-01-0
|
neorganiska skābe
|
1.B-un-1.C
|
(3) 1.B-un-1.C
|
–
|
L
|
|
in vivo nekodīgas vielas (vielas, kas nav kodīgas)
|
|
fenetilbromīds
|
103-63-9
|
elektrofīla viela
|
NK
|
(3) NK
|
jā
|
Š
|
|
4-amino-1,2,4-
triazols
|
584-13-4
|
organiska bāze
|
NK
|
(3) NK
|
–
|
CV
|
|
4-(metiltio)-
benzaldehīds
|
3446-89-7
|
elektrofīla viela
|
NK
|
(3) NK
|
jā
|
Š
|
|
laurīnskābe
|
143-07-7
|
organiska skābe
|
NK
|
(3) NK
|
–
|
CV
|
Saīsinājumi: CAS Nr. = Chemical Abstracts Service reģistra numurs VRM = validēta references metode; NK = nekodīga viela; CV = cieta viela; Š = šķidrums.
1 Standartvielas, kas sagrupētas vispirms kodīgās un nekodīgās vielās, pēc tam pa kodīguma apakškategorijām un tad pa ķimikāliju klasēm, tika izraudzītas no vielām, kuras tika izmantotas ECVAM EpiSkin™ un EpiDerm™ validācijas pētījumos (8) (9) (10) un pēcvalidācijas pētījumos, kuru pamatā ir EpiSkin™ (22), EpiDerm™, SkinEthic™ un epiCS® izstrādātāju sagādātie dati (23). Ja nav norādīts citādi, vielas testētas tīrības līmenī, kāds piemīt komerciāli iegādātai vielai (8). Izlasē, cik vien iespējams, iekļautas vielas, kas: i) ir reprezentatīvas attiecībā uz to kodīguma atbildreakciju diapazonu (piem., nekodīgas, vāji līdz stipri kodīgas), ko iespējams mērīt vai paredzēt ar VRM, ii) ir reprezentatīvas attiecībā uz validācijas pētījumos izmantotajām ķimikāliju klasēm, iii) ir ar labi definētu ķīmisku struktūru, iv) ar VRM inducē reproducējamus rezultātus, v) ar in vivo testēšanas references metodi inducē skaidrus rezultātus; vi) ir komerciāli pieejamas un vii) nav saistītas ar augstām likvidēšanas izmaksām.
2 Ķimikāliju klasi piešķīruši Barratt et al. (8).
3 Attiecīgās ANO iepakojuma grupas attiecīgi priekš ANO GHS/CLP 1.A, 1.B un 1.C kategorijas ir ir I, II un III.
4 Šajā tabulā atspoguļotās VRM in vitro prognozes iegūtas ar testa modeļiem EpiSkin™ un EpiDerm™ (VRM) testēšanas metodes izstrādātāju veiktā pēcvalidācijas testēšanā.
5 ECVAM ādas korozijas validācijas pētījumos iegūtās vērtības, kas raksturo ādas dzīvotspēju, netika koriģētas attiecībā uz tiešo MTT redukciju (validācijas pētījumos netika izdarītas kontroles ar nonāvētiem audiem). Tomēr šajā tabulā sniegtie testēšanas metodes izstrādātāju radītie pēcvalidācijas dati iegūti ar pielāgotām kontrolēm (23).
14.Kompetences pierādīšanā lietotājam ieteicams pēc audu saņemšanas verificēt, ka to barjerīpašības atbilst RhE modeļa ražotāja dotajai specifikācijai. Īpaši svarīgi tas ir tad, ja audu sūtījums piegādāts no tālienes vai piegāde bijusi ilga. Kad testēšanas metode sekmīgi apgūta un kompetence tās izmantošanā pierādīta, šādu verifikāciju vairs nav nepieciešams veikt katru reizi. Tomēr, ja testēšanas metodi izmanto parastajā praksē, barjerfunkciju ieteicams joprojām novērtēt regulāri.
PROCEDŪRA
15.Tālāk vispārīgi aprakstīti šīs testēšanas metodes aptverto ādas korozijas novērtēšanai paredzēto RhE testēšanas modeļu komponenti un procedūras. RhE modeļus, kas atzīti par zinātniski derīgiem izmantošanai šajā testēšanas metodē, proti, modeļus EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE un epiCS® (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33), var iegūt no komerciāliem piegādātājiem. Attiecībā uz šiem četriem RhE modeļiem ir pieejamas darba standartprocedūras (SOP), un pārskats par šo modeļu testēšanas metodes galvenajiem komponentiem sniegts 2. papildinājumā. Jebkuru no šiem modeļiem īstenojot un izmantojot laboratorijā, ieteicams iepazīties ar attiecīgo SOP. Testēšanai ar šīs testēšanas metodes aptvertajiem četriem RhE testēšanas modeļiem būtu jāatbilst tālāk minētajiem nosacījumiem.
RHE TESTĒŠANAS METODES KOMPONENTI
Vispārīgie nosacījumi
16.Epitēlija rekonstruēšanai jāizmanto nepārveidoti cilvēka keratinocīti. Zem funkcionējoša stratum corneum jābūt vairākiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu slāņiem (bazālajam slānim, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum jābūt vairākslāņainam, ar tādu esenciālo lipīdu profilu, lai izveidotos funkcionāla barjera, kura ir pietiekami robusta, lai nepieļautu citotoksisku etalonķimikāliju, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS) vai Triton X-100, ātru penetrēšanos. Barjerfunkcija būtu uzskatāmi jāpierāda, un šo funkciju iespējams novērtēt, vai nu nosakot, pie kādas koncentrācijas etalonķimikālija pēc noteikta ekspozīcijas laika par 50 % samazina audu dzīvotspēju (IC50), vai nosakot, kāds ekspozīcijas laiks vajadzīgs, lai pēc tam, kad konkrētā noteiktā koncentrācijā aplicēta etalonķimikālija (sk. 18. punktu), par 50 % samazinātos šūnu dzīvotspēja (ET50). RhE modeļa aizturētājīpašībām jābūt tādām, lai ap stratum corneum esošais materiāls nenokļūtu dzīvotspējīgos audos, kā dēļ var tikt nepareizi modelēta ādas ekspozīcija. RhE modelis nedrīkst būt kontaminēts ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu vai sēnītēm.
Funkcionālie nosacījumi
Dzīvotspēja
17.Audu dzīvotspējas kvantitatīvai noteikšanai izmanto MTT testu (27). RhE audu modeļa dzīvotspējīgās šūnas vitālo krāsvielu MTT spēj reducēt par zilas krāsas MTT formazāna nogulsnēm, kuras pēc tam no audiem tiek ekstrahētas ar izopropanola (vai līdzīga šķīdinātāja) starpniecību. Jau paša ekstrakcijas šķīduma optiskajam blīvumam (OB) jābūt pietiekami zemam, t. i., OB < 0,1. Ekstrahēto MTT formazānu kvantitatīvi var izteikt, vai nu izmantojot standartabsorbcijas OB mērīšanu, vai HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (38). RhE modeļa lietotājiem jānodrošina, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst negatīvās kontroles vajadzībām definētajiem kritērijiem. RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam jānosaka negatīvās kontroles OB vērtību pieņemamības diapazons (augšējā un apakšējā robežvērtība). Četru validēto šajā testēšanas metodē iekļauto RhE testa modeļu negatīvās kontroles OB vērtību pieņemamības diapazoni ir norādīti 2. tabulā. HPLC/UPLC spektrofotometrijas lietotājam par negatīvās kontroles pieņemšanas kritēriju jāizmanto 2. tabulā norādītie negatīvās kontroles OB diapazoni. Jādokumentē, vai visā ekspozīcijas periodā ar negatīvo kontroli apstrādātie audi kultūrā ir stabili (uzrāda tādus pašus OB rādītājus).
2. tabula. Partijas kvalitātes kontrolei paredzētie negatīvās kontroles optiskā blīvuma vērtību pieņemamības diapazoni
|
|
Apakšējā pieņemamības robežvērtība
|
Augšējā pieņemamības robežvērtība
|
|
EpiSkin™
|
> 0,6
|
< 1,5
|
|
EpiDerm™ SCT (EPI-200)
|
> 0,8
|
< 2,8
|
|
SkinEthic™ RHE
|
> 0,8
|
< 3,0
|
|
epiCS®
|
> 0,8
|
< 2,8
|
Barjerfunkcija
18.Stratum corneum un tā lipīdsastāvam jābūt pietiekamam, lai nepieļautu noteiktu citotoksisku etalonķimikāliju, piemēram, SDS vai Triton X-100, strauju penetrēšanos, un to nosaka ar IC50 vai ET50 (3. tabula). RhE modeļa izstrādātājam/tirgotājam, piegādājot audus galalietotājam, jāpierāda katras izmantotā RhE modeļa partijas barjerfunkcija (sk. 21. punktu).
Morfoloģija
19.RhE modelis būtu histoloģiski jāizmeklē, pierādot, ka tam ir vairākslāņu struktūra, kas ir tāda pati kā cilvēka epidermas struktūra un satur stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum un stratum corneum, un cilvēka epidermas lipīdprofilam līdzīgs lipīdprofils. RhE modeļa izstrādātājam/tirgotājam, piegādājot audus galalietotājam, jāiesniedz katras izmantotā RhE modeļa partijas histoloģisks izmeklējums, kas pierāda, ka tam piemīt vajadzīgā audu morfoloģija (sk. 21. punktu).
Reproducējamība
20.Testēšanas metodes lietotājiem būtu jāpierāda šo testēšanas metožu reproducējamība, tās izmantojot ilgākā laika nogrieznī ar pozitīvajām un negatīvajām kontrolēm. Turklāt šī testēšanas metode būtu jāizmanto tikai tad, ja RhE modeļa izstrādātājs/piegādātājs sagādā datus, kas pierāda metodes reproducējamību, to izmantojot ilgākā laika nogrieznī ar kodīgām un nekodīgām ķimikālijām no, piem., kontrolvielu saraksta (1. tabula). Ja kādu no testēšanas metodēm izmanto iedalīšanai apakškategorijās, jāpierāda arī reproducējamība attiecībā uz iedalīšanu apakškategorijās.
Kvalitātes kontrole (QC)
21.RhE modelis jāizmanto tikai tad, ja izstrādātājs/piegādātājs pierādījis, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst definētajiem produkcijas pieņemamības kritērijiem, kuru vidū svarīgākie ir dzīvotspēja (17. punkts), barjerfunkcija (18. punkts) un morfoloģija (19. punkts). Šos datus dara pieejamus testēšanas metodes lietotājiem, lai tie šo informāciju varētu iekļaut testēšanas pārskatā. Kodīgu vielu klasificēšanā uzticamām prognozēm der tikai rezultāti, kas iegūti ar kvalitātes kontrolē pieņemtām audu partijām. RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam jānosaka IC50 vai ET50 vērtību pieņemamības diapazons (augšējā un apakšējā robežvērtība). Pieņemamības diapazoni attiecībā uz četriem validētajiem testa modeļiem ir norādīti 3. tabulā.
3. tabula. Partiju caurlaišanas QC kritēriji
|
|
Apakšējā pieņemamības robežvērtība
|
Augšējā pieņemamības robežvērtība
|
|
EpiSkin™
(18 stundas ilga apstrāde
ar SDS (33).
|
IC50 = 1,0 mg/ml
|
IC50 = 3,0 mg/ml
|
|
EpiDerm™ SCT (EPI-200)
(1 % Triton X-100)(34)
|
ET50 = 4,0 stundas
|
ET50 = 8,7 stundas
|
|
SkinEthic™ RHE
(1 % Triton X-100)(35)
|
ET50 = 4,0 stundas
|
ET50 = 10,0 stundas
|
|
epiCS®
(1 % Triton X-100)(36)
|
ET50 = 2,0 stundas
|
ET50 = 7,0 stundas
|
Testējamās ķimikālijas un kontrolķimikāliju aplicēšana
22.Uz katru testējamo ķimikāliju un kontrolēm un katru ekspozīcijas laiku jāizmanto vismaz divi audu replikāti. Testējamās ķīmiskās vielas, kas ir šķidrumi vai cietas vielas, uz epidermas virsmas vienmērīgā slānī jāaplicē pietiekamā daudzumā, t. i., vismaz 70 μl/cm2 vai 30 mg/cm2, raugoties, lai netiktu testēta nefiksēta deva. Atkarībā no modeļa, lai nodrošinātu iespējami labāku testējamās vielas saskari ar epidermas virsmu, testējot cietas vielas, epidermas virsma vispirms jāsamitrina ar dejonizētu vai destilētu ūdeni, un tikai tad var aplicēt vielu (34) (35) 36) (37). Ja vien iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Aplicēšanas metodei jābūt testējamai ķimikālijai piemērotai (sk., piem., atsauces (34–37)). Ekspozīcijas perioda beigās testējamā ķimikālija no epidermas virsmas rūpīgi jānoskalo ar buferšķīdumu uz ūdens bāzes vai 0,9 % NaCl šķīdumu. Atkarībā no tā, kurš no četriem validētajiem RhE testēšanas modeļiem tiek izmantots, uz katru testējamo ķimikāliju tiek izmantot divi vai trīs ekspozīcijas laiki (attiecībā uz visiem četriem derīgajiem RhE modeļiem 3 min un 1 h; attiecībā uz EpiSkinTM papildu ekspozīcijas laiks četras stundas). Atkarībā no izmantotā RhE testēšanas modeļa un novērtētā ekspozīcijas perioda, inkubācijas temperatūra ekspozīcijas laikā var variēt no istabas temperatūras līdz pat 37 °C.
23.Katrā izpildes reizē jāizmanto paralēlā negatīvā kontrole un pozitīvā kontrole (PC), lai pierādītu, ka audu dzīvotspēja (izmanto negatīvās kontroles), barjerfunkcija un no tās izrietošais audu jutīgums (izmanto PC) ietilpst noteiktā vēsturiskā pieņemamības diapazonā. Ierosinātās pozitīvās kontroles ķimikālijas atkarībā no izmantotā RhE modeļa ir ledus etiķskābe vai 8N KOH. Jāņem vērā, ka 8N KOH ir tiešs MTT reducētājs, attiecībā uz kuru varētu būt vajadzīgas 25. un 26. punktā aprakstītās pielāgotās kontroles. Ieteicamās negatīvās kontroles vielas ir 0,9 % NaCl šķīdums vai ūdens.
Šūnu dzīvotspējas mērījumi
24.Šūnu dzīvotspējas mērīšanai šajā testēšanas metodē būtu jāizmanto MTT tests, kas ir kvantitatīvs tests (27). Audu paraugu uz 3 stundām ievieto attiecīgas koncentrācijas (piemēram, 0,3–1 mg/ml) MTT šķīdumā. Pēc tam iegūtās zilas krāsas formazāna nogulsnes ekstrahē ar šķīdinātāju (piemēram, izopropanolu vai paskābinātu izopropanolu) un nosaka formazāna koncentrāciju, mērot optisko blīvumu pie viļņa garuma 570 nm ar frekvenču joslas filtru, kura maksimums ir± 30 nm, vai izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (sk. 30. un 31. punktu) (38).
25.Testējamās ķimikālijas ar MTT testu var interferēties, MTT tieši reducējoties līdz zilajam formazānam un/vai notiekot krāsu interferencei, ja testējamajai ķimikālijai absorbcija dabiski vai apstrādes procedūru rezultātā notiek tajā pašā OB diapazonā kā formazānam (570 ± 30 nm, galvenokārt zilas un violetas ķimikālijas). Būtu jāizmanto tādas papildu kontroles, kurās detektē un ievērtē šādu testējamo ķimikāliju izraisītu potenciālo interferenci, kā, piemēram, nespecifiskās MTT redukcijas kontrole (NSMTT kontrole) un nespecifiskas krāsas kontrole (NSC kontrole) (sk. 26. līdz 30. punktu). Tas ir īpaši svarīgi tad, ja kāda konkrēta testējamā ķimikālija no audiem netiek pilnīgi noskalota vai izkļūst caur epidermu un tātad brīdī, kad tiek veikts dzīvotspējas tests ar MTT, atrodas šajos audos. Detalizēts apraksts, kā ievērtēt tiešo MTT reducēšanos un krāsvielu radītas interferences, atrodams testa modeļiem paredzētajās SOP (34) (35) (36) (37).
26.Lai noteiktu tiešus MTT reducētājus, katra testējamā ķimikālija jāpievieno svaigi sagatavotai MTT “barotnei” (34) (35) (36) (37). Ja testējamo ķimikāliju saturošais MTT maisījums iekrāsojas zils/violets, uzskata, ka testējamā ķimikālija tieši reducē MTT, un neatkarīgi no tā, vai mēra standartabsorbciju (OB) vai izdara HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru, tālāk jāizdara funkcionāla pārbaude ar dzīvnotnespējīgu epidermu. Šajā papildu funkcionālajā pārbaudē izmanto nonāvētus audus, kam piemīt tikai reziduāla metaboliska aktivitāte, taču testējamo ķimikāliju tie absorbē līdzīgā daudzumā kā dzīvotspējīgi audi. Katru MTT reducētāju ķimikāliju uz vienu ekspozīcijas laiku aplicē vismaz diviem nonāvētu audu replikātiem, ar kuriem veic pilnu ādas korozijas testu. Pēc tam aprēķina audu faktisko dzīvotspēju, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar MTT reducētājam eksponētiem dzīviem audiem, atņemot procentuālo nespecifisko MTT redukciju, kas iegūta ar tam pašam MTT reducētājam eksponētiem nonāvētiem audiem un aprēķināta attiecībā pret negatīvo kontroli, kura izpildīta paralēli koriģējamam testam (% NSMTT).
27.Lai noteiktu iespējamo interferenci, ko rada krāsainas testējamās ķimikālijas vai testējamās ķimikālijas, kuras saskarē ar ūdeni vai izopropanolu iekrāsojas, un izlemtu, vai nav vajadzīgas papildu kontroles, jāizdara testējamās ķimikālijas spektrālanalīze ūdenī (ekspozīcijas vide) un/vai izopropanolā (ekstrakcijas šķīdums). Ja testējamā ķimikālija ūdenī un/vai izopropanolā absorbē gaismu 570 ± 30 nm diapazonā, jāizdara vēl papildu kontroles ar krāsvielām vai arī jāizmanto HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūra, kuras gadījumā kontroles nav vajadzīgas (sk. 30. un 31. punktu). Mērot standartabsorbciju OB, katru interferējošo krāsaino testējamo ķimikāliju vienā ekspozīcijas laikā aplicē uz vismaz diviem dzīvotspējīgu audu replikātiem, kuriem izdara visu ādas korozijas testu, taču, lai iegūtu nespecifiskas krāsas (NSCliving) kontroli, MTT inkubācijas solī tos inkubē barotnē, nevis MTT šķīdumā. Sakarā ar to, ka dzīviem audiem piemīt bioloģiska mainība, par katru krāsaino testējamo ķimikāliju katrā izpildes reizē uz ekspozīcijas laiku jābūt paralēlai kontrolei NSCliving. Pēc tam aprēķina audu faktisko dzīvotspēju, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar interferējošai testējamajai ķimikālijai eksponētiem un MTT šķīdumā inkubētiem dzīviem audiem, atņemot procentuālo nespecifisko krāsu, kas iegūta ar interferējošai testējamai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, kuri paralēli koriģējamam testam inkubēti barotnē bez MTT (%NSCliving).
28.Mērot tādu testējamo ķimikāliju standartabsorbciju OB, par kurām konstatēts, ka tās gan tieši reducē MTT (sk. 26. punktu), gan izraisa krāsu interferenci (sk. 27. punktu), papildus iepriekšējos punktos aprakstītajām kontrolēm NSMTT un NSCliving jābūt arī kādam trešajam kontroļu kopumam. Tas parasti attiecas uz MTT testā interferējošām tumšas (piem., zilas, violetas, melnas) krāsas testējamajām ķimikālijām, jo raksturīgās krāsas dēļ ir grūti novērtēt to spēju tieši reducēt MTT, kā aprakstīts 26. punktā. Šīs testējamās ķimikālijas var piesaistīties gan dzīviem, gan nonāvētiem audiem, un tāpēc ar kontroli var NSMTT koriģēt ne tikai iespējamu tiešu MTT redukciju, ko izraisījusi testējamā ķimikālija, bet arī krāsas interferenci, ko radījusi testējamās ķimikālijas piesaistīšanās nonāvētajiem audiem. Tādējādi koriģēšana attiecībā uz krāsas interferenci var notikt dubultā, jo krāsas interference, ko radījusi testējamās ķimikālijas saistīšanās ar dzīviem audiem, jau tiek koriģēta ar kontroli NSCliving. Lai nepieļautu varbūtību, ka krāsas interference tiek koriģēta divreiz, jāizdara trešā kontrole attiecībā uz nespecifisku krāsu nonāvētajos audos (NSCkilled). Šajā papildu kontrolē testējamo ķimikāliju uz katru ekspozīcijas laiku aplicē vismaz diviem nonāvēto audu replikātiem, kam veic visu testēšanas procedūru, taču MTT inkubācijas posmā tos inkubē nevis MTT šķīdumā, bet gan barotnē. Neatkarīgi no veikto testu/izpildes reižu skaita attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju pietiek ar vienu kontroli NSCkilled, taču tā jāizdara paralēli kontrolei NSMTT un, ja iespējams, ar to pašu audu partiju. Pēc tam aprēķina audu faktisko dzīvotspēju, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, atņemot % NSMTT un % NSCliving un pieskaitot procentuālo nespecifisko krāsu, kas iegūta ar interferējošai testējamajai ķimikālijai eksponētiem un barotnē bez MTT inkubētiem nonāvētajiem audiem un aprēķināta attiecībā pret negatīvo kontroli, kura izpildīta paralēli koriģējamam testam (% NSCkilled).
29.Svarīgi ievērot, ka nespecifiskas MTT redukcijas un nespecifiskas krāsas interferenču dēļ var tikt iegūti audu ekstrakta rādījumi, kas pārsniedz spektrofotometra linearitātes diapazonu. Tādēļ katrai laboratorijai, pirms regulatīvos nolūkos sākt testēt testējamas ķimikālijas, jānosaka sava spektrofotometra linearitātes diapazons, izmantojot komerciāli pieejamu MTT formazānu (CAS Nr. 57360-69-7). Ja tādu audu ekstraktu optiskais blīvums, kas iegūti ar testējamo ķimikāliju, neveicot korekciju attiecībā uz tiešu MTT redukciju un/vai krāsas interferenci, ir spektrofotometra lineārā diapazona robežās vai ar testējamo ķimikāliju iegūtā nekoriģētā procentuālā dzīvotspēja jau ir ≤ 50 %, tiešo MTT reducētāju un interferējošas krāsas testējamo ķimikāliju novērtēšanai ar spektrofotometru ir lietderīgi mērīt standartabsorbciju (OB). Tomēr rezultāti attiecībā uz tādām testējamām ķimikālijām, kurām % NSMTT un/ vai % NSCliving > 50 % no negatīvās kontroles, jāinterpretē piesardzīgi.
30.Attiecībā uz testējamām krāsainām ķimikālijām, kuras standartabsorbcijas (OB) mērījumiem nav piemērotas, jo pārāk stipri interferē ar MTT testu, MTT formazāna mērīšanai var izmantot alternatīvo HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (sk. 31. punktu) (37). HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēma dod iespēju MTT formazānu pirms tā kvantitatīvas noteikšanas atdalīt no testējamās ķimikālijas (38). Tāpēc neatkarīgi no testējamās ķimikālijas, ja tiek izmantota HPLC/UPLC spektrofotometrija, NSCliving vai NSCkilled kontroles nav jāveic. Taču, ja ir aizdomas, ka testējamā ķimikālija tieši reducē MTT, vai tai ir krāsa, kas traucē novērtēt ķimikālijas spēju tieši reducēt MTT (kā aprakstīts 26. punktā), ir jāizmanto NSMTT kontroles. MTT formazāna mērīšanai izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometriju, kā MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, procentuālo attiecību pret MTT formazāna smailes laukumu, kas iegūts ar paralēlo negatīvo kontroli, aprēķina audu procentuālo dzīvotspēju. Attiecībā uz testējamām ķimikālijām, kas spēj tieši reducēt MTT, audu faktisko dzīvotspēju aprēķina, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, atņemot % NSMTT. Visbeidzot jāatzīmē, ka nav iespējams novērtēt tādus tiešus MTT reducētājus, kuri arī var radīt krāsas interferenci, kuri pēc apstrādes saglabājas audos un kuri MTT reducē tik spēcīgi, ka testētā audu ekstrakta OB (izmantojot standarta OB mērīšanu) vai smailes laukumi (izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometriju) pārsniedz spektrofotometra linearitātes diapazonu, taču šādi gadījumi ir ļoti reti.
31.Ar jebkāda veida testējamām ķimikālijām (krāsainas, bezkrāsainas, MTT reducētājas un MTT nereducētājas) MTT formazāna mērīšanai var izmantot arī HPLC/UPLC spektrofotometriju (38). Tā kā HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas ir daudzveidīgas, pirms HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu izmanto, lai kvantitatīvi noteiktu MTT formazānu no audu ekstraktiem, būtu jāpierāda minētās sistēmas kvalifikācija, izpildot pieņemamības kritērijus, kas noteikti attiecībā uz tādu kvalifikācijas standartparametru kopumu, kuru pamatā ir ASV Pārtikas un zāļu pārvaldes izstrādātās nozares vadlīnijās par bioanalītisko metožu validēšanu aprakstītie parametri (38) (39). Šie galvenie parametri un to pieņemamības kritēriji ir norādīti 4. papildinājumā. Kad 4. papildinājumā noteiktie pieņemamības kritēriji izpildīti, HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu uzskata par kvalificētu un gatavu tam, lai noteiktu MTT formazāna daudzumu, ievērojot šīs testēšanas metodes aprakstā sniegtos eksperimentēšanas nosacījumus.
Pieņemamības kritēriji
32.Attiecībā uz jebkuru testēšanas metodi, kurā tiek izmantoti derīgi RhE modeļi, ar negatīvo kontroli apstrādātu audu optiskajam blīvumam vajadzētu atbilst 2. tabulā aprakstīto audu kvalitātei un tas nedrīkstētu būt mazāks par vēsturiski noteiktajām robežvērtībām. Ar PK, proti, ledus etiķskābi vai 8N KOH apstrādātajiem audiem būtu jāatspoguļo audu spēja reaģēt uz kodīgu ķimikāliju apstākļos, kur ievēroti testēšanas modeļa nosacījumi (sk. 2. papildinājumu). Testējamai ķimikālijai un/vai kontrolķimikālijām izmantoto audu replikātu mainībai jābūt robežās, kas pieņemtas attiecībā uz katru derīgo RhE modeli izvirzītajās prasībās (sk. 2. papildinājumu) (piem., divu audu replikātu mainības starpība nedrīkst pārsniegt 30 %). Ja kādā izpildes reizē iekļautā negatīvā kontrole vai pozitīvā kontrole ir ārpus pieņemtajiem diapazoniem, izpildes reizi uzskata par nederīgu un tā jāatkārto. Ja ārpus definētā diapazona ir mainība attiecībā uz testējamām ķimikālijām, tās jātestē atkārtoti.
Rezultātu interpretēšana un prognozēšanas modelis
33.Par katru testējamo ķimikāliju iegūtās OB vērtības var izmantot dzīvotspējīgo šūnu procentuālā īpatsvara aprēķināšanai salīdzinājumā ar negatīvo kontroli, kurai to pieņem par 100 %. Ja izmanto HPLC/UPLC spektrofotometriju, audu procentuālo dzīvotspēju aprēķina kā MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, procentuālo attiecību pret MTT formazāna smailes laukumu, kas iegūts ar paralēlo negatīvo kontroli. Procentuālās šūnu dzīvotspējas robežvērtības, kas korozīvas testējamās ķimikālijas šķir no nekorozīvām (vai dod iespēju atšķirt dažādas kodīgu vielu apakškategorijas), attiecībā uz katru šīs testēšanas metodes aptverto testa modeli ir definētas zemāk 35. un 36. punktā un šīs vērtības būtu jāizmanto rezultātu interpretēšanai.
34.Ja rezultātā iegūtā klasifikācija nav nepārprotama, attiecībā uz testējamu ķimikāliju vajadzētu pietikt ar vienu testēšanas izpildes reizi, kurā ietilpst vismaz divi audu replikāti. Tomēr, ja rezultāti ir uz robežas, piemēram, ja nesakrīt replikātu mērījumi, var apsvērt, vai neveikt otru izpildes reizi, bet, ja divu pirmo izpildes reižu rezultāti nesakrīt, arī trešo.
35.Ar ANO GHS / CLP asociētais prognozēšanas modelis attiecībā uz EpiSkin™ ādas korozijas testēšanas modeli (9)(34)(22), ir sniegts 4. tabulā.
4. tabula. EpiSkinTM prognozēšanas modelis.
|
Pa ekspozīcijas laikpunktiem mērītā dzīvotspēja (t = 3, 60 un 240 minūtes)
|
Prognoze, ko aplūko
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas < 35 %
|
kodīga:
• fakultatīvā 1.A apakškategorija*
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 35 % UN
pēc 60 min ekspozīcijas < 35 %
VAI
pēc 60 min ekspozīcijas ≥ 35 % UN
pēc 240 min ekspozīcijas < 35 %
|
kodīga:
fakultatīvo apakškategoriju 1.B un 1.C kombinācija
|
|
pēc 240 min ekspozīcijas ≥ 35 %
|
nekodīga
|
36.Ar ANO GHS/CLP klasifikācijas sistēmu asociētajiem ādas korozijas testēšanas modeļiem EpiDerm™ SCT (10)(23)(35), SkinEthic™ RHE (17)(18) (23) (36), un epiCS® (16)(23)(37) 5. tabula sniedz prognozēšanas modeļus.
5. tabula. EpiDermTM SCT, SkinEthic™ RHE un epiCS®
|
Pa ekspozīcijas laikpunktiem mērītā dzīvotspēja (t = 3 60 minūtes)
|
Prognoze, ko aplūko
|
|
1. SOLIS attiecībā uz EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE un epiCS®
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas < 50 %
|
kodīga
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 50 % UN
Pēc 60 min ekspozīcijas < 15 %
|
kodīga
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 50 % UN
Pēc 60 min ekspozīcijas ≥ 15 %
|
nekodīga
|
|
2. SOLIS attiecībā uz EpiDerm™ SCT sakarā ar vielām, kas 1. solī identificētas kā kodīgas
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas < 25 %
|
fakultatīvā 1.A apakškategorija *
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 25 %
|
fakultatīvo apakškategoriju 1.B un 1.C kombinācija
|
|
2. SOLIS attiecībā uz SkinEthic™ RHE sakarā ar vielām, kas 1. solī identificētas kā kodīgas
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas < 18 %
|
fakultatīvā 1.A apakškategorija *
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 18 %
|
fakultatīvo apakškategoriju 1.B un 1.C kombinācija
|
|
2. SOLIS attiecībā uz epiCS® sakarā ar vielām, kas 1. solī identificētas kā kodīgas
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas < 15 %
|
fakultatīvā 1.A apakškategorija *
|
|
Pēc 3 min ekspozīcijas ≥ 15 %
|
fakultatīvo apakškategoriju 1.B un 1.C kombinācija
|
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Dati
37.Par katru testu, arī par atkārtotiem eksperimentiem, ja tos veic, visus datus par atsevišķajiem audu replikātiem (piemēram, optiskā blīvuma vērtības, datus par testējamās vielas ietekmi uz šūnu dzīvotspēju un tās klasifikācijas datus) apkopo tabulas veidā. Turklāt ziņojumā attiecībā uz katru testu būtu jāiekļauj audu replikātu dzīvotspējas un mainības koeficienta vidējās vērtības un diapazoni. Par katru testējamo ķimikāliju ziņojumā jāatspoguļo tiešu MTT reducētāju vai testējamu krāsainu ķimikāliju novērotā mijiedarbība ar MTT reaģentu.
Testēšanas pārskats
38.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamās un kontroles ķimikālijas:
-Vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā un ja praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.
-Daudzkomponentu vielas, UVCB un maisījumi: iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
-izskats, šķīdība ūdenī un papildu relevantās fizikālķīmiskās īpašības;
-avots, no kura dzīvnieki saņemti, sērijas numurs, ja zināms;
-testējamās ķimikālijas / kontrolvielas pirmstestēšanas apstrāde (piem., sildīšana, sasmalcināšana), ja tāda veikta;
-testējamās ķimikālijas stabilitāte, izmantošanas termiņš vai atkārtotas analīzes datums, ja tas zināms;
-glabāšanas apstākļi.
Izmantotais RhE modelis un protokols un attiecīgās izvēles pamatojums (attiecīgā gadījumā)
Testa apstākļi:
-izmantotais RhE modelis (arī sērijas numurs);
-MTT kvantitatīvajai noteikšanai izmantotās mērierīces (piemēram, spektrofotometra) kalibrēšanas dati, viļņa garums un frekvenču joslas filtrs (attiecīgā gadījumā), un mērierīces linearitātes diapazons;
-MTT formazāna kvantitatīvajai noteikšanai izmantotās metodes apraksts;
-HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas kvalifikācijas apraksts (attiecīgā gadījumā);
-pietiekama papildinformācija par izmantoto konkrēto RhE modeli, arī tā veiktspēju. No tiem jānorāda vismaz:
I)dzīvotspēja,
II)barjerfunkcija,
III)morfoloģija,
IV)reproducējamība un prognozēšanas spēja,
V)modeļa kvalitātes kontroles (QC);
-norāde uz modeļa vēsturiskajiem datiem. No tiem jānorāda vismaz kvalitātes kontroles datu pieņemamība attiecībā uz vēsturiskajiem datiem par partiju kontroles rezultātiem,
-Apliecināta testēšanas metodes izmantošanas kompetence, kas pirms attiecīgās testēšanas metodes regulāras izmantošanas pierādīta, testējot standartvielas.
Testa procedūra:
-detalizēta informācija par izmantoto testēšanas procedūru (arī par mazgāšanas procedūrām, ko izmanto pēc ekspozīcijas perioda);
-izmantotās testējamās ķimikālijas un kontrolķimikāliju devas;
-ekspozīcijas laiks vai laiki un temperatūra vai temperatūras;
-attiecībā uz tiešajiem MTT reducētājiem un/vai testējamām krāsojošām ķimikālijām izmantotās kontroles; norādes (attiecīgā gadījumā);
-uz katru testējamo ķimikāliju un kontrolēm (pozitīvā kontrole, negatīvā kontrole un NSMTT, NSCliving un NSCkilled, attiecīgā gadījumā) izmantoto audu replikātu skaits uz vienu ekspozīcijas laiku;
-apraksts par lēmuma pieņemšanas kritēriju / prognozēšanas modeli, kas izmantots, pamatojoties uz lietoto RhE modeli;
-apraksts par jebkādām testa procedūras (arī mazgāšanas procedūru) modifikācijām.
Izpildes reizes un testa pieņemamības kritēriji:
-pozitīvās un negatīvās kontroles vidējās vērtības un pieņemamības diapazoni, kas balstīti uz vēsturiskajiem datiem;
-pieņemamā mainība pozitīvām un negatīvām kontrolēm izmantojamiem audu replikātiem;
-pieņemamā mainība testējamai ķimikālijai izmantojamiem audu replikātiem.
Rezultāti:
-tabulās apkopoti dati par atsevišķām testējamām ķimikālijām un kontrolēm par katru ekspozīcijas laiku, katru izpildes reizi un katru replikāta mērījumu, norādot arī OB vai MTT formazāna smailes laukumu, audu procentuālo dzīvotspēju, audu vidējo procentuālo dzīvotspēju, replikātu atšķirības, standartnovirzi un/vai mainības koeficientu (attiecīgā gadījumā);
-attiecīgā gadījumā to kontroļu rezultāti, kas izmantotas tiešiem MTT reducētājiem un/vai krāsojošām testējamām ķimikālijām, norādot arī OB vai MTT formazāna smailes laukumu, % NSMTT, % NSCliving, % NSCkilled, standartnovirzi un/vai mainības koeficientu (attiecīgā gadījumā) un audu galīgo pareizo procentuālo dzīvotspēju;
-rezultāti, kas iegūti ar testējamo ķimikāliju (ķimikālijām) un kontrolķimikālijām, salīdzinājumā ar noteiktajiem izpildes reizes un testa pieņemamības kritērijiem;
-citu novērotu ietekmju apraksts;
-atvasinātā klasifikācija ar norādi uz izmantoto prognozēšanas modeli un/vai lēmuma pieņemšanas kritēriju.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)UN (2013). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth Revised Edition, UN
New York
and
Geneva. Available at:
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
(2)Chapter B.4 of this Annex, Acute Dermal Irritation, Corrosion.
(3)Chapter B.40 of this Annex, In Vitro Skin Corrosion.
(4)Chapter B.65 of this Annex, In Vitro Membrane Barrier Test Method.
(5)Chapter B.46 of this Annex, In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method.
(6)OECD (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment of Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(7)Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23:219-255.
(8)Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the Test Chemicals. Toxicol.In Vitro 12:471-482.
(9)Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls
M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhutter H.-G., and Liebsch M. (1998). The
ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for SkinCorrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicol.in Vitro 12:483-524.
(10)Liebsch M., Traue D., Barrabas C., Spielmann H., Uphill, P., Wilkins S., Wiemann C., Kaufmann T., Remmele M. and Holzhütter H. G. (2000). The ECVAM Prevalidation Study on the Use of EpiDerm for Skin Corrosivity Testing, ATLA 28: 371-401.
(11)Balls M., Blaauboer B.J., Fentem
J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H. et Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops, ATLA 23:129-147.
(12)ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological TestMethods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.
(13)ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research
Triangle
Park,
NC,
USA.
(14)EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the EpiSkin™ Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.
(15)EC-ECVAM (2000). Statement on the Application of the EpiDerm™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC14), 21 March 2000.
(16)Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S., Losse J., Thomas D., Siefken W., Ahr H.J., Vohr H.W. and Fuchs H.W. (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000)-A New Reconstructed Epidermis for In Vitro Skin Corrosivity Testing. Toxicol.In Vitro 19: 925-929.
(17)Kandárová H., Liebsch M., Spielmann,H., Genschow E., Schmidt E., Traue D., Guest R., Whittingham A., Warren N, Gamer A.O., Remmele M., Kaufmann T., Wittmer E., De Wever B., and Rosdy M. (2006). Assessment of the Human Epidermis Model SkinEthic RHE for In Vitro Skin Corrosion Testing of Chemicals According to New OECD TG 431. Toxicol.In Vitro 20: 547-559.
(18)Tornier C., Roquet M. and Fraissinette A.B. (2010). Adaptation of the Validated SkinEthic™ Reconstructed Human Epidermis (RHE) Skin Corrosion Test Method to 0.5 cm2 Tissue Sample. Toxicol. In Vitro 24: 1379-1385.
(19)EC-ECVAM (2006). Statement on the Application of the SkinEthic™ Human Skin Model for Skin Corrosivity Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC25), 17 November 2006.
(20)EC-ECVAM (2009). ESAC Statement on the Scientific Validity of an In-Vitro Test Method for Skin Corrosivity Testing: the EST-1000, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 12 June 2009.
(21)OECD (2013). Summary Document on the Statistical Performance of Methods in OECD Test Guideline 431 for Sub-categorisation. Environment, Health, and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 190). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(22)Alépée N., Grandidier M.H., and Cotovio J. (2014). Sub-Categorisation of Skin Corrosive Chemicals by the EpiSkin™ Reconstructed Human Epidermis Skin Corrosion Test Method According to UN GHS: Revision of OECD Test Guideline 431. Toxicol. In Vitro 28:131-145.
(23)Desprez B., Barroso J., Griesinger C., Kandárová H., Alépée N., and Fuchs, H. (2015). Two Novel Prediction Models Improve Predictions of Skin Corrosive Sub-categories by Test Methods of OECD Test Guideline No 431. Toxicol. In Vitro 29:2055-2080.
(24)OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Methods For Skin Corrosion in Relation to OECD TG 431. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 219). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris
(25)OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. . Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(26)Eskes C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62:393-403.
(27)Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65:55-63.
(28)Tinois E., et al. (1994). The Episkin Model: Successful Reconstruction of Human Epidermis In Vitro. In: In Vitro Skin Toxicology. Rougier A.,. Goldberg A.M and Maibach H.I. (Eds): 133-140.
(29)Cannon C. L., Neal P.J., Southee J.A., Kubilus J. and Klausner M. (1994), New Epidermal Model for Dermal Irritancy Testing. Toxicol.in Vitro 8:889 - 891.
(30)Ponec M., Boelsma E, Weerheim A, Mulder A, Bouwstra J and Mommaas M. (2000). Lipid and Ultrastructural Characterization of Reconstructed Skin Models. Inter. J. Pharmaceu. 203:211 - 225.
(31)Tinois E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M. and Thivolet J. (1991). In Vitro and Post - Transplantation Differentiation of Human Keratinocytes Grown on the Human Type IV Collagen Film of a Bilayered Dermal Substitute. Exp. Cell Res. 193:310-319.
(32)Parenteau N.L., Bilbo P, Nolte CJ, Mason VS and Rosenberg M. (1992). The Organotypic Culture of Human Skin Keratinocytes and Fibroblasts to Achieve Form and Function. Cytotech. 9:163-171.
(33)Wilkins L.M., Watson SR, Prosky SJ, Meunier SF and Parenteau N.L. (1994). Development of a Bilayered Living Skin Construct for Clinical Applications. Biotech. Bioeng. 43/8:747-756.
(34)EpiSkin™ SOP (December 2011). INVITTOX Protocol (No 118). EpiSkin™ Skin Corrosivity Test.
(35)EpiDerm™ SOP (February 2012). Version MK-24-007-0024 Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Corrosion Test (EPI-200-SCT), for Use with MatTek Corporation's Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm.
(36)SkinEthic™ RHE SOP (January 2012). INVITTOX Protocol SkinEthic™ Skin Corrosivity Test.
(37)EpiCS® SOP (January 2012). Version 4.1 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test Epidermal Skin Test 1000 (epiCS® ) CellSystems.
(38)Alépée N., Barroso J., De Smedt A., De Wever B., Hibatallah J., Klaric M., Mewes K.R., Millet M., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Templier M., and McNamee P. Use of HPLC/UPLC- spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)- based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29: 741-761.
(39)US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. (May 2001). Available at:
[http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf]
.
1. papildinājums
DEFINĪCIJAS
Pareizība: pakāpe, kādā testēšanas metodes rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no relevantuma aspektiem. Ar šo terminu, tāpat kā terminu “konkordantums”, bieži vien saprot testa pareizo rezultātu īpatsvaru (25).
Šūnu dzīvotspēja: parametrs, kas raksturo šūnu populācijas kopējo aktivitāti, piemēram, šūnu mitohondriju dehidrogenāžu spēju reducēt vitālo krāsvielu MTT (3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds, tiazolilzilais), kas atkarībā no nosakāmā testēšanas beigupunkta un izmantotā testēšanas plāna korelē ar dzīvo šūnu kopējo skaitu un/vai dzīvotspēju.
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Konkordantums: tādas testēšanas metodes veiktspējas mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pašā nozīmē kā terminu “pareizība”, ar to saprotot visu to testēto ķimikāliju īpatsvaru, kas pareizi klasificētas kā pozitīvas vai negatīvas. Konkordantums ir lielā mērā atkarīgs no to pozitīvo rezultātu prevalences, kādi iegūti attiecībā uz pētāmajiem testējamo ķimikāliju veidiem (25).
ET50: parametrs, ko var aprēķināt pēc ekspozīcijas laika, kas pēc specifiskas noteiktas koncentrācijas etalonķimikālijas aplicēšanas nepieciešams šūnu dzīvotspējas samazināšanai par 50 % (sk. arī IC50).
GHS (Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētā sistēma): sistēma, kas piedāvā ķimikāliju (vielu un maisījumu) klasifikāciju pa standartizētiem fizisko apdraudējumu, veselības apdraudējumu un vidisko apdraudējumu tipiem un līmeņiem un izmanto tādus attiecīgus komunikācijas elementus kā piktogrammas, signālvārdi, bīstamības apzīmējumi, drošības prasību apzīmējumi un drošības datu lapas, lai sniegtu informāciju par ķimikāliju nelabvēlīgo ietekmi un tādējādi aizsargātu cilvēkus (arī darba devējus un darba ņēmējus, transporta darbiniekus, patērētājus un avārijas dienestu darbiniekus) un vidi(1).
HPLC. augstas izšķirtspējas šķidrumhromatogrāfija.
IATA: integrētā testēšanas un novērtēšanas pieeja.
IC50: parametrs, ko var aprēķināt pēc etalonķimikālijas koncentrācijas, pie kuras audu dzīvotspēja pēc noteikta ekspozīcijas laika samazinās par 50 % (IC50) (sk. arī ET50).
Nefiksēta deva: uz epidermas aplicētas testējamās ķimikālijas daudzums, kas lielāks par epidermas virsmas pilnīgai un vienmērīgai pārklāšanai nepieciešamo daudzumu. Maisījums vai šķīdums, kas sastāv no divām vai vairāk vielām, kuras tajā savstarpēji nereaģē.
Vienkomponenta viela: tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vismaz 80 % (masa/masa) veido viena galvenā sastāvdaļa.
MTT: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds; tiazolilzilā tetrazolija bromīds.
Daudzkomponentu viela: tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vairāk nekā viena no galvenajām sastāvdaļām ir koncentrācijā ≥ 10 % (masa/masa) un < 80 % (masa/masa). Daudzkomponentu vielas tiek iegūtas ražošanas procesā. Atšķirība starp maisījumu un daudzkomponentu vielu ir tāda, ka maisījumu iegūst, divas vai vairākas vielas sajaucot bez ķīmiskas reakcijas. Daudzkomponentu viela rodas ķīmiskā reakcijā.
NK: nekodīgs.
Kontrole NSCkilled: nespecifiskas krāsas kontrole nonāvētos audos.
Kontrole NSCliving: nespecifiskas krāsas kontrole dzīvos audos.
NSMTT: nespecifiskā MTT redukcija.
OB: optiskais blīvums.
PK: pozitīvā kontrole, proti, replikāts, kurā ir visi testēšanas sistēmas komponenti un kurš apstrādāts ar ķimikāliju, par ko zināms, ka tā izraisa pozitīvu atbildreakciju. Lai būtu iespējams novērtēt pozitīvās kontroles atbildreakcijas mainību laikā, pozitīvās atbildreakcijas intensitāte nedrīkstētu būt pārāk liela.
Veiktspējas standarti (VS): uz validētu testēšanas metodi bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Tajos ietilpst: (i) nepieciešamie testēšanas metodes komponenti; (ii) minimāls tādu references ķimikāliju saraksts, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; kā arī iii), uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — tādi paši pareizības un ticamības līmeņi, kā būtu jāiegūst ar novērtējamo testēšanas metodi, to izvērtējot ar references vielām no minimālā saraksta (25).
Relevantums: parametrs, kas raksturo testēšanas metodes un interesējošās ietekmes sakarību un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Pakāpe, kādā ar testu var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testēšanas metodes pareizības (konkordantuma) aspektu (25).
Ticamība: parametrs, kas izsaka, kādā pakāpē, izmantojot vienu un to pašu protokolu, kādu testēšanas metodi vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās ilgākā laika nogrieznī var izmantot reproducējami. To novērtē, aprēķinot intralaboratorisko un interlaboratorisko reproducējamību (25).
Izpildes reize: reize, kurā vienu vai vairākas ķimikālijas testē paralēli negatīvai kontrolei un pozitīvai kontrolei.
Jutība: tas, cik liela daļa no visām pozitīvajām/aktīvajām ķimikālijām ar šo testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tas ir pareizības mērs testēšanas metodei, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (25).
Ādas korozija in vivo: neatgriezenisku ādas bojājumu rašanās; proti, redzama nekroze, kas caur epidermu skar zemādu un rodas, testējamo ķimikāliju aplicējot uz ādas uz laiku līdz četrām stundām. Reakcijām uz kodīgumu parasti ir raksturīgas čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērošanas perioda beigās — ādas izbalējuma radīta atkrāsošanās, ādas laukumi, kur izkritis apmatojums, un rētas. Neskaidros gadījumos bojājums jānovērtē histopatoloģiski.
Specifiskums: tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām ķimikālijām ar testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (25).
Viela: ķīmisks elements un tā dabiski radušies vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, ieskaitot to stabilizācijai nepieciešamās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušos piejaukumus, bet izņemot šķīdinātājus, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu. Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
UPLC: īpaši augstas izšķirtspējas šķidrumhromatogrāfija.
UVCB: vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli.
2. papildinājums
ĀDAS KOROZIJAS TESTĒŠANAS VAJADZĪBĀM VALIDĒTO RhE TESTĒŠANAS MODEĻU GALVENIE KOMPONENTI
|
Testēšanas modeļa komponenti
|
EpiSkinTM
|
EpiDermTM SCT
|
SkinEthicTM RHE
|
epiCS®
|
|
Modeļa virsma
|
0,38 cm2
|
0,63 cm2
|
0,5 cm2
|
0,6 cm2
|
|
Audu replikātu skaits
|
uz ekspozīcijas laiku vismaz 2
|
uz ekspozīcijas laiku 2–3
|
uz ekspozīcijas laiku vismaz 2
|
uz ekspozīcijas laiku vismaz 2
|
|
Apstrādes devas un aplicēšana
|
Šķidrumi un viskozas vielas: 50 µl ± 3 µl (131,6 µl/cm2)
Cietas vielas: 20 2 mg (52,6 mg/cm2) + 100 µl ± 5µl NaCl šķīduma (9 g/l)
Vaskainas/lipīgas vielas: 50 2 mg (131,6 mg/cm2) ar neilona tīkliņu
|
Šķidrumi: 50 µl (79,4 µl/cm2) ar neilona tīkliņu vai bez tā
Testējamās ķimikālijas pirmstestēšanas saderība ar neilona tīkliņu
Puscietas vielas: 50 µl (79.4 µl/cm2)
Cietas vielas: 25 µl H2O (vai attiecīgā gadījumā vairāk) + 25 mg (39,7 mg/cm2)
Vaski: plakanu “diskveida” gabalu (diametrā apm. 8. mm) novieto uz salvetes, kas samitrināta ar 15 µl H2O.
|
šķidrumi un viskozas vielas: 40 µl ± 3µl (80 µl/cm2) ar neilona tīkliņu
Testējamās ķimikālijas pirmstestēšanas saderība ar neilona tīkliņu
cietas vielas: 20 µl ± 2µl H2O + 20 3 mg (40 mg/cm2)
vaskainas/lipīgas vielas: 20 3 mg (40 mg/cm2) ar neilona tīkliņu
|
šķidrumi: 50 µl (83,3 µl/cm2) ar neilona tīkliņu
Testējamās ķimikālijas pirmstestēšanas saderība ar neilona tīkliņu
puscietas vielas: 50 µl (83,3 µl/cm2)
cietas vielas: 25 mg (41,7 mg/cm2) + 25 µl H2O (vai attiecīgā gadījumā vairāk)
vaskainas vielas: plakanu “diskveida” gabalu (diametrā apm. 8. mm) novieto uz salvetes, kas samitrināta ar 15 µl H2O.
|
|
Priekšpārbaude attiecībā uz tiešo MTT reducēšanos
|
50 µl (šķidruma) vai 20 mg (cietas vielas) + 2 ml MTT
0,3 mg/ml šķīduma uz 180 5 min
37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem ūdensapstrādātiem audiem
|
50 µl (šķidruma) vai 25 mg (cietas vielas) + 1 ml MTT
1 mg/ml šķīduma uz 60 min
37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem aukstumapstrādātiem audiem
|
40 µl (šķidruma) vai 20 mg (cietas vielas) + 1 ml MTT
1 mg/ml šķīduma uz 180 ± 15 min 37 °C temperatūrā pie 5 % CO2, , gaisa relatīvais mitrums 95 %
ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem aukstumapstrādātiem audiem
|
50 µl (šķidruma) vai 25 mg (cietas vielas) + 1 ml MTT
1 mg/ml šķīduma uz 60 min
37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem aukstumapstrādātiem audiem
|
|
Priekšpārbaude attiecībā uz krāsas interferenci
|
10 µl (šķidruma) vai 10 mg (cietas vielas) + 90 µl H2O, maisīts 15 min istabas temperatūrā
ja šķīdums iekrāsojas, jāizdara pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem
|
50 µl (šķidruma) vai 25 mg (cietas vielas) + 300 µl H2O
uz 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
ja šķīdums iekrāsojas, jāizdara pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem
|
40 µl (šķidruma) vai 20 mg (cietas vielas) + 300 µl H2O, maisīts 60 min istabas temperatūrā
ja testējamā ķimikālija ir krāsaina, jāizdara pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem
|
50 µl (šķidruma) vai 25 mg (cietas vielas) + 300 µl H2O
uz 60 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
ja šķīdums iekrāsojas, jāizdara pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem
|
|
Ekspozīcijas laiks un temperatūra
|
3 min, 60 min ( 5 min)
un 240 min ( 10 min)
vēdināmā skapī
istabas temperatūrā (IT, 18–28oC)
|
3 min istabas temperatūrā un 60 min
37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
|
3 min istabas temperatūrā un 60 min
37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
|
3 min istabas temperatūrā un 60 min
37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
|
|
Skalošana
|
25 ml 1 x fosfātu fizioloģiskais buferšķīdums (2 ml / izsviešana)
|
20 reižu ar pastāvīgu maigu strūklu
1 x fosfātu fizioloģiskā buferšķīduma
|
20 reižu ar pastāvīgu maigu strūklu
1 x fosfātu fizioloģiskā buferšķīduma
|
20 reižu ar pastāvīgu maigu strūklu
1 x fosfātu fizioloģiskā buferšķīduma
|
|
Negatīvā kontrole
|
50 µl NaCl šķīduma (9 g/l)
testēta ar katru ekspozīcijas laiku
|
50 µl H2O
testēta ar katru ekspozīcijas laiku
|
40 µl H2O
testēta ar katru ekspozīcijas laiku
|
50 µl H2O
testēta ar katru ekspozīcijas laiku
|
|
Pozitīvā kontrole
|
50 µl ledus etiķskābes
testēšana tikai 4 stundas
|
50 µl 8N KOH
testēta ar katru ekspozīcijas laiku
|
40 µl 8N KOH
testēšana tikai 1 stundu
|
50 µl 8N KOH
testēta ar katru ekspozīcijas laiku
|
|
MTT šķīdums
|
2 ml 0,3 mg/ml
|
300 µl 1 mg/ml
|
300 µl 1 mg/ml
|
300 µl 1 mg/ml
|
|
MTT inkubācijas laiks un temperatūra
|
180 min ( 15 min) 37 oC temperatūrā pie 5% CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
|
180 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
|
180 min (± 15 min) 37oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
|
180 min 37 oC temperatūrā pie 5 % CO2, gaisa relatīvais mitrums 95 %
|
|
Ekstrahēšanas šķīdinātājs
|
500 µl paskābināta izopropanola
(0,04 N HCl izopropanolā)
(pilnīgi iegremdēti izolēti audi).
|
2 ml izopropanola
(ekstrahē no iegremdētā materiāla augšpuses un apakšpuses)
|
1,5 ml izopropanola
(ekstrahē no iegremdētā materiāla augšpuses un apakšpuses)
|
2 ml izopropanola
(ekstrahē no iegremdētā materiāla augšpuses un apakšpuses)
|
|
Ekstrahēšanas laiks un temperatūra
|
istabas temperatūrā pa nakti, aizsargāti no gaismas
|
bez kratīšanas istabas temperatūrā pa nakti vai ar kratīšanu istabas temperatūrā 120 min (~120 rpm)
|
bez kratīšanas istabas temperatūrā pa nakti vai ar kratīšanu istabas temperatūrā 120 min (~120 rpm)
|
bez kratīšanas istabas temperatūrā pa nakti vai ar kratīšanu istabas temperatūrā 120 min (~120 rpm)
|
|
Optiskā blīvuma lasījumi
|
570 nm (545 – 595 nm)
bez references filtra
|
570 nm (vai 540 nm)
bez references filtra
|
570 nm (540 – 600 nm)
bez references filtra
|
540 – 570 nm
bez references filtra
|
|
Audu kvalitātes kontrole
|
18 stundas ilga apstrāde ar SDS
1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,0 mg/ml
|
apstrāde ar 1 % Triton X-100
4,08 stundas ≤ ET50 ≤ 8,7 stundas
|
apstrāde ar 1 % Triton X-100
4,0 stundas ≤ ET50 ≤ 10,0 stundas
|
apstrāde ar 1 % Triton X-100
2,0 stundas ≤ ET50 ≤ 7,0 stundas
|
|
Pieņemamības kritēriji
|
1. Ar negatīvo kontroli (NaCl) apstrādāto audu replikātu vidējam optiskajam blīvumam attiecībā uz katru ekspozīcijas laiku vajadzētu būt ≥ 0,6 and ≤ 1,5
2. Tādiem audu replikātiem, kas 4 stundas eksponēti pozitīvajā kontrolē (ledus etiķskābe), vidējai dzīvotspējai, kura izteikta procentos no negatīvās kontroles, vajadzētu būt ≤ 20 %
3. Dzīvotspējas diapazonā 20–100 % un attiecībā uz OB ≥ 0,3, šo divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirība nedrīkstētu pārsniegt 30 %.
|
1. Ar negatīvo kontroli (H2O) apstrādāto audu replikātu vidējam optiskajam blīvumam attiecībā uz katru ekspozīcijas laiku vajadzētu būt ≥ 0,8 and ≤ 2,8
2. Tādiem audu replikātiem, kas 1 stundu eksponēti pozitīvajā kontrolē (8N KOH), vidējai dzīvotspējai, kura izteikta procentos no negatīvās kontroles, vajadzētu būt ≤ 15 %
3. Dzīvotspējas diapazonā 20–100 % mainības koeficientiem (CV) starp audu replikātiem jābūt 30 %.
|
1. Ar negatīvo kontroli (H2O) apstrādāto audu replikātu vidējam optiskajam blīvumam attiecībā uz katru ekspozīcijas laiku vajadzētu būt ≥ 0,8 and ≤ 3,0
2. Tādiem audu replikātiem, kas 1 stundu (un attiecīgā gadījumā 4 stundas) eksponēti pozitīvajā kontrolē (8N KOH), vidējai dzīvotspējai, kura izteikta procentos no negatīvās kontroles, vajadzētu būt ≤ 15 %
3. Dzīvotspējas diapazonā 20–100 % un attiecībā uz OB ≥ 0,3, šo divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirība nedrīkstētu pārsniegt 30 %
|
1. Ar negatīvo kontroli (H2O) apstrādāto audu replikātu vidējam optiskajam blīvumam attiecībā uz katru ekspozīcijas laiku vajadzētu būt ≥ 0,8 and ≤ 2,8
2. Tādiem audu replikātiem, kas 1 stundu eksponēti pozitīvajāā kontrolē (8N KOH), vidējai dzīvotspējai, kura izteikta procentos no negatīvās kontroles, vajadzētu būt ≤ 20 %
3. Dzīvotspējas diapazonā 20–100 % un attiecībā uz OB ≥ 0,3, šo divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirība nedrīkstētu pārsniegt 30 %
|
3. papildinājums
TESTĒŠANAS MODEĻU VEIKTSPĒJA ATTIECĪBĀ UZ IEDALĪŠANU APAKŠKATEGORIJĀS
Tabulā zemāk norādīta šo četru testēšanas modeļu veiktspēja, kas aprēķināta uz tādu 80 ķimikāliju kopumu, kuras testējuši četri testa izstrādātāji. Aprēķinus izdarījis ESAO sekretariāts un pārskatījusi un par tiem vienojusies ekspertu apakšgrupa (21) (23).
Iedalīšana apakškategorijās ir iespējama ar testēšanas modeļiem EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE un epiCS® (proti, 1.A apakškategorija attiecībā pret 1.B un 1.C apakškategoriju un attiecībā pret NK).
Šo četru testa modeļu veiktspēja, pārspīlētas klasificēšanas rādītāji, nepietiekami prasīgas klasificēšanas rādītāji un pareizība (prognozētspēja) to 80 ķimikāliju kopumam, kuras attiecībā uz katru testa modeli testētas 2 vai 3 reizes:
|
STATISTIKA PAR PROGNOZĒM, KAS IEGŪTAS PAR VISU ĶIMIKĀLIJU KOPUMU
|
|
(n = 80 ķimikālijas, kas vairāk nekā divās neatkarīgās izpildes reizēs testētas ar epiCS® vai trijās neatkarīgās izpildes reizēs attiecībā uz EpiDerm™ SCT, EpiSkin™ un SkinEthic™ RhE, proti, attiecīgi 159* vai 240 klasifikācijas)
* sakarā ar nepieejamību viena ķimikālija ar epiCS® testēta vienreiz (23)
|
|
|
EpiSkin™
|
EpiDerm TM
|
SkinEthic™
|
epiCS®
|
|
Pārspīlētas klasificēšanas gadījumi:
|
|
|
|
|
|
1B un 1.C pārspīlēti klasificēti par 1.A
|
21,50 %
|
29,0 %
|
31,2 %
|
32,8 %
|
|
Nekodīgas vielas pārspīlēti klasificētas par 1.B un 1.C
|
20,7 %
|
23,4 %
|
27,0 %
|
28,4 %
|
|
Nekodīgas vielas pārspīlēti klasificētas par 1.A
|
0,00 %
|
2,7 %
|
0,0 %
|
0,00 %
|
|
Viela pārspīlēti klasificēta par kodīgu vielu.
|
20,7 %
|
26,1 %
|
27,0 %
|
28,4 %
|
|
Vispārējais pārspīlētas klasificēšanas līmenis (visām kategorijām)
|
17,9 %
|
23,3 %
|
24,5 %
|
25,8 %
|
|
Nepietiekami prasīgas klasificēšanas gadījumi:
|
|
|
|
|
|
1.A nepietiekami prasīgi klasificēta par 1.B un 1.C
|
16,7 %
|
16,7 %
|
16,7 %
|
12,5 %
|
|
1.A nepietiekami prasīgi klasificēta par nekodīgu
|
0,00 %
|
0,00 %
|
0,00 %
|
0,00 %
|
|
1.B un 1.C nepietiekami klasificētas par nekodīgām
|
2,2 %
|
0,00 %
|
7,5 %
|
6,6 %
|
|
Vispārējais nepietiekami prasīgas klasificēšanas līmenis (visām kategorijām)
|
3,3 %
|
2,5 %
|
5,4 %
|
4,4 %
|
|
Pareiza klasifikācija:
|
|
|
|
|
|
Pareizi klasificēta 1.A
|
83,3 %
|
83,3 %
|
83,3 %
|
87,5 %
|
|
Pareizi klasificēta 1.B un 1.C
|
76,3 %
|
71,0 %
|
61,3 %
|
60,7 %
|
|
Pareizi klasificēta nekodīga viela
|
79,3 %
|
73,9 %
|
73,0 %
|
71,62 %
|
|
Kopējā pareizība
|
78,8 %
|
74,2 %
|
70 %
|
69,8 %
|
NK: nekodīga
4. papildinājums
Galvenie parametri un pieņemamības kritēriji no RhE audiem ekstrahēta MTT formazāna mērīšanai paredzētas HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas kvalificēšanai
|
Parametrs
|
Saskaņā ar FDA norādījumiem izstrādāts protokols (37) (38)
|
Pieņemamības kritēriji
|
|
Selektivitāte
|
Izopropanola, dzīva tukšā parauga (izopropanola ekstrakts no neapstrādātiem dzīviem RhE audiem), nedzīva tukšā parauga (izopropanola ekstrakts no neapstrādātiem nedzīviem RhE audiem) analīze
|
Laukumsinterference ≤ 20 % no laukumaLLOQ1
|
|
Precizitāte
|
Kvalitātes kontroles (t. i., MTT formazāns koncentrācijā 1,6 µg/ml, 16 µg/ml un 160 µg/ml) izopropanolā (n=5)
|
CV ≤ 15 % vai attiecībā uz LLOQ ≤ 20 %
|
|
Pareizība
|
Kvalitātes kontroles izopropanolā (n=5)
|
% novirze ≤ 15 % vai attiecībā uz LLOQ ≤ 20 %
|
|
Matricas ietekme
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=5)
|
85 % ≤ matricas ietekme % ≤ 115 %
|
|
Pārnesums
|
Izopropanola analīze, ko izdara pēc ULOQ2 standarta analīzes
|
Laukumsinterference ≤ 20 % no laukumaLLOQ
|
|
Reproducējamība (vienā un tajā pašā dienā)
|
3 neatkarīgas kalibrēšanas līknes (balstītas uz 6 secīgiem MTT formazāna 1/3 atšķaidījumiem izopropanolā, sākot no ULOQ, t. i., 200 µg/ml);
Kvalitātes kontroles izopropanolā (n=5)
|
Kalibrēšanas līknes: % novirze ≤ 15 % vai attiecībā uz LLOQ ≤ 20 %
Kvalitātes kontroles: % Novirze ≤ 15 % un CV ≤ 15 %
|
|
Reproducējamība (pa dienām)
|
1. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
2. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
3. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
|
|
|
MTT formazāna īslaicīgā stabilitāte RhE audu ekstraktā
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=3), kas analizēts sagatavošanas dienā un pēc 24 stundu ilgas glabāšanas istabas temperatūrā
|
% novirze ≤ 15 %
|
|
MTT formazāna ilglaicīgā stabilitāte RhE audu ekstraktā (ja vajadzīgs)
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=3), kas analizēts sagatavošanas dienā un pēc vairāku dienu ilgas glabāšanas noteiktā temperatūrā (piem., 4 ºC, -20 ºC, -80 ºC)
|
% novirze ≤ 15 %
|
1LLOQ: apakšējā kvantitatīvās noteikšanas robeža, kas noteikta tā, lai aptvertu audu dzīvotspēju 1–2 %, proti, 0,8 µg/ml.
2ULOQ: augšējā kvantitatīvās noteikšanas robeža, kas saskaņā ar definīciju vismaz divreiz pārsniedz augstāko gaidāmo MTT formazāna koncentrāciju no negatīvajām kontrolēm iegūtos izopropanola ekstraktos, proti, 200 µg/ml.”
(7) B daļā B.46. nodaļu aizstāj ar šādu:
“B.46. ĀDAS KAIRINĀJUMA NOTEIKŠANA AR CILVĒKA EPIDERMAS REKONSTRUKCIJAS MODEĻA IN VITRO TESTU
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijai (TG) Nr. 439 (2015). Ādas kairinājums ir atgriezenisks ādas bojājums, kas rodas, testējamo ķimikāliju aplicējot uz laiku līdz četrām stundām [atbilstoši definīcijai, kas dota Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētajā sistēmā (GHS) (1) un Eiropas Savienības (ES) Regulā Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (CLP regula)
]. Šajā testēšanas metodē aprakstīta in vitro procedūra, ko var izmantot kairinošu ķimikāliju (vielu un maisījumu) bīstamības identificēšanai saskaņā ar ANO GHS / CLP 2. kategoriju (2). Reģionos, kas nepieņem fakultatīvo ANO GHS 3. kategoriju (vāji kairinātāji), šo testēšanas metodi var izmantot arī neklasificētu ķimikāliju identificēšanai. Tāpēc atkarībā no tiesiskā regulējuma un izmantotās klasifikācijas sistēmas šo testēšanas metodi var izmantot, lai noteiktu ķimikāliju spēju izraisīt ādas kairinājumu; to izmanto vai nu kā atsevišķu aizstājējtestu in vivo ādas kairinājuma testēšanai, vai kā daļēju aizstājējtestu testēšanas stratēģijas ietvaros (3).
2.Ādas kairinājumu parasti novērtē, izmantojot laboratorijas dzīvniekus [TM B.4, kas ekvivalenta ESAO TG Nr. 404, kura sākotnēji pieņemta 1981. gadā un pārstrādāta 1992., 2002. un 2015. gadā] (4). Kodīguma testēšanai ir pieņemtas trīs validētas in vitro testēšanas metodes: ES TM B.40 (ekvivalenta ESAO TG Nr. 430), TM B.40a (ekvivalenta ESAO TG Nr. 431) un TM B.65 (ekvivalenta ESAO TG Nr. 435) (5) (6) (7). ESAO norādījumu dokuments par integrētām pieejām testēšanai un novērtēšanai attiecībā uz ādas koroziju un kairinājumu (IATA) apraksta vairākus moduļus, kuros tiek grupēti informācijas avoti un analīzes rīki, un, pirmkārt, sniedz norādījumus par to, kā, novērtējot ķimikāliju potenciālu radīt ādas kairinājumu un ādas koroziju, integrēt un izmantot jau esošos testēšanā un citādi iegūtos datus, un, otrkārt, ierosina pieeju, ko izmantot, ja vajadzīga turpmāka testēšana (3).
3.Šī testēšanas metode pievēršas tādam cilvēka veselības beigupunktam kā ādas kairinājums. Tās pamatā ir in vitro testēšanas sistēma, kurā izmanto cilvēka epidermas rekonstrukcijas modeļus (RhE), kuru bioķīmiskās un fizioloģiskās īpašības ir ļoti līdzīgas cilvēka ādas virsējās daļas, t. i., epidermas, īpašībām. Lai rekonstruētu epidermas modeli, kam ir reprezentatīva histoloģija un citoloģiskā arhitektūra, RhE testēšanas sistēmā par šūnu avotu izmanto nepārveidotus cilvēka keratinocītus. Ir pieejami veiktspējas standarti (VS), kas atvieglo līdzīgu un modificētu RhE testēšanas metožu validēšanu un novērtēšanu saskaņā ar ESAO norādījumu dokumenta Nr. 34 principiem (8) (9). Attiecīgā testēšanas vadlīnija sākotnēji pieņemta 2010. gadā, 2013. gadā atjaunināta, lai tajā iekļautu papildu RhE modeļus, un 2015. gadā atjaunināta, lai ietvertu atsauci uz IATA norādījumu dokumentu un ieviestu alternatīvu procedūru, ko izmanto dzīvotspējas mērīšanai.
4.Pirmsvalidēšanas, optimizēšanas un validēšanas pētījumi ir pabeigti attiecībā uz četriem komerciāli pieejamiem in vitro testa modeļiem (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28), kuru pamatā ir RhE testēšanas sistēma (jutība 80 %, specifiskums 70 % un precizitāte 75 %). Minētie četri testa modeļi ir iekļauti šajā TM un norādīti 2. papildinājumā, kurā sniegta arī informācija par tā validēšanas pētījuma veidu, kas izmantots attiecīgo testēšanas metožu validēšanai. Kā norādīts 2. papildinājumā, šīs testēšanas metodes un veiktspējas standartu (8) izstrādē ir izmantota validētā references metode (VRM).
5.ESAO datu savstarpējā atzīšana tiks nodrošināta tikai attiecībā uz testa modeļiem, kas validēti saskaņā ar veiktspējas standartiem (8), ja minētos testa modeļus ESAO ir pārskatījusi un pieņēmusi. Šajā testēšanas metodē iekļautos testa modeļus un attiecīgo ESAO TG var bez izšķirības izmantot, lai, turklāt izmantojot datu savstarpējās atzīšanas priekšrocības, izpildītu valstu prasības attiecībā uz testa rezultātiem, kas iegūti, izmantojot in vitro testēšanas metodes ādas kairinājuma noteikšanai.
6.Šajā dokumentā izmantoto terminu definīcijas ir dotas 1. papildinājumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI
7.Kā liecina pilnīgais provizoriskās validācijas pētījums, kurā novērtētas un raksturotas RhE testēšanas metodes (16), minētās testēšanas metodes ierobežojums ir tāds, ka tā nenodrošina iespēju ķimikālijas klasificēt fakultatīvajā ANO GHS 3. kategorijā (vāji kairinātāji) (1). Tāpēc šīs testēšanas metodes izmantošanas veids būs atkarīgs no dalībvalstu tiesiskā regulējuma. Kas attiecas uz ES, 3. kategorija CLP regulā nav iekļauta. Attiecībā uz to, kā pilnīgi izvērtēt lokālo ietekmi uz ādu pēc vienreizējas dermālas ekspozīcijas, jāizmanto ESAO norādījumu dokuments par integrētajām testēšanas un novērtēšanas pieejām (3). Ir atzīts, ka cilvēka ādas izmantošanai jāatbilst nacionālām un starptautiskām ētiskajām normām un nosacījumiem.
8.Šī testēšanas metode pievēršas tādam cilvēka veselības beigupunktam kā ādas kairinājums. Lai gan tā nesniedz pietiekamu informāciju par ādas koroziju, tomēr jānorāda, ka TM B.40a par ādas koroziju (līdzvērtīga ESAO TG Nr. 431) pamatojas uz tādu pašu RhE testēšanas sistēmu, bet izmanto citu protokolu (6). Šīs testēšanas metodes pamatā ir RhE modeļi, kuros izmanto cilvēka keratinocītus un kuri tādējādi in vitro pārstāv attiecīgās sugas mērķorgānu. Tā turklāt tiešā veidā aptver iekaisuma kaskādes/mehānisma sākotnējo posmu norisēs (šūnu un audu bojājumi, kuru rezultāts ir lokalizēta trauma), kuras notiek, kairinājumam rodoties in vivo. Ar šo testēšanas metodi saistītajā validēšanas procesā ir testēts plašs ķimikāliju spektrs, un validēšanas pētījuma datubāze aptver kopumā 58 ķimikālijas (16)(18)(23). Šī testēšanas metode ir izmantojama cietvielām, šķidrumiem, pusšķidrām vielām un vaskiem. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumi; cietvielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja iespējams, cietvielas pirms aplicēšanas jāsamaļ smalkā pulverī; nekāda cita priekšapstrāde paraugam nav vajadzīga. Validācijas pētījumā vēl nav novērtētas gāzes un aerosoli (29). Kaut arī jādomā, ka vispār gāzes un aerosolus ar RhE tehnoloģiju testēt ir iespējams, ar pašreizējo testēšanas metodi tos testēt nevar.
9.Pirms testēšanas metodi attiecībā uz maisījumu izmanto, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Šādi apsvērumi nav vajadzīgi, ja pastāv regulatīva prasība maisījumu testēt. Tomēr maisījumi aptver plašu kategoriju un sastāvu spektru un patlaban par maisījumu testēšanu sevišķi daudz informācijas nav pieejams, tāpēc, ja var pierādīt, ka kādai konkrētai maisījumu kategorijai (piemēram, saskaņā ar stratēģiju, ko piedāvā Eskes u. c., 2012. g.) (30) attiecīgā testēšanas metode nav izmantojama, šo testēšanas metodi šai konkrētajai maisījumu kategorijai nevajag izmantot. Līdzīga rūpība jāievēro gadījumos, kad ir konstatēta konkrētu ķimikāliju klašu vai fizikālķīmisko īpašību nepiemērotība pašreizējai testēšanas metodei.
10.Testējamās ķimikālijas, kas gaismu absorbē tādā pašā diapazonā kā MTT formazāns, un testējamās ķimikālijas, kas vitālo krāsvielu MTT spēj tieši reducēt (līdz MTT formazānam), var ietekmēt šūnu dzīvotspējas mērījumus un tādēļ koriģēšanai var būt nepieciešams izmantot pielāgotas kontroles (sk. 28.–34. punktu).
11.Vienai atsevišķai testēšanas reizei ar trim audu replikātiem jābūt pietiekamai gadījumos, kad testējamās ķīmiskās vielas klasifikācija ir nepārprotama. Tomēr ja rezultāti ir uz robežas, piemēram, replikātu mērījumiem trūkst konkordances un/vai vidējā procentuālā dzīvotspēja ir 50 ± 5 %, jāapsver, vai nav vajadzīga otrā testēšanas reize, kā arī vai nav vajadzīga trešā, ja nesakrīt abu pirmo divu testēšanas reižu rezultāti.
TESTA PRINCIPS
12.Testējamo ķimikāliju topikāli aplicē uz trīsdimensiju RhE modeļa, kuru veido nepārveidoti cilvēka epidermas keratinocīti, kas kultivēti tā, lai veidotos labi diferencēts daudzslāņains cilvēka epidermas modelis. Tam ir bazālais, spinālais un granulārais slānis, vairākslāņu stratum corneum ar lamelāriem lipīdu starpšūnu slāņiem, kuru uzbūve ir reprezentatīva galvenajām lipīdu klasēm in vivo.
13.Ķimikāliju izraisīts ādas kairinājums, kas izpaužas galvenokārt kā eritēma un tūska, ir notikumu kaskādes rezultāts, kuras sākums ir ķimikāliju penetrācija caur stratum corneum, kur tās var radīt bojājumus apakšējos keratinocītu un citu ādas šūnu slāņos. Bojātās šūnas var vai nu izdalīt iekaisuma mediatorus, vai izraisīt iekaisuma kaskādi, kas skar arī dermā esošās šūnas, jo īpaši asinsvadu stromālās un endoteliālās šūnas. Novēroto eritēmu un tūsku izraisa endoteliālo šūnu dilatācija un pieaugošā caurlaidība (29). Uz RhE balstītas testēšanas metodes ļauj bez vaskularizācijas in vitro testēšanas sistēmā, izmantojot šūnu dzīvotspējas rādījumus, mērīt kaskādes iniciācijas notikumus, piemēram, šūnu/audu bojājumus (16) (17).
14.Šūnu dzīvotspēju RhE modeļos mēra pēc vitālās krāsvielas MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds, tiazolilzilais; CAS Nr. 298-93-1] fermentatīvās pārvēršanās par zilas krāsas formazāna sāli, kura daudzumu audu ekstraktā nosaka kvantitatīvi (31). Kairinošas ķimikālijas tiek klasificētas pēc to spējas šūnu dzīvotspēju samazināt zemāk par noteiktu robežvērtību (t. i., ≤ 50 %, ANO GHS / CLP 2. kategorija). Atkarībā no tiesiskā regulējuma un testēšanas metodes piemērojamības ķimikālijas, kuru iedarbībā šūnu dzīvotspēja pārsniedz noteikto robežvērtību, var uzskatīt par kairinājumu neizraisošām (t. i., > 50 %, neklasificētas vielas).
KOMPETENCES PIERĀDĪŠANA
15.Pirms kādu no četriem šai testēšanas metodei atbilstošajiem validētajiem testa modeļiem (2. papildinājumā) sākt izmantot regulāri, laboratorijām jāpierāda tehniskā kompetence, izmantojot 1. tabulā ieteiktās 10 standartvielas. Gadījumos, kad, piemēram, kāda sarakstā norādīta viela nav pieejama, var izmantot citu vielu, par kuru pieejami pietiekami in vivo un in vitro references dati (piem., vielu no references ķimikāliju saraksta (8)), ja vien tiek izmantoti tie paši 1. tabulā aprakstītie izraudzīšanās kritēriji. Alternatīvas standartvielas izmantošana ir jāpamato.
16.Ieteicams, lai kompetences pārbaudes ietvaros lietotāji pēc audu saņemšanas verificētu šo audu barjerfunkciju, kā precizējis RhE modeļa ražotājs. Īpaši svarīgi tas ir tad, ja audu sūtījums veicis tālu ceļu vai aizņēmis ilgu laiku. Kad testēšanas metode ir sekmīgi ieviesta un tās izmantošanas prasme apgūta un uzskatāmi parādīta, šādu verifikāciju vairs nav nepieciešams veikt regulāri. Tomēr, ja testēšanas metodi izmanto parastajā praksē, ir ieteicams turpināt regulāri novērtēt barjerfunkciju.
1. tabula. Standartvielas1
|
Viela
|
CAS Nr.
|
In vivo punkti2
|
Agregātstāvoklis
|
ANO GHS kategorija
|
|
NEKLASIFICĒTAS VIELAS (ANO GHS nekategorizētas vielas)
|
|
naftalīnetiķskābe
|
86-87-3
|
0
|
Ciets
|
Nekat.
|
|
izopropanols
|
67-63-0
|
0,3
|
Šķidrs
|
Nekat.
|
|
metilstearāts
|
112-61-8
|
1
|
Ciets
|
Nekat.
|
|
heptilbutirāts
|
5870-93-9
|
1,7
|
Šķidrs
|
Nekat.
(Fakult. 3. kat.)3
|
|
heksilsalicilāts
|
6259-76-3
|
2
|
Šķidrs
|
Nekat.
(Fakult. 3. kat.)3
|
|
KLASIFICĒTAS VIELAS (ANO GHS 2. kategorija)
|
|
ciklamenaldehīds
|
103-95-7
|
2,3
|
Šķidrs
|
2. kat.
|
|
1-bromheksāns
|
111-25-1
|
2,7
|
Šķidrs
|
2. kat.
|
|
kālija hidroksīds (5 % ūd.)
|
1310-58-3
|
3
|
Šķidrs
|
2. kat.
|
|
1-metil-3-fenil-1-piperazīns
|
5271-27-2
|
3,3
|
Ciets
|
2. kat.
|
|
heptanāls
|
111-71-7
|
3,4
|
Šķidrs
|
2. kat.
|
1 Standartvielas ir validēšanas pētījumā izmantotu vielu apakškopa, un tās izraugās pēc šādiem kritērijiem: i) ķīmiskās vielas ir komerciāli pieejamas, ii) tās ir visam Dreiza [Draize] kairinājuma skalas diapazonam reprezentatīvas (no nekairinošām līdz stipri kairinošām), iii) tās ir ar precīzi noteiktu ķīmisko struktūru, iv) vielas ir reprezentatīvas validēšanas procesā izmantotajām ķīmiskajām funkcijām, v) tās vairākās testēšanas reizēs un vairākās laboratorijās devušas reproducējamus in vitro rezultātus, vi) par tām ir iegūtas pareizas prognozes in vitro un vii) tās nav ārkārtīgi toksiskas (piem., kancerogēnas vai reproduktīvajai sistēmai toksiskas) un to utilizācijas izmaksas nav pārlieku augstas.
2 In vivo punkti saskaņā ar TM B.4 (4).
3 Pēc šīs testēšanas metodes atsevišķi neklasificē vielas, ko var klasificēt ANO GHS 3. kat. (vāji kairinātāji) (1).
PROCEDŪRA
17.Turpmāk aprakstīti ādas kairinājuma noteikšanai izmantojamās RhE testēšanas metodes komponenti un procedūras (sk. arī 3. papildinājumu par parametriem, kas attiecas uz katru testa modeli). Par četriem šai testēšanas metodei atbilstīgajiem modeļiem ir pieejamas darba standartprocedūras (SOP) (32) (33) (34) (35).
RhE TESTĒŠANAS METODES KOMPONENTI
Vispārīgi nosacījumi
18.Epitēlija rekonstruēšanai jāizmanto nepārveidoti cilvēka keratinocīti. Zem funkcionāla stratum corneum jābūt vairākiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu slāņiem (bazālajam slānim, stratum spinosum, stratum granulosum). Stratum corneum jābūt vairākslāņainam, ar tādu esenciālo lipīdu profilu, lai izveidotos funkcionējoša barjera, kura ir pietiekami robusta, lai nepieļautu citotoksisku etalonķimikāliju, piemēram, nātrija dodecilsulfāta (SDS) vai Triton X-100, ātru penetrēšanos. Barjerfunkcija ir uzskatāmi jāparāda, un to var novērtēt, nosakot koncentrāciju, kurā etalonķimikālija pēc noteikta ekspozīcijas laika samazina audu dzīvotspēju par 50 % (IC50), vai nosakot ekspozīcijas laiku, kas pēc noteiktas koncentrācijas etalonķimikālijas aplicēšanas nepieciešams šūnu dzīvotspējas samazināšanai par 50 % (ET50). RhE modeļa aizturēšanas īpašībām jānovērš ap stratum corneum esošā materiāla pāreja dzīvotspējīgos audos, kuras dēļ var tikt nepareizi modelēta ekspozīcija uz ādu. RhE modelis nedrīkst būt kontaminēts ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu vai sēnītēm.
Funkcionāli nosacījumi
Dzīvotspēja
19.Dzīvotspējas kvantificēšanai izmanto MTT testu (31). RhE audu modeļa dzīvotspējīgās šūnas var vitālo krāsvielu MTT reducēt par zilas krāsas MTT formazāna nogulsnēm, kuras pēc tam tiek ekstrahētas no audiem, izmantojot izopropanolu (vai līdzīgu šķīdinātāju). Ekstrakcijas šķīdinātāja optiskajam blīvumam (OD) jābūt pietiekami mazam, t. i., OD< 0,1. Ekstrahēto MTT formazānu var kvantificēt, izmantojot vai nu standartabsorbcijas (OD) mērīšanu, vai HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (36). RhE modeļa lietotājiem jānodrošina, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst negatīvās kontroles vajadzībām definētajiem kritērijiem. RhE modeļa izstrādātājs/piegādātājs nosaka negatīvās kontroles OD vērtību pieņemamības diapazonu (augšējā un apakšējā robežvērtība) (ādas kairinājuma noteikšanai izmantojamās testēšanas metodes apstākļos). Pieņemamības diapazoni šajā testēšanas metodē iekļautajiem četriem validētajiem RhE modeļiem ir norādīti 2. tabulā. HPLC/UPLC spektrofotometrijas lietotājam negatīvās kontroles OD diapazoni, kas norādīti 2. tabulā, jāizmanto par negatīvās kontroles pieņemšanas kritēriju. Jādokumentē ar negatīvo kontroli apstrādāto audu stabilitāte kultūrā (jābūt ar salīdzināmiem dzīvotspējas rādītājiem) visas testa ekspozīcijas perioda laikā.
2. tabula. Šajā TM iekļauto testa modeļu negatīvās kontroles OD vērtību pieņemamības diapazoni
|
|
Apakšējā pieņemamības robežvērtība
|
Augšējā pieņemamības robežvērtība
|
|
EpiSkinTM (SM)
|
≥ 0,6
|
≤ 1,5
|
|
EpiDerm™ SIT (EPI-200)
|
≥ 0,8
|
≤ 2,8
|
|
SkinEthic™ RHE
|
≥ 0,8
|
≤ 3,0
|
|
LabCyte EPI-MODEL24 SIT
|
≥ 0,7
|
≤ 2,5
|
Barjerfunkcija
20.Stratum corneum un tā lipīdsastāvam jābūt pietiekamam, lai nepieļautu citotoksisku etalonķimikāliju, piemēram, SDS vai Triton X-100, strauju penetrēšanos, un to nosaka ar IC50 vai ET50 (3. tabula).
Morfoloģija
21.Jāveic RhE modeļa histoloģiski izmeklējumi, kas uzskatāmi parāda modeļa līdzību cilvēka epidermas struktūrai (ieskaitot vairākslāņu stratum corneum).
Reproducējamība
22.Testēšanas metodes pozitīvās un negatīvās kontroles rezultātiem uzskatāmi jāparāda reproducējamība laikā.
Kvalitātes kontrole (QC)
23.RhE modelis jāizmanto tikai tad, ja izstrādātājs/piegādātājs uzskatāmi parāda, ka visas izmantotās RhE modeļa partijas atbilst definētajiem produkcijas pieņemamības kritērijiem, kuru vidū svarīgākie ir dzīvotspēja (19. punkts), barjerfunkcija (20. punkts) un morfoloģija (21. punkts). Šie dati jādara pieejami testēšanas metodes lietotājiem, lai tie šo informāciju iekļautu testēšanas pārskatā. RhE modeļa izstrādātājam/piegādātājam jānosaka IC50 vai ET50 vērtību pieņemamības diapazons (augšējā un apakšējā robežvērtība). Kairinātāja klasifikācijas prognozēšanai ir derīgi tikai ar prasībām atbilstošiem audu modeļiem iegūtie rezultāti. Pieņemamības diapazoni šajā TM iekļautajiem četriem testa modeļiem ir norādīti 3. tabulā.
3. tabula. Šajā TM iekļauto testa modeļu partiju QC pieņemamības kritēriji
|
|
Apakšējā pieņemamības robežvērtība
|
Augšējā pieņemamības robežvērtība
|
|
EpiSkinTM (SM)
(18 stundu apstrāde ar SDS)(32)
|
IC50 = 1,0 mg/ml
|
IC50 = 3,0 mg/ml
|
|
EpiDerm™ SIT (EPI-200)
(1 % Triton X-100)(33)
|
ET50 = 4,0 h
|
ET50 = 8,7 h
|
|
SkinEthic™ RHE
(1 % Triton X-100)(34)
|
ET50 = 4,0 h
|
ET50 = 10,0 h
|
|
LabCyte EPI-MODEL24 SIT
(18 stundu apstrāde ar SDS)(35)
|
IC50 = 1,4 mg/ml
|
IC50 = 4,0 mg/ml
|
Testējamo un kontroles ķimikāliju aplicēšana
24.Katrai testējamai ķimikālijai un kontrolei katrā izpildes reizē vajadzīgi vismaz trīs replikāti. Testējamās ķimikālijas, kas ir šķidras vai cietas vielas, uz epidermas virsmas vienmērīgā slānī jāaplicē pietiekamā daudzumā, t. i., no 26 līdz 83 μl/cm2 vai mg/cm2, raugoties, lai deva nebūtu pārmērīga (sk. 3. papildinājumu). Pirms cietu ķimikāliju aplicēšanas epidermas virsma jāsamitrina ar dejonizētu vai destilētu ūdeni, lai nodrošinātu labāku testējamās ķimikālijas un epidermas virsmas kontaktu. Ja iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Dažos gadījumos vielas izlīdzināšanai var izmantot neilona tīkliņu (sk. 3. papildinājumu). Ekspozīcijas perioda beigās testējamā ķimikālija no epidermas virsmas rūpīgi jānoskalo ar buferšķīdumu vai 0,9 % NaCl. Atkarībā no izmantotā RhE testa modeļa ekspozīcijas periods ilgst no 15 līdz 60 minūtēm un inkubācijas temperatūra ir no 20 līdz 37 °C. Minētos ekspozīcijas periodus un temperatūras optimizē katrai RhE testēšanas metodei atsevišķi, un tie reprezentē testa modeļu atšķirīgās būtiskās īpašības (piemēram, barjerfunkcija) (sk.
3. papildinājumu).
25.Katrā izpildes reizē jāizmanto paralēlā negatīvā kontrole (NC) un pozitīvā kontrole (PC), lai uzskatāmi parādītu, ka audu dzīvotspēja (izmanto NC), barjerfunkcija un no tās izrietošais audu jutīgums (izmanto PC) atbilst noteiktam vēsturiskam pieņemamības diapazonam. Ieteicamā PC ir SDS 5 % šķīdums ūdenī. Ieteicamā NK ir ūdens vai fosfātu fizioloģiskais buferšķīdums (PBS).
Šūnu dzīvotspējas mērījumi
26.Saskaņā ar testa procedūru ir svarīgi, lai dzīvotspējas mērīšana tiktu veikta nevis tūlīt pēc testējamās ķimikālijas ekspozīcijas, bet gan pēc tam, kad ir pagājis pietiekami ilgs noskaloto audu pēcapstrādes inkubācijas periods jaunā barotnē. Minētajā periodā izzūd vājas citotoksiskas iedarbības pazīmes un parādās nepārprotamas citotoksiskas iedarbības izpausmes. Optimizējot divus no šai testēšanas metodei pamatā esošajiem RhE testa modeļiem, tika konstatēts, ka optimāls ir 42 stundu ilgs pēcapstrādes inkubācijas periods (11) (12) (13) (14) (15).
27.Šūnu dzīvotspējas mērīšanai saskaņā ar šo testēšanas metodi izmantojamā standartizētā kvantitatīvā metode ir MTT tests. Tā ir audu trīsdimensiju modelim piemērota metode. Audu paraugu uz 3 stundām ievieto atbilstošas koncentrācijas (piemēram, 0,3–1 mg/ml) MTT šķīdumā. Dzīvotspējīgās šūnas pārveido MTT par zilas krāsas formazānu. Pēc tam veic nogulsnētā zilas krāsas formazāna produkta ekstrakciju ar šķīdinātāju (piemēram, izopropanolu vai paskābinātu izopropanolu) un nosaka formazāna koncentrāciju, mērot optisko blīvumu pie viļņa garuma 570 nm ± 30 nm vai izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (sk. 34. punktu) (36).
28.Testējamās ķimikālijas optiskās īpašības vai ķīmiskā iedarbība uz MTT (piemēram, ķimikālija var gan kavēt, gan veicināt krāsas veidošanos vai atkrāsošanos) var traucēt testu, un tāpēc dzīvotspēja var būt noteikta nepareizi. Tas var notikt gadījumos, kad testējamo ķimikāliju pilnībā nenoskalo no audiem vai tad, ja tā penetrējas epidermā. Ja testējamā ķimikālija tieši iedarbojas uz MTT (piemēram, MTT reducētājs), tai ir dabiska krāsa vai krāsa izveidojas ekspozīcijas laikā, testējamās ķimikālijas radīto dzīvotspējas mērījumu traucējumu noteikšanai un korekcijām jāizmanto papildu kontroles (sk. 29. un 33. punktu). Darba standartprocedūrās par šajā testēšanas metodē iekļautajiem četriem validētajiem modeļiem ir pieejams sīks apraksts par to, kā koriģēt tiešo MTT redukciju un interferenci, ko rada krāsvielas (32) (33) (34) (35).
29.Lai noteiktu tiešos MTT reducētājus, katra testējamā ķimikālija jāpievieno svaigi sagatavotam MTT šķīdumam. Ja testējamo ķimikāliju saturošais MTT maisījums iekrāsojas zilā/violetā krāsā, uzskata, ka testējamā ķimikālija tieši reducē MTT, un jāveic no standartabsorbcijas (OD) mērīšanas vai HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūras neatkarīga nedzīvotspējīgo RhE šūnu funkcionāla pārbaude. Šajā papildu funkcionālajā pārbaudē izmanto nedzīvus audus, kam piemīt tikai reziduāla metaboliska aktivitāte, taču tie testējamo ķimikāliju absorbē līdzīgi kā dzīvotspējīgi audi. Katru MTT reducējošu testējamo ķimikāliju aplicē uz vismaz diviem nedzīvo audu replikātiem, kam veic visu testēšanas procedūru ar mērķi ģenerēt nespecifisku MTT redukciju (NSMTT) (32) (33) (34) (35). Neatkarīgi no veikto neatkarīgo testu/izpildes reižu skaita katrai testējamajai ķimikālijai ir pietiekami veikt vienu NSMTT kontroli. Faktisko audu dzīvotspēju tad aprēķina, no audu dzīvotspējas procentiem, kas iegūti ar MTT reducētājam eksponētiem dzīviem audiem, atņemot nespecifiskas MTT redukcijas procentus, kas iegūti ar tam pašam MTT reducētājam eksponētiem nedzīviem audiem un aprēķināti attiecībā pret negatīvo kontroli, kas veikta paralēli koriģējamajam testam (%NSMTT).
30.Lai noteiktu iespējamo interferenci, ko rada testējamās ķimikālijas, kurām ir krāsa, vai testējamās ķimikālijas, kuras krāsu iegūst, nonākot saskarē ar ūdeni vai izopropanolu, un lemtu par papildu kontroļu nepieciešamību, jāveic testējamās ķimikālijas spektrālanalīze ūdenī (ekspozīcijas vide) un/vai izopropanolā (ekstrakcijas šķīdums). Ja testējamā ķimikālija ūdenī un/vai izopropanolā absorbē gaismu 570 ± 30 nm diapazonā, jāveic turpmākas krāsvielu kontroles vai arī jāizmanto HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūra, kuras gadījumā kontroles nav vajadzīgas (sk. 33. un 34. punktu). Mērot standartabsorbciju (OD), katru interferējošo iekrāsoto testējamo ķimikāliju aplicē uz vismaz diviem dzīvotspējīgu audu replikātiem, kuriem veic visu testēšanas procedūru, taču, lai iegūtu nespecifiskas krāsas (NSCliving) kontroli, MTT inkubācijas solī tos inkubē barotnē, nevis MTT šķīdumā. Ņemot vērā dzīvajiem audiem raksturīgo bioloģisko mainību, NSCliving kontrole jāveic paralēli iekrāsotās ķimikālijas testēšanai un vairākkārtējas testēšanas gadījumā katram veiktajam testam (katrā izpildes reizē) jāveic neatkarīga NSCliving kontrole. Faktisko audu dzīvotspēju tad aprēķina, no audu dzīvotspējas procentiem, kas iegūti ar traucējošajai testējamajai ķimikālijai eksponētiem un MTT šķīdumā inkubētiem dzīviem audiem, atņemot nespecifiskas krāsas procentus, kas iegūti ar traucējošajai testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, kuri paralēli koriģējamajam testam inkubēti barotnē bez MTT (%NSCliving).
31.Mērot tādu testējamo ķimikāliju standartabsorbciju (OD), par kurām konstatēts, ka tās gan tieši reducē MTT (sk. 29. punktu), gan izraisa krāsu interferenci (sk. 30. punktu), papildus iepriekšējos punktos aprakstītajām NSMTT un NSCliving kontrolēm jābūt arī kādam trešajam kontroļu kopumam. Tas parasti attiecas uz MTT testu traucējošām tumšas (piem., zilas, violetas, melnas) krāsas testējamajām ķimikālijām, jo tām raksturīgās krāsas dēļ ir grūti novērtēt to spēju tieši reducēt MTT, kā aprakstīts 29. punktā. Šīs testējamās ķimikālijas var piesaistīties gan dzīviem, gan nedzīviem audiem, un tāpēc ar NSMTT kontroli var koriģēt ne tikai iespējamu tiešu MTT redukciju, ko izraisa testējamā ķimikālija, bet arī krāsas interferenci, ko rada testējamās ķimikālijas piesaistīšanās nedzīviem audiem. Tā rezultātā var notikt dubulta krāsas interferences korekcija, jo ar NSCliving kontroli jau tiek koriģēta krāsas interference, ko rada testējamās ķimikālijas piesaistīšanās dzīviem audiem. Lai izvairītos no iespējamas dubultas krāsas interferences korekcijas, ir jāveic trešā kontrole attiecībā uz nespecifisku krāsu nedzīvos audos (NSCkilled). Šajā papildu kontrolē testējamo ķimikāliju izmanto vismaz diviem nedzīvu audu replikātiem, kam veic visu testēšanas procedūru, taču MTT inkubācijas posmā tos inkubē barotnē, nevis MTT šķīdumā. Katrai ķimikālijai neatkarīgi no veikto testu/izpildes reižu skaita ir pietiekami veikt vienu NSCkilled kontroli, taču tā jāveic paralēli NSMTT kontrolei un, ja iespējams, ar to pašu audu partiju. Faktisko audu dzīvotspēju tad aprēķina, no audu dzīvotspējas procentiem, kas iegūti ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, atņemot %NSMTT un %NSCliving un pieskaitot nespecifiskas krāsas procentus, kas iegūti ar traucējošajai testējamajai ķimikālijai eksponētiem un barotnē bez MTT inkubētiem nedzīviem audiem un aprēķināti attiecībā pret negatīvo kontroli, kas veikta paralēli koriģējamajam testam (%NSCkilled).
32.Svarīgi atzīmēt, ka nespecifiskas MTT redukcijas un nespecifiskas krāsas interferenču dēļ var tikt iegūti audu ekstrakta rādījumi, kas pārsniedz spektrofotometra linearitātes diapazonu. Tādēļ katrai laboratorijai pirms regulatīvos nolūkos veicamas testējamo ķimikāliju testēšanas sākšanas jānosaka sava spektrofotometra linearitātes diapazons, izmantojot komerciāli pieejamu MTT formazānu (CAS Nr. 57360-69-7). Gadījumos, kad tādu audu ekstraktu optiskais blīvums, kas iegūti ar testējamo ķimikāliju, neveicot korekcijas par tiešu MTT redukciju un/vai krāsas interferenci, ir spektrofotometra lineārā diapazona robežās vai ar testējamo ķimikāliju iegūtā nekoriģētā dzīvotspēja procentos jau ir ≤ 50 %, tiešo MTT reducētāju un interferējošas krāsas testējamo ķimikāliju novērtēšanai ir atbilstoši veikt standartabsorbcijas (OD) mērījumus ar spektrofotometru. Tomēr par testējamām ķimikālijām iegūtie rezultāti, kas uzrāda %NSMTT un/vai %NSCliving ≥ 50% no negatīvās kontroles, būtu jāuztver piesardzīgi, jo tos izmanto par robežvērtību klasificēto un neklasificēto ķimikāliju nošķiršanai (sk. 36. punktu).
33.Attiecībā uz testējamām ķimikālijām, kurām ir krāsa un kuras nav piemērotas standarta absorbcijas (OD) mērījumiem, jo pārāk lielā mērā interferē ar MTT testu, MTT formazāna mērīšanai var izmantot alternatīvo HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (sk. 34. punktu) (36). HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēma ļauj pirms kvantificēšanas MTT formazānu atdalīt no testējamās ķimikālijas (36). Tāpēc neatkarīgi no testējamās ķimikālijas, ja tiek izmantota HPLC/UPLC spektrofotometrija, NSCliving vai NSCkilled kontroles nav jāveic. Taču, ja ir aizdomas, ka testējamā ķimikālija tieši reducē MTT, vai tai ir krāsa, kas traucē novērtēt ķimikālijas spēju tieši reducēt MTT (kā aprakstīts 29. punktā), ir jāizmanto NSMTT kontroles. Izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometriju MTT formazāna mērīšanai, audu dzīvotspēju aprēķina kā MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, un MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar paralēlo negatīvo kontroli, attiecību procentos. Testējamām ķimikālijām, kas spēj tieši reducēt MTT, audu faktisko dzīvotspēju aprēķina, no audu dzīvotspējas procentiem, kas iegūti ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, atņemot %NSMTT. Visbeidzot jāatzīmē, ka tiešos MTT reducētājus, kuri arī var radīt krāsas interferenci, kurus pēc apstrādes saglabā audos un kuri reducē MTT tik spēcīgi, ka testētā audu ekstrakta OD (izmantojot standarta OD mērīšanu) vai smailes laukumi (izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometriju) pārsniedz spektrofotometra linearitātes diapazonu, nevar novērtēt, taču šādi gadījumi ir ļoti reti.
34.HPLC/UPLC spektrofotometriju MTT formazāna mērīšanai var izmantot arī ar visa veida ķimikālijām (ar krāsu, bez krāsas, MTT reducētāji un MTT nereducētāji) (36). Ņemot vērā HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu daudzveidību, pirms HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu izmanto, lai kvantificētu no audu ekstraktiem iegūtu MTT formazānu, būtu jāpierāda minētās sistēmas kvalifikācijas atbilstība pieņemamības kritērijiem, kas noteikti kvalifikācijas standartparametru kopumam, kuru pamatā ir parametri, kas aprakstīti ASV Pārtikas un zāļu pārvaldes izstrādātājās nozares vadlīnijās par bioanalītisko metožu validēšanu (36) (37). Minētie galvenie parametri un to pieņemamības kritēriji ir norādīti 4. papildinājumā. Ja ir izpildīti 4. papildinājumā noteiktie pieņemamības kritēriji, HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu uzskata par kvalificētu un gatavu MTT formazāna mērījumu veikšanai ar šajā testēšanas metodē aprakstītajiem eksperimentēšanas nosacījumiem.
Pieņemamības kritēriji
35.Katrai testēšanas metodei, kurā izmanto testēšanai derīgas RhE modeļu partijas (sk. 23. punktu), ar negatīvās kontroles vielu apstrādātajiem audiem noteiktajām optiskā blīvuma vērtībām jāraksturo šo audu kvalitāte visos nosūtīšanas un saņemšanas cikla posmos un visos protokola procesos. Optiskā blīvuma kontrolvērtības nedrīkst būt zemākas par vēsturiski noteiktajām robežvērtībām. Tāpat arī audiem, kas apstrādāti ar pozitīvās kontroles vielām, piemēram, SDS 5 % šķīdumu ūdenī, būtu jāatspoguļo to spēja reaģēt uz kairinošu ķimikāliju šīs testa metodes apstākļos (sk. 3. papildinājumu un papildinformāciju šajā TG iekļauto četru testa modeļu SOP (32) (33) (34) (35)). Saistītajiem attiecīgajiem audu replikātu mainības mērījumiem, t. i., standartnovirzēm, ir jāatbilst pieņemamības robežvērtībām, kas noteiktas izmantotajam testa modelim (sk. 3. papildinājumu).
Rezultātu interpretēšana un prognozes modelis
36.Katrai testējamajai ķimikālijai iegūtās OD vērtības var izmantot dzīvotspējīgo šūnu daļas aprēķināšanai salīdzinājumā ar negatīvo kontroli, kuru pieņem par 100 %. Ja izmanto HPLC/UPLC spektrofotometriju, audu dzīvotspēju aprēķina kā MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, un MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar paralēlo negatīvo kontroli, attiecību procentos. Precīzi jānosaka un jādokumentē šūnu dzīvotspējas robežvērtība, pēc kuras identificē un atšķir testējamās kairinošās ķimikālijas no šādi neklasificētajām ķimikālijām, kā arī testēšanas rezultātu izvērtēšanai izmantotās statistiskās procedūras, un uzskatāmi jāparāda to piemērotība (informācijai sk. testa modeļu SOP). Kairināmības prognozēšanas robežvērtības ir šādas:
-ja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas vidējā audu dzīvotspēja procentos ir mazāka nekā vai vienāda ar (≤) 50 %, ķimikāliju identificē kā tādu, kas jāklasificē un jāmarķē saskaņā ar ANO GHS / CLP (2. kategorija vai 1. kategorija). Tā kā ar šajā testēšanas metodē iekļautajiem RhE testa modeļiem nav iespējams noteikt, vai ķimikālija ietilpst ANO GHS / CLP 1. vai 2. kategorijā, lēmuma pieņemšanai par galīgo klasifikāciju ir vajadzīga papildinformācija par ādas koroziju [sk. arī ESAO norādījumu dokumentu par IATA (3)]. Ja tiek konstatēts, ka testējamā ķimikālija nav kodīga (piemēram, pamatojoties uz TM 40, B.40a vai B.65), un audu dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas ir mazāka nekā vai vienāda ar (≤) 50 %, uzskata, ka testējamā ķimikālija izraisa tādu ādas kairinājumu, ka tā jāklasificē ANO GHS / CLP 2. kategorijā;
-ja audu dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcapstrādes inkubēšanas ir lielāka par (>) 50 %, atkarībā no dalībvalstu tiesiskā regulējuma var uzskatīt, ka testējamā ķimikālija neizraisa ādas kairinājumu un ANO GHS / CLP sistēmā ir neklasificēta viela.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Dati
37.Par katru izpildes reizi, arī par atkārtotiem eksperimentiem, ja tos veic, tabulas veidā apkopo visus datus par visiem audu replikātiem (piemēram, optiskā blīvuma vērtības, procentos aprēķinātas šūnu dzīvotspējas datus par katru ķimikāliju un tās klasifikācijas datus). Par katru izpildes reizi jānorāda rezultāta vidējā vērtība ± standartnovirze. Par katru testējamo ķimikāliju jādokumentē novērotā iedarbība ar MTT reaģentu un testējamo ķimikāliju, kurai ir krāsa.
Testēšanas pārskats
38.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija un kontroles ķimikālijas:
-vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā un ja praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. c.;
-daudzkomponentu viela, UVCB un maisījums: iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām;
-izskats, šķīdība ūdenī un papildu relevantās fizikālķīmiskās īpašības;
-avots, sērijas numurs, ja zināms;
-testējamās ķimikālijas / kontroles ķimikāliju pirmstestēšanas apstrāde (piem., sildīšana, sasmalcināšana), ja tāda veikta;
-testējamās ķimikālijas stabilitāte, izmantošanas termiņš vai atkārtotas analīzes datums, ja tas zināms;
-glabāšanas apstākļi.
Izmantotais RhE modelis un protokols (un attiecīgās izvēles pamatojums)
Testa apstākļi:
-izmantotais RhE modelis (arī partijas numurs);
- MTT kvantificēšanai izmantotās mērierīces (piemēram, spektrofotometra) kalibrēšanas dati, viļņa garums un frekvenču joslas filtrs (attiecīgā gadījumā), un mērierīces linearitātes diapazons; MTT formazāna kvantificēšanai izmantotās metodes apraksts;
-HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas kvalifikācijas apraksts (attiecīgā gadījumā); pilnīga papildinformācija par izmantoto RhE modeli un tā veiktspējas raksturlielumiem. No tiem jānorāda vismaz:
i) dzīvotspēja;
ii) barjerfunkcija;
iii) morfoloģija;
iv) reproducējamība un prognozējamība;
v) modeļa kvalitātes kontroles (QC);
-vēsturiskie dati par modeli. No tiem jānorāda vismaz kvalitātes kontroles datu pieņemamība saskaņā ar vēsturiskajiem datiem par partiju kontroles rezultātiem;
-apliecināta kompetence testēšanas metodes veikšanā, kura pirms attiecīgās testēšanas metodes regulāras izmantošanas pierādīta, veicot standartvielu testēšanu.
Testa procedūra:
- detalizēta informācija par izmantoto testa procedūru (arī par mazgāšanas procedūrām, ko izmanto pēc ekspozīcijas perioda); testējamās ķimikālijas deva un izmantotās kontroles;
- ekspozīcijas ilgums un temperatūra un pēcekspozīcijas inkubēšanas laiks;
-kontroles, kas izmantotas tiešajiem MTT reducētājiem un/vai testējamām ķimikālijām, kurām ir krāsa (attiecīgā gadījumā);
-izmantoto audu replikātu skaits katrai ķimikālijai un kontrolei (pozitīvā kontrole, negatīvā kontrole un NSMTT, NSCliving un NSCkilled, ja tāda veikta);
-apraksts par lēmuma pieņemšanas kritēriju / prognozes modeli, kas piemērots, pamatojoties uz izmantoto RhE modeli;
-testa procedūras (arī mazgāšanas procedūru) modifikāciju apraksts, ja tādas bijušas.
Izpildes reizes un testa pieņemamības kritēriji:
- pozitīvās un negatīvās kontroles vidējās vērtības un pieņemamības diapazoni, kas balstīti uz vēsturiskajiem datiem; pieņemama mainība starp pozitīvām un negatīvām kontrolēm izmantojamiem audu replikātiem;
- pieņemama mainība starp testējamai ķimikālijai izmantojamiem audu replikātiem.
Rezultāti:
- tabulā apkopoti dati par individuālu testējamo ķimikāliju par katru izpildes reizi un katru replikāta mērījumu, tostarp OD vai MTT formazāna smailes laukums, audu dzīvotspēja procentos, vidējā audu dzīvotspēja procentos un standartnovirze;
- attiecīgā gadījumā — to kontroļu rezultāti, kas izmantotas tiešajiem MTT reducētājiem un/vai testējamām ķimikālijām, kurām ir krāsa, tostarp OD vai MTT formazāna smailes laukums, %NSMTT, %NSCliving, %NSCkilled, standartnovirze, pareiza galīgā audu dzīvotspēja procentos;
-rezultāti, kas iegūti ar testējamo ķimikāliju (ķimikālijām) un kontrolēm, salīdzinājumā ar noteiktajiem izpildes reizes un testa pieņemamības kritērijiem;
- jebkādas citas novērotās ietekmes apraksts;
-atvasinātā klasifikācija ar norādi uz izmantoto prognozes modeli un/vai lēmuma pieņemšanas kritēriju.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at:
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
.
(2)EURL-ECVAM (2009). Statement on the “Performance Under UN GHS of Three In Vitro Assays for Skin Irritation Testing and the Adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM Skin Irritation Performance Standards”, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC31), 9 April 2009. Available at:
https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication//ESAC31_skin-irritation-statement_20090922.pdf
(3)OECD (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(4)Šā pielikuma B.4. nodaļa “Akūts ādas kairinājums/korozija”.
(5)Šā pielikuma B.40. nodaļa “Ādas korozija in vitro: transkutānā elektriskā pretestība (TEP).
(6)Šā pielikuma B.40a nodaļa “Ādas korozija in vitro: rekonstruētas cilvēka epidermas RHE tests”
(7)Šā pielikuma B.65. nodaļa “In vitro barjermembrānas testa metode”.
(8)OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Epidermis (RhE) Test Methods for Skin Irritation in Relation to TG 439. Environment, health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 220). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(9)OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(10)Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001). A Prevalidation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation, Results and Evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.
(11)Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002). Refinement of the EPISKIN Protocol for the Assessment of Acute Skin Irritation of Chemicals: Follow-Up to the ECVAM Prevalidation Study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770.
(12)Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests, ALTEX 21, 107–114.
(13)Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests – An Assessment of the Performance of the Optimised Test, ATLA 33, 351-367.
(14)Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model Within the Framework of the ECVAM Validation Process, ATLA 33, 329-349.
(15)Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002). Follow-Up to the ECVAM Prevalidation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.
(16)Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test, ATLA 35, 559-601.
(17)Hoffmann S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α.
(18)Eskes C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals, ATLA 35, 603-619.
(19)Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007). In Vitro Acute Skin Irritancy of Chemicals Using the Validated EPISKIN Model in a Tiered Strategy - Results and Performances with 184 Cosmetic Ingredients, ALTEX, 14, 351-358.
(20)EURL-ECVAM (2007). Statement on the Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 April 2007. Available at: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication//ESAC26_statement_SkinIrritation_20070525_C.pdf
(21)EURL-ECVAM. (2007). Performance Standards for Applying Human Skin Models to In Vitro Skin Irritation Testing. N.B. These are the original PS used for the validation of two test methods. These PS should not be used any longer as an updated version (8) is now available.
(22)EURL-ECVAM. (2008). Statement on the Scientific Validity of In Vitro Tests for Skin Irritation Testing, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 November 2008. https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/about-ecvam/archive-publications/publication/ESAC_Statement_SkinEthic-EpiDerm-FINAL-0812-01.pdf
(23)OECD (2010). Explanatory Background Document to the OECD Draft Test Guideline on In Vitro Skin Irritation Testing. Environment, Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, (No 137), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(24)Katoh, M., Hamajima, F., Ogasawara, T. and Hata K. (2009). Assessment of Human Epidermal Model LabCyte EPI-MODEL for In Vitro Skin Irritation Testing According to European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM)-Validated Protocol, J Toxicol Sci, 34, 327-334
(25)Katoh, M. and Hata K. (2011). Refinement of LabCyte EPI-MODEL24 Skin Irritation Test Method for Adaptation to the Requirements of OECD Test Guideline 439, AATEX, 16, 111-122
(26)OECD (2011). Validation Report for the Skin Irritation Test Method Using LabCyte EPI-MODEL24. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 159), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(27)OECD (2011). Peer Review Report of Validation of the Skin Irritation Test Using LabCyte EPI-MODEL24. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 155), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(28)Kojima, H., Ando, Y., Idehara, K., Katoh, M., Kosaka, T., Miyaoka, E., Shinoda, S., Suzuki, T., Yamaguchi, Y., Yoshimura, I., Yuasa, A., Watanabe, Y. and Omori, T. (2012). Validation Study of the In Vitro Skin Irritation Test with the LabCyte EPI-MODEL24, Altern Lab Anim, 40, 33-50.
(29)Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004). In Vitro Skin Irritation: Fact and Future. State of the Art Review of Mechanisms and Models, Toxicol. In Vitro 18, 231-243.
(30)Eskes, C. et al. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403).
(31)Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63.
(32)EpiSkin™ (February 2009). SOP, Version 1.8ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkin™ Test Method 15 min - 42 hours for the Prediction of acute Skin Irritation of Chemicals
(33)EpiDerm™ (Revised March 2009). SOP, Version 7.0, Protocol for: In Vitro EpiDerm™ Skin Irritation Test (EPI-200-SIT), for Use with MatTek Corporation's Reconstructed Human Epidermal Model EpiDerm (EPI-200).
(34)SkinEthic™ RHE (February 2009) SOP, Version 2.0, SkinEthic Skin Irritation Test-42bis Test Method for the Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals: 42 Minutes Application + 42 Hours Post-Incubation.
(35)LabCyte (June 2011). EPI-MODEL24 SIT SOP, Version 8.3, Skin Irritation Test Using the Reconstructed Human Model “LabCyte EPI-MODEL24”
(36)Alépée, N., Barroso, J., De Smedt, A., De Wever, B., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K.R., Millet, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Templier, M., and McNamee, P. Use of HPLC/UPLC-Spectrophotometry for Detection of MTT Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)-Based Test Methods Employing the MTT Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Manuscript in preparation.
(37)US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. May 2001. Available at: [
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf
].
(38)Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995). Irritant Contact Dermatitis, in: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.
(39)EURL-ECVAM (2009). Performance Standards for In Vitro Skin Irritation Test Methods Based on Reconstructed Human Epidermis (RhE). N.B. This is the current version of the ECVAM PS, updated in 2009 in view of the implementation of UN GHS. These PS should not be used any longer as an updated version (8) is now available related to the present TG.
(40)EURL-ECVAM. (2009). ESAC Statement on the Performance Standards (PS) for In Vitro Skin Irritation Testing Using Reconstructed Human Epidermis, Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC31), 8 July 2009.
(41)EC (2001). Commission Directive 2001/59/EC of 6 August 2001 Adapting to Technical Progress for the 28th Time Council Directive 67/548/EEC on the Approximation of Laws, Regulations and Administrative Provisions Relating to the Classification, Packaging and Labelling of Dangerous Substances, Official Journal of the European Union L225, 1-333.
1. papildinājums
DEFINĪCIJAS
Pareizība: pakāpe, kādā testēšanas metodes rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas mērs un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pat nozīmē kā terminu “konkordantums”, ar to saprotot testēšanas metodes pareizo iznākumu īpatsvaru (9).
Šūnu dzīvotspēja: parametrs, kas raksturo šūnu populācijas kopējo aktivitāti, piemēram, šūnu mitohondriju dehidrogenāžu spēju reducēt vitālo krāsvielu MTT (3–(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds, tiazolilzilais), kas atkarībā no nosakāmā testēšanas beigupunkta un izmantotā testēšanas plāna korelē ar dzīvo šūnu kopējo skaitu un/vai dzīvotspēju.
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Konkordantums: tādu testa modeļu veiktspējas mērs, ar kuriem iegūst kategoriālus rezultātus, un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pat nozīmē kā terminu “pareizība”, ar to saprotot visu to testēto ķimikāliju īpatsvaru, kas pareizi klasificētas kā pozitīvas vai negatīvas. Konkordantums lielā mērā ir atkarīgs no to pozitīvo rezultātu prevalences, kādi iegūti attiecībā uz pētāmajiem testējamo ķimikāliju veidiem (9).
ET50: parametrs, ko var aprēķināt pēc ekspozīcijas laika, kas pēc noteiktas koncentrācijas etalonķimikālijas aplicēšanas nepieciešams šūnu dzīvotspējas samazināšanai par 50 % (sk. arī IC50).
GHS (Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētā sistēma): sistēma, kurā ķimikālijas (vielas un maisījumus) klasificē pēc standartizētiem fizisko apdraudējumu, veselības apdraudējumu un vidisko apdraudējumu tipiem un līmeņiem un izmanto tādus attiecīgus komunikācijas elementus kā piktogrammas, signālvārdi, bīstamības apzīmējumi, drošības prasību apzīmējumi un drošības datu lapas, lai sniegtu informāciju par ķimikāliju nelabvēlīgo ietekmi un tādējādi aizsargātu cilvēkus (arī darba devējus un darba ņēmējus, transporta darbiniekus, patērētājus un avārijas dienestu darbiniekus) un vidi (1).
HPLC: augsti efektīvā šķidruma hromatogrāfija.
IATA: integrētā testēšanas un novērtēšanas pieeja.
IC50: parametrs, ko var aprēķināt pēc etalonķimikālijas koncentrācijas, kurā audu dzīvotspēja pēc noteikta ekspozīcijas laika samazinās par 50 % (IC50) (sk. arī ET50).
Pārmērīga deva: uz epidermas aplicētās testējamās ķimikālijas daudzums, kas ir lielāks par epidermas virsmas pilnīgai un vienmērīgai pārklāšanai nepieciešamo daudzumu.
Maisījums: maisījums vai šķīdums, kas sastāv no divām vai vairāk vielām.
Vienkomponenta viela: tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vismaz 80 % (masa/masa) veido viena galvenā sastāvdaļa.
MTT: 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds; tiazolilzilā tetrazolija bromīds.
Daudzkomponentu viela: tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vairāk nekā viena no galvenajām sastāvdaļām ir koncentrācijā ≥ 10 % (masa/masa) un < 80 % (masa/masa). Daudzkomponentu vielas tiek iegūtas ražošanas procesā. Atšķirība starp maisījumu un daudzkomponentu vielu ir tāda, ka maisījumu iegūst, divas vai vairākas vielas sajaucot bez ķīmiskas reakcijas. Daudzkomponentu viela rodas ķīmiskā reakcijā.
NSCkilled: nespecifiska krāsa nedzīvos audos.
NSCliving: nespecifiska krāsa dzīvos audos.
NSMTT: nespecifiska MTT redukcija.
Veiktspējas standarti (VS): uz validētu testēšanas metodi bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē pēc noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Tajos ietilpst: (i) nepieciešamie testēšanas metodes komponenti; (ii) minimāls tādu references ķimikāliju saraksts, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; kā arī iii) uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — salīdzināmi pareizības un ticamības līmeņi, kā būtu jāiegūst ar ierosināto testēšanas metodi, to izvērtējot ar references ķimikālijām no minimālā saraksta (9).
PC: pozitīvā kontrole, replikāts, kuram ir visi testēšanas sistēmas komponenti un kurš apstrādāts ar vielu, par ko zināms, ka tā inducē pozitīvu atbildreakciju. Lai būtu iespējams novērtēt pozitīvās kontroles atbildreakcijas mainību laikā, pozitīvās atbildreakcijas intensitāte nedrīkstētu būt pārlieku liela.
Relevantums: parametrs, kas raksturo testa attiecināmību uz interesējošo ietekmi un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Tā ir pakāpe, kādā ar testu var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testēšanas metodes pareizības (konkordantuma) aspektu (9).
Ticamība: parametrs, kas izsaka, kādā pakāpē, izmantojot vienu un to pašu protokolu, kādu testēšanas metodi vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās ilgākā laika nogrieznī var izmantot reproducējami. To novērtē, aprēķinot iekšlaboratorisko un starplaboratorisko reproducējamību (9).
Aizstājējtests: ikdienā lietota testa aizstāšanai paredzēts tests, kuru pieņemts izmantot bīstamības identificēšanai un/vai riska novērtēšanai, ar pierādītu spēju ekvivalentā vai labākā veidā, salīdzinot ar pieņemto testu, nodrošināt (pēc vajadzības) cilvēka un dzīvnieku veselības vai vides aizsardzību visās iespējamās testēšanas situācijās un ar visām iespējamām ķimikālijām (9).
Izpildes reize: reize, kurā vienu vai vairākas ķimikālijas vienlaikus testē ar negatīvu kontroli un pozitīvu kontroli.
Jutība: tā visu pozitīvo/aktīvo testējamo ķimikāliju daļa, kas ar testu tiek pareizi klasificētas. Tas ir tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (9).
Ādas kairinājums in vivo: atgriezenisks ādas bojājums, kas rodas, testējamo ķimikāliju aplicējot uz laiku līdz četrām stundām. Ādas kairinājums ir lokāla skarto ādas audu reakcija, kas parādās neilgi pēc kairinātāja iedarbības (38). To izraisa lokāla iekaisuma reakcija, kas saistīta ar ādas audu dabisko (nespecifisko) imūnsistēmu. Tā svarīgākā iezīme ir procesu atgriezeniskums, kas saistīti ar iekaisuma reakcijām un ar iekaisuma procesu saistītā kairinājuma raksturīgo klīnisko pazīmju (eritēma, tūska, nieze un sāpes) lielāko daļu.
Specifiskums: tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām testējamajām ķimikālijām ar testu tiek klasificētas pareizi. Tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (9).
Viela: ķīmisks elements un tā dabiski radušies vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, ieskaitot to stabilizācijai nepieciešamās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušos piejaukumus, bet izņemot šķīdinātājus, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu.
Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
UPLC: īpaši augstefektīva šķidrumhromatogrāfija.
UVCB: vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli.
2. papildinājums
ŠAJĀ TESTĒŠANAS METODĒ IEKĻAUTIE TESTA MODEĻI
|
Nr.
|
Testa modeļa nosaukums
|
Validācijas pētījuma veids
|
Atsauces
|
|
1
|
EpiSkin™
|
Pilnīgs provizoriskās validācijas pētījums (2003–2007). Šā modeļa komponenti tika izmantoti, lai noteiktu sākotnējo un atjaunināto ECVAM VS (39) (40) (21)* būtiskos testēšanas metodes komponentus. Turklāt metodes dati, kas saistīti ar neklasificēto/klasificēto vielu identifikāciju, veidoja galveno pamatu sākotnējo VS* specifiskuma un jutības vērtību noteikšanai.
|
(2) (10) (11) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (23) (32) (39) (40)
|
|
2
|
EpiDerm™ SIT (EPI-200)
|
EpiDerm™ (oriģināls): šim testa modelim, tāpat kā 1. modelim, pilnīga provizoriskā validācija veikta 2003.–2007. gadā. Šā modeļa komponenti tika izmantoti, lai noteiktu sākotnējo un atjaunināto ECVAM VS (39) (40) (21)* būtiskos testēšanas metožu komponentus.
|
(2) ( (10) (12) (13) (15) (16) (17) (18) (20) (21) (23) (33) (39) (40)
|
|
|
|
EpiDerm™ SIT (EPI-200): Oriģinālā modeļa EpiDerm™ modifikācija validēta, izmantojot sākotnējos ECVAM VS (21) 2008. gadā*.
|
(2) (21) (22) (23) (33)
|
|
3
|
SkinEthic™ RHE
|
Validācijas pētījums balstīts uz sākotnējiem ECVAM veiktspējas standartiem (21) 2008. gadā*.
|
(2) (21) (22) (23) (31)
|
|
4
|
LabCyte EPI-MODEL24 SIT
|
Validācijas pētījums (2011–2012) balstīts uz ESAO TG Nr. 439 (8) veiktspējas standartiem (VS), kuri balstīti uz atjauninātajiem ECVAM VS* (39) (40).
|
(24) (25) (26) (27) (28) (35) (39) (40) un šīs TG (8) veiktspējas standarti.
|
*) Sākotnējie ECVAM veiktspējas standarti (VS) (21) tika izstrādāti 2007. gadā pēc tam, kad bija pabeigts provizoriskās validācijas pētījums (16), kurā novērtēta 1. un 2. testa modeļa veiktspēja, pamatojoties uz klasifikācijas sistēmu, kas aprakstīta ES Bīstamo vielu direktīvas 28. grozījumā (41). 2008. gadā tika ieviesta ANO GHS (1) un ES CLP, un robežvērtība, ko izmanto neklasificētu vielu nošķiršanā no klasificētām vielām, mainīta no 2.0 uz 2.3 in vivo punktiem. Lai pielāgotos šīm mainītajām regulatīvajām prasībām, 2009. gadā tika atjauninātas ECVAM VS pareizības vērtības un references ķimikāliju saraksts (2) (39) (40). Tāpat kā sākotnējie VS, arī atjauninātie VS bija lielā mērā balstīti uz 1. un 2. modeļa datiem (16), taču papildus izmantoti 3. modeļa dati par references ķimikālijām. Atjauninātos ECVAM VS 2010. gadā izmantoja ar šo TG (8) saistīto VS noteikšanai. Šajā testēšanas metodē EpiSkin™ tiek uzskatīts par VRM, jo to izmantoja visu VS kritēriju izstrādē. Detalizēta informācija par validācijas pētījumiem, iegūto datu apkopojums un pamatinformācija par VS pielāgojumiem, kas veicami pēc ANO GHS/CLP ieviešanas, atrodama ECVAM/BfR paskaidrojošajā pamatdokumentā, kas pievienots atbilstīgajai ESAO TG Nr. 439 (23).
SIT: ādas kairinājuma tests.
RHE: cilvēka epidermas rekonstrukcija.
3. papildinājums
PROTOKOLA PARAMETRI KATRAM ŠAJĀ TESTĒŠANAS METODĒ
IEKĻAUTAJAM TESTA MODELIM
RhE modeļiem ir ļoti līdzīgi protokoli, un jo īpaši tiem visiem ir 42 stundu ilgs pēcinkubācijas periods (32) (33) (34) (35). Galvenokārt atšķiras trīs parametri, kas saistīti ar dažādajām testa modeļu barjerfunkcijām, proti, A) pirmsinkubācijas laiks un tilpums, B) testējamo ķimikāliju aplicēšana un C) pēcinkubācijas tilpums.
|
|
EpiSkinTM (SM)
|
EpiDermTM SIT (EPI-200)
|
SkinEthic
RHETM
|
LabCyte
EPI-MODEL24 SIT
|
|
A) Pirmsinkubācija
|
|
Inkubācijas laiks
|
18–24 stundas
|
18–24 stundas
|
< 2 stundas
|
15–30 stundas
|
|
Vidējs tilpums
|
2 ml
|
0,9 ml
|
0,3 vai 1 ml
|
0,5 ml
|
|
B) TESTĒJAMĀS ĶIMIKĀLIJAS APLICĒŠANA
|
|
Šķidrumi
|
10μl (26μl/cm2)
|
30μl (47μl/cm2)
|
16μl (32μl/cm2)
|
25μl (83 μl/cm2)
|
|
Cietvielas
|
10 mg (26 mg/cm2)
+ DW (5 μl)
|
25 mg (39 mg/cm2)
+ DPBS (25 μl)
|
16 mg (32 mg/cm2)
+ DW (10 μl)
|
25 mg (83 mg/cm2)
+ DW (25 μl)
|
|
Vai izmanto neilona tīkliņu?
|
Neizmanto
|
Vajadzības gadījumā izmanto
|
Izmanto
|
Neizmanto
|
|
Kopējais aplicēšanas laiks
|
15 minūtes
|
60 minūtes
|
42 minūtes
|
15 minūtes
|
|
Aplicēšanas temperatūra
|
RT
|
a) RT 25 minūtes
b) 37ºC 35 minūtes
|
RT
|
RT
|
|
C) Pēcinkubācijas tilpums
|
|
Vidējs tilpums
|
2 ml
|
0,9 ml x 2
|
2 ml
|
1 ml
|
|
D) Maksimālais pieļaujamais mainīgums
|
|
Standartnovirze (SD) starp audu replikātiem
|
SD
|
SD
|
SD
|
SD
|
RT: istabas temperatūra.
DW: destilēts ūdens.
DPBS: Dulbeko fosfātu fizioloģiskais buferšķīdums
4. papildinājums
Galvenie parametri un pieņemamības kritēriji no RhE audiem ekstrahēta MTT formazāna mērīšanai paredzētas HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas kvalificēšanai
|
Parametrs
|
Protokols saskaņā ar FDA norādījumiem (36) (37)
|
Pieņemamības kritēriji
|
|
Selektivitāte
|
Izopropanola, dzīva tukšā parauga (izopropanola ekstrakts no neapstrādātiem dzīviem RhE audiem), nedzīva tukšā parauga (izopropanola ekstrakts no neapstrādātiem nedzīviem RhE audiem) analīze
|
Laukumsinterference ≤ 20 % no laukumaLLOQ1
|
|
Precizitāte
|
Kvalitātes kontroles (t. i., MTT formazāns koncentrācijā 1,6 µg/ml, 16 µg/ml un 160 µg/ml) izopropanolā (n=5)
|
CV ≤ 15 % vai ≤ 20 % attiecībā uz LLOQ
|
|
Pareizība
|
Kvalitātes kontroles izopropanolā (n=5)
|
% novirze ≤ 15 % vai ≤ 20 % attiecībā uz LLOQ
|
|
Matrices efekts
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=5)
|
85 % ≤ matrices efekts % ≤ 115 %
|
|
Pārnese
|
Izopropanola analīze pēc ULOQ2 standarta
|
Laukumsinterference ≤ 20 % no laukumaLLOQ
|
|
Reproducējamība (tajā pašā dienā)
|
3 neatkarīgas kalibrēšanas līknes (balstītas uz 6 secīgiem MTT formazāna 1/3 atšķaidījumiem izopropanolā, sākot no ULOQ, t. i., 200 µg/ml);
Kvalitātes kontroles izopropanolā (n=5)
|
Kalibrēšanas līknes: % novirze ≤ 15 % vai ≤ 20 % attiecībā uz LLOQ
Kvalitātes kontroles: % novirze ≤ 15% un CV ≤ 15%
|
|
Reproducējamība (no vienas dienas otrā)
|
1. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
2. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
3. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
|
|
|
MTT formazāna īslaicīga stabilitāte RhE audu ekstraktā
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=3), kas analizēts sagatavošanas dienā un pēc 24 stundu ilgas glabāšanas istabas temperatūrā
|
%Novirze ≤ 15 %
|
|
MTT formazāna ilglaicīga stabilitāte RhE audu ekstraktā (ja vajadzīgs)
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=3), kas analizēts sagatavošanas dienā un pēc vairāku dienu ilgas glabāšanas noteiktā temperatūrā (piem., 4 ºC, -20 ºC, -80 ºC)
|
%Novirze ≤ 15 %
|
(8) B daļā pievieno šādas nodaļas:
“B.63. REPRODUKTĪVĀS / ONTOĢENĒTISKĀS TOKSICITĀTES SKRĪNINGA TESTS
IEVADS
1.Šī testēšanas metode ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijai (TG) Nr. 421 (2016). ESAO vadlīnijas par ķimikāliju testēšanu periodiski tiek pārskatītas, ņemot vērā zinātnes attīstību. Sākotnējā vadlīnija Nr. 421 par skrīninga testu tika pieņemta 1995. gadā, pamatojoties uz protokolu par “Sākotnējo reproduktīvā toksiskuma skrīninga testu”, kas apspriests divās ekspertu sanāksmēs Londonā 1990. gadā (1) un Tokijā 1992. gadā (2).
2.Pēc tam, kad 1998. gadā ESAO tika sākta prioritāra darbība ar mērķi pārskatīt esošās testēšanas vadlīnijas un izstrādāt jaunas testēšanas vadlīnijas par endokrīno disruptoru skrīningu un testēšanu (3), šī testēšanas metode tika atjaunināta, iekļaujot tajā endokrīnajiem disruptoriem relevantus beigupunktus. Piemēram, ESAO TG Nr. 407 (Atkārtotas devas 28 dienu orālās toksicitātes pētījums ar grauzējiem, šā pielikuma B.7. nodaļa) 2008. gadā tika papildināta ar parametriem, kas piemēroti testējamo ķimikāliju endokrīnās aktivitātes noteikšanai. TG Nr. 421 tika atjaunināta, lai skrīninga TG, kur ekspozīcijas periodi aptver dažus jutīgos attīstības periodus (prenatālais vai agrīns postnatālais periods), iekļautu dažus endokrīnajiem disruptoriem relevantus beigupunktus.
3.Izvēlētie endokrīnajiem disruptoriem relevantie papildu beigupunkti, kas ir daļa arī no TG Nr. 443 (Paplašinātais vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījums, šā pielikuma B.56. nodaļa), tika iekļauti TG Nr. 421, pamatojoties uz priekšizpēti, kurā aplūkoti zinātniski un tehniski jautājumi par minēto beigupunktu iekļaušanu, kā arī iespējamie testēšanas plānojuma pielāgojumi, kas vajadzīgi minēto beigupunktu iekļaušanai (4).
4.Šī testēšanas metode ir izstrādāta, lai iegūtu ierobežotu informāciju par testējamās ķimikālijas ietekmi uz tēviņu un mātīšu reproduktīvo spēju, piemēram, gonadālo funkciju, pārošanās uzvedību, apaugļošanos, miesas augļa attīstību un dzemdībām. Tā nav nedz alternatīva B.31., B.34., B.35. vai B.56. testēšanas metodei, nedz tās aizstāj.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI
5.Šo skrīninga testa metodi var izmantot, lai iegūtu sākotnējo informāciju par iespējamo ietekmi uz reprodukciju un/vai attīstību vai nu ķimikāliju toksikoloģisko īpašību novērtēšanas agrīnā posmā, vai par ķimikālijām, kas rada bažas. To var izmantot arī kā daļu no sākotnējo skrīninga testu kopuma attiecībā uz esošajām ķimikālijām, par kurām pieejams maz toksikoloģiskās informācijas vai tā nav pieejama vispār, vai kā devu diapazona noteikšanas pētījumu plašākiem reprodukcijas/ontoģenēzes pētījumiem; to var izmantot citos relevantos gadījumos. Veicot pētījumu, ir jāievēro galvenie principi un apsvērumi, kas noteikti ESAO norādījumu dokumentā Nr. 19 par klīnisko pazīmju atpazīšanu, novērtēšanu un izmantošanu par humānajiem beigupunktiem eksperimenta dzīvniekiem, kurus izmanto drošības novērtējumā (5).
6.Šī testēšanas metode nesniedz pilnīgu informāciju par visiem reprodukcijas un attīstības aspektiem. Konkrētāk, tā piedāvā tikai ierobežotus līdzekļus, ar ko detektēt prenatālās ekspozīcijas postnatālās izpausmes vai ietekmi, kas var rasties postnatālās ekspozīcijas laikā. Ņemot vērā dzīvnieku salīdzinoši mazo skaitu devas grupās, beigupunktu selektivitāti, pētījuma īso ilgumu un citus iemeslus, šī metode nesniedz pierādījumus galīgajiem apgalvojumiem par ietekmes neesību. Turklāt, ja nav datu no citiem reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes testiem, pozitīvie rezultāti ir noderīgi sākotnējai bīstamības novērtēšanai un palīdz pieņemt lēmumus par papildu testēšanas nepieciešamību un laiku.
7.Rezultāti, kas iegūti par endokrīnajiem parametriem, ir jāaplūko ESAO endokrīni disruptīvu ķimikāliju testēšanas un novērtēšanas konceptuālā satvara (6) kontekstā. Atjauninātā ESAO TG Nr. 421 ir iekļauta minētā konceptuālā satvara 4. līmenī, kur ietilpst in vivo testi, kas sniedz datus par nelabvēlīgu ietekmi uz endokrīnajiem beigupunktiem. Endokrīnu signālu pašu par sevi tomēr nevar uzskatīt par pietiekamu pierādījumu tam, ka testējamā ķimikālija ir endokrīnais disruptors.
8.Šajā testēšanas metodē izmanto perorālo testējamās ķimikālijas ievadīšanu. Citu ekspozīcijas ceļu izmantošanas gadījumā var būt vajadzīgas modifikācijas.
9.Pirms testēšanas metodi attiecībā uz maisījumu izmanto, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Šādi apsvērumi nav vajadzīgi, ja pastāv regulatīva prasība maisījumu testēt.
10.Izmantotās definīcijas sniegtas 1. papildinājumā.
TESTA PRINCIPS
11.Testējamo ķimikāliju pakāpeniski pieaugošās devās saņem vairākas tēviņu un mātīšu grupas. Tēviņiem testējamās ķimikālijas jādod vismaz četras nedēļas līdz dienai pirms plānotās nonāvēšanas (minēto dienu ieskaitot); minētais laikposms aptver vismaz divas nedēļas pirms pārošanas, pārošanas periodu un aptuveni divas nedēļas pēc pārošanas. Ņemot vērā ierobežoto pirmspārošanas devu došanas periodu tēviņiem, auglība var nebūt precīzs testikulārās toksicitātes rādītājs. Tāpēc būtiska ir sēklinieku detalizēta histopatoloģiska izmeklēšana. Divu nedēļu ilgais pirmspārošanas devu došanas periods apvienojumā ar turpmākiem pārošanās/auglības novērojumiem ar kopējo devu došanas periodu vismaz četras nedēļas, kam seko tēviņu gonādu detalizēta histopatoloģija, tiek uzskatīts par pietiekamu, lai varētu noteikt lielāko daļu ietekmes uz tēviņu auglību un spermatoģenēzi.
12.Mātītēm devas dod visu pētījuma laiku, kas aptver divas nedēļas pirms pārošanas (aptverot divus pilnus estrālos ciklus), laiku līdz apaugļošanās brīdim, grūsnības laiku un vismaz trīspadsmit dienas pēc dzemdībām, līdz dienai pirms plānotās nonāvēšanas (minēto dienu ieskaitot).
13.Pētījuma ilgums pēc aklimatizācijas un estrālā cikla izvērtējuma, ko veic pirms devu došanas, ir atkarīgs no mātīšu rādītājiem un ir aptuveni 63 dienas [vismaz 14 dienas pirms pārošanas, (ne vairāk kā) 14 dienas pārošana, 22 dienas gestācija, 13 dienas laktācija].
14.Devu došanas perioda laikā katru dienu rūpīgi novēro, vai dzīvniekiem neparādās toksiskuma pazīmes. Dzīvniekiem, kas testa periodā nobeigušies vai ir nonāvēti, izdara autopsiju, un izdzīvojušos dzīvniekus testa beigās nonāvē un tiem izdara autopsiju.
METODES APRAKSTS
Dzīvnieku sugas izraudzīšanās
15.Šo testēšanas metodi paredzēts izmantot ar žurkām. Ja šajā testēšanas metodē noteiktie parametri tiek pētīti citās grauzēju sugās, tas sīki jāpamato. Starptautiskajā validēšanas programmā endokrīno disruptoru detektēšanai saskaņā ar ESAO TG Nr. 407 (šā pielikuma B.7. nodaļa) tika izmantotas tikai žurkas. Nedrīkst izmantot līnijas ar zemu auglību vai līnijas, par kurām ir labi zināms, ka tām ir bieži sastopami attīstības defekti. Jāizmanto veselīgi iepriekš nepāroti dzīvnieki, kuriem eksperimentālas procedūras iepriekš nav veiktas. Jānorāda testa dzīvnieku suga, līnija, dzimums, masa un vecums. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkst pārsniegt 20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi. Ja pētījumu veic kā sākotnēju pētījumu ilgtermiņa pētījumam vai pētījumam, kas aptver visu paaudzi, vēlams abos pētījumos izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus.
Turēšana un barošana
16.Visām procedūrām jāatbilst vietējiem laboratorijas dzīvnieku labturības standartiem. Telpā, kurā tur izmēģinājuma dzīvniekus, jābūt 22° C (± 3° C) temperatūrai. Lai gan relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, izņemot telpu uzkopšanas laiku, vēlams nepārsniegt 70 %, jāorientējas uz 50–60 %. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas – tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzirdināmajam ūdenim. Uztura izvēli var ietekmēt vajadzība tam piemaisīt testējamo ķimikāliju, ja ķimikāliju ievada šādā ceļā.
17.Dzīvniekus ieteicams turēt mazās viendzimuma grupās; ja tas zinātniski pamatoti, dzīvniekus var turēt atsevišķi. Ja dzīvniekus tur grupās, dzīvnieku skaits vienā būrī nedrīkstētu pārsniegt 5. Pārošanas procedūras jāveic attiecīgajam nolūkam piemērotos būros. Grūsnas mātītes jātur atsevišķi, un tām jānodrošina migas ierīkošanai vajadzīgie materiāli. Mātītes laktācijas periodā tiks turētas atsevišķi kopā ar to pēcnācēju.
18.Barība regulāri jāanalizē, lai noteiktu kontaminantu klātbūtni. Barības paraugs jāglabā līdz ziņojuma pabeigšanai.
Dzīvnieku sagatavošana
19.Veselīgus jaunus pieaugušus dzīvniekus nejaušināti iedala kontrolgrupās un apstrādes grupas. Būrus izvieto tā, lai būru novietojuma varbūtējā ietekme būtu iespējami maza. Dzīvniekus unikāli identificē un pirms pētījuma sākšanas vismaz piecas dienas tur būros, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos.
Devu sagatavošana
20.Testējamo ķimikāliju ieteicams ievadīt perorāli, ja vien par piemērotākiem netiek uzskatīti citi ievadīšanas ceļi. Ja izvēlēts perorālais ievadīšanas ceļš, testējamo ķimikāliju parasti ievada ar gavāžu; tomēr testējamo ķimikāliju var ievadīt arī ar uzturu vai dzirdināmo ūdeni.
21.Ja vajadzīgs, testējamo ķimikāliju izšķīdina vai suspendē piemērotā nesējā. Kad vien iespējams, ieteicams lietošanai izvēlēties ūdens šķīdumu/suspensiju vai, ja tas nav iespējams, šķīdumu/emulsiju eļļā (piemēram, kukurūzas eļļā), vai, ja arī tas nav iespējams, šķīdumu citos nesējos. Ja nesējs nav ūdens, ir jāzina šā nesēja toksiskās īpašības. Jānosaka testējamās ķimikālijas stabilitāte un homogenitāte nesējā.
PROCEDŪRA
Dzīvnieku skaits un dzimums
22.Ieteicams, lai katrā grupā sākumā būtu vismaz 10 tēviņi un 12–13 mātītes. Pirms ekspozīcijas izvērtē mātīšu estrālos ciklus, un dzīvniekus, kam nav novērojami tipiski 4–5 dienu cikli, pētījumā neiekļauj; tāpēc ieteicams izmantot lielāku skaitu mātīšu, lai katrā grupā būtu 10 mātītes. Izņemot izteiktas toksiskās ietekmes gadījumus, sagaidāms, ka katrā grupā būs vismaz 8 grūsnas mātītes, kas parasti ir minimālais pieļaujamais grūsno mātīšu skaits grupā. Mērķis ir nodrošināt pietiekamu daudzumu grūsnu mātīšu un pietiekamu daudzumu pēcnācēju, lai varētu ticami izvērtēt testējamās ķimikālijas spēju ietekmēt auglību, grūsnību, mātišķo uzvedību un zīdīšanu, kā arī F1 pēcnācēju augšanu un attīstību no aizmešanās līdz 13. dienai pēc piedzimšanas.
Devas
23.Parasti jāizmanto vismaz trīs testa grupas un kontrolgrupa. Devu līmeņus var noteikt, pamatojoties uz informāciju, kas iegūta akūta toksiskuma testos, vai atkārtotas devas pētījumu rezultātiem. Ar kontrolgrupas dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupu dzīvniekiem, izņemot attiecībā uz testējamās ķimikālijas ievadīšanu. Ja testējamās ķimikālijas ievadīšanai izmanto nesēju, kontrolgrupa saņem lielāko izmantoto nesēja daudzumu.
24.Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā visus pieejamos toksiskuma un (toksiko)kinētiskos datus. Jāņem vērā arī tas, ka grūsnu un negrūsnu dzīvnieku jutība var atšķirties. Augstākais devas līmenis jāizvēlas tāds, lai tas izraisītu toksisku ietekmi, bet ne nobeigšanos vai smagas ciešanas. Pēc tam jāizvēlas tāda lejupēja devas līmeņu virkne, lai ar to varētu parādīt jebkādas ar devu saistītas atbildreakcijas, kā arī to, ka zemākajā devas līmenī nelabvēlīga ietekme nav novērojama (NOAEL). Devu līmeņu noteikšanai to samazinājuma virzienā optimums bieži vien ir divkārši līdz četrkārši intervāli, un bieži vien ir ieteicamāk pievienot ceturto testa grupu, nevis izmantot ļoti plašu devu intervālu (piemēram, vairāk nekā 10 reizes).
25.Ja ir novērota vispārēja toksicitāte (piemēram, ķermeņa masas samazināšanās, ietekme uz aknām, sirdi, plaušām vai nierēm utt.) vai citas pārmaiņas, kas var nebūt toksiskas atbildreakcijas (piemēram, samazināts barības patēriņš, aknas palielināšanās), ir jābūt piesardzīgiem, interpretējot novēroto iedarbību uz jutīgiem endokrīnajiem beigupunktiem.
Robežtests
26.Ja perorālajā pētījumā, kurā izmanto vienu devas līmeni, kas ir vismaz 1000 mg/kg ķermeņa masas dienā, vai — ja testējamo ķimikāliju ievada ar uzturu vai dzirdināmo ūdeni — līdzvērtīgs procentuālais daudzums uzturā vai dzirdināmajā ūdenī, un kuru veic, ievērojot šajā pētījumā aprakstītās procedūras, novērojama toksiska ietekme nerodas un ja, pamatojoties uz datiem par strukturāli radniecīgām vielām, toksicitāte nav sagaidāma, var uzskatīt, ka pilns pētījums ar vairākiem devu līmeņiem nav vajadzīgs. Robežtestu neizmanto gadījumos, kad cilvēka ekspozīcija norāda uz to, ka ir jāizmanto augstāks perorālās devas līmenis. Ja izmanto citus ievadīšanas veidus, tādus kā ieelpošana vai aplicēšana uz ādas, maksimālā sasniedzamā koncentrācija bieži vien ir atkarīga no testējamo ķimikāliju fizikālķīmiskajām īpašībām.
Devu došana
27.Dzīvnieki testējamās ķimikālijas devu saņem katru dienu 7 dienas nedēļā. Ja izmanto gavāžu, dzīvniekiem testējamā ķimikālija jāsaņem vienreizējā devā, ko ievada ar kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas cauruli. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa masas, izņemot tādus ūdens šķīdumus, kur var lietot 2 ml uz 100 g ķermeņa masas. Izņemot kairinošas vai kodīgas testējamās ķimikālijas, kam lielākās koncentrācijās parasti ir saasināta ietekme, testa tilpuma mainība būtu jāsamazina līdz minimumam, koncentrāciju koriģējot tā, lai visos devu līmeņos saglabātos konstants tilpums.
28.Ja testējamo ķimikāliju ievada ar uzturu vai dzirdināmo ūdeni, ir svarīgi nodrošināt, ka testējamās ķimikālijas daudzums neizjauc normālu uztura vai ūdens līdzsvaru. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar uzturu, var izmantot nemainīgu koncentrāciju uzturā (ppm) vai nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieku ķermeņa masu; izmantotā alternatīva ir jānorāda. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar gavāžu, deva jādod katru dienu vienādā laikā un vismaz reizi nedēļā jākoriģē tā, lai uzturētu nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa masu.
Eksperimenta grafiks
29.Devas abu dzimumu dzīvniekiem jāsāk dot vismaz 2 nedēļas pirms pārošanas, pēc tam, kad tie vismaz piecas dienas tikuši aklimatizēti un mātītēm ir novēroti normāli estrālie cikli (divu nedēļu ilgā priekšapstrādes periodā). Pētījums jāplāno tā, lai estrālā cikla izvērtēšana sāktos drīz pēc tam, kad dzīvnieki ir sasnieguši pilnīgu dzimumgatavību. Dažādām žurku līnijām pilnīgas dzimumgatavības sasniegšanas vecums dažādās laboratorijās var nedaudz atšķirties, piemēram, Sprague Dawley līnijas žurkas to sasniedz 10 nedēļu vecumā, Wistar līnijas žurkas — 12 nedēļu vecumā. Mātes ar pēcnācēju jānonāvē 13. pēcdzemdību dienā vai drīz pēc tam. Dzimšanas diena (proti, dienā, kurā dzemdības ir beigušās) ir 0. pēcdzemdību diena. Mātītes, kam nav novērojamas kopulācijas pazīmes, nonāvē 24–26 dienas pēc pēdējās pārošanas perioda dienas. Pārošanas perioda laikā abu dzimumu dzīvniekiem devas turpina dot. Pēc pārošanas perioda tēviņiem devas jāturpina dot vismaz līdz minimālā kopējā devu došanas perioda (28 dienas) beigām. Pēc tam tos vai nu nonāvē, vai arī patur dzīvus un tiem turpina dot devas, lai tos, iespējams, izmantotu otrai pārošanai, ja tāda vajadzīga.
30.Vecākpaaudzes mātītēm devas turpina dot katru dienu visu grūsnības laiku un vismaz līdz 13. pēcdzemdību dienai vai dienai pirms nonāvēšanas (minētās dienas ieskaitot). Pētījumos, kuros testējamo ķīmisko vielu ievada inhalācijas ceļā vai caur ādu, devas jāturpina dot vismaz līdz gestācijas 19. dienai (ieskaitot) un jāatsāk dot pēc iespējas drīz, bet ne vēlāk kā 4. dienā pēc dzemdībām.
31.Eksperimenta grafika shēma ir dota 2. papildinājumā.
Pārošanas procedūra
32.Parasti šajā pētījumā jāizmanto pārošanas shēma 1:1 (viens tēviņš uz vienu mātīti). Izņēmumi pieļaujami tēviņu nāves gadījumā. Mātīte jātur kopā ar to pašu tēviņu, līdz tiek novērotas kopulācijas pazīmes vai ir pagājušas divas nedēļas. Katru rītu mātītēm pārbauda spermas vai embola klātbūtni makstī. Grūsnību sāk skaitīt no dienas, kurā ir apstiprinājies kopulācijas fakts (konstatēts maksts embols vai sperma). Ja pārošana ir neveiksmīga, var apsvērt mātīšu atkārtotu pārošanu ar tās pašas grupas tēviņiem.
Metiena lielums
33.Ceturtajā dienā pēc piedzimšanas katra metiena lielumu var koriģēt, nejaušināti izņemot liekos mazuļus tā, lai katrā metienā pēc iespējas būtu četri vai pieci katra dzimuma mazuļi atkarībā no izmantotās žurku līnijas parastā metiena lieluma. No diviem liekajiem mazuļiem jāņem asins paraugi, kurus apkopo un izmanto seruma T4 līmeņu noteikšanai. Mazuļu selektīva izņemšana, piemēram, pēc ķermeņa masas vai anoģenitālā attāluma (AGD), nav piemērota. Ja vīrišķā vai sievišķā dzimuma mazuļu skaita dēļ nav iespējams nodrošināt, ka katrā metienā ir četri vai pieci katra dzimuma mazuļi, ir pieļaujama metiena lieluma daļēja koriģēšana (piemēram, seši tēviņi un četras mātītes). Ja metiena lielums ir mazāks par korekcijas robežvērtību (8 vai 10 mazuļi vienā metienā), mazuļus no metiena neizņem. Ja korekcijas robežvērtību pārsniedz tikai viens mazulis, izņem tikai vienu mazuli un no tā ņem asins paraugus, ko izmanto iespējamiem seruma T4 novērtējumiem.
34.Ja metiena lielums netiek koriģēts, 4. dienā pēc piedzimšanas divus mazuļus no katra metiena nonāvē un no tiem ņem asins paraugus, ko izmanto tiroīdhormona seruma koncentrācijas mērīšanai. Ja iespējams, diviem mazuļiem katrā metienā jābūt sievišķā dzimuma mazuļiem, lai vīrišķā dzimuma mazuļus rezervētu zīdekļu retencijas izvērtējumiem, izņemot gadījumus, kad šo mazuļu izņemšanas rezultātā galējam novērtējumam nepaliek neviena mātīte. Mazuļus no metiena neizņem, ja tā lielums būs mazāks nekā 8 vai 10 mazuļi vienā metienā (atkarībā no izmantotās žurku līnijas parastā metiena lieluma). Ja, pamatojoties uz parasto metiena lielumu, lieks ir tikai viens mazulis, izņem tikai vienu mazuli un no tā ņem asins paraugus, ko izmanto iespējamiem seruma T4 novērtējumiem.
NOVĒROJUMI DZĪVES LAIKĀ
Klīniskie novērojumi
35.Visā testa periodā vismaz reizi dienā jāizdara klīniskie novērojumi; ja ir novērotas toksiskuma pazīmes, tie jāizdara biežāk. Klīniskie novērojumi katru dienu jāizdara, vēlams, vienā un tajā pašā laikā vai laikos, ņemot vērā gaidāmo ietekmju maksimumperiodu pēc devu došanas. Jāreģistrē acīm redzamas izmaiņas uzvedībā, grūtas vai novēlotas atnešanās pazīmes un visas toksiskuma pazīmes, kā arī mirstība. Šajos datos jāiekļauj toksiskuma pazīmju parādīšanās laiks, pakāpe un ilgums.
Ķermeņa masa un barības/ūdens patēriņš
36.Tēviņi un mātītes jānosver pirmajā devas došanas dienā, tad vismaz reizi nedēļā un pētījuma beigās. Grūsnības laikā mātītes jānosver 0., 7., 14. un 20. dienā un 24 stundu laikā pēc atnešanās (0. vai 1. pēcdzemdību diena), kā arī vismaz 4. un 13. pēcdzemdību dienā. Novērojumu rezultāti jāreģistrē atsevišķi par katru pieaugušo dzīvnieku.
37.Pirmspārošanas, grūsnības un laktācijas laikā barības patēriņš jāmēra vismaz reizi nedēļā. Barības patēriņa mērīšana pārošanas laikā ir fakultatīva. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar dzirdināmo ūdeni, minētajos laikposmos ir jāmēra arī ūdens patēriņš.
Estrālie cikli
38.Lai pētījumam atlasītu mātītes ar regulāru cikliskumu, pirms apstrādes sākšanas jānovēro estrālie cikli (sk. 22. punktu). No apstrādes perioda sākuma līdz brīdim, kad ir novērotas pārošanās pazīmes, katru dienu jāveic arī vaginālo uztriepju monitorings. Ja pastāv bažas par akūta stresa ietekmi, kas, uzsākot devu došanu, var mainīt estrālos ciklus, laboratorijas var testa dzīvniekus divas nedēļas pakļaut ekspozīcijai un pēc tam reizi dienā ievākt vaginālās uztriepes, lai pirmspārošanas periodā vismaz divas nedēļas veiktu estrālo ciklu novērošanu, ko turpina veikt arī pārošanas periodā, līdz ir iegūti pārošanās pierādījumi. Iegūstot maksts / dzemdes kakla šūnas, jārūpējas par to, lai nepieļautu gļotādas bojājumus, kas var inducēt viltus grūsnību (7) (8).
Pēcnācēju parametri
39.Jāreģistrē gestācijas ilgums, ko aprēķina no 0. grūsnības dienas. Pēc atnešanās katru metienu iespējami drīz pārbauda, lai noteiktu mazuļu, nedzīvi dzimušo, dzīvi dzimušo un nīkuļu (mazuļi, kas ir ievērojami mazāki nekā atbilstīgie kontrolmazuļi) skaitu un dzimumu un acīmredzamu anomāliju klātbūtni.
40.24 stundu laikā pēc atnešanās (0. vai 1. diena pēc piedzimšanas) un vismaz 4. un 13. dienā pēc piedzimšanas jāsaskaita dzīvie mazuļi un jānosaka to dzimums, un jānosver metieni. Papildus 35. punktā aprakstītajiem novērojumiem jāreģistrē pēcnācēju uzvedības anomālijas.
41.Katra mazuļa AGD jāmēra vienā un tajā pašā dienā pēc piedzimšanas no 0. līdz 4. dienai pēc piedzimšanas. Mazulis ir jānosver tajā pašā dienā, kad tiek mērīts AGD, un AGD ir jāpielāgo mazuļa izmēram, priekšroku dodot kvadrātsaknei no ķermeņa svara (9). Kā ieteikts ESAO GD 151 (10), 12. vai 13. dienā pēc piedzimšanas ir jāsaskaita vīrišķā dzimuma mazuļu zīdekļi/areolas.
Klīniskā bioķīmija
42.Asins paraugus no noteiktas vietas ņem saskaņā ar šādu grafiku:
-
4. dienā pēc piedzimšanas — no vismaz diviem mazuļiem katrā metienā, ja mazuļu skaits to ļauj (sk. 33.–34. punktu),
-
pētījuma beigās 13. dienā — no visām mātēm un vismaz diviem mazuļiem katrā metienā, un
-
pētījuma beigās — no visiem pieaugušiem tēviņiem.
Visus asins paraugus glabā piemērotos apstākļos. Asins paraugos, kas ņemti no mazuļiem 13. dienā un pieaugušiem tēviņiem, nosaka tiroīdhormonu (T4) seruma līmeņus. Ja vajadzīgs, T4 līmeņus nosaka arī asins paraugos, kas ņemti no mātēm un 4. dienas mazuļiem. Attiecīgā gadījumā var fakultatīvi mērīt citus hormonus. Tiroīdhormona analīžu veikšanai mazuļu asinis var apkopot pa metieniem. Tiroīdhormonus (T4 un TSH) vēlams mērīt kopējā formā (kopējais T4 un kopējais TSH).
43.Noteikto hormonu mainību un absolūto koncentrāciju var ietekmēt šādi faktori:
-nonāvēšanas laiks hormonu koncentrāciju diennakts mainības dēļ,
-nonāvēšanas metode, kurā dzīvniekiem netiek radīts nevajadzīgs stress, kas varētu ietekmēt hormonu koncentrācijas,
-hormonu noteikšanas testa komplekti, kas var atšķirties pēc standartlīknēm.
44.Plazmas paraugi, kas paredzēti tieši hormonu noteikšanai, ir jāiegūst salīdzināmā dienas laikā. Skaitliskās vērtības, ko iegūst, analizējot hormonu koncentrācijas, atšķiras atkarībā no tirdzniecībā pieejamajiem testēšanas komplektiem.
Patoloģija
Makroskopiskā autopsija
45.Tūlīt pēc nonāvēšanas vai nāves, kas iestājusies pētījuma laikā, pieaugušie dzīvnieki makroskopiski jāpārbauda attiecībā uz anomālijām vai patoloģiskām pārmaiņām. Īpaša uzmanība jāpievērš reproduktīvās sistēmas orgāniem. Jāreģistrē implantācijas vietu skaits. Lai noteiktu estrālā cikla fāzi un ļautu to saistīt ar olnīcu histopatoloģiju, vaginālās uztriepes jāizmeklē autopsijas dienas rītā.
46.Visu pieaugušo tēviņu sēklinieki un sēklinieku piedēkļi, kā arī prostata un sēklas pūslīši ar prostatas priekšējām daivām (kopā) pēc vajadzības jāatbrīvo no pieguļošiem audiem, un to slapjais svars jānosaka iespējami drīz pēc disekcijas, lai izvairītos no izžūšanas. Turklāt fakultatīvos orgānu masas mērījumos var ietvert arī tūpļa cēlājmuskuļa un briedumķermeņa muskuļa kompleksu, Kupera dziedzerus un dzimumlocekļa galviņu tēviņiem un abas olnīcas (slapjais svars) un dzemdi (ar dzemdes kaklu) mātītēm; ietveršanas gadījumā minētie masas mērījumi jāveic iespējami drīz pēc disekcijas.
47.Nedzīvi mazuļi un mazuļi, kas nonāvēti 13. dienā pēc piedzimšanas vai drīz pēc tam, vismaz rūpīgi ārēji jāpārbauda, lai konstatētu iespējamas acīmredzamas anomālijas. Īpaša uzmanība jāpievērš ārējām reproduktīvajām ģenitālijām, kuras jāpārbauda, meklējot attīstības izmaiņu pazīmes. 13. dienā jāsaglabā vairogdziedzeris, kas izņemts no 1 vīrišķā un 1 sievišķa dzimuma mazuļa katrā metienā.
48.Jāsaglabā visu pieaugušo dzīvnieku olnīcas, sēklinieki, iekšējie dzimumorgāni (dzemde un dzemdes kakls, sēklinieku piedēkļi, prostata, sēklas pūslīši un prostatas priekšējās daivas), vairogdziedzeris un visi orgāni, kam ir redzami makroskopiski bojājumi. Sēklinieku un sēklinieku piedēkļu parastai pārbaudei nav ieteicams izmantot formalīna fiksāciju. Attiecībā uz šiem audiem pieņemama metode ir izmantot Buēna fiksatoru vai modificētu Davidsona fiksatoru (11). Lai nodrošinātu fiksatora ātru penetrēšanos, bālgano apvalku (tunica albuginea) var abos orgāna polos uzmanīgi un sekli pārdurt ar adatu.
Histopatoloģija
49.Veic lielākās devas grupas dzīvnieku un kontrolgrupas dzīvnieku olnīcu, sēklinieku un sēklinieku piedēkļu detalizētu histopatoloģisku izmeklēšanu (īpašu uzsvaru liekot uz sēklinieku intersticiālo šūnu struktūras spermatoģenēzi un histopatoloģiju). Vajadzības gadījumā var izmeklēt pārējos saglabātos mazuļu un pieaugušo dzīvnieku orgānus, arī vairogdziedzeri. Vairogdziedzera masu var noteikt pēc fiksācijas. Tas jāatbrīvo no piegulošiem audiem ļoti uzmanīgi un tikai pēc fiksācijas, lai izvairītos no audu bojājumiem. Audu bojājumi var apgrūtināt histopatoloģijas analīzi. Ja lielākās devas grupā ir novērotas pārmaiņas, minētās izmeklēšanas jāveic arī citu devu grupu dzīvniekiem. Norādījumos par histopatoloģiju (11) ir sīki izklāstīta papildu informācija par endokrīno audu disekciju, fiksāciju, secēšanu un histopatoloģiju.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Dati
50.Jāsniedz dati par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati jāapkopo tabulā, kurā redzams testa sākumā katrā testā grupā esošo dzīvnieku skaits, to dzīvnieku skaits, kas atrasti miruši testa laikā vai nonāvēti humānu apsvērumu dēļ, nāves iestāšanās vai humānās nonāvēšanas laiks, auglīgo dzīvnieku skaits, grūsno mātīšu skaits, to dzīvnieku skaits, kam novērotas toksicitātes pazīmes, novēroto toksicitātes pazīmju apraksts, arī toksiskās darbības sākuma laiks, ilgums un stiprums, histopatoloģisko pārmaiņu veidi un visi relevantie dati par metienu. Tabulas veidā sagatavotā kopsavilkuma ziņojuma paraugs, kas ir ļoti noderīgs ietekmes uz reprodukciju/attīstību izvērtēšanai, ir sniegts 3. papildinājumā.
51.Tā kā pētījuma tvērums ir ierobežots, statistiskajai analīzei, ko veic, lai izvērtētu rezultātu nozīmīgumu, ir ierobežota vērtība attiecībā uz daudziem beigupunktiem, jo īpaši reproduktīvajiem beigupunktiem. Ja tiek izmantota statistiskā analīze, izvēlētajai metodei jābūt atbilstošai pārbaudāmā mainīgā lieluma sadalījumam, un tā jāizvēlas pirms pētījuma sākšanas. AGD un zīdekļu retencijas statistiskajai analīzei jābalstās uz atsevišķu mazuļu datiem, ņemot vērā ietekmi uz metienu. Vajadzības gadījumā analīzes vienība ir metiens. Mazuļu ķermeņa masas statistiskajai analīzei jābalstās uz atsevišķu mazuļu datiem, ņemot vērā metiena lielumu. Ņemot vērā grupu mazo lielumu, pētījuma interpretēšanā par palīglīdzekli var būt lietderīgi izmantot arī vēsturiskos kontroles datus (piemēram, datus par metiena lielumu), ja tādi ir pieejami.
Rezultātu izvērtēšana
52.Šā toksicitātes pētījuma konstatējumi jāizvērtē, ņemot vērā novēroto ietekmi, autopsiju un mikroskopiskos konstatējumus. Vērtējums ietver testējamās ķimikālijas devas saistību ar anomāliju — to vidū makroskopisko bojājumu, identificēto mērķorgānu, neauglības, klīnisko anomāliju, ietekmes uz reproduktīvajiem un metiena rādītājiem, ķermeņa masas pārmaiņu, ietekmes uz mirstību un citas toksiskās iedarbības – esību vai neesību, incidenci un smagumu.
53.Tēviņu apstrādes periods ir īss, tāpēc, novērtējot ietekmi uz tēviņu reproduktīvo funkciju, papildus auglības datiem jāņem vērā sēklinieku un sēklinieku piedēkļu histopatoloģija. Pētījuma interpretēšanā par palīglīdzekli var būt lietderīgi izmantot arī vēsturiskus kontroles datus par reprodukciju/ontoģenēzi (piemēram, datus par metiena lielumu, AGD, zīdekļu retenciju, seruma T4 līmeņiem), ja tādi pieejami.
54.Kvalitātes kontroles vajadzībām ir ierosināts apkopot vēsturiskus kontroldatus un skaitliskajiem datiem, it sevišķi parametriem, kas saistīti ar endokrīnās sistēmas traucējumu izraisītāju noteikšanu, aprēķināt variācijas koeficientus. Šos datus var izmantot salīdzināšanas nolūkos, kad tiek novērtēti faktiskie pētījumi.
Testēšanas pārskats
55.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija:
-avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams,
-testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja tā zināma;
vienkomponenta viela:
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības,
-ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.;
daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:
-iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
Nesējs (attiecīgā gadījumā):
-
nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens.
Testa dzīvnieki:
-
izmantotās sugas/līnijas,
-
dzīvnieku skaits, vecums un dzimums,
-
avots, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.,
-
katra dzīvnieka masa testa sākumā,
-
sugas izvēles pamatojums, ja tā nav žurka.
Testēšanas nosacījumi:
-
devu līmeņa izraudzīšanās pamatojums,
-
detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas maisījuma/barības preparāta sagatavošanu, sasniegto preparāta koncentrāciju, stabilitāti un homogenitāti,
-
detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas devu došanu,
-
attiecīgā gadījumā testējamās ķimikālijas koncentrācijas (ppm) barībā / dzirdināmajā ūdenī pārrēķins faktiskajā devā (mg uz kg ķermeņa masas dienā),
-
detalizēta informācija par barības un ūdens kvalitāti,
-
detalizēts apraksts par nejaušināšanas procedūru, kas izmantota, lai atlasītu mazuļus izņemšanai no metiena, ja šāda izņemšana notikusi.
Rezultāti:
-
ķermeņa masa / ķermeņa masas izmaiņas,
-
barības patēriņš un ūdens patēriņš (ja šādi dati ir pieejami),
-
dati par toksiskajām atbildes reakcijām atkarībā no dzimuma un devas, arī dati par auglību, gestāciju un citām toksicitātes pazīmēm,
-
gestācijas ilgums,
-
toksiska vai cita iedarbība uz reprodukciju, pēcnācējiem, postnatālo augšanu utt.,
-
klīnisko novērojumu veids, smagums un ilgums (atgriezenisks vai neatgriezenisks),
-
pieaugušu mātīšu skaits ar normālu vai nenormālu estrālo ciklu un cikla ilgums,
-
dzīvi dzimušo skaits un pēcimplantācijas zudums,
-
mazuļu ķermeņa masas dati,
-
visu mazuļu AGD (un ķermeņa masa AGD mērīšanas dienā),
-
zīdekļu retencija vīrišķā dzimuma mazuļiem,
-
vairogdziedzera hormonu līmenis 13 dienu veciem mazuļiem un pieaugušiem tēviņiem (un mātēm un 4 dienas veciem mazuļiem, ja šādi mērījumi veikti),
-
to mazuļu skaits, kam ir makroskopiskas anomālijas, ārējo ģenitāliju makroskopisks izvērtējums, nīkuļu skaits,
-
nāves iestāšanās laiks testa laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši līdz pētījuma beigām,
-
implantāciju skaits, metiena lielums un masa datu reģistrēšanas laikā,
-
ķermeņa masa nonāvēšanas laikā un dati par vecākpaaudzes dzīvnieku orgānu masu,
-
autopsijas konstatējumi,
-
histopatoloģiskas izmeklēšanas rezultātu detalizēts apraksts,
-
absorbcijas dati (ja pieejami),
-
rezultātu statistiskā apstrāde (attiecīgā gadījumā).
Rezultātu iztirzājums.
Secinājumi.
Rezultātu interpretēšana
56.Pētījums sniegs izvērtējumu par reproduktīvo/ontoģenētisko toksicitāti, kas saistīta atkārtotu devu došanu (sk. 5. un 6. punktu). Tas varētu norādīt uz nepieciešamību veikt turpmākas izmeklēšanas un sniedz norādījumus turpmāko pētījumu plānošanā. Ar reprodukciju un ontoģenēzi saistīto rezultātu interpretēšanā par palīglīdzekli jāizmanto ESAO norādījumu dokuments Nr. 43 (12). ESAO norādījumu dokumentā Nr. 106 par grauzēju endokrīno un reproduktīvo testu histoloģisko izvērtēšanu (11) sniegta informācija par (endokrīno) orgānu un vaginālo uztriepju sagatavošanu un izvērtēšanu; minētā informācija var būt noderīga saistībā ar šo TG.
LITERATŪRA
(1)OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Available upon request at Organisation for Economic and Cooperation and Development, Paris.
(2)OECD (1992). Chairman's Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Available Upon Request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(3)OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Available Upon Request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(4)OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(5)OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, .Paris.
(6)OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment(No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(7)Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.
(8)Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.
(9)Gallavan R.H. Jr , Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L..(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.
(10)OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(11)OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No106), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(12)OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
1. papildinājums
DEFINĪCIJAS (sk. arī ESAO GD 150 (6))
Androgenitāte ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā funkcionēt kā dabiskam androgēnu tipa hormonam (piemēram, testosteronam).
Antiandrogenitāte ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā nomākt dabiska androgēnu tipa hormona (piemēram, testosterona) darbību.
Antiestrogenitāte ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā nomākt dabiska estrogēnu tipa hormona (piemēram, estradiola 17ß) darbību.
Antitireoidāla iedarbība ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā nomākt dabiska tiroīdhormona (piemēram, T3) darbību.
Ķimikālija ir viela vai maisījums.
Ontoģenētiskā toksicitāte: reproduktīvās toksicitātes izpausme, kas liecina par pēcnācēju prenatāliem, perinatāliem, postnatāliem, strukturāliem vai funkcionāliem traucējumiem.
Dozējums ir vispārīgs termins, kas aptver devu, tās ievadīšanas biežumu un ilgumu.
Deva ir ievadītās testējamās ķimikālijas daudzums. Devu izsaka ar testējamās ķimikālijas masu uz testa dzīvnieka ķermeņa masas vienību dienā (piemēram, mg uz kg ķermeņa masas dienā) vai kā nemainīgu koncentrāciju barībā.
Izteikta toksicitāte ir vispārīgs termins, kas apzīmē acīmredzamas toksicitātes pazīmes pēc testējamās ķimikālijas ievadīšanas. Šīm pazīmēm jābūt pietiekamām, lai varētu novērtēt bīstamību, un tādām, lai varētu sagaidīt, ka ievadītās devas palielināšana izraisīs smagas toksicitātes pazīmes un, iespējams, mirstību.
Fertilitātes traucējumi ir tēviņu vai mātīšu reproduktīvās funkcijas vai spējas traucējumi.
Maternālā toksicitāte: nelabvēlīgā ietekme uz gravidām mātītēm, kas ir specifiska (tieša ietekme) vai nespecifiska (netieša ietekme).
NOAEL ir saīsinājums, kas apzīmē nenovērojamās nelabvēlīgās ietekmes līmeni. Tas ir augstākais devas līmenis, kurā netiek konstatētas ar vielas saņemšanu saistītas negatīvas parādības.
Estrogenitāte ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā darboties kā dabiskam estrogēnu tipa hormonam (piemēram, estradiolam 17ß).
Reproduktīvā toksicitāte ir kaitīga ietekme uz pēcnācējiem un/vai tēviņu un mātīšu reproduktīvās funkcijas vai spējas traucējumi.
Testējamā ķimikālija ir jebkura viela vai maisījums, ko testē ar šo testēšanas metodi.
Tireoidāla iedarbība ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā darboties kā dabiskam tiroīdhormonam (piemēram, T3).
Validācija ir zinātnisks process, kura mērķis ir raksturot testēšanas metodes darbības prasības un ierobežojumus un apliecināt tās ticamību un piemērotību konkrētam nolūkam.
2. papildinājums
EKSPERIMENTA GRAFIKA SHĒMA, KURĀ NORĀDĪTS MAKSIMĀLAIS PĒTĪJUMA ILGUMS, KURA PAMATĀ IR 14 DIENU ILGS PĀROŠANAS PERIODS
3. papildinājums
TABULAS VEIDĀ SAGATAVOTS KOPSAVILKUMA ZIŅOJUMS PAR IETEKMI UZ REPRODUKCIJU/ONTOĢENĒZI
|
NOVĒROJUMI
|
VĒRTĪBAS
|
|
Dozējums (vienības)
|
0 (kontrole)
|
. . .
|
. . .
|
. . .
|
. . .
|
|
Dzīvnieku pāri (N)
|
|
|
|
|
|
|
Estrālais cikls (vismaz vidējais neregulāru ciklu ilgums un biežums)
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes, kam novērojamas kopulācijas pazīmes (N)
|
|
|
|
|
|
|
Grūsnas mātītes (N)
|
|
|
|
|
|
|
Apaugļošanās dienas 1–5 (N)
|
|
|
|
|
|
|
Apaugļošanās dienas 6– . . .() (N)
|
|
|
|
|
|
|
Grūsnība 21 diena (N)
|
|
|
|
|
|
|
Grūsnība = 22 dienas (N)
|
|
|
|
|
|
|
Grūsnība 23 dienas (N)
|
|
|
|
|
|
|
Mātes ar dzīviem mazuļiem (N)
|
|
|
|
|
|
|
Mātes ar dzīviem mazuļiem 4. dienā pēc dzemdībām (N)
|
|
|
|
|
|
|
Implanti vienai mātei (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Dzīvie mazuļi vienai mātei piedzimšanas brīdī (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Dzīvie mazuļi vienai mātei 4. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Dzimumu attiecība (tēv./māt.) piedzimstot (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Dzimumu attiecība (tēv./māt.) 4. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Metiena masa piedzimstot (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Metiena masa 4. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Mazuļu masa piedzimstot (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Mazuļu masa AGD mērīšanas laikā (tēviņu vidējā masa, mātīšu vidējā masa)
|
|
|
|
|
|
|
Mazuļu AGD tajā pašā postnatālajā dienā, laikā no dzimšanas līdz 4. dienai (tēviņu vidējā masa, mātīšu vidējā masa)
|
|
|
|
|
|
|
Metiena masa 4. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Zīdekļu retencija vīrišķā dzimuma mazuļiem 13. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Metiena masa 13. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
MAZUĻI AR ANOMĀLIJĀM
|
|
Mātes, kam nav neviena šāda mazuļa
|
|
|
|
|
|
|
Mātes ar 1 šādu mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātes ar ≥ 2 šādiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
|
PĒCNĀCĒJU ZUDUMI
|
|
Prenatāli / pēc implantācijām (implantāciju skaits mīnus dzīvi dzimušo skaits)
|
|
Mātītes, kas nav zaudējušas mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar vienu zaudētu mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar diviem zaudētiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar ≥ 3 zaudētiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
|
Postnatāli (dzīvi dzimušo skaits mīnus 13. postnatālajā dienā dzīvo mazuļu skaits)
|
|
Mātītes, kas nav zaudējušas mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar vienu zaudētu mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar diviem zaudētiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar ≥ 3 zaudētiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
B.64. KOMBINĒTS ATKĀRTOTAS DEVAS TOKSISKUMA PĒTĪJUMS AR REPRODUKTĪVĀS/ONTOĢENĒTISKĀS TOKSICITĀTES SKRĪNINGA TESTU
IEVADS
1.Šī testēšanas metode ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijai (TG) Nr. 422 (2016). ESAO vadlīnijas par ķimikāliju testēšanu periodiski tiek pārskatītas, ņemot vērā zinātnes attīstību. Sākotnējā vadlīnija Nr. 422 par skrīninga testu tika pieņemta 1996. gadā, pamatojoties uz protokolu par “Kombinēto atkārtotas devas un reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes skrīninga testu”, kas apspriests divās ekspertu sanāksmēs Londonā 1990. gadā (1) un Tokijā 1992. gadā (2).
2.Šī testēšanas metode apvieno reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes skrīninga daļu, kuras pamatā ir pieredze, kas gūta dalībvalstīs, izmantojot sākotnējo metodi ar lielā apjomā ražotām esošajām ķimikālijām, un pieredze, kas gūta izpētes testos ar pozitīvās kontroles vielām (3) (4), un atkārtotas devas toksiskuma daļu saskaņā ar ESAO testēšanas vadlīniju Nr. 407 (Atkārtotas devas 28 dienu orālās toksicitātes pētījums ar grauzējiem), kura atbilst šā pielikuma B.7. nodaļai.
3.Pēc tam, kad 1998. gadā ESAO tika sākta prioritāra darbība ar mērķi pārskatīt esošās testēšanas vadlīnijas un izstrādāt jaunas testēšanas vadlīnijas par endokrīno disruptoru skrīningu un testēšanu (5), šī testēšanas metode tika atjaunināta, iekļaujot tajā endokrīnajiem disruptoriem relevantus beigupunktus. Šajā kontekstā TG Nr. 407 (kas atbilst šā pielikuma B.7. nodaļai) 2008. gadā tika papildināta ar parametriem, kas piemēroti testējamo ķimikāliju endokrīnās aktivitātes noteikšanai. TG Nr. 422 tika atjaunināta, lai skrīninga TG, kur ekspozīcijas periodi aptver dažus jutīgos attīstības periodus (prenatālais vai agrīns postnatālais periods), iekļautu dažus endokrīnajiem disruptoriem relevantus beigupunktus.
4.Izvēlētie endokrīnajiem disruptoriem relevantie papildu beigupunkti, kas ir daļa arī no TG Nr. 443 (Paplašinātais vienas paaudzes reproduktīvās toksicitātes pētījums, šā pielikuma B.56. nodaļa), tika iekļauti TG Nr. 422, pamatojoties uz priekšizpēti, kurā aplūkoti zinātniski un tehniski jautājumi par minēto beigupunktu iekļaušanu, kā arī iespējamie testēšanas plānojuma pielāgojumi, kas vajadzīgi minēto beigupunktu iekļaušanai (6).
5.Šī testēšanas metode ir izstrādāta, lai iegūtu ierobežotu informāciju par testējamās ķimikālijas ietekmi uz tēviņu un mātīšu reproduktīvo spēju, piemēram, gonadālo funkciju, pārošanās uzvedību, apaugļošanos, miesas augļa attīstību un dzemdībām. Tā nav nedz alternatīva B.31., B.34., B.35. vai B.56. testēšanas metodei, nedz tās aizstāj.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI
6.Novērtējot un izvērtējot testējamās ķimikālijas toksiskās īpašības, orālo toksicitāti ar atkārtotām devām var noteikt pēc tam, kad akūtās toksicitātes testos ir iegūta sākotnējā informācija par toksicitāti. Šis pētījums sniedz informāciju par iespējamajiem veselības apdraudējumiem, kas varētu rasties no atkārtotas ekspozīcijas relatīvi ierobežotā laikposmā. Metodē ietilpst atkārtotas devas toksiskuma pamatpētījums, ko var izmantot attiecībā uz ķimikālijām, par kurām nav pamatoti veikt 90 dienu pētījumu (piemēram, ja ražošanas apjoms nepārsniedz noteiktas robežvērtības), vai par provizorisku pētījumu ilgtermiņa pētījumam. Veicot pētījumu, ir jāievēro galvenie principi un apsvērumi, kas noteikti ESAO norādījumu dokumentā Nr. 19 par klīnisko pazīmju atpazīšanu, novērtēšanu un izmantošanu par humānajiem beigupunktiem eksperimenta dzīvniekiem, kurus izmanto drošības novērtējumā (7).
7.Šī metode ietver arī reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes skrīninga testu, un tāpēc to var izmantot arī, lai sniegtu sākotnējo informāciju par iespējamo ietekmi uz tēviņu un mātīšu reproduktīvo spēju, piemēram, gonadālo funkciju, pārošanās uzvedību, apaugļošanos, miesas augļa attīstību un dzemdībām, vai nu ķimikāliju toksikoloģisko īpašību novērtēšanas agrīnā posmā, vai par ķimikālijām, kas rada bažas. Šī testēšanas metode nesniedz pilnīgu informāciju par visiem reprodukcijas un attīstības aspektiem. Konkrētāk, tā piedāvā tikai ierobežotus līdzekļus, ar ko detektēt prenatālās ekspozīcijas postnatālās izpausmes vai ietekmi, kas var rasties postnatālās ekspozīcijas laikā. Beigupunktu selektivitātes, pētījuma īsā ilguma un citu iemeslu dēļ šī metode nesniedz pierādījumus galīgajiem apgalvojumiem par reproduktīvās/ontoģenētiskās ietekmes neesību. Turklāt, ja nav datu no citiem reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes testiem, pozitīvie rezultāti ir noderīgi sākotnējai bīstamības novērtēšanai un palīdz pieņemt lēmumus par papildu testēšanas nepieciešamību un laiku.
8.Rezultāti, kas iegūti par endokrīnajiem parametriem, ir jāaplūko ESAO endokrīni disruptīvu ķimikāliju testēšanas un novērtēšanas konceptuālā satvara (8) kontekstā. Atjauninātā ESAO TG Nr. 422 ir iekļauta minētā konceptuālā satvara 4. līmenī, kur ietilpst in vivo testi, kas sniedz datus par nelabvēlīgu ietekmi uz endokrīnajiem beigupunktiem. Endokrīnu signālu pašu par sevi tomēr nevar uzskatīt par pietiekamu pierādījumu tam, ka testējamā ķimikālija ir endokrīnais disruptors.
9.Šajā testēšanas metodē uzsvars likts arī uz neiroloģisko ietekmi kā īpašu beigupunktu un uzsvērta vajadzība izdarīt rūpīgus dzīvnieku klīniskos novērojumus, lai iegūtu iespējami daudz informācijas. Ar šo metodi jāidentificē ķimikālijas ar neirotoksisku potenciālu, saistībā ar kuru varētu būt pamatoti veikt turpmāku padziļinātu izpēti. Turklāt metode var dot arī pamatnorādes uz imunoloģisko ietekmi.
10.Ja nav datu no citiem sistēmiskās toksicitātes, reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes, neirotoksicitātes un/vai imūntoksicitātes pētījumiem, pozitīvie rezultāti ir noderīgi sākotnējai bīstamības novērtēšanai un palīdz pieņemt lēmumus par papildu testēšanas nepieciešamību un laiku. Tests var būt īpaši noderīgs kā daļa no ESAO skrīninga informācijas datu kopas (SIDS), lai novērtētu esošās ķimikālijas, par kurām ir pieejams maz toksikoloģiskās informācijas vai tā nav pieejama vispār, un tas var kalpot par alternatīvu divu atsevišķu testu, proti, atkārtotas devas toksiskuma testa (ESAO TG Nr. 407, kas atbilst šā pielikuma B.7. nodaļai) un reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes testa (ESAO TG Nr. 421, kas atbilst šā pielikuma B.63. nodaļai) veikšanai. To var izmantot arī par devu diapazona noteikšanas pētījumu plašākiem reprodukcijas/ontoģenēzes pētījumiem vai citos relevantos gadījumos.
11.Parasti tiek pieņemts, ka grūsnu un negrūsnu dzīvnieku jutība atšķiras. Tāpēc šajā kombinētajā testā var būt grūti noteikt devu līmeņus, kas ir pietiekami gan vispārējas sistēmiskas toksicitātes, gan specifiskas reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes izvērtēšanai; to vieglāk izdarīt, ja individuālos testus veic atsevišķi. Turklāt testa rezultātus attiecībā uz vispārējo sistēmisko toksicitāti var būt sarežģītāk interpretēt nekā tad, ja veic atsevišķu atkārtotas devas pētījumu, jo īpaši gadījumos, kad seruma un histopatoloģijas parametri pētījumā netiek izvērtēti vienlaicīgi. Šo tehnisko sarežģījumu dēļ šā kombinētā skrīninga testa veikšanai ir vajadzīga liela pieredze toksicitātes testēšanā. No otras puses, papildus tam, ka testā tiek izmantots mazāks skaits dzīvnieku, kombinētais tests var nodrošināt labāku veidu, kā tiešo ietekmi uz reprodukciju/ontoģenēzi nošķir no ietekmes, kas ir sekundāra citiem (sistēmiskas) ietekmes veidiem.
12.Šajā testā devu došanas periods ir ilgāks nekā parastā 28 dienu ilgā atkārtotas devas pētījumā. Tomēr salīdzinājumā ar situāciju, kad papildus reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes skrīninga testam tiek veikts 28 dienu ilgs atkārtotas devas pētījums, šajā testā katrā grupā tiek izmantots mazāks skaits katra dzimuma dzīvnieku
13.Šajā testēšanas metodē izmanto perorālo testējamās ķimikālijas ievadīšanu. Citu ekspozīcijas ceļu izmantošanas gadījumā var būt vajadzīgas modifikācijas.
14.Pirms testēšanas metodi attiecībā uz maisījumu izmanto, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Šādi apsvērumi nav vajadzīgi, ja pastāv regulatīva prasība maisījumu testēt.
15.Izmantotās definīcijas sniegtas 1. papildinājumā.
TESTA PRINCIPS
16.Testējamo ķimikāliju pakāpeniski pieaugošās devās saņem vairākas tēviņu un mātīšu grupas. Tēviņiem testējamās ķimikālijas jādod vismaz četras nedēļas līdz dienai pirms plānotās nonāvēšanas (minēto dienu ieskaitot); minētais laikposms aptver vismaz divas nedēļas pirms pārošanas, pārošanas periodu un aptuveni divas nedēļas pēc pārošanas. Ņemot vērā ierobežoto pirmspārošanas devu došanas periodu tēviņiem, auglība var nebūt īpaši precīzs testikulārās toksicitātes rādītājs. Tāpēc būtiska ir sēklinieku detalizēta histopatoloģiska izmeklēšana. Divu nedēļu ilgais pirmspārošanas devu došanas periods apvienojumā ar turpmākiem pārošanās/auglības novērojumiem ar kopējo devu došanas periodu vismaz četras nedēļas, kam seko tēviņu gonādu detalizēta histopatoloģija, tiek uzskatīts par pietiekamu, lai varētu noteikt lielāko daļu ietekmes uz tēviņu auglību un spermatoģenēzi.
17.Mātītēm devas dod visu pētījuma laiku, kas aptver divas nedēļas pirms pārošanas (aptverot divus pilnus estrālos ciklus), laiku līdz apaugļošanās brīdim, grūsnības laiku un vismaz trīspadsmit dienas pēc dzemdībām, līdz dienai pirms plānotās nonāvēšanas (minēto dienu ieskaitot).
18.Pētījuma ilgums pēc aklimatizācijas un estrālā cikla izvērtējuma, ko veic pirms devu došanas, ir atkarīgs no mātīšu rādītājiem un ir aptuveni 63 dienas [vismaz 14 dienas pirms pārošanas, (ne vairāk kā) 14 dienas pārošana, 22 dienas gestācija, 13 dienas laktācija].
19.Devu došanas perioda laikā katru dienu rūpīgi novēro, vai dzīvniekiem neparādās toksiskuma pazīmes. Dzīvniekiem, kas testa laikā nobeigušies vai ir nonāvēti, izdara autopsiju, un izdzīvojušos dzīvniekus testa beigās nonāvē un tiem izdara autopsiju.
METODES APRAKSTS
Dzīvnieku sugas izraudzīšanās
20.Šo testēšanas metodi paredzēts izmantot ar žurkām. Ja šajā TG Nr. 422 noteiktie parametri tiek pētīti citās grauzēju sugās, tas sīki jāpamato. Starptautiskajā validēšanas programmā endokrīno disruptoru detektēšanai saskaņā ar TG Nr. 407 izmantoja tikai žurkas. Nedrīkst izmantot līnijas ar zemu auglību vai līnijas, par kurām ir labi zināms, ka tām ir bieži sastopami attīstības defekti. Jāizmanto veselīgi iepriekš nepāroti dzīvnieki, kuriem eksperimentālas procedūras iepriekš nav veiktas. Jānorāda testa dzīvnieku suga, līnija, dzimums, masa un vecums. Pētījuma sākumā dzīvnieku masas atšķirībām jābūt minimālām un tās nedrīkst pārsniegt ± 20 % no vidējās masas, kas noteikta katram dzimumam atsevišķi. Ja pētījumu veic kā sākotnēju pētījumu ilgtermiņa pētījumam vai pētījumam, kas aptver visu paaudzi, vēlams abos pētījumos izmantot vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekus.
Turēšana un barošana
21.Visām procedūrām jāatbilst vietējiem laboratorijas dzīvnieku labturības standartiem. Temperatūrai eksperimentālo dzīvnieku turēšanas telpā jābūt 22 °C (± 3 °). Relatīvajam mitrumam jābūt vismaz 30 % un, vēlams, ne augstākam par 70 %, izņemot telpu uzkopšanas laiku. Dzīvniekus 12 stundas diennaktī tur mākslīgā apgaismojumā, bet 12 stundas – tumsā. Var izmantot parasto laboratorijas barību ar neierobežotu piekļuvi dzirdināmajam ūdenim. Uztura izvēli var ietekmēt vajadzība tam piemaisīt testējamo ķimikāliju, ja ķimikāliju ievada šādā ceļā.
22.Dzīvniekus ieteicams turēt mazās viendzimuma grupās; ja tas zinātniski pamatoti, dzīvniekus var turēt atsevišķi. Ja dzīvniekus tur grupās, dzīvnieku skaits vienā būrī nedrīkstētu pārsniegt 5. Pārošanas procedūras jāveic attiecīgajam nolūkam piemērotos būros. Grūsnas mātītes jātur atsevišķi, un tām jānodrošina migas ierīkošanai vajadzīgie materiāli. Mātītes laktācijas periodā tiks turētas atsevišķi kopā ar to pēcnācēju.
23.Barība regulāri jāanalizē, lai noteiktu kontaminantu klātbūtni. Barības paraugs jāglabā līdz ziņojuma pabeigšanai.
Dzīvnieku sagatavošana
24.Veselīgus jaunus pieaugušus dzīvniekus nejaušināti iedala apstrādes grupās un ievieto būros. Būri jāizvieto tā, lai būru novietojuma varbūtējā ietekme būtu iespējami maza. Dzīvniekus unikāli identificē un pirms pētījuma sākšanas vismaz piecas dienas tur būros, lai tie aklimatizētos laboratorijas apstākļos.
Devu sagatavošana
25.Testējamo ķimikāliju ieteicams ievadīt perorāli, ja vien par piemērotākiem netiek uzskatīti citi ievadīšanas ceļi. Ja izvēlēts perorālais ievadīšanas ceļš, testējamo ķimikāliju parasti ievada ar gavāžu; tomēr testējamo ķimikāliju var ievadīt arī ar uzturu vai dzirdināmo ūdeni.
26.Ja vajadzīgs, testējamo ķimikāliju izšķīdina vai suspendē piemērotā nesējā. Kad vien iespējams, ieteicams lietošanai izvēlēties ūdens šķīdumu/suspensiju vai, ja tas nav iespējams, šķīdumu/suspensiju eļļā (piemēram, kukurūzas eļļā), vai, ja arī tas nav iespējams, šķīdumu citos nesējos. Ja nesējs nav ūdens, ir jāzina šā nesēja toksiskās īpašības. Jānosaka testējamās ķimikālijas stabilitāte un homogenitāte nesējā.
PROCEDŪRA
Dzīvnieku skaits un dzimums
27.Ieteicams, lai katrā grupā sākumā būtu vismaz 10 tēviņi un 12–13 mātītes. Pirms ekspozīcijas izvērtē mātīšu estrālos ciklus, un dzīvniekus, kam nav novērojami tipiski 4–5 dienu cikli, pētījumā neiekļauj; tāpēc ieteicams izmantot lielāku skaitu mātīšu, lai katrā grupā būtu 10 mātītes. Izņemot izteiktas toksiskās ietekmes gadījumus, sagaidāms, ka katrā grupā būs vismaz 8 grūsnas mātītes, kas parasti ir minimālais pieļaujamais grūsno mātīšu skaits grupā. Mērķis ir nodrošināt pietiekamu daudzumu grūsnu mātīšu un pietiekamu daudzumu pēcnācēju, lai varētu ticami izvērtēt testējamās ķimikālijas spēju ietekmēt auglību, grūsnību, mātišķo uzvedību un zīdīšanu, kā arī F1 pēcnācēju augšanu un attīstību no aizmešanās līdz 13. dienai pēc piedzimšanas. Ja ir plānota dzīvnieku nonāvēšana pētījuma gaitā, skaits jāpalielina par dzīvnieku skaitu, ko paredzēts nonāvēt pirms pētījuma pabeigšanas. Jāapsver papildu satelītgrupas (pieci dzīvnieki no katra dzimuma) iekļaušana kontrolgrupā un lielākās devas grupā, lai vismaz 14 dienas pēc apstrādes novērotu sistēmiskas toksiskās ietekmes atgriezeniskumu, noturību vai vēlīnu parādīšanos. Satelītgrupas dzīvniekus nepāro un līdz ar to neizmanto reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes novērtēšanai.
Devas
28.Parasti jāizmanto vismaz trīs testa grupas un kontrolgrupa. Ja piemēroti vispārējās toksicitātes dati nav pieejami, var izdarīt diapazona noteikšanas pētījumu (ar vienas līnijas un izcelsmes dzīvniekiem), kas palīdzētu noteikt izmantojamās devas. Ar kontrolgrupas dzīvniekiem jārīkojas tāpat kā ar testa grupu dzīvniekiem, izņemot attiecībā uz testējamās ķimikālijas ievadīšanu. Ja testējamās ķimikālijas ievadīšanai izmanto nesēju, kontrolgrupa saņem lielāko izmantoto nesēja daudzumu.
29.Devu līmeņi jāizvēlas, ņemot vērā visus pieejamos toksiskuma un (toksiko)kinētiskos datus. Jāņem vērā arī tas, ka grūsnu un negrūsnu dzīvnieku jutība var atšķirties. Augstākais devas līmenis jāizvēlas tāds, lai tas izraisītu toksisku ietekmi, bet ne nobeigšanos vai acīmredzamas ciešanas. Pēc tam jāizvēlas tāda lejupēja devas līmeņu virkne, lai ar to varētu parādīt jebkādas ar devu saistītas atbildreakcijas, kā arī to, ka zemākajā devas līmenī nelabvēlīga ietekme nav novērojama. Optimums bieži vien ir divkārši līdz četrkārši intervāli, un bieži vien ir ieteicamāk pievienot ceturto testa grupu, nevis izmantot ļoti plašu devu intervālu (piemēram, vairāk nekā 10 reizes).
30.Ja ir novērota vispārēja toksicitāte (piemēram, ķermeņa masas samazināšanās, ietekme uz aknām, sirdi, plaušām vai nierēm utt.) vai citas pārmaiņas, kas var nebūt toksiskas atbildreakcijas (piemēram, samazināts barības patēriņš, aknas palielināšanās), ir jābūt piesardzīgiem, interpretējot novēroto iedarbību uz jutīgiem endokrīnajiem beigupunktiem.
Robežtests
31.Ja perorālajā pētījumā, kurā izmanto vienu devas līmeni, kas ir vismaz 1000 mg/kg ķermeņa masas dienā, vai – ja testējamo ķimikāliju ievada ar uzturu – līdzvērtīgs procentuālais daudzums uzturā vai dzirdināmajā ūdenī (aprēķināts pēc ķermeņa masas), un kuru veic, ievērojot šajā pētījumā aprakstītās procedūras, novērojama toksiska ietekme nerodas un ja, pamatojoties uz datiem par strukturāli radniecīgām vielām, toksicitāte nav sagaidāma, var uzskatīt, ka pilns pētījums ar vairākiem devu līmeņiem nav vajadzīgs. Robežtestu neizmanto gadījumos, kad cilvēka ekspozīcija norāda uz to, ka ir jāizmanto augstāks devas līmenis. Ja izmanto citus ievadīšanas veidus, tādus kā ieelpošana vai aplicēšana uz ādas, maksimālā sasniedzamā ekspozīcija bieži vien ir atkarīga no testējamo ķimikāliju fizikālķīmiskajām īpašībām.
Devu došana
32.Dzīvnieki testējamās ķimikālijas devu saņem katru dienu 7 dienas nedēļā. Ja izmanto gavāžu, dzīvniekiem testējamā ķimikālija jāsaņem vienreizējā devā, ko ievada ar kuņģa zondi vai piemērotu intubācijas cauruli. Maksimālais šķidruma tilpums, ko vienā paņēmienā var ievadīt, ir atkarīgs no testa dzīvnieka lieluma. Tilpums nedrīkst pārsniegt 1 ml uz 100 g ķermeņa masas, izņemot tādus ūdens šķīdumus, kur var lietot 2 ml uz 100 g ķermeņa masas. Izņemot kairinošas vai kodīgas testējamās ķimikālijas, kam lielākās koncentrācijās parasti ir saasināta ietekme, testa tilpuma mainība būtu jāsamazina līdz minimumam, koncentrāciju koriģējot tā, lai visos devu līmeņos saglabātos konstants tilpums.
33.Ja testējamās ķimikālijas ievada ar uzturu vai dzirdināmo ūdeni, ir svarīgi nodrošināt, ka testējamās ķimikālijas daudzums neizjauc normālu uztura vai ūdens līdzsvaru. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar uzturu, var izmantot nemainīgu koncentrāciju uzturā (ppm) vai nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieku ķermeņa masu; izmantotā alternatīva ir jānorāda. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar gavāžu, deva jādod katru dienu vienādā laikā un vismaz reizi nedēļā jākoriģē tā, lai uzturētu nemainīgu devas līmeni attiecībā pret dzīvnieka ķermeņa masu. Ja kombinēto pētījumu izmanto par provizorisku pētījumu ilgtermiņa vai pilnīgam reproduktīvās toksicitātes pētījumam, abos pētījumos jāizmanto līdzīgs uzturs.
Eksperimenta grafiks
34.Devas abu dzimumu dzīvniekiem jāsāk dot 2 nedēļas pirms pārošanas, pēc tam, kad tie vismaz piecas dienas tikuši aklimatizēti un mātītēm ir novēroti normāli estrālie cikli (divu nedēļu ilgā priekšapstrādes periodā). Pētījums jāplāno tā, lai estrālā cikla izvērtēšana sāktos drīz pēc tam, kad dzīvnieki ir sasnieguši pilnīgu dzimumgatavību. Dažādām žurku līnijām pilnīgas dzimumgatavības sasniegšanas vecums dažādās laboratorijās var nedaudz atšķirties, piemēram, Sprague Dawley līnijas žurkas to sasniedz 10 nedēļu vecumā, Wistar līnijas žurkas — 12 nedēļu vecumā. Mātes ar pēcnācēju jānonāvē 13. pēcdzemdību dienā vai drīz pēc tam. Lai nodrošinātu, ka mātes nakti pirms asins ņemšanas (ja izvēlēts šis variants) nav barojušās, mātes un to pēcnācējs nav obligāti jānogalina tajā pašā dienā. Dzimšanas diena (proti, dienā, kurā dzemdības ir beigušās) ir 0. pēcdzemdību diena. Mātītes, kam nav novērojamas kopulācijas pazīmes, nonāvē 24–26 dienas pēc pēdējās pārošanas perioda dienas. Pārošanas perioda laikā abu dzimumu dzīvniekiem devas turpina dot. Pēc pārošanas perioda tēviņiem devas jāturpina dot vismaz līdz minimālā kopējā devu došanas perioda (28 dienas) beigām. Pēc tam tos vai nu nonāvē, vai arī patur dzīvus un tiem turpina dot devas, lai tos, iespējams, izmantotu otrai pārošanai, ja tāda vajadzīga.
35.Vecākpaaudzes mātītēm devas turpina dot katru dienu visu grūsnības laiku un vismaz līdz 13. pēcdzemdību dienai vai dienai pirms nonāvēšanas (minētās dienas ieskaitot). Pētījumos, kuros testējamo ķīmisko vielu ievada inhalācijas ceļā vai caur ādu, devas jāturpina dot vismaz līdz gestācijas 19. dienai (ieskaitot) un jāatsāk dot pēc iespējas drīz, bet ne vēlāk kā 4. dienā pēc dzemdībām.
36.Satelītgrupas dzīvniekus (ja tie iekļauti), kas paredzēti papildu novērojumiem, nepāro. Pēc pirmās plānotās mātīšu nonāvēšanas tie jātur vēl vismaz 14 dienas bez apstrādes, lai detektētu toksiskās ietekmes vēlīnu parādīšanos vai noturību, vai atgūšanos no tās.
37.Eksperimenta grafika shēma ir dota 2. papildinājumā.
Estrālie cikli
38.Lai pētījumam atlasītu mātītes ar regulāru cikliskumu, pirms apstrādes sākšanas jānovēro estrālie cikli (sk. 27. punktu). No apstrādes perioda sākuma līdz brīdim, kad ir novērotas pārošanās pazīmes, katru dienu jāveic arī vaginālo uztriepju monitorings. Ja pastāv bažas par akūta stresa ietekmi, kas, uzsākot devu došanu, var mainīt estrālos ciklus, laboratorijas var testa dzīvniekus divas nedēļas pakļaut ekspozīcijai un pēc tam reizi dienā ievākt vaginālās uztriepes, lai pirmspārošanas periodā vismaz divas nedēļas veiktu estrālo ciklu monitoringu, ko turpina veikt arī pārošanas periodā, līdz ir iegūti pārošanās pierādījumi. Iegūstot maksts / dzemdes kakla šūnas, jārūpējas par to, lai nepieļautu gļotādas bojājumus, kas var inducēt viltus grūsnību (8) (9).
Pārošanas procedūra
39.Parasti šajā pētījumā jāizmanto pārošanas shēma 1:1 (viens tēviņš uz vienu mātīti). Izņēmumi pieļaujami tēviņu nāves gadījumā. Mātīte jātur kopā ar to pašu tēviņu, līdz tiek novērotas kopulācijas pazīmes vai ir pagājušas divas nedēļas. Katru rītu mātītēm pārbauda spermas vai embola klātbūtni makstī. Grūsnību sāk skaitīt no dienas, kurā ir apstiprinājies kopulācijas fakts (konstatēts maksts embols vai sperma). Ja pārošana ir nesekmīga, var apsvērt mātīšu atkārtotu pārošanu ar tās pašas grupas tēviņiem.
Metiena lielums
40.Ceturtajā dienā pēc piedzimšanas katra metiena lielumu var koriģēt, nejaušināti izņemot liekos mazuļus tā, lai katrā metienā pēc iespējas būtu četri vai pieci katra dzimuma mazuļi atkarībā no izmantotās žurku līnijas parastā metiena lieluma. No diviem liekajiem mazuļiem jāņem asins paraugi, tie jāapkopo un jāizmanto seruma T4 līmeņu noteikšanai. Mazuļu selektīva izņemšana, piemēram, pēc ķermeņa masas vai anoģenitālā attāluma (AGD), nav piemērota. Ja vīrišķā vai sievišķā dzimuma mazuļu skaita dēļ nav iespējams nodrošināt, ka katrā metienā ir četri vai pieci katra dzimuma mazuļi, ir pieļaujama metiena lieluma daļēja koriģēšana (piemēram, seši tēviņi un četras mātītes). Ja metiena lielums ir mazāks par korekcijas robežvērtību (8 vai 10 mazuļi vienā metienā), mazuļus no metiena neizņem. Ja korekcijas robežvērtību pārsniedz tikai viens mazulis, izņem tikai vienu mazuli un no tā ņem asins paraugus, ko izmanto iespējamiem seruma T4 novērtējumiem.
41.Ja metiena lielums netiek koriģēts, 4. dienā pēc piedzimšanas divus mazuļus no katra metiena nonāvē un no tiem ņem asins paraugus, ko izmanto tiroīdhormona seruma koncentrācijas mērīšanai. Ja iespējams, diviem mazuļiem katrā metienā jābūt sievišķā dzimuma mazuļiem, lai vīrišķā dzimuma mazuļus rezervētu zīdekļu retencijas izvērtējumiem, izņemot gadījumus, kad šo mazuļu izņemšanas rezultātā galējam novērtējumam nepaliek neviena mātīte. Mazuļus no metiena neizņem, ja tā lielums būs mazāks nekā 8 vai 10 mazuļi vienā metienā (atkarībā no izmantotās žurku līnijas parastā metiena lieluma). Ja, pamatojoties uz parasto metiena lielumu, lieks ir tikai viens mazulis, izņem tikai vienu mazuli un no tā ņem asins paraugus, ko izmanto iespējamiem seruma T4 novērtējumiem.
Novērojumi
42.Vismaz reizi dienā, vēlams — vienā un tajā pašā laikā vai laikos un ņemot vērā gaidāmo ietekmju maksimumperiodu pēc devu došanas, jāizdara vispārīgi klīniski novērojumi. Jāreģistrē dzīvnieku veselības stāvoklis. Vismaz divreiz dienā visus dzīvniekus novēro attiecībā uz morbiditāti un mirstību.
43.Vienu reizi pirms pirmās ekspozīcijas (lai varētu izdarīt salīdzinājumus vienam un tam pašam dzīvniekam) un pēc tam vismaz reizi nedēļā jāveic detalizēti klīniskie novērojumi visiem vecākpaaudzes dzīvniekiem. Šie novērojumi jāizdara standartnožogojumā ārpus dzīvnieka turēšanas būra, ieteicams, katru dienu vienā un tajā pašā laikā. Tie rūpīgi jāreģistrē, ieteicams, izmantojot punktu sistēmas, ko skaidri noteikusi testēšanas laboratorija. Jācenšas nodrošināt, lai testēšanas apstākļu mainība būtu minimāla un lai novērojumus izdarītu novērotāji, kas nav informēti par apstrādi. Jāreģistrē šādas pazīmes (neizsmeļošs saraksts): izmaiņas ādā, apmatojumā, acīs, gļotādās, sekrētu un ekskrētu parādīšanās un veģetatīvās nervu sistēmas reakcijas (piemēram, asarošana, piloerekcija, acs zīlītes diametra pārmaiņas, neraksturīga elpošana). Jāreģistrē arī pārmaiņas gaitā, stājā un atbildes reakcijās uz manipulācijām, kā arī kloniskas vai toniskas kustības, stereotipiska uzvedība (piemēram, pārmērīga apmatojuma laizīšana, atkārtota riņķošana), grūtas vai ilgstošas dzemdības vai savāda uzvedība (piemēram, pašsakropļošanās, staigāšana atmuguriski) (10).
44.Kādā brīdī pētījuma laikā jānovērtē piecu tēviņu un piecu mātīšu, kas nejauši izvēlētas no katras grupas, sensorā reaktivitāte uz dažāda veida kairinājumiem (piemēram, dzirdes, redzes un proprioreceptīvajiem kairinājumiem) (8) (9) (11), satvēriena spēks (12) un kustību aktivitāte (13). Papildinformācija par izmantojamajām procedūrām ir atrodama attiecīgajos atsauces materiālos. Tomēr norādīto procedūru vietā var izmantot arī citas procedūras. Tēviņiem šie funkcionālie novērojumi jāveic, tuvojoties devu došanas perioda beigām, neilgi pirms plānotās nonāvēšanas, bet pirms asins paraugu ņemšanas hematoloģijai vai klīniskās ķīmijas izmeklējumiem (sk. 53.–56. punktu, arī 1. zemsvītras piezīmi). Mātītēm šo funkcionālo testu laikā jābūt fizioloģiski līdzīgā stāvoklī, un tās vēlams testēt vienu reizi pēdējās laktācijas nedēļas laikā (piemēram, 6.–13. laktācijas dienā), neilgi pirms plānotās nonāvēšanas. Māšu un mazuļu atšķiršanas laikiem jābūt pēc iespējas īsākiem.
45.Funkcionālos novērojumus, kas veicami vienu reizi pētījuma beigās, var neveikt, ja pētījums ir provizorisks pētījums turpmākam subhroniskam (90 dienas) vai ilgtermiņa pētījumam. Tādā gadījumā funkcionālie novērojumi ir jāiekļauj minētajā turpmākajā pētījumā. Tomēr šajā atkārtotas devas pētījumā iegūtie funkcionālo novērojumu dati var atvieglot devu līmeņu izvēli turpmākajam subhroniskajam vai ilgtermiņa pētījumam.
46.Izņēmuma kārtā funkcionālos novērojumus var neveikt arī tām grupām, kurām toksicitātes pazīmes izpaužas tādā mērā, kas varētu ievērojami traucēt funkcionālā testa veikšanu.
47.Jāreģistrē gestācijas ilgums, ko aprēķina no 0. grūsnības dienas. Pēc atnešanās katru metienu iespējami drīz pārbauda, lai noteiktu mazuļu, nedzīvi dzimušo, dzīvi dzimušo un nīkuļu (mazuļi, kas ir ievērojami mazāki nekā atbilstīgie kontrolmazuļi) skaitu un dzimumu un acīmredzamu anomāliju klātbūtni.
48.24 stundu laikā pēc atnešanās (0. vai 1. diena pēc piedzimšanas) un vismaz 4. un 13. dienā pēc piedzimšanas jāsaskaita dzīvie mazuļi un jānosaka to dzimums, un jānosver metieni. Papildus vecākpaaudzes dzīvnieku novērojumiem (sk. 43. un 44. punktu) jāreģistrē pēcnācēju uzvedības anomālijas.
49.Katra mazuļa AGD jāmēra vienā un tajā pašā dienā pēc piedzimšanas no 0. līdz 4. dienai pēc piedzimšanas. Mazulis ir jānosver tajā pašā dienā, kad tiek mērīts AGD, un AGD ir jāpielāgo mazuļa izmēram, priekšroku dodot kvadrātsaknei no ķermeņa svara (14). Kā ieteikts ESAO GD 151 (15), 12. vai 13. dienā pēc piedzimšanas ir jāsaskaita vīrišķā dzimuma mazuļu zīdekļi/areolas.
Ķermeņa masa un barības/ūdens patēriņš
50.Tēviņi un mātītes jānosver pirmajā devas došanas dienā, tad vismaz reizi nedēļā un pētījuma beigās. Grūsnības laikā mātītes jānosver 0., 7., 14. un 20. dienā un 24 stundu laikā pēc atnešanās (0. vai 1. pēcdzemdību diena), kā arī vismaz 4. un 13. pēcdzemdību dienā. Novērojumu rezultāti jāreģistrē atsevišķi par katru pieaugušo dzīvnieku.
51.Pirmspārošanas, grūsnības un laktācijas laikā barības patēriņš jāmēra vismaz reizi nedēļā. Barības patēriņa mērīšana pārošanas laikā ir fakultatīva. Ja testējamo ķimikāliju ievada ar ūdeni, minētajos laikposmos ir jāmēra arī ūdens patēriņš.
Hematoloģija
52.Pētījuma laikā pieciem tēviņiem un piecām mātītēm, kas nejauši izvēlētas no katras grupas, vienu reizi jāveic šādi hematoloģiski izmeklējumi: hematokrīts, hemoglobīna koncentrācijas, eritrocītu skaits, retikulocīti, leikocītu skaits un leikocitārā formula, trombocītu skaits un asinsreces laika/potenciāla noteikšana. Ja testējamajai ķimikālijai vai tās iespējamajiem metabolītiem ir oksidējošas īpašības vai pastāv aizdomas, ka tiem tādas varētu būt, jānosaka arī methemoglobīna koncentrācija un Heinca ķermenīši.
53.Asins paraugi jāņem no norādītās vietas. Paraugu ņemšanas laikā mātītēm ir jābūt fizioloģiski līdzīgā stāvoklī. Lai izvairītos no praktiskām grūtībām, kas saistītas ar mainību grūsnības sākumā, asins savākšanu mātītēm var veikt pirms pārošanas perioda beigām kā alternatīvu paraugu ņemšanai tieši pirms dzīvnieku eitanāzijas procedūras vai tās ietvaros. Asins paraugus no tēviņiem vēlams ņemt tieši pirms dzīvnieku eitanāzijas procedūras vai tās ietvaros. Alternatīvi asins savākšanu tēviņiem var veikt arī pārošanas perioda beigās, ja šis brīdis ticis izvēlēts mātītēm.
54.Asins paraugi jāglabā piemērotos apstākļos.
Klīniskā bioķīmija
55.Asins paraugiem, kas iegūti no izvēlētiem pieciem tēviņiem un piecām mātītēm katrā grupā, veic klīniskās bioķīmijas analīzes, lai izpētītu būtisku toksisko ietekmi uz audiem un, konkrēti, uz nierēm un aknām. Ir ieteicams dzīvniekus nakti pirms asins paraugu ņemšanas nebarot. Plazmā vai serumā jānosaka nātrijs, kālijs, glikoze, kopējais holesterīns, urīnviela, kreatinīns, kopējais olbaltums un albumīns, vismaz divi fermenti, kas norāda uz hepatocelulāro ietekmi, (piemēram, alanīnaminotransferāze, aspartātaminotransferāze un sorbitoldehidrogenāze) un žultsskābes. Noteiktos apstākļos noderīgu informāciju var sniegt papildu fermentu (aknu fermentu vai citu fermentu) un bilirubīna noteikšana.
56.Asins paraugus no noteiktas vietas ņem saskaņā ar šādu grafiku:
-4. dienā pēc piedzimšanas — no vismaz diviem mazuļiem katrā metienā, ja mazuļu skaits to ļauj (sk. 40.-41. punktu),
-pētījuma beigās 13. dienā — no visām mātēm un vismaz diviem mazuļiem katrā metienā, un
-pētījuma beigās — no visiem pieaugušiem tēviņiem.
Visus asins paraugus glabā piemērotos apstākļos. Asins paraugos, kas ņemti no mazuļiem 13. dienā un pieaugušiem tēviņiem, nosaka tiroīdhormonu (T4) seruma līmeņus. Ja vajadzīgs, T4 līmeņus nosaka arī asins paraugos, kas ņemti no mātēm un 4. dienas mazuļiem. Attiecīgā gadījumā var fakultatīvi mērīt citus hormonus. Tiroīdhormona analīžu veikšanai mazuļu asinis var apkopot pa metieniem. Tiroīdhormonus (T4 un TSH) vēlams mērīt kopējā formā (kopējais T4 un kopējais TSH).
57.Pēdējā pētījuma nedēļā, izmantojot urīna savākšanu noteiktā laika periodā, pieciem nejauši izvēlētiem tēviņiem katrā grupā pēc izvēles var veikt šādus urīnanalīzes mērījumus: izskats, tilpums, osmolalitāte vai īpatnējais svars, pH, proteīns, glikoze un asinis/ asins šūnas.
58.Turklāt jāapsver iespēja veikt vispārēja audu bojājuma seruma marķieru izpēti. Ja testējamās ķimikālijas zināmās īpašības var ietekmēt saistītos metaboliskos profilus vai ir aizdomas par šādu ietekmi, jānosaka arī kalcijs, fosfāts, triglicerīdu līmenis tukšā dūšā un glikoze tukšā dūšā, īpaši hormoni, methemoglobīns un holīnesterāze. Tie jānosaka katrā gadījumā atsevišķi.
59.Noteikto hormonu mainību un absolūto koncentrāciju var ietekmēt šādi faktori:
-nonāvēšanas laiks hormonu koncentrāciju diennakts mainības dēļ,
-nonāvēšanas metode, kurā dzīvniekiem netiek radīts nevajadzīgs stress, kas varētu ietekmēt hormonu koncentrācijas,
-hormonu noteikšanas testa komplekti, kas var atšķirties pēc standartlīknēm.
60.Plazmas paraugi, kas paredzēti tieši hormonu noteikšanai, ir jāiegūst salīdzināmā dienas laikā. Skaitliskās vērtības, ko iegūst, analizējot hormonu koncentrācijas, atšķiras atkarībā no tirdzniecībā pieejamajiem testēšanas komplektiem.
61.Ja vēsturiskie bāzlīnijas dati ir nepietiekami, jāapsver iespēja noteikt hematoloģiskos un klīniskās bioķīmijas mainīgos lielumus pirms devu došanas sākšanas vai, vēlams, dzīvniekiem, kas nav ietverti eksperimentālajās grupās. Dati par mātītēm jāiegūst no dzīvniekiem laktācijas periodā.
PATOLOĢIJA
Makroskopiskā autopsija
62.Visiem pētījumā izmantotajiem pieaugušajiem dzīvniekiem jāveic pilna, detalizēta makroskopiska autopsija, kas ietver ķermeņa ārējās virsmas, visu atveru un galvaskausa, krūšu un vēdera dobumu un to satura rūpīgu izpēti. Īpaša uzmanība jāpievērš reproduktīvās sistēmas orgāniem. Jāreģistrē implantācijas vietu skaits. Autopsijas dienā jāizmeklē vaginālās uztriepes, lai noteiktu estrālā cikla fāzi un ļautu to saistīt ar mātīšu reproduktīvo orgānu histopatoloģiju.
63.Visu pieaugušo tēviņu sēklinieki un sēklinieku piedēkļi, kā arī prostata un sēklas pūslīši ar prostatas priekšējām daivām (kopā) pēc vajadzības jāatbrīvo no pieguļošiem audiem, un to slapjais svars jānosaka iespējami drīz pēc disekcijas, lai izvairītos no izžūšanas. Turklāt fakultatīvos orgānu masas mērījumos var ietvert arī tūpļa cēlājmuskuļa un briedumķermeņa muskuļa kompleksu, Kupera dziedzerus un dzimumlocekļa galviņu tēviņiem un abas olnīcas (slapjais svars) un dzemdi (ar dzemdes kaklu) mātītēm; ietveršanas gadījumā minētie masas mērījumi jāveic iespējami drīz pēc disekcijas. Jāsaglabā visu pieaugušo dzīvnieku olnīcas, sēklinieki, sēklinieku piedēkļi, iekšējie dzimumorgāni un visi orgāni, kam ir makroskopiski bojājumi.
64.Vairogdziedzeri, kas ņemti no visiem pieaugušajiem tēviņiem un mātītēm un viena 13 dienas veca vīrišķā dzimuma un sievišķā dzimuma mazuļa katrā metienā, vispiemērotākajā fiksējošajā vidē jāsaglabā paredzētajai turpmākajai histopatoloģiskajai izmeklēšanai. Vairogdziedzera masu var noteikt pēc fiksācijas. Tas jāatbrīvo no piegulošiem audiem ļoti uzmanīgi un tikai pēc fiksācijas, lai izvairītos no audu bojājumiem. Audu bojājumi var apgrūtināt histopatoloģijas analīzi. Asins paraugi jāņem no precīzi norādītas vietas tieši pirms dzīvnieku eitanāzijas procedūras vai tās laikā un jāglabā piemērotos apstākļos (sk. 56. punktu).
65.Turklāt vismaz piecu pieaugušu tēviņu un mātīšu, kas nejauši izvēlētas no katras grupas (izņemot dzīvniekus, kas ir nāvei tuvā stāvoklī un/vai eitanazēti pirms pētījuma beigām), aknas, nieres, virsnieres, tīms, liesa, smadzenes un sirds pēc vajadzības jāatbrīvo no piegulošiem audiem un to slapjais svars jānosaka iespējami drīz pēc disekcijas, lai izvairītos no izžūšanas. Šādi audi jāglabā audu tipam un paredzētajai turpmākajai histopatoloģiskajai izmeklēšanai vispiemērotākajā fiksējošajā vidē: visi audi ar makroskopiskiem bojājumiem, smadzenes (reprezentatīvas daļas, tostarp galasmadzenes, smadzenītes un tilts), muguras smadzenes, acis, kuņģis, tievā un resnā zarna (arī Peijera plātnīte), aknas, nieres, virsnieres, liesa, sirds, tīms, traheja un plaušas (saglabātas, piepūšot ar fiksatoru un pēc tam iegremdējot), gonādas (sēklinieki un olnīcas), iekšējie dzimumorgāni (dzemde un dzemdes kakls, sēklinieku piedēkļi, prostata un sēklas pūslīši kopā ar prostatas priekšējo daivu), vagīna, urīnpūslis, limfmezgli (saskaņā ar laboratorijas pieredzi papildus proksimālam drenējošam limfmezglam ir jāņem vēl viens limfmezgls (16)), perifērais nervs (sēžas nervs vai apakšstilba nervs), vēlams, tiešā muskuļa tuvumā, skeleta muskulis un kauls ar kaula smadzenēm (izgriezums vai, alternatīvi, svaigs kaula smadzeņu aspirāts). Sēkliniekus ieteicams fiksēt, iegremdējot tos Buēna fiksatorā vai Davidsona fiksatorā (16) (17) (18); šos audus nav ieteicams fiksēt formalīnā. Lai nodrošinātu fiksatora ātru penetrēšanos, bālgano apvalku (tunica albuginea) var abos orgāna polos uzmanīgi un sekli pārdurt ar adatu. Klīnisko un citu konstatējumu rezultātā var rasties vajadzība papildus izmeklēt citus audus. Jāsaglabā arī orgāni, ko, pamatojoties uz zināmajām testējamās ķimikālijas īpašībām, uzskata par iespējamiem mērķorgāniem.
66.Vērtīgas norādes par endokrīnu iedarbību var gūt no šādiem audiem: gonādas (olnīcas un sēklinieki), iekšējie dzimumorgāni (dzemde un dzemdes kakls, sēklinieku piedēkļi, sēklas pūslīši ar prostatas priekšējām daivām, dorsolaterālā un ventrālā prostata), vagīna, hipofīze, tēviņu krūts dziedzeris un virsnieru dziedzeris. Tēviņu krūts dziedzeru pārmaiņas nav pietiekami dokumentētas, taču šis parametrs var būt ļoti jutīgs pret vielām ar estrogēnisku iedarbību. To orgānu/audu novērošana, kas nav uzskaitīti 65. punktā, nav obligāta.
67.Nedzīvi mazuļi un mazuļi, kas nonāvēti 13. dienā pēc piedzimšanas vai drīz pēc tam, vismaz rūpīgi ārēji jāpārbauda, lai konstatētu iespējamas acīmredzamas anomālijas. Īpaša uzmanība jāpievērš ārējām reproduktīvajām ģenitālijām, kuras jāpārbauda, meklējot attīstības izmaiņu pazīmes.
Histopatoloģija
68.Saglabātajiem orgāniem un audiem, kas iegūti no atlasītajiem kontrolgrupas un lielākās devas grupas dzīvniekiem, veic pilnu histopatoloģisko izmeklēšanu (īpašu uzsvaru liekot uz spermatoģenēzes posmiem tēviņu gonādās un sēklinieku intersticiālo šūnu struktūras histopatoloģiju). Vajadzības gadījumā var izmeklēt mazuļu un pārējo pieaugušo dzīvnieku vairogdziedzeri. Ja lielākās devas grupā ir novērotas ar apstrādi saistītas pārmaiņas, minētie izmeklējumi jāattiecina arī uz citu devu grupu dzīvniekiem. Norādījumos par histopatoloģiju (10) ir sīki izklāstīta papildu informācija par endokrīno audu disekciju, fiksāciju, secēšanu un histopatoloģiju.
69.Jāizmeklē visi makroskopiskie bojājumi. Lai palīdzētu noskaidrot NOAEL, jāizmeklē mērķorgāni citās devu grupās, jo īpaši grupās, kas uzrāda NOAEL.
70.Ja izmanto satelītgrupu, histopatoloģiskā izmeklēšana jāizdara audiem un orgāniem, uz kuriem apstrādātajās grupās ir konstatēta ietekme.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Dati
71.Jāsniedz dati par atsevišķiem dzīvniekiem. Turklāt visi dati jāapkopo tabulā, kurā redzams testa sākumā katrā testā grupā esošo dzīvnieku skaits, to dzīvnieku skaits, kas atrasti miruši testa laikā vai eitanazēti humānu apsvērumu dēļ, nāves iestāšanās vai eitanāzijas laiks, auglīgo dzīvnieku skaits, grūsno mātīšu skaits, to dzīvnieku skaits, kam novērotas toksicitātes pazīmes, novēroto toksicitātes pazīmju apraksts, arī toksiskās darbības sākuma laiks, ilgums un stiprums, histopatoloģisko pārmaiņu veidi un visi relevantie dati par metienu. Tabulas veidā sagatavotā kopsavilkuma ziņojuma paraugs, kas ir ļoti noderīgs ietekmes uz reprodukciju/attīstību izvērtēšanai, ir sniegts 3. papildinājumā.
72.Ja iespējams, skaitliskie rezultāti jāizvērtē ar piemērotu un vispārpieņemtu statistikas metodi. Salīdzinot ietekmi visā devu diapazonā, jāizvairās no vairāku t-testu izmantošanas. Statistikas metodes jāizvēlas pētījuma plānošanas laikā. AGD un zīdekļu retencijas statistiskajai analīzei jābalstās uz atsevišķu mazuļu datiem, ņemot vērā ietekmi uz metienu. Vajadzības gadījumā analīzes vienība ir metiens. Mazuļu ķermeņa masas statistiskajai analīzei jābalstās uz atsevišķu mazuļu datiem, ņemot vērā metiena lielumu. Tā kā pētījuma tvērums ir ierobežots, statistiskajai analīzei, ko veic, lai izvērtētu rezultātu nozīmīgumu, ir ierobežota vērtība attiecībā uz daudziem beigupunktiem, jo īpaši reproduktīvajiem beigupunktiem. Dažas no visplašāk izmantotajām metodēm, jo īpaši parametriskie testi centrālās tendences mērīšanai, nav piemērotas. Ja tiek izmantota statistiskā analīze, izvēlētajai metodei jābūt atbilstošai pārbaudāmā mainīgā lieluma sadalījumam, un tā jāizvēlas pirms pētījuma sākšanas.
Rezultātu izvērtēšana
73.Šā toksicitātes pētījuma konstatējumi jāizvērtē, ņemot vērā novēroto ietekmi, autopsiju un mikroskopiskos konstatējumus. Vērtējums ietver testējamās ķimikālijas devas saistību ar anomāliju — to vidū makroskopisko bojājumu, identificēto mērķorgānu, neauglības, klīnisko anomāliju, ietekmes uz reproduktīvajiem un metiena rādītājiem, ķermeņa masas pārmaiņu, ietekmes uz mirstību un citas toksiskās iedarbības – esību vai neesību, incidenci un smagumu.
74.Tēviņu apstrādes periods ir īss, tāpēc, novērtējot ietekmi uz tēviņu reproduktīvo funkciju, papildus auglības datiem jāņem vērā sēklinieku un sēklinieku piedēkļu histopatoloģija. Pētījuma interpretēšanā par palīglīdzekli var būt lietderīgi izmantot arī vēsturiskus kontroles datus par reprodukciju/ontoģenēzi (piemēram, datus par metiena lielumu, AGD, zīdekļu retenciju, seruma T4 līmeņiem), ja tādi pieejami.
75.Kvalitātes kontroles vajadzībām ir ierosināts apkopot vēsturiskus kontroldatus un skaitliskajiem datiem, it sevišķi parametriem, kas saistīti ar endokrīnās sistēmas traucējumu izraisītāju noteikšanu, aprēķināt variācijas koeficientus. Šos datus var izmantot salīdzināšanas nolūkos, kad tiek novērtēti faktiskie pētījumi.
Testēšanas pārskats
76.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija:
-avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams,
-testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja tā zināma;
vienkomponenta viela:
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības,
-ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.;
daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:
-iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
Nesējs (attiecīgā gadījumā):
-
nesēja izvēles pamatojums, ja nesējs nav ūdens.
Testa dzīvnieki:
-
izmantotās sugas/līnijas,
-
dzīvnieku skaits, vecums un dzimums,
-
avots, turēšanas apstākļi, uzturs u. tml.,
-
katra dzīvnieka masa testa sākumā,
-
sugas izvēles pamatojums, ja tā nav žurka.
Testēšanas nosacījumi:
-
devu līmeņa izraudzīšanās pamatojums,
-
detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas maisījuma/barības preparāta sagatavošanu, sasniegto preparāta koncentrāciju, stabilitāti un homogenitāti,
-
detalizēta informācija par testējamās ķimikālijas devu došanu,
-
attiecīgā gadījumā testējamās ķimikālijas koncentrācijas (ppm) barībā / dzirdināmajā ūdenī pārrēķins faktiskajā devā (mg uz kg ķermeņa masas dienā),
-
detalizēta informācija par barības un ūdens kvalitāti,
-
detalizēts apraksts par nejaušināšanas procedūru, kas izmantota, lai atlasītu mazuļus izņemšanai no metiena, ja šāda izņemšana notikusi.
Rezultāti:
-
ķermeņa masa / ķermeņa masas izmaiņas,
-
attiecīgā gadījumā barības patēriņš un ūdens patēriņš,
-
dati par toksiskajām atbildes reakcijām atkarībā no dzimuma un devas, arī dati par auglību, gestāciju un citām toksicitātes pazīmēm,
-
-
gestācijas ilgums,
-
toksiska vai cita iedarbība uz reprodukciju, pēcnācējiem, postnatālo augšanu utt.,
-
klīnisko novērojumu veids, smagums un ilgums (atgriezenisks vai neatgriezenisks),
-
sensoriskās aktivitātes, satvēriena spēka un kustību aktivitātes novērtējums,
-
hematoloģiskie testi ar attiecīgajām bāzes līnijas vērtībām,
-
klīniskās bioķīmijas testi ar attiecīgajām bāzes līnijas vērtībām,
-
pieaugušu mātīšu skaits ar normālu vai nenormālu estrālo ciklu un cikla ilgums,
-
dzīvi dzimušo skaits un pēcimplantācijas zudums,
-
to mazuļu skaits, kam ir makroskopiskas anomālijas, ārējo ģenitāliju makroskopisks izvērtējums, nīkuļu skaits,
-
nāves iestāšanās laiks testa laikā vai norāde, ka dzīvnieki ir izdzīvojuši līdz pētījuma beigām,
-
implantāciju skaits, metiena lielums un masa datu reģistrēšanas laikā,
-
mazuļu ķermeņa masas dati,
-
visu mazuļu AGD (un ķermeņa masa AGD mērīšanas dienā),
-
zīdekļu retencija vīrišķā dzimuma mazuļiem,
-
vairogdziedzera hormonu līmenis 13 dienu veciem mazuļiem un pieaugušiem tēviņiem (un mātēm un 4 dienas veciem mazuļiem, ja šādi mērījumi veikti),
-
-
ķermeņa masa nonāvēšanas laikā un dati par vecākpaaudzes dzīvnieku orgānu masu,
-
autopsijas konstatējumi,
-
histopatoloģiskas izmeklēšanas rezultātu detalizēts apraksts,
-
absorbcijas dati (ja pieejami),
-
rezultātu statistiskā apstrāde (attiecīgā gadījumā).
Rezultātu iztirzājums.
Secinājumi.
Rezultātu interpretēšana
77.Pētījums sniegs izvērtējumu par reproduktīvo/ontoģenētisko toksicitāti, kas saistīta atkārtotu devu došanu. Konkrētāk, tā kā uzsvars ir likts uz vispārējās toksicitātes un reproduktīvās/ontoģenētiskās toksicitātes beigupunktiem, pētījuma rezultāti ļaus reproduktīvo/ontoģenētisko ietekmi, kas radusies bez vispārējas toksicitātes, atšķirt no ietekmes, kura izpaužas tikai pie līmeņiem, kas ir toksiski arī vecākpaaudzes dzīvniekiem (sk. 7.–11. punktu). Tas varētu norādīt uz nepieciešamību veikt turpmākas izmeklēšanas un sniegt norādījumus turpmāko pētījumu plānošanā. Ar reprodukciju un ontoģenēzi saistīto rezultātu interpretēšanā par palīglīdzekli jāizmanto ESAO norādījumu dokuments Nr. 43 (19). ESAO norādījumu dokumentā Nr. 106 par grauzēju endokrīno un reproduktīvo testu histoloģisko izvērtēšanu (16) sniegta informācija par (endokrīno) orgānu un vaginālo uztriepju sagatavošanu un izvērtēšanu; minētā informācija var būt noderīga saistībā ar šo testēšanas metodi.
LITERATŪRA
(1)OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris
(2)OECD (1992). Chairman's Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. . Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris
(3)Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol, Sci., 19, 141-149.
(4)Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol., 18, 89-95.
(5)OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998, Available upon request at Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris
(6)OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(7)OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(8)Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97.
(9)Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York.
(10)IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60).
(11)Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.
(12)Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.
(13)Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13, 599-609.
(14)Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp and V.L. Reynolds. (1999). “Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights”, Reproductive Toxicology, 13: 383-390.
(15)OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(16)OECD (2009).Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No. 106) Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(17)Hess RA and Moore BJ. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (Eds.). Academic Press: San Diego, CA, pp. 52-85.
(18)Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM. (2002). Fixation of Testes and Eyes Using a Modified Davidson's Fluid: Comparison with Bouin's Fluid and Conventional Davidson's fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533.
(19)OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(20)OECD (2011), Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption (No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
1. papildinājums
DEFINĪCIJAS (sk. arī (20) ESAO GD 150)
Androgenitāte ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā funkcionēt kā dabiskam androgēnu tipa hormonam (piemēram, testosteronam).
Antiandrogenitāte ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā nomākt dabiska androgēnu tipa hormona (piemēram, testosterona) darbību.
Antiestrogenitāte ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā nomākt dabiska estrogēnu tipa hormona (piemēram, estradiola 17ß) darbību.
Antitireoidāla iedarbība ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā nomākt dabiska tiroīdhormona (piemēram, T3) darbību.
Ķimikālija ir viela vai maisījums.
Ontoģenētiskā toksicitāte: reproduktīvās toksicitātes izpausme, kas liecina par pēcnācēju prenatāliem, perinatāliem, postnatāliem, strukturāliem vai funkcionāliem traucējumiem.
Deva ir ievadītās testējamās ķimikālijas daudzums. Devu izsaka ar testējamās ķimikālijas masu uz testa dzīvnieka ķermeņa masas vienību dienā (piemēram, mg uz kg ķermeņa masas dienā) vai kā nemainīgu koncentrāciju barībā.
Dozējums ir vispārīgs termins, kas aptver devu, tās ievadīšanas biežumu un ilgumu.
Izteikta toksicitāte ir vispārīgs termins, kas apzīmē acīmredzamas toksicitātes pazīmes pēc testējamās ķimikālijas ievadīšanas. Šīm pazīmēm jābūt pietiekamām, lai varētu novērtēt bīstamību, un tādām, lai varētu sagaidīt, ka ievadītās devas palielināšana izraisīs smagas toksicitātes pazīmes un, iespējams, mirstību.
Fertilitātes traucējumi ir tēviņu vai mātīšu reproduktīvās funkcijas vai spējas traucējumi.
Maternālā toksicitāte: nelabvēlīgā ietekme uz gravidām mātītēm, kas ir specifiska (tieša ietekme) vai nespecifiska (netieša ietekme) un saistīta ar gravidu stāvokli.
NOAEL ir saīsinājums, kas apzīmē nenovērojamās nelabvēlīgās ietekmes līmeni. Tas ir augstākais devas līmenis, kurā netiek konstatētas ar vielas saņemšanu saistītas negatīvas parādības.
Estrogenitāte ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā darboties kā dabiskam estrogēnu tipa hormonam (piemēram, estradiolam 17ß).
Reproduktīvā toksicitāte ir kaitīga ietekme uz pēcnācējiem un/vai tēviņu un mātīšu reproduktīvās funkcijas vai spējas traucējumi.
Testējamā ķimikālija ir jebkura viela vai maisījums, ko testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
Tireoidāla iedarbība ir ķimikālijas spēja zīdītāja organismā darboties kā dabiskam tiroīdhormonam (piemēram, T3).
Validācija ir zinātnisks process, kura mērķis ir raksturot testēšanas metodes darbības prasības un ierobežojumus un apliecināt tās ticamību un piemērotību konkrētam nolūkam.
2. papildinājums
EKSPERIMENTA GRAFIKA SHĒMA, KURĀ NORĀDĪTS MAKSIMĀLAIS PĒTĪJUMA ILGUMS, KURA PAMATĀ IR 14 DIENU ILGS PĀROŠANAS PERIODS
3. papildinājums
TABULAS VEIDĀ SAGATAVOTS KOPSAVILKUMA ZIŅOJUMS PAR IETEKMI UZ REPRODUKCIJU/ONTOĢENĒZI
|
NOVĒROJUMI
|
VĒRTĪBAS
|
|
Dozējums (vienības).......
|
0 (kontrole)
|
. . .
|
. . .
|
. . .
|
. . .
|
|
Dzīvnieku pāri (N)
|
|
|
|
|
|
|
Estrālais cikls (vismaz vidējais neregulāru ciklu ilgums un biežums)
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes, kam novērojamas kopulācijas pazīmes (N)
|
|
|
|
|
|
|
Grūsnas mātītes (N)
|
|
|
|
|
|
|
Apaugļošanās dienas 1–5 (N)
|
|
|
|
|
|
|
Apaugļošanās dienas 6– . . .(
) (N)
|
|
|
|
|
|
|
Grūsnība≤21 diena (N)
|
|
|
|
|
|
|
Grūsnība = 22 dienas (N)
|
|
|
|
|
|
|
Grūsnība ≥ 23 dienas (N)
|
|
|
|
|
|
|
Mātes ar dzīviem mazuļiem (N)
|
|
|
|
|
|
|
Mātes ar dzīviem mazuļiem 4. dienā pēc dzemdībām (N)
|
|
|
|
|
|
|
Implanti vienai mātei (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Dzīvie mazuļi vienai mātei piedzimšanas brīdī (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Dzīvie mazuļi vienai mātei 4. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Dzimumu attiecība (tēv./māt.) piedzimstot (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Dzimumu attiecība (tēv./māt.) 4. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Metiena masa piedzimstot (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Metiena masa 4. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Mazuļu masa piedzimstot (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Mazuļu masa AGD mērīšanas laikā (tēviņu vidējā masa, mātīšu vidējā masa)
|
|
|
|
|
|
|
Mazuļu AGD tajā pašā postnatālajā dienā, laikā no dzimšanas līdz 4. dienai (tēviņu vidējā masa, mātīšu vidējā masa)
|
|
|
|
|
|
|
Metiena masa 4. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Metiena masa 13. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
Zīdekļu retencija vīrišķā dzimuma mazuļiem 13. dienā (vidēji)
|
|
|
|
|
|
|
MAZUĻI AR ANOMĀLIJĀM
|
|
Mātes, kam nav neviena šāda mazuļa
|
|
|
|
|
|
|
Mātes ar 1 šādu mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātes ar ≥ 2 šādiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
|
PĒCNĀCĒJU ZUDUMI
|
|
Prenatāli (implantāciju skaits mīnus dzīvi dzimušo skaits)
|
|
Mātītes, kas nav zaudējušas mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar vienu zaudētu mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar diviem zaudētiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar ≥ 3 zaudētiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
|
Postnatāli (dzīvi dzimušo skaits mīnus 13. postnatālajā dienā dzīvo mazuļu skaits)
|
|
Mātītes, kas nav zaudējušas mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar vienu zaudētu mazuli
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar diviem zaudētiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
|
Mātītes ar ≥ 3 zaudētiem mazuļiem
|
|
|
|
|
|
B.65. IN VITRO BARJERMEMBRĀNAS TESTA METODE ATTIECĪBĀ UZ ĀDAS KOROZIJU
IEVADS
1.Šī testēšanas metode ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijai (TG) Nr. 435 (2015). Ādas korozija ir nepārejošs ādas bojājums, kas izpaužas kā tāda redzama nekroze visā epidermā, kura ietiecas dermā un radusies pēc tam, kad uz ādas aplicēta testējamā ķimikālija atbilstoši definīcijai, kas dota Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētajā sistēmā (GHS) (1) un Eiropas Savienības (ES) Regulā Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (CLP regula)
. Šī testēšanas metode, kas ir ekvivalenta atjauninātajai ESAO testēšanas vadlīnijai Nr. 435, nosaka in vitro barjermembrānas testa metodi, ko var izmantot kodīgu ķimikāliju identificēšanai. Testēšanas metodē izmanto mākslīgu membrānu, kas izstrādāta tā, lai tā reaģētu uz kodīgām ķimikālijām līdzīgā veidā kā dzīvnieku āda in situ.
2.Kodīgumu ādai parasti novērtē, aplicējot testējamo ķimikāliju uz dzīvu dzīvnieku ādas un nosakot audu bojājumu pakāpi pēc noteikta laika (2). Papildus šai testēšanas metodei ir pieņemtas vairākas citas in vitro testēšanas metodes, kas ir alternatīvas (3)(4) in vivo standartprocedūrai ar truša ādu (šā pielikuma B.4. nodaļa, ekvivalenta ESAO TG Nr. 404), kuru izmanto kodīgu ķimikāliju identificēšanai (2). ANO GHS secīgu pārbaužu un izvērtēšanas stratēģijā kodīguma ādai novērtēšanai un klasificēšanai un ESAO norādījumu dokumentā par integrētu testēšanas un novērtēšanas pieeju (IATA) attiecībā uz ādas kairinājumu/koroziju ieteikts izmantot validētas un pieņemtas in vitro testēšanas metodes, kas aprakstītas 3. un 4. modulī (1)(5). IATA apraksta vairākus moduļus, kuros tiek grupēti informācijas avoti un analīzes rīki, un, pirmkārt, sniedz norādījumus par to, kā, novērtējot ķimikāliju potenciālu radīt ādas kairinājumu un ādas koroziju, integrēt un izmantot jau esošos testēšanā un citādi iegūtos datus, un, otrkārt, ierosina pieeju, ko izmantot, ja vajadzīga turpmāka testēšana, tostarp gadījumos, kad ir iegūti negatīvi rezultāti (5). Atbilstoši šai modulārajai pieejai pozitīvos rezultātus, kas iegūti, īstenojot in vitro testēšanas metodi, var izmantot ķimikāliju klasificēšanai par kodīgām vielām bez nepieciešamības veikt testus ar dzīvniekiem, tādējādi samazinot un pilnveidojot dzīvnieku izmantošanu un novēršot sāpēs un diskomfortu, ko dzīvniekiem var radīt to izmantošana minētajam mērķim.
3.In vitro barjermembrānas modeļa, kas komerciāli pieejams ar nosaukumu Corrositex®, validācijas pētījumi ir pabeigti (6)(7)(8), un tie liecina, ka šā modeļa vispārējā pareizība ādas korozijas paredzēšanā ir 79 % (128/163), jutība — 85 % (76/89) un specifiskums — 70 % (52/74), izmantojot 163 vielu un maisījumu datubāzi (7). Šo validēto referencmetodi (VRM), pamatojoties uz tās atzīto derīgumu, ieteicams izmantot par daļu no secīgu pārbaužu stratēģijas ķimikāliju ādas korozijas briesmu potenciāla novērtēšanai (5)(7). Pirms attiecībā uz ādas koroziju iespējams regulatīvām vajadzībām izmantot kādu in vitro barjermembrānas modeli, saskaņā ar iepriekš noteiktiem veiktspējas standartiem (VS) (10) būtu jānosaka tā ticamība, relevantums (pareizība) un piedāvātā lietojuma ierobežojumi, lai būtu drošība par tā līdzību VRM (9). ESAO datu savstarpējā atzīšana (Mutual acceptance of data) būs garantēta tikai tad, kad jebkāda jauna ierosināta vai atjaunināta VS atbilstoša metode būs izskatīta un iekļauta ekvivalentajā ESAO testēšanas vadlīnijā. Patlaban tikai viena in vitro metode ir iekļauta ESAO testēšanas vadlīnijā Nr. 435 un šajā testēšanas metodē, proti, komerciāli pieejamais Corrositex® modelis.
4.Citās testēšanas metodēs kodīguma ādai testēšanai izmanto rekonstruētu cilvēka ādu (ESAO TG Nr. 431) (3) un izolētu žurkas ādu (ESAO TG Nr. 430) (4). Šī testēšanas vadlīnija paredz arī kodīgo ķimikāliju iedalīšanu trīs ANO GHS kodīguma apakškategorijās un trīs ANO transportēšanas iepakojuma grupās attiecībā uz kodīguma risku. Šī testēšanas vadlīnija sākotnēji pieņemta 2006. gadā un 2015. gadā atjaunināta, lai ietvertu atsauci uz IATA norādījumu dokumentu un atjauninātu standartvielu sarakstu.
DEFINĪCIJAS
5.Izmantotās definīcijas sniegtas papildinājumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI
6.Šajā testēšanas metodē aprakstītais tests dod iespēju identificēt kodīgas testējamās ķimikālijas un ļauj kodīgas testējamās ķimikālijas iedalīt apakškategorijās saskaņā ar ANO GHS / CLP (1. tabula). Turklāt šādu testēšanas metodi var izmantot, lai konkrētām transportēšanas testu vajadzībām pieņemtu lēmumus par konkrētu ķimikāliju klašu, piemēram, organisku un neorganisku skābju, skābju atvasinājumu un bāžu, kodīgumu vai nekodīgumu (7)(11)(12). Šajā testēšanas metodē aprakstīta vispārēja procedūra, kas ir līdzīga validētajai testēšanas referencmetodei (7). Šī testēšanas metode gan pietiekami neinformē par ādas kairinājumu, taču jānorāda, ka tādai ietekmei uz veselību kā ādas kairinājums in vitro īpaši pievēršas TM B.46., kas ir ekvivalenta ESAO TG Nr. 439 (13). Attiecībā uz to, kā pilnīgi izvērtēt lokālo ietekmi uz ādu pēc vienreizējas dermālas ekspozīcijas, jāizmanto ESAO norādījumu dokuments par integrētajām testēšanas un novērtēšanas pieejām (5).
1. tabula. ANO GHS kategorija “Kodīgs ādai” un tās apakškategorijas (1)
|
Kodīguma kategorija (1. kategorija)
(iestādēm, kas neizmanto apakškategorijas)
|
Iespējamās kodīguma apakškategorijas
(iestādēm, kas izmanto apakškategorijas, tostarp CLP regulu)
|
Kodīgs ≥ 1 no 3 dzīvniekiem
|
|
|
|
Ekspozīcija
|
Novērošana
|
|
Kodīgs
|
Kodīguma apakškategorija 1A
|
≤ 3 minūtes
|
≤1 stunda
|
|
|
Kodīguma apakškategorija 1B
|
> 3 minūtes / ≤ 1 stunda
|
≤ 14 dienas
|
|
|
Kodīguma apakškategorija 1C
|
> 1 stunda / ≤ 4 stundas
|
≤ 14 dienas
|
7.Validētās referencmetodes (7) ierobežojums ir tāds, ka daudzas nekodīgas ķimikālijas un dažas kodīgas ķimikālijas, pamatojoties uz sākotnējā saderības testa rezultātiem (sk. 13. punktu), var netikt atzītas par derīgām testēšanai. Ķimikālijas uz ūdens bāzes, kuru pH ir diapazonā no 4,5 līdz 8,5, bieži vien nav derīgas testēšanai; tomēr 85 % no testētajām ķimikālijām, kuru pH ir minētajā diapazonā, nebija kodīgas testos ar dzīvniekiem (7). In vitro barjermembrānas metodi var izmantot, lai testētu cietvielas (ūdenī šķīstošas vai nešķīstošas), šķidrumus (ūdens vai neūdens) un emulsijas. Tomēr ar barjermembrānas metodi nevar testēt tādas testējamās ķimikālijas, kas neizraisa detektējamas izmaiņas saderības testā (piemēram, krāsas maiņu validētās testēšanas referencmetodes ķimikāliju detektēšanas sistēmā (CDS)); tās jātestē, izmantojot citas testēšanas metodes.
TESTA PRINCIPS
8.Testēšanas sistēmai ir divi komponenti: sintētiska makromolekulāra biobarjera un ķimikāliju detektēšanas sistēma (CDS); ar šo testēšanas metodi, izmantojot CDS, nosaka barjermembrānas bojājumus, kas rodas pēc kodīgas testējamās ķimikālijas aplicēšanas uz sintētiskas makromolekulāras barjermembrānas (7) un ko izraisa, domājams, tie paši korozijas mehānismi, kuri iedarbojas uz dzīvu ādu.
9.Barjermembrānas penetrāciju (jeb ķimikālijas izlaušanos cauri tai) var mērīt, izmantojot vairākas procedūras vai CDS; to var mērīt arī pēc pH indikatorkrāsvielas krāsas izmaiņām vai kādu citu zem barjeras esoša indikatoršķīduma īpašību izmaiņām.
10.Jānosaka, vai barjermembrāna ir derīga, t. i., atbilstīga un uzticama, paredzētajam lietojumam. Šajā sakarā ir jāpārliecinās, ka dažādi preparāti nodrošina barjeras īpašības, piemēram, tie spēj saglabāt barjeru pret nekodīgām ķimikālijām, un tie dod iespēju ķimikāliju kodīgās īpašības iedalīt dažādajās ANO GHS kodīguma apakškategorijās (1). Piešķirtā klasifikācija pamatojas uz laiku, kādā ķimikālija caur barjermembrānu nokļūst līdz indikatoršķīdumam.
KOMPETENCES PIERĀDĪŠANA
11.Pirms šai testēšanas metodei atbilstošo in vitro barjermembrānas metodi sākt izmantot regulāri, laboratorijām jāpierāda tehniskā kompetence, pareizi saklasificējot 2. tabulā ieteiktās 12 standartvielas. Gadījumos, kur kāda sarakstā norādīta viela nav pieejama vai kur tas attaisnojami, var izmantot citu vielu, par kuru pieejami pietiekami in vivo un in vitro references dati (piem., vielu no references ķimikāliju saraksta (10)), ja vien tiek izmantoti tie paši 1. tabulā aprakstītie izraudzīšanās kritēriji.
2. tabula. Standartvielas1
|
Viela2
|
CAS Nr.
|
Ķimikāliju klase
|
In Vivo ANO GHS apakškategorija3
|
In Vitro ANO GHS apakškategorija3
|
|
Bora trifluorīddihidrāts
|
13319-75-0
|
Neorganiskas skābes
|
1A
|
1A
|
|
Slāpekļskābe
|
7697-37-2
|
Neorganiskas skābes
|
1A
|
1A
|
|
Fosfora pentahlorīds
|
10026-13-8
|
Neorganisko skābju prekursori
|
1A
|
1A
|
|
Valerilhlorīds
|
638-29-9
|
Skābju hlorīdi
|
1B
|
1B
|
|
Nātrija hidroksīds
|
1310-73-2
|
Neorganiskas bāzes
|
1B
|
1B
|
|
1-(2-aminoetil) piperazīns
|
140-31-8
|
Alifātiskie amīni
|
1B
|
1B
|
|
Benzolsulfonilhlorīds
|
98-09-9
|
Skābju hlorīdi
|
1C
|
1C
|
|
N, N-dimetilbenzilamīns
|
103-83-3
|
Anilīni
|
1C
|
1C
|
|
Tetraetilēnpentamīns
|
112-57-2
|
Alifātiskie amīni
|
1C
|
1C
|
|
Eigenols
|
97-53-0
|
Fenoli
|
NK
|
NK
|
|
Nonilakrilāts
|
2664-55-3
|
Akrilāti/metakrilāti
|
NK
|
NK
|
|
Nātrija bikarbonāts
|
144-55-8
|
Neorganiski sāļi
|
NK
|
NK
|
1Iepriekš sarakstā norādītās divpadsmit vielas ietver trīs vielas no katras no trim ANO GHS kodīgo vielu apakškategorijām un trīs nekodīgas vielas, tās ir viegli pieejamas no komerciāliem piegādātājiem un ANO GHS apakškategorija ir balstīta uz rezultātiem, kas iegūti, veicot kvalitatīvu testēšanu in vivo. Šīs vielas izvēlētas no saraksta ar 40 standartvielām, kas iekļautas to ķimikāliju minimālajā sarakstā, kuras norādītas tādu testēšanas metožu pareizības un ticamības pierādīšanai, kuras ir strukturāli un funkcionāli līdzīgas validētajai testēšanas referencmetodei, un kas atlasītas no 163 standartvielām, ko sākotnēji izmantoja testēšanas referencmetodes (Corrositex®) validēšanai (7) (10) (14). Minētās atlases mērķis bija, ciktāl iespējams, iekļaut ķimikālijas, kas: ir reprezentatīvas attiecībā uz tādu kodīguma atbildreakciju diapazonu (piem., nekodīgas; ANO iepakojuma grupu I, II un III kodīgas vielas), ko iespējams mērīt vai paredzēt ar validēto testēšanas referencmetodi; ir reprezentatīvas attiecībā uz validācijas procesos izmantotajām ķimikāliju klasēm; ir ar labi definētu ķīmisku struktūru; ar validēto testēšanas referencmetodi inducē reproducējamus rezultātus; in vivo referenctestā inducē skaidrus rezultātus; ir komerciāli pieejamas un ar tām nesaistās augstas likvidēšanas izmaksas (14).
2 Vielas, kas testētas tīrā veidā vai ar tīrību ≥ 90 %.
3ANO GHS apakškategoriju 1A, 1B un 1C attiecīgās ANO iepakojuma grupas ir I, II un III. NK — nekodīgs.
PROCEDŪRA
12.Turpmākajos punktos aprakstīti kodīguma novērtēšanai paredzētās uz pašreizējo VRM, proti, komerciāli pieejamo Corrositex®, balstītās mākslīgas barjermembrānas testa metodes (7)(15) komponenti un procedūras. Barjermembrānu un saderības šķīdumus vai indikatoršķīdumus, kā arī šķīdumus, ko izmanto ķimikāliju kategorizēšanai, var izstrādāt, sagatavot vai iegūt tirdzniecībā, piemēram, VRM Corrositex® gadījumā. Validētajai testēšanas referencmetodei ir pieejams parauga testēšanas metodes protokols (7). Testēšana jāveic apkārtējās vides temperatūrā (17–25 °C), un komponentiem jāatbilst šādiem nosacījumiem.
Testējamās ķimikālijas saderības tests
13.Pirms barjermembrānas testa veikšanas veic saderības testu, lai noteiktu, vai testējamā ķimikālija ir detektējama ar CDS. Ja testējamo ķimikāliju ar CDS nevar detektēt, barjermembrānas testa metode nav piemērota konkrētās testējamās ķimikālijas iespējamā kodīguma izvērtēšanai un jāizmanto cita testēšanas metode. Saderības testā izmantotajai CDS un ekspozīcijas nosacījumiem jāatspoguļo ekspozīcija turpmākajā barjermembrānas testā.
Testējamās ķimikālijas laika skalas kategorijas tests
14.Ja testēšanas metode to ļauj, testējamai ķimikālijai, kas ir kvalificēta ar saderības testu, jāveic laika skalas kategorijas tests, proti, skrīninga tests, ko izmanto, lai nošķirtu vājas un stipras skābes vai bāzes. Piemēram, validētajā testēšanas referencmetodē laika skalas kategorizēšanas testu izmanto, lai atkarībā no tā, vai ir detektēta būtiska skābju vai sārmu rezerve, noteiktu, kura no divām laika skalām būtu jāizmanto. Kodīguma un ANO GHS kodīguma ādai apakškategorijas noteikšanai būtu jāizmanto divas atšķirīgas izlaušanās laika skalas atkarībā no testējamās ķimikālijas skābju vai sārmu rezerves.
Barjermembrānas testa metodes komponenti
Barjermembrāna
15.Barjermembrāna sastāv no diviem komponentiem: makromolekulāra ūdens proteīngela un caurlaidīgas pamatmembrānas. Proteīngelam jābūt šķidrumu un cietvielas necaurlaidīgam, taču tas var korodēties un kļūt caurlaidīgs. Gatavā barjermembrāna jāuzglabā iepriekš noteiktos apstākļos, kas novērš gela bojāšanos, piemēram, izžūšanu, mikrobu augšanu, tā nobīdi un plaisāšanu, kas varētu pasliktināt tā funkciju. Jānosaka pieļaujamais glabāšanas termiņš un barjermembrānas preparāti, ko pēc minētā termiņa neizmanto.
16.Caurlaidīgā pamatmembrāna nodrošina mehānisku balstu proteīngelam sarecēšanas procesā un eksponētību testējamajai ķimikālijai. Pamatmembrānai jānovērš gela noslīdēšana vai nobīde, un tai viegli jālaiž cauri visas testējamās ķimikālijas.
17.Proteīngels, kas sastāv no proteīna, piemēram, keratīna, kolagēna vai proteīnu maisījumiem, kuri veido gela matrici, kalpo par testējamās ķimikālijas mērķi. Proteīnmateriālu novieto uz pamatmembrānas virsmas, un pirms barjermembrānas novietošanas uz indikatoršķīduma tam ļauj sarecēt. Proteīngelam jābūt viscaur vienādi biezam un blīvam un bez gaisa burbuļiem vai defektiem, kas varētu ietekmēt tā funkcionālo integritāti.
Ķimikāliju detektēšanas sistēma (CDS)
18.Indikatoršķīdumam, kas ir tas pats šķīdums, ko izmanto saderības testā, būtu jāreaģē uz testējamās ķimikālijas klātbūtni. Jāizmanto pH indikatorkrāsviela vai krāsvielu kombinācija, piemēram, krezolsarkanais un metiloranžais, kas, reaģējot uz testējamās ķimikālijas klātbūtni, maina savu krāsu. Mērīšanas sistēma var būt vizuāla vai elektroniska.
19.Lai noteiktu detektējamo ķimikāliju klāstu un detektēšanas kvantitatīvos ierobežojumus, jānovērtē, cik relevantas un ticamas ir detektēšanas sistēmas, kas izstrādātas, lai detektētu testējamās ķimikālijas iziešanu caur barjermembrānu.
TESTA NORISE
Testēšanas metodes komponentu montāža
20.Barjermembrānu ievieto ar indikatoršķīdumu pildītā mēģenē (vai caurulē) tā, lai pamatmembrāna pilnībā saskartos ar indikatoršķīdumu un nerastos gaisa burbuļi. Jāraugās, lai tiktu saglabāta barjeras integritāte.
Testējamās ķimikālijas aplicēšana
21.Testējamo ķimikāliju pietiekamā daudzumā, piemēram, 500 μl šķidruma vai 500 mg smalki saberztas pulverveida cietvielas veidā (7), rūpīgi uzklāj uz barjermembrānas augšējās virsmas un vienmērīgi izkliedē. Katrai testējamajai ķimikālijai un to atbilstošajām kontrolēm (sk. 23.–25. punktu) sagatavo pietiekamu skaitu replikātu, piemēram, četrus (7). Reģistrē laiku, kad testējamā ķimikālija aplicēta uz barjermembrānas. Lai nodrošinātu, ka tiek precīzi reģistrēti īsi korozijas laiki, testējamās vielas replikātu mēģenēs aplicē dažādos laikos.
Barjermembrānas penetrācijas mērījumi
22.Katru mēģeni pienācīgi uzrauga, un reģistrē laiku, kad notikušas pirmās izmaiņas indikatoršķīdumā, t. i., barjeras penetrācija, un nosaka laika intervālu no aplicēšanas līdz barjermembrānas penetrācijai.
Kontroles
23.Testos, kuros testējamo ķimikāliju izmanto kopā ar nesēju vai šķīdinātāju, nesējam vai šķīdinātājam jābūt saderīgam ar barjermembrānas sistēmu, proti, tam nevajadzētu izjaukt barjermembrānas sistēmas integritāti un mainīt testējamās ķimikālijas kodīgumu. Attiecīgā gadījumā, lai noteiktu šķīdinātāja saderību ar barjermembrānas sistēmu, vienlaikus ar testējamo ķimikāliju jātestē šķīdinātāja (vai nesēja) kontrole.
24.Lai novērtētu, vai testēšanas sistēma darbojas pieņemami, vienlaikus ar testējamo ķimikāliju jātestē arī pozitīva (kodīga) kontrole ar vidēju kodīguma aktivitāti, piemēram, 110 ± 15 mg nātrija hidroksīda (ANO GHS 1.B kodīguma apakškategorija) (7). Lai izvērtētu kodīgas testējamās ķimikālijas relatīvo kodīguma potenciālu, var būt lietderīgi izmantot otru pozitīvo kontroli, kas pieder pie tās pašas ķimikāliju klases kā testējamā ķimikālija. Jāizvēlas vidēji kodīga pozitīvā kontrole vai kontroles (piemēram, ANO GHS 1.B apakškategorija), lai detektētu izmaiņas penetrēšanās laikā, kas var būt nepieņemami ilgāks vai īsāks par noteikto atsauces vērtību un tādējādi norādīt uz to, ka testēšanas sistēma nedarbojas pareizi. Ārkārtīgi kodīgas (ANO GHS 1.A apakškategorija) vai nekodīgas ķimikālijas šim nolūkam nav sevišķi lietderīgas. ANO GHS 1.B apakškategorijas ķimikālija ļautu detektēt pārāk garu vai īsu izlaušanās laiku. Lai noteiktu testēšanas metodes spēju konsekventi atšķirt vāji kodīgas un nekodīgas ķimikālijas, par pozitīvo kontroli var izmantot vāji kodīgu ķimikāliju (ANO GHS 1.C apakškategorija). Neatkarīgi no izmantotās pieejas jānosaka pieņemams pozitīvās kontroles atbildreakciju intervāls, kas balstīts uz izmantotās pozitīvās kontroles vai kontroļu izlaušanās laiku vēsturisko intervālu, piemēram, vidējās standartnovirzes ± 2-3. Lai varētu detektēt novirzes ārpus pieņemamā intervāla, katrā pētījumā jānosaka precīzs pozitīvās kontroles izlaušanās laiks.
25.Vienlaikus ar testējamo ķimikāliju jātestē arī negatīva (nekodīga) kontrole, piemēram, 10 % citronskābe, 6 % propionskābe (7), kas ir vēl viens kvalitātes kontroles līdzeklis, ar ko pierādīt barjermembrānas funkcionālo integritāti.
Pētījuma pieņemamības kritēriji
26.Testējamās ķimikālijas kodīguma prognozēšanai izmanto laiku (minūtēs), kas pagājis no testējamās ķimikālijas aplicēšanas uz barjermembrānas līdz barjeras penetrācijai, atbilstīgi katrai ANO GHS kodīguma apakškategorijai noteiktajiem laika parametriem. Lai pētījumu uzskatītu par pieņemamu, paralēlajai pozitīvajai kontrolei jāuzrāda sagaidāmais penetrēšanās atbildreakcijas laiks (piemēram, 8–16 minūtes ilgs izlaušanās laiks, ja par pozitīvo kontroli izmanto nātrija hidroksīdu), paralēlā negatīvā kontrole nedrīkst būt kodīga un paralēlā šķīdinātāja kontrole, ja tāda ir iekļauta, nedrīkst būt kodīga un tā nedrīkst mainīt testējamās ķimikālijas kodīguma potenciālu. Pirms šai testēšanas metodei atbilstošo metodi sākt izmantot regulāri, laboratorijām jāpierāda tehniskā kompetence, izmantojot 2. tabulā ieteiktās 12 vielas. Attiecībā uz jaunām atdarinājuma metodēm, kas izstrādātas saskaņā ar šo testēšanas metodi un ir strukturāli un funkcionāli līdzīgas validētajai referencmetodei (14), pirms jaunās metodes izmantošanas regulatīviem mērķiem ir jāpierāda tās ticamība un pareizība, šim nolūkam izmantojot iepriekš noteiktus veiktspējas standartus (10).
Rezultātu interpretēšana un testējamo ķimikāliju kodīguma klasifikācija
27.Testējamo ķimikāliju ANO GHS kodīguma apakškategorijās (1) un attiecīgā gadījumā ANO iekopojuma grupā (16) klasificē atbilstoši laikam (minūtēs), kas pagājis no testējamās ķimikālijas aplicēšanas barjermembrānai līdz barjeras penetrācijai. Katrai piedāvātajai testēšanas metodei nosaka laika sliekšņvērtības katrā no trim kodīguma apakškategorijām. Pieņemot galīgos lēmumus par laika sliekšņvērtībām, jāņem vērā nepieciešamība līdz minimumam samazināt korozijas briesmu pārāk zemas klasifikācijas (t. i., šķietami negatīvu rezultātu) skaitu. Pašreizējā testēšanās vadlīnijā jāizmanto metodes Corrositex® laika sliekšņvērtības, kas norādītās 3. tabulā, jo tā patlaban ir vienīgā testēšanas vadlīnijā ietvertā testēšanas metode (7).
3. tabula. Corrositex® prognozes modelis
|
Vidējais izlaušanās laiks (minūtēs)
|
ANO GHS prognoze3
|
|
1. kategorijas testējamās ķimikālijas1
(nosaka ar metodē paredzēto kategorizēšanas testu)
|
1. kategorijas testējamās ķimikālijas2 (nosaka ar metodē paredzēto kategorizēšanas testu)
|
|
|
0–3 min
|
0–3 min
|
Kodīgs
fakultatīvā 1.A apakškategorija
|
|
> 3 līdz 60 min
|
> 3 līdz 30 min
|
Kodīgs
fakultatīvā 1.B apakškategorija
|
|
> 60 līdz 240 min
|
> 30 līdz 60 min
|
Kodīgs
fakultatīvā 1.C apakškategorija
|
|
> 240 min
|
> 60 min
|
Nekodīgs
|
1 Testējamās ķimikālijas ar lielu skābju/sārmu rezervi (6).
2 Testējamās ķimikālijas ar mazu skābju/sārmu rezervi (6).
3 ANO GHS 1.A, 1.B un 1.C apakškategorija atbilst attiecīgi ANO I, II un III iepakojuma grupai.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Dati
28.Laiks (minūtēs), kas pagājis no testējamās ķimikālijas un pozitīvās kontroles vai kontroļu aplicēšanas līdz barjeras penetrācijai, jānorāda tabulā katram replikātam atsevišķi, kā arī jānorāda katra izmēģinājuma vidējā ± standartnovirze.
Testēšanas pārskats
29.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija un kontroles vielas:
-vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā un ja praktiski iespējams — piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. c.;
-daudzkomponentu viela, UVCB un maisījums: iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām;
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;
-avots, sērijas numurs, ja zināms;
-testējamās ķimikālijas / kontrolvielas pirmstestēšanas apstrāde (piem., sildīšana, sasmalcināšana), ja tāda veikta;
-testējamās ķimikālijas stabilitāte, izmantošanas termiņš vai atkārtotas analīzes datums, ja tas zināms;
-glabāšanas apstākļi.
Nesējs:
-identifikācija, koncentrācija (attiecīgā gadījumā), izmantotais tilpums;
-nesēja izraudzīšanās pamatojums.
Izmantotais in vitro barjermembrānas modelis un protokols, arī pierādīta pareizība un ticamība
Testēšanas nosacījumi:
-izmantoto iekārtu un sagatavošanas procedūru apraksts;
-izmantotās in vitro barjermembrānas izcelsme un sastāvs;
-indikatoršķīduma sastāvs un īpašības;
-detektēšanas metode;
-testējamās ķimikālijas un kontroles vielas daudzumi;
-replikātu skaits;
-
laika skalas kategorijas testa apraksts un pamatojums;
-aplicēšanas metode;
-
novērojumu laiki;
-
izmantoto izvērtēšanas un klasificēšanas kritēriju apraksts;
-
apliecināta kompetence testēšanas metodes veikšanā, kura pirms attiecīgās testēšanas metodes regulāras izmantošanas pierādīta, veicot standartķimikāliju testēšanu.
Rezultāti:
-tabulā apkopoti individuāli jēldati, kas iegūti no katra replikāta individuāliem testa un kontroles paraugiem;
-
citas novērotās ietekmes apraksts;
-atvasinātā klasifikācija ar norādi uz izmantoto prognozes modeli un/vai lēmuma pieņemšanas kritēriju.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fifth Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at:
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
.
(2)Šā pielikuma B.4. nodaļa “Akūts ādas kairinājums/korozija”.
(3)Šā pielikuma B.40a nodaļa “Ādas korozija in vitro: rekonstruētas cilvēka epidermas RHE tests”.
(4)Šā pielikuma B.40. nodaļa “Ādas korozija in vitro: transkutānā elektriskā pretestība (TEP).
(5)OECD (2015). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment of Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(6)Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G. and Liebsch, M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxicology In Vitro 12, 483-524.
(7)ICCVAM (1999). Corrositex®. An In Vitro Test Method for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by ICCVAM, NTP and NICEATM. NIEHS, NIH Publication (No 99-4495.)
(8)Gordon V.C., Harvell J.D. and Maibach H.I. (1994). Dermal Corrosion, the Corrositex® System: A DOT Accepted Method to Predict Corrosivity Potential of Test Materials. In vitro Skin Toxicology-Irritation, Phototoxicity, Sensitization. Alternative Methods in Toxicology 10, 37-45.
(9)OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications. Series on testing and Assessment (No 34).
(10)OECD (2014). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 435. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris. Available at:
http://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/PerfStand-TG430-June14.pdf
.
(11)ECVAM (2001). Statement on the Application of the CORROSITEX® Assay for Skin Corrosivity Testing. 15th Meeting of ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC), Ispra, Italy. ATLA 29, 96-97.
(12)U.S. DOT (2002). Exemption DOT-E-10904 (Fifth Revision). (September 20, 2002). Washington, D.C., U.S. DOT.
(13)Chapter B.46 of this Annex, In Vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. ICCVAM (2004). ICCVAM Recommended Performance Standards for In Vitro Test Methods for Skin Corrosion. NIEHS, NIH Publication No 04-4510. Available at:
http://www.ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/dermal_docs/ps/ps044510.pdf
.
(14)U.S. EPA (1996). Method 1120, Dermal Corrosion. Available at:
http://www.epa.gov/osw/hazard/testmethods/sw846/pdfs/1120.pdf
.
(15)United Nations (UN) (2013). UN Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Model Regulations, 18th Revised Edition (Part, Chapter 2.8), UN, 2013. Available at:
http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/unrec/rev18/English/Rev18_Volume1_Part2.pdf
.
Papildinājums
DEFINĪCIJAS
Pareizība: pakāpe, kādā testēšanas metodes rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas mērs un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pat nozīmē kā terminu “konkordantums”, ar to saprotot testēšanas metodes pareizo iznākumu īpatsvaru (9).
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Ķimikāliju detektēšanas sistēma (CDS): vizuāla vai elektroniska mērīšanas sistēma, kurā izmanto indikatoršķīdumu, kas reaģē uz testējamās ķimikālijas klātbūtni, piemēram, ar izmaiņām pH indikatorkrāsvielā vai krāsvielu kombinācijā, kam, reaģējot uz testējamās ķimikālijas klātbūtni, mainīsies krāsa, vai ar cita veida ķīmiskām vai elektroķīmiskām reakcijām.
Konkordantums: tādas testēšanas metodes veiktspējas mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pat nozīmē kā terminu “pareizība”, ar to saprotot visu to testēto ķimikāliju īpatsvaru, kas pareizi klasificētas kā pozitīvas vai negatīvas. Konkordantums lielā mērā ir atkarīgs no to pozitīvo rezultātu prevalences, kādi iegūti attiecībā uz pētāmajiem testējamo ķimikāliju veidiem (9).
GHS (Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētā sistēma): sistēma, kurā ķimikālijas (vielas un maisījumus) klasificē pēc standartizētiem fizisko apdraudējumu, veselības apdraudējumu un vidisko apdraudējumu tipiem un līmeņiem un izmanto tādus attiecīgus komunikācijas elementus kā piktogrammas, signālvārdi, bīstamības apzīmējumi, drošības prasību apzīmējumi un drošības datu lapas, lai sniegtu informāciju par ķimikāliju nelabvēlīgo ietekmi un tādējādi aizsargātu cilvēkus (arī darba devējus un darba ņēmējus, transporta darbiniekus, patērētājus un avārijas dienestu darbiniekus) un vidi (1).
IATA: integrētā testēšanas un novērtēšanas pieeja.
Maisījums: maisījums vai šķīdums, kas sastāv no divām vai vairākām vielām.
Vienkomponenta viela: tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vismaz 80 % (masa/masa) veido viena galvenā sastāvdaļa.
Daudzkomponentu viela: tāda pēc kvantitatīvā sastāva definēta viela, kurā vairāk nekā viena no galvenajām sastāvdaļām ir koncentrācijā ≥ 10 % (masa/masa) un < 80 % (masa/masa). Daudzkomponentu vielas tiek iegūtas ražošanas procesā. Atšķirība starp maisījumu un daudzkomponentu vielu ir tāda, ka maisījumu iegūst, divas vai vairākas vielas sajaucot bez ķīmiskas reakcijas. Daudzkomponentu viela rodas ķīmiskā reakcijā.
NK: nekodīgs.
Veiktspējas standarti: uz validētu testēšanas metodi bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē pēc noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Tajos ietilpst i) nepieciešamie testēšanas metodes komponenti; ii) minimāls tādu references ķimikāliju saraksts, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; kā arī iii), uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — tādi paši pareizības un ticamības līmeņi, kā būtu jāiegūst ar novērtējamo testēšanas metodi, to izvērtējot ar references vielām no minimālā saraksta (9).
Relevantums: parametrs, kas raksturo testēšanas metodes un interesējošās ietekmes sakarību un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Pakāpe, kādā ar testu var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testēšanas metodes pareizības (konkordantuma) aspektu (9).
Ticamība: parametrs, kas izsaka, kādā pakāpē, izmantojot vienu un to pašu protokolu, kādu testēšanas metodi vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās ilgākā laika nogrieznī var izmantot reproducējami. To novērtē, aprēķinot iekšlaboratorisko un starplaboratorisko reproducējamību (9).
Jutība: tas, cik liela daļa visu pozitīvo/aktīvo ķimikāliju ar šo testēšanas metodi tiek pareizi kvalificētas. Tas ir tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (9).
Ādas korozija in vivo: neatgriezenisku ādas bojājumu rašanās; proti, redzama nekroze, kas caur epidermu skar zemādu un rodas, testējamo ķimikāliju aplicējot uz ādas uz laiku līdz četrām stundām. Tipiskas reakcijas uz kodīgumu ir čūlas, asiņošana, asiņainas kreveles un 14 dienu novērošanas perioda beigās — ādas izbalējuma radīta atkrāsošanās, ādas laukumi, kur izkritis apmatojums, un rētas. Neskaidros gadījumos bojājums jānovērtē histopatoloģiski.
Specifiskums: tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām ķimikālijām ar testēšanas metodi tiek klasificētas pareizi. Tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (9).
Viela: ķīmisks elements un tā dabiski radušies vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, ieskaitot to stabilizācijai nepieciešamās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušos piejaukumus, bet izņemot šķīdinātājus, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu.
Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
UVCB: vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli.
B.66 STABILI TRANSFICĒTAS TRANSAKTIVĀCIJAS IN VITRO TESTI, AR KO KONSTATĒ ESTROGĒNU RECEPTORU AGONISTUS UN ANTAGONISTUS
VISPĀRĪGS IEVADS
ESAO rezultātbalstītas testēšanas vadlīnijas
1.Šī testēšanas metode ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 455 (2016) aprakstītajam. TG 455 ir veiktspējā balstītas testēšanas vadlīnija (PBTG), kurā aprakstīta stabili transficētas transaktivācijas in vitro testēšanas metodika, ar ko konstatē estrogēnu receptoru agonistus un antagonistus (ER TA testi). Tajā ietilpst vairākas mehānistiski un funkcionāli līdzīgas testēšanas metodes, ko izmanto, lai identificētu estrogēnu receptora (t.i., ER un/vai ER) agonistus un antagonistus, un tā varētu atvieglot jaunu līdzīgu vai modificētu testēšanas metožu izstrādi atbilstīgi validēšanas principiem, kas izklāstīti ESAO vadlīniju dokumentā par Bīstamības novērtēšanā izmantojamu jaunu vai atjauninātu testēšanas metožu validēšanu un starptautisku akceptēšanu (1). Pilnībā validētās references testēšanas metodes (2. un 3. papildinājums), kas ir šīs PBTG pamatā, ir šādas:
-stabili transficētas TA (STTA) tests (2), izmantojot šūnu līniju (h) ERα-HeLa-9903; un
-VM7Luc ER TA tests (3), izmantojot šūnu līniju VM7Luc4E2, kur galvenokārt ir ekspresēta līnija hERα un daļēji hER(4)(5).
Līdzīgu testu izstrādē, kas vērsti uz to pašu apdraudējumu/iznākumu, ir pieejami un būtu jāizmanto snieguma standarti (PS) (6) (7). Tas dod iespēju savlaicīgi grozīt PBTG 455, proti, atjaunināto PBTG papildināt ar jauniem līdzīgiem testiem; tomēr līdzīgus testus pievienos tikai pēc izskatīšanas un apstiprināšanas ESAO, ka snieguma standarti ir izpildīti. TG 455 iekļautos testus tam, lai izpildītu ESAO valstu prasības pēc estrogēnu receptora transaktivācijas testa rezultātiem, vienlaikus izmantojot ESAO datu savstarpējo atzīšanu, šos testus var izmantot bez izšķirības.
Testēšanas metodē iekļauto testu konteksts un principi
2.ESAO 1998. gadā sāka īstenot prioritārus pasākumus ar mērķi pārskatīt esošās un izstrādāt jaunas testēšanas vadlīnijas par potenciāli endokrīnās sistēmas traucējumus izraisošu ķimikāliju skrīningu un testēšanu. ESAO konceptuālais satvars (KS) potenciāli endokrīnās sistēmas traucējumus izraisošu ķimikāliju testēšanai un novērtēšanai 2012. gadā tika pārskatīts. Gan sākotnējais, gan pārskatītais KS ir iekļauts pielikumā ESAO Vadlīniju dokumentam par standartizētām testēšanas metodēm ķimikāliju vērtēšanai attiecībā uz endokrīnajiem disruptoriem (8). KS aptver piecus līmeņus, no kuriem katrs atbilst citam bioloģiskās sarežģītības līmenim. Šajā testēšanas metodē aprakstītie ER transaktivācijas (TA) testi atbilst 2. līmenim, kur ietilpst “in vitro testi, kas sniedz datus par izvēlētiem endokrīniem mehānismiem/ceļiem”. Šī testēšanas metode ir paredzēta in vitro transaktivācijas testiem, ar ko identificē estrogēnu receptoru (ER) agonistus un antagonistus.
3.Estrogēnu un ER mijiedarbība var ietekmēt estrogēnu regulētos gēnus, un tā rezultātā var tikt inducēti vai inhibēti šūnu procesi, tostarp tie, kas saistīti ar šūnu vairošanos, normālu augļa attīstību un reproduktīvo funkciju (9)(10)(11). Normālu estrogēnisko sistēmu traucējumi var negatīvi ietekmēt normālu attīstību (ontoģenēzi), reproduktīvo veselību un reproduktīvās sistēmas integritāti.
4.In vitro TA testu pamatā ir vielu tieša vai netieša mijiedarbība ar specifisku receptoru, kas regulē reportiergēna produkta transkripciju. Šādi testi ir plaši izmantoti, lai izvērtētu gēnu ekspresiju, ko regulē specifiski nukleārie receptori, piem., ER (12) (13) (14) (15) (16). Ir ierosināts, ka tos varētu izmantot, lai detektētu estrogēnisku transaktivāciju, ko regulē ER (17) (18) (19). Pastāv vismaz divi lieli nukleāro ER apakštipi: α un β, un tos kodē atšķirīgi gēni. Attiecīgajiem proteīniem ir atšķirīgas bioloģiskās funkcijas, kā arī atšķirīgs sadalījums audos un atšķirīga ligandu afinitāte (20)(21)(22)(23)(24)(25)(26). Nukleārais ERα mediē klasisko estrogēnisko reakciju (27)(28)(29)(30), tāpēc vairums modeļu, ko pašlaik izstrādā ER aktivācijas vai inhibīcijas mērīšanai, balstās uz ERα. Testus izmanto, lai identificētu ķimikālijas, kas aktivē (vai inhibē) ER ar liganda piesaisti, pēc kuras receptora-liganda komplekss piesaistās specifiskiem DNS reakcijas elementiem un transaktivē reportiergēnu, kā rezultātā palielinās marķierproteīna ekspresija šūnās. Testos var izmantot dažādas reportiergēnu reakcijas. Uz luciferāzes balstītās sistēmās luciferāzes enzīms luciferīna substrātu pārveido bioluminiscējošā produktā, ko var kvantitatīvi izmērīt ar luminometru. Citi izplatīti marķieri ir fluorescējošais proteīns un LacZ gēns, kas kodē β-galaktozidāzi — enzīmu, kas bezkrāsaino substrātu X-gal (5- brom-4-hlor-indolil-galaktopiranozīdu) pārveido zilā produktā, ko var kvantificēt ar spektrofotometru. Šos marķierus var ātri un lēti izvērtēt ar komerciāli pieejamiem testa komplektiem.
5.STTA un VM7Luc TA testu validācijas pētījumi apliecina, ka šie testi ir ticami un relevanti konkrētajam nolūkam (3)(4)(5)(30). Veiktspējas standarti uz luminiscenci balstītiem ER TA testiem, kuros izmanto krūšu šūnas, ir iekļauti ziņojumā "ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals” (3). Šie veiktspējas standarti ir grozīti tā, lai tos varētu izmantot gan STTA, gan VM7Luc TA testiem (2).
6.Šajā testēšanas metodē izmantotās definīcijas un saīsinājumi ir aprakstīti 1. papildinājumā.
TA testu tvērums un ierobežojumi
7.Šos testus ierosināts izmantot skrīninga un prioritizēšanas vajadzībām, tomēr tie var sniegt arī mehānistisku informāciju, ko var izmantot pierādījumu izsvēršamas pieejā. Tie attiecas uz TA, ko inducē ķīmiska piesaiste ER in vitro sistēmā. Tāpēc rezultātus nevajadzētu tieši ekstrapolēt uz neskartas endokrīnās sistēmas kompleksajiem signalizēšanas un regulēšanas mehānismiem in vivo.
8.Uzskata, ka ER mediēta TA ir viens no nozīmīgākajiem endokrīnās disrupcijas (ED) mehānismiem, lai gan ED izraisa arī citi mehānismi, t. sk. i) mijiedarbība ar citiem endokrīnās sistēmas receptoriem un enzīmu sistēmām, ii) hormonu sintēze, iii) hormonu metaboliskā aktivācija/inaktivācija, iv) hormonu sadalījums mērķaudos un v) hormonu izvadīšana no organisma. Neviens pie šīs testēšanas metodes apskatītais tests neattiecas uz šiem darbības modiem.
9.Šī testēšanas metode attiecas uz ķimikāliju spēju aktivēt (t. i., darboties kā agonistam) un nomākt (t. i., darboties kā antagonistam) ER regulētu transkripciju. Dažas ķimikālijas — atkarībā no izmantotajām šūnām — var iedarboties gan kā agonisti, gan kā antagonisti, un tās sauc par selektīvajiem estrogēnu receptora modulatoriem (SERM). Ja ķimikālijas šajos testos uzrāda negatīvus rezultātus, tad, pirms izdarīt secinājumu, ka tās receptoram nepiesaistās, tās varētu būt lietderīgi novērtēt ER piesaistīšanas testos. Turklāt šie testi sniedz tikai informāciju par vecākmolekulas aktivitāti, ņemot vērā in vitro šūnu sistēmu ierobežotās metabolizēšanas spējas. Tā kā validācijas pētījumā tika izmantotas tikai atsevišķas vielas, nav informācijas par testa izmantojamību ar maisījumiem. Tomēr šī testēšanas metode teorētiski ir piemērojama daudzkomponentu vielu, UVCB un maisījumu testēšanai. Pirms datu iegūšanai normatīvām vajadzībām šo testēšanas metodi izmanto attiecībā uz daudzkomponentu vielu, UVCB vai maisījumu, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Šādi apsvērumi nav vajadzīgi, ja attiecībā uz maisījuma testēšanu pastāv regulatīva prasība.
10.Informatīvā nolūkā 1. tabulā ir sniegti agonista testa rezultāti 34 vielām, kas testētas ar abām pilnībā validētajām references testēšanas metodēm, kuras aprakstītas šajā testēšanas metodē. No šīm vielām 26 nešaubīgi klasificētas kā ER agonisti, un, kā iziet no publicētajiem pārskatiem, 8 vielas uzrādīja negatīvus rezultātus, t. sk. in vitro ER piesaistes un TA testos un/vai uterotrofiskajā testā (2)(3)(18)(31)(32)(33)(34). 2. tabulā ir sniegti antagonista testa rezultāti 15 vielām, kas testētas ar abām pilnībā validētajām references testēšanas metodēm, kuras aprakstītas šajā testēšanas metodē. No šīm vielām 4 nešaubīgi/potenciāli klasificētas kā ER antagonisti, un, kā iziet no publicētajiem pārskatiem, 10 vielas uzrādīja negatīvus rezultātus, t. sk. in vitro ER piesaistes un TA testos (2)(3)(18)(31). Runājot par 1. un 2. tabulā apkopotajiem datiem, abas references testēšanas metodes ļauj izdarīt 100 % vienādus secinājumus par visu vielu klasifikāciju (izņemot vienu vielu — mifepristonu — antagonista testā), un katra viela ir pareizi klasificēta kā ER agonists/antagonists vai negatīvs rezultāts. Papildu informācija par šo ķimikāliju grupu un par vēl citām ķimikālijām, kas validācijas pētījumu gaitā testētas STTA VM7Luc ER TA testos, ir sniegta ERTA veiktspējas standartu (6)(7), 2. papildinājumā (1., 2. un 3. tabula).
1. tabula. Pārskats par STTA un VM7Luc ER TA testu rezultātiem attiecībā uz vielām, kas testētas abos agonista testos un klasificētas kā ES agonisti (POS) vai kā negatīvi rezultāti (NEG)
|
|
Viela
|
CAS Nr.
|
STTA tests1
|
VM7Luc ER TA tests2
|
Klasifikācijas datu avots4
|
|
|
|
|
ER TA
aktivitāte
|
PC10 vērtība (M)
|
PC50 vērtībab (M)
|
ER TA aktivitāte
|
EC50 vērtība b,3 (M)
|
Citi ER TA testic
|
ER
piesaistes testi
|
Uterotrofiskie testi
|
|
1
|
17ß-estradiolsa
|
50-28-2
|
POZ
|
<1,00 × 10-11
|
<1,00 × 10-11
|
POZ
|
5,63 × 10-12
|
POZ (227/227)
|
POZ
|
POZ
|
|
2
|
17α-estradiolsa
|
57-91-0
|
POZ
|
7,24 × 10-11
|
6,44 × 10-10
|
POZ
|
1,40 × 10-9
|
POZ (11/11)
|
POZ
|
POZ
|
|
3
|
17α-etinilestradiolsa
|
57-63-6
|
POZ
|
<1,00 × 10-11
|
<1,00 × 10-11
|
POZ
|
7,31 × 10-12
|
POZ (22/22)
|
POZ
|
POZ
|
|
4
|
17β-trenbolons
|
10161-33-8
|
POZ
|
1,78 × 10-8
|
2,73 × 10-7
|
POZ
|
4,20 × 10-8
|
POZ (2/2)
|
NT
|
NT
|
|
5
|
19-nortestosteronsa
|
434-22-0
|
POZ
|
9,64 × 10-9
|
2,71 × 10-7
|
POZ
|
1,80 × 10-6
|
POZ (4/4)
|
POZ
|
POZ
|
|
6
|
4-kumilfenolsa
|
599-64-4
|
POZ
|
1,49 × 10-7
|
1,60 × 10-6
|
POZ
|
3,20 × 10-7
|
POZ (5/5)
|
POZ
|
NT
|
|
7
|
4-terc-oktilfenolsa
|
140-66-9
|
POZ
|
1,85 × 10-9
|
7,37 × 10-8
|
POZ
|
3,19 × 10-8
|
POZ (21/24)
|
POZ
|
POZ
|
|
8
|
Apigenīnsa
|
520-36-5
|
POZ
|
1,31 × 10-7
|
5,71 × 10-7
|
POZ
|
1,60 × 10-6
|
POZ (26/26)
|
POZ
|
NT
|
|
9
|
Atrazīnsa
|
1912-24-9
|
NEG
|
-
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG (30/30)
|
NEG
|
NT
|
|
10
|
Bisfenols Aa
|
80-05-7
|
POZ
|
2,02 × 10-8
|
2,94 × 10-7
|
POZ
|
5,33 × 10-7
|
POZ (65/65)
|
POZ
|
POZ
|
|
11
|
Bisfenols Ba
|
77-40-7
|
POZ
|
2,36 × 10-8
|
2,11 × 10-7
|
POZ
|
1,95 × 10-7
|
POZ (6/6)
|
POZ
|
POZ
|
|
12
|
Butilbenzilftalātsa
|
85-68-7
|
POZ
|
1,14 × 10-6
|
4,11 × 10-6
|
POZ
|
1,98 × 10-6
|
POZ (12/14)
|
POZ
|
NEG
|
|
13
|
Kortikosteronsa
|
50-22-6
|
NEG
|
-
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG (6/6)
|
NEG
|
NT
|
|
14
|
Kumestrolsa
|
479-13-0
|
POZ
|
1,23 × 10-9
|
2,00 × 10-8
|
POZ
|
1,32 × 10-7
|
POZ (30/30)
|
POZ
|
NT
|
|
15
|
Daidzeīnsa
|
486-66-8
|
POZ
|
1,76 × 10-8
|
1,51 × 10-7
|
POZ
|
7,95 × 10-7
|
POZ (39/39)
|
POZ
|
POZ
|
|
16
|
Dietilstilbestrolsa
|
56-53-1
|
POZ
|
<1,00 × 10-11
|
2,04 × 10-11
|
POZ
|
3,34 × 10-11
|
POZ (42/42)
|
POZ
|
NT
|
|
17
|
Di-n-butilftalāts
|
84-74-2
|
POZ
|
4,09 × 10-6
|
|
POZ
|
4,09 × 10-6
|
POZ (6/11)
|
POZ
|
NEG
|
|
18
|
Etilparabēns
|
120-47-8
|
POZ
|
5,00 × 10-6
|
PC50 nav
|
POZ
|
2,48 × 10-5
|
POZ
|
|
NT
|
|
19
|
Estronsa
|
53-16-7
|
POZ
|
3,02 × 10-11
|
5,88 × 10-10
|
POZ
|
2,34 × 10-10
|
POZ (26/28)
|
POZ
|
POZ
|
|
20
|
Genisteīnsa
|
446-72-0
|
POZ
|
2,24 × 10-9
|
2,45 × 10-8
|
POZ
|
2,71 × 10-7
|
POZ (100/102)
|
POZ
|
POZ
|
|
21
|
Haloperidols
|
52-86-8
|
NEG
|
-
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG (2/2)
|
NEG
|
NT
|
|
22
|
Kampferols
|
520-18-3
|
POZ
|
1,36 × 10-7
|
1,21 × 10-6
|
POZ
|
3,99 × 10-6
|
POZ (23/23)
|
POZ
|
NT
|
|
23
|
Keponsa
|
143-50-0
|
POZ
|
7,11 × 10-7
|
7,68 × 10-6
|
POZ
|
4,91 × 10-7
|
POZ (14/18)
|
POZ
|
NT
|
|
24
|
Ketokonazols
|
65277-42-1
|
NEG
|
-
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG (2/2)
|
NEG
|
NT
|
|
25
|
Linuronsa
|
330-55-2
|
NEG
|
-
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG (8/8)
|
NEG
|
NT
|
|
26
|
mezo-heksestrolsa
|
84-16-2
|
POZ
|
<1,00 × 10-11
|
2,75 × 10-11
|
POZ
|
1,65 × 10-11
|
POZ (4/4)
|
POZ
|
NT
|
|
27
|
Metiltestosteronsa
|
58-18-4
|
POZ
|
1,73 × 10-7
|
4,11 × 10-6
|
POZ
|
2,68 × 10-6
|
POZ (5/6)
|
POZ
|
NT
|
|
28
|
Morīns
|
480-16-0
|
POZ
|
5,43 × 10-7
|
4,16 × 10-6
|
POZ
|
2,37 × 10-6
|
POZ (2/2)
|
POZ
|
NT
|
|
29
|
Noretinodrelsa
|
68-23-5
|
POZ
|
1,11 × 10-11
|
1,50 × 10-9
|
POZ
|
9,39 × 10-10
|
POZ (5/5)
|
POZ
|
NT
|
|
30
|
p,p’-metoksihlorsa
|
72-43-5
|
POZ
|
1,23 × 10-6
|
(PC50 nav)b
|
POZ
|
1,92 × 10-6
|
POZ (24/27)
|
POZ
|
POZ
|
|
31
|
Fenobarbitālsa
|
57-30-7
|
NEG
|
-
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG (2/2)
|
NEG
|
NT
|
|
32
|
Rezerpīns
|
50-55-5
|
NEG
|
-
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG (4/4)
|
NEG
|
NT
|
|
33
|
Spironolaktonsa
|
52-01-7
|
NEG
|
-
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG (4/4)
|
NEG
|
NT
|
|
34
|
Testosterons
|
58-22-0
|
POZ
|
2,82 × 10-8
|
9,78 × 10-6
|
POZ
|
1,75 × 10-5
|
POZ (5/10)
|
POZ
|
NT
|
Saīsinājumi: CAS Nr. = Chemical Abstracts Service reģistra numurs M = molārs; EC50 = testējamās vielas 50 % efektīvā koncentrācija; NEG = negatīvs; POZ = pozitīvs; NT = nav testēts; PC10 (un PC50) = testējamās vielas koncentrācija, pie kuras aktivitāte ir 10 % (vai 50 % PC50 gadījumā) no aktivitātes, ko izraisa pozitīvs rezultāts (E2, 1nM) katrā platē.
aIzplatītas vielas, kas testētas STTA un VM7Luc ER TA testos un klasificētas kā ER agonisti vai negatīvi, un izmantotas, lai novērtētu VM7Luc ER TA validācijas pētījuma pareizību ( ICCVAM VM7Luc ER TA Evaluation Report, tabula 4-1 (3)).
bMaksimālā koncentrācija, kas testēta bez ierobežojumiem citotoksicitātes vai nešķīdības dēļ, bija 1 x 10-5 M (STTA) un 1 x 10-3 M (VM7Luc ER TA).
cSkaitļi iekavās norāda pozitīvo (POZ) vai negatīvo (NEG) rezultātu skaitu attiecībā pret kopējo references pētījumu skaitu.
1Vērtības, par kurām ziņots dokumentā “Draft Report of Pre-validation and Inter-laboratory Validation For Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay to Detect Estrogenic Activity - The Human Estrogen Receptor Alpha Mediated Reporter Gene Assay Using hER-HeLa-9903 Cell Line (2)”.
2ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists (3).
3Vidējās EC50 vērtības aprēķinātas, izmantojot vērtības, ko paziņoja laboratroijas, kas iesaistītas VM7Luc ER TA validācijas pētījumā (XDS, ECVAM un Hiyoshi) (3).
4Vielas klasificētas ER agonisti vai negatīvi, pamatojoties uz informāciju dokumentos “ICCVAM Background Review Documents (BRD) for ER Binding and TA test methods” (31), kā arī uz informāciju publikācijās, kas publicētas un recenzētas pēc ICCVAM BRDs (2) (3) (18) (31) (33) (34).
Piezīmes. Pie šīs testēšanas metodes aprakstītajos testos netiek izmantoti tie paši mērījumi. Dažos gadījumos EC50 nav iespējams aprēķināt, jo nav ģenerēta pilna devas-efekta līkne. Lai gan STTA testā galvenais mērījums ir PC10 vērtība, ir iespējami vēl citi gadījumi, kur derīgu informāciju sniedz PCx vērtība.
2. tabula. Salīdzinājums par STTA un VM7Luc ER TA testu rezultātiem attiecībā uz vielām, kas testētas abos antagonista testos un klasificētas kā ES antagonisti (POS) vai kā negatīvi rezultāti (NEG)
|
|
Vielaa
|
CAS Nr.
|
ER STTA tests1
|
VM7Luc ER TA tests2
|
ER STTA
sagaidāmie
rezultāti4
|
ICCVAM 5
saskaņotā klasifikācija
|
MeSH6
ķimikāliju klase
|
Produktu klase7
|
|
|
|
|
ER TA
aktivitāte
|
IC50 vērtībab
(M)
|
ER TA
aktivitāte
|
IC50 vērtībab,3
(M)
|
|
|
|
|
|
1
|
4-hidroksitamoksifēns
|
68047-06-3
|
POZ
|
3,97 × 10-9
|
POZ
|
2,08 × 10-7
|
mēreni POZ
|
POZ
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
2
|
Dibenz[a,h]antracēns
|
53-70-3
|
POZ
|
Nav IC50:
|
POZ
|
Nav IC50:
|
POZ
|
PP
|
Policiklisks savienojums
|
Laboratoriju ķimikālija, dabisks produkts
|
|
3
|
Mifepristons
|
84371-65-3
|
POZ
|
5,61 × 10-6
|
NEG
|
-
|
vāji POZ
|
NEG
|
Steroīds
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
4
|
Raloksifēns HCl
|
82640-04-8
|
POZ
|
7,86 × 10-10
|
POZ
|
1,19 × 10-9
|
mēreni POZ
|
POZ
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
5
|
Tamoksifēns
|
10540-29-1
|
POZ
|
4,91 × 10-7
|
POZ
|
8,17 × 10-7
|
POZ
|
POZ
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
6
|
17β-estradiols
|
50-28-2
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
PN
|
PN
|
Steroīds
|
Farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
7
|
Apigenīns
|
520-36-5
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG
|
NEG
|
Heterociklisks savienojums
|
Krāsviela, dabisks produkts, farmaceitisks starpprodukts
|
|
8
|
Atrazīns
|
1912-24-9
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG
|
PN
|
Heterociklisks savienojums
|
Herbicīds
|
|
9
|
Di-n-butilftalāts
|
84-74-2
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG
|
NEG
|
Esteris, ftalskābe
|
Kosmētikas līdzekļu sastāvdaļa, rūpnieciska ķimikālija, plastifikators
|
|
10
|
Fenarimols
|
60168-88-9
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
nav testēts;
|
PN
|
Heterociklisks savienojums, pirimidīns
|
Fungicīds
|
|
11
|
Flavons
|
525-82-6
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
PN
|
PN
|
Flavonoīds, heterociklisks savienojums
|
Dabisks produkts, farmaceitisks līdzeklis
|
|
12
|
Flutamīds
|
13311-84-7
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
NEG
|
PN
|
Amīds
|
Farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
13
|
Genisteīns
|
446-72-0
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
PN
|
NEG
|
Flavonoīds, heterociklisks savienojums
|
Dabisks produkts, farmaceitisks līdzeklis
|
|
14
|
p-n-nonilfenols
|
104-40-5
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
nav testēts
|
NEG
|
Fenols
|
Ķimikāliju starpprodukts
|
|
15
|
Resveratrols
|
501-36-0
|
NEG
|
-
|
NEG
|
-
|
PN
|
NEG
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Dabisks produkts
|
Saīsinājumi: CAS Nr. = Chemical Abstracts Service reģistra numurs M = molārs; EC50 = testējamās vielas 50 % maksimālā inhibējošā koncentrācija; NEG = negatīvs; PN = pieņem, ka negatīvs; POZ = pozitīvs; PP = pieņem, ka pozitīvs.
aIzplatītas vielas, kas testētas STTA un VM7Luc ER TA testos un klasificētas kā ER antagonisti vai negatīvi, un izmantotas, lai novērtētu VM7Luc ER TA validācijas pētījuma pareizību (2) (3).
bMaksimālā koncentrācija, kas testēta bez ierobežojumiem citotoksicitātes vai nešķīdības dēļ, bija 1 x 10-3 M (STTA) un 1 x 10-5 M (VM7Luc ER TA).
1 The Validation Report of the Stably transfected Transcriptional Activation Assay to Detect ER mediated activity, Part B (2)
2 ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists (3).
3Vidējās IC50 vērtības aprēķinātas, izmantojot vērtības, ko paziņoja laboratorijas, kas iesaistītas VM7Luc ER TA validācijas pētījumā (XDS, ECVAM un Hiyoshi) (3).
4 ER STTA gaidāmā aktivitāte, pamatojoties uz to zināmo ietekmi, kas secināma no CERI vēsturiskajiem datiem par ER receptoru testu un uterotrofisko testu un no informācijas, kas apkopota brīvpieejamā literatūrā (2)
5Vielas klasificētas ER antagonisti vai negatīvi, pamatojoties uz informāciju dokumentos “ICCVAM Background Review Documents (BRD) for ER Binding and TA assays” (31), kā arī uz informāciju publikācijās, kas publicētas un recenzētas pēc ICCVAM BRDs (2) (3) (18) (31).
6 Vielas iedalītas vienā vai vairākās ķimikāliju klasēs, izmantojot ASV Nacionālās medicīnas bibliotēkas priekšmetu klasifikatoru (MeSH), kas ir starptautiski atzīta, standartizēta klasifikācijas sistēma (pieejama http://www.nlm.nih.gov/mesh).
7 Vielas iedalītas vienā vai vairākās ķimikāliju klasēs, izmantojot ASV Nacionālās medicīnas bibliotēkas bīstamo vielu datubāzi (pieejama http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB).
ER TA testa KOMPONENTI
Nepieciešamie testa komponenti
11.Šo testēšanas metodi piemēro testiem, kuros izmanto stabili transficētu vai endogēnisku ERα receptoru un stabili transficētu reportiergēnu konstruktu viena vai vairāku estrogēniskas reakcijas elementu kontrolē; tomēr klātesoši var būt arī citi receptori, piemēram, ERβ. Tie ir nepieciešamie testa komponenti.
Kontroles
12.Apraksta ierosinātos paralēlos references standartus katram agonista un antagonista testam. Paralēlās kontroles (negatīvs, šķīdinātājs, pozitīvs) vajadzības gadījumā kalpo kā indikators, ka tests funkcionē pie testēšanas nosacījumiem, un ļauj savstarpēji salīdzināt eksperimentus; parasti tie ir daļa no konkrētā eksperimenta pieņemamības kritērijiem (1).
Standarta kvalitātes kontroles procedūras
13.Katram testam veic aprakstītās standarta kvalitātes kontroles procedūras, lai nodrošinātu, ka šūnu līnija vairāku pasāžu gaitā saglabājas stabila, nesatur mikoplazmu (t.i., nav kontaminēta ar baktērijām) un saglabā spēju laika gaitā nodrošināt gaidītās ER mediētās reakcijas. Jāpārbauda arī, vai šūnu līnijas identitāte ir pareiza un vai nav citu kontaminantu (piem., sēnīšu, raugu un vīrusu).
Laboratorijas kvalifikācijas pierādīšana
14.Pirms nezināmu ķimikāliju testēšanas ar kādu no šajā testa metodē aprakstītajiem testiem katrai laboratorijai ir jāpierāda sava kompetence testa izmantošanā. Kompetences pierādīšanas labad katra laboratorija testē 14 standartvielas, ko izmanto agonistu testēšanā un kas norādītas 3 tabulā, un 10 standartvielas, ko izmanto antagonistu testēšanā un kas norādītas 4. tabulā. Kompetences pierādīšana arī ļauj pārliecināties par testa sistēmas reaģētspēju. Standartvielu testēšanas saraksts ir daļa no references vielām, kas norādītas ER TA testu veiktspējas standartos (6). Šīs vielas ir komerciāli pieejamas, tās ir reprezentatīvas tādu ķimikāliju klasēm, ko parasti saista ar ER agonistu vai antagonistu aktivitāti, tām ir pienācīgs potences diapazons, kas sagaidāms no ER agonistiem/antagonistiem (t.i., no spēcīga līdz vājam) un tās ietver negatīvas vielas. Standartvielas testē vismaz divas reizes dažādās dienās. Kompetence ir pierādīta, ja katra standartviela tiek pareizi klasificēta (pozitīva/negatīva reakcija). Kompetences testēšanu atkārto katrs laborants, kas apgūst testēšanas metodi. Atkarībā no šūnu tipa dažas standartvielas var izpausties kā SERM, proti, gan kā agonisti, gan kā antagonisti. Tomēr standartvielas 3. un 4. tabulā ir klasificētas pēc to zināmās dominējošās aktivitātes, un tieši pēc tās vadās kompetences izvērtēšanā.
15.Kompetences pierādīšanas un kvalitātes kontroles vajadzīgām katra laboratorija izveido agonistu un antagonistu vēsturisko datubāzi ar šādiem datiem: references standartvielas (piem., 17β-estradiols un tamoksifēns), pozitīvās un negatīvās kontrolķimikālijas un šķīdinātāja kontrole (piem., DMSO). Sākumā datubāzi ģenerē no vismaz 10 neatkarīgām testa izpildes reizēm ar agonistiem (piem., 17β-estradiolu) un 10 neatkarīgām testa izpildes reizēm ar antagonistiem (piem., tamoksifēnu). Lai datubāzi paplašinātu un tādējādi nodrošinātu laboratorijas konsekventu sniegumu un kompetenci biotestu veikšanā, datubāzi papildina ar vēlāku references standartvielu un šķīdinātāja kontroļu analīžu rezultātiem.
3. tabula. Saraksts ar (14) standartvielām, ko izmanto agonistu testā8
|
Nr.7
|
Viela
|
CAS Nr.
|
Sagaidāmā reakcija1
|
STTA tests
|
VM7Luc ER TA tests
|
MeSH ķimikāliju klase5
|
Produktu klase6
|
|
|
|
|
|
PC10 vērtība (M)2
|
PC50 vērtība (M)2
|
Testa koncentrācijas diapazons (M)
|
VM7Luc EC50 vērtība (M)3
|
Augstākā koncentrācija diapazona noteikšanai (M)4
|
|
|
|
14
|
Dietilstilbestrols
|
56-53-1
|
POZ
|
<1,00 × 10-11
|
2,04 × 10-11
|
10-14 – 10-8
|
3,34 × 10-11
|
3,73 × 10-4
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Farmaceitisks līdzeklis, veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
12
|
17α-estradiols
|
57-91-0
|
POZ
|
4,27 × 10-11
|
6,44 × 10-10
|
10-11 – 10-5
|
1,40 × 10-9
|
3,67 × 10-3
|
Steroīds
|
Farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
15
|
mezo-heksestrols
|
84-16-2
|
POZ
|
<1,00 × 10-11
|
2,75 × 10-11
|
10-11 – 10-5
|
1,65 × 10-11
|
3,70 × 10-3
|
Ogļūdeņradis (ciklisks), fenols
|
Farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
11
|
4-terc-oktilfenols
|
140-66-9
|
POZ
|
1,85 × 10-9
|
7,37 × 10-8
|
10-11 – 10-5
|
3,19 × 10-8
|
4,85 × 10-3
|
Fenols
|
Ķimikāliju starpprodukts
|
|
9
|
Genisteīns
|
446-72-0
|
POZ
|
2,24 × 10-9
|
2,45 × 10-8
|
10-11 – 10-5
|
2,71 × 10-7
|
3,70 × 10-4
|
Flavonoīds, heterociklisks savienojums
|
Dabisks produkts, farmaceitisks līdzeklis
|
|
6
|
Bisfenols A
|
80-05-7
|
POZ
|
2,02 × 10-8
|
2,94 × 10-7
|
10-11 – 10-5
|
5,33 × 10-7
|
4,38 × 10-3
|
Fenols
|
Ķimikāliju starpprodukts
|
|
2
|
Kampferols
|
520-18-3
|
POZ
|
1,36 × 10-7
|
1,21 × 10-6
|
10-11 – 10-5
|
3,99 × 10-6
|
3,49 × 10-3
|
Flavonoīds, heterociklisks savienojums
|
Dabisks produkts
|
|
3
|
Butilbenzilftalāts
|
85-68-7
|
POZ
|
1,14 × 10-6
|
4,11 × 10-6
|
10-11 – 10-5
|
1,98 × 10-6
|
3,20 × 10-4
|
Karbonskābe, esteris, ftalskābe
|
Plastifikators, rūpnieciska ķimikālija
|
|
4
|
p,p’- metoksihlors
|
72-43-5
|
POZ
|
1,23 × 10-6
|
-
|
10-11 – 10-5
|
1,92 × 10-6
|
2,89 × 10-3
|
Ogļūdeņradis (halogenēts)
|
Pesticīds, veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
1
|
Etilparabēns
|
120-47-8
|
POZ
|
5,00 × 10-6
|
-
|
10-11 – 10-5
|
2,48 × 10-5
|
6,02 × 10-3
|
Karbonskābe, fenols
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
17
|
Atrazīns
|
1912-24-9
|
NEG
|
-
|
-
|
10-10 – 10-4
|
-
|
4,64 × 10-4
|
Heterociklisks savienojums
|
Herbicīds
|
|
20
|
Spironolaktons
|
52-01-7
|
NEG
|
-
|
-
|
10-11 – 10-5
|
-
|
2,40 × 10-3
|
Laktons, steroīds
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
21
|
Ketokonazols
|
65277-42-1
|
NEG
|
-
|
-
|
10-11 – 10-5
|
-
|
9,41 × 10-5
|
Heterociklisks savienojums
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
22
|
Rezerpīns
|
50-55-5
|
NEG
|
-
|
-
|
10-11 – 10-5
|
-
|
1,64 × 10-3
|
Heterociklisks savienojums, indols
|
Farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
Saīsinājumi: CAS Nr. = Chemical Abstracts Service reģistra numurs EC50 = testējamās vielas 50 % efektīvā koncentrācija; NEG = negatīvs; POZ = pozitīvs;PC10 (un PC50) = testējamās vielas koncentrācija, pie kuras aktivitāte ir 10 % (vai 50 % PC50 gadījumā) no aktivitātes, ko izraisa pozitīvs rezultāts (E2, 1nM) katrā platē.
1Vielas klasificētas kā pozitīvas vai negatīvas ER agonista aspektā, pamatojoties uz informāciju dokumentos “ICCVAM Background Review Documents (BRD) for ER Binding and TA assays” (31), empīriskiem datiem un informāciju publikācijās, kas publicētas un recenzētas pēc ICCVAM BRDs (2) (3) (18) (31) (32) (33) (34).
2Vērtības, par kurām ziņots dokumentā “Draft Report of Pre-validation and Inter-laboratory Validation For Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay to Detect Estrogenic Activity - The Human Estrogen Receptor Alpha Mediated Reporter Gene Assay Using hER-HeLa-9903 Cell Line (30)”.
3Vidējās EC50 vērtības aprēķinātas, izmantojot vērtības, ko paziņoja laboratorijas, kas iesaistītas VM7Luc ER TA validācijas pētījumā (XDS, ECVAM un Hiyoshi) (3).
4Norādītās koncentrācijas atbilst augstākajām testētajām koncentrācijām (diapazona noteikšanas tests) VM7Luc ER TA testa validēšanas gaitā. Ja dažādās laboratorijās koncentrācijas atšķīrās, norādīta augstākā koncentrācija. Sk. tabulu 4-10 dokumentā “ICCVAM Test Method Evaluation Report; The LUMI-Cell®ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals” (3).
5Vielas iedalītas vienā vai vairākās ķimikāliju klasēs, izmantojot ASV Nacionālās medicīnas bibliotēkas priekšmetu klasifikatoru (MeSH), kas ir starptautiski atzīta, standartizēta klasifikācijas sistēma (pieejama ).
6Vielas iedalītas vienā vai vairākās ķimikāliju klasēs, izmantojot ASV Nacionālās medicīnas bibliotēkas bīstamo vielu datubāzi (pieejama
Ja standartviela vairs nav komerciāli pieejama, var izmanot vielu, kurai ir tāda pati klasifikācija un salīdzināma potence, darbības mods un ķīmiskā klase.
4. tabula. Saraksts ar (10) standartvielām, ko izmanto antagonistu testā
|
|
Vielaa
|
CAS Nr.
|
ER STTA tests1
|
VM7Luc ER TA tests2
|
ER STTA1 sagaidāmie rezultāti
|
ICCVAM5
saskaņotā klasifikācija
|
MeSH6
ķimikāliju klase
|
Produktu klase7
|
|
|
|
|
ER TA aktivitāte
|
IC50 (M)
|
Testa koncentrācijas diapazons (M)
|
ER TA aktivitāte
|
IC503 (M)
|
Augstākā koncentrācija diapazona noteikšanai (M)4
|
|
|
|
|
|
1
|
4-hidroksitamoksifēns
|
68047-06-3
|
POZ
|
3,97 × 10-9
|
10-12 – 10-7
|
POZ
|
2,08 × 10-7
|
2,58 × 10-4
|
mēreni POZ
|
POZ
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
2
|
Raloksifēns HCl
|
82640-04-8
|
POZ
|
7,86 × 10-10
|
10-12 – 10-7
|
POZ
|
1,19 × 10-9
|
1,96 × 10-4
|
mēreni POZ
|
POZ
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
3
|
Tamoksifēns
|
10540-29-1
|
POZ
|
4,91 × 10-7
|
10-10 – 10-5
|
POZ
|
8,17 × 10-7
|
2,69 × 10-4
|
POZ
|
POZ
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Farmaceitisks līdzeklis
|
|
4
|
17β-estradiols
|
50-28-2
|
NEG
|
-
|
10-9 – 10-4
|
NEG
|
-
|
3,67 × 10-3
|
potenciāli negatīvs *
|
PN
|
Steroīds
|
Farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
5
|
Apigenīns
|
520-36-5
|
NEG
|
-
|
10-9 – 10-4
|
NEG
|
-
|
3,70 × 10-4
|
NEG
|
NEG
|
Heterociklisks savienojums
|
Krāsviela, dabisks produkts, farmaceitisks starpprodukts
|
|
6
|
Di-n-butilftalāts
|
84-74-2
|
NEG
|
-
|
10-8 – 10-3
|
NEG
|
-
|
3,59 × 10-3
|
NEG
|
NEG
|
Esteris, ftalskābe
|
Kosmētikas līdzekļu sastāvdaļa, rūpnieciska ķimikālija, plastifikators
|
|
7
|
Flavons
|
525-82-6
|
NEG
|
-
|
10-8 – 10-3
|
NEG
|
-
|
4,50 × 10-4
|
potenciāli negatīvs *
|
PN
|
Flavonoīds, heterociklisks savienojums
|
Dabisks produkts, farmaceitisks līdzeklis
|
|
8
|
Genisteīns
|
446-72-0
|
NEG
|
-
|
10-9 – 10-4
|
NEG
|
-
|
3,70 × 10-4
|
potenciāli negatīvs *
|
NEG
|
Flavonoīds, heterociklisks savienojums
|
Dabisks produkts, farmaceitisks līdzeklis
|
|
9
|
p-n-nonilfenols
|
104-40-5
|
NEG
|
-
|
10-9 – 10-4
|
NEG
|
-
|
4,54 × 10-4
|
nav testēts
|
NEG
|
Fenols
|
Ķimikāliju starpprodukts
|
|
10
|
Resveratrols
|
501-36-0
|
NEG
|
-
|
10-8 – 10-3
|
NEG
|
-
|
4,38 × 10-4
|
potenciāli negatīvs *
|
NEG
|
Ogļūdeņradis (ciklisks)
|
Dabisks produkts
|
Saīsinājumi: CAS Nr. = Chemical Abstracts Service reģistra numurs M = molārs; EC50 = testējamās vielas 50 % maksimālā inhibējošā koncentrācija; NEG = negatīvs; PN = pieņem, ka negatīvs; POZ = pozitīvs.
* klasificēts kā negatīvs saskaņā ar literatūras apskatu (2).
aIzplatītas vielas, kas testētas STTA un VM7Luc ER TA testos un klasificētas kā ER antagonisti vai negatīvi, un izmantotas, lai novērtētu VM7Luc ER TA validācijas pētījuma pareizību (2) (3).
1 The Validation Report of the Stably transfected Transcriptional Activation Assay to Detect ER mediated activity, Part B (2)
2 ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists (3).
3Vidējās IC50 vērtības aprēķinātas, izmantojot vērtības, ko paziņoja laboratorijas, kas iesaistītas VM7Luc ER TA validācijas pētījumā (XDS, ECVAM un Hiyoshi) (3).
4Norādītās koncentrācijas atbilst augstākajām testētajām koncentrācijām (diapazona noteikšanas tests) VM7Luc ER TA testa validēšanas gaitā. Ja dažādās laboratorijās koncentrācijas atšķīrās, norādīta augstākā koncentrācija. Sk. tabulu 4-11 dokumentā “ICCVAM Test Method Evaluation Report; The LUMI-Cell®ER (VM7Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals” (3).
5Vielas klasificētas ER antagonisti vai negatīvi, pamatojoties uz informāciju dokumentos “ICCVAM Background Review Documents (BRD) for ER Binding and test methods” (31), kā arī uz informāciju publikācijās, kas publicētas un recenzētas pēc ICCVAM BRDs (2) (3) (18) (31).
6 Vielas iedalītas vienā vai vairākās ķimikāliju klasēs, izmantojot ASV Nacionālās medicīnas bibliotēkas priekšmetu klasifikatoru (MeSH), kas ir starptautiski atzīta, standartizēta klasifikācijas sistēma (pieejama http://www.nlm.nih.gov/mesh).
7 Vielas iedalītas vienā vai vairākās ķimikāliju klasēs, izmantojot ASV Nacionālās medicīnas bibliotēkas bīstamo vielu datubāzi (pieejama http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?HSDB).
Testa pieņemamības kritēriji
16.Testa pieņemšana vai noraidīšana ir atkarīga no rezultātiem, kas iegūti ar katrā eksperimentā izmantotajiem references standartiem un kontrolēm. References standartvielu vērtībām PC50 (EC50) vai IC50 būtu jāatbilst pieņemamības kritērijiem, kas paredzēti izvēlētajam testam (par STTA sk. 2. papildinājumu, par VM7Luc ER TA sk. 3. papildinājumu), un visas pozitīvās/negatīvās kontroles būtu pareizi jāklasificē attiecībā uz katru eksperimentu, kas atzīts par pieņemamu. Laboratorija savu spēju pastāvīgi veikt testu pierāda, izveidojot un uzturot datubāzi, kurā apkopoti references standartvielu un kontroļu vēsturiskie rezultāti (sk. 15. punktu). Kā pasākumu, ar ko nodrošina reproducējamību laboratorijas robežās, var izmantot references standartu līknes piemeklēšanas parametru vidējo vērtību standartnovirzes (SN) vai variācijas koeficientus (VK), kas iegūti daudzos eksperimentos. Bez tam attiecībā uz pieņemamības kritērijiem ir jāievēro šādi principi.
-Datiem jābūt pietiekamiem, lai varētu kvantitatīvi novērtēt ER aktivāciju (agonistu testā) vai inhibīciju (antagonistu testā) (t.i., efektivitāti un potenci).
-Lai garantētu adekvātu jutību, marķiera vidējai aktivitātei pie references estrogēna references koncentrācijas jābūt vismaz testēšanas metodes paredzētajai minimālajai aktivitātei attiecībā pret nesēja (šķīdinātāja) kontroles marķiera vidējo vērtību. Testos STTA un VM7Luc ER TA šī minimālā vērtība ir četras reizes lielāka par nesēja kontroles vidējo vērtību katrā platē.
-Testētajām koncentrācijām jāsaglabājas testa ķimikāliju šķīdības diapazonā un tās nedrīkst būt citotoksiskas.
Datu analīze
17.Lai noteiktu, vai reakcija ir pozitīva vai negatīva, izmanto katram testam definēto datu interpretēšanas procedūru.
18.Ja ir izpildīti pieņemamības kritēriji (16. punkts), tas nozīmē, ka tests darbojas pareizi, tomēr tas negarantē, ka konkrētajā izpildes reizē tiks iegūti pareizi dati. Labākais pierādījums iegūto datu pareizībai ir pirmās izpildes reizes rezultātu replicēšana. Ja divās izpildes reizēs tiek iegūti reproducējami rezultāti (piem., rezultāti abās izpildes reizēs liecina, ka testa ķimikālija ir pozitīva), nav nepieciešams testu izpildīt vēl trešo reizi.
19.Ja divās izpildes reizēs netiek netiek iegūti reproducējami rezultāti (piem., testa ķimikālija ir pozitīva vienā izpildes reizē, bet negatīva otrā) vai ka ir nepieciešama lielāka pārliecība par šā testa iznākumu, vajadzīgas vismaz trīs neatkarīgas izpildes reizes. Tādā gadījumā klasifikācijas pamatā ir divi sakritīgie rezultāti no trim.
Vispārīgie datu interpretācijas kritēriji
20.Pašlaik nav vispārpieņemtas metodes, kā interpretēt ER TA datus. Tomēr gan kvalitatīvajos (piem., pozitīvs/negatīvs), gan kvantitatīvajos (piem., EC50, PC50, IC50) ER mediētās aktivitātes novērtējumos ir jābalstās uz empīriskiem datiem un pamatotiem zinātniskiem spriedumiem. Ja iespējams, pozitīvie rezultāti jāraksturo gan ar ietekmes intensitāti salīdzinājumā ar nesēja (šķīdinātāja) kontroli vai references estrogēnu, gan ar koncentrāciju, pie kuras novērojama ietekme (piem., EC50, PC50, RPCMax, IC50 u.c.).
Testēšanas pārskats
21.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Tests:
-izmantotais tests,
-kontrole/ references standarts/ testējamā ķimikālija,
-avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams,
-pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināma,
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā, ja tā zināma,
-(attiecīgā gadījumā) pH, osmolalitātes un izgulsnēšanās mērījums kultūras barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota.
Vienkomponenta viela.
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības,
-ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.
Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:
-iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
Šķīdinātājs/nesējs:
-raksturojums (iedaba, piegādātājs un sērija),
-šķīdinātāja/nesēja izvēles pamatojums,
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja tā zināma.
Šūnas:
-šūnu tips un avots:
·Vai ER ir endogēniski ekspresēts? Ja nē, tad kuri receptori tikuši transficēti?
·Izmantotie reportiergēnu konstrukti (t.sk. avotsugas);
·Transfekcijas metode;
·Atlases metode, ko izmanto stabilas transfekcijas uzturēšanai (attiecīgā gadījumā);
·Vai transfekcijas metode ļauj iegūt stabilas līnijas?
-šūnu pasāžu skaits (pēc atkausēšanas);
-šūnu pasāžu skaits (atkausēšanas brīdī);
-šūnu kultūru audzēšanas metodes.
Testēšanas nosacījumi:
-šķīdības ierobežojumi;
-apraksts par izmantotajām dzīvotspējas novērtēšanas metodēm;
-barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija;
-testējamās ķimikālijas koncentrācija;
-pievienotā nesēja un testējamās ķimikālijas tilpums;
-inkubācijas temperatūra un mitrums;
-apstrādes ilgums;
-šūnu blīvums apstrādes sākumā un gaitā;
-pozitīvie un negatīvie references standarti;
-marķierreaģenti (produkta nosaukums, piegādātājs, sērija);
-kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testa rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs.
Pieņemamības pārbaude
-indukcija kārtās katrā testa platē un tas, vai tiek izpildīts testā vajadzīgais minimums, pamatojoties uz vēsturiskajiem datiem par kontrolēm;
-pieņemamības kritēriju faktiskās vērtības, piem., log10EC50, log10PC50, logIC50 un Hilla virziena koeficienta vērtības attiecībā uz testā paralēli iekļautajām pozitīvajām kontrolēm/references standartiem.
Rezultāti:
-jēldati un normalizēti dati;
-maksimālais vairākkāršās indukcijas līmenis;
-dati par citotoksicitāti;
-zemākā iedarbīgā koncentrācija (LEC), ja tāda ir;
-attiecīgā gadījumā — RPCMax, PCMax, PC50, IC50 un/vai EC50 vērtības;
-ja iespējams, koncentrācijas–atbildreakcijas sakarība,
-statistiskās analīzes (ja tādas ir), kā arī kļūdas un ticamības mērs (piem., SEM, SN, VK vai 95% CI) un apraksts par to, kā šīs vērtības iegūtas.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(2)OECD (2015). Report of the Inter-Laboratory Validation for Stably Transfected Transactivation Assay to detect Estrogenic and Anti-estrogenic Activity. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 225), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(3)ICCVAM (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method, an In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists, National Institute of Environmental Health Sciences: Research Triangle Park, NC.
(4)Pujol P. et al. (1998). Differential Expression of Estrogen Receptor-Alpha and -Beta Messenger RNAs as a Potential Marker of Ovarian Carcinogenesis, Cancer. Res., 58(23): p. 5367-73.
(5)Rogers J.M. and Denison M.S. (2000). Recombinant Cell Bioassays for Endocrine Disruptors: Development of a Stably Transfected Human Ovarian Cell Line for the Detection of Estrogenic and Anti-Estrogenic Chemicals, In Vitro and Molecular Toxicology: Journal of Basic and Applied Research, 13(1): p. 67-82.
(6)OECD (2012). Performance Standards For Stably Transfected Transactivation In Vitro Assay to Detect Estrogen Receptor Agonists (for TG 455). Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 173.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(7)OECD (2015). Performance Standards For Stably Transfected Transactivation In Vitro Assay to Detect Estrogen Receptor Antagonists. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 174.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(8)OECD (2012). Guidance Document on Standardized Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(9)Cavailles V. (2002). Estrogens and Receptors: an Evolving Concept. Climacteric, 5 Suppl 2: p. 20- 6.
(10)Welboren W.J. et al. (2009). Genomic Actions of Estrogen Receptor Alpha: What are the Targets and how are they Regulated? Endocr. Relat. Cancer, 16(4): p. 1073-89.
(11)Younes M. and Honma N. (2011). Estrogen Receptor Beta, Arch. Pathol. Lab. Med., 135(1): p. 63- 6.
(12)Jefferson W.N., et al. (2002). Assessing Estrogenic Activity of Phytochemicals Using Transcriptional Activation and Immature Mouse Uterotrophic Responses, Journal of Chromatography B, 777(1-2): p. 179-189.
(13)Sonneveld E. et al. (2006). Comparison of In Vitro and In Vivo Screening Models for Androgenic and Estrogenic Activities, Toxicol. Sci., 89(1): p. 173-187.
(14)Takeyoshi M. et al. (2002). The Efficacy of Endocrine Disruptor Screening Tests in Detecting Anti- Estrogenic Effects Downstream of Receptor-Ligand Interactions, Toxicology Letters, 126(2): p. 91- 98.
(15)Combes R.D. (2000). Endocrine Disruptors: a Critical Review of In Vitro and In Vivo Testing Strategies for Assessing their Toxic Hazard to Humans, ATLA Alternatives to Laboratory Animals,28(1): p. 81-118.
(16)Escande A. et al. (2006). Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta, Biochem. Pharmacol,71(10): p. 1459-69.
(17)Gray L.E. Jr. (1998). Tiered Screening and Testing Strategy for Xenoestrogens and Antiandrogens, Toxicol. Lett, 102-103, 677-680.
(18)EDSTAC (1998). Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee (EDSTAC) Final Report.
(19)ICCVAM (2003). ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays.
(20)Gustafsson J.Ö. (1999). Estrogen Receptor ß - A New Dimension in Estrogen Mechanism of Action, Journal of Endocrinology, 163(3): p. 379-383.
(21)Ogawa S. et al. (1998). The Complete Primary Structure of Human Estrogen Receptor ß (hERß) and its Heterodimerization with ERIn Vivo and In Vitro, Biochemical and Biophysical Research Communications, 243(1): p. 122-126.
(22)Enmark E. et al. (1997). Human Estrogen Receptor ß-Gene Structure, Chromosomal Localization, and Expression Pattern, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,82(12): p. 4258-4265.
(23)Ball L.J. et al. (2009). Cell Type- and Estrogen Receptor-Subtype Specific Regulation of Selective Estrogen Receptor Modulator Regulatory Elements, Molecular and Cellular Endocrinology, 299(2): p. 204-211.
(24)Barkhem T. et al. (1998). Differential Response of Estrogen Receptor Alpha and Estrogen Receptor Beta to Partial Estrogen Agonists/Antagonists, Mol. Pharmacol, 54(1): p. 105-12.
(25)Deroo B.J. and Buensuceso A.V. (2010). Minireview: Estrogen Receptor-ß: Mechanistic Insights from Recent Studies, Molecular Endocrinology, 24(9): p. 1703-1714.
(26)Harris D.M. et al. (2005). Phytoestrogens Induce Differential Estrogen Receptor Alpha- or Beta- Mediated Responses in Transfected Breast Cancer Cells, Experimental Biology and Medicine, 230(8): p. 558-568.
(27)Anderson J.N. Clark J.H. and Peck E.J.Jr. (1972). The Relationship Between Nuclear Receptor- Estrogen Binding and Uterotrophic Responses, Biochemical and Biophysical Research Communications, 48(6): p. 1460-1468.
(28)Toft D. (1972). The Interaction of Uterine Estrogen Receptors with DNA, Journal of Steroid Biochemistry, 3(3): p. 515-522.
(29)Gorski J. et al. (1968), Hormone Receptors: Studies on the Interaction of Estrogen with the Uterus, Recent Progress in Hormone Research, 24: p. 45-80.
(30)Jensen E.V. et al. (1967), Estrogen-Receptor Interactions in Target Tissues, Archives d'Anatomie Microscopique et de Morphologie Experimentale, 56(3):p. 547-569.
(31)ICCVAM (2002). Background Review Document: Estrogen Receptor Transcriptional Activation (TA) Assay. Appendix D, Substances Tested in the ER TA Assay, NIH Publication Report (No 03-4505.).
(32)Kanno J. et al. (2001). The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay to Screen Compounds for In Vivo Estrogenic Responses: Phase 1, Environ. Health Persp., 109:785-94.
(33)Kanno J. et al. (2003). The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay: Phase Two Dose -Response Studies, Environ. Health Persp., 111:1530-1549.
(34)Kanno J. et al. (2003), The OECD Program to Validate the Rat Uterotrophic Bioassay: Phase Two – Coded Single-Dose Studies, Environ. Health Persp., 111:1550-1558.
(35)Geisinger et al. (1989) Characterization of a human ovarian carcinoma cell line with estrogen and progesterone receptors, Cancer 63, 280-288.
(36)Baldwin et al. (1998) BG-1 ovarian cell line: an alternative model for examining estrogen-dependent growth in vitro, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, 34, 649-654.
(37)Li, Y. et al. (2014) Research resource: STR DNA profile and gene expression comparisons of human BG-1 cells and a BG-1/MCF-7 clonal variant, Mol. Endo. 28, 2072-2081.
(38)Rogers, J.M. and Denison, M.S. (2000) Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors: development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenic and anti-estrogenic chemicals, In Vitro & Molec. Toxicol. 13, 67-82.
1. papildinājums
Definīcijas un saīsinājumi
Pieņemamības kritēriji: minimālie standarti, kas attiecas uz eksperimenta kontrolēm un references standartiem. Lai eksperimentu uzskatītu par derīgu, visiem pieņemamības kritērijiem jābūt izpildītiem.
Pareizība (konkordantums): pakāpe, kādā testa rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testa veiktspējas raksturlielums un viens no tā relevantuma aspektiem. Ar šo terminu, tāpat kā terminu “konkordantums”, bieži vien saprot testa pareizo iznākumu īpatsvaru (1).
Agonists: viela, kas piesaistē konkrētam receptoram rada reakciju, piemēram, transkripciju.
Antagonists: tāda veida receptora ligands vai ķimikālija, kas piesaistē receptoram pats(-i) par sevi neizraisa bioloģisku reakciju, bet gan bloķē vai mīkstina agonista mediētas reakcijas.
Antiestrogēniska aktivitāte: ķimikālijas spēja nomākt 17β-estradiola aktivitāti, ko mediē estrogēnu receptori.
Šūnu morfoloģija: tādu šūnu forma un izskats, kas monoslānī audzētas audu kultūras plates vienā iedobē. Mirstošām šūnām bieži novērojama anormāla šūnu morfoloģija.
KS: ESAO konceptuālais satvars (KS) endokrīnās sistēmas traucējumus izraisošu ķimikāliju testēšanai un novērtēšanai.
Apstrāde ar ogli/dekstrānu: šūnu kultūrā izmantota seruma apstrāde. Apstrāde ar ogli/dekstrānu (bieži vien to sauc arī par “stripingu”) likvidē endogēniskos hormonus un hormonus piesaistošus proteīnus.
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Citotoksicitāte: kaitīga ietekme uz šūnas struktūru vai funkcionalitāti, kas galu galā var novest pie šūnas nāves; to var atspoguļot šūnu skaita samazinājums iedobē ekspozīcijas perioda beigās vai šūnu funkcijas kapacitātes samazinājums salīdzinājumā ar paralēlo nesēja kontroli.
VK: variācijas koeficients.
DCC-FBS: liellopu embriju serums, kas apstrādāts ar dekstrāna pārklātu ogli.
DMEM: Dulbeko modificētā Īgla barotne.
DMSO: dimetilsulfoksīds.
E2: 17β-estradiols.
EC50: testējamās ķimikālijas 50 % efektīvā koncentrācija.
ED: endokrīnās sistēmas darbības traucējumi.
hERα: cilvēka estrogēnu receptors alfa
hERß: cilvēka estrogēnu receptors beta
EFM: bezestrogēna barotne. Dulbeko modificētā Īgla barotne (DMEM), kas papildināta ar 4,5 % DCC-FBS, 1,9 % L-glutamīnu un 0,9 % penicilīna un streptomicīna maisījumu.
ER: estrogēna receptors
ERE: estrogēna atbildreakcijas elements
Estrogēniska aktivitāte: ķimikālijas spēja imitēt 17β-estradiolu, proti, piesaistīties estrogēnu receptoriem un aktivēt tos. Ar šo testēšanas metodi var konstatēt hERα mediētu estrogēnisku aktivitāti.
ERTA: estrogēna receptora transaktivācija
FBS: liellopu embriju serums
HeLa: nemirstīga cilvēka dzemdes kakla šūnu līnija
HeLa9903: HeLa šūnu apakšklons, kurā stabili transficēts hER un luciferāzes reportiergēns
IC50: testējamās inhibējošās ķimikālijas 50 % iedarbīgā koncentrācija.
ICCVAM: Alternatīvo metožu validēšanas koordinēšanas starpaģentūru komiteja.
Starplaboratoriju reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vairākas kvalificētas laboratorijas spēj iegūt kvalitatīvi un kvantitatīvi līdzīgus rezultātus, ja tās izmanto vienu un to pašu protokolu un vienas un tās pašas testējamās vielas. Starplaboratoriju reproducējamību (saukta arī par interlaboratoriju reproducējamību) nosaka prevalidēšanas un validēšanas procesā, un šis lielums rāda, cik lielā mērā testēšanu vienlīdz sekmīgi iespējams veikt dažādās laboratorijās (1).
Iekšlaboratorijas reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vienā laboratorijā strādājoši kvalificēti darbinieki spēj sekmīgi atkārtot iepriekš iegūtus rezultātus, ja to pašu protokolu izmanto citā laikā. Saukts arī par intralaboratoriju reproducējamību (1).
LEC: zemākā iedarbīgā koncentrācija, t.i., zemākā koncentrācija, kurā testējamā ķīmikālija izraisa reakciju (t.i., testa ķimikālijas zemākā koncentrācija, pie kuras indukcija kārtās ir statistiski atšķirīga no paralēlās nesēja kontroles).
Atdarinājuma tests: sadzīvisks apzīmējums testam, kas ir noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgs validētai un pieņemtai testēšanas references metodei. Brīvi aizstājama ar līdzīgu testēšanas metodi.
MT: metalotionīns
MMTV: peļu piena dziedzeru audzēja vīruss
OHT: 4-hidroksitamoksifēns
PBTG: veiktspējā balstītas testēšanas vadlīnijas
(PC) Pozitīvā kontrole: ļoti aktīva viela — vēlams, 17ß-estradiols —, ko iekļauj visos testos un kas palīdz garantēt testa pienācīgu funkcionēšanu.
PC10: testējamās ķimikālijas koncentrācija, pie kuras izmērītā aktivitāte agonista testā ir 10 % no maksimālās aktivitātes, ko inducē PC (testā STTA — E2 pie 1nM) katrā iedobē.
PC50: testējamās ķimikālijas koncentrācija, pie kuras izmērītā aktivitāte agonista testā ir 50 % no maksimālās aktivitātes, ko inducē PC (E2 pie testēšanas metodē norādītās references koncentrācijas) katrā iedobē.
PCMax: testējamās ķimikālijas koncentrēšana, kas inducē RPCMax
Veiktspējas standarti: uz validēta testa bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē pēc noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testu salīdzināmību. Tie ietver 1) nepieciešamos testa komponentus; 2) minimālo tādu references ķimikāliju sarakstu, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; kā arī 3) uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — salīdzināmi pareizības un ticamības līmeņi, kā būtu jāiegūst ar ierosināto testu, to izvērtējot ar references ķimikālijām no minimālā saraksta (1).
Standartvielas: veiktspējas standartos iekļauto references vielu apakškopa, ko laboratorijas var izmantot, lai pierādītu savu tehnisko kompetenci ar standartizētu testēšanas metodi. Šādu vielu atlases kritēriji parasti ir, piemēram šādi: viela ir reprezentatīva dažādām reakcijām, ir komerciāli pieejama un un par to pie pieejami ļoti kvalitatīvi references dati.
Kompetence: vēl pirms nezināmu vielu testēšanas pierādīta spēja testu pienācīgi veikt.
References estrogēns (pozitīvā kontrole, PC): 17β-estradiols (E2, CAS 50-28-2).
References standarts: references viela, ko izmanto, lai pierādītu testa piemērotību. Testos STTA un VM7Luc ER TA references standarts ir 17β-estradiols.
References testēšanas metodes: testi, uz kuriem balstās PBTG 455.
Relevantums: parametrs, kas raksturo testa attiecināmību uz interesējošo ietekmi un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Tā ir pakāpe, kādā ar testu var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testa pareizības (konkordantuma) aspektu (1).
Ticamība: parametrs, kas izsaka, kādā pakāpē vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās pēc vienu un tā paša protokola var ilgstoši reproducējami veikt konkrētu testu. To novērtē, aprēķinot reproducējamību vienā laboratorijā un vairākās laboratorijās.
RLU: relatīvās gaismas vienības
RNS: ribonukleīnskābe
RPCMax: testējamās ķimikālijas inducētās atbildreakcijas maksimālais līmenis, ko izsaka kā procentus no 1nM, E2 inducētās atbildreakcijas tajā pašā platē.
RPMI: RPMI 1640 barotne, kas papildināta ar 0,9% penicilīna un streptomicīna maisījumu un 8,0% liellopu embriju serumu (FBS).
Izpildes reize: atsevišķs eksperiments, kurā izvērtē ķīmisko iedarbību uz testa bioloģisko iznākumu. Katra izpildes reize ir pilns eksperiments, ko izdara replikāta iedobēs vienlaikus un ar šūnām no tā paša šūnu krājuma.
Neatkarīga izpildes reize: atsevišķs, neatkarīgs eksperiments, kurā izvērtē ķīmisko iedarbību uz testa bioloģisko iznākumu; izmanto šūnas no dažādiem krājumiem, svaigi atšķaidītas ķimikālijas un testu izdara vai nu dažādās dienās, vai tajā pašā dienā dažādi laboranti.
SN: standartnovirze
Jutība: tas, cik liela daļa no visām pozitīvajām/aktīvajām vielām ar testu tiek klasificētas pareizi. Tas ir tāda testa pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testa relevantuma izvērtēšanā (1).
Specifiskums: tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām vielām ar testu tiek klasificētas pareizi. Tas ir tāda testa pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testa relevantuma izvērtēšanā (1).
Stabila transfekcija: norise, kuras laikā DNS tiek transficēta kultivētajās šūnās tādā veidā, ka tiek stabili integrēta šūnas genomā, kā rezultātā ir iespējama transficēto gēnu stabila ekspresija. Stabili transficētu šūnu klonus atlasa ar stabiliem marķieriem (piem., pretestība G418).
Tests STTA: stabili transficētas transaktivācijas tests, ERα transkripcionālās aktivācijas tests, izmantojot šūnu līniju HeLa 9903.
Pētījums: visi eksperimentālā darba posmi, kas izpildīti, lai specifiskā testā izvērtētu vienu atsevišķu, specifisku vielu. Pētījumā ietilpst visi eksperimenta posmi, tostarp testējamās vielas atšķaidīšana testa barotnē, provizoriskie diapazona noteikšanas testi, visi nepieciešamie visaptverošie testi, datu analīze, kvalitātes nodrošināšana, citotoksicitātes novērtēšana utt. Pētījuma pabeigšana ļauj klasificēt, kā testējamā ķimikālija iespaido testā novērtēto toksiskumu (t.i., aktīva, neaktīva, neviennozīmīga), un raksturot atbildreakciju attiecībā pret pozitīvo references ķimikāliju.
Viela: REACH regulā viela definēta kā ķīmisks elements un tā dabiski vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, tostarp tās stabilizācijai vajadzīgās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušies piejaukumi, kas nav šķīdinātāji, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu. Ļoti līdzīga definīcija tiek izmantota ANO GHS (1).
TA (transaktivācija): mRNS sintēzes iniciēšana kā atbildreakcija uz specifisku ķīmisko signālu, piemēram, estrogēna piesaisti estrogēna receptoram.
Tests: šīs testēšanas metodes kontekstā tests ir viena no metodikām, kas atzīta par derīgu, proti, kas izpilda norādītos veiktspējas kritērijus. Testa komponenti ir, piemēram, specifiska šūnu līnija un attiecīgie augšanas apstākļi, specifiska barotne, kurā veic testu, plašu sagatavošanas nosacījumi, testējamo ķimikāliju sagatavošana un atšķaidīšana, kā arī visi citi vajadzīgie kvalitātes kontroles pasākumi un saistītie datu izvērtēšanas posmi.
Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, kuru testē, izmantojot šo testēšanas metodi.
Transkripcija mRNS sintēze
UVCB: ķīmiskas vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti un bioloģiski materiāli.
Validēta testēšanas metode: tests, kura relevantums (ieskaitot pareizību) un ticamība attiecībā uz lietošanu konkrētā nolūkā ir pārbaudīta validācijas pētījumos. Jāievēro, ka validētas testēšanas metodes veiktspēja pareizības un ticamības ziņā var nebūt pietiekama, lai to izmantotu paredzētajam nolūkam (1).
Validācija: Process, kurā nosaka, kādā mērā konkrēta pieeja, metode, tests, process vai novērtējums ir ticams un relevants konkrētajam nolūkam (1).
VC (nesēja kontrole): šķīdinātāju, kurā izšķīdina testējamās un kontroles ķimikālijas, testē tikai kā nesēju bez izšķīdinātas ķimikālijas.
VM7: nemirstīga adenokarcinomas šūna, kas endogēniski ekspresē estrogēnu receptorus.
VM7Luc4E2: Šūnu līnija VM7Luc4E2 atvasināta no VM7 nemirstīgām cilvēka adenokarcinomas šūnām, kas spēj endogēniski ekspresēt abas estrogēnu receptoru formas (ERα and ERβ) un ir stabili transficētas ar plazmīdu pGudLuc7.ERE. Plazmīds satur četras kopijas no sintezēta oligonukleotīda, kas satur estrogēna atbildreakcijas elementu virs MMTV promotera un jāņtārpiņa luciferāzes gēnu.
Vāji pozitīvā kontrole: vāji aktīva viela, kas izvēlēta no references ķimikāliju saraksta; to iekļauj visos testos un tā palīdz garantēt testa pienācīgu funkcionēšanu.
2. papildinājums
Stabili transficētas cilvēka estrogēnu receptoru α transaktivācijas tests, kurā nosaka ķimikāliju agonistu un antagonistu estrogēnisko aktivitāti, izmantojot šūnu līniju hERα-HeLa-9903
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
1.Šajā transaktivācijas (TA) testā šūnu līniju hERα-HeLa-9903 izmanto, lai noteiktu estrogēnisku agonista aktivitāti, ko mediē cilvēku estrogēnu receptors alfa (hERα). Japānas Ķimikāliju izvērtēšanas un izpētes institūta (CERI) veiktajā stabili transficētas transaktivācijas (STTA) validācijas pētījumā, kurā šūnu līniju ERα-HeLa-9903 izmantoja, lai noteiktu estrogēnisku agonista un antagonista aktivitāti, ko mediē cilvēku estrogēnu receptors alfa (hERα), pierādījās, ka tests ir ticams un relevants konkrētajam nolūkam (1).
2.Šis tests ir īpaši paredzēts hERα-mediētas TA noteikšanai, par mērījuma parametru izmantojot hemiluminiscenci. Tomēr pie tādām fitoestrogēnu koncentrācijām, kas pārsniedz 1 μM, ir novēroti receptoru nemediēti luminiscences signāli, ko izraisa luciferāzes reportiergēna pārmērīga aktivācija. Lai gan devas-efekta līkne liecina, ka patiesa ER sistēmas aktivācija notiek pie zemākām koncentrācijām, ir lietderīgi rūpīgi izpētīt tādu luciferāzes ekspresiju stabili transficētās ER TA testu sistēmās (1. papildinājums), ko iegūst pie augstām fitoestrogēnu koncentrācijām vai tādu savienojumu koncentrācijām, par kuriem ir aizdomas, ka tie līdzīgi kā fitoestrogēni izraisa luciferāzes reportiergēna pārmērīgu aktivāciju.
3.Pirms šā testa izmantošanas regulatīviem mērķiem ir jāizlasa sadaļas “VISPĀRĪGAIS IEVADS” un “ER TA testa KOMPONENTI”. Šajā testēšanas vadlīnijā izmantotās definīcijas un saīsinājumi ir aprakstīti 2.1. papildinājumā.
TESTA PRINCIPS (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
4.Testu izmanto, lai signalizētu, ka estrogēnu receptors ir piesaistījies ligandam. Pēc liganda piesaistes receptora-liganda komplekss translocējas uz kodolu, kur tas piesaistās specifiskiem DNS reakcijas elementiem un transaktivē jāņtārpiņa luciferāzes reportiergēnu, kā rezultātā palielinās luciferāzes fermenta ekspresija šūnās. Luciferīns ir substrāts, kuru luciferāzes enzīms pārveido bioluminiscējošā produktā, ko var kvantitatīvi izmērīt ar luminometru. Luciferāzes aktivitāti var ātri un lēti izvērtēt ar vairākiem komerciāli pieejamiem testa komplektiem.
5.Testa sistēmā izmanto šūnu līniju hERα-HeLa-9903, kas iegūta no cilvēka dzemdes kakla audzēja un kam ir divi stabili insertēti konstrukti: i) hER ekspersijas konstrukts (kura cilvēka receptors iekodēts pilnībā) un ii) jāņtārpiņa luciferāzes reportiergēna konstrukts, kam ir pieci vitelogenīna estrogēna atbildreakcijas elementa (ERE) tandēmie atkārtojumi, ko regulē peļu metalotionīna (MT) promoters ar TATA elementu. Peļu MT TATA gēna konstrukts līdz šim izrādījies visrezultatīvākais, tāpēc tieši to parasti izmanto. Tāpēc šī šūnu līnija hERα-HeLa-9903 ļauj izmērīt testējamās ķimikālijas spēju inducēt luciferāzes gēna ekspresijas hERα mediētu transaktivāciju.
6.ER agonista testā datu interpretācijas pamatā ir tas, vai testējamās ķimikālijas inducētais maksimālais abildreakcijas līmenis ir vienāds ar vai lielāks par agonista atbildreakciju, kas ir vienāda ar 10 % no atbildreakcijas, ko izraisa koncentrācija, kura inducē pozitīvās kontroles (PC) (17β-estradiols (E2)) maksimālo atbildreakciju (1 nM) (t.i., . the PK10). ER antagonista testā datu interpretācijas pamatā ir tas, vai atbildreakcija parāda vismaz 30 % aktivitātes samazinājumu salīdzinājumā ar atbildreakciju, ko inducē ar kontroles pastiprinājumu (25 pM, E2), neizraisot citotoksicitāti. Datu analīze un interpretācija sīkāk iztirzāta 34.–48. punktā.
PROCEDŪRA
Šūnu līnijas
7.Testam izmanto stabili transficēto šūnu līniju hERα-HeLa-9903. Šūnu līniju var iegūt no Japānas Pētniecības bioresursu kolekcijas (JCRB) šūnu bankas, parakstot materiālu nodošanas līgumu.
8.Testēšanā izmanto tikai tādas šūnas, kas nesatur mikoplazmu. Vislabākā un jutīgākā metode, kā noteikt inficēšanos ar mikoplazmu, ir RT-PCR (polimerāzes ķēdes reakcija reāllaikā) (4) (5) (6).
Šūnu līnijas stabilitāte
9.Lai kontrolētu šūnu līnijas stabilitāti, agonista testā par references standartu izmanto E2, 17α-estradiolu, 17α-metiltestosteronu un kortikosteronu; tāpat vismaz vienu reizi testa veikšanas laikā mēra visu koncentrācijas–atbildreakcijas līkni pie 1. tabulā norādītajām testa koncentrācijām, un iegūtajiem rezultātiem jābūt saskanīgiem ar 1. tabulā norādītajiem rezultātiem.
10.Antagonista testā vienlaikus paralēli katrai testa izpildes reizei mēra arī divu references standartu — tamoksifēna un flutamīda — pilnas koncentrācijas līknes. Pārliecinās, vai abu ķimikāliju kvalitatīvā klasifikācija (pozitīvs vai negatīvs) ir pareiza.
Šūnu kultivēšanas un uzsēšanas apstākļi
11.Šūnas uztur fenolsarkano nesaturošā Īgla minimālajā barotnē (EMEM), kas papildināta ar 60 mg/l antibiotiku (kanamicīnu) un 10 % liellopu embriju serumu, kurš apstrādāts ar dekstrāna pārklātu ogli (DCC-FBS), CO2 inkubatorā (5 % CO2) 37±1˚C temperatūrā. Kad sasniegta 75 -90 % konfluence, šūnas var sadalīt 10 ml subkultūrās, kas satur 0,4 x 105 – 1 x 105 šūnas/ml, kultivēšanas trauciņos, kuru diametrs ir100 mm. Šūnas suspendē 10 % FBS-EMEM barotnē (kas ir līdzvērtīga EMEM un DCC-FBS barotnei) un tad uzsēj mikroplates iedobēs tā, lai blīvums būtu 1 x 104 šūnas/(100 μl x iedobe). Tad pirms eksponēšanas ķimikālijai šūnas 3 stundas preinkubē 5% CO2 inkubatorā 37˚±1˚C temperatūrā. Plastmasas materiālos nedrīkst notikt nekāda estrogēniska aktivitāte.
12.Lai saglabātu reakcijas integritāti, šūnas audzē vairākās pasāžās no sasaldēta krājuma kondicionētā barotnē, un pasāžu skaits nedrīkst pārsniegt 40. Attiecībā uz šūnu līniju hERα-HeLa-9903 tas būs mazāk par trim mēnešiem. Tomēr, ja šūnas audzē nepienācīgos kultivēšanas apstākļos, šūnu sniegums var pasliktināties.
13.DCC-FBS var vai nu sagatavot tā, kā aprakstīts 2.2. papildinājumā, vai iegūt no komerciāliem avotiem.
Pieņemamības kritēriji
Pozitīvi un negatīvi references standarti ER agonistu testā
14.Pirms pētījuma un tā laikā ir jāverificē testa sistēmas reaģētspēja,, izmantojot stipru estrogēnu (E2), vāju estrogēnu (17α-estradiolu), ļoti vāju agonistu (17α-metiltestosteronu) un negatīvu vielu (kortikosteronu) piemērotā koncentrācijā. 1. tabulā sniegts pieņemamo vērtību diapazons, kas sagatavots validācijas pētījuma (1) gaitā. Šos 4 paralēlos references standartus iekļauj katrā eksperimentā, un rezultātiem jāietilpst dotajās pieņemamajās robežās. Ja tā nav, tad jānoskaidro, kāpēc pieņemamības kritēriji nav izpildīti (iemesli var būt, piem., manipulācijas ar šūnām vai seruma un antibiotiku kvalitāte un koncentrācija), un tests jāatkārto. Ja pieņemamības kritēriji ir izpildīti, tad ļoti svarīga ir šūnu kultivēšanas materiālu konsekventa izmantošana, lai nodrošinātu minimālu EC50, PC50 un PC10 vērtību mainību. Četri paralēlie references standarti, kas jāiekļauj katrā eksperimentā (ko veic identiskos apstākļos, tostarp ar tādiem pašiem materiāliem, šūnu pasāžas līmeni un laborantiem), var nodrošināt testa jutību, jo pieņemamā diapazonā jābūt gan trīs pozitīvo references standartu PC10, gan PC50 un EC50 vērtībām, ja tās var aprēķināt (sk. 1. tabulu).
1. tabula. ER agonista testa četru references standartu pieņemamo vērtību diapazons
|
Nosaukums
|
logPC50
|
logPC10
|
logEC50
|
Hilla virziena koeficients
|
Testa diapazons
|
|
17β-estradiols (E2)
CAS Nr.: 50-28-2
|
-11,4~-10,1
|
<-11
|
-11,3~-10,1
|
0,7~1,5
|
10-14~10-8M
|
|
17α-estradiols
CAS Nr.: 57-91-0
|
-9,6~-8,1
|
-10,7~-9,3
|
-9,6~-8,4
|
0,9~2,0
|
10-12~10-6M
|
|
Kortikosterons
CAS Nr.: 50-22-6
|
–
|
–
|
–
|
–
|
10-10~10-4M
|
|
17α-metiltestosterons
CAS Nr.: 58-18-4
|
-6,0~-5,1
|
-8,0~-6,2
|
–
|
–
|
10-11~10-5M
|
Pozitīvi un negatīvi references standarti ER antagonistu testā
15.Pirms pētījuma un tā laikā ir jāverificē testa sistēmas reaģētspēja, izmantojot pozitīvu vielu (tamoksifēns) un negatīvu vielu (flutamīds) piemērotā koncentrācijā. 2. tabulā sniegts pieņemamo vērtību diapazons, kas sagatavots validācijas pētījuma (1) gaitā. Šos divus paralēlos references standartus iekļauj katrā eksperimentā, un rezultāti, kā norādīts kritērijos, būtu jānovērtē par pareiziem. Ja tā nav, tad jānoskaidro, kāpēc kritēriji nav izpildīti (iemesli var būt, piem., manipulācijas ar šūnām vai seruma un antibiotiku kvalitāte un koncentrācija), un tests jāatkārto. Bez tam jāaprēķina arī pozitīvās vielas (tamoksifēna) IC50 vērtības, un rezultātiem ir jāietilpst dotajās pieņemamības robežās. Ja pieņemamības kritēriji ir izpildīti, tad ļoti svarīga ir šūnu kultivēšanas materiālu konsekventa izmantošana, lai nodrošinātu minimālu IC50 vērtību mainību. Divi paralēlie references standarti, kas jāiekļauj katrā eksperimentā (ko veic identiskos apstākļos, tostarp ar tādiem pašiem materiāliem, šūnu pasāžas līmeni un laborantiem), var nodrošināt testa jutību (sk. 2. tabulu).
2. tabula. ER antagonista testa divu references standartu pieņemamo vērtību diapazons
|
Nosaukums
|
Kritēriji
|
LogIC50
|
Testa diapazons
|
|
Tamoksifēns
CAS Nr.: 10540-29-1
|
Pozitīva:
jāaprēķina IC50
|
-5,942～-7,596
|
10-10～10-5M
|
|
Flutamīds
CAS Nr.: 13311-84-7
|
Negatīva:
nav jāaprēķina IC30
|
-
|
10-10 ～10-5M
|
Pozitīvās kontroles un nesēja kontroles
16.ER agonista testa (1 nM, E2) un ER antagonista testa (10μM TAM) pozitīvās kontrole (PC) katrā platē jātestē vismaz trīskārši. Nesēju, kurā izšķīdina testējamo ķimikāliju, testē kā nesēja kontroli (VC) katrā platē vismaz trīskārši. Papildus šai VC, ja PC izmanto citu nesēju, nevis testējamo ķimikāliju, šī cita nesēja kontrole ir jātestē vismaz trīskārši tajā pašā platē kopā ar PC.
ER agonista testa kvalitātes kritēriji
17.Pozitīvās kontroles (1 nM, E2) vidējai luciferāzes aktivitātei jābūt vismaz 4 reizes lielākai par vidējo VC katrā platē. Šis kritērijs izvēlēts, pamatojoties uz novērtēšanas parametru uzticamību validācijas pētījumā (vēsturiski 4 līdz 30 reizes).
18.Kas attiecas uz testa kvalitātes kontroli, indukcijas palielinājums, kas atbilst paralēlās pozitīvās kontroles (1 nM, E2) PC10 vērtībai, par 1+2SN pārsniedz paralēlās nesēja kontroles indukcijas vērtību (=1). PC10 vērtības var izrādīties nozīmīgas prioritizēšanas vajadzībām, proti, lai vienkāršotu vajadzīgo datu analīzi salīdzinājumā ar statistisko analīzi. Statistiskā analīze sniedz informāciju par nozīmību, tomēr tā tā nav kvantitatīvs parametrs attiecībā uz koncentrācijas potenciālu, tāpēc tas prioritizēšanā ir mazāk noderīgs.
ER antagonista testa kvalitātes kritēriji
19.Pastiprinātās kontroles (25 nM, E2) vidējai luciferāzes aktivitātei jābūt vismaz 4 reizes lielākai par vidējo VC katrā platē. Šis kritērijs izvēlēts, pamatojoties uz novērtēšanas parametru uzticamību validācijas pētījumā.
20.Kas attiecas uz testa kvalitātes kontroli, 1 nM, E2 relatīvajai transkripcionālai aktivācijai (RTA) jābūt lielākai par 100%, RTA 1μM 4-hidroksitamoksifēna (OHT) RTA jābūt mazākai par 40,6% un 100 μM digitonīna (Dig) RTA jābūt mazākai par 0%.
Laboratorijas kvalifikācijas pierādīšana (sk. 14. punktu un 3. un 4. tabulu sadaļā “ER TA TESTA KOMPONENTI”).
Nesējs
21.Par paralēlo VC izmanto dimetilsulfoksīdu (DMSO) vai piemērotu šķīdinātāju tādā pašā koncentrācijā, kādu izmanto pozitīvajām un negatīvajām kontrolēm un testējamām ķimikālijām. Testa ķimikālijas izšķīdina tādā šķīdinātājā, kurā attiecīgā testējamā ķimikālija šķīst un kurš ir sajaucams ar šūnu barotni. Piemēroti nesēji ir ūdens, etanols (tīrība 95 -100 %) un DMSO. Ja izmanto DMSO, tā saturs nedrīkst pārsniegt 0,1 % (tilp/.tilp.). Par katru nesēju ir jāpierāda, ka maksimālais izmantotais tilpums nav citotoksisks un neietekmē testa veikšanu.
Testējamo ķimikāliju sagatavošana
22.Parasti testējamās ķimikālijas izšķīdina DMSO vai citā piemērotā šķīdinātājā; iegūto šķīdumu pēc tam vairākkārt atšķaida ar to pašu šķīdinātāju attiecībā 1:10, un iegūto atšķaidījumu izmanto atšķaidīšanai ar barotni.
Šķīdība un citotoksicitāte Apsvērumi par diapazona noteikšanu
23.Ir jāveic sākotnējais tests, lai noteiktu katras testējamās ķimikālijas koncentrācijas diapazonu un noteiktu, vai testējamā ķimikālija varētu uzrādīt kādas šķīdības vai citotoksicitātes problēmas. Sākumā ķimikālijas testē līdz maksimālajai koncentrācijai 1 μl/ml, 1 mg/ml vai 1 mM, atkarībā no tā, kura ir viszemākā. Pamatojoties uz sākotnējā testā novēroto citotoksicitāti vai nešķīdību, pirmajā galīgā testa izpildes reizē ķimikāliju testē sērijveida logaritmiskos atšķaidījumos, sākot ar augstāko pieņemamo koncentrāciju (piem., 1 mM, 100µM, 10µM utt.), un vēro, kad šķīdums kļūst duļķains vai rada nogulsnes. Koncentrācijas otrajā un, ja vajadzīgs, trešajā izpildes reizē pēc vajadzības pielāgo nolūkā labāk raksturot koncentrācijas-atbildreakcijas līkni un izvairīties no koncentrācijām, pie kurām ķimikālija izrādījusies nešķīstoša vai pārmērīgu citotoksicitāti izraisoša.
24.Kas attiecas uz ER agonistiem un antagonistiem, datus interpretējot, ņem vērā to, ka pieaugošs citotoksicitātes līmenis var mainīt vai izslēgt tipisku sigmoidālu atbildreakciju. Jāizmanto tādas citotoksicitātes testēšanas metodes, kas var sniegt informāciju par 80 % šūnu dzīvotspēju, izmantojot piemērotu, laboratorijā apstiprinātu testu.
25.Ja citotoksicitātes testa rezultāti liecina, ka testējamās ķimikālijas koncentrācija ir šūnu skaitu samazinājusi par 20 % vai vairāk, šī koncentrācija ir uzskatāma par citotoksisku, un visas koncentrācijas, kas ir vienādas ar vai lielākas par šo robežvērtību, no novērtējuma izslēdz.
Eksponēšana ķimikālijai un izkārtojums testa platē
26.Ķimikāliju atšķaidīšanās (1. un 2. etaps) un šūnu eksponēšanas (3. etaps) procedūra var būt šāda.
1. etaps. Katru testa ķimikāliju seriāli atšķaida DMSO vai piemērotā šķīdinātājā un ievieto mikrotitrēšanas plates iedobēs tā, lai sasniegtu tādas galīgās seriālās koncentrācijas, kādas noteiktas sākotnējā diapazona noteikšanas testā (parasti, piemēram, šādās sērijās: 1 mM, 100 µM, 10 µM, 1µM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, and 10 pM (10-3-10-11 M)) trīskāršai testēšanai.
2. etaps. Ķimikāliju atšķaidīšana: Vispirms 1,5 µl testējamās ķimikālijas atšķaida ar šķīdinātāju, lai iegūtu barotnes tilpumu 500 µl.
3. etaps. Šūnu ķīmiskā ekspozīcija: 50 µl no 2. etapā sagatavotā atšķaidījuma ievieto testa iedobē, kas satur 104 šūnas/100 µl/iedobē.
Ieteicamais galīgais barotnes tilpums katrā iedobē ir 150 µl. Testa paraugu un references standartu sadalījums var būt tāds, kāds redzams 3. un 4. tabulā.
3. tabula. References standartu koncentrāciju sadalījums ER agonista testa platē
|
Rinda
|
17α-metiltestosterons
|
Kortikosterons
|
17α-estradiols
|
E2
|
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
konc. 1 (10 µM)
|
→
|
→
|
100 µM
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
|
B
|
konc. 2 (1 µM)
|
→
|
→
|
10 µM
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
|
C
|
konc. 3 (100 nM)
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
|
D
|
konc. 4 (10 nM)
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
10 pM
|
→
|
→
|
|
E
|
konc. 5 (1 nM)
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
1 pM
|
→
|
→
|
|
F
|
konc. 6 (100 pM)
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
10 pM
|
→
|
→
|
0,1 pM
|
→
|
→
|
|
G
|
konc. 7 (10 pM)
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
1 pM
|
→
|
→
|
0,01 pM
|
→
|
→
|
|
H
|
VC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
PC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
27.References standartus (E2, 17α-estradiols, 17Katrā testa platē iekļauj arī iedobes, kas satur PC, kura apstrādāta ar 1 nM no E2 un spēj izraisīt maksimālu E2 inducēšanu, un iedobes, kas satur VC, kura apstrādāta tikai ar DMSO (vai piemērotu šķīdinātāju (4. tabula). Ja vienā eksperimentā izmanto šūnas no dažādiem avotiem (piem., atšķirīgs pasāžu skaits vai atšķirīgas partijas utt.), tad references standartus testē ar katru šūnu avotu.
4. tabula. Testējamo ķimikāliju un plates kontroles ķimikāliju koncentrāciju sadalījums ER agonista testa platē
|
Rinda
|
Testējamā ķimikālija 1
|
Testējamā ķimikālija 2
|
Testējamā ķimikālija 3
|
Testējamā ķimikālija 4
|
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
konc. 1 (10 µM)
|
→
|
→
|
1 mM
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
|
B
|
konc. 2 (1 µM)
|
→
|
→
|
100 µM
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
|
C
|
konc. 3 (100 nM)
|
→
|
→
|
10 µM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
|
D
|
konc. 4 (10 nM)
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
10 pM
|
→
|
→
|
|
E
|
konc. 5 (1 nM)
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
1 pM
|
→
|
→
|
|
F
|
konc. 6 (100 pM)
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
10 pM
|
→
|
→
|
0,1 pM
|
→
|
→
|
|
G
|
konc. 7 (10 pM)
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
1 pM
|
→
|
→
|
0,01 pM
|
→
|
→
|
|
H
|
VC
|
|
→
|
→
|
→
|
|
→
|
→
|
PC
|
|
→
|
→
|
→
|
|
→
|
→
|
5. tabula. References standartu koncentrāciju sadalījums ER antagonista testa platē
|
Rinda
|
Tamoksifēns
|
Flutamīds
|
Testējamā ķimikālija 1
|
Testējamā ķimikālija 2
|
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
konc. 1 (10 µM)
|
→
|
→
|
10 µM
|
→
|
→
|
10 µM
|
→
|
→
|
10 µM
|
→
|
→
|
|
B
|
konc. 2 (1 µM)
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
|
C
|
konc. 3 (100 nM)
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
|
D
|
konc. 4 (10 nM)
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
|
E
|
konc. 5 (1 nM)
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
|
F
|
konc. 6 (100 pM)
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
|
G
|
0,1% DMSO
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
1 µM OHT
|
→
|
→
|
100 µM Dig
|
→
|
→
|
|
H
|
VC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
PC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
|
VC: nesēja kontrole (0,1% DMSO); PC: pozitīvā kontrole (1 nM, E2), OHT :4-hidroksitamoksifēns, Dig: digitonīns.
|
|
|
|
= pastiprināts ar 25pM, E2
|
28.Lai novērtētu ķimikāliju antagonistisko aktivitāti, iedobēs, kas atrodas A līdz G rindā, pievieno 25pM, E2. References standartus (tamoksifēns un flutamīds) testē katrā izpildes reizē. Katrā testa platē iekļauj arī iedobes ar PC, kas apstrādātas ar 1 nM, E2 un ko var izmantot par šūnu līnijas hERα-HeLa-9903 kvalitātes kontroli, iedobes ar VC, kas apstrādātas ar DMSO (vai piemērotu šķīdinātāju), iedobes ar 0,1% DMSO, kas apstrādātas ar DMSO, kurš pievienots E2 pastiprinātajai koncentrācijai, kas atbilst “pastiprinātajai kontrolei”, iedobes ar 1 µM OHT galīgajā koncentrācijā un iedobes ar 100 µM Dig (5. tabula). Pārējās testa platēs izkārtojums ir tāds pats, taču netiek iekļautas references standartu iedobes (6. tabula). Ja vienā eksperimentā izmanto šūnas no dažādiem avotiem (piem., atšķirīgs pasāžu skaits vai atšķirīgas partijas utt.), tad references standartus testē ar katru šūnu avotu.
6. tabula. Testējamo ķimikāliju un plates kontroles ķimikāliju koncentrāciju sadalījums ER antagonista testa platē
|
Rinda
|
Testējamā ķimikālija 1
|
Testējamā ķimikālija 2
|
Testējamā ķimikālija 3
|
Testējamā ķimikālija 4
|
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
konc. 1 (10 µM)
|
→
|
→
|
10 µM
|
→
|
→
|
10 µM
|
→
|
→
|
10 µM
|
→
|
→
|
|
B
|
konc. 2 (1 µM)
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
1 µM
|
→
|
→
|
|
C
|
konc. 3 (100 nM)
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
100 nM
|
→
|
→
|
|
D
|
konc. 4 (10 nM)
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
10 nM
|
→
|
→
|
|
E
|
konc. 5 (1 nM)
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
1 nM
|
→
|
→
|
|
F
|
konc. 6 (100 pM)
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
100 pM
|
→
|
→
|
|
G
|
0,1% DMSO
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
1 µM OHT
|
→
|
→
|
100 µM Dig
|
→
|
→
|
|
H
|
VC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
PC
|
→
|
→
|
→
|
→
|
→
|
|
VC: nesēja kontrole (0,1% DMSO); PC: pozitīvā kontrole (1 nM, E2); OHT: 4-hidroksitamoksifēns, Dig: digitonīns
|
|
|
|
: pastiprināts ar 25pM, E2
|
|
|
|
|
|
|
|
|
29.Pienācīgi jāpārliecinās, ka nav nekādu malas efektu; ja ir aizdomas, ka malas efekti varētu rasties, izkārtojums platē ir jāmaina, lai tos novērstu, piemēram, malās esošās iedobes var atstāt tukšas.
30.Pēc ķimikāliju pievienošanas testa plates 20-24 h inkubē 5% CO2 inkubatorā 37±1ºC temperatūrā, lai inducētu reportiergēnu produktu veidošanos.
31.Īpaša uzmanība jāpievērš sevišķi gaistošiem savienojumiem. Tādos gadījumos tuvumā esošās kontroliedobes var dot pseidopozitīvus rezultātus, un tie būtu jāsalīdzina ar gaidītajām un vēsturiskajām kontrolvērtībām. Nedaudzajos gadījumos, kad gaistamība var izrādīties problemātiska, ieteicams izmantot iedobju aizlīmes, kas ļauj testēšanas laikā efektīvi izolēt atsevišķas iedobes.
32.Lai nodrošinātu rezultātu neatkarību, galīgos testus ar to pašu ķimikāliju atkārto dažādās dienās.
Luciferāzes tests
33.Šajā testā var izmantot tirdzniecībā pieejamus luciferāzes testa reaģentus [piem., luciferāzes testa sistēmu Steady-Glo® (Promega, E2510 vai līdzvērtīgs)] vai standarta luciferāzes testa sistēmu (Promega, E1500 vai līdzvērtīgs), ar nosacījumu, ka tiek izpildīti pieņemamības kritēriji. Testa reaģentus izvēlās atkarībā no izmantojamā luminometra jutības. Ja izmanto standarta luciferāzes testa sistēmu, pirms substrāta pievienošanas izmanto šūnu kultūras līzes reaģentu (piem., Promega, E1531 vai līdzvērtīgs). Luciferāzes reaģentu lieto saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
DATU ANALĪZE
ER agonista tests
34.ER agonista testa gadījumā relatīvo transkripcionālo aktivitāti attiecībā pret PC (1 nM, E2) iegūst, analizējot luminiscences signālus tajā pašā platē šādos etapos (ir pieņemamas arī līdzvērtīgas matemātiskās darbības):
1. etaps. Aprēķina VC vidējo vērtību.
2. etaps. Datu normalizācijas nolūkā šo VC vidējo vērtību atskaita no vērtības, kas iegūta attiecībā uz katru iedobi.
3. etaps. Aprēķina normalizētās PC vidējo vērtību.
4. etaps. Plates katras iedobes normalizēto vērtību dala ar normalizētās PC vidējo vērtību (PC=100 %).
Attiecībā uz karu iedobi iegūtā vērtība atbilst šīs iedobes transkripcionālajai aktivitātei salīdzinājumā ar PC atbildreakciju.
5. etaps. Aprēķina testējamās ķimikālijas katras koncentrāciju grupas relatīvās transkripcionālās aktivitātes vidējo vērtību. Iegūtais rezultāts liecina par vidējo transkripcionālo aktivitāti (atbildreakcija) un par to, pie kādas koncentrācijas šī atbildreakcija tiek inducēta (sk. nākamo sadaļu).
EC50, PC50 un PC10 inducēšanas noteikšana
35.Lai aprēķinātu EC50, ir vajadzīga pilnīga koncentrācijas-atbildreakcijas līkne, tomēr tas ne vienmēr ir iespējami vai lietderīgi, jo var pastāvēt zināmi koncentrācijas diapazona ierobežojumi (piemēram, citotoksicitātes vai šķīdības problēmu dēļ). Tomēr, tā kā EC50 un maksimālais inducēšanas līmenis (kas atbilst Hilla vienādojuma maksimālajai vērtībai) ir informatīvi parametri, tie parametri pēc iespējas būtu jānorāda. EC50 un maksimālā inducēšanas līmeņa aprēķinā jāizmanto piemērota statistiskā programmatūra (piem., Graphpad Prism).Ja datiem par koncentrāciju un atbildreakciju ir piemērojams Hilla logistiskais vienādojums, EC50 aprēķina ar šādu vienādojumu(7):
Y= bāzes punkts+ (virsotnes punkts- bāzes punkts) / (1+10 exp ((log EC50 -X) x Hilla virziena koeficients)) kur:
X ir koncentrācijas logaritms; un
Y ir reakcija; to mēra no sigmoidālās līknes bāzes līdz virsotnei. Hilla logistiskajā vienādojumā bāzes punkts ir nulle.
36.Par katru testējamo ķimikāliju sniedz šādus datus:
RPCMax , kas ir testa ķimikālijas inducētās atbildreakcijas maksimālais līmenis un ko izsaka procentos no 1 nM, E2 inducētās atbildreakcijas rajā pašā platē, kā arī PCMax (koncentrācija, kas atbilst RPCMax); un
ja ķimikālijas ir pozitīvas — koncentrācijas, kas inducē PC10 un attiecīgā gadījumā PC50.
37.PCx vērtību var aprēķināt, interpolējot starp 2 punktiem uz X-Y līknes, no kuriem viens atrodas uzreiz virs, bet otrs uzreiz zem PCx vērtības. Ja datu punktiem, kas atrodas uzreiz virs un uzreiz zem PCx vērtības, ir koordinātas attiecīgi (a,b) un (c,d), tad PCx vērtību var aprēķināt ar šādu vienādojumu:
log[PCx] = log[c]+(x-d)/(d-b)
38.PC vērtību apraksts sniegts 1. attēlā.
1. attēls. PC vērtību atvasināšanas piemērs. PC (1 nM, E2) ir katrā testa platē
ER antagonista tests
39.ER antagonista testa gadījumā relatīvo transkripcionālo aktivitāti (RTA) attiecībā pret pastiprināto kontroli (25 pM, E2) iegūst, analizējot luminiscences signālus tajā pašā platē šādos etapos (ir pieņemamas arī līdzvērtīgas matemātiskās darbības):
1. etaps. Aprēķina VC vidējo vērtību.
2. etaps. Datu normalizācijas nolūkā šo VC vidējo vērtību atskaita no vērtības, kas iegūta attiecībā uz katru iedobi. 3. etaps. Aprēķina normalizētās pastiprinātās kontroles vidējo vērtību.
4. etaps. Plates katras iedobes normalizēto vērtību dala ar normalizētās pastiprinātās kontroles vidējo vērtību (pastiprinātā kontrole=100 %).
Attiecībā uz karu iedobi iegūtā vērtība atbilst šīs iedobes transkripcionālajai aktivitātei salīdzinājumā ar pastiprinātās kontroles atbildreakciju.
5. etaps. Aprēķina katras koncentrāciju grupas relatīvās transkripcionālās aktivitātes vidējo vērtību.
IC30 and IC50 inducēšanas noteikšana
40.Ja ķimikālijas ir pozitīvas — koncentrācijas, kas inducē IC30 un attiecīgā gadījumā IC50.
41.ICx vērtību var aprēķināt, interpolējot starp 2 punktiem uz X-Y līknes, no kuriem viens atrodas uzreiz virs, bet otrs uzreiz zem ICx vērtības. Ja datu punktiem, kas atrodas uzreiz virs un uzreiz zem ICx vērtības, ir koordinātas attiecīgi (c,d) un (a,b), tad ICx vērtību var aprēķināt ar šādu vienādojumu:
lin ICx = a-(b-(100-x)) (a-c) /(b-d)
2. attēls. IC vērtību atvasināšanas piemērs. Pastiprinātā kontrole (25 pM, E2) ir katrā testa platē
RTA: relatīvā transkripcionālā aktivitāte
42.Rezultātu pamatā ir divas (vai trīs) neatkarīgas izpildes reizes. Ja divās izpildes reizēs tiek iegūti salīdzināmi un līdz ar to reproducējami rezultāti, nav nepieciešams testu izpildīt vēl trešo reizi. Rezultāti ir pieņemami, ja tie:
-atbilst pieņemamības kritērijiem (sk. sadaļu “Pieņemamības kritēriji”, 14.-20. punkts),
-ir reproducējami.
Datu interpretācijas kritēriji
7. tabula. Pozitīvu un negatīvu rezultātu interpretācijas kritēriji ER agonistu testā
|
Pozitīvs
|
Ja ir iegūta tāda RPCMax vērtība, kas ir vienāda ar vai lielāka par 10 % no pozitīvās kontroles atbildreakcijas vismaz divās no divām vai divās no trijām izpildes reizēm.
|
|
Negatīvs
|
Ja RPCMax vērtība nesasniedz vismaz 10 % no pozitīvās kontroles atbildreakcijas vismaz divās no divām vai divās no trijām izpildes reizēm.
|
8. tabula. Pozitīvu un negatīvu rezultātu interpretācijas kritēriji ER antagonistu testā
|
Pozitīvs
|
Ja IC30 ir aprēķināta vismaz divās no divām vai divās no trijām izpildes reizēm.
|
|
Negatīvs
|
Ja IC30 nav aprēķināta divās no divām vai divās no trijām izpildes reizēm.
|
43.Datu interpretācijas kritēriji ir redzami 7. un 8. tabulā. Pozitīvos rezultātus raksturo gan ietekmes intensitāte, gan koncentrācija, pie kuras novērojama ietekme Šo divējādo mērķi iespējams sasniegt, ja rezultātus izsaka kā koncentrāciju, pie kuras agonista testā sasniedz 50 % (PC50) vai 10 % (PC10) no PC vērtībām un antagonista testā 50 % (IC50) vai 30% (IC30) no pastiprinātās kontroles vērtībām tiek inhibētas. Testējamo ķimikāliju uzskata par pozitīvu, ka testējamās ķimikālijas inducētā maksimālā atbildreakcija (RPCMax) ir vienāda ar vai lielāka par 10 % no PC atbildreakcijas vismaz divās no divām vai divās no trijām izpildes reizēm, un par negatīvu, ja RPCMax nesasniedz vismaz 10 % no pozitīvās kontroles atbildreakcijas vismaz divās no divām vai divās no trijām izpildes reizēm.
44.PC10, PC50 un PCMax ER agonista testā un IC30 un IC50 ER antagonista testā var aprēķināt, izmantojot izklājlapu, kas pieejama kopā ar šīm testēšanas vadlīnijām ESAO publiskajā vietnē.
45.PC10 vai PC50 un IC30 vai IC50 vērtību noteikšanai ir pietiekami testu atkārtot divreiz. Tomēr, ja datu bāzlīnija tajā pašā koncentrāciju diapazonā uzrāda pārlieku augstu variācijas koeficientu (VK, %), šos datus nevar uzskatīt par ticamiem un ir jānoskaidro šādu variāciju iemesls. To triplicēto jēldatu (t.i., luminiscences intensitātes datu) variācijas koeficientam, kurus izmanto kā datu punktus PC10 aprēķinā, ir jābūt mazākam par 20 %.
46.Ja ir izpildīti pieņemamības kritēriji, tas nozīmē, ka testa sistēma darbojas pareizi, tomēr tas negarantē, ka konkrētajā izpildes reizē tiks iegūti pareizi dati. Labākais pierādījums iegūto datu pareizībai ir pirmās izpildes reizes rezultātu duplicēšana.
47.ER agonista testa gadījumā, kur ir nepieciešama plašāka informācija papildus tai, kas vajadzīga šajās vadlīnijās paredzētajam skrīningam un prioritizēšanai attiecībā uz pozitīvām testējamām ķimikālijām, jo īpaši PC10-PC49 ķimikālijām, kā arī ķimikālijām, par kurām ir aizdomas, ka tās varētu pārlieku stimulēt luciferāzi, apstiprinājumu tam, ka novērotā luciferāzes aktivitāte ir tikai ERα specifiska atbildreakcija, var gūt, izmantojot ERα antagonistu (sk. 2.1. papildinājumu).
TESTĒŠANAS PĀRSKATS
48.Sk. 20. punktu sadaļā “ER TA TESTA KOMPONENTI”.
LITERATŪRA
(1)OECD (2015). Report of the Inter-Laboratory Validation for Stably Transfected Transactivation Assay to detect Estrogenic and Anti-estrogenic Activity. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 225), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(2)Escande A., et al. (2006). Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta, Biochem. Pharmacol., 71, 1459-1469.
(3)Kuiper G.G., et al. (1998). Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor Beta, Endocrinol., 139, 4252-4263.
(4)Spaepen M., et al. (1992). Detection of Bacterial and Mycoplasma Contamination in Cell Cultures by Polymerase Chain Reaction, FEMS Microbiol. Lett., 78(1), 89-94.
(5)Kobayashi H., et al. (1995). Rapid Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Cultures by Enzymatic Detection of Polymerase Chain Reaction (PCR) Products, J. Vet. Med. Sci., 57(4), 769- 71.
(6)Dussurget O. and Roulland-Dussoix D. (1994). Rapid, Sensitive PCR-Based Detection of Mycoplasmas in Simulated Samples of Animal Sera, Appl. Environ. Microbiol., 60(3), 953-9.
(7)De Lean A., Munson P.J. and Rodbard D. (1978). Simultaneous Analysis of Families of Sigmoidal Curves: Application to Bioassay, Radioligand Assay, and Physiological Dose-Response Curves, Am. J. Physiol., 235, E97-El02.
2.1. papildinājums
Pseidopozitīvi rezultāti: novērtējums par receptoru nemediētiem luminiscences signāliem
1.ER agonista testā pseidopozitīvus rezultātus var dot vai nu ER nemediēta luciferāzes gēna aktivācija, vai gēna produkta tieša aktivācija, vai nesaistīta fluorescence. Par šādu efektu liecina nepilnīga vai neparasta devas-atbildreakcijas līkne. Ja rodas šādas aizdomas, izvērtē, kāda ietekme uz atbildreakciju ir ER antagonistam (piem., 4-hidroksitamoksifēnam (OHT)) netoksiskās koncentrācijās. Šim nolūkam var nebūt derīgs tīrais antagonists ICI 182780 , jo pienācīga ICI 182780 koncentrācija var samazināt VK vērtību, bet tas savukārt ietekmē datu analīzi.
2.Lai garantētu šādas pieejas derīgumu, tajā pašā platē jātestē šādi elementi:
-nezināmās ķimikālijas agonistiskā aktivitāte ar OHT (10 µM) un bez tā;
-VK (trīsreiz)
-OHT (trīsreiz)
-1 nM, E2 (trīsreiz) kā agonista PC
-1 nM, E2 + OHT (trīsreiz)
Datu interpretācijas kritēriji
Piezīme. Visās iedobēs nesējs ir tādā pašā koncentrācijā.
-Ja nezināmās ķimikālijas agonistisko aktivitāti NEIETEKMĒ apstrāde ar ER antagonistu, rezultātu uzskata par “negatīvu”.
-Ja nezināmās ķimikālijas agonistiskā aktivitāti ir pilnībā inhibēta, piemēro interpretācijas kritērijus.
-Ja agonistiskā aktivitāte pie zemākās koncentrācijas ir vienāda a vai lielāka par PC10 , nezināmās ķimikālijas atbildreakcija ir inhibēta tādā pašā vai lielākā mērā kā PC10 atbildreakcija. Aprēķina starpību starp atbildreakcijām ar ER antagonistu apstrādātās un neapstrādātās iedobēs; šo starpību uzskata par patieso atbildreakciju un izmanto, lai aprēķinātu parametrus, kas nepieciešami ķimikālijas klasificēšanai.
Datu analīze
Pārbauda veiktspējas standartu.
Pārbauda VK starp iedobēm, kas apstrādātas vienādos apstākļos.
1.Aprēķina VK vidējo vērtību.
2.Šo VK vidējo vērtību atskaita no katras ar OHT neapstrādātās iedobes vērtības.
3.Aprēķina OHT vidējo vērtību.
4.Šo VK vidējo vērtību atskaita no katras ar OHT apstrādātās iedobes vērtības.
5.Aprēķina PC vidējo vērtību.
6.Aprēķina visu pārējo iedobju relatīvo transkripcionālo aktivitāti attiecībā pret PC.
2.2. papildinājums
Ar DCC (ar dekstrānu pārklāta ogle) apstrādāta seruma sagatavošana
1.Seruma apstrādāšana ar DCC (ar dekstrānu pārklāta ogle) plaši izmantots paņēmiens, kā no seruma atdalīt šūnu barotnei pievienotos estrogēniskos savienojumus, lai izslēgtu, ka atbildreakcija ir nobīdījusies, jo serumā ir estrogēnu atliekas. Ar šo paņēmienu var apstrādāt 500 ml liellopu embriju seruma.
Sastāvdaļas
2.Nepieciešamie materiāli un aprīkojums
Materiāli
Aktīvā ogle
Dekstrāns
Magnija hlorīda heksahidrāts (MgCl2 6H2O)
Saharoze
1 M HEPES buferšķīdums (pH 7,4)
Filtrācijas ceļā iegūts ultratīrs ūdens
Aprīkojums
Autoklāvēts stikla trauks (izmēru attiecīgi pielāgo) Parastā laboratorijas centrifūga (temperatūru iespējams iestatīt uz 4°C)
Procedūra
3.Šī procedūra domāta centrifūgas mēģenēm ar tilpumu 50 ml.
[1. diena] Ar dekstrānu pārklāto ogli suspendē 1 l ultratīrā ūdens, kam pievienots 1,5 mM MgCl2, 0,25 M saharozes, 2,5 g ogles, 0,25 g dekstrāna un 5 mM HEPES; maisa 4°C visu nakti.
[2. diena] Suspensiju salej 50 ml centrifūgas mēģenēs un 10 minūtes centrifugē ar 10000 apgr./min. 4°C temperatūrā. Atdala supernatantu, un pusi no ogles nogulsnēm atliek 4°C temperatūrā izmantošanai 3. dienā. Atlikušu pusi suspendē FBS, kas ir lēni atkausēts (lai nepieļautu izgulsnēšanos) un pēc tam 30 minūtes 56°C temperatūrā inaktivēts; pārlej autoklāvētā stikla traukā (piem., Erlenmeijera kolbā). Šo suspensiju atstāj uz nakti un lēni maisa 4°C temperatūrā.
[3. diena. ] FBS suspensiju salej centrifūgas mēģenēs un 10 minūtes centrifugē ar 10000 apgr./min. 4°C temperatūrā. Savāc FBS un pārlej to 2. dienā sagatavotajās un atliktajās ogles nogulsnēs. Šīs ogles nogulsnes suspendē FBS un uz nakti lēni maisa 4 °C temperatūrā.
[4. diena.] Šo suspensiju salej mēģenēs, 10 min. centrifugē pie 10000 apgr./min. 4°C temperatūrā; supernatantu sterilizē, filtrējot caur 0,2 μm sterilu filtru. Šo ar DCC apstrādāto FBS glabā -20°C temperatūrā, un tas ir jāizmanto gada laikā.
3. PAPILDINĀJUMS
VM7Luc estrogēna receptoru transaktivācijas tests estrogēna receptoru agonistu un antagonistu noteikšanai
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
1.Šajā testā izmanto VM7Luc4E2 šūnu līniju. To ir apstiprinājis Alternatīvu toksikoloģisko metožu novērtēšanas nacionālās toksikoloģijas programmas starpaģentūru centrs (National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, NICEATM) un Alternatīvo metožu validēšanas starpaģentūru koordinācijas komiteja (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) (1). VM7Luc šūnu līnijas galvenokārt ekspresē endogēniskos ERα un nelielu daudzumu endogēnisko ERβ (2) (3) (4).
2.Šis tests ir izmantojams ļoti daudzām vielām, ja vien tās šķīst dimetilsulfoksīdā (DMSO; CAS Nr. 67-68-5), nereaģē ar DMSO vai šūnu kultūru un testējamajā koncentrācijā nav citotoksiskas. Ja DMSO izmantošana nav iespējama, var izmantot citu nesēju, piem., etanolu vai ūdeni (sk. 12. punktu). Pierādītā VM7Luc ER TA (ant)agonistu testa veiktspēja liecina, ka ar šo testu iegūtie dati var sniegt informāciju par ER mediētiem darbības mehānismiem, un tos var izmantot, nosakot, kuras vielas testējamas prioritāri.
3.Šis tests ir īpaši paredzēts hERα un hERß mediētas TA noteikšanai, par mērījuma parametru izmantojot hemiluminiscenci. Hemiluminiscence tiek plaši izmantota biotestos, jo luminiscencei ir augsta signāla un fona attiecība (10). Tomēr vielas, kas inhibē luciferāzes fermentu, var radīt maldīgu priekšstatu par jāņtārpiņu luciferāzes aktivitāti šūnu testos, proteīnu stabilizācijas dēļ izraisot šķietamu inhibīciju vai pastiprinātu luminiscenci (10). Turklāt dažos uz luciferāzi balstītos ER reportiergēnu testos ir novēroti receptoru nemediēti luminiscences signāli luciferāzes reportiergēna pārmērīgas aktivācijas dēļ, ja fitoestrogēnu koncentrācija ir lielāka par 1 μM (9) (11). Lai gan devas–atbildreakcijas līkne liecina, ka ER sistēmas patiesā aktivācija rodas pie mazākām koncentrācijām, stabili transficētu ER TA testu sistēmās rūpīgi jāpārbauda luciferāzes ekspresija, kas iegūta pie fitoestrogēnu vai tādu līdzīgu savienojumu, par kuriem ir aizdomas, ka tie rada fitoestrogēniem līdzīgu pārmērīgu luciferāzes reportiergēna aktivāciju, augstām koncentrācijām (sk. 2. papildinājumu).
4.Pirms šā testa izmantošanas regulatīviem mērķiem ir jāizlasa sadaļa “VISPĀRĪGAIS IEVADS” un “ER TA TESTA KOMPONENTI”. Šajā testēšanas metodē izmantotās definīcijas un saīsinājumi ir aprakstīti 1. papildinājumā.
TESTA PRINCIPS (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
5.Testu izmanto, lai norādītu ER ligandu saistīšanos, kam seko receptoru–ligandu kompleksa translokācija uz kodolu. Kodolā receptoru–ligandu komplekss saistās ar specifiskiem DNS atbildreakcijas elementiem un transaktivē reportiergēnu (luc), kā rezultātā veidojas luciferāze un pēc tam izstarojas gaisma, kuru var kvantitatīvi noteikt ar luminometru. Luciferāzes aktivitāti var ātri un lēti izvērtēt ar vairākiem komerciāli pieejamiem testa komplektiem. VM7Luc ER TA testā izmanto uz ER reaģējošu cilvēka krūts adenokarcinomas šūnu līniju VM7, kas ir stabili transficēta ar jāņtārpiņu luc reportiera konstruktu, ko regulē četri estrogēnu atbildreakcijas elementi, kas ievietoti pirms peles krūts audzēja vīrusa promotera (MMTV), lai noteiktu vielas, kas in vitro uzrāda ER agonistu vai antagonistu aktivitāti. Šim MMTV promoteram vērojama tikai neliela krusteniskā reakcija ar citiem steroīdajiem un nesteroīdajiem hormoniem (8). Datu interpretācijas kritēriji ir detalizēti aprakstīti 41. punktā. Īsumā, pozitīvu atbildreakciju raksturo tāda koncentrācijas–atbildreakcijas līkne, kurā ir vismaz trīs punkti, kur kļūdu joslas (vidējā vērtība ± standartnovirze) nepārklājas, kā arī tādas amplitūdas izmaiņas (normalizētā relatīvā gaismas vienība (RLU)), kas ir vismaz 20 % no references standarta maksimālās vērtības(17β-estradiols [E2; CAS Nr. 50-28-2] agonistu testam, raloksifena HCl [Ral; CAS Nr. 84449-90-1]/E2 antagonistu testam).
PROCEDŪRA
Šūnu līnija
6.Testam izmanto stabili transficēto šūnu līniju VM7Luc4E2. Pašlaik šūnu līnija iegādājama tikai ar tehniskās licences līgumu no Kalifornijas universitātes Deivisā (University of California, Davis), Kalifornijā, ASV, un no Xenobiotic Detection Systems Inc. Daremā, Ziemeļkarolīnā, ASV.
Šūnu līnijas stabilitāte
7.Lai saglabātu šūnu līnijas stabilitāti un integritāti, šūnas audzē vairākās pasāžās no sasaldēta krājuma šūnu uzturēšanas barotnē (sk. 9. punktu). Šūnas nedrīkst kultivēt vairāk nekā 30 pasāžās. VM7Luc4E2 šūnu līnijai 30 pasāžas nozīmē apmēram trīs mēnešus.
Šūnu kultivēšanas un uzsēšanas apstākļi
8.Jāievēro Norādījumos par labu šūnu kultivēšanas praksi (Guidance on Good Cell Culture Practice) (5) (6) norādītās procedūras, lai nodrošinātu visu materiālu un metožu kvalitāti un garantētu visa veiktā darba integritāti, derīgumu un reproducējamību.
9.VM7Luc4E2 šūnas tur RPMI 1640 barotnē, kam pievienots 0,9 % penicilīna–streptomicīna maisījums (Pen-Strep) un 8,0 % liellopu embriju serums (FBS), īpašā audu kultivēšanas inkubatorā 37 ºC ± 1 ºC temperatūrā, 90 % ± 5 % mitrumā un 5,0 % ± 1 % CO2/gaisā.
10.Kad sasniegta ~80 % konfluence, VM7Luc4E2 šūnas 48 stundas subkultivē un kondicionē bezestrogēna vidē pirms šūnu uzsēšanas 96 iedobju platēs, lai eksponētu testējamām ķimikālijām un analizētu no estrogēna atkarīgo luciferāzes aktivitātes inducēšanu. Bezestrogēna barotne ( EFM) satur Dulbeko modificēto Īgla barotni (DMEM) bez fenolsarkanā, kas papildināta ar 4,5 % ar ogli/dekstrānu apstrādātu FBS, 1,9 % L-glutamīnu un 0,9 % Pen-Strep. Nevienam plastmasas izstrādājumam nedrīkst būt estrogēniskas aktivitātes [sk. detalizēto protokolu (7)].
Pieņemamības kritēriji
11.Testa apstiprināšanas vai noraidīšanas pamatā ir novērtējums par rezultātiem, kas katrā 96 iedobju platē iegūti ar references standartiem un kontroli. Katru references standartu testē vairākās koncentrācijās, un ir vairāki katras references standarta un kontroles koncentrācijas paraugi. Rezultātus salīdzina ar kvalitātes kontrolēm (KK) šiem parametriem, kas iegūti no agonistu un antagonistu vēsturiskajām datubāzēm, ko katra laboratorija izveidojusi kompetences pierādīšanas laikā. Vēsturiskajās datubāzēs pastāvīgi tiek atjauninātas references standartu un kontroles vērtības. Ja mainās aprīkojums vai laboratorijas apstākļi, var būt nepieciešams izveidot atjauninātas vēsturiskās datubāzes.
Agonistu tests
Diapazona noteikšanas tests
·Inducēšana: nosaka inducēšanu platē, , vidējo augstāko E2 references standarta relatīvās gaismas vienības (RLU) vērtību dalot ar vidējo DMSO kontroles RLU vērtību. Parasti iegūst pieckāršu indukciju, taču eksperimentu uzskata par pieņemamu, ja indukcija ir vismaz četrkārša vai lielāka.
·DMSO kontroles rezultāti: šķīdinātāja kontroles RLU vērtībām jābūt ne vairāk kā 2,5 reizes lielākām par vēsturiskās šķīdinātāja kontroles vidējās RLU vērtības standartnovirzi.
·Eksperiments, kas neatbilst kādam no pieņemamības kritērijiem, jāatmet un jāatkārto.
Visaptverošs tests
Te ietilpst pieņemamības kritēriji no agonistu diapazona noteikšanas testa un tālāk norādītie kritēriji.
·References standarta rezultāti. E2 references standarta koncentrācijas–atbildreakcijas līknei jābūt sigmoidālai un ar vismaz trim vērtībām koncentrācijas–atbildreakcijas līknes lineārajā daļā.
·Pozitīvās kontroles rezultāti. Metoksihlora kontroles RLU vērtībām jābūt lielākām par DMSO vidējo vērtību plus trīskāršu standartnovirzi no DMSO vidējās vērtības.
·Eksperiments, kas neatbilst pat vienam pieņemamības kritērijam, jāatmet un jāatkārto.
Antagonistu tests
Diapazona noteikšanas tests
·Samazinājums Samazinājumu platē nosaka, vidējo augstāko Ral/E2 references standarta RLU vērtību dalot ar vidējo DMSO kontroles RLU vērtību. Parasti iegūst pieckāršu samazinājumu, taču eksperimentu uzskata par pieņemamu, ja samazinājums ir vismaz trīskāršs.
·E2 kontroles rezultāti. E2 kontroles RLU vērtībām jābūt ne vairāk kā 2,5 reizes lielākām par vēsturiskās E2 kontroles vidējās RLU vērtības standartnovirzi.
·DMSO kontroles rezultāti: DMSO kontroles RLU vērtībām jābūt ne vairāk kā 2,5 reizes lielākām par vēsturiskās šķīdinātāja kontroles vidējās RLU vērtības standartnovirzi.
·Eksperiments, kas neatbilst pat vienam pieņemamības kritērijam, jāatmet un jāatkārto.
Visaptverošs tests
Te ietilpst pieņemamības kritēriji no antagonistu diapazona noteikšanas testa un tālāk norādītie kritēriji.
·References standarta rezultāti. Ral/E2 references standarta koncentrācijas–atbildreakcijas līknei jābūt sigmoidālai un ar vismaz trim vērtībām koncentrācijas–atbildreakcijas līknes lineārajā daļā.
·Pozitīvās kontroles rezultāti. Tamoksifēna/E2 kontroles RLU vērtībām jābūt mazākām par E2 kontroles vidējo vērtību mīnus trīskāršu standartnovirzi no E2 kontroles vidējās vērtības.
·Eksperiments, kas neatbilst pat vienam pieņemamības kritērijam, jāatmet un jāatkārto.
References standarti, pozitīvās un nesēja kontroles
Nesēja kontrole (agonistu un antagonistu testi)
12.Nesēju, kurā izšķīdina testējamo ķimikāliju, testē kā nesēja kontroli (VC). VM7Luc ER TA testa validēšanā izmantotais nesējs bija 1 % (tilpumkoncentrācija) dimetilsulfoksīds (DMSO, CAS Nr. 67-68-5) (sk. 24. punktu). Ja izmanto citu nesēju, nevis DMSO, visi references standarti, kontroles un testējamās ķimikālijas vajadzības gadījumā jātestē tajā pašā nesējā.
References standarts (agonistu diapazona noteikšana)
13.References standarts ir E2 (CAS Nr. 50-28-2). Diapazona noteikšanas testēšanā references standarts nozīmē, ka četras E2 koncentrācijas (1,84 x 10-10, 4,59 x 10-11, 1,15 x 10-11 un 2,87 x 10-12 M) sērijveidā atšķaida, katru koncentrāciju testējot dubultiedobēs.
References standarts (agonistu visaptverošs tests)
14.Visaptverošā testēšanā E2 sērijveidā atšķaida attiecībā 1:2, līdz iegūst 11 E2 koncentrācijas (diapazonā no 3,67 x 10-10 līdz 3,59 x 10-13 M) dubultiedobēs.
References standarts (antagonistu diapazona noteikšana)
15.References standarts ir Ral (CAS Nr. 84449-90-1) un E2 (CAS Nr. 50-28-2) maisījums. Diapazona noteikšanas testēšanā Ral/E2 maisījumu sērijveidā atšķaida, līdz iegūst trīs Ral koncentrācijas (3,06 × 10-9; 7,67 × 10-10 un 1,92 × 10-10M) ar E2 konstantā koncentrācijā (9,18 × 10-11 M) dubultiedobēs.
References standarts (antagonistu visaptverošs tests)
16.Visaptverošā testēšanā Ral (diapazonā no 2,45× 10-8 līdz 9,57 × 10-11 M) sērijveidā atšķaida attiecībā 1:2 ar E2 konstantā koncentrācijā (9,18 × 10-11 M), līdz iegūst deviņas Ral/E2 koncentrācijas dubultiedobēs.
Vāji pozitīvā kontrole (agonisti)
17.Vāji pozitīvā kontrole ir 9,06 × 10-6 M p,p'-metoksihlors (metoksihlors; CAS Nr. 72-43-5) EFM barotnē.
Vāji pozitīvā kontrole (antagonisti)
18.Vāji pozitīvā kontrole ir tamoksifēns (CAS Nr. 10540-29-1) 3,36 × 10-6 M ar E2 9,18 × 10-11 M EFM barotnē.
E2 kontrole (tikai antagonistu tests)
19.E2 kontrole ir E2 9,18 × 10-11 MEFM barotnē, un to izmanto kā bāzlīnijas negatīvo kontroli.
Vairākkāršā indukcija (agonisti)
20.References standarta (E2) luciferāzes aktivitātes indukciju nosaka, vidējo augstāko E2 references standarta RLU vērtību dalot ar vidējo DMSO kontroles RLU vērtību, un rezultātam jābūt vairāk nekā četras reizes lielākam.
Vairākkāršais samazinājums (antagonisti)
21.References standarta (Ral/E2) luciferāzes aktivitātes vidējo vērtību nosaka, vidējo augstāko Ral/E2 references standarta RLU vērtību dalot ar vidējo DMSO kontroles RLU vērtību, tai jābūt vairāk nekā trīs reizes lielākai.
Laboratorijas kompetences pierādīšana (sk. 14. punktu un 3. un 4. tabulu šīs testēšanas metodes sadaļā “ER TA TESTA KOMPONENTI”)
Nesējs
22.Testa ķimikālijas izšķīdina tādā šķīdinātājā, kurā attiecīgā testējamā ķimikālija šķīst un kurš ir sajaucams ar šūnu barotni. Piemēroti nesēji ir ūdens, etanols (tīrība 95 -100 %) un DMSO. Ja izmanto DMSO, tā saturs nedrīkst pārsniegt 1 % (tilp/.tilp.). Par katru nesēju ir jāpierāda, ka maksimālais izmantotais tilpums nav citotoksisks un neietekmē testa veikšanu. References standartus un kontroles izšķīdina 100 % šķīdinātājā un pēc tam EFM barotnē atšķaida līdz atbilstīgām koncentrācijām.
Testējamo ķimikāliju sagatavošana
23.Testējamās ķimikālijas izšķīdina 100 % DMSO (vai piemērotā šķīdinātājā) un pēc tam EFM barotnē atšķaida līdz atbilstīgām koncentrācijām. Pirms izšķīdināšanas un atšķaidīšanas jānogaida, līdz visas testējamās ķimikālijas sasilst līdz istabas temperatūrai. Katram eksperimentam jāsagatavo svaigi testējamo ķimikāliju šķīdumi. Šķīdumos nedrīkst būt redzamas nogulsnes vai duļķes. References standartu un kontroļu izejšķīdumus var sagatavot lielā apjomā, taču galīgais references standarts, kontroles atšķaidījumi un testējamās ķimikālijas katram eksperimentam jāsagatavo svaigas un jāizmanto 24 stundās pēc sagatavošanas.
Šķīdība un citotoksicitāte Apsvērumi par diapazona noteikšanu
24.Diapazona noteikšanas pamatā ir septiņi sērijveida atšķaidījumi attiecībā 1:10 divos atkārtojumos. Sākumā testējamās ķimikālijas testē pie maksimālās koncentrācijas 1 mg/ml (~1 mM) agonistu testēšanā un 20 µg/ml (~10 μM) antagonistu testēšanā. Diapazona noteikšanas eksperimentus izmanto, lai noteiktu:
-testējamās ķimikālijas sākuma koncentrācijas, kas izmantojamas visaptverošā testēšanā;
-testējamās ķimikālijas atšķaidījumus (1:2 vai 1:5), kas izmantojami visaptverošā testēšanā.
25.Šūnu dzīvotspējas/citotoksicitātes novērtējums ir ietverts agonistu un antagonistu testu protokolos (7) un iekļauts diapazona noteikšanas un visaptverošajā testēšanā. Citotoksicitātes metode, ko izmantoja šūnu dzīvotspējas novērtēšanai VM7Luc ER TA testa (1) validēšanas laikā, bija mērogota kvalitatīvā vizuālās novērošanas metode, tomēr citotoksicitātes noteikšanai var izmantot kvantitatīvu metodi (skatīt protokolu (7)). Nevar izmantot datus par testējamās ķimikālijas koncentrācijām, kas izraisa dzīvotspējas samazināšanos par vairāk nekā 20 %.
Eksponēšana ķimikālijai un izkārtojums testa platē
26.Šūnas saskaita un uzsēj audu kultūras 96 iedobju platēs (2 x 105 šūnas vienā iedobē) EFM barotnē, un inkubē 24 stundas, lai šūnas varētu piestiprināties pie plates. EFM atdala un aizstāj ar testējamajām un references ķimikālijām EFM barotnē, un inkubē 19–24 stundas. Īpaša uzmanība jāpievērš ļoti gaistošām vielām, jo tuvējās kontroliedobes var dot pseidopozitīvus rezultātus. Šādos gadījumos ieteicams izmantot iedobju aizlīmes, kas ļauj testēšanas laikā efektīvi izolēt atsevišķas iedobes.
Diapazona noteikšanas tests
27.Diapazona noteikšanas testēšanā izmanto visas 96 iedobju plates iedobes; testē līdz pat sešām testējamajām ķimikālijām septiņās dažādās koncentrācijās, ko iegūst sērijveida atšķaidīšanā attiecībā 1:10 divos atkārtojumos (sk. 1. un 2. attēlu).
- Agonistu diapazona noteikšanas testēšanā izmanto četras E2 koncentrācijas divos atkārtojumos kā references standartu un četras DMSO kontroles replikāta iedobes.
-Antagonistu diapazona noteikšanas testēšanā izmanto trīs Ral/E2 maisījuma koncentrācijas (E2 ir konstants 9,18 × 10-11 M) divos atkārtojumos kā references standartu un trīs replikātu iedobes, kas paredzētas E2 un DMSO kontrolēm.
1. attēls. Agonistu diapazona noteikšanas testa 96 iedobju plates izkārtojums
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
TC1-1
|
TC1-1
|
TC2-1
|
TC2-1
|
TC3-1
|
TC3-1
|
TC4-1
|
TC4-1
|
TC5-1
|
TC5-1
|
TC6-1
|
TC6-1
|
|
B
|
TC1-2
|
TC1-2
|
TC2-2
|
TC2-2
|
TC3-2
|
TC3-2
|
TC4-2
|
TC4-2
|
TC5-2
|
TC5-2
|
TC6-2
|
TC6-2
|
|
C
|
TC1-3
|
TC1-3
|
TC2-3
|
TC2-3
|
TC3-3
|
TC3-3
|
TC4-3
|
TC4-3
|
TC5-3
|
TC5-3
|
TC6-3
|
TC6-3
|
|
D
|
TC1-4
|
TC1-4
|
TC2-4
|
TC2-4
|
TC3-4
|
TC3-4
|
TC4-4
|
TC4-4
|
TC5-4
|
TC5-4
|
TC6-4
|
TC6-4
|
|
E
|
TC1-5
|
TC1-5
|
TC2-5
|
TC2-5
|
TC3-5
|
TC3-5
|
TC4-5
|
TC4-5
|
TC5-5
|
TC5-5
|
TC6-5
|
TC6-5
|
|
F
|
TC1-6
|
TC1-6
|
TC2-6
|
TC2-6
|
TC3-6
|
TC3-6
|
TC4-6
|
TC4-6
|
TC5-6
|
TC5-6
|
TC6-6
|
TC6-6
|
|
G
|
TC1-7
|
TC1-7
|
TC2-7
|
TC2-7
|
TC3-7
|
TC3-7
|
TC4-7
|
TC4-7
|
TC5-7
|
TC5-7
|
TC6-7
|
TC6-7
|
|
H
|
E2-1
|
E2-2
|
E2-3
|
E2-4
|
VC
|
VC
|
VC
|
VC
|
E2-1
|
E2-2
|
E2-3
|
E2-4
|
2. attēls. Antagonistu diapazona noteikšanas testa 96 iedobju plates izkārtojums
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
TC1-1
|
TC1-1
|
TC2-1
|
TC2-1
|
TC3-1
|
TC3-1
|
TC4-1
|
TC4-1
|
TC5-1
|
TC5-1
|
TC6-1
|
TC6-1
|
|
B
|
TC1-2
|
TC1-2
|
TC2-2
|
TC2-2
|
TC3-2
|
TC3-2
|
TC4-2
|
TC4-2
|
TC5-2
|
TC5-2
|
TC6-2
|
TC6-2
|
|
C
|
TC1-3
|
TC1-3
|
TC2-3
|
TC2-3
|
TC3-3
|
TC3-3
|
TC4-3
|
TC4-3
|
TC5-3
|
TC5-3
|
TC6-3
|
TC6-3
|
|
D
|
TC1-4
|
TC1-4
|
TC2-4
|
TC2-4
|
TC3-4
|
TC3-4
|
TC4-4
|
TC4-4
|
TC5-4
|
TC5-4
|
TC6-4
|
TC6-4
|
|
E
|
TC1-5
|
TC1-5
|
TC2-5
|
TC2-5
|
TC3-5
|
TC3-5
|
TC4-5
|
TC4-5
|
TC5-5
|
TC5-5
|
TC6-5
|
TC6-5
|
|
F
|
TC1-6
|
TC1-6
|
TC2-6
|
TC2-6
|
TC3-6
|
TC3-6
|
TC4-6
|
TC4-6
|
TC5-6
|
TC5-6
|
TC6-6
|
TC6-6
|
|
G
|
TC1-7
|
TC1-7
|
TC2-7
|
TC2-7
|
TC3-7
|
TC3-7
|
TC4-7
|
TC4-7
|
TC5-7
|
TC5-7
|
TC6-7
|
TC6-7
|
|
H
|
Ral-1
|
Ral-2
|
Ral-3
|
VC
|
VC
|
VC
|
E2
|
E2
|
E2
|
Ral-1
|
Ral-2
|
Ral-3
|
28.Ieteicamais galīgais barotnes tilpums katrā iedobē ir 200 µl. Izmanto tikai tādas testa plates, kurās šūnām visās iedobēs dzīvotspēja ir 80 % un lielāka.
29.Sākuma koncentrāciju noteikšana visaptverošai agonistu testēšanai ir detalizēti aprakstīta agonistu protokolā (7). Īsumā, tiek izmantoti tālāk aprakstītie kritēriji.
-Ja testējamās ķimikālijas koncentrācijas līknē neviens punkts nav lielāks par DMSO kontroles rezultātu vidējo vērtību plus trīskāršu standartnovirzi, visaptverošai testēšanai izmanto 11 atšķaidījumu sēriju attiecībā 1:2, sākot ar maksimālo šķīstošo koncentrāciju.
-Ja testējamās ķimikālijas koncentrācijas līknē ir punkti, kas ir lielāki par DMSO kontroles rezultātu vidējo vērtību plus trīskāršu standartnovirzi, visaptverošā testēšanā izmanto 11 secīgus atšķaidījumus, un sākuma koncentrācijai jābūt par vienu logaritmu augstākai nekā koncentrācijai, kas diapazona noteikšanā dod augstāko koriģēto RLU vērtību. 11 atšķaidījumu sērijas pamatā ir atšķaidījumi attiecībā 1:2 vai 1:5 atbilstīgi tālāk aprakstītajiem kritērijiem.
11 punktu atšķaidījumu sērija attiecībā 1:2 jāizmanto, ja šādi iegūtais koncentrāciju diapazons ļauj novērot atbildreakciju pilnu diapazonu, pamatojoties uz koncentrācijas–atbildreakcijas līkni, kas iegūta diapazona noteikšanas testā. Pretējā gadījumā izmanto atšķaidījumu attiecībā 1:5.
-Ja diapazona noteikšanas testā testējamā ķimikālija uzrāda vielai divfāzu koncentrācijas–atbildreakcijas līkni, arī visaptverošajā testēšanā ir jāapskata abas fāzes.
30.Sākuma koncentrāciju noteikšana visaptverošai antagonistu testēšanai ir detalizēti aprakstīta antagonistu protokolā (7). Īsumā, tiek izmantoti tālāk aprakstītie kritēriji.
-Ja testējamās ķimikālijas koncentrācijas līknē neviens punkts nav mazāks par E2 kontroles rezultātu vidējo vērtību mīnus trīskāršu standartnovirzi, visaptverošai testēšanai izmanto 11 punktu atšķaidījumu sēriju attiecībā 1:2, sākot ar maksimālo šķīstošo koncentrāciju.
-Ja testējamās ķimikālijas koncentrācijas līknē ir punkti, kas ir mazāki par E2 kontroles rezultātu vidējo vērtību mīnus trīskāršu standartnovirzi, visaptverošā testēšanā izmanto 11 secīgus atšķaidījumus, un sākuma koncentrācijai jābūt vienai no šādām:
§koncentrācija, kas diapazona noteikšanā dod zemāko koriģēto RLU vērtību;
§maksimālā šķīstošā koncentrācija (sk. 14-2. attēlu antagonistu protokolā (7));
§zemākā citotoksiskā koncentrācija (attiecīgu piemēru sk. 14-3. attēlā antagonistu protokolā (7)).
-11 atšķaidījumu sērijas pamatā ir atšķaidījumi attiecībā 1:2 vai 1:5 atbilstīgi tālāk aprakstītajiem kritērijiem.
11 punktu atšķaidījumu sērija attiecībā 1:2 jāizmanto, ja šādi iegūtais koncentrāciju diapazons ļauj novērot atbildreakciju pilnu diapazonu, pamatojoties uz koncentrācijas–atbildreakcijas līkni, kas iegūta diapazona noteikšanas testā. Pretējā gadījumā jāizmanto atšķaidījums attiecībā 1:5.
Visaptverošie testi
31.Visaptveroša testēšana sastāv no 11 punktu atšķaidījumu sērijas (atšķaidījumu sērija attiecībā 1:2 vai 1:5 atbilstīgi visaptverošas testēšanas kritēriju sākuma koncentrācijai), katru koncentrāciju testējot trīs replikāta iedobēs 96 iedobju platē (sk. 3. un 4. attēlu).
-Agonistu visaptverošā testēšanā par references standartu izmanto 11 E2 koncentrācijas divos atkārtojumos. Katrā platē ir četras replikāta iedobes DMSO kontrolei un četras replikāta iedobes metoksihlora kontrolei (9,06 x 10-6 M).
-Antagonistu visaptverošā testēšanā par references standartu izmanto deviņas Ral/E2 koncentrācijas (E2 ir konstants ar 9,18 × 10-11 M) divos atkārtojumos, četras replikāta iedobes domātas E2 9,18 × 10-11 M kontrolei, četras replikāta iedobes domātas DMSO kontrolēm un vēl četras —tamoksifēnam 3,36 x 10-6M.
3. attēls. Agonistu visaptveroša testa 96 iedobju plates izkārtojums
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
TC1-1
|
TC1-2
|
TC1-3
|
TC1-4
|
TC1-5
|
TC1-6
|
TC1-7
|
TC1-8
|
TC1-9
|
TC1-10
|
TC1-11
|
VC
|
|
B
|
TC1-1
|
TC1-2
|
TC1-3
|
TC1-4
|
TC1-5
|
TC1-6
|
TC1-7
|
TC1-8
|
TC1-9
|
TC1-10
|
TC1-11
|
VC
|
|
C
|
TC1-1
|
TC1-2
|
TC1-3
|
TC1-4
|
TC1-5
|
TC1-6
|
TC1-7
|
TC1-8
|
TC1-9
|
TC1-10
|
TC1-11
|
VC
|
|
D
|
TC2-1
|
TC2-2
|
TC2-3
|
TC2-4
|
TC2-5
|
TC2-6
|
TC2-7
|
TC2-8
|
TC2-9
|
TC2-10
|
TC2-11
|
VC
|
|
E
|
TC2-1
|
TC2-2
|
TC2-3
|
TC2-4
|
TC2-5
|
TC2-6
|
TC2-7
|
TC2-8
|
TC2-9
|
TC2-10
|
TC2-11
|
Meth
|
|
F
|
TC2-1
|
TC2-2
|
TC2-3
|
TC2-4
|
TC2-5
|
TC2-6
|
TC2-7
|
TC2-8
|
TC2-9
|
TC2-10
|
TC2-11
|
Meth
|
|
G
|
E2-1
|
E2-2
|
E2-3
|
E2-4
|
E2-5
|
E2-6
|
E2-7
|
E2-8
|
E2-9
|
E2-10
|
E2-11
|
Meth
|
|
H
|
E2-1
|
E2-2
|
E2-3
|
E2-4
|
E2-5
|
E2-6
|
E2-7
|
E2-8
|
E2-9
|
E2-10
|
E2-11
|
Meth
|
4. attēls. Antagonistu visaptveroša testa 96 iedobju plates izkārtojums
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
TC1-1
|
TC1-2
|
TC1-3
|
TC1-4
|
TC1-5
|
TC1-6
|
TC1-7
|
TC1-8
|
TC1-9
|
TC1-10
|
TC1-11
|
VC
|
|
B
|
TC1-1
|
TC1-2
|
TC1-3
|
TC1-4
|
TC1-5
|
TC1-6
|
TC1-7
|
TC1-8
|
TC1-9
|
TC1-10
|
TC1-11
|
VC
|
|
C
|
TC1-1
|
TC1-2
|
TC1-3
|
TC1-4
|
TC1-5
|
TC1-6
|
TC1-7
|
TC1-8
|
TC1-9
|
TC1-10
|
TC1-11
|
VC
|
|
D
|
TC2-1
|
TC2-2
|
TC2-3
|
TC2-4
|
TC2-5
|
TC2-6
|
TC2-7
|
TC2-8
|
TC2-9
|
TC2-10
|
TC2-11
|
VC
|
|
E
|
TC2-1
|
TC2-2
|
TC2-3
|
TC2-4
|
TC2-5
|
TC2-6
|
TC2-7
|
TC2-8
|
TC2-9
|
TC2-10
|
TC2-11
|
Tam
|
|
F
|
TC2-1
|
TC2-2
|
TC2-3
|
TC2-4
|
TC2-5
|
TC2-6
|
TC2-7
|
TC2-8
|
TC2-9
|
TC2-10
|
TC2-11
|
Tam
|
|
G
|
Ral-1
|
Ral-2
|
Ral-3
|
Ral-4
|
Ral-5
|
Ral-6
|
Ral-7
|
Ral-8
|
Ral-9
|
E2
|
E2
|
Tam
|
|
H
|
Ral-1
|
Ral-2
|
Ral-3
|
Ral-4
|
Ral-5
|
Ral-6
|
Ral-7
|
Ral-8
|
Ral-9
|
E2
|
E2
|
Tam
|
32.Lai nodrošinātu rezultātu neatkarību, visaptverošos testus ar to pašu ķimikāliju atkārto dažādās dienās. Jāveic vismaz divi visaptveroši testi. Ja testu rezultāti ir savstarpējā pretrunā (piem., viens tests ir pozitīvs, otrs negatīvs) vai ja viens tests ir neadekvāts, jāveic trešais papildu tests.
Luminiscences mērīšana
33.Luminiscenci mēra diapazonā no 300 līdz 650 nm ar inžekcijas luminometru un programmatūru, kas kontrolē inžekcijas tilpumu un mērījumu intervālu (7). Gaismas emisiju no katras iedobes izsaka kā RLU uz katru iedobi.
DATU ANALĪZE
EC50/IC50 noteikšana
34.EC50 vērtību (puse no testējamās ķimikālijas maksimālās efektīvās koncentrācijas [agonisti]) un IC50 vērtību (puse no testējamās ķimikālijas maksimālās inhibējošās koncentrācijas [antagonisti]) nosaka, pamatojoties uz koncentrācijas–atbildreakcijas datiem. Testējamajām ķimikālijām, kas ir pozitīvas vienā vai vairākās koncentrācijās, testējamās ķimikālijas koncentrāciju, kas izraisa pusi no maksimālās atbildreakcijas (IC50 vai EC50), aprēķina, izmantojot Hilla funkciju vai piemērotu alternatīvu. Hilla funkcija ir četru parametru logistisks matemātisks modelis, kas testējamās ķimikālijas koncentrāciju saista ar atbildreakciju (parasti pēc sigmoidālas līknes), izmantojot tālāk norādīto vienādojumu.
kur:
Y = atbildreakcija (t. i., RLU);
X = koncentrācijas logaritms;
Bāze = minimālā atbildreakcija;
Virsotne = maksimālā atbildreakcija;
lg EC50 (vai lg IC50) = X logaritms, kas atbilst atbildreakcijai, kura atrodas pa vidu starp bāzi un virsotni
Hilla virziena koeficients = līknes stāvums.
Ar šo modeli aprēķina rezultātus, kas ir vissaderīgākie ar vērtībām “Virsotne”, “Bāze”, “Hilla virziena koeficients”, IC50 un EC50. EC50 un IC50 vērtību aprēķināšanai jāizmanto atbilstoša statistiskā programmatūra (piem., Graphpad PrismR).
Izlecošo vērtību noteikšana
35.Lai izdarītu kvalitatīvus statistiskus secinājumus, būtu lietderīgi veikt arī (bet ne tikai) Q-testu (sk. agonistu un antagonistu protokolus (7)), lai noteiktu “nederīgās” iedobes, kas izslēdzamas no datu analīzes.
36.Attiecībā uz E2 references standarta replikātiem (paraugā ir divas iedobes) jebkuru replikāta koriģēto RLU vērtību konkrētā E2 koncentrācijā uzskata par izlecošo vērtību, ja vēsturiskajā datubāzē tās vērtība par vairāk nekā 20 % atšķiras no koriģētās RLU vērtības šai koncentrācijai.
Luminometra datu apkopošana un koriģēšana diapazona noteikšanas testēšanai
37.Neapstrādātie dati no luminometra jāpārsūta uz testam īpaši izveidotu izklājlapas veidni. Jānosaka, vai ir izlecošo vērtību datu punkti, kas jāizslēdz. (Analīzē noteiktos parametrus sk. sadaļā “Testa pieņemamības kritēriji”.) Veic šādus aprēķinus.
Agonists:
1. etaps.
Aprēķina DMSO nesēja kontroles (VC) vidējo vērtību.
2. etaps.
Datu normalizācijas nolūkā šo DMSO VC vidējo vērtību atskaita no vērtības, kas iegūta attiecībā uz katru iedobi.
3. etaps.
Aprēķina references standarta (E2) vidējo vairākkāršo indukciju.
4. etaps.
Aprēķina testējamo ķimikāliju vidējo EC50 vērtību.
Antagonists:
1. etaps.
Aprēķina DMSO VC vidējo vērtību.
2. etaps.
Datu normalizācijas nolūkā šo DMSO VC vidējo vērtību atskaita no vērtības, kas iegūta attiecībā uz katru iedobi.
3. etaps.
Aprēķina references standarta (Ral/E2) vidējo vairākkāršo samazinājumu.
4. etaps.
Aprēķina E2 references standarta vidējo vērtību.
5. etaps.
Aprēķina testējamo ķimikāliju vidējo IC50 vērtību.
Luminometra datu apkopošana un koriģēšana visaptverošai testēšanai
38.Neapstrādātie dati no luminometra jāpārsūta uz testam īpaši izveidotu izklājlapas veidni. Jānosaka, vai ir izlecošo vērtību datu punkti, kas jāizslēdz. (Analīzē noteiktos parametrus sk. sadaļā “Testa pieņemamības kritēriji”.) Veic tālāk aprakstītos aprēķinus.
Agonists:
1. etaps.
Aprēķina DMSO VC vidējo vērtību.
2. etaps.
Datu normalizācijas nolūkā šo DMSO VC vidējo vērtību atskaita no vērtības, kas iegūta attiecībā uz katru iedobi.
3. etaps.
Aprēķina references standarta (E2) vidējo vairākkāršo indukciju.
4. etaps.
Aprēķina E2 un testējamo ķimikāliju vidējo EC50 vērtību.
5. etaps.
Aprēķina metoksihlora vidējo koriģēto RLU vērtību.
Antagonists:
1. etaps.
Aprēķina DMSO VC vidējo vērtību.
2. etaps.
Datu normalizācijas nolūkā šo DMSO VC vidējo vērtību atskaita no vērtības, kas iegūta attiecībā uz katru iedobi.
3. etaps.
Aprēķina references standarta (Ral/E2) vidējo vairākkāršo indukciju.
4. etaps.
Aprēķina Ral/E2 un testējamo ķimikāliju vidējo IC50 vērtību.
5. etaps.
Aprēķina tamoksifēna vidējo koriģēto RLU vērtību.
6. etaps.
Aprēķina E2 references standarta vidējo vērtību.
Datu interpretācijas kritēriji
39.VM7Luc ER TA tests ir viens no rīkiem, ko izmanto pierādījumu izsvēršanas pieejā un kas palīdz noteikt, kuras vielas ir prioritāri jātestē ED in vivo testos. Šajā prioritizēšanas procedūrā ietilpst testējamās ķimikālijas klasificēšana par pozitīvu vai negatīvu attiecībā uz ER agonistu vai antagonistu aktivitāti. VM7Luc ER TA testa validēšanas pētījumā izmantotie pozitīvu un negatīvu rezultātu interpretācijas kritēriji ir aprakstīti 1. tabulā.
1. tabula. Pozitīvu un negatīvu rezultātu interpretācijas kritēriji
|
AGONISTU AKTIVITĀTE
|
|
Pozitīvs
|
-Visas testējamās ķimikālijas, kas klasificētas kā pozitīvas attiecībā uz ER agonistu aktivitāti, ir ar šādu koncentrācijas–atbildreakcijas līkni: bāzlīnija, pozitīvs slīpums un plato vai virsotne. Dažos gadījumos var būt definēti tikai divi no šiem raksturlielumiem (bāzlīnija –slīpums vai slīpums –virsotne).
-Uz pozitīvā slīpuma līnijas ir vismaz trīs punkti, kur kļūdu joslas ar nepārklājas (vidējais ± SN). Bāzlīniju veidojošos punktus izslēdz, savukārt līknes lineārā daļa var ietvert virsotnes punktu vai plato pirmo punktu.
-Lai ķimikāliju klasificētu par pozitīvu, atbildreakcijas amplitūdai (starpībai starp bāzlīniju un virsotni) — jābūt vismaz 20 % no references standarta E2 maksimālās vērtības (t. i., 2000 RLU vai vairāk, ja references standarta [E2] maksimālo atbildreakcijas vērtību koriģē uz 10 000 RLU).
-Ja iespējams, EC50 vērtība jāaprēķina katrai pozitīvai testējamai ķimikālijai.
|
|
Negatīvs
|
Vidējā koriģētā RLU konkrētai koncentrācijai ir vienāda ar vai mazāka par DMSO kontroles RLU vidējo vērtību plus trīskārša DMSO RLU standartnovirze.
|
|
Neadekvāts
|
Datus, kurus nozīmīgu kvalitatīvu vai kvantitatīvu ierobežojumu dēļ uzskata par nederīgiem aktivitātes esības vai neesības pierādīšanai, uzskata par neadekvātiem, un tos nevar izmantot, lai noteiktu, vai testējamā ķimikālija ir pozitīva vai negatīva. Tāpēc ķimikālijas jātestē atkārtoti.
|
|
ANTAGONISTU AKTIVITĀTE
|
|
Pozitīvs
|
-No testējamās datiem iegūst šādu koncentrācijas–atbildreakcijas līkni: bāzlīnija un negatīvs slīpums.
-Uz negatīvā slīpuma līnijas ir vismaz trīs punkti, kur kļūdu joslas ar nepārklājas; bāzlīniju veidojošos punktus izslēdz, savukārt līknes lineārā daļa var ietvert plato pirmo punktu.
-Aktivitātes samazinājumam jābūt vismaz 20 % no references standarta Ral/E2 maksimālās vērtības (t. i., 8000 RLU vai mazāk, ja references standarta [Ral/E2] maksimālo atbildreakcijas vērtību koriģē uz 10 000 RLU).
-Testējamās ķimikālijas augstākajai necitotoksiskajai koncentrācijai jābūt mazākai par vai vienādai ar 1 x 10-5 M.
-Ja iespējams, IC50 vērtība jāaprēķina katrai pozitīvai testējamai ķimikālijai.
|
|
Negatīvs
|
Koncentrācijā, kas mazāka par 1,0 × 10-5 M, visi datu punkti ir virs EC80 vērtības (80 % no E2 atbildreakcijas jeb 8000 RLU).
|
|
Neadekvāts
|
Datus, kurus nozīmīgu kvalitatīvu vai kvantitatīvu ierobežojumu dēļ uzskata par nederīgiem aktivitātes esības vai neesības pierādīšanai, uzskata par neadekvātiem, un tos nevar izmantot, lai noteiktu, vai testējamā ķimikālija ir pozitīva vai negatīva. Tāpēc ķimikālija jātestē atkārtoti.
|
40.Pozitīvos rezultātus raksturo gan ietekmes intensitāte, gan koncentrācija, pie kuras novērojama ietekme, ja iespējams. Pozitīvu, negatīvu un neadekvātu rezultātu piemēri sniegti 5. un 6. attēlā.
5. attēls. Agonisti: pozitīvi, negatīvi un neadekvāti rezultāti
6. attēls. Antagonisti: pozitīvi, negatīvi un neadekvāti rezultāti
41.EC50 un IC50 var aprēķināt, izmantojot četru parametru Hilla funkciju (papildinformāciju sk. agonistu protokolā un antagonistu protokolā (7)). Ja ir izpildīti pieņemamības kritēriji, tas nozīmē, ka testa sistēma darbojas pareizi, tomēr tas negarantē, ka konkrētajā izpildes reizē tiks iegūti pareizi dati. Labākais pierādījums iegūto datu pareizībai ir pirmās izpildes reizes rezultātu duplicēšana (sk. 19. punktu sadaļā “ER TA TESTA KOMPONENTI”).
TESTĒŠANAS PĀRSKATS
42.Sk. 20. punktu sadaļā “ER TA TESTA KOMPONENTI”.
LITERATŪRA
(1)ICCVAM. (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report on the LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Method for Identifying ER Agonists and Antagonists, National Institute of Environmental Health Sciences: Research Triangle Park, NC.
(2)Monje P., Boland R. (2001). Subcellular Distribution of Native Estrogen Receptor α and β Isoforms in Rabbit Uterus and Ovary, J. Cell Biochem., 82(3): 467-479.
(3)Pujol P., et al. (1998). Differential
Expression of Estrogen Receptor-Alpha and -Beta Messenger RNAs as a Potential Marker of Ovarian Carcinogenesis, Cancer Res., 58(23): 5367-5373.
(4)Weihua Z., et al. (2000). Estrogen
Receptor (ER) β, a Modulator of ERα in the Uterus, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97(11): 936-5941.
(5)Balls M., et al. (2006). The Importance of Good Cell Culture Practice (GCCP), ALTEX, 23(Suppl): p. 270-273.
(6)Coecke S., et al. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice: a Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, Alternatives to Laboratory Animals, 33: p. 261-287.
(7)ICCVAM (2011). ICCVAM Test Method Evaluation Report, The LUMI-CELL® ER (BG1Luc ER TA) Test Method: An In Vitro Assay for Identifying Human Estrogen Receptor Agonist and Antagonist Activity of Chemicals, NIH Publication No 11-7850.
(8)Rogers J.M., Denison M.S. (2000). Recombinant Cell Bioassays for Endocrine Disruptors: Development of a Stably Transfected Human Ovarian Cell Line for the Detection of Estrogenic and Anti-Estrogenic Chemicals, In Vitro Mol. Toxicol.,13(1):67-82.
(9)Escande A., et al. (2006). Evaluation of Ligand Selectivity Using Reporter Cell Lines Stably Expressing Estrogen Receptor Alpha or Beta, Biochem. Pharmacol., 71(10):1459-69.
(10)Thorne N., Inglese J., Auld D.S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology, Chemistry and Biology,17(6):646-57.
(11)(11)
Kuiper G.G, et al. (1998). Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor Beta, Endocrinology,139(10):4252-63.
(12)Geisinger, et al. (1989). Characterization of a human ovarian carcinoma cell line with estrogen and progesterone receptors, Cancer 63, 280-288.
(13)Baldwin, et al. (1998). BG-1 ovarian cell line: an alternative model for examining estrogen-dependent growth in vitro, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal, 34, 649-654.
(14)Li, Y., et al. (2014). Research resource: STR DNA profile and gene expression comparisons of human BG-1 cells and a BG-1/MCF-7 clonal variant, Mol. Endo. 28, 2072-2081.
(15)Rogers, J.M. and Denison, M.S. (2000). Recombinant cell bioassays for endocrine disruptors:development of a stably transfected human ovarian cell line for the detection of estrogenicand anti-estrogenic chemicals, In Vitro & Molec. Toxicol. 13, 67-82.
4. PAPILDINĀJUMS
Stabili transficētu cilvēka estrogēna α receptoru transaktivācijas tests ķimikāliju estrogēniskas agonistu un antagonistu aktivitātes noteikšanai, izmantojot ERα CALUX šūnu līniju
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
1.ERα CALUX transaktivācijas testā izmanto cilvēka U2OS šūnu līniju, lai noteiktu estrogēnu agonistu un antagonistu aktivitāti, ko mediē cilvēka estrogēna alfa receptors (hERα). Stabili transficētu ERα CALUX biotesta, ko piedāvā BioDetection Systems BV (Amsterdama, Nīderlande), validēšanas pētījumā pierādīja testa relevantumu un ticamību paredzētajam nolūkam (1). ERα CALUX šūnu līnija ekspresē tikai stabili transficētus cilvēka ERα (2) (3).
2.Šis tests ir īpaši paredzēts hERα mediētas transaktivācijas noteikšanai, par mērījuma parametru izmantojot bioluminiscenci. Augstās signāla un trokšņa attiecības dēļ bioluminiscenci plaši izmanto biotestos (4).
3.Novērots, ka fitoestrogēni koncentrācijā, kas ir lielāka par 1 µM, pārmērīgi aktivē luciferāzes reportiergēnu, tā izraisot receptoru nemediētu luminiscenci (5) (6) (7). Tāpēc stabili transficētu ER transaktivācijas testos rūpīgi jāpārbauda fitoestrogēnu vai citu līdzīgu savienojumu, kas var pārmērīgi aktivēt luciferāzes ekspresiju, augstākas koncentrācijas (sk. 2. papildinājumu).
4.Pirms šā testa izmantošanas regulatīviem mērķiem ir jāizlasa sadaļa “VISPĀRĪGAIS IEVADS” un “ER TA TESTA KOMPONENTI”. Šajā testēšanas metodē izmantotās definīcijas un saīsinājumi ir aprakstīti 1. papildinājumā.
TESTA PRINCIPS (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
5.Biotestu izmanto, lai novērtētu ER ligandu saistīšanos un receptoru–ligandu kompleksa sekojošu translokāciju uz kodolu. Kodolā receptoru–ligandu komplekss saista īpašus DNS atbildreakcijas elementus un transaktivē jāņtārpiņu luciferāzes reportiergēnu, kā rezultātā palielinās luciferāzes fermenta šūnu ekspresija. Pēc luciferāzes substrāta luciferīna pievienošanas luciferīns pārvēršas par bioluminiscējošu produktu. Radīto gaismu var viegli uztvert un kvantitatīvi noteikt ar luminometru.
6.Testa sistēmā izmanto stabili transficētu ERα CALUX šūnas. ERα CALUX šūnas izveidotas no cilvēka osteoblastiskas osteosarkomas U2OS šūnu līnijas. Cilvēka U2OS šūnas stabili transficēja ar 3xHRE-TATA-Luc un pSG5-neo-hERα, izmantojot kalcija fosfāta līdznogulsnēšanās metodi. U2OS šūnu līnija tika izvēlēta kā labākais variants, ko izmantot kā reportieršūnu līniju, kas reaģē uz estrogēnu (un citiem steroīdajiem hormoniem), un tā pamatā ir novērojums, ka U2OS šūnu līnijā endogēnisko receptoru aktivitāte bija neliela vai tās nebija vispār. Endogēnisko receptoru neesamību novērtēja tikai ar luciferāzes reportierplazmīdām, un pēc receptoru ligandu pievienošanas netika konstatēta nekāda aktivitāte. Turklāt pēc radniecīgu receptoru pagaidu pievienošanas šī šūnu līnija uzturēja spēcīgas hormonu mediētas atbildreakcijas (2) (3) (8).
7.Ķimikāliju testēšanā ar ERα CALUX šūnu līniju, lai noteiktu estrogēnisku vai antiestrogēnisku aktivitāti, ietilpst priekšskrīnings un visaptveroši testi. Priekšskrīninga laikā visaptverošās testēšanas vajadzībām nosaka testējamo ķimikāliju šķīdību, citotoksicitāti un precīzāku koncentrāciju diapazonu. Visaptverošajos testos testējamo ķimikāliju precīzāko koncentrāciju diapazonu testē ERα CALUX biotestos, un pēc tam testējamās ķimikālijas klasificē pēc agonisma vai antagonisma.
8.Datu interpretācijas kritēriji ir detalizēti aprakstīti 59. punktā. Īsumā, testējamo ķimikāliju uzskata par pozitīvu attiecībā uz agonismu, ja vismaz divu secīgu testējamās ķimikālijas koncentrāciju atbildreakcija ir vienāda ar vai lielāka par 10 % no references standarta (17β-estradiola) maksimālās atbildreakcijas (PC10). Testējamo ķimikāliju uzskata par pozitīvu attiecībā uz antagonismu, ja vismaz divu secīgu testējamās ķimikālijas koncentrāciju atbildreakcija ir vienāda ar vai mazāka par 80 % no references standarta (tamoksifēna) maksimālās atbildreakcijas (PC80).
PROCEDŪRA
Šūnu līnija
9.Testam jāizmanto stabili transficēta U2OS ERα CALUX šūnu līnija. Šūnu līniju var iegādāties ar tehniskās licences līgumu no BioDetection Systems BV, Amsterdama, Nīderlande.
10.Drīkst izmantot tikai šūnu kultūras bez mikoplazmas. Jābūt apliecinājumam, ka izmantojamajās šūnu partijās nav mikoplazmas piesārņojuma, vai arī pirms lietošanas jāveic mikoplazmas tests. Precīzai mikoplazmas infekcijas noteikšanai jāizmanto RT-PCR (polimerāzes ķēdes reakcija reāllaikā) (9).
Šūnu līnijas stabilitāte
11.Lai saglabātu CALUX šūnu stabilitāti un integritāti, šūnas jāglabā šķidrajā slāpeklī (–800C). Pēc šūnu atkausēšanas jaunas kultūras aizsākšanai šūnas jāsubkultivē vismaz divreiz, tikai pēc tam tās drīkst izmantot ķimikāliju estrogēniskas agonistu un antagonistu aktivitātes novērtēšanai. Šūnas nedrīkst subkultivēt vairāk nekā 30 pasāžās.
12.Lai kontrolētu šūnu līnijas stabilitāti laika gaitā, agonistu un antagonistu testa sistēmas reaģētspēju verificē, novērtējot references standarta EC50 vai IC50. Tāpat jākontrolē arī pozitīvās kontroles parauga (PC) un negatīvās kontroles parauga (NC) relatīvā indukcija. Rezultātiem jāatbilst agonistu (3.C tabula) vai antagonistu ERα CALUX biotesta (4.C tabula) pieņemamības kritērijiem. References standarti, pozitīvās un negatīvās kontroles ir norādītas 1. tabulā (agonisms) un 2. tabulā (antagonisms).
Šūnu kultivēšanas un uzsēšanas apstākļi
13.U2OS šūnas jākultivē barotnē (DMEM/F12 (1:1) barotne ar fenolsarkano kā pH indikatoru, kam pievienots liellopu embriju serums (7,5 %), aizvietojamās aminoskābes (1 %), 10 vienības/ml penicilīna, streptomicīna un geneticīna (G-418) kā atlases marķieris). Šūnas jāievieto CO2 inkubatorā (5 % CO2) 37 0C temperatūrā un 100 % mitrumā. Kad šūnas sasniedz 85–95 % konfluenci, tās jāsubkultivē vai jāsagatavo uzsēšanai 96 iedobju mikrotitrēšanas platēs. Ja šūnas gatavo uzsēšanai, tās atkārtoti jāsuspendē 1 x 105 šūnas/ml bezestrogēna testa barotnē (DMEM/F12 (1:1) barotne bez fenolsarkanā, kam pievienots liellopu embriju serums (5 % tilpumkoncentrācija), kas apstrādāts ar dekstrāna pārklātu ogli, aizvietojamās aminoskābes (1 % tilpumkoncentrācija), 10 vienības/ml penicilīna un streptomicīna) un jāuzsēj 96 iedobju mikrotitrēšanas plates iedobēs (100 µl homogenizētas šūnu suspensijas). Pirms ekspozīcijas šūnas 24 stundas vispirms jāinkubē CO2 inkubatorā (5 % CO2, 37 0C, 100 % mitrums). Plastmasas izstrādājumi nedrīkst saturēt estrogēnu.
Pieņemamības kritēriji
14.Testējamās(-o) ķimikālijas(-u) agonistisko un antagonistisko aktivitāti testē testu sērijā. Testu sērijā ietilpst ne vairāk kā 6 mikrotitrēšanas plates. Katrā testu sērijā ietilpst references standarta, pozitīvās kontroles parauga, negatīvās kontroles parauga un šķīdinātāja kontroļu vismaz 1 pilna atšķaidījumu sērija. 1. un 2. attēlā parādīta plašu sagatavošana agonistu un antagonistu testu sērijai.
15.Katrs references standartu, testējamo ķimikāliju, visu šķīdinātāja kontroļu un pozitīvo un negatīvo kontroļu atšķaidījums jāanalizē trīs atkārtojumos. Katras trīs atkārtojumos veiktās analīzes rezultātiem jāatbilst 3.A un 4.A tabulā norādītajām prasībām.
16.References standarta (17β-estradiols agonisma noteikšanai; tamoksifēns antagonisma noteikšanai) pilnu atšķaidījumu sēriju mēra katras testu sērijas pirmajā platē. Lai atlikušo 5 mikrotitrēšanas plašu analīzes rezultātus varētu salīdzināt ar pirmās mikrotitrēšanas plates rezultātiem, kas satur references standarta pilnu koncentrācijas–atbildreakcijas līkni, visās platēs jābūt 3 kontroles paraugiem: šķīdinātāja kontrolei, testētajam references standartam visaugstākajā koncentrācijā un references standarta aptuvenās EC50 (agonisms) vai IC50 (antagonisms) koncentrācijas. Vidējo kontroles paraugu attiecībai pirmajā platē un pārējās 5 platēs jāatbilst 3.C tabulā (agonisms) vai 4.C tabulā (antagonisms) norādītajām prasībām.
17.Katrai mikrotitrēšanas platei testu sērijā aprēķina z faktoru (10). Z faktors jāaprēķina pēc atbildreakcijām pie references standarta augstākajām un zemākajām koncentrācijām. Mikrotitrēšanas plati uzskata par derīgu, ja tā atbilst 3.C tabulā (agonisms) vai 4.C tabulā (antagonisms) norādītajām prasībām.
18.References standarta devas–atbildreakcijas līknei jābūt sigmoidālai. EC50 vai IC50, kas iegūta references standarta atšķaidījumu sērijā, ir jāatbilst 3.C tabulā (agonisms) vai 4.C tabulā (antagonisms) norādītajām prasībām.
19.Katrā testu sērijā jābūt pozitīvās kontroles un negatīvās kontroles paraugam. Relatīvajai indukcijai, kas aprēķināta, pamatojoties uz pozitīvās kontroles paraugu un negatīvās kontroles paraugu, jāatbilst 3.C tabulā (agonisms) vai 4.C tabulā (antagonisms) norādītajām prasībām.
20.Visā mērījumu laikā jānosaka, kāds ir references standarta augstākās koncentrācijas indukcijas koeficients, proti, vidējo augstāko 17β-estradiola references standarta relatīvās gaismas vienības (RLU) atbildreakciju dala ar vidējo references šķīdinātāja kontroles RLU atbildreakciju. Šim indukcijas koeficientam jāatbilst 3.C tabulā (agonisms) vai 4.C tabulā (antagonisms) norādītajām minimālajām prasībām par vairākkāršo indukciju.
21.Tikai tās mikrotitrēšanas plates, kas atbilst visiem iepriekš minētajiem apstiprināšanas kritērijiem, uzskatāmas par derīgām un izmantojamas testējamo ķimikāliju atbildreakcijas novērtēšanai.
22.Pieņemamības kritērijus piemēro gan priekšskrīningam, gan visaptverošiem testiem.
1. tabula. References standarta, pozitīvās kontroles (PC) un negatīvās kontroles (NC) koncentrācijas agonistu CALUX biotestam
|
|
Viela
|
CAS reģ. nr.
|
Testa diapazons (M)
|
|
References standarts
|
17β-estradiols
|
50-28-2
|
1*10-13 - 1*10-10
|
|
Pozitīvā kontrole (PC)
|
17α-metiltestosterons
|
58-18-4
|
3*10-6
|
|
Negatīvā kontrole (NC)
|
kortikosterons
|
50-22-6
|
1*10-8
|
2. tabula. References standarta, pozitīvās kontroles (PC) un negatīvās kontroles (NC) koncentrācijas antagonistu CALUX biotestam
|
|
Viela
|
CAS reģ. nr.
|
Testa diapazons (M)
|
|
References standarts
|
tamoksifēns
|
10540-29-1
|
3*10-9 - 1*10-5
|
|
Pozitīvā kontrole (PC)
|
4-hidroksitamoksifēns
|
68047-06-3
|
1*10-9
|
|
Negatīvā kontrole (NC)
|
resveratrols
|
501-36-0
|
1,0*10-5
|
3. tabula. Pieņemamības kritēriji agonistu ERα CALUX biotestam
|
A — atsevišķi paraugi platē
|
Kritērijs
|
|
1
|
Trīs atkārtojumu iedobju maksimālā %SN (NC, PC, katram testējamās ķimikālijas un references standarta atšķaidījumam, izņemot C0)
|
< 15 %
|
|
2
|
Trīs atkārtojumu iedobju maksimālā %SN (references standartam un testējamās ķimikālijas šķīdinātāja kontrolēm (C0, SC))
|
< 30 %
|
|
3
|
LDH maksimālā noplūde kā citotoksicitātes mērījums
|
< 120 %
|
|
B — vienā mikrotitrēšanas platē
|
|
|
4
|
Attiecība starp references standarta šķīdinātāja kontroli (C0; 1. plate) un testējamās ķimikālijas šķīdinātāja kontroli (SC; 2.–x. plate)
|
no 0,5 līdz 2,0
|
|
5
|
Attiecība starp apt. EC50 un references standarta augstāko koncentrāciju 1. platē un apt. EC50 un references standarta augstāko koncentrāciju 2.–x. platē (C4, C8)
|
no 0,70 līdz 1,30
|
|
6
|
Z faktors katrai platei
|
>0,6
|
|
C — analīžu vienā sērijā (visas plates vienā sērijā)
|
|
|
7
|
References standarta sigmoidāla līkne
|
Jā (17ß-estradiols)
|
|
8
|
References standarta (17ß-estradiols) EC50 diapazons
|
4 * 10-12–4 * 10-11 M
|
|
9
|
Augstākās 17ß-estradiola koncentrācijas minimālā vairākkāršā indukcija attiecībā uz references standarta šķīdinātāja kontroli
|
5
|
|
10
|
Relatīvā indukcija (%) PC
|
> 30 %
|
|
11
|
Relatīvā indukcija (%) NC
|
<10%
|
4. tabula. Pieņemamības kritēriji antagonistu ERα CALUX biotestam
|
A — atsevišķi paraugi platē
|
Kritērijs
|
|
1
|
Trīs atkārtojumu iedobju maksimālā %SN (NC, PC, katram testējamās ķimikālijas un references standarta atšķaidījumam, šķīdinātāja kontrolei (C0))
|
< 15 %
|
|
2
|
Trīs atkārtojumu iedobju maksimālā %SN (nesēja kontrolei (VC) un references standarta augstākajai koncentrācijai (C8))
|
< 30 %
|
|
3
|
LDH maksimālā noplūde kā citotoksicitātes mērījums
|
< 120 %
|
|
B — vienā mikrotitrēšanas platē
|
|
|
4
|
Attiecība starp references standarta šķīdinātāja kontroli (C0; 1. plate) un testējamās ķimikālijas šķīdinātāja kontroli (SC; 2.–x. plate)
|
no 0,70 līdz 1,30
|
|
5
|
Attiecība starp apt. IC50 references standarta koncentrāciju 1. platē un apt. IC50 references standarta koncentrāciju 2.–x. platē (C4)
|
no 0,70 līdz 1,30
|
|
6
|
Attiecība starp references standarta augstāko koncentrāciju 1. platē un references standarta augstāko koncentrāciju 2.–x. platē (C8)
|
no 0,50 līdz 2,0
|
|
7
|
Z faktors katrai platei
|
>0,6
|
|
C — analīžu vienā sērijā (visas plates vienā sērijā)
|
|
|
8
|
References standarta sigmoidāla līkne
|
Jā (tamoksifēns)
|
|
9
|
References standarta (tamoksifēns) IC50 diapazons
|
1*10-8 - 1*10-7 M
|
|
10
|
References standarta šķīdinātāja kontroles minimālā vairākkāršā indukcija attiecībā uz tamoksifēna augstāko koncentrāciju
|
2,5
|
|
11
|
Relatīvā indukcija (%) PC
|
<70 %
|
|
12
|
Relatīvā indukcija (%) NC
|
>85%
|
Šķīdinātāja/nesēja kontrole, references standarti, pozitīvās kontroles, negatīvās kontroles
23.Gan priekšskrīningā, gan visaptverošā testā jāizmanto viena un tā pati šķīdinātāja/nesēja kontrole, references standarti, pozitīvās kontroles un negatīvās kontroles. Arī references standartu, pozitīvo kontroļu un negatīvo kontroļu koncentrācijai jābūt tādai pašai.
Šķīdinātāja kontrole
24.Šķīdinātāju, kurā izšķīdina testējamo ķimikāliju, testē kā šķīdinātāja kontroli. ERα CALUX biotesta validēšanai kā nesēju izmantoja dimetilsulfoksīdu (DMSO, 1 % (tilpumkoncentrācija); CAS Nr. 67-68-5). Ja izmanto citu šķīdinātāju, nevis DMSO, visi references standarti, kontroles un testējamās ķimikālijas jātestē tajā pašā nesējā. Jāievēro, ka šķīdinātāja kontrole antagonistu pētījumiem satur noteiktas koncentrācijas agonistu references standartu 17β-estradiolu (aptuveni EC50 koncentrācija). Lai testētu antagonistu pētījumiem izmantojamo šķīdinātāju, jāsagatavo un jātestē nesēja kontrole.
Nesēja kontrole (antagonisms)
25.Lai testētu antagonismu, testa barotnei pievieno agonistu references standartu (17β-estradiolu) konstantā koncentrācijā (aptuveni EC50 koncentrācija). Lai noteiktu testējamo ķimikāliju izšķīdināšanai izmantojamā šķīdinātāja antagonismu, jāsagatavo testa barotne, kas nesatur agonistu references standartu (17β-estradiola) konstantā koncentrācijā. Šis kontroles paraugs paredzēts kā nesēja kontrole. Dimetilsulfoksīds (DMSO, 1% (tilp./tilp.); ERα CALUX biotesta validēšanai kā nesēju izmantoja dimetilsulfoksīdu (DMSO, 1 % (tilpumkoncentrācija); CAS Nr. 67-68-5). Ja izmanto citu šķīdinātāju, nevis DMSO, visi references standarti, kontroles un testējamās ķimikālijas jātestē tajā pašā nesējā.
Izmantojamie standarti
26.Agonistu references standarts ir 17β-estradiols (1. tabula). References standarts nozīmē 17β-estradiola astoņu koncentrāciju atšķaidījumu sēriju (1*10-13, 3*10-13, 1*10-12, 3*10-12, 6*10-12, 1*10-11, 3*10-11, 1*10-10 M).
27.Antagonistu references standarts ir tamoksifēns (2. tabula). References standarts nozīmē tamoksifēna astoņu koncentrāciju atšķaidījumu sēriju (3*10-09, 1*10-08, 3*10-08, 1*10-07, 3*10-07, 1*10-06, 3*10-06, 1*10-05 M). Antagonistu references standarta katru koncentrāciju inkubē kopā ar agonistu references standartu 17β-estradiolu konstantā koncentrācijā (3 * 10-12 M).
Pozitīvā kontrole
28.Pozitīvā kontrole agonistu pētījumiem ir 17α-metiltestosterons (1. tabula).
29.Pozitīvā kontrole antagonistu pētījumiem ir 4-hidroksitamoksifēns (2. tabula). Antagonistu pozitīvo kontroli inkubē kopā ar agonistu references standartu 17β-estradiolu konstantā koncentrācijā (3 * 10-12 M).
Negatīvā kontrole
30.Negatīvā kontrole agonistu pētījumiem ir kortikosterons (1. tabula).
31.Negatīvā kontrole antagonistu pētījumiem ir resveratrols (2. tabula). Antagonistu negatīvo kontroli inkubē kopā ar agonistu references standartu 17β-estradiolu konstantā koncentrācijā (3 * 10-12 M).
Laboratorijas kompetences pierādīšana (sk. 14. punktu un 3. un 4. tabulu šīs testēšanas metodes sadaļā “ER TA TESTA KOMPONENTI”)
Nesējs
32.Testējamo ķimikāliju izšķīdināšanai izmantojamajam šķīdinātājam pilnībā jāizšķīdina testējamā ķimikālija, un tam jābūt sajaucamam ar šūnu barotni. Piemēroti šķīdinātāji ir DMSO, ūdens un etanols (tīrība no 95 % līdz 100 %). Ja kā šķīdinātāju izmanto DMSO, inkubēšanas laikā DMSO maksimālā koncentrācija nedrīkst pārsniegt 1 % (tilpumkoncentrācija). Pirms lietošanas jāpārbauda, vai šķīdinātājs nav citotoksisks un neietekmē testa veikšanu.
References standartu, pozitīvo kontroļu, negatīvo kontroļu un testējamo ķimikāliju sagatavošana
33.References standartus, pozitīvās kontroles, negatīvās kontroles un testējamās ķimikālijas izšķīdina 100 % DMSO (vai piemērotā šķīdinātājā). Pēc tam tajā pašā šķīdinātājā sagatavo attiecīgus (sērijveida) atšķaidījumus. Pirms izšķīdināšanas jānogaida, līdz visas vielas sasilst līdz istabas temperatūrai. Svaigi sagatavotos references standartu, pozitīvo kontroļu, negatīvo kontroļu un testējamo ķimikāliju izejšķīdumos nedrīkst būt redzamas nogulsnes vai duļķes. References standartu un kontroļu izejšķīdumus var sagatavot lielā apjomā. Pirms katra eksperimenta jāsagatavo svaigi testējamo ķimikāliju izejšķīdumi. References standartu, pozitīvo kontroļu, negatīvo kontroļu un testējamo ķimikāliju galīgie atšķaidījumi katram eksperimentam jāsagatavo svaigi un jāizmanto 24 stundās pēc sagatavošanas.
Šķīdība, citotoksicitāte un diapazona noteikšana
34.Priekšskrīningā nosaka testējamo ķimikāliju šķīdību izvēlētajā šķīdinātājā. Sagatavo izejšķīdumu ar maksimālo koncentrāciju 0,1 M. Ja šādā koncentrācijā ir šķīdības problēmas, jāsagatavo mazākas koncentrācijas izejšķīdumi, līdz testējamās ķimikālijas izšķīst pilnībā. Priekšskrīningā testē testējamo ķimikāliju 1:10 sērijveida atšķaidījumus. Agonistu vai antagonistu testēšanā maksimālā testa koncentrācija ir 1 mM. Pēc priekšskrīninga iegūst precīzāku testējamo ķimikāliju koncentrāciju diapazonu, kas jātestē visaptverošajā testā. Visaptverošā testēšanā izmantojamajiem atšķaidījumiem jābūt 1x, 3x, 10x, 30x, 100x, 300x, 1000x un 3000x.
35.Agonistu un antagonistu testu protokolos ir ietverta citotoksicitātes testēšana (11). Citotoksicitātes testēšana ir iekļauta gan priekšskrīningā, gan visaptverošajā testā. ERα CALUX biotesta validēšanas laikā citotoksicitātes novērtēšanai izmantotā metode bija laktātdehidrogenāzes (LDH) noplūdes tests kombinācijā ar šūnu kvalitatīvu vizuālu pārbaudi (sk. 4.1. papildinājumu) pēc eksponēšanas testējamām ķimikālijām. Tomēr citotoksicitātes noteikšanai var izmantot citas kvantitatīvas metodes (piem., uz tetrazolu balstītu kolorimetrisko (MTT) testu vai citotoksicitātes CALUX biotestu). Parasti testējamo ķimikāliju koncentrācijas, pie kādām šūnu dzīvotspēja samazinās par vairāk nekā 20 %, uzskatāmas par citotoksiskām, tāpēc tās nav izmantojamas datu novērtēšanai. Attiecībā uz LDH noplūdes testu testējamās ķimikālijas koncentrācija uzskatāma par citotoksisku, ja LDH noplūdes procents ir lielāks par 120 %.
Eksponēšana testējamai ķimikālijai un izkārtojums testa platē
36.Pēc saplūdušu kultivētu šūnu kolbas tripsinizācijas šūnas atkārtoti suspendē 1 x 105 šūnas/ml bezestrogēna testa barotnē. Simts µl atkārtoti suspendētu šūnu uzsēj 96 iedobju mikrotitrēšanas plates iekšējās iedobēs. Ārējās iedobēs iepilda 200 µl fosfātu fizioloģiskā buferšķīduma (PBS) (sk. 1. un 2. attēlu). Uzsētās šūnas 24 stundas vispirms inkubē CO2 inkubatorā (5 % CO2, 37 °C, 100 % mitrums).
37.Pēc preinkubācijas plates vizuāli pārbauda, lai noteiktu citotoksicitāti (sk. 4.1. papildinājumu), kontamināciju un konfluenci. Testēšanai izmanto tikai tās plates, kurās nav redzamas citotoksicitātes un kontaminācijas un ir vismaz 85 % konfluences. No iekšējām iedobēm uzmanīgi izvada barotni, ko aizstāj ar 200 µl bezestrogēna testa barotnes, kas satur references standartu, testējamo ķimikāliju, pozitīvo kontroļu, negatīvo kontroļu un šķīdinātāja kontroļu attiecīgo atšķaidījumu sēriju (5. tabula: agonistu pētījumi; 6. tabula: antagonistu pētījumi). Visus references standartus, testējamās ķimikālijas, pozitīvās kontroles, negatīvās kontroles un šķīdinātāja kontroles testē trīs atkārtojumos. 1. attēlā redzams plates izkārtojums agonistu testēšanai. 2. attēlā redzams plates izkārtojums antagonistu testēšanai. Plates izkārtojums priekšskrīningā un visaptverošajā testēšanā ir vienāds. Antagonistu testēšanā visās iekšējās iedobēs, izņemot nesēja kontroles (VC) iedobes, ir arī agonistu references standarts (17β-estradiols) konstantā koncentrācijā (3 * 10-12 M). Jāievēro, ka katrā TC platē jāpievieno references standarti C8 un C4.
38.Pēc šūnu eksponēšanas visām ķimikālijām 96 iedobju mikrotitrēšanas plates jāinkubē vēl 24 stundas CO2 inkubatorā (5 % CO2, 37 °C, 100 % mitrums).
1. attēls. Izkārtojums 96 iedobju mikrotitrēšanas platēs priekšskrīningā un agonistiskās iedarbības novērtēšanā
2. attēls. Izkārtojums 96 iedobju mikrotitrēšanas platēs priekšskrīningā un antagonistiskās iedarbības novērtēšanā
Luminiscences mērīšana
39.Luminiscences mērīšana ir detalizēti aprakstīta agonistu un antagonistu testu protokolā (10). Barotne no iedobēm jāizvada, bet šūnas pēc 24 stundu inkubēšanas jālizē, lai atvērtu šūnas membrānu un varētu izmērīt luciferāzes aktivitāti.
40.Luminiscences izmērīšanai šajā procedūrā nepieciešams luminometrs ar 2 inžektoriem. Luciferāzes reakciju sāk, inžektējot substrāta luciferīnu. Reakciju pārtrauc, pievienojot 0,2 M NaOH. Reakciju pārtrauc, lai nepieļautu luminiscences pārnešanu no vienas iedobes citā.
41.No katras iedobes izstaroto gaismu izsaka kā relatīvās gaismas vienības (RLU) uz katru iedobi.
Priekšskrīnings
42.Priekšskrīninga analīzes rezultātus izmanto, lai noteiktu visaptverošajā testēšanā testējamo ķimikāliju precīzāku koncentrāciju diapazonu. Priekšskrīninga analīzes rezultātu novērtēšana un visaptverošajā testēšanā testējamo ķimikāliju precīzāka koncentrāciju diapazona noteikšana ir detalizēti aprakstīta agonistu un antagonistu testu protokolā (10). Šeit ir sniegts īss kopsavilkums par testējamo ķimikāliju precīzāka koncentrāciju diapazona noteikšanu agonistu un antagonistu testēšanā. Norādījumus par sērijveida atšķaidījumiem sk. 5. un 6. tabulā.
Koncentrāciju izvēle agonistiskās iedarbības novērtēšanai
43.Priekšskrīningā testējamās ķimikālijas jātestē, izmantojot 5. tabulā (agonisms) un 6. tabulā (antagonisms) norādītās atšķaidījumu sērijas. Visas koncentrācijas jātestē trīs atkārtojumu iedobēs atbilstoši 1. attēlā (agonisms) vai 2. attēlā (antagonisms) norādītajam plašu izkārtojumam.
44.Tikai pieņemamības kritērijiem atbilstoši analīzes rezultāti (3. tabula) uzskatāmi par derīgiem un izmantojami testējamo ķimikāliju atbildreakcijas novērtēšanai. Ja viena vai vairākas mikrotitrēšanas plates analīzes sērijā neatbilst pieņemamības kritērijiem, attiecīgās mikrotitrēšanas plates jāanalizē atkārtoti. Ja pirmā plate, kura satur visu references standarta atšķaidījumu sēriju, neatbilst pieņemamības kritērijiem, visa testa sērija (6 plates) jāanalizē atkārtoti.
45.Testējamo ķimikāliju sākotnējie koncentrāciju diapazoni jākoriģē un priekšskrīnings jāatkārto, ja:
-novēro citotoksicitāti. Priekšskrīninga procedūra jāatkārto ar testējamās ķimikālijas mazākām, necitotoksiskām koncentrācijām;
-testējamās ķimikālijas priekšskrīningā neiegūst pilnu devas–atbildreakcijas līkni, jo testētās koncentrācijas rada maksimālu indukciju. Priekšskrīnings jāatkārto ar mazākām testējamās ķimikālijas koncentrācijām.
46.Ja novēro derīgu, no devas atkarīgu atbildreakciju, jāizvēlas (mazākā) koncentrācija, kādā novēro maksimālo indukciju un nenovēro citotoksicitāti. Testējamās ķimikālijas augstākajai koncentrācijai, kas jātestē visaptverošajā testā, jābūt 3 reizes lielākai par šo izvēlēto koncentrāciju.
47.Testējamās ķimikālijas visa precīzāku atšķaidījumu sērija jāsagatavo atbilstoši 5. tabulā norādītajiem atšķaidīšanas etapiem, sākot ar minēto augstāko koncentrāciju.
48.Testējamā ķimikālija, kas neizraisa nekādu agonistisku iedarbību, jātestē visaptverošajos testos, sākot ar augstāko necitotoksisko koncentrāciju, kas konstatēta priekšskrīningā.
Koncentrāciju izvēle antagonistiskās iedarbības novērtēšanai
49.Tikai pieņemamības kritērijiem atbilstoši analīzes rezultāti (4. tabula) uzskatāmi par derīgiem un izmantojami testējamo ķimikāliju atbildreakcijas novērtēšanai. Ja viena vai vairākas mikrotitrēšanas plates analīzes sērijā neatbilst pieņemamības kritērijiem, attiecīgās mikrotitrēšanas plates jāanalizē atkārtoti. Ja pirmā plate, kura satur visu references standarta atšķaidījumu sēriju, neatbilst pieņemamības kritērijiem, visa testa sērija (6 plates) jāanalizē atkārtoti.
50.Testējamo ķimikāliju sākotnējie koncentrāciju diapazoni jākoriģē un priekšskrīnings jāatkārto, ja:
-novēro citotoksicitāti. Priekšskrīninga procedūra jāatkārto ar testējamās ķimikālijas mazākām, necitotoksiskām koncentrācijām;
-testējamās ķimikālijas priekšskrīningā neiegūst pilnu devas–atbildreakcijas līkni, jo testētās koncentrācijas rada maksimālu inhibīciju. Priekšskrīnings jāatkārto ar mazākām testējamās ķimikālijas koncentrācijām.
51.Ja novēro derīgu, no devas atkarīgu atbildreakciju, jāizvēlas (mazākā) koncentrācija, kādā novēro maksimālo inhibīciju un nenovēro citotoksicitāti. Testējamās ķimikālijas augstākajai koncentrācijai, kas jātestē visaptverošajā testā, jābūt 3 reizes lielākai par šo izvēlēto koncentrāciju.
52.Testējamās ķimikālijas visa precīzāku atšķaidījumu sērija jāsagatavo atbilstoši 6. tabulā norādītajiem atšķaidīšanas etapiem, sākot ar minēto augstāko koncentrāciju.
53.Testējamā ķimikālija, kas neizraisa nekādu antagonistisku iedarbību, jātestē visaptverošajos testos, sākot ar augstāko necitotoksisko koncentrāciju, kas konstatēta priekšskrīningā..
Visaptverošie testi
54.Kad noteikts precīzākais koncentrāciju diapazons, testējamās ķimikālijas jātestē visaptverošajā testā, izmantojot 5. tabulā (agonisms) un 6. tabulā (antagonisms) norādītās atšķaidījumu sērijas. Visas koncentrācijas jātestē trīs atkārtojumu iedobēs atbilstoši 1. attēlā (agonisms) vai 2. attēlā (antagonisms) norādītajam plašu izkārtojumam.
55.Tikai pieņemamības kritērijiem atbilstoši analīzes rezultāti (3.un 4. tabula) uzskatāmi par derīgiem un izmantojami testējamo ķimikāliju atbildreakcijas novērtēšanai. Ja viena vai vairākas mikrotitrēšanas plates analīzes sērijā neatbilst pieņemamības kritērijiem, attiecīgās mikrotitrēšanas plates jāanalizē atkārtoti. Ja pirmā plate, kura satur visu references standarta atšķaidījumu sēriju, neatbilst pieņemamības kritērijiem, visa testa sērija (6 plates) jāanalizē atkārtoti.
5. tabula. References standartu, kontroļu un testējamo ķimikāliju koncentrācija un atšķaidījumi, ko izmanto agonistu testēšanā
|
References standarts 17β-estradiols
|
TCx — priekšskrīnings
|
TCx — visaptverošais tests
|
Kontroles
|
|
konc. (M)
|
atšķaidījums
|
atšķaidījums
|
konc. (M)
|
|
C0
|
0
|
TCx-1
|
10 000 000 x
|
TCx-1
|
3 000 x
|
PC
|
3*10-6
|
|
C1
|
1*10-13
|
TCx-2
|
1 000 000 x
|
TCx-2
|
1000 x
|
NC:
|
1*10-8
|
|
C2
|
3*10-13
|
TCx-3
|
100 000 x
|
TCx-3
|
300 x
|
C0
|
0
|
|
C3
|
1*10-12
|
TCx-4
|
10 000 x
|
TCx-4
|
100 x
|
SC
|
0
|
|
C4
|
3*10-12
|
TCx-5
|
1 000 x
|
TCx-5
|
30 x
|
|
|
|
C5
|
6*10-12
|
TCx-6
|
100 x
|
TCx-6
|
10 x
|
|
|
|
C6
|
1*10-11
|
TCx-7
|
10 x
|
TCx-7
|
3 x
|
|
|
|
C7
|
3*10-11
|
TCx-8
|
1 x
|
TCx-8
|
1 x
|
|
|
|
C8
|
1*10-10
|
|
|
|
|
|
|
6. tabula. References standartu, kontroļu un testējamo ķimikāliju koncentrācija un atšķaidījumi, ko izmanto antagonistu testēšanā
|
References standarts tamoksifēns
|
TCx — priekšskrīnings
|
TCx — visaptverošais tests
|
Kontroles
|
|
konc. (M)
|
atšķaidījums
|
atšķaidījums
|
konc. (M)
|
|
C0
|
0
|
TCx-1
|
10 000 000 x
|
TCx-1
|
3 000 x
|
PC
|
1*10-9
|
|
C1
|
3*10-9
|
TCx-2
|
1 000 000 x
|
TCx-2
|
1 000 x
|
NC:
|
1*10-5
|
|
C2
|
1*10-8
|
TCx-3
|
100 000 x
|
TCx-3
|
300 x
|
C0
|
0
|
|
C3
|
3*10-8
|
TCx-4
|
10 000 x
|
TCx-4
|
100 x
|
SC
|
0
|
|
C4
|
1*10-7
|
TCx-5
|
1 000 x
|
TCx-5
|
30 x
|
|
|
|
C5
|
3*10-7
|
TCx-6
|
100 x
|
TCx-6
|
10 x
|
Pievienotais agonists
|
|
C6
|
1*10-6
|
TCx-7
|
10 x
|
TCx-7
|
3 x
|
konc. (M)
|
|
C7
|
3*10-6
|
TCx-8
|
1 x
|
TCx-8
|
1 x
|
17β-estradiols
|
3*10-12
|
|
C8
|
1*10-5
|
|
|
|
|
|
|
Datu apkopošana un datu analīze
56.Agonistu testēšana: [pēc priekšskrīninga un visaptverošajiem testiem nosaka testējamās ķimikālijas EC10, EC50, PC10, PC50 un maksimālo indukciju (TCxmax). Antagonistu testēšana: aprēķina IC20, IC50, PC80, PC50 un minimālo indukciju (TCxmin). 3. attēlā (agonisms) un 4. attēlā (antagonisms) šie parametri attēloti grafiski. Nepieciešamos parametrus aprēķina, pamatojoties uz katras testējamās ķimikālijas relatīvo indukciju (attiecībā pret references standarta maksimālo indukciju (= 100 %)). Datu novērtēšanai jāizmanto nelineārā regresija (mainīgs slīpums, 4 parametri) atbilstoši šim vienādojumam:
57.Neapstrādātie dati no luminometra, kas izteikti kā relatīvās gaismas vienības (RLU), jāpārsūta uz priekšskrīningam un visaptverošajam testam īpaši izveidotu izklājlapas veidni. Neapstrādātajiem datiem jāatbilst 3.A un 3.B tabulā (agonisms) vai 4.A un 4.B tabulā (antagonisms) norādītajiem pieņemamības kritērijiem. Ja neapstrādātie dati atbilst pieņemamības kritērijiem, nepieciešamo parametru noteikšanai veic tālāk aprakstītos aprēķinus.
Agonisms
-References standarta šķīdinātāja kontroles vidējo RLU atņem no neapstrādātajiem atsauces datiem par references standartiem.
-Testējamās ķimikālijas šķīdinātāja kontroles vidējo RLU atņem no neapstrādātajiem datiem par testējamo ķimikāliju.
-Aprēķina references standarta katras koncentrācijas relatīvo indukciju. References standarta augstākās koncentrācijas indukcija ir 100 %.
-Aprēķina testējamās ķimikālijas katras koncentrācijas relatīvo indukciju salīdzinājumā ar references standarta augstāko koncentrāciju 100 %.
-Pēc nelineārās regresijas (mainīgs slīpums, 4 parametri) novērtē analīzes rezultātus.
-Nosaka references standarta EC50 un EC10.
-Nosaka testējamo ķimikāliju EC50 un EC10.
-Nosaka testējamās ķimikālijas maksimālo relatīvo indukciju (TCmax).
-Nosaka testējamo ķimikāliju PC10 un PC50.
Testējamām ķimikālijām ne vienmēr var iegūt pilnu devas–atbildreakcijas līkni, piem., citotoksicitātes vai šķīdības problēmu dēļ. Tad nav iespējams noteikt arī EC50, EC10 un PC50. Tādos gadījumos iespējams noteikt tikai PC10 un TCmax.
Antagonisms
-References standarta augstākās koncentrācijas vidējo RLU atņem no neapstrādātajiem atsauces datiem par references standartiem.
-References standarta augstākās koncentrācijas vidējo RLU atņem no neapstrādātajiem atsauces datiem par testējamām ķimikālijām.
-Aprēķina references standarta katras koncentrācijas relatīvo indukciju. References standarta zemākās koncentrācijas indukcija ir 100 %.
-Aprēķina testējamās ķimikālijas katras koncentrācijas relatīvo indukciju salīdzinājumā ar references standarta zemāko koncentrāciju 100 %.
-Pēc nelineārās regresijas (mainīgs slīpums, 4 parametri) novērtē analīzes rezultātus.
-Nosaka references standarta IC50 un IC20.
-Nosaka testējamo ķimikāliju IC50 un IC20.
-Nosaka testējamās ķimikālijas minimālo relatīvo indukciju (TCmin).
-Nosaka testējamo ķimikāliju PC80 un PC50.
3. attēls. Pārskats par agonistu testā noteiktajiem parametriem
4. attēls. Pārskats par antagonistu testā noteiktajiem parametriem
Testējamām ķimikālijām ne vienmēr var iegūt pilnu devas–atbildreakcijas līkni, piem., citotoksicitātes vai šķīdības problēmu dēļ. Tad nav iespējams noteikt arī IC50, IC20 un PC50. Tādos gadījumos iespējams noteikt tikai PC20 un TCmin.
58.Rezultātu pamatā ir divas (vai trīs) neatkarīgas izpildes reizes. Ja divās izpildes reizēs tiek iegūti salīdzināmi un līdz ar to reproducējami rezultāti, nav nepieciešams testu izpildīt vēl trešo reizi. Rezultāti ir pieņemami, ja tie:
-atbilst pieņemamības kritērijiem (sk. 14.–22. punktu sadaļā “Pieņemamības kritēriji”);
-ir reproducējami.
Datu interpretācijas kritēriji
59.Interpretējot datus un lemjot, vai testējamā ķimikālija ir pozitīva vai negatīva, jāizmanto tālāk aprakstītie kritēriji.
Agonisms
Katrā visaptverošajā testā testējamo ķimikāliju uzskata par pozitīvu, ja:
1
TCmax ir vienāda ar vai lielāka par 10 % no references standarta maksimālās atbildreakcijas (REF10).
2
Vismaz 2 secīgas testējamās ķimikālijas koncentrācijas ir vienādas ar vai lielākas par REF10.
Katrā visaptverošajā testā testējamo ķimikāliju uzskata par negatīvu, ja:
1
TCmax nepārsniedz 10 % no references standarta maksimālās atbildreakcijas (REF10);
2
mazāk nekā 2 testējamās ķimikālijas koncentrācijas ir vienādas ar vai lielākas par REF10.
Antagonisms
Katrā visaptverošajā testā testējamo ķimikāliju uzskata par pozitīvu, ja:
1
TCmin ir vienāda ar vai mazāka par 80% no references standarta maksimālās atbildreakcijas (REF80 = 20% inhibīcija).
2
Vismaz 2 secīgas testējamās ķimikālijas koncentrācijas ir vienādas ar vai mazākas par REF80.
Katrā visaptverošajā testā testējamo ķimikāliju uzskata par negatīvu, ja:
1
TCmin pārsniedz 80% no references standarta maksimālās atbildreakcijas (REF80 = 20% inhibīcija).
2
Mazāk nekā 2 testējamās ķimikālijas koncentrācijas ir vienādas ar vai lielākas par REF80.
60.Lai raksturotu testējamās ķimikālijas pozitīvās atbildreakcijas potenci, apskata šādus parametrus: ietekmes intensitāte (agonisms: TCmax; antagonisms: TCmin) un koncentrācija, pie kuras novērojama ietekme (agonisms: EC10, EC50, PC10, PC50; antagonisms: IC20, IC50, PC80, PC50).
TESTĒŠANAS PĀRSKATS
61.Sk. 20. punktu sadaļā “ER TA TESTA KOMPONENTI”.
LITERATŪRA
(1)OECD (2016). Draft Validation report of the (anti-) ERα CALUX bioassay - transactivation bioassay for the detection of compounds with (anti)estrogenic potential. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 240). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris
(2)
Sonneveld E
,
Jansen HJ
,
Riteco JA
,
Brouwer A
,
van der Burg B
. (2005). Development of androgen- and estrogen-responsive bioassays, members of a panel of human cell line-based highly selective steroid-responsive bioassays.
Toxicol Sci.
83(1), 136-148.
(3)Quaedackers ME, van den Brink CE, Wissink S, Schreurs RHMM, Gustafsson JA, van der Saag PT, and van der Burg B. (2001). 4-Hydroxytamoxifen trans-represses nuclear factor-kB Activity in human osteoblastic U2OS cells through estrogen receptor (ER)α and not through ERβ. Endocrinology 142(3), 1156-1166.
(4)Thorne N, Inglese J and Auld DS. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other
Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology, Chemistry and Biology17(6):646-57.
(5)
Escande A
,
Pillon A
,
Servant N
,
Cravedi JP
,
Larrea F
,
Muhn P
,
Nicolas JC
,
Cavaillès V
and
Balaguer P
. (2006). Evaluation of ligand selectivity using reporter cell lines stably expressing estrogen receptor alpha or beta. Biochem. Pharmacol., 71, 1459-1469.
(6)
Kuiper GG
,
Lemmen JG
,
Carlsson B
,
Corton JC
,
Safe SH
,
van der Saag PT
,
van der Burg B
and
Gustafsson JA
. (1998). Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor beta. Endocrinol., 139, 4252-4263.
(7)Sotoca AM, Bovee TFH, Brand W, Velikova N, Boeren S, Murk AJ, Vervoort J, Rietjens IMCM. (2010). Superinduction of estrogen receptor mediated gene expression in luciferase based reporter gene assays is mediated by a post-transcriptional mechanism. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol., 122, 204–211.
(8)Sonneveld E, Riteco JAC, Jansen HJ, Pieterse B, Brouwer A, Schoonen WG, and van der Burg B. (2006). Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci., 89(1), 173–187.
(9)
Kobayashi H
,
Yamamoto K
,
Eguchi M
,
Kubo M
,
Nakagami S
,
Wakisaka S
,
Kaizuka M
and
Ishii H
. (1995). Rapid detection of mycoplasma contamination in cell cultures by enzymatic detection of polymerase chain reaction (PCR) products. J. Vet. Med. Sci., 57(4), 769-771.
(10)Zhang J-H, Chung TDY, and Oldenburg KR. (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throuphut screening assays. J. Biomol. Scr., 4, 67-73
(11)Besselink H, Middelhof I, and Felzel, E. (2014). Transactivation assay for the detection of compounds with (anti)estrogenic potential using ERα CALUX cells. BioDetection Systems BV (BDS). Amsterdam, the Netherlands.
4.1. papildinājums. Šūnu dzīvotspējas vizuāla pārbaude
|
Konfluence < 5 %. Šūnas ir tikko uzsētas. Šūnu dzīvotspēja 100 %.
Klasifikācija “citotoksicitātes nav”.
|
|
Konfluence > 85 %. Šajā posmā šūnas ir eksponētas testējamām ķimikālijām. Šūnu dzīvotspēja 95 %.
Klasifikācija “citotoksicitātes nav”.
|
|
Konfluence > 95 %. Šūnas ir blīvi saspiedušās un sāk pāraugt. Šūnu dzīvotspēja 95 %.
Klasifikācija “citotoksicitātes nav”.
|
|
Šūnu dzīvotspēja 25 %. Šūnas atdalās, un saskare starp šūnām samazinās. Šūnas ir noapaļotas. Klasifikācija “citotoksicitāte”.
|
|
Šūnu dzīvotspēja 5 %. Šūnas ir pavisam atdalījušās, un nesaskaras. Šūnas ir noapaļotas. Klasifikācija “citotoksicitāte”.
|
|
|
|
|
|
B.67. ZĪDĪTĀJU ŠŪNU GĒNU MUTĀCIJU IN VITRO TESTI AR TIMIDĪNKINĀZES GĒNU
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO Testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 490 (2016) aprakstītajam. Testēšanas metodes tiek pastāvīgi pārskatītas zinātnes sasniegumu, normatīvo prasību un dzīvnieku labturības apsvērumu gaismā. Peļu limfomas ķīmiskā analīze (MLA) un TK6 tests ar timidīnkināzes (TK) lokusu sākotnēji bija iekļauti B.17. testēšanas metodē. Vēlāk Genotoksiskuma testēšanas starptautiskā darbsemināra (IWGT) MLA ekspertu darbgrupa sagatavoja starptautiski saskaņotus ieteikumus par MLA ķīmiskās analīzes pieņemamības kritērijiem un datu interpretēšanu (1)(2)(3)(4)(5), un minētie ieteikumi ir iestrādāti šajā jaunajā, B.67. testēšanas metodē. Šī testēšanas metode ir paredzēta MLA un – tā kā tajā izmanto TK lokusu – arī TK6 testam. MLA jau iepriekš plaši izmantota normatīvām vajadzībām, bet TK6 lietots daudz retāk. Lai gan abu šūnu līniju beigupunkti ir līdzīgi, tās nav savstarpēji aizstājamas, un normatīvajās programmās var būt pamatoti dota priekšroka vienas vai otras līnijas izmantošanai kādai konkrētai normatīvai vajadzībai. Piemēram, MLA validācijā pierādījās, ka tā ir piemērota, lai detektētu ne tikai gēnu mutāciju, bet arī testējamās ķimikālijas spēju inducēt strukturālus hromosomu bojājumus. Šī testēšanas metode pieder pie ģenētiski toksikoloģiskās testēšanas metožu sērijas. ESAO nesen izstrādājusi dokumentu, kas īsi informē par ģenētiski toksikoloģisko testēšanu un sniedz pārskatu par neseniem ESAO ģenētiskā toksiskuma testēšanas vadlīniju grozījumiem (6).
2.Šā zīdītāju šūnu gēnu mutāciju in vitro testa nolūks ir detektēt ķimikāliju izraisītas gēnu mutācijas. Ar šajos testos izmantotajām šūnu līnijām mēra turpvērstas reportiergēnu mutācijas endogēniskajā timidīnkināzes gēnā (cilvēka šūnu TK un grauzēju šūnu Tk; šajā testēšanas metodē abi dēvēti par TK). Šo testēšanas metodi paredzēts izmantot ar divām šūnu līnijām, proti, L5178Y TK+/--3.7.2C peļu limfomas šūnu līniju (vispārīgais nosaukums L5178Y) un TK6 cilvēka limfoblastoīdo šūnu līniju (vispārīgais nosaukums TK6). Kaut arī abas šūnu līnijas atšķiras izcelsmes, šūnu augšanas, p53 statusa un citādā ziņā, TK gēnu mutācijas testēšanu abu tipu šūnās ir iespējams veikt līdzīgā veidā, kas aprakstīts šajā testēšanas metodē.
3.Timidīnkināzes gēna autosomālā un heterozigotiskā iedaba ļauj detektēt dzīvotspējīgas kolonijas, kuru šūnās pēc mutācijas no TK+/- uz TK-/- timidīnkināzes ferments vairs neizpaužas. Šo neesību var radīt TK gēnu ietekmējoši ģenētiski notikumi, un to vidū var būt kā gēnu mutācijas (punktveida mutācijas, nolasīšanas fāzes nobīdes mutācijas, sīkas delēcijas u. c.), tā hromosomāli notikumi (plašas delēcijas, strukturālas hromosomu aberācijas un mitotiskā rekombinācija). Pēdējie minētie notikumi izpaužas kā heterozigotitātes zudums, un cilvēka kanceroģenēzē tā ir parasta ģenētiska tumorsupresorgēnu pārmaiņa. Teorētiski ar MLA ir iespējams detektēt pilnīgu TK nesējas hromosomas zudumu dalīšanās vārpstas traucējumu un/vai mitotiskas neizšķiršanās ietekmē. Citoģenētiskā un molekulārā analīze, izmantotas kopā, skaidri parāda, ka daļa MLA TK mutantu ir neizšķiršanās rezultāts. Tomēr pierādījumu svars rāda, ka, piemērojot citotoksicitātes standartkritērijus (aprakstīti šajā testēšanas metodē), ar TK gēnu mutācijas testiem nav iespējams uzticami detektēt aneigēnus, un tāpēc šie testi aneigēnu detektēšanai nav piemēroti (7)(8)(9).
4.TK gēnu mutācijas testos tiek ģenerēti divām atšķirīgām fenotipiskajām klasēm piederīgi TK mutanti: normāli augošie mutanti, kas aug tikpat ātri kā TK heterozigotiskās šūnas, un lēnaudzīgie mutanti, kuru augšanu raksturo pagarināts dubultošanās laiks. Normāli augošie un lēnaudzīgie mutanti MLA tiek saukti attiecīgi par lielo un mazo koloniju mutantiem, bet TK6 – par agrīno un vēlīno koloniju mutantiem. Lielo un mazo koloniju MLA mutantu molekulārās un citoģenētiskās īpašības ir sīki izpētītas (8)(10)(11)(12)(13). Visnotaļ sīki pētītas arī agrīno un vēlīno TK6 mutantu molekulārās un citoģenētiskās īpašības (14)(15)(16)(17). Abu šūnu tipu lēnaudzīgos mutantus ietekmējuši ģenētiski bojājumi, kuri izpaužas ar augšanu regulējošu varbūtīgu gēnu vai gēniem TK lokusa tuvumā un kuru rezultāts ir ilgāks dubultošanās laiks un vēlīno jeb mazo koloniju veidošanās (18). Lēnaudzīgo mutantu inducēšana tiek saistīta ar ķimikālijām, kas inducē plašas strukturālas izmaiņas hromosomālā līmenī. Šūnas, kuru bojājumi neizpaužas ar augšanu regulējošu varbūtīgu gēnu vai gēniem TK lokusa tuvumā, aug līdzīgā ātrumā kā vecākšūnas un kļūst par normāli augošiem mutantiem. Tādu mutantu inducēšana, kuri aug galvenokārt normāli, tiek saistīta ar ķimikālijām, kas iedarbojas galvenokārt kā punktveida mutagēni. Tāpēc ir svarīgi pieskaitīt gan lēnaudzīgos, gan normāli augošos mutantus, lai tādā veidā apzinātu tos visus un iegūtu priekšstatu par testējamās ķimikālijas inducēto bojājumu tipu vai tipiem (mutagēni / klastogēni) (10)(12)(18)(19).
5.Šis testēšanas metodes apraksts strukturēts tā, lai dotu vispārīgu informāciju, kas attiecas gan uz MLA, gan uz TK6, un pēc tam sīkākas vadlīnijas par katru atsevišķo testu.
6.Izmantotās definīcijas sniegtas 1. pielikumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI
7.In vitro testos metaboliskai aktivācijai parasti jāizmanto eksogēnisks avots. Eksogēniskā metaboliskās aktivācijas sistēma in vivo apstākļus atdarina nepilnīgi.
8.Būtu jāraugās, lai nerodas tādi apstākļi (proti, varbūtēja mijiedarbība ar testa sistēmu), kas noved pie artefaktuāli pozitīviem rezultātiem, kurus nerada testējamās ķimikālijas un šūnas ģenētiskā materiāla mijiedarbība; pie tādiem apstākļiem pieder arī pH vai osmolalitātes pārmaiņas, mijiedarbība ar barotnes sastāvdaļām (20)(21) vai pārāk augsti citotoksicitātes līmeņi (22)(23)(24). MLA un TK6 testā par pārāk augstiem uzskata līmeņus, kas pārsniedz 28. punktā definētos ieteicamos augšējos citotoksicitātes līmeņus. Turklāt jāatzīmē, ka testējamās vielas, kuras ir timidīna analogi vai iedarbojas kā timidīna analogi, šūnu apstrādes laikā var izraisīt spontānu fona mutantu selektīvu augšanu un tādējādi palielināt mutantu biežumu, tāpēc šo vielu adekvātas izvērtēšanas labad jāizmanto papildu testēšanas metodes (25).
9.Attiecībā uz nanomateriāliem, kas iegūti ar inženierijas paņēmieniem, šo testēšanas metodi var būt vajadzīgs pielāgot, taču tas šeit nav konkrēti aprakstīts.
10.Pirms šo testēšanas metodi izmantot maisījuma testēšanai nolūkā iegūt datus kādam normatīvam mērķim, jāapsver, vai un kādā veidā tā varētu dot minētajam mērķim piemērotus rezultātus. Ja pastāv normatīva prasība maisījumu testēt, šāda apsvēršana nav vajadzīga.
11.Mutantšūnas, kurās pēc mutācijas no TK+/- uz TK-/- vairs neizpaužas timidīnkināzes fermentatīvā darbība, ir rezistentas pret pirimidīna analoga trifluortimidīna (TFT) citostatisko iedarbību. TK standartšūnas ir jutīgas pret TFT, kas izraisa šūnu metabolisma inhibēšanu un aptur šūnu turpmāko dalīšanos. Tātad mutantšūnas TFT klātbūtnē spēj proliferēt un veidot redzamas kolonijas, turpretī TK fermentu saturošās šūnas to nespēj.
TESTA PRINCIPS
12.Šūnas, kas ir suspensijā, uz piemērotu laiku (sk. 33. punktu) gan ar eksogēnisku metaboliskas aktivācijas avotu, gan bez tā (sk. 19. punktu) eksponē testējamajai ķimikālijai un pēc tam subkultivē, lai noteiktu citotoksicitāti un lai pirms mutantu atlasīšanas varētu notikt fenotipiskā ekspresija. Citotoksicitāti nosaka pēc relatīvā kopējā pieauguma (RTG; sk. 25. punktu) MLA gadījumā un pēc relatīvās izdzīvotības (RS; sk. 26. punktu) TK6 gadījumā. Lai inducēto mutāciju fenotipiskā ekspresija varētu izpausties gandrīz optimāli, apstrādātās kultūras barotnē tur pietiekami ilgu laiku, kas ir raksturīgs katram izvēlētajam šūnu tipam (sk. 37. punktu). Kad notikusi fenotipiskā ekspresija, nosaka mutantu biežumu, noteiktu skaitu šūnu izsējot barotnē, kas satur selektīvo aģentu, ar kuru detektē mutantkolonijas, un barotnē bez selektīvā aģenta, pēc kuras nosaka klonēšanās efektivitāti (dzīvotspēju). Pēc piemērota inkubēšanas laika kolonijas saskaita. Mutantu biežumu aprēķina pēc mutantkoloniju skaita, ko koriģē ar klonēšanās efektivitāti mutantu atlasīšanas brīdī.
METODES APRAKSTS
Preparāti
Šūnas
13.Attiecībā uz MLA: tā kā MLA ir izstrādāta un aprakstīta, izmantojot L5178Y šūnu TK+/- -3.7.2C apakšlīniju, jāņem šī konkrētā apakšlīnija. L5178Y šūnu līnija tikusi atvasināta no DBA-2 peļu timīnās limfomas, kas inducēta ar metilholantrēnu (26). Clive un līdzstrādnieki L5178Y šūnas (Clive klasificētas kā TK+/+ -3) apstrādāja ar etilmetāna sulfonātu un izolēja TK-/- (klasificēta kā TK-/- -3.7) klonu, par selektīvo aģentu izmantojot bromdeoksiuridīnu. No TK-/- tika izolēts un izmantošanai MLA aprakstīts spontāns TK+/- klons (klasificēts kā TK+/- -3.7.2.) un apakšklons (klasificēts kā TK+/--3.7.2C) (27). Šīs šūnu līnijas kariotips tika publicēts (28)(29)(30)(31). Tā modālais hromosomu skaits ir 40. Ir viena metacentriska hromosoma (t12 13), kas būtu jāpieskaita kā viena hromosoma. Peļu TK lokuss atrodas 11. hromosomas distālajā galā. L5178Y TK+/- -3.7.2C šūnu līnijai mutācijas ir abās p53 alēlēs, un tā rada p53 mutantproteīnu (32)(33). Visdrīzāk TK+/--3.7.2C šūnu līnijas p53 statuss ir tas, kas nosaka, cik labi tests spēj detektēt plašus bojājumus (17).
14.Attiecībā uz TK6: TK6 ir cilvēka limfoblastoīdo šūnu līnija. Vecākšūnu līnija ir Epstein–Barr vīrusa transformēta šūnu līnija, WI-L2, sākotnēji iegūta no piecgadīga zēna, kurš sirga ar pārmantotu sferocitozi. Pirmo izolēto klonu, HH4, mutagenizēja ar ICR191, un rezultātā ieguva TK heterozigotisku šūnu līniju, TK6 (34). TK6 šūnas ir gandrīz diploīdas, un reprezentatīvais kariotips ir 47, XY, 13+, t(14; 20), t(3; 21) (35). Cilvēka TK lokuss atrodas 17. hromosomas garajā plecā. TK6 ir p53 ziņā kompetenta šūnu līnija, jo tai abās alēlēs ir savvaļas tipa p53 sekvence un ekspresijā – tikai savvaļas tipa p53 proteīns (53).
15.Kad testēšanas laboratorija veic izejkultūras veidošanu vai papildināšanu, gan MLA, gan TK6 gadījumā ieteicams nodrošināt, ka nav kontaminācijas ar Mycoplasma, noteikt šūnu kariotipu vai iekrāsot TK lokusu nesošās hromosomas un pārbaudīt populāciju dubultošanās laikus. Jānosaka, kāds ir testēšanas laboratorijā izmantoto šūnu normālais šūnas cikla ilgums, un tam jāsakrīt ar publicētajiem šūnu raksturlielumiem (16)(19)(37). Šī izejkultūra jāglabā -150 oC vai zemākā temperatūrā, un no tās gatavojamas visas šūnu darbkultūras.
16.Pirms ar krioprezervācijas palīdzību lielā skaitā veidot darbkultūras vai vienkārši pirms kultūras izmantošanas eksperimentā tā var būt jāattīra no iepriekš pastāvošajām mutantšūnām [, izņemot tad, ja šķīdinātāja kontrolē mutantu biežums (MF) jau tolaik ir pieņemamā diapazonā (attiecībā uz MLA sk. 2. tabulu)]. Tas darāms, izmantojot metotreksātu (
aminopterīnu
), lai šūnas, kurās TK neizpaužas, tiktu negatīvi atlasītas, un pievienojot kultūrai timidīnu, hipoksantīnu un glicīnu (L5178Y) vai 2’-deoksicitidīnu (TK6), lai tādā veidā nodrošinātu TK ziņā kompetento šūnu optimālu augšanu (19)(38)(39), TK6 gadījumā (40). Vispārīgus ieteikumus par labu praksi šūnu kultūru uzturēšanā, kā arī ieteikumus konkrēti par L5178Y un TK6 šūnām skatīt (19)(31)(37)(39)(41). Laboratorijām, kam šūnu izejkultūras vajadzīgas MLA vai TK6 iniciēšanas nolūkiem vai kam vajadzīgas jaunas šūnu izejkultūras, ir pieejams labi aprakstītu šūnu repozitorijs (37).
Barotne un kultivēšanas apstākļi
17.Abos testos kultūru uzturēšanai jāizmanto attiecīgas barotnes un attiecīgi inkubācijas apstākļi (piem., kultivēšanas trauki, mitrināta atmosfēra ar CO2 koncentrāciju 5 %, inkubācijas temperatūra 37 °C). Šūnu kultūras vienmēr jātur tādos apstākļos, lai būtu nodrošināts, ka augšana notiek eksponenciālā fāzē. Īpaši svarīgi ir izraudzīties tādu barotni un tādus kultivēšanas apstākļus, kuri nodrošina šūnu optimālu augšanu ekspresijas periodā un gan mutantšūnu, gan nemutējušo šūnu klonēšanos. Gan MLA, gan TK6 gadījumā svarīgi ir arī tas, lai kultivēšanas apstākļi nodrošinātu optimālu augšanu kā lielo/agrīno, tā mazo/vēlīno koloniju TK mutantiem. Vairāk par kultivēšanu, arī par vajadzību pienācīgi termiski inaktivēt zirgu serumu, ja mutantu atlasē tiek izmantota RPMI barotne, skatīt (19)(31)(38)(39)(40)(42).
Kultūru sagatavošana
18.No izejkultūrām tiek pavairotas šūnas, tās iesētas kultūras barotnē tādā blīvumā, lai apstrādes periodā un ekspresijas periodā kultūras suspensijās joprojām augtu eksponenciāli.
Metaboliskā aktivācija
19.Ja strādā ar L5178Y un TK6 šūnām – to endogēniskā metaboliskā kapacitāte nav pietiekama –, jāizmanto eksogēniskas metaboliskās aktivācijas sistēmas. Visplašāk izmantotā sistēma, kuru iesaka izmantot pēc noklusējuma, ja vien nav pamata izmantot citu, ir ar kofaktoru papildināta postmitohondriālā frakcija (S9) no grauzēju (parasti žurku) aknām, kas apstrādātas ar fermentus inducējošām vielām, piemēram, Aroclor 1254 (43)(44)(45) vai fenobarbitālu kombinācijā ar β-naftoflavonu (46)(47)(48)(49)(50)(51). Pēdējā minētā kombinācija nav pretrunā ar Stokholmas Konvenciju par noturīgajiem organiskajiem piesārņotājiem (52) un izrādījusies tikpat produktīva jauktas funkcijas oksidāžu inducētāja kā Aroclor 1254 (45)(46)(47)(48)(49). S9 frakciju parasti izmanto 1–2 % tilpumkoncentrācijā, bet galīgajā testa barotnē tilpumkoncentrāciju var palielināt līdz 10 %. Eksogēnās metaboliskās aktivācijas sistēmas vai metaboliskā inducētāja veida un koncentrācijas izvēli var ietekmēt testējamo ķimikāliju klase.
Testējamās ķimikālijas sagatavošana
20.Cietas testējamās ķimikālijas jāsagatavo attiecīgos šķīdinātājos un attiecīgā gadījumā pirms šūnu apstrādes jāatšķaida (sk. 21. punktu). Šķidras testējamās ķimikālijas var testa sistēmai pievienot tieši un/vai pirms testa sistēmas apstrādes atšķaidīt. Gāzveida vai gaistošas testējamās ķimikālijas jātestē pēc attiecīgām standarta protokolu modifikācijām, piemēram, apstrādi veicot hermētiski noslēgtos kultivēšanas traukos (53)(54)(55). Testējamās ķimikālijas preparāti jāpagatavo tieši pirms apstrādes, ja vien dati par stabilitāti neliecina, ka tos var glabāt.
Testēšanas nosacījumi
Šķīdinātāji
21.Šķīdinātājs jāizvēlas tā, lai optimizētu testējamās ķimikālijas šķīdību, šķīdinātājam negatīvi neietekmējot testa norisi, piemēram, nemainot šūnu augšanu, neskarot testējamās ķimikālijas integritāti, nereaģējot ar kultivēšanas traukiem, nepasliktinot metaboliskās aktivācijas sistēmu. Ja vien iespējams, ieteicams vispirms apsvērt, vai neizmantot šķīdinātāju (vai kultūras barotni) uz ūdens bāzes. Plaši atzīti šķīdinātāji ir ūdens vai dimetilsulfoksīds. Galīgajā apstrādes barotnē organisko šķīdinātāju tilpumkoncentrācijai parasti nevajadzētu pārsniegt 1 %, bet uz (sālsūdens vai saldūdens) bāzes pagatavotu šķīdinātāju tilpumkoncentrācijai – 10 %. Ja tiek izmantoti ne tik plaši atzīti šķīdinātāji (piem., etanols vai acetons), to izmantošana jāpamato ar datiem, kas apliecina to saderību ar testējamajām ķimikālijām, izmantoto testa sistēmu un ģenētiskās toksicitātes neesību izmantotajā koncentrācijā. Ja šādu apliecinošu datu nav, svarīgi ir izmantot arī neapstrādātas kontroles (sk. definīciju 1. papildinājumā), lai ar tām pierādītu, ka izraudzītajam šķīdinātājam nav deletējošas vai mutagēniskas ietekmes.
CitotoksiCITĀTES mērīšana un apstrādes koncentrāciju izraudzīšanās
22.Nosakot augstāko testējamās ķimikālijas koncentrāciju, neizraugās koncentrācijas, kas spēj izraisīt tādas artefaktuāli pozitīvas atbildreakcijas kā pārmērīga citotoksicitāte (sk. 28. punktu), izgulsnēšanās (sk. 29. punktu) kultūras barotnē vai manāmas pH vai osmolalitātes pārmaiņas (sk. 8. punktu). Lai nepieļautu artefaktuāli pozitīvus rezultātus un uzturētu pienācīgus kultivēšanas apstākļus gadījumā, ja testējamā ķimikālija pievienošanas brīdī manāmi maina barotnes pH, to var koriģēt, galīgajā apstrādes barotnē pievienojot buferšķīdumu.
23.Koncentrācijas izraugās pēc citotoksicitātes un citiem apsvērumiem (sk. 27.–30. punktu). Kaut arī citotoksicitātes izvērtēšana sākotnējā testā var noderēt, lai sekmīgāk noteiktu galvenajā eksperimentā izmantojamās koncentrācijas, sākotnējais tests nav jāveic obligāti. Pat ja citotoksicitāte izvērtēta jau no sākuma, galvenajā eksperimentā tā joprojām jānosaka katrai kultūrai. Ja eksperimentā nosaka diapazonu, būtu jāaptver plašs koncentrāciju spektrs un eksperiments jābeidz vai nu pirmajā dienā pēc apstrādes, vai (ja izmantotās koncentrācijas izrādās piemērotas) tas jāturpina divu dienu ilgajā ekspresijas laikā līdz mutantu atlasei.
24.Citotoksicitāte jānosaka katrā individuālā testa kultūrā un kontrolkultūrā: MLA (2) un TK6 (15) atbilstošās metodes ir definētas ar starptautiski saskaņotu praksi.
25.Abās (agara un mikroiedobju) MLA versijās citotoksicitāte jāizvērtē, izmantojot relatīvo kopējo pieaugumu (RTG), kuru 1975. gadā sākotnēji definējuši Clive un Spektor (2). Tas ietver relatīvo suspensijas pieaugumu (RSG: testa kultūra / šķīdinātāja kontrole) šūnu apstrādes laikā, ekspresijas laiku un relatīvo klonēšanās efektivitāti (RCE: testa kultūra / šķīdinātāja kontrole) mutantu atlasīšanas brīdī (2). Jāatzīmē, ka ar RSG ir ņemts vērā arī apstrādes laikā novērojamais šūnu zudums testa kultūrā (sk. formulas 2. papildinājumā).
26.Attiecībā uz TK6 citotoksicitāte jāizvērtē pēc relatīvās izdzīvotības (RS), proti, pēc to šūnu klonēšanās efektivitātes (CE), kuras tūlīt pēc apstrādes uzsētas uz platēm, CE koriģējot atkarībā no šūnu zuduma apstrādes laikā salīdzinājumā ar šūnu skaitu negatīvajā kontrolē (kurā izdzīvotību pieņem par 100 %), sk. formulu 2. papildinājumā.
27.Jāizvērtē vismaz četras testējamās koncentrācijas (nerēķinot šķīdinātāja un pozitīvās kontroles), kas atbilst pieņemamības kritērijiem (attiecīga citotoksicitāte, šūnu skaits u. c.). Lai gan ir ieteicams izmantot duplikatīvas kultūras, ar katru testējamo koncentrāciju var izmantot vai nu replikatīvas, vai atsevišķas apstrādātas kultūras. Ar replikatīvajām kultūrām pie kādas konkrētas koncentrācijas iegūtie rezultāti pārskatā būtu jāatspoguļo atsevišķi, bet datu analīzes vajadzībām tos drīkst apvienot (55). Attiecībā uz testējamajām ķimikālijām, kas uzrāda nelielu vai neuzrāda nekādu citotoksicitāti, parasti noderēs divkāršotas līdz trīskāršotas koncentrācijas intervāli. Ja citotoksicitāte ir novērojama, koncentrācijas jāizraugās tā, lai citotoksitātes diapazons aptvertu gan koncentrācijas, pie kurām citotoksicitāte ir tāda, kāda aprakstīta 28. punktā, gan koncentrācijas, pie kurām citotoksicitāte ir vidēji liela vai maza, vai arī tās nav. Daudzām testējamajām ķimikālijām ir novērojama stāva koncentrācijatkarīgās atbildreakcijas līkne, un, lai aptvertu visu citotoksicitātes diapazonu vai lai detalizēti izpētītu devas un atbildreakcijas sakarību, var būt nepieciešams izmantot koncentrācijas ar tuvākiem intervāliem un vairāk nekā četras koncentrācijas, jo īpaši situācijās, kur eksperiments jāatkārto (sk. 70. punktu). Vairāk nekā 4 koncentrācijas var būt īpaši vajadzīgas, ja jāizmanto atsevišķas kultūras.
28.Ja maksimālo koncentrāciju izraugās pēc citotoksicitātes, ar augstāko koncentrāciju MLA gadījumā būtu jācenšas panākt 20 līdz 10 % lielu RTG, bet TK6 gadījumā – 20 līdz 10 % lielu RS (67. punkts).
29.Mazšķīstošu testējamo ķimikāliju gadījumā, kuras pie koncentrācijām, kas zemākas par zemāko nešķīstošās frakcijas koncentrāciju, nav citotoksiskas, pie augstākās analizētās koncentrācijas pēc apstrādes ar testējamo ķimikāliju jārodas ar neapbruņotu aci vai ar invertēto mikroskopu redzamai duļķainībai vai nogulsnēm. Pat ja citotoksicitāte novērojama pie koncentrācijas, kas augstāka par zemāko nešķīstošās frakcijas koncentrāciju, ieteicams testēt tikai vienu koncentrāciju, kas rada acīmredzamu duļķainību vai nogulsnes, jo nogulsnes var artefaktiski ietekmēt rezultātus. Tā kā MLA un TK6 tiek izmantotas suspensijas kultūras, īpaši būtu jāraugās, lai nogulsnes netraucētu testa izdarīšanā. Turklāt var būt lietderīgi pirms eksperimenta noteikt šķīdību kultūras barotnē.
30.Ja nogulsnes vai ierobežojoša citotoksicitāte netiek novēroti, augstākajai testējamajai koncentrācijai jāatbilst 10 mM, 2 mg/ml vai 2 μl/ml atkarībā no tā, kura ir zemāka (57)(58). Ja testējamās ķimikālijas sastāvs nav noteikts, piem., tā ir viela, kuras sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, tā ir komplekss reakcijas produkts vai bioloģisks materiāls [t. i., ķīmiska viela, kuras sastāvs nav zināms vai ir mainīgs (UVCB)], vidiski ekstrakti u. tml., gadījumos, kur netiek novērota pietiekama citotoksicitāte, augstākā koncentrācija var būt jāpalielina (piem., līdz 5 mg/ml), lai būtu panākta augstāka katras sastāvdaļas koncentrācija. Tomēr jāpiebilst, ka attiecībā uz cilvēkiem paredzētajām zālēm šīs prasības var būt citādas (59).
Kontroles
31.Ikvienā eksperimentā jāiekļauj paralēlas negatīvās kontroles (sk. 21. punktu), proti, tikai šķīdinātāju apstrādes barotnē, ar ko rīkojas tieši tāpat kā ar apstrādātajām kultūrām.
32.Paralēlās pozitīvās kontroles ir nepieciešamas, lai pierādītu laboratorijas spēju identificēt mutagēnus izmantotā testēšanas protokola apstākļos, (attiecīgā gadījumā) eksogēnās metaboliskās aktivācijas sistēmas efektivitāti un to, ka tiek adekvāti detektēti kā mazo/vēlīno, tā lielo/agrīno koloniju TK mutanti. Pozitīvo kontroļu piemēri sniegti zemāk 1. tabulā. Var izmantot alternatīvas pozitīvās kontrolvielas, ja tas ir pamatoti. Tā kā zīdītāju šūnu ģenētiskās toksicitātes in vitro testi ir pietiekami standartizēti īslaicīgām (3–4 stundu ilgām) apstrādēm, kas tiek veiktas paralēli ar tikpat ilgu metabolisko aktivāciju un bez tās, ir iespēja pozitīvās kontroles izmantot tik vien kā attiecībā uz mutagēnu, kam nepieciešama metaboliskā aktivācija. Šajā gadījumā viena vienīga pozitīva kontroles atbildreakcija apliecinās gan metaboliskās aktivācijas sistēmas darbību, gan testa sistēmas reaģētspēju. Ilglaicīgas (piem., 24 stundas bez S9) apstrādes gadījumā tomēr vajadzīga atsevišķa pozitīvā kontrole, jo apstrādes ilgums atšķirsies no tā, ko izmanto testā ar metabolisko aktivāciju. Lai varētu pierādīt testa sistēmas jutību, katra pozitīvā kontrole būtu jāizmanto ar vienu vai vairākām tādām koncentrācijām, ar kurām gaidāma reproducējama un detektējama palielināšanās salīdzinājumā ar fonu, turklāt atbildreakciju nedrīkstētu kompromitēt citotoksicitāte, kas pārsniedz šai testēšanas metodei specificētās robežas (sk. 28. punktu).
1. tabula. References vielas, ko ieteicams izmantot laboratorijas kompetences novērtēšanai un pozitīvo kontroļu izraudzīšanās vajadzībām
|
Kategorija
|
Viela
|
CAS Nr.
|
|
1. Mutagēni, kuriem metaboliskā aktivācija nav vajadzīga
|
|
Metilmetānsulfonāts
|
66-27-3
|
|
Mitomicīns C
|
50-07-7
|
|
4-Nitrohinolīn-N-oksīds
|
56-57-5
|
|
2. Mutagēni, kuriem metaboliskā aktivācija ir vajadzīga
|
|
Benz(a)pirēns
|
50-32-8
|
|
Ciklofosfamīds (monohidrāts)
|
50-18-0
(6055-19-2)
|
|
7,12-Dimetilbenzantracēns
|
57-97-6
|
|
3-Metilholantrēns
|
56-49-5
|
PROCEDŪRA
Apstrāde ar testējamo ķimikāliju
33.Proliferējošas šūnas ar testējamo ķimikāliju apstrādā gan metaboliskās aktivācijas sistēmas klātbūtnē, gan bez tās. Ekspozīcijai jāilgst attiecīgu laiku (parasti pietiek ar 3–4 stundām). Tomēr jāpiebilst, ka attiecībā uz cilvēkiem paredzētajām zālēm šīs prasības var būt citādas (59). MLA gadījumā, ja īslaicīga apstrāde dod negatīvus rezultātus un ir informācija, kas liecina, ka var būt vajadzīga ilgāka apstrāde [piem., nukleozīda analogiem, mazšķīstošām ķimikālijām (5)(59)], jāapsver testa izdarīšana, izmantojot ilglaicīgāku apstrādi, piem., 24 stundas bez S9.
34.Minimālais šūnu skaits, ko izmanto katrai testa kultūrai (gan kontrolkultūrai, gan apstrādātai kultūrai), katrā testa posmā jābalsta uz spontāno mutantu biežumu. Vispārīgs princips ir šūnas apstrādāt un pasāžām ņemt tādā skaitā, lai visās testa fāzēs (apstrādē, fenotipiskajā ekspresijā un mutantu atlasē) katrā eksperimentālajā kultūrā saglabātos vismaz 10, bet ideālā gadījumā 100 spontāno mutantu (56).
35.MLA gadījumā ieteicamais pieņemamais spontāno mutantu biežums ir 35–140 x 10-6 (agara versijā) un 50–170 x 10-6 (mikroiedobju versijā) (sk. 2. tabulu). Lai katrā testa kultūrā pēc apstrādes paliktu vismaz 10 un ideāli 100 spontāno mutantu, ir jāapstrādā vismaz 6 x 106 šūnu. Šāda skaita apstrāde un pietiekama šūnu skaita uzturēšana ekspresijas un mutantu atlasei vajadzīgās klonēšanas laikā visās eksperimenta fāzēs nodrošina pietiekami daudz (10 vai vairāk) spontāno mutantu, arī kultūrās, kas apstrādātas ar koncentrācijām, kuras rada 90 % citotoksicitāti (izmērīta ar 10 % RGT) (19)(38)(39).
36.TK6 gadījumā spontāno mutantu biežums parasti ir 2–10 x 10-6. Lai katrā kultūrā pēc apstrādes paliktu vismaz 10 spontāno mutantu, ir jāapstrādā vismaz 20 x 106 šūnu. Šāda šūnu skaita apstrāde nodrošina pietiekami daudz (10 vai vairāk) spontāno mutantu, arī kultūrās, kas apstrādātas ar koncentrācijām, kuras rada 90 % citotoksicitāti (10 % RS). Turklāt pietiekamā skaitā jābūt arī šūnām, ko kultivē ekspresijas periodā un mutantu atlasīšanas nolūkā uzsēj uz platēm (60).
Fenotipiskās ekspresijas laiks un citotoksicitātes un mutantu biežuma mērīšana
37.Lai jauninducēto mutantu fenotipiskā ekspresija varētu izpausties gandrīz optimāli, pēc apstrādes šūnas vēl kultivē noteiktu laiku, kas ir katrai šūnu līnijai specifisks. MLA gadījumā fenotipiskās ekspresijas periods ilgst 2 dienas. TK6 gadījumā fenotipiskās ekspresijas periods ir 3–4 dienas. Ja veic 24 stundu ilgu apstrādi, ekspresijas periodu sāk skaitīt no apstrādes beigu brīža.
38.Fenotipiskās ekspresijas perioda laikā šūnas katru dienu tiek saskaitītas. MLA gadījumā šūnu skaitīšanas rezultātu izmanto, lai aprēķinātu dienišķo suspensijas pieaugumu (SG). Kad beidzies 2 dienu ilgais ekspresijas periods, barotnē ar selektīvo aģentu un bez tā šūnas tiek suspendētas, lai noteiktu attiecīgi mutantu skaitu (selekcijas plates) un klonēšanās efektivitāti (dzīvotspējas plates). Ir divas vienādi pieņemamas metodes, ar kurām MLA tiek klonēti atlasīšanai vajadzīgie mutanti: vienā metodē izmanto mīksto agaru, bet otrā – šķidru barotni 96 iedobju mikrotitrēšanas platēs (19)(38)(39). TK6 gadījumā klonēšana notiek, izmantojot šķidras barotnes un 96 iedobju mikrotitrēšanas plates (16).
39.Vienīgais ieteicamais selektīvais aģents TK mutantiem ir trifluortimidīns (TFT).
40.MLA gadījumā agara platēm un mikroiedobju platēm skaitīšanu veic pēc 10–12 dienu ilgas inkubācijas. TK6 gadījumā agrīnos mutantus nosaka, kolonijas uz mikroiedobju platēm pieskaitot pēc 10–14 dienām. Lai parādītos lēnaudzīgie (vēlīnie) TK6 mutanti, pēc agrīno mutantu pieskaitīšanas šūnām no jauna jāpievieno barotne un TFT, un tad plates jāinkubē vēl 7–10 dienas (62). Vairāk par lēnaudzīgo un normāli augošo TK mutantu pieskaitīšanu skatīt 42. un 44. punktā.
41.Attiecīgās aprēķina formulas abiem testiem, arī abām MLA (agara un mikroiedobju) metodēm skatīt 2. papildinājumā. Pēc MLA agara metodes pieskaita kolonijas, atbilstoši klonēšanās efektivitātei koriģē mutantu koloniju skaitu un tad aprēķina MF. MLA un TK6 mikroiedobju versijā klonēšanās efektivitāti gan selekcijas platēm, gan klonēšanās efektivitātes platēm nosaka pēc t. s. Puasona sadalījuma (63). MF aprēķina, vadoties pēc šīm divām klonēšanās efektivitātes vērtībām.
Mutantkoloniju raksturošana
42.MLA gadījumā, ja testējamā ķimikālija ir pozitīva (sk. 62.–63. punktu), koloniju lielums vai augšana jāraksturo vismaz vienā no testa kultūrām (parasti pie augstākās pieņemamās pozitīvās koncentrācijas) un negatīvajā un pozitīvajā kontrolē. Ja testējamā ķimikālija ir negatīva (sk. 64. punktu), mutantkoloniju raksturošana jāveic negatīvajā un pozitīvajā kontrolē. Pēc MLA mikroiedobju metodes mazo koloniju mutantus definē kā tādus, kuri klāj mazāk nekā 25 % no iedobes platības, mērot pēc diametra, bet lielo koloniju mutantus – kā tādus, kuri klāj vairāk nekā 25 % no iedobes platības, mērot pēc diametra. Pēc agara metodes mutantkolonijas skaita un to lielumu nosaka automātiski, izmantojot koloniju skaitītāju. Koloniju lieluma noteikšanā iespējamās pieejas sīkāk aprakstītas literatūrā (19)(38)(40). Koloniju raksturošana negatīvajā un pozitīvajā kontrolē vajadzīga tādēļ, lai pierādītu, ka pētījums izdarīts adekvāti.
43.Testējamo ķimikāliju nevar noteikt par negatīvu, ja pozitīvajā kontrolē nav adekvāti detektēti kā lielo, tā mazo koloniju mutanti. Koloniju raksturošanu var izmantot, lai sniegtu vispārīgu informāciju par testējamās ķimikālijas spēju izraisīt punktveida mutācijas un/vai hromosomālus notikumus (4. punkts).
44.TK6: normāli augošos un lēnaudzīgos mutantus diferencē pēc inkubācijas laika atšķirības (sk. 40. punktu). TK6 gadījumā parasti saskaita gan agrīnos, gan vēlīnos mutantus visās kultūrās, arī negatīvajā un pozitīvajā kontrolē. Koloniju raksturošana negatīvajā un pozitīvajā kontrolē vajadzīga tādēļ, lai pierādītu, ka pētījums izdarīts adekvāti. Testējamo ķimikāliju nevar noteikt par negatīvu, ja pozitīvajā kontrolē nav adekvāti detektēti kā agrīnie, tā vēlīnie mutanti. Koloniju raksturošanu var izmantot, lai sniegtu vispārīgu informāciju par testējamās ķimikālijas spēju izraisīt punktveida mutācijas un/vai hromosomālus notikumus (4. punkts).
Laboratorijas kompetence
45.Lai pirms testa pastāvīgas izmantošanas demonstrētu pietiekamu vajadzīgo pieredzi, laboratorijai jābūt veikušai eksperimentu sēriju ar pozitīvās kontroles references vielām, kam ir dažādi iedarbības mehānismi (tās izraugās no 1. tabulas saraksta un vismaz vienai no tām aktīvai jābūt ar metabolisku aktivāciju un vienai — bez tās), un ar dažādām negatīvajām kontrolēm (neapstrādātām kultūrām un dažādiem šķīdinātājiem/nesējiem). Šo pozitīvo un negatīvo kontroļu atbildreakcijām jāsaskan ar literatūras datiem. Šī prasība neattiecas uz laboratorijām, kurām ir pieredze, t. i., kuru rīcībā ir vēsturisko datu bāze, kas aprakstīta 47.–50. punktā. MLA gadījumā pozitīvās un negatīvās kontroles vērtībām jābūt saskaņā ar IWGT ieteikumiem (sk. 2. tabulu).
46.Lai varētu pierādīt, ka laboratorija ir kompetenta detektēt mutagēniskas ķimikālijas, noteikt metaboliskās aktivācijas sistēmas efektivitāti un pierādīt, ka šūnu augšanas apstākļi apstrādes laikā, fenotipiskā ekspresija un mutantu atlase, kā arī skaitīšanas procedūras atbilst vajadzīgajam, pozitīvas kontroles vielu (sk. 1. tabulu) izlase jāpēta gan pie īslaicīgas un ilglaicīgas (ja izmanto) apstrādes bez metaboliskas aktivācijas, gan pie īslaicīgas apstrādes metaboliskas aktivācijas apstākļos. Lai varētu pierādīt testa sistēmas jutību un dinamisko diapazonu, jāizraugās tāds izlases ķimikāliju koncentrāciju diapazons, kurā palielinājumi virs fona līmeņa būs reproducējami un koncentrācijatkarīgi.
Vēsturisko kontroļu dati
47.Laboratorijai jānosaka:
-vēsturisks pozitīvo kontroļu diapazons un sadalījums,
-vēsturisks negatīvo (neapstrādātu, ar šķīdinātāju) kontroļu diapazons un sadalījums.
48.Pirmoreiz iegūstot datus par vēsturisko negatīvo kontroļu sadalījumu, paralēlajām negatīvajām kontrolēm jāatbilst publicētajiem datiem par negatīvajām kontrolēm. Kontroļu sadalījumam tiekot papildinātam ar jauniem eksperimentu datiem, paralēlajām negatīvajām kontrolēm ideālā gadījumā jābūt minētā sadalījuma 95 % kontrolrobežās (64)(65).
49.Laboratorijas vēsturiskā negatīvo kontroļu datubāze sākotnēji jāveido ar vismaz 10 eksperimentiem, bet vēlams, lai tajā būtu vismaz 20 eksperimenti, kas veikti salīdzināmos eksperimentēšanas apstākļos. Lai varētu noteikt, cik mainīgi ir laboratorijas pozitīvo un negatīvo kontroļu dati, un parādīt, ka laboratorijā šī metodika “tiek kontrolēta” (66), laboratorijām jāizmanto tādas kvalitātes kontroles metodes kā kontroldiagrammas (piem., C diagrammas vai X joslu diagrammas (65)). Papildu ieteikumi par vēsturisko datu izveidi un izmantošanu atrodami literatūrā (64).
50.Negatīvo kontroļu datiem vajadzētu būt mutantu biežumam atsevišķās vai, ieteicams, replikatīvajās kultūrās; sk. aprakstu 27. punktā. Paralēlajām negatīvajām kontrolēm ideālā gadījumā jābūt laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datubāzes sadalījuma 95 % kontrolrobežās. Tādus negatīvo kontroļu datus, kas ir ārpus 95 % kontrolrobežas, iekļaušanai vēsturiskajā kontroļu sadalījumā var pieņemt tikai tad, ja šie dati nav pārmērīgi anomālas vērtības un ja ir pierādījumi, ka testa sistēma “tiek kontrolēta” (sk. 49. punktu) un nav gadījusies ne tehniska kļūme, ne cilvēka kļūda.
51.Jebkādas izmaiņas eksperimenta protokolā jāapsver, ņemot vērā attiecīgo datu atbilstību laboratorijas esošajai vēsturisko kontroļu datubāzei. Būtisku neatbilstību gadījumā jāveido jauna vēsturisko kontroļu datubāze.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Rezultātu izklāsts
52.Datu izklāstā gan MLA, gan TK6 gadījumā jāiekļauj zemāk aprakstītie dati, kas vajadzīgi, lai aprēķinātu citotoksicitāti (attiecīgi RTG vai RS) un mutantu biežumu apstrādātajās un kontroles kultūrās.
53.MLA gadījumā jānorāda individuālu kultūru dati par RSG, RTG, klonēšanās efektivitāti mutantu atlasīšanas brīdī un mutantkoloniju skaits (agara versijā) vai tukšo iedobju skaits (mikroiedobju versijā). Mutantu biežums (MF) jāizteic ar mutantšūnu skaitu uz miljonu izdzīvojušo šūnu. Ja atbildreakcija ir pozitīva, vismaz pie vienas no testējamās ķimikālijas koncentrācijām (parasti pie augstākās pozitīvās koncentrācijas) un negatīvajā un pozitīvajā kontrolē jānorāda mazo un lielo koloniju MF (un/vai to īpatsvars kopējā MF). Ja atbildreakcija ir negatīva, mazo un lielo koloniju MF jānorāda negatīvajā kontrolē un pozitīvajā kontrolē.
54.TK6 gadījumā jānorāda individuālu kultūru dati par RS, klonēšanās efektivitāti mutantu atlasīšanas brīdī un tukšo iedobju skaits attiecībā uz agrīnajiem un vēlīnajiem mutantiem. MF jāizteic ar mutantšūnu skaitu uz izdzīvojušo šūnu skaitu un jānorāda gan kopējais MF, gan agrīno un vēlīno mutantu MF (un/vai to īpatsvars kopējā MF).
Pieņemamības kritēriji
55.Lai varētu noteikt konkrētas ķimikālijas testēšanas koprezultātus, gan MLA, gan TK6 gadījumā jābūt izpildītiem šādiem kritērijiem:
-testēšana notikusi ar diviem eksperimentēšanas nosacījumiem (īslaicīga apstrāde ar metabolisko aktivāciju un bez tās, sk. 33. punktu), ja vien vienā no tiem rezultāti nav bijuši pozitīvi;
-pietiekams šūnu un koncentrāciju skaits ir analizēšanai derīgs (sk. 27. punktu un 34.–36. punktu);
-augstākās koncentrācijas izvēles kritēriji atbilst 28.–30. punktā aprakstītajiem.
Negatīvo un pozitīvo kontroļu pieņemamības kritēriji
56.IWGT izveidotā MLA ekspertu darbgrupa ir analizējusi lielu daudzumu MLA datu, un rezultātā ir panākta starptautiska vienprātība par konkrētiem MLA pieņemamības kritērijiem (1)(2)(3)(4)(5). Tāpēc šajā testēšanas metodē sniegti konkrēti ieteikumi par to, kā MLA gadījumā nosakāma negatīvās un pozitīvās kontroles pieņemamība un izvērtējami individuālu vielu rezultāti. TK6 datubāze ir daudz mazāka un nav tikusi izvērtēta darbgrupā.
57.MLA gadījumā ikviens eksperiments jāizvērtē to tāda viedokļa, vai neapstrādātā/šķīdinātāja kontrole atbilst IWGT izveidotās MLA darbgrupas noteiktajiem pieņemamības kritērijiem (sk. (4) un zemāk 2. tabulu) attiecībā uz: 1) MF (turklāt MLA agara un mikroiedobju versijās IWGT pieņemamie MF ir atšķirīgi); 2) klonēšanās efektivitāti (CE) mutantu atlasīšanas brīdī un 3) suspensijas pieaugumu (SG) šķīdinātāja kontrolē (formulas sk. 2. papildinājumā).
2. tabula. MLA pieņemamības kritēriji
|
Parametrs
|
Mīkstā agara metode
|
Mikroiedobju metode
|
|
Mutantu biežums
|
35–140 x 10-6
|
50–170 x10-6
|
|
Klonēšanās efektivitāte
|
65–120%
|
65–120%
|
|
Suspensijas pieaugums
|
8 līdz 32-kārtīgs (3–4 stundu apstrādē)
32 līdz 180-kārtīgs (24 stundu apstrādē, ja tādu veic)
|
8 līdz 32-kārtīgs (3–4 stundu apstrādē)
32 līdz 180-kārtīgs (24 stundu apstrādē, ja tādu veic)
|
58.MLA gadījumā ikviens tests jāizvērtē arī no tā viedokļa, vai pozitīvā kontrole (kontroles) atbilst vismaz vienam no šādiem diviem IWGT darbgrupas izstrādātiem pieņemamības kritērijiem:
-pozitīvajai kontrolei jāuzrāda absolūts kopējā MF palielinājums, t. i., palielinājums, kas pārsniedz vismaz 300 x 10-6 lielo spontāno fona MF [inducēto MF jeb IMF]. Vismaz 40 % no IMF jābūt mazo koloniju MF;
-pozitīvajā kontrolē mazo koloniju MF palielinājumam vismaz par 150 x 10-6 jāpārsniedz tas, kas ir paralēlajā neapstrādātajā/šķīdinātāja kontrolē (150 x 10-6 liels mazo koloniju IMF).
59.TK6 gadījumā tests ir pieņemams, ja paralēlā negatīvā kontrole tiek uzskatīta par pieņemamu iekļaušanai laboratorijas vēsturisko negatīvo kontroļu datubāzē saskaņā ar 48.–49. punktu. Turklāt paralēlajām pozitīvajām kontrolēm (sk. 32. punktu) jāinducē atbildreakcijas, kas atbilst tām, kuras ģenerētas vēsturiskajā pozitīvo kontroļu datubāzē iekļautajās kontrolēs, un jāizsaka statistiski ievērojams palielinājums salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli.
60.Abos testos pozitīvajā kontroles kultūrā novērotās citotoksicitātes augšējai robežvērtībai jābūt tādai pašai kā eksperimentālajās kultūrās. Tas nozīmē, ka RTG/RS jābūt ne mazākam par 10 %. Lai pierādītu, ka pozitīvās kontroles pieņemamības kritēriji ir izpildīti, pietiek ar vienu koncentrāciju (vai pietiek izmantot vienu no pozitīvās kontroles kultūras koncentrācijām, ja tādas ir vairākas). Turklāt pozitīvās kontroles MF jābūt laboratorijas noteiktā pieņemamā diapazona robežās.
Rezultātu izvērtēšana un interpretēšana
61.IWGT Peļu limfomas ekspertu darbgrupa ir daudz izdarījusi MLA bioloģiskā relevantuma un pozitīvas atbildreakcijas kritēriju jomā (4). Tāpēc šajā testēšanas metodē sniegti konkrēti ieteikumi par to, kā interpretēt ar MLA testēto ķimikāliju rezultātus (sk. 62.–64. punktu). TK6 datubāze ir daudz mazāka un nav tikusi izvērtēta darbgrupā. Tāpēc ieteikumi par TK6 datu interpretēšanu ir vispārīgāki (sk. 65.–66. punktu). Papildus doti daži ieteikumi, kas attiecas uz abiem testiem (sk. 67.–71. punktu).
Tikai MLA
62.Lai nodrošinātu MF palielinājuma bioloģisko relevantumu, ieteicama šāda pieeja pozitīvas un negatīvas atbildreakcijas noteikšanā. Tajā neizmanto statistisko analīzi kā vairumā pārējo testu, bet gan iepriekš noteiktu inducēto mutantu biežumu (t. i., MF palielinājumu, kas pārsniedz paralēlās kontroles uzrādīto), ko apzīmē ar vispārējo izvērtējuma koeficientu (GEF), kurš noteikts, analizējot līdzdalīgo laboratoriju iegūto negatīvās kontroles MF datu sadalījumu (4). MLA agara versijā GEF ir 90 x 10-6, un MLA mikroiedobju versijā GEF ir 126 x 10-6.
63.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi pozitīvu, kad pie kāda no vērtētajiem eksperimenta nosacījumiem (sk. 33. punktu) MF palielinājums, kas pārsniedz paralēlās kontroles uzrādīto, ir lielāks par GEF un palielinājums ir koncentrācijatkarīgs (piem., ar dinamikas rindas trenda testu noteikts). Tādā gadījumā šajā testa sistēmā uzskata, ka testējamā ķimikālija spēj inducēt mutācijas.
64.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi negatīvu, kad ne pie viena no vērtētajiem eksperimenta nosacījumiem (sk. 33. punktu) nav koncentrācijatkarīgas atbildreakcijas vai, ja MF palielinājums ir, tas nepārsniedz GEF. Tādā gadījumā šajā testa sistēmā uzskata, ka testējamā ķimikālija nespēj inducēt mutācijas.
Tikai TK6
65.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi pozitīvu, kad pie kāda no vērtētajiem eksperimenta nosacījumiem (sk. 33. punktu):
-vismaz vienā no testa koncentrācijām salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli novērojams statistiski nozīmīgs palielinājums,
-šo palielinājumu izvērtējot ar attiecīgu dinamikas rindas trenda testu, konstatējams, ka tas ir koncentrācijatkarīgs,
-kāds no rezultātiem ir ārpus vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma (piem., ārpus 95 % kontrolrobežām Puasona sadalījumā; sk. 48. punktu).
Ja visi šie kritēriji izpildīti, šajā testēšanas sistēmā uzskata, ka testējamā ķimikālija spēj inducēt mutācijas. Ieteikumi par piemērotākajām statistiskajām metodēm atrodami literatūrā (66)(67).
66.Ja ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par viennozīmīgi negatīvu, kad ne pie viena no vērtētajiem eksperimenta nosacījumiem (sk. 33. punktu):
-nevienā testa koncentrācijā nav statistiski nozīmīga palielinājuma salīdzinājumā ar paralēlo negatīvo kontroli,
-ar attiecīgu dinamikas rindas trenda testu nav konstatējams palielinājuma koncentrācijatkarīgums,
-visi rezultāti ir vēsturisko negatīvo kontroļu datu sadalījuma robežās (piem., 95 % kontrolrobežās Puasona sadalījumā); sk. 48. punktu).
Tādā gadījumā šajā testa sistēmā uzskata, ka testējamā ķimikālija nespēj inducēt mutācijas.
Kopīgi MLA un TK6
67.Ja maksimālo koncentrāciju izraugās pēc citotoksicitātes, ar augstāko koncentrāciju būtu jācenšas panākt 20 līdz 10 % lielu RTG/RS. Pastāv vienprātība par to, ka jābūt piesardzīgiem, interpretējot vienīgi 20 līdz 10 % RTG/RS robežās esošos pozitīvos rezultātus, un rezultāts nebūtu jāuzskata par pozitīvu, ja MF palielinājums (ja vērtēts) ir tik tikko 10 % RTG/RS līmenī vai mazāks par to (2)(59).
68.Ja nav kultūras, kas uzrādītu 10–20 % lielu RGT/RS, noteikt, vai testējamā ķimikālija ir mutagēna, zināmos apstākļos var palīdzēt papildu informācija. Šīs situācijas ir šādas: 1) datu punktu rindas no 100 % līdz 20 % RTG/RS robežās nedod mutagenitātes pierādījumus (t. i., nav konstatējama atbildreakcijas atkarība no devas, mutantu biežums nav lielāks kā paralēlajā negatīvajā kontrolē vai vēsturiskajos fona diapazonos u. c.), un vismaz viens datu punkts atrodas 20 līdz 25 % RTG/RS robežās; 2) datu punktu rindas no 100 % līdz 25 % RTG/RS robežās nedod mutagenitātes pierādījumus (t. i., nav konstatējama atbildreakcijas atkarība no devas, mutantu biežums nav lielāks kā paralēlajā negatīvajā kontrolē vai vēsturiskajos fona diapazonos u. c.), un ir arī viens negatīvs datu punkts nedaudz zem 10 % RTG/RS līmeņa. Abās šajās situācijās var secināt, ka testējamā ķimikālija ir negatīva.
69.Nepārprotami pozitīva vai negatīva atbildreakcija nav obligāti jāverificē.
70.Ja atbildreakcija nav atbilstoši iepriekš rakstītajam nedz nepārprotami negatīva, nedz nepārprotami pozitīva un/vai lai rezultāta bioloģiskais relevantums būtu labāk nosakāms, šie dati jāizvērtē ekspertam un/vai jāturpina pētīt. Var būt lietderīgi izdarīt atkārtotu eksperimentu ar modificētiem nosacījumiem [piem., koncentrācijas intervāliem, kas palielinātu varbūtību iegūt datu punktus 10–20 % RTG/RS diapazonā, atšķirīgi metaboliskās aktivācijas nosacījumi (proti, S9 koncentrācija vai S9 avots) un apstrādes ilgums].
71.Retos gadījumos pat pēc sīkākas izpētes datu kopums neļauj izdarīt slēdzienu par pozitīviem vai negatīviem rezultātiem. Tāpēc būtu jāsecina, ka testējamās ķimikālijas atbildreakcija bijusi neskaidra (to vienlīdz varbūtīgi ir interpretēt gan kā pozitīvu, gan kā negatīvu).
Testēšanas pārskats
72.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija:
-avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams,
-pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināma,
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā, ja zināma,
-(attiecīgā gadījumā) pH, osmolalitātes un izgulsnēšanās mērījums kultūras barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota.
Vienkomponenta viela:
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības,
-ķīmiskā identifikācija, piemēram, IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, attiecīgā gadījumā, ja praktiski iespējams, piemaisījumu ķīmiskā identitāte u. tml.
Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:
-iespējami izsmeļoši raksturoti pēc komponentu ķīmiskās identitātes (sk. iepriekš), kvantitatīvās sastopamības un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
Šķīdinātājs:
-šķīdinātāja izraudzīšanās pamatojums,
-šķīdinātāja īpatsvars galīgajā kultūras barotnē.
Šūnas:
Laboratorijas izejkultūru gadījumā:
-šūnu tips un avots un to vēsture testēšanas laboratorijā,
-kariotipiskās īpašības un/vai modālais hromosomu skaits,
-šūnu kultūru uzturēšanas metodes,
-mikoplazmas neesība,
-šūnu dubultošanās laiks.
Testēšanas nosacījumi:
-koncentrāciju izvēles un šūnu kultūru skaita izraudzīšanās pamatojums, piem., dati par citotoksicitāti un šķīdības ierobežojumi,
-barotnes sastāvs, CO2 koncentrācija, mitruma līmenis,
-testējamās ķimikālijas koncentrācija, izteikta kā galīgā koncentrācija kultūras barotnē (piem., kultūras barotnes μg vai mg/ml vai mM),
-kultūras barotnē pievienotā šķīdinātāja un testējamās ķimikālijas koncentrācija (un/vai tilpums),
-inkubācijas temperatūra,
-inkubācijas laiks,
-apstrādes ilgums,
-šūnu blīvums apstrādes laikā,
-metaboliskās aktivācijas sistēmas veids un sastāvs (S9 avots, S9 maisījuma sagatavošanas metode, S9 maisījuma koncentrācija vai tilpums un S9 koncentrācija vai tilpums galīgajā kultūras barotnē, S9 kvalitātes kontroles),
-attiecībā uz katru no apstrādes nosacījumiem — pozitīvās un negatīvās kontroles vielas, galīgās koncentrācijas,
-fenotipiskās ekspresijas periods (norādot uzsēto šūnu skaitu, subkultūras un attiecīgā gadījumā barošanas grafiku),
-selektīvā aģenta identitāte un koncentrācija,
-MLA gadījumā norāda izmantoto versiju (agars vai mikroiedobes),
-testu pieņemamības kritēriji,
-dzīvotspējīgo šūnu un mutantšūnu skaitīšanas metodes,
-citotoksicitātes mērīšanas metodes,
-jebkāda citotoksicitātei un izmantotajai metodei relevanta papildinformācija,
-inkubācijas laiks pēc uzsēšanas,
-uzskaitīto koloniju lielums un veids (attiecīgā gadījumā norādot kritērijus, pēc kuriem kolonijas definē kā “mazas” vai “lielas”),
-kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai pētījuma rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs,
-(attiecīgā gadījumā) pH, osmolalitātes un izgulsnēšanās noteikšanai izmantotās metodes.
Rezultāti:
-par katru kultūru — apstrādāto šūnu un apakškultūrām izmantoto šūnu skaits,
-toksicitātes parametri (MLA gadījumā RTG, un TK6 gadījumā RS),
-izgulsnēšanās pazīmes un noteikšanas laiks,
-selektīvā un neselektīvā barotnē uzsēto šūnu skaits,
-koloniju skaits neselektīvajā barotnē un rezistento koloniju skaits selektīvajā barotnē, saistītais mutantu biežums,
-koloniju lielums negatīvajā un pozitīvajā kontrolē un (ja testējamā ķimikālija ir pozitīva) vismaz pie vienas koncentrācijas un saistītais mutantu biežums,
-ja iespējams, koncentrācijas–atbildreakcijas sakarība,
-paralēlo negatīvo (šķīdinātājs) un pozitīvo kontroļu dati (koncentrācijas un šķīdinātāji),
-vēsturisko negatīvo (šķīdinātājs) un pozitīvo kontroļu dati (koncentrācijas un šķīdinātāji), norādot diapazonus, vidējās vērtības un standartnovirzes, vēsturisko kontroļu pamatā esošo testu skaits,
-statistiskās analīzes (par atsevišķām kultūrām un attiecīgā gadījumā par apkopotiem replikātiem) un p-vērtības, ja tādas ir. MLA gadījumā – arī GEF izvērtējums.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)Moore, M.M., Honma, M. Clements, J. (Rapporteur), Awogi, T., Bolcsfoldi, G., Cole, J., Gollapudi, B., Harrington-Brock, K., Mitchell, A., Muster, W., Myhr, B., O'Donovan, M., Ouldelhkim, M-C., San, R., Shimada, H. and Stankowski, L.F. Jr. (2000). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus (TK) Gene Mutation Assay: International Workshop on Genotoxicity Test Procedures (IWGTP) Workgroup Report, Environ. Mol. Mutagen., 35 (3): 185-190.
(2)Moore, M.M., Honma, M., Clements, J., Harrington-Brock, K., Awogi, T., Bolcsfoldi, G., Cifone, M., Collard, D., Fellows, M., Flanders, K., Gollapudi, B., Jenkinson, P., Kirby, P., Kirchner, S., Kraycer, J., McEnaney, S., Muster, W., Myhr, B., O’Donovan, M., Oliver, Ouldelhkim, M-C., Pant, K., Preston, R., Riach, C., San, R., Shimada, H. and Stankowski, L.F. Jr. (2002). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus Gene Mutation Assay: Follow-Up International Workshop on Genotoxicity Test Procedures, New Orleans, Louisiana, (April 2000), Environ. Mol. Mutagen., 40 (4): 292-299.
(3)Moore, M.M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Cifone, M., Delongchamp, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Jenkinson, P., Kirby, P., Kirchner, S., Muster, W., Myhr, B., O’Donovan, M., Ouldelhkim, M-C., Pant, K., Preston, R., Riach, C., San, R., Stankowski, L.F. Jr., Thakur, A., Wakuri, S. and Yoshimura, I. (2003). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Locus Gene Mutation Assay: International Workshop (Plymouth, UK) on Genotoxicity Test Procedures Workgroup Report, Mutation Res., 540: 127-140.
(4)Moore, M.M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Burlinson, B., Cifone, M., Clarke, J., Delongchamp, R., Durward, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Hou, S., Jenkinson, P., Lloyd, M., Majeska, J., Myhr, B., O’Donovan, M., Omori, T., Riach, C., San, R., Stankowski, L.F. Jr., Thakur, A.K., Van Goethem, F., Wakuri, S. and Yoshimura, I. (2006). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Gene Mutation Assay: Follow-Up Meeting of the International Workshop on Genotoxicity Tests – Aberdeen, Scotland, 2003 – Assay Acceptance Criteria, Positive Controls, and Data Evaluation, Environ. Mol. Mutagen., 47 (1): 1-5.
(5)Moore, M.M., Honma, M., Clements, J., Bolcsfoldi, G., Burlinson, B., Cifone, M., Clarke, J., Clay, P., Doppalapudi, R., Fellows, M., Gollapudi, B., Hou, S., Jenkinson, P., Muster, W., Pant, K., Kidd, D.A., Lorge, E., Lloyd, M., Myhr, B., O’Donovan, M., Riach, C., Stankowski, L.F. Jr., Thakur A.K. and Van Goethem, F. (2007). Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Mutation Assay: Meeting of the International Workshop on Genotoxicity Testing, San Francisco, 2005, Recommendations for 24-h Treatment, Mutation. Res., 627 (1): 36-40.
(6)OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.
(7)Fellows M.D., Luker, T., Cooper, A. and O'Donovan, M.R. (2012). Unusual Structure-Genotoxicity Relationship in Mouse Lymphoma Cells Observed with a Series of Kinase Inhibitors. Mutation, Res., 746 (1): 21-28.
(8)Honma, M., Momose, M., Sakamoto, H., Sofuni, T. and Hayashi, M. (2001). Spindol Poisons Induce Allelic Loss in Mouse Lymphoma Cells Through Mitotic Non-Disjunction. Mutation Res., 493 (1-2): 101-114.
(9)Wang, J., Sawyer, J.R., Chen, L., Chen, T., Honma, M., Mei, N. and Moore, M.M. (2009). The Mouse Lymphoma Assay Detects Recombination, Deletion, and Aneuploidy, Toxicol. Sci.., 109 (1): 96-105.
(10)Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A., and Hozier, J.C. (1990). Molecular Dissection of Mutations at the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma Cells. Proc. National. Academy. Sci. USA, 87 (1): 51-55.
(11)Hozier, J., Sawyer, J., Moore, M., Howard, B. and Clive, D. (1981). Cytogenetic Analysis of the L5178Y/TK+/- Leads to TK-/- Mouse Lymphoma Mutagenesis Assay System, Mutation Res., 84 (1): 169-181.
(12)Hozier, J., Sawyer, J., Clive, D. and Moore, M.M. (1985). Chromosome 11 Aberrations in Small Colony L5178Y TK-/- Mutants Early in their Clonal History, Mutation Res., 147 (5): 237-242.
(13)Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J. (1985). Analysis of Trifluorothymidine-Resistant (TFTr) Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res., 151 (1): 161-174.
(14)Liber H.L., Call K.M. and Little J.B. (1987). Molecular and Biochemical Analyses of Spontaneous and X-Ray-Induced Mutants in Human Lymphoblastoid Cells. Mutation Res., 178 (1): 143-153.
(15)Li C.Y., Yandell D.W. and Little J.B. (1992). Molecular Mechanisms of Spontaneous and Induced Loss of Heterozygosity in Human Cells In Vitro. Somat. Cell Mol. Genet., 18 (1): 77-87.
(16)Honma M., Hayashi M. and Sofuni T. (1997). Cytotoxic and Mutagenic Responses to X-Rays and Chemical Mutagens in Normal and P53-Mutated Human Lymphoblastoid Cells. Mutation. Res., 374 (1): 89-98.
(17)Honma, M., Momose, M., Tanabe, H., Sakamoto, H., Yu, Y., Little, J.B., Sofuni, T. and Hayashi, M. (2000). Requirement of Wild-Type P53 Protein for Maintenance of Chromosomal Integrity. Mol. Carcinogen., 28 (4): 203-14.
(18)Amundson S.A. and Liber H.L. (1992). A Comparison of Induced Mutation at Homologous Alleles of the TK Locus in Human Cells. II. Molecular Analysis of Mutants. Mutation Res., 267 (1): 89-95.
(19)Schisler M.R., Moore M.M. and Gollapudi B.B. (2013). In Vitro Mouse Lymphoma (L5178Y TK+/- -3.7.2C) Forward Mutation Assay. In Protocols in Genotoxicity Assessment A. Dhawan and M. Bajpayee (Eds.), Springer Protocols, Humana Press: 27-50.
(20)Long, L.H., Kirkland, D., Whitwell, J. and Halliwell, B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634 (1-2): 177-183.
(21)Nesslany, F., Simar-Meintieres, S., Watzinger, M., Talahari, I. and Marzin, D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutagen., 49 (6): 439-452.
(22)Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion Concentrations. Environ. Mutagen., 8 (6): 879-886.
(23)Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268 (2): 297-305.
(24)Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr, Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257: 147-204.
(25)Wang J., Heflich R.H. and Moore M.M. (2007). A Method to Distinguish Between the De Novo Induction of Thymidine Kinase Mutants and the Selection of Pre-Existing Thymidine Kinase Mutants in the Mouse Lymphoma Assay. Mutation Res., 626 (1-2): 185-190.
(26)Fischer, G.A. (1958). Studies on the Culture of Leukemic Cells In Vitro. Ann. N.Y. Academy Sci., 76: 673-680.
(27)Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and Brown, M.M.M. (1979). Validation and Characterization of the L5178Y/TK+/-- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. Mutation Res., 59(1): 61-108.
(28)Sawyer, J., Moore, M.M., Clive, D. and Hozier, J. (1985). Cytogenetic Characterization of the L5178Y TK+/- 3.7.2C Mouse Lymphoma Cell Line, Mutation Res., 147 (5): 243-253.
(29)Sawyer J.R., Moore M.M. and Hozier J.C. (1989). High-Resolution Cytogenetic Characterization of the L5178Y TK+/- Mouse Lymphoma Cell Line, Mutation Res., 214 (2): 181-193.
(30)Sawyer, J.R., Binz, R.L., Wang, J. and Moore, M.M. (2006). Multicolor Spectral Karyotyping of the L5178Y TK+/--3.7.2C Mouse Lymphoma Cell Line, Environ. Mol. Mutagen., 47 (2): 127-131.
(31)Fellows, M.D., McDermott, A., Clare, K.R., Doherty, A. and Aardema, M.J. (2014). The Spectral Karyotype of L5178Y TK+/- Mouse Lymphoma Cells Clone 3.7.2C and Factors Affecting Mutant Frequency at the Thymidine Kinase (TK) Locus in the Microtitre Mouse Lymphoma Assay, Environ. Mol. Mutagen., 55 (1): 35-42.
(32)Storer, R.D., Jraynak, A.R., McKelvey, T.W., Elia, M.C., Goodrow, T.L. and DeLuca, J.G. (1997). The Mouse Lymphoma L5178Y TK+/- Cell Line is Heterozygous for a Codon 170 Mutation in the P53 Tumor Suppressor Gene. Mutation. Res., 373 (2): 157-165.
(33)Clark L.S., Harrington-Brock, K., Wang, J., Sargent, L., Lowry, D., Reynolds, S.H. and Moore, M.M. (2004). Loss of P53 Heterozygosity is not Responsible for the Small Colony Thymidine Kinase Mutant Phenotype in L5178Y Mouse Lymphoma Cells. Mutagen., 19 (4): 263-268.
(34)Skopek T.R., Liber, H.L., Penman, B.W. and Thilly, W.G. (1978). Isolation of a Human Lymphoblastoid Line Heterozygous at the Thymidine Kinase Locus: Possibility for a Rapid Human Cell Mutation Assay. Biochem. Biophys. Res. Commun., 84 (2): 411–416.
(35)Honma M. (2005). Generation of Loss of Heterozygosity and its Dependency on P53 Status in Human Lymphoblastoid Cells. Environ. Mol. Mutagen., 45 (2-3): 162-176.
(36)Xia, F., Wang, X., Wang, Y.H., Tsang, N.M., Yandell, D.W., Kelsey, K.T. and Liber, H.L. (1995). Altered P53 Status Correlates with Differences in Sensitivity to Radiation-Induced Mutation and Apoptosis in Two Closely Related Human Lymphoblast Lines. Cancer. Res., 55 (1): 12-15.
(37)Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, M. Honma, A. Kohara, J. van Benthem, S. Galloway, M.J. Armstrong, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, A. Sutter, D.J. Kirkland (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation).
(38)Lloyd M. and Kidd D. (2012). The Mouse Lymphoma Assay. Springer Protocols: Methods in Molecular Biology 817, Genetic Toxicology Principles and Methods, ed. Parry and Parry, Humana Press. ISBN, 978-1-61779-420-9, 35-54.
(39)Mei N., Guo X. and Moore M.M. (2014). Methods for Using the Mouse Lymphoma Assay to Screen for Chemical Mutagenicity and Photo-Mutagenicity. In: Optimization in Drug Discover: In Vitro Methods: Yan Z and Caldwell(Eds) , 2nd Edition, GW; Humana Press, Totowa, NJ.
(40)Liber H.L. and Thilly W.G. (1982). Mutation Assay at the Thymidine Kinase Locus in Diploidhuman Lymphoblasts. Mutation Res., 94 (2): 467-485.
(41)Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T., Hay, R., Merten, OW., Price, A., Schechtman, L., Stacey, G. and Stokes, W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. ATLA, 33 (3): 261-287.
(42)Moore M.M. and Howard B.E. (1982). Quantitation of Small Colony Trifluorothymidine-Resistant Mutants of L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells in RPMI-1640 Medium, Mutation Res., 104 (4-5): 287-294.
(43)Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31 (6): 347-364.
(44)Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113 (3-4): 173-215.
(45)Natarajan, A.T., Tates, A.D, Van Buul, P.P.W., Meijers, M. and De Vogel, N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens After Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37 (1): 83-90.
(46)Matsuoka A., Hayashi M. and Ishidate M. Jr. (1979). Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro. Mutation Res., 66 (3): 277-290.
(47)Ong T.M., et al. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4 (1): 55-65
(48)Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992). Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen., 7 (3): 175-177.
(49)Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing. de Serres F.J., et al. (Eds, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
(50)Galloway S.M., et al. (1994). Report from Working Group on In Vitro Tests for Chromosomal Aberrations. Mutation Res., 312 (3): 241-261.
(51)Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/Beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28 (1): 51-59.
(52)UNEP (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP).
(53)Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Genotoxic Effects of Airborne Agents Tice R.R., Costa D.L.and Schaich K.M. (Eds.). New York, Plenum, pp. 91-103.
(54)Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen., 5 (6): 795-801.
(55)Asakura M., Sasaki T., Sugiyama T., Arito H., Fukushima, S. and Matsushima, T. (2008). An Improved System for Exposure of Cultured Mammalian Cells to Gaseous Compounds in the Chromosomal Aberration Assay. Mutation Res., 652 (2): 122-130.
(56)Arlett C.F., et al. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Ed.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101.
(57)Morita T., Honma M. and Morikawa K. (2012). Effect of Reducing the Top Concentration Used in the In Vitro Chromosomal Aberration Test in CHL Cells on the Evaluation of Industrial Chemical Genotoxicity.
Mutation Res.
, 741 (1-2): 32-56.
(58)Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay. Environ. Mol. Mutagen., 54 (1): 36-43.
(59)USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Available at: [
https://www.federalregister.gov/a/2012-13774
].
(60)Honma M. and Hayashi M. (2011). Comparison of In Vitro Micronucleus and Gene Mutation Assay Results for P53-Competent Versus P53-Deficient Human Lymphoblastoid Cells. Environ. Mol. Mutagen., 52 (5): 373-384.
(61)Moore-Brown, M.M., Clive, D., Howard, B.E., Batson, A.G. and Johnson, K.O. (1981). The Utilization of Trifluorothymidine (TFT) to Select for Thymidine Kinase-Deficient (TK-/-) Mutants from L5178Y/TK+/- Mouse Lymphoma Cells, Mutation Res., 85 (5): 363-378.
(62)Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HRPT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK locus. Mutation Res., 216 (1): 9-17.
(63)Furth E.E., Thilly, W.G., Penman, B.W., Liber, H.L. and Rand, W.M. (1981). Quantitative Assay for Mutation in Diploid Human Lymphoblasts Using Microtiter Plates. Anal. Biochem., 110 (1): 1-8.
(64)Hayashi, M, Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H. J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation Res., 723 (2): 87-90.
(65)Ryan T.P. (2000). Statistical Methods for Quality Improvement. John Wiley and Sons, New York 2nd Edition.
(66)OECD (2014). Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 199.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(67)Fleiss J.L., Levin B. and Paik M.C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.
1. papildinājums
Definīcijas
Aneigēns: ķimikālija vai process, kas mijiedarbībā ar mitotiskā un mejotiskā šūnu dalīšanās cikla komponentiem izraisa šūnu vai organismu aneiploīdiju.
Aneiploīdija: novirze no normālā diploīdā (vai haploīdā) hromosomu skaita par vienu vai vairākām atsevišķām hromosomām, bet ne par veselu hromosomu komplektu vai komplektiem (poliploīdija).
Bāzu pāru maiņas mutagēni: ķimikālijas, kas izraisa DNS bāzu pāru maiņu.
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Klonēšanās efektivitāte: to zemā blīvumā uzsēto šūnu procents, no kurām var izaugt pieskaitāma kolonija.
Klastogēns: ķimikālija vai process, kas šūnu vai organismu populācijās izraisa strukturālas hromosomu aberācijas.
Citotoksicitāte: attiecībā uz šīs testēšanas metodes aptverto ķīmisko analīzi citotoksicitāte ir relatīvā kopējā pieauguma (RTG) samazinājums MLA gadījumā vai relatīvās izdzīvotības (RS) samazinājums TK6 gadījumā.
Tieša mutācija: tāda gēna mutācija no vecāktipa uz mutantformu, kura maina vai izdzēš iekodētā proteīna fermentatīvo darbību vai tā funkciju.
Nolasīšanas fāzes nobīdes mutagēni: ķimikālijas, kas DNS molekulā izraisa viena vai vairāku bāzu pāru pievienošanos vai izzušanu.
Genotoksisks: vispārīgs termins, kas aptver visu veidu bojājumus DNS vai hromosomās, tostarp DNS pārrāvumus, aduktus, pārkārtojumus, mutācijas, hromosomu aberācijas un aneiploīdiju. Ne visas genotoksiskās ietekmes rada mutācijas vai noturīgus hromosomu bojājumus.
Mitotiskā rekombinācija: mitozes laikā notiekoša homoloģisku hromatīdu rekombinācija, kuras rezultātā var inducēties DNS dubultpavedienu pārrāvumi vai zust heterozigotāte.
Mutagēnisks: tāds, kas pārmantojami maina vienu vai vairākas DNS bāzu pāru sekvences gēnos vai hromosomu struktūru (hromosomu aberācijas).
Mutantu biežums (MF): novēroto mutantšūnu skaita attiecība pret dzīvotspējīgo šūnu skaitu.
Fenotipiskās ekspresijas laiks: pēcapstrādes laiks, kad ģenētiskā pārmaiņa nostiprinās genomā un jebkādi līdzšinējā gēna produkti izsīkst tiktāl, ka mainās arī fenotipiskā pazīme.
Relatīvā izdzīvotība (RS): RS attiecībā uz TK6 izmanto par apstrādes radīta citotoksicitātes mēru. Tā ir tūlīt pēc apstrādes uz platēm uzsētu šūnu relatīvā klonēšanās efektivitāte (CE) salīdzinājumā ar negatīvās kontroles klonēšanās efektivitāti.
Relatīvais suspensijas pieaugums (RSG): MLA gadījumā tas ir relatīvais kopējais suspensijas divdienu pieaugums testa kultūrā attiecībā pret kopējo suspensijas divdienu pieaugumu negatīvajā/šķīdinātāja kontrolē (Clive and Spector, 1975). Ar RSG būtu jāizsaka testa kultūras un negatīvās/šķīdinātāja kontroles relatīvā pieauguma salīdzinājums apstrādes periodā.
Relatīvais kopējais pieaugums (RTG): RTG attiecībā uz MLA izmanto par apstrādes radītas citotoksicitātes mēru. Tas ir testa kultūru relatīvā pieauguma mērs (salīdzinājumā ar nesēja kontroli) noteiktās testa fāzēs, proti, apstrādē, divu dienu ilgajā ekspresijas laikā un atlasīšanai vajadzīgo mutantu klonēšanā. Katras testa kultūras RSG tiek reizināts ar testa kultūras relatīvo klonēšanas efektivitāti mutantu atlasīšanas laikā un izteikts attiecībā pret klonēšanas efektivitāti negatīvajā/šķīdinātāja kontrolē (Clive and Spector, 1975).
Aknu S9 frakcijas: aknu homogenāta supernatants pēc centrifugēšanas pie 9000 g, t. i., jēlu aknu ekstrakts.
S9 maisījums: aknu S9 frakcijas un metaboliskajai fermentatīvajai darbībai nepieciešamo kofaktoru maisījums.
Suspensijas pieaugums (SG): MLA apstrādes un ekspresijas fāzes laikā konstatētā šūnu skaita palielinājuma reižu skaits. Īslaicīgā (3–4 stundu ilgā) apstrādē SG tiek aprēķināts, reizinot palielinājuma reižu skaitu 1. dienā un palielinājuma reižu skaitu 2. dienā. Ja izmanto 24 stundu ilgu apstrādi, SG ir 24 stundu apstrādes laikā notikušā palielinājuma reižu skaits, reizināts ar ekspresijas 1. un 2. dienā notikušā palielinājuma reižu skaitu.
Šķīdinātāja kontrole: vispārīgs termins, ar ko definē kontroles kultūras, kuras saņem vienīgi testējamās ķimikālijas šķīdināšanai izmantoto šķīdinātāju.
Testējamā ķimikālija: viela vai maisījums, kuru testē ar šo testēšanas metodi.
Neapstrādātās kontroles: kultūras, kuras neapstrādā (t. i., ne ar testējamo ķimikāliju, ne ar šķīdinātāju), bet ar kurām izdara tādas pašas manipulācijas kā ar kultūrām, kuras apstrādā ar testējamo ķimikāliju.
2. papildinājums
FORMULAS
Citotoksicitāte
Abām (agara un mikroiedobju) MLA versijām
Citotoksicitāti definē kā relatīvo kopējo pieaugumu (RTG), un tas ietver relatīvo suspensijas pieaugumu (RSG) divu dienu ilgajā ekspresijas periodā un relatīvo klonēšanās efektivitāti (RCE), kuru nosaka mutantu atlases brīdī. Gan RTG, gan RSG un RCE izsaka procentuāli.
RSG aprēķināšana. Suspensijas pieaugums viens (SG1) ir pieauguma temps laikā no 0. dienas līdz 1. dienai (šūnu koncentrācija 1. dienā, dalīta ar šūnu koncentrāciju 0. dienā), un suspensijas pieaugums divi (SG2) ir pieauguma temps laikā no 1. dienas līdz 2. dienai (šūnu koncentrācija 2. dienā, dalīta ar šūnu koncentrāciju 1. dienā). RSG ir apstrādātās kultūras kopējais SG (SG1 x SG2) salīdzinājumā ar neapstrādāto/šķīdinātāja kontroli. Tas ir: RSG = [SG1(test) x SG2(test)] / [SG1(control) x SG2(control)]. SG1 aprēķināms no sākotnējās šūnu koncentrācijas, kas izmantota šūnu apstrādes sākumā. Šādā veidā tiek ņemta vērā šūnu apstrādes laikā testa kultūrās izveidojusies diferenciāla citotoksicitāte, ja tāda ir.
RCE ir testa kultūras relatīvā klonēšanās efektivitāte mutantu atlasīšanas brīdī attiecībā pret klonēšanās efektivitāti negatīvajā/šķīdinātāja kontrolē.
Relatīvais kopējais pieaugums (RTG): RTG=RSG x RCE
TK6
Relatīvā izdzīvotība (RS)
Citotoksicitāti vērtē pēc relatīvās izdzīvotības, t. i., pēc tā, kāda ir tūlīt pēc apstrādes uzsētu šūnu klonēšanās efektivitāte (CE), kas koriģēta pēc jebkāda šūnu zuduma apstrādes laikā, salīdzinājumā ar klonēšanās efektivitāti negatīvajās kontrolēs (tajās konstatēto izdzīvotību pieņem par 100 %). Ar apstrādes laikā radušos šūnu zudumu saistīto korekciju var aprēķināt šādi:
Koriģētā CE = CE
RS ar testējamo ķimikāliju apstrādātai kultūrai aprēķina šādi:
Mutantu biežums attiecībā uz MLA un uz TK6
Mutantu biežums (MF) ir mutantkoloniju klonēšanās efektivitāte selektīvā barotnē (CEM), kas koriģēta pēc klonēšanās efektivitātes neselektīvā barotnē mutantu atlasīšanas brīdī (CEV), respektīvi, MF=CEM/CEV. Zemāk aprakstīts, kā šīs divas klonēšanās efektivitātes aprēķināmas agara un mikroiedobju metodes gadījumā.
MLA agara versija. MLA mīkstā agara versijā koloniju skaitu uz mutantu atlasīšanas plates (CM) un koloniju skaitu uz atlasīšanai neparedzētās jeb klonēšanās efektivitātes (dzīvotspējas uzskaites) plates (CV) nosaka, tiešā veidā saskaitot klonus. Ja klonēšanās efektivitātes (CE) vajadzībai uz mutantu atlasīšanas (CEM) platēm un uz atlasīšanai neparedzētām jeb klonēšanas efektivitātes (dzīvotspējas uzskaites) platēm (CEV) uzsēj 600 šūnas un mutantu atlasīšanai izmanto 3 x 106 šūnas,
CEM = CM / (3 x 106) = (CM / 3) x 10-6
CEV = CV / 600
MLA un TK6 mikroiedobju versija. MLA mikroiedobju versijā CM un CV tiek noteikta, reizinot mikroiedobju kopskaitu (TW) un to koloniju varbūtīgo skaitu, kas ir katrā mikroiedobju plates iedobē (P).
CM = PM x TWM
CV = PV x TWV
Pēc Puasona sadalījuma (Furth et al., 1981) nulles terma P iegūst šādi:
P = - ln (EW / TW),
kur EW ir tukšās iedobes un TW ir iedobju kopskaits. Tādējādi
CEM = CM / TM = (PM x TWM) / TM
CEV = CV / TV = (PV x TWV) / TV
Mazo un lielo koloniju mutantu biežumu MLA mikroiedobju versijā aprēķina tieši tāpat, tukšo iedobju skaitu attiecinot uz mazajām un lielajām kolonijām.
TK6 gadījumā mazo un lielo koloniju mutantu biežumu nosaka, pamatojoties uz agrīnajiem un vēlīnajiem mutantiem.
B.68. ĪSA EKSPOZĪCIJAS LAIKA IN VITRO TESTĒŠANAS METODE, AR KURU IDENTIFICĒT i) ĶIMIKĀLIJAS, KAS IZRAISA NOPIETNUS ACU BOJĀJUMUS, UN ii) ĶIMIKĀLIJAS, KURAS NAV JĀKLASIFICĒ KĀ ACU KAIRINĀJUMA VAI NOPIETNU ACU BOJĀJUMU IZRAISĪTĀJAS
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 491 (2017) aprakstītajam. Īsa ekspozīcijas laika (STE) testēšanas metode ir in vitro metode, kuru noteiktos apstākļos un ar zināmiem ierobežojumiem var lietot tādu ķimikāliju (vielu un maisījumu) bīstamības klasificēšanai un marķēšanai, kas izraisa nopietnus acu bojājumus vai kuras nav jāklasificē kā nopietnu acu bojājumu vai acu kairinājuma izraisītājas, atbilstoši definīcijai, kas dota Apvienoto Nāciju Organizācijas (ANO) Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētajā sistēmā (GHS) (1) un Eiropas Savienības (ES) Regulā Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (CLP regula).
2.Ilgus gadus ķimikāliju potenciālā bīstamība acīm tikusi vērtēta galvenokārt ar truša acu in vivo testu (TM B.5 (8), ekvivalents OECD TG 405). Ir vispārpieņemts, ka pārskatāmā nākotnē neviens atsevišķs alternatīvs in vitro tests nespēs pilnībā aizstāt truša acu in vivo testu, ar kuru var prognozēt pilnu nopietnu acu bojājumu / acu kairinājuma atbildreakciju spektru un vienlaikus aptvert dažādas ķīmisko vielu klases. Tomēr truša acu testu varētu būt iespējams pilnībā aizstāt, (pakāpjveida) testēšanā stratēģiski kombinējot alternatīvas testēšanas metodes (2). Ar lejupēju pieeju tiktu testētas ķimikālijas, par kurām ir informācija, ka tās ir potenciāli ļoti kairinošas acīm vai izraisa nopietnus acu bojājumus. Ar augšupēju pieeju turpretim testētu ķimikālijas, par kurām ir informācija, ka tās acīm nav tik kairinošas, lai būtu jāklasificē. Kaut arī STE testēšanas metodi nevar uzskatīt par pilnīgu truša acu in vivo testa aizstājēju, normatīvām vajadzībām veiktas klasificēšanas un marķēšanas kontekstā tā ir piemērota izmantošanai tādā pakāpjveida testēšanas stratēģijā kā augšupējā/lejupējā pieeja un ļauj bez turpmākas testēšanas identificēt i) ķimikālijas, kas izraisa nopietnus acu bojājumus (ANO GHS / CLP 1. kategorija), un ii) ķimikālijas (izņemot ļoti gaistošas vielas un visas cietās ķimikālijas, kas nav virsmaktīvās vielas), kuras nav jāklasificē kā acu kairinājuma vai nopietnu acu bojājumu izraisītājas (ANO GHS / CLP nekategorizētas ķimikālijas) (1)(2). Tomēr, ja ar STE testēšanas metodi ķimikālija netiek klasificēta kā nopietnu acu bojājumu izraisītāja (ANO GHS / CLP 1. kategorija) vai kā ANO GHS / CLP nekategorizēta ķimikālija (neizraisa nopietnus acu bojājumus vai acu kairinājumu), būs vajadzīga papildu testēšana, lai noteiktu galīgo klasifikāciju. Turklāt, pirms ar augšupēju pieeju STE testēšanas metodi izmantot klasifikācijas shēmā, kas nav ANO GHS / CLP, jākonsultējas ar attiecīgajām regulatīvajām iestādēm. Piemērotākās testēšanas metodes izvēle un šīs testēšanas metodes izmantošana jāskata kontekstā ar ESAO Norādījumu dokumentu par integrētu pieeju nopietnu acu bojājumu un acu kairinājuma testēšanā un novērtēšanā [OECD Guidance Document on an Integrated Approaches on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye irritation] (14).
3.Šajā testēšanas metodē aprakstītas procedūras, ko izmanto, lai testējamās ķimikālijas potenciālo bīstamību acīm izvērtētu pēc tās spējas inducēt citotoksicitāti, ja pielieto īsa ekspozīcijas laika testēšanas metodi. Ķimikāliju citotoksiskā iedarbība uz radzenes epitēlijšūnām ir nozīmīga veida iedarbība (MOA), kas izraisa radzenes epitēlijšūnu bojājumus un acu kairinājumu. Šūnu dzīvotspēju ar STE testēšanas metodi novērtē pēc tā, cik lielā mērā vitālo krāsvielu MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijbromīds, saukts arī par tiazolilzilo tetrazolijbromīdu) dzīvās šūnas fermentatīvi pārvērš par zilas krāsas formazāna sāli, kura daudzumu šūnu ekstraktā nosaka kvantitatīvi (3). Iegūto šūnu dzīvotspēju salīdzina ar šķīdinātāja kontroli (relatīvā dzīvotspēja) un izmanto, lai aplēstu testējamās ķimikālijas potenciālo bīstamību acīm. Ja gan ar 5 %, gan ar 0,05 % koncentrāciju iegūtā šūnu dzīvotspēja ir mazāka par vai vienāda ar (≤) 70 %, testējamo ķimikāliju klasificē ANO GHS / CLP 1. kategorijā. Ja turpretim gan ar 5 %, gan ar 0,05 % koncentrāciju iegūtā šūnu dzīvotspēja ir lielāka par (>) 70 %, pieņem, ka testējamo ķimikāliju nav vajadzības kategorizēt ANO GHS / CLP sistēmā.
4.Terminu “testējamā ķimikālija” šajā testēšanas metodē izmanto, lai apzīmētu to, kas tiek testēts, bez sasaistes ar STE testēšanas metodes pielietojamību vielu un/vai maisījumu testēšanā. Definīcijas dotas papildinājumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI
5.Šīs testēšanas metodes pamatā ir Kao korporācijas izstrādātais protokols (4), kas izvērtēts divos dažādos validācijas pētījumos: vienu no tiem veikusi Japānas Dzīvniektestēšanas alternatīvu sabiedrība (JSAAE) (5), bet otru – Japānas Alternatīvo metožu validācijas centrs (JaCVAM) (6). Pamatojoties uz šo validācijas pētījumu pārskatiem un citiem testēšanas metodi pamatojošiem dokumentiem, zinātnisko recenzēšanu veica NICEATM/ICCVAM (7).
6.Kad STE testēšanas metodi izmantoja, lai identificētu ķimikālijas (vielas un maisījumus), kas izraisa nopietnus acu bojājumus (ANO GHS / CLP 1. kategorija) (1), iegūtie dati par 125 ķimikālijām (gan vielām, gan maisījumiem) salīdzinājumā ar truša acu in vivo testu uzrādīja kopējo pareizību 83 % (104/125), pseidopozitīvu īpatsvaru 1 % (1/86) un pseidonegatīvu īpatsvaru 51 % (20/39) (7). Uzrādītais pseidonegatīvu īpatsvars šajā kontekstā nav kritiski svarīgs, jo visas testējamās ķimikālijas, kuru inducētā šūnu dzīvotspēja pie 5 % koncentrācijas ir ≤ 70% un pie 0,05 % koncentrācijas > 70%, vēlāk tiks testētas ar citām pienācīgi validētām in vitro testēšanas metodēm vai – kritiskā gadījumā – ar truša acu in vivo testu, izvēli izdarot atkarībā no normatīvajām prasībām un saskaņā ar patlaban ieteiktajām secīgas testēšanas stratēģijas un pierādījumu izsvēršanas pieejām (1) (8). Testētas tika galvenokārt vienkomponenta vielas, bet ir arī ierobežots daudzums datu par maisījumu testēšanu. Daudzkomponentu vielu un maisījumu testēšanā šī testēšanas metode ir tehniski piemērojama. Tomēr pirms tās izmantošanas maisījuma testēšanai, lai iegūtu datus kādam normatīvajam mērķim, jāapsver, vai un kādēļ tā varētu sniegt minētajam mērķim piemērotus rezultātus. Ja pastāv normatīva prasība maisījumu testēt, tāda apsvēršana nav vajadzīga. Kad STE testēšanas metodi izmantoja ANO GHS / CLP 1. kategorijā klasificējamu testējamo ķimikāliju identificēšanai, nekādus citus īpašus trūkumus tā neuzrādīja. Pētnieki var apsvērt šīs testēšanas metodes izmantošanu ar testējamajām ķimikālijām, un tā tiktu pieņemts, ka šūnu dzīvotspēja ≤ 70% gan pie 5 %, gan pie 0,05 % koncentrācijas uzrāda nopietnus acu bojājumus inducējošu atbildreakciju, un ķimikālija bez turpmākas testēšanas būtu jāklasificē ANO GHS / CLP 1. kategorijā.
7.Kad STE testēšanas metodi izmantoja, lai identificētu ķimikālijas (vielas un maisījumus), kuras nav jāklasificē kā acu kairinājuma vai nopietnu acu bojājumu izraisītājas (t. i., ANO GHS / CLP nekategorizētas ķimikālijas), iegūtie dati par 130 ķimikālijām (gan vielām, gan maisījumiem) salīdzinājumā ar truša acu in vivo testu uzrādīja kopējo pareizību 85 % (110/130), pseidonegatīvu īpatsvaru 12 % (9/73) un pseidopozitīvu īpatsvaru 19 % (11/57) (7). Ja no datu kopas izslēdz ļoti gaistošas vielas un cietas vietas, kas nav virsmaktīvās vielas, kopējā pareizība pieaug līdz 90 % (92/102), pseidonegatīvu īpatsvars sarūk līdz 2 % (1/54) un pseidopozitīvu īpatsvars saglabājas 19 % (9/48) (7) Sekas ir tādas, ka tad, ja STE tiek izmantota, lai identificētu testējamās ķimikālijas, kuras nav jāklasificē kā acu kairinājuma vai nopietnu acu bojājumu izraisītājas (ANO GHS / CLP nekategorizētas ķimikālijas), metodes potenciālie trūkumi ir liels pseidonegatīvu īpatsvars i) ļoti gaistošām vielām ar tvaika spiedienu virs 6 kPa un ii) cietām ķimikālijām (vielām un maisījumiem), kas nav virsmaktīvās vielas un maisījumi, kuru sastāvā ir vienīgi virsmaktīvās vielas. Šādas ķimikālijas ir izslēgtas no STE testēšanas metodes piemērojamības jomas (7).
8.Papildus 6. un 7. punktā minētajām ķimikālijām ar STE testēšanas metodi ģenerētajā datu kopā ietilpst arī pašmāju dati par 40 maisījumiem. Šie dati, kad tos salīdzināja ar Dreiza [Draize] in vivo acu testa spēju paredzēt, kuri maisījumi nav jāklasificē ANO GHS / CLP klasifikācijas sistēmā, uzrādīja pareizību 88 % (35/40), pseidopozitīvu īpatsvaru 50 % (5/10) un pseidonegatīvu īpatsvaru 0 % (0/30) (9). Tāpēc STE metodi var izmantot, lai ar augšupēju pieeju identificētu identificētu maisījumus kā ANO GHS / CLP nekategorizētas ķimikālijas. Tāpat kā cieto vielu gadījumā, izņēmums ir cietie maisījumi, ja vien tie pilnībā nesastāv no virsmaktīvajām vielām. Turklāt, lai nepieļautu to, ka ķimikālijas kaitīgums tiek paredzēts nepietiekami, ar sevišķu rūpību jāvērtē maisījumi, kuru sastāvā ir vielas ar tvaika spiedienu virs 6 kPa, un iegūtie rezultāti jāpamato katrā atsevišķā gadījumā.
9.Tā kā ar STE testēšanas metodi daudzas ANO GHS / CLP 1. kategorijas ķimikālijas tiek nepietiekami stingri novērtētas, ierindojot tās 2., 2A vai 2B kategorijā, savukārt daudzas ANO GHS / CLP nekategorizētas ķimikālijas tiek novērtētas pārlieku stingri, tāpat ierindojot tās 2., 2A vai 2B kategorijā, STE testēšanas metodi nevar izmantot, lai testējamās ķimikālijas identificētu kā tādas, kas ietilpst ANO GHS / CLP 2.kategorijā vai ANO GHS / CLP 2A kategorijā (acu kairinājums) vai 2B kategorijā (viegls acu kairinājums) (7). Tālab var būt nepieciešams veikt turpmāku testēšanu ar citu piemērotu metodi.
10.STE testēšanas metode ir derīga testējamajām ķimikālijām, kuras izšķīdinātas vai vismaz 5 minūšu ilgumā vienmērīgi suspendētas fizioloģiskajā šķīdumā, 5 % dimetilsulfoksīda (DMSO), kas izšķīdināts fizioloģiskajā šķīdumā, vai minerāleļļā. STE testēšanas metode nav derīga testējamajām ķimikālijām, kuras ir nešķīstošas vai kuras nevar vismaz 5 minūšu ilgumā vienmērīgi suspendēt fizioloģiskajā šķīdumā, 5 % DMSO, kas izšķīdināts fizioloģiskajā šķīdumā, vai minerāleļļā. Minerāleļļu STE testēšanas metodē ir iespējams izmantot tāpēc, ka ekspozīcijas laiks ir īss. Tāpēc STE testēšanas metode ir piemērota, lai paredzētu ūdenī nešķīstošu testējamo ķimikāliju (piem., garķēdes alifātisko spirtu vai ketonu) potenciālo bīstamību acīm, ja vien šīs ķimikālijas ir iespējams iejaukt kādā no trijiem iepriekš nosauktajiem šķīdinātājiem.
11.Terminu “testējamā ķimikālija” šajā testēšanas metodē izmanto, lai apzīmētu to, kas tiek testēts1, bez sasaistes ar STE testēšanas metodes pielietojamību vielu un/vai maisījumu testēšanā.
TESTA PRINCIPS
12.STE testēšanas metode ir uz citotoksicitātes principa pamatota in vitro ķīmiskā analīze, kuru veic uz saplūstoša SIRC (Statens Seruminstitut Rabbit Cornea) šūnu monoslāņa, kas kultivēts uz 96 mikroiebobju polikarbonāta platēm (4). Testējamajai ķimikālijai ļauj iedarboties piecas minūtes, un tad, izmantojot MTT ķīmisko analīzi, citotoksicitāti kvantitatīvi izmēra SIRC šūnu relatīvās dzīvotspējas izteiksmē (4). Pēc konstatētā šūnu dzīvotspējas samazinājuma paredz potenciālo nelabvēlīgo ietekmi, kas var izraisīt acs bojājumus.
13.Ir zināms, ka 80 % no truša acī iepilinātā šķīduma trīs līdz četru minūšu laikā tiek izvadīti caur konjunktīvas maisu, bet cilvēka gadījumā vienas līdz divu minūšu laikā šādā veidā tiek izvadīti vairāk nekā 80 % iepilinātā šķīduma (10). Ar STE testēšanas metodi ir mēģināts tuvināties šiem ekspozīcijas laikiem, un citotoksicitāte tiek izmantota par beigupunktu, lai novērtētu kaitējumu, kas SIRC šūnām nodarīts piecās minūtēs, kuru laikā uz tām iedarbojusies testējamā ķimikālija.
KOMPETENCES PIERĀDĪŠANA
14.Pirms šeit aprakstīto STE testēšanas metodi sākt izmantot regulāri, laboratorijām jāpierāda tehniskā kompetence, pareizi saklasificējot 1. tabulā ieteiktās 11 vielas. Šīs vielas izraudzītas tā, lai būtu pārstāvēts pilns nopietnu acu bojājumu un acu kairinājuma atbildreakciju spektrs, kas noteikts ar truša acu in vivo testiem (TG-405) un atbilst ANO GHS / CLP klasifikācijas sistēmai (1). Citi atlases kritēriji bija vielu komerciālā pieejamība, kvalitatīvu in vivo references datu pieejamība un kvalitatīvu ar STE testēšanas metodi iegūtu in vitro datu pieejamība (3). Gadījumos, kur kāda sarakstā norādīta viela nav pieejama vai kur tas attaisnojami, var izmantot citu vielu, par kuru pieejami pietiekami in vivo un in vitro references dati, ja vien tiek izmantoti šeit aprakstītie kritēriji.
1. tabula. Standartvielu saraksts
|
Viela
|
CAS Nr.
|
Ķimikāliju klase1
|
Agregāt-stāvoklis
|
In vivo ANO GHS / CLP Kat.2
|
Šķīdinātājs STE testā
|
STE ANO GHS / CLP Kat.
|
|
Benzalkonija hlorīds
(10%, ūdens šķīdums)
|
8001-54-5
|
Onijsavieno-jums
|
Šķidrs
|
1. kategorija
|
Fizioloģiskais šķīdums
|
1.kategorija
|
|
Triton X-100 (100 %)
|
9002-93-1
|
Ēteris
|
Šķidrs
|
1. kategorija
|
Fizioloģiskais šķīdums
|
1.kategorija
|
|
Acid Red 92
|
18472-87-2
|
Heterociklisks savienojums; bromīn-savienojums; hlorīnsavienojums
|
Ciets
|
1. kategorija
|
Fizioloģiskais šķīdums
|
1.kategorija
|
|
Nātrija hidroksīds
|
1310-73-2
|
Sārms; neorganiska ķīmiska viela
|
Ciets
|
1.kategorija3
|
Fizioloģiskais šķīdums
|
1.kategorija
|
|
Butirolaktons
|
96-48-0
|
Laktons; heterociklisks savienojums
|
Šķidrs
|
2A kategorija (CLP 2.kategorija)
|
Fizioloģiskais šķīdums
|
Nav iespējams prognozēt
|
|
1-oktanols
|
111-87-5
|
Spirts
|
Šķidrs
|
2A/B kategorija4 (CLP 2.kategorija)
|
Minerāleļļa
|
Nav iespējams prognozēt
|
|
Ciklopentanols
|
96-41-3
|
Spirts; ogļūdeņradis, ciklisks
|
Šķidrs
|
2A/B kategorija5 (CLP 2.kategorija)
|
Fizioloģiskais šķīdums
|
Nav iespējams prognozēt
|
|
2-etoksietilacetāts
|
111-15-9
|
Spirts; ēteris
|
Šķidrs
|
Nekategorizēts
|
Fizioloģiskais šķīdums
|
Nekategorizēts
|
|
Dodekāns
|
112-40-3
|
Ogļūdeņradis, aciklisks
|
Šķidrs
|
Nekategorizēts
|
Minerāleļļa
|
Nekategorizēts
|
|
Metilizobutilketons
|
108-10-1
|
Ketons
|
Šķidrs
|
Nekategorizēts
|
Minerāleļļa
|
Nekategorizēts
|
|
1,1-dimetilguanidīnsulfāts
|
598-65-2
|
Amidīns; sēra savienojums
|
Ciets
|
Nekategorizēts
|
Fizioloģiskais šķīdums
|
Nekategorizēts
|
PROCEDŪRA
Šūnu monoslāņa sagatavošana
15.STE testēšanas metodē jāizmanto truša radzenes (SIRC) šūnu līnija. SIRC šūnas ieteicams sagādāt no kvalificētas šūnu bankas, piem., Amerikas tipveida kultūru kolekcijas CCL60.
16.SIRC šūnas kultivē 37 °C pie 5 % CO2 un mitrinātā atmosfērā kultivēšanas kolbā ar kultūras barotni, kura sastāv no Īgla minimālās barotnes (MEM), kas papildināta ar 10 % liellopu embriju seruma jeb govju fetālā seruma (FBS), 2 mM L-glutamīna, 50–100 vienībām/ml penicilīna un 50–100 µg/ml streptomicīna. Kultivēšanas kolbā kofluējušās šūnas jāatdala, izmantojot tripsīna-etilēndiamīntetraetiķskābes šķīdumu. Atdalīšanai var lietot šūnu skrāpi. Pirms šūnas izmantot rutīnas testiem, kultivēšanas kolbā tās jāpavairo (piem., 2–3 pārsējumos). Pēc atkausēšanas šūnas nebūtu jāpavairo vairāk kā 25 pārsējumos.
17.Pēc tam izmantošanai STE testā gatavās šūnas sagatavo attiecīgā šūnu slāņa biezumā un uzsēj uz 96 iedobju mikrotitrēšanas plates. Ieteicamais šūnu uzsēšanas blīvums ir 6,0 × 103 šūnas uz vienu iedobi, ja šūnas lieto četras dienas pēc uzsēšanas, vai 3,0 × 103 šūnas uz vienu iedobi, ja šūnas lieto piecas dienas pēc uzsēšanas, pie kultivēšanas tilpuma 200 µl. STE testā izmantojamās šūnas, kas kultūras barotnē uzsētas atbilstošā biezumā, līdz testēšanas brīdim, t. i., četrās vai piecās dienās pēc uzsēšanas, sasniegs vairāk nekā 80 % kofluenci.
Testējamās ķimikālijas un kontroles vielu aplicēšana
18.Vēlamākais šķīdinātājs, kurā izšķīdināt vai suspendēt testējamo ķimikāliju, ir fizioloģiskais šķīdums. Ja testējamā ķimikālija ir mazšķīstoša vai vismaz uz piecām minūtēm nevar tikt vienmērīgi izšķīdināta vai suspendēta fizioloģiskajā šķīdumā, otrā labākā izvēle ir 5 % DMSO (CAS Nr. 67-68-5), kas izšķīdināts fizioloģiskajā šķīdumā. Ja testējamā ķimikālija vismaz uz piecām minūtēm nevar tikt vienmērīgi izšķīdināta vai suspendēta ne fizioloģiskajā šķīdumā, ne 5 % DMSO, kas izšķīdināts fizioloģiskajā šķīdumā, nākamā izvēle ir minerāleļļa (CAS Nr. 8042-47-5).
19.Izvēlētajā šķīdinātājā testējamo ķimikāliju vienmērīgi izšķīdina vai suspendē 5 % (masa/masa) koncentrācijā un pēc tam, izmantojot sērijveida 10-kārtēju atšķaidījumu, atšķaida līdz 0,5 % un 0,05 % koncentrācijai. Katra testējamā ķimikālija jātestē gan 5%, gan 0,05 % koncentrācijā. Uz 96 iedobju plates kultivētās šūnas katrā iedobē piecas minūtes istabas temperatūrā eksponē 200 mikrolitriem (µl) testējamās ķimikālijas šķīduma (vai suspensijas), kuras koncentrācija ir 5 % vai 0,05 %. Testējamās ķimikālijas (vienkomponenta vielas, daudzkomponentu vielas vai maisījumus) uzskata par tīrām vielām un neatkarīgi no to patiesās tīrības atšķaida vai suspendē saskaņā ar aprakstīto metodi.
20.Katrā atkārtojumā uz katras plates par barotnes kontroli izmanto 16. punktā aprakstīto kultūras barotni. Turklāt katrā atkārtojumā uz katras plates šūnas jāeksponē arī šķīdinātāja kontroles paraugiem. Ir pierādīts, ka 18. punktā aprakstītajiem šķīdinātājiem nav kaitīgas ietekmes uz SIRC šūnu dzīvotspēju.
21.STE testēšanas metodē par pozitīvo kontroli katrā atkārtojumā uz katras plates jāizmanto 0,01 % nātrija laurilsulfāts (SLS), kas izšķīdināts fizioloģiskajā šķīdumā. Lai varētu aprēķināt šūnu dzīvotspēju pozitīvajā kontrolē, katrā atkārtojumā uz katras plates jāiekļauj arī fizioloģiskā šķīduma kontrole.
22.Lai noteiktu, kā kompensēt optisko blīvumu, būs vajadzīgs tukšais paraugs, un to pielieto iedobēm, kurās ir tikai fosfātu fizioloģiskais buferšķīdums, kas nesatur kalciju un magniju (PBS-) vai šūnas.
23.Ikviens paraugs (testējamā ķimikālija 5 % un 0,05 % koncentrācijā, barotnes kontrole, šķīdinātāja kontrole un pozitīvā kontrole) jātestē trīs reizes katrā atkārtojumā, uz piecām minūtēm istabas temperatūrā šūnas eksponējot 200 mikrolitriem attiecīgās testējamās vai kontroles ķimikālijas.
24.Etalonvielas ir lietderīgi izmantot, lai novērtētu kādai konkrētai ķimikāliju vai produktu klasei piederīgas nezināmas ķimikālijas spēju izraisīt acu kairinājumu vai arī lai novērtētu kāda acu kairinātāja relatīvo spēju izsaukt noteiktas intensitātes atbildreakciju uz kairinājumu.
Šūnu dzīvotspējas mērīšana
25.Pēc eksponēšanas šūnas divreiz mazgā ar 200 μl PBS un tad pievieno 200 μl MTT šķīduma (0,5 mg MTT uz mililitru kultūras barotnes). Pēc divu stundu ilga reakcijas laika inkubatorā (37˚C, 5% CO2) dekantē MTT šķīdumu, tad MTT formazānu ekstrahē, uz 60 minūtēm istabas temperatūrā tumsā pievienojot 200 mikrolitrus (μl) 0,04 N sālsskābes ar izopropanolu, un pie 570 nm ar mikroplašu lasītāju izmēra MTT formazāna šķīduma absorbciju. Testējamo ķimikāliju interference ar MTT ķīmisko analīzi (ar krāsvielām vai tiešiem MTT reducētājiem) rodas tikai tad, ja pēcekspozīcijas skalošanas laikā no testa sistēmas paliek neizvadīts ievērojams daudzums testējamās ķimikālijas. Tas ir aktuāli gadījumā ar trīsdimensionālajiem rekonstruētas cilvēka radzenes vai rekonstruētas cilvēka epidermas audiem, bet neattiecas uz divdimensionālajām šūnu kultūrām, kuras izmanto STE testēšanas metodē.
Rezultātu interpretēšana un prognostiskais modelis
26.Par katru testējamo ķimikāliju iegūtās optiskā blīvuma (OB) vērtības izmanto, lai aprēķinātu šūnu dzīvotspēju salīdzinājumā ar šķīdinātāja kontroli, kurai to pieņem par 100 %. Šūnu relatīvo dzīvotspēju izsaka ar procentuālo īpatsvaru, testējamās ķimikālijas OB dalot ar šķīdinātāja kontroles OB (iepriekš no abām vērtībām atņem tukšā parauga OB).
Līdzīgā veidā šūnu relatīvo dzīvotspēju procentuāli izsaka katrai šķīdinātāja kontrolei, tās OB dalot ar barotnes kontroles OB (iepriekš no abām vērtībām atņem tukšā parauga OB).
27.Jāizdara trīs neatkarīgi atkārtojumi, katrs no tiem ar trijām replikāta iedobēm (t. i., n=9). Ar katras testējamās ķimikālijas un šķīdinātāja kontroles trijām iedobēm iegūto vidējo aritmētisko katrā neatkarīgajā atkārtojumā izmanto, lai aprēķinātu šūnu relatīvās dzīvotspējas vidējo aritmētisko vērtību. Šūnu dzīvotspējas galīgo vidējo aritmētisko vērtību aprēķina no visiem trijiem neatkarīgajiem atkārtojumiem.
28.Tālāk norādītas šūnu dzīvotspējas robežvērtības tādu testējamo ķimikāliju identificēšanai, kuras inducē nopietnus acu bojājumus (ANO GHS / CLP 1. kategorija), un arī tādu testējamo ķimikāliju identificēšanai, kuras nav jāklasificē kā acīm kairinošas vai nopietnus acu bojājumus izraisošas (ANO GHS / CLP nekategorizētās ķimikālijas).
2. tabula. STE testēšanas metodes prognostiskais modelis
|
Šūnu dzīvotspēja
|
ANO GHS / CLP klasifikācija
|
Piemērojamība
|
|
Pie 5 %
|
Pie 0,05 %
|
|
|
|
> 70%
|
> 70%
|
Nekategorizēta
|
Vielas un maisījumi, izņemot:
i) ļoti gaistošas vielas, kuru tvaika spiediens pārsniedz 6 kPa1, un
ii) cietas ķimikālijas (vielas un maisījumus), kas nav virsmaktīvās vielas vai maisījumi, kuri pilnībā sastāv no virsmaktīvām vielām
|
|
≤ 70%
|
> 70%
|
Nav iespējams prognozēt
|
Nepiemēro
|
|
≤ 70%
|
≤ 70%
|
1. kategorija
|
Vielas un maisījumi2
|
Pieņemamības kritēriji
29.Testēšanas rezultātus uzskata par pieņemamiem, ja ir izpildīti visi zemāk nosauktie kritēriji.
a)(Kultūras barotnei eksponētās) barotnes kontroles optiskajam blīvumam, no kura atņemts tukšā parauga optiskais blīvums, jābūt 0,3 vai lielākam.
b)Šķīdinātāja kontroles dzīvotspējai attiecībā pret barotnes kontroli jābūt 80 % vai lielākai. Ja katrā atkārtojumā izmanto vairāku šķīdinātāju kontroles: lai ar šiem šķīdinātajiem testētās ķimikālijas būtu kvalificējamas, ikvienā no minētajām kontrolēm šūnu dzīvotspējai jābūt lielākai par 80 %.
c)Ar pozitīvo kontroli (0,01 % SLS) iegūtajai šūnu dzīvotspējai jābūt vēsturiskās vidējās vērtības divu standartnoviržu robežās. Pozitīvās kontroles augšējās un apakšējās pieņemamības robežvērtības būtu jāatjaunina regulāri, t. i., reizi trijos mēnešos vai ikreiz, kad tests ar pieņemamu rezultātu izdarīts laboratorijā, kur testēšana notiek neregulāri (t. i., retāk nekā reizi mēnesī). Ja laboratorijas veikto eksperimentu nav pietiekami daudz, lai iegūtu statistiski robustu pozitīvo kontroļu sadalījumu, ir pieņemami izmantot metodes izstrādātāja noteiktās augšējās un apakšējās pieņemamības robežvērtības, t. i., vērtības intervālā no 21,1 % līdz 62,3 % atkarībā no izstrādātāja laboratorijas vēsturiskajiem datiem, un pašiem savu sadalījumu izveidot pirmo rutīnas testu laikā.
d)Testējamās ķimikālijas 5 % un 0,05 % koncentrācijā trijos neatkarīgos atkārtojumos iegūtas galīgās šūnu dzīvotspējas standartnovirzei jābūt mazākai nekā 15 %.
Ja viens vai vairāki no šiem kritērijiem nav izpildīti, rezultātus atmet un izdara trīs citus neatkarīgus atkārtojumus.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Dati
30.Pārskatā jāiekļauj dati par katru individuālo mikroiebobi (piem., šūnu dzīvotspējas vērtības) visos atkārtojumos, kā arī jānorāda kopējā vidējā vērtība, standartnovirze un klasifikācija.
Testēšanas pārskats
31.Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija un kontroles vielas
-Vienkomponenta viela: ķīmiskā identifikācija, piem., IUPAC vai CAS nosaukums(-i), CAS numurs(-i), SMILES vai InChI kods, struktūrformula un/vai citi identifikācijas dati
-Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījums: iespējami izsmeļošs raksturojums ar, piem., sastāvdaļu ķīmisko identitāti (sk. iepriekš), tīrību, kvantitatīvo saturu un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām
-Agregātstāvoklis, gaistamība, pH, LogP, molekulmasa, ķīmiskā klase un citas pētījuma veikšanai relevantas fizikālķīmiskās īpašības, ciktāl šī informācija ir pieejama
-Tīrība, piemaisījumu ķīmiskā identitāte (attiecīgā gadījumā, ja šī informācija ir pieejama) utt.
-Pirmstestēšanas apstrāde, ja tāda veikta (piem., sildīšana, smalcināšana)
-Glabāšanas apstākļi un stabilitāte, ciktāl šī informācija ir pieejama
Testēšanas metodes nosacījumi un procedūras
-Sponsora, testējošās iestādes, pētījuma vadītāja vārds/nosaukums un adrese
-Izmantotās testēšanas metodes apraksts
-Izmantotā šūnu līnija, tās avots, pasāžas numurs un testēšanā izmantoto šūnu konfluence
-Sīkas ziņas par izmantoto testēšanas procedūru
-Izmantoto atkārtojumu un replikātu skaits
-Izmantotās testējamās ķimikālijas koncentrācijas (ja atšķiras no rekomendētajām)
-Katras testējamās ķimikālijas šķīdinātāja izraudzīšanās pamatojums
-Ar testējamo ķimikāliju saistītās ekspozīcijas ilgums (ja atšķiras no rekomendētā)
-Testēšanas procedūras modifikāciju apraksts, ja tādas bijušas
-Izmantoto izvērtēšanas un lēmumpieņemšanas kritēriju apraksts
-Atsauce uz vēsturisko pozitīvo kontroles vidējo vērtību un standartnovirzi (SD)
– Apliecināta laboratorijas kompetence izmantot šo testēšanas metodi (piem., testējot standartvielas) vai apliecināta testēšanas metodes ilgstoša reproducējamība
Rezultāti
-Par katru testējamo ķimikāliju un kontroles vielu un par katru testēto koncentrāciju tabulā jānorāda individuālās OD vērtības katrā replikāta mikroiedobē, OD vidējās aritmētiskās vērtības katrā neatkarīgā atkārtojumā, procentuālā šūnu dzīvotspēja katrā neatkarīgā atkārtojumā un procentuālās šūnu dzīvotspējas galīgā vidējā aritmētiskā vērtība un SD, kas aptver trīs atkārtojumus
-Barotnes, šķīdinātāja un pozitīvās kontroles rezultāti pēc piemērotiem pētījuma pieņemamības kritērijiem
-Jebkādas citas novērotās ietekmes apraksts
-Kopējā atvasinātā klasifikācija ar norādi uz izmantoto prognostisko modeli un/vai lēmumpieņemšanas kritēriju
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)United Nations UN (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Fifth revised edition. New York & Geneva: United Nations Publications. ISBN: 978-92-1-117006-1. Available at:
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html
.
(2)Scott L, et al. (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-Up and Top-Down Approaches. Toxicol. In Vitro 24, 1-9.
(3)Mosmann T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to 7 Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65, 55-63.
(4)Takahashi Y, et al. (2008). Development of the Short Time Exposure (STE) Test: an In Vitro Eye Irritation Test Using SIRC Cells. Toxicol. In Vitro 22,760-770.
(5)Sakaguchi H, et al. (2011). Validation Study of the Short Time Exposure (STE) Test to Assess the Eye Irritation Potential of Chemicals. Toxicol. In Vitro 25,796-809.
(6)Kojima H, et al. (2013). Second-Phase Validation of Short Time Exposure Tests for Assessment of Eye Irritation Potency of Chemicals. Toxicol. In Vitro 27, pp.1855-1869.
(7)ICCVAM (2013). Short Time Exposure (STE) Test Method Summary Review Document, NIH. Available at: [http://www.ntp.niehs.nih.gov/iccvam/docs/ocutox_docs/STE-SRD-NICEATM-508.pdf].
(8)Šā pielikuma B.5. nodaļa “Akūts acu kairinājums/korozija”.
(9)Saito K, et al. (2015). Predictive Performance of the Short Time Exposure Test for Identifying Eye Irritation Potential of Chemical Mixtures.
(10)Mikkelson TJ, Chrai SS and Robinson JR. (1973). Altered Bioavailability of Drugs in the Eye Due to Drug-Protein Interaction. J. Pharm. Sci.1648-1653.
(11)ECETOC (1998). Eye Irritation Reference Chemicals Data Bank. Technical Report (No 48. (2)), Brussels, Belgium.
(12)Gautheron P, et al. (1992). Bovine Corneal Opacity and Permeability Test: an In Vitro Assay of Ocular Irritancy. Fundam Appl Toxicol. 18, 442–449.
(13)OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(14)OECD (2017). Guidance Document on an Integrated Approaches on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye irritation. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 263). Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
Papildinājums
DEFINĪCIJAS
Pareizība: pakāpe, kādā ar testēšanas metodi iegūto mērījumu rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas raksturlielums un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto tādā pat nozīmē kā terminu “konkordantums”, ar to saprotot testēšanas metodes pareizo iznākumu īpatsvaru (13).
Etalonķimikālija: ķimikālija, ko salīdzināšanā ar testējamo ķimikāliju izmanto par standartu. Etalonķimikālijai jāpiemīt šādām īpašībām: i) konsekvents un uzticams avots vai avoti; ii) strukturāla un funkcionāla līdzība ar testējamās vielas klases vielām; iii) labi zināmas fizikālās un ķīmiskās īpašības; iv) apliecinoši dati par zināmajām ietekmēm un v) vielas zināmajai potencei jāatbilst vēlamās atbildreakcijas diapazonam.
Augšupēja pieeja: pakāpeniska pieeja, ko izmanto ķimikālijai, par kuru ir aizdomas, ka tā nav jāklasificē kā acu kairinājuma vai nopietnu acu bojājumu izraisītāja, un kas sākas ar to ķimikāliju nošķiršanu, kuras nav jāklasificē (negatīvs iznākums), no citām ķimikālijām (pozitīvs iznākums).
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Acu kairinājums: izmaiņas acī, kas rodas pēc testējamās ķimikālijas aplicēšanas uz acs priekšējās virsmas un kas 21 dienas laikā pēc aplicēšanas ir pilnībā atgriezeniskas. Nozīmē to pašu, ko “atgriezeniska ietekme uz acīm” un ANO GHS / CLP 2. kategorija.
Pseidonegatīvu īpatsvars: pozitīvā iznākuma ķimikāliju proporcija, kuras ar testēšanas metodi aplami noteiktas par negatīvām. Tas ir viens no testēšanas metodes veiktspējas raksturlielumiem.
Pseidopozitīvu īpatsvars: negatīvā iznākuma ķimikāliju proporcija, kuras ar testēšanas metodi aplami noteiktas par pozitīvām. Tas ir viens no testēšanas metodes veiktspējas raksturlielumiem.
Bīstamība: tāda aģenta vai situācijas iedabiska īpašība, kam piemīt potenciāls atstāt nelabvēlīgu ietekmi uz šim aģentam eksponētu organismu, sistēmu vai (sub)populāciju.
Barotnes kontrole: neapstrādāts replikāts, kurā ir visi testa sistēmas komponenti. Ar šo paraugu izdara tādas pašas manipulācijas kā ar paraugiem, kas apstrādāti ar testējamo ķimikāliju, un citiem kontrolparaugiem, lai tādējādi noteiktu, vai šķīdinātājs un testa sistēma mijiedarbojas.
Maisījums: maisījums vai šķīdums, kas sastāv no divām vai vairāk vielām.
Vienkomponenta viela: viela, definēta ar tās kvantitatīvo sastāvu, kurā viena galvenā sastāvdaļa veido vismaz 80 % (masa/masa).
MTT: 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds; tiazolilzilais tetrazolija bromīds.
Daudzkomponentu viela: viela, definēta ar tās kvantitatīvo sastāvu, kurā vairāk nekā viena no galvenajām sastāvdaļām ir koncentrācijā ≥ 10 % (masa/masa) un < 80 % (masa/masa). Daudzkomponentu viela tiek iegūta ražošanas procesā. Atšķirība starp maisījumu un daudzkomponentu vielu ir tāda, ka maisījumu iegūst, divas vai vairākas vielas sajaucot bez ķīmiskas reakcijas. Daudzkomponentu viela rodas ķīmiskā reakcijā.
OB: optiskais blīvums.
Pozitīvā kontrole: replikāts, kurā ir visi testa sistēmas komponenti un kurš apstrādāts ar vielu, par ko ir zināms, ka tā inducē pozitīvu atbildreakciju. Lai būtu iespēja novērtēt pozitīvās kontroles atbildreakcijas mainību laikā, pozitīvās atbildreakcijas intensitāte nedrīkstētu būt pārlieku liela.
Relevantums: parametrs, kas raksturo testa attiecināmību uz interesējošo ietekmi un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Tā ir pakāpe, kādā ar testu var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testēšanas metodes pareizības (konkordantuma) aspektu (10).
Ticamība: pakāpe, kādā vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās pēc viena un tā paša protokola var ilgāku laiku reproducējami izmantot konkrētu testēšanas metodi. To novērtē, aprēķinot metodes intralaboratorisko un interlaboratorisko reproducējamību un intralaboratorisko atkārtojamību (13).
Jutība: tas, cik liela proporcija no visām pozitīvajām/aktīvajām ķimikālijām ar testu tiek klasificētas pareizi. Tas ir pareizības mērs testēšanas metodei, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (10).
Nopietni acu bojājumi: acs audu bojājumi vai nopietna fiziska redzes pasliktināšanās, kas rodas pēc testējamās ķimikālijas aplicēšanas uz acs priekšējās virsmas un kas 21 dienas laikā pēc aplicēšanas nav pilnībā atgriezeniska. Nozīmē to pašu, ko “neatgriezeniska ietekme uz acīm” un ANO GHS / CLP 1. kategorija.
Šķīdinātāja/nesēja kontrole: neapstrādāts paraugs, kurā ir visi testa sistēmas komponenti, to vidū šķīdinātājs vai nesējs, ko izmanto ar testējamo ķimikāliju apstrādātajos paraugos un citos kontrolparaugos, un kuru izmanto, lai noteiktu bāzlīnijas atbildreakciju paraugiem, kas apstrādāti ar attiecīgajā šķīdinātājā vai nesējā izšķīdinātu testējamo ķimikāliju. Ja testā izmanto arī paralēlu barotnes kontroli, šis paraugs parāda arī to, vai šķīdinātājs vai nesējs mijiedarbojas ar testa sistēmu.
Specifiskums: tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām ķimikālijām ar testu tiek klasificētas pareizi. Tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (13).
Viela: ķīmisks elements un tā dabiski radušies vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, ieskaitot to stabilizācijai nepieciešamās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušos piejaukumus, bet izņemot šķīdinātājus, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu.
Virsmaktīvā viela: viela, piem., detergents, kas spēj samazināt šķidruma virsmas spraigumu un tādējādi ļauj tam putot vai penetrēt cietvielas; to dēvē arī par mitrinātāju.
Testējamā ķimikālija: jebkura viela vai maisījums, ko testē ar šo testēšanas metodi.
Secīgas testēšanas stratēģija: pakāpeniskas testēšanas stratēģija, kurā noteiktā secībā pārskata visu esošo informāciju par testējamo ķimikāliju, katrā pakāpē izmantojot pierādījumu izsvēršanu, lai pirms pārejas uz nākamo pakāpi noteiktu, vai ir pieejams pietiekami daudz informācijas, lai pieņemtu lēmumu par bīstamības klasifikāciju. Ja testējamās ķimikālijas kairinātājpotenciālu var noteikt, pamatojoties uz esošo informāciju, papildu testēšana nav jāveic. Ja, pamatojoties uz esošo informāciju, testējamās ķimikālijas kairinātājpotenciālu noteikt nevar, ievēro pakāpenisku secīgu procedūru testēšanai ar dzīvniekiem, un to dara tik ilgi, līdz var viennozīmīgi pieņemt lēmumu par klasifikāciju.
Lejupēja pieeja: pakāpeniska pieeja, ko izmanto testējamai ķimikālijai, par kuru ir aizdomas, ka tā izraisa nopietnus acu bojājumus, un kas sākas ar to ķimikāliju nošķiršanu, kuras inducē nopietnus acu bojājumus (pozitīvs rezultāts), no citām ķimikālijām (negatīvs rezultāts).
Apvienoto Nāciju Organizācijas Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētā sistēma (ANO GHS): sistēma, kurā ķimikālijas (vielas un maisījumus) klasificē pēc standartizētiem fizisko apdraudējumu, veselības apdraudējumu un vidisko apdraudējumu tipiem un līmeņiem un kura paredz atbilstošus saziņas elementus, piem., piktogrammas, signālvārdus, bīstamības apzīmējumus, drošības prasību apzīmējumus un drošības datu lapas, ar mērķi sniegt informāciju par ķimikāliju nelabvēlīgo ietekmi, lai aizsargātu cilvēkus (viņu vidū darba devējus, darba ņēmējus, transporta darbiniekus, patērētājus un avārijas dienestu darbiniekus) un vidi (1).
ANO GHS / CLP 1. kategorija: sk. “Nopietnu acu bojājumu” definīciju.
ANO GHS / CLP 2. kategorija: sk. “Acu kairinājuma” definīciju.
ANO GHS / CLP nekategorizētas ķimikālijas: Ķimikālijas, kas nav klasificētas ANO GHS / CLP 1. vai 2. kategorijā (vai ANO GHS 2A vai 2B kategorijā).
UVCB: vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli.
B.69 REKONSTRUĒTA, CILVĒKA RADZENEI LĪDZĪGA EPITĒLIJA (RhCE) TESTĒŠANAS METODE, KURĀ IDENTIFICĒ ĶIMIKĀLIJAS, KURAS NAV JĀKLASIFICĒ UN JĀMARĶĒ KĀ TĀDAS, KAS IZRAISA ACU KAIRINĀJUMU VAI NOPIETNUS ACU BOJĀJUMUS
IEVADS
1.Šī testēšanas metode (TM) ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijā (TG) Nr. 492 (2017) aprakstītajam. Nopietni acu bojājumi ir acs audu bojājumi vai nopietna fiziska redzes pasliktināšanās, kas rodas pēc testējamās ķimikālijas aplicēšanas uz acs priekšējās virsmas un kas 21 dienas laikā pēc aplicēšanas nav pilnībā atgriezeniska, saskaņā ar Apvienoto Nāciju Organizācijas Ķīmisko vielu klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizēto sistēmu (ANO GHS) (1) un Eiropas Savienības (ES) Regulu (EK) Nr. 1272/2008 par vielu un maisījumu klasificēšanu, marķēšanu un iepakošanu (CLP). Saskaņā ar ANO GHS un CLP acu kairinājums ir izmaiņas acī, kas rodas pēc testējamās ķimikālijas aplicēšanas uz acs priekšējās virsmas un kas 21 dienas laikā pēc aplicēšanas ir pilnībā atgriezeniskas. Testējamās ķimikālijas, kas izraisa nopietnus acu bojājumus, klasificē ANO GHS un CLP 1. kategorijā, bet testējamās ķimikālijas, kas izraisa acu kairinājumu, klasificē ANO GHS un CLP 2. kategorijā. Testējamās ķimikālijas, kuras nav klasificētas par tādām, kas izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus, saskaņā ar definīciju ir ķīmiskās vielas, kuras neatbilst priekšnosacījumiem klasificēšanai ANO GHS un CLP 1. vai 2. kategorijā (2A vai 2B), t. i., tās tiek uzskatītas par ANO GHS un CLP nekategorizētām ķimikālijām.
2.Nopietnu acu bojājumu / acu kairinājuma novērtēšanai parasti izmantoti laboratorijas dzīvnieki (TM B.5 (2)). Vispiemērotākās testēšanas metodes izvēle un šīs testēšanas metodes izmantošana jāskata ESAO Vadlīniju par integrētu pieeju nopietnu acu bojājumu un acu kairinājuma testēšanai un novērtēšanai (39) kontekstā.
3.Šajā testēšanas metodē aprakstīta in vitro procedūra, pēc kuras var noteikt ķimikālijas (vielas un maisījumus), kuras nav jāklasificē un jāmarķē kā tādas, kas saskaņā ar ANO GHS un CLP izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus. Tajā izmanto rekonstruētu cilvēka radzenei līdzīgu epitēliju (RhCE), kura īpašības ļoti līdzinās cilvēka radzenes epitēlija histoloģiskajām, morfoloģiskajām, bioķīmiskajām un fizioloģiskajām īpašībām. Vēl četras in vitro testēšanas metodes ir apstiprinātas, uzskatāmas par zinātniski derīgām un pieņemtas kā TM B.47 (3), B.48 (4), B.61 (5) un B.68 (6), lai noteiktu cilvēka veselības beigupunktam atbilstošos nopietnos acu bojājumus / acu kairinājumu.
4.Šajā testēšanas metodē iekļauti divi apstiprināti testi, kuros izmanto komerciāli pieejamus RhCE modeļus. Validācijas pētījumi acu kairinājuma / nopietnu acu bojājumu novērtēšanai veikti (7)(8)(9)(10)(11)(12)(13) ar EpiOcular™ acu kairinājuma testu (EIT) un SkinEthic™ cilvēka radzenes epitēlija (HCE) acu kairinājuma testu (EIT). Katrā no šiem testiem par testa sistēmu izmanto komerciāli pieejamas RhCE audu konstrukcijas, tālāk tekstā tās sauktas par validētām references metodēm: attiecīgi VRM1 un VRM2. No šiem validācijas pētījumiem un to neatkarīgajiem salīdzinošajiem izvērtējumiem (9)(12) secināja, ka ar EpiOcular™ EIT un SkinEthic™ HCE EIT iespējams pareizi identificēt ķimikālijas (vielas un maisījumus), kuras nav jāklasificē un jāmarķē kā tādas, kas izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus saskaņā ar ANO GHS, un testus ieteica kā zinātniski derīgus šim nolūkam (13).
5.Patlaban ir vispārpieņemts, ka tuvākajā nākotnē neviena atsevišķa in vitro testēšanas metode nevarēs pilnībā aizstāt Dreiza [Draize] in vivo acu testu (2)(14) un prognozēt visas nopietnu acu bojājumu / acu kairinājuma atbildreakcijas dažādām ķimikāliju klasēm. Tomēr Dreiza acu testu varētu būt iespējams pilnībā aizstāt, (pakāpjveida) testēšanas stratēģijā stratēģiski kombinējot vairākas alternatīvas testēšanas metodes, piem., augšupēju/lejupēju pieeju (15). Augšupējā pieeja (15) ir izstrādāta gadījumiem, kad, pamatojoties uz esošo informāciju, paredzams, ka ķimikālija neizraisīs tādu acu kairinājumu, ka tā būtu jāklasificē, savukārt lejupējā pieeja (15) ir izstrādāta gadījumiem, kad, pamatojoties uz esošo informāciju, ķimikālija izraisīs nopietnus acu bojājumus. EpiOcular™ EIT un SkinEthic™ HCE EIT ieteicams izmantot tādā testēšanas stratēģijā kā Scott et al. ierosinātā augšupējā/lejupējā pieeja, piemēram, par sākotnējo posmu augšupējā pieejā vai kā vienu no pēdējiem posmiem lejupējā pieejā, tādu ķimikāliju identificēšanai, kuras saskaņā ar ANO GHS / CLP (nekategorizētas ķīmiskās vielas) bez papildu testēšanas nav jāklasificē kā tādas, kas izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus (15). Taču EpiOcular™ EIT un SkinEthic™ HCE EIT nav paredzēti ANO GHS / CLP 1. kategorijas (nopietni acu bojājumi) un ANO GHS / CLP 2. kategorijas (acu kairinājums) atšķiršanai. Šī diferenciācija būs jānosaka citā testēšanas stratēģijas pakāpē (15). Tāpēc testējamā ķimikālija, kura ar EpiOcular™ EIT vai SkinEthic™ HCE EIT identificēta par tādu, kas jāklasificē kā acu kairinājumu / nopietnus acu bojājumus izraisoša, jātestē papildus (in vitro un/vai in vivo), lai nonāktu pie galīgā secinājuma (ANO GHS / CLP nekategorizēta, 2. kategorijas vai 1. kategorijas ķimikālija), izmantojot, piem., TM B.47, B.48, B.61 vai B.68.
6.Šajā testēšanas metodē aprakstīta procedūra, ko izmanto, lai izvērtētu testējamās ķimikālijas potenciālo bīstamību acīm, pamatojoties uz tās spēju izraisīt citotoksicitāti RhCE audu konstrukcijā, ko nosaka ar MTT ķīmisko analīzi (16) (sk. 21. punktu). RhCE audu dzīvotspēju pēc eksponēšanas testējamai ķimikālijai nosaka salīdzinājumā ar audiem, kas apstrādāti ar negatīvās kontroles vielu (% dzīvotspējas), pēc tam to izmanto, lai prognozētu testējamās ķimikālijas potenciālo bīstamību acīm.
7.Lai saskaņā ar ESAO Vadlīniju Nr. 34 (18) principiem būtu vieglāk validēt jaunus vai grozītus in vitro RhCE testus, kas līdzinās EpiOcular™ EIT un SkinEthic™ HCE EIT, un lai ESAO TG 492 būtu iespējams savlaicīgi grozīt ar mērķi tajā iekļaut šos testus, ir pieejami veiktspējas standarti (17). Attiecībā uz testiem, kas validēti saskaņā ar veiktspējas standartiem, datu savstarpējā atzīšana (MAD) saskaņā ar ESAO nolīgumu būs garantēta tikai tad, ja ESAO šos testus būs izskatījusi un iekļāvusi attiecīgajā testēšanas vadlīnijā.
DEFINĪCIJAS
8.Definīcijas ir sniegtas 1. papildinājumā.
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI
9.Šīs testēšanas metodes pamatā ir komerciālas trīsdimensiju RhCE audu konstrukcijas, ko ražo, izmantojot primāros cilvēka epidermas keratinocītus (t. i., EpiOcular™ OCL-200) vai imortalizētas cilvēka radzenes epitēlija šūnas (t. i., SkinEthic™ HCE/S). EpiOcular™ OCL-200 un SkinEthic™ HCE/S RhCE audu konstrukcijas ir līdzīgas in vivo radzenes epitēlija trīsdimensiju struktūrai, un tās ražo no pētāmās sugas šūnām (19)(20). Turklāt ar testiem tieši nosaka citotoksicitāti, ko izraisa ķimikālijas iekļūšana cauri radzenei un šūnu un audu bojājumu rašanās, pēc tam citotoksiskā atbildreakcija nosaka nopietnu acu bojājumu / acu kairinājuma vispārējo iznākumu in vivo. Šūnu bojājumus var izraisīt vairāki iedarbības veidi (sk. 20. punktu), taču citotoksicitātei ir svarīga vai pat primāra mehānistiska nozīme ķimikālijas izraisītas nopietnu acu bojājumu / acu kairinājuma vispārējās atbildreakcijas noteikšanā, kas neatkarīgi no audu bojājumu pamatā esošiem fizikāli ķīmiskajiem procesiem in vivo izpaužas galvenokārt kā radzenes apduļķošanās, irīts, konjunktīvas apsārtums un/vai konjunktīvas hemoze.
10.Šīs testēšanas metodes pamatā esošajā validēšanas pētījumā testētas ļoti daudzas ķimikālijas, aptverot ļoti dažādus ķīmisko vielu veidus, ķīmisko vielu klases, molekulmasas, LogP, ķīmiskās struktūras utt. EpiOcular™ EIT validēšanas datubāzē kopumā bija ietvertas 113 ķimikālijas, saskaņā ar ESAO QSAR instrumentu kopuma analīzi aptverot 95 dažādas organiskās funkcionālās grupas (8). Vairākums šo ķimikāliju bija vienkomponenta vielas, taču pētījumā bija iekļautas arī vairākas daudzkomponentu vielas (tostarp 3 homopolimēri, 5 kopolimēri un 10 kvazipolimēri). 113 testēto ķimikāliju sadalījums pēc agregātstāvokļa un ANO GHS / CLP kategorijām bija šāds: 13 1. kategorijas šķidrumi, 15 1. kategorijas cietvielas, 6 2A kategorijas šķidrumi, 10 2A kategorijas cietvielas, 7 2B kategorijas šķidrumi, 7 2B kategorijas cietvielas, 27 nekategorizēti šķidrumi un 28 nekategorizētas cietvielas (8). SkinEthic™ HCE EIT validēšanas datubāzē kopumā bija ietvertas 200 ķimikālijas, aptverot 165 dažādas organiskās funkcionālās grupas (8)(10)(11). Vairākums šo ķimikāliju bija vienkomponenta vielas, taču pētījumā bija iekļautas arī vairākas daudzkomponentu vielas (tostarp 10 polimēri). 200 testēto ķimikāliju sadalījums pēc agregātstāvokļa un ANO GHS / CLP kategorijām bija šāds: 27 1. kategorijas šķidrumi, 24 1. kategorijas cietvielas, 19 2A kategorijas šķidrumi, 10 2A kategorijas cietvielas, 9 2B kategorijas šķidrumi, 8 2B kategorijas cietvielas, 50 nekategorizēti šķidrumi un 53 nekategorizētas cietvielas (10)(11).
11.Šī testēšanas metode attiecas uz vielām un maisījumiem, kā arī uz cietām vielām, šķidrumiem, puscietām vielām un vaskiem. Šķidrumi var būt ūdens vai neūdens šķīdumi; cietas vielas var būt gan ūdenī šķīstošas, gan nešķīstošas. Ja iespējams, cietas vielas pirms aplicēšanas jāsamaļ smalkā pulverī; nekāda cita priekšapstrāde paraugam nav vajadzīga. Validēšanas pētījumā nav novērtētas gāzes un aerosoli. Kaut arī domājams, ka vispār ir iespējams tos testēt ar RhCE tehnoloģiju, ar pašreizējo testēšanas metodi gāzes un aerosolus testēt nevar.
12.Testējamās ķimikālijas, kas absorbē gaismu tādā pašā diapazonā kā MTT formazāns (dabiski vai pēc apstrādes), un testējamās ķimikālijas, kas spēj tiešā veidā reducēt vitālo krāsvielu MTT (par MTT formazānu), var traucēt audu dzīvotspējas mērījumiem, un korekcijai jāizmanto pielāgotas kontroles. Iespējami nepieciešamo pielāgoto kontroļu veids atšķirsies atkarībā no testējamās ķimikālijas radītās interferences veida un MTT formazāna kvantitatīvai noteikšanai izmantotās procedūras (sk. 36.–42. punktu).
13.Pirmsvalidēšanas (21)(22) un pilnās validēšanas (8)(10)(11) pētījumos iegūtie rezultāti pierādījuši, ka EpiOcular™ EIT un SkinEthic™ HCE EIT ir izmantojams laboratorijās, kurās iepriekš nav veikta ķīmiskā analīze, un tie ir reproducējami tajā pašā un citās laboratorijās. Pamatojoties uz šiem pētījumiem, prognožu konkordantuma reproducējamības līmenis, ko var sagaidīt no EpiOcular™ EIT no iegūtajiem datiem par 113 ķimikālijām, ir aptuveni 95 % tajā pašā laboratorijā un 93 % citās laboratorijās. Prognožu konkordantuma reproducējamības līmenis, ko var sagaidīt no SkinEthic™ HCE EIT iegūtajiem datiem par 120 ķimikālijām, ir aptuveni 92 % tajā pašā laboratorijā un 95 % citās laboratorijās.
14.EpiOcular™ EIT var izmantot tādu ķimikāliju identificēšanai, kuras saskaņā ar ANO GHS un CLP klasifikācijas sistēmu nav jāklasificē kā tādas, kas izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus. Ņemot vērā validēšanas pētījumā (8) iegūtos datus, EpiOcular™ EIT vispārējā pareizība ir 80 % (no datiem par 112 ķimikālijām), jutība ir 96 % (no datiem par 57 ķimikālijām), pseidonegatīvu īpatsvars ir 4 % (no datiem par 57 ķimikālijām), specifiskums ir 63 % (no datiem par 55 ķimikālijām) un pseidopozitīvu īpatsvars ir 37 % (no datiem par 55 ķimikālijām), salīdzinot ar truša acu in vivo references testa datiem (TM B.5) (2)(14), kas klasificēti saskaņā ar ANO GHS un CLP klasifikācijas sistēmu. Pētījumā, kurā ar EpiOcular™ EIT testēja 97 šķidrus agroķīmijas preparātus, pierādīja, ka šā veida maisījumu testēšanas metodes veiktspēja ir līdzīga validēšanas pētījuma veiktspējai (23). 97 preparātu sadalījums bija šāds: 21 1. kategorijas, 19 2A kategorijas, 14 2B kategorijas un 43 nekategorizēti, kas klasificēti saskaņā ar ANO GHS klasifikācijas sistēmu atbilstoši truša acu in vivo references testa datiem (TM B.5) (2)(14). Ieguva vispārējo pareizību 82 % (no datiem par 97 preparātiem), jutību 91 % (no datiem par 54 preparātiem), pseidonegatīvu īpatsvaru 9 % (no datiem par 54 preparātiem), specifiskumu 72 % (no datiem par 43 preparātiem) un pseidopozitīvu īpatsvaru 28 % (no datiem par 43 preparātiem) (23).
15.SkinEthic™ HCE EIT var izmantot tādu ķimikāliju identificēšanai, kuras saskaņā ar ANO GHS un CLP klasifikācijas sistēmu nav jāklasificē kā tādas, kas izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus. Ņemot vērā validēšanas pētījumā (10)(11) iegūtos datus, SkinEthic™ HCE EIT vispārējā pareizība ir 84 % (no datiem par 200 ķimikālijām), jutība ir 95 % (no datiem par 97 ķimikālijām), pseidonegatīvu īpatsvars ir 5 % (no datiem par 97 ķimikālijām), specifiskums ir 72 % (no datiem par 103 ķimikālijām) un pseidopozitīvu īpatsvars ir 28 % (no datiem par 103 ķimikālijām), salīdzinot ar truša acu in vivo references testa datiem (TM B.5) (2)(14), kas klasificēti saskaņā ar ANO GHS un CLP klasifikācijas sistēmu.
16.Ar abiem RhCE testiem vielām vai maisījumiem iegūtais pseidonegatīvu īpatsvars atbilst 12 % kopējās varbūtības, ka atkārtotā testēšanā ar in vivo Dreiza acu testu ķimikālijas tiek identificētas kā ANO GHS un CLP 2. kategorijas vai ANO GHS un CLP nekategorizētas ķimikālijas; tā iemesls ir metodei raksturīgā mainība viena testa ietvaros (24). Ar abām RhCE testēšanas metodēm vielām vai maisījumiem iegūtajam pseidopozitīvu īpatsvaram šīs testēšanas metodes kontekstā nav būtiskas nozīmes, jo, izmantojot pierādījumu izsvēršanu pakāpjveida testēšanas stratēģijā, visas testējamās ķimikālijas, kuras rada audu dzīvotspēju, kas atbilst noteiktajām robežvērtībām vai ir mazāka par tām (sk. 44. punktu), atkarībā no regulatīvajām prasībām būs jātestē papildus ar citām in vitro testēšanas metodēm vai, ja citas iespējas nebūtu, ar trušiem. Šīs testēšanas metodes var izmantot visu veidu ķimikālijām, negatīvu rezultātu pieņemot par norādi, ka ķimikālija nav jāklasificē kā tāda, kas izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus (ANO GHS un CLP nekategorizēta). Pirms EpiOcular™ EIT un SkinEthic™ HCE EIT izmantošanas klasificēšanas shēmās, kas nav ANO GHS / CLP, jākonsultējas ar attiecīgajām regulatīvajām iestādēm.
17.Šīs testēšanas metodes ierobežojums ir tāds, ka ar to nevar atšķirt acu kairinājumu / atgriezenisku ietekmi uz acīm (2. kategorija) no nopietniem acu bojājumiem / neatgriezeniskas ietekmes uz acīm (1. kategorija), kā noteikts ANO GHS un CLP, nedz arī acu kairinātājus (fakultatīvā 2A kategorija) no viegliem acu kairinātājiem (fakultatīvā 2B kategorija), kā noteikts ANO GHS (1). Šiem nolūkiem nepieciešama papildu testēšana ar citām in vitro testēšanas metodēm.
18.Terminu “testējamā ķimikālija” šajā testēšanas metodē izmanto, lai apzīmētu to, kas tiek testēts, bez sasaistes ar RhCE testēšanas metodes pielietojamību vielu un/vai maisījumu testēšanā.
TESTA PRINCIPS
19.Testējamo ķimikāliju vietēji aplicē uz vismaz divām trīsdimensiju RhCE audu konstrukcijām, un audu dzīvotspēju mēra pēc ekspozīcijas un pēcekspozīcijas inkubēšanas laika. RhCE audus rekonstruē no primāriem cilvēka epidermas keratinocītiem vai imortalizētām cilvēka radzenes epitēlija šūnām, kas kultivētas vairākas dienas, tā lai veidotos stratificēts, labi diferencēts plakans epitēlijs, kas ir morfoloģiski līdzīgs epitēlijam cilvēka radzenē. EpiOcular™ RhCE audu konstrukciju veido vismaz 3 dzīvotspējīgi šūnu slāņi un nekeratinizēta virsma, un tai piemīt radzenei līdzīga struktūra, kas ir analoga struktūrai in vivo. SkinEthic™ HCE RhCE audu konstrukciju līdzīgi normālam cilvēka radzenes epitēlijam veido vismaz 4 dzīvotspējīgi šūnu slāņi, to vidū cilindriskās bazālās šūnas, pārejas spārnveida šūnas un virspusējās plakanās šūnas (20)(26).
20.Ķimikālijas izraisīti nopietni acu bojājumi / acu kairinājums, kas in vivo izpaužas galvenokārt kā radzenes apduļķošanās, irīts, konjunktīvas apsārtums un/vai konjunktīvas hemoze, ir rezultāts virknei notikumu, kas sākas ar ķimikālijas iekļūšanu cauri radzenei un/vai konjunktīvai un šūnu bojājumu rašanos. Šūnu bojājumus var izraisīt vairāki iedarbības veidi: šūnas membrānas līze (piem., virsmaktīvo vielu, organisku šķīdinātāju izraisīta); makromolekulu (īpaši proteīnu) koagulācija (piem., virsmaktīvo vielu, organisku šķīdinātāju, sārmu un skābju izraisīta); lipīdu pārziepošanās (piem., sārmu izraisīta); alkilēšana vai cita kovalenta mijiedarbība ar makromolekulām (piem., balināšanas līdzekļu, peroksīdu un alkilētāju izraisīta) (15)(27)(28). Tomēr pierādīts, ka citotoksicitātei ir svarīga vai pat primāra mehānistiska nozīme ķimikālijas izraisītas nopietnu acu bojājumu / acu kairinājuma vispārējās atbildreakcijas noteikšanā neatkarīgi no audu bojājumu pamatā esošiem fizikāli ķīmiskajiem procesiem (29)(30). Turklāt ķimikālijas potenciālu izraisīt nopietnus acu bojājumus / acu kairinājumu galvenokārt nosaka sākotnējā bojājuma apjoms (31), kas korelē ar šūnu mirstības apjomu (29) un sekojošo atbildreakciju un iespējamo iznākumu apjomu (32). Tādējādi pavisam viegli kairinātāji parasti ietekmē tikai virspusējo radzenes epitēliju, viegli un vidēji smagi kairinātāji bojā galvenokārt epitēliju un virspusējo stromu, bet smagi kairinātāji bojā epitēliju, dziļo stromu un reizēm radzenes endotēliju (30)(33). RhCE audu konstrukcijas dzīvotspējas mērīšana, ko pēc vietējas eksponēšanas testējamai ķimikālijai veic, lai noteiktu ķimikālijas, kuras nav jāklasificē kā tādas, kas izraisa nopietnus acu bojājumus / acu kairinājumu (ANO GHS un CLP nekategorizētas ķimikālijas), pamatojas uz pieņēmumu, ka visas ķimikālijas, kas izraisa nopietnus acu bojājumus vai acu kairinājumu, radzenes epitēlijā un/vai konjunktīvā izraisīs citotoksicitāti.
21.RhCE audu dzīvotspēju ierasts mērīt pēc audu dzīvotspējīgo šūnu ierosinātas vitālās krāsvielas MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds; tiazolilzilais tetrazolija bromīds; CAS Nr. 298-93-1] fermentatīvās pārvēršanās par zilas krāsas MTT formazāna sāli, kura daudzumu kvantitatīvi nosaka audu ekstraktā (16). Par ķimikālijām, kuras nav jāklasificē un jāmarķē saskaņā ar ANO GHS / CLP (nekategorizētas ķimikālijas), nosaka tādas ķimikālijas, kas nesamazina audu dzīvotspēju zem noteiktas robežvērtības (t. i., audu dzīvotspēja > 60 % EpiOcular™ EIT un SkinEthic™ HCE EITL testā vai > 50 % SkinEthic™ HCE EITS testā) (sk. 44. punktu).
KOMPETENCES PIERĀDĪŠANA
22.Pirms RhCE testu regulāras izmantošanas normatīviem mērķiem laboratorijām jāpierāda sava tehniskā kompetence, pareizi prognozējot 1. tabulā norādītās piecpadsmit standartķimikālijas. Šīs ķimikālijas atlasītas no VRM validēšanas pētījumos izmantotajām ķimikālijām (8)(10)(11). Atlasē iespējamajā apjomā iekļautas ķimikālijas: i) ar atšķirīgu agregātstāvokli; ii) kas aptver visas nopietnu acu bojājumu / acu kairinājuma atbildreakcijas in vivo atbilstoši augstas kvalitātes rezultātiem, kas iegūti truša acu in vivo references testā (TM B.5) (2)(14) un ANO GHS klasifikācijas sistēmā (t. i., 1., 2A, 2B kategorijas vai nekategorizētas ķimikālijas) (1) un CLP klasifikācijas sistēmā (t. i., 1., 2. kategorijas vai nekategorizētas ķimikālijas); iii) kas aptver klasifikācijas atšķirīgos faktorus in vivo (24)(25); iv) kas atbilst validēšanas pētījumā izmantotajām ķimikāliju klasēm (8)(10)(11); v) kas plaši aptver organiskās funkcionālās grupas (8)(10)(11); vi) kuru ķīmiskā struktūra ir precīzi noteikta (8)(10)(11); vii) kurām ir krāsa un/vai kas ir tiešas MTT reducētājas; viii) ar kurām to validēšanas laikā ar RhCE testēšanas metodēm ieguva reproducējamus rezultātus; ix) kuras to validēšanas pētījumu laikā tika pareizi prognozētas ar RhCE testēšanas metodēm; x) kas aptver visas atbildreakcijas in vitro atbilstoši augstas kvalitātes RhCE testēšanas metožu datiem (dzīvotspēja no 0 līdz 100 %); xi) kas ir komerciāli pieejamas; xii) kuru lietošana nav saistīta ar pārlieku augstām iegādes un/vai atkritumu apsaimniekošanas izmaksām. Gadījumos, kad kāda no norādītajām ķimikālijām nav pieejama vai nav izmantojama citu pamatotu iemeslu dēļ, var izmantot citu ķimikāliju, kas atbilst iepriekš aprakstītajiem kritērijiem, piem., ķimikāliju, kas izmantota VRM validēšanai. Šādas atkāpes jāpamato.
1. tabula. Standartķimikāliju saraksts
|
Ķīmiskais nosaukums
|
CAS Nr.
|
Organiskā funkcionālā grupa1
|
Agregātstāvoklis
|
VRM1 dzīvotspēja (%)2
|
VRM2 dzīvotspēja (%)3
|
VRM prognoze
|
MTT reducētājs
|
Krāsas interf.
|
|
In vivo 1. kategorija4
|
|
Metiltioglikolāts
|
2365-48-2
|
Karbonskābes esteris; tiospirts
|
Šķidrs
|
10,9±6,4
|
5,5±7,4
|
Nav iespējams prognozēt
|
Jā
(spēcīgs)
|
Nē
|
|
Hidroksietilakrilāts
|
818-61-1
|
Akrilāts;
spirts
|
Šķidrs
|
7,5±4,75
|
1,6±1,0
|
Nav iespējams prognozēt
|
Nē
|
Nē
|
|
2,5-Dimetil-2,5-heksāndiols
|
110-03-2
|
Spirts
|
Ciets
|
2,3±0,2
|
0,2±0,1
|
Nav iespējams prognozēt
|
Nē
|
Nē
|
|
Nātrija oksalāts
|
62-76-0
|
Oksokarbonskābe
|
Ciets
|
29,0±1,2
|
5,3±4,1
|
Nav iespējams prognozēt
|
Nē
|
Nē
|
|
In vivo 2A kategorija4
|
|
2,4,11,13-Tetraazatetradekāndiimidamīds, N,N''-bis(4-hlorfenil)-3,12-diimino-, di-D-glikonāts
(20 %, ūdens)6
|
18472-51-0
|
Aromātiskais heterocikliskais halogenīds; arilhalogenīds; dihidroksilgrupa; guanidīns
|
Šķidrs
|
4,0±1,1
|
1,3±0,6
|
Nav iespējams prognozēt
|
Nē
|
Jā
(vājš)
|
|
Nātrija benzoāts
|
532-32-1
|
Arils; karbonskābe
|
Ciets
|
3,5±2,6
|
0,6±0,1
|
Nav iespējams prognozēt
|
Nē
|
Nē
|
|
In vivo 2B kategorija4
|
|
Dietiltoluamīds
|
134-62-3
|
Benzamīds
|
Šķidrs
|
15,6±6,3
|
2,8±0,9
|
Nav iespējams prognozēt
|
Nē
|
Nē
|
|
2,2-Dimetil-3-metilēnbiciklo [2.2.1] heptāns
|
79-92-5
|
Alkāns, sazarots ar trešējo oglekli; alkēns; bicikloheptāns; karbocikli ar tiltiņu saturošu gredzenu; cikloalkāns
|
Ciets
|
4,7±1,5
|
15,8±1,1
|
Nav iespējams prognozēt
|
Nē
|
Nē
|
|
In vivo nekategorizētas4
|
|
1-Etil-3-metilimidazolija etilsulfāts
|
342573-75-5
|
Alkoksils; amonija sāls; arils; imidazols; sulfāts
|
Šķidrs
|
79,9±6,4
|
79,4±6,2
|
Nekategor.
|
Nē
|
Nē
|
|
Dikaprililēteris
|
629-82-3
|
Alkoksils;
ēteris
|
Šķidrs
|
97,8±4,3
|
95,2±3,0
|
Nekategor.
|
Nē
|
Nē
|
|
Piperonila butoksīds
|
51-03-6
|
Alkoksils; benzdioksols; benzils; ēteris
|
Šķidrs
|
104,2±4,2
|
96,5±3,5
|
Nekategor.
|
Nē
|
Nē
|
|
Polietilēnglikola (PEG-40) hidrogenēta rīcineļļa
|
61788-85-0
|
Acilals; spirts; alils; ēteris
|
Viskozs
|
77,6±5,4
|
89,1±2,9
|
Nekategor.
|
Nē
|
Nē
|
|
1-(4-Hlorfenil)-3-(3,4-dihlorfenil)urīnviela
|
101-20-2
|
Aromātiskais heterocikliskais halogenīds; arilhalogenīds; urīnvielas atvasinājumi
|
Ciets
|
106,7±5,3
|
101,9±6,6
|
Nekategor.
|
Nē
|
Nē
|
|
2,2'-Metilēn-bis-(6-(2H-benzotriazol-2-il)-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenols)
|
103597-45-1
|
Alkāns, sazarots ar četraizvietoto oglekli; saplūdusi karbocikliskā aromātviela; saplūduši piesātinātie heterocikli; prekursoru hinoīdu savienojumi; terc-butils
|
Ciets
|
102,7±13,4
|
97,7±5,6
|
Nekategor.
|
Nē
|
Nē
|
|
Kālija tetrafluorborāts
|
14075-53-7
|
Neorganisks sāls
|
Ciets
|
88,6±3,3
|
92,9±5,1
|
Nekategor.
|
Nē
|
Nē
|
23.Ieteicams, lai kompetences testēšanas ietvaros lietotāji pēc audu saņemšanas verificētu šo audu barjerfunkcijas, kā precizējis RhCE audu konstrukcijas ražotājs (sk. 25., 27. un 30. punktu). Īpaši svarīgi tas ir tad, ja audi sūtīti no tālienes / sūtīšana aizņēmusi ilgu laiku. Kad tests ir sekmīgi ieviests un apgūts un tā izmantošanas prasme pierādīta, šādu verifikāciju vairs nav nepieciešams veikt katru reizi. Tomēr, ja testu izmanto parastajā praksē, barjerfunkciju novērtēšanu ieteicams turpināt regulāri.
PROCEDŪRA
24.Testi, uz kuriem pašlaik attiecas šī testēšanas metode, ir zinātniski derīgie EpiOcular™ EIT un SkinEthic™ HCE EIT (9)(12)(13), ko dēvē par validēto references metodi (attiecīgi VRM1 un VRM2). RhCE testēšanas metodēm ir pieejamas standartprocedūras, kas jāizmanto, ieviešot un izmantojot testēšanas metodes laboratorijā (34)(35). Nākamajos punktos un 2. papildinājumā aprakstītas RhCE testu galvenās sastāvdaļas un procedūras.
RHCE TESTĒŠANAS METODES KOMPONENTI
Vispārīgi nosacījumi
25.Lai rekonstruētu radzenei līdzīga epitēlija trīsdimensiju audus, jāizmanto attiecīgas cilvēka šūnas, kam jāsastāv no pieaugoši stratificētām, bet ne pārragotām šūnām. RhCE audu konstrukciju gatavo insertos ar porainu sintētisku membrānu, caur kuru šūnām var piekļūt barības vielas. Rekonstruētajā radzenei līdzīgajā epitēlijā jābūt vairākiem dzīvotspējīgu, nekeratinizētu epitēlija šūnu slāņiem. RhCE audu konstrukcijas epitēlija virsmai jābūt tiešā saskarē ar gaisu, lai būtu iespējama tieša vietēja eksponēšana testējamajām ķimikālijām līdzīgi tam, kā in vivo tiktu eksponēts radzenes epitēlijs. RhCE audu konstrukcijai jāveido pietiekami spēcīga funkcionāla barjera, lai aizturētu citotoksisko etalonvielu, piem., Triton X-100 vai nātrija dodecilsulfāta (SDS), ātru penetrāciju. Barjerfunkcija būtu uzskatāmi jāpierāda, un šo funkciju iespējams novērtēt, vai nu nosakot, kāds ekspozīcijas laiks vajadzīgs, lai pēc tam, kad konkrētā noteiktā koncentrācijā aplicēta etalonviela (piem., 100 µl 0,3% (tilp./tilp.) Triton X-100), par 50 % samazinātos audu dzīvotspēja (ET50), vai nosakot, pie kādas koncentrācijas etalonviela pēc noteikta ekspozīcijas laika (piem., 30 minūšu ilgas apstrādes ar 50 µl SDS) par 50 % samazina audu dzīvotspēju (IC50) (sk. 30. punktu). RhCE audu konstrukcijas aizturošajām īpašībām jānovērš testējamās ķimikālijas nokļūšana pāri dzīvotspējīgo audu malai, jo tā dēļ var tikt nepareizi modelēta faktiskā iedarbība uz radzeni. RhCE audu konstrukcijas izveidē izmantotās cilvēka šūnas nedrīkst būt kontaminētas ar baktērijām, vīrusiem, mikoplazmu vai sēnītēm. Piegādātājam jāpārbauda audu konstrukcijas sterilitāte, lai pārliecinātos, ka nav kontaminācijas ar sēnītēm un baktērijām.
Funkcionāli nosacījumi
Dzīvotspēja
26.Audu dzīvotspējas kvantitatīvai noteikšanai izmanto MTT ķīmisko analīzi (16). RhCE audu konstrukcijas dzīvotspējīgās šūnas vitālo krāsvielu MTT reducē par zilas krāsas MTT formazāna nogulsnēm, ko pēc tam no audiem ekstrahē ar izopropanolu (vai līdzīgu šķīdinātāju). Ekstrahēto MTT formazānu var kvantitatīvi noteikt ar standarta absorbcijas (optiskā blīvuma jeb OB) mērījumu vai HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (36). Tīra ekstrakcijas šķīdinātāja OB jābūt pietiekami zemam, t. i., OB < 0,1. RhCE audu konstrukcijas lietotājiem jānodrošina, ka katra izmantotā RhCE audu konstrukcijas partija atbilst negatīvajai kontrolei definētajiem kritērijiem. Negatīvās kontroles OB vērtību pieņemamības diapazoni attiecīgajām VRM ir norādīti 2. tabulā. HPLC/UPLC spektrofotometrijas lietotājam par negatīvās kontroles apstiprināšanas kritēriju jāizmanto 2. tabulā norādītie negatīvās kontroles OB diapazoni. Testēšanas pārskatā jābūt dokumentētam, ka ar negatīvās kontroles vielu apstrādātie audi kultūrā ir stabili (nodrošina līdzīgus audu dzīvotspējas mērījumus) visas testa ekspozīcijas laikā. Audu ražotājam audu partijas izlaides kvalitātes kontroles ietvaros jāveic līdzīga procedūra, taču šajā gadījumā var būt spēkā no 2. tabulā norādītajiem atšķirīgi apstiprināšanas kritēriji. RhCE audu konstrukcijas izstrādātājam/piegādātājam jānosaka negatīvās kontroles OB vērtību pieņemamības diapazons (augšējā un apakšējā robežvērtība) (QC testēšanas metodes apstākļos).
2. tabula. Testa lietotājiem paredzētie negatīvās kontroles optiskā blīvuma vērtību pieņemamības diapazoni
|
Tests
|
Apakšējā pieņemamības robežvērtība
|
Augšējā pieņemamības robežvērtība
|
|
EpiOcular™ EIT (OCL-200) – VRM1
(gan šķidru , gan cietu vielu protokoliem)
|
> 0,81
|
< 2,5
|
|
SkinEthic™ HCE EIT (HCE/S) – VRM2
(gan šķidru , gan cietu vielu protokoliem)
|
> 1,0
|
≤ 2,5
|
Barjerfunkcija
27.RhCE audu konstrukcijai jābūt pietiekami biezai un noturīgai, lai aizturētu citotoksisku etalonvielu ātru penetrāciju, ko nosaka pēc ET50 (Triton X-100) vai pēc IC50 (SDS) (3. tabula). RhCE audu konstrukcijas izstrādātājam/pārdevējam, kad tas piegādā audus gala lietotājam, jāpierāda katras izmantojamās RhCE audu konstrukcijas partijas barjerfunkcija (sk. 30. punktu).
Morfoloģija
28.RhCE audu konstrukcijas histoloģiskā izmeklējumā jāpierāda līdzība cilvēka radzenes epitēlija struktūrai (jābūt vismaz 3 slāņiem dzīvotspējīgu epitēlija šūnu un nekeratinizētai virsmai). Attiecīgajām VRM izstrādātājs/piegādātājs ir izveidojis atbilstošu morfoloģiju, tāpēc testēšanas metodes lietotājam tā nav atkārtoti jāpierāda katrai izmantojamajai audu partijai.
Reproducējamība
29.Testēšanas metodes pozitīvās un negatīvās kontroles rezultātiem uzskatāmi jāparāda to reproducējamība laika gaitā.
Kvalitātes kontrole (QC)
30.RhCE audu konstrukciju drīkst izmantot tikai tad, ja izstrādātājs/piegādātājs pierāda, ka ikviena izmantojamās RhCE audu konstrukcijas partija atbilst definētajiem produkcijas izlaides kritērijiem, no kuriem svarīgākie ir dzīvotspēja (26. punkts) un barjerfunkcija (27. punkts). RhCE audu konstrukcijas izstrādātājam/piegādātājam jānosaka ar ET50 vai IC50 mērītas (sk. 25. un 26. punktu) barjerfunkcijas pieņemamības diapazons (augšējā un apakšējā robežvērtība). ET50 un IC50 pieņemamības diapazons, ko RhCE audu konstrukciju izstrādātājs/piegādātājs izmanto kā QC partijas izlaides kritēriju (izmanto VRM), ir norādīts 3. tabulā. RhCE audu konstrukcijas izstrādātājam/piegādātājam dati, kas pierāda atbilstību visiem produkcijas izlaides kritērijiem, jādara pieejami testēšanas metodes lietotājiem, lai tie šo informāciju varētu iekļaut testēšanas pārskatā. Tikai ar visiem šiem produkcijas izlaides kritērijiem atbilstošiem audiem iegūti rezultāti. ir pieņemami tādu ķimikāliju ticamai prognozēšanai, kuras saskaņā ar ANO GHS / CLP nav jāklasificē un jāmarķē kā acu kairinājuma vai nopietnu acu bojājumu izraisītājas.
3. tabula. Partiju izlaides QC kritērijs
|
Tests
|
Apakšējā pieņemamības robežvērtība
|
Augšējā pieņemamības robežvērtība
|
|
EpiOcular™ EIT (OCL-200) – VRM1
(100 µl 0,3 % (tilpums/tilpums) Triton X-100)
|
ET50 = 12,2 min
|
ET50 = 37,5 min
|
|
SkinEthic™ HCE EIT (HCE/S) – VRM2 (30 minūšu ilga apstrāde ar 50 µl SDS)
|
IC50 = 1 mg/ml
|
IC50 = 3,2 mg/ml
|
Testējamās ķimikālijas un kontroles vielu aplicēšana
31.Katrai testējamai ķimikālijai un katrai kontroles vielai katrā izpildes reizē vajadzīgi vismaz divi audu replikāti. Izmanto divus atšķirīgus apstrādes protokolus: vienu šķidrām testējamajām ķimikālijām un vienu cietām testējamajām ķimikālijām (34)(35). Atbilstoši abām metodēm un protokoliem pirms testējamo ķimikāliju aplicēšanas audu konstrukcijas virsma jāsamitrina ar kalciju un magniju nesaturošu Dulbeko fosfātu fizioloģisko buferšķīdumu (Ca2+/Mg2+ nesaturošs DPBS), lai atdarinātu cilvēka acs mitruma apstākļus. Audu apstrādi sāk, tos eksponējot testējamai ķimikālijai (ķimikālijām) un kontroles vielām. Atbilstoši abiem apstrādes protokoliem abās VRM testējamā ķimikālija vai kontroles viela uz epitēlija virsmas vienmērīgā slānī jāaplicē pietiekamā daudzumā, taču izvairoties no pārmērīgas devas (sk 32. un 33. punktu) (2. papildinājums).
32.Testējamās ķimikālijas, kas 37 °C vai zemākā temperatūrā ir pilināmas ar pipeti (ja nepieciešams, izmantojot pozitīvo maināmo uzgaļu virzuļpipeti), saskaņā ar VRM uzskata par šķidrumiem, pārējos gadījumos tās uzskatāmas par cietām vielām (sk 33. punktu). Saskaņā ar VRM šķidras testējamās ķimikālijas vienmērīgi uzklāj audu virsmai (t. i., aplicē vismaz 60 µl/cm2) (sk. 2. papildinājumu, (33)(34)). Lai nodrošinātu audu pareizu devu, ciktāl iespējams, jāizvairās no kapilārās iedarbības (virsmas spraiguma efekta), kas var rasties insertam (uz audu virsmas) aplicētā nelielā tilpuma dēļ. Ar šķidrām testējamajām ķimikālijām apstrādātos audus 30 minūtes inkubē standarta kultivēšanas apstākļos (37 ± 2 oC, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM). Ekspozīcijas laika beigās šķidrā testējamā ķimikālija un kontroles vielas no audu virsmas rūpīgi jānoņem, istabas temperatūrā intensīvi skalojot ar Ca2+/Mg2+ nesaturošu DPBS. Nākamā darbība pēc skalošanas ir pēcekspozīcijas iegremdēšana svaigā istabas temperatūras barotnē (lai atbrīvotos no audos absorbējušās testējamās ķimikālijas) uz iepriekš noteiktu laiku, kas atšķiras atkarībā no izmantotās VRM. Tikai saskaņā ar VMR1 pēcekspozīcijas inkubēšanai svaigā barotnē standarta kultivēšanas apstākļos jānotiek pirms MTT ķīmiskās analīzes (sk. 2. papildinājumu, (34)(35)).
33.Testējamās ķimikālijas, kas līdz 37 °C temperatūrā nav pilināmas ar pipeti, saskaņā ar VRM uzskata par cietām vielām. Aplicējamajam testējamās ķimikālijas daudzumam jābūt pietiekamam, lai pilnībā nosegtu audu virsmu, t. i., jāaplicē vismaz 60 mg/cm2 (2. papildinājums). Ja iespējams, cietas vielas jātestē smalka pulvera veidā. Ar cietām testējamajām ķimikālijām apstrādātos audus iepriekš noteiktu laiku (atkarībā no izmantotās VRM) inkubē standarta kultivēšanas apstākļos (sk. 2. papildinājumu, (34)(35)). Ekspozīcijas laika beigās cietā testējamā ķimikālija un kontroles vielas no audu virsmas rūpīgi jānoņem, istabas temperatūrā intensīvi skalojot ar Ca2+/Mg2+ nesaturošu DPBS. Nākamā darbība pēc skalošanas un pirms MTT ķīmiskās analīzes ir pēcekspozīcijas iegremdēšana svaigā istabas temperatūras barotnē (lai atbrīvotos no audos absorbējušās testējamās ķimikālijas) uz iepriekš noteiktu laiku, kas atšķiras atkarībā no izmantotās VRM, un pēcekspozīcijas inkubēšana svaigā barotnē standarta kultivēšanas apstākļos (sk. 2. papildinājumu, (34)(35)).
34.Katrā izpildes reizē jāiekļauj paralēlas negatīvās un pozitīvās kontroles, lai pierādītu, ka audu dzīvotspēja (kas noteikta ar negatīvo kontroli) un jutība (kas noteikta ar pozitīvo kontroli) atbilst pēc vēsturiskajiem datiem noteiktajiem pieņemamības diapazoniem. Paralēlā negatīvā kontrole arī nodrošina pamatdatus (100 % audu dzīvotspēja), lai aprēķinātu ar testējamo ķimikāliju apstrādāto audu relatīvo dzīvotspēju procentos (%Viabilitytest). Ar VRM lietojamā ieteicamā pozitīvās kontroles viela ir neatšķaidīts metilacetāts (CAS Nr. 79-20-9, komerciāli pieejams, piem., no Sigma-Aldrich, kat. Nr. 45997; šķidrums). Ar VRM1 un VRM2 lietojamās ieteicamās negatīvās kontroles vielas ir attiecīgi ultratīrs H2O un Ca2+/Mg2+ nesaturošs DPBS. Šīs ir VRM validēšanas pētījumos izmantotās kontroles vielas, un par tām ir visvairāk vēsturisko datu. Piemērotu alternatīvu pozitīvās vai negatīvās kontroles vielu izmantošana zinātniski un pienācīgi jāpamato. Negatīvās un pozitīvās kontroles jātestē pēc tiem pašiem protokoliem, ko izmanto izpildes reizē iekļautajām testējamajām ķimikālijām (t. i., šķidrumiem un/vai cietām vielām). Nākamā darbība pēc aplicēšanas un pirms MTT ķīmiskās analīzes attiecīgā gadījumā ir apstrādājamā parauga ekspozīcija, skalošana, pēcekspozīcijas iegremdēšana un pēcekspozīcijas inkubēšana, kā paredzēts kontrolēm, kuras izpilda paralēli šķidrām testējamajām ķimikālijām (sk. 32. punktu), vai kontrolēm, kuras izpilda paralēli cietām testējamajām ķimikālijām (sk. 33. punktu) (sk. 35. punktu) (34)(35). Ar vienu negatīvās un pozitīvās kontroles komplektu pietiek visām vienāda agregātstāvokļa (šķidrumiem vai cietām vielām) testējamajām ķimikālijām vienā un tajā pašā izpildes reizē.
Audu dzīvotspējas mērījumi
35.Audu dzīvotspējas mērīšanai ar šo testēšanas metodi izmantojamā standartizētā kvantitatīvā metode (16) ir MTT ķīmiskā analīze. Tā ir audu trīsdimensiju konstrukcijai piemērota metode. MTT ķīmisko analīzi veic tūlīt pēc pēcekspozīcijas inkubēšanas perioda. Saskaņā ar VRM RhCE audu konstrukcijas paraugu uz 180 ± 15 minūtēm ievieto 0,3 ml MTT šķīduma koncentrācijā 1 mg/ml standarta kultivēšanas apstākļos. RhCE audu konstrukcijas dzīvotspējīgās šūnas vitālo krāsvielu MTT reducē par zilas krāsas MTT formazāna nogulsnēm. Pēc tam izgulsnēto zilās krāsas MTT formazāna produktu no audiem ekstrahē, piemērotā tilpumā izmantojot izopropanolu (vai līdzīgu šķīdinātāju) (34)(35). Ar šķidrām testējamajām ķimikālijām testētie audi jāekstrahē gan no audu augšpuses, gan apakšpuses, bet ar cietām testējamajām ķimikālijām un krāsainiem šķidrumiem testētos audus pietiek ekstrahēt no audu apakšpuses (lai mazinātu izopropanola ekstrakcijas šķīduma iespējamo kontaminēšanu ar testējamo ķimikāliju, kas varētu būt palikusi uz audiem). Arī ar šķidrām testējamajām ķīmiskajām vielām, kas nav viegli noskalojamas, testētos audus pietiek ekstrahēt tikai no audu apakšpuses. Paralēli testētās negatīvās un pozitīvās kontroles vielas jāapstrādā līdzīgi testējamajai ķimikālijai. Ekstrahēto MTT formazānu var kvantitatīvi noteikt ar standarta absorbcijas (OB) mērījumu pie viļņa garuma 570 nm, izmantojot frekvenču joslas filtru, kas nepārsniedz ± 30 nm, vai ar HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (sk. 42. punktu) (11)(36).
36.Testējamās ķimikālijas optiskās īpašības vai ķīmiskās reakcijas ar MTT var traucēt MTT formazāna noteikšanu, un tāpēc dzīvotspēja var būt noteikta nepareizi. Testējamās ķimikālijas var ietekmēt MTT formazāna noteikšanu, MTT tieši reducējot par zilas krāsas MTT formazānu un/vai krāsas interferences dēļ, ja testējamā ķimikālija dabiski vai apstrādes procedūru rezultātā absorbējas tādā pašā OB diapazonā kā MTT formazāns (t. i., apmēram 570 nm). Pirms testēšanas jāveic priekšpārbaudes, lai varētu identificēt potenciālus tiešos MTT reducētājus un/vai krāsu interferējošas ķimikālijas, un šādu testējamo ķimikāliju radītās iespējamās interferences noteikšanai un korekcijām jāizmanto papildu kontroles (sk. 37.–41. punktu). Īpaši svarīgi tas ir tad, ja kādu konkrētu testējamo ķimikāliju pilnībā nenoskalo no RhCE audu konstrukcijas vai ja tā iespiežas radzenei līdzīgajā epitēlijā un tāpēc MTT ķīmiskās analīzes laikā atrodas RhCE audu konstrukcijās. Testējamām ķimikālijām, kas absorbē gaismu tādā pašā diapazonā kā MTT formazāns (dabiski vai pēc apstrādes) un kurām pārāk lielas interferences, t. i., lielas absorbcijas pie viļņa garuma 570 ± 30 nm, dēļ nav izmantojams MTT formazāna standarta absorbcijas (OB) mērījums, MTT formazāna noteikšanai var izmantot HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūru (sk. 41. un 42. punktu) (11)(36). VRM standartprocedūrās ir pieejams plašs apraksts par to, kā noteikt un koriģēt tiešo MTT redukciju un krāsvielu interferenci (34)(35). III un IV papildinājumā sniegtas arī ilustratīvas diagrammas ar norādījumiem par to, kā identificēt tiešos MTT reducētājus un/vai krāsu interferējošas ķimikālijas un kā ar tām rīkoties attiecīgi VRM1 un VRM2 gadījumā.
37.Lai noteiktu iespējamo interferenci, ko rada testējamās ķimikālijas, kas absorbē gaismu tādā pašā diapazonā kā MTT formazāns (dabiski vai pēc apstrādes), un lemtu par papildu kontroļu nepieciešamību, testējamo ķimikāliju pievieno ūdenim un/vai izopropanolam un attiecīgo laiku inkubē istabas temperatūrā (sk. 2. papildinājumu, (34)(35)). Ja ar VRM1 testējamā ķimikālija ūdenī un/vai izopropanolā absorbē pietiekamu gaismu diapazonā 570 ± 20 nm (sk. 3. papildinājumu) vai ja ar VRM2, sajaucot testējamo ķimikāliju ar ūdeni, iegūst krāsainu šķīdumu (sk. 4. papildinājumu), pieņem, ka testējamā ķimikālija interferē ar MTT formazāna standarta absorbcijas (OB) mērīšanu, un tad jāizpilda papildu kontroles ar krāsvielu vai arī jāizmanto HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūra; minētās kontroles šādā gadījumā nav vajadzīgas (sk. 41. un 42. punktu un III un IV papildinājumu) (34)(35). Mērot standartabsorbciju (OB), katru interferējošo testējamo ķimikāliju aplicē uz vismaz diviem dzīvotspējīgu audu replikātiem, ar kuriem veic visu testēšanas procedūru, taču, lai iegūtu NSCliving kontroli (nespecifiska krāsa dzīvos audos), MTT inkubācijas posmā tos inkubē barotnē, nevis MTT šķīdumā (34)(35). Ņemot vērā dzīvajiem audiem raksturīgo bioloģisko mainību, NSCliving kontrole jāveic paralēli iekrāsotās ķimikālijas testēšanai un vairākkārtējas testēšanas gadījumā katram veiktajam testam (katrā izpildes reizē) jāveic neatkarīga NSCliving kontrole. Faktisko audu dzīvotspēju tad aprēķina, no audu dzīvotspējas procentiem, kas iegūti ar interferējošajai testējamajai ķimikālijai eksponētiem un MTT šķīdumā inkubētiem dzīviem audiem (%Viabilitytest), atņemot nespecifiskas krāsas procentus, kas iegūti ar interferējošajai testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, kuri paralēli koriģējamajam testam inkubēti barotnē bez MTT (%NSCliving). Tātad faktiskā audu dzīvotspēja = [%Viabilitytest] - [%NSCliving].
38.Lai identificētu tiešos MTT reducētājus, katra testējamā ķimikālija jāpievieno svaigi pagatavotam MTT šķīdumam. MTT šķīdumam pievieno attiecīgu daudzumu testējamās ķimikālijas un maisījumu apmēram 3 stundas inkubē standarta kultivēšanas apstākļos (skatīt III un IV papildinājumu) (34)(35). Ja MTT maisījums, kas satur testējamo ķimikāliju (nešķīstošas testējamās ķimikālijas gadījumā, tās suspensiju), kļūst zils/violets, pieņem, ka testējamā ķimikālija tieši reducē MTT, un neatkarīgi no standarta absorbcijas (OB) mērījuma vai HPLC/UPLC spektrofotometrijas procedūras izmantošanas dzīvotnespējīgu RhCE audu konstrukcijām jāveic papildu funkcionāla pārbaude. Šajā papildu funkcionālajā pārbaudē izmanto nonāvētus audus, kuriem piemīt vairs tikai atlikusī metaboliskā aktivitāte, taču kuri testējamo ķimikāliju absorbē un saglabā tāpat kā dzīvotspējīgie audi. VRM1 nonāvētos audus sagatavo, tos eksponējot zemai temperatūrai (“nonāvēti aukstumapstrādāti”). VRM2 nedzīvos audus sagatavo, tos ilgstoši (piem., vismaz 24 stundas ± 1 stundu) inkubējot ūdenī un pēc tam glabājot zemā temperatūrā (“nonāvēti ūdensapstrādāti”). Katru MTT reducējošo testējamo ķimikāliju aplicē uz vismaz diviem nonāvētu audu replikātiem, ar kuriem veic visu testēšanas procedūru, lai iegūtu nespecifisku MTT redukcijas (NSMTT) kontroli (34)(35). Ar vienu NSMTT kontroli pietiek vienai testējamai ķimikālijai neatkarīgi no veikto neatkarīgo testu / izpildes reižu skaita. Audu faktisko dzīvotspēju tad aprēķina, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar MTT reducētājam eksponētiem dzīviem audiem (%Viabilitytest), atņemot procentuālo nespecifisko MTT redukciju, kas iegūta ar tam pašam MTT reducētājam eksponētiem nonāvētiem audiem un aprēķināta attiecībā pret negatīvo kontroli, kura izpildīta paralēli koriģējamam testam (%NSMTT). Tātad faktiskā audu dzīvotspēja = [%Viabilitytest] - [%NSMTT].
39.Testējamām ķimikālijām, kas identificētas kā krāsu interferējošas (sk. 37. punktu) un tiešu MTT redukciju izraisošas (sk. 38. punktu), standarta absorbcijas (OB) mērījumu veikšanai papildus iepriekšējos punktos aprakstītajām NSMTT un NSCliving kontrolēm būs nepieciešams arī trešais kontroļu komplekts. Parasti tā ir tumšas krāsas testējamajām ķimikālijām, kas gaismu absorbē 570 ± 30 nm diapazonā (piemēram, zilām, violetām, melnām), jo to sākotnējā krāsa traucē novērtēt to spēju tieši reducēt MTT, kā aprakstīts 38. punktā. Tāpēc pēc noklusējama jālieto NSMTT kontroles kopā ar NSCliving kontrolēm. Testējamās ķimikālijas, kuras tiek pārbaudītas ar abām – NSMTT un NSCliving – kontrolēm, var absorbēt un saglabāt gan dzīvie, gan nonāvētie audi. Tāpēc šajā gadījumā NSMTT kontrole var koriģēt ne tikai testējamās ķimikālijas izraisīto iespējamo tiešo MTT redukciju, bet arī krāsas interferenci, kas rodas no tā, ka testējamo ķimikāliju absorbē un saglabā nonāvētie audi. Šādi kļūst iespējama dubulta krāsas interferences koriģēšana, jo NSCliving kontrole jau koriģē krāsas interferenci, kas rodas no tā, ka testējamo ķimikāliju absorbē un saglabā dzīvie audi. Lai novērstu iespējamo dubulto krāsas interferences koriģēšanu, jāveic trešā kontrole attiecībā uz nespecifisku krāsu nedzīvos audos (NSCkilled) (sk. III un IV papildinājumu) (34)(35). Pārbaudē ar šo papildu kontroli testējamo ķimikāliju izmanto vismaz diviem nonāvētu audu replikātiem, ar kuriem veic visu testēšanas procedūru, taču MTT inkubācijas posmā tos inkubē barotnē, nevis MTT šķīdumā. Ar vienu NSCkilled kontroli pietiek vienai testējamai ķimikālijai neatkarīgi no veikto neatkarīgo testu / izpildes reižu skaita, taču tā jāizdara paralēli NSMTT kontrolei un ar to pašu audu partiju. Audu faktisko dzīvotspēju tad aprēķina, no procentuālās audu dzīvotspējas, kas iegūta ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem (%Viabilitytest), atņemot %NSMTT un atņemot %NSCliving, un pieskaitot procentuālo nespecifisko krāsu, kas iegūta ar interferējošai testējamajai ķimikālijai eksponētiem un barotnē bez MTT inkubētiem nonāvētajiem audiem un aprēķināta attiecībā pret negatīvo kontroli, kura izpildīta paralēli koriģējamam testam (%NSCkilled). Tātad faktiskā audu dzīvotspēja = [%Viabilitytest] - [%NSMTT] - [%NSCliving] + [%NSCkilled].
40.Svarīgi ievērot, ka (tad, kad veic standarta absorbcijas mērījumus) nespecifiskā MTT redukcija un nespecifiskā krāsas interference var palielināt audu ekstrakta OB virs spektrofotometra linearitātes diapazona un ka (tad, kad veic HPLC/UPLC spektrofotometrijas mērījumus) nespecifiskā MTT redukcija var palielināt arī audu ekstrakta MTT formazāna smailes laukumu virs spektrofotometra linearitātes diapazona. Pamatojoties uz to, ir svarīgi, lai pirms normatīviem mērķiem veiktas ķimikāliju testēšanas sākuma katra laboratorija noteiktu sava spektrofotometra OB/smailes laukuma linearitātes diapazonu, piem., ar MTT formazānu (CAS Nr. 57360-69-7), kas komerciāli pieejams, piem., no Sigma-Aldrich (kat. Nr. M2003).
41.Standarta absorbcijas (OB) noteikšana ar spektrofotometru ir piemērota tiešu MTT reducētāju un krāsu interferējošu testējamo ķimikāliju novērtēšanai, ja novērotā interference MTT formazāna noteikšanā nav pārāk spēcīga (t. i., ar testējamo ķimikāliju iegūtie audu ekstraktu OB, nekoriģējot tiešu MTT redukciju un/vai krāsas interferenci, atbilst spektrofotometra lineārajam diapazonam). Tomēr par testējamajām ķimikālijām iegūtie rezultāti, kuriem negatīvās kontroles %NSMTT un/vai %NSCliving ir ≥ 60 % (VRM1 un VRM2 šķidrumu protokolam) vai 50 % (VRM2 cietu vielu protokolam), būtu jāuztver piesardzīgi, jo tā ir robežvērtība, ko VRM izmanto, lai nošķirtu klasificējamas ķimikālijas no neklasificējamām ķimikālijām (sk. 44. punktu). Standarta absorbciju (OB) tomēr nevar noteikt, ja interference MTT formazāna noteikšanā ir pārāk liela (t. i., izraisa to, ka nekoriģētie testējamo audu ekstraktu OB ir ārpus spektrofotometra lineārā diapazona). Ja krāsainas testējamās ķimikālijas vai testējamās ķimikālijas, kam krāsa izveidojas saskarē ar ūdeni vai izopropanolu, pārāk stipri interferē ar MTT formazāna standarta absorbcijas (OB) mērīšanu, tās tomēr var novērtēt ar HPLC/UPLC spektrofotometriju (sk. III un IV papildinājumu). Tas ir tāpēc, ka ar HPLC/UPLC sistēmu MTT formazānu no ķimikālijas var atdalīt pirms kvantitatīvās noteikšanas (36). Tāpēc neatkarīgi no testējamās ķimikālijas, ja tiek izmantota HPLC/UPLC spektrofotometrija, NSCliving vai NSCkilled kontroles nav jāveic. Ja ir aizdomas, ka testējamā ķimikālija tieši reducē MTT, NSMTT kontroles tomēr jāizmanto (atbilstoši 38. punktā aprakstītajai procedūrai). NSMTT kontroles jāizmanto arī testējamām ķimikālijām, kurām ir krāsa (jau sākotnēji vai parādās, kad viela ir ūdenī), kas traucē novērtēt to spēju tieši reducēt MTT, kā aprakstīts 38. punktā. MTT formazāna mērīšanai izmantojot HPLC/UPLC spektrofotometriju, kā MTT formazāna smailes laukuma, kas iegūts ar testējamajai ķimikālijai eksponētiem dzīviem audiem, procentuālo attiecību pret MTT formazāna smailes laukumu, kas iegūts ar paralēlo negatīvo kontroli, aprēķina audu procentuālo dzīvotspēju. Testējamām ķimikālijām, kas spēj tieši reducēt MTT, audu faktisko dzīvotspēju aprēķina, no %Viabilitytest atņemot %NSMTT, kā aprakstīts 38. punkta pēdējā teikumā. Visbeidzot jāņem vērā, ka tādus tiešus MTT reducētājus vai tiešus MTT reducētājus, kas turklāt ir krāsu interferējoši, kuri pēc apstrādes saglabājas audos un reducē MTT tik spēcīgi, ka testējamo audu ekstraktu OB (noteikti ar standarta OB mērījumu) vai smaiļu laukumi (noteikti ar UPLC/HPLC spektrofotometriju) ir ārpus spektrofotometra lineārā diapazona, nav iespējams novērtēt ar RhCE testēšanas metodēm, lai gan tas sagaidāms tikai ļoti retās situācijās.
42.HPLC/UPLC spektrofotometriju MTT formazāna mērīšanai var izmantot ar visa veida testējamajām ķimikālijām (ar krāsu, bez krāsas, MTT reducētāji un MTT nereducētāji) (11) (36). HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas ir dažādas, tāpēc katram lietotājam nav praktiski iespējams noteikt pilnīgi vienādus sistēmas darbības apstākļus. Tāpēc, pirms HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu izmantot, lai kvantificētu no audu ekstraktiem iegūtu MTT formazānu, būtu jāpierāda minētās sistēmas kvalifikācijas atbilstība pieņemamības kritērijiem, kas noteikti kvalifikācijas standartparametru kopumam, kuru pamatā ir parametri, kas aprakstīti ASV Pārtikas un zāļu pārvaldes izstrādātājās nozares vadlīnijās par bioanalītisko metožu validēšanu (36)(38). Šie galvenie parametri un to pieņemamības kritēriji ir norādīti 5. papildinājumā. Kad 5. papildinājumā noteiktie pieņemamības kritēriji izpildīti, HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmu uzskata par kvalificētu un gatavu tam, lai noteiktu MTT formazāna daudzumu, ievērojot šīs testēšanas metodes aprakstā sniegtos eksperimentēšanas nosacījumus.
Pieņemamības kritēriji
43.Katrā testēšanas reizē, kad izmanto RhCE audu partijas, kas atbilst kvalitātes kontroles prasībām (sk. 30. punktu), ar negatīvās kontroles vielu apstrādāto audu OB jābūt tādam, kas atspoguļo to audu kvalitāti, kuriem ievērotas prasības sūtīšanas, saņemšanas posmiem un visiem protokola procesiem, un to rezultāti nedrīkst būt ārpus 2. tabulā aprakstītajām vēsturiski noteiktajām robežām (sk. 26. punktu). Tāpat ar pozitīvās kontroles vielu, t. i., metilacetātu, apstrādāto audu vidējai dzīvotspējai jābūt < 50 % attiecībā pret negatīvo kontroli VRM1 šķidrumu vai cietu vielu protokoliem un ≤ 30 % (šķidrumu protokolam) vai ≤ 20 % (cietu vielu protokolam) attiecībā pret negatīvo kontroli VRM2, tādējādi atspoguļojot audu spēju reaģēt uz kairinošu testējamo ķimikāliju šīs testēšanas metodes apstākļos (34)(35). Testējamo ķimikāliju un kontroles vielu audu replikātu mainībai jāatbilst pieņemtajām robežām (t. i., dzīvotspējas atšķirībai starp diviem audu replikātiem jābūt mazākai par 20 % vai arī standartnovirze (SD) starp trim audu replikātiem nedrīkst pārsniegt 18 %). Ja izpildes reizē iekļautā negatīvā kontrole vai pozitīvā kontrole neatbilst pieņemtajiem diapazoniem, izpildes reizi uzskata par “nekvalificētu”, un tā jāatkārto. Ja testējamās ķimikālijas audu replikātu mainība neatbilst pieņemtajam diapazonam, tests jāuzskata par “nekvalificētu”, un testējamā ķimikālija jātestē atkārtoti.
Rezultātu interpretēšana un prognostiskais modelis
44.Katras testējamās ķimikālijas audu replikātu ekstraktiem iegūtās OB vērtības / smailes laukumi jāizmanto vidējās audu dzīvotspējas procentos (vidējā vērtība starp audu replikātiem) aprēķināšanai salīdzinājumā ar negatīvo kontroli, kas noteikta kā 100 %. Audu procentuālās dzīvotspējas robežvērtības, pēc kurām nosaka, kuras testējamās ķimikālijas nav jāklasificē kā tādas, kas izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus (ANO GHS un CLP nekategorizētas ķimikālijas), norādītas 4. tabulā. Tādējādi rezultāti jāinterpretē, kā aprakstīts tālāk tekstā.
-Testējamo ķimikāliju nosaka par tādu, kas nav jāklasificē un jāmarķē saskaņā ar ANO GHS / CLP (nekategorizētas ķimikālijas), ja audu vidējā procentuālā dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcekspozīcijas inkubēšanas perioda ir lielāka par (>) audu procentuālajai dzīvotspējai noteikto robežvērtību, kas norādīta 4. tabulā. Šādā gadījumā nav nepieciešama papildu testēšana ar citām testēšanas metodēm.
-Ja audu vidējā procentuālā dzīvotspēja pēc ekspozīcijas un pēcekspozīcijas inkubēšanas perioda ir mazāka par vai vienāda ar (≤) audu procentuālajai dzīvotspējai noteikto robežvērtību, prognozēšana nav iespējama (norādīts 4. tabulā). Šādā gadījumā būs nepieciešama papildu testēšana ar citām testēšanas metodēm, jo RhCE testēšanas metodes uzrāda zināmu skaitu pseidopozitīvu rezultātu (sk. 14.–15. punktu), un nav iespējams izšķirties starp ANO GHS un CLP 1. un 2. kategoriju (sk. 17. punktu).
4. tabula. Prognostiskie modeļi sakaņā ar ANO GHS / CLP klasifikāciju
|
VRM
|
Nekategorizēta
|
Nav iespējams prognozēt
|
|
VRM1 — EpiOcular™ EIT
(abiem protokoliem)
|
Audu vidējā dzīvotspēja > 60 %
|
Audu vidējā dzīvotspēja ≤ 60 %
|
|
VRM2 — SkinEthic™ HCE EIT
(šķidrumu protokolam)
|
Audu vidējā dzīvotspēja > 60 %
|
Audu vidējā dzīvotspēja ≤ 60 %
|
|
VRM2 — SkinEthic™ HCE EIT
(cietvielu protokolam)
|
Audu vidējā dzīvotspēja > 50 %
|
Audu vidējā dzīvotspēja ≤ 50 %
|
45.Vienam testam ar vismaz diviem audu replikātiem jābūt pietiekamam gadījumos, kad testējamās ķimikālijas uzrādītais rezultāts ir nepārprotams. Tomēr, kad rezultāti ir neskaidri, piem., nesakritīgi mērījumu rezultāti atkārtojumos un/vai vidējā audu dzīvotspēja procentos ir 60 ± 5 % (VRM1, kā arī VRM2 šķidrumu protokolam) vai 50 ± 5 % (VRM2 cietvielu protokolam), jāapsver vajadzība pēc otrā vai pat pēc trešā testa, ja nesakrīt pirmo divu testu rezultāti.
46.Īpašu veidu maisījumiem, ja tas ir piemēroti un pamatoti, var apsvērt atšķirīgas audu dzīvotspējas procentos robežvērtības, pēc kā klasificējamas ķimikālijas nošķir no neklasificējamām ķimikālijām, lai palielinātu testēšanas metodes vispārējo veiktspēju šādu veidu maisījumiem (sk. 14. punktu). Etalonķimikālijas var noderēt, lai novērtētu nezināmu testējamo ķimikāliju vai produktu klases spēju izraisīt nopietnus acu bojājumus / acu kairinājumu vai novērtētu klasificētas ķimikālijas relatīvo spēju izraisīt acu toksicitāti konkrētā pozitīvu atbildreakciju diapazonā.
DATI UN PĀRSKATA SAGATAVOŠANA
Dati
47.Datus par atsevišķiem audu replikātiem katrā izpildes reizē, arī par atkārtotiem testiem, ja tos veic, (piem., OB vērtības / MTT formazāna smailes laukumus un aprēķinātās audu procentuālās dzīvotspējas datus par testējamo ķimikāliju un kontrolēm, kā arī galīgo RhCE testēšanas metodes prognozi) tabulas veidā apkopo par katru testējamo ķimikāliju. Pārskatā jāiekļauj arī vidējā audu dzīvotspēja procentos un dzīvotspējas atšķirība starp diviem audu replikātiem (ja n = 2 audu replikāti) vai SN (ja n ≥ 3 audu replikāti) par katru atsevišķu testējamo ķimikāliju un kontroli. Pārskatā jāiekļauj visas katrai testējamai ķimikālijai novērotās interferences MTT formazāna mērīšanā, kuras izpaužas kā tieša MTT redukcija un/vai krāsas interference.
Testēšanas pārskats
48.
Testēšanas pārskatā norāda šādu informāciju.
Testējamā ķimikālija
Vienkomponenta viela
-Ķīmiskā identifikācija, piem., IUPAC vai CAS nosaukums(-i), CAS numurs(-i), SMILES vai InChI kods, struktūrformula un/vai citi identifikācijas dati.
-Agregātstāvoklis, gaistamība, pH, LogP, molekulmasa, ķīmisko vielu klase un papildu attiecīgās fizikāli ķīmiskās īpašības saistībā ar pētījuma veikšanu, ciktāl šī informācija ir pieejama.
-Tīrība, piemaisījumu ķīmiskā identitāte (attiecīgā gadījumā un ja šī informācija ir pieejama) utt.
-Apstrāde pirms testēšanas, ja tāda veikta (piem., sildīšana, smalcināšana).
-Glabāšanas apstākļi un stabilitāte, ciktāl šī informācija ir pieejama.
Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi
-Iespējami izsmeļošs raksturojums ar, piem., sastāvdaļu ķīmisko identitāti (sk. iepriekš), tīrību, kvantitatīvo saturu un relevantajām fizikālķīmiskajām īpašībām.
-Agregātstāvoklis un papildu attiecīgās fizikāli ķīmiskās īpašības saistībā ar pētījuma veikšanu, ciktāl šī informācija ir pieejama.
-Tīrība, piemaisījumu ķīmiskā identitāte (attiecīgā gadījumā, ja šī informācija ir pieejama) utt.
-Pirmstestēšanas apstrāde, ja tāda veikta (piem., sildīšana, smalcināšana).
-Glabāšanas apstākļi un stabilitāte, ciktāl šī informācija ir pieejama.
Pozitīvās un negatīvās kontroles vielas
-Ķīmiskā identifikācija, piem., IUPAC vai CAS nosaukums(-i), CAS numurs(-i), SMILES vai InChI kods, struktūrformula un/vai citi identifikācijas dati.
-Agregātstāvoklis, gaistamība, molekulmasa, ķīmisko vielu klase un papildu attiecīgās fizikāli ķīmiskās īpašības saistībā ar pētījuma veikšanu, ciktāl šī informācija ir pieejama.
-Tīrība, piemaisījumu ķīmiskā identitāte (attiecīgā gadījumā, ja šī informācija ir pieejama) utt.
-Pirmstestēšanas apstrāde, ja tāda veikta (piem., sildīšana, smalcināšana).
-Glabāšanas apstākļi un stabilitāte, ciktāl šī informācija ir pieejama.
-Pamatojums citas tādas negatīvās kontroles izmantošanai, kas nav ultratīrs H2O vai Ca2+/Mg2+ nesaturošs DPBS, ja tāda izmantota.
-Pamatojums citas tādas pozitīvās kontroles izmantošanai, kas nav neatšķaidīts metilacetāts, ja tāda izmantota.
-Norāde uz vēsturiskajiem pozitīvo un negatīvo kontroļu rezultātiem, kas apliecina atbilstību testa izpildes pieņemamības kritērijiem.
Informācija par sponsoru un testējošo iestādi
-Sponsora, testējošās iestādes, pētījuma vadītāja vārds/nosaukums un adrese.
RhCE audu konstrukcija un izmantotais protokols (attiecīgā gadījumā ar izvēles pamatojumu)
Testēšanas metodes apstākļi
-Izmantotā RhCE audu konstrukcija, arī partijas numurs.
-MTT formazāna noteikšanai izmantotais viļņa garums un frekvenču josla (attiecīgā gadījumā), kā arī mērierīces (piem., spektrofotometra) linearitātes diapazons.
-MTT formazāna noteikšanai izmantotās metodes apraksts.
-Izmantotās HPLC/UPLC spektrofotometrijas sistēmas apraksts (attiecīgā gadījumā).
-Pilnīga papildinformācija par konkrēto izmantoto RhCE audu konstrukciju, arī tās veiktspējas raksturlielumi. No tiem jānorāda vismaz:
I)dzīvotspējas kvalitātes kontrole (piegādātājs);
II)dzīvotspēja testēšanas metodes apstākļos (lietotājs);
III)barjerfunkcijas kvalitātes kontrole;
IV)morfoloģija, ja ir pieejama informācija;
V)reproducējamība un prognozētspēja;
VI)RhCE audu konstrukcijas citas kvalitātes kontroles (QC), ja ir pieejama informācija.
-Norāde uz RhCE audu konstrukcijas vēsturiskajiem datiem. No tiem jānorāda vismaz: QC datu pieņemamība saskaņā ar vēsturiskajiem datiem par partiju kontroles rezultātiem.
-Paziņojums, ka pirms regulāras izmantošanas testējošā iestāde ir pierādījusi kompetenci testēšanas metodes izmantošanā, testējot standartķimikālijas.
Izpildes reizes un testa pieņemamības kritēriji
-Pozitīvās un negatīvās kontroles vidējās vērtības un pieņemamības diapazoni, kas balstīti uz vēsturiskajiem datiem.
-Pieņemamā mainība pozitīvām un negatīvām kontrolēm izmantojamiem audu replikātiem.
-Pieņemamā mainība testējamai ķimikālijai izmantojamiem audu replikātiem.
Testa procedūra
-Informācija par izmantoto testēšanas procedūru.
-Izmantotās testējamās ķimikālijas un kontroles vielu devas.
-Ekspozīcijas, pēcekspozīcijas iegremdēšanas un pēcekspozīcijas inkubēšanas periodu ilgums un temperatūra (attiecīgā gadījumā).
-Testa procedūras modifikāciju apraksts, ja tādas bijušas.
-Kontroles, kas izmantotas tiešajiem MTT reducētājiem un/vai testējamajām ķimikālijām, kurām ir krāsa (attiecīgā gadījumā).
-Katrai testējamai ķimikālijai un kontrolēm (pozitīvā kontrole, negatīvā kontrole, NSMTT, NSCliving un NSCkilled, ja tādas izmantotas) izmantoto audu replikātu skaits.
Rezultāti
-Datu apkopojums tabulā par atsevišķām testējamajām ķimikālijām un kontroles vielām par katru izpildes reizi (arī par atkārtotiem eksperimentiem, ja tādi veikti) un par katru replikāta mērījumu, arī OB vērtība vai MTT formazāna smailes laukums, audu dzīvotspēja procentos, vidējā audu dzīvotspēja procentos, atšķirība starp audu replikātiem vai SN un galīgā prognoze.
-Attiecīgā gadījumā tiešiem MTT reducētājiem un/vai krāsainām testējamajām ķimikālijām izmantoto kontroļu rezultāti, arī OB vērtība vai MTT formazāna smailes laukums, %NSMTT, %NSCliving, %NSCkilled, atšķirība starp audu replikātiem vai SN, galīgā pareizā audu dzīvotspēja procentos un galīgā prognoze.
-Rezultāti, kas iegūti ar testējamo ķimikāliju (ķimikālijām) un kontrolķimikālijām, salīdzinājumā ar noteiktajiem izpildes reizes un testa pieņemamības kritērijiem.
-Citas novērotās ietekmes, piem., krāsainas testējamās ķimikālijas izraisītas audu iekrāsošanās, apraksts.
Rezultātu iztirzājums
Secinājumi
LITERATŪRA
(1)UN (2015). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). ST/SG/AC.10/30/Rev.6, Sixth Revised Edition, New York and Geneva: United Nations. Available at:
http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/English/ST-SG-AC10-30-Rev6e.pdf
.
(2)Šā pielikuma B.5. nodaļa “Akūts acu kairinājums/korozija”.
(3)Šā pielikuma B.47. nodaļa “Liellopu radzenes apduļķošanās un caurlaidības testēšanas metode, kurā identificē i) nopietnu acu bojājumu inducētājas ķimikālijas un ii) ķimikālijas, kuras nav jāklasificē kā tādas, kas izraisa acu kairinājumu vai nopietnus acu bojājumus”.
(4)Šā pielikuma B.48. nodaļa “Izolētas vistas acs testēšanas metode, kurā identificē i) nopietnu acu bojājumu inducētājas ķimikālijas un ii) ķimikālijas, kuras nav jāklasificē”.
(5)Šā pielikuma B.61. nodaļa “Fluoresceīna caurplūdes testēšanas metode acu korozijas vai nopietna kairinājuma izraisītāju identificēšanai”.
(6)Šā pielikuma B.68. nodaļa “Īsa ekspozīcijas laika in vitro testēšanas metode, ar kuru identificēt i) ķimikālijas, kas izraisa nopietnus acu bojājumus, un ii) ķimikālijas, kuras nav jāklasificē kā acu kairinājuma vai nopietnu acu bojājumu izraisītājas”.
(7)Freeman, S.J., Alépée N., Barroso, J., Cole, T., Compagnoni, A., Rubingh, C., Eskes, C., Lammers, J., McNamee, P., Pfannenbecker, U., Zuang, V. (2010). Prospective Validation Study of Reconstructed Human Tissue Models for Eye Irritation Testing. ALTEX 27, Special Issue 2010, 261-266.
(8)EC EURL ECVAM (2014). The EURL ECVAM - Cosmetics Europe prospective validation study of Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE)-based test methods for identifying chemicals not requiring classification and labelling for serious eye damage/eye irritation: Validation Study Report. EUR 28125 EN; doi:10.2787/41680. Available at:
http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC100280
.
(9)EURL ECVAM Science Advisory Committee (2014). ESAC Opinion on the EURL ECVAM Eye Irritation Validation Study (EIVS) on EpiOcularTM EIT and SkinEthicTM HCE and a related Cosmetics Europe study on HPLC/UPLC-spectrophotometry as an alternative endpoint detection system for MTT-formazan. ESAC Opinion No 2014-03 of 17 November 2014; EUR 28173 EN; doi: 10.2787/043697. Available at:
http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103702
.
(10)Alépée, N., Leblanc, V., Adriaens, E., Grandidier, M.H., Lelièvre, D, Meloni, M., Nardelli, L., Roper, C.S, Santirocco, E., Toner, F., Van Rompay, A., Vinall, J., Cotovio, J. (2016). Multi-laboratory validation of SkinEthic HCE test method for testing serious eye damage/eye irritation using liquid chemicals. Toxicol. In Vitro 31, 43-53.
(11)Alépée, N., Adriaens, E., Grandidier, M.H., Meloni, M., Nardelli, L., Vinall, C.J., Toner, F., Roper, C.S, Van Rompay, A.R., Leblanc, V., Cotovio, J. (2016). Multi-laboratory evaluation of SkinEthic HCE test method for testing serious eye damage/eye irritation using solid chemicals and overall performance of the test method with regard to solid and liquid chemicals testing. Toxicol. In Vitro 34, 55-70.
(12)EURL ECVAM Science Advisory Committee (2016). ESAC Opinion on the SkinEthic™ Human Corneal Epithelium (HCE) Eye Irritation Test (EIT). ESAC Opinion No 2016-02 of 24 June 2016; EUR 28175 EN; doi : 10.2787/390390. Available at:
http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC103704
.
(13)EC EURL ECVAM (2016). Recommendation on the Use of the Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Methods for Identifying Chemicals not Requiring Classification and Labelling for Serious Eye Damage/Eye Irritation According to UN GHS. (Manuscript in Preparation).
(14)Draize, J.H., Woodard, G., Calvery, H.O. (1944). Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. Journal of Pharmacol. and Exp. Therapeutics 82, 377-390.
(15)Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., Zuang, V. (2010). A Proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace In Vivo Studies Using Bottom-Up and Top-Down Approaches. Toxicol. In Vitro 24, 1-9.
(16)Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods 65, 55-63.
(17)OECD (2016). Series on Testing and Assessment No 216: Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Reconstructed Human Cornea-Like Epithelium (RhCE) Test Methods for Identifying Chemicals not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage, Based on the Validated Reference Methods EpiOcular™ EIT and SkinEthic™ HCE EIT described in TG 492. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(18)OECD (2005). Series on Testing and Assessment No 34: Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(19)Kaluzhny, Y., Kandárová, H., Hayden, P., Kubilus, J., d'Argembeau-Thornton, L., Klausner, M. (2011). Development of the EpiOcular™ Eye Irritation Test for Hazard Identification and Labelling of Eye Irritating Chemicals in Response to the Requirements of the EU Cosmetics Directive and REACH Legislation. Altern. Lab. Anim. 39, 339-364.
(20)Nguyen, D.H., Beuerman, R.W., De Wever, B., Rosdy, M. (2003). Three-dimensional construct of the human corneal epithelium for in vitro toxicology. In: Salem, H., Katz, S.A. (Eds), Alternative Toxicological Methods, CRC Press, pp. 147-159.
(21)Pfannenbecker, U., Bessou-Touya, S., Faller, C., Harbell, J., Jacob, T., Raabe, H., Tailhardat, M., Alépée, N., De Smedt, A., De Wever, B., Jones, P., Kaluzhny, Y., Le Varlet, B., McNamee, P., Marrec-Fairley, M., Van Goethem, F. (2013). Cosmetics Europe multi-laboratory pre-validation of the EpiOcular™ reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol. In Vitro 27, 619-626.
(22)Alépée, N., Bessou-Touya, S., Cotovio, J., de Smedt, A., de Wever, B., Faller, C., Jones, P., Le Varlet, B., Marrec-Fairley, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., van Goethem, F., McNamee, P. (2013). Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the SkinEthic™ Reconstituted Human Corneal Epithelium Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol. In Vitro 27, 1476-1488.
(23)Kolle, S.N., Moreno, M.C.R., Mayer, W., van Cott, A., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. (2015). The EpiOcular™ Eye Irritation Test is the Method of Choice for In Vitro Eye Irritation Testing of Agrochemical Formulations: Correlation Analysis of EpiOcular™ Eye Irritation Test and BCOP Test Data to UN GHS, US EPA and Brazil ANIVSA Classifications. Altern. Lab. Anim. 43, 1-18.
(24)Adriaens, E., Barroso, J., Eskes, C., Hoffmann, S., McNamee, P., Alépée, N., Bessou-Touya, S., De Smedt, A., De Wever, B., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Zuang, V. (2014). Retrospective Analysis of the Draize Test for Serious Eye Damage/Eye Irritation: Importance of Understanding the In Vivo Endpoints Under UN GHS/EU CLP for the Development and Evaluation of In Vitro Test Methods. Arch. Toxicol. 88, 701-723.
(25)Barroso, J., Pfannenbecker, U., Adriaens, E., Alépée, N., Cluzel, M., De Smedt, A., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K.R., Millet, M., Templier, M., McNamee, P. (2017). Cosmetics Europe compilation of historical serious eye damage/eye irritation in vivo data analysed by drivers of classification to support the selection of chemicals for development and evaluation of alternative methods/strategies: the Draize eye test Reference Database (DRD). Arch. Toxicol. 91, 521-547.
(26)Meloni, M., De Servi, B., Marasco, D., Del Prete, S. (2011). Molecular mechanism of ocular surface damage: Application to an in vitro dry eye model on human corneal epithelium. Molecular Vision 17, 113-126.
(27)Hackett, R.B., McDonald, T.O. (1991). Eye Irritation. In Advances in Modern Toxicology: Dermatoxicology Marzulli F.N.and Maibach H.I. (Eds.), 4th Edition, pp. 749–815. Washington, DC, USA: Hemisphere Publishing Corporation.
(28)Fox, D.A., Boyes, W.K. (2008). Toxic Responses of the Ocular and Visual System. In Cassaret and Doull’s Toxicology: The Basic Science of Poisons Klaassen C.D.(Ed.), 7th Edition, pp. 665–697. Withby, ON, Canada: McGraw-Hill Ryerson.
(29)Jester, J.V., Li, H.F., Petroll, W.M., Parker, R.D., Cavanagh, H.D., Carr, G.J., Smith, B., Maurer, J.K. (1998). Area and Depth of Surfactant Induced Corneal Injury Correlates with Cell Death. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 922–936.
(30)Maurer, J.K., Parker, R.D., Jester, J.V. (2002). Extent of Corneal Injury as the Mechanistic Basis for Ocular Irritation: Key Findings and Recommendations for the Development of Alternative Assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36, 106-117.
(31)Jester, J.V., Li, L., Molai, A., Maurer, J.K. (2001). Extent of Corneal Injury as a Mechanistic Basis for Alternative Eye Irritation Tests. Toxicol. In Vitro 15, 115–130.
(32)Jester, J.V., Petroll, W.M., Bean, J., Parker, R.D., Carr, G.J., Cavanagh, H.D., Maurer, J.K. (1998). Area and Depth of Surfactant-Induced Corneal Injury Predicts Extent of Subsequent Ocular Responses. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2610–2625.
(33)Jester, J.V. (2006). Extent of Corneal Injury as a Biomarker for Hazard Assessment and the Development of Alternative Models to the Draize Rabbit Eye Test. Cutan. Ocul. Toxicol. 25, 41–54.
(34)EpiOcular™ EIT SOP, Version 8 (March 05, 2013). EpiOcular™ EIT for the Prediction of Acute Ocular Irritation of Chemicals. Available at: [https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index].
(35)SkinEthic™ HCE EIT SOP, Version 1. (July 20, 2015). SkinEthic™ HCE Eye Irritation Test (EITL for Liquids, EITS for Solids) for the Prediction of Acute Ocular Irritation of Chemicals. Available at:
https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/index.cfm/methodsAndProtocols/index
.
(36)Alépée, N., Barroso, J., De Smedt, A., De Wever, B., Hibatallah, J., Klaric, M., Mewes, K.R., Millet, M., Pfannenbecker, U., Tailhardat, M., Templier, M., McNamee, P. (2015). Use of HPLC/UPLC-Spectrophotometry for Detection of Formazan in In Vitro Reconstructed Human Tissue (RhT)-Based Test Methods Employing the MTT-Reduction Assay to Expand their Applicability to Strongly Coloured Test Chemicals. Toxicol. In Vitro 29, 741-761.
(37)Kaluzhny, Y., Kandárová, H., Handa, Y., DeLuca, J., Truong, T., Hunter, A., Kearney, P., d'Argembeau-Thornton, L., Klausner, M. (2015). EpiOcular™ Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern. Lab Anim. 43, 101-127.
(38)US FDA (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. May 2001. Available at:
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf
.
(39)OECD (2017). Guidance Document on an Integrated Approaches on Testing and Assessment for Serious Eye Damage and Eye irritation. Series on Testing and Assessment No 263. ENV Publications, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
1. papildinājums
DEFINĪCIJAS
Pareizība: pakāpe, kādā ar testēšanas metodi iegūto mērījumu rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testēšanas metodes veiktspējas mērs un viens no relevantuma aspektiem. Šo terminu bieži izmanto ar nozīmi “konkordantums”, ar to domājot testēšanas metodes pareizo rezultātu īpatsvaru (18).
Etalonķimikālija: ķimikālija, ko izmanto par standartu salīdzināšanā ar testējamo ķimikāliju. Etalonķimikālijai jāpiemīt šādām īpašībām: i) konsekvents un uzticams avots vai avoti tās identificēšanas un raksturošanas vajadzībām; ii) strukturāla, funkcionāla un/vai ķīmiska un produktklases līdzība ar testējamo ķimikāliju; iii) labi zināmas fizikālķīmiskās īpašības; iv) papildu dati par zināmajiem iedarbības veidiem; v) vielas zināmais iedarbības stiprums atbilst vēlamās atbildreakcijas diapazonam.
Augšupēja pieeja: pakāpeniska pieeja, ko izmanto testējamai ķimikālijai, par kuru ir aizdomas, ka tā nav jāklasificē vai jāmarķē kā acu kairinājuma vai nopietnu acu bojājumu izraisītāja, un kas sākas ar to ķimikāliju nošķiršanu, kuras nav jāklasificē vai jāmarķē (negatīvs iznākums), no citām ķimikālijām (pozitīvs iznākums).
Ķimikālija: viela vai maisījums.
Konkordantums: sk. “Pareizības” definīciju.
Radzene: acābola priekšējā caurspīdīgā daļa, kas pārklāj varavīksneni un zīlīti un ielaiž acī gaismu.
VK: variācijas koeficients.
Nov.: novirze.
EIT: acu kairinājuma tests.
EURL-ECVAM: Eiropas Savienības References laboratorija dzīvniektestēšanas alternatīvu jomā.
Acu kairinājums: izmaiņas acī, kas rodas pēc testējamās ķimikālijas aplicēšanas uz acs priekšējās virsmas un kas 21 dienas laikā pēc aplicēšanas ir pilnīgi atgriezeniskas. Nozīmē to pašu, ko “atgriezeniska ietekme uz acīm” un ANO GHS / CLP 2. kategorija.
ET50: ekspozīcijas laiks, kas pēc noteiktas koncentrācijas etalonķimikālijas aplicēšanas nepieciešams audu dzīvotspējas samazināšanai par 50 %.
Pseidonegatīvu īpatsvars: visu to vielu daļa, kurām ir attiecīgā veida iedarbība, bet kuras ar konkrēto testēšanas metodi tiek kļūdaini identificētas par vielām bez attiecīgā veida iedarbības. Tas ir viens no testēšanas metodes veiktspējas raksturlielumiem.
Pseidopozitīvu īpatsvars: visu to vielu daļa, kurām nav attiecīgā veida iedarbības, bet kuras ar konkrēto testēšanas metodi tiek kļūdaini identificētas par vielām ar attiecīgā veida iedarbību. Tas ir viens no testēšanas metodes veiktspējas raksturlielumiem.
Bīstamība: tāda aģenta vai situācijas iedabiska īpašība, kam piemīt potenciāls atstāt nelabvēlīgu ietekmi uz šim aģentam eksponētu organismu, sistēmu vai (sub)populāciju.
HCE: SkinEthic™ cilvēka radzenes epitēlijs.
HPLC: augstefektīva šķidrumhromatogrāfija.
IC50: koncentrācija, kādā etalonķimikālija pēc noteikta ekspozīcijas laika (piem., 30 minūšu apstrādes ar SDS) audu dzīvotspēju samazina par 50 %.
Pārmērīga deva: uz RhCE audu konstrukcijas aplicētās testējamās ķimikālijas daudzums, kas ir lielāks par epitēlija virsmas pilnīgai un vienmērīgai pārklāšanai nepieciešamo daudzumu.
Neatgriezeniska ietekme uz acīm: sk. “Nopietnu acu bojājumu” definīciju.
LLOQ: kvantitatīvās noteikšanas apakšējā robeža.
LogP: oktanola-ūdens sadalījuma koeficienta logaritms.
Maisījums: maisījums vai šķīdums, kas sastāv no divām vai vairāk vielām.
Vienkomponenta viela: viela, definēta ar tās kvantitatīvo sastāvu, kurā viena galvenā sastāvdaļa veido vismaz 80 % (masa/masa).
Daudzkomponentu viela: viela, definēta ar tās kvantitatīvo sastāvu, kurā vairāk nekā viena no galvenajām sastāvdaļām ir koncentrācijā ≥ 10 % (masa/masa) un < 80 % (masa/masa). Daudzkomponentu viela tiek iegūta ražošanas procesā. Atšķirība starp maisījumu un daudzkomponentu vielu ir tāda, ka maisījumu iegūst, divas vai vairākas vielas sajaucot bez ķīmiskas reakcijas. Daudzkomponentu viela rodas ķīmiskā reakcijā.
MTT: 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds; tiazolilzilais tetrazolija bromīds.
Negatīvā kontrole: paraugs, kurā ir visi testa sistēmas komponenti un kurš apstrādāts ar vielu, par ko ir zināms, ka konkrētajā testa sistēmā tā neinducē pozitīvu atbildreakciju. Ar šo paraugu izdara tādas pašas manipulācijas kā ar paraugiem, kas apstrādāti ar testējamo ķimikāliju, un citiem kontrolparaugiem, un to izmanto, lai noteiktu 100 % audu dzīvotspēju.
Neklasificētas ķimikālijas: ķimikālijas, kuras nav klasificētas kā acu kairinājuma (ANO GHS / CLP 2. kategorija, ANO GHS 2A vai 2B kategorija) vai nopietnu acu bojājumu (ANO GHS / CLP 1. kategorija) izraisītājas. Nozīmē to pašu, ko “ANO GHS / CLP nekategorizētas ķimikālijas”.
NSCkilled: nespecifiska krāsa nedzīvos audos.
NSCliving: nespecifiska krāsa dzīvos audos.
NSMTT: nespecifiskā MTT redukcija.
OB: optiskais blīvums.
Veiktspējas standarti: uz validētu testēšanas metodi (tādu, kura tiek uzskatīta par zinātniski validētu) bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē pēc noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testēšanas metožu salīdzināmību. Šeit iekļauti: (i) nepieciešamie testēšanas metodes komponenti; (ii) minimāls tādu references ķimikāliju saraksts, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; iii) uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — salīdzināmi pareizības un ticamības līmeņi, kā būtu jāiegūst ar ierosināto testēšanas metodi, to izvērtējot ar references ķimikālijām no minimālā saraksta (18).
Pozitīvā kontrole: paraugs, kurā ir visi testa sistēmas komponenti un kurš apstrādāts ar vielu, par ko ir zināms, ka konkrētajā testa sistēmā tā inducē pozitīvu atbildreakciju. Ar šo paraugu izdara tādas pašas manipulācijas kā ar paraugiem, kas apstrādāti ar testējamo ķimikāliju, un citiem kontrolparaugiem. Lai būtu iespēja novērtēt pozitīvās kontroles atbildreakcijas mainību laikā, pozitīvās atbildreakcijas intensitāte nedrīkstētu būt pārlieku liela.
Relevantums: parametrs, kas raksturo testa attiecināmību uz interesējošo ietekmi un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Tā ir pakāpe, kādā ar testu var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testēšanas metodes pareizības (konkordantuma) aspektu (18).
Ticamība: pakāpe, kādā vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās pēc viena un tā paša protokola var ilgāku laiku reproducējami izmantot konkrētu testēšanas metodi. To novērtē, aprēķinot metodes intralaboratorisko un interlaboratorisko reproducējamību un intralaboratorisko atkārtojamību (18).
Aizstājējtests: ikdienā lietota testa aizstāšanai paredzēts tests, kuru pieņemts izmantot bīstamības identificēšanai un/vai riska novērtēšanai, ar pierādītu spēju ekvivalentā vai labākā veidā, salīdzinot ar pieņemto testu, nodrošināt (pēc vajadzības) cilvēka un dzīvnieku veselības vai vides aizsardzību visās iespējamās testēšanas situācijās un ar visām iespējamām ķimikālijām (18).
Reproducējamība: tādu rezultātu savstarpējā atbilstība, kas iegūti, ar vienu un to pašu testa protokolu testējot vienu to pašu ķimikāliju (sk. “Ticamības” definīciju) (18).
Atgriezeniska ietekme uz acīm: sk. “Acu kairinājuma” definīciju.
RhCE: rekonstruēts cilvēka radzenei līdzīgs epitēlijs.
Izpildes reize: reize, kurā vienu vai vairākas ķimikālijas testē paralēli negatīvai kontrolei un pozitīvai kontrolei.
SD: standartnovirze.
Jutība: tā visu pozitīvo/aktīvo testējamo ķimikāliju daļa, kas ar testu tiek pareizi klasificētas. Tas ir pareizības mērs testēšanas metodei, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (18).
Nopietni acu bojājumi: acs audu bojājumi vai nopietna fiziska redzes pasliktināšanās, kas rodas pēc testējamās vielas aplicēšanas uz acs priekšējās virsmas un kas 21 dienas laikā pēc aplicēšanas nav pilnībā atgriezeniska. Nozīmē to pašu, ko “neatgriezeniska ietekme uz acīm” un ANO GHS / CLP 1. kategorija.
Darbības standartprocedūras (SOP): oficiālas, rakstiskas procedūras, kas detalizēti apraksta, kā veicamas konkrētas rutīnas un konkrētam testam specifiskas laboratorijas darbības. Tās ir nepieciešamas saskaņā ar labu laboratorijas praksi (GLP).
Specifiskums: tas, cik liela daļa no visām negatīvajām/neaktīvajām testējamajām ķimikālijām ar testu tiek klasificētas pareizi. Tādas testēšanas metodes pareizības mērs, ar kuru iegūst kategoriālus rezultātus, un svarīgs faktors testēšanas metodes relevantuma izvērtēšanā (18).
Viela: ķīmisks elements un tā dabiski radušies vai ražošanas procesā iegūti savienojumi, ieskaitot to stabilizācijai nepieciešamās piedevas, kā arī izmantotajos procesos radušos piejaukumus, bet izņemot šķīdinātājus, kurus var atdalīt, neietekmējot vielas stabilitāti un nemainot tās sastāvu.
Tests: atsevišķas testējamās ķimikālijas paralēla testēšana ar vismaz diviem audu replikātiem, kā noteikts attiecīgajā SOP.
Audu dzīvotspēja: parametrs, ar ko šūnu populācijas kopējo aktivitāti rekonstruētos audos mēra kā to spēju reducēt vitālo krāsvielu MTT, kas atkarībā no nosakāmā beigupunkta un izmantotās testēšanas shēmas korelē ar dzīvo šūnu kopskaitu un/vai dzīvotspēju.
Lejupēja pieeja: pakāpeniska pieeja, ko izmanto ķimikālijai, par kuru ir aizdomas, ka tā izraisa nopietnus acu bojājumus, un kas sākas ar to ķimikāliju nošķiršanu, kuras inducē nopietnus acu bojājumus (pozitīvs rezultāts), no citām ķimikālijām (negatīvs rezultāts).
Testējamā ķimikālija: viela vai maisījums, kuru testē ar šo testēšanas metodi.
Secīgas testēšanas stratēģija: pakāpeniskas testēšanas stratēģija, kurā testēšanas metodes pielieto noteiktā secībā. Izmantojot pierādījumu izsvēršanu, visu esošo informāciju par testējamo ķimikāliju pārskata, lai pirms pārejas uz nākamo stratēģijas pakāpi noteiktu, vai pieejamās informācijas apjoms ir pietiekams, lai pieņemtu lēmumu par bīstamības klasifikāciju. Ja testējamās ķimikālijas bīstamības potenciālu/potenci var noteikt, pamatojoties uz konkrētajā pakāpē pieejamo informāciju, papildu testēšana nav jāveic (18).
ULOQ: kvantitatīvās noteikšanas augšējā robeža.
Apvienoto Nāciju Organizācijas Ķimikāliju klasificēšanas un marķēšanas globāli harmonizētā sistēma (ANO GHS): sistēma, kurā ķimikālijas (vielas un maisījumus) klasificē pēc standartizētiem fizisko apdraudējumu, veselības apdraudējumu un vidisko apdraudējumu tipiem un līmeņiem un izmanto tādus attiecīgus komunikācijas elementus kā piktogrammas, signālvārdi, bīstamības apzīmējumi, drošības prasību apzīmējumi un drošības datu lapas, lai sniegtu informāciju par ķimikāliju nelabvēlīgo ietekmi un tādējādi aizsargātu cilvēkus (arī darba devējus un darba ņēmējus, transporta darbiniekus, patērētājus un avārijas dienestu darbiniekus) un vidi (1).
ANO GHS un CLP 1. kategorija: sk. “Nopietnu acu bojājumu” definīciju.
ANO GHS un CLP 2. kategorija: sk. “Acu kairinājuma” definīciju.
ANO GHS un CLP nekategorizētas ķimikālijas: Ķimikālijas, kas neatbilst prasībām klasificēšanai ANO GHS / CLP 1. vai 2. kategorijā (vai ANO GHS 2A vai 2B kategorijā). Nozīmē to pašu, ko “neklasificētas ķimikālijas”.
UPLC: īpaši augstefektīva šķidrumhromatogrāfija.
UVCB: vielas, kuru sastāvs nav zināms vai ir mainīgs, kompleksi reakcijas produkti vai bioloģiski materiāli.
Derīga testēšanas metode: testēšanas metode, kas tiek uzskatīta par pietiekami relevantu un ticamu konkrētam nolūkam un kas ir balstīta uz zinātniskiem principiem. Testēšanas metode nekad nav derīga absolūtā izteiksmē; tā vienmēr ir derīga tikai kādam konkrētam nolūkam (18).
Validēta testēšanas metode: testēšanas metode, kuras relevantums (ieskaitot pareizību) un ticamība attiecībā uz lietošanu konkrētā nolūkā ir pārbaudīta validācijas pētījumos. Jāievēro, ka validētas testēšanas metodes veiktspēja pareizības un ticamības ziņā var nebūt pietiekama, lai to izmantotu paredzētajam nolūkam (18).
VRM: validēta references metode.
VRM1: EpiOcular™ EIT dēvē par 1. validēto references metodi.
VRM2: SkinEthic™ HCE EIT dēvē par 2. validēto references metodi.
Pierādījumu izsvēršana: process, kurā izsver dažādu informācijas elementu stiprās un vājās puses, cenšoties izdarīt un pamatot secinājumu par testējamās vielas bīstamības potenciālu.
2. papildinājums
ĶIMIKĀLIJU, KURAS NAV JĀKLASIFICĒ UN JĀMARĶĒ KĀ TĀDAS, KAS IZRAISA ACU KAIRINĀJUMU VAI NOPIETNUS ACU BOJĀJUMUS, IDENTIFICĒŠANAI VALIDĒTO RhCE TESTU GALVENĀS SASTĀVDAĻAS
|
Testa sastāvdaļas
|
EpiOcular™ EIT
(VRM1)
|
SkinEthic™ HCE EIT
(VRM2)
|
|
Protokoli
|
Šķidrumi
(pilināmi ar pipeti 37 ± 1 °C vai zemākā temperatūrā 15 min)
|
Cietas vielas
(nav pilināmas ar pipeti)
|
Šķidrumi un viskozas vielas
(pilināmi ar pipeti)
|
Cietas vielas
(nav pilināmas ar pipeti)
|
|
Modeļa virsma
|
0,6 cm2
|
0,6 cm2
|
0,5 cm2
|
0,5 cm2
|
|
Audu replikātu skaits
|
Vismaz 2
|
Vismaz 2
|
Vismaz 2
|
Vismaz 2
|
|
Priekšpārbaude
attiecībā uz krāsas interferenci
|
50 µl + 1 ml H2O 60 min 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM (bezkrāsainas testējamās ķimikālijas), vai
50 µl + 2 ml izopropanola, maisa 2–3 h RT (krāsainas testējamās ķimikālijas)
→ ja testējamās ķimikālijas OB pie 570±20 nm pēc izopropanola vai ūdens OB atņemšanas ir > 0,08 (tas atbilst apmēram 5% no negatīvās kontroles vidējā OB), jāpielieto dzīvas pielāgotas kontroles
|
50 mg + 1 ml H2O 60 min 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
(bezkrāsainas testējamās ķimikālijas) un/vai
50 mg + 2 ml izopropanola, maisa 2–3 h pie RT (krāsainas un bezkrāsainas testējamās ķimikālijas)
→ ja testējamās ķimikālijas OB pie 570±20 nm pēc izopropanola vai ūdens OB atņemšanas ir > 0,08 (tas atbilst apmēram 5% no negatīvās kontroles vidējā OB), jāpielieto dzīvas pielāgotas kontroles
|
10 mg + 90 µl H2O maisa 30 ± 2 min pie istabas temperatūras (RT, 18-28oC)
→ ja testējamā ķimikālija ir krāsaina, jāpielieto pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem
|
10 mg + 90 µl H2O maisa 30 ± 2 min pie RT
→ ja testējamā ķimikālija ir krāsaina, jāpielieto pielāgotas kontroles ar dzīviem audiem
|
|
Priekšpārbaude attiecībā uz tiešo MTT reducēšanos
|
50 µl + 1 ml MTT 1 mg/ml šķīduma 180 ± 15 min
37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
→ ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem aukstumapstrādātiem audiem
(par negatīvo kontroli izmanto 50 μl sterila dejonizēta ūdens MTT šķīdumā)
|
50 mg + 1 ml MTT 1 mg/ml šķīduma 180 ± 15 min
37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
→ ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem aukstumapstrādātiem audiem
(par negatīvo kontroli izmanto 50 μl sterila dejonizēta ūdens MTT šķīdumā)
|
30 µl + 300 µl MTT 1 mg/ml šķīduma 180 ± 15 min 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
→ ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem ūdensapstrādātiem audiem
(par negatīvo kontroli izmanto 30 μl sterila dejonizēta ūdens MTT šķīdumā)
|
30 mg + 300 µl MTT
1 mg/ml šķīduma 180 ± 15 min 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
→ ja šķīdums iekrāsojas zils vai violets, jāizdara pielāgotas kontroles ar nonāvētiem ūdensapstrādātiem audiem
(par negatīvo kontroli izmanto 30 μl sterila dejonizēta ūdens MTT šķīdumā)
|
|
Priekšapstrāde
|
20 µl Ca2+/Mg2+ nesaturošs DPBS
30 ± 2 min 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM, sargājot no gaismas
|
20 µl Ca2+/Mg2+ nesaturošs DPBS
30 ± 2 min 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM, sargājot no gaismas
|
-
|
-
|
|
Apstrādes devas un aplicēšana
|
50 µl (83,3 µl/cm2)
|
50 mg (83,3 mg/cm2) ar kalibrētu instrumentu (piem., pilna karote bez kaudzes, kas kalibrēta 50 mg nātrija hlorīda ietveršanai).
|
10 µl Ca2+/Mg2+ nesaturošs DPBS
+ 30 ± 2 µl (60 µl/cm2)
viskozām vielām izmanto neilona sietu
|
30 µl Ca2+/Mg2+ nesaturošs DPBS
+ 30 ± 2 mg (60 mg/cm2)
|
|
Ekspozīcijas
ilgums un temperatūra
|
30 min (± 2 min)
kultūras barotnē:
37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
6 stundas (± 0,25 h)
kultūras barotnē:
37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
30 min (± 2 min)
kultūras barotnē:
37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
4 stundas (± 0,1 h)
kultūras barotnē:
37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
|
Skalošana istabas temperatūrā
|
3 reizes 100 ml
Ca2+/Mg2+ nesaturošā DPBS
|
3 reizes 100 ml
Ca2+/Mg2+ nesaturošā DPBS
|
20 ml Ca2+/Mg2+ nesaturoša DPBS
|
25 ml Ca2+/Mg2+ nesaturoša DPBS
|
|
Pēcekspozīcijas iegremdēšana
|
12 min (± 2 min) pie RT, kultūras barotnē
|
25 min (± 2 min) pie RT, kultūras barotnē
|
30 min (± 2 min) 37 oC temperatūrā, 5 % CO2, 95 % RM, kultūras barotnē
|
30 min (± 2 min) pie RT, kultūras barotnē
|
|
Pēcekspozīcijas inkubēšana
|
120 min (± 15 min) kultūras barotnē 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
18 h (± 0,25 h) kultūras barotnē 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
nav
|
18 h (± 0,5 h) kultūras barotnē 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
|
Negatīvā kontrole
|
50 µl H2O
Testē paralēli
|
50 µl H2O
Testē paralēli
|
30 ± 2 µl Ca2+/Mg2+ nesaturoša DPBS
Testē paralēli
|
30 ± 2 µl Ca2+/Mg2+ nesaturoša DPBS
Testē paralēli
|
|
Pozitīvā kontrole
|
50 µl metilacetāta
Testē paralēli
|
50 µl metilacetāta
Testē paralēli
|
30 ± 2 µl metilacetāta
Testē paralēli
|
30 ± 2 µl metilacetāta
Testē paralēli
|
|
MTT šķīdums
|
300 µl 1 mg/ml
|
300 µl 1 mg/ml
|
300 µl 1 mg/ml
|
300 µl 1 mg/ml
|
|
MTT inkubācijas
ilgums un temperatūra
|
180 min (± 15 min) 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
180 min (± 15 min) 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
180 min (± 15 min) 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
180 min (± 15 min) 37 ± 2 ºC temperatūrā, 5 ± 1 % CO2, ≥ 95 % RM
|
|
Ekstrakcijas šķīdinātājs
|
2 ml izopropanola
(ekstrakcija no inserta augšas un apakšas, caurdurot audus)
|
2 ml izopropanola
(ekstrakcija no inserta apakšas, caurdurot audus)
|
1,5 ml izopropanola
(ekstrakcija no inserta augšas un apakšas)
|
1,5 ml izopropanola
(ekstrakcija no inserta apakšas)
|
|
Ekstrakcijas ilgums un temperatūra
|
2–3 h ar kratīšanu (~120 apgr./min) pie RT vai pa nakti 4–10 °C temperatūrā
|
2–3 h ar kratīšanu (~120 apgr./min) pie RT vai pa nakti 4–10 °C temperatūrā
|
4 h ar kratīšanu (~120 apgr./min) pie RT vai vismaz pa nakti bez kratīšanas 4–10 °C temperatūrā
|
Vismaz 2 h ar kratīšanu (~120 apgr./min) pie RT
|
|
OB rādījums
|
570 nm (550–590 nm)
bez references filtra
|
570 nm (550–590 nm)
bez references filtra
|
570 nm (540–600 nm)
bez references filtra
|
570 nm (540–600 nm)
bez references filtra
|
|
Audu kvalitātes kontrole
|
Apstrāde ar 100 µl 0,3 % (tilpums/tipums) Triton X-100
12,2 min ≤ ET50 ≤ 37,5 min
|
Apstrāde ar 100 µl 0,3 % (tilpums/tipums) Triton X-100
12,2 min ≤ ET50 ≤ 37,5 min
|
30 min apstrāde ar SDS (50 µl)
1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,5 mg/ml
|
30 min apstrāde ar SDS (50 µl)
1,0 mg/ml ≤ IC50 ≤ 3,2 mg/ml
|
|
Pieņemamības kritēriji
|
1. Ar negatīvo kontroli apstrādāto audu replikātu vidējam OB jābūt > 0,8 un < 2,5.
2. Ar pozitīvo kontroli 30 min eksponēto audu replikātu vidējai dzīvotspējai, kas izteikta kā % no negatīvās kontroles, jābūt < 50 %.
3. Divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirībai jābūt mazākai par 20 %.
|
1. Ar negatīvo kontroli apstrādāto audu replikātu vidējam OB jābūt > 0,8 un < 2,5.
2. Ar pozitīvo kontroli 6 stundas eksponēto audu replikātu vidējai dzīvotspējai, kas izteikta kā % no negatīvās kontroles, jābūt < 50 %.
3. Divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirībai jābūt mazākai par 20 %.
|
1. Ar negatīvo kontroli apstrādāto audu replikātu vidējam OB jābūt > 1,0 un ≤ 2,5.
2. Ar pozitīvo kontroli 30 min eksponēto audu replikātu vidējai dzīvotspējai, kas izteikta kā % no negatīvās kontroles, jābūt ≤ 30 %.
3. Divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirībai jābūt mazākai par 20 %.
|
1. Ar negatīvo kontroli apstrādāto audu replikātu vidējam OB jābūt > 1,0 un ≤ 2,5.
2. Ar pozitīvo kontroli 4 stundas eksponēto audu replikātu vidējai dzīvotspējai, kas izteikta kā % no negatīvās kontroles, jābūt ≤ 20 %.
3. Divu audu replikātu dzīvotspējas atšķirībai jābūt mazākai par 20 %.
|
3. papildinājums
ILUSTRATĪVA DIAGRAMMA AR NORĀDĪJUMIEM PAR TO, KĀ IDENTIFICĒT TIEŠOS MTT REDUCĒTĀJUS UN/VAI KRĀSU INTERFERĒJOŠAS ĶIMIKĀLIJAS UN KĀ AR TĀM RĪKOTIES ATBILSTOŠI VRM1 STANDARTPROCEDŪRAI
4. papildinājums
ILUSTRATĪVA DIAGRAMMA AR NORĀDĪJUMIEM PAR TO, KĀ IDENTIFICĒT TIEŠOS MTT REDUCĒTĀJUS UN/VAI KRĀSU INTERFERĒJOŠAS ĶIMIKĀLIJAS UN KĀ AR TĀM RĪKOTIES ATBILSTOŠI VRM2 STANDARTPROCEDŪRAI
5. papildinājums
GALVENIE PARAMETRI UN PIEŅEMAMĪBAS KRITĒRIJI NO RhCE AUDU KONSTRUKCIJĀM EKSTRAHĒTA MTT FORMAZĀNA MĒRĪŠANAI PAREDZĒTAS HPLC/UPLC SPEKTROFOTOMETRIJAS SISTĒMAS KVALIFICĒŠANAI
|
Parametrs
|
Saskaņā ar FDA norādījumiem izstrādāts protokols (36)(38)
|
Pieņemamības kritēriji
|
|
Selektivitāte
|
Izopropanola, dzīva tukšā parauga (izopropanola ekstrakts no neapstrādātu dzīvu RhCE audu konstrukcijām), nedzīva tukšā parauga (izopropanola ekstrakts no neapstrādātu nonāvēRhCE audu konstrukcijām) un krāsas (piem., metilēnzilā) analīze
|
Laukumsinterference ≤ 20 % no laukumaLLOQ1
|
|
Precizitāte
|
Kvalitātes kontroles (t. i., MTT formazāns koncentrācijā 1,6 µg/ml, 16 µg/ml un 160 µg/ml) izopropanolā (n=5)
|
CV ≤ 15 % vai attiecībā uz LLOQ ≤ 20 %
|
|
Pareizība
|
Kvalitātes kontroles izopropanolā (n=5)
|
% nov. ≤ 15 % vai attiecībā uz LLOQ ≤ 20 %
|
|
Matrices efekts
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=5)
|
85 % ≤ matrices efekts % ≤ 115 %
|
|
Pārnesums
|
Izopropanola analīze pēc ULOQ2 standarta
|
Laukumsinterference ≤ 20 % no laukumaLLOQ
|
|
Reproducējamība (tajā pašā dienā)
|
3 neatkarīgas kalibrēšanas līknes (balstītas uz 6 secīgiem MTT formazāna 1/3 atšķaidījumiem izopropanolā, sākot no ULOQ, t. i., 200 µg/ml);
Kvalitātes kontroles izopropanolā (n=5)
|
Kalibrēšanas līknes: % nov. ≤ 15 % vai attiecībā uz LLOQ ≤ 20 %
Kvalitātes kontroles: % nov. ≤ 15 % un CV ≤ 15 %
|
|
Reproducējamība (no vienas dienas otrā)
|
1. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
2. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
3. diena: 1 kalibrēšanas līkne un kvalitātes kontroles izopropanolā (n=3)
|
|
|
MTT formazāna īslaicīgā stabilitāte RhCE audu ekstraktā
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=3), kas analizēts sagatavošanas dienā un pēc 24 stundu ilgas glabāšanas istabas temperatūrā
|
% nov. ≤ 15 %
|
|
MTT formazāna ilglaicīgā stabilitāte RhCE audu ekstraktā (ja vajadzīgs)
|
Kvalitātes kontroles dzīvā tukšajā paraugā (n=3), kas analizēts sagatavošanas dienā un pēc vairāku dienu ilgas glabāšanas -20°C temperatūrā
|
% nov. ≤ 15 %
|
B.70. CILVĒKA REKOMBINANTIE ESTROGĒNRECEPTORU (hrER) IN VITRO TESTI TĀDU ĶIMIKĀLIJU NOTEIKŠANAI, KAM PIEMĪT ER AFINITĀTE
VISPĀRĪGS IEVADS
Veiktspējā balstītas testēšanas ESAO vadlīnija
1.Šī testēšanas metode ir ekvivalenta ESAO testēšanas vadlīnijai (TG) Nr. 493 (2015). Minētā TG Nr. 493 ir veiktspējā balstītas testēšanas vadlīnija (PBTG), kas apraksta cilvēka rekombinantās in vitro testēšanas metodiku tādu vielu noteikšanai, kam piemīt estrogēnreceptoru afinitāte (hrER saistīšanās testi). Tajā ietilpst divas mehānistiski un funkcionāli līdzīgas testēšanas metodes, ko izmanto, lai identificētu vielas, kas saistās ar estrogēnreceptoru (t. i., ERα), un tā varētu atvieglot jaunu līdzīgu vai modificētu testēšanas metožu izstrādi atbilstīgi validēšanas principiem, kas izklāstīti ESAO vadlīniju dokumentā Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment (1). Šīs PBTG pamatā ir divas pilnībā validētas references testēšanas metodes (sk. 2. un 3. papildinājumu):
-Freibergera–Vilsona (Freyberger–Wilson; turpmāk FW) estrogēnreceptoru (ER) saistīšanās in vitro tests, kurā izmanto pilnu cilvēka rekombinanto ERα (2), un
-Ķīmiskās izvērtēšanas un pētniecības institūta (Chemical Evaluation and Research Institute and Research Institute; turpmāk “CERI”) estrogēnreceptoru saistīšanās in vitro tests, kurā izmanto cilvēka rekombinanto liganda saistīšanās domēna proteīnu (2).
Ir izstrādāti veiktspējas standarti (VS) (3), kas sekmē līdzīgu testēšanas metožu izstrādi un validēšanu attiecībā uz to pašu bīstamības beigupunktu un dod iespēju savlaicīgi grozīt PBTG Nr. 493, atjaunināto PBTG ļaujot papildināt ar jauniem līdzīgiem testiem. Tomēr līdzīgus testus pievieno tikai pēc to izskatīšanas un ESAO apstiprinājuma, ka ir izpildīti veiktspējas standarti. Izmantojot ESAO datu savstarpējo atzīšanu, TG Nr. 493 iekļautos testus bez izšķirības var izmantot, lai nodrošinātu ESAO dalībvalstu prasības pēc testēšanas rezultātiem attiecībā uz estrogēnreceptora saistīšanos.
Testēšanas metodē iekļauto testu konteksts un principi
2.ESAO 1998. gadā sāka īstenot prioritārus pasākumus ar mērķi pārskatīt esošās un izstrādāt jaunas testēšanas vadlīnijas potenciālo endokrīno disruptoru skrīningam un testēšanai. 2012. gadā tika pārskatīts ESAO potenciālo endokrīno disruptoru testēšanas un novērtēšanas konceptuālais satvars (KS). Gan sākotnējais, gan pārskatītais KS ir iekļauts pielikumā Vadlīniju dokumentam par standartizētām testēšanas metodēm ķimikāliju vērtēšanai attiecībā uz potenciālu endokrīni disruptīvu iedarbību (4). KS aptver piecus līmeņus, no kuriem katrs atbilst citam bioloģiskās sarežģītības līmenim. Šajā testēšanas metodē aprakstītie ER saistīšanās testi atbilst 2. līmenim, kas ietver “in vitro testus, kas sniedz datus par izvēlētiem endokrīniem mehānismiem/ceļiem”. Testēšanas metode paredzēta in vitro receptoru saistīšanās testiem, ar ko identificē cilvēka estrogēnreceptora alfa (ER) ligandus.
3.Ir skaidri pierādīts in vitro ER saistīšanās testa relevantums attiecībā uz bioloģiskajām funkcijām. ER saistīšanās testi izstrādāti, lai identificētu ķimikālijas, kam piemīt disruptīvs potenciāls attiecībā uz estrogēnu tipa hormonu ceļu, un pēdējo divdesmit gadu laikā tie plaši izmantoti, lai raksturotu ER audu izkliedi, kā arī identificētu ER agonistus/antagonistus. Šie testi atspoguļo ligandu–receptoru mijiedarbību, kas attiecībā uz reproduktīvo funkciju visiem mugurkaulniekiem ir estrogēnu signālceļa sākumpunkts.
4.Estrogēnu–ER mijiedarbība var ietekmēt estrogēnu regulēto gēnu transkripciju un inducēt negenomisku ietekmi, un tā rezultātā var tikt inducēti vai inhibēti šūnu procesi, tostarp tādi, kas saistīti ar šūnu vairošanos, normālu augļa attīstību un reproduktīvo funkciju (5)(6)(7). Normālu estrogēnisko sistēmu traucējumi var negatīvi ietekmēt normālu attīstību (ontoģenēzi), reproduktīvo veselību un reproduktīvās sistēmas integritāti. Neatbilstoši ER signāli var radīt, piemēram, palielinātu hormonatkarīgu audzēju risku, pasliktinātu auglību un mainītu augļa augšanas un attīstības gaitu (8).
5.In vitro saistīšanās testu pamatā ir vielu tieša vai netieša mijiedarbība ar specifisku receptoru liganda saistīšanās domēnu, kas regulē gēnu transkripciju. Cilvēka rekombinantā estrogēnreceptora alfa (hrERα) saistīšanās testa galvenais komponents mēra radioaktīvi iezīmēta liganda ([3H]17β-estradiola) spēju saistīties ar ER arvien pieaugošu testējamās ķimikālijas (t. i., konkurenta) koncentrāciju klātbūtnē. Testējamās ķimikālijas, kam piemīt augsta ER afinitāte, konkurē ar radioaktīvi iezīmēto ligandu pie zemākas koncentrācijas nekā ķimikālijas ar zemāku receptora afinitāti. Šis tests sastāv no diviem svarīgākajiem komponentiem: piesātinājuma–saistīšanās eksperimenta, kas raksturo receptora–liganda mijiedarbības parametrus un dokumentē ER specifiskumu, un konkurējošās saistīšanās eksperimenta, kas attiecībā uz saistīšanos ar ER raksturo konkurenci starp testējamo ķimikāliju un radioaktīvi marķēto ligandu.
6.CERI validējošie pētījumi un FW saistīšanās testi ir pierādījuši, ka minētie komponenti ir relevanti un ticami paredzētajam nolūkam (2).
7.Šajā testēšanas metodē izmantotās definīcijas un saīsinājumi ir aprakstīti 1. papildinājumā.
Receptora saistīšanās testu tvērums un ierobežojumi
8.Šie testi paredzēti skrīninga un prioritizēšanas vajadzībām, tomēr tie var sniegt arī informāciju par molekulāro iniciācijas notikumu (MIE), ko var izmantot pierādījumu svara pieejā. Šie testi in vitro sistēmā aplūko ķīmisko saistīšanos ar ERα liganda saistīšanās domēnu. Tāpēc rezultātus nevajadzētu tieši ekstrapolēt uz neskartas endokrīnās sistēmas kompleksajiem signalizēšanas un regulēšanas mehānismiem in vivo.
9.Dabīgā liganda (17β-estradiola) saistīšanās ir sākumpunkts molekulāru notikumu sērijā, kas aktivizē mērķa gēnu transkripciju un galu galā kulminē ar fizioloģiskām pārmaiņām (9). Tādējādi saistīšanās ar ERα liganda saistīšanās domēnu tiek uzskatīta par vienu no svarīgākajiem ER mediētiem endokrīnās disrupcijas (ED) mehānismiem, lai gan pastāv arī citi ED izraisoši mehānismi, t. sk.: i) mijiedarbība ar citiem ERα domēniem, ne tikai ar liganda saistīšanās kabatu; ii) mijiedarbība ar citiem estrogēnu signalizēšanā būtiskiem receptoriem, ar ERβ un estrogēnreceptoru, kas sasaistīts ar G proteīnu, ar citiem endokrīnās sistēmas receptoriem un fermentu sistēmām; iii) hormonu sintēze; iv) metaboliska hormonu aktivācija un/vai inaktivācija; v) hormonu izkliede mērķaudos un vi) hormonu izvadīšana no organisma. Neviens šajā testēšanas metodē iekļautais tests neattiecas uz uzskaitītajiem iedarbības veidiem.
10.Šī testēšanas metode aplūko vielu spēju saistīties ar cilvēka ERα, un tā neizšķir ERα agonistus un antagonistus. Šajos testos netiek aplūkoti tādi tālāki lejupēji notikumi kā gēnu transkripcija vai fizioloģiskas pārmaiņas. Tā kā validācijā tika izmantotas tikai vienkomponenta vielas, nav informācijas par testa izmantojamību ar maisījumiem. Tomēr teorētiski šie testi ir izmantojami daudzkomponentu vielu un maisījumu testēšanai. Pirms testēšanas metodi attiecībā uz maisījumu izmanto, lai iegūtu datus kādai plānotai regulatīvai vajadzībai, jāapsver, vai un kādēļ tā var sniegt tādam nolūkam piemērotus rezultātus. Šādi apsvērumi nav vajadzīgi, ja pastāv regulatīva prasība maisījumu testēt.
11.Šūnas nesaturošām receptoru sistēmām nepiemīt iekšēja metaboliskā spēja, un tās nav validētas kombinācijā ar metaboliskām fermentu sistēmām. Pētījumu plānā gan varētu iekļaut metabolisku aktivitāti, bet tam būtu vajadzīga papildu validācija.
12.Nedrīkst testēt tādas ķimikālijas, kas varētu atņemt proteīna, proti, receptorproteīna, dabiskās īpašības (piem., virsmaktīvie aģenti) vai mainīt testa buferšķīduma pH, vai arī tās drīkst testēt tikai koncentrācijās, kas šādu mijiedarbību nepieļauj. Visos pārējos gadījumos testā izmantojamās testējamās ķimikālijas koncentrācijas diapazons ir atkarīgs no tās šķīdības testa buferšķīdumā.
13.Informatīvā nolūkā 1. tabulā ir sniegti testa rezultāti par 24 vielām, kas testētas ar abiem pilnībā validētajiem references testiem, kas aprakstīti šajā testēšanas metodē. No publicētajiem testēšanas pārskatiem t. sk. no in vitro testiem uz ER transkripcionālo aktivāciju un/vai uterotrofiskā testa izriet, ka 17 no šīm vielām klasificētas kā tādas, kas saistās ar ER, bet 6 vielas ir nesaistās ar ER (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Runājot par 1. tabulā apkopotajiem datiem, abu testu rezultāti gandrīz 100 % sakrita attiecībā uz visu vielu klasifikāciju līdz pat 10-4M, un visas vielas bija pareizi klasificētas kā saistīgas vai nesaistīgas ar ER. Papildu informācija par šo vielu grupu un par citām vielām, kas validācijas pētījumu gaitā testētas ER saistīšanās testos, ir sniegta hrER saistīšanās testa veiktspējas standartos (3), 2. papildinājumā (1., 2. un 3. tabulā).
1. tabula. Vielu klasifikācija pēc to saistīšanās vai nesaistīšanās ar ER, testējot tās ar FW un CERI hrER saistīšanās testiem, un salīdzinājums ar sagaidāmo rezultātu
|
|
Vielas nosaukums
|
CAS reģ. Nr.
|
Sagaidāmais rezultāts
|
FW tests
|
CERI tests
|
Klase pēc MeSH
klasifikācijas
|
Produkta klase
|
|
|
|
|
|
Koncentrācijas
diapazons (M)
|
Klasifikācija
|
Koncentrācijas
diapazons (M)
|
Klasifikācija
|
|
|
|
1
|
17β-estradiols
|
50-28-2
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-6
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-6
|
saisteklis
|
steroīds
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
2
|
Noretinodrels
|
68-23-5
|
saisteklis
|
3x10-9 – 30x10-4
|
saisteklis
|
3x10-9 – 30x10-4
|
saisteklis
|
steroīds
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
3
|
Noretindrons
|
68-22-4
|
saisteklis
|
3x10-9 – 30x10-4
|
saisteklis
|
3x10-9 – 30x10-4
|
saisteklis
|
steroīds
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
4
|
Di-n-butilftalāts
|
84-74-2
|
nesaisteklis*
|
1x10-10 – 1x10-4
|
nesaisteklis*†
|
1x10-10 – 1x10-4
|
nesaisteklis*†
|
ogļūdeņradis (ciklisks), esteris
|
plastifikators, ķimikāliju starpprodukts
|
|
5
|
DES
|
56-53-1
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
ogļūdeņradis (ciklisks), fenols
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
6
|
17α-etinilestradiols
|
57-63-6
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
steroīds
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
7
|
Mezo-heksestrols
|
84-16-2
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
ogļūdeņradis (ciklisks), fenols
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
8
|
Genisteīns
|
446-72-0
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
ogļūdeņradis (heterociklisks), flavonoīds
|
dabisks produkts
|
|
9
|
Ekvols
|
531-95-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
fitoestrogēna metabolīts
|
dabisks produkts
|
|
10
|
Butilparabēns (n butil-4-hidroksibenzoāts)
|
94-26-8
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
parabēns
|
konservants
|
|
11
|
Nonilfenols (maisījums)
|
84852-15-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
alkilfenols
|
starpproduktu savienojums
|
|
12
|
o,p’-DDT
|
789-02-6
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
hlororganiska viela
|
insekticīds
|
|
13
|
Kortikosterons
|
50-22-6
|
nesaisteklis*
|
1x10-10 – 1x10-4
|
nesaisteklis
|
1x10-10 – 1x10-4
|
nesaisteklis
|
steroīds
|
dabisks produkts
|
|
14
|
Zearalenons
|
17924-92-4
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
ogļūdeņradis (heterociklisks), laktons
|
dabisks produkts
|
|
15
|
Tamoksifēns
|
10540-29-1
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
ogļūdeņradis (ciklisks)
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
16
|
5α-dihidrotestosterons
|
521-18-6
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
nefenolisks steroīds
|
dabisks produkts
|
|
17
|
Bisfenols A
|
80-05-7
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
fenols
|
ķimikāliju starpprodukts
|
|
18
|
4-n-heptilfenols
|
1987-50-4
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
neskaidra a
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
alkilfenols
|
starpprodukts
|
|
19
|
Kepons (hlordekons)
|
143-50-0
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
ogļūdeņradis (halogenēts)
|
pesticīds
|
|
20
|
Benz(a)antracēns
|
56-55-3
|
nesaisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
nesaisteklis b
|
1x10-10 – 1x10-3
|
nesaisteklis b
|
aromātiskais ogļūdeņradis
|
starpprodukts
|
|
21
|
Enterolaktons
|
78473-71-9
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
saisteklis
|
fitoestrogēns
|
dabisks produkts
|
|
22
|
Progesterons
|
57-83-0
|
nesaisteklis*
|
1x10-10 – 1x10-4
|
nesaisteklis
|
1x10-10 – 1x10-4
|
nesaisteklis
|
steroīds
|
dabisks produkts
|
|
23
|
Oktiltrietoksisilāns
|
2943-75-1
|
nesaisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
nesaisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
nesaisteklis
|
silāns
|
virsmas modifikators
|
|
24
|
Atrazīns
|
1912-24-9
|
nesaisteklis*
|
1x10-10 – 1x10-4
|
nesaisteklis
|
1x10-10 – 1x10-4
|
nesaisteklis
|
heterociklisks savienojums
|
herbicīds
|
HrER SAISTĪŠANĀS testa KOMPONENTI
Nepieciešamie testa komponenti
14.Šī testēšanas metode attiecas uz testiem, kuru galvenais elements ir estrogēnreceptors (ER) un atbilstoša stipruma ligands, ko testā var izmantot kā marķieri / iezīmēto elementu un kas, palielinoties testējamās ķimikālijas koncentrācijai, var tikt pārvietots. Saistīšanās testu divi galvenie komponenti ir šādi: 1) piesātinājuma–saistīšanās tests un 2) konkurējošā saistīšanās. Piesātinājuma–saistīšanās testu izmanto, lai apstiprinātu receptoru preparātu specifiskumu un aktivitāti, savukārt konkurējošās saistīšanās eksperimenta mērķis ir izvērtēt testējamās ķimikālijas spēju saistīties ar hrER.
Kontroles
15.Apraksta ierosinātos paralēlos references estrogēnus un kontroles. Paralēlās kontroles — šķīdinātājs (nesējs), pozitīvā kontrole (saistīgs ar ER; stipra un vāja afinitāte), negatīvā kontrole (nesaistīgs) — vajadzības gadījumā kalpo kā indikators, ka tests pie konkrētajiem testēšanas nosacījumiem funkcionē un ļauj savstarpēji salīdzināt eksperimentus; parasti paralēlās kontroles ir daļa no konkrētā eksperimenta pieņemamības kritērijiem (1). Katrā testa izpildes reizē vienā platē ir jābūt atsauces estrogēna un kontroļu (t.i. vāja saistekļa un nesaistekļa) pilnai koncentrāciju līknei. Visās pārējās platēs jāiekļauj: 1) katra E2 un vāja saistekļa augstas koncentrācijas (aptuveni tāda, pie kuras radioaktīvi marķētais ligands tiek pilnībā pārvietots) un vidējas koncentrācijas (aptuveni IC50) triplikāti; 2) šķīdinātāja kontroles un nespecifiskās saistīšanās triplikāti.
Standarta kvalitātes kontroles procedūras
16.Katram testam veic aprakstītās standarta kvalitātes kontroles procedūras, lai nodrošinātu, ka aktīvie receptori, pareizas ķīmiskās koncentrācijas un tolerances intervāli saglabājas stabili vairākkārtējās replikācijās un nezaudē spēju laika gaitā nodrošināt gaidītās ER saistīšanās reakcijas.
Laboratorijas kvalifikācijas pierādīšana
17.Visām laboratorijām pirms nezināmu ķimikāliju testēšanas ar jebkuru no šīs testēšanas metodes testiem jāpierāda sava kvalifikācija konkrētā testa izmantošanā, veicot piesātinājuma testus, lai apstiprinātu ER preparāta specifiskumu un aktivitāti, un konkurējošās saistīšanās testus ar references estrogēniem un kontrolēm (vājiem saistekļiem un nesaistekļiem). Laboratorijai jāizveido vēsturiska datubāze, kurā apkopti trīs līdz piecu neatkarīgu, dažādās dienās veiktu eksperimentu rezultāti, kas gūti ar references estrogēnu un kontrolēm. Šie eksperimenti būs pamats laboratorijas references estrogēnam un vēsturiskajām kontrolēm, un turpmākās testēšanas reizēs tos izmantos kā testu pieņemamības novērtējuma daļu.
18.Jāapstiprina arī testa sistēmas reaģētspēja, izdarot 2. tabulā iekļauto standartvielu testēšanu. Standartvielu saraksts ir ER saistīšanās testu veiktspējas standartos norādīto references vielu apakškopa (3). Šīs vielas ir komerciāli pieejamas un ir attiecībā uz tādu ķimikāliju klasēm, ko parasti asociē ar ER afinitāti, reprezentatīvas, kā arī tām ir pienācīgs ER afinitātes diapazons (no spēcīgas līdz vājai), kāds būtu sagaidāms ER saistekļiem un nesaistekļiem (t. i., attiecībā uz negatīvajiem rezultātiem). Attiecībā uz katru standartvielu testētajām koncentrācijām būtu jāaptver 2. tabulā norādītais diapazons. Ar katru vielu jāveic vismaz trīs eksperimenti, un rezultātiem jāatbilst sagaidāmajai ķīmiskajai aktivitātei. Katrs eksperimentu veic neatkarīgi (t. i., ar jauniem receptora atšķaidījumiem, ķimikālijām un reaģentu), katrai koncentrācijai izmantojot trīs replikātus. Kompetence ir pierādīta, ja katra standartviela tiek pareizi klasificēta (pozitīva/negatīva reakcija). Kompetences testēšanu atkārto katrs laborants, kas apgūst testēšanas metodi.
2. tabula. HrER konkurējošās saistīšanās testu kontroļu un standartvielu saraksts1
|
Nr.
|
Vielas nosaukums
|
CAS reģ. Nr.2
|
Sagaidāmais
rezultāts 3,4
|
Testa koncentrācijas diapazons (M)
|
MeSH ķimikāliju klase5
|
Produkta klase6
|
|
Kontroles (references estrogēns, vājš saisteklis, nesaisteklis)
|
|
1
|
17βestradiols
|
50-28-2
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-6
|
steroīds
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
2
|
Noretinodrels (vai)
Noretindrons
|
68-23-5 (vai)
68-22-4
|
saisteklis
|
3x10-9 – 30x10-6
|
steroīds
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
3
|
Oktiltrietoksisilāns
|
2943-75-1
|
nesaisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
silāns
|
virsmas modifikators
|
|
Standartvielas6
|
|
4
|
Dietilstilbestrols
|
56-53-1
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-6
|
ogļūdeņradis (ciklisks), fenols
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
5
|
17α-etinilestradiols
|
57-63-6
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-6
|
steroīds
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
6
|
Mezo-heksestrols
|
84-16-2
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-6
|
ogļūdeņradis (ciklisks), fenols
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
7
|
Tamoksifēns
|
10540-29-1
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-6
|
ogļūdeņradis (ciklisks)
|
farmaceitisks un veterinārfarmaceitisks līdzeklis
|
|
8
|
Genisteīns
|
446-72-0
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
heterociklisks savienojums, flavonoīds
|
dabisks produkts
|
|
9
|
Bisfenols A
|
80-05-7
|
saisteklis
|
1x10-10 – 1x10-3
|
fenols
|
ķimikāliju starpprodukts
|
|
10
|
Zearalonons
|
17924-92-4
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-3
|
heterociklisks savienojums, laktons
|
dabisks produkts
|
|
11
|
Butilparabēns
|
94-26-8
|
saisteklis
|
1x10-11 – 1x10-3
|
Karbonskābe, fenols
|
konservants
|
|
12
|
Atrazīns
|
1912-24-9
|
nesaisteklis
|
1x10-11 – 1x10-6
|
heterociklisks savienojums
|
herbicīds
|
|
13
|
Di-n-butilftalāts (DBP)7
|
84-74-2
|
nesaisteklis8
|
1x10-10 – 1x10-4
|
ogļūdeņradis (ciklisks), esteris
|
plastifikators, ķimikāliju starpprodukts
|
|
14
|
Kortikosterons
|
50-22-6
|
nesaisteklis
|
1x10-11 – 1x10-4
|
steroīds
|
dabisks produkts
|
Testējamo ķimikāliju šķīdības un koncentrācijas diapazona noteikšana
19.Ir jāveic sagatavošanās tests, lai noteiktu katras testējamās ķimikālijas šķīdības robežu un identificētu piemērotu koncentrācijas diapazonu, kas tiks izmantots testā. Sākotnēji katras testējamās ķimikālijas šķīdības robežu nosaka šķīdinātājā un pēc tam apstiprina testēšanas apstākļos. Galīgā testā izmantojamā koncentrācija nepārsniedz 1 mM. Diapazona noteikšanas testēšanā ietilpst šķīdinātāja kontrole; paralēli tai testē astoņus sērijveida logaritmiskus atšķaidījumus, sākot ar augstāko pieņemamo koncentrāciju (piem., 1 mM vai zemāku, balstoties uz šķīdības robežu), un vēro, kad šķīdums kļūst duļķains vai rada nogulsnes. Trešā un ceturtā eksperimenta koncentrācijas būtu jāpielāgo pēc vajadzības, lai labāk raksturotu koncentrācijas–atbildreakcijas līkni.
Pieņemamības kritēriji katrai testēšanas reizei
20.Konkrēta eksperimenta pieņemšana vai noraidīšana notiek, izvērtējot rezultātus, kas iegūti ar references estrogēnu un kontroli. Pirmkārt, — attiecībā uz 1. plati — pilnām koncentrāciju līknēm, kas iegūtas ar katra eksperimenta references kontroli, jāatbilst līknei atbilstošajiem veiktspējas mērījumu parametriem (piem., IC50 un Hilla virziena koeficientam), balstoties uz rezultātiem, kas paziņoti attiecīgajos CERI un FW testu protokolos (2. un 3. papildinājums), un vēsturiskajiem kontroles datiem, ko apkopojusi testa veicēja laboratorija. Katrā eksperimentā jābūt pareizi klasificētām visām kontrolēm (references estrogēni, vāji saistekļi un nesaistekļi). Otrkārt, visās turpmākajās platēs ir jāvērtē kontroles konsekventums attiecībā pret 1. plati. Testā jāizmanto pietiekams testējamās ķimikālijas koncentrāciju diapazons, lai skaidri definētu konkurējošās saistīšanās līknes augšējo punktu. Rezultātu mainībai starp katras testējamās ķimikālijas koncentrācijas replikātiem, kā arī starp trim neatkarīgajām testēšanas reizēm jābūt saprātīgi pieļaujamās robežās un zinātniski pamatojamai. Laboratorija savu spēju konsekventi veikt testu pierāda, izveidojot un uzturot vēsturisku datubāzi, kurā apkopoti references estrogēnu un kontroļu rezultāti. Lai nodrošinātu reproducējamību laboratorijas ietvaros, var izmantot references estrogēna un vāja saistekļa kontroles līknēm atbilstošo parametru vidējo vērtību standartnovirzes (SN) vai variācijas koeficientus (VK), kas iegūti daudzos eksperimentos. Katrā testēšanas reizē iegūtos plates kontroļu rezultātus, kā arī ar katru testējamo ķimikāliju iegūtos rezultātus ir jāizvērtē speciālistam.
Bez tam attiecībā uz pieņemamības kritērijiem ir jāievēro šādi principi:
-datiem jābūt pietiekamiem, lai varētu kvantitatīvi novērtēt ER saistīšanos;
-testētajām koncentrācijām jāsaglabājas testējamās ķimikālijas šķīdības diapazonā.
Datu analīze
21.Definētajai datu analīzes procedūrai attiecībā uz piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās datiem jāatbilst pamatprincipiem, ko izmanto receptora–liganda mijiedarbības raksturošanai. Parasti piesātinājuma–saistīšanās datus analizē, izmantojot nelineāru regresijas modeli, kas atspoguļo gan kopējo, gan nespecifisko saistīšanos. Iespējams, ka, nosakot Bmax un Kd, vajadzēs izmantot liganda noplicināšanās korekciju (piem., Swillens, 1995 (19)). Datus no konkurējošās saistīšanās testiem parasti transformē (piem., procentuālā specifiskā saistīšanās un testējamās ķimikālijas koncentrācija (log M)). Katras testējamās ķimikālijas aplēstais log (IC50) ir jānosaka, izmantojot piemērotu nelineāras līknes piemeklēšanas programmatūru, lai panāktu atbilstību Hilla vienādojumam ar četriem parametriem. Pēc sākotnējās analīzes jāpārbauda, vai līkne atbilst parametriem, un vizuāli jānosaka, cik precīzi saistīšanās dati atbilst ģenerētajai konkurējošās saistīšanās līknei. Dažos gadījumos, lai panāktu precīzāko atbilstību līknei, var būt jāveic papildu analīze (piem., ierobežojot līknes augšējo un/vai apakšējo punktu, izmantojot 10 % kritēriju, sk. 4. papildinājumu un 2. atsauci (III.A.2. iedaļa).
22.Ja ir izpildīti pieņemamības kritēriji (20. punkts), tas nozīmē, ka testa sistēma darbojas pareizi, tomēr tas negarantē, ka konkrētajā testā tiks iegūti pareizi dati. Labākais pierādījums iegūto datu pareizībai ir pareizu pirmā izpildītā testa rezultātu replicēšana.
Vispārīgie datu interpretācijas kritēriji
23.Pašlaik nav vispārpieņemtas metodes, kā interpretēt ER saistīšanās datus. Tomēr visi hrER-mediētas aktivitātes kvalitatīvie (piem., saisteklis/nesaisteklis) un/vai kvantitatīvie (piem., log IC50, relatīvā afinitāte (relative binding affinity — RBA), utt.) novērtējumi jābalsta uz empīriskiem datiem un pamatotiem zinātniskiem spriedumiem.
Testēšanas pārskats
24.Testēšanas pārskatā norāda šādas ziņas.
Tests:
-izmantotais tests.
Kontroles/references/testējamā ķimikālija:
-avots, sērijas numurs, izmantošanas termiņš, ja pieejams;
-pašas testējamās ķimikālijas stabilitāte, ja zināma;
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā, ja zināma;
-(attiecīgā gadījumā) pH, osmolalitātes un nogulsnēšanās mērījums kultūras barotnē, kurā testējamā ķimikālija pievienota.
Vienkomponenta viela:
-izskats, šķīdība ūdenī un citas relevantas fizikālķīmiskās īpašības;
-ķīmiskā identifikācija, piem., IUPAC vai CAS nosaukums, CAS numurs, SMILES vai InChI kods, struktūrformula, tīrība, piemaisījumu ķīmiskā identitāte (attiecīgā gadījumā, ja šī informācija ir pieejama) utt.
Daudzkomponentu viela, UVCB un maisījumi:
-iespējami izsmeļošs raksturojums, norādot sastāvdaļu ķīmisko identitāti (sk. iepriekš), kvantitatīvo saturu un relevantās fizikālķīmiskās īpašības.
Šķīdinātājs/nesējs:
-raksturojums (veids, piegādātājs un sērija);
-šķīdinātāja/nesēja izvēles pamatojums;
-testējamās ķimikālijas šķīdība un stabilitāte šķīdinātājā/nesējā, ja zināma.
Receptori:
-receptoru avots (piegādātājs, kataloga Nr., sērija, receptora suga, piegādātāja nodrošinātā aktīvo receptoru koncentrācija, piegādātāja sertifikāts);
-receptoru raksturojums (ieskaitot piesātinājuma–saistīšanās rezultātus): Kd, Bmax;
-receptoru uzglabāšana;
-radioaktīvi marķētais ligands:
-piegādātājs, kataloga Nr., sērija, specifiskā aktivitāte.
Testēšanas apstākļi:
-šķīdības ierobežojums konkrētā testa apstākļos;
-saistīšanās buferšķīduma sastāvs;
-receptora koncentrācija;
-iezīmētā elementa (t. i., radioaktīvi marķētā liganda) koncentrācija;
-testējamās ķimikālijas koncentrācijas;
-nesēja saturs (procentuāli) galīgajā testā;
-inkubācijas temperatūra un ilgums;
-metode ar kuru nosaka, vai saistīts/brīvs;
-pozitīvās un negatīvās kontroles/references vielas;
-kritēriji, pēc kuriem novērtē, vai testa rezultāts ir pozitīvs, negatīvs vai neskaidrs.
Pieņemamības pārbaude
-faktiskās IC50 un Hilla virziena koeficienta vērtības paralēlajām pozitīvajām kontroles/references vielām.
Rezultāti:
-jēldati un saistītie/brīvie dati;
-denaturēta apstiprinoša pārbaude (attiecīgā gadījumā);
-zemākā iedarbīgā koncentrācija (LEC), ja tāda ir;
-RBA un/vai IC50 vērtība (attiecīgā gadījumā);
-ja iespējams, koncentrācijas–atbildreakcijas sakarība;
-statistiskās analīzes (attiecīgā gadījumā), kā arī kļūdas un ticamības mērs (piem., vidējās vērtības standartnovirze (SEM), standartnovirze (SN), variācijas koeficients (VK) vai 95% ticamības intervāls (CI)) un apraksts, kā šīs vērtības iegūtas.
Rezultātu iztirzājums:
-10% kritērija piemērošana.
Secinājums
LITERATŪRA
(1)OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(2)OECD (2015). Integrated Summary Report: Validation of Two Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 226), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(3)OECD (2015). Performance Standards for Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 222), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(4)OECD (2012). Guidance Document on Standardized Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environmental, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(5)Cavailles V. (2002). Estrogens and Receptors: an Evolving Concept, Climacteric, 5 Suppl 2: p.20-6.
(6)Welboren W.J., et al. (2009). Genomic Actions of Estrogen Receptor Alpha: What are the Targets and How are they Regulated? Endocr. Relat. Cancer., 16(4): p. 1073-89.
(7)Younes M. and Honma N. (2011). Estrogen Receptor Beta, Arch. Pathol. Lab. Med., 135(1):
p. 63-6.
(8)Diamanti-Kandarakis et al. (2009). Endocrine-Disrupting Chemicals: an Endocrine Society Sci. Statement, Endo Rev 30(4):293-342.
(9)ICCVAM (2002). Background Review Document. Current Status of Test Methods for Detecting Endocrine Disruptors: In Vitro Estrogen Receptor Binding Assays. (NIH Publication No 03-4504). National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC.
(10)ICCVAM (2003). ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays.
(11)ICCVAM (2006). ICCVAM Evaluation of In Vitro Test Methods for Detecting Potential Endocrine Disruptors: Estrogen Receptor and Androgen Receptor Binding and Transcriptional Activation Assays.
(12)Akahori Y. et al. (2008). Relationship Between the Results of In Vitro Receptor Binding Assay to Human Estrogen Receptor Alpha and In Vivo Uterotrophic Assay: Comparative Study with 65 Selected Chemicals, Toxicol. In Vitro, 22(1): 225-231.
(13)OECD (2007). Additional Data Supporting the Test Guideline on the Uterotrophic Bioassay in Rodents, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 67), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(14)Takeyoshi, M. (2006). Draft Report of Pre-validation and Inter-laboratory Validation For Stably Transfected Transcriptional Activation (TA) Assay to Detect Estrogenic Activity - The Human Estrogen Receptor Alpha Mediated Reporter Gene Assay Using hER-HeLa-9903 Cell Line, Chemicals Evaluation and Research Institute (CERI): Japan. p. 1-188.
(15)Yamasaki, K; Noda, S; Imatanaka, N; Yakabe, Y. (2004). Comparative Study of the Uterotrophic Potency of 14 Chemicals in a Uterotrophic Assay and their Receptor-Binding Affinity, Toxicol. Letters, 146: 111-120.
(16)Kummer V; Maskova, J; Zraly, Z; Neca, J; Simeckova, P; Vondracek, J; Machala, M. (2008). Estrogenic Activity of Environmental Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Uterus of Immature Wistar Rats. Toxicol. Letters, 180: 213-221.
(17)Gozgit, JM; Nestor, KM; Fasco, MJ; Pentecost, BT; Arcaro, KF. (2004). Differential Action of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons on Endogenous Estrogen-Responsive Genes and on a Transfected Estrogen-Responsive Reporter in MCF-7 Cells. Toxicol. and Applied Pharmacol., 196: 58-67.
(18)Santodonato, J. (1997). Review of the Estrogenic and Antiestrogenic Activity of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons: Relationship to Carcinogenicity. Chemosphere, 34: 835-848.
(19)Swillens S (1995). Interpretation of Binding Curves Obtained with High Receptor Concentrations: Practical Aid for Computer Analysis, Mol Pharmacol 47(6):1197-1203.
1. papildinājums
Definīcijas un saīsinājumi
10 % kritērijs: izvēle no analīzes izslēgt tādus datu punktus, kuros ar replikātiem iegūtā [3H]17β-estradiola specifiskās saistīšanās procentuālā vidējā vērtība par 10 % vai vairāk pārsniedz pie zemākas koncentrācijas iegūto vidējo vērtību (sk. 4. papildinājumu).
Pieņemamības kritēriji: minimālie standarti, kas attiecas uz eksperimenta kontrolēm un references standartiem. Lai eksperimentu uzskatītu par derīgu, visiem pieņemamības kritērijiem jābūt izpildītiem.
Pareizība (konkordantums): pakāpe, kādā testa rezultāti sakrīt ar pieņemtajām atsauces vērtībām. Tas ir testa veiktspējas raksturlielums un viens no tā relevantuma aspektiem. Ar šo terminu, tāpat kā terminu “konkordantums”, bieži vien saprot testa pareizo iznākumu īpatsvaru (1).
KS: ESAO konceptuālais satvars (KS) endokrīno disruptoru testēšanai un izvērtēšanai.
Ķimikālija: viela vai maisījums.
VK: variācijas koeficients.
E2: 17β-estradiols.
ED: endokrīnā disrupcija.
hERα: cilvēka estrogēnreceptors alfa.
ER: estrogēnreceptors.
Estrogēniskā aktivitāte: ķimikālijas spēja imitēt 17β-estradiolu, proti, saistīties ar estrogēnreceptoriem. Ar šo testēšanas metodi var konstatēt saistīšanos ar hERα.
IC50: testējamās inhibējošās ķimikālijas 50 % efektīvā koncentrācija.
ICCVAM: Alternatīvo metožu validēšanas koordinēšanas starpaģentūru komiteja.
Starplaboratoriju reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vairākas kvalificētas laboratorijas spēj iegūt kvalitatīvi un kvantitatīvi līdzīgus rezultātus, ja tās izmanto vienu un to pašu protokolu un vienas un tās pašas testējamās vielas. Starplaboratoriju reproducējamību (saukta arī par “interlaboratoriju reproducējamību”) nosaka prevalidēšanas un validēšanas procesā, un šis lielums rāda, cik lielā mērā testēšanu vienlīdz sekmīgi iespējams veikt dažādās laboratorijās (1).
Iekšlaboratorijas reproducējamība: lielums, kas raksturo, kādā mērā vienā laboratorijā strādājoši kvalificēti darbinieki spēj sekmīgi atkārtot iepriekš iegūtus rezultātus, ja to pašu protokolu izmanto citā laikā. Saukts arī par “intralaboratoriju reproducējamību” (1).
LEC: zemākā iedarbīgā koncentrācija ir zemākā koncentrācija, kurā testējamā ķīmikālija izraisa reakciju (t. i., testējamās ķimikālijas zemākā koncentrācija, pie kuras indukcijas reizinājums ir statistiski atšķirīgs no paralēlās nesēja kontroles).
Atdarinājuma tests: sadzīvisks apzīmējums testam, kas ir noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgs validētai un pieņemtai testēšanas references metodei. Brīvi aizstājams ar līdzīgu testēšanas metodi.
PBTG: veiktspējā balstītas testēšanas vadlīnijas.
Veiktspējas standarti: uz validētu testēšanas metodi bāzēti standarti, pēc kuriem izvērtē noteikšanas mehānisma vai funkcionalitātes ziņā līdzīgu testu salīdzināmību. Tie ietver: 1) nepieciešamos testa komponentus; 2) minimālo tādu references ķimikāliju sarakstu, kuras izraudzītas no citām ķimikālijām, ko izmanto, lai pierādītu pieņemamu validētās testēšanas metodes veiktspēju; kā arī 3) uz attiecīgajā validētajā testēšanas metodē iegūto rezultātu pamata — salīdzināmus pareizības un ticamības līmeņus, kādi būtu jāiegūst ar ierosināto testu, to izvērtējot ar references ķimikālijām no minimālā saraksta (1).
Standartvielas: veiktspējas standartos iekļauto references vielu apakškopa, ko laboratorijas var izmantot, lai pierādītu savu tehnisko kompetenci ar standartizētu testu. Šādu vielu atlases kritēriji parasti ir, piemēram šādi: viela ir reprezentatīva dažādām reakcijām, ir komerciāli pieejama un par to pieejami ļoti kvalitatīvi references dati.
Kompetence: vēl pirms nezināmu vielu testēšanas pierādīta spēja pienācīgi veikt testu.
References estrogēns: 17ß-estradiols (E2, CAS 50-28-2).
References testēšanas metodes: testi, uz kuriem balstās PBTG Nr. 493.
RBA: relatīvā afinitāte. Vielas RBA aprēķina kā procentuālu vērtību no vielas log (IC50) attiecībā pret 17β-estradiola log (IC50).
Relevantums: parametrs, kas raksturo testa attiecināmību uz interesējošo ietekmi un to, vai testu lietot konkrētam nolūkam ir jēgpilni un noderīgi. Tā ir pakāpe, kādā ar testu var pareizi izmērīt vai prognozēt interesējošo bioloģisko ietekmi. Relevantums ietver arī testa pareizības (konkordantuma) aspektu (1).
Ticamība: parametrs, kas izsaka, kādā pakāpē vienā un tajā pašā laboratorijā vai dažādās laboratorijās pēc vienu un tā paša protokola var ilgstoši reproducējami veikt konkrētu testu. To novērtē, aprēķinot reproducējamību vienā laboratorijā un vairākās laboratorijās.
SN: standartnovirze.
Testējamā ķimikālija: viela vai maisījums, kuru testē ar šo testēšanas metodi.
Validēta testēšanas metode: tests, kura relevantums (ieskaitot pareizību) un ticamība attiecībā uz lietošanu konkrētā nolūkā ir pārbaudīta validācijas pētījumos. Jāievēro, ka validētas testēšanas metodes veiktspēja pareizības un ticamības ziņā var nebūt pietiekama, lai to izmantotu paredzētajam nolūkam (1).
Validācija: Process, kurā nosaka, kādā mērā konkrēta pieeja, metode, tests, process vai novērtējums ir ticams un relevants konkrētajam nolūkam (1).
2. papildinājums
Freibergera–Vilsona in vitro testi, kas balstās uz piesātinājumu un konkurējošo saistīšanos ar estrogēnreceptoru (ER) un kuros izmanto pilnu rekombinanto ER
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
1.Šis in vitro piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās ar estrogēnreceptoriem (ER) tests izmanto pilnu cilvēka receptoru — ER(hrER) —, iegūtu un izolētu no insektu šūnām, kuras inficētas ar bakulovīrusu. Freibergera un Vilsona izstrādātajam protokolam veikts starptautisks daudzlaboratoriju validēšanas pētījums (2), kas pierādīja testa relevanci un ticamību paredzētajam nolūkam.
2.Šis tests ir skrīninga procedūra, ar ko identificē vielas, kas spēj saistīties ar pilnu hrERα. To izmanto, lai noteiktu testējamās ķimikālijas spēju konkurēt ar 17β-estradiolu attiecībā uz saistīšanos ar hrERα. Kvantitatīvie testa rezultāti var ietvert IC50 (mērs, kas rāda testējamās ķimikālijas koncentrāciju, kas vajadzīga, lai no hrERα pārvietotu pusi no [3H]-17β-estradiola) un testējamo ķimikāliju relatīvo afinitāti attiecībā uz hrERα salīdzinājumā ar 17β-estradiolu. Ķīmiskā skrīninga vajadzībām pieņemami kvalitatīvie testa rezultāti var ietvert testējamo ķimikāliju klasificēšanu saistīgās vai nesaistīgās ar hrERα vai tādās, kuru saistīgums ir neskaidrs, uz to kritēriju pamata, kas aprakstīti attiecībā uz saistīšanās līknēm.
3.Testā izmanto radioaktīvi marķētu ligandu, tāpēc laboratorijai būs vajadzīga radioaktīvo materiālu licence. Visas procedūras ar radioaktīvajiem izotopiem un bīstamām ķimikālijām jāveic, ievērojot nacionālajos tiesību aktos paredzētos noteikumus un procedūras.
4.Pirms šā testa izmantošanas regulatīviem mērķiem jāizlasa sadaļas “VISPĀRĪGAIS IEVADS” un “HrER SAISTĪŠANĀS TESTA KOMPONENTI”. Šajā testēšanas vadlīnijā izmantotās definīcijas un saīsinājumi ir aprakstīti 1. papildinājumā.
TESTA PRINCIPI (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
5.HrERα saistīšanās tests mēra radioaktīvi iezīmēta liganda ([3H]17β-estradiola) spēju saistīties ar ER arvien pieaugošu testējamās ķimikālijas (t. i., konkurenta) koncentrāciju klātbūtnē. Testējamās ķimikālijas, kam piemīt augsta ER afinitāte, konkurē ar radioaktīvi iezīmēto ligandu pie zemākas koncentrācijas nekā ķimikālijas ar zemāku receptora afinitāti.
6.Šis tests sastāv no diviem svarīgākajiem komponentiem: piesātinājuma–saistīšanās eksperimenta, kas raksturo receptora–liganda mijiedarbības parametrus, un konkurējošās saistīšanās eksperimenta, kas attiecībā uz saistīšanos ar ER raksturo konkurenci starp testējamo ķimikāliju un radioaktīvi marķēto ligandu.
7.Piesātinājuma–saistīšanās eksperimenta mērķis ir raksturot konkrētas receptoru partijas afinitāti un konkurējošās saistīšanās eksperimentā — to skaitu preparātā. Piesātinājuma–saistīšanās eksperiments līdzsvara apstākļos mēra fiksētas estrogēnreceptora koncentrācijas afinitāti tā dabīgajam ligandam (to izsaka disociācijas konstante, Kd), un aktīvo receptoru domēnu koncentrāciju (Bmax).
8.Konkurējošās saistīšanās eksperiments mēra tādas vielas afinitāti, kura attiecībā uz saistīšanos ar ER konkurē ar [3H]17β-estradiolu. Afinitāti kvantitatīvi izsaka kā testējamās ķimikālijas koncentrāciju, kas līdzsvara apstākļos inhibē 50 % [3H]17β-estradiola specifiskās saistīšanās (apzīmē kā “50 % inhibējošo koncentrāciju” vai IC50). To var izvērtēt arī, izmantojot relatīvo afinitāti (RBA, relatīvā salīdzinājumā ar estradiola IC50, ko atsevišķi mēra tajā pašā izpildes reizē). Konkurējošās saistīšanās eksperiments mēra fiksētas koncentrācijas [3H]17β-estradiola spēju saistīties ar ER plaša testējamās ķimikālijas koncentrāciju diapazona (astoņas intensitātes pakāpes) klātbūtnē. Pēc tam, ja iespējams, datus pārveido Hilla vienādojuma (A. Hills, 1910) formā, kas apraksta radioaktīvi marķētā liganda pārvietošanu, ko izraisa viena domēna konkurējošais saisteklis. Radioaktīvi marķētā estradiola pārvietošanas pakāpe līdzsvara apstākļos tiek izmantota, lai testējamo ķimikāliju raksturotu kā saistīgu, nesaistīgu vai tādu, kam ir neskaidra reakcija.
PROCEDŪRA
Pieņemamas hrERα proteīna veiktspējas pierādīšana
9.Pirms piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās testu ieviešanas laboratorijas ikdienas praksē attiecībā uz katru jaunu hrERα partiju ir jāpierāda to veiktspējas pareizība laboratorijā, kurā to izmantos. Veiktspēju pierāda ar divu etapu procedūru. Proti,
-veic [3H]-17β-estradiola saistīšanās–piesātinājuma testu, lai pierādītu specifiskumu attiecībā uz hrERα un piesātinājumu. Ar iegūto datu nelineāras regresijas analīzi (piem., BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995) un no tiem izveidotu Skačārda (Scatchard) diagrammu dokumentē hrERα spēju saistīt [3H]-17β-estradiolu (Kd) un katras partijas receptoru skaitu (Bmax);
-veic konkurējošās saistīšanas testu, izmantojot kontroles vielas (references estrogēnu (17β-estradiolu)), vāju saistekli (piem., noretinodrelu vai noretindronu) un nesaistekli (oktiltrietoksisilānu (OTES)). Katra laboratorija izveido un uztur vēsturisku datubāzi, kurā dokumentē IC50 konsekventumu un citas būtiskas references estrogēna un vāja saistekļa vērtības, kas iegūtas dažādos eksperimentos un ar atšķirīgām hrERα partijām. Ar kontroles vielām iegūto konkurējošās saistīšanās līkņu parametriem jābūt 95 % ticamības intervāla robežās (sk. 1. tabulu); tas izstrādāts, izmantojot to laboratoriju datus, kuras piedalījās šā testa validēšanas pētījumā (2).
1. tabula. References estrogēna un vāja saistekļa veiktspējas kritēriji, kas izstrādāti FW hrER saistīšanās testam.
|
Viela
|
Parametrs
|
Vidējā vērtībaa
|
Standartnovirze (n)
|
95 % ticamības intervālib
|
|
|
|
|
|
apakšējā robeža
|
augšējā robeža
|
|
17β-estradiols
|
augstākais (%)
|
100,44
|
10,84 (67)
|
97,8
|
103,1
|
|
|
zemākais (%)
|
0,29
|
1,25 (67)
|
-0,01
|
0,60
|
|
|
Hilla virziena koeficients
|
-1,06
|
0,20 (67)
|
-1,11
|
-1,02
|
|
|
LogIC50 (M)
|
-8,92c
|
0,18 (67)
|
-8,97
|
-8,88
|
|
Noretinodrels
|
augstākais (%)
|
99,42
|
8,90 (68)
|
97,27
|
101,60
|
|
|
zemākais (%)
|
2,02
|
3,42 (68)
|
1,19
|
2,84
|
|
|
Hilla virziena koeficients
|
-1,01
|
0,38 (68)
|
-1,10
|
-0,92
|
|
|
Log IC50 (M)
|
-6,39
|
0,27 (68)
|
-6,46
|
-6,33
|
|
Noretindronsc
|
augstākais (%)
|
96,14
|
8,44 (27)
|
92,80
|
99,48
|
|
|
zemākais (%)
|
2,38
|
5,02 (27)
|
0,40
|
4,37
|
|
|
Hilla virziena koeficients
|
-1,41
|
0,32 (27)
|
-1,53
|
-1,28
|
|
|
LogIC50(M)
|
-5,73
|
0,27 (27)
|
-5,84
|
-5,62
|
aVidējā vērtība (n) ± standartnovirze (SN) kontroles testu izpildes reizēm, ko validēšanas pētījuma gaitā veica četras laboratorijas, tika aprēķināta, izmantojot līknei atbilstošo parametru aplēses (Hilla vienādojumu ar četriem parametriem) (sk. 2. atsauces N pielikumu).
b95 % ticamības intervāli sniegti kā paraugs pieņemamības kritērijiem.
cValidēšanas pētījuma 4. apakšuzdevumā noretindrona testēšana nebija obligāta (sk. 2. atsauci, sk. 4. apakšuzdevumu). Tādējādi vidējā vērtība ± SN (n) kontroles testu veikšanas reizēm, ko īstenoja divas laboratorijas, tika aprēķināta, izmantojot līknei atbilstošo parametru aplēses (Hilla vienādojumu ar četriem parametriem).
IC50 diapazons būs atkarīgs no receptoru preparāta Kd un katrā konkrētajā laboratorijā izmantotās radioaktīvi marķētā liganda koncentrācijas. Ir pieņemama IC50 diapazona atbilstoša pielāgošana, ņemot vērā to, kādos apstākļos tests ir veikts.
Laboratorijas kvalifikācijas pierādīšana
10.Sk. šīs testēšanas metodes sadaļas “HrER SAISTĪŠANĀS TESTA KOMPONENTI” 17. un 18. punktu un 2. tabulu. Katrā (piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās) testā īsteno trīs neatkarīgas testa izpildes reizes (t. i., ar jauniem receptora atšķaidījumiem, ķimikālijām un reaģentiem), tās veic dažādās dienās un katrā izpildes reizē izmanto trīs replikātus.
Receptora (hrERα) koncentrācijas noteikšana
11.Aktīvā receptora koncentrācija katrā atsevišķā partijā un atkarībā no uzglabāšanas apstākļiem var būt nedaudz atšķirīga. Tāpēc ir jānosaka no piegādātāja saņemtā aktīvā receptora koncentrācija. Tas ļaus panākt atbilstošu aktīvā receptora koncentrāciju testa veikšanas laikā.
12.Apstākļos, kas atbilst konkurējošās saistīšanās apstākļiem (proti, ar 1 nM [3H]-estradiola), nominālas receptora koncentrācijas — 0,25, 0,5, 0,75 un 1 nM — inkubē bez estradiola (kopējā saistīšanās) un ar 1 µM nemarķēta estradiola (nespecifiskā saistīšanās). Grafiski attēlo sakarību starp specifisko saistīšanos (starpību starp kopējo saistīšanos un nespecifisko saistīšanos) un receptora nominālo koncentrāciju. Receptora koncentrācija, pie kuras iegūst tādas specifiskās saistīšanās vērtības, kas atbilst 40 % pievienotā radioaktīvā marķējuma, ļauj noteikt atbilstošo nominālo receptora koncentrāciju, kuru attiecīgi izmanto piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās eksperimentiem. Samērā bieži galīgā hrER koncentrācija, kas atbilst šim nosacījumam, ir 0,5 nM.
13.Ja pēc atkārtotiem mēģinājumiem neizdodas sasniegt 20 % kritēriju, eksperimenta uzstādījumus pārbauda attiecībā uz iespējamām kļūdām. Nespēja sasniegt 20 % kritēriju var norādīt, ka rekombinantajā partijā ir ļoti maz aktīvā receptora; šādos gadījumos jāapsver iespēja izmantot citu receptora partiju.
Piesātinājuma tests
14.[3H]17β-estradiola astoņu augoša stipruma koncentrāciju triplikātus vērtē, pie šādiem trim turpmāk uzskaitītajiem nosacījumiem (sk. 2. tabulu):
-testu veic bez nemarķēta 17β-estradiola un ER klātbūtnē. Šādi, mērot radioaktivitāti iedobēs, kurās ir tikai [3H]17β-estradiols, nosaka kopējo saistīšanos;
-testu veic ar nemarķēta 17β-estradiola koncentrāciju, kas tūkstoškārt pārsniedz marķētā 17β-estradiola koncentrāciju, un ER klātbūtnē. Šāda nosacījuma mērķis ir piesātināt aktīvos saistīšanās domēnus ar nemarķētu 17β-estradiolu un, mērot radioaktivitāti iedobēs, noteikt nespecifisko saistīšanos. Visu pārējo karsto estradiolu, kas spēj saistīties ar receptoru, uzskata par nespecifiskā domēnā saistīgu, jo aukstajam estradiolam jābūt tik lielā koncentrācijā, ka tas saistās ar visiem uz receptora pieejamajiem specifiskajiem domēniem;
-testu veic bez nemarķēta 17β-estradiola un bez ER (kopējās radioaktivitātes noteikšana).
[3H]-17β-estradiola un nemarķēta 17β-estradiola šķīdumu sagatavošana
15.Buferšķīdumam pievienojot 12 nM [3H]-17β-estradiola izejšķīduma, sagatavo [3H]-17β-estradiola atšķaidījumus, kuru sākotnējās koncentrācijas ir 0,12nM–12 nM. Galīgā testa koncentrācijas diapazonā no 0,03 līdz 3,0 nM iegūst, 40 µl šādi sagatavoto šķīdumu iepilinot attiecīgajās 96 iedobju mikrotitrēšanas plates iedobēs (beigu tilpums 160 μl). Testa buferšķīduma, [3H]-17β-estradiola izejšķīduma un atšķaidījumu sagatavošana, kā arī koncentrāciju noteikšana ir sīki izskaidrota FW testa protokolā (2).
16.Atšķaidījumus no etanolu saturoša 17β-estradiola šķīduma sagatavo, pievienojot tam testa buferšķīdumu, lai iegūtu astoņas augoša stipruma koncentrācijas, kas sākotnēji ir diapazonā no 0,06 µM līdz 6 µM. Galīgā testa koncentrācijas diapazonā no 0,03 µM līdz 3 µM iegūst, 80 µl šādi sagatavoto šķīdumu iepilinot attiecīgajās 96 iedobju mikrotitrēšanas plates iedobēs (beigu tilpums 160 μl). Nemarķētā 17β-estradiola galīgajai koncentrācijai atsevišķās nespecifiskās saistīšanās testa iedobēs jābūt tūkstoškārt lielākai par marķētā [3H]-17β- estradiola koncentrāciju. Nemarķēta 17β-estradiola atšķaidījumu sagatavošana ir sīki izskaidrota FW testa protokolā (2).
17.Izmanto receptora nominālo koncentrāciju, pie kuras specifiskā saistīšanās ir 20±5 % (sk. 12.-13. punktu). HrERα šķīdumu jāsagatavo tieši pirms lietošanas.
18.96 iedobju mikrotitrēšanas plates sagatavo saskaņā ar 2. tabulas norādījumiem, katrai koncentrācijai sagatavojot trīs replikātus. 2.2. papildinājumā sniegts piemērs [3H]-17β-estradiola, nemarķēta 17β-estradiola, buferšķīduma un receptora koncentrācijām un tilpumiem testa platē.
2. tabula. Piesātinājuma–saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojums
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
|
A
|
0,03 nM [3H] E2 + ER
|
0,06 nM [3H] E2 + ER
|
0,08 nM [3H] E2 + ER
|
0,10 nM [3H] E2 + ER
|
Kopējā saistīšanās (šķīdinātājs)
|
|
B
|
0,30 nM [3H] E2 + ER
|
0,60 nM [3H] E2 + ER
|
1,0 nM [3H] E2 + ER
|
3,0 nM [3H] E2 + ER
|
|
|
C
|
|
|
|
|
|
|
D
|
0,03 nM [3H] E2 + ER + 0,03 µM E2
|
0,06 nM [3H] E2 + ER + 0,06 µM E2
|
0,08 nM [3H] E2 + ER + 0,08 µM E2
|
0,10 nM [3H] E2 + ER
+ 0,10 µM E2
|
Nespecifiskā saistīšanās
|
|
E
|
0,30 nM [3H] E2 + ER + 0,30 µM E2
|
0,60 nM [3H] E2 + ER + 0,60 µM E2
|
1,0 nM [3H] E2 + ER
+ 1,0 µM E2
|
3,0 nM [3H] E2 + ER +
3,0 µM E2
|
|
|
F
|
|
|
|
|
|
|
G
|
|
|
|
|
|
|
H
|
|
|
|
|
|
19.Testa mikrotitrēšanas plates 16 līdz 20 stundas inkubē 2° līdz 8°C temperatūrā un inkubācijas periodā novieto rotatora.
Ar hrERα saistītā [3H]-17β-estradiola mērīšana
20.[3H]-17β-estradiolu, kas piesaistījies hrERα, no brīvā [3H]-17β-estradiola atdala, katrā iedobē pievienojot 80 μl aukstas DCC suspensijas, tad 10 minūtes kratot mikrotitrēšanas plates un 10 minūtes centrifugējot ar aptuveni 2500 apgr./min. Lai procedūras gaitā nepieļautu [3H]-17β-estradiola atdalīšanos no hrERα, kam tas piesaistījies, ir ļoti svarīgi buferšķīdumus un testa iedobes turēt 2 līdz 8°C temperatūrā un katru testa soli veikt ātri. Lai plates varētu apstrādāt ātri un efektīvi, ir vajadzīgs mikrotitrēšanas plašu kratītājs.
21.Ņem 50 µl supernatanta, kas satur ar hrERα saistīto [3H]-17β-estradiolu, un novieto uz otras mikrotitrēšanas plates; to dara ar īpašu piesardzību, lai nepieļautu iedobju kontamināciju, saskaroties DCC.
22.Pēc tam katrai iedobei (A1–B12 un D1–E12) pievieno 200 μl scintilācijas šķidruma, kas kodolemisiju kinētisko enerģiju spēj pārveidot gaismas enerģijā. Katrā no G1–H12 (kopējam dpm atbilstošajām) iedobēm iepilina 40 μl [3H]-17β-estradiola sērijveida atšķaidījuma; tam jānokļūst tieši scintilācijas šķīdumā mērījumu plates iedobēs atbilstoši 3. tabulas norādījumiem, proti, šajās iedobēs jābūt tikai 200 μl scintilācijas šķidruma un atbilstošam [3H]-17β-estradiola atšķaidījumam. Ar šiem mērījumiem pierāda, cik daudz [3H]-17β-estradiola (izteikta dpm) pievienots katrā iedobju kopumā, kas demonstrē kopējo saistīšanos un nespecifisko saistīšanos.
3. tabula. Piesātinājuma–saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojums, radioaktivitātes mērījums
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
|
A
|
0,03 nM [3H] E2 + ER
|
0,06 nM [3H] E2 + ER
|
0,08 nM [3H] E2 + ER
|
0,10 nM [3 H] E2 + ER
|
Kopējā saistīšanās (šķīdinātājs)
|
|
B
|
0,30 nM [3H] E2 + ER
|
0,60 nM [3H] E2 + ER
|
1,0 nM [3H] E2 + ER
|
3,0 nM [3H] E2 + ER
|
|
|
C
|
|
|
|
|
|
|
D
|
0,03 nM [3H] E2 + ER + 0,03 µM E2
|
0,06 nM [3H] E2 + ER + 0,06 µM E2
|
0,08 nM [3H] E2 + ER + 0,08 µM E22
|
0,10 nM [3H] E2 + ER
+ 0,10 µM E2
|
Nespecifiskā saistīšanās
|
|
E
|
0,30 nM [3H] E2 + ER + 0,30 µM E2
|
0,60 nM [3H] E2 + ER + 0,60 µM E2
|
1,0 nM [3H] E2 + ER
+ 1,0 µM E2
|
3,0 nM [3H] E2 + ER +
3,0 µM E2
|
|
|
F
|
|
|
|
|
|
|
G
|
0,03 nM [3H] E2
(kopējais dpm)
|
0,06 nM [3H] E2
|
0,08 nM [3H] E2
|
0,10 nM [3H] E2
|
(kopējais dpm)
|
|
H
|
0,30 nM [3H] E2
|
0,60 nM [3H] E2
|
1,0 nM [3H] E2
|
3,0 nM [3H] E2
|
|
23.Mērījumu sāk ne mazāk kāpēc divu stundu ilgas nogaidīšanas, un skaitīšanas laiks katrai iedobei ir 40 minūtes. Nosakot dpm uz iedobi un piemērojot slāpēšanas korekciju, izmanto mikrotitrēšanas plates scintilāciju skaitītāju. Ja mikrotitrēšanas plates scintilāciju skaitītājs nav pieejams, paraugu skaitīšanai var izmantot parasto skaitītāju. Šādā gadījumā var apsvērt skaitīšanas laika samazināšanu.
Konkurējošās saistīšanās tests
24.Konkurējošās saistīšanās tests mēra vienas konkrētas [3H]-17β- estradiola koncentrācijas saistīšanos arvien pieaugošu testējamās ķimikālijas koncentrāciju klātbūtnē. Katrā testa veikšanas reizē izmanto trīs paralēlus katras koncentrācijas replikātus. Papildus tam attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju testu izpilda trīs reizes, un tas nenotiek paralēli, bet dažādos laikos. Testu veic vienā vai vairākās 96 iedobju mikrotitrēšanas platēs.
Kontroles
25.Veicot testu, katrā eksperimentā jāiekļauj paralēlais šķīdinātājs un kontroles (t. i., references estrogēns, vājš saisteklis un nesaisteklis). Katrā testa izpildes reizē vienā platē ir jābūt atsauces estrogēna un kontroļu (t.i. vāja saistekļa un nesaistekļa) pilnai koncentrāciju līknei. Visās pārējās platēs ir jābūt: i) katra E2 un vāja saistekļa triplikātiem augstā koncentrācijā (maksimāla pārvietošana) un vidējā koncentrācijā (aptuveni IC50); ii) šķīdinātāja kontroles un nespecifiskās saistīšanās triplikātiem. Testa buferšķīduma, kontroļu, [3H]-17β-estradiola, hrERα un testējamo ķimikāliju šķīdumu sagatavošanas procedūras ir aprakstītas 2. atsaucē (sk. FW testa protokolu K pielikumā).
Šķīdinātāja kontrole
26.Šķīdinātāja kontrole rāda, vai nenotiek šķīdinātāja mijiedarbība ar testa sistēmu, kā arī mēra kopējo saistīšanos (apzīmē ar “TB” — total binding). Ieteicamais šķīdinātājs ir etanols. Ja testējamās ķimikālijas visaugstākā koncentrācija etanolā nešķīst, kā alternatīvu var izmantot dimetilsulfoksīdu (“DMSO”). Galīgajā testā etanola vai attiecīgā gadījumā DMSO koncentrācijai iedobēs jābūt 1,5 % un ne vairāk kā 2 %.
Buferšķīduma kontrole
27.Buferšķīduma kontrole (“BC”) nedrīkst saturēt ne šķīdinātāju, ne testējamo ķimikāliju, bet tā satur visus citus testa komponentus. Buferšķīduma kontroles rezultātus salīdzina ar šķīdinātāja kontroli, lai verificētu, ka izmantotais šķīdinātājs neietekmē testa sistēmu.
Stiprs saisteklis (references estrogēns)
28.17β-estradiols (CAS 50-28-2) ir endogēnisks ligands ar augstu afinitāti (alfa apakštipa) ER. Katram hrERα konkurējošās saistīšanās testam sagatavo standarta līkni ar nemarķētu 17β-estradiolu, lai varētu novērtēt, kāda ir mainība laika gaitā, veicot testu tajā pašā laboratorijā. Sagatavo astoņus nemarķēta 17β-estradiola šķīdumus etanolā tā, lai testa iedobēs šķīdumu koncentrācija būtu no 100 nM–10 pM (-7[logM] līdz -11[logM]), ar šādiem intervāliem: (-7[logM], -8[logM], -8.5[logM], -9[logM], - 9,5[logM], -10[logM], -11[logM]). Nemarķēta 17β-estradiola (1 µM) augstākā koncentrācija kalpo arī kā nespecifiskās saistīšanās (NSB) indikators. 4. tabulā šo koncentrāciju apzīmē ar kodu “NSB”, lai gan tā ir arī standarta līknes daļa.
Vājš saisteklis
29.Lai demonstrētu katra eksperimenta jutīgumu un ļautu novērtēt, kāda ir rezultātu mainība, veicot testu laika gaitā, tajā iekļauj vāju saistekli (noretinodrelu (CAS 68-23-5) vai noretindronu (CAS 68-22-4). Sagatavo astoņus vāja saistekļa šķīdumus etanolā tā, lai testa iedobēs šķīdumu koncentrācija būtu 3 nM–30 pM (no -8,5[logM] līdz -4,5[logM]), ar šādiem intervāliem: -4,5[logM], -5[logM], -5,5[logM], -6[logM], -6,5[logM], -7[logM],-7,5[logM], -8,5[logM].
Nesaisteklis
30.Kā negatīvo kontroli (nesaistekli) izmanto oktiltrietoksisilānu (OTES, CAS 2943-75-1). Tas apstiprinās, ka tests spēs noteikt ķimikālijas, kas nesaistās ar hrERα. Sagatavo astoņus vāja saistekļa šķīdumus etanolā tā, lai testa iedobēs šķīdumu koncentrācija būtu 0,1 nM–1000 μM (no -10[logM] līdz -3[logM]), ar logaritmisku palielinājumu. Alternatīvi par nesaistekļa kontroli var izmantot di-n-butilftalātu (DBP). Ir pierādīts, ka tā maksimālā šķīdība testā ir -4[logM].
HrERα koncentrācija
31.Izmanto receptora daudzumu, pie kura specifiskā saistīšanās ir 20±5 % no 1 nM radioaktīvi marķētā liganda (sk. 2. papildinājuma 12.-13. punktu). HrERα šķīdumu jāsagatavo tieši pirms lietošanas.
[3H]-17β-estradiols
32.[3H]-17β-estradiola koncentrācija testa iedobēs ir 1,0 nM.
Testējamās ķimikālijas
33.Vispirms ir jāveic šķīdības tests, lai noteiktu katras testējamās ķimikālijas šķīdības robežu un identificētu piemērotu koncentrācijas diapazonu, kas tiks izmantots testa protokolā. Sākotnēji katras testējamās ķimikālijas šķīdības robežu nosaka šķīdinātājā un pēc tam apstiprina testēšanas apstākļos. Galīgā testā izmantojamā koncentrācija nepārsniedz 1 mM. Diapazona noteikšanas testēšanā ietilpst šķīdinātāja kontrole; paralēli tai testē astoņus sērijveida logaritmiskus atšķaidījumus, sākot ar augstāko pieņemamo koncentrāciju (piem., 1 mM vai zemāku, balstoties uz šķīdības robežu), un vēro, kad šķīdums kļūst duļķains vai rada nogulsnes (sk. arī 35. punktu). Testējamo ķimikāliju testē, izmantojot līkni ar astoņām log koncentrācijām un diapazona noteikšanas testā identificētajiem intervāliem. Trešā un ceturtā eksperimenta koncentrācijas būtu jāpielāgo pēc vajadzības, lai labāk raksturotu koncentrācijas–atbildreakcijas līkni.
34.Testējamās ķimikālijas atšķaidījumus sagatavo atbilstošā šķīdinātājā (sk. 2. papildinājuma 26. punktu). Ja testējamās ķimikālijas augstākā koncentrācija nešķīst ne etanolā, ne DMSO un lielāka šķīdinātāja daudzuma pievienošana galīgajā testa stobriņā novestu pie pieņemamās robežas pārsniegšanas, augstāko koncentrāciju var samazināt par vienu intervālu uz leju. Šādā gadījumā sērijveida koncentrācijas var papildināt ar vienu papildkoncentrāciju diapazona apakšā. Visas pārējas sērijveida koncentrācijas paliek nemainīgas.
35.Pievienojot testējamās ķimikālijas šķīdumus testa iedobēs, tos rūpīgi vēro, jo pievienošanas laikā var rasties nogulsnes. Datus par tām iedobēm, kurās konstatē nogulsnes, neņem vērā, pielāgojot datus līknei, un testa pārskatā norāda izslēgšanas iemeslu.
36.Ja no citiem avotiem jau ir pieejama informācija par testējamās ķimikālijas log (IC50), atšķaidījumus var būt lietderīgi ģeometriski izkārtot (t. i., pa 0,5 log vienībām ap paredzamo log (IC50). Galīgajam rezultātam būtu jāatspoguļo pietiekama koncentrāciju izkliede abās log (IC50) pusēs, arī līknes augšējā un apakšējā punktā, un koncentrācijām jābūt pietiekami raksturojošām attiecībā uz saistīšanās līkni.
Testa plates izkārtojums
37.Sagatavo marķētas mikrotitrēšanas plates, kurās ir pa sešiem šādiem kodētiem inkubētiem replikātiem: šķīdinātāja kontrole un references estrogēns visaugstākajā koncentrācijā, kas kalpo arī par nespecifiskās saistīšanās (NSB) rādītāju; un pa trim šādiem kodētiem inkubētiem replikātiem: astoņas nesaistīgās kontroles (oktiltrietoksisilāna) koncentrācijas, septiņas references estrogēna zemākās koncentrācijas, astoņas vāja saistekļa devas līmeņa koncentrācijas un astoņas koncentrācijas no katras testējamās ķimikālijas (TC). Mikrotitrēšanas plates izkārtojuma diagrammas paraugs pilnām references estrogēna un kontroļu koncentrāciju līknēm ir sniegts 4. tabulā. Atsevišķas mikrotitrēšanas plates izmanto testējamām ķimikālijām, un tajās jāiekļauj testa plates kontroles, t. i., 1) E2 un vāja saistekļa triplikāti augstā koncentrācijā (maksimāla pārvietošana) un vidējā koncentrācijā (aptuveni IC50); 2) šķīdinātāja kontrole un nespecifiskā saistīšanās, no katra pa sešiem replikātiem (5. tabula). Konkurējošās saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojuma darblapas paraugs ar trijām nezināmām testējamajām ķimikālijām ir dots 2.3. papildinājumā. 4. un 5. tabulā norādītās koncentrācijas ir galīgās testa koncentrācijas. Maksimālā E2 koncentrācija ir 1×10-7 M, un attiecībā uz vāju saistekli jāizmanto augstākā koncentrācija, kas 1. mikrotirēšanas platē izmantota vājam saisteklim. IC50 koncentrāciju nosaka laboratorija, balstoties uz savu vēsturisko kontroles datubāzi. Tiek sagaidīts, ka šī vērtība būs līdzīga validācijas pētījumos konstatētajai vērtībai (sk. 1. tabulu).
4. tabula. Konkurējošās saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojums, pilnas atsauces estrogēnu un kontroļu koncentrāciju līknes (1. plate).
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
TB (tikai šķīdinātājs)
|
TB (tikai šķīdinātājs)
|
NSB
|
NSB
|
|
B
|
E2 (1×10-7)
|
E2 (1×10-8)
|
E2 (1×10-8,5)
|
E2 (1×10-9)
|
|
C
|
E2 (1×10-9,5)
|
E2 (1×10-10)
|
E2 (1×10-11)
|
Tukša iedobe*
|
|
D
|
NE (1×10-4,5)
|
NE (1×10-5)
|
NE (1×10-5,5)
|
NE (1×10-6)
|
|
E
|
NE (1×10-6,5)
|
NE (1×10-7)
|
NE (1×10-7,5)
|
NE (1×10-8,5)
|
|
F
|
OTES (1×10-3)
|
OTES (1×10-4)
|
OTES (1×10-5)
|
OTES (1×10-6)
|
|
G
|
OTES (1×10-7)
|
OTES (1×10-8)
|
OTES (1×10-9)
|
OTES (1×10-10)
|
|
H
|
tukša iedobe (karsta)**
|
tukša iedobe (karsta)**
|
Buferšķīduma kontrole
|
Buferšķīduma kontrole
|
5. tabula. Konkurējošās saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojums, pilnas testējamo ķimikāliju un plates kontroļu koncentrāciju līknes.
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
A
|
TB (tikai šķīdinātājs)
|
TB (tikai šķīdinātājs)
|
NSB
|
NSB
|
|
B
|
TC1 (1×10-3)
|
TC1 (1×10-4)
|
TC1 (1×10-5)
|
TC1 (1×10-6)
|
|
C
|
TC1 (1×10-7)
|
TC1 (1×10-8)
|
TC1 (1×10-9)
|
TC1 (1×10-10)
|
|
D
|
TC2 (1×10-3)
|
TC2 (1×10-4)
|
TC2 (1×10-5)
|
TC2 (1×10-6)
|
|
E
|
TC2 (1×10-7)
|
TC2 (1×10-8)
|
TC2 (1×10-9)
|
TC2 (1×10-10)
|
|
F
|
TC3 (1×10-3)
|
TC3 (1×10-4)
|
TC3 (1×10-5)
|
TC3 (1×10-6)
|
|
G
|
TC3 (1×10-7)
|
TC3 (1×10-8)
|
TC3 (1×10-9)
|
TC3 (1×10-10)
|
|
H
|
NE (IC50)
|
NE (1×10-4,5)
|
E2 (IC50)
|
E2 (1×10-7)
|
Konkurējošās saistīšanās testa izpilde
38.Kā parādīts 6. tabulā, katrā testēšanas iedobē pievieno 80 μl šķīdinātāja kontroles, testa buferšķīduma kontroles, references estrogēna, vāja saistekļa, nesaistekļa un testa buferšķīdumā sagatavotas testējamās ķimikālijas. Pēc tam katrā iedobē pievieno 40 µl 4 nM [3H]-17β-estradiola šķīduma. 10 līdz 15 minūtes viegli rotē 2–8°C temperatūrā, pēc tam pievieno 40 µl hrERα šķīduma. Testa mikrotitrēšanas plates 16 līdz 20 stundas inkubē 2° līdz 8°C temperatūrā un inkubācijas periodā novieto rotatora.
6. tabula. HrER konkurējošās saistīšanās testa komponentu tilpums mikrotitrēšanas platēs
|
Tilpums (μl)
|
Komponents
|
|
80
|
Nemarķēts 17β-estradiols, noretinodrels, OTES, testējamās ķimikālijas, šķīdinātājs vai buferšķīdums
|
|
40
|
4 nM [3H]-17β-estradiola šķīduma
|
|
40
|
hrERα šķīdums ar noteiktu koncentrāciju
|
|
160
|
Kopējais tilpums katrā testa plates iedobē
|
39.Pēc tam (saskaņā ar piesātinājuma–saistīšanās testa apraksta 20.–23. punktu) kvantificē ar hrERα saistīto [3H]-17β-estradiolu, taču pirms tam, katrā iedobē pievienojot 80 μl aukstas DCC suspensijas, no brīvā [3H]-17β-estradiola atdala ar hrERα saistīto [3H]-17β-estradiolu/
40.Iedobes H1–6 (sk. aili “Tukša iedobe (karsta)” 4. tabulā) raksturo marķēta [3H]-estradiola dpm 40 μl. 40 μl alikvotu pārnes tieši scintilācijas šķīdumā iedobēs H1–H6.
Pieņemamības kritēriji
Piesātinājuma–saistīšanās tests
41.Ja tiek izmantotas pieaugošas [3H]-17β-estradiola koncentrācijas, specifiskās saistīšanās līknei ir jāsasniedz atslābuma periods, kas norāda uz hrERα piesātinājumu ar ligandu.
42.Pieņemamības diapazons attiecībā uz specifisko saistīšanos pie 1 nM [3H]-17β-estradiola koncentrācijas ir 15–25% no kopējās pievienotās radioaktivitātes vidējās vērtības, kas mērīta visās izpildes reizēs. Ir pieļaujamas atsevišķas nelielas novirzes no minētā diapazona, tomēr, ja izpildes reizēs pastāvīgi iegūst rezultātus ārpus minētā diapazona vai ja konkrētā izpildes reizē novirze ir ļoti būtiska, ir jāpielāgo proteīnu koncentrācija un piesātinājuma tests jāatkārto.
43.Datiem jābūt attēlojamiem lineāras Skačārda diagrammas veidā.
44.Nespecifiskā saistīšanās nedrīkst būt pārmērīga. Nespecifiskās saistīšanās vērtība parasti ir <35 % no kopējās saistīšanās. Tomēr minētā procentuālā attiecība dažkārt šo limitu var pārsniegt, ja testā tiek mērīts ļoti zems dpm pie zemākās radioaktīvi marķētā 17β-estradiola koncentrācijas.
Konkurējošās saistīšanās tests
45.Pie pieaugošām nemarķēta 17β-estradiola koncentrācijām [3H]-17β-estradiolu pakāpeniski pārvieto no receptora tādā veidā, kas līdzinās viena domēna konkurējošajai saistīšanai.
46.References estrogēna (t. i., 17β-estradiola) IC50 vērtībai jābūt aptuveni vienādai ar [3H]-17β-estradiola molāro koncentrāciju, kam pieskaitīta piesātinājuma–saistīšanās testā noteiktā diasociācijas konstante (Kd).
47.Visās testa izpildes reizēs kopējās specifiskās saistīšanās vērtībai pastāvīgi jābūt pieņemamības diapazonā (20 ± 5 %), pie nosacījuma, ka kopējās pievienotās radioaktivitātes vidējā mērītā koncentrācija katrā iedobē ir 1 nM. Ir pieļaujamas atsevišķas nelielas novirzes no minētā diapazona, tomēr, ja izpildes reizēs pastāvīgi iegūst rezultātus ārpus minētā diapazona vai ja konkrētā izpildes reizē novirze ir ļoti būtiska, ir jāpielāgo proteīnu koncentrācija.
48.Šķīdinātājs nedrīkst mainīt testa jutīgumu vai reproducējamību. Šķīdinātāja kontroles rezultātus (TB iedobes) salīdzina ar buferšķīduma kontroli, lai verificētu, ka izmantotais šķīdinātājs neietekmē testa sistēmu. Ja šķīdinātājs neietekmē testa gaitu, TB un buferšķīduma kontrolēm jābūt salīdzināmām.
49.Testējot ar koncentrācijām, kas nepārsniedz 10-3 M (OTES) vai 10-4 M (DBP), nesaisteklim nevajadzētu no hrERα pārvietot vairāk nekā 25 % [3H]-17β-estradiola.
50.Izmantojot FW hrER saistīšanās testa validēšanas pētījuma datus (2. atsauces N pielikums), tika izstrādāti references estrogēna un divu vāju saistekļu (piem., noretinodrels, noretindrons) veiktspējas kritēriji. Ir sniegti 95 % ticamības intervāli vidējām vērtībām (n) +/- SN; tās tika iegūtas no visiem kontroles testiem, ko izpildīja laboratorijas, kuras piedalījās validēšanas pētījumā. 95 % ticamības intervālus aprēķināja references estrogēna un vāju saistekļu līknes pielāgošanas parametriem (t. i., augšējam un apakšējam punktam, Hilla virziena koeficientam un log IC50) un vāju saistekļu log10RBA attiecībā pret references estrogēnu; tos izmanto par pozitīvās kontroles veiktspējas kritērijiem. 1. tabulā sniegti līknes pielāgošanas parametru paredzamie diapazoni, kurus var izmantot kā veiktspējas kritērijus. Praksē IC50 diapazons var būt nedaudz atšķirīgs atkarībā no receptora preparāta Kd un liganda koncentrācijas.
51.Testējamo ķimikāliju līknes pielāgošanas parametriem veiktspējas kritēriji izstrādāti netika, jo pastāv pārāk plašs esošu potenciāli testējamu ķimikāliju spektrs un potenciālās afinitātes un rezultātu mainīgums (piem., pilna līkne, daļēja līkne, neatbilstība līknei). Tomēr katrā testēšanas reizē un ar katru testējamo ķimikāliju iegūtos rezultātus būtu jāizvērtē speciālistam. Testā jāizmanto pietiekams testējamās ķimikālijas koncentrāciju diapazons, lai skaidri definētu konkurējošās saistīšanās līknes augšējo punktu (t. i., 90–100 % saistīšanās). Rezultātu mainībai starp katras testējamās ķimikālijas koncentrācijas replikātiem, kā arī starp trim neatkarīgajām izpildes reizēm jābūt saprātīgi pieļaujamās robežās un zinātniski pamatojamai. Izpildot kontroles testus attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju, mērījumiem būtu jātuvojas veiktspējas parametriem, kas paziņoti attiecībā uz šo FW testu, un tiem jābūt saskanīgiem ar attiecīgās laboratorijas vēsturiskajiem kontroldatiem.
DATU ANALĪZE
Piesātinājuma–saistīšanās tests
52.Tiek mērīta gan kopējā, gan nespecifiskā saistīšanās. No šim vērtībām, nespecifisko saistīšanos atņemot no kopējās saistīšanās, tiek aprēķināta pieaugošu [3H]-17β-estradiola koncentrāciju specifiskā saistīšanās līdzsvara apstākļos. Grafikā, kurā specifisko saistīšanos attēlo attiecībā pret [3H]-17β-estradiola koncentrāciju, attiecībā uz maksimālo specifisko saistīšanos ir jāsasniedz atslābuma periods, kas norāda uz hrERα piesātinājumu ar [3H]-17β-estradiolu. Turklāt datu analīzē būtu jākonstatē [3H]-17β- estradiola saistīšanās ar vienu augstas afinitātes saistīšanās domēnu. Piesātinājuma–saistīšanās līknē attēlo nespecifisko, kopējo un specifisko saistīšanos. Šo datu turpmākai analīzei izmanto nelineārās regresijas analīzi (piem., BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995), un galīgos datus attēlo ar Skačārda diagrammu.
53.Analizējot datus, Bmax un Kd nosaka no kopējās saistīšanās datiem vien, izmantojot pieņēmumu, ka nespecifiskā saistīšanās ir lineāra, ja vien nav pamatota iemesla izmantot citu metodi. Turklāt, meklējot labāko atbilstību līknei, izmanto robustu regresiju, ja vien nav pamatota iemesla rīkoties citādi. Pārskatā norāda izvēlēto robustas regresijas metodi. Nosakot Bmax un Kd no piesātinājuma–saistīšanās datiem, vienmēr jāizmanto liganda noplicināšanās korekcija (piem., Swillens (1995) metode).
Konkurējošās saistīšanās tests
54.Konkurējošās saistīšanās līkni grafiski attēlo kā specifisko [3H]-17β-estradiola saistīšanos attiecībā pret konkurenta koncentrāciju (log10 vienībās). Testējamās ķimikālijas koncentrācija, kas inhibē 50 % [3H]17β-estradiola maksimālās specifiskās saistīšanās, ir IC50 vērtība.
55.Pozitīvo kontroļu (t. i., references estrogēna un vāja saistekļa) log (IC50) vērtību aplēses nosaka, izmantojot atbilstošu nelineāru līknes piemeklēšanas programmatūru, lai panāktu atbilstību Hilla vienādojumam ar četriem parametriem (piem., BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995). Veicot pielāgošanu līknei, augšējo un apakšējo punktu, virziena koeficientu un log (IC50) parasti neierobežo. Meklējot labāko atbilstību līknei, izmanto robustu regresiju, ja vien nav pamatota iemesla rīkoties citādi. Liganda noplicināšanās korekciju neizmanto. Pēc sākotnējās analīzes katru saistīšanās līkni pārskata, lai nodrošinātu pienācīgu atbilstību paraugam. Vāja saistekļa relatīvo afinitāti (RBA) aprēķina kā procentuālu vērtību no vāja saistekļa log (IC50) attiecībā pret 17β-estradiola log (IC50). Ar pozitīvajām kontrolēm un nesaistekļu kontrolēm iegūtos rezultātus izvērtē, sekojot testa veikšanas norādēm 2. papildinājuma 45.–50. punktā.
56.Datus par visam testējamajām ķimikālijām būtu jāanalizē, izmantojot pakāpenisku pieeju, kas nodrošina datu pienācīgu analīzi un to, ka katra konkurējošās saistīšanās līkne tiek klasificēta pareizi. Pirms katras testa veikšanas reizes testējamās ķimikālijas datus sākotnēji analizē standartizētā veidā, identiski tam, kā tiek analizēti references estrogēns un vāja saistekļa kontroles (sk. 55. punktu iepriekš tekstā). Pēc tam katrā testa veikšanas reizē tehniski pārskata, vai līkne atbilst parametriem, un vizuāli nosaka, cik precīzi dati atbilst ģenerētajai konkurējošās saistīšanās līknei. Ja šīs tehniskās pārbaudes laikā novēro, ka [3H]-17β-estradiola specifiskā saistīšanās atkarībā no koncentrācijas procentuāli samazinās, rezultātu mainība tehnisko replikātu starpā pie katras ķīmiskās koncentrācijas ir neliela un līknes atbilstība parametriem trīs testa veikšanas reizēs ir konsekventa, tas ir pietiekami uzticams rādītājs, ka tests un datu analīze ir veikti pareizi.
Datu interpretācija
57.Pie nosacījuma, ka ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par saistīgu ar hrERα, ja saistīšanās līkne ir pielāgojama un zemākais atbildreakcijas līknes punkts datu diapazonā ir mazāks par 50 % (1. attēls).
58.Pie nosacījuma, ka ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par nesaistīgu ar hrERα, ja:
-saistīšanās līkne ir pielāgojama un pielāgotās atbildreakcijas līknes zemākais punkts datu diapazonā ir lielāks par 75 % vai
-saistīšanās līkni pielāgot nevar un visu koncentrāciju grupu vidējā zemākā nenoapaļotā procentuālā saistīšanās pēc datiem pārsniedz 75 %.
59.Testējamās ķimikālijas klasifikāciju uzskata par neskaidru, ja nav izpildīts neviens no iepriekšminētajiem nosacījumiem (t. i., zemākais pielāgotās atbildreakcijas līknes punkts ir robežās no 76 – 51 %).
7. tabula. Kritēriji, pēc kuriem klasificē testējamās ķimikālijas, izmantojot konkurējošās saistīšanās līkni.
|
Klasifikācija
|
Kritēriji
|
|
Saisteklisa
|
Saistīšanās līkni var pielāgot.
·Zemākais atbildreakcijas līknes punkts datu diapazonā ir mazāks par 50 %.
|
|
Nesaisteklisb
|
Ja saistīšanās līkni var pielāgot,
·pielāgotās atbildreakcijas līknes zemākais punkts datu diapazonā ir virs 75 %.
Ja saistīšanās līkni nevar pielāgot,
·visu koncentrāciju grupu vidējā zemākā nenoapaļotā procentuālā saistīšanās pēc datiem pārsniedz 75 %.
|
|
Neskaidrac
|
Jebkura testa izpildes reize, kas neuzrāda testējamās ķimikālijas saistīgumu vai nesaistīgumu
(piem., pielāgotās atbildreakcijas līknes zemākais punkts ir robežās no 76–51 %).
|
1. attēls. Piemēri, kā klasificē testējamās ķimikālijas, izmantojot konkurējošās saistīšanās līkni.
60.Laboratorijā attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju testu veic vairākas izpildes reizes, un katrai izpildes reizei atkarībā no rezultāta piešķir ciparisku vērtību, no kuras pēc tam aprēķina vidējo vērtību atbilstoši 8. tabulā sniegtajam paraugam. Vidējos rezultātus, kas apkopoti konkrētajā laboratorijā, salīdzina ar gaidīto katras testējamās ķimikālijas klasifikāciju.
8. tabula. Metode, pēc kuras klasificē testējamo ķimikāliju, izmantojot vairākas testēšanas reizes vienā laboratorijā.
|
Katrai izpildes reizei piešķir ciparisku vērtību:
|
|
Klasifikācija
|
Cipariska vērtība
|
|
Saisteklis
|
2
|
|
Neskaidrs
|
1
|
|
Nesaisteklis
|
0
|
|
Izpildes reizēs iegūto ciparisko vērtību vidējās vērtības klasificēšana:
|
|
Klasifikācija
|
Cipariska vērtība
|
|
Saisteklis
|
Vidēji ≥ 1,5
|
|
Neskaidrs
|
0,5 ≤ Vidējā vērtība < 1,5
|
|
Nesaisteklis
|
Vidēji < 0,5
|
TESTĒŠANAS PĀRSKATS
61.Sk. šīs testēšanas metodes sadaļas “HrER SAISTĪŠANĀS TESTA KOMPONENTI” 24. punktu.
2.1. papildinājums
Terminu saraksts
[3H]E2: 17β-estradiols, radioaktīvi marķēts ar tritiju.
DCC: ar dekstrānu pārklāta ogle.
E2: nemarķēts 17β-estradiols (inerts).
Testa buferšķīdums: 10 mM tris, 10 mg liellopu seruma albumīna/ml, 2 mM DTT, 10 % glicerīna, 0,2 mM leupeptīna (pH 7,5).
hrERα: cilvēka rekombinantais estrogēnreceptors alfa.
Replikāts: viena no vairākām vienāda satura un vienādas koncentrācijas iedobēm, kuras paralēli testē vienā testēšanas reizē. Pēc šī protokola katru testējamās ķimikālijas koncentrāciju testē ar trim replikātiem (triplikātiem); proti, pie katras testējamās ķimikālijas koncentrācijas ir trīs replikāti, kurus testē vienlaicīgi.
Izpildes reize: viss paralēli testēto miktotitrēšanas plates testa iedobju kopums, kas nodrošina visu informāciju, kura vajadzīga, lai raksturotu testējamās ķimikālijas saistīšanos ar hrERα, (t. i., kopējais testa iedobei pievienotais [3H]-17β-estradiols, maksimālā [3H]-17β-estradiola saistīšanās ar hrERα, nespecifiskā saistīšanās un kopējā saistīšanās pie dažādām testējamās ķimikālijas koncentrācijām). Izpildes reize var nozīmēt pat tikai vienas testēšanas iedobes (t. i., replikāta) testēšanu pie katras koncentrācijas, tomēr šajā konkrētajā gadījumā protokols pieprasa testēt ar triplikātiem, un viena izpildes reize nozīmē trīs testēšanas iedobes pie katras koncentrācijas. Papildus minētajam šis protokols prasa ar katru ķimikāliju veikt trīs neatkarīgas (proti, neveicot paralēli) izpildes reizes.
2.2. papildinājums
Tipisks [3H]-17β-estradiola piesātinājuma tests ar trijām replikāta iedobēm
|
Tipisks [3H]-17β-estradiola piesātinājuma tests ar trijām replikāta iedobēm
|
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tipa kods
|
Karsta E2 sākotnēja koncentrācija (nM)
|
Karsta E2 tilpums (μl)
|
Karsta E2 beigu koncentrācija (nM)
|
Auksta E2 sākotnēja koncentrācija (µM)
|
Auksta E2 tilpums (μl)
|
Auksta E2 beigu koncentrācija (µM)
|
Buferšķīduma tilpums (μl)
|
Receptora tilpums (μl)
|
Kopējais tilpums iedobēs
|
|
A1
|
1
|
H
|
0,12
|
40
|
0,03
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A2
|
2
|
H
|
0,12
|
40
|
0,03
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A3
|
3
|
H
|
0,12
|
40
|
0,03
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A4
|
1
|
H
|
0,24
|
40
|
0,06
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A5
|
2
|
H
|
0,24
|
40
|
0,06
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A6
|
3
|
H
|
0,24
|
40
|
0,06
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A7
|
1
|
H
|
0,32
|
40
|
0,08
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A8
|
2
|
H
|
0,32
|
40
|
0,08
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A9
|
3
|
H
|
0,32
|
40
|
0,08
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A10
|
1
|
H
|
0,40
|
40
|
0,10
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A11
|
2
|
H
|
0,40
|
40
|
0,10
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
A12
|
3
|
H
|
0,40
|
40
|
0,10
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B1
|
1
|
H
|
1,20
|
40
|
0,30
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B2
|
2
|
H
|
1,20
|
40
|
0,30
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B3
|
3
|
H
|
1,20
|
40
|
0,30
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B4
|
1
|
H
|
2,40
|
40
|
0,60
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B5
|
2
|
H
|
2,40
|
40
|
0,60
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B6
|
3
|
H
|
2,40
|
40
|
0,60
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B7
|
1
|
H
|
4,00
|
40
|
1,00
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B8
|
2
|
H
|
4,00
|
40
|
1,00
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B9
|
3
|
H
|
4,00
|
40
|
1,00
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B10
|
1
|
H
|
12,00
|
40
|
3,00
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B11
|
2
|
H
|
12,00
|
40
|
3,00
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
B12
|
3
|
H
|
12,00
|
40
|
3,00
|
―
|
―
|
―
|
80
|
40
|
160
|
|
D1
|
1
|
HC
|
0,12
|
40
|
0,03
|
0,06
|
80
|
0,03
|
―
|
40
|
160
|
|
D2
|
2
|
HC
|
0,12
|
40
|
0,03
|
0,06
|
80
|
0,03
|
―
|
40
|
160
|
|
D3
|
3
|
HC
|
0,12
|
40
|
0,03
|
0,06
|
80
|
0,03
|
―
|
40
|
160
|
|
D4
|
1
|
HC
|
0,24
|
40
|
0,06
|
0,12
|
80
|
0,06
|
―
|
40
|
160
|
|
D5
|
2
|
HC
|
0,24
|
40
|
0,06
|
0,12
|
80
|
0,06
|
―
|
40
|
160
|
|
D6
|
3
|
HC
|
0,24
|
40
|
0,06
|
0,12
|
80
|
0,06
|
―
|
40
|
160
|
|
D7
|
1
|
HC
|
0,32
|
40
|
0,08
|
0,16
|
80
|
0,08
|
―
|
40
|
160
|
|
D8
|
2
|
HC
|
0,32
|
40
|
0,08
|
0,16
|
80
|
0,08
|
―
|
40
|
160
|
|
D9
|
3
|
HC
|
0,32
|
40
|
0,08
|
0,16
|
80
|
0,08
|
―
|
40
|
160
|
|
D10
|
1
|
HC
|
0,40
|
40
|
0,10
|
0,2
|
80
|
0,1
|
―
|
40
|
160
|
|
D11
|
2
|
HC
|
0,40
|
40
|
0,10
|
0,2
|
80
|
0,1
|
―
|
40
|
160
|
|
D12
|
3
|
HC
|
0,40
|
40
|
0,10
|
0,2
|
80
|
0,1
|
―
|
40
|
160
|
|
Tipisks [3H]-17β-estradiola piesātinājuma tests ar trijām replikāta iedobēm
|
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tipa kods
|
Karsta E2 sākotnēja koncentrācija (nM)
|
Karsta E2 tilpums (μl)
|
Karsta E2 beigu koncentrācija (nM)
|
Auksta E2 sākotnēja koncentrācija (μM)
|
Auksta E2 tilpums (μl)
|
Auksta E2 beigu koncentrācija (μM)
|
Buferšķīduma tilpums (μl)
|
Receptora tilpums (μl)
|
Kopējais tilpums iedobēs
|
|
E1
|
1
|
HC
|
1,20
|
40
|
0,30
|
0,6
|
80
|
0,3
|
―
|
40
|
160
|
|
E2
|
2
|
HC
|
1,20
|
40
|
0,30
|
0,6
|
80
|
0,3
|
―
|
40
|
160
|
|
E3
|
3
|
HC
|
1,20
|
40
|
0,30
|
0,6
|
80
|
0,3
|
―
|
40
|
160
|
|
E4
|
1
|
HC
|
2,40
|
40
|
0,60
|
1,2
|
80
|
0,6
|
―
|
40
|
160
|
|
E5
|
2
|
HC
|
2,40
|
40
|
0,60
|
1,2
|
80
|
0,6
|
―
|
40
|
160
|
|
E6
|
3
|
HC
|
2,40
|
40
|
0,60
|
1,2
|
80
|
0,6
|
―
|
40
|
160
|
|
E7
|
1
|
HC
|
4,00
|
40
|
1,00
|
2
|
80
|
1
|
―
|
40
|
160
|
|
E8
|
2
|
HC
|
4,00
|
40
|
1,00
|
2
|
80
|
1
|
―
|
40
|
160
|
|
E9
|
3
|
HC
|
4,00
|
40
|
1,00
|
2
|
80
|
1
|
―
|
40
|
160
|
|
E10
|
1
|
HC
|
12,00
|
40
|
3,00
|
6
|
80
|
3
|
―
|
40
|
160
|
|
E11
|
2
|
HC
|
12,00
|
40
|
3,00
|
6
|
80
|
3
|
―
|
40
|
160
|
|
E12
|
3
|
HC
|
12,00
|
40
|
3,00
|
6
|
80
|
3
|
―
|
40
|
160
|
|
G1
|
1
|
Karsta
|
0,12
|
40
|
0,03
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G2
|
2
|
Karsta
|
0,12
|
40
|
0,03
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G3
|
3
|
Karsta
|
0,12
|
40
|
0,03
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G4
|
1
|
Karsta
|
0,24
|
40
|
0,06
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G5
|
2
|
Karsta
|
0,24
|
40
|
0,06
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G6
|
3
|
Karsta
|
0,24
|
40
|
0,06
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G7
|
1
|
Karsta
|
0,32
|
40
|
0,08
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G8
|
2
|
Karsta
|
0,32
|
40
|
0,08
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G9
|
3
|
Karsta
|
0,32
|
40
|
0,08
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G10
|
1
|
Karsta
|
0,40
|
40
|
0,10
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G11
|
2
|
Karsta
|
0,40
|
40
|
0,10
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
G12
|
3
|
Karsta
|
0,40
|
40
|
0,10
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H1
|
1
|
Karsta
|
1,20
|
40
|
0,30
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H2
|
2
|
Karsta
|
1,20
|
40
|
0,30
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H3
|
3
|
Karsta
|
1,20
|
40
|
0,30
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H4
|
1
|
Karsta
|
2,40
|
40
|
0,60
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H5
|
2
|
Karsta
|
2,40
|
40
|
0,60
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H6
|
3
|
Karsta
|
2,40
|
40
|
0,60
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H7
|
1
|
Karsta
|
4,00
|
40
|
1,00
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H8
|
2
|
Karsta
|
4,00
|
40
|
1,00
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H9
|
3
|
Karsta
|
4,00
|
40
|
1,00
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H10
|
1
|
Karsta
|
12,00
|
40
|
3,00
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H11
|
2
|
Karsta
|
12,00
|
40
|
3,00
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
|
H12
|
3
|
Karsta
|
12,00
|
40
|
3,00
|
―
|
―
|
―
|
―
|
―
|
40
|
Piezīme: “karstās” iedobes inkubācijas laikā ir tukšas. 40 µl pievieno tikai scintilāciju skaitīšanai.
2.3. papildinājums Konkurējošās saistīšanās testa iedobju izkārtojums
|
Plate
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tips
|
Iedobes kods
|
Koncentrācijas kods
|
Konkurenta sākotnējā koncentrācija
(M)
|
hrER izejšķīdums
(μl)
|
Buferšķīduma tilpums (μl)
|
Iezīmētā elementa (karsta E2) tilpums (μL)
|
Tilpums atšķaidījuma platē (μL)
|
Beigu tilpums (μl)
|
Konkurenta beigu koncentrācija
(M)
|
|
S
|
A1
|
1
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB1
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A2
|
2
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB2
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A3
|
3
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB3
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A4
|
1
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB4
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A5
|
2
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB5
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A6
|
3
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB6
|
-
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
S
|
A7
|
1
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A8
|
2
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A9
|
3
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A10
|
1
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A11
|
2
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
A12
|
3
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
B1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S1
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
B2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S1
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
B3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S1
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
B4
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S2
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
B5
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S2
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
B6
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S2
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
B7
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S3
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
B8
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S3
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
B9
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S3
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
B10
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S4
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
B11
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S4
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
B12
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S4
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
C1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S5
|
6,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-10
|
|
S
|
C2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S5
|
6,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-10
|
|
S
|
C3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S5
|
6,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-10
|
|
S
|
C4
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S6
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
C5
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S6
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
C6
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S6
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
C7
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S7
|
2,00E-11
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-11
|
|
S
|
C8
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S7
|
2,00E-11
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-11
|
|
S
|
C9
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S7
|
2,00E-11
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-11
|
|
S
|
C10
|
1
|
tukša
|
tukša
|
B1
|
-
|
-
|
160
|
-
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
C11
|
2
|
tukša
|
tukša
|
B2
|
-
|
-
|
160
|
-
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
C12
|
3
|
tukša
|
tukša
|
B3
|
-
|
-
|
160
|
-
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
D1
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP1
|
6,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
D2
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP1
|
6,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
D3
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP1
|
6,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
D4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP2
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
S
|
D5
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP2
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
S
|
D6
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP2
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
S
|
D7
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP3
|
6,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-06
|
|
S
|
D8
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP3
|
6,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-06
|
|
S
|
D9
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP3
|
6,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-06
|
|
S
|
D10
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP4
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
D11
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP4
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
D12
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP4
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
Konkurējošās saistīšanās testa iedobju izkārtojums
|
|
Plate
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tips
|
Iedobes kods
|
Koncentrācijas kods
|
Konkurenta sākotnējā koncentrācija (M)
|
hrER izejšķīdums
(μl)
|
Buferšķīduma tilpums (μl)
|
Iezīmētā elementa (karsta E2) tilpums (μL)
|
Tilpums atšķaidījuma platē (μL)
|
Beigu tilpums
(μl)
|
Konkurenta beigu koncentrācija (M)
|
|
S
|
E1
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
E2
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
E3
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
E4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
2,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
E5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
2,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
E6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
2,00E-07
|
40
|
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
S
|
E7
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-08
|
|
S
|
E8
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-08
|
|
S
|
E9
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-08
|
|
S
|
E10
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
E11
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
E12
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP
|
6,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-09
|
|
S
|
F1
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-03
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
S
|
F2
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-03
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
S
|
F3
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-03
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
S
|
F4
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-04
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
S
|
F5
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-04
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
S
|
F6
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-04
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
S
|
F7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
F8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
F9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-05
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-05
|
|
S
|
F10
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
F11
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
F12
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
S
|
G1
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
G2
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
G3
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-07
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
3,0E-07
|
|
S
|
G4
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
G5
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
G6
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-08
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
S
|
G7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
G8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
G9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-09
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
S
|
G10
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
-
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
G11
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
-
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
G12
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES
|
2,00E-10
|
40
|
-
|
40
|
-
|
160
|
1,0E-10
|
|
S
|
H1
|
1
|
karsta
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H2
|
1
|
karsta
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H3
|
1
|
karsta
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H4
|
1
|
karsta
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H5
|
1
|
karsta
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H6
|
1
|
karsta
|
H
|
H
|
-
|
-
|
-
|
40
|
-
|
40
|
-
|
|
S
|
H7
|
1
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H8
|
1
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H9
|
1
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H10
|
1
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H11
|
1
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
|
S
|
H12
|
1
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC
|
-
|
40
|
80
|
40
|
-
|
160
|
-
|
Piezīme: “karstās” iedobes inkubācijas laikā ir tukšas. 40 µl pievieno tikai scintilāciju skaitīšanai.
|
Konkurējošās saistīšanās testa iedobju izkārtojums
|
|
Plate
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tips
|
Iedobes kods
|
Koncentrācijas kods
|
Konkurenta sākotnējā koncentrācija (M)
|
hrER izejšķīdums
(μL)
|
Buferšķīduma tilpums (μL)
|
Iezīmētā elementa (karsta E2) tilpums (μL)
|
Tilpums atšķaidījuma platē
(μL)
|
Beigu tilpums (μl)
|
Konkurenta beigu koncentrācija (M)
|
|
P1
|
A1
|
1
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TBB1B1
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A2
|
2
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB2
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A3
|
3
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB3
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A4
|
1
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB4
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A5
|
2
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB5
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A6
|
3
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB6
|
-
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
-
|
|
P1
|
A7
|
1
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A8
|
2
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A9
|
3
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A10
|
1
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A11
|
2
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
A12
|
3
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S0
|
2,00E-06
|
40
|
-
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
B1
|
1
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
B2
|
2
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
B3
|
3
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
B4
|
1
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
B5
|
2
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
B6
|
3
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
B7
|
1
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
B8
|
2
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
B9
|
3
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
B10
|
1
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
B11
|
2
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
B12
|
3
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
C1
|
1
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
C2
|
2
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
C3
|
3
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
C4
|
1
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C5
|
2
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C6
|
3
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C7
|
1
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C8
|
2
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C9
|
3
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C10
|
1
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
C11
|
2
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
C12
|
3
|
testējamā ķimikālija 1
|
TC1
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
D1
|
1
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
D2
|
2
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
D3
|
3
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
D4
|
1
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
D5
|
2
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
D6
|
3
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
D7
|
1
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
D8
|
2
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
D9
|
3
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
D10
|
1
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
D11
|
2
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
D12
|
3
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E1
|
1
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E2
|
2
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E3
|
3
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
Konkurējošās saistīšanās testa iedobju izkārtojums
|
|
Plate
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tips
|
Iedobes kods
|
Koncentrācijas kods
|
Konkurenta sākotnējā koncentrācija (M)
|
hrER izejšķīdums
(μL)
|
Buferšķīduma tilpums (μL)
|
Iezīmētā elementa (karsta E2) tilpums (μL)
|
Tilpums atšķaidījuma platē
(μL)
|
Beigu tilpums (μl)
|
Konkurenta beigu koncentrācija (M)
|
|
P1
|
E4
|
1
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
6
|
-
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
E5
|
2
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
6
|
-
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
E6
|
3
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
6
|
-
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
E7
|
1
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
7
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
E8
|
2
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
7
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
E9
|
3
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
7
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
E10
|
1
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
8
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
E11
|
2
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
8
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
E12
|
3
|
testējamā ķimikālija 2
|
TC2
|
8
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
F1
|
1
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
F2
|
2
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
F3
|
3
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
1
|
2,00E-03
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-03
|
|
P1
|
F4
|
1
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
F5
|
2
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
F6
|
3
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
2
|
2,00E-04
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-04
|
|
P1
|
F7
|
1
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F8
|
2
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F9
|
3
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
3
|
2,00E-05
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F10
|
1
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F11
|
2
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F12
|
3
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
4
|
2,00E-06
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-06
|
|
P1
|
G1
|
1
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
G2
|
2
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
G3
|
3
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
5
|
2,00E-07
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-07
|
|
P1
|
G4
|
1
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
G5
|
2
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
G6
|
3
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
6
|
2,00E-08
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-08
|
|
P1
|
G7
|
1
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
G8
|
2
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
G9
|
3
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
7
|
2,00E-09
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-09
|
|
P1
|
G10
|
1
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
G11
|
2
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
G12
|
3
|
testējamā ķimikālija 3
|
TC3
|
8
|
2,00E-10
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
1,0E-10
|
|
P1
|
H1
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H2
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H3
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
|
1,00E-4,5
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
|
1,00E-4,5
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
|
1,00E-4,5
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H7
|
1
|
auksts E2 S
|
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H8
|
2
|
auksts E2 S
|
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H9
|
3
|
auksts E2 S
|
|
|
IC50
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H10
|
1
|
auksts E2 S
|
|
|
1,00E-7
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H11
|
2
|
auksts E2 S
|
|
|
1,00E-7
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
|
P1
|
H12
|
3
|
auksts E2 S
|
|
|
1,00E-7
|
40
|
0
|
40
|
80
|
160
|
|
3. papildinājums
Ķīmiskās izvērtēšanas un pētniecības institūta (CERI) estrogēnreceptoru saistīšanās in vitro tests, kurā izmanto cilvēka rekombinanto ERα liganda saistīšanās domēna proteīnu
SĀKOTNĒJIE APSVĒRUMI UN IEROBEŽOJUMI (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
1.Šis estrogēnreceptora (ERα) piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās in vitro tests izmanto cilvēka ERα liganda saistīšanās domēnu (LBD). Šo proteīnu modeli izstrādājis Ķīmiskās izvērtēšanas un pētniecības institūts (CERI) Japānā, un tas eksistē kā glutationa-S-transferāzes (GST) jauktais proteīns, kuru ekpresē E. coli. CERI protokolam veikts starptautisks daudzlaboratoriju validēšanas pētījums (2), kas pierādīja testa relevanci un ticamību paredzētajam nolūkam.
2.Šis tests ir skrīninga procedūra, ar ko identificē vielas, kas spēj saistīties ar hrERα. To izmanto, lai noteiktu testējamās ķimikālijas spēju konkurēt ar 17β-estradiolu attiecībā uz saistīšanos ar hrERα-LBD. Kvantitatīvie testa rezultāti var ietvert IC50 (mērs, kas rāda testējamās ķimikālijas koncentrāciju, kas vajadzīga, lai no hrERα pārvietotu pusi no [3H]-17β-estradiola) un testējamo ķimikāliju relatīvo afinitāti attiecībā uz hrERα salīdzinājumā ar 17β-estradiolu. Ķīmiskā skrīninga vajadzībām pieņemami kvalitatīvie testa rezultāti var ietvert testējamo ķimikāliju klasificēšanu saistīgās vai nesaistīgās ar hrERα vai tādās, kuru saistīgums ir neskaidrs, uz to kritēriju pamata, kas aprakstīti attiecībā uz saistīšanās līknēm.
3.Testā izmanto radioaktīvi marķētu ligandu, tāpēc laboratorijai būs vajadzīga radioaktīvo materiālu licence. Visas procedūras ar radioaktīvajiem izotopiem un bīstamām ķimikālijām jāveic, ievērojot nacionālajos tiesību aktos paredzētos noteikumus un procedūras.
4.Pirms šā testa izmantošanas regulatīviem mērķiem jāizlasa sadaļas “VISPĀRĪGAIS IEVADS” un “HrER SAISTĪŠANĀS TESTA KOMPONENTI”. Šajā testēšanas vadlīnijā izmantotās definīcijas un saīsinājumi ir aprakstīti 1. papildinājumā.
TESTA PRINCIPI (sk. arī VISPĀRĪGO IEVADU)
5.HrERα saistīšanās tests mēra radioaktīvi iezīmēta liganda ([3H]17β-estradiola) spēju saistīties ar ER arvien pieaugošu testējamās ķimikālijas (t.i. konkurenta) koncentrāciju klātbūtnē. Testējamās ķimikālijas, kam piemīt augsta ER afinitāte, konkurē ar radioaktīvi iezīmēto ligandu pie zemākas koncentrācijas nekā ķimikālijas ar zemāku receptora afinitāti.
6.Šis tests sastāv no diviem svarīgākajiem komponentiem: piesātinājuma–saistīšanās eksperimenta, kas raksturo receptora–liganda mijiedarbības parametrus, un konkurējošās saistīšanās eksperimenta, kas attiecībā uz saistīšanos ar ER raksturo konkurenci starp testējamo ķimikāliju un radioaktīvi marķēto ligandu.
7.Piesātinājuma–saistīšanās eksperimenta mērķis ir raksturot konkrētas receptoru partijas afinitāti un konkurējošās saistīšanās eksperimentā — to skaitu preparātā. Piesātinājuma–saistīšanās eksperiments līdzsvara apstākļos mēra fiksētas estrogēnreceptora koncentrācijas afinitāti tā dabīgajam ligandam (to izsaka disociācijas konstante, Kd) un aktīvo receptoru domēnu koncentrāciju (Bmax).
8.Konkurējošās saistīšanās eksperiments mēra tādas vielas afinitāti, kura attiecībā uz saistīšanos ar ER konkurē ar [3H]17β-estradiolu. Afinitāti kvantitatīvi izsaka kā testējamās ķimikālijas koncentrāciju, kas līdzsvara apstākļos inhibē 50 % [3H]17β-estradiola specifiskās saistīšanās (apzīmē kā “50 % inhibējošo koncentrāciju” vai IC50). To var izvērtēt arī, izmantojot relatīvo afinitāti (RBA, relatīvā salīdzinājumā ar estradiola IC50, ko atsevišķi mēra tajā pašā izpildes reizē). Konkurējošās saistīšanās eksperiments mēra fiksētas koncentrācijas [3H]17β-estradiola spēju saistīties ar ER plaša testējamās ķimikālijas koncentrāciju diapazona (astoņas intensitātes pakāpes) klātbūtnē. Pēc tam, ja iespējams, datus pārveido Hilla vienādojuma (A. Hills, 1910) formā, kas apraksta radioaktīvi marķētā liganda pārvietošanu, ko izraisa viena domēna konkurējošais saisteklis. Radioaktīvi marķētā estradiola pārvietošanas pakāpe līdzsvara apstākļos tiek izmantota, lai testējamo ķimikāliju raksturotu kā saistīgu, nesaistīgu vai tādu, kam ir neskaidra reakcija.
PROCEDŪRA
Pieņemamas hrERα proteīna veiktspējas pierādīšana
9.Pirms piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās testu ieviešanas laboratorijas ikdienas praksē attiecībā uz katru jaunu hrERα partiju ir jāpierāda to veiktspējas pareizība laboratorijā, kurā to izmantos. Veiktspēju pierāda ar divu etapu procedūru. Proti,
-veic [3H]-17β-estradiola saistīšanās piesātinājuma testu, lai pierādītu hrERα specifiskumu un piesātinājumu. Ar iegūto datu nelineāras regresijas analīzi (piem., BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995) un no tiem izveidotu Skačārda diagrammu dokumentē hrERα spēju saistīt [3H]-17β-estradiolu (Kd) un katras partijas receptoru skaitu (Bmax);
-veic konkurējošās saistīšanas testu, izmantojot kontroles vielas (references estrogēnu (17β-estradiolu), vāji saistīgu vielu (piem., noretinodrelu vai noretindronu) un nesaistīgu vielu (oktiltrietoksisilānu, apzīmē ar “OTES”). Katra laboratorija izveido un uztur vēsturisku datubāzi, kurā dokumentē IC50 konsekventumu un citas būtiskas references estrogēna un vāja saistekļa vērtības, kas iegūtas dažādos eksperimentos un ar atšķirīgām hrERα partijām. Turklāt ar kontroles vielām iegūto konkurējošās saistīšanās līkņu parametriem jābūt 95 % ticamības intervāla robežās (sk. 1. tabulu); tas izstrādāts, izmantojot to laboratoriju datus, kuras piedalījās šā testa validēšanas pētījumā (2).
1. tabula. References estrogēna un vāja saistekļa veiktspējas kritēriji, kas izstrādāti CERI hrER saistīšanās testam.
|
Viela
|
Parametrs
|
Vidējā vērtībaa
|
Standartnovirze (n)
|
95 % ticamības intervālib
|
|
|
|
|
|
apakšējā robeža
|
augšējā robeža
|
|
17β-estradiols
|
Augšējais
|
104,74
|
13,12 (70)
|
101,6
|
107,9
|
|
|
Apakšējais
|
0,85
|
2,41 (70)
|
0,28
|
1,43
|
|
|
Hilla virziena koeficients
|
-1,22
|
0,20 (70)
|
-1,27
|
-1,17
|
|
|
LogIC50
|
-8,93
|
0,23 (70)
|
-8,98
|
-8,87
|
|
Noretinodrels
|
Augšējais
|
101,31
|
10,55 (68)
|
98,76
|
103,90
|
|
|
Apakšējais
|
2,39
|
5,01 (68)
|
1,18
|
3,60
|
|
|
Hilla virziena koeficients
|
-1,04
|
0,21 (68)
|
-1,09
|
-0,99
|
|
|
LogIC50
|
-6,19
|
0,40 (68)
|
-6,29
|
-6,10
|
|
Noretindronsc
|
Augšējais
|
92,27
|
7,79 (23)
|
88,90
|
95,63
|
|
|
Apakšējais
|
16,52
|
10,59 (23)
|
11,94
|
21,10
|
|
|
Hilla virziena koeficients
|
-1,18
|
0,32 (23)
|
-1,31
|
-1,04
|
|
|
LogIC50
|
-6,01
|
0,54 (23)
|
-6,25
|
-5,78
|
Laboratorijas kvalifikācijas pierādīšana
10.Sk. šīs testēšanas metodes sadaļas “HrER SAISTĪŠANĀS TESTA KOMPONENTI” 17. un 18. punktu un 2. tabulu. Katrā (piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās) testā īsteno trīs neatkarīgas testa izpildes reizes (t. i., ar jauniem receptora atšķaidījumiem, ķimikālijām un reaģentiem), tās veic dažādās dienās un katrā izpildes reizē izmanto trīs replikātus.
Receptora (hrERα) koncentrācijas noteikšana
11.Aktīvā receptora koncentrācija katrā atsevišķā partijā un atkarībā no uzglabāšanas apstākļiem var būt nedaudz atšķirīga. Tāpēc ir jānosaka no piegādātāja saņemtā aktīvā receptora koncentrācija. Tas ļaus panākt atbilstošu aktīvā receptora koncentrāciju testa veikšanas laikā.
12.Apstākļos, kas atbilst konkurējošās saistīšanās apstākļiem (proti, ar 0,5 nM [3H]-estradiola), nominālas receptora koncentrācijas — 0,1, 0,2, 0,4 un 0,6 nM — inkubē bez estradiola (kopējā saistīšanās) un ar 1 µM nemarķēta estradiola (nespecifiskā saistīšanās). Grafiski attēlo sakarību starp specifisko saistīšanos (starpību starp kopējo saistīšanos un nespecifisko saistīšanos) un receptora nominālo koncentrāciju. Receptora koncentrācija, pie kuras iegūst tādas specifiskās saistīšanās vērtības, kas atbilst 40 % pievienotā radioaktīvā marķējuma, ļauj noteikt atbilstošo receptora koncentrāciju, kuru attiecīgi izmanto piesātinājuma un konkurējošās saistīšanās eksperimentiem. Samērā bieži galīgā hrER koncentrācija, kas atbilst šim nosacījumam, ir 0,2 nM.
13.Ja pēc atkārtotiem mēģinājumiem neizdodas sasniegt 40 % kritēriju, eksperimenta uzstādījumus pārbauda attiecībā uz iespējamām kļūdām. Nespēja sasniegt 40 % kritēriju var norādīt, ka rekombinantajā partijā ir ļoti maz aktīvā receptora; šādos gadījumos jāapsver iespēja izmantot citu receptora partiju.
Piesātinājuma tests
14.[3H]17β-estradiola astoņu augoša stipruma koncentrāciju triplikātus vērtē, pie šādiem trim turpmāk uzskaitītajiem nosacījumiem (sk. 2. tabulu):
a.testu veic bez nemarķēta 17β-estradiola un ER klātbūtnē. Šādi, mērot radioaktivitāti iedobēs, kurās ir tikai [3H]17β-estradiols, nosaka kopējo saistīšanos;
b.testu veic ar nemarķēta 17β-estradiola koncentrāciju, kas 2000 reižu pārsniedz marķētā 17β-estradiola koncentrāciju, un ER klātbūtnē. Šāda nosacījuma mērķis ir piesātināt aktīvos saistīšanās domēnus ar nemarķētu 17β-estradiolu un, mērot radioaktivitāti iedobēs, noteikt nespecifisko saistīšanos. Visu pārējo karsto estradiolu, kas spēj saistīties ar receptoru, uzskata par nespecifiskā domēnā saistīgu, jo aukstajam estradiolam jābūt tik lielā koncentrācijā, ka tas saistās ar visiem uz receptora pieejamajiem specifiskajiem domēniem;
c.testu veic bez nemarķēta 17β-estradiola un bez ER (kopējās radioaktivitātes noteikšana).
[3H]-17β-estradiola un nemarķēta 17β-estradiola šķīdumu un hrERα sagatavošana
15.Lai sagatavotu 40 nM [3H]-17β-estradiola šķīduma, ņem 1 µM izejšķīduma — [3H]-17β-estradiola šķīdums dimetilsulfoksīdā (DMSO) —, kam pievieno DMSO (iegūstot 200 nM) un pēc tam testa buferšķīdumu istabas temperatūrā (iegūstot 40 nM). No šiem 40 nM šķīduma, izmantojot testa buferšķīdumu istabas temperatūrā, sagatavo virkni [3H]-17β-estradiola atšķaidījumu koncentrācijās no 0,313 nM līdz 40 nM (sk. paraugu 2. tabulas 12. ailē). Galīgā testa koncentrācijas diapazonā no 0,0313 līdz 4,0 nM iegūst, 10 µl šādi sagatavoto šķīdumu iepilinot attiecīgajās 96 iedobju mikrotitrēšanas plates iedobēs (sk. 2. un 3. tabulu). Testa buferšķīduma sagatavošana un [3H]-17β-estradiola oriģinālā izejšķīduma aprēķināšanas metode, balstoties uz specifisko aktivitāti, kā arī atšķaidījumu sagatavošana un koncentrāciju noteikšana ir sīki izskaidrota CERI testa protokolā (2).
16.Atšķaidījumus no nemarķēta 17β-estradiola šķīduma sagatavo, 1 nM 17β-estradiola izejšķīduma pievienojot testa buferšķīdumu, lai iegūtu astoņas augoša stipruma koncentrācijas, kas sākotnēji ir diapazonā no 0,625 µM līdz 80 µM. Galīgā testa koncentrācijas diapazonā 0,0625–8 µM iegūst, 10 µl šādi sagatavoto šķīdumu iepilinot attiecīgajās 96 iedobju mikrotitrēšanas plates iedobēs, kurās paredzēts mērīt nespecifisko saistīšanos (sk. 2. un 3. tabulu). Nemarķēta 17β-estradiola atšķaidījumu sagatavošana ir sīki izskaidrota CERI testa protokolā (2).
17.Izmanto receptora koncentrāciju, pie kuras specifiskā saistīšanās ir 40±10 % (sk. 12.–13. punktu). HrERα šķīdumu sagatavo ar ledusaukstu testa buferšķīdumu un tieši pirms izmantošanas, t. i., pēc tam, kad ir jau sagatavotas visas pārējās iedobes, kas paredzētas kopējās saistīšanās un nespecifiskās saistīšanās noteikšanai un tikai karstajam ligandam paredzētās iedobes.
18.96 iedobju mikrotitrēšanas plates sagatavo saskaņā ar 2. tabulas norādījumiem, katrai [3H]-17β-estradiola koncentrācijai sagatavojot trīs replikātus. 3. tabulā sniegti testa protokolā paredzētie [3H]-17β-estradiola, nemarķēta 17β-estradiola, buferšķīduma un receptora tilpumi.
2. tabula. Piesātinājuma–saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojums
|
|
1*
|
2*
|
3*
|
4*
|
5*
|
6*
|
7*
|
8*
|
9*
|
10
|
11**
|
12**
|
|
|
TB
mērīšanai
|
NSB
mērīšanai
|
Tikai karstā liganda noteikšanai
|
|
Nemarķēta E2 atšķaidījumi plates 4.–6. kolonnai
|
[3H]E2 atšķaidījumi plates 1.–9. kolonnai
|
|
A
|
0,0313 nM [ 3H] E2
+ ER
|
0,0313 nM [3H] E2
+ 0,0625 μM E2
+ ER
|
0,0313 nM
|
|
0,625 μM
|
0,313 nM
|
|
B
|
0,0625 nM [3H] E2
+ ER
|
0,0625 nM [3H] E2
+ 0,125 μM E2
+ ER
|
0,0625 nM
|
|
1,25 μM
|
0,625 nM
|
|
C
|
0,125 nM [3H] E2
+ ER
|
0,125 nM [3H] E2
+ 0,25 μM E2
+ ER
|
0,125 nM
|
|
2,5 μM
|
1,25 nM
|
|
D
|
0,250 nM [3H] E2
+ ER
|
0,250 nM [3H] E2
+ 0,5 μM E2
+ ER
|
0,250 nM
|
|
5 μM
|
2,5 nM
|
|
E
|
0,50 nM [ H] E2
+ ER
|
0,50 nM [3H] E2
+ 1 μM E2
+ ER
|
0,50 nM
|
|
10 μM
|
5 nM
|
|
F
|
1,00 nM [3H] E2
+ ER
|
1,00 nM [3H] E2
+ 2 μM E2
+ ER
|
1,00 nM
|
|
20 μM
|
10 nM
|
|
G
|
2,00 nM [3H] E2
+ ER
|
2,00 nM [3H] E2
+ 4 μM E2
+ ER
|
2,00 nM
|
|
40 μM
|
20 nM
|
|
H
|
4,00 nM [3H] E2
+ ER
|
4,00 nM [3H] E2
+ 8 μM E2
+ ER
|
4,00 nM
|
|
80 μM
|
40 nM
|
3. tabula. Reaģenta tilpumi piesātinājuma testa mikrotitrēšanas platē
|
Ailes numurs
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7*
|
8*
|
9*
|
|
Sagatavošanas soļi
|
TB iedobes
|
NSB iedobes
|
Tikai karstais ligands
|
|
Komponentu tilpums minētajām reakcijas iedobēm un pievienošanas kārtība
|
Buferšķīdums
|
60 µl
|
50 µl
|
90 µl
|
|
|
nemarķēts E2 (2. tabulas 11. aile)
|
-
|
10 μl
|
-
|
|
|
[3H]E2 (2. tabulas 12. josla)
|
10 µl
|
10 µl
|
10 µl
|
|
|
hrERα
|
30 µl
|
30 µl
|
-
|
|
Kopējais reaģenta tilpums
|
100 µl
|
100 µl
|
100 µl
|
|
Inkubācija
|
REAKCIJA PĒC 2 STUNDU INKUBĀCIJAS
|
Radioaktivitātes kvantificēšana uzreiz pēc sagatavošanas. Neinkubē
|
|
Apstrāde ar 0,4 % DCC
|
Jā
|
Jā
|
Nē
|
|
0,4 % DCC tilpums
|
100 µl
|
100 µl
|
-
|
|
Filtrēšana
|
Jā
|
Jā
|
Nē
|
|
DPM MĒRĪŠANA
|
|
Scintilācijas kokteilim pievienotais kvantificēšanas tilpums
|
100 µl**
|
100 µl**
|
50 µl
|
19.Kopējas saistīšanās un nespecifiskās saistīšanās noteikšanai paredzētās mikrotitrēšanas testa plates divas stundas inkubē istabas temperatūrā (22–28°C).
Ar hrERα saistītā [3H]-17β-estradiola mērīšana
20.Pēc divu stundu inkubācijas perioda ar hrERα saistītais [3H]-17β-estradiols ir jāatdala no [3H]-17β-estradiola, iedobēm pievienojot 100 µl ledusaukstas 0,4% DCC suspensijas. Pēc tam testa plates uz 10 minūtēm novieto uz ledus, un reakcijas maisījumu un DCC suspensiju filtrē, pārnesot uz mikrotitrēšanas plates filtra, kā rezultātā tiek atdalīts DCC. Pēc tam LSC mēģenēs esošajam scintilācijas šķīdumam pievieno 100 µl filtrāta, lai ar šķidruma scintilāciju skaitīšanas metodi noteiktu sabrukumu skaitu minūtē (dpm) uz mēģeni.
21.Ja mikrotitrēšanas plates filtrs nav pieejams, alternatīvs veids DCC atdalīšanai ir centrifugēšana. Ņem 50 µl supernatanta, kas satur ar hrERα saistīto [3H]-17β-estradiolu, un izmanto to scintilāciju skaitīšanai; to dara ar īpašu piesardzību, lai nepieļautu iedobju kontamināciju, saskaroties DCC.
22.Iedobes ar karsto ligandu vienu pašu izmanto, lai noteiktu testa iedobēm pievienotā [3H]-17β-estradiola sabrukumu skaitu minūtē (dpm). Radioaktivitāti kvantificē uzreiz pēc sagatavošanas. Šīs iedobes neinkubē un neapstrādā ar DCC suspensiju, bet to saturu pārnes tieši scintilācijas šķīdumā. Ar šiem mērījumi pierāda, cik daudz [3H]-17β-estradiola (izteikta dpm) pievienots katrā iedobju kopumā, kas demonstrē kopējo saistīšanos un nespecifisko saistīšanos.
Konkurējošās saistīšanās tests
23.Konkurējošās saistīšanās tests mēra vienas konkrētas [3H]-17β- estradiola koncentrācijas saistīšanos arvien pieaugošu testējamās ķimikālijas koncentrāciju klātbūtnē. Katrā testa veikšanas reizē izmanto trīs paralēlus katras koncentrācijas replikātus. Papildus tam attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju testu izpilda trīs reizes, un tas nenotiek paralēli, bet dažādos laikos. Testu veic vienā vai vairākās 96 iedobju mikrotitrēšanas platēs.
Kontroles
24.Veicot testu, katrā eksperimentā jāiekļauj paralēlais šķīdinātājs un kontroles (t. i., references estrogēns, vājš saisteklis un nesaisteklis). Katrā testa izpildes reizē vienā platē ir jābūt atsauces estrogēna un kontroļu (t.i. vāja saistekļa un nesaistekļa) pilnai koncentrāciju līknei. Visās pārējās platēs ir jābūt: i) E2 un vāja saistekļa triplikātiem augstā koncentrācijā (maksimāla pārvietošana, t. i., gandrīz pilnīga radioaktīvi marķētā liganda pārvietošana) un vidējā koncentrācijā (aptuveni IC50); ii) šķīdinātāja kontroļu un nespecifiskās saistīšanās triplikātiem. Testa buferšķīduma, kontroļu, [3H]-17β-estradiola, hrERα un testējamo ķimikāliju šķīdumu sagatavošanas procedūras ir sīki aprakstītas CERI testa protokolā (2).
Šķīdinātāja kontrole
25.Šķīdinātāja kontrole rāda, vai nenotiek šķīdinātāja mijiedarbība ar testa sistēmu, kā arī mēra kopējo saistīšanos (apzīmē ar “TB” — total binding). Ieteicamais šķīdinātājs ir DMSO. Ja testējamās ķimikālijas visaugstākā koncentrācija dimetilsulfoksīdā nešķīst, kā alternatīvu var izmantot etanolu. Galīgajā testā DMSO koncentrācija iedobēs ir 2,05 %, un to var palielināt līdz 2,5 % gadījumos, kad testējamā ķimikālija slikti šķīst. Nevajadzētu izmantot DMSO koncentrācijās, kas pārsniedz 2,5 %, jo augstākas koncentrācijas šķīdinātājs var izraisīt interferenci uz testu. Testējamajām ķimikālijām, kas nešķīst DMSO, bet ir šķīstošas etanolā, bez interferences uz testu var izmantot ne vairāk kā 2 % etanola šķīdumu.
Buferšķīduma kontrole
26.Buferšķīduma kontrole (“BC”) nedrīkst saturēt ne šķīdinātāju, ne testējamo ķimikāliju, bet tā satur visus citus testa komponentus. Buferšķīduma kontroles rezultātus salīdzina ar šķīdinātāja kontroli, lai verificētu, ka izmantotais šķīdinātājs neietekmē testa sistēmu.
Stiprs saisteklis (references estrogēns)
27.17β-estradiols (CAS 50-28-2) ir endogēnisks ligands ar augstu afinitāti (alfa apakštipa) ER. Katram hrERα konkurējošās saistīšanās testam sagatavo standarta līkni ar nemarķētu 17β-estradiolu, lai varētu novērtēt, kāda ir mainība laika gaitā, veicot testu tajā pašā laboratorijā. Sagatavo astoņus nemarķēta 17β-estradiola šķīdumus dimetilsulfoksīdā (DMSO) tā, lai testa iedobēs, kuras izmantos standarta līknei, šķīdumu galīgā koncentrācija būtu ar šādiem intervāliem: 10-6, 10-7, 10-8, 10-8,5, 10-9, 10-9,5, 10-10, 10-11 M. Nemarķēta 17β-estradiola (1 µM) augstākā koncentrācija kalpo kā nespecifiskās saistīšanās indikators. 4. tabulā šo koncentrāciju apzīmē ar kodu “NSB”, lai gan tā ir arī standarta līknes daļa.
Vājš saisteklis
28.Lai demonstrētu katra eksperimenta jutīgumu un ļautu novērtēt, kāda ir rezultātu mainība, veicot testu laika gaitā, tajā iekļauj vāju saistekli (noretinodrelu (CAS 68-23-5) vai — alternatīvi — noretindronu (CAS 68-22-4). Sagatavo astoņus vāja saistekļa šķīdumus dimetilsulfoksīdā (DMSO) un testa buferšķīdumā ar šādām galīgajām koncentrācijām testa iedobēs: 10-4,5, 10-5,5, 10-6, 10-6,5, 10-7, 10-7,5, 10-8 un 10-9 M.
Nesaisteklis
29.Kā negatīvo kontroli (nesaistekli) izmanto oktiltrietoksisilānu (OTES, CAS 2943-75-1). Tas apstiprinās, ka tests spēs noteikt ķimikālijas, kas nesaistās ar hrERα. Sagatavo astoņus nesaistekļa šķīdumus dimetilsulfoksīdā (DMSO) un testa buferšķīdumā ar šādām galīgajām koncentrācijām testa iedobēs: 10-3,10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M. Alternatīvi par nesaistekļa kontroli var izmantot di-n-butilftalātu (DBP, CAS 84-72-2), bet to testē tikai līdz koncentrācijai 10-4M. Ir pierādīts, ka DBP maksimālā šķīdība testā ir 10-4M.
HrERα koncentrācija
30.Izmanto receptora daudzumu, pie kura specifiskā saistīšanās ir 40±10 % (sk. 3. papildinājuma 12.-13. punktu). HrERα šķīdumu sagatavo, tieši pirms izmantošanas funkcionālo hrERα atšķaidot ar ledusaukstu testa buferšķīdumu.
[3H]17β-estradiols
31.[3H]-17β-estradiola galīgā koncentrācija testa iedobēs ir 0,5 nM.
Testējamās ķimikālijas
32.Vispirms ir jāveic šķīdības tests, lai noteiktu katras testējamās ķimikālijas šķīdības robežu un identificētu piemērotu koncentrācijas diapazonu, kas tiks izmantots testa protokolā. Sākotnēji katras testējamās ķimikālijas šķīdības robežu nosaka šķīdinātājā un pēc tam apstiprina testēšanas apstākļos. Galīgā testā izmantojamā koncentrācija nepārsniedz 1 mM. Diapazona noteikšanas testēšanā ietilpst šķīdinātāja kontrole; paralēli tai testē vismaz astoņus sērijveida logaritmiskus atšķaidījumus, sākot ar augstāko pieņemamo koncentrāciju (piem., 1 mM vai zemāku, balstoties uz šķīdības robežu), un vēro, kad šķīdums kļūst duļķains vai rada nogulsnes (sk. arī 3.papildinājuma 35. punktu). Kad testa koncentrāciju diapazons ir noteikts, testējamo ķimikāliju testē, izmantojot astoņas diapazona noteikšanas testā identificētās log koncentrācijas ar attiecīgajiem intervāliem. Otrajā un trešajā eksperimentā izmantotās koncentrācijas pielāgo pēc vajadzības, lai labāk raksturotu koncentrācijas–atbildreakcijas līkni.
33.Testējamās ķimikālijas atšķaidījumus sagatavo atbilstošā šķīdinātājā (sk. 3.papildinājuma 25. punktu). Ja testējamās ķimikālijas augstākā koncentrācija nešķīst ne DMSO, ne etanolā un lielāka šķīdinātāja daudzuma pievienošana galīgajā testa stobriņā novestu pie pieņemamās robežas pārsniegšanas, augstāko koncentrāciju var samazināt par vienu intervālu uz leju. Šādā gadījumā sērijveida koncentrācijas var papildināt ar vienu papildkoncentrāciju amplitūdas apakšā. Visas pārējas sērijveida koncentrācijas paliek nemainīgas.
34.Pievienojot testējamās ķimikālijas šķīdumus testa iedobēs, tos rūpīgi vēro, jo pievienošanas laikā var rasties nogulsnes. Datus par tām iedobēm, kurās konstatē nogulsnes, neņem vērā, pielāgojot datus līknei, un testa pārskatā norāda izslēgšanas iemeslu.
35.Ja no citiem avotiem jau ir pieejama informācija par testējamās ķimikālijas log(IC50), atšķaidījumus var būt lietderīgi ģeometriski izkārtot ciešāk ap paredzamo log(IC50) (t. i., pa 0,5 log vienībām). Galīgajiem rezultātiem būtu jāatspoguļo pietiekama koncentrāciju izkliede abās log (IC50) pusēs, arī līknes augšējā un apakšējā punktā, un koncentrācijām jābūt pietiekami raksturojošām attiecībā uz saistīšanās līkni.
Testa plates izkārtojums
36.Sagatavo marķētas mikrotitrēšanas plates, kurās ir pa sešiem šādiem inkubētiem replikātiem: šķīdinātāja kontrole, references estrogēns (E2) visaugstākajā koncentrācijā, kas kalpo arī par nespecifiskās saistīšanās (NSB) rādītāju, buferšķīduma kontrole, trīs inkubēti replikāti katram no šiem: astoņas nesaistīgās kontroles (oktiltrietoksisilāna) koncentrācijas, septiņas zemākās references estrogēna (E2) koncentrācijas, astoņas vāja saistekļa (noretinodrela vai noretindrona) koncentrācijas un astoņas koncentrācijas no katras testējamās ķimikālijas (TC). Mikrotitrēšanas plates izkārtojuma diagrammas paraugs pilnām references estrogēna un kontroļu koncentrāciju līknēm ir sniegts 4. tabulā. Atsevišķas mikrotitrēšanas plates izmanto testējamai ķimikālijai, un ir vajadzīgas testa plates kontroles, t. i., i) E2 un vāja saistekļa triplikāti augstā koncentrācijā (maksimāla pārvietošana) un vidējā koncentrācijā (aptuveni IC50); ii) šķīdinātāja kontrole (kopējā saistīšanās) un nespecifiskā saistīšanās, no katra pa sešiem replikātiem (5. tabula). Konkurējošās saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojuma paraugs ar trijām nezināmām testējamajām ķimikālijām ir dots 3.3. papildinājumā. Darblapā, kā arī 4. un 5. tabulā norādītās koncentrācijas attiecas uz galīgajām koncentrācijām, ko izmanto katrā testēšanas iedobē. Maksimālā E2 koncentrācija ir 1×10-7 M, un attiecībā uz vāju saistekli jāizmanto augstākā koncentrācija, kas 1. mikrotirēšanas platē izmantota vājam saisteklim. IC50 koncentrāciju nosaka laboratorija, balstoties uz savu vēsturisko kontroles datubāzi. Tiek sagaidīts, ka šī vērtība būs līdzīga validācijas pētījumos konstatētajai vērtībai (sk. 1. tabulu).
4. tabula. Konkurējošās saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojums1,2, pilnas atsauces estrogēnu un kontroļu koncentrāciju līknes (1. plate).
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
|
Buferšķīduma kontrole un pozitīvā kontrole (E2)
|
Vāji pozitīva kontrole
(noretinodrels)
|
Negatīvā kontrole
(OTES)
|
TB un NSB
|
|
A
|
Tukša iedobe*
|
1×10-9 M
|
1×10-10 M
|
TB (šķīdinātāja kontrole) (2,05 % DMSO)
|
|
B
|
E2 (1×10-11 M)
|
1×10-8 M
|
1×10-9 M
|
|
|
C
|
E2 (1×10-10 M)
|
1×10-7,5 M
|
1×10-8 M
|
NSB (10-6 M E2)
|
|
D
|
E2 (1×10-9,5 M)
|
1×10-7 M
|
1×10-7 M
|
|
|
E
|
E2 (1×10-9 M)
|
1×10-6,5 M
|
1×10-6 M
|
Buferšķīduma kontrole
|
|
F
|
E2 (1×10-8,5 M)
|
1×10-6 M
|
1×10-5 M
|
|
|
G
|
E2 (1×10-8 M)
|
1×10-5,5 M
|
1×10-4 M
|
Tukša iedobe (karsta)**
|
|
H
|
E2 (1×10-7 M)
|
1×10-4,5 M
|
1×10-3 M
|
|
5. tabula. Konkurējošās saistīšanās testa mikrotitrēšanas plates izkārtojums, papildu plates testējamajām ķimikālijām (TC) un plates kontrolēm.
|
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
|
|
Testējamā ķimikālija Nr. 1 (TC-1)
|
Testējamā ķimikālija Nr. 2
(TC-2)
|
Testējamā ķimikālija Nr. 3
(TC-3)
|
Kontroles
|
|
A
|
TC-1 (1×10-10 M)
|
TC-2 (1×10-10 M)
|
TC-3 (1×10-10 M)
|
E2 (1×10-7M)
|
|
B
|
TC-1 (1×10-9 M)
|
TC-2 (1×10-9 M)
|
TC-3 (1×10-9 M)
|
E2 (IC50)
|
|
C
|
TC-1 (1×10-8 M)
|
TC-2 (1×10-8 M)
|
TC-3 (1×10-8 M)
|
NE (1×10-4,5M)
|
|
D
|
TC-1 (1×10-7 M)
|
TC-2 (1×10-7 M)
|
TC-3 (1×10-7 M)
|
NE (IC50)
|
|
E
|
TC-1 (1×10-6 M)
|
TC-2 (1×10-6 M)
|
TC-3 (1×10-6 M)
|
NSB (10-6 M E2)
|
|
F
|
TC-1 (1×10-5 M)
|
TC-2 (1×10-5 M)
|
TC-3 (1×10-5 M)
|
|
|
G
|
TC-1 (1×10-4 M)
|
TC-2 (1×10-4 M)
|
TC-3 (1×10-4 M)
|
TB (šķīdinātāja kontrole)
|
|
H
|
TC-1 (1×10-3 M)
|
TC-2 (1×10-3 M)
|
TC-3 (1×10-3 M)
|
|
Konkurējošās saistīšanās testa izpilde
37.Katrā testēšanas plates iedobē (izņemot iedobes, kas attiecas uz kopējo saistīšanos, un tukšās, karstās iedobes, kā parādīts 6. tabulā) iepilina 50 μl testa buferšķīduma, tad samaisa ar 10 µl attiecīgi šķīdinātāja kontroles, references estrogēna (E2), vāja saistekļa, nesaistekļa un testējamās ķimikālijas un 10 µl 5 nM [3H]-17β-estradiola šķīduma. Pēc tam katrā platē pievieno 30 µl ledusauksta receptora šķīduma, un uzmanīgi samaisa. Kā pēdējo reaģentu pievieno hrERα šķīdumu. Testa mikrotitrēšanas plates divas stundas inkubē istabas temperatūrā (22–28°C).
6. tabula. HrER konkurējošās saistīšanās testa komponentu tilpums mikrotitrēšanas platēs
|
Sagatavošanas soļi
|
Visas iedobes, izņemot TB
|
TB iedobes
|
Tukšās iedobes (karstas)
|
|
Komponentu tilpums minētajām reakcijas iedobēm un pievienošanas kārtība
|
Testa buferšķīdums istabas temperatūrā
|
50 µl
|
60 µl
|
90 µl
|
|
|
Nemarķēts E2, vājš saisteklis, nesaisteklis, šķīdinātājs un testējamās ķimikālijas*
|
10 µl
|
-
|
-
|
|
|
[3H]-17β-estradiols pietiekamā daudzumā, lai panāktu galīgo koncentrāciju 0,5 nM (t. i., 5 nM)
|
10 µl
|
10 µl
|
10 µl
|
|
|
Noteiktā hrERα koncentrācija (sk. 12.–13. punktu)
|
30 µl
|
30 µl
|
-
|
|
Kopējais tilpums katrā testa plates iedobē
|
100 µl
|
100 µl
|
100 µl
|
38.Saskaņā ar aprakstu 3. papildinājuma 21.–23. punktā (attiecas uz piesātinājuma–saistīšanās testu) kvantificē ar hrERα saistīto [3H]-17β-estradiolu, taču pirms tam, katrā iedobē pievienojot 100 μl ledusaukstas DCC suspensijas, no brīvā [3H]-17β-estradiola jābūt atdalītam ar hrERα saistītajam [3H]-17β-estradiolam.
39.Iedobes G10–12 un H10–12 (sk. 4. tabulas aili “Tukša iedobe (karsta)”) raksturo marķēta [3H]-estradiola dpm 10 μl. 10 μl alikvotu pārnes tieši scintilācijas šķīdumā.
Pieņemamības kritēriji
Piesātinājuma–saistīšanās tests
40.Ja tiek izmantotas pieaugošas [3H]-17β-estradiola koncentrācijas, specifiskās saistīšanās līknei ir jāsasniedz atslābuma periods, kas norāda uz hrERα piesātinājumu ar ligandu.
41.Pieņemamības diapazons attiecībā uz specifisko saistīšanos pie 0,5 nM [3H]-17β-estradiola koncentrācijas ir 30–50% no kopējās pievienotās radioaktivitātes vidējās vērtības, kas mērīta visās izpildes reizēs. Ir pieļaujamas atsevišķas nelielas novirzes no minētā diapazona, tomēr, ja izpildes reizēs pastāvīgi iegūst rezultātus ārpus minētā diapazona vai ja konkrētā izpildes reizē novirze ir ļoti būtiska, ir jāpielāgo proteīnu koncentrācija un piesātinājuma tests jāatkārto.
42.Datiem jābūt attēlojamiem lineāras Skačārda diagrammas veidā.
43.Nespecifiskā saistīšanās nedrīkst būt pārmērīga. Nespecifiskās saistīšanās vērtība parasti ir <35 % no kopējās saistīšanās. Tomēr minētā procentuālā attiecība dažkārt šo limitu var pārsniegt, ja testā tiek mērīts ļoti zems dpm pie zemākās radioaktīvi marķētā 17β-estradiola koncentrācijas.
Konkurējošās saistīšanās tests
44.Pie pieaugošām nemarķēta 17β-estradiola koncentrācijām [3H]-17β-estradiolu pakāpeniski pārvieto no receptora tādā veidā, kas līdzinās viena domēna konkurējošajai saistīšanai.
45.References estrogēna (t. i., 17β-estradiola) IC50 vērtībai jābūt aptuveni vienādai ar [3H]-17β-estradiola molāro koncentrāciju, kam pieskaitīta piesātinājuma–saistīšanās testā noteiktā diasociācijas konstante (Kd).
46.Visās testa izpildes reizēs kopējās specifiskās saistīšanās vērtībai pastāvīgi jābūt pieņemamības diapazonā (40 ± 10 %), pie nosacījuma, ka kopējās pievienotās radioaktivitātes vidējā mērītā koncentrācija katrā iedobē ir 0,5 nM. Ir pieļaujamas atsevišķas nelielas novirzes no minētā diapazona, tomēr, ja izpildes reizēs pastāvīgi iegūst rezultātus ārpus minētā diapazona vai ja konkrētā izpildes reizē novirze ir ļoti būtiska, ir jāpielāgo proteīnu koncentrācija.
47.Šķīdinātājs nedrīkst mainīt testa jutīgumu vai reproducējamību. Šķīdinātāja kontroles rezultātus (TB iedobes) salīdzina ar buferšķīduma kontroli, lai verificētu, ka izmantotais šķīdinātājs neietekmē testa sistēmu. Ja šķīdinātājs neietekmē testa gaitu, TB un buferšķīduma kontrolēm jābūt salīdzināmām.
48.Testējot ar koncentrācijām, kas nepārsniedz 10-3 M (OTES) vai 10-4 M (DBP), nesaisteklim nevajadzētu no hrERα pārvietot vairāk nekā 25 % [3H]-17β-estradiola.
49.Izmantojot CERI hrER saistīšanās testa validēšanas pētījuma datus (2. atsauces N pielikums), tika izstrādāti veiktspējas kritēriji attiecībā uz references estrogēnu un diviem vājiem saistekļiem (piem., noretinodrels, noretindrons). Ir sniegti 95 % ticamības intervāli vidējām vērtībām ± SN (n), kas tika iegūtas no visiem kontroles testiem, ko izpildīja četras laboratorijas, kuras piedalījās validēšanas pētījumā. 95 % ticamības intervālus aprēķināja references estrogēna un vāju saistekļu līknes pielāgošanas parametriem (t. i., augšējam un apakšējam punktam, Hilla virziena koeficientam un log IC50) un vāju saistekļu log10RBA attiecībā pret references estrogēnu. 1. tabulā sniegti līknes pielāgošanas parametru paredzamie diapazoni, kurus var izmantot kā veiktspējas kritērijus. Praksē IC50 diapazons var būt nedaudz atšķirīgs atkarībā no eksperimentāli iegūtā receptora preparāta Kd un testā izmantotās liganda koncentrācijas.
50.Testējamo ķimikāliju līknes pielāgošanas parametriem veiktspējas kritēriji izstrādāti netika, jo pastāv pārāk plašs esošu potenciāli testējamu ķimikāliju spektrs un potenciālās afinitātes un rezultātu mainīgums (piem., pilna līkne, daļēja līkne, neatbilstība līknei). Tomēr katrā testēšanas reizē un ar katru testējamo ķimikāliju iegūtos rezultātus būtu jāizvērtē speciālistam. Testā jāizmanto pietiekams testējamās ķimikālijas koncentrāciju diapazons, lai skaidri definētu konkurējošās saistīšanās līknes augšējo punktu (t. i., 90–100 % saistīšanās). Rezultātu mainībai starp katras testējamās ķimikālijas koncentrācijas replikātiem, kā arī starp trim neatkarīgajām izpildes reizēm jābūt saprātīgi pieļaujamās robežās un zinātniski pamatojamai. Izpildot kontroles testus attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju, mērījumiem būtu jātuvojas veiktspējas parametriem, kas paziņoti attiecībā uz šo CERI testu, un tiem jābūt saskanīgiem ar attiecīgās laboratorijas vēsturiskajiem kontroldatiem.
DATU ANALĪZE
Piesātinājuma–saistīšanās tests
51.Tiek mērīta gan kopējā, gan nespecifiskā saistīšanās. No šim vērtībām, nespecifisko saistīšanos atņemot no kopējās saistīšanās, tiek aprēķināta pieaugošu [3H]-17β-estradiola koncentrāciju specifiskā saistīšanās līdzsvara apstākļos. Grafikā, kurā specifisko saistīšanos attēlo attiecībā pret [3H]-17β-estradiola koncentrāciju, attiecībā uz maksimālo specifisko saistīšanos ir jāsasniedz atslābuma periods, kas norāda uz hrERα piesātinājumu ar [3H]-17β-estradiolu. Turklāt datu analīzē būtu jākonstatē [3H]-17β- estradiola saistīšanās ar vienu augstas afinitātes saistīšanās domēnu. Piesātinājuma–saistīšanās līknē attēlo nespecifisko, kopējo un specifisko saistīšanos. Šo datu turpmākai analīzei izmanto nelineārās regresijas analīzi (piem., BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995), un galīgos datus attēlo ar Skačārda diagrammu.
52.Analizējot datus, Bmax un Kd nosaka no kopējās saistīšanās datiem vien, izmantojot pieņēmumu, ka nespecifiskā saistīšanās ir lineāra, ja vien nav pamatota iemesla izmantot citu metodi. Turklāt, meklējot labāko atbilstību līknei, izmanto robustu regresiju, ja vien nav pamatota iemesla rīkoties citādi. Pārskatā norāda izvēlēto robustas regresijas metodi. Nosakot Bmax un Kd no piesātinājuma–saistīšanās datiem, vienmēr jāizmanto liganda noplicināšanās korekcija (piem., Swillens (1995) metode).
Konkurējošās saistīšanās tests
53.Konkurējošās saistīšanās līkni grafiski attēlo kā specifisko [3H]-17β-estradiola saistīšanos attiecībā pret konkurenta koncentrāciju (log10 vienībās). Testējamās ķimikālijas koncentrācija, kas inhibē 50 % [3H]17β-estradiola maksimālās specifiskās saistīšanās, ir IC50 vērtība.
54.Pozitīvo kontroļu (t. i., references estrogēna un vāja saistekļa) log (IC50) vērtību aplēses nosaka, izmantojot atbilstošu nelineāru līknes piemeklēšanas programmatūru, lai panāktu atbilstību Hilla vienādojumam ar četriem parametriem (piem., BioSoft; McPherson, 1985; Motulsky, 1995). Veicot pielāgošanu līknei, augšējo un apakšējo punktu, virziena koeficientu un log (IC50) parasti neierobežo. Meklējot labāko atbilstību līknei, izmanto robustu regresiju, ja vien nav pamatota iemesla rīkoties citādi. Liganda noplicināšanās korekciju neizmanto. Pēc sākotnējās analīzes katru saistīšanās līkni pārskata, lai nodrošinātu pienācīgu atbilstību paraugam. Vāja saistekļa relatīvo afinitāti (RBA) aprēķina kā procentuālu vērtību no vāja saistekļa log (IC50) attiecībā pret 17β-estradiola log (IC50). Ar pozitīvajām kontrolēm un nesaistekļu kontrolēm iegūtos rezultātus izvērtē, sekojot testa veikšanas norādēm 23. papildinājuma 44.–49. punktā.
55.Datus par visam testējamajām ķimikālijām būtu jāanalizē, izmantojot pakāpenisku pieeju, kas nodrošina datu pienācīgu analīzi un to, ka katra konkurējošās saistīšanās līkne tiek klasificēta pareizi. Pirms katras testa izpildes reizes testējamās ķimikālijas ieteicams sākotnēji analizēt standartizētā veidā, identiski tam, kā tiek analizēti references estrogēns un vāja saistekļa kontroles (sk. 3. papildinājuma 54.punktu). Pēc tam katrā testa veikšanas reizē tehniski pārskata, vai līkne atbilst parametriem, un vizuāli nosaka, cik precīzi dati atbilst ģenerētajai konkurējošās saistīšanās līknei. Ja šīs tehniskās pārbaudes laikā novēro, ka [3H]-17β-estradiola specifiskā saistīšanās atkarībā no koncentrācijas procentuāli samazinās, rezultātu mainība tehnisko replikātu starpā pie katras testējamās ķīmiskās koncentrācijas ir neliela un līknes atbilstība parametriem trīs testa veikšanas reizēs ir konsekventa, tas ir pietiekami uzticams rādītājs, ka tests un datu analīze ir veikti pareizi.
Datu interpretācija
56.Pie nosacījuma, ka ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par saistīgu ar hrERα, ja saistīšanās līkne ir pielāgojama un zemākais atbildreakcijas līknes punkts datu diapazonā ir mazāks par 50 % (1. attēls).
57.Pie nosacījuma, ka ir izpildīti visi pieņemamības kritēriji, testējamo ķimikāliju uzskata par nesaistīgu ar hrERα, ja:
-saistīšanās līkne ir pielāgojama un pielāgotās atbildreakcijas līknes zemākais punkts datu diapazonā ir lielāks par 75 % vai
-saistīšanās līkni pielāgot nevar un visu koncentrāciju grupu vidējā zemākā nenoapaļotā procentuālā saistīšanās pēc datiem pārsniedz 75 %.
58.Testējamās ķimikālijas klasifikāciju uzskata par neskaidru, ja nav izpildīts neviens no iepriekšminētajiem nosacījumiem (t. i., zemākais pielāgotās atbildreakcijas līknes punkts ir robežās no 76 – 51 %).
7. tabula. Kritēriji, pēc kuriem klasificē testējamās ķimikālijas, izmantojot konkurējošās saistīšanās līkni.
|
Klasifikācija
|
Kritēriji
|
|
Saisteklisa
|
Saistīšanās līkni var pielāgot.
·Zemākais atbildreakcijas līknes punkts datu diapazonā ir mazāks par 50 %.
|
|
Nesaisteklisb
|
Ja saistīšanās līkni var pielāgot,
·pielāgotās atbildreakcijas līknes zemākais punkts datu diapazonā ir virs 75 %.
Ja saistīšanās līkni nevar pielāgot,
·visu koncentrāciju grupu vidējā zemākā nenoapaļotā procentuālā saistīšanās pēc datiem pārsniedz 75 %.
|
|
Neskaidrac
|
Jebkura testa izpildes reize, kas neuzrāda testējamās ķimikālijas saistīgumu vai nesaistīgumu
(piem., pielāgotās atbildreakcijas līknes zemākais punkts ir robežās no 76–51 %).
|
1. attēls. Piemēri, kā klasificē testējamās ķimikālijas, izmantojot konkurējošās saistīšanās līkni.
59.Laboratorijā attiecībā uz katru testējamo ķimikāliju testu veic vairākas izpildes reizes, un katrai izpildes reizei atkarībā no rezultāta piešķir ciparisku vērtību, no kuras pēc tam aprēķina vidējo vērtību atbilstoši 8. tabulā sniegtajam paraugam. Vidējos rezultātus, kas apkopoti konkrētajā laboratorijā, salīdzina ar gaidīto katras testējamās ķimikālijas klasifikāciju.
8. tabula. Metode, pēc kuras klasificē testējamo ķimikāliju, izmantojot vairākas testēšanas reizes vienā laboratorijā.
|
Katrai izpildes reizei piešķir ciparisku vērtību:
|
|
Klasifikācija
|
Cipariska vērtība
|
|
Saisteklis
|
2
|
|
Neskaidrs
|
1
|
|
Nesaisteklis
|
0
|
|
Izpildes reizēs iegūto ciparisko vērtību vidējās vērtības klasificēšana:
|
|
Klasifikācija
|
Cipariska vērtība
|
|
Saisteklis
|
Vidēji ≥ 1,5
|
|
Neskaidrs
|
0,5 ≤ Vidējā vērtība < 1,5
|
|
Nesaisteklis
|
Vidēji < 0,5
|
TESTĒŠANAS PĀRSKATS
60.Sk. šīs testēšanas metodes sadaļas “HrER SAISTĪŠANĀS TESTA KOMPONENTI” 24. punktu.
3.1. papildinājums
Terminu saraksts
[3H]E2: 17β-estradiols, kas radioaktīvi marķēts ar tritiju.
DCC: ar dekstrānu pārklāta ogle.
E2: nemarķēts 17β-estradiols (inerts).
Testa buferšķīdums: 10 mM tris-HCl (pH 7,4), kas satur 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 % glicerīna, 0,2 mM leupeptīna, 1 mM ditiotreitola un 10 mg/ml liellopu seruma albumīna.
hrERα: cilvēka rekombinantais estrogēnreceptors alfa (liganda saistīšanās domēns).
Replikāts: viena no vairākām vienāda satura un vienādas koncentrācijas iedobēm, kuras paralēli testē vienā testēšanas reizē. Pēc šī protokola katru testējamās ķimikālijas koncentrāciju testē ar trim replikātiem (triplikātiem); proti, pie katras testējamās ķimikālijas koncentrācijas ir trīs replikāti, kurus testē vienlaicīgi.
Izpildes reize: viss paralēli testēto miktotitrēšanas plates testa iedobju kopums, kas nodrošina visu informāciju, kura vajadzīga, lai raksturotu testējamās ķimikālijas saistīšanos ar hrERα, (t. i., kopējais testa iedobei pievienotais [3H]-17β-estradiols, maksimālā [3H]-17β-estradiola saistīšanās ar hrERα, nespecifiskā saistīšanās un kopējā saistīšanās pie dažādām testējamās ķimikālijas koncentrācijām). Izpildes reize var nozīmēt pat tikai vienas testēšanas iedobes (t. i., replikāta) testēšanu pie katras koncentrācijas, tomēr šajā konkrētajā gadījumā protokols pieprasa testēt ar triplikātiem, un viena izpildes reize nozīmē trīs testēšanas iedobes pie katras koncentrācijas. Papildus minētajam šis protokols prasa veikt trīs neatkarīgas (proti, neveicot paralēli) izpildes reizes ar katru ķimikāliju.
3.2. papildinājums
Konkurējošās saistīšanās testa iedobju izkārtojums
|
Plate
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tips
|
Iedobes kods
|
Koncentrācijas kods
|
Konkurenta sākotnējā koncentrācija (M)
|
hrER izejšķīdums (μl)
|
Buferšķīduma tilpums (μl)
|
Iezīmētā elementa (karsta E2) tilpums (μL)
|
Tilpums atšķaidījuma platē (μL)
|
Beigu tilpums (μl)
|
Konkurenta beigu koncentrācija (M)
|
|
S
|
A1
|
1
|
tukša
|
BK
|
BK1
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
|
S
|
A2
|
2
|
tukša
|
BK
|
BK2
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
|
S
|
A3
|
3
|
tukša
|
BK
|
BK3
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
—
|
|
S
|
B1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S1
|
1,00E-10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-11
|
|
S
|
B2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S1
|
1,00E-10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-11
|
|
S
|
B3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S1
|
1,00E-10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-11
|
|
S
|
C1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S2
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
C2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S2
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
C3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S2
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
D1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S3
|
3,16E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-10
|
|
S
|
D2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S3
|
3,16E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-10
|
|
S
|
D3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S3
|
3,16E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-10
|
|
S
|
E1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S4
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
E2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S4
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
E3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S4
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
F1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S5
|
3,16E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-09
|
|
S
|
F2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S5
|
3,16E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-09
|
|
S
|
F3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S5
|
3,16E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-09
|
|
S
|
G1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S6
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
G2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S6
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
G3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S6
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
H1
|
1
|
auksts E2
|
S
|
S7
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
H2
|
2
|
auksts E2
|
S
|
S7
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
H3
|
3
|
auksts E2
|
S
|
S7
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
A4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP1
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
A5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP1
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
A6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP1
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
B4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP2
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
B5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP2
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
B6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP2
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
C4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP3
|
3,16E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-08
|
|
S
|
C5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP3
|
3,16E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-08
|
|
S
|
C6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP3
|
3,16E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-08
|
|
S
|
D4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
D5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
D6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
E4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP5
|
3,16E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-07
|
|
S
|
E5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP5
|
3,16E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-07
|
|
S
|
E6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP5
|
3,16E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-07
|
|
S
|
F4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
F5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
F6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
G4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP7
|
3,16E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-06
|
|
S
|
G5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP7
|
3,16E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-06
|
|
S
|
G6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP7
|
3,16E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-06
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Konkurējošās saistīšanās testa iedobju izkārtojums
|
|
Plate
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tips
|
Iedobes kods
|
Koncentrācijas kods
|
Konkurenta sākotnējā koncentrācija (M)
|
hrER izejšķīdums (μl)
|
Buferšķīduma tilpums (μl)
|
Iezīmētā elementa (karsta E2) tilpums (μL)
|
Tilpums atšķaidījuma platē (μL)
|
Beigu tilpums (μl)
|
Konkurenta beigu koncentrācija (M)
|
|
S
|
H4
|
1
|
noretinodrels
|
NE
|
WP8
|
3,16E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-05
|
|
S
|
H5
|
2
|
noretinodrels
|
NE
|
WP8
|
3,16E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-05
|
|
S
|
H6
|
3
|
noretinodrels
|
NE
|
WP8
|
3,16E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
3,2E-05
|
|
S
|
A7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
A8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
A9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
S
|
B7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
B8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
B9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
S
|
C7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
C8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
C9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
S
|
D7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
D8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
D9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
S
|
E7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
E8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
E9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
F7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
S
|
F8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
S
|
F9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
S
|
G7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
S
|
G8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
S
|
G9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
S
|
H7
|
1
|
OTES
|
N
|
OTES8DBP7
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
S
|
H8
|
2
|
OTES
|
N
|
OTES88
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
S
|
H9
|
3
|
OTES
|
N
|
OTES8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
S
|
A10
|
1
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB1
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
A11
|
2
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB2
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
A12
|
3
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB3
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
B10
|
4
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB4
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
B11
|
5
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB5
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
B12
|
6
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB6
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
C10
|
1
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S1
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
C11
|
2
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S2
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
C12
|
3
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S3
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
D10
|
4
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S4
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
D11
|
5
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
D12
|
6
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
S
|
E10
|
1
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC1
|
-
|
-
|
100
|
-
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
E11
|
2
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC2
|
-
|
-
|
100
|
-
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
E12
|
3
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC3
|
-
|
-
|
100
|
-
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
F10
|
4
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC4
|
-
|
-
|
100
|
-
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
F11
|
5
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC5
|
-
|
-
|
100
|
-
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
F12
|
6
|
buferšķīduma kontrole
|
BC
|
BC6
|
-
|
-
|
100
|
-
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
G10*
|
1
|
tukša iedobe (karsta)
|
karsta
|
H1
|
-
|
90
|
-
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
G11*
|
2
|
tukša iedobe (karsta)
|
karsta
|
H2
|
-
|
90
|
-
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
G12*
|
3
|
tukša iedobe (karsta)
|
karsta
|
H3
|
-
|
90
|
-
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
H10*
|
4
|
tukša iedobe (karsta)
|
karsta
|
H4
|
-
|
90
|
-
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
H11*
|
5
|
tukša iedobe (karsta)
|
karsta
|
H5
|
-
|
90
|
-
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
S
|
H12
|
6
|
tukša iedobe (karsta)
|
karsta
|
H6
|
-
|
90
|
-
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
Konkurējošās saistīšanās testa iedobju izkārtojums
|
|
Plate
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tips
|
Iedobes kods
|
Koncentrācijas kods
|
Konkurenta sākotnējā koncentrācija (M)
|
hrER izejšķīdums (μl)
|
Buferšķīduma tilpums (μl)
|
Iezīmētā elementa (karsta E2) tilpums (μL)
|
Tilpums atšķaidījuma platē (μL)
|
Beigu tilpums (μl)
|
Konkurenta beigu koncentrācija (M)
|
|
P1
|
A1
|
1
|
nezināms 1
|
U1
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A2
|
2
|
nezināms 1
|
U1
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A3
|
3
|
nezināms 1
|
U1
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
B1
|
1
|
nezināms 1
|
U1
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B2
|
2
|
nezināms 1
|
U1
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B3
|
3
|
nezināms 1
|
U1
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C1
|
1
|
nezināms 1
|
U1
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C2
|
2
|
nezināms 1
|
U1
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C3
|
3
|
nezināms 1
|
U1
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
D1
|
1
|
nezināms 1
|
U1
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D2
|
2
|
nezināms 1
|
U1
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D3
|
3
|
nezināms 1
|
U1
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E1
|
1
|
nezināms 1
|
U1
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E2
|
2
|
nezināms 1
|
U1
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E3
|
3
|
nezināms 1
|
U1
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F1
|
1
|
nezināms 1
|
U1
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F2
|
2
|
nezināms 1
|
U1
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F3
|
3
|
nezināms 1
|
U1
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
G1
|
1
|
nezināms 1
|
U1
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G2
|
2
|
nezināms 1
|
U1
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G3
|
3
|
nezināms 1
|
U1
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
H1
|
1
|
nezināms 1
|
U1
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H2
|
2
|
nezināms 1
|
U1
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H3
|
3
|
nezināms 1
|
U1
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
A4
|
1
|
nezināms 2
|
U2
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A5
|
2
|
nezināms 2
|
U2
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A6
|
3
|
nezināms 2
|
U2
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
B4
|
1
|
nezināms 2
|
U2
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B5
|
2
|
nezināms 2
|
U2
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B6
|
3
|
nezināms 2
|
U2
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C4
|
1
|
nezināms 2
|
U2
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C5
|
2
|
nezināms 2
|
U2
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C6
|
3
|
nezināms 2
|
U2
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
D4
|
1
|
nezināms 2
|
U2
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D5
|
2
|
nezināms 2
|
U2
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D6
|
3
|
nezināms 2
|
U2
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E4
|
1
|
nezināms 2
|
U2
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E5
|
2
|
nezināms 2
|
U2
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E6
|
3
|
nezināms 2
|
U2
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F4
|
1
|
nezināms 2
|
U2
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F5
|
2
|
nezināms 2
|
U2
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F6
|
3
|
nezināms 2
|
U2
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
G4
|
1
|
nezināms 2
|
U2
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G5
|
2
|
nezināms 2
|
U2
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G6
|
3
|
nezināms 2
|
U2
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
H4
|
1
|
nezināms 2
|
U2
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H5
|
2
|
nezināms 2
|
U2
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H6
|
3
|
nezināms 2
|
U2
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
Konkurējošās saistīšanās testa iedobju izkārtojums
|
|
Plate
|
Pozīcija
|
Replikāts
|
Iedobes tips
|
Iedobes kods
|
Koncentrācijas kods
|
Konkurenta sākotnējā koncentrācija (M)
|
hrER izejšķīdums (μl)
|
Buferšķīduma tilpums (μl)
|
Iezīmētā elementa (karsta E2) tilpums (μL)
|
Tilpums atšķaidījuma platē (μL)
|
Beigu tilpums (μl)
|
Konkurenta beigu koncentrācija (M)
|
|
P1
|
A7
|
1
|
nezināms 3
|
U3
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A8
|
2
|
nezināms 3
|
U3
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
A9
|
3
|
nezināms 3
|
U3
|
1
|
1,00E-09
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-10
|
|
P1
|
B7
|
1
|
nezināms 3
|
U3
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B8
|
2
|
nezināms 3
|
U3
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
B9
|
3
|
nezināms 3
|
U3
|
2
|
1,00E-08
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-09
|
|
P1
|
C7
|
1
|
nezināms 3
|
U3
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C8
|
2
|
nezināms 3
|
U3
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
C9
|
3
|
nezināms 3
|
U3
|
3
|
1,00E-07
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-08
|
|
P1
|
D7
|
1
|
nezināms 3
|
U3
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D8
|
2
|
nezināms 3
|
U3
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
D9
|
3
|
nezināms 3
|
U3
|
4
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-07
|
|
P1
|
E7
|
1
|
nezināms 3
|
U3
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E8
|
2
|
nezināms 3
|
U3
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E9
|
3
|
nezināms 3
|
U3
|
5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F7
|
1
|
nezināms 3
|
U3
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F8
|
2
|
nezināms 3
|
U3
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
F9
|
3
|
nezināms 3
|
U3
|
6
|
1,00E-04
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-05
|
|
P1
|
G7
|
1
|
nezināms 3
|
U3
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G8
|
2
|
nezināms 3
|
U3
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
G9
|
3
|
nezināms 3
|
U3
|
7
|
1,00E-03
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-04
|
|
P1
|
H7
|
1
|
nezināms 3
|
U3
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H8
|
2
|
nezināms 3
|
U3
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
H9
|
3
|
nezināms 3
|
U3
|
8
|
1,00E-02
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-03
|
|
P1
|
A10
|
1
|
E2 kontrole (max)
|
S
|
E2max1
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-07
|
|
P1
|
A11
|
2
|
E2 kontrole (max)
|
S
|
E2max2
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-07
|
|
P1
|
A12
|
3
|
E2 kontrole (max)
|
S
|
E2max3
|
1,00E-06
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-07
|
|
P1
|
B10
|
1
|
E2 kontrole (IC50)
|
S
|
E2IC501
|
E2IC50x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
E2IC50
|
|
P1
|
B11
|
2
|
E2 kontrole (IC50)
|
S
|
E2IC502
|
E2IC50x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
E2IC50
|
|
P1
|
B12
|
3
|
E2 kontrole (IC50)
|
S
|
E2IC503
|
E2IC50x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
E2IC50
|
|
P1
|
C10
|
1
|
NE kontrole (max)
|
S
|
Nemax1
|
1,00E-3,5
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-4,5
|
|
P1
|
C11
|
2
|
NE kontrole (max)
|
S
|
Nemax2
|
1,00E-3,5
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-4,5
|
|
P1
|
C12
|
3
|
NE kontrole (max)
|
S
|
Nemax3
|
1,00E-3,5
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,00E-4,5
|
|
P1
|
D10
|
1
|
NE kontrole (IC50)
|
S
|
NEIC501
|
NEIC50 x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
NEIC50
|
|
P1
|
D11
|
2
|
NE kontrole (IC50)
|
S
|
NEIC502
|
NEIC50 x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
NEIC50
|
|
P1
|
D12
|
3
|
NE kontrole (IC50)
|
S
|
NEIC503
|
NEIC50 x10
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
NEIC50
|
|
P1
|
E10
|
1
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S1
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E11
|
2
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S2
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
E12
|
3
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S3
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F10
|
4
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S4
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F11
|
5
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S5
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
F12
|
6
|
auksts E2 (augsta koncentrācija)
|
NSB
|
S6
|
1,00E-05
|
30
|
50
|
10
|
10
|
100
|
1,0E-06
|
|
P1
|
G10
|
1
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB1
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
G11
|
2
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB2
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
G12
|
3
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB3
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
H10
|
4
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB4
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
H11
|
5
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB5
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
|
P1
|
H12
|
6
|
kopējā saistīšanās
|
TB
|
TB6
|
-
|
30
|
60
|
10
|
-
|
100
|
-
|
4. papildinājums
ApsvĒrumi, kas jĀŅem vĒrĀ, analizĒjot hrER konkurĒjoŠĀs saistĪŠanĀs testa datus
1.HrERα konkurējošās saistīšanās tests mēra vienas konkrētas [3H]-17β- estradiola koncentrācijas saistīšanos arvien pieaugošu testējamās ķimikālijas koncentrāciju klātbūtnē. Konkurējošās saistīšanās līkni grafiski attēlo kā specifisko [3H]-17β-estradiola saistīšanos attiecībā pret konkurenta koncentrāciju (log10 vienībās). Testējamās ķimikālijas koncentrācija, kas inhibē 50 % [3H]17β-estradiola maksimālās specifiskās saistīšanās, ir IC50 vērtība.
References estrogēna un vāja saistekļa ģenerēto datu analīze (1)
2.Kontroles testēšanas reizēs iegūtos datus transformē turpmākai analizēšanai (t. i., procentuālā [3H]-17β-estradiola specifiskā saistīšanās un kontroles ķimikālijas log koncentrācija). Pozitīvo kontroļu (t. i., references estrogēna un vāja saistekļa) log (IC50) vērtību aplēses nosaka, izmantojot atbilstošu nelineāru līknes piemeklēšanas programmatūru, lai panāktu atbilstību Hilla vienādojumam ar četriem parametriem, piem., BioSoft; GraphPad Prism) (2). Veicot pielāgošanu līknei, augšējo un apakšējo punktu, virziena koeficientu un log (IC50) ierobežot parasti nav vajadzīgs. Meklējot labāko atbilstību līknei, izmanto robustu regresiju, ja vien nav pamatota iemesla rīkoties citādi. Pārskatā norāda izvēlēto robustas regresijas metodi. FW vai CERI hrER testiem liganda noplicināšanās korekcija nav vajadzīga, bet attiecīgā gadījumā var apsvērt tās lietošanu. Pēc sākotnējās analīzes katru saistīšanās līkni pārskata, lai nodrošinātu pienācīgu atbilstību paraugam. Vāja saistekļa relatīvo afinitāti (RBA) var aprēķināt kā procentuālu vērtību no vāja saistekļa log (IC50) attiecībā pret 17β-estradiola log (IC50). Ar pozitīvajām kontrolēm un nesaistīgām kontrolēm iegūtos rezultātus izvērtē, izmantojot testa veiktspējas un pieņemamības kritērijus, kas aprakstīti šajā testa metodē (20. punkts), 2.papildinājumā (FW testa 41.–51. punkts) un 3. papildinājumā (CERI tests, 41.–51. punkts). 1. attēlā sniegti references estrogēna un vāja saistekļa piemēri, testu veicot trīs reizes.
1. attēls. Konkurējošās saistīšanās līknes piemēri ar references estrogēnu un vāja saistekļa kontroli.
Testējamo ķimikāliju ģenerēto datu analīze
3.Datus par visam testējamajām ķimikālijām būtu jāanalizē, izmantojot pakāpenisku pieeju, kas nodrošina datu pienācīgu analīzi un to, ka katra konkurējošās saistīšanās līkne tiek klasificēta pareizi. Pirms katras testa veikšanas reizes testējamās ķimikālijas datus sākotnēji analizē standartizētā veidā, identiski tam, kā tiek analizēti references estrogēns un vāja saistekļa kontroles. Pēc tam katrā testa veikšanas reizē tehniski pārskata, vai līkne atbilst parametriem, un vizuāli nosaka, cik precīzi dati atbilst ģenerētajai konkurējošās saistīšanās līknei. Ja šīs tehniskās pārbaudes laikā novēro, ka [3H]-17β-estradiola specifiskā saistīšanās atkarībā no koncentrācijas procentuāli samazinās, rezultātu mainība tehnisko replikātu starpā pie katras ķīmiskās koncentrācijas ir neliela un līknes atbilstība parametriem trīs testa veikšanas reizēs ir konsekventa, tas ir pietiekami uzticams rādītājs, ka tests un datu analīze ir veikti pareizi. Katrā testēšanas reizē attiecībā uz testējamo ķimikāliju iegūtos rezultātus ir jāizvērtē speciālistam, un datiem, pēc kuriem katru testējamo ķimikāliju klasificē kā saistīgu vai nesaistīgu, jābūt zinātniski pamatojamiem.
4.Dažkārt var būt situācijas, kad hrER saistīšanās datu pienācīgas analizēšanas un interpretēšanas vajadzībām datiem ir jāveic zināmas korekcijas. Agrākos pētījumos ir novēroti gadījumi, kad receptora konkurējošās saistīšanās datu analīzi un interpretāciju apgrūtina procentuālās specifiskās saistīšanās pieaugums, ja ķimikālijas testē augstākā koncentrācijā (2. attēls). Šī problēma ir plaši zināma dažādu receptora konkurējošās saistīšanās testu protokolu lietotājiem (3). Šādos gadījumos no koncentrācijas atkarīgā atbildreakcija tiek novērota pie zemākām koncentrācijām, bet, kad testējamās ķimikālijas koncentrācija tuvojas šķīdības robežai, [3H]17β-estradiola pārvietošana vairs nesamazinās. Šādos gadījumos pie augstākajām koncentrācijām iegūtie dati norāda uz to, ka ir sasniegta testa bioloģiskā robeža. Piemēram, šis fenomens daudzkārt tiek saistīts ar ķīmisko nešķīdību un izgulsnēšanos pie augstākām koncentrācijām vai arī var atspoguļot to, ka pie visaugstākajām ķīmiskajām koncentrācijām ir pārsniegta ar dekstrānu pārklātas ogles spēja atdalīšanās procedūras laikā uztvert nesaistītu radioaktīvi marķētu ligandu. Ja, veicot konkurējošās saistīšanās datu pielāgošanu divvirzienu līknei, šādus datu punktus saglabā, tas dažkārt var novest pie nepareizas ER saistīšanās potenciāla klasificēšanas attiecībā uz testējamo ķimikāliju (2. attēls). Lai no tā izvairītos, FW un CERI hrER saistīšanās testu protokoli ietver izvēli no analīzes izslēgt tādus datu punktus, kuros ar replikātiem iegūtā [3H]17β-estradiola specifiskās saistīšanās procentuālā vidējā vērtība par 10 % vai vairāk pārsniedz ar kādu zemāku koncentrāciju novēroto vidējo vērtību (to dēvē par 10 % kritēriju). Šo kritēriju attiecībā uz konkrēto līkni var izmantot tikai vienreiz, un, lai līkni varētu pareizi klasificēt, jāpaliek vēl datiem vismaz par sešām koncentrācijām.
2. attēls. Piemēri: konkurējošās saistīšanās līknes, izmantojot 10 % kritēriju un bez tā.
5.To, vai ir atbilstoši izmantot 10 % kritēriju, lai labotu šīs līknes, ir rūpīgi jāizsver, un to izmanto vien gadījumos, kad dati stipri liecina par hrER saistekli. Kad FW hrER saistīšanās testa validācijas pētījuma laikā veica eksperimentus, tika novērots, ka dažkārt 10 % kritērija piemērošana izraisa neplānotas un neparedzamas sekas. Attiecībā uz ķimikālijām, kas nemijiedarbojās ar receptoru r (t. i., faktiskie nesaistekļi), pie aptuveni 100 % radioaktīvi marķēto ligandu saistīšanās bieži bija vērojama mainība, kas visā testēto koncentrāciju diapazonā pārsniedz 10 %. Ja viszemākā vērtība tika konstatēta pie zemas koncentrācijas, datus par visām augstākajām koncentrācijām potenciāli varētu izņemt no analizējamiem datiem, izmantojot 10 % kritēriju, lai gan šīs koncentrācijas var izrādīties noderīgas, nosakot, vai attiecīgā ķimikālija ir nesaisteklis. 3. attēlā sniegtie piemēri ilustrē gadījumus, kad 10 % kritērija izmantošana nav piemērota.
3. attēls. Piemēri: konkurējošās saistīšanās dati gadījumos, kad nepiemēro 10 % kritēriju.
Atsauces
(1)OECD (2015). Integrated Summary Report: Validation of Two Binding Assays Using Human Recombinant Estrogen Receptor Alpha (hrERα), Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 226), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
(2)Motulsky H. and Christopoulos A. (2003). The law of mass action, In Fitting Models to Biological Data Using Linear and Non-linear Regression. GraphPad Software Inc., San Diego, CA, pp 187-191. Www.graphpad.com/manuals/Prism4/RegressionBook.pdf
(3)Laws SC, Yavanhxay S, Cooper RL, Eldridge JC. (2006). Nature of the Binding Interaction for 50 Structurally Diverse Chemicals with Rat Estrogen Receptors. Toxicological Sci. 94(1):46-56.
