1990R2676 — IT — 13.08.2005 — 011.001

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Trattandosi di un semplice strumento di documentazione, esso non impegna la responsabilità delle istituzioni

►B	REGOLAMENTO (CEE) N. 2676/90 DELLA COMMISSIONE del 17 settembre 1990 che determina i metodi d'analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino (GU L 272, 3.10.1990, p.1)

Modificato da:

		Gazzetta ufficiale
		No	page	date
►M1	REGOLAMENTO (CEE) N. 2348/91 DELLA COMMISSIONE del 29 luglio 1991	L 214	39	2.8.1991
M3	REGOLAMENTO (CEE) N. 2645/92 DELLA COMMISSIONE dell'11 settembre 1992	L 266	10	12.9.1992
M4	REGOLAMENTO (CE) N. 60/95 DELLA COMMISSIONE del 16 gennaio 1995	L 11	19	17.1.1995
►M5	REGOLAMENTO (CE) N. 69/96 DELLA COMMISSIONE del 18 gennaio 1996	L 14	13	19.1.1996
►M6	REGOLAMENTO (CE) N. 822/97 DELLA COMMISSIONE del 6 maggio 1997	L 117	10	7.5.1997
►M7	REGOLAMENTO (CE) N. 761/1999 DELLA COMMISSIONE del 12 aprile 1999	L 99	4	14.4.1999
►M8	REGOLAMENTO (CE) N. 1622/2000 DELLA COMMISSIONE del 24 luglio 2000	L 194	1	31.7.2000
►M10	REGOLAMENTO (CE) N. 440/2003 DELLA COMMISSIONE del 10 marzo 2003	L 66	15	11.3.2003
►M11	REGOLAMENTO (CE) N. 128/2004 DELLA COMMISSIONE del 23 gennaio 2004	L 19	3	27.1.2004
►M12	REGOLAMENTO (CE) N. 355/2005 DELLA COMMISSIONE del 28 febbraio 2005	L 56	3	2.3.2005
►M13	REGOLAMENTO (CE) N. 1293/2005 DELLA COMMISSIONE del 5 agosto 2005	L 205	12	6.8.2005

Rettificato da:

C1	Rettifica, GU L 311, 28.10.1992, pag. 40  (2676/90)

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▼B

REGOLAMENTO (CEE) N. 2676/90 DELLA COMMISSIONE

del 17 settembre 1990

che determina i metodi d'analisi comunitari da utilizzare nel settore del vino

Articolo 1

1.  I metodi d'analisi comunitari applicabili nel settore del vino che consentono, nelle transazioni commerciali e nelle operazioni di controllo:

sono quelli riportati nell'allegato del presente regolamento.

2.  Per le sostanze per le quali sono stati fissati metodi di riferimento e metodi usuali, prevalgono i risultati ottenuti applicando i metodi di riferimento.

Articolo 2

Ai fini dell'applicazione del presente regolamento:

Per «singolo risultato» si intende il valore ottenuto applicando una volta e completamente il metodo di analisi normalizzato su un solo campione.

In assenza di indicazioni la probabilità è del 95 %.

Articolo 3

1.  Sotto la responsabilità del direttore del laboratorio, i metodi di analisi automatizzati sono ammessi a condizione che la ripetibilità e la riproducibilità dei risultati siano almeno equivalenti a quelle dei risultati ottenuti con i metodi di analisi di cui all'allegato.

In caso di controversie, i metodi automatizzati non possono prevalere su quelli riportati in allegato.

▼M12 —————

▼B

Articolo 4

Quando si fa riferimento all'acqua per le soluzioni, le diluizioni o i lavaggi, si intende sempre acqua distillata o acqua demineralizzata di purezza almeno equivalente. Tutti i prodotti chimici devono essere di purezza analitica, salvo specificazioni diverse.

Articolo 5

Il regolamento (CEE) n. 1108/82 è abrogato.

Tuttavia l'articolo 1, paragrafo 4 del regolamento precitato resta applicabile fino al 31 dicembre 1990.

Articolo 6

Il presente regolamento entra in vigore il giorno della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

Esso è applicabile a decorrere dal 1° ottobre 1990.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

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ALLEGATO

1.   MASSA VOLUMICA A 20 °C E DENSITÀ RELATIVA A 20 °C

1.   DEFINIZIONI

La massa volumica è il rapporto fra la massa di un certo volume di vino o di mosto a 20 °C e il volume stesso. Si esprime in grammi per millilitro ed il suo simbolo è ρ 20 °C.

La densità relativa a 20 °C o densità 20 °C/20 °C è il rapporto, espresso in numeri decimali, fra la massa di un certo volume di vino o di mosto a 20 °C e la massa dello stesso volume di acqua alla stessa temperatura.

Il suo simbolo è

2.   PRINCIPIO DEI METODI

La massa volumica e la densità relativa a 20 °C vengono determinati sul campione di analisi:

Osservazione:

Per determinazioni molto precise, la massa volumica deve essere corretta dell'azione del biossido di zolfo:

ρ 20 °C = ρ′ 20 °C – 0,0006 · S

ρ 20 °C

=

massa volumica corretta

ρ′ 20 °C

=

massa volumica osservata

S

=

biossido di zolfo totale in g/l

3.   TRATTAMENTO PRELIMINARE DEL CAMPIONE

Se il vino o il mosto contengono quantità notevoli di biossido di carbonio, eliminarne la maggior parte agitando 250 ml di campione in un pallone da 1 000 ml o filtrando sotto vuoto su 2 g di cotone collocato in un'allunga.

4.   METODO DI RIFERIMENTO

4.1.   Apparecchiatura

Materiale d'uso comune in laboratorio, in particolare:

4.1.1.

Picnometro ( 5 ), in vetro pyrex da circa 100 ml provvisto di un termometro mobile con raccordo smerigliato, graduato in decimi di grado da 10 °C a 30 °C. Tale termometro deve essere controllato (fig. 1). Fig. 1 Picnometro e relativo pallone tara Detto picnometro porta un tubo laterale di 25 mm di lunghezza e di 1 mm al massimo di diametro interno, terminante con una parte conica smerigliata. Questo tubo laterale può essere chiuso da un «tappo ricevitore» costituito da un tubo conico smerigliato terminante con una parte affilata. Questo tappo serve da camera di dilatazione. Le due smerigliature dell'apparecchiatura devono essere realizzate con la massima cura.

4.1.2.

Pallone tara avente lo stesso volume esterno del picnometro (a meno di circa 1 ml) e di massa uguale alla massa del picnometro pieno di un liquido di densità 1,01 (soluzione al 2 % m/v di cloruro di sodio). Involucro coibentato che si adatta perfettamente al corpo del picnometro.

4.1.3.

Bilancia a due piatti con portata di almeno 300 g e sensibilità di 0,1 mg, oppure bilancia monopiatto con portata di almeno 200 g e sensibilità di 0,1 mg.

4.2.   Taratura del picnometro

La taratura del picnometro comporta la determinazione delle seguenti caratteristiche:

4.2.1.   Utilizzazione di una bilancia a due piatti

Una volta collocato il pallone tara sul piatto sinistro della bilancia ed il picnometro pulito ed asciutto munito del relativo «tappo ricevitore» sul piatto destro, raggiungere l'equilibrio ponendo accanto al picnometro i pesi necessari: p grammi.

Riempire con cura il picnometro con acqua distillata a temperatura ambiente ed immergere il termometro; asciugare con cura il picnometro e collocarlo nell'involucro coibentato; agitare capovolgendo finché la temperatura letta al termometro sia costante. Portare il livello esattamente al bordo superiore del tubo laterale. Asciugare questo tubo ed applicare il «tappo ricevitore»; leggere la temperatura t °C con accuratezza ed effettuare l'eventuale correzione della scala del termometro. Pesare il picnometro pieno d'acqua: sia p′ la massa in grammi che realizza l'equilibrio.

Calcoli ( 6 )

Tara del picnometro vuoto:

Tara a vuoto = p + m

m

=

massa d'aria contenuta nel picnometro

m

=

0,0012 (p − p′)

Volume a 20 °C:

V20 °C = (p + m − p′) · Ft

Ft

=

fattore ricavato dalla tabella I per la temperatura t °C

V20 °C deve essere noto con l'approssimazione di ± 0,001 ml

Massa in acqua a 20 °C:

M20 °C = V20 °C · 0,998203

0,998203

=

massa volumica dell'acqua a 20 °C.

4.2.2.   Utilizzazione di una bilancia monopiatto

Determinare:

Calcoli ( 7 ):

Tara del picnometro vuoto:

Tara a vuoto: P − m

m

=

massa d'aria contenuta nel picnometro

m

=

0,0012 (P1 − P)

Volume a 20 °C

V20 °C = [P1 − (P − m)] · Ft

Ft

=

fattore ricavato nella tabella I in corrispondenza alla temperatura t °C

Il volume a 20 °C deve essere noto con l'approssimazione di ± 0,001 ml.

Massa dell'acqua a 20 °C.

M20 °C = V20 °C · 0,998203

0,998203

=

massa volumica dell'acqua a 20 °C.

4.3.   Modo di operare ( 8 )

4.3.1.   Utilizzazione di una bilancia a due piatti

Pesare il picnometro riempito con il campione preparato per l'analisi (3) secondo le indicazioni descritte al punto 4.2.1. Sia p″ la massa in grammi che realizza l'equilibrio a t °C.

Massa del liquido contenuto nel picnometro = p + m − p″.

Massa volumica apparente a t °C:

Calcolare la massa volumica a 20 °C con l'aiuto di una delle tabelle di correzione riportate di seguito, in funzione della natura del liquido studiato: vino secco (tabella II), mosto naturale o concentrato (tabella III), vino dolce (tabella IV).

Si esprime la densità 20 °C/20 °C del vino dividendo la massa volumica a 20 °C per 0,998203.

4.3.2.   Utilizzazione di una bilancia monopiatto (8) 

Pesare il pallone tara, sia T1 la sua massa.

Calcolare dT = T1 − T0.

Massa del picnometro vuoto al momento della misurazione = P − m + dT.

Pesare il picnometro riempito con il campione preparato per l'analisi (3), seguendo le istruzioni riportate al punto 4.2.1. Sia P2 la massa misurata a t °C.

Massa del liquido contenuto nel picnometro a t °C = P2 − (P − m + dT).

Massa volumica apparente a t °C:

Calcolare la massa volumica a 20 °C del liquido studiato (vino secco, mosto naturale e concentrato, vino dolce) con il procedimento indicato al punto 4.3.1.

La densità 20 °C/20 °C si ottiene dividendo la massa volumica a 20 °C per 0,998203.

4.3.3.

Ripetibilità sulla massa volumica: — per i vini secchi e amabili: r = 0,00010; — per i vini dolci: r = 0,00018.

4.3.4.

Riproducibilità sulla massa volumica: — per i vini secchi e amabili: R = 0,00037; — per i vini dolci: R = 0,00045.

▼M8 —————

▼B

6.   ESEMPIO DI CALCOLO DELLA MASSA VOLUMICA A 20 °C E DELLA DENSITÀ A 20 °C/20 °C (METODO DI RIFERIMENTO)

6.1.   Picnometria su bilancia a due piatti

6.1.1.   Determinazione delle costanti del picnometro

1.	Pesata del picnometro pulito ed asciutto: Tara = picnometro + p p = 104,9454 g

2.	Pesata del picnometro pieno d'acqua alla temperatura t °C: Tara = picnometro + acqua + p′ p′ = 1,2396 g per t = 20,5 °C

3.	Calcolo della massa d'aria contenuta nel picnometro: m = 0,0012 (p − p′) m = 0,0012 (104,9454 − 1,2396) m = 0,1244 g

4.	Caratteristiche da tenere presenti: Tara del picnometro vuoto: p + m p + m = 104,9454 + 0,1244 p + m = 105,0698 g Volume a 20 °C = (p + m − p′) · Ft °C F20,50 °C = 1,001900 V20 °C = (105,0698 − 1,2396) · 1,001900 V20 °C = 104,0275 ml Massa dell'acqua a 20 °C = V20 °C · 0,998203 M20 °C = 103,8405 g

6.1.2.   Determinazione della massa volumica a 20° C e della densità 20° C/20° C di un vino secco:

p″ = 1,2622 a 17,80 °C

ρ17,80 °C = 0,99788 g/ml

La tabella II consente di calcolare ρ20 °C a partire da ρt °C mediante la relazione:

Per t = 17,80 °C e per un titolo alcolometrico di 11 % vol, si trova c = 0,54

ρ20 °C = 0,99734 g/ml

6.2.   Picnometria su bilancia monopiatto

6.2.1.   Determinazioni delle costanti del picnometro

1.	Pesata del picnometro pulito e asciutto P = 67,7913 g

2.	Pesata del picnometro pieno d'acqua alla temperatura t °C P1 = 169,2715 a 21,65 °C

3.	Calcolo della massa d'aria contenuta nel picnometro: m = 0,0012 (P1 − P) m = 0,0012 × 101,4802 m = 0,1218 g

4.

Caratteristiche da tenere presenti: Tara del picnometro vuoto: P − m P − m = 67,7913 − 0,1218 P − m = 67,6695 g Volume a 20 °C = [P1 − (P − m)] Ft °C F21,65 °C = 1,002140 V20 °C = (169,2715 − 67,6695) × 1,002140 V20 °C = 101,8194 ml Massa dell'acqua a 20 °C = V20 °C × 0,998203 M20 °C = 101,6364 g Massa del pallone tara: To To = 171,9160 g.

6.2.2.   Determinazione della massa volumica a 20° C e della densità 20° C/20° C di un vino secco:

T1 = 171,9178 g

dT = 171,9178 − 171,9160 = 0,0018 g

P − m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g

P2 = 169,2799 a 18 °C

ρ18 °C = 0,99793 g/ml

La tabella II consente di calcolare ρ 20 °C a partire da ρ t °C mediante la relazione:

Per t = 18 °C con un titolo alcolometrico di 11 % vol, si trova c = 0,49

ρ20 °C = 0,99744 g/ml

TABELLA I

Fattori F

per i quali bisogna moltiplicare la massa dell'acqua contenuta nel picnometro in pyrex a t° per calcolare il volume del picnometro a 20 °C

TABELLA II

Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini secchi e dei vini secchi privati dell'alcole misurata a t° con un picnometro in pyrex per ricondurre il risultato a 20 °C

Nota: Si può utilizzare questa tabella per trasformare la densità

in

.

TABELLA III

Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei mosti naturali e dei mosti concentrati misurata a t° con un picnometro in pyrex per ricondurre il risultato a 20 °C

Nota: Si può utilizzare questa tabella per trasformare la densità

in

.

TABELLA IV

Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini di 13 % vol o più contenenti zucchero residuo misurata con picnometro in pyrex a t° per ricondurre il risultato a 20 °C

TABELLA V

Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini secchi e dei vini secchi privati dell'alcole misurata a t° mediante un areometro od un picnometro in vetro ordinario a t° per ricondurre il risultato a 20 °C

Nota: Si può utilizzare questa tabella per trasformare la densità

in

.

TABELLA VI

Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei mosti naturali e dei mosti concentrati misurata a t° mediante un picnometro od un areometro in vetro ordinario per ricondurre il risultato a 20 °C

Nota: Si può utilizzare questa tabella per trasformare la densità

in

.

TABELLA VII

Tabella delle correzioni c per la temperatura sulla massa volumica dei vini di 13 % vol o più contenenti zucchero residuo misurata mediante areometro o picnometro in vetro ordinario a t° per ricondurla a 20 °C

2.   DETERMINAZIONE DEL TENORE ZUCCHERINO DEI MOSTI, DEI MOSTI CONCENTRATI E DEI MOSTI CONCENTRATI RETTIFICATI MEDIANTE RIFRATTOMETRIA

1.   PRINCIPIO DEL METODO

Si riporta l'indice di rifrazione a 20 °C, espresso in valore assoluto o in percento in massa di saccarosio, nella tabella corrispondente per ottenere il grado zuccherino in grammi/litro o in grammi per chilogrammo di mosto, di mosto concentrato e di mosto concentrato rettificato.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.   Rifrattometro tipo Abbé

Il rifrattometro deve essere dotato di una scala che indichi:

Il rifrattometro deve essere provvisto di un termometro con una scala compresa almeno tra + 15 °C e + 25 °C e di un dispositivo di circolazione d'acqua che consenta di effettuare le misurazioni a una temperatura di 20 °C ± 5 °C.

Occorre seguire scrupolosamente le istruzioni per l'impiego dello strumento, in particolare per quanto riguarda la taratura e la sorgente luminosa.

3.   PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

3.1.   Mosti e mosti concentrati

Filtrare eventualmente i mosti con una garza asciutta piegata in quattro e, dopo aver eliminato le prime gocce di filtrato, effettuare la determinazione sul prodotto filtrato.

3.2.   Mosto concentrato rettificato

Utilizzare, a seconda della concentrazione, il mosto concentrato rettificato oppure la soluzione ottenuta portando a 500 g, con acqua, 200 g di mosto concentrato rettificato pesato accuratamente.

4.   MODO DI OPERARE

Portare il campione ad una temperatura prossima ai 20 °C. Deporre una piccola presa di campione sul prisma inferiore del rifrattometro, avendo cura che, pressando i prisma l'uno contro l'altro, il campione copra uniformemente la superficie del vetro, ed effettuare la misura seguendo le istruzioni per l'uso dell'apparecchio in questione.

Leggere la percentuale in massa di saccarosio con la precisione dello 0,1 % oppure l'indice di rifrazione con 4 cifre decimali.

Effettuare almeno due determinazioni sullo stesso campione preparato. Rilevare la temperatura t °C.

5.   CALCOLI

5.1.   Correzione di temperatura

5.1.1.

Apparecchi graduati in % in massa di saccarosio: per la correzione della temperatura ricorrere alla tabella I.

5.1.2.

Apparecchi graduati in indice di rifrazione: riportare l'indice misurato a t °C nella tabella II per ottenere (colonna 1) il corrispondente valore della percentuale in massa di saccarosio a t °C. Tale valore viene quindi corretto rispetto alla temperatura ed espresso a 20 °C per mezzo della tabella I.

5.2.   Tenore zuccherino dei mosti e dei mosti concentrati

Riportare nella tabella II la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C per ottenere il tenore zuccherino in grammi/litro e in grammi/chilogrammo. Il tenore zuccherino è espresso in zucchero invertito con una cifra decimale.

5.3.   Tenore zuccherino del mosto concentrato rettificato

Riportare la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C nella tabella III per ottenere il tenore zuccherino in grammi/litro e in grammi/chilogrammo. Il tenore zuccherino è espresso in zucchero invertito con una cifra decimale.

Se la misura è stata effettuata sul mosto concentrato rettificato diluito, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.

5.4.   Indice di rifrazione dei mosti, dei mosti concentrati e dei mosti concentrati rettificati

Riportare nella tabella II la percentuale in massa di saccarosio a 20 °C per ricavare l'indice di rifrazione a 20 °C. Tale valore è espresso con quattro cifre decimali.

TABELLA I

Correzione da apportare nel caso in cui la percentuale in massa di saccarosio sia stata determinata a una temperatura diversa da 20 °C

Nota: Le variazioni di temperatura per rapportare a 20 °C non devono superare ± 5 °C.

TABELLA II

La tabella riporta il tenore zuccherino ( 9 ) dei mosti e dei mosti concentrati espresso in grammi/litro e in grammi/chilogrammo, determinato per mezzo di un rifrattometro graduato in percentuale in massa di saccarosio a 20 °C o in indice di rifrazione a 20 °C. È anche riportata la massa volumica a 20 °C.

TABELLA III

La tabella riporta il tenore zuccherino ( 10 ) dei mosti concentrati rettificati in grammi/litro e in grammi/chilogrammo, determinato per mezzo di un rifrattometro graduato in percentuale in massa di saccarosio a 20 °C oppure in indice di rifrazione a 20 °C. È anche riportata la massa volumica a 20 °C.

3.   TITOLO ALCOLOMETRICO VOLUMICO

1.   DEFINIZIONE

Il titolo alcolometrico volumico è uguale al numero di litri di etanolo contenuti in 100 l di vino. Detti volumi si intendono misurati alla temperatura di 20 °C. Il simbolo è «% vol».

Osservazione:

Nel titolo alcolometrico oltre all'etanolo sono compresi i suoi omologhi e gli esteri etilici che passano nel distillato.

2.   PRINCIPIO DEI METODI

2.1.   Distillazione del vino alcalinizzato con una sospensione di idrossido di calcio

Determinazione del titolo alcolometrico del distillato.

▼M12

2.2.   Metodi di riferimento

▼B

2.3.   Metodi usuali

2.3.1.   Determinazione del titolo alcolometrico del distillato per aerometria

▼M11 —————

▼B

2.3.3.   Determinazione del titolo alcolometrico del distillato mediante rifrattometria

Nota:

Per esprimere il titolo alcolometrico partendo dalla massa volumica del distillato, utilizzare le tabelle pratiche I, II e III riportate nell'allegato II del presente capitolo. Queste sono state calcolate a partire dalla tabella alcolometrica internazionale pubblicata nel 1972 dall'Organizzazione internazionale di metrologia legale nella raccomandazione n. 22 ed adottata dall'OIV (assemblea generale del 1974). Nella tabella I è riportata l'equazione generale che correla il titolo alcolometrico volumico e la massa volumica delle miscele idroalcoliche in funzione della temperatura.

3.   DISTILLAZIONE

3.1.   Apparecchiatura

3.1.1.

Apparecchio di distillazione costituito da: — un pallone da 1 litro a smerigliatura normalizzata; — una colonna di rettifica alta circa 20 cm o qualsiasi altro dispositivo atto ad impedire il traseinamento; — una sorgente di calore; occorre prevedere un opportuno dispositivo che impedisca la pirogenazione delle sostanze che compongono l'estratto; — un refrigerante terminante con un tubo affilato che porti il distillato nel fondo del pallone di raccolta tarato contenente alcuni millilitri di acqua.

3.1.2.

Dispositivo per l'estrazione in corrente di vapore costituita da: 1. un generatore di vapore d'acqua; 2. un gorgogliatore; 3. una colonna di rettifica; 4. un refrigerante. Si può utilizzare qualunque modello di apparecchio di distillazione o di apparecchio di estrazione in corrente di vapore d'acqua a condizione che rispondano al saggio seguente: distillare 5 volte di seguito una miscela idroalcolica a 10 % vol. Dopo l'ultima distillazione, il distillato deve presentare un titolo alcolometrico di almeno 9,9 % vol, vale a dire che nel corso di ciascuna distillazione non si deve perdere una quantità di alcool superiore a 0,02 % vol.

3.2.   Reattivi

3.2.1.   Sospensione di idrossido di calcio 2 M

Si ottiene versando con cautela 1 l di acqua calda (60-70 °C) su 120 g di calce viva CaO.

3.3.   Preparazione del campione

I vini giovani o i vini spumanti devono essere preliminarmente privati della maggior parte del biossido di carbonio agitando 250-300 ml di vino in un pallone di 500 ml.

3.4.   Modo di operare

Prelevare mediante un pallone tarato 200 ml di vino.

Annotare la sua temperatura.

Versarli nel pallone dell'apparecchiatura di distillazione o nel gorgogliatore dell'apparecchio di estrazione in corrente di vapore d'acqua. Risciacquare quattro volte il pallone tarato con 5 ml di acqua che si aggiunge nel pallone o nel gorgogliatore. Aggiungere 10 ml di idrossido di calcio (3.2.1) ed alcuni frammenti di materiale poroso inerte (pietra pomice) nel caso della distillazione.

Raccogliere il distillato nel pallone tarato da 200 ml che è stato utilizzato per misurare il vino.

Raccogliere, nel caso della distillazione, un volume uguale ai tre quarti circa del volume iniziale mentre, nel caso dell'estrazione in vapore d'acqua, raccogliere 198-199 ml di distillato. Portare a 200 millilitri con acqua distillata a una temperatura uguale a quella iniziale, con l'approssimazione di ± 2 °C.

Mescolare con cautela.

Avvertenza

Nel caso di vini particolarmente ricchi di ioni ammoniacali, ridistillare eventualmente il distillato nelle condizioni descritte precedentemente sostituendo la sospensione di idrossido di calcio con 1 ml di acido solforico al 10 % (v/v).

▼M12

4.   METODI DI RIFERIMENTO

4-A.   Determinazione del titolo alcolometrico del distillato mediante picnometria

▼B

4.1.   Apparecchiatura

4.1.1.

Utilizzare il picnometro tarato come riportato al capitolo «massa volumica».

4.2.   Modo di operare

Effettuare la determinazione della massa volumica apparente del distillato (3.4) a t °C come indicato nel capitolo 1 «Massa volumica» ai punti 4.3.1 e 4.3.2; sia ρt °C tale massa volumica.

4.3.   Espressione dei risultati

4.3.1.   Modo di calcolare

Esprimere il titolo alcolometrico a 20 °C mediante la tabella I. Nella tabella cercare sulla linea orizzontale corrispondente alla temperatura T intera immediatamente inferiore a t° la più piccola massa volumica superiore a ρt. Utilizzare la differenza tabulare letta sotto tale massa volumica per calcolare la massa volumica ρ alla temperatura intera considerata T.

Sulla riga di detta temperatura T, dalla massa volumica ρ′ della tabella immediatamente superiore a ρ si sottrae la massa volumica calcolata. Questa differenza va divisa per la differenza tabulare letta a destra della massa volumica ρ′. Il quoziente dà la parte decimale del titolo alcolometrico, mentre la parte del grado stesso è indicata in testa alla colonna ove figura la massa volumica ρ′.

Nell'allegato del presente capitolo è illustrato un esempio di calcolo del titolo alcolometrico.

Per tale correzione di temperatura, è stato elaborato un programma di calcolo che consente eventualmente di effettuarla automaticamente.

4.3.2.   Ripetibilità (r):

r = 0,10 % vol

4.3.3.   Riproducibilità (R):

R = 0,19 % vol

▼M12

4-B.   Determinazione del titolo alcolometrico dei vini per mezzo di una bilancia idrostatica

▼M11

1.   METODO DI MISURAZIONE

1.1.   Introduzione

Il Titolo alcolometrico volumico (TAV) dei vini deve essere misurato prima della loro commercializzazione principalmente ai fini della conformità alle norme di etichettatura.

Il Titolo alcolometrico volumico è pari al numero di litri di etanolo contenuti in 100 litri di vino; detti volumi si intendono entrambi misurati alla temperatura di 20° C. Il suo simbolo è « % vol.».

1.2.   Oggetto e campo di applicazione

Il metodo di misurazione descritto è la densimetria per mezzo di una bilancia idrostatica.

In ottemperanza alle vigenti disposizioni normative, la temperatura di prova è di 20° C.

1.3.   Principio e definizioni

Il principio del metodo consiste innanzitutto nel distillare il vino volume per volume. Il metodo di distillazione è descritto nel presente capitolo. Tale distillazione permette di eliminare le sostanze non volatili. Gli omologhi dell'etanolo, nonché l'etanolo e i suoi omologhi e gli esteri etilici sono compresi nel titolo alcolometrico, poiché si ritrovano nel distillato.

In un secondo tempo si misura la massa volumica del distillato ottenuto. La massa volumica di un liquido ad una determinata temperatura è pari al quoziente della sua massa divisa per il suo volume: ρ2 = m/V; per un vino essa è espressa in g/ml.

Il titolo alcolometrico dei vini può essere misurato per densimetria utilizzando la bilancia idrostatica, in base al principio di Archimede secondo cui un corpo immerso in un liquido riceve una spinta verticale, dal basso verso l'alto, uguale al peso del liquido spostato.

1.4.   Reagenti

Nel corso dell'analisi, salvo indicazione contraria, utilizzare unicamente reagenti di qualità analitica riconosciuta ed acqua almeno di classe 3, quali definiti in ISO 3696:1987.

1.4.1.   Soluzione detergente del pescante (idrossido di sodio, 30 % m/v)

Per preparare 100 ml di soluzione, pesare 30 g di idrossido di sodio e portare a volume con etanolo al 96 % vol.

1.5.   Apparecchiatura e materiale

Comune dotazione di laboratorio, in particolare i seguenti elementi:

1.5.1.

Bilancia idrostatica monopiatto con precisione di 1 mg.

1.5.2.

Pescante con volume di almeno 20 ml, specificamente adattato alla bilancia, sospeso con un filo di diametro inferiore o uguale a 0,1 mm.

1.5.3.

Provetta cilindrica con tacca di livello. Il pescante deve poter essere introdotto interamente nella provetta, al di sotto della tacca; la superficie del liquido dev'essere attraversata soltanto dal filo di sospensione. La provetta deve avere un diametro interno maggiore di almeno 6 mm di quello del pescante.

1.5.4.

Termometro (o sonda termometrica) con scala in gradi e decimi di grado, da 10 a 40° C, tarato a ± 0,05° C.

1.5.5.

Pesi verificati da un organismo riconosciuto di certificazione.

1.6.   Modo di operare

Dopo ogni misurazione, il pescante e la provetta devono essere puliti con acqua distillata, asciugati con carta morbida da laboratorio che non lasci fibre e risciacquati con la soluzione di cui si vuole determinare la massa volumica. Le misurazioni devono essere effettuate appena lo strumento è giunto a stabilità in modo da limitare le perdite di alcole per evaporazione.

1.6.1.   Taratura della bilancia

Sebbene le bilance siano generalmente munite di un dispositivo interno di taratura, la bilancia idrostatica deve poter essere tarata con pesi controllati da un organismo ufficiale di certificazione.

1.6.2.   Taratura del pescante

1.6.2.1.

Riempire la provetta sino alla tacca di livello con acqua bidistillata (o di purezza equivalente, ad esempio microfiltrata, di conducibilità 18,2 MΩ/cm), ad una temperatura compresa tra 15 e 25° C, ma preferibilmente prossima a 20° C.

1.6.2.2.

Immergere il pescante e il termometro nel liquido, agitare, leggere la massa volumica del liquido sullo strumento e, se necessario, correggere la lettura affinché sia uguale a quella dell'acqua alla temperatura di misurazione.

1.6.3.   Controllo con soluzione idroalcolica

1.6.3.1.

Riempire la provetta cilindrica sino alla tacca con una soluzione idroalcolica di titolo noto ad una temperatura compresa tra 15 e 25° C, ma preferibilmente prossima a 20° C.

1.6.3.2.

Immergere il pescante e il termometro nel liquido, agitare e leggere sullo strumento la massa volumica del liquido (o il suo titolo alcolometrico, se lo strumento lo consente). Il titolo alcolometrico così determinato dev'essere lo stesso di quello inizialmente noto.

Nota: Questa soluzione di titolo alcolometrico noto può servire per la taratura del pescante, invece dell'acqua bidistillata.

1.6.4.   Misurazione della massa volumica di un distillato (o del suo titolo alcolometrico, se lo strumento lo consente)

1.6.4.1.

Versare il campione nella provetta cilindrica sino alla tacca.

1.6.4.2.

Immergere il pescante e il termometro nel liquido, agitare e leggere sullo strumento la massa volumica del liquido (o, se possibile, il suo titolo alcolometrico). Annotare la temperatura se la massa volumica viene misurata a t° C ρt.

1.6.4.3.

Correggere ρt utilizzando la tabella delle masse volumiche ρt delle miscele idroalcoliche (tabella II dell'allegato II del presente capitolo).

1.6.5.   Pulitura del pescante e della provetta cilindrica.

1.6.5.1.

Immergere il pescante nella soluzione detergente posta nella provetta.

1.6.5.2.

Lasciare in immersione per un'ora, imprimendo periodicamente al pescante un movimento rotatorio.

1.6.5.3.

Risciacquare con abbondante acqua corrente e poi con acqua distillata.

1.6.5.4.

Asciugare con carta morbida da laboratorio che non lasci fibre.

Effettuare queste operazioni alla prima utilizzazione del pescante, poi periodicamente, ogni qual volta ciò sia necessario.

1.6.6.   Risultato

A partire dalla massa volumica ρ20, calcolare il titolo alcolometrico effettivo mediante la tabella alcolometrica che fornisce il valore del titolo alcolometrico volumico (% vol.) a 20° C in funzione della massa volumica a 20° C delle miscele idroalcoliche. Si tratta della tabella internazionale alcolometrica adottata dall'Organizzazione internazionale di metrologia legale nella sua raccomandazione n. 22.

2.   RAFFRONTO DELLE MISURE EFFETTUATE PER MEZZO DELLA BILANCIA IDROSTATICA CON QUELLE OTTENUTE TRAMITE DENSIMETRIA ELETTRONICA

A partire da campioni il cui titolo alcolometrico è compreso fra 4 % vol. e 18 % vol., si è proceduto alla misurazione della ripetibilità e della riproducibilità dopo una prova interlaboratorio. Si tratta di un raffronto delle misure del titolo alcolometrico di vari campioni ottenute tramite bilancia idrostatica e densimetria elettronica, che includono i valori di ripetibilità e di riproducibilità scaturiti da prove interlaboratorio effettuate su grande scala.

2.1.   Campioni:

Si tratta di vini di densità diverse e titoli alcolometrici preparati mensilmente su scala industriale, prelevati da uno stock di bottiglie conservate in condizioni normali, e forniti anonimamente ai laboratori.

2.2.   Laboratori:

I laboratori che prendono parte alle prove mensili organizzate dall'Unione Italiana Vini (Verona, Italia) conformemente alla normativa ISO 5725 (UNI 9225) ed all'«International Protocol of Proficiency test for chemical analysis laboratories» (Protocollo internazionale di verifica dell'idoneità per i laboratori che effettuano analisi chimiche), definito dall'AOAC, dall'ISO e dall'IUPAC, e nell'osservanza degli orientamenti ISO 43 e ILAC G13. La società sopra citata trasmette una relazione annua a tutti i partecipanti.

2.3.   Apparecchiatura:

2.3.1.

Una bilancia idrostatica elettronica (la cui precisione consente di fornire la massa volumica sino alla quinta cifra decimale) eventualmente munita di un apparecchio di elaborazione dei dati.

2.3.2.

Un densimetro elettronico eventualmente dotato di un campionatore automatico.

2.4.   Analisi

In base alle norme di convalida dei metodi di analisi, ogni campione è analizzato per due volte consecutivamente per determinare il titolo alcolometrico.

2.5.   Risultati

La tabella 1 mostra i risultati di misurazione ottenuti dai laboratori che si servono di una bilancia idrostatica.

La tabella 2 mostra i risultati ottenuti dai laboratori che si servono di un densimetro elettronico.

2.6.   Valutazione dei risultati

2.6.1.

I risultati delle prove sono stati esaminati per evidenziare l'errore sistematico individuale (p < 0,025) utilizzando successivamente i test di Cochran e di Grubbs, secondo le procedure descritte nel «Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies» internazionalmente riconosciuto.

2.6.2.

Ripetibilità (r) e riproducibilità (R) I calcoli di ripetibilità (r) e riproducibilità (R) definiti dal protocollo sono stati effettuati sui risultati rimanenti dopo l'eliminazione dei valori aberranti. Quando si procede alla valutazione di un nuovo metodo, spesso non vi sono metodi di riferimento convalidati o metodi statutari per paragonare i criteri di precisione. Per mettere a confronto i dati di precisione ottenuti mediante le prove collaborative si fa riferimento quindi a livelli di precisione «stimati». Tali livelli «stimati» sono calcolati con la formula di Horwitz. Il raffronto dei risultati delle prove ed i livelli previsti indica se il metodo è sufficientemente accurato per il livello di analita misurato. Il valore «stimato» di Horwitz è calcolato con la formula di Horwitz RSDR = 2(1-0,5 logC) laddove C = concentrazione misurata di analita espressa in decimi (es.: 1 g/100 g = 0,01). Il valore Horrat fornisce un paragone della precisione effettiva determinata con la precisione prevista dalla formula di Horwitz per il metodo ed al livello particolare di concentrazione dell'analita; essa è calcolata nel seguente modo: HoR = RSDR(misurato)/RSDR(Horwitz)

2.6.3.

Precisione interlaboratorio Un valore Horrat di 1 indica generalmente un grado di precisione interlaboratorio soddisfacente, mentre un valore superiore a 2 indica generalmente un grado di precisione insoddisfacente, ossia una precisione eccessivamente variabile vuoi per ragioni analitiche vuoi perché la variazione ottenuta è più elevata di quella stimata per il metodo adoperato. Hor è così calcolato ed utilizzato per determinare la precisione interlaboratorio con la seguente approssimazione: RSDr(Horwitz) = 0,66 RSDR(Horwitz) (il che presuppone la seguente approssimazione: r = 0,66 R) La tabella 3 mostra le differenze esistenti tra le misurazioni ottenute dai laboratori che si servono del densimetro elettronico e quelli che utilizzano la bilancia idrostatica. Al di fuori del campione 2000/3 che ha un titolo alcolometrico molto basso e per il quale entrambe le tecniche impiegate mostrano un basso livello di riproducibilità, si osserva una buona concordanza per gli altri campioni.

2.6.4.

Parametri di fedeltà La tabella 4 indica la media generale dei parametri di fedeltà calcolati a partire da tutte le prove mensili effettuate tra il mese di gennaio 1999 e il mese di maggio 2001. In particolare: Ripetibilità (r) = 0,074 ( % vol.) per la bilancia idrostatica e 0,061 ( % vol.) per la densimetria elettronica Riproducibilità (R) = 0,229 ( % vol.) per la bilancia idrostatica e 0,174 ( % vol.) per la densimetria elettronica.

2.7.   Conclusione

Dai risultati relativi alla determinazione del titolo alcolometrico di una vasta gamma di vini emerge che le misurazioni effettuate con la bilancia idrostatica concordano con quelle effettuate per densimetria elettronica utilizzando un risonatore di flessione e che i valori dei parametri di validazione sono simili per i due metodi.

▼M12

4-C.   Determinazione del titolo alcolometrico volumico dei vini per densimetria elettronica con un misuratore elettronico della frequenza di risonanza

1.   Metodo di misurazione

1.1.   Titolo e introduzione

Il titolo alcolometrico volumico (TAV) dei vini deve essere misurato prima della loro commercializzazione, principalmente ai fini della conformità alle norme di etichettatura.

Il titolo alcolometrico volumico è definito al punto 1 del presente capitolo.

1.2.   Oggetto e campo d'applicazione

Il metodo di misurazione descritto è la densimetria elettronica con un misuratore elettronico della frequenza di risonanza.

In ottemperanza alle vigenti disposizioni normative, la temperatura di prova è di 20 °C.

1.3.   Principio e definizioni

Il principio del metodo consiste innanzitutto nel distillare il vino volume per volume. Il metodo di distillazione è descritto al punto 3 del presente capitolo. Tale distillazione permette di eliminare le sostanze non volatili. Gli omologhi dell'etanolo, l'etanolo e i suoi omologhi legati agli esteri sono compresi nel titolo alcolometrico poiché si ritrovano nel distillato.

In un secondo tempo si misura la massa volumica del distillato ottenuto. La massa volumica di un liquido ad una data temperatura è il rapporto fra la massa e il volume del liquido:

ρ = m/V, per un vino, essa è espressa in g/ml.

Per una soluzione idroalcolica quale un distillato, se la temperatura è nota, è possibile stabilire la corrispondenza tra una massa volumica e un titolo alcolometrico mediante alcune tabelle. Tale titolo alcolometrico corrisponde a quello del vino (distillazione volume per volume).

Nel presente metodo la massa volumica del distillato è misurata per densimetria elettronica con un misuratore della frequenza di risonanza. Il principio consiste nel misurare il periodo di oscillazione di un tubo contenente il campione sottoposto a eccitazione elettromagnetica. Ciò consente di calcolare la massa volumica, che è legata al periodo di oscillazione in base alla formula seguente:

(1)

ρ

=

massa volumica del campione

T

=

periodo di vibrazione indotta

M

=

massa del tubo vuoto

C

=

costante di richiamo

V

=

volume del campione sottoposto a vibrazione

Tale relazione è: ρ = A T2 – B (2). Esiste pertanto una relazione lineare tra la massa volumica e il periodo elevato al quadrato. Le costanti A e B sono specifiche a ogni oscillatore e sono stimate misurando il periodo di fluidi la cui massa volumica è nota.

1.4.   Reagenti e prodotti

1.4.1.   Fluidi di riferimento

Per regolare il densimetro occorrono due fluidi di riferimento. Le masse volumiche dei fluidi di riferimento devono essere l'una superiore e l'altra inferiore a quelle dei distillati da misurare. È raccomandato uno scarto di massa volumica tra i fluidi di riferimento superiore a 0,01000 g/ml. La massa volumica dei fluidi di riferimento deve essere nota con un'incertezza inferiore a ± 0,00005 g/ml, per una temperatura di 20,00 +/- 0,05 °C.

Per la misurazione del TAV dei vini mediante densimetro elettronico, i fluidi di riferimento sono:

1.4.2.   Prodotti per la pulizia e l'essiccazione

1.5.   Apparecchiatura

1.5.1.   Densimetro elettronico per la misurazione della frequenza di risonanza

Il densimetro elettronico contiene gli elementi seguenti:

Il densimetro deve essere posto su un supporto perfettamente stabile ed essere isolato da qualsiasi vibrazione.

1.5.2.   Controllo della temperatura della cella di misura

Il tubo di misura è posto in un involucro termostatico. La stabilità della temperatura deve essere superiore a +/- 0,02 °C.

Quando il densimetro lo consente è necessario controllare la temperatura della cella di misura, che può influenzare sensibilmente i risultati delle determinazioni. La massa volumica di una soluzione idroalcolica con TAV 10 % vol è di 0,98471 g/ml a 20 °C e di 0,98447 g/ml a 21 °C, ossia una differenza di 0,00024 g/ml.

La temperatura di prova è di 20 °C. La misurazione della temperatura della cella è effettuata con un termometro con risoluzione inferiore a 0,01 °C, calibrato secondo gli standard nazionali e in grado di misurare la temperatura con un'incertezza inferiore a +/- 0,07 °C.

1.5.3.   Calibratura dell'apparecchio

L'apparecchio deve essere calibrato prima di essere utilizzato per la prima volta e successivamente ogni sei mesi o quando un controllo non dia risultati soddisfacenti. L'obiettivo consiste nell'utilizzare due fluidi di riferimento per calcolare le costanti A e B [cfr. relazione (2)]. Per la realizzazione pratica della calibratura, fare riferimento alle istruzioni fornite con l'apparecchio. In linea di massima la calibratura è effettuata con aria secca (tenendo conto della pressione atmosferica) e acqua molto pura (bidistillata e/o microfiltrata, di resistività molto elevata > 18 MΩ).

1.5.4.   Verifica della calibratura

Per verificare la calibratura si misura la massa volumica di fluidi di riferimento.

Effettuare ogni giorno una verifica della massa volumica dell'aria: una differenza superiore a 0,00008 g/ml tra la massa volumica teorica e quella osservata può essere un indice di sporcizia del tubo. Occorrerà in questo caso procedere alla pulizia del tubo. Dopo questa operazione, verificare nuovamente la massa volumica dell'aria: se l'esito della verifica non è risolutivo occorre regolare di nuovo l'apparecchio.

Procedere anche alla verifica della massa volumica dell'acqua: se la differenza tra la massa volumica teorica e quella osservata è superiore a 0,00008 g/ml occorre regolare di nuovo l'apparecchio.

Se è difficile controllare la temperatura della cella, è possibile verificare direttamente la massa volumica di una soluzione idroalcolica con TAV analogo a quello dei distillati analizzati.

1.5.5.   Controllo

Ove la differenza tra la massa volumica teorica di una soluzione di riferimento (nota con un'incertezza di ± 0,00005 g/ml) e la massa volumica misurata sia superiore a 0,00008 g/ml, occorre verificare la temperatura della cella.

1.6.   Campionamento e preparazione dei campioni

Cfr. il punto 3 del presente capitolo («Distillazione»).

1.7.   Modo di operare

Dopo la distillazione, misurare la massa volumica o il TAV del distillato per densimetria.

L'operatore deve assicurarsi che la temperatura della cella di misura sia stabile. Il distillato inserito nella cella del densimetro non deve contenere bolle d'aria e deve essere omogeneo. Se si dispone di un sistema d'illuminazione che consente di verificare l'assenza di bolle, spegnerlo subito dopo la verifica perché il calore generato dalla lampada incide sulla temperatura di misurazione.

Se l'apparecchio indica soltanto il periodo, la massa volumica viene calcolata grazie alle costanti A e B (cfr. 1.3). Se l'apparecchio non indica direttamente il TAV, conoscendo la massa volumica si può ricavare il TAV per mezzo delle tabelle.

1.8.   Espressione dei risultati

Il titolo alcolometrico volumico del vino è quello ottenuto per il distillato ed è espresso in «% vol».

Se non sono state rispettate le condizioni di temperatura previste, occorre effettuare una correzione per esprimerlo a 20 °C. Il risultato è espresso con due decimali.

1.9.   Osservazioni

Il volume introdotto nella cella deve essere sufficientemente elevato per evitare il rischio di contaminazione provocata dal campione precedente. Occorre quindi effettuare almeno due determinazioni; ove non diano risultati compresi entro il limite di ripetibilità, sarà necessario procedere a una terza determinazione. In genere i risultati delle ultime due determinazioni sono omogenei, il che consente di scartare il primo valore.

1.10.   Parametri di fedeltà

Per campioni con TAV compreso tra 4 % e 18 % vol

2.   Prove interlaboratorio. Fedeltà ed esattezza con aggiunta di etanolo

Le caratteristiche di efficacia del metodo indicate al punto 1.10 sono il risultato di una prova interlaboratorio realizzata conformemente alle procedure definite a livello internazionale su 6 campioni ad opera di 11 laboratori.

Tutti i dettagli e i calcoli di ripetibilità e di riproducibilità effettuati per questa prova sono descritti nel capitolo «Titre alcoometrique volumique» (punto 4.B.2) del Recueil international des méthodes d'analyses dell'Organizzazione internazionale della vigna e del vino (edizione 2004).

▼M8 —————

▼B

6.   ESEMPIO DI CALCOLO DEL TITOLO ALCOLOMETRICO DI UN VINO

6.1.   Picnometria su bilancia a due piatti

6.1.1.

Le costanti del picnometro sono state determinate e calcolate come indicato al capitolo 1 «Massa volumica e densità relativa» (6.1.1).

6.1.2.

Pesata del picnometro pieno di distillato     Esempio numerico Tara = picnometro + distillato a t °C + p″ t °C = 18,90 °C t °C corretto = 18,70 °C p″ = 2,8074 g p + m − p″ = massa del distillato a t °C 105,0698 − 2,8074 = 102,2624 g Massa volumica apparente a t °C

6.1.3.

Calcolo del titolo alcolometrico Riferirsi alla tabella delle masse volumiche apparenti delle miscele idro-alcoliche a diverse temperature, come indicato precedentemente Sulla riga 18 °C della tabella delle masse volumiche apparenti, la più piccola massa superiore alla massa osservata 0,983076 è 0,98398, nella colonna 11 %. La massa volumica a 18 °C è: (98307,6 + 0,7 × 22) 10−5 = 0,98323 0,98398 − 0,98323 = 0,00075. La parte decimale del titolo alcolometrico è 75/114 = 0,65. Il titolo alcolometrico è: 11,65 % vol.

6.2.   Picnometria su bilancia monopiatto

6.2.1.

Le costanti del picnometro sono state determinate e calcolate al capitolo 1 «Massa volumica e densità relativa» (6.2.1).

6.2.2.

Pesata del picnometro pieno di distillato Peso del pallone tara al momento della determinazione (in grammi): T1 = 171,9178 Picnometro pieno di distillato a 20,50 °C (in grammi): P2 = 167,8438 Variazione della spinta dell'aria: dT = 171,9178 − 171,9160   = + 0,0018 Massa del distillato a 20,50 °C: Lt = 167,8438 − (67,6695 + 0,0018)   = 100,1725 Massa volumica apparente del distillato

6.2.3.

Calcolo del titolo alcolometrico Riferirsi alla tabella delle masse volumiche apparenti delle miscele idro-alcoliche a diverse temperature, come indicato precedentemente Sulla riga 20 °C della tabella delle masse volumiche apparenti, la più piccola massa superiore alla massa osservata 0,983825 è 0,98471, nella colonna 10 %. La massa volumica a 20 °C è: (98382,5 + 0,50 × 24) 10−5 = 0,983945 0,98471 − 0,983945 = 0,000765. La parte decimale del titolo alcolometrico è 76,5/119 = 0,64. Il titolo alcolometrico è: 10,64 % vol.

FORMULA PER IL CALCOLO DELLE TABELLE ALCOLOMETRICHE DELLE MISCELE DI ALCOLE ETILICO ED ACQUA

La massa volumica «ρ», espressa in chilogrammi per metro cubo (kg/m3), di una miscela di alcole etilico e di acqua alla temperatura t, espressa in gradi Celsius, è data dalla formula seguente in funzione:

La formula è valida per le temperature comprese tra − 20 °C e + 40 °C.

Coefficienti numerici della formula

TABELLA 1

TITOLO ALCOLOMETRICO INTERNAZIONALE A 20 °C

Tabella delle masse volumiche apparenti di miscele idroalcoliche misurate con picnometro in vetro pyrex

Masse volumiche a t° corrette della spinta dell'aria

TABELLA II

TITOLO ALCOLOMETRICO INTERNAZIONALE A 20 °C

Tabella delle correzioni da apportare al titolo alcolometrico apparente per correggere l'influenza della temperatura

Aggiungere o sottrarre al titolo alcolometrico apparente a t° C (alcolometro in vetro ordinario) la correzione qui sotto indicata.

TABELLA III

TITOLO ALCOLOMETRICO INTERNAZIONALE A 20 °C

Tavola delle masse volumiche apparenti delle miscele idroalcoliche

Apparecchi in vetro ordinario

Masse volumiche a t° C, corrette della spinta dell'aria

TABELLA IV

Tabella di corrispondenza tra gli indici di rifrazione a 20 °C e i titoli alcolometrici a 20 °C delle miscele idroalcoliche pure e dei distillati

4.   ESTRATTO SECCO TOTALE

Sostanze secche totali

1.   DEFINIZIONE

L'estratto secco totale o sostanze secche totali è costituito dall'insieme di tutte le sostanze che, in condizioni fisiche determinate, non volatilizzano. Queste condizioni fisiche debbono essere fissate in modo tale che le sostanze componenti tale estratto subiscano il minimo di alterazione possibile.

L'estratto non riduttore è l'estratto secco totale dal quale sono stati detratti gli zuccheri totali.

L'estratto ridotto è l'estratto secco dal quale sono stati detratti gli zuccheri totali eccedenti 1 g/l, il solfato di potassio eccedente 1 g/l, il mannitolo, se presente, e tutte le sostanze chimiche eventualmente aggiunte al vino.

Il resto di estratto è l'estratto non riduttore dal quale è stata detratta l'acidità fissa, espressa in acido tartarico.

L'estratto è espresso in grammi per litro e dev'essere determinato con l'approssimazione di 0,5 g.

2.   PRINCIPIO DEL METODO

Metodo unico: metodo densimetrico.

L'estratto secco totale è calcolato indirettamente in base al valore della densità del mosto e, nel caso del vino, in base alla densità del vino dealcolizzato.

Questo estratto secco è espresso dalla quantità di saccarosio che, disciolta in una quantità d'acqua sufficiente ad avere un litro, dà una soluzione avente la stessa densità del mosto o del vino dealcolizzato. Questa quantità è fornita dalla tabella I.

3.   MODO DI OPERARE

La densità relativa

del «vino dealcolizzato» (dr) è calcolata con la formula:

dr = dv − da + 1,000

dove

dv

=

densità relativa del vino a 20 °C (corretta per l'acidità volatile) ( 12 )

da

=

densità relativa a 20 °C della miscela idroalcolica avente lo stesso titolo alcolometrico del vino

Il valore di dr può anche essere calcolato in base alle masse volumiche a 20 °C, ρv del vino e ρa della miscela idroalcolica allo stesso titolo alcolometrico, mediante la formula:

dr = 1,0018 (ρv − ρa) + 1,000

dove il coefficiente 1,0018 può praticamente essere assimilato ad 1 allorché ρv è inferiore ad 1,05, come avviene nella maggioranza dei casi.

4.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Riportare la densità dr 20 20 del vino dealcolizzato o la densità d20 20 del mosto nella tabella I per ricavare il peso dell'estratto secco totale in grammi per litro.

Il peso dell'estratto secco totale è espresso in g/l con una cifra decimale.

TABELLA I

per il calcolo del tenore in estratto secco totale (grammi per litro)

5.   ZUCCHERI RIDUTTORI

1.   DEFINIZIONE

Gli zuccheri riduttori sono costituiti dall'insieme degli zuccheri a funzione chetonica o aldeidica dosati in base alla loro azione riducente sulla soluzione cupro-alcalina.

2.   PRINCIPIO DEI METODI

2.1.   Defecazione

2.1.1.

Metodo di riferimento: passaggio del vino neutralizzato e dealcolizzato su una colonna scambiatrice di anioni sotto forma di acetato, dove i suoi anioni vengono scambiati con ioni acetici, e successiva defecazione con acetato neutro di piombo.

2.1.2.

Metodi usuali: il vino viene trattato con uno dei seguenti reattivi: 2.1.2.1. Acetato neutro di piombo 2.1.2.2. Ferrocianuro II di zinco

2.2.   Dosaggio

2.2.1.

Metodo unico: dopo aver fatto reagire il vino o il mosto defecati con una quantità determinata di soluzione cupro-alcalina, l'eccesso di ioni rameici viene dosato per iodometria.

3.   DEFECAZIONE

Il liquido nel quale vanno dosati gli zuccheri deve avere un contenuto in zuccheri compreso tra 0,5 e 5 g/l.

Se il vino è secco, bisogna evitare di diluirlo durante la defecazione; se è dolce, esso va diluito nel corso della defecazione, in modo da portare il contenuto in zuccheri entro i limiti indicati secondo la tabella seguente.

3.1.   Metodo di riferimento

3.1.1.   Reattivi

3.1.1.1.

Soluzione di acido cloridrico (HCl), 1 M

3.1.1.2.

Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 1 M

3.1.1.3.

Soluzione di acido acetico (CH3COOH), 4 M

3.1.1.4.

Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 2 M

3.1.1.5.

Resina scambiatrice di anioni [tipo Dowex 3 (20 — 50 mesh) o resina equivalente] preparata nel modo seguente: In fondo ad una buretta collocare un piccolo tampone di lana di vetro e 15 ml di resina scambiatrice di anioni (3.1.1.5). Al momento della messa in funzione, sottoporre la resina a 2 cicli completi di rigenerazione con passaggi alternati di soluzioni M di acido cloridrico (3.1.1.1) e di idrossido di sodio (3.1.1.2). Dopo il lavaggio con 50 ml di acqua distillata, travasare la resina in un becher, aggiungere 50 ml di una soluzione 4 M di acido acetico (3.1.1.3) ed agitare per 5 minuti Riempire nuovamente la buretta e far passare attraverso la colonna 100 ml di soluzione di acido acetico 4 M (3.1.1.3) (è preferibile disporre di una riserva di resina conservata in un recipiente riempito con la soluzione 4 M di acido acetico). Lavare la colonna con acqua distillata sino a neutralità dell'effluente. Rigenerazione della resina. Far passare 150 ml di una soluzione 2 M di idrossido di sodio per eliminare gli acidi e gran parte delle sostanze coloranti fissate sulla resina. Lavare con 100 ml d'acque. Far passare 100 ml di soluzione 4 M di acido acetico. Lavare la colonna sino a neutralità dell'effluente.

3.1.1.6.

Soluzione di acetato neutro di piombo (approssimativamente satura): Acetato neutro di piombo Pb (CH3COO)2 · 3 H2O 250 g Acqua molto calda q.b.a: 500 ml Agitare sino a dissoluzione.

3.1.1.7.

Carbonato di calcio, Ca CO3.

3.1.2.   Modo di operare

3.1.2.1.   Vini secchi

Introdurre 50 ml di vino in un recipiente cilindrico del diametro di 10-12 cm circa ed addizionare ½ (n − 0,5) ml di una soluzione M di idrossido di sodio (3.1.1.2) (dove n è il volume di una soluzione 0,1 M di idrossido di sodio impiegato per il dosaggio dell'acidità totale su 10 ml di vino); evaporare su bagnomaria bollente con l'aiuto di un getto di aria calda sino a ridurre la quantità di liquido a circa 20 ml.

Fare defluire 3 ml di tale liquido ogni 2 minuti attraverso la colonna scambiatrice di anioni in forma di acetato (3.1.1.5). Raccogliere l'effluente in un matraccio tarato da 100 ml. Lavare sei volte il recipiente e la colonna con 10 ml di acqua distillata, aggiungere agitando 2,5 ml di soluzione satura di acetato di piombo (3.1.1.6) e 0,5 g di carbonato di calcio (3.1.1.7); agitare a più riprese e lasciare riposare almeno 15 minuti; portare a volume con acqua. Filtrare.

1 ml di questo filtrato corrisponde a 0,5 ml di vino.

3.1.2.2.   Mosti, mistelle, vini dolci e vini amabili

Si riportano a titolo indicativo alcune diluizioni.

1.   Mosti e mistelle

Diluire al 10 % il liquido da analizzare e prelevare 10 ml di tale diluizione.

2.	Vini dolci, alcolizzati o meno, di massa volumica compresa tra 1,005 e 1,038. Prelevare 20 ml di liquido da analizzare previamente diluito al 20 %.

3.

Vini amabili, di massa volumica compresa tra 0,997 e 1,005. Prelevare 20 ml di vino non diluito. Fare defluire il volume di vino o di mosto sopra indicato attraverso la colonna scambiatrice di anioni sotto forma di acetato nella misura di 3 ml ogni due minuti. Raccogliere l'effluente in un pallone tarato da 100 ml, lavare la colonna con acqua fino ad ottenere 90 ml circa di effluente. Aggiungere 0,5 g di carbonato di calcio, 1 ml di una soluzione satura di acetato di piombo; agitare e lasciare riposare per almeno 15 minuti agitando di tanto in tanto; portare a volume con acqua. Filtrare. In questi casi: 1) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,01 ml di mosto o di mistella, 2) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,04 ml di vino dolce, 3) 1 ml di filtrato corrisponde a 0,20 ml di vino amabile.

▼M8 —————

▼B

4.   DOSAGGIO

4.1.   Reattivi

4.1.1.   Soluzione cupro-alcalina:

Sciogliere il solfato di rame in 100 ml di acqua, l'acido citrico in 300 ml di acqua e il carbonato di sodio in 300-400 ml di acqua calda. Mescolare la soluzione di acido citrico e la soluzione di carbonato di sodio. Aggiungere quindi la soluzione di solfato di rame e portare a 1 l.

4.1.2.   Soluzione di ioduro di potassio al 30 %:

Conservare in bottiglia di vetro scuro.

4.1.3.   Acido solforico al 25 %:

Versare l'acido nell'acqua, lasciare raffreddare e portare a 100 ml.

4.1.4.   Salda d'amido a 5 g/l:

Disperdere 5 g di amido in circa 500 ml di acqua. Portare a ebollizione agitando e mantenere l'ebollizione per 10 minuti; aggiungere 200 g di cloruro di sodio (NaCl) e, dopo il raffreddamento, portare a 1 l.

In un pallone tarato da 200 ml introdurre:

Immergere il pallone in bagnomaria a 60 °C per il tempo sufficiente affinché la soluzione raggiunga la temperatura di 50 °C, da mantenere per 15 minuti. Lasciare quindi raffreddare il pallone spontaneamente per 30 minuti immergendolo poi in un bagno di acqua fredda. Travasare quindi in un pallone tarato da 1 l e portare a volume; questa soluzione si mantiene per un mese. Al momento dell'impiego neutralizzare la quantità prelevata (tale soluzione è approssimativamente 0,06 M acida), con una soluzione di idrossido di sodio.

4.2.   Modo di operare

In un pallone da 300 ml, introdurre 25 ml di soluzione cupro-alcalina, 15 ml di acqua e 10 ml di soluzione defecante. Questo volume di soluzione zuccherina non deve contenere più di 60 mg di zucchero invertito.

Aggiungere alcuni granuli di pietra pomice. Adattare al pallone un refrigerante a ricadere e portare ad ebollizione entro 2 minuti. Mantenere l'ebollizione per 10 minuti esatti.

Raffreddare immediatamente in corrente d'acqua fredda. Completato il raffreddamento aggiungere 10 ml di soluzione di ioduro di potassio al 30 % (4.1.2), 25 ml di acido solforico al 25 % (4.1.3) e 2 ml di salda d'amido (4. 1.4).

Titolare con la soluzione 0,1 M di tiosolfato di sodio (4.1.5). Sia n il numero di millilitri utilizzati.

Effettuare a parte una prova in bianco, sostituendo i 25 ml di soluzione zuccherina con 25 ml di acqua distillata. Sia n′ il volume di tiosolfato impiegato.

4.3.   Espressione dei risultati

4.3.1.   Calcoli

La quantità di zucchero del rino, espressa in zucchero invertito, contenuta nel campione in esame, è riportata nella tabella seguente in funzione del numero (n′ − n) di millilitri di tiosolfato utilizzati.

Esprimere il tenore di zucchero in grammi di zucchero invertito per litro con una cifra decimale, tenendo conto delle diluizioni effettuate nel corso della defecazione e del volume del di campione.

4.3.2.   Ripetibilità

r

=

0,015 xi

xi

=

concentrazione di zucchero invertito in g/l del campione

4.3.3.   Riproducibilità

R

=

0,058 xi

xi

=

concentrazione di zucchero invertito in g/l del campione

6.   SACCAROSIO

1.   PRINCIPIO DEI METODI

I.	Metodo ri ricerca qualitativa per cromatografia su strato sottile. Il saccarosio è separato dagli altri zuccheri per cromatografia su strato sottile di cellulosa e rivelato per mezzo del reattivo urea-acido cloridrico in stufa a 105 °C.

II.

Metodo di ricerca e di dosaggio per cromatografia liquida ad alta risoluzione. Il saccarosio viene separato su colonna di silice addizionata di alchilammina e rivelato per rifrattometria. Il dosaggio viene effettuato rispetto ad uno standard esterno analizzato nelle stesse condizioni. Osservazione: La genuinità di un mosto o di un vino può essere controllata con il metodo della RMN del deuterio descritta per la rivelazione dello zuccheraggio dei mosti, dei mosti concentrati, dei mosti concentrati rettificati e dei vini. Per la ricerca ed il dosaggio del saccarosio può essere impiegato il metodo gascromatografico descritto nel capitolo 42, lettera f).

2.   METODO DI RICERCA QUALITATIVA PER CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE

2.1.   Materiale

2.1.1.   Lastre per cromatografia ricoperte di uno strato sottile di cellulosa.

2.1.2.   Vasca cromatografica

2.1.3.   Siringa micrometrica o micropipetta

2.1.4.   Stufa termostatabile a 105 ± 2° C

2.2.   Reattivi

2.2.1.   Carbone decolorante

2.2.2.

Fase mobile: cloruro di metilene — acido acetico (d20° — 1,05 g/ml) — etanolo — metanolo — acqua (50: 25: 9: 6: 10)

2.2.3.

Rivelatore Urea: 5 g Acido cloridrico 2 M: 20 ml Etanolo: 100 ml

2.2.4.

Soluzione di riferimento Glucosio: 35 g Fruttosio: 35 g Saccarosio: 0,5 g Acqua q.b. a: 1 000 ml

2.3.   Modo di operare

2.3.1.   Preparazione del campione

Se il mosto o il vino è fortemente colorato, decolorarlo trattandolo con carbone attivo.

Nel caso di mosto concentrato rettificato, usare la soluzione avente un tenore zuccherino del 25 % (m/m) (25° Brix) preparata come indicato al capitolo «Determinazione del pH» al punto 4.1.2 e diluirla a un quarto portando da 25 ml a 100 ml con acqua in pallone tarato.

2.3.2.   Cromatogramma

A 2,5 cm dal bordo inferiore della lastra cromatografica deporre:

Porre la lastra nella vasca per cromatografia satura dei vapori della fase mobile e lasciar migrare il solvente fino ad un centimetro dal bordo superiore. Togliere la lastra e asciugarla in corrente di aria calda. Ripetere due volte la migrazione asciugando ogni volta la lastra. Polverizzare uniformemente sulla lastra 15 ml del rivelatore e porla in stufa a 105 °C per 5 minuti.

2.4.   Risultati

Il saccarosio ed il fruttosio danno macchie di colore blu intenso su fondo bianco; il glucosio dà una macchia verdastra meno intensa.

3.   METODO DI RICERCA E DI DETERMINAZIONE PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA RISOLUZIONE

Le condizioni cromatografiche sono date a titolo indicativo.

3.1.   Apparecchiatura

3.1.1.   Cromatografo in fase liquida ad alta risoluzione corredato di:

1)	un iniettore (loop) da 10 µl,

2)	un rivelatore, rifrattometro differenziale o rifrattometro interferometro,

3)	una colonna di silice con alchilammina legata (lunghezza 250 mm e diametro interno 4 mm),

4)	una precolonna riempita con la stessa fase,

5)	un dispositivo per isolare o termostatare (30 °C) l'insieme precolonna-colonna,

6)	un registratore ed eventualmente un integratore,

7)	flusso della fase mobile: 1 ml/minuto.

3.1.2.   Dispositivo di filtrazione su membrana (0,45 µm)

3.2.   Reattivi

3.2.1.   Acqua bidistillata

3.2.2.   Acetonitrile (CH3 CN) di qualità HPLC

3.2.3.

Fase mobile: acetonitrile-acqua, previamente filtrati su membrana (0,45 µm), (80 − 20 v/v) Detta fase mobile deve essere degassificata prima dell'uso.

3.2.4.

Soluzione di riferimento: soluzione acquosa di saccarosio di 1,2 g/l. Filtrarla su membrana (0,45 µm).

3.3.   Modo di operare

3.3.1.   Preparazione del campione

3.3.2.   Determinazione cromatografica

Iniettare in fasi successive nel cromatografo 10 µl della soluzione di riferimento e 10 µl del campione preparato come indicato al punto 3.3.1.

Ripetere le iniezioni nello stesso ordine.

Registrare il cromatogramma.

Il tempo di ritenzione del saccarosio è di circa 10 minuti.

3.4.   Calcoli

Utilizzare per il calcolo la media delle due risposte ottenute per la soluzione di riferimento e per il campione.

3.4.1.   Per i vini e i mosti

Calcolare il tenore in g/l.

3.4.2.   Per i mosti concentrati ed i mosti concentrati rettificati

Sia C = g/l il tenore in saccarosio della soluzione del mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v).

Tenore zuccherino in grammi per chilogrammo di mosto concentrato rettificato: 2,5 · C

3.5.   Espressione dei risultati

Il tenore in saccarosio si esprime con una cifra decimale in g/l nel caso dei vini, dei mosti e dei mosti concentrati rettificati nel caso dei mosti concentrati rettificati, in g/kg.

7.   GLUCOSIO E FRUTTOSIO

1.   DEFINIZIONE

Il glucosio ed il fruttosio possono essere determinati singolarmente con un metodo enzimatico, al solo scopo di calcolare il rapporto glucosio/fruttosio.

2.   PRINCIPIO

Il glucosio e il fruttosio sono fosforilati con adenosina-trifosfato (ATP) con una reazione enzimatica catalizzata dall'esochinasi (HK) e danno glucosio-6-fosfato (G6P) e fruttosio-6-fosfato (F6P):

glucosio + ATP G6P + ADP

fruttosio + ATP F6P + ADP

In un primo tempo il glucosio-6-fosfato viene ossidato a gluconato-6-fosfato dal nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato (NADP) in presenza dell'enzima glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (G6PDH). La quantità di nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato ridotto (NADPH) che si forma corrisponde alla quantità di glucosio-6-fosfato e quindi a quella del glucosio.

G6P + NADP+ Gluconato-6-fosfato + NADPH + H+

Il nicotinammide-adenina-dinulceotide-fosfato ridotto si dosa per assorbimento a 340 nm.

Al termine di questa reazione, il fruttosio-6-fosfato viene trasformato dall'azione della fosfoglucosio-isomerasi (PGI) in glucosio-6-fosfato

F6P G6P

Il glucosio-6-fosfato reagisce di nuovo con il nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato per dare gluconato-6-fosfato e nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato ridotto; questo viene quindi dosato.

3.   APPARECCHIATURA

4.   REATTIVI

4.1.

Soluzione 1: tampone (trietanolammina 0,3 M; pH = 7,6; 4 · 10−3 M in Mg++) sciogliere 11,2 g di cloridrato di trietanolammina (C2H5)3N · HCl) e 0,2 g di Mg SO4 · 7 H2O in 150 ml di acqua bidistillata, aggiungere circa 4 ml di soluzione 5 M di idrossido di sodio (NaOH) per ottenere un pH uguale a 7,6 e portare a 200 ml. Questa soluzione tampone può essere conservata a + 4 °C per quattro settimane.

4.2.	Soluzione 2: soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato (circa 11,5 · 10−3 M): sciogliere 50 mg di nicotinammide-adenina-dinucleotide-fosfato bisodico in 5 ml di acqua bidistillata. La soluzione si conserva a +4 °C per quattro settimane.

4.3.	Soluzione 3: soluzione di adenosina-5′-trifosfato (circa 81 · 10−3M): sciogliere 250 mg di adenosina-5′-trifosfato disodico e 250 mg di bicarbonato di sodio NaHCO3 in 5 ml di acqua bidistillata. Questa soluzione si mantiene a + 4 °C per quattro settimane.

4.4.	Soluzione 4: Esochinasi/glucosio-6-fosfato-deidrogenasi: miscelare 0,5 ml di esochinasi (2 mg di proteina/ml, cioè 280 U/ml) e 0,5 ml di glucosio-6-fosfato-deidrogenasi (1 mg di proteina per ml). A + 4 °C la soluzione si conserva per un anno.

4.5	Soluzione 5: fosfoglucosio-isomerasi (2 mg di proteina per ml, cioè 700 U/ml). La sospensione viene utilizzata senza diluizione. A + 4 °C circa la soluzione si conserva per un anno. Nota: l'insieme dei reattivi per il dosaggio si trova pronto in commercio.

5.   MODO DI OPERARE

5.1.   Preparazione del campione

Effettuare le seguenti diluizioni in funzione della quantità presunta di glucosio + fruttosio per litro:

5.2.   Dosaggio

Regolato lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 340 nm, effettuare le misure rispetto all'aria (senza la cella sul percorso ottico) o rispetto all'acqua.

Temperatura 20—25 °C.

In 2 celle aventi un cammino ottico di 1 cm, introdurre:

Mescolare e dopo circa 3 minuti leggere l'assorbanza delle soluzioni (A1). Provocare la reazione aggiungendo:

Mescolare; aspettare 15 minuti; effettuare la misura dell'assorbanza e verificare dopo 2 minuti che la reazione sia terminata (A2).

Aggiungere immediatamente:

Mescolare; effettuare la lettura dopo 10 minuti; verificare l'arresto della reazione dopo 2 minuti (A3).

Determinare le differenze di assorbanza:

A2 − A1 che corrisponde al glucosio,

A3 − A2 che corrisponde al fruttosio,

per la prova in bianco e per il campione.

Determinare la differenza di assorbanza tra la prova in bianco (ΔAT) ed il campione (ΔAD) e fissare:

per il glucosio: ΔAG = ΔAC − ΔAB

per il fruttosio: ΔAF = ΔAC − ΔAB

Osservazione:

il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro. Qui sopra è riportato soltanto a titolo indicativo. Si raccomanda di determinarlo per ciascun lotto.

5.3.   Espressione dei risultati

5.3.1.   Calcolo

La formula generale per il calcolo delle concentrazioni è la seguente:

V

=

volume della soluzione impiegata per la prova (ml)

v

=

volume del campione (ml)

PM

=

massa molecolare della sostanza da dosare

d

=

cammino ottico della cella (cm)

ε

=

coefficiente di assorbimento dell'NADPH a 340 nm = 6,3 (m mole−1 · l · cm−1)

V

=

2,92 ml per la determinazione del glucosio

V

=

2,94 ml per la determinazione del fruttosio

v

=

0,20 ml

PM

=

180

d

=

1

Si ottiene:

Per il glucosio: Cg/l = 0,417 · ΔAG

Per il fruttosio: Cg/l = 0,420 · ΔAF

Se per preparare il campione, è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore F.

Osservazione:

Per misure effettuate alle lunghezze d'onda 334 o 365 nm si ottiene:

5.3.2.   Ripetibilità (r)

r = 0,056 xi

5.3.3.   Riproducibilità (R)

R

=

0,12 + 0,076 xi

xi

=

tenore in glucosio o fruttosio in grammi per litro

8.   RIVELAZIONE DELL'AUMENTO DEL TITOLO ALCOLOMETRICO NATURALE DEI MOSTI DI UVE, DEI MOSTI DI UVE CONCENTRATI, DEI MOSTI DI UVE CONCENTRATI RETTIFICATI E DEI VINI MEDIANTE LA RISONANZA MAGNETICA NUCLEARE DEL DEUTERIO (RMN — FINS/SNIF — NMR)

1.   DEFINIZIONE

Gli atomi di deuterio contenuti negli zuccheri e nell'acqua di un mosto di uva si ridistribuiscono dopo la fermentazione nelle molecole I, II, III e IV del vino:

L'aggiunta di zuccheri esogeni (zuccheraggio a secco) prima della fermentazione del mosto si ripercuoterà sulla ridistribuzione del deuterio.

Rispetto ai valori dei parametri relativi ad un vino campione naturale della stessa regione, lo zuccheraggio con zucchero esogeno provocherà le seguenti variazioni:

(D/H)I

:

rapporto isotopico nella molecola I

(D/H)II

:

rapporto isotopico nella molecola II

:

rapporto isotopico dell'acqua e del vino

R = 2(D/H)II/(D/H)I, esprime la distribuzione relativa del deuterio nelle molecole I e II; R viene direttamente misurato a partire dalle intensità h dei segnali e quindi R = 3hII/hI.

(D/H)I caratterizza soprattutto la specie vegetale che ha sintetizzato lo zucchero ed in misura minore la geografia del luogo di raccolta (natura dell'acqua impiegata per la fotosintesi).

(D/H)II rappresenta la climatologia del luogo di produzione delle uve (qualità dell'acqua piovana e condizioni meteorologiche) ed in misura minore, la concentrazione zuccherina del mosto iniziale.

rappresenta la climatologia del luogo di produzione e la ricchezza in zucchero del mosto iniziale.

2.   PRINCIPIO

La determinazione dei parametri sopra definiti [(R, (D/H)I, (D/H)II)], è effettuata per RMN del deuterio sull'etanolo estratto dal vino o dai prodotti di fermentazione del mosto, del mosto concentrato, del mosto concentrato rettificato ottenuti in determinate condizioni. Essa è eventualmente completata con la determinazione del rapporto isotopico dell'acqua estratta dal vino,

e del rapporto isotopico 13C/12C dell'etanolo.

▼M1 —————

▼B

3.   PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PER L'ANALISI

3.1.   Estrazione dell'etanolo e dell'acqua dal vino

Osservazione: Può essere utilizzata qualsiasi apparecchiatura per l'estrazione dell'etanolo a condizione che permetta di recuperare il 98-98,5 % dell'alcol del vino ottenendo un distillato che abbia un titolo compreso tra il 92 e il 93 % mas. (95 % vol).

3.1.1.   Apparecchiature e reattivi

3.1.2.   Modo di operare

3.1.2.1.

Determinare il titolo alcolometrico del vino con l'approssimazione di 0,05 % vol. Sia tv.

3.1.2.2.

Estrazione dell'etanolo Versare una presa di campione omogeneo di 500 ml di vino avente titolo alcolometrico tv nel pallone dell'apparecchiatura per la distillazione che abbia un tasso di riflusso costante di circa 0,9. Collocare un matraccio con smerigliatura da 125 ml, preventivamente tarato, per la raccolta del distillato. Raccogliere il liquido che distilla tra 78,0 e 78,2 °C pari a circa 40-60 ml. Interrompere l'operazione per 5 minuti quando la temperatura supera i 78,5 °C. Non appena la temperatura raggiunge nuovamente i 78 °C tornare a prelevare il distillato sino a 78,5 °C e ripetere tale operazione fino a quando la temperatura, dopo aver interrotto il prelievo ed aver fatto continuare l'operazione in circuito chiuso, non decresce più. La distillazione completa dura circa 5 ore. Questo procedimento consente di recuperare il 98-98,5 % dell'alcool totale del vino, in un distillato al 92-93 % in massa (95 % vol), titolo per il quale sono state fissate le condizioni RMN descritte al paragrafo 4. Pesare l'etanolo estratto. In un flacone da 60 ml conservare una parte (60 ml) omogenea delle code di distillazione, che rappresenta l'acqua del vino. Determinare eventualmente il suo rapporto isotopico. Osservazione: se si dispone di uno spettrometro con sonda da 10 mm (vedi paragrafo 4), saramo sufficienti 300 ml di vino.

3.1.2.3.

Determinazione del titolo alcolometrico dell'alcol estratto Su un campione di circa 0,5 ml di alcol, di massa p esattamente nota, determinare il tenore in acqua con il metodo Karl Fischer e sia esso p′g. Figura 1 — Dispositivo per l'estrazione dell'etanolo Il titolo massico dell'etanolo è dato da

3.2.   Fermentazione dei mosti, dei mosti concentrati e dei mosti concentrati rettificati

3.2.1.   Materiali e reattivi

Se si conosce il rapporto isotopico dell'acqua del mosto, i lieviti possono essere preventivamente riattivati insemensandoli per 5 minuti in una piccola quantità di acqua tiepida non distillata (1 g in 50 ml), avente un rapporto isotopico vicino a quello dell'acqua del mosto.

Quando non si conosce il rapporto isotopico dell'acqua del mosto, è preferibile insemensare direttamente.

La quantità di lieviti secchi da utilizzare è dell'ordine di 1 g, cioè circa 1010 cellule per 1 l di mosto.

Recipiente per la fermentazione da 1,5 l munito di un dispositivo che consenta di operare senza contatto con l'aria e di condensare i vapori di alcol in modo che durante la fermentazione non si abbia alcuna perdita di etanolo. La percentuale di conversione degli zuccheri fermentescibili in etanolo deve essere superiore al 98 %.

3.2.2.   Modo di operare

3.2.2.1.   Mosti

3.2.2.2.   Mosti concentrati

Nel recipiente di fermentazione versare un volume V ml di mosto concentrato contenente circa 170 g di zucchero. Completare il volume ad 1 l con (1 000 − V) ml di acqua avente lo stesso rapporto isotopico dell'acqua del mosto naturale testimone. Insemensare come indicato al punto 3.2.1. Aggiungere 3 grammi di Bacto Yeast Nitrogen (Base without amino acids DIFCO). Omogeneizzare e continuare come prima.

3.2.2.3.   Mosti concentrati rettificati

Procedere come descritto al punto 3.2.2.2 portando al volume di un litro con (1 000 − V) ml di acqua avente lo stesso rapporto isotopico dell'acqua del mosto naturale testimone in cui sono stati sciolti 3 grammi di acido tartarico.

Osservazione: Conservare 50 ml di campione di mosto, di mosto desolfitato, di mosto concentrato o di mosto concentrato rettificato per l'eventuale estrazione dell'acqua e la determinazione del suo rapporto isotopico

.

L'estrazione dell'acqua dai mosti potrà essere effettuata molto semplicemente per distillazione azeotropica con toluene.

3.3.   Preparazione del campione di alcol per la misura RMN

3.3.1.   Reattivi

N,N-tetrametilurea (TMU): utilizzare un campione di riferimento di TMU avente rapporto isotopico D/H conosciuto e controllato. Tale campione può essere fornito da:

3.3.2.   Modo di operare

3.4.   Preparazione del campione di acqua per la misurazione RMN, che servirà eventualmente a determinarne il suo rapporto isotopico.

3.4.1.   Reattivi

N,N-tetrametilurea (TMU): vedi 3.3.1

3.4.2.   Modo di operare

Introdune in una bottiglia preventivamente tarata 3 ml di acqua ottenuta come al punto 3.1.2 o al punto 3.2 (Osservazione); pesare con l'approssimazione di 0,1 mg (m′E); aggiungere quindi 4 ml dello standard interno (TMU) e pesarlo con l'approssimazione di 0,1 mg (m′st); omogeneizzare la miscela per agitazione.

Osservazione: Se il laboratorio dispone di uno spettrometro di massa di rapporti isotopici, tale misura potrà essere effettuata su detto strumento in modo da alleggerire il carico dello spettrometro RMN. È in effetti necessario verificare il rapporto TIV (5.2) per ciascuna serie di vini studiata.

4.   REGISTRAZIONE DEGLI SPETTRI RMN 2H DELL'ALCOL E DELL'ACQUA

Determinazione dei parametri isotopici

4.1.   Apparecchiatura

4.2.   Regolazione dello spettrometro e verifiche

4.2.1.   Regolazione

Procedere alle normali regolazioni di omogeneità e di sensibilità seguendo le indicazioni del costruttore.

4.2.2.   Verifica della validità delle regolazioni

Utilizzare etanoli di riferimento, contrassegnati con le lettere C, V e B, che presentino una composizione isotopica diversa ma tarata con precisione. Siano C = alcol di canna da zucchero o di mais, V = alcol di vino e B = alcol di barbabietola. Tali campioni sono forniti dal BCR (3.3.1).

Seguendo il procedimento di cui al punto 4.3, determinare i valori isotopici di questi alcol e trascriverli Cmis, Vmis, Bmis. (Vedi 5.3).

Confrontarli con i rispettivi valori di riferimento dati, contrassegnati da Cst, Bst, Vst (vedi 5.3).

Figura 2a

Spettro RMN 2H di un etanolo di vino con uno standard interno

(TMU: N,N tetrametilurea)

Figura 2b

Spettro 2H dell'etanolo realizzato nelle stesse condizioni della figura 2a senza moltiplicazione esponenziale (LB = O)

Lo scarto tipo di ripetibilità ottenuto sulla media di 10 ripetizioni di ciascuno spettro deve essere inferiore a 0,01 per il rapporto R ed inferiore a 0,3 ppm per (D/H)I e per (D/H)II.

I valori medi ottenuti per i vari parametri isotopici [(R, (D/H)I, (D/H)II)] devono cadere nel corrispondente scarto tipo di ripetibilità dato, per tali parametri, per i tre alcol di riferimento, del BCR in caso contrario occorre effettuare nuovamente la regolazione.

4.3.   Registrazione degli spettri RMN

Porre il campione di alcol preparato come in 3.3 (o quello di acqua preparato come in 3.4) in un tubo da 15 o da 10 mm e introdurlo nella sonda.

Gli spettri RMN devono essere ottenuti nelle seguenti condizioni:

Effettuare per ciascuno spettro un numero di accumulazioni NS sufficiente ad ottenere il rapporto segnale/rumore dato al punto 4-1 e ripetere NE = 10 volte tale serie di NS accumulazioni. I valori di NS dipendono dal tipo di spettrometro e di sonda utilizzati (vedi 4) e si sceglierà ad esempio:

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Caso dell'etanolo

Per ciascuno dei 10 spettri determinare (vedi spettro RMN dell'etanolo, figura 2a):

dove

L'utilizzazione dell'altezza dei segnali al posto delle superfici misurabili con minore precisione suppone larghezze uguali a metà altezza e questa è un'approssimazione ragionevole (figura 2 b).

5.2.   Caso dell'acqua

Quando il rapporto isotopico dell'acqua è determinato con l'RMN, partendo dalla miscela acqua-TMU, si usa la seguente relazione:

dove

5.3.

Per ciascuno dei parametri isotopici, calcolare la media di 10 determinazioni e l'intervallo fiduciale. Un software opzionale (ad esempio RMN-FINS) adattabile all'elaboratore dello spettrometro consente di effettuare in linea tali calcoli. Osservazione: Se, dopo la regolazione dello spettrometro, si ha uno scarto sistematico tra i valori medi ottenuti per le caratteristiche isotopiche degli alcoli di riferimento (4.2.2) e i valori indicati dal BCR, a meno dello scarto-tipo, si potrà applicare la seguente correzione per ottenere il valore reale di un campione X qualsiasi. L'interpolazione si effettuerà prendendo i valori dei campioni di riferimento immediatamente superiore e inferiore a quello del campione X. Sia il valore misurato e il valore corretto; si avrà: dove Esempio: Campioni di riferimento forniti e tarati dal BCR: Campioni di riferimento misurati dal laboratorio: Campione sospetto non corretto: Si calcola α = 1,0255 e

6.   INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Confrontare il valore RX ottenuto per il rapporto R del campione sospetto con i rapporti ottenuti per i vini testimoni. Se il valore di RX si discosta di più di 2 scarti tipo dal valore medio RT ottenuto per i vini testimoni, vi è presunzione di adulterazione.

6.1.   Aumento del titolo alcolometrico naturale con aggiunta di zucchero di barbabietola o di canna o con glucosio di mais

6.1.1.   Vini

RX maggiore di RT: presunzione di addizione di zucchero di barbabietola.

RX inferiore a RT: presunzione di addizione di zucchero da canna o di zucchero da mais.

Notare che (D/H)II X e (D/H)W QX sono aumentati.

Esaminare (D/H)I X. Vi è presunzione di:

6.1.2.   Mosti, mosti concentrati e mosti concentrati rettificati

I valori dei parametri isotopici dell'alcol estratto, come indicato al punto 3.1 del prodotto fermentato ottenuto (3.2) dal mosto, dal mosto concentrato e dal mosto concentrato rettificato, vengono esaminati secondo quanto prescritto in 6 «interpretazione dei risultati» (6.1.1) confrontandoli con l'alcol estratto dal prodotto di fermentazione dei mosti naturali testimoni.

L'arricchimento, E % vol, esprime il volume di alcol apportato al prodotto fermentato. Conoscendo l'eventuale diluizione effettuata prima della fermentazione (mosti concentrati e mosti concentrati rettificati) ammettendo che 16,83 g di zucchero danno l'1 % vol di alcol, calcolare la quantità in massa di zucchero aggiunto per litro di mosto, di mosto concentrato o di mosto concentrato rettificato.

6.2.   Aumento del titolo alcolometrico naturale con l'aggiunta di una miscela di zucchero di barbabietola e di zucchero di canna o di glucosio di mais

I rapporti istotopici (D/H)I e R risultano meno modificati che nel caso di arricchimento con un solo tipo di zucchero.

(D/H)II e (D/H)W Q risultano aumentati.

La conferma di queste aggiunte può aversi determinando il rapporto 13C/12C dell'etanolo con lo spettrometria di massa; questo rapporto risulterà in tale caso aumentato.

9.   CENERI

1.   DEFINIZIONE

Con il termine ceneri si intende l'insieme dei prodotti ottenuti per incenerimento del residuo dell'evaporazione del vino, condotto in modo da ottenere la totalità dei cationi (ad esclusione dello ione ammonio) sotto forma di carbonati o di altri sali minerali anidri.

2.   PRINCIPIO DEL METODO

Incenerimento dell'estratto del vino, effettuato fra 500 e 550 °C fino a combustione completa del carbonio.

3.   APPARECCHIATURA

3.1.	Bagnomaria a 100 °C

3.2.	Bilancia con sensibilità di un decimo di milligrammo

3.3.	Piastra riscaldante o evaporatore all'infrarosso

3.4.	Forno elettrico con termoregolatore

3.5.	Essiccatore

3.6.	Capsula in platino a fondo piano del diametro di 70 mm ed altezza di 25 mm

4.   MODO DI OPERARE

Versare 20 ml di vino nella capsula in platino previamente tarata (Po g). Fare evaporare su bagnomaria a 100 °C, scaldare il residuo sulla piastra riscaldante a 200 °C o sotto l'evaporatore all'infrarosso, fino a carbonizzazione. Quando non si ha più emissione di vapore, porre la capsula nel forno elettrico portato alla temperatura di 525 ± 25 °C. Dopo 15 minuti di carbonizzazione, ritirare la capusla dal forno, aggiungere 5 ml di acqua distillata che vengono successivamente fatti evaporare sul bagnomaria o sotto l'evaporatore all'infrarosso e riscaldare di nuovo a 525 °C per una decina di minuti.

Se la combustione delle particelle carboniose non è completa, ricominciare le operazioni di lavaggio delle particelle carboniose, di evaporazione dell'acqua e di incenerimento.

Per i vini ricchi di zucchero, conviene, precedentemente alla prima calcinazione, aggiungere all'estratto alcune gocce di olio vegetale puro per impedire che il contenuto trabocchi.

Dopo raffreddamento in essiccatore, pesare la capsula; sia P1g il peso.

Il peso delle ceneri corrispondente al campione prelevato per la prova (20 ml) è p = (P1 − Po) g.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.	Metodo di calcolo Il peso P delle ceneri epresso in grammi per litro con due cifre decimali sarà: P = 50 · p

10.   ALCALINITÀ DELLE CENERI

1.   DEFINIZIONE

Si denomina l'alcalinità delle ceneri la somma dei cationi, diversi dall'ammonio, combinati agli acidi organici del vino.

2.   PRINCIPIO DEL METODO

Titolazione in presenza di metilarancio delle ceneri solubilizzate a caldo con un eccesso noto di acido titolato.

3.   REATTIVI E MATERIALE

3.1.	Soluzione 0,05 M di acido solforico (H2SO4)

3.2.	Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH)

3.3.	Soluzioni in acqua distillata di metilarancio allo 0,1 %

3.4.	Bagnomaria a 100 °C

4.   MODO DI OPERARE

Aggiungere nella capsula di platino contenente le ceneri di 20 ml di vino 10 ml di soluzione 0,05 M di acido solforico (3.1); porre la capsula su bagnomaria a 100 °C per 15 minuti circa, rompendo il residuo con l'aiuto di una bacchetta di vetro per agevolare la dissoluzione. Aggiungere quindi due gocce di soluzione di metilarancio e titolare l'eccesso di acido solforico con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) fino a viraggio al giallo dell'indicatore.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Metodo di calcolo

L'alcalinità delle ceneri espressa in milliequivalenti per litro, con una cifra decimale sarà:

A = 5 (10 − n)

n

=

numero di millilitri di idrossido di sodio 0,1 M

11.   CLORURI

1.   PRINCIPIO DEL METODO

I cloruri vengono dosati direttamente nel vino mediante potenziometria facendo uso dell'elettrodo Ag/AgCl.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	pH metro millivoltmetro graduato almeno di 2 in 2 mV

2.2.	Agitatore magnetico

2.3.	Elettrodo Ag/AgCl, con una soluzione satura di nitrato di potassio come elettrolita

2.4.	Microburetta graduata a 1/100 di ml

2.5.	Cronometro

3.   REATTIVI

3.1.	Soluzione standard di cloruri: 2,1027 g di cloruro di potassio, KCl (massimo 0,005 % guadi Brix), essiccati prima dell'uso mediante conservazione per qualche giorno in un essiccatore, vengono sciolti in acqua distillata e portati al volume di 1 litro. 1 ml di questa soluzione contiene 1 mg di Cl−.

3.2.	Soluzione titolata di nitrato di argento: 4,7912 g di nitrato di argento, AgNO3, vengono sciolti e portati al volume di 1 litro in una soluzione alcolica al 10 % (v/v): 1 ml di questa soluzione corrisponde a 1 mg di Cl−.

3.3.	Acido nitrico almeno al 65 % ( ρ 20 = 1,40 g/ml).

4.   MODO DI OPERARE

4.1.

5,0 ml di soluzione standard di cloruri vengono introdotti in un recipiente cilindrico di 150 ml sistemato su un agitatore magnetico, diluiti a 100 ml circa con acqua distillata ed acidificati con 1,0 ml di acido nitrico al 65 % minimo. Dopo l'immersione dell'elettrodo, titolare aggiungendo con la microburetta la soluzione titolata di nitrato di argento, agitando moderatamente. Le aggiunte effettuate sono, all'inizio di 1,00 ml per i primi 4 ml, leggere i valori corrispondenti in millivolt. Aggiungere poi i 2 ml successivi suddivisi in frazioni di 0,20 ml. Riprendere infine le aggiunte di 1 ml per volta, finché non saranno stati aggiunti in totale 10 ml. Dopo ciascuna aggiunta aspettare circa 30 secondi prima di effettuare la lettura dei millivolt corrispondenti. Portare i valori ottenuti su carta millimetrata, in funzione dei millilitri di soluzione titolata corrispondenti e determinare il potenziale del punto di equivalenza in base al punto singolo della curva ottenuta.

4.2.

In un recipiente cilindrico da 150 ml vengono introdotti 5 ml della soluzione standard di cloruri, nonché 95 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico al 65 % minimo. Immergere l'elettrodo e titolare agitando fino a ottenimento del potenziale del punto di equivalenza. Questa determinazione viene ripetuta fino al raggiungimento di una buona concordanza tra i risultati. È necessario effettuare questo controllo prima di ciascuna serie di dosaggi dei cloruri nei campioni.

4.3.	50 ml di vino da analizzare vengono introdotti in un recipiente cilindrico da 150 ml. Aggiungere 50 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico di concentrazione non inferiore al 65 % e titolare secondo il procedimento indicato al punto 4.2.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Calcoli

Se n rappresenta il numero dei millilitri di soluzione titolata di nitrato d'argento, il tenore in cloruri del prodotto in esame è:

5.2.   Ripetibilità (r)

r

=

1,2 mg di C1 per litro

r

=

0,03 meq/l

r

=

2,0 mg NaCl/l

5.3.   Riproducibilità (R)

R

=

4,1 mg di Cl per litro

R

=

0,12 meq/l

R

=

6,8 mg NaCl/l

6.

Osservazioni: Dosaggio molto preciso. Si fa riferimento alla curva di titolazione completa ottenuta durante il dosaggio del prodotto in esame mediante la soluzione di nitrato di argento. a) Versare 50 ml di vino da analizzare in un recipiente cilindrico da 150 ml. Aggiungere 50 ml di acqua distillata e 1 ml di acido nitrico ad una concentrazione non inferiore al 65 %. Titolare per mezzo della soluzione di nitrato di argento, procedendo ad aggiunte di 0,5 ml per le quali si rileva il corrispondente potenziale in millivolt. Dedurre da questa prima titolazione il volume approssimativo di soluzione di nitrato di argento necessario. b) Ricominciare il dosaggio nelle stesse condizioni. Procedere all'inizio ad aggiunte di 0,5 ml di soluzione titolante fino a che il volume aggiunto è inferiore di 1,5-2 ml al volume determinato in a). Procedere quindi ad aggiunte di 0,2 ml; continuare le aggiunte al di là del punto di equivalenza approssimativamente individuato, in modo simmetrico, mediante aggiunta di 0,2 e poi di 0,5 ml. Il punto finale del dosaggio ed il volume di soluzione di nitrato di argento esattamente consumato viene ottenuto: — tracciando la curva e determinando il punto di equivalenza, oppure — con il calcolo: —  — dove: —   V = volume di soluzione titolata al punto di equivalenza V′ = volume di soluzione titolata prima del più grande salto di potenziale ΔVi = volume costante delle frazioni di soluzione titolata aggiunte, ovvero 0,2 ml ΔΔE1 = differenza di potenziale prima della più grande variazione di potenziale ΔΔE2 = seconda differenza di potenziale dopo la più grande variazione di potenziale Esempio: Volume di soluzione titolata di AgNO3 Potenziale E in mV Differenza ΔE Differenza seconda ΔΔE 0 204         4   0,2 208   0     4   0,4 212   2     6   0,6 218   0     6   0,8 224   0     6   1,0 230   2     8   1,2 238   4     12   1,4 250   10     22   1,6 272   22     44   1,8 316   10     34   2,0 350   8     26   2,2 376   6     20   2,4 396     In questo esempio il punto finale della titolazione è situato tra 1,6 e 1,8 ml: perché è in questo intervallo che appare il più grande salto di potenziale (ΔE = 44 mV). Il volume di soluzione titolata di nitrato di argento consumato per dosare i cloruri nella aliquota di sostanza da analizzare è il seguente:

12.   SOLFATI

1.   PRINCIPIO DEI METODI

1.1.   Metodo di riferimento

Precipitazione del solfato di bario e pesata. Il fosfato di bario precipitato nelle stesse condizioni viene eliminato mediante lavaggio del precipitato con acido cloridrico.

Nel caso dei mosti o dei vini ricchi di anidride solforosa, è necessaria una desolfitazione preliminare mediante ebollizione al riparo dall'aria.

1.2.   Metodo rapido di prova

Classificazione dei vini in diverse categorie mediante un metodo detto dei limiti, basato sulla precipitazione del solfato di bario mediante una soluzione titolata di ione bario.

2.   METODO DI RIFERIMENTO

2.1.   Reattivi

2.1.1.

Acido cloridrico in soluzione 2 M.

2.1.2.

Cloruro di bario in soluzione di 200 g/l di BaCl2, 2H2O.

2.2.   Modo di operare

2.2.1.   Caso generale

In una provetta da centrifuga da 50 ml introdurre 40 ml di campione da analizzare; aggiungere 2 ml di acido cloridrico 2 M e 2 ml di soluzione di cloruro di bario di 200 g/l; agitare con una bacchetta di vetro; lavare la bacchetta con poca acqua distillata e lasciare a riposo per 5 minuti. Centrifugare per 5 minuti, poi decantare con precauzione il liquido surnatante.

Lavare quindi il precipitato di solfato di bario procedendo come segue: aggiungere 10 ml di acido cloridrico 2 M, mettere il precipitato in sospensione e centrifugare per 5 minuti. Separare con precauzione il liquido surnatante. Ripetere due volte il lavaggio del precipitato nelle stesse condizioni con 15 ml di acqua distillata ogni volta.

Travasare quantitativamente lavando con acqua distillata il precipitato in una capsula di platino tarata e sistemarla su un bagnomaria a 100 °C fino a evaporazione a secco. Il precipitato essiccato viene calcinato parecchie volte brevemente su fiamma fino a ottenimento di un residuo bianco. Lasciar raffreddare in un essiccatore e pesare.

Sia m la massa in milligrammi di solfato di bario ottenuta.

2.2.2.

Caso particolare: mosti solfitati e vino a elevato tenore di anidride solforosa Procedere in primo luogo all'eliminazione dell'anidride solforosa. In una beuta da 500 ml munita di imbuto separatore e di tubo di scarico introdurre 25 ml d'acqua e 1 ml di acido cloridrico ( ρ 20 = 1,15 — 1,18 g/ml). Far bollire questa soluzione per eliminare l'aria e introdurre 100 ml di vino attraverso l'imbuto separatore, mantenendo l'ebollizione. Continuare l'ebollizione finché il volume del liquido contenuto nella beuta viene ridotto a circa 75 ml e travasarlo quantitativamente, previo raffreddamento, in un matraccio tarato da 100 ml. Portare a volume con acqua. Procedere al dosaggio dei solfati su un'aliquota di 40 ml, come indicato al punto 2.2.1.

2.3.   Espressione dei risultati

2.3.1.   Calcoli

Il tenore in solfati, espresso in milligrammi per litro di solfato di potassio, K2SO4 è di:

18,67 × m

Il tenore del mosto o del vino in solfati viene espresso in milligrammi per litro di solfato di potassio, senza decimali.

2.3.2.   Ripetibilità (r)

Fino a 1 000 mg/l: r = 27 mg/l

Attorno a 1 500 mg/l: r = 41 mg/l

2.3.3.   Riproducibilità (R)

Fino a 1 000 mg/l: R = 51 mg/l

Attorno a 1 500 mg/l: R = 81 mg/l

▼M8 —————

▼B

13.   ACIDITÀ TOTALE

1.   DEFINIZIONE

L'acidità totale è la somma delle acidità titolabili allorché si porta il pH a 7 per addizione di una soluzione alcalina titolata.

Il biossido di carbonio non è compreso nell'acidità totale.

2.   PRINCIPIO DI METODO

Titolazione potenziometrica o titolazione in presenza di blu di bromotimolo, come indicatore di fine reazione, per confronto con un campione colorato.

3.   REATTIVI

3.1.	Soluzione tampone a pH 7,0: fosfato monopotassico KH2PO4: 107,3 g soluzione M di idrossido di sodio (NaOH): 500 ml acqua q.b. a: 1 000 ml Le soluzioni tampone reperibili in commercio possono essere utilizzate.

3.2.	Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH).

3.3.	Soluzione di blu di bromotimolo a 4 g/l. Blu di bromotimolo (C27H28Br2O5S): … 4 g Alcool neutro a 96 % vol: … 200 ml Dopo aver solubilizzato aggiungere:   Acqua esente da CO2: … 200 ml Soluzione M di idrossido di sodio   q.b. a colorazione blu-verde (pH = 7): … 7,5 ml Acqua q.b. a: … 1 000 ml

4.   APPARECCHIATURA

4.1.	Pompa per vuoto ad acqua.

4.2.	Beuta da vuoto da 500 ml.

4.3.

Potenziometro con scala tarata in unità di pH e relativi elettrodi. L'elettrodo di vetro deve essere conservato in acqua distillata. L'elettrodo al calomelano-cloruro di potassio saturo deve essere conservato in una soluzione satura di cloruro di potassio. Nella maggior parte dei casi si usa un elettrodo combinato; conservarlo in acqua distillata.

4.4.	Recipiente cilindrico da 50 ml per i vini e da 100 ml per i mosti concentrati rettificati.

5.   MODO DI OPERARE

5.1.   Preparazione del campione

5.1.1.   Vini

Eliminazione del biossido di carbonio. Porre in una beuta da vuoto 50 ml di vino; agitare e fare contemporaneamente il vuoto mediante la pompa ad acqua. L'agitazione deve durare 1-2 minuti.

5.1.2.   Mosti concentrati rettificati

Introdurre 200 g di mosto concentrato rettificato pesato esattamente, in un pallone tarato da 500 ml. Portare a volume con acqua. Omogeneizzare.

5.2.   Titolazione potenziometrica

5.2.1.   Taratura del pHmetro

Si effettua a 20 °C seguendo le istruzioni date per l'apparecchio utilizzato con la soluzione tampone a pH 7 a 20 °C.

5.2.2.   Modo di operare

In un recipiente cilindrico (4.4) versare una quantità del campione preparato come descritto al punto 5.1 pari a 10 ml nel caso del vino ed a 50 ml nel caso del mosto concentrato rettificato. Aggiungere 10 ml circa di acqua distillata e aggiungere con la buretta la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) sino a portare il pH a 7 a 20 °C. L'addizione della soluzione alcalina deve essere effettuata lentamente sotto costante agitazione. Sia n il numero di ml di NaOH 0,1 M utilizzati.

5.3.   Titolazione con indicatore (blu di bromotimolo)

5.3.1.   Prova preliminare: fissazione dello standard di colorazione

Versare in un recipiente cilindrico (4.4) 25 ml di acqua distillata bollita, 1 ml di soluzione di blu di bromotimolo (3.3) e una quantità di campione preparato come descritto al punto 5.1 pari a 10 ml nel caso del vino ed a 50 ml nel caso del mosto concentrato rettificato. Aggiungere la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) sino ad ottenere una colorazione blu-verde. Aggiungere 5 ml della soluzione tampone a pH 7 (3.1).

5.3.2.   Dosaggio

Versare in un recipiente cilindrico (4.4) 30 ml di acqua distillata bollita, 1 ml di soluzione di blu di bromotimolo (3.3), un volume di campione, preparato come indicato al punto 5.1, da 10 ml nel caso del vino e da 50 ml nel caso di mosto concentrato rettificato. Aggiungere la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) sino ad ottenere una colorazione identica a quella ottenuta con il saggio preliminare (5.3.1). Sia n il numero di ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 M versati.

6.   ESPRESSIONE DEL RISULTATI

6.1.   Metodo di calcolo

6.1.1.   Vini

L'acidità totale, espressa in milliequivalenti per litro, sarà:

A = 10 n,

il valore è dato con una cifra decimale.

L'acidità toale, espressa in grammi di acido tartarico per litro, sarà:

A′ = 0,075 · A,

il valore è dato con una cifra decimale.

6.1.2.   Mosti concentrati rettificati

6.2.   Ripetibilità (r): per la titolazione con l'indicatore

r

=

0,9 meq/l

r

=

0,07 g di acido tartarico/l

6.3.   Riproducibilità (R): per la titolazione con l'indicatore (5.3)

Per i vini bianchi e rosati:

R

=

3,6 meq/l

R

=

0,3 g di acido tartarico/l

Per i vini rossi:

R

=

5,1 meq/l

R

=

0,4 g di acido tartarico/l

14.   ACIDITÀ VOLATILE

1.   DEFINIZIONE

L'acidità volatile è costituita dagli acidi appartenenti alla serie acetica che si trovano nel vino allo stato libero o come sali.

2.   PRINCIPIO DEL METODO

Titolazione degli acidi volatili separati dal vino per trascinamento in corrente di vapore d'acqua e rettifica dei vapori.

Il vino viene prima liberato dal biossido di carbonio.

In queste condizioni occorre sottrarre dall'acidità del distillato l'acidità del biossido di zolfo libero e combinato che è stato distillato.

Occorre anche detrarre l'acidità dovuta all'acido sorbico eventualmente aggiunto al vino.

Nota: L'acido salicilico utilizzato in taluni paesi prima dell'analisi per stabilizzare i vini, si ritrova in parte nel distillato. È quindi necessario dosarlo e detrarlo dall'acidità volatile. Il metodo di dosaggio è riportato nel punto 7 al presente capitolo.

3.   REATTIVI

3.1.	Acido tartarico cristallizzato (C4H6O6)

3.2.	Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (NaOH)

3.3.	Soluzione di fenolftaleina all'1 % in alcol neutro al 96 % vol

3.4.	Acido cloridrico ( ρ 20 = 1,18 — 1,19 g/ml) diluito ¼ (v/v)

3.5.	Soluzione 0,005 M di iodio (I2)

3.6.	Ioduro di potassio cristallizzato (KI)

3.7.	Salda di amido a 5 g/l Disperdere 5 g di amido in circa 500 ml di acqua. Portare all'ebollizione agitando e mantenerla per 10 minuti; aggiungere 200 g di cloruro di sodio. Dopo aver lasciato raffreddare portare a 1 l.

3.8.	Soluzione satura di tetraborato di sodio (Na2B4O7, 10 H2O), cioè circa 55 g/l a 20 °C.

4.   APPARECCHIATURA

4.1.

Apparecchio di distillazione in corrente di vapore di acqua composto da: 1. un generatore di vapore d'acqua; il vapore d'acqua prodotto deve essere esente da biossido di carbonio; 2. un gorgogliatore; 3. una colonna di rettifica; 4. un refrigerante. L'apparecchio deve soddisfare alle condizioni definite dai seguenti tre saggi: a) Versare nel gorgogliatore 20 ml di acqua bollita; raccogliere 250 ml di distillato ed addizionarvi 0,1 ml di soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) e 2 gocce della soluzione di fenolftaleina (3.3); la colorazione rosa deve mantenersi stabile per almeno 10 secondi (vapore d'acqua esente da biossido di carbonio). b) Versare nel gorgogliatore 20 ml di una soluzione 0,1 M di acido acetico. Raccogliere 250 ml di distillato. Titolare con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2). Il volume impiegato deve essere almeno pari a 19,9 ml (acido acetico trascinato ≥ 99,5 %). c) Versare nel gorgogliatore 20 ml di una soluzione M di acido lattico. Raccogliere 250 ml di distillato e titolarne l'acidità con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2). Il volume impiegato deve essere inferiore o uguale a 1,0 ml (acido lattico distillato ≤ 0,5 %). Gli apparecchi o le tecniche che soddisfano a questi saggi sono da considerare apparecchi o tecniche ufficiali internazionali.

4.2.	Pompa per vuoto a caduta d'acqua.

4.3.	Beuta da vuoto.

5.   MODO DI OPERARE

5.1.	Preparazione del campione: eliminazione del biossido di carbonio. Versare circa 50 ml di vino in una beuta da vuoto; agitare e creare contemporaneamente il vuoto per mezzo della pompa per vuoto a caduta d'acqua. L'agitazione deve durare 1 o 2 minuti.

5.2.	Trascinamento in corrente di vapore d'acqua Versare nel gorgogliatore 20 ml di vino privato, come descritto al punto 5.1, del biossido di carbonio. Aggiungere circa 0,5 g di acido tartarico (3.1). Raccogliere almeno 250 ml di distillato.

5.3.

Titolazione Titolare con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio (3.2) in presenza di due gocce di soluzione di fenolftaleina (3.3), sia n il volume in ml impiegato. Aggiungere 4 gocce di acido cloridrico diluito ¼ (3.4), 2 ml di salda di amido (3.7) ed alcuni cristalli di ioduro di potassio (3.6). Titolare il biossido di zolfo libero con la soluzione 0,005 M di iodio (3.5). Sia n′ il volume in ml impiegato. Aggiungere la soluzione satura di tetraborato di sodio (3.8) sino al ritorno del colore rosa. Titolare il biossido di zolfo combinato con la soluzione 0,005 M di iodio (3.5). Sia n″ il volume in ml impiegato.

6.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1.   Procedimento di calcolo

L'acidità volatile espressa in milliequivalenti per litro, con una cifra decimale, sarà:

A = 5 (n − 0,1 n′ − 0,05 n″)

L'acidità volatile espressa in grammi di acido acetico per litro con due cifre decimali, sarà:

0,300 (n − 0,1 n′ − 0,05 n″)

6.2.   Ripetibilità (r)

r

=

0,7 meq/l

r

=

0,04 g di acido acetico/l

6.3.   Riproducibilità (R)

R

=

1,3 meq/l

R

=

0,08 g di acido acetico/l

6.4.   Vini addizionati di acido sorbico

Poiché con i primi 250 ml di distillato viene trascinato il 96 % dell'acido sorbico, occorre detrarre la sua acidità dall'acidità volatile tenendo conto che 100 mg di acido sorbico, corrispondono ad una acidità di 0,89 milliequivalenti o di 0,053 g di acido acetico e conoscendo il tenore di acido sorbico (mg/l) determinato a parte.

7.   DETERMINAZIONE DELL'ACIDO SALICILICO TRASCINATO NEL DISTILLATO DELL'ACIDITÀ VOLATILE

7.1.   Principio

Una volta determinata l'acidità volatile ed effettuata la correzione per il biossido di zolfo, la presenza di acido salicilico è caratterizzata, dopo acidificazione, dalla colorazione violetta che si forma per addizione di un sale di ferro III.

La determinazione dell'acido salicilico trascinato nel distillato con l'acidità volatile, è effettuata su un secondo distillato avente lo stesso volume di quello su cui è stato effettuato il dosaggio dell'acidità volatile. In tale distillato, si determina l'acido salicilico con un metodo colorimetrico per confronto. Lo si detrae quindi dall'acidità del distillato.

7.2.   Reattivi

7.2.1.

Acido cloridrico (HCl) ( ρ 20 = 1,18 — 1,19 g/ml)

7.2.2.

Tiosolfato di sodio (Na2S2O3; 5 H2O) in soluzione 0,1 M.

7.2.3.

Soluzione di solfato ferrico ammonico [Fe2(SO4)3 · (NH4)2 SO4 · 24 H2O] al 10 % (m/v).

7.2.4.

Soluzione di salicilato di sodio 0,01 M Soluzione contenente 1,60 g/l di salicilato di sodio (Na C7 H5 O3).

7.3.   Modo di operare

7.3.1.   Caratterizzazione dell'acido salicilico nel distillato dell'acidità volatile

Subito dopo avere determinato l'acidità volatile ed averla corretta per il biossido di zolfo libero e combinato, aggiungere nella beuta 0,5 ml di acido cloridrico (7.2.1), 3 ml della soluzione 0,1 M di tiosolfato di sodio (7.2.2) ed 1 ml della soluzione di solfato ferrico ammonico (7.2.3).

In presenza di acido salicilico si ha la formazione di una colorazione violetta.

7.3.2.   Dosaggio dell'acido salicilico

Nella beuta conica di cui al punto precedente segnare con un trattino di riferimento il volume del distillato. Svuotare e quindi lavare la beuta.

Sottoporre a distillazione in corrente di vapori d'acqua una nuova presa di campione da 20 ml di vino e raccogliere il distillato nella beuta riempiendola sino al trattino di riferimento. Aggiungere 0,3 ml di acido cloridrico (7.2.1) e 1 ml della soluzione di solfato ferrico ammonico (7.2.3). Il contenuto della beuta assume una colorazione violetta.

Versare, in una beuta identica a quella recante la tacca di riferimento, acqua distillata sino a raggiungere lo stesso livello del distillato. Aggiungere 0,3 ml di acido cloridrico (7.2.1) e 1 ml di soluzione di solfato ferrico ammonico (7.2.3). Aggiungere con una buretta la soluzione di salicilato di sodio 0,01 M (7.2.4) sino ad ottenere una colorazione violetta della stessa intensità di quella della beuta contenente il distillato di vino.

Sia n‴ il numero di millilitri utilizzati.

7.4.   Correzione dell'acidità volatile

Detrarre 0,1 · n‴ ml dal volume di n ml di soluzione di idrossido di sodio 0,1 M impiegato per titolare l'acidità del distillato in sede di dosaggio dell'ecidità volatile.

15.   ACIDITÀ FISSA

1.   PRINCIPIO

L'acidità fissa è determinata per differenza tra l'acidità totale e l'acidità volatile.

2.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

L'acidità fissa si esprime:

16.   ACIDO TARTARICO

1.   PRINCIPIO DEI METODI

1.1.   Metodo di riferimento

L'acido tartarico, precipitato sotto forma di racemato di calcio, viene dosato per via ponderale. Tale dosaggio può essere completato da un dosaggio volumetrico di confronto. Le condizioni di precipitazione (pH, volume totale impiegato, concentrazioni degli ioni precipitanti) sono tali che il racemato di calcio precipita completamente, mentre il tartrato di calcio levogiro D(−) rimane in soluzione.

Il vino, quando è stato addizionato di acido metatartarico che rende incompleta la precipitazione del racemato di calcio, dovrà essere previamente idrolizzato.

1.2.   Metodo usuale

L'acido tartarico, isolato mediante una colonna scambiatrice di anioni, è dosato colorimetricamente nell'eluato grazie alla colorazione rossa che dà con l'acido vanadico. Questo eluato contiene anche gli acidi lattico e malico, che non interferiscono nell'analisi.

2.   METODO DI RIFERIMENTO

2.1.   Metodo ponderale

2.1.1.   Reattivi

2.1.1.1.

Soluzione di acetato di calcio, contenente 10 g/l di calcio: Carbonato di calcio (CaCO3): … 25 g Acido acetico glaciale (CH3COOH) (ρ20 = 1,05 g/ml): … 40 ml Acqua q.b. a.: … 1 000 l

2.1.1.2.

Racemato di calcio cristallizzato: Ca C4O6H4: 4H2O In un becher da 400 ml introdurre 20 ml di una soluzione di acido L(+) tartarico contenente 5 g/l, 20 ml di una soluzione di D(−) tartrato di ammonio a 6, 126 g/l e 6 ml della soluzione di acetato di calcio contenente 10 g/l di calcio (2.1.1.1). Lasciar precipitare per due ore. Raccogliere il precipitato su un crogiuolo filtrante di porosità n. 4 e lavarlo in tre riprese con 30 ml circa di acqua distillata. Essiccare in stufa a 70 °C fino a peso costante. Con le quantità di reattivo adoperate si ottengono circa 340 mg di racemato di calcio cristallizzato. Conservare in recipiente chiuso.

2.1.1.3.

Soluzione precipitante (pH 4,75): —  acido D(−)tartarico: … 122 mg —  idrossido di ammonio (ρ20 = 0,97 g/ml) diluita al 25% (v/v): … 0,3 ml —  soluzione di acetato di calcio contenente 10 g/l di calcio: 8,8 ml —  acqua q.b. a: … 1 000 ml Sciogliere l'acido D(−) tartarico e aggiungere l'idrossido di ammonio; portare il volume a 900 ml con acqua; aggiungere 8,8 ml di soluzione di acetato di calcio (2.1.1.1), agitare, aggiustare il pH a 4,75 con l'acido acetico. Portare a 1 litro. Poiché il racemato di calcio è leggermente solubile in questo liquido, è opportuno aggiungere 5 mg/l di racemato di calcio, agitare per 12 ore e filtrare.

2.1.2.   Modo di operare

2.1.2.1.   Vini non addizionati di acido metatartarico

In un becher da 600 ml, porre 500 ml di soluzione precipitante e 10 ml di vino. Mescolare e favorire la precipitazione sfregando le pareti del becher con l'estremità di una bacchetta di vetro. Lasciar precipitare per 12 ore (una notte).

Filtrare su crogiuolo filtrante di porosità n. 4, tarato e collocato su una beuta a vuoto pulita, facendo in modo che il liquido porti con sé il precipitato. Risciacquare col filtrato il recipiente di precipitazione, in maniera da raccogliere le ultime particelle di precipitato.

Essiccare in stufa a 70 °C fino a peso costante. Pesare: sia p il peso di racemato di calcio CaC4O6H4 cristallizzato con 4 molecole d'acqua.

2.1.2.2.   Vini addizionati di acido metatartarico

In caso di presenza effettiva o sospetta di acido metatartarico nel vino, procedere all'idrolisi di tale acido nelle condizioni seguenti:

In una beuta da 50 ml versare 10 ml di vino e 0,4 ml di acido acetico glaciale (CH3COOH, ρ20 = 1,05 g/ml). Chiudere la beuta con un tappo fornito di paraspruzzi e far bollire per 30 minuti. Dopo raffreddamento, travasare in un becher il liquido contenuto nella beuta; risciacquare per due volte la beuta con 5 ml d'acqua e proseguire come indicato più sopra.

Nel calcolo finale, l'acido metatartarico viene computato come acido tartarico.

2.1.3.   Espressioni dei risultati

Una molecola di racemato di calcio corrisponde a mezza molecola di acido L(+)tartarico del vino.

La quantità di acido tartarico per litro di vino espressa in milliequivalenti con una cifra decimale, è uguale a: 384,5 p.

La quantità di acido tartarico per litro di vino, espressa con una cifra decimale in grammi di acido tartarico, è uguale a: 28,84 p.

La quantità di acido tartarico per litro di vino, espressa con una cifra decimale in grammi di tartrato acido di potassio, è uguale a: 36,15 p.

2.2.   Dosaggio volumetrico di confronto

2.2.1.   Reattivi

2.2.1.1.

Acido cloridrico (HCI) (ρ20 = 1,18 - 1,19 g/ml) diluito 1/5 (v/v)

2.2.1.2.

Soluzione di EDTA 0,05 M: EDTA (sale disodico biidrato dell'acido etilendiamminotetracetico (C10H14N2O8Na2; 2H2O): … 18,61 g Acqua distillata q.b. a: … 1 000 ml

2.2.1.3.

Soluzione d'idrossido di sodio al 40 % (p/v): Idrossido di sodio (NaOH): … 40 g Acqua distillata q.b. a: … 100 ml

2.2.1.4.

Indicatore complessometrico all'acido calconcarbonico 1 % (m/m): Acido calconcarbonico o acido 2-idrossi-4-sulfo-1-naftilazo-3-naftoico (C21H14H2O7S, 3H2O): 1 g Solfato di sodio anidro (Na2SO4): … 100 g

2.2.2.   Modo di operare

Dopo pesata, rimettere il crogiuolo contenente il precipitato di racemato di calcio sulla beuta da vuoto e sciogliere il precipitato con 10 ml di acido cloridrico diluito (2.2.1.1). Lavare il crogiuolo filtrante con 50 ml di acqua distillata.

Aggiungere 5 ml di soluzione di idrossido di sodio al 40 % (2.2.1.3) e 30 mg circa di indicatore (2.2.1.4). Titolare con l'EDTA 0,05 M (2.2.1.2). Sia n il numero di ml impiegati.

2.2.3.   Espressione dei risultati

La quantità di acido tartarico per litro di vino espressa con una cifra decimale in milliequivalenti, è uguale a: 5 n.

La quantità di acido tartarico per litro di vino espressa con una cifra decimale, in grammi di acido tartarico, è uguale a: 0,375 n.

La quantità di acido tartarico per litro di vino espresso con una cifra decimale, in grammi di tartrato acido di potassio, è uguale a: 0,470 n.

▼M8 —————

▼B

17.   ACIDO CITRICO

1.   PRINCIPIO DEI METODO

L'acido citrico viene trasformato in ossalacetato e acetato in una reazione catalizzata dalla citrato-liasi (CL):

citrato ossalacetato + acetato

In presenza della malato-deidrogenasi (MDH) e della lattato-deidrogenasi (LDH), l'ossalacetato e il suo derivato di decarbossilazione, il piruvato, vengono ridotti dal nicotinammide — adenina-dinucleotide ridotto (NADH) a L-malato ed a L-lattado:

Ossalacetato + NADH + H+ L-malato + NAD+

Piruvato + NADH + H+ L-lattato + NAD+

In queste reazioni, la quantità di NADH ossidato a NAD+ è proporzionale al citrato presente. L'ossidazione dell'NADH viene misurata dalla diminuzione della sua assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm.

2.   REATTIVI

2.1.

Tampone a pH 7,8 (glicilglicina 0,51 M; pH 7,8 Zn2+: 0,6 · 10− 3 M): sciogliere in circa 70 ml di acqua bidistillata 7,13 g di glicilglicina; portare il pH a 7,8 con circa 13 ml di soluzione di idrossido di sodio 5 M; addizionare 10 ml di soluzione di cloruro di zinco ZnCl2 80 mg/100 ml; portare a 100 ml con acqua bidistillata. La soluzione rimane stabile a + 4 °C per almeno 4 settimane.

2.2.	Soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide ridotto (NADH), circa 6 · 10− 3 M, sciogliere 30 mg di NADH e 60 mg di NaHCO3 in 6 ml di acqua bidistillata.

2.3.	Soluzione di malato deidrogenasi/lattato deidrogenasi (MDH/LDH) (0,5 mg MDH/ml; 2,5 mg/ml): miscelare 0,1 ml di MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml di soluzione di solfato di ammonio (3,2 M) l 0,5 ml di LDH (5 mg/ml). A 4 °C questa sospensione si mantiene stabile per almeno un anno.

2.4.

Citrato-liasi CL (5 mg di proteina/ml): sciogliere in un ml di acqua ghiacciata 168 mg di liofilizzato. Alla temperatura di 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno una settimana e se congelata per almeno 4 settimane. Prima del dosaggio si raccomanda di procedere alla verifica dell'attività dell'enzima.

2.5.	Polivinilpolipirrolidone (PVPP) Nota: L'insieme dei reattivi necessari per la determinazione si trova pronto in commercio.

3.   APPARECCHIATURA

3.1.

Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, massimo di assorbimento dell'NADH. In alternativa si può usare, il fotometro a spettro discontinuo con lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm. Poiché si tratta di misure assolute di assorbanza (senza curva di taratura ma con riferimento al coefficiente di estinzione del NADH), occorre controllare le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio.

3.2.	Celle di vetro con cammino ottico di 1 cm o celle monouso.

3.3.	Micropipette per il prelievo di volumi compresi tra 0,02 e 2 ml.

4.   PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

Il dosaggio del citrato si effettua in genere direttamente sul vino senza preventiva decolorazione o diluizione, a condizione che il tenore in acido citrico sia inferiore a 400 mg/l. In caso contrario diluire il vino in modo che la concentrazione in citrato sia compresa tra 20 e 400 mg/l (quantità di citrato nella presa di campione compresa fra 5 µg e 80 µg).

Nel caso del vino rosso ricco di composti fenolici, si raccomanda di trattarlo preliminarmente con la PVPP:

mettere in sospensione nell'acqua 0,2 gr circa di PVPP, lasciare riposare per 15 minuti. Filtrare su filtro a pieghe.

Addizionare a 10 ml di vino versato in una beuta conica da 50 ml, il PVPP umido prelevato dal filtro con la spatola. Agitare per 2-3 minuti. Filtrare.

5.   MODO DI OPERARE

Regolato lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 340 nm, effettuare le misure di assorbanza in celle da 1 cm dopo aver aggiustato l'apparecchio allo zero di assorbanza contro aria (senza la cella sul percorso ottico).

Introdurre nelle celle da 1 cm:

Mescolare; dopo circa 5 minuti leggere le assorbanze della soluzione del bianco e di quella del campione (A1).

Aggiungere:

Mescolare; attendere che la reazione abbia termine (circa 5 minuti) e leggere le assorbanze della soluzione del bianco e del campione (A2).

Determinare le differenze di assorbanza (A1 − A2) del bianco e del campione.

Sottrarre la differenza delle assorbanze del bianco dalla differenza delle assorbanze del campione: ΔA = ΔAC − ΔAB

Nota:

il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro; qui viene dato soltanto a titolo indicativo. Se ne raccomanda la determinazione per ciascun lotto.

6.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Il tenore in acido citrico è dato in mg per litro (mg/l) senza cifre decimali.

6.1.   Metodo di calcolo

La concentrazione in milligrammi per litro è data dalla seguente formula generale:

dove:

V

=

volume in ml della soluzione impiegata per la prova (in questo caso 3,14 ml)

v

=

volume del campione in ml (in questo caso 0,2 ml)

PM

=

peso molecolare della sostanza da dosare (in questo caso acido citrico anidro = 192,1)

d

=

cammino ottico della cella in cm (in questo caso 1 cm)

ε

=

coefficiente di assorbanza dell'NADH a 340 nm,

ε

=

6,3 mmole − 1 · l · cm − 1.

Si ottiene:

C = 479 · ΔA

Se per preparare il campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.

Nota:

a 334 nm: C = 488 · ΔA (ε = 6,2 mmole − 1 · l · cm − 1)

a 365 nm: C = 887 · ΔA (ε = 3,4 mmole − 1 · l · cm − 1)

6.2.   Ripetibilità (r)

Tenore in acido citrico inferiore a 400 mg/l: r = 14 mg/l

Tenore in acido citrico superiore a 400 mg/l: r = 28 mg/l

6.3.   Riproducibilità (R)

Tenore in acido citrico inferiore a 400 mg/l: R = 39 mg/l

Tenore in acido citrico superiore a 400 mg/l: R = 65 mg/l.

18.   ACIDO LATTICO

1.   PRINCIPIO DEL METODO

1.1.   Metodo di riferimento

L'acido lattico totale (L-lattato e D-lattato) viene ossidato, in presenza di nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD), a piruvato mediante una reazione catalizzata dalla L-lattato deidrogenasi (L-LDH) e dalla D-lattato deidrogenasi (D-LDH).

L'equilibrio della reazione è spostato verso il lattato. L'eliminazione del piruvato dal mezzo di reazione sposta l'equilibrio della reazione nel verso della formazione di piruvato. In presenza di L-glutammato, il piruvato è trasformato in L-alanina con una reazione catalizzata dal glutammato-piruvato-transaminasi (GPT)

(1)	L-lattato + NAD+ piruvato + NADH + H+

(2)	D-lattato + NAD+ piruvato + NADH + H+

(3)	Piruvato + L-glutammato L-alanina + α-chetoglutarato

La formazione di NADH, misurata dall'aumento di assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm, è proporzionale alla quantità di lattato presente.

Nota:

L'acido L-lattico può essere determinato singolarmente mediante le reazioni (1) e (3).

L'acido D-lattico può essere determinato singolarmente mediante le reazioni (2) e (3).

1.2.   Metodo usuale

L'acido lattico, separato su colonna di resina scambiatrice di anioni viene ossidato a etanale e dosato per colorimetria dopo reazione con nitroprussiato di sodio e piperidina.

2.   METODO DI RIFERIMENTO

2.1.   Reattivi

2.1.1.

Soluzione tampone a pH 10 (glicilglicina a 0,6 mole/l; L-glutammato a 0,1 mole/l). Sciogliere in circa 50 ml di acqua bidistillata 4,75 g di glicilglicina, e 0,88 g di acido L-glutammico; portare a pH 10 con alcuni ml di soluzione di idrossido di sodio a 10 M e portare a 60 ml con acqua bidistillata. Alla temperatura di 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno 12 settimane.

2.1.2.

Soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD) a circa 40 · 10 − 3 M; sciogliere in 30 ml di acqua bidistillata 900 mg di NAD. Alla temperatura di 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno 4 settimane.

2.1.3.

Sospensione di glutammato-piruvato-transaminasi (GPT) a 20 mg/ml. Alla temperatura di 4 °C la sospensione si mantiene stabile per almeno 1 anno.

2.1.4.

Sospensione di L-lattato-deidrogenasi (L-LDH) a 5 mg/ml. Alla temperatura di 4 °C la sospensione si mantiene stabile per almeno 1 anno.

2.1.5.

Sospensione di D-lattato-deidrogenasi (D-LDH) a 5 mg/ml. Alla temperatura di 4 °C la sospensione si mantiene stabile per almeno 1 anno. Prima del dosaggio si raccomanda di procedere alla verifica dell'attività dell'enzima. Nota: Il complesso dei reattivi necessari è reperibile in commercio.

2.2.   Apparecchiatura

2.2.1.

Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, e massimo di assorbimento dell'NADH. In alternativa può essere impiegato un fotometro a spettro discontinuo con lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm. Poiché si tratta di misurazioni assolute di assorbanza (senza curva di taratura, ma con riferimento al coefficiente di estinzione del NADH), occorre controllare le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio.

2.2.2.

Celle di vetro con cammino ottico da 1 cm o celle monouso.

2.2.3.

Micropipette per il prelievo di volumi compresi tra 0,02 e 2 ml.

2.3.   Preparazione del campione

Evitare di toccare con le dita la parte di vetreria che viene a contatto con il mezzo di reazione in quanto ciò potrebbe apportare acido L-lattico che falserebbe il risultato.

Se la concentrazione in acido lattico è inferiore a 100 mg/l, il dosaggio del lattato si effettua in genere direttamente sul vino senza decolorazione preliminare e senza diluizione. Se la concentrazione in acido lattico è compresa tra:

2.4.   Modo di operare

2.4.1.   Dosaggio dell'acido lattico totale

Prima di procedere al dosaggio la soluzione tampone deve essere portata a 20-25 °C.

Regolato lo spettrofotometro sulla lunghezza d'onda di 340 nm, effettuare le misure di assorbanza nelle celle da 1 cm, aggiustando l'apparecchio allo zero di assorbanza contro aria (togliendo la cella dal percorso ottico) o contro acqua.

Introdurre nelle celle da 1 cm:

Mescolare mediante una bacchetta di vetro o di materiale sintetico provvista di una estremità appiattita; dopo circa 5 minuti misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A1).

Aggiungere 0,02 ml di soluzione 2.1.4 e 0,05 ml di soluzione 2.1.5, omogeneizzare, attendere la fine della reazione circa 30 minuti misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A2).

Determinare le differenze di assorbanza (A2 − A1) del bianco e del campione.

Detrarre la differenza di assorbanza del bianco dalla differenza di assorbanza del campione:

ΔA = ΔAC − ΔAB

2.4.2.   Dosaggio dell'acido L-lattico e dell'acido D-lattico

Il dosaggio dell'acido L-lattico e D-lattico può essere realizzato singolarmente applicando il modo di operare indicato per l'acido lattico totale, ma operando come segue una volta determinato A1:

Aggiungere 0,02 ml di soluzione 2.1.4, omogeneizzare, aspettare la fine della reazione (circa 20 minuti) e misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A2).

Aggiungere 0,05 ml di soluzione 2.1.5, omogeneizzare, attendere che la reazione abbia termine (30 minuti circa) e misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A3).

Determinare le differenze di assorbanze (A2 − A1) per l'acido L-lattico e (A3 − A2) per l'acido D-lattico del bianco e del campione.

Detrarre la differenza di assorbanza del bianco dalla differenza di assorbanze del campione:

ΔA = ΔAC − ΔAB

Nota:

Il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro. Qui viene riportato soltanto a titolo indicativo. Se ne raccomanda la determinazione per ciascun lotto. Quando si dosa soltanto l'acido L-lattico, il tempo di incubazione dopo l'addizione della L-lattato deidrogenasi può essere ridotto a 10 minuti.

2.5.

Espressione dei risultati La concentrazione in acido lattico è espressa in grammi per litro (g/l) con una cifra decimale. 2.5.1.   Procedimento di calcolo La concentrazione in grammi per litro si calcola mediante la formula generale: V = volume in ml della soluzione impiegata per la prova (V = 2,24 ml per l'acido L-lattico, V = 2,29 ml per l'acido D-lattico e per l'acido lattico totale) v = volume del campione in ml (in questo caso 0,2 ml) PM = peso molecolare della sostanza da dosare (in questo caso acido DL lattico = 90,08) d = cammino ottico della cella in cm (in questo caso 1 cm) ε = coefficiente di assorbanza dell'NADH a 340 nm, ε = 6,3 (mmole − 1 · l · cm − 1). 2.5.1.1.   Acido lattico totale e acido D-lattico C = 0,164 · ΔA Se per la preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione. Misura a 334 nm: C = 0,167 · ΔA (ε = 6,2 mmole − 1 · l · cm − 1) Misura a 365 nm: C = 0,303 · ΔA (ε = 3,4 mmole − 1 · l · cm − 1) 2.5.1.2.   Acido L-lattico C = 0,160 · ΔA Se per la preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione. misura a 334 nm: C = 0,163 · ΔA (ε = 6,2 mmole − 1 · l · cm − 1) misura a 365 nm: C = 0,297 · ΔA (ε = 3,4 mmole − 1 · l · cm − 1) 2.5.2.   Ripetibilità (r) r = 0,02 + 0,07 Xi g/l Xi = concentrazione in acido lattico del campione espressa in grammi per litro 2.5.3.   Riproducibilità (R) R = 0,05 + 0,125 Xi g/l Xi = concentrazione in acido lattico del campione espressa in grammi per litro

▼M8 —————

▼B

19.   ACIDO L-MALICO

1.   PRINCIPIO DEL METODO

L'acido L-malico (L-malato) viene ossidato in presenza di nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD), a ossalacetato mediante una reazione catalizzata dalla L-malato-deidrogenasi (L-MDH).

L'equilibrio della reazione è spostato verso il malato. L'eliminazione dell'ossalacetato dal mezzo di reazione sposta l'equilibrio della reazione nel senso della formazione dell'ossalacetato. In presenza di L-glutammato, l'ossalacetato viene trasformato in L-aspartato, mediante una reazione catalizzata dalla glutammato-ossalacelato-transaminasi (GOT).

(1)	L-malato + NAD+ ossalacetato + NADH + H+

(2)	Ossalacetato + L-glutammato L-aspartato + α-chetoglutarato.

La formazione di NADH misurata attraverso l'aumento di assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm, è proporzionale alla quantità di L-malato presente.

2.   REATTIVI

2.1.

Tampone a pH 10 (glicilglicina 0,60 M, L-glutammato 0,1 M) Sciogliere in circa 50 ml di acqua bidistillata 4,75 g di glicilglicina e 0,88 g di acido L-glutammico; correggere il pH a 10 con circa 4,6 ml di soluzione di idrossido di sodio 10 M e portare a 60 ml con acqua bidistillata. Alla temperatura di 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno 12 settimane.

2.2.	Soluzione di nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD), circa 47 · 10 − 3 M: sciogliere in 12 ml di acqua bidistillata 420 mg di NAD. Alla temperatura di + 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno 4 settimane.

2.3.	Sospensione di glutammato-ossalacetato-transaminasi (GOT) a 2 mg/ml. Alla temperatura di + 4 °C la sospensione si mantiene stabile per almeno un anno.

2.4.	Soluzione di L-malato-deidrogenasi (L-MDH) a 5 mg/ml. Alla temperatura di + 4 °C la soluzione si mantiene stabile per almeno un anno. Osservazione: Il complesso dei reattivi necessari per il dosaggio è reperibile in commercio.

3.   APPARECCHIATURA

3.1.

Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni a 340 nm, massimo di assorbimento dell'NADH In alternativa può essere utilizzato un fotometro a spettro discontinuo con lunghezza d'onda a 334 nm o a 365 nm. Poiché si tratta di misurazioni assolute di assorbanza (senza curva di taratura, ma riferite al coefficiente di estinzione dell'NADH), occorre controllare le scale delle lunghezze d'onda e delle assorbanze dell'apparecchio.

3.2.	Celle di vetro con un cammino ottico di 1 cm o celle monouso.

3.3.	Micropipette che consentano di prelevare volumi compresi tra 0,01 e 2 ml.

4.   PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

In genere la determinazione dell'L-malato si effettua direttamente sul vino senza preventiva decolorazione e senza diluizione, a condizione che il tenore in acido L-malico sia inferiore a 350 mg/l per misurazioni a 365 nm. In caso contrario, diluire il vino con acqua bidistillata in modo che la concentrazione in L-malato si porti fra 30 e 350 mg/l (quantità di L-malato nel campione di saggio compresa fra 3 e 35 µg).

Se la concentrazione di malato nel vino è inferiore a 30 mg/l, il volume della pesata può essere aumentato sino ad 1 ml. In questo caso ridurre il volume di acqua da aggiungere in modo da avere gli stessi volumi totali nelle due celle.

5.   MODO DI OPERARE

Con lo spettrofotometro regolato sulla lunghezza d'onda 340 nm, effettuare le misure di assorbanza nelle celle aventi un cammino ottico di 1 cm, aggiustando l'apparecchio allo zero di assorbanza contro aria (togliendo la cella dal percorso ottico) o contro acqua.

Introdurre nelle celle da 1 cm:

Mescolare. Dopo circa 3 minuti, misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione da dosare (A1).

Aggiungere:

Mescolare. Attendere la fine della reazione (circa 5-10 minuti) e misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e del campione (A2).

Determinare le differenze delle assorbanze (A2 − A1) del bianco e del campione.

Detrarre la differenza delle assorbanze del bianco dalla differenza delle assorbanze del campione.

ΔA = ΔAC − ΔAB

Osservazione:

Il tempo necessario per l'azione degli enzimi può variare da un lotto all'altro. Quello sopra riportato è dato soltanto a titolo indicativo. Si raccomanda di determinarlo per ciascun lotto.

6.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

La concentrazione in acido L-malico è espressa in grammi per litro (g/l) con una cifra decimale.

6.1.   Metodo di calcolo

La concentrazione in grammi per litro è calcolata con la formula generale:

V

=

volume in ml della soluzione impiegata per la prova (in questo caso 2,22 ml)

v

=

volume del campione in ml (in questo caso 0,1 ml)

PM

=

peso molecolare della sostanza da dosare (in questo caso acido L-malico = 134,09)

d

=

cammino ottico della cella in cm (in questo caso 1 cm)

ε

=

coefficiente di assorbanza del NADH: a 340 nm ε = 6,3 mmole − 1 · l · cm − 1

Per il L-malato si ottiene:

C = 0,473 · ΔA g/l.

Se per la preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.

Nota:

6.2.   Ripetibilità (r)

r

=

0,03 + 0,034 xi

xi

=

concentrazione in acido malico del campione espressa in g/l.

6.3.   Riproducibilità (R)

R

=

0,05 + 0,071 xi

xi

=

concentrazione in acido malico del campione in g/l.

▼M7

20.   ACIDO D-MALICO

(dosaggio con metodo enzimatico)

1.   PRINCIPIO

In presenza di D-malato-deidrogenasi (D-MDH), l'acido D-malico (D-malato) viene ossidato in ossalacetato dalla nicotinammide-adenina-dinucleotide (NAD). L'ossalacetato formato è trasformato in piruvato e biossido di carbonio.

D-malato + NAD+ piruvato + CO2 + NADH + H+

La formazione di NADH, misurata tramite l'aumento dell'assorbanza alla lunghezza d'onda di 334, 340 o 365 nm, è proporzionale alla quantità di D-malato presente.

2.   REATTIVI

I reattivi che consentono circa 30 determinazioni si trovano in commercio in confezioni costituiti da un kit comprendente:

Preparazione delle soluzioni

Stabilità delle soluzioni

Il contenuto del flacone n. 1 si conserva a + 4 °C per almeno un anno; la soluzione 2 si conserva a + 4 °C per circa 3 settimane e a − 20 °C per due mesi; la soluzione 3 si conserva per 5 giorni a + 4 °C.

3.   APPARECCHIATURA

4.   PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

Il dosaggio del D-malato viene effettuato, di norma, direttamente sul vino senza decolorazione preliminare.

La quantità di D-malato nella cella deve essere compresa tra 2 e 50 μg, e pertanto occorre diluire il vino in modo tale che la concentrazione di malato sia compresa tra 0,02 e 0,5 g/l oppure 0,02 e 0,3 g/l, a seconda dello strumento utilizzato.

Tabella di diluizione

5.   MODO DI OPERARE

Lo spettrofotometro è regolato sulla lunghezza d'onda di 340 nm, le misurazioni dell'assorbanza sono effettuate nelle celle con cammino ottico di 1 cm; l'assorbanza zero è regolata rispetto all'aria (senza cella sul cammino ottico) o rispetto all'acqua.

Nelle celle con cammino ottico di 1 cm, introdurre:

Mescolare. Dopo circa 6 minuti, misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e dell'aliquota in esame (A1).

Aggiungere:

Mescolare. Attendere la fine della reazione (circa 20 minuti) e misurare le assorbanze delle soluzioni del bianco e dell'aliquota in esame (A2).

Determinare le differenze di assorbanza (A2 − A1) del bianco (ΔAT) e dell'aliquota in esame (ΔAE). Detrarre la differenza di assorbanza del bianco dalla differenza di assorbanza dell'aliquota in esame:

.

Osservazione:

Il tempo necessario all'azione degli enzimi può variare a seconda del lotto e pertanto il suo valore qui sopra fornito è solo a titolo indicativo. Si raccomanda di determinarlo per ciascun lotto.

L'acido D-malico reagisce rapidamente. Un'attività supplementare dell'enzima trasforma anche l'acido L-tartrico, anche se la velocità è molto inferiore. È questo il motivo per cui si verifica una debole reazione parassita che può essere corretta per estrapolazione (cfr. appendice A).

6.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

La concentrazione, in milligrammi per litro, è calcolata con la seguente formula generale:

dove:

V

=

volume del bianco in ml (qui 2,95 ml)

v

=

volume del campione in ml (qui 0,1 ml)

PM

=

peso molecolare della sostanza da dosare (qui acido D-malico = 134,09)

d

=

cammino ottico della cella in cm (qui 1 cm)

ε

=

coefficiente di assorbimento del NADH: a 340 nm = 6,3 (1 mmol−1 cm−1) a 365 nm = 3,4 (1 mmol−1 cm−1) a 334 nm = 6,18 (1 mmol−1 cm−1).

Se nella preparazione del campione è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.

La concentrazione in acido D-malico è espressa in milligrammi per litro (mg/1) senza decimali.

7.   FEDELTÀ

I dati del test interlaboratori sulla fedeltà del metodo sono sintetizzati nell'appendice B. I valori derivati dal test interlaboratori possono essere inapplicabili a gamme di concentrazione dell'analita e a matrici diverse da quelle indicate nell'appendice B.

7.1.   Ripetibilità

La differenza assoluta tra 2 singoli risultati ottenuti su una materia identica, da parte di un operatore che utilizza la stessa apparecchiatura, nel più breve intervallo di tempo, non dovrà essere maggiore del valore di ripetibilità r in più del 5 % dei casi.

Il valore è:

r

=

11 mg/l

7.2.   Riproducibilità

La differenza assoluta tra due singoli risultati ottenuti su una materia identica in due laboratori non dovrà essere maggiore del valore di riproducibilità R in più del 5 % dei casi.

Il valore è:

R

=

20 mg/l

▼M10

8.   DOSAGGIO DELL'ACIDO D-MALICO [D(+)-MALICO] NEI VINI, PER BASSI TENORI

8.1.   Campo di applicazione

Il metodo descritto è applicato al dosaggio, per via enzimatica, dell'acido D-malico dei vini con tenori inferiori a 50 mg/l.

8.2.   Principio

Il principio del metodo è descritto al punto 1. La formazione di NADH, misurata tramite l'aumento dell'assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm, è proporzionale alla quantità di D-malato presente, dopo l'introduzione, nella cella di misurazione, di una quantità di acido D-malico equivalente a 50 mg/l.

8.3.   Reagenti

Soluzione di acido D-malico a 0,199 g/l, oltre ai reagenti indicati al punto 2.

8.4.   Apparecchiatura

La stessa indicata al punto 3.

8.5.   Preparazione del campione

Come indicato al punto 4.

8.6.   Modo di operare

Il modo di operare è quello indicato al punto 5, ma con l'introduzione nella cella di misurazione di una quantità di acido D-malico equivalente a 50 mg/l (introduzione di 0,025 ml di una soluzione di acido D-malico a 0,199 g/l, in sostituzione del volume equivalente dell'acqua); i valori ottenuti sono diminuiti di 50 mg/l.

8.7.   Convalida interna

La seguente tabella riassume il dossier di convalida interna del metodo di dosaggio dell'acido D-malico, dopo aggiunta preliminare di 50 mg/l di questo isomero.

▼M7

Appendice A

Come trattare le reazioni parassite

Le reazioni parassite sono generalmente dovute a reazioni secondarie dell'enzima, alla presenza di altri enzimi nella matrice del campione o all'interazione di uno o più elementi della matrice con un cofattore della reazione enzimatica.

Nella reazione normale I'assorbanza raggiunge un valore costante dopo un certo tempo, in genere 10-20 minuti, a seconda della velocità della reazione enzimatica specifica. Tuttavia, in caso di reazioni secondarie, l'assorbanza non raggiunge un valore costante, ma aumenta regolarmente nel tempo: questo tipo di processo viene usualmente chiamato «reazione parassita».

Qualora si presenti questo problema, occorre misurare l'assorbanza della soluzione ad intervalli regolari (2-5 minuti), dopo il tempo necessario affinché la soluzione-standard raggiunga la sua assorbanza finale. Quando l'assorbanza aumenta regolarmente, procedere a 5 0 6 misure; operare quindi un'estrapolazione grafica o mediante calcolo per ottenere il valore dell'assorbanza della soluzione al momento in cui è stato aggiunto l'enzima finale (T0). La differenza di assorbanza estrapolata a quel momento (Af − Ai) viene utilizzata nel calcolo della concentrazione del substrato.

Figura 1: reazione parassita

Appendice B

▼B

21.   ACIDO MALICO TOTALE

METODO USUALE

1.   PRINCIPIO DEI METODO

L'acido malico separato per mezzo di una colonna scambiatrice di anioni viene dosato colorimetricamente nell'eluato utilizzando la colorazione gialla che si ottiene per azione dell'acido solforico al 96 % e dell'acido cromotropico. Le sostanze contenute nell'eluato che interferiscono in questa reazione, contrariamente all'acido malico, reagiscono con l'acido solforico all'86 % e l'acido cromotropico.

Per eliminare quindi questa interferenza è sufficiente sottrarre dall'assorbanza ottenuta dopo reazione con acido cromotropico ed acido solforico al 96 % l'assorbanza ottenuta dopo reazione con acido cromotropico ed acido solforico all'86 %.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	Colonna di vetro lunga circa 250 mm e con diametro interno di 35 mm, munita di rubinetto.

2.2.	Colonna di vetro lunga circa 300 mm e con diametro interno di 10-11 mm, munita di rubinetto.

2.3.	Bagnomaria a 100 °C.

2.4.	Spettrofotometro che permetta di eseguire misure di assorbanza alla lunghezza d'onda di 420 nm con celle di 10 mm di cammino ottico.

3.   REATTIVI

3.1.	Scambiatore di anioni di forte basicità (per esempio Merck III).

3.2.	Idrossido di sodio al 5 % (m/v).

3.3.	Acido acetico al 30 % (m/v).

3.4.	Acido acetico allo 0,5 % (m/v).

3.5.	Soluzione di solfato di sodio (Na2SO4) al 10 % (m/v).

3.6.	Acido solforico concentrato al 95-97 % (m/m).

3.7.	Acido solforico all'86 % (m/m).

3.8.	Soluzione di acido cromotropico al 5 % (m/v). Da preparare volta per volta prima di ogni dosaggio sciogliendo 500 mg di cromatropato di sodio (C10H6Na2O8S2 · 2 H2O) in 10 ml di acqua distillata.

3.9.	Soluzione di acido DL — malico di 0,5 g/l. Sciogliere 250 mg di acido malico (C4H6O5) nella soluzione di solfato di sodio al 10 % (3.5) e portare a 500 ml con la stessa soluzione.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione dello scambiatore di ioni

Porre nella colonna di vetro 35 × 250 mm, al di sopra del rubinetto, un tampone di lana di vetro impregnato di acqua distillata. Versare nella colonna lo scambiatore di ioni in sospensione in acqua lasciando uno spazio libero di circa 50 mm al di sopra della superficie dello scambiatore.

Dopo lavaggio con 1 000 ml di acqua distillata, riempire la colonna con la soluzione di idrossido di sodio al 5 %, lasciare percolare il liquido sino a circa 2-3 mm al di sopra della superficie dello scambiatore di ioni, ripetere ancora per due volte questa operazione e lasciare in contatto per un'ora. Lavare la colonna con 1 000 ml di acqua distillata, riempire quindi la colonna con la soluzione di acido acetico al 30 %, lasciar percolare il liquido sino a 2-3 mm circa al di sopra della superficie dello scambiatore di ioni.

Ripetere questa operazione per due volte e lasciare in contatto per almeno ventiquattro ore prima dell'uso. Conservare lo scambiatore di ioni in acido acetico al 30 % per i successivi dosaggi.

4.2.   Preparazione della colonna a scambiatore ionico

Porre nella colonna di vetro 11 × 300 mm, al di sopra del rubinetto, un tampone di lana di vetro. Versare nella colonna lo scambiatore di ioni preparato come descritto in 4.1 per un'altezza di 10 cm. Con il rubinetto aperto lasciare percolare la soluzione di acido acetico al 30 % sino a circa 2-3 mm al di sopra della superficie della resina. Lavare quindi con 50 ml della soluzione di acido acetico allo 0,5 %.

4.3.   Isolamento dell'acido DL-malico

Versare sulla resina preparata come descritto in 4.2 10 ml di vino o di mosto.

Lasciare percolare il vino, goccia a goccia (una goccia al secondo circa), sino a circa 2-3 mm al di sopra della superficie della resina. Lavare la colonna prima con 50 ml circa della soluzione di acido acetico allo 0,5 % e dopo con circa 50 ml di acqua distillata; lasciare percolare queste soluzioni con la stessa velocità del vino.

Eluire gli acidi fissati sulla resina a scambio ionico per mezzo della soluzione di solfato di sodio al 10 % con la stessa velocità delle operazioni precedenti (1 goccia al secondo), raccogliere l'eluato in un pallone tarato da 100 ml sino al segno di taratura.

La resina può essere rigenerata come descritto in 4.1.

4.4.   Dosaggio dell'acido malico

In due provette a tappo smerigliato, a bocca larga, da 30 ml, «A» e «B», introdurre 1,0 ml di eluato e 1,0 ml della soluzione di acido cromotropico al 5 %. Nella provetta «A» aggiungere 10,0 ml di acido solforico all'86 % (bianco) e nella provetta «B» 10,0 ml di acido solforico al 96 % (campione). Tappare ed agitare per ottenere una perfetta omogeneità senza bagnare la parte smerigliata. Porre le due provette per 10 minuti esatti nel bagno maria portato preventivamente a ebollizione vivace. Far raffreddare le provette a 20 °C al buio.

Esattamente dopo 90 minuti dall'inizio del raffreddamento misurare l'assorbanza della provetta «B» contro il bianco (provetta «A») alla lunghezza d'onda di 420 nm nelle celle da 10 mm di cammino ottico.

4.5.   Curva di taratura

In palloncini tarati da 50 ml versare 5 - 10 - 15 e 20 ml della soluzione di acido malico di 0,5 g/l; portare a segno con la soluzione di solfato di sodio al 10 %.

Le soluzioni così ottenute corrispondono ad eluati ottenuti a partire da vini contenenti 0,5 - 1,0 - 1,5 e 2,0 g di acido DL-malico per litro.

Continuare come indicato in 4.4.

I valori dell'assorbanza ottenuti con queste soluzioni, riportati in funzione dei tenori in acido malico corrispondenti, si allineano su una retta passante per l'origine.

Poiché l'intensità della colorazione è notevolmente influenzata dalla concentrazione dell'acido solforico, è necessario controllare la curva di taratura per almeno un punto per ogni serie di misure per mettere in evidenza una eventuale variazione della concentrazione dell'acido solforico.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Riportare l'assorbanza misurata per l'eluato sulla curva di taratura per ottenere il tenore in acido DL-malico in grammi per litro con une divra decimale.

Ripetibilità

tenore < 2 g/l: r

=

0,1 g/l

tenore > 2 g/l: r

=

0,2 g/l

Riproducibilità

R = 0,3 g/l

22.   ACIDO SORBICO

1.   PRINCIPIO DEI METODI

1.1.   Metodo di dosaggio per spettrofotometria di assorbimento nell'ultravioletto

L'acido sorbico (acido 2,4 esadienoico trans, trans) estratto per distillazione in corrente di vapor d'acqua, viene dosato nel distillato del vino per spettrofotometria di assorbimento nell'ultravioletto. Le sostanze che interferiscono sulla misura dell'assorbimento nell'ultravioletto vengono eliminate per evaporazione a secco dell'aliquota di distillato prelevata, leggermente alcalinizzata con una soluzione di idrossido di calcio. I tenori inferiori a 20 mg/l devono essere confermati per cromatografia su strato sottile (sensibilità: 1 mg/l).

1.2.   Metodo di dosaggio per gascromatografia

L'acido sorbico estratto con etere etilico è dosato per cromatografia in fase gassosa in presenza di uno standard interno.

1.3.   Metodo di ricerca di tracce per cromatografia su strato sottile

L'acido sorbico, estratto con etere etilico, viene preparato per cromatografia su strato sottile. Se ne determina quindi semiquantitativamente la concentrazione.

2.   METODO DI DOSAGGIO PER SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO NELL'ULTRAVIOLETTO

2.1.   Reattivi

2.1.1.

Acido tartarico, C4H6O6, cristallizzato.

2.1.2.

Soluzione d'idrossido di calcio, Ca (OH)2 circa 0,02 M.

2.1.3.

Soluzione di riferimento di acido sorbico a 20 mg per litro. Sciogliere 20 mg di acido sorbico, C6H8O2, in 2 ml circa di soluzione 0,1 M di idrossido di sodio. Versarli in un pallone tarato da 1 000 ml e portare a volume con acqua. Si possono anche sciogliere 26,8 mg di sorbato di potassio, C6H7KO2, in acqua e portarli a 1 000 ml con acqua.

2.2.   Apparecchiatura

2.2.1.

Apparecchio di distillazione in corrente di vapore d'acqua (vedi «Acidità volatile»).

2.2.2.

Bagnomaria a 100 °C.

2.2.3.

Spettrofotometro regolato a 256 nm con celle in quarzo a cammino ottico da 1 cm.

2.3.   Modo di operare

2.3.1.   Distillazione

Versare nel gorgogliatore dell'apparecchio di distillazione in corrente di vapore 10 ml di vino, aggiungere 1-2 g di acido tartarico (2.1.1). Raccogliere 250 ml di distillato.

2.3.2.   Curva di taratura

Preparare, per diluizione con acqua della soluzione di riferimento (2.1.3), quattro soluzioni di riferimento aventi rispettivamente concentrazione di 0,5 - 1 - 2,5 e 5 mg di acido sorbico per litro; misurare con lo spettrofotometro le rispettive assorbanze a 256 nm, rispetto all'acqua distillata. Tracciare la curva delle variazioni dell'assorbanza in funzione della concentrazione delle soluzioni. La variazione è lineare.

2.3.3.   Dosaggio

Porre 5 ml di distillato in una capsula di 55 mm di diametro; aggiungere 1 ml di soluzione di idrossido di calcio (2.1.2). Portare a secco su bagnomaria bollente.

Riprendere il residuo con alcuni millilitri di acqua distillata, versare quantitativamente in un matraccio tarato da 20 ml e portare a volume con le acque di lavaggio. Misurare con uno spettrofotometro l'assorbanza a 256 nm rispetto a una soluzione in bianco ottenuta per diluizione con acqua a 20 ml di 1 ml di soluzione di idrossido di calcio (2.1.2).

Portare il valore dell'assorbanza misurato sulla retta di taratura e determinare la concentrazione C della soluzione in acido sorbico.

Osservazione:

Nella pratica corrente l'evaporazione a secco può essere trascurata. Effettuare direttamente la misura dell'assorbanza sul distillato diluito 1:4 contro acqua distillata.

2.4.   Espressione dei risultati

2.4.1.   Calcolo

La concentrazione in acido sorbico del vino espressa in milligrammi per litro è uguale a:

100 × C

dove

C

=

concentrazione in acido sorbico della soluzione analizzata per spettrofotometria, espressa in milligrammi per litro.

3.   METODO DI DOSAGGIO PER CROMATOGRAFIA IN FASE GASSOSA

3.1.   Reattivi

3.1.1.

Etere etilico, (C2H5)2O, distillato al momento dell'impiego.

3.1.2.

Soluzione dello standard interno: soluzione di 1 g per litro di acido undecanoico, C11H22O2, in etanolo al 95 % (vol.).

3.1.3.

Soluzione di acido solforico, H2SO4 (ρ20o = 1,84 g/ml), diluito a 1/3 (v/v).

3.2.   Apparecchiatura

3.2.1.

Gascromatografo corredato da un rivelatore a ionizzazione di fiamma e da una colonna in acciaio inossidabile (4 m × 1/8 di pollice) trattata preliminarmente con dimetildiclorosilano e riempita con una fase stazionaria costituita da una miscela di dietilenglicol succinato (5 %) e di acido fosforico (1 %) (DEGS — H3PO4) o da una miscela di dietilenglicol adipato (7 %) e di acido fosforico (1 %) (DEGA — H3PO4) fissato su Gaschrom Q 80 — 100 mesh. Per il trattamento con il dimetilclorosilano (DMDCS) far passare nella colonna una soluzione in toluene di DMDCS al 2-3 %. Lavare immediatamente la colonna con metanolo, far passare una corrente di azoto, poi esoano e nuovamente corrente di azoto. Quindi riempire la colonna. Condizioni operative: Temperatura del forno: 175 °C. Temperatura dell'iniettore e del rivelatore: 230 °C. Gas vettore: azoto (flusso 20 ml/minuto).

3.2.2.

Microsiringa da 10 microlitri graduata in 0,1 microlitri. Osservazione: Altri tipi di colonne possono ugualmente permettere una buona separazione, in particolare la colonna capillare (FFAP, per esempio). Il modo di operare descritto di seguito è dato a titolo di esempio.

3.3.   Modo di operare

3.3.1.   Preparazione del campione da analizzare

In una provetta in vetro da circa 40 ml, dotata di tappo smerigliato, introdurre 20 ml di vino, aggiungere 2 ml di soluzione di standard interno (3.1.2) e 1 ml di soluzione diluita di acido solforico (3.1.3).

Dopo aver agitato capovolgendo più volte, aggiungere al contenuto della provetta 10 ml di etere etilico (3.1.1). Estrarre l'acido sorbico agitando la provetta per 5 minuti. Lasciare decantare.

3.3.2.   Preparazione della soluzione di riferimento

Scegliere un vino il cui estratto in etere etilico dia un cromatogramma che non presenti alcun picco con tempo di ritenzione dell'acido sorbico; aggiungere a questo vino 100 mg/l di acido sorbico. Trattare 20 ml del campione così ottenuto secondo il modo di operare descritto al punto 3.3.1.

3.3.3.   Cromatografia

Iniettare successivamente nel cromatografo con una microsiringa 2 µl della fase eterea ottenuta al punto 3.3.2 e 2 µl della fase eterea ottenuta al punto 3.3.1.

Registrare i rispettivi cromatogrammi; verificare che i rispettivi tempi di ritenzione dell'acido sorbico e dello standard interno siano identici. Misurare l'altezza (o la superficie) di ciascuno dei picchi ottenuti.

3.4.   Espressione dei risultati

3.4.1.   Calcolo

La concentrazione in acido sorbico del vino analizzato, espressa in milligrammi per litro, è uguale a:

H

=

altezza del picco dell'acido sorbico nella soluzione di riferimento.

h

=

altezza del picco dell'acido sorbico nel campione da analizzare.

I

=

altezza del picco dello standard interno nella soluzione di riferimento.

i

=

altezza del picco dello standard interno nel campione da analizzare.

Nota:

la concentrazione in acido sorbico può essere determinata nello stesso modo prendendo in considerazione la misura della superficie dei rispettivi picchi.

4.   METODO DI RICERCA DI TRACCE DI ACIDO SORBICO MEDIANTE CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE

4.1.   Reattivi

4.1.1.

Etere etilico, (C2H5)2O.

4.1.2.

Soluzione acquosa di acido solforico, H2SO4 (ρ 20 = 1,84 g/ml) diluito a 1/3 (v/v).

4.1.3.

Soluzione di riferimento di acido sorbico in una miscela idroetanolica al 10 % di etanolo (vol.): 20 mg/l circa.

4.1.4.

Fase mobile: esano — pentano — acido acetico (20:20:3) (C6H14 — C5H12 — CH3COOH) (ρ 20 = 1,05 g/ml).

4.2.   Apparecchiatura

4.2.1.

Lastre per cromatografia su strato sottile, pronte per l'uso, da 20 × 20 cm ricoperte con gel di poliammide (spessore: 0,15 mm) addizionato di un indicatore di fluorescenza.

4.2.2.

Camera cromatografica per strato sottile.

4.2.3.

Micropipetta o microsiringa che consenta di depositare volumi da 5 µl con la precisione di ± 0,1 µl.

4.2.4.

Lampada a raggi ultravioletti (254 nm).

4.3.   Modo di operare

4.3.1.   Preparazione del campione da analizzare

Versare in una provetta da circa 25 ml, provvista di tappo smerigliato, 10 ml di vino, aggiungere 1 ml di soluzione di acido solforico diluito (4.1.2) e 5 ml di etere etilico (4.1.1). Agitare capovolgendo più volte. Lasciare decantare.

4.3.2.   Preparazione delle soluzioni diluite di riferimento

Preparare, per diluizione della soluzione 4.1.3, cinque soluzioni diluite di riferimento contenenti rispettivamente 2-4-6-8 e 10 mg di acido sorbico per litro.

4.3.3.   Cromatografia

Con una microsiringa o una micropipetta deporre, a 2 cm dal bordo inferiore della lastra, 5 µl della fase eterea ottenuta al punto 4.3.1 e 5 µl di ciascuna delle soluzioni diluite di riferimento (4.3.2), distanziando i depositi tra di loro di 2 cm.

Versare la fase mobile (4.1.4) nella camera cromatografica sino a raggiungere un'altezza di circa 0,5 cm e lasciare che l'atmosfera della camera si saturi dei vapori dei solventi. Introdurre la lastra nella vaschetta. Lasciare sviluppare il cromatogramma per 12-15 cm (la durata dello sviluppo è di circa 30 minuti). Asciugare la lastra in corrente di aria fredda. Esaminare il cromatogramma sotto luce ultravioletta a 254 nm.

La macchie relative all'acido sorbico hanno una colorazione viola scuro sul fondo giallo fluorescente della lastra.

4.4.   Espressione dei risultati

Il confronto fra le intensità della macchia del campione da analizzare e quella delle macchie delle soluzioni di riferimento consente di valutare semiquantitativamente la concentrazione in acido sorbico fra 2 e 10 mg per litro. Per determinare una concentrazione uguale a 1 mg per litro occorrerà un deposito di 10 µl di soluzione del campione da analizzare, mentre per determinare concentrazioni superiori a 10 mg per litro il volume del deposito della soluzione da analizzare dovrà essere inferiore a 5 µl (da misurare con una microsiringa).

23.   ACIDO L-ASCORBICO

1.   PRINCIPIO DEI METODI

I metodi proposti consentono di dosare l'acido L-ascorbico e l'acido deidroascorbico presenti nei vini o nei mosti.

1.1.   Metodo di riferimento (fluorimetrico)

L'acido L-ascorbico è ossidato ad acido deidroascorbico con l'impiego del carbone attivo. Tale composto per reazione con l'ortofenilendiammina (O.P.D.A.) forma un composto fluorescente. Un bianco in presenza di acido borico consente di determinare la fluorescenza parassita (per formazione di un complesso acido borico — acido deidroascorbico) e di sottrarla quindi dal dosaggio fluorimetrico.

1.2.   Metodo usuale (colorimetrico)

L'acido L-ascorbico viene ossidato con iodio in acido deidroascorbico, composto che viene quindi precipitato dalla 2,4 dinitrofenilidrazina come bis (2,4-dinitrofenilidrazone). Dopo separazione per cromatografia su strato sottile e solubilizzazione in ambiente acetico, questo composto di colorazione rossa viene dosato per spettrofotometria a 500 nm.

2.   METODO DI RIFERIMENTO (METODO FLUORIMETRICO)

2.1.   Reattivi

2.1.1.

Soluzione di dicloridrato di orto-fenilendiammina (C6H10Cl2N2) a 0,02 g per 100 ml, preparati al momento.

2.1.2.

Soluzione di acetato di sodio triidrato (CH3COONa 3H2O), a 500 g/l.

2.1.3.

Soluzione mista di acido borico e di acetato di sodio. Sciogliere 3 g di acido borico, H3BO3, in 100 ml di soluzione di acetato di sodio (2.1.2). Questa soluzione deve essere preparata al momento dell'uso.

2.1.4.

Soluzione di acido acetico glaciale, (CH3COOH (ρ20 = 1,05 g/ml) diluito al 56 % (v/v) a pH 1,2 circa.

2.1.5.

Soluzione di riferimento di acido L-ascorbico da 1 g per litro. Sciogliere immediatamente prima dell'impiego 50 mg di acido L-ascorbico, C6H8O6, previamente disidratato in un essiccatore al riparo dalla luce, in 50 ml di soluzione di acido acetico (2.1.4).

2.1.6.

Carbone attivo molto puro per analisi ( 15 ) Porre, in una beuta da 2 l, 100 g di carbone attivo, aggiungere 500 ml di una soluzione di acido cloridrico, (HCl) (ρ20 = 1,19 g/ml) al 10 % (v/v). Portare a ebollizione, filtrare su filtro in vetro sinterizzato di porosità 3. Raccogliere il carbone così trattato in una beuta da 2 l, aggiungere 1 l di acqua, agitare e filtrare su filtro di vetro sinterizzato di porosità 3. Ripetere due volte l'operazione. Porre il residuo in una stufa regolata a 115 ± 5 °C per 12 ore (ad esempio una notte).

2.2.   Apparecchiatura

2.2.1.

Fluorimetro. Utilizzare uno spettrofluorimetro dotato di una lampada a spettro continuo regolandolo sulla potenza minima della lampada. Le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione ottimali per la prova saranno determinate previamente e in funzione dell'apparecchio impiegato. A titolo indicativo la lunghezza d'onda di eccitazione si situa intorno ai 350 nm, e la lunghezza d'onda di emissione intorno ai 430 nm. Celle di 1 cm di cammino ottico.

2.2.2.

Filtro in vetro sinterizzato di porosità 3.

2.2.3.

Provette (diametro ≊ 10 mm).

2.2.4.

Agitatore per provette.

2.3.   Modo di operare

2.3.1.   Preparazione del campione di vino o di mosto

Prelevare un volume di vino o di mosto e diluirlo a 100 ml in un matraccio tarato con la soluzione di acido acetico al 56 % (2.1.4), in modo da ottenere una soluzione la cui concentrazione in acido L-ascorbico sia compresa fra 0 e 60 mg/l. Agitare per omogeneizzare il contenuto del matraccio tarato. Aggiungere 2 g di carbone attivo (2.1.6) e lasciare a contatto per 15 minuti agitando di tanto in tanto. Filtrare su carta da filtro ordinaria eliminando i primi millilitri di filtrato. In due matracci tarati da 100 ml introdurre, in uno, 5 ml della soluzione mista di acido barico e di acetato di sodio (2.1.3) (testimone), nell'altro, 5 ml della soluzione di acetato di sodio (2.1.2) (campione). Lasciare a contatto per 15 minuti agitando di tanto in tanto, e completare a 100 ml con acqua distillata.

Prelevare 2 ml del contenuto di ciascun matraccio, aggiungere 5 ml di soluzione di ortofenilendiammina (2.1.1), agitare; lasciare sviluppare la reazione per 30 minuti in assenza di luce ed effettuare quindi la misura allo spettrofluorimetro.

2.3.2.   Curva di taratura

In tre matracci tarati da 100 ml porre rispettivamente 2, 4, 6 ml della soluzione di riferimento di acido L-ascorbico (2.1.5), completare a 100 ml con la soluzione di acido acetico (2.1.4), agitando per omogeneizzare. Le soluzioni di riferimento preparate contengono rispettivamente 2-4-6 mg/100 ml.

Aggiungere 2 g di carbone attivo (2.1.6) in ciascuno dei matracci e lasciare a contatto per 15 minuti agitando di tanto in tanto. Filtrare su carta da filtro ordinaria eliminando i primi millilitri. Introdurre rispettivamente 5 ml di ciascuno dei filtrati raccolti nei tre matracci da 100 ml (prima serie), ripetere l'operazione con un seconda serie di tre matracci tarati. Aggiungere in ciascuno dei matracci della prima serie (corrispondenti al testimone) 5 ml di soluzione mista di acido borico e acetato di sodio (2.1.3) e in ciascun matraccio della seconda serie 5 ml di soluzione di acetato di sodio (2.1.2).

Lasciare a contatto per 15 minuti agitando di tanto in tanto, e completare a 100 ml con acqua distillata. Prelevare 2 ml del contenuto di ciascuno dei matracci, aggiungere 5 ml di soluzione di ortofenilendiammina (2.1.1), agitare, lasciare sviluppare la reazione per 30 minuti in assenza di luce ed effettuare quindi la misura allo spettrofluorimetro.

2.3.3.   Determinazione fluorimetrica

Regolare per ciascuna soluzione della curva di taratura e per la soluzione del dosaggio lo zero della scala delle misure sul bianco corrispondente. Effettuare quindi la misurazione dell'intensità della fluorescenza per ogni soluzione della serie a titolo noto e della serie del campione per il dosaggio.

Tracciare la curva di taratura; essa deve risultare lineare e passare per l'origine degli assi. Riportare su tale retta il valore relativo al dosaggio e sottrarre il tenore C in acido L-ascorbico + acido deidroascorbico della soluzione analizzata.

2.3.4.   Espressione dei risultati

La concentrazione del vino in acido L-ascorbico + acido deidroascorbico espressa in milligrammi per litro sarà:

C · F

F

=

fattore di diluizione.

▼M8 —————

▼B

24.   pH

1.   PRINCIPIO

Misura della differenza di potenziale fra due elettrodi immersi nel liquido in esame. Uno degli elettrodi ha un potenziale che è una funzione definita del pH del liquido, mentre l'altro ha un potenziale fisso e noto e costituisce l'elettrodo di riferimento.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	pHmetro a scala graduata in unità pH in modo da consentire delle misurazioni con un'approssimazione di almeno 0,05 unità.

2.2.	Elettrodi. 2.2.1. Elettrodi in vetro, da conservare in acqua distillata. 2.2.2. Elettrodi di riferimento a calomelano e cloruro di potassio saturo, conservati in una soluzione satura di cloruro di potassio. 2.2.3. Oppure un elettrodo combinato da conservare in acqua distillata.

3.   REATTIVI

3.1.

Soluzioni tampone: 3.1.1. Soluzione satura di tartrato acido di potassio. Soluzione contenente almeno 5,7 g/l di tartrato acido di potassio (C4H5KO6) a 20 °C. Tale soluzione può conservarsi fino a 2 mesi in presenza di 0,1 g di timolo per 200 ml. pH 3,57 a 20 °C 3,56 a 25 °C 3,55 a 30 °C 3.1.2. Soluzione 0,05 M di ftalato acido di potassio. Soluzione contenente 10,211 g/l di ftalato acido di potassio (C8H5KO4) a 20 °C. (Tempo massimo di conservazione: 2 mesi). pH 3,999 a 15 °C 4,003 a 20 °C 4,008 a 25 °C 4,015 a 30 °C 3.1.3. Soluzione contenente: Fosfato monopotassico, KH2PO4 … 3,402 g Fosfato dipotassico, K2HPO4 … 4,354 g Acqua q.b.a. … 1 l (Tempo massimo di conservazione: 2 mesi) pH 6,90 a 15 °C 6,88 a 20 °C 6,86 a 25 °C 6,85 a 30 °C NB: Possono essere impiegate anche le soluzioni tampone di riferimento reperibili in commercio.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione del campione per l'analisi

4.1.1.   Mosto e vino

Operare direttamente sul mosto o sul vino.

4.1.2.   Mosto concentrato rettificato

Diluire il mosto concentrato rettificato con acqua per ottenere una concentrazione di 25 ± 0,5 % (m/m) in zuccheri totali (25 °Brix).

Se P è il tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali del mosto concentrato rettificato, pesare una quantità uguale a:

e completare a 100 g con acqua. L'acqua utilizzata deve avere una conduttività inferiore a 2 microsiemens per centimetro.

4.2.   Azzeramento dell'apparecchio

Prima di effettuare le misurazioni occorre azzerare l'apparecchio, seguendo le indicazioni date per l'apparecchio utilizzato.

4.3.   Taratura del pHmetro

La taratura si effettua a 20 °C seguendo le indicazioni date per l'apparecchio utilizzato con le soluzioni tampone a pH 6,88 e 3,57 a 20 °C. Utilizzare la soluzione tampone a pH 4,00 a 20 °C per controllare la calibratura della scala.

4.4.   Misura

Immergere l'elettrodo nel campione da analizzare la cui temperatura dev'essere compresa fra 20 e 25 °C e il più possibile vicina a 20 °C. Leggere direttamente sulla scala il valore del pH.

Effettuare almeno due determinazioni sullo stesso campione.

Prendere come risultato la media aritmetica delle due determinazioni.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Il pH del mosto, del vino o della soluzione al 25 % (m/m) (25 °Brix) del mosto concentrato rettificato è espressa con 2 cifre decimali.

25.   ANIDRIDE SOLFOROSA

1.   DEFINIZIONE

Si chiama anidride solforosa l'anidride solforosa presente nel mosto o nel vino nelle forme seguenti: H2SO3, HSO3− , il cui equilibrio dipende dal pH e dalla temperatura:

H2SO3 H+ +

H2SO3 rappresenta l'anidride solforosa molecolare.

Si chiama anidride solforosa totale l'insieme delle varie forme di anidride solforosa presenti nel vino allo stato libero o combinato.

2.   ANIDRIDE SOLFOROSA LIBERA E TOTALE

2.1.   Principio dei metodi

2.1.1.   Metodo di riferimento

2.1.1.1.   Vini e mosti

L'anidride solforosa viene trascinata da una corrente di aria o di azoto e viene fisata ed ossidata per gorgogliamento in una soluzione diluita neutra di perossido di idrogeno. L'acido solforico formato viene dosato con una soluzione titolata di idrossido di sodio. L'anidride solforosa libera viene estratta dal vino per trascinamento a freddo (10 °C).

L'anidride solforosa totale viene estratta dal vino per trascinamento a caldo (100 °C circa).

2.1.1.2.   Mosti concentrati rettificati

L'anidride solforosa totale è estratta per trascinamento a caldo (circa 100 °C) del mosto rettificato concentrato previamente diluito.

2.1.2.   Metodo rapido (vini e mosti)

L'anidride solforosa libera viene dosata mediante titolazione iodometrica diretta.

Si dosa quindi l'anidride solforosa combinata mediante titolazione iodometrica effettuata dopo idrolisi alcalina. Sommandola all'anidride solforosa libera, si ottiene l'anidride solforosa totale.

2.2.   Metodo di riferimento

2.2.1.   Apparecchiatura

2.2.1.1.

L'apparecchio utilizzato deve essere conforme allo schema qui riportato, in particolare per quanto riguarda il refrigerante. Fig. 1 Le dimensioni sono riportate in millimetri. I diametri interni dei 4 tubi concentrici che costituiscono il refrigerante sono: 45, 34, 27 e 10 mm. Il tubo di adduzione del gas nel gorgogliatore «B» termina con una sferetta dal diametro di 1 cm portante sulla circonferenza massima orizzontale 20 fori del diametro di 0,2 mm. Esso può ugualmente terminare con una piastra di vetro sinterizzato che assicuri la formazione di un elevato numero di bolle molto piccole che consentano di realizzare un buon contatto fra le fasi gassose e liquide. Il flusso di gas attraverso l'apparecchio deve essere di circa 40 l/h. La bottiglia posta a destra dell'apparecchio ha lo scopo di limitare al valore di 20-30 cm di acqua la depressione prodotta dalla pompa a caduta d'acqua. Per poter regolare tale depressione in modo da avere un flusso corretto, è opportuno inserire fra il gorgogliatore e la bottiglia un flussimetro a tubo semicapillare.

2.2.1.2.

Microburetta

2.2.2.   Reattivi

2.2.2.1.

Acido fosforico all'85 % (H3PO4) (ρ20 = 1,71 g/ml).

2.2.2.2.

Soluzione di perossido di idrogeno a 9,1 g di H2O2/l (3 volumi).

2.2.2.3.

Reattivo indicatore: rosso di metile … 100 mg blu di metilene … 50 mg alcol a 50 % vol. … 100 ml

2.2.2.4.

Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), 0,01 M.

2.2.3.   Modo di operare

2.2.3.1.   Dosaggio dell'anidride solforosa libera

Prima del dosaggio il vino deve essere mantenuto per due giorni a 20 °C in una bottiglia piena e tappata.

2.2.3.2.   Espressione dei risultati

L'anidride solforosa libera è espressa in mg/l senza decimali.

2.2.3.2.1.

Calcolo Anidride solforosa libera in mg/l: 6,4 n.

2.2.3.3.   Dosaggio dell'anidride solforosa totale

2.2.3.3.1.

Per i mosti concentrati rettificati, utilizzare la soluzione ottenuta diluendo il campione per l'analisi al 40 % (m/v) come indicato al punto 5.1.2 del capitolo «Acidità totale». Introdurre nel pallone «A» da 250 ml dell'apparecchio, 50 ml di tale soluzione e 5 ml di acido fosforico (2.2.2.1). Collegare il pallone con l'apparecchiatura.

2.2.3.3.2.

Vini e mosti Tenore presunto del campione ≤ 50 mg/l di SO2 totale. Versare nel pallone «A» da 250 ml dell'apparecchio, 50 ml di campione e 15 ml di acido fosforico (2.2.2.1). Collegare il pallone con l'apparecchiatura. Tuttavia, sino al ►M5  31 agosto 1996 ◄ al più tardi, per determinare il tenore in anidride solforosa dei succhi d'uva si usano 5 ml di acido fosforico (2.2.2.1) diluiti al 25 % (m/v).

2.2.3.3.3.

Tenore presunto del campione ≥ 50 mg/l di SO2 totale. Versare nel pallone «A» da 100 ml dell'apparecchio 20 ml di campione e 5 ml di acido fosforico (2.2.2.1). Collegare il pallone con l'apparecchiatura. Porre nel gorgogliatore «B» 2 × 3 ml di soluzione di perossido di idrogeno (2.2.2.2), neutralizzarla come sopra e portare il vino contenuto nel pallone «A» ad ebollizione per mezzo di una piccola fiamma alta 4-5 cm che deve lambire direttamente il fondo del pallone. Per evitare la piroscissione delle sostanze estrattive del vino sulle pareti del pallone, posarlo, anziché su una rete metallica, su un disco provvisto di un foro del diametro di 30 mm. Mantenere l'ebollizione durante il passaggio della corrente d'aria (o di azoto). Entro 15 minuti l'anidride solforosa totale viene estratta ed ossidata. Dosare quindi l'acido solforico formatosi con la soluzione 0,01 M di idrossido di sodio (2.2.2.4). Sia n il numero di ml utilizzati.

2.2.3.4.   Espressione dei risultati

L'anidride solforosa totale è espressa in milligrammi/litro (mg/l) o in milligrammi/chilogrammo (mg/kg) di zuccheri totali senza cifre decimali.

2.2.4.2.1.

Calcolo Vini e mosti Anidride solforosa totale in mg/l: — Campioni poveri di anidride solforosa (quantità di campione analizzata 50 ml): — 6,4 · n — Altri campioni (quantità di campione analizzata 20 ml): — 16 · n Mosti concentrati rettificati Anidride solforosa in milligrammi per chilo di zuccheri totali (quantità di campione analizzato preparato come in 2.2.3.3.1, 50 ml): P = tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali.

2.2.3.4.2.

Ripetibilità (r) Tenore < 50 mg/l (presa di campione 50 ml), r = 1 mg/l Tenore > 50 mg/l (presa di campione 20 ml), r = 6 mg/l

2.2.3.2.3.

Riproducibilità Tenore < 50 mg/l (presa di campione 50 ml), R = 9 mg/l Tenore > 50 mg/l (presa di campione 20 ml), R = 15 mg/l

▼M8 —————

▼B

3.   ANIDRIDE SOLFOROSA MOLECOLARE

3.1.   Principio del metodo

La percentuale di anidride solforosa molecolare, H2SO3, nell'anidride solforosa libera viene valutata in funzione del pH, del titolo alcolometrico e della temperatura.

Per una data temperatura e un dato titolo alcolometrico:

H2SO3 H+ +

(1)

dove

pKM

=

L

=

i

=

forza ionica.

A e B

=

coefficienti che variano con la temperatura e con il titolo alcolometrico.

KT

=

costante termodinamica di dissociazione; il valore di pkT è dato nella tabella 1 in funzione del titolo alcolometrico e della temperatura.

KM

=

costante mista di dissociazione.

Attribuendo alla forza ionica i il valore medio 0,038, la tabella 2 dà i valori di pkM in funzione della temperatura e del titolo alcolometrico.

Il tenore in anidride solforosa molecolare ottenuto dalla relazione (1) è dato nella tabella 3 in funzione del pH, della temperatura e del titolo alcolometrico.

3.2.   Calcolo

Conoscendo il pH del vino ed il relativo titolo alcolometrico, la percentuale di anidride solforosa molecolare per una data temperatura t °C, è data nella tabella 3; sia X %.

Tenore in anidride solforosa molecolare espresso in mg/l:

X · C

C

=

tenore in anidride solforosa libera espresso in mg/l.

26.   SODIO

1.   PRINCIPIO DEI METODI

1.1.   Metodo di riferimento: Spettrofotometria di assorbimento atomico

Il sodio viene dosato direttamente nel vino per spettrofotometria di assorbimento atomico dopo addizione di un tampone spettrale di cloruro di cesio per evitare la ionizzazione del sodio.

1.2.   Metodo usuale: Fotometria di fiamma

Il sodio viene dosato direttamente nel vino diluito al 10 % mediante fotometria di fiamma.

2.   METODO DI RIFERIMENTO

2.1.   Reattivi

2.1.1.   Soluzione di sodio di 1 g per litro

Utilizzare una soluzione standard di sodio di 1 g/l del tipo in commercio. Questa soluzione può essere preparata sciogliendo 2,542 g di cloruro di sodio NaCl essiccato, in acqua distillata e portando il volume ad un litro.

Conservare questa soluzione in una bottiglia di polietilene.

2.1.2.   Soluzione modello:

2.1.3.   Soluzione di cloruro di cesio al 5 % in cesio

Sciogliere 6,330 g di cloruro di cesio CsCl in 100 ml di acqua distillata.

2.2.   Apparecchiatura

2.2.1.

Spettrofotometro di assorbimento atomico. Gas di alimentazione del bruciatore: aria e acetilene.

2.2.2.

Lampada a catodo cavo al sodio.

2.3.   Modo di operare

2.3.1.   Preparazione del campione

Prelevare 2,5 ml di vino versandoli in un pallone tarato da 50 ml; aggiungere 1 ml di soluzione di cloruro di cesio (2.1.3) e portare a volume con acqua distillata.

2.3.2.   Taratura

Versare in una serie di palloni tarati da 100 ml 5,0 ml di soluzione modello; aggiungere in ciascuno di essi rispettivamente 0 - 2,5 - 5 - 7,5 - 10 ml della soluzione di sodio a 1 g/l (2.1.1), previamente diluita 1/100; aggiungere in tutti i recipienti 2 ml della soluzione di cloruro di cesio (2.1.3) e completare a 100 ml con acqua distillata.

Le soluzioni di taratura preparate hanno una concentrazione rispettivamente di 0 - 0,25 - 0,50 - 0,75 - 1,00 mg di sodio per litro e contengono 1 g di cesio per litro. Queste soluzioni devono essere conservate in bottiglie di polietilene.

2.3.3.   Dosaggio

Regolare la lunghezza d'onda a 589,0 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con la soluzione modello contenente 1 g di cesio per litro (2.3.2). Aspirare direttamente il vino diluito nel bruciatore dello spettrofotometro, quindi successivamente le soluzioni di taratura (2.3.2). Leggere le assorbanze, effettuare le determinazioni in doppio.

2.4.   Espressione dei risultati

2.4.1.   Calcolo

Tracciare la curva dell'assorbanza in funzione della concentrazione di sodio delle soluzioni di taratura.

Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione su tale curva e determinare la concentrazione C di sodio in milligrammi per litro.

La concentrazione di sodio espressa in milligrammi per litro di vino, senza cifre decimali, sarà:

20 · C

2.4.2.   Ripetibilità (r)

r = 1 + 0,024 Xi mg/l

dove

Xi

=

concentrazione in sodio del campione espressa in mg/l.

2.4.3.   Riproducibilità (R)

R = 2,5 + 0,05 Xi mg/l

dove

Xi

=

concentrazione in sodio del campione espressa in mg/l.

▼M8 —————

▼B

27.   POTASSIO

1.   PRINCIPIO DEI METODI

1.1.   Metodo di riferimento

Il potassio viene dosato direttamente nel vino diluito per spettrofotometria di assorbimento atomico dopo addizione di un tampone spettrale di cloruro di cesio per evitare la ionizzazione del potassio.

1.2.   Metodo usuale

Il potassio viene dosato direttamente nel vino diluito per fotometria di fiamma.

2.   METODO DI RIFERIMENTO

2.1.   Reattivi

2.1.1.   Soluzione di potassio di 1 g per litro

Usare una soluzione standard di potassio di 1 g/l del tipo in commercio. Questa soluzione può essere preparata sciogliendo 4,813 g di tartrato acido di potassio (C4H5KO6) in acqua distillata e portando il volume ad un litro.

2.1.2.   Soluzione modello:

2.1.3.   Soluzione di cloruro di cesio al 5 % in cesio

Sciogliere 6,330 g di cloruro di cesio CSCl in 100 ml di acqua distillata.

2.2.   Apparecchiatura

2.2.1.

Spettrofotometro di assorbimento atomico. Gas di alimentazione del bruciatore: aria e acetilene.

2.2.2.

Lampada a catodo cavo al potassio.

2.3.   Modo di operare

2.3.1.   Preparazione del campione

Prelevare 2,5 ml di vino (previamente diluito al 10 %), versarli in un pallone tarato da 50 ml; aggiungere 1 ml di soluzione di cloruro di cesio (2.1.3) e portare a volume con acqua distillata.

2.3.2.   Taratura

Versare in una serie di palloni tarati da 100 ml 5 ml di soluzione modello (2.1.2); aggiungere rispettivamente 0 - 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 ml della soluzione di potassio di 1 g/l (2.1.1) (previamente diluita al 10 %); aggiungere in tutti i palloni 2 ml della soluzione di cloruro di cesio (2.1.3) e portare il volume a 100 ml con acqua distillata. Le soluzioni di taratura preparate hanno un titolo rispettivamente di 0 - 2 - 4 - 6 - 8 mg di potassio per litro e contengono 1 g di cesio per litro; vanno conservate in flaconi di polietilene.

2.3.3.   Dosaggio

Regolare la lunghezza d'onda a 769,9 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con la soluzione modello contenente 1 g di cesio per litro (2.3.2). Aspirare direttamente il vino diluito (2.3.1) nel bruciatore dello spettrofotometro, quindi successivamente le soluzioni di taratura (2.3.2). Leggere le assorbanze, effettuare le determinazioni in doppio.

2.4.   Espressione dei risultati

2.4.1.   Calcolo

Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione di potassio delle soluzioni di taratura. Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione di vino diluito su tale curva e determinare la concentrazione C di potassio in milligrammi per litro.

La concentrazione di potassio espressa in milligrammi per litro di vino, è data da: F · C dove F = fattore di diluizione (in questo caso 200)

2.4.2.   Ripetibilità (r)

r = 35 mg/l

2.4.3.   Riproducibilità (R)

R = 66 mg/l

2.4.4.   Altre espressioni dei risultati

▼M8 —————

▼B

28.   MAGNESIO

1.   PRINCIPIO

Il magnesio viene dosato direttamente nel vino opportunamente diluito mediante spettrofotometria di assorbimento atomico.

2.   REAGENTI

2.1.   Soluzione di taratura concentrata di magnesio di 1 g/l.

Utilizzare una soluzione standard di 1 g/l magnesio reperibile in commercio. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 8,3646 g di cloruro di magnesio (MgCl2, 6 H2O) in acqua distillata e portando il volume ad 1 litro.

2.2.   Soluzione di taratura diluita: 5 mg di magnesio per litro.

Osservazione:

Conservare le soluzioni di taratura di magnesio in flaconi in polietilene.

3.   APPARECCHIATURA

3.1.	Spettrofotometro di assorbimento atomico dotato di un bruciatore alimentato con aria e acetilene.

3.2.	Lampada a catodo cavo al magnesio.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione del campione

Diluire il vino all' 1 % con acqua distillata.

4.2.   Taratura

In una serie di palloni tarati da 100 ml, versare 5 - 10 - 15 - 20 ml della soluzione 2.2 e completare a 100 ml con acqua distillata. Le soluzioni ottenute contengono rispettivamente 0,25 - 0,50 - 0,75 - 1 mg di magnesio per litro. Conservarle in flaconi di polietilene.

4.3.   Dosaggio

Selezionare la lunghezza d'onda a 285 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua distillata. Aspirare direttamente il vino diluito nel bruciatore dello spettrofotometro ripetendo quindi l'operazione con le varie soluzioni di taratura preparate al punto 4.2. Rilevare le assorbanze; effettuare le determinazioni in doppio.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Calcolo

Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in magnesio delle soluzioni di taratura.

Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione di vino diluito su detta curva e determinare la concentrazione C di magnesio.

La concentrazione di magnesio espressa in milligrammi per litro di vino senza cifre decimali è data da:

100 · C

5.2.   Ripetibilità (r)

r = 3 mg/l

5.3.   Riproducibilità (R)

R = 8 mg/l

29.   CALCIO

1.   PRINCIPIO

Il calcio viene dosato direttamente nel vino opportunamente diluito mediante spettrofotometria di assorbimento atomico dopo addizione di un tampone spettrale.

2.   REAGENTI

2.1.   Soluzione di taratura a 1 g di calcio per litro.

Utilizzare una soluzione standard di calcio reperibile in commercio, di un g/l. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 2,5 g di carbonato di calcio, CA CO3, nella quantità di HCL al 10 % (v/v) sufficiente a scioglierla, portando quindi il volume ad 1 l con acqua distillata.

2.2.   Soluzione di taratura diluita a 50 mg di calcio per litro.

Osservazione:

conservare le soluzioni di taratura di calcio in flaconi di polietilene.

2.3.   Soluzione di cloruro di lantanio di 50 g/l in lantanio.

Sciogliere 13,369 g di cloruro di lantanio (La Cl3 · 7 H2O) in acqua distillata; aggiungere 1 ml di HCl diluito al 10 % (v/v) e portare il volume a 100 ml.

3.   APPARECCHIATURA

3.1.	Spettrofotometro di assorbimento atomico dotato di un bruciatore alimentato con aria/acetilene.

3.2.	Lampada a catodo cavo al calcio.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione del campione

In un pallone da 20 ml versare 1 ml di vino, 2 ml di soluzione 2.3 e portare a volume con acqua distillata. Il titolo in lantanio del vino diluito al 5 % è di 5 g/l.

Osservazione:

Per i vini dolci, è sufficiente la concentrazione di 5 g di lantanio per litro a condizione che la diluizione porti il tenore in zuccheri a meno di 2,5 g/l. Per concentrazioni in zuccheri superiori occorre portare il tenore in lantanio a 10 g/l.

4.2.   Taratura

Porre in cinque palloni tarati da 100 ml rispettivamente 0 - 5 - 10 - 15 - e 20 ml della soluzione 2.2; aggiungere in tutti i palloni 10 ml della soluzione 2.3 e portare il volume a 100 ml con acqua distillata. Le soluzioni di taratura così preparate contengono rispettivamente 0 - 2,5 - 5 - 7,5 e 10 mg di calcio per litro e 5 g di lantanio per litro. Conservare queste soluzioni in flaconi di polietilene.

4.3.   Dosaggio

Selezionare la lunghezza d'onda di 422,7 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con la soluzione contenente 5 g di lantanio per litro (4.2). Aspirare direttamente il vino diluito nel bruciatore dello spettrofotometro e quindi, una dopo l'altra, le soluzioni di taratura preparate al punto 4.2. Rilevare le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Calcolo

Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in calcio delle soluzioni di taratura.

Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione di vino diluito su tale curva e determinare la concentrazione C di calcio. La concentrazione in calcio, espressa in mg/l di vino mediante numeri interi, è data da:

20 · C

5.2.   Ripetibilità (r)

tenore < 60 mg/l: r

=

2,7 mg/l

tenore > 60 mg/l: r

=

4 mg/l

5.3.   Riproducibilità (R)

R

=

0,114 xi − 0,5

Xi

=

concentrazione in mg/l del campione.

30.   FERRO

1.   PRINCIPIO DEL METODI

Metodo di riferimento

Il ferro viene dosato direttamente per spettrofotometria di assorbimento atomico previa opportuna diluizione del vino ed eliminazione dell'alcool.

Metodo usuale

Dopo mineralizzazione del vino mediante perossido di idrogeno, il ferro III viene portato allo stato di ferro II e viene quindi dosato grazie alla colorazione rossa che dà con l'ortofenantrolina.

2.   METODO DI RIFERIMENTO

2.1.   Reattivi

2.1.1.

Soluzione di taratura concentrata di ferro III di 1 g/l. Utilizzare una soluzione standard del tipo in commercio di 1 g /l. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 8,6341 g di solfato ferrico ammonico [FeNH4(SO4)2 · 12H2O] in acqua distillata leggermente acidificata con acido cloridrico M e portando il volume ad 1 l.

2.1.2.

Soluzione di taratura diluita di ferro di 100 mg/l.

2.2.   Apparecchiatura

2.2.1.

Evaporatore rotante con bagnomaria termoregolato.

2.2.2.

Spettrofotometro di assorbimento atomico dotato di un bruciatore alimentato con aria/acetilene.

2.2.3.

Lampada a catodo cavo al ferro.

2.3.   Modo di operare

2.3.1.   Preparazione del campione

Eliminare l'alcol del vino per concentrazione del suo volume a circa la metà mediante un evaporatore rotativo (50-60 °C). Riportare al volume iniziale con acqua distillata.

Prima del dosaggio effettuare, se necessario, una diluizione.

2.3.2.   Taratura

In cinque palloni tarati da 100 ml, porre 1 - 2 - 3 - 4 - 5 ml della soluzione di ferro di 100 mg/l (2.1.2) e portare a 100 ml con acqua distillata. Le soluzioni preparate contengono rispettivamente 1 - 2 - 3 - 4 - 5 mg di ferro per litro.

Conservare queste soluzioni in flaconi di polietilene.

2.3.3.   Dosaggio

Regolare la lunghezza d'onda a 248,3 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con l'acqua distillata. Aspirare direttamente nel bruciatore dello spettrofotometro il campione diluito e quindi le varie soluzioni di taratura preparate al punto 2.3.2. Leggere le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.

2.4.   Espressione dei risultati

2.4.1.   Calcolo

Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in ferro delle soluzioni di taratura. Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il campione di vino diluito su tale curva e determinare la concentrazione in ferro C.

La concentrazione in ferro espressa in mg/l di vino, con una cifra decimale, è data da:

C · F

F

=

fattore di diluizione

▼M8 —————

▼B

31.   RAME

1.   PRINCIPIO DEL METODO

È basato sull'impiego della spettrofotometria di assorbimento atomico.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	Capsula di platino.

2.2.	Spettrofotometro di assorbimento atomico.

2.3.	Lampada a catodo cavo al rame.

2.4.	Gas di alimentazione: aria acetiline o protossido di azoto/acetilene.

3.   REATTIVI

3.1.	Rame metallo.

3.2.	Acido nitrico concentrato (HNO3) 65 % (ρ20 = 1,38 g/ml).

3.3.	Acido nitrico diluito 1/2 (v/v).

3.4.

Soluzione di rame a 1 g/l Utilizzare una soluzione standard di rame del tipo in commercio. Questa soluzione può essere preparata pesando 1,000 g di rame metallico e trasferendo quantitativamente in un matraccio tarato da 1 000 ml. Aggiungere acido nitrico diluito 1/2 (3.3) nella quantità esattamente necessaria a sciogliere il metallo e quindi 10 ml di acido nitrico concentrato (3.2); portare infine a volume con acqua bidistillata.

3.5.	Soluzione di rame a 100 mg/l Prelevare 10 ml della soluzione 3.4 e versarli in un pallone tarato da 100 ml portando a volume con acqua bidistillata.

4.   PROCEDIMENTO

4.1.   Preparazione del campione e dosaggio del rame

Se occorre preparare una diluizione appropriata con acqua bidistillata.

4.2.   Taratura

Prelevare 0,5 - 1 - 2 ml della soluzione 3.5 (100 mg di rame per litro), porli in matracci tarati da 100 ml portando a volume con acqua bidistillata; le soluzioni ottenute contengono rispettivamente 0,5 - 1 - 2 mg/l di rame.

4.3.   Dosaggio

Selezionare la lunghezza d'onda a 324,8 nm, regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua bidistillata. Aspirare direttamente il campione diluito nel bruciatore dello spettrofotometro e dopo, una dopo l'altra, le soluzioni di taratura preparate in 4.2. Leggere le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Calcolo

Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in rame delle soluzioni di taratura.

Riportare il valore dell'assorbanza letta per il campione di vino diluito sulla curva di taratura e rilevare la concentrazione C in mg/l.

Se F è fattore di diluizione, il tenore in rame del vino, espresso in milligrammi per litro con due cifre decimali è: F · C

Osservazioni:

a)Le soluzioni per la costruzione della curva di taratura e le diluizioni del campione devono comunque essere scelte sia in funzione della sensibilità dell'apparecchiatura usata che della concentrazione del metallo presente nel campione.

b)Per concentrazioni molto basse di rame nel campione in esame operare nel modo seguente: porre 100 ml del campione in una capsula di platino, evaporare su bagnomaria a 100 °C fino a consistenza sciropposa, aggiungere goccia a goccia 2,5 ml di acido nitrico concentrato (3.2) cercando di coprire tutto il fondo della capsula. Procedere cautamente all'incenerimento del residuo su piastra riscaldante elettrica oppure su piccola fiamma; introdurre quindi la capsula in forno a muffola regolato alla temperatura di 500 ° ± 25 °C, lasciandola per circa un'ora. Dopo raffreddamento umettare le ceneri con 1 ml di acido nitrico concentrato (3.2), spappolandole con una bacchetta di vetro; evaporare e carbonizzare nuovamente con le stesse modalità. Portare nuovamente la capsula in muffola per 15 minuti; ripetere almeno tre volte il trattamento con acido nitrico concentrato (3.2). Solubilizzare le ceneri aggiungendo nella capsula 1 ml di acido nitrico concentrato (3.2) e 2 ml di acqua bidistillata; travasare in un matraccio tarato da 10 ml. Lavare tre volte la capsula con 2 ml per volta di acqua bidistillata, portare infine a volume con acqua bidistillata.

32.   CADMIO

1.   PRINCIPIO DEL METODO

Il cadmio viene dosato direttamente nel vino mediante spettrofotometria di assorbimento atomico senza fiamma.

2.   APPARECCHIATURA

Tutta la vetreria dev'essere preliminarmente lavata con acido nitrico concentrato caldo (70-80 °C) e sciacquata con acqua bidistillata.

2.1.	Spettrofotometro ad assorbimento atomico provvisto di un forno a grafite, di un correttore di rumori di fondo e di un registratore multipotenziometrico.

2.2.	Lampada a catodo cavo al cadmio.

2.3.	Micropipette di 5 µl munite di ghiere speciali per misure di assorbimento atomico.

3.   REATTIVI

L'acqua usata deve essere acqua bidistillata in un apparecchio di vetro borosilicato oppure acqua di purezza equivalente. Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica riconosciuta e in particolare esenti da cadmio.

3.1.	Acido fosforico all'85 % (ρ20 = 1,71 g/ml).

3.2.	Soluzione di acido fosforico ottenuta portando 8 ml di acido fosforico a 100 ml con acqua.

3.3.	Soluzione 0,02 M di sale bisodico dell'acido etilendiamminotetracetico (EDTA).

3.4.	Soluzione tampone a pH 9, ottenuta sciogliendo, in un pallone tarato da 100 ml, 5,4 g di cloruro di ammonio in qualche millilitro d'acqua, aggiungendo 35 ml di soluzione di idrossido di ammonio (ρ20 = 0,92 g/ml) diluita al 25 % (v/v) e portando a volume con acqua.

3.5.	Nero eriocromo T: diluizione solida all'1 % (m/m) in cloruro di sodio.

3.6.

Solfato di cadmio (3CdSO4 · 8H2O). Il titolo del solfato di cadmio dev'essere verificato operando come segue: pesare esattamente 102,6 mg del campione di solfato di cadmio, immetterlo quantitativamente in un becher con acqua, agitare fino a scioglimento; aggiungere 5 ml di soluzione tampone a pH 9 e circa 20 mg di nero eriocromo T. Titolare con soluzione di EDTA finché l'indicatore vira al blu. Il volume di EDTA utilizzato deve essere pari a 20 ml; se esso varia di poco, correggere in conseguenza l'aliquota di solfato di cadmio pesata utilizzata per la preparazione della soluzione di riferimento.

3.7.

Soluzione di riferimento di cadmio di 1 g per litro. Usare una soluzione standard esistente in commercio. Questa soluzione può essere ottenuta sciogliendo 2,2820 g di solfato di cadmio in acqua e portando il volume a 1 litro. Conservare la soluzione in un flacone di vetro borosilicato a tappo smerigliato.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione del campione

Diluire il vino 1:2 (v/v) con la soluzione di acido fosforico.

4.2.   Preparazione delle soluzioni della curva di taratura

Partendo dalla soluzione di riferimento di cadmio preparare mediante diluizioni successive soluzioni contenenti rispettivamente 2,5 - 5 - 10 - 15 microgrammi di cadmio per litro.

4.3.   Determinazione

4.3.1.   Programma del forno (proposto a titolo indicativo):

Essiccazione a 100 °C per 30 secondi.

Mineralizzazione a 900 °C per 20 secondi.

Atomizzazione a 2 250 °C per 2-3 secondi.

Erogazione di azoto (gas di lavaggio): 6 litri/minuto.

NB:

Alla fine dell'operazione, portare la temperatura fino a 2 700 °C per depurare il forno.

4.3.2.   Misure di assorbimento atomico

Selezionare la lunghezza d'onda a 228,8 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua bidistillata. Iniettare nel forno, mediante micropipetta, per tre volte, 5 µl di ciascuna delle soluzioni della gamma di taratura e della soluzione del campione da analizzare. Registrare le assorbanze misurate. Calcolare il valore medio dell'assorbanza partendo dai risultati relativi alle tre iniezioni.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Modo di calcolo

Tracciare la curva delle variazioni dell'assorbanza in funzione delle concentrazioni di cadmio delle soluzioni della gamma di taratura. La variazione è lineare. Riportare il valore medio dell'assorbanza della soluzione del campione sulla retta di taratura, dedurne la concentrazione C in cadmio. La concentrazione in cadmio espressa in microgrammi per litro di vino è pari a:

2 · C

33.   ARGENTO

1.   PRINCIPIO DEL METODO

È basato sull'impiego della spettrofotometria di assorbimento atomico previa mineralizzazione del campione.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	Capsula di platino.

2.2.	Bagnomaria termostato a 100 °C.

2.3.	Muffola regolata a 500-525 °C.

2.4.	Spettrofotometro di assorbimento atomico.

2.5.	Lampada a catodo cavo ad argento.

2.6.	Gas di alimentazione: aria acetilene.

3.   REATTIVI

3.1.	Nitrato d'argento (AgNO3).

3.2.	Acido nitrico concentrato (HNO3) 65 % (ρ20 = 1,38 g/ml).

3.3.	Acido nitrico diluito 1/10 (v/v).

3.4.	Soluzione d'argento di 1 g/l. Usare una soluzione standard di argento del tipo in commercio. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 1,575 g di nitrato d'argento in acido nitrico diluito e completando il volume a 1 000 ml con acido nitrico diluito.

3.5.	Soluzione d'argento a 10 mg/l. Diluire 10 ml della soluzione 3.4 a 1 000 ml con acido nitrico diluito.

4.   PROCEDIMENTO

4.1.   Preparazione del campione

Porre 20 ml del campione in capsula di platino, evaporare a secco su bagnomaria bollente a 100 °C. Incenerire in muffola fino a ceneri bianche a 500-525 °C. Riprendere le ceneri con 1 ml di acido nitrico concentrato (3.2), evaporare a bagnomaria a 100 °C, ripetere l'aggiunta di 1 ml di acido nitrico (3.2) e l'evaporazione. Aggiungere 5 ml di acido nitrico diluito (3.3) e scaldare leggermente sino a dissoluzione.

4.2.   Taratura

Una serie di matracci tarati da 100 ml si pongono 2 - 4 - 6 - 8 - 10 e 20 ml di soluzione 3.5 d'argento di 10 mg/l, si porta a volume con acido nitrico diluito (3.3). Tali soluzioni contengono 0,20 - 0,40 - 0,60 - 0,80 - 1,0 e 2,0 mg/l d'argento.

4.3.   Dosaggio

Selezionare la lunghezza d'onda a 328,1 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con l'acido nitrico diluito 3.3. Aspirare direttamente nel bruciatore dello spettrofotometro la soluzione del campione ottenuta in 4.1 e dopo, successivamente, le soluzioni di taratura. Leggere le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Calcolo

Tracciare la curva della variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in argento delle soluzioni di taratura.

Riportare il valore dell'assorbanza letto per il dosaggio (4.1) sulla curva di taratura e ricavare la concentrazione C in mg/l.

Il tenore in argento del vino, espresso in milligrammi per litro, espresso con due cifre decimali, è dato da: 0,25 C.

Osservazione:

Le soluzioni di riferimento per la determinazione della curva di taratura, la quantità di campione prelevato e il volume finale di liquido possono essere modificati in funzione della sensibilità dell'apparecchiatura usata.

34.   ZINCO

1.   PRINCIPIO

Lo zinco viene dosato direttamente nel vino dealcolizzato mediante spettrofotometria di assorbimento atomico.

2.   REATTIVI

L'acqua impiegata deve essere acqua bidistillata in un apparecchio in vetro borosilicato oppure acqua di purezza equivalente.

2.1.	Soluzione di taratura di zinco ad 1 g/l. Utilizzare una soluzione standard di zinco del tipo in commercio. Tale soluzione può essere preparata sciogliendo 4,3975 g di solfato di zinco (Zn SO4 · 7 H2O) in acqua e portando il volume ad un litro.

2.2.	Soluzione standard diluita di zinco a 100 mg/l.

3.   APPARECCHIATURA

3.1.	Evaporatore rotante con bagnomaria termostatato.

3.2.	Spettrofotometro di assorbimento atomico con un bruciatore alimentato ad aria/acetilene.

3.3.	Lampada a catodo cavo allo zinco.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione del campione

Eliminare l'alcol riducendo a metà 100 ml di vino posti in un evaporatore rotativo (temperatura: 50-60 °C). Riportare al volume iniziale di 100 ml con acqua bidistillata.

4.2.   TARATURA

In quattro palloni tarati da 100 ml, porre 0,5 - 1 - 1,5 - 2 ml della soluzione di zinco a 100 mg/l (2.2) e portare al segno di taratura con acqua bidistillata. Le soluzioni di taratura corrispondono rispettivamente a 0,5 - 1 - 1,5 · 2 mg di zinco per litro.

4.3.   Dosaggio

Regolare la lunghezza d'onda a 213,9 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua bidistillata. Aspirare direttamente nel bruciatore dello spettrofotometro il vino e quindi le varie soluzioni di taratura. Leggere le assorbanze. Effettuare le determinazioni in doppio.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Calcolo

Tracciare la curva di variazione dell'assorbanza in funzione della concentrazione in zinco delle soluzioni di taratura. Riportare il valore medio delle assorbanze ottenute per il vino e determinare la concentrazione di zinco in milligrammi per litro di vino con una cifra decimale.

35.   PIOMBO

1.   PRINCIPIO DEL METODO

Il piombo viene dosato direttamente nel vino mediante spettrofotometria di assorbimento atomico senza fiamma.

2.   APPARECCHIATURA

Tutta la vetreria dev'essere preliminarmente lavata con acido nitrico concentrato caldo (70-80 °C) e sciacquata con acqua bidistillata.

2.1.	Spettrofotometro di assorbimento atomico provvisto di forno a grafite, di correttore di assorbimento non specifico e di registratore multipotenziometrico.

2.2.	Lampada a catodo cavo al piombo.

2.3.	Micropipette da 5 µl munite di ghiere speciali per misure di assorbimento atomico.

3.   REATTIVI

Tutti i reattivi devono essere di purezza analitica riconosciuta e in particolare devono essere esenti da piombo. L'acqua utilizzata deve essere acqua bidistillata in un apparecchio di vetro borosilicato o acqua di purezza equivalente.

3.1.	Acido fosforico all'85 % (ρ20 = 1,71 g/ml)

3.2.	Soluzione di acido fosforico ottenuta portando 8 ml di acido fosforico a 100 ml con acqua

3.3.	Acido nitrico (ρ20 = 1,38 g/ml)

3.4.

Soluzione di piombo da 1 g per litro Usare una soluzione standard del commercio. Questa soluzione può essere ottenuta sciogliendo 1,600 g di nitrato di piombo II Pb (NO3)2, in acido nitrico diluito all'1 % (v/v) e portando al volume di 1 litro. Conservare la soluzione in un flacone di vetro borosilicato a tappo smerigliato.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione del campione

Diluire il vino 1:2 oppure 1:3 con la soluzione di acido fosforico (3.2) secondo la concentrazione presunta di piombo.

4.2.   Preparazione delle soluzioni di taratura

A partire dalla soluzione di riferimento di piombo 3.4, preparare, mediante diluizioni successive con acqua bidistillata, soluzioni contenenti rispettivamente 25-50-100-150 microgrammi di piombo per litro.

4.3.   Determinazione

4.3.1.   Programma del forno (proposto a titolo indicativo):

Essiccazione a 100 °C per 30 secondi.

Mineralizzazione a 900 °C per 20 secondi.

Atomizzazione a 2 250 °C per 2-3 secondi.

Flusso di azoto (gas di lavaggio): 6 litri/minuto.

NB:

Alla fine dell'operazione portare la temperatura fino a 2 700 °C, onde pulire il forno.

4.3.2.   Misure

Selezionare la lunghezza d'onda di 217 nm. Regolare lo zero della scala delle assorbanze con acqua bidistillata. Iniettare nel forno programmato, mediante una micropipetta, per tre volte, 5 µl di ciascuna delle soluzioni di taratura e della soluzione del campione da analizzare. Registrare le assorbanze misurate. Calcolare il valore dell'assorbanza partendo dai risultati relativi alle tre iniezioni.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

5.1.   Calcolo

Tracciare la curva delle variazioni dell'assorbanza in funzione delle concentrazioni di piombo delle soluzioni di taratura. La variazione è lineare. Riportare il valore medio dell'assorbanza della soluzione del campione sulla retta di taratura e ricavare la concentrazione C in piombo. La concentrazione di piombo espressa in microgrammi per litro di vino è pari a:

C × F

dove:

F

=

fattore di diluizione

36.   FLUORURI

1.   PRINCIPIO

Il tenore di fluoruri del vino, addizionato di una soluzione tampone, viene determinato mediante un elettrodo specifico a membrana solida. Il potenziale misurato è proporzionale al logaritmo dell'attività degli ioni fluoruro nel mezzo studiato conformemente alla relazione:

E = Eo ± S log a F

dove:

E

=

potenziale dell'elettrodo ionico specifico misurato rispetto all'elettrodo di riferimento nel mezzo studiato.

Eo

=

potenziale standard della cella di misura.

S

=

fattore di Nernst, a 25 °C il fattore di Nernst teorico è uguale a 59,2 mV.

a F

=

attività degli ioni fluoruro nella soluzione studiata.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	Elettrodo a membrana cristallina specifico dello ione fluoro.

2.2.	Elettrodo di riferimento (calomelano oppure Ag/AgCl).

2.3.	Millivoltmetro (pHmetro con una graduazione in millivolt), precisione 0,1 mV.

2.4.	Agitatore magnetico con piastra isolante per proteggere la soluzione analizzata dal calore del motore. Cilindro agitatore ricoperto di plastica (polietilene o materiale equivalente).

2.5.	Becher in plastica, da 30 o da 50 ml e flaconi di plastica (polietilene o materiale equivalente).

2.6.	Pipette di precisione (pipette graduate in microlitri o qualsiasi altra pipetta equivalente).

3.   REATTIVI

3.1.

Soluzione madre di fluoruro a 1 g/l Utilizzare una soluzione standard del commercio a 1 g/l. Questa soluzione può essere preparata sciogliendo 2,210 g di fluoruro di sodio (essiccato 3-4 ore a 105 °C) in acqua distillata. Portare al volume di 1 000 ml con acqua distillata. La soluzione viene conservata in un flacone di plastica.

3.2.	Soluzioni standard di fluoruro di concentrazione appropriata vengono preparate mediante diluizione della soluzione madre con acqua distillata e conservate in flaconi di plastica. Le soluzioni standard il cui tenore di fluoruro è dell'ordine del mg/l devono essere preparate estemporaneamente.

3.3.

Soluzione tampone pH 5,5 A 10 g di acido cicloesandiammino (1,2) tetracetico (CDTA) viene aggiunta acqua (circa 50 ml); aggiungere una soluzione contenente 58 g di cloruro di sodio e 29,4 g di citrato trisodico in 700 ml di acqua distillata. Il CDTA viene sciolto aggiungendo una soluzione di idrossido di sodio al 32 % (m/v) (circa 6 ml). Aggiungere infine 57 ml di acido acetico (ρ20 = 1,05 g/ml) e portare il pH a 5,5 con la soluzione di idrossido di sodio al 32 % (circa 45 ml). Lasciar raffreddare e portare al volume di un litro con acqua distillata.

4.   MODO DI OPERARE

Osservazione preliminare:

È necessario controllare che tutte le soluzioni conservino, durante la misurazione, una temperatura di 25 ± 1 °C (uno scarto di ± 1 °C provoca una modifica di circa ± 0,2 mV).

4.1.   Metodo diretto

In un becher di plastica introdurre un volume definito di vino e un volume uguale di soluzione tampone.

La soluzione viene agitata in modo omogeneo e moderato. Quando l'apparecchio indicatore è stabile (la stabilità viene ottenuta allorché il potenziale varia al massimo di 0,2-0,3 mV/3 minuti), leggere il valore del potenziale in mV.

4.2.   Metodo delle aggiunte

Senza interrompere l'agitazione, il mezzo studiato viene addizionato, mediante pipetta di precisione, di un volume noto di soluzione standard di fluoruro. Quando l'apparecchio indicatore è stabile, leggere il valore del potenziale in mV.

Scegliere la concentrazione della soluzione standard aggiunta come segue:

La condizione b) semplifica i calcoli (vedi 5).

La concentrazione approssimativa del mezzo studiato viene letta su una retta di taratura tracciata in coordinate semilogaritmiche con soluzioni standard contenenti 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 mg/l di fluoruri.

Osservazione:

se la concentrazione approssimativa del mezzo studiato supera il campo di concentrazione delle soluzioni standard, diluire il campione.

Esempio:

Sia 0,25 mg/l F− il tenore approssimativo del mezzo studiato (volume 20 ml); la concentrazione deve essere maggiorata di 0,25 mg/l. A questo scopo aggiungere, ad esempio alla soluzione, con la pipetta di precisione appropriata, 0,20 ml (= 1 %) di una soluzione standard contenente 25 mg/l F− oppure 0,050 ml di una soluzione standard da 100 mg/l F−.

5.   CALCOLI

Il tenore di fluoruri del mezzo studiato, espresso in mg/l, si ottiene con la formula seguente:

dove:

C F

=

concentrazione in fluoruro del mezzo studiato (mg/l).

C a

=

concentrazione del fluoruro aggiunto (mg/l) nel mezzo studiato (V a ).

V o

=

volume iniziale del mezzo studiato prima dell'aggiunta (ml).

V a

=

volume della soluzione aggiunta (ml).

ΔE

=

differenza tra i potenziali E1 ed E2 ottenuti ai punti 4.1 e 4.2 (mV).

S

=

fattore di Nernst della soluzione in esame.

Se V a è molto vicino a V o (vedi 4.2) la formula si semplifica e diventa:

Il valore ottenuto deve essere moltiplicato per il fattore di diluizione derivante dall'aggiunta del tampone.

37.   ANIDRIDE CARBONICA

▼M13

1.   PRINCIPIO DEL METODO

▼B

1.1.   Metodo di riferimento

1.1.1.   Vini tranquilli (sovrappressione CO2 ≤ 0,5 · 105 Pa)

Il volume di vino prelevato dal campione, portato a temperatura prossima a O °C, viene versato in un eccesso di soluzione titolata di idrossido di sodio, sufficiente a portare il pH a 10-11. Si titola con una soluzione acida in presenza di anidrasi carbonica. Il contenuto in CO2 viene ricavato dal volume di soluzione acida impiegato per passare da pH 8,6 (forma bicarbonato) a pH 4,0 (acido carbonico). Una titolazione di riferimento, effettuata nelle stesse condizioni sul vino privato di CO2, permette di tener conto del volume di soluzione di idrossido di sodio consumato dagli acidi del vino.

1.1.2.   Vini frizzanti e spumanti

Il campione di vino da analizzare viene portato a temperatura prossima al suo punto di congelamento. Dopo prelevamento di un dato volume, destinato a servire da riferimento dopo eliminazione di CO2, si alcalinizza il resto della bottiglia per fissare tutta l'anidride carbonica sotto forma di Na2CO3. Si titola con una soluzione acida in presenza di anidrasi carbonica. Il tenore di CO2 viene ricavato dal volume di soluzione acida impiegata per passare da pH 8,6 (forma bicarbonato) a pH 4,0 (acido carbonico). Una titolazione di riferimento, effettuata nelle stesse condizioni sul vino privato di CO2, permette di tener conto del volume di soluzione di idrossido di sodio consumata dagli acidi del vino.

▼M13 —————

▼B

2.   METODO DI RIFERIMENTO

2.1.   Vini tranquilli (sovrappressione dell'anidride carbonica ≤ 0,5 · 105 Pa).

2.1.1.   Apparecchiatura

2.1.1.1.

Agitatore magnetico.

2.1.1.2.

pHmetro

2.1.2.   Reattivi

2.1.2.1.

Soluzione titolata di idrossido di sodio (NaOH), 0,1 M.

2.1.2.2.

Soluzione titolata di acido solforico (H2SO4), 0,05 M.

2.1.2.3.

Soluzione di anidrasi carbonica, a 1 g/l.

2.1.3.   Modo di operare

Raffreddare a temperatura prossima a O °C tanto il campione di vino quanto la pipetta da 10 ml destinata al suo prelevamento.

Versare in un becher da 100 ml 25 ml di soluzione d'idrossido di sodio (2.1.2.1); aggiungere due gocce di soluzione acquosa di anidrasi carbonica (2.1.2.3). Introdurre 10 ml di vino mediante la pipetta raffreddata a 0 °C.

Porre il becher sull'agitatore magnetico, collocare l'elettrodo e la barretta magnetica e procedere ad agitazione moderata.

Quando il liquido è tornato a temperatura ambiente, titolare lentamente con la soluzione di acido solforico (2.1.2.2) fino a pH 8,6.

Continuare l'aggiunta di acido solforico (2.1.2.2) fino a pH 4,0. Sia n ml il volume utilizzato per passare dal pH 8,6 a 4,0.

Procedere quindi all'eliminazione della CO2 su 50 ml di vino circa, agitando sotto vuoto per tre minuti e riscaldando il recipiente in bagnomaria a 25 °C circa.

Ripetere su 10 ml di vino privato di CO2 le operazioni sopra descritte: sia n ml il volume utilizzato.

2.1.4.   Espressione dei risultati

1 ml di soluzione titolata di idrossido di sodio 0,1 M corrisponde a 4,4 mg di CO2.

La quantità di CO2, espressa in g per litro di vino, è data dall'espressione:

0,44 (n − n).

Essa si esprime con due cifre decimali.

Osservazione: Nel caso dei vini a basso contenuto di CO2 (CO2< 1 g/l), l'aggiunta di anidrasi carbonica per catalizzare l'idratazione di CO2 non è necessaria.

2.2.   Vini frizzanti e spumanti

2.2.1.   Apparecchiatura

2.2.1.1.

Agitatore magnetico.

2.2.1.2.

pHmetro.

2.2.2.   Reattivi

2.2.2.1.

Soluzione di idrossido di sodio (NaOH), al 50 % (m/m).

2.2.2.2.

Soluzione titolata di acido solforico (H2SO4), 0,05 M.

2.2.2.3.

Soluzione di anidrasi carbonica a 1 g/l.

2.2.3   Modo di operare

Sulla bottiglia di vino da analizzare, tracciare un segno di riferimento al livello del riempimento e raffreddare fino a congelamento incipiente.

Lasciare che la bottiglia si riscaldi leggermente, agitando di continuo, fino a scomparsa dei cristalli di ghiaccio.

Stappare rapidamente, e mettere da parte, in un cilindro graduato, da 45 a 50 ml di vino, che serviranno al dosaggio di riferimento. Il volume esatto (v ml) di questo prelievo sarà determinato leggendolo sul cilindro, dopo il suo ritorno alla temperatura ambiente.

Appena effettuato il prelevamento, aggiungere 20 ml di soluzione di idrossido di sodio (2.2.2.1) nella bottiglia se questa ha una capacità di 750 ml.

Attendere che il vino sia tornato a temperatura ambiente.

In un becher da 100 ml, introdurre 30 ml di acqua distillata bollita e due gocce della soluzione di anidrasi carboncia (2.2.2.3). Aggiungere 10 ml di vino alcalinizzato.

Porre il becher sull'agitatore magnetico, introdurre l'elettrodo e la barretta magnetica e procedere ad agitazione moderata.

Titolare lentamente con la soluzione di acido solforico (2.2.2.2) fino a pH 8,6.

Proseguire la titolazione con acido solforico (2.2.2.2) fino a pH 4,0. Sia n ml il volume utilizzato fra pH 8,6 e 4,0.

Procedere quindi all'eliminazione della CO2 dai v ml di vino messi da parte per il dosaggio di riferimento, agitando sotto vuoto per tre minuti e riscaldando il recipiente su bagnomaria a 25°C circa. Introdurre 10 ml di vino privato di CO2 in 30 ml di acqua distillata bollita e aggiungere 2 - 3 gocce di soluzione di idrossido di sodio (2.2.2.1) per portare il pH a 10 - 11. Operare poi nel modo più sopra descritto. Siano n' i ml di acido solforico 0,05 M impiegati.

2.2.4.   Espressione dei risultati

1 ml della soluzione di acido solforico 0,05 M corrisponde a 4,4 mg di CO2.

Vuotare la bottiglia del vino alcalinizzato in essa contenuto e determinare con l'approssimazione di 1 ml il volume iniziale del vino riempiendola con acqua fino al segno di riferimento: sia V ml.

La quantità di CO2, espressa in g per litro di vino, è data dall'espressione:

ed è espressa con due cifre decimali.

2.3.    ►M13  Calcolo della sovrappressione teorica ◄

La sovrappressione a 20 °C, Paph20 espressa in pascals, è data dalla formula

dove:

Q

:

tenore di CO2 in g/l di vino

A

:

titolo alcolometrico del vino a 20 °C

S

:

tenore in zuccheri in g/l di vino

Patm

:

pressione atmosferica espressa in pascals

▼M8 —————

▼M13 —————

▼M13

37 bis —   MISURAZIONE DELLA SOVRAPPRESSIONE DEI VINI SPUMANTI E FRIZZANTI

1.   PRINCIPIO

Dopo la stabilizzazione termica e l’agitazione della bottiglia, misurare la sovrappressione con un afrometro (strumento per misurare la pressione). La sovrappressione è espressa in pascal (Pa) (metodo di tipo I). Questo metodo si applica anche ai vini spumanti gassificati e ai vini frizzanti gassificati.

2.   APPARECCHIATURA

Lo strumento che consente di misurare la sovrappressione nelle bottiglie di vini spumanti o frizzanti si chiama afrometro. La sua forma è diversa a seconda della chiusura della bottiglia (capsula metallica, tappo a corona, tappo di sughero o di plastica).

2.1.   Per le bottiglie munite di capsula

Consta di tre parti (figura 1):

2.2.   Per le bottiglie munite di tappo

Consta di due parti (figura 2):

Osservazioni sui manometri che si trovano su questi due tipi di apparecchi

3.   MODO DI OPERARE

La misurazione deve essere effettuata su bottiglie la cui temperatura sia stabilizzata da almeno 24 ore. Dopo aver forato il tappo a corona, il tappo di sughero o il tappo di plastica, per effettuare la lettura occorre agitare vigorosamente la bottiglia sino a ottenere una pressione costante.

3.1.   Bottiglie munite di capsula

Infilare il dente della staffa sotto l’adattatore della bottiglia. Avvitare il dado in modo che il tutto stringa la bottiglia. La parte superiore risulta così avvitata nel dado. Per evitare perdite di gas, la capsula deve essere forata il più rapidamente possibile, in modo da portare il giunto a contatto con la capsula. Per effettuare la lettura, occorre poi agitare vigorosamente la bottiglia sino a ottenere una pressione costante.

3.2.   Bottiglie munite di tappo

Collocare una punta sull’estremità dell’ago e posizionare il tutto sul tappo; stringere le quattro viti sul tappo; avvitare la parte superiore (l’ago attraversa il tappo). La punta deve cadere nella bottiglia in modo che la pressione possa essere trasmessa al manometro. Effettuare la lettura dopo avere agitato la bottiglia sino a ottenere una pressione costante. Recuperare la punta dopo la lettura.

4.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

La sovrappressione a 20 °C (Paph20) è espressa in pascal (Pa) o in kilopascal (kPa); deve essere coerente con la precisione del manometro (ad esempio: 6,3 105 Pa oppure 630 kPa e non 6,33 105 Pa o 633 kPa per un manometro di classe 1 e fondo scala 1 000 kPa).

Se la temperatura di misurazione è diversa da 20 °C, è opportuno correggerla moltiplicando la pressione misurata per il coefficiente riportato nella tabella 1.

5.   CONTROLLO DEI RISULTATI

Metodo di determinazione diretta di parametri fisici (metodo di tipo I)

Verifica degli afrometri

Gli afrometri devono essere verificati periodicamente (almeno una volta l’anno).

La verifica è effettuata per mezzo di un banco di taratura che consente di confrontare il manometro da verificare con un manometro di riferimento di classe superiore, calibrato secondo gli standard nazionali, montato in parallelo. Il controllo è utilizzato per confrontare i valori indicati dai due apparecchi per pressioni crescenti e successivamente per pressioni decrescenti. Qualora venga riscontrata una differenza tra i due manometri, una vite di regolazione consente di effettuare le correzioni necessarie.

Tutti i laboratori e gli organismi autorizzati sono dotati di tali banchi di taratura, che sono disponibili anche presso i costruttori di manometri.

▼M7

38.   DERIVATI CIANICI

(Attenzione:rispettare le prescrizioni di sicurezza per le manipolazioni dei prodotti chimici, per la clorammina T, la piridina, il cianuro di potassio, l'acido cloridrico e l'acido fosforico. Per lo smaltimento dei prodotti usati, attenersi a modalità conformi alle norme e ai regolamenti ecologici in materia. Opportuna cautela per l'acido cianidrico liberato nella distillazione del vino acidificato).

1.   PRINCIPIO

L'acido cianidrico libero e totale del vino viene liberato per idrolisi acida e separato per distillazione. Dopo reazione con la clorammina T e la piridina, il dialdeide glutaconico formato è dosato per colorimetria, grazie alla colorazione blu che manifesta con l'acido dimetil 1,3 barbiturico.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.   Apparecchiatura di distillazione

Utilizzare l'apparecchiatura di distillazione descritta per la determinazione del titolo alcolometrico volumico del vino

2.2.	Pallone da 500 ml a smerigliatura normalizzata

2.3.	Bagnomaria termostatato a 20 °C

2.4.	Spettrofotometro che consenta misurazioni dell'assorbanza alla lunghezza d'onda di 590 nm

2.5.	Celle di vetro o celle monouso con cammino ottico di 20 mm

3.   REAGENTI

3.1.	Acido fosforico (H3PO4) al 25 % (m/v)

3.2.	Soluzione di clorammina T(C7H7ClNNa O2S, 3H2O) al 3 % (m/v)

3.3.	Soluzione di acido 1,3-dimetilbarbiturico: sciogliere 3,658 g di acido 1,3-dimetilbarbiturico (C6H8N2O3) in 15 ml di piridina e 3 ml di acido cloridrico (ρ20 = 1,19 g/ml) e portare a 50 ml con acqua distillata.

3.4.	Cianuro di potassio (KCN)

3.5.	Soluzione di ioduro di potassio (KI) al 10 % (m/v)

3.6.	Soluzione di nitrato d'argento (AgNO3), 0,1 M

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Distillazione

Nel pallone da 500 ml (2.2) introdurre 25 ml di vino, 50 ml di acqua distillata, 1 ml di acido fosforico (3.1) ed alcune perle di vetro. Posizionare immediatamente il pallone sull'apparecchio di distillazione. Mediante un tubo sottile, travasare il distillato in una beuta graduata da 50 ml contenente 10 ml d'acqua. La beuta viene immersa in acqua ghiacciata. Raccogliere 30-35 ml di distillato (ossia circa 45 ml di liquido totale nella beuta graduata).

Lavare il tubo sottile del refrigerante con qualche millilitro di acqua distillata, portare a 20 °C il distillato e portarlo al livello della tacca con acqua distillata.

4.2.   Misurazione

Porre 25 ml di distillato in una beuta conica da 50 ml munita di tappo smerigliato, aggiungere 1 ml di soluzione di clorammina T (3.2) e tappare ermeticamente. Dopo esattamente 60 secondi aggiungere 3 ml di soluzione di acido dimetil-1,3 barbiturico (3.3), tappare ermeticamente e lasciar riposare per 10 minuti. Misurare quindi l'assorbanza rispetto al bianco (25 ml di acqua distillata invece di 25 ml di distillato) alla lunghezza d'onda di 590 nm nelle celle con cammino ottico di 20 mm.

5.   COSTRUZIONE DELLA CURVA DI TARATURA

5.1.   Titolazione argentimetrica del cianuro di potassio

In una beuta graduata da 300 ml sciogliere circa 0,2 g di KCN (3.4) esattamente pesata in 100 ml di acqua distillata. Aggiungere 0,2 ml di soluzione di ioduro di potassio (3.5) e titolare con la soluzione di nitrato di 0,1 M (3.6) sino ad ottenere una colorazione giallastra stabile.

1 ml di soluzione 0,1 M di nitrato d'argento corrispondente a 13,2 mg di KCN, calcolare il titolo del campione di KCN.

5.2.   Curva dello standard

5.2.1.   Preparazione delle soluzioni standard

Una volta noto il titolo del KCN determinato secondo il punto 5.1, preparare una soluzione standard contenente 30 mg/l di acido cianidrico (30 mg HCN ≅ 72,3 mg KCN). Diluire questa soluzione a 1/10.

Introdurre 1,0- 2,0- 3,0- 4,0- e 5,0 ml della soluzione standard diluita nelle beute graduate da 100 ml e portare al livello della tacca con acqua distillata. Le soluzioni preparate hanno rispettivamente i titoli 30-60-90-120 e 150 μg/l di acido cianidrico.

5.2.2.   Dosaggio

Prelevare 25 ml delle soluzioni così ottenute e proseguire come indicato ai precedenti punti 4.1 e 4.2.

I valori delle assorbanze ottenuti con queste soluzioni standard riportati in funzione dei corrispondenti tenori di acido cianidrico sono allineati su una retta passante per l'origine.

6.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

L'acido cianidrico è espresso in microgrammi per litro (μg/l), senza decimali.

6.1.   Calcolo

Leggere il tenore di acido cianidrico sulla curva di taratura. Se è stata effettuata una diluizione, moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione.

Ripetibilità (r) e riproducibilità (R)

Vino bianco

= r = 3,1 μg/l ossia circa 6 % · xi R = 12 μg/l ossia circa 25 % · xi

Vino rosso

= r = 6,4 μg/l ossia circa 8 % · xi R = 23 μg/l ossia circa 29 % · xi

xi

=

concentrazione media di HCN nel vino

xi

=

48,4 μg/l per il vino bianco

xi

=

80,5 μg/l per il vino rosso.

▼B

39.   ISOSOLFOCIANATO DI ALLILE

1.   PRINCIPIO DEL METODO

L'isosolfocianato di allile, eventualmente presente nel vino, viene raccolto per distillazione ed individuato per via gascromatografica.

2.   REATTIVI

2.1.	Etanolo assoluto.

2.2.	Soluzione standard: soluzione in alcool assoluto di isosolfocianato di allile contenente 15 mg/l di principio attivo.

2.3.	Miscela frigorifera costituita da etanolo e ghiaccio secco (temperatura − 60 °C).

3.   APPARECCHIATURA

3.1.	Apparecchiatura da distillazione in corrente di azoto come da figura.

3.2.	Mantello riscaldante termoregolabile.

3.3.	Flussimetro.

3.4.	Gascromatografo con rivelatore spettrofotometrico di fiamma munito di filtro selettivo per composti solforati (λ = 394 nm) o altro rivelatore adatto a tale determinazione.

3.5.	Colonne cromatografiche in acciaio inossidabile, diametro interno 3 mm, lunghezza 3 m, riempite con carbowax 20 M al 10 % su cromosorb WHP 80-100 mesh.

3.6.	Microsiringhe da 10 µl.

4.   MODO DI OPERARE

Prelevare 2 l di vino e porli nel pallone da distillazione. Introdurre pochi ml di etanolo (2.1) nei due tubi di raccolta fino a completa immersione della parte porosa per la dispersione dei gas. Raffreddare esternamente i due tubi con la miscela frigorifera. Collegare il pallone ai tubi di raccolta ed iniziare l'immissione nell'apparecchio di un flusso di azoto di circa 3 l l'ora. Riscaldare il vino a 80 °C regolando opportunamente la temperatura del mantello termoregolabile e raccogliere complessivamente 45-50 ml di distillato.

Stabilizzare il gascromatografo; a tal fine sono consigliate le seguenti condizioni operative:

Introdurre con l'apposita microsiringa una quantità di soluzione standard tale che il picco corrispondente all'isosolfocianato di allile possa essere agevolmente individuato sul gascromatogramma.

Iniettare quindi un'aliquota del distillato e controllare se in corrispondenza del tempo di ritenzione dell'isosolfocianato di allile si ha comparsa di picchi.

Nelle condizioni adottate nella prova, non vi sono normalmente composti naturali del vino interferenti in corrispondenza del tempo di ritenzione della sostanza ricercata.

Apparecchiatura di distillazione in corrente di azoto

40.   CARATTERISTICHE CROMATICHE

1.   VINI E MOSTI

1.1.   Definizione

Per caratteristiche cromatiche di un vino si intende la luminosità e la cromaticità.

La luminosità corrisponde alla trasmittanza. Essa varia in modo inversamente proporzionale all'intensità del colore del vino.

La cromaticità corrisponde alla lunghezza d'onda dominante (che caratterizza la tonalità) e alla purezza.

Convenzionalmente e per motivi pratici, le caratteristiche cromatiche dei vini rossi e rosati vengono dichiarate mediante l'intensità del colore e la tonalità, secondo un procedimento adottato come metodo usuale.

1.2.   Principio dei metodi

1.2.1.   Metodo di riferimento

Metodo spettrofotometrico che permette il calcolo dei valori tristimolari e dei coefficienti tricromatici necessari alla specificazione del colore nei termini definiti dalla «Commission Internationale de l'Eclairage (CIE)».

1.2.2.   Metodo usuale (applicabile ai vini rossi e rosati)

Metodo spettrofotometrico in cui le caratteristiche cromatiche sono espresse convenzionalmente come segue:

L'intensità è data dalla somma delle assorbanze alle lunghezze d'onda di 420, 520 e 620 nm lette con celle da 1 cm di cammino ottico.

La tonalità del colore è espressa dal rapporto tra l'assorbanza a 420 nm e l'assorbanza a 520 nm.

1.3.   Metodo di riferimento

1.3.1.   Apparecchiatura

1.3.1.1.

Spettrofotometro in grado di effettuare misurazioni comprese tra 300 e 700 nm.

1.3.1.2.

Celle di vetro, disponibili a coppie, con cammino ottico b pari a 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1 - 2 e 4 cm.

1.3.2.   Modo di operare

1.3.2.1.   Preparazione del campione.

Se il vino è torbido, occorre chiarificarlo per centrifugazione.

I vini giovani o spumanti, devono essere liberati dalla maggior parte della loro anidride carbonica mediante agitazione sotto vuoto.

1.3.2.2.   Misure

Il cammino ottico b delle celle impiegate deve essere scelto in modo che l'assorbanza misurata sia compresa tra 0,3 e 0,7.

A titolo indicativo si consiglia di utilizzare celle da 2 cm (o 4 cm) di cammino ottico per i vini bianchi, 1 cm per i vini rosati e 0,1 (o 0,2 cm) per i vini rossi.

Effettuare le misure spettrofotometriche prendendo come liquido di riferimento, per regolare lo zero della scala delle assorbanze alle lunghezze d'onda 445, 495, 550 e 625 nm, l'acqua distillata posta in una cella avente lo stesso cammino ottico b.

Rilevare per il cammino ottico b le quattro assorbanze ottenute per il vino; siano A445, A495, A550, A625 (con 3 decimali).

1.3.3.   Calcoli

Rilevare le trasmittanze (T %) corrispondenti riportando i valori delle assorbanze per b cm di cammino ottico sulla tabella I; siano: T445, T495, T550, T625.

1.3.4.   Espressione dei risultati

1.3.4.1.

La luminosità relativa è data dal valore di Y espresso in percentuale. (Per il nero Y % = 0, per l'incolore Y % = 100).

1.3.4.2.

La cromaticità è espressa dalla lunghezza d'onda dominante e dalla purezza. Queste si determinano ricorrendo al diagramma cromatico, che rappresenta il locus di tutti i colori dello spettro, riportato in figura 1. In esso il punto zero corrisponde alla sorgente di luce bianca impiegata, rappresentata dalla illuminante standard C di coordinate xo = 0,3101 e yo = 0,3163, che rappresenta la luce del giorno mediamente chiara. — Lunghezza d'onda dominante. — Tracciare sul diagramma il punto C di coordinate x ed y. Se il punto C cade all'esterno del triangolo AOB, tracciare prolungandola, la retta che unisce il punto O con il punto C; questa interseca il locus di cui sopra in un punto S che corrisponde alla lunghezza d'onda dominante. — Nel caso in cui il punto C cade all'interno del triangolo AOB, tracciare la retta da C ad O; essa intersecherà il locus in un punto che corrisponde alla lunghezza d'onda del colore complementare del vino. Tale lunghezza d'onda è espressa con il relativo valore seguito dalla lettera C. — Purezza. — Quando il punto C cada all'esterno del triangolo AOB, la purezza è espressa in percentuale dal rapporto: —  — Quando il punto C cada all'interno del triangolo AOC, la purezza è espressa in percentuale dal rapporto: —   ( 17 ) — dove il punto P è il punto d'intersezione della retta OC con la linea delle porpore. — Se si conoscono x ed y, la purezza è anche data direttamente dai diagrammi cromatici (figure 2, 3, 4, 5 e 6).

1.3.4.3.

Risultati. La luminosità, la cromaticità (espressa dalla lunghezza d'onda dominante) e la purezza definiscono in modo completo il colore di un vino. Queste devono essere indicate sul certificato di analisi con il valore del cammino ottico su cui sono state effettuate le misure.

▼M8 —————

▼B

TABELLA I

Trasformazione delle assorbanze in trasmittanze (T %)

Modalità di impiego:

Leggere la prima cifra decimale del valore dell'assorbanza nella colonna verticale 1 e la seconda cifra decimale nella riga orizzontale 2.

Leggere il numero in corrispondenza della loro intersezione. Per ottenere la trasmittanza, dividere tale valore per 10 se l'assorbanza è inferiore a 1, per 100 se è compresa tra 1 e 2, per 1 000 se è compresa tra 2 e 3.

Avvertenza:

Il valore riportato in ciascuna casella in alto a destra consente di tener conto per interpolazione della terza cifra decimale del valore dell'assorbanza.

Esempio:

Le trasmittanze T % vengono espresse a meno dello 0,1 %.

Figura 1

Diagramma di cromaticità rappresentante il locus di tutti i colori dello spettro.

Figura 2

Diagramma di cromaticità per i vini rosso vivo e i vini rosso mattone.

Figura 3

Diagramma di cromaticità per i vini rosso vivo e i vini rosso mattone.

Figura 4

Diagramma di cromaticità per i vini rosso vivo e i vini rosso porpora.

Figura 5

Diagramma di cromaticità per i vini rosso vivo e i vini rosso porpora.

Figura 6

Diagramma di cromaticità per i vini rosso mattone e i vini rosso porpora.

2.   MOSTI CONCENTRATI RETTIFICATI

2.1.   Principio

Misurazione dell'assorbanza, a 425 nm sotto spessore di 1 cm, del mosto concentrato rettificato la cui concentrazione in zuccheri è stata portata al 25 % (m/m) (25 ° Brix).

2.2.   Apparecchiatura

2.2.1.

Spettrofotometro che consenta di effettuare misure fra 300 e 700 nm.

2.2.2.

Celle di vetro, a cammino ottico da 1 cm.

2.2.3.

Filtro a membrana con porosità di 0,45 µm.

2.3.   Modo di operare

2.3.1.   Preparazione del campione

Utilizzare la soluzione il cui titolo in zuccheri è del 25 % (m/m) (25 ° Brix) preparata secondo le indicazioni del punto 4.1.2 del capitolo «pH». Filtrarla su filtro a membrana di porosità 0,45 µm.

2.3.2.   Determinazione dell'assorbanza

Regolare l'assorbanza zero alla lunghezza d'onda 425 nm su una cella di cammino ottico da 1 cm contenente acqua distillata.

Rilevare l'assorbanza A, a questa lunghezza d'onda, della soluzione al 25 % in zuccheri (25 ° Brix), ottenuta al punto 2.3.1, posta in una cella a cammino ottico da 1 cm.

2.4.   Espressione dei risultati

L'assorbanza a 425 nm del mosto concentrato rettificato in soluzione al 25 % (m/m) in zuccheri (25 ° Brix) è espressa con due cifre decimali.

41.   INDICE DI FOLIN-CIOCALTEU

1.   DEFINIZIONE

L'indice di Folin-Ciocalteu è il risultato che si ottiene applicando il metodo seguente.

2.   PRINCIPIO

L'insieme dei composti fenolici del vino viene ossidato dal reattivo di Folin-Ciocalteu. Questo è costituito da una miscela di acido fosfotungstico (H3PW12O40) e di acido fosfomolibdico (H3PMo12O40) che si riduce, con l'ossidazione dei fenoli, a una miscela di ossidi blu di tungsteno (W8O23) e di molibdeno (Mo8O23).

La colorazione blu prodotta ha un assorbimento massimo intorno a 750 nm. Essa è proporzionale al tenore in composti fenolici.

3.   REATTIVI

I reattivi devono essere di qualità analitica. L'acqua utilizzata deve essere distillata o avere purezza equivalente.

3.1.   Reattivo di Folin-Ciocalteu

Questo reattivo si trova in commercio pronto per l'uso. Può essere preparato nel modo seguente: sciogliere 100 g tungstato di sodio (Na2WO4 · 2H2O) e 25 g di molibdato di sodio (NaMoO4 · 2H2O) in 700 ml di acqua distillata; aggiungere 50 ml di acido fosforico all '85 % (ρ20 = 1,71 g/ml) e 100 ml di acido cloridrico concentrato (ρ20 = 1,19 g/ml). Portare ad ebollizione in riflusso per 10 ore, aggiungere quindi 150 g di solfato di litio (Li2SO4 · H2O), alcune gocce di bromo e portare nuovamente all'ebollizione per 15 minuti. Raffreddare e portare ad 1 l con acqua distillata.

3.2.	Soluzione al 20 % (m/v) di carbonato di sodio (Na2CO3) anidro.

4.   APPARECCHIATURA

Comune dotazione di laboratorio, in particolare:

4.1.	Palloni tarati da 100 ml.

4.2.	Spettrofotometro con lunghezza d'onda a 750 nm.

5.   MODO DI OPERARE

5.1.   Vini rossi

In un pallone tarato da 100 ml (4.1), versare nell'ordine:

Portare a 100 ml con acqua distillata.

Agitare per omogeneizzare. Attendere 30 minuti che la reazione sia completa. Determinare l'assorbanza a 750 nm per 1 cm rispetto al riferimento preparato con acqua distillata al posto del vino.

Se l'assorbanza letta non ha un valore prossimo a 0,3, è opportuno ricominciare il procedimento, modificando la diluizione del vino in modo da ottenere tale assorbanza.

5.2.   Vini bianchi

Operare nelle stesse condizioni, su 1 ml di vino non diluito.

5.3.   Mosti concentrati rettificati

5.3.1.   Preparazione del campione

Utilizzare la soluzione il cui tenore in zuccheri è del 25 % (m/m) (25 ° Brix) preparata secondo le indicazioni del punto 4.1.2, del capitolo «pH».

5.3.2.   Misura

Operare come descritto nel caso dei vini rossi (5.1) su 5 ml di campione preparato come in 5.3.1 e misurare l'assorbanza rispetto a un bianco preparato con 5 ml di una soluzione al 25 % (m/m) di zucchero invertito.

6.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1.   Calcolo

Esprimere il risultato sotto forma di un indice ottenuto moltiplicando l'assorbanza per 100, nel caso dei vini rossi diluiti al 20 % (o per il fattore corrispondente alla diluizione operata) e per 20 nel caso dei vini bianchi. Nel caso dei mosti concentrati rettificati l'assorbanza deve essere moltiplicata per 16.

6.2.   Ripetibilità

La differenza tra i risultati di due determinazioni effettuate simultaneamente o rapidamente l'una dopo l'altra dallo stesso analista, non deve essere superiore a 1.

Una buona ripetibilità dei risultati dipende dall'impiego rigorosamente corretto dell'apparecchiatura (palloni tarati e celle).

42.   METODI DI ANALISI PARTICOLARI PER MOSTI CONCENTRATI RETTIFICATI

a)   CATIONI TOTALI

1.   PRINCIPIO

Si tratta la presa di campione con uno scambiatore di cationi fortemente acido. I cationi vengono scambiati con l'H+ e vengono espressi per differenza tra l'acidità totale dell'effluente e quella della presa di campione.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	Colonna in vetro della lunghezza di circa 300 mm e di 10-11 mm di diametro interno, provvista di un rubinetto.

2.2.	pHmetro graduato almeno in decimi di unità pH.

2.3.	Elettrodi. — Elettrodo in vetro, da conservare in acqua distillata, — Elettrodo di riferimento al calomelano-cloruro di potassio saturo, da conservare in soluzione satura di cloruro di potassio, — oppure elettrodo combinato da conservare in acqua distillata.

3.   REATTIVI

3.1.	Scambiatore di cationi fortemente acido, nella forma H+. Prima di utilizzarla far gonfiare la resina immergendola in acqua per una notte.

3.2.	Soluzione 0,1 M di idrossido di sodio.

3.3.	Indicatore di pH (di carta).

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione del campione

Utilizzare la soluzione ottenuta diluendo il mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v) come indicato al punto 5.1.2 del capitolo «Acidità totale».

4.2.   Preparazione della colonna scambiatrice di ioni

Introdurre nella colonna circa 10 ml di scambiatore di ioni preventivamente gonfieto nella forma H+; lavare la colonna con acqua distillata sino ad eliminazione dell'acidità controllata mediante l'indicatore di carta.

4.3.   Scambio di ioni

Fare passare attraverso la colonna, alla velocità di una goccia al secondo, 100 ml della soluzione di mosto concentrato rettificato preparata secondo le indicazioni del punto 4.1. Raccogliere l'effluente in un becher. Lavare la colonna con 50 ml di acqua distillata. Titolare l'acidità dell'effluente (comprese le acque di lavaggio) con la soluzione 0,1 M di idrossido di sodio sino ad ottenere un pH 7 a 20 °C. Il liquido alcalino va aggiunto lentamente agitando in continuazione la soluzione. Sia n ml il volume di soluzione 0,1 M di idrossido di sodio impiegato.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

I cationi totali vengono espressi in milliequivalenti per chilo di zuccheri totali con una cifra decimale.

5.1.   Calcoli

b)   CONDUTTIVITÀ

1.   PRINCIPIO

Misura della conduttività elettrica di una colonna di liquido delimitata da due elettrodi di platino paralleli fra di loro, che costituiscono uno dei lati di un ponte di Wheatstone.

La conduttività varia con la temperatura ed è espressa a 20 °C.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	Conduttimetro per misure di conduttività tra 1 e 1 000 microsiemens per cm.

2.2.	Bagnomaria in grado di portare la temperatura dei campioni da analizzare a circa 20 °C (20 ± 2 °C).

3.   REATTIVI

3.1.	Acqua demineralizzata la cui conduttività specifica sia inferiore a 2 microsiemens per cm a 20 °C.

3.2.

Soluzione di cloruro di potassio di riferimento. Sciogliere 0,581 g di cloruro di potassio, KCl, previamente essiccato fino a massa costante alla temperatura di 105 °C, in acqua demineralizzata (3.1). Portare a un litro con acqua demineralizzata (3.1). Tale soluzione ha una conduttività di 1 000 microsiemens per cm a 20 °C. Può essere conservata per non più di 3 mesi.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Preparazione del campione

Utilizzare la soluzione il cui tenore in zuccheri totali è del 25 % (m/m) (25 ° Brix) come indicato al capitolo «pH», al punto 4.1.2.

4.2.   Determinazione della conduttività

Portare il campione da analizzare a 20 °C per immersione in un bagno d'acqua. Controllare la temperatura con l'approssimazione di 0,1 °C.

Lavare due volte la cella di misura del conduttimetro con la soluzione da esaminare.

Misurare la conduttività espressa in microsiemens per cm.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Per la soluzione al 25 % (m/m) (25 ° Brix) del mosto concentrato rettificato, la conduttività è espressa in microsiemens per cm (µS cm−1) a 20 °C, senza cifre decimali.

5.1.   Calcolo

Se l'apparecchio non è dotato di un compensatore di temperatura, correggere la conduttività misurata mediante la tabella I. Se la temperatura è inferiore a 20 °C, aggiungere la correzione; se la temperatura è superiore a 20 °C, sottrarre la correzione.

c)   IDROSSIMETILFURFURALE

1.   PRINCIPIO DEI METODI

1.1.   Metodo colorimetrico

Le aldeidi derivate dal furano, di cui l'idrossimetilfurfurale è la principale, reagiscono con l'acido barbiturico e la paratoluidina per dare un composto rosso che viene dosato per colorimetria a 550 nm.

1.2.   Metodo per cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC)

Separazione su colonna in fase inversa e determinazione a 280 nm.

2.   METODO COLORIMETRICO

2.1.   Apparecchiatura

2.1.1.

Spettrofotometro per misure comprese fra 300 e 700 nm.

2.1.2.

Celle in vetro, a cammino ottico da 1 cm.

2.2.   Reattivi

2.2.1.   Acido barbiturico in soluzione allo 0,5 % (m/v).

Sciogliere 500 mg di acido barbiturico, C4O3N2H4, in acqua distillata riscaldando leggermente in bagnomaria a 100 °; portare a 100 ml con acqua distillata. La soluzione può essere conservata per circa una settimana.

2.2.2.   Paratoluidina in soluzione al 10 % (m/v).

10 g di paratoluidina, C6H4(CH3)NH2 vengono posti in un pallone tarato da 100 ml, aggiungere 50 ml di isopropanolo, CH3CH(OH)CH3, e 10 ml di acido acetico glaciale, CH3COOH, (ρ20 = 1,05 g/ml); completare a 100 ml con isopropanolo. Questa soluzione dev'essere rinnovata ogni giorno.

2.2.3.   Etanale (CH3CHO) in soluzione acquosa all'1 % (m/v). Da preparare al momento dell'uso.

2.2.4.   Idrossimetilfurfurale, C6O3H6, in soluzione acquosa di 1 g/l.

Preparare per diluizioni successive delle soluzione contenenti 5 - 10 - 20 - 30 e 40 mg/l. La soluzione a 1 g/l e le relative diluizioni devono essere preparate al momento dell'uso.

2.3.   Modo di operare

2.3.1.   Preparazione del campione

Utilizzare la soluzione ottenuta diluendo il mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v) come indicato al punto 5.1.2 del capitolo «Acidità totale». Effettuare il dosaggio su 2 ml di tale soluzione.

2.3.2.   Dosaggio colorimetrico

Porre in 2 flaconi a e b da 25 ml tappati a smeriglio, 2 ml di campione preparato come indicato al 2.3.1. Aggiungere in ciascun flacone 5 ml di soluzione di paratoluidina (2.2.2); mescolare. Aggiungere nel flacone b (bianco) 1 ml di acqua distillata e nel flacone a (campione), 1 ml di soluzione di acido barbiturico (2.2.1). Agitare per omogeneizzare. Travasare il contenuto dei flaconi nelle celle dello spettrofotometro a cammino ottico da 1 cm. Dopo aver regolato lo zero della scala delle assorbanze sul contenuto del flacone b alla lunghezza d'onda di 550 nm, osservare la variazione dell'assorbanza del contenuto del flacone a rilevandone il valore massimo A raggiunto nell'intervallo tra 2 e 5 minuti.

I campioni in cui il tenore in idrossimetilfurfurale è superiore ai 30 mg/l devono essere diluiti prima dell'analisi.

2.3.3.   Determinazione della curva di taratura

Porre, in una serie di due flaconi a e b da 25 ml, 2 ml di ciascuna delle soluzioni di idrometilfurfurale da 5 - 10 - 20 - 30 e 40 mg/l (2.2.4) e trattarli come descritto al punto 2.3.2.

La rappresentazione grafica delle assorbanze in funzione della concentrazione in mg/l dell'idrossimetilfurfurale nelle soluzioni di riferimento è una retta passante per l'origine.

2.4.   Espressione dei risultati

La concentrazione in idrossimetilfurfurale dei mosti concentrati rettificati è espressa in milligrammi per chilogrammo di zuccheri totali.

2.4.1.   Calcolo

La concentrazione C mg/l in idrossimetifurfurale del campione da analizzare si ottiene riportando sulla curva di taratura l'assorbanza A determinata per detto campione.

Concentrazione di idrossimetilfurfurale in milligrammi per chilogrammo di zuccheri totali:

P

=

tenore percentuale in zuccheri totali del mosto concentrato rettificato.

3.   METODO PER CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA RISOLUZIONE

3.1.   Apparecchiatura

3.1.1.   Cromatografo in fase liquida ad alta risoluzione completa di:

Flusso della fase mobile: 1,5 ml/minuto.

3.1.2.   Dispositivo di filtrazione su membrana (0,45 µm)

3.2.   Reattivi

3.2.1.

Acqua bidistillata.

3.2.2.

Metanolo, CH3OH, distillato o di qualità HPLC.

3.2.3.

Acido acetico, CH3COOH (ρ20 = 1,05 g/ml).

3.2.4.

Fase mobile: acqua — metanolo (3.2.2) — acido acetico (3.2.3) previamente filtrati su membrana (0,45 µm), (40- 9- 1 v/v). Detta fase mobile dev'essere preparata ogni giorno e degassata prima dell'uso.

3.2.5.

Soluzione di riferimento di idrossimetilfurfurale a 25 mg/l (m/v). Versare in un pallone tarato da 100 ml, 25 g pesati esattamente di idrossimetilfurfurale (C6H3O6) e portare a volume con metanolo (3.2.2). Diluire la soluzione al 10 % con metanolo (3.2.2) e filtrarla su membrana (0,45 µm). Questa soluzione, mantenuta in frigorifero in un flacone di vetro imbrunito e chiuso ermeticamente, si conserva per 2-3 mesi.

3.3.   Modo di operare

3.3.1.   Preparazione del campione

Utilizzare la soluzione ottenuta diluendo il mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v) come indicato al capitolo «Acidità totale», punto 5.1.2, filtrata su membrana (0,45 µm).

3.3.2.   Determinazione cromatografica

Iniettare nel cromatografo 5 (o 10) µl del campione preparato come indicato al punto 3.3.1 e 5 (o 10) µl della soluzione di riferimento di idrossimetilfurfurale (3.2.5). Registrare il cromatogramma.

Il tempo di ritenzione dell'idrossimetilfurfurale è circa 6-7 minuti.

3.4.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

Il tenore in idrossimetilfurfurale dei mosti concentrati rettificati si esprime in milligrammi per chilogrammo di zuccheri totali.

3.4.1.   Calcolo

Sia C mg/l, il tenore in idrossimetilfurfurale della soluzione di mosto concentrato rettificato al 40 % (m/v).

Concentrazione dell'idrossimetilfurfurale in milligrammi per chilogrammo di zuccheri totali:

P

=

tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali del mosto concentrato retttificato.

d)   METALLI PESANTI

1.   PRINCIPI

I.   Metodo rapido di valutazione dei metalli pesanti.

Nei mosti concentrati rettificati opportunamente diluiti i metalli pesanti sono messi in evidenza dalla colorazione dovuta alla formazione di solfuri. La loro valutazione è effettuata per confronto con una soluzione di riferimento di piombo corrispondente al tenore massimo ammissibile.

II.   Determinazione del tenore di piombo per spettrofotometria di assorbimento atomico.

Il chelato formato dal piombo con il pirrolidinditiocarbammato di ammonio viene estratto con il metilisobutilchetone di cui si misura l'assorbanza a 283,3 nm. Si determina quindi il tenore in piombo con il metodo delle aggiunte.

2.   METODO RAPIDO DI VALUTAZIONE DEI METALLI PESANTI

2.1.   Reattivi

2.1.1.   Acido cloridrico al 70 % (m/v).

Prelevare 70 g di acido cloridrico, (HCl) (ρ20 = 1,16 — 1,19 g/ml) e portare a 100 ml con acqua.

2.1.2.   Acido cloridrico diluito al 20 % (m/v).

Prelevare 20 g di acido cloridrico, (HCl) (ρ20 = 1,16 — 1,19 g/ml) e completare a 100 ml con acqua.

2.1.3.   Ammoniaca diluita.

Prelevare 14 g di ammoniaca, NH3 (ρ20 = 0,931 — 0,934 g/ml) e portare a 100 ml con acqua.

2.1.4.   Soluzione tampone a pH 3,5.

Sciogliere 25 g di acetato di ammonio, (CH3COONH4), in 25 ml di acqua ed aggiungere 38 ml di acido cloridrico diluito (2.1.1). Se occorre, aggiustare il pH con l'acido cloridrico diluito (2.1.2) o con ammoniaca diluita (2.1.3) e portare a 100 ml con acqua.

2.1.5.   Soluzione di tioacetammide, (C2H5NS), al 4 % (m/v).

2.1.6.   Soluzione di glicerolo (C3H8O3) all '85 % (m/v).

.

2.1.7.   Reattivo alla tioacetammide

Aggiungere a 0,2 ml di soluzione di tioacetammide (2.1.5), 1 ml della miscela ottenuta con 5 ml di acqua, 15 ml di idrossido di in soluzione sodio 1 M e 20 ml di glicerolo (2.1.6). Riscaldare in bagnomaria a 100 °C per 20 secondi. Preparare al momento dell'uso.

2.1.8.   Soluzione di piombo a 0,002 g/l.

Preparare una soluzione a 1 g/l piombo sciogliendo in acqua 0,400 g di nitrato di piombo, Pb (NO3)2, e portare a 250 ml con acqua. Al momento dell'impiego diluire questa soluzione al 2 ‰ (v/v) con acqua in modo da ottenere la soluzione a 0,002 g/l.

2.2.   Modo di operare

Diluire 10 g del campione di mosto concentrato rettificato in 10 ml di acqua. Aggiungere 2 ml di soluzione tampone a pH 3,5 (2.1.4); mescolare. Aggiungere 1,2 ml di reattivo alla tioacetammide (2.1.7). Mescolare immediatamente. Preparare la soluzione di confronto nelle stesse condizioni utilizzando 10 ml di soluzione a 0,002 g/l di piombo (2.1.8).

Dopo 2 minuti l'eventuale colorazione bruna della soluzione di mosto concentrato rettificato non deve essere più intensa di quella della soluzione di confronto.

2.3.   Calcolo

Il saggio, nelle condizioni descritte, corrisponde ad un tenore massimo ammissibile di metalli pesanti, espresso come piombo, di 2 mg/kg di mosto concentrato rettificato.

3.   DETERMINAZIONE DEL TENORE DI PIOMBO PER SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO

3.1.   Apparecchiatura

3.1.1.

Spettrofotometro di assorbimento atomico completo di bruciatore alimentato con aria-acetilene.

3.1.2.

Lampada a catodo cavo al piombo.

3.2.   Reattivi

3.2.1.

Acido acetico diluito. Prelevare 12 g di acido acetico glaciale (ρ20 = 1,05 g/ml) e completare a 100 ml con acqua.

3.2.2.

Soluzione di pirrolidinditiocarbammato di ammonio, C5H12N2S2, all' 1 % (m/v).

3.2.3.

Metilisobutilchetone, (CH3)2CHCH2COCH3.

3.2.4.

Soluzione di piombo allo 0,010 g/l. Diluire all' 1 % (v/v) la soluzione di piombo a 1 g/l (2.1.8).

3.3.   Modo di operare

3.3.1.   Soluzione da esaminare

Diluire 10 g di mosto concentrato rettificato in una miscela a parti uguali di acido acetico diluito (3.2.1) e di acqua e portare a 100 ml con tale miscela.

Aggiungere 2 ml di soluzione di pirrolidinditiocarbammato di ammonio (3.2.2) e 10 ml di metilisobutilchetone (3.2.3). Agitare al riparo dalla luce diretta per 30 secondi. Fare separare i due strati. Utilizzare lo strato di metilsobutilchetone.

3.3.2.   Soluzione di riferimento

Preparare tre soluzioni di riferimento contenenti oltre ai 10 g di mosto concentrato rettificato, rispettivamente 1, 2 e 3 ml della soluzione di piombo a 0,010 g/l (3.2.4). Trattarle come la soluzione in esame.

3.3.3.   Bianco

Preparare un bianco procedendo nelle stesse condizioni descritte al punto 3.3.1 per la soluzione da esaminare ma senza aggiungere il mosto concentrato rettificato.

3.3.4.   Determinazione

Selezionare la lunghezza d'onda 283,3 nm.

Polverizzare nella fiamma il metilisobutilchetone proveniente dal saggio in bianco e regolare l'assorbanza zero.

Operando sugli estratti determinare le assorbanze corrispondenti alla soluzione in esame ed alle soluzioni di riferimento.

3.4.   Espressione dei risultati

Esprimere il tenore di piombo in milligrammi per chilogrammo di mosto concentrato rettificato con una cifra decimale.

3.4.1.   Calcolo

Tracciare la curva che rappresenta la variazione delle assorbanze in funzione della concentrazione di piombo addizionato alle soluzioni di riferimento, ponendo la concentrazione della soluzione da esaminare uguale a zero.

Estrapolare la retta di congiunzione dei punti sono ad incontrare l'asse delle concentrazioni dal lato negativo. La distanza di questo punto dall'origine rappresenta la concentrazione in piombo della soluzione da esaminare.

e)   DETERMINAZIONE CHIMICA DELL'ETANOLO

Questo metodo di dosaggio è utilizzato per la determinazione del titolo alcolometrico dei liquidi leggermente alcolici quali i mosti, i mosti concentrati, i mosti concentrati rettificati.

1.   PRINCIPIO

Distillazione semplice del liquido. Ossidazione dell'etanolo del distillato mediante bicromato di potassio. Titolazione dell'eccesso di bicromato con una soluzione di ferro II.

2.   APPARECCHIATURA

2.1.	Utilizzare l'apparecchio di distillazione descritto al punto 3.2. del capitolo «Titolo alcolometrico».

3.   REATTIVI

3.1.   Soluzione di bicromato di potassio

Sciogliere 33,600 g di bicromato di potassio (K2Cr2O7) nella quantità di acqua sufficiente ad ottenere 1 l a 20 °C.

Un millilitro di questa soluzione ossida 7,8924 mg di alcool.

3.2.   Soluzione di solfato di ferro II e di ammonio

Sciogliere 135 g di solfato di ferro II e di ammonio, FeSO4, (NH4)2SO4 · 6 H2O in acqua, aggiungere 20 ml di acido solforico concentrato, H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml), portare ad 1 l con acqua. Questa soluzione, appena preparata, corrisponde all'incirca a metà del suo volume di soluzione di bicromato. In seguito si ossida lentamente.

3.3.   Soluzione di permanganato di potassio

Sciogliere 1,088 g di permanganato di potassio, KMnO4, in una quantità di acqua sufficiente per 1 litro.

3.4.   Acido solforico diluito ½ (v/v)

Aggiungere a 500 ml di acqua lentamente ed agitando 500 ml di acido solforico, H2SO4 (ρ20 = 1,84 g/ml).

3.5.   Reattivo all'ortofenantrolina ferrosa

Sciogliere 0,695 g di solfato ferroso (FeSO4 · 7H2O) in 100 ml di acqua, aggiungere 1,485 g di monoidrato di orto-fenantrolina (C12H8N2 · H2O). Riscaldare per favorire la dissoluzione. Questa soluzione, di colore rosso vivo, si conserva molto bene.

4.   MODO DI OPERARE

4.1.   Distillazione

Versare nel pallone di distillazione 100 g del mosto concentrato rettificato e 100 ml di acqua. Raccogliere il distillato in un pallone tarato da 100 ml e portare a volume con acqua.

4.2.   Ossidazione

In una beuta con tappo smerigliato da 300 ml il cui collo termini con una svasatura in modo da poter sciacquare il collo stesso senza perdite, versare 20 ml di soluzione titolata di bicromato di potassio (3.1), 20 ml di acido solforico diluito ½ (v/v) (3.4) e agitare. Aggiungere 20 ml di distillato. Tappare la beuta, agitare e lasciare trascorrere almeno 30 minuti agitando di tanto in tanto (beuta «campione»).

4.3.    Titolazione

Titolare l'eccesso di bicromato con la soluzione di solfato di ferro II e ammonio (3.2) dopo aver aggiunto 4 gocce di reattivo all'ortofenantrolina (3.5). Arrestare la titolazione quando la colorazione passa dall'azzurro verde al marrone.

Per individuare con maggiore precisione il punto di viraggio, ritornare dal marrone all'azzurro-verde con la soluzione di permanganato di potassio (3.3). Sottrarre un decimo del volume impiegato di questa soluzione dal volume della soluzione di solfato di ferro II impiegato, sia n tale differenza.

Ripetere lo stesso procedimento titolando in una beuta identica alla precedente le stesse quantità di reattivi sostituendo i 20 ml di distillato con 20 ml di acqua (beuta «bianco»). Sia n′ la differenza.

5.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

L'etanolo è espresso in grammi per chilogrammo di zuccheri totali con una cifra decimale.

5.1.   Calcolo

n′ ml di soluzione ferrosa riducono 20 ml di soluzione di bicromato che ossidano 157,85 mg di etanolo puro.

Un millilitro di soluzione di ferro II ha lo stesso potere riducente di:

n′ − n ml di soluzione di ferro II hanno lo stesso potere riducente di:

Etanolo in g/kg di mosto concentrato rettificato:

Etanolo in g/kg di zuccheri totali:

dove P = tenore percentuale (m/m) in zuccheri totali.

f)   MESO-INOSITOLO, SCILLO-INOSITOLO E SACCAROSIO

1.   PRINCIPIO DEL METODO

Cromatografia in fase gassosa di derivati silanizzati.

2.   REAGENTI

2.1.	Standard interno: xilitolo (soluzione acquosa di circa 10 g/l aggiunta di una punta di spatola di sodio azide)

2.2.	Bistrimetilsililtrifluoroacetamide — BSTFA — (C8H18F3NOSi2)

2.3.	Trimetilclorosilano (C3H9ClSi)

2.4.	Piridina p. a. (C5H5N)

2.5.	Meso-inositolo (C6H12O6)

3.   APPARECCHIATURA

3.1.   Gascromatografo dotato di:

3.2.

Colonna capillare (per esempio in silice fusa, OV 1, spessore del film di 0,15 µ, lunghezza di 25 m e diametro interno di 0,3 mm). Condizioni di lavoro: fase di trasporto: idrogeno o elio — flusso del gas di trasporto: circa 2 ml/minuto, — temperatura dell'iniettore e del rivelatore: 300 °C, — programmazione di temperatura: 1 minuto a 160 °C, 4 °C/minuto fino a 260 °C, isoterma a 260 °C per 15 minuti, — rapporto di splittaggio: circa 1 a 20.

3.3.	Integratore.

3.4.	Siringa micrometrica da 10 µl.

3.5.	Micropipette da 50, 100 e 200 µl.

3.6.	Fiale da 2 ml con tappo teflonato.

3.7.

Stufa.

4.   MODO DI OPERARE

Circa 5 g di MCR, esattamente pesati in un matraccio da 50 ml sono aggiunti di 1 ml di soluzione standard di xilitolo (2.1) e portati a volume con acqua. Dopo omogeneizzazione del campione si prelevano 100 µl di soluzione che si pongono in fiala (3.6) e si portano a secchezza sotto leggera corrente d'aria, previa eventuale aggiunta di 100 µl di etanolo assoluto per facilitare l'evaporazione.

Il residuo si scioglie accuratamente in 100 µl di piridina (2.4), si aggiungono 100 µl di bis-trimetilsililtrifluoroacetamide (2.2) e 10 µl di trimetilclorosilano (2.3), si sigilla la fiala con tappo teflonato e si pone in stufa a 60 °C per un'ora.

Si prelevano 0,5 µl del limpido iniettando ad ago vuoto e caldo con lo splittaggio sopraindicato.

5.   CALCOLO DEI FATTORI DI RISPOSTA

5.1.   Si prepara una soluzione contenente:

glucosio 60 g/l, fruttosio 60 g/l, meso-inositolo 1 g/l e saccarosio 1 g/l.

Si pesano 5 g di detta soluzione e si procede come al punto 4. Si calcolano dal cromatogramma ottenuto i fattori di risposta del meso-inositolo e del saccarosio rispetto allo xilitolo.

Per lo scillo-inositolo, non disponibile in commercio, che ha un tempo di ritenzione compreso fra l'ultimo picco delle forme anomeriche del glucosio e quello del meso-inositolo (vedi figura allegata), si usa lo stesso fattore di risposta ottenuto per il meso-inositolo.

6.   ESPRESSIONE DEI RISULTATI

6.1.	Il meso-inositolo e lo scillo-inositolo si esprimono in mg/kg di zuccheri totali. Il saccarosio si esprime in g/kg di mosto. Figura: Cromatogramma in fase gassosa del meso-inositolo, dello scillo-inositolo e del saccarosio.

▼M6

43.   DETERMINAZIONE DEL RAPPORTO ISOTOPICO 18O/16O DELL'ACQUA CONTENUTA NEI VINI

I.   DESCRIZIONE DEL METODO

1.   Scopo del Metodo

Il presente metodo ha lo scopo di misurare il rapporto isotopico 18O/16O di acque di diverse origini. Il rapporto isotopico 18O/16O può essere espresso come deviazione δ ‰ in relazione al valore del rapporto isotopico del riferimento internazionale V.SMOW:

2.   Principio

Il rapporto isotopico 18O/16O è determinato per spettrometria di massa dei rapporti isotopici (SMRI) a partire dalle correnti ioniche m/z 46 (12C16O18O) e m/z 44 (12C16O2) prodotte dall'anidride carbonica ottenuta dopo lo scambio con l'acqua contenuta nel vino, secondo la reazione:

C16O2 + H2 18O ↔ C16O18O + H2 16O

L'anidride carbonica della fase gassosa è utilizzata per l'analisi.

3.   Reattivi

4.   Apparecchiatura di laboratorio

5.   Determinazioni sperimentali

5.1.   Metodo manuale

Introduzione del campione

Raffreddare le due rampe con azoto liquido, quindi spurgare tutto il sistema fino a 0,1 mm Hg aprendo le valvole.

Richiudere poi le valvole e lasciare riscaldare l'insieme. Ripetere il ciclo di degassaggio fino a pressione costante.

Raffreddare la rampa di lavoro − 70 °C (con una miscela di azoto liquido e alcool) per far gelare l'acqua e mettere l'insieme sotto vuoto. Dopo la stabilizzazione del vuoto, isolare la rampa mediante la valvola e spurgare il sistema d'introduzione della CO2. Introdurre la CO2 gassosa nella rampa di lavoro e, dopo averla isolata dal resto del sistema, immergere la rampa nel bagno termostatato a 25 °C (± 0,5 °C) per 12 ore (una notte). Per ottimizzare il tempo necessario all'equilibratura si consiglia di preparare i campioni alla fine della giornata e di lasciare che l'equilibrio si stabilisca durante la notte.

Adattare alla linea a vuoto a lato della rampa di lavoro un portacampioni capace di contenere un ugual numero di celle di misura e di palloni contenenti la CO2 scambiata. Spurgare accuratamente le celle vuote e trasferire successivamente i gas scambiati contenuti nei palloni nelle celle di misura raffreddate con l'azoto liquido. Lasciare infine riscaldare le celle di misura a temperatura ambiente.

5.2.   Utilizzazione di un apparecchio di scambio automatico

Per ottenere l'equilibrio riempire la bocetta per il campione con 2 ml di vino o 2 ml d'acqua (riferimento di lavoro del laboratorio) e raffreddarli a − 18 °C. Adattare al sistema di equilibratura i portacampioni contenenti i prodotti congelati e, dopo aver fatto il vuoto nel sistema, introdurre l'anidride carbonica ad una pressione di 800 hPa.

L'equilibrio è raggiunto a una temperatura di 22 ± 0,5 °C dopo un minimo di 5 ore e agitazione moderata. Poiché la durata dell'equilibratura dipende dalla forma geometrica della boccetta, è necessario determinare in precedenza la durata ottimale per il sistema utilizzato.

Trasferire successivamente l'anidride carbonica contenuta nelle boccette nella camera di introduzione dello spettrometro di massa tramite un tubo capillare ed effettuare la misurazione secondo il protocollo specifico per ciascun tipo di apparecchio.

6.   Calcolo e espressione dei risultati

La differenza relativa δ′ del rapporto della intensità degli ioni m/z 46 e 44 (I46/I44) tra il campione e il riferimento è espressa in ‰ dalla relazione seguente:

Il tenore in 18O del campione in rapporto al termine di riferimento V.SMOW sulla scala V.SMOW-SLAP è dato dalla relazione:

Il valore accettato per l'acqua dello SLAP è uguale a − 55,5 ‰ rispetto al V.SMOW. Il rapporto isotopico del riferimento deve essere determinato dopo ogni serie di 10 misurazioni su campioni sconosciuti.

7.   Ripetibilità e riproducibilità della misura

▼M7

44.   DOSAGGIO DEL CARBAMMATO DI ETILE NEI VINI: METODO DI RIVELAZIONE SELETTIVA PER CROMATOGRAFIA IN FASE GASSOSA/SPETTROMETRIA DI MASSA

(Applicabile nella determinazione del carbammato di etile per concentrazioni comprese tra 10 e 200 μg/l).

(Attenzione:rispettare le prescrizioni di sicurezza per le manipolazioni dei prodotti chimici, per l'etanolo, l'acetone ed i prodotti cancerogeni: carbammato di etile e diclorometano. Per lo smaltimento dei solventi usati attenersi a modalità conformi alle norme e ai regolamenti ecologici in materia).

A.   Principio del metodo

Il carbammato di propile viene aggiunto ad un campione come standard interno, la soluzione viene diluita con acqua e viene posta in una colonna di estrazione in fase solida da 50 ml. Il carbammato di etile e il carbammato di propile vengono eluiti con diclorometano.

L'eluato viene concentrato mediante un evaporatore a rotazione sotto vuoto. Il concentrato viene analizzato per cromatografia in fase gassosa (CG); la rivelazione viene effettuata mediante spettrometria di massa per fragmentometria in modo SIM (Selected ions monitoring).

B.   Apparecchiatura e condizioni cromatografiche (dati a titolo esemplificativo)

C.   Reattivi

D.   Preparazione del campione test

Porre il materiale test in due becher distinti da 100 ml utilizzando le seguenti quantità:

In ciascun becher aggiungere 1 ml di soluzione CP di standard interno, C e) 3 ed acqua per ottenere un volume totale di 40 ml (o 40 g).

E.   Estrazione

Eseguire l'estrazione sotto la cappa aspirante con ventilazione adeguata.

Trasferire il preparato di cui alla lettera D nella colonna di estrazione.

Risciacquare il becher con 10 ml di acqua e trasferire l'acqua di risciacquo nella colonna.

Lasciare che il liquido si absorba nella colonna per 4 minuti. Eluire con 2 × 80 ml di diclorometano. Raccogliere l'eluato in una beuta conica da 300 ml.

Evaporare l'eluato sino a 2-3 ml mediante l'evaporatore a rotazione in bagnomaria a 30 °C (

NB: non lasciare evaporare a secco

).

Trasferire il residuo concentrato in un tubo graduato da 4 ml con una pipetta Pasteur.

Sciacquare la beuta con 1 ml di diclorometano e trasferire il liquido di lavaggio nel tubo. Concentrare il campione ad 1 ml in debole corrente di azoto

Trasferire eventualmente il concentrato in una beuta del dispositivo di trasporto del campione per l'analisi CG/SM.

F.   Analisi CG/SM

G.   Analisi collaborativa

La tabella riporta i singoli risultati per il campione di prova pratica e per i due tipi di vino.

L'applicazione del test di Cochran ha comportato l'eliminazione di una sola coppia di risultati, sia per il vino con titolo alcolometrico maggiore di 14 % vol. che per il vino con titolo alcolometrico minore o uguale a 14 % vol., ciascuno proveniente da un laboratorio differente.

La riproducibilità relativa tende a diminuire con l'aumento della concentrazione di carbammato di etile.

▼M10

45.   DETERMINAZIONE DEL RAPPORTO ISOTOPICO 13C/12C PER SPETTROMETRIA DI MASSA ISOTOPICA DELL'ETANOLO DEL VINO O DELL'ETANOLO OTTENUTO PER FERMENTAZIONE DEI MOSTI, DEI MOSTI CONCENTRATI O DEI MOSTI CONCENTRATI RETTIFICATI

1.   CAMPO DI APPLICAZIONE

Il metodo consente la misurazione del rapporto isotopico 13C/12C dell'etanolo del vino e di quello dell'etanolo ottenuto per fermentazione dei prodotti derivati della vite (mosto, mosto concentrato, mosto concentrato rettificato).

2.   RIFERIMENTI NORMATIVI

ISO

:

5725: 1994 «Esattezza dei risultati e metodi di misura — Determinazione della ripetibilità e della riproducibilità di un metodo di misura normalizzato mediante test interlaboratori»

V–PDB

:

Vienna-Pee-Dee Belemnite (RPDB = 0,0112372).

Metodo 8 dell'allegato del presente regolamento

:

«Rivelazione dell'aumento di titolo alcolometrico naturale dei mosti di uve, dei mosti di uve concentrati, dei mosti di uve concentrati rettificati e dei vini mediante la risonanza magnetica nucleare del deuterio (RMN-FINS)».

3.   TERMINI E DEFINIZIONI

13C/12C

:

Rapporto tra il numero di isotopi del carbonio 13 (13C) e del carbonio 12 (12C) per un campione determinato.

δ13C

:

Tenore di carbonio 13 (13C) espresso in parti per mille (‰).

RMN-FINS

:

Frazionamento isotopico naturale specifico studiato per risonanza magnetica nucleare.

V–PDB

:

Vienna Pee Dee Belemnite. Il PDB, riferimento primario per la misura delle variazioni naturali dei tenori isotopici di carbonio 13, era un carbonato di calcio proveniente da un rostro di belemnite del periodo Cretaceo della formazione «Pee-Dee» dello Stato della Carolina del Sud (USA). Il suo rapporto isotopico 13C/12C o RPDB è RPDB = 0,0112372. Il PDB è esaurito da parecchio tempo, ma è rimasto il riferimento primario per esprimere le variazioni naturali dei tenori isotopici di carbonio 13, rispetto al quale vengono tarati i materiali di riferimento, disponibili presso l'Agenzia internazionale dell'energia atomica (AIEA) a Vienna (Austria). Le determinazioni isotopiche dell'abbondanza naturale di carbonio 13 sono pertanto espresse, per convenzione, rispetto al V-PDB.

m/z

:

Rapporto massa/carico.

4.   PRINCIPIO

Nella fotosintesi, l'assimilazione di anidride carbonica da parte dei vegetali avviene secondo due principali tipi di metabolismo: il C3 (ciclo di Calvin) e il C4 (Hatch e Slack). Questi due meccanismi di fotosintesi presentano un frazionamento isotopico differente. I prodotti delle piante C4, quali gli zuccheri e l'alcole da fermentazione, presentano dei tenori di carbonio 13 più elevati di quelli dei loro omologhi provenienti dalle piante C3. La maggior parte dei vegetali quali la vite e la barbabietola, appartengono al gruppo C3. La canna da zucchero e il granturco appartengono al gruppo C4. La misurazione del tenore di carbonio 13 consente quindi di rivelare e di valutare lo zucchero di origine C4 (zucchero di canna o isoglucosio di granturco) aggiunto ai prodotti derivati dall'uva (mosti di uve, vini …). Le informazioni combinate del tenore di carbonio 13 con quelle ottenute per RMN-FINS consentono anche di quantificare l'aggiunta di miscele di zuccheri o di alcoli originari delle piante C3 e C4.

Il tenore di carbonio 13 è determinato sull'anidride carbonica risultante dalla combustione completa del campione. Le abbondanze dei principali isotopomeri di massa 44 (12C16O2), 45 (13C16O2 e 12C17O16O) e 46 (12C16O18O), risultanti dalle varie combinazioni possibili degli isotopi 18O, 17O, 16O, 13C e 12C, vengono determinate a partire dalle correnti ioniche misurate su tre collettori differenti di uno spettrometro di massa isotopica. I contributi degli isotopomeri 13C17O16O e 12C17O2 possono essere trascurati, data la loro abbondanza molto scarsa. La corrente ionica per m/z = 45 viene corretta, per tener conto del contributo di 12C17O16O che viene calcolato in funzione dell'intensità della corrente misurata per m/z = 46, considerando le abbondanze relative di 18O e 17O (correzione di Craig). La comparazione con un riferimento tarato in base al riferimento internazionale V-PDB consente il calcolo del tenore di carbonio 13 sulla scala relativa δ13C.

5.   REAGENTI

I materiali e le sostanze consumabili dipendono dall'apparecchiatura (6) utilizzata dal laboratorio. I sistemi generalmente utilizzati sono quelli basati sull'analizzatore elementare. Quest'ultimo può essere progettato per l'introduzione di campioni posti in capsule metalliche sigillate o per l'iniezione di campioni liquidi attraverso una membrana con una siringa.

A seconda del tipo di apparecchiatura utilizzata, possono essere utilizzati i seguenti materiali di riferimento, reagenti e sostanze consumabili:

6.   ATTREZZATURA E MATERIALE

6.1.   Spettrometro di massa per rapporto isotopico (SMRI)

Spettrometro di massa per rapporto isotopico (SMRI) che consente di determinare il tenore relativo di 13C del gas CO2 in abbondanza naturale con una precisione interna dello 0,05 ‰ o meglio espresso in valore relativo (9). La precisione interna viene qui definita come la differenza tra due misure dello stesso campione di CO2. Lo spettrometro di massa per la misurazione dei rapporti isotopici è generalmente munito di un collettore triplo per misurare simultaneamente le intensità per m/z = 44, 45 e 46. Lo spettrometro di massa per rapporto isotopico deve essere munito di un sistema di introduzione doppio, per misurare in alternanza il campione in esame e un campione di riferimento oppure deve disporre di un sistema integrato che effettui la combustione quantitativa dei campioni e separi il biossido di carbonio dagli altri prodotti della combustione prima della misurazione nello spettrometro di massa.

6.2.   Apparecchiatura di combustione

Apparecchiatura di combustione in grado di convertire quantitativamente l'etanolo in biossido di carbonio ed eliminare tutti gli altri prodotti di combustione (acqua compresa) senza alcun frazionamento isotopico. L'apparecchiatura può essere costituita da un sistema a flusso continuo incorporato nella strumentazione di spettrometria di massa (6.2.1) o da un sistema di combustione distinto (6.2.2). Essa deve consentire di ottenere una precisione almeno equivalente a quella indicata al punto 11.

6.2.1.   Sistemi a flusso continuo

Questi sistemi sono costituiti da un analizzatore elementare o da un cromatografo in fase gassosa munito di un sistema di combustione in linea.

Per i sistemi atti all'introduzione dei campioni contenuti in capsule metalliche, viene utilizzato il seguente materiale di laboratorio:

Nota: per limitare i rischi di evaporazione dei campioni di etanolo, è possibile porre nelle capsule una sostanza assorbente (ad esempio, cromosorb W 45-60 maglie) di cui si sarà preventivamente verificato, con una misurazione in bianco, che non contiene quantità significative di carbonio tali da alterare le misurazioni.

Nel caso di un analizzatore elementare con iniettore per liquidi o di un sistema di preparazione per cromatografia-combustione, viene utilizzato il seguente materiale di laboratorio:

Questi materiali di laboratorio sono qui indicati a titolo esemplificativo e possono essere sostituiti con altri materiali che offrano prestazioni equivalenti, a seconda del tipo di apparecchiatura di combustione e di spettrometria di massa utilizzata dal laboratorio.

6.2.2.   Sistemi di preparazione separati

In questo caso, i campioni di biossido di carbonio derivanti dalla combustione dei campioni in esame e del riferimento sono raccolti in fiale che sono successivamente poste nel doppio sistema di entrata dello spettrometro per l'analisi isotopica. Si possono utilizzare diversi tipi di apparecchiature di combustione descritte nella letteratura:

7.   PREPARAZIONE DEI CAMPIONI PER IL TEST

L'etanolo deve essere estratto a partire dal vino prima della determinazione isotopica. Questa estrazione viene effettuata per distillazione del vino, come descritto al punto 3.1 del metodo n. 8 (RMN-FINS).

Nel caso di mosto di uve, di mosto di uve concentrato e di mosto di uve concentrato rettificato, gli zuccheri devono essere fermentati in etanolo, innanzitutto come descritto al punto 3.2 del metodo n. 8.

8.   MODO DI OPERARE

Tutte le fasi preparatorie devono essere effettuate senza perdita significativa di etanolo per evaporazione, il che altererebbe la composizione isotopica del campione.

La descrizione qui in appresso fa riferimento alle procedure generalmente utilizzate per la combustione dei campioni di etanolo mediante sistemi automatici di combustione esistenti in commercio. Per la preparazione del biossido di carbonio per l'analisi isotopica può essere utilizzato qualsiasi altro metodo che procuri che il campione di etanolo sia quantitativamente convertito in biossido di carbonio, senza alcuna perdita di etanolo per evaporazione.

Procedura sperimentale basata sull'utilizzazione di un analizzatore elementare

9.   CALCOLO

L'obiettivo del metodo consiste nel misurare il rapporto isotopico 13C/12C dell'etanolo estratto a partire dal vino o dai prodotti derivati dell'uva dopo fermentazione. Il rapporto isotopico 13C/12C può essere espresso dalla sua deviazione da un riferimento di lavoro. La deviazione isotopica del carbonio 13 (δ 13C) viene quindi calcolata su una scala delta per mille (δ/1000) per comparazione dei risultati ottenuti per il campione in esame rispetto a quelli del riferimento di lavoro precedentemente tarato in base al riferimento primario internazionale (V-PDB). I valori δ 13C sono espressi in base al riferimento di lavoro mediante la seguente formula:

δ13Ccamp./rif ‰ = 1 000 × (Rcamp-Rrif)/Rrif

dove Rcamp. e Rrif sono rispettivamente i rapporti isotopici 13C/12C del campione e quelli del biossido di carbonio utilizzato come gas di riferimento.

I valori δ 13C sono allora espressi rispetto al V-PDB secondo la formula

δ13Ccamp/V-PDB ‰ = δ13Ccamp./rif δ13Crif/V-PDB + (δ13Ccamp./rif × δ13Crif/V-PDB)/1 000

dove δ13Crif/V-PDB è la deviazione isotopica preventivamente determinata del riferimento di lavoro rispetto al V-PDB.

Durante la misurazione in linea, possono essere rilevate piccole derive dovute alla variazione delle condizioni strumentali. In tal caso, le δ13C dei campioni devono essere corrette in funzione della differenza del valore δ13C misurato per il campione standard di lavoro e il suo valore vero, precedentemente tarato sul V-PDB per comparazione con uno dei materiali di riferimento internazionali. Tra due misure del campione standard di lavoro, si può assumere che la deriva, e quindi la correzione da apportare ai risultati dei campioni, siano lineari. Il campione standard di lavoro deve essere misurato all'inizio e alla fine di ogni serie di campioni. Si può quindi calcolare una correzione per ogni campione mediante un'interpolazione lineare.

10.   GARANZIA DI QUALITÀ E CONTROLLO

Controllare che il valore 13C per il riferimento di lavoro non differisca di oltre lo 0,5 ‰ dal valore ammesso. In caso contrario, dovrà essere controllata ed eventualmente riaggiustata la regolazione della strumentazione dello spettrometro.

Per ogni campione, verificare che la differenza di risultato tra le due capsule misurate successivamente sia inferiore allo 0,3 ‰. Il risultato finale per un campione determinato è allora il valore medio delle due capsule. Se la differenza è maggiore dello 0,3 ‰, la misura deve essere ripetuta.

Un controllo del funzionamento corretto della misura può essere basato sull'intensità della corrente ionica per m/z = 44, che è proporzionale alla quantità di carbonio iniettata nell'analizzatore elementare. Nelle condizioni standard, l'intensità di questa corrente ionica dovrebbe essere praticamente costante per i campioni in esame. Una deviazione significativa deve far sospettare un'evaporazione di etanolo (ad esempio, una capsula non perfettamente sigillata) oppure una instabilità dell'analizzatore elementare o dello spettrometro di massa.

11.   CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE DEL METODO (Precisione)

È stato effettuato un primo studio in collaborazione (11.1) su distillati contenenti alcoli di origine vinica, alcoli di canna e di barbabietola e varie miscele di queste tre origini. Questo studio non ha tenuto conto della fase di distillazione; sono pertanto state considerate anche informazioni complementari ottenute da altri test interlaboratori effettuati su vini (11.2) e segnatamente circuiti di test di attitudine (11.3) per le misure isotopiche. Risulta che i differenti sistemi di distillazione utilizzati in condizioni soddisfacenti — e in particolare quelli per le misure RMN-FINS — non comportano variabilità significative per le determinazioni δ13C dell'etanolo del vino. I parametri di fedeltà osservati per i vini sono pressoché identici a quelli ottenuti nello studio in collaborazione (11.1) sui distillati.

11.1.   Studio in collaborazione sui distillati

Anno del test interlaboratori

:

1996

Numero di laboratori

:

20

Numero di campioni

:

6 campioni in doppio cieco

Analita

:

δ 13C dell'etanolo

11.2.   Studio interlaboratori su due vini e un alcole

Anno del test interlaboratori

:

1996

Numero di laboratori

:

14 per la distillazione dei vini, di cui 7 anche per la misura δ 13C dell'etanolo dei vini 8 per la misura δ 13C del campione di alcole

Numero di campioni

:

3 (vino bianco TAV 9,3 % vol., vino bianco TAV 9,6 % vol. e alcole di titolo alcolometrico 93 % m/m)

Analita

:

δ 13C dell'etanolo

I laboratori partecipanti hanno utilizzato differenti sistemi di distillazione. Le determinazioni isotopiche δ 13C effettuate da un solo laboratorio sull'insieme dei distillati rispediti dai partecipanti non rivelano alcun valore aberrante né alcun valore significativamente differente dai valori medi. La varianza dei risultati (S2 = 0,0059) è comparabile alle varianze della ripetibilità Sr2 dello studio in collaborazione sui distillati (11.1).

11.3.   Risultati delle serie di prove di attitudine ai test isotopici

Dal dicembre 1994 vengono organizzati regolarmente degli esercizi di attitudine internazionali per le determinazioni isotopiche sui vini e sugli alcoli (distillati di TAV 96 % vol.). I risultati consentono ai laboratori partecipanti di controllare la qualità delle loro analisi. L'utilizzazione statistica dei risultati consente di apprezzare la variabilità delle determinazioni in condizioni di riproducibilità e quindi di stimare i parametri della varianza e del limite di riproducibilità. I risultati ottenuti per le determinazioni δ

13

C dell'etanolo dei vini e dei distillati sono riassunti nella tabella seguente:

11.4.   Limiti di ripetibilità e di riproducibilità

I dati dei vari esercizi interlaboratori presentati nelle precedenti tabelle consentono pertanto di stabilire per questo metodo (inserendo anche la fase di distillazione) i limiti di ripetibilità e di riproducibilità seguenti:

---

( 1 ) GU n. L 84 del 27. 3. 1987, pag. 1.

( 2 ) GU n. L 132 del 23. 5. 1990, pag. 19.

( 3 ) GU n. L 133 del 14. 5. 1982, pag. 1.

( 4 ) 

Nota: Le tabelle, i diagrammi e una parte delle figure riportati nell'allegato sono stati messi a disposizione della Commissione delle Comunità europee dall'Ufficio internazionale della vigna e del vino di Parigi.

( 5 ) Si può usare qualsiasi picnometro avente caratteristiche equivalenti.

( 6 ) Al punto 6 del presente capitolo si riporta un esempio numerico.

( 7 ) Al punto 6 del presente capitolo si riporta un esempio numerico.

( 8 ) Al punto 6 del presente capitolo si riporta un esempio numerico.

( 9 ) Il tenore in zucchero è espresso come zucchero invertito.

( 10 ) Il tenore in zucchero è espresso come zucchero invertito.

( 11 ) Esempio: per un titolo massico del 12 %: p = 0,12.

( 12 ) Prima di effettuare questo calcolo, la densità relativa (o la massa volumica) del vino, misurata nel modo sopra indicato, dev'essere corretta dall'azione dell'acidità volatile secondo la formula:

dv = d20 20 − 0,0000086 a oppure ρv = ρ20 − 0,0000086 a

nella quale a rappresenta la quantità di acidità volatile espressa in milliequivalenti per litro.

( 13 ) Questi valori sono dati in attesa della costituzione di una banca dati comunitaria.

( 14 ) Questi relazi sono dati in ottese della costituzione di una banca dati comunitaria.

( 15 ) Una delle denominazioni commerciali è «norite».

( 16 ) 105 pascal (Pa) = 1 bar.

( 17 ) Tale distanza va misurate nel verso OC.

( 18 ) Per certi vini particolarmente ricchi, è consigliabile utilizzare una colonna capillare di 50 m di lunghezza.

( 19 ) Per certi vini particolarmente ricchi, può essere consigliabile effettuare una programmazione della temperatura di 2 °C/minuto.