1998L0057 — IT — 30.07.2006 — 001.001

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Trattandosi di un semplice strumento di documentazione, esso non impegna la responsabilità delle istituzioni

►B	DIRETTIVA 98/57/CE DEL CONSIGLIO del 20 luglio 1998 concernente la lotta contro Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. (GU L 235, 21.8.1998, p.1)

Modificato da:

		Gazzetta ufficiale
		No	page	date
►M1	DIRETTIVA 2006/63/CE DELLA COMMISSIONE del 14 luglio 2006	L 206	36	27.7.2006

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DIRETTIVA 98/57/CE DEL CONSIGLIO

del 20 luglio 1998

concernente la lotta contro Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Articolo 1

La presente direttiva ha per oggetto i provvedimenti da adottare negli Stati membri per combattere l'agente patogeno «Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.», precedentemente noto come Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (in prosieguo: «l'organismo nocivo»), con riferimento alle piante ospiti dell'organismo nocivo elencate nell'allegato I, sezione 1 (in prosieguo: «il materiale vegetale elencato»), allo scopo di:

Articolo 2

1.  Gli Stati membri effettuano ogni anno accertamenti ufficiali sistematici riguardanti la presenza dell'organismo nocivo nel materiale vegetale elencato originario dei rispettivi territori nazionali. Al fine di individuare altre possibili fonti di contaminazione che minacciano la produzione del materiale vegetale elencato, essi procedono ad una valutazione dei rischi e, a meno che durante la valutazione non sia stato individuato alcun rischio di propagazione, effettuano, nelle zone di produzione del materiale vegetale elencato, accertamenti ufficiali mirati alla ricerca dell'organismo nocivo su vegetali diversi dal materiale vegetale elencato, comprese le solanacee selvatiche ospiti, nonché sulle acque superficiali impiegate per l'irrigazione o l'irrorazione del materiale vegetale elencato e sulle acque reflue scaricate dagli impianti di trasformazione industriale o di imballaggio in cui viene manipolato il materiale vegetale elencato e impiegate per l'irrigazione o l'irrorazione di questo materiale. La portata degli accertamenti mirati è definita a seconda dei rischi identificati. Gli Stati membri possono inoltre effettuare accertamenti ufficiali per la ricerca dell'organismo nocivo in altri materiali, quali terreno di coltura, suolo e rifiuti solidi di impianti di trasformazione industriale o di imballaggio.

2.  Gli accertamenti ufficiali di cui al paragrafo 1 devono essere effettuati:

Per questi accertamenti, ulteriori particolari relativi alle procedure di ispezione e al numero, all'origine, alla stratificazione e al momento del prelievo dei campioni sono stabiliti dall'organismo ufficiale competente, quale definito dalla direttiva 77/93/CEE, in base a fondati principi scientifici e statistici e alla biologia dell'organismo nocivo, tenendo altresì conto, negli Stati membri interessati, degli specifici sistemi di produzione del materiale vegetale elencato e, se del caso, di altre piante ospiti dell'organismo nocivo.

3.  Le modalità specifiche e i risultati degli accertamenti ufficiali di cui al paragrafo 1 sono notificati ogni anno agli altri Stati membri e alla Commissione, secondo le prescrizioni dell'allegato I, sezione II, punto 2. Le notifiche sono effettuate entro il 1o giugno ad eccezione di quelle relative alle patate usate come sementi ottenute dall'agricoltore e utilizzate nella sua azienda, che sono effettuate entro il 1o settembre. Le modalità specifiche e i risultati concernenti le colture si riferiscono alla produzione dell'anno precedente. I dati contenuti nelle notifiche possono essere presentati al comitato.

4.  Sono adottati secondo la procedura di cui all'articolo 16 bis della direttiva 77/93/CEE:

5.  Possono essere adottati secondo la procedura di cui all'articolo 16 bis della direttiva 77/93/CEE:

Articolo 3

Gli Stati membri provvedono affinché, ogniqualvolta si sospetti o venga confermata la presenza nel loro territorio dell'organismo nocivo, ne venga data comunicazione ai rispettivi organismi ufficiali responsabili.

Articolo 4

1.  In caso di presenza sospetta, gli organismi ufficiali competenti dello Stato membro, o degli Stati membri, dove è stato segnalato il caso, provvedono ad effettuare prove di laboratorio ufficiali o sotto controllo ufficiale utilizzando, per il materiale vegetale elencato, il metodo appropriato di cui all'allegato II secondo quanto disposto nell'allegato III, punto 1, ovvero, in tutti gli altri casi, secondo un qualsiasi altro metodo ufficialmente approvato, al fine di confermare o smentire la presenza sospetta. In caso di conferma si applicano le disposizioni dell'allegato III, punto 2.

2.  In attesa della conferma o della smentita della presenza sospetta di cui al paragrafo 1, in ogni caso di presenza sospetta in cui:

gli organismi ufficiali responsabili degli Stati membri per quanto concerne la loro produzione:

3.  Nei casi di presenza sospetta in cui esista un rischio di contaminazione del materiale vegetale elencato o delle acque superficiali da o in uno o più altri Stati membri, lo Stato membro in cui la presenza sospetta è stata segnalata notifica immediatamente agli altri Stati membri interessati le caratteristiche della manifestazione stessa, a seconda del rischio identificato e detti Stati membri collaborano opportunamente tra loro. Lo(Gli) Stato(i) membro(i) destinatario(i) della suddetta notifica adotta(ano) misure precauzionali a norma del paragrafo 2, lettera c), e intraprende(ono), ove necessario, ulteriori azioni a norma dei paragrafi 1 e 2.

4.  Sono adottate secondo la procedura di cui all'articolo 16 bis della direttiva 77/93/CEE:

Articolo 5

1.  Qualora le prove di laboratorio ufficiali o condotte sotto controllo ufficiale applicando, per il materiale vegetale elencato, il metodo appropriato di cui all'allegato II oppure, in tutti gli altri casi, un qualsiasi metodo ufficialmente approvato, confermino la presenza dell'organismo nocivo in un campione prelevato a norma della presente direttiva, gli organismi ufficiali responsabili di uno Stato membro, sulla base di fondati principi scientifici, della biologia dell'organismo nocivo e dei particolari sistemi di produzione, lavorazione e commercializzazione delle piante ospiti di tale organismo nocivo in detto Stato membro:

2.  Gli Stati membri notificano immediatamente agli altri Stati membri e alla Commissione, ai sensi delle disposizioni dell'allegato V, punto 3, i casi di contaminazione dichiarata ai sensi del paragrafo 1, lettera a), punto ii), e lettera c), punto ii), nonché i dati specifici relativi alla delimitazione della zona di cui al paragrafo 1, lettera a), punto iv), e, se del caso, al paragrafo 1, lettera c), punto iii). I dati contenuti nella notifica ai sensi del presente paragrafo possono essere presentati al comitato.

Contemporaneamente gli Stati membri presentano alla Commissione la notifica supplementare di cui al punto 4 dell'allegato V. I dati contenuti nella notifica ai sensi del presente comma sono presentati immediatamente ai membri del comitato.

3.  In seguito alla notifica di cui al paragrafo 2 e in base agli elementi ivi menzionati, gli altri Stati membri specificati nella notifica avviano un accertamento a norma del paragrafo 1, lettera a), punto i), e, dove applicabile, del paragrafo 1, lettera c), punto i), e, se del caso, intraprendono ulteriori azioni a norma dei paragrafi 1 e 2.

Articolo 6

1.  Gli Stati membri vietano la messa a dimora del materiale vegetale elencato dichiarato contaminato ai sensi dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), e dispongono che esso, sotto il controllo degli organismi nazionali responsabili, sia soggetto ad una delle disposizioni dell'allegato VI, punto 1, in modo che sia assicurata l'inesistenza di rischi identificabili di propagazione dell'organismo nocivo.

2.  Gli Stati membri vietano la messa a dimora del materiale vegetale elencato ritenuto probabilmente contaminato ai sensi dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii), e lettera c), punto iii) — compreso il materiale vegetale elencato per il quale è stato individuato un rischio, prodotto in luoghi di produzione ritenuti probabilmente contaminati ai sensi dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii) — e dispongono che esso, sotto il controllo degli organismi nazionali responsabili, sia destinato ad un impiego appropriato o sia eliminato ai sensi dell'allegato VI, punto 2, in modo che sia assicurata l'inesistenza di rischi identificabili di propagazione dell'organismo nocivo.

3.  Gli Stati membri prescrivono che i macchinari, i veicoli, i contenitori, i magazzini o le relative parti, nonché qualsiasi altro oggetto, compresi i materiali di imballaggio, dichiarati contaminati ai sensi dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto ii), o ritenuti probabilmente contaminti ai sensi dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iii) e lettera c), punto iii), siano distrutti o decontaminati secondo i metodi adeguati di cui all'allegato VI, punto 3. Dopo la decontaminazione, gli oggetti in questione non sono più considerati contaminati.

4.  Fatte salve le misure attuate ai sensi dei paragrafi 1, 2 e 3, gli Stati membri prescrivono che, nelle zone delimitate ai sensi dell'articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto iv), e lettera c), punto iii), sia applicata una serie di misure come precisato nell'allegato VI, punti 4.1 e 4.2. I dati relativi a tali misure sono notificati ogni anno agli altri Stati membri e alla Commissione. I dati contenuti nella notifica possono essere presentati al comitato.

Articolo 7

1.  Gli Stati membri dispongono che i tuberi-seme di patata debbono essere conformi ai requisiti della direttiva 77/93/CEE e derivare direttamente da materiali, ottenuti nell'ambito di un programma ufficialmente approvato, che sono risultati esenti dall'organismo nocivo in prove ufficiali o sotto controllo ufficiale, eseguite utilizzando il metodo appropriato di cui all'allegato II.

Dette prove sono eseguite da uno Stato membro:

2.  Possono essere adottate secondo la procedura di cui all'articolo 16 bis della direttiva 77/93/CEE:

Articolo 8

Gli Stati membri vietano la detenzione e la manipolazione dell'organismo nocivo.

Articolo 9

Fatte salve le disposizioni della direttiva 77/93/CEE, gli Stati membri possono autorizzare deroghe alle diposizioni degli articoli 6 e 8 della presente direttiva, ai sensi delle disposizioni della direttiva 95/44/CE, per prove o scopi scientifici e per lavori di selezione varietale ( 5 ).

Articolo 10

Per la propria produzione gli Stati membri possono adottare, qualora risultino necessarie, misure supplementari o più rigorose per combattere l'organismo nocivo o per prevenirne la propagazione, sempreché siano conformi alle disposizioni della direttiva 77/93/CEE.

I dati relativi a tali misure sono notificati agli altri Stati membri e alla Commissione. I dati contenuti nella notifica possono essere presentati al comitato.

Articolo 11

Le eventuali modifiche degli allegati della presente direttiva, da apportare alla luce degli sviluppi tecnici e scientifici, sono adottate secondo la procedura di cui all'articolo 16 bis della direttiva 77/93/CEE. Nel caso dei metodi stabiliti nell'allegato II e delle misure di cui all'allegato VI, punti 4.1 e 4.2, della presente direttiva, la Commissione presenta al comitato, anteriormente al 1o gennaio 2002, una relazione di riesame di tali metodi e misure elaborata alla luce dell'esperienza acquisita.

Articolo 12

1.  Gli Stati membri mettono in vigore le disposizioni legislative, regolamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva con effetto al 21 agosto 1999. Essi ne informano immediatamente la Commissione.

Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva o sono corredate di un siffatto riferimento all'atto della pubblicazione ufficiale. Le modalità di tale riferimento sono decise dagli Stati membri.

2.  Gli Stati membri comunicano immediatamente alla Commissione il testo delle disposizioni essenziali di diritto interno che essi adottano nel settore disciplinato dalla presente direttiva. La Commissione ne informa gli altri Stati membri.

Articolo 13

La presente direttiva entra in vigore il giorno della pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunità europee.

Articolo 14

Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva.

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ALLEGATO I

SEZIONE I

Elenco delle piante ospiti di Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. di cui all'articolo 1

SEZIONE II

Accertamenti

1.

Gli accertamenti ufficiali di cui all'articolo 2, paragrafo 2, lettera a), debbono essere basati sulla biologia del microrganismo nocivo e sul particolare sistema di produzione nello Stato membro interessato. Essi debbono comprendere: i) nel caso delle patate, — a momenti appropriati, l'ispezione visuale della pianta durante la crescita e/o il prelievo di campioni di tuberi-seme e di altre patate durante la stagione di crescita oppure in magazzino. Questi campioni debbono essere sottoposti a ispezione visuale ufficiale o sotto sorveglianza ufficiale, comportante il sezionamento dei tuberi, — e inoltre, — nel caso dei tuberi-seme e, se del caso, di altre patate, esami di laboratorio, ufficiali o sotto sorveglianza ufficiale secondo il metodo di cui all'allegato II; ii) nel caso del pomodoro, — l'ispezione visuale, a momenti appropriati, almeno durante la crescita delle piante destinate al reimpianto ad usi professionali.

2.

La notifica degli accertamenti ufficiali di cui all'articolo 2, paragrafo 3, deve comprendere: i) nel caso delle patate, — la superficie totale, valutata in ettari, coltivata a patate da seme e ad altri tipi di patata, — la stratificazione per categoria (patate da seme e da consumo), e se del caso, per regione, — il numero dei campioni prelevati per l'esame e il calendario dei prelievi, — il numero di ispezioni visuali sul terreno, — il numero delle ispezioni visuali sui tuberi (e l'entità dei campioni); ii) nel caso delle piante di pomodori, almeno durante la crescita, destinate al reimpianto ad usi professionali, — numero totale stimato delle piante, — il numero delle ispezioni visuali; iii) nel caso delle piante ospiti diverse dalla patata e dal pomodoro, comprese le solanacee selvatiche ospiti, — la specie, — il numero e la cadenza dei campioni prelevati, — la zona/il corso d'acqua sottoposti a prelievo, secondo i casi, — il metodo di analisi; iv) nel caso degli accertamenti sull'acqua e sugli scarichi di reflui degli impianti di trasformazione industriale o di imballaggio, — il numero e la cadenza dei campioni, — la zona/il corso d'acqua/l'ubicazione dell'impianto sottoposti a prelievo, secondo i casi, — il metodo di analisi.

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ALLEGATO II

SCHEMA PER LA DIAGNOSI, IL RILEVAMENTO E L’IDENTIFICAZIONE DI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

CAMPO DI APPLICAZIONE DELLO SCHEMA DIAGNOSTICO

Lo schema presentato descrive i procedimenti da utilizzare per:

INDICE

PRINCIPI GENERALI

I protocolli ottimizzati per i vari metodi, i reagenti convalidati e i dettagli per la preparazione del materiale per i saggi ed i controlli figurano nelle appendici. Un elenco dei laboratori coinvolti nell’ottimizzazione e convalida dei protocolli figura nell’appendice 1.

Dato che i protocolli comportano il rilevamento di un organismo da quarantena e prevedono l’uso di colture vitali di R. solanacearum come materiale di controllo, le procedure dovranno essere svolte in opportune condizioni di quarantena, con adeguate strutture per lo smaltimento dei rifiuti e secondo le modalità e le condizioni previste da appropriate autorizzazioni rilasciate dalle autorità ufficiali per la quarantena dei vegetali.

I parametri dei saggi devono garantire un rilevamento certo e riproducibile dei livelli di R. solanacearum ai valori di soglia dei metodi prescelti.

È indispensabile un’accurata preparazione dei controlli positivi.

La realizzazione dei saggi sulla base delle soglie richieste implica inoltre la corretta regolazione, manutenzione e taratura degli strumenti, una corretta manipolazione e conservazione dei reagenti nonché l’applicazione di tutte le misure atte ad impedire la contaminazione tra i campioni, come ad esempio la separazione dei controlli positivi dai campioni da saggiare. Per evitare errori amministrativi e di altro genere devono essere applicate misure uniformi per il controllo della qualità, in particolare per quanto riguarda l’etichettatura e la documentazione.

Una manifestazione sospetta ai sensi dell’articolo 4, paragrafo 2, della direttiva 98/57/CE implica un risultato positivo nei saggi diagnostici o di selezione preliminare fatti su un campione secondo quanto indicato nei diagrammi di flusso. Se il primo saggio di selezione preliminare (IF, PCR/FISH o isolamento selettivo) risulta positivo, esso deve essere confermato da un secondo saggio di selezione preliminare basato su un principio biologico differente.

Se il primo saggio di selezione preliminare risulta positivo, si sospetta una contaminazione da R. solanacearum ed occorre procedere ad un secondo saggio. Se il secondo saggio di selezione preliminare è positivo, il sospetto è confermato (manifestazione sospetta) ed occorre procedere ai saggi analitici successivi, secondo quanto previsto dallo schema. Se il secondo saggio di selezione preliminare è negativo, il campione non si considera contaminato da R. solanacearum.

Per confermare la presenza di R. solanacearum ai sensi dell’articolo 5, paragrafo 1, della direttiva 98/57/CE è necessario isolare e identificare l’organismo in coltura pura e verificarne la patogenicità.

SEZIONE I

APPLICAZIONE DELLO SCHEMA

1.   Schema di rilevamento per la diagnosi del marciume bruno e dell’avvizzimento batterico (Ralstonia solanacearum) nei tuberi di patata, nelle piante di patata e di pomodoro o in altre piante ospiti che presentano sintomi di queste malattie.

Il procedimento sottoindicato deve essere applicato ai tuberi e alle piante di patata che presentano sintomi tipici o sospetti di marciume bruno o di avvizzimento associato ad alterazioni vascolari. Esso comporta un saggio rapido di selezione preliminare, l’isolamento dell’agente patogeno dal tessuto vascolare infetto su terreni di coltura (selettivi) e, in caso di esito positivo, l’identificazione della coltura come Ralstonia solanacearum.

2.   Schema di rilevamento e identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata asintomatici

Principi

Il procedimento è diretto a rilevare le infezioni latenti nei tuberi di patata. Un risultato positivo ottenuto da almeno due saggi di selezione preliminare3, basati su principi biologici differenti, deve essere confermato dall’isolamento del patogeno e quindi, in caso di isolamento di colonie tipiche, dall’identificazione di una coltura pura di R. solanacearum. Il fatto che uno solo dei saggi di selezione preliminare risulti positivo non è sufficiente per far considerare sospetto il campione.

I saggi di selezione preliminare e i saggi di isolamento devono consentire soglie di rilevamento comprese tra 103 e 104 cellule per ml di sedimento risospeso, incluse come controllo positivo in ciascuna serie di saggi analitici.

3.   Schema di rilevamento e identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di piante di patata e di pomodoro o di altre piante ospiti asintomatiche

SEZIONE II

METODI DETTAGLIATI PER IL RILEVAMENTO DI RALSTONIA SOLANACEARUM NEI TUBERI DI PATATA, NELLE PIANTE DI PATATA E DI POMODORO O IN ALTRE PIANTE OSPITI CHE PRESENTANO SINTOMI DI MARCIUME BRUNO O DI AVVIZZIMENTO BATTERICO.

1.   Sintomi (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Sintomi nella patata

Pianta di patata. La fase iniziale dell’infezione in pieno campo si riconosce dalla perdita di turgore delle foglie della parte superiore della pianta con le alte temperature diurne, reversibile durante la notte. Nelle prime fasi dell’avvizzimento le foglie rimangono verdi, successivamente compaiono ingiallimento, necrosi brune nonché epinastia. L’avvizzimento di un germoglio o della pianta intera si aggrava, diventa presto irreversibile e porta a collasso e morte della pianta. Il tessuto vascolare dei fusti di piante avvizzite tagliato trasversalmente di solito si presenta bruno e gocciole di un liquido lattiginoso possono essudare dalla superficie tagliata o essere facilmente fatte uscire per compressione. Quando un fusto tagliato trasversalmente viene immerso verticalmente nell’acqua limpida e in quiete di un bicchiere, filamenti biancastri scendono dai tessuti vascolari verso il fondo.

Tubero di patata. I tuberi di patata devono essere tagliati trasversalmente vicino all’ombelico (punto di attacco dello stolone) oppure longitudinalmente sopra al punto di attacco dello stolone. La fase iniziale dell’infezione consiste in un’alterazione di colore da giallo vitreo a marrone chiaro dell’anello vascolare, da cui dopo pochi minuti fuoriesce spontaneamente un liquido batterico color crema chiaro. In seguito la decolorazione vascolare diventa di un marrone più netto e la necrosi può estendersi al tessuto parenchimatico. Nelle fasi avanzate l’infezione si espande centrifugamente sino ad emergere in corrispondenza dell’ombelico e degli occhi dai quali può fuoriuscire essudato batterico cui rimangono aderenti particelle di terreno. Sulla superficie dei tuberi possono comparire tacche bruno-rossastre, leggermente infossate, dovute al collasso interno dei tessuti vascolari. Nelle fasi avanzate della malattia è frequente lo sviluppo secondario di marciume molle causato da funghi e batteri.

1.2.   Sintomi nel pomodoro

Pianta di pomodoro. Il primo sintomo visibile è l’aspetto flaccido delle foglie più giovani. In condizioni ambientali favorevoli per l’agente patogeno (temperature del suolo di circa 25 °C, umidità satura) in pochi giorni seguono epinastia e flaccidezza di un lato della pianta o dell’intera pianta, portando la stessa al collasso totale. In condizioni meno favorevoli (temperatura del suolo inferiore a 21 °C) l’avvizzimento ha evoluzione più lenta, ma sul fusto possono svilupparsi numerose radici avventizie. Si possono osservare striature idropiche che partono dalla base del fusto, indice di necrosi del sistema vascolare. Quando il fusto è tagliato trasversalmente, dai tessuti vascolari bruni scoloriti essudano gocce di liquido batterico bianco o giallastro.

1.3.   Sintomi in altre piante ospiti

Piante di Solanum dulcamara e S. nigrum. In condizioni naturali è raro rilevare sintomi di collasso e avvizzimento in queste piante erbacee ospiti, tranne nel caso in cui le temperature del suolo siano superiori a 25 °C o i livelli di inoculo siano assai elevati (come ad esempio per un S. nigrum che cresca in prossimità di piante infette di patata o di pomodoro). Qualora compaia avvizzimento, i sintomi sono gli stessi descritti per le piante di pomodoro. Le piante di S. dulcamara che non presentano segni di avvizzimento e che si sviluppano con radici e fusti in acqua possono presentare uno scolorimento interno color marrone chiaro dei tessuti vascolari nella sezione trasversale della base del fusto o di sue parti subacquee. Può esservi fuoriuscita di essudato batterico dai tessuti vascolari recisi o formazione di filamenti di essudato se il fusto reciso viene collocato verticalmente in acqua, anche in assenza di sintomi di avvizzimento.

2.   Saggi rapidi di selezione preliminare

I saggi rapidi di selezione preliminare facilitano la formulazione di una diagnosi presunta, ma non sono fondamentali. Effettuare uno o più dei seguenti saggi convalidati:

2.1.   Prova di fuoriuscita di essudato dal fusto

(cfr. sezione VI.A.1)

2.2.   Rilevamento dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato (PHB)

I caratteristici granuli di PHB nelle cellule di Ralstonia solanacearum sono resi visibili colorando con blu Nilo A o nero Sudan B strisci di essudato batterico provenienti da tessuto infetto, fissati mediante calore su un vetrino da microscopio (cfr. sezione VI.A.2).

2.3.   Prove di sieroagglutinazione

(cfr. sezione VI.A.3)

2.4.   Altri saggi

Altri saggi rapidi appropriati per la selezione preliminare sono il saggio IF (sezione VI.A.5), il saggio FISH (sezione VI.A.7), i saggi ELISA (sezione VI.A.8) e i saggi PCR (sezione VI.A.6).

3.   Metodo di isolamento

4.   Saggi di identificazione di R. solanacearum

I saggi di conferma dell’identificazione di presunti isolati di R. solanacearum sono elencati nella sezione VI.B.

SEZIONE III

1.   Metodi dettagliati per il rilevamento e l’identificazione di Ralstonia solanacearum in campioni di tuberi di patata asintomatici

1.1.   Preparazione del campione

Nota:

Trattamento preliminare facoltativo da far precedere alla preparazione del campione:

1.1.1.

Rimuovere con un bisturi o con un pelapatate pulito e disinfettato la buccia intorno all’ombelico (punto di attacco dello stolone) di ciascun tubero, in modo da rendere visibile il tessuto vascolare. Asportare accuratamente un piccolo cono di tessuto vascolare dall’ombelico di ciascun tubero, riducendo al minimo la quantità di tessuto non vascolare (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). NB: Mettere da parte i tuberi (marcescenti) con sintomi sospetti e saggiarli individualmente. Se nel corso dell’asportazione del cono ombelicale si osservano sintomi sospetti di marciume bruno, è necessario procedere ad un’indagine visiva del tubero tagliando quest’ultimo vicino all’ombelico. I tuberi tagliati che presentano sintomi sospetti devono essere tenuti per almeno 2 giorni a temperatura ambiente in modo da consentire la suberificazione e quindi conservati ad una temperatura compresa tra 4 e 10 °C in adeguate condizioni di quarantena. Tutti i tuberi, compresi quelli sospetti, devono essere conservati secondo quanto previsto all’allegato III.

1.1.2.

Raccogliere i coni ombelicali in contenitori monouso nuovi che possano essere chiusi e/o sigillati (qualora vengano riutilizzati, i contenitori devono essere puliti e disinfettati accuratamente mediante composti clorurati). I coni ombelicali andrebbero di preferenza trattati immediatamente. Se ciò non fosse possibile, conservarli nel contenitore, senza aggiunta di tampone, refrigerati per non più di 72 ore o a temperatura ambiente per non più di 24 ore. Trattare i coni ombelicali secondo una delle seguenti procedure: a) Coprire i coni con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) e porre in un agitatore rotativo (50-100 giri/m) per 4 ore a non più di 24 °C o per 16-24 ore se refrigerati. b) Omogeneizzare i coni con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) in un mixer (p. es. Waring o Ultra Thurax) o schiacciandoli in un sacchetto di macerazione monouso sigillato (p. es. Stomacher o Bioreba in polietilene di elevato spessore, 150 mm × 250 mm, sterile per irradiazione) usando un martello di gomma o uno strumento di macinazione appropriato (p. es. Homex). NB: L’omogeneizzazione dei campioni per mezzo di un mixer comporta un rischio elevato di contaminazione incrociata. Prendere opportune precauzioni per evitare versamenti o generazione di aerosol nel corso del processo di estrazione. Assicurarsi che per ogni campione vengano usati lame e contenitori appena sterilizzati. Qualora si debba effettuare un saggio PCR, evitare i residui di DNA sui contenitori o gli apparecchi di macinazione. Per il saggio PCR si raccomanda lo schiacciamento in sacchetti monouso e l’impiego di provette monouso.

1.1.3.

Far decantare il supernatante. Se eccessivamente torbido, chiarificare mediante centrifugazione a bassa velocità (non oltre 180 g per 10 minuti a una temperatura compresa tra 4 e 10 °C) o filtrazione sotto vuoto (40-100 µm), lavando il filtro con una dose supplementare ( 10 ml) di tampone di estrazione.

1.1.4.

Concentrare la frazione batterica mediante centrifugazione a 7 000 g per 15 minuti (o 10 000 g per 10 minuti) a una temperatura compresa tra 4 e 10 °C e scartare il supernatante senza far muovere il sedimento.

1.1.5.

Risospendere il sedimento in 1,5 ml di tampone per sedimento da centrifuga (appendice 4). Usare 500 µl per R. solanacearum, 500 µl per Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus e 500 µl a fini di riferimento. Aggiungere glicerolo sterile a una concentrazione finale del 10-25 % (v/v) ai 500 µl del quantitativo di riferimento e al resto del quantitativo da saggiare, mescolare nel vortex e conservare ad una temperatura compresa tra 16 e 24 °C (settimane) o tra 68 e 86° C (mesi). Mantenere i quantitativi da saggiare a una temperatura compresa tra 4 e 10 °C durante il saggio. Non è consigliabile procedere a cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Qualora sia richiesto un trasporto dell’estratto, la consegna deve essere effettuata in un contenitore refrigerato entro un massimo di 24-48 ore.

1.1.6.

È indispensabile che tutti i campioni e i controlli positivi di R. solanacearum siano trattati separatamente per evitare contaminazioni. Ciò vale per i vetrini di immunofluorescenza e per tutti i saggi.

1.2.   Saggi analitici

Cfr. il diagramma di flusso e la descrizione dei saggi e dei protocolli ottimizzati nelle relative appendici:

2.   Metodi dettagliati per il rilevamento e l’identificazione di R. solanacearum in campioni di piante di patata e di pomodoro o di altre piante ospiti asintomatiche

2.1.   Preparazione del campione

NB: Ai fini del rilevamento delle infezioni latenti di R. solanacearum si consiglia di saggiare campioni compositi. Il procedimento può essere applicato efficacemente a campioni compositi comprendenti fino a un massimo di 200 parti di fusto. Qualora si effettuino campagne di monitoraggio a fini di sorveglianza, esse devono basarsi su un campione statisticamente rappresentativo della popolazione di piante in esame.

2.1.1.

Raccogliere segmenti di fusto lunghi 1-2 cm in un recipiente sterile chiuso secondo le procedure di campionamento di seguito indicate. Piantine di pomodoro da vivaio. Servendosi di un coltello pulito e disinfettato, asportare un segmento di 1 cm dalla base di ciascun fusto, appena al di sopra del livello del suolo. Piante di pomodoro coltivate in campo o in serra. Servendosi di un coltello pulito e disinfettato, asportare il germoglio laterale più basso da ciascuna piantina incidendo appena sopra il punto di giuntura con il fusto principale. Asportare il segmento di 1 cm più basso da ciascun germoglio laterale. Altre piante ospiti. Servendosi di un coltello o di un paio di forbici da giardinaggio pulite e disinfettate, asportare un segmento di 1 cm dalla base di ciascun fusto, appena al di sopra del livello del suolo. Per S. dulcamara o altre piante ospiti che crescono in acqua, asportare segmenti di 1-2 cm dai fusti subacquei o dagli stoloni con radici acquatiche. Si consiglia, nel campionare un determinato luogo, di saggiare un campione rappresentativo di almeno 10 piante per punto di campionamento di ciascuna pianta erbacea potenzialmente ospite. Il rilevamento del patogeno è più attendibile nella tarda primavera, in estate e in autunno, sebbene nel Solanum dulcamara che cresce lungo i corsi d’acqua le infezioni naturali possano essere rilevate durante tutto l’anno. Tra le piante ospiti note figurano le piante di patata spontanee, Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium e altri membri della famiglia delle solanacee. Altre piante ospiti sono Pelargonium spp. e Portulaca oleracea. Tra le erbacee europee note o potenziali ospiti di popolazioni di R. solanacearum razza 3 biovar 2 nelle radici e/o nelle rizosfere, in particolari condizioni ambientali, figurano Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfara e Urtica dioica. NB: In questa fase può essere effettuato un esame visivo per individuare sintomi interni (colorazione vascolare o essudato batterico). Mettere da parte i segmenti di fusto che presentano sintomi sospetti e saggiarli individualmente (cfr. sezione II).

2.1.2.

Disinfettare brevemente i segmenti di fusto con etanolo al 70 % e asciugare immediatamente tamponando con carta bibula. Trattare poi i segmenti di fusto con uno dei metodi seguenti: a) coprire i segmenti con un volume sufficiente (circa 40 ml) di tampone di estrazione (appendice 4) e porre in un agitatore rotativo (50-100 rpm) per 4 ore a non più di 24 °C o per 16-24 ore se refrigerati; oppure b) trattare i segmenti immediatamente schiacciandoli in un sacchetto di macerazione resistente (p. es. Stomacher o Bioreba) con un volume adeguato di tampone di estrazione (appendice 4) usando un martello di gomma o uno strumento di macinazione appropriato (p. es. Homex). Se ciò non fosse possibile, conservare i segmenti di fusto refrigerati per non più di 72 ore o a temperatura ambiente per non più di 24 ore.

2.1.3.

Decantare il supernatante dopo averlo lasciato riposare per 15 minuti.

2.1.4.

Non è in genere necessario procedere a un’ulteriore chiarificazione dell’estratto o concentrazione della frazione batterica, ma esse possono essere ottenute mediante filtrazione e/o centrifugazione secondo quanto descritto nelle sezioni III.1.1.3-1.1.5.

2.1.5.

Dividere l’estratto del campione puro o concentrato in due parti uguali. Mantenerne una metà a 4-10 °C durante il saggio e conservare l’altra metà con glicerolo sterile al 10-25 % (v/v) a una temperatura compresa tra 16 e 24 °C (settimane) o tra 68 e 86 °C (mesi) qualora siano necessari ulteriori saggi.

2.2.   Saggi analitici

Cfr. il diagramma di flusso e la descrizione delle prove e dei protocolli ottimizzati nelle relative appendici:

SEZIONE IV

1.   Schema di rilevamento e identificazione di R. solanacearum nell’acqua.

2.   Metodi di rilevamento e identificazione di R. solanacearum nell’acqua

Principi

Lo schema di rilevamento convalidato descritto nella presente sezione può essere usato per il rilevamento del patogeno in campioni di acque superficiali nonché per saggiare campioni di acque reflue o di reflui di lavorazione delle patate. Tuttavia è importante tener conto del fatto che la sensibilità prevista di rilevamento varia a seconda del substrato. La sensibilità del saggio di isolamento è condizionata dalle popolazioni di batteri saprofiti competitori, generalmente assai più numerose nelle acque reflue e nei reflui di lavorazione delle patate che nelle acque superficiali. Mentre nel caso delle acque superficiali la soglia di sensibilità dello schema sotto descritto arriva a 103 cellule per litro, nel caso delle acque reflue o dei reflui di lavorazione delle patate la soglia è assai superiore. È pertanto consigliabile effettuare i saggi sui reflui dopo eventuali trattamenti di depurazione (sedimentazione o filtrazione), che determinano una riduzione delle popolazioni di batteri saprofiti. Nel valutare l’affidabilità degli eventuali risultati negativi ottenuti si deve tener conto dei limiti di sensibilità dello schema diagnostico. Nonostante sia stato usato efficacemente in monitoraggi ed esami volti a stabilire la presenza o l’assenza del patogeno in acque superficiali, lo schema presenta alcuni limiti di cui è necessario tener conto nell’ambito di analoghi monitoraggi su acque reflue o su reflui di lavorazione delle patate.

2.1.   Preparazione del campione

Nota:

2.1.1.

Nei punti di prelievo designati, riempire provette o bottiglie sterili monuso con campioni di acqua, attingendo a una profondità possibilmente superiore a 30 cm e a non oltre 2 metri dalla riva. Per le acque reflue o i reflui di lavorazione, prelevare i campioni nel punto di scarico delle acque. La dimensione massima raccomandata dei campioni per punto di prelievo è di 500 ml. Se si opta per campioni di dimensioni più piccole, è consigliabile prelevare i campioni ad almeno 3 riprese per punto di prelievo; ogni campione deve consistere di 2 sottocampioni duplicati di almeno 30 ml. Per monitoraggi estesi, selezionare almeno 3 punti di prelievo per 3 km di corso d’acqua e assicurarsi che vengano prelevati campioni anche dagli affluenti.

2.1.2.

Trasportare i campioni in condizioni di oscurità e a bassa temperatura (4-10 °C) ed analizzarli entro 24 ore.

2.1.3.

Se necessario la frazione batterica può essere concentrata usando uno dei seguenti metodi: a) Centrifugare i sottocampioni di 30-50 ml a 10 000 g per 10 minuti (o a 7 000 g per 15 minuti), preferibilmente a una temperatura di 4-10 °C, scartare il sopranatante e risospendere il sedimento in 1 ml di tampone per sedimento (appendice 4). b) Filtrare attraverso una membrana (dimensioni minime dei pori 0,45 µm) e successivamente lavare quest’ultima in 5-10 ml di tampone per sedimento, conservando le soluzioni di lavaggio. Questo metodo è consigliato per grandi quantità di acqua che contengono un numero ridotto di saprofiti. In generale non si consiglia di effettuare la concentrazione sui campioni di acque reflue o di reflui di lavorazione della patata, giacché la presenza di popolazioni più numerose di batteri saprofiti competitori inibisce il rilevamento di R. solanacearum.

2.2.   Saggi analitici

Cfr. il diagramma di flusso e la descrizione delle prove nelle relative appendici.

SEZIONE V

1.   Schema di rilevamento e identificazione di R. solanacearum nel terreno

2.   Metodi di rilevamento e identificazione di R. solanacearum nel terreno

Principi

Lo schema di rilevamento convalidato, descritto nella presente sezione, viene usato per rilevare la presenza del patogeno nei campioni di terreno oltre che per saggiare campioni di scarti solidi di lavorazione della patata o di fanghi di depurazione. La sensibilità di tali metodi non risulta tuttavia sufficiente a garantire il rilevamento di popolazioni ridotte e/o irregolarmente distribuite di R. solanacearum, che possono essere presenti nei campioni naturalmente contaminati di questi materiali.

Nel valutare l’affidabilità degli eventuali risultati negativi ottenuti, come pure nell’ambito di monitoraggi volti a determinare la presenza o l’assenza del patogeno nel terreno o nei fanghi di depurazione, occorre tener conto dei limiti di sensibilità di questo schema diagnostico. La prova più affidabile per rilevare la presenza del patogeno nel terreno di un appezzamento è di piantare una pianta ospite sensibile e di monitorare l’eventuale infezione, sebbene anche con questo metodo possano sfuggire bassi livelli di contaminazione.

2.1.   Preparazione del campione

2.1.1.

Per la preparazione del campione di terra di un appezzamento attenersi alle norme di base usate per il campionamento dei nematodi. Prelevare 0,5-1 kg di terra per campione da 60 punti di prelievo per 0,3 ha, a una profondità di 10-20 cm (o in una griglia di 7 × 7metri). Se si sospetta la presenza del patogeno, aumentare il numero di punti di prelievo a 120 per 0,3 ha. Conservare i campioni a una temperatura di 12-15 °C prima di saggiare. Prelevare un totale di 1 kg di fanghi di depurazione e fanghi provenienti dalla lavorazione della patata da siti rappresentativi del volume totale dei fanghi da esaminare. Mescolare bene ciascun campione prima di saggiare.

2.1.2.

Disperdere i sottocampioni di 10-25 g di terra o di fanghi con un agitatore rotativo (250 rpm) in 60-150 ml di tampone di estrazione (appendice 4) per un massimo di 2 ore. Se necessario aggiungere lo 0,02 % di Tween 20 e 10-20 g di ghiaia sterile per agevolare la dispersione.

2.1.3.

Conservare la sospensione a 4 °C durante il saggio.

2.2.   Saggi diagnostici

Cfr. il diagramma di flusso e la descrizione dei saggi nelle relative appendici.

SEZIONE VI

PROTOCOLLI OTTIMIZZATI PER IL RILEVAMENTO E L’IDENTIFICAZIONE DI R. SOLANACEARUM

A.   SAGGI DIAGNOSTICI E DI RILEVAMENTO

1.   Prova di fuoriuscita dell’essudato dal fusto

La presenza di R. solanacearum nei fusti di piante di patata e di pomodoro e in altre piante ospiti con sintomi di avvizzimento può essere rilevata presuntivamente mediante la seguente prova: tagliare il fusto appena sopra il livello del terreno; sospendere la superficie sezionata in una provetta di acqua limpida e in quiete; osservare se dopo pochi minuti si verifica la caratteristica fuoriuscita di filamenti biancastri di essudato batterico dai fasci fibrovascolari tagliati.

2.   Rilevamento dei granuli di poli-beta-idrossibutirrato

Colorazione blu Nilo

Colorazione nero Sudan

3.   Saggio sierologico di agglutinazione

Il metodo migliore per osservare l’agglutinazione di cellule di R. solanacearum nell’essudato batterico o in estratti di tessuto sintomatico consiste nel servirsi di anticorpi convalidati (appendice 3) legati ad opportuni marcatori colorati quali cellule rosse di Staphylococcus aureus o particelle di lattice colorate. Se si utilizza un kit disponibile in commercio (appendice 3) seguire le istruzioni del fabbricante. In caso contrario seguire la seguente procedura:

4.   Isolamento selettivo

4.1.   Isolamento selettivo in piastra

NB: Prima di usare questo metodo per la prima volta, effettuare saggi preliminari per garantire il rilevamento riproducibile di almeno 103-104 unità formanti colonia di R. solanacearum per ml aggiunte a estratti dei campioni precedentemente risultati negativi.

Servirsi di un substrato selettivo adeguatamente convalidato come il substrato SMSA (modificato da Elphinstone et al., 1996; cfr. l’appendice 2).

Occorre particolare attenzione anche per distinguere R. solanacearum da altri batteri che potrebbero sviluppare colonie sul terreno di coltura. Inoltre, le colonie di R. solanacearum possono presentare una morfologia atipica se le piastre sono sovrappopolate o se sono presenti anche batteri antagonisti. Qualora si sospettino effetti di competizione o antagonismo, il campione deve essere sottoposto a un saggio di tipo diverso.

Per ottenere la massima sensibilità di rilevamento con questo metodo è preferibile disporre di estratto del campione preparato al momento. Tuttavia, esso può essere eseguito anche su estratti conservati in glicerolo ad una temperatura compresa tra 68 e 86 °C.

Come controllo positivo, preparare diluizioni decimali di una sospensione di 106 cfu/ml di un ceppo virulento di biovar 2 di R. solanacearum (p. es. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Per evitare possibili contaminazioni, preparare i controlli positivi in un ambiente totalmente separato da quello dei campioni da saggiare.

Per ogni nuovo lotto di un substrato selettivo preparato, l’idoneità per lo sviluppo del patogeno andrebbe verificata prima che il lotto venga usato per saggiare campioni ordinari.

Saggiare il materiale di controllo con lo stesso metodo utilizzato per il/i campione/i.

4.1.1.

Predisporre le sospensioni da inseminare sulle piastre a diluizioni tali da rendere minimo l'effetto di eventuali popolazioni batteriche saprofite formanti colonia associate al materiale. Inseminare 50-100 µl per piastra di estratto del campione e di ogni diluizione.

4.1.2.

Mantenere le piastre in incubazione a una temperatura di 28 °C. Osservare le piastre dopo 48 ore e in seguito quotidianamente per un periodo fino a 6 giorni. Le colonie tipiche di R. solanacearum su SMSA sono di color bianco-latte, piatte, irregolari e fluide e dopo 3 giorni di incubazione sviluppano una colorazione da rosa a rosso sangue al centro, con striature interne e vortici (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). NB: Su questo substrato possono formarsi colonie atipiche di R. solanacearum. Esse possono essere piccole, tonde, di un colore uniforme rosso e non fluide o soltanto in parte fluide e quindi difficili da distinguere dai batteri saprofiti formatori di colonie.

4.1.3.

Purificare le presunte colonie di R. solanacearum dopo avere effettuato uno striscio o una diluizione in piastra su un mezzo nutritivo generale per ottenere colonie isolate (appendice 2).

4.1.4.

Le colture possono essere conservate a breve termine in acqua sterile (pH 6-8, senza cloruri) a temperatura ambiente e in condizioni di oscurità, oppure a lungo termine in un mezzo crioprotettivo adeguato a una temperatura compresa tra 68 e 86 °C o liofilizzate.

4.1.5.

Identificare le presunte colonie (cfr. sezione VI.B) ed effettuare un saggio di patogenicità (cfr. sezione VI.C).

L’isolamento selettivo in piastra è negativo se non si osservano colonie dopo sei giorni o se non si trovano colonie presunte tipiche di R. solanacearum, purché non si sospetti inibizione causata da competizione o antagonismo da parte di altri batteri e nel controllo positivo si trovino le caratteristiche colonie di R. solanacearum. L’isolamento in piastra è positivo se vengono rilevate colonie presunte di R. solanacearum.

4.2.   Procedura di arricchimento

Servirsi di un substrato di arricchimento convalidato come il brodo di Wilbrink modificato (cfr. appendice 2).

Questa procedura può essere usata per aumentare selettivamente le popolazioni di R. solanacearum negli estratti del campione e per aumentare la sensibilità di rilevamento. La procedura è anche efficace per diluire gli inibitori della reazione PCR (1:100). Va notato comunque che l’arricchimento di R. solanacearum può essere compromesso a causa di una competizione o di un antagonismo da parte di organismi saprofiti che spesso vengono arricchiti allo stesso tempo. L’isolamento di R. solanacearum da brodi di coltura arricchiti può pertanto rivelarsi difficile. Inoltre, dato che le popolazioni di saprofiti sierologicamente affini possono aumentare, è consigliabile servirsi di anticorpi monoclonali specifici anziché di anticorpi policlonali qualora si debba effettuare il saggio ELISA.

4.2.1.

Per il PCR post-arricchimento trasferire 100 µl di estratto del campione in 10 ml di brodo di arricchimento (appendice 2), precedentemente frazionato in provette o bottiglie esenti da DNA. Per l’ELISA post-arricchimento possono essere aggiunte proporzioni maggiori di estratto del campione nel brodo (p. es. 100 µl in 1,0 ml di brodo di arricchimento).

4.2.2.

Mantenere in incubazione per 72 ore a una temperatura di 27-30 °C in coltura agitata o statica, senza chiudere ermeticamente i tappi al fine di consentire l’aerazione.

4.2.3.

Mescolare bene prima di usare nei saggi ELISA o PCR.

4.2.4.

Trattare il brodo arricchito secondo lo stesso metodo usato per i campioni nei saggi precedenti. NB: Se si prevede un’inibizione dell’arricchimento di R. solanacearum a causa di elevate popolazioni di determinati batteri saprofiti competitori, l’arricchimento dagli estratti dei campioni prima dell’eventuale centrifugazione o di altre procedure di concentrazione può dare risultati migliori.

5.   saggio IF

Principi

Tenuto conto della sua comprovata capacità di garantire il rilevamento delle soglie richieste, si raccomanda l’uso del saggio IF come saggio di selezione preliminare principale.

Quando il saggio IF è usato come saggio di selezione preliminare principale e l’esito è positivo, occorre procedere ad un secondo saggio che può essere l’isolamento, la PCR o il FISH. Quando il saggio IF è usato come secondo saggio di selezione preliminare e l’esito è positivo, per completare l’analisi occorre procedere ad ulteriori saggi sulla base del diagramma di flusso.

NB: Servirsi di una fonte convalidata di anticorpi per R. solanacearum (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Si consiglia di determinare il titolo di ciascun nuovo lotto di anticorpi. Il titolo si definisce come la più alta diluizione alla quale si verifica una reazione ottimale saggiando una sospensione contenente da 105 a 106 cellule per ml del ceppo omologo di R. solanacearum e usando un’appropriata diluizione del coniugato di isotiocianato di fluoresceina (FITC), secondo le istruzioni del produttore. Gli antisieri policlonali convalidati hanno tutti un titolo IF di almeno 1:2 000. Durante il saggio, gli anticorpi dovrebbero essere usati a diluizioni di lavoro prossime o corrispondenti a tale titolo.

Il saggio va effettuato su estratti di campione preparati al momento dell’uso. Se necessario, esso può essere eseguito efficacemente su estratti conservati in glicerolo ad una temperatura compresa tra 68 e 86 °C. Il glicerolo può essere rimosso dal campione mediante aggiunta di 1 ml di tampone per sedimento da centrifuga (appendice 4), ricentrifugazione per 15 minuti a 7 000 g e risospensione in un volume uguale di tampone per sedimento da centrifuga. Questa operazione non sempre è necessaria, soprattutto se i campioni vengono fissati ai vetrini mediante esposizione alla fiamma.

Preparare vetrini separati di controllo positivo del ceppo omologo o di qualunque altro ceppo di riferimento di R. solanacearum sospeso in estratto di patata, come specificato nell’appendice 3, e facoltativamente in tampone.

Ove possibile si dovrebbe usare tessuto contaminato naturalmente (conservato mediante liofilizzazione o congelamento a una temperatura compresa tra 16 e 24 °C) come controllo analogo nello stesso vetrino.

Come controllo negativo, usare aliquote di estratto di campione precedentemente risultato negativo per R. solanacearum.

I materiali di controllo positivi e negativi standardizzati che possono essere impiegati per questa prova figurano nell’appendice 3.

Usare vetrini per microscopio con più pozzetti, preferibilmente con 10 pozzetti di almeno 6 mm di diametro.

Eseguire il saggio sul materiale di controllo secondo lo stesso metodo usato per il/i campione/i.

5.1.   Preparare i vetrini di saggio con uno dei seguenti procedimenti.

5.2.

Far evaporare il liquido delle goccioline a temperatura ambiente o mediante riscaldamento a una temperatura compresa tra 40 e 45 °C. Fissare le cellule batteriche al vetrino scaldandolo (15 minuti a 60 °C), passandolo alla fiamma, con etanolo al 95 % o seguendo le istruzioni specifiche fornite dal produttore degli anticorpi. Se necessario, i vetrini fissati possono essere quindi conservati congelati in un contenitore ben asciutto per il tempo minimo necessario (fino a un massimo di tre mesi) prima di essere usati per ulteriori saggi.

5.3.

Procedimento IF i) Se il vetrino di saggio è stato preparato secondo il procedimento di cui al punto 5.1.i): Preparare una serie di diluizioni decimali. Il primo pozzetto dovrebbe avere 1/2 del titolo (T/2), gli altri rispettivamente 1/4 del titolo (T/4), 1/2 del titolo (T/2), il titolo (T) e il doppio del titolo (2T). ii) Se il vetrino di saggio è stato preparato secondo il procedimento di cui al punto 5.1.ii): Preparare la diluizione di lavoro (WD) dell’anticorpo nel tampone IF. La diluizione di lavoro incide sulla specificità. Figura 1.  Preparazione del vetrino di saggio secondo i punti 5.1.i) e 5.3.i)   Diluizione del sedimento risospeso 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Diluizione del sedimento risospeso (T = titolo) T/2 T/4 T/2 T 2T  Diluizioni 1:2 dell’antisiero/anticorpo Campione 1   1 2 3 4 5 Duplicato del campione 1 o campione 2 6 7 8 9 10 Figura 2.  Preparazione del vetrino di saggio secondo i punti 5.1.ii) e 5.3.ii)   Diluizione di lavoro dell’antisiero/anticorpo 1/1 1/10 1/100 vuoto vuoto  Diluizione decimale del sedimento risospeso Campione 1     1 2 3 4 5 Duplicato del campione 1 o campione 2 6 7 8 9 10 5.3.1. Disporre i vetrini su carta bibula umida. Coprire completamente ciascun pozzetto di saggio con la/le diluizione/i di anticorpo. Il volume di anticorpo messo su ciascun pozzetto deve essere almeno equivalente al volume di estratto. In assenza di istruzioni specifiche da parte del fornitore degli anticorpi, si proceda come segue: 5.3.2. Mantenere in incubazione i vetrini su carta umida in un contenitore chiuso per 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C). 5.3.3. Scuotere via le goccioline da ciascun vetrino e sciacquare accuratamente con tampone IF. Lavare immergendo per 5 minuti nel tampone IF-Tween (appendice 4) e poi nel tampone IF. Evitare la produzione di aerosol o il trasferimento di goccioline, che potrebbero provocare una contaminazione incrociata. Rimuovere accuratamente l’umidità in eccesso tamponando delicatamente con carta bibula. 5.3.4. Disporre i vetrini su carta bibula umida. Coprire i pozzetti di saggio con la diluizione di coniugato di FITC usato per determinare la concentrazione. Il volume di coniugato messo sui pozzetti deve essere identico al volume dell’anticorpo. 5.3.5. Mantenere in incubazione i vetrini su carta umida sotto copertura per 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 °C). 5.3.6. Scuotere via le goccioline di coniugato dal vetrino. Sciacquare e lavare come in precedenza (paragrafo 5.3.3). Rimuovere accuratamente l’umidità in eccesso. 5.3.7. Trasferire con una pipetta 5-10 µl di tampone glicerol-fosfato 0,1 M (appendice 4) o di un liquido di montaggio commerciale antiscolorimento in ciascun pozzetto e chiudere con un vetrino coprioggetti.

5.4.

Lettura della colorazione IF 5.4.1 Esaminare i vetrini con un microscopio a epifluorescenza dotato di filtri idonei all’eccitazione del FITC, in olio o liquido di immersione, a 500-1 000 ingrandimenti. Esaminare attentamente i pozzetti lungo due diametri ortogonali e lungo il perimetro. Per i campioni che presentano assenza o un basso numero di cellule, osservare almeno 40 campi microscopici. Esaminare anzitutto il vetrino del controllo positivo. Le cellule devono avere fluorescenza brillante ed essere interamente colorate al titolo o alla diluizione di lavoro determinati dell’anticorpo. Il saggio IF (sezione VI.A.5) deve essere ripetuto se la colorazione è anomala. 5.4.2. Verificare la presenza di cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica di R. solanacearum nei pozzetti di saggio dei vetrini (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensità della fluorescenza deve essere equivalente al ceppo di controllo positivo con la stessa diluizione di anticorpi. Le cellule che presentano una colorazione incompleta o una debole fluorescenza devono essere ignorate. In caso di sospetta contaminazione occorre ripetere il saggio. Tale sospetto può sorgere ad esempio se tutti i vetrini di un lotto presentano cellule positive dovute alla contaminazione del tampone o se vengono rilevate cellule positive (al di fuori dei pozzetti) sul rivestimento dei vetrini. 5.4.3. La prova di immunofluorescenza presenta alcuni problemi inerenti alla sua specificità. Nei precipitati di coni ombelicali e frammenti di fusto di patata è possibile che si manifesti la presenza di una popolazione di fondo di cellule fluorescenti con morfologia atipica e di batteri saprofiti a reazione incrociata simili per dimensioni e morfologia a R. solanacearum. 5.4.4. Considerare soltanto le cellule fluorescenti aventi dimensioni e morfologia tipica al titolo o alla diluizione di lavoro degli anticorpi secondo quanto indicato alla sezione 5.3. 5.4.5. Interpretazione della lettura della colorazione IF i) Per ciascun campione in cui vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica, stimare il numero medio di cellule tipiche per campo microscopico e calcolare il numero di cellule tipiche per ml di sedimento di centrifuga risospeso (appendice 5). La lettura della colorazione IF è positiva per i campioni che presentano almeno 5 × 103 cellule tipiche per ml di sedimento di centrifuga risospeso. Il campione si considera potenzialmente contaminato ed occorre procedere ad ulteriori saggi. ii) La lettura della colorazione IF è negativa per i campioni che presentano meno di 5 × 103 cellule per ml di sedimento di centrifuga risospeso. Il campione si considera negativo e non sono necessari ulteriori saggi.

6.   Saggi PCR

Principi

Quando il saggio PCR è usato come saggio di selezione preliminare principale e l’esito è positivo, occorre procedere all’isolamento o alla colorazione IF come secondo saggio di selezione preliminare obbligatorio. Quando il saggio PCR è utilizzato come secondo saggio di selezione preliminare e l’esito è positivo, per completare la diagnosi devono essere effettuati i saggi previsti dal diagramma di flusso.

Si raccomanda di usare questo metodo come saggio di selezione preliminare principale solo dopo aver acquisito una competenza specializzata.

NB: Un saggio preliminare con questo metodo dovrebbe permettere il rilevamento riproducibile di 103-104 cellule di R. solanacearum per ml aggiunte a estratti di un campione precedentemente risultato negativo. Può essere necessario condurre esperimenti di ottimizzazione per raggiungere livelli massimi di sensibilità e specificità in tutti i laboratori.

Servirsi di reagenti e protocolli PCR convalidati (cfr. appendice 6). Scegliere preferibilmente un metodo con controllo interno.

Prendere le opportune precauzioni per evitare la contaminazione del campione con il DNA bersaglio. Per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione con il DNA bersaglio, il saggio PCR andrebbe eseguito da tecnici esperti, in laboratori di biologia molecolare specializzati.

I controlli negativi (per procedure di estrazione del DNA e PCR) devono essere sempre trattati come campione finale nel procedimento, al fine di evidenziare la presenza di eventuale disseminazione di DNA.

Nel saggio PCR devono essere inclusi i seguenti controlli negativi:

Devono essere inoltre inclusi i seguenti controlli positivi:

Per evitare potenziali contaminazioni, preparare i controlli positivi in un ambiente separato da quello dei campioni da saggiare.

Nella misura del possibile, gli estratti del campione devono essere privi di residui di terra. In taluni casi può essere pertanto consigliabile, in previsione dell’utilizzo di protocolli PRC, preparare gli estratti a partire da patate lavate.

I materiali di controllo positivi e negativi standardizzati che possono essere impiegati per questa prova sono elencati nell’appendice 3.

6.1.   Metodi di purificazione del DNA

Servirsi di campioni di controllo positivi e negativi, come sopra indicato (cfr. appendice 3).

Eseguire il saggio sul materiale di controllo secondo lo stesso metodo usato per il/i campione/i.

Esistono vari metodi per purificare il DNA bersaglio da substrati di campioni complessi, eliminando in tal modo gli inibitori della PCR e di altre reazioni enzimatiche e concentrando il DNA bersaglio nell’estratto del campione. Il metodo seguente è stato ottimizzato per l’impiego con i metodi PCR convalidati che figurano all’appendice 6.

a)   Metodo di Pastrik (2000)

b)   Altri metodi

È possibile applicare altri metodi di estrazione del DNA (p. es. Qiagen DNeasy Plant Kit), purché essi diano prova di un’efficacia equivalente nel purificare il DNA da campioni di controllo contenenti da 103 a 104 cellule del patogeno per ml.

6.2.   PCR

6.2.1.

Preparare la sequenza di nucleotidi di riferimento (primer) per la prova e il controllo, secondo i protocolli convalidati (sezione VI.A.6). Preparare una diluizione decimale dell’estratto di DNA proveniente dal campione (1:10 in UPW).

6.2.2.

Preparare la miscela di reazione PCR in un ambiente privo di contaminazione secondo i protocolli pubblicati (appendice 6). Ove possibile si consiglia di usare un protocollo PCR multiplex che includa anche un controllo interno della PCR.

6.2.3.

Aggiungere 2-5 µl di estratto di DNA per 25 µl di miscela di reazione PCR in provette da PCR sterili, conformemente ai protocolli PCR (appendice 6).

6.2.4.

Includere un campione di controllo negativo contenente unicamente la miscela di reazione PCR e aggiungere la stessa fonte di UPW usata nella miscela PCR al posto del campione.

6.2.5.

Porre le provette nello stesso termociclatore usato nei saggi preliminari ed eseguire il programma PCR opportunamente ottimizzato (appendice 6).

6.3.   Analisi del prodotto della PCR

6.3.1.

Separare gli ampliconi della PCR mediante elettroforesi in gel di agarosio. Far correre almeno 12 µl di miscela di reazione del DNA amplificato proveniente da ciascun campione mescolata con 3 µl di tampone di caricamento (appendice 6) in gel di agarosio al 2,0 % (p/v) in tampone TAE (tris-acetato-EDTA) (appendice 6) a una tensione di 5-8 V per cm. Usare un marcatore DNA adeguato, ad esempio un ladder a 100 bp.

6.3.2.

Visualizzare le bande di DNA mediante colorazione con etidio bromuro (0,5 mg/l) per 30-60 minuti adottando opportune precauzioni nella manipolazione di questo mutagene.

6.3.3.

Osservare il gel colorato con transilluminazione UV a onde corte (p. es. λ = 302 nm) per individuare prodotti della PCR amplificati delle dimensioni previste (appendice 6) e documentare i risultati.

6.3.4.

Per ogni nuovo risultato positivo, verificare l’autenticità dell’amplicone della PCR effettuando un’analisi di restrizione enzimatica su un campione del DNA amplificato rimasto, incubando alla temperatura e per il tempo ottimale con un enzima e un tampone adeguati (cfr. appendice 6). Separare i frammenti digeriti mediante elettroforesi in gel di agarosio come in precedenza, osservare il profilo caratteristico di restrizione dei frammenti con transilluminazione UV previa colorazione con etidio bromuro e confrontare con il controllo positivo non digerito e digerito.

Interpretazione del risultato della colorazione PCR

Il saggio PCR è negativo se la presenza dell’amplicone PCR delle dimensioni previste, specifico per R. solanacearum, viene evidenziata in tutti i campioni del controllo positivo ma non nel campione in esame (in caso di PCR multiplex con primer di controllo interno specifici per le piante: un secondo prodotto PCR delle dimensioni previste deve essere amplificato con il campione in questione).

Il saggio PCR è positivo se si evidenzia l’amplicone PCR specifico per R. solanacearum, delle dimensioni previste e (ove necessario) con il profilo di restrizione caratteristico, a condizione che esso non si manifesti in nessuno dei campioni di controllo negativo. La conferma affidabile di un risultato positivo può essere inoltre ottenuta ripetendo la prova con una seconda serie di primer PCR (appendice 6).

NB: Si può sospettare un’inibizione della PCR se il campione di controllo positivo contenente R. solanacearum in acqua produce l’amplicone previsto ma i controlli positivi contenenti R. solanacearum in estratto di patata danno risultati negativi. Nei protocolli di multiplex PCR con controlli interni della PCR, l’inibizione della reazione è probabile quando non si ottiene nessuno dei due ampliconi.

Se l’amplicone previsto si manifesta in almeno uno dei controlli negativi si può sospettare una contaminazione.

7.   Saggio FISH

Principi

Quando il saggio FISH è usato come primo saggio di selezione preliminare e l’esito è positivo, come secondo saggio di selezione preliminare obbligatorio dovrà essere effettuato il saggio di isolamento o la colorazione IF. Quando il saggio FISH è usato come secondo saggio di selezione preliminare e l’esito è positivo, per completare la diagnosi devono essere effettuati i saggi previsti dal diagramma di flusso.

NB: Usare oligosonde convalidate specifiche per R. solanacearum (appendice 7). Un saggio preliminare con questo metodo dovrebbe permettere il rilevamento riproducibile di almeno 103-104 cellule di R. solanacearum per ml aggiunte a estratti del campione precedentemente risultati negativi.

Il seguente procedimento andrebbe preferibilmente eseguito su estratti di campione preparati al momento dell’uso, ma può essere effettuato con successo su estratti conservati in glicerolo a una temperatura compresa tra 16 e 24 °C o tra 68 e 86 °C.

Come controllo negativo, usare aliquote di estratto di campione precedentemente risultato negativo per R. solanacearum.

Come controllo positivo preparare sospensioni contenenti 105-106 cellule per ml di R. solanacearum biovar 2 (p. es. ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, cfr. appendice 3) in tampone fosfato 0,01 M provenienti da una coltura di 3-5 giorni. Preparare vetrini separati di controllo positivo del ceppo omologo o di qualunque altro ceppo di riferimento di R. solanacearum sospeso in estratto di patata, come specificato nell’appendice 3, punto B.

L’uso di un’oligosonda eubatterica marcata con FITC fornisce un controllo per il processo di ibridizzazione, poiché verranno colorati tutti gli eubatteri presenti nel campione.

I materiali di controllo positivi e negativi standardizzati che possono essere impiegati per questa prova sono elencati nell’appendice 3, punto A.

Eseguire il saggio sul materiale di controllo secondo lo stesso metodo usato per il/i campione/i.

7.1.   Fissazione dell’estratto da patata

Protocollo secondo Wullings et al. (1998)

7.1.1.

Preparare la soluzione fissativa (appendice 7).

7.1.2.

Trasferire con una pipetta 100 µl di ciascun estratto del campione in una provetta Eppendorf e centrifugare per 7 minuti a 7 000 g.

7.1.3.

Rimuovere il supernatante e sciogliere il precipitato in 200 µl di fissativo preparato meno di 24 ore prima. Mescolare nel vortex e incubare per 1 ora in frigorifero.

7.1.4.

Centrifugare per 7 minuti a 7 000 g, rimuovere il supernatante e risospendere il precipitato in 75 µl di tampone fosfato 0,01 M (appendice 7).

7.1.5.

Distribuire 16 µl delle sospensioni fissate su un vetrino multitest pulito, come indicato nella figura 7.1. Applicare 2 diversi campioni per vetrino, non diluiti, e utilizzarne 10 µl per fare una diluizione 1:100 (in tampone fosfato 0,01 M). Il resto della soluzione campione (49 µl) può essere conservato a 20 °C previa aggiunta di 1 volume di etanolo al 96 %. Qualora il saggio FISH debba essere ripetuto, rimuovere l’etanolo mediante centrifugazione ed aggiungere un volume equivalente di tampone fosfato 0,01 M (mescolare nel vortex). Figura 7.1  Schema del vetrino FISH. Campione 1 Bianco Bianco Bianco Campione 2 pozzetto 1 pozzetto 2 pozzetto 3 pozzetto 4 pozzetto 5 Campione 1 Bianco Bianco Bianco Campione 2 pozzetto 6 pozzetto 7 pozzetto 8 pozzetto 9 pozzetto 10 Coprioggetti 1   Coprioggetti 2

7.1.6.

Far asciugare i vetrini all’aria (o su un essiccatore per vetrini a 37 °C) e fissarli mediante esposizione alla fiamma. A questo punto il procedimento può essere interrotto e l’ibridazione continuata il giorno successivo. I vetrini devono essere conservati asciutti e al riparo dalla polvere a temperatura ambiente.

7.2.   Ibridazione

7.2.1.

Disidratare le cellule in una serie graduata di etanolo (50 %, 80 % e 96 %), un minuto per ciascuna gradazione. Far asciugare i vetrini all’aria in un portavetrini.

7.2.2.

Preparare una camera di incubazione umida coprendo il fondo di un recipiente ermetico con carta bibula o carta da filtro immersa in 1x hybmix (appendice 7). Procedere alla pre-incubazione nel forno di ibridazione a 45 °C per almeno 10 minuti.

7.2.3.

Applicare 10 μl di soluzione di ibridazione (appendice 7) a 8 pozzetti (1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 e 10, cfr. figura 7.1) di ciascun vetrino, lasciando vuoti i due pozzetti centrali (3 e 8).

7.2.4.

Applicare i coprioggetti (24 × 24 mm) al primo e agli ultimi 4 pozzetti evitando di imprigionare aria all’interno. Porre i vetrini nella camera umida preriscaldata e lasciar ibridare al buio per 5 ore nel forno a 45 °C.

7.2.5.

Preparare 3 bicchieri contenenti 1 l di acqua molecolare Milli-Q, 1 l di 1x hybmix (334 ml di 3x hybmix e 666 ml di acqua Milli-Q) e 1 l di 1/8x hybmix (42 ml di 3x hybmix e 958 ml di acqua Milli-Q). Mettere in pre-incubazione a bagnomaria a 45 °C.

7.2.6.

Togliere i coprioggetti dai vetrini e porre questi ultimi in un portavetrini.

7.2.7.

Sciacquare via la sonda in eccesso mediante incubazione per 15 minuti nel bicchiere con 1x hybmix a 45 °C.

7.2.8.

Trasferire il portavetrini in una soluzione di lavaggio costituita da 1/8 hybmix e lasciar incubare per altri 15 minuti.

7.2.9.

Immergere rapidamente i vetrini in acqua Milli-Q e porli su carta da filtro. Rimuovere l’umidità in eccesso coprendo delicatamente la superficie con carta da filtro. Trasferire con una pipetta 5-10 µl di soluzione di montaggio antiscolorimento (p. es. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA o equivalente) su ciascun pozzetto e applicare un largo coprioggetti (24 × 60 mm) sull’intero vetrino.

7.3.   Lettura del saggio FISH

7.3.1.

Osservare immediatamente i vetrini con un microscopio predisposto per l’epifluorescenza a 630 o 1 000 × ingrandimenti in olio da immersione. Con un filtro idoneo per l’isotiocianato di fluoresceina (FITC), le cellule eubatteriche del campione (inclusa la maggior parte delle cellule Gram-negative) appaiono colorate di un verde fluorescente. Usando un filtro per la tetrametilrodamina-5-isotiocianato, le cellule di R. solanacaearum marcate con Cy3 appaiono colorate di un rosso fluorescente. Confrontare la morfologia delle cellule con quella dei controlli positivi. Le cellule devono avere fluorescenza brillante ed essere interamente colorate. Il saggio FISH (sezione VI.A.7) deve essere ripetuto se la colorazione è anomala. Esaminare attentamente i pozzetti lungo due diametri ortogonali e lungo il perimetro. Per i campioni che presentano assenza o un basso numero di cellule, osservare almeno 40 campi microscopici.

7.3.2.

Verificare la presenza di cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica di R. solanacearum nei pozzetti di saggio dei vetrini (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’intensità della fluorescenza deve essere equivalente o maggiore rispetto a quella del ceppo di controllo positivo. Le cellule che presentano una colorazione incompleta o una debole fluorescenza devono essere ignorate.

7.3.3.

In caso di sospetta contaminazione occorre ripetere il saggio. Tale sospetto può sorgere, ad esempio, se tutti i vetrini di un lotto presentano cellule positive dovute alla contaminazione del tampone o se vengono rilevate cellule positive (al di fuori dei pozzetti) sul rivestimento dei vetrini.

7.3.4.

Il saggio FISH presenta una serie di inconvenienti legati alla sua specificità. Nei precipitati di coni ombelicali e frammenti di fusto di patata è possibile che si manifesti, sia pure con minor frequenza rispetto al saggio IF, la presenza di una popolazione di fondo di cellule fluorescenti con morfologia atipica e di batteri saprofiti a reazione incrociata simili per dimensioni e morfologia a R. solanacearum.

7.3.5.

Considerare soltanto le cellule fluorescenti aventi dimensioni e morfologia tipiche.

7.3.6.

Interpretazione del risultato del saggio FISH: i) I risultati del saggio FISH sono considerati validi quando in tutti i controlli positivi e in nessuno dei controlli negativi si osservano cellule fluorescenti brillanti di colore verde con dimensioni e morfologia caratteristiche di R. solanacearum usando il filtro FITC e cellule fluorescenti brillanti di colore rosso usando il filtro rodamina. Per ciascun campione in cui vengono trovate cellule fluorescenti brillanti con morfologia caratteristica, stimare il numero medio di cellule tipiche per campo ottico e calcolare il numero di cellule tipiche per ml di sedimento centrifuga risospeso (appendice 4). I campioni che presentano almeno 5 × 103 cellule per ml di sedimento risospeso si considerano potenzialmente contaminati e rendono necessari ulteriori saggi. I campioni che presentano meno di 5 × 103 cellule per ml di sedimento risospeso si considerano negativi. ii) Il saggio FISH è negativo quando usando il filtro rodamina non si osservano cellule fluorescenti brillanti di colore rosso con dimensioni e morfologia caratteristiche di R. solanacearum, a condizione che, con lo stesso filtro, tali cellule brillanti tipiche di colore rosso appaiano nelle preparazioni dei controlli positivi.

8.   Saggi ELISA

Principi

A motivo della sua sensibilità piuttosto bassa, il saggio ELISA può essere usato unicamente come saggio facoltativo in aggiunta ai saggi IF, PCR o FISH. Quando si usa il saggio DAS-ELISA è obbligatorio l’arricchimento e l’impiego di anticorpi monoclonali (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). L’arricchimento dei campioni prima del saggio ELISA può rivelarsi utile per aumentare la sensibilità del saggio, ma può avere insuccesso a causa della competizione da parte di altri organismi presenti nel campione.

NB: Servirsi di una fonte convalidata di anticorpi per R. solanacearum (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Si consiglia di determinare il titolo di ciascun nuovo lotto di anticorpi. Il titolo si definisce come la più alta diluizione alla quale si verifica una reazione ottimale saggiando una sospensione contenente da 105 a 106 cellule per ml del ceppo omologo di R. solanacearum e usando opportuni coniugati di anticorpi secondari, secondo le istruzioni del produttore. Durante il saggio, gli anticorpi dovrebbero essere usati a diluizioni di lavoro prossime o corrispondenti al titolo della formulazione commerciale.

Determinare il titolo degli anticorpi su una sospensione di 105-106 cellule per ml del ceppo omologo di R. solanacearum.

Come controlli negativi, includere un estratto di campione precedentemente risultato negativo per R. solanacearum e una sospensione di un batterio non avente reazione incrociata in soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS).

Come controllo positivo usare aliquote di estratto del campione precedentemente risultato negativo, miscelato con 103-106 cellule per ml di R. solanacearum biovar 2 (p. es. ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, vedi appendice 2 A e 2 B). Per confrontare i risultati su ciascuna piastra usare una sospensione standard di 105-106 cellule per ml in tampone PBS di R. solanacearum. Assicurarsi che i controlli positivi siano nettamente separati dal campione o dai campioni da saggiare sulla piastra da microtitolazione.

I materiali di controllo positivi e negativi standardizzati che possono essere impiegati per questo saggio sono elencati nell’appendice 3, punto A.

Saggiare il materiale di controllo con lo stesso metodo usato per il/i campione/i.

Sono stati convalidati due protocolli ELISA.

a)   ELISA indiretto (secondo Robinson Smith et al., 1995)

b)   DASI-ELISA

Interpretazione dei risultati dei saggi ELISA

Il saggio Elisa è negativo se la densità ottica (D.O.) media dei pozzetti del campione duplicato è inferiore al doppio della D.O. del pozzetto di controllo negativo dell’estratto del campione, a condizione che la D.O. per tutti i controlli positivi sia superiore a 1,0 (dopo incubazione di 90 minuti con il substrato) e superiore al doppio della D.O. ottenuta per gli estratti del campione negativo.

Il saggio ELISA è positivo se la D.O. media dei pozzetti del campione duplicato è superiore al doppio della D.O. del pozzetto dell’estratto del campione negativo, a condizione che la D.O. per tutti i pozzetti di controllo negativo sia inferiore al doppio della D.O. dei pozzetti di controllo positivi.

Una lettura negativa del saggio ELISA nei pozzetti di controllo positivi indica che il saggio non è stato effettuato correttamente oppure che è stato inibito. Una lettura positiva del saggio ELISA nei pozzetti di controllo negativi indica che si è verificata una contaminazione incrociata o un legame di anticorpi non specifico.

9.   Saggio biologico

NB: Un saggio preliminare svolto con questo metodo deve permettere il rilevamento riproducibile di 103-104 unità formanti colonia di R. solanacearum per ml aggiunte agli estratti dei campioni precedentemente risultati negativi (per la preparazione cfr. l’appendice 3).

La massima sensibilità di rilevamento si può avere usando estratto del campione preparato al momento e disponendo di condizioni di crescita ottimali. Tuttavia, il metodo può essere efficacemente applicato ad estratti conservati in glicerolo ad una temperatura compresa tra 68 e 86 °C.

Il protocollo descritto sotto si basa su Janse (1988):

9.1.

Usare 10 piante di una cultivar di pomodoro adeguata (p. es. Moneymaker o cultivar di equivalente sensibilità constatata in saggi di laboratorio), ciascuna allo stadio di tre foglie vere. Per i dettagli relativi alla coltura cfr. l’appendice 8. Alternativamente usare le melanzane (p.es Black Beauty o cultivar di sensibilità equivalente), ma esclusivamente piante allo stadio di 2-3 foglie fino al pieno sviluppo della terza foglia vera. Si è osservato che nella melanzana i sintomi sono meno gravi e compaiono più lentamente. Ove possibile si raccomanda quindi di usare le piantine di pomodoro.

9.2.

Distribuire 100 µl di estratto del campione tra le piantine da saggiare. 9.2.1.   Inoculazione mediante siringa Inoculare i fusti della piantina immediatamente sopra i cotiledoni usando una siringa con ago ipodermico (non inferiore a 23G). Distribuire il campione tra le piantine. 9.2.2.   Inoculazione per incisione Tenendo la pianta con due dita, versare mediante una pipetta una goccia (5-10 µl circa) del precipitato sospeso sul fusto tra i cotiledoni e la prima foglia. Usando un bisturi sterile, praticare un’incisione diagonale di circa 1,0 cm e di profondità pari a circa 2/3 dello spessore del fusto. Il taglio deve iniziare dalla goccia di precipitato. Sigillare il taglio con vaselina sterile mediante siringa.

9.3.

Inoculare, con la stessa tecnica, 5 piantine con una sospensione acquosa di 105 – 106 cellule per ml preparata da una coltura di 48 ore di un ceppo virulento di R. solanacearum biovar 2 come controllo positivo e con un tampone per sedimento come controllo negativo. Separare le piante del controllo positivo e negativo dalle altre per evitare contaminazione.

9.4.

Far crescere le piantine in locali di quarantena fino a un massimo di 4 settimane a una temperatura di 25-30 °C ad alta umidità relativa con annaffiature adeguate per evitare un eccesso di acqua o un avvizzimento causato da mancanza di acqua. Per evitare la contaminazione, incubare le piante per il controllo positivo e quelle per il controllo negativo su ripiani chiaramente separati all’interno di una serra o di una camera di crescita o, qualora si disponga di uno spazio limitato, garantire una rigida separazione fra i trattamenti. Se le piante usate per diversi campioni devono essere messe in incubazione insieme, separarle con schermi adeguati. Nel concimare, innaffiare, esaminare ed eseguire ogni atto, fare molta attenzione per evitare una contaminazione incrociata. È di fondamentale importanza tenere le serre e le camere di crescita libere da fitofagi che potrebbero trasmettere il batterio da un campione all’altro. Vedere se si sviluppano sintomi di perdita di turgore, epinastia, clorosi e/o arresto della crescita.

9.5.	Isolare dalle piante infette (cfr. sezione II.3) presunte colonie di R. solanacearum e identificarle in coltura pura (cfr. sezione VI.B).

9.6.	Se dopo 3 settimane non si osservano sintomi, procedere a un saggio di isolamento/IF/PCR su un campione multiplo di sezioni di 1 cm di fusto prelevate da ciascuna pianta al di sopra del punto di inoculazione. Se la prova è positiva effettuare l’isolamento diretto in piastra (sezione 4.1).

9.7.	Identificare presunte colture purificate di R. solanacearum (cfr. sezione VI.B).

I risultati del saggio biologico possono considerarsi validi se le piante del controllo positivo presentano sintomi tipici, se il batterio può essere reisolato a partire da queste piante e se nessun sintomo viene riscontrato sui controlli negativi. Il saggio biologico è negativo se le piante inoculate non risultano infettate da R. solanacearum e a condizione che quest’ultimo venga individuato nei controlli positivi. Il saggio biologico è positivo se le piante inoculate risultano infettate da R. solanacearum.

B.   Saggi di identificazione

Identificare le colture pure di presunti isolati di R. solanacearum utilizzando almeno due dei saggi seguenti, basati su principi biologici diversi.

Se opportuno, per ciascun saggio effettuato includere ceppi di riferimento conosciuti (appendice 3).

1.   Saggi di identificazione nutrizionali ed enzimatici

Determinare le seguenti proprietà fenotipiche, sistematicamente presenti o assenti in R. solanacearum secondo i metodi di Lelliott e Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001)

2.   Saggio IF

2.1.	Preparare una sospensione di circa 106 cellule per ml in tampone IF (appendice 4).

2.2.	Preparare una serie di diluizioni 1:2 di un antisiero adeguato (cfr. il sito web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.	Applicare il procedimento IF (sezione VI.A.5).

2.4.	Il risultato del saggio è positivo se il titolo IF della coltura in esame è equivalente a quello del controllo positivo.

3.   Saggio Elisa

NB: Se si effettuano soltanto 2 saggi di identificazione, non utilizzare altri saggi sierologici in aggiunta a questo metodo.

3.1.	Preparare una sospensione di circa 108 cellule per ml in 1X tampone PBS (appendice 4).

3.2.	Effettuare una procedura ELISA adeguata con un anticorpo monoclonale specifico per R. solanacearum.

3.3.	Il risultato del saggio è positivo se la lettura ELISA ottenuta dalla coltura è equivalente ad almeno la metà di quella del controllo positivo.

4.   Saggio PCR

4.1.	Preparare una sospensione di circa 106 cellule per ml in acqua distillata al grado molecolare sterile.

4.2.	Riscaldare 100 µl della sospensione di cellule in provette chiuse su una piastra riscaldante o a bagnomaria a 100 °C per 4 minuti. I campioni possono quindi essere conservati a una temperatura compresa tra 16 e 24 °C fino al momento d’uso.

4.3.	Applicare procedimenti PCR adeguati per amplificare gli ampliconi specifici per R. solanacearum [p. es. Seal et al. (1993); Pastrik e Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)].

4.4.	L’identificazione di R. solanacearum è positiva se gli ampliconi della PCR presentano le stesse dimensioni e gli stessi polimorfismi di restrizione dei frammenti che si osservano nel ceppo di controllo positivo.

5.   Saggio FISH

5.1.	Preparare una sospensione di circa 106 cellule per ml in acqua ultrapura.

5.2.	Applicare il procedimento FISH (sezione VI.A.7) con almeno 2 oligosonde specifiche per R. solanacearum (appendice 7).

5.3.	Il risultato del saggio FISH è positivo se si ottengono le stesse reazioni sia nella coltura che nel controllo positivo.

6.   Profilo degli acidi grassi (FAP)

6.1.	Far crescere la coltura in esame su triptone-soia-agar (Oxoid) per 48 ore a 28 °C.

6.2.	Applicare un procedimento FAP di tipo adeguato (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.	Il saggio FAP è positivo se il profilo della coltura in esame è identico a quello del controllo positivo. La presenza degli acidi grassi caratteristici 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2OH e l’assenza di 16:0 3OH sono altamente indicative della presenza della specie Ralstonia.

7.   Metodi di caratterizzazione del ceppo

La caratterizzazione del ceppo tramite uno dei seguenti metodi è consigliabile per ogni nuovo caso di isolamento di R. solanacearum.

Se appropriato, per ciascun saggio effettuato includere ceppi di riferimento conosciuti (appendice 3).

7.1.   Determinazione della biovar

Ralstonia solanacearum è suddiviso in biovar in base alla capacità di utilizzare e/o ossidare tre disaccaridi e tre alcoli esosi (Hayward, 1964 e Hayward et al., 1990). Il terreno nutritivo per il saggio della biovar è descritto nell’appendice 2. Il saggio può essere effettuato efficacemente inoculando per infissione i terreni con colture pure di isolati di R. solanacearum e mantenendo in incubazione a 28 °C. Se i terreni sono ripartiti in 96 pozzetti sterili di piastre da coltura cellulare (200 µl per pozzetto), un cambiamento di colore dal verde oliva al giallo osservato entro 72 ore indica che il saggio è positivo.

Ulteriori saggi differenziano la biovar 2 in subfenotipi

7.2.   Impronte genomiche

La differenziazione molecolare dei ceppi nel complesso di R. solanacearum può essere effettuata mediante diverse tecniche, tra cui:

7.2.1.

Analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2.

PCR su sequenze ripetute usando i primer REP, BOX e ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3.

Analisi del polimorfismo della lunghezza del frammento di amplificazione (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3.   Metodi PCR

Primer specifici PCR (Pastrik et al., 2002; cfr. appendice 6) possono essere usati per differenziare ceppi appartenenti alla divisione 1 (biovar 3, 4 e 5) e alla divisione 2 (biovar 1, 2A e 2T) di R. solanacearum, quali originariamente definite dall’analisi RFLP (Cook et al., 1989) e dal sequenziamento del 16S rDNA (Taghavi et al., 1996).

C.   Saggio di conferma

La prova di patogenicità deve essere effettuata come conferma finale di una diagnosi di R. solanacearum e per valutare la virulenza delle colture identificate come R. solanacearum.

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Appendice 1

Laboratori coinvolti nell’ottimizzazione e nella convalida dei protocolli

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Appendice 2

Terreni nutritivi per l’isolamento e la coltura di R. solanacearum

a)   Terreni nutritivi generali

Agar nutritivo (NA)

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Lievito peptone glucosio agar (YPGA)

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Saccarosio-peptone-agar (SPA)

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Substrato al tetrazolio di Kelman

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Raffreddare a 50 °C e aggiungere una soluzione di cloruro di trifeniltetrazolio (Sigma), sterilizzata per filtrazione, fino a concentrazione finale di 50 mg/litro.

b)   Terreni di coltura selettivi convalidati

Substrato SMSA (Englebrecht, 1994 modificato da Elphinstone et al., 1996)

Sciogliere gli ingredienti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Raffreddare a 50 °C e aggiungere soluzioni madre acquose dei seguenti ingredienti, sterilizzate per filtrazione, fino a ottenere le concentrazioni finali specificate:

NB:

Conservare i terreni di coltura e le soluzioni madri di antibiotici a 4 °C al buio e usarli entro un mese.

La piastre devono essere esenti da condensa superficiale prima dell’uso.

Evitare di far asciugare eccessivamente le piastre.

Il controllo della qualità dovrebbe essere fatto per ogni nuovo lotto di substrato inseminando sulle piastre una sospensione di una coltura di riferimento di R. solanacearum (cfr. appendice 3) e osservando la formazione delle tipiche colonie dopo un’incubazione di 2-5 giorni a 28 °C.

c)   Terreni di arricchimento convalidati

Brodo SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Preparare come per il terreno selettivo SMSA all’agar, eliminando il Bacto-agar e il cloruro di trifeniltetrazolo.

Brodo di Wilbrink modificato (Caruso et al., 2002)

Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti e raffreddare a 50 °C.

Aggiungere le soluzioni madre di antibiotici come per il brodo SMSA.

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Appendice 3

A.   Materiale di controllo standardizzato disponibile in commercio

a)   Isolati batterici

Si consiglia di usare i seguenti isolati batterici come materiale standard di riferimento per i controlli positivi (tabella 1) o durante l’ottimizzazione dei saggi per evitare reazioni incrociate (tabella 2). Tutti i ceppi sono disponibili in commercio presso:

NB: L’autenticità dei ceppi summenzionati può essere garantita soltanto se gli stessi sono ottenuti da una coltura autentica di collezione.

b)   1Materiale di controllo standardizzato disponibile in commercio

Il materiale di controllo standard sottoelencato è disponibile presso la collezione di colture NCPPB:

Sedimento di centrifuga liofilizzato estratto da 200 tuberi di patata sani come controllo negativo per tutti i saggi.

Sedimento di centrifuga liofilizzato estratto da 200 tuberi di patata sani contenenti da 103 a 104 e da 104 a 106 cellule di R. solanacearum biovar 2 (ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) come controlli positivi per i saggi sierologici e per i saggi PCR. Dato che il processo di liofilizzazione può condizionare la vitalità delle cellule, i sedimenti liofilizzati non si prestano ad essere usati come controlli standard nei saggi di isolamento o nei saggi biologici.

Sospensioni fissate in formalina di R. solanacearum biovar 2 (ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) a 106 cellule per ml come controlli positivi per i saggi sierologici.

B.   Preparazione di controlli positivi e negativi

Preparare una coltura di 48 ore di un ceppo virulento di R. solanacearum razza 3 biovar 2 (p. es. ceppo NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) su substrato base SMSA e sospendere in tampone fosfato 10 mM per ottenere una densità cellulare di circa 2 × 108 cfu/ml. Questa concentrazione si ottiene comunemente con una sospensione lievemente torbida equivalente a una densità ottica di 0,15 a 600 nm.

Asportare il cono ombelicale di 200 tuberi di una varietà a buccia bianca in cui sia stata accertata assenza di R. solanacearum.

Trattare i coni ombelicali come di consueto e risospendere il sedimento in 10 ml.

Preparare 10 microprovette sterili da 1,5 ml con 900 µl del sedimento risospeso.

Trasferire 100 µl della sospensione di R. solanacearum nella prima microprovetta. Mescolare nel vortex.

Stabilire livelli decimali di contaminazione mediante ulteriori diluizioni nelle altre cinque microprovette.

Le sei microprovette contaminate verranno usate come controlli positivi. Le quattro microprovette non contaminate verranno utilizzate come controlli negativi. Etichettare le microprovette di conseguenza.

Preparare aliquote di 100 µl in microprovette sterili da 1,5 ml, ottenendo così 9 copie di ciascun campione di controllo. Conservare a una temperatura compresa fra 16 e 24 °C fino all’uso.

La presenza e la quantificazione di R. solanacearum nei campioni di controllo deve essere in primo luogo confermata dal saggio IF.

Per il saggio PCR procedere all’estrazione del DNA dai campioni di controllo positivi e negativi per ciascuna serie di campioni da saggiare.

Per i saggi IF e FISH effettuare prove sui campioni di controllo positivi e negativi per ciascuna serie di campioni da saggiare.

Per i saggi IF, FISH e PCR la presenza di R. solanacearum deve essere rilevata in almeno 106 e 104 cellule/ml dei controlli positivi e non deve essere rilevata in nessuno dei controlli negativi.

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Appendice 4

Tamponi per le procedure dei saggi

INDICAZIONE GENERALE: i tamponi sterilizzati non aperti possono essere conservati fino a un anno.

1.   Tamponi per procedura di estrazione

1.1.   Tampone di estrazione (tampone fosfato 50 mM, pH 7,0)

Questo tampone è utilizzato per l’estrazione del batterio dai tessuti vegetali mediante omogeneizzazione o agitazione.

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 min.

Possono risultare utili i seguenti componenti supplementari:

1.2.   Tampone per sedimento (tampone fosfato 10 mM, pH 7,2)

Questo tampone è impiegato per risospendere e diluire l’estratto di coni ombelicali di patate concentrato nel sedimento di centrifugazione.

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

2.   Tamponi per il saggio IF

2.1.   Tampone IF: soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS) 10 mM, pH 7,2

Questo tampone viene impiegato per la diluizione degli anticorpi.

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

2.2.   Tampone IF-Tween

Questo tampone è usato per lavare i vetrini.

Aggiungere lo 0,1 % di Tween 20 al tampone IF.

2.3.   Glicerolo tamponato al fosfato, pH 7,6

Questo tampone viene impiegato come liquido di montaggio sui pozzetti dei vetrini IF per incrementare la fluorescenza.

Soluzioni di montaggio antiscolorimento sono disponibili in commercio, p. es. Vectashield® (Laboratori Vector) o Citifluor® (Leica).

3.   Tamponi per il saggio ELISA indiretto

3.1.   Tampone di rivestimento a doppia forza (pH 9,6).

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

Si può aggiungere solfito sodico (0,2 %) come antiossidante se necessario per impedire la formazione di composti aromatici ossidati.

3.2.   Soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS) 10X, pH 7,4

3.3.   Tampone PBS-Tween

3.4.   Tampone bloccante (anticorpi) (da preparare al momento dell’uso)

3.5.   Soluzione substrato fosfatasi alcalina, pH 9,8

Mescolare e regolare a pH 9,8 con HCI concentrato.

Portare a 1 litro con acqua distillata.

Aggiungere 0,2 g di MgCl2.

Sciogliere due compresse da 5 mg di substrato per la fosfatasi (Sigma) per ogni 15 ml di soluzione.

4.   Tamponi per il saggio DASI-ELISA

4.1.   Tampone di rivestimento (pH 9,6)

Sciogliere gli ingredienti e controllare il pH.

4.2.   Soluzione fisiologica tamponata al fosfato (PBS) pH 7,2-7,4

4.3.   Tampone PBS-Tween

4.4.   Tampone per il substrato (pH 9,8).

Mescolare e regolare a pH 9,8 con HCI concentrato.

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Appendice 5

Determinazione del livello di contaminazione nei saggi IF e FISH

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Appendice 6

Protocolli e reagenti PCR convalidati

NB: I saggi preliminari dovrebbero consentire il rilevamento riproducibile di 103-104 cellule di R. solanacearum per ml di estratto del campione.

I saggi preliminari, inoltre, non dovrebbero presentare falsi positivi in una serie di ceppi batterici selezionati (cfr. appendice 3).

1.   Protocollo PCR di Seal et al. (1993)

1.1.   Primer oligonucleotidici

Dimensioni attese degli ampliconi del DNA stampo di R. solanacearum = 288 bp

1.2.   Miscela di reazione PCR

1.3.   Condizioni di reazione della PCR

Eseguire il seguente programma:

NB: Questo programma è ottimizzato per l'impiego con un termociclatore Perkin Elmer 9600. Qualora vengano usati altri modelli potrà essere necessario modificare la durata delle fasi ii), iii) e iv).

1.4.   Analisi di restrizione enzimatica degli ampliconi

I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum producono uno specifico polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione dopo essere stati incubati a 37 °C con enzima Ava II.

2.   Protocollo PCR di Pastrik e Maiss (2000)

2.1.   Primer oligonucleotidici

Dimensioni attese degli ampliconi del DNA stampo di R. solanacearum = 553 bp

2.2.   Miscela di reazione PCR

2.3.   Condizioni di reazione della PCR

Eseguire il seguente programma:

NB: Questo programma è ottimizzato per l'impiego con un termociclatore MJ Research PTC 200. Qualora vengano usati altri modelli potrà essere necessario modificare la durata delle fasi ii), iii) e iv).

2.4.   Analisi di restrizione enzimatica degli ampliconi

I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum producono uno specifico polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione con l'enzima Taq I dopo essere stati incubati a 65 °C per 30 minuti. I frammenti di restrizione ottenuti dal frammento specifico di R. solanacearum hanno dimensioni di 457 bp e 96 bp.

3.   Protocollo PCR multiplex con controllo interno della PCR (Pastrik et al., 2002)

3.1.   Primer oligonucleotidici

Dimensioni attese degli ampliconi del DNA stampo di R. solanacearum = 718 bp (set di primer RS)

Dimensioni attese degli ampliconi del controllo interno PCR 18S rRNA = 310 bp (set di primer NS)

3.2.   Miscela di reazione PCR

3.3.   Condizioni di reazione della PCR

Eseguire il seguente programma:

NB: Questo programma è ottimizzato per l'impiego con un termociclatore MJ Research PTC 200. Qualora vengano utilizzati altri modelli potrà essere necessario modificare la durata delle fasi ii), iii) e iv).

3.4.   Analisi di restrizione enzimatica degli ampliconi

I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum producono uno specifico polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione con l'enzima Bsm I o un isoschizomero (p. es. Mva 1269 I) dopo essere stati incubati a 65 °C per 30 minuti.

4.   Protocollo PCR specifico per le biovar di R. solanacearum (Pastrik et al., 2001)

4.1.   Primer oligonucleotidici

Dimensioni attese degli ampliconi del DNA stampo di R. solanacearum:

con Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

con Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp

4.2.   Miscela di reazione PCR

4.3.   Condizioni di reazione della PCR

Eseguire il seguente programma sia per le reazioni specifiche per le biovar 1/2 che per quelle specifiche per le biovar 3/4/5:

NB: Questo programma è ottimizzato per l'impiego con un termociclatore MJ Research PTC 200. Qualora vengano usati altri modelli potrà essere necessario modificare la durata delle fasi ii), iii) e iv).

4.4.   Analisi di restrizione enzimatica degli ampliconi

I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum usando i primer Rs-1-F e Rs-1-R producono uno specifico polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione con l'enzima Bsm I o un isoschizomero (p. es. Mva 1269 I) dopo essere stati incubati a 65 °C per 30 minuti. I prodotti della PCR amplificati a partire dal DNA di R. solanacearum usando i primer Rs-1-F e Rs-3-R non hanno punti di restrizione.

5.   Preparazione del tampone di caricamento

5.1.   Blu di bromofenolo (soluzione madre al 10 %)

5.2.   Tampone di caricamento

6.   10X tampone tris-acetato-EDTA (TAE), pH 8,0

Diluire a 1X prima dell'impiego.

Disponibile anche in commercio (p es. Invitrogen o equivalente).

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Appendice 7

Reagenti convalidati per il saggio FISH

1.   Oligosonde

Sonda specifica per R. solanacearum OLI-1-CY3: 5′-ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Sonda eubatterica non specifica EUB-338-FITC: 5′-gct gcc tcc cgt agg agt-3′

2.   Soluzione fissativa

[ATTENZIONE! IL FISSATIVO CONTIENE PARAFORMALDEIDE, CHE È TOSSICA. INDOSSARE GUANTI E NON INALARE. SI CONSIGLIA DI LAVORARE SOTTO CAPPA CHIMICA].

3.   3X Hybmix

Diluire a 1X come prescritto.

4.   Soluzione di ibridazione

Preparare quantità di soluzione d'ibridazione secondo i calcoli di cui alla tabella 1. Per ciascun vetrino (contenente 2 campioni diversi in duplicato) sono necessari 90 μl di soluzione di ibridazione. IMPORTANTE: LA FORMAMMIDE È ESTREMAMENTE TOSSICA, INDOSSARE GUANTI E PRENDERE OPPORTUNE PRECAUZIONI!

5.   Tampone fosfato 0,1 M, pH 7,0

Sciogliere gli ingredienti, controllare il pH e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.

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Appendice 8

Condizioni di coltura per le melanzane e i pomodori

Seminare i semi di pomodoro (Lycopersicon esculentum) o di melanzana (Solanum melongena) in terra da semina pastorizzata. Trapiantare le piantine con cotiledoni completamente sviluppati (10-14 giorni) in terra da vaso pastorizzata.

Le melanzane o i pomodori dovrebbero essere coltivati in una serra nelle seguenti condizioni ambientali prima dell’inoculazione:

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

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ALLEGATO III

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ALLEGATO IV

Gli accertamenti di cui all’articolo 5, paragrafo 1, lettera a), punto i), comprendono, secondo il caso, i seguenti elementi:

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ALLEGATO V

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ALLEGATO VI

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ALLEGATO VII

I metodi ufficialmente approvati di eliminazione dei rifiuti di cui all’allegato VI, paragrafo 1, si uniformano alle disposizioni seguenti in modo da escludere qualsiasi rischio identificabile di disseminazione dell’organismo nocivo:

Le alternative descritte nel presente allegato valgono parimenti per i rifiuti associati alla manipolazione, allo smaltimento ed alla lavorazione di lotti di prodotto contaminati.

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( 1 ) GU C 124 del 21.4.1997, pag. 12 e GU C 108 del 7.4.1998, pag. 85.

( 2 ) GU C 14 del 19.1.1998, pag. 34.

( 3 ) GU C 206 del 7.7.1997, pag. 57.

( 4 ) GU L 26 del 31.1.1977, pag. 20. Direttiva modificate da ultimo dalla direttiva 98/2/CE della Commissione (GU L 15 del 21.1.1998, pag. 34).

( 5 ) GU L 184 del 3.8.1995, pag. 34. Direttiva modificata da ultimo dalla direttiva 97/46/CE della Commissione (GU L 204 del 31.7.1997, pag. 43).