| 19.3.2014 | IT | Gazzetta ufficiale dell'Unione europea | L 81/1 | 19.3.2014 | SL | Uradni list Evropske unije | L 81/1 |
| REGOLAMENTO (UE) N. 260/2014 DELLA COMMISSIONE | UREDBA KOMISIJE (EU) št. 260/2014 |
| del 24 gennaio 2014 | z dne 24. januarja 2014 |
| recante modifica del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), al fine di adeguarlo al progresso tecnico | o spremembi Uredbe (ES) št. 440/2008 o določitvi testnih metod v skladu z Uredbo (ES) št. 1907/2006 Evropskega parlamenta in Sveta o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) zaradi njene prilagoditve tehničnemu napredku |
| (Testo rilevante ai fini del SEE) | (Besedilo velja za EGP) |
| LA COMMISSIONE EUROPEA, | EVROPSKA KOMISIJA JE – |
| visto il trattato sul funzionamento dell’Unione europea, | ob upoštevanju Pogodbe o delovanju Evropske unije, |
| visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un’Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE (1), in particolare l’articolo 13, paragrafo 3, | ob upoštevanju Uredbe (ES) št. 1907/2006 Evropskega Parlamenta in Sveta z dne 18. decembra 2006 o registraciji, evalvaciji, avtorizaciji in omejevanju kemikalij (REACH) ter o ustanovitvi Evropske agencije za kemikalije in o spremembi Direktive 1999/45/ES ter o razveljavitvi Uredbe Sveta (EGS) št. 793/93 in Uredbe Komisije (ES) št. 1488/94 ter Direktive Sveta 76/769/EGS in direktiv Komisije 91/155/EGS, 93/67/EGS, 93/105/ES in 2000/21/ES (1) ter zlasti člena 13(3) Uredbe, |
| considerando quanto segue: | ob upoštevanju naslednjega: |
| (1) | Il regolamento (CE) n. 440/2008 (2) della Commissione istituisce i metodi di prova per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l’ecotossicità delle sostanze applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006. | (1) | Uredba Komisije (ES) št. 440/2008 (2) določa preskusne metode za ugotavljanje fizikalno-kemijskih lastnosti, strupenosti in strupenosti za okolje snovi, ki jih je treba uporabiti za namene Uredbe (ES) št. 1907/2006. |
| (2) | È necessario aggiornare il regolamento (CE) n. 440/2008 per includervi in via prioritaria nuovi e aggiornati metodi di prova alternativi adottati di recente dall’OCSE, volti a ridurre il numero di animali usati a scopi di sperimentazione, conformemente alla direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010, sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (3) e alla direttiva 86/609/CEE del Consiglio, del 24 novembre 1986, concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative degli Stati membri relative alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici (4). | (2) | Uredbo (ES) št. 440/2008 je treba posodobiti tako, da se vanjo prednostno vključijo nove in posodobljene alternativne preskusne metode, ki jih je pred kratkim sprejel OECD, da se zmanjša število preskusnih živali v skladu z Direktivo 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (3), in Direktivo Sveta 86/609/EGS z dne 24. novembra 1986 o približevanju zakonov in drugih predpisov držav članic o varstvu živali, ki se uporabljajo za poskusne in druge znanstvene namene (4). |
| (3) | Questo adeguamento contiene due metodi per la determinazione delle proprietà fisico-chimiche, ivi compreso un adeguamento del metodo dell’idrosolubilità e un nuovo metodo di prova sui coefficienti di ripartizione per le sostanze persistenti, bioaccumulabili e tossiche (PBT), quattro metodi nuovi ed un metodo aggiornato per la determinazione dell’ecotossicità e del destino e del comportamento ambientale; nove metodi per la determinazione della tossicità ed altri effetti sulla salute, tra cui quattro metodi di prova sulla tossicità per inalazione che comprendono l’aggiornamento di tre metodi esistenti e un metodo nuovo per ridurre il numero di animali utilizzati e migliorare la valutazione degli effetti, un aggiornamento del metodo di prova per la tossicità orale a dose ripetuta (28 giorni) al fine di includere dei parametri per la valutazione dell’attività endocrina, un aggiornamento del metodo di prova di tossicocinetica utile per l’impostazione e la comprensione della logica degli studi tossicologici e un aggiornamento dei metodi sulla tossicità cronica e la cancerogenesi e dei metodi combinati tossicità cronica/cancerogenesi. | (3) | Prilagoditev vsebuje dve metodi za določanje fizikalno-kemijskih lastnosti, vključno s posodobitvijo preskusne metode za določanje topnosti v vodi in novo preskusno metodo za določanje porazdelitvenega koeficienta, ki se uporabljata pri ocenjevanju obstojnih snovi, snovi, ki se kopičijo v organizmih, in strupenih snovi (PBT); štiri nove in eno posodobljeno metodo za določanje strupenosti za okolje ter končnega stanja in obnašanja v okolju; devet metod za določanje strupenosti in drugih učinkov na zdravje, vključno s štirimi preskusnimi metodami za določanje strupenosti pri vdihavanju, ki obsegajo tri posodobljene metode in eno novo metodo za zmanjšanje števila preskusnih živali in izboljšanje ocen učinkov, posodobitev metode 28-dnevnega preskusa oralne strupenosti za vključitev parametrov za oceno endokrine dejavnosti, posodobitev metode za preskus toksikokinetike, ki je pomembna za zasnovo in razumevanje toksikoloških raziskav, in posodobitve metod za preskus kronične strupenosti, rakotvornosti ter kombinacije kronične strupenosti in rakotvornosti. |
| (4) | È pertanto opportuno modificare di conseguenza il regolamento (CE) n. 440/2008. | (4) | Uredbo (ES) št. 440/2008 bi bilo zato treba ustrezno spremeniti. |
| (5) | Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato istituito dall’articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006, | (5) | Ukrepi iz te uredbe so v skladu z mnenjem odbora, ustanovljenega v skladu s členom 133 Uredbe (ES) št. 1907/2006 – |
| HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO: | SPREJELA NASLEDNJO UREDBO: |
| Articolo 1 | Člen 1 |
| L’allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è modificato conformemente all’allegato del presente regolamento. | Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni v skladu s Prilogo k tej uredbi. |
| Articolo 2 | Člen 2 |
| Il presente regolamento entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea. | Ta uredba začne veljati tretji dan po objavi v Uradnem listu Evropske unije. |
| Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. | Ta uredba je v celoti zavezujoča in se neposredno uporablja v vseh državah članicah. |
| Fatto a Bruxelles, il 24 gennaio 2014 | V Bruslju, 24. januarja 2014 |
| Per la Commissione | Za Komisijo |
| Il presidente | Predsednik |
| José Manuel BARROSO | José Manuel BARROSO |
| (1) GU L 396 del 30.12.2006, pag. 1. | (1) UL L 396, 30.12.2006, str. 1. |
| (2) GU L 142 del 31.5.2008, pag. 1. | (2) UL L 142, 31.5.2008, str. 1. |
| (3) GU L 276 del 20.10.2010, pag. 33. | (3) UL L 276, 20.10.2010, str. 33. |
| (4) GU L 358 del 18.12.1986, pag. 1. | (4) UL L 358, 18.12.1986, str. 1. |
| ALLEGATO | PRILOGA |
| L’allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è così modificato: | Priloga k Uredbi (ES) št. 440/2008 se spremeni: |
| 1) | il capitolo A.6 è sostituito dal seguente: | «A.6. IDROSOLUBILITÀ | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 105 (1995) Questo metodo di prova è una versione riveduta della linea guida originale n. 105 adottata nel 1981. Non vi sono differenze significative tra l’attuale versione e quella del 1981, in quanto è stato modificato soprattutto il formato. La revisione si basa sul metodo di prova dell’UE “Idrosolubilità” (1). | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 2. | L’idrosolubilità di una sostanza può essere considerevolmente alterata dalla presenza di impurità. Il presente metodo di prova riguarda la determinazione dell’idrosolubilità di sostanze fondamentalmente pure che sono stabili in acqua e non volatili. Prima di determinare l’idrosolubilità è utile disporre di alcune informazioni preliminari sulla sostanza in esame, come la formula strutturale, la tensione di vapore, la costante di dissociazione e l’idrolisi in funzione del pH. | 3. | In questo capitolo sono descritti due metodi: il metodo dell’eluizione su colonna e il metodo del matraccio che riguardano rispettivamente solubilità inferiori e superiori a 10–2 g/l. Viene anche descritta una semplice prova preliminare che consente di determinare approssimativamente la quantità adeguata di campione da utilizzare nella prova finale e il tempo necessario per raggiungere la saturazione. | DEFINIZIONI E UNITÀ | 4. | L’idrosolubilità di una sostanza è la concentrazione massica di saturazione della sostanza in acqua ad una determinata temperatura. | 5. | L’idrosolubilità è espressa in massa di soluto per volume di soluzione. L’unità SI è kg/m3 (ma si può anche far uso di g/l). | SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO | 6. | Per questo metodo non è necessario utilizzare sostanze chimiche di riferimento quando si esamina una sostanza. | DESCRIZIONE DEI METODI | Condizioni sperimentali | 7. | La prova deve essere preferibilmente effettuata a 20 ± 0,5 °C, mantenendo costante la temperatura scelta in tutte le parti dell’apparecchiatura. | Prova preliminare | 8. | Nell’ambito di una procedura in più fasi successive (stepwise), in un cilindro graduato da 10 ml con tappo di vetro vengono versati volumi crescenti di acqua a temperatura ambiente su circa 0,1 g di campione (le sostanze in esame solide devono essere polverizzate). Dopo ciascuna aggiunta di acqua, la miscela viene agitata per 10 minuti e controllata visivamente per verificare la presenza di particelle non disciolte del campione. Se, dopo l’aggiunta di 10 ml d’acqua, il campione, o parte di esso, resta indisciolto, l’esperimento deve essere proseguito in un cilindro graduato da 100 ml. La solubilità approssimativa è indicata nella tabella 1 in corrispondenza del volume d’acqua necessario per ottenere la dissoluzione completa del campione. Quando la solubilità è bassa, può occorrere più tempo per sciogliere la sostanza in esame e si devono prevedere almeno 24 ore. Se dopo 24 ore la sostanza in esame non è ancora disciolta, occorre aspettare più a lungo (fino a 96 ore) o tentare un’ulteriore diluizione per stabilire se occorre utilizzare il metodo di eluizione su colonna o il metodo del matraccio. | Tabella 1 | ml di acqua per 0,1 g di campione | 0,1 | 0,5 | 1 | 2 | 10 | 100 | > 100 | solubilità approssimativa in g/l | > 1 000 | Da 1 000 a 200 | Da 200 a 100 | Da 100 a 50 | Da 50 a 10 | Da 10 a 1 | < 1 | Metodo dell’eluizione su colonna | Principio | 9. | Questo metodo si basa sull’eluizione della sostanza in esame con acqua in una microcolonna caricata con un materiale di supporto inerte, precedentemente rivestito con un eccesso della sostanza stessa (2). L’idrosolubilità è data dalla concentrazione massica dell’eluato quando questo ha raggiunto un plateau in funzione del tempo. | Apparecchiatura | 10. | L’apparecchiatura è costituita da una microcolonna (figura 1) mantenuta a temperatura costante, collegata ad una pompa di ricircolo (figura 2) o a un recipiente di livellamento (figura 3). La microcolonna contiene un supporto inerte tenuto fermo da un piccolo tampone di lana di vetro che serve anche per filtrare le particelle. Il materiale di supporto può essere costituito da perline di vetro, farina fossile o altri materiali inerti. | 11. | La microcolonna di cui alla figura 1 è adatta alla configurazione con la pompa di ricircolo. È caratterizzata da uno spazio di testa pari ad almeno cinque volte il volume di letto (eliminato all’inizio dell’esperimento) e il volume di cinque campioni (eliminati dall’analisi nel corso dell’esperimento). In alternativa, le dimensioni possono essere ridotte se è possibile aggiungere acqua nel corso dell’esperimento per sostituire i primi cinque volumi di letto, scartati perché contenenti impurità. La colonna è collegata con giunti in materiale inerte alla pompa di ricircolo, che consente una velocità di flusso pari a circa 25 ml/h. La pompa di ricircolo può essere, ad esempio, una pompa peristaltica o a membrana. Occorre fare in modo che non ci sia contaminazione e/o adsorbimento con il materiale del tubo. | 12. | La rappresentazione schematica di una configurazione con recipiente di livellamento è riportata nella figura 3. In questa configurazione la microcolonna è munita di un rubinetto ad una via. Il collegamento con il recipiente di livellamento consiste in un giunto di vetro smerigliato e un tubo in materiale inerte. La velocità del flusso proveniente dal recipiente di livellamento deve essere pari a circa 25 ml/h. | Figura 1 | Dimensioni in mm | A. | Connessione per giunto di vetro smerigliato | B. | Spazio di testa | C. | Diametro interno 5 | D. | Diametro esterno 19 | E. | Tampone di lana di vetro | F. | Rubinetto | Figura 2 | A. | Equilibrio atmosferico | B. | Flussimetro | C. | Microcolonna | D. | Pompa di circolazione termocontrollata | E. | Pompa di ricircolo | F. | Valvola a due vie per il campionamento | Figura 3 | A. | Recipiente di livellamento (per esempio bottiglia da 2,5 litri) | B. | Colonna | C. | Collettore di frazione | D. | Termostato | E. | Tubo in teflon | F. | Giunto in vetro smerigliato | G. | Tubi per l’acqua (tra il termostato e la colonna, diametro interno 8 mm circa) | 13. | Circa 600 mg del materiale di supporto sono trasferiti in un matraccio da 50 ml. Una quantità adeguata della sostanza in esame è sciolta in un solvente volatile di purezza analitica e una quantità adeguata di questa soluzione viene aggiunta al materiale di supporto. Il solvente è completamente evaporato, utilizzando ad esempio un evaporatore rotante, perché altrimenti non si ottiene la saturazione dell’acqua del supporto nel corso della fase di eluizione per via della partizione in superficie. Il materiale di supporto così impregnato viene lasciato a bagno per due ore in 5 ml circa di acqua, e quindi la sospensione viene versata nella microcolonna. Altrimenti, si può versare il materiale di supporto impregnato a secco nella microcolonna riempita di acqua lasciando poi il tutto a riposo per due ore per raggiungere l’equilibrio. | 14. | Il caricamento del materiale di supporto può causare problemi, dando luogo a risultati erronei, se la sostanza di prova si deposita sotto forma di olio. Occorre valutare questi problemi e riportare i dettagli nella relazione. | Procedura con pompa di ricircolo | 15. | Si avvia il flusso attraverso la colonna. Si raccomanda di usare un flusso di approssimativamente 25 ml/h (che corrisponde a 10 volte il volume di letto della colonna descritta per ora). Per eliminare le impurità solubili in acqua, si devono scartare almeno i primi cinque volumi di letto. Successivamente si attiva la pompa fino al raggiungimento dell’equilibrio, che è dimostrato da cinque campioni successivi, le cui concentrazioni non differiscono tra loro più del ± 30 % in una distribuzione casuale. Questi campionamenti devono essere separati l’uno dall’altro da intervalli di tempo corrispondenti almeno al passaggio di un volume corrispondente a dieci volte il volume di letto della colonna. In funzione del metodo analitico utilizzato, può risultare preferibile stabilire una curva concentrazione/tempo per evidenziare che è stato raggiunto l’equilibrio. | Procedura con recipiente di livellamento | 16. | Vanno prelevate ed analizzate con il metodo prescelto frazioni di eluato successive. Per determinare la solubilità si utilizzano le frazioni provenienti dalla fase centrale di eluizione, dove le concentrazioni sono costanti (con uno scarto masso di ± 30 %) in almeno cinque frazioni consecutive. | 17. | L’eluente più indicato è l’acqua bidistillata, ma si può utilizzare anche acqua deionizzata, caratterizzata da una resistività superiore a 10 megaohm/cm e un tenore totale di carbonio organico inferiore a 0,01 %. | 18. | Nell’ambito di entrambe le procedure, l’operazione viene ripetuta una seconda volta dimezzando la velocità di flusso. Se i risultati delle due operazioni concordano, la prova è riuscita. Se la solubilità misurata è superiore con il flusso inferiore, occorre proseguire con il dimezzamento del flusso fino a quando due serie successive non forniscano lo stesso valore di solubilità. | 19. | Nell’ambito di entrambe le procedure, occorre esaminare le frazioni per controllare la presenza di materiale colloidale mediante l’esame dell’effetto Tyndall. La presenza di particelle invalida la prova che deve essere ripetuta dopo aver migliorato l’azione filtrante della colonna. | 20. | Occorre misurare il pH di ogni campione, preferibilmente utilizzando cartine indicatrici speciali. | Metodo del matraccio | Principio | 21. | La sostanza in esame (polverizzata, se solida) è disciolta in acqua a una temperatura leggermente superiore alla temperatura di prova. Quando viene raggiunta la saturazione, la miscela viene raffreddata e mantenuta alla temperatura di prova. In alternativa, la misurazione può essere eseguita direttamente alla temperatura di prova se, mediante un appropriato campionamento, si è sicuri di avere raggiunto l’equilibrio di saturazione. Successivamente, si determina mediante un metodo analitico adeguato la concentrazione massica della sostanza in esame nella soluzione acquosa che non deve contenere particelle indisciolte (3). | Apparecchiatura | 22. | Occorre il materiale seguente: | — | normale strumentazione e vetreria da laboratorio, | — | un apparecchio per l’agitazione delle soluzioni a temperatura costante controllata, | — | se necessario per le emulsioni, una centrifuga (preferibilmente termostatata), e | — | apparecchiatura analitica. | Procedura | 23. | Sulla base della prova preliminare viene valutata la quantità di sostanza necessaria per saturare il volume di acqua stabilito. Una quantità di sostanza pari a cinque volte la suddetta quantità viene pesata direttamente in tre recipienti di vetro (per esempio, provette da centrifuga, matracci) provvisti di tappi di vetro. In ciascun recipiente viene aggiunto un volume d’acqua, scelto in funzione del metodo analitico e del “range” di solubilità. I recipienti sono chiusi ermeticamente e poi agitati a 30 °C. Si deve utilizzare un apparecchio di agitazione o di mescolamento che funzioni a temperatura costante, per esempio un agitatore magnetico in un bagnomaria termostatato. Dopo un giorno, uno dei recipienti viene equilibrato per 24 ore alla temperatura di prova, con agitazione saltuaria. Il contenuto del recipiente viene successivamente centrifugato alla temperatura di prova, e viene misurata, con un opportuno metodo analitico, la concentrazione della sostanza in esame nella fase acquosa limpida. Gli altri due matracci vengono trattati in modo analogo dopo un’equilibrazione iniziale a 30 °C per due e tre giorni, rispettivamente. Se le concentrazioni misurate almeno negli ultimi due recipienti non divergono di più del 15 %, la prova è riuscita. Se invece i risultati relativi ai recipienti 1, 2 e 3 evidenziano una tendenza verso valori crescenti, l’intera prova deve essere ripetuta utilizzando tempi di equilibrazione più lunghi. | 24. | La prova può essere effettuata anche senza la preincubazione a 30 °C. Per calcolare la velocità con cui si raggiunge l’equilibrio di saturazione, si prelevano dei campioni fino a quando il tempo di agitazione non influisce più sulle concentrazioni. | 25. | Occorre misurare il pH di ogni campione, preferibilmente utilizzando cartine indicatrici speciali. | Determinazioni analitiche | 26. | Per queste determinazioni è preferibile ricorrere a un metodo analitico specifico per la sostanza in esame, poiché piccole quantità di impurità solubili possono causare grandi errori nella misura della solubilità. Esempi di metodi sono: gascromatografia, cromatografia liquida, titolazione, fotometria e voltammetria. | DATI E RELAZIONE | Dati | Metodo dell’eluizione su colonna | 27. | Per ciascuna serie si deve calcolare il valore medio di almeno cinque campioni consecutivi, prelevati in corrispondenza del plateau di saturazione, nonché la deviazione standard. I valori medi ottenuti in due prove con velocità di flusso diverse non devono divergere di oltre il 30 %. | Metodo del matraccio | 28. | Occorre calcolare la media dei risultati ottenuti da ognuno dei tre matracci, che tra loro non deve differire di più del 15 %. | Relazione sulla prova | Metodo dell’eluizione su colonna | 29. | La relazione deve contenere le seguenti informazioni: | — | risultati della prova preliminare, | — | identità chimica e impurità (tappa di purificazione preliminare, se del caso), | — | concentrazioni, flussi e pH individuali di ciascun campione, | — | medie e deviazioni standard di almeno cinque campioni dal plateau di saturazione per ciascuna serie, | — | media di almeno due serie successive, | — | temperatura dell’acqua durante il processo di saturazione, | — | metodo di analisi utilizzato, | — | natura del materiale di supporto, | — | impregnazione del materiale di supporto, | — | solvente utilizzato, | — | indicazione di un’eventuale instabilità chimica della sostanza durante la prova, | — | tutte le informazioni attinenti all’interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurità e lo stato fisico della sostanza in esame. | Metodo del matraccio | 30. | La relazione deve contenere le seguenti informazioni: | — | risultati della prova preliminare, | — | identità chimica e impurità (tappa di purificazione preliminare, se del caso), | — | singole determinazioni analitiche e rispettivo valore medio nel caso sia stato determinato più di un valore per ciascun matraccio, | — | pH di ciascun campione, | — | media dei valori per vari matracci i cui risultati siano concordanti, | — | temperatura di prova, | — | metodo analitico, | — | indicazione di un’eventuale instabilità chimica della sostanza durante la prova, | — | tutte le informazioni utili per l’interpretazione dei risultati, in particolare per quanto riguarda le impurità e lo stato fisico della sostanza in esame. | BIBLIOGRAFIA | (1) | Direttiva 92/69/CEE della Commissione, del 31 luglio 1992, recante diciassettesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari ed amministrative relative alla classificazione, all’imballaggio e all’etichettatura delle sostanze pericolose (GU L 383 del 29.12.1992, pag. 113). | (2) | NF T 20-045 (AFNOR) (settembre 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method. | (3) | NF T 20-046 (AFNOR) (settembre 1985). Chemical products for industrial use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flaskmethod», | 1. | poglavje A.6 se nadomesti z naslednjim: | „A.6 TOPNOST V VODI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 105 (1995). Je revidirana različica prvotne TG 105, ki je bila sprejeta leta 1981. Med sedanjo različico in tisto iz leta 1981 ni vsebinskih razlik, temveč je spremenjena predvsem oblika. Revizija je temeljila na preskusni metodi EU ‚Topnost v vodi‘ (1). | ZAČETNI PREUDARKI | 2. | Na topnost snovi v vodi lahko znatno vpliva prisotnost nečistot. S to preskusno metodo se določa topnost v vodi za v glavnem čiste snovi, ki so stabilne v vodi in niso hlapne. Pred določanjem topnosti v vodi je koristno imeti nekatere predhodne informacije o preskusni snovi, kot so strukturna formula, parni tlak, disociacijska konstanta in hidroliza v odvisnosti od pH. | 3. | V tej preskusni metodi sta opisani dve metodi, in sicer metoda z izpiranjem kolone in metoda z bučko, ki se uporabljata za topnost pod 10–2 g/l oziroma nad njo. Opisan je tudi preprost predhodni preskus. Ta omogoča določitev približne količine vzorca, ki bo uporabljena v končnem preskusu, in časa, potrebnega za dosego nasičenja. | OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE | 4. | Topnost snovi v vodi je masna koncentracija nasičene raztopine te snovi v vodi pri določeni temperaturi. | 5. | Topnost v vodi je izražena v masi topljenca na volumen raztopine. Enota SI je kg/m3, lahko pa se uporablja tudi g/l. | REFERENČNE KEMIKALIJE | 6. | Pri preiskovanju preskusne snovi ni treba uporabiti referenčnih kemikalij. | OPIS METOD | Preskusni pogoji | 7. | Preskus se po možnosti opravi pri 20 ± 0,5 °C. Izbrana temperatura mora biti konstantna v vseh bistvenih delih opreme. | Predhodni preskus | 8. | Približno 0,1 g vzorca (trdne preskusne snovi je treba uprašiti) v 10-mililitrskem merilnem valju s steklenim zamaškom se postopno dodajajo vse večje količine vode sobne temperature. Po vsakem dodatku določene količine vode se zmes 10 minut stresa, nato pa se vizualno preveri, ali so v njej prisotni neraztopljeni delci vzorca. Če po dodanih 10 ml vode vzorec ali del vzorca ostane neraztopljen, se preskus nadaljuje v 100-mililitrskem merilnem valju. Približna topnost je navedena v preglednici 1 pod tisto količino vode, v kateri se je vzorec popolnoma raztopil. Kadar je topnost nizka, je lahko za raztopitev preskusne snovi potrebnega veliko časa, počakati pa je treba najmanj 24 ur. Če preskusna snov po 24 urah še vedno ni raztopljena, je treba počakati dlje (do 96 ur) ali jo dodatno razredčiti, da se ugotovi, ali je treba uporabiti metodo z izpiranjem kolone ali metodo z bučko. | Preglednica 1 | ml vode za 0,1 g topne snovi | 0,1 | 0,5 | 1 | 2 | 10 | 100 | > 100 | približna topnost v g/l | > 1 000 | 1 000 do 200 | 200 do 100 | 100 do 50 | 50 do 10 | 10 do 1 | < 1 | Metoda z izpiranjem kolone | Načelo | 9. | Ta metoda temelji na izpiranju preskusne snovi z vodo iz mikrokolone, ki je napolnjena z inertnim nosilcem, na katerega se predhodno nanese prebitna količina preskusne snovi (2). Topnost v vodi se določi, ko masna koncentracija eluata doseže konstantno raven v odvisnosti od časa. | Aparatura | 10. | Aparaturo sestavlja mikrokolona (slika 1), v kateri se ohranja konstantna temperatura in ki je povezana bodisi z recirkulacijsko črpalko (slika 2) bodisi z nivojsko posodo (slika 3). Mikrokolona vsebuje inertni nosilec, katerega uhajanje preprečuje majhen čep iz steklene volne, ki se uporablja tudi za filtracijo delcev. Kot nosilec je mogoče uporabiti steklene kroglice, diatomejsko zemljo ali druge inertne materiale. | 11. | Mikrokolona na sliki 1 je primerna za postavitev z recirkulacijsko črpalko. Ima nadprostor s petkratnim volumnom polnitve (pet volumnov polnitve se na začetku preskusa zavrže) in volumen petih vzorcev (ki se med preskusom vzamejo za analizo). Lahko je tudi manjša, če je mogoče v sistem med preskusom dodajati vodo za nadomestitev začetnih petih volumnov polnitve, ki se zavržejo skupaj z nečistotami. Kolona je s cevjo iz inertnega materiala povezana z recirkulacijsko črpalko z zmogljivostjo približno 25 ml/h. Recirkulacijska črpalka je lahko na primer peristaltična ali membranska črpalka. Paziti je treba, da material cevi ne povzroči onesnaženja in/ali adsorpcije. | 12. | Shema postavitve z nivojsko posodo je prikazana na sliki 3. Pri tej postavitvi je mikrokolona opremljena z enosmernim petelinčkom. Povezavo z nivojsko posodo sestavljata spojka iz brušenega stekla in cev iz inertnega materiala. Pretok iz nivojske posode mora biti približno 25 ml/h. | Slika 1 | Mere v mm | A. | Priključek za spojko iz brušenega stekla | B. | Nadprostor | C. | Notranjost 5 | D. | Zunanjost 19 | E. | Čep iz steklene volne | F. | Petelinček | Slika 2 | A. | Atmosfersko uravnoteževanje | B. | Merilnik pretoka | C. | Mikrokolona | D. | Termostatirana cirkulacijska črpalka | E. | Recirkulacijska črpalka | F. | Dvosmerni ventil za vzorčenje | Slika 3 | A. | Nivojska posoda (npr. 2,5-litrska laboratorijska steklenica) | B. | Kolona | C. | Zbiralnik frakcij | D. | Termostat | E. | Teflonska cev | F. | Spojka iz brušenega stekla | G. | Dovod vode (med termostatom in kolono, notranji premer: približno 8 mm) | 13. | Približno 600 mg nosilca se prenese v 50-mililitrsko bučko z okroglim dnom. Primerna količina preskusne snovi se raztopi v analitsko čistem hlapnem topilu, nato pa se ustrezna količina te raztopine doda nosilcu. Topilo se popolnoma upari, npr. z rotacijskim uparjalnikom, sicer se nosilec med izpiranjem ne bo nasitil z vodo zaradi porazdelitve na površini. Nosilec z naneseno preskusno snovjo se dve uri namaka v približno 5 ml vode, nato pa se suspenzija prelije v mikrokolono. Druga možnost je, da se v mikrokolono, napolnjeno z vodo, strese suh nosilec z naneseno preskusno snovjo in se nato pusti približno dve uri, da se vzpostavi ravnotežje. | 14. | Nanašanje na nosilec lahko povzroči težave, ki lahko privedejo do napačnih rezultatov, npr. če se preskusna snov poseda kot olje. Take težave je treba preučiti in o tem poročati. | Postopek z recirkulacijsko črpalko | 15. | Tok se požene skozi kolono. Priporočljivo je, da se uporabi pretok približno 25 ml/h, ki ustreza 10 volumnom polnitve na uro za opisano kolono. Najmanj prvih pet volumnov polnitve se zavrže, da se odstranijo v vodi topne nečistote. Zatem naj črpalka deluje do vzpostavitve ravnotežja, ki je opredeljeno s petimi zaporednimi vzorci, katerih koncentracije se med seboj ne razlikujejo za več kot ± 30 %. Časovni intervali med temi vzorci morajo ustrezati prehodu najmanj deset volumnov polnitve. Glede na uporabljeno analitsko metodo je morda priporočljivo izdelati krivuljo koncentracija-čas, ki prikazuje vzpostavitev ravnotežja. | Postopek z nivojsko posodo | 16. | Zaporedne frakcije eluata se zberejo in analizirajo z izbrano metodo. Za določitev topnosti se uporabijo frakcije eluata iz srednjega območja, kjer so koncentracije pri najmanj petih zaporednih frakcijah konstantne v območju ± 30 %. | 17. | Najprimernejši eluent je dvakrat destilirana voda. Uporabi se lahko tudi deionizirana voda z upornostjo nad 10 megaomov/cm, in vsebnostjo organskega ogljika pod 0,01 %. | 18. | Pri obeh postopkih se druga meritev opravi pri polovičnem pretoku prve meritve. Če so rezultati obeh meritev skladni, je preskus zadovoljiv. Če je pri manjšem pretoku izmerjena topnost večja, je treba pretok razpolavljati, dokler ni topnost pri dveh zaporednih meritvah enaka. | 19. | Pri obeh postopkih je treba s preverjanjem Tyndallovega efekta preveriti, ali frakcije vsebujejo koloidne delce. Ob prisotnosti delcev je treba preskus razveljaviti in ga ponoviti, ko se izboljša filtracija v koloni. | 20. | Izmeriti je treba pH vsakega vzorca, po možnosti s posebnimi merilnimi lističi. | Metoda z bučko | Načelo | 21. | Preskusna snov (trdne snovi je treba uprašiti) se raztopi v vodi pri temperaturi, ki je nekoliko višja od temperature preskusa. Ko se doseže nasičenost, se zmes ohladi in ohranja na temperaturi preskusa. Meritev se lahko izvede tudi neposredno pri temperaturi preskusa, če se z ustreznim vzorčenjem zagotovi, da je dosežena točka nasičenja. Nato se z ustrezno analitsko metodo (3) določi masna koncentracija preskusne snovi v vodni raztopini, ki ne sme vsebovati neraztopljenih delcev. | Aparatura | 22. | Potrebna je naslednja oprema: | — | običajna laboratorijska steklovina in instrumentarij, | — | naprava za stresanje ali mešanje raztopin pri nadzorovani konstantni temperaturi, | — | če je potrebna za emulzije, centrifuga (po možnosti termostatirana) in | — | analitska oprema. | Postopek | 23. | S predhodnim preskusom se oceni količina preskusne snovi, potrebna za nasičenje želenega volumna vode. Približno petkratnik te količine se zatehta v vsako od treh steklenih posod s steklenimi zamaški (npr. centrifugirke, bučke). V vsako posodo se doda volumen vode, izbran glede na analitsko metodo in območje topnosti. Posode se tesno zamašijo in pretresejo pri 30 °C. Uporabiti je treba napravo za stresanje ali mešanje, ki lahko deluje pri konstantni temperaturi, npr. napravo za magnetno mešanje v termostatirani vodni kopeli. Po enem dnevu se v eni od posod 24 ur vzpostavlja ravnotežje pri temperaturi preskusa, pri čemer se posoda občasno pretrese. Vsebina posode se pri temperaturi preskusa centrifugira, nato pa se z ustrezno analitsko metodo določi koncentracija preskusne snovi v bistri vodni fazi. S preostalima posodama se ravna podobno po začetnem vzpostavljanju ravnotežja pri 30 °C, ki traja pri eni dva in pri drugi tri dni. Če se izmerjene koncentracije v vsaj zadnjih dveh posodah ne razlikujejo za več kot 15 %, je preskus zadovoljiv. Če se pri rezultatih, izmerjenih v posodah 1, 2 in 3, kaže težnja k naraščanju vrednosti, je treba celoten preskus ponoviti z daljšimi časi za vzpostavljanje ravnotežja. | 24. | Preskus se lahko opravi tudi brez predhodne inkubacije pri 30 °C. Da se oceni hitrost doseganja točke nasičenja, se vzorci jemljejo, dokler čas mešanja ne vpliva več na izmerjene koncentracije. | 25. | Izmeriti je treba pH vsakega vzorca, po možnosti s posebnimi merilnimi lističi. | Analitsko določanje | 26. | Po možnosti se uporabi metoda, specifična za posamezno snov, saj lahko majhne količine topnih nečistot povzročijo velike napake pri izmerjeni topnosti. Primeri takih metod so: plinska ali tekočinska kromatografija, titracija, fotometrija, voltametrija. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | Metoda z izpiranjem kolone | 27. | Za vsako ponovitev je treba izračunati srednjo vrednost in standardni odklon za najmanj pet zaporednih vzorcev, vzetih pri točki nasičenja. Srednje vrednosti, dobljene pri dveh preskusih z različnimi pretoki, se ne smejo razlikovati za več kot 30 %. | Metoda z bučko | 28. | Za vsako od treh bučk se izračuna povprečna vrednost rezultatov, ki se ne smejo razlikovati za več kot 15 %. | Poročilo o preskusu | Metoda z izpiranjem kolone | 29. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | — | rezultate predhodnega preskusa, | — | kemijsko identiteto in nečistote (predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno), | — | koncentracije, pretoke in pH za vsak vzorec, | — | srednje vrednosti in standardne odklone za najmanj pet vzorcev, vzetih pri točki nasičenja vsake ponovitve, | — | povprečje najmanj dveh zaporednih ponovitev, | — | temperaturo vode med procesom nasičenja, | — | analitsko metodo, | — | vrsto nosilca, | — | nanašanje na nosilec, | — | uporabljeno topilo, | — | dokaze o kakršni koli kemijski nestabilnosti snovi med preskusom, | — | vse informacije, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja preskusne snovi. | Metoda z bučko | 30. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | — | rezultate predhodnega preskusa, | — | kemijsko identiteto in nečistote (predhodno prečiščevanje, če je bilo opravljeno), | — | posamezne analitske določitve in povprečje, če je bilo za posamezno bučko določenih več vrednosti, | — | pH vsakega vzorca, | — | povprečje vrednosti za različne bučke, pri katerih so bili rezultati skladni, | — | temperaturo preskusa, | — | analitsko metodo, | — | dokaze o kakršni koli kemijski nestabilnosti snovi med preskusom, | — | vse informacije, pomembne za razlago rezultatov, zlasti glede nečistot in agregatnega stanja preskusne snovi. | VIRI: | (1) | Direktiva Komisije 92/69/EGS z dne 31. julija 1992 o sedemnajsti prilagoditvi tehničnemu napredku Direktive Sveta 67/548/EGS o približevanju zakonov in drugih predpisov v zvezi z razvrščanjem, pakiranjem in označevanjem nevarnih snovi (UL L 383, 29.12.1992, str. 54). | (2) | NF T 20-045 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility – Column elution method. | (3) | NF T 20-046 (AFNOR) (september 1985). Chemical products for industrial use – Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility – Flask method.“; |
| 2) | è aggiunto il capitolo A.23: | «A.23. COEFFICIENTE DI RIPARTIZIONE (1-OTTANOLO/ACQUA): METODO DELL’AGITAZIONE LENTA | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 123 (2006). Il metodo dell’agitazione lenta ha permesso di determinare con esattezza valori logaritmici del coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua (POW) fino a 8,2 (1). Costituisce pertanto un approccio sperimentale adeguato per la determinazione diretta del POW di sostanze fortemente idrofobiche. | 2. | Tra gli altri metodi per la determinazione del coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua (POW) si annoverano il metodo “dell’agitazione in bottiglia” (shake flask) (2) e la determinazione del POW dal comportamento di ritenzione nell’HPCL (cromatografia liquida ad alta prestazione) a fase inversa (3). Il metodo “dell’agitazione in bottiglia” tende a falsare i risultati a causa del trasferimento di microgoccioline di ottanolo nella fase acquosa. Con l’aumento dei valori del POW, la presenza di queste goccioline nella fase acquosa porta ad una crescente sovrastimazione della concentrazione della sostanza in esame nell’acqua. L’applicazione di questo metodo è pertanto limitata alle sostanze con log POW < 4. Il secondo metodo si basa su valori affidabili di POW determinati direttamente per calibrare la relazione tra il comportamento di ritenzione nell’HPLC e i valori POW misurati. Esisteva un progetto di linea guida OCSE per determinare i coefficienti di ripartizione 1-ottanolo/acqua di sostanze ionizzabili (4) che tuttavia è stato abbandonato. | 3. | Il presente metodo di prova è stato messo a punto nei Paesi Bassi. La precisione dei metodi descritti è stata validata e ottimizzata nel corso di uno studio di validazione interlaboratorio (ring test) al quale hanno partecipato 15 laboratori (5). | CONSIDERAZIONI INIZIALI | Significato e utilizzo | 4. | Nel caso di sostanze organiche inerti, sono state individuate relazioni molto significative tra i coefficienti di ripartizione 1-ottanolo/acqua (POW) e il bioaccumulo di queste sostanze nei pesci. Inoltre, è stata anche dimostrata una correlazione tra il POW e, da un lato, la tossicità per i pesci e, dall’altro, l’assorbimento di sostanze chimiche nei solidi, come suoli e sedimenti Il riferimento bibliografico (6) contiene un’ampia panoramica di queste relazioni. | 5. | È stata accertata l’esistenza di una vasta gamma di relazioni tra il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua e altre proprietà delle sostanze, di interesse per la chimica e la tossicologia ambientali. Il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua è pertanto diventato un parametro fondamentale ai fini della valutazione del rischio ambientale delle sostanze chimiche e della previsione del destino di tali sostanze nell’ambiente. | Ambito di applicazione | 6. | Si ritiene che il metodo dell’agitazione lenta riduca la formazione di microgoccioline dalle goccioline di 1-ottanolo nella fase acquosa; di conseguenza non si verifica la sovrastimazione della concentrazione in fase acquosa dovuta all’associazione di molecole della sostanza di prova a queste goccioline. Il metodo dell’agitazione lenta si presta in particolare alla determinazione del POW di sostanze con log POW previsto uguale o superiore a 5, per le quali il metodo dell’agitazione in bottiglia (2) tende a fornire risultati erronei. | DEFINIZIONI E UNITÀ | 7. | Il coefficiente di ripartizione di una sostanza tra l’acqua e un solvente lipofilo (1-ottanolo) caratterizza la distribuzione in equilibrio della sostanza chimica tra le due fasi. Il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua (POW) è definito come il rapporto tra la concentrazione in equilibrio della sostanza in esame in 1-ottanolo saturato con acqua (CO) e la concentrazione in equilibrio della sostanza in esame in acqua saturata con 1-ottanolo (CW). | In quanto rapporto tra due concentrazioni si tratta di un valore adimensionale. Generalmente è espresso con il suo logaritmo decimale (log POW). Visto che il POW dipende dalla temperatura, la relazione sulla prova dovrà precisare la temperatura delle determinazioni. | PRINCIPIO DEL METODO | 8. | Al fine di determinare il coefficiente di ripartizione, l’acqua, l’1-ottanolo e la sostanza in esame devono essere portati in equilibrio tra loro a temperatura costante. Si procede successivamente a misurare le concentrazioni della sostanza in esame nelle due fasi. | 9. | Il metodo dell’agitazione lenta proposto permette di ridurre le difficoltà sperimentali associate alla formazione di microgoccioline che si verificano nel metodo dell’agitazione in bottiglia. Con il metodo dell’agitazione lenta, l’acqua, l’1-ottanolo e la sostanza in esame si equilibrano in un reattore termostatato sottoposto ad agitazione. Gli scambi tra le fasi sono accelerati dall’agitazione. Quest’ultima produce una leggera turbolenza che favorisce gli scambi tra 1-ottanolo e acqua senza provocare la formazione di microgoccioline (1). | APPLICABILITÀ DELLA PROVA | 10. | Dato che la presenza di sostanze diverse dalla sostanza in esame potrebbe influenzare il coefficiente di attività di quest’ultima, essa deve essere testata allo stato puro. Ai fini della determinazione del coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua occorre utilizzare una sostanza che presenti il grado di purezza più elevato disponibile in commercio. | 11. | Il presente metodo si applica alle sostanze pure che non si dissociano né si associano e che non manifestano un’attività interfacciale significativa. Può essere utilizzato per determinare il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua di tali sostanze e delle relative miscele. In quest’ultimo caso, i coefficienti di ripartizione ottenuti variano in funzione della composizione chimica della miscela in esame e della composizione elettrolitica della fase acquosa. Adottando alcune misure supplementari, il metodo può essere applicato anche a sostanze che si dissociano o si associano (paragrafo 12). | 12. | A motivo della molteplicità di equilibri dell’acqua e dell’1-ottanolo presenti nella ripartizione 1-ottanolo/acqua delle sostanze dissociabili, come acidi organici e fenoli, basi organiche e composti organometallici, il coefficiente di ripartizione 1-ottanolo/acqua è una costante fortemente dipendente dalla composizione elettrolitica (7) (8). Ai fini della determinazione di questo coefficiente, è necessario controllare il pH e la composizione elettrolitica, i cui valori devono essere riportati nella relazione sulla prova. La valutazione di questi coefficienti di ripartizione deve essere effettuata da specialisti (“giudizio esperto”). Utilizzando i valori delle costanti di dissociazione, occorre scegliere valori di pH adeguati in modo da stabilire un coefficiente di ripartizione per ciascuno stato di ionizzazione. I composti organometallici devono essere testati usando tamponi non complessanti (8). Alla luce delle conoscenze attuali in materia di chimica in fase acquosa (costanti di complessazione e di dissociazione), le condizioni sperimentali devono essere scelte in modo da poter stimare la speciazione della sostanza in esame in fase acquosa. La forza ionica deve essere identica in tutti gli esperimenti, grazie all’utilizzo di un elettrolita di fondo. | 13. | Le sostanze con bassa idrosolubilità o un elevato valore POW possono creare problemi in quanto le loro concentrazioni in acqua sono talmente deboli che diventa difficile determinarle con esattezza. Il presente metodo di prova fornisce indicazioni su come risolvere questo problema. | INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME | 14. | Il livello di purezza dei reagenti chimici deve corrispondere almeno al grado analitico. Si raccomanda di utilizzare sostanze non marcate, di composizione chimica nota e di purezza pari almeno al 99 % o sostanze radiomarcate di composizione chimica e purezza radiochimica note. Nel caso di traccianti radioattivi a breve emivita, occorre applicare correzioni a fronte della degradazione. Se la sostanza in esame è radiomarcata, occorre usare un metodo analitico specifico, in modo che la radioattività misurata sia correlata direttamente alla sostanza in esame. | 15. | La stima del valore log v può essere ottenuta utilizzando gli appositi software venduti in commercio, o basandosi sul rapporto tra le solubilità in entrambi i solventi. | 16. | Prima di applicare il metodo dell’agitazione lenta per la determinazione del POW, occorre disporre delle seguenti informazioni sulla sostanza in esame: | a) | formula strutturale; | b) | metodi analitici adeguati per la determinazione della concentrazione della sostanza in acqua e in 1-ottanolo; | c) | costante o costanti di dissociazione di sostanze ionizzabili (Linea guida OCSE n. 112) (9); | d) | idrosolubilità (10); | e) | idrolisi abiotica (11); | f) | pronta biodegradabilità (12); | g) | tensione di vapore (13). | DESCRIZIONE DEL METODO | Materiale e apparecchiatura | 17. | L’esperimento richiede un’apparecchiatura standard di laboratorio, in particolare: | — | agitatori magnetici e bacchette di agitazione magnetiche rivestite di Teflon per agitare la fase acquosa, | — | strumenti analitici che permettono di determinare la concentrazione della sostanza in esame alle concentrazioni previste, | — | un agitatore dotato di rubinetto alla base. In funzione della stima del log POW e del limite di rivelabilità (Limit of Detection — LOD) della sostanza in esame, occorre considerare l’utilizzo di un recipiente di reazione con la medesima geometria ma di volume superiore ad un litro, in modo da ottenere un volume di acqua sufficiente per l’estrazione e l’analisi chimiche. La concentrazione della sostanza in esame nell’estratto acquoso sarà pertanto più elevata, rendendo così più affidabile la determinazione analitica. All’appendice 1 figura una tabella che riporta le stime del volume minimo necessario, il LOD del composto, la stima del valore log POW e l’idrosolubilità del composto. La tabella si basa sulla relazione tra il log POW e il rapporto tra le solubilità in ottanolo e in acqua, secondo Pinsuwan et al. (14): | dove: | (concentrazione molare), | e sulla relazione presentata da Lyman (15) per la stima dell’idrosolubilità. Le idrosolubilità calcolate con l’equazione riportata nell’appendice 1 sono da considerarsi come una prima stima. Occorre rilevare che l’utilizzatore è libero di determinare l’idrosolubilità mediante qualsiasi altro rapporto che si ritenga rappresenti meglio il rapporto tra idrofobicità e solubilità. Per i composti solidi, ad esempio, si raccomanda di includere il punto di fusione nella previsione della solubilità. Se si utilizza un’equazione modificata, occorre accertarsi che l’equazione per il calcolo della solubilità in ottanolo sia tuttora valida. L’appendice 2 riporta una rappresentazione schematica di un agitatore con rivestimento esterno in vetro, di capacità di circa un litro. Le proporzioni del contenitore rappresentato nell’appendice 2 si sono dimostrate ottimali e devono essere mantenute qualora si utilizzi un apparecchiatura di dimensioni diverse, | — | è indispensabile disporre di un dispositivo per mantenere costante la temperatura durante l’esperimento di agitazione lenta. | 18. | I recipienti devono essere in materiale inerte in modo che l’adsorbimento sulle loro superfici sia trascurabile. | Preparazione delle soluzioni di prova | 19. | La determinazione del POW deve essere eseguita utilizzando 1-ottanolo della qualità più pura disponibile in commercio (grado di purezza minima di 99 %). Si raccomanda di purificare la soluzione mediante estrazione acida, basica e con acqua, seguita da essiccazione. L’1-ottanolo può, inoltre, essere purificato per distillazione. Le soluzioni standard delle sostanze in esame devono essere preparate con 1-ottanolo purificato. L’acqua usata per la determinazione del POW deve essere distillata in apparecchi di vetro o quarzo, o trattata con un sistema di purificazione o di qualità HPLC. La filtrazione dell’acqua distillata deve essere eseguita mediante filtro di 0,22 μm; è altresì necessario prevedere delle prove in bianco per assicurarsi che gli estratti concentrati non contengano impurità che possano interferire con la sostanza in esame. Se si usa un filtro in fibra di vetro, occorre pulirlo lasciandolo almeno tre ore in un forno a 400 °C. | 20. | Entrambi i solventi devono essere reciprocamente saturati prima dell’esperimento, portandoli all’equilibrio in un recipiente sufficientemente grande. A tal fine occorre sottoporre il sistema a due fasi di agitazione lenta per due giorni. | 21. | Selezionare un’adeguata concentrazione della sostanza in esame e scioglierla in 1-ottanolo (saturato con acqua). È necessario determinare il coefficiente di ripartizione in soluzioni diluite in 1-ottanolo e acqua. Pertanto la concentrazione della sostanza di prova non deve superare il 70 % della sua solubilità con una concentrazione massima di 0,1 M in ciascuna fase (1). Le soluzioni di 1-ottanolo utilizzate per l’esperimento devono essere prive della sostanza in esame in sospensione allo stato solido. | 22. | Sciogliere la quantità adeguata di sostanza in esame in 1-ottanolo (saturato con acqua). Se la stima del valore logaritmico di POW è superiore a 5, ci si deve assicurare che le soluzioni di 1-ottanolo utilizzate per l’esperimento non contengano la sostanza in esame in sospensione allo stato solido. A tale fine, si esegue la procedura seguente per le sostanze chimiche il cui valore stimato di log POW è > 5: | — | si scioglie la sostanza in esame in 1-ottanolo (saturato con acqua), | — | si lascia riposare la soluzione sufficientemente a lungo perché la sostanza solida sospesa si depositi. Durante la decantazione, la concentrazione della sostanza in esame è monitorata, | — | una volta che le concentrazioni misurate nella soluzione di 1-ottanolo hanno raggiunto un valore stabile, si diluisce la soluzione madre con un volume adeguato di 1-ottanolo, | — | si misura la concentrazione della soluzione madre diluita. Se la concentrazione misurata è coerente con la diluizione, la soluzione madre diluita può essere utilizzata nell’esperimento ad agitazione lenta. | Estrazione e analisi di campioni | 23. | L’analisi della sostanza in esame è effettuata mediante un metodo analitico convalidato. I ricercatori devono dimostrare che, durante la prova, le concentrazioni nella fase di 1-ottanolo saturato con l’acqua e in fase acquosa saturata con 1-ottanolo sono superiori al limite di quantificazione del metodo analitico usato. Occorre stabilire prima dell’esperimento i recuperi analitici mediante analisi della sostanza in esame in fase acquosa e in fase 1-ottanolo, laddove siano necessari metodi di estrazione. Il segnale analitico deve essere corretto per tenere conto delle prove in bianco e si provvederà ad evitare qualsiasi trasferimento dell’analita da un campione all’altro. | 24. | Prima dell’analisi, in caso di basse concentrazioni delle sostanze di prova idrofobiche in fase acquosa, sarà probabilmente necessario estrarre la fase acquosa mediante un solvente organico e preconcentrare l’estratto. Per la stessa ragione, è necessario ridurre le concentrazioni delle eventuali prove in bianco. A tale scopo, si devono utilizzare solventi di estrema purezza, preferibilmente solventi utilizzati per l’analisi dei residui. Inoltre, una pulizia accurata (ad esempio lavaggio con solvente o essiccazione a temperatura elevata) degli strumenti in vetro prima dell’esperimento può diminuire il rischio di contaminazione incrociata. | 25. | È possibile ottenere una stima del log POW con un apposito programma o ricorrendo al parere di uno specialista. Se il suo valore è superiore a sei, è necessario prestare molta attenzione alle correzioni in funzione dei bianchi e ai trasferimenti dell’analita da un campione all’altro. D’altro canto, se il log POW è superiore a 6, è obbligatorio uno standard surrogato per correggere il tasso di recupero, in modo da ottenere fattori di preconcentrazione elevati. Esistono in commercio diversi programmi software per il calcolo della stima del log POW ad esempio, Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) e ACD log P (19) (1). I riferimenti bibliografici (da 20 a 22) descrivono i vari metodi di stima. | 26. | I limiti di quantificazione (limits of quantification — LOQ) della sostanza in esame in 1-ottanolo e in acqua sono stabiliti secondo metodi riconosciuti. Come principio di base, il limite di quantificazione di un metodo corrisponde alla concentrazione in acqua o in 1-ottanolo che produce un rapporto segnale-disturbo pari a dieci. Occorre scegliere metodi di estrazione e di preconcentrazione adeguati e precisare i recuperi analitici. Occorre scegliere un fattore di preconcentrazione adeguato che produca un segnale dell’intensità richiesta nel corso della determinazione analitica. | 27. | In funzione dei parametri del metodo analitico e delle concentrazioni previste, si stabilisce il volume approssimativo del campione che permetterà un’accurata determinazione della concentrazione della sostanza. Per ottenere un segnale analitico sufficiente, è opportuno non utilizzare campioni di acqua troppo esigui. D’altro canto, i campioni di acqua non devono neanche essere troppo grandi, poiché il volume di acqua restante rischia di essere insufficiente per il numero minimo di analisi necessario (n = 5). Nell’appendice 1 sono riportati i volumi minimi dei campioni in funzione del volume del recipiente, il limite di quantificazione della sostanza in esame e la sua solubilità. | 28. | La quantificazione delle sostanze di prova si effettua per confronto con le curve di calibrazione dei loro composti. Le concentrazioni nei campioni analizzati devono essere comprese tra le concentrazioni degli standard. | 29. | Per le sostanze in esame il cui log POW stimato è superiore a sei, occorre aggiungere uno standard surrogato nel campione di acqua prima dell’estrazione per rilevare le perdite che si verificano durante l’estrazione e la preconcentrazione dei campioni di acqua. Affinché la correzione del recupero sia accurata, gli standard surrogati devono avere proprietà molto simili o identiche a quelle della sostanza in esame. A tale scopo, si utilizzano preferibilmente analoghi marcati con isotopi (stabili) della sostanza di prova (perdeuterati o marcati 13C, ad esempio). Se l’utilizzo di analoghi marcati con isotopi stabili (13C o 2H) risulta impossibile, si deve dimostrare, basandosi su dati affidabili tratti da pubblicazioni, che le proprietà fisico-chimiche dello standard surrogato sono molto vicine a quelle della sostanza in esame. Nel corso dell’estrazione liquido-liquido della fase acquosa possono formarsi emulsioni, che possono essere ridotte con l’aggiunta di sale e lasciando decantare l’emulsione tutta la notte. I metodi utilizzati per estrarre e preconcentrare i campioni devono essere riportati nella relazione sulla prova. | 30. | Prima di essere analizzati, i campioni prelevati dalla fase 1-ottanolo possono, se necessario, essere diluiti con un adeguato solvente. Inoltre, si raccomanda l’utilizzo di standard surrogati per correggere il tasso di recupero per le sostanze che hanno evidenziato un grado di variazione elevato nel corso delle prove di recupero (deviazione standard relativa > 10 %). | 31. | La relazione sulla prova dovrà contenere i dettagli del metodo analitico, e includere: il metodo di estrazione, i fattori di preconcentrazione e di diluizione, i parametri degli strumenti, il processo di calibrazione, l’intervallo di calibrazione, il recupero analitico della sostanza in esame dall’acqua, l’aggiunta di standard surrogati per correggere il tasso di recupero, i valori delle prove in bianco, i limiti di rivelabilità e i limiti di quantificazione. | Esecuzione della prova | Rapporti volumetrici ottimali 1-ottanolo/acqua | 32. | La scelta dei volumi di acqua e di 1-ottanolo deve avvenire in funzione degli elementi seguenti: il limite di quantificazione in 1-ottanolo e in acqua, i fattori di preconcentrazione applicati ai campioni di acqua, i volumi di campionamento prelevati in 1-ottanolo e in acqua nonché le concentrazioni previste. Per ragioni sperimentali, il volume di 1-ottanolo nel metodo dell’agitazione lenta deve essere scelto in modo che lo strato di 1-ottanolo sia sufficientemente spesso (> 0,5 cm) da non risultare alterato dopo un campionamento della fase 1-ottanolo. | 33. | Per determinare i composti il cui log POW è uguale o superiore a 4,5, il rapporto tra i volumi di ciascuna fase abitualmente utilizzati sono da 20 a 50 ml di 1-ottanolo e da 950 a 980 ml di acqua in un recipiente da un litro. | Condizioni sperimentali | 34. | Durante la prova, al recipiente di reazione è applicato un termostato in modo da limitare la variazione di temperatura a meno di 1 °C. La prova deve essere effettuata a 25 °C. | 35. | Il sistema sperimentale deve essere protetto dalla luce del giorno, effettuando la prova in una camera oscura o coprendo il recipiente di reazione con un foglio di alluminio. | 36. | La prova deve essere effettuata in un ambiente (per quanto possibile) privo di polvere. | 37. | Il sistema 1-ottanolo/acqua è agitato fino al raggiungimento dell’equilibrio. Il tempo necessario per raggiungere l’equilibrio è valutato in un esperimento pilota effettuando una prova ad agitazione lenta durante la quale l’acqua e l’1-ottanolo sono sottoposti periodicamente a campionamento. I campionamenti devono avvenire ad intervalli di almeno cinque ore. | 38. | La determinazione del POW deve essere effettuata sulla base di almeno tre prove indipendenti di agitazione lenta. | Determinazione del tempo necessario per raggiungere l’equilibrio | 39. | Si considera che l’equilibrio sia stato raggiunto quando la regressione del rapporto delle concentrazioni 1-ottanolo/acqua in funzione del tempo (in un arco temporale che comprende quattro punti) si traduce in una pendenza che non si discosta in modo significativo da zero per un livello p uguale a 0,05. Occorre raggiungere l’equilibrio almeno 24 ore prima di poter iniziare il campionamento. In linea di massima, il campionamento delle sostanze il cui log POW stimato è < 5 può essere effettuato nel corso del secondo e terzo giorno. È possibile che il tempo necessario per giungere all’equilibrio sia più lungo per le sostanze maggiormente idrofobiche. Nel caso di una sostanza con log POW = 8,23 (decaclorobifenile), sono state sufficienti 144 ore per raggiungere l’equilibrio. L’equilibrio è valutato mediante una serie di campionamenti effettuati dallo stesso recipiente. | Inizio della prova | 40. | All’inizio della prova, riempire il recipiente di reazione con acqua saturata in 1-ottanolo; attendere quindi che il sistema raggiunga la temperatura termostata. | 41. | Aggiungere con attenzione al recipiente di reazione la quantità voluta di sostanza in esame (disciolta nel volume richiesto di 1-ottanolo saturato con acqua). Si tratta di un momento critico della prova poiché si deve evitare una miscela turbolenta delle due fasi. A tal fine, la fase 1-ottanolo può essere versata delicatamente con una pipetta sulla parete del contenitore di prova, vicino alla superficie dell’acqua. In tal modo scorrerà lungo la parete formando una pellicola sopra la fase acquosa. Evitare accuratamente di decantare l’1-ottanolo direttamente nella bottiglia; le gocce di 1-ottanolo non devono cadere direttamente nell’acqua. | 42. | Una volta iniziata la fase di agitazione, aumentare lentamente la velocità. Qualora non sia possibile regolare adeguatamente i motori dell’agitatore, si consideri il ricorso ad un trasformatore. La velocità di agitazione deve essere regolata in modo da creare un vortice nell’interfaccia acqua/1-ottanolo di profondità massima compresa tra 0,5 e 2,5 cm. Occorre diminuire la velocità di agitazione se la profondità del vortice supera 2,5 cm; altrimenti si possono formare microgoccioline di 1-ottanolo nella fase acquosa che determinano una sovrastimazione della concentrazione della sostanza in esame nell’acqua. Sulla base dei risultati di una prova interlaboratorio di convalida (5), si raccomanda di applicare una velocità massima di agitazione di 2,5 cm. Ciò rappresenta un compromesso che permette di giungere rapidamente all’equilibrio pur limitando la formazione di microgoccioline di 1-ottanolo. | Prelievo e trattamento dei campioni | 43. | Prima di effettuare i prelievi, spegnere l’agitatore e attendere che i liquidi si immobilizzino. Una volta effettuato il campionamento, riavviare delicatamente l’agitatore, come sopra descritto, e quindi aumentare progressivamente la velocità di agitazione. | 44. | I campioni di fase acquosa sono prelevati da un rubinetto posto alla base del recipiente di reazione. Scartare sempre il volume morto di acqua contenuto nei rubinetti (circa 5 ml per il contenitore illustrato nell’appendice 2). L’acqua contenuta nei rubinetti non è stata sottoposta ad agitazione e non è pertanto in equilibrio con il resto del liquido. Prendere nota del volume dei campioni di acqua e, al momento di determinare il bilancio di massa, assicurarsi di tener conto della quantità di sostanza di prova presente nell’acqua eliminata. Ridurre al minimo le perdite dovute a evaporazione facendo scorrere delicatamente l’acqua nell’imbuto separatore in modo da non perturbare lo strato acqua/1-ottanolo. | 45. | I campioni di 1-ottanolo sono ottenuti aspirando una piccola parte (circa 100 μl) dello strato di 1-ottanolo con una siringa da 100 μl in vetro e metallo, evitando accuratamente di agitare l’interfaccia. Prendere nota del volume di liquido prelevato. È sufficiente una piccola quota, dato che il campione di 1-ottanolo sarà diluito. | 46. | Si devono evitare i trasferimenti inutili dei campioni. A tal fine è opportuno determinare il volume dei campioni mediante analisi gravimetrica. Nel caso di campioni di acqua, il volume è determinato mediante la raccolta del campione in un imbuto di separazione che contiene già il volume di solvente richiesto. | DATI E RELAZIONE | 47. | Nel presente metodo di prova il valore POW è determinato effettuando tre esperimenti ad agitazione lenta (tre unità sperimentali) con il composto in esame, in condizioni sperimentali identiche. La regressione utilizzata per dimostrare il raggiungimento dell’equilibrio deve basarsi sui risultati di almeno quattro determinazioni CO/CW effettuate in momenti consecutivi. Ciò consente di calcolare la varianza, come misura dell’incertezza del valore medio ottenuto in ciascuna unità sperimentale. | 48. | Il POW può essere caratterizzato dalla varianza dei dati ottenuti in ciascuna unità sperimentale. Tali informazioni sono utilizzate per calcolare il POW come la media ponderata dei risultati di ciascuna unità sperimentale. A tal fine, come coefficiente di ponderazione è utilizzato l’inverso della varianza dei risultati delle unità sperimentali. Di conseguenza, i dati che presentano una accentuata variazione (espressa in termini di varianza), e che sono pertanto meno affidabili, incideranno in misura minore sul risultato finale rispetto ai dati con varianza limitata. | 49. | La deviazione standard ponderata è calcolata in modo analogo. Caratterizza la ripetibilità della misurazione del POW. Una deviazione standard ponderata con valore basso sta a indicare una ripetibilità elevata della determinazione del POW in uno stesso laboratorio. L’elaborazione statistica formale dei dati è riassunta come illustrato qui di seguito. | Trattamento dei risultati | Dimostrazione del conseguimento dell’equilibrio | 50. | Il logaritmo della relazione delle concentrazioni della sostanza in esame in 1-ottanolo e in acqua (log CO/CW) è calcolato per ciascun tempo di prelievo. Il raggiungimento dell’equilibrio chimico si dimostra tracciando una curva di questa relazione in funzione del tempo. Una fase di plateau in questo tracciato, in corrispondenza di almeno quattro punti consecutivi sull’asse del tempo, indica che l’equilibrio è stato raggiunto e che il composto è completamente disciolto in 1-ottanolo. In caso contrario, si deve proseguire la prova fino ad ottenere, per quattro punti consecutivi sull’asse del tempo, una pendenza non significativamente diversa da zero per un livello p uguale a 0,05, che dimostra che il log CO/CW è indipendente dal tempo. | Calcolo del log POW | 51. | Il valore del log POW dell’unità sperimentale corrisponde alla media ponderata del logaritmo CO/CW per la parte della curva del logaritmo CO/CW in funzione del tempo per la quale è stato dimostrato che l’equilibrio è stato raggiunto. Questa media è calcolata ponderando i dati con l’inverso della varianza, in modo che l’influenza dei dati sul risultato finale sia inversamente proporzionale alla loro incertezza. | Media del log POW | 52. | Il valore medio del log POW di varie unità sperimentali corrisponde alla media dei risultati di ciascuna unità sperimentale ponderati con le loro rispettive varianze. | Il calcolo è effettuato secondo la formula seguente: | dove: | log POW,i | = | valore log POW di ciascuna unità sperimentale i; | log POW,Av | = | valore medio ponderato di ciascuna determinazione di log POW; | wi | = | ponderazione statistica attribuita al valore log POW dell’unità sperimentale i. | L’inverso della varianza del log POW,i è utilizzata come wi | . | 53. | La stima dell’errore della media del log POW corrisponde alla ripetibilità del log CO/CW determinato durante la fase di equilibrio in ciascuna unità sperimentale. È espressa come la deviazione ponderata standard del POW,Av (σlog Pow,Av) che a sua volta misura l’errore associato al log POW,Av. La deviazione ponderata può essere calcolata a partire dalla varianza ponderata (varlog Pow,Av) nel modo seguente: | dove “n” rappresenta il numero di unità sperimentali. | Relazione sulla prova | 54. | La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti: | | Sostanza in esame: | — | nome comune, nome chimico, numero CAS, formula strutturale (eventualmente, con indicazione della posizione in caso di sostanze radiomarcate) e proprietà fisico-chimiche pertinenti (cfr. paragrafo 17), | — | purezza (impurità) della sostanza in esame, | — | purezza radiochimica delle sostanze marcate e attività molare (se del caso), | — | stima preliminare del log POW e metodo utilizzato per calcolare questo valore. | | Condizioni sperimentali: | — | date di realizzazione degli studi, | — | temperatura nel corso dell’esperimento, | — | volumi di 1-ottanolo e di acqua all’inizio della prova, | — | volumi dei campioni di 1-ottanolo e di acqua prelevati, | — | volumi di 1-ottanolo e di acqua che restano nei recipienti di prova, | — | descrizione dei recipienti di prova e delle condizioni di agitazione (la geometria della barra di agitazione e del recipiente di prova, altezza del vortice in mm, e quando disponibile: | — | metodi analitici utilizzati per determinare la sostanza in esame e loro limite di quantificazione, | — | tempi di campionamento, | — | pH della fase acquosa e tamponi utilizzati quando si regola il pH in presenza di molecole ionizzabili, | — | numero di ripetizioni. | | Risultati: | — | ripetibilità e sensibilità dei metodi analitici usati, | — | concentrazioni della sostanza di prova determinate in 1-ottanolo e in acqua in funzione del tempo, | — | dimostrazione del bilancio di massa, | — | temperatura e deviazione standard della temperatura o intervallo delle temperature, durante la prova, | — | regressione del rapporto delle concentrazioni in funzione del tempo, | — | valore medio del log Pow,Av e suo errore standard, | — | analisi e interpretazione dei risultati, | — | esempi di dati grezzi di analisi rappresentative (tutti i dati grezzi devono essere conservati conformemente alle buone pratiche di laboratorio), in particolare il tasso di recupero dei surrogati, il numero di livelli utilizzato nella calibrazione (oltre ai criteri per il coefficiente di correlazione della curva di taratura) e risultati del GQ/CQ, | — | se è disponibile: relazione di validazione del protocollo sperimentale (da citare nei riferimenti bibliografici). | BIBLIOGRAFIA: | (1) | De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ‘slow-stirring’ method. Environ. Toxicol. Chem., 8: 499-512. | (2) | Capitolo A.8 del presente allegato, Coefficiente di partizione. | (3) | Capitolo A.8 del presente allegato, Coefficiente di partizione. | (4) | OCSE (2000). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Parigi. | (5) | Tolls J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (POW) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01. | (6) | Boethling R.S., Mackay D. (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA. | (7) | Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. | (8) | Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602. | (9) | OCSE (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Parigi. | (10) | Capitolo A.6 del presente allegato, Idrosolubilità. | (11) | Capitolo C.7 del presente allegato, Degradazione — Idrolisi della degradazione abiotica in funzione del pH. | (12) | Capitolo C.4 — parti da II a VII (Metodi da A a F) del presente allegato, Determinazione della pronta biodegradabilità. | (13) | Capitolo A.4 del presente allegato, Tensione di vapore. | (14) | Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626. | (15) | Lyman WJ (1990). Solubility in water. In: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 to 2-52. | (16) | Leo A, Weininger D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA. | (17) | Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. | (18) | Compudrug L. (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapest. | (19) | ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Canada, 2001. | (20) | Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. In Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C. | (21) | Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488. | (22) | Jübermann O. (1958). Houben-Weyl, ed, Methoden der Organischen Chemie: 386-390. | Appendice 1 | Tabelle di calcolo dei volumi minimi di acqua richiesti per l’individuazione delle sostanze in esame con valori log POW diversi in fase acquosa | Ipotesi: | — | Volume massimo di ciascuna aliquota = 10 % del volume totale; 5 aliquote = 50 % del volume totale | — | . Se le concentrazioni sono inferiori, si dovranno utilizzare volumi maggiori | — | Volume utilizzato per la determinazione del limite di rivelabilità (LOD) = 100 ml | — | Il rapporto del log POW in funzione di log SW e del log POW in funzione di SR (solubilità relativa, Soct/Sw) sono rappresentazioni ragionevoli dei rapporti per le sostanze in esame | Stima di Sw | log Pow | equazione | log Sw | Sw (mg/l) | 4 | 0,496 | 3,133E+00 | 4,5 | 0,035 | 1,084E+00 | 5 | –0,426 | 3,750E-01 | 5,5 | –0,887 | 1,297E-01 | 6 | –1,348 | 4,487E-02 | 6,5 | –1,809 | 1,552E-02 | 7 | –2,270 | 5,370E-03 | 7,5 | –2,731 | 1,858E-03 | 8 | –3,192 | 6,427E-04 | Stima di Soc | log Pow | equazione | Soct (mg/l) | 4 | 3,763E+04 | 4,5 | 4,816E+04 | 5 | 6,165E+04 | 5,5 | 7,890E+04 | 6 | 1,010E+05 | 6,5 | 1,293E+05 | 7 | 1,654E+05 | 7,5 | 2,117E+05 | 8 | 2,710E+05 | Massa totale della sostanza in esame | (mg) | Massoct/Masswater | MassH2O | (mg) | ConcH2O | (mg/l) | Massoct | (mg) | Concoct | (mg/l) | 1 319 | 526 | 2,5017 | 2,6333 | 1 317 | 26 333 | 1 686 | 1 664 | 1,0127 | 1,0660 | 1 685 | 33 709 | 2 158 | 5 263 | 0,4099 | 0,4315 | 2 157 | 43 149 | 2 762 | 16 644 | 0,1659 | 0,1747 | 2 762 | 55 230 | 3 535 | 52 632 | 0,0672 | 0,0707 | 3 535 | 70 691 | 4 524 | 1664 36 | 0,0272 | 0,0286 | 4 524 | 90 480 | 5 790 | 5263 16 | 0,0110 | 0,0116 | 5 790 | 115 807 | 7 411 | 1 664 357 | 0,0045 | 0,0047 | 7 411 | 148 223 | 9 486 | 5 263 158 | 0,0018 | 0,0019 | 9 486 | 189 713 | Calcolo dei volumi | Volume minimo richiesto per la fase H2O a ciascuna concentrazione del limite di rivelabilità (LOD) | log Kow | LOD (microgrammi/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | | 0,04 | 0,38 | 3,80 | 38 | 380 | 4,5 | | 0,09 | 0,94 | 9,38 | 94 | 938 | 5 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 232 | 2 318 | 5,5 | | 0,57 | 5,73 | 57,26 | 573 | 5 726 | 6 | | 1,41 | 14,15 | 141 | 1 415 | 14 146 | 6,5 | | 3,50 | 34,95 | 350 | 3 495 | 34 950 | 7 | | 8,64 | 86,35 | 864 | 8 635 | 86 351 | 7,5 | | 21,33 | 213 | 2 133 | 21 335 | 213 346 | 8 | | 52,71 | 527 | 5 271 | 52 711 | 527 111 | Volume usato per LOD (l) | 0,1 | | | | | | Legenda | Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equilibrazione da 1 litro. | Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equilibrazione da 2 litri. | Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equilibrazione da 5 litri. | Rappresenta < 10 % del volume totale della fase acquosa, recipiente di equilibrazione da 10 litri. | Supera del 10 % anche il recipiente di equilibrazione da 10 litri. | Tabella riassuntiva dei volumi necessari, in funzione della solubilità dell’acqua e del Log POW | Volume minimo richiesto per la fase H2O ad ogni concentrazione LOD (ml) | log Pow | Sw (mg/l) | LOD (microgrammi/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | 10 | | 0,01 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | | 5 | | 0,02 | 0,24 | 2,38 | 23,80 | 237,97 | | 3 | | 0,04 | 0,40 | 3,97 | 39,66 | 396,62 | | 1 | | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | 1 189,86 | 4,5 | 5 | | 0,02 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | | 2 | | 0,05 | 0,51 | 5,08 | 50,84 | 508,42 | | 1 | | 0,10 | 1,02 | 10,17 | 101,68 | 1 016,83 | | 0,5 | | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | 2 033,67 | 5 | 1 | | 0,09 | 0,87 | 8,69 | 86,90 | 869,01 | | 0,5 | | 0,17 | 1,74 | 17,38 | 173,80 | 1 738,02 | | 0,375 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 231,75 | 2 317,53 | | 0,2 | | 0,43 | 4,35 | 43,45 | 434,51 | 4 345,05 | 5,5 | 0,4 | | 0,19 | 1,86 | 18,57 | 185,68 | 1 856,79 | | 0,2 | | 0,37 | 3,71 | 37,14 | 371,36 | 3 713,59 | | 0,1 | | 0,74 | 7,43 | 74,27 | 742,72 | 7 427,17 | | 0,05 | | 1,49 | 14,85 | 148,54 | 1 485,43 | 14 854,35 | 6 | 0,1 | | 0,63 | 6,35 | 63,48 | 634,80 | 6 347,95 | | 0,05 | | 1,27 | 12,70 | 126,96 | 1 269,59 | 12 695,91 | | 0,025 | | 2,54 | 25,39 | 253,92 | 2 539,18 | 25 391,82 | | 0,0125 | | 5,08 | 50,78 | 507,84 | 5 078,36 | 50 783,64 | 6,5 | 0,025 | | 2,17 | 21,70 | 217,02 | 2 170,25 | 21 702,46 | | 0,0125 | | 4,34 | 43,40 | 434,05 | 4 340,49 | 43 404,93 | | 0,006 | | 9,04 | 90,43 | 904,27 | 9 042,69 | 90 426,93 | | 0,003 | | 18,09 | 180,85 | 1 808,54 | 18 085,39 | 180 853,86 | 7 | 0,006 | | 7,73 | 77,29 | 772,89 | 7 728,85 | 77 288,50 | | 0,003 | | 15,46 | 154,58 | 1 545,77 | 15 457,70 | 154 577,01 | | 0,0015 | | 23,19 | 231,87 | 2 318,66 | 23 186,55 | 231 865,51 | | 0,001 | | 46,37 | 463,73 | 4 637,31 | 46 373,10 | 463 731,03 | 7,5 | 0,002 | | 19,82 | 198,18 | 1 981,77 | 19 817,73 | 198 177,33 | | 0,001 | | 39,64 | 396,35 | 3 963,55 | 39 635,47 | 396 354,66 | | 0,0005 | | 79,27 | 792,71 | 7 927,09 | 79 270,93 | 792 709,32 | | 0,00025 | | 158,54 | 1 585,42 | 15 854,19 | 158 541,86 | 1 585 418,63 | 8 | 0,001 | | 33,88 | 338,77 | 3 387,68 | 33 876,77 | 338 767,72 | | 0,0005 | | 67,75 | 677,54 | 6 775,35 | 67 753,54 | 677 535,44 | | 0,00025 | | 135,51 | 1 355,07 | 13 550,71 | 135 507,09 | 1 355 070,89 | | 0,000125 | | 271,01 | 2 710,14 | 27 101,42 | 271 014,18 | 2 710 141,77 | Volume usato per la determinazione del LOD (l) | 0,1 | | | | | | Appendice 2 | Esempio di recipiente di prova con rivestimento esterno in vetro per il metodo dell’agitazione lenta al fine di determinare il POW | » | 2. | doda se poglavje A.23: | „A.23 PORAZDELITVENI KOEFICIENT (1-OKTANOL/VODA): METODA POČASNEGA MEŠANJA | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 123 (2006). Vrednosti porazdelitvenega koeficienta 1-oktanol/voda (POW) do log POW 8,2 so bile natančno določene z metodo počasnega mešanja (1). Zato gre za primeren preskusni pristop k neposrednemu določanju POW zelo hidrofobnih snovi. | 2. | Preostali metodi za določanje porazdelitvenega koeficienta 1-oktanol/vode (POW) sta metoda ‚stresanja bučke‘ (2) in določanje POW na podlagi retencijskega vedenja pri tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo (3). Pri metodi ‚stresanja bučke‘ so pogosti artefakti zaradi prenosa mikrokapljic oktanola v vodno fazo. S povečevanjem vrednosti POW prisotnost teh kapljic v vodni fazi vodi do povečanega precenjevanja koncentracije preskusne snovi v vodi. Zato je uporaba te metode omejena na snovi z log POW < 4. Pri drugi metodi se z opiranjem na zanesljive podatke iz neposredno določenih vrednosti POW umeri razmerje med retencijskim vedenjem pri HPLC in izmerjenimi vrednostmi POW. Na voljo je bil tudi osnutek smernice OECD za določanje porazdelitvenih koeficientov 1-oktanol/voda za snovi, ki lahko ionizirajo (4), ki pa se ne uporablja več. | 3. | Ta preskusna metoda je bila razvita na Nizozemskem. Natančnost metod, opisanih v tem dokumentu, je bila validirana in optimizirana v primerjalni validacijski študiji, v kateri je sodelovalo 15 laboratorijev (5). | ZAČETNI PREUDARKI | Pomen in uporaba | 4. | Za inertne organske snovi so bila ugotovljena zelo pomembna razmerja med porazdelitvenimi koeficienti 1-oktanol/voda (POW) in njihovo bioakumulacijo v ribah. Poleg tega je bilo dokazano, da je POW povezan s strupenostjo za ribe, pa tudi s sorpcijo kemikalij na trdne snovi, kot so prsti in usedline. Obsežen pregled razmerij je naveden v viru (6). | 5. | Ugotovljena so bila najrazličnejša razmerja med porazdelitvenim koeficientom 1-oktanol/voda in drugimi lastnostmi snovi, pomembnimi za okoljsko toksikologijo in kemijo. Porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda je zato postal ključni parameter pri ocenjevanju tveganja kemikalij za okolje, pa tudi pri napovedovanju vpliva kemikalij v okolju. | Področje uporabe | 6. | S preskusom s počasnim mešanjem naj bi se zmanjševala tvorba mikrokapljic iz kapljic 1-oktanola v vodni fazi. Posledično ne pride do precenjevanja vodne koncentracije zaradi molekul preskusne snovi, ki so združene s takimi kapljicami. Zato je metoda počasnega mešanja posebej primerna za ugotavljanje POW za snovi s pričakovanimi vrednostmi log POW 5 in več, za katere metoda stresanja bučke pogosto da napačne rezultate (2). | OPREDELITEV POJMOV IN ENOTE | 7. | Porazdelitveni koeficient snovi med vodo in lipofilnim topilom (1-oktanolom) označuje ravnotežno porazdelitev kemikalije med obema fazama. Porazdelitveni koeficient med vodo in 1-oktanolom (POW) je opredeljen kot razmerje ravnotežnih koncentracij preskusne snovi v 1-oktanolu, nasičenem z vodo (CO), in vodi, nasičeni z 1-oktanolom (CW). | Kot razmerje koncentracij je porazdelitveni koeficient brez razsežnosti. Najpogosteje je podan kot desetiški logaritem (log POW). Odvisen je od temperature, sporočeni podatki pa morajo vključevati temperaturo merjenja. | NAČELO METODE | 8. | Za določitev porazdelitvenega koeficienta se voda, 1-oktanol in preskusna snov medsebojno uravnotežijo pri konstantni temperaturi. Potem se določijo koncentracije preskusne snovi v obeh fazah. | 9. | Težave pri preskušanju, povezane s tvorbo mikrokapljic med preskusom stresanja bučke, se lahko zmanjšajo z uporabo preskusa s počasnim mešanjem, ki je predlagan v tem dokumentu. V njem se voda, 1-oktanol in preskusna snov uravnotežijo v termostatiranem mešalnem reaktorju. Izmenjava med fazama se pospeši z mešanjem. To povzroči omejeno turbulenco, kar pospeši izmenjavo med 1-oktanolom in vodo, ne da bi se pri tem tvorile mikrokapljice (1). | UPORABNOST PRESKUSA | 10. | Ker lahko prisotnost snovi, ki niso preskusna snov, vpliva na koeficient aktivnosti preskusne snovi, je treba preskusno snov preskušati v čistem stanju. Za preskus porazdelitve 1-oktanol/voda je treba uporabiti najvišjo tržno dostopno čistost. | 11. | Ta metoda se uporablja za čiste snovi, ki ne disociirajo ali asociirajo in ne kažejo bistvene medfazne aktivnosti. Uporablja se lahko za ugotavljanje porazdelitvenega razmerja 1-oktanol/voda takih snovi in zmesi. Kadar se metoda uporablja za zmesi, so ugotovljena porazdelitvena razmerja 1-oktanol/voda pogojna ter odvisna od kemijske sestave preskušane zmesi in elektrolitske sestave, uporabljene za vodno fazo. Če se izvedejo dodatni koraki, je metoda uporabna tudi za spojine, ki disociirajo ali asociirajo (odstavek 12). | 12. | Ker porazdelitev 1-oktanol/voda pri snoveh, ki disociirajo – kot so organske kisline in fenoli, organske baze ter organokovinske snovi –, vključuje več ravnotežij v vodi in 1-oktanolu, je porazdelitveno razmerje 1-oktanol/voda pogojna konstanta, ki je močno odvisna od elektrolitske sestave (7) (8). Zato je treba pri določanju porazdelitvenega razmerja 1-oktanol/voda pri preskusu nadzirati vrednost pH in elektrolitsko sestavo ter o njiju poročati. Pri ocenjevanju teh porazdelitvenih razmerij je potrebna strokovna presoja. Z uporabo vrednosti disociacijskih konstant je treba izbrati ustrezne vrednosti pH, tako da se porazdelitveno razmerje določi za vsako ionizacijsko stanje. Kadar se preskušajo organokovinske spojine, je treba uporabiti nekompleksirajoče pufre (8). Ob upoštevanju sedanjega znanja o vodni kemiji (kompleksacijske konstante, disociacijske konstante) je treba preskusne pogoje izbrati tako, da se lahko oceni speciacija preskusne snovi v vodni fazi. Ionska moč mora biti v vseh preskusih enaka, kar se doseže z uporabo osnovnega elektrolita. | 13. | Kadar se preskus opravlja za snovi z nizko topnostjo v vodi ali visokim POW, se lahko pojavijo težave, saj koncentracije v vodi postanejo zelo nizke, kar oteži njihovo natančno določanje. Ta preskusna metoda vsebuje napotke, kako to težavo odpraviti. | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 14. | Kemijski reagenti morajo biti analitsko čisti ali še kakovostnejši. Priporoča se uporaba neoznačenih preskusnih snovi z znano kemijsko sestavo in po možnosti vsaj 99-odstotno čistostjo ali izotopsko označenih preskusnih spojin z znano kemijsko sestavo in radiokemijsko čistostjo. Pri sledilih s kratko razpolovno dobo je treba uporabiti popravke razpada. Pri izotopsko označenih preskusnih spojinah je treba uporabiti analitsko metodo, specifično za dano kemikalijo, da se zagotovi, da se izmerjena radioaktivnost nanaša neposredno na preskusno snov. | 15. | Oceno log POW je mogoče dobiti s tržno dostopno programsko opremo za ocenjevanje log POW ali z uporabo razmerja topnosti v obeh topilih. | 16. | Pred izvedbo preskusa s počasnim mešanjem za določitev POW morajo biti na voljo naslednje informacije o preskusni snovi: | (a) | strukturna formula; | (b) | ustrezne analitske metode za ugotavljanje koncentracije snovi v vodi in 1-oktanolu; | (c) | disociacijske konstante snovi, ki lahko ionizirajo (Smernica OECD 112 (9)); | (d) | topnost v vodi (10); | (e) | abiotska hidroliza (11); | (f) | dobra biorazgradljivost (12); | (g) | parni tlak (13). | OPIS METODE | Oprema in aparatura | 17. | Potrebna je standardna laboratorijska oprema, zlasti: | — | za mešanje vodne faze se uporabljajo magnetna mešala in magnetne mešalne palice, prevlečene s teflonom, | — | analitski instrumenti, primerni za ugotavljanje koncentracije preskusne snovi pri pričakovanih koncentracijah, | — | mešalna posoda s pipo pri dnu. Glede na oceno log POW in mejo zaznavnosti (LOD) preskusne spojine je treba razmisliti o uporabi reakcijske posode, ki ima enako geometrijo in je večja od enega litra, da se lahko zagotovi zadosten volumen vode za kemijsko ekstrakcijo in analizo. To privede do višjih koncentracij v vodnem ekstraktu in s tem do zanesljivejšega analitskega določanja. Dodatek 1 vsebuje preglednico, v kateri so navedene ocene najmanjšega potrebnega volumna, LOD spojine, njen ocenjeni log POW in njena topnost v vodi. Preglednica temelji na razmerju med log POW ter razmerjem topnosti v oktanolu in vodi, kot so ga predstavili Pinsuwan idr. (14): | — | — | kjer je | — | (v molih), | ter na razmerju, ki ga je podal Lyman (15) za napovedovanje topnosti v vodi. Topnosti v vodi, izračunane z enačbo, kot je navedena v Dodatku 1, je treba obravnavati kot prvo oceno. Opozoriti je treba, da lahko uporabnik pripravi oceno topnosti v vodi tudi z uporabo katerega koli razmerja, za katero se šteje, da bolje predstavlja razmerje med hidrofobnostjo in topnostjo. Priporoča se na primer, naj se za trdne spojine v napovedovanje topnosti vključi tališče. Če se uporabi spremenjena enačba, se je treba prepričati, da enačba za izračun topnosti v oktanolu še vedno velja. V Dodatku 2 je prikazana shema mešalne posode s stekleno oblogo, katere prostornina znaša približno en liter. Razmerja med merami posode, prikazane v Dodatku 2, so se izkazala za ugodna in jih je treba ohraniti, kadar se uporabi aparatura druge velikosti, | — | bistveno je sredstvo za ohranjanje konstantne temperature med preskusom s počasnim mešanjem. | 18. | Posode morajo biti izdelane iz inertnega materiala, tako da je adsorpcija na površine posode zanemarljiva. | Priprava preskusnih raztopin | 19. | POW je treba določiti z najčistejšim 1-oktanolom, ki je na voljo na trgu (vsaj + 99-odstotnim). Priporoča se prečiščenje 1-oktanola z ekstrakcijo s kislino, bazo in vodo ter poznejšim sušenjem. Poleg tega se lahko 1-oktanol prečisti z destilacijo. Prečiščeni 1-oktanol se uporabi za pripravo standardnih raztopin preskusnih snovi. Voda, ki bo uporabljena pri določanju POW, mora biti destilirana v stekleni ali kremenčevi aparaturi ali pridobljena iz prečiščevalnega sistema, lahko pa se uporablja tudi voda HPLC-čistosti. Za destilirano vodo je potrebno filtriranje skozi filter z velikostjo por 0,22 μm. Vključiti je treba slepe vzorce, s čimer se zagotovi, da v koncentriranih ekstraktih ni nečistot, ki lahko interferirajo s preskusno snovjo. Če se uporablja filter iz steklenih vlaken, ga je treba očistiti s triurnim segrevanjem v peči pri 400 °C. | 20. | Pred preskusom se topili medsebojno nasitita z uravnoteženjem v dovolj veliki posodi. To se doseže tako, da se dvofazni sistem dva dneva počasi meša. | 21. | Izbrana ustrezna koncentracija preskusne snovi se raztopi v 1-oktanolu (nasičenem z vodo). Porazdelitveni koeficient 1-oktanol/voda je treba določiti v razredčenih raztopinah v 1-oktanolu in vodi. Zato koncentracija preskusne snovi ne sme presegati 70 % njene topnosti z največjo koncentracijo 0,1 M v kateri koli fazi (1). V raztopinah z 1-oktanolom, uporabljenih za preskus, ne sme biti suspendirane trdne preskusne snovi. | 22. | Ustrezna količina preskusne snovi se raztopi v 1-oktanolu (nasičenem z vodo). Če ocena log POW presega vrednost 5, je treba poskrbeti, da v raztopinah z 1-oktanolom, uporabljenih za preskus, ni suspendirane trdne preskusne snovi. V ta namen se upošteva postopek za kemikalije z ocenjeno vrednostjo log POW > 5: | — | preskusna snov se raztopi v 1-oktanolu (nasičenem z vodo), | — | raztopina se pusti dovolj dolgo, da se suspendirana trdna snov posede. Med posedanjem se spremlja koncentracija preskusne snovi, | — | ko izmerjene koncentracije v raztopini z 1-oktanolom dosežejo stabilne vrednosti, se osnovna raztopina razredči z ustreznim volumnom 1-oktanola, | — | izmeri se koncentracija razredčene osnovne raztopine. Če je izmerjena koncentracija v skladu z razredčitvijo, se lahko razredčena osnovna raztopina uporabi v preskusu s počasnim mešanjem. | Ekstrakcija in analiza vzorcev | 23. | Za analizo preskusne snovi je treba uporabiti validirano analitsko metodo. Raziskovalci morajo zagotoviti dokaze, da so koncentracije v fazi 1-oktanola, nasičenega z vodo, in fazi vode, nasičene z 1-oktanolom, med preskusom nad mejo določljivosti uporabljenih analitskih postopkov. V primerih, v katerih so potrebne ekstrakcijske metode, je treba analitske izkoristke preskusne snovi iz vodne faze in faze 1-oktanola določiti pred preskusom. Analitski signal je treba popraviti za slepe vzorce in paziti, da prenos analita iz enega vzorca v drugega ni mogoč. | 24. | Pred analizo bosta zaradi dokaj nizkih koncentracij hidrofobnih preskusnih snovi v vodni fazi verjetno potrebna ekstrakcija iz vodne faze z organskim topilom in predkoncentriranje ekstrakta. Iz istega razloga je treba znižati morebitne koncentracije slepih vzorcev. V ta namen je treba uporabiti topila visoke čistosti, po možnosti topila za analizo ostankov. Poleg tega lahko navzkrižno kontaminacijo pomaga preprečiti delo s steklovino, ki se predhodno skrbno očisti (npr. s pomivanjem v topilu ali segrevanjem v peči pri zvišani temperaturi). | 25. | Ocena log POW se lahko pridobi s programom za ocenjevanje ali s strokovno presojo. Če je vrednost višja od 6, je treba skrbno spremljati popravke za slepe vzorce in prenos analita. Če ocena log POW presega 6, je obvezna uporaba nadomestnega standarda za popravek izkoristka, da je mogoče doseči visoke faktorje predkoncentracije. Na trgu so na voljo številni računalniški programi za ocenjevanje log POW (1), npr. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) in ACD log P (19). Opisi pristopov k ocenjevanju so na voljo v virih (20–22). | 26. | Meje določljivosti (LOQ) za ugotavljanje preskusne snovi v 1-oktanolu in vodi je treba določiti s sprejetimi metodami. Načeloma se lahko meja določljivosti metode določi kot koncentracija v vodi ali 1-oktanolu, katere razmerje med signalom in hrupom znaša 10. Izbrati je treba ustrezno metodo ekstrakcije in predkoncentriranja ter opredeliti analitske izkoristke. Izbere se ustrezen predkoncentracijski faktor, da se pri analitskem določanju dobi signal potrebne intenzivnosti. | 27. | Na podlagi parametrov analitske metode in pričakovanih koncentracij se določi približna velikost vzorca, ki je potrebna za natančno določitev koncentracije spojine. Izogibati se je treba uporabi vzorcev vode, ki so premajhni za doseganje zadostnega analitskega signala. Prav tako se je treba izogibati prevelikim vzorcem vode, saj sicer lahko ostane premalo vode za najmanjše število zahtevanih analiz (n = 5). V Dodatku 1 so navedeni minimalni volumni vzorcev v odvisnosti od prostornine posode, LOD preskusne snovi in topnosti preskusne snovi. | 28. | Količinska določitev preskusnih snovi se izvede s primerjavo z umeritvenimi krivuljami zadevne spojine. Koncentracije v analiziranih vzorcih je treba razvrstiti glede na koncentracije standardov. | 29. | Za preskusne snovi z oceno log POW, višjo od 6, je treba vzorcu vode pred ekstrakcijo primešati nadomestni standard, da se ugotovijo izgube, ki se pojavijo med ekstrakcijo in predkoncentriranjem vzorcev vode. Za natančen popravek izkoristka morajo imeti nadomestki lastnosti, ki so zelo podobne ali celo enake lastnostim preskusne snovi. Po možnosti se za ta namen uporabljajo (stabilni) izotopno označeni analogi preiskovanih snovi (na primer devterirani analogi ali analogi, označeni z izotopom 13C). Če uporaba označenih stabilnih izotopov, tj. 13C ali 2H, ni mogoča, je treba z opiranjem na zanesljive podatke v literaturi dokazati, da so fizikalno-kemijske lastnosti nadomestka zelo podobne lastnostim preskusne snovi. Med tekočinsko-tekočinsko ekstrakcijo vodne faze se lahko tvorijo emulzije. Njihovo nastajanje je mogoče zmanjšati tako, da se doda sol, emulzija pa pusti čez noč mirovati. O metodah, ki se uporabijo za ekstrahiranje in predkoncentriranje vzorcev, je treba poročati. | 30. | Vzorci, odvzeti iz faze 1-oktanola, se lahko pred analizo po potrebi razredčijo z ustreznim topilom. Poleg tega je uporaba nadomestnih standardov za popravek izkoristka priporočljiva za snovi, za katere so se v preskusih izkoristka pokazala velika odstopanja (relativni standardni odklon > 10 %). | 31. | O podrobnostih analitske metode je treba poročati. To vključuje metodo ekstrakcije, predkoncentracijske faktorje in faktorje redčenja, parametre instrumentov, postopek umerjanja, umeritveno območje, analitski izkoristek preskusne snovi iz vode, dodajanje nadomestnih standardov za popravek izkoristka, vrednosti slepih vzorcev, meje zaznavnosti in meje določljivosti. | Izvedba preskusa | Optimalna razmerja volumnov 1-oktanol/voda | 32. | Pri izbiri volumnov vode in 1-oktanola je treba upoštevati LOQ v 1-oktanolu in vodi, predkoncentracijske faktorje, uporabljene za vzorce vode, vzorčene volumne v 1-oktanolu in vodi ter pričakovane koncentracije. Za namene preskusa je treba volumen 1-oktanola v sistemu počasnega mešanja izbrati tako, da je plast 1-oktanola dovolj debela (> 0,5 cm), da omogoča vzorčenje faze 1-oktanola brez povzročanja motenj v njej. | 33. | Običajna fazna razmerja, uporabljena za določitve spojin, katerih log POW znaša 4,5 in več, so 20 do 50 ml 1-oktanola in 950 do 980 ml vode v litrski posodi. | Preskusni pogoji | 34. | Med preskusom je reakcijska posoda termostatirana, da se temperaturne spremembe zmanjšajo pod 1 °C. Analizo je treba opraviti pri 25 °C. | 35. | Preskusni sistem je treba zaščititi pred dnevno svetlobo, bodisi tako, da se preskus izvaja v temnem prostoru, bodisi tako, da se reakcijska posoda pokrije z aluminijasto folijo. | 36. | Preskus je treba izvajati v brezprašnem okolju (kolikor je to mogoče). | 37. | Sistem 1-oktanol-voda se meša, dokler ni doseženo ravnotežje. V pilotnem preskusu se dolžina obdobja za vzpostavljanje ravnotežja oceni z izvedbo preskusa s počasnim mešanjem ter rednim vzorčenjem vode in 1-oktanola. Intervali vzorčenja morajo znašati najmanj pet ur. | 38. | POW je treba vsakič določiti z vsaj tremi neodvisnimi preskusi s počasnim mešanjem. | Določanje časa do vzpostavitve ravnotežja | 39. | Domneva se, da je ravnotežje doseženo, ko regresija razmerja koncentracij 1-oktanol/voda glede na čas v obdobju štirih časovnih točk da naklon, ki ne odstopa bistveno od nič pri vrednosti p = 0,05. Najkrajši čas do vzpostavitve ravnotežja je en dan pred začetkom vzorčenja. Načeloma se lahko vzorčenje snovi, katerih log POW je ocenjen na manj kot 5, opravi drugi in tretji dan. Pri bolj hidrofobnih spojinah bo morda treba vzpostavljanje ravnotežja podaljšati. Za spojino z log POW 8,23 (dekaklorobifenil) je bilo za uravnoteženje potrebnih 144 ur. Ravnotežje se oceni z večkratnim vzorčenjem v isti posodi. | Začetek preskusa | 40. | Na začetku preskusa se reakcijska posoda napolni z vodo, nasičeno z 1-oktanolom. Dopustiti je treba dovolj časa, da se doseže termostatirana temperatura. | 41. | Želena količina preskusne snovi (raztopljene v zahtevanem volumnu 1-oktanola, nasičenega z vodo) se pazljivo doda v reakcijsko posodo. To je ključni korak v preskusu, saj se je treba izogniti turbulentnemu mešanju obeh faz. V ta namen je treba fazo 1-oktanola s pipeto počasi dodajati na steno preskusne posode blizu vodne površine. Tako bo zadevna faza tekla stekla po steni in ustvarila film nad vodno fazo. Vedno se je treba izogibati odlivanju 1-oktanola neposredno v posodo; kapljice 1-oktanola ne smejo padati neposredno v vodo. | 42. | Po začetku mešanja je treba njegovo hitrost počasi povečevati. Če mešalnih motorjev ni mogoče ustrezno prilagoditi, je treba razmisliti o uporabi transformatorja. Hitrost mešanja je treba nastaviti tako, da se na prehodu med vodo in 1-oktanolom ustvari vrtinec, globok 0,5 do največ 2,5 cm. Hitrost mešanja je treba zmanjšati, če globina vrtinca preseže 2,5 cm; v nasprotnem primeru se lahko iz kapljic 1-oktanola v vodni fazi tvorijo mikrokapljice, kar privede do precenjevanja koncentracije preskusne snovi v vodi. Največja hitrost mešanja 2,5 cm se priporoča na podlagi ugotovitev primerjalne validacijske študije (5). Je kompromis med hitrim vzpostavljanjem ravnotežja in omejevanjem tvorbe mikrokapljic 1-oktanola. | Vzorčenje in obdelava vzorcev | 43. | Pred vzorčenjem je treba mešalo izključiti in počakati, da se tekočine umirijo. Po končanem vzorčenju se mešalo počasi znova zažene, kot je opisano zgoraj, zatem pa se hitrost mešanja postopno povečuje. | 44. | Vodna faza se vzorči z uporabo petelinčka na dnu reakcijske posode. Mrtvi volumen vode, ki ga vsebuje pipica (pri posodi, prikazani v Dodatku 2, je to približno 5 ml), se vedno zavrže. Voda v pipici ni premešana in zato ni uravnotežena z glavnino. Volumen vzorcev vode je treba zabeležiti, paziti pa je treba, da se pri določanju masne bilance upošteva količina preskusne snovi v zavrženi vodi. Izgube zaradi izhlapevanja je treba čim bolj zmanjšati, tako da se pusti voda mirno teči v lij ločnik, ne da bi prišlo do motenj v plasti vode/1-oktanola. | 45. | Vzorci 1-oktanola se pridobijo tako, da se s 100-mikrolitrsko stekleno-kovinsko brizgo iz plasti 1-oktanola odvzame majhen alikvot (približno 100 μl). Paziti je treba, da se ne povzročijo motnje na prehodu faz. Volumen vzorčene tekočine se zabeleži. Zadošča že majhen alikvot, saj bo vzorec 1-oktanola razredčen. | 46. | Izogibati se je treba nepotrebnim korakom pri prenosu vzorcev. V ta namen je treba volumen vzorca določiti gravimetrično. Pri vzorcih vode se to lahko doseže tako, da se vzorec vode zbere v liju ločniku, ki že vsebuje zahtevani volumen topila. | PODATKI IN POROČANJE | 47. | V skladu s to preskusno metodo se POW določi tako, da se v enakih pogojih opravijo trije preskusi s počasnim mešanjem (tri preskusne enote) s preiskovano spojino. Regresija, ki se uporabi za dokaz doseženega ravnotežja, mora temeljiti na rezultatih vsaj štirih določitev CO/CW v zaporednih časovnih točkah. S tem se omogoči izračun variance kot merila nezanesljivosti povprečne vrednosti, dobljene v vsaki preskusni enoti. | 48. | POW se lahko označuje z varianco v dobljenih podatkih za vsako preskusno enoto. Ta podatek se uporabi za izračun POW kot tehtanega povprečja rezultatov posameznih preskusnih enot. V ta namen se kot utež uporabi obratna vrednost variance rezultatov preskusnih enot. Posledično imajo podatki z velikim odstopanjem (izraženim kot varianca) in torej manjšo zanesljivostjo manjši vpliv na rezultat kot podatki z majhno varianco. | 49. | Podobno se izračuna tehtani standardni odklon. Ta označuje ponovljivost merjenja POW. Nizka vrednost tehtanega standardnega odklona kaže, da je bilo določanje POW v okviru enega laboratorija zelo ponovljivo. Formalna statistična obdelava podatkov je opisana v nadaljevanju. | Obdelava rezultatov | Dokaz doseženega ravnotežja | 50. | Logaritem razmerja koncentracij preskusne snovi v 1-oktanolu in vodi (log (CO/Cw)) se izračuna za vsak čas vzorčenja. Doseženo kemijsko ravnotežje se dokaže z grafičnim prikazom tega razmerja glede na čas. Konstantna raven v tem grafičnem prikazu, ki temelji na vsaj štirih zaporednih časovnih točkah, kaže, da je bilo ravnotežje doseženo in da je spojina popolnoma raztopljena v 1-oktanolu. V nasprotnem primeru je treba preskus nadaljevati, dokler štiri zaporedne časovne točke ne dajo naklona, ki ne odstopa bistveno od nič pri vrednosti p = 0,05, kar kaže, da je log Co/Cw neodvisen od časa. | Izračun log POW | 51. | Vrednost log POW preskusne enote se izračuna kot tehtana povprečna vrednost log Co/Cw za tisti del krivulje log Co/Cw v odvisnosti od časa, za katerega je bilo prikazano ravnotežje. Tehtano povprečje se izračuna z uteževanjem podatkov z obratno vrednostjo variance, tako da je vpliv podatkov na končni rezultat obratno sorazmeren z nezanesljivostjo podatkov. | Povprečni log POW | 52. | Povprečna vrednost log POW različnih preskusnih enot se izračuna kot povprečje rezultatov posameznih preskusnih enot, uteženih z njihovimi posameznimi variancami. | Izračun se opravi tako: | kjer je | log POW,i | = | vrednost log POW posamezne preskusne enote i; | log POW,Av | = | tehtana povprečna vrednost posameznih določitev log POW; | wi | = | statistična utež, dodeljena vrednosti log POW preskusne enote i. | Obratna vrednost variance log POW,i se uporabi kot wi ( | ). | 53. | Napaka povprečne vrednosti log POW se oceni kot ponovljivost log Co/Cw, določenega med fazo vzpostavljanja ravnotežja v posameznih preskusnih enotah. Izražena je kot tehtani standardni odklon log POW,Av (σlog Pow,Av), ki je merilo napake, povezane s POW,Av. Tehtani standardni odklon se lahko izračuna iz tehtane variance (varlog Pow,Av) tako: | Simbol n predstavlja število preskusnih enot. | Poročilo o preskusu | 54. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna snov | — | splošno ime, kemijsko ime, številko CAS, strukturno formulo (v kateri je naveden položaj označevalca, kadar je uporabljena izotopsko označena snov) in zadevne fizikalno-kemijske lastnosti (glej odstavek 17), | — | čistost (nečistote) preskusne snovi, | — | čistost označevalca označenih kemikalij in molarno aktivnost (kjer je ustrezno), | — | predhodno oceno log POW in metodo, uporabljeno za izpeljavo vrednosti. | | Preskusni pogoji | — | datume izvajanja študij, | — | temperaturo med preskusom, | — | volumne 1-oktanola in vode na začetku preskusa, | — | volumne odvzetih vzorcev 1-oktanola in vode, | — | volumne 1-oktanola in vode, ki so preostali v preskusnih posodah, | — | opis uporabljenih preskusnih posod in pogojev mešanja (geometrija mešalne palice in preskusne posode, globina vrtinca v mm in, kadar je na voljo, hitrost mešanja), | — | uporabljene analitske metode za določanje preskusne snovi in meje določljivosti metod, | — | čase vzorčenja, | — | pH vodne faze in uporabljene pufre, kadar se pH prilagodi za molekule, ki lahko ionizirajo, | — | število ponovitev. | | Rezultati | — | ponovljivost in občutljivost uporabljenih analitskih metod, | — | ugotovljene koncentracije preskusne snovi v 1-oktanolu in vodi v odvisnosti od časa, | — | prikaz masne bilance, | — | temperaturo in standardni odklon ali temperaturno območje med preskusom, | — | regresijo razmerja koncentracij v odvisnosti od časa, | — | povprečno vrednost log POW,Av in njeno standardno napako, | — | razpravo in razlago rezultatov, | — | primere surovih podatkov reprezentativne analize (vse surove podatke je treba shraniti v skladu s standardi dobre laboratorijske prakse), vključno z izkoristki nadomestkov, številom ravni, uporabljenih v umerjanju (skupaj z merili za korelacijski koeficient umeritvene krivulje), in rezultate zagotavljanja/nadzora kakovosti (QA/QC), | — | kadar je na voljo, validacijsko poročilo o postopku analize (ki se navede med viri). | VIRI: | (1) | De Bruijn, J. H. M., Busser, F., Seinen, W., Hermens, J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the ‚slow-stirring‘ method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499–512. | (2) | Poglavje A.8 te priloge, Porazdelitveni koeficient. | (3) | Poglavje A.8 te priloge, Porazdelitveni koeficient. | (4) | OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Pariz. | (5) | Tolls, J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01. | (6) | Boethling, R. S., Mackay, D. (ur.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, ZDA. | (7) | Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, New York, NY. | (8) | Arnold, C. G., Widenhaupt, A., David, M. M., Müller, S. R., Haderlein, S. 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American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 do 2-52. | (16) | Leo, A., Weininger, D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA. | (17) | Meylan, W. (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y. | (18) | Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budimpešta. | (19) | ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Kanada, 2001. | (20) | Lyman, W. J. (1990). Octanol/water partition coefficient. V: Lyman, W. J., Reehl, W. F., Rosenblatt, D. H. (ur.). Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C. | (21) | Rekker, R. F., de Kort, H. M. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479–488. | (22) | Jübermann, O. (1958). Houben-Weyl (ur.), Methoden der Organischen Chemie: 386–390. | Dodatek 1 | Preglednice za izračun najmanjših volumnov vode, potrebnih za zaznavanje preskusnih snovi z različnimi vrednostmi log Pow v vodni fazi | Predpostavke: | — | največji volumen posameznih alikvotov = 10 % skupnega volumna; 5 alikvotov = 50 % skupnega volumna, | — | . V primeru nižjih koncentracij so potrebni večji volumni, | — | volumen, uporabljen za določitev LOD = 100 ml, | — | log POW v odvisnosti od log SW in log POW v odvisnosti od SR (SOKT/SW) smiselno predstavljata razmerja za preskusne snovi. | Ocena Sw | log Pow | enačba | log Sw | Sw (mg/l) | 4 | 0,496 | 3,133E+00 | 4,5 | 0,035 | 1,084E+00 | 5 | –0,426 | 3,750E-01 | 5,5 | –0,887 | 1,297E-01 | 6 | –1,348 | 4,487E-02 | 6,5 | –1,809 | 1,552E-02 | 7 | –2,270 | 5,370E-03 | 7,5 | –2,731 | 1,858E-03 | 8 | –3,192 | 6,427E-04 | Ocena Sokt | log Pow | enačba | Sokt (mg/l) | 4 | 3,763E+04 | 4,5 | 4,816E+04 | 5 | 6,165E+04 | 5,5 | 7,890E+04 | 6 | 1,010E+05 | 6,5 | 1,293E+05 | 7 | 1,654E+05 | 7,5 | 2,117E+05 | 8 | 2,710E+05 | Skupna masa preskusne snovi | (mg) | masaokt/masavoda | masaH2O | (mg) | koncH2O | (mg/l) | masaokt | (mg) | koncokt | (mg/l) | 1 319 | 526 | 2,5017 | 2,6333 | 1 317 | 26 333 | 1 686 | 1 664 | 1,0127 | 1,0660 | 1 685 | 33 709 | 2 158 | 5 263 | 0,4099 | 0,4315 | 2 157 | 43 149 | 2 762 | 16 644 | 0,1659 | 0,1747 | 2 762 | 55 230 | 3 535 | 52 632 | 0,0672 | 0,0707 | 3 535 | 70 691 | 4 524 | 1664 36 | 0,0272 | 0,0286 | 4 524 | 90 480 | 5 790 | 5263 16 | 0,0110 | 0,0116 | 5 790 | 115 807 | 7 411 | 1 664 357 | 0,0045 | 0,0047 | 7 411 | 148 223 | 9 486 | 5 263 158 | 0,0018 | 0,0019 | 9 486 | 189 713 | Izračun volumnov | Najmanjši potrebni volumen za fazo H2O pri vsaki koncentraciji LOD | log Kow | LOD (mikrogrami/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | | 0,04 | 0,38 | 3,80 | 38 | 380 | 4,5 | | 0,09 | 0,94 | 9,38 | 94 | 938 | 5 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 232 | 2 318 | 5,5 | | 0,57 | 5,73 | 57,26 | 573 | 5 726 | 6 | | 1,41 | 14,15 | 141 | 1 415 | 14 146 | 6,5 | | 3,50 | 34,95 | 350 | 3 495 | 34 950 | 7 | | 8,64 | 86,35 | 864 | 8 635 | 86 351 | 7,5 | | 21,33 | 213 | 2 133 | 21 335 | 213 346 | 8 | | 52,71 | 527 | 5 271 | 52 711 | 527 111 | Volumen, uporabljen za LOD (I) | 0,1 | | | | | | Ključ za izračune | Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, litrska posoda za vzpostavljanje ravnotežja. | Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 2-litrska posoda za vzpostavljanje ravnotežja. | Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 5-litrska posoda za vzpostavljanje ravnotežja. | Predstavlja < 10 % skupnega volumna vodne faze, 10-litrska posoda za vzpostavljanje ravnotežja. | Presega 10 % celo 10-litrske posode za vzpostavljanje ravnotežja. | Pregled potrebnih volumnov v odvisnosti od topnosti v vodi in log POW | Najmanjši potrebni volumen za fazo H2O pri vsaki koncentraciji LOD (ml) | log Pow | Sw (mg/l) | LOD (mikrogrami/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 | 4 | 10 | | 0,01 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | | 5 | | 0,02 | 0,24 | 2,38 | 23,80 | 237,97 | | 3 | | 0,04 | 0,40 | 3,97 | 39,66 | 396,62 | | 1 | | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | 1 189,86 | 4,5 | 5 | | 0,02 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | | 2 | | 0,05 | 0,51 | 5,08 | 50,84 | 508,42 | | 1 | | 0,10 | 1,02 | 10,17 | 101,68 | 1 016,83 | | 0,5 | | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | 2 033,67 | 5 | 1 | | 0,09 | 0,87 | 8,69 | 86,90 | 869,01 | | 0,5 | | 0,17 | 1,74 | 17,38 | 173,80 | 1 738,02 | | 0,375 | | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 231,75 | 2 317,53 | | 0,2 | | 0,43 | 4,35 | 43,45 | 434,51 | 4 345,05 | 5,5 | 0,4 | | 0,19 | 1,86 | 18,57 | 185,68 | 1 856,79 | | 0,2 | | 0,37 | 3,71 | 37,14 | 371,36 | 3 713,59 | | 0,1 | | 0,74 | 7,43 | 74,27 | 742,72 | 7 427,17 | | 0,05 | | 1,49 | 14,85 | 148,54 | 1 485,43 | 14 854,35 | 6 | 0,1 | | 0,63 | 6,35 | 63,48 | 634,80 | 6 347,95 | | 0,05 | | 1,27 | 12,70 | 126,96 | 1 269,59 | 12 695,91 | | 0,025 | | 2,54 | 25,39 | 253,92 | 2 539,18 | 25 391,82 | | 0,0125 | | 5,08 | 50,78 | 507,84 | 5 078,36 | 50 783,64 | 6,5 | 0,025 | | 2,17 | 21,70 | 217,02 | 2 170,25 | 21 702,46 | | 0,0125 | | 4,34 | 43,40 | 434,05 | 4 340,49 | 43 404,93 | | 0,006 | | 9,04 | 90,43 | 904,27 | 9 042,69 | 90 426,93 | | 0,003 | | 18,09 | 180,85 | 1 808,54 | 18 085,39 | 180 853,86 | 7 | 0,006 | | 7,73 | 77,29 | 772,89 | 7 728,85 | 77 288,50 | | 0,003 | | 15,46 | 154,58 | 1 545,77 | 15 457,70 | 154 577,01 | | 0,0015 | | 23,19 | 231,87 | 2 318,66 | 23 186,55 | 231 865,51 | | 0,001 | | 46,37 | 463,73 | 4 637,31 | 46 373,10 | 463 731,03 | 7,5 | 0,002 | | 19,82 | 198,18 | 1 981,77 | 19 817,73 | 198 177,33 | | 0,001 | | 39,64 | 396,35 | 3 963,55 | 39 635,47 | 396 354,66 | | 0,0005 | | 79,27 | 792,71 | 7 927,09 | 79 270,93 | 792 709,32 | | 0,00025 | | 158,54 | 1 585,42 | 15 854,19 | 158 541,86 | 1 585 418,63 | 8 | 0,001 | | 33,88 | 338,77 | 3 387,68 | 33 876,77 | 338 767,72 | | 0,0005 | | 67,75 | 677,54 | 6 775,35 | 67 753,54 | 677 535,44 | | 0,00025 | | 135,51 | 1 355,07 | 13 550,71 | 135 507,09 | 1 355 070,89 | | 0,000125 | | 271,01 | 2 710,14 | 27 101,42 | 271 014,18 | 2 710 141,77 | Volumen, uporabljen za LOD (I) | 0,1 | | | | | | Dodatek 2 | Primer preskusne posode s stekleno oblogo za preskus s počasnim mešanjem za določanje POW | “ |
| 3) | il capitolo B.2 è sostituito dal seguente: | «B.2. TOSSICITÀ ACUTA PER INALAZIONE | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova equivale alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 403 (2009) (1). La prima linea guida sulla tossicità acuta per inalazione n. 403 è stata adottata nel 1981. Questo metodo di prova rivisto B.2 (equivalente alla linea guida n. 403 rivista) è stato concepito per offrire una maggior flessibilità, ridurre l’utilizzo di animali e rispondere alle prescrizioni normative. Questo metodo di prova prevede due tipi di studi: un protocollo tradizionale di determinazione della LC50 e un protocollo “concentrazione × tempo” (C × t). Le caratteristiche principali di questo metodo di prova sono la capacità di ottenere un rapporto concentrazione/risposta che va da “letale” a “non letale” al fine del calcolo della mediana della concentrazione letale (CL50), della soglia di concentrazione non letale (come la CL01) e della pendenza, nonché la capacità di determinare un’eventuale sensibilità legata al sesso. Il protocollo C × t deve essere utilizzato quando sussiste una particolare esigenza scientifica o normativa che preveda una prova su animali per varie durate di esposizione, ad esempio per la pianificazione territoriale o la pianificazione della risposta di emergenza [per ottenere, ad esempio, i livelli guida di esposizione acuta (Acute Exposure Guideline Levels — AEGL), le raccomandazioni per la pianificazione delle misure di emergenza (Emergency Response Planning Guidelines — ERPG), o i livelli soglia di esposizione acuta (Acute Exposure Threshold Levels — AETL)]. | 2. | Nel documento d’orientamento sulla prove di tossicità acuta per inalazione (documento d’orientamento n. 39) (2) sono riportate indicazioni sulla realizzazione e l’interpretazione degli studi legati a questo metodo di prova. | 3. | Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono specificate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento n. 39 (2). | 4. | Questo metodo di prova consente di caratterizzare le sostanze in esame, di sottoporle ad una valutazione quantitativa dei rischi e di classificarle a norma del regolamento (CE) n. 1272/2008 (3). Il documento di orientamento n. 39 (2) fornisce indicazioni per la scelta del metodo di prova adeguato per le prove di tossicità acuta. Quando sono necessarie solo informazioni sulla classificazione e l’etichettatura, si raccomanda di far riferimento al capitolo B.52 del presente allegato (4) [cfr. documento d’orientamento n. 39 (2)]. Questo metodo di prova B.2 non è specificamente destinato a testare materiali speciali come le sostanze isometriche o fibrose poco solubili o i nanomateriali di sintesi. | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 5. | Prima di decidere di avvalersi di questo metodo di prova, il laboratorio che esegue la prova deve esaminare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame, ivi compresi gli studi esistenti [ad esempio capitolo B.52 del presente allegato (4)] i cui risultati renderebbero inutili prove aggiuntive, al fine di ricorrere il meno possibile agli animali. Tra le informazioni utili per la scelta della specie, del ceppo, del sesso, della modalità di esposizione e delle concentrazioni più adeguati, rientrano l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame; i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo; gli impieghi previsti e il potenziale in termini di esposizione umana; dati (Q)SAR e dati tossicologici disponibili su sostanze chimiche di struttura affine [cfr. documento d’orientamento n. 39 (2)]. | 6. | Occorre evitare il più possibile di testare sostanze chimiche corrosive o gravemente irritanti a concentrazioni che possono provocare dolore e sofferenza intensi. Per stabilire se sia possibile evitare prove aggiuntive, occorre valutare il potenziale di corrosione/irritazione secondo i criteri degli specialisti in funzione degli elementi seguenti: dati sperimentali sull’uomo e l’animale (provenienti, ad esempio, da prove a dosi ripetute realizzate a concentrazioni non corrosive né irritanti), dati in vitro disponibili [ad esempio dai capitoli B.40 (5), B.40 bis (6) del presente allegato o dalla linea guida dell’OCSE n. 435 (7)], valori del pH, informazioni concernenti sostanze analoghe o qualsiasi altro dato pertinente. Per specifiche esigenze normative (ad esempio per la pianificazione di emergenza), questo metodo di prova può essere utilizzato per esporre animali a sostanze di questo tipo in quanto consente al responsabile dello studio o al ricercatore principale di scegliere le concentrazioni. Tuttavia le concentrazioni auspicate non devono avere effetti corrosivi/irritanti gravi, pur essendo sufficienti a prolungare la curva concentrazione-risposta fino a livelli corrispondenti all’obiettivo scientifico e normativo della prova. Occorre sempre giustificare le concentrazioni scelte [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. | PRINCIPIO DELLA PROVA | 7. | Questo metodo di prova rivisto B.2 è stato concepito per ottenere informazioni sufficienti sulla tossicità acuta di una sostanza chimica al fine di consentirne la classificazione e fornire dati sulla letalità (CL50, CL01 e inclinazione) per uno o entrambi i sessi. Questi dati sono necessari per le valutazioni quantitative dei rischi. Il metodo in questione prevede due procedure diverse. La prima è un protocollo tradizionale in cui gruppi di animali sono esposti ad una concentrazione limite (prova limite) o a una serie di concentrazioni secondo una procedura articolata in fasi successive per una durata prestabilita, di solito pari a 4 ore. Se necessario per motivi regolamentari, la durata dell’esposizione può essere diversa. La seconda procedura è un protocollo (“C × t”) in cui gruppi di animali sono esposti ad una concentrazione (concentrazione limite) o a una serie di concentrazioni diverse per durate diverse. | 8. | Ai fini dell’interpretazione dei risultati della prova, gli animali moribondi o che manifestano segni evidenti di dolore o di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia e considerati alla stregua degli animali morti naturalmente nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di uno documento d’orientamento specifico, che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (8). | DESCRIZIONE DEL METODO | Selezione delle specie animali | 9. | Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. La specie generalmente utilizzata è il ratto e occorre motivare l’eventuale scelta di una specie diversa. | Preparazione degli animali | 10. | Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno dell’esposizione, gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 8 e 12 settimane il cui peso corporeo non deve superare, per ciascun sesso, ± 20 % del peso medio degli animali di ciascun sesso della stessa età precedentemente esposti. Gli animali sono scelti a caso e marcati per l’identificazione individuale. Affinché si adattino alle condizioni di laboratorio, devono essere lasciati nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova e, poco prima della prova, vanno anche acclimatati alle apparecchiature di prova per attenuare la tensione causata dal nuovo ambiente. | Condizioni di allevamento degli animali | 11. | La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene unicamente per via nasale, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sugli effetti misurati (endpoint) fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respiratorio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adattamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti “a corpo intero” ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da laboratorio, accompagnate da acqua a volontà. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. | Camere di inalazione | 12. | La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposizione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione “a naso solo” per gli studi di aerosol liquidi o solidi e per i vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione “a corpo intero” può essere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità atmosferica di una camera di esposizione “a corpo intero”, il volume complessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i principi delle tecniche di esposizione “a corpo intero” e per sola via nasale, nonché i relativi vantaggi e svantaggi. | CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE | Somministrazione delle concentrazioni | 13. | Le esposizioni “a naso solo” possono durare fino a 6 ore per i ratti. Nel caso dei topi, questa forma di esposizione deve durare al massimo 4 ore. Qualora siano necessari esposizioni di più lunga durata, occorre spiegarne il motivo [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Gli animali esposti agli aerosol in camere “a corpo intero” devono essere sistemati individualmente per evitare l’ingestione della sostanza in esame nel corso della pulizia degli altri animali presenti nella stessa gabbia. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa. Nel corso dell’esposizione “a corpo intero” si può continuare a somministrare acqua. | 14. | Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, dalla concentrazione prescelta e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che si presenti nel corso della sua manipolazione e del suo utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere saggiate in atmosfera secca. Occorre prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive. | Distribuzione granulometrica | 15. | La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare degli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) compreso tra 1 e 4 μm con una deviazione standard geometrica (σg) compresa tra 1,5 e 3,0 (2) (9) (10). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario il parere di uno specialista. Ad esempio, le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole del limite inferiore sopraindicato, e le particelle caricate, le fibre e i materiali igroscopici (le cui dimensioni aumentano nell’ambiente umido delle vie respiratorie) possono oltrepassare il limite superiore. | Preparazione della sostanza in esame in un veicolo | 16. | Per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in esame nell’atmosfera si può utilizzare un veicolo. Di norma è preferibile utilizzare l’acqua. Le particelle possono essere sottoposte a processi meccanici per ottenere la distribuzione granulometrica voluta, tuttavia occorre prestare attenzione a non decomporre o alterare la sostanza in esame. Qualora si ritenga che i processi meccanici abbiano alterato la composizione della sostanza in esame (temperatura estrema dovuta alla frizione da eccessiva macinazione), occorrerà verificare mediante analisi la composizione della sostanza in esame. Occorre prestare particolare attenzione a non contaminare la sostanza in esame. Non è necessario testare le materie granulari non friabili, appositamente concepite per essere non inalabili. Per dimostrare che la manipolazione del materiale granulare non produce particelle respirabili, effettuare una prova di logorio per attrito. Se la prova di logorio produce sostanze respirabili, occorre effettuare una prova di tossicità per inalazione. | Animali di controllo | 17. | Non è necessario un gruppo di controllo negativo (aria) in parallelo. Se per produrre l’atmosfera di prova si utilizza un veicolo diverso dall’acqua, è necessario allestire un gruppo di controllo del veicolo solo se non si dispone di dati storici sulla tossicità. Se in uno studio di tossicità della sostanza in esame in un mezzo non si rileva tossicità, ciò significa che il mezzo non è tossico alla concentrazione in questione; pertanto non occorre un gruppo di controllo del veicolo. | MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE | Flusso d’aria nella camera di esposizione | 18. | Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio della concentrazione (o stabilità) dell’atmosfera di prova costituisce una misurazione permanente di tutti i parametri dinamici e un modo indiretto di controllare quelli che regolano la produzione dell’atmosfera di prova. Nelle camere d’esposizione “a naso solo”, si farà il possibile, per evitare la reinalazione qualora il flusso d’aria attraverso il sistema di esposizione non sia in grado di garantire una circolazione dinamica dell’atmosfera di prova. Esistono metodi specifici cui si può ricorrere per dimostrare che non si verificano reinalazioni nelle condizioni sperimentali prescelte (2) (11). La concentrazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non poter rispettare questi standard, è necessario misurarle. | Temperatura e umidità relativa della camera | 19. | La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. L’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale, sia per le esposizioni “a naso solo” che per quelle “a corpo intero”, è monitorata e registrata almeno tre volte (per le prove che durano fino a 4 ore) e tutte le ore per le durate più brevi. L’umidità relativa deve idealmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, quando si testano miscele acquose) o che l’umidità non possa essere misurata per via delle interferenze della sostanza in esame con il metodo di prova. | Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale | 20. | Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla divisione della massa generata dalla sostanza in esame per il volume totale di aria circolata nella camera. La concentrazione nominale non serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficienza di produzione del sistema di prova e può essere utile per individuare eventuali problemi a questo livello. | Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale | 21. | La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica è accettabile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su opportune caratterizzazioni, specifiche per la sostanza in esame, effettuate prima dello studio. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per determinare la concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti in polvere, ma occorrono dati analitici che dimostrino che la composizione del materiale in sospensione nell’aria è analoga a quella del materiale di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente sotto forma di aerosol) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto. Le concentrazioni bersaglio nominali e reali devono essere riportate nella relazione, ma nell’analisi statistica per il calcolo dei valori delle concentrazioni letali sono utilizzate solo le concentrazioni reali. | 22. | Si deve utilizzare, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il campione allo studio va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità di contaminanti e di impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area di picco, peso molecolare risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, o altre stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione è opportuno che confermi almeno in parte la caratterizzazione del cliente (colore, natura fisica ecc.). | 23. | L’atmosfera di esposizione è mantenuta il più costante possibile e monitorata in continuo e/o in modo intermittente secondo il metodo di analisi. Quando si procede ad un campionamento intermittente, in uno studio di quattro ore si devono raccogliere campioni dell’atmosfera della camera almeno due volte. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un solo campione nell’intero periodo di esposizione. Se si osservano evidenti fluttuazioni da un campione all’altro, per le concentrazioni successive si devono prelevare quattro campioni per esposizione. Gli scarti di concentrazione in ogni camera e la concentrazione media non devono superare ± 10 % per i gas e i vapori o ± 20 % per gli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera di esposizione (t95) La durata di un’esposizione coincide con il tempo di produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario per ottenere il t95. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene indicazioni per la stima di t95. | 24. | Per le miscele molto complesse costituite da gas o vapori e da aerosol (atmosfere di combustione o sostanze di prova propulse da prodotti/dispositivi specializzati, ad esempio), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere una sostanza indicatrice (analita). Quando la sostanza in esame è una miscela, la concentrazione analitica dovrà essere indicata per la preparazione e non solo per la sostanza attiva o il componente (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni reali sono reperibili nel documento d’orientamento n. 39 (2). | Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica | 25. | La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata almeno due volte nel corso di ciascuna esposizione di 4 ore, utilizzando un impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS (Aerodynamic Particle Sizer). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e con un altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato nel corso dell’intero studio. Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta mediante l’analisi su filtro [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa equivalenza viene stabilita nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misurazioni di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere un’esposizione. È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che possono condensarsi e formare aerosol o se, in un’atmosfera di vapore, si rilevano particelle che si presume possano formare fasi miste (cfr. paragrafo 15). | PROCEDURA | 26. | Qui di seguito sono descritti due tipi di studio: il protocollo tradizionale e il protocollo C × t. Entrambi i protocolli possono comprendere uno studio di osservazione, uno studio principale e/o una prova limite (protocollo tradizionale) o una prova a concentrazione limite (C × t). Se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile, il responsabile dello studio può scegliere di effettuare queste prove solo con animali di questo sesso. Se per l’esposizione “a naso solo” s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. Prima di iniziare lo studio, è opportuno esaminare tutti i dati disponibili al fine di ridurre al minimo l’utilizzo di animali. Ad esempio, i dati ottenuti sulla base del capitolo B.52 del presente allegato (4) possono rendere superfluo lo studio di osservazione e dimostrare anche se uno dei due sessi è più sensibile [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. | PROTOCOLLO TRADIZIONALE: | Osservazioni generali: Protocollo tradizionale | 27. | In uno studio tradizionale, gruppi di animali sono esposti a una sostanza di prova per un periodo stabilito di tempo (generalmente 4 ore) in una camera di esposizione “a naso solo” o “a corpo intero”. Gli animali sono esposti ad una concentrazione limite (prova limite) o ad almeno tre concentrazioni in fasi successive (studio principale). Lo studio principale può essere preceduto da uno studio di osservazione, a meno che non si disponga già di alcune informazioni sulla sostanza in esame, tratte da uno studio B.52 precedente [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. | Studio di osservazione: Protocollo tradizionale | 28. | Uno studio di osservazione consente di stimare l’attività della sostanza in esame, di individuare le differenze tra i sessi in termini di sensibilità alla sostanza, e di scegliere più agevolmente i livelli di concentrazione per lo studio principale o la prova limite. Al momento della scelta dei livelli di concentrazione per lo studio di osservazione, è opportuno utilizzare tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i dati (Q)SAR e i dati relativi a sostanze chimiche analoghe. Per ogni concentrazione, è opportuno esporre al massimo tre maschi e tre femmine (può essere necessario utilizzare tre animali per sesso per stabilire una differenza di sensibilità tra i sessi). Uno studio di osservazione può essere effettuato con un’unica concentrazione, ma se necessario si possono testare più concentrazioni. Questo studio non deve vertere su un numero di animali e di concentrazioni analogo a quello utilizzato per uno studio principale. Invece di effettuare uno studio di osservazione, è possibile utilizzare i risultati di uno studio B.52 (4) precedente [cfr. documento di orientamento n. 39(2)]. | Prova limite: Protocollo tradizionale | 29. | Un prova limite viene effettuata quando si sa per certo o si prevede che la sostanza di prova sarà praticamente non tossica, ossia determinerà una reazione di tossicità solo al di sopra della concentrazione limite regolamentare. In una prova limite, un solo gruppo di tre maschi e tre femmine è esposto alla sostanza in esame ad una concentrazione limite. Le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame possono essere ricavate da conoscenze relative a sostanze simili testate, tenendo conto dell’identità e della percentuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologica. Nel caso in cui le informazioni sulla tossicità della sostanza siano scarse o nulle, o in cui ci si attenda che la sostanza in esame sia tossica, occorre eseguire la prova principale. | 30. | La scelta delle concentrazioni limite dipende in genere dagli obblighi normativi. Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentrazioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 ppm, 20 mg/l e 5 mg/l (o, altrimenti, la concentrazione massima raggiungibile) (3). Può risultare tecnicamente difficile raggiungere le concentrazioni limite di alcune sostanze, in particolare se si tratta di vapori e aerosol. Per le prove con aerosol, l’obiettivo principale è giungere ad una dimensione delle particelle che sia respirabile (ossia DAMM da 1 a 4 μm), il che è possibile con la maggior parte delle sostanze testate ad una concentrazione di 2 mg/l. [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Il regolamento (CE) n. 1272/2008 sconsiglia di effettuare delle prove a concentrazioni superiori alla concentrazione limite per ragioni di benessere degli animali. Le prove con concentrazioni limite devono essere prese in considerazione solo quando è molto probabile che i loro risultati rivestano un interesse diretto per la protezione della salute umana (3) e, in tal caso, occorre spiegarlo nella relazione. Nel caso di sostanze potenzialmente esplosive si devono adottare precauzioni per evitare condizioni che favoriscano un’esplosione. Per evitare il ricorso inutile ad animali, occorre effettuare una prova senza animali prima della prova limite, per accertarsi che sia possibile ottenere le condizioni di prova nella camera. | 31. | Se alla concentrazione limite si registrano mortalità o stati di agonia, i risultati della prova limite possono fungere da studio di osservazione per ulteriori prove a concentrazioni diverse (cfr. studio principale). Se le proprietà fisiche o chimiche di una sostanza in esame impediscono di raggiungere una concentrazione limite, occorrerà testare la massima concentrazione raggiungibile. Se la letalità a questa concentrazione è inferiore al 50 %, non occorre proseguire la prova. Qualora non sia stato possibile raggiungere la concentrazione massima, occorre fornire, nella relazione di studio, una spiegazione e dati giustificativi. Se la concentrazione massima raggiungibile per un vapore non comporta tossicità, può essere necessario produrre la sostanza in esame sotto forma di aerosol liquido. | Studio principale: Protocollo tradizionale | 32. | In uno studio principale di norma si utilizzano cinque maschi e cinque femmine (o cinque animali del sesso più sensibile, se noto) per livello di concentrazione, con almeno tre livelli diversi di concentrazione. Per effettuare un’adeguata analisi statistica, occorre prevedere un numero sufficiente di livelli di concentrazione. L’intervallo di tempo tra l’esposizione dei vari gruppi è determinato dalla comparsa, dalla durata e dalla gravità dei segni di tossicità rilevati. L’esposizione al livello di concentrazione superiore deve essere ritardata fino a quando non si abbia la ragionevole certezza che gli animali già sottoposti alla prova siano sopravvissuti. Il responsabile dello studio può in tal caso adeguare la concentrazione “bersaglio” per il gruppo successivo. Per gli studi sulla tossicità per inalazione, che richiedono tecnologie sofisticate, non sarà sempre possibile procedere in questo modo; in tal caso l’esposizione degli animali alla concentrazione superiore si dovrà basare sull’esperienza acquisita e sui pareri di esperti. Per le prove riguardanti le miscele, è opportuno fare riferimento al documento di orientamento n. 39 (2). | PROTOCOLLO “CONCENTRAZIONE × TEMPO” (C × T) | Osservazioni generali: Protocollo C × t | 33. | Uno studio sequenziale “concentrazione × tempo” (C × t) può costituire un’alternativa al protocollo tradizionale quando si tratta di valutare la tossicità per inalazione (12) (13) (14). Nell’ambito di questo approccio gli animali sono esposti alla sostanza in esame a vari livelli di concentrazione e per durate di esposizioni variabili. Tutte le prove sono effettuate in camere di esposizione “a naso solo”, in quanto le camere “a corpo intero” non sono adatte a questo protocollo. Il diagramma di flusso all’appendice 1 illustra questo protocollo. Un’analisi di simulazione ha evidenziato che il protocollo tradizionale e il protocollo C × t erano entrambi in grado di fornire valori affidabili della CL50 ma che il protocollo C × t consentiva generalmente di ottenere valori più affidabili per la CL01 e la CL10 (15). | 34. | Un’analisi di simulazione ha evidenziato che generalmente è opportuno utilizzare due animali per intervallo di C × t (un animale di ciascun sesso o due animali del sesso più sensibile) per testare 4 concentrazioni e 5 durate di esposizione nel corso di uno studio principale. Il responsabile dello studio, in determinate circostanze, può decidere di utilizzare due ratti per sesso per intervallo di C × t (15). L’utilizzo di 2 animali per sesso, per punto di concentrazione e di tempo può contribuire a ridurre gli errori sistematici e la variabilità delle stime, aumentare il tasso di precisione delle stime e migliorare la copertura dell’intervallo di confidenza. Tuttavia in caso di correlazione insufficiente dei dati (quando si utilizza un animale di ciascun sesso o due animali del sesso più sensibile), può bastare anche una quinta concentrazione di esposizione. Per ulteriori informazioni sul numero di animali e le concentrazioni da utilizzare per uno studio C × t, cfr. il documento di orientamento n. 39 (2). | Studio di osservazione: Protocollo C × t | 35. | Uno studio di osservazione consente di stimare l’attività della sostanza in esame, e di scegliere più agevolmente i livelli di concentrazione per l’esposizione nello studio principale. Uno studio di osservazione con al massimo tre animali per sesso e per concentrazione può essere utile per scegliere un’adeguata concentrazione di partenza per lo studio principale e ridurre il numero di animali utilizzati, [per maggiori informazioni cfr. l’appendice III del documento di orientamento n. 39 (2)]. Per stabilire la differenza di sensibilità tra i sessi possono essere necessari tre animali per sesso. Questi animali devono essere oggetto di una sola esposizione, in genere di 240 minuti. La possibilità di generare atmosfere di prova adeguate deve essere valutata nel corso di prove tecniche preliminari senza animali. Di norma non occorre effettuare uno studio di osservazione se i dati sulla mortalità sono già disponibili [tratti da uno studio B.52 (4)]. Nel selezionare la concentrazione iniziale auspicata in uno studio B.2, il responsabile dello studio tiene conto dei profili di mortalità osservati in un qualsiasi studio B.52 (4) disponibile, per entrambi i sessi e per tutte le concentrazioni testate [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. | Concentrazione iniziale: Protocollo C × t | 36. | La concentrazione iniziale (sessione di esposizione I) (appendice 1) è una concentrazione limite o una concentrazione scelta dal responsabile dello studio in base allo studio di osservazione. Dei gruppi formati da un animale di ciascun sesso sono esposti a questa concentrazione per periodi di durata variabile (15, 30, 60, 120 o 240 minuti) per un totale di 10 animali per quella che viene denominata “sessione di esposizione I” (appendice 1). | 37. | La scelta delle concentrazioni limite dipende in genere dagli obblighi normativi. Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentrazioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 ppm, 20 mg/l e 5 mg/l (o, altrimenti, la concentrazione massima raggiungibile) (3). Può risultare tecnicamente difficile raggiungere le concentrazioni limite di alcune sostanze, in particolare se si tratta di vapori e aerosol. Per le prove su aerosol, l’obiettivo è giungere ad una dimensione delle particelle che sia respirabile (ossia DAMM da 1 a 4 μm) a una concentrazione limite di 2 mg/l. Ciò è possibile con la maggior parte delle sostanze chimiche in esame. Le prove con aerosol a concentrazioni superiori a 2 mg/l sono eseguite solo se si è riusciti a generare particelle di dimensioni respirabili [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Il regolamento (CE) n. 1272/2008 sconsiglia di effettuare delle prove a concentrazioni superiori alla concentrazione limite per ragioni di benessere degli animali (3). Le prove effettuate superando il limite di concentrazione vanno prese in considerazione solo se è altamente probabile che i loro risultati rivestano un interesse diretto per la protezione della salute umana (3) e occorre giustificare questa scelta nella relazione di studio. Nel caso di sostanze potenzialmente esplosive si devono adottare precauzioni per evitare condizioni che favoriscano un’esplosione. Per evitare l’uso inutile di animali, occorre effettuare una prova senza animali prima della prova alla concentrazione iniziale per accertarsi che è possibile ottenere nella camera le condizioni sperimentali di una prova a tale concentrazione. | 38. | Se alla concentrazione iniziale si verificano mortalità o agonie, i risultati a questa concentrazione possono fungere da punto di partenza per ulteriori prove ad altre concentrazioni (cfr. studio principale). Se la concentrazione limite non è raggiungibile per via delle proprietà fisiche o chimiche della sostanza in esame, si effettueranno le prove in questione alla concentrazione massima raggiungibile. Se la letalità a questa concentrazione è inferiore al 50 %, non occorre proseguire la prova. Qualora non sia stato possibile raggiungere la concentrazione massima, occorre fornire, nella relazione di studio, una spiegazione e dati giustificativi. Se la concentrazione massima raggiungibile per un vapore non comporta tossicità, può essere necessario produrre la sostanza in esame sotto forma di aerosol liquido. | Studio principale: Protocollo C × t | 39. | La concentrazione iniziale (sessione di esposizione I) (appendice 1) testata nello studio principale è una concentrazione limite o una concentrazione scelta dal responsabile dello studio in base allo studio di osservazione. Se nel corso o successivamente alla sessione di esposizione I si riscontrano casi di mortalità, l’esposizione minima (C × t) che ha provocato la mortalità funge da parametro per stabilire la concentrazione e i periodi di esposizione per la sessione di esposizione II. Ciascuna sessione di esposizione successiva dipenderà dalla sessione precedente (cfr. appendice 1). | 40. | Per molte sostanze i risultati ottenuti alla concentrazione iniziale, insieme a quelli ottenuti nelle tre sessioni di esposizione supplementari su una scala temporale più corta (la durata dei periodi di esposizione successivi secondo una progressione geometrica di fattore √2), sono sufficienti per stabilire il rapporto di mortalità C × t (15), anche se può essere utile ricorrere ad una quinta concentrazione di esposizione [cfr. appendice 1 e documento di orientamento n. 39 (2)]. Per il trattamento matematico dei risultati per il protocollo C × T, cfr. appendice 1. | OSSERVAZIONI | 41. | Durante il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami clinici degli animali. Dopo l’esposizione, l’esame clinico va effettuato almeno due volte il giorno stesso dell’esposizione, o più spesso a seconda della risposta degli animali al trattamento, e almeno una volta al giorno nei successivi 14 giorni. Il periodo di osservazione non ha durata fissa, in quanto dipende dalla natura dei segni clinici, dal momento della loro comparsa e dalla durata del periodo di recupero. Un elemento importante è rappresentato dal momento della comparsa e della scomparsa dei segni di tossicità, soprattutto se negli animali è rilevabile una tendenza a manifestare segni di tossicità tardiva. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematicamente e riportate singolarmente per ciascun animale. Gli animali moribondi o che manifestano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia, per ragioni legate al loro benessere. Occorre fare attenzione, quando si effettuano gli esami clinici alla ricerca di segni di tossicità, a non confondere un cattivo aspetto iniziale e alterazioni respiratorie passeggere, imputabili al procedimento di esposizione, con la tossicità delle sostanze in esame che richiederebbe un’uccisione prematura degli animali. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri riassunti nel documento di orientamento OCSE (19) citato in bibliografia al punto (7). Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile. | 42. | Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso autonomo e centrale, dell’attività somatomotoria e del comportamento. Si annoterà, laddove possibile, l’eventuale differenziazione tra gli effetti locali e sistemici. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dal trattamento o dal confinamento. | Peso corporeo | 43. | Il peso di ciascun animale è rilevato e annotato una volta durante il periodo di adattamento, il giorno dell’esposizione, prima che questa abbia inizio (giorno 0), e almeno nei giorni 1, 3 e 7 (e successivamente una volta la settimana), così come al momento del decesso o dell’eutanasia, se posteriore al giorno 1. Il peso corporeo è manifestamente uno degli indici fondamentali di tossicità, pertanto gli animali che mostrano un calo ≥ 20 % rispetto al peso anteriore allo studio devono essere monitorati attentamente. Alla fine del periodo post esposizione si pesano e si sottopongono a eutanasia gli animali sopravvissuti. | Patologia | 44. | Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della prova o che sono sottoposti a eutanasia e ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti a autopsia macroscopica. Se non è possibile eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere eseguita non appena possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni animale si annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, prestando particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie. | 45. | È possibile effettuare altri esami previamente inclusi nel disegno sperimentale, per ampliare il valore interpretativo dello studio, quali, ad esempio, la determinazione del peso polmonare nei ratti sopravvissuti e/o la ricerca, per esame microscopico, di irritazioni delle vie respiratorie. Si possono anche esaminare gli organi che mostrano macropatologie negli animali che sopravvivono più di 24 ore, così come gli organi per i quali si ha la certezza o il sospetto che siano stati colpiti. L’esame microscopico dell’intero apparato respiratorio può fornire informazioni utili sulle sostanze in esame che reagiscono con l’acqua, come gli acidi e le sostanze chimiche igroscopiche. | DATI E RELAZIONE | Dati | 46. | Si devono indicare il peso corporeo e i risultati dell’autopsia per ciascun animale. I dati degli esami clinici devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo sottoposto alla prova, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e l’esito dell’autopsia. | Relazione sulla prova | 47. | La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi: | | Animali sperimentali e condizioni di allevamento: | — | descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta, | — | specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse dal ratto, | — | numero, età e sesso degli animali, | — | metodo di randomizzazione, | — | dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della dieta e origine dell’acqua), | — | descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in particolare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie. | | Sostanza chimica in esame: | — | natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa l’isomerizzazione), | — | dati di identificazione e numero CAS (Chemical Abstract Services), se noto. | | Veicolo: | — | motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione della scelta del veicolo utilizzato (se diverso dall’acqua), | — | dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con i risultati dello studio. | | Camera di inalazione: | — | descrizione della camera di inalazione, che includa le dimensioni e il volume, | — | provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposizione degli animali e per la generazione dell’atmosfera, | — | apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granulometria e della concentrazione reale, | — | fonte dell’aria, trattamento dell’aria immessa/estratta e sistema di climatizzazione utilizzato, | — | metodi utilizzati per tarare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omogeneità dell’atmosfera di prova, | — | differenza di pressione (positiva o negativa), | — | bocchette di esposizione per camera (“a naso solo”); ubicazione degli animali nel sistema (camera di esposizione “a corpo intero”), | — | omogeneità/stabilità nel tempo dell’atmosfera di prova, | — | ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campionamento dell’atmosfera di prova nella camera, | — | velocità del flusso d’aria, velocità del flusso d’aria in ogni bocchetta di esposizione (“a naso solo”) o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della camera (“a corpo intero”), | — | informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per misurare l’ossigeno e il diossido di carbonio, se applicabile, | — | tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t95), | — | numero di ricambi del volume per ora, | — | dosatori (se applicabile). | | Dati sull’esposizione: | — | giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio principale, | — | concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta circolare nella camera), | — | concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, vapori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse, | — | esprimere le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, mg/l, mg/m3 ecc.), indicando facoltativamente tra parentesi le unità di volume (ad esempio, ppm, ppb ecc.), | — | distribuzione delle dimensioni delle particelle, diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica (σg), con relativi metodi di calcolo; devono essere indicate anche le singole analisi granulometriche. | | Condizioni sperimentali | — | ragguagli sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando le eventuali procedure impiegate per ridurre la granulometria delle sostanze solide o per preparare soluzioni della sostanza in esame. Qualora i processi meccanici abbiano alterato la composizione della sostanza, includere i risultati delle analisi eseguite per verificare la composizione, | — | descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali, | — | ragguagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal mezzo campionato), | — | giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali. | | Risultati | — | tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera, | — | tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera, | — | tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul campionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e della σg, | — | tabella con i dati sulle risposte e il livello di concentrazione per ciascun animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti), | — | peso corporeo di ciascun animale oggetto dello studio; data e ora della morte se avviene prima dell’eutanasia prevista, momento dell’insorgenza e evoluzione dei segni di tossicità e, se del caso, loro reversibilità, | — | reperti necroscopici ed eventuali reperti istopatologici per ciascun animale, | — | stime della letalità (CL50, DL01), con limiti di confidenza del 95 % e inclinazione (se fornita dal metodo di valutazione), | — | relazione statistica, ivi compresa la stima del fattore n (per il protocollo C × t). Occorre fornire il nome del software statistico utilizzato. | | Discussione e interpretazione dei risultati | — | dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria, | — | esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti, | — | spiegare perché è stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (8), | — | se una prova in base al capitolo B.52 del presente allegato (4) ha dovuto essere interrotta in favore del presente metodo B.2 occorre spiegare il motivo, | — | nella valutazione globale dello studio, occorre tener conto della coerenza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali e reali e del rapporto tra loro, | — | occorre esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo d’azione prevalente (sistemico o locale). | BIBLIOGRAFIA: | (1) | OCSE (2009). Determinazione della tossicità acuta per inalazione. Linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 403, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (2) | OCSE (2009). Documento di orientamento per la determinazione della tossicità acuta per inalazione. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (3) | Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1). | (4) | Capitolo B.52 del presente allegato. Tossicità acuta per inalazione — Metodo della classe di tossicità acuta. | (5) | Capitolo B.40 del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: Test di resistenza elettrica transcutanea (TER). | (6) | Capitolo B.40 bis testguidelines del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: Test su modelli di pelle umana. | (7) | OCSE (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. Linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 435 OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (8) | OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (9) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Appl. Toxicol. Toxicol. 18: 321-327. | (10) | Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. | (11) | Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167. | (12) | Zwart JHE, Arts JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278-290. | (13) | Zwart JHE, Arts JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105-117. | (14) | Ten Berge WF and Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65-71. | (15) | OCSE (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OCSE, Parigi. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (16) | Finney DJ (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, Londra/New York. | DEFINIZIONE | Sostanza chimica in esame: Qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova. | Appendice 1 | Protocollo C × t | 1. | Uno studio sequenziale “concentrazione × tempo” (C × t) può costituire un’alternativa al protocollo tradizionale quando si tratta di valutare la tossicità per inalazione (12) (13) (14). Va eseguito di preferenza quando sussiste una particolare esigenza normativa o scientifica che richiede prove su animali per varie durate di esposizione, ad esempio per la pianificazione della risposta di emergenza o la pianificazione territoriale. Si inizia solitamente con una prova alla concentrazione limite (sessione di esposizione I) nel corso della quale gli animali sono esposti alla sostanza in esame per cinque durate diverse (ad esempio 15, 30, 60, 120 e 240 minuti) in modo da ottenere varie durate di esposizione nel corso di una stessa sessione (cfr. figura 1). Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentrazioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 ppm, 20 mg/l e 5 mg/l. Questi livelli possono essere superati solo se esistono motivi di carattere normativo o scientifico per effettuare delle prove a questi livelli di concentrazione (cfr. paragrafo 37 del capitolo B.2). | 2. | Qualora si abbiano poche o nessuna informazione sulla tossicità della sostanza in esame, occorre seguire uno studio di osservazione in cui gruppi di almeno tre animali per sesso sono esposti a concentrazioni bersaglio selezionate dal responsabile dello studio, di norma per 240 minuti. | 3. | Se nel corso della sessione di esposizione I è saggiata una concentrazione limite e si osserva una mortalità inferiore al 50 %, non occorre effettuare prove aggiuntive. Se, per motivi regolamentari o scientifici, occorre stabilire la relazione concentrazione/tempo/reazione per livelli più elevati rispetto alla concentrazione limite indicata, l’esposizione successiva è effettuata, ad esempio, al doppio della concentrazione limite (2L nella figura 1). | 4. | Se, alla concentrazione limite, viene osservata una tossicità, sono necessarie prove aggiuntive (studio principale). Queste esposizioni aggiuntive sono effettuate a concentrazioni inferiori (figura 1: sessioni di esposizione II, III o IV) o a concentrazioni superiori per periodi più brevi (figura 1: sessione di esposizione IV) adeguati e meno distanziati. | 5. | La prova (concentrazione iniziale e concentrazioni aggiuntive) è realizzata con 1 animale di ciascun sesso per punto concentrazione/tempo o con due animali del sesso più sensibile alla sostanza in esame per punto concentrazione/tempo. Il responsabile dello studio, in determinate circostanze, può decidere di utilizzare 2 ratti di ciascun sesso per punto concentrazione/tempo (o 4 animali del sesso più sensibile per punto concentrazione/tempo) (15). L’utilizzo di 2 animali per sesso, per punto di concentrazione e di tempo generalmente riduce le distorsioni e la variabilità delle stime, aumenta il tasso di precisione delle stime e migliora la copertura dell’intervallo di confidenza legato al presente protocollo. Ulteriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento n. 39 (2). | 6. | Idealmente ciascuna sessione di esposizione è effettuata in una sola giornata. Ciò consente di ritardare l’esposizione successiva fino a quando non si abbia la ragionevole certezza che gli animali già sottoposti alla prova siano sopravvissuti e permette al responsabile dello studio di adattare la concentrazione e la durata per la successiva sessione di esposizione. È consigliabile iniziare ogni sessione di esposizione con il gruppo che sarà esposto più a lungo, ossia il gruppo destinato ad un’esposizione di 240 minuti, seguito dal gruppo di 120 minuti e via dicendo. Se, ad esempio, gli animali del gruppo di 240 minuti dopo 90 minuti iniziano a morire o mostrano segni evidenti di tossicità (ad esempio variazioni estreme nel pattern respiratorio come la respirazione difficoltosa), non avrebbe senso esporre un gruppo per 120 minuti perché la mortalità sarebbe probabilmente del 100 %. In tal caso il responsabile dello studio deve optare per durate di esposizione più brevi per la concentrazione in questione (ad esempio, 90, 65, 45, 33 e 25 minuti). | 7. | La concentrazione nella camera deve essere misurata spesso per determinare la concentrazione media ponderata per il tempo per ogni durata di esposizione. Laddove possibile, nell’analisi statistica occorre utilizzare l’orario della morte di ciascun animale (più che la durata di esposizione). | 8. | Occorre esaminare i risultati delle quattro prime sessioni di esposizione per individuare gli eventuali dati mancanti nella curva concentrazione-tempo (cfr. figura 1). Se mancano dei dati, si può realizzare un’esposizione supplementare (5a concentrazione). La concentrazione e le durate di esposizione di questa 5a esposizione sono scelte per colmare questa lacuna. | 9. | Tutte le sessioni di esposizione (ivi compresa la prima) sono utilizzate per calcolare il rapporto concentrazione-tempo-risposta mediante un’analisi statistica (16). Se possibile, per ciascun intervallo C × t si utilizzerà la concentrazione media ponderata in funzione del tempo e la durata di esposizione fino alla morte (se questa si verifica nel corso dell’esposizione). | Figura 1 | Illustrazione ipotetica di un rapporto concentrazione-tempo-mortalità nei ratti | Simboli vuoti = animali sopravissuti. Simboli pieni = animali morti | Triangoli = femmine; Cerchi = maschi | Linea piena = valori di CL50 (da 7,5 a 240 min.) per i maschi n = 1 | Linea tratteggiata = valori di CL50 (da 7,5 a 240 min.) per le femmine n = 1 | Linee punteggiate = valori della CL50 ipotetica per i maschi e le femmine se n fosse stato pari a 2 (12). | Legenda | Concentrazione: | Tempo di esposizione: | 10. | Qui di seguito è riportato un esempio della procedura per fasi: | Sessione di esposizione I — Prova alla concentrazione limite (cfr. figura 1) | — | 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto (2) | — | Concentrazione bersaglio (3) = concentrazione limite | — | Esporre cinque gruppi di animali a questa concentrazione bersaglio per, rispettivamente, 15, 30, 60, 120 e 240 minuti. | ↓ | Sessione di esposizione II (4) — Studio principale | — | 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto | — | Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (5) (1/2L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1). | ↓ | Sessione di esposizione III — Studio principale | — | 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo, 10 animali in tutto | — | Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (5) (1/4L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1). | ↓ | Sessione di esposizione IV’ — Studio principale | — | 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo; 10 animali in tutto | — | Esporre cinque gruppi di animali ad una concentrazione inferiore (5) (1/8L) per durate di esposizione leggermente più lunghe (spaziatura di √2; cfr. figura 1). | oppure | Sessione di esposizione IV — Studio principale | — | 1 animale/sesso per punto concentrazione/tempo; 10 animali in tutto | — | Esporre cinque gruppi animali ad una concentrazione superiore (6) (2L) per durate di esposizione leggermente più brevi (spaziatura di √2; cfr. figura 1). | Trattamento matematico dei risultati per il protocollo C × t | 11. | Una procedura C × t costituita da 4 o 5 concentrazioni di esposizione e 5 durate di esposizione genera 20 o 25 valori, rispettivamente. Con questi valori, la relazione C × t può essere calcolata con un’analisi statistica (16): | Equazione 1: | in cui C = concentrazione; t = durata di esposizione, o | Equazione 2: | in cui | Con l’equazione 1, il valore CL50 può essere calcolato per un determinato periodo di tempo (ad esempio 4 ore, 1 ora, 30 minuti, o qualsiasi altro periodo compreso nell’intervallo dei periodi testati) utilizzando P = 5 (50 % di risposta). La regola di Haber si applica solo quando n = 1. La CL01 può essere calcolata con P = 2,67. | » | 3. | poglavje B.2 se nadomesti z naslednjim: | „B.2 AKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 403 (2009) (1). Prvotna Smernica za preskušanje 403 v zvezi z akutno strupenostjo pri vdihavanju (TG 403) je bila sprejeta leta 1981. Ta revidirana preskusna metoda B.2 (ki ustreza revidirani TG 403) je bila zasnovana tako, da omogoča večjo prožnost, zmanjšuje uporabo živali in izpolnjuje zakonodajne potrebe. V revidirani preskusni metodi sta predstavljeni dve vrsti študij: tradicionalni protokol LC50 in protokol koncentracija × čas (C × t). Glavni značilnosti te preskusne metode sta, da je z njo mogoče dobiti razmerje koncentracija-odziv, ki se giblje od nesmrtnih do smrtnih rezultatov, za določitev srednje smrtne koncentracije (LC50), nesmrtne mejne koncentracije (npr. LC01) in naklona, ter opredeliti morebitno občutljivost glede na spol. Protokol C × t je treba uporabiti v primeru posebne zakonodajne ali znanstvene potrebe po preskušanju živali v več časovnih obdobjih, na primer za namene načrtovanja odzivanja v nujnih primerih (npr. določanja orientacijskih ravni pri akutni izpostavljenosti (AEGL), smernic za načrtovanje zaščite in reševanja (ERPG) ali vrednosti mejnih ravni pri akutni izpostavljenosti (AETL)) ali načrtovanja rabe tal. | 2. | Napotke glede izvedbe in razlage študij te preskusne metode je mogoče najti v Dokumentu s smernicami za preskušanje akutne strupenosti pri vdihavanju (GD 39) (2). | 3. | Pojmi, ki se uporabljajo v tej preskusni metodi, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v GD 39 (2). | 4. | Ta preskusna metoda omogoča opredelitev lastnosti in kvantitativno oceno tveganja preskusnih kemikalij ter njihovo razvrščanje v skladu z Uredbo (ES) št. 1272/2008 (3). GD 39 (2) zagotavlja napotke za izbiro primerne metode za preskušanje akutne strupenosti. Kadar so potrebne samo informacije o razvrščanju in označevanju, se navadno priporoča poglavje B.52 te priloge (4) (glej GD 39 (2)). Ta preskusna metoda B.2 ni posebej namenjena preskušanju posebnih materialov, kot so slabo topni izometrični ali vlaknati materiali ali proizvedeni nanomateriali. | ZAČETNI PREUDARKI | 5. | Da se čim bolj zmanjša uporaba živali, mora preskuševalni laboratorij pred razmislekom o preskušanju v skladu s to preskusno metodo preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, vključno z obstoječimi študijami (npr. poglavje B.52 te priloge (4)), katerih podatki bi omogočili izognitev dodatnemu preskušanju. Informacije, ki lahko pomagajo pri izbiri najprimernejše vrste, seva, spola, načina izpostavljenosti in ustreznih preskusnih koncentracij, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh (glej GD 39 (2)). | 6. | Preskušanju jedkih in/ali dražilnih preskusnih kemikalij pri koncentracijah, za katere se pričakuje, da bodo povzročile hude bolečine in/ali trpljenje, se je treba čim bolj izogibati. Jedki/dražilni potencial je treba oceniti s strokovno presojo ob uporabi dokazov, kot so izkušnje pri ljudeh in živalih (npr. iz študij s ponavljajočimi se odmerki, opravljenih pri nejedkih/nedražilnih koncentracijah), obstoječi podatki in vitro (npr. iz poglavij B.40 (5) in B.40 bis (6) te priloge ali iz OECD TG 435 (7)), vrednosti pH, informacije o podobnih snoveh ali kateri koli drugi pomembni podatki, da se razišče, ali je mogoče nadaljnje preskušanje opustiti. Za posebne zakonodajne potrebe (npr. pri načrtovanju odzivanja v nujnih primerih) se lahko ta preskusna metoda uporabi za izpostavljanje živali tem snovem, ker vodji ali glavnemu raziskovalcu študije zagotavlja nadzor nad izbiro ciljnih koncentracij. Ciljne koncentracije ne smejo povzročiti resnih dražilnih/jedkih učinkov, morajo pa biti zadostne za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, ki izpolnjuje zakonodajni in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je treba izbrati za vsak primer posebej in utemeljiti njihovo izbiro (glej GD 39 (2)). | NAČELO PRESKUSA | 7. | Ta revidirana preskusna metoda B.2 je bila zasnovana za pridobitev zadostnih informacij o akutni strupenosti preskusne kemikalije, da se omogoči njena razvrstitev in zagotovijo podatki o smrtnosti (npr. LC50, LC01 in naklon) za enega ali oba spola – kot je potrebno za kvantitativne ocene tveganja. Ta preskusna metoda vključuje dve metodi. Prva je tradicionalni protokol, pri katerem so skupine živali izpostavljene mejni koncentraciji (mejni preskus) ali seriji koncentracij v postopnem postopku za vnaprej določeno obdobje, običajno 4 ure. Za izpolnitev posebnih zakonodajnih namenov se lahko uporabijo tudi druga obdobja izpostavljenosti. Druga metoda je protokol C × t, pri katerem so skupine živali izpostavljene eni (mejni) koncentraciji ali seriji koncentracij skozi več obdobij. | 8. | Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo bolečine ali kažejo znake hudega in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti ter jih pri razlagi rezultatov preskusa upoštevati enako kot živali, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejem odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o humanih končnih točkah (8). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 9. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih vrst pa je treba utemeljiti. | Priprava živali | 10. | Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan izpostavljenosti morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 8–12 tednov in tehtajo ± 20 % srednje teže za posamezni spol vseh predhodno izpostavljenih živali iste starosti. Živali se izberejo naključno in označijo za posamično prepoznavanje. Pred začetkom preskusa so najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. Poleg tega jih je treba pred preskušanjem krajše obdobje privajati na preskusno aparaturo, saj se tako zmanjša stres, ki ga povzroči uvedba v novo okolje. | Oskrba živali | 11. | Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogoče, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posamično, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja običajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena količina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna z zaporedjem 12 ur svetlobe/12 ur teme. | Inhalacijske komore | 12. | Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemikalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot način izpostavljenosti uporabi izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave oziroma smrčka). Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije tekočih ali trdnih aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogoče je, da bo posebne cilje študije lažje doseči z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpostavljanje celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in pomanjkljivosti so opisani v GD 39 (2). | POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI | Dajanje koncentracij | 13. | Izpostavljenost nosu lahko pri podganah traja do 6 ur. Če se uporabljajo miši, izpostavljenost nosu navadno ne sme biti daljša od 4 ur. Če so potrebne dolgoročnejše študije, je treba to utemeljiti (glej GD 39 (2)). Živali, ki so izpostavljene aerosolom v komorah za izpostavljanje celega telesa, morajo biti nastanjene posamično, da se prepreči zaužitje preskusne kemikalije ob medsebojnem čiščenju primerkov v kletki. V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko ves čas uživajo vodo. | 14. | Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetneje prisotna med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemično reaktivne preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozračju. Paziti je treba, da ne nastanejo eksplozivne koncentracije. | Porazdelitev velikosti delcev | 15. | Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba določiti velikost delcev. Da se omogoči izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, so priporočeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) znaša 1–4 μm z geometričnim standardnim odklonom (σg) 1,5–3,0 (2) (9) (10). Prizadevanje za izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogoče izpolniti, je treba zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci, vlakna in higroskopne snovi (katerih velikost se v vlažnem okolju dihal poveča) pa presegajo navedene vrednosti. | Priprava preskusne kemikalije v nosilcu | 16. | Za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije v atmosferi se lahko uporabi nosilec. Praviloma je treba prednostno uporabiti vodo. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko uporabijo mehanski postopki, da se doseže zahtevana porazdelitev velikosti delcev, vendar je treba paziti, da preskusna kemikalija ne razpade ali se spremeni. Kadar se zdi, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije (npr. ob zelo visokih temperaturah, nastalih zaradi trenja pri pretiranem mletju), je treba sestavo te preskusne kemikalije analitsko preveriti. Skrbno je treba paziti, da se preskusna kemikalija ne kontaminira. Nekrušljivih granulatov, ki so namenoma formulirani tako, da jih ni mogoče vdihniti, ni treba preskušati. Uporabiti je treba preskus drobljivosti, da se dokaže, da pri ravnanju z granulatom ne nastajajo delci, ki jih je mogoče vdihniti. Če pri preskusu drobljivosti nastanejo snovi, ki jih je mogoče vdihniti, je treba opraviti preskus strupenosti pri vdihavanju. | Kontrolne živali | 17. | Sočasna negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna. Kadar se v pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporablja nevodni nosilec, je treba kontrolno skupino z nosilcem uporabiti samo, če niso na voljo pretekli podatki o strupenosti pri vdihavanju. Če študija strupenosti preskusne kemikalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec pri preskušeni koncentraciji ni strupen; kontrola z nosilcem torej ni potrebna. | SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI | Pretok zraka v komori | 18. | Pretok zraka skozi komoro je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Spremljanje koncentracije (ali stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je neločljivo povezana z vsemi dinamičnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri ustvarjanja atmosfere. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja v primerih, v katerih pretok zraka skozi sistem izpostavljanja ni zadosten za zagotovitev dinamičnega toka atmosfere s preskusno kemikalijo. Za dokazovanje, da v izbranih pogojih postopka ni ponovnega vdihavanja, so na voljo predpisane metodologije (2) (11). Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstaja razlog za domnevo, da teh standardov ni mogoče izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. | Temperatura in relativna vlažnost v komori | 19. | Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti celega telesa spremljati ter jo zabeležiti najmanj trikrat, če izpostavljenost traja do 4 ure, medtem ko se pri krajših časih izpostavljenosti ta meritev zabeleži vsako uro. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi nemerljivo zaradi interference preskusne kemikalije s preskusno metodo. | Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija | 20. | Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izračunati in zabeležiti nazivno koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pač pa pri primerjavi z dejansko koncentracijo pokaže, kako učinkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri tem ustvarjanju. | Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija | 21. | Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije v območju dihanja živali v inhalacijski komori. Meri se s specifičnimi metodami (npr. z neposrednim vzorčenjem, adsorpcijskimi ali kemičnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifičnimi metodami, kot je gravimetrična analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetrične analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole tekočin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifičnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetrično analizo se lahko določi tudi koncentracija večkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. V poročilu o študiji je treba navesti ciljne, nazivne in dejanske koncentracije, vendar se v statističnih analizah za izračun vrednosti smrtnih koncentracij uporabljajo samo dejanske koncentracije. | 22. | Po možnosti je treba uporabiti eno serijo preskusne kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred začetkom študije je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vključno z njeno čistostjo ter, če je to tehnično izvedljivo, identiteto in količinami ugotovljenih kontaminantov in nečistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj delno potrdi naročnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). | 23. | Atmosfera v komori za izpostavljanje naj bo konstantna, kolikor je to izvedljivo, ter naj se glede na analitsko metodo spremlja stalno in/ali v rednih intervalih. Kadar se uporablja vzorčenje v intervalih, je treba v štiriurni študiji vzorce atmosfere v komori vzeti najmanj dvakrat. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, se lahko v celotnem obdobju izpostavljenosti vzame en vzorec. Če se med posameznimi vzorci pojavijo izrazita nihanja, je treba pri preskušanju naslednjih koncentracij uporabiti štiri vzorce na izpostavljenost. Posamezni vzorci koncentracije v komori od srednje koncentracije ne smejo odstopati za več kot ± 10 % za pline in hlape oziroma za več kot ± 20 % za tekoče ali trdne aerosole. Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori (t95). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije, pri tem pa je upoštevan čas, potreben za dosego t95. Napotki za ocenjevanje t95 so na voljo v GD 39 (2). | 24. | Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov (npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša drugače, zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), ki je navadno glavna aktivna snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za zmes in ne le za aktivno snov ali sestavino (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (2). | Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev | 25. | Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba med vsako 4-urno izpostavljenostjo določiti vsaj dvakrat s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instrumentom, kot je aerodinamični merilnik delcev. Če je mogoče prikazati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetrični filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost mogoče prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se čim bolj zmanjša količina pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba izpostavljanje ponoviti. Za hlape je treba velikost delcev določiti, če obstaja možnost, da se bodo hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogoče mešane faze, zaznajo delci (glej odstavek 15). | POSTOPEK | 26. | V nadaljevanju sta opisani dve vrsti študij: tradicionalni protokol in protokol C × t. Oba lahko vključujeta opazovalno študijo, glavno študijo in/ali mejni preskus (tradicionalni protokol) oziroma preskušanje pri mejni koncentraciji (C × t). Če je znano, da je en spol občutljivejši, se lahko vodja študije odloči te študije izvesti samo z njim. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se čim bolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Pred začetkom je treba preučiti vse razpoložljive podatke, da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Tako se lahko na primer s podatki, pridobljenimi na podlagi poglavja B.52 te priloge (4), odpravi potreba po opazovalni študiji in dokaže večja občutljivost enega spola (glej GD 39 (2)). | TRADICIONALNI PROTOKOL | Splošni preudarki: tradicionalni protokol | 27. | Pri tradicionalni študiji se skupine živali za točno določen čas (običajno 4 ure) izpostavijo preskusni kemikaliji bodisi v komori za izpostavljanje nosu bodisi v komori za izpostavljanje celega telesa. Živali se izpostavijo bodisi mejni koncentraciji (mejni preskus) bodisi najmanj trem koncentracijam v postopnem postopku (glavna študija). Pred glavno študijo se lahko izvede opazovalna študija, razen če so že na voljo nekatere informacije o preskusni kemikaliji, kot je predhodno izvedena študija B.52 (glej GD 39 (2)). | Opazovalna študija: tradicionalni protokol | 28. | Opazovalna študija se uporablja za ocenjevanje moči preskusne kemikalije, opredelitev razlik med spoloma glede občutljivosti in pomoč pri izbiri koncentracij izpostavljenosti za glavno študijo ali mejni preskus. Pri izbiri koncentracij za opazovalno študijo je treba uporabiti vse informacije, ki so na voljo, vključno z razpoložljivimi podatki (Q)SAR in podatki za podobne kemikalije. Vsaki koncentraciji se izpostavi največ tri samce in tri samice (3 živali/spol so lahko potrebne, da se ugotovi razlika med spoloma). Opazovalna študija lahko zajema eno samo koncentracijo, po potrebi pa se jih lahko preskusi tudi več. Opazovalna študija ne sme vključevati toliko živali in koncentracij, da je podobna glavni študiji. Namesto opazovalne študije se lahko uporabi predhodno izvedena študija B.52 (4) (glej GD 39 (2)). | Mejni preskus: tradicionalni protokol | 29. | Mejni preskus se uporabi, kadar je znano ali se pričakuje, da je preskusna kemikalija praktično nestrupena, tj. da povzroči toksično reakcijo samo nad zakonsko predpisano mejno koncentracijo. Pri mejnem preskusu se ena skupina treh samcev in treh samic izpostavi preskusni kemikaliji pri mejni koncentraciji. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije se lahko pridobijo na podlagi znanja o podobnih preskušenih kemikalijah ob upoštevanju identitete in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko pomembne. Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih ni ali kadar se pričakuje, da je kemikalija strupena, je treba opraviti glavni preskus. | 30. | Izbira mejnih koncentracij je navadno odvisna od zakonodajnih zahtev. Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l (ali najvišje dosegljive koncentracije) (3). Ustvarjanje mejnih koncentracij nekaterih preskusnih kemikalij, zlasti kemikalij v obliki hlapov in aerosolov, je lahko tehnično zahtevno. Pri preskušanju aerosolov mora biti glavni cilj ustvariti delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (MMAD 1–4 μm). To je mogoče z večino preskusnih kemikalij pri koncentraciji 2 mg/l. Preskušanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (glej GD 39 (2)). V Uredbi (ES) št. 1272/2008 se zaradi dobrobiti živali (3) preskušanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Tako preskušanje se lahko predvidi samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo rezultati takega preskusa neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi (3), poleg tega pa je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. V primeru potencialno eksplozivnih preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je treba pred mejnim preskusom opraviti preskus brez živali in tako zagotoviti, da je v komori mogoče doseči pogoje za mejni preskus. | 31. | Če se pri mejni koncentraciji opazi smrtnost ali umiranje, se lahko rezultati mejnega preskusa uporabijo kot opazovalna študija za nadaljnje preskušanje pri drugih koncentracijah (glej glavno študijo). Kadar zaradi fizikalnih ali kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ni mogoče doseči mejne koncentracije, je treba preskusiti najvišjo dosegljivo koncentracijo. Če ta povzroči manj kot 50-odstotno smrtnost, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Kadar mejne koncentracije ni mogoče doseči, je treba v poročilu o študiji navesti pojasnilo in podporne podatke. Če najvišja dosegljiva koncentracija hlapov ne izzove strupenih učinkov, bo morda treba preskusno kemikalijo pripraviti v obliki tekočega aerosola. | Glavna študija: tradicionalni protokol | 32. | Glavna študija se običajno opravlja s petimi samci in petimi samicami (ali petimi živalmi občutljivejšega spola, če je znan) na koncentracijo, pri čemer se uporabijo najmanj tri različne koncentracije. Za zanesljivo statistično analizo je treba uporabiti zadostne koncentracije. Časovni interval med skupinami za izpostavljanje je določen glede na nastop, trajanje in resnost znakov zastrupitve. Z izpostavljanjem živali naslednji stopnji koncentracije je treba počakati, dokler ni mogoče z razumno gotovostjo sklepati o preživetju predhodno preskušenih živali. Tako lahko vodja študije prilagodi ciljno koncentracijo za naslednjo skupino za izpostavljanje. Zaradi odvisnosti od kompleksnih tehnologij to pri inhalacijskih študijah morda ni vedno praktično, zato mora izpostavljanje živali naslednji stopnji koncentracije temeljiti na predhodnih izkušnjah in znanstveni presoji. Pri preskušanju zmesi je treba upoštevati GD 39 (2). | PROTOKOL KONCENTRACIJA × ČAS (C × T) | Splošni preudarki: protokol C × t | 33. | Postopna študija C × t se lahko obravnava kot alternativa tradicionalnemu protokolu, kadar se preskuša strupenost pri vdihavanju (12) (13) (14). Ta pristop omogoča, da se živali izpostavijo preskusni kemikaliji pri več koncentracijah in ob različnih obdobjih izpostavljenosti. Celotno preskušanje se izvaja v komori za izpostavljanje nosu (komore za izpostavljanje celega telesa za protokol C × t niso praktične). Ta protokol je ponazorjen v diagramu poteka v Dodatku 1. Simulacijska analiza je pokazala, da je mogoče s tradicionalnim protokolom in protokolom C × t dobiti zanesljive vrednosti LC50, vendar je protokol C × t na splošno boljši pri zagotavljanju zanesljivih vrednosti LC01 in LC10 (15). | 34. | Simulacijska analiza je pokazala, da lahko uporaba dveh živali na interval C × t (po ena žival vsakega spola, če se uporabljata oba spola, ali dve živali občutljivejšega spola) na splošno zadošča, kadar se v glavni študiji preskušajo štiri koncentracije in pet obdobij izpostavljenosti. V nekaterih okoliščinah se lahko vodja študije odloči uporabiti po dve podgani vsakega spola na interval C × t (15). Uporaba dveh živali vsakega spola na koncentracijo in časovno točko lahko zmanjša izkrivljenost in spremenljivost ocen, poveča stopnjo uspešnosti ocenjevanja ter izboljša obseg intervala zaupanja. Vendar lahko v primeru nezadostnega ujemanja s podatki za ocenjevanje (ob uporabi ene živali vsakega spola ali dveh živali občutljivejšega spola) zadošča tudi peta koncentracija izpostavljenosti. Več napotkov o številu živali in koncentracij, ki jih je treba uporabiti v študiji C × t, je na voljo v GD 39 (2). | Opazovalna študija: protokol C × t | 35. | Opazovalna študija se uporablja za ocenjevanje moči preskusne kemikalije in pomoč pri izbiri koncentracij izpostavljenosti za glavno študijo. Da se izbere primerna začetna koncentracija za glavno študijo in čim bolj zmanjša število uporabljenih živali, je lahko potrebna opazovalna študija z do tremi živalmi/spol/koncentracijo (za podrobnosti glej Dodatek III k GD 39 (2)). Za ugotavljanje razlike med spoloma bo morda treba uporabiti tri živali na spol. Te živali je treba izpostaviti za eno samo obdobje, ki navadno traja 240 min. Izvedljivost ustvarjanja ustreznih preskusnih atmosfer je treba oceniti med predhodnimi tehničnimi preskusi brez živali. Če so na voljo podatki o smrtnosti iz študije B.52 (4), opazovalne študije običajno ni treba opraviti. Vodja študije mora pri izbiri začetne ciljne koncentracije v študiji B.2 upoštevati vzorce smrtnosti, opažene v kateri koli razpoložljivi študiji B.52 (4) za oba spola in vse preskušene koncentracije (glej GD 39 (2)). | Začetna koncentracija: protokol C × t | 36. | Začetna koncentracija (izpostavitev I) (Dodatek 1) je bodisi mejna koncentracija bodisi koncentracija, ki jo vodja študije izbere na podlagi opazovalne študije. Skupine s po 1 živaljo/spol se tej koncentraciji izpostavijo za več obdobij (v trajanju npr. 15, 30, 60, 120 ali 240 minut), tako da je vseh živali skupaj 10 (celotni postopek imenujemo izpostavitev I) (Dodatek 1). | 37. | Izbira mejnih koncentracij je navadno odvisna od zakonodajnih zahtev. Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l (ali najvišje dosegljive koncentracije) (3). Ustvarjanje mejnih koncentracij nekaterih preskusnih kemikalij, zlasti kemikalij v obliki hlapov in aerosolov, je lahko tehnično zahtevno. Pri preskušanju aerosolov mora biti cilj ustvariti delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (tj. MMAD 1–4 μm), pri mejni koncentraciji 2 mg/l. To je mogoče pri večini preskusnih kemikalij. Preskušanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (glej GD 39 (2)). V Uredbi (ES) št. 1272/2008 se zaradi dobrobiti živali preskušanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Tako preskušanje se lahko predvidi samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo rezultati takega preskusa neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi (3), poleg tega pa je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. V primeru potencialno eksplozivnih preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je treba pred preskušanjem pri začetni koncentraciji opraviti preskus brez živali in tako zagotoviti, da je v komori mogoče doseči pogoje za to koncentracijo. | 38. | Če se pri začetni koncentraciji opazi smrtnost ali umiranje, se lahko rezultati, dobljeni pri tej koncentraciji, uporabijo kot izhodišče za nadaljnje preskušanje pri drugih koncentracijah (glej glavno študijo). Kadar zaradi fizikalnih ali kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ni mogoče doseči mejne koncentracije, je treba preskusiti najvišjo dosegljivo koncentracijo. Če ta povzroči manj kot 50-odstotno smrtnost, nadaljnje preskušanje ni potrebno. Kadar mejne koncentracije ni mogoče doseči, je treba v poročilu o študiji navesti pojasnilo in podporne podatke. Če najvišja dosegljiva koncentracija hlapov ne izzove strupenih učinkov, bo morda treba preskusno kemikalijo pripraviti v obliki tekočega aerosola. | Glavna študija: protokol C × t | 39. | Začetna koncentracija (izpostavitev I) (Dodatek 1), preskušena v glavni študiji, je bodisi mejna koncentracija bodisi koncentracija, ki jo vodja študije določi na podlagi opazovalne študije. Če je bila med izpostavitvijo I ali po njej opažena smrtnost, se minimalna izpostavljenost (C × t), ki povzroči smrtnost, upošteva kot smernica za določitev koncentracije in obdobij izpostavljenosti za izpostavitev II. Vsaka naslednja izpostavitev je odvisna od prejšnje izpostavitve (glej Dodatek 1). | 40. | Za številne preskusne kemikalije rezultati, dobljeni pri začetni koncentraciji, skupaj s tremi dodatnimi izpostavitvami v okviru drobnejše časovne mreže (tj. geometrične razmaknjenosti obdobij izpostavljenosti, kot jo določa faktor med zaporednimi obdobji, običajno √2) zadoščajo za določitev razmerja smrtnosti C × t (15), čeprav lahko uporaba 5. koncentracije izpostavljenosti prinese nekatere koristi (glej Dodatek 1 in GD 39 (2)). Za matematično obdelavo rezultatov pri protokolu C × t glej Dodatek 1. | OPAZOVANJA | 41. | Med obdobjem izpostavljenosti je treba živali pogosto klinično opazovati. Po izpostavljenosti je treba klinična opazovanja izvajati skupno 14 dni, in sicer na dan izpostavljenosti najmanj dvakrat ali pogosteje, če to nakazuje odziv živali na tretiranje, nato pa najmanj enkrat na dan. Dolžina obdobja opazovanja ni točno določena, pač pa jo je treba določiti glede na naravo in čas nastopa kliničnih znakov ter dolžino obdobja okrevanja. Časi pojava in izginotja pokazateljev strupenosti so pomembni, zlasti če se ti znaki nagibajo k zapoznelosti. Vsa opažanja se sistematično zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za vsako žival posebej. Umirajoče živali ter živali, ki kažejo znake hude bolečine in/ali trajnega in hudega trpljenja, je treba zaradi njihove dobrobiti humano usmrtiti. Pri pregledih za kliničnimi pokazatelji strupenosti je treba paziti, da se začetni slab videz in prehodne spremembe v dihanju, ki so posledica postopka izpostavljanja, ne zamenjajo za strupenost, povezano s preskusno kemikalijo, ki bi zahtevala predčasno usmrtitev živali. Upoštevati je treba načela in merila, povzeta v Dokumentu s smernicami o humanih končnih točkah (GD 19) (7). Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti zabeležiti čim natančneje. | 42. | Opazovanja v kletkah morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, v dihalih, obtočilih, avtonomnem in osrednjem živčevju ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Kadar je to mogoče, je treba zabeležiti vsa razlikovanja med lokalnimi in sistemskimi učinki. Pozorno je treba opazovati tremorje, krče, slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. | Telesna teža | 43. | Težo posameznih živali je treba zabeležiti enkrat v obdobju prilagajanja na okolje, na dan izpostavljenosti pred izpostavljenostjo (dan 0) ter vsaj 1., 3. in 7. dan (nato pa tedensko), poleg tega pa še ob poginu ali evtanaziji, če ta nastopi po 1. dnevu. Telesna teža se priznava kot bistveni kazalnik strupenosti, tako da je treba živali, pri katerih se v primerjavi z vrednostmi pred študijo opazi trajen upad za ≥ 20 %, skrbno spremljati. Preživele živali se ob koncu obdobja po izpostavljenosti stehtajo in humano usmrtijo. | Patologija | 44. | Na vseh preskusnih živalih, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so evtanazirane in odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba opraviti makroskopsko obdukcijo. Če je ni mogoče opraviti takoj po odkritju poginule živali, je treba žival ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza čim bolj zmanjša. Obdukcijo je treba opraviti čim prej, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. | 45. | Za razširitev razlagalne vrednosti študije se lahko razmisli o dodatnih samoumevno vključenih pregledih, kot sta tehtanje pljuč preživelih podgan in/ali zagotavljanje dokazov o dražilnosti z mikroskopskim pregledom dihal. Med pregledanimi organi so lahko tudi tisti, ki kažejo makroskopske patološke znake pri živalih, ki so preživele 24 ur ali več, in organi, za katere je znano ali se pričakuje, da so prizadeti. Mikroskopski pregled celotnih dihal lahko zagotovi koristne informacije za preskusne kemikalije, ki reagirajo z vodo, kot so kisline in higroskopne preskusne kemikalije. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 46. | Zagotoviti je treba podatke o telesni teži in ugotovitvah obdukcije posameznih živali. Podatke o kliničnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifične znake zastrupitve, število živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije. | Poročilo o preskusu | 47. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno: | | Preskusne živali in oskrba | — | opis pogojev v kletkah, vključno s številom (ali spremembo števila) živali na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, | — | uporabljeno vrsta/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana, | — | število, starost in spol živali, | — | metodo randomizacije, | — | podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom hrane in virom vode), | — | opis morebitne priprave živali pred preskusom, vključno s hrano, karanteno in zdravljenjem. | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo), | — | identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), če je znana. | | Nosilec | — | utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda), | — | pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na rezultat študije. | | Inhalacijska komora | — | opis inhalacijske komore, vključno z merami in prostornino, | — | izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje atmosfere, | — | opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske koncentracije, | — | vir zraka in obdelavo dovajanega/odvajanega zraka ter sistem za klimatiziranje, | — | metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene preskusne atmosfere, | — | razliko v tlaku (pozitivna ali negativna), | — | izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v sistemu (izpostavljanje celega telesa), | — | časovno homogenost/stabilnost preskusne atmosfere, | — | položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzorčenja preskusne atmosfere v komori, | — | stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino (izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega telesa), | — | informacije o opremi, uporabljeni za merjenje kisika in ogljikovega dioksida, če se uporablja, | — | čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t95), | — | število zamenjav volumna zraka na uro, | — | merilne naprave (če se uporabljajo). | | Podatki o izpostavljenosti | — | utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, | — | nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), | — | dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v območju dihanja živali, za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira ločeno, | — | vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (npr. mg/l, mg/m3 itd.); v oklepajih se lahko navedejo tudi prostorninske enote (npr. ppm, ppb itd.), | — | porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) in geometrični standardni odklon (σg), vključno z metodami za njihov izračun. Poročati je treba o posameznih analizah velikosti delcev. | | Preskusni pogoji | — | podatke o pripravi preskusne kemikalije, vključno s podrobnostmi o postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije. Kadar obstaja možnost, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije, je treba vključiti rezultate analiz za preverjanje sestave te preskusne kemikalije, | — | opis (ki po možnosti vključuje diagram) opreme, uporabljene za ustvarjanje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, | — | podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji (vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzorčenje), | — | utemeljitev določitve preskusnih koncentracij. | | Rezultati | — | preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, | — | preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, | — | preglednice s podatki o velikosti delcev, vključno s podatki o analitskem vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izračuni MMAD in σg, | — | preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za živali, ki kažejo znake zastrupitve, vključno s smrtnostjo ter naravo, resnostjo, časom nastopa in trajanjem učinkov), | — | telesne teže posameznih živali, izmerjene med študijo; datum in čas smrti, če je ta nastopila pred predvideno evtanazijo; časovni potek nastopa znakov zastrupitve in ali so bili ti reverzibilni za vsako žival, | — | izsledke obdukcije in histopatološke preiskave za vsako žival, če so na voljo, | — | ocene smrtnosti (npr. LC50, LD01), vključno s 95-odstotnimi mejami zaupanja in naklonom (če tako določa ocenjevalna metoda), | — | statistično povezanost, vključno z oceno eksponenta n (protokol C × t). Navesti je treba ime uporabljene statistične programske opreme. | | Razprava in razlaga rezultatov | — | poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpolnitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, | — | z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogoče izpolniti, | — | če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o humanih končnih točkah (8) humano žrtvovati živali, ki so trpele bolečine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, | — | če je bilo preskušanje na podlagi poglavja B.52 te priloge (4) prekinjeno v korist te preskusne metode B.2, je treba to utemeljiti, | — | v splošno oceno študije je treba vključiti doslednost metod, uporabljenih za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, | — | obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujoči način delovanja (sistemski ali lokalni). | VIRI: | (1) | OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 403, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (3) | Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spremembi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). | (4) | Poglavje B.52 te priloge, Akutna strupenost pri vdihavanju – metoda razredov akutne strupenosti. | (5) | Poglavje B.40 te priloge, Jedkost za kožo in vitro: preskus transkutane električne upornosti (TER). | (6) | Poglavje B.40 bis te priloge, Jedkost za kožo in vitro: preskus z modelom človeške kože. | (7) | OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (9) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327. | (10) | Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2. izdaja) Informa Healthcare, New York. | (11) | Pauluhn, J. in Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167. | (12) | Zwart, J. H. E., Arts, J. M., ten Berge, W. F., Appelman, L. M. (1992). Alternative Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290. | (13) | Zwart, J. H. E., Arts, J. M., Klokman-Houweling, E. D., Schoen, E. D. (1990). Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117. | (14) | Ten Berge, W. F. in Zwart, A. (1989). More Efficient Use of Animals in Acute Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71. | (15) | OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (16) | Finney, D. J. (1977). Probit Analysis, 3. izdaja, Cambridge University Press, London/New York. | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 1 | Protokol C × t | 1. | Postopna študija koncentracija × čas (C × t) se lahko obravnava kot alternativa tradicionalnemu protokolu, kadar se preskuša strupenost pri vdihavanju (12) (13) (14). Po možnosti jo je treba uporabljati ob posebni zakonodajni ali znanstveni potrebi po preskušanju živali v več različno dolgih časovnih obdobjih, na primer za načrtovanje odzivanja v nujnih primerih ali načrtovanje rabe tal. Ta pristop se običajno začne s preskušanjem pri mejni koncentraciji (izpostavitev I), ko se živali izpostavijo preskusni kemikaliji za pet časovnih obdobij (v trajanju npr. 15, 30, 60, 120 in 240 min), tako da se v eni izpostavitvi pridobijo podatki za več časovnih obdobij (glej sliko 1). Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l. Te koncentracije se smejo preseči samo ob zakonodajni ali znanstveni potrebi po preskušanju pri višjih koncentracijah (glej odstavek 37 glavnega dela poglavja B.2). | 2. | Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih ni, je treba opraviti opazovalno študijo, v kateri se skupine največ 3 živali na spol izpostavijo ciljnim koncentracijam, ki jih določi vodja študije, navadno za 240 min. | 3. | Če se med izpostavitvijo I preskusi mejna koncentracija in se opazi manj kot 50-odstotna smrtnost, dodatno preskušanje ni potrebno. Če obstaja zakonodajna ali znanstvena potreba po določitvi razmerja koncentracija/čas/odziv pri višjih koncentracijah od opredeljene mejne, je treba naslednjo izpostavitev izvesti pri višji koncentraciji, npr. dvakratniku mejne koncentracije (tj. 2L na sliki 1). | 4. | Če se pri mejni koncentraciji ugotovi strupenost, je potrebno dodatno preskušanje (glavna študija). To dodatno izpostavljanje se izvede bodisi pri nižjih koncentracijah (na sliki 1: izpostavitve II, III ali IV’) bodisi pri višjih koncentracijah za krajša obdobja (na sliki 1: izpostavitev IV), ki so prilagojena in nekoliko manj razmaknjena. | 5. | Preskus (začetna in dodatne koncentracije) se opravi z 1 živaljo/spol na koncentracijo/časovno točko ali 2 živalma občutljivejšega spola na koncentracijo/časovno točko. V nekaterih okoliščinah se lahko vodja študije odloči uporabiti 2 podgani/spol na koncentracijo/časovno točko (ali 4 živali občutljivejšega spola na koncentracijo/časovno točko) (15). Uporaba 2 živali na spol na koncentracijo/časovno točko na splošno zmanjša pristranskost in spremenljivost ocen, poveča stopnjo uspešnosti ocenjevanja ter izboljša pokritost intervala zaupanja v primerjavi s protokolom, kot je opisan tukaj. Več podrobnosti je na voljo v GD 39 (2). | 6. | Po možnosti se vsaka izpostavitev izvede v enem dnevu. Tako se lahko z naslednjo izpostavitvijo počaka, dokler ni mogoče z razumno gotovostjo sklepati o preživetju, vodja študije pa lahko prilagodi ciljno koncentracijo in obdobja za naslednjo izpostavitev. Vsako izpostavitev je priporočljivo začeti s skupino, ki bo izpostavljena najdlje, npr. s skupino za 240-minutno izpostavljanje, tej sledi skupina za 120-minutno izpostavljanje itn. Če na primer živali v 240-minutni skupini po 90 minutah umirajo ali kažejo resne znake zastrupitve (npr. velike spremembe v vzorcu dihanja, kot je oteženo dihanje), izpostavljanje skupine za 120 minut ne bi bilo smiselno, ker bi bila smrtnost verjetno 100-odstotna. Zato mora vodja študije za zadevno koncentracijo izbrati krajša obdobja izpostavljenosti (npr. 90, 65, 45, 33 in 25 minut). | 7. | Koncentracijo v komori je treba pogosto meriti, da se določi časovno tehtana povprečna koncentracija za vsako obdobje izpostavljenosti. Kadar koli je to mogoče, je treba v statistični analizi uporabiti čas smrti za vsako žival (namesto obdobja izpostavljenosti). | 8. | Rezultate prvih štirih izpostavitev je treba preučiti, da se opredeli podatkovna vrzel v krivulji koncentracija-čas (glej sliko 1). V primeru nezadostnega ujemanja se lahko izvede dodatna izpostavitev (5. koncentracija). Koncentracijo in obdobja izpostavljenosti za 5. izpostavitev je treba izbrati tako, da se zapolni ta vrzel. | 9. | Vse izpostavitve (vključno s prvo) se uporabijo za izračun razmerja koncentracija-čas-odziv s statistično analizo (16). Če je to mogoče, je treba za vsak interval C × t uporabiti časovno tehtano povprečno koncentracijo in obdobje izpostavljenosti do smrti (če ta nastopi med izpostavljenostjo). | Slika 1 | Hipotetični prikaz razmerja koncentracija-čas-smrtnost pri podganah | Prazni simboli = preživele živali; polni simboli = poginule živali | Trikotniki = samice; krožci = samci | Neprekinjena črta = vrednosti LC50 (razpon 7,5–240 min) za samce pri n = 1 | Črtkana črta = vrednosti LC50 (razpon 7,5–240 min) za samice pri n = 1 | Pikčasta črta = hipotetične vrednosti LC50 za samce in samice, če bi veljalo n = 2 (12) | Glosar | Koncentracija: | Čas izpostavljenosti: | 10. | V nadaljevanju je predstavljen primer postopnega postopka: | Izpostavitev I – preskušanje pri mejni koncentraciji (glej sliko 1) | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali (2) | — | Ciljna koncentracija (3) = mejna koncentracija. | — | Pet skupin živali se tej ciljni koncentraciji izpostavi za 15, 30, 60, 120 oziroma 240 minut. | ↓ | Izpostavitev II (4) – glavna študija | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali. | — | Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (5) (1/2 L) z malce daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1). | ↓ | Izpostavitev III – glavna študija | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali. | — | Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (5) (1/4 L) z malce daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1). | ↓ | Izpostavitev IV’ – glavna študija | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali. | — | Pet skupin živali se izpostavi nižji koncentraciji (5) (1/8 L) z malce daljšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1). | ↓ali | Izpostavitev IV – glavna študija | — | 1 žival/spol na koncentracijo/časovno točko; skupno 10 živali. | — | Pet skupin živali se izpostavi višji koncentraciji (6) (2 L) z malce krajšimi obdobji izpostavljenosti (razmaknjenimi glede na faktor √2; glej sliko 1). | Matematična obdelava rezultatov za protokol C × t | 11. | Postopek C × t, ki zajema 4 ali 5 koncentracij izpostavljenosti in pet obdobij, da 20 oziroma 25 podatkovnih točk. S temi podatkovnimi točkami se lahko razmerje C × t izračuna s statistično analizo (16): | Enačba 1 | kjer je C = koncentracija; t = obdobje izpostavljenosti, ali | Enačba 2 | kjer je | Z enačbo 1 se lahko izračuna vrednost LC50 za dano časovno obdobje (npr. 4 ure, 1 uro, 30 minut ali katero koli časovno obdobje v razponu preskuševanih časovnih obdobij) z uporabo P = 5 (50-odstotni odziv). Opozoriti je treba, da Haberjevo pravilo velja samo, kadar je n = 1. Vrednost LC01 se lahko izračuna z uporabo P = 2,67. | “ |
| 4) | i capitoli B.7 e B.8 sono sostituiti dal capitolo seguente: | «B.7. TOSSICITÀ A DOSE RIPETUTA (28 GIORNI) PER VIA ORALE NEI RODITORI | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 407 (2008). La prima linea guida n. 407 è stata adottata nel 1981. Nel 1995 è stata adottata una versione rivista per ottenere informazioni aggiuntive dagli animali utilizzati nello studio, in particolare in materia di neurotossicità e immunotossicità. | 2. | Nel 1998 l’OCSE ha avviato un’attività prioritaria relativa alla revisione delle linee guida esistenti e all’elaborazione di nuove linee guida per lo screening e le prove dei potenziali interferenti endocrini (8). Uno degli obiettivi era aggiornare la linea guida dell’OCSE n. 407 “Tossicità a dose ripetuta (28 giorni) per via orale nei roditori” introducendo dei parametri adatti per l’individuazione dell’attività endocrina delle sostanze in esame. Questo protocollo è stato sottoposto a un programma internazionale mirante a valutare la pertinenza e la praticabilità dei parametri addizionali, la prestazione di questi parametri per le sostanze chimiche con attività (anti)estrogenica, (anti)androgenica e (anti)tiroidea, la loro riproducibilità intra e inter-laboratori e la loro interferenza con i parametri richiesti dalla versione precedente della linea guida n. 407. I numerosi dati ottenuti sono stati raccolti e valutati attentamente in una relazione esaustiva dell’OCSE (9). Il presente metodo di prova B.7 (equivalente alla linea guida n. 407) è frutto dell’esperienza e dei risultati ottenuti nel corso del programma internazionale di prova. Consente di contestualizzare alcuni effetti endocrino-mediati con altri effetti tossicologici. | CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI | 3. | Nella valutazione e nell’esame delle caratteristiche tossiche di una sostanza chimica è possibile determinare la tossicità orale utilizzando dosi ripetute dopo aver ottenuto dati preliminari sulla tossicità mediante test di tossicità acuta. Il presente metodo di prova mira a studiare gli effetti su una gamma molto ampia di potenziali bersagli di tossicità. Fornisce informazioni sui potenziali rischi per la salute che un’esposizione ripetuta può comportare in un arco di tempo relativamente limitato, tra cui gli effetti sul sistema nervoso, immunologico ed endocrino. In relazione a questi endpoint specifici, il metodo deve consentire di individuare le sostanze chimiche potenzialmente neurotossiche che potrebbero giustificare studi più approfonditi di questo aspetto, e le sostanze chimiche che interferiscono con la fisiologia della tiroide. Questo metodo può inoltre fornire dati sulle sostanze chimiche che incidono sugli organi riproduttivi maschili e/o femminili dei giovani animali adulti, evidenziando anche eventuali effetti immunologici. | 4. | I risultati del metodo di prova B.7 devono essere utilizzati per individuare i pericoli e valutare i rischi. I risultati ottenuti per quanto riguarda i parametri endocrini devono essere interpretati alla luce del “Quadro concettuale dell’OCSE per le prove e la valutazione delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino” (11). Il metodo prevede uno studio di base della tossicità a dosi ripetute che può essere utilizzato per le sostanze chimiche per le quali uno studio di 90 giorni non si giustifica (ad esempio quando il volume di produzione non supera determinate quantità) o prima di uno studio a lungo termine. Il periodo di esposizione deve essere di 28 giorni. | 5. | Il programma internazionale realizzato per la convalida di parametri in grado di individuare l’attività endocrina di una sostanza in esame ha evidenziato che la qualità dei dati ottenuti con questo metodo di prova dipende in ampia misura dall’esperienza del laboratorio che effettua le prove. Ciò vale soprattutto per la determinazione istopatologica di cambiamenti ciclici negli organi riproduttori femminili e la determinazione del peso dei piccoli organi ormono-dipendenti che sono difficili da dissecare. È stato messo a punto un documento di orientamento sull’istopatologia (19), che è disponibile sul sito dell’OCSE nella rubrica relativa alle linee guida per le prove sulle sostanze chimiche. Il documento è destinato ad aiutare i patologi nelle loro analisi e a migliorare la sensibilità delle prove. Nel metodo di prova sono stati integrati svariati parametri indicativi di una tossicità per il sistema endocrino. Gli endpoint per i quali non sono disponibili dati sufficienti a dimostrane l’utilità o che, nell’ambito del programma di convalida, hanno dimostrato una scarsa capacità di individuare gli interferenti endocrini sono proposti come endpoint opzionali (cfr. appendice 2). | 6. | Sulla base dei dati generati nel corso del processo di validazione, occorre sottolineare che la sensibilità di questo saggio non è sufficiente per individuare tutte le sostanze caratterizzate da un’attività (anti)androgenica o (anti)estrogenica (9). Il presente metodo di prova deve essere eseguito in una fase della vita estremamente sensibile alle interferenze endocrine. Tuttavia questo metodo ha permesso, nel corso del processo di convalida, di individuare delle sostanze con un forte o un debole impatto sulla funzione tiroidea e delle sostanze che agiscono fortemente o in misura ridotta sul sistema endocrino mediante recettori dell’estrogeno o dell’androgeno; nella maggior parte dei casi, tuttavia, non ha consentito di individuare le sostanze con effetti endocrini che incidono in misura limitata su questi recettori. Questo metodo non può pertanto essere descritto come prova di screening dell’attività endocrina. | 7. | Di conseguenza l’assenza di effetti legati a questi meccanismi di azione non può essere considerata una prova dell’assenza di effetti sul sistema endocrino. Per quanto riguarda gli effetti endocrini-mediati, la caratterizzazione delle sostanze non deve basarsi unicamente sui risultati del presente metodo di prova ma deve essere utilizzata nell’ambito di un approccio fondato sull’“onere della prova” che integri tutti i dati esistenti su una sostanza chimica per caratterizzarne la potenziale attività endocrina. Per questa ragione, le decisioni di tipo regolamentare relative all’attività endocrina delle sostanze chimiche (caratterizzazione dei composti) devono avvalersi di un approccio di ampio respiro, e non fondarsi solo sui risultati di questo metodo di prova. | 8. | Naturalmente tutte le procedure che prevedono l’utilizzo di animali rispetteranno le norme locali in materia di cura degli animali. Le descrizioni delle cure e dei trattamenti riportate qui di seguito corrispondono a norme di prestazione minime che, se del caso, sono sostituite dalla regolamentazione locale, qualora questa sia più rigorosa. Ulteriori indicazioni sul trattamento umano degli animali sono fornite dall’OCSE (14). | 9. | L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo. | PRINCIPIO DELLA PROVA | 10. | Ogni giorno, per un periodo di 28 giorni, si somministra per via orale la sostanza in esame in dosi crescenti a vari gruppi di animali da esperimento, laddove ad ogni gruppo corrisponde un determinato livello di dose. Durante il periodo di somministrazione gli animali vengono esaminati attentamente e quotidianamente al fine di rilevare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o oggetto di eutanasia durante la prova vengono sottoposti a autopsia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a autopsia. Uno studio a 28 giorni fornisce informazioni sugli effetti di un’esposizione ripetuta per via orale e può dimostrare la necessità di condurre ulteriori studi a più lungo termine. Può inoltre fornire informazioni sulla selezione delle concentrazioni in vista di studi a più lungo termine. I dati tratti dal metodo di prova devono permettere di caratterizzare la tossicità della sostanza in esame, avere un’indicazione sul rapporto dosaggio-risposta e determinare il NOAEL (no-observed-adverse effects — livello fino al quale non si osservano effetti dannosi). | DESCRIZIONE DEL METODO | Selezione delle specie animali | 11. | Il ratto è la specie preferita, ma sono ammesse anche altre specie di roditori. Se i parametri specificati nel metodo di prova B.7 sono studiati in un’altra specie di roditori occorre fornire una giustificazione dettagliata. Benché dal punto di vista biologico sia plausibile che altre specie rispondano ai prodotti tossici in modo simile ai ratti, l’utilizzo di specie più piccole può causare una maggiore variabilità dei risultati vista la difficoltà tecnica a sezionare organi di dimensioni inferiori. Nel programma internazionale di convalida per l’individuazione degli interferenti endocrini, il ratto è stata l’unica specie animale utilizzata. Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. La somministrazione deve iniziare il più presto possibile dopo lo svezzamento e comunque prima che gli animali abbiano raggiunto le nove settimane di vita. All’inizio dello studio la variazione di peso degli animali deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio per ciascun sesso. Se uno studio di tossicità orale a dose ripetuta costituisce una tappa preliminare di uno studio a lungo termine, si utilizzano di preferenza animali provenienti dallo stesso ceppo e aventi la medesima origine in entrambi gli studi. | Stabulazione e alimentazione | 12. | Tutte le procedure devono attenersi agli standard locali in materia di cura degli animali da esperimento. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 oC (± 3 oC). L’umidità relativa deve essere almeno del 30 % e preferibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia del laboratorio, ma l’obiettivo da raggiungere è un’umidità del 50-60 %. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua potabile. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire un’adeguata miscela della sostanza in esame, se somministrata con questo metodo. Gli animali devono essere sistemati nelle gabbie in piccoli gruppi dello stesso sesso; possono essere sistemati in gabbie individuali se necessario per ragioni scientifiche. Ciascuna gabbia non deve ospitare più di cinque animali. | 13. | L’alimentazione deve essere analizzata periodicamente per verificare la presenza di contaminanti. Un campione del mangime somministrato deve essere conservato fino al completamento della relazione. | Preparazione degli animali | 14. | Gli animali adulti, sani e giovani vengono suddivisi a caso in gruppi di controllo e di trattamento. Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Gli animali devono essere identificati in modo univoco e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio dello studio, in modo da consentirne l’adattamento alle condizioni di laboratorio. | Preparazione delle dosi | 15. | La sostanza di prova viene somministrata per via intragastrica, oppure con la dieta o l’acqua. Il metodo di somministrazione orale dipende dallo scopo dello studio e dalle caratteristiche fisiche/chimiche/tossico-cinetiche della sostanza in esame. | 16. | Ove necessario, la sostanza di prova è disciolta o sospesa in un veicolo adeguato. Si raccomanda di prendere in considerazione, in primis e ogni qualvolta possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta l’uso di una soluzione/sospensione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Se si usano veicoli diversi dall’acqua è necessario conoscerne le caratteristiche tossiche. È necessario determinare la stabilità della sostanza di prova nel veicolo. | PROCEDURA | Numero e sesso degli animali | 17. | Per ciascun livello di dosaggio dovranno essere utilizzati almeno 10 animali (5 di sesso femminile e 5 di sesso maschile). Se si prevedono sacrifici intermedi, il numero deve essere aumentato del numero di animali che si prevede di sottoporre a eutanasia prima del completamento dello studio. Si può considerare di includere un gruppo satellite supplementare di dieci animali (5 per sesso) nel gruppo di controllo e nel gruppo trattato con la dose più elevata al fine di monitorare la reversibilità, la persistenza, l’insorgenza ritardata di effetti tossici, per almeno 14 giorni dopo il trattamento. | Dosaggio | 18. | In genere si devono utilizzare almeno tre gruppi di trattamento e un gruppo di controllo; tuttavia, se la valutazione di altri dati porta a prevedere l’assenza di effetti a una dose ripetuta di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno, può essere eseguito un saggio limite. Per stabilire le dosi da utilizzare, in mancanza di dati adeguati si può effettuare uno studio preliminare di tipo “range finding”. Fatta eccezione per la somministrazione della sostanza in esame, gli animali del gruppo di controllo devono essere trattati in modo identico agli esemplari del gruppo di trattamento. Se si usa un veicolo per la somministrazione della sostanza in esame, al gruppo di controllo verrà somministrato il medesimo veicolo nel volume massimo utilizzato. | 19. | I livelli di dosaggio devono essere selezionati tenendo conto di tutti i dati esistenti sulla tossicità e le caratteristiche (tossico-)cinetiche della sostanza in esame o di sostanze affini. Il livello massimo di dosaggio deve essere tale da indurre effetti tossici senza cagionare la morte o sofferenze gravi. Deve inoltre essere selezionata una serie decrescente di dosaggi al fine di individuare eventuali risposte dosi-correlate e il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi (NOAEL). In genere, per determinare i livelli decrescenti di dosaggio si consiglia un intervallo con un fattore compreso tra 2 e 4 e spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che avere un intervallo eccessivamente lungo (ad esempio superiore a un fattore 10) fra un dosaggio e l’altro. | 20. | Nel caso di tossicità generale osservata (ad esempio riduzione del peso corporeo, effetti a livello epatico, cardiaco, polmonare o renale ecc.) o di altri cambiamenti che potrebbero non essere dovuti ad effetti tossici (diminuzione dell’assunzione di alimenti, dilatazione del fegato), gli effetti rilevati sugli endpoint neurologici, endocrini o legati al sistema immunitario devono essere interpretati con cautela. | Prova limite | 21. | Se una prova, effettuata secondo le procedure descritte per il presente studio, con un livello di dose di almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno o in caso di somministrazione con gli alimenti o l’acqua, ad una concentrazione equivalente (in funzione del peso corporeo), non produce effetti tossici osservabili e se i dati relativi a sostanze di struttura analoga non indicano tossicità, si può considerare che non è necessario eseguire uno studio completo utilizzando tre livelli di dose. Si effettua il saggio limite, tranne quando i dati sull’esposizione umana indicano la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato. | Somministrazione delle dosi | 22. | La sostanza in esame è somministrata agli animali giornalmente, sette giorni su sette, per un periodo di 28 giorni. Se viene effettuata per via intragastrica, la somministrazione deve avvenire in dose singola mediante sonda gastrica o idonea cannula per intubazione. Il volume massimo di liquido somministrabile in una volta sola dipende dalla taglia dell’animale, ma non deve superare 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose per le quali si possono prevedere fino a 2 ml/100 g di peso corporeo. Salvo nel caso di sostanze chimiche irritanti o corrosive, i cui effetti di norma tendono a esacerbarsi con l’aumentare della concentrazione, la variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concentrazione, in modo da mantenere un volume costante per tutti i livelli di dose. | 23. | Per le sostanze somministrate con la dieta o l’acqua è importante impedire che la quantità della sostanza in esame interferisca con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. Se la sostanza in esame è somministrata con la dieta, si può utilizzare una concentrazione costante nella dieta (ppm) o un livello di dose costante in funzione del peso corporeo di ciascun animale, avendo cura di specificare quale sia l’alternativa prescelta. Se la sostanza è somministrata per via intragastrica, la dose deve essere somministrata ogni giorno alla stessa ora e all’occorrenza modificata per mantenere costante il livello di dose rispetto al peso dell’animale. Qualora, prima di uno studio a lungo termine, si effettui uno studio preliminare a dose ripetuta, la dieta degli animali deve essere identica nei due studi. | Osservazioni | 24. | Il periodo di osservazione ha una durata di 28 giorni. Gli animali del gruppo satellite destinato al monitoraggio di follow up devono essere esaminati per almeno ulteriori 14 giorni senza alcun trattamento, al fine di individuare l’insorgenza tardiva, la persistenza o la scomparsa degli effetti tossici. | 25. | Le osservazioni cliniche generali devono essere effettuate almeno una volta al giorno, preferibilmente alla stessa ora e tenendo conto del periodo di massima intensità degli effetti previsti dopo la somministrazione. Si registrano le informazioni concernenti le condizioni di salute degli animali. Almeno due volte al giorno, tutti gli animali vengono esaminati al fine di determinare la morbilità e la mortalità. | 26. | Una volta prima dell’esposizione iniziale (per consentire un confronto sullo stesso soggetto) e, successivamente, almeno una volta la settimana tutti gli animali vengono sottoposti ad osservazioni cliniche particolareggiate. Queste osservazioni devono essere eseguite fuori dalle gabbie, collocando gli animali in un recinto standard, di preferenza sempre alla stessa ora. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente usando sistemi di punteggio statistico definiti appositamente dal laboratorio di prova. Si avrà cura di ridurre al minimo le variazioni delle condizioni sperimentali; le osservazioni devono essere effettuate da persone che non sono a conoscenza del trattamento somministrato. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle mucose, della comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell’attività autonomica (per esempio lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Vanno inoltre registrati cambiamenti dell’andatura, della postura e della risposta alla manipolazione, nonché la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipie (ad esempio tolettatura eccessiva, continuo girare in cerchio) o comportamenti insoliti (ad esempio automutilazione, marcia a ritroso) (2). | 27. | Nella quarta settimana di esposizione si procede alla valutazione della reattività sensoriale a diversi tipi di stimolo (2) (per esempio uditivi, visivi e propriocettivi) (3) (4) (5), della forza prensile (6) e dell’attività motoria (7). Ulteriori indicazioni sulle procedure utilizzabili sono contenute nelle voci bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate procedure alternative non indicate nella bibliografia. | 28. | Le osservazioni funzionali previste per la quarta settimana di esposizione possono essere evitate nel caso di uno studio preliminare ad un successivo studio subcronico (90 giorni). In questa eventualità, le osservazioni funzionali devono essere incluse nello studio complementare. D’altro canto, le informazioni ricavate dalle osservazioni funzionali nel corso dello studio a dose ripetuta possono essere utili nella determinazione dei livelli di dosaggio per un successivo studio subcronico. | 29. | Eccezionalmente è possibile omettere le osservazioni funzionali per i gruppi che evidenzino comunque segni di tossicità tali da interferire in modo significativo con l’esecuzione degli esami funzionali. | 30. | Nel corso dell’autopsia, si può (eventualmente) determinare il ciclo estrale per tutte le femmine mediante un Paptest. Queste osservazioni forniscono informazioni sullo stadio del ciclo estrale al momento dell’eutanasia e agevoleranno la valutazione istologica dei tessuti sensibili agli estrogeni [cfr. Linee guida sull’istopatologia (19)]. | Peso corporeo e consumo di cibo/acqua | 31. | Tutti gli animali devono essere pesati almeno una volta la settimana e il consumo di cibo deve essere determinato almeno una volta la settimana. Se la sostanza in esame viene somministrata con l’acqua, anche il consumo di acqua va misurato almeno una volta la settimana. | Ematologia | 32. | Al termine del periodo di prova, occorre procedere agli esami ematologici seguenti: ematocrito, concentrazioni di emoglobina, conteggio degli eritrociti, reticulociti, conteggio totale e differenziale dei leucociti, numero di placchette e misura del tempo e del potenziale di coagulazione. Se la sostanza in esame o i suoi metaboliti putativi hanno o possono avere proprietà ossidanti occorre effettuare altre analisi, relative tra l’altro alla concentrazione di metaemoglobine o ai corpi di Heinz. | 33. | I campioni di sangue devono essere prelevati da un determinato sito immediatamente prima o durante l’eutanasia degli animali e conservati in condizioni adeguate. Gli animali devono essere a digiuno la notte prima dell’eutanasia (7). | Biochimica clinica | 34. | Gli esami biochimico-clinici finalizzati allo studio dei principali effetti tossici sui tessuti e, in particolare, sui reni e sul fegato devono essere effettuati su campioni di sangue prelevati da tutti gli animali immediatamente prima o durante la loro soppressione (eccetto gli animali trovati moribondi e/o soppressi nel corso dello studio). Le analisi sul plasma o sul siero comprenderanno il sodio, il potassio, il glucosio, il colesterolo totale, l’urea, la creatinina, le proteine totali e l’albumina, almeno due enzimi indicatori degli effetti epatocellulari (come l’alanina aminotransferasi, l’aspartato aminotransferasi, la fosfatasi alcalina, la gamma-glutamil transpeptidasi e la glutammato-deidrogenasi). Le determinazioni di altri enzimi (di origine epatica o di altro tipo) e della bilirubina possono talvolta fornire indicazioni utili. | 35. | A titolo facoltativo, nel corso dell’ultima settimana dello studio, si possono effettuare le seguenti analisi delle urine su campioni raccolti in momenti specifici: aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine, glucosio e sangue/cellule ematiche. | 36. | È inoltre necessario considerare la possibilità di condurre studi sul plasma o sui marker sierologici dei danni generici ai tessuti. Altre determinazioni dovranno essere eseguite qualora si abbia motivo di ritenere o di sospettare che le proprietà della sostanza in esame possano alterare i profili metabolici riguardanti il calcio, il fosfato, i trigliceridi, gli ormoni specifici e la colinesterasi. Queste analisi vanno effettuate per alcune classi di sostanze chimiche oppure caso per caso. | 37. | Anche se la valutazione internazionale degli endpoint legati al sistema endocrino non è riuscita a stabilire in modo chiaro il vantaggio dell’analisi degli ormoni tirodei (T3, T4) e della TSH, potrebbe essere utile conservare dei campioni di plasma o di siero per misurare la T3, la T4 e la TSH (opzionale) se vi sono indicazioni di un effetto sull’asse ipofiso-tiroideo. Per lo stoccaggio questi campioni possono essere congelati a - 20°. I fattori seguenti possono influenzare la variabilità e le concentrazioni assolute delle analisi ormonali: | — | momento dell’eutanasia, per via della variazione diurna delle concentrazioni ormonali, | — | metodi di eutanasia, evitando di stressare inutilmente gli animali in quanto ciò potrebbe incidere sulle concentrazioni ormonali, | — | kit per le analisi ormonali che possono differire per le loro curve standard. | L’identificazione definitiva delle sostanze chimiche che agiscono sul sistema tiroideo è più affidabile se si fonda sull’analisi istopatologica più che sui livelli ormonali. | 38. | I campioni di plasma destinati specificatamente all’analisi ormonale devono essere prelevati nelle stesse ore della giornata. Si raccomanda di tenere conto dei tassi di T3, T4 e TSH provocati da alterazioni dell’istopatologia della tiroide. I valori numerici ottenuti dalle analisi delle concentrazioni ormonali differiscono in funzione dei kit disponibili in commercio utilizzati. Pertanto non è sempre possibile fornire criteri di prestazione fondati su dati storici omogenei. In alternativa, i laboratori devono fare il possibile per mantenere i coefficienti di variazione al di sotto di 25 per la T3 e la T4 e di 35 per la TSH. Tutte le concentrazioni devono essere annotate in ng/ml. | 39. | Se i dati di riferimento storici sono inadeguati, occorre tenere conto delle variabili ematologiche e di biochimica clinica prima di iniziare i dosaggi, di preferenza su un gruppo di animali diverso dal gruppo in esame. | PATOLOGIA | Autopsia macroscopica | 40. | Tutti gli animali dello studio vanno sottoposti ad un’autopsia macroscopica completa e dettagliata che comprenda un attento esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Il fegato, i reni, le ghiandole surrenali, i testicoli, gli epididimi, l’insieme composto dalla prostata e le vescicole seminali con le ghiandole della coagulazione, il timo, la milza, il cervello e il cuore di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati prima del completamento dello studio) vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati immediatamente dopo l’ablazione, per evitare l’essiccamento. Occorre prelevare con cautela l’insieme della prostata in modo da evitare di perforare le vescicole seminali piene di liquido. In alternativa si può liberare la vescicola seminale e la prostata dai tessuti aderenti e pesarli previa fissazione. | 41. | Eventualmente, per evitare il disseccamento, subito dopo la dissezione si possono pesare due altri organi: le due ovaie (peso a umido) e l’utero, ivi compreso il collo dell’utero [gli orientamenti sull’ablazione e la preparazione dei tessuti uterini ai fini del loro peso sono contenuti nella linea guida dell’OCSE n. 440 (18)]. | 42. | Il peso della tiroide (facoltativo) può essere stabilito dopo la fissazione. Anche in questo caso l’ablazione deve essere eseguita con cautela e solo previa fissazione per evitare di danneggiare i tessuti. L’eventuale danneggiamento dei tessuti infatti potrebbe compromettere l’analisi istopatologica. | 43. | I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato sia per il tipo di tessuto, sia per l’esame istopatologico che si intende effettuare successivamente (cfr. paragrafo 47): tutte le lesioni macroscopiche, cervello (porzioni rappresentative comprendenti cervello, cervelletto, bulbo e ponte), midollo spinale, occhi, stomaco, intestino tenue e crasso (comprese le placche di Peyer), fegato, reni, ghiandole surrenali, milza, cuore, trachea e polmoni (conservati con dilatazione mediante fissativo e poi immersione), gonadi (testicoli e ovaie), organi sessuali accessori (utero e collo dell’utero, epididimi, prostata + vescicole seminali con ghiandole della coagulazione), vagina, vescica e linfonodi [oltre al linfonodo più vicino un altro linfonodo, in funzione dell’esperienza del laboratorio (15)], nervo periferico (sciatico o tibiale) preferibilmente in prossimità del muscolo, muscolo e osso dello scheletro con il midollo osseo (una sezione/o un preparato fresco di midollo osseo aspirato). Si raccomanda di fissare i testicoli mediante immersione in un fissativo di Bouin o di Davidson modificato (16) (17). La tunica albuginea deve essere perforata, con un ago, con delicatezza e superficialmente in entrambi i poli dell’organo per consentire la rapida penetrazione del fissativo. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza in esame. | 44. | I tessuti elencati qui di seguito possono apportare informazioni utili sugli effetti endocrini: gonadi (ovaie e testicoli), organi sessuali accessori (utero, collo dell’utero, epididimi, vescicole seminali con ghiandole di coagulazione, prostata dorso laterale e ventrale), vagina, ipofisi, ghiandola mammaria maschile, tiroide e ghiandola surrenale. Non ci sono sufficienti riscontri di alterazioni nelle ghiandole mammarie maschili, ma questo parametro può essere molto sensibile alle sostanze con attività estrogenica. L’osservazione degli organi/tessuti non ripresi nel paragrafo 43 è facoltativa (cfr. appendice 2). | 45. | Il documento di orientamento sull’istopatologia (19) fornisce informazioni supplementari sulla dissezione, la fissazione, l’asportazione e l’istopatologia dei tessuti endocrini. | 46. | Nel corso del programma internazionale di prove, è stato rilevato che gli effetti endocrini poco evidenti, dovuti a sostanze chimiche in grado di squilibrare leggermente l’omeostasi degli ormoni sessuali, possono essere individuati dalla loro capacità di interferire sulla sincronizzazione del ciclo estrale in vari tessuti più che da evidenti alterazioni istopatologiche degli organi sessuali femminili. Sebbene non vi siano prove inconfutabili in tal senso, si raccomanda di tenere conto, nell’interpretazione dell’esame istologico delle ovaie, di una possibile asincronia del ciclo estrale (cellule follicolari, tecali e della granulosa). Se si esamina la fase del ciclo mediante un Paptest, si può tenere conto anche di questo dato come elemento di confronto aggiuntivo. | Esame istopatologico | 47. | Gli organi e i tessuti conservati di tutti gli animali del gruppo di controllo e del gruppo trattato con la dose più elevata vanno sottoposti a un esame istopatologico completo. Si procede a questi esami anche sugli animali degli altri gruppi se nel gruppo cui viene somministrata la dose più elevata si osservano alterazioni correlate al trattamento. | 48. | Si procederà all’esame di tutte le lesioni macroscopiche. | 49. | Quando si utilizza un gruppo satellite l’esame istopatologico va eseguito sui tessuti e sugli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati. | DATI E RELAZIONE | Dati | 50. | Devono essere riportati i dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo di trattamento il numero di animali all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante la prova o sottoposti a eutanasia per motivi umanitari e il momento di tutti i decessi/soppressioni, il numero di animali che manifestano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati con indicazione del momento dell’insorgenza, della durata e della gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di animali che manifesta ciascun tipo di lesione. | 51. | Se possibile, i risultati numerici devono essere valutati sulla base di un metodo statistico appropriato e comunemente accettato. I confronti degli effetti osservati nell’ambito di un intervallo di dosaggio deve rendere inutile l’utilizzo di prove t multiple. I metodi statistici devono essere selezionati durante la fase di progettazione dello studio. | 52. | Ai fini del controllo di qualità, si suggerisce di raccogliere dati di controllo storici e di calcolare i coefficienti di variazione per i dati numerici, in particolare per i parametri legati all’individuazione degli interferenti endocrini. Questi dati possono essere utilizzati, a fini di confronto, in fase di valutazione degli studi effettivamente realizzati. | Relazione sulla prova | 53. | La relazione deve contenere le seguenti informazioni: | | Sostanza chimica in esame: | — | natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche, | — | dati identificativi. | | Veicolo (se del caso): | — | motivazione della scelta del veicolo, se diverso dall’acqua. | | Animali sperimentali: | — | specie/ceppo impiegati, | — | numero, età e sesso degli animali, | — | provenienza, stabulazione, dieta ecc., | — | peso di ciascun animale all’inizio della prova, | — | qualora non siano stati utilizzati ratti, occorre spiegarne il motivo. | | Condizioni sperimentali: | — | criteri di selezione delle dosi, | — | informazioni dettagliate sulla formulazione della sostanza chimica in esame/preparazione della dieta, sulla concentrazione utilizzata, sulla stabilità e sull’omogeneità del preparato, | — | modalità precise di somministrazione della sostanza chimica in esame, | — | se del caso, conversione della concentrazione della sostanza nella dieta o nell’acqua (ppm) in dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno), | — | informazioni dettagliate sulla qualità degli alimenti e dell’acqua. | | Endpoint facoltativi esaminati: | — | elenco degli endpoint facoltativi esaminati. | | Risultati: | — | peso corporeo/variazioni del peso corporeo, | — | assunzione di cibo, ed eventualmente di acqua, | — | dati sulla risposta tossica per sesso e livello di dose, compresi segni di tossicità, | — | natura, gravità e durata degli effetti clinici (sia reversibili che non reversibili), | — | valutazione dell’attività sensoriale, della forza prensile e dell’attività motoria, | — | test ematologici con i relativi valori basali, | — | test biochimici clinici con i relativi valori basali, | — | peso corporeo al momento dell’eutanasia e dati sul peso degli organi, | — | referti autoptici, | — | descrizione dettagliata di tutti i risultati istopatologici, | — | dati sull’assorbimento, se disponibili, | — | elaborazione statistica dei risultati, se del caso. | | Discussione dei risultati | | Conclusioni | Appendice 1 | DEFINIZIONI | | Androgenicità: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone androgenico naturale (ad esempio il testosterone) in un mammifero. | | Antiandrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di un ormone androgenico naturale (ad esempio il testosterone) in un mammifero. | | Antiestrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di un ormone estrogenico naturale (ad esempio estradiolo 17ß) in un mammifero. | | Attività antitiroidea: la capacità di una sostanza chimica di inibire l’attività di un ormone tiroideo naturale (ad es T3.) in un mammifero. | | Dosaggio: termine generale che indica la dose, la frequenza e la durata della somministrazione. | | Dose: quantità di sostanza somministrata. La dose è espressa col peso della sostanza in esame per unità di peso corporeo dell’animale testato per giorno (mg/kg peso corporeo/giorno) o come una concentrazione costante nella dieta. | | Tossicità evidente: termine generale che designa i segnali evidenti di tossicità a seguito della somministrazione di una sostanza. Questi segni devono essere sufficienti per consentire la valutazione dei pericoli ed essere tali che si possa prevedere che l’aumento della dose somministrata comporti la comparsa di segni di tossicità grave e probabilmente la mortalità. | | NOAEL è l’abbreviazione di no-observed-adverse-effect level, ossia la dose più elevata alla quale non si osservano effetti avversi legati al trattamento. | | Estrogenicità: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone estrogenico naturale (ad esempio estradiolo 17ß) in un mammifero. | | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova. | | Attività tiroidea: la capacità di una sostanza chimica di agire come un ormone tiroideo naturale (ad es T3.) in un mammifero. | | Validazione è un processo scientifico destinato a caratterizzare le prescrizioni e i limiti operativi di un metodo di prova e a dimostrarne l’affidabilità e la pertinenza per un obiettivo specifico. | Appendice 2 | Endpoint raccomandati nel metodo di prova B.7 per l’individuazione degli interferenti endocrini | Endpoint obbligatori | Endpoint facoltativi | Peso | — | Testicoli | — | Epididimi | — | Ghiandole surrenali | — | Prostata + vescicole seminali con ghiandole della coagulazione | — | Ovaie | — | Utero, ivi compreso il collo dell’utero | — | Tiroide | Esame istopatologico | — | Gonadi: | — | Testicoli e | — | Ovaie | — | Organi sessuali accessori: | — | Epididimi, | — | Prostata + vescicole seminali con ghiandole della coagulazione | — | Utero, ivi compreso il collo dell’utero | — | Ghiandole surrenali | — | Tiroide | — | Vagina | — | Paptest | — | Ghiandole mammarie maschili | — | Ipofisi | Dosaggi ormonali | | — | Livelli di T3 e T4 circolanti | — | Livelli di TSH circolante | BIBLIOGRAFIA | (1) | OCSE (Parigi, 1992) Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity. | (2) | IPCS (1986). 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Academic Press: San Diego, CA, pagg. 52-85. | (17) | Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533. | (18) | OCSE (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. | (19) | OCSE (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11. | B.8. TOSSICITÀ SUBACUTA PER INALAZIONE: STUDIO A 28 GIORNI | SINTESI | Il presente metodo di prova rivisto B.8 è stato concepito per caratterizzare pienamente la tossicità per inalazione della sostanza in esame a seguito di un’esposizione ripetuta per un periodo di tempo limitato (28 giorni) e fornire dati per valutazioni quantitative dei rischi legati all’inalazione. Dei gruppi di roditori, composti da almeno 5 maschi e 5 femmine, sono esposti per 6 ore al giorno per 28 giorni a: a) la sostanza in esame a tre o più livelli di concentrazione; b) all’aria filtrata (controllo negativo); e/o c) al veicolo (gruppi di controllo del veicolo). Di norma gli animali sono esposti alla sostanza in esame per 5 giorni ma è possibile anche esporli 7 giorni su 7. Vengono sempre testati sia maschi che femmine, ma possono essere esposti a livelli di concentrazione diversi se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile ad una determinata sostanza. Per caratterizzare in modo più adeguato la tossicità della sostanza in esame, il presente metodo consente al responsabile dello studio di includere dei gruppi satellite (reversibilità), lavaggio bronchioalveolare, esami neurologici e ulteriori valutazioni istopatologiche o di patologia clinica. | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 412 (2009). La prima linea guida dell’OCSE sulla tossicità acuta per inalazione n. 412 è stata adottata nel 1981 (1). Questo metodo di prova B.8 (che corrisponde alla linea guida n. 412 rivista) è stato aggiornato per tenere conto dei progressi scientifici e rispondere alle esigenze normative attuali e future. | 2. | Il presente metodo consente di caratterizzare gli effetti avversi risultanti da un’esposizione quotidiana ripetuta, per inalazione, ad una sostanza per 28 giorni. I dati tratti da uno studio sulla tossicità subacuta per inalazione (a 28 giorni) possono essere utilizzati per le stime quantitative dei rischi [se lo studio non è seguito da una prova di tossicità subcronica per inalazione a 90 giorni (capitolo B.29 del presente allegato)]. Questi dati possono fornire informazioni che consentono di determinare le concentrazioni per studi a più lungo termine come lo studio sulla tossicità subcronica per inalazione a 90 giorni. Il presente metodo di prova non è destinato specificatamente ai test sui nanomateriali. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono riportate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento n. 39 (2). | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 3. | Il laboratorio incaricato della prova deve tenere conto di tutte le informazioni disponibili sulla sostanza in esame prima di svolgere lo studio, in modo da migliorare la qualità dello studio e ridurre al minimo l’utilizzo di animali. Tre le informazioni utili per la scelta delle concentrazioni adeguate saranno considerate l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo; l’impiego o gli impieghi previsti per l’esposizione umana, dati (Q)SAR disponibili e dati tossicologici in merito a sostanze chimiche di struttura affine; e dati tratti da prove sulla tossicità acuta per inalazione. Se si prevedono o si constatano effetti neurotossici nel corso dello studio, il responsabile dello studio può decidere di includere le valutazioni ritenute necessarie come una serie di osservazioni funzionali (functional observational battery — fob) e la misurazione dell’attività motoria. Lo svolgimento di questi esami aggiuntivi non interferisce con l’impostazione di base dello studio, anche se la durata delle esposizioni può essere fondamentale in relazione ad alcuni esami specifici. | 4. | Le diluzioni di sostanze corrosive o irritanti possono essere saggiate a concentrazioni che non consentono di conseguire il grado di tossicità auspicato [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Nell’esposizione degli animali a questa sostanze, le concentrazioni auspicate devono essere sufficientemente basse da non provocare dolore e stress intensi, pur essendo sufficienti a prolungare la curva concentrazione-risposta fino a dei livelli corrispondenti all’obiettivo scientifico e regolamentare della prova. La scelta di queste concentrazioni deve avvenire caso per caso, di preferenza in base ad uno studio di tipo “range finding” adeguatamente impostato che fornisca informazioni sull’endpoint, l’eventuale soglia di irritazione e il momento dell’insorgenza (cfr. punti da 11 a 13). Occorre fornire la giustificazione della scelta delle concentrazioni. | 5. | Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia. Gli animali moribondi sono considerati alla stregua degli animali che muoiono nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di uno documento d’orientamento dell’OCSE, che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (3). | DESCRIZIONE DEL METODO | Selezione delle specie animali | 6. | Si devono utilizzare roditori adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. La specie preferita è il ratto. In caso di utilizzo di un’altra specie è necessario motivarne la scelta. | Preparazione degli animali | 7. | Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno della randomizzazione gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 7 e 9 settimane. Il loro peso corporeo non deve superare di ± 20 % del peso medio per ciascun sesso. Gli animali sono scelti in modo casuale, marchiati per consentire l’individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova, affinché si adattino alle condizioni di laboratorio. | Condizioni di allevamento degli animali | 8. | Gli animali devono essere identificati individualmente, possibilmente mediante dispositivi subcutanei al fine di agevolarne l’osservazione e evitare qualsiasi confusione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene “a naso solo”, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sugli endpoint fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respiratorio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adattamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti “a corpo intero” ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da laboratorio, accompagnate da acqua potabile a volontà. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. | Camere di inalazione | 9. | La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposizione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione per via nasale per gli studi di aerosol liquidi o solidi e di vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione “a corpo intero” può essere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità atmosferica di una camera di esposizione “a corpo intero”, il volume complessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i principi delle tecniche di esposizione “a naso solo”e “a corpo intero”, nonché i relativi vantaggi e svantaggi. | STUDI DI TOSSICITÀ | Concentrazioni limite | 10. | A differenza degli studi di tossicità acuta, per gli studi di tossicità subacuta per inalazione a 28 giorni non è definita la concentrazione massima. La concentrazione massima testata deve tenere conto di: 1) la concentrazione massima raggiungibile; 2) il livello di esposizione umana corrispondente al “peggiore dei casi”; 3) la necessità di mantenere un’adeguata alimentazione di ossigeno; e/o 4) il benessere degli animali. In assenza di limiti basati sui dati, si possono utilizzare i valori limite del regolamento (CE) n. 1272/2008 (13) (ossia una concentrazione massima di 5 mg/l per gli aerosol, di 20 mg/l per i vapori e 20 000 ppm per i gas); cfr. documento di orientamento n. 39 (2). Qualora sia necessario superare questi valori limite, per le prove con gas o sostanze fortemente volatili (ad esempio i refrigeranti), occorre giustificare questo superamento. La concentrazione limite deve provocare una chiara tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3). | Studio per la determinazione dell’intervallo di dosi (range finding) | 11. | Prima di iniziare lo studio principale, occorre generalmente effettuare uno studio preliminare di tipo range finding. Uno studio di questo tipo è più completo di uno studio di osservazione perché non si limita alla scelta delle concentrazioni. Le conoscenze acquisite grazie a questo tipo di studio possono determinare il buon esito dello studio principale. Uno studio per determinare l’adeguato intervallo di dosi può, ad esempio, fornire informazioni tecniche sul metodo di analisi, la granulometria delle particelle, la scoperta di meccanismi di tossicità, i dati istopatologici e di patologia clinica e le stime circa le concentrazioni NOAEL e MTC (concentrazione massima tollerata) nello studio principale. Il responsabile dello studio può decidere di utilizzare uno studio di tipo range finding per individuare: la soglia di irritazione dell’apparato respiratorio (ad esempio mediante istopatologia dell’apparato respiratorio, test sulla funzionalità polmonare e lavaggi broncoalveolari), la concentrazione massima tollerata dagli animali senza che risentano uno stress eccessivo e i parametri che consentono di caratterizzare al meglio la tossicità della sostanza in esame. | 12. | Uno studio per la determinazione degli intervalli di dose può comportare uno o più livelli di concentrazione. Per ogni livello di concentrazione sono esposti al massimo tre maschi e tre femmine. Lo studio in questione deve durare da un minimo di 5 giorni ad un massimo di 14 giorni. Nella relazione sullo studio è opportuno illustrare la ragione della scelta delle concentrazioni per lo studio principale, il cui scopo è dimostrare una relazione concentrazione-risposta sulla base dell’endpoint ritenuto a priori più sensibile La concentrazione inferiore deve essere del tipo NOAEL mentre la concentrazione più elevata deve comportare una chiara tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3). | 13. | Nello studio di tipo range finding, al momento della scelta dei livelli di concentrazione, occorre tener conto di tutte le informazioni disponibili, anche quelle relative alle relazioni struttura-attività e i dati concernenti sostanze chimiche analoghe (cfr. paragrafo 3). Lo studio di determinazione dell’intervallo di dosi può confermare o invalidare la scelta degli endpoint più sensibili secondo criteri meccanicistici, come l’inibizione della colinesterasi dovuta a organofosfati, la formazione di metaemoglobine da parte di agenti eritrotossici, gli ormoni tiroidei (T3 e T4) nel caso degli agenti i tireotossici, le proteine, la LDH, la presenza di neutrofili nei lavaggi broncoalveolari nel caso di particelle inoffensive scarsamente solubili o di aerosol irritanti per i polmoni. | Studio principale | 14. | Uno studio principale di tossicità subcronica di norma comprende tre livelli di concentrazione e un controllo negativo (aria) e/o un controllo del veicolo, se necessario (cfr. paragrafo 17). Per scegliere i livelli di esposizione adeguati, occorre avvalersi di tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i risultati degli studi sistemici di tossicità, il metabolismo e la cinetica (occorre fare il possibile per evitare i livelli di concentrazione elevati caratterizzati da processi cinetici di saturazione). Ogni gruppo comprende almeno 10 roditori (5 maschi e 5 femmine) che sono esposti alla sostanza in esame per 6 ore al giorno, 5 giorni la settimana per 4 settimane (per una durata totale dello studio di 28 giorni). Gli animali possono anche essere esposti per 7 giorni la settimana (ad esempio nel caso di prove su prodotti farmaceutici inalati). Se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile alla sostanza in esame, i livelli di concentrazione possono differire secondo il sesso al fine di ottimizzare la concentrazione-risposta come indicato al paragrafo 15. Se per l’esposizione solo per via nasale s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore o superiore (ad esempio 22 ore al giorno) deve essere debitamente motivata. [cfr. il documento di orientamento n. 39 (2)]. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa, a meno che l’esposizione quotidiana sia superiore a 6 ore. Nel corso dell’esposizione “a corpo intero” si può continuare a somministrare acqua. | 15. | Le concentrazioni bersaglio selezionate devono consentire di individuare l’organo o gli organi bersaglio e evidenziare una concentrazione-risposta chiara. | — | Il livello di concentrazione elevato deve ridurre gli effetti tossici senza provocare segni persistenti o la morte che impedirebbero una valutazione significativa dei risultati | — | Il o i livelli di concentrazione medi devono essere intervallati in modo da produrre una graduazione degli effetti tossici tra la bassa e l’alta concentrazione | — | Il livello di dose inferiore non deve produrre effetti tossici o al massimo produrre effetti poco rilevanti. | Studio satellite (studio di reversibilità) | 16. | Uno studio di reversibilità può essere utilizzato per evidenziare il carattere reversibile, persistente o ritardato della tossicità, per un periodo post-trattamento di una durata adeguata, e comunque di almeno 14 giorni. I gruppi satellite sono costituiti da cinque maschi e cinque femmine esposti contemporaneamente agli animali in esame nell’ambito dello studio principale. Questi gruppi devono essere esposti alla concentrazione più elevata della sostanza in esame. Sarebbe opportuno utilizzare anche un gruppo di controllo (aria) e/o un gruppo di controllo del mezzo (cfr. paragrafo 17). | Animali di controllo | 17. | Gli animali del controllo negativo (aria) devono essere trattati come gli animali del gruppo soggetto alla prova, ad eccezione del fatto che sono esposti ad aria filtrata e non alla sostanza in esame. Quando per produrre l’atmosfera di prova si utilizza acqua o un’altra sostanza, occorre integrare nello studio un gruppo di controllo del veicolo al posto del gruppo di controllo negativo (aria). Laddove possibile è opportuno utilizzare l’acqua come veicolo. In tal caso, gli animali del gruppo di controllo devono essere esposti all’aria caratterizzata dalla stessa umidità relativa dell’aria del gruppo in esame. La selezione di un veicolo adeguato deve basarsi su dati dello studio preliminare o storici adeguati. Qualora non si disponga di informazioni sufficienti sulla tossicità di un veicolo, il responsabile dello studio può utilizzare un gruppo di controllo negativo (aria) e un gruppo di controllo del veicolo, anche se questa opzione è vivamente sconsigliata. Se i dati storici indicano che un veicolo non è tossico, non occorre ricorrere a un gruppo di controllo negativo (aria) ma basta utilizzare un gruppo di controllo del veicolo. Se uno studio preliminare effettuato su una sostanza in esame incorporata in un veicolo non rileva nessuna tossicità, significa che il veicolo non è tossico alla concentrazione in questione e che si deve utilizzare questo gruppo di controllo del veicolo. | CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE | Somministrazione delle concentrazioni | 18. | Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, dalla concentrazione prescelta e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che essa si presenti nel corso della manipolazione e dell’utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere testate in atmosfera secca. Occorre prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive. Per ridurre la granulometria, il materiale particolato può essere sottoposto a processi meccanici. Ulteriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento n. 39 (2). | Distribuzione granulometrica | 19. | La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare degli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) da 1 a 3 μm con una deviazione standard geometrica (σg) compresa tra 1,5 e 3,0 (4). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario presentare il parere di un esperto. Ad esempio le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole dello standard indicato, mentre le particelle caricate e le fibre possono superare questo standard. | Preparazione della sostanza in esame in un veicolo | 20. | Idealmente la sostanza deve essere testata senza un veicolo. Qualora sia necessario utilizzare un veicolo per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in esame, è preferibile utilizzare l’acqua. Quando una sostanza è disciolta in un veicolo, occorre verificarne la stabilità. | MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE | Flusso d’aria nella camera di esposizione | 21. | Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio in tempo reale della concentrazione (o stabilità temporale) dell’atmosfera di prova costituisce una misura integrale di tutti i parametri dinamici e un modo indiretto di controllare tutti i parametri dinamici di inalazione. Se la concentrazione è monitorata in tempo reale, la frequenza di misurazione dei flussi d’aria può essere diminuita ad un’unica misurazione per giorno di esposizione. Si farà il possibile, nelle camere d’esposizione “a naso solo”, per evitare la reinalazione. La concentrazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non poter rispettare queste concentrazioni, è necessario misurare le concentrazioni di ossigeno e di anidride carbonica. Se le misurazioni effettuate il primo giorno di esposizione dimostrano che i livelli di questi gas sono corretti, non occorrono altre misurazioni. | Temperatura e umidità relativa della camera | 22. | La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. Sia nel caso delle esposizioni “a naso solo” che per le esposizioni “a corpo intero”, l’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale è costantemente monitorata e registrata ogni ora nel corso di ciascuna esposizione, se possibile. L’umidità relativa deve preferibilmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, nel caso delle miscele acquose) o che l’umidità non possa essere misurata per via delle interferenze della sostanza con il presente metodo di prova. | Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale | 23. | Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla massa della sostanza in esame generata divisa per il volume di aria che è passato nel sistema della camera di inalazione. La concentrazione nominale non serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficienza di produzione del sistema di prova e può essere utile per individuare eventuali problemi di produzione. | Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale | 24. | La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame prelevata nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici, come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica è ammissibile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su opportune caratterizzazioni specifiche della sostanza in esame effettuate prima dello studio in corso. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per determinare la concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti in polvere, ma occorrono dati analitici che dimostrino che la composizione del materiale in sospensione nell’aria è analoga a quella del materiale di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente in sospensione nell’aria) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto. | 25. | Nel corso dell’intero studio, è opportuno utilizzare, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il campione va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità dei contaminanti e delle impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area del picco, peso molecolare risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, oppure altre stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione il laboratorio potrebbe confermare almeno una parte delle caratteristiche fornite dallo sponsor (colore, natura fisica ecc.). | 26. | L’atmosfera di esposizione deve essere mantenuta costante nei limiti del possibile. Per verificare la stabilità delle condizioni di esposizione si può utilizzare un dispositivo di monitoraggio in tempo reale, come un fotometro per aerosol o un analizzatore di idrocarburi totali per i vapori. La concentrazione reale della camera deve essere misurata almeno 3 volte nel corso di ogni giorno di esposizione per ciascun livello di esposizione. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un campione per periodo di esposizione. Idealmente si deve prelevare questo campione per l’intero periodo di esposizione. La concentrazione dei singoli campioni prelevati nella camera non deve deviare dalla concentrazione media della camera più del ± 10 %, nel caso di gas e vapori, o ± 20 % nel caso degli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario affinché la camera di esposizione raggiunga l’equilibrio (t95). La durata di un’esposizione copre il tempo di produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario per raggiungere l’equilibrio delle concentrazioni nella camera (t95) e il loro declino. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene indicazioni per la stima di t95. | 27. | Per miscele molto complesse costituite da gas/vapori e aerosol (ad esempio, atmosfere di combustione e sostanze chimiche generate per propulsione da appositi prodotti/dispositivi finali), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere almeno una sostanza indicatrice (analita), normalmente il principio attivo principale della miscela. Quando la sostanza chimica in esame è una miscela, nella relazione dovrà essere indicata la concentrazione analitica per l’intera miscela e non solo quella del principio attivo o della sostanza indicatrice (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni reali sono reperibili nel documento d’orientamento n. 39 (2). | Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica | 28. | La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata almeno una volta la settimana per ciascuna concentrazione, utilizzando un impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS (Aerodynamic Particle Sizer). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e con l’altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato nel corso dell’intero studio. | 29. | Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta con l’analisi su filtri [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa equivalenza può essere dimostrata a tutte le concentrazioni saggiate nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misurazioni di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere uno studio. | 30. | È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che rischiano di condensarsi e formare aerosol o se si rilevano particelle in un’atmosfera di vapori che si presume possano formare fasi miste. | OSSERVAZIONI | 31. | Prima e dopo il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami clinici degli animali. Osservazioni più frequenti possono essere utili in funzione della risposta degli animali nel corso dell’esposizione. Quando l’osservazione degli animali è ostacolata dai tubi di contenzione, dalla scarsa illuminazione nella camere “a corpo intero” o da atmosfere opache, gli animali vanno attentamente osservati dopo l’esposizione. Le osservazioni fatte prima dell’esposizione del giorno successivo possono rilevare l’eventuale reversibilità o esacerbazione degli effetti tossici. | 32. | Tutte le osservazioni vanno registrate e riportate singolarmente per ciascun animale. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile. | 33. | Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso, dell’attività somatomotoria e del comportamento. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dall’esposizione o dalla reclusione. Lo studio può prevedere ulteriori valutazioni riguardanti: cinetica, biomonitoraggio, funzione polmonare, ritenzione di materiali scarsamente solubili che si accumulano nel tessuto polmonare e variazioni comportamentali. | PESO CORPOREO | 34. | Il peso di ogni singolo animale deve essere registrato immediatamente prima dell’esposizione (giorno 0), e due volte la settimana successivamente (ad esempio: il venerdì e il lunedì per verificare il recupero dopo un fine settimana senza esposizione, o a intervalli di tempo che consentano di valutare la tossicità sistemica) e al momento della morte o dell’eutanasia. In assenza di effetti nel corso delle prime 2 settimane, il peso corporeo può essere misurato ogni settimana fino al termine dello studio. Gli animali del gruppo satellite (studio di reversibilità) devono continuare ad essere pesati a cadenza settimanale per l’intero periodo di recupero. Al termine dello studio, tutti gli animali devono essere pesati prima dell’eutanasia per non falsare il calcolo del rapporto tra il peso degli organi e il peso corporeo. | CONSUMO DI ALIMENTI E DI ACQUA | 35. | Si deve procedere settimanalmente alla misura del consumo alimentare, anche il consumo di acqua può essere misurato. | PATOLOGIA CLINICA | 36. | Tutti gli animali, ivi compresi quelli dei gruppi di controllo e dei gruppi satelliti, una volta sacrificati devono essere sottoposti a esami clinici. L’intervallo di tempo tra la fine dell’esposizione e il prelievo di sangue deve essere annotato, soprattutto quando la ricostituzione dell’endpoint è rapida. Alla fine dell’esposizione, si raccomanda il campionamento per i parametri caratterizzati da una breve emivita del plasma (COHb, CHE e MetHb). | 37. | Nella tabella 1 sono elencati i parametri di patologia clinica generalmente necessari per gli esami tossicologici. L’esame delle urine non è sempre richiesto, ma può essere effettuato se ritenuto utile in funzione della tossicità prevista o osservata. Per caratterizzare meglio la tossicità della sostanza in esame, il responsabile dello studio può decidere di valutare ulteriori parametri (ad esempio attività colinesterasica, lipidi, ormoni, equilibrio acido/base, metaemoglobina o corpi di Heinz, creatinina chinasi, rapporto mieloide/eritroide, troponina, emogas, lattato deidrogenasi, sorbitolo deidrogenasi, glutammato-deidrogenasi e gamma-glutamil transpeptidasi). | Tabella 1 | Parametri standard di patologia clinica | Ematologia | Conteggio eritrocitario | Ematocrito | Concentrazione dell’emoglobina | Tenore globulare medio in emoglobina | Volume medio corpuscolare | Concentrazione di emoglobina corpuscolare media | Reticolociti | Conta totale dei globuli bianchi | Conta differenziale dei globuli bianchi | Conta delle piastrine | Coagulabilità (scegliere un parametro): | — | Tempo di protrombina | — | Tempo di coagulazione | — | Tempo di tromboplastina parziale attivata | Chimica clinica | Glucosio (8) | Colesterolo totale | Trigliceridi | Azoto ureico ematico | Bilirubina totale | Creatinina | Proteina totale | Albumina | Globulina | Alanina-aminotransferasi | Aspartato amminotransferasi | Fosfatasi alcalina | Potassio | Sodio | Calcio | Fosforo | Cloruro | Esame delle urine (facoltativo) | Aspetto (colore e torbidità) | Volume | Densità relativa o osmolalità | pH | Proteina totale | Glucosio | Sangue/cellule ematiche | 38. | Qualora esista la prova che le vie respiratorie inferiori (gli alveoli) sono il principale sito di deposito e ritenzione, si può ricorrere al lavaggio broncoalveolare (BAL) come tecnica migliore per analizzare quantitativamente i parametri del rapporto dose-effetto, incentrandosi soprattutto sull’alveolite, l’infiammazione polmonare e la fosfolipidosi. Questo esame consente di analizzare adeguatamente l’evoluzione del rapporto dose-effetto e del decorso temporale di una lesione alveolare. Il fluido del lavaggio può essere analizzato basandosi sul numero totale e differenziale di leucociti, proteine totali e lattato deidrogenasi. Altri parametri da considerare sono quelli indicativi di lesione lisosomiale, fosfolipidosi, fibrosi, e infiammazione irritativa o allergica che può comprendere la determinazione di citochine o di chemiochine proinfiammatorie. Le misure legate al BAL spesso integrano i risultati degli esami istopatologici senza tuttavia sostituirli. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene le indicazioni su come effettuare il lavaggio dei polmoni. | PATOLOGIA MACROSCOPICA E PESO DEGLI ORGANI | 39. | Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della prova e quelli che sono ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti al dissanguamento totale (se fattibile) e autopsia macroscopica. Occorre annotare il tempo trascorso tra la fine dell’ultima esposizione di ogni animale e il loro sacrificio. Se non è possibile eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere eseguita non appena possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni animale si annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, prestando particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie. | 40. | Nella tabella 2 sono elencati gli organi e i tessuti che devono essere conservati in un ambiente adeguato nel corso dell’autopsia macroscopica ai fini dell’esame istopatologico. La conservazione degli organi e dei tessuti [tra parentesi quadre] e di qualsiasi altro organo o tessuto sono a discrezione del responsabile dello studio. Gli organi indicati in grassetto devono essere espiantati e pesati allo stato umido, appena possibile dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. La tiroide e gli epididimi devono essere pesati solo se necessario in quanto la loro asportazione può ostacolare la valutazione istopatologica. Gli organi e i tessuti sono fissati mediante formalina tamponata al 10 % o un altro fissativo adeguato, non appena finita l’autopsia e non meno di 24-48 ore prima dell’ablazione, in funzione del fissativo utilizzato. | Tabella 2 | Organi e tessuti preservati nel corso dell’autopsia macroscopica | Ghiandole surrenali | Midollo osseo (e/o aspirato fresco di midollo) | Cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte) | [Occhi (retina, nervo ottico) e palpebre] | Cuore | Reni | Laringe (3 livelli, 1 livello per comprendere la base dell’epiglottide) | Fegato | Polmone (tutti i lobi ad un livello, compresi i bronchi principali) | Linfonodi della regione ilare del polmone, soprattutto per il particolato di sostanze chimiche poco solubile. Per esami più approfonditi e/o studi incentrati sull’aspetto immunologico, si possono esaminare anche altri linfonodi, ad esempio quelli delle regioni mediastinale, cervicale/submandibolare e/o auricolare. | Tessuti nasofaringei (almeno 4 livelli; 1 livello per comprendere il dotto nasofaringeo e il tessuto associato al naso — Nasal Associated Lymphoid Tissue — NALT) | Esofago | [Bulbo olfattivo] | Ovaie | Vescicole seminali | Midollo spinale (cervicale, mediotoracico e lombare) | Milza | Stomaco | Testicoli | Timo | Tiroide | Trachea almeno a 2 livelli, ivi comprese 1 sezione longitudinale attraverso la carena e 1 sezione trasversale) | [Vescica] | Utero | Tutte le lesioni macroscopiche | 41. | I polmoni devono essere asportati intatti, pesati e trattati con un fissativo idoneo ad una pressione di 20-30 cm di acqua per garantire che la struttura dei polmoni venga preservata (5). Le sezioni sono prelevate per tutti i lobi ad un livello, ivi inclusi i bronchi principali, ma se si effettua un lavaggio polmonare, il lobo che non è stato lavato è sezionato su tre livelli (non sezioni in serie) | 42. | Si devono esaminare almeno 4 livelli di tessuti rinofaringei, uno dei quali deve comportare il canale rinofaringeo (5) (6) (7) (8) (9) per permettere un esame adeguato dell’epitelio squamoso, transizionale (respiratorio non cigliato), respiratorio (respiratorio cigliato) e olfattivo, nonché del tessuto linfatico (NALT) (10) (11). Occorre inoltre esaminare tre livelli della laringe, tra cui uno che comprenda la base dell’epiglottide (12). Occorre esaminare almeno due livelli della trachea, ivi compresa una sezione longitudinale lungo la carena della biforcazione dei bronchi extrapolmonari e una sezione trasversale. | ESAME ISTOPATOLOGICO | 43. | Una valutazione istopatologica di tutti gli organi e i tessuti di cui alla tabella 2 è necessaria per i gruppi di controllo e i gruppi trattati con la concentrazione più elevata, e per tutti gli animali che muoiono o subiscono l’eutanasia nel corso dello studio. Occorre prestare particolare attenzione all’apparato respiratorio, agli organi bersaglio e alle lesioni macroscopiche. Gli organi e tessuti sui quali si riscontrano delle lesioni nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata devono essere esaminati in tutti i gruppi. Il responsabile dello studio può decidere di effettuare valutazioni istopatologiche anche per altri gruppi al fine di dimostrare una chiara risposta alle concentrazioni Quando si utilizza un gruppo satellite (reversibilità), la valutazione istopatologica va eseguita su tutti i tessuti e gli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati. Se nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata si registra un numero eccessivo di morti premature o altri tipi di problemi che possono compromettere il significato dei dati, occorre effettuare una valutazione istopatologica del livello di concentrazione immediatamente inferiore. Si deve cercare di correlare le osservazioni macroscopiche con i risultati degli esami microscopici. | DATI E RELAZIONE | Dati | 44. | Per i singoli animali occorre fornire i dati riguardanti il peso corporeo, il consumo di cibo, la patologia clinica, la patologia macroscopica, il peso degli organi e l’istopatologia. I dati di osservazione clinica devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo di prova, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e la reversibilità, e i risultati dell’autopsia. Tutti i risultati, quantitativi e descrittivi, devono essere valutati con un metodo statistico idoneo. Può essere utilizzato qualsiasi metodo statistico generalmente riconosciuto. I metodi statistici devono essere stabiliti nella fase di concezione dello studio. | Relazione sulla prova | 45. | La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi: | | Animali sperimentali e condizioni di allevamento: | — | descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta, | — | specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse dal ratto; Possono essere forniti dati di origine e storici se riguardano animali esposti a condizioni di esposizione, di stabulazione e di digiuno simili, | — | numero, età e sesso degli animali, | — | metodo di randomizzazione, | — | descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in particolare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie. | | Sostanza chimica in esame: | — | natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa l’isomerizzazione), | — | dati di identificazione e numero CAS (Chemical Abstract Services), se noto. | | Veicolo: | — | motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione per la scelta del veicolo (se diverso dall’acqua), | — | dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con i risultati dello studio. | | Camera di inalazione: | — | descrizione dettagliata della camera di inalazione, comprendente il volume e un diagramma, | — | provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposizione degli animali e per la generazione dell’atmosfera, | — | apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granulometria e della concentrazione reale, | — | fonte dell’aria e sistema di climatizzazione utilizzato, | — | metodi utilizzati per calibrare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omogeneità dell’atmosfera di prova, | — | differenza di pressione (positiva o negativa), | — | bocchette di esposizione per camera (“a naso solo”); ubicazione degli animali nella camera (“a corpo intero”), | — | stabilità dell’atmosfera di prova, | — | ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campionamento dell’atmosfera della prova nella camera, | — | trattamento dell’aria fornita/estratta, | — | portate dell’aria, portata dell’aria in ogni punto di esposizione (“a naso solo”) o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della camera (“a corpo intero”), | — | tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t95), | — | numero di sostituzioni del volume per ora, | — | dispositivi di misurazione (se applicabile). | | Dati sull’esposizione: | — | giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio principale, | — | concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta circolare nella camera), | — | concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, vapori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse, | — | riportare le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, mg/l, mg/m3 ecc.), più che in unità di volume (ad esempio, ppm, ppb ecc.), | — | distribuzione della dimensione delle particelle, diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica (σg), con relativi metodi di calcolo. Occorre indicare anche le singole analisi granulometriche. | | Condizioni sperimentali: | — | indicazioni sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando i dettagli delle procedure impiegate per ridurre la granulometria dei solidi o per preparare soluzioni della sostanza in esame, | — | una descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali, | — | ragguagli sull’apparecchiatura utilizzata per monitorare la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera (ad esempio sviluppo di una curva di calibrazione), | — | informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per raccogliere campioni per la determinazione della concentrazione e della distribuzione della dimensione delle particelle nella camera, | — | dettagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal mezzo campionato), | — | metodo di randomizzazione per l’assegnazione degli animali nei gruppi sperimentali e di controllo, | — | dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della dieta, origine dell’acqua), | — | giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali. | | Risultati: | — | tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera, | — | tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera, | — | tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul campionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e della σg, | — | tabella con i dati di risposta e livello di concentrazione per ciascun animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti), | — | tabella con il peso dei singoli animali, | — | tabella con il consumo di cibo, | — | tabella con i dati clinico-patologici, | — | reperti necroscopici ed reperti istopatologici per ciascun animale, se disponibili, | — | tabella con altri eventuali parametri misurati. | | Discussione e interpretazione dei risultati: | — | occorre dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria, | — | occorre esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti, | — | si deve tenere conto, nella valutazione globale dello studio, della coerenza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali e reali e considerare il rapporto tra di esse, | — | si deve esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo d’azione prevalente (sistemico o locale), | — | occorre fornire delle spiegazioni qualora sia stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (3), | — | occorre individuare gli organi bersaglio, | — | occorre definire il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi (NOAEL) e la dose minima con effetto avverso osservabile (LOAEL). | BIBLIOGRAFIA: | (1) | OCSE (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (3) | OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (4) | Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pagg. 229-258. | (6) | Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. | (7) | Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238. | (8) | Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. | (9) | Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. | (10) | Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. | (11) | Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. | (12) | Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428. | (13) | Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1). | Appendice 1 | DEFINIZIONI | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. | » | 4. | poglavji B.7 in B.8 se nadomestita z naslednjima: | „B.7 28-DNEVNA ŠTUDIJA ORALNE STRUPENOSTI S PONAVLJAJOČIMI SE ODMERKI NA GLODAVCIH | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 407 (2008). Prvotna Smernica za preskušanje 407 je bila sprejeta leta 1981. Leta 1995 je bila sprejeta revidirana različica, da bi se z živalmi, uporabljenimi v študiji, pridobile dodatne informacije, zlasti o nevrotoksičnosti in imunotoksičnosti. | 2. | OECD se je leta 1998 lotila prednostne naloge revidiranja obstoječih smernic za preskušanje ter priprave novih smernic za presejalne preskuse in preskušanje potencialnih povzročiteljev endokrinih motenj (8). Eden od elementov te naloge je bil posodobitev obstoječe smernice OECD za ‚28-dnevno študijo oralne strupenosti s ponavljajočimi se odmerki na glodavcih‘ (TG 407) s parametri, ki so primerni za odkrivanje endokrinega delovanja preskusnih kemikalij. Ta postopek je bil predmet obsežnega mednarodnega programa za preskušanje pomena in uporabnosti dodatnih parametrov, učinkovitosti teh parametrov pri kemikalijah z (anti)estrogenim, (anti)androgenim in (proti)ščitničnim delovanjem, ponovljivosti v enem ali več laboratorijih ter interference novih parametrov s parametri, zahtevanimi v prejšnji smernici TG 407. Velika količina podatkov, ki je bila pri tem pridobljena, je bila zbrana in podrobno ocenjena v izčrpnem poročilu OECD (9). Ta posodobljena preskusna metoda B.7 (ki ustreza smernici TG 407) je plod izkušenj in rezultatov, pridobljenih med mednarodnim preskusnim programom. Z njo se lahko nekateri z endokrinim sistemom posredovani učinki obravnavajo skupaj z drugimi toksikološkimi učinki. | ZAČETNI PREUDARKI IN OMEJITVE | 3. | Pri ocenjevanju in vrednotenju strupenih lastnosti kemikalije se lahko metoda s ponavljanjem odmerkov uporabi za določitev oralne strupenosti, potem ko se s preskusi akutne strupenosti že pridobijo začetne informacije o strupenosti. Cilj te preskusne metode je preučiti učinke na zelo različne možne tarče strupenosti. Z njo se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki lahko nastanejo pri ponavljajoči se izpostavljenosti v razmeroma omejenem obdobju, vključno z učinki na živčni, imunski in endokrini sistem. V zvezi s temi končnimi točkami bi se s to metodo morale identificirati kemikalije, ki imajo nevrotoksični potencial, zaradi katerega je morda upravičena dodatna poglobljena raziskava tega vidika, in kemikalije, ki vplivajo na fiziologijo ščitnice. Z njo se lahko pridobijo tudi podatki o kemikalijah, ki vplivajo na razmnoževalne organe mladih odraslih živali moškega in/ali ženskega spola, nakaže pa lahko tudi imunološke učinke. | 4. | Rezultate te preskusne metode B.7 je treba uporabiti za opredeljevanje nevarnosti in oceno tveganja. Rezultate, ki se dobijo s parametri, povezanimi z endokrinim sistemom, je treba obravnavati ob upoštevanju dokumenta OECD z naslovom ‚Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals‘ (11). Metoda obsega osnovno študijo strupenosti s ponavljajočimi se odmerki, ki se lahko uporabi za kemikalije, za katere ni upravičena 90-dnevna študija (npr. če obseg proizvodnje ne presega določenih mej), ali kot predhodna študija za dolgoročno študijo. Izpostavljenost mora trajati 28 dni. | 5. | Mednarodni program za validacijo parametrov, primernih za morebitno odkrivanje endokrinega delovanja preskusne kemikalije, je pokazal, da je kakovost podatkov, pridobljenih s to preskusno metodo B.7, precej odvisna od izkušenj preskuševalnega laboratorija. To se nanaša zlasti na histopatološko odkrivanje cikličnih sprememb pri razmnoževalnih organih samic ali določanje teže malih, hormonsko odvisnih organov, ki jih je težko secirati. Napotki o histopatologiji so bili pripravljeni (19). Na voljo so na javni spletni strani OECD s smernicami za preskušanje. Njihov namen je pomagati patologom pri preiskavah in pripomoči k povečanju občutljivosti analize. V to preskusno metodo je bilo vključenih več parametrov, za katere je bilo ugotovljeno, da so kazalniki endokrine strupenosti. Parametri, za katere ni bilo na voljo dovolj podatkov, ki bi dokazovali njihovo uporabnost, ali za katere se je v validacijskem programu izkazalo, da je njihova zmožnost odkrivanja povzročiteljev endokrinih motenj slaba, so predlagani kot neobvezne končne točke (glej Dodatek 2). | 6. | Glede na podatke, pridobljene v validacijskem postopku, je treba poudariti, da ta analiza ni dovolj občutljiva za identifikacijo vseh snovi z (anti)androgenim ali (anti)estrogenim načinom delovanja (9). Ta preskusna metoda se ne izvaja v fazi življenja, ki je najbolj občutljiva za endokrine motnje. Kljub temu pa so bile pri tej preskusni metodi med validacijskim postopkom identificirane snovi, ki šibko in močno vplivajo na delovanje ščitnice, ter snovi z močnim in zmernim endokrinim delovanjem, ki delujejo prek estrogenih ali androgenih receptorjev, v le redkih primerih pa so bile identificirane snovi z endokrinim delovanjem, ki šibko vplivajo na estrogene ali androgene receptorje. Zato te metode ni mogoče opisati kot presejalno analizo za endokrino delovanje. | 7. | Neobstoj učinkov, povezanih s temi načini delovanja, se zato ne sme obravnavati kot dokaz o neobstoju učinkov na endokrini sistem. Kar zadeva z endokrinim sistemom posredovane učinke, se snovi torej ne smejo opredeliti samo na podlagi rezultatov te preskusne metode, temveč je treba za označitev potencialnega endokrinega delovanja uporabiti pristop, ki temelji na zanesljivosti dokazov in vključuje vse obstoječe podatke o kemikaliji. Zato mora sprejetje regulativne odločitve o endokrinem delovanju (opredelitev snovi) temeljiti na široko zasnovanem pristopu, in ne samo na rezultatih te preskusne metode. | 8. | Priznano je, da morajo vsi postopki z živalmi izpolnjevati lokalne standarde, ki veljajo za oskrbo živali; spodaj opisana oskrba živali in ravnanje z njimi pomenita minimalne standarde izvajanja, nad katerimi prevladajo lokalni predpisi, če so strožji. OECD je določila dodatne napotke o humanem ravnanju z živalmi (14). | 9. | Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 10. | Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih oralno daje več skupinam preskusnih živali, in sicer po ena velikost odmerka na skupino v obdobju 28 dni. V obdobju dajanja odmerkov je treba živali vsak dan pozorno opazovati, ali kažejo znake zastrupitve. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so evtanazirane, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se preživele živali evtanazirajo, nato pa se na njih opravi obdukcija. Z 28-dnevno študijo se pridobijo informacije o učinkih ponavljajoče se oralne izpostavljenosti, poleg tega pa lahko ta študija nakaže potrebo po dodatnih dolgoročnejših študijah. Prav tako lahko pomaga pridobiti informacije o izbiri koncentracij za dolgoročnejše študije. S podatki, pridobljenimi na podlagi preskusne metode, mora biti mogoče opredeliti strupenost preskusne kemikalije, nakazati razmerje med odmerkom in odzivom ter določiti raven brez opaženih škodljivih učinkov (NOAEL). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 11. | Priporočena vrsta glodavca je podgana, čeprav se lahko uporabijo tudi druge vrste glodavcev. Če se parametri, določeni pri tej preskusni metodi B.7, preiskujejo na drugi vrsti glodavcev, je treba to podrobno utemeljiti. Čeprav je biološko verjetno, da se druge vrste na strupene snovi odzivajo podobno kot podgane, je pri manjših vrstah mogoča večja spremenljivost zaradi tehničnih izzivov pri seciranju manjših organov. V mednarodnem validacijskem programu za odkrivanje povzročiteljev endokrinih motenj je bila podgana edina uporabljena vrsta. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Odmerke je treba začeti dajati čim prej po odstavitvi od sesanja, vsekakor pa preden so živali stare 9 tednov. Na začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali čim manjše in ne smejo presegati ± 20 % povprečne teže za vsak spol. Če se študija s ponavljajočimi se oralnimi odmerki izvaja kot predhodna študija dolgoročnejše študije, je zaželeno, da se v obeh študijah uporabijo živali istega seva in istega izvora. | Nastanitev in hranjenje | 12. | Vsi postopki morajo biti v skladu z lokalnimi standardi oskrbe laboratorijskih živali. Temperatura prostora s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna s fotoperiodo 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Na izbiro hrane lahko vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije, če se daje po tej metodi. Živali morajo biti nastanjene v majhnih skupinah istega spola; posamično so lahko nastanjene, če je to znanstveno utemeljeno. Pri skupinski nastanitvi je lahko v kletki največ pet živali. | 13. | Hrano je treba redno analizirati, da ne vsebuje kontaminantov. Vzorec hrane je treba hraniti, dokler poročilo ni končano. | Priprava živali | 14. | Zdrave mlade odrasle živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi položaja kletk čim manjši. Živali se označijo z edinstvenimi oznakami in so pred začetkom tretiranja najmanj pet dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. | Priprava odmerkov | 15. | Preskusna kemikalija se daje z gavažo ali s hrano ali pitno vodo. Metoda oralnega dajanja odmerkov je odvisna od namena študije in fizikalnih/kemijskih/toksikokinetičnih lastnosti preskusne kemikalije. | 16. | Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/suspenzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Določiti je treba stabilnost preskusne kemikalije v nosilcu. | POSTOPEK | Število in spol živali | 17. | Za vsako velikost odmerka je treba uporabiti vsaj 10 živali (pet samic in pet samcev). Če je načrtovana evtanazija med študijo, je treba to število povečati za toliko živali, kolikor se jih namerava evtanazirati pred zaključkom študije. Razmisliti je treba o dodatni satelitski skupini desetih živali (pet vsakega spola) v kontrolni skupini in skupini, tretirani z največjim odmerkom, na katerih bi se vsaj 14 dni po tretiranju opazovalo reverzibilnost, obstojnost ali zapoznelost nastopa strupenih učinkov. | Odmerjanje | 18. | Na splošno je treba uporabiti najmanj tri preskusne skupine in kontrolno skupino, če pa se na podlagi ocene drugih podatkov pri odmerku 1 000 mg/kg telesne teže/dan učinki ne pričakujejo, se lahko izvede mejni preskus. Če ustrezni podatki niso na voljo, se lahko opravi študija za ugotavljanje območja (na živalih istega seva in izvora), s pomočjo katere se določijo odmerki, ki bodo uporabljeni. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da niso deležne tretiranja s preskusno kemikalijo. Če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec, mora kontrolna skupina prejeti največjo uporabljeno količino nosilca. | 19. | Pri izbiri velikosti odmerkov je treba upoštevati vse podatke o strupenosti in (toksiko)kinetične podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne kemikalije. Izbrati je treba največjo velikost odmerka, da se povzročijo strupeni učinki, ne pa tudi smrt ali hudo trpljenje. Nato je treba izbrati padajoče zaporedje velikosti odmerkov, da se pokažejo vsi odzivi, ki so odvisni od velikosti odmerka, in ugotovi najmanjša velikost odmerka, pri kateri ni opaženih škodljivih učinkov (NOAEL). Za določanje padajočih velikosti odmerkov je velikokrat najbolje uporabiti dva- do štirikratne intervale, namesto zelo velikih intervalov (npr. večjih od desetkratnika) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati 4. preskusno skupino. | 20. | Če se ugotovijo splošna strupenost (npr. zmanjšana telesna teža, učinki na jetra, srce, pljuča ali ledvice itd.) ali druge spremembe, ki morda niso toksične reakcije (npr. zmanjšan vnos hrane, povečanje jeter), je potrebna previdnost pri razlagi ugotovljenih učinkov na imunske, nevrološke ali endokrine občutljive končne točke. | Mejni preskus | 21. | Če preskus pri odmerku, velikem najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, ali pri enakovrednem deležu v hrani ali pitni vodi pri vnosu s hrano ali pitno vodo (na podlagi telesne teže), pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, ne povzroči opaznih strupenih učinkov in če na podlagi podatkov o strukturno sorodnih kemikalijah strupenost ni pričakovana, popolna študija s tremi velikostmi odmerkov morda ni potrebna. Mejni preskus se uporabi, razen če izpostavljenost človeka nakazuje potrebo po uporabi večjega odmerka. | Dajanje odmerkov | 22. | Preskusna kemikalija se daje živalim vsak dan 7 dni na teden v obdobju 28 dni. Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, jo je treba dajati v enkratnem odmerku z uporabo želodčne cevke ali ustrezne intubacijske kanile. Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. Količina ne sme presegati 1 ml/100 g telesne teže, razen pri vodnih raztopinah, pri katerih se lahko uporabi 2 ml/100 g telesne teže. Razen pri dražilnih ali jedkih kemikalijah, ki pri večjih koncentracijah navadno povzročijo močnejše učinke, je treba s prilagajanjem koncentracije čim bolj zmanjšati spremenljivost preskusne količine, da se zagotovi stalna količina pri vseh velikostih odmerkov. | 23. | Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalen vnos hrane ali porabo vode. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali; uporabljeni način je treba navesti. Če se kemikalija daje z gavažo, je treba odmerke dajati vsak dan ob približno istem času in jih ustrezno prilagajati, da se vzdržuje konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali. Če se študija s ponavljajočimi se odmerki izvaja kot predhodna študija dolgoročne študije, je treba v obeh študijah uporabiti podobno hrano. | Opazovanja | 24. | Obdobje opazovanja mora trajati 28 dni. Živali iz satelitske skupine, ki so bile izbrane za opazovanja po koncu tretiranja, je treba pustiti vsaj 14 dni brez kakršnega koli tretiranja, da se odkrije zapoznel nastop, obstojnost ali izginotje strupenih učinkov. | 25. | Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka. Podatke o zdravstvenem stanju živali je treba zabeležiti. Živali je treba vsaj dvakrat na dan opazovati za odkrivanje obolevnosti in smrtnosti. | 26. | Enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogočanje primerjav na istem osebku) in nato vsaj enkrat na teden je treba opraviti natančna klinična opazovanja vseh živali. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj kletk, v katerih živali bivajo, na standardnem mestu in po možnosti vedno ob istem času. Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti z uporabo sistemov točkovanja, ki jih izrecno določi preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, da se preskusni pogoji čim manj spreminjajo in da opazovanja po možnosti opravijo opazovalci, ki s tretiranjem niso seznanjeni. Pozornost je med drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, očeh in sluznicah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živčevja (npr. solzenju, piloerekciji, velikosti zenic, nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z živalmi, pa tudi prisotnost kloničnih ali toničnih gibov, stereotipij (npr. prekomernega čiščenja, ponavljajočega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (2). | 27. | V četrtem tednu izpostavljenosti je treba oceniti senzorične reakcije na različne vrste dražljajev (2) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) (3) (4) (5), moč oprijema (6) in motorično aktivnost (7). Nadaljnje podrobnosti glede možnih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je mogoče tudi druge postopke, ki niso opisani v navedenih virih. | 28. | Funkcionalna opazovanja, ki se izvajajo v četrtem tednu izpostavljenosti, se lahko izpustijo, če se študija izvaja kot predhodna študija poznejše (90-dnevne) študije subkronične strupenosti. V takem primeru je treba funkcionalna opazovanja vključiti v to dopolnilno študijo. Po drugi strani pa lahko podatki o funkcionalnih opazovanjih, pridobljeni v študiji s ponavljajočimi se odmerki, pomagajo pri določanju velikosti odmerkov za poznejšo študijo subkronične strupenosti. | 29. | Izjemoma se lahko funkcionalna opazovanja izpustijo tudi za skupine, ki sicer kažejo znake zastrupitve v tolikšnem obsegu, da bi to močno oviralo izvedbo funkcionalnega preskusa. | 30. | Pri obdukciji se lahko z vaginalnim brisom določi cikel estrusa vseh samic (ni obvezno). Ta opazovanja zagotovijo informacije o fazi cikla estrusa ob žrtvovanju in pomagajo pri histološki oceni tkiv, občutljivih na estrogen (glej napotke o histopatologiji (19)). | Telesna teža in poraba hrane/vode | 31. | Vse živali je treba stehtati vsaj enkrat na teden. Porabo hrane je treba meriti najmanj tedensko. Če se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba vsaj enkrat na teden izmeriti tudi porabo vode. | Hematologija | 32. | Ob koncu preskusnega obdobja je treba opraviti naslednje hematološke preiskave: hematokrit, koncentracija hemoglobina, število eritrocitov, retikulociti, skupno in diferencialno število levkocitov, število trombocitov ter čas/zmožnost koagulacije. Druge preiskave, ki jih je treba opraviti, če imajo preskusna kemikalija ali njeni domnevni metaboliti oksidativne lastnosti oziroma če obstaja sum, da jih imajo, vključujejo koncentracijo methemoglobina in Heinzeva telesca. | 33. | Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu neposredno pred postopkom evtanazije živali ali med njim in jih hraniti v ustreznih pogojih. Živali je treba pred evtanazijo čez noč postiti (7). | Klinična biokemija | 34. | Klinične biokemične preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih učinkov na tkiva, zlasti na ledvice in jetra, je treba opraviti na vzorcih krvi, ki so bili vsem živalim odvzeti neposredno pred postopkom njihove evtanazije ali med njim (razen živalim, ki so bile najdene umirajoče in/ali so bile evtanazirane pred koncem študije). Preiskave plazme ali seruma vključujejo določanje natrija, kalija, glukoze, skupnega holesterola, sečnine, kreatinina, skupnih beljakovin in albumina, najmanj dveh encimov, ki sta kazalnika hepatoceličnih učinkov (kot so alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, alkalna fosfataza, γ-glutamil transpeptidaza in glutamat-dehidrogenaza), ter žolčnih kislin. Meritve dodatnih encimov (jetrnega ali drugega izvora) in bilirubina lahko v nekaterih okoliščinah zagotovijo koristne informacije. | 35. | Po izbiri se lahko v zadnjem tednu študije izvedejo naslednje analize urina, dobljenega z zbiranjem v določenih časovnih obdobjih: videz, količina, osmolalnost ali specifična teža, pH, beljakovine, glukoza in kri/krvne celice. | 36. | Poleg tega je treba razmisliti o študijah za preiskovanje plazemskih ali serumskih označevalcev splošnih poškodb tkiva. Druge preiskave, ki jih je treba opraviti, če lahko znane lastnosti preskusne kemikalije vplivajo na povezane presnovne profile ali če obstaja sum, da lahko vplivajo nanje, vključujejo določanje kalcija, fosfatov, trigliceridov, posebnih hormonov in holinesteraze. Te je treba opredeliti pri kemikalijah določenih razredov oziroma za vsak primer posebej. | 37. | Čeprav v mednarodni oceni z endokrinim sistemom povezanih končnih točk ni bilo mogoče dokazati nedvomne koristi določanja ščitničnih hormonov (T3 in T4) in TSH, je lahko koristno obdržati vzorce plazme ali seruma za merjenje T3, T4 in TSH (ni obvezno), če obstaja znak o učinku na hipofizno-ščitnično os. Ti vzorci se lahko hranijo zamrznjeni pri –20 °C. Na spremenljivost in absolutne koncentracije pri določanju hormonov lahko vplivajo naslednji dejavniki: | — | čas žrtvovanja zaradi spreminjanja koncentracij hormonov preko dneva, | — | način žrtvovanja, da se prepreči nepotreben stres pri živalih, ki lahko vpliva na koncentracije hormonov, | — | preskusni kompleti, ki se uporabljajo za določanje hormonov in se lahko razlikujejo po standardnih krivuljah. | Dokončno identifikacijo kemikalij, ki vplivajo na ščitnico, je zanesljiveje opraviti s histopatološko analizo kot z ravnmi hormonov. | 38. | Vzorce plazme, ki so predvideni posebej za določanje hormonov, je treba odvzeti ob primerljivih urah dneva. Priporočljivo je, da se razmisli o določanju ravni T3, T4 in TSH, sproženih s histopatološkimi spremembami ščitnice. Številčne vrednosti, pridobljene pri analiziranju koncentracij hormonov, so pri različnih kompletih za analize, ki so na voljo na trgu, različne. Zato morda ne bo mogoče določiti izvedbenih meril, ki temeljijo na enotnih preteklih podatkih. Druga možnost pa je, da si laboratoriji prizadevajo za kontrolne koeficiente variacije, ki so nižji od 25 za T3 in T4 ter nižji od 35 za TSH. Vse koncentracije morajo biti zabeležene v ng/ml. | 39. | Če pretekli izhodiščni podatki niso ustrezni, je treba razmisliti o določitvi hematoloških in kliničnih biokemičnih spremenljivk pred začetkom dajanja odmerkov ali po možnosti pri sklopu živali, ki niso vključene v preskusne skupine. | PATOLOGIJA | Makroskopska obdukcija | 40. | Na vseh živalih v študiji se opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Z jeter, ledvic, nadledvičnih žlez, mod, nadmodka, prostate in semenskih mešičkov s celotnimi koagulacijskimi žlezami, priželjca, vranice, možganov in srca vseh živali (razen živali, ki so bile najdene umirajoče in/ali so bile evtanazirane pred koncem študije) je treba, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva in nato izmeriti njihovo mokro težo čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. Pri prostati in vseh delih, ki spadajo k njej, je potrebna previdnost pri odstranjevanju priraščenih tkiv, da se ne prebodejo semenski mešički, ki so napolnjeni s tekočino. Lahko pa se semenski mešički in prostata obrežejo in stehtajo po fiksaciji. | 41. | Poleg tega se lahko čim prej po disekciji, da se ne izsušita, stehtata tudi naslednji tkivi: oba jajčnika (mokra teža) in maternica, vključno z vratom (napotki za odstranitev in pripravo materničnih tkiv za tehtanje so na voljo v OECD TG 440 (18)). | 42. | Teža ščitnice (ni obvezno) se lahko določi po fiksaciji. Pri odstranjevanju priraščenih tkiv je prav tako potrebna velika previdnost, opravi pa se lahko šele po fiksaciji, da se preprečijo poškodbe tkiv, ki lahko ogrozijo histopatološko analizo. | 43. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (glej odstavek 47): vse vidne lezije, možgane (reprezentativne regije, vključno z velikimi in malimi možgani ter mostom), hrbtenjačo, oko, želodec, tanko in debelo črevo (vključno s Peyerjevimi ploščami), jetra, ledvice, nadledvične žleze, vranico, srce, priželjc, ščitnico, sapnik in pljuča (shranijo se tako, da se napihnejo s fiksativom in nato potopijo), spolne žleze (moda in jajčnike), pomožne spolne organe (maternico in vrat, nadmodek, prostato in semenske mešičke s koagulacijskimi žlezami), vagino, sečni mehur, bezgavke (poleg najbližje drenažne bezgavke je treba vzeti še eno bezgavko v skladu z izkušnjami laboratorija (15)), periferni živec (ishiadični ali tibialni), po možnosti v neposredni bližini mišice, skeletno mišico in kost s kostnim mozgom (rezina ali sveže prepariran punktat kostnega mozga). Priporočljivo je, da se moda fiksirajo s potopitvijo v Bouinov ali prilagojen Davidsonov fiksativ (16) (17). Tunico albugineo je treba nežno in plitvo punktirati na obeh polih organa z iglo, da lahko fiksativ hitro prodre v tkivo. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. | 44. | Z naslednjimi tkivi je mogoče pridobiti koristne informacije o endokrinih učinkih: spolnimi žlezami (jajčniki in modi), pomožnimi spolnimi organi (maternico, vključno z vratom, nadmodkom, semenskimi mešički s koagulacijskimi žlezami ter dorzolateralno in ventralno prostato), vagino, hipofizo, mlečno žlezo samcev, ščitnico in nadledvično žlezo. Spremembe v mlečnih žlezah samcev niso bile zadostno dokumentirane, vendar je lahko ta parameter zelo občutljiv za snovi z estrogenim delovanjem. Opazovanja organov/tkiv, ki niso našteti v odstavku 43, niso obvezna (glej Dodatek 2). | 45. | Več informacij o disekciji, fiksaciji, sekciji in histopatologiji endokrinih tkiv je na voljo v napotkih o histopatologiji (19). | 46. | V mednarodnem preskusnem programu je bilo pridobljenih nekaj dokazov, da se lahko manj opazni endokrini učinki kemikalij z majhno zmožnostjo za vplivanje na homeostazo spolnih hormonov lažje odkrijejo z motnjami sinhronizacije cikla estrusa v različnih tkivih kot z očitnimi histopatološkimi spremembami spolnih organov samic. Čeprav ni dokončnega dokaza o takih učinkih, je priporočljivo, da se dokazi o možni asinhronosti cikla estrusa upoštevajo pri razlagi histopatologije jajčnikov (folikularne celice ter celice teke in granuloze), maternice, materničnega vratu in vagine. V to primerjavo se lahko, če se ocenjuje, vključi tudi faza cikla, ugotovljena z vaginalnimi brisi. | Histopatologija | 47. | Popolno histopatološko preiskavo je treba opraviti na shranjenih organih in tkivih vseh živali iz kontrolne skupine ter živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom. Te preiskave je treba razširiti na živali iz skupin, tretiranih z vsemi drugimi odmerki, če se v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opazijo spremembe, povezane s tretiranjem. | 48. | Pregledati je treba vse vidne lezije. | 49. | Če se uporablja satelitska skupina, je treba opraviti histopatološko preiskavo na tkivih in organih, na katerih so bili opaženi učinki v tretiranih skupinah. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 50. | Podatke je treba navesti za vsako žival. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile evtanazirane iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali evtanazije, število živali, ki kažejo znake zastrupitve, opis opaženih znakov zastrupitve, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih učinkov, število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in njihova resnost ter odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. | 51. | Če je mogoče, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Pri primerjavah učinka vzdolž odmernega območja se je treba izogibati večkratnim preskusom t. Statistične metode je treba izbrati med zasnovo študije. | 52. | Za nadzor kakovosti se predlaga zbiranje preteklih kontrolnih podatkov in izračun koeficientov variacije za številčne podatke, zlasti za parametre, povezane z odkrivanjem povzročiteljev endokrinih motenj. Ti podatki se lahko uporabijo za primerjave, ko se ocenjujejo aktualne študije. | Poročilo o preskusu | 53. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijske podatke. | | Nosilec (če je ustrezno) | — | utemeljitev izbire nosilca, če to ni voda. | | Preskusne živali | — | uporabljeno vrsta/sev, | — | število, starost in spol živali, | — | vir, nastanitvene pogoje, hrano itd., | — | težo vsake živali na začetku preskusa, | — | utemeljitev vrste, če to ni podgana. | | Preskusni pogoji | — | utemeljitev izbire velikosti odmerkov, | — | podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, | — | podatke o dajanju preskusne kemikalije, | — | preračunavanje koncentracije preskusne kemikalije v hrani ali vodi (ppm) v dejanski odmerek (mg/kg telesne teže/dan), če je ustrezno, | — | podatke o kakovosti hrane in vode. | | Neobvezne končne točke, ki se preiskujejo | — | seznam neobveznih končnih točk, ki se preiskujejo. | | Rezultati | — | telesno težo/spremembe telesne teže, | — | porabo hrane in, če je ustrezno, porabo vode, | — | podatke o toksičnih reakcijah glede na spol in velikosti odmerka, vključno z znaki zastrupitve, | — | vrsto, resnost in trajanje kliničnih opažanj (ali so reverzibilna ali ne), | — | ocene senzorične aktivnosti, moči oprijema in motorične aktivnosti, | — | hematološke preskuse z ustreznimi referenčnimi vrednostmi, | — | klinične biokemijske preskuse z ustreznimi referenčnimi vrednostmi, | — | telesno težo ob evtanaziji in podatke o teži organov, | — | izsledke obdukcije, | — | podroben opis vseh ugotovitev histopatoloških preiskav, | — | podatke o absorpciji, če so na voljo, | — | statistično obdelavo rezultatov, kjer je to primerno. | | Razprava o rezultatih. | | Sklepi. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | | Androgenost je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni androgeni hormon (npr. testosteron) v sesalskem organizmu. | | Antiandrogenost je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega androgenega hormona (npr. testosterona) v sesalskem organizmu. | | Antiestrogenost je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega estrogenega hormona (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu. | | Protiščitnično delovanje je zmožnost kemikalije, da zavira delovanje naravnega ščitničnega hormona (npr. T3) v sesalskem organizmu. | | Odmerjanje je splošni izraz, ki obsega odmerek ter pogostnost in trajanje dajanja odmerka. | | Odmerek je količina dane preskusne kemikalije. Izražen je kot masa preskusne kemikalije na enoto telesne teže preskusne živali na dan (npr. mg/kg telesne teže/dan) ali kot konstantna koncentracija v hrani. | | Očitna strupenost je splošni izraz, ki opisuje jasne znake zastrupitve po dajanju preskusne kemikalije. Ti morajo zadostovati za oceno nevarnosti in biti takšni, da bi povečanje danega odmerka najverjetneje povzročilo razvoj resnih znakov zastrupitve in verjetno smrt. | | NOAEL je kratica za raven brez opaženih škodljivih učinkov (no-observed-adverse-effect level). To je največji odmerek, pri katerem ni opaženih škodljivih učinkov zaradi tretiranja. | | Estrogenost je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni estrogeni hormon (npr. 17 β-estradiola) v sesalskem organizmu. | | Preskusna kemikalija je vsaka snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | | Ščitnično delovanje je zmožnost kemikalije, da deluje tako kot naravni ščitnični hormon (npr. T3) v sesalskem organizmu. | | Validacija je znanstveni proces, s katerim se določijo delovne zahteve in omejitve preskusne metode ter pokažeta njena zanesljivost in ustreznost za določeni namen. | Dodatek 2 | Končne točke, priporočene za odkrivanje povzročiteljev endokrinih motenj v tej preskusni metodi B.7 | Obvezne končne točke | Neobvezne končne točke | Teža | — | moda | — | nadmodek | — | nadledvične žleze | — | prostata in semenski mešički s koagulacijskimi žlezami | — | jajčniki | — | maternica, vključno z vratom | — | ščitnica | Histopatologija | — | spolne žleze: | — | moda in | — | jajčniki | — | pomožni spolni organi: | — | nadmodek | — | prostata in semenski mešički s koagulacijskimi žlezami | — | maternica, vključno z vratom | — | nadledvične žleze | — | ščitnica | — | vagina | — | vaginalni brisi | — | mlečne žleze samcev | — | hipofiza | Meritve hormonov | | — | raven T3 in T4 v obtoku | — | raven TSH v obtoku | VIRI: | (1) | OECD (Pariz, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neurotoxicity. | (2) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria. Dokument št. 60. | (3) | Tupper, D. E., Wallace R. B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003. | (4) | Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704. | (5) | Moser, V. C., McDaniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283. | (6) | Meyer, O. A., Tilson, H. A., Byrd, W. C., Riley, M. T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236. | (7) | Crofton, K. M., Howard, J. L., Moser, V. C., Gill, M. W., Reiter, L. W., Tilson, H. A., MacPhail, R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609. | (8) | OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10.–11. marec 1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5. | (9) | OECD (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment No 59, ENV/JM/MONO(2006)26. | (10) | OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment No 21, ENV/JM/MONO(2002)8. | (11) | OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.html. | (12) | OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2. | (13) | OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3. | (14) | OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation. Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000)7. | (15) | Haley, P., Perry, R., Ennulat, D., Frame, S., Johnson, C., Lapointe, J.-M., Nyska, A., Snyder, P. W., Walker, D., Walter, G. (2005). STP Position Paper: Best Practice Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. Toxicol Pathol 33: 404–407. | (16) | Hess, R. A., Moore, B. J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of the Testis. V: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin, R. E., in Heindel, J. J. (ur.). Academic Press: San Diego, Kalifornija, str. 52–85. | (17) | Latendresse, J. R., Warbrittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. (2002). Fixation of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533. | (18) | OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals No440: Uterotrophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties. | (19) | OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. ENV/JM/Mono(2009)11. | B.8 SUBAKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU: 28-DNEVNA ŠTUDIJA | POVZETEK | Ta revidirana preskusna metoda B.8 je bila zasnovana za celovito opredelitev strupenosti preskusne kemikalije pri vdihavanju po ponavljajoči se izpostavljenosti v omejenem časovnem obdobju (28 dni) in zagotavljanje podatkov za kvantitativne ocene tveganja pri vdihavanju. Skupine najmanj 5 samcev in 5 samic glodavcev se 28 dni po 6 ur na dan izpostavljajo a) trem ali več različnim koncentracijam preskusne kemikalije, b) filtriranemu zraku (negativna kontrola) in/ali c) nosilcu (kontrola z nosilcem). Navadno se živali izpostavljajo 5 dni na teden, dovoljeno pa je tudi izpostavljanje 7 dni na teden. Vedno se preskušajo samci in samice, vendar se lahko izpostavljajo različnim koncentracijam, če je znano, da je en spol občutljivejši na določeno preskusno kemikalijo. Ta metoda vodji študije omogoča prožnost za vključitev satelitskih skupin (skupin za reverzibilnost), bronhoalveolarne lavaže (BAL), nevroloških preskusov ter dodatnih kliničnih patoloških in histopatoloških ocen, da se bolje opredeli strupenost preskusne kemikalije. | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 412 (2009). Prvotna smernica za preskušanje 412 v zvezi s subakutno strupenostjo pri vdihavanju (TG 412) je bila sprejeta leta 1981 (1). Ta preskusna metoda B.8 (ki ustreza revidirani TG 412) je bila posodobljena, da upošteva trenutno stanje v znanosti ter izpolnjuje sedanje in prihodnje zakonodajne potrebe. | 2. | Ta metoda omogoča opredeljevanje škodljivih učinkov po ponavljajoči se dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji z vdihavanjem, pri čemer preskušanje traja 28 dni. Podatki, pridobljeni z 28-dnevnimi študijami subakutne strupenosti pri vdihavanju, se lahko uporabljajo za kvantitativne ocene tveganja (če taki študiji ne sledi 90-dnevna študija subkronične strupenosti pri vdihavanju (poglavje B.29 te priloge)). Ti podatki lahko tudi zagotovijo informacije o izbiri koncentracij za dolgoročnejše študije, kot je 90-dnevna študija subkronične strupenosti pri vdihavanju. Ta preskusna metoda ni posebej namenjena preskušanju nanomaterialov. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 39 (2). | ZAČETNI PREUDARKI | 3. | Da se poveča kakovost študije in kar najbolj zmanjša uporaba živali, mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji. Informacije, ki pomagajo pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij, lahko vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah ter podatke, pridobljene s preskušanjem akutne strupenosti pri vdihavanju. Če se med študijo pričakuje ali opazi nevrotoksičnost, se lahko vodja študije odloči vključiti ustrezne ocene, kot sta sklop funkcionalnih opazovanj (FOB) in merjenje motorične aktivnosti. Čeprav je lahko čas izpostavitve odločilen za posebne preglede, izvajanje teh dodatnih dejavnosti ne sme posegati v osnovno zasnovo študije. | 4. | Razredčine jedkih ali dražilnih preskusnih kemikalij se lahko preskušajo pri koncentracijah, ki bodo zagotovile želeno stopnjo strupenosti (glej GD 39 (2)). Pri izpostavljanju živali tem snovem morajo biti ciljne koncentracije dovolj nizke, da ne povzročijo očitnih bolečin in trpljenja, vendar zadostne za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, ki izpolnjuje zakonodajni in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je treba izbrati za vsak primer posebej, po možnosti na podlagi ustrezno zasnovane študije za ugotavljanje območja, s katero se pridobijo informacije o kritičnih končnih točkah, morebitnem pragu draženja in času nastopa (glej odstavke 11–13). Izbrane koncentracije je treba utemeljiti. | 5. | Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo bolečine ali kažejo znake hudega in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti. Umirajoče živali se upoštevajo enako kot tiste, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami OECD o humanih končnih točkah (3). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 6. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle glodavce običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana. Uporabo drugih vrst je treba utemeljiti. | Priprava živali | 7. | Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan randomizacije morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 7 do 9 tednov in katerih telesna teža ne odstopa za več kot ± 20 % od povprečne teže za vsak spol. Živali se naključno izberejo, označijo za posamično prepoznavanje in so pred začetkom preskusa najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. | Oskrba živali | 8. | Živali je treba posamično identificirati, po možnosti s podkožnimi transponderji, da se olajšajo opazovanja in prepreči zmeda. Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogoče, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posamično, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja običajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena količina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe/12 ur teme. | Inhalacijske komore | 9. | Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemikalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot način izpostavljenosti uporabi izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smrčka). Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije tekočih ali trdnih aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogoče je, da bo posebne cilje študije lažje doseči z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpostavljenost celega telesa, skupni ‚volumen‘ preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in pomanjkljivosti so obravnavani v GD 39 (2). | ŠTUDIJE STRUPENOSTI | Mejne koncentracije | 10. | V nasprotju s študijami akutne strupenosti, za 28-dnevne študije subakutne strupenosti pri vdihavanju ni opredeljenih mejnih koncentracij. Pri določanju najvišje koncentracije, ki bo preskušena, je treba upoštevati: 1. najvišjo dosegljivo koncentracijo, 2. stopnjo izpostavljenosti ljudi ‚v najslabšem primeru‘, 3. potrebo po ohranjanju zadostne oskrbe s kisikom in/ali 4. preudarke v zvezi z dobrobitjo živali. Če ni mej, ki temeljijo na podatkih, se lahko uporabijo meje za akutno strupenost iz Uredbe (ES) št. 1272/2008 (13) (tj. do najvišje koncentracije 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za hlape in 20 000 ppm za pline) (glej GD 39 (2)). Če je treba pri preskušanju plinov ali lahko hlapnih preskusnih kemikalij (npr. hladil) te meje preseči, je to treba utemeljiti. Mejna koncentracija mora povzročiti nedvomno strupenost, ne da bi živalim povzročila nepotreben stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3). | Študija za ugotavljanje območja | 11. | Pred začetkom glavne študije je morda treba opraviti študijo za ugotavljanje območja. Ta je obsežnejša od opazovalne študije, saj ni omejena z izbiro koncentracij. Spoznanja, pridobljena v njej, lahko zagotovijo uspešnost glavne študije. S študijo za ugotavljanje območja se lahko na primer zagotovijo tehnične informacije o analitskih metodah, določanju velikosti delcev in odkrivanju mehanizmov strupenosti, klinični patološki in histopatološki podatki ter ocene, kolikšne so lahko koncentracije NOAEL in MTC v glavni študiji. Vodja študije se lahko študijo za ugotavljanje območja odloči uporabiti za določitev pragu draženja dihal (npr. s histopatološko preiskavo dihal, preskusom pljučne funkcije ali bronhoalveolarno lavažo), zgornje koncentracije, ki jo živali prenesejo brez nepotrebnega stresa, in parametrov, s katerimi bo mogoče najbolje opredeliti strupenost preskusne kemikalije. | 12. | Študija za ugotavljanje območja lahko zajema eno ali več koncentracij. Vsaki od njih se izpostavi največ tri samce in tri samice. Študija za ugotavljanje območja mora trajati vsaj 5 dni in običajno največ 14 dni. V poročilu o študiji je treba utemeljiti izbrane koncentracije za glavno študijo. Cilj glavne študije je dokazati razmerje koncentracija-odziv na podlagi pričakovanja o tem, katera bo najobčutljivejša končna točka. Nizka koncentracija mora biti po možnosti koncentracija brez opaznih škodljivih učinkov, medtem ko mora visoka koncentracija povzročiti nedvomne strupene učinke, ne da bi živalim povzročila nepotrebni stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3). | 13. | Pri izbiri koncentracij za študijo za ugotavljanje območja je treba upoštevati vse razpoložljive informacije, vključno z razmerji struktura-aktivnost in podatki o podobnih kemikalijah (glej odstavek 3). S študijo za ugotavljanje območja se lahko potrdijo/zavrnejo pričakovanja o najobčutljivejših končnih točkah po mehanističnih merilih, npr. o inhibiciji holinesteraze z organofosfati, nastajanju methemoglobina zaradi eritrocitotoksičnih snovi, ščitničnih hormonih (T3, T4) v primeru tirotoksičnih snovi ter o beljakovinah, LDH ali nevtrofilcih pri bronhoalveolarni lavaži v primeru neškodljivih slabo topnih delcev ali aerosolov, ki dražijo pljuča. | Glavna študija | 14. | Glavna študija subakutne strupenosti običajno zajema tri različne koncentracije ter po potrebi tudi sočasno negativno kontrolo (z zrakom) in/ali kontrolo z nosilcem (glej odstavek 17). Pri izbiri primernih stopenj izpostavljenosti si je treba pomagati z vsemi razpoložljivimi podatki, vključno z rezultati študij sistemske strupenosti, presnovo in kinetiko (poseben poudarek je treba nameniti izogibanju visokim koncentracijam, ki nasitijo kinetične procese). Vsaka preskusna skupina vsebuje najmanj 10 glodavcev (5 samcev in 5 samic), ki se 4 tedne po 5 dni na teden 6 ur na dan izpostavljajo preskusni kemikaliji (skupno študija traja 28 dni). Živali se lahko izpostavljajo tudi 7 dni na teden (npr. pri preskušanju farmacevtskih izdelkov, ki se vdihavajo). Če je znano, da je en spol občutljivejši na določeno preskusno kemikalijo, se lahko spola izpostavljata različnim koncentracijam, da se zagotovi optimalen odziv na koncentracijo, kot je opisano v odstavku 15. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Kadar se uporabi obdobje izpostavljenosti, krajše od 6 ur/dan, ali kadar je treba opraviti študijo izpostavljenosti celega telesa z dolgimi obdobji (npr. 22 ur/dan), je treba to utemeljiti (glej GD 39 (2)). V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano, razen če je to obdobje daljše od 6 ur. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko živali ves čas uživajo vodo. | 15. | Z izbranimi ciljnimi koncentracijami je treba opredeliti ciljne organe in prikazati jasen odziv na koncentracijo: | — | visoka koncentracija mora imeti strupene učinke, vendar ne sme povzročiti dolgotrajnih znakov ali smrtnosti, ki bi preprečili smiselno oceno, | — | vmesne koncentracije morajo biti razporejene tako, da se doseže stopnjevanje med strupenimi učinki nizke in visoke koncentracije, | — | nizka koncentracija mora povzročiti šibke znake strupenosti oziroma takih znakov ne sme povzročiti. | Satelitska študija (študija reverzibilnosti) | 16. | Satelitska študija (študija reverzibilnosti) se lahko uporabi za opazovanje reverzibilnosti, obstojnosti ali zapoznelega pojava zastrupitve v ustrezno dolgem obdobju po tretiranju, ki pa ne sme bili krajše od 14 dni. Satelitske skupine (skupine za reverzibilnost) so sestavljene iz petih samcev in petih samic, ki se izpostavijo sočasno s preskusnimi živalmi v glavni študiji. Skupine za satelitsko študijo (študijo reverzibilnosti) je treba preskusni kemikaliji izpostaviti pri najvišji koncentraciji, pri čemer se po potrebi uporabi sočasna kontrola z zrakom in/ali kontrola z nosilcem (glej odstavek 17). | Kontrolne živali | 17. | Z živalmi za sočasno negativno kontrolo (z zrakom) je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da se namesto preskusni kemikaliji izpostavijo filtriranemu zraku. Kadar se za pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporabi voda ali druga snov, je treba v študijo namesto negativne kontrolne skupine (z zrakom) vključiti kontrolno skupino z nosilcem. Če je le mogoče, je treba kot nosilec uporabiti vodo. Kadar se kot nosilec uporabi voda, morajo biti kontrolne živali izpostavljene zraku z enako relativno vlažnostjo kot pri preskusnih skupinah. Izbira ustreznega nosilca mora temeljiti na primerno izvedeni predhodni študiji ali preteklih podatkih. Če o strupenosti nosilca ni veliko znanega, se lahko vodja študije odloči uporabiti negativno kontrolo (z zrakom) in kontrolo z nosilcem, vendar se to močno odsvetuje. Kadar pretekli podatki razkrijejo, da nosilec ni strupen, negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna in je treba uporabiti samo kontrolo z nosilcem. Če predhodna študija preskusne kemikalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec ni strupen pri preskušeni koncentraciji, tako da je treba uporabiti to kontrolo z nosilcem. | POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI | Dajanje koncentracij | 18. | Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetnejša med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemično reaktivne preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozračju. Paziti je treba, da se ne ustvarijo eksplozivne koncentracije. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko zaradi zmanjšanja velikosti delcev uporabijo mehanski postopki. Več napotkov je na voljo v GD 39 (2). | Porazdelitev velikosti delcev | 19. | Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba določiti velikost delcev. Da se omogoči izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, so priporočeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) znaša 1–3 μm z geometričnim standardnim odklonom (σg) 1,5–3,0 (4). Prizadevanje za izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogoče izpolniti, je treba zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci in vlakna pa lahko presegajo navedene vrednosti. | Priprava preskusne kemikalije v nosilcu | 20. | Preskusno kemikalijo je treba po možnosti preskušati brez nosilca. Če je uporaba nosilca nujna za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije, je treba prednostno uporabiti vodo. Vedno, kadar se preskusna kemikalija raztopi v nosilcu, je treba dokazati njeno stabilnost. | SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI | Pretok zraka v komori | 21. | Pretok zraka skozi komoro za izpostavljanje je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Sprotno spremljanje koncentracije (ali časovne stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je neločljivo povezana z vsemi dinamičnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri vdihavanja. Če se koncentracija spremlja sproti, se lahko pogostnost merjenja pretoka zraka zmanjša na eno meritev na izpostavljenost na dan. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja. Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstaja razlog za domnevo, da tega standarda ni mogoče izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. Če meritve prvi dan izpostavljenosti pokažejo, da sta ravni teh plinov ustrezni, nadaljnje merjenje ni potrebno. | Temperatura in relativna vlažnost v komori | 22. | Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti celega telesa stalno spremljati ter jo med vsako izpostavljenostjo vsako uro zabeležiti, če je to mogoče. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi nemerljivo zaradi interference preskusne kemikalije s preskusno metodo. | Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija | 23. | Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izračunati in zabeležiti nazivno koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem inhalacijske komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pač pa pri primerjavi z dejansko koncentracijo pokaže, kako učinkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri ustvarjanju. | Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija | 24. | Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije, vzorčena v območju dihanja živali v inhalacijski komori. Dejanske koncentracije se merijo s specifičnimi metodami (npr. z neposrednim vzorčenjem, adsorpcijskimi ali kemičnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifičnimi metodami, kot je gravimetrična analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetrične analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole tekočin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifičnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetrično analizo se lahko določi tudi koncentracija večkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. | 25. | Po možnosti je treba v celotni študiji uporabljati eno serijo preskusne kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred začetkom študije je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vključno z njeno čistostjo ter, če je to tehnično izvedljivo, identiteto in količinami ugotovljenih kontaminantov in nečistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj delno potrdi naročnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). | 26. | Atmosfera v komori za izpostavljanje mora biti konstantna, kolikor je to izvedljivo. Za dokazovanje stabilnosti pogojev izpostavljenosti se lahko uporabi naprava za sprotno spremljanje, kot je aerosolni fotometer za aerosole ali analizator skupnih ogljikovodikov za hlape. Dejansko koncentracijo v komori je treba izmeriti najmanj trikrat vsak dan izpostavljenosti za vsako stopnjo izpostavljenosti. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, zadostuje, da se v vsakem obdobju izpostavljenosti vzame le en vzorec. V tem primeru se vzorec po možnosti zbira prek celotnega obdobja izpostavljenosti. Posamezni vzorci koncentracije v komori lahko od srednje koncentracije v komori odstopajo za največ ± 10 % za pline in hlape oziroma za največ ± 20 % za tekoče ali trdne aerosole. Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori (t95). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije. Pri tem sta upoštevana čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v komori (t95), in čas upadanja. Napotki za ocenjevanje t95 so na voljo v GD 39 (2). | 27. | Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov (npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša drugače. Zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), navadno glavno aktivno snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno sestavino ali indikatorsko snov (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (2). | Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev | 28. | Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba določiti najmanj vsak teden za vsako koncentracijo s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instrumentom, kot je aerodinamični merilnik delcev (APS). Če je mogoče prikazati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. | 29. | Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetrični filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost pri vseh preskušenih koncentracijah mogoče prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se kar najbolj zmanjša količina pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba študijo ponoviti. | 30. | Velikost delcev za hlape je treba določiti, če obstaja možnost, da se bodo hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogoče mešane faze, zaznajo delci. | OPAZOVANJA | 31. | Živali je treba klinično opazovati pred obdobjem izpostavljenosti ter med njim in po njem. Pogostejša opazovanja so lahko indicirana glede na odziv živali med izpostavljenostjo. Kadar opazovanje živali ovirajo uporaba zadrževalnih cevi za živali, slabo osvetljene komore za izpostavljanje celega telesa ali motne atmosfere, je treba živali pozorno opazovati po izpostavljenosti. Z opazovanji živali, preden so te izpostavljene naslednjega dne, je mogoče oceniti reverzibilnost ali okrepitev strupenih učinkov. | 32. | Vsa opažanja se sistematično zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za vsako žival posebej. Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti navesti čim natančneje. | 33. | Opazovanja v kletkah morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, v dihalih, obtočilih in živčevju ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Pozorno je treba opazovati tremorje, krče, slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. V protokol študije se lahko vključijo dodatne ocene, kot so kinetika, biomonitoring, pljučna funkcija, retencija slabo topnih snovi, ki se kopičijo v pljučnem tkivu, in vedenjske spremembe. | TELESNA TEŽA | 34. | Težo posameznih živali je treba zabeležiti malo pred prvo izpostavljenostjo (dan 0), zatem pa dvakrat na teden (na primer ob petkih in ponedeljkih, da se prikaže okrevanje čez konec tedna, ko se živali ne izpostavljajo, ali na podlagi časovnega intervala, da se omogoči ocena sistemske strupenosti) ter ob poginu ali evtanaziji. Če v prvih 2 tednih ni učinkov, se lahko do konca študije telesna teža meri tedensko. Živali v satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), če se uporabljajo, je treba tedensko tehtati prek celotnega obdobja okrevanja. Ob koncu študije je treba malo pred žrtvovanjem vse živali stehtati, da se omogoči nepristranski izračun razmerij med težo organov in telesno težo. | PORABA HRANE IN VODE | 35. | Porabo hrane je treba meriti tedensko. Meri se lahko tudi poraba vode. | KLINIČNA PATOLOGIJA | 36. | Klinične patološke ocene je treba opraviti za vse živali, vključno s tistimi v kontrolni skupini in satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), ko se žrtvujejo. Navesti je treba časovni interval med koncem izpostavljenosti in odvzemom krvi, zlasti kadar se obravnavana končna točka hitro vrne v prvotno stanje. Vzorčenje po koncu izpostavljenosti je indicirano za tiste parametre, ki imajo kratko plazemsko razpolovno dobo (npr. COHb, CHE in MetHb). | 37. | V preglednici 1 so našteti klinični patološki parametri, ki se navadno zahtevajo za vse toksikološke študije. Analiza urina se ne zahteva vedno, vendar se lahko opravi, kadar se zdi koristna na podlagi pričakovane ali opažene strupenosti. Vodja študije se lahko za boljšo opredelitev strupenosti preskusne kemikalije odloči oceniti dodatne parametre (npr. holinesterazo, lipide, hormone, kislinsko-bazno ravnovesje, methemoglobin ali Heinzeva telesca, kreatin-kinazo, razmerje med mieloidnimi in eritroidnimi celicami, troponine, pline v arterijski krvi, laktat-dehidrogenazo, sorbitol-dehidrogenazo ter γ-glutamiltranspeptidazo). | Preglednica 1 | Standardni klinični patološki parametri | Hematologija | število eritrocitov | hematokrit | koncentracija hemoglobina | povprečna količina hemoglobina v eritrocitih | povprečni volumen eritrocitov | povprečna koncentracija hemoglobina v eritrocitih | retikulociti | skupno število levkocitov | diferencialno število levkocitov | število trombocitov | zmožnost koagulacije (izberite eno): | — | protrombinski čas | — | čas koagulacije | — | parcialni tromboplastinski čas | Klinična kemija | glukoza (8) | skupni holesterol | trigliceridi | sečninski dušik v krvi | skupni bilirubin | kreatinin | skupne beljakovine | albumin | globulin | alanin-aminotransferaza | aspartat-aminotransferaza | alkalna fosfataza | kalij | natrij | kalcij | fosfor | klorid | Analiza urina (ni obvezno) | videz (barva in motnost) | količina | specifična teža ali osmolalnost | pH | skupne beljakovine | glukoza | kri/krvne celice | 38. | Kadar obstajajo dokazi, da je spodnji predel dihalnih poti (tj. alveole) primarno mesto odlaganja in retencije, je lahko bronhoalveolarna lavaža (BAL) najprimernejša tehnika za kvantitativno analizo na hipotezi temelječih parametrov razmerij med odmerkom in učinkom s poudarkom na alveolitisu, vnetju pljuč in fosfolipidozi. Tako je mogoče ustrezno preiskati spremembe v odzivu na odmerek in časovnem poteku alveolarne okvare. Bronhoalveolarni izpirek se lahko uporabi za analizo skupnega in diferencialnega števila levkocitov, skupnih beljakovin ter laktat-dehidrogenaze. Drugi parametri, ki se lahko obravnavajo, so tisti, ki nakazujejo lizosomske poškodbe, fosfolipidozo, fibrozo in dražilno ali alergijsko vnetje – pri slednjem se lahko vključi določitev vnetnih citokinov/kemokinov. Meritve BAL navadno dopolnjujejo rezultate histopatoloških preiskav, ne morejo pa jih nadomestiti. Napotki o tem, kako opraviti lavažo pljuč, so na voljo v GD 39 (2). | MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA IN TEŽA ORGANOV | 39. | Vse preskusne živali, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba popolnoma eksangvinirati (če je to izvedljivo) in na njih opraviti makroskopsko obdukcijo. Navesti je treba čas med koncem zadnje izpostavljenosti vsake živali in njenim žrtvovanjem. Če obdukcije ni mogoče opraviti nemudoma po odkritju poginule živali, jo je treba ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza kar najbolj zmanjša. Obdukcije je treba opraviti takoj, ko je mogoče, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. | 40. | V preglednici 2 so našteti organi in tkiva, ki jih je treba med makroskopsko obdukcijo shraniti v ustreznem mediju za histopatološke preiskave. O shranjevanju organov in tkiv [v oglatih oklepajih] ter vseh drugih organov in tkiv odloča vodja študije. Z organov v krepki pisavi je treba odstraniti priraščena tkiva in navedene organe stehtati čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. Ščitnico in nadmodek je treba stehtati samo, če je to potrebno, ker lahko ostanki obrezovanja otežijo histopatološko oceno. Tkiva in organe je treba takoj po obdukciji in najmanj 24–48 ur (odvisno od uporabljenega fiksativa) pred obrezovanjem fiksirati v 10-odstotnem puferiranem formalinu ali drugem ustreznem fiksativu. | Preglednica 2 | Organi in tkiva, ki se shranijo med makroskopsko obdukcijo | nadledvične žleze | kostni mozeg (in/ali svež punktat) | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | [oči (mrežnica, vidni živec) in veke] | srce | ledvice | grlo (3 ravni, 1 raven naj vključuje spodnji del poklopca) | jetra | pljuča (vsi režnji na eni ravni, vključno z glavnima sapnicama) | Hilusne bezgavke, zlasti za slabo topne preskusne kemikalije, ki jih tvorijo delci. Za bolj poglobljene preiskave in/ali študije z imunološkim poudarkom se lahko razmisli o dodatnih bezgavkah, npr. iz medpljučnega, vratnega/podčeljustnega in/ali ušesnega predela. | nazofaringealna tkiva (vsaj 4 ravni, 1 raven naj vključuje nazofaringealni vod in z nosom povezano limfatično tkivo (NALT)) | požiralnik | [vohalni betič] | Jajčniki | semenski mešički | hrbtenjača (vratni, prsni in ledveni del) | vranica | želodec | moda | priželjc | ščitnica | sapnik (vsaj 2 ravni, ki vključujeta 1 vzdolžni prerez skozi karino in 1 prečni prerez) | [sečni mehur] | maternica | vse vidne lezije | 41. | Pljuča je treba odstraniti nepoškodovana, jih stehtati in napolniti z ustreznim fiksativom pri tlaku 20–30 cm vode, da se ohrani njihova struktura (5). Rezine je treba zbrati za vse režnje na eni ravni, vključno z glavnima sapnicama, če pa se opravi lavaža pljuč, je treba iz neizpranega režnja vzeti rezine na treh ravneh (ki niso zaporedne). | 42. | Pregledati je treba najmanj 4 ravni nazofaringealnih tkiv, od katerih mora ena vključevati nazofaringealni vod (5, 6, 7, 8, 9), da se omogoči ustrezna preiskava ploščatega, prehodnega (neciliarnega respiratornega), respiratornega (ciliarnega respiratornega) in vohalnega epitelija, ter drenažno limfatično tkivo (NALT; 10, 11). Preiskati je treba tri ravni grla, od katerih mora ena vključevati spodnji del poklopca (12). Pregledati je treba vsaj dve ravni sapnika, kar vključuje en vzdolžni prerez skozi karino razcepišča glavnih sapnic in en prečni prerez. | HISTOPATOLOGIJA | 43. | Histopatološko oceno vseh organov in tkiv iz preglednice 2 je treba opraviti pri kontrolni skupini in skupini, tretirani z visoko koncentracijo, ter pri vseh živalih, ki poginejo ali so žrtvovane med študijo. Posebno pozornost je treba nameniti dihalom, ciljnim organom in vidnim lezijam. Organe in tkiva, ki imajo lezije v skupini, tretirani z visoko koncentracijo, je treba pregledati v vseh skupinah. Vodja študije se lahko odloči izvesti histopatološke ocene za dodatne skupine, da se prikaže jasen odziv na koncentracijo. Če se uporablja satelitska skupina (skupina za reverzibilnost), je treba opraviti histopatološko oceno za vsa tkiva in organe, na katerih so bili opaženi učinki v tretiranih skupinah. Če se v skupini, izpostavljeni visoki koncentraciji, pojavijo čezmerno število zgodnjih smrti ali druge težave, ki ogrožajo pomen podatkov, je treba skupino, tretirano z najbližjo nižjo koncentracijo, histopatološko pregledati. Makroskopska opažanja in mikroskopske ugotovitve je treba poskusiti povezati. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 44. | Za posamezne živali je treba navesti podatke o telesni teži, porabi hrane, klinični patologiji, makroskopski patologiji, teži organov in histopatologiji. Podatke o kliničnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifične znake zastrupitve, število živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije. Vse rezultate, kvantitativne in naključne, je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabi se lahko katera koli splošno priznana statistična metoda, izbrati pa jo je treba med zasnovo študije. | Poročilo o preskusu | 45. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno: | | Preskusne živali in oskrba | — | opis pogojev v kletkah, vključno s številom (ali spremembo števila) živali na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana. Podatki o izvoru in preteklosti se lahko navedejo, če se nanašajo na živali, za katere so bili uporabljeni podobni pogoji izpostavljenosti, nastanitveni pogoji in pogoji postenja, | — | število, starost in spol živali, | — | metodo randomizacije, | — | opis morebitne priprave živali pred preskusom, vključno s hrano, karanteno in zdravljenjem. | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo), | — | identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), če je znana. | | Nosilec | — | utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda), | — | pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na rezultat študije. | | Inhalacijska komora | — | podroben opis inhalacijske komore, vključno s prostornino in diagramom, | — | izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje atmosfere, | — | opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske koncentracije, | — | vir zraka in uporabljeni sistem za klimatiziranje, | — | metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene preskusne atmosfere, | — | razliko v tlaku (pozitivno ali negativno), | — | izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v komori (izpostavljanje celega telesa), | — | stabilnost preskusne atmosfere, | — | položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzorčenja preskusne atmosfere v komori, | — | obdelavo dovajanega/odvajanega zraka, | — | stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino (izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega telesa), | — | čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t95), | — | število zamenjav volumna zraka na uro, | — | merilne naprave (če se uporabljajo). | | Podatki o izpostavljenosti | — | utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, | — | nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), | — | dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v območju dihanja živali; za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira ločeno, | — | vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (mg/l, mg/m3 itd.) in ne v prostorninskih enotah (ppm, ppb itd.), | — | porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) in geometrični standardni odklon (σg), vključno z metodami za njihov izračun. Poročati je treba o posameznih analizah velikosti delcev. | | Preskusni pogoji | — | podatke o pripravi preskusne kemikalije, vključno s podrobnostmi o postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije, | — | opis (ki po možnosti vključuje diagram) opreme, uporabljene za ustvarjanje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, | — | podatke o opremi, uporabljeni za spremljanje temperature, vlažnosti in pretoka zraka v komori (tj. pripravo umeritvene krivulje), | — | podatke o opremi, uporabljeni za jemanje vzorcev za določanje koncentracije in porazdelitve velikosti delcev v komori, | — | podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji (vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzorčenje), | — | metodo randomizacije pri dodeljevanju živali preskusnim in kontrolnim skupinam, | — | podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom hrane in virom vode), | — | utemeljitev določitve preskusnih koncentracij. | | Rezultati | — | preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, | — | preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, | — | preglednice s podatki o velikosti delcev, vključno s podatki o analitskem vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izračuni MMAD in σg, | — | preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za živali, ki kažejo znake zastrupitve, vključno s smrtnostjo ter naravo, resnostjo, časom nastopa in trajanjem učinkov), | — | preglednice s težami posameznih živali, | — | preglednice o porabi hrane, | — | preglednice s kliničnimi patološkimi podatki, | — | ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, če so na voljo, | — | preglednice z drugimi izmerjenimi parametri. | | Razprava in razlaga rezultatov | — | poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpolnitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, | — | z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogoče izpolniti, | — | v splošno oceno študije je treba vključiti doslednost metod, uporabljenih za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, | — | obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujoči način delovanja (sistemski ali lokalni), | — | če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o humanih končnih točkah (3) humano žrtvovati živali, ki so trpele bolečine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, | — | opredeliti je treba ciljne organe, | — | določiti je treba vrednosti NOAEL in LOAEL. | VIRI: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 412, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. | (4) | Whalan, J. E. in Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (poglavje 9). V: Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H. P. in Brain, J. D. (ur.), Springer Verlag Heidelberg, str. 229–258. | (6) | Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312. | (7) | Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231–238. | (8) | Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. V: Waalkes, M. P. in Ward, J. M. (ur.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263. | (9) | Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372. | (10) | Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224. | (11) | Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285. | (12) | Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419–428. | (13) | Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spremembi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode.; | “ |
| 5) | i capitoli B.29 e B.30 sono sostituiti dai seguenti: | «B.29. TOSSICITÀ SUBACUTA PER INALAZIONE: STUDIO A 90 GIORNI | SINTESI | Il presente metodo di prova rivisto B.29 è stato concepito per caratterizzare pienamente la tossicità per inalazione della sostanza per una durata subcronica (90 giorni) e fornire dati affidabili per valutazioni quantitative dei rischi legati all’inalazione. Dei gruppi di roditori, composti da almeno 10 maschi e 10 femmine, sono esposti per 6 ore al giorno per 90 giorni (13 settimane) a: a) la sostanza in esame a tre livelli di concentrazione o più; b) all’aria filtrata (controllo negativo); e/o c) al veicolo (gruppi di controllo del veicolo). Di norma gli animali sono esposti alla sostanza in esame per 5 giorni la settimana ma è possibile anche esporli 7 giorni su 7. Vengono sempre testati sia maschi che femmine, ma possono essere esposti a livelli di concentrazione diversi se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile ad una determinata sostanza. Per caratterizzare in modo più adeguato la tossicità della sostanza in esame, il presente metodo consente al responsabile dello studio di includere dei gruppi satellite (reversibilità), sacrifici intermedi, lavaggio bronchioalveolare (BAL), esami neurologici e ulteriori valutazioni istopatologiche o di patologia clinica. | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche 413 (2009). La prima linea guida dell’OCSE sulla tossicità subcronica per inalazione n. 413 è stata adottata nel 1981 (1). Questo metodo di prova B.29 (che corrisponde alla linea guida n. 413 rivista del 2009) è stato aggiornato per tenere conto dei progressi scientifici e rispondere alle esigenze normative attuali e future. | 2. | Gli studi di tossicità subcronica per inalazione sono utilizzati principalmente per calcolare le concentrazioni stabilite dalla normativa per valutare i rischi per i lavoratori nell’ambiente professionale. Servono anche a valutare i rischi per le persone nelle abitazioni, i trasporti e l’ambiente. Il presente metodo consente di caratterizzare gli effetti avversi risultanti da un’esposizione quotidiana ripetuta, per inalazione, ad una sostanza per 90 giorni (che corrisponde a circa 10 % della durata di vita di un ratto). I dati tratti dagli studi sulla tossicità subcronica per inalazione possono servire per le stime quantitative dei rischi e la scelta delle concentrazioni negli studi di tossicità cronica. Il presente metodo di prova non è destinato specificatamente ai test sui nanomateriali. Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono riportate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento n. 39 (2). | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 3. | Il laboratorio deve tenere conto di tutte le informazioni disponibili sulla sostanza in esame prima di svolgere la prove, in modo da migliorare la qualità dello studio e ridurre al minimo l’utilizzo di animali. Tre le informazioni utili per la scelta delle concentrazioni adeguate si annoverano: l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo; gli impieghi previsti o i rischi di esposizione umana, i dati (Q)SAR disponibili e i dati tossicologici in merito a sostanze chimiche di struttura affine; o dati tratti da altri studi di esposizione ripetuta. Se nel corso dello studio si prevedono o si constatano effetti neurotossici, il responsabile dello studio può decidere di includere le valutazioni ritenute necessarie e anche una serie di osservazioni funzionali (functional observational battery — fob) e misurazioni dell’attività motoria. Lo svolgimento di questi esami aggiuntivi non interferisce con l’impostazione di base dello studio, anche se la durata delle esposizioni può essere fondamentale in relazione ad alcuni esami specifici. | 4. | Le diluzioni di sostanze corrosive o irritanti possono essere saggiate a concentrazioni che consentono di conseguire il grado di tossicità auspicato. Per ulteriori informazioni si invita a consultare il documento di orientamento n. 39 (2). Nell’esposizione degli animali a questa sostanze, le concentrazioni auspicate devono essere sufficientemente basse da non provocare dolore e stress intensi, pur essendo sufficienti a prolungare la curva concentrazione-risposta fino a dei livelli corrispondenti all’obiettivo scientifico e regolamentare della prova. La scelta di queste concentrazioni deve avvenire caso per caso, di preferenza in base ad uno studio di tipo range finding adeguatamente impostato che fornisca informazioni sull’endpoint critico, le eventuali soglie di irritazione e il momento dell’insorgenza degli effetti (cfr. paragrafi da 11 a 13). Occorre fornire la giustificazione della scelta delle concentrazioni. | 5. | Gli animali moribondi o chiaramente sofferenti o recanti segni gravi e persistenti di sofferenza devono essere sottoposti a eutanasia. Gli animali moribondi sono considerati alla stregua degli animali che muoiono nel corso della prova. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto di un documento d’orientamento dell’OCSE, che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente (3). | DESCRIZIONE DEL METODO | Selezione delle specie animali | 6. | Si devono utilizzare roditori adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. La specie preferita è il ratto. In caso di utilizzo di un’altra specie è necessario motivarne la scelta. | Preparazione degli animali | 7. | Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno della randomizzazione gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 7 e 9 settimane. Il loro peso corporeo non deve superare di ± 20 % del peso medio per ciascun sesso. Gli animali sono scelti in modo casuale, marchiati per consentire l’individuazione dei singoli esemplari e tenuti nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova, affinché si acclimatino alle condizioni di laboratorio,. | Condizioni di allevamento degli animali | 8. | Gli animali devono essere identificati individualmente, possibilmente mediante dispositivi subcutanei al fine di agevolarne l’osservazione e evitare qualsiasi confusione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene “a naso solo”, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non devono provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sui parametri fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respiratorio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di adattamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti “a corpo intero” ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la durata dell’esposizione per evitare che filtrino l’aerosol attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da laboratorio, accompagnate da acqua potabile a volontà. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. | Camere di inalazione | 9. | La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposizione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione per via nasale per gli studi di aerosol liquidi o solidi e di vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione “a corpo intero” può essere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità atmosferica di una camera di esposizione “a corpo intero”, il volume complessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume della camera. Il documento di orientamento n. 39 (2) descrive i principi delle tecniche di esposizione “a corpo intero” e per sola via nasale, nonché i relativi vantaggi e svantaggi. | STUDI DI TOSSICITÀ | Concentrazioni limite | 10. | A differenza degli studi di tossicità acuta, per gli studi di tossicità subcronica per inalazione non è definita la concentrazione massima. La concentrazione massima testata deve tenere conto di: 1) la concentrazione massima raggiungibile; 2) il livello di esposizione umana corrispondente al “peggiore dei casi”; 3) la necessità di mantenere un’adeguata alimentazione di ossigeno; e/o 4) il benessere degli animali. In assenza di limiti basati sui dati, si possono utilizzare i valori limite del regolamento (CE) n. 1272/2008 (13) (ossia una concentrazione massima di 5 mg/l per gli aerosol, di 20 mg/l per i vapori e 20 000 ppm per i gas); cfr. documento di orientamento n. 39 (2). Qualora sia necessario superare questi valori limite, per le prove con gas o sostanze fortemente volatili (ad esempio i refrigeranti), occorre giustificare questo superamento. La concentrazione limite deve provocare una chiara tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3). | Studio per la determinazione dell’intervallo di dosi (range finding) | 11. | Prima di iniziare lo studio principale, è di norma necessario effettuare uno studio preliminare di tipo range finding. Uno studio di questo tipo è più completo di uno studio di osservazione perché non si limita alla scelta delle concentrazioni. Le conoscenze acquisite grazie a questo tipo di studio possono determinare il buon esito dello studio principale. Uno studio per determinare l’adeguato intervallo di dosi può, ad esempio, fornire informazioni tecniche sul metodo di analisi, la dimensione delle particelle, la scoperta di meccanismi di tossicità, i dati istopatologici e di patologia clinica e le stime circa le concentrazioni NOAEL e MTC nello studio principale. Il responsabile dello studio può decidere di utilizzare uno studio di tipo range finding per individuare: la soglia di irritazione dell’apparato respiratorio (ad esempio mediante istopatologia dell’apparato respiratorio, test sulla funzionalità polmonare e lavaggi broncoalveolari), la concentrazione più alta tollerata dagli animali senza provocare stress eccessivo e i parametri che permetteranno di caratterizzare al meglio la tossicità della sostanza in esame. | 12. | Uno studio per la determinazione degli intervalli di dose può comportare uno o più livelli di concentrazione. In funzione degli effetti da misurare selezionati si devono esporre da tre a sei maschi e da tre a sei femmine a ciascun livello di concentrazione. Lo studio in questione deve durare da un minimo di 5 giorni ad un massimo di 28 giorni. Nella relazione sullo studio è opportuno illustrare la ragione della scelta delle concentrazioni per lo studio principale. il cui scopo è dimostrare una relazione concentrazione-risposta sulla base dell’endpoint ritenuto a priori più sensibile La concentrazione inferiore deve essere del tipo NOAEL mentre la concentrazione più elevata deve comportare una chiara tossicità, senza causare stress eccessivo per gli animali né incidere sulla loro longevità (3). | 13. | Nello studio di tipo range finding, al momento della scelta dei livelli di concentrazione occorre tener conto di tutte le informazioni disponibili, anche quelle relative alle relazioni struttura-attività e i dati concernenti sostanze chimiche analoghe (cfr. paragrafo 3). Lo studio di determinazione dell’intervallo di dosi può confermare o invalidare la scelta degli endpoint ritenuti più sensibili secondo criteri meccanicisti, come l’inibizione della colinesterasi dovuta a organofosfati, la formazione di metaemoglobine da parte di agenti eritrotossici, gli ormoni tiroidei (T3 e T4) per i tireotossici, le proteine, la LDH, i neutrofili nei lavaggi broncoalveolari nel caso di particelle inoffensive scarsamente solubili o di aerosol irritanti per i polmoni. | Studio principale | 14. | Uno studio principale di tossicità subcronica di norma comprende tre livelli di concentrazione e, parallelamente, controlli negativi (aria) e/o del veicolo, se necessario (cfr. paragrafo 18). Per scegliere i livelli di esposizione adeguati, occorre avvalersi di tutte le informazioni disponibili, ivi compresi i risultati degli studi di tossicità sistemica, studi sul metabolismo e la cinetica (occorre fare il possibile per evitare livelli di concentrazione elevati caratterizzati da processi cinetici di saturazione). Ogni gruppo comprende 20 roditori (10 maschi e 10 femmine) che sono esposti alla sostanza in esame per 6 ore al giorno, 5 giorni la settimana per 13 settimane (per una durata totale dello studio di 90 giorni). Gli animali possono anche essere esposti per 7 giorni su 7 (ad esempio nel caso di prove su prodotti farmaceutici inalati). Se uno dei due sessi è notoriamente più sensibile alla sostanza in esame, i livelli di concentrazione possono differire secondo il sesso al fine di ottimizzare la concentrazione-risposta come indicato al paragrafo 15. Se per l’esposizione “a naso solo” s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore o superiore (ad esempio 22 ore al giorno) deve essere debitamente motivata. [cfr. il documento di orientamento n. 39 (2)]. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa, a meno che l’esposizione quotidiana sia superiore a 6 ore. Nel corso dell’esposizione “a corpo intero” si può continuare a somministrare acqua. | 15. | Le concentrazioni bersaglio selezionate devono consentire di individuare l’organo o gli organi bersaglio e di evidenziare una concentrazione-risposta chiara. | — | Il livello di concentrazione elevato deve produrre effetti tossici senza provocare segni persistenti o la morte che impedirebbero una valutazione significativa dei risultati | — | Il o i livelli di concentrazione medi devono essere intervallati in modo da produrre una graduazione degli effetti tossici tra la bassa e l’alta concentrazione | — | Il livello di dose inferiore non deve produrre effetti tossici o al massimo effetti poco rilevanti. | Sacrifici intermedi | 16. | Se si prevedono sacrifici intermedi, ad ogni esposizione il numero di animali deve essere aumentato del numero di animali che si prevede di sacrificare prima del completamento dello studio. Occorre fornire la giustificazione del ricorso ai sacrifici intermedi di cui si deve tenere adeguatamente conto nelle analisi statistiche. | Studio di gruppi satelliti (studio di reversibilità) | 17. | Uno studio di reversibilità può essere utilizzato per evidenziare il carattere reversibile persistente o ritardato della tossicità, per un periodo post-trattamento di una durata adeguata, e comunque di almeno 14 giorni. I gruppi satellite sono costituiti da 10 maschi e 10 femmine esposti contemporaneamente agli animali in esame nell’ambito dello studio principale. Questi gruppi devono essere esposti alla concentrazione più elevata della sostanza in esame. Sarebbe opportuno utilizzare anche un gruppo di controllo dell’aria e/o un gruppo di controllo del mezzo (cfr. paragrafo 18). | Animali di controllo | 18. | Gli animali del controllo negativo (aria) devono essere trattati come gli animali del gruppo soggetto alla prova, con la sola differenza che sono esposti ad aria filtrata e non alla sostanza in esame. Quando per produrre l’atmosfera di prova si utilizza acqua o un’altra sostanza, occorre integrare nello studio un gruppo di controllo del veicolo al posto del gruppo di controllo negativo (aria). Laddove possibile è opportuno utilizzare l’acqua come veicolo. In tal caso, gli animali del gruppo di controllo devono essere esposti all’aria caratterizzata dalla stessa umidità relativa dell’aria del gruppo in esame. La selezione di un veicolo adeguato deve basarsi su dati dello studio preliminare o storici adeguati. Qualora non si disponga di informazioni sufficienti sulla tossicità di un veicolo, il responsabile dello studio può utilizzare un gruppo di controllo negativo (aria) e un gruppo di controllo del veicolo, anche se questa opzione è vivamente sconsigliata. Se i dati storici indicano che un veicolo non è tossico, non occorre ricorrere a un gruppo di controllo negativo (aria) ma basta utilizzare un gruppo di controllo del veicolo. Se uno studio preliminare effettuato su una sostanza in esame incorporata in un veicolo non evidenzia nessuna tossicità, significa che il veicolo non è tossico alla concentrazione testata e che si deve utilizzare questo gruppo di controllo del veicolo. | CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE | Somministrazione delle concentrazioni | 19. | Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da testare dipende dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, dalle concentrazioni prescelte e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che si presenti nel corso della manipolazione e dell’utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere testate in atmosfera secca. Occorre prestare attenzione al fine di evitare concentrazioni esplosive. Per ridurre la granulometria, il materiale particolato può essere sottoposto a processi meccanici. Ulteriori informazioni sono riportate nel documento di orientamento n. 39 (2). | Distribuzione granulometrica | 20. | La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare degli aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) da 1 a 3 μm, con una deviazione standard geometrica (σg) compresa tra 1,5 e 3 (4). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario fornire il parere di un esperto. Ad esempio le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole dello standard indicato, mentre le particelle caricate e le fibre possono essere più grandi rispetto a tale standard. | Preparazione della sostanza in esame in un veicolo | 21. | Idealmente la sostanza deve essere testata senza un veicolo. Qualora sia necessario utilizzare un veicolo per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in esame, è preferibile utilizzare l’acqua. Quando una sostanza è disciolta in un veicolo, occorre verificarne la stabilità. | MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE | Flusso d’aria nella camera di esposizione | 22. | Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio in tempo reale della concentrazione (o stabilità temporale) dell’atmosfera di prova costituisce una misura permanente di tutti i parametri dinamici e un modo indiretto di controllarle tutti i parametri importanti per l’inalazione. Se la concentrazione è monitorata in tempo reale, la frequenza di misurazione della portata dell’aria può essere diminuita ad un’unica misurazione per giorno di esposizione. Si farà il possibile, nelle camere d’esposizione “a naso solo”, per evitare la reinalazione. La concentrazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non poter rispettare queste concentrazioni, è necessario misurare le concentrazioni di ossigeno e di anidride carbonica. Se le misurazioni effettuate il primo giorno di esposizione dimostrano che i livelli di questi gas sono corretti, non occorrono altre misurazioni. | Temperatura e umidità relativa della camera | 23. | La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 °C ± 3 °C. Sia nel caso delle esposizioni “a naso solo” che per le esposizioni “a corpo intero”, l’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale è costantemente monitorata e registrata ogni ora nel corso di ciascuna esposizione, se possibile. L’umidità relativa deve preferibilmente essere mantenuta tra 30 e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, quando si studiano miscele acquose) o che non possa essere misurata per via delle interferenze della sostanza con il presente metodo di prova. | Sostanza chimica in esame: Concentrazione nominale | 24. | Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla divisione della massa della sostanza in esame generata per il volume di aria che è passato nel sistema della camera di inalazione. La concentrazione nominale non serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficienza di produzione del sistema di prova e può essere utile per individuare eventuali problemi di produzione. | Sostanza chimica in esame: Concentrazione reale | 25. | La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame prelevata nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici, come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica è ammissibile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su opportune caratterizzazioni specifiche della sostanza in esame effettuate prima dello studio in corso. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica per determinare la concentrazione di un aerosol che contiene varie componenti in polvere, ma in tal caso occorrono dati analitici che dimostrino che la composizione del prodotto in sospensione nell’aria è analoga a quella del prodotto di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente in sospensione nell’aria) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto. | 26. | Nel corso dell’intero studio, si deve utilizzare, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il campione va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità dei contaminanti e delle impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area del picco, peso molecolare risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, oppure altre stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia per precauzione potrebbe confermare almeno in parte le caratteristiche fornite dallo sponsor (colore, natura fisica ecc.). | 27. | L’atmosfera di concentrazione deve essere mantenuta costante nei limiti del possibile. Per verificare la stabilità delle condizioni di esposizione si può utilizzare un dispositivo di monitoraggio in tempo reale, come un fotometro per aerosol o un analizzatore di idrocarburi totali per i vapori. La concentrazione reale della camera deve essere misurata almeno 3 volte nel corso di ogni giorno di esposizione per ciascun livello di esposizione. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un campione per periodo di esposizione. Idealmente si deve prelevare questo campione per l’intero periodo di esposizione. La concentrazione dei singoli campioni prelevati nella camera non deve deviare dalla concentrazione media della camera più del ± 10 %, nel caso di gas e vapori, o ± 20 % nel caso degli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario affinché la camera di esposizione raggiunga l’equilibrio (t95). La durata di un’esposizione copre il tempo di produzione della sostanza in esame, ivi compreso il tempo necessario affinché la camera raggiunga l’equilibrio (t95) e la degradazione. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene indicazioni per la stima di t95. | 28. | Per miscele molto complesse costituite da gas o vapori e da aerosol (ad esempio, atmosfere di combustione e sostanze chimiche generate per propulsione da appositi prodotti/dispositivi finali), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere almeno una sostanza indicatrice (analita), usualmente il principio attivo principale della miscela. Quando la sostanza chimica in esame è una miscela, nella relazione deve essere indicata la concentrazione analitica corrispondente alla miscela e non solo quella del principio attivo o della sostanza indicatrice (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni effettive sono reperibili nel documento d’orientamento n. 39 (2). | Sostanza chimica in esame: Distribuzione granulometrica | 29. | La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata almeno una volta la settimana per ciascuna concentrazione, utilizzando un impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro APS (Aerodynamic Particle Sizer). Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e con l’altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato nel corso dell’intero studio. | 30. | Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta con l’analisi su filtri [cfr. documento di orientamento n. 39 (2)]. Se questa equivalenza può essere dimostrata a tutte le concentrazioni saggiate nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misure di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati incerti che potrebbero comportare la necessità di ripetere uno studio. | 31. | È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che rischiano di condensarsi e formare aerosol o se si rilevano particelle in un’atmosfera di vapori che si presume possano formare fasi miste. | OSSERVAZIONI | 32. | Prima, durante e dopo il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami clinici degli animali. Osservazioni più frequenti possono essere utili in funzione della risposta degli animali nel corso dell’esposizione. Quando l’osservazione degli animali è ostacolata dai tubi di contenzione, dalla scarsa illuminazione nelle camere “a corpo intero” o da atmosfere opache, gli animali vanno attentamente osservati dopo l’esposizione. Le osservazioni fatte prima dell’esposizione del giorno successivo possono rilevare l’eventuale reversibilità o esacerbazione degli effetti tossici. | 33. | Tutte le osservazioni vanno registrate e riportate singolarmente per ciascun animale. Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile. | 34. | Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso, e dell’attività somatomotoria e del comportamento. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dall’esposizione o dalla reclusione. Lo studio può prevedere ulteriori valutazioni riguardanti: cinetica, biomonitoraggio, funzione polmonare, ritenzione di materiali scarsamente solubili che si accumulano nel tessuto polmonare e variazioni comportamentali. | PESO CORPOREO | 35. | Il peso di ogni singolo animale deve essere registrato immediatamente prima dell’esposizione (giorno 0), e due volte la settimana successivamente (ad esempio: il venerdì e il lunedì per verificare il recupero dopo un fine settimana senza esposizione, o a intervalli di tempo che consentano di valutare la tossicità sistemica) e al momento del decesso o dell’eutanasia. In assenza di effetti nel corso delle prime 4 settimane, il peso corporeo può essere misurato ogni settimana fino al termine dello studio. Gli animali del gruppo satellite (studio di reversibilità) devono continuare ad essere pesati a cadenza settimanale per l’intero periodo di recupero. Al termine dello studio, tutti gli animali devono essere pesati prima dell’eutanasia per non falsare il calcolo del rapporto tra il peso degli organi e il peso corporeo. | CONSUMO DI ALIMENTI E DI ACQUA | 36. | Si deve procedere settimanalmente alla misura del consumo alimentare, anche il consumo di acqua può essere misurato. | PATOLOGIA CLINICA | 37. | Tutti gli animali, ivi compresi quelli dei gruppi di controllo e dei gruppi satelliti, una volta sacrificati devono essere sottoposti a esami clinici. L’intervallo di tempo tra la fine dell’esposizione e il prelievo di sangue deve essere annotato, soprattutto quando la ricostituzione dell’endpoint è rapida. Alla fine dell’esposizione, si raccomanda il campionamento per i parametri caratterizzati da una breve emivita del plasma (COHb, CHE e MetHb). | 38. | Nella tabella 1 sono elencati i parametri di patologia clinica generalmente necessari per gli esami tossicologici. L’esame delle urine non è sempre richiesto, ma può essere effettuato se ritenuto utile in funzione della tossicità prevista o osservata. Per caratterizzare meglio la tossicità della sostanza in esame, il responsabile dello studio può decidere di valutare ulteriori parametri (ad esempio attività colinesterasica, lipidi, ormoni, equilibrio acido/base, metaemoglobina o corpi di Heinz, creatinina chinasi, rapporto mieloide/eritroide, troponina, emogas, lattato deidrogenasi, sorbitolo deidrogenasi, glutammato-deidrogenasi e gamma-glutamil transpeptidasi). | Tabella 1 | Parametri standard di patologia clinica | Ematologia | Conta eritrocitaria | Ematocrito | Concentrazione dell’emoglobina | Tenore globulare medio in emoglobina | Volume medio corpuscolare | Concentrazione di emoglobina corpuscolare media | Reticolociti | Conteggio dei globuli bianchi | Conta differenziale dei globuli bianchi | Conta delle piastrine | Coagulabilità (scegliere un parametro): | — | Tempo di protrombina | — | Tempo di coagulazione | — | Tempo di tromboplastina parziale attivata | Chimica clinica | Glucosio (9) | Colesterolo totale | Trigliceridi | Azoto ureico ematico | Bilirubina totale | Creatinina | Proteina totale | Albumina | Globulina | Alanina-aminotransferasi | Aspartato amminotransferasi | Fosfatasi alcalina | Potassio | Sodio | Calcio | Fosforo | Cloruro | Esame delle urine (facoltativo) | Aspetto (colore e torbidità) | Volume | Densità relativa o osmolalità | pH | Proteina totale | Glucosio | Sangue/cellule ematiche | 39. | Qualora esista la prova che le vie respiratorie inferiori (gli alveoli) sono il principale sito di deposito e ritenzione, si può ricorrere al lavaggio broncoalveolare (BAL) come tecnica migliore per analizzare quantitativamente i parametri del rapporto dose-effetto, incentrandosi soprattutto sull’alveolite, l’infiammazione polmonare e la fosfolipidosi. Questo esame consente di analizzare adeguatamente l’evoluzione del rapporto dose-effetto e del decorso temporale di una lesione alveolare. Il fluido di lavaggio può essere analizzato basandosi sul numero totale e differenziale di leucociti, proteine totali e lattato deidrogenasi. Altri parametri da considerare sono quelli indicativi di lesione lisosomiale, fosfolipidosi, fibrosi e infiammazione irritativa o allergica, che possono comprendere la determinazione di citochine o di chemiochine proinfiammatorie. Le misure legate al BAL spesso integrano i risultati degli esami istopatologici senza tuttavia sostituirli. Il documento di orientamento n. 39 (2) contiene le indicazioni su come effettuare il lavaggio dei polmoni. | ESAME OFTALMOLOGICO | 40. | Prima della somministrazione della sostanza in esame e al termine dello studio per tutti i gruppi trattati con una concentrazione elevata, occorre effettuare, avvalendosi di un oftalmoscopio o di un dispositivo equivalente, un esame oftalmologico del fondo dell’occhio, dei mezzi di rifrazione, dell’iride, della congiuntiva. Se sono individuate delle alterazioni a livello degli occhi, occorre esaminare tutti gli animali degli altri gruppi, ivi compreso il gruppo satellite (reversibilità). | PATOLOGIA MACROSCOPICA E PESO DEGLI ORGANI | 41. | Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della prova e quelli che sono ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti al dissanguamento totale (se fattibile) e autopsia macroscopica. Occorre annotare il tempo trascorso tra la fine dell’ultima esposizione di ogni animale e il suo sacrificio. Se non è possibile eseguire l’autopsia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa da ridurre al minimo l’autolisi. L’autopsia deve essere effettuata non appena possibile, di norma entro un giorno o due dal decesso. Per ogni animale si annoteranno tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, prestando particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie. | 42. | Nella tabella 2 sono elencati gli organi e i tessuti che devono essere conservati in un ambiente adeguato nel corso dell’autopsia macroscopica ai fini dell’esame istopatologico. La conservazione degli organi e dei tessuti [tra parentesi quadre] e di qualsiasi altro organo o tessuto sono a discrezione del responsabile dello studio. Gli organi indicati in grassetto devono essere esportati e pesati umidi, appena possibile dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. La tiroide e gli epididimi devono essere pesati solo se necessario in quanto la loro asportazione può ostacolare la valutazione istopatologica. Gli organi e i tessuti sono fissati mediante formalina tamponata al 10 % o un altro fissativo adeguato, non appena finita l’autopsia e non meno di 24-48 ore prima dell’ablazione, in funzione del fissativo utilizzato. | Tabella 2 | Organi e tessuti preservati nel corso dell’autopsia macroscopica | Ghiandole surrenali | Aorta | Midollo osseo (e/o aspirato fresco di midollo) | Cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte) | Intestino cieco | Colon | Duodeno | [Epididimi] | [Occhi (retina, nervo ottico) e palpebre] | Femore e grassella | Cistifellea (se presente) | [Ghiandole di Harder] | Cuore | Ileo | Digiuno | Reni | [Ghiandole lacrimali (extraorbitali)] | Laringe (3 livelli, ivi compresa la base dell’epiglottide) | Fegato | Polmone (tutti i lobi ad un livello, compresi i bronchi principali) | Linfonodi della regione ilare del polmone, soprattutto per il particolato di sostanze chimiche poco solubile. Per esami più approfonditi e/o studi incentrati sull’aspetto immunologico, si possono esaminare anche altri linfonodi, ad esempio quelli delle regioni mediastinale, cervicale/submandibolare e/o auricolare. | Linfonodi (distali dal punto di ingresso) | Ghiandola mammaria (femminile) | Muscolo (coscia) | Tessuti rinofaringei (almeno 4 livelli; 1 livello per comprendere il canale rinofaringeo e il tessuto associato al naso — Nasal Associated Lymphoid Tissue — NALT) | Esofago | [Bulbo olfattivo] | Ovaie | Pancreas | Paratiroidi | Nervo periferico (sciatico o tibiale, di preferenza vicino al muscolo) | Pituitaria | Prostata | Retto | Ghiandole salivari | Vescicole seminali | Pelle | Midollo spinale (cervicale, mediotoracico e lombare) | Milza | Sterno | Stomaco | Denti | Testicoli | Timo | Tiroidi | [Lingua] | Trachea (almeno 2 livelli, tra cui 1 sezione longitudinale attraverso la carena e 1 sezione trasversale) | [Uretere] | [Uretra] | Vescica | Utero | Organi bersaglio | Tutte le lesioni macroscopiche e le masse | 43. | I polmoni devono essere asportati intatti, pesati e trattati con un fissativo idoneo ad una pressione di 20-30 cm di acqua per garantire che la struttura dei polmoni venga preservata (5). Le sezioni sono prelevate per tutti i lobi ad un livello, ivi inclusi i bronchi principali, ma se si effettua un lavaggio polmonare, il lobo che non è stato lavato è sezionato su tre livelli (non sezioni in serie). | 44. | Si devono esaminare almeno 4 livelli di tessuti rinofaringei, uno dei quali deve comportare il canale rinofaringeo (5) (6) (7) (8) (9) per permettere un esame adeguato dell’epitelio squamoso, transizionale (respiratorio non cigliato), respiratorio (respiratorio cigliato) e olfattivo, nonché del tessuto linfatico (NALT) (10) (11). Occorre inoltre esaminare tre livelli della laringe, e uno di questi deve includere la base dell’epiglottide (12). Occorre esaminare almeno due livelli della trachea, ivi compresa una sezione longitudinale lungo la carena della biforcazione dei bronchi extrapolmonari e una sezione trasversale. | ESAME ISTOPATOLOGICO | 45. | Una valutazione istopatologica di tutti gli organi e i tessuti di cui alla tabella 2 è necessaria per i gruppi di controllo e i gruppi trattati con la concentrazione più elevata, e per tutti gli animali che muoiono o subiscono l’eutanasia nel corso dello studio. Occorre prestare particolare attenzione all’apparato respiratorio, agli organi bersaglio e alle lesioni macroscopiche. Gli organi e tessuti sui quali si riscontrano delle lesioni nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata devono essere esaminati in tutti i gruppi. Il responsabile dello studio può decidere di effettuare valutazioni istopatologiche anche per altri gruppi al fine di dimostrare una chiara risposta alle concentrazioni Quando si utilizza un gruppo satellite (reversibilità), la valutazione istopatologica va eseguita su tutti i tessuti e gli organi per i quali sono stati osservati effetti nei gruppi trattati. Se nel gruppo trattato con la concentrazione più elevata si registra un numero eccessivo di morti premature o altri tipi di problemi che possono compromettere il significato dei dati, occorre effettuare una valutazione istopatologica del livello di concentrazione immediatamente inferiore. Si deve cercare di correlare le osservazioni macroscopiche con i risultati degli esami microscopici. | DATI E RELAZIONE | Dati | 46. | Per i singoli animali occorre fornire i dati riguardanti il peso corporeo, il consumo di cibo, la patologia clinica, la patologia macroscopica, il peso degli organi e l’istopatologia. I dati di osservazione clinica devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo di prova, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e i risultati dell’autopsia. Tutti i risultati, quantitativi e descrittivi, devono essere valutati con un metodo statistico idoneo. Può essere utilizzato qualsiasi metodo statistico generalmente riconosciuto. I metodi statistici devono essere stabiliti nella fase di concezione dello studio. | Relazione sulla prova | 47. | La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi: | | Animali sperimentali e condizioni di allevamento: | — | descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta, | — | specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse dal ratto; possono essere forniti dati di origine o dati storici se riguardano animali esposti a condizioni di esposizione, di stabulazione e di digiuno simili, | — | numero, età e sesso degli animali, | — | metodo di randomizzazione, | — | descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in particolare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie. | | Sostanza chimica in esame: | — | natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (compresa l’isomerizzazione), | — | dati di identificazione e numero CAS (Chemical Abstract Services), se noto. | | Veicolo: | — | motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione per la scelta del veicolo (se diverso dall’acqua), | — | dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con i risultati dello studio. | | Camera di inalazione: | — | descrizione dettagliata della camera di inalazione, comprendente il volume e un diagramma, | — | provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposizione degli animali e per la generazione dell’atmosfera, | — | apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granulometria e della concentrazione reale, | — | fonte dell’aria e sistema di climatizzazione utilizzato, | — | metodi utilizzati per calibrare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omogeneità dell’atmosfera di prova, | — | differenza di pressione (positiva o negativa), | — | bocchette di esposizione per camera (“a naso solo”); ubicazione degli animali nella camera (“a corpo intero”), | — | stabilità dell’atmosfera di prova, | — | ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campionamento dell’atmosfera della prova nella camera, | — | trattamento dell’aria fornita/estratta, | — | flussi d’aria, portata dell’aria in ogni bocchetta di esposizione (“a naso solo”) o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della camera (“a corpo intero”), | — | tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t95), | — | numero di sostituzioni del volume per ora, | — | dispositivi di misurazione (se applicabile). | | Dati sull’esposizione: | — | giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio principale, | — | concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta circolare nella camera), | — | concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, vapori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse, | — | riportare le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, mg/l, mg/m3 ecc.), più che in unità di volume (ad esempio, ppm, ppb ecc.), | — | distribuzione della dimensione delle particelle, diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica (σg), con relativi metodi di calcolo. Occorre indicare anche le singole analisi granulometriche. | | Condizioni sperimentali: | — | indicazioni sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando i dettagli delle procedure impiegate per ridurre la granulometria dei materiali solidi o per preparare soluzioni della sostanza in esame, | — | una descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali, | — | ragguagli sull’apparecchiatura utilizzata per monitorare la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera (ad esempio sviluppo di una curva di calibrazione), | — | informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per raccogliere campioni per la determinazione della concentrazione e della distribuzione della dimensione delle particelle nella camera, | — | dettagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla convalida di tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal mezzo campionato), | — | metodo di randomizzazione per l’assegnazione degli animali nei gruppi sperimentali e di controllo, | — | dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della dieta, origine dell’acqua), | — | giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali. | | Risultati: | — | tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera, | — | tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera, | — | tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul campionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e della σg, | — | tabella con i dati di risposta e livello di concentrazione per ciascun animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità, inizio e durata degli effetti), | — | tabella con il peso dei singoli animali, | — | tabella con il consumo di cibo, | — | tabella con i dati clinico-patologici, | — | reperti necroscopici e reperti istopatologici per ciascun animale, se disponibili. | | Discussione e interpretazione dei risultati: | — | occorre dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria, | — | occorre esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti, | — | si deve tenere conto, nella valutazione globale dello studio, della coerenza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali ed effettive e considerare il rapporto tra esse, | — | si deve esaminare la causa probabile di decesso e il meccanismo d’azione prevalente (sistemico o locale), | — | occorre fornire delle spiegazioni qualora sia stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (3), | — | occorre individuare gli organi bersaglio, | — | occorre definire il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi (NOAEL) e il livello più basso al quale si osserva un effetto avverso (LOAEL). | BIBLIOGRAFIA: | (1) | OCSE (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (3) | OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. | (4) | Whalan.E and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9) in Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H.P. and Brain, J.D. (eds), Springer Verlag Heidelberg, pagg. 229-258. | (6) | Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309-312. | (7) | Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231-238. | (8) | Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. In: Waalkes MP and Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263. | (9) | Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353-372. | (10) | Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijvestijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219-224. | (11) | Kuper CF, Arts JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140-141: 281-285. | (12) | Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419-428. | (13) | Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1). | Appendice 1 | DEFINIZIONI | Sostanza chimica in esame: Qualsiasi sostanza o miscela testata secondo il presente metodo di prova. | B.30. STUDI DI TOSSICITÀ CRONICA | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 452 (2009). La prima linea guida 452 è stata adottata nel 1981. Si è ritenuto necessario sviluppare questa versione riveduta del metodo di prova B.30 alla luce dei recenti progressi nell’ambito del benessere animale e degli obblighi normativi (1) (2) (3) (4). L’aggiornamento del presente metodo di prova B.30 si è svolto in parallelo alle revisioni del capitolo B.32 del presente allegato, studi di cancerogenesi, e del capitolo B.33 del presente allegato, studi combinati di tossicità cronica/cancerogenesi, con l’obiettivo di integrare le informazioni in relazione agli animali usati nello studio e di fornire maggiori dettagli sulla scelta delle dosi. Il presente metodo di prova è concepito per testare un’ampia serie di sostanze chimiche, tra cui pesticidi e sostanze chimiche industriali. | 2. | La maggior parte degli studi di tossicità cronica è svolta su specie di roditori, pertanto il presente metodo di prova è destinato ad applicarsi in primo luogo agli studi che hanno ad oggetto queste specie. Se dovesse risultare necessario condurre tali studi sui non roditori, possono trovare applicazione, con le opportune modifiche, anche i principi e le procedure esposti nel presente metodo di prova, congiuntamente a quelli specificati al capitolo B.27 del presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (5), come indicato nel documento di orientamento n. 116 dell’OCSE — Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (6). | 3. | Le tre vie principali di somministrazione usate in relazione alla tossicità cronica sono: orale, cutanea e per inalazione. La scelta della via di somministrazione è fatta in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza in esame e della più probabile via di esposizione degli esseri umani. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta della via di esposizione. | 4. | Questo metodo di prova è incentrato sull’esposizione per via orale, ossia la via più usata negli studi di tossicità cronica. Gli studi sulla tossicità cronica che prevedono un’esposizione per via cutanea o per inalazione possono essere necessari anche per la valutazione del rischio per la salute umana e/o possono essere richiesti da determinati quadri normativi, ma entrambe le vie di esposizione evidenziano una complessità considerevole sul piano tecnico. Questo tipo di studi dovrà essere impostato caso per caso, ma il metodo di prova qui esposto per la valutazione e l’esame della tossicità cronica con somministrazione orale potrebbe costituire la base di un protocollo per studi per inalazione e/o cutanei, per quanto riguarda le raccomandazioni per i periodi di trattamento, i parametri clinici e patologici ecc. L’OCSE ha pubblicato documenti di orientamento sulla somministrazione di sostanze chimiche in esame per inalazione (6) (7) e per via cutanea (6). Il capitolo B.8 del presente allegato (8) e il capitolo B.29 del presente allegato (9), insieme al documento di orientamento dell’OCSE — Acute inhalation testing (7) vanno consultati in particolare nell’impostazione di studi a lungo termine che prevedono l’esposizione per inalazione. Il capitolo B.9 del presente allegato (10) va consultato nel caso di prove svolte per via cutanea. | 5. | Lo studio della tossicità cronica fornisce informazioni sui possibili rischi per la salute che potrebbero derivare dall’esposizione ripetuta nell’arco di un periodo considerevole della vita delle specie usate. Con questo studio sarà possibile ottenere informazioni sugli effetti tossici della sostanza chimica in esame, oltre ad indicare gli organi bersaglio e la possibilità di accumulo. Esso può inoltre fornire indicazioni sul cosiddetto no-observed-adverse-effect level (livello fino al quale non si osservano effetti dannosi) applicabile per la determinazione di criteri di sicurezza per l’esposizione umana. Si sottolinea inoltre la necessità di sottoporre gli animali ad attente osservazioni cliniche, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di informazioni. | 6. | Tra gli obiettivi degli studi condotti con questo metodo di prova figurano: | — | l’individuazione della tossicità cronica di una sostanza chimica in esame, | — | l’individuazione degli organi bersaglio, | — | la caratterizzazione del rapporto dose-risposta, | — | l’individuazione di un no-observed-adverse-effect level (NOAEL), ossia il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi, o di un punto di partenza per la determinazione di una dose di riferimento (BMD), | — | la previsione degli effetti di tossicità cronica ai livelli di esposizione umana, | — | la produzione di dati per verificare le ipotesi relative alle modalità di azione (6). | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 7. | Nella valutazione e nell’esame delle caratteristiche tossicologiche di una sostanza chimica in esame, prima di condurre lo studio i laboratori che eseguono la prova devono considerare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame al fine di orientare il disegno sperimentale nella maniera più efficiente per valutare il potenziale di tossicità cronica limitando al minimo necessario l’uso di animali. Tre le informazioni utili per il disegno sperimentale saranno considerate l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame, le informazioni sulle modalità di azione, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo, l’impiego o gli impieghi previsti per l’esposizione umana, dati (Q)SAR e i dati tossicologici disponibili in merito a sostanze chimiche di struttura affine, i dati tossicocinetici disponibili (dose unica e dose ripetuta, laddove disponibile) e i risultati di altri studi a dose ripetuta. La determinazione della tossicità cronica si effettua solamente una volta ottenuti i primi risultati delle prove di tossicità a dose ripetuta su 28 giorni e/o 90 giorni. È opportuno prendere in considerazione un approccio a tappe nello svolgimento delle prove di tossicità svolti nel quadro della valutazione generale degli effetti potenzialmente nocivi di una particolare sostanza chimica in esame (11) (12) (13) (14). | 8. | I metodi statistici più adeguati per l’analisi dei risultati, tenuto conto del disegno sperimentale e degli obiettivi, sono stabiliti prima dell’inizio dello studio. Occorre inoltre determinare se le statistiche debbano o meno tenere conto dell’aggiustamento in funzione della sopravvivenza e dell’analisi effettuata in caso di morte prematura degli animali di uno o più gruppi. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) e il documento di orientamento dell’OCSE n. 35 — Analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (15) forniscono indicazioni sulle analisi statistiche appropriate e sui riferimenti fondamentali a metodi statistici riconosciuti a livello internazionale. | 9. | Nella realizzazione di uno studio di tossicità cronica è opportuno seguire sempre i principi guida e le considerazioni specificati nel documento di orientamento dell’OCSE n. 19 — Recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (16), in particolare nel paragrafo 62. Tale paragrafo precisa che negli studi che prevedono la somministrazione ripetuta di dosi, se un animale manifesta segnali clinici progressivi, che conducano a un ulteriore peggioramento delle sue condizioni, è necessario decidere con cognizione di causa se sottoporre l’animale ad eutanasia. In questa decisione va soppesato anche il valore delle informazioni che possono essere ottenute continuando a includere tale animale nello studio e il suo stato in generale. Se si decide di continuare a mantenere l’animale nello studio occorre aumentare la frequenza delle osservazioni, a seconda del caso. È anche possibile, senza pregiudicare il fine della prova, sospendere temporaneamente la somministrazione delle dosi se ciò allevia il dolore o riduce lo stress cui è sottoposto l’animale, oppure ancora ridurre le dosi. | 10. | Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) e due pubblicazioni dell’International Life Sciences Institute (17) (18) forniscono ragguagli dettagliati in merito ai dibattiti sulla selezione delle dosi per gli studi di tossicità cronica e cancerogenesi. La strategia di base per la scelta delle dosi dipende dal o dagli obiettivi fondamentali dello studio (paragrafo 6). Nel selezionare il livello adeguato delle dosi sarebbe opportuno trovare un equilibrio tra, da un lato, l’individuazione dei rischi e, dall’altro, la caratterizzazione e la rilevanza delle risposte alle basse dosi. Ciò assume particolare importanza nella situazione in cui si deve svolgere uno studio combinato di tossicità cronica e di cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) (paragrafo 11). | 11. | È opportuno valutare l’opportunità di svolgere uno studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) piuttosto che eseguire in separata sede uno studio di tossicità cronica (il presente metodo di prova B.30) e uno studio di cancerogenesi (capitolo B.32 del presente allegato). La prova combinata è più efficiente sotto il profilo della gestione dei tempi e dei costi rispetto alla conduzione di due studi distinti, pur senza compromettere la qualità dei dati nella fase che verifica la cronicità e nella fase che verifica la cancerogenesi. Nello svolgimento di uno studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) occorre tuttavia tenere opportunamente in considerazione i principi della selezione delle dosi (paragrafi 9 e 20-25). È inoltre riconosciuto che determinati quadri normativi richiedono la conduzione di studi ben distinti. | 12. | Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono specificate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6). | PRINCIPIO DELLA PROVA | 13. | La sostanza chimica in esame è somministrata giornalmente in dosi graduali a diversi gruppi di animali sperimentali, di norma per un periodo di 12 mesi, ma a seconda degli obblighi normativi possono essere scelti anche periodi più lunghi o più corti (cfr. paragrafo 33). La durata scelta deve essere sufficientemente lunga da garantire la manifestazione degli effetti della tossicità cumulata senza che insorgano gli effetti distorsivi dei cambiamenti geriatrici. È opportuno che gli scostamenti da una durata di esposizione di 12 mesi siano giustificati, in particolare in caso di periodi di durata inferiore. La sostanza chimica in esame di norma è somministrata per via orale, ma può essere opportuno anche ricorrere alla via inalatoria o cutanea. Il disegno sperimentale può anche prevedere uno o più sacrifici intermedi, ad esempio dopo 3 e 6 mesi, e a tale fine possono essere introdotti nello studio ulteriori animali (cfr. paragrafo 19). Durante il periodo di somministrazione si tengono gli animali sotto attenta osservazione per individuare eventuali segni di tossicità. Gli animali deceduti o soppressi durante l’esperimento vengono sottoposti a necroscopia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a necroscopia. | DESCRIZIONE DEL METODO | Selezione delle specie animali | 14. | Il presente metodo di prova riguarda innanzitutto la valutazione e l’esame della tossicità cronica nei roditori (cfr. paragrafo 2), sebbene sia riconosciuto che determinati regimi normativi possano richiedere studi analoghi su non roditori. La scelta delle specie deve essere motivata. Il disegno e lo svolgimento di studi di tossicità cronica su specie di non roditori, se richieste, vanno basate sui principi indicati nel presente metodo di prova e in quelli specificati nel capitolo B.27 del presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (5). Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta delle specie e del ceppo. | 15. | Nel presente metodo di prova la specie di roditore di elezione è il ratto, sebbene si possano utilizzare anche altre specie di roditori, come il topo. I ratti e i topi costituiscono i modelli sperimentali preferibili in ragione della loro aspettativa di vita relativamente breve, del loro uso diffuso in studi farmacologici e tossicologici, della loro sensibilità all’induzione di tumori e della disponibilità di ceppi sufficientemente caratterizzati. Viste queste caratteristiche, è disponibile una grande quantità di informazioni di carattere fisiologico e patologico. Occorre utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Lo studio di tossicità cronica va svolto su animali dello stesso ceppo e della medesima provenienza di quelli utilizzati in uno o più studi preliminari di tossicità di durata inferiore. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. | Condizioni di stabulazione e alimentazione | 16. | Gli animali devono essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti piccoli gruppi dello stesso sesso. La sistemazione individuale va considerata soltanto se scientificamente giustificata (19) (20) (21). Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C). L’umidità relativa deve essere almeno del 30 % e preferibilmente non superiore al 70 %; tranne durante la pulizia del laboratorio, con l’obiettivo del 50-60 %. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua di abbeveraggio. La dieta deve corrispondere a tutti i requisiti nutrizionali delle specie in esame e il tenore di contaminanti dietetici, tra cui anche i residui di pesticidi, inquinanti organici persistenti, fitoestrogeni, metalli pesanti e micotossine, che potrebbero influenzare l’esito della prova, deve essere il più basso possibile. Le informazioni analitiche sui livelli di nutrienti e di contaminanti dietetici devono essere prodotte periodicamente, quantomeno all’inizio dello studio e in caso di cambio del lotto impiegato, e vanno riportate nella relazione finale. Analogamente, devono essere fornite anche informazioni analitiche sull’acqua di abbeveraggio usata nello studio. La scelta della dieta può essere condizionata dalla necessità di garantire una combinazione adeguata tra una data sostanza chimica in esame e l’esigenza di rispettare i requisiti nutrizionali degli animali nel momento in cui la sostanza chimica è somministrata con il cibo. | Preparazione degli animali | 17. | Si utilizzano animali sani, che siano stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno 7 giorni e non siano stati precedentemente sottoposti ad altre procedure sperimentali. Nel caso dei roditori, la somministrazione delle dosi agli animali deve iniziare il più presto possibile in seguito allo svezzamento e all’acclimatazione e preferibilmente prima che gli animali raggiungano le 8 settimane di età. Gli animali usati per la prova devono essere caratterizzati per quanto concerne specie, ceppo, provenienza, sesso, peso ed età. All’inizio dello studio la variazione ponderale degli animali di ciascun sesso utilizzati deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio di tutti gli animali interessati dallo studio, operando un distinguo a seconda del sesso. L’assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento avviene mediante randomizzazione. In seguito all’assegnazione randomizzata, non dovrebbero esserci più differenze significative nel peso medio corporeo tra gruppi dello stesso sesso. Se sono presenti differenze statisticamente rilevanti, la fase di randomizzazione va ripetuta, nei limiti del possibile. Ad ogni animale va assegnato un numero di identificazione univoco, che sarà riportato sull’animale in maniera indelebile tramite tatuaggio, impianto di un microchip o un altro metodo analogo. | PROCEDURA | Numero e sesso degli animali | 18. | È opportuno usare animali di entrambi i sessi. E necessario impiegare un numero di animali tale da consentire che alla fine dello studio sia disponibile una quantità di animali in ogni gruppo sufficiente per effettuare una valutazione biologica e statistica. Per quanto riguarda i roditori, per ciascun livello di dose di norma si usano almeno 20 esemplari per sesso in ogni gruppo, mentre per i non roditori si raccomanda un minimo di 4 esemplari per sesso in ciascun gruppo. Negli studi che prevedono la presenza di topi potrebbero essere necessari ulteriori animali in ciascun gruppo-dose per poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso. | Disposizioni relative ai sacrifici intermedi, a gruppi satellite e ad animali sentinella | 19. | Lo studio può prevedere disposizioni relative ai sacrifici intermedi (almeno 10 animali/sesso/gruppo), ad esempio dopo 6 mesi, al fine di reperire informazioni sull’evoluzione di alterazioni tossicologiche e dati meccanicistici. Se tali informazioni sono già disponibili sulla base di studi sulla tossicità a dose ripetuta sulla sostanza chimica in esame, tali sacrifici intermedi possono non essere scientificamente giustificati. Ai fini del monitoraggio della reversibilità dei cambiamenti tossicologici indotti dalla sostanza chimica in esame possono essere previsti anche gruppi satellite. Tali gruppi di norma saranno limitati al livello di dose più elevato dello studio e ai gruppi di controllo. Al fine di monitorare lo stato della patologia, se necessario durante lo studio è possibile aggiungere un altro gruppo di animali sentinella (solitamente 5 esemplari per sesso) (22). Se sono previsti sacrifici intermedi o inclusioni di gruppi satellite o di animali sentinella, il numero di animali previsto dal disegno sperimentale va aumentato della quantità di animali che si intende sacrificare prima della conclusione dello studio. Gli animali interessati di norma sono sottoposti alle medesime osservazioni, tra cui il controllo del peso corporeo, il consumo di cibo/acqua, analisi ematologiche e biochimico-cliniche ed esami patologici degli animali coinvolti nella fase di esame della tossicità cronica dello studio principale, sebbene sia possibile disporre anche che (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio) le osservazioni siano limitate a parametri essenziali specifici, come la neurotossicità o l’immunotossicità. | Gruppi-dose e dosaggi | 20. | Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce indicazioni in merito a tutti gli aspetti legati alla scelta delle dosi e all’intervallo tra i livelli di dose. Occorre utilizzare almeno tre livelli di dose e un controllo parallelo, tranne quando si esegue una prova limite (cfr. paragrafo 27). I livelli di dose sono generalmente basati sui risultati di precedenti studi di durata inferiore con dosi ripetute o di determinazione degli intervalli di dose e devono tenere conto dei dati tossicologici e tossicocinetici esistenti disponibili relativi alla sostanza chimica in esame o a sostanze chimiche analoghe. | 21. | A meno che la natura fisico-chimica o gli effetti biologici della sostanza chimica in esame non impongano limiti in tal senso, il livello di dose più elevato di norma va scelto con l’obiettivo di individuare gli organi bersaglio e gli effetti tossici senza provocare sofferenza, tossicità grave, morbilità o morte. In considerazione dei fattori di cui al paragrafo 22 sottostante, il livello di dose più elevato è scelto per rendere manifesta la tossicità, ad esempio con un calo dell’aumento del peso (circa del 10 %). | 22. | Tuttavia, a seconda degli obiettivi dello studio (cfr. paragrafo 6), si può optare per una dose massima inferiore alla dose che renda manifesta la tossicità, ad esempio se una dose provoca un effetto indesiderato preoccupante che però ha un impatto lieve sull’aspettativa di vita o sul peso corporeo. La dose massima non può essere superiore a 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno (dose limite, cfr. paragrafo 27). | 23. | I livelli di dose e l’intervallo tra i livelli di dose possono essere scelti per stabilire un rapporto dose-risposta e un NOAEL o altri risultati attesi dello studio, ad esempio una dose di riferimento (BMD, benchmark dose, cfr. paragrafo 25) al livello di dose più basso. Tra i fattori da tenere in considerazione nella scelta delle dosi più basse rientrano anche la curva attesa del rapporto dose-risposta, le dosi alle quali possono subentrare dei cambiamenti nel metabolismo o nella modalità di azione tossica, il livello a cui si prevede una soglia o il livello che si prevede possa costituire un punto di partenza per un’estrapolazione a basse dosi. | 24. | L’intervallo tra i livelli di dose scelto dipenderà dalle caratteristiche della sostanza chimica di prova e non può essere imposto dal presente metodo di prova, ma di frequente fattori tra due e quattro forniscono buoni risultati delle prove se applicati per determinare dosi a livelli discendenti, mentre spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che utilizzare intervalli molto distanziati (ad esempio oltre un fattore di circa 6-10) tra le dosi. In linea generale va evitato l’uso di fattori superiori a 10 e se vi si ricorre è opportuno giustificare tale scelta. | 25. | Come illustrato ulteriormente nel documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6), nella scelta della dose vanno tenuti in considerazione, tra l’altro, i seguenti aspetti: | — | non linearità o punti di flesso presunti o riscontrati nella curva dose-risposta, | — | aspetti tossicocinetici e range di dosi a cui subentra o meno induzione metabolica, saturazione o non linearità tra dosi esterne e interne, | — | lesioni precursive, indicatori degli effetti o indicatori di processi biologici fondamentali sottostanti in corso, | — | aspetti principali (o presunti) delle modalità di azione, ad esempio dosi alle quali inizia a subentrare citotossicità, i livelli ormonali sono perturbati, i meccanismi di omeostasi sono superati ecc., | — | regioni della curva dose-risposta per cui è necessaria una stima particolarmente precisa, ad esempio nell’ambito della dose di riferimento prevista o di una soglia ipotizzata, | — | considerazione dei livelli previsti di esposizione umana. | 26. | Il gruppo di controllo deve essere non trattato o trattato solo con il veicolo nel caso si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza chimica in esame. Salvo il trattamento con la sostanza chimica in esame, gli animali del gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di controllo riceverà il veicolo al volume più elevato dei gruppi-dose. Se una sostanza chimica è somministrata con la dieta e comporta una riduzione dell’assunzione di cibo significativa a causa di una minore palatabilità, può essere utile aggiungere un ulteriore gruppo di controllo alimentato allo stesso modo che si presterà di più a tale scopo. | 27. | Se, basandosi sulle informazioni degli studi preliminari, è possibile prevedere che una prova a un livello di dose equivalente ad almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno probabilmente non produce effetti avversi e se, sulla base dei dati relativi a sostanze chimiche strutturalmente affini, non si prevede tossicità, uno studio completo con tre livelli di dose può non essere ritenuto necessario. Si può applicare un limite di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno eccetto nei casi in cui l’esposizione umana indica la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato. | Preparazione delle dosi e somministrazione della sostanza chimica in esame | 28. | La sostanza chimica in esame di norma viene somministrata con il cibo, l’acqua di abbeveraggio o per via intragastrica. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori informazioni in merito alle vie e ai metodi di somministrazione. La via di somministrazione dipende dall’obiettivo dello studio, dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza chimica in esame, dalla sua biodisponibilità e dalla via e dal metodo predominanti di esposizione degli esseri umani. È necessario giustificare la scelta della via e del metodo di somministrazione. Nell’interesse della salute animale, la somministrazione mediante sonda orale di norma va scelta solo per le sostanze per cui questa via e questo metodo di somministrazione corrispondono ragionevolmente a una potenziale esposizione umana (ad esempio farmaci). Per le sostanze chimiche ingerite con gli alimenti o presenti nell’ambiente, inclusi i pesticidi, la somministrazione avviene solitamente con il cibo o l’acqua di abbeveraggio. Tuttavia in alcune circostanze, ad esempio nel caso dell’esposizione professionale, può essere opportuna la somministrazione per altre vie. | 29. | Ove necessario, la sostanza chimica di prova è disciolta o sospesa in un veicolo adeguato. È opportuno tenere conto, a seconda del caso, delle seguenti caratteristiche del veicolo e di altri additivi: effetti sull’assorbimento, sulla distribuzione, sul metabolismo o sulla ritenzione della sostanza chimica in esame, effetti sulle proprietà chimiche della sostanza chimica in esame che possono alterarne le caratteristiche tossiche ed effetti sulla consumazione di cibo o acqua sullo stato nutrizionale degli animali. Si raccomanda di prendere anzitutto in considerazione, ogni qualvolta possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/emulsione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Dei veicoli diversi dall’acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. Devono essere disponibili informazioni in merito alla stabilità della sostanza chimica in esame e all’omogeneità delle soluzioni o razioni di dosaggio (a seconda del caso) nelle condizioni di somministrazione (ad esempio dieta). | 30. | Per le sostanze chimiche somministrate con la dieta o l’acqua di abbeveraggio è importante impedire che le quantità della sostanza chimica in esame interferiscano con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. In studi a lungo termine che ricorrono alla somministrazione con la dieta, la concentrazione nel cibo della sostanza chimica in esame di norma non può superare la soglia massima del 5 % della dieta totale, al fine di evitare degli squilibri alimentari. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può ricorrere sia a una concentrazione alimentare costante (mg/kg di cibo o ppm), sia a dosi di livello costante in funzione del peso dell’animale (mg/kg di peso corporeo), con calcolo su base settimanale. La scelta di eventuali alternative va specificata. | 31. | In caso di somministrazione per via orale, agli animali viene somministrata una dose giornaliera della sostanza chimica in esame (sette giorni la settimana), di norma per un periodo di 12 mesi (cfr. anche paragrafo 33), sebbene a seconda degli obblighi normativi possa essere richiesta una durata superiore. Occorre giustificare la scelta di eventuali altri regimi di dosaggio, ad esempio cinque giorni la settimana. In caso di somministrazione per via cutanea, di norma gli animali sono trattati con la sostanza chimica in esame per almeno 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, così come specificato nel capitolo B.9 del presente allegato (10), per un periodo di 12 mesi. L’esposizione per via inalatoria si protrae per 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, ma, se giustificata, può essere scelta un’esposizione di 5 giorni la settimana. La durata del periodo di somministrazione di norma è di 12 mesi. Se delle specie di roditori diverse dai ratti sono sottoposte a esposizione “a naso solo”, è possibile adeguare la durata massima di esposizione per ridurre al minimo il loro stress. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore al giorno deve essere debitamente motivata. Cfr. anche il capitolo B.8 del presente allegato (8). | 32. | Se la somministrazione della sostanza chimica in esame avviene per via intragastrica, deve avvenire per mezzo di una sonda gastrica o una cannula per intubazione ogni giorno all’incirca allo stesso orario. Di norma viene somministrata una dose singola una volta al giorno, ma laddove, ad esempio, la sostanza chimica in esame fosse un irritante locale, è possibile mantenere la dose giornaliera ripartendola su due momenti diversi (due volte al giorno). Il massimo volume di liquido che può essere somministrato in un’unica soluzione dipende dalle dimensioni dell’animale. Il volume deve essere limitato il più possibile e per i roditori non può superare, di norma, 1 ml/100 g di peso corporeo (22). La variabilità dei volumi somministrati va ridotta al minimo regolando la concentrazione in modo da assicurare un volume costante in tutti i livelli di dose. Sostanze chimiche potenzialmente corrosive o irritanti sono considerate un’eccezione e devono essere diluite per evitare effetti locali gravi. Va evitato lo svolgimento di prove con concentrazioni che rischiano di essere corrosive o irritanti per il tratto gastrointestinale. | Durata dello studio | 33. | Sebbene il presente metodo di prova sia impostato in primo luogo come uno studio di tossicità cronica della durata di 12 mesi, il disegno sperimentale rende possibile e può essere applicato anche a studi dalla durata più breve (ad esempio 6 o 9 mesi) o più lunga (ad esempio 18 o 24 mesi), a seconda delle disposizioni di regimi normativi specifici o dagli specifici fini meccanicistici. È opportuno che gli scostamenti da una durata di esposizione di 12 mesi siano giustificati, in particolare in caso di periodi di durata inferiore. I gruppi satellite inclusi nello studio per monitorare la reversibilità dei cambiamenti a livello tossicologico indotti dalla sostanza chimica in esame sono tenuti senza trattamento per un periodo non inferiore a 4 settimane e non oltre un terzo della durata dello studio una volta terminata l’esposizione. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (6) fornisce ulteriori indicazioni, tra cui considerazioni in merito alla sopravvivenza nello studio. | OSSERVAZIONI | 34. | Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mortalità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi inclusi. Le osservazioni cliniche vanno effettuate almeno una volta al giorno, preferibilmente alla/e stessa/e ora/e, tenendo conto del periodo di picco degli effetti previsti dopo la somministrazione nel caso in cui questa avvenga per via intragastrica. | 35. | Tutti gli animali vanno sottoposti a dettagliate osservazioni cliniche almeno una volta prima della prima esposizione (per consentire il confronto all’interno dei gruppi di soggetti) e, successivamente, al termine della prima settimana dello studio e successivamente a cadenza mensile. Le osservazioni devono rispettare un protocollo che limiti al minimo indispensabile le differenze tra i singoli e non devono dipendere dai risultati del gruppo esaminato. Le osservazioni del caso vanno eseguite fuori dalla gabbia di stabulazione, preferibilmente in un ambiente standard e all’incirca sempre allo stesso orario. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente usando sistemi di punteggio statistico definiti appositamente dal laboratorio che esegue la prova. Occorre adottare ogni misura per ridurre al minimo le variazioni delle condizioni di osservazione. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle membrane mucose, della comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell’attività del sistema nervoso autonomo (per esempio lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Verranno inoltre registrate le modifiche osservate nel comportamento, nella postura e nella risposta alla manipolazione, come pure la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipi (per esempio tolettatura eccessiva, continuo girare in tondo) o comportamenti insoliti (per esempio automutilazione, marcia a ritroso) (24). | 36. | Tutti gli animali devono essere sottoposti a un esame oftalmologico con un oftalmoscopio o un altro dispositivo idoneo, prima della prima somministrazione della sostanza chimica in esame. Al termine dello studio, questo esame deve essere condotto preferibilmente su tutti gli animali, ma almeno sui gruppi ad alta dose e di controllo. Se si riscontrano alterazioni degli occhi correlate al trattamento è necessario esaminare tutti gli animali. Se da un’analisi strutturale o da altre informazioni si riscontra una tossicità oculare, la frequenza degli esami oculari va intensificata. | 37. | Per le sostanze chimiche per cui prove precedenti di tossicità a dose ripetuta a 28 giorni e/o a 90 giorni hanno indicato potenziali effetti neurotossici, possono essere svolte valutazioni facoltative della reattività sensoriale a stimoli di vario tipo (24) (ad esempio stimoli uditivi, visivi e propriocettivi) (25), (26), (27), della forza di presa (28) e dell’attività motoria (29) prima dell’inizio dello studio e a cadenza trimestrale dopo l’inizio dello studio fino al 12° mese incluso, così come alla fine dello studio (se più lungo di 12 mesi). Ulteriori indicazioni sui procedimenti utilizzabili sono contenute nelle voci bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate anche procedure alternative non indicate nella bibliografia. | 38. | Le sostanze chimiche per cui prove di tossicità a dose ripetuta a 28 giorni e/o a 90 giorni hanno indicato effetti potenzialmente immunotossici, alla fine dello studio possono essere sottoposte ad ulteriori analisi facoltative di tale parametro. | Peso corporeo, consumo di cibo/acqua ed efficienza alimentare | 39. | Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimentare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Se la sostanza chimica è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto della misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ultimo è alterato. | Esami ematologici e biochimico-clinici | 40. | Negli studi che prevedono la presenza di roditori, vanno svolti esami ematologici su almeno 10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo, a 3, 6 e 12 mesi, così come alla fine dello studio (se di durata superiore a 12 mesi), sempre sugli stessi animali. Se sono previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso (cfr. paragrafo 18). Negli studi con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minori di animali (ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono necessariamente essere condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai parametri ematologici in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. Occorre prelevare campioni di sangue da un sito specifico, ad esempio con punture cardiache o dal seno retro-orbitale, sotto anestesia. | 41. | Vanno esaminati i seguenti parametri (30): conteggio totale e differenziato dei leucociti, conteggio degli eritrociti, conteggio delle piastrine, ematocrito (volume sanguigno occupato dalla componente eritrocitaria), volume corpuscolare medio, emoglobina corpuscolare media, concentrazione di emoglobina corpuscolare media, tempo di prototrombina e tempo di tromboplastina parziale attivata. Possono essere misurati anche altri parametri ematologici come i corpi di Heinz o un’altra morfologia eritrocitaria atipica o metaemoglobina, se del caso, a seconda della tossicità della sostanza chimica in esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in funzione dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza chimica in esame. Se la sostanza chimica in esame ha un effetto sul sistema ematopoietico, possono essere indicati anche il conteggio dei reticolociti e la citologia del midollo osseo, sebbene questi non siano necessariamente esami di routine. | 42. | Le determinazioni biochimiche cliniche per lo studio degli effetti tossici gravi sui tessuti e, specificamente, gli effetti su reni e fegato, vanno condotte su campioni di sangue prelevati da almeno 10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo, ai medesimi intervalli di tempo specificati per gli esami ematologici e sempre sugli stessi animali. Se sono previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter eseguire tutte le determinazioni biochimiche cliniche del caso. Negli studi con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minori di animali (ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai parametri di biochimica clinica in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. Si raccomanda di lasciare gli animali a digiuno la notte precedente la raccolta dei campioni (ad eccezione dei topi). Vanno esaminati i seguenti parametri (30): glucosio, urea (azoto ureico), creatinina, proteine totali, albumina, calcio, sodio, potassio, colesterolo totale, almeno due esami idonei alla valutazione epatocellulare (alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, glutammato deidrogenasi, acidi biliari totali) (31) e almeno due esami idonei alla valutazione epatobiliare (fosfatasi alcalina, gamma-glutamil transferasi, 5’-nucleotidasi, bilirubina totale, acidi biliari totali) (31). Se opportuno possono essere misurati anche altri parametri di chimica clinica, come i trigliceridi a digiuno, ormoni specifici e colinesterasi, a seconda della tossicità della sostanza chimica in esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in funzione dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza chimica in esame. | 43. | L’esame delle urine va effettuato su almeno 10 esemplari di sesso maschile e 10 esemplari di sesso femminile per gruppo sui campioni raccolti seguendo gli stessi intervalli applicati in ambito ematologico e di chimica clinica. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscontrato nessun effetto sull’esame delle urine in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. I seguenti parametri sono stati inclusi in una raccomandazione di esperti su studi di patologia clinica (30): aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine totali e glucosio. Altre determinazioni riguardano il chetone, l’urobilinogeno, la bilirubina e il sangue occulto. Se necessario, per ampliare lo studio dell’effetto o degli effetti osservato/i è possibile impiegare ulteriori parametri. | 44. | Generalmente si considera necessario determinare le variabili di riferimento di natura ematologica e di biochimica clinica prima di iniziare un trattamento in studi che coinvolgono dei cani, ma ciò non è ritenuto necessario negli studi che prevedono l’uso di roditori (30). Tuttavia se non si dispone di dati storici di riferimento adeguati (cfr. paragrafo 50), si dovrebbe considerare di produrre tali dati. | Patologia | Necroscopia macroscopica | 45. | Di norma tutti gli animali dello studio vanno sottoposti a completa e dettagliata necroscopia macroscopica che comprende un attento esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Tuttavia si può anche disporre (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio o per i gruppi satellite) che le osservazioni siano limitate a parametri specifici essenziali, come la neurotossicità o l’immunotossicità (cfr. paragrafo 19). Gli animali in oggetto non devono necessariamente essere sottoposti ad autopsia e alle procedure successive descritte nei seguenti paragrafi. Per gli animali sentinella, valutando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a discrezione del responsabile scientifico dello studio. | 46. | Va misurato il peso degli organi di ciascun animale, tranne di quelli esclusi dall’ultima parte del paragrafo 45. Le ghiandole surrenali, il cervello, l’epididimo, il cuore, i reni, il fegato, le ovaie, la milza, i testicoli, la tiroide (pesata post-fissazione, con paratiroidi) e l’utero di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati nel frattempo) vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. In studi che prevedono l’uso di topi, la misurazione del peso delle ghiandole surrenali è facoltativa. | 47. | I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo (32) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi): | tutte le lesioni macroscopiche | cuore | pancreas | stomaco (prestomaco, stomaco ghiandolare) | ghiandole surrenali | ileo | ghiandola paratiroidea | [denti] | aorta | digiuno | nervo periferico | testicoli | cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte) | reni | pituitaria | timo | intestino cieco | ghiandola lacrimale (esorbitale) | prostata | tiroide | cervice | fegato | retto | [lingua] | ghiandola della coagulazione | polmone | ghiandola salivare | trachea | colon | linfonodi (superficiali e profondi) | vescicola seminale | vescica | duodeno | ghiandola mammaria (obbligatoria per esemplari di sesso femminile e, se visibile ai fini della la dissezione, anche per quelli di sesso maschile) | muscolo scheletrico | utero (cervice inclusa) | epididimo | [tratto respiratorio superiore, incluso il naso, i turbinati e i seni paranasali] | pelle | [uretere] | occhi (retina inclusa) | esofago | midollo spinale (a tre livelli: cervicale, mediotoracico e lombare) | [uretra] | [femore con articolazione] | [bulbo olfattivo] | milza | vagina | cistifellea (eccetto per i topi) | ovaia | [sterno] | sezione di midollo osseo e/o un aspirato di midollo osseo fresco | ghiandola di Harder | | | | In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza chimica in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per via cutanea, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla via orale. In particolare, sono essenziali il campionamento e la conservazione della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi che prevedono la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco dei tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratorio deve corrispondere alle raccomandazioni contenute nel capitolo B.8 del presente allegato (8) e del capitolo B.29 del presente allegato (9). Per altri organi/tessuti (oltre ai tessuti conservati specificamente del tratto respiratorio) va esaminato l’elenco degli organi relativo alla via orale. | Esame istopatologico | 48. | Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi di patologia tossicologica (32). Come minimo, gli esami istopatologici devono prevedere quanto segue: | — | tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo, | — | tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel corso dello studio, | — | tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche, | — | tessuti bersaglio o tessuti che hanno evidenziato cambiamenti legati al trattamento nel gruppo ad alta dose, di tutti gli animali in tutti gli altri gruppi-dose, | — | in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno esaminati entrambi gli organi. | DATI E RELAZIONE | Dati | 49. | Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo sperimentale il numero di animali presenti all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante il test o sacrificati per motivi umanitari e il momento di tutti i decessi/soppressioni, il numero di animali che presentano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento dell’esordio, durata e gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di animali rapportata al tipo di lesione. Le tabelle riassuntive dei dati devono fornire le medie e le deviazioni standard (per dati raccolti in via continuativa) relative agli animali che evidenziano effetti tossici o lesioni, oltre all’indicazione dell’entità delle lesioni. | 50. | I dati storici di controllo possono essere utili per interpretare i risultati dello studio, ad esempio quando i dati forniti da gruppi di controllo paralleli sembrano divergere significativamente da dati recenti relativi ad animali di controllo dello stesso centro di prova/della stessa colonia. Se valutati, i dati storici di controllo vanno trasmessi dallo stesso laboratorio e devono riferirsi ad animali della medesima età e dello stesso ceppo, nonché essere generati nei cinque anni che precedono lo studio in questione. | 51. | I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico adeguato e generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da analizzare vanno scelti già in sede di determinazione del disegno sperimentale (paragrafo 8). Questa scelta deve rendere possibili degli aggiustamenti in funzione del grado di sopravvivenza, se necessario. | Relazione sulla prova | 52. | La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti: | | Sostanza chimica in esame: | — | natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche, | — | dati identificativi, | — | origine della sostanza chimica, | — | numero del lotto, | — | certificazione dell’analisi chimica. | | Veicolo (se del caso): | — | giustificazione della scelta del veicolo (se diverso dall’acqua). | | Animali sperimentali: | — | specie/ceppo utilizzato e giustificazione della scelta effettuata, | — | numero, età e sesso degli animali all’inizio della prova, | — | origine, condizioni di stabulazione, dieta ecc., | — | peso di ciascun animale all’inizio della prova. | | Condizioni sperimentali: | — | criteri di scelta della via di somministrazione e della dose, | — | laddove opportuno, metodi statistici usati per analizzare i dati, | — | dettagli sulla formulazione della sostanza chimica in esame/la preparazione della dieta, | — | dati di analisi sulla concentrazione, la stabilità e l’omogeneità della preparazione, | — | via di somministrazione e relativi dettagli della sostanza chimica in esame, | — | per gli studi che prevedono la somministrazione per via inalatoria, scelta tra esposizione “a naso solo” o “a corpo intero”, | — | dosi effettive (mg/kg di peso corporeo/giorno) e, se del caso, fattore di conversione tra la concentrazione della sostanza chimica in esame nella dieta/acqua di abbeveraggio (mg/kg o ppm) e la dose effettiva, | — | informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell’acqua. | | Risultati (vanno indicati dati da presentare sotto forma di tabelle e dati individuali sugli animali): | — | dati sulla sopravvivenza degli animali, | — | peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo, | — | assunzione di cibo, calcoli sull’efficienza alimentare, se effettuati, nonché consumo di acqua, se del caso, | — | dati sulla risposta tossica per sesso e livello di dose, compresi segni di tossicità, | — | natura, incidenza (e, se classificata, la gravità) e durata dei segni clinici (temporanei o permanenti), | — | esame oftalmologico, | — | esami ematologici, | — | esami di biochimica clinica, | — | esame delle urine, | — | risultati di tutti gli esami sulla neurotossicità o immunotossicità, | — | peso corporeo finale, | — | peso degli organi (anche in relazione al peso corporeo, se del caso), | — | referti autoptici, | — | descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici relativi al trattamento, | — | dati sull’assorbimento, se disponibili. | | Elaborazione statistica dei risultati, se del caso | | Discussione dei risultati, compreso: | — | rapporti dose-risposta, | — | esame di tutte le informazioni sulle modalità di azione, | — | discussione su tutti gli approcci di modellizzazione, | — | determinazione BMD, NOAEL o LOAEL, | — | dati storici di controllo, | — | rilevanza per gli esseri umani. | | Conclusioni | BIBLIOGRAFIA | (1) | OCSE (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208. | (3) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191. | (4) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445. | (5) | Capitolo B.27 del presente allegato, Test di tossicità orale subcronica Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori. | (6) | OCSE (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines | (7) | OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment N°39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (8) | Capitolo B.8 del presente allegato, Tossicità subacuta a dose ripetuta (28 giorni) per inalazione. | (9) | Capitolo B.29 del presente allegato, Studio di tossicità subcronica a dose ripetuta (90 giorni) per inalazione | (10) | Capitolo B.9 del presente allegato, Tossicità a dose ripetuta (28 giorni) per via cutanea. | (11) | Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al. (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1-7. | (12) | Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (13) | Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al. (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37-68. | (14) | Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al. (2006). A Tiered Approach to LIFE Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69-98. | (15) | OCSE (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paris. | (16) | OCSE (2000). 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ILSI Press, Washington, DC. | (19) | Direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010, sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (GU L 276 del 20.10.2010, pag. 33). | (20) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (21) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (22) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (23) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. | (24) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. | (25) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (26) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. | (27) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (28) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. 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Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Appendice 1 | DEFINIZIONI | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. | » | 5. | poglavji B.29 in B.30 se nadomestita z naslednjima: | „B.29 SUBKRONIČNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU: 90-DNEVNA ŠTUDIJA | POVZETEK | Ta revidirana preskusna metoda B.29 je bila zasnovana za celovito opredelitev strupenosti preskusne kemikalije pri vdihavanju v subkroničnem obdobju (90 dni) in zagotavljanje podatkov za kvantitativne ocene tveganja pri vdihavanju. Skupine 10 samcev in 10 samic glodavcev se 90 dni (13 tednov) po 6 ur na dan izpostavljajo a) trem ali več različnim koncentracijam preskusne kemikalije, b) filtriranemu zraku (negativna kontrola) in/ali c) nosilcu (kontrola z nosilcem). Navadno se živali izpostavljajo 5 dni na teden, dovoljeno pa je tudi izpostavljanje 7 dni na teden. Vedno se preskušajo samci in samice, vendar se lahko izpostavljajo različnim koncentracijam, če je znano, da je en spol občutljivejši za določeno preskusno kemikalijo. Ta metoda vodji študije omogoča prožnost za vključitev satelitskih skupin (skupin za reverzibilnost), vmesnih žrtvovanj, bronhoalveolarne lavaže (BAL), nevroloških preskusov ter dodatnih kliničnih patoloških in histopatoloških ocen, da se bolje opredeli strupenost preskusne kemikalije. | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD 413 (2009). Prvotna smernica za preskušanje 413 v zvezi s subkronično strupenostjo pri vdihavanju (TG 413) je bila sprejeta leta 1981 (1). Ta preskusna metoda B.29 (ki ustreza revidirani TG 413 (2009)) je bila posodobljena, da upošteva trenutno stanje v znanosti ter izpolnjuje sedanje in prihodnje zakonodajne potrebe. | 2. | Študije subkronične strupenosti pri vdihavanju se uporabljajo predvsem za določanje zakonsko predpisanih koncentracij za ocenjevanje tveganj za delavce v delovnem okolju. Uporabljajo se tudi za ocenjevanje tveganj za ljudi v njihovem bivalnem okolju in med prevozom ter okoljskih tveganj. Ta metoda omogoča opredelitev škodljivih učinkov po ponavljajoči se dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji z vdihavanjem, pri čemer preskušanje traja 90 dni (približno 10 % življenjske dobe podgane). Podatki, pridobljeni s študijami subkronične strupenosti pri vdihavanju se lahko uporabijo za kvantitativne ocene tveganja in izbiro koncentracij za študije kronične strupenosti. Ta preskusna metoda ni posebej namenjena preskušanju nanomaterialov. Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami (GD) št. 39 (2). | ZAČETNI PREUDARKI | 3. | Da se poveča kakovost študije in kar najbolj zmanjša uporaba živali, mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji. Informacije, ki pomagajo pri izbiri ustreznih preskusnih koncentracij, lahko vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajočo se izpostavljenostjo. Če se med študijo pričakuje ali opazi nevrotoksičnost, se lahko vodja študije odloči vključiti ustrezne ocene, kot sta sklop funkcionalnih opazovanj (FOB) in merjenje motorične aktivnosti. Čeprav je lahko čas izpostavitve odločilen za posebne preglede, izvajanje teh dodatnih dejavnosti ne sme posegati v osnovno zasnovo študije. | 4. | Razredčine jedkih ali dražilnih preskusnih kemikalij se lahko preskušajo pri koncentracijah, ki bodo zagotovile želeno stopnjo strupenosti. Več informacij je na voljo v GD 39 (2). Pri izpostavljanju živali tem snovem morajo biti ciljne koncentracije dovolj nizke, da ne povzročijo očitnih bolečin in trpljenja, vendar zadostne za razširitev krivulje koncentracija-odziv na ravni, ki izpolnjuje zakonodajni in znanstveni cilj preskusa. Te koncentracije je treba izbrati za vsak primer posebej, po možnosti na podlagi ustrezno zasnovane študije za ugotavljanje območja, s katero se pridobijo informacije o kritičnih končnih točkah, morebitnem pragu draženja in času nastopa (glej odstavke 11–13). Izbrane koncentracije je treba utemeljiti. | 5. | Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo bolečine ali kažejo znake hudega in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti. Umirajoče živali se upoštevajo enako kot tiste, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami OECD o humanih končnih točkah (3). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 6. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle glodavce običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih vrst je treba utemeljiti. | Priprava živali | 7. | Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan randomizacije morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 7 do 9 tednov. Njihova telesna teža ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže za vsak spol. Živali se naključno izberejo, označijo za posamično prepoznavanje in so pred začetkom preskusa najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. | Oskrba živali | 8. | Živali je treba posamično identificirati, po možnosti s podkožnimi transponderji, da se olajšajo opazovanja in prepreči zmeda. Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogoče, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posamično, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja običajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena količina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe/12 ur teme. | Inhalacijske komore | 9. | Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemikalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot način izpostavljenosti uporabi izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smrčka). Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije tekočih ali trdnih aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogoče je, da bo posebne cilje študije lažje doseči z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpostavljenost celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune prednosti in pomanjkljivosti so obravnavani v GD 39 (2). | ŠTUDIJE STRUPENOSTI | Mejne koncentracije | 10. | V nasprotju s študijami akutne strupenosti, za študije subkronične strupenosti pri vdihavanju ni opredeljenih mejnih koncentracij. Pri določanju najvišje koncentracije, ki bo preskušena, je treba upoštevati: 1. najvišjo dosegljivo koncentracijo, 2. stopnjo izpostavljenosti ljudi ‚v najslabšem primeru‘, 3. dobrobitjo živali. Če ni mej, ki temeljijo na podatkih, se lahko uporabijo meje za akutno strupenost iz Uredbe (ES) št. 1272/2008 (13) (tj. do najvišje koncentracije 5 mg/l za aerosole, 20 mg/l za hlape in 20 000 ppm za pline) (glej GD 39 (2)). Če je treba pri preskušanju plinov ali lahko hlapnih preskusnih kemikalij (npr. hladil) te meje preseči, je to treba utemeljiti. Mejna koncentracija mora povzročiti nedvomno strupenost, ne da bi živalim povzročila nepotrebni stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3). | Študija za ugotavljanje območja | 11. | Pred začetkom glavne študije je navadno treba opraviti študijo za ugotavljanje območja. Ta je obsežnejša od opazovalne študije, saj ni omejena z izbiro koncentracij. Spoznanja, pridobljena v njej, lahko zagotovijo uspešnost glavne študije. S študijo za ugotavljanje območja se lahko na primer zagotovijo tehnične informacije o analitskih metodah, določanju velikosti delcev in odkrivanju mehanizmov strupenosti, klinični patološki in histopatološki podatki ter ocene, kolikšne so lahko koncentracije NOAEL in MTC v glavni študiji. Vodja študije se lahko študijo za ugotavljanje območja odloči uporabiti za določitev pragu draženja dihal (npr. s histopatološko preiskavo dihal, preskusom pljučne funkcije ali bronhoalveolarno lavažo), zgornje koncentracije, ki jo živali prenesejo brez nepotrebnega stresa, in parametrov, s katerimi bo mogoče najbolje opredeliti strupenost preskusne kemikalije. | 12. | Študija za ugotavljanje območja lahko zajema eno ali več koncentracij. Glede na izbrane končne točke je treba vsaki koncentraciji izpostaviti tri do šest samcev in tri do šest samic. Študija za ugotavljanje območja mora trajati vsaj 5 dni in navadno največ 28 dni. V poročilu o študiji je treba utemeljiti izbrane koncentracije za glavno študijo. Cilj glavne študije je dokazati razmerje koncentracija-odziv na podlagi pričakovanja o tem, katera bo najobčutljivejša končna točka. Nizka koncentracija mora biti po možnosti koncentracija brez opaznih škodljivih učinkov, medtem ko mora visoka koncentracija povzročiti nedvomno strupenost, ne da bi živalim povzročila nepotrebni stres ali vplivala na njihovo življenjsko dobo (3). | 13. | Pri izbiri koncentracij za študijo za ugotavljanje območja je treba upoštevati vse razpoložljive informacije, vključno z razmerji struktura-aktivnost in podatki o podobnih kemikalijah (glej odstavek 3). S študijo za ugotavljanje območja se lahko potrdijo/zavrnejo pričakovanja o najobčutljivejših končnih točkah po mehanističnih merilih, npr. o inhibiciji holinesteraze z organofosfati, nastajanju methemoglobina zaradi eritrocitotoksičnih snovi, ščitničnih hormonih (T3, T4) v primeru tirotoksičnih snovi ter o beljakovinah, LDH ali nevtrofilcih pri bronhoalveolarni lavaži v primeru neškodljivih slabo topnih delcev ali aerosolov, ki dražijo pljuča. | Glavna študija | 14. | Glavna študija subkronične strupenosti običajno zajema tri različne koncentracije ter po potrebi tudi sočasno negativno kontrolo (z zrakom) in/ali kontrolo z nosilcem (glej odstavek 18). Pri izbiri primernih stopenj izpostavljenosti si je treba pomagati z vsemi razpoložljivimi podatki, vključno z rezultati študij sistemske strupenosti, presnovo in kinetiko (poseben poudarek je treba nameniti izogibanju visokim koncentracijam, ki nasitijo kinetične procese). Vsaka preskusna skupina vsebuje 10 samcev in 10 samic glodavcev, ki se 13 tednov (skupno študija traja vsaj 90 dni) po 5 dni na teden 6 ur na dan izpostavljajo preskusni kemikaliji. Živali se lahko izpostavljajo tudi 7 dni na teden (npr. pri preskušanju farmacevtskih izdelkov, ki se vdihavajo). Če je znano, da je en spol občutljivejši na določeno preskusno kemikalijo, se lahko spola izpostavljata različnim koncentracijam, da se zagotovi optimalen odziv na koncentracijo, kot je opisano v odstavku 15. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Kadar se uporabi obdobje izpostavljenosti, krajše od 6 ur/dan, ali kadar je treba opraviti študijo izpostavljenosti celega telesa z dolgimi obdobji (npr. 22 ur/dan), je treba to utemeljiti (glej GD 39 (2)). V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano, razen če je to obdobje daljše od 6 ur. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko živali ves čas uživajo vodo. | 15. | Z izbranimi ciljnimi koncentracijami je treba opredeliti ciljne organe in prikazati jasen odziv na koncentracijo: | — | visoka koncentracija mora imeti strupene učinke, vendar ne sme povzročiti dolgotrajnih znakov ali smrtnosti, ki bi preprečili smiselno oceno, | — | vmesne koncentracije morajo biti razporejene tako, da se doseže stopnjevanje med strupenimi učinki nizke in visoke koncentracije, | — | nizka koncentracija mora povzročiti šibke znake strupenosti oziroma takih znakov ne sme povzročiti. | Vmesna žrtvovanja | 16. | Če se načrtujejo vmesna žrtvovanja, je treba število živali pri vsaki stopnji izpostavljenosti povečati za toliko, kolikor se jih namerava žrtvovati pred zaključkom študije. Uporabo vmesnih žrtvovanj je treba utemeljiti in žrtvovane živali ustrezno upoštevati v statističnih analizah. | Satelitska študija (študija reverzibilnosti) | 17. | Satelitska študija (študija reverzibilnosti) se lahko uporabi za opazovanje reverzibilnosti, obstojnosti ali zapoznelega nastopa zastrupitve v ustrezno dolgem obdobju po tretiranju, ki pa ne sme bili krajše od 14 dni. Satelitske skupine (skupine za reverzibilnost) so sestavljene iz 10 samcev in 10 samic, ki se izpostavijo sočasno s preskusnimi živalmi v glavni študiji. Skupine za satelitsko študijo (študijo reverzibilnosti) je treba preskusni kemikaliji izpostaviti pri najvišji koncentraciji, pri čemer se po potrebi uporabi sočasna kontrola z zrakom in/ali kontrola z nosilcem (glej odstavek 18). | Kontrolne živali | 18. | Z živalmi za sočasno negativno kontrolo (z zrakom) je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da se namesto preskusni kemikaliji izpostavijo filtriranemu zraku. Kadar se za pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporabi voda ali druga snov, je treba v študijo namesto negativne kontrolne skupine (z zrakom) vključiti kontrolno skupino z nosilcem. Če je le mogoče, je treba kot nosilec uporabiti vodo. Kadar se kot nosilec uporabi voda, morajo biti kontrolne živali izpostavljene zraku z enako relativno vlažnostjo kot pri preskusnih skupinah. Izbira ustreznega nosilca mora temeljiti na primerno izvedeni predhodni študiji ali preteklih podatkih. Če o strupenosti nosilca ni veliko znanega, se lahko vodja študije odloči uporabiti negativno kontrolo (z zrakom) in kontrolo z nosilcem, vendar se to močno odsvetuje. Kadar pretekli podatki razkrijejo, da nosilec ni strupen, negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna in je treba uporabiti samo kontrolo z nosilcem. Če predhodna študija preskusne kemikalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec ni strupen pri preskušeni koncentraciji, tako da je treba uporabiti to kontrolo z nosilcem. | POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI | Dajanje koncentracij | 19. | Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbranih koncentracij in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetnejša med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemično reaktivne preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozračju. Paziti je treba, da se ne ustvarijo eksplozivne koncentracije. Za snovi, ki jih tvorijo delci, se lahko zaradi zmanjšanja velikosti delcev uporabijo mehanski postopki. Več napotkov je na voljo v GD 39 (2). | Porazdelitev velikosti delcev | 20. | Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba določiti velikost delcev. Da se omogoči izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, so priporočeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) znaša 1–3 μm z geometričnim standardnim odklonom (σg) 1,5–3,0 (4). Prizadevanje za izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogoče izpolniti, je treba zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci in vlakna pa lahko presegajo navedene vrednosti. | Priprava preskusne kemikalije v nosilcu | 21. | Preskusno kemikalijo je treba po možnosti preskušati brez nosilca. Če je uporaba nosilca nujna za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije, je treba prednostno uporabiti vodo. Vedno, kadar se preskusna kemikalija raztopi v nosilcu, je treba dokazati njeno stabilnost. | SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI | Pretok zraka v komori | 22. | Pretok zraka skozi komoro za izpostavljanje je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Sprotno spremljanje koncentracije (ali časovne stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je neločljivo povezana z vsemi dinamičnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri vdihavanja. Če se koncentracija spremlja sproti, se lahko pogostnost merjenja pretoka zraka zmanjša na eno meritev na izpostavljenost na dan. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja. Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstaja razlog za domnevo, da tega standarda ni mogoče izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. Če meritve prvi dan izpostavljenosti pokažejo, da sta ravni teh plinov ustrezni, nadaljnje merjenje ni potrebno. | Temperatura in relativna vlažnost v komori | 23. | Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti celega telesa stalno spremljati ter jo med vsako izpostavljenostjo vsako uro zabeležiti, kadar je to mogoče. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi neizmerljivo zaradi interference preskusne kemikalije s preskusno metodo. | Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija | 24. | Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izračunati in zabeležiti nazivno koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem inhalacijske komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pač pa pri primerjavi z dejansko koncentracijo nakaže, kako učinkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri ustvarjanju. | Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija | 25. | Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije, vzorčena v območju dihanja živali v inhalacijski komori. Dejanske koncentracije se merijo s specifičnimi metodami (npr. z neposrednim vzorčenjem, adsorpcijskimi ali kemičnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifičnimi metodami, kot je gravimetrična analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetrične analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole tekočin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifičnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetrično analizo se lahko določi tudi koncentracija večkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. | 26. | Po možnosti je treba v celotni študiji uporabljati eno serijo preskusne kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred začetkom študije je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vključno z njeno čistostjo ter, če je to tehnično izvedljivo, identiteto in količinami ugotovljenih kontaminantov in nečistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj v omejenem obsegu potrdi naročnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). | 27. | Atmosfera v komori za izpostavljanje mora biti konstantna, kolikor je to izvedljivo. Za dokazovanje stabilnosti pogojev izpostavljenosti se lahko uporabi naprava za sprotno spremljanje, kot je aerosolni fotometer za aerosole ali analizator skupnih ogljikovodikov za hlape. Dejansko koncentracijo v komori je treba izmeriti najmanj trikrat vsak dan izpostavljenosti za vsako stopnjo izpostavljenosti. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, zadostuje, da se v vsakem obdobju izpostavljenosti vzame le en vzorec. V tem primeru se vzorec po možnosti zbira prek celotnega obdobja izpostavljenosti. Posamezni vzorci koncentracije v komori lahko od srednje koncentracije v komori odstopajo za največ ± 10 % za pline in hlape oziroma za največ ± 20 % za tekoče ali trdne aerosole. Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori (t95). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije. Pri tem sta upoštevana čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v komori (t95), in čas padanja. Napotki za ocenjevanje t95 so na voljo v GD 39 (2). | 28. | Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz plinov/hlapov in aerosolov (npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša drugače. Zato je treba za vsako fazo (plin/hlape in aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), po navadi glavno aktivno sestavino v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno sestavino ali indikatorsko snov (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (2). | Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev | 29. | Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba določiti najmanj vsak teden za vsako koncentracijo s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instrumentom, kot je aerodinamični merilnik delcev (APS). Če je mogoče prikazati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. | 30. | Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetrični filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (2)). Če je enakovrednost pri vseh preskušenih koncentracijah mogoče prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, s katerimi se kar najbolj zmanjša količina pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba študijo ponoviti. | 31. | Velikost delcev za hlape je treba določiti, če je mogoče, da se bodo hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogoče mešane faze, zaznajo delci. | OPAZOVANJA | 32. | Živali je treba klinično opazovati pred obdobjem izpostavljenosti ter med njim in po njem. Pogostejša opazovanja so lahko indicirana glede na odziv živali med izpostavljenostjo. Kadar opazovanje živali ovirajo uporaba zadrževalnih cevi za živali, slabo osvetljene komore za izpostavljanje celega telesa ali motne atmosfere, je treba živali pozorno opazovati po izpostavljenosti. Z opazovanji živali, preden so te izpostavljene naslednjega dne, je mogoče oceniti reverzibilnost ali okrepitev strupenih učinkov. | 33. | Vsa opažanja se sistematično zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za vsako žival posebej. Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti navesti čim natančneje. | 34. | Opazovanja v kletkah morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, v dihalih, obtočilih in živčevju ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Pozorno je treba opazovati tremorje, krče, slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. V protokol študije se lahko vključijo dodatne ocene, kot so kinetika, biomonitoring, pljučna funkcija, zadrževanje slabo topnih snovi, ki se kopičijo v pljučnem tkivu, in vedenjske spremembe. | TELESNA TEŽA | 35. | Težo posameznih živali je treba zabeležiti malo pred prvo izpostavljenostjo (dan 0), zatem pa dvakrat na teden (na primer ob petkih in ponedeljkih, da se prikaže okrevanje čez konec tedna, ko se živali ne izpostavljajo, ali na podlagi časovnega intervala, da se omogoči ocena sistemske strupenosti) ter ob poginu ali evtanaziji. Če v prvih 4 tednih ni učinkov, se lahko do konca študije telesna teža meri tedensko. Živali v satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), če se uporabljajo, je treba tedensko tehtati prek celotnega obdobja okrevanja. Ob koncu študije je treba malo pred žrtvovanjem vse živali stehtati, da se omogoči nepristranski izračun razmerij med težo organov in telesno težo. | PORABA HRANE IN VODE | 36. | Porabo hrane je treba meriti tedensko. Meri se lahko tudi poraba vode. | KLINIČNA PATOLOGIJA | 37. | Klinične patološke ocene je treba opraviti za vse živali, vključno s tistimi v kontrolnih skupinah in satelitski skupini (skupini za reverzibilnost), ko se žrtvujejo. Navesti je treba časovni interval med koncem izpostavljenosti in jemanjem krvi, zlasti kadar se obravnavana končna točka hitro vrne v prvotno stanje. Vzorčenje po koncu izpostavljenosti je indicirano za tiste parametre, ki imajo kratko plazemsko razpolovno dobo (npr. COHb, CHE in MetHb). | 38. | V preglednici 1 so našteti klinični patološki parametri, ki se navadno zahtevajo za vse toksikološke študije. Analiza urina se ne zahteva redno, vendar se lahko opravi, kadar se zdi koristna na podlagi pričakovane ali opažene strupenosti. Vodja študije se lahko za boljšo opredelitev strupenosti preskusne kemikalije odloči oceniti dodatne parametre (npr. holinesterazo, lipide, hormone, kislinsko-bazno ravnovesje, methemoglobin ali Heinzeva telesca, kreatin-kinazo, razmerje med mieloidnimi in eritroidnimi celicami, troponine, pline v arterijski krvi, laktat-dehidrogenazo, sorbital-dehidrogenazo ter γ-glutamiltranspeptidazo). | Preglednica 1 | Standardni klinični patološki parametri | Hematologija | število eritrocitov | hematokrit | koncentracija hemoglobina | povprečna količina hemoglobina v eritrocitih | povprečni volumen eritrocitov | povprečna koncentracija hemoglobina v eritrocitih | retikulociti | skupno število levkocitov | diferencialno število levkocitov | število trombocitov | zmožnost koagulacije (izberite eno): | — | protrombinski čas | — | čas koagulacije | — | parcialni tromboplastinski čas | Klinična kemija | glukoza (9) | skupni holesterol | trigliceridi | sečninski dušik v krvi | skupni bilirubin | kreatinin | skupne beljakovine | albumin | globulin | alanin-aminotransferaza | aspartat-aminotransferaza | alkalna fosfataza | kalij | natrij | kalcij | fosfor | klorid | Analiza urina (ni obvezno) | videz (barva in motnost) | količina | specifična teža ali osmolalnost | pH | skupne beljakovine | glukoza | kri/krvne celice | 39. | Kadar obstajajo dokazi, da je spodnji del dihalnih poti (tj. alveole) primarno mesto odlaganja in retencije, je lahko bronhoalveolarna lavaža (BAL) najprimernejša tehnika za kvantitativno analizo na hipotezi temelječih parametrov razmerij med odmerkom in učinkom s poudarkom na alveolitisu, vnetju pljuč in fosfolipidozi. Tako je mogoče ustrezno preiskati spremembe v odzivu na odmerek in časovnem poteku alveolarne okvare. Bronhoalveolarni izpirek se lahko uporabi za analizo skupnega in diferencialnega števila levkocitov, skupnih beljakovin ter laktat-dehidrogenaze. Drugi parametri, ki se lahko obravnavajo, so tisti, ki nakazujejo lizosomske poškodbe, fosfolipidozo, fibrozo in dražilno ali alergijsko vnetje – pri slednjem se lahko vključi določitev vnetnih citokinov/kemokinov. Meritve BAL navadno dopolnjujejo rezultate histopatoloških preiskav, ne morejo pa jih nadomestiti. Napotki o tem, kako opraviti lavažo pljuč, so na voljo v GD 39 (2). | OFTALMOLOŠKE PREISKAVE | 40. | Z oftalmoskopom ali enakovredno napravo je treba opraviti oftalmološke preiskave očesnega ozadja, optičnih medijev, šarenice in veznice, in sicer pred dajanjem preskusne kemikalije na vseh živalih ter ob prenehanju tretiranja na vseh skupinah, tretiranih z visoko koncentracijo, in kontrolnih skupinah. Če se v očeh zaznajo spremembe, je treba pregledati tudi vse živali iz drugih skupin, vključno s satelitsko skupino (skupino za reverzibilnost). | MAKROSKOPSKA PATOLOGIJA IN TEŽA ORGANOV | 41. | Vse preskusne živali, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba popolnoma eksangvinirati (če je to izvedljivo) in na njih opraviti makroskopsko obdukcijo. Navesti je treba čas med koncem zadnje izpostavljenosti vsake živali in njenim žrtvovanjem. Če obdukcije ni mogoče opraviti nemudoma po odkritju poginule živali, jo je treba ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza kar najbolj zmanjša. Obdukcije je treba opraviti takoj, ko je mogoče, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. | 42. | V preglednici 2 so našteti organi in tkiva, ki jih je treba med makroskopsko obdukcijo shraniti v ustreznem mediju za histopatološke preiskave. O shranjevanju organov in tkiv [v oglatih oklepajih] ter vseh drugih organov in tkiv odloča vodja študije. Z organov v krepki pisavi je treba odstraniti priraščena tkiva in navedene organe stehtati čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. Ščitnico in nadmodek je treba stehtati samo, če je to potrebno, ker lahko ostanki obrezovanja ogrozijo histopatološko oceno. Tkiva in organe je treba takoj po obdukciji in najmanj 24–48 ur (odvisno od uporabljenega fiksativa) pred obrezovanjem fiksirati v 10-odstotnem puferiranem formalinu ali drugem ustreznem fiksativu. | Preglednica 2 | Organi in tkiva, ki se shranijo med makroskopsko obdukcijo | nadledvične žleze | aorta | kostni mozeg (in/ali svež punktat) | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | slepo črevo | debelo črevo | dvanajsternik | [nadmodek] | [oči (mrežnica, vidni živec) in veke] | stegnenica in kolenski sklep | žolčnik (če je) | [Harderjeve žleze] | srce | vito črevo | tešče črevo | ledvice | [solzne žleze (zunaj očesne votline)] | grlo (3 ravni, vključno s spodnjim delom poklopca) | jetra | pljuča (vsi režnji na eni ravni, vključno z glavnima sapnicama) | Hilusne bezgavke, zlasti za slabo topne preskusne kemikalije, ki jih tvorijo delci. Za bolj poglobljene preiskave in/ali študije z imunološkim poudarkom se lahko razmisli o dodatnih bezgavkah, npr. iz medpljučnega, vratnega/podčeljustnega in/ali ušesnega predela. | bezgavke (oddaljene od vstopnega mesta) | mlečna žleza (samičina) | mišica (stegenska) | nazofaringealna tkiva (vsaj 4 ravni, 1 raven naj vključuje nazofaringealni vod in z nosom povezano limfatično tkivo (NALT)) | požiralnik | [vohalni betič] | jajčniki | trebušna slinavka | obščitnice | periferni živec (ishiadični ali tibialni, po možnosti v bližini mišice) | hipofiza | prostata | rektum | žleze slinavke | semenski mešički | koža | hrbtenjača (vratni, prsni in ledveni del) | vranica | prsnica | želodec | zobje | moda | priželjc | ščitnica | [jezik] | sapnik (vsaj 2 ravni, ki vključujeta 1 vzdolžni prerez skozi karino in 1 prečni prerez) | [sečevod] | [sečnica] | sečni mehur | maternica | ciljni organi | vse vidne lezije in skupki tkiv | 43. | Pljuča je treba odstraniti nepoškodovana, jih stehtati in napolniti z ustreznim fiksativom pri tlaku 20–30 cm vode, da se ohrani njihova struktura (5). Rezine je treba zbrati za vse režnje na eni ravni, vključno z glavnima sapnicama, če pa se opravi lavaža pljuč, je treba iz neizpranega režnja vzeti rezine na treh ravneh (ki niso zaporedne). | 44. | Pregledati je treba najmanj 4 ravni nazofaringealnih tkiv, od katerih mora ena vključevati nazofaringealni vod (5) (6) (7) (8) (9), da se omogoči ustrezna preiskava ploščatega, prehodnega (neciliarnega respiratornega), respiratornega (ciliarnega respiratornega) in vohalnega epitelija, ter drenažno limfatično tkivo (NALT) (10) (11). Preiskati je treba tri ravni grla, od katerih mora ena vključevati spodnji del poklopca (12). Pregledati je treba vsaj dve ravni sapnika, kar vključuje en vzdolžni prerez skozi karino razcepišča glavnih sapnic in en prečni prerez. | HISTOPATOLOGIJA | 45. | Histopatološko oceno vseh organov in tkiv iz preglednice 2 je treba opraviti pri kontrolni skupini in skupini, tretirani z visoko koncentracijo, ter pri vseh živalih, ki poginejo ali so žrtvovane med študijo. Posebno pozornost je treba nameniti dihalom, ciljnim organom in vidnim lezijam. Organe in tkiva, ki imajo lezije v skupini, tretirani z visoko koncentracijo, je treba pregledati v vseh skupinah. Vodja študije se lahko odloči izvesti histopatološke ocene za dodatne skupine, da se prikaže jasen odziv na koncentracijo. Če se uporablja satelitska skupina (skupina za reverzibilnost), je treba opraviti histopatološko oceno za vsa tkiva in organe, na katerih so bili opaženi učinki v tretiranih skupinah. Če se v skupini, izpostavljeni visoki koncentraciji, pojavijo čezmerno število zgodnjih smrti ali druge težave, ki ogrožajo pomen podatkov, je treba skupino, tretirano z najbližjo nižjo koncentracijo, histopatološko pregledati. Makroskopska opažanja in mikroskopske ugotovitve je treba poskusiti povezati. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 46. | Za posamezne živali je treba navesti podatke o telesni teži, porabi hrane, klinični patologiji, makroskopski patologiji, teži organov in histopatologiji. Podatke o kliničnih opažanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifične znake zastrupitve, število živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije. Vse rezultate, kvantitativne in naključne, je treba oceniti z ustrezno statistično metodo. Uporabi se lahko katera koli splošno priznana statistična metoda, izbrati pa jo je treba med zasnovo študije. | Poročilo o preskusu | 47. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno: | | Preskusne živali in oskrba | — | opis pogojev v kletkah, vključno s številom (ali spremembo števila) živali na kletko, nastiljem, temperaturo in relativno vlažnostjo prostora, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana. Podatki o izvoru in preteklosti se lahko navedejo, če se nanašajo na živali, za katere so bili uporabljeni podobni pogoji izpostavljenosti, nastanitveni pogoji in pogoji postenja, | — | število, starost in spol živali, | — | metodo randomizacije, | — | opis morebitne priprave živali pred preskusom, vključno s hrano, karanteno in zdravljenjem. | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo), | — | identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), če je znana. | | Nosilec | — | utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda), | — | pretekle ali vzporedno pridobljene podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na rezultat študije. | | Inhalacijska komora | — | podroben opis inhalacijske komore, vključno s prostornino in diagramom, | — | izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje atmosfere, | — | opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske koncentracije, | — | vir zraka in uporabljeni sistem za klimatiziranje, | — | metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene preskusne atmosfere, | — | razliko v tlaku (pozitivno ali negativno), | — | izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v komori (izpostavljanje celega telesa), | — | stabilnost preskusne atmosfere, | — | položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzorčenja preskusne atmosfere v komori, | — | obdelavo dovajanega/odvajanega zraka, | — | stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino (izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega telesa), | — | čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t95), | — | število zamenjav volumnov zraka na uro, | — | merilne naprave (če se uporabljajo). | | Podatki o izpostavljenosti | — | utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, | — | nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), | — | dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v območju dihanja živali; za zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira ločeno, | — | vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (mg/l, mg/m3 itd.), in ne v prostorninskih enotah (ppm, ppb itd.), | — | porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) in geometrični standardni odklon (σg), vključno z metodami za njihov izračun. Poročati je treba o posameznih analizah velikosti delcev. | | Preskusni pogoji | — | podatke o pripravi preskusne kemikalije, vključno s podrobnostmi o postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije, | — | opis (ki po možnosti vključuje diagram) opreme, uporabljene za ustvarjanje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, | — | podatke o opremi, uporabljeni za spremljanje temperature, vlažnosti in pretoka zraka v komori (tj. pripravo umeritvene krivulje), | — | podatke o opremi, uporabljeni za jemanje vzorcev za določanje koncentracije in porazdelitve velikosti delcev v komori, | — | podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji (vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzorčenje), | — | metodo randomizacije pri dodeljevanju živali preskusnim in kontrolnim skupinam, | — | podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom hrane in virom vode), | — | utemeljitev določitve preskusnih koncentracij. | | Rezultati | — | preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, | — | preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah v komori, | — | preglednice s podatki o velikosti delcev, vključno s podatki o analitskem vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izračuni MMAD in σg, | — | preglednice s podatki o odzivu in koncentracijo za vsako žival (tj. za živali, ki kažejo znake zastrupitve, vključno s smrtnostjo ter naravo, resnostjo, časom nastopa in trajanjem učinkov), | — | preglednice o teži posameznih živali, | — | preglednice o porabi hrane, | — | preglednice s kliničnimi patološkimi podatki, | — | ugotovitve obdukcije in histopatološke ugotovitve za vsako žival, če so na voljo. | | Razprava in razlaga rezultatov | — | poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpolnitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, | — | z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogoče izpolniti, | — | v splošno oceno študije je treba vključiti doslednost metod, uporabljenih za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, | — | obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujoči način delovanja (sistemski ali lokalni), | — | če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o humanih končnih točkah (3) humano žrtvovati živali, ki so trpele bolečine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti, | — | opredeliti je treba ciljne organe, | — | določiti je treba vrednosti NOAEL in LOAEL. | VIRI: | (1) | OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Guideline No 413, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (3) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. | (4) | Whalan, J. E. in Redden, J. C. (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency. | (5) | Dungworth, D. L., Tyler, W. S., Plopper, C. E. (1985). Morphological Methods for Gross and Microscopic Pathology (poglavje 9). V: Toxicology of Inhaled Material, Witschi, H. P. in Brain, J. D. (ur.), Springer Verlag Heidelberg, str. 229–258. | (6) | Young, J. T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312. | (7) | Harkema, J. R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in laboratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 231–238. | (8) | Woutersen, R. A., Garderen-Hoetmer, A., van Slootweg, P. J., Feron, V. J. (1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in humans. V: Waalkes, M. P. in Ward, J. M. (ur.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215–263. | (9) | Mery, S., Gross, E. A., Joyner, D. R., Godo, M., Morgan, K. T. (1994). Nasal diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372. | (10) | Kuper, C. F., Koornstra, P. J., Hameleers, D. M. H., Biewenga, J., Spit, B. J., Duijvestijn, A. M., Breda Vriesman van, P. J. C., Sminia, T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224. | (11) | Kuper, C. F., Arts, J. H. E., Feron, V. J. (2003). Toxicity to nasal-associated lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285. | (12) | Lewis, D. J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of Anatomy 132(3): 419–428. | (13) | Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spremembi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | B.30 ŠTUDIJE KRONIČNE STRUPENOSTI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 452 (2009). Prvotna TG 452 je bila sprejeta leta 1981. Priprava te revidirane preskusne metode B.30 je bila ocenjena kot nujna zaradi upoštevanja nedavnega razvoja na področju dobrobiti živali in zakonodajnih zahtev (1) (2) (3) (4). Ta preskusna metoda B.30 je bila posodobljena vzporedno z revizijama poglavja B.32 te priloge z naslovom ‚Študije rakotvornosti‘ in poglavja B.33 te priloge z naslovom ‚Kombinirane študije kronične strupenosti/rakotvornosti‘, da bi se z uporabo živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo več podatkov o izbiri odmerkov. Ta preskusna metoda je zasnovana za preskušanje zelo različnih kemikalij, vključno s pesticidi in industrijskimi kemikalijami. | 2. | Večina študij kronične strupenosti se opravi na glodavcih, zato je ta preskusna metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso glodavci, se lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo načela in postopki, opisani v tej metodi, ter načela in postopki iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodavcih‘ (5), kot je navedeno v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (6). | 3. | Glavni trije načini dajanja, ki se uporabljajo v študijah kronične strupenosti, so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira načina dajanja je odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prevladujočega načina izpostavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri načina izpostavljenosti so na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 (6). | 4. | Ta preskusna metoda je osredotočena na oralno izpostavljenost, ki se v študijah kronične strupenosti uporablja najpogosteje. Dolgoročne študije kronične strupenosti, ki vključujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavljenost, so lahko prav tako potrebne za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena načina izpostavljenosti tehnično precej zapletena. Take študije je treba zasnovati za vsak primer posebej, je pa mogoče preskusno metodo za ocenjevanje in vrednotenje kronične strupenosti z oralnim načinom dajanja, opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo za protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporočila glede obdobij tretiranja, kliničnih in patoloških parametrov itd. Za inhalacijski (6) (7) in dermalni način dajanja (6) preskusnih kemikalij so na voljo napotki OECD. Pri zasnovi dolgoročnejših študij z inhalacijsko izpostavljenostjo je treba podrobno preučiti predvsem poglavji B.8 (8) in B.29 te priloge (9) ter Dokument s smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdihavanju (7). V primeru preskušanja z dermalnim načinom dajanja je treba upoštevati poglavje B.9 te priloge (10). | 5. | S študijo kronične strupenosti se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki se lahko pojavijo ob ponavljajoči se izpostavljenosti prek znatnega dela življenjske dobe uporabljene vrste. Z njo se pridobijo informacije o strupenih učinkih preskusne kemikalije ter nakažejo ciljni organi in možnost kopičenja. Poleg tega se lahko s študijo oceni vrednost brez opaženega škodljivega učinka, ki se lahko uporabi za določitev varnostnih meril za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi potreba po skrbnem kliničnem opazovanju živali, da se pridobi kar največ informacij. | 6. | Cilji študij, na katere se nanaša ta preskusna metoda, vključujejo: | — | opredelitev kronične strupenosti preskusne kemikalije, | — | opredelitev ciljnih organov, | — | opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom, | — | opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega učinka (NOAEL) ali izhodiščne točke za določitev primerjalnega odmerka (benchmark dose – BMD), | — | napoved učinkov kronične strupenosti pri stopnjah izpostavljenosti ljudi, | — | zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede načina delovanja (6). | ZAČETNI PREUDARKI | 7. | Pri ocenjevanju in vrednotenju toksikoloških lastnosti preskusne kemikalije mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, da se zasnova študije osredotoči na učinkovitejše preskušanje potenciala kronične strupenosti in da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; vse informacije o načinu delovanja; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh; razpoložljive toksikokinetične podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem odmerku in tudi pri ponavljajočih se odmerkih, če so na voljo) ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajočo se izpostavljenostjo. Kronično strupenost je treba ugotavljati šele po pridobitvi začetnih informacij o strupenosti na podlagi 28- in/ali 90-dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajočimi se odmerki. V okviru splošne ocene potencialnih škodljivih učinkov določene preskusne kemikalije na zdravje je treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju kronične strupenosti (11) (12) (13) (14). | 8. | Pred začetkom študije je treba določiti najprimernejše statistične metode za analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, ki jih je treba preučiti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vključevati prilagoditev glede na preživetje in analizo v primeru predčasnega prenehanja tretiranja ene ali več skupin. Napotki o primernih statističnih analizah in ključne reference mednarodno priznanih statističnih metod so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6) ter v Dokumentu s smernicami št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (15). | 9. | Pri izvajanju študije kronične strupenosti je treba vedno upoštevati vodilna načela in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o prepoznavanju, ocenjevanju in uporabi kliničnih znakov kot humanih končnih točk za preskusne živali pri oceni varnosti (16), zlasti odstavek 62 navedenega dokumenta. V tem odstavku je navedeno: ‚Pri študijah, ki vključujejo ponavljajoče se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odločitev, ali naj se žival humano usmrti ali ne, če kaže klinične znake, ki se stopnjujejo in vodijo v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odločitev mora vključevati razmislek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranitvijo zadevne živali v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme odločitev, da se žival ohrani v preskusu, je treba po potrebi povečati pogostnost opazovanj. Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa začasno prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bolečine ali trpljenje, ali da se zmanjša preskusni odmerek.‘ | 10. | Podrobni napotki in razprava o načelih izbire odmerkov za študije kronične strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (17) (18). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glavnega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni ter opredeljevanjem učinkov majhnih odmerkov in njihovim pomenom na drugi strani. To je zlasti pomembno, kadar bo izvedena kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) (odstavek 11). | 11. | Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto ločene izvedbe študije kronične strupenosti (ta preskusna metoda B.30) in študije rakotvornosti (poglavje B.32 te priloge) izvede kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge). S kombiniranim preskusom se v primerjavi z izvedbo dveh ločenih študij zagotovi večja učinkovitost v smislu časa in stroškov, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost podatkov v fazi v zvezi s kronično strupenostjo ali v fazi v zvezi z rakotvornostjo. Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) skrbno upoštevati načela izbire odmerkov (odstavki 9 in 20–25), poleg tega pa se tudi priznava, da se na podlagi nekaterih zakonodajnih okvirov lahko zahteva ločena izvedba študij. | 12. | Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). | NAČELO PRESKUSA | 13. | Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih daje več skupinam preskusnih živali, pri čemer preskus navadno traja 12 mesecev, čeprav se lahko glede na zakonodajne zahteve izberejo tudi daljša ali krajša obdobja (glej odstavek 33). Izbrano obdobje mora biti dovolj dolgo, da se lahko pokažejo učinki kumulativne strupenosti, ne pa tudi zavajajoči učinki sprememb, povezanih s staranjem. Odstopanja od 12-mesečnega obdobja izpostavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Preskusna kemikalija se navadno daje oralno, čeprav je lahko primerno tudi preskušanje z inhalacijskim ali dermalnim načinom dajanja. Zasnova študije lahko vključuje tudi eno ali več vmesnih usmrtitev, npr. pri 3 ali 6 mesecih, zaradi česar se lahko vključijo dodatne skupine živali (glej odstavek 19). V obdobju dajanja odmerkov je treba pozorno opazovati, ali živali kažejo znake zastrupitve. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih opravi obdukcija. | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 14. | Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju kronične strupenosti na glodavcih (glej odstavek 2), čeprav se priznava, da se lahko z nekaterimi zakonodajnimi ureditvami zahtevajo podobne študije na vrstah, ki niso glodavci. Izbiro živalske vrste je treba utemeljiti. Kadar se zahtevajo študije kronične strupenosti na vrstah, ki niso glodavci, morata zasnova in izvajanje takih študij morata temeljiti na načelih, opisanih v tej preskusni metodi, ter na tistih iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodavcih‘ (5). Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). | 15. | V tej preskusni metodi je priporočena vrsta podgana, uporabijo pa se lahko tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Podgane in miši so najprimernejši preskusni modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razširjene uporabe v farmakoloških in toksikoloških študijah, občutljivosti za indukcijo tumorjev ter razpoložljivosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi teh lastnosti je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. V študiji kronične strupenosti je treba uporabiti isti sev in izvor živali kot v predhodnih krajših študijah strupenosti. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. | Nastanitveni in prehranjevalni pogoji | 16. | Živali se lahko nastanijo posamično ali dajo v kletke v manjših skupinah istega spola; posamična nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno utemeljena (19) (20) (21). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi mora biti 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30-odstotna in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontaminantov v hranilih in hrani, vsaj na začetku študije in kadar se zamenja serija uporabljane kemikalije, ter jih vključiti v končno poročilo. Prav tako je treba zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju prehranskih potreb živali. | Priprava živali | 17. | Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale laboratorijskim razmeram in še niso bile vključene v preskusne postopke. V primeru glodavcev je treba odmerke začeti dajati čim prej po odstavitvi od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupinami v okviru vsakega spola ne sme biti večjih razlik v povprečni telesni teži. Če obstajajo statistično pomembne razlike, je treba fazo randomizacije ponoviti, če je to mogoče. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identifikacijsko številko in jo trajno označiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo mikročipa ali drugo ustrezno metodo. | POSTOPEK | Število in spol živali | 18. | Uporabiti je treba oba spola. Število živali mora biti zadostno, da je ob koncu študije v vsaki skupini dovolj živali za temeljito biološko in statistično ocenjevanje. Pri glodavcih je treba običajno uporabiti najmanj 20 živali na spol za vsako velikost odmerka, medtem ko se pri vrstah, ki niso glodavci, priporočajo najmanj 4 živali na spol na skupino. V študijah, ki vključujejo miši, so lahko potrebne dodatne živali v vsaki odmerni skupini, da je mogoče opraviti vse zahtevane hematološke preiskave. | Uporaba vmesnih usmrtitev, satelitskih skupin in opozorilnih živali | 19. | Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne usmrtitve (vsaj 10 živali/spol/skupino), npr. pri 6 mesecih, da se zagotovijo informacije o napredovanju toksikoloških sprememb in mehanistične informacije. Kadar so take informacije že na voljo iz prejšnjih študij strupenosti s ponavljajočimi se odmerki v zvezi z zadevno preskusno kemikalijo, vmesne usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Vključijo se lahko tudi satelitske skupine za spremljanje reverzibilnosti morebitnih toksikoloških sprememb, ki jih povzroči preiskovana preskusna kemikalija; te preiskave so navadno omejene na največji odmerek v študiji in kontrolo. Poleg tega se lahko po potrebi predvidi dodatna skupina opozorilnih živali (navadno 5 živali na spol) za spremljanje patološkega stanja med študijo (22). Če se načrtujejo vmesne usmrtitve ali vključitev satelitskih ali opozorilnih skupin, je treba število živali v zasnovi študije povečati za toliko, kolikor se jih namerava usmrtiti pred zaključkom študije. Za te živali so običajno potrebna enaka opazovanja kot za živali v fazi študije v zvezi s kronično strupenostjo, vključno s telesno težo, porabo hrane/vode, hematološkimi in kliničnimi biokemičnimi meritvami ter patološkimi preiskavami, čeprav se lahko predvidi tudi (za skupine za vmesno usmrtitev), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksičnost ali imunotoksičnost. | Odmerne skupine in odmerjanje | 20. | Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih velikosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in sočasno kontrolo, razen če se opravi mejni preskus (glej odstavek 27). Velikosti odmerkov navadno temeljijo na rezultatih kratkoročnejših študij s ponavljajočimi se odmerki ali študij za ugotavljanje območja, pri njihovem določanju pa je treba upoštevati vse obstoječe toksikološke in toksikokinetične podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. | 21. | Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških učinkov preskusne kemikalije to ni mogoče, je navadno treba največjo velikost odmerka izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih učinkov, pri čemer se je treba izogibati povzročanju trpljenja, hude zastrupitve, obolevnosti ali smrti. Ob upoštevanju dejavnikov, navedenih v odstavku 22 spodaj, je treba največji odmerek izbrati tako, da se izzovejo znaki strupenosti, na primer upočasnitev pridobivanja telesne teže (približno 10-odstotna). | 22. | Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi največji odmerek, manjši od odmerka, ki povzroča znake zastrupitve, npr. če odmerek izzove škodljiv učinek, ki vzbuja zaskrbljenost, ne vpliva pa bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. Največji odmerek ne sme presegati 1 000 mg/kg telesne teže/dan (mejni odmerek, glej odstavek 27). | 23. | Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za določanje odziva v odvisnosti od odmerka in vrednosti NOAEL ali drugega želenega izida študije, npr. BMD (glej odstavek 25) pri najmanjšem odmerku. Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri določitvi manjših odmerkov, vključujejo pričakovani naklon krivulje odmerek-odziv, odmerke, pri katerih se lahko pojavijo pomembne spremembe v presnovi ali načinu strupenega delovanja, velikost, pri kateri se pričakuje prag, ali velikost, pri kateri se pričakuje izhodiščna točka za ekstrapolacijo majhnih odmerkov. | 24. | Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od lastnosti preskusne kemikalije in je v tej preskusni metodi ni mogoče predpisati, vendar dva- do štirikratni intervali velikokrat zagotovijo visoko učinkovitost preskusa, kadar se uporabijo za določitev padajočih velikosti odmerkov, namesto uporabe zelo velikih intervalov (npr. večjih od faktorja približno 6–10) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati četrto preskusno skupino. Na splošno se je treba izogibati uporabi faktorjev, večjih od 10, če se uporabijo, pa je to treba utemeljiti. | 25. | Kot je nadalje navedeno v Dokumentu s smernicami št. 116 (6), je treba pri izbiri odmerkov upoštevati: | — | znane ali domnevne nelinearnosti ali točke pregiba na krivulji odmerek-odziv, | — | toksikokinetiko in odmerna območja, v katerih se pojavljajo ali ne pojavljajo presnovna indukcija, nasičenje ali nelinearnost med zunanjimi in notranjimi odmerki, | — | prekurzorske lezije, označevalce učinka ali kazalnike delovanja ključnih temeljnih bioloških procesov, | — | ključne (ali domnevne) vidike načina delovanja, kot so odmerki, pri katerih se začne pojavljati citotoksičnost, so ravni hormonov motene, homeostatični mehanizmi preobremenjeni itd., | — | predele krivulje odmerek-odziv, pri katerih je potrebna posebno zanesljiva ocena, npr. v območju pričakovanega BMD ali predvidenega praga, | — | preudarke v zvezi s pričakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi. | 26. | Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusni skupini, le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora kontrolna skupina prejeti največjo količino nosilca, ki je bila uporabljena med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem zaradi njene manjše okusnosti povzroči bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja kot primernejša kontrola. | 27. | Če je mogoče na podlagi informacij iz predhodnih študij predvideti, da preskus pri eni velikosti odmerka, enakovredni najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, pri katerem so uporabljeni postopki, opisani za to študijo, verjetno ne bo povzročil škodljivih učinkov, in če glede na podatke o strukturno sorodnih kemikalijah strupenost ni pričakovana, popolna študija s tremi velikostmi odmerkov morda ne bo potrebna. Lahko se uporabi meja 1 000 mg/kg telesne teže/dan, razen če izpostavljenost ljudi nakazuje potrebo po večjem odmerku. | Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije | 28. | Preskusna kemikalija se običajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo oziroma z gavažo. Dodatne informacije o načinih in metodah dajanja so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). Način in metoda dajanja sta odvisna od namena študije, fizikalnih/kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujočega načina in metode izpostavljenosti ljudi. Izbrani način in metodo dajanja je treba utemeljiti. Zaradi dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri tistih snoveh, pri katerih sta ta način in metoda dajanja razumno reprezentativna za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). Prehranske in okoljske kemikalije, vključno s pesticidi, se navadno dajejo s hrano ali pitno vodo. V nekaterih scenarijih, npr. pri izpostavljenosti na delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi načini dajanja. | 29. | Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, kot je ustrezno: učinke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo preskusne kemikalije, učinke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter učinke na porabo hrane ali vode ali na prehranjenost živali. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homogenosti raztopin ali hrane, ki se bodo uporabljale v preskusu (kot je ustrezno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). | 30. | Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehranjevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoročnih študijah strupenosti, pri katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se preprečijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg telesne teže), ki se izračuna vsak teden. Uporabljeni način je treba navesti. | 31. | V primeru oralnega dajanja živali dobijo odmerek preskusne kemikalije vsak dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa navadno traja 12 mesecev (glej tudi odstavek 33), čeprav so lahko glede na zakonodajne zahteve potrebna tudi daljša obdobja. Vsak drugačen režim odmerjanja, npr. pet dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali s preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na teden, kot je navedeno v poglavju B.9 te priloge (10), prek obdobja 12 mesecev. Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, uporabiti pa je mogoče tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. Obdobje izpostavljenosti praviloma traja 12 mesecev. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljši časi izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na dan, je treba utemeljiti. Glej tudi poglavje B.8 te priloge (8). | 32. | Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem uporabljati želodčno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko dnevno odmerjena količina ohranja tudi z dajanjem polovičnih odmerkov (dvakrat na dan). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. To količino je treba ohranjati tako majhno, kot je praktično, praviloma pa pri glodavcih ne sme preseči 1 ml/100 g telesne teže (22). Spremenljivost preskusne količine je treba kar najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali dražilne kemikalije, ki jih je treba razredčiti, da se preprečijo resni lokalni učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati. | Trajanje študije | 33. | Čeprav je ta preskusna metoda primarno zasnovana kot 12-mesečna študija kronične strupenosti, je zasnovana tako, da se lahko uporablja tudi za kratkoročnejše (npr. 6- ali 9-mesečne) ali dolgoročnejše (npr. 18- ali 24-mesečne) študije, glede na zahteve konkretnih zakonodajnih ureditev ali za posebne mehanistične namene. Odstopanja od 12-mesečnega obdobja izpostavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Satelitske skupine, vključene za spremljanje reverzibilnosti toksikoloških sprememb, ki jih povzroči preiskovana preskusna kemikalija, se s preskusno kemikalijo ne tretirajo najmanj 4 tedne in največ eno tretjino celotnega trajanja študije po koncu izpostavljenosti. Več napotkov, vključno s preudarki o preživetju v študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (6). | OPAZOVANJA | 34. | Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, običajno na začetku in koncu vsakega dne, vključno s konci tedna in prazniki. Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka, če gre za dajanje z gavažo. | 35. | Podrobna klinična opazovanja je treba opraviti na vseh živalih vsaj enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogočanje primerjav na istem osebku), ob koncu prvega tedna študije, zatem pa mesečno. Protokol za opazovanja je treba določiti tako, da so razlike med posameznimi opazovalci čim manjše in neodvisne od preskusne skupine. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj kletk, v katerih živali bivajo, po možnosti na standardnem mestu in vedno ob istem času. Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti z uporabo sistemov točkovanja, ki jih izrecno določi preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, da se pogoji opazovanja čim manj spreminjajo. Pozornost je med drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, očeh in sluznicah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živčevja (npr. solzenju, piloerekciji, velikosti zenic in nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z živalmi, pa tudi prisotnost kloničnih ali toničnih gibov, stereotipij (npr. prekomernega čiščenja, ponavljajočega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (24). | 36. | Na vseh živalih je treba pred prvim dajanjem preskusne kemikalije z oftalmoskopom ali drugo primerno opremo opraviti oftalmološko preiskavo. Ob koncu študije je treba to preiskavo po možnosti opraviti na vseh živalih, vsekakor pa vsaj pri skupini, tretirani z velikim odmerkom, in kontrolni skupini. Če se v očeh zaznajo spremembe, povezane s tretiranjem, je treba pregledati vse živali. Če strukturna analiza ali druge informacije kažejo na strupenost za oči, je treba pogostnost preiskav oči povečati. | 37. | Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus strupenosti s ponavljajočimi se odmerki nakazal potencial za povzročanje nevrotoksičnih učinkov, se lahko po izbiri ocenijo senzorične reakcije na različne vrste dražljajev (24) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) (25) (26) (27), moč oprijema (28) ter motorična aktivnost (29), in sicer pred začetkom študije ter vsake 3 mesece po začetku študije do 12. meseca in vključno z njim, pa tudi ob koncu študije (če je daljša od 12 mesecev). Nadaljnje podrobnosti glede možnih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je mogoče tudi druge postopke, ki v njih niso opisani. | 38. | Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus strupenosti s ponavljajočimi se odmerki nakazal potencial za povzročanje imunotoksičnih učinkov, se lahko nadaljnje preiskave te končne točke po izbiri opravijo ob koncu študije. | Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane | 39. | Vse živali je treba stehtati na začetku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja. | Hematologija in klinična biokemija | 40. | V študijah z glodavci je treba hematološke preiskave opravljati na vsaj 10 samcih in 10 samicah na skupino, in sicer pri 3, 6 in 12 mesecih, pa tudi ob koncu študije (če je daljša od 12 mesecev), pri čemer je treba za te preiskave v vsej študiji uporabljati iste živali. Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih hematoloških preiskav potrebne satelitske živali (glej odstavek 18). V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritve pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki na hematološke parametre. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. | 41. | Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (30): skupno in diferencialno število levkocitov, število eritrocitov, število trombocitov, koncentracijo hemoglobina, hematokrit (volumen stisnjenih eritrocitov), povprečni volumen eritrocitov (MCV), povprečno količino hemoglobina v eritrocitih (MCH), povprečno koncentracijo hemoglobina v eritrocitih (MCHC), protrombinski čas in aktivirani parcialni tromboplastinski čas. Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi hematološki parametri, kot so Heinzeva telesca ali druge netipične morfološke oblike eritrocitov ali methemoglobin. Na splošno je treba sprejeti prožni pristop glede na opažene in/ali pričakovane učinke dane preskusne kemikalije. Če preskusna kemikalija učinkuje na krvotvorni sistem, sta lahko indicirana tudi meritev števila retikulocitov in citološka preiskava kostnega mozga, čeprav teh ni treba izvajati redno. | 42. | Klinične biokemične preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih učinkov na tkiva ter zlasti ledvice in jetra je treba opravljati na vzorcih krvi, odvzetih najmanj 10 samcem in 10 samicam na skupino v istih časovnih intervalih, kot so določeni za hematološke preiskave, ter pri tem prek celotne študije uporabljati iste živali. Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih kliničnih biokemičnih preiskav potrebne satelitske živali. V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki na klinične biokemične parametre. Pred odvzemom vzorcev krvi je priporočljivo živali čez noč postiti (kar pa ne velja za miši). Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (30): glukozo, sečnino (sečninski dušik), kreatinin, skupne beljakovine, albumin, kalcij, natrij, kalij, skupni holesterol, najmanj dva ustrezna preskusa za hepatocelularno oceno (alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, glutamat-dehidrogenaza, skupne žolčne kisline) (31) in najmanj dva ustrezna preskusa za hepatobiliarno oceno (alkalna fosfataza, γ-glutamil transferaza, 5’-nukleotidaza, skupni bilirubin, skupne žolčne kisline) (31). Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi klinični kemični parametri, kot so vrednost trigliceridov na tešče, specifični hormoni in holinesteraza. Na splošno je potreben prožni pristop glede na opažene in/ali pričakovane učinke dane preskusne kemikalije. | 43. | Analize urina je treba opraviti na najmanj 10 samcih in 10 samicah na skupino na vzorcih, zbranih v istih časovnih intervalih kot pri hematoloških in kliničnih kemičnih preiskavah. Meritev pri 3 mesecih ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki pri analizi urina. V strokovno priporočilo glede kliničnih patoloških študij (30) je bil vključen naslednji seznam parametrov: videz, količina, osmolalnost ali specifična teža, pH, skupne beljakovine in glukoza. Druge določitve vključujejo keton, urobilinogen, bilirubin in okultno kri. Če je treba preiskavo opaženih učinkov razširiti, se lahko uporabijo dodatni parametri. | 44. | Na splošno se šteje, da je treba izhodiščne hematološke in klinične biokemične spremenljivke določiti pred tretiranjem v študijah s psi, ne pa tudi v študijah z glodavci (30). Če pa so pretekli izhodiščni podatki (glej odstavek 50) nezadostni, je treba razmisliti o pripravi takih podatkov. | Patologija | Makroskopska obdukcija | 45. | Praviloma se na vseh živalih v študiji opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Lahko pa se tudi predvidi (za skupine za vmesno usmrtitev ali satelitske skupine), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksičnost ali imunotoksičnost (glej odstavek 19). Obdukcija in poznejši postopki, opisani v naslednjih odstavkih, pri teh živalih niso potrebni. Za opozorilne živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odloča vodja študije. | 46. | Stehtati je treba organe vseh živali, razen tistih, ki se izključijo na podlagi zadnjega dela odstavka 45. Z nadledvičnih žlez, možganov, nadmodka, srca, ledvic, jeter, jajčnikov, vranice, mod, ščitnice (stehtane po fiksaciji skupaj z obščitnicami) in maternice vseh živali (razen živali, ki so bile najdene umirajoče in/ali so bile usmrčene med študijo) je treba, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva in nato izmeriti njihovo mokro težo čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. V študijah z mišmi tehtanje nadledvičnih žlez ni obvezno. | 47. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (32) (tkiva v oglatih oklepajih niso obvezna): | vse vidne lezije | srce | trebušna slinavka | želodec (predželodec, žlezni želodec) | nadledvična žleza | vito črevo | obščitnica | [zobje] | aorta | tešče črevo | periferni živec | modo | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | ledvica | hipofiza | priželjc | slepo črevo | solzna žleza (zunaj očesne votline) | prostata | ščitnica | maternični vrat | jetra | rektum | [jezik] | koagulacijska žleza | pljuča | žleza slinavka | sapnik | debelo črevo | bezgavke (povrhnje in globoke) | semenski mešiček | sečni mehur | dvanajsternik | mlečna žleza (obvezna za samice, in če jo je mogoče secirati s prostim očesom, za samce) | skeletna mišica | maternica (vključno z materničnim vratom) | nadmodek | [zgornja dihala, vključno z nosom, nosnimi školjkami in obnosnimi votlinami] | koža | [sečevod] | oko (vključno z mrežnico) | požiralnik | hrbtenjača (na treh ravneh: vratni, prsni in ledveni) | [sečnica] | [stegnenica s sklepom] | [vohalni betič] | vranica | vagina | žolčnik (pri vrstah, ki niso podgane) | jajčnik | [prsnica] | rezina in/ali svež punktat kostnega mozga | Harderjeva žleza | | | | Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba shraniti oba organa. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim načinom dajanja je treba shraniti iste organe, kot so določeni na seznamu za oralni način, bistveno pa je posebno vzorčenje in shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporočilom iz poglavij B.8 (8) in B.29 te priloge (9). Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preučiti seznam organov, določen za oralni način dajanja. | Histopatologija | 48. | Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patoloških študij (32). Histopatološke preiskave morajo obsegati vsaj: | — | vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne skupine, | — | vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmrčene med študijo, | — | vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, | — | ciljna tkiva ali tkiva, pri katerih so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretiranjem povezane spremembe, vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, | — | pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba pregledati oba organa. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 49. | Navesti je treba podatke za posamezne živali in za vse ocenjevane parametre. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake zastrupitve, opis opaženih znakov zastrupitve, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih učinkov, ter število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi podatki je treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni učinki ali lezije, ter razvrstitev lezij. | 50. | Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s sočasnimi kontrolami, bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija ter se nanašati na živali iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih pred zadevno študijo. | 51. | Če je ustrezno, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Statistične metode in podatke, ki bodo analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 8). V izbiri je treba predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne. | Poročilo o preskusu | 52. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijske podatke, | — | izvor kemikalije, | — | številko serije, | — | potrdilo o kemijski analizi. | | Nosilec (če je ustrezno) | — | utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda). | | Preskusne živali | — | uporabljeno vrsta/sev in utemeljitev izbire, | — | število, starost in spol živali ob začetku preskusa, | — | izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., | — | težo vsake živali ob začetku preskusa. | | Preskusni pogoji | — | utemeljitev načina dajanja in izbire odmerkov, | — | če je ustrezno, uporabljene statistične metode za analizo podatkov, | — | podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, | — | analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, | — | način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, | — | za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost nosu ali izpostavljenost celega telesa, | — | dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v dejanski odmerek, če je ustrezno, | — | podatke o kakovosti hrane in vode. | | Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za posamezne živali) | — | podatke o preživetju, | — | telesno težo/spremembe telesne teže, | — | porabo hrane, izračune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo vode, če je ustrezno, | — | podatke o toksični reakciji glede na spol in velikost odmerka, vključno z znaki zastrupitve, | — | vrsto, pogostnost (in če se ocenjuje, resnost) in trajanje kliničnih opažanj (prehodnih ali trajnih), | — | oftalmološko preiskavo, | — | hematološke preskuse, | — | klinične biokemične preskuse, | — | analize urina, | — | rezultat morebitnih preiskav nevrotoksičnosti ali imunotoksičnosti, | — | terminalno telesno težo, | — | težo organov (in razmerja med težami organov, če je ustrezno), | — | izsledke obdukcije, | — | podroben opis ugotovitev vseh s tretiranjem povezanih histopatoloških preiskav, | — | podatke o absorpciji, če so na voljo. | | Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno | | Razprava o rezultatih | — | razmerja med odmerkom in odzivom, | — | preučitev vseh informacij o načinu delovanja, | — | razpravo o morebitnih pristopih modeliranja, | — | določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, | — | pretekle kontrolne podatke, | — | pomembnost za ljudi. | | Sklepi. | VIRI: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. | (3) | Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191. | (4) | Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. | (5) | Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkronične oralne toksičnosti: 90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodalcih. | (6) | OECD (2012). 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| 6) | i capitoli B.32 e B.33 sono sostituiti dai seguenti: | «B.32. STUDI DI CANCEROGENESI | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 451 (2009). La prima linea guida n. 451 sugli studi di carcinogenesi è stata adottata nel 1981. Si è ritenuto necessario sviluppare questa versione riveduta del metodo di prova B.32 alla luce dei recenti progressi nell’ambito del benessere animale e degli obblighi normativi (2) (3) (4) (5) (6). L’aggiornamento del presente metodo di prova B.32 si è svolto in parallelo alle revisioni del capitolo B.30 del presente allegato, studi di tossicità cronica, e del capitolo B.33 del presente allegato, studi combinati di tossicità cronica/cancerogenesi, con l’obiettivo di integrare le informazioni in relazione agli animali usati nello studio e di fornire maggiori dettagli sulla scelta delle dosi. Il presente metodo di prova B.32 è concepito per testare un’ampia serie di sostanze chimiche, tra cui pesticidi e sostanze chimiche industriali. Va tuttavia specificato che alcuni dettagli e requisiti possono essere diversi per i prodotti farmaceutici (cfr. Conferenza internazionale sull’armonizzazione, Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals). | 2. | La maggior parte degli studi di cancerogenesi è svolta su specie di roditori, pertanto il presente metodo di prova è destinato ad applicarsi in primo luogo agli studi che hanno ad oggetto queste specie. Se dovesse risultare necessario condurre tali studi sui non roditori, possono trovare applicazione, con le opportune modifiche, anche i principi e le procedure esposti nel presente metodo di prova, congiuntamente a quelli specificati al capitolo B.27 del presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (6). Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 — Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies fornisce ulteriori orientamenti al riguardo (7). | 3. | Le tre vie principali di somministrazione negli studi di cancerogenesi sono: orale, cutanea e per inalazione. La scelta della via di somministrazione è fatta in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza in esame e della più probabile via di esposizione degli esseri umani. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta della via di esposizione. | 4. | Questo metodo di prova è incentrato sull’esposizione per via orale, ossia la via più usata negli studi di cancerogenesi. Gli studi sulla cancerogenesi che prevedono un’esposizione per via cutanea o per inalazione possono essere necessari anche per la valutazione del rischio per la salute umana e/o possono essere richiesti da determinati regimi normativi, ma entrambe le vie di esposizione evidenziano una complessità considerevole sul piano tecnico. Questo tipo di studi dovrà essere impostato caso per caso, ma il metodo di prova qui esposto per la valutazione e l’esame della cancerogenesi con somministrazione orale potrebbe costituire la base di un protocollo per studi per inalazione e/o cutanei, per quanto riguarda le raccomandazioni per i periodi di trattamenti, i parametri clinici e patologici ecc. L’OCSE ha pubblicato documenti di orientamento sulla somministrazione delle sostanze chimiche in esame per via cutanea (7) e per inalazione (7) (8). Il capitolo B.8 del presente allegato (9) e il capitolo B.29 del presente allegato (10), insieme al documento di orientamento dell’OCSE — Acute inhalation testing (8) vanno consultati in particolare nell’impostazione di studi a lungo termine che prevedono l’esposizione per inalazione. Il capitolo B.9 del presente allegato (11) va consultato nel caso di prove svolte per via cutanea. | 5. | Lo studio della cancerogenesi fornisce informazioni sui possibili rischi per la salute che potrebbero derivare dall’esposizione ripetuta nell’arco di un periodo che può estendersi fino all’intero ciclo di vita delle specie usate. Con questo studio sarà possibile ottenere informazioni sugli effetti tossici della sostanza chimica in esame, tra cui la potenziale cancerogenesi, oltre a dare indicazioni su organi bersaglio e sulla possibilità di accumulo. Esso può inoltre fornire indicazioni sul cosiddetto no-observed-adverse-effect level (livello fino al quale non si osservano effetti dannosi) per gli effetti tossici e, nel caso di cancerogeni non genotossici, per le risposte tumorali, consentendo la determinazione di criteri di sicurezza per l’esposizione umana. Si sottolinea inoltre la necessità di sottoporre gli animali ad attente osservazioni cliniche, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di informazioni. | 6. | Tra gli obiettivi degli studi di cancerogenesi condotti con questo metodo di prova figurano: | — | l’individuazione delle proprietà cancerogene di una sostanza chimica in esame, che risultano in una maggiore incidenza di neoplasmi, una più grande proporzione di neoplasmi maligni o una riduzione nei tempi di latenza di neoplasmi, il tutto in confronto a gruppi di controllo, | — | l’individuazione di uno o più organi bersaglio di cancerogenesi, | — | l’individuazione dei tempi di latenza di neoplasmi, | — | la caratterizzazione del rapporto dose-risposta al tumore, | — | l’individuazione di un NOAEL (no-observed-adverse-effect level — livello fino al quale non si osservano effetti dannosi), o di un punto di partenza per la determinazione di una dose di riferimento (BMD), | — | l’estrapolazione di effetti cancerogeni relativi a un’esposizione umana a basse dosi, | — | la produzione di dati per verificare le ipotesi relative alle modalità di azione (2) (7) (12) (13) (14) (15). | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 7. | Nella valutazione e nell’esame della potenziale cancerogenesi di una sostanza chimica in esame, prima di condurre lo studio, i laboratori che eseguono la prova devono considerare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame al fine di orientare il disegno sperimentale nella maniera più efficiente per valutare il potenziale di tossicità cronica limitando al minimo necessario l’uso di animali. Le informazioni e considerazioni relative alle modalità di azione di una presunta sostanza cancerogena (2) (7) (12) (13) (14) (15) sono particolarmente importanti, poiché l’impostazione ottimale potrebbe variare a seconda del fatto che una sostanza chimica sia una sostanza cancerogena genotossica nota o presunta. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indicazioni, tra cui considerazioni in merito alle modalità di azione. | 8. | Tra le informazioni utili per il disegno sperimentale saranno considerate l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo, incluse delle prove di genotossicità, l’impiego o gli impieghi previsti per l’esposizione umana, dati (Q)SAR, di mutagenesi/genotossicità, cancerogenesi e altri dati tossicologici disponibili in merito a sostanze chimiche di struttura affine; i dati tossicocinetici disponibili (dose unica e dose ripetuta, laddove disponibile) e i risultati di altri studi a dose ripetuta. La valutazione della cancerogenesi si effettua una volta ottenuti i primi risultati delle prove di tossicità a dose ripetuta su 28 giorni e/o 90 giorni. Anche prove di iniziazione-promozione di tumori a breve termine possono fornire informazioni utili. È opportuno prendere in considerazione un approccio a tappe nello svolgimento delle prove di cancerogenesi svolte nel quadro della valutazione generale degli effetti potenzialmente nocivi di una particolare sostanza chimica in esame (16) (17) (18) (19). | 9. | I metodi statistici più adeguati per l’analisi dei risultati, tenuto conto del disegno sperimentale e degli obiettivi, sono stabiliti prima dell’inizio dello studio. Occorre inoltre determinare se le statistiche debbano o meno tenere conto dell’aggiustamento in funzione della sopravvivenza, dell’analisi dei rischi cumulati di tumore legati al tempo di sopravvivenza, dell’analisi dei tempi di latenza del tumore e dell’analisi effettuata in caso di morte prematura degli animali di uno o più gruppi. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) e il documento di orientamento dell’OCSE n. 35 — Analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (20) forniscono indicazioni sulle analisi statistiche appropriate e sui riferimenti fondamentali a metodi statistici riconosciuti a livello internazionale. | 10. | Nella realizzazione di uno studio di cancerogenesi è opportuno seguire sempre i principi guida e le considerazioni specificati nel documento di orientamento dell’OCSE n. 19 — Recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (21), in particolare nel paragrafo 62. Tale paragrafo precisa che negli studi che prevedono la somministrazione ripetuta di dosi, se un animale manifesta segnali clinici progressivi, che conducano a un ulteriore peggioramento delle sue condizioni, è necessario decidere con cognizione di causa se sottoporre l’animale ad eutanasia. In questa decisione va anche soppesato il valore delle informazioni che possono essere ottenute continuando a includere tale animale nello studio e il suo stato in generale. Se si decide di continuare a mantenere l’animale nello studio occorre aumentare la frequenza delle osservazioni, a seconda del caso. È anche possibile, senza pregiudicare il fine della prova, sospendere temporaneamente la somministrazione delle dosi se ciò allevia il dolore o riduce lo stress cui è sottoposto l’animale, oppure ancora ridurre le dosi. | 11. | Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) e due pubblicazioni dell’International Life Sciences Institute (22) (23) forniscono ragguagli dettagliati in merito ai dibattiti sui principi nella scelta delle dosi per gli studi di tossicità cronica e cancerogenesi. La strategia di base per la scelta delle dosi dipende dall’obiettivo o dagli obiettivi fondamentali dello studio (paragrafo 6). Nel selezionare il livello adeguato delle dosi sarebbe opportuno trovare un equilibrio tra, da un lato, l’individuazione dei rischi e, dall’altro, la caratterizzazione e la rilevanza delle risposte alle basse dosi. Ciò assume particolare importanza nella situazione in cui si deve svolgere uno studio combinato di tossicità cronica e di cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) (paragrafo 12). | 12. | È opportuno valutare l’opportunità di svolgere uno studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi (capitolo B.33 del presente allegato) piuttosto che eseguire in separata sede uno studio di tossicità cronica (il capitolo B.30 del presente allegato) e uno studio di cancerogenesi (il presente metodo di prova B.32). La prova combinata è più efficiente sotto il profilo della gestione dei tempi e dei costi rispetto alla conduzione di due studi distinti, pur senza compromettere la qualità dei dati nella fase che verifica la cronicità e nella fase che verifica la cancerogenesi. Nello svolgimento di uno studio combinato di tossicità cronica e cancerogenicità (capitolo B.33 del presente alleato) occorre tuttavia tenere opportunamente in considerazione i principi della selezione delle dosi (paragrafi 11 e 22-25). È inoltre riconosciuto che determinati quadri normativi richiedono la conduzione di studi ben distinti. | 13. | Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono specificate alla fine del capitolo e nel documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7). | PRINCIPIO DELLA PROVA | 14. | La sostanza chimica in esame è somministrata giornalmente in dosi crescenti a vari gruppi di animali da esperimento per la maggior parte della loro vita, di norma per via orale. Può essere opportuna anche la somministrazione per inalazione o per via cutanea. Gli animali sono sottoposti ad attenta osservazione per accertare eventuali sintomi di tossicità e lo sviluppo di lesioni neoplastiche. Gli animali deceduti o soppressi durante l’esperimento vengono sottoposti a necroscopia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a necroscopia. | DESCRIZIONE DEL METODO | Selezione delle specie animali | 15. | Il presente metodo di prova è dedicato innanzitutto alla valutazione e all’esame della cancerogenesi nei roditori (paragrafo 2). L’uso di specie di non roditori può essere considerato se i dati disponibili indicano che ciò sia più appropriato per prevedere gli effetti sulla salute umana. La scelta della specie deve essere motivata. La specie di elezione tra i roditori è il ratto, sebbene si possano utilizzare anche altre specie di roditori, come il topo. Nonostante l’uso di topi possa avere un’utilità limitata nelle prove di cancerogenesi (24), (25) (26), nel quadro di alcuni programmi di natura normativa le prove di cancerogenesi sui tipi sono tuttora previste, salvo nei casi in cui è stato appurato che una tale prova non è necessaria dal punto di vista scientifico. I ratti e i topi costituiscono i modelli sperimentali preferibili in ragione della loro aspettativa di vita relativamente breve, del loro uso diffuso in studi farmacologici e tossicologici, della loro sensibilità all’induzione di tumori e della disponibilità di ceppi sufficientemente caratterizzati. Viste queste caratteristiche, è disponibile una grande quantità di informazioni di carattere fisiologico e patologico. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta delle specie e del ceppo. | 16. | Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Lo studio di cancerogenesi andrebbe preferibilmente condotto su animali dello stesso ceppo e della stessa provenienza rispetto a quelli utilizzati per studi preliminari di tossicità di durata inferiore. Ciononostante, se è appurato che animali dello stesso ceppo e della medesima provenienza presentano problemi nel soddisfare i criteri di sopravvivenza normalmente riconosciuti per studi a lungo termine [cfr. il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7)] si dovrebbe considerare l’utilizzo di un ceppo di animali che evidenzia un tasso di sopravvivenza accettabile per uno studio a lungo termine. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. | Condizioni di stabulazione e alimentazione | 17. | Gli animali devono essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti piccoli gruppi dello stesso sesso. La sistemazione individuale va considerata soltanto se scientificamente giustificata (27) (28) (29). Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 C (± 3 C). L’umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve essere non inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia del laboratorio. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua di abbeveraggio. La dieta deve corrispondere a tutti i requisiti nutrizionali delle specie in esame e il tenore di contaminanti dietetici, tra cui anche i residui di pesticidi, inquinanti organici persistenti, fitoestrogeni, metalli pesanti e micotossine, che potrebbero influenzare l’esito della prova, deve essere il più basso possibile. Le informazioni analitiche sui livelli di nutrienti e di contaminanti dietetici devono essere prodotte periodicamente, quantomeno all’inizio dello studio e in caso di cambio del lotto impiegato, e vanno riportate nella relazione finale. Analogamente, devono essere fornite anche informazioni analitiche sull’acqua di abbeveraggio usata nello studio. La scelta della dieta può essere condizionata dalla necessità di garantire una combinazione adeguata tra una data sostanza chimica in esame e l’esigenza di rispettare i requisiti nutrizionali degli animali nel momento in cui la sostanza chimica è somministrata con il cibo. | Preparazione degli animali | 18. | Si utilizzano animali sani, che siano stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno 7 giorni e non siano stati precedentemente sottoposti ad altre procedure sperimentali. Nel caso dei roditori, la somministrazione delle dosi agli animali deve iniziare il più presto possibile in seguito allo svezzamento e all’acclimatazione e preferibilmente prima che gli animali raggiungano le 8 settimane di età. Gli animali del test vanno caratterizzati per quanto concerne specie, ceppo, provenienza, sesso, peso e/o età. All’inizio dello studio la variazione ponderale degli animali di ciascun sesso utilizzati deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio di tutti gli animali interessati dallo studio, operando un distinguo a seconda del sesso. L’assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento avviene mediante randomizzazione. In seguito all’assegnazione randomizzata, non dovrebbero esserci più differenze significative nel peso medio corporeo tra gruppi dello stesso sesso. Se sono presenti differenze statisticamente rilevanti, la fase di randomizzazione va ripetuta, nei limiti del possibile. Ad ogni animale va assegnato un numero di identificazione univoco, che sarà riportato sull’animale in maniera indelebile tramite tatuaggio, impianto di un microchip o un altro metodo analogo. | PROCEDURA | Numero e sesso degli animali | 19. | È opportuno usare animali di entrambi i sessi. È opportuno utilizzare un numero sufficiente di animali, in modo tale da poter valutare in maniera approfondita l’evoluzione dei dati dal punto di vista biologico e statistico. Ogni gruppo-dose e gruppo di controllo parallelo devono pertanto essere composti da almeno 50 animali per sesso. A seconda della finalità dello studio, si può aumentare la potenza statistica delle stime principali ripartendo gli animali in maniera disomogenea tra i vari gruppi-dose, assegnando oltre 50 animali ai gruppi a bassa dose, ad esempio per stimare il potenziale cancerogeno a basse dosi. Tuttavia va riconosciuto che un aumento moderato della dimensione dei gruppi comporterà un aumento relativamente esiguo della potenza statistica dello studio. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito al disegno statistico dello studio e alla scelta dei livelli di dose per sfruttare al massimo la potenza statistica. | Disposizioni relative sacrifici intermedi e ai gruppi satellite (sentinella) | 20. | Lo studio può prevedere disposizioni relative ai sacrifici intermedi, ad esempio dopo 12 mesi, al fine di reperire informazioni sull’evoluzione di alterazioni neoplastiche e dati meccanicistici, se scientificamente giustificato. Se tali informazioni sono già disponibili sulla base di studi sulla tossicità a dose ripetuta sulla sostanza chimica in esame, tali sacrifici intermedi possono non essere scientificamente giustificati. Se il disegno sperimentale prevede dei sacrifici intermedi, il numero di animali in ciascun gruppo-dose previsto a tale scopo sarà, di norma, pari a 10 animali per sesso e il numero complessivo di animali previsti dal disegno sperimentale dovrà aumentare del numero di animali che saranno sacrificati prima della conclusione dello studio. Al fine di monitorare lo stato della patologia, se necessario durante lo studio è possibile aggiungere un altro gruppo di animali sentinella (solitamente 5 esemplari per sesso) (30). Ulteriori elementi sono forniti nel documento di orientamento OCSE n. 116 (7). | Gruppi-dose e dosaggi | 21. | Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce indicazioni in merito a tutti gli aspetti legati alla scelta delle dosi e all’intervallo tra i livelli di dose. Si somministrano almeno tre diversi livelli di dose e un controllo parallelo. I livelli di dose sono generalmente basati sui risultati di precedenti studi di durata inferiore con dosi ripetute o di determinazione degli intervalli di dose e devono tenere conto dei dati tossicologici e tossicocinetici esistenti disponibili relativi alla sostanza chimica in esame o a sostanze chimiche analoghe. | 22. | A meno che la natura fisico-chimica o gli effetti biologici della sostanza chimica in esame non impongano limiti in tal senso, il livello di dose più elevato va scelto con l’obiettivo di individuare gli organi bersaglio e gli effetti tossici senza provocare sofferenza, tossicità grave, morbilità o morte. In considerazione dei fattori di cui al paragrafo 23 sottostante, il livello di dose più elevato di norma è scelto per rendere manifesta la tossicità, ad esempio con un calo dell’aumento del peso (circa del 10 %). Tuttavia, a seconda degli obiettivi dello studio (cfr. paragrafo 6), si può optare per una dose massima inferiore alla dose che renda manifesta la tossicità, ad esempio se una dose provoca un effetto indesiderato preoccupante che però ha un impatto lieve sull’aspettativa di vita o sul peso corporeo. | 23. | I livelli di dose e l’intervallo tra i livelli di dose possono essere scelti per stabilire un rapporto dose-risposta e, a seconda delle modalità di azione della sostanza chimica in esame, un NOAEL o altri risultati attesi dello studio, ad esempio una dose di riferimento (BMD, benchmark dose, cfr. paragrafo 25) al livello di dose più basso. Tra i fattori da tenere in considerazione nella scelta delle dosi più basse rientrano anche la curva attesa del rapporto dose-risposta, le dosi alle quali possono subentrare dei cambiamenti nel metabolismo o nella modalità di azione tossica, il livello a cui si prevede una soglia o il livello che si prevede possa costituire un punto di partenza per un’estrapolazione a basse dosi. | 24. | L’intervallo tra i livelli di dose scelto dipenderà dalle caratteristiche della sostanza chimica di prova e non può essere imposto dal presente metodo di prova, ma di frequente fattori tra due e quattro forniscono buoni risultati delle prove per determinare dosi a livelli discendenti, mentre spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che utilizzare intervalli molto distanziati (ad esempio oltre un fattore di circa 6-10) tra le dosi. In linea generale va evitato l’uso di fattori superiori a 10 e se vi si ricorre è opportuno giustificare tale scelta. | 25. | Come precisato ulteriormente nel documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7), nella scelta della dose vanno tenuti in considerazione, tra l’altro, i seguenti aspetti: | — | non linearità o punti di flesso presunti o riscontrati nella curva dose-risposta, | — | aspetti tossicocinetici e range di dosi a cui subentra o meno induzione metabolica, saturazione o non linearità tra dosi esterne e interne, | — | lesioni precursive, indicatori degli effetti o indicatori di processi biologici fondamentali sottostanti in corso, | — | aspetti principali (o presunti) delle modalità di azione, ad esempio dosi alle quali inizia a subentrare citotossicità, i livelli ormonali sono perturbati, i meccanismi di omeostasi sono superati ecc., | — | regioni della curva dose-risposta per cui è necessaria una stima particolarmente precisa, ad esempio nell’ambito della dose di riferimento prevista o di una soglia ipotizzata, | — | considerazione dei livelli previsti di esposizione umana. | 26. | Il gruppo di controllo deve essere non trattato o trattato solo con il veicolo nel caso si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza chimica in esame. Salvo il trattamento con la sostanza chimica in esame, gli animali del gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di controllo riceverà il veicolo al volume più elevato dei gruppi-dose. Se una sostanza chimica è somministrata con la dieta e comporta una riduzione dell’assunzione di cibo significativa a causa di una minore palatabilità, può essere utile aggiungere un ulteriore gruppo di controllo alimentato allo stesso modo che si presterà di più a tale scopo. | Preparazione delle dosi e somministrazione della sostanza chimica in esame | 27. | La sostanza chimica in esame di norma viene somministrata con il cibo, l’acqua di abbeveraggio o per via intragastrica. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alle vie e ai metodi di somministrazione. La via di somministrazione dipende dall’obiettivo dello studio, dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza chimica in esame, dalla sua biodisponibilità e dalla via e dal metodo predominanti di esposizione degli esseri umani. È necessario giustificare la scelta della via e del metodo di somministrazione. Nell’interesse della salute animale, la somministrazione mediante sonda orale di norma è scelta solo per le sostanze per cui questa via e questo metodo di somministrazione corrispondono ragionevolmente a una potenziale esposizione umana (ad esempio farmaci). Per le sostanze chimiche ingerite con gli alimenti o presenti nell’ambiente, inclusi i pesticidi, la somministrazione avviene solitamente con il cibo o l’acqua di abbeveraggio. Tuttavia in alcune circostanze, ad esempio nel caso dell’esposizione professionale, può essere opportuna la somministrazione per altre vie. | 28. | Ove necessario, la sostanza di prova è disciolta o sospesa in un veicolo adeguato. È opportuno tenere conto, a seconda del caso, delle seguenti caratteristiche del veicolo e di altri additivi: effetti sull’assorbimento, sulla distribuzione, sul metabolismo o sulla ritenzione della sostanza chimica in esame, effetti sulle proprietà chimiche della sostanza chimica in esame che possono alterarne le caratteristiche tossiche ed effetti sulla consumazione di cibo o acqua sullo stato nutrizionale degli animali. Si raccomanda di prendere anzitutto in considerazione, ogni qualvolta possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/emulsione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Dei veicoli diversi dall’acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. Devono essere disponibili informazioni in merito alla stabilità della sostanza chimica in esame e all’omogeneità delle soluzioni o razioni di dosaggio (a seconda del caso) nelle condizioni di somministrazione (ad esempio dieta). | 29. | Per le sostanze somministrate con la dieta o l’acqua di abbeveraggio è importante impedire che le quantità della sostanza in esame interferiscano con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. In studi a lungo termine che ricorrono alla somministrazione con la dieta, la concentrazione nel cibo della sostanza chimica in esame di norma non può superare la soglia massima del 5 % della dieta totale, al fine di evitare degli squilibri alimentari. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può ricorrere sia a una concentrazione alimentare costante (mg/kg di cibo o ppm), sia a dosi di livello costante in funzione del peso dell’animale (mg/kg di peso corporeo), con calcolo su base settimanale. La scelta di eventuali alternative va specificata. | 30. | In caso di somministrazione per via orale, agli animali viene somministrata una dose giornaliera della sostanza chimica in esame (sette giorni la settimana), di norma per un periodo di 24 mesi (cfr. anche paragrafo 32) per i roditori. Occorre giustificare la scelta di eventuali altri regimi di dosaggio, ad esempio cinque giorni la settimana. In caso di somministrazione per via epidermica, di norma gli animali sono trattati con la sostanza chimica in esame per almeno 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, così come specificato nel capitolo B.9 del presente allegato (11), per un periodo di 24 mesi. L’esposizione per via inalatoria si protrae per 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, ma, se giustificata, può essere scelta un’esposizione di 5 giorni la settimana. La durata del periodo di somministrazione di norma è di 24 mesi. Se delle specie di roditori diverse dai ratti sono sottoposte a esposizione “a naso solo”, è possibile adeguare la durata massima di esposizione per ridurre al minimo il loro stress. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore al giorno deve essere debitamente motivata. Cfr. anche il capitolo B.8 del presente allegato (9). | 31. | Se la somministrazione della sostanza chimica in esame avviene per via intragastrica, deve avvenire per mezzo di una sonda o una cannula per intubazione ogni giorno all’incirca allo stesso orario. Di norma viene somministrata una dose singola una volta al giorno, ma laddove, ad esempio, la sostanza chimica in esame fosse un irritante locale, è possibile mantenere la dose giornaliera ripartendola su due momenti diversi (due volte al giorno). Il massimo volume di liquido che può essere somministrato in un’unica soluzione dipende dalle dimensioni dell’animale. Il volume deve essere limitato il più possibile e per i roditori non può superare, di norma, 1 ml/100 g di peso corporeo (31). La variabilità dei volumi somministrati va ridotta al minimo regolando le concentrazioni in modo da assicurare un volume costante in tutti i livelli di dose. Sostanze chimiche potenzialmente corrosive o irritanti sono considerate un’eccezione e devono essere diluite per evitare effetti locali gravi. Va evitato lo svolgimento di prove con concentrazioni che rischiano di essere corrosive o irritanti per il tratto gastrointestinale. | Durata dello studio | 32. | Per i roditori la durata della prova di norma è di 24 mesi, il che corrisponde alla maggior parte della vita normale degli animali sperimentali. La durata degli studi può essere più lunga o più breve a seconda della durata di vita del ceppo delle specie animali previste per lo studio, ma deve essere giustificata. Per determinati ceppi di topi, ad esempio AKR/J, C3H/J o C57BL/6J, può essere più appropriata una durata di 18 mesi. Qui di seguito saranno forniti alcuni orientamenti relativi alla durata e alla conclusione dello studio e alla sopravvivenza. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 — Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7) fornisce ulteriori orientamenti in materia, tra cui le considerazioni sull’accettabilità di ritenere negativo uno studio di cancerogenesi in relazione alla sopravvivenza degli animali. | — | Va vagliata la possibilità di concludere lo studio quando la quantità di animali sopravvissuti nei gruppi a dose più bassa o del gruppo di controllo è più bassa del 25 % | — | Lo studio non va concluso in caso di morti premature dovute alla tossicità limitate al gruppo ad alta dose | — | Nella valutazione della sopravvivenza si deve distinguere a seconda del sesso degli animali | — | Lo studio non si deve prolungare oltre il momento in cui i dati resi disponibili in questo contesto non sono più sufficienti per giungere a una valutazione valida dal punto di vista statistico. | OSSERVAZIONI | 33. | Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mortalità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi inclusi. Inoltre gli animali devono essere sottoposti a un controllo quotidiano dei segni di rilevanza tossicologica, tenendo conto del periodo di picco degli effetti previsti dopo la somministrazione nel caso in cui questa avvenga per via intragastrica. Si dedicherà speciale attenzione all’insorgenza dei tumori: si registrerà la data di inizio, la posizione, le dimensioni, l’aspetto e la progressione di ogni tumore macroscopicamente visibile o palpabile. | Peso corporeo, consumo di cibo/acqua ed efficienza alimentare | 34. | Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimentare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto della misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ultimo è alterato. | Ematologia, biochimica clinica e altre misurazioni | 35. | Al fine di sfruttare al massimo le informazioni ottenute dallo studio, soprattutto per quando riguarda le considerazioni legate alle modalità di azione, a discrezione del responsabile scientifico dello studio è possibile effettuare dei prelievi di sangue ai fini di analisi ematologiche e di biochimica clinica. Potrebbe essere utile anche effettuare l’esame delle urine. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indicazioni sul valore di tali campionamenti nel quadro di uno studio di cancerogenesi. Se lo si ritiene opportuno, si può effettuare un campionamento del sangue per determinazioni ematologiche e di chimica clinica nonché per l’esame delle urine nel quadro di un sacrificio intermedio (paragrafo 20) e al termine dello studio, effettuandolo su un minimo di 10 animali per sesso e per gruppo. Occorre prelevare campioni di sangue da un sito specifico, ad esempio con punture cardiache o dal seno retro-orbitale, sotto anestesia. Tali campioni vanno conservati, se del caso, in condizioni idonee. Per l’esame possono essere preparati anche degli strisci di sangue, in particolare se il midollo osseo sembra rientrare tra gli organi bersaglio, sebbene il valore di tale esame ai fini della valutazione del potenziale cancerogeno/oncogeno non sia indiscusso (32). | PATOLOGIA | Necroscopia macroscopica | 36. | Tutti gli animali dello studio, ad eccezione degli animali sentinella (cfr. paragrafo 20) e altri animali satellite dovranno essere sottoposti ad una necroscopia dettagliata completa, che comprende un accurato esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi, della cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Per gli animali sentinella e altri animali satellite, valutando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a discrezione del responsabile scientifico dello studio. Il peso degli organi di norma non rientra nello studio di cancerogenesi, poiché i cambiamenti geriatrici prima, e in fasi successive lo sviluppo di tumori hanno un effetto distorsivo sull’utilità dei relativi dati. Il peso degli organi potrebbe essere tuttavia importante ai fini della valutazione della forza probante dei dati e in particolare per considerazioni sulle modalità di azione. Se tali dati sono rilevati nel quadro di uno studio satellite, vanno raccolti a distanza di non oltre un anno dall’inizio dello studio. | 37. | I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo (33) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi). | tutte le lesioni macroscopiche | cuore | pancreas | stomaco (prestomaco, stomaco ghiandolare | ghiandole surrenali | ileo | ghiandola paratiroidea | [denti] | aorta | digiuno | nervo periferico | testicoli | cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte) | reni | pituitaria | timo | intestino cieco | ghiandola lacrimale (esorbitale) | prostata | tiroide | cervice | fegato | retto | [lingua] | ghiandola della coagulazione | polmone | ghiandola salivare | trachea | colon | Linfonodi (superficiali e profondi) | vescicola seminale | vescica | duodeno | ghiandola mammaria (obbligatoria per esemplari di sesso femminile e, se visibile ai fini della la dissezione, anche per quelli di sesso maschile) | muscolo scheletrico | utero (cervice inclusa) | epididimo | [tratto respiratorio superiore, incluso il naso, i turbinati e i seni paranasali] | pelle | [uretere] | occhi (retina inclusa) | esofago | midollo spinale (a tre livelli: cervicale, mediotoracico e lombare) | [uretra] | [femore con articolazione] | [bulbo olfattivo] | milza | vagina | cistifellea (eccetto per i topi) | ovaia | [sterno] | sezione di midollo osseo e/o un aspirato di midollo osseo fresco | ghiandola di Harder | | | | In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per via epidermica, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla via orale. In particolare, sono essenziali il campionamento e la conservazione della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi che prevedono la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco dei tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratori deve corrispondere alle raccomandazioni contenute nei capitoli B.8 e B.29 del presente allegato. Per altri organi/tessuti (oltre ai tessuti conservati specificamente del tratto respiratorio) va esaminato l’elenco degli organi relativo alla via orale. | Esame istopatologico | 38. | Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi di patologia tossicologica (33). Come minimo, vanno esaminati i seguenti tessuti: | — | tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo, | — | tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel corso dello studio, | — | tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche, tumori compresi, | — | se si osservano dei cambiamenti istopatologici in relazione al trattamento nel gruppo ad alta dose, tali tessuti vanno esaminati in ogni animale di tutti gli altri gruppi-dose, | — | in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno esaminati entrambi gli organi. | DATI E RELAZIONE | Dati | 39. | Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo sperimentale il numero di animali presenti all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante la prova o sottoposti ad eutanasia e il momento di tutti i decessi/eutanasie, il numero di animali che presentano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento dell’esordio, durata e gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di animali rapportata al tipo di lesione. Tabelle riassuntive dei dati devono fornire le medie e le deviazioni standard (per dati raccolti in via continuativa) relative agli animali che evidenziano effetti tossici o lesioni, oltre all’indicazione dell’entità delle lesioni. | 40. | I dati storici di controllo possono essere utili per interpretare i risultati dello studio, ad esempio quando i dati forniti da gruppi di controllo paralleli sembrano divergere significativamente da dati recenti relativi ad animali di controllo dello stesso centro di prova/della stessa colonia. Se valutati, i dati storici di controllo vanno trasmessi dallo stesso laboratorio e devono riferirsi ad animali della medesima età e dello stesso ceppo, nonché essere generati nei cinque anni che precedono lo studio in questione. | 41. | I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico adeguato e generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da analizzare vanno scelti già in sede di determinazione del disegno sperimentale. Questa scelta deve rendere possibili degli aggiustamenti in funzione del grado di sopravvivenza, se necessario. | Relazione sulla prova | 42. | La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti: | | Sostanza chimica in esame: | — | natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche, | — | dati identificativi, | — | origine della sostanza chimica, | — | numero del lotto, | — | certificazione dell’analisi chimica. | | Veicolo (se del caso): | — | motivazione della scelta del veicolo utilizzato, se diverso dall’acqua. | | Animali sperimentali: | — | specie/ceppo utilizzato e giustificazione della scelta effettuata, | — | numero, età e sesso degli animali all’inizio della prova, | — | origine, condizioni di stabulazione, dieta ecc., | — | peso di ciascun animale all’inizio della prova. | | Condizioni sperimentali: | — | criteri di scelta della via di somministrazione e della dose, | — | laddove opportuno, metodi statistici usati per analizzare i dati, | — | dettagli sulla formulazione della sostanza chimica in esame/la preparazione della dieta, | — | dati di analisi sulla concentrazione, la stabilità e l’omogeneità della preparazione, | — | via di somministrazione e relativi dettagli della sostanza chimica in esame, | — | per gli studi che prevedono la somministrazione per via inalatoria, scelta tra esposizione “a naso solo” o “a corpo intero”, | — | dosi effettive (mg/kg di peso corporeo/giorno) e, se del caso, fattore di conversione tra la concentrazione della sostanza chimica in esame nella dieta/acqua di abbeveraggio (mg/kg o ppm) e la dose effettiva, | — | dettagli relativi alla qualità del cibo e dell’acqua. | | Risultati (vanno indicati dati da presentare sotto forma di tabelle e dati individuali sugli animali) | | Dati generali: | — | dati sulla sopravvivenza degli animali, | — | peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo, | — | assunzione di cibo, calcoli sull’efficienza alimentare, se effettuati, nonché consumo di acqua, se del caso, | — | dati tossicocinetici (se disponibili), | — | dati oftalmoscopici (se disponibili), | — | esami ematologici (se disponibili), | — | esami di chimica clinica (se disponibili). | | Risultati clinici: | — | segni di tossicità, | — | incidenza (e, se classificata, la gravità) di eventuali anomalie, | — | natura, gravità e durata dei segni clinici (transitori o permanenti). | | Dati necroscopici: | — | peso corporeo finale, | — | peso degli organi (anche in relazione al peso corporeo, se del caso), | — | reperti necroscopici; incidenza e gravità delle anomalie. | | Esame istopatologico. | — | reperti istopatologici non neoplastici, | — | reperti istopatologici neoplastici, | — | correlazione tra reperti macroscopici e microscopici, | — | descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici relativi al trattamento, inclusi i livelli di gravità, | — | relazioni su eventuali esami inter pares dei vetrini. | | Elaborazione statistica dei risultati, se del caso | | Discussione dei risultati, compreso: | — | discussione su tutti gli approcci di modellizzazione, | — | rapporti dose-risposta, | — | dati storici di controllo, | — | esame di tutte le informazioni sulle modalità di azione, | — | determinazione BMD, NOAEL o LOAEL, | — | rilevanza per gli esseri umani. | | Conclusioni | BIBLIOGRAFIA | (1) | OCSE (1995). 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The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105:1196-1203. | (27) | Direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 22 settembre 2010, sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (GU L 276 del 20.10.2010, pag. 33). | (28) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21:15-23. | (32) | Weingand K, et al. (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198-201. | (33) | Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P, et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Appendice 1 | DEFINIZIONI | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova. | B.33. STUDI COMBINATI DI TOSSICITÀ CRONICA/CANCEROGENESI | INTRODUZIONE | 1. | Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 453 (2009) La prima linea guida 453 è stata adottata nel 1981. Si è ritenuto necessario sviluppare questa versione aggiornata del metodo di prova B.33 alla luce dei recenti progressi nell’ambito del benessere animale e degli obblighi normativi (1) (2) (3) (4) (5). L’aggiornamento del presente metodo di prova B.33 si è svolto in parallelo alle revisioni del capitolo B.32 del presente allegato, studi di cancerogenesi, e del capitolo B.30 del presente allegato, studi di tossicità cronica, con l’obiettivo di integrare le informazioni in relazione agli animali usati nello studio e di fornire maggiori dettagli sulla scelta delle dosi. Il presente metodo di prova è concepito per testare un’ampia serie di sostanze chimiche, tra cui pesticidi e sostanze chimiche industriali. Va tuttavia specificato che alcuni dettagli e requisiti possono essere diversi per i prodotti farmaceutici (cfr. Conferenza internazionale sull’armonizzazione, Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of Pharmaceuticals). | 2. | La maggior parte degli studi di tossicità cronica e cancerogenesi è svolta su specie di roditori, pertanto il presente metodo di prova è destinato ad applicarsi in primo luogo agli studi che hanno ad oggetto queste specie. Se dovesse risultare necessario condurre tali studi sui non roditori, possono trovare applicazione, con le opportune modifiche, anche i principi e le procedure esposti nel presente metodo di prova, congiuntamente a quelli specificati al capitolo B.27 del presente allegato (studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (6), come indicato nel documento di orientamento dell’OCSE — Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies (7). | 3. | Le tre vie principali di somministrazione usate in relazione alla tossicità cronica/cancerogenesi sono: orale, cutanea e per inalazione. La scelta della via di somministrazione è fatta in funzione delle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza in esame e della più probabile via di esposizione degli esseri umani. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta della via di esposizione. | 4. | Questo metodo di prova è incentrato sull’esposizione per via orale, ossia la via più usata negli studi di tossicità cronica e di cancerogenesi. Gli studi a lungo termine che prevedono un’esposizione per via cutanea o per inalazione possono essere necessari anche per la valutazione del rischio per la salute umana e/o possono essere richiesti da determinati regimi normativi, ma entrambe le vie di esposizione evidenziano una complessità considerevole sul piano tecnico. Questo tipo di studi dovrà essere concepito caso per caso, ma il metodo di prova qui esposto per la valutazione e l’esame della tossicità cronica e della cancerogenesi con somministrazione orale potrebbe costituire la base di un protocollo per studi per inalazione e/o cutanei, per quanto riguarda le raccomandazioni per i periodi di trattamenti, i parametri clinici e patologici ecc. L’OCSE ha pubblicato documenti di orientamento sulla somministrazione delle sostanze chimiche in esame per via cutanea (7) e per inalazione (7) (8). Il capitolo B.8 del presente allegato (9) e il capitolo B.29 del presente allegato (10), insieme al documento di orientamento dell’OCSE — Acute inhalation testing (8) vanno consultati in particolare nell’impostazione di studi a lungo termine che prevedono l’esposizione per inalazione. Il capitolo B.9 del presente allegato (11) va consultato nel caso di prove svolte per via cutanea. | 5. | Lo studio combinato di tossicità cronica/cancerogenesi fornisce informazioni sui possibili rischi per la salute che potrebbero derivare dall’esposizione ripetuta nell’arco di un periodo che può estendersi fino all’intero ciclo di vita delle specie usate. Con questo studio sarà possibile ottenere informazioni sugli effetti tossici della sostanza chimica in esame, tra cui la potenziale cancerogenesi, e dare indicazioni su organi bersaglio e sulla possibilità di accumulo. Esso può inoltre fornire indicazioni sul cosiddetto no-observed-adverse-effect level (livello fino al quale non si osservano effetti dannosi) per gli effetti tossici e, nel caso di cancerogeni non genotossici, per le risposte tumorali, consentendo la determinazione di criteri di sicurezza per l’esposizione umana. Si sottolinea inoltre la necessità di sottoporre gli animali ad attente osservazioni cliniche, allo scopo di ottenere il maggior numero possibile di informazioni. | 6. | Tra gli obiettivi degli studi di tossicità cronica/cancerogenesi condotti con questo metodo di prova figurano: | — | l’individuazione delle proprietà cancerogene di una sostanza chimica in esame, che risultano in una maggiore incidenza di neoplasmi, una più grande proporzione di neoplasmi maligni o una riduzione nei tempi di latenza di neoplasmi, il tutto in confronto a gruppi di controllo, | — | l’individuazione dei tempi di latenza di neoplasmi, | — | l’individuazione della tossicità cronica della sostanza chimica in esame, | — | l’individuazione di uno o più organi bersaglio di tossicità cronica e cancerogenesi, | — | la caratterizzazione del rapporto dose-risposta, | — | l’individuazione di un no-observed-adverse-effect level (NOAEL), ossia il livello fino al quale non si osservano effetti dannosi o di un punto di partenza per la determinazione di una dose di riferimento (BMD), | — | l’estrapolazione di effetti cancerogeni relativi a un’esposizione umana a basse dosi, | — | la previsione degli effetti di tossicità cronica ai livelli di esposizione umana, | — | la produzione di dati per verificare le ipotesi relative alle modalità di azione (2) (7) (12) (13) (14) (15). | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 7. | Nella valutazione e nell’esame della potenziale cancerogenesi e tossicità cronica di una sostanza chimica in esame, prima di condurre lo studio, i laboratori che eseguono la prova devono considerare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame al fine di orientare il disegno sperimentale nella maniera più efficiente per valutare il potenziale di tossicità cronica limitando al minimo necessario l’uso di animali. Le informazioni e considerazioni relative alle modalità di azione di una presunta sostanza cancerogena (2) (7) (12) (13) (14) (15) sono particolarmente importanti, poiché il disegno ottimale potrebbe variare a seconda del fatto che una sostanza chimica sia una sostanza cancerogena genotossica nota o presunta. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indicazioni, tra cui considerazioni in merito alle modalità di azione. | 8. | Tre le informazioni utili per il disegno sperimentale saranno considerate l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza chimica in esame, le informazioni sulle modalità di azione, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo, incluse delle prove di genotossicità; l’impiego o gli impieghi previsti per l’esposizione umana, dati (Q)SAR, di mutagenesi/genotossicità, cancerogenesi e altri dati tossicologici disponibili in merito a sostanze chimiche di struttura affine; i dati tossicocinetici disponibili (dose unica e dose ripetuta, laddove disponibile) e i risultati di altri studi a dose ripetuta. La determinazione della tossicità cronica/cancerogenesi si effettua solamente una volta ottenuti i primi risultati delle prove di tossicità a dose ripetuta su 28 giorni e/o 90 giorni. Anche prove di iniziazione-promozione di tumori a breve termine possono fornire informazioni utili. È opportuno prendere in considerazione un approccio a tappe nello svolgimento delle prove di cancerogenesi svolte nel quadro della valutazione generale degli effetti potenzialmente nocivi di una particolare sostanza chimica in esame (16) (17) (18) (19). | 9. | I metodi statistici più adeguati per l’analisi dei risultati, tenuto conto del disegno sperimentale e degli obiettivi, sono stabiliti prima dell’inizio dello studio. Occorre inoltre determinare se le statistiche debbano o meno tenere conto dell’aggiustamento in funzione della sopravvivenza, dell’analisi dei rischi cumulati di tumore legati al tempo di sopravvivenza, dell’analisi dei tempi di latenza del tumore e dell’analisi effettuata in caso di morte prematura degli animali di uno o più gruppi. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) e il documento di orientamento dell’OCSE n. 35 — Analysis and evaluation of chronic toxicity and carcinogenicity studies (20) forniscono indicazioni sulle analisi statistiche appropriate e sui riferimenti fondamentali a metodi statistici riconosciuti a livello internazionale. | 10. | Nella realizzazione di uno studio di cancerogenesi è opportuno seguire sempre i principi guida e le considerazioni specificati nel documento di orientamento dell’OCSE n. 19 — Recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation (21), in particolare nel paragrafo 62. Tale paragrafo precisa che negli studi che prevedono la somministrazione ripetuta di dosi, se un animale manifesta segnali clinici progressivi, che conducano a un ulteriore peggioramento delle sue condizioni, è necessario decidere con cognizione di causa se sottoporre l’animale ad eutanasia. In questa decisione va anche soppesato il valore delle informazioni che possono essere ottenute continuando a includere tale animale nello studio e il suo stato in generale. Se si decide di continuare a mantenere l’animale nello studio occorre aumentare la frequenza delle osservazioni, a seconda del caso. È anche possibile, senza pregiudicare il fine della prova, sospendere temporaneamente la somministrazione delle dosi se ciò allevia il dolore o riduce lo stress cui è sottoposto l’animale, oppure ancora ridurre le dosi. | 11. | Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) e due pubblicazioni dell’International Life Sciences Institute (22) (23) forniscono ragguagli dettagliati in merito ai dibattiti sulla selezione delle dosi per gli studi di tossicità cronica e cancerogenesi. La strategia di base per la scelta delle dosi dipende dal o dagli obiettivi fondamentali dello studio (paragrafo 6). Nel selezionare il livello adeguato delle dosi sarebbe opportuno trovare un equilibrio tra, da un lato, l’individuazione dei rischi e, dall’altro, la caratterizzazione e la rilevanza delle risposte alle basse dosi. Ciò assume particolare rilevanza nel caso del presente studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi. | 12. | È opportuno valutare l’opportunità di svolgere il presente studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi piuttosto che eseguire in separata sede uno studio di tossicità cronica (capitolo B.30 del presente allegato) e uno studio di cancerogenesi (capitolo B.32 del presente allegato). La prova combinata è più efficiente sotto il profilo della gestione dei tempi e dei costi nonché di un numero minore di animali utilizzati rispetto alla conduzione di due studi distinti, pur senza compromettere la qualità dei dati nella fase che verifica la cronicità e nella fase che verifica la cancerogenesi. Nello svolgimento di uno studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi occorre tuttavia tenere opportunamente in considerazione i principi della selezione delle dosi (paragrafi 11 e 22-26). È inoltre riconosciuto che determinati quadri normativi richiedono la conduzione di studi ben distinti. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori orientamenti sul disegno dello studio combinato di tossicità cronica e cancerogenesi al fine di ottenere la massima efficacia negli studi in termini di possibilità di riduzione dell’uso di animali e di armonizzazione delle varie procedure sperimentali. | 13. | Le definizioni usate nel contesto del presente metodo di prova sono specificate alla fine del presente capitolo e nel documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7). | PRINCIPIO DELLA PROVA | 14. | Il disegno sperimentale prevede due fasi parallele, una relativa alla cronicità, l’altra relativa alla cancerogenesi (per la durata delle fasi si rimanda rispettivamente ai paragrafi 34 e 35). La sostanza chimica in esame di norma è somministrata per via orale, ma può essere opportuno anche ricorrere alla via inalatoria o cutanea. Per la fase relativa alla cronicità, la sostanza chimica in esame è somministrata giornalmente in dosi graduali a diversi gruppi di animali, con un livello di dose per gruppo, di norma per un periodo di 12 mesi, ma a seconda degli obblighi normativi possono essere scelti anche periodi più lunghi o più corti (cfr. paragrafo 34). La durata scelta deve essere sufficientemente lunga da garantire la manifestazione degli effetti della tossicità cumulata senza che insorgano gli effetti distorsivi dei cambiamenti geriatrici. Il disegno sperimentale può anche prevedere uno o più sacrifici intermedi, ad esempio dopo 3 e 6 mesi, e a tale fine possono essere introdotti nello studio ulteriori animali (cfr. paragrafo 20). Per la fase relativa alla cancerogenesi, la sostanza chimica in esame è somministrata giornalmente a vari gruppi di animali per la maggior parte della loro vita. In entrambe le fasi gli animali sono sottoposti ad attenta osservazione per accertare eventuali sintomi di tossicità e lo sviluppo di lesioni neoplastiche. Gli animali deceduti o soppressi durante l’esperimento vengono sottoposti a necroscopia. Al termine della prova gli animali superstiti vengono soppressi e sottoposti a necroscopia. | DESCRIZIONE DEL METODO | Selezione delle specie animali | 15. | Il presente metodo di prova è dedicato innanzitutto alla valutazione e all’esame della tossicità cronica e della cancerogenesi nei roditori (paragrafo 2). L’uso di specie di non roditori può essere considerato se i dati disponibili indicano che ciò sia più appropriato per prevedere gli effetti sulla salute umana. La scelta del veicolo deve essere motivata. La specie di elezione è il ratto, sebbene si possano utilizzare anche altre specie di roditori, come il topo. Nonostante l’uso di topi possa avere un’utilità limitata nelle prove di cancerogenesi (24), (25) (26), nel quadro di alcuni programmi di natura normativa le prove di cancerogenesi sui tipi sono tuttora previste, salvo nei casi in cui è stato appurato che una tale prova non è necessaria dal punto di vista scientifico. I ratti e i topi costituiscono i modelli sperimentali preferibili in ragione della loro aspettativa di vita relativamente breve, del loro uso diffuso in studi farmacologici e tossicologici, della loro sensibilità all’induzione di tumori e della disponibilità di ceppi sufficientemente caratterizzati. Viste queste caratteristiche, è disponibile una grande quantità di informazioni di carattere fisiologico e patologico. Il disegno e lo svolgimento di studi di tossicità cronica/cancerogenesi su specie di non roditori, se richieste, vanno basate sui principi indicati nel presente metodo di prova e in quelli specificati nel capitolo B.27 del presente allegato (Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori) (6). Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alla scelta delle specie e del ceppo. | 16. | Si devono utilizzare animali adulti giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. Lo studio combinato di tossicità cronica/cancerogenesi andrebbe condotto su animali dello stesso ceppo e della stessa provenienza rispetto a quelli utilizzati per studi preliminari di tossicità di durata inferiore. Ciononostante, se è appurato che animali dello stesso ceppo e della medesima provenienza presentano problemi nel soddisfare i criteri di sopravvivenza normalmente riconosciuti per studi a lungo termine [cfr. il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7)] si dovrebbe considerare l’utilizzo di un ceppo di animali che evidenzia un tasso di sopravvivenza accettabile per uno studio a lungo termine. Le femmine devono essere nullipare e non gravide. | Condizioni di stabulazione e alimentazione | 17. | Gli animali devono essere alloggiati in gabbie individuali o contenenti piccoli gruppi dello stesso sesso. La sistemazione individuale va considerata soltanto se scientificamente giustificata (27) (28) (29). Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C). L’umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve essere non inferiore al 30 % e possibilmente non superiore al 70 %, tranne durante la pulizia del laboratorio. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua di abbeveraggio. La dieta deve corrispondere a tutti i requisiti nutrizionali delle specie in esame e il tenore di contaminanti dietetici, tra cui anche i residui di pesticidi, inquinanti organici persistenti, fitoestrogeni, metalli pesanti e micotossine, che potrebbero influenzare l’esito della prova, deve essere il più basso possibile. Le informazioni analitiche sui livelli di nutrienti e di contaminanti dietetici devono essere prodotte periodicamente, quantomeno all’inizio dello studio e in caso di cambio del lotto impiegato, e vanno riportate nella relazione finale. Analogamente, devono essere fornite anche informazioni analitiche sull’acqua di abbeveraggio usata nello studio. La scelta della dieta può essere condizionata dalla necessità di garantire una combinazione adeguata tra una data sostanza chimica in esame e l’esigenza di rispettare i requisiti nutrizionali degli animali nel momento in cui la sostanza chimica è somministrata con il cibo. | Preparazione degli animali | 18. | Si utilizzano animali sani, che siano stati acclimatati alle condizioni di laboratorio per almeno 7 giorni e non siano stati precedentemente sottoposti ad altre procedure sperimentali. Nel caso dei roditori, la somministrazione delle dosi agli animali deve iniziare il più presto possibile in seguito allo svezzamento e all’acclimatazione e preferibilmente prima che gli animali raggiungano le 8 settimane di età. Gli animali del test vanno caratterizzati per quanto concerne specie, ceppo, provenienza, sesso, peso e/o età. All’inizio dello studio la variazione ponderale degli animali di ciascun sesso utilizzati deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio di tutti gli animali interessati dallo studio, operando un distinguo a seconda del sesso. L’assegnazione degli animali al gruppo di controllo e di trattamento avviene mediante randomizzazione. In seguito all’assegnazione randomizzata, non dovrebbero esserci più differenze significative nel peso medio corporeo tra gruppi dello stesso sesso. Se sono presenti differenze statisticamente rilevanti, la fase di randomizzazione va ripetuta, nei limiti del possibile. Ad ogni animale va assegnato un numero di identificazione univoco, che sarà riportato sull’animale in maniera indelebile tramite tatuaggio, impianto di un microchip o un altro metodo analogo. | PROCEDURA | Numero e sesso degli animali | 19. | È opportuno usare animali di entrambi i sessi. È opportuno utilizzare un numero sufficiente di animali, in modo tale da poter valutare in maniera approfondita l’evoluzione dei dati dal punto di vista biologico e statistico. Per i roditori, ogni gruppo-dose (come illustrato al paragrafo 22) e ogni gruppo di controllo parallelo previsti per la fase dello studio relativa alla cancerogenesi devono pertanto essere composti da almeno 50 animali per sesso. A seconda della finalità dello studio, si può aumentare la potenza statistica delle stime principali ripartendo gli animali in maniera in maniera disomogenea tra i vari gruppi-dose, assegnando oltre 50 animali ai gruppi a bassa dose, ad esempio per valutare il potenziale cancerogeno a basse dosi. Tuttavia va riconosciuto che un aumento moderato della dimensione dei gruppi comporterà un aumento relativamente esiguo della potenza statistica dello studio. Per i roditori, ogni gruppo-dose (come illustrato al paragrafo 22) e ogni gruppo di controllo parallelo previsti per la fase dello studio relativa alla tossicità cronica devono essere composti da almeno 10 animali per sesso. Si fa presente che questo numero è inferiore a quello degli studi relativi alla tossicità cronica (capitolo B.30 del presente allegato). L’interpretazione dei dati rilevati con un numero ridotto di animali per gruppo nella fase relativa alla tossicità cronica di questo studio combinato sarà tuttavia avallata dai dati rilevati con un numero maggiore di animali nella fase dedicata alla cancerogenesi. Negli studi che prevedono la presenza di topi, nella fase relativa alla tossicità cronica potrebbero essere necessari ulteriori animali in ciascun gruppo-dose al fine di poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito al disegno statistico dello studio e alla scelta dei livelli di dose per sfruttare al massimo la potenza statistica. | Disposizioni relative ai sacrifici intermedi, a gruppi satellite e ad animali sentinella | 20. | Lo studio può prevedere disposizioni relative ai sacrifici intermedi, ad esempio dopo 6 mesi nella fase relativa alla tossicità cronica, al fine di reperire informazioni sull’evoluzione di alterazioni non neoplastiche e dati meccanicistici, se scientificamente giustificato. Se tali informazioni sono già disponibili sulla base di studi sulla tossicità a dose ripetuta sulla sostanza chimica in esame, tali sacrifici intermedi possono non essere scientificamente giustificati. Gli animali usati nella fase relativa alla tossicità cronica dello studio, di norma dalla durata di 12 mesi (paragrafo 34) forniscono dati sui sacrifici intermedi per la fase dello studio relativa alla cancerogenesi, riducendo pertanto il numero totale di animali usati nello studio. Nella fase relativa alla tossicità cronica dello studio, ai fini del monitoraggio della reversibilità dei cambiamenti tossicologici indotti dalla sostanza chimica in esame possono essere previsti anche gruppi satellite. Tali gruppi possono essere limitati al livello di dose più elevato dello studio e ai gruppi di controllo. Al fine di monitorare lo stato della patologia, se necessario durante lo studio è possibile aggiungere un altro gruppo di animali sentinella (solitamente 5 esemplari per sesso) (30). Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indicazioni sul disegno sperimentale al fine di includere i sacrifici intermedi, gli animali satellite e sentinella, riducendo al contempo il numero di animali usati complessivamente. | 21. | Se il disegno sperimentale prevede animali satellite e/o sacrifici intermedi, il numero di animali in ciascun gruppo-dose previsto a tale scopo sarà, di norma, pari a 10 animali per sesso e il numero complessivo di animali previsti dal disegno sperimentale dovrà aumentare del numero di animali che si prevede di sopprimere prima della conclusione dello studio. Gli animali oggetto di sacrifici intermedi e gli animali satellite di norma sono sottoposti alle medesime osservazioni, tra cui il controllo del peso corporeo, il consumo di cibo/acqua, analisi ematologiche e biochimico-cliniche ed esami patologici degli animali coinvolti nella fase di esame della tossicità cronica dello studio principale, sebbene sia possibile disporre anche che (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio) le osservazioni siano limitate a parametri chiave specifici come la neurotossicità o l’immunotossicità. | Gruppi-dose e dosaggi | 22. | Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce indicazioni in merito a tutti gli aspetti legati alla scelta delle dosi e all’intervallo tra i livelli di dose. Si somministrano almeno tre diversi livelli di dose e un controllo parallelo, sia per la fase relativa alla cronicità, sia a quella relativa alla cancerogenesi. I livelli di dose sono generalmente basati sui risultati di precedenti studi di durata inferiore con dosi ripetute o di determinazione degli intervalli di dose e devono tenere conto dei dati tossicologici e tossicocinetici esistenti disponibili relativi alla sostanza chimica in esame o a sostanze chimiche analoghe. | 23. | Per la fase relativa dello studio relativa alla tossicità cronica, si può non considerare necessario eseguire uno studio completo utilizzando tre livelli di dose qualora si possa prevedere che una prova svolta con un livello di dose, equivalente ad almeno 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno, probabilmente non produrrà effetti avversi. Tale decisione si deve basare sui risultati di studi preliminari e su una probabile assenza di tossicità in base a dati relativi a sostanze chimiche di struttura affine. Si può applicare un limite di 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno eccetto nei casi in cui l’esposizione umana indica la necessità di utilizzare un livello di dose più elevato. | 24. | A meno che la natura fisico-chimica o gli effetti biologici della sostanza chimica in esame non impongano limiti in tal senso, il livello di dose più elevato va scelto con l’obiettivo di individuare gli organi bersaglio e gli effetti tossici senza provocare sofferenza, tossicità grave, morbilità o morte. Il livello di dose più elevato di norma è scelto per rendere manifesta la tossicità, ad esempio con un calo dell’aumento del peso (circa del 10 %). Tuttavia, a seconda degli obiettivi dello studio (cfr. paragrafo 6), si può optare per una dose massima inferiore alla dose che renda manifesta la tossicità, ad esempio se una dose provoca un effetto indesiderato preoccupante che però ha un impatto lieve sull’aspettativa di vita o sul peso corporeo. | 25. | I livelli di dose e l’intervallo tra i livelli di dose possono essere scelti per stabilire un rapporto dose-risposta e, a seconda delle modalità di azione della sostanza chimica in esame, un NOAEL o altri risultati attesi dello studio, ad esempio una dose di riferimento (BMD, benchmark dose, cfr. paragrafo 27). Tra i fattori da tenere in considerazione nella scelta delle dosi più basse rientrano anche la curva attesa del rapporto dose-risposta, le dosi alle quali possono subentrare dei cambiamenti nel metabolismo o nella modalità di azione tossica, il livello a cui si prevede una soglia o il livello che si prevede possa costituire un punto di partenza per un’estrapolazione a basse dosi. L’obiettivo principale di uno studio combinato di cancerogenesi/tossicità cronica è di ottenere informazioni ai fini della valutazione del rischio di cancerogenesi, mentre ottenere informazioni sulla cronicità tossica di norma è un obiettivo secondario. Questo aspetto va tenuto in considerazione nella scelta dei livelli di dose e dell’intervallo tra i livelli di dose per lo studio. | 26. | L’intervallo tra i livelli di dose scelto dipenderà dagli obiettivi dello studio e dalle caratteristiche della sostanza chimica in esame e non può essere imposto in ogni suo dettaglio dal presente metodo di prova, ma di frequente fattori tra due e quattro forniscono buoni risultati delle prove se applicati per determinare dosi a livelli discendenti, mentre spesso è preferibile aggiungere un quarto gruppo di prova piuttosto che utilizzare intervalli molto distanziati (ad esempio oltre un fattore di circa 6-10) tra le dosi. In linea generale va evitato l’uso di fattori superiori a 10 e se vi si ricorre è opportuno giustificare tale scelta. | 27. | Come precisato ulteriormente nel documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7), nella scelta della dose vanno tenuti in considerazione, tra l’altro, i seguenti aspetti: | — | non linearità o punti di flesso presunti o riscontrati nella curva dose-risposta, | — | aspetti tossicocinetici e range di dosi a cui subentra o meno induzione metabolica, saturazione o non linearità tra dosi esterne e interne, | — | lesioni precursive, indicatori degli effetti o indicatori di processi biologici fondamentali sottostanti in corso, | — | aspetti principali (o presunti) delle modalità di azione, ad esempio dosi alle quali inizia a subentrare citotossicità, i livelli ormonali sono perturbati, i meccanismi di omeostasi sono superati ecc., | — | regioni della curva dose-risposta per cui è necessaria una stima particolarmente precisa, ad esempio nell’ambito della dose di riferimento prevista o di una soglia ipotizzata, | — | considerazione dei livelli previsti di esposizione umana, soprattutto nella scelta delle dosi intermedie e basse. | 28. | Il gruppo di controllo deve essere non trattato o trattato solo con il veicolo nel caso si utilizzi un veicolo per somministrare la sostanza chimica in esame. Salvo il trattamento con la sostanza in esame, gli animali del gruppo di controllo vanno manipolati esattamente come quelli dei gruppi sperimentali. Se si utilizza un veicolo, il gruppo di controllo riceverà il veicolo al volume più elevato dei gruppi-dose. Se una sostanza chimica è somministrata con la dieta e comporta una riduzione dell’assunzione di cibo significativa a causa di una minore palatabilità, può essere utile aggiungere un ulteriore gruppo di controllo alimentato allo stesso modo che si presterà di più a tale scopo. | Preparazione delle dosi e somministrazione della sostanza chimica in esame | 29. | La sostanza chimica in esame di norma viene somministrata con il cibo, l’acqua di abbeveraggio o per via intragastrica. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori informazioni in merito alle vie e ai metodi di somministrazione. La via di somministrazione dipende dall’obiettivo dello studio, dalle caratteristiche chimico-fisiche della sostanza chimica in esame, dalla sua biodisponibilità e dalla via e dal metodo predominanti di esposizione degli esseri umani. È necessario giustificare la scelta della via e del metodo di somministrazione. Nell’interesse della salute animale, la somministrazione mediante sonda orale di norma è scelta solo per le sostanze per cui questa via e questo metodo di somministrazione corrispondono ragionevolmente a una potenziale esposizione umana (ad esempio farmaci). Per le sostanze chimiche ingerite con gli alimenti o presenti nell’ambiente, inclusi i pesticidi, la somministrazione avviene solitamente con il cibo o l’acqua di abbeveraggio. Tuttavia in alcune circostanze, ad esempio nel caso dell’esposizione professionale, può essere opportuna la somministrazione per altre vie. | 30. | Ove necessario, la sostanza di prova è disciolta o sospesa in un veicolo adeguato. È opportuno tenere conto, a seconda del caso, delle seguenti caratteristiche del veicolo e di altri additivi: effetti sull’assorbimento, sulla distribuzione, sul metabolismo o sulla ritenzione della sostanza chimica in esame, effetti sulle proprietà chimiche della sostanza chimica in esame che possono alterarne le caratteristiche tossiche ed effetti sulla consumazione di cibo o acqua sullo stato nutrizionale degli animali. Si raccomanda di prendere anzitutto in considerazione, ogni qualvolta possibile, l’uso di una soluzione/sospensione acquosa, e in seconda battuta quello di una soluzione/emulsione in olio (ad esempio olio di semi di mais) e infine la possibile soluzione in altri veicoli. Dei veicoli diversi dall’acqua devono essere note le caratteristiche tossiche. Devono essere disponibili informazioni in merito alla stabilità della sostanza chimica in esame e all’omogeneità delle soluzioni o razioni di dosaggio (a seconda del caso) nelle condizioni di somministrazione (ad esempio dieta). | 31. | Per le sostanze somministrate con la dieta o l’acqua di abbeveraggio è importante impedire che le quantità della sostanza in esame interferiscano con la normale alimentazione o il normale bilancio dei liquidi. In studi a lungo termine che ricorrono alla somministrazione con la dieta, la concentrazione nel cibo della sostanza chimica in esame di norma non può superare la soglia massima del 5 % della dieta totale, al fine di evitare degli squilibri alimentari. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con la dieta, si può ricorrere sia a una concentrazione alimentare costante (mg/kg di cibo o ppm), sia a dosi di livello costante in funzione del peso dell’animale (mg/kg di peso corporeo), con calcolo su base settimanale. La scelta di eventuali alternative va specificata. | 32. | In caso di somministrazione per via orale è prevista una dose giornaliera della sostanza chimica in esame (sette giorni la settimana) per un periodo di 12 mesi (fase relativa alla cronicità) o 24 mesi (fase relativa alla cancerogenesi), cfr. anche paragrafi 33 e 34. Occorre giustificare la scelta di eventuali altri regimi di dosaggio, ad esempio cinque giorni la settimana. In caso di somministrazione per via cutanea, di norma gli animali sono trattati con la sostanza chimica in esame per almeno 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, così come specificato nel capitolo B.9 del presente allegato (11), per un periodo di 12 mesi (fase relativa alla cronicità) o 24 mesi (fase relativa alla cancerogenesi). L’esposizione per via inalatoria si protrae per 6 ore al giorno, 7 giorni la settimana, ma, se giustificata, può essere scelta un’esposizione di 5 giorni la settimana. La durata del periodo di somministrazione di norma è di 12 mesi (fase relativa alla cronicità) o 24 mesi (fase relativa alla cancerogenesi). Se per l’esposizione “a naso solo” s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è si possono adeguare le durate massime di esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. La scelta di una durata di esposizione inferiore a 6 ore al giorno deve essere debitamente motivata. Cfr. anche il capitolo B.8 del presente allegato (9). | 33. | Se la somministrazione della sostanza chimica in esame avviene per via intragastrica, deve avvenire per mezzo di una sonda gastrica o una cannula per intubazione ogni giorno all’incirca allo stesso orario. Di norma viene somministrata una dose singola una volta al giorno, ma laddove, ad esempio, la sostanza chimica in esame fosse un irritante locale, è possibile mantenere la dose giornaliera ripartendola su due momenti diversi (due volte al giorno). Il massimo volume di liquido che può essere somministrato in un’unica soluzione dipende dalle dimensioni dell’animale. Il volume deve essere limitato il più possibile e per i roditori non può superare, di norma, 1 ml/100 g di peso corporeo (31). La variabilità dei volumi somministrati va ridotta al minimo regolando le concentrazioni in modo da assicurare un volume costante in tutti i livelli di dose. Sostanze chimiche potenzialmente corrosive o irritanti sono considerate un’eccezione e devono essere diluite per evitare effetti locali gravi. Va evitato lo svolgimento di prove con concentrazioni che rischiano di essere corrosive o irritanti per il tratto gastrointestinale. | Durata dello studio | 34. | Il periodo di esposizione e la durata della fase relativa alla cronicità del presente studio di norma sono pari a 12 mesi, ma il disegno sperimentale rende possibile e può essere applicato anche a studi dalla durata più breve (ad esempio 6 o 9 mesi) o più lunga (ad esempio 18 o 24 mesi), a seconda delle disposizioni di regimi normativi specifici o dagli specifici fini meccanicistici. È opportuno che gli scostamenti da una durata di esposizione di 12 mesi siano giustificati, in particolare in caso di periodi di durata inferiore. Tutti i gruppi-dose previsti per questa fase saranno conclusi nel momento previsto ai fini della valutazione della tossicità cronica e della patologia non neoplastica. Una volta terminata l’esposizione, ai gruppi satellite previsti per controllare la reversibilità di eventuali alterazioni tossicologiche indotte dalla sostanza chimica in esame non sarà somministrata alcuna dose per un periodo non inferiore di 4 settimane e non superiore a un terzo della durata totale dello studio. | 35. | La durata della fase del presente studio relativa alla cancerogenesi per i roditori di norma sarà pari a 24 mesi, un periodo che si estende per la maggior parte della durata di vita normale degli animali utilizzati. La durata degli studi può essere più lunga o più breve a seconda della durata di vita del ceppo delle specie animali previste per lo studio, ma deve essere giustificata. Per determinati ceppi di topi, ad esempio AKR/J, C3H/J o C57BL/6J, può essere più appropriata una durata di 18 mesi. Qui di seguito saranno forniti alcuni orientamenti relativi alla durata e al termine dello studio e alla sopravvivenza. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori orientamenti in materia, tra cui le considerazioni sull’accettabilità di uno studio di cancerogenesi negativo in relazione alla sopravvivenza degli animali. | — | Va considerata la decisione di concludere lo studio se il numero di animali sopravvissuti nei gruppi a dose più bassa è inferiore al 25 % | — | Lo studio non va concluso in caso di morti premature dovute alla tossicità limitate al gruppo ad alta dose | — | Le valutazioni relative alla sopravvivenza vanno effettuate distinguendo tra i due sessi | — | Lo studio non si deve prolungare oltre il momento in cui i dati resi disponibili in questo contesto non sono più sufficienti per giungere a una valutazione valida dal punto di vista statistico. | OSSERVAZIONI (FASE RELATIVA ALLA CRONICITÀ TOSSICA) | 36. | Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mortalità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi inclusi. Le osservazioni cliniche vanno effettuate almeno una volta al giorno, preferibilmente alla/e stessa/e ora/e, tenendo conto del periodo di picco degli effetti previsti dopo la somministrazione nel caso in cui questa avvenga per via intragastrica. | 37. | Tutti gli animali vanno sottoposti a dettagliate osservazioni cliniche almeno una volta prima della prima esposizione (per consentire il confronto all’interno dei gruppi di soggetti) e, successivamente, al termine della prima settimana dello studio e successivamente a cadenza mensile. Le osservazioni devono rispettare un protocollo che limiti al minimo indispensabile le differenze tra i singoli e non devono dipendere dai risultati del gruppo esaminato. Le osservazioni del caso vanno eseguite fuori dalla gabbia di stabulazione, preferibilmente in un ambiente standard e sempre all’incirca allo stesso orario. Occorre registrare con cura le osservazioni, preferibilmente usando sistemi di punteggio statistico definiti appositamente dal laboratorio che esegue la prova. Occorre adottare ogni misura per ridurre al minimo le variazioni delle condizioni di osservazione. Si terrà conto, tra l’altro, di tutte le alterazioni della cute, del pelo, degli occhi, delle membrane mucose, della comparsa di secrezioni ed escrezioni e dell’attività del sistema nervoso autonomo (per esempio lacrimazione, piloerezione, ampiezza pupillare, ritmo respiratorio insolito). Verranno inoltre registrate le modifiche osservate nel comportamento, nella postura e nella risposta alla manipolazione, come pure la presenza di movimenti clonici o tonici, stereotipi (per esempio tolettatura eccessiva, continuo girare in tondo) o comportamenti insoliti (per esempio automutilazione, marcia a ritroso) (32). | 38. | Tutti gli animali vanno sottoposti a un esame oftalmologico con un oftalmoscopio o un altro dispositivo idoneo, prima della prima somministrazione della sostanza chimica in esame. Al termine dello studio, questo esame va condotto preferibilmente su tutti gli animali, ma almeno sui gruppi ad alta dose e di controllo. Se si riscontrano alterazioni degli occhi correlate al trattamento è necessario esaminare tutti gli animali. Se da un’analisi strutturale o da altre informazioni si riscontra una tossicità oculare, la frequenza degli esami oculari va intensificata. | 39. | Per le sostanze chimiche per cui prove precedenti di tossicità a dose ripetuta a 28 giorni e/o a 90 giorni hanno indicato potenziali effetti neurotossici, possono essere svolte valutazioni facoltative della reattività sensoriale a stimoli di vario tipo (32) (ad esempio stimoli uditivi, visivi e propriocettivi) (33) (34) (35), della forza di presa (36) e dell’attività motoria (37) prima dell’inizio dello studio e a cadenza trimestrale dopo l’inizio dello studio fino al 12° mese incluso, così come alla fine dello studio (se più lungo di 12 mesi). Ulteriori indicazioni sui procedimenti utilizzabili sono contenute nelle voci bibliografiche citate. Tuttavia possono essere applicate anche procedure alternative non indicate nella bibliografia. | 40. | Le sostanze chimiche per cui prove di tossicità a dose ripetuta a 28 giorni e/o a 90 giorni hanno indicato potenziali effetti immunotossici, alla fine dello studio possono essere sottoposte ad ulteriori analisi facoltative di tale parametro. | Peso corporeo, consumo di cibo/acqua ed efficienza alimentare | 41. | Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimentare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese Se la sostanza chimica in esame è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto della misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ultimo è alterato. | Esami ematologici e biochimici clinici | 42. | Negli studi che prevedono la presenza di roditori, vanno svolti esami ematologici su tutti gli animali sperimentali (10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo), a 3, 6 e 12 mesi, così come alla fine dello studio (se di durata superiore a 12 mesi). Se sono previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter eseguire tutti gli esami ematologici del caso (cfr. paragrafo 19). Negli studi con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minore di animali (ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono necessariamente essere condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai parametri ematologici in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. Occorre prelevare campioni di sangue da un sito specifico, ad esempio con punture cardiache o dal seno retro-orbitale, sotto anestesia. | 43. | Vanno esaminati i seguenti parametri (38): conteggio totale e differenziato dei leucociti, conteggio degli eritrociti, conteggio delle piastrine, ematocrito (volume sanguigno occupato dalla componente eritrocitaria), volume corpuscolare medio, emoglobina corpuscolare media, concentrazione di emoglobina corpuscolare media, tempo di prototrombina e tempo di tromboplastina parziale attivata. Possono essere misurati anche altri parametri ematologici come i corpi di Heinz o un’altra morfologia eritrocitaria atipica o metaemoglobina, se del caso, a seconda della tossicità della sostanza chimica in esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in funzione dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza chimica in esame. Se la sostanza chimica in esame ha un effetto sul sistema ematopoietico, possono essere indicati anche il conteggio dei reticolociti e la citologia del midollo osseo, sebbene questi non siano necessariamente esami di routine. | 44. | Le determinazioni biochimiche cliniche per lo studio degli effetti tossici gravi sui tessuti e, specificamente, gli effetti su reni e fegato, vanno condotte su campioni di sangue prelevati da almeno 10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo, ai medesimi intervalli di tempo specificati per gli esami ematologici e sempre sugli stessi animali. Se sono previsti dei topi, può essere necessario prevedere animali satellite per poter eseguire tutte le determinazioni biochimiche cliniche del caso. Negli studi con non roditori, saranno presi dei campioni da quantità minore di animali (ad esempio 4 animali per sesso per ciascun gruppo negli studi con cani), a stadi intermedi e alla fine dello studio, analogamente ai roditori. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscontrato nessun effetto in base ai parametri di biochimica clinica in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. Si raccomanda di lasciare gli animali a digiuno la notte precedente la raccolta dei campioni (ad eccezione dei topi) (10). Vanno esaminati i seguenti parametri (38): glucosio, urea (azoto ureico), creatinina, proteine totali, albumina, calcio, sodio, potassio, colesterolo totale, almeno due esami idonei alla valutazione epatocellulare (alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, glutammato deidrogenasi, acidi biliari totali (39) e almeno due esami idonei alla valutazione epatobiliare (fosfatasi alcalina, gamma-glutamil transferasi, 5’-nucleotidasi, bilirubina totale, acidi biliari totali) (39). Se opportuno possono essere misurati anche altri parametri di chimica clinica, come i trigliceridi a digiuno, ormoni specifici e colinesterasi, a seconda della tossicità della sostanza chimica in esame. Nel complesso è necessario adottare un approccio flessibile, in funzione delle specie e dell’effetto osservato e/o previsto relativo ad una data sostanza. | 45. | L’esame delle urine va effettuato su tutti gli animali sperimentali (10 animali di sesso maschile e 10 animali di sesso femminile per gruppo) sui campioni raccolti seguendo gli stessi intervalli applicati in ambito ematologico e di chimica clinica. Le misurazioni a 3 mesi, sia per i roditori, sia per i non roditori, non devono essere necessariamente condotte se non è stato riscontrato nessun effetto sull’esame delle urine in uno studio precedente della durata di 90 giorni condotto con livelli di dose comparabili. I seguenti parametri sono stati inclusi in una raccomandazione di esperti su studi di patologia clinica (38): aspetto, volume, osmolalità o densità relativa, pH, proteine totali e glucosio. Altre determinazioni riguardano il chetone, l’urobilinogeno, la bilirubina e il sangue occulto. Se necessario, per ampliare lo studio dell’effetto o degli effetti osservato/i è possibile impiegare ulteriori parametri. | 46. | Generalmente si considera necessario determinare le variabili di riferimento di natura ematologica e di biochimica clinica prima di iniziare un trattamento in studi che coinvolgono dei cani, ma ciò non è ritenuto necessario negli studi che prevedono l’uso di roditori (38). Se tuttavia non si dispone di dati storici di riferimento adeguati (cfr. paragrafo 58), si dovrebbe considerare di produrre tali dati. | PATOLOGIA | Necroscopia macroscopica | 47. | Tutti gli animali dello studio di norma vanno sottoposti a completa e dettagliata necroscopia macroscopica che comprende un attento esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi e delle cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Tuttavia si può anche disporre (per i gruppi che saranno sacrificati nel corso dello studio o per i gruppi satellite) che le osservazioni siano limitate a parametri specifici e fondamentali, come la neurotossicità o l’immunotossicità (cfr. paragrafo 21). Gli animali in oggetto non devono necessariamente essere sottoposti ad autopsia e alle procedure successive descritte nei seguenti paragrafi. Per gli animali sentinella, valutando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a discrezione del responsabile scientifico dello studio. | 48. | Si deve misurare il peso degli organi di ciascun animale, tranne di quelli esclusi dall’ultima parte del paragrafo 47. Fegato, reni, ghiandole surrenali, testicoli, epididimi, utero, ovaie, timo, milza, cervello e cuore di tutti gli animali (tranne quelli trovati moribondi e/o sacrificati nel frattempo) vanno opportunamente liberati da eventuali tessuti aderenti e pesati umidi immediatamente dopo la dissezione, per evitare l’essiccamento. | 49. | I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo (40) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi): | tutte le lesioni macroscopiche | cuore | pancreas | stomaco (prestomaco, stomaco ghiandolare) | ghiandole surrenali | ileo | ghiandola paratiroidea | [denti] | aorta | digiuno | nervo periferico | testicoli | cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte) | reni | pituitaria | Timo | intestino cieco | ghiandola lacrimale (esorbitale) | prostata, | tiroide | cervice | fegato | retto | [lingua] | ghiandola della coagulazione | polmone | ghiandola salivare | trachea | colon | linfonodi (superficiali e profondi) | vescicola seminale | vescica | duodeno | ghiandola mammaria (obbligatoria per esemplari di sesso femminile e, se visibile ai fini della la dissezione, anche per quelli di sesso maschile | muscolo scheletrico | utero (cervice inclusa) | epididimo | [tratto respiratorio superiore, incluso il naso, i turbinati e i seni paranasali] | pelle | [uretere] | occhi (retina inclusa) | esofago | midollo spinale (a tre livelli: Cervicale, mediotoracico e lombare) | [uretra] | [femore con articolazione] | [bulbo olfattivo] | milza | vagina | cistifellea (eccetto per i topi) | ovaia | [sterno] | sezione di midollo osseo e/o un aspirato di midollo osseo fresco | ghiandola di Harder | | | | In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per via epidermica, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla via orale. In particolare, è necessario procedere al campionamento e alla conservazione della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi che prevedono la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco dei tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratorio deve corrispondere alle raccomandazioni contenute nel capitolo B.8 del presente allegato (8) e del capitolo B.29 del presente allegato (9). Per altri organi/tessuti (oltre ai tessuti conservati specificamente del tratto respiratorio) va esaminato l’elenco degli organi relativo alla via orale. | Esame istopatologico | 50. | Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi di patologia tossicologica (40). Come minimo, gli esami istopatologici prevedono quanto segue: | — | tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo, | — | tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel corso dello studio, | — | tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche, | — | tessuti bersaglio o tessuti che hanno evidenziato cambiamenti legati al trattamento nel gruppo ad alta dose, di tutti gli animali in tutti gli altri gruppi-dose, | — | in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno esaminati entrambi gli organi. | OSSERVAZIONI (FASE RELATIVA ALLA CANCEROGENESI) | 51. | Tutti gli animali vanno osservati per identificare segni di morbilità e mortalità, in genere all’inizio e alla fine della giornata, weekend e giorni festivi inclusi. Inoltre gli animali devono essere sottoposti a un controllo quotidiano dei segni di rilevanza tossicologica. Negli studi che prevedono una somministrazione per via intragastrica, gli animali devono essere controllati nel periodo immediatamente successivo alla somministrazione della dose. Va prestata particolare attenzione allo sviluppo di tumori e si registrerà la data di inizio, la posizione, le dimensioni, l’aspetto e la progressione di ogni tumore grossolanamente visibile o palpabile. | 52. | Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio del trattamento, almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Le misurazioni del consumo di cibo e dell’efficienza alimentare devono essere effettuati almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. Se la sostanza chimica in esame è somministrata con l’acqua di abbeveraggio, il consumo di acqua deve essere misurato almeno una volta la settimana nelle prime 13 settimane e successivamente almeno una volta al mese. È utile tener conto della misurazione del consumo di acqua anche negli studi in cui quest’ultimo è alterato. | Ematologia, biochimica clinica e altre misurazioni | 53. | Al fine di sfruttare al massimo le informazioni ottenute dallo studio, soprattutto per quando riguarda le considerazioni legate alle modalità di azione è possibile effettuare dei prelievi di sangue ai fini di analisi ematologiche e di biochimica clinica, ma la scelta è a discrezione del responsabile scientifico dello studio. Potrebbe essere utile anche effettuare l’esame delle urine. I dati sugli animali usati nella fase relativa alla tossicità cronica dello studio, di norma dalla durata di 12 mesi (paragrafo 34) forniscono informazioni su questi parametri. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 116 (7) fornisce ulteriori indicazioni sul valore di tali campionamenti nel quadro di uno studio di cancerogenesi. Se alla fine del test si raccolgono campioni di sangue, ciò deve avvenire alla fine del periodo di prova, subito prima o nel corso della procedura di soppressione degli animali. Occorre che i campioni siano prelevati da un sito specifico, ad esempio con punture cardiache o dal seno retro-orbitale, sotto anestesia. Per l’esame possono essere preparati anche degli strisci di sangue, in particolare se si presume che il midollo osseo rientri tra gli organi bersaglio, sebbene il valore di tale esame degli strisci di sangue nella fase relativa alla cancerogenesi ai fini della valutazione del potenziale cancerogeno/oncogeno non sia indiscusso (38). | PATOLOGIA | Necroscopia macroscopica | 54. | Tutti gli animali dello studio, ad eccezione degli animali sentinella e di altri animali satellite (cfr. paragrafo 20), dovranno essere sottoposti ad una necroscopia completa, comprendente un accurato esame della superficie esterna del corpo, di tutti gli orifizi, della cavità cranica, toracica e addominale e del loro contenuto. Per gli animali sentinella e altri animali satellite, valutando caso per caso può essere necessaria un’autopsia, a discrezione del responsabile scientifico dello studio. Il peso degli organi di norma non rientra nello studio di cancerogenesi, poiché i cambiamenti geriatrici prima, e in fasi successive lo sviluppo di tumori hanno un effetto distorsivo sull’utilità dei relativi dati. Il peso degli organi potrebbe essere tuttavia importante ai fini della valutazione della forza probante dei dati e in particolare per considerazioni sulle modalità di azione. Se tali dati sono rilevati nel quadro di uno studio satellite, vanno raccolti a distanza di non oltre un anno dall’inizio dello studio. | 55. | I seguenti tessuti vanno conservati nel mezzo di fissazione più appropriato sia per il tipo di tessuto, sia per il previsto esame istopatologico successivo (40) (i tessuti tra parentesi quadre sono facoltativi): | tutte le lesioni macroscopiche | cuore | pancreas | stomaco (prestomaco, stomaco ghiandolare) | ghiandole surrenali | ileo | ghiandola paratiroidea | [denti] | aorta | digiuno | nervo periferico | testicoli | cervello (incluse le sezioni di cervello, cervelletto, bulbo/ponte) | reni | pituitaria | timo | intestino cieco | ghiandola lacrimale (esorbitale) | prostata, | tiroide | cervice | fegato | retto | [lingua] | ghiandola della coagulazione | polmone | ghiandola salivare | trachea | colon | linfonodi (superficiali e profondi) | vescicola seminale | vescica | duodeno | ghiandola mammaria (obbligatoria per esemplari di sesso femminile e, se visibile ai fini della la dissezione, anche per quelli di sesso maschile) | muscolo scheletrico | utero (cervice inclusa) | epididimo | [tratto respiratorio superiore, incluso il naso, i turbinati e i seni paranasali] | pelle | [uretere] | occhi (retina inclusa) | esofago | midollo spinale (a tre livelli: cervicale, mediotoracico e lombare) | [uretra] | [femore con articolazione] | [bulbo olfattivo] | milza | vagina | cistifellea (eccetto per i topi) | ovaia | [sterno] | sezione di midollo osseo e/o un aspirato di midollo osseo fresco | ghiandola di Harder | | | | In caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno conservati entrambi gli organi. I reperti clinici e di altro tipo possono evidenziare la necessità di esaminare altri tessuti. Vanno inoltre conservati tutti gli organi considerati organi bersaglio in base alle proprietà note della sostanza in esame. Negli studi che prevedono una somministrazione per via epidermica, vanno preservati gli organi di cui all’elenco riferito alla via orale. In particolare, è necessario procedere al campionamento e alla conservazione della pelle della zona di applicazione della sostanza. In studi che prevedono la via inalatoria come metodo di somministrazione, l’elenco dei tessuti da conservare ed esaminare in relazione al tratto respiratori deve corrispondere alle raccomandazioni contenute nel capitolo B.8 del presente allegato (8) e del capitolo B.29 del presente allegato (9). Per altri organi/tessuti (oltre ai tessuti conservati specificamente del tratto respiratorio) va esaminato l’elenco degli organi relativo alla via orale. | Esame istopatologico | 56. | Sono disponibili orientamenti sulle buone pratiche nella conduzione di studi di patologia tossicologica (40). Come minimo, vanno esaminati i seguenti tessuti: | — | tutti i tessuti dei gruppi ad alta dose e di controllo; | — | tutti i tessuti degli animali che sono morti o sono stati sacrificati nel corso dello studio; | — | tutti i tessuti che evidenziano anomalie macroscopiche, tumori compresi; | — | se si osservano dei cambiamenti istopatologici in relazione al trattamento nel gruppo ad alta dose, tali tessuti vanno esaminati in ogni animale di tutti gli altri gruppi-dose; | — | in caso di organi pari, ad esempio i reni o le ghiandole surrenali, vanno esaminati entrambi gli organi. | DATI E RELAZIONE (CANCEROGENESI E TOSSICITÀ CRONICA) | Dati | 57. | Devono essere forniti dati individuali su ciascun animale. Inoltre, tutti i dati vanno riassunti sotto forma di tabelle che indichino per ogni gruppo sperimentale il numero di animali presenti all’inizio della prova, il numero di animali trovati morti durante il test o sacrificati per motivi umanitari e il momento di tutti i decessi/soppressioni, il numero di animali che presentano segni di tossicità, una descrizione dei segni di tossicità osservati, quali momento dell’esordio, durata e gravità di tutti gli effetti tossici, il numero di animali che presentano lesioni, il tipo di lesioni e la percentuale di animali rapportata al tipo di lesione. Tabelle riassuntive dei dati devono fornire le medie e le deviazioni standard (per dati raccolti in via continuativa) relative agli animali che evidenziano effetti tossici o lesioni, oltre all’indicazione dell’entità delle lesioni. | 58. | I dati storici di controllo possono essere utili per interpretare i risultati dello studio, ad esempio quando i dati forniti da gruppi di controllo paralleli sembrano divergere significativamente da dati recenti relativi ad animali di controllo dello stesso centro di prova/della stessa colonia. Se valutati, i dati storici di controllo vanno trasmessi dallo stesso laboratorio e devono riferirsi ad animali della medesima età e dello stesso ceppo, nonché essere generati nei cinque anni che precedono lo studio in questione. | 59. | I risultati numerici vanno valutati mediante un metodo statistico adeguato e generalmente accettabile. I metodi statistici e i dati da analizzare vanno scelti già in sede di determinazione del disegno sperimentale. Questa scelta deve rendere possibili degli aggiustamenti in funzione del grado di sopravvivenza, se necessario. | 60. | La relazione sulla prova deve riportare le informazioni seguenti: | | Sostanza chimica in esame: | — | natura fisica, purezza e proprietà fisico-chimiche, | — | dati identificativi, | — | origine della sostanza chimica, | — | numero del lotto, | — | certificazione dell’analisi chimica. | | Veicolo (se del caso): | — | giustificazione per la scelta del veicolo, se diverso dall’acqua. | | Animali sperimentali. | — | specie/ceppo utilizzato e giustificazione della scelta effettuata, | — | numero, età e sesso degli animali all’inizio della prova, | — | origine, condizioni di stabulazione, dieta ecc., | — | peso di ciascun animale all’inizio del saggio. | | Condizioni sperimentali: | — | criteri di scelta della via di somministrazione e della dose, | — | laddove opportuno, metodi statistici usati per analizzare i dati, | — | dettagli sulla formulazione della sostanza chimica in esame/la preparazione della dieta, | — | dati di analisi sulla concentrazione, la stabilità e l’omogeneità della preparazione, | — | via di somministrazione e relativi dettagli della sostanza chimica in esame, | — | per gli studi che prevedono la somministrazione per via inalatoria, scelta tra esposizione “a naso solo” o “a corpo intero”, | — | dosi effettive (mg/kg di peso corporeo/giorno) e, se del caso, fattore di conversione tra la concentrazione della sostanza chimica in esame nella dieta/acqua di abbeveraggio (mg/kg o ppm) e la dose effettiva, | — | informazioni dettagliate sulla qualità del cibo e dell’acqua. | | Risultati (vanno indicati dati da presentare sotto forma di tabelle e dati individuali sugli animali) | | Dati generali: | — | dati sulla sopravvivenza degli animali, | — | peso corporeo/cambiamenti del peso corporeo, | — | assunzione di cibo, calcoli sull’efficienza alimentare, se effettuati, nonché consumo di acqua, se del caso, | — | dati tossicocinetici, se disponibili, | — | dati oftalmoscopici (se disponibili), | — | esami ematologici (se disponibili), | — | esami di chimica clinica (se disponibili). | | Risultati clinici: | — | segni di tossicità, | — | incidenza (e, se classificata, la gravità) di eventuali anomalie, | — | natura, gravità e durata dei segni clinici (reversibili o meno). | | Dati necroscopici: | — | peso corporeo finale, | — | peso degli organi (anche in relazione al peso corporeo, se del caso), | — | reperti necroscopici; incidenza e gravità delle anomalie. | | Esame istopatologico: | — | reperti istopatologici non neoplastici, | — | qualsiasi altro reperto istopatologico, | — | correlazione tra reperti macroscopici e microscopici, | — | descrizione particolareggiata di tutti i reperti istopatologici relativi al trattamento, inclusi i livelli di gravità, | — | relazioni su eventuali esami inter pares dei vetrini. | | Elaborazione statistica dei risultati, se del caso | | Discussione dei risultati: | — | discussione su tutti gli approcci di modellizzazione, | — | rapporti dose-risposta, | — | dati umani storici, | — | esame di tutte le informazioni sulle modalità di azione, | — | determinazione BMD, NOAEL o LOAEL, | — | rilevanza per gli esseri umani. | | Conclusioni | BIBLIOGRAFIA | (1) | OCSE (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Paris. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC. | (3) | Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163-208 | (4) | Barlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145-191 | (5) | Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437-445 | (6) | Capitolo B.27 del presente allegato, Test di tossicità orale subcronica Studio della tossicità orale con somministrazione ripetuta di dosi per 90 giorni sui non roditori. | (7) | OCSE (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 - Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, available on the OECD public website for Test Guideline at www.oecd.org/env/testguidelines | (8) | OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Capitolo B.8 del presente allegato, Tossicità subacuta a dose ripetuta (28 giorni) per inalazione. | (10) | Capitolo B.29 del presente allegato, Studio di tossicità subcronica a dose ripetuta (90 giorni) per inalazione. | (11) | Capitolo B.9 del presente allegato, Tossicità a dose ripetuta (28 giorni) per via cutanea. | (12) | Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36:793-801. | (13) | Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589. | (14) | Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. 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A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23. | (32) | IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. | (33) | Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999-1003. | (34) | Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health 9: 691-704. | (35) | Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267-283. | (36) | Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. 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Toxicologic Pathology 32: 126-131. | Appendice 1 | DEFINIZIONI | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. | » | 6. | poglavji B.32 in B.33 se nadomestita z naslednjima: | „B.32 ŠTUDIJE RAKOTVORNOSTI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 451 (2009). Prvotna TG 451 v zvezi s študijami rakotvornosti je bila sprejeta leta 1981. Priprava te revidirane preskusne metode B.32 je bila ocenjena kot nujna zaradi upoštevanja nedavnega razvoja na področju dobrobiti živali in zakonodajnih zahtev (2) (3) (4) (5) (6). Ta preskusna metoda B.32 je bila posodobljena vzporedno z revizijama poglavja B.30 te priloge z naslovom ‚Študije kronične strupenosti‘ in poglavja B.33 te priloge z naslovom ‚Kombinirane študije kronične strupenosti/rakotvornosti‘, da bi se z uporabo živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo več podatkov o izbiri odmerkov. Ta preskusna metoda B.32 je zasnovana za preskušanje zelo različnih kemikalij, vključno s pesticidi in industrijskimi kemikalijami. Vendar je treba opozoriti, da so lahko nekatere podrobnosti in zahteve za farmacevtske izdelke drugačne (glej Smernico Mednarodne konference o usklajevanju (ICH) S1B o preskušanju rakotvornosti farmacevtskih izdelkov). | 2. | Večina študij rakotvornosti se opravi na glodavcih, zato je ta preskusna metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso glodavci, se lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo načela in postopki, opisani v tej preskusni metodi, ter načela in postopki iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodavcih‘ (6). Več napotkov je na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (7). | 3. | Glavni trije načini dajanja, ki se uporabljajo v študijah rakotvornosti, so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira načina dajanja je odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prevladujočega načina izpostavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri načina izpostavljenosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 4. | Ta preskusna metoda je osredotočena na oralno izpostavljenost, ki se v študijah rakotvornosti uporablja najpogosteje. Študije rakotvornosti, ki vključujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavljenost, so lahko prav tako potrebne za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena načina izpostavljenosti tehnično precej zapletena. Take študije je treba zasnovati za vsak primer posebej, je pa mogoče preskusno metodo za ocenjevanje in vrednotenje rakotvornosti z oralnim načinom dajanja, opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo za protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporočila glede obdobij tretiranja, kliničnih in patoloških parametrov itd. Za dermalni (7) in inhalacijski način dajanja (7) (8) preskusnih kemikalij so na voljo napotki OECD. Pri zasnovi dolgoročnejših študij z inhalacijsko izpostavljenostjo je treba podrobno preučiti poglavji B.8 (9) in B.29 te priloge (10) ter Dokument s smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdihavanju (8). V primeru preskušanja z dermalnim načinom dajanja je treba upoštevati poglavje B.9 te priloge (11). | 5. | S študijo rakotvornosti se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki se lahko pojavijo ob ponavljajoči se izpostavljenosti v obdobju, ki obsega največ celotno življenjsko dobo uporabljene vrste. Z njo se pridobijo informacije o strupenih učinkih preskusne kemikalije, vključno s potencialno rakotvornostjo, lahko pa se nakažejo tudi ciljni organi in možnost kopičenja. S študijo se lahko oceni vrednost brez opaženega škodljivega učinka za strupene učinke in – v primeru rakotvornih snovi, ki niso genotoksične – za tumorske odzive, ki se lahko uporabi za določitev varnostnih meril za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi potreba po skrbnem kliničnem opazovanju živali, da se pridobi kar največ informacij. | 6. | Cilji študij rakotvornosti, na katere se nanaša ta preskusna metoda, vključujejo: | — | opredelitev rakotvornih lastnosti preskusne kemikalije, ki v primerjavi s sočasnimi kontrolnimi skupinami privedejo do povečane pojavnosti novotvorb, povečanega deleža malignih novotvorb ali skrajšanja časa do pojava novotvorb, | — | opredelitev ciljnih organov rakotvornosti, | — | opredelitev časa do pojava novotvorb, | — | opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom za tumorje, | — | opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega učinka (NOAEL) ali izhodiščne točke za določitev primerjalnega odmerka (benchmark dose – BMD), | — | ekstrapolacijo rakotvornih učinkov na stopnje izpostavljenosti ljudi pri majhnih odmerkih, | — | zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede načina delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15). | ZAČETNI PREUDARKI | 7. | Pri ocenjevanju in vrednotenju potencialne rakotvornosti preskusne kemikalije mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, da se zasnova študije osredotoči na učinkovitejše preskušanje rakotvornega potenciala in da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Informacije o načinu delovanja domnevne rakotvorne snovi in upoštevanje njenega načina delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15) so posebej pomembni, saj se lahko optimalna zasnova študije razlikuje glede na to, ali je preskusna kemikalija znana ali domnevna genotoksična rakotvorna snov. Več napotkov o preudarkih v zvezi z načinom delovanja je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 8. | Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo, vključno s preskusi genotoksičnosti; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR, podatke o mutagenosti/genotoksičnosti in rakotvornosti ter druge toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh; razpoložljive toksikokinetične podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem odmerku in tudi pri ponavljajočih se odmerkih, če so na voljo) ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajočo se izpostavljenostjo. Rakotvornost je treba ocenjevati šele po pridobitvi začetnih informacij o strupenosti na podlagi 28-dnevnega in/ali 90-dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajočimi se odmerki. Koristne informacije se lahko zagotovijo tudi s kratkoročnimi preskusi iniciacije/spodbujanja razvoja raka. V okviru splošne ocene potencialnih škodljivih učinkov določene preskusne kemikalije na zdravje je treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju rakotvornosti (16) (17) (18) (19). | 9. | Pred začetkom študije je treba določiti najprimernejše statistične metode za analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, o katerih je treba razmisliti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vključevati prilagoditev glede na preživetje, analizo kumulativnih tveganj tumorjev glede na trajanje preživetja, analizo časa do pojava tumorjev in analizo v primeru predčasnega prenehanja tretiranja ene ali več skupin. Napotki o primernih statističnih analizah in ključne reference mednarodno priznanih statističnih metod so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v Dokumentu s smernicami št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (20). | 10. | Pri izvajanju študije rakotvornosti je treba vedno upoštevati vodilna načela in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 o prepoznavanju, ocenjevanju in uporabi kliničnih znakov kot humanih končnih točk za preskusne živali v oceni varnosti (21), zlasti odstavek 62 navedenega dokumenta. V tem odstavku je navedeno: ‚Pri študijah, ki vključujejo ponavljajoče se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odločitev, ali naj se žival humano usmrti ali ne, če kaže klinične znake, ki se stopnjujejo in vodijo v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odločitev mora vključevati razmislek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranitvijo zadevne živali v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme odločitev, da se žival ohrani v preskusu, je treba po potrebi povečati pogostnost opazovanj. Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa začasno prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bolečine ali trpljenje, ali da se zmanjša preskusni odmerek.‘ | 11. | Podrobni napotki in razprava o načelih izbire odmerkov za študije kronične strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (22) (23). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glavnega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni ter opredeljevanjem učinkov majhnih odmerkov in njihovim pomenom na drugi strani. To je zlasti pomembno, kadar bo izvedena kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) (odstavek 12). | 12. | Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto ločene izvedbe študije kronične strupenosti (poglavje B.30 te priloge) in študije rakotvornosti (ta preskusna metoda B.32) izvede kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge). S kombiniranim preskusom se v primerjavi z izvedbo dveh ločenih študij zagotovi večja učinkovitost v smislu časa in stroškov, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost podatkov v fazi v zvezi s kronično strupenostjo ali fazi v zvezi z rakotvornostjo. Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kronične strupenosti in rakotvornosti (poglavje B.33 te priloge) skrbno upoštevati načela izbire odmerkov (odstavki 11 in 22–25), poleg tega pa se tudi priznava, da se na podlagi nekaterih zakonodajnih okvirov lahko zahteva ločena izvedba študij. | 13. | Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | NAČELO PRESKUSA | 14. | Preskusna kemikalija se dnevno v stopnjevanih odmerkih daje več skupinam preskusnih živali, pri čemer preskus traja večino njihove življenjske dobe, način dajanja pa je navadno oralni. Primerno je lahko tudi preskušanje z inhalacijskim ali dermalnim načinom dajanja. Živali je treba pozorno opazovati, da se odkrijejo znaki strupenosti in nastanek neoplastičnih lezij. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih opravi obdukcija. | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 15. | Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju rakotvornosti pri glodavcih (odstavek 2). O uporabi vrst, ki niso glodavci, se lahko razmisli, kadar razpoložljivi podatki kažejo, da so ustreznejše za napovedovanje učinkov na zdravje ljudi. Izbiro živalske vrste je treba utemeljiti. Priporočena vrsta glodavca je podgana, uporabijo pa se lahko tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Čeprav je uporabnost miši pri preskušanju rakotvornosti lahko omejena (24) (25) (26), se lahko z nekaterimi veljavnimi zakonodajnimi ureditvami še vedno zahteva preskušanje rakotvornosti na miših, razen če se ugotovi, da taka študija z znanstvenega vidika ni nujna. Podgane in miši so najprimernejši preskusni modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razširjene uporabe v farmakoloških in toksikoloških študijah, občutljivosti za indukcijo tumorjev ter razpoložljivosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi teh lastnosti je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 16. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Po možnosti je treba v študiji rakotvornosti uporabiti isti sev in izvor živali kot v predhodnih krajših študijah strupenosti, čeprav je treba – če je znano, da se pri živalih zadevnega seva in izvora pojavljajo težave pri doseganju običajno sprejetih meril preživetja za dolgoročne študije (glej Dokument s smernicami št. 116 (7)) – razmisliti o uporabi seva živali, katerega stopnja preživetja je sprejemljiva za dolgoročno študijo. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. | Nastanitev in hranjenje | 17. | Živali se lahko nastanijo posamično ali dajo v kletke v manjših skupinah istega spola; posamična nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno utemeljena (27) (28) (29). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura prostora s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontaminantov v hranilih in hrani, vsaj na začetku študije in kadar se zamenja serija uporabljane kemikalije, ter jih vključiti v končno poročilo. Prav tako je treba zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju prehranskih potreb živali. | Priprava živali | 18. | Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale laboratorijskim razmeram in še niso bile vključene v preskusne postopke. V primeru glodavcev je treba odmerke začeti dajati čim prej po odstavitvi od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupinami v okviru vsakega spola ne sme biti večjih razlik v povprečni telesni teži. Če obstajajo statistično pomembne razlike, je treba fazo randomizacije ponoviti, če je to mogoče. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identifikacijsko številko in jo trajno označiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo mikročipa ali drugo ustrezno metodo. | POSTOPEK | Število in spol živali | 19. | Uporabiti je treba oba spola. Živali mora biti dovolj za temeljito biološko in statistično ocenjevanje. Zato mora vsaka odmerna skupina in sočasna kontrolna skupina vsebovati najmanj 50 živali vsakega spola. Glede na namen študije je mogoče povečati statistično moč ključnih ocen z neenakim dodeljevanjem živali različnim odmernim skupinam, tako da je v skupinah, tretiranih z majhnimi odmerki, več kot 50 živali, npr. za ocenjevanje rakotvornega potenciala pri majhnih odmerkih. Vendar se je treba zavedati, da je ob zmernem povečanju velikosti skupine povečanje statistične moči študije razmeroma majhno. Več informacij o statistični zasnovi študije in izbiri velikosti odmerkov za čim obsežnejše povečanje statistične moči je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | Uporaba vmesnih usmrtitev in satelitskih (opozorilnih) skupin | 20. | Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne usmrtitve, npr. pri 12 mesecih, da se zagotovijo informacije o napredovanju neoplastičnih sprememb in mehanistične informacije. Kadar so take informacije že na voljo iz prejšnjih študij strupenosti s ponavljajočimi se odmerki v zvezi z zadevno preskusno kemikalijo, vmesne usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Če se v zasnovo študije vključijo vmesne usmrtitve, število živali v vsaki odmerni skupini, za katere se načrtuje vmesna usmrtitev, navadno znaša 10 živali na spol, skupno število živali v zasnovi študije pa je treba povečati za toliko, kolikor se jih namerava usmrtiti pred zaključkom študije. Poleg tega se lahko po potrebi predvidi dodatna skupina opozorilnih živali (običajno 5 živali vsakega spola) za spremljanje patološkega stanja med študijo (30). Več napotkov je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | Odmerne skupine in odmerjanje | 21. | Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih velikosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Uporabiti je treba najmanj tri velikosti odmerkov in sočasno kontrolo. Velikosti odmerkov navadno temeljijo na rezultatih kratkoročnejših študij s ponavljajočimi se odmerki ali študij za ugotavljanje območja, pri njihovem določanju pa je treba upoštevati vse obstoječe toksikološke in toksikokinetične podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. | 22. | Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških učinkov preskusne kemikalije to ni mogoče, je treba največjo velikost odmerka izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih učinkov, pri čemer se je treba izogibati povzročanju trpljenja, hude zastrupitve, obolevnosti ali smrti. Ob upoštevanju dejavnikov, navedenih v odstavku 23 spodaj, je treba največji odmerek praviloma izbrati tako, da se izzovejo znaki strupenosti, na primer upočasnitev pridobivanja telesne teže (približno 10-odstotna). Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi največji odmerek, manjši od odmerka, ki povzroča znake strupenosti, npr. če odmerek izzove škodljiv učinek, ki vzbuja zaskrbljenost, ne vpliva pa bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. | 23. | Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za določanje odziva v odvisnosti od odmerka in – glede na način delovanja preskusne kemikalije – vrednosti NOAEL ali drugega želenega rezultata študije, npr. BMD (glej odstavek 25) pri najmanjšem odmerku. Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri določitvi manjših odmerkov, vključujejo pričakovani naklon krivulje odmerek-odziv, odmerke, pri katerih se lahko pojavijo pomembne spremembe v presnovi ali načinu strupenega delovanja, velikost, pri kateri se pričakuje prag, ali velikost, pri kateri se pričakuje izhodiščna točka za ekstrapolacijo majhnih odmerkov. | 24. | Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od lastnosti preskusne kemikalije in je v tej preskusni metodi ni mogoče predpisati, vendar dva- do štirikratni intervali velikokrat zagotovijo visoko učinkovitost preskusa pri določanju padajočih velikosti odmerkov, namesto uporabe zelo velikih intervalov (npr. večjih od faktorja približno 6–10) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati četrto preskusno skupino. Na splošno se je treba izogibati uporabi faktorjev, večjih od 10, če se uporabijo, pa je to treba utemeljiti. | 25. | Kot je nadalje opisano v Dokumentu s smernicami št. 116 (7), je treba pri izbiri odmerkov upoštevati: | — | znane ali domnevne nelinearnosti ali točke pregiba na krivulji odmerek-odziv, | — | toksikokinetiko in odmerna območja, v katerih se pojavljajo ali ne pojavljajo presnovna indukcija, nasičenje ali nelinearnost med zunanjimi in notranjimi odmerki, | — | prekurzorske lezije, označevalce učinka ali kazalnike delovanja ključnih temeljnih bioloških procesov, | — | ključne (ali domnevne) vidike načina delovanja, kot so odmerki, pri katerih se začne pojavljati citotoksičnost, so ravni hormonov motene, homeostatični mehanizmi preobremenjeni itd., | — | predele krivulje odmerek-odziv, v katerih je potrebna posebno zanesljiva ocena, npr. v območju pričakovanega BMD ali predvidenega praga, | — | preudarke v zvezi s pričakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi. | 26. | Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusnih skupinah, le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora kontrolna skupina prejeti največjo količino nosilca, ki je bila uporabljena med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem zaradi njene manjše okusnosti povzroči bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja kot primernejša kontrola. | Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije | 27. | Preskusna kemikalija se običajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo oziroma z gavažo. Dodatne informacije o načinih in metodah dajanja so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Način in metoda dajanja sta odvisna od namena študije, fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujočega načina in metode izpostavljenosti ljudi. Izbrani način in metodo dajanja je treba utemeljiti. Zaradi dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri tistih snoveh, pri katerih sta ta način in metoda dajanja razumno reprezentativna za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). Prehranske in okoljske kemikalije, vključno s pesticidi, se navadno dajejo s hrano ali pitno vodo. Pri nekaterih scenarijih, npr. izpostavljenosti na delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi načini dajanja. | 28. | Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, kot je ustrezno: učinke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo preskusne kemikalije, učinke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter učinke na porabo hrane ali vode ali na prehranjenost živali. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homogenosti raztopin ali hrane, ki se bodo uporabljale v preskusu (kot je ustrezno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). | 29. | Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehranjevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoročnih študijah strupenosti, pri katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se preprečijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg telesne teže), ki se izračuna vsak teden. Uporabljeni način je treba navesti. | 30. | V primeru oralnega dajanja živali dobivajo odmerek preskusne kemikalije vsak dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa pri glodavcih navadno traja 24 mesecev (glej tudi odstavek 32). Vsak drugačen režim odmerjanja, npr. pet dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali s preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na teden, kot je navedeno v poglavju B.9 te priloge (11), prek obdobja 24 mesecev. Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, uporabiti pa je mogoče tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. Obdobje izpostavljenosti praviloma traja 24 mesecev. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na dan, je treba utemeljiti. Glej tudi poglavje B.8 te priloge (9). | 31. | Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem uporabljati želodčno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko dnevno odmerjena količina ohranja tudi z dajanjem polovičnih odmerkov (dvakrat na dan). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. To količino je treba ohranjati tako majhno, kot je praktično, praviloma pa pri glodavcih ne sme preseči 1 ml/100 g telesne teže (31). Spremenljivost preskusne količine je treba kar najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali dražilne kemikalije, ki jih je treba razredčiti, da se preprečijo resni lokalni učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati. | Trajanje študije | 32. | Študija pri glodavcih navadno traja 24 mesecev, kar ustreza večini normalne življenjske dobe živali, ki bodo uporabljene. Glede na življenjsko dobo in sev živalske vrste v študiji se lahko uporabijo tudi krajša ali daljša obdobja študije, vendar je treba to utemeljiti. Za nekatere seve miši, npr. AKR/J, C3H/J ali C57BL/6J, je lahko primernejše 18-mesečno obdobje. V nadaljevanju je nekaj napotkov o trajanju in zaključku študije ter preživetju; več napotkov, vključno s preudarki o sprejemljivosti negativnih rezultatov študije rakotvornosti glede na preživetje v študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (7). | — | Kadar število preživelih živali v skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, ali kontrolni skupini pade pod 25 %, je treba razmisliti o zaključku študije. | — | Kadar zaradi strupenosti prezgodaj poginejo samo živali v skupini, tretirani z velikim odmerkom, to ne sme biti razlog za zaključek študije. | — | Preživetje je treba obravnavati ločeno za vsak spol. | — | Študija se ne sme podaljševati prek točke, ko razpoložljivi podatki iz študije ne zadoščajo več za statistično veljavno oceno. | OPAZOVANJA | 33. | Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, običajno na začetku in koncu vsakega dne, vključno s konci tedna in prazniki. Poleg tega je treba živali pregledati enkrat na dan za odkrivanje konkretnih toksikološko pomembnih znakov, ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka, če gre za dajanje z gavažo. Posebno pozornost je treba nameniti nastanku tumorjev ter zabeležiti čas nastopa, mesto, mere, videz in progresijo vsakega makroskopsko vidnega ali otipljivega tumorja. | Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane | 34. | Vse živali je treba stehtati na začetku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja. | Hematološke, klinične biokemične in druge meritve | 35. | Da bi se s študijo pridobilo kar največ informacij, zlasti kar zadeva razmisleke o načinu delovanja, se lahko jemljejo vzorci krvi za hematološke in klinične biokemične preiskave, o čemer odloči vodja študije. Primerna je lahko tudi analiza urina. Več napotkov o vrednosti jemanja takih vzorcev v okviru študije rakotvornosti je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Če se štejeta za primerna, se lahko odvzem vzorcev krvi za hematološke in klinične kemične preiskave ter analiza urina opravita kot del vmesne usmrtitve (odstavek 20) ter ob zaključku študije na najmanj 10 živalih na spol na skupino. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji, in jih shraniti, če je ustrezno, v primernih pogojih. Za pregled se lahko pripravijo tudi krvni razmazi, zlasti če kaže, da je ciljni organ kostni mozeg, čeprav so bili izraženi dvomi o vrednosti takega pregleda za ocenjevanje rakotvornega/onkogenega potenciala (32). | PATOLOGIJA | Makroskopska obdukcija | 36. | Na vseh živalih v študiji, razen na opozorilnih (glej odstavek 20) in drugih satelitskih živalih, se opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Za opozorilne in druge satelitske živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odloča vodja študije. Tehtanje organov navadno ni del študije rakotvornosti, saj je zaradi sprememb, povezanih s staranjem, v poznejših fazah pa zaradi nastanka tumorjev, lahko motena koristnost podatkov o teži organov. So pa lahko ti podatki odločilni za oceno zanesljivosti dokazov in zlasti za preudarke v zvezi z načinom delovanja. Če je teža organov del satelitske študije, jo je treba izmeriti najpozneje 1 leto po začetku študije. | 37. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (33) (tkiva v oglatih oklepajih niso obvezna): | vse vidne lezije | srce | trebušna slinavka | želodec (predželodec, žlezni želodec) | nadledvična žleza | vito črevo | obščitnica | [zobje] | aorta | tešče črevo | periferni živec | modo | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | ledvica | hipofiza | priželjc | slepo črevo | solzna žleza (zunaj očesne votline) | prostata | ščitnica | maternični vrat | jetra | rektum | [jezik] | koagulacijska žleza | pljuča | žleza slinavka | sapnik | debelo črevo | bezgavke (povrhnje in globoke) | semenski mešiček | sečni mehur | dvanajsternik | mlečna žleza (obvezna za samice, in če jo je mogoče secirati s prostim očesom, za samce) | skeletna mišica | maternica (vključno z vratom) | nadmodek | [zgornja dihala, vključno z nosom, nosnimi školjkami in obnosnimi votlinami] | koža | [sečevod] | oko (vključno z mrežnico) | požiralnik | hrbtenjača (na treh ravneh: vratni, prsni in ledveni) | [sečnica] | [stegnenica s sklepom] | [vohalni betič] | vranica | vagina | žolčnik (pri vrstah, ki niso podgane) | jajčnik | [prsnica] | rezina in/ali svež punktat kostnega mozga | Harderjeva žleza | | | | Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba shraniti oba organa. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim načinom dajanja je treba shraniti iste organe, kot so določeni na seznamu za oralni način, bistveno pa je posebno vzorčenje in shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporočilom iz poglavij B.8 in B.29 te priloge. Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preučiti seznam organov, določen za oralni način dajanja. | Histopatologija | 38. | Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patoloških študij (33). Pregledati je treba vsaj naslednja tkiva: | — | vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne skupine, | — | vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmrčene med študijo, | — | vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, vključno s tumorji, | — | kadar so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretiranjem povezane histopatološke spremembe, je treba pregledati ista tkiva vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, | — | pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba pregledati oba organa. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 39. | Navesti je treba podatke za posamezne živali za vse ocenjevane parametre. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake zastrupitve, opis opaženih znakov zastrupitve, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih učinkov, ter število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi podatki je treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni učinki ali lezije, ter razvrstitev lezij. | 40. | Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s sočasnimi kontrolami, bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija ter se nanašati na živali iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih pred zadevno študijo. | 41. | Če je ustrezno, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Statistične metode in podatke, ki bodo analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 9). V izbiri je treba predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne. | Poročilo o preskusu | 42. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijske podatke, | — | izvor kemikalije, | — | številko serije, | — | potrdilo o kemijski analizi. | | Nosilec (če je ustrezno) | — | utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda). | | Preskusne živali | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev izbire, | — | število, starost in spol živali na začetku preskusa, | — | izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., | — | težo vsake živali ob začetku preskusa. | | Preskusni pogoji | — | utemeljitev načina dajanja in izbire odmerkov, | — | če je ustrezno, uporabljene statistične metode za analizo podatkov, | — | podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, | — | analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, | — | način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, | — | za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost nosu ali izpostavljenost celega telesa, | — | dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v dejanski odmerek, če je ustrezno, | — | podatke o kakovosti hrane in vode. | | Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za posamezne živali) | | Splošno | — | podatke o preživetju, | — | telesno težo/spremembe telesne teže, | — | porabo hrane, izračune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo vode, če je ustrezno, | — | toksikokinetične podatke (če so na voljo), | — | oftalmoskopiranje (če so podatki na voljo), | — | hematologijo (če so podatki na voljo), | — | klinično kemijo (če so podatki na voljo). | | Klinični izsledki | — | znake zastrupitve, | — | pojavnost (in resnost, če se ocenjuje) vseh abnormalnosti, | — | vrsto, resnost in trajanje kliničnih opažanj (prehodnih ali trajnih). | | Obdukcijski podatki | — | terminalno telesno težo, | — | težo organov in razmerja med težami organov, če je ustrezno, | — | izsledke obdukcije; pojavnost in resnost abnormalnosti. | | Histopatologija | — | neneoplastične ugotovitve histopatoloških preiskav, | — | neoplastične ugotovitve histopatoloških preiskav, | — | povezanost makroskopskih in mikroskopskih ugotovitev, | — | podroben opis vseh s tretiranjem povezanih ugotovitev histopatoloških preiskav, vključno z razvrstitvami resnosti, | — | navedbo morebitnih medsebojnih strokovnih pregledov mikroskopskih preparatov. | | Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno | | Razprava o rezultatih | — | razpravo o pristopih modeliranja, | — | razmerja med odmerkom in odzivom, | — | pretekle kontrolne podatke, | — | preučitev vseh informacij o načinu delovanja, | — | določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, | — | pomembnost za ljudi. | | Sklepi. | VIRI: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. | (3) | Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. | (4) | Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191. | (5) | Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. | (6) | Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkronične oralne toksičnosti: 90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodalcih. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druga izdaja. Series on Testing and Assessment No. 116, na voljo na javni spletni strani OECD o smernicah za preskušanje na naslovu www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (9) | Poglavje B.8 te priloge, Subakutna strupenost pri vdihavanju: 28-dnevna študija. | (10) | Poglavje B.29 te priloge, Subkronična strupenost pri vdihavanju: 90-dnevna študija. | (11) | Poglavje B.9 te priloge, Strupenost (v stiku s kožo) pri ponavljajočem se odmerku (28 dni). | (12) | Boobis, A. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M. E., Vickers, C., Willcocks, D., Farland, W. (2006). IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, 36: 793–801. | (13) | Cohen, S. M., Meek, M. E., Klaunig, J. E., Patton, D. E., in Fenner-Crisp, P. A. (2003). The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589. | (14) | Holsapple, M. P., Pitot, H. C., Cohen, S. N., Boobis, A. R., Klaunig, J. E., Pastoor, T., Dellarco, V. L., Dragan, Y. P. (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51–56. | (15) | Meek, E. M., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., Lehman-McKemmon, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton, D. E. (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591–653. | (16) | Carmichael, N. G., Barton, H. 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Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment No. 35 and Series on Pesticides No. 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Pariz. | (21) | OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pariz. | (22) | Rhomberg, L. R., Baetcke, K., Blancato, J., Bus, J., Cohen, S., Conolly, R., Dixit, R., Doe, J., Ekelman, K., Fenner-Crisp, P., Harvey, P., Hattis, D., Jacobs, A., Jacobson-Kram, D., Lewandowski, T., Liteplo, R., Pelkonen, O., Rice, J., Somers, D., Turturro, A., West, W., Olin, S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837. | (23) | ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran, J. A. (ur.). ILSI Press, Washington, DC. | (24) | Griffiths, S. A., Parkinson, C., McAuslane, J. A. N., in Lumley, C. E. (1994). The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1): 214. | (25) | Usui, T., Griffiths, S. A., in Lumley, C. E. (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. V: D’Arcy POF & Harron DWG (ur.). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. str. 279–284. | (26) | Carmichael, N. G., Enzmann, H., Pate, I., Waechter, F. (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203. | (27) | Direktiva 2010/63/EU Evropskega parlamenta in Sveta z dne 22. septembra 2010 o zaščiti živali, ki se uporabljajo v znanstvene namene (UL L 276, 20.10.2010, str. 33). | (28) | National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86–23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. | (29) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2. | (30) | GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. | (31) | Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., Pfister, R., Rabemampianina, Y., Smith, D., Vidal, J.-M., van de Vorstenbosch, C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23. | (32) | Weingand, K., idr. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fund. Appl. Toxicol. 29: 198–201. | (33) | Crissman, J., Goodman, D., Hildebrandt, P., idr. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | B.33 KOMBINIRANE ŠTUDIJE KRONIČNE STRUPENOSTI/RAKOTVORNOSTI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 453 (2009). Prvotna TG 453 je bila sprejeta leta 1981. Priprava te posodobljene preskusne metode B.33 je bila ocenjena kot nujna zaradi upoštevanja nedavnega razvoja na področju dobrobiti živali in zakonodajnih zahtev (1) (2) (3) (4) (5). Ta preskusna metoda B.33 je bila posodobljena vzporedno z revizijama poglavja B.32 te priloge z naslovom ‚Študije rakotvornosti‘ in poglavja B.30 te priloge z naslovom ‚Študije kronične strupenosti‘, da bi se z uporabo živali v študiji pridobile dodatne informacije in da bi se zagotovilo več podatkov o izbiri odmerkov. Ta preskusna metoda je zasnovana za preskušanje zelo različnih kemikalij, vključno s pesticidi in industrijskimi kemikalijami. Vendar je treba opozoriti, da so lahko nekatere podrobnosti in zahteve za farmacevtske izdelke drugačne (glej Smernico Mednarodne konference o usklajevanju (ICH) S1B o preskušanju rakotvornosti farmacevtskih izdelkov). | 2. | Večina študij kronične strupenosti in rakotvornosti se opravi na glodavcih, zato je ta preskusna metoda namenjena zlasti uporabi v študijah, opravljenih na teh živalskih vrstah. Če bi bilo take študije treba izvesti na vrstah, ki niso glodavci, se lahko z ustreznimi prilagoditvami prav tako uporabijo načela in postopki, opisani v tej metodi, ter načela in postopki iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodavcih‘ (6), kot je navedeno v Dokumentu s smernicami OECD št. 116 o zasnovi in izvajanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (7). | 3. | Glavni trije načini dajanja, ki se uporabljajo v študijah kronične strupenosti/rakotvornosti, so oralni, dermalni in inhalacijski. Izbira načina dajanja je odvisna od fizikalnih in kemijskih lastnosti preskusne kemikalije ter prevladujočega načina izpostavljenosti ljudi. Dodatne informacije o izbiri načina izpostavljenosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 4. | Ta preskusna metoda je osredotočena na oralno izpostavljenost, ki se v študijah kronične strupenosti in rakotvornosti uporablja najpogosteje. Dolgoročne študije, ki vključujejo dermalno ali inhalacijsko izpostavljenost, so lahko prav tako lahko potrebne za oceno tveganja za zdravje ljudi in/ali na podlagi nekaterih zakonodajnih ureditev, vendar pa sta oba navedena načina izpostavljenosti tehnično precej zapletena. Take študije je treba zasnovati za vsak primer posebej, je pa mogoče preskusno metodo za ocenjevanje in vrednotenje kronične strupenosti in rakotvornosti z oralnim načinom dajanja, opisano v tem dokumentu, uporabiti kot osnovo za protokol za inhalacijske in/ali dermalne študije, kar zadeva priporočila glede obdobij tretiranja, kliničnih in patoloških parametrov itd. Za inhalacijski (7) (8) in dermalni način dajanja (7) preskusnih kemikalij so na voljo napotki OECD. Pri zasnovi dolgoročnejših študij z inhalacijsko izpostavljenostjo je treba podrobno preučiti poglavji B.8 (9) in B.29 te priloge (10) ter Dokument s smernicami OECD o preskušanju akutne strupenosti pri vdihavanju (8). V primeru preskušanja z dermalnim načinom dajanja je treba upoštevati poglavje B.9 te priloge (11). | 5. | S kombinirano študijo kronične strupenosti/rakotvornosti se pridobivajo informacije o možnih nevarnostih za zdravje, ki se lahko pojavijo ob ponavljajoči se izpostavljenosti v obdobju, ki obsega največ celotno življenjsko dobo uporabljene vrste. Z njo se pridobijo informacije o strupenih učinkih preskusne kemikalije, vključno s potencialno rakotvornostjo, nakažejo se ciljni organi in možnost kopičenja. S študijo se lahko oceni vrednost brez opaženega škodljivega učinka za strupene učinke in – v primeru rakotvornih snovi, ki niso genotoksične – za tumorske odzive, ki se lahko uporabi za določitev varnostnih meril za izpostavljenost ljudi. Poudarjena je tudi potreba po skrbnem kliničnem opazovanju živali, da se pridobi kar največ informacij. | 6. | Cilji študij kronične strupenosti/rakotvornosti, na katere se nanaša ta preskusna metoda, vključujejo: | — | opredelitev rakotvornih lastnosti preskusne kemikalije, ki v primerjavi s sočasnimi kontrolnimi skupinami privedejo do povečane pojavnosti novotvorb, povečanega deleža malignih novotvorb ali skrajšanja časa do pojava novotvorb, | — | opredelitev časa do pojava novotvorb, | — | opredelitev kronične strupenosti preskusne kemikalije, | — | opredelitev ciljnih organov kronične strupenosti in rakotvornosti, | — | opredelitev razmerja med odmerkom in odzivom, | — | opredelitev vrednosti brez opaženega škodljivega učinka (NOAEL) ali izhodiščne točke za določitev primerjalnega odmerka (benchmark dose – BMD), | — | ekstrapolacijo rakotvornih učinkov na stopnje izpostavljenosti ljudi pri majhnih odmerkih, | — | napoved učinkov kronične strupenosti pri stopnjah izpostavljenosti ljudi, | — | zagotovitev podatkov za preskušanje hipotez glede načina delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15). | ZAČETNI PREUDARKI | 7. | Pri ocenjevanju in vrednotenju potencialne rakotvornosti in kronične strupenosti preskusne kemikalije mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, da se zasnova študije osredotoči na učinkovitejše preskušanje toksikoloških lastnosti te kemikalije in da se kar najbolj zmanjša uporaba živali. Informacije o načinu delovanja domnevne rakotvorne snovi in upoštevanje njenega načina delovanja (2) (7) (12) (13) (14) (15) so posebej pomembni, saj se lahko optimalna zasnova študije razlikuje glede na to, ali je preskusna kemikalija znana ali domnevna genotoksična rakotvorna snov. Več napotkov o preudarkih v zvezi z načinom delovanja je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 8. | Informacije, ki pomagajo pri zasnovi študije, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; vse informacije o načinu delovanja; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo, vključno s preskusi genotoksičnosti; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR, podatke o mutagenosti/genotoksičnosti in rakotvornosti ter druge toksikološke podatke o strukturno sorodnih snoveh; razpoložljive toksikokinetične podatke (podatke o kinetiki pri enkratnem odmerku in tudi pri ponavljajočih se odmerkih, če so na voljo) ter podatke, pridobljene z drugimi študijami s ponavljajočo se izpostavljenostjo. Kronično strupenost/rakotvornost je treba ugotavljati šele po pridobitvi začetnih informacij o strupenosti na podlagi 28-dnevnega in/ali 90-dnevnega preskusa strupenosti s ponavljajočimi se odmerki. Koristne informacije se lahko zagotovijo tudi s kratkoročnimi preskusi iniciacije/spodbujanja razvoja raka. V okviru splošne ocene potencialnih škodljivih učinkov določene preskusne kemikalije na zdravje je treba razmisliti o postopnem pristopu k preskušanju rakotvornosti (16) (17) (18) (19). | 9. | Pred začetkom študije je treba določiti najprimernejše statistične metode za analizo rezultatov ob upoštevanju zasnove in ciljev preskusa. Med vidiki, ki jih je treba preučiti, je tudi vprašanje, ali bi morala statistika vključevati prilagoditev glede na preživetje, analizo kumulativnih tveganj tumorjev glede na trajanje preživetja, analizo časa do pojava tumorjev in analizo v primeru predčasnega prenehanja tretiranja ene ali več skupin. Napotki o primernih statističnih analizah in ključne reference mednarodno priznanih statističnih metod so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v Dokumentu s smernicami št. 35 o analizi in ocenjevanju študij kronične strupenosti in rakotvornosti (20). | 10. | Pri izvajanju študije rakotvornosti je treba vedno upoštevati vodilna načela in preudarke, opisane v Dokumentu s smernicami OECD o prepoznavanju, ocenjevanju in uporabi kliničnih znakov kot humanih končnih točk za preskusne živali v oceni varnosti (21), zlasti odstavek 62 navedenega dokumenta. V tem odstavku je navedeno: ‚Pri študijah, ki vključujejo ponavljajoče se odmerke, je treba sprejeti premišljeno odločitev, ali naj se žival humano usmrti ali ne, če kaže klinične znake, ki se stopnjujejo in vodijo v dodatno poslabšanje njenega stanja. Ta odločitev mora vključevati razmislek o vrednosti informacij, ki bodo pridobljene z ohranitvijo zadevne živali v študiji glede na njeno splošno stanje. Če se sprejme odločitev, da se žival ohrani v preskusu, je treba po potrebi povečati pogostnost opazovanj. Obstaja tudi možnost, da se brez ogrožanja namena preskusa začasno prekine dajanje odmerkov, če bi to ublažilo bolečine ali trpljenje, ali da se zmanjša preskusni odmerek.‘ | 11. | Podrobni napotki in razprava o načelih izbire odmerkov za študije kronične strupenosti in rakotvornosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7) ter v dveh publikacijah, ki ju je pripravil International Life Sciences Institute (22) (23). Osrednja strategija izbire odmerkov je odvisna od glavnega cilja ali ciljev študije (odstavek 6). Pri izbiri ustreznih velikosti odmerkov je treba najti ravnotežje med spremljanjem nevarnosti na eni strani ter opredeljevanjem učinkov majhnih odmerkov in njihovim pomenom na drugi. To je zlasti pomembno v primeru te kombinirane študije kronične strupenosti in rakotvornosti. | 12. | Razmisliti je treba o možnosti, da se namesto ločene izvedbe študije kronične strupenosti (poglavje B.30 te priloge) in študije rakotvornosti (poglavje B.32 te priloge) izvede ta kombinirana študija kronične strupenosti in rakotvornosti. S kombiniranim preskusom se v primerjavi z izvedbo dveh ločenih študij zagotovi večja učinkovitost v smislu časa in stroškov ter se nekoliko zmanjša uporaba živali, ne da bi bila pri tem ogrožena kakovost podatkov v fazi v zvezi s kronično strupenostjo ali fazi v zvezi z rakotvornostjo. Vendar je treba pri izvajanju kombinirane študije kronične strupenosti in rakotvornosti skrbno upoštevati načela izbire odmerkov (odstavki 11 in 22–26), poleg tega pa se tudi priznava, da se na podlagi nekaterih zakonodajnih okvirov lahko zahteva ločena izvedba študij. Več napotkov o tem, kako zasnovati kombinirano študijo kronične strupenosti in rakotvornosti, da bo mogoče z njo kar najbolj zmanjšati število uporabljenih živali in racionalizirati različne preskusne postopke, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 13. | Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni na koncu tega poglavja in v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | NAČELO PRESKUSA | 14. | Študija je zasnovana z dvema vzporednima fazama – fazo v zvezi s kronično strupenostjo in fazo v zvezi z rakotvornostjo (glede trajanja glej odstavek 34 oziroma odstavek 35). Preskusna kemikalija se navadno daje oralno, čeprav je lahko primerno tudi preskušanje z inhalacijskim ali dermalnim načinom dajanja. V fazi v zvezi s kronično strupenostjo se preskusna kemikalija dnevno v stopnjevanih odmerkih daje več skupinam preskusnih živali, in sicer ena velikost odmerka na skupino, pri čemer preskus običajno traja 12 mesecev, čeprav se lahko glede na zakonodajne zahteve izberejo tudi daljša ali krajša obdobja (glej odstavek 34). Izbrano obdobje mora biti dovolj dolgo, da se lahko pokažejo morebitni učinki kumulativne strupenosti, ne pa tudi zavajajoči učinki sprememb, povezanih s staranjem. Zasnova študije lahko vključuje tudi eno ali več vmesnih usmrtitev, npr. pri 3 ali 6 mesecih, zaradi česar se lahko vključijo dodatne skupine živali (glej odstavek 20). V fazi v zvezi z rakotvornostjo se preskusna kemikalija dnevno daje več skupinam preskusnih živali, pri čemer preskus traja večino njihove življenjske dobe. Živali je treba v obeh fazah skrbno opazovati, da se odkrijejo znaki strupenosti in nastanek neoplastičnih lezij. Na živalih, ki med preskusom poginejo ali so usmrčene, se opravi obdukcija, ob koncu preskusa pa se tudi preživele živali usmrtijo in se na njih opravi obdukcija. | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 15. | Ta preskusna metoda je namenjena predvsem ocenjevanju in vrednotenju kronične strupenosti in rakotvornosti pri glodavcih (odstavek 2). O uporabi vrst, ki niso glodavci, se lahko razmisli, kadar razpoložljivi podatki kažejo, da so ustreznejše za napovedovanje učinkov na zdravje ljudi. Izbiro živalske vrste je treba utemeljiti. Priporočena vrsta glodavca je podgana, čeprav se lahko uporabijo tudi druge vrste glodavcev, npr. miš. Čeprav je uporabnost miši pri preskušanju rakotvornosti lahko omejena (24) (25) (26), se lahko z nekaterimi veljavnimi zakonodajnimi ureditvami še vedno zahteva preskušanje rakotvornosti na miših, razen če se ugotovi, da taka študija z znanstvenega vidika ni nujna. Podgane in miši so najprimernejši preskusni modeli zaradi njihove razmeroma kratke življenjske dobe, razširjene uporabe v farmakoloških in toksikoloških študijah, občutljivosti za indukcijo tumorjev ter razpoložljivosti dovolj opredeljenih sevov. Zaradi teh lastnosti je na voljo veliko informacij o njihovi fiziologiji in patologiji. Kadar se zahtevajo študije kronične strupenosti/rakotvornosti na vrstah, ki niso glodavci, morata zasnova in izvajanje takih študij temeljiti na načelih, opisanih v tej preskusni metodi, ter na načelih iz poglavja B.27 te priloge z naslovom ‚90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodalcih‘ (6). Dodatne informacije o izbiri živalske vrste in seva so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 16. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Po možnosti je treba v kombinirani študiji kronične strupenosti/rakotvornosti uporabiti isti sev in izvor živali kot v predhodnih krajših študijah strupenosti, čeprav je treba – če je znano, da se pri živalih zadevnega seva in izvora pojavljajo težave pri doseganju običajno sprejetih meril preživetja za dolgoročne študije (glej Dokument s smernicami št. 116 (7)) – razmisliti o uporabi seva živali, katerega stopnja preživetja je sprejemljiva za dolgoročno študijo. Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. | Nastanitveni in prehranjevalni pogoji | 17. | Živali se lahko nastanijo posamično ali dajo v kletke v manjših skupinah istega spola; posamična nastanitev se lahko predvidi samo, če je znanstveno utemeljena (27) (28) (29). Kletke je treba razporediti tako, da so morebitni učinki zaradi njihovega položaja čim manjši. Temperatura prostora s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C). Čeprav mora biti relativna vlažnost vsaj 30 % in po možnosti ne sme presegati 70 %, razen med čiščenjem prostora, mora biti cilj 50- do 60-odstotna vlažnost. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. Hrana mora zadovoljevati vse prehranske potrebe preskušane živalske vrste, vsebnost kontaminantov, med drugim ostankov pesticidov, obstojnih organskih onesnaževal, fitoestrogenov, težkih kovin in mikotoksinov, ki lahko vplivajo na rezultat preskusa, pa mora biti čim manjša. Redno je treba pripravljati analitske informacije o ravneh kontaminantov v hranilih in hrani, vsaj na začetku študije in kadar se zamenja serija uporabljane kemikalije, ter jih vključiti v končno poročilo. Prav tako je treba zagotoviti analitske informacije o pitni vodi, uporabljeni v študiji. Kadar se preskusna kemikalija daje s hrano, lahko na izbiro hrane vpliva potreba po zagotovitvi ustrezne primesi preskusne kemikalije in zadovoljevanju prehranskih potreb živali. | Priprava živali | 18. | Uporabiti je treba zdrave živali, ki so se najmanj 7 dni prilagajale laboratorijskim razmeram in še niso bile vključene v preskusne postopke. V primeru glodavcev je treba odmerke začeti dajati čim prej po odstavitvi od sesanja in prilagajanju na okolje, po možnosti preden so živali stare 8 tednov. Opredeliti je treba vrsto, sev, izvor, spol, težo in starost preskusnih živali. Ob začetku študije morajo biti razlike v teži uporabljenih živali za vsak spol čim manjše, njihova teža pa ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže vseh živali v študiji glede na spol. Živali se naključno dodelijo kontrolnim in tretiranim skupinam. Po randomizaciji med skupinami v okviru vsakega spola ne sme biti večjih razlik v povprečni telesni teži. Če obstajajo statistično pomembne razlike, je treba fazo randomizacije ponoviti, če je to mogoče. Vsaki živali je treba dodeliti edinstveno identifikacijsko številko in jo trajno označiti s to številko s tetovažo, vsaditvijo mikročipa ali drugo ustrezno metodo. | POSTOPEK | Število in spol živali | 19. | Uporabiti je treba oba spola. Živali mora biti dovolj za temeljito biološko in statistično ocenjevanje. Pri glodavcih mora zato vsaka odmerna skupina (kot je navedeno v odstavku 22) in sočasna kontrolna skupina, namenjena fazi študije v zvezi z rakotvornostjo, vsebovati najmanj 50 živali vsakega spola. Glede na namen študije je mogoče povečati statistično moč ključnih ocen z neenakim dodeljevanjem živali različnim odmernim skupinam, tako da je v skupinah, tretiranih z majhnimi odmerki, več kot 50 živali, npr. za ocenjevanje rakotvornega potenciala pri majhnih odmerkih. Vendar se je treba zavedati, da je ob zmernem povečanju velikosti skupine povečanje statistične moči študije razmeroma majhno. Vsaka odmerna skupina (kot je navedeno v odstavku 22) in sočasna kontrolna skupina, namenjena fazi študije v zvezi s kronično strupenostjo, mora v primeru glodavcev vsebovati najmanj 10 živali vsakega spola. Opozoriti je treba, da je to število manjše kot v študiji kronične strupenosti (poglavje B.30 te priloge). Vendar bo razlaga podatkov, pridobljenih z manjšim številom živali na skupino v fazi te kombinirane študije v zvezi s kronično strupenostjo, podkrepljena s podatki, pridobljenimi z večjim številom živali v fazi študije v zvezi z rakotvornostjo. V študijah, ki vključujejo miši, bodo v vsaki odmerni skupini za fazo v zvezi s kronično strupenostjo morda potrebne dodatne živali, da bo mogoče opraviti vse zahtevane hematološke preiskave. Več informacij o statistični zasnovi študije in izbiri velikosti odmerkov za čim obsežnejše povečanje statistične moči je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | Uporaba vmesnih usmrtitev, satelitske skupine in opozorilnih živali | 20. | Če je to znanstveno utemeljeno, se lahko v študiji predvidijo vmesne usmrtitve, npr. pri 6 mesecih za fazo v zvezi s kronično strupenostjo, da se zagotovijo informacije o napredovanju ne-neoplastičnih sprememb in mehanistične informacije. Kadar so take informacije že na voljo iz prejšnjih študij strupenosti s ponavljajočimi se odmerki v zvezi z zadevno preskusno kemikalijo, vmesne usmrtitve morda niso znanstveno utemeljene. Z živalmi, uporabljenimi v fazi študije v zvezi s kronično strupenostjo, ki običajno traja 12 mesecev (odstavek 34), se pridobijo podatki v zvezi z vmesnimi usmrtitvami za fazo študije v zvezi z rakotvornostjo, s čimer se zmanjša skupno število uporabljenih živali. V fazo študije v zvezi s kronično strupenostjo se lahko vključijo tudi satelitske skupine za spremljanje reverzibilnosti morebitnih toksikoloških sprememb, ki jih povzroči preiskovana preskusna kemikalija. Te preiskave so lahko omejene na največji odmerek v študiji in kontrolo. Po potrebi se lahko predvidi dodatna skupina opozorilnih živali (navadno 5 živali na spol) za spremljanje patološkega stanja med študijo (30). Več napotkov o tem, kako zasnovati študijo, da se vključijo vmesne usmrtitve ter satelitske in opozorilne živali, hkrati pa kar najbolj zmanjša skupno število uporabljenih živali, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | 21. | Če se v zasnovo študije vključijo satelitske živali in/ali vmesne usmrtitve, število živali v vsaki odmerni skupini, vključenih v ta namen, navadno znaša 10 živali na spol, skupno število živali v zasnovi študije pa je treba povečati za toliko, kolikor se jih namerava usmrtiti pred zaključkom študije. Za živali za vmesno usmrtitev in satelitske živali so običajno potrebna enaka opazovanja kot za živali v fazi glavne študije v zvezi s kronično strupenostjo, vključno s telesno težo, porabo hrane/vode, hematološkimi in kliničnimi biokemičnimi meritvami ter patološkimi preiskavami, čeprav se lahko predvidi tudi (pri skupinah za vmesno usmrtitev), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksičnost ali imunotoksičnost. | Odmerne skupine in odmerjanje | 22. | Napotki glede vseh vidikov izbire odmerkov in razporeditve njihovih velikosti so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Za fazo v zvezi s kronično strupenostjo in fazo v zvezi z rakotvornostjo je treba uporabiti najmanj tri velikosti odmerkov in sočasno kontrolo. Velikosti odmerkov navadno temeljijo na rezultatih kratkoročnejših študij s ponavljajočimi se odmerki ali študij za ugotavljanje območja, pri njihovem določanju pa je treba upoštevati vse obstoječe toksikološke in toksikokinetične podatke, ki so na voljo za preskusno kemikalijo ali sorodne snovi. | 23. | Za fazo študije v zvezi s kronično strupenostjo se lahko oceni, da celotna študija s tremi velikostmi odmerkov ni potrebna, če je mogoče predvideti, da preskus pri eni velikosti odmerka, enakovredni najmanj 1 000 mg/kg telesne teže/dan, verjetno ne bo povzročil škodljivih učinkov. To predvidevanje mora temeljiti na informacijah iz predhodnih študij in preudarku, da na podlagi podatkov o strukturno sorodnih kemikalijah strupenost ni pričakovana. Lahko se uporabi meja 1 000 mg/kg telesne teže/dan, razen če izpostavljenost ljudi nakazuje potrebo po uporabi večjega odmerka. | 24. | Razen kadar zaradi fizikalno-kemijskih lastnosti ali bioloških učinkov preskusne kemikalije to ni mogoče, je treba največjo velikost odmerka izbrati za opredelitev glavnih ciljnih organov in strupenih učinkov, pri čemer se je treba izogibati povzročanju trpljenja, hude zastrupitve, obolevnosti ali smrti. Največjo velikost odmerka je praviloma treba izbrati tako, da se izzovejo znaki strupenosti, na primer upočasnitev pridobivanja telesne teže (približno 10-odstotna). Vendar se lahko glede na cilje študije (glej odstavek 6) izbere tudi največji odmerek, manjši od odmerka, ki povzroča znake strupenosti, npr. če odmerek izzove škodljiv učinek, ki vzbuja zaskrbljenost, ne vpliva pa bistveno na življenjsko dobo ali telesno težo. | 25. | Velikosti odmerkov in razporeditev med njimi se lahko izberejo za določanje odziva v odvisnosti od odmerka in – glede na način delovanja preskusne kemikalije – vrednosti NOAEL ali drugega želenega rezultata študije, npr. BMD (glej odstavek 27). Dejavniki, ki jih je treba upoštevati pri določitvi manjših odmerkov, vključujejo pričakovani naklon krivulje odmerek-odziv, odmerke, pri katerih se lahko pojavijo pomembne spremembe v presnovi ali načinu strupenega delovanja, velikost, pri kateri se pričakuje prag, ali velikost, pri kateri se pričakuje izhodiščna točka za ekstrapolacijo majhnih odmerkov. Glavni cilj kombinirane študije rakotvornosti/kronične strupenosti je pridobiti informacije za oceno tveganja za rakotvornost, informacije o kronični strupenosti pa so navadno podrejen cilj. To je treba upoštevati pri izbiri velikosti odmerkov in razporeditve med njimi za študijo. | 26. | Izbrana razporeditev velikosti odmerkov je odvisna od ciljev študije in lastnosti preskusne kemikalije ter je v tej preskusni metodi ni mogoče natančno predpisati, vendar dva- do štirikratni intervali velikokrat zagotovijo visoko učinkovitost preskusa pri določanju padajočih velikosti odmerkov, namesto uporabe zelo velikih intervalov (npr. večjih od faktorja približno 6–10) med odmerki pa je pogosto primerneje dodati četrto preskusno skupino. Na splošno se je treba izogibati uporabi faktorjev, večjih od 10, če se uporabijo, pa je to treba utemeljiti. | 27. | Kot je nadalje opisano v Dokumentu s smernicami št. 116 (7), je treba pri izbiri odmerkov upoštevati: | — | znane ali domnevne nelinearnosti ali točke pregiba na krivulji odmerek-odziv, | — | toksikokinetiko in odmerna območja, v katerih se pojavljajo ali ne pojavljajo presnovna indukcija, nasičenje ali nelinearnost med zunanjimi in notranjimi odmerki, | — | prekurzorske lezije, označevalce učinka ali kazalnike delovanja ključnih temeljnih bioloških procesov, | — | ključne (ali domnevne) vidike načina delovanja, kot so odmerki, pri katerih se začne pojavljati citotoksičnost, so ravni hormonov motene, homeostatični mehanizmi preobremenjeni itd., | — | predele krivulje odmerek-odziv, v katerih je potrebna posebno zanesljiva ocena, npr. v območju pričakovanega BMD ali predvidenega praga, | — | preudarke v zvezi s pričakovanimi stopnjami izpostavljenosti ljudi, zlasti pri izbiri srednjih in majhnih odmerkov. | 28. | Kontrolna skupina je netretirana skupina ali kontrolna skupina z nosilcem, če se pri dajanju preskusne kemikalije uporablja nosilec. Z živalmi v kontrolni skupini je treba ravnati enako kot z živalmi v preskusnih skupinah, le da se ne tretirajo s preskusno kemikalijo. Če se uporablja nosilec, mora kontrolna skupina prejeti največjo količino nosilca, ki je bila uporabljena med odmernimi skupinami. Če se preskusna snov daje s hrano in se s tem zaradi njene manjše okusnosti povzroči bistveno zmanjšanje vnosa hrane, je lahko koristna dodatna, po parih hranjena kontrolna skupina, ki se uporablja kot primernejša kontrola. | Priprava odmerkov in dajanje preskusne kemikalije | 29. | Preskusna kemikalija se običajno daje oralno, s hrano ali pitno vodo oziroma z gavažo. Dodatne informacije o načinih in metodah dajanja so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Način in metoda dajanja sta odvisna od namena študije, fizikalnih/kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, njene biološke dostopnosti ter prevladujočega načina in metode izpostavljenosti ljudi. Izbrani način in metodo dajanja je treba utemeljiti. Zaradi dobrobiti živali je treba oralno gavažo praviloma izbrati samo pri tistih snoveh, pri katerih sta ta način in metoda dajanja razumno reprezentativna za potencialno izpostavljenost ljudi (npr. pri farmacevtskih izdelkih). Prehranske in okoljske kemikalije, vključno s pesticidi, se navadno dajejo s hrano ali pitno vodo. Pri nekaterih scenarijih, npr. izpostavljenosti na delovnem mestu, pa so lahko primernejši drugi načini dajanja. | 30. | Po potrebi se preskusna kemikalija raztopi ali suspendira v ustreznem nosilcu. Upoštevati je treba naslednje lastnosti nosilca in drugih aditivov, kot je ustrezno: učinke na absorpcijo, porazdelitev, presnovo ali retencijo preskusne kemikalije, učinke na kemijske lastnosti preskusne kemikalije, ki lahko spremenijo njene strupene lastnosti, ter učinke na porabo hrane ali vode ali na prehranjenost živali. Priporočljivo je, da se, če je mogoče, najprej preuči možnost uporabe vodne raztopine/suspenzije, nato raztopine/emulzije v olju (npr. koruznem), šele potem pa možnost raztopine v drugih nosilcih. Pri nevodnih nosilcih morajo biti strupene lastnosti nosilca znane. Na voljo morajo biti informacije o stabilnosti preskusne kemikalije in homogenosti raztopin ali hrane (kot je ustrezno), v pogojih dajanja (npr. s hrano). | 31. | Pri kemikalijah, ki se dajejo s hrano ali pitno vodo, je treba zagotoviti, da količine uporabljene preskusne kemikalije ne vplivajo na normalno prehranjevanje ali vodno ravnotežje. Pri dolgoročnih študijah strupenosti, pri katerih se uporablja dajanje s hrano, koncentracija preskusne kemikalije v hrani praviloma ne sme presegati zgornje meje 5 % vse hrane, da se preprečijo prehranska neravnovesja. Če se preskusna kemikalija daje s hrano, se lahko uporabi bodisi konstantna koncentracija v hrani (mg/kg hrane ali ppm) bodisi konstantna velikost odmerka glede na telesno težo živali (mg/kg telesne teže), ki se izračuna vsak teden. Uporabljeni način je treba navesti. | 32. | V primeru oralnega dajanja živali dobivajo odmerek preskusne kemikalije vsak dan (sedem dni na teden), preskusno obdobje pa traja 12 mesecev (faza v zvezi s kronično strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakotvornostjo) – glej tudi odstavka 33 in 34. Vsak drugačen režim odmerjanja, npr. pet dni na teden, je treba utemeljiti. V primeru dermalnega dajanja so živali s preskusno kemikalijo navadno tretirane vsaj 6 ur na dan 7 dni na teden, kot je navedeno v poglavju B.9 te priloge (11), prek obdobja 12 mesecev (faza v zvezi s kronično strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakotvornostjo). Inhalacijska izpostavljenost se izvaja 6 ur na dan 7 dni na teden, uporabiti pa je mogoče tudi izpostavljenost 5 dni na teden, če je utemeljena. Obdobje izpostavljenosti praviloma traja 12 mesecev (faza v zvezi s kronično strupenostjo) ali 24 mesecev (faza v zvezi z rakotvornostjo). Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Obdobja izpostavljenosti, krajša od 6 ur na dan, je treba utemeljiti. Glej tudi poglavje B.8 te priloge (9). | 33. | Če se preskusna kemikalija živalim daje z gavažo, je treba pri tem uporabljati želodčno cevko ali ustrezno intubacijsko kanilo, postopek pa opravljati vsak dan ob podobnem času. Običajno živali dobijo enkraten odmerek enkrat na dan, če pa je kemikalija na primer lokalni dražljivec, se lahko dnevno odmerjena količina ohranja tudi z dajanjem polovičnih odmerkov (dvakrat na dan). Največja količina tekočine, ki se lahko da naenkrat, je odvisna od velikosti preskusne živali. To količino je treba ohranjati tako majhno, kot je praktično, praviloma pa pri glodavcih ne sme preseči 1 ml/100 g telesne teže (31). Spremenljivost preskusne količine je treba kar najbolj zmanjšati s prilagajanjem koncentracije, da se zagotovi konstantna količina pri vseh velikostih odmerkov. Izjema so potencialno jedke ali dražilne kemikalije, ki jih je treba razredčiti, da se preprečijo resni lokalni učinki. Preskušanju pri koncentracijah, pri katerih obstaja verjetnost jedkosti ali dražilnosti za prebavni trakt, se je treba izogibati. | Trajanje študije | 34. | Obdobje odmerjanja in faza te študije v zvezi s kronično strupenostjo običajno trajata 12 mesecev, je pa ta zasnova študije taka, da se lahko uporablja tudi za kratkoročnejše (npr. 6- ali 9-mesečne) ali dolgoročnejše (npr. 18- ali 24-mesečne) študije, glede na zahteve konkretnih zakonodajnih ureditev ali za posebne mehanistične namene. Odstopanja od 12-mesečnega obdobja izpostavljenosti je treba utemeljiti, zlasti krajša obdobja. Vse odmerne skupine, dodeljene tej fazi, se ob določenem času prenehajo tretirati, da se ocenijo kronična strupenost in ne-neoplastične patološke spremembe. Satelitske skupine, vključene za spremljanje reverzibilnosti toksikoloških sprememb, ki jih povzroči preiskovana preskusna kemikalija, se s preskusno kemikalijo ne tretirajo najmanj 4 tedne in največ eno tretjino celotnega trajanja študije po koncu izpostavljenosti. | 35. | Faza te študije v zvezi z rakotvornostjo pri glodavcih običajno traja 24 mesecev in ustreza večini normalne življenjske dobe živali, ki bodo uporabljene. Glede na življenjsko dobo in sev živalske vrste v študiji se lahko uporabijo tudi krajša ali daljša obdobja študije, vendar je treba to utemeljiti. Za nekatere seve miši, npr. AKR/J, C3H/J ali C57BL/6J, je lahko primernejše 18-mesečno obdobje. V nadaljevanju je nekaj napotkov o trajanju in zaključku študije ter preživetju; več napotkov, vključno s preudarki o sprejemljivosti sprejemljivosti negativnih rezultatov študije rakotvornosti glede na preživetje v študiji, je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). | — | Kadar število preživelih živali v skupinah, tretiranih z manjšimi odmerki, ali kontrolni skupini pade pod 25 %, je treba razmisliti o zaključku študije. | — | Kadar zaradi strupenosti prezgodaj poginejo samo živali v skupini, tretirani z velikim odmerkom, to ne sme biti razlog za zaključek študije. | — | Preživetje je treba obravnavati ločeno za vsak spol. | — | Študija se ne sme podaljševati prek točke, ko razpoložljivi podatki iz študije ne zadoščajo več za statistično veljavno oceno. | OPAZOVANJA (FAZA V ZVEZI S KRONIČNO STRUPENOSTJO) | 36. | Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, običajno na začetku in koncu vsakega dne, vključno s konci tedna in prazniki. Splošna klinična opazovanja je treba opraviti vsaj enkrat na dan, po možnosti vsak dan ob istem času in ob upoštevanju obdobja največje intenzivnosti pričakovanih učinkov po vnosu odmerka, če gre za dajanje z gavažo. | 37. | Podrobna klinična opazovanja je treba opraviti na vseh živalih vsaj enkrat pred prvo izpostavljenostjo (za omogočanje primerjav na istem osebku), ob koncu prvega tedna študije, zatem pa mesečno. Protokol za opazovanja je treba določiti tako, da so razlike med posameznimi opazovalci čim manjše in neodvisne od preskusne skupine. Ta opazovanja je treba opraviti zunaj kletk, v katerih bivajo živali, po možnosti na standardnem mestu in vedno ob istem času. Opažanja je treba skrbno zabeležiti, po možnosti s sistemi točkovanja, ki jih izrecno določi preskuševalni laboratorij. Prizadevati si je treba, da se pogoji opazovanja čim manj spreminjajo. Pozornost je med drugim treba nameniti vsem spremembam na koži, kožuhu, očeh in sluznicah, pojavu sekrecije in ekskrecije ter delovanju avtonomnega živčevja (npr. solzenju, piloerekciji, velikosti zenic, nenavadnemu vzorcu dihanja). Prav tako je treba zabeležiti spremembe v hoji, drži in odzivu na ravnanje z živalmi, pa tudi prisotnost kloničnih ali toničnih gibov, stereotipij (npr. prekomernega čiščenja, ponavljajočega se vrtenja v krogu) ali nenormalnega vedenja (npr. samopohabe, vzvratne hoje) (32). | 38. | Na vseh živalih je treba pred prvim dajanjem preskusne kemikalije z oftalmoskopom ali drugo primerno opremo opraviti oftalmološko preiskavo. Ob koncu študije je treba to preiskavo po možnosti opraviti na vseh živalih, vsekakor pa vsaj pri skupini, tretirani z velikim odmerkom, in kontrolni skupini. Če se v očeh zaznajo spremembe, povezane s tretiranjem, je treba pregledati vse živali. Če strukturna analiza ali druge informacije kažejo na strupenost za oči, je treba pogostnost preiskav oči povečati. | 39. | Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus strupenosti s ponavljajočimi se odmerki nakazal potencial za povzročanje nevrotoksičnih učinkov, se lahko po izbiri ocenijo senzorične reakcije na različne vrste dražljajev (32) (npr. slušne, vidne in proprioceptivne dražljaje) (33) (34) (35), moč oprijema (36) ter motorična aktivnost (37), in sicer pred začetkom študije ter vsake 3 mesece po začetku študije do 12. meseca in vključno z njim, pa tudi ob koncu študije (če je daljša od 12 mesecev). Nadaljnje podrobnosti glede mogočih postopkov so na voljo v navedenih virih. Uporabiti je mogoče tudi druge postopke, ki v njih niso opisani. | 40. | Za kemikalije, v zvezi s katerimi je predhodni 28- in/ali 90-dnevni preskus strupenosti s ponavljajočimi se odmerki nakazal potencial za povzročanje imunotoksičnih učinkov, se lahko nadaljnje preiskave te končne točke po izbiri opravijo ob koncu študije. | Telesna teža, poraba hrane/vode in izkoristek hrane | 41. | Vse živali je treba stehtati na začetku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja. | Hematologija in klinična biokemija | 42. | V študijah z glodavci je treba hematološke preiskave opravljati na vseh živalih v študiji (10 samcih in 10 samicah na skupino), in sicer pri 3, 6 in 12 mesecih, pa tudi ob koncu študije (če je daljša od 12 mesecev). Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih hematoloških preiskav potrebne satelitske živali (glej odstavek 19). V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki na hematološke parametre. Vzorce krvi je treba odvzeti na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. | 43. | Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (38): skupno in diferencialno število levkocitov, število eritrocitov, število trombocitov, koncentracijo hemoglobina, hematokrit (volumen stisnjenih eritrocitov), povprečni volumen eritrocitov (MCV), povprečno količino hemoglobina v eritrocitih (MCH), povprečno koncentracijo hemoglobina v eritrocitih (MCHC), protrombinski čas in aktivirani parcialni tromboplastinski čas. Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi hematološki parametri, kot so Heinzeva telesca ali druge netipične morfološke oblike eritrocitov ali methemoglobin. Na splošno je treba sprejeti prožni pristop glede na opažene in/ali pričakovane učinke dane preskusne kemikalije. Če preskusna kemikalija učinkuje na krvotvorni sistem, sta lahko indicirana tudi meritev števila retikulocitov in citološka preiskava kostnega mozga, čeprav teh ni treba izvajati redno. | 44. | Klinične biokemične preiskave za ugotavljanje glavnih strupenih učinkov na tkiva ter zlasti ledvice in jetra je treba opravljati na vzorcih krvi, odvzetih vsem živalim v študiji (10 samcem in 10 samicam na skupino) v istih časovnih intervalih, kot so določeni za hematološke preiskave. Pri miših so lahko za izvedbo vseh zahtevanih kliničnih biokemičnih preiskav potrebne satelitske živali. V študijah na vrstah, ki niso glodavci, se vzorci jemljejo manjšemu številu živali (npr. 4 živalim na spol na skupino v študijah s psi) ob vmesnih vzorčenjih in ob koncu študije, kot je opisano za glodavce. Meritev pri 3 mesecih, pa naj gre za študije z glodavci ali vrstami, ki niso glodavci, ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki na klinične biokemične parametre. Pred odvzemom vzorcev krvi je priporočljivo živali čez noč postiti (kar pa ne velja za miši) (10). Preiskati je treba naslednji seznam parametrov (38): glukozo, sečnino (sečninski dušik), kreatinin, skupne beljakovine, albumin, kalcij, natrij, kalij, skupni holesterol, najmanj dva ustrezna preskusa za hepatocelularno oceno (alanin-aminotransferaza, aspartat-aminotransferaza, glutamat-dehidrogenaza, skupne žolčne kisline) (39) in najmanj dva ustrezna preskusa za hepatobiliarno oceno (alkalna fosfataza, γ-glutamil transferaza, 5’-nukleotidaza, skupni bilirubin, skupne žolčne kisline) (39). Glede na strupenost preskusne kemikalije se lahko, kot je primerno, merijo tudi drugi klinični kemični parametri, kot so vrednost trigliceridov na tešče, specifični hormoni in holinesteraza. Na splošno je potreben prožni pristop glede na opažene in/ali pričakovane učinke dane preskusne kemikalije. | 45. | Analize urina je treba opravljati na vseh živalih v študiji (10 samcih in 10 samicah na skupino) na vzorcih, zbranih v istih časovnih intervalih kot pri hematoloških in kliničnih kemičnih preiskavah. Meritev pri 3 mesecih ni treba opraviti, če v predhodni 90-dnevni študiji, izvedeni s primerljivimi velikostmi odmerkov, niso bili opaženi učinki pri analizi urina. V strokovno priporočilo glede kliničnih patoloških študij (38) je bil vključen naslednji seznam parametrov: videz, količina, osmolalnost ali specifična teža, pH, skupne beljakovine in glukoza. Druge določitve vključujejo keton, urobilinogen, bilirubin in okultno kri. Če je treba preiskavo opaženih učinkov razširiti, se lahko uporabijo dodatni parametri. | 46. | Na splošno se šteje, da je v študijah s psi pred tretiranjem treba določiti izhodiščne hematološke in klinične biokemične spremenljivke, v študijah z glodavci pa to ni potrebno (38). Če pa so pretekli izhodiščni podatki (glej odstavek 58) nezadostni, je treba razmisliti o pripravi takih podatkov. | PATOLOGIJA | Makroskopska obdukcija | 47. | Praviloma se na vseh živalih v študiji opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Lahko pa se tudi predvidi (za skupine za vmesno usmrtitev ali satelitske skupine), da se meritve omejijo na specifična ključna merila, kot sta nevrotoksičnost ali imunotoksičnost (glej odstavek 21). Obdukcija in poznejši postopki, opisani v naslednjih odstavkih, pri teh živalih niso potrebni. Za opozorilne živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odloča vodja študije. | 48. | Stehtati je treba organe vseh živalih, razen tistih, ki se izključijo na podlagi zadnjega dela odstavka 47. Z nadledvičnih žlez, možganov, nadmodka, srca, ledvic, jeter, jajčnikov, vranice, mod, ščitnice (stehtane po fiksaciji skupaj z obščitnicami) in maternice vseh živali (razen živali, ki so bile najdene umirajoče in/ali so bile usmrčene med študijo) je treba, kot je ustrezno, odstraniti vsa priraščena tkiva in nato izmeriti njihovo mokro težo čim prej po disekciji, da se ne izsušijo. | 49. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (40) (tkiva v oglatih oklepajih niso obvezna): | vse vidne lezije | srce | trebušna slinavka | želodec (predželodec, žlezni želodec) | nadledvična žleza | vito črevo | obščitnica | [zobje] | aorta | tešče črevo | periferni živec | modo | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | ledvica | hipofiza | priželjc | slepo črevo | solzna žleza (zunaj očesne votline) | prostata | ščitnica | maternični vrat | jetra | rektum | [jezik] | koagulacijska žleza | pljuča | žleza slinavka | sapnik | debelo črevo | bezgavke (povrhnje in globoke) | semenski mešiček | sečni mehur | dvanajsternik | mlečna žleza (obvezna za samice, in če jo je mogoče secirati s prostim očesom, za samce) | skeletna mišica | maternica (vključno z vratom) | nadmodek | [zgornja dihala, vključno z nosom, nosnimi školjkami in obnosnimi votlinami] | koža | [sečevod] | oko (vključno z mrežnico) | požiralnik | hrbtenjača (na treh ravneh: vratni, prsni in ledveni) | [sečnica] | [stegnenica s sklepom] | [vohalni betič] | vranica | vagina | žolčnik (pri vrstah, ki niso podgane) | jajčnik | [prsnica] | rezina in/ali svež punktat kostnega mozga | Harderjeva žleza | | | | Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba shraniti oba organa. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim načinom dajanja je treba pregledati iste organe, kot so določeni na seznamu za oralni način, potrebno pa je posebno vzorčenje in shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporočilom iz poglavij B.8 (9) in B.29 te priloge (10). Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preučiti seznam organov, določen za oralni način dajanja. | Histopatologija | 50. | Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patoloških študij (40). Histopatološke preiskave morajo obsegati vsaj: | — | vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne skupine, | — | vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmrčene med študijo, | — | vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, | — | ciljna tkiva ali tkiva, pri katerih so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretiranjem povezane spremembe, vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, | — | pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba pregledati oba organa. | OPAZOVANJA (FAZA V ZVEZI Z RAKOTVORNOSTJO) | 51. | Vse živali je treba pregledovati za odkrivanje obolevnosti ali smrtnosti, običajno na začetku in koncu vsakega dne, vključno s konci tedna in prazniki. Poleg tega je treba živali pregledati enkrat na dan za odkrivanje konkretnih toksikološko pomembnih znakov. Pri študijah, v katerih se uporabi gavaža, je treba živali pregledati takoj po vnosu odmerka. Posebno pozornost je treba nameniti nastanku tumorjev ter zabeležiti čas nastopa, mesto, mere, videz in progresijo vsakega makroskopsko vidnega ali otipljivega tumorja. | 52. | Vse živali je treba stehtati na začetku tretiranja, vsaj enkrat na teden prvih 13 tednov, zatem pa najmanj enkrat na mesec. Meritve porabe in izkoristka hrane je treba prvih 13 tednov opravljati vsaj enkrat na teden, nato pa najmanj enkrat na mesec. Kadar se preskusna kemikalija daje s pitno vodo, je treba porabo vode prvih 13 tednov meriti vsaj enkrat na teden, zatem pa najmanj enkrat na mesec. O meritvah porabe vode je treba razmisliti tudi pri študijah, pri katerih se spremenijo vzorci pitja. | Hematološke, klinične biokemične in druge meritve | 53. | Da bi se s študijo pridobilo kar največ informacij, zlasti kar zadeva razmisleke o načinu delovanja, se lahko jemljejo vzorci krvi za hematološke in klinične biokemične preiskave, čeprav o tem odloča vodja študije. Primerna je lahko tudi analiza urina. Informacije o teh parametrih se zagotovijo s podatki, ki so bili pridobljeni z živalmi, uporabljenimi v fazi študije v zvezi s kronično strupenostjo, ki običajno traja 12 mesecev (odstavek 34). Več napotkov o vrednosti jemanja takih vzorcev v okviru študije rakotvornosti je na voljo v Dokumentu s smernicami št. 116 (7). Če se odvzamejo vzorci krvi, je treba to storiti ob koncu preskusnega obdobja, tik pred postopkom usmrtitve živali ali v okviru tega postopka. Odvzeti jih je treba na imenovanem mestu, na primer s punkcijo srca ali iz retroorbitalnega sinusa, medtem ko je žival v anesteziji. Za pregled se lahko pripravijo tudi krvni razmazi, zlasti če kaže, da je ciljni organ kostni mozeg, čeprav so bili izraženi dvomi o vrednosti takega pregleda krvnih razmazov v fazi v zvezi z rakotvornostjo za ocenjevanje rakotvornega/onkogenega potenciala (38). | PATOLOGIJA | Makroskopska obdukcija | 54. | Na vseh živalih v študiji, razen na opozorilnih in drugih satelitskih živalih (glej odstavek 20), se opravi popolna in natančna makroskopska obdukcija, ki obsega natančen pregled zunanje površine telesa, vseh odprtin, lobanjske, prsne in trebušne votline ter njihove vsebine. Za opozorilne in druge satelitske živali je lahko obdukcija potrebna v posameznih primerih, o čemer odloča vodja študije. Tehtanje organov navadno ni del študije rakotvornosti, saj je zaradi sprememb, povezanih s staranjem, v poznejših fazah pa zaradi nastanka tumorjev, lahko motena koristnost podatkov o teži organov. So pa lahko ti podatki odločilni za oceno zanesljivosti dokazov in zlasti za preudarke v zvezi z načinom delovanja. Če je teža organov del satelitske študije, jo je treba izmeriti najpozneje eno leto po začetku študije. | 55. | Naslednja tkiva je treba shraniti v fiksacijskem sredstvu, ki je najprimernejše za vrsto tkiva in predvideno poznejšo histopatološko preiskavo (40) (tkiva v oglatih oklepajih niso obvezna): | vse vidne lezije | srce | trebušna slinavka | želodec (predželodec, žlezni želodec) | nadledvična žleza | vito črevo | obščitnica | [zobje] | aorta | tešče črevo | periferni živec | modo | možgani (vključno z rezinami velikih in malih možganov ter podaljšane hrbtenjače/mosta) | ledvica | hipofiza | priželjc | slepo črevo | solzna žleza (zunaj očesne votline) | prostata | ščitnica | maternični vrat | jetra | danka | [jezik] | koagulacijska žleza | pljuča | žleza slinavka | sapnik | debelo črevo | bezgavke (povrhnje in globoke) | semenski mešiček | sečni mehur | dvanajsternik | mlečna žleza (obvezna za samice, in če jo je mogoče secirati s prostim očesom, za samce) | skeletna mišica | maternica (vključno z vratom) | nadmodek | [zgornja dihala, vključno z nosom, nosnimi školjkami in obnosnimi votlinami] | koža | [sečevod] | oko (vključno z mrežnico) | požiralnik | hrbtenjača (na treh ravneh: vratni, prsni in ledveni) | [sečnica] | [stegnenica s sklepom] | [vohalni betič] | vranica | vagina | žolčnik (pri vrstah, ki niso podgane) | jajčnik | [prsnica] | rezina in/ali svež punktat kostnega mozga | Harderjeva žleza | | | | Pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba shraniti oba organa. Na podlagi kliničnih in drugih izsledkov se lahko pokaže potreba po preiskavah dodatnih tkiv. Poleg tega je treba shraniti vse organe, ki bi lahko bili ciljni organi glede na znane lastnosti preskusne kemikalije. V študijah z dermalnim načinom dajanja je treba pregledati iste organe, kot so določeni na seznamu za oralni način, potrebno pa je posebno vzorčenje in shranjevanje kože z mesta nanosa. V inhalacijskih študijah je treba v zvezi s seznamom shranjenih in pregledanih tkiv dihal slediti priporočilom iz poglavij B.8 (8) in B.29 te priloge (9). Za druge organe/tkiva (in poleg posebej shranjenih tkiv dihal) je treba preučiti seznam organov, določen za oralni način dajanja. | Histopatologija | 56. | Na voljo so napotki o najboljših praksah pri izvajanju toksikoloških patoloških študij (40). Pregledati je treba vsaj naslednja tkiva: | — | vsa tkiva živali iz skupine, tretirane z velikim odmerkom, in kontrolne skupine, | — | vsa tkiva živali, ki so poginile ali bile usmrčene med študijo, | — | vsa tkiva, ki kažejo makroskopske abnormalnosti, vključno s tumorji, | — | kadar so bile v skupini, tretirani z velikim odmerkom, opažene s tretiranjem povezane histopatološke spremembe, je treba pregledati ista tkiva vseh živali iz vseh drugih odmernih skupin, | — | pri parnih organih, npr. ledvicah ali nadledvičnih žlezah, je treba pregledati oba organa. | PODATKI IN POROČANJE (FAZA V ZVEZI Z RAKOTVORNOSTJO IN FAZA V ZVEZI S KRONIČNO STRUPENOSTJO) | Podatki | 57. | Navesti je treba podatke za posamezne živali za vse ocenjevane parametre. Poleg tega je treba vse podatke povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navede število živali na začetku preskusa, število živali, ki so bile med preskusom najdene poginule ali so bile usmrčene iz humanih razlogov, in čas vsake smrti ali humane usmrtitve, število živali, ki kažejo znake strupenosti, opis opaženih znakov zastrupitve, vključno s časom njihovega nastopa, trajanjem in resnostjo vseh strupenih učinkov, ter število živali, pri katerih so opažene lezije, vrste lezij in odstotek živali, pri katerih je opažena posamezna vrsta lezije. V preglednicah s povzetimi podatki je treba navesti srednje vrednosti in standardne odklone (za preskusne podatke, ki se nenehno zbirajo) za živali, pri katerih so opaženi strupeni učinki ali lezije, ter razvrstitev lezij. | 58. | Pretekli kontrolni podatki so lahko dragoceni za razlago rezultatov študije, npr. kadar obstajajo znaki, da podatki, zagotovljeni s sočasnimi kontrolami, bistveno odstopajo od nedavnih podatkov, pridobljenih na kontrolnih živalih iz istega preskuševalnega laboratorija/kolonije. Če se ocenjujejo pretekli kontrolni podatki, morajo izhajati iz istega laboratorija, se nanašati na živali iste starosti in seva, poleg tega pa morajo biti pridobljeni v petih letih pred zadevno študijo. | 59. | Če je ustrezno, je treba številčne rezultate ocenjevati na podlagi primerne in splošno priznane statistične metode. Statistične metode in podatke, ki bodo analizirani, je treba izbrati pri zasnovi študije (odstavek 9). V izbiri je treba predvideti prilagoditve glede na preživetje, če so potrebne. | 60. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in fizikalno-kemijske lastnosti, | — | identifikacijske podatke, | — | izvor kemikalije, | — | številko serije, | — | potrdilo o kemijski analizi. | | Nosilec (če je ustrezno) | — | utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda). | | Preskusne živali | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev izbire, | — | število, starost in spol živali na začetku preskusa, | — | izvor, nastanitvene pogoje, hrano itd., | — | težo vsake živali ob začetku preskusa. | | Preskusni pogoji | — | utemeljitev načina dajanja in izbire odmerkov, | — | če je ustrezno, uporabljene statistične metode za analizo podatkov, | — | podatke o formulaciji preskusne kemikalije/pripravi hrane, | — | analitske podatke o doseženi koncentraciji, stabilnosti in homogenosti pripravka, | — | način dajanja in podatke o dajanju preskusne kemikalije, | — | za inhalacijske študije informacijo, ali je bila uporabljena izpostavljenost nosu ali izpostavljenost celega telesa, | — | dejanske odmerke (mg/kg telesne teže/dan) in faktor za pretvorbo koncentracije preskusne snovi v hrani/pitni vodi (mg/kg ali ppm) v dejanski odmerek, če je primerno, | — | podatke o kakovosti hrane in vode. | | Rezultati (predstaviti je treba povzete podatke v preglednicah in podatke za posamezne živali) | | Splošno | — | podatke o preživetju, | — | telesno težo/spremembe telesne teže, | — | porabo hrane, izračune izkoristka hrane, če so bili narejeni, in porabo vode, če je ustrezno, | — | toksikokinetične podatke, če so na voljo, | — | oftalmoskopiranje (če so podatki na voljo), | — | hematologijo (če so podatki na voljo), | — | klinično kemijo (če so podatki na voljo). | | Klinični izsledki | — | znake zastrupitve, | — | pojavnost (in resnost, če se ocenjuje) vseh abnormalnosti, | — | vrsto, resnost in trajanje kliničnih opažanj (prehodnih ali trajnih). | | Obdukcijski podatki | — | terminalno telesno težo, | — | težo organov in razmerja med težami organov, če je ustrezno, | — | izsledke obdukcije; pojavnost in resnost abnormalnosti. | | Histopatologija | — | neneoplastične ugotovitve histopatoloških preiskav, | — | neoplastične ugotovitve histopatoloških preiskav, | — | povezanost makroskopskih in mikroskopskih ugotovitev, | — | podroben opis vseh s tretiranjem povezanih ugotovitev histopatoloških preiskav, vključno z razvrstitvami resnosti, | — | navedbo morebitnih medsebojnih strokovnih pregledov mikroskopskih preparatov. | | Statistična obdelava rezultatov, če je ustrezno | | Razprava o rezultatih | — | razpravo o pristopih modeliranja, | — | razmerja med odmerkom in odzivom, | — | pretekle kontrolne podatke, | — | preučitev vseh informacij o načinu delovanja, | — | določitev BMD, NOAEL ali LOAEL, | — | pomembnost za ljudi. | | Sklepi. | VIRI: | (1) | OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rim, 1995), internal working document, Environment Directorate, OECD, Pariz. | (2) | EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency, Washington, DC. | (3) | Combes, R. D., Gaunt, I., Balls, M. (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208. | (4) | Barlow, S. M., Greig, J. B., Bridges, J. W., idr. (2002). Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191. | (5) | Chhabra, R. S., Bucher, J. R., Wolfe, M., Portier, C. (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445. | (6) | Poglavje B.27 te priloge, Preskus subkronične oralne toksičnosti: 90-dnevna študija oralne toksičnosti s ponavljajočimi se odmerki na neglodalcih. | (7) | OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – druga izdaja. Series on Testing and Assessment No. 116, na voljo na javni spletni strani OECD o smernicah za preskušanje na naslovu www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (9) | Poglavje B.8 te priloge, Subakutna strupenost pri vdihavanju: 28-dnevna študija. | (10) | Poglavje B.29 te priloge, Subkronična strupenost pri vdihavanju: 90-dnevna študija. | (11) | Poglavje B.9 te priloge, Strupenost (v stiku s kožo) pri ponavljajočem se odmerku (28 dni). | (12) | Boobis, A. R., Cohen, S. 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| 7) | il capitolo B.36 è sostituito dal seguente: | «B.36. TOSSICOCINETICA | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 417 (2010). Gli studi incentrati sulla tossicocinetica di una sostanza chimica si prefiggono di ottenere informazioni adeguate sull’assorbimento, la distribuzione, la biotrasformazione (ovvero il metabolismo) e l’escrezione della sostanza, di facilitare la comprensione della relazione tra la concentrazione, o la dose, e la tossicità osservata e di contribuire a comprendere il meccanismo attraverso il quale la sostanza chimica in esame esercita la propria tossicità. La tossicocinetica può aiutare a comprendere gli studi tossicologici dimostrando che l’esposizione degli animali da laboratorio alla sostanza in esame è di natura sistemica e rivelando quali siano i gruppi funzionali circolanti (composto progenitore/metaboliti). I principali parametri tossicocinetici ricavati dagli studi forniscono anche informazioni sul potenziale di accumulo della sostanza in esame nei tessuti e/o negli organi, come pure sul rischio di induzione di biotrasformazioni derivanti dall’esposizione alla sostanza. | 2. | I dati tossicocinetici possono essere utili per valutare se i dati di tossicità negli animali sono pertinenti ed adeguati ad essere estrapolati per valutare i pericoli e/o i rischi per gli esseri umani. Inoltre, gli studi tossicocinetici possono fornire informazioni utili a determinare i livelli di dose per gli studi di tossicità (cinetica lineare o non-lineare), gli effetti derivanti dalla via di somministrazione, la biodisponibilità e i problemi connessi all’impostazione dello studio. Alcuni tipi di dati tossicocinetici possono servire a elaborare dei modelli tossicocinetici su base fisiologica. | 3. | I dati tossicocinetici e metabolici sono importanti sotto diversi aspetti. Possono ad esempio fornire indicazioni su eventuali tossicità e modalità d’azione e su come queste interagiscono con i livelli di dose e la via di esposizione. Inoltre, i dati sul metabolismo possono fornire informazioni utili per valutare l’importanza, sul piano tossicologico, dell’esposizione a metaboliti esogeni della sostanza in esame. | 4. | La presenza di dati tossicocinetici adeguati aiuterà a confermare l’accettabilità e l’applicabilità dei metodi fondati sulle relazioni quantitative struttura-attività e le interpolazioni fondate sul metodo read-across o sul metodo del raggruppamento per valutare la sicurezza delle sostanze chimiche. I dati cinetici possono anche servire a valutare la rilevanza tossicologica di altri studi (ad esempio quelli in vivo/in vitro). | 5. | Salvo menzione contraria (cfr. in particolare i paragrafi da 74 a 78), il presente metodo di prova presuppone la somministrazione della sostanza in esame per via orale. | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 6. | Gli endpoint e i parametri tossicocinetici da misurare per le diverse classi di sostanze chimiche (ad esempio pesticidi, biocidi, sostanze chimiche industriali) sono diversi a seconda delle necessità e degli obblighi imposti dai diversi regimi normativi. Contrariamente alla maggior parte degli altri metodi di prova, il presente metodo descrive delle prove tossicocinetiche che comprendono misurazioni ed endpoint multipli. In futuro potranno essere sviluppati nuovi metodi di prova, e/o documenti di orientamento, per descrivere ciascun endpoint separatamente e più in dettaglio. Per quanto riguarda il presente metodo, la definizione di quali prove o quali valutazioni condurre è subordinata alle esigenze e/o ai bisogni dei singoli regimi normativi. | 7. | Si possono allestire molti tipi di studi per valutare il comportamento tossicocinetico della sostanza in esame in riposta alle disposizioni normative. Tuttavia, a seconda delle particolari situazioni o esigenze normative, per valutare la sostanza in questione non sempre è necessario ricorrere a tutti i diversi studi a disposizione. L’impostazione di uno studio tossicocinetico deve essere sufficientemente flessibile, in modo da poter prendere in considerazione le caratteristiche della sostanza analizzata. In alcuni casi, sarà sufficiente esplorare solo una particolare serie di aspetti per prevenire i pericoli e i rischi associati alla sostanza. In alcune situazioni, è possibile estrarre dati tossicocinetici dalle valutazioni svolte per altri studi tossicologici, in altre, possono essere necessari studi tossicocinetici più approfonditi, a seconda dei regimi normativi e/o nel caso sia necessario rispondere a nuove questioni sorte nel corso della valutazione della sostanza. | 8. | Per migliorare la qualità delle analisi ed evitare un inutile ricorso ad animali, prima di svolgere le prove il laboratorio deve prendere in considerazione tutte le informazioni disponibili sulla sostanza e sui rilevanti metaboliti e analoghi. Le informazioni possono comprendere dati provenienti da altri metodi di prova pertinenti (studi in vivo, in vitro e/o valutazioni in silico). Per programmare lo studio e interpretare i risultati potrebbero risultare utili le proprietà fisico-chimiche, ad esempio: il coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua (espresso in valore log POW), la costante di dissociazione (pKa), l’idrosolubilità, la pressione di vapore e il peso molecolare di una sostanza. Li si può determinare utilizzando metodi idonei, descritti nei metodi di prova pertinenti. | LIMITI | 9. | Il presente metodo di prova non è stato concepito per casi particolari, quali femmine gravide o che allattano e relativa prole, né per valutare gli eventuali residui in animali da produzione alimentare esposti alla sostanza. Tuttavia, i dati ottenuti da uno studio allestito secondo il presente metodo possono fornire informazioni generali utili a impostare studi specifici per questo tipo di indagini. Il presente metodo di prova non è destinato a essere utilizzato per test sui nanomateriali. Una relazione sull’analisi preliminare delle linee guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche in merito alla loro applicabilità ai nanomateriali suggerisce che non sia possibile applicare a tali materiali la linea guida dell’OCSE n. 417 (equivalente al presente metodo B.36) (1). | DEFINIZIONI | 10. | Le definizioni utilizzate ai fini del presente metodo di prova sono fornite in appendice. | CONSIDERAZIONI SUL BENESSERE DEGLI ANIMALI | 11. | Il documento di orientamento dell’OCSE n. 19 contiene delle indicazioni sul trattamento umano degli animali (2). Se ne raccomanda la consultazione per tutti gli studi in vivo e in vitro descritti nel presente metodo. | DESCRIZIONE DEI METODI | Studi pilota | 12. | Si raccomanda e incoraggia il ricorso a studi pilota per la scelta dei parametri sperimentali per gli studi tossicocinetici (es.: metabolismo, bilancio di massa, procedure analitiche, definizione delle dosi, esalazioni di CO2 ecc.). Potrebbe non essere necessario ricorrere all’uso di sostanze chimiche radiomarcate per caratterizzare alcuni dei parametri elencati sopra. | Scelta degli animali | Specie | 13. | Le specie (e i ceppi) animali utilizzati per le prove tossicocinetiche devono di preferenza essere identiche a quelle utilizzate in altri studi tossicologici svolti con la sostanza in esame. Normalmente viene utilizzato il ratto, in quanto specie ampiamente usata negli studi tossicologici. Il ricorso o l’aggiunta di altre specie possono essere giustificati se uno studio tossicologico importante ha dimostrato la presenza di tossicità rilevante nelle specie in questione o se è dimostrato che la loro tossicità/tossicocinetica è più pertinente per l’uomo. In caso di utilizzo di un’altra specie e ceppo è necessario motivare la scelta. | 14. | Salvo indicazioni contrarie, la specie scelta per il presente metodo di prova è il ratto. Se si fa ricorso ad altre specie, alcuni aspetti del metodo potrebbero necessitare di modifiche. | Età e ceppo | 15. | Gli animali utilizzati devono essere adulti giovani (normalmente, 6-12 settimane al momento della somministrazione) e sani (cfr. anche paragrafi 13 e 14). In caso non si utilizzino giovani adulti, è necessario motivare la scelta. All’inizio della prova gli animali devono essere nella stessa fascia di età. La variazione ponderale degli animali utilizzati deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio di tutti gli animali interessati dallo studio. Idealmente, il ceppo usato sarà lo stesso di quello utilizzato per stabilire la banca dati tossicologica della sostanza in esame. | Numero e sesso degli animali | 16. | Ciascuna dose sperimentale va somministrata a un minimo di quattro animali dello stesso sesso. È necessario giustificare la scelta del sesso dell’animale. Occorre prendere in considerazione l’opportunità di ricorrere ad animali di entrambi i sessi (quattro maschi e quattro femmine) in presenza di dati che suffragano differenze tossicologiche significative legate al sesso. | Condizioni di stabulazione e alimentazione | 17. | Nel corso della prova gli animali vanno stabulati individualmente. La stabulazione in gruppo può essere giustificata in determinate circostanze. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. La temperatura dello stabulario deve essere di 22 °C (± 3 °C) con un’umidità relativa del 30-70 %. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua potabile. | Sostanza chimica in esame | 18. | Occorre usare una sostanza radiomarcata al 14C per tutti gli aspetti dello studio che riguardano il bilancio di massa e l’identificazione dei metaboliti; tuttavia, nel caso sia dimostrato che: | — | è possibile valutare adeguatamente il bilancio di massa e l’identificazione dei metaboliti utilizzando una sostanza chimica non marcata, | — | la specificità analitica e la sensibilità del metodo che fa ricorso a una sostanza non radioattiva sono uguali o maggiori di quelle che si sarebbero ottenute con una sostanza radiomarcata, | non è necessario utilizzare una sostanza radiomarcata. Inoltre, si può ricorrere ad altri isotopi radioattivi e stabili, in particolare se tali elementi sono responsabili della porzione tossica della sostanza in esame o ne fanno parte. Se possibile, il marcatore radioattivo deve collocarsi in quella porzione centrale della molecola che è metabolicamente stabile (vale a dire, non è scambiabile, non è rimossa metabolicamente come CO2 e non è incorporata nell’insieme dei radicali monocarbonici dell’organismo). Per seguire il destino metabolico della sostanza in esame potrebbe essere necessario marcare vari punti o determinate regioni della sua molecola. | 19. | Le sostanze radiomarcate e non radiomarcate sono analizzate utilizzando metodi idonei a stabilirne purezza e identità. La radiopurezza della sostanza radioattiva in esame deve essere la massima raggiungibile per tale sostanza (idealmente, superiore al 95 %) ed è necessario fare un ragionevole sforzo per identificare eventuali impurità presenti in percentuale pari o superiore al 2 %. Nella relazione sulla prova vengono riportate la purezza, l’identità e l’eventuale percentuale di presenza di impurità. Alcuni regimi normativi possono fornire sia ulteriori orientamenti per la definizione e la caratterizzazione delle sostanze chimiche composte da miscele sia metodi per determinarne la purezza. | Scelta delle dosi | Studio pilota | 20. | Una dose unica somministrata per via orale è generalmente sufficiente per lo studio pilota. Va utilizzata una dose non tossica ma sufficientemente elevata da consentire l’identificazione dei metaboliti negli escreti (e nel plasma, se del caso) e da soddisfare lo scopo dichiarato dello studio pilota, come stabilito al paragrafo 12 del presente metodo. | Studio principale | 21. | Per gli studi principali, è preferibile ricorrere a un minimo di due dosi dato che le informazioni raccolte da almeno due gruppi-dose possono essere d’aiuto a stabilire le dosi da somministrare in altri studi di tossicità e per la valutazione dose-risposta nelle prove di tossicità già disponibili. | 22. | Se vengono somministrate due dosi, devono entrambe essere in dosaggio sufficientemente alto da consentire l’identificazione dei metaboliti negli escreti (e nel plasma, se del caso). Le informazioni provenienti dai dati sulla tossicità già disponibili vanno prese in considerazione al momento di scegliere la dose. Se non si dispone di informazioni (provenienti, ad esempio, da studi di tossicità acuta orale che indichino i segni clinici di tossicità, oppure da studi sulla tossicità da dosi ripetute), per la dose più elevata è possibile prendere in considerazione un valore inferiore alla stima della DL50 (per via orale e per via cutanea) o della CL50 (per inalazione) o inferiore al valore più basso nella gamma di valori sperimentali stimati di tossicità acuta. La dose più bassa corrisponderà a una frazione della dose più elevata. | 23. | Se viene utilizzato un solo livello di dose, sarà idealmente una dose sufficientemente elevata da consentire l’identificazione dei metaboliti negli escreti (e nel plasma, se del caso) anche senza produrre tossicità apparente. Occorre giustificare la decisione di non includere un secondo livello di dose. | 24. | Se è necessario stabilire gli effetti della dose sui processi cinetici, due dosi potrebbero non essere sufficienti e almeno una dose dovrebbe essere sufficientemente elevata da saturare tali processi. Se l’area sotto la curva “concentrazione plasmatica/tempo” (AUC) non è lineare nell’intervallo tra la somministrazione di due livelli di dose nello studio principale, si può chiaramente dedurre che la saturazione di uno (o più) dei processi cinetici avviene in un punto compreso tra questi due livelli di dose. | 25. | Nel caso di sostanze di prova con bassa tossicità, va utilizzata una dose massima di 1 000 mg/kg di peso corporeo (per via orale e per via cutanea; se la somministrazione avviene per inalazione, cfr. capitolo B.2 del presente allegato; in quest’ultimo caso, generalmente, la dose non supera i 2 mg/l). Considerazioni specifiche relative a una determinata sostanza possono rendere necessaria una dose superiore, in funzione dei regimi normativi. Occorre sempre giustificare la scelta di una particolare dose. | 26. | I dati relativi alla tossicocinetica e alla distribuzione tissutale ottenuti a partire da una dose singola possono essere sufficienti per determinare il potenziale di accumulo e/o di persistenza. In alcune circostanze può essere tuttavia necessario somministrare dosi ripetute: i) per valutare più accuratamente il potenziale di accumulo e/o di persistenza o l’evoluzione dei parametri tossicocinetici (per esempio induzione e inibizione enzimatica); oppure, ii) per rispondere alle esigenze della normativa applicabile. Negli studi a dosi ripetute è generalmente sufficiente la somministrazione ripetuta di dosi basse, ma, in determinate circostanze, può essere necessario somministrare a più riprese dosi elevate (cfr. anche paragrafo 57). | Somministrazione della sostanza chimica in esame | 27. | È necessario sciogliere la sostanza in esame o prepararne una sospensione omogenea nello stesso veicolo utilizzato per gli altri studi di tossicità orale realizzati sulla sostanza con somministrazione mediante sonda, se il veicolo è conosciuto. La scelta del veicolo deve essere motivata. Quando si imposta lo studio è necessario prendere in considerazione la scelta del veicolo e il volume delle dosi. Il metodo consueto di somministrazione è tramite sonda gastrica; ciononostante, in casi specifici può essere più opportuno ricorrere a capsule di gelatina o a una somministrazione con la dieta (in entrambi i casi è necessario giustificare la scelta). È altrettanto necessario avvalersi di mezzi di verifica delle dosi effettivamente somministrate a ogni animale. | 28. | Il volume massimo dei liquidi da somministrare tramite sonda gastrica in una sola volta dipende dalla taglia degli animali, dal tipo di veicolo scelto per la dose e dalla soppressione o meno dell’alimentazione prima della somministrazione della sostanza in esame. Occorre giustificare la scelta di sospendere o continuare l’alimentazione prima della somministrazione della dose. Solitamente, va utilizzato il minor volume possibile sia per veicoli acquosi sia per veicoli non acquosi. Di norma, per i roditori il livello di dose non deve superare i 10 ml/kg di peso corporeo. Nel caso di sostanze più lipofile, il volume del veicolo utilizzato può essere di 4 ml/kg di peso corporeo o superiore. Nel caso di somministrazione ripetuta, quando il digiuno quotidiano è controindicato, occorre considerare l’uso di livelli di dose più bassi (per esempio, da 2 a 4 ml/kg di peso corporeo). Se possibile, prendere in considerazione la possibilità di utilizzare livelli di dose coerenti con quello somministrato in altri studi su sostanze chimiche in esame somministrate per via orale tramite sonda gastrica. | 29. | La somministrazione della sostanza in esame per via endovenosa e la misurazione del tenore della sostanza nel sangue e/o negli escreti può servire a determinare la biodisponibilità o l’assorbimento orale relativo. Per lo studio per via endovenosa, viene somministrata una dose singola della sostanza in esame (generalmente equivalente, ma non superiore, alla dose orale più bassa — cfr. “Scelta delle dosi”) utilizzando un veicolo idoneo. La dose va somministrata in un volume adeguato (es. 1 ml/kg di peso corporeo) e nel sito prescelto ad almeno quattro animali di sesso adatto (si possono utilizzare animali di entrambi i sessi, giustificando la scelta, cfr. paragrafo 16). Per la somministrazione della sostanza in esame per via endovenosa, è necessario sciogliere completamente o preparare una soluzione in sospensione della dose. Fare in modo che il veicolo per la somministrazione per via endovenosa non interferisca col flusso sanguigno o con l’integrità delle cellule sanguigne. Se la sostanza viene infusa tramite un’apposita pompa, la velocità di somministrazione deve essere registrata e va standardizzata per tutti gli animali. È necessario ricorrere ad anestesia se si procede all’incanulamento della vena giugulare (per somministrare la sostanza in esame e/o per prelievo di sangue) o se per la somministrazione si fa ricorso all’arteria femorale. Considerare con attenzione il tipo di anestesia, in quanto può incidere sulla tossicocinetica. Gli animali devono potersi riprendere adeguatamente prima della somministrazione della sostanza chimica in esame incorporata nel veicolo. | 30. | Per determinate sostanze chimiche è possibile ricorrere ad altre vie di somministrazione (come le vie cutanee e l’inalazione, per esempio, cfr. paragrafi da 74 a 78), in funzione delle loro proprietà fisico-chimiche e l’utilizzo o la via di esposizione umana previsti. | Misurazioni | Bilancio di massa | 31. | Il bilancio di massa viene determinato in base alla somma della percentuale di dose (radioattiva) somministrata escreta nelle urine, nelle feci e nell’aria espirata, e della percentuale presente nei tessuti, nel resto della carcassa e nell’acqua di risciacquo delle gabbie (cfr. paragrafo 46). In generale, sono considerati adeguati i recuperi totali della sostanza chimica (radioattività) somministrata superiori al 90 %. | Assorbimento | 32. | È possibile calcolare una stima iniziale dell’assorbimento escludendo dal bilancio di massa la percentuale della dose nel tratto gastrointestinale e/o nelle feci. Per il calcolo della percentuale di assorbimento, cfr. paragrafo 33. Per l’analisi degli escreti, cfr. paragrafi da 44 a 49. Se non è possibile stabilire con esattezza, per mezzo di un bilancio di massa, l’assorbimento conseguente a una somministrazione per via orale (per esempio se più del 20 % della dose somministrata è presente nelle feci), può essere necessario procedere a studi più approfonditi che possono includere: 1) la somministrazione per via orale della sostanza in esame e la misurazione della sostanza nella bile; oppure 2) la somministrazione per via orale e per endovena della sostanza in esame e la misurazione della quantità netta di sostanza presente nelle urine, più quella nell’aria espirata e più quella nella carcassa, per ciascuna delle due vie citate. In entrambi gli studi, la misurazione della radioattività è utilizzata come metodo sostitutivo all’analisi specifica della sostanza chimica in esame e dei suoi metaboliti. | 33. | Per lo studio dell’escrezione biliare, la sostanza in esame viene somministrata generalmente per via orale. In questo tipo di studio, è necessario incanulare le vie biliari di almeno quattro animali di sesso adatto (o di entrambi i sessi, giustificando la scelta) e somministrare una dose singola della sostanza in esame. Dopo la somministrazione della sostanza, occorre monitorare l’escrezione di radioattività/sostanza in esame nella bile per il tempo necessario a stimare la percentuale della dose somministrata che viene escreta per questa via, in modo da calcolare direttamente a partire da questo dato la percentuale dell’assorbimento per via orale, nel modo seguente: | 34. | Per alcune classi di sostanze la dose assorbita può essere secreta direttamente attraverso le membrane intestinali. In questi casi, la misurazione della percentuale della dose presente nelle feci dopo la somministrazione orale in ratti con dotto biliare incanulato non è considerata rappresentativa della dose non assorbita. Nei casi in cui si presume avvenga una secrezione intestinale, si raccomanda di basare il calcolo della percentuale della dose assorbita a partire dall’assorbimento calcolato, confrontando l’escrezione a seguito di somministrazione per via orale e l’escrezione tramite somministrazione per via endovenosa (in ratti intatti o con dotto biliare incanulato) (cfr. paragrafo 35). Inoltre, quando la quantificazione della secrezione intestinale è considerata necessaria, si consiglia di misurare l’escrezione presso ratti con dotto biliare incanulato dopo aver somministrato la dose per via endovenosa. | Biodisponibilità | 35. | La biodisponibilità può essere determinata a partire dalla cinetica plasmatica/sanguigna dei gruppi esposti per via orale e per via endovenosa, come descritto ai paragrafi 50-52, attraverso analisi chimiche specifiche della sostanza in esame e/o del o dei metaboliti corrispondenti, evitando, pertanto, di ricorrere alla radiomarcatura della sostanza in causa. Per calcolare la biodisponibilità (F) della sostanza chimica in esame oppure del metabolita o dei metaboliti corrispondenti, ricorrere a questa formula: | dove “AUC” è l’area sotto la curva “concentrazione plasmatica/tempo”, mentre “exp” è la via di somministrazione sperimentale (orale, cutanea, inalatoria). | 36. | Nella valutazione del rischio legato ad effetti sistemici, è generalmente preferibile ricorrere alla biodisponibilità del componente tossico, invece che alla percentuale di assorbimento, per confrontare le concentrazioni sistemiche ricavate da studi sugli animali con dati analoghi di biomonitoraggio provenienti da studi sull’esposizione professionale. La situazione può diventare più complessa se le dosi si situano nell’intervallo di risposta non lineare; è quindi importante che un precedente studio tossicocinetico consenta di scegliere una gamma di dosi con risposta nell’intervallo lineare. | Distribuzione tissutale | 37. | È importante conoscere la distribuzione tissutale della sostanza in esame e/o dei suoi metaboliti per poter identificare i tessuti bersaglio, comprendere i meccanismi soggiacenti alla tossicità e per poter ottenere informazioni sul potenziale di accumulo e di persistenza della sostanza e dei metaboliti. La percentuale della dose (radioattiva) totale nei tessuti e nel resto della carcassa va misurata per lo meno al termine dello studio di escrezione (vale a dire, di solito, fino a 7 giorni dopo la somministrazione della dose, oppure prima in funzione del comportamento specifico della sostanza in esame). Se alla fine dello studio non si rileva la presenza della sostanza nei tessuti (ad esempio nel caso in cui la sostanza sia stata eliminata prima della fine dello studio a causa di un’emivita breve) occorre prestare particolare attenzione per evitare una scorretta interpretazione dei dati. In situazioni simili, la distribuzione tissutale deve essere analizzata quando si raggiunge la concentrazione massima nel plasma/nel sangue (Tmax) oppure il picco dell’escrezione urinaria della sostanza chimica in esame (e/o dei metaboliti), a seconda del caso (cfr. paragrafo 38). Inoltre, può essere necessario raccogliere tessuti anche in altri momenti in modo da poter determinare la distribuzione della sostanza in esame e/o dei metaboliti nei tessuti, valutare la dipendenza temporale (se del caso), aiutare a stabilire il bilancio di massa e/o se ciò è richiesto da un’autorità competente. I tessuti da prelevare comprendono fegato, grasso, tratto gastrointestinale, reni, milza, sangue intero, residuo della carcassa, tessuti dell’organo bersaglio ed altri eventuali tessuti (es. tiroide, eritrociti, organi riproduttivi, pelle e — in particolare negli animali pigmentati — occhi) potenzialmente importanti per la valutazione tossicologica della sostanza in esame. Occorre analizzare la più ampia gamma possibile di tessuti negli stessi momenti, per sfruttare al massimo l’uso degli animali e nell’eventualità che, negli studi di tossicità cronica e subcronica, si osservino effetti tossici nell’organo bersaglio. Vanno inoltre registrate la concentrazione del residuo (radioattivo) e le relazioni percentuali tra concentrazione nei tessuti e nel plasma (nel sangue). | 38. | È inoltre possibile che la valutazione della distribuzione tissutale in ulteriori momenti — ad esempio nel momento della concentrazione di picco nel plasma/nel sangue (es. Tmax) o al massimo dell’escrezione urinaria — ottenuta, rispettivamente, a partire da studi di cinetica plasmatica/sanguigna o da studi sull’escrezione, possa essere necessaria a un’autorità competente o venga richiesta da quest’ultima. Si tratta di un’informazione che può aiutare a comprendere la tossicità e il potenziale di accumulo e di persistenza della sostanza in esame e dei metaboliti. Occorre giustificare la scelta dei campioni; i campioni da sottoporre ad analisi devono solitamente essere uguali a quelli indicati sopra (cfr. paragrafo 37). | 39. | Negli studi sulla distribuzione tissutale è possibile quantificare la radioattività ricorrendo a dissezione, omogeneizzazione, combustione e/o solubilizzazione degli organi, seguite da conteggio in scintillazione liquida dei residui intrappolati. Altre tecniche (es. autoradiografia quantitativa a corpo intero e microautoradiografia dei recettori), attualmente a diversi livelli di sviluppo, potrebbero dimostrarsi utili per determinare la distribuzione di una sostanza chimica negli organi e/o nei tessuti (3) (4). | 40. | Per le vie d’esposizione che non siano quella orale, occorre prelevare e analizzare tessuti specifici, ad esempio i polmoni negli studi che prevedono la somministrazione per via inalatoria e la pelle in quelli con somministrazione per via cutanea. Cfr. paragrafi da 74 a 78. | Metabolismo | 41. | È necessario raccogliere escreti (e plasma, se del caso) per procedere all’identificazione e alla quantificazione di una sostanza chimica e dei suoi metaboliti, non modificati, come descritto ai paragrafi da 44 a 49. È accettabile raggruppare gli escreti per facilitare l’identificazione dei metaboliti in seno a un determinato gruppo-dose. Si raccomanda di stabilire il profilo dei metaboliti per ogni fase dello studio. Tuttavia, se l’assenza di campioni o di radioattività impedisce di farlo, è accettabile raggruppare l’urina e le feci raccolte in diversi momenti, ma provenienti solo da animali dello stesso sesso che abbiano ricevuto la stessa dose. Utilizzare metodi qualitativi e quantitativi appropriati per le analisi delle urine, delle feci e della radioattività espirata nonché, se del caso, della bile degli animali esposti. | 42. | Occorre fare un ragionevole sforzo per identificare tutti i metaboliti presenti in una percentuale uguale o superiore al 5 % della dose somministrata e tracciare uno schema metabolico per la sostanza in esame. Se la quantità della sostanza chimica in esame presente negli escreti è pari o superiore al 5 % della dose somministrata, la sostanza chimica va identificata. Con “identificata” si intende che venga determinata la struttura esatta dei suoi componenti. Normalmente, l’identificazione avviene effettuando simultaneamente una co-cromatografia del metabolita e dei modelli conosciuti, usando due sistemi diversi, oppure utilizzando tecniche in grado di determinare con sicurezza la struttura come la spettrometria di massa, la risonanza magnetica nucleare ecc. Nel caso della co-cromatografia, i metodi cromatografici che utilizzano la stessa fase stazionaria con due sistemi di solventi diversi non sono considerati adeguati per verificare l’identità dei metaboliti in quanto i due sistemi non sono indipendenti. L’identificazione tramite co-cromatografia va ottenuta utilizzando due sistemi diversi e indipendenti sul piano analitico, come ad esempio la cromatografia su strato sottile (TLC) in fase normale o inversa, oppure la cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC). Se la qualità della separazione cromatografica è adeguata, non è necessario ottenere un’ulteriore conferma tramite mezzi spettroscopici. Per un’identificazione inequivocabile è possibile ricorrere anche a metodi che forniscono informazioni strutturali: cromatografia in fase liquida/spettrometria di massa (LC-MS), oppure cromatografia in fase liquida/spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS), gascromatografia/spettrometria di massa (GC-MS) e spettrometria di risonanza magnetica nucleare. | 43. | Se non è possibile procedere all’identificazione dei metaboliti che rappresentano, individualmente, il 5 % od oltre della dose somministrata è necessario fornire una giustificazione/spiegazione di questo fatto nella relazione finale. Potrebbe essere utile identificare i metaboliti che rappresentano meno del 5 % della dose somministrata per migliorare la comprensione della via metabolica per la valutazione dei rischi e/o dei pericoli della sostanza in esame. Ogniqualvolta possibile, è necessario fornire la conferma della struttura dei metaboliti, che potrebbe rendere necessario stabilire il profilo metabolico nel plasma, nel sangue o in altri tessuti. | Escrezione | 44. | Il tasso e il grado di escrezione della sostanza somministrata devono essere determinati attraverso la misurazione della percentuale di dose (radioattiva) recuperata dalle urine, dalle feci e dall’aria espirata. Si tratta di dati utili anche per stabilire il bilancio di massa. Le quantità della sostanza (radioattività) in esame eliminate nelle urine, nelle feci e nell’aria espirata devono essere determinate ad intervalli appropriati (cfr. paragrafi da 47 a 49). Gli esperimenti a dosi ripetute devono essere appositamente impostati, in modo da consentire la raccolta di dati sugli escreti sufficienti a raggiungere gli obiettivi stabiliti al paragrafo 26. Ciò consentirà di poterli confrontare con quelli degli esperimenti con dose unica. | 45. | Se lo studio pilota dimostra che la quantità di sostanza in esame (radioattività) escreta nell’aria espirata non è significativa (secondo il paragrafo 49), per lo studio definitivo non sarà necessario raccogliere l’aria espirata. | 46. | Ciascun animale viene collocato in un’unità metabolica separata per la raccolta degli escreti (urina, feci, aria espirata). Alla fine di ciascun periodo di raccolta (cfr. paragrafi da 47 a 49), le unità metaboliche vanno risciacquate con un solvente adeguato (“acqua di risciacquo”) per assicurare il massimo recupero della sostanza in esame (radioattività). La raccolta degli escreti termina in capo a sette giorni o dopo aver recuperato almeno il 90 % della dose, a seconda di quale eventualità si verifica per prima. | 47. | La quantità totale della sostanza in esame (radioattività) nelle urine dev’essere determinata almeno due volte nel corso della prima giornata di raccolta (una delle quali 24 ore dopo la somministrazione della dose) per poi continuare una volta al giorno fino alla fine dello studio. Per la prima giornata, si raccomanda di optare per più di due momenti di campionamento (ad esempio dopo 6, 12 e 24 ore). I risultati degli studi pilota vanno analizzati per trarre informazioni sull’opportunità di introdurre momenti di raccolta diversi o supplementari. È necessario giustificare la scelta del calendario adottato. | 48. | La quantità totale della sostanza in esame (radioattività) nelle feci dev’essere determinata una volta al giorno, a partire da 24 ore dopo la somministrazione della dose e fino alla fine dello studio, salvo indicazioni contrarie provenienti dagli studi pilota che suggeriscano di svolgere raccolte più frequenti o in altri momenti. È necessario giustificare la scelta di un calendario alternativo. | 49. | Se in un determinato studio meno dell’1 % della dose somministrata viene rilevata nell’aria espirata raccolta in un periodo di 24 ore, la raccolta di CO2 espirata e di altri materiali volatili può essere sospesa. | Studi in funzione del tempo | Cinetica plasmatica/sanguigna | 50. | Lo scopo di questi studi è di ottenere delle stime relative ai principali parametri tossicocinetici della sostanza in esame [es.: Cmax, Tmax, emivita (t1/2), AUC]. È possibile svolgere gli studi somministrando una dose unica, ma generalmente se ne somministrano due o più. Le dosi vengono stabilite a seconda della natura e/o dell’oggetto dello studio. I dati cinetici possono essere necessari per risolvere questioni quali la biodisponibilità della sostanza in esame e/o per chiarire gli effetti della dose sull’eliminazione (vale a dire, per chiarire se la saturazione dell’eliminazione dipende o meno dalla dose). | 51. | Per questo tipo di studi, devono essere usati almeno quattro animali dello stesso sesso per ogni gruppo-dose. È necessario giustificare la scelta del sesso degli animali. Occorre prendere in considerazione l’opportunità di ricorrere ad animali di entrambi i sessi (quattro maschi e quattro femmine) in presenza di dati che suffragano differenze tossicologiche significative legate al sesso. | 52. | Dopo la somministrazione della sostanza (radiomarcata), utilizzare un metodo di campionamento adeguato per prelevare campioni di sangue da ogni animale in momenti idonei. Eventuali potenziali effetti del campionamento ripetuto sulla salute/fisiologia degli animali e/o la sensibilità del metodo analitico potrebbero limitare il volume e il numero di campioni di sangue da prelevare da ciascun animale. Devono essere sottoposti ad analisi campioni provenienti da ogni singolo animale. In determinate circostanze (ad esempio per la caratterizzazione dei metaboliti), può essere necessario raggruppare i campioni provenienti da diversi animali. I campioni raggruppati devono essere chiaramente identificati e occorre fornire una spiegazione per la scelta del raggruppamento. Se si utilizza una sostanza chimica radiomarcata, può essere opportuno determinare la radioattività totale presente. In tal caso, la radioattività totale deve essere analizzata nel sangue intero e nel plasma o nel plasma e negli eritrociti, per poter calcolare il rapporto sangue/plasma. In altre circostanze, potrebbero essere necessari studi più approfonditi che includano l’identificazione del composto progenitore e/o dei metaboliti o la valutazione della fissazione alle proteine. | Altri studi di cinetica tissutale | 53. | Questi studi si propongono di ottenere informazioni sull’evoluzione nel tempo, per chiarire questioni legate ad aspetti quali il meccanismo dell’azione tossica, il bioaccumulo e la biopersistenza, determinando i livelli della sostanza chimica in esame nei vari tessuti. I tipi di tessuti selezionati e il numero di momenti da sottoporre a valutazione dipenderanno dagli aspetti oggetto dello studio e dalla base dei dati tossicologici disponibili per la sostanza chimica in esame. Il disegno di questi ulteriori studi di cinetica tissutale deve tenere conto delle informazioni raccolte seguendo le indicazioni dei paragrafi da 37 a 40. Gli studi possono essere condotti somministrando una dose unica o dosi ripetute. Occorre fornire una giustificazione dettagliata dell’approccio scelto. | 54. | Le ragioni che possono giustificare il ricorso a ulteriori studi cinetici comprendono: | — | indicazioni di una emivita prolungata nel sangue, che suggeriscono la possibilità di un accumulo della sostanza nei diversi tessuti, oppure | — | l’interesse a verificare se è stato raggiunto uno stadio stazionario in determinati tessuti (ad esempio, negli studi a somministrazione ripetuta, sebbene possa sembrare che la concentrazione della sostanza in esame nel sangue abbia raggiunto uno stato apparentemente stazionario, può essere utile confermare se sia stata raggiunta la stessa concentrazione stazionaria anche nei tessuti bersaglio). | 55. | Per questo tipo di studi in funzione del tempo, occorre somministrare per via orale una dose adeguata della sostanza chimica in esame ad almeno quattro animali, per ciascuna dose e per punto temporale, e sorvegliare l’evoluzione nel tempo della distribuzione nei tessuti selezionati. Si utilizzano animali dello stesso sesso, salvo se si è osservata una tossicità specifica legata al sesso. A seconda dell’oggetto dello studio, si procederà o meno all’analisi della radioattività totale o della sostanza madre e/o dei metaboliti. Utilizzare tecniche idonee per valutare la distribuzione tissutale. | Induzione/Inibizione enzimatica | 56. | In uno o più dei casi elencati di seguito può essere necessario svolgere studi sui possibili effetti dell’induzione/inibizione enzimatica o della biotrasformazione della sostanza in esame: | 1) | se alcuni elementi indicano una possibile relazione tra biotrasformazione della sostanza in esame e aumento della tossicità; | 2) | se i dati sulla tossicità disponibili segnalano una relazione non lineare tra dose e metabolismo; | 3) | se gli studi sull’identificazione dei metaboliti identificano un metabolita potenzialmente tossico che può essere stato prodotto da una via enzimatica indotta dalla sostanza chimica in esame; | 4) | per spiegare effetti che si presume siano legati a fenomeni di induzione enzimatica; | 5) | in caso di esperimenti in vitro o in vivo con specie e in condizioni diverse, se vengono osservate alterazioni tossicologiche rilevanti nel profilo metabolico della sostanza in esame, può essere necessario caratterizzare l’enzima o gli enzimi coinvolti (per esempio, enzimi di fase I come gli isoenzimi del sistema della monoossigenasi dipendente dal citocroma P450, enzimi di fase II come gli isoenzimi della uridina difosfato glucoronil-transferasi, o ogni altro enzima pertinente). Queste informazioni possono essere utilizzate per valutare la pertinenza delle specie in causa per le estrapolazioni inter-specie. | 57. | Per valutare le variazioni tossicocinetiche legate alla sostanza in esame, è necessario utilizzare protocolli di studio adeguati, debitamente convalidati e giustificati. Il disegno dello studio può ad esempio prevedere la somministrazione di dosi ripetute di una sostanza non marcata, seguite da una dose unica radiomarcata somministrata il 14° giorno, oppure la somministrazione di dosi ripetute con una sostanza radiomarcata con campionamenti il 1o, 7° e 14° giorno in modo da determinare il profilo dei metaboliti. La somministrazione di dosi ripetute della sostanza chimica radiomarcata, inoltre, può fornire informazioni sul bioaccumulo (cfr. paragrafo 26). | METODI COMPLEMENTARI | 58. | Altri metodi, al di là degli esperimenti in vivo descritti in questo metodo di prova, possono fornire informazioni utili su assorbimento, distribuzione, metabolismo o eliminazione delle sostanze chimiche in determinate specie. | Uso dei dati ottenuti in vitro | 59. | Utilizzando sistemi di prova adeguati è possibile studiare in vitro molti aspetti del metabolismo della sostanza in esame. Si può ricorrere a epatociti isolati di fresco o coltivati, oppure a frazioni subcellulari (es.: microsomi e citosol o frazione S9) epatiche per studiare i possibili metaboliti. Il metabolismo locale nell’organo bersaglio, ad esempio il polmone, può fornire indicazioni interessanti per la valutazione dei rischi. A tal fine, possono essere utili frazioni microsomiali dei tessuti bersaglio. Gli studi che ricorrono ai microsomi possono servire a indagare potenziali differenze dovute al genere o alle fasi di vita e a caratterizzare i parametri enzimatici (Km e Vmax) che possono essere d’aiuto nella valutazione della dose-dipendenza del metabolismo rispetto ai livelli di esposizione. Inoltre, i microsomi possono essere utili nell’identificazione degli enzimi microsomiali specifici coinvolti nel metabolismo della sostanza in esame, un aspetto che può rivelarsi importante per le estrapolazioni inter-specie (cfr. anche paragrafo 56). È inoltre possibile esaminare il potenziale di induzione della biotrasformazione utilizzando frazioni subcellulari epatiche (es. microsomi e citosol) di animali pretrattati con la sostanza in questione, attraverso studi di induzione sugli epatociti in vitro o a partire da determinate linee cellulari che esprimono degli enzimi pertinenti. In determinate circostanze e in condizioni adeguate, le frazioni subcellulari provenienti da tessuti umani possono essere prese in considerazione ed essere utilizzate per determinare eventuali differenze tra specie a livello di biotrasformazione. I risultati degli studi in vitro possono essere utili anche per sviluppare modelli tossicocinetici su base fisiologica (5). | 60. | A partire da studi in vitro sull’assorbimento cutaneo, si possono ottenere informazioni supplementari per caratterizzare l’assorbimento (6). | 61. | È possibile utilizzare colture cellulari primarie da cellule epatiche e campioni tissutali freschi per chiarire questioni simili a quelle studiate ricorrendo a microsomi epatici. In alcuni casi, si potrebbero trovare risposte a determinate questioni utilizzando linee cellulari che esprimano specificamente l’enzima in causa, o linee cellulari geneticamente modificate. In altri casi, può essere utile studiare in vitro l’inibizione e l’induzione di isoenzimi specifici del citocroma P450 (es. CYP1A1, 2E1, 1A2, e altri) e/o di enzimi di fase II, attraverso il composto progenitore. Le informazioni ottenute possono dimostrarsi utili per composti di struttura simile. | Uso di dati tossicocinetici provenienti da studi di tossicità quali informazioni complementari | 62. | Le analisi di campioni di sangue, tessuti e/o escreti svolte all’interno di altri studi di tossicità possono fornire dati su biodisponibilità, cambiamenti nella concentrazione plasmatica in funzione del tempo (AUC, Cmax), potenziale di bioaccumulo, tassi di eliminazione e cambiamenti nel metabolismo e nella cinetica legati al genere o alle fasi di vita. | 63. | Si possono effettuare modifiche a livello di impostazione dello studio per rispondere a domande concernenti: la saturazione delle vie di assorbimento, di biotrasformazione o di escrezione a dosi più elevate; il funzionamento di nuove vie metaboliche a dosi più elevate; la limitazione dei metaboliti tossici, sempre a dosi più elevate. | 64. | Si possono affrontare anche altre considerazioni legate alla valutazione dei rischi: | — | la sensibilità in funzione dell’età, dovuta alle differenze nello stato della barriera emato-encefalica, a livello dei reni e/o delle capacità di detossificazione, | — | la sensibilità di determinate sottopopolazioni dovuta a differenze nella capacità di biotrasformazione o ad altre differenze tossicocinetiche, | — | il grado di esposizione fetale per trasferimento transplacentare delle sostanze chimiche o l’esposizione neonatale attraverso l’allattamento. | Uso dei modelli tossicocinetici | 65. | I modelli tossicocinetici possono essere utili per diversi aspetti della valutazione dei rischi e dei pericoli, ad esempio nella previsione dell’esposizione sistemica e della dose trasmessa ai tessuti interni. Inoltre, possono servire per chiarire determinate questioni relative alle modalità d’azione, potendo fungere da base per estrapolazioni interspecie, tra vie di esposizione, tra dosaggi, e per la valutazione dei rischi per l’uomo. Tra i dati utili per l’elaborazione di modelli tossicocinetici su base fisiologica per una sostanza chimica in esame in una determinata specie si trovano: 1) i coefficienti di ripartizione; 2) le costanti biochimiche e i parametri fisiologici; 3) i parametri di assorbimento specifico per via di esposizione; e 4) i dati cinetici in vivo per la valutazione dei modelli [ad esempio i parametri di eliminazione per le vie di escrezione pertinenti (> 10 %) nonché Km e Vmax per il metabolismo]. I dati sperimentali usati per elaborare il modello devono essere generati ricorrendo a metodi scientificamente solidi e i risultati ottenuti dall’applicazione del modello devono essere convalidati. Per facilitare l’elaborazione di modelli non compartimentali o a base fisiologica (7) vengono spesso determinati parametri specifici a una sostanza chimica o a una specie in esame, quali i tassi di assorbimento, il coefficiente di ripartizione sangue-tessuto e le costanti di velocità metabolica. | DATI E RELAZIONE | 66. | Si raccomanda di inserire un indice nella relazione. | Corpo della relazione | 67. | Il corpo della relazione deve includere le informazioni previste dal presente metodo di prova, organizzate nelle sezioni e nei paragrafi descritti di seguito. | Sintesi | 68. | Occorre esporre sinteticamente l’impostazione dello studio e il metodo usato. È altrettanto necessario evidenziare i risultati principali concernenti il bilancio di massa, la natura e l’importanza dei metaboliti, i residui nei tessuti, il tasso di eliminazione, il potenziale di bioaccumulo, le differenze legate al sesso ecc. La sintesi dev’essere dettagliata a sufficienza da consentire una valutazione dei risultati. | Introduzione | 69. | In questa sezione si presentano gli obiettivi dello studio, le ragioni alla sua base e l’impostazione sperimentale, come pure i riferimenti pertinenti ed eventuali cenni storici. | Materiali e metodi | 70. | Vanno descritte in dettaglio tutte le informazioni pertinenti, in particolare: | a) | sostanza chimica in esame | È necessario includere l’identificazione del prodotto chimico, che deve comprendere: denominazione chimica, struttura molecolare, composizione chimica qualitativa e quantitativa, grado di purezza chimica e, se possibile, tipo e quantità delle eventuali impurità. Occorre inoltre includere informazioni sulle proprietà fisico-chimiche, incluso stato fisico, colore, grado lordo di solubilità e/o coefficiente di ripartizione, stabilità e, se del caso, corrosività. Se del caso, fornire informazioni sugli isomeri. Se la sostanza chimica è radiomarcata, vanno indicati: il tipo di radionuclide, la posizione della marcatura, l’attività specifica e il grado di purezza radiochimica. | Si deve indicare il tipo o la descrizione dei veicoli, dei diluenti, degli agenti di sospensione e degli emulsionanti o di altri materiali utilizzati per somministrare la sostanza in esame; | b) | animali da laboratorio | È necessario fornire informazioni sugli animali utilizzati per la prova, incluse quelle sulla selezione, giustificandola, della specie, del ceppo, dell’età all’inizio dello studio, del sesso, insieme a informazioni su peso corporeo, stato di salute e condizioni di allevamento; | c) | metodi | Occorre fornire dettagli sull’impostazione dello studio e sulla metodologia utilizzata, includendo: | 1) | una giustificazione delle eventuali modifiche alla via e, se del caso, alle condizioni di esposizione; | 2) | una giustificazione della scelta dei livelli della dose; | 3) | la descrizione degli studi pilota sottesi al disegno sperimentale degli studi di follow-up, se del caso, allegando i dati di supporto provenienti dagli studi pilota; | 4) | la modalità di preparazione della soluzione somministrata, il tipo di solvente o veicolo, se utilizzato; | 5) | il numero dei gruppi esposti e il numero degli animali per ciascun gruppo; | 6) | il livello e il volume delle dosi (e attività specifica in caso di utilizzo di marcatori radioattivi); | 7) | la o le vie e i metodi di somministrazione; | 8) | la frequenza di somministrazione; | 9) | il periodo di digiuno (se del caso); | 10) | la radioattività totale per animale; | 11) | la manipolazione degli animali; | 12) | la raccolta e il trattamento dei campioni; | 13) | i metodi d’analisi utilizzati per la separazione, quantificazione e identificazione dei metaboliti; | 14) | i limiti di rivelabilità per i metodi utilizzati; | 15) | le altre misure e procedure sperimentali utilizzate (inclusa la validazione dei metodi per l’analisi dei metaboliti); | d) | analisi statistica | Se per analizzare i risultati degli studi si ricorre all’analisi statistica, la relazione deve includere sufficienti informazioni sul metodo di analisi e sul programma informatico utilizzati, in maniera tale che un revisore o un esperto di statistica indipendente possa rivalutare e ricostruire l’analisi. | Nel caso si ricorra a una modellizzazione sistemica, utilizzando ad esempio modelli tossicocinetici su base fisiologica, la presentazione dei modelli deve includerne una descrizione completa in modo da poterli ricostruire e convalidare in modo indipendente (cfr. paragrafo 65 e l’appendice “Definizioni”). | Risultati | 71. | I dati vanno riportati sinteticamente in una tabella, con una valutazione statistica idonea e una descrizione. Quelli relativi al conteggio della radioattività devono essere sintetizzati e presentati nel modo più consono allo studio, in genere in microgrammi o milligrammi equivalenti per massa del campione, sebbene sia possibile utilizzare altre unità. In questa sezione della relazione vanno inserite le illustrazioni grafiche dei risultati, la riproduzione dei dati cromatografici e spettrometrici, l’identificazione/quantificazione dei metaboliti e le vie metaboliche proposte, ivi compresa la struttura molecolare dei metaboliti. Inoltre, ove pertinenti, vanno incluse le informazioni elencate di seguito: | 1) | quantità e recupero percentuale della radioattività nelle urine, nelle feci, nell’aria espirata e nell’acqua di risciacquo delle urine e delle feci dalle gabbie. | — | Per gli studi per via cutanea, è inoltre necessario includere i dati sul recupero della sostanza dalla cute trattata e dai lavaggi della cute, i dati relativi alla radioattività residua nella copertura protettiva della pelle e nell’unità metabolica, nonché i risultati dello studio sul lavaggio cutaneo; per ulteriori informazioni, cfr. paragrafi da 74 a 77, | — | per gli studi per via inalatoria, includere anche i dati sul recupero della sostanza in esame nei polmoni e nei tessuti nasali (8); per ulteriori informazioni, cfr. paragrafo 78; | 2) | distribuzione nei tessuti, espressa in percentuale della dose somministrata e come concentrazione (microgrammi equivalenti per grammo di tessuto) e rapporti tessuto/sangue o tessuto/plasma; | 3) | bilancio di materia elaborato per ciascuno studio, che implica l’analisi dei tessuti e degli escreti; | 4) | concentrazione del plasma e parametri tossicocinetici (biodisponibilità, AUC, Cmax, Tmax, eliminazione, emivita) della sostanza dopo la somministrazione attraverso la o le vie di esposizione pertinenti; | 5) | tasso e grado di assorbimento della sostanza chimica in esame dopo la somministrazione attraverso la o le vie di esposizione pertinenti; | 6) | quantità della sostanza chimica e dei metaboliti (espressa in percentuale della dose somministrata) raccolta negli escreti; | 7) | riferimento ai dati sugli animali presentati in allegato per tutti i parametri e gli endpoint misurati (ad esempio, dose somministrata, percentuale di recupero, concentrazioni, parametri tossicocinetici ecc.). | 8) | grafico sul quale figurano le vie metaboliche proposte e la struttura metabolica dei metaboliti. | Discussione dei risultati e conclusioni | 72. | In questa sezione della relazione l’autore, o gli autori, devono: | 1) | proporre la via metabolica, basata sui risultati del metabolismo e sull’eliminazione della sostanza chimica in esame; | 2) | esaminare le eventuali differenze legate alla specie e al sesso, rispetto all’eliminazione e/o alla biotrasformazione della sostanza chimica in esame; | 3) | presentare sotto forma di tabella ed esaminare l’identità e l’importanza dei metaboliti, i tassi di eliminazione, il potenziale di bioaccumulo e il livello dei residui tissutali del composto progenitore e/o del o dei metaboliti, oltre a eventuali alterazioni dei parametri tossicocinetici in funzione della dose; | 4) | integrare in questa sezione eventuali dati tossicocinetici pertinenti, ottenuti nel corso dello svolgimento degli studi di tossicità; | 5) | fornire una conclusione concisa, giustificata dai risultati dello studio; | 6) | aggiungere altre sezioni, se necessario. | 73. | Le eventuali ulteriori sezioni possono servire ad includere informazioni bibliografiche a sostegno degli studi, tabelle, grafici, appendici ecc. | VIE DI ESPOSIZIONE ALTERNATIVE | Via cutanea | Esposizione per via cutanea | 74. | Questa sezione contiene indicazioni specifiche per studi di tossicocinetica sulla sostanza in esame somministrata per via cutanea. Per quanto riguarda l’assorbimento cutaneo, consultare il capitolo B.44 del presente allegato: Assorbimento cutaneo: metodo in vivo (9). Per altri endpoint, quali la distribuzione e il metabolismo, è possibile utilizzare il presente metodo di prova (B.36). Nell’esposizione per via cutanea, è possibile utilizzare uno o più livelli di dose della sostanza chimica in esame. La sostanza chimica in esame (sostanza chimica pura, diluita o formulazione che la contenga, da applicare sulla pelle) deve essere identica (o essere un suo surrogato plausibile) a quella a cui possono essere esposti gli esseri umani o le altre specie bersaglio potenziali. Il livello o i livelli di dose devono essere scelti conformemente a quanto indicato ai paragrafi da 20 a 26 del presente metodo di prova. I fattori di cui tenere conto nella scelta della o delle dosi da somministrare per via cutanea sono la prevista esposizione umana e/o le dosi alle quali è stata osservata tossicità in altri studi di tossicità cutanea. La o le dosi da somministrare per via cutanea devono essere disciolte in un veicolo idoneo e applicate in congrua quantità. Poco prima della prova si effettua il taglio del pelo nella parte dorsale del corpo degli animali. Si può usare la rasatura, ma questa dovrebbe essere effettuata circa 24 ore prima dell’inizio della prova. Durante le operazioni di taglio o rasatura, si deve badare a non ledere la cute dell’animale per evitarne l’abrasione che potrebbe alterarne la permeabilità. Si dovrà preparare circa il 10 % della superficie corporea per l’applicazione della sostanza in esame. In caso di sostanze altamente tossiche, la superficie può essere inferiore al 10 %, ma deve però essere coperta quanto più possibile da uno strato uniforme e sottile della sostanza. La superficie esposta deve essere la stessa per tutti i gruppi di animali che partecipano alla prova cutanea. Le superfici esposte devono essere protette con una protezione idonea adeguatamente fissata in posizione. Gli animali vanno alloggiati separatamente. | 75. | È necessario svolgere uno studio sul lavaggio cutaneo per determinare la quantità di dose somministrata che può essere rimossa dalla pelle mediante un lavaggio della superficie esposta con sapone delicato e acqua. Tale studio può essere utilizzato anche per stabilire il bilancio di massa quando la sostanza in esame viene somministrata per via cutanea. Per realizzare questo studio, applicare un dose unica della sostanza su due animali. La scelta del livello della dose va effettuata conformemente a quanto indicato al paragrafo 23 del presente metodo di prova (cfr. anche paragrafo 76 per indicazioni sul tempo di contatto con la pelle). Per valutare l’efficacia della rimozione della sostanza in esame attraverso questo metodo di lavaggio, occorre determinare la quantità di sostanza recuperata nell’acqua di lavaggio. | 76. | Salvo che la corrosività lo impedisca, una volta applicata, la sostanza chimica in esame va lasciata a contatto della pelle per un minimo di 6 ore. Una volta rimossa la protezione, l’area esposta deve essere lavata seguendo la procedura descritta per lo studio sul lavaggio cutaneo (cfr. paragrafo 75). Analizzare sia la protezione sia l’acqua di lavaggio per determinare la quantità residua della sostanza chimica in esame. Al termine dello studio, gli animali vengono sottoposti a eutanasia, conformemente al riferimento bibliografico (2), e la pelle esposta viene rimossa. Occorre analizzare una sezione idonea della pelle esposta per determinare i residui della sostanza chimica in esame (radioattività). | 77. | Per la valutazione tossicocinetica dei prodotti farmaceutici può essere necessario ricorrere ad altri protocolli, conformemente agli obblighi normativi applicabili. | Via inalatoria | 78. | Per questo tipo di studi va utilizzata una concentrazione unica (o più concentrazioni, se necessario) della sostanza in esame. La o le concentrazioni devono essere scelte conformemente a quanto indicato ai paragrafi da 20 a 26 del presente metodo di prova. La somministrazione per via inalatoria deve effettuarsi tramite apparecchi che consentono di esporre solo il naso o la testa, in modo da evitare l’assorbimento tramite altre vie d’esposizione (8). Se vengono utilizzate altre condizioni di esposizione per via inalatoria, è necessario giustificare e documentare la scelta. Il periodo di esposizione va indicato (generalmente, si situa tra le 4 e le 6 ore). | BIBLIOGRAFIA | (1) | OCSE (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paris. | (2) | OCSE (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment N°19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paris. | (3) | Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81. | (4) | Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25-40. | (5) | Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400 – 411. | (6) | Capitolo B.45 del presente allegato, Assorbimento cutaneo: metodo in vitro. | (7) | IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety. | (8) | OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paris. | (9) | Capitolo B.44 del presente allegato, Assorbimento cutaneo: metodo in vivo. | (10) | Barton HA, et al. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35. | (11) | Gibaldi M and Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York. | Appendice | DEFINIZIONI | Assorbimento: processo o processi tramite i quali una sostanza chimica attraversa i tessuti o vi penetra. L’assorbimento si riferisce a un composto progenitore e a tutti i suoi metaboliti. Non va confuso con “biodisponibilità”. | Accumulo (bioaccumulo): aumento, nel corso del tempo, della quantità della sostanza chimica in esame nei tessuti (solitamente tessuti grassi, dopo ripetute esposizioni); se la quantità somministrata della sostanza in esame è maggiore della quantità eliminata, essa si accumula nell’organismo fino anche a raggiungere concentrazioni tossiche. | ADME: sigla che sta per “Assorbimento, Distribuzione, Metabolismo ed Escrezione”. | AUC (Area Under the Curve, area sotto la curva): area sotto la curva “concentrazione plasmatica/tempo” della sostanza in esame. Rappresenta il volume totale della sostanza in esame assorbita dal corpo in un intervallo di tempo predeterminato. In condizioni lineari, l’AUC (da zero a infinito) è proporzionale al volume totale della sostanza in esame assorbita dal corpo, a prescindere dal tasso di assorbimento. | Autoradiografia: (autoradiografia a corpo intero) tecnica utilizzata per determinare qualitativamente e/o quantitativamente la localizzazione tissutale della sostanza radioattiva in esame; utilizza pellicola a raggi X o, più recentemente, immagini digitali su schermi al fosforo per visualizzare molecole o frammenti di molecole radiomarcate, registrando l’irraggiamento emesso all’interno dell’oggetto studiato. Rispetto alla dissezione degli organi, l’autoradiografia quantitativa a corpo intero può comportare dei vantaggi per determinare la distribuzione della sostanza in esame e valutare il recupero globale e la risoluzione del materiale radioattivo nei tessuti. Un vantaggio significativo, per esempio, è rappresentato dal fatto che questa tecnica può essere utilizzata su un modello animale pigmentato per valutare l’eventuale associazione della sostanza in esame con la melanina, che può legarsi ad alcune molecole. Tuttavia, sebbene possa rappresentare un mezzo utile per visualizzare globalmente i siti di fissazione di grande capacità e bassa affinità, questa tecnica può rivelarsi meno efficace per quanto riguarda il riconoscimento di siti bersaglio specifici quali i siti di fissaggio dei recettori per rilevare i quali è necessario ricorrere a risoluzioni e sensibilità relativamente elevate. Quando si ricorre all’autoradiografia, gli esperimenti intesi a determinare il bilancio di massa dei composti somministrati vanno svolti su un gruppo distinto o tramite uno studio distinto rispetto a quello che si concentra sulla distribuzione tissutale, nel quale tutti gli escreti (che possono includere l’aria espirata) e le carcasse intere vengono omogeneizzati e testati tramite conteggio in scintillazione liquida. | Escrezione biliare: escrezione attraverso i dotti biliari. | Bioaccumulo: cfr. “accumulo”. | Biodisponibilità: frazione di una dose somministrata che raggiunge la circolazione sistemica o viene resa disponibile nel sito dell’attività fisiologica. Generalmente, la biodisponibilità della sostanza in esame si riferisce al composto progenitore, ma potrebbe riferirsi ai suoi metaboliti. Tiene conto di una sola forma chimica. NB biodisponibilità e assorbimento non sono sinonimi. La differenza, ad esempio, tra assorbimento orale (cioè presenza nella parete intestinale e circolazione portale) e biodisponibilità (cioè presenza nel sangue sistemico e nei tessuti) potrebbe derivare, tra le varie possibilità, dalla degradazione chimica dovuta al metabolismo delle pareti intestinali, dall’efflusso verso il lume intestinale o dal metabolismo presistemico nel fegato (10). La biodisponibilità del componente tossico (il composto progenitore o un metabolita) rappresenta un parametro fondamentale per la valutazione del rischio per gli esseri umani (estrapolazione da dosi basse a dosi alte, estrapolazione da una via all’altra) per poter derivare un valore interno dal NOAEL o dalla BMD esterni (dose applicata). Per studiare gli effetti sul fegato in caso di somministrazione orale, è sufficiente l’assorbimento orale. Tuttavia, per valutare tutti gli altri effetti, escluso quello alla porta d’entrata, il parametro generalmente più affidabile da utilizzare per un’ulteriore valutazione del rischio è rappresentato dalla biodisponibilità e non dall’assorbimento. | Biopersistenza: cfr. “Persistenza”. | Biotrasformazione: conversione chimica (solitamente enzimatica), all’interno del corpo, della sostanza in esame in una sostanza chimica diversa. Sinonimo di “metabolismo”. | Cmax : concentrazione massima (picco di concentrazione) nel sangue (plasma/siero) dopo la somministrazione, oppure escrezione massima (picco di escrezione) nelle urine o nelle feci dopo la somministrazione. | Velocità di eliminazione (clearance rate): misura quantitativa della velocità alla quale una sostanza viene eliminata dal sangue, dal plasma o da un dato tessuto, per unità di tempo. | Compartimento: porzione (o unità) strutturale o biochimica di un corpo, tessuto o cellula, separata dal resto di tale corpo, tessuto o cellula. | Vie di detossificazione: serie di tappe che conducono all’eliminazione delle sostanze tossiche dal corpo, per trasformazione metabolica o per escrezione. | Distribuzione: dispersione di un prodotto chimico e dei suoi derivati attraverso l’organismo. | Enzimi/Isoenzimi: Proteine che catalizzano le reazioni chimiche. Gli isoenzimi sono enzimi che catalizzano reazioni chimiche simili ma si differenziamo nella sequenza degli aminoacidi. | Parametri enzimatici: Km (costante di Michaelis) e Vmax (velocità massima). | Escrezione: processo o processi attraverso i quali una sostanza somministrata e/o i suoi metaboliti vengono rimossi dal corpo. | Esogeno: introdotto dall’esterno o prodotto all’esterno dell’organismo o del sistema. | Estrapolazione: inferenza di uno o più valori sconosciuti sulla base di ciò che è conosciuto o è stato osservato. | Emivita (t1/2): tempo necessario a ridurre della metà la concentrazione della sostanza in esame in un comparto. Si riferisce generalmente alla concentrazione del plasma o alla quantità della sostanza presente nell’intero corpo. | Induzione/Induzione enzimatica: sintesi degli enzimi in risposta a uno stimolo ambientale o a una molecola induttrice. | Linearità/cinetica lineare: in cinetica si definisce un processo come lineare quando tutte le velocità di trasferimento tra compartimenti sono proporzionali alle quantità o concentrazioni presenti, cioè di primo ordine. Di conseguenza i volumi di eliminazione e di distribuzione sono costanti, allo stesso modo delle emivite. Le concentrazioni ottenute sono proporzionali ai tassi di somministrazione (esposizione) e l’accumulo è più facilmente prevedibile. È possibile valutare la linearità/non linearità attraverso il confronto dei parametri pertinenti, ad esempio l’AUC, dopo la somministrazione di dosi diverse o dopo un’esposizione singola e un’esposizione ripetuta. L’assenza di dose-dipendenza può essere indicativa della saturazione degli enzimi coinvolti nel metabolismo del composto, un aumento dell’AUC dopo esposizione ripetuta rispetto all’esposizione singola può indicare invece l’inibizione del metabolismo e, infine, una riduzione dell’AUC può indicare l’induzione del metabolismo [cfr. anche (11)]. | Bilancio di massa: contabilità delle entrate e delle uscite dal sistema della sostanza chimica in esame. | Bilancio di materia: cfr. “bilancio di massa”. | Meccanismo (Modalità) di tossicità/d’azione: il meccanismo d’azione si riferisce alle interazioni biochimiche specifiche attraverso le quali una sostanza produce il suo effetto. La modalità d’azione si riferisce ai fenomeni più generali attraverso i quali si manifesta la tossicità di una sostanza. | Metabolismo: sinonimo di “biotrasformazione”. | Metaboliti: prodotti del metabolismo o dei processi metabolici. | Assorbimento orale: percentuale della dose di sostanza in esame assorbita a partire dal sito di somministrazione (per esempio: tratto gastrointestinale). Si tratta di un parametro fondamentale che può aiutare a comprendere quale frazione della sostanza somministrata raggiunge la vena porta e in seguito il fegato. | Coefficiente di ripartizione: chiamato anche “coefficiente di distribuzione”, misura la solubilità differenziale di una sostanza chimica in due solventi. | Concentrazione sanguinea (plasmatica/sierica) massima: concentrazione massima (picco di concentrazione) nel sangue (plasma/siero) dopo la somministrazione (cfr. anche “Cmax”). | Persistenza (biopersistenza): presenza a lungo termine di una sostanza chimica (in un sistema biologico) dovuta alla sua resistenza alla degradazione/eliminazione. | Metodo read-across: metodo con il quale le informazioni sull’endpoint di una o più sostanze chimiche vengono utilizzate per prevedere l’endpoint della sostanza in esame. | Autoradiografia microscopica dei recettori (microautoradiografia dei recettori): tecnica che può essere utilizzata per studiare l’interazione xenobiotica con popolazioni di cellule o siti tissutali specifici, per esempio nel quadro degli studi sulla fissazione al recettore o sulla modalità d’azione specifica che possono richiedere una qualità di risoluzione e sensibilità impossibile da ottenere con altre tecniche come l’autoradiografia a corpo intero. | Via di somministrazione (per via orale, endovenosa, cutanea, per inalazione ecc.): come le sostanze chimiche vengono somministrate al corpo (es.: per via orale mediante sonda gastrica o mediante dieta, per via cutanea, per inalazione, per endovena ecc.). | Saturazione: stato nel quale uno o più processi cinetici (es.: assorbimento, metabolismo o eliminazione) raggiungono il picco massimo (sono cioè “saturi”). | Sensibilità: capacità di un metodo o di uno strumento di discriminare tra misurazioni corrispondenti a diversi livelli di risposta alla variabile in causa. | Concentrazione sanguinea (plasmatica) allo stato stazionario: stato di non equilibrio di un sistema aperto nel quale tutte le forze che agiscono sul sistema sono perfettamente controbilanciate da forze opposte in modo tale che tutti i componenti del sistema abbiano una concentrazione stazionaria, nonostante al suo interno circoli della materia. | Modellizzazione dei sistemi (modello tossicocinetico su base fisiologica, modello su base farmacocinetica, modello farmacocinetico su base fisiologica, modello su base biologica ecc.): modello astratto che utilizza il linguaggio matematico per descrivere il comportamento di un sistema. | Tessuto bersaglio: tessuto nel quale si manifesta il principale effetto avverso del tossico. | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. | Distribuzione tissutale: movimento reversibile di una sostanza chimica da un punto a un altro del corpo. La distribuzione tissutale può essere studiata ricorrendo a dissezione, omogeneizzazione, combustione e conteggio in scintillazione liquida di un organo oppure a autoradiografia qualitativa o quantitativa a corpo intero. Il primo metodo è utile per ottenere la concentrazione e la percentuale di recupero nei tessuti e nella carcassa degli stessi animali, ma può fornire una risoluzione insufficiente per tutti i tessuti e raggiungere un recupero globale che è lungi dall’essere ideale (< 90 %). Cfr. “autoradiografia”. | Tmax : tempo necessario a raggiungere Cmax. | Tossicocinetica (farmacocinetica): studio dell’assorbimento, della distribuzione, del metabolismo e dell’escrezione delle sostanze chimiche, nel tempo. | Convalida dei modelli: processo destinato a valutare se un modello descriva convenientemente i dati tossicocinetici disponibili. I modelli possono essere valutati attraverso la comparazione statistica o visiva delle loro predizioni con i valori sperimentali, in funzione di una variabile indipendente comune (ad esempio il tempo). La portata della valutazione dev’essere giustificata in funzione dell’uso che si intende fare del modello. | » | 7. | poglavje B.36 se nadomesti z naslednjim: | „B.36 TOKSIKOKINETIKA | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza OECD TG 417 (2010). Študije, s katerimi se preučuje toksikokinetika (TK) preskusne kemikalije, se izvajajo za pridobitev zadostnih informacij o njeni absorpciji, porazdelitvi, biotransformaciji (tj. presnovi) in izločanju, za pomoč pri povezovanju koncentracije ali odmerka z opaženo strupenostjo ter za razumevanje mehanizma strupenosti te kemikalije. TK lahko pomaga razumeti toksikološke študije z dokazovanjem, da so preskusne živali sistemsko izpostavljene preskusni kemikaliji, in razkrivanjem, kateri deli kemikalije krožijo (izhodiščna kemikalija/metaboliti). Osnovni toksikokinetični parametri, določeni v teh študijah, zagotavljajo tudi informacije o potencialu za kopičenje preskusne kemikalije v tkivih in/ali organih ter potencialu za indukcijo biotransformacije, ki je posledica izpostavljenosti preskusni kemikaliji. | 2. | Toksikokinetični podatki lahko pomagajo oceniti, ali so podatki o strupenosti za živali ustrezni in uporabni za ekstrapolacijo v oceno nevarnosti in/ali tveganja za ljudi. Poleg tega se lahko s toksikokinetičnimi študijami pridobijo koristne informacije za določanje velikosti odmerkov pri toksikoloških študijah (linearna/nelinearna kinetika) ter za ugotavljanje učinkov načina dajanja, biološke dostopnosti in vidikov, povezanih z zasnovo študije. Nekatere vrste toksikokinetičnih podatkov je mogoče uporabiti pri zasnovi toksikokinetičnih modelov, temelječih na fiziologiji (PBTK). | 3. | Podatki o metabolitih/toksikokinetični podatki imajo pomembne uporabe, kot je nakazovanje morebitnih strupenosti in načinov delovanja ter njihove povezanosti z velikostjo odmerka in načinom izpostavljenosti. Poleg tega se lahko s podatki o presnovi pridobijo informacije, ki so uporabne pri ocenjevanju toksikološkega pomena izpostavljenosti eksogeno ustvarjenim metabolitom preskusne kemikalije. | 4. | Ustrezni toksikokinetični podatki lahko pomagajo dodatno podkrepiti sprejemljivost in uporabnost kvantitativnih razmerij med strukturo in aktivnostjo ter pristopov navzkrižnega branja ali združevanja v skupine pri ocenjevanju varnosti kemikalij. Poleg tega se lahko kinetični podatki uporabljajo tudi za ocenjevanje toksikološkega pomena drugih študij (npr. in vivo/in vitro). | 5. | Če niso navedeni drugi načini dajanja (glej zlasti odstavke 74–78), se ta preskusna metoda uporablja za oralno dajanje preskusne kemikalije. | ZAČETNI PREUDARKI | 6. | Zakonodajni sistemi imajo za različne razrede kemikalij (npr. pesticide, biocide, industrijske kemikalije) različne zahteve in potrebe glede merjenja končnih točk in parametrov, povezanih s toksikokinetiko. V nasprotju z večino preskusnih metod je v tej preskusni metodi opisano toksikokinetično preskušanje, ki vključuje več meritev in končnih točk. V prihodnosti bo morda pripravljenih več novih preskusnih metod in/ali dokumentov s smernicami, v katerih bo podrobneje opisana vsaka končna točka posebej. V primeru te preskusne metode je odločitev o tem, kateri preskusi ali ocene se izvedejo, odvisna od zahtev in/ali potreb posameznega zakonodajnega sistema. | 7. | Za ocenjevanje toksikokinetičnega vedenja preskusne kemikalije za zakonodajne namene se lahko izvedejo številne študije. Vendar glede na posebne zakonodajne potrebe ali okoliščine za ocenjevanje preskusne kemikalije vse morda niso potrebne. Pri zasnovi toksikokinetičnih študij sta potrebna prožnost in upoštevanje lastnosti preiskovane preskusne kemikalije. Včasih je morda treba preiskati samo določen sklop vprašanj, da se odpravijo pomisleki glede nevarnosti in tveganj, povezani s preskusno kemikalijo. V nekaterih okoliščinah se lahko toksikokinetični podatki zbirajo v okviru ocenjevanja v drugih toksikoloških študijah. Spet v drugih primerih so lahko – odvisno od zakonodajnih potreb in/ali če se pri ocenjevanju preskusne kemikalije pojavijo nova vprašanja – potrebne dodatne in/ali obsežnejše toksikokinetične študije. | 8. | Da se poveča kakovost študije in v izogib nepotrebni uporabi živali mora preskuševalni laboratorij pred izvedbo študije preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji ter zadevnih metabolitih in analogih. To lahko vključuje podatke iz drugih ustreznih preskusnih metod (študij in vivo, študij in vitro in/ali ocen in silico). Za načrtovanje študije in razlago rezultatov so lahko koristne fizikalno-kemijske lastnosti, kot so porazdelitveni koeficient oktanol/voda (izražen kot log POW), pKa, topnost v vodi, parni tlak in molekulska masa kemikalije. Te lastnosti se lahko ugotovijo z ustreznimi metodami, opisanimi v zadevnih preskusnih metodah. | OMEJITVE | 9. | Ta preskusna metoda ni zasnovana za obravnavanje posebnih okoliščin, kot so breje ali doječe živali in zarod, ali ocenjevanje morebitnih ostankov v izpostavljenih živalih, ki so namenjene proizvodnji hrane. Vendar pa lahko podatki, pridobljeni s študijo B.36, zagotovijo splošne osnovne informacije, ki se uporabijo za usmerjanje zasnove posebnih študij za take preiskave. Ta preskusna metoda ni namenjena preskušanju nanomaterialov. Kot je navedeno v poročilu o predhodnem pregledu smernic za preskušanje OECD, namenjenemu oceni njihove uporabnosti za nanomateriale, se TG 417 (ki ustreza tej preskusni metodi B.36) za nanomateriale ne sme uporabljati (1). | OPREDELITEV POJMOV | 10. | Pojmi, ki se uporabljajo v tej preskusni metodi, so opredeljeni v Dodatku. | PREUDARKI V ZVEZI Z DOBROBITJO ŽIVALI | 11. | Napotki o humanem ravnanju z živalmi so na voljo v Dokumentu s smernicami OECD (GD) 19 (2). Priporoča se, naj se GD 19 uporablja za vse študije in vivo ter in vitro, opisane v tej preskusni metodi. | OPIS METOD | Pilotne študije | 12. | Uporaba pilotnih študij se priporoča in spodbuja za izbiro preskusnih parametrov toksikoloških študij (npr. presnove, masne bilance, analitskih postopkov, odmernega območja, izdihovanja CO2 itd.). Za opredelitev nekaterih od teh parametrov uporaba izotopsko označenih kemikalij morda ni potrebna. | Izbira živali | Vrsta | 13. | Živalska vrsta (in sev) v toksikokinetičnem preskušanju mora biti po možnosti ista, kot se uporablja v drugih toksikoloških študijah, izvedenih s preiskovano preskusno kemikalijo. Praviloma je treba uporabiti podgano, saj se v toksikoloških študijah obširno uporablja. Uporaba drugih ali dodatnih vrst je lahko upravičena, če je iz pomembnih toksikoloških študij razvidna precejšnja strupenost za te vrste ali če se pokaže, da je strupenost/toksikokinetika pri njih bolj relevantna za ugotavljanje strupenosti/toksikokinetike pri ljudeh. Izbiro živalske vrste in njenega seva je treba utemeljiti. | 14. | Če ni navedeno drugače, se pri tej preskusni metodi kot preskusna vrsta uporablja podgana. Za uporabo drugih preskusnih vrst morda je treba nekatere elemente metode morda treba prilagoditi. | Starost in sev | 15. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali (v času odmerjanja navadno stare 6–12 tednov) (glej tudi odstavka 13 in 14). Uporabo živali, ki niso mladi odrasli osebki, je treba utemeljiti. Na začetku študije morajo biti vse živali podobne starosti. Teža posameznih živali ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže v preskusni skupini. Po možnosti je treba uporabiti isti sev, ki je bil uporabljen pri pripravi toksikološke zbirke podatkov za preskusno kemikalijo. | Število in spol živali | 16. | Za vsak preskušeni odmerek je treba uporabiti najmanj štiri živali enega spola. Spol uporabljenih živali je treba utemeljiti. O uporabi obeh spolov (štirih samcev in štirih samic) je treba razmisliti, če obstajajo dokazi o pomembnih razlikah v strupenosti glede na spol. | Nastanitveni in prehranjevalni pogoji | 17. | V splošnem morajo biti živali v preskusnem obdobju nastanjene posamično. Skupinska nastanitev je lahko utemeljena v posebnih okoliščinah. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe in 12 ur teme. Temperatura v prostoru s preskusnimi živalmi mora znašati 22 °C (± 3 °C), relativna vlažnost pa 30–70 %. Za hranjenje se lahko uporablja običajna laboratorijska hrana z neomejeno količino pitne vode. | Preskusna kemikalija | 18. | Za vse vidike študije v zvezi z masno bilanco in identifikacijo metabolitov je treba uporabljati preskusno kemikalijo, ki je označena z izotopom 14C. Če pa se lahko dokaže, da: | — | je mogoče masno bilanco primerno oceniti in metabolite ustrezno identificirati z neoznačeno preskusno kemikalijo, | — | sta analitska specifičnost in občutljivost metode ob uporabi neradioaktivne preskusne kemikalije enaki tistima, ki bi se lahko zagotovili z izotopsko označeno preskusno kemikalijo, ali večji od njiju, | izotopsko označene preskusne kemikalije ni treba uporabiti. Poleg tega se lahko uporabijo tudi drugi radioaktivni in stabilni izotopi, zlasti če je zadevni element razlog za strupenost ali je udeležen v strupenem delu preskusne kemikalije. Če je mogoče, mora biti radioaktivni označevalec v osrednjem delu molekule, ki je presnovno stabilen (ni izmenljiv, se ne izloči s presnovo kot CO2 in ne postane del skupin z enim ogljikovim atomom v organizmu). Za spremljanje presnovne poti preskusne kemikalije je lahko potrebno označevanje več mest ali specifičnih regij molekule. | 19. | Izotopsko označene preskusne kemikalije in tiste, ki niso izotopsko označene, je treba analizirati z ustreznimi metodami za ugotavljanje čistosti in identitete. Radiokemijska čistost radioaktivne preskusne kemikalije mora biti najvišja dosegljiva za dano preskusno kemikalijo (po možnosti mora biti višja od 95 %), razumno pa si je treba tudi prizadevati za identifikacijo nečistot z vsaj 2-odstotnim deležem. Poročati je treba o čistosti ter identiteti in deležu vseh nečistot, ki so bile identificirane. V posameznih zakonodajnih ureditvah so lahko zagotovljeni dodatni napotki v pomoč pri opredeljevanju in določanju preskusnih kemikalij, sestavljenih iz zmesi, ter metode za določanje čistosti. | Izbira odmerkov | Pilotna študija | 20. | Navadno za pilotno študijo zadošča enkraten oralni odmerek. Ta ne sme biti strupen, mora pa biti dovolj velik za identifikacijo metabolitov v izločkih (in, če je primerno, plazmi) in izpolnitev opredeljenega namena pilotne študije, kot je navedeno v odstavku 12 te preskusne metode. | Glavne študije | 21. | Za glavne študije sta priporočljiva najmanj dva odmerka, saj lahko informacije, zbrane na podlagi vsaj dveh odmernih skupin, pomagajo pri določitvi odmerkov v drugih študijah strupenosti in pri ocenjevanju odziva v odvisnosti od odmerka v že razpoložljivih preskusih strupenosti. | 22. | Kadar se data dva odmerka, morata biti oba dovolj velika, da je mogoče identificirati metabolite v izločkih (in če je primerno, plazmi). Pri izbiri odmerkov je treba upoštevati informacije iz razpoložljivih podatkov o strupenosti. Če te niso na voljo (npr. iz študij akutne oralne strupenosti, v katerih se preiskujejo klinični znaki strupenosti, ali iz študij strupenosti s ponavljajočimi se odmerki), se lahko za večji odmerek predvidi vrednost, ki je nižja od ocene LD50 (za oralni in dermalni način dajanja) ali LC50 (za inhalacijski način dajanja) ali od nižje vrednosti ocene območja akutne strupenosti. Večji odmerek mora biti eden od večkratnikov manjšega odmerka. | 23. | Če se preiskuje samo ena velikost odmerka, mora biti ta po možnosti dovolj velik, da je mogoče identificirati metabolite v izločkih (in, če je primerno, plazmi), vendar ne sme povzročiti očitne strupenosti. Nevključitev druge velikosti odmerka je treba utemeljiti. | 24. | Če je treba ugotoviti učinek odmerka na kinetične procese, dva odmerka morda ne bosta zadoščala, vsaj en odmerek pa mora biti dovolj velik, da se ti procesi nasitijo. Če območje pod krivuljo plazemska koncentracija-čas (AUC) med dvema velikostma odmerkov, ki se uporabljata v glavni študiji, ni linearna, je to dober znak, da se nekje med obema velikostma odmerkov pojavlja nasičenost enega ali več kinetičnih procesov. | 25. | Za preskusne kemikalije z nizko strupenostjo je treba uporabiti največji odmerek 1 000 mg/kg telesne teže (pri oralnem in dermalnem dajanju; če je način dajanja inhalacijski, so napotki v poglavju B.2 te priloge, običajno pa ta odmerek ne presega 2 mg/l). V skladu z zakonodajnimi potrebami je lahko zaradi lastnosti, specifične za obravnavano kemikalijo, potreben večji odmerek. Izbiro odmerkov je treba vedno utemeljiti. | 26. | Podatki o toksikokinetiki in porazdelitvi v tkivih, pridobljeni z enkratnim odmerkom, lahko zadoščajo za določitev potenciala za kopičenje in/ali obstojnost. Vendar je v nekaterih okoliščinah lahko potrebno dajanje s ponavljajočimi se odmerki, (i) da se celoviteje obravnavajo potencial za kopičenje in/ali obstojnost ali spremembe v TK (npr. indukcija in inhibicija encimov) ali (ii) če se to zahteva v veljavni zakonodajni ureditvi. Čeprav v študijah s ponavljajočimi se odmerki običajno zadošča dajanje ponavljajočih se majhnih odmerkov, je v nekaterih okoliščinah lahko potrebno tudi dajanje ponavljajočih se velikih odmerkov (glej tudi odstavek 57). | Dajanje preskusne kemikalije | 27. | Preskusno kemikalijo je treba raztopiti ali homogeno suspendirati v enakem nosilcu, kot se uporablja v drugih študijah strupenosti z oralno gavažo, izvedenih z zadevno preskusno kemikalijo, če so take informacije o nosilcu na voljo. Izbiro nosilca je treba utemeljiti. Nosilec in velikost odmerkov je treba predvideti v zasnovi študije. Običajna metoda dajanja je z gavažo, vendar je lahko v določenih okoliščinah primernejše dajanje z želatinastimi kapsulami ali v prehranskih mešanicah (v obeh primerih je treba navesti utemeljitev). Potrditi je treba dejanski odmerek, dan vsaki živali. | 28. | Največja količina tekočine, ki bo dana naenkrat z oralno gavažo, je odvisna od velikosti preskusnih živali, vrste nosilca za odmerke in tega, ali se živalim pred dajanjem preskusne kemikalije hrana odreka ali ne. Hranjenje ali omejevanje hrane pred dajanjem odmerkov je treba utemeljiti. Praviloma je treba količino ohranjati tako majhno, kot je praktično, kar velja tako za vodne kot nevodne nosilce. Velikosti odmerkov pri glodavcih navadno ne smejo presegati 10 ml/kg telesne teže. Količine nosilcev, ki se uporabijo za bolj lipofilne preskusne kemikalije, se lahko začnejo pri 4 ml/kg telesne teže. Za ponavljajoče se odmerjanje, pri katerem je dnevno postenje kontraindicirano, je treba predvideti manjše velikosti odmerkov (npr. 2–4 ml/kg telesne teže). Kadar je mogoče, je treba razmisliti o uporabi količin odmerkov, ki so v skladu s tistimi, ki so bili uporabljeni v drugih študijah z oralno gavažo v zvezi s preskusno kemikalijo. | 29. | Intravenozno (IV) dajanje preskusne kemikalije in merjenje njene prisotnosti v krvi in/ali izločkih se lahko uporabita za ugotavljanje biološke dostopnosti ali relativne oralne absorpcije. V IV-študiji se z uporabo ustreznega nosilca da enkraten odmerek preskusne kemikalije (ki je navadno enak manjšemu oralnemu odmerku, ne sme pa ga presegati – glej odstavke o izbiri odmerkov). To snov je treba dati v ustrezni količini (npr. 1 ml/kg telesne teže) na izbranem mestu dajanja najmanj štirim živalim primernega spola (uporabita se lahko oba spola, če je to upravičeno – glej odstavek 16). Za IV-dajanje preskusne kemikalije je potreben popolnoma raztopljen ali suspendiran pripravek z odmerkom. Nosilec za IV-dajanje ne sme vplivati na celovitost ali pretok krvi. Če se preskusna kemikalija daje z infuzijo, je treba o hitrosti infuzije poročati in jo uskladiti za vse živali, če se uporablja infuzijska črpalka. Kadar se izvede kanilacija jugularne vene (za dajanje preskusne kemikalije in/ali odvzem krvi) ali se za dajanje uporabi stegenska arterija, je treba uporabiti anestezijo. O vrsti anestezije je treba skrbno razmisliti, saj lahko vpliva na toksikokinetiko. Preden se živalim da preskusna kemikalija z nosilcem, jim je treba omogočiti, da si dovolj opomorejo. | 30. | Za nekatere preskusne kemikalije se glede na njihove fizikalno-kemijske lastnosti in pričakovano uporabo ali izpostavljenost ljudi lahko uporabijo drugi načini dajanja, npr. dermalni in inhalacijski (glej odstavke 74–78). | Meritve | Masna bilanca | 31. | Masna bilanca se določi s seštetjem deleža danega (radioaktivnega) odmerka, ki se izloči v urinu, iztrebkih in izdihanem zraku, ter deleža, prisotnega v tkivih, preostanku trupa in tekočini od izpiranja kletke (glej odstavek 46). Na splošno se šteje, da ustrezna skupna rekuperacija znaša > 90 % dane preskusne kemikalije (radioaktivnosti). | Absorpcija | 32. | Začetno oceno absorpcije je mogoče dobiti z izključitvijo deleža odmerka v prebavnem traktu in/ali iztrebkih iz določanja masne bilance. Za izračun deleža absorpcije glej odstavek 33. Za preiskovanje izločkov glej odstavke 44–49. Če natančnega obsega absorpcije po oralnem dajanju odmerka ni mogoče ugotoviti iz študij masne bilance (npr. kadar je v iztrebkih več kot 20 % danega odmerka), so morda potrebne dodatne preiskave. Te študije lahko zajemajo bodisi (1) oralno dajanje preskusne kemikalije in merjenje njene prisotnosti v žolču bodisi (2) oralno in IV-dajanje preskusne kemikalije ter merjenje njene neto količine v urinu, izdihanem zraku in trupu za vsakega od obeh načinov dajanja. V kateri koli od obeh zasnov študij se merjenje radioaktivnosti uporabi kot nadomestna metoda za analizo, specifično za kemikalijo, preskusne kemikalije in metabolitov. | 33. | Če se izvaja študija žolčnega izločanja, se navadno uporabi oralni način dajanja. V tej študiji je treba izvesti kanilacijo žolčnih vodov pri najmanj štirih živalih ustreznega spola (ali obeh spolov, če je to upravičeno) in jim dati enkratni odmerek preskusne kemikalije. Po dajanju preskusne kemikalije je treba izločanje radioaktivnosti/preskusne kemikalije v žolču spremljati tako dolgo, kolikor je potrebno za oceno deleža danega odmerka, ki se izloči na ta način, s tem podatkom pa se lahko neposredno izračuna obseg oralne absorpcije, in sicer z enačbo: | 34. | Pri nekaterih razredih preskusnih kemikalij se lahko pojavi neposredna sekrecija absorbiranega odmerka skozi črevesne sluznice. V takih primerih se šteje, da merjenje deleža odmerka v iztrebkih po oralnem dajanju pri podgani, pri kateri je bila izvedena kanilacija žolčnega voda, ni reprezentativno za neabsorbirani odmerek. Če se zdi, da se pojavlja sekrecija v črevesju, je priporočljivo, da delež absorbiranega odmerka temelji na absorpciji, izračunani s primerjavo med izločanjem po oralnem in izločanjem po IV-dajanju (nedotaknjena podgana ali podgana, na kateri je bila izvedena kanilacija žolčnega voda) (glej odstavek 35). Kadar se šteje, da je potrebna količinska opredelitev sekrecije v črevesju, je priporočljivo tudi izmeriti izločanje po IV-dajanju odmerka pri podgani, na kateri je bila izvedena kanilacija žolčnega voda. | Biološka dostopnost | 35. | Biološka dostopnost se lahko določi na podlagi plazemske/krvne kinetike skupine, tretirane z oralnim dajanjem, in skupine, tretirane z IV-dajanjem, kot je opisano v odstavkih 50–52, s posebno kemijsko analizo preskusne kemikalije in/ali zadevnih metabolitov, tako da izotopsko označena preskusna kemikalija ni potrebna. Nato se izračuna biološka dostopnost (F) preskusne kemikalije ali zadevnih metabolitov, in sicer z enačbo: | , | pri čemer je AUC območje pod krivuljo plazemska koncentracija-čas, exp pa način dajanja pri preskusu (oralni, dermalni ali inhalacijski). | 36. | Pri ocenjevanju tveganja sistemskih učinkov je uporaba biološke dostopnosti strupene sestavine navadno ustreznejša od uporabe deleža absorpcije, če se sistemske koncentracije iz študij na živalih primerjajo s podobnimi podatki o biomonitoringu, pridobljenimi s študijami izpostavljenosti delavcev. Okoliščine pa lahko postanejo bolj zapletene, če so odmerki v nelinearnem območju, zato je pomembno, da se s toksikokinetičnim presejalnim preskusom določijo odmerki v linearnem območju. | Porazdelitev v tkivih | 37. | Poznavanje porazdelitve preskusne kemikalije in/ali njenih metabolitov v tkivih je pomembno za opredelitev ciljnih tkiv, razumevanje osnovnih mehanizmov strupenosti ter pridobivanje informacij o potencialu za kopičenje in obstojnost preskusne kemikalije in metabolitov. Delež celotnega (radioaktivnega) odmerka v tkivih in preostanku trupa je treba izmeriti vsaj ob koncu preskusa z izločanjem (npr. navadno do 7 dni po odmerku ali prej, odvisno od posebnega obnašanja preskusne kemikalije). Če se ob koncu študije v tkivih preskusne kemikalije ne odkrije (npr. ker se je zaradi kratke razpolovne dobe izločila pred koncem študije), je treba paziti, da se podatki ne razlagajo napačno. V takem primeru je treba preiskavo porazdelitve v tkivih opraviti v času najvišje plazemske/krvne koncentracije (Tmax) ali najvišje stopnje izločanja preskusne kemikalije (in/ali metabolitov) z urinom, kot je ustrezno (glej odstavek 38). Poleg tega je morda treba tkiva zbirati tudi v dodatnih časovnih točkah, in sicer za ugotavljanje porazdelitve preskusne kemikalije in/ali njenih metabolitov v tkivih, ocenjevanje odvisnosti od časa (po potrebi), v pomoč pri določanju masne bilance in/ali če to zahteva pristojni organ. Tkiva, ki jih je treba zbrati, so med drugim jetra, maščoba, prebavni trakt, ledvice, vranica, polna kri, preostanek trupa, tkiva ciljnih organov in vsa druga tkiva (npr. ščitnica, eritrociti, razmnoževalni organi, koža, oko (zlasti pri pigmentiranih živalih)), ki so lahko pomembna pri toksikološki oceni preskusne kemikalije. Razmisliti je treba o analiziranju dodatnih tkiv, zbranih v istih časovnih točkah, da se živali kar najbolj izkoristijo ter če se v študijah subkronične ali kronične strupenosti opazi strupenost za ciljni organ. Poročati je treba tudi o koncentraciji (radioaktivnega) ostanka in razmerjih tkivo-plazma (kri). | 38. | Mogoče je tudi, da je treba porazdelitev v tkivih oceniti še v dodatnih časovnih točkah, na primer ob najvišji koncentraciji v plazmi/krvi (npr. Tmax) ali najvišji stopnji izločanja z urinom, določenih na podlagi ustreznih preskusih plazemske/krvne kinetike ali preskusih z izločanjem, ali pa da to zahteva pristojni organ. Te informacije so lahko koristne za razumevanje strupenosti ter potenciala za kopičenje in obstojnost preskusne kemikalije in metabolitov. Izbiro vzorca je treba utemeljiti; vzorci za analizo so navadno enaki zgoraj navedenim (glej odstavek 37). | 39. | Za študije porazdelitve v tkivih je količino radioaktivnosti mogoče določiti z disekcijo organov, homogenizacijo, sežigom in/ali solubilizacijo, čemur sledi tekočinsko scintilacijsko štetje (LSC) zajetih ostankov. Nekatere tehnike, ki so trenutno na različnih stopnjah razvoja, npr. kvantitativna avtoradiografija celega telesa in receptorska mikroskopska avtoradiografija, se lahko izkažejo kot koristne pri določanju porazdelitve preskusne kemikalije v organih in/ali tkivih (3) (4). | 40. | Pri načinih izpostavljenosti, ki niso oralni, je treba zbrati in analizirati specifična tkiva, kot so pljuča pri inhalacijskih študijah in koža pri dermalnih študijah. Glej odstavke 74–78. | Presnova | 41. | Izločke (in po potrebi plazmo) je treba zbrati, da se identificirajo nespremenjena preskusna kemikalija in metaboliti ter določijo njihove količine, kot je opisano v odstavkih 44–49. Sprejemljivo je združevanje izločkov, da se olajša identifikacija metabolitov v določeni odmerni skupini. Priporočljivo je določiti profile metabolitov iz vsakega časovnega obdobja. Če to zaradi pomanjkanja vzorcev in/ali radioaktivnosti ni mogoče, je sprejemljivo združevanje urina in iztrebkov, zbranih v različnih časovnih točkah, vendar morajo ti biti od živali istega spola in iz iste odmerne skupine. Za analiziranje urina, iztrebkov, izdihane radioaktivnosti tretiranih živali in po potrebi žolča je treba uporabiti ustrezne kvalitativne in kvantitativne metode. | 42. | Razumno si je treba prizadevati, da se identificirajo vsi metaboliti z vsaj 5-odstotnim deležem danega odmerka in pripravi shema presnove za preskusno kemikalijo. Identificirati je treba preskusne kemikalije, za katere je bilo pri analizi izločkov ugotovljeno, da obsegajo 5 % danega odmerka ali več. Identifikacija pomeni točno določanje strukture sestavin. Navadno se izvede z dodatno kromatografijo metabolita z znanimi standardi z dvema različnima sistemoma ali tehnikami, ki omogočajo pozitivno strukturno identifikacijo, kot so masna spektrometrija, jedrska magnetna resonanca (NMR) itd. Pri dodatni kromatografiji kromatografske tehnike, pri katerih se uporablja ista stacionarna faza z dvema različnima topilnima sistemoma, niso ustrezne za potrjevanje identitete metabolita, ki temelji na dveh metodah, saj metodi nista neodvisni. Za identifikacijo z dodatno kromatografijo je treba uporabiti dva različna in analitsko neodvisna sistema, kot sta tankoplastna kromatografija (TLC) z reverzno in normalno fazo ter tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC). Če je kromatografsko ločevanje ustrezne kakovosti, dodatno potrjevanje s spektroskopskimi metodami ni potrebno. Nedvoumna identifikacija pa je mogoča tudi z metodami, s katerimi se pridobivajo strukturne informacije, kot so: tekočinska kromatografija z masno spektrometrija (LC-MS) ali tekočinska kromatografija s tandemsko masno spektrometrijo (LC-MS/MS), plinska kromatografija z masno spektrometrijo (GC-MS) in spektroskopija z jedrsko magnetno resonanco. | 43. | Če metabolitov z vsaj 5-odstotnim deležem danega odmerka ni mogoče identificirati, je treba v končnem poročilu to utemeljiti/pojasniti. Morda je ustrezno identificirati metabolite, ki predstavljajo manj kot 5 % danega odmerka, da se izboljša razumevanje presnovne poti za oceno nevarnosti in/ali tveganja preskusne kemikalije. Če je to mogoče, je treba navesti potrditev strukture. Za to je morda treba določiti profile metabolitov v plazmi, krvi ali drugih tkivih. | Izločanje | 44. | Stopnjo in obseg izločanja danega odmerka je treba določiti tako, da se izmeri delež (radioaktivnega) odmerka, pridobljen iz urina, iztrebkov in izdihanega zraka. Ti podatki pomagajo tudi pri določanju masne bilance. Količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti), izločene z urinom, iztrebki in izdihanim zrakom, je treba določati v ustreznih časovnih intervalih (glej odstavke 47–49). Preskusi s ponavljajočimi se odmerki morajo biti ustrezno zasnovani, da je mogoče zbirati podatke o izločanju za izpolnitev ciljev iz odstavka 26. S tem se omogoči primerjave s preskusi z enkratnim odmerkom. | 45. | Če pilotna študija pokaže, da v izdihanem zraku ni pomembne količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti) (v skladu z odstavkom 49), v končni študiji izdihanega zraka ni treba zbirati. | 46. | Za zbiranje izločkov (urina, iztrebkov in izdihanega zraka) se vsaka žival namesti v ločeno enoto za preiskave presnove. Ob koncu vsakega obdobja zbiranja (glej odstavke 47–49) je treba te enote sprati z ustreznim topilom (ta postopek se imenuje ‚izpiranje kletke‘), da se zagotovi kar največja rekuperacija preskusne kemikalije (radioaktivnosti). Izločki se nehajo zbirati po 7 dneh ali po tem, ko je bilo pridobljenih vsaj 90 % danega odmerka, kar od tega je prej. | 47. | Skupne količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti) v urinu je treba prvi dan zbiranja določati vsaj dvakrat, od tega enkrat 24 ur po odmerku, nato pa enkrat na dan do konca študije. Priporočljivo je, da se za prvi dan izbereta več kot dve časovni točki vzorčenja (npr. 6, 12 in 24 ur po odmerku). Rezultate pilotnih študij je treba analizirati, da se pridobijo informacije o drugih ali dodatnih časovnih točkah zbiranja. Razpored zbiranja je treba utemeljiti. | 48. | Skupne količine preskusne kemikalije (radioaktivnosti) v iztrebkih je treba ugotavljati dnevno, prvič 24 ur po dajanju odmerka, do konca študije, razen če pilotne študije kažejo, da so za zbiranje potrebne druge ali dodatne časovne točke. Drugačne razporede zbiranja je treba utemeljiti. | 49. | Zbiranje izdihanega CO2 in drugih hlapnih snovi se lahko v določenem preskusu v študiji prekine, ko se v 24-urnem obdobju zbiranja izdihanega zraka v njem ugotovi manj kot 1 % danega odmerka. | Študije časovnega poteka | Plazemska/krvna kinetika | 50. | Namen teh študij je oceniti osnovne toksikokinetične parametre (npr. Cmax, Tmax, razpolovno dobo (t1/2), AUC) preskusne kemikalije. Opravijo se lahko pri enem odmerku, navadno pa pri dveh ali več odmerkih. Odmerek je treba določiti glede na vrsto preskusa in/ali vidik, obravnavan v študiji. Kinetični podatki so lahko potrebni za reševanje vprašanj, kot je biološka dostopnost preskusne kemikalije, in/ali za pojasnitev učinka odmerka na izčistek (npr. ali je nasičenost izčistka odvisna od odmerka). | 51. | Za te študije je treba uporabiti najmanj štiri živali istega spola na odmerno skupino. Spol uporabljenih živali je treba utemeljiti. O uporabi obeh spolov (štirih samcev in štirih samic) je treba razmisliti, če obstajajo dokazi o pomembnih razlikah v strupenosti glede na spol. | 52. | Potem ko se živalim da preskusna kemikalija (izotopsko označena), je treba vsaki živali v ustreznih časovnih točkah z ustrezno metodo odvzeti vzorce krvi. Velikost in število vzorcev krvi, ki se lahko odvzamejo eni živali, sta lahko omejena zaradi možnih učinkov večkratnega jemanja vzorcev na zdravje/fiziologijo živali in/ali občutljivosti analitske metode. Vzorce je treba analizirati za vsako posamezno žival. V nekaterih primerih (npr. pri opredeljevanju lastnosti metabolitov) je mogoče treba združiti vzorce več živali. Združene vzorce je treba jasno identificirati, združitev pa utemeljiti. Če se uporabi izotopsko označena preskusna kemikalija, je morda ustrezno analizirati skupno prisotnost radioaktivnosti. V tem primeru je treba skupno radioaktivnost analizirati v polni krvi in plazmi ali plazmi in rdečih krvničkah, da se lahko izračuna razmerje kri-plazma. V drugih primerih so morda potrebne bolj specifične preiskave, za katere je treba identificirati izhodiščno spojino in/ali metabolite, ali ocena vezave na beljakovine. | Kinetika drugih tkiv | 53. | Namen teh študij je pridobiti informacije o časovnem poteku ter z določitvijo količine preskusne kemikalije v različnih tkivih ugotoviti parametre, kot so način strupenega delovanja, kopičenje v organizmih in biološka obstojnost. Izbira tkiv in število časovnih točk, ki bodo ocenjene, so odvisni od obravnavanega vidika in toksikološke zbirke podatkov za preskusno kemikalijo. Pri zasnovi teh kinetičnih študij na drugih tkivih je treba upoštevati informacije, zbrane v skladu z odstavki 37–40. Pri njih se lahko uporabijo enkratni odmerki ali ponavljajoči se odmerki. Uporabljeni pristop je treba natančno utemeljiti. | 54. | Razlogi za izvajanje kinetičnih študij na drugih tkivih so lahko: | — | dokazana podaljšana razpolovna doba v krvi, kar kaže na možnost kopičenja preskusne kemikalije v različnih tkivih, ali | — | želja ugotoviti, ali je bila v določenih tkivih dosežena stabilna raven koncentracije (na primer pri študijah s ponavljajočimi se odmerki je bila morda raven dinamičnega ravnotežja preskusne kemikalije v krvi očitno dosežena, vseeno pa se želi preveriti, da je bila dosežena tudi v ciljnih tkivih). | 55. | Pri teh vrstah študij časovnega poteka je treba ustrezni oralni odmerek preskusne kemikalije dati vsaj štirim živalim na odmerek in časovno točko, nato pa je treba spremljati časovni potek porazdelitve v izbranih tkivih. Uporabijo se lahko živali samo enega spola, razen če je ugotovljeno, da je strupenost odvisna od spola. Od obravnavanega vidika je odvisno tudi, ali se analizirajo celotna radioaktivnost ali izhodiščna kemikalija in/ali metaboliti. Porazdelitev v tkivih je treba oceniti z ustreznimi tehnikami. | Indukcija/inhibicija encimov | 56. | V enem ali več naslednjih primerih so lahko potrebne študije možnih učinkov indukcije/inhibicije encimov ali biotransformacije preučevane preskusne kemikalije: | 1. | razpoložljivi dokazi kažejo povezavo med biotransformacijo preskusne kemikalije in povečano strupenostjo; | 2. | razpoložljivi podatki o strupenosti kažejo nelinearno razmerje med odmerkom in presnovo; | 3. | rezultati študij za identifikacijo metabolitov kažejo obstoj potencialno strupenega metabolita, ki je morda rezultat encimske poti, ki jo je povzročila preskusna kemikalija; | 4. | pri pojasnjevanju učinkov, za katere se domneva povezava s pojavom indukcije encimov; | 5. | če se pri preskusih in vitro ali in vivo na različnih vrstah ali v različnih pogojih ugotovijo za strupenost pomembne spremembe presnovnega profila preskusne kemikalije, je morda potrebna opredelitev lastnosti udeleženih encimov (npr. encimi faze I, kot so izoencimi od citokroma P450 odvisnega monooksigenaznega sistema, encimi faze II, kot so izoencimi sulfotransferaze ali uridin difosfat glukuronozil transferaze. ali kateri koli drugi pomembni encimi). Te informacije se lahko uporabijo za oceno primernosti ekstrapolacij ene živalske vrste na drugo. | 57. | Za ocenjevanje sprememb v toksikokinetiki, povezanih s preskusno kemikalijo, je treba uporabiti primerne protokole študij, ki so ustrezno validirani in utemeljeni. Zasnove študij lahko na primer obsegajo ponavljajoče se odmerke neoznačene preskusne kemikalije, čemur 14. dan sledi enkraten izotopsko označen odmerek, ali ponavljajoče se odmerke izotopsko označene preskusne kemikalije in vzorčenje na 1., 7. in 14. dan za določitev presnovnih profilov. S ponavljajočimi se odmerki izotopsko označene preskusne kemikalije se lahko pridobijo tudi informacije o kopičenju v organizmih (glej odstavek 26). | DODATNI PRISTOPI | 58. | Z dodatnimi pristopi poleg preskusov in vivo, opisanih v tej preskusni metodi, se lahko pridobijo koristne informacije o absorpciji, porazdelitvi, presnovi ali izločanju preskusne kemikalije pri nekaterih vrstah. | Uporaba informacij iz preskusov in vitro | 59. | S študijami in vitro, v katerih so uporabljeni ustrezni preskusni sistemi, je mogoče dobiti odgovore na več vprašanj o presnovi preskusne kemikalije. Za preučevanje mogočih metabolitov se lahko uporabijo sveže izolirani ali kultivirani hepatociti in podcelične frakcije (npr. mikrosomi in citosolska frakcija ali frakcija S9) iz jeter. Za oceno tveganja je lahko zanimiva lokalna presnova v ciljnem organu, npr. pljučih. Za te namene so lahko koristne mikrosomske frakcije ciljnih tkiv. Študije z mikrosomi so lahko koristne za obravnavanje morebitnih razlik med spoloma in glede na fazo življenja ter za opredelitev encimskih parametrov (Km in Vmax), ki so lahko v pomoč pri ocenjevanju odvisnosti presnove od odmerka v povezavi s stopnjami izpostavljenosti. Poleg tega so lahko mikrosomi v pomoč pri identifikaciji posebnih mikrosomskih encimov, ki sodelujejo pri presnovi preskusne kemikalije, kar je lahko pomembno pri ekstrapolaciji ene živalske vrste na drugo (glej tudi odstavek 56). Prav tako se lahko preuči potencial za indukcijo biotransformacije, in sicer s podceličnimi frakcijami (npr. mikrosomi in citosoli) iz jeter živali, predhodno tretiranih s preiskovano preskusno kemikalijo, in vitro v študijah indukcije hepatocitov, ali na podlagi določenih celičnih linij, v katerih so izraženi ustrezni encimi. V nekaterih okoliščinah in ustreznih pogojih se lahko za določanje možnih razlik pri biotransformaciji med vrstami predvidi uporaba podceličnih frakcij iz človeških tkiv. Rezultati iz preiskav in vitro se lahko uporabijo tudi pri izdelavi modelov PBTK (5). | 60. | S študijami dermalne absorpcije in vitro se lahko pridobijo dodatne informacije za opredelitev absorpcije (6). | 61. | Primarne celične kulture iz jetrnih celic in rezin svežega tkiva se lahko uporabijo za obravnavo podobnih vprašanj kot pri jetrnih mikrosomih. V nekaterih primerih je mogoče na konkretna vprašanja odgovoriti s celičnimi linijami z opredeljenimi izraženimi ustreznimi encimi ali spremenjenimi celičnimi linijami. V nekaterih primerih je lahko koristno preučevati inhibicijo in indukcijo posebnih izoencimov citokroma P450 (npr. CYP1A1, 2E1, 1A2 in drugih) in/ali encimov faze II z izhodiščno spojino v okviru študij in vitro. Pridobljene informacije so lahko koristne za spojine s podobno strukturo. | Uporaba toksikokinetičnih podatkov iz študij strupenosti kot dodatnih informacij | 62. | Analiza vzorcev krvi, tkiva in/ali izločkov, pridobljenih med izvajanjem drugih študij strupenosti, lahko zagotovi podatke o biološki dostopnosti, spremembah plazemske koncentracije v odvisnosti od časa (AUC, Cmax), potencialu za kopičenje v organizmih, stopnjah izčistkov ter spremembah v presnovi in kinetiki glede na spol ali fazo življenja. | 63. | Zasnova študije se lahko prilagodi, da se poiščejo odgovori na vprašanja v zvezi z: nasičenostjo absorpcije, potmi biotransformacije ali izločanja pri večjih odmerkih; delovanjem novih presnovnih poti pri večjih odmerkih in omejenostjo strupenih metabolitov na večje odmerke. | 64. | Drugi vidiki ocene nevarnosti bi lahko bili na primer: | — | s starostjo povezana občutljivost zaradi razlik v stanju krvno-možganske pregrade, ledvic in/ali zmožnosti razstrupljanja, | — | občutljivost podpopulacij zaradi razlik v zmožnostih biotransformacije ali drugih toksikokinetičnih razlik, | — | stopnja izpostavljenosti fetusa pri transplacentarnem prenosu kemikalij ali novorojene živali prek laktacije. | Uporaba toksikokinetičnega modeliranja | 65. | Toksikokinetični modeli lahko prispevajo k različnim vidikom ocenjevanja nevarnosti in tveganja, na primer pri napovedovanju sistemske izpostavljenosti in odmerka za notranje tkivo. Poleg tega se lahko z njimi obravnavajo konkretna vprašanja o načinu delovanja, lahko pa so tudi osnova za ekstrapolacijo na druge vrste, načine izpostavljenosti in vzorce dajanja odmerkov ter ocenjevanje tveganja za ljudi. Podatki, koristni za izdelavo modelov PBTK za preskusno kemikalijo za dano vrsto, vključujejo 1. porazdelitvene koeficiente, 2. biokemične konstante in fiziološke parametre, 3. parametre absorpcije pri različnih načinih izpostavljenosti in 4. kinetične podatke in vivo za ovrednotenje modela (npr. parametri izčistkov za ustrezne poti izločanja (> 10 %), Km in Vmax za presnovo). Preskusne podatke, uporabljene pri izdelavi modela, je treba pridobiti z znanstveno utemeljenimi metodami, rezultate modela pa validirati. Parametri, specifični za preskusno kemikalijo in vrsto, kot so stopnje absorpcije, porazdelitev med krvjo in tkivom ter konstante hitrosti presnove, se pogosto določajo, da bi se olajšala izdelava nerazdelčnih modelov ali modelov, ki temeljijo na fiziologiji (7). | PODATKI IN POROČANJE | 66. | Priporočljivo je, da poročilo o študiji vsebuje kazalo. | Osrednji del poročila | 67. | V osrednjem delu poročila morajo biti predstavljene informacije, ki jih obsega ta preskusna metoda. Razčlenjeno mora biti na oddelke in odstavke, kot je navedeno v nadaljevanju. | Povzetek | 68. | Ta oddelek poročila o študiji mora vsebovati povzetek zasnove študije in opis uporabljenih metod. V njem morajo biti poudarjene ključne ugotovitve v zvezi z masno bilanco, lastnostmi in pomembnostjo metabolitov, ostanki tkiv, stopnjo izčistkov, potencialom za kopičenje v organizmih, razlikami glede na spol itd. Povzetek mora biti dovolj podroben, da omogoča oceno ugotovitev. | Uvod | 69. | Ta del poročila mora vsebovati cilje študije, razloge zanjo, njeno zasnovo ter ustrezne vire in pretekle podatke o področju. | Materiali in metode | 70. | V tem oddelku poročila morajo biti podrobno navedene vse ustrezne informacije, vključno z naslednjimi: | (a) | Preskusna kemikalija | V tem pododdelku je treba identificirati preskusno kemikalijo in navesti: kemijsko ime, molekulsko strukturo, kvalitativno in kvantitativno opredelitev kemijske sestave, kemijsko čistost ter po možnosti vrsto in količino nečistot. Vključiti je treba tudi informacije o fizikalnih/kemijskih lastnostih, vključno z agregatnim stanjem, barvo, bruto koeficientom topnosti in/ali porazdelitvenim koeficientom, stabilnostjo in po potrebi jedkostjo. Če je ustrezno, je treba navesti informacije o izomerih. Če je preskusna kemikalija izotopsko označena, je treba v ta poddel vključiti naslednje informacije: vrsto radionuklida, položaj oznake, specifično aktivnost in radiokemijsko čistost. | Opisati je trebe vse nosilce, redčila, snovi za upočasnitev sedimentacije v suspenziji, emulgatorje ali druge snovi, uporabljene pri dajanju preskusne kemikalije. | (b) | Preskusne živali | V tem pododdelku je treba navesti informacije o preskusnih živalih, vključno z izbranimi vrstami in razlogi za njihovo uporabo, sevom in starostjo ob začetku študije, spolom in telesno težo, zdravstvenim stanjem in oskrbo živali. | (c) | Metode | V tem poddelu je treba navesti podrobne informacije o zasnovi študije in uporabljeni metodologiji. Vsebovati mora naslednje informacije: | 1. | utemeljitev spremembe načina izpostavljenosti in pogojev izpostavljenosti, če je ustrezno; | 2. | utemeljitev izbranih velikosti odmerkov; | 3. | opis pilotnih študij, uporabljenih za preskusno zasnovo nadaljnjih študij, če je ustrezno. Predložiti je treba podporne podatke pilotne študije; | 4. | opis priprave raztopin za odmerjanje z navedbo vrste topila ali nosilca, če je bil uporabljen; | 5. | število tretiranih skupin in število živali na skupino; | 6. | velikosti in količino odmerkov (in specifična aktivnost odmerka, če se uporabi radioaktivnost); | 7. | načine in metode dajanja odmerkov; | 8. | pogostnost dajanja odmerkov; | 9. | obdobje postenja (če se uporabi); | 10. | skupno radioaktivnost na žival; | 11. | opis ravnanja z živalmi; | 12. | opis jemanja vzorcev in ravnanja z njimi; | 13. | analitske metode, uporabljene za ločevanje, določanje količine in identifikacijo metabolitov; | 14. | mejo zaznavnosti za uporabljene metode; | 15. | druge uporabljene preskusne meritve in postopke (vključno z validacijo metod za analizo metabolitov). | (d) | Statistična analiza | Če se za analizo ugotovitev študije uporabi statistična analiza, je treba vključiti zadostne informacije o metodi analize in uporabljenem računalniškem programu, da lahko neodvisni ocenjevalec/statistik analizo znova oceni in ponovi. | Če se uporabijo študije sistemskega modeliranja, kot je PBTK, je treba v predstavitev modelov vključiti popoln opis modela, da se lahko izvedeta neodvisna ponovitev in validacija modela (glej odstavek 65 in Dodatek: opredelitev pojmov). | Rezultati | 71. | Vse podatke je treba povzeti in predstaviti v preglednicah z ustrezno statistično oceno ter jih opisati v tem delu. Podatke, pridobljene pri merjenju radioaktivnosti, je treba povzeti in predstaviti, kot je ustrezno za študijo, navadno v ekvivalentih mikrogramov ali miligramov na maso vzorca, lahko pa se uporabijo tudi druge enote. Ta del mora vključevati grafične ponazoritve ugotovitev, izvode reprezentativnih kromatografskih in spektrometričnih podatkov, identifikacijo/količinsko opredelitev metabolitov in predlagane presnovne poti, vključno z molekulsko strukturo metabolitov. Poleg tega je treba po potrebi v ta del vključiti naslednje informacije: | 1. | količino in delež rekuperacije radioaktivnosti v urinu, iztrebkih, izdihanem zraku ter v urinu in iztrebkih ob izpiranju kletk; | — | pri dermalnih študijah je treba vključiti tudi podatke o rekuperaciji preskusne kemikalije iz tretirane kože in ob umivanju kože, ostanku radioaktivnosti na aparaturi, ki pokriva kožo, in v enoti za preiskave presnove ter rezultate študije z umivanjem kože. Za več podrobnosti glej odstavke 74–77, | — | pri inhalacijskih študijah je treba vključiti tudi podatke o rekuperaciji preskusne kemikalije iz pljuč in nosnih tkiv (8). Za več podrobnosti glej odstavek 78; | 2. | porazdelitev v tkivih, izraženo kot delež danega odmerka in koncentracija (ekvivalenti mikrogramov na gram tkiva), in razmerja tkivo-kri ali tkivo-plazma; | 3. | materialno bilanco, izdelano na podlagi vsake študije, ki vključuje analizo telesnih tkiv in izločkov; | 4. | plazemske koncentracije in toksikokinetične parametre (biološka dostopnost, AUC, Cmax, Tmax, izčistek, razpolovna doba) po tem, ko je bil dan odmerek preskusne kemikalije v skladu z ustreznimi načini izpostavljenosti; | 5. | stopnjo in obseg absorpcije preskusne kemikalije po tem, ko je bil dan odmerek v skladu z ustreznimi načini izpostavljenosti; | 6. | količine preskusne kemikalije in metabolitov (izražene kot delež danega odmerka), zbranih v izločkih; | 7. | sklicevanje na podatke iz dodatka, ki vsebujejo podatke o posamezni živali za vse končne točke meritev (npr. dajanje odmerka, delež rekuperacije, koncentracije, toksikokinetični parametri itd.); | 8. | grafično predstavitev predlaganih presnovnih poti in molekulskih struktur metabolitov. | Razprava in sklepi | 72. | Avtorji morajo v tem oddelku: | 1. | na podlagi rezultatov v zvezi s presnovo in izločanjem preskusne kemikalije predlagati presnovno pot; | 2. | preučiti morebitne razlike glede na vrsto in spol v zvezi z izločanjem in/ali biotransformacijo preskusne kemikalije; | 3. | v preglednici predstaviti in preučiti identifikacijo in pomembnost metabolitov, stopnje izčistkov, potencial za kopičenje v organizmih, ravni ostankov tkiv izhodiščne snovi in/ali metabolitov ter morebitne od odmerka odvisne spremembe toksikokinetičnih parametrov, kot je ustrezno; | 4. | v ta del vključiti vse ustrezne toksikokinetične podatke, pridobljene med izvajanjem študij strupenosti; | 5. | oblikovati jedrnat sklep, ki ga je mogoče podpreti z ugotovitvami študije; | 6. | (po potrebi ali kot je ustrezno) dodati oddelke. | 73. | Za vključitev podpornih bibliografskih informacij, preglednic, grafičnih predstavitev, dodatkov itd. je treba uporabiti dodatne oddelke. | DRUGI NAČINI IZPOSTAVLJENOSTI | Dermalni način | Dermalno tretiranje | 74. | Ta oddelek vsebuje posebne informacije o preiskovanju toksikokinetike preskusne kemikalije pri dermalnem načinu dajanja. Več o dermalni absorpciji je na voljo v poglavju B.44 te priloge (Absorpcija skozi kožo: metoda in vivo (9)). Za druge končne točke, kot sta porazdelitev in presnova, se lahko uporabi ta preskusna metoda B.36. Za dermalno tretiranje je treba uporabiti eno ali več velikosti odmerkov preskusne kemikalije. Preskusna kemikalija (npr. čista, razredčena ali formulirana snov, ki vsebuje preskusno kemikalijo in se nanese na kožo) mora biti enaka (ali realističen nadomestek) tisti, ki so ji lahko izpostavljeni ljudje ali druge potencialne ciljne vrste. Velikosti odmerkov je treba določiti v skladu z odstavki 20–26 te preskusne metode. Med dejavniki, ki bi jih bilo mogoče upoštevati pri izbiri dermalnega odmerka, so pričakovana izpostavljenost človeka in/ali odmerki, pri katerih je bila v drugih študijah dermalne strupenosti ugotovljenost strupenost. Dermalne odmerke je treba po potrebi raztopiti v ustreznem nosilcu in nanesti v količini, ustrezni za nanos odmerka. Tik pred začetkom preskusa je treba preskusnim živalim ostriči dlako s hrbtnega dela trupa. Dlaka se lahko tudi obrije, vendar je treba to opraviti približno 24 ur pred preskusom. Med striženjem ali britjem dlake je treba paziti, da se koža ne odrgne, kar bi lahko spremenilo njeno prepustnost. Za nanos preskusne kemikalije je treba ostriči oziroma obriti približno 10 % površine telesa. Pri zelo strupenih kemikalijah je lahko površina pokritosti manjša od 10 %, vendar mora biti s tanko in enakomerno plastjo pokrite čim več površine. Površina tretiranja mora biti enaka v vseh preskusnih skupinah z dermalnim tretiranjem. Površine, ki se tretirajo, je treba pokriti z ustrezno zaščito, ki bo ostala na mestu. Živali morajo biti nastanjene posamično. | 75. | Študijo z umivanjem kože je treba opraviti, da se oceni, koliko nanesenega odmerka preskusne kemikalije se lahko odstrani s kože z umivanjem tretirane kožne površine z blagim milom in vodo. Ta študija je lahko tudi v pomoč pri določanju masne bilance pri dermalnem načinu dajanja preskusne kemikalije. Pri tej študiji z umivanjem kože je treba na dve živali nanesti enkraten odmerek preskusne kemikalije. Velikost odmerka se izbere v skladu z odstavkom 23 te preskusne metode (glej tudi odstavek 76 o trajanju stika s kožo). Določiti je treba, koliko preskusne kemikalije se pridobi iz vode z milom, s katero se je umivala koža, da se oceni učinkovitost njenega odstranjevanja z umivanjem. | 76. | Preskusno kemikalijo je treba nanesti na kožo in jo na njej pustiti vsaj 6 ur, razen če to ni mogoče zaradi jedkosti. Ko se zaščita odstrani, je treba tretirano površino umiti v skladu s postopkom, opisanim v študiji z umivanjem kože (glej odstavek 75). Zaščito in vodo z milom, s katero je bila umita koža, je treba analizirati, da se ugotovi prisotnost ostankov preskusne kemikalije. Ob koncu študij je treba vsako žival humano usmrtiti v skladu z virom (2), tretirano kožo pa odstraniti. Ustrezen del tretirane kože je treba analizirati, da se določijo ostanki preskusne kemikalije (radioaktivnosti). | 77. | Za toksikokinetično oceno farmacevtskih izdelkov so v skladu z ustrezno zakonodajno ureditvijo morda potrebni drugačni postopki. | Inhalacijski način | 78. | Uporabiti je treba eno samo koncentracijo preskusne kemikalije (ali po potrebi več). Koncentracije je treba določiti v skladu z odstavki 20–26 te preskusne metode. Tretiranje z vdihavanjem je treba izvajati z aparaturo z nosnim stožcem ali aparaturo za izpostavljanje glave, da se prepreči absorpcija prek drugih načinov izpostavljenosti (8). Če se uporabijo drugi pogoji izpostavljenosti z vdihavanjem, je treba to izbiro utemeljiti in dokumentirati. Trajanje izpostavljenosti z vdihavanjem je treba opredeliti; navadno traja 4–6 ur. | VIRI: | (1) | OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials No. 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Pariz. | (2) | OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Pariz. | (3) | Solon, E. G., Kraus, L. (2002). Quantitative whole-body autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81. | (4) | Stumpf, W. E. (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 25–40. | (5) | Loizou, G., Spendiff, M., Barton, H. A., Bessems, J., Bois, F. Y., d’Yvoire, M. B., Buist. H., Clewell, H. J. 3., Meek, B., Gundert-Remy, U., Goerlitz, G., Schmitt, W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411. | (6) | Poglavje B.45 te priloge, Absorpcija skozi kožo: metoda in vitro. | (7) | IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No 9. Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pariz. | (9) | Poglavje B.44 te priloge, Absorpcija skozi kožo: metoda in vivo. | (10) | Barton, H. A., idr. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35. | (11) | Gibaldi, M., in Perrier, D., (1982), Pharmacokinetics, 2. izdaja, Marcel Dekker, Inc., New York. | Dodatek | OPREDELITEV POJMOV | Absorpcija: procesi sprejemanja kemikalij v tkiva ali skozi tkiva. Nanaša se na izhodiščno spojino in vse njene metabolite. Ne sme se mešati z ‚biološko dostopnostjo‘. | Kopičenje v organizmih (bioakumulacija): povečanje količine preskusne kemikalije skozi čas v tkivih (navadno maščobnih tkivih po ponavljajoči se izpostavljenosti); če je stopnja vnosa preskusne kemikalije v telo višja od stopnje njenega izločanja, se preskusna kemikalija kopiči v organizmu in lahko doseže strupene koncentracije. | ADME: kratica za ‚absorpcija, porazdelitev, presnova in izločanje‘. | AUC: (območje pod krivuljo plazemska koncentracija-čas): območje pod krivuljo na grafičnem prikazu, ki predstavlja koncentracijo preskusne kemikalije v plazmi v odvisnosti od časa. Predstavlja skupno količino preskusne kemikalije, ki jo telo absorbira v vnaprej določenem obdobju. V linearnih pogojih je AUC (od časa nič do neskončnosti) sorazmerna s skupno količino preskusne kemikalije, ki jo telo absorbira, ne glede na stopnjo absorpcije. | Avtoradiografija: (avtoradiografija celega telesa): pri tej tehniki, s katero se kvalitativno in/ali kvantitativno določa mesto radioaktivne preskusne kemikalije v tkivu, se uporablja rentgensko slikanje, v zadnjem času pa tudi digitalno slikanje s fosforno ploščo, pri čemer se slika oddano sevanje v notranjosti predmeta študije, s tem pa izotopsko označene molekule ali njihovi deli postanejo vidni. Kvantitativna avtoradiografija celega telesa ima lahko v primerjavi z disekcijo organov nekatere prednosti pri ocenjevanju porazdelitve preskusne kemikalije, skupne rekuperacije in ločljivosti radioaktivne snovi v tkivih. Ena od pomembnih prednosti je na primer, da se lahko ta tehnika pri modelu s pigmentiranimi živalmi uporabi za oceno morebitne asociacije preskusne kemikalije z melaninom, ki lahko veže nekatere molekule. Čeprav lahko z njo dobimo koristne preglede veznih mest z visoko zmogljivostjo in nizko afiniteto na ravni celega telesa, je lahko omejena pri prepoznavanju konkretnih ciljnih mest, kot so receptorska vezna mesta, kjer sta za zaznavanje potrebni razmeroma visoka ločljivost in velika občutljivost. Če se uporabi avtoradiografija, je treba preskuse za določanje masne bilance dane spojine opraviti na skupini ali v študiji, ločeni od preskusa določanja porazdelitve v tkivu, pri katerih se vsi izločki (ki lahko vključujejo tudi izdihan zrak) in celotni trupi homogenizirajo in analizirajo s tekočinskim scintilacijskim štetjem. | Žolčno izločanje: izločanje prek žolčnih vodov. | Bioakumulacija: glej ‚kopičenje v organizmih‘. | Biološka dostopnost: del danega odmerka, ki doseže sistemski obtok ali je na voljo na mestu fiziološke aktivnosti. Navadno se biološka dostopnost preskusne kemikalije nanaša na izhodiščno spojino, lahko pa tudi na njene metabolite. Pri tem se upošteva samo ena kemijska oblika. Opomba: biološka dostopnost in absorpcija nista sopomenki. Razlika med, na primer, oralno absorpcijo (tj. prisotnost v črevesni steni in portalnem obtoku) in biološko dostopnostjo (tj. prisotnost v sistemskem krvnem obtoku in tkivih) lahko med drugim izhaja iz kemijske razgradnje, ki je posledica presnove v črevesni steni, ali prenosa odtoka nazaj v črevesno svetlino, ali predsistemske presnove v jetrih (10). Biološka dostopnost strupene sestavine (izhodiščne spojine ali metabolita) je bistveni parameter pri oceni tveganja za ljudi (ekstrapolacija velikega na majhen odmerek, ekstrapolacija na druge načine dajanja), da se iz zunanjega NOAEL ali BMD (uporabljeni odmerek) izpelje notranja vrednost. Za učinke na jetra po oralnem dajanju zadošča oralna absorpcija. Za vse učinke, razen učinkov na vstopnem mestu, pa je biološka dostopnost v primerjavi z absorpcijo navadno zanesljivejši parameter za nadaljnjo uporabo v oceni tveganja. | Biološka obstojnost: glej ‚obstojnost‘. | Biotransformacija: (navadno encimska) kemična pretvorba preiskovane preskusne kemikalije v telesu v drugo kemikalijo. Sopomenka za ‚presnovo‘. | Cmax : bodisi najvišja (plazemska/serumska) koncentracija v krvi po dajanju odmerka bodisi največje izločanje (v urinu ali iztrebkih) po dajanju odmerka. | Stopnja izčistka: kvantitativno merilo stopnje odstranjevanja preskusne kemikalije iz krvi, plazme ali določenih tkiv na enoto časa. | Razdelek: strukturni ali biokemični del (ali enota) telesa, tkiva ali celice, ki je ločen od preostanka. | Načini razstrupljanja: vrsta korakov, ki vodi do odstranitve strupenih kemikalij iz telesa, bodisi s presnovno spremembo bodisi z izločanjem. | Porazdelitev: razpršenost preskusne kemikalije in njenih derivatov po organizmu. | Encimi/izoencimi: beljakovine, ki pospešujejo kemične reakcije. Izoencimi so encimi, ki pospešujejo podobne kemične reakcije, vendar imajo drugačno zaporedje aminokislin. | Encimski parametri: Km: Michaelisova konstanta in Vmax: največja hitrost. | Izločanje: procesi, s katerimi se dana preskusna kemikalija in/ali njeni metaboliti odstranijo iz telesa. | Eksogeno: izvirajoče ali ustvarjeno zunaj organizma ali sistema. | Ekstrapolacija: sklepanje o eni ali več neznanih vrednostih na podlagi tega, kar je znano ali opaženo. | Razpolovna doba (t1/2): čas, ki je potreben, da se koncentracija preskusne kemikalije v razdelku zmanjša za polovico. Navadno se nanaša na plazemsko koncentracijo ali količino preskusne kemikalije v celem telesu. | Indukcija/indukcija encimov: sinteza encimov kot odziv na okoljski dražljaj ali induktor. | Linearnost/linearna kinetika: pri kinetiki je proces linearen, ko so vse stopnje prenosa med razdelki sorazmerne s prisotnimi količinami ali koncentracijami, tj. proces prvega reda. Količine izčistkov in porazdelitev so zato konstantne, kar velja tudi za razpolovne dobe. Dosežena koncentracija je sorazmerna z velikostjo odmerka (izpostavljenostjo), kopičenje pa je lažje napovedati. Ali gre za linearnost ali nelinearnost, se lahko oceni s primerjanjem ustreznih parametrov, npr. AUC, po različnih odmerkih ali po enkratni in ponavljajoči se izpostavljenosti. Če se ne ugotovi odvisnost od velikosti odmerka, je to lahko znak nasičenosti encimov, ki sodelujejo pri presnovi spojine, povečanje AUC po ponavljajoči se izpostavljenosti v primerjavi z enkratno izpostavljenostjo je lahko znak inhibicije presnove, zmanjšanje AUC pa znak indukcije presnove (glej tudi vir (11)). | Masna bilanca: količinska razlika med preskusno kemikalijo, ki vstopa v sistem, in preskusno kemikalijo, ki zapušča sistem. | Materialna bilanca: glej ‚masna bilanca‘. | Mehanizem (način) strupenosti/mehanizem (način) delovanja: mehanizem delovanja se nanaša na konkretno biokemično interakcijo, s katero preskusna kemikalija povzroči učinek. Način delovanja se nanaša na splošnejše poti, ki vodijo k strupenosti preskusne kemikalije. | Presnova: sopomenka za ‚biotransformacijo‘. | Metaboliti: produkti presnove ali presnovnih procesov. | Oralna absorpcija: delež odmerka preskusne kemikalije, ki se absorbira z mesta dajanja (npr. iz prebavnega trakta). Ta ključni parameter se lahko uporabi za razumevanje dela dane preskusne kemikalije, ki doseže portalno veno, nato pa jetra. | Porazdelitveni koeficient: imenovan tudi distribucijski koeficient; merilo različne topnosti kemikalije v dveh topilih. | Najvišja (plazemska/serumska) raven v krvi: najvišja (plazemska/serumska) koncentracija v krvi po dajanju odmerka (glej tudi ‚Cmax‘). | Obstojnost (biološka obstojnost): dolgoročna prisotnost kemikalije (v biološkem sistemu) zaradi odpornosti na razgradnjo/izločanje. | Navzkrižno branje: informacije o končnih točkah za eno ali več kemikalij se uporabijo za napovedovanje končne točke za ciljno kemikalijo. | Receptorska mikroskopska avtoradiografija (ali receptorska mikroavtoradiografija): ta tehnika se lahko uporabi za preiskovanje ksenobiotične interakcije s konkretnimi tkivnimi mesti ali celičnimi populacijami, na primer pri študijah receptorske vezave ali posebnega načina delovanja, pri katerih sta lahko potrebni visoka ločljivost in velika občutljivost, ki pa morda nista mogoči z drugimi tehnikami, kakršna je na primer avtoradiografija celega telesa. | Način dajanja (oralni, IV, dermalni, inhalacijski itd.): nanaša se na način, kako se kemikalije vnašajo v telo (npr. oralno z gavažo, oralno s hrano, dermalno, z vdihavanjem, intravenozno itd.). | Nasičenost: stanje, pri katerem eden ali več kinetičnih procesov (npr. absorpcija, presnova ali čiščenje) poteka najintenzivneje (procesi so ‚nasičeni‘). | Občutljivost: zmožnost metode ali instrumenta, da razlikuje med meritvenimi odzivi, ki predstavljajo različne stopnje preiskovane spremenljivke. | (Plazemska) raven dinamičnega ravnotežja v krvi: neravnotežno stanje odprtega sistema, v katerem vse sile, ki delujejo na sistem, natančno izenačujejo nasprotne sile, tako da koncentracije vseh sestavnih delov ostajajo nespremenjene, čeprav snov teče skozi sistem. | Sistemsko modeliranje (na fiziologiji temelječe toksikokinetično, na farmakokinetiki temelječe, na fiziologiji temelječe farmakokinetično, na biologiji temelječe itd.): abstraktni model, ki uporablja matematični jezik za opisovanje vedenja sistema. | Ciljno tkivo: tkivo, v katerem se kaže glavni škodljivi učinek strupene snovi. | Preskusna kemikalija: kemikalija ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Porazdelitev v tkivih: reverzibilno gibanje preskusne kemikalije z enega mesta v telesu na drugo. Porazdelitev v tkivih se lahko preiskuje z disekcijo organov, homogenizacijo, sežigom in tekočinskim scintilacijskim štetjem ali s kvalitativno in/ali kvantitativno avtoradiografijo celega telesa. Prva metoda je primerna za pridobivanje podatkov o koncentraciji in deležu rekuperacije iz tkiv in preostankov trupov istih živali, vendar ima lahko nezadostno ločljivost za vsa tkiva in morda ne zagotavlja najboljše možne ravni skupne rekuperacije (< 90 %). Za opredelitev druge metode glej zgoraj. | Tmax : čas, potreben za dosego Cmax. | Toksikokinetika (farmakokinetika): področje, ki preučuje absorpcijo, porazdelitev, presnovo in izločanje kemikalij skozi čas. | Validacija modelov: postopek ocenjevanja, ali model ustrezno in dosledno opisuje vse razpoložljive toksikokinetične podatke. Modeli se lahko ocenjujejo s statistično in vizualno primerjavo napovedi modela s preskusnimi vrednostmi glede na skupno neodvisno spremenljivko (npr. čas). Obseg ocene mora biti utemeljen glede na predvideno uporabo modela.; | “ |
| 8) | è aggiunto il capitolo B52: | «B.52. TOSSICITÀ ACUTA PER INALAZIONE — METODO DELLA CLASSE DI TOSSICITÀ ACUTA | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 436 (2009). La prima linea guida sulla tossicità acuta per inalazione (TG n. 403) è stata adottata nel 1981 e successivamente riveduta (cfr. capitolo B.2 del presente allegato) (1). Dopo l’adozione della revisione del metodo della classe di tossicità acuta per via orale (capitolo B.1 ter del presente allegato) (5), si è ritenuto opportuno mettere a punto un metodo della classe di tossicità acuta per inalazione (2) (3) (4). Una valutazione retrospettiva di questo metodo ne ha dimostrato l’idoneità ai fini della classificazione e dell’etichettatura (6). Il metodo di prova della classe di tossicità acuta per inalazione consente di classificare la tossicità della sostanza chimica in esame mediante una serie di fasi in cui si saggiano concentrazioni fisse predeterminate. Sebbene la letalità sia l’endpoint fondamentale, gli animali che presentano segni di dolore e sofferenza gravi o morte imminente devono essere sottoposti a eutanasia per ridurne al minimo la sofferenza. Il documento di orientamento dell’OCSE n. 19 (7) contiene indicazioni utili per riconoscere tali segni. | 2. | Nel documento d’orientamento sulle prove di tossicità acuta per inalazione (documento d’orientamento n. 39) (8) figurano indicazioni sull’esecuzione e sull’interpretazione del presente metodo di prova. | 3. | Le definizioni usate nell’ambito del presente metodo di prova figurano nell’appendice 1 e nel documento di orientamento n. 39 (8). | 4. | Questo metodo fornisce informazioni sulla pericolosità della sostanza esaminata, permettendone la classificazione secondo il regolamento (CE) n. 1272/2008 per la classificazione delle sostanze chimiche che causano tossicità acuta (9). Qualora sia necessario effettuare stime puntuali di valori di CL50 o analisi della curva concentrazione-risposta, il metodo più adatto è quello descritto nel capitolo B.2 del presente allegato (1). Per ulteriori indicazioni sulla scelta del metodo di prova, consultare il documento di orientamento n. 39 (8). Questo metodo di prova non è specificamente destinato a testare materiali speciali come le materie isometriche o fibrose poco solubili o i nanomateriali di sintesi. | CONSIDERAZIONI INIZIALI | 5. | Prima di eseguire una prova in base a questo metodo, il laboratorio deve considerare tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame, ivi compresi gli studi esistenti i cui risultati concorrano ad escludere la necessità di ulteriori prove, al fine di ricorrere il meno possibile all’impiego di animali. Tra le informazioni utili per la scelta della specie, del ceppo, del sesso, della modalità di esposizione e delle concentrazioni più adeguati, rientrano l’identità, la struttura chimica e le proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, i risultati di eventuali altre prove di tossicità in vitro o in vivo, l’impiego o gli impieghi previsti e potenziali per l’esposizione umana, dati (Q)SAR e dati tossicologici disponibili in merito alle sostanze chimiche di struttura affine. Non si deve utilizzare il presente metodo per saggiare concentrazioni che si prevede provochino dolore e sofferenza gravi a causa di proprietà corrosive (11) o fortemente irritanti (cfr. documento di orientamento n. 39) (8). | PRINCIPIO DELLA PROVA | 6. | Mediante un procedimento articolato in fasi successive che prevede un periodo di esposizione di 4 ore alla sostanza in esame, si ricavano informazioni sulla sua tossicità acuta per inalazione sufficienti a consentirne la classificazione. La durata dell’esposizione può essere diversa se necessario a fini di legge. In ciascuna fase di prova di una concentrazione prestabilita sono utilizzati 3 animali dello stesso sesso. In unzione del numero di animali morti e/o moribondi, possono bastare 2 fasi per valutare la tossicità acuta della sostanza in esame. Se uno dei due sessi è più sensibile dell’altro, si può proseguire la prova solo con gli animali del sesso più sensibile. L’esito di una fase determina come proseguire nella fase successiva, nei seguenti termini: | a) | non occorrono altre prove; | b) | si sottopongono alla prova 3 animali di ciascun sesso; oppure | c) | si sottopongono alla prova 6 animali solo del sesso più sensibile, ossia il limite inferiore della classe di tossicità deve essere determinato in base a prove con 6 animali per gruppo di concentrazione in esame, indipendentemente dal sesso. | 7. | Gli animali moribondi o che manifestano segni evidenti di dolore o di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia e, ai fini dell’interpretazione dei risultati della prova, sono considerati alla stregua di animali morti spontaneamente nel corso dell’esperimento. I criteri da applicare per decidere in merito all’eutanasia degli animali moribondi o in stato di grave sofferenza sono oggetto del documento di orientamento n. 19 (7), che contiene anche indicazioni su come riconoscere i segni di morte prevedibile o imminente. | DESCRIZIONE DEL METODO | Selezione delle specie animali | 8. | Si devono utilizzare animali adulti, giovani e sani appartenenti a ceppi comunemente usati in laboratorio. La specie preferita è il ratto. Occorre motivare l’eventuale scelta di un’altra specie. | Preparazione degli animali | 9. | Le femmine devono essere nullipare e non gravide. Il giorno dell’esposizione, gli animali selezionati devono essere giovani adulti di età compresa tra 8 e 12 settimane, il cui peso corporeo non eccede ± 20 % del peso medio, per ciascun sesso, degli animali della stessa età precedentemente esposti. Gli animali sono scelti a caso e marcati individualmente per poterli identificare. Affinché si acclimatino alle condizioni di laboratorio, devono essere lasciati nelle gabbie per almeno 5 giorni prima dell’inizio della prova e, poco prima della prova, vanno anche acclimatati alle apparecchiature utilizzate per le prove, per attenuare la tensione causata dal nuovo ambiente. | Allevamento degli animali | 10. | La temperatura dello stabulario deve essere di 22 ± 3 °C. L’umidità relativa va idealmente mantenuta tra 30 % e 70 %, anche se ciò potrebbe non essere possibile quando si utilizza l’acqua come veicolo. Prima e dopo l’esposizione, gli animali sono generalmente tenuti in gabbia, suddivisi per sesso e concentrazione, ma il numero di animali per gabbia non deve interferire con un’agevole osservazione di ogni singolo animale e deve ridurre al minimo le perdite dovute a cannibalismo e combattimenti. Se l’esposizione avviene unicamente per via nasale, potrebbe essere necessario abituarli ai dispositivi di contenzione, che non dovrebbero provocare agli animali eccessivi stress fisici, termici o dinamici. La contenzione può incidere sui parametri fisiologici, come la temperatura corporea (ipertermia) e/o il volume respiratorio al minuto. Se si dispone di dati generici che dimostrano che nessuna di queste alterazioni avviene a un livello apprezzabile, il periodo di acclimatamento ai dispositivi di contenzione non è necessario. Gli animali esposti “a corpo intero” ad un aerosol devono essere stabulati separatamente per la durata dell’esposizione per evitare che l’aerosol filtri attraverso il pelo degli altri animali presenti nella gabbia. Salvo nei periodi di esposizione, gli animali possono essere nutriti in base a diete convenzionali e certificate da laboratorio, accompagnate da acqua potabile a volontà. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 d’oscurità. | Camere di inalazione | 11. | La scelta della camera di inalazione dipende dalla natura della sostanza chimica in esame e dalla finalità della prova. Il metodo preferito di esposizione è quello per via nasale (con cui s’intende l’esposizione unicamente della testa, del naso o del muso). Di norma si predilige l’esposizione per via nasale per gli studi di aerosol liquidi o solidi e di vapori che si possono condensare sotto forma di aerosol. L’esposizione del corpo intero può essere più indicata per conseguire obiettivi di studio particolari, ma tale scelta deve essere giustificata nella relazione sullo studio. Per garantire la stabilità atmosferica di una camera di esposizione del corpo intero, il volume complessivo degli animali sottoposti alla prova non deve superare il 5 % del volume della camera. Il documento orientativo 39 (8) descrive i principi delle tecniche di esposizione del corpo intero e per sola via nasale, nonché i relativi vantaggi e svantaggi. | CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE | Somministrazione delle concentrazioni | 12. | Si raccomanda un’esposizione della durata fissa di quattro ore, escludendo il tempo di equilibrazione. Per esigenze specifiche può essere necessario ricorrere ad altri tempi di esposizione, nel qual caso occorre fornire una giustificazione nella relazione sullo studio (cfr. documento di orientamento n. 39) (8). Gli animali esposti in camere “a corpo intero” devono essere stabulati individualmente per evitare che gli animali coabitanti ingeriscano la sostanza in esame pulendosi reciprocamente il mantello. Durante il periodo di esposizione l’alimentazione va sospesa. Nel corso dell’esposizione “a corpo intero” si può continuare a somministrare acqua. | 13. | Gli animali sono esposti alla sostanza in esame sotto forma di gas, vapore, aerosol o una loro miscela. Lo stato fisico da saggiare dipende dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame, dalla concentrazione prescelta e/o dalla forma fisica nella quale è più probabile che essa si presenti nel corso della sua manipolazione e del suo utilizzo. Le sostanze igroscopiche e reattive dal punto di vista chimico devono essere saggiate in atmosfera secca. Prestare attenzione ad evitare concentrazioni esplosive. | Distribuzione granulometrica | 14. | La granulometria deve essere effettuata per tutti gli aerosol e i vapori che potrebbero condensarsi e formare aerosol. Per consentire l’esposizione di tutte le zone pertinenti delle vie respiratorie, si raccomanda di utilizzare aerosol con diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) da 1 a 4 μm con una deviazione standard geometrica (σg) compresa tra 1,5 e 3,0 (8) (13) (14). Occorre fare quanto possibile per rispettare queste condizioni, ma qualora non ci si riuscisse è necessario presentare il parere di un esperto. Ad esempio, le particelle dei fumi metallici possono essere più piccole del limite inferiore sopraindicato, e le particelle caricate, le fibre e il materiale igroscopico (le cui dimensioni aumentano nell’ambiente umido delle vie respiratorie) possono oltrepassare il limite superiore. | Preparazione della sostanza in esame in un veicolo | 15. | Per ottenere la concentrazione e la granulometria adeguate della sostanza in esame nell’atmosfera si può utilizzare un veicolo. Di norma è preferibile utilizzare l’acqua. Per ottenere la distribuzione granulometrica desiderata il materiale particellato può essere sottoposto a processi meccanici, avendo però cura di non decomporre o alterare la sostanza in esame. Se si ritiene che i processi meccanici abbiano provocato alterazioni (ad esempio, a causa delle alte temperature generate dalla frizione durante una macinazione eccessiva), si deve analizzare la composizione chimica della sostanza in esame. Prestare particolare attenzione a non contaminare la sostanza in esame. Non è necessario saggiare le sostanze granulari non friabili, appositamente concepite per non poter essere inalate. Per dimostrare che la manipolazione del materiale granulare non produce particelle respirabili, effettuare una prova di logorio per attrito. Se questa produce particelle respirabili, effettuare una prova di tossicità per inalazione. | Animali di controllo | 16. | Non è necessario un gruppo di controllo negativo (aria) in parallelo. Se per produrre l’atmosfera di prova si utilizza un veicolo diverso dall’acqua, è necessario allestire un gruppo di controllo del veicolo solo se non si dispone di dati storici sulla tossicità. Se lo studio di tossicità di una sostanza in esame incorporata in un veicolo non rivela alcuna tossicità, significa che il veicolo non è tossico alla concentrazione saggiata e pertanto non è necessario allestire un gruppo di controllo del veicolo. | MONITORAGGIO DELLE CONDIZIONI DI ESPOSIZIONE | Flusso d’aria nella camera di esposizione | 17. | Durante ogni esposizione è necessario regolare attentamente, monitorare in continuo e registrare almeno una volta l’ora il flusso d’aria nella camera. Il monitoraggio della concentrazione (o stabilità) dell’atmosfera di prova costituisce una misura permanente di tutti i parametri dinamici e un modo indiretto di controllare tutti quelli che regolano la produzione dell’atmosfera di prova. Si farà il possibile, nelle camere d’esposizione unicamente per via nasale, per evitare la reinalazione qualora il flusso d’aria attraverso il sistema di esposizione non sia in grado di produrre una circolazione dinamica dell’atmosfera che contiene la sostanza in esame. Esistono metodologie specifiche a cui si può ricorrere per dimostrare l’assenza di reinalazione nelle condizioni sperimentali prescelte (8) (15). La concentrazione di ossigeno deve essere pari ad almeno il 19 % e la concentrazione di biossido di carbonio non deve superare l’1 %. Qualora si ritenga di non rispettare queste concentrazioni, è necessario misurarle. | Temperatura e umidità relativa della camera | 18. | La temperatura della camera deve essere mantenuta a 22 ± 3 °C. Sia nel caso delle esposizioni unicamente per via nasale che per le esposizioni del corpo intero, l’umidità relativa nella zona in cui respira l’animale è monitorata e registrata almeno tre volte per le prove che durano fino a 4 ore, oppure una volta l’ora per le prove più brevi. L’umidità relativa dovrebbe idealmente essere mantenuta tra 30 % e 70 % ma può accadere che questi valori non siano raggiungibili (ad esempio, quando si studiano miscele acquose) o che non possa essere misurata per via delle interferenze della sostanza con il metodo di prova. | Concentrazione nominale della sostanza chimica in esame | 19. | Laddove possibile, si deve calcolare e registrare la concentrazione nominale nella camera di esposizione. La concentrazione nominale è data dalla divisione della massa della sostanza in esame generata per il volume totale di aria circolata nella camera. La concentrazione nominale non serve a caratterizzare l’esposizione degli animali, ma un confronto tra la concentrazione nominale e la concentrazione reale dà un’indicazione dell’efficacia del sistema di prova quanto alla sua capacità di generazione e può essere utile per individuare eventuali problemi a questo livello. | Concentrazione reale della sostanza chimica in esame | 20. | La concentrazione reale è la concentrazione della sostanza in esame nella zona della camera di inalazione in cui gli animali respirano. Le concentrazioni reali possono essere determinate con metodi specifici (ad esempio campionamento diretto, metodi di adsorbimento o di reazione chimica, e successiva caratterizzazione analitica) o con metodi non specifici, come l’analisi gravimetrica mediante filtrazione. Il ricorso all’analisi gravimetrica è ammissibile solo per gli aerosol di polveri che contengono un unico componente o per gli aerosol di liquidi poco volatili e deve fondarsi su opportune caratterizzazioni specifiche della sostanza in esame effettuate prima dello studio in corso. È possibile ricorrere all’analisi gravimetrica anche per determinare la concentrazione di un aerosol di polveri con vari componenti, ma in tal caso sono necessari dati analitici che dimostrino che la composizione del prodotto in sospensione nell’aria è analoga a quella del prodotto di partenza. In assenza di questi dati, può essere necessario rianalizzare periodicamente la sostanza in esame (idealmente in sospensione nell’aria) durante lo studio. Per gli agenti aerosolizzati che possono evaporare o sublimarsi, occorre dimostrare che tutte le fasi sono state raccolte con il metodo prescelto. Le concentrazioni bersaglio, nominali e reali devono essere riportate nella relazione, ma nell’analisi statistica per calcolare i valori delle concentrazioni letali sono utilizzate solo le concentrazioni reali. | 21. | Si utilizza, se possibile, un unico lotto della sostanza in esame e il campione allo studio va conservato in condizioni che ne mantengano la purezza, l’omogeneità e la stabilità. Prima di iniziare lo studio, occorre caratterizzare la sostanza in esame, valutandone anche la purezza e, se tecnicamente fattibile, l’identità e le quantità dei contaminanti e delle impurità individuati. A tal fine occorre conoscere quanto meno i dati seguenti: tempo di ritenzione e relativa area del picco, peso molecolare risultante dalla spettroscopia di massa o dalla gascromatografia, oppure altre stime. Il laboratorio che effettua la prova non è responsabile dell’identità del campione in esame, tuttavia, per precauzione, è consigliabile che confermi almeno una parte delle caratteristiche fornite dallo sponsor (colore, natura fisica ecc.). | 22. | L’atmosfera di esposizione è mantenuta il più costante possibile e monitorata in continuo e/o in modo intermittente secondo il metodo di analisi. Quando si procede ad un campionamento intermittente, in uno studio di quattro ore si devono raccogliere campioni dell’atmosfera della camera almeno due volte. Se ciò non è possibile, per via di limitazioni inerenti al flusso d’aria o delle basse concentrazioni, è possibile prelevare un solo campione nell’intero periodo di esposizione. Se si osservano evidenti fluttuazioni da un campione all’altro, per le concentrazioni successive si devono prelevare quattro campioni per esposizione. La concentrazione dei singoli campioni prelevati nella camera non deve deviare dalla concentrazione media della camera più del ± 10 %, nel caso di gas e vapori, o ± 20 % nel caso degli aerosol liquidi o solidi. Occorre calcolare e prender nota del tempo necessario affinché la camera di esposizione raggiunga l’equilibrio (t95). La durata di un’esposizione corrisponde al tempo in cui la sostanza in esame viene generata, ivi compreso il tempo necessario per raggiungere t95. Il documento di orientamento n. 39 (8) contiene indicazioni per la stima di t95. | 23. | Per miscele molto complesse costituite da gas o vapori e da aerosol (ad esempio, atmosfere di combustione e sostanze chimiche generate per propulsione da appositi prodotti/dispositivi finali), ogni fase può comportarsi diversamente nella camera di inalazione. Per ciascuna fase (gas/vapore e aerosol) occorre pertanto scegliere almeno una sostanza indicatrice (analita), normalmente il principio attivo principale della miscela. Quando la sostanza chimica in esame è una miscela, nella relazione dovrà essere indicata la concentrazione analitica corrispondente alla miscela e non solo quella del principio attivo o del componente in esame (analita). Informazioni aggiuntive sulle concentrazioni effettive sono reperibili nel documento di orientamento n. 39 (8). | Granulometria della sostanza chimica in esame | 24. | La distribuzione granulometrica degli aerosol deve essere determinata almeno due volte nel corso di ciascuna esposizione di 4 ore, utilizzando un impattore a cascata o un altro strumento, come uno spettrometro per la misura delle dimensioni aerodinamiche delle particelle. Se i risultati ottenuti con l’impattore a cascata e con l’altro strumento risultano equivalenti, quest’ultimo può essere utilizzato nel corso dell’intero studio. Per confermare l’efficienza di estrazione dello strumento principale, occorre utilizzare parallelamente un secondo strumento, come un filtro gravimetrico o un impinger/gorgogliatore. La concentrazione massica ottenuta dall’analisi granulometrica deve avvicinarsi, con scarti ragionevoli, a quella ottenuta con l’analisi su filtri [cfr. documento di orientamento n. 39 (8)]. Se questa equivalenza viene stabilita nella fase iniziale dello studio, non è necessario effettuare ulteriori misure di conferma. Per il benessere degli animali occorre ridurre il più possibile i dati non conclusivi che potrebbero comportare la necessità di ripetere un’esposizione. È necessario effettuare un’analisi granulometrica nel caso di vapori che rischiano di condensarsi e formare aerosol o se si rilevano particelle in un’atmosfera di vapori che si presume possano formare fasi miste (cfr. paragrafo 14). | PROCEDURA | Prova principale | 25. | In ogni fase si utilizzano tre animali di ciascun sesso, oppure sei animali del sesso più sensibile. Se per l’esposizione solo per via nasale s’impiegano specie di roditori diverse dai ratti, è possibile adeguare la durata massima d’esposizione per ridurre al minimo lo stress tollerato dalla specie in causa. Come dose iniziale si sceglie quella tra le quattro concentrazioni fisse che ha la maggior probabilità di produrre effetti tossici in alcuni degli animali esposti. Gli schemi di prova per i gas, i vapori e gli aerosol (che figurano nelle appendici da 2 a 4) rappresentano il procedimento da seguire in funzione dei valori limite delle categorie CLP da 1a 4 (9) stabilite per i gas (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (appendice 2), per i vapori (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (appendice 3) e per gli aerosol (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (appendice 4). La categoria 5, che non è prevista dal regolamento (CE) n. 1272/2008 (regolamento CLP) (9) si riferisce alle concentrazioni al di sopra del relativo limite. Ad ogni concentrazione iniziale si applica lo schema di prova corrispondente. Il modus operandi consiste nel seguire le frecce indicate negli schemi in funzione del numero di animali sottoposti a eutanasia o morti spontaneamente, fino a poter stabilire una categoria. | 26. | L’intervallo di tempo tra l’esposizione dei vari gruppi è determinato dalla comparsa, dalla durata e dalla gravità dei segni di tossicità rilevati. Si espongono animali al livello di concentrazione superiore solo quando si ha la ragionevole certezza che i precedenti animali esposti sono sopravvissuti. Si consiglia di far trascorrere tre o quattro giorni tra le esposizioni per consentire l’osservazione di eventuali segni di tossicità tardiva. L’intervallo di tempo può essere modificato secondo necessità, ad esempio in caso di risposte non conclusive. | Prova limite | 27. | Un prova limite viene effettuata quando si sa per certo o si prevede che la sostanza in esame è praticamente non tossica, ossia che determinerà una reazione di tossicità solo al di sopra della concentrazione limite autorizzata. Le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame possono essere ricavate da prove già realizzate con sostanze o miscele simili, tenendo conto dell’identità e della percentuale dei componenti dei quali è nota la rilevanza tossicologica. Se le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame sono scarse o nulle, o se ci si attende che sia tossica, è necessario eseguire la prova principale (per ulteriori indicazioni, cfr. documento di orientamento n. 39) (8). | 28. | Seguendo il procedimento normale, la prova limite del presente metodo di prova consiste nell’esporre tre animali di ciascun sesso, o sei animali del sesso più sensibile, alle concentrazioni di 20 000 ppm per i gas, 20 mg/l per i vapori e 5 mg/l per le polveri/nebbie, se raggiungibili. Per le prove con aerosol, l’obiettivo principale è ottenere particelle di dimensioni respirabili (ossia DAMM da 1 a 4 μm), il che è possibile con la maggior parte delle sostanze testate a una concentrazione di 2 mg/l. Le prove con aerosol a concentrazioni superiori a 2 mg/l sono eseguite solo se si è riusciti a generare particelle di dimensioni respirabili (cfr. documento di orientamento n. 39) (8). Per ragioni legate al benessere degli animali, il sistema GHS (16) sconsiglia di testare concentrazioni superiori alla concentrazione limite. Per quanto concerne la sperimentazione in relazione alla categoria 5 del sistema GHS (16), non prevista dal regolamento (CE) n. 1272/2008 (9), va considerata solo se è altamente probabile che i risultati abbiano una pertinenza diretta con la protezione della salute umana e occorre darne giustificazione nella relazione. Nel caso di sostanze potenzialmente esplosive si devono adottare precauzioni per evitare condizioni che favoriscano un’esplosione. Per evitare il ricorso inutile ad animali, occorre effettuare una prova senza animali prima della prova limite, per accertarsi che sia possibile ottenere le condizioni per quest’ultima nella camera. | OSSERVAZIONI | 29. | Durante il periodo di esposizione è necessario eseguire frequenti esami clinici degli animali. Dopo l’esposizione, l’esame clinico va effettuato almeno due volte il giorno stesso dell’esposizione, o più spesso a seconda della risposta degli animali al trattamento, e almeno una volta al giorno nei successivi 14 giorni. Il periodo di osservazione non ha durata fissa, in quanto dipende dalla natura dei segni clinici, dal momento della loro comparsa e dalla durata del periodo di recupero. Un elemento importante è rappresentato dal momento della comparsa e della scomparsa dei segni di tossicità, soprattutto se negli animali è rilevabile una tendenza a manifestare segni di tossicità tardiva. Tutte le osservazioni vanno registrate sistematicamente e riportate singolarmente per ciascun animale. Gli animali moribondi o che manifestano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente devono essere sottoposti a eutanasia, per ragioni legate al loro benessere. Occorre fare attenzione, quando si effettua l’esame clinico alla ricerca di segni di tossicità, a non confondere un cattivo aspetto iniziale e alterazioni respiratorie passeggere, imputabili al procedimento di esposizione, con gli effetti dell’esposizione vera e propria. Si devono tenere in considerazione i principi e i criteri riassunti nel documento di orientamento OCSE citato in bibliografia al punto (7). Nel caso di animali sottoposti a eutanasia o rinvenuti morti, il momento del decesso deve essere registrato con la massima precisione possibile. | 30. | Si osserveranno eventuali alterazioni della cute e del pelo, degli occhi e delle mucose, del sistema respiratorio e circolatorio, del sistema nervoso autonomo e centrale, dell’attività e del comportamento somatomotori. Si annoterà, laddove possibile, l’eventuale differenziazione tra gli effetti locali e sistemici. Particolare attenzione deve essere rivolta all’osservazione di tremori, convulsioni, salivazione, diarrea, letargia, sonno e coma. La misura della temperatura rettale può corroborare una bradipnea riflessa o un’ipo/ipertermia causate dall’esposizione o dalla reclusione. | Peso corporeo | 31. | Il peso di ciascun animale è rilevato e annotato una volta durante il periodo di acclimatazione, il giorno dell’esposizione, prima che questa abbia inizio (giorno 0), e almeno nei giorni 1, 3 e 7 (e successivamente una volta la settimana), così come al momento del decesso o dell’eutanasia, se posteriore al giorno 1. Il peso corporeo è manifestamente uno dei primi indici di tossicità e gli animali che mostrano un calo ponderale ≥ 20 % rispetto al peso anteriore allo studio devono essere osservati attentamente. Alla fine del periodo post esposizione si pesano e si sottopongono a eutanasia gli animali sopravvissuti. | Patologia | 32. | Tutti gli animali utilizzati (compresi quelli che muoiono nel corso della prova o che sono sottoposti a eutanasia e ritirati dallo studio per motivi legati al loro benessere) devono essere sottoposti a necroscopia macroscopica. Se non è possibile eseguire la necroscopia subito dopo il rilevamento del decesso, l’animale deve essere refrigerato (non congelato) ad una temperatura sufficientemente bassa da rallentare l’autolisi. La necroscopia va effettuata il più rapidamente possibile, di norma entro uno o due giorni dal decesso, annotando per ogni animale tutte le alterazioni patologiche macroscopiche, con particolare attenzione a quelle delle vie respiratorie. | 33. | È possibile effettuare altri esami previamente inclusi nel disegno sperimentale, per ampliare il valore interpretativo dello studio, quali, ad esempio, la determinazione del peso polmonare nei ratti sopravvissuti e/o la ricerca, per esame microscopico, di irritazioni delle vie respiratorie. Si possono anche esaminare gli organi che mostrano macropatologie negli animali che sopravvivono più di 24 ore, così come gli organi di cui si ha la certezza o il sospetto che siano stati colpiti. L’esame microscopico dell’intero apparato respiratorio può fornire informazioni utili sulle sostanze in esame che reagiscono con l’acqua, come gli acidi e le sostanze chimiche igroscopiche. | DATI E RELAZIONE | Dati | 34. | Si devono indicare il peso corporeo e i risultati della necroscopia per ciascun animale. I dati degli esami clinici devono essere riassunti in una tabella indicante, per ogni gruppo sottoposto alla prova, il numero di animali utilizzati, il numero di animali che hanno manifestato segni specifici di tossicità, il numero di animali rinvenuti morti durante la prova o sottoposti a eutanasia, il momento del decesso di ciascun animale, la descrizione degli effetti tossici con indicazioni sul decorso e sulla reversibilità, e l’esito della necroscopia. | Relazione sulla prova | 35. | La relazione deve contenere le seguenti informazioni, a seconda dei casi: | | Animali sperimentali e condizioni di allevamento: | — | descrizione delle condizioni di stabulazione, tra cui: numero (o modifica del numero) di animali per gabbia, materiale utilizzato per la lettiera, temperatura ambiente e umidità relativa, fotoperiodo e dieta, | — | specie/ceppo utilizzati e giustificazione dell’impiego di specie diverse dal ratto, | — | numero, età e sesso degli animali, | — | metodo di randomizzazione, | — | dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua (compresi tipo/origine della dieta e origine dell’acqua), | — | descrizione dell’eventuale condizionamento prima della prova, in particolare per quanto concerne dieta, quarantena e terapie. | | Sostanza chimica in esame: | — | natura fisica, purezza e, se del caso, proprietà fisico-chimiche pertinenti (compresa l’isomerizzazione), | — | dati di identificazione e numero CAS, se noto. | | Veicolo: | — | motivazione dell’utilizzo di un veicolo e giustificazione della scelta del veicolo utilizzato (se diverso dall’acqua), | — | dati storici o paralleli che dimostrano che il veicolo non interferisce con i risultati dello studio. | | Camera di inalazione: | — | descrizione della camera di inalazione, che includa le dimensioni e il volume, | — | provenienza e descrizione delle apparecchiature utilizzate per l’esposizione degli animali e per la generazione dell’atmosfera, | — | apparecchi di misurazione della temperatura, dell’umidità, della granulometria e della concentrazione reale, | — | fonte dell’aria, trattamento dell’aria immessa/estratta e sistema di climatizzazione utilizzato, | — | metodi utilizzati per tarare l’apparecchiatura al fine di garantire l’omogeneità dell’atmosfera di prova, | — | differenza di pressione (positiva o negativa), | — | bocchette di esposizione per camera (unicamente via nasale); ubicazione degli animali nel sistema (camera di esposizione “a corpo intero”), | — | omogeneità/stabilità nel tempo dell’atmosfera di prova, | — | ubicazione dei sensori termometrici e igrometrici e dei punti di campionamento dell’atmosfera di prova nella camera, | — | velocità del flusso d’aria, velocità del flusso d’aria in ogni bocchetta di esposizione (“a naso solo”) o rapporto tra il volume occupato dagli animali e il volume della camera (“a corpo intero”), | — | informazioni sull’apparecchiatura utilizzata per misurare l’ossigeno e il diossido di carbonio, se applicabile, | — | tempo necessario per raggiungere l’equilibrio nella camera (t95), | — | numero di cambi di volume per ora, | — | dosatori (se applicabile). | | Dati sull’esposizione: | — | giustificazione della scelta della concentrazione bersaglio dello studio principale, | — | concentrazioni nominali (ottenute dividendo la massa della sostanza in esame immessa nella camera d’inalazione per il volume dell’aria fatta circolare nella camera), | — | concentrazioni reali ottenute nella zona in cui respirano gli animali; per le miscele in esame che producono forme fisiche eterogenee (gas, vapori, aerosol), si può analizzare separatamente ciascuna di esse, | — | esprimere le concentrazioni atmosferiche in unità di massa (ad esempio, mg/l, mg/m3 ecc.), indicando facoltativamente tra parentesi le unità di volume (ad esempio, ppm, ppb), | — | distribuzione granulometrica, diametro aerodinamico mediano di massa (DAMM) e deviazione standard geometrica (σg), con relativi metodi di calcolo. Devono essere indicate anche le singole analisi granulometriche. | | Condizioni sperimentali: | — | ragguagli sulla preparazione della sostanza chimica in esame, precisando le eventuali procedure impiegate per ridurre la granulometria delle sostanze solide o per preparare soluzioni della sostanza in esame. Qualora i processi meccanici abbiano alterato la composizione della sostanza, includere i risultati delle analisi eseguite per verificare la composizione, | — | descrizione (di preferenza corredata di uno schema) dell’apparecchiatura utilizzata per generare l’atmosfera sperimentale e per esporvi gli animali, | — | ragguagli sul metodo d’analisi chimica impiegato e sulla validazione di tale metodo (specificando l’efficienza di recupero della sostanza in esame dal mezzo campionato), | — | giustificazione della scelta delle concentrazioni sperimentali. | | Risultati: | — | tabella con la temperatura, l’umidità e il flusso d’aria nella camera, | — | tabella con le concentrazioni nominali e reali nella camera, | — | tabella con i dati granulometrici, ivi compresi i dati analitici sul campionamento, sulla distribuzione granulometrica e i calcoli del DAMM e della σg, | — | tabella con risposta e livello di concentrazione per ciascun animale (vale a dire animali che manifestano segni di tossicità, mortalità compresa, natura, gravità e durata degli effetti), | — | peso corporeo di ciascun animale registrato nei giorni in cui si è svolto lo studio, precisando la data e l’ora del decesso, se anteriore all’eutanasia programmata; momento della comparsa dei segni di tossicità, loro decorso ed eventuale reversibilità, per ciascun animale, | — | reperti necroscopici ed eventuali reperti istopatologici per ciascun animale, | — | categoria nel sistema CLP e valore limite della CL50. | | Discussione e interpretazione dei risultati: | — | dare particolare importanza alla descrizione dei metodi impiegati per soddisfare i criteri del presente metodo di prova, ad esempio per quanto concerne la concentrazione limite o la granulometria, | — | esaminare la respirabilità delle particelle alla luce dei risultati complessivi, in special modo se i criteri granulometrici non sono stati soddisfatti, | — | tenere conto, nella valutazione globale dello studio, della coerenza dei metodi utilizzati per determinare le concentrazioni nominali e reali e considerare il rapporto tra di esse, | — | considerare la causa probabile di decesso e il meccanismo d’azione prevalente (sistemico o locale), | — | spiegare perché è stato necessario sottoporre ad eutanasia animali che manifestavano dolore intenso e/o segni di sofferenza grave e persistente, in base ai criteri illustrati nel documento di orientamento dell’OCSE citato in bibliografia al punto (7). | BIBLIOGRAFIA | (1) | Capitolo B.2 del presente allegato, Tossicità acuta per inalazione. | (2) | Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W, and Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254. | (3) | Diener W, Kayser D and Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549. | (4) | Diener W and Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134. | (5) | Capitolo B.1 ter del presente allegato, Tossicità acuta orale — Metodo della classe di tossicità acuta. | (6) | OCSE (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Paris. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (7) | OCSE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (8) | OCSE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Paris. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (9) | Regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 16 dicembre 2008, relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele che modifica e abroga le direttive 67/548/CEE e 1999/45/CE e che reca modifica al regolamento (CE) n. 1907/2006 (GU L 353 del 31.12.2008, pag. 1). | (10) | Capitolo B.40 del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: test di resistenza elettrica transcutanea (TER). | (11) | Capitolo B.40 bis del presente allegato, Corrosione cutanea in vitro: test su modelli di pelle umana. | (12) | OCSE (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Paris. Disponibile all’indirizzo: http://www.oecd.org/env/testguidelines | (13) | Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2nd Edition) Informa Healthcare, New York. | (14) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Appl. Toxicol. Toxicol. 18: 321-327. | (15) | Pauluhn J and Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167 | (16) | ONU (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, UN New York and Geneva. Disponibile all’indirizzo: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ ghs/ghs_welcome_e.html | Appendice 1 | DEFINIZIONI | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. | Appendice 2 | Procedimento da seguire per i gas in funzione della concentrazione iniziale (ppm/4 h) | Osservazioni generali (12) | Nella presente appendice è schematizzato il procedimento da seguire per ciascuna concentrazione iniziale. | Appendice 2a: concentrazione iniziale di 100 ppm | Appendice 2b: concentrazione iniziale di 500 ppm | Appendice 2c: concentrazione iniziale di 2 500 ppm | Appendice 2d: concentrazione iniziale di 20 000 ppm | Il procedimento segue le frecce indicate, in funzione del numero di animali sottoposti a eutanasia o morti spontaneamente. | Appendice 2a | Tossicità acuta per inalazione: | procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 100 ppm/4 h per i gas | Appendice 2b | Tossicità acuta per inalazione: | procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 500 ppm/4h per i gas | Appendice 2c | Tossicità acuta per inalazione: | procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 2 500 ppm/4h per i gas | Appendice 2d | Tossicità acuta per inalazione: | procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 20 000 ppm/4h per i gas | Appendice 3 | Procedimento da seguire per i vapori in funzione della concentrazione iniziale (mg/l/4 h) | Osservazioni generali (13) | Nella presente appendice è schematizzato il procedimento da seguire per ciascuna concentrazione iniziale. | Appendice 3a: concentrazione iniziale 0,5 mg/l | Appendice 3b: concentrazione iniziale 2,0 mg/l | Appendice 3c: concentrazione iniziale 10 mg/l | Appendice 3d: concentrazione iniziale 20 mg/l | Il procedimento segue le frecce indicate, in funzione del numero di animali sottoposti a eutanasia o morti spontaneamente. | Appendice 3a | Tossicità acuta per inalazione: | procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 0,5 mg/L/4h per i vapori | Appendice 3b | Tossicità Acuta per Inalazione: | Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 2 mg/L/4h per i vapori | Appendice 3c | Tossicità Acuta per Inalazione: | Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 10 mg/L/4h per i vapori | Appendice 3d | Tossicità Acuta per Inalazione: | Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 20 mg/L/4h per i vapori | Appendice 4 | Procedimento da seguire per gli aerosol in funzione della concentrazione iniziale (mg/l/4 h) | Osservazioni generali (14) | Nella presente appendice è schematizzato il procedimento da seguire per ciascuna concentrazione iniziale. | Appendice 4a: concentrazione iniziale 0,05 mg/l | Appendice 4b: concentrazione iniziale 0,5 mg/l | Appendice 4c: concentrazione iniziale 1 mg/l | Appendice 4d: concentrazione iniziale 5 mg/l | Il procedimento segue le frecce indicate, in funzione del numero di animali sottoposti a eutanasia o morti spontaneamente. | Appendice 4a | Tossicità Acuta per Inalazione: | Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 0.05 mg/L/4h per i vapori | Appendice 4b | Tossicità acuta per inalazione: | procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 0,5 mg/L/4h per gli aerosol | Appendice 4c | Tossicità acuta per inalazione: | procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 1 mg/L/4h per gli aerosol | Appendice 4d | Tossicità Acuta per Inalazione: | Procedimento sperimentale con concentrazione iniziale di 5 mg/L/4h per gli aerosol | » | 8. | doda se poglavje B.52: | „B.52 AKUTNA STRUPENOST PRI VDIHAVANJU – METODA RAZREDOV AKUTNE STRUPENOSTI | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 436 (2009). Prvotna TG 403 v zvezi z akutno strupenostjo pri vdihavanju je bila sprejeta leta 1981 in je bila odtlej revidirana (glej poglavje B.2 te priloge (1)). Priprava metode razredov akutne strupenosti (ATC) pri vdihavanju (2) (3) (4) je bila ocenjena kot ustrezna po sprejetju revidirane oralne metode ATC (poglavje B.1 tris te priloge) (5). Retrospektivna ocena učinkovitosti preskusne metode ATC za akutno strupenost pri vdihavanju je pokazala, da je primerna za namene razvrščanja in označevanja (6). Preskusna metoda ATC pri vdihavanju bo omogočila uporabo zaporednih faz točno določenih ciljnih koncentracij za zagotovitev razvrstitve strupenosti preskusne kemikalije. Kot ključna končna točka se uporablja smrtnost, vendar je treba živali, ki doživljajo hude bolečine ali muke oziroma ki trpijo ali katerih smrt je neizbežna, humano usmrtiti, da se njihovo trpljenje čim bolj zmanjša. Napotki o humanih končnih točkah so na voljo v Dokumentu s smernicami OECD št. 19 (7). | 2. | Napotki glede izvedbe in razlage te preskusne metode so na voljo v Dokumentu s smernicami št. 39 za preskušanje akutne strupenosti pri vdihavanju (GD 39) (8). | 3. | Pojmi, ki se uporabljajo v okviru te preskusne metode, so opredeljeni v Dodatku 1 in v GD 39 (8). | 4. | S to preskusno metodo se pridobivajo informacije o nevarnih lastnostih in omogoča razvrstitev preskusne kemikalije v skladu z Uredbo (ES) št. 1272/2008 za razvrščanje kemikalij, ki povzročajo akutno strupenost (9). Če so potrebne ocenjene vrednosti LC50 ali analize odziva na koncentracijo, je primerno uporabiti preskusno metodo iz poglavja B.2 te priloge (1). Več napotkov o izbiri preskusne metode je na voljo v GD 39 (8). Ta preskusna metoda ni posebej namenjena preskušanju posebnih materialov, kot so slabo topni izometrični ali vlaknati materiali ali proizvedeni nanomateriali. | ZAČETNI PREUDARKI | 5. | Da se uporaba živali kar najbolj zmanjša, mora preskuševalni laboratorij pred razmislekom o preskušanju v skladu s to preskusno metodo preučiti vse razpoložljive informacije o preskusni kemikaliji, vključno z obstoječimi študijami, katerih podatki bi omogočili izognitev dodatnemu preskušanju. Informacije, ki lahko pomagajo pri izbiri najprimernejše vrste, seva, spola, načina izpostavljenosti in ustreznih preskusnih koncentracij, vključujejo identiteto, kemijsko strukturo in fizikalno-kemijske lastnosti preskusne kemikalije; rezultate morebitnih preskusov strupenosti in vitro ali in vivo; pričakovane uporabe in potencial za izpostavljenost ljudi; razpoložljive podatke (Q)SAR in toksikološke podatke o strukturno sorodnih kemikalijah. S to preskusno metodo se ne smejo preskušati koncentracije, za katere se pričakuje, da bodo zaradi jedkega (11) ali izrazito dražilnega delovanja povzročile hude bolečine in trpljenje (glej GD 39 (8)). | NAČELO PRESKUSA | 6. | Preskus temelji na načelu, da se s postopnim postopkom med 4-urno izpostavljenostjo pridobi dovolj informacij o akutni strupenosti pri vdihavanju preskusne kemikalije, da je mogoče to kemikalijo razvrstiti. Za izpolnitev posebnih zakonodajnih namenov se lahko uporabijo tudi druga obdobja izpostavljenosti. V vseh točno določenih fazah koncentracij se preskusijo po 3 živali vsakega spola. Glede na smrtnost in/ali umirajoče stanje živali lahko za presojo akutne strupenosti preskusne kemikalije zadoščata 2 fazi. Če se zagotovijo dokazi, da je en spol občutljivejši od drugega, se lahko preskus nadaljuje samo z občutljivejšim spolom. Od rezultata predhodne faze je odvisna naslednja faza, na primer: | (a) | nadaljnje preskušanje ni potrebno; | (b) | preskušanje s tremi živalmi na spol ali | (c) | preskušanje s 6 živalmi izključno občutljivejšega spola, tj. morajo ocene spodnje meje razreda strupenosti temeljiti na 6 živalih na skupino za preskusno koncentracijo, ne glede na spol. | 7. | Umirajoče živali ali živali, ki očitno trpijo bolečine ali kažejo znake hudega in trajnega trpljenja, je treba humano usmrtiti ter jih pri razlagi rezultatov preskusa upoštevati enako kot živali, ki so poginile med preskusom. Merila za sprejetje odločitve o usmrtitvi umirajočih živali ali živali, ki zelo trpijo, in napotki za prepoznavanje predvidljive ali neizbežne smrti so obravnavani v Dokumentu s smernicami št. 19 o humanih končnih točkah (7). | OPIS METODE | Izbira živalske vrste | 8. | Uporabiti je treba zdrave mlade odrasle živali običajno uporabljanih laboratorijskih sevov. Najprimernejša vrsta je podgana, uporabo drugih vrst pa je treba utemeljiti. | Priprava živali | 9. | Samice še niso smele kotiti in ne smejo biti breje. Na dan izpostavljenosti morajo biti živali mladi odrasli primerki, ki so stari 8 do 12 tednov, njihova teža pa ne sme odstopati za več kot ± 20 % od povprečne teže za vsak spol vseh predhodno izpostavljenih živali pri isti starosti. Živali se naključno izberejo in označijo za posamično prepoznavanje. Pred začetkom preskusa so najmanj 5 dni v kletkah, da se prilagodijo laboratorijskim razmeram. Poleg tega jih je treba pred preskušanjem krajše obdobje privajati na preskusno aparaturo, saj se tako zmanjša stres, ki ga povzroči uvedba v novo okolje. | Oskrba živali | 10. | Temperatura v prostoru za oskrbo preskusnih živali mora biti 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, čeprav to morda ne bo mogoče, kadar se kot nosilec uporablja voda. Pred izpostavljanjem in po njem morajo biti živali v kletkah na splošno združene v skupine po spolu in koncentraciji, pri čemer število primerkov na kletko ne sme vplivati na neovirano opazovanje posamezne živali ter mora kar najbolj zmanjšati izgube zaradi kanibalizma in spopadov. Kadar bo izpostavljen samo nos živali, jih bo morda treba privajati na zadrževalne cevi. Te živalim ne smejo povzročati prevelikega fizičnega ali toplotnega stresa ali stresa zaradi imobilizacije. Omejevanje gibanja lahko vpliva na fiziološke končne točke, kot sta telesna temperatura (hipertermija) in/ali minutni dihalni volumen. Če so na voljo splošni podatki, ki kažejo, da se takih sprememb ne pojavi zelo veliko, predhodno prilagajanje zadrževalnim cevem ni potrebno. Živali, ki se izpostavijo aerosolu s celim telesom, morajo biti med izpostavljenostjo nastanjene posamično, da preskusnega aerosola ne morejo filtrirati preko kožuhov drugih primerkov v kletki. Razen med izpostavljenostjo se lahko uporablja običajna in potrjena laboratorijska hrana, ki jo spremlja neomejena količina pitne vode iz komunalnega omrežja. Osvetlitev mora biti umetna, pri čemer je zaporedje 12 ur svetlobe/12 ur teme. | Inhalacijske komore | 11. | Pri izbiri inhalacijske komore je treba upoštevati lastnosti preskusne kemikalije in cilj preskusa. Po možnosti se kot način izpostavljenosti uporabi izpostavljenost nosu (imenovana tudi izpostavljenost glave ali smrčka). Izpostavljenost nosu je navadno najprimernejša za študije tekočih ali trdnih aerosolov ter za hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole. Mogoče je, da bo posebne cilje študije lažje doseči z izpostavljenostjo celega telesa, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. Kadar se uporablja komora za izpostavljenost celega telesa, skupni volumen preskusnih živali ne sme presegati 5 % prostornine komore, da se zagotovi stabilnost atmosfere. Načela tehnik izpostavljanja nosu in celega telesa ter njune posamezne prednosti in pomanjkljivosti so opisani v GD 39 (8). | POGOJI IZPOSTAVLJENOSTI | Dajanje koncentracij | 12. | Priporoča se, da se določi štiriurna izpostavljenost, pri čemer ta čas ne vključuje časa za vzpostavljanje ravnotežja. Za izpolnitev posebnih zahtev je lahko potrebno drugačno obdobje, vendar je treba to utemeljiti v poročilu o študiji (glej GD 39 (8)). Živali, ki so izpostavljene v komorah za izpostavljanje celega telesa, morajo biti nastanjene posamično, da se prepreči zaužitje preskusne kemikalije ob medsebojnem čiščenju primerkov v kletki. V obdobju izpostavljenosti je treba živalim odrekati hrano. Med izpostavljenostjo celega telesa lahko ves čas uživajo vodo. | 13. | Živali se izpostavijo preskusni kemikaliji v obliki plina, hlapov, aerosola ali njihovih zmesi. Agregatno stanje, ki bo preskušeno, je odvisno od fizikalno-kemijskih lastnosti preskusne kemikalije, izbrane koncentracije in/ali fizikalne oblike, ki bo najverjetneje prisotna med ravnanjem s preskusno kemikalijo in njeno uporabo. Higroskopne in kemično reaktivne preskusne kemikalije je treba preskušati v suhem ozračju. Paziti je treba, da se ne ustvarijo eksplozivne koncentracije. | Porazdelitev velikosti delcev | 14. | Za vse aerosole in hlape, ki lahko kondenzirajo v aerosole, je treba določiti velikost delcev. Da se omogoči izpostavljenost vseh ustreznih predelov dihal, so priporočeni aerosoli, katerih mediana porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) znaša 1–4 μm z geometričnim standardnim odklonom (σg) 1,5–3,0 (8) (13) (14). Prizadevanje za izpolnitev tega standarda naj bo razumno; če ga ni mogoče izpolniti, je treba zagotoviti strokovno presojo. Delci kovinskih hlapov so lahko na primer manjši od tega standarda, naelektreni delci, vlakna in higroskopne snovi (katerih velikost se v vlažnem okolju dihal poveča) pa lahko presegajo navedene vrednosti. | Priprava preskusne kemikalije v nosilcu | 15. | Za ustvarjanje primerne koncentracije in velikosti delcev preskusne kemikalije v atmosferi se lahko uporabi nosilec. Praviloma je treba prednostno uporabiti vodo. Za snov, ki jo tvorijo delci, se lahko uporabijo mehanski postopki, da se doseže zahtevana porazdelitev velikosti delcev, vendar je treba paziti, da preskusna kemikalija ne razpade ali se spremeni. Kadar se zdi, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije (npr. ob zelo visoki temperaturi, nastali zaradi trenja pri pretiranem mletju), je treba sestavo te preskusne kemikalije analitsko preveriti. Skrbno je treba paziti, da se preskusna kemikalija ne onesnaži. Nekrušljivih granulatov, ki so namenoma formulirani tako, da jih ni mogoče vdihniti, ni treba preskušati. Uporabiti je treba preskus drobljivosti, da se dokaže, da pri ravnanju z granulatom ne nastajajo delci, ki jih je mogoče vdihniti. Če v preskusu drobljivosti nastanejo snovi, ki jih je mogoče vdihniti, je treba opraviti preskus strupenosti pri vdihavanju. | Kontrolne živali | 16. | Sočasna negativna kontrolna skupina (z zrakom) ni potrebna. Kadar se v pomoč pri ustvarjanju preskusne atmosfere uporablja nevodni nosilec, je treba kontrolno skupino z nosilcem uporabiti samo, če niso na voljo pretekli podatki o strupenosti pri vdihavanju. Če študija strupenosti preskusne kemikalije, formulirane v nosilcu, ne pokaže strupenosti, iz tega sledi, da nosilec pri preskušeni koncentraciji ni strupen; kontrola z nosilcem torej ni potrebna. | SPREMLJANJE POGOJEV IZPOSTAVLJENOSTI | Pretok zraka v komori | 17. | Pretok zraka skozi komoro je treba med vsako izpostavljenostjo skrbno nadzorovati, stalno spremljati in zabeležiti najmanj vsako uro. Spremljanje koncentracije (ali stabilnosti) preskusne atmosfere je meritev, ki je neločljivo povezana z vsemi dinamičnimi parametri in zagotavlja posredno sredstvo za nadzor nad vsemi pomembnimi dinamičnimi parametri ustvarjanja atmosfere. Pri komorah za izpostavljanje nosu je treba posebno pozornost nameniti preprečevanju ponovnega vdihavanja v primerih, v katerih pretok zraka skozi sistem izpostavljanja ni zadosten za zagotovitev dinamičnega toka atmosfere s preskusno kemikalijo. Za dokazovanje, da v izbranih pogojih postopka ne prihaja do ponovnega vdihavanja, so na voljo predpisane metodologije (8) (15). Koncentracija kisika mora znašati najmanj 19 %, koncentracija ogljikovega dioksida pa ne sme presegati 1 %. Če obstajajo razlogi za mnenje, da teh standardov ni mogoče izpolniti, je treba koncentraciji kisika in ogljikovega dioksida izmeriti. | Temperatura in relativna vlažnost v komori | 18. | Temperaturo v komori je treba ohranjati pri 22 ± 3 °C. Relativno vlažnost v območju dihanja živali je treba pri izpostavljenosti nosu in izpostavljenosti celega telesa spremljati ter jo zabeležiti najmanj trikrat, če izpostavljenost traja do 4 ure, medtem ko se pri krajših časih izpostavljenosti ta meritev zabeleži vsako uro. Relativno vlažnost je treba po možnosti ohranjati v območju 30–70 %, vendar je to lahko bodisi nedosegljivo (npr. pri preskušanju zmesi na vodni osnovi) bodisi neizmerljivo zaradi interference preskusne kemikalije s preskusno metodo. | Preskusna kemikalija: nazivna koncentracija | 19. | Vedno, kadar je to izvedljivo, je treba izračunati in zabeležiti nazivno koncentracijo v komori za izpostavljanje. Nazivna koncentracija je masa ustvarjene preskusne kemikalije, deljena s skupnim volumnom zraka, ki preide skozi sistem komore. Nazivna koncentracija se ne uporablja za opredeljevanje izpostavljenosti živali, pač pa pri primerjavi z dejansko koncentracijo pokaže, kako učinkovito je ustvarjanje preskusnega sistema, in se torej lahko uporabi za odkrivanje težav pri tem ustvarjanju. | Preskusna kemikalija: dejanska koncentracija | 20. | Dejanska koncentracija je koncentracija preskusne kemikalije v območju dihanja živali v inhalacijski komori. Meri se s specifičnimi metodami (npr. z neposrednim vzorčenjem, adsorpcijskimi ali kemičnimi reaktivnimi metodami in naknadnim analitskim opredeljevanjem) ali nespecifičnimi metodami, kot je gravimetrična analiza s filtriranjem. Uporaba gravimetrične analize je sprejemljiva samo za enokomponentne prašne aerosole ali aerosole tekočin z majhno hlapnostjo ter jo je treba pred študijo podpreti z ustreznimi opredelitvami, specifičnimi za preskusno kemikalijo. Z gravimetrično analizo se lahko določi tudi koncentracija večkomponentnega prašnega aerosola, vendar so za to potrebni analitski podatki, ki kažejo, da je sestava snovi v zraku podobna začetni snovi. Če te informacije niso na voljo, bo morda treba med študijo znova analizirati preskusno kemikalijo (po možnosti takrat, ko lebdi v zraku) v rednih intervalih. Za aerosolizirane snovi, ki lahko izhlapijo ali sublimirajo, je treba prikazati, da so bile vse faze zbrane z izbrano metodo. V poročilu o študiji je treba navesti ciljne, nazivne in dejanske koncentracije, vendar se v statističnih analizah za izračun vrednosti smrtnih koncentracij uporabljajo samo dejanske koncentracije. | 21. | Po možnosti je treba uporabiti eno serijo preskusne kemikalije, preskusni vzorec pa je treba hraniti v pogojih, v katerih se ohranjajo njegova čistost, homogenost in stabilnost. Pred začetkom študije je treba opredeliti lastnosti preskusne kemikalije, vključno z njeno čistostjo ter, če je to tehnično izvedljivo, identiteto in količinami ugotovljenih kontaminantov in nečistot. To se lahko med drugim prikaže z naslednjimi podatki: z retencijskim časom in relativno površino vrha, molekulsko maso, ugotovljeno na podlagi analiz z masno spektroskopijo ali plinsko kromatografijo, ali z drugimi ocenami. Čeprav identiteta preskusnega vzorca ni odgovornost preskuševalnega laboratorija, je morda smotrno, da ta vsaj deloma potrdi naročnikovo opredelitev lastnosti (npr. barvo, agregatno stanje itd.). | 22. | Atmosfera v komori za izpostavljanje naj bo konstantna, kolikor je to izvedljivo, ter naj se glede na analitsko metodo spremlja stalno in/ali v rednih intervalih. Kadar se uporablja vzorčenje v intervalih, je treba v štiriurni študiji vzorce atmosfere v komori vzeti najmanj dvakrat. Če to zaradi omejenih stopenj pretoka zraka ali nizkih koncentracij ni izvedljivo, se lahko v celotnem obdobju izpostavljenosti vzame en vzorec. Če se med posameznimi vzorci pojavijo izrazita nihanja, je treba pri preskušanju naslednjih koncentracij uporabiti štiri vzorce na izpostavljenost. Posamezni vzorci koncentracije v komori od srednje koncentracije ne smejo odstopati za več kot ± 10 % za pline in hlape oziroma za več kot ± 20 % za tekoče ali trdne aerosole. Izračunati in zabeležiti je treba čas do vzpostavitve ravnotežja v komori (t95). Čas izpostavljenosti pokriva čas ustvarjanja preskusne kemikalije, pri tem pa je upoštevan čas, potreben za dosego t95. Napotki za ocenjevanje t95 so na voljo v GD 39 (8). | 23. | Pri zelo kompleksnih zmeseh, sestavljenih iz hlapov/plinov in aerosolov (npr. zgorevalnih atmosfer in preskusnih kemikalij, potiskanih iz namenskih proizvodov/naprav za posebno uporabo), se lahko v inhalacijski komori vsaka faza obnaša drugače, zato je treba za vsako fazo (hlape/plin in aerosol) izbrati najmanj eno indikatorsko snov (analit), ki je navadno glavna aktivna snov v zmesi. Kadar je preskusna kemikalija zmes, je treba analitsko koncentracijo navesti za celotno zmes in ne le za aktivno snov ali sestavino (analit). Dodatne informacije o dejanskih koncentracijah so na voljo v GD 39 (8). | Preskusna kemikalija: porazdelitev velikosti delcev | 24. | Porazdelitev velikosti delcev aerosolov je treba med vsako 4-urno izpostavljenostjo določiti vsaj dvakrat s kaskadnim impaktorjem ali nadomestnim instrumentom, kot je aerodinamični merilnik delcev. Če je mogoče prikazati enakovrednost rezultatov, dobljenih s kaskadnim impaktorjem in nadomestnim instrumentom, se lahko nadomestni instrument uporablja skozi celotno študijo. Vzporedno s primarnim instrumentom je treba za potrditev njegove učinkovitosti zbiranja uporabljati še drugo napravo, kot je gravimetrični filter ali (plinska) izpiralka. Masna koncentracija, dobljena z analizo velikosti delcev, mora biti v razumnih mejah masne koncentracije, dobljene z analizo s filtriranjem (glej GD 39 (8)). Če je enakovrednost mogoče prikazati zgodaj v študiji, se lahko nadaljnje potrditvene meritve opustijo. Zaradi dobrobiti živali je treba sprejeti ukrepe, da se čim bolj zmanjša količina pomanjkljivih podatkov, zaradi katerih bi bilo treba izpostavljanje ponoviti. Za hlape je treba velikost delcev določiti, če obstaja možnost, da se bodo hlapi kondenzirali v aerosol, ali če se v atmosferi s hlapi, v kateri so mogoče mešane faze, zaznajo delci (glej odstavek 14). | POSTOPEK | Glavni preskus | 25. | V vsaki fazi se uporabijo tri živali na spol ali šest živali občutljivejšega spola. Če se z nosom izpostavijo vrste glodavcev, ki niso podgane, se lahko najdaljša obdobja izpostavljenosti prilagodijo, da se kar najbolj zmanjša trpljenje, značilno za uporabljeno vrsto. Koncentracija, ki bo uporabljena kot začetni odmerek, se izbere med štirimi točno določenimi koncentracijami, začetna koncentracija pa mora biti tista, ki bo najverjetneje povzročila zastrupitev pri nekaterih od živali, ki bodo prejele odmerek. Sheme preskušanja za pline, hlape in aerosole (vključene v dodatke 2–4) ponazarjajo preskušanje z mejnimi vrednostmi kategorij 1–4 iz Uredbe (ES) št. 1272/2008 (9) za pline (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4 h) (Dodatek 2), hlape (0,5, 2, 10, 20 mg/l/4 h) (Dodatek 3) in aerosole (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l/4 h) (Dodatek 4). Kategorija 5, ki se v navedeni uredbi ne izvaja, se nanaša na koncentracije nad zadevnimi mejnimi koncentracijami. Za vsako začetno koncentracijo se uporablja zadevna shema preskušanja. Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku sledi prikazanim puščicam, dokler ni mogoča razvrstitev v kategorijo. | 26. | Časovni interval med skupinami za izpostavljanje je določen glede na nastop, trajanje in resnost strupenih znakov. Z izpostavljanjem živali naslednji stopnji koncentracije je treba počakati, dokler ni mogoče z razumno gotovostjo sklepati o preživetju predhodno preskušenih živali. Med izpostavljanji naslednji stopnji koncentracije je priporočljivo počakati tri ali štiri dni, da se omogoči opazovanje zapoznele strupenosti. Časovni interval se lahko ustrezno prilagodi, npr. pri neopredeljivih odzivih. | Mejni preskus | 27. | Mejni preskus se uporabi, kadar je znano ali se pričakuje, da je preskusna kemikalija praktično nestrupena, tj. da povzroči toksično reakcijo samo nad zakonsko predpisano mejno koncentracijo. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije se lahko pridobijo na podlagi znanja o podobnih preskušenih snoveh ali podobnih zmeseh ob upoštevanju identitete in odstotka sestavin, za katere je znano, da so toksikološko pomembne. Kadar je informacij o strupenosti preskusne kemikalije malo oziroma jih ni ali kadar se pričakuje, da je strupena, je treba opraviti glavni preskus (več napotkov je na voljo v GD 39 (8)). | 28. | Z običajnim postopkom se tri živali na spol ali šest živali občutljivejšega spola izpostavi koncentraciji 20 000 ppm za pline, 20 mg/l za hlape oziroma 5 mg/l za prah/meglice (če so te koncentracije dosegljive), kar se uporabi kot mejni preskus za to preskusno metodo. Pri preskušanju aerosolov mora biti glavni cilj ustvariti delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (tj. MMAD 1–4 μm). To je mogoče z večino preskusnih kemikalij pri koncentraciji 2 mg/l. Preskušanje aerosolov pri koncentracijah, višjih od 2 mg/l, se lahko izvaja samo, če se lahko zagotovi delce takšne velikosti, da jih je mogoče vdihniti (glej GD 39 (8)). V skladu z globalno usklajenim sistemom za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS) (16) se zaradi dobrobiti živali preskušanje nad mejno koncentracijo odsvetuje. Preskušanje v kategoriji 5 v skladu z GHS (16), ki se v Uredbi (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja, se sme predvideti samo, kadar obstaja velika verjetnost, da bodo rezultati takega preskusa neposredno pomembni za varovanje zdravja ljudi, poleg tega pa je treba to utemeljiti v poročilu o študiji. V primeru potencialno eksplozivnih preskusnih kemikalij je treba paziti, da se ne ustvarijo ugodni pogoji za eksplozijo. Zaradi izogibanja nepotrebni uporabi živali je treba pred mejnim preskusom opraviti preskus brez živali in tako zagotoviti, da je v komori mogoče doseči pogoje za mejni preskus. | OPAZOVANJA | 29. | Med obdobjem izpostavljenosti je treba živali pogosto klinično opazovati. Po izpostavljenosti je treba klinična opazovanja izvajati skupno 14 dni, in sicer na dan izpostavljenosti najmanj dvakrat ali pogosteje, če to nakazuje odziv živali na tretiranje, nato pa najmanj enkrat na dan. Dolžina obdobja opazovanja ni točno določena, pač pa jo je treba določiti glede na naravo in čas nastopa kliničnih znakov ter dolžino obdobja okrevanja. Časi pojava in izginotja pokazateljev strupenosti so pomembni, zlasti če se ti znaki nagibajo k zapoznelosti. Vsa opažanja se sistematično zabeležijo, pri čemer se evidence vodijo za vsako žival posebej. Umirajoče živali ter živali, ki kažejo znake hude bolečine in/ali trajnega in hudega trpljenja, je treba zaradi njihove dobrobiti humano usmrtiti. Pri pregledih za kliničnimi pokazatelji strupenosti je treba paziti, da se začetni slab videz in prehodne spremembe v dihanju, ki so posledica postopka izpostavljanja, ne zamenjajo za učinke, povezane s tretiranjem. Upoštevati je treba načela in merila, povzeta v Dokumentu s smernicami o humanih končnih točkah (7). Kadar se živali usmrtijo iz humanih razlogov ali so najdene poginule, je treba čas smrti zabeležiti čim natančneje. | 30. | Opazovanja v kletkah morajo vključevati spremembe na koži in kožuhu, očeh in sluznicah, v dihalih, obtočilih, avtonomnem in osrednjem živčevju ter pri somatomotoričnih aktivnostih in vedenjskih vzorcih. Kadar je to mogoče, je treba zabeležiti vsa razlikovanja med lokalnimi in sistemskimi učinki. Pozorno je treba opazovati tremorje, krče, slinjenje, drisko, letargijo, spanje in komo. Z merjenjem rektalne temperature se lahko pridobijo podporni dokazi o refleksni bradipneji ali hipo-/hipertermiji, povezani s tretiranjem ali konfinacijo. | Telesna teža | 31. | Težo posameznih živali je treba zabeležiti enkrat v obdobju prilagajanja na okolje, na dan izpostavljenosti pred izpostavljenostjo (dan 0) ter vsaj 1., 3. in 7. dan (nato pa tedensko), poleg tega pa še ob poginu ali evtanaziji, če ta nastopi po 1. dnevu. Telesna teža se priznava kot bistveni kazalnik strupenosti, tako da je treba živali, pri katerih se v primerjavi z vrednostmi pred študijo opazi trajen upad za ≥ 20 %, skrbno spremljati. Preživele živali se ob koncu obdobja po izpostavljenosti stehtajo in humano usmrtijo. | Patologija | 32. | Na vseh preskusnih živalih, vključno s tistimi, ki med preskusom poginejo ali so evtanazirane in odstranjene iz študije zaradi njihove dobrobiti, je treba opraviti makroskopsko obdukcijo. Če je ni mogoče opraviti takoj po odkritju poginule živali, je treba žival ohladiti (ne zamrzniti) na dovolj nizko temperaturo, da se avtoliza čim bolj zmanjša. Obdukcijo je treba opraviti čim prej, navadno v dnevu ali dveh. Za vsako žival je treba zabeležiti vse makroskopske patološke spremembe s posebnim poudarkom na spremembah dihal. | 33. | Za razširitev razlagalne vrednosti študije se lahko razmisli o dodatnih samoumevno vključenih pregledih, kot sta tehtanje pljuč preživelih podgan in/ali zagotavljanje dokazov o dražilnosti z mikroskopskim pregledom dihal. Med pregledanimi organi so lahko tudi tisti, ki kažejo makroskopske patološke znake pri živalih, ki so preživele 24 ur ali več, in organi, za katere je znano ali se pričakuje, da so prizadeti. Mikroskopski pregled celotnih dihal lahko zagotovi koristne informacije za preskusne kemikalije, ki reagirajo z vodo, kot so kisline in higroskopne preskusne kemikalije. | PODATKI IN POROČANJE | Podatki | 34. | Zagotoviti je treba podatke o telesni teži in ugotovitvah obdukcije posameznih živali. Podatke o kliničnih opazovanjih je treba povzeti v preglednicah, v katerih se za vsako preskusno skupino navedejo število uporabljenih živali, število živali, ki kažejo specifične znake zastrupitve, število živali, ki so bile najdene poginule med preskusom ali usmrčene iz humanih razlogov, čas smrti posameznih živali, opis in časovni potek strupenih učinkov in reverzibilnosti ter ugotovitve obdukcije. | Poročilo o preskusu | 35. | Poročilo o preskusu mora vsebovati naslednje informacije, kot je primerno: | | Preskusne živali in oskrba | — | opis pogojev v kletkah, vključno s številom (ali spremembo števila) živali na kletko, nastiljem, temperaturo prostora in relativno vlažnostjo, fotoperiodo ter opredelitvijo hrane, | — | uporabljeno vrsto/sev in utemeljitev uporabe vrste, ki ni podgana, | — | število, starost in spol živali, | — | metodo randomizacije, | — | podatke o kakovosti hrane in vode (vključno z vrsto/virom hrane in virom vode), | — | opis morebitne priprave živali pred preskusom, vključno s hrano, karanteno in zdravljenjem. | | Preskusna kemikalija | — | agregatno stanje, čistost in, če je to ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vključno z izomerizacijo), | — | identifikacijske podatke in registrsko številko Službe za izmenjavo kemijskih izvlečkov (CAS), če je znana. | | Nosilec | — | utemeljitev uporabe nosilca in utemeljitev izbire nosilca (če to ni voda), | — | pretekle ali tekoče podatke, ki dokazujejo, da nosilec ne vpliva na rezultat študije. | | Inhalacijska komora | — | opis inhalacijske komore, vključno z merami in prostornino, | — | izvor in opis opreme, uporabljene za izpostavljanje živali in ustvarjanje atmosfere, | — | opremo za merjenje temperature, vlažnosti, velikosti delcev in dejanske koncentracije, | — | vir zraka, obdelavo dovajanega/odvajanega zraka in sistem za klimatiziranje, | — | metode, uporabljene za umerjanje opreme za zagotavljanje homogene preskusne atmosfere, | — | razliko v tlaku (pozitivna ali negativna), | — | izpostavitvene odprtine na komoro (izpostavljanje nosu); položaj živali v sistemu (izpostavljanje celega telesa), | — | časovno homogenost/stabilnost preskusne atmosfere, | — | položaj tipal za zaznavanje temperature in vlažnosti ter mesto vzorčenja preskusne atmosfere v komori, | — | stopnje pretoka zraka, stopnjo pretoka zraka/izpostavitveno odprtino (izpostavljanje nosu) ali število živali/komoro (izpostavljanje celega telesa), | — | informacije o opremi, uporabljeni za merjenje kisika in ogljikovega dioksida, če je ustrezno, | — | čas, potreben za vzpostavitev ravnotežja v inhalacijski komori (t95), | — | število zamenjav volumnov zraka na uro, | — | merilne naprave (če je ustrezno). | | Podatki o izpostavljenosti | — | utemeljitev izbire ciljne koncentracije v glavni študiji, | — | nazivne koncentracije (skupna masa ustvarjene preskusne kemikalije v inhalacijski komori, deljena z volumnom zraka, ki preide skozi komoro), | — | dejanske koncentracije preskusne kemikalije, ki se vzamejo v območju dihanja živali; za preskusne zmesi, pri katerih nastajajo heterogene fizikalne oblike (plini, hlapi, aerosoli), se lahko vsaka analizira ločeno, | — | vse koncentracije v zraku je treba navesti v masnih enotah (npr. mg/l, mg/m3 itd.); v oklepajih se lahko navedejo tudi prostorninske enote (npr. ppm, ppb), | — | porazdelitev velikosti delcev, mediano porazdelitvene mase delcev v zraku glede na aerodinamični premer (MMAD) in geometrični standardni odklon (σg), vključno z metodami za njihov izračun. Poročati je treba o posameznih analizah velikosti delcev. | | Preskusni pogoji | — | podatke o pripravi preskusne kemikalije, vključno s podrobnostmi o postopkih, uporabljenih za zmanjšanje velikosti delcev trdnih snovi ali pripravo raztopin preskusne kemikalije. Kadar obstaja možnost, da so mehanski postopki spremenili sestavo preskusne kemikalije, je treba vključiti rezultate analiz za preverjanje sestave te preskusne kemikalije, | — | opis (ki po možnosti vključuje diagram) opreme, uporabljene za ustvarjanje preskusne atmosfere in izpostavljanje živali preskusni atmosferi, | — | podatke o uporabljeni kemijski analitski metodi in njeni validaciji (vključno z rekuperacijo preskusne kemikalije iz nosilca za vzorčenje), | — | utemeljitev določitve preskusnih koncentracij. | | Rezultati | — | preglednice o temperaturi, vlažnosti in pretoku zraka v komori, | — | preglednice s podatki o nazivnih in dejanskih koncentracijah, | — | preglednice s podatki o velikosti delcev, vključno s podatki o analitskem vzorčenju, porazdelitvijo velikosti delcev ter izračuni MMAD in σg, | — | preglednice s podatki o odzivu in koncentracijah za vsako žival (tj. za živali, ki kažejo znake strupenosti, vključno s smrtnostjo ter naravo, resnostjo in trajanjem učinkov), | — | telesne teže posameznih živali, izmerjene med študijo, datum in čas smrti, če je ta nastopila pred predvideno evtanazijo; časovni potek nastopa znakov zastrupitve in ali so bili ti reverzibilni za vsako žival, | — | izsledke obdukcije in histopatološke preiskave za vsako žival, če so na voljo, | — | razvrstitev kategorij po Uredbi (ES) št. 1272/2008 in mejno vrednost LC50. | | Razprava in razlaga rezultatov | — | poseben poudarek je treba nameniti opisu metod, uporabljenih za izpolnitev meril te preskusne metode, npr. glede mejne koncentracije ali velikosti delcev, | — | z vidika splošnih ugotovitev je treba obravnavati možnost vdihavanja delcev, zlasti če meril glede velikosti delcev ni bilo mogoče izpolniti, | — | v splošno oceno študije je treba vključiti doslednost metod, uporabljenih za določanje nazivne in dejanske koncentracije, ter razmerje med njima, | — | obravnavati je treba verjetni vzrok smrti in prevladujoči način delovanja (sistemski ali lokalni), | — | če je bilo treba na podlagi meril iz Dokumenta s smernicami OECD o humanih končnih točkah (7) humano žrtvovati živali, ki so trpele bolečine ali kazale znake hudega in trajnega trpljenja, je treba to pojasniti. | VIRI: | (1) | Poglavje B.2 te priloge, Akutna strupenost pri vdihavanju. | (2) | Holzhütter, H.-G., Genschow, E., Diener, W., in Schlede, E. (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243–254. | (3) | Diener, W., Kayser, D., in Schlede, E. (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537–549. | (4) | Diener, W., in Schlede, E. (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129–134. | (5) | Poglavje B.1 tris te priloge, Akutna oralna toksičnost – metoda razredov akutne toksičnosti. | (6) | OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 105, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (7) | OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (8) | OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 39, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (9) | Uredba (ES) št. 1272/2008 Evropskega parlamenta in Sveta z dne 16. decembra 2008 o razvrščanju, označevanju in pakiranju snovi ter zmesi, o spremembi in razveljavitvi direktiv 67/548/EGS in 1999/45/ES ter spremembi Uredbe (ES) št. 1907/2006 (UL L 353, 31.12.2008, str. 1). | (10) | Poglavje B.40 te priloge, Jedkost za kožo in vitro: preskus transkutane električne upornosti (TER). | (11) | Poglavje B.40 bis te priloge, Jedkost za kožo in vitro: preskus z modelom človeške kože. | (12) | OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals No. 435, OECD, Pariz. Na voljo na: http://www.oecd.org/env/testguidelines. | (13) | Phalen, R. F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2. izdaja) Informa Healthcare, New York. | (14) | SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327. | (15) | Pauluhn, J., in Thiel, A. (2007). A Simple Approach to Validation of Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160–167. | (16) | OZN (2007), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30, OZN New York in Ženeva. Na voljo na: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki začetni koncentraciji za pline (ppM/4 H) | Splošne opombe (12) | Za vsako začetno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vključenih v ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. | Dodatek 2a: začetna koncentracija je 100 ppm | Dodatek 2b: začetna koncentracija je 500 ppm | Dodatek 2c: začetna koncentracija je 2 500 ppm | Dodatek 2d: začetna koncentracija je 20 000 ppm | Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku sledi prikazanim puščicam. | Dodatek 2a | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 100 ppm/4 h za pline | Dodatek 2b | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 500 ppm/4 h za pline | Dodatek 2c | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 2 500 ppm/4 h za pline | Dodatek 2d | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 20 000 ppm/4 h za pline | Dodatek 3 | Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki začetni koncentraciji za hlape (mg/L/4 H) | Splošne opombe (13) | Za vsako začetno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vključenih v ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. | Dodatek 3a: začetna koncentracija je 0,5 mg/l | Dodatek 3b: začetna koncentracija je 2,0 mg/l | Dodatek 3c: začetna koncentracija je 10 mg/l | Dodatek 3d: začetna koncentracija je 20 mg/l | Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku sledi prikazanim puščicam. | Dodatek 3a | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 0,5 mg/L/4 h za hlape | Dodatek 3b | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 2 mg/L/4 h za hlape | Dodatek 3c | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentraci jo 10 mg/L/4 h za hlape | Dodatek 3d | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 20 mg/L/4 h za hlape | Dodatek 4 | Postopek, ki ga je treba upoštevati pri vsaki začetni koncentraciji za aerosole (mg/L/4 H) | Splošne opombe (14) | Za vsako začetno koncentracijo je v zadevnih shemah preskušanja, vključenih v ta dodatek, prikazan postopek, ki ga je treba upoštevati. | Dodatek 4a: začetna koncentracija je 0,05 mg/l | Dodatek 4b: začetna koncentracija je 0,5 mg/l | Dodatek 4c: začetna koncentracija je 1 mg/l | Dodatek 4d: začetna koncentracija je 5 mg/l | Glede na število humano usmrčenih ali poginulih živali se v preskusnem postopku sledi prikazanim puščicam. | Dodatek 4a | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentraci jo 0,05 mg/L/4 h za aerosole | Dodatek 4b | Akutna strupenost privdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 0,5 mg/L/4 h za aerosole | Dodatek 4c | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 1 mg/L/4 h za aerosole | Dodatek 4d | Akutna strupenost pri vdihavanju: | preskusni postopek z začetno koncentracijo 5 mg/L/4 h za aerosole | “ |
| 9) | i capitolo C.10 è sostituito dal seguente: | «C.10. PROVA DI SIMULAZIONE SUI SISTEMI DI TRATTAMENTO AEROBICO DEI LIQUAMI: C.10-A: UNITÀ CON FANGHI ATTIVI — C.10-B: BIOFILM | C.10-A: unità con fanghi attivi | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 303 (2001). Negli anni Cinquanta si è capito che i tensioattivi, da poco introdotti, provocavano una formazione di schiuma eccessiva negli impianti di trattamento delle acque reflue e nei fiumi. Si trattava di sostanze che non venivano completamente eliminate nel trattamento aerobico e in alcuni casi limitavano l’eliminazione di altra materia organica. Queste constatazioni hanno stimolato molte ricerche scientifiche incentrate sull’eliminazione dei tensioattivi dalle acque reflue e sulla possibilità di utilizzare nuove sostanze chimiche prodotte industrialmente per il trattamento di questo tipo di acque. Sono state utilizzate unità modello rappresentative dei due principali tipi di trattamento biologico aerobico delle acque reflue: fanghi attivi e filtri percolatori (detti anche filtri biologici). Sarebbe stato poco pratico, ed estremamente costoso, distribuire le singole nuove sostanze chimiche e monitorare i grandi impianti per il trattamento delle acque, anche solo su base locale. | CONSIDERAZIONI INIZIALI | Unità con fanghi attivi | 2. | Sono state descritte unità modello con fanghi attivi di dimensioni variabili: da 300 ml fino a circa 2 000 ml. Alcune riproducevano da vicino il funzionamento degli impianti di scala normale, con vasche di sedimentazione dalle quali i fanghi sedimentati venivano ripompati verso il serbatoio di aerazione, mentre altre unità non prevedevano vasche di sedimentazione, cfr. Swisher (1). La dimensione dell’apparecchio rappresenta un compromesso; da un lato dev’essere sufficientemente grande da consentire un buon funzionamento meccanico e da fornire un volume adeguato di campioni senza che ciò incida sull’operatività, mentre dall’altro deve essere di dimensione sufficientemente contenuta da evitare sprechi di materiali e spazio. | 3. | Due tipi di apparecchiature sono stati utilizzati su larga scala e in modo soddisfacente: le unità Husmann (2) e le unità a vaso poroso (3) e (4), impiegate inizialmente per lo studio dei tensioattivi; entrambe queste apparecchiature vengono descritte nel presente metodo di prova. Anche altri apparecchi hanno dato esito soddisfacente, cfr. ad esempio Eckenfelder (5). Dato il costo e gli sforzi relativamente onerosi legati all’applicazione di questa prova di simulazione, sono state analizzate in parallelo anche altre prove di screening, più semplici e meno costose, che sono ora incluse nel capitolo C.4, lettere da A a F, del presente allegato (6). L’esperienza acquisita in merito a molti tensioattivi e ad altre sostanze chimiche ha dimostrato che quelli che superano le prove di screening (sono cioè prontamente biodegradabili) si degradano anche nella prova di simulazione. Alcuni tra quelli che non superano le prove di screening superano però le prove di biodegradabilità intrinseca [capitoli C.12 (7) e C.19 (8) del presente allegato], ma solo alcuni di questi ultimi si degradano nella prova di simulazione, mentre le sostanze chimiche che non superano le prove di biodegradabilità intrinseca non si degradano nelle prove di simulazione (9), (10), (11). | 4. | In alcuni casi, sono sufficienti le prove di simulazione svolte in un singolo insieme di condizioni di funzionamento specifiche. I risultati sono espressi sotto forma di eliminazione percentuale della sostanza chimica in esame o del carbonio organico disciolto (DOC). La descrizione della prova in questione è fornita nel presente metodo. Tuttavia, a differenza della precedente versione del presente capitolo che descriveva solo un tipo di apparecchio per il trattamento dei liquami artificiali a unità abbinate, utilizzando un metodo relativamente approssimativo per i fanghi esausti, il presente testo offre una serie di alternative, riguardo il tipo di apparecchio, la modalità di funzionamento, la rimozione dei liquami e dei fanghi esausti. Il testo segue da vicino quello della norma ISO 11733 (12), che è stato passato attentamente al setaccio in fase di preparazione, sebbene il metodo non sia stato sottoposto a prove interlaboratorio (ring-test). | 5. | In altri casi, sono necessari dati più precisi riguardo alla concentrazione della sostanza chimica in esame negli effluenti ed è quindi inevitabile ricorrere a un metodo più completo. Ad esempio, il tasso di eliminazione dei fanghi esausti va controllato con più precisione nel corso di ogni singola giornata e per tutto il periodo di prova, per cui le unità devono funzionare secondo diversi tassi di eliminazione. Un metodo veramente completo dovrebbe inoltre includere prove eseguite a due o tre temperature diverse: un metodo simile è descritto da Birch (13) (14) e riassunto nell’appendice 6. Tuttavia, le conoscenze attualmente a disposizione sono insufficienti per poter decidere quale dei modelli cinetici siano applicabili alla biodegradazione delle sostanze chimiche negli impianti per il trattamento delle acque reflue e, in generale, negli ambienti acquatici. L’applicazione della cinetica di Monod, cfr. appendice 6 a titolo d’esempio, si limita alle sostanze chimiche presenti in quantità pari a 1 mg/l e oltre, ma alcuni ritengono che anche questo sia da dimostrare. Le prove condotte su concentrazioni che meglio riflettono quelle riscontrabili nelle acque reflue sono riportate nell’appendice 7; queste prove sono state inserite in appendice, analogamente a quelle nell’appendice 6, e non pubblicate come metodi di prova a sé stanti. | Filtri | 6. | Si è prestata meno attenzione ai modelli pilota a filtri percolatori (detti anche letti percolatori), forse perché sono più complessi e meno compatti rispetto agli impianti pilota a fanghi attivi. Gerike et al. hanno sviluppato unità a filtri percolatori, facendole funzionare in modalità abbinata (15). Si tratta di filtri relativamente grandi (altezza: 2 m; volume: 60 l) che richiedono ciascuno fino a 2 l/h di liquami. Bauman et al. (16) hanno simulato dei filtri percolatori inserendo delle strisce di “fibra pile” di poliestere in tubi lunghi 1 m (diametro interno: 14 mm) dopo averle immerse in fanghi attivi concentrati per 30 min. La sostanza chimica in esame, quale unica fonte di carbonio in una soluzione minerale salina, è stata introdotta nel tubo verticale, valutando in seguito la biodegradazione attraverso la misurazione del DOC negli effluenti e del CO2 nel gas emesso. | 7. | I biofiltri sono stati simulati seguendo una procedura diversa (15); le superfici interne di alcuni tubi rotanti, leggermente inclinati rispetto all’asse orizzontale, sono state irrorate con acque reflue (circa 250 ml/h) con e senza la sostanza chimica in esame, e gli effluenti risultanti sono stati analizzati per determinare la presenza di DOC e/o della sostanza. | PRINCIPIO DELLA PROVA | 8. | Il metodo intende determinare l’eliminazione e la biodegradazione primaria e/o completa di sostanze chimiche organiche idrosolubili attraverso microrganismi aerobici, in un sistema di prova a funzionamento continuo che simula il processo a fanghi attivi. Le fonti di carbonio e di energia per i microrganismi sono costituite da un mezzo organico facilmente biodegradabile e dalla sostanza chimica organica in esame. | 9. | Due unità di prova a funzionamento continuo (impianti a fanghi attivi o vasi porosi) vengono fatte operare in parallelo in condizioni identiche, scelte in quanto adatte ai fini della prova. Normalmente, il tempo medio di ritenzione idraulica è di 6 h e l’età media dei fanghi (tempo di ritenzione dei fanghi) varia da 6 a 10 giorni. I fanghi sono eliminati mediante uno dei metodi; la sostanza chimica in esame viene aggiunta agli affluenti (mezzo organico) di una sola delle due unità, con una concentrazione di carbonio organico disciolto (DOC) tra 10 mg/l e 20 mg/l. La seconda unità viene utilizzata come unità di controllo per determinare la biodegradazione del mezzo organico. | 10. | A intervalli frequenti vengono saggiati campioni degli effluenti, nei quali vengono determinati il DOC, preferibilmente, oppure la COD (domanda chimica di ossigeno), insieme alla concentrazione della sostanza chimica in esame (se richiesto) attraverso analisi specifiche sugli effluenti provenienti dall’unità che riceve la sostanza. Quando si effettuano le misurazioni del DOC o della COD, si assume che la differenza fra le concentrazioni medie degli effluenti nelle due unità (di prova e di controllo) sia dovuta alla sostanza in esame o ai suoi metaboliti organici. Tale differenza viene confrontata con la concentrazione di DOC o COD negli affluenti dovuta all’immissione della sostanza chimica in esame, al fine di determinare l’eliminazione di quest’ultima. | 11. | È generalmente possibile distinguere tra biodegradazione e bioassorbimento attraverso un attento esame della curva eliminazione-tempo e la biodegradazione può normalmente essere confermata attraverso una prova di biodegradazione rapida utilizzando un inoculo acclimatato proveniente dall’unità che ha ricevuto la sostanza in esame. | INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA CHIMICA IN ESAME | 12. | È necessario disporre delle caratteristiche di purezza, idrosolubilità, volatilità e adsorbimento della sostanza in esame, in modo da permettere la corretta interpretazione dei risultati. Le sostanze chimiche volatili e insolubili non possono normalmente essere sottoposte a prova, se non dopo aver preso particolari precauzioni (cfr. appendice 5). Per calcolare i valori teorici e/o per controllare i valori dei parametri significativi, per esempio ThOD (domanda teorica di ossigeno), DOC e COD, è necessario conoscere la struttura chimica o la formula bruta. | 13. | Per una scelta mirata delle concentrazioni da sottoporre a prova e per interpretare correttamente dei valori di biodegradazione bassi, possono essere utili informazioni sulla tossicità della sostanza chimica in esame per i microrganismi (cfr. appendice 4). | SOGLIE MINIME | 14. | La biodegradabilità primaria dei tensioattivi è l’applicazione originaria della presente prova di simulazione (di conferma), e l’immissione sul mercato di un tensioattivo è subordinata all’eliminazione di più dell’80 % della sostanza specifica. Se il tasso dell’80 % non è raggiunto, si può applicare la prova di simulazione (di conferma) e il tensioattivo è immesso sul mercato solo se viene eliminato più del 90 % della sostanza chimica specifica. Per le sostanze chimiche in generale, il problema di ottenere un risultato positivo o negativo (pass/fail) non si pone e la percentuale di eliminazione ottenuta può servire per un calcolo approssimativo della probabile concentrazione nell’ambiente, da utilizzare nella valutazione dei rischi dovuti alle sostanze chimiche. I risultati tendono ad essere del tipo “tutto o niente”. La percentuale di eliminazione del DOC ottenuta in diversi studi su sostanze chimiche pure era superiore al 90 % in oltre tre quarti dei prodotti chimici che presentavano un grado di biodegradabilità significativo e superiore all’80 % nel novanta per cento degli stessi. | 15. | Un numero relativamente contenuto di sostanze chimiche (ad esempio tensioattivi) è presente nei liquami alle stesse concentrazioni utilizzate nel presente metodo di prova (circa 10 mg C/l). A simili concentrazioni alcune sostanze chimiche possono essere inibitrici, mentre la cinetica di eliminazione di altre sostanze può differire a basse concentrazioni. È possibile valutare la degradazione con più precisione ricorrendo a metodi modificati e scegliendo delle concentrazioni realisticamente basse della sostanza chimica in esame; i risultati ottenuti potrebbero servire a calcolare le costanti cinetiche. Tuttavia, le tecniche sperimentali necessarie non sono state ancora completamente convalidate, né sono stati definiti i modelli cinetici che descrivono le reazioni di biodegradazione (cfr. appendice 7). | SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO | 16. | A volte, per assicurare il corretto svolgimento della procedura sperimentale, è utile sottoporre a prova, parallelamente alle sostanze chimiche in esame, anche delle sostanze chimiche il cui comportamento è conosciuto, ad esempio: acido adipico, 2-fenilfenolo, 1-naftolo, acido difenico, 1-acido naftoico ecc. (9) (10) (11). | RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI DELLE PROVE | 17. | Il numero di relazioni sulle prove di simulazione è molto inferiore rispetto a quello delle relazioni sulle prove di biodegradabilità immediata. Per le sostanze chimiche in esame degradate all’80 % od oltre la riproducibilità tra le prove condotte simultaneamente è buona (dal 10 al 15 %), ma la variabilità aumenta per le sostanze meno efficacemente degradate. Inoltre, alcune sostanze limite hanno fornito risultati molto eterogenei (ad esempio 10 %, 90 %) a diverse riprese nel corso delle nove settimane della prova. | 18. | I risultati ottenuti con i due tipi di apparecchi non si differenziano di molto, ma alcune sostanze chimiche hanno subito una degradazione più estesa e costante con liquami domestici invece che con liquami artificiali ricostituiti secondo la formula OCSE. | DESCRIZIONE DEL METODO DI PROVA | Apparecchiatura | Sistema di prova | 19. | Il sistema di prova per una singola sostanza chimica comprende un’unità di prova e un’unità di controllo; se vengono svolte solo analisi specifiche (biodegradazione primaria) è sufficiente la sola unità di prova. Una sola unità di controllo può essere utilizzata per diverse unità di prova che ricevono le stesse o diverse sostanze chimiche sperimentali. In caso di abbinamento (appendice 3), a ciascuna unità di prova deve corrispondere un’unità di controllo. Il sistema di prova può consistere in un modello di impianto a fanghi attivi — unità di Husmann (appendice 1, figura 1) — o in un vaso poroso (appendice 1, figura 2). In entrambi i casi è necessario utilizzare serbatoi di capacità sufficiente a ricevere affluenti ed effluenti, insieme a pompe per il dosaggio degli affluenti, mischiati o non mischiati alla soluzione contenente la sostanza chimica in esame. | 20. | Ciascuna unità a fanghi attivi consiste in un recipiente di aerazione con una capacità nota di circa 3 litri di fanghi attivi e di un sedimentatore (chiarificatore secondario) contenente circa 1,5 litri; è possibile modificare parzialmente i volumi regolando l’altezza del sedimentatore. È consentito l’utilizzo di recipienti di dimensioni diverse, se sottoposti a carichi idraulici paragonabili. In caso non sia possibile mantenere la temperatura della sala prova nell’intervallo desiderato, si raccomanda l’uso di recipienti a camicia termostatica ad acqua. I fanghi attivi sono riciclati dal sedimentatore al recipiente di aerazione attraverso una pompa ad aria compressa o una pompa dosatrice, in continuo o a intervalli regolari. | 21. | Il sistema a vaso poroso consiste in un cilindro poroso a fondo conico, contenuto all’interno di un recipiente leggermente più grande, di forma identica ma in materia plastica impermeabile. Per il vaso poroso, un materiale adatto è il polietilene, spesso 2 mm e con pori di dimensione non superiore a 90 μm. La separazione dei fanghi e del mezzo organico trattato avviene mediante passaggio differenziale attraverso la parete porosa. Gli effluenti fluiscono nello spazio anulare dal quale traboccano nel recipiente di raccolta. Non avviene alcuna decantazione e di conseguenza non vi è ricircolo di fanghi. L’intero sistema può essere montato in un bagnomaria controllato termostaticamente. I vasi porosi si ostruiscono e rischiano di traboccare nelle fasi iniziali. Se ciò avviene, occorre sostituire il rivestimento poroso con un rivestimento pulito, cominciando per prima cosa a sifonare i fanghi dal vaso a un secchio pulito per poi rimuovere il rivestimento ostruito. Dopo aver asciugato il cilindro impermeabile esterno, occorre collocare un rivestimento pulito e rimettere i fanghi nel vaso. È anche necessario raschiare e trasferire con cura eventuali fanghi aderenti ai lati del rivestimento ostruito. La pulizia dei vasi ostruiti si effettua ricorrendo inizialmente a un leggero getto d’acqua per rimuovere i fanghi residui, in seguito mettendo a bagno i vasi prima in una soluzione diluita di ipoclorito di sodio poi in acqua, infine sciacquando accuratamente con acqua. | 22. | Occorre applicare tecniche appropriate all’aerazione dei fanghi nei recipienti di aerazione di entrambi i sistemi, utilizzando, ad esempio, aeratori oppure aria compressa. Se occorre, l’aria viene purificata (passando attraverso un filtro idoneo) e lavata. È necessario insufflare nel sistema una quantità d’aria sufficiente per mantenere le condizioni aerobiche e tenere perennemente in sospensione i fiocchi di fango nel corso della prova. | Apparecchio di filtrazione o centrifuga | 23. | I campioni vengono filtrati attraverso filtri a membrana di porosità idonea (diametro d’apertura nominale di 0,45 μm) che adsorbono le sostanze chimiche organiche solubili e rilasciano la minima quantità possibile di carbonio organico. Se i filtri utilizzati rilasciano carbonio organico, occorre lavarli accuratamente con acqua calda per rimuovere il carbonio organico lisciviato. In alternativa si può usare una centrifuga in grado di girare a 40 000 m/s2. | Apparecchiatura di analisi | 24. | Apparecchiatura richiesta per determinare: | — | DOC (carbonio organico disciolto) e TOC (carbonio organico totale) o COD (domanda chimica di ossigeno), | — | sostanze chimiche specifiche, se richiesto, | — | solidi sospesi, pH, concentrazione di ossigeno nell’acqua, | — | temperatura, acidità e alcalinità, | — | ammonio, nitriti e nitrati, se la prova è svolta in condizioni nitrificanti. | Acqua | 25. | Acqua di rubinetto, contenente meno di 3 mg/l di DOC. Determinare l’alcalinità se non già nota. | 26. | Acqua deionizzata, contenente meno di 2 mg/l di DOC. | Mezzo organico | 27. | Sono accettati, quali mezzo organico, i liquami artificiali, quelli domestici o una miscela di entrambi. È stato dimostrato (11) (14) che, spesso, l’uso di soli liquami domestici genera un maggior tasso di eliminazione del DOC e consente addirittura l’eliminazione e la biodegradazione di alcune sostanze chimiche che non sono invece biodegradate se si usano liquami artificiali ricostituiti secondo la formula OCSE. Inoltre, l’aggiunta costante o intermittente di liquami domestici spesso stabilizza i fanghi attivi e li rende capaci, crucialmente, di decantare in modo ottimale. Si raccomanda, quindi, l’uso di liquami domestici. Occorre misurare la concentrazione di DOC o COD in ciascun nuovo lotto di mezzo organico e determinarne l’acidità o alcalinità. Se il mezzo organico presenta una bassa acidità o alcalinità potrebbe essere necessario aggiungere un tampone idoneo (idrogenocarbonato di sodio o diidrogenofosfato di potassio), per mantenere un pH di circa 7,5 ± 0,5 nel recipiente di aerazione nel corso della prova. La quantità del tampone da aggiungere, e quando aggiungerla, vanno decise caso per caso. Quando le miscele vengono utilizzate in continuo o a intermittenza, occorre mantenere il DOC (o la COD) della miscela stessa a un valore pressoché costante, ad esempio diluendola con acqua. | Liquami artificiali | 28. | Sciogliere per ogni litro di acqua di rubinetto i seguenti composti: 160 mg di peptone; 110 mg di estratto di carne; 30 mg di urea; 28 mg di idrogenofosfato di potassio (K2HPO4); 7 mg di cloruro di sodio (NaCl); 4 mg di cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2H2O); 2 mg di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7H20); questi liquami artificiali ricostituiti secondo la formula OCSE rappresentano un esempio dove la concentrazione media di DOC negli affluenti è di circa 100 mg/l. In alternativa, utilizzare altre composizioni, con la stessa concentrazione di DOC, più prossime ai liquami reali. Se occorrono affluenti meno concentrati, diluire i liquami artificiali con acqua di rubinetto, ad esempio 1:1, per ottenere una concentrazione di circa 50 mg/l. Gli affluenti meno concentrati consentono una migliore crescita di organismi nitrificanti: occorrerà ricorrere a una concentrazione inferiore se è necessario svolgere uno studio sulla simulazione di impianti di depurazione delle acque reflue dove sia presente nitrificazione. Questi liquami artificiali, a base di acqua distillata, possono essere preparati in forma concentrata e conservati a circa 1 °C per una settimana al massimo. Se occorre, diluire con acqua di rubinetto. (Questo mezzo non è del tutto soddisfacente perché, in particolare, la concentrazione di azoto è molto elevata e il tenore di carbonio è relativamente basso, ma non è stata suggerita un’alternativa migliore, se non attraverso l’aggiunta di un tampone fosfato e di peptone). | Liquami domestici | 29. | Utilizzare liquami freschi decantati raccolti giornalmente in un impianto di trattamento delle acque reflue che riceve principalmente liquami domestici. Occorre prelevare i liquami prima che avvenga la sedimentazione primaria, dallo stramazzo della vasca di sedimentazione primaria oppure dall’alimentazione dell’impianto a fanghi attivi; i liquami devono essere il più possibile privi delle particelle più grosse. È possibile utilizzarli dopo averli stoccati anche per diversi giorni (in generale, però, non più di sette) a 4 °C, se è provato che il DOC (o la COD) non sono diminuiti in modo significativo (vale a dire di più del 20 %) in fase di stoccaggio. Al fine di limitare eventuali perturbazioni al sistema, occorre correggere il DOC (o la COD) di ogni nuovo lotto per ottenere un valore adeguato costante prima dell’uso, ad esempio diluendolo con acqua. | Fanghi attivi | 30. | Raccogliere un campione di fanghi attivi per l’inoculazione dal serbatoio di aerazione di un impianto di trattamento o da una unità pilota di laboratorio per il trattamento delle acque di scarico che tratti prevalentemente acque di origine domestica. | Soluzioni madre della sostanza in esame | 31. | Per le sostanze che presentano una solubilità adeguata, preparare delle soluzioni madre a concentrazioni idonee (es.: da 1 a 5 g/l) in acqua deionizzata o nella frazione minerale dei liquami artificiali (per le sostanze insolubili o volatili, cfr. appendice 5). Determinare il DOC e il carbonio organico totale (TOC) della soluzione madre e ripetere le misure per ciascun nuovo lotto. Se la differenza tra il DOC e il TOC supera il 20 %, verificare l’idrosolubilità della sostanza chimica in esame. Confrontare il DOC o la concentrazione della sostanza in esame, misurata attraverso un’analisi specifica della soluzione madre, con il valore nominale, per assicurarsi che il tasso di recupero sia sufficiente (solitamente deve superare il 90 %). Verificare, in particolare per le dispersioni, se il DOC può essere utilizzato come parametro analitico o se invece si possa applicare solo una tecnica d’analisi specifica per la sostanza in esame. Le dispersioni impongono il ricorso alla centrifuga dei campioni. Per ciascun nuovo lotto, misurare DOC, COD o la sostanza in esame attraverso un’analisi specifica. | 32. | Determinare il pH della soluzione madre. I valori estremi indicano che l’aggiunta della sostanza chimica può influenzare il pH dei fanghi attivi nel sistema di prova. In tal caso, neutralizzare la soluzione madre per ottenere un pH di 7 ± 0,5 ricorrendo a piccole quantità di acido o di base inorganici, evitando però la precipitazione della sostanza in esame. | PROCEDURA | 33. | La procedura descritta si applica alle unità a fanghi attivi; è necessario modificarla leggermente per il sistema a vaso poroso. | Preparazione dell’inoculo | 34. | Per cominciare, inoculare il sistema sottoposto a prova con fanghi attivi o con un inoculo contenente una bassa concentrazione di microrganismi. Conservare l’inoculo in luogo aerato a temperatura ambiente ed utilizzarlo entro le 24 ore. Nel primo caso, raccogliere un campione di fanghi attivi dalla vasca di aerazione di un impianto di trattamento biologico delle acque reflue che funzioni efficientemente o da un’unità pilota sperimentale che riceva prevalentemente liquami domestici. Se è necessario simulare condizioni nitrificanti, raccogliere i fanghi attivi da un impianto di trattamento delle acque reflue in presenza di nitrificazione. Determinare la concentrazione di solidi in sospensione e, se necessario, concentrare i fanghi per sedimentazione in modo che il volume aggiunto al sistema sia minimo. Verificare che la concentrazione di partenza di materia secca sia intorno a 2,5 g/l. | 35. | Nel secondo caso, utilizzare come inoculo da 2 ml/l a 10 ml/l di effluenti provenienti da un impianto di trattamento biologico dei liquami domestici. Per ottenere il maggior numero possibile di specie o ceppi differenti di batteri può essere utile mescolare degli inoculi provenienti da varie fonti, ad esempio acque di superficie. In tal caso, i fanghi attivi si formeranno e svilupperanno nel sistema di prova. | Dosaggio del mezzo organico | 36. | Pulire accuratamente, all’inizio e durante la prova, tutti i recipienti destinati ad affluenti ed effluenti e i tubi che li collegano, per eliminare la proliferazione microbica. Riunire i sistemi di prova in un ambiente a temperatura controllata (normalmente tra i 20 e i 25 °C) oppure utilizzare unità di prova a camicia termostatica ad acqua. Preparare un volume sufficiente del mezzo organico richiesto (cfr. paragrafi da 27 a 29). Cominciare a riempire il recipiente di aerazione e il sedimentatore con il mezzo organico e aggiungere l’inoculo (paragrafi 34, 35). Mettere in azione il dispositivo di aerazione in modo che i fanghi siano mantenuti in sospensione e in condizioni aerobiche, cominciando a dosare gli affluenti e a riciclare i fanghi sedimentati. Dosare il mezzo organico dai recipienti di stoccaggio trasferendolo nei recipienti di aerazione (paragrafi 20, 21) delle unità di prova e di controllo e raccogliere i rispettivi effluenti in recipienti di stoccaggio simili. Per ottenere il normale tempo di ritenzione idraulica di 6 h, occorre pompare il mezzo organico a 0,5 l/h. Per confermare questa velocità di flusso, misurare la quantità quotidiana di mezzo organico dosato registrando la riduzione dei volumi del mezzo nei recipienti di stoccaggio. È necessario ricorrere ad altre modalità di dosaggio per determinare gli effetti dello scarico intermittente di una sostanza chimica oppure dell’aggiunta di “dosi shock”. | 37. | Se il mezzo organico viene preparato in vista di un’utilizzazione la cui durata supera le 24 ore, è possibile refrigerarlo a circa 4 °C o conservarlo utilizzando un metodo adeguato, in modo da prevenire la crescita microbica e la biodegradazione al di fuori delle unità di prova (paragrafo 29). Se si utilizzano i liquami artificiali, è possibile preparare e stoccare a circa 4 °C una soluzione madre concentrata (es.: dieci volte superiore a quella normale, cfr. paragrafo 28). La soluzione madre può essere mischiata con il volume adeguato di acqua di rubinetto prima dell’uso; oppure, può essere pompata direttamente, mentre il volume adeguato di acqua di rubinetto viene pompato separatamente. | Dosaggio della sostanza chimica in esame | 38. | Aggiungere un volume adeguato della soluzione madre della sostanza chimica (paragrafo 31) al recipiente di stoccaggio degli affluenti, oppure dosarla direttamente nel recipiente di aerazione, ricorrendo a un’altra pompa. La concentrazione di prova media normale negli affluenti dovrebbe situarsi tra 10 mg/l e 20 mg/l di DOC, e la concentrazione massima è di 50 mg/l. Se l’idrosolubilità della sostanza in esame è bassa, o se è possibile che si producano effetti tossici, occorre ridurre la concentrazione a 5 mg/l di DOC o addirittura meno, ma solo se è possibile applicare un metodo di analisi specifico (le sostanze di prova disperse e scarsamente solubili in acqua possono essere aggiunte attraverso tecniche di dosaggio speciali, cfr. appendice 5). | 39. | Quando il sistema è stabilizzato ed elimina il DOC dal mezzo organico in modo efficiente (all’80 % circa), cominciare ad aggiungere la sostanza. È importante verificare che tutte le unità operino allo stesso grado di efficienza prima di aggiungere la sostanza in esame; se così non fosse, spesso è utile mischiare i singoli fanghi e ridistribuirli in quantità uguali alle diverse unità. Se si utilizza un inoculo di circa 2,5 g/l (peso secco) di fanghi attivi, la sostanza chimica in esame può essere aggiunta sin dall’inizio della prova, in quando aggiungere direttamente e fin dall’inizio dei quantitativi crescenti presenta il vantaggio di rendere i fanghi attivi più adattabili alla sostanza in esame. A prescindere dal modo in cui viene aggiunta la sostanza in esame, si raccomanda di misurare ad intervalli regolari la velocità di flusso e/o i volumi nel o nei recipienti di stoccaggio. | Manipolazione dei fanghi attivi | 40. | Indipendentemente dall’inoculo utilizzato, di norma la concentrazione dei solidi nei fanghi attivi si stabilizza nel corso della prova tra 1 e 3 g/l (peso secco), a seconda della qualità e della concentrazione del mezzo organico, delle condizioni di funzionamento, della natura dei microrganismi presenti e dell’influenza della sostanza in esame. | 41. | Determinare i solidi in sospensione nel recipiente di aerazione almeno una volta la settimana, eliminando il surplus di fanghi per mantenere la concentrazione da 1 g/l a 3 g/l (peso secco), oppure controllare che l’età media dei fanghi si mantenga a un valore costante tra i 6 e i 10 giorni. Ad esempio, se viene scelto un tempo di ritenzione medio dei fanghi di 8 giorni, occorre rimuovere giornalmente 1/8 del volume di fanghi attivi dal recipiente di aerazione ed eliminarlo. Questa operazione va effettuata quotidianamente o, preferibilmente, attraverso una pompa automatica intermittente. Il mantenimento della concentrazione dei solidi in sospensione a un valore costante, o entro limiti ristretti, non rende però costante il tempo di ritenzione dei fanghi, e cioè la variabile che permette di determinare la concentrazione della sostanza in esame negli effluenti. | 42. | Per tutta la durata della prova, rimuovere, almeno una volta al giorno, eventuali fanghi che aderiscono alle pareti del recipiente di aerazione e al sedimentatore e rimetterli in sospensione. Controllare e pulire regolarmente tutti i tubi e le tubature per evitare la crescita di biofilm. Riciclare i fanghi sedimentati, rinviandoli dal sedimentatore al recipiente di aerazione, preferibilmente attraverso una pompa a intermittenza. Il sistema a vasi porosi non comporta alcun riciclo, ma occorre fare attenzione e inserire vasi interni puliti prima che il volume all’interno del recipiente raggiunga un livello troppo alto (paragrafo 21). | 43. | Nelle unità di Husmann si possono verificare cattiva sedimentazione e perdita di fanghi. È possibile rimediarvi effettuando in parallelo, nelle unità di prova e di controllo, una o più delle operazioni elencate di seguito: | — | aggiungendo a intervalli regolari, ad esempio settimanalmente, dei fanghi freschi o un flocculante (es.: 2 ml per recipiente di una soluzione di FeCl3 a 50 g/l), facendo attenzione a che il FeCl3 non reagisca con la sostanza chimica in esame e non la faccia precipitare, | — | sostituendo la pompa ad aria compressa con una pompa peristaltica, al fine di creare un flusso di ricircolo dei fanghi pressappoco uguale al flusso degli affluenti in entrata da utilizzare e consentire lo sviluppo di una zona anaerobica nei fanghi sedimentati (la geometria della pompa ad aria compressa limita il flusso minimo di ritorno dei fanghi a circa dodici volte quello degli affluenti da trattare), | — | pompando i fanghi in modo intermittente dal sedimentatore verso il recipiente di aerazione (es.: per 5 minuti ogni 2,5 h per riciclare da 1 l/h a 1,5 l/h), | — | utilizzando un agente antischiuma atossico a concentrazione minima, che prevenga perdite dovute alla formazione di schiuma (es.: olio di silicone), | — | insufflando aria nei fanghi del sedimentatore, in soffi brevi e intensi (es.: 10 secondi ogni ora), | — | dosando il mezzo organico a intervalli regolari nel recipiente di aerazione (es.: dai 3 ai 10 minuti l’ora). | Campionamento e analisi | 44. | A intervalli regolari, misurare la concentrazione dell’ossigeno disciolto, la temperatura e il pH dei fanghi attivi nei recipienti di aerazione. Assicurarsi che sia sempre disponibile sufficiente ossigeno (> 2 mg/l) e che la temperatura si situi nell’intervallo richiesto (normalmente tra i 20 e i 25 °C). Mantenere il pH a 7,5 ± 0,5 dosando piccole quantità di una base o di un acido inorganici nel recipiente d’aerazione o negli affluenti, oppure aumentando la capacità tampone del mezzo organico (cfr. paragrafo 27). Se si verifica nitrificazione viene prodotto acido: l’ossidazione di 1 mg di azoto produce l’equivalente di circa 7 mg di CO3 –. La frequenza delle misurazioni dipende dal parametro da misurare e dalla stabilità del sistema e può variare in funzione della cadenza giornaliera o settimanale. | 45. | Occorre misurare il DOC o la COD negli affluenti dei recipienti di controllo e di prova. La concentrazione della sostanza in esame negli affluenti di prova va determinata attraverso analisi specifiche od occorre stimarla a partire dalla concentrazione nella soluzione madre (paragrafo 31), dal volume utilizzato e dalla quantità di liquami dosati nell’unità di prova. Si raccomanda di calcolare la concentrazione della sostanza in esame in modo da ridurre la variabilità dei dati sulla concentrazione. | 46. | Prelevare dei campioni adatti dagli effluenti raccolti (es. campioni compositi sulle 24 h) e filtrarli attraverso una membrana con pori di 0,45 μm oppure centrifugarli a circa 40 000 m/s2 per circa 15 min. Ricorrere alla centrifugazione se il filtraggio risulta difficile. Determinare il DOC o la COD almeno due volte, in modo da misurare la biodegradazione completa e, se richiesto, quella primaria, attraverso un’analisi specifica per la sostanza in esame. | 47. | L’utilizzo della COD può far sorgere problemi analitici a basse concentrazioni ed è raccomandato solo se la concentrazione di prova è sufficientemente alta (circa 30 mg/l). Inoltre, in caso di sostanze chimiche fortemente adsorbenti, si raccomanda di misurare la quantità di sostanza chimica adsorbita nei fanghi attraverso una tecnica di analisi specifica per la sostanza in esame. | 48. | La frequenza di campionamento dipende dalla durata prevista della prova. Si raccomandano tre campionamenti la settimana. Quando le unità iniziano a funzionare efficacemente, occorre lasciar trascorrere un periodo di adattamento da una a sei settimane a partire dall’introduzione della sostanza in esame, in modo da consentire il raggiungimento di uno stato stazionario. Per valutare i risultati della prova è necessario ottenere, preferibilmente, un minimo di 15 valori validi nel corso della fase di plateau (paragrafo 59), che dura normalmente tre settimane. È possibile interrompere la prova una volta raggiunto un grado di eliminazione sufficiente (es. > 90 %) e se si hanno a disposizione i 15 valori sopracitati a seguito di analisi svolte quotidianamente (giorni feriali) per tre settimane. La prova non deve generalmente estendersi al di là delle 12 settimane a partire dalla prima aggiunta della sostanza in esame. | 49. | Se i fanghi subiscono un processo di nitrificazione ed occorre studiare gli effetti della sostanza in esame su tale processo, è opportuno analizzare campioni degli effluenti delle unità di prova e di controllo almeno una volta la settimana per rilevare ammonio e/o nitriti e nitrati. | 50. | Le analisi vanno svolte il più rapidamente possibile, in particolare quelle che riguardano l’azoto. In caso fosse necessario rimandare le analisi, conservare i campioni a circa 4 °C al buio, in bottiglie piene ed ermeticamente chiuse. Se è necessario stoccare i campioni per più di 48 h, la conservazione può avvenire tramite congelazione, acidificazione (es. 10 ml/l di un soluzione di acido solforico a 400 g/l) o aggiunta di una sostanza tossica idonea [es. 20 ml/l di una soluzione di cloruro di mercurio (II) a 10 g/l]. Assicurarsi che la tecnica di conservazione non incida sui risultati dell’analisi. | Abbinamento delle unità di prova | 51. | Se è necessario abbinare le unità (appendice 3), occorre scambiare quotidianamente la stessa quantità di fanghi attivi (da 150 ml a 1 500 ml per i recipienti di aerazione contenenti tre litri di liquido) tra i recipienti di aerazione dell’unità di prova e dell’unità di controllo. Se la sostanza in esame si adsorbe fortemente sui fanghi, cambiare solo il surnatante dei sedimentatori. In entrambi i casi, introdurre un fattore di correzione per calcolare i risultati della prova (paragrafo 55). | DATI E RELAZIONE | Trattamento dei risultati | 52. | Per ogni valutazione programmata, calcolare la percentuale di eliminazione della sostanza in esame in termini di DOC o di COD ricorrendo alla seguente equazione: | dove: | Dt | = | percentuale di eliminazione del DOC o della COD al tempo t | Cs | = | valori del DOC o della COD negli affluenti, dovuti alla sostanza chimica in esame, preferibilmente stimati a partire dalla soluzione madre (mg/l) | E | = | valori del DOC o della COD misurati negli effluenti di prova al tempo t (mg/l) | Eo | = | valori del DOC o della COD misurati negli effluenti di controllo al tempo t (mg/l) | 53. | Il grado di eliminazione del DOC o della COD dal mezzo organico dell’unità di controllo è utile per valutare l’attività di biodegradazione dei fanghi attivi nel corso della prova. Calcolare la percentuale di eliminazione ricorrendo alla seguente equazione: | dove: | DB | = | percentuale di eliminazione del DOC o della COD dal mezzo organico dell’unità di controllo al tempo t | CM | = | DOC o COD del mezzo organico negli affluenti di controllo (mg/l) | Calcolare, in via facoltativa, la percentuale di eliminazione del DOC o della COD generati dal mezzo organico e dalla sostanza in esame nell’unità di prova, ricorrendo alla seguente equazione: | dove: | DT | = | percentuale di eliminazione del DOC o della COD nella totalità degli affluenti di prova | CT | = | DOC o COD della totalità degli affluenti di prova o calcolati a partire dalle soluzioni madri (mg/l) | 54. | Per ogni rilevazione calcolare l’eliminazione della sostanza in esame, se è stata misurata con un metodo di analisi specifico, ricorrendo alla seguente equazione: | dove: | DST | = | percentuale di eliminazione primaria della sostanza chimica in esame al tempo t | Si | = | concentrazione misurata o stimata della sostanza chimica in esame negli affluenti di prova (mg/l) | Se | = | concentrazione misurata della sostanza chimica in esame negli effluenti di prova al tempo t (mg/l) | 55. | In modalità abbinata, compensare la diluizione della sostanza in esame nel recipiente di aerazione dovuta allo scambio di fanghi utilizzando un fattore di correzione (cfr. appendice 3). Se è stato applicato un tempo medio di ritenzione idraulica pari a 6 h ed è stata scambiata la metà del volume dei fanghi attivi contenuti nel recipiente di aerazione, occorre correggere i valori determinati dell’eliminazione quotidiana (Dt, paragrafo 52) in modo da ottenere il grado reale di eliminazione, Dtc, della sostanza in esame, a partire dalla seguente equazione: | Espressione dei risultati della prova | 56. | Tracciare su un grafico le curve dell’eliminazione Dt (o Dtc) e Dst, se disponibile, in funzione del tempo (cfr. appendice 2). È possibile trarre alcune conclusioni sul processo di eliminazione della sostanza in esame (per se o attraverso il DOC) a partire dall’andamento della curva. | Adsorbimento | 57. | Se già dall’inizio della prova si osserva una forte eliminazione della sostanza in esame in termini di DOC, la sostanza è stata probabilmente eliminata per adsorbimento sui solidi dei fanghi attivi. È possibile provare il fenomeno misurando l’adsorbimento della sostanza in esame mediante un’analisi specifica. È raro che l’eliminazione del DOC delle sostanze adsorbibili si mantenga elevata nel corso di tutta la prova; normalmente, il grado di eliminazione è elevato all’inizio per poi declinare progressivamente fino a raggiungere un valore di equilibrio. Tuttavia, se la sostanza chimica adsorbibile in esame fosse tale da causare, in un modo o nell’altro, un’acclimatazione della popolazione microbica, l’eliminazione del DOC della sostanza chimica aumenterebbe fino a raggiungere un elevato valore di plateau. | Fase di latenza | 58. | Molte delle sostanze chimiche in esame, analogamente a quanto avviene nelle prove di screening statiche, attraversano una fase di latenza prima che avvenga una biodegradazione a pieno regime. Nel corso della fase di latenza, l’acclimatazione o l’adattamento dei batteri degradanti avviene senza che si produca, o quasi, l’eliminazione della sostanza in esame; in seguito, inizia la proliferazione dei batteri. Al termine di questa fase, quando circa il 10 per cento della quantità iniziale della sostanza in esame viene eliminata (compreso anche per adsorbimento, se del caso) si suppone che inizi la fase di degradazione. Il tempo di latenza è spesso notevolmente variabile e scarsamente riproducibile. | Fase di plateau | 59. | La fase di plateau di una curva di eliminazione in un test in continuo è definita come la fase nella quale si raggiunge il massimo livello di degradazione. La fase di plateau dovrebbe protrarsi per almeno 3 settimane ed essere determinata attraverso la misurazione di 15 valori validi. | Grado medio di eliminazione della sostanza chimica in esame | 60. | Calcolare il valore medio a partire dai valori di eliminazione (Dt) della sostanza in esame durante la fase di plateau. Arrotondata all’unità più vicina (1 %), tale media rappresenta il grado di eliminazione della sostanza in esame. Si raccomanda inoltre di calcolare l’intervallo di confidenza (95 %) del valore medio. | Eliminazione del mezzo organico | 61. | Tracciare su un grafico la percentuale di eliminazione del DOC o della COD dal mezzo organico dell’unità di controllo (DB) in funzione del tempo. Indicare il grado medio di eliminazione come per la sostanza in esame (paragrafo 60). | Indicazione della biodegradazione | 62. | Se la sostanza in esame non viene adsorbita in modo significativo sui fanghi attivi e se la curva di eliminazione presenta il profilo tipico di una curva di biodegradazione con fasi di latenza, degradazione e plateau (cfr. paragrafi 58 e 59), l’eliminazione misurata può essere attribuita con certezza alla biodegradazione. Se il livello di eliminazione è alto in fase iniziale, la prova di simulazione non consente di distinguere tra i processi di eliminazione biologici e non biologici. In questi casi, come nei casi in cui la biodegradazione suscita dubbi (ad esempio, quando si osserva un fenomeno di stripping), occorre analizzare le sostanze in esame adsorbite oppure effettuare prove di biodegradazione statiche supplementari basate su parametri che indicano chiaramente i processi biologici. Si tratta di prove che si basano sul consumo di ossigeno [capitolo C.4, lettere D, E e F del presente allegato (6)] o sulla misurazione della produzione di diossido di carbonio [capitolo C.4-C del presente allegato (6)] oppure sul metodo ISO per la prova del CO2 nello spazio di testa (18) che utilizza un inoculo pre-esposto proveniente dal test di simulazione. Se sono state misurate sia l’eliminazione del DOC sia l’eliminazione della sostanza chimica specifica, la presenza di differenze significative (essendo la prima inferiore alla seconda) tra le percentuali indica che gli effluenti contengono dei prodotti organici intermedi probabilmente più difficili da degradare rispetto al composto progenitore. | Validità dei risultati della prova | 63. | L’ottenimento di informazioni sulla normale attività di biodegradazione dell’inoculo è subordinata alla determinazione del grado di eliminazione del mezzo organico (paragrafo 53) nell’unità di controllo. Il test è da considerare valido se il grado di eliminazione del DOC e della COD nella o nelle unità di controllo è superiore all’80 % dopo due settimane e se non si osserva alcun fenomeno insolito. | 64. | Se è stata utilizzata una sostanza chimica di riferimento prontamente biodegradabile, il grado di biodegradazione (Dt, paragrafo 52) deve essere superiore al 90 %. | 65. | Se la prova viene svolta in condizioni nitrificanti, la concentrazione media negli effluenti deve essere < 1 mg/l di azoto ammoniacale e < 2 mg/l di azoto sotto forma di nitriti. | 66. | Se non vengono soddisfatti questi criteri, ripetere la prova utilizzando un inoculo proveniente da una fonte diversa, sottoporre a prova una sostanza di riferimento e riesaminare tutte le procedure sperimentali. | Relazione sulla prova | 67. | La relazione deve includere le seguenti informazioni: | | Sostanza chimica in esame: | — | dati identificativi, | — | natura fisica e proprietà fisico-chimiche. | | Condizioni sperimentali: | — | descrizione del sistema di prova utilizzato; qualsiasi modifica introdotta nella prova per testare le sostanze chimiche insolubili o volatili, | — | tipo di mezzo organico, | — | proporzione e natura degli effluenti industriali presenti nelle acque di scarico, se note, | — | inoculo: natura e località del campionamento, concentrazione ed eventuale pretrattamento, | — | soluzioni madre della sostanza chimica in esame: tenore di DOC e di TOC; modalità di preparazione, se si tratta di una sospensione; concentrazione utilizzata per la prova; giustificare, eventualmente, valori che si discostano dall’intervallo 10-20 mg/l di DOC; modalità di aggiunta; data della prima aggiunta; eventuali modifiche, | — | età media dei fanghi attivi e tempo medio di ritenzione idraulica; metodo di rimozione dei fanghi attivi esausti; metodi per affrontare il rigonfiamento (bulking), la perdita di fanghi attivi ecc., | — | tecniche di analisi utilizzate, | — | temperatura di prova, | — | qualità del rigonfiamento dei fanghi; indice di volume dei fanghi (SVI, sludge volume index); solidi sospesi nella miscela liquida (MLSS, mixed liquor suspended solids), | — | ogni eventuale scarto dalla normale modalità operativa e ogni eventuale circostanza suscettibile di aver inciso sui risultati. | | Risultati della prova: | — | tutti i dati derivanti dalle misurazioni (DOC, COD, analisi specifiche, pH, temperatura, concentrazione di ossigeno, solidi sospesi, sostanze azotate, se del caso), | — | tutti i valori calcolati per Dt (o Dtc) DB e DSt, presentati sotto forma di tabella e di curve di eliminazione, | — | informazioni sulle fasi di latenza e di plateau, la durata della prova, il grado di eliminazione della sostanza in esame e del mezzo organico nell’unità di controllo, insieme alle informazioni statistiche e conclusioni sulla biodegradabilità e sulla validità della prova, | — | discussione dei risultati. | BIBLIOGRAFIA | (1) | Swisher RD (1987). «Surfactant Biodegradation», 2nd Edn. Marcel Dekker Inc. New York, 1085 pp. | (2) | German Government (1962). Ordinance of the degradability of detergents in washing and cleaning agents. Bundesgesetzblatt, Pt.1 No.49: 698-706. | (3) | Painter HA and King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, UK. | (4) | Painter HA and King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915. | (5) | Eckenfelder, W.W (19) US EPA. | (6) | Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della “pronta” (ready) biodegradabilità. | (7) | Capitolo C.12 del presente allegato, Biodegradazione — saggio SCAS modificato. | (8) | Capitolo C.19 del presente allegato, Stima del coefficiente di adsorbimento (K OC ) sul terreno e sui fanghi di acque da scarico mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). | (9) | Gerike P and Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3:157-173. | (10) | Gerike P and Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55. | (11) | Painter HA and Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. pp 113-138, In: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. | (12) | ISO 11733 (1995; revised 2004). Evaluation of the elimination and biodegradability of organic substances in an aqueous medium - activated sludge simulation test. | (13) | Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48. | (14) | Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340-343. | (15) | Gerike P, Fischer WK and Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758. | (16) | Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. | (17) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. pagg. 91-98 ISBN 011 751661 9. | (18) | ISO 14593 (1998). Water Quality — Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels. | Appendice 1 | Figura 1 | Attrezzatura per valutare la biodegradabilità | Unità di Husmann | A. | recipiente di stoccaggio | B. | pompa dosatrice | C. | recipiente di aerazione (capacità 3 litri) | D. | decantatore | E. | pompa ad aria compressa | F. | recipiente di raccolta | G. | aeratore | H. | flussimetro | Figura 2 | Attrezzatura per valutare la biodegradabilità | Vaso poroso | A. | recipiente di stoccaggio | B. | pompa dosatrice | C. | recipiente poroso di aerazione | D. | recipiente esterno impermeabile | E. | recipiente di raccolta | F. | diffusore | G. | flussimetro | Figura 3 | Dettagli del recipiente di aerazione a vaso poroso da 3 litri | Appendice 2 | Esempio di curva di eliminazione | Appendice 3 | [INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI] | ABBINAMENTO DELLE UNITÀ DI PROVA | Nel tentativo di livellare le popolazioni microbiche nei fanghi attivi dell’unità di prova (dove confluiscono i liquami più la sostanza in esame) e dell’unità di controllo (dove confluiscono solo i liquami) è stato introdotto uno scambio giornaliero di fanghi tra le due unità (1). La procedura, detta “abbinamento”, ha dato origine al “processo ad unità abbinate”. L’abbinamento, inizialmente realizzato su unità di Husmann a fanghi attivi, è stato applicato anche a unità a vasi porosi (2) (3). I risultati ottenuti con unità abbinate e con unità non abbinate, sia nel caso di unità di Husmann sia in quello di unità a vasi porosi, non presentano differenze significative e non c’è quindi alcun vantaggio ad investire tempo ed energia nell’abbinamento. | Lo scambio dei fanghi può far credere che avvenga un’eliminazione piuttosto importante, dato che una parte della sostanza chimica in esame viene trasferita e che lo scarto tra la concentrazione di tale sostanza negli effluenti di prova e negli effluenti di controllo diviene pressoché nullo. È quindi necessario applicare dei fattori di correzione che dipendono dalla frazione oggetto dello scambio e dal tempo medio di ritenzione idraulica. È stato pubblicato un metodo di calcolo più dettagliato (1). | Calcolare il grado d’eliminazione corretto del DOC o della COD utilizzando la formula generale: | dove: | Dtc | = | percentuale di eliminazione, corretta, del DOC o della COD | Dt | = | percentuale di eliminazione, determinata, del DOC o della COD | a | = | frazione volumetrica scambiata tra le unità a fanghi attivi | r | = | tempo medio di ritenzione idraulica (h) | Se, per esempio, viene scambiata la metà del volume del recipiente di aerazione (a = 0,5) e il tempo medio di ritenzione idraulica è di 6 h, la formula di correzione diventa: | BIBLIOGRAFIA | (1) | Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135. | (2) | Painter HA, Bealing DJ (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test. pagg. 113-138. In: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G. | (3) | Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, UK. | Appendice 4 | VALUTAZIONE DELL’INIBIZIONE DEI FANGHI ATTIVI | Processo a mezzo delle sostanze chimiche in esame | 1. | Può succedere che una sostanza chimica (o dei liquami) non vengano né degradati né eliminati nella prova di simulazione e che possano addirittura avere un effetto inibitorio sui microrganismi dei fanghi. Alcune sostanze chimiche vengono biodegradate a basse concentrazioni ma svolgono un’azione inibitoria a concentrazioni superiori (ormesi). Gli effetti inibitori possono essere rivelati a uno stadio precedente oppure essere determinati attraverso una prova di tossicità, utilizzando un inoculo simile o identico a quello usato nella prova di simulazione (1). Si tratta di metodi di prova inibitori del consumo di ossigeno [capitolo C.11 del presente allegato (2) e norma ISO 8192 (3)] oppure inibitori della crescita degli organismi dei fanghi attivi [norma ISO 15522 (4)] | 2. | L’inibizione che avviene nel corso della prova di simulazione si manifesta attraverso la differenza del DOC e della COD degli effluenti del recipiente di prova e di quelli del recipiente di controllo, che è superiore al DOC aggiunto attraverso la sostanza chimica in esame. Altrimenti espresso, la presenza della sostanza chimica in esame riduce la percentuale di eliminazione della COD (nonché del BOD e della COD, e/o di NH+ 4) del mezzo organico trattato. Se ciò avviene, occorrerà ricominciare la prova riportando la concentrazione della sostanza in esame a un livello al quale non abbia effetti inibitori ed eventualmente anche diminuendone ulteriormente la concentrazione fino a un valore che la renda biodegradata. Tuttavia, se la sostanza in esame (o i liquami) alterano il processo a tutte le concentrazioni testate, si tratta verosimilmente di una sostanza difficile, se non impossibile, da trattare biologicamente, ma potrebbe valere la pena di ripetere la prova con fanghi attivi provenienti da una fonte diversa e/o sottoporli a un’acclimatazione più progressiva. | 3. | Al contrario, se nella simulazione di prova la sostanza in esame viene eliminata biologicamente al primo tentativo, la sua concentrazione va aumentata nel caso in cui si cerchi di stabilire se tale sostanza possa svolgere azione inibitoria. | 4. | Quando si tenta di determinare il grado di inibizione, occorre ricordare che la popolazione dei fanghi attivi può evolvere e questo fa sì che, nel tempo, i microrganismi possano sviluppare una tolleranza nei confronti della sostanza chimica inibitrice. | 5. | Calcolo del grado di inibizione: | È possibile calcolare le percentuali globali di eliminazione, Ro, di BOD, DOC, COD ecc. nelle unità di prova e di controllo utilizzando la seguente formula: | dove: | I | = | concentrazione di BOD, DOC, COD ecc. negli affluenti dei recipienti di prova o di controllo (mg/l) | E | = | concentrazioni rispettive negli effluenti (mg/l) | I ed E devono essere corrette per tenere conto del DOC proveniente dalla sostanza in esame nelle unità di prova, altrimenti la percentuale di inibizione risulterà imprecisa. | Il grado di inibizione prodotto dalla presenza della sostanza in esame può essere calcolato secondo la formula seguente: | dove: | Rc | = | percentuale di eliminazione nei recipienti di controllo | Rt | = | percentuale di eliminazione dei recipienit di prova | BIBLIOGRAFIA | (1) | Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259. | (2) | Capitolo C.11 del presente allegato, Biodegradazione — Fanghi attivi: saggio di inibizione della respirazione. | (3) | ISO 8192 (2007) Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation. | (4) | ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms. | Appendice 5 | Sostanze chimiche in esame scarsamente solubili in acqua — sostanze volatili | Sostanze chimiche scarsamente solubili in acqua | Sono stati pubblicati apparentemente pochi studi incentrati su prove di simulazione del trattamento delle acque reflue condotte su sostanze chimiche scarsamente solubili in acqua e insolubili (1) (2) (3). | Non esiste un metodo universale di dispersione di una sostanza chimica applicabile a tutte le sostanze chimiche insolubili. Dei quattro tipi di metodi descritti nella norma ISO 10634 (4), i due che sembrerebbero essere adatti alla dispersione delle sostanze destinate a una prova di simulazione fanno ricorso ad agenti emulsionanti e/o energia ultrasonica. È opportuno determinare la stabilità della dispersione ottenuta su un periodo di almeno 24 ore. Le dispersioni convenientemente stabilizzate, contenute in recipienti costantemente sottoposti ad agitazione (paragrafo 38), sono in seguito introdotte nei recipienti di aerazione, separatamente dai liquami domestici (o artificiali). | Se le dispersioni sono stabili, è necessario esaminare in che modo è possibile determinare la sostanza in esame nella sua forma dispersa. È improbabile che il DOC sia stato determinato in maniera adeguata, e va quindi messo a punto un metodo analitico specifico per la sostanza in esame da applicare agli effluenti, ai solidi degli effluenti e ai fanghi attivi. Il destino della sostanza chimica in esame nella simulazione del trattamento a fanghi attivi sarà in tal caso determinato nelle fasi solide e liquide. È quindi necessario calcolare un “bilancio di massa” per stabilire se la sostanza in esame è stata biodegradata. Tale bilancio, tuttavia, segnala solo la biodegradazione primaria. Sarà necessario dimostrare la biodegradazione completa attraverso un test respirometrico di pronta biodegradabilità [capitolo C.4 del presente allegato (5), lettere C, F o D] utilizzando come inoculo dei fanghi esposti alla sostanza in esame nella prova di simulazione. | Sostanze chimiche volatili | La simulazione del trattamento delle acque reflue con le sostanze chimiche volatili è discutibile e problematica. Come già rilevato per le sostanze poco solubili in acqua, sono apparentemente rari gli studi che descrivono le prove di simulazione con sostanze volatili. Occorre adattare uno strumento classico per la miscelatura integrale turando ermeticamente i recipienti di aerazione e decantazione, misurando e controllando il flusso d’aria con flussimetri, e facendo passare il gas in uscita attraverso trappole che consentono di raccogliere materia organica volatile. In alcuni casi, il gas in uscita viene convogliato verso una trappola fredda tramite una pompa a vuoto, oppure viene estratto mediante la tecnica “purge and trap” in una trappola contenente Tenax e gel di silice per analisi gascromatografiche. La sostanza in esame presente nella trappola può essere determinata analiticamente. | La prova viene svolta in due fasi. Le unità vengono messe in funzione inizialmente senza fanghi, pompando i liquami artificiali addizionati della sostanza in esame nel recipiente di aerazione. Per alcuni giorni i campioni di affluenti, effluenti e gas in uscita vengono raccolti e analizzati per determinare la presenza della sostanza in esame. A partire dai dati raccolti, è possibile calcolare la percentuale (Rvs) della sostanza in esame estratta dal sistema tramite stripping. | Si conduce in seguito la normale prova biologica (con fanghi attivi), in condizioni sperimentali identiche a quelle utilizzate per lo studio basato sullo stripping, misurando anche il DOC e la COD, per verificare che le unità operino efficacemente. È inoltre opportuno eseguire analisi occasionali per misurare la presenza della sostanza in esame negli affluenti, negli effluenti e nei gas in uscita nel corso della prima parte della prova; dopo l’acclimatazione, le analisi vanno condotte con più frequenza. I dati raccolti allo stato stazionario permettono, di nuovo, di calcolare la percentuale di eliminazione della sostanza in esame nella fase liquida attraverso i processi fisici e biologici (RT), nonché la proporzione estratta dal sistema (RV) tramite stripping. | Calcolo: | a) | nella prova non biologica, la percentuale (RVP) della sostanza in esame estratta dal sistema (tramite stripping) può essere calcolata a partire dalla formula: | dove: | RVP | = | eliminazione della sostanza in esame per volatilizzazione (%), | SVP | = | sostanza in esame raccolta nella trappola espressa come concentrazione equivalente nella fase liquida (mg/l), | SIP | = | concentrazione della sostanza in esame negli effluenti (mg/l); | b) | nella prova biologica, la percentuale (RV) della sostanza in esame estratta dal sistema (tramite stripping) può essere calcolata a partire dalla formula: | dove: | RV | = | eliminazione della sostanza in esame per volatilizzazione nella prova biologica (%), | SV | = | sostanza in esame raccolta nella trappola, nella prova biologica, espressa come concentrazione equivalente negli affluenti liquidi (mg/l), | SI | = | concentrazione della sostanza in esame negli affluenti (mg/l); | c) | nella prova biologica, la percentuale (RT) della sostanza in esame eliminata attraverso tutti i diversi processi può essere calcolata a partire dalla formula: | dove: | SE= concentrazione della sostanza chimica in esame negli effluenti (liquidi) (mg/l); | d) | quindi, la percentuale (RBA) rimossa per biodegradazione e per adsorbimento può essere calcolata a partire dalla formula: | È consigliabile svolgere altre prove per determinare se la sostanza in esame è adsorbita; in tal caso, si potrebbe procedere ad un’ulteriore correzione; | e) | un confronto tra la proporzione di sostanza in esame estratta durante la prova biologica (Rv) e durante quella non-biologica (Rvp) mostra l’effetto complessivo del trattamento biologico sull’emissione della sostanza in esame nell’atmosfera. | Esempio: | Benzene | Tempo di ritenzione dei fanghi = 4 giorni | Tempo di ritenzione del liquame artificiale = 8 h | SIP | = | SI = 150 mg/l | SVP | = | 150 mg/l (SEP = 0) | SV | = | 22,5 mg/l | SE | = | 50 μg/l | Pertanto, | RVP | = | 100 %, RV = 15 % | RT | = | 100 % e RBA = 85 %. | Si è ipotizzato che il benzene non venga adsorbito sui fanghi attivi. | BIBLIOGRAFIA | (1) | Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854. | (2) | Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA. | (3) | Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97. | (4) | ISO 10634 (1995) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. | (5) | Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della “pronta” (ready) biodegradabilità. | Appendice 6 | Effetti del tempo di ritenzione dei fanghi sulla trattabilità delle sostanze chimiche | INTRODUZIONE | 1. | Il metodo qui descritto è stato concepito per verificare se le sostanze chimiche in esame (in generale quelle riconosciute come biodegradabili intrinsecamente ma non prontamente) possono venire biodegradate nei limiti imposti dagli impianti di trattamento delle acque reflue. I risultati sono espressi in termini di percentuali di eliminazione e di biodegradazione. Le condizioni di funzionamento delle unità a fanghi attivi e la scelta degli affluenti da trattare portano a oscillazioni piuttosto marcate della concentrazione della sostanza in esame negli effluenti. Le prove vengono svolte su una sola concentrazione nominale di solidi dei fanghi attivi o su un solo tempo di ritenzione nominale dei fanghi e i regimi di eliminazione dei fanghi esausti descritti possono far variare notevolmente il tempo di ritenzione nel corso della prova, sia da un giorno all’altro che all’interno di una sola giornata. | 2. | In questa variante (1) (2), il tempo di ritenzione dei fanghi è mantenuto all’interno di limiti molto più stretti nel corso di ciascun periodo di 24 ore (come avviene su vasta scala) e quindi la concentrazione negli effluenti risulta più costante. Si raccomanda l’uso di liquami domestici in quanto generano un tasso più elevato e consistente di eliminazione. Occorre inoltre esaminare gli effetti di un certo numero di valori attinenti ai tempi di ritenzione dei fanghi ed è necessario uno studio più dettagliato per determinare l’incidenza di una gamma di temperature diverse sulla concentrazione degli effluenti. | 3. | Non esiste ancora un consenso generale sui modelli cinetici che riproducono la biodegradazione delle sostanze chimiche nelle condizioni riscontrabili in un impianto per il trattamento delle acque reflue. Si è scelto di applicare ai dati raccolti il modello di Monod per la crescita batterica e per l’utilizzo del substrato (1) (2), in quanto trattasi di metodo destinato ad essere applicato solo a sostanze chimiche prodotte in grandi quantità e quindi presenti nelle acque reflue in concentrazioni superiori a 1 mg/l. La validità del modello semplificato e delle ipotesi formulate è stata stabilita utilizzando una serie di alcoli etossilati con vari gradi di biodegradabilità primaria (2) (3). | Nota: | Questa variante segue da vicino il metodo di prova qui descritto (C.10-A), discostandosene solo nei dettagli illustrati di seguito. | PRINCIPIO DELLA PROVA | 4. | Si utilizzano delle unità a vaso poroso con fanghi attivi — concepite per facilitare l’eliminazione (quasi) continua di liquami misti grazie a una regolazione molto precisa dei tempi di ritenzione dei fanghi (SRT, o θs) — in modo non abbinato, con diversi tempi di ritenzione e, facoltativamente, diverse temperature. Il tempo di ritenzione si situa generalmente tra 2 e 10 giorni e la temperatura tra 5 e 20 °C. Si dosano, separatamente, nelle unità i liquami di preferenza domestici e una soluzione della sostanza in esame, agli intervalli più idonei ad ottenere il tempo di ritenzione richiesto per i liquami (da 3 a 6 ore) e la concentrazione desiderata della sostanza in esame nei liquami da trattare. Le unità di controllo che non ricevono la sostanza in esame funzionano in parallelo, a fini di comparazione. | 5. | È possibile utilizzare altri tipi di apparecchiature, ma occorre prestare estrema attenzione per assicurare un controllo ottimale dei tempi di ritenzione. Ad esempio, se si utilizzano impianti che comprendono un decantatore, potrebbe essere necessario tener conto della perdita di solidi attraverso gli effluenti. Inoltre, è necessario prendere precauzioni particolari per evitare errori dovuti a variazioni della quantità dei fanghi nei decantatori. | 6. | Le unità sono fatte funzionare nelle varie combinazioni di condizioni scelte e, dopo aver raggiunto l’equilibrio, si misurano le concentrazioni medie della sostanza in esame negli effluenti nello stato stazionario e, facoltativamente, la COD, su un periodo di circa tre settimane. La valutazione della percentuale di eliminazione della sostanza in esame e, facoltativamente, della COD, è espressa da una rappresentazione grafica della relazione tra le condizioni di funzionamento dell’impianto e la concentrazione negli effluenti. A partire da qui è possibile calcolare le costanti cinetiche sperimentali e prevedere le condizioni nelle quali la sostanza in esame può essere trattata. | INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME | 7. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 12 e 13. | SOGLIE MINIME | 8. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 14 e 15. | SOSTANZA CHIMICA DI RIFERIMENTO | 9. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 16. | RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI DELLE PROVE | 10. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 17 e 18. | DESCRIZIONE DEL METODO | Apparecchiatura | 11. | Per questo metodo, l’unità adatta è una versione modificata del sistema a vaso poroso (appendice 6.1). Si tratta di un recipiente interno (o rivestimento) in polipropilene poroso di 3,2 mm di spessore, con pori da circa 90 μm e con giunti saldati di testa, che rendono questa unità più robusta rispetto a quella descritta al paragrafo 21 del presente capitolo, C.10-A. Il rivestimento è inserito in un recipiente esterno in polietilene impermeabile composto da due elementi: una base circolare forata (per permettere il passaggio di due tubi di aerazione e di un tubo per lo scarico dei fanghi) e un cilindro superiore avvitato sulla base e provvisto di un’uscita posizionata in modo tale da versare un volume noto (3 l) nel vaso poroso. Uno dei tubi di aerazione è dotato di un diffusore e l’altro è aperto alle estremità e disposto ad angolo retto rispetto al diffusore posto nel recipiente. Questo sistema crea turbolenze sufficienti ad assicurare che i contenuti del recipiente siano mescolati integralmente e a generare concentrazioni dell’ossigeno disciolto superiori a 2 mg/l. | 12. | Sistemare le unità, in numero adeguato, in un bagnomaria o in ambienti a temperatura costante e termostatizzata tra 5 e 20 °C (± 1 °C). Sono necessarie due pompe per dosare la soluzione della sostanza in esame e dei liquami decantati nei recipienti di aerazione alla portata richiesta (rispettivamente 0-1,0 ml/min e 0-25 ml/min) e una terza pompa per l’eliminazione dei fanghi esausti dai recipienti di aerazione. Il flusso dei fanghi esausti deve essere molto lento ed è ottenuto attraverso una pompa regolata a velocità superiore che funziona a intermittenza grazie a un timer settato, ad esempio, su 10 secondi al minuto, che risulta in un flusso di 3 ml/min e in una portata di fanghi eliminati pari a 0,5 ml/min. | Apparecchio di filtrazione o centrifuga | 13. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 23. | Apparecchiatura di analisi | 14. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 24. | Acqua | 15. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 25 e 26. | Mezzo organico | 16. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 27. | Liquami artificiali | 17. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 28. | Liquami domestici | 18. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 29. | Fanghi attivi | 19. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafo 30. | Soluzioni madre della sostanza in esame | 20. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi 31 e 32. | PROCEDURA | Preparazione dell’inoculo | 21. | Si applica il capitolo C.10-A solo il paragrafo 34 — utilizzare fanghi attivi (circa 2,5 g/l). | Numero di unità di prova | 22. | Nel caso di una prova semplice, ad esempio per misurare unicamente la percentuale di eliminazione, è sufficiente un solo valore di tempo di ritenzione dei fanghi, ma se si vuole ricavare dati necessari a calcolare le costanti cinetiche sperimentali, occorreranno 4 o 5 valori del tempo di ritenzione. I valori scelti si situano generalmente tra 2 e 10 giorni. Risulta più pratico effettuare una prova applicando 4 o 5 diversi valori del tempo di ritenzione dei fanghi simultaneamente alla stessa temperatura; per studi più approfonditi, si utilizzano gli stessi tempi di ritenzione o eventualmente una serie di valori diversi, a temperature diverse situate nell’intervallo tra 5 e 20 °C. La biodegradazione primaria (utilizzo principale) richiede normalmente una sola unità per ciascuna combinazione di condizioni. Tuttavia, per la biodegradazione completa occorre aggiungere un’unità di controllo per ciascuna combinazione di condizioni, destinata ad accogliere i liquami ma non la sostanza in esame. Se si presume che nei liquami utilizzati sia presente la sostanza in esame, è possibile incorporare delle unità di controllo al momento di valutare la biodegradazione primaria e apportare le correzioni necessarie ai calcoli. | Dosaggio del mezzo organico e della sostanza chimica in esame | 23. | Si applicano i paragrafi da 36 a 39 del capitolo C.10-A, facendo però attenzione a dosare separatamente la soluzione della sostanza in esame e a utilizzare diversi tassi di eliminazione dei fanghi. Occorre inoltre monitorare frequentemente, ad esempio due volte al giorno, e se necessario aggiustare entro ± 10 %, la portata degli affluenti, degli effluenti e dei fanghi esausti. Se i metodi di analisi comportano delle difficoltà per i liquami domestici, si possono utilizzare al loro posto dei liquami artificiali, assicurandosi che i diversi mezzi forniscano dati cinetici paragonabili. | Manipolazione delle unità a fanghi attivi | 24. | Si applicano i paragrafi da 40 a 43 del capitolo C.10-A, facendo però attenzione a controllare il tempo di ritenzione dei fanghi solo attraverso un’eliminazione a flusso “costante” dei fanghi esausti. | Campionamento e analisi | 25. | Si applicano i paragrafi da 44 a 50 del capitolo C.10-A, determinando, inoltre, la concentrazione della sostanza in esame ed eventualmente il DOC; la COD non va utilizzata. | DATI E RELAZIONE | Trattamento dei risultati | 26. | Si applica il capitolo C.10 lettera A, paragrafi da 52 a 54. | Espressione dei risultati della prova | 27. | Si applica il capitolo C.10-A, paragrafi da 56 a 62. | Calcolo delle costanti cinetiche | 28. | È più realistico esprimere la concentrazione media della sostanza in analisi allo stato stazionario negli effluenti e descrivere come essa vari in funzione delle condizioni di funzionamento dell’impianto, invece che citare la percentuale di biodegradazione primaria. A tal fine è possibile utilizzare l’equazione [6] dell’appendice 6.2, che può fornire i valori dei parametri KS, μm e θSC, tempo critico di ritenzione dei fanghi. | [Alternativamente, è possibile ottenere i valori di KS e μm utilizzando un programma informatico semplice che adatta la curva teorica calcolata a partire dall’equazione [2] (appendice 6.2) ai valori sperimentali ottenuti. Anche se la soluzione ottenuta non rappresenterà una risposta assoluta, si può ottenere una ragionevole approssimazione dei valori KS e μm]. | Variabilità dei risultati | 29. | Capita frequentemente di ottenere parametri cinetici variabili per una medesima sostanza. Si ritiene che le condizioni di crescita dei fanghi e le condizioni nella quali si svolge la prova (come al paragrafo 5 e in altre prove) incidano fortemente sui risultati. Un aspetto di tale variabilità è stato esaminato da Grady et al (4), che hanno suggerito di applicare i termini “effettiva” e “intrinseca” a due condizioni estreme che rappresentano i limiti dello stato fisiologico raggiungibile da una coltura nel corso di una prova cinetica. Se lo stato si mantiene inalterato nel corso della prova, i valori dei parametri cinetici riflettono le condizioni dell’ambiente dal quale provengono i microrganismi; tali valori vengono detti “effettivi” ovvero attualmente esistenti. All’estremo opposto, se le condizioni della prova sono tali da permettere il pieno sviluppo del sistema di sintesi proteica e quindi il massimo tasso di crescita, i parametri cinetici risultanti vengono detti “intrinseci” e dipendono unicamente dalla natura del substrato e dal tipo di batteri che compongono la coltura. A titolo orientativo, si otterranno valori effettivi mantenendo il rapporto tra concentrazione del substrato e microrganismi degradanti (So/Xo) a livelli bassi (ad esempio 0,025), mentre si otterranno valori intrinseci mantenendolo a livelli alti (ad esempio, 20 o oltre). In entrambi i casi, So deve essere pari o superiore al valore applicabile di Ks, la costante di semisaturazione. | 30. | La variabilità e altri aspetti della cinetica di biodegradazione sono stati discussi nel corso di una recente riunione del SETAC (5). Gli studi discussi, sia quelli già pubblicati sia quelli in fase progettuale, dovrebbero presto consentirci di avere un’immagine più chiara della cinetica alla base del trattamento delle acque reflue negli impianti e permetterci quindi una migliore interpretazione dei dati esistenti e di impostare in futuro delle linee guida più pertinenti per i metodi di prova. | BIBLIOGRAFIA | (1) | Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33-48. | (2) | Birch RR (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340-343. | (3) | Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411-422. | (4) | Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742-748. | (5) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels. | Appendice 6.1 | Vaso poroso con regolazione del tempo di ritenzione dei fanghi | Appendice 6.2 | Calcolo delle costanti cinetiche | 1. | Supponendo che si applichi la cinetica di Monod e tenendo conto di un bilancio di massa dei solidi attivi e del substrato nel sistema a fanghi attivi (1), le seguenti espressioni descrivono lo stato stazionario: | [1] | ovvero | [2] | dove: | S1 | = | concentrazione del substrato negli effluenti (mg/l) | KS | = | costante di semisaturazione, concentrazione alla quale μ = μm/2 (mg/l) | μ | = | tasso di crescita specifico (d–1) | μm | = | valore massimo di μm (d–1) | Kd | = | velocità di degradazione specifica dei solidi attivi (d–1) | θS | = | tempo medio di ritenzione dei fanghi (d) | Lo studio dell’equazione conduce alle seguenti conclusioni: | i) | la concentrazione negli effluenti è indipendente da quella negli affluenti (S0); di conseguenza, la percentuale di biodegradazione varia in funzione della concentrazione negli affluenti, S0; | ii) | l’unico parametro di controllo dell’impianto che incide su S1 è il tempo di ritenzione dei fanghi θS; | iii) | a una data concentrazione negli affluenti, S0, corrisponderà un tempo critico di ritenzione dei fanghi, secondo la seguente formula: | [3] | dove: | θSC= tempo critico di ritenzione dei fanghi al di sotto del quale i microrganismi competenti vengono eliminati dall’impianto; | iv) | dato che gli altri parametri dell’equazione [2] sono associati alla cinetica di crescita, è probabile che la temperatura incida sul livello del substrato degli effluenti e sull’età critica dei fanghi, ovvero, il tempo di ritenzione dei fanghi necessario ad ottenere un certo grado di trattamento aumenta in funzione della diminuzione della temperatura. | 2. | A partire da un bilancio di massa dei solidi nel sistema a vaso poroso, e supponendo che la concentrazione dei solidi negli effluenti dell’impianto, X2, sia bassa rispetto a quella nel recipiente di aerazione, X1, il tempo di ritenzione dei fanghi è dato da: | [4] | e | dove: | V | = | volume del recipiente di aerazione (l) | X1 | = | concentrazione dei solidi nel recipiente di aerazione (mg/l) | X2 | = | concentrazione dei solidi negli effluenti (mg/l) | Q0 | = | velocità di flusso degli affluenti (l/d) | Q1 | = | velocità di flusso dei fanghi esausti (l/d) | Regolando la velocità di flusso dei fanghi esausti, Q1, è quindi possibile regolare il tempo di ritenzione dei fanghi al determinato valore prescelto. | Conclusioni: | 3. | Scopo principale della prova è consentire di prevedere la concentrazione della sostanza in esame negli effluenti e, di conseguenza, i livelli di tale sostanza nelle acque che li ricevono. | 4. | Tracciando S1 in funzione di θS è a volte possibile valutare con facilità il tempo critico di ritenzione dei fanghi, come ad esempio nella curva 3 della figura 1. Se non è possibile farlo, il valore θSC può essere calcolato, insieme ai valori approssimativi di μm e KS, tracciando S1, in funzione di S1•θS. | Riarrangiando l’equazione, si ottiene: | [5] | se il valore di Kd è basso, si ottiene 1 + θs • Kd ~ 1 e [5] diventa: | [6] | Di conseguenza la curva dovrebbe diventare una retta (cfr. la figura 2) con inclinazione 1/μm che interseca KS/μm; inoltre: θS ~1/μm. | Figura 1 | Tre temperature; cinque tempi di ritenzione dei fanghi | Figura 2 | Retta di regressione SRT · S1 in funzione di S1 a T = 5 °C | Legenda | Concentrazione negli effluenti | Curva | Appendice 7 | PROVE SVOLTE A BASSE CONCENTRAZIONI (μg/l) | 1. | Negli ambienti acquatici, che includono le acque reflue, diverse sostanze chimiche sono spesso presenti a concentrazioni molto basse (μg/l). In tal caso, le sostanze non servono da substrati primari per la crescita ed è invece più verosimile che subiscano una degradazione in quanto substrati secondari che non intervengono nella crescita, parallelamente a una serie di composti a base di carbonio presenti in natura. Di conseguenza, la degradazione di questo tipo di composti non risponde al modello descritto all’appendice 6. Si possono però applicare diversi altri modelli e, date le condizioni prevalentemente presenti nei sistemi di trattamento delle acque reflue, è possibile utilizzare contemporaneamente molti modelli. Occorre svolgere studi molto più approfonditi per chiarire questo punto. | 2. | Nel frattempo, è possibile applicare la procedura descritta nel presente testo (capitolo C.10-A), ma solo per la biodegradabilità primaria, utilizzando basse concentrazioni idonee (< 100 μg/l) e una procedura di analisi convalidata. È possibile calcolare la percentuale di biodegradazione (cfr. paragrafo 54 del metodo di prova) a condizione che venga tenuto conto dei processi abiotici (adsorbimento, volatilità ecc.). Si può prendere ad esempio lo studio condotto da Nyholm e dai suoi collaboratori (1) (2), con un ciclo di 4 ore in un sistema a riempimento e scarico (fill and draw). Lo studio riporta costanti di pseudo primo ordine per le cinque sostanze chimiche addizionate a liquami artificiali, da 5 a 100 μg/l (per la biodegradabilità finale è possibile utilizzare sostanze di prova marcate con 14C). La descrizione di questo processo si situa al di fuori dell’ambito del presente metodo di prova in quanto non si tratta di procedure sulle quali vi è consenso, sebbene un metodo proposto per la norma ISO 14592 (3) contenga delle indicazioni sull’uso delle sostanze chimiche marcate con 14C. | Prova a mezzo di unità semicontinue per fanghi attivi (SCAS) | 3. | È stata in seguito proposta una prova più semplice, in due fasi (4) (5) (6); il metodo, che prevede il ricorso a unità semicontinue (SCAS), è seguito da prove cinetiche brevi condotte su campioni prelevati dalle unità SCAS. Il sistema SCAS funziona con flussi di fanghi esausti conosciuti (a differenza del metodo originale C.12) e viene alimentato con liquami artificiali ricostituiti secondo la formula OCSE modificata o con liquami domestici. La formula dei liquami artificiali è stata modificata (a causa di un diverso valore di pH e scarsa capacità di sedimentazione dei fanghi) con l’aggiunta di un tampone fosfato, di estratto di lievito, cloruro di ferro (III) e tracce di oligoelementi, inoltre la COD è stata aumentata a circa 750 mg/l incrementando la concentrazione di peptone ed estratti di carne. Le unità hanno funzionato in cicli continui di 24 ore: 23 ore di aerazione, eliminazione dei fanghi esausti, sedimentazione, estrazione del liquido sopranatante (effluenti) seguite dall’aggiunta di liquami artificiali e sostanza in esame, fino a 100 μg/l (vale a dire circa la stessa concentrazione applicata nella prova breve). Una volta la settimana il 10 % della totalità dei fanghi è stata sostituita con fanghi freschi in modo da mantenere l’equilibrio della popolazione microbica. | 4. | Le concentrazioni della sostanza in esame vengono misurate inizialmente e alla fine della fase di aerazione e la prova viene condotta finché si raggiunge un’eliminazione costante della sostanza: possono essere necessari da una settimana a diversi mesi. | Prova breve | 5. | Viene svolta una prova breve (es. 8 ore) per determinare la costante di velocità cinetica di pseudo primo ordine per la degradazione della sostanza chimica in esame nei fanghi attivi le cui origini e modalità di sviluppo sono conosciute ma diverse. In particolare, vengono presi campioni di fanghi dai reattori SCAS — alla fine di un periodo di aerazione, quando la concentrazione del substrato è bassa — durante un test di acclimatazione (paragrafi 3 e 4). A scopo di confronto, i fanghi possono essere presi anche da un’unità SCAS operante in parallelo ma non esposta alla sostanza in esame. Aerare le miscele di fanghi e della sostanza in esame aggiunta a due o più concentrazioni nell’intervallo da 1 a 50 μg/l, senza aggiungere liquami artificiali o altro substrato organico. La sostanza in esame rimasta in soluzione viene misurata a intervalli regolari, ad esempio ogni ora, a seconda della sua degradabilità, per non più di 24 ore. Centrifugare i campioni prima di sottoporli ad adeguata analisi. | Calcoli | 6. | I dati provenienti dalle unità SCAS vengono utilizzati per calcolare la percentuale di eliminazione della sostanza in esame (paragrafo 54). È inoltre possibile calcolare la costante di velocità media, K1 (corretta, per tenere conto della concentrazione dei solidi in sospensione), ricorrendo alla formula seguente: | dove: | t | = | tempo di aerazione (23 ore) | Ce | = | concentrazione alla fine del periodo di aerazione (μg/l) | Ci | = | concentrazione all’inizio del periodo di aerazione (μg/l) | SS | = | concentrazione dei solidi dei fanghi attivi (g/l) | 7. | Nella prova breve, tracciare il logaritmo della concentrazione percentuale restante in funzione del tempo; la curva della parte iniziale (degradazione 10-50 %) del grafico è equivalente a K1, la costante di (pseudo) primo ordine. Correggere la costante in funzione della concentrazione dei solidi nei fanghi, dividendo la curva per la concentrazione di tali solidi. Il risultato deve precisare anche le concentrazioni iniziali della sostanza in esame e dei solidi in sospensione, il tempo di ritenzione dei fanghi, il carico e la fonte dei fanghi e indicare, se del caso, un’eventuale pre-esposizione alla sostanza in esame. | Variabilità dei risultati | 8. | La variabilità e altri aspetti della cinetica di biodegradazione sono stati discussi nel corso di una recente riunione del SETAC (7). Gli studi discussi, sia quelli già pubblicati sia quelli in fase progettuale, dovrebbero presto consentirci di avere un’immagine più chiara della cinetica alla base del trattamento delle acque reflue negli impianti e permetterci quindi una migliore interpretazione dei dati esistenti e di impostare in futuro delle linee guida più pertinenti per i metodi di prova. | BIBLIOGRAFIA | (1) | Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A and Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353. | (2) | Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, and Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510. | (3) | ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water. | (4) | Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP and Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864. | (5) | Berg UT and Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735. | (6) | Danish Environmental Protection Agency. (1996). (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen. | (7) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Workshop at Port Sunlight, UK. Eds. Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K. and Verstraete, W. 4-6th Sept. 1996. SETAC- Europe, Brussels. | C.10-B: Biofilm | INTRODUZIONE | 1. | Generalmente le prove di simulazione vengono svolte sulle sostanze che non superano la prova di screening per la pronta biodegradabilità [capitolo C.4, lettere da A a F, del presente allegato (9)] ma superano invece quella per la biodegradabilità intrinseca. In casi eccezionali, le prove di simulazione vengono applicate anche a sostanze chimiche sulle quali è necessario ottenere maggiori informazioni, specialmente le sostanze prodotte in grandi quantità; normalmente, viene applicata la prova a fanghi attivi (C.10-A). In alcuni casi, tuttavia, sono necessarie informazioni specifiche relative al comportamento di una determinata sostanza quando viene sottoposta a metodi di trattamento delle acque reflue che comportano il ricorso a biofilm, in particolare attraverso l’uso di filtri percolatori, biodischi (rotating biological contactors) o letti fluidi; per venire incontro a tale necessità, sono state sviluppate diverse soluzioni. | 2. | Gerike et al. (1) hanno sviluppato delle unità pilota costituite da filtri percolatori di grandi dimensioni, facendole funzionare in modalità abbinata. I filtri occupavano però troppo spazio e richiedevano quantità relativamente elevate di liquami o liquami artificiali. Truesdale et al. (2) hanno utilizzato filtri percolatori più piccoli (1,83 m × 0,15 m di diametro) alimentati con liquami naturali privi di tensioattivi, ma che richiedevano comunque quantità significative di liquami. Erano necessarie fino a 14 settimane per sviluppare un biofilm “maturo” e bisognava attendere altre 4-8 settimane, dopo la prima introduzione del tensioattivo in esame, perché avvenisse l’acclimatazione. | 3. | Baumann et al. (3) sono ricorsi a un filtro molto più piccolo che usava “fibra pile” di poliestere precedentemente immersa in fanghi attivi come mezzo inerte di supporto per il biofilm. La sostanza in esame costituiva l’unica fonte di carbonio e la biodegradabilità veniva valutata a partire dalle misure del DOC nell’affluente e nell’effluente e dalla quantità di CO2 nel gas emesso. | 4. | Gloyna et al. (4) hanno adottato un approccio completamente diverso e a loro si deve l’invenzione del reattore tubolare rotante. Sulla superficie interna del tubo rotante (sull’area della superficie conosciuta) è stato coltivato un biofilm introducendo gli affluenti dall’estremità superiore del tubo (leggermente inclinato rispetto all’asse orizzontale). Il reattore è stato utilizzato per studiare la biodegradabilità dei tensioattivi (5), lo spessore ottimale del biofilm e la diffusione attraverso il film (6). Gloyna et al. hanno poi perfezionato e modificato il reattore in modo da poter determinare il CO2 nel gas emesso. | 5. | Il reattore tubolare rotante è stato adottato dallo Standing Committee of Analysts del Regno Unito come metodo standard per valutare la biodegradabilità delle sostanze chimiche (7) nonché la trattabilità e tossicità delle acque reflue (8). Il metodo qui descritto presenta il vantaggio di essere semplice, compatto e riproducibile e di richiedere quantità relativamente contenute di mezzo organico. | PRINCIPIO DELLA PROVA | 6. | Si applicano sulla superficie interna del tubo inclinato, facendolo ruotare lentamente, i liquami (artificiali o domestici) e la sostanza in esame, introdotta separatamente o miscelata. Sulla superficie interna si sviluppa uno strato di microrganismi, simili a quelli presenti sui biofiltri. Il funzionamento del reattore è calibrato in modo da ottenere un’eliminazione adeguata della materia organica e, se necessario, l’ossidazione dell’ammonio. | 7. | Si raccolgono gli effluenti dal tubo e li si fa decantare e/o filtrare prima di analizzarli per verificare la presenza del DOC e/o della sostanza chimica in esame, scegliendo un metodo specifico. Si fanno funzionare in parallelo le unità di controllo che non ricevono la sostanza in esame, a fini di comparazione. Quando si effettuano le misurazioni del DOC negli effluenti, si presume che la differenza fra le concentrazioni medie delle due unità (di prova e di controllo) sia dovuta alla sostanza in esame o ai suoi metaboliti organici. Tale differenza è confrontata con la concentrazione della sostanza chimica in esame (in termini di DOC) negli affluenti, al fine di determinarne l’eliminazione. | 8. | È generalmente possibile distinguere tra biodegradazione e bioassorbimento osservando con attenzione la curva eliminazione-tempo; normalmente, la biodegradazione può essere confermata da una prova di pronta biodegradazione (consumo di ossigeno e produzione di diossido di carbonio) utilizzando un inoculo acclimatato estratto alla fine della prova dai reattori che hanno ricevuto la sostanza in esame. | INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME | 9. | È necessario disporre delle caratteristiche di purezza, idrosolubilità, volatilità e adsorbimento della sostanza in esame, in modo da permettere la corretta interpretazione dei risultati. | 10. | Le sostanze chimiche volatili e scarsamente solubili non possono normalmente essere testate se non dopo aver preso particolari precauzioni (cfr. capitolo C.10-A, appendice 5). È necessario conoscerne la struttura chimica o la formula bruta per calcolare i valori teorici e/o per controllare i valori dei parametri significativi, per esempio ThOD (domanda teorica di ossigeno) e DOC. | 11. | Le informazioni sulla tossicità della sostanza chimica in esame per i microrganismi (cfr. capitolo C.10-A, appendice 4) possono essere utili per una scelta mirata delle concentrazioni da sottoporre a prova e per interpretare correttamente valori di biodegradazione bassi. | SOGLIE MINIME | 12. | Originariamente, l’immissione sul mercato dei tensioattivi era subordinata al raggiungimento di un tasso minimo di biodegradazione primaria pari almeno all’80 %. Se il tasso dell’80 % non viene raggiunto, si può applicare la presente prova di simulazione (di conferma) e il tensioattivo è immesso sul mercato solo se viene eliminato più del 90 % della sostanza chimica specifica. In generale, per le sostanze chimiche, il problema di ottenere un risultato positivo o negativo (pass/fail) non si pone e la percentuale di eliminazione ottenuta può servire per un calcolo approssimativo della probabile concentrazione nell’ambiente, da utilizzare nella valutazione dei rischi dovuti alle sostanze chimiche. La percentuale di eliminazione del DOC ottenuta in diversi studi su sostanze chimiche pure era superiore al 90 % in oltre tre quarti dei prodotti chimici che presentavano un grado di biodegradabilità significativo ed era superiore all’80 % nel novanta per cento degli stessi. | SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO | 13. | Per assicurare il corretto svolgimento della procedura sperimentale è utile, a volte, testare in parallelo delle sostanze chimiche il cui comportamento è conosciuto. Si può, ad esempio, ricorrere ad acido adipico, 2-fenilfenolo, 1-naftolo, acido difenico e 1-acido naftoico. | RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI DELLE PROVE | 14. | Un laboratorio situato nel Regno Unito ha calcolato una deviazione standard relativa del 3,5 % all’interno delle prove e del 5 % tra le prove (7). | DESCRIZIONE DEL METODO | Apparecchiatura | Reattori tubolari rotanti | 15. | L’apparecchiatura (cfr. appendice 8, figure 1 e 2) consiste in una serie di tubi acrilici, lunghi 30,5 cm con diametro interno di 5 cm, applicati su ruote con corone in gomma all’interno di una struttura di supporto in metallo. I tubi, la cui superficie interna viene resa ruvida con lana abrasiva, hanno un bordo esterno alto circa 0,5 cm che ne permette il fissaggio sulle ruote; all’estremità superiore (estremità di carico) si trova un bordo interno di 0,5 cm, per la ritenzione dei liquidi. Occorre inclinare i tubi a un angolo di circa un grado rispetto al piano orizzontale, per consentire che il mezzo di prova applicato ai tubi puliti resti in contatto con la loro superficie per il tempo richiesto. Fare girare lentamente le ruote gommate attraverso un motore a velocità variabile. Controllare la temperatura dei tubi collocandoli in una camera a temperatura costante. | 16. | Porre ciascun reattore tubolare in un tubo leggermente più grande e chiuso da un tappo, assicurandosi che le giunzioni siano a tenuta stagna, in modo da raccogliere in una soluzione alcalina il CO2 del gas emesso, per poi misurarlo (6). | 17. | Alimentare ogni tubo con mezzo organico contenente, se del caso, la sostanza in esame; prevedere per ciascun tubo un recipiente della capacità di 20 l per lo stoccaggio di sufficiente mezzo organico per 24 ore (A) (cfr. figura 2). Se richiesto, la sostanza chimica in esame può essere dosata separatamente. Sul fondo di ciascun recipiente di stoccaggio c’è un foro d’uscita collegato attraverso un tubicino idoneo, ad esempio in gomma siliconata, via una pompa peristaltica (B) a un tubicino di alimentazione acrilico o in vetro che entra per 2-4 cm nell’estremità superiore (di carico) del tubo inclinato (C). L’effluente sgocciola quindi dalla parte inferiore del tubo inclinato verso un altro recipiente di stoccaggio (D). Far decantare l’effluente, o filtrarlo, prima di analizzarlo. | Apparecchio di filtrazione — centrifuga | 18. | I campioni vengono filtrati attraverso filtri a membrana di porosità idonea (diametro d’apertura nominale di 0,45 μm) che adsorbono le sostanze chimiche organiche solubili o rilasciano la minima quantità possibile di carbonio organico. Se i filtri utilizzati rilasciano carbonio organico, occorre lavarli accuratamente con acqua calda per rimuovere il carbonio organico lisciviato. In alternativa si può usare una centrifuga in grado di girare a 40 000 m/s2. | 19. | Apparecchiatura di analisi che permette di determinare: | — | DOC/carbonio organico totale (TOC) o domanda chimica di ossigeno (COD), | — | sostanze chimiche specifiche (HPLC, GC ecc.) se richiesto, | — | pH, temperatura, acidità, alcalinità, | — | ammonio, nitrito e nitrato, se la prova è svolta in condizioni nitrificanti. | Acqua | 20. | Acqua di rubinetto, contenente meno di 3 mg/l di DOC. | 21. | Acqua distillata o deionizzata, contenente meno di 2 mg/l di DOC. | Mezzo organico | 22. | Sono accettati quali mezzo organico i liquami artificiali, quelli domestici o una miscela di entrambi. È stato dimostrato che l’uso di soli liquami domestici genera spesso un maggior tasso di eliminazione del DOC (nelle unità a fanghi attivi) e consente addirittura la biodegradazione di alcune sostanze chimiche che non sono invece biodegradate se si usano liquami artificiali ricostituiti secondo la formula OCSE. Si raccomanda quindi l’uso di liquami domestici. Occorre misurare la concentrazione di DOC (o COD) in ciascun nuovo lotto di mezzo organico e occorre conoscerne l’acidità o l’alcalinità. Se il mezzo organico presenta una bassa acidità o alcalinità potrebbe essere necessario aggiungere un tampone idoneo (idrogenocarbonato di sodio o idrogenofosfato di potassio) per mantenere un pH di circa 7,5 ± 0,5 nel reattore nel corso della prova. La quantità del tampone da aggiungere, e quando aggiungerla, vanno decise caso per caso. | Liquami artificiali | 23. | Sciogliere per ogni litro di acqua di rubinetto i seguenti composti: 160 mg di peptone; 110 mg di estratto di carne; 30 mg di urea; 28 mg di idrogenofosfato di potassio (K2HPO4); 7 mg di cloruro di sodio (NaCl); 4 mg di cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2H2O); 2 mg di solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7H20). Questi liquami artificiali ricostituiti secondo la formula OCSE costituiscono un esempio dove la concentrazione media di DOC negli affluenti è di circa 100 mg/l. In alternativa, utilizzare altre composizioni con la stessa concentrazione di DOC, più prossime ai liquami reali. I liquami artificiali, a base di acqua distillata, possono essere preparati in forma concentrata e conservati a circa 1 °C per una settimana al massimo. Se occorre, diluire con acqua di rubinetto (si tratta, peraltro, di un mezzo organico insoddisfacente in particolare perché la concentrazione di azoto è molto elevata e il tenore di carbonio è relativamente basso, ma non è stata suggerita un’alternativa migliore, se non attraverso l’aggiunta di un tampone fosfato e di peptone). | Liquami domestici | 24. | Utilizzare liquami freschi decantati raccolti giornalmente in un impianto di trattamento delle acque reflue che riceve principalmente liquami domestici. Occorre prelevare i liquami dallo stramazzo della vasca di sedimentazione primaria oppure dall’alimentazione dell’impianto a fanghi attivi; i liquami devono essere il più possibile privi delle particelle più grosse. I liquami possono essere utilizzati dopo averli stoccati anche per diversi giorni a 4 °C, se è provato che il DOC (o la COD) non sono diminuiti in modo significativo (vale a dire di più del 20 %) in fase di stoccaggio. Al fine di limitare eventuali perturbazioni al sistema, occorre correggere il DOC (o la COD) di ogni nuovo lotto a un valore adeguato costante prima dell’uso, ad esempio diluendolo con acqua. | Lubrificante | 25. | Per lubrificare i rulli della pompa peristaltica, utilizzare glicerolo od olio d’oliva: entrambi sono adatti per i tubi in gomma siliconata. | Soluzioni madre della sostanza in esame | 26. | Per le sostanze che presentano una solubilità adeguata, preparare delle soluzioni madre a concentrazioni idonee (es.: da 1 a 5 g/l) in acqua deionizzata o nella frazione minerale dei liquami artificiali. Per le sostanze insolubili, cfr. capitolo C.10-A, appendice 5; non applicare il metodo alle sostanze chimiche volatili senza prima modificare i reattori tubolari (paragrafo 16). Determinare il DOC e il TOC della soluzione madre e ripetere le misure per ciascun nuovo lotto. Se la differenza tra il DOC e il TOC supera il 20 %, verificare l’idrosolubilità della sostanza chimica in esame. Confrontare il DOC o la concentrazione della sostanza in esame misurata attraverso un’analisi specifica della soluzione madre a valore nominale, per assicurarsi che il tasso di recupero sia sufficiente (solitamente deve superare il 90 %). Verificare, in particolare per le dispersioni, se il DOC può essere utilizzato come parametro analitico, o se invece si possa applicare solo una tecnica d’analisi specifica per la sostanza in esame. Le dispersioni impongono il ricorso alla centrifuga dei campioni. Per ciascun nuovo lotto, misurare DOC, COD o la sostanza in esame attraverso un’analisi specifica. | 27. | Determinare il pH della soluzione madre. I valori estremi indicano che l’aggiunta della sostanza chimica può influenzare il pH dei fanghi attivi nel sistema di prova. In tal caso, neutralizzare la soluzione madre per ottenere un pH di 7 ± 0,5 ricorrendo a piccole quantità di acido o di base inorganica, evitando però la precipitazione della sostanza in esame. | PROCEDURA | Preparazione del mezzo organico da dosare | 28. | Pulire accuratamente, all’inizio e durante la prova, tutti i recipienti destinati ad affluenti ed effluenti e i tubi che li collegano, per eliminare la proliferazione microbica. | 29. | Preparare giornalmente liquami artificiali freschi (paragrafo 23) a partire dai solidi o dalla soluzione madre concentrata, diluendo con acqua di rubinetto. Misurare la quantità richiesta in un cilindro e aggiungerla in un recipiente per gli affluenti, pulito. Inoltre, se necessario, aggiungere la quantità richiesta della soluzione madre della sostanza in esame o della sostanza di riferimento ai liquami artificiali prima della diluzione. Per praticità o per evitare eventuali perdite della sostanza, prepararne a parte una soluzione diluita, in un recipiente separato, e caricarla nei tubi inclinati attraverso una diversa pompa dosatrice. | 30. | In alternativa (e preferibilmente), usare liquami domestici decantati freschi (paragrafo 24), se possibile raccolti giornalmente. | Funzionamento dei reattori tubolari rotanti | 31. | Per valutare una singola sostanza chimica sono necessari due identici reattori tubolari, installati in un ambiente a temperatura costante, normalmente a 22 ± 2 °C. | 32. | Regolare la pompa peristaltica in modo da caricare 250 ± 25 ml/h del mezzo organico (senza sostanza chimica) nei tubi inclinati, che dovranno ruotare a 18 ± 2 rpm. Applicare il lubrificante (paragrafo 25) ai tubicini della pompa, all’inizio e a intervalli regolari durante la prova, per assicurare un funzionamento corretto e prolungare la durata dei tubicini. | 33. | Regolare l’angolo di inclinazione dei tubi rispetto al piano orizzontale, in modo da produrre un tempo di residenza di 125 ± 12,5 sec per il carico nel tubo pulito. Fare una stima del tempo di ritenzione aggiungendo al liquido erogato un marcatore non biologico (es.: NaCl, colorante inerte): il tempo necessario a raggiungere la massima concentrazione negli effluenti viene considerato tempo medio di ritenzione (nel momento di massimo sviluppo del film, il tempo di ritenzione può aumentare fino a 30 minuti circa). | 34. | È stato confermato che i tassi, le velocità e i tempi indicati producono percentuali di eliminazione adeguate (> 80 %) del DOC (o COD) ed effluenti nitrificati. La portata del flusso va modificata se l’eliminazione è insufficiente o se va simulato il funzionamento di un particolare impianto di depurazione. In quest’ultimo caso, occorre continuare a regolare il dosaggio del mezzo organico fino a ottenere una prestazione del reattore identica a quella dell’impianto di depurazione. | Inoculazione | 35. | In caso si faccia uso di liquami artificiali, l’inoculazione per via aerea può essere sufficiente ad avviare la proliferazione dei microrganismi; altrimenti aggiungere al liquido erogato 1 ml/l di liquami decantati, per 3 giorni. | Misurazioni | 36. | Verificare, ad intervalli regolari, che i dosaggi e le velocità di rotazione rientrino nei limiti richiesti. Inoltre, misurare il pH degli effluenti, specialmente se si prevede che si verifichi nitrificazione. | Campionamento e analisi | 37. | Il metodo, la modalità e la frequenza del campionamento vengono scelti in funzione dello scopo prefisso della prova. Ad esempio, è possibile prelevare campioni di affluenti o effluenti con un campionamento istantaneo oppure su un periodo più lungo (es.: 3-6 ore). Nel corso del primo periodo, e quindi senza sostanza chimica in esame, prelevare dei campioni due volte la settimana. Filtrare i campioni tramite membrane o centrifugarli a circa 40 000 m/sec2 per più o meno 15 minuti (paragrafo 18). Potrebbe essere necessario far decantare e/o passare i campioni da un filtro grossolano prima di filtrarli tramite membrane. Determinare il DOC o la COD almeno due volte e, se richiesto, il BOD, l’ammonio e i nitriti/nitrati. | 38. | Dopo la raccolta e la preparazione dei campioni, occorre svolgere le analisi il più rapidamente possibile. In caso fosse necessario rimandare le analisi, conservare i campioni a circa 4 °C al buio, in bottiglie piene ed ermeticamente chiuse. Se è necessario stoccare i campioni per più di 48 h, la conservazione può avvenire tramite congelazione, acidificazione o aggiunta di una sostanza tossica idonea [es. 20 ml/l di una soluzione di cloruro di mercurio (II) a 10 g/l]. Assicurarsi che la tecnica di conservazione non incida sui risultati dell’analisi. | Periodo di attivazione | 39. | Si tratta del periodo nel quale il biofilm cresce fino ad ottenere lo spessore ottimale: generalmente due settimane e comunque non più di sei. L’eliminazione (paragrafo 44) del DOC (o della COD) aumenta e raggiunge un valore di plateau: una volta raggiunto un valore di plateau simile in entrambi i tubi, sceglierne uno che diventerà l’unità di controllo per il resto della prova, durante la quale le loro prestazioni devono rimanere coerenti. | Addizione della sostanza chimica in esame | 40. | A questo punto, aggiungere all’altro tubo reattore la sostanza chimica in esame nella concentrazione richiesta, di solito 10-20 mg C/l, mentre nel reattore di controllo viene aggiunto solo il mezzo organico. | Periodo di acclimatazione | 41. | Continuare a svolgere analisi con cadenza bisettimanale per il DOC (o la COD) e, se è necessario valutare la biodegradabilità, misurare anche la concentrazione della sostanza in esame attraverso analisi specifiche. Lasciare acclimatare per un periodo da una a sei settimane (o più a lungo se sussistono condizioni particolari) dopo la prima addizione della sostanza in esame. Quando la percentuale di eliminazione (paragrafi 43-45) raggiunge il valore massimo, ottenere 12-15 valori validi nella fase di plateau nel corso di 3 settimane per calcolare la percentuale media di eliminazione. La prova è considerata conclusa se si è raggiunta una percentuale di eliminazione sufficientemente alta. La prova non deve generalmente estendersi al di là delle 12 settimane a partire dalla prima addizione della sostanza in esame. | Distacco del biofilm | 42. | Dalle pareti dei tubi si distaccano, ad intervalli piuttosto regolari, delle grandi quantità di biofilm. Per assicurare che ciò non incida sulla confrontabilità dei risultati, fare in modo che le prove coprano un periodo equivalente ad almeno due cicli completi di crescita e distacco. | DATI E RELAZIONE | Trattamento dei risultati | 43. | Per ogni valutazione programmata, calcolare la percentuale di eliminazione della sostanza in esame in termini di DOC (o di COD) ricorrendo alla seguente equazione: | dove: | Dt | = | percentuale di eliminazione del DOC o della COD al tempo t; | Cs | = | concentrazione del DOC (o della COD) negli affluenti dovuta alla sostanza chimica in esame, preferibilmente stimata a partire dalla concentrazione della soluzione madre immessa (mg/l) e dal suo volume; | E | = | valore del DOC (o della COD) misurato negli effluenti di prova al tempo t (mg/l); | Eo | = | valore del DOC (o della COD) misurato negli effluenti di controllo al tempo t (mg/l). | Ripetere il calcolo per la sostanza chimica di riferimento, se sottoposta a prova. | Prestazioni del reattore di controllo | 44. | Il grado di eliminazione del DOC o della COD (DB) dal mezzo organico dell’unità di controllo è utile per valutare l’attività di biodegradazione del biofilm nel corso della prova. Calcolare la percentuale di eliminazione ricorrendo alla seguente equazione: | dove: | Cm= DOC (o COD) del mezzo organico negli affluenti di controllo (mg/l). | 45. | Calcolare l’eliminazione (DST) della sostanza in esame, se misurata, ricorrendo a un metodo di analisi specifico ad ogni misurazione, con la seguente equazione: | dove: | Si | = | concentrazione misurata o, preferibilmente, stimata della sostanza chimica in esame negli affluenti di prova (mg/l) | Se | = | concentrazione misurata della sostanza chimica in esame negli effluenti di prova al tempo t (mg/l) | Se il metodo di analisi produce un valore positivo nei liquami non arricchiti equivalente a Sc mg/l, calcolare la percentuale di eliminazione (DSC) ricorrendo alla seguente equazione: | Espressione dei risultati della prova | 46. | Tracciare su un grafico le curve dell’eliminazione Dt e DST (o DSC), se del caso, in funzione del tempo (cfr. capitolo C.10-A, appendice 2). Utilizzare la media (arrotondata all’unità più vicina) e la deviazione standard dei 12-15 valori ottenuti per DT (e per DST, se disponibile) durante la fase di plateau, come percentuale di eliminazione della sostanza in esame. A partire dall’andamento della curva di eliminazione si possono trarre alcune conclusioni sui processi di eliminazione. | Adsorbimento | 47. | Se già dall’inizio della prova si osserva una forte eliminazione della sostanza in esame in termini di DOC, la sostanza è stata probabilmente eliminata tramite adsorbimento sul biofilm. Dovrebbe essere possibile confermare tale ipotesi determinando la quantità della sostanza in esame adsorbita sui solidi distaccati dal film. È raro che l’eliminazione del DOC delle sostanze adsorbibili si mantenga elevata nel corso di tutta la prova; normalmente, il grado di eliminazione è elevato all’inizio per poi declinare progressivamente fino a raggiungere un valore di equilibrio. Tuttavia, se la sostanza chimica adsorbibile in esame fosse tale da causare, in un modo o nell’altro, un’acclimatazione della popolazione microbica, l’eliminazione del DOC della sostanza chimica aumenterebbe fino a raggiungere un elevato valore di plateau. | Fase di latenza | 48. | Molte delle sostanze chimiche in esame, analogamente a quanto avviene nelle prove di screening statiche, attraversano una fase di latenza prima che avvenga una biodegradazione a pieno regime. Nel corso della fase di latenza, l’acclimatazione o l’adattamento dei batteri degradanti avviene senza che si produca, o quasi, l’eliminazione della sostanza in esame; in seguito i batteri cominciano a proliferare. Al termine di questa fase, quando circa il 10 per cento della quantità iniziale della sostanza in esame viene eliminata (compreso anche per adsorbimento, se del caso) si suppone, arbitrariamente, che inizi la fase di degradazione. Il tempo di latenza è spesso notevolmente variabile e scarsamente riproducibile. | Fase di plateau | 49. | La fase di plateau di una curva di eliminazione in un test in continuo è definita come la fase nella quale si raggiunge il massimo livello di degradazione. La fase dovrebbe protrarsi per almeno 3 settimane ed essere determinata attraverso la misurazione di 12-15 valori validi. | Grado medio di eliminazione della sostanza chimica in esame | 50. | Calcolare il valore medio a partire dai valori di eliminazione Dt (e Dst, se disponibile) della sostanza in esame durante la fase di plateau. Arrotondata all’unità più vicina (1 %), tale media rappresenta il grado di eliminazione della sostanza in esame. Si raccomanda inoltre di calcolare l’intervallo di confidenza (95 %) del valore medio. Utilizzare lo stesso metodo per calcolare il valore medio (DB) di eliminazione del mezzo organico nel recipiente di controllo. | Indicazione della biodegradazione | 51. | Se la sostanza in esame non viene adsorbita in modo significativo sul biofilm e se la curva di eliminazione presenta il profilo tipico di una curva di biodegradazione con fasi di latenza, di degradazione e di plateau (cfr. paragrafi 48 e 49), l’eliminazione misurata può essere attribuita con certezza alla biodegradazione. Se il livello di eliminazione è alto in fase iniziale, la prova di simulazione non consente di distinguere tra i processi di eliminazione biologici e abiotici. In questi casi, come nei casi in cui la biodegradazione suscita dubbi (ad esempio, quando si osserva un fenomeno di stripping), occorre analizzare le sostanze in esame adsorbite su campioni del biofilm oppure effettuare prove di biodegradazione statiche supplementari basate su parametri che indicano chiaramente i processi biologici. Si tratta di prove che si basano sul consumo di ossigeno (capitolo C.4 del presente allegato, lettere D, E e F) o sulla produzione di CO2 (capitolo C.4-C, del presente allegato, ovvero prova del CO2 nello spazio di testa) (10); occorre usare come inoculo del biofilm pre-esposto proveniente dal reattore idoneo. | 52. | Se sono state misurate sia l’eliminazione del DOC sia l’eliminazione della sostanza chimica specifica, la presenza di differenze significative (essendo la prima inferiore alla seconda) tra le percentuali indica che gli effluenti contengono dei prodotti organici intermedi probabilmente più difficili da degradare rispetto al composto progenitore, che vanno sottoposti ad analisi. | Validità dei risultati della prova | 53. | Il test è da considerare valido se il grado di eliminazione del DOC (o della COD), DB, nelle unità di controllo è superiore all’80 % dopo due settimane e se non si osserva alcun fenomeno insolito. | 54. | Se è stata testata una sostanza (di riferimento) prontamente biodegradabile, il grado di biodegradazione deve essere superiore al 90 % e la differenza tra i valori determinati nelle repliche non deve eccedere il 5 %. Se i due criteri non vengono soddisfatti, è necessario rivedere le procedure sperimentali e/o prelevare i liquami domestici da un’altra fonte. | 55. | Analogamente, i valori di biodegradazione ottenuti nelle unità replica dove è stata trattata la sostanza in esame (se ne sono state utilizzate), non devono presentare differenze superiori al 5 %. Se questo criterio non viene rispettato ma i tassi di eliminazione sono alti, occorre continuare le analisi per altre tre settimane. Se il tasso di eliminazione è basso, si devono studiare gli effetti inibitori della sostanza chimica, se non sono già conosciuti, e ripetere la prova con una concentrazione più bassa della sostanza, se possibile. | Relazione | 56. | La relazione sulla prova deve includere le seguenti informazioni: | | Sostanza chimica in esame: | — | dati identificativi, | — | natura fisica e, se del caso, proprietà chimico-fisiche. | | Condizioni sperimentali: | — | qualsiasi modifica al sistema di prova, specialmente se vengono utilizzate sostanze insolubili o volatili, | — | tipo di mezzo organico, | — | proporzione e natura degli effluenti industriali presenti nei liquami, se l’informazione è pertinente e conosciuta, | — | modalità di inoculazione, | — | soluzione madre della sostanza in esame: tenore in DOC (carbonio organico disciolto) e TOC (carbonio organico totale); modalità di preparazione, se si tratta di una sospensione; concentrazione o concentrazioni usate per la prova; giustificare, eventualmente, i valori che si discostano dall’intervallo 10-20 mg/l di DOC; modalità di addizione; data della prima addizione; eventuali cambiamenti nella concentrazione, | — | tempo medio di ritenzione idraulica (senza crescita); velocità di rotazione del tubo; angolo di inclinazione approssimativo, se possibile, | — | dettagli sul distacco del biofilm; tempo e intensità, | — | temperatura della prova e gamma di temperature, | — | tecniche di analisi utilizzate. | | Risultati della prova: | — | tutti i dati derivanti dalle misurazioni: DOC, COD, analisi specifiche, pH, temperatura, sostanze azotate, se rilevante, | — | tutti i valori calcolati per Dt (o Dtc) DB e DS, presentati sotto forma di tabella e di curve di eliminazione, | — | informazioni sulle fasi di latenza e di plateau, la durata della prova, il grado di eliminazione della sostanza in esame, della sostanza di riferimento (se testata) e del mezzo organico (nell’unità di controllo), insieme ad informazioni statistiche e conclusioni sulla biodegradabilità e sulla validità della prova, | — | discussione dei risultati. | BIBLIOGRAFIA | (1) | Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat Res. 14: 753-758. | (2) | Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444. | (3) | Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220. | (4) | Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357. | (5) | Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94. | (6) | Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int.J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881. | (7) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London. | (8) | Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London. | (9) | Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della “pronta” (ready) biodegradabilità, lettere da A a F. | (10) | ISO 14593 (1998) Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels. | Appendice 8 | Figura 1 | Tubi rotanti | Legenda: | Vista in pianta | Vista A/B | Ruote motrici | Ruote non motrici | Motore con alimentazione | Riduttore | Flangia interna | Meccanismo d’inclinazione | Trasmissione a coppia conica | Figura 2 | Schema di flusso | A: Recipiente di alimentazione | B: Pompa peristaltica | C: Tubo rotante | D: Recipiente di raccolta degli effluenti | DEFINIZIONI | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. | Sostanza chimica (in inglese chemical): occorre notare che il termine “chemical” viene ampiamente utilizzato negli accordi UNCED e nei documenti posteriori e include sostanze, prodotti, miscele, preparazioni o qualsiasi altro termine utilizzato nei sistemi esistenti per descrivere i prodotti chimici in questione. | » | 9. | poglavje C.10 se nadomesti z naslednjim: | „C.10: SIMULACIJSKI PRESKUS ZA AEROBNO ČIŠČENJE ODPADNE VODE: C.10-A: ENOTE Z AKTIVNIM BLATOM – C.10-B: BIOFILMI | C.10-A: Enote z aktivnim blatom | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 303 (2001). V petdesetih letih prejšnjega stoletja so spoznali, da na novo uvedene površinsko aktivne snovi povzročajo čezmerno penjenje v čistilnih napravah in rekah. Te snovi z aerobnim čiščenjem niso bile v celoti odstranjene, v nekaterih primerih pa so tudi omejevale odstranjevanje drugih organskih snovi. To je sprožilo številne raziskave o tem, kako bi bilo mogoče površinsko aktivne snovi odstraniti iz odpadnih voda in ali se nove kemikalije, ki jih proizvaja industrija, pri čiščenju odpadne vode odstranijo. Za to so bili uporabljeni modeli enot, ki so predstavljali dve glavni vrsti aerobnega biološkega čiščenja odpadne vode (z aktivnim blatom in precejanjem). Zelo nepraktično in drago bi bilo, če bi vsako novo kemikalijo razširili po velikih čistilnih napravah in jo spremljali pri njih, tudi če bi se to izvajalo na lokalni ravni. | ZAČETNI PREUDARKI | Enote z aktivnim blatom | 2. | V opisih modelov enot z aktivnim blatom je navedena velikost od 300 ml do približno 2 000 ml. Nekateri modeli so bili natančni posnetki naprav v naravni velikosti z usedalniki blata, pri katerih se usedeno blato črpa nazaj v prezračevalni bazen, medtem ko so bili drugi brez usedalnikov, npr. Swisher (1). Velikost naprave je kompromis; biti mora dovolj velika za uspešno mehansko delovanje in zagotovitev zadostne količine vzorcev, ne da bi to vplivalo na delovanje, ne sme pa biti tako velika, da bi bilo potrebnega preveč prostora in materiala. | 3. | Dve obliki naprav, ki se obsežno in zadovoljivo uporabljata, sta Husmannova naprava (2) in naprava s poroznimi posodami (3) (4), ki sta se najprej uporabljali pri preučevanju površinsko aktivnih snovi in sta opisani v tej preskusni metodi. Zadovoljivo so se uporabljale tudi druge, npr. Eckenfelderjeva naprava (5). Zaradi razmeroma visokih stroškov in velikega truda pri uporabi tega simulacijskega preskusa so se vzporedno raziskovali preprostejši in cenejši presejalni preskusi, ki so zdaj vključeni v poglavje C.4, A–F, te priloge (6). Izkušnje s številnimi površinsko aktivnimi snovmi in drugimi kemikalijami so pokazale, da so se tiste, ki so uspešno opravile presejalne preskuse (dobra biološka razgradljivost), razgradile tudi pri simulacijskem preskusu. Nekatere od tistih, ki presejalnih preskusov niso uspešno opravile, so uspešno opravile preskuse inherentne biološke razgradljivosti (poglavji C.12 (7) in C.19 (8) te priloge), vendar so se samo nekatere iz zadnje skupine razgradile pri simulacijskem preskusu, medtem ko se kemikalije, ki niso uspešno opravile preskusov inherentne biološke razgradljivosti, pri simulacijskih preskusih niso razgradile (9) (10) (11). | 4. | Za nekatere namene zadostujejo simulacijski preskusi, opravljeni na podlagi enega samega niza obratovalnih pogojev; rezultati so izraženi kot odstotni delež odstranitve preskusne kemikalije ali raztopljenega organskega ogljika (DOC). Tak preskus je opisan v tej preskusni metodi. Vendar v nasprotju s prejšnjo različico tega poglavja, v kateri je bila opisana samo ena vrsta naprave za čiščenje sintetične odpadne vode v sistemu spojenih enot, pri katerem se je uporabljala razmeroma preprosta metoda odvajanja blata, to besedilo ponuja vrsto različnih možnosti. Opisane so različne možnosti glede na vrsto naprave, način delovanja, odpadno vodo in način odvajanja blata. To besedilo natančno sledi besedilu standarda ISO 11733 (12), ki je bil med njegovo pripravo natančno pregledan, čeprav metoda ni bila predmet krožnega testa. | 5. | Za druge namene mora biti koncentracija preskusne kemikalije v iztoku natančneje znana; za kar pa je potrebna celovitejša metoda. Na primer, hitrost odvajanja blata je treba natančneje kontrolirati ves dan in skozi celoten preskus, naprave pa morajo obratovati pri različnih hitrostih odvajanja blata. Vsestransko celovita metoda zahteva, da se preskusi izvedejo tudi pri dveh ali treh različnih temperaturah: tako metodo je opisal Birch (13) (14) in je povzeta v Dodatku 6. Vendar sedanje znanje ne zadostuje za odločitev, kateri od kinetičnih modelov so uporabni za biološko razgradnjo kemikalij pri čiščenju odpadnih voda in v vodnem okolju na splošno. Uporaba Monodove kinetike, ki je v Dodatku 6 navedena kot primer, je omejena na kemikalije, katerih koncentracija je vsaj 1 mg/l, vendar je po mnenju nekaterih celo to še treba utemeljiti. Preskusi pri koncentracijah, ki so bolj podobne tistim iz odpadnih voda, so navedeni v Dodatku 7, vendar so taki preskusi in preskusi v Dodatku 6 vključeni v dodatke in niso obravnavani kot ločene preskusne metode. | Filtri | 6. | Mnogo manj pozornosti je bilo namenjene modelom precejalnih filtrov, morda zato, ker so bolj nerodni in manj kompaktni kot modeli čistilnih naprav z aktivnim blatom. Gerike idr. so razvili enote s precejalniki in jih uporabili v sistemu spojenih enot (15). Ti filtri so bili razmeroma veliki (višina 2 m; prostornina 60 l), tako da sta bila za vsakega potrebna kar 2 l/h odpadne vode. Baumann idr. (16) so precejalne filtre simulirali tako, da so trakove iz poliestrske ‚volne‘ najprej za 30 minut namočili v koncentrirano aktivno blato, nato pa jih vstavili v enometrske cevi (z notranjim premerom 14 mm). Preskusna kemikalija je bila kot edini vir ogljika v raztopini mineralnih snovi spuščena po navpični cevi, biološka razgradnja pa je bila ocenjena na podlagi meritev DOC v iztoku in CO2 v nastalem plinu. | 7. | Biofiltri so bili simulirani drugače (15); skozi vrteče se cevi, nagnjene pod majhnim kotom glede na vodoravno ploskev, je bila spuščena odpadna voda (približno 250 ml/h) s preskusno kemikalijo in brez nje, v zbranih iztokih pa sta bila analizirana DOC in/ali določena preskusna kemikalija. | NAČELO PRESKUSA | 8. | Ta metoda je zasnovana za določitev odstranitve ter primarne in/ali končne biološke razgradnje vodotopnih organskih kemikalij z aerobnimi mikroorganizmi v kontinuirano delujočem preskusnem sistemu, ki simulira proces z aktivnim blatom. Lahko biološko razgradljiv organski medij in organska preskusna kemikalija sta vira ogljika in energije za mikroorganizme. | 9. | Dve kontinuirano delujoči preskusni enoti (napravi z aktivnim blatom ali porozni posodi) obratujeta vzporedno v enakih pogojih, ki so izbrani glede na namen preskusa. Običajno je srednji hidravlični zadrževalni čas 6 h, srednja starost blata (zadrževalni čas blata) pa 6 do 10 dni. Blato se odvaja po eni od dveh metod, preskusna kemikalija pa se običajno doda v koncentraciji 10 mg/l do 20 mg/l raztopljenega organskega ogljika (DOC) v pritok (organskemu mediju) ene od enot. Druga enota se uporablja kot kontrolna enota za določitev biološke razgradnje organskega medija. | 10. | V pogosto vzetih vzorcih iztokov se s specifično analizo določi po možnosti DOC ali kemijska potreba po kisiku (KPK) ter koncentracija preskusne kemikalije (po potrebi) v iztoku iz enote, v katero se dovaja preskusna kemikalija. Domneva se, da razlika med koncentracijama DOC ali KPK v iztoku iz preskusne in kontrolne enote nastane zaradi preskusne kemikalije ali njenih organskih metabolitov. Ta razlika se primerja s koncentracijo DOC ali KPK v pritoku zaradi dodane preskusne kemikalije, da se ugotovi odstranitev preskusne kemikalije. | 11. | Biološko razgradnjo je običajno mogoče ločiti od biološke adsorpcije s skrbno preučitvijo časovne krivulje odstranitve in jo je običajno mogoče potrditi s preskusom dobre biološke razgradljivosti, pri katerem se uporabi aklimatizirani inokulum iz naprave, v katero se dovaja preskusna kemikalija. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 12. | Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani čistost, vodotopnost, hlapnost in adsorpcijske lastnosti preskusne kemikalije. Hlapnih in netopnih kemikalij običajno ni mogoče preskusiti, če se ne sprejmejo posebni previdnostni ukrepi (glej Dodatek 5). Za izračun teoretičnih vrednosti in/ali preverjanje izmerjenih vrednosti parametrov, npr. teoretične potrebe po kisiku (TPK), raztopljenega organskega ogljika (DOC) in kemijske potrebe po kisiku (KPK), je treba poznati kemično strukturo ali vsaj empirično formulo. | 13. | Informacije o strupenosti preskusne kemikalije za mikroorganizme (glej Dodatek 4) so lahko uporabne za izbiro primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgradljivosti. | RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA | 14. | Pri prvotni uporabi tega simulacijskega (potrditvenega) preskusa za primarno biološko razgradnjo površinsko aktivnih snovi se zahteva več kot 80-odstotna odstranitev določene kemikalije, preden se lahko površinsko aktivna snov da na trg. Če 80-odstotna vrednost ni dosežena, se ta simulacijski (potrditveni) preskus lahko uporabi, površinsko aktivna snov pa se lahko da na trg samo, če je odstranjenih več kot 90 % določene kemikalije. Pri kemikalijah na splošno ni dvoma o uspešno ali neuspešno opravljenem preskusu, dobljena vrednost deleža odstranitve v odstotkih pa se lahko uporabi v približnih izračunih verjetne okoljske koncentracije, ki bo uporabljena pri ocenah nevarnosti, ki jo pomenijo kemikalije. Rezultati navadno sledijo vzorcu vse ali nič. V vrsti raziskav čistih kemikalij je bilo ugotovljeno, da je bil delež odstranitve DOC > 90-odstotni pri več kot treh četrtinah in > 80-odstotni pri več kot 90 % kemikalij, ki so pokazale kakršno koli značilno stopnjo biološke razgradljivosti. | 15. | V odpadnih vodah je razmeroma malo kemikalij (npr. površinsko aktivnih snovi) prisotnih v koncentracijah (približno 10 mg C/l), uporabljenih pri tem preskusu. Nekatere kemikalije so lahko pri teh koncentracijah zaviralne, medtem ko je lahko kinetika odstranjevanja drugih pri nizkih koncentracijah drugačna. Natančnejša ocena razgradnje bi bila mogoča s spremenjenimi metodami, pri katerih bi se uporabile realno nizke koncentracije preskusne kemikalije, zbrani podatki pa bi se lahko uporabili za izračun kinetičnih konstant. Vendar potrebne poskusne tehnike še niso bile v celoti potrjene niti niso bili vzpostavljeni kinetični modeli, ki opisujejo biološko razgradne reakcije (glej Dodatek 7). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 16. | Za zagotovitev pravilnega izvajanja poskusnega postopka je koristno, da se hkrati s preučevanjem preskusnih kemikalij občasno preskusijo kemikalije, katerih obnašanje je znano. Med takimi kemikalijami so adipinska kislina, 2-fenilfenol, 1-naftol, difenil-2,2-dikarboksilna kislina in 1-karboksi naftalenska kislina (9) (10) (11). | OBNOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA | 17. | O raziskavah simulacijskih preskusov je veliko manj poročil kot o preskusih lahke biološke razgradljivosti. Ponovljivost pri (sočasnih) ponovitvah je dobra (med 10- in 15-odstotna) pri preskusnih kemikalijah, katerih razgradnja je 80- ali več odstotna, vendar pa je pri kemikalijah, pri katerih razgradnja ni tako dobra, variabilnost večja. Prav tako so bili pri nekaterih mejnih kemikalijah dobljeni zelo različni rezultati (npr. 10 %, 90 %) ob različnih časih v obdobju devetih tednov, ki je dopuščeno za preskus. | 18. | Pri rezultatih, pridobljenih z dvema vrstama naprave, so bile razlike majhne, vendar pa so se nekatere kemikalije bolj in dosledneje razgrajevale pri gospodinjski odpadni vodi kot pri sintetični odpadni vodi OECD. | OPIS PRESKUSNE METODE | Naprava | Preskusni sistem | 19. | Preskusni sistem za eno preskusno kemikalijo sestavljata preskusna in kontrolna enota; če se izvajajo samo specifične analize (primarna biološka razgradnja), je potrebna samo preskusna enota. Ena kontrolna enota se lahko uporablja za več preskusnih enot, ki prejemajo enake ali različne preskusne kemikalije. V primeru sistema spojenih enot (Dodatek 3) mora imeti vsaka preskusna enota svojo kontrolno enoto. Preskusni sistem je lahko model čistilne naprave z aktivnim blatom, Husmannova naprava (Dodatek 1, slika 1) ali porozna posoda (Dodatek 1, slika 2). V obeh primerih so potrebne dovolj velike posode za shranjevanje pritokov in iztokov ter črpalke za odmerjanje pritoka, bodisi zmešanega z raztopino preskusne kemikalije bodisi ločenega. | 20. | Vsako čistilno napravo z aktivnim blatom sestavljata prezračevalna posoda z znano prostornino približno 3 litrov aktivnega blata in usedalnik (sekundarni bistrilnik) s prostornino približno 1,5 litra; prostornini se lahko deloma spremenita z nastavitvijo višine usedalnika. Dopustne so posode drugačnih velikosti, če delujejo s primerljivimi hidravličnimi obremenitvami. Če temperature v preskusnem prostoru ni mogoče ohranjati v želenem razponu, se priporoča uporaba posod z vodnim plaščem z nadzorovano temperaturo. Za recikliranje aktivnega blata iz usedalnika v prezračevalno posodo, bodisi kontinuirano bodisi v rednih presledkih, se uporablja črpalka ‚airlift‘ ali dozirna črpalka. | 21. | Sistem poroznih posod je sestavljen iz notranjega poroznega valja s stožčastim dnom, ki stoji v nekoliko večji posodi enake oblike, narejeni iz neprepustnega plastičnega materiala. Primeren material za porozno posodo je porozni polietilen z največjo velikostjo por 90 μm in debelino 2 mm. Blato se iz obdelanega organskega medija se ločuje z diferencialnim prehodom skozi porozno steno. Iztoki se zbirajo v krožnem prostoru, od koder se prelivajo v zbiralnik. Usedanja ni, zato se blato ne vrača. Celotni sistem se lahko namesti v vodno kopel, nadzorovano s termostatom. Porozne posode se zamašijo, zato lahko v začetnih fazah pride do razlivanja. V takem primeru je treba porozni vložek zamenjati s čistim, pri čemer se blato najprej izčrpa iz posode v čisto vedro, nato pa se odstrani zamašeni vložek. Ko je neprepustni zunanji valj očiščen, se vstavi čist vložek, blato pa se vrne v posodo. Prav tako je treba skrbno postrgati in prenesti blato, ki se je prijelo ob straneh zamašenega vložka. Zamašene posode se najprej očistijo s tankim curkom vode, da se odstrani preostalo blato, zatem se namočijo v razredčeno raztopino natrijevega hipoklorita in nato v vodo, nazadnje pa se temeljito sperejo z vodo. | 22. | Za prezračevanje blata v prezračevalnih posodah obeh sistemov so potrebne primerne tehnike, na primer sintrane kocke (difuzorji) in stisnjen zrak. Zrak se po potrebi očisti tako, da prehaja skozi primeren filter in nato opere. Skozi sistem mora prehajati zadostna količina zraka, da se vzdržujejo aerobni pogoji in da se kosmi blata ves čas preskusa ohranjajo v suspenziji. | Naprava za filtriranje ali centrifuga | 23. | Naprava za filtriranje vzorcev z membranskimi filtri ustrezne poroznosti (nazivni premer odprtine 0,45 μm), ki adsorbirajo topne organske kemikalije in sprostijo čim manj organskega ogljika. Če se uporabljajo filtri, ki sproščajo organski ogljik, jih je treba skrbno sprati z vročo vodo, da se odstrani izlužljivi organski ogljik. Namesto tega se lahko uporabi centrifuga, ki lahko doseže 40 000 m/s2. | Analitska oprema | 24. | Naprava, potrebna za določitev: | — | DOC (raztopljenega organskega ogljika) in TOC (celotnega organskega ogljika) ali KPK (kemijske potrebe po kisiku), | — | določene kemikalije, če se to zahteva, | — | suspendiranih trdnih snovi, vrednosti pH, koncentracije kisika v vodi, | — | temperature, kislosti in bazičnosti, | — | amonija, nitrita in nitrata, če se preskus izvaja v nitrifikacijskih pogojih. | Voda | 25. | Vodovodna voda, ki vsebuje manj kot 3 mg/l DOC. Če bazičnost še ni znana, jo je treba določiti. | 26. | Deionizirana voda, ki vsebuje manj kot 2 mg/l DOC. | Organski medij | 27. | Kot organski medij so dovoljene sintetične odpadne vode, gospodinjske odpadne vode ali oboje. Izkazalo se je (11) (14), da je pri uporabi samo gospodinjske odpadne vode delež odstranitve DOC pogosto večji ter da celo omogoča odstranitev in biološko razgradnjo nekaterih kemikalij, ki se biološko ne razgradijo, kadar se uporabi sintetična odpadna voda OECD. Prav tako stalno ali občasno dodajanje gospodinjske odpadne vode pogosto stabilizira aktivno blato, vključno z bistveno zmožnostjo dobrega usedanja. Zato se priporoča uporaba gospodinjske odpadne vode. Koncentracijo DOC ali KPK je treba izmeriti v vsaki novi šarži organskega medija. Poznati je treba njegovo kislost ali bazičnost. Pri nizki kislosti ali bazičnosti mu je morda treba dodati primeren pufer (natrijev hidrogen karbonat ali kalijev dihidrogen fosfat), da se med preskusom vrednost pH v prezračevalni posodi ohranja pri približno 7,5 ± 0,5. O količini puferja, ki jo je treba dodati, in času, ko ga je treba dodati, je treba odločiti v vsakem primeru posebej. Kadar se bodisi redno bodisi občasno uporabljajo zmesi, je treba ohranjati približno konstantno vrednost DOC (ali KPK) v zmesi, npr. z redčenjem z vodo. | Sintetična odpadna voda | 28. | V vsakem litru vodovodne vode je treba raztopiti: 160 mg peptona; 110 mg mesnega ekstrakta; 30 mg sečnine; 28 mg brezvodnega dikalijevega hidrogen fosfata (K2HPO4); 7 mg natrijevega klorida (NaCl); 4 mg kalcijevega klorid dihidrata (CaCl2.2H2O) in 2 mg magnezijevega sulfat heptahidrata (Mg2SO4.7H20). Ta sintetična odpadna voda OECD je primer in predstavlja srednjo koncentracijo DOC v pritoku, ki znaša približno 100 mg/l. Uporabijo se lahko tudi druge sestave s približno enako koncentracijo DOC, ki so bolj podobne pravi odpadni vodi. Če je potreben manj koncentriran pritok, je treba sintetično odpadno vodo razredčiti z vodovodno vodo, na primer v razmerju 1 : 1, da nastane koncentracija približno 50 mg/l. Tak šibkejši pritok bo omogočal boljšo rast nitirifikacijskih organizmov, zato je treba to spremembo uporabiti pri simulacijskem preskušanju čistilnih naprav z nitrifikacijo. Ta sintetična odpadna voda se lahko pripravi v destilirani vodi v koncentrirani obliki in shranjuje največ en teden pri približno 1 °C. Po potrebi se razredči z vodovodno vodo. (Ta medij je nezadovoljiv, npr. koncentracija dušika je zelo visoka, vsebnost ogljika je razmeroma nizka, vendar ni bilo predlaganega nič boljšega, razen naj se doda več fosfata kot puferja in dodatni pepton.) | Gospodinjska odpadna voda | 29. | Uporabiti je treba svežo usedeno odpadno vodo, ki se dnevno zbira iz čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno gospodinjska odpadna voda. Pred primarnim usedanjem jo je treba odvzeti iz prelivnega kanala primarnega usedalnika ali vtoka v čistilno napravo z aktivnim blatom, biti pa mora večinoma brez grobih delcev. Odpadna voda se lahko uporabi po večdnevnem shranjevanju (ki na splošno ne sme trajati več kot 7 dni) pri približno 4 °C, če je dokazano, da se DOC (ali KPK) med shranjevanjem ni bistveno zmanjšal (tj. za manj kot 20 %). Da se omejijo motnje v sistemu, je treba DOC (ali KPK) vsake nove šarže pred uporabo uravnati na ustrezno konstantno vrednost, npr. z redčenjem z vodovodno vodo. | Aktivno blato | 30. | Aktivno blato za inokulacijo je treba zbrati iz prezračevalnega bazena dobro delujoče čistilne naprave ali laboratorijske enote z aktivnim blatom, v kateri se čistijo predvsem gospodinjske odpadne vode. | Založne raztopine preskusne kemikalije | 31. | Za kemikalije z ustrezno topnostjo je treba pripraviti osnovne raztopine z ustreznimi koncentracijami (npr. 1 do 5 g/l) v deionizirani vodi ali mineralnem deležu sintetične odpadne vode (za netopne in hlapne kemikalije glej Dodatek 5). Določiti je treba DOC in celotni organski ogljik (TOC) osnovne raztopine, meritve pa ponoviti za vsako novo šaržo. Če je razlika med DOC in TOC večja od 20 %, je treba preveriti vodotopnost preskusne kemikalije. DOC ali koncentracijo preskusne kemikalije, izmerjeno s specifično analizo osnovne raztopine, je treba primerjati z nazivno vrednostjo, da se ugotovi, ali je izkoristek dovolj dober (običajno je mogoče pričakovati > 90-odstotni izkoristek). Zlasti za disperzije je treba ugotoviti, ali je mogoče DOC uporabiti kot analitski parameter ali ne oziroma ali je mogoče uporabiti samo analitsko tehniko, specifično za preskusno kemikalijo. Za disperzije je potrebno centrifugiranje vzorcev. Pri vsaki novi šarži je treba s specifično analizo izmeriti DOC, KPK ali preskusno kemikalijo. | 32. | Določiti je treba pH osnovne raztopine. Skrajne vrednosti kažejo, da lahko dodatek kemikalije vpliva na pH aktivnega blata v preskusnem sistemu. V takem primeru je treba osnovno raztopino nevtralizirati z majhnimi količinami anorganske kisline ali baze, da se doseže vrednost pH 7 ± 0,5, vendar pa je treba preprečiti obarjanje preskusne kemikalije. | POSTOPEK | 33. | Opisan je postopek za naprave z aktivnim blatom; za sistem s poroznimi posodami ga je treba nekoliko prilagoditi. | Priprava inokuluma | 34. | Na začetku preskusa je treba preskusni sistem inokulirati bodisi z aktivnim blatom bodisi z inokulumom, ki vsebuje nizko koncentracijo mikroorganizmov. Inokulum je treba do začetka uporabe prezračevati pri sobni temperaturi in ga uporabiti v 24 urah. V prvem primeru se vzorec aktivnega blata vzame iz prezračevalnega bazena učinkovito delujoče biološke čistilne naprave ali laboratorijske čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno gospodinjska odpadna voda. Če je treba simulirati nitrifikacijske pogoje, se blato vzame iz čistilne naprave, v kateri poteka nitrifikacija. Določiti je treba koncentracijo suspendiranih trdnih snovi in po potrebi blato zgostiti z usedanjem, tako da je količina, ki se doda v preskusni sistem, minimalna. Zagotoviti je treba, da je začetna koncentracija suhe snovi približno 2,5 g/l. | 35. | V drugem primeru se kot inokulum uporabi 2 ml/l do 10 ml/l iztoka iz biološke čistilne naprave za gospodinjske odpadne vode. Da bi dobili čim več različnih vrst bakterij, je lahko koristno, če se dodajo inokulumi iz različnih drugih virov, na primer iz površinske vode. V tem primeru se bo aktivno blato razvijalo in raslo v preskusnem sistemu. | Odmerjanje organskega medija | 36. | Zagotoviti je treba, da so posode za pritok in iztok ter cevi, ki vodijo iz posod za pritok in v posode za iztok, povsem čiste, da se prepreči rast mikrobov na začetku in med celotnim preskusom. Preskusne sisteme je treba sestaviti v prostoru z nadzorovano temperaturo (običajno 20 do 25 °C) ali pa je treba uporabiti preskusne enote z vodnim plaščem. Pripraviti je treba zadostno količino potrebnega organskega medija (odstavki 27 do 29). Najprej se z organskim medijem napolnita prezračevalna posoda in usedalnik, nato se doda inokulum (odstavka 34 in 35). Začne se prezračevanje, tako da se blato ohranja v suspenziji in v aerobnem stanju; nato se začne odmerjanje pritoka in recikliranje usedenega blata. Organski medij se odmerja iz posod za shranjevanje v prezračevalne posode (odstavka 20 in 21) preskusne in kontrolne enote, ustrezni iztoki pa se zbirajo v podobne posode za shranjevanje. Da bi dobili običajni hidravlični zadrževalni čas 6 h, se organski medij črpa s pretokom 0,5 l/h. Za potrditev tega pretoka je treba izmeriti dnevno količino odmerjenega organskega medija, tako da se zapiše zmanjšanje prostornine medija v posodah za shranjevanje. Za določitev učinkov občasnega spuščanja ali ‚udarne‘ obremenitve s kemikalijami bi bili potrebni drugi načini odmerjanja. | 37. | Če je organski medij pripravljen za uporabo več kot 1 dan, je potrebno hlajenje pri približno 4 °C ali druge ustrezne metode ohranjanja, da se preprečita rast mikrobov in biološka razgradnja zunaj preskusnih enot (odstavek 29). Če se uporablja sintetična odpadna voda, je mogoče pripraviti koncentrirano osnovno raztopino (npr. 10-kratnik običajne koncentracije, odstavek 28) in jo shranjevati pri približno 4 °C. Ta osnovna raztopina se lahko pred uporabo dobro zmeša z ustrezno količino vodovodne vode, lahko pa se tudi črpa neposredno, medtem ko se ustrezna količina vodovodne vode črpa ločeno. | Odmerjanje preskusne kemikalije | 38. | Ustrezna količina osnovne raztopine preskusne kemikalije (odstavek 31) se doda v posodo za shranjevanje pritoka ali pa se s posebno črpalko odmeri neposredno v prezračevalno posodo. Običajna srednja preskusna koncentracija v pritoku mora biti med 10 mg/l in 20 mg/l DOC, zgornja koncentracija pa ne sme presegati 50 mg/l. Če je preskusna kemikalija slabo topna v vodi ali če obstaja velika možnost za nastanek strupenih učinkov, je treba koncentracijo zmanjšati na 5 mg/l DOC ali celo manj, vendar samo če je na voljo in izvedena primerna specifična analitska metoda (s posebnimi tehnikami odmerjanja se lahko dodajo dispergirane preskusne kemikalije, ki so slabo topne v vodi, glej Dodatek 5). | 39. | Potem ko se sistem stabilizira in učinkovito odstranjuje DOC organskega medija (približno 80 %), se začne dodajati preskusna kemikalija. Pred tem je treba preveriti, ali vse enote delujejo enako učinkovito; če ne, običajno pomaga, če se posamezna blata zmešajo in se v posamezne enote znova razdelijo enake količine. Kadar se uporabi inokulum iz (približno) 2,5 g/l (suhe teže) aktivnega blata, se lahko preskusna kemikalija dodaja od začetka preskusa, saj neposredno dodajanje vedno večjih količin od začetka omogoča, da se lahko aktivno blato bolje prilagodi preskusni kemikaliji. Ne glede na način dodajanja preskusne kemikalije je priporočljivo, da se v rednih presledkih merijo ustrezni pretok in/ali prostornine v posodah za shranjevanje. | Ravnanje z aktivnim blatom | 40. | Koncentracija trdnih snovi v aktivnem blatu se med preskusom običajno stabilizira znotraj omejitev ne glede na uporabljeni inokulum, in sicer znaša 1 do 3 g/l (suhe teže), odvisno od kakovosti in koncentracije organskega medija, obratovalnih pogojev, narave prisotnih mikroorganizmov in vpliva preskusne kemikalije. | 41. | Treba je bodisi vsaj tedensko določiti suspendirane trdne snovi v prezračevalnih posodah in odstraniti odvečno blato, da se ohrani koncentracija 1 do 3 g/l (suhe teže), bodisi vzdrževati srednjo starost blata pri konstantni vrednosti, običajno v razponu 6 do 10 dni. Če je na primer izbran zadrževalni čas blata 8 dni, je treba vsak dan odstraniti 1/8 aktivnega blata v prezračevalni posodi in ga zavreči. To je treba izvajati vsak dan, po možnosti s samodejno črpalko, ki deluje v presledkih. Z vzdrževanjem konstantne koncentracije suspendiranih trdnih snovi ali vzdrževanjem te koncentracije v ozkih mejah se ne vzdržuje konstantni zadrževalni čas blata (SRT), ki je obratovalna spremenljivka, ki določa vrednost koncentracije preskusne kemikalije v iztoku. | 42. | Med celotnim preskusom je treba vsaj enkrat na dan odstraniti vse blato, ki se prime na stene prezračevalne posode in usedalnika, tako da se znova suspendira. Redno je treba preverjati in čistiti vse cevi, da se prepreči rast biofilma. Usedeno blato iz usedalnika je treba reciklirati v prezračevalno posodo, po možnosti s črpanjem v presledkih. V sistemu poroznih posod recikliranja ni, vendar je treba zagotoviti, da se vstavijo čiste notranje posode, preden se prostornina v posodi znatno poveča (odstavek 21). | 43. | V Husmannovih enotah lahko pride do slabega usedanja in izgube blata. To je mogoče popraviti z enim ali več spodaj navedenimi ukrepi, ki se izvedejo sočasno v preskusni in kontrolni enoti: | — | v rednih presledkih, npr. tedensko, se lahko dodaja sveže blato ali flokulant (na primer 2 ml/posodo 50 g/l FeCl3), vendar se je treba prepričati, da ne pride do reakcije ali obarjanja preskusne kemikalije s FeCl3, | — | črpalka ‚airlift‘ se lahko nadomesti s peristaltično črpalko, s čimer se omogočita pretok reciklata, ki je približno enak pretoku pritoka, ki ga je treba uporabiti, in razvoj anaerobnega območja v usedenem blatu (geometrija črpalke ‚airlift‘ omejuje minimalni pretok povratnega blata na približno 12-kratnik pretoka pritoka), | — | blato se lahko v presledkih črpa iz usedalnika v prezračevalno posodo (npr. 5 minut vsake 2,5 h, da se reciklira od 1 l/h do 1,5 l/h), | — | za preprečitev izgube zaradi penjenja se lahko uporabi nestrupeno sredstvo proti penjenju v minimalni koncentraciji (npr. silikonsko olje), | — | skozi blato v usedalniku se lahko v kratkih udarnih curkih spušča zrak (npr. 10 sekund vsako uro), | — | organski medij se lahko v prezračevalno posodo odmerja v presledkih (npr. od 3 do 10 minut vsako uro). | Vzorčenje in analiza | 44. | V rednih presledkih je treba meriti koncentracijo raztopljenega kisika, temperaturo in vrednost pH aktivnega blata v prezračevalnih posodah. Zagotoviti je treba, da je vedno na voljo dovolj kisika (> 2 mg/l) in da se temperatura vzdržuje v zahtevanem obsegu (običajno 20 do 25 °C). Vrednost pH je treba vzdrževati pri 7,5 ± 0,5 z odmerjanjem majhnih količin anorganske baze ali kisline v prezračevalno posodo ali pritok ali s povečevanjem puferske sposobnosti organskega medija (glej odstavek 27). Pri nitrifikaciji nastane kislina, pri čemer pri oksidaciji 1 mg N nastane ekvivalent približno 7 mg CO3 –. Pogostost meritev je odvisna od parametra, ki ga je treba izmeriti, in stabilnosti sistema, lahko pa se izvajajo dnevno ali tedensko. | 45. | Izmeriti je treba DOC ali KPK v pritokih v kontrolne in preskusne posode. S specifično analizo je treba izmeriti koncentracijo preskusne kemikalije v preskusnem pritoku ali jo oceniti na podlagi koncentracije v osnovni raztopini (odstavek 31), uporabljene količine in količine odpadne vode, odmerjene v preskusno enoto. Priporočljivo je, da se koncentracija preskusne kemikalije izračuna, da se zmanjša variabilnost podatkov o koncentraciji. | 46. | Iz zbranega iztoka je treba vzeti primerne vzorce (npr. 24-urne sestavljene vzorce) in jih filtrirati skozi membrano z velikostjo por 0,45 μm ali jih približno 15 minut centrifugirati pri približno 40 000 m/s2. Centrifugiranje je treba uporabiti, če je filtriranje težavno. DOC ali KPK je treba določiti vsaj v dveh ponovitvah, da se s specifično analizo za preskusno kemikalijo izmeri končna biološka razgradnja in po potrebi primarna biološka razgradnja. | 47. | Uporaba KPK lahko pri nizkih koncentracijah povzroči analitične težave, zato se priporoča samo, če je uporabljena dovolj visoka preskusna koncentracija (približno 30 mg/l). Prav tako se za kemikalije, ki se močno adsorbirajo, priporoča, da se količina adsorbirane kemikalije v blatu izmeri z analitsko tehniko, specifično za preskusno kemikalijo. | 48. | Pogostost vzorčenja je odvisna od pričakovanega trajanja preskusa. Priporoča se vzorčenje trikrat na teden. Ko enote učinkovito delujejo, je treba omogočiti prilagajanje, ki traja od 1 do največ 6 tednov po vnosu preskusne kemikalije, da se doseže stabilno stanje. Po možnosti je treba za oceno rezultata preskusa pridobiti najmanj 15 veljavnih vrednosti v fazi konstantne ravni (odstavek 59), ki običajno traja 3 tedne. Preskus se lahko konča, če je dosežena zadostna stopnja odstranitve (npr. > 90-odstotna) in je na voljo teh 15 vrednosti, ki predstavljajo analize, ki so se 3 tedne izvajale vsak delovni dan. Običajno preskus ne sme trajati več kot 12 tednov po tem, ko je bila dodana preskusna kemikalija. | 49. | Če se v blatu začne nitrifikacija in je treba preučiti učinke preskusne kemikalije na nitrifikacijo, je treba vzorce iz iztoka preskusne in kontrolne enote vsaj enkrat tedensko analizirati za določitev amonija in/ali nitrita in nitrata. | 50. | Vse analize je treba izvesti čim prej, zlasti določitve dušika. Če je treba analize odložiti, je treba vzorce shraniti v temnem prostoru v polnih in tesno zaprtih steklenicah pri približno 4 °C. Če je treba vzorce shraniti za več kot 48 h, jih je treba globoko zamrzniti, acidificirati (npr. 10 ml/l raztopine 400 g/l žveplove kisline) ali dodati primerno strupeno snov (npr. 20 ml/l raztopine 10 g/l živosrebrovega (II) klorida). Zagotoviti je treba, da tehnika shranjevanja ne vpliva na rezultate analize. | Spajanje preskusnih enot | 51. | Če bodo uporabljene spojene enote (Dodatek 3), je treba dnevno izmenjati enako količino aktivnega blata (150 ml do 1 500 ml za prezračevalne posode, ki vsebujejo 3 litre suspenzije) med prezračevalnimi posodami preskusne enote in njene kontrolne enote. Če se preskusna kemikalija močno adsorbira na blato, je treba zamenjati samo supernatant iz usedalnikov. V obeh primerih je treba za izračun rezultatov preskusa uporabiti korekcijski faktor (odstavek 55). | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 52. | Za vsako časovno določeno oceno se izračuna delež odstranitve DOC ali KPK preskusne kemikalije, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | Dt | = | odstotni delež odstranitve DOC ali KPK v času t, | Cs | = | DOC ali KPK v pritoku zaradi preskusne kemikalije, po možnosti ocenjen na podlagi osnovne raztopine (mg/l), | E | = | izmerjena vrednost DOC ali KPK v preskusnem iztoku v času t (mg/l), | Eo | = | izmerjena vrednost DOC ali KPK v kontrolnem iztoku v času t (mg/l). | 53. | Stopnja odstranitve DOC ali KPK organskega medija v kontrolni enoti je koristna informacija pri oceni biorazgradne dejavnosti aktivnega blata med preskusom. Delež odstranitve se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | DB | = | odstotni delež odstranitve DOC ali KPK organskega medija v kontrolni enoti v času t, | CM | = | DOC ali KPK organskega medija v kontrolnem pritoku (mg/l). | Po želji se lahko izračuna tudi delež odstranitve DOC ali KPK zaradi organskega medija in preskusne kemikalije v preskusni enoti, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | DT | = | odstotni delež odstranitve DOC ali KPK celotnega preskusnega pritoka, | CT | = | DOC ali KPK celotnega preskusnega pritoka ali izračunan na podlagi osnovnih raztopin (mg/l). | 54. | Pri vsaki časovno določeni oceni se izračuna odstranitev preskusne kemikalije, če je bila izmerjena s specifično analitsko metodo, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | DST | = | odstotni delež primarne odstranitve preskusne kemikalije v času t, | Si | = | izmerjena ali ocenjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem pritoku (mg/l), | Se | = | izmerjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem iztoku v času t (mg/l). | 55. | Če je bil uporabljen sistem spojenih enot, je treba razredčenje preskusne kemikalije v prezračevalni posodi zaradi izmenjave blata izravnati s korekcijskim faktorjem (glej Dodatek 3). Če sta bila uporabljena srednji hidravlični zadrževalni čas 6 h in izmenjava polovice količine aktivnega blata v prezračevalni posodi, je treba določene vrednosti dnevne odstranitve (Dt, odstavek 52) popraviti, da se izračuna dejanska stopnja odstranitve, Dtc, preskusne kemikalije, za kar se uporabi enačba: | Izražanje rezultatov preskusa | 56. | Delež odstranitve Dt (ali Dtc) in Dst, če je na voljo, se prikaže grafično v odvisnosti od časa (glej Dodatek 2). Na podlagi oblike krivulje odstranitve preskusne kemikalije (per se ali kot DOC) se lahko izpeljejo nekatere ugotovitve o procesu odstranjevanja. | Adsorpcija | 57. | Če se velika odstranitev DOC pri preskusni kemikaliji opazi na začetku preskusa, se preskusna kemikalija verjetno odstranjuje z adsorpcijo na trdne snovi aktivnega blata. To je mogoče dokazati z določitvijo adsorbirane preskusne kemikalije s specifično analizo. Odstranitev DOC pri kemikalijah, ki se adsorbirajo, redko ostane visoka med celotnim preskusom; po navadi je stopnja odstranitve visoka na začetku, nato postopoma pade na ravnotežno vrednost. Če pa bi lahko preskusna kemikalija, ki se adsorbira, tako ali drugače povzročila aklimatizacijo mikrobne populacije, bi se odstranitev DOC pri preskusni kemikaliji povečala in dosegla visoko vrednost konstantne ravni. | Faza prilagajanja | 58. | Kot pri statičnih presejalnih preskusih je pri številnih preskusnih kemikalijah pred popolno biološko razgradnjo potrebna faza prilagajanja. V njej se bakterije, ki razgrajujejo, aklimatizirajo ali prilagodijo skoraj brez odstranjevanja preskusne kemikalije; nato nastopi začetna rast teh bakterij. Ta faza se konča, za fazo razgradnje pa se šteje, da se je začela, ko je odstranjenih približno 10 % začetne količine preskusne kemikalije (po dopuščeni adsorpciji, če se zgodi). Faza prilagajanja je pogosto zelo spremenljiva in težko ponovljiva. | Faza konstantne ravni | 59. | Faza konstantne ravni krivulje odstranjevanja v kontinuiranem preskusu je opredeljena kot faza, v kateri je razgradnja največja. Trajati mora vsaj 3 tedne in imeti približno 15 izmerjenih veljavnih vrednosti. | Srednja stopnja odstranitve preskusne kemikalije | 60. | Izračuna se srednja vrednost na podlagi vrednosti odstranitve (Dt) preskusne kemikalije v fazi konstantne ravni. Ta stopnja, ki je zaokrožena na najbližje celo število (1 %), je stopnja odstranitve preskusne kemikalije. Priporoča se tudi, da se izračuna 95-odstotni interval zaupanja za srednjo vrednost. | Odstranitev organskega medija | 61. | Delež odstranitve DOC ali KPK organskega medija v kontrolni enoti (DB) se prikaže grafično v odvisnosti od časa. Srednja stopnja odstranitve se navede enako kot pri preskusni kemikaliji (odstavek 60). | Znak biološke razgradnje | 62. | Če se preskusna kemikalija ne adsorbira znatno na aktivno blato in ima krivulja odstranitve značilno obliko krivulje biološke razgradnje s fazo prilagajanja, fazo razgradnje in fazo konstantne ravni (odstavka 58 in 59), je mogoče izmerjeno odstranitev zanesljivo pripisati biološki razgradnji. Če se veliko preskusne kemikalije odstrani že na začetku, simulacijski preskus ne more razlikovati med biološkim in abiotskim procesom odstranitve. V takih in drugih primerih, v katerih obstaja dvom o biološki razgradnji (npr. pri ločevanju (stripping)), je treba analizirati adsorbirane preskusne kemikalije ali opraviti dodatne statične preskuse biološke razgradnje na podlagi parametrov, ki jasno nakazujejo biološke procese. Taki preskusi so metode porabe kisika (poglavje C.4-D, E in F te priloge (6)), ali preskus z merjenjem nastajanja ogljikovega dioksida (poglavje C.4-C te priloge (6)), ali metoda nadprostora ISO (18), pri kateri se uporabi predhodno izpostavljeni inokulum iz simulacijskega preskusa. Če sta bili izmerjeni odstranitev DOC in odstranitev specifične kemikalije, velike razlike med odstranjenimi deleži (pri čemer je prva vrednost nižja od druge) kažejo, da so bili v iztokih vmesni organski produkti, ki se morda težje razgradijo kot matična kemikalija. | Veljavnost rezultatov preskusa | 63. | Informacije o običajnem biorazgradnem obnašanju inokuluma se pridobijo, če je določena stopnja odstranitve organskega medija (odstavek 53) v kontrolni enoti. Preskus je treba šteti za veljaven, če je stopnja odstranitve DOC ali KPK v kontrolnih enotah po dveh tednih > 80-odstotna in če ni bilo opaženega nič nenavadnega. | 64. | Če je bila uporabljena lahko biološko razgradljiva (referenčna) kemikalija, mora biti stopnja biološke razgradnje (Dt, odstavek 52) > 90-odstotna. | 65. | Če preskus poteka v nitrifikacijskih pogojih, mora biti srednja koncentracija v iztokih < 1 mg/l amonijevega dušika in < 2 mg/l nitritnega dušika. | 66. | Če ta merila (odstavki 63 do 65) niso izpolnjena, je treba preskus ponoviti z inokulumom iz drugega vira, preskusiti referenčno kemikalijo in pregledati vse poskusne postopke. | Poročilo o preskusu | 67. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | identifikacijski podatki, | — | fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti. | | Preskusni pogoji: | — | vrsta preskusnega sistema; spremembe za preskuse netopnih in hlapnih kemikalij, | — | vrsta organskega medija, | — | delež in vrsta industrijskih odplak v odpadni vodi, če sta znana, | — | inokulum, vrsta in mesta vzorčenja, koncentracija in predobdelava, | — | založna raztopina preskusne kemikalije: vsebnost DOC in TOC; kako je pripravljena, če je suspenzija; uporabljena preskusna koncentracija; razlogi za odstopanje od razpona 10–20 mg/l DOC; metoda dodajanja; datum prvega dodajanja; spremembe, | — | srednja starost blata in srednji hidravlični zadrževalni čas; metoda odstranjevanja odvečnega blata; metode za preprečevanje kopičenja, izgube blata itd., | — | uporabljene analitske tehnike, | — | temperatura med preskusom, | — | lastnosti kopičenja blata, volumski indeks blata (VIB), koncentracija aktivnega blata (MLSS), | — | odstopanja od standardnih postopkov in okoliščine, ki bi lahko vplivale na rezultate. | | Rezultati preskusa: | — | vsi izmerjeni podatki (DOC, KPK, specifične analize, pH, temperatura, koncentracija kisika, suspendirane trdne snovi, dušikove snovi, če je ustrezno), | — | vse izračunane vrednosti Dt (ali Dtc), DB, DSt v tabelarni obliki in krivuljah odstranitve, | — | informacije o fazi prilagajanja in fazi konstantne ravni, trajanju preskusa, stopnji odstranitve preskusne kemikalije in organskega medija v kontrolni enoti, statistične informacije ter izjave o biološki razgradljivosti in veljavnosti preskusa, | — | obravnava rezultatov. | VIRI: | (1) | Swisher, R. D. (1987). ‚Surfactant Biodegradation‘, 2. izdaja, Marcel Dekker Inc. New York, 1085 str. | (2) | Nemška vlada (1962). Uredba o razgradljivosti detergentov v pralnih in čistilnih sredstvih. Bundesgesetzblatt, Pt. 1, št. 49: 698–706. | (3) | Painter, H. A., in King, E. F. (1978a). WRc porous-pot method for assessing biodegradability. Technical Report No. 70, Water Research Centre, Medmenham, Združeno kraljestvo. | (4) | Painter, H. A., in King, E. F. (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909–915. | (5) | Eckenfelder, W. W. (19), US EPA. | (6) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti. | (7) | Poglavje C.12 te priloge, Biorazgradnja – Spremenjeni SCAS preskus. | (8) | Poglavje C.19 te priloge, Ocenjevanje adsorpcijskega koeficienta (K OC ) tal in odpadnega blata (blata iz čistilnih naprav) s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). | (9) | Gerike, P., in Fischer, W. K. (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3: 157–173. | (10) | Gerike, P., in Fischer, W. K. (1981), kot (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45–55. | (11) | Painter, H. A., in Bealing, D. (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test, str. 113–138, V: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. Ur. Jacobsen, B. N., Muntau, H., Angeletti, G. | (12) | ISO 11733 (1995; revidiran 2004). Vrednotenje odstranjevanja in biorazgradljivosti organskih snovi v vodi – simulacijski preskus z aktivnim blatom. | (13) | Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33–48. | (14) | Birch, R. R. (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340–343. | (15) | Gerike, P., Fischer, W. K., in Holtmann, W. (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat. Res. 14: 753–758. | (16) | Baumann, U., Kuhn, G., in Benz, M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220. | (17) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials, str. 91–98 ISBN 011 751661 9. | (18) | ISO 14593 (1998). Kakovost vode – Vrednotenje končne biorazgradljivosti organskih spojin v vodi. Metoda z analizo anorganskega ogljika v zaprtih posodah. | Dodatek 1 | Slika 1 | Oprema za ocenjevanje biološke razgradljivosti | Husmannova enota | A. | Posoda za shranjevanje | B. | Dozirna črpalka | C. | Prezračevalna komora (prostornina 3 l) | D. | Usedalnik | E. | Črpalka ‚airlift‘ | F. | Zbiralna posoda | G. | Prezračevalo | H. | Merilnik pretoka zraka | Slika 2 | Oprema za ocenjevanje biološke razgradljivosti | Porozna posoda | A. | Posoda za shranjevanje | B. | Dozirna črpalka | C. | Porozna prezračevalna posoda | D. | Zunanja neprepustna posoda | E. | Zbiralna posoda | F. | Difuzor | G. | Merilnik pretoka zraka | Slika 3 | Podrobnosti o 3-litrski porozni prezračevalni posodi | Dodatek 2 | Primer krivulje odstranjevanja | Dodatek 3 | [INFORMATIVNO] | SPAJANJE PRESKUSNIH ENOT | Da bi poskušali izenačiti populacije mikrobov v blatu v preskusni enoti, v katero priteka odpadna voda s preskusno kemikalijo, in kontrolni enoti, v katero priteka samo odpadna voda, je bila uvedena dnevna izmenjava blata (1). Postopek je bil poimenovan spajanje, metoda pa je znana kot spojene enote. Spajanje se je sprva izvajalo s Husmannovimi enotami z aktivnim blatom, vendar pa se je izvajalo tudi z enotami poroznih posod (2) (3). Med rezultati nespojenih in spojenih enot ni bilo ugotovljenih bistvenih razlik, najsi so bile uporabljene Husmannove enote ali porozne posode, zato čas in energija, vložena v spajanje enot, ne prinašata nobenih koristi. | Izmenjave blata lahko ustvarijo videz precej velike odstranitve, ker se del preskusne snovi prenese in se koncentracije preskusne kemikalije v preskusnem in kontrolnem iztoku skoraj izenačijo. Zato je treba uporabiti korekcijske faktorje, ki so odvisni od izmenjanega deleža in srednjega hidravličnega zadrževalnega časa. Objavljenih je bilo več podrobnosti o izračunu (1). | Izračuna se popravljena stopnja odstranitve DOC ali KPK, za kar se uporabi splošna formula: | pri čemer je: | Dtc | = | popravljeni odstotni delež odstranitve DOC ali KPK, | Dt | = | določeni odstotni delež odstranitve DOC ali KPK, | a | = | delež izmenjane količine med enotami z aktivnim blatom, | r | = | srednji hidravlični zadrževalni čas (h). | Če se na primer izmenja polovica količine aktivnega blata v prezračevalnem bazenu (a = 0,5) in je srednji hidravlični zadrževalni čas 6 h, je korekcijska formula naslednja: | VIRI: | (1) | Fischer, W., Gerike, P., Holtmann, W. (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131–1135. | (2) | Painter, H. A., Bealing, D. J. (1989). Experience and Data from the OECD Activated Sludge Simulation Test, str. 113–138. V: Laboratory Tests for Simulation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Ur. Jacobsen, B. N., Muntau, H., Angeletti, G. | (3) | Painter, H. A., King, E. F. (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, Združeno kraljestvo. | Dodatek 4 | VREDNOTENJE ZAVIRANJA AKTIVNEGA BLATA | Postopek s preskusnimi kemikalijami | 1. | Lahko se zgodi, da se kemikalija (ali odpadna voda) pri simulacijskem preskusu ne razgradi ali odstrani ter ima celo zaviralni učinek na mikroorganizme v blatu. Druge kemikalije se biološko razgradijo pri nizkih koncentracijah, pri višjih koncentracijah pa so zaviralne (hormeza). Zaviralni učinki se lahko pokažejo v zgodnejši fazi ali pa se določijo s preskusom strupenosti, pri katerem se uporabi inokulum, ki je podoben ali enak inokulumu, uporabljenemu pri simulacijskem preskusu (1). Take metode so zaviranje porabe kisika (poglavje C.11 te priloge (2) in ISO 8192 (3)) ali zaviranje rasti mikroorganizmov v blatu (ISO 15522 (4)). | 2. | Pri simulacijskem preskusu se zaviranje pokaže tako, da je razlika v raztopljenem organskem ogljiku (DOC) ali kemijski potrebi po kisiku (KPK) med iztokom iz preskusne posode in iztokom iz kontrolne enote večja od DOC, ki je dodan kot preskusna kemikalija. Z drugimi besedami, delež odstranitve DOC (in biokemijske potrebe po kisiku (BPK), kemijske potrebe po kisiku (KPK) in/ali NH+ 4) obdelanega organskega medija se zaradi preskusne kemikalije zmanjša. Če se to zgodi, je treba preskus ponavljati z zniževanjem koncentracije preskusne kemikalije, dokler ni dosežena raven, na kateri ni zaviranja, in morda z nadaljnjim zniževanjem koncentracije, dokler ni preskusna kemikalija biološko razgrajena. Če pa preskusna kemikalija (ali odpadna voda) negativno vpliva na proces pri vseh preskušenih koncentracijah, to nakazuje, da je kemikalijo težko, če ne celo nemogoče biološko obdelati, vendar pa bi bilo morda koristno preskus ponoviti z aktivnim blatom iz drugega vira in/ali omogočiti postopnejšo aklimatizacijo blata. | 3. | V nasprotnem primeru, če je preskusna kemikalija biološko odstranjena pri prvem poskusu v simulacijskem preskusu, je treba njeno koncentracijo povišati, če je treba vedeti, ali bi lahko bila zaviralna. | 4. | Ko se poskušajo določiti stopnje zaviranja, je treba upoštevati, da se lahko populacija aktivnega blata spreminja, tako da lahko sčasoma mikroorganizmi postanejo odporni proti zaviralni kemikaliji. | 5. | Izračun stopnje zaviranja: | Skupni delež odstranitve Ro, BPK, DOC, KPK itd. za preskusno in kontrolno enoto se lahko izračuna z enačbo: | pri čemer je: | I | = | koncentracija BPK, DOC, KPK itd. v pritoku za preskusno ali kontrolno posodo (mg/l), | E | = | zadevne koncentracije v iztoku (mg/l). | I in E je treba popraviti za DOC zaradi preskusne kemikalije v preskusnih enotah, sicer bodo izračuni deleža zaviranja nepravilni. | Stopnja zaviranja, ki jo povzroči preskusna kemikalija, se lahko izračuna z enačbo: | pri čemer je: | Rc | = | delež odstranitve v kontrolnih posodah, | Rt | = | delež odstranitve v preskusnih posodah. | VIRI: | (1) | Reynolds, L., idr. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259. | (2) | Poglavje C.11 te priloge, Biorazgradnja – Preskus zaviranja dihanja aktivnega blata. | (3) | ISO 8192 (2007) Kakovost vode – Preskus inhibicije porabe kisika z aktivnim blatom za oksidacijo ogljika in amonija. | (4) | ISO 15522 (1999) Kakovost vode – Določanje zaviralnega učinka sestavin vode na rast mikroorganizmov aktivnega blata. | Dodatek 5 | Slabo vodotopne preskusne kemikalije – hlapne kemikalije | Slabo vodotopne kemikalije | V zvezi z uporabo slabo vodotopnih in netopnih kemikalij v preskusih za simulacijo čiščenja odpadne vode je bilo objavljenih le malo poročil (1) (2) (3). | Ne obstaja ena sama metoda za dispergiranje preskusne kemikalije, ki bi se uporabljala za vse netopne kemikalije. Za poskus dispergiranja preskusnih kemikalij pri simulacijskem preskušanju bi se zdeli primerni dve od štirih metod, opisanih v ISO 10634 (4): uporaba emulgatorjev in/ali ultrazvoka. Ugotoviti je treba vsaj 24-urno stabilnost nastale disperzije. Primerno stabilizirane disperzije, ki se hranijo v zbiralniku s stalnim mešanjem (odstavek 38), se nato odmerijo v prezračevalni bazen ločeno od gospodinjske (ali sintetične) odpadne vode. | Če so disperzije stabilne, je treba preučiti, kako se lahko preskusna kemikalija določi v dispergirani obliki. DOC verjetno ne bo primeren, zato bo treba določiti posebno analitsko metodo za preskusno kemikalijo, ki jo bo mogoče uporabiti za iztoke, trdne snovi v iztoku in aktivno blato. Usoda preskusne kemikalije pri simulaciji procesa z aktivnim blatom bo nato določena v tekoči in trdni fazi. Določi se torej ‚masna bilanca‘, na podlagi katere se ugotavlja, ali je bila preskusna kemikalija biološko razgrajena. Vendar bo to pomenilo samo primarno biološko razgradnjo. Končno biološko razgradnjo je treba poskusiti dokazati z respirometričnim preskusom za dobro biološko razgradljivost (poglavje C.4 te priloge (5), C, F ali D), pri katerem se kot inokulum uporabi blato, izpostavljeno preskusni kemikaliji v simulacijskem preskusu. | Hlapne kemikalije | Uporaba simulacij čiščenja odpadne vode za hlapne kemikalije je sporna in problematična. Podobno, kot pri slabo vodotopnih preskusnih kemikalijah, je bilo tudi o simulacijskih preskusih s hlapnimi kemikalijami objavljenih zelo malo poročil. Klasična naprava s popolnim premešanjem je prilagojena z zatesnitvijo prezračevalnega bazena in usedalnika, pri čemer se pretok zraka meri in nadzoruje z merilniki pretoka, izhodni plin pa prehaja skozi lovilnike za zbiranje hlapnih organskih snovi. V nekaterih primerih vakuumska črpalka usmeri izhodni plin skozi ‚hladni‘ lovilnik ali lovilnik ‚izpihni in ujemi‘, ki vsebuje Tenax ali silikagel za analize s plinsko kromatografijo. Preskusno kemikalijo v lovilniku je mogoče določiti analitično. | Preskus se izvaja v dveh delih. Enote najprej delujejo brez blata, vendar s sintetično odpadno vodo in preskusno kemikalijo, ki se črpa v prezračevalni bazen. Nekaj dni se zbirajo in analizirajo vzorci pritoka, iztoka in izhodnega plina, da se določi preskusna kemikalija. Na podlagi zbranih podatkov se lahko izračuna delež (Rvs) preskusne kemikalije, izločene iz sistema. | Nato se opravi običajni biološki preskus (z blatom) pri enakih obratovalnih pogojih kot pri raziskavi izločanja. Izmerita se tudi DOC ali KPK, s čimer se preveri učinkovitost delovanja enot. Opravijo se občasne analize, s katerimi se določi preskusna kemikalija v pritoku, iztoku in izhodnem plinu v prvem delu preskusa; po aklimatizaciji se analize izvajajo pogosteje. Tudi tu se lahko na podlagi podatkov v stabilnem stanju izračuna delež odstranitve preskusne kemikalije iz tekoče faze z vsemi procesi (RT) (fizikalnimi in biološkimi) in tudi delež (RV), izločen iz sistema. | Izračun: | (a) | Pri nebiološkem preskusu se lahko delež (RVP) preskusne snovi, izločene iz sistema, izračuna z enačbo: | pri čemer je: | RVP | = | odstranitev preskusne kemikalije s hlapenjem (%), | SVP | = | preskusna kemikalija, zbrana v lovilniku, izražena kot ekvivalent koncentracije v tekoči fazi (mg/l), | SIP | = | koncentracija preskusne kemikalije v pritoku (mg/l). | (b) | Pri biološkem preskusu se lahko delež (RV) preskusne snovi, izločene iz sistema, izračuna z enačbo: | pri čemer je: | RV | = | odstranitev preskusne kemikalije sz uplinjanjem pri biološkem preskusu (%), | SV | = | preskusna kemikalija, zbrana v lovilniku pri biološkem preskusu, izražena kot ekvivalent koncentracije v tekočem pritoku (mg/l), | SI | = | koncentracija preskusne kemikalije v pritoku (mg/l). | (c) | Pri biološkem preskusu je delež (RT) preskusne kemikalije, odstranjene z vsemi procesi, podan z enačbo: | pri čemer je: | SE= koncentracija preskusne kemikalije v (tekočem) iztoku (mg/l). | (d) | Delež (RBA), odstranjen z biološko razgradnjo in adsorpcijo, se torej lahko izračuna z enačbo: | Opraviti je treba ločene preskuse, da bi ugotovili, ali je preskusna kemikalija adsorbirana; če je, se lahko izvede nadaljnji popravek. | (e) | Primerjava med deležem preskusne kemikalije, izločene iz sistemov biološkega (Rv) in nebiološkega preskusa (Rvp), kaže splošni učinek, ki ga je biološka obdelava imela na emisijo preskusne kemikalije v ozračje. | Primer: | benzen | Zadrževalni čas blata = 4 dni | Sintetična odpadna voda; zadrževalni čas = 8 ur | SIP | = | SI = 150 mg/l | SVP | = | 150 mg/l (SEP = 0) | SV | = | 22,5 mg/l | SE | = | 50 μg/l | Torej: | RVP | = | 100 %, RV = 15 % | RT | = | 100 % in RBA = 85 %. | Za benzen se je domnevalo, da se ne adsorbira na blato. | VIRI: | (1) | Horn, J. A., Moyer, J. E., Hale, J. H. (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939–854. | (2) | Pitter, P., Chudoba, J. (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, ZDA. | (3) | Stover, E. L., Kincannon, D. F (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97. | (4) | ISO 10634 (1995) Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgradljivosti v vodi. | (5) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti. | Dodatek 6 | Učinki zadrževalnega časa blata (SRT) na možnost obdelave kemikalij | UVOD | 1. | Metoda, opisana v glavnem besedilu, je bila zasnovana za ugotovitev, ali se lahko preskusne kemikalije (običajno tiste, za katere je znano, da so inherentno, vendar ne dobro biološko razgradljive) biološko razgradijo v okvirih, določenih v čistilnih napravah. Rezultati so izraženi v deležu odstranitve in deležu biološke razgradnje. Pogoji delovanja enot z aktivnim blatom in izbira pritoka omogočajo precej različne koncentracije preskusne kemikalije v iztoku. Preskusi se izvajajo pri samo eni nazivni koncentraciji trdnih snovi v blatu ali enem nazivnem zadrževalnem času blata (SRT), opisani sistemi odstranjevanja odvečnega blata pa lahko povzročijo velika nihanja vrednosti SRT med preskusom, in sicer od enega do drugega dne in tudi v enem dnevu. | 2. | V tej različici (1) (2) se SRT v celotnem 24-urnem obdobju vzdržuje v veliko ožjih mejah (tako, kot pri velikih sistemih), kar vodi do bolj konstantne koncentracije v iztokih. Priporoča se gospodinjska odpadna voda, ker omogoča doslednejše in večje deleže odstranitve. Preučijo se tudi učinki vrste vrednosti SRT, s podrobnejšim preučevanjem pa se lahko določijo učinki različnih temperatur na koncentracijo v iztoku. | 3. | Ni še splošnega soglasja o tem, kateri kinetični modeli delujejo pri biološki razgradnji kemikalij v pogojih čistilne naprave za odpadne vode. Za zbrane podatke je bil izbran Monodov model rasti bakterij in uporabe substrata (1) (2), saj je bila metoda namenjena samo uporabi za kemikalije, ki se proizvajajo v velikih količinah in so tako v odpadnih vodah prisotne v koncentracijah, višjih od 1 mg/l. Veljavnost poenostavljenega modela in izdelanih predpostavk je bila določena z nizom alkoholnih etoksilatov, ki imajo različne stopnje primarne biološke razgradljivosti (2) (3). | Opomba: | v tej različici se večinoma natančno upošteva besedilo preskusne metode C.10-A, zato so v nadaljevanju navedene samo tiste podrobnosti, ki se razlikujejo. | NAČELO PRESKUSA | 4. | Enote poroznih posod z aktivnim blatom, zasnovane za olajšanje (skoraj) kontinuiranega odstranjevanja suspenzije aktivnega blata, ki omogoča zelo natančen nadzor nad zadrževalnim časom blata (SRT ali θs), obratujejo v nespojenem načinu pri različnih SRT in lahko tudi pri različnih temperaturah. Zadrževalni čas je običajno 2 do 10 dni, temperatura pa 5 do 20 °C. Odpadna voda, po možnosti gospodinjska, in raztopina preskusne kemikalije se ločeno odmerjata v enote s hitrostjo, s katero se dosežeta zahtevani zadrževalni čas odpadne vode (3 do 6 ur) in zahtevana koncentracija preskusne kemikalije v pritoku. Kontrolne enote, v katere se preskusna kemikalija ne dovaja, zaradi primerjave obratujejo vzporedno. | 5. | Uporabijo se lahko druge vrste naprav, vendar je treba zelo paziti, da se doseže dober nadzor nad SRT. Na primer, pri uporabi naprav, ki vključujejo usedalnik, bo morda treba upoštevati izgubo trdnih snovi prek iztoka iz naprave. Poleg tega je treba predvideti tudi posebne previdnostne ukrepe, da se preprečijo napake zaradi spreminjanja količine blata v usedalniku. | 6. | Enote obratujejo pri vsakem izbranem nizu pogojev, in ko je doseženo ravnotežje, se v približno treh tednih dobijo povprečne koncentracije preskusne kemikalije v iztokih v stacionarnem stanju in (neobvezno) DOC. Poleg ocene deleža odstranitve preskusne kemikalije in (neobvezno) DOC je v grafični obliki izraženo razmerje med obratovalnimi pogoji naprave in koncentracijo v iztoku. Na podlagi tega poskusa se lahko izračunajo okvirne kinetične konstante in napovejo pogoji, v katerih se lahko preskusna kemikalija obdela. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 7. | Uporabljata se odstavka 12 in 13 poglavja C.10-A. | RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA | 8. | Uporabljata se odstavka 14 in 15 poglavja C.10-A. | REFERENČNA PRESKUSNA KEMIKALIJA | 9. | Uporablja se odstavek 16 poglavja C.10-A. | PONOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA | 10. | Uporabljata se odstavka 17 in 18 poglavja C.10-A. | OPIS METODE | Naprava | 11. | Primerna enota je modificirani sistem poroznih posod (Dodatek 6.1). Sestavlja ga notranja posoda (ali vložek), narejena iz poroznega polipropilena debeline 3,2 mm in z velikostjo por približno 90 μm, stik pa je soležno čelno zvarjen. (Enota je tako bolj robustna kot tista, opisana v odstavku 21 tega poglavja C.10-A.) Vložek je vstavljen v neprepustno zunanjo posodo iz polietilena, ki je sestavljena iz dveh delov: krožnega podnožja, v katero so izvrtane luknje za dva voda za zrak in vod za odstranjevanje odvečnega blata, ter zgornjega valja, ki je z vijaki pritrjen na podnožje in ima odvod nameščen tako, da omogoča znano prostornino (3 l) v porozni posodi. Eden od vodov za zrak je opremljen z difuzorjem, drugi pa je odprt in postavljen pravokotno na difuzor v posodi. Ta sistem proizvaja potrebno vrtinčenje za zagotovitev, da je vsebina posode popolnoma premešana in da so zagotovljene koncentracije raztopljenega kisika, ki so večje od 2 mg/l. | 12. | Ustrezno število enot se vzdržuje pri nadzorovani temperaturi v razponu 5 do 20 °C (± 1 °C) bodisi v vodnih kopelih bodisi v prostorih s stalno temperaturo. Potrebni sta črpalki za odmerjanje raztopine preskusne kemikalije in usedenega blata v prezračevalne posode s potrebnim pretokom (0–1,0 ml/min oziroma 0–25 ml/min) ter tretja črpalka za odstranjevanje odpadnega blata iz prezračevalnih posod. Potreben zelo majhen pretok odpadnega blata se doseže s črpalko, ki je nastavljena na večji pretok in deluje v presledkih z uporabo časovnega stikala, npr. delovanje 10 sekund na minuto, pretok črpalke 3 ml/min, s čimer se doseže pretok odvečnega blata 0,5 ml/min. | Naprava za filtriranje ali centrifuga | 13. | Uporablja se odstavek 23 poglavja C.10-A. | Analitska oprema | 14. | Uporablja se odstavek 24 poglavja C.10-A. | Voda | 15. | Uporabljata se odstavka 25 in 26 poglavja C.10-A. | Organski medij | 16. | Uporablja se odstavek 27 poglavja C.10-A. | Sintetična odpadna voda | 17. | Uporablja se odstavek 28 poglavja C.10-A. | Gospodinjska odpadna voda | 18. | Uporablja se odstavek 29 poglavja C.10-A. | Aktivno blato | 19. | Uporablja se odstavek 30 poglavja C.10-A. | Založne raztopine preskusne kemikalije | 20. | Uporabljata se odstavka 31 in 32 poglavja C.10-A. | POSTOPEK | Priprava inokuluma | 21. | Uporablja se samo odstavek 34 poglavja C.10-A – uporaba aktivnega blata (približno 2,5 g/l). | Število preskusnih enot | 22. | Pri preprostem preskusu, pri katerem se izmeri delež odstranitve, je potreben samo en SRT, da pa bi dobili podatke, potrebne za izračun okvirnih kinetičnih konstant, pa so potrebne 4 ali 5 vrednosti SRT. Običajno se izberejo vrednosti od 2 do 10 dni. Pripravno je izvesti preskus pri 4 ali 5 SRT sočasno pri eni temperaturi; pri obsežnejših raziskavah se iste vrednosti SRT ali morda različen razpon vrednosti uporabijo pri drugih temperaturah v razponu od 5 do 20 °C. Za primarno biološko razgradnjo (glavna uporaba) je običajno potrebna samo ena enota na niz pogojev. Vendar je za končno biološko razgradljivost za vsak niz pogojev potrebna kontrolna enota, v katero se dovaja odpadna voda, ne pa tudi preskusna kemikalija. Če se domneva, da je v uporabljeni odpadni vodi preskusna kemikalija, je treba pri oceni primarne biološke razgradnje uporabiti kontrolne enote in opraviti potrebne popravke v izračunih. | Odmerjanje organskega medija in preskusne kemikalije | 23. | Uporabljajo se odstavki 36 do 39 poglavja C.10-A, vendar je treba upoštevati, da se raztopina preskusne kemikalije odmerja ločeno in da se uporabljajo različni pretoki odvečnega blata. Pogosto je treba tudi spremljati in po potrebi prilagoditi – za ± 10 % – pretok pritokov, iztokov in odstranjevanja odvečnega blata, npr. dvakrat na dan. Če se pri uporabi gospodinjske odpadne vode pojavijo težave pri analitskih metodah, je treba preskus izvesti s sintetično odpadno vodo, vendar je treba zagotoviti, da različni mediji dajejo primerljive kinetične podatke. | Ravnanje z enotami z aktivnim blatom | 24. | Uporabljajo se odstavki 40 do 43 poglavja C.10-A, vendar je treba SRT nadzorovati samo s ‚konstantnim‘ pretokom odvečnega blata. | Vzorčenje in analiza | 25. | Uporabljajo se odstavki 44 do 50 poglavja C.10-A, le da je treba določiti koncentracijo preskusne kemikalije, poljubno pa tudi DOC; KPK naj se ne bi uporabljal. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 26. | Uporabljajo se odstavki 52 do 54 poglavja C.10-A. | Izražanje rezultatov preskusa | 27. | Uporabljajo se odstavki 56 do 62 poglavja C.10-A. | Izračun kinetičnih konstant | 28. | Realneje je navesti srednjo koncentracijo preskusne kemikalije v iztoku v stacionarnem stanju in opisati, kako se spreminja glede na obratovalne pogoje v napravi, kot navesti delež primarne biološke razgradnje. To se lahko stori z enačbo (6) iz Dodatka 6.2, s katero lahko dobimo vrednosti za KS, μm in θSC, kritični zadrževalni čas blata. | (Približne vrednosti KS in μm se lahko dobijo tudi s preprostim računalniškim programom, ki teoretično krivuljo, izračunano z enačbo 2 (Dodatek 6.2), prilagodi dobljenim poskusnim vrednostim. Čeprav nobena dana rešitev ne bo edinstvena, je mogoče dobiti razumen približek KS in μm.) | Variabilnost rezultatov | 29. | Iz izkušenj je znano, da se za posamezne kemikalije dobijo variabilne vrednosti kinetičnih parametrov. Domneva se, da pogoji, v katerih je bilo blato gojeno, in pogoji, ki vladajo pri uporabljenem preskusu (kot v odstavku 5 in pri drugih preskusih), zelo vplivajo na dobljene vrednosti. En vidik te variabilnosti so obravnavali Grady idr. (4), ki so predlagali, da je treba za dvoje skrajnih stanj, ki predstavljata meje fiziološkega stanja, ki ga kultura lahko doseže med kinetičnim poskusom, uporabiti izraza ‚obstoječe‘ in ‚intrinzično‘ uporabiti za dvoje skrajnih pogojev, Če se stanje med preskusom ne sme spremeniti, vrednosti kinetičnega parametra izražajo pogoje v okolju, iz katerega so bili mikroorganizmi vzeti; te vrednosti se imenujejo ‚obstoječe‘ ali trenutne. V drugem skrajnem primeru, če so pogoji pri preskusu taki, da omogočajo popoln razvoj sistema za sintezo beljakovin, ki omogoča največjo mogočo hitrost rasti, se za dobljene kinetične parametre šteje, da so ‚intrinzični‘, ter so odvisni samo od narave substrata in vrst bakterij v kulturi. Na primer, obstoječe vrednosti bodo dobljene z ohranjanjem nizkega razmerja med koncentracijo substrata in kompetentnimi mikroorganizmi (So/Xo), npr. 0,025, intrinzične vrednosti pa nastopajo, ko je to razmerje visoko, npr. vsaj 20. V obeh primerih mora biti So enak ustrezni vrednosti konstante polovičnega nasičenja Ks ali jo presegati. | 30. | Variabilnost in druge plati kinetike biološke razgradnje so bile obravnavane na nedavni delavnici SETAC (5). Iz takih raziskav, objavljenih in načrtovanih, bi moral izhajati jasnejši pogled na kinetiko, ki deluje v čistilnih napravah, da bi bilo mogoče bolje razlagati podatke in predlagati ustreznejše načrte za prihodnje preskusne metode. | VIRI: | (1) | Birch, R. R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol Deterg.: 33–48. | (2) | Birch, R. R. (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 340–343. | (3) | Birch, R. R. (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol., 50: 411–422. | (4) | Grady, C. P. L, Smets, B. F., in Barbeau, D. S. (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res., 30 (3): 742–748. | (5) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Delavnica v Port Sunlightu, ZK. Ur. Hales, S. G., Feitjel, T., King, H., Fox, K., Verstraete, W., 4.–6. sept. 1996. SETAC Europe, Bruselj. | Dodatek 6.1 | Porozna posoda z nadzorom SRT | Dodatek 6.2 | Izračun kinetičnih konstant | 1. | Ob predpostavki, da se uporablja Monodova kinetika, in ob upoštevanju masne bilance aktivnih trdnih snovi in substrata v sistemu z aktivnim blatom (1) je mogoče dobiti naslednji enačbi, ki opisujeta stacionarno stanje: | [1] | ali | [2] | pri čemer je: | S1 | = | koncentracija substrata v iztoku (mg/l), | KS | = | konstanta polovičnega nasičenja, koncentracija, pri kateri μ = μm/2 (mg/l), | μ | = | specifična hitrost rasti (d–1), | μm | = | največja vrednost μm(d–1), | Kd | = | specifična hitrost odmiranja aktivnih trdnih snovi (d–1), | θS | = | srednji zadrževalni čas blata, SRT (d). | Preučitev te enačbe vodi do naslednjih ugotovitev: | (i) | koncentracija v iztoku je neodvisna od koncentracije v pritoku (S0); zato se delež biološke razgradnje spreminja s koncentracijo v pritoku S0; | (ii) | edini parameter nadzora naprave, ki vpliva na S1, je zadrževalni čas blata θS; | (iii) | za dano koncentracijo v pritoku S0 obstaja kritični zadrževalni čas blata, tako da velja: | [3] | pri čemer je: | θSC= kritični zadrževalni čas blata, pred potekom katerega so mikroorganizmi odplaknjeni iz naprave; | (iv) | ker so drugi parametri v enačbi (2) povezani s kinetiko rasti, temperatura verjetno vpliva na raven substrata v iztoku in kritično starost blata, tj. zadrževalni čas blata, potreben za dosego določene stopnje obdelave, bi se z zniževanjem temperature povečeval. | 2. | Iz masne bilance trdnih snovi v sistemu poroznih posod in ob predpostavki, da je koncentracija trdnih snovi v iztoku iz naprave X2 nizka v primerjavi s koncentracijo v prezračevalni posodi X1, je zadrževalni čas blata: | [4] | in | pri čemer je: | V | = | prostornina prezračevalne posode (l), | X1 | = | koncentracija trdnih snovi v prezračevalni posodi (mg/l), | X2 | = | koncentracija trdnih snovi v iztoku (mg/l), | Q0 | = | pretok pritoka (l/d), | Q1 | = | pretok odpadnega blata (l/d). | Zadrževalni čas blata je torej pri kateri koli predhodno izbrani vrednosti mogoče nadzorovati z nadzorom nad pretokom odvečnega blata Q1. | Sklepne ugotovitve | 3. | Glavni namen preskusa je torej omogočiti napovedovanje koncentracije v iztoku in s tem ravni preskusne kemikalije v vodi, v katero se dovaja. | 4. | Z grafičnim prikazom S1 v odvisnosti od θS je mogoče včasih takoj oceniti kritični zadrževalni čas blata θSC, npr. krivulja 3 na sliki 1. Če to ni mogoče, se θSC, skupaj s približnima vrednostma μm in KS, lahko izračuna z grafičnim prikazom S1 v odvisnosti od S1•θS. | Enačba (1) se preoblikuje takole: | [5] | Če je Kd majhen, potem 1 + θs • Kd ~ 1 in [5] se spremeni v naslednjo enačbo: | [6] | Grafični prikaz bi torej moral biti ravna črta (glej sliko 2) z naklonom 1/μm in sečiščem KS/μm; tudi θS ~1/μm. | Slika 1 | Tri temperature; pet SRT | Slika 2 | Regresijska premica SRT · S1 v odvisnosti od S1 pri T = 5 °C | Glosar: | Koncentracija v iztoku | Krivulja | Dodatek 7 | PRESKUS PRI NIZKIH KONCENTRACIJAH (μg/l) | 1. | Številne kemikalije so običajno v vodnem okolju in celo v odpadnih vodah v zelo nizkih koncentracijah (μg/l). Pri takih koncentracijah verjetno ne delujejo kot primarni substrati za rast, ampak se verjetneje razgradijo kot sekundarni substrati, ki ne posredujejo pri rasti, sočasno z vrsto naravno prisotnih ogljikovih snovi. Posledično razgradnja takih kemikalij ni primerna za model, opisan v Dodatku 6. Uporabiti bi bilo mogoče številne modele, v pogojih, ki vladajo v sistemih za čiščenje odpadnih voda, pa lahko sočasno deluje več kot en model. Za osvetlitev te težave bo potrebnih veliko več raziskav. | 2. | Medtem se lahko uporablja postopek, naveden v glavnem besedilu (poglavje C.10-A), vendar samo za primarno biološko razgradljivost, pri čemer se uporabijo primerno nizke koncentracije (< 100 μg/l) in potrjen analitski postopek. Delež biološke razgradnje se lahko izračuna (glej odstavek 54 preskusne metode), če se upoštevajo abiotični procesi (adsorpcija, hlapnost itd.). Primer je raziskava Nyholma in njegovih sodelavcev (1) (2), pri kateri je bil uporabljen 4-urni ciklus v sistemu ‚napolni in izprazni‘. Poročali so o konstantah psevdo prvega reda za 5 kemikalij, dodanih v sintetično odpadno vodo pri koncentraciji 5 do 100 μg/l. (Za dokončno biološko razgradljivost se lahko uporabijo preskusne kemikalije, označene s 14C.) Opis tega presega obseg uporabe te preskusne metode, saj za zdaj še ni dogovorjenih postopkov, čeprav predlagana metoda za standard ISO 14592 (3) vsebuje navodilo za uporabo kemikalij, označenih s 14C. | Preskus SCAS | 3. | Pozneje je bil predlagan preprostejši dvostopenjski preskus (4) (5) (6); metodi polkontinuiranega aktivnega blata (SCAS) sledijo kratkoročni kinetični preskusi na vzorcih, odvzetih iz enot SCAS. Sistem SCAS deluje z znanimi hitrostmi odstranjevanja odvečnega blata (v nasprotju s prvotno preskusno metodo iz poglavja C.12), vanj pa se dovaja spremenjena sintetična odpadna voda OECD ali gospodinjska odpadna voda. Sintetična odpadna voda je bila spremenjena (zaradi spremenljive vrednosti pH in slabe usedljivosti blata) z dodatkom fosfata kot puferja, kvasnega ekstrakta, železovega (III) klorida in soli elementov v sledovih, njen COD pa je bil povečan na približno 750 mg/l s povečanjem koncentracije peptona in mesnega ekstrakta. Enote so delovale v 24-urnem ciklu: prezračevanje 23 ur, odstranjevanje odvečnega blata, usedanje, odvzem supernatanta (iztok), ki jim sledi dodajanje sintetične odpadne vode in preskusne kemikalije do 100 μg/l (tj. pri približno enaki koncentraciji kot pri kratkoročnem preskusu). Enkrat tedensko je bilo 10 % vsega blata nadomeščenih s svežim blatom, da se je ohranila uravnotežena mikrobna populacija. | 4. | Koncentracije preskusne kemikalije se izmerijo na začetku in koncu prezračevanja, preskus pa se nadaljuje, dokler ni doseženo konstantno odstranjevanje preskusne kemikalije; to traja od enega tedna do več mesecev. | Kratkoročni preskus | 5. | Kratkoročni preskus (npr. 8 ur) se uporabi za določitev konstante kinetike (psevdo) prvega reda za razgradnjo preskusne kemikalije v aktivnem blatu znanega, a različnega izvora in razvoja. Zlasti se vzorci blata vzamejo iz reaktorjev SCAS – ob koncu prezračevalnega obdobja, ko je koncentracija organskega substrata nizka – med potekom poskusa aklimatizacije (odstavka 3 in 4). Blato se za primerjavo lahko vzame tudi iz vzporedne enote SCAS, ki ni bila izpostavljena preskusni kemikaliji. Mešanice blata in preskusne kemikalije, dodane pri dveh ali več koncentracijah v razponu 1–50 μg/l, se prezračijo, ne da bi se dodala sintetična odpadna voda ali drug organski substrat. Preskusna kemikalija, ki ostane v raztopini, se določa v rednih presledkih, npr. vsako uro, odvisno od razgradljivosti kemikalije, vendar ne več kot 24 ur. Vzorci se pred ustrezno analizo centrifugirajo. | Izračuni | 6. | Podatki iz enot SCAS se uporabijo za izračun deleža odstranitve preskusne kemikalije (odstavek 54). Izračuna se lahko tudi povprečna hitrostna konstanta K1 (normalizirana za koncentracijo suspendiranih trdnih snovi), za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | t | = | čas prezračevanja (23h), | Ce | = | koncentracija ob koncu prezračevalnega obdobja (μg/l), | Ci | = | koncentracija na začetku prezračevanja (μg/l), | SS | = | koncentracija trdnih snovi v aktivnem blatu (g/l). | 7. | Pri kratkoročnem preskusu se log% preostale koncentracije grafično prikaže v odvisnosti od časa, naklon začetnega dela (10–50-odstotna razgradnja) krivulje pa je enak K1, konstanti (psevdo) prvega reda. Konstanta se normalizira glede na koncentracijo trdnih snovi v blatu z delitvijo naklona s koncentracijo trdnih snovi v blata. Prikazani rezultat mora vključevati tudi podrobnosti o začetnih koncentracijah preskusne kemikalije in trdnih snovi, zadrževalnem času blata, nalaganju blata in viru ter podrobnosti o (morebitni) predhodni izpostavljenosti preskusni kemikaliji. | Variabilnost rezultatov | 8. | Variabilnost in druge plati kinetike biološke razgradnje so bile obravnavane na nedavni delavnici SETAC (7). Iz takih raziskav, objavljenih in načrtovanih, bi moral izhajati jasnejši pogled na kinetiko, ki deluje v čistilnih napravah, da bi bilo mogoče bolje razlagati podatke in predlagati ustreznejše načrte za prihodnje preskusne metode. | VIRI: | (1) | Nyholm, N., Jacobsen, B. N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., Dambourg, A., in Schultz, B. (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353. | (2) | Jacobsen, B. N., Nyholm, N., Pedersen, B. M., Poulsen, O., in Ostfeldt, P. (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510. | (3) | ISO 14592 (ISO/TC 147/ SC5/ WG4, N264) (1998). Kakovost vode – Vrednotenje aerobne biorazgradljivosti organskih spojin pri nizkih koncentracijah v vodi. | (4) | Nyholm, N., Ingerslev, F., Berg, U. T., Pedersen, J. P., in Frimer-Larsen, H. (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864. | (5) | Berg, U. T., in Nyholm, N. (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735. | (6) | Danish Environmental Protection Agency. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N., Berg, U. T., Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Köbenhavn. | (7) | Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Delavnica v Port Sunlightu, Združeno kraljestvo. Ur. Hales, S. G, Feitjel, T., King, H., Fox, K., in Verstraete, W., 4.–6. sept. 1996. SETAC Europe, Bruselj. | C.10-B: Biofilmi | UVOD | 1. | Simulacijski preskusi se običajno uporabljajo za kemikalije, ki niso uspešno opravile presejalnega preskusa za dobro biološko razgradljivost (poglavje C.4-A do F te priloge (9)), vendar so uspešno opravile preskus za inherentno biološko razgradljivost. Simulacijski preskusi se izjemoma uporabijo tudi za kemikalijo, o kateri je potrebnih več informacij, zlasti za kemikalije, ki se proizvajajo v velikih količinah; običajno se uporabi preskus z aktivnim blatom (C.10-A). Vendar pa so v nekaterih okoliščinah potrebne posebne informacije o odzivanju kemikalije na metode čiščenja odpadne vode, ki vključujejo biofilme, to so precejalniki, rotirajoči biološki kontaktorji in reaktorji s tehnologijo vrtinčnih plasti. Za izpolnitev te potrebe so bile razvite različne naprave. | 2. | Gerike idr. (1) so uporabili velike precejalnike v pilotnem merilu, ki so delovali v spojenem načinu. Ti filtri so zavzeli veliko prostora in zahtevali razmeroma veliko odpadne vode ali sintetične odpadne vode. Truesdale idr. (2) so opisali manjše filtre (premer 1,83 × 1,83 metra), v katere so dovajali naravno odpadno vodo brez površinsko aktivnih snovi, vendar so bile še vedno potrebne razmeroma velike količine. Za nastanek ‚zrelega‘ biofilma je bilo potrebnih kar 14 tednov, dodatnih 4 do 8 tednov pa je bilo potrebnih za začetek aklimatizacije po prvem vnosu preskusne površinsko aktivne snovi. | 3. | Baumann idr. (3) so razvili mnogo manjši filter, za katerega so kot nosilni inertni medij uporabili umetno volno iz poliestra, predhodno namočeno v aktivno blato. Preskusna kemikalija je bila uporabljena kot edini vir ogljika, biološka razgradljivost pa je bila ocenjena na podlagi meritev raztopljenega organskega ogljika (DOC) v pritoku in iztoku ter količine CO2 v izhodnem plinu. | 4. | Precej drugačen pristop so uporabili Gloyna idr. (4), ki so izumili rotirajoči cevni reaktor. Na notranji površini rotirajoče cevi so na znani površini vzgojili biofilm, tako da so z vrha cevi, ki je bila pod majhnim kotom nagnjena glede na vodoravno površino, spuščali pritok. Reaktor se je uporabljal za preučevanje biološke razgradljivosti površinsko aktivnih snovi (5), pa tudi za preučevanje optimalne debeline biofilma in difuzije prek njega (6). Slednji avtorji so reaktor razvijali dalje, med drugim so ga spremenili tako, da je mogoče določiti CO2 v izhodnem plinu. | 5. | Stalni odbor analitikov (Združeno kraljestvo) je rotirajoči cevni reaktor sprejel kot standardno metodo za oceno biološke razgradljivosti kemikalij (7), možnosti čiščenja odpadnih voda in njihove strupenosti (8). Prednosti opisane metode so preprostost, pripravnost, ponovljivost in potrebne razmeroma majhne količine organskega medija. | NAČELO PRESKUSA | 6. | Sintetična ali gospodinjska odpadna voda in preskusna kemikalija se v mešanici ali posamezno naneseta na notranjo površino počasi rotirajoče nagnjene cevi. Na notranji površini se ustvari plast mikroorganizmov, podobnih mikroorganizmom na mediju biološkega filtra. Izberejo se pogoji delovanja reaktorja, da se doseže ustrezna odstranitev organske snovi in po potrebi oksidacija amonija. | 7. | Iztok iz cevi se zbere in pusti, da se usede, in/ali filtrira pred analizo za določitev raztopljenega organskega ogljika (DOC) in/ali preskusne kemikalije s posebno metodo. Kontrolne enote, v katere se preskusna kemikalija ne dovaja, zaradi primerjave obratujejo vzporedno v enakih pogojih. Domneva se, da razlika med koncentracijami DOC v iztoku iz preskusne in kontrolne enote nastane zaradi preskusne kemikalije in njenih organskih metabolitov. Ta razlika se primerja s koncentracijo dodane preskusne kemikalije (kot DOC), da se izračuna odstranitev preskusne kemikalije. | 8. | Biološko razgradnjo je običajno mogoče ločiti od biološke adsorpcije s skrbno preučitvijo časovne krivulje odstranitve. Običajno jo je mogoče potrditi s preskusom dobre biološke razgradljivosti (poraba kisika ali nastajanje ogljikovega dioksida), pri katerem se uporabi aklimatizirani inokulum, ob koncu preskusa vzet iz reaktorjev, v katere se dovaja preskusna kemikalija. | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 9. | Za pravilno razlago rezultatov morajo biti znani čistost, vodotopnost, hlapnost in adsorpcijske lastnosti preskusne kemikalije. | 10. | Običajno hlapnih in slabo topnih kemikalij ni mogoče preskusiti, če se ne sprejmejo posebni previdnostni ukrepi (glej Dodatek 5 k poglavju C.10-A). Za izračun teoretičnih vrednosti in/ali preverjanje izmerjenih vrednosti parametrov, npr. teoretične potrebe po kisiku (TPK) in DOC, je treba poznati tudi kemično strukturo ali vsaj empirično formulo. | 11. | Informacije o strupenosti preskusne kemikalije za mikroorganizme (glej Dodatek 4 k poglavju C.10-A) so lahko uporabne za izbiro primernih preskusnih koncentracij in so lahko bistvene za pravilno razlago nizkih vrednosti biološke razgradljivosti. | RAVNI USPEŠNO OPRAVLJENEGA PRESKUSA | 12. | Prvotno se je zahtevalo, da primarna biološka razgradnja površinsko aktivnih snovi doseže 80 % ali več, preden se lahko kemikalija da na trg. Če 80-odstotna vrednost ni dosežena, se lahko uporabi ta simulacijski (potrditveni) preskus, površinsko aktivna snov pa se lahko da na trg samo, če je odstranjenih več kot 90 % določene kemikalije. Pri kemikalijah na splošno ni dvoma o uspešno ali neuspešno prestanem preskusu, dobljena vrednost odstranjenega odstotnega deleža pa se lahko uporabi v približnih izračunih verjetne okoljske koncentracije, ki se uporablja pri ocenah nevarnosti, ki jo pomenijo kemikalije. V vrsti raziskav čistih kemikalij je bilo ugotovljeno, da je bil delež odstranitve DOC > 90-odstotni pri več kot treh četrtinah in > 80-odstotni pri več kot 90 % kemikalij, ki so pokazale kakršno koli pomembno stopnjo biološke razgradljivosti. | REFERENČNE KEMIKALIJE | 13. | Za zagotovitev pravilnega izvajanja poskusnega postopka je občasno koristno preskusiti referenčne kemikalije, katerih obnašanje je znano. Med takimi kemikalijami so adipinska kislina, 2-fenilfenol, 1-naftol, difenil-2,2-dikarboksilna kislina, 1-karboksi naftalenska kislina itd. (9) (10) (11). | PONOVLJIVOST REZULTATOV PRESKUSA | 14. | Po ugotovitvah laboratorija iz Združenega kraljestva je relativni standardni odklon v preskusih 3,5-odstotni, med preskusi pa 5-odstotni (7). | OPIS METODE | Naprava | Rotirajoči cevni reaktorji | 15. | Naprava (glej sliki 1 in 2 v Dodatku 8) je sestavljena iz niza akrilnih cevi z dolžino 30,5 cm in notranjim premerom 5 cm, oprtih na kolesca z gumijastim robom v kovinskem nosilnem okvirju. Vsaka cev ima zunanji rob, globok približno 0,5 cm, ki jo drži na kolescih, notranja površina je bila hrapavljena z grobo žičnato volno, na zgornjem (dovodnem) koncu pa je 0,5 cm globok notranji rob, ki zadržuje tekočino. Cevi so nagnjene pod kotom približno 1 stopinje glede na vodoravno površino, da se doseže potrebni kontaktni čas, ko je preskusni medij vnesen v čisto cev. Kolesca z gumijastim robom poganja motor s počasno spremenljivo hitrostjo. Temperatura cevi se nadzoruje s postavitvijo v prostor s konstantno temperaturo. | 16. | Z vstavitvijo vsakega cevnega reaktorja v nekoliko večjo cev, zaprto s pokrovom, ter zagotovitvijo, da so stiki neprepustni za plin, je mogoče v bazični raztopini zbrati izhodni CO2 za nadaljnje meritve (6). | 17. | 24-urna zaloga organskega medija z dodano preskusno kemikalijo, če je ustrezno, za vsako cev je shranjena v 20-litrski posodi za shranjevanje (A) (glej sliko 2). Raztopina preskusne kemikalije se po potrebi lahko odmerja ločeno. Pri dnu vsake posode za shranjevanje je izhod, ki je s cevjo iz primernega materiala, npr. silikonske gume, prek peristaltične črpalke (B) povezan s stekleno ali akrilno dovodno cevjo, ki je potisnjena 2–4 cm v notranjost višjega (dovodnega) konca nagnjene cevi (C). Iztok kaplja iz spodnjega konca nagnjene cevi in se zbira v drugi posodi za shranjevanje (D). Pred analizo se usede ali filtrira. | Naprava za filtriranje ali centrifuga | 18. | Naprava za filtriranje vzorcev z membranskimi filtri ustrezne poroznosti (nazivni premer odprtine 0,45 μm), ki adsorbirajo organske kemikalije ali sprostijo čim manj organskega ogljika. Če se uporabljajo filtri, ki sproščajo organski ogljik, jih je treba skrbno sprati z vročo vodo, da se odstrani izlužljivi organski ogljik. Namesto tega se lahko uporabi centrifuga, ki lahko doseže 40 000 m/s2. | 19. | Analitska oprema za določanje: | — | DOC/celotnega organskega ogljika (TOC) ali kemijske potrebe po kisiku (KPK), | — | določene kemikalije (HPLC, GC itd.), če se to zahteva, | — | vrednosti pH, temperature, kislosti, bazičnosti, | — | amonija, nitrita, nitrata, če se preskus izvaja v nitrifikacijskih pogojih. | Voda | 20. | Vodovodna voda, ki vsebuje manj kot 3 mg/l DOC. | 21. | Destilirana ali deionizirana voda, ki vsebuje manj kot 2 mg/l DOC. | Organski medij | 22. | Kot organski medij so lahko uporabijo sintetične odpadne vode, gospodinjske odpadne vode ali mešanica obojih. Izkazalo se je, da je pri uporabi samo gospodinjske odpadne vode delež odstranitve DOC pogosto večji (v enotah z aktivnim blatom) in da celo omogoča biološko razgradnjo nekaterih kemikalij, ki se biološko ne razgradijo, kadar se uporabi sintetična odpadna voda OECD. Zato se priporoča uporaba gospodinjske odpadne vode. Koncentracijo DOC (ali KPK) je treba izmeriti v vsaki novi šarži organskega medija. Kislost ali bazičnost organskega medija mora biti znana. Mediju bo morda treba dodati primeren pufer (natrijev hidrogen karbonat ali kalijev hidrogen fosfat), če je njegova kislost ali bazičnost nizka, da se med preskusom vrednost pH v reaktorju ohranja pri približno 7,5 ± 0,5. O količini puferja, ki jo je treba dodati, in času, ko ga je treba dodati, je treba odločiti v vsakem primeru posebej. | Sintetična odpadna voda | 23. | V vsakem litru vodovodne vode je treba raztopiti: 160 mg peptona; 110 mg mesnega ekstrakta; 30 mg sečnine; 28 mg brezvodnega dikalijevega hidrogen fosfata (K2HPO4); 7 mg natrijevega klorida (NaCl); 4 mg kalcijevega klorid dihidrata (CaCl2.2H2O) in 2 mg magnezijevega sulfat heptahidrata (Mg2SO4.7H20). Ta sintetična odpadna voda OECD je primer in predstavlja srednjo koncentracijo DOC v pritoku, tj. približno 100 mg/l. Uporabijo se lahko tudi druge sestave s približno enakimi koncentracijami DOC, ki so bolj podobne pravi odpadni vodi. Ta sintetična odpadna voda se lahko pripravi v destilirani vodi v koncentrirani obliki in shranjuje največ en teden pri približno 1 °C. Po potrebi se razredči z vodovodno vodo. (Ta medij je nezadovoljiv, npr. koncentracija dušika je zelo visoka, vsebnost ogljika je razmeroma nizka, vendar ni bilo boljšega predloga, razen, naj se doda več fosfata kot puferja in več peptona.) | Gospodinjska odpadna voda | 24. | Uporabiti je treba svežo usedeno odpadno vodo, ki se dnevno zbira iz čistilne naprave, v katero se dovaja pretežno gospodinjska odpadna voda. Zbrati jo je treba iz prelivnega kanala primarnega usedalnika ali vtoka v čistilno napravo z aktivnim blatom, biti pa mora večinoma brez grobih delcev. Odpadna voda se lahko uporabi po večdnevnem shranjevanju pri približno 4 °C, če je dokazano, da se DOC (ali KPK) med shranjevanjem ni bistveno zmanjšal (tj. za manj kot 20 %). Da se omejijo motnje v sistemu, je treba DOC (ali KPK) vsake nove šarže pred uporabo uravnati na ustrezno konstantno vrednost, npr. z redčenjem z vodovodno vodo. | Mazivo | 25. | Za mazanje valjčkov peristaltične črpalke se lahko uporablja glicerol ali oljčno olje: oba sta primerna za uporabo pri ceveh iz silikonske gume. | Založne raztopine preskusne kemikalije | 26. | Za kemikalije z ustrezno topnostjo je treba pripraviti osnovne raztopine z ustreznimi koncentracijami (npr. 1 do 5 g/l) v deionizirani vodi ali mineralnem deležu sintetične odpadne vode. Za netopne kemikalije glej Dodatek 5 v poglavju C.10-A. Ta metoda brez sprememb cevnih reaktorjev ni primerna za hlapne kemikalije (odstavek 16). Določiti je treba DOC in TOC osnovne raztopine, meritve pa ponoviti za vsako novo šaržo. Če je razlika med DOC in TOC večja od 20 %, je treba preveriti vodotopnost preskusne kemikalije. DOC ali koncentracijo preskusne kemikalije, izmerjeno s specifično analizo osnovne raztopine, je treba primerjati z nazivno vrednostjo, da se ugotovi, ali je izkoristek dovolj dober (običajno je mogoče pričakovati > 90-odstotnega). Zlasti za disperzije je treba ugotoviti, ali je mogoče DOC uporabiti kot analitski parameter ali ne oziroma ali je mogoče uporabiti samo analitsko tehniko, specifično za preskusno kemikalijo. Za disperzije je potrebno centrifugiranje vzorcev. Pri vsaki novi šarži je treba s specifično analizo izmeriti DOC, KPK ali koncentracijo preskusne kemikalije. | 27. | Določiti je treba pH osnovne raztopine. Skrajne vrednosti kažejo, da dodatek kemikalije lahko vpliva na pH aktivnega blata v preskusnem sistemu. V takem primeru je treba osnovno raztopino nevtralizirati z majhnimi količinami anorganske kisline ali baze, da se doseže vrednost pH 7 ± 0,5, vendar pa je treba preprečiti obarjanje preskusne kemikalije. | POSTOPEK | Priprava organskega medija za odmerjanje | 28. | Zagotoviti je treba, da so vsi vsebniki pritoka in iztoka ter cevi, ki vodijo iz posod za pritok in vanje, povsem čisti, da se prepreči rast mikrobov na začetku in med celotnim preskusom. | 29. | Vsak dan je treba pripraviti svežo sintetično odpadno vodo (odstavek 23), bodisi iz trdnih snovi bodisi iz koncentrirane osnovne raztopine z ustreznim redčenjem z vodovodno vodo. Potrebno količino je treba izmeriti v valju in dodati v čisto posodo za pritok. Po potrebi se sintetični odpadni vodi pred razredčenjem doda tudi potrebna količina osnovne raztopine preskusne kemikalije ali referenčne kemikalije. Če je bolj pripravno ali potrebno, da se prepreči izguba preskusne kemikalije, se pripravi ločena razredčena raztopina preskusne kemikalije v ločenem zbiralniku in se prek druge dozirne črpalke vnese v nagnjene cevi. | 30. | Alternativno (in prednostno) se uporabi usedena gospodinjska odpadna voda (odstavek 24), po možnosti sveža, zbrana vsak dan. | Delovanje rotirajočih cevnih reaktorjev | 31. | Za oceno ene preskusne kemikalije sta potrebna dva enaka cevna reaktorja, ki se namestita v prostoru s konstantno temperaturo, ki običajno znaša 22 ± 2 °C. | 32. | Peristaltične črpalke je treba nastaviti tako, da dovajajo 250 ± 25 ml/h organskega medija (brez preskusne kemikalije) v nagnjene cevi, ki se vrtijo pri 18 ± 2 vrtljajih na minuto. Cevi črpalke je treba na začetku preskusa in med samim preskusom namazati (odstavek 25), da se podaljša njihova življenjska doba in zagotovi pravilno delovanje. | 33. | Kot naklona cevi glede na vodoravno površino je treba nastaviti tako, da se zagotovi zadrževalni čas vtoka v čisti cevi 125 ± 12,5 s. Zadrževalni čas se oceni tako, da se v vtok doda nebiološki marker (npr. NaCl, inertno barvilo): čas, potreben za doseganje najvišje koncentracije v iztoku, se šteje za srednji zadrževalni čas (ko je film največji, se lahko zadrževalni čas poveča do približno 30 min). | 34. | Za te pretoke, hitrosti in čase je bilo ugotovljeno, da zagotavljajo ustrezno odstranitev (> 80-odstotno) DOC (ali KPK) in proizvajajo nitrificirane iztoke. Hitrost pretoka je treba spremeniti, če odstranitev ni zadostna ali če je treba simulirati delovanje določene čistilne naprave. V tem primeru je treba hitrost odmerjanja organskega medija prilagajati, dokler se delovanje reaktorja ne ujema z delovanjem čistilne naprave. | Inokulacija | 35. | Kadar se uporabi sintetična odpadna voda, lahko za začetek rasti mikroorganizmov zadostuje inokulacija z izpostavitvijo zraku, sicer je treba vtoku za 3 dni dodati 1 ml/l usedene odpadne vode. | Meritve | 36. | V rednih presledkih je treba preverjati, ali so stopnje odmerjanja in hitrosti rotiranja v okviru zahtevanih meja. Izmeriti je treba tudi pH iztoka, zlasti če se pričakuje nitrifikacija. | Vzorčenje in analiza | 37. | Metoda, vzorec in pogostost vzorčenja se izberejo glede na namen preskusa. Na primer, vzamejo se enkratni (ali zajemni) vzorci pritoka in iztoka ali pa se vzorci zbirajo dlje, npr. 3 do 6 ur. V prvem obdobju brez preskusne kemikalije je treba vzorce jemati dvakrat tedensko. Treba jih je filtrirati skozi membrane ali jih približno 15 minut centrifugirati pri približno 40 000 m/s2 (odstavek 18). Morda jih bo treba pred filtriranjem skozi membrano pustiti, da se usedejo, in/ali jih prefiltirati skozi grobi filter. DOC (ali KPK) je treba določiti vsaj v dveh ponovitvah, po potrebi pa tudi BPK, amonij in nitrit/nitrat. | 38. | Vse analize je treba izvesti čim prej po zbiranju in pripravi vzorcev. Če je treba analize odložiti, je treba vzorce shraniti v temnem prostoru v polnih in tesno zaprtih steklenicah pri približno 4 °C. Če je treba vzorce shraniti za več kot 48 h, jih je treba globoko zamrzniti, acidificirati ali dodati primerno strupeno kemikalijo (npr. 20 ml/l raztopine 10 g/l živosrebrovega (II) klorida). Zagotoviti je treba, da tehnika shranjevanja ne vpliva na rezultate analize. | Pripravljalno obdobje | 39. | V tem obdobju biofilm na površini raste, da doseže optimalno debelino. To obdobje običajno traja približno 2 tedna, vendar ne sme preseči 6 tednov. Odstranitev (odstavek 44) DOC (ali KPK) se poveča in doseže vrednost konstantne ravni. Ko je v obeh ceveh dosežena podobna vrednost konstantne ravni, se za preostanek preskusa ena cev izbere za kontrolno. V tem času mora njuno delovanje ostati skladno. | Vnos preskusne kemikalije | 40. | Na tej stopnji se v drugi reaktor doda preskusna kemikalija pri potrebni koncentraciji, ki je običajno 10–20 mg C/l. V kontrolno enoto se še naprej dovaja samo organski medij. | Obdobje aklimatizacije | 41. | Še naprej je treba dvakrat na teden izvajati analize za določitev DOC (ali KPK), in če je treba oceniti primarno biološko razgradljivost, s specifično analizo izmeriti tudi koncentracijo preskusne kemikalije. Za aklimatizacijo je potrebnih od 1 do 6 tednov (ali več v posebnih pogojih) po prvem vnosu preskusne kemikalije. Ko delež odstranitve (odstavki 43 do 45) doseže najvišjo vrednost, je treba dobiti 12 do 15 veljavnih vrednosti v fazi konstantne ravni v približno 3 tednih, da se oceni srednji delež odstranitve. Preskus se šteje za končan, če je dosežena dovolj visoka stopnja odstranitve. Običajno preskus ne sme trajati več kot 12 tednov po tem, ko je bila prvič dodana preskusna kemikalija. | Luščenje filma | 42. | Nenadno odstranjevanje velikih količin presežnega filma iz cevi ali luščenje poteka v razmeroma rednih presledkih. Za zagotovitev, da to ne vpliva na primerljivost rezultatov, je treba omogočiti, da preskusi zajemajo vsaj dva polna cikla rasti in luščenja. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 43. | Za vsako časovno določeno oceno se izračuna delež odstranitve DOC (ali KPK) preskusne kemikalije, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | Dt | = | delež odstranitve DOC (ali KPK) pri času t, | Cs | = | koncentracija DOC (ali KPK) v pritoku zaradi preskusne kemikalije, po možnosti ocenjena na podlagi koncentracije v osnovni raztopini in dodane količine (mg/l), | E | = | izmerjena vrednost DOC (ali KPK) v preskusnem iztoku v času t (mg/l), | Eo | = | izmerjena vrednost DOC (ali KPK) v kontrolnem iztoku v času t (mg/l). | Izračun se ponovi za referenčno kemikalijo, če se preskuša. | Delovanje kontrolnega reaktorja | 44. | Delež odstranitve DOC (ali KPK) (DB) organskega medija v kontrolnem reaktorju je koristna informacija pri oceni biorazgradne dejavnosti biofilma med preskusom. Delež odstranitve se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | Cm= DOC (ali KPK) organskega medija v kontrolnem pritoku (mg/l). | 45. | Pri vsaki časovno določeni oceni se izračuna odstranitev (DST) preskusne kemikalije, če je bila izmerjena s specifično analitsko metodo, za kar se uporabi enačba: | pri čemer je: | Si | = | izmerjena ali raje ocenjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem pritoku (mg/l), | Se | = | izmerjena koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem iztoku v času t (mg/l). | Če je z analitsko metodo dobljena pozitivna vrednost v nespremenjeni odpadni vodi enaka S c mg/l, se delež odstranitve (DSC) izračuna z enačbo: | Izražanje rezultatov preskusa | 46. | Delež odstranitve D t in DST (ali DSC), če je na voljo, se prikaže grafično v odvisnosti od časa (glej Dodatek 2 k poglavju C.10-A). Vzame se srednji (zaokrožen na najbližje celo število) in standardni odklon 12–15 vrednosti za DT (in za DST, če je na voljo), pridobljenih v fazi konstantne ravni kot delež odstranitve preskusne kemikalije. Na podlagi krivulje odstranitve se lahko izpeljejo nekatere ugotovitve o procesu odstranjevanja. | Adsorpcija | 47. | Če se velika odstranitev DOC preskusne kemikalije opazi na začetku preskusa, se preskusna kemikalija verjetno odstranjuje z adsorpcijo na biofilm. To je mogoče dokazati z določitvijo adsorbirane preskusne kemikalije na trdnih snoveh, odluščenih s filma. Odstranitev DOC kemikalij, ki se adsorbirajo, redko ostane visoka med celotnim preskusom; po navadi je stopnja odstranitve visoka na začetku, nato pa postopoma pade na ravnotežno vrednost. Če pa bi adsorbirana preskusna kemikalija lahko povzročila aklimatizacijo mikrobne populacije, bi se odstranitev DOC preskusne kemikalije povečala in dosegla visoko vrednost konstantne ravni. | Faza prilagajanja | 48. | Kot pri statičnih presejalnih preskusih je pri številnih preskusnih kemikalijah pred popolno biološko razgradnjo potrebna faza prilagajanja. V njej se kompetentne bakterije aklimatizirajo (ali prilagodijo) skoraj brez odstranitve preskusne kemikalije; nato nastopi začetna rast teh bakterij. Ta faza se konča, za fazo razgradnje pa se poljubno šteje, da se je začela, ko je odstranjenih približno 10 % začetne količine preskusne kemikalije (po dopuščeni adsorpciji, če se zgodi). Faza prilagajanja je pogosto zelo spremenljiva in slabo ponovljiva. | Faza konstantne ravni | 49. | Faza konstantne ravni krivulje odstranjevanja v kontinuiranem preskusu je opredeljena kot faza, v kateri je razgradnja največja. Trajati mora vsaj 3 tedne in imeti približno 12–15 izmerjenih veljavnih vrednosti. | Srednja stopnja odstranitve preskusne kemikalije | 50. | Izračuna se srednja vrednost na podlagi vrednosti odstranitve Dt (in Dst, če je na voljo) preskusne kemikalije v fazi konstantne ravni. Ta stopnja, ki je zaokrožena na najbližje celo število (1 %), je stopnja odstranitve preskusne kemikalije. Priporoča se tudi, da se izračuna 95-odstotni interval zaupanja za srednjo vrednost. Podobno se izračuna tudi srednja stopnja (DB) odstranitve organskega medija v kontrolni posodi. | Znak biološke razgradnje | 51. | Če se preskusna kemikalija ne adsorbira znatno na biofilm in ima krivulja odstranitve značilno obliko krivulje biološke razgradnje s fazo prilagajanja, fazo razgradnje in fazo konstantne ravni (odstavka 48 in 49), je mogoče izmerjeno odstranitev zanesljivo pripisati biološki razgradnji. Če se veliko preskusne kemikalije odstrani že na začetku, simulacijski preskus ne more razlikovati med biološkim in abiotskim procesom odstranitve. V takih in drugih primerih, v katerih obstaja dvom o biološki razgradnji (npr. pri ločevanju (stripping)), je treba analizirati adsorbirano preskusno kemikalijo na vzorcih filma ali opraviti dodatne statične (presejalne) preskuse biološke razgradljivosti na podlagi parametrov, ki jasno nakazujejo biološke procese. Taki preskusi so metode porabe kisika (poglavje C.4-D, E in F te priloge) (9) ali preskus, pri katerem se meri nastajanje CO2 (poglavje C.4-C te priloge ali metoda nadprostora) (10); kot inokulum se uporabi predhodno izpostavljeni biofilm iz ustreznega reaktorja. | 52. | Če sta bili izmerjeni odstranitev DOC in odstranitev specifične kemikalije, velike razlike med odstranjenimi deleži (pri čemer je prva vrednost nižja od druge) kažejo, da so bili v iztokih vmesni organski produkti, ki se morda težje razgradijo; to je treba raziskati. | Veljavnost rezultatov preskusa | 53. | Preskus je treba šteti za veljaven, če je stopnja odstranitve DOC (ali KPK) (DB) v kontrolnih enotah po 2 tednih delovanja > 80-odstotna in če ni bilo opaženega nič nenavadnega. | 54. | Če se je preskušala dobro razgradljiva (referenčna) kemikalija, mora biti stopnja biološke razgradnje > 90-odstotna, razlika med vrednostmi ponovitev pa ne sme biti večja od 5 %. Če ti merili nista izpolnjeni, je treba pregledati poskusne postopke in/ali dobiti gospodinjsko odpadno vodo iz drugega vira. | 55. | Razlike med vrednostmi biološke razgradnje iz podvojenih enot (če se uporabljajo), v katerih se obdeluje preskusna kemikalija, prav tako ne smejo biti večje od 5 %. Če to merilo ni izpolnjeno, vendar so odstranitve visoke, je treba analizo nadaljevati še 3 tedne. Če je odstranitev nizka, je treba preučiti zaviralne učinke preskusne kemikalije, če niso znani, in preskus ponoviti pri nižji koncentraciji preskusne kemikalije, če je to izvedljivo. | Poročilo o preskusu | 56. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | identifikacijski podatki, | — | fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti. | | Preskusni pogoji: | — | spremembe preskusnega sistema, zlasti če se preskušajo netopne ali hlapne snovi, | — | vrsta organskega medija, | — | delež in vrsta industrijskih odpadkov v odpadni vodi, če se uporabljata in sta znana, | — | metoda inokulacije, | — | založna raztopina preskusne kemikalije – vsebnost DOC (raztopljenega organskega ogljika) in TOC (celotnega organskega ogljika); kako je pripravljena, če je suspenzija; uporabljene preskusne koncentracije; razlogi za odstopanje od razpona 10–20 mg/l DOC; metoda dodajanja; datum prvega dodajanja; spremembe v koncentraciji, | — | srednji hidravlični zadrževalni čas (brez rasti); rotacijska hitrost cevi; približen kot naklona, če je mogoče, | — | podrobnosti o luščenju; čas in intenzivnost, | — | preskusna temperatura in razpon, | — | uporabljene analitske tehnike. | | Rezultati preskusa: | — | vsi izmerjeni podatki DOC, KPK, specifične analize, pH, temperatura, dušikove snovi, če je ustrezno, | — | vsi izračunani podatki Dt (ali Dtc), DB, DSt v tabelarni obliki in krivuljah odstranitve, | — | informacije o fazi prilagajanja in fazi konstantne ravni, trajanju preskusa, stopnji odstranitve preskusne kemikalije, referenčne kemikalije (če se preskuša) in organskega medija (v kontrolni enoti), statistični podatki ter izjave o biološki razgradljivosti in veljavnosti preskusa, | — | obravnava rezultatov. | VIRI: | (1) | Gerike, P., Fischer, W., Holtmann, W. (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753–758. | (2) | Truesdale, G. A., Jones, K., Vandyke, K. G. (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material. Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444. | (3) | Baumann, U., Kuhn, G., in Benz, M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214–220. | (4) | Gloyna, E. F., Comstock, R. F., Renn, C. E. (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357. | (5) | Kumke, G. W., Renn, C. E. (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92–94. | (6) | Tomlinson, T. G., Snaddon, D. H. M. (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int. J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881. | (7) | Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, London. | (8) | Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, London. | (9) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti. | (10) | ISO 14593 (1998). Kakovost vode – Vrednotenje končne biorazgradljivosti organskih snovi v vodi. Metoda z analizo sproščenega anorganskega ogljika v zaprtih posodah. | Dodatek 8 | Slika 1 | Rotirajoče cevi | Glosar: | Tloris | Pogled A/B | Gnana kolesa | Negnana kolesa | Pogonski motor | Reduktor | Notranja prirobnica | Nagibni mehanizem | Stožčasti zobnik | Slika 2 | Diagram pretoka | A: Rezervoar | B: Peristaltična črpalka | C: Rotirajoča cev | D: Zbiralnik iztoka | OPREDELITEV POJMOV | Preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Kemikalije: ‚Opozoriti je treba, da se izraz ‚kemikalija‘ v sporazumih UNCED in nadaljnjih dokumentih uporablja v širokem pomenu ter vključuje snovi, proizvode, zmesi, pripravke ali vse druge izraze, ki se lahko v obstoječih sistemih uporabijo za označevanje vključenosti.‘ | ‘ |
| 10) | sono aggiunti i capitoli C.27, C.28, C.29 e C.30: | «C.27. PROVA DI TOSSICITÀ SU CHIRONOMIDE IN ACQUA-SEDIMENTO CON SEDIMENTO ADDIZIONATO | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida OCSE n. 218 (2004) ed è inteso a valutare gli effetti di un’esposizione prolungata a sostanze chimiche su larve di Chironomus sp., un dittero che vive nei sedimenti di acqua dolce. Tiene conto anche dei protocolli per le prove di tossicità su Chironomus riparius e Chironomus tentans messi a punto in Europa (1) (2) (3) e in Nord America (4) (5) (6) (7) (8) e sottoposti a prove interlaboratorio (1) (6) (9). È possibile utilizzare anche altre specie ben documentate, ad esempio Chironomus yoshimatsui (10) (11). | 2. | Questo metodo prevede che l’esposizione alla sostanza in esame avvenga a mezzo di sedimenti addizionati. La scelta dello scenario d’esposizione dipende dalla finalità della prova. Lo scenario che consiste nell’addizionare i sedimenti con la sostanza in esame è inteso a simulare il persistere di livelli cumulativi della sostanza. In questo sistema sperimentale sedimento-acqua è il sedimento ad essere addizionato. | 3. | In genere le sostanze da saggiare su organismi che vivono nei sedimenti persistono a lungo in questo comparto. Questi organismi possono essere esposti per diverse vie. L’importanza relativa di ogni via d’esposizione e il tempo impiegato da ciascuna di esse per contribuire all’effetto tossico globale dipendono dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame. Per le sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) oppure per le sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, l’ingestione di alimenti contaminati può costituire una via d’esposizione importante. Per non sottovalutare la tossicità delle sostanze altamente lipofile, si può considerare l’opportunità di aggiungere alimenti al sedimento prima di applicare la sostanza in esame. Il presente metodo, per tenere conto di tutte le possibili vie di esposizione, prevede un’esposizione a lungo termine: la prova dura da 20 a 28 giorni per C. riparius e C. yoshimatsui, e da 28 a 65 giorni per C. tentans. Se occorrono dati a breve termine per un fine specifico, ad esempio studiare gli effetti di una sostanza chimica instabile, è possibile ritirare dopo dieci giorni di prova le repliche supplementari allestite nell’ambito dello stesso impianto sperimentale. | 4. | Gli endpoint misurati sono il numero totale di adulti comparsi e il tempo intercorso fino alla loro comparsa. Se occorrono dati a breve termine, si consiglia di effettuare dopo dieci giorni le misurazioni relative alla sopravvivenza e alla crescita delle larve, utilizzando le eventuali repliche supplementari. | 5. | Si raccomanda di usare un sedimento artificiale, che presenta numerosi vantaggi rispetto a quello naturale: | — | riduce la variabilità sperimentale in quanto costituisce una “matrice standardizzata” riproducibile, ed elimina la necessità di trovare delle fonti di sedimenti pulite e incontaminate, | — | consente di effettuare le prove in qualsiasi momento dell’anno, senza che occorra tenere conto della variabilità stagionale dei sedimenti, e non richiede di essere trattato prima delle prove per eliminare la fauna indigena; riduce inoltre i costi associati alla raccolta sul terreno di quantità sufficienti di sedimento per le prove di routine, | — | è possibile mettere a confronto e classificare le sostanze in base alla loro tossicità. | 6. | L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo. | PRINCIPIO DELLA PROVA | 7. | Si espongono dei chironomidi al primo stadio larvale a un intervallo di concentrazioni della sostanza in esame in un sistema sedimento-acqua. La sostanza in esame è aggiunta al sedimento e le larve al primo stadio vengo in seguito introdotte nei becher dove le concentrazioni sedimento-acqua sono state stabilizzate. Le percentuali di emergenza e crescita dei chironomidi sono misurate alla fine della prova. La sopravvivenza e il peso delle larve possono essere misurati anche dopo 10 giorni, se necessario (utilizzando le eventuali repliche supplementari). Questi dati sono analizzati tramite un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x dell’emergenza, della sopravvivenza o della crescita delle larve (ad esempio CE15, CE50 ecc.), oppure mediante verifica di un’ipotesi statistica per determinare un valore NOEC/LOEC. Nel secondo caso occorre confrontare i valori degli effetti con i valori di controllo per mezzo di prove statistiche. | INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME | 8. | È necessario conoscere l’idrosolubilità e la tensione di vapore della sostanza in esame, il coefficiente di ripartizione misurato o calcolato nel sedimento e la sua stabilità nell’acqua e nel sedimento. Occorre inoltre disporre di un metodo analitico affidabile per la quantificazione della sostanza in esame nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, di cui devono essere noti e riportati nella relazione l’accuratezza e il limite di rivelabilità. È anche utile conoscere la formula strutturale e la purezza della sostanza in esame, come pure il suo destino chimico (ad esempio, dissipazione, degradazione abiotica e biotica ecc.). Ulteriori orientamenti per saggiare le sostanze con caratteristiche fisico-chimiche che rendono difficoltosa l’esecuzione delle prove sono contenuti in (12). | SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO | 9. | Per assicurarsi che il protocollo e le condizioni di prova siano affidabili si possono saggiare regolarmente delle sostanze di riferimento. Tra i tossici di riferimento utilizzati con successo in prove interlaboratorio e studi di validazione vi sono: lindano, trifluralin, pentaclorofenolo, cloruro di cadmio e cloruro di potassio (1) (2) (5) (6) (13). | VALIDITÀ DELLA PROVA | 10. | Perché il test sia valido devono realizzarsi le seguenti condizioni: | — | l’emergenza nei controlli deve arrivare almeno al 70 % alla fine del test (1) (6), | — | per quanto riguarda C. riparius e C. yoshimatsui, l’emergenza allo stadio adulto nei recipienti di controllo deve avvenire tra i 12 e i 23 giorni successivi alla loro introduzione nei recipienti; per C. tentans il periodo va da 20 a 65 giorni, | — | alla fine della prova, si devono misurare il pH e la concentrazione dell’ossigeno disciolto in ogni recipiente. La concentrazione dell’ossigeno deve essere almeno il 60 % del suo valore di saturazione in aria (ASV) alla temperatura applicata e il pH dell’acqua sovrastante deve essere compreso tra 6 e 9 in tutti i recipienti di prova, | — | la temperatura dell’acqua non deve variare di oltre ± 1.0 °C e può essere regolata per mezzo di un camera isotermica, nel qual caso la temperatura ambiente dovrà essere periodicamente confermata, a congrui intervalli di tempo. | DESCRIZIONE DEL METODO | Recipienti di prova | 11. | Lo studio è condotto in becher di vetro da 600 ml, di 8 cm di diametro. Possono essere utilizzati anche altri recipienti, purché garantiscano profondità sufficiente ad accogliere il sedimento e l’acqua sovrastante. La superficie del sedimento deve essere tale da offrire uno spazio da 2 a 3 cm2 per larva. La profondità dello strato sedimentario e la profondità dell’acqua sovrastante devono essere in un rapporto di 1:4. I recipienti e gli altri apparecchi destinati ad entrare in contatto con il sistema di prova devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte (ad esempio Teflon). | Selezione delle specie | 12. | La specie che conviene utilizzare per la prova è Chironomus riparius. Si può utilizzare anche Chironomus tentans, anche se è più difficile da manipolare e richiede un periodo di prova più lungo. Si può utilizzare anche Chironomus yoshimatsui. Metodi di coltura di Chironomus riparius figurano nell’appendice 2. Sono reperibili informazioni anche sulle condizioni di coltura delle altre specie: Chironomus tentans (4) e Chironomus yoshimatsui (11). Occorre identificare la specie prima dell’avvio della sperimentazione, ma non è necessario farlo prima di ogni singola prova se gli organismi sono stati coltivati dal laboratorio che esegue la sperimentazione. | Sedimento | 13. | Utilizzare di preferenza sedimento artificiale (detto anche sedimento formulato). Se si sceglie di utilizzare un sedimento naturale, occorre caratterizzarlo, almeno quanto a pH e tenore di carbonio organico (la determinazione di altri parametri, come il rapporto C/N e la granulometria è altrettanto raccomandata), e assicurarsi che sia esente da ogni contaminazione e da altri organismi che potrebbero entrare in competizione con i chironomidi o consumarli. Prima di impiegare un sedimento naturale in una prova di tossicità su chironomidi, si consiglia inoltre di farlo riposare per sette giorni alle stesse condizioni in cui verrà realizzata la prova. Per questo test si consiglia di utilizzare il sedimento artificiale basato su quello di cui al metodo di prova C.8 (14) e costituito secondo la seguente formula (1) (15) (16): | a) | 4-5 % (peso secco) di torba, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0. È importante utilizzare torba sotto forma di polvere, finemente macinata (granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata unicamente all’aria; | b) | 20 % (peso secco) di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza superiore al 30 %); | c) | 75-76 % (peso secco) di sabbia quarzosa (composta in prevalenza da sabbia fine, con oltre il 50 % delle particelle di granulometria compresa tra 50 e 200 μm); | d) | aggiunta di acqua deionizzata fino ad ottenere un tenore di umidità totale della miscela compreso tra 30 e 50 %; | e) | aggiunta di carbonato di calcio di qualità chimicamente pura (CaCO3) per aggiustare il pH della miscela finale a 7,0 ± 0,5. Il tenore di carbonio organico della miscela finale dovrà essere del 2 % (± 0,5 %), ottenuto aggiungendo le dovute quantità di torba e sabbia, come indicato in a) e c). | 14. | La provenienza di torba, argilla caolinica e sabbia deve essere nota. Occorre verificare che i componenti del sedimento non siano contaminati da sostanze chimiche (es.: metalli pesanti, composti organoclorurati o organo fosforati ecc.). L’appendice 3 contiene un esempio per la preparazione del sedimento artificiale. È possibile mescolare componenti secchi, se si può dimostrare che con l’aggiunta di acqua sovrastante non si verifica alcuna separazione dei componenti del sedimento (es. particelle di torba che galleggiano) e che la torba o il sedimento sono sufficientemente condizionati. | Acqua | 15. | Le acque che presentano le caratteristiche chimiche indicate alle appendici 2 e 4 sono considerate adatte per le prove. È possibile utilizzare come acqua di allevamento e acqua di prova ogni tipo di acqua idonea, quali acqua naturale (di superficie o freatica), ricostituita (cfr. appendice 2) o di rubinetto non clorata, se i chironomidi riescono a sopravvivervi per la durata della coltura e della prova senza manifestare segni di stress. All’inizio della prova, il pH dell’acqua di prova dev’essere compreso tra 6 e 9 e la durezza totale non dev’essere superiore a 400 mg/l (come CaCO3). Utilizzare, però, un’acqua meno dura se si sospetta il rischio di un’interazione tra gli ioni che provocano la durezza e la sostanza in esame (nel qual caso il mezzo Elendt M4 non può essere usato). Utilizzare lo stesso tipo di acqua nel corso di tutta la prova. Misurare le caratteristiche della qualità dell’acqua elencate nell’appendice 4 almeno due volte l’anno o quando si sospetta che possano essere cambiate significativamente. | Soluzioni madre — sedimenti addizionati | 16. | I sedimenti addizionati — alla concentrazione desiderata — vengono generalmente preparati aggiungendo una soluzione della sostanza in esame direttamente al sedimento. La soluzione madre della sostanza in esame dissolta in acqua deionizzata viene mescolata con il sedimento artificiale ricorrendo a un laminatoio, a un miscelatore per mangimi oppure a mano. Se scarsamente solubile in acqua, la sostanza in esame può essere disciolta nel minor volume possibile di un solvente organico idoneo (per esempio esano, acetone, cloroformio). La soluzione ottenuta va poi mischiata con 10 g di sabbia quarzosa fine per ciascun recipiente di prova. Il solvente va lasciato evaporare e deve essere completamente eliminato dalla sabbia; la sabbia va poi mescolata alla quantità di sedimento necessaria per un becher. Per solubilizzare, disperdere o emulsionare la sostanza in esame, si possono impiegare soltanto agenti che volatilizzano rapidamente. Occorre tener conto, al momento di preparare il sedimento, della sabbia contenuta nella sostanza in esame e nella miscela di sabbia (il sedimento, quindi, va preparato utilizzando meno sabbia). Fare attenzione a che la sostanza in esame aggiunta al sedimento sia perfettamente e omogeneamente distribuita al suo interno. Se necessario, analizzare dei sottocampioni per verificare il grado di omogeneità. | DISEGNO SPERIMENTALE | 17. | Il disegno comprende la selezione del numero delle concentrazioni di prova, e dell’intervallo fra esse, del numero di recipienti per ciascun livello di concentrazione e del numero di larve per recipiente. È qui descritto il procedimento da seguire per la stima puntuale della CE, la stima della NOEC e per l’esecuzione di una prova limite. | Disegno per l’analisi di regressione | 18. | La concentrazione che determina un effetto (ad esempio CE15, CE50) e l’intervallo di concentrazioni alle quali la sostanza in esame produce un effetto interessante devono essere contemplati dalle concentrazioni incluse nella prova. In genere la precisione e, in particolare, la validità della stima delle concentrazioni con effetto (CEX) saranno maggiori quando la concentrazione con effetto rientra nell’intervallo di concentrazioni da testare. Bisogna evitare di estrapolare risultati molto al di sotto della concentrazione efficace più debole o al di sopra della concentrazione massima. È utile condurre una prova preliminare di determinazione dell’intervallo di concentrazioni per delimitare le concentrazioni su cui imperniare la prova (cfr. paragrafo 27). | 19. | Se si deve stimare la CEX occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, allestendo tre repliche per ciascuna concentrazione. In ogni caso, per ottenere una buona stima del modello, è consigliabile utilizzare un numero sufficiente di concentrazioni. Il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere maggiore di due (salvo nel caso in cui la curva dose/risposta sia poco accentuata). Il numero di repliche per trattamento può essere diminuito se si aumenta il numero di concentrazioni che danno risposte diverse. L’aumento del numero di repliche o la riduzione degli intervalli tra le concentrazioni tendono a ridurre gli intervalli di confidenza per la prova. Il numero delle repliche sarà maggiore se si deve stimare la percentuale di sopravvivenza e la crescita delle larve dopo 10 giorni. | Disegno per la stima di una NOEC/LOEC | 20. | Se occorre stimare la LOEC o la NOEC si saggeranno cinque concentrazioni con almeno quattro repliche, e il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere superiore a due. Il numero di repliche deve essere tale da garantire una potenza statistica che consenta di rilevare una differenza del 20 % con l’unità di controllo, a un grado di significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto riguarda la velocità di sviluppo, è in genere appropriata un’analisi della varianza (ANOVA), come ad esempio il test di Dunnett o il test di Williams (17) (18) (19) (20). Per il tasso di emergenza si può utilizzare il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione secondo Bonferroni) o il test di Mantel-Haenszel. | Prova limite | 21. | Se la prova preliminare di determinazione dell’intervallo delle concentrazioni non ha prodotto alcun effetto, si può condurre una prova limite (una concentrazione di prova e un controllo). Lo scopo della prova limite è quello di condurre un test con una concentrazione sufficientemente alta da consentire ai responsabili delle decisioni di escludere eventuali effetti tossici della sostanza in esame; il limite va fissato a una concentrazione la cui comparsa è improbabile in tutte le situazioni. Si raccomanda un rapporto di 1 000 mg/kg (peso secco). Di norma è necessario allestire sei repliche sia per gli organismi trattati che per quelli di controllo. Occorre dimostrare che la potenza statistica è sufficiente per rilevare una differenza del 20 % con gli organismi di controllo, a un grado di significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto concerne la risposta in termini di velocità di sviluppo e peso, il test t costituisce un metodo statistico adatto se i dati rispettano le condizioni imposte da questo test (normalità, varianze omogenee). In caso contrario, si può ricorrere al test t per varianze disuguali o a un test non parametrico, come il test di Wilcoxon-Mann-Whithey. Quanto al tasso di emergenza, il test esatto di Fisher è appropriato. | PROCEDURA | Condizioni di esposizione | Preparazione del sistema sedimento addizionato-acqua | 22. | Per l’applicazione della sostanza in esame (14), si raccomanda l’uso del processo di addizione descritto nel metodo di prova C.8: Tossicità per i lombrichi. I sedimenti addizionati vengono posti nei recipienti e viene aggiunta acqua sovrastante per produrre un rapporto volumetrico sedimento-acqua di 1:4 (cfr. paragrafi 11 e 15). La profondità dello strato sedimentario dev’essere tra 1,5 e 3 cm. Per evitare la separazione degli ingredienti del sedimento e la risospensione delle particelle fini durante l’aggiunta dell’acqua, si può ricoprire il sedimento con un disco di plastica durante l’operazione di riempimento della colonna d’acqua, per poi ritirarlo a operazione completata. Possono essere utilizzati anche altri dispositivi. | 23. | I recipienti così allestiti devono essere coperti (ad esempio, da piastre di vetro). Nel corso della prova si provvederà, se necessario, ad aggiungere l’acqua necessaria a mantenere il volume originario per compensare l’evaporazione, avendo cura di utilizzare acqua distillata o deionizzata per evitare l’accumulo di sali. | Stabilizzazione | 24. | Una volta che il sedimento addizionato sovrastato da uno strato d’acqua è stato preparato, è preferibile lasciare che la sostanza in esame si ripartisca tra la fase acquosa e il sedimento (3) (4) (6) (13); di preferenza, ciò dovrebbe avvenire nelle stesse condizioni di temperatura e aerazione utilizzate nella prova. Il tempo di equilibratura può durare alcune ore, dei giorni o, in rari casi, fino a 4 o 5 settimane, a seconda del sedimento e della sostanza chimica. Non occorre attendere il raggiungimento dell’equilibrio, perché molte sostanze rischiano di degradarsi nel corso di questo periodo, ma è raccomandato un tempo di attesa di 48 ore. Al termine di questo periodo di equilibratura, occorre misurare la concentrazione della sostanza in esame nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, almeno alla concentrazione massima e a una più bassa (cfr. paragrafo 38). Tali misurazioni analitiche della sostanza in esame consentono di calcolare il bilancio di massa e di esprimere i risultati in funzione delle concentrazioni misurate. | Introduzione degli organismi di prova | 25. | Quattro o cinque giorni prima di introdurre gli organismi nei recipienti, si prelevano dalle colture ammassi di uova e le si depositano in recipienti piccoli con il mezzo di coltura. Si può utilizzare il mezzo vecchio prelevato dalla coltura madre o un mezzo fresco. In quest’ultimo caso, si aggiunge una piccola quantità di cibo, ad esempio alghe verdi e/o qualche goccia di filtrato di una sospensione di mangime per pesci in fiocchi (cfr. appendice 2). Si devono utilizzare solo ammassi di uova appena deposti. Di solito le larve compaiono qualche giorno dopo la deposizione delle uova (da 2 a 3 giorni per Chironomus riparius a 20 oC e da 1 a 4 giorni per Chironomus tentans a 23 oC e Chironomus yoshimatsui a 25 oC) e la loro crescita avviene in quattro stadi, ciascuno di una durata compresa tra 4 e 8 giorni. Questa prova si applica al primo stadio larvale (2-3 oppure 1-4 giorni dopo la schiusa). È possibile verificare lo stadio di sviluppo dei moscerini in base alle dimensioni della capsula cefalica (6). | 26. | In ciascun recipiente contenente il sedimento addizionato e l’acqua si depositano, per mezzo di una pipetta smussata, venti larve al primo stadio scelte a caso. L’aerazione dell’acqua deve essere interrotta per 24 ore dal momento dell’introduzione delle larve nei recipienti (cfr. paragrafi 24 e 32). In base al disegno sperimentale adottato (cfr. paragrafi 19 e 20), il numero di larve utilizzate per concentrazione è almeno 60 per la stima puntuale della CE e 80 per la determinazione della NOEC. | Concentrazioni di prova | 27. | Può essere utile effettuare una prova preliminare per determinare la gamma delle concentrazioni per la prova vera e propria. A tal fine si utilizza una serie di concentrazioni della sostanza in esame molto intervallate tra loro. Applicando la stessa densità superficiale di chironomidi prevista per la prova vera e propria, i chironomidi sono esposti ad ogni concentrazione della sostanza in esame per un periodo che consenta di stimare le concentrazioni di prova adeguate e non è necessaria alcuna replica. | 28. | Le concentrazioni di prova per la prova vera e propria sono decise in funzione dell’esito del saggio di determinazione dell’intervallo di concentrazione. Occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, scelte in base a quanto indicato nei paragrafi 18-20. | Controlli | 29. | La prova prevede l’allestimento di recipienti di controllo, senza la sostanza in esame ma con il sedimento, e un congruo numero di repliche (cfr. paragrafi 19-20). Se la sostanza in esame è stata applicata mediante un solvente (cfr. paragrafo 16), si deve aggiungere un recipiente di controllo che contenga sedimento e solvente. | Sistema di prova | 30. | Si impiegano sistemi statici. I sistemi semistatici oppure a flusso, con rinnovo intermittente o continuo dell’acqua sovrastante, possono essere utilizzati in casi eccezionali, ad esempio se le specifiche della qualità dell’acqua diventano inadeguate per gli organismi in esame oppure influiscono sull’equilibrio chimico (nel caso in cui, ad esempio, i livelli di ossigeno disciolto si abbassino troppo, la concentrazione degli escreti aumenti eccessivamente o i minerali prodotti dalla lisciviazione del sedimento alterino il pH e/o la durezza dell’acqua). È tuttavia sufficiente e preferibile ricorrere ad altri metodi di miglioramento della qualità dell’acqua sovrastante, come l’areazione. | Cibo | 31. | Le larve devono essere nutrite, di preferenza ogni giorno o almeno tre volte la settimana. Durante i primi 10 giorni la dieta giornaliera ritenuta adeguata per le larve in questo stadio consiste in 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg per C. yoshimatsui) pro capite di mangime per pesci (sospensione acquosa o finemente macinato, del tipo Tetra-Min o Tetra-Phyll; cfr. appendice 2). Può essere necessario aumentare leggermente la dose per le larve più vecchie: 0,5-1 mg per larva al giorno dovrebbe essere sufficiente per il resto della prova. Si diminuirà la razione di mangime di tutti gli organismi trattati e dei controlli se si osserva la comparsa di funghi o il decesso di organismi di controllo. Se non si riesce ad arrestare lo sviluppo fungino occorre ripetere la prova. Se la prova verte su sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) o sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, la quantità di cibo necessaria alla sopravvivenza e alla crescita naturale degli organismi può essere incorporata al sedimento artificiale prima del periodo di stabilizzazione. In tal caso il mangime per pesci è sostituito con alimenti vegetali, ad esempio 0,5 % (peso secco) di foglie finemente macinate di ortica (Urtica dioica), gelso (Morus alba), trifoglio bianco (Trifolium repens), spinacio (Spinacia oleracea) o di altro materiale vegetale (Cerophyl o alfa cellulosa). | Condizioni di incubazione | 32. | L’acqua sovrastante dei recipienti è sottoposta a una moderata aerazione, di preferenza a partire da 24 ore dopo l’introduzione delle larve e fino alla fine della prova (avendo cura che la concentrazione di ossigeno disciolto non scenda sotto il 60 % del valore di saturazione dell’aria). L’aria è insufflata tramite pipette Pasteur in vetro fissate a 2-3 cm sopra lo strato di sedimento (nella misura di una o poche bolle al secondo). Se la sostanza in esame è volatile, va eventualmente considerato di sopprimere l’aerazione. | 33. | La prova è effettuata a una temperatura costante di 20 °C (± 2 °C). Per C. tentans e C. yoshimatsui la temperatura consigliata è, rispettivamente, di 23 °C e 25 °C (± 2 °C). Il fotoperiodo è di 16 ore e l’intensità luminosa compresa tra 500 e 1 000 lux. | Durata dell’esposizione | 34. | L’esposizione ha inizio con l’introduzione delle larve nei recipienti trattati e di controllo. La prova dura 28 giorni per C. riparius e C. yoshimatsui, e 65 giorni per C. tentans. Se i moscerini emergono prima, la prova può concludersi dopo almeno cinque giorni dall’emergenza dell’ultimo adulto di controllo. | Osservazioni | Emergenza | 35. | Si deve determinare il tempo di sviluppo e il numero totale di moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi. I maschi si distinguono facilmente perché dotati di antenne piumate. | 36. | I recipienti vanno osservati almeno tre volte la settimana, per verificare che non presentino attività anomala (abbandono del sedimento, movimenti natatori insoliti ecc.) rispetto a quelli di controllo. Durante il periodo della prevista emergenza è necessario contare tutti i giorni i moscerini emersi e registrare il sesso e il numero di quelli completamente emersi. Una volta identificati, i moscerini sono tolti dai recipienti. Ogni ammasso di uova deposto prima della fine della prova deve essere registrato e poi tolto per impedire l’introduzione di nuove larve nel sedimento. Va registrato anche il numero delle pupe visibili che non sono riuscite ad emergere. L’appendice 5 contiene indicazioni su come misurare l’emergenza. | Crescita e sopravvivenza | 37. | Se occorre rilevare i dati sulla sopravvivenza e la crescita della larve dopo 10 giorni, si allestiscono recipienti supplementari all’inizio della prova da usare successivamente. Il sedimento di questi recipienti supplementari è setacciato con un setaccio da 250 μm per trattenere le larve. La morte è determinata da due criteri: l’immobilità o l’assenza di reazione a uno stimolo meccanico. Anche le larve non recuperate devono essere contate tra i decessi (è possibile che le larve morte all’inizio della prova siano state degradate da microbi). Dopo avere determinato il peso secco (senza ceneri) delle larve sopravvissute per ogni recipiente, si calcola il peso secco individuale medio per recipiente. Per determinare a quale stadio si trovano le larve sopravvissute si possono misurare le dimensioni della capsula cefalica di ogni individuo. | Misurazioni analitiche | Concentrazione della sostanza in esame | 38. | Prima di iniziare la prova (cioè prima di introdurre le larve), occorre prelevare campioni di sedimento da almeno uno dei recipienti per ciascun trattamento, per determinare analiticamente la concentrazione nel sedimento della sostanza in esame. Occorre analizzare, come minimo, dei campioni dell’acqua sopranatante, dell’acqua interstiziale e del sedimento all’inizio della prova (cfr. paragrafo 24) e alla fine, e ciò per la concentrazione massima e per una più bassa. La concentrazione della sostanza in esame ci informa sul comportamento/ripartizione della sostanza nel sistema acqua-sedimento. | 39. | Quando si effettuano misurazioni intermedie (ad esempio, al settimo giorno) e se l’analisi richiede campioni voluminosi che non possono essere prelevati dai recipienti senza influire sull’impianto sperimentale, le determinazioni analitiche sono praticate su campioni prelevati da recipienti supplementari trattati allo stesso modo (anche contenenti organismi di prova) ma non utilizzati per le osservazioni biologiche. | 40. | Per isolare l’acqua interstiziale si raccomanda di centrifugare i campioni, ad esempio, a 10 000 g e a 4oC per 30 minuti. Se però è dimostrato che la sostanza in esame non adsorbe sui filtri, è accettabile anche la filtrazione. In alcuni casi, se i campioni sono troppo piccoli, può rivelarsi impossibile analizzare le concentrazioni nell’acqua interstiziale. | Parametri fisici e chimici | 41. | Il pH e la temperatura dei recipienti devono essere debitamente misurati (cfr. paragrafo 10). All’inizio e alla fine della prova è necessario misurare la durezza dell’acqua e il tenore di ammoniaca nei controlli e in un recipiente trattato alla concentrazione massima. | DATI E RELAZIONE | Trattamento dei risultati | 42. | Scopo di questa prova è determinare l’effetto della sostanza in esame sulla velocità di sviluppo e sul numero totale di moscerini moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi oppure, nel caso della prova a 10 giorni, gli effetti sulla sopravvivenza e sul peso delle larve. Se nulla indica che i due sessi presentano differenze statistiche di sensibilità, ai fini dell’analisi statistica i risultati ottenuti sui maschi e sulle femmine possono essere raggruppati. Le differenze di sensibilità tra i sessi possono essere valutate statisticamente tramite, ad esempio, il test χ2-r x 2. La sopravvivenza delle larve e il peso secco individuale medio per recipiente devono essere determinati dopo 10 giorni, se del caso. | 43. | Le concentrazioni con effetto espresse (basate sul peso secco), sono calcolate di preferenza sulla base delle concentrazioni dei sedimenti misurate all’inizio della prova (cfr. paragrafo 38). | 44. | Per effettuare una stima puntuale della CE50 o di qualsiasi altra CEX, le statistiche per recipiente possono essere usate alla stregua di repliche. Quando si calcola un intervallo di confidenza per una qualsiasi CEX occorre tener conto della variabilità tra i recipienti oppure dimostrare che tale variabilità è di entità trascurabile. Quando il modello è adattato mediante il metodo dei minimi quadrati, è necessario trasformare le statistiche per recipiente al fine di aumentare l’omogeneità della varianza. I valori della CEX devono però essere calcolati dopo che il risultato è stato ritrasformato nel suo valore originario. | 45. | Se l’analisi statistica mira a determinare la NOEC/LOEC mediante verifica di un’ipotesi, la variabilità tra i recipienti deve essere presa in considerazione, ad esempio mediante un’analisi ANOVA gerarchica. In situazioni dove non sussistono tutti i consueti presupposti per l’ANOVA si possono invece utilizzare test più robusti (21). | Tasso di emergenza | 46. | I tassi di emergenza sono dati di tipo quantale e possono essere analizzati con il test di Cochran-Armitage applicato in modo regressivo se si ipotizza un rapporto dose-risposta monotonico e i tassi di emergenza corroborano questa ipotesi. In caso contrario, si può utilizzare un test esatto di Fisher o un test di Mantel-Haenszel con correzione dei valori p secondo Bonferroni-Holm. Se si osserva che la variabilità tra le repliche alla stessa concentrazione è maggiore di quanto una distribuzione binomiale indicherebbe (variazione spesso denominata “extrabinomiale”), si applicherà un test più robusto (Cochran-Armitage o Fisher esatto) come proposto alla nota (21). | Si determina la somma dei moscerini emersi per recipiente (ne) e la si divide per il numero di larve introdotte (na): | dove: | ER | = | tasso di emergenza | ne | = | numero di moscerini emersi per recipiente | na | = | numero di larve introdotte per recipiente | 47. | Un’alternativa più adatta ai campioni di grandi dimensioni, in presenza di varianza extrabinomiale, consiste nel trattare il tasso di emergenza come una risposta continua e adottare procedure quali il test di William, se si ipotizza che il rapporto dose-risposta sia monotonico e se i dati del tasso di emergenza corroborano tale ipotesi. Conviene utilizzare il test di Dunnett quando l’ipotesi di monotonicità è infondata. Ai fini di questa analisi un campione è considerato di grandi dimensioni quando il numero di moscerini emersi e il numero dei non emersi sono entrambi superiori a cinque per replica. | 48. | Prima di applicare i metodi ANOVA, occorre dapprima trasformare i valori del tasso di emergenza (ER) per la radice quadrata dell’arcoseno oppure secondo Freeman-Tukeylper ottenere una distribuzione prossima a quella normale e livellare le varianze. Il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione Bonferroni) oppure il test di Mantel-Haenszel possono essere impiegati quando si utilizzano delle frequenze assolute. La trasformazione con la radice quadrata dell’arcoseno consiste nel calcolare la funzione inversa del seno (seno-1) della radice quadrata del tasso di emergenza (ER). | 49. | Per i tassi di emergenza, i valori della CEX sono calcolati con un’analisi di regressione [oppure probit (22), logit, Weibull, appositi software commerciali ecc.]. Se l’analisi di regressione è inconcludente (ad esempio, quando vi sono meno di due risposte parziali), si fa ricorso ad altri metodi non parametrici quali la media mobile o una semplice interpolazione. | Velocità di sviluppo | 50. | Il tempo medio di sviluppo è il tempo medio intercorso tra l’introduzione delle larve (giorno 0 della prova) e l’emergenza della coorte sperimentale di moscerini (per calcolare il tempo reale di sviluppo si deve tenere conto dell’età delle larve al momento dell’introduzione). La velocità di sviluppo è inversamente proporzionale al tempo di sviluppo (unità: 1/giorno) e consiste nella parte di sviluppo larvale che avviene quotidianamente. Per valutare la tossicità nei sedimenti si preferisce far riferimento alla velocità di sviluppo perché, rispetto al tempo di sviluppo, ha una varianza più bassa e valori più omogenei e più prossimi a una distribuzione normale. È anche per questo che si possono applicare test parametrici potenti, più adatti alla velocità di sviluppo che al tempo di sviluppo. Se la velocità di sviluppo è trattata come risposta continua, i valori della CEX possono essere stimati avvalendosi dell’analisi di regressione [ad esempio (23) (24)]. | 51. | Per i test statistici seguenti, il numero di moscerini osservati il giorno x è considerato essere emerso a metà dell’intervallo tra il giorno x e il giorno x - l (l = lunghezza dell’intervallo di osservazione, di solito 1 giorno). La velocità media di sviluppo per recipiente (x) è calcolata come segue: | dove: | : | velocità media di sviluppo per recipiente | i | : | indice dell’intervallo di osservazione | m | : | numero massimo di intervalli di osservazione | : | numero di moscerini emersi nell’intervallo di osservazione i | ne | : | numero totale di moscerini emersi alla fine dell’esperimento (= | ) | xi | : | velocità di sviluppo dei moscerini emersi nell’intervallo i | dove: | dayi | : | giorno dell’osservazione (contato a partire dall’applicazione) | li | : | lunghezza dell’intervallo d’osservazione i (espressa in giorni, di solito 1 giorno) | Relazione sulla prova | 52. | La relazione sulla prova deve contenere almeno le seguenti informazioni: | | Sostanza in esame: | — | natura fisica e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (idrosolubilità, tensione di vapore, coefficiente di ripartizione nel suolo (o nel sedimento, se disponibile), stabilità nell’acqua ecc.), | — | dati di identificazione chimica (nome comune, nome chimico, formula strutturale, numero CAS ecc.) compresi purezza e metodo di analisi per la quantificazione della sostanza in esame. | | Specie in esame: | — | animali utilizzati: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi e condizioni di allevamento, | — | informazioni sulla manipolazione degli ammassi di uova e delle larve, | — | età degli animali al momento della loro introduzione nei recipienti di prova. | | Condizioni sperimentali: | — | sedimento utilizzato (specificare se naturale o artificiale), | — | se il sedimento è naturale: ubicazione e descrizione del sito di campionamento del sedimento e, se possibile, cronistoria della contaminazione; caratteristiche: pH, tenore di carbonio organico, rapporto C/N e granulometria (se del caso). | — | preparazione del sedimento artificiale: ingredienti e caratteristiche (tenore di carbonio organico, pH, tenore di umidità ecc., all’inizio della prova), | — | preparazione dell’acqua per la prova (se l’acqua è ricostituita) e caratteristiche (concentrazione dell’ossigeno, pH, conduttività, durezza ecc., all’inizio della prova), | — | spessore del sedimento e profondità dell’acqua sovrastante, | — | volume dell’acqua sovrastante e dell’acqua interstiziale; peso del sedimento umido, con acqua interstiziale e senza, | — | recipienti di prova (materiale e dimensioni), | — | metodo per l’addizione della sostanza al sedimento: concentrazioni utilizzate nella prova, numero di repliche e, se del caso, solventi utilizzati, | — | fase di stabilizzazione del sistema sedimento addizionato-acqua: durata e condizioni, | — | condizioni di incubazione: temperatura, fotoperiodo e intensità luminosa, aerazione (frequenza e intensità), | — | informazioni dettagliate sull’alimentazione, che comprendono il tipo di mangime, la preparazione, la quantità e il regime di alimentazione. | | Risultati: | — | concentrazioni di prova, nominali e concentrate, e risultati di tutte le analisi condotte per determinare la concentrazione della sostanza in esame nel recipiente di prova, | — | qualità dell’acqua nei recipienti di prova, ossia pH, temperatura, ossigeno disciolto, durezza e ammoniaca, | — | aggiunta di acqua per sostituire quella eventualmente evaporata, | — | numero di moscerini maschi e femmine emersi, per ciascun recipiente e ciascun giorno, | — | numero di larve non emerse come moscerini, per recipiente, | — | peso secco individuale medio delle larve, per recipiente e, se del caso, per stadio larvale, | — | percentuale di emergenza per replica e per concentrazione (risultati raggruppati per moscerini maschi e femmine), | — | velocità media di sviluppo dei moscerini completamente emersi, per replica e per concentrazione somministrata (risultati raggruppati per moscerini maschi e femmine), | — | stime degli endpoint di tossicità, ad esempio per CEX (e relativi intervalli di confidenza), NOEC e/o LOEC, nonché metodi statistici utilizzati per determinarli, | — | discussione dei risultati comprese le eventuali ripercussioni sui risultati dovute allo scostamento dal presente metodo di prova. | BIBLIOGRAFIA | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canadàs biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. | (10) | Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. | (11) | Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. | (12) | OCSE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Capitolo C.8 del presente allegato, Tossicità per i lombrichi. | (15) | Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. | (16) | Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. | (17) | Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. | (18) | Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. | (19) | Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. | (20) | Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. | (21) | Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. | (22) | Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. | (23) | Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. | (24) | Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. | Appendice 1 | DEFINIZIONI | Ai fini del presente metodo si applicano le seguenti definizioni: | | Sedimento artificiale: sintetico o formulato, miscela di materiali utilizzati per simulare le componenti fisiche di un sedimento naturale. | | Acqua sovrastante: acqua posta sopra il sedimento nel recipiente di prova. | | Acqua interstiziale: acqua che occupa lo spazio tra il sedimento e le particelle di terreno. | | Sedimento addizionato: sedimento al quale è stata aggiunta la sostanza in esame. | | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova. | Appendice 2 | Indicazioni per l’allevamento di Chironomus riparius | 1. | Le larve di Chironomus possono essere allevate in cristallizzatori o in grandi recipienti. Il fondo del recipiente è ricoperto di un sottile strato di sabbia di quarzo dello spessore di circa 5-10 mm. Anche il Kieselguhr (ad esempio l’articolo 8117 di Merck) ha dato prova di essere un substrato idoneo (nel qual caso ne basta uno strato ancora più sottile, di pochi millimetri). Si aggiunge acqua di qualità adeguata ad un’altezza di vari centimetri, avendo cura di mantenere questo livello iniziale aggiungendo acqua in caso di evaporazione per prevenire il disseccamento. L’acqua può essere rinnovata completamente, se necessario. Fornire un’aerazione moderata. I recipienti di allevamento devono essere situati in apposite gabbie per impedire la fuga degli adulti emergenti. La gabbia dev’essere sufficientemente grande per consentire agli adulti emersi di sfarfallare, condizione imprescindibile per la copulazione (dimensioni minime: 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Le gabbie devono essere tenute a temperatura ambiente, oppure a una temperatura costante di 20 ± 2 °C, con un fotoperiodo di 16 ore di luce (a un’intensità luminosa di circa 1 000 lux) e 8 ore di buio. Secondo le informazioni disponibili, un’umidità relativa dell’aria inferiore a 60 % può impedire la riproduzione. | Acqua di diluizione | 3. | Può essere utilizzata qualsiasi acqua naturale o sintetica di qualità adeguata. Normalmente viene utilizzata acqua di pozzo, acqua di rubinetto non clorata e mezzi artificiali (come Elendt M4 o M7, si veda di seguito). L’acqua deve essere aerata prima dell’uso. Se necessario, si può rinnovare l’acqua di allevamento versando o sifonando l’acqua usata dai recipienti, facendo attenzione a non distruggere i tubi delle larve. | Alimentazione delle larve | 4. | Le larve di Chironomus sono nutrite con mangime per pesci in fiocchi (Tetra Min®, Tetra Phyll® o altra marca registrata equivalente), in dose giornaliera di circa 250 mg per recipiente. Il mangime può essere somministrato sotto forma di polvere macinata secca o sospensione acquosa: si aggiunge 1,0 g di fiocchi a 20 ml di acqua di diluizione e si agita la miscela per renderla omogenea. La dieta a base di questo preparato consiste in 5 ml al giorno per recipiente (agitare prima dell’uso). La dose può essere più abbondante per le larve più vecchie. | 5. | L’alimentazione è adattata in funzione della qualità dell’acqua. Se il mezzo di coltura diventa torbido, occorre somministrare meno mangime. Le quantità di mangime somministrate vanno controllate scrupolosamente: se scarse faranno migrare le larve verso la colonna d’acqua, se in eccesso intensificheranno l’attività microbica e abbasseranno la concentrazione di ossigeno. La conseguenza, in entrambi i casi, potrebbe essere l’inibizione della crescita degli organismi. | 6. | Nell’allestire i nuovi recipienti di allevamento è possibile aggiungere anche alcune cellule di alghe verdi (come Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). | Alimentazione degli adulti emersi | 7. | Alcuni ricercatori suggeriscono, come mezzo di alimentazione per gli adulti emersi, un tampone di ovatta imbevuto di una soluzione satura di saccarosio. | Emergenza | 8. | Alla temperatura di 20 ± 2 °C gli adulti iniziano ad emergere dai recipienti di allevamento delle larve dopo circa 13-15 giorni. I maschi si distinguono facilmente perché dotati di antenne piumate. | Ammassi di uova | 9. | Dal momento in cui si osserva la presenza di adulti nelle gabbie di allevamento, occorre controllare tre volte la settimana, in tutti i recipienti, se sono stati depositati ammassi gelatinosi di uova. Se presenti, gli ammassi di uova devono essere rimossi con cura e trasferiti in un recipiente piccolo contenente un campione dell’acqua di allevamento. Essi sono utilizzati per allestire un nuovo recipiente di allevamento (ad esempio, 2-4 ammassi per recipiente) oppure per eseguire prove di tossicità. | 10. | Le larve al primo stadio compaiono di norma dopo 2-3 giorni. | Allestimento di nuovi recipienti di coltura | 11. | Una volta avviate le colture, dovrebbe essere possibile allestire un nuovo recipiente per la coltura di larve a cadenza settimanale o meno spesso, secondo quanto richiesto dalla prova, ritirando i recipienti vecchi dopo che i moscerini adulti sono emersi. Questo sistema permette di ottenere regolarmente una quota di adulti con un’organizzazione minima. | Preparazione delle soluzioni di prova M4 e M7 | 12. | Il mezzo M4 è stato descritto da Elendt (1990). Il mezzo M7 è preparato come l’M4 tranne per le sostanze indicate nella tabella 1, le cui concentrazioni nel mezzo M7 sono quattro volte inferiori rispetto al mezzo M4. Una pubblicazione sul mezzo M7 è in preparazione (Elendt, comunicazione personale). La soluzione di prova non deve essere preparata secondo le istruzioni di Elendt e Bias (1990), perché le concentrazioni di NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 e K2HPO4 indicate per la preparazione delle soluzioni madre non sono adatte. | Preparazione del mezzo M7 | 13. | Ciascuna soluzione madre (I) è preparata separatamente e a partire da queste soluzioni madri (I) si prepara la soluzione madre combinata (II) (cfr. tabella 1). Per preparare il mezzo M7 mescolare 50 ml di soluzione madre combinata (II) con i quantitativi di ogni soluzione madre con macronutrienti indicati nella tabella 2 e portare a 1 litro aggiungendo acqua deionizzata. Per preparare una soluzione madre vitaminica, aggiungere tre vitamine all’acqua deionizzata, come indicato nella tabella 3, e versare 0,1 ml della soluzione madre combinata di vitamine al mezzo M7 finale poco prima dell’uso La soluzione di vitamine combinate è conservata in congelatore in piccole aliquote. Aerare e stabilizzare il mezzo. | BIBLIOGRAFIA | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | Tabella 1 | Soluzioni madre di oligoelementi per i mezzi M4 e M7 | Soluzioni madre (I) | Quantità (mg) per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata | Preparazione della soluzione madre combinata (II): mescolare le quantità seguenti (ml) di soluzioni madre (I) e portare a 1 litro aggiungendo acqua deionizzata | Concentrazioni finali nelle soluzioni di prova (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (15) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (15) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (15) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (15) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (15) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (15) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (15) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (15) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (15) (16) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Tabella 2 | Soluzioni madre di macronutrienti per i mezzi M4 e M7 | | Quantità per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata | (mg) | Quantità di soluzione madre di macronutrienti aggiunta per preparare i mezzi M4 e M7 | (ml/l) | Concentrazioni finali delle soluzioni di prova M4 e M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Tabella 3 | Soluzione madre vitaminica per i mezzi M4 e M7. Le tre soluzioni di vitamine sono mescolate in modo da formare un’unica soluzione madre vitaminica. | | Quantità per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata | (mg) | Quantità di soluzione madre vitaminica aggiunta per preparare i mezzi M4 e M7 | (ml/l) | Concentrazioni finali delle soluzioni di prova M4 e M7 | (mg/l) | Tiamina cloridrato | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianocobalamina (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotina | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | BIBLIOGRAFIA | Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. | Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on LIFE History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. | Appendice 3 | PREPARAZIONE DEL SEDIMENTO ARTIFICIALE | Composizione del sedimento | Il sedimento è preparato come illustrato nella tabella sottostante: | Componente | Caratteristiche | % di sedimento | peso secco | Torba | Torba di sfagno, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0, priva di residui visibili di piante, finemente macinata (granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata all’aria | 4-5 | Sabbia di quarzo | Granulometria: > 50 % delle particelle ha dimensioni comprese tra 50 e 200 μm | 75-76 | Argilla caolinica | Tenore di caolinite ≥ 30 % | 20 | Carbonio organico | Regolato aggiungendo torba e sabbia | 2 (± 0,5) | Carbonato di calcio | CaCO3, in polvere, chimicamente puro | 0,05-0,1 | Acqua | Conduttività ≤ 10 μS/cm | 30-50 | Preparazione | Far essiccare all’aria e macinare finemente la torba. Preparare una sospensione della quantità richiesta di polvere di torba in acqua deionizzata utilizzando un omogeneizzatore ad alte prestazioni. Aggiustare il pH della sospensione a 5,5 ± 0,5 con CaCO3. Conservare per almeno due giorni la sospensione a temperatura di 20 ± 2 °C agitandola leggermente per stabilizzare il pH e favorire il costituirsi di una flora microbica stabile. Misurare nuovamente il pH, che deve essere pari a 6,0 ± 0,5. Successivamente mescolare la sospensione di torba con gli altri componenti (sabbia e argilla caolinica) e con acqua deionizzata, fino ad ottenere un sedimento omogeneo con tenore in acqua pari al 30-50 % del peso secco del sedimento. Misurare ancora una volta il pH della miscela finale e aggiustare a 6,5-7,5 con CaCO3 se necessario. Prelevare campioni del sedimento per determinare il peso secco e il tenore di carbonio organico. Prima di impiegare il sedimento artificiale in una prova di tossicità su chironomidi, si consiglia di conservarlo per sette giorni alle stesse condizioni in cui si realizzerà la prova. | Conservazione | I componenti secchi destinati alla preparazione del sedimento artificiale possono essere conservati in luogo fresco e asciutto, a temperatura ambiente. Il sedimento artificiale (umido) non può essere conservato prima del suo impiego per la prova, ma deve essere utilizzato subito dopo il periodo di riposo di 7 giorni che ne conclude la preparazione. | BIBLIOGRAFIA | Capitolo C.8 del presente allegato. Tossicità per i lombrichi. | Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. | Appendice 4 | Caratteristiche chimiche di un’acqua di diluizione accettabile | Sostanza | Concentrazioni | Particolato | < 20 mg/l | Carbonio organico totale | < 2 mg/l | Ammoniaca non ionizzata | < 1 μg/l | Durezza espressa come CaCO3 | < 400 mg/l (17) | Cloro residuo | < 10 μg/l | Pesticidi organofosforati totali | < 50 ng/l | Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati | < 50 ng/l | Cloro organico totale | < 25 ng/l | Appendice 5 | Indicazioni per monitorare l’emergenza delle larve di chironomidi | A partire dal 20o giorno fino alla fine della prova, in cima ai becher si collocano contenitori “trappola”. Un esempio di trappola è raffigurato nell’immagine sottostante. | A: reticella di nylon | B: contenitore di plastica capovolto | C: becher senza beccuccio | D: aperture ricoperte di reticella attraverso cui si effettua il ricambio dell’acqua | E: acqua | F: sedimento | C. 28. PROVA DI TOSSICITÀ SU CHIRONOMIDI IN SEDIMENTO-ACQUA CON ACQUA ADDIZIONATA | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida OCSE n. 219 (2004) ed è inteso a valutare gli effetti di un’esposizione prolungata a sostanze chimiche su larve di Chironomus sp., un dittero che vive nei sedimenti di acqua dolce. Si basa principalmente sulla linea guida della BBA che utilizza un sistema sperimentale sedimento-acqua con terreno artificiale, in cui l’esposizione avviene nella colonna d’acqua (1) e tiene conto anche dei protocolli per le prove di tossicità su Chironomus riparius e Chironomus tentans messi a punto in Europa e in Nord America (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) e sottoposti a prove interlaboratorio (1) (6) (9). È possibile utilizzare anche altre specie ben documentate, ad esempio Chironomus yoshimatsui (10 (11). | 2. | Questo metodo prevede che l’esposizione alla sostanza in esame avvenga a mezzo d’acqua addizionata. La scelta dello scenario d’esposizione dipende dalla finalità della prova. Lo scenario d’esposizione, che consiste nell’addizionare alla colonna d’acqua la sostanza in esame, è inteso a simulare la dispersione di pesticidi nebulizzati e copre il picco iniziale di concentrazioni nell’acqua interstiziale. È utile anche per altri tipi di esposizione (fuoriuscite di sostanze chimiche, ad esempio), tranne quando i processi di accumulo hanno durata superiore a quella della prova. | 3. | In genere le sostanze da saggiare su organismi che vivono nei sedimenti persistono a lungo in questo comparto. L’esposizione di questi organismi può avvenire per diverse vie. L’importanza relativa di ogni via d’esposizione e il tempo impiegato da ciascuna di esse per contribuire all’effetto tossico globale dipendono dalle proprietà fisico-chimiche della sostanza in esame. Per le sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) oppure per le sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, l’ingestione di alimenti contaminati può costituire una via d’esposizione importante. Per non sottovalutare la tossicità delle sostanze altamente lipofile, si può considerare l’opportunità di aggiungere cibo al sedimento prima di applicare la sostanza in esame. Il presente metodo, per tenere conto di tutte le possibili vie di esposizione, prevede un’esposizione a lungo termine: la prova dura da 20 a 28 giorni per C. riparius e C. yoshimatsui, e da 28 a 65 giorni per C. tentans. Se si ha bisogno di dati a breve termine per un fine specifico, ad esempio studiare gli effetti di sostanze chimiche instabili, è possibile ritirare dopo dieci giorni di prova le repliche supplementari allestite nell’ambito dello stesso impianto sperimentale. | 4. | Gli endpoint misurati sono il numero totale di adulti emersi e il tempo intercorso fino alla loro emergenza. Se occorrono dati a breve termine, si raccomanda di effettuare dopo dieci giorni le misurazioni relative alla sopravvivenza e alla crescita delle larve, utilizzando le eventuali repliche supplementari. | 5. | Si raccomanda di usare un sedimento artificiale, che presenta numerosi vantaggi rispetto a quello naturale: | — | riduce la variabilità sperimentale in quanto costituisce una “matrice standardizzata” riproducibile, ed elimina la necessità di trovare delle fonti di sedimenti pulite e incontaminate, | — | consente di effettuare le prove in qualsiasi momento dell’anno, senza che occorra tenere conto della variabilità stagionale dei sedimenti, e non richiede di essere trattato prima delle prove per eliminare la fauna indigena; riduce inoltre i costi associati alla raccolta sul terreno di quantità sufficienti di sedimento per le prove di routine, | — | consente di mettere a confronto e classificare le sostanze in base alla loro tossicità: i dati sulla tossicità ricavati da prove con sedimenti naturali e artificiali sono comparabili per varie sostanze chimiche (2). | 6. | L’appendice 1 contiene le definizioni di termini utili ai fini del presente metodo. | PRINCIPIO DEL METODO | 7. | Si espongono dei chironomidi al primo stadio larvale a un intervallo di concentrazioni della sostanza in esame in un sistema sedimento-acqua. La prova inizia introducendo le larve al primo stadio nei becher contenenti il sistema sedimento-acqua e aggiungendo successivamente all’acqua la sostanza in esame. La percentuale di emergenza e la velocità di sviluppo dei chironomidi sono misurate alla fine della prova. Dopo 10 giorni, se necessario, si misurano anche la sopravvivenza e il peso delle larve (utilizzando eventuali repliche supplementari). Questi dati sono analizzati tramite un modello di regressione per stimare la concentrazione che causerebbe una riduzione percentuale x dell’emergenza, della sopravvivenza o della crescita delle larve (ad esempio CE15, CE50 ecc.), oppure mediante verifica di un’ipotesi statistica per determinare un valore LOEC/NOEC. Nel secondo caso occorre confrontare i valori degli effetti con i valori di controllo per mezzo di prove statistiche. | INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME | 8. | È necessario conoscere l’idrosolubilità e la tensione di vapore della sostanza in esame, il coefficiente di ripartizione misurato o calcolato nel sedimento e la sua stabilità nell’acqua e nel sedimento. Occorre inoltre avvalersi di un metodo analitico affidabile per la quantificazione della sostanza in esame nell’acqua sovrastante, nell’acqua interstiziale e nel sedimento, di cui devono essere noti e riportati nella relazione l’accuratezza e il limite di rivelabilità. È anche utile conoscere la formula strutturale e la purezza della sostanza in esame, come pure il suo destino chimico (ad esempio, dissipazione, degradazione abiotica e biotica ecc.). Ulteriori orientamenti per saggiare le sostanze con caratteristiche fisico-chimiche che rendono difficoltosa l’esecuzione delle prove sono contenuti in (12). | SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO | 9. | Per assicurarsi che il protocollo e le condizioni di prova siano affidabili si possono saggiare regolarmente delle sostanze di riferimento. Tra i tossici di riferimento utilizzati con successo in prove interlaboratorio e studi di validazione vi sono: lindano, trifluralin, pentaclorofenolo, cloruro di cadmio e cloruro di potassio (1) (2) (5) (6) (13). | VALIDITÀ DELLA PROVA | 10. | Perché la prova sia valida devono realizzarsi le seguenti condizioni: | — | alla fine della prova l’emergenza nei controlli deve essere almeno pari al 70 % (1) (6), | — | per quanto riguarda C. riparius e C. yoshimatsui, l’emergenza allo stadio adulto nei recipienti di controllo deve avvenire tra i 12 e i 23 giorni successivi alla loro introduzione nei recipienti; per C. tentans il periodo va da 20 a 65 giorni, | — | alla fine della prova, si devono misurare il pH e la concentrazione dell’ossigeno disciolto in ogni recipiente. La concentrazione dell’ossigeno deve essere almeno il 60 % del suo valore di saturazione in aria (ASV) alla temperatura applicata e il pH dell’acqua sovrastante deve essere compreso tra 6 e 9 in tutti i recipienti di prova, | — | la temperatura dell’acqua non deve variare di oltre ± 1,0 °C e può essere regolata per mezzo di una camera isotermica, nel qual caso la temperatura ambiente dovrà essere periodicamente confermata, a congrui intervalli di tempo. | DESCRIZIONE DEL METODO | Recipienti di prova | 11. | Lo studio è condotto in becher di vetro da 600 ml, di 8 cm di diametro. Possono essere utilizzati anche altri recipienti, purché garantiscano profondità sufficiente ad accogliere il sedimento e l’acqua sovrastante. La superficie del sedimento deve essere tale da offrire uno spazio da 2 a 3 cm2 per larva. Lo spessore dello strato sedimentario e la profondità dell’acqua sovrastante devono essere in rapporto 1:4. I recipienti e gli altri apparecchi destinati ad entrare in contatto con il sistema sperimentale devono essere interamente di vetro o di altro materiale chimicamente inerte (ad esempio Teflon). | Selezione delle specie | 12. | La specie che meglio si presta a questa prova è Chironomus riparius. Chironomus tentans è altrettanto adatto, sebbene sia più difficile da manipolare e richieda un periodo di prova più lungo. Si può utilizzare anche Chironomus yoshimatsui. Le istruzioni sul metodo di allevamento di Chironomus riparius figurano nell’appendice 2. Sono reperibili informazioni anche sulle condizioni di allevamento delle altre specie: Chironomus tentans (4) e Chironomus yoshimatsui (11). Occorre identificare la specie prima dell’avvio della sperimentazione, ma non è necessario farlo prima di ogni singola prova se gli organismi sono stati coltivati dal laboratorio che esegue la sperimentazione. | Sedimento | 13. | Si utilizza di preferenza sedimento artificiale. Se si sceglie di utilizzare un sedimento naturale, occorre caratterizzarlo, almeno quanto a pH e tenore di carbonio organico (la determinazione di altri parametri, come il rapporto C/N e la granulometria è altrettanto raccomandata), e assicurarsi che sia esente da ogni contaminazione e da altri organismi che potrebbero entrare in competizione con i chironomidi o consumarli. Prima di impiegare un sedimento naturale in una prova di tossicità su chironomidi, si raccomanda inoltre di mantenerlo per sette giorni alle stesse condizioni in cui verrà realizzata la prova. Per questo test si raccomanda di utilizzare il sedimento artificiale basato su quello di cui al metodo di prova C.8 (14) e costituito secondo la seguente formula (1) (15) (16): | a) | 4-5 % (peso secco) di torba, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0. È importante utilizzare torba sotto forma di polvere, finemente macinata (granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata unicamente all’aria; | b) | 20 % (peso secco) di argilla caolinica (tenore di caolinite di preferenza superiore al 30 %); | c) | 75-76 % (peso secco) di sabbia di quarzo (composta in prevalenza da sabbia fine, con oltre il 50 % delle particelle di granulometria compresa tra 50 e 200 μm); | d) | aggiunta di acqua deionizzata fino ad ottenere un tenore di umidità totale della miscela compreso tra 30 % e 50 %; | e) | aggiunta di carbonato di calcio di qualità chimicamente pura (CaCO3) per aggiustare il pH della miscela finale a 7,0 ± 0,5. | f) | il tenore di carbonio organico della miscela finale dovrà essere del 2 % (± 0,5 %), ottenuto aggiungendo le dovute quantità di torba e sabbia, come indicato in a) e c). | 14. | Il luogo di provenienza di torba, argilla caolinica e sabbia deve essere noto. Occorre verificare che i componenti del sedimento non siano contaminati da sostanze chimiche (ad esempio, metalli pesanti, composti organoclorurati, composti organofosforici ecc.). Un esempio di preparazione del sedimento artificiale figura nell’appendice 3. I componenti possono anche essere mescolati allo stato secco, purché si dimostri che dopo l’aggiunta dell’acqua sovrastante non si separino (ad esempio, particelle di torba in sospensione) e che la torba o il sedimento sono condizionati a sufficienza. | Acqua | 15. | Le acque che presentano le caratteristiche chimiche indicate nelle appendici 2 e 4 per un’acqua di diluizione accettabile sono considerate adatte per la prova. È possibile utilizzare come acqua di coltura e acqua di diluizione qualsiasi acqua naturale (di superficie o freatica), acqua ricostituita (cfr. appendice 2) o acqua di rubinetto non clorata se i chironomidi sopravvivono durante l’allevamento e la prova senza manifestare segni di stress. All’inizio della prova il pH dell’acqua di prova deve situarsi tra 6 e 9 e la sua durezza complessiva non superare 400 mg/l di CaCO3. Se però si sospetta che vi sia un’interazione tra gli ioni che determinano la durezza e la sostanza in esame, occorre utilizzare un’acqua meno dura (in tal caso il mezzo Elendt M4 non è idoneo). Lo stesso tipo di acqua deve essere impiegato per tutta la prova. Le caratteristiche della qualità dell’acqua indicate nell’appendice 4 vanno misurate almeno due volte l’anno oppure quando si sospetta che abbiano subito un’alterazione significativa. | Soluzioni madre — Acqua addizionata | 16. | Le concentrazioni sperimentali sono calcolate in base alle concentrazioni della colonna d’acqua, ossia l’acqua sovrastante il sedimento. Le soluzioni di prova alle concentrazioni prescelte vanno in genere preparate per diluizione di una soluzione madre. Le soluzioni madre devono preferibilmente essere preparate solubilizzando la sostanza nel mezzo di prova. In alcuni casi può rendersi necessario l’uso di solventi o disperdenti per ottenere una soluzione madre di adeguata concentrazione. Tra i solventi che si possono usare vi sono: acetone, etanolo, metanolo, etere monometilico del glicol etilenico, etere dimetilico del glicol etilenico, dimetilformammide e glicol trietilenico. Disperdenti utilizzabili sono Cremophor RH40, Tween 80, metilcellulosa 0,01 % e HCO-40. La concentrazione dell’agente solubilizzante nel mezzo di prova finale deve essere minima (ossia ≤ 0,1 ml/l) e identica in tutti i trattamenti. Qualora si utilizzi un agente solubilizzante, questo non deve avere effetti significativi sulla sopravvivenza né effetti negativi visibili sulle larve di chironomide, effetti che si ricavano dall’osservazione del recipiente di controllo trattato con solo solvente. L’uso di questi materiali dovrebbe tuttavia essere evitato il più possibile. | DISEGNO SPERIMENTALE | 17. | Il disegno sperimentale comprende la selezione del numero delle concentrazioni della sostanza in esame e dell’intervallo fra esse, il numero di recipienti per ciascun livello di concentrazione e il numero di larve per recipiente. È qui descritto il procedimento da seguire per la stima puntuale della CE, la stima della NOEC e per l’esecuzione di una prova limite. Come impostazione sperimentale, l’analisi di regressione è da preferirsi alla verifica di un’ipotesi. | Disegno per l’analisi di regressione | 18. | La concentrazione che determina un effetto (ad esempio CE15, CE50) e l’intervallo delle concentrazioni alle quali la sostanza in esame produce un effetto d’interesse devono rientrare tra le concentrazioni incluse nella prova. In genere la precisione e, in particolare, la validità della stima delle concentrazioni che determinano un effetto (CEX) saranno maggiori quando la concentrazione con effetto rientra nell’intervallo delle concentrazioni da testare. Bisogna evitare di estrapolare risultati molto al di sotto della concentrazione efficace minima o al di sopra di quella massima. È utile condurre una prova preliminare di determinazione dell’intervallo delle concentrazioni per delimitare quelle su cui impostare la prova (cfr. paragrafo 27). | 19. | Se si deve stimare la CEX occorre saggiare almeno cinque concentrazioni e allestire tre repliche per ciascuna concentrazione. In ogni caso, per ottenere una buona stima del modello, è consigliabile utilizzare un numero sufficiente di concentrazioni. Il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere maggiore di due (salvo nel caso in cui la curva dose/risposta sia poco accentuata). Il numero di repliche per trattamento può essere diminuito se si aumenta il numero di concentrazioni che danno risposte diverse. L’aumento del numero di repliche o la riduzione degli intervalli delle concentrazioni tendono a ridurre gli intervalli di confidenza per la prova. Il numero delle repliche sarà maggiore se si deve stimare la percentuale di sopravvivenza e crescita delle larve dopo 10 giorni. | Disegno per la stima di una NOEC/LOEC | 20. | Se occorre stimare la LOEC/NOEC si saggeranno cinque concentrazioni con almeno quattro repliche, e il fattore tra una concentrazione e l’altra non deve essere superiore a due. Il numero di repliche deve essere tale da garantire una potenza statistica che consenta di rilevare una differenza del 20 % con gli organismi di controllo, applicando una significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto riguarda la velocità di sviluppo, è in genere appropriata un’analisi della varianza (ANOVA), come ad esempio il test di Dunnett o il test di Williams (17) (18) (19) (20). Per il tasso di emergenza si può utilizzare il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione secondo Bonferroni) o il test di Mantel-Haenszel. | Prova limite | 21. | Se la prova preliminare per determinare l’intervallo delle concentrazioni non ha prodotto alcun effetto, si può condurre una prova limite (una concentrazione di prova e un controllo). Scopo della prova limite è di indicare che la concentrazione tossica della sostanza in esame è superiore alla concentrazione limite saggiata. Per questo metodo di prova non è possibile raccomandare una concentrazione precisa, che è lasciata alla discrezione dei regolatori. Di norma è necessario allestire sei repliche sia per gli organismi trattati che per quelli di controllo. Occorre dimostrare che la potenza statistica è sufficiente per rilevare una differenza del 20 % con il controllo, applicando una significatività statistica del 5 % (p = 0,05). Per quanto concerne la risposta in termini di velocità di sviluppo e peso, il test t costituisce un metodo statistico idoneo se i dati rispettano le condizioni imposte da questo test (normalità, varianze omogenee). In caso contrario, si può ricorrere al test t per varianze disuguali o a un test non parametrico, come il test di Wilcoxon-Mann-Whithey. Quanto al tasso di emergenza, il test esatto di Fisher è appropriato. | PROCEDURA | Condizioni di esposizione | Preparazione del sistema addizionato acqua-sedimento | 22. | Si deposita nei recipienti una congrua quantità di sedimento artificiale (cfr. paragrafi 13-14 e appendice 3), in modo da formare uno strato di almeno 1,5 cm. Si aggiunge acqua fino ad un’altezza di 6 cm (cfr. paragrafo 15). Il rapporto tra spessore del sedimento e profondità dell’acqua non deve essere superiore a 1:4 e lo strato di sedimento non deve oltrepassare i 3 cm. Il sistema sedimento-acqua è posto in moderata aerazione per sette giorni prima di introdurvi gli organismi di prova (cfr. paragrafo 14 e appendice 3). Per evitare la separazione degli ingredienti del sedimento e la risospensione delle particelle fini durante l’aggiunta dell’acqua, si può ricoprire il sedimento con un disco di plastica durante l’operazione di riempimento della colonna d’acqua per poi ritirarlo a operazione completata. Possono essere utilizzati anche altri dispositivi. | 23. | I recipienti così allestiti devono essere coperti (ad esempio, da piastre di vetro). Nel corso della prova si provvederà, se necessario, ad aggiungere l’acqua necessaria a mantenere il volume originario per compensare l’evaporazione, avendo cura di utilizzare acqua distillata o deionizzata per evitare l’accumulo di sali. | Introduzione degli organismi di prova | 24. | Quattro o cinque giorni prima di introdurre gli organismi nei recipienti, si prelevano dagli allevamenti ammassi di uova e li si depositano in recipienti piccoli contenenti mezzo di coltura. Si può utilizzare il mezzo vecchio prelevato dalla coltura madre o un mezzo fresco. In quest’ultimo caso, si aggiunge una piccola quantità di cibo, ad esempio alghe verdi e/o qualche goccia di filtrato di una sospensione di mangime per pesci in fiocchi (cfr. appendice 2). Si devono utilizzare solo ammassi di uova appena deposti. Di solito le larve compaiono qualche giorno dopo la deposizione delle uova (da 2 a 3 giorni per Chironomus riparius a 20 oC e da 1 a 4 giorni per Chironomus tentans a 23 C e Chironomus yoshimatsui a 25 oC) e la loro crescita avviene in quattro stadi, ciascuno di una durata compresa tra 4 e 8 giorni. Questa prova si esegue al primo stadio larvale (2-3 oppure 1-4 giorni dopo la schiusa). È possibile verificare lo stadio di sviluppo dei moscerini in base alle dimensioni della capsula cefalica (6). | 25. | In ciascun recipiente contenente il sistema addizionato sedimento-acqua si distribuiscono casualmente, per mezzo di una pipetta smussata, venti larve al primo stadio. L’aerazione dell’acqua deve essere interrotta per 24 ore dal momento dell’introduzione delle larve nei recipienti (cfr. paragrafi 24 e 32). In base al disegno sperimentale adottato (cfr. paragrafi 19 e 20), il numero di larve utilizzate per concentrazione è almeno 60 per la stima puntuale della CE e 80 per la determinazione della NOEC. | 26. | Ventiquattr’ore dopo avere introdotto le larve, la sostanza da saggiare è aggiunta nella colonna d’acqua sovrastante e i recipienti vengono di nuovo sottoposti a moderata aerazione. Piccoli volumi della soluzione contenente la sostanza in esame sono iniettati con un pipetta sotto la superficie dell’acqua. In seguito si mescola delicatamente l’acqua sovrastante, con la dovuta cautela per evitare la risospensione del sedimento. | Concentrazioni di prova | 27. | Può essere utile effettuare una prova preliminare per determinare la gamma delle concentrazioni per la prova vera e propria. A tal fine si utilizza a una serie di concentrazioni della sostanza in esame molto intervallate tra loro. Applicando la stessa densità superficiale di chironomidi prevista per la prova vera e propria, i chironomidi sono esposti ad ogni concentrazione della sostanza in esame per un periodo che consenta di stimare le concentrazioni di prova adeguate e non è necessaria alcuna replica. | 28. | Le concentrazioni sperimentali per la prova vera e propria sono decise in funzione dell’esito della prova di determinazione dell’intervallo di concentrazione. Occorre saggiare almeno cinque concentrazioni, scelte in base a quanto indicato nei paragrafi 18-20. | Controlli | 29. | La prova prevede l’allestimento di recipienti di controllo, senza la sostanza in esame ma con il sedimento, e un congruo numero di repliche (cfr. paragrafi 19-20). Se la sostanza in esame è stata applicata mediante un solvente (cfr. paragrafo 16), si deve aggiungere un recipiente di controllo che contenga sedimento e solvente. | Sistema di prova | 30. | Si impiegano sistemi statici. I sistemi semistatici oppure a flusso, con rinnovo intermittente o continuo dell’acqua sovrastante, possono essere utilizzati in casi eccezionali, ad esempio se le specifiche della qualità dell’acqua diventano inadeguate per gli organismi in esame oppure influiscono sull’equilibrio chimico (nel caso in cui, ad esempio, i livelli di ossigeno disciolto si abbassino troppo, la concentrazione degli escreti aumenti eccessivamente o i minerali prodotti dalla lisciviazione del sedimento alterino il pH e/o la durezza dell’acqua). È tuttavia sufficiente e preferibile ricorrere ad altri metodi di miglioramento della qualità dell’acqua sovrastante, come l’aerazione. | Alimentazione | 31. | Le larve devono essere nutrite, di preferenza ogni giorno o almeno tre volte la settimana. Durante i primi 10 giorni l’alimentazione giornaliera ritenuta adeguata per le larve giovani consiste in 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg per C. yoshimatsui) pro capite di mangime per pesci (sospensione acquosa o finemente macinato, del tipo Tetra-Min o Tetra-Phyll; cfr. appendice 2). Può essere necessario aumentare leggermente la dose per le larve più vecchie: 0,5-1 mg per larva al giorno dovrebbe essere sufficiente per il resto della prova. Si diminuirà la razione di cibo di tutti gli organismi trattati e dei controlli se si osserva la comparsa di funghi o il decesso di organismi di controllo. Se non si riesce ad arrestare lo sviluppo fungino occorre ripetere la prova. Se la prova verte su sostanze fortemente adsorbenti (ad esempio, con log Kow > 5) o sostanze che si legano in modo covalente al sedimento, la quantità di cibo necessaria alla sopravvivenza e alla crescita naturale degli organismi può essere incorporata al sedimento artificiale prima del periodo di stabilizzazione. In tal caso il mangime per pesci è sostituito con alimenti vegetali, ad esempio 0,5 % (peso secco) di foglie finemente macinate di ortica (Urtica dioica), gelso (Morus alba), trifoglio bianco (Trifolium repens), spinacio (Spinacia oleracea) o di altro materiale vegetale (Cerophyl o alfa cellulosa). | Condizioni di incubazione | 32. | L’acqua sovrastante dei recipienti è sottoposta a una moderata aerazione, di preferenza a partire da 24 ore dopo l’introduzione delle larve e fino alla fine della prova (avendo cura che la concentrazione di ossigeno disciolto non scenda sotto il 60 % del suo valore di saturazione dell’aria). L’aria è insufflata tramite pipette Pasteur in vetro fissate a 2-3 cm sopra lo strato di sedimento (nella misura di una o poche bolle al secondo). Se la sostanza in esame è volatile, va eventualmente considerato di non aerare il sistema. | 33. | La prova è effettuata a una temperatura costante di 20 °C (± 2 °C). Per C. tentans e C. yoshimatsui la temperatura raccomandata è, rispettivamente, di 23 °C e 25 °C (± 2 °C). Il fotoperiodo è di 16 ore e l’intensità luminosa compresa tra 500 e 1 000 lux. | Durata dell’esposizione | 34. | L’esposizione ha inizio con l’introduzione delle larve nei recipienti trattati e di controllo. La prova dura 28 giorni per C. riparius e C. yoshimatsui, e 65 giorni per C. tentans. Se i moscerini emergono prima, la prova può concludersi dopo almeno cinque giorni dall’emergenza dell’ultimo adulto di controllo. | OSSERVAZIONI | Emergenza | 35. | Si deve determinare il tempo di sviluppo e il numero totale di moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi. I maschi si distinguono facilmente perché dotati di antenne piumate. | 36. | I recipienti vanno osservati almeno tre volte la settimana, per verificare che non presentino attività anomala (abbandono del sedimento, movimenti natatori insoliti ecc.) rispetto a quelli di controllo. Durante il periodo della prevista emergenza è necessario contare tutti i giorni i moscerini emersi e registrare il sesso e il numero di quelli completamente emersi. Una volta identificati, i moscerini sono tolti dai recipienti. Ogni ammasso di uova deposto prima della fine della prova deve essere registrato e poi tolto per impedire l’introduzione di nuove larve nel sedimento. Va registrato anche il numero delle pupe visibili che non sono riuscite ad emergere. L’appendice 5 contiene indicazioni su come misurare l’emergenza. | Crescita e sopravvivenza | 37. | Se occorre rilevare i dati sulla sopravvivenza e la crescita della larve dopo 10 giorni, si allestiscono recipienti supplementari all’inizio della prova da usare successivamente. Il sedimento di questi recipienti supplementari è setacciato con un setaccio da 250 μm per trattenere le larve. La morte è determinata da due criteri: l’immobilità o l’assenza di reazione a uno stimolo meccanico. Anche le larve non recuperate devono essere contate tra i decessi (è possibile che le larve morte all’inizio della prova siano state degradate da microbi). Dopo avere determinato il peso secco (senza ceneri) delle larve sopravvissute per ogni recipiente, si calcola il peso secco individuale medio per recipiente. Per determinare a quale stadio si trovano le larve sopravvissute si possono misurare le dimensioni della capsula cefalica di ogni individuo. | Misurazioni analitiche | Concentrazione della sostanza in esame | 38. | Occorre analizzare, come minimo, dei campioni dell’acqua sovrastante, dell’acqua interstiziale e del sedimento all’inizio della prova (di preferenza un’ora dopo l’applicazione della sostanza in esame) e alla fine, e ciò per la concentrazione massima e per una più bassa. La concentrazione della sostanza in esame ci informa sul comportamento/ripartizione della sostanza nel sistema acqua-sedimento. Dato che il prelievo di campioni di sedimento all’inizio della prova può perturbare l’impianto sperimentale (rimozione di larve, ad esempio), è opportuno usare dei recipienti supplementari per effettuare i rilievi analitici all’inizio ed eventualmente durante la prova (cfr. paragrafo 39). Non è necessario analizzare il sedimento se la ripartizione della sostanza in esame tra l’acqua e il sedimento è stata chiaramente determinata con uno studio acqua/sedimento condotto in condizioni analoghe (ad esempio, rapporto sedimento/acqua, tipo di applicazione, tenore di carbonio organico nel sedimento). | 39. | Quando si effettuano misurazioni intermedie (ad esempio, al settimo giorno) e se l’analisi richiede campioni voluminosi che non possono essere prelevati dai recipienti senza influire sull’impianto sperimentale, le determinazioni analitiche sono praticate su campioni prelevati dai recipienti supplementari trattati allo stesso modo (anche contenenti gli organismi di prova) ma non utilizzati per le osservazioni biologiche. | 40. | Per isolare l’acqua interstiziale si raccomanda di centrifugare i campioni, ad esempio, a 10 000 g e a 4oC per 30 minuti. Se però è dimostrato che la sostanza in esame non adsorbe sui filtri, è accettabile anche la filtrazione. In alcuni casi, se i campioni sono troppo piccoli, può rivelarsi impossibile analizzare le concentrazioni nell’acqua interstiziale. | Parametri fisici e chimici | 41. | Il pH, l’ossigeno disciolto nell’acqua di prova e la temperatura dei recipienti devono essere debitamente misurati (cfr. paragrafo 10). All’inizio e alla fine della prova è necessario misurare la durezza dell’acqua e il tenore di ammoniaca nei controlli e in un recipiente trattato alla concentrazione massima. | DATI E RELAZIONE | Trattamento dei risultati | 42. | Scopo di questa prova è determinare l’effetto della sostanza in esame sulla velocità di sviluppo e sul numero totale di moscerini maschi e femmine adulti completamente emersi oppure, nel caso della prova a 10 giorni, gli effetti sulla sopravvivenza e sul peso delle larve. Se nulla indica che i due sessi presentano differenze statistiche di sensibilità, ai fini dell’analisi statistica i risultati ottenuti sui maschi e sulle femmine possono essere raggruppati. Le differenze di sensibilità tra i sessi possono essere valutate statisticamente tramite, ad esempio, il test χ2-r x 2. La sopravvivenza delle larve e il peso secco individuale medio per recipiente devono essere determinati dopo 10 giorni, se del caso. | 43. | Le concentrazioni con effetto, espresse come concentrazioni nell’acqua sovrastante, sono calcolate di preferenza sulla base delle concentrazioni misurate all’inizio della prova (cfr. paragrafo 38). | 44. | Per effettuare una stima puntuale della CE50 o di qualsiasi altra CEX, le statistiche per recipiente possono essere usate alla stregua di repliche. Quando si calcola un intervallo di confidenza per una qualsiasi CEX occorre tener conto della variabilità tra i recipienti oppure dimostrare che tale variabilità è di entità trascurabile. Quando il modello è adattato mediante il metodo dei minimi quadrati, è necessario trasformare le statistiche per recipiente al fine di aumentare l’omogeneità della varianza. I valori della CEX devono però essere calcolati dopo che il risultato è stato ritrasformato nel suo valore originario. | 45. | Se l’analisi statistica mira a determinare la NOEC/LOEC mediante la verifica di ipotesi, la variabilità tra i recipienti deve essere presa in considerazione, ad esempio con un’analisi ANOVA gerarchica. In situazioni dove non sussistono tutti i consueti presupposti per l’ANOVA si possono invece utilizzare test più robusti (21). | Tasso di emergenza | 46. | I tassi di emergenza sono dati di tipo quantale e possono essere analizzati con il test di Cochran-Armitage applicato in modo regressivo se si ipotizza un rapporto dose-risposta monotonico e i tassi di emergenza corroborano questa ipotesi. In caso contrario, si può utilizzare un test esatto di Fisher o un test di Mantel-Haenszel con correzione dei valori p secondo Bonferroni-Holm. Se si osserva che la variabilità tra le repliche alla stessa concentrazione è maggiore di quanto una distribuzione binomiale indicherebbe (variazione spesso denominata “extrabinomiale”), si applicherà un test più potente (Cochran-Armitage o Fisher esatto) come proposto in (21). | 47. | Si determina la somma dei moscerini emersi per recipiente (ne) e la si divide per il numero di larve introdotte (na): | dove: | TE | = | tasso di emergenza | ne | = | numero di moscerini emersi per recipiente | na | = | numero di larve introdotte per recipiente | 48. | Un’alternativa più adatta ai campioni di grandi dimensioni, in presenza di varianza extrabinomiale, consiste nel trattare il tasso di emergenza come una risposta continua e adottare procedure quali il test di William, se si ipotizza che il rapporto dose-risposta sia monotonico e se i dati del tasso di emergenza corroborano tale ipotesi. Conviene utilizzare il test di Dunnett quando l’ipotesi di monotonicità è infondata. Ai fini di questa analisi un campione è considerato di grandi dimensioni quando il numero di moscerini emersi e il numero dei non emersi sono entrambi superiori a cinque per replica. | 49. | Prima di applicare i metodi ANOVA, occorre trasformare i valori del TE per la radice quadrata dell’arcoseno oppure secondo Freeman-Tukeylper ottenere una distribuzione prossima a quella normale e livellare le varianze. Il test di Cochran-Armitage, il test esatto di Fisher (con correzione Bonferroni) oppure il test di Mantel-Haenszel possono essere impiegati quando si utilizzano delle frequenze assolute. La trasformazione con la radice quadrata dell’arcoseno consiste nel calcolare la funzione inversa del seno (seno-1) della radice quadrata del TE. | 50. | Per i tassi di emergenza, i valori della CEX sono calcolati con un’analisi di regressione [oppure probit (22), logit, Weibull, appositi software commerciali ecc.]. Se l’analisi di regressione è inconcludente (ad esempio, quando vi sono meno di due risposte parziali), si fa ricorso ad altri metodi non parametrici quali media mobile o interpolazione lineare. | Velocità di sviluppo | 51. | Il tempo medio di sviluppo è il tempo medio intercorso tra l’introduzione delle larve (giorno 0 della prova) e l’emergenza della coorte sperimentale di moscerini (per calcolare il tempo reale di sviluppo si deve tenere conto dell’età delle larve al momento dell’introduzione). La velocità di sviluppo è inversamente proporzionale al tempo di sviluppo (unità: 1/giorno) e consiste nella parte di sviluppo larvale che avviene quotidianamente. Per valutare la tossicità nei sedimenti si preferisce far riferimento alla velocità di sviluppo perché, rispetto al tempo di sviluppo, ha una varianza più bassa e valori più omogenei e più prossimi a una distribuzione normale. È anche per questo che si possono applicare test parametrici potenti, più adatti alla velocità di sviluppo che al tempo di sviluppo. Se la velocità di sviluppo è trattata come risposta continua, i valori della CEX possono essere stimati avvalendosi dell’analisi di regressione (ad esempio (23) (24)]. | 52. | Per i test statistici seguenti, il numero di moscerini osservati il giorno x è considerato essere emerso a metà dell’intervallo tra il giorno x e il giorno x - l (l = lunghezza dell’intervallo di osservazione, di solito 1 giorno). La velocità media di sviluppo per recipiente (x) è calcolata come segue: | dove: | : | velocità media di sviluppo per recipiente | i | : | indice dell’intervallo di osservazione | m | : | numero massimo di intervalli di osservazione | : | numero di moscerini emersi nell’intervallo di osservazione i | ne | : | numero totale di moscerini emersi alla fine dell’esperimento (= | ) | xi | : | velocità di sviluppo dei moscerini emersi nell’intervallo i | dove: | giornoi | : | giorno dell’osservazione (contato a partire dall’applicazione) | li | : | lunghezza dell’intervallo d’osservazione i (espressa in giorni, di solito 1 giorno) | Relazione sulla prova | 53. | La relazione sulla prova deve contenere almeno le seguenti informazioni: | | Sostanza in esame: | — | natura fisica e, se del caso, proprietà fisico-chimiche (idrosolubilità, tensione di vapore, coefficiente di ripartizione nel terreno — o nel sedimento, se noto —, stabilità nell’acqua ecc.), | — | identificazione chimica (nome comune, nome chimico, formula strutturale, numero CAS ecc.), purezza e metodo di analisi per la quantificazione della sostanza in esame. | | Specie in esame: | — | animali utilizzati: specie, nome scientifico, provenienza degli organismi e condizioni di allevamento, | — | informazioni sulla manipolazione degli ammassi di uova e delle larve, | — | età degli animali al momento della loro introduzione nei recipienti di prova. | | Condizioni sperimentali: | — | sedimento utilizzato, ossia se naturale o artificiale, | — | per il sedimento naturale, ubicazione e descrizione del sito di campionamento e, se possibile, cronistoria della contaminazione; caratteristiche: pH, tenore di carbonio organico, rapporto C/N e granulometria (se del caso), | — | preparazione del sedimento artificiale: ingredienti e caratteristiche (tenore di carbonio organico, pH, umidità ecc. all’inizio della prova), | — | preparazione dell’acqua (se si utilizza acqua artificiale) e caratteristiche (concentrazione di ossigeno, pH, conduttività, durezza ecc. all’inizio della prova), | — | spessore del sedimento e profondità dell’acqua sovrastante, | — | volume dell’acqua sovrastante e dell’acqua interstiziale; peso del sedimento umido con e senza acqua interstiziale, | — | recipienti di prova (materiale e dimensioni), | — | metodo di preparazione delle soluzioni madre e delle concentrazioni in esame, | — | applicazione della sostanza in esame: concentrazioni utilizzate, numero di repliche e impiego di eventuali solventi, | — | condizioni d’incubazione: temperatura, fotoperiodo, intensità luminosa, aerazione (frequenza e intensità), | — | informazioni dettagliate sull’alimentazione, che comprendano il tipo di mangime, la preparazione, la quantità e il regime di alimentazione. | | Risultati: | — | concentrazioni nominali sperimentali, concentrazioni sperimentali misurate e risultati di tutte le analisi condotte per determinare la concentrazione della sostanza in esame nel recipiente di prova, | — | qualità dell’acqua nei recipienti, ossia pH, temperatura, ossigeno disciolto, durezza e tenore di ammoniaca, | — | sostituzione dell’eventuale acqua evaporata nel corso della prova, | — | numero di moscerini maschi e femmine emersi, al giorno, per recipiente, | — | numero di larve non emerse come moscerini per recipiente, | — | peso secco individuale medio delle larve per recipiente, e per stadio larvale, se del caso, | — | percentuale di emergenza per replica e per concentrazione (risultati raggruppati per moscerini maschi e femmine), | — | velocità media di sviluppo dei moscerini completamente emersi per replica e per concentrazione somministrata (risultati raggruppati per moscerini maschi e femmine), | — | stime degli endpoint di tossicità, ad esempio CEX (e relativi intervalli di confidenza), NOEC e/o LOEC, e metodi statistici impiegati per determinarle, | — | discussione dei risultati, comprese le eventuali ripercussioni sui risultati dovute allo scostamento dal presente metodo di prova. | BIBLIOGRAFIA | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canadàs biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. | (10) | Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. | (11) | Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. | (12) | OCSE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Capitolo C.8 del presente allegato, Tossicità per i lombrichi. | (15) | Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. | (16) | Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. | (17) | Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. | (18) | Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. | (19) | Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. | (20) | Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. | (21) | Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585. | (22) | Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. | (23) | Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. | (24) | Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. | Appendice 1 | DEFINIZIONI | Ai fini del presente metodo si applicano le seguenti definizioni: | | Sedimento artificiale, sintetico o formulato: una miscela di materiali usati per simulare i componenti fisici di un sedimento naturale. | | Acqua sovrastante: l’acqua al di sopra del sedimento nel recipiente di prova. | | Acqua interstiziale o soluzione circolante: l’acqua che occupa lo spazio tra il sedimento e le particelle di terreno. | | Acqua addizionata: l’acqua utilizzata per la prova alla quale è stata aggiunta la sostanza in esame. | | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata utilizzando il presente metodo di prova. | Appendice 2 | Indicazioni per l’allevamento di Chironomus riparius | 1. | Le larve di Chironomus possono essere allevate in cristallizzatori o in grandi recipienti. Il fondo del recipiente è ricoperto di un sottile strato di sabbia di quarzo dello spessore di circa 5-10 mm. Anche il Kieselguhr (ad esempio l’articolo 8117 di Merck) ha dato prova di essere un substrato idoneo (nel qual caso basta uno strato ancora più sottile di pochi millimetri). Si aggiunge acqua di qualità adeguata ad un’altezza di vari centimetri, avendo cura di mantenere questo livello iniziale aggiungendo acqua in caso di evaporazione per prevenire il disseccamento. L’acqua può essere rinnovata completamente, se necessario. Fornire un’aerazione moderata. I recipienti di coltura devono essere situati in apposite gabbie per impedire la fuga degli adulti via via che emergono. La gabbia deve essere sufficientemente grande per consentire agli adulti emersi di sfarfallare, condizione imprescindibile per la copulazione (dimensioni minime: 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Le gabbie devono essere tenute a temperatura ambiente, oppure a una temperatura costante di 20 ± 2 °C, con un fotoperiodo di 16 ore di luce (a un’intensità luminosa di circa.1 000 lux) e 8 ore di buio. Da alcuni studi si è appreso che un’umidità relativa dell’aria inferiore a 60 % può impedire la riproduzione. | Acqua di diluizione | 3. | Può essere utilizzata qualsiasi acqua naturale o sintetica di qualità adeguata. Di solito si impiega acqua di pozzo, acqua di rubinetto non clorata e mezzi artificiali (come Elendt M4 o M7, si veda di seguito). L’acqua deve essere aerata prima dell’uso. Se necessario, si può rinnovare l’acqua di coltura versando o sifonando l’acqua usata dai recipienti facendo attenzione a non distruggere i tubi delle larve. | Alimentazione delle larve | 4. | Le larve di Chironomus sono nutrite con mangime per pesci in fiocchi (Tetra Min®, Tetra Phyll® o altra marca registrata equivalente), in dose giornaliera di circa 250 mg per recipiente. Il mangime può essere somministrato sotto forma di polvere macinata secca o in sospensione acquosa: aggiungere 1,0 g di fiocchi a 20 ml di acqua di diluizione e agitare la miscela per renderla omogenea. La dieta a base di questo preparato può consistere in 5 ml al giorno per recipiente (agitare prima dell’uso). La dose può essere più abbondante per le larve più vecchie. | 5. | L’alimentazione è adattata in funzione della qualità dell’acqua. Se il mezzo di coltura diventa torbido, occorre somministrare meno mangime. Le quantità di mangime introdotte nei recipienti vanno controllate scrupolosamente: se scarse faranno migrare le larve verso la colonna d’acqua, se in eccesso intensificheranno l’attività microbica e abbasseranno la concentrazione di ossigeno. La conseguenza, in entrambi i casi, potrebbe essere l’inibizione della crescita degli organismi. | 6. | Nell’allestire nuovi recipienti di allevamento è possibile aggiungere anche alcune cellule di alghe verdi (come Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). | Alimentazione degli adulti emersi | 7. | Alcuni ricercatori suggeriscono, come mezzo di alimentazione per gli adulti emersi, un tampone di ovatta imbevuto di una soluzione satura di saccarosio. | Emergenza | 8. | Alla temperatura di 20 ± 2 °C gli adulti iniziano ad emergere dai recipienti di allevamento delle larve dopo circa 13-15 giorni. I maschi si distinguono facilmente in quanto provvisti di antenne piumate. | Ammassi di uova | 9. | Dal momento in cui si osserva la presenza di adulti nelle gabbie di allevamento, occorre controllare tutti i recipienti tre volte la settimana per vedere se sono state deposte le uova, sotto forma di ammassi gelatinosi. Gli ammassi di uova devono essere rimossi con cura e trasferiti in un recipiente piccolo contenente un campione dell’acqua di coltura. Essi sono utilizzati per preparare un nuovo recipiente di coltura (ad esempio, 2-4 ammassi per recipiente) oppure per eseguire prove di tossicità. | 10. | Le larve al primo stadio nascono di norma dopo 2-3 giorni. | Allestimento di nuovi recipienti di coltura | 11. | Una volta avviate le colture, dovrebbe essere possibile allestire un nuovo recipiente per la coltura di larve a cadenza settimanale o meno spesso, secondo quanto richiesto dalla prova, ritirando i recipienti vecchi dopo che i moscerini adulti sono emersi. Questo sistema permette di ottenere regolarmente una quota di adulti con un’organizzazione minima. | Preparazione delle soluzioni di prova M4 e M7 | 12. | Il mezzo M4 è stato descritto da Elendt (1990). Il mezzo M7 è preparato come l’M4 tranne per le sostanze indicate nella tabella 1, le cui concentrazioni nel mezzo M7 sono quattro volte inferiori rispetto al mezzo M4. Una pubblicazione sul mezzo M7 è in preparazione (Elendt, comunicazione personale). La soluzione di prova non deve essere preparata secondo le istruzioni di Elendt e Bias (1990), perché le concentrazioni di NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 e K2HPO4 indicate per la preparazione delle soluzioni madre non sono adatte. | Preparazione del mezzo M7 | 13. | Ogni soluzione madre (I) è preparata separatamente e a partire da ciascuna di esse (I) si prepara la soluzione madre combinata (II) (cfr. tabella 1). Per preparare il mezzo M7 prelevare 50 ml di soluzione madre combinata (II), mescolarla ai quantitativi di ogni soluzione madre con macronutrienti indicati nella tabella 2 e portare a 1 litro aggiungendo acqua deionizzata. Per preparare una soluzione madre vitaminica, aggiungere tre vitamine a acqua deionizzata, come indicato nella tabella 3, e versare 0,1 ml della soluzione madre combinata di vitamine al mezzo M7 finale poco prima dell’uso (conservare la soluzione madre vitaminica in congelatore in piccole aliquote). Aerare e stabilizzare il mezzo. | Tabella 1 | Soluzioni madre di oligoelementi per i mezzi M4 e M7 | Soluzioni madre (I) | Quantità (mg) per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata | Preparazione della soluzione madre combinata (II): mescolare le quantità seguenti (ml) di soluzioni madre (I) e portare a 1 litro aggiungendo acqua deionizzata | Concentrazioni finali nelle soluzioni di prova (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (18) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 • 4 H2O (18) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (18) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (18) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 • 6 H2O (18) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (18) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 • 2 H2O (18) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 • 2 H2O (18) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 • 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA • 2 H2O (18) (19) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 • 7 H2O (18) (19) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Tabella 2 | Soluzioni madre di macronutrienti per i mezzi M4 e M7 | | Quantità per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata | (mg) | Quantità di soluzione madre di macronutrienti aggiunta per preparare i mezzi M4 e M7 | (ml/l) | Concentrazioni finali nelle soluzioni di prova M4 e M7 | (mg/l) | CaCl2 • 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 • 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 • 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Tabella 3 | Soluzione madre vitaminica per i mezzi M4 e M7 | Le tre soluzioni di vitamine sono mescolate in modo da formare un’unica soluzione madre vitaminica | | Quantità per formare una soluzione di 1 litro con acqua deionizzata | (mg) | Quantità di soluzione madre vitaminica aggiunta per preparare i mezzi M4 e M7 | (ml/l) | Final concentrations in test solutions M4 and M7 | (mg/l) | Tiamina cloridrato | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianocobalamina (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotina | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | BIBLIOGRAFIA | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H.Köpp. Berlin 1995. | Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. | Elendt BP and Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on LIFE History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. | Appendice 3 | PREPARAZIONE DEL SEDIMENTO ARTIFICIALE | Composizione del sedimento | Il sedimento è preparato come illustrato nella tabella sottostante: | Componente | Caratteristiche | % di sedimento | peso secco | Torba | Torba di sfagno, con pH più vicino possibile a 5,5-6,0, priva di residui visibili di piante, finemente macinata (granulometria ≤ 1 mm) ed essiccata all’aria | 4-5 | Sabbia di quarzo | Granulometria: > 50 % delle particelle ha dimensioni comprese tra 50 e 200 μm | 75-76 | Argilla caolinica | Tenore di caolinite ≥ 30 % | 20 | Carbonio organico | Regolato aggiungendo torba e sabbia | 2 (± 0,5) | Carbonato di calcio | CaCO3, in polvere, chimicamente puro | 0,05-0,1 | Acqua | Conduttività ≤ 10 μS/cm | 30-50 | Preparazione | Far essiccare all’aria e macinare finemente la torba. Preparare una sospensione della quantità richiesta di polvere di torba in acqua deionizzata utilizzando un omogeneizzatore ad alte prestazioni. Aggiustare il pH della sospensione a 5,5 ± 0,5 con CaCO3. Conservare per almeno due giorni la sospensione a temperatura di 20 ± 2 °C agitandola leggermente per stabilizzare il pH e favorire il costituirsi di una flora microbica stabile. Misurare nuovamente il pH, che deve essere pari a 6,0 ± 0,5. Successivamente mescolare la sospensione di torba con gli altri componenti (sabbia e argilla caolinica) e con acqua deionizzata, fino ad ottenere un sedimento omogeneo con tenore in acqua pari al 30-50 % del peso secco del sedimento. Misurare ancora una volta il pH della miscela finale e aggiustare a 6,5-7,5 con CaCO3 se necessario. Prelevare campioni del sedimento per determinare il peso secco e il tenore di carbonio organico. Prima di impiegare il sedimento artificiale in una prova di tossicità su chironomidi, si consiglia di conservarlo per sette giorni alle stesse condizioni in cui si realizzerà la prova. | Conservazione | I componenti secchi destinati alla preparazione del sedimento artificiale possono essere conservati in luogo fresco e asciutto, a temperatura ambiente. Il sedimento artificiale (umido) non può essere conservato prima del suo impiego per la prova, ma deve essere utilizzato subito dopo il periodo di riposo di 7 giorni che ne conclude la preparazione. | BIBLIOGRAFIA | Capitolo C.8 del presente allegato. Tossicità per i lombrichi. | Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. | Appendice 4 | Caratteristiche chimiche di un’acqua di diluizione accettabile | Sostanza | Concentrazioni | Particolato | < 20 mg/l | Carbonio organico totale | < 2 mg/l | Ammoniaca non ionizzata | < 1 μg/l | Durezza espressa come CaCO3 | < 400 mg/l (20) | Cloro residuo | < 10 μg/l | Pesticidi organofosforati totali | < 50 ng/l | Pesticidi organoclorurati totali più difenili policlorurati | < 50 ng/l | Cloro organico totale | < 25 ng/l | Appendice 5 | Indicazioni per monitorare l’emergenza delle larve di chironomidi | A partire dal 20o giorno fino alla fine della prova è necessario collocare dei contenitori «trappola» in cima ai becher utilizzati per la prova. Un esempio di trappola è raffigurato nell’immagine sottostante. | A | : | reticella di nylon (del tipo zanzariera) | B | : | contenitore di plastica capovolto | C | : | becher senza beccuccio | D | : | aperture protette da reticella attraverso cui si effettua il ricambio d’acqua | E | : | acqua | F | : | sedimento | C.29. PRONTA BIODEGRADABILITÀ — CO2 IN RECIPIENTI ERMETICI (prova del CO2 nello spazio di testa) | INTRODUZIONE | 1. | Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida OCSE n. 310 (2006). Si tratta di un metodo di screening che consente di valutare la pronta biodegradabilità delle sostanze chimiche e che fornisce informazioni analoghe ai sei metodi di prova descritti nel capitolo C.4 del presente allegato (da A a F). Pertanto, una sostanza chimica che risulta positiva a questo metodo di prova può essere considerata prontamente biodegradabile e quindi rapidamente biodegradabile nell’ambiente. | 2. | L’ormai consolidato metodo del biossido di carbonio (CO2) (1), basato sul test originale di Sturm (2) che permette di valutare la biodegradabilità delle sostanze chimiche organiche misurando il biossido di carbonio prodotto dall’attività microbica, è in genere quello che meglio si presta a saggiare le sostanze chimiche poco solubili e quelle fortemente adsorbenti. È utilizzato anche per le sostanze solubili (ma non volatili), poiché molti ritengono che lo sviluppo di biossido di carbonio sia l’unica prova inequivocabile dell’attività microbica. L’eliminazione del carbonio organico disciolto può avvenire mediante processi fisico-chimici (adsorbimento, volatilizzazione, precipitazione, idrolisi), nonché ad opera dell’azione microbica e di molte reazioni non biologiche che consumano ossigeno; è raro che il CO2 sia prodotto a partire da prodotti chimici organici per via abiotica. Nel test di Sturm originale e in quello modificato (1) (2), il CO2 è estratto dalla fase liquida ed inviato negli assorbitori per gorgogliamento (ossia insufflando nel mezzo liquido l’aria trattata per eliminare il CO2), mentre nella versione di Larson (3) (4) è trasferito dal reattore agli assorbitori facendo passare nello spazio di testa un flusso d’aria priva di CO2 e, in più, agitando il reattore in continuo. Solo nella versione modificata di Larson il reattore viene agitato; l’agitazione è prescritta solo per le sostanze insolubili nella norma ISO 9439 (5) e nella versione originale degli Stati Uniti (6), entrambe le quali prescrivono il gorgogliamento invece della sostituzione dell’aria nello spazio di testa. In un altro metodo ufficiale dell’agenzia statunitense per la protezione dell’ambiente (US EPA) (7), che si basa sul metodo di Gledhill (8), il reattore agitato è chiuso ermeticamente e il CO2 prodotto è raccolto direttamente dalla fase gassosa in una trappola alcalina interna, come nel respirometro classico di Warburg/Barcroft. | 3. | È stato tuttavia dimostrato, nell’applicazione della prova standard modificata di Sturm a varie sostanze chimiche (9), che il carbone inorganico si accumula nel mezzo. Nella degradazione di 20 mg C/l di anilina, ad esempio, si è osservata una concentrazione di carbonio inorganico dell’ordine di 8 mg/l, da cui si è desunto che la raccolta di CO2 nelle trappole alcaline non rispecchia la quantità reale di CO2 prodotta dall’azione microbica nelle fasi intermedie della degradazione. Pertanto, la prescrizione secondo la quale, per poter classificare la sostanza in esame come prontamente biodegradabile, è necessario raggiungere una produzione di CO2 superiore al 60 % della produzione massima teorica (ThCO2) nella fase di crescita di 10 giorni (“time window”, ossia i 10 giorni immediatamente successivi al raggiungimento della soglia del 10 % di biodegradazione) non è rispettata nel caso di alcune sostanze chimiche che rientrerebbero in questa categoria utilizzando come criterio l’eliminazione del carbonio organico disciolto (DOC). | 4. | Quando la degradazione percentuale è inferiore al valore previsto, è probabile che una quantità di carbonio inorganico si sia accumulata nella soluzione di prova. La degradabilità può allora essere valutata tramite le altre prove di pronta biodegradabilità. | 5. | Altri inconvenienti del metodo di Sturm (laboriosità, tempi lunghi, propensione a errori sperimentali e non applicabilità alle sostanze chimiche volatili) avevano già indotto i ricercatori ad orientarsi verso una tecnica con recipienti ermetici, diversa da quella di Gledhill, prescindendo dall’uso di un flusso di gas continuo (10) (11). Boatman et al. (12) hanno riveduto i primi metodi e hanno adottato un sistema con spazio di testa chiuso, in cui il CO2 è liberato nello spazio di testa alla fine dell’incubazione mediante acidificazione del mezzo. Il CO2 era misurato per gascromatografia/analisi del carbonio inorganico in campioni prelevati automaticamente dallo spazio di testa, senza però tenere conto del carbonio inorganico disciolto (DIC) nella fase liquida. Inoltre, i recipienti utilizzati erano molto piccoli (20 ml) e contenevano soltanto 10 ml di mezzo, il che era fonte di problemi, ad esempio quando si aggiungevano quantità necessariamente molto piccole di sostanze chimiche insolubili, e/o per il fatto che il mezzo inoculato rischiava di non contenere affatto i microrganismi in grado di degradare le sostanze in esame o di contenerli in un numero insufficiente. | 6. | Tali problemi sono stati risolti dagli studi indipendenti di Struijs e Stoltenkamp (13) e di Birch e Fletcher (14), questi ultimi ispirati dalla loro esperienza con le apparecchiature utilizzate nella prova di biodegradazione anaerobica (15). Nel primo metodo (13) il CO2 era misurato nello spazio di testa dopo l’acidificazione e l’equilibrazione, mentre nel secondo (14) il DIC era misurato nelle fasi gassosa e liquida, senza trattamento; più del 90 % del carbonio inorganico formatosi era presente nella fase liquida. Entrambi i metodi presentavano vantaggi rispetto al test di Sturm: poggiavano su un sistema sperimentale più compatto e maneggevole, si applicavano anche alle sostanze chimiche volatili ed evitavano che la misurazione del CO2 prodotto fosse ritardata. | 7. | I due approcci sono stati combinati nella norma ISO sul CO2 nello spazio di testa (16), che è stata sottoposta a prove interlaboratorio (17) e costituisce la base del presente metodo di prova. Essi sono stati anche utilizzati nel metodo dell’EPA (18). Sono stati raccomandati due metodi di misurazione del CO2: il CO2 nello spazio di testa dopo acidificazione (13) e il carbonio inorganico nella fase liquida dopo l’aggiunta di un agente alcalino in eccesso. Quest’ultimo è stato introdotto da Peterson nel corso della prova interlaboratorio, condotta da CONCAWE (19), del presente metodo dello spazio di testa modificato, per misurare la biodegradabilità intrinseca. Nel 1992 è stata effettuata una revisione dei metodi di cui al capitolo C.4 del presente allegato per la pronta biodegradabilità (20) e le modifiche apportate in quella sede sono state integrate nel metodo di prova qui descritto, cosicché le condizioni (mezzo, durata ecc.) sono per il resto identiche a quelle del test di Sturm riveduto (20). Birch e Fletcher (14) hanno dimostrato che, sulle stesse sostanze, la prova dello spazio di testa dava risultati molto simili a quelli della prova interlaboratorio condotta dall’OCSE (21) dei metodi di prova riveduti. | PRINCIPIO DEL METODO | 8. | La sostanza chimica in esame, normalmente a una concentrazione di 20 mg C/l e unica fonte di carbonio ed energia, è incubata in un tampone a base di sali minerali in cui è stata inoculata una popolazione mista di microrganismi. La prova è eseguita in bottiglie ermeticamente chiuse contenenti aria nello spazio di testa, che costituisce una riserva di ossigeno per la biodegradazione aerobica. Si determina il CO2 sviluppatosi dalla biodegradazione aerobica completa della sostanza in esame misurando la quantità eccedente di carbonio inorganico prodotta nelle bottiglie rispetto a quella prodotta nelle bottiglie di controllo, che contengono solo il mezzo inoculato. Il grado di biodegradazione è espresso come percentuale della produzione massima teorica di carbonio inorganico (ThIC), in base alla quantità di sostanza chimica in esame (in carbonio organico) aggiunta all’inizio. | 9. | È anche possibile misurare l’eliminazione del DOC e/o il grado di biodegradazione primaria della sostanza chimica in esame (20). | INFORMAZIONI SULLA SOSTANZA IN ESAME | 10. | Per poter calcolare la percentuale di degradazione occorre conoscere il tenore (% del peso) di carbonio organico della sostanza chimica in esame, desumendolo dalla sua struttura chimica oppure misurandolo. Per le sostanze volatili, è utile misurare o calcolare la costante di Henry per determinare un rapporto adeguato tra il volume dello spazio di testa e quello di liquido. Le informazioni sulla tossicità della sostanza in esame per i microrganismi aiutano a scegliere la concentrazione sperimentale adatta e a interpretare i risultati quando indicano scarsa biodegradabilità: si raccomanda di includere un controllo per l’inibizione, tranne nel caso in cui si sappia che la sostanza in esame non inibisce l’attività microbica (cfr. paragrafo 24). | APPLICABILITÀ DEL METODO | 11. | La prova si applica alle sostanze chimiche idrosolubili e insolubili, purché la sostanza in esame sia ben dispersa. Se per il rapporto volumico spazio di testa/liquido si applica il rapporto raccomandato di 1:2, le sostanze volatili la cui costante di Henry non supera 50 Pa.m3.mol-1 possono essere saggiate, poiché la porzione di sostanza in esame nello spazio libero non sarà superiore all’1 % (13). Si può utilizzare uno spazio di testa di volume inferiore per saggiare sostanze chimiche più volatili, la cui biodisponibilità rischia tuttavia di essere limitante soprattutto se sono poco idrosolubili. L’operatore deve però assicurarsi che il rapporto volumico spazio di testa/liquido e la concentrazione della sostanza in esame lascino ossigeno in quantità sufficiente da permettere il compiersi di una biodegradazione aerobica completa (evitando, ad esempio, di usare un substrato molto concentrato e uno spazio di testa ridotto). Ulteriori orientamenti a questo proposito si trovano nei riferimenti bibliografici (13) e (23). | SOSTANZE CHIMICHE DI RIFERIMENTO | 12. | Occorre verificare il procedimento sperimentale saggiando in parallelo una sostanza di riferimento la cui biodegradabilità sia nota. A tal fine si può ricorrere all’anilina, al benzoato di sodio o al glicol etilenico quando si saggiano sostanze chimiche idrosolubili, e all’1-ottanolo quando si saggiano sostanze chimiche poco solubili (13). La biodegradazione di queste sostanze deve essere superiore al 60 % della ThIC dopo 14 giorni. | RIPRODUCIBILITÀ | 13. | Dalla prova interlaboratorio del metodo realizzata dall’ISO (17) sono emersi i seguenti risultati, ottenuti applicando le condizioni raccomandate, ivi compresa la concentrazione della sostanza in esame pari a 20 mg C/l. | Sostanza chimica in esame | Percentuale media di biodegradazione | (28 giorni) | Coefficiente di variazione | (%) | Numero di laboratori | Anilina | 90 | 16 | 17 | 1-ottanolo | 85 | 12 | 14 | Con l’anilina, la variabilità interna della prova (riproducibilità) è risultata bassa, con coefficienti di variabilità non superiori a 5 % in quasi tutte le prove. Nei due casi con peggiore riproducibilità, la causa è probabilmente una produzione elevata di carbonio inorganico nei controlli. La riproducibilità con l’1-ottanolo ha dato risultati meno soddisfacenti, risultando comunque inferiore al 10 % nel 79 % delle prove. Questa maggiore variabilità interna della prova potrebbe derivare da errori di dosaggio, dato che il volume di 1-ottanolo da iniettare nelle bottiglie era assai piccolo (3 to 4 μl). Si osservano coefficienti di variazione più alti quando si utilizzano concentrazioni più deboli della sostanza in esame, in particolare al di sotto di 10 mg C/l. Si può in parte ovviare a questo inconveniente riducendo la concentrazione del carbonio inorganico totale (TIC) nell’inoculo. | 14. | Una prova interlaboratorio, organizzata dall’UE (24), di cinque tensioattivi a una concentrazione di 10 mg C/l ha dato i seguenti risultati: | Sostanza chimica in esame | Percentuale media di biodegradazione | (28 giorni) | Coefficiente di variazione | (%) | Numero di laboratori | Tetrapropilenbenzene | solfonato | 17 | 45 | 10 | Di-isoottilsulfosuccinato | (anionico) | 72 | 22 | 9 | Cloruro di esadecil-trimetilammonio (21) | (cationico) | 75 | 13 | 10 | Isononilfenolo(etossillato)9 | (non ionico) | 41 | 32 | 10 | Cocoamidopropil | dimetilidrossi | sulfobetaina | (anfotero) | 60 | 23 | 11 | Dai risultati si ricava che in generale la variabilità è maggiore per i tensioattivi meno degradabili. La variabilità interna della prova è stata inferiore al 15 % in più del 90 % dei casi, senza mai superare il 30-40 %. | NB: | La maggior parte dei tensioattivi non sono specie molecolari semplici bensì miscele di isomeri, omologhi ecc. che degradano dopo periodi di latenza diversi e a diverse velocità cinetiche, dando luogo a curve poco nette, attenuate, cosicché la soglia del 60 % rischia di non essere raggiunta nell’arco dei 10 giorni, anche se ogni singola specie molecolare, se saggiata isolatamente, la raggiungerebbe. Questo fenomeno può essere osservato anche con altre miscele complesse. | DESCRIZIONE DEL METODO | Apparecchiatura | 15. | Normale attrezzatura da laboratorio e: | a) | bottiglie da siero, chiuse ermeticamente con tappi di butile e ghiere di alluminio. La capacità raccomandata è di 125 ml, ossia un volume totale di circa 160 ml (nel qual caso il volume noto di ciascuna bottiglia deve essere di 160 ± 1 ml). Si possono utilizzare bottiglie più piccole se i risultati soddisfano le condizioni di cui ai paragrafi 66 e 67; | b) | analizzatore di carbonio o altro strumento (ad esempio, gascromatografo) per misurare il carbonio inorganico; | c) | siringhe ad alta precisione per i campioni gassosi e liquidi; | d) | agitatore orbitale in ambiente termostatato; | e) | flusso d’aria priva di CO2 — può esser preparata facendo passare un flusso d’aria attraverso granuli di calce sodata o impiegando una miscela gassosa costituita da 80 % di N2 e 20 % di 02 (facoltativo) (cfr. paragrafo 28); | f) | dispositivo di filtrazione su membrana con porosità da 0,20 a 0,45 μm (facoltativo); | g) | analizzatore di carbonio organico (facoltativo). | Reagenti | 16. | Impiegare sempre reagenti di grado analitico. | Acqua | 17. | Utilizzare acqua distillata o deionizzata con contenuto totale di carbonio organico ≤ 1 mg/l. Questo valore rappresenta una quantità ≤ 5 % del tenore iniziale di carbonio organico introdotto dalla dose raccomandata della sostanza chimica in esame. | Soluzioni madre per il mezzo a base di sali minerali | 18. | Le soluzioni madre e il mezzo a base di sali minerali sono simili a quelli della norma ISO 14593 (16) e delle prove di “pronta biodegradabilità” descritte nel capitolo C.4 (20). Una concentrazione più alta di cloruro di ammonio (2,0 g/l invece di 0,5 g/l) è da usarsi solo in casi molto eccezionali, ad esempio quando la concentrazione della sostanza in esame eccede i 40 mg C/l. Le soluzioni madre devono essere conservate al freddo e per non più di sei mesi, o per meno tempo se si osserva una precipitazione o una proliferazione microbica. Preparare le soluzioni madre seguenti: | a) | diidrogenofosfato di potassio (KH2PO4) 8,50 g | idrogenofosfato di potassio (K2HPO4) 21,75 g | sodio idrogenofosfato diidrato (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g | cloruro d’ammonio (NH4Cl) 0,50 g | Sciogliere in acqua e portare a 1 litro. Questa soluzione deve avere un pH pari a 7,4 (± 0,2). Se così non fosse, preparare una nuova soluzione; | b) | cloruro di calcio diidrato (CaCl2.2H2O) 36,40 g | Sciogliere in acqua e portare a 1 litro; | c) | solfato di magnesio eptaidrato (Mg2SO4.7H20) 22,50 g | Sciogliere in acqua e portare a 1 litro; | d) | cloruro di ferro (III) esaidrato (FeCl3.6H20) 0,25 g | Sciogliere in acqua portando a 1 litro e aggiungere una goccia di HCl concentrato. | Preparazione del mezzo minerale | 19. | Mescolare 10 ml di soluzione (a) con 800 ml di acqua (paragrafo 17), aggiungere 1 ml delle soluzioni (b), (c) e (d) e portare a 1 litro con acqua (paragrafo 17). | Altri reagenti | 20. | Acido fosforico concentrato (H3PO4) (> 85 % massa per volume). | Soluzione di idrossido di sodio 7M | 21. | Sciogliere 280 g di idrossido di sodio (NaOH) in 1 litro di acqua (paragrafo 17). Determinare la concentrazione di DIC di questa soluzione e tenere conto di questo valore nel calcolo del risultato della prova (cfr. paragrafi 55 e 61), in particolare alla luce del criterio di validità di cui al paragrafo 66, lettera b). Preparare una nuova soluzione se la concentrazione di DIC è troppo alta. | Sostanza chimica in esame | 22. | Preparare una soluzione madre di una sostanza chimica sufficientemente solubile in acqua (paragrafo 17) oppure nel mezzo di prova (paragrafo 19), a una concentrazione di preferenza 100 volte superiore alla concentrazione finale da utilizzarsi nella prova; può essere necessario aggiustare il pH della soluzione madre. La soluzione madre deve essere aggiunta al mezzo minerale in modo da ottenere una concentrazione finale di carbonio organico tra 2 e 40 mg C/l. di preferenza 20 mg C/l. Concentrazioni più basse rischiano di diminuire la precisione. Le sostanze liquide solubili e insolubili possono essere introdotte direttamente nei recipienti con siringhe ad alta precisione. Le sostanze chimiche poco solubili e insolubili possono richiedere un trattamento speciale (25), da scegliere tra i seguenti: | a) | aggiunta diretta delle aliquote pesate note; | b) | dispersione ultrasonica prima dell’aggiunta; | c) | dispersione con l’ausilio di agenti emulsionanti di cui occorre stabilire, prima dell’aggiunta, se esercitano un effetto inibitorio o stimolante sull’attività microbica; | d) | adsorbimento della sostanza in esame liquida, o di una soluzione della sostanza in esame in un solvente volatile adeguato, su un mezzo o un supporto inerte (ad esempio un filtro in fibra di vetro), seguito dall’evaporazione del solvente, se utilizzato, e dall’aggiunta diretta delle aliquote note; | e) | introduzione in un recipiente vuoto di un’aliquota nota di una soluzione della sostanza chimica in esame in un solvente facilmente volatile, seguita da evaporazione del solvente. | Occorre saggiare gli agenti o i solventi di cui alle lettere c), d) ed e) per verificare se hanno un effetto stimolante o inibitorio sull’attività microbica [cfr. paragrafo 42, lettera b)]. | Sostanze chimiche di riferimento | 23. | Preparare una soluzione madre della sostanza chimica di riferimento (solubile) in acqua (paragrafo 17), a una concentrazione di preferenza 100 volte superiore alla concentrazione finale (20 mg C/l) da utilizzarsi nella prova. | Verifica dell’inibizione | 24. | Si osserva spesso che le sostanze chimiche in esame non si degradano in modo significativo nelle condizioni sperimentali stabilite nelle prove per valutare la pronta biodegradazione. Ciò potrebbe essere causato dal fatto che la sostanza in esame esercita un effetto inibitore sull’inoculo alla concentrazione alla quale è saggiata. Il disegno sperimentale può prevedere una verifica dell’effetto inibitore, per facilitare l’individuazione (in retrospettiva) dell’inibizione come causa possibile o fattore concomitante, oppure, al contrario, per dissipare questa ipotesi e mostrare che la degradazione debole o nulla è imputabile unicamente al fatto che i microrganismi non attaccano la sostanza nelle condizioni in cui è condotta la prova. Per ottenere informazioni sulla tossicità della sostanza chimica in esame per i microrganismi (aerobici), preparare una soluzione nel mezzo di prova contenente la sostanza in esame e la sostanza di riferimento (paragrafo 19), ciascuna alle stesse concentrazioni utilizzate nel mezzo di prova (cfr. paragrafi 22 e 23). | Inoculo | 25. | L’inoculo può essere di varia origine: fanghi attivi, acqua di scarico (non clorata), acque superficiali e terreni, oppure da una miscela di questi elementi (20). Occorre verificare l’attività di biodegradazione dell’origine utilizzando una sostanza chimica di riferimento. Indipendentemente dall’origine, non utilizzare microrganismi che sono già stati esposti alla sostanza in esame se il procedimento è destinato a una prova per determinare la pronta biodegradabilità. | Attenzione: | il fango attivo e l’acqua di scarico contengono organismi patogeni e devono essere manipolati con cautela. | 26. | In base all’esperienza acquisita, il volume ottimale dell’inoculo è quello che soddisfa le seguenti condizioni: | — | è sufficiente a fornire un’adeguata attività di biodegradazione, | — | degrada la sostanza chimica di riferimento alla percentuale prestabilita (cfr. paragrafo 66), | — | fornisce da 102 a 105 unità formanti colonie per millilitro nella miscela finale, | — | dà luogo normalmente a una concentrazione di 4 mg/l di solidi sospesi nella miscela finale quando si usa fango attivo; possono essere impiegate concentrazioni fino a 30 mg/l, tenendo presente che rischiano di aumentare notevolmente la produzione di CO2 nei bianchi (26), | — | costituisce meno del 10 % della concentrazione iniziale di carbonio organico introdotto dalla sostanza chimica in esame, | — | equivale generalmente a un quantitativo compreso tra 1 ml e 10 ml di inoculo per litro di soluzione di prova. | Fango attivo | 27. | Raccogliere un campione di fango attivo fresco dal serbatoio di aerazione di un impianto di trattamento o da un’unità pilota di laboratorio per il trattamento delle acque di scarico che tratti prevalentemente liquami domestici. Se necessario, setacciarlo per rimuovere le particelle grossolane (con un setaccio a maglia da 1 mm2) e mantenerlo in condizioni aerobiche sino al momento dell’uso. | 28. | In alternativa, far decantare o centrifugare (per esempio a 1 100 g per 10 minuti) dopo la rimozione delle eventuali particelle grossolane. Scartare il surnatante. Il fango può essere lavato nella soluzione minerale. Sospendere il fango concentrato nel mezzo minerale per ottenere una concentrazione di 3-5 g di solidi sospesi/l e aerare finché sia necessario. | 29. | Il fango deve essere prelevato da un impianto di trattamento convenzionale ben funzionante. Se il fango è stato prelevato da un impianto ad alta potenzialità o si ritiene contenga inibitori deve essere lavato. Decantare o centrifugare il fango risospeso dopo accurata miscelazione, scartare il surnatante e risospendere il fango lavato in un volume ulteriore di mezzo minerale. Ripetere questa procedura fino a quando il fango può essere considerato esente da substrato e inibitori in eccesso. | 30. | Prelevare un campione di fango risospeso (a risospensione ultimata) oppure di fango non trattato appena prima di utilizzarlo per determinare il peso secco dei solidi sospesi. | 31. | Un’ulteriore alternativa è quella di omogeneizzare il fango attivo (3-5 g di solidi sospesi/l). Trattare il fango in un miscelatore Waring per due minuti a velocità media. Decantare il fango miscelato per 30 minuti, o più a lungo se necessario, e utilizzare il liquido sovrastante come inoculo nel rapporto di 10 ml per litro di mezzo minerale. | 32. | È possibile ottenere una riduzione ulteriore dello sviluppo di CO2 nel bianco aerando il fango tutta una notte con aria priva di CO2. In questa prova la concentrazione dell’inoculo deve essere pari a 4 mg/l di solidi di fanghi attivi (13). | Effluenti secondari | 33. | L’inoculo può provenire anche da un effluente secondario di un impianto di trattamento o da una unità pilota di laboratorio che riceve prevalentemente liquami domestici. Conservato in condizioni aerobiche, il campione può essere utilizzato il giorno del prelievo oppure può essere precondizionato, se necessario. Filtrare l’effluente con un filtro grossolano per rimuovere le parti solide più evidenti e misurarne il pH. | 34. | Per ridurre il tenore di carbonio inorganico del filtrato, lo si fa gorgogliare insufflandogli aria priva di CO2 [paragrafo 15, lettera e)] per 1 ora, mantenendo il pH a 6,5 con acido fosforico (paragrafo 20). Riportare il pH al valore di partenza con dell’idrossido di sodio (paragrafo 21) e, dopo decantazione di circa 1 ora, prelevare un volume appropriato di surnatante per l’inoculo. Questa procedura riduce il tenore di carbonio inorganico nell’inoculo. Ad esempio, se si utilizza il volume massimo raccomandato di effluente filtrato e gorgogliato (100 ml) per litro come inoculo, la quantità di carbonio inorganico nei bianchi è compresa tra 0,4 e 1,3 mg/l (14), il che rappresenta da 2 % a 6,5 % del carbonio della sostanza in esame, per una concentrazione di 20 mg C/l, e da 4 % a 13 %, per una concentrazione di 10 mg C/l. | Acque superficiali | 35. | Da un’acqua superficiale adeguata si preleva un campione che sarà conservato in condizioni aerobiche e impiegato il giorno stesso del prelievo. Se necessario, concentrare il campione filtrandolo o centrifugandolo. Il volume dell’inoculo da utilizzare in ogni recipiente di prova deve soddisfare i criteri di cui al paragrafo 26. | Terreno | 36. | Prelevare un campione di terreno appropriato, a una profondità massima di 20 cm sotto la superficie del terreno. Occorre asportare le pietre, i residui di piante e gli invertebrati prima di passare il campione attraverso un setaccio con maglia di 2 mm (se il campione è troppo umido da non poter essere setacciato immediatamente, farlo asciugare parzialmente all’aria). Va conservato in condizioni aerobiche e impiegato il giorno stesso del prelievo (se il campione è trasportato in una busta di polietilene con la chiusura non ermetica può essere conservato a una temperatura compresa tra 2 °C e 4 °C nella busta stessa fino a un mese). | Precondizionamento dell’inoculo | 37. | L’inoculo può essere precondizionato in base alle condizioni in cui si svolgerà la prova, ma non può essere preadattato alla sostanza in esame. Il precondizionamento può diminuire lo sviluppo di CO2 nel bianco. Il precondizionamento consiste nell’aerare il fango attivo, dopo averlo diluito nel mezzo di prova a 30 mg/l, con aria umida priva di CO2 per un periodo fino a 5-7 giorni alla temperatura in cui si svolgerà la prova. | PROCEDURA SPERIMENTALE | Numero di bottiglie | 38. | Il numero delle bottiglie [paragrafo 15, lettera a)] necessarie per una prova dipenderà dalla frequenza delle analisi e dalla durata della prova. | 39. | Si raccomanda di effettuare l’analisi in triplicato dopo un numero di intervalli di tempo sufficiente per poter individuare la fase di crescita di 10 giorni. Alla fine della prova analizzare almeno altre cinque bottiglie sperimentali [paragrafo 15, lettera a)] delle serie a), b) e c) (cfr. paragrafo 42), per poter calcolare gli intervalli di confidenza al 95 % per la percentuale media di biodegradazione. | Mezzo inoculato | 40. | L’inoculo è utilizzato a una concentrazione di 4 mg/l di solidi secchi di fango attivo. Preparare subito prima dell’uso una quantità sufficiente di mezzo inoculato aggiungendo, ad esempio, 2 ml di fango attivo opportunamente trattato (paragrafi da 27 a 32) con concentrazione di 2 000 mg/l a 1 litro di mezzo salino (paragrafo 19). Se si impiega effluenti secondari, aggiungere fino a 100 ml di effluenti (paragrafo 33) a 900 ml di mezzo salino (paragrafo 19) e portare a 1 litro con il mezzo. | Preparazione delle bottiglie | 41. | Versare aliquote di mezzo inoculato nelle bottiglie di ciascuna replica in modo che il rapporto spazio di testa/liquido sia di 1:2 (ad esempio, introducendo 107 ml in bottiglie dalla capacità di 160 ml). Si possono utilizzare altri rapporti, tenendo però conto dell’avvertenza di cui al paragrafo 11. Indipendentemente dal tipo di inoculo impiegato, occorre aver cura di mescolare correttamente il mezzo inoculato affinché sia distribuito uniformemente nelle bottiglie. | 42. | Preparare delle serie di bottiglie [paragrafo 15, lettera a)] da destinare ai seguenti usi: | f) | recipienti per la prova (denominati FT) contenenti la sostanza chimica in esame; | g) | recipienti per la prova in bianco (denominati FB) contenenti solo il mezzo di prova e l’inoculo; vanno aggiunte anche tutte le sostanze chimiche, i solventi, gli agenti o i filtri di fibra di vetro usati per introdurre la sostanza in esame nei recipienti di prova; | h) | recipienti (denominati FC) contenenti la sostanza chimica di riferimento per verificare la procedura; | i) | se necessario, recipienti (denominati FI) per verificare l’eventuale effetto inibitorio della sostanza chimica in esame, contenenti sia la sostanza in esame sia la sostanza di riferimento alle stesse concentrazioni (paragrafo 24) delle bottiglie FT e FC. | j) | recipienti (denominati FS) per verificare l’eventuale degradazione abiotica: si tratta di recipienti come in a) a cui si sono aggiunti 50 mg/l di HgCl2 o che sono stati sterilizzati in altro modo (ad esempio, autoclave). | 43. | Introdurre nelle bottiglie, sotto forma di soluzioni madre acquose (paragrafi 22, 23 e 24), le sostanze chimiche solubili in esame e quelle di riferimento in modo da ottenere una concentrazione compresa tra 10 e 20 mg C/l. | 44. | Le sostanze chimiche insolubili in esame e di riferimento possono essere introdotte nelle bottiglie in svariati modi [cfr. paragrafo 22, lettere da a) a e)], in funzione della natura della sostanza in esame, prima o dopo l’aggiunta del mezzo inoculato, secondo il metodo di trattamento della sostanza in esame. Se si ricorre a uno dei procedimenti indicati nel paragrafo 22, lettere da a) a e), le bottiglie per il bianco FB [paragrafo 42, lettera b)] devono essere trattate allo stesso modo, salvo non contenere la sostanza in esame o quella di riferimento. | 45. | Iniettare con una microsiringa le sostanze chimiche in esame volatili nelle bottiglie ermeticamente chiuse (paragrafo 47). La dose è calcolata in base al volume iniettato e alla densità della sostanza in esame. | 46. | Se necessario, aggiungere acqua nei recipienti affinché il volume di liquido sia identico in tutti i recipienti. Assicurarsi che il rapporto spazio di testa/liquido (normalmente di 1:2) e la concentrazione della sostanza in esame siano tali da garantire la presenza di ossigeno nello spazio di testa in quantità sufficiente a permettere la biodegradazione completa. | 47. | Chiudere ermeticamente tutte le bottiglie, ad esempio con tappi di butile e ghiere di alluminio. È in questa fase che vanno aggiunte le sostanze in esame volatili (paragrafo 45). Se si deve monitorare la diminuzione della concentrazione di DOC della soluzione sperimentale e analizzare al tempo zero la concentrazione iniziale di carbonio inorganico [controlli sterili, paragrafo 42, lettera e)] o altri parametri, prelevare un campione adeguato dal recipiente di prova. Eliminare successivamente il recipiente di prova e il suo contenuto. | 48. | Collocare le bottiglie ermeticamente chiuse in un agitatore orbitale [paragrafo 15, lettera d)], regolato a una velocità di rotazione sufficiente a mantenere il contenuto delle bottiglie ben mescolato e in sospensione (ad esempio da 150 a 200 rpm), e incubarle al buio a temperatura costante di 20 °C (± 1 °C). | Campionamento | 49. | La strategia di campionamento dipende dal periodo di latenza e dalla velocità cinetica di biodegradazione della sostanza chimica in esame. Le bottiglie sono analizzate ed eliminate il giorno stesso del campionamento, che deve avvenire almeno a cadenza settimanale o più di frequente (ad esempio, due volte la settimana) se si deve definire una curva completa di degradazione. Ritirare dall’agitatore il numero necessario di repliche di ogni categoria: FT, FB e FC e, se del caso, FI e FS (cfr. paragrafo 42). La prova dura normalmente 28 giorni. Se la curva di biodegradazione indica il raggiungimento di un plateau prima di questo termine, la prova può essere conclusa prima di 28 giorni. Prelevare dei campioni dalle cinque bottiglie destinate ad essere analizzate il 28° giorno della prova e utilizzare i risultati per calcolare gli intervalli di confidenza o il coefficiente di variazione della percentuale di biodegradazione. Le bottiglie destinate a verificare l’inibizione e la degradazione abiotica non devono essere campionate con la stessa frequenza delle altre: basteranno due prelievi, effettuati il 1o e il 28° giorno della prova. | Analisi del carbonio inorganico (IC) | 50. | La produzione di CO2 nelle bottiglie è determinata misurando l’aumento della concentrazione di carbonio inorganico durante l’incubazione. Si raccomandano due metodi, descritti di seguito, per misurare la quantità di carbonio inorganico prodotta durante la prova. Poiché possono dare risultati leggermente diversi, nella stessa serie di prove si deve impiegare o l’uno o l’altro metodo. | 51. | Il metodo (a) è consigliato se si ritiene che il mezzo contenga residui, ad esempio di filtri in fibra di vetro e/o della sostanza in esame insolubile. Se non si dispone di un analizzatore di carbonio, l’analisi può essere eseguita con un gascromatografo. Durante l’analisi del gas nello spazio di testa è importante mantenere le bottiglie alla temperatura in cui è stata condotta la prova, o quantomeno prossime alla stessa. Il metodo (b) può essere di più facile applicazione per i laboratori che impiegano analizzatori di carbonio per misurare il carbonio inorganico. È importante che la soluzione di idrossido di sodio (paragrafo 21) utilizzata per convertire il CO2 in carbonato sia preparata ex novo oppure che sia noto il suo tenore di carbonio inorganico, in modo da poter tenere conto di questo valore al momento di calcolare i risultati della prova [cfr. paragrafo 66, lettera b)]. | Metodo (a): acidificazione a pH < 3 | 52. | Prima di ogni lotto di analisi, l’analizzatore di carbonio inorganico è tarato con una sostanza dal tenore standard di carbonio inorganico (ad esempio una diluizione 1 % p/p di CO2 in N2). Iniettare l’acido fosforico concentrato (paragrafo 20) nel tappo di ogni bottiglia campionata per abbassare il pH del mezzo a un valore < 3 (ad esempio, aggiungendo 1 ml a 107 ml di mezzo di prova). Rimettere le bottiglie nell’agitatore. Dopo averle agitate per un’ora alla temperatura in cui è stata condotta la prova, togliere le bottiglie dall’agitatore, prelevare dallo spazio di testa di ciascuna bottiglia delle aliquote di gas (ad esempio, 1 ml) e iniettarle nell’analizzatore di carbonio inorganico. Annotare le concentrazioni di carbonio inorganico misurate esprimendole in mg C/l. | 53. | Questo metodo verte sul principio secondo il quale dopo l’acidificazione a pH < 3 e l’equilibrazione a 20 °C, la costante di equilibrio per la ripartizione del CO2 tra la fase liquida e la fase gassosa nelle bottiglie è pari a 1,0 se misurata sotto forma di concentrazione (13). Tale rapporto deve essere dimostrato almeno una volta per il sistema sperimentale, nel seguente modo: | allestire delle bottiglie contenenti 5 e 10 mg/l di carbonio inorganico utilizzando una soluzione di carbonato di sodio (Na2CO3) in acqua priva di CO2 preparata acidificando l’acqua a pH 6,5 con acido fosforico (paragrafo 20), facendola gorgorgliare per una notte immettendo aria priva di CO2 e portando il pH alla neutralità con alcali. Assicurarsi che il rapporto volumico tra lo spazio di testa e il liquido sia lo stesso delle prove (ad esempio 1:2). Acidificare ed equilibrare come indicato nel paragrafo 52 e misurare le concentrazioni di carbonio inorganico nello spazio di testa e nella fase liquida. Verificare che le due concentrazioni siano le stesse, nei limiti dell’errore sperimentale. Se non lo sono, riesaminare il procedimento. Non è necessario verificare la ripartizione del carbonio inorganico tra la fase liquida e quella gassosa ad ogni prova, limitandosi a farlo, ad esempio, durante la taratura. | 54. | Se occorre misurare l’eliminazione del DOC (unicamente per sostanze idrosolubili), prelevare campioni della fase liquida da bottiglie separate (non acidificate), filtrarli su membrana e iniettarli nell’analizzatore di carbonio organico disciolto. Queste bottiglie possono servire eventualmente per altre analisi, al fine di misurare la biodegradazione primaria. | Metodo (b): conversione del CO2 in carbonato | 55. | Prima di ogni lotto di analisi, tarare l’analizzatore di carbonio inorganico mediante uno standard adeguato, ad esempio una soluzione di bicarbonato di sodio (NaHCO3) in acqua priva di CO2 (cfr. paragrafo 53) a una concentrazione di carbonio inorganico compresa tra 0 e 20 mg per litro. Iniettare una soluzione di idrossido di sodio (7M, paragrafo 21) (ad esempio, aggiungendo 1 ml a 107 ml di mezzo di prova) nel tappo di ogni bottiglia campionata e agitare le bottiglie per un’ora alla temperatura stabilita per la prova. Utilizzare la stessa soluzione di NaOH in tutte le bottiglie analizzate lo stesso giorno, ma non necessariamente in tutte le sessioni di campionamento effettuate nel corso della prova. Se occorre rilevare i valori assoluti del tenore di carbonio inorganico nei bianchi in tutte le sessioni di campionamento, si dovrà determinare il tenore di carbonio inorganico della soluzione di NaOH ogniqualvolta la si utilizza. Togliere le bottiglie dall’agitatore e farle decantare. Prelevare con un siringa da ogni bottiglia un idoneo volume della fase liquida (ad esempio, da 50 a 1 000 μl), iniettare i campioni nell’analizzatore di carbonio inorganico e prendere nota delle concentrazioni di carbonio inorganico. Assicurarsi che l’analizzatore utilizzato sia predisposto a trattare i campioni alcalini ottenuti con questo metodo. | 56. | Questo metodo verte sul principio secondo il quale dopo l’aggiunta di alcali e l’agitazione, la concentrazione di carbonio inorganico nello spazio di testa è trascurabile. Ciò deve essere verificato almeno una volta nel sistema sperimentale: a tal fine utilizzare gli standard di carbonio inorganico, aggiungere alcali e equilibrare, per poi misurare la concentrazione di carbonio inorganico sia nello spazio di testa che nella fase liquida (cfr. paragrafo 53). La concentrazione nello spazio di testa deve essere praticamente nulla. Non è necessario verificare l’assorbimento pressoché completo di CO2 ad ogni prova. | 57. | Se occorre misurare l’eliminazione del DOC (unicamente per sostanze in esame idrosolubili), prelevare campioni della fase liquida da bottiglie separate (non contenenti alcali aggiunti), filtrarli su membrana e iniettarli nell’analizzatore di carbonio organico disciolto. Queste bottiglie possono servire eventualmente per altre analisi, al fine di misurare la biodegradazione primaria. | DATI E RELAZIONE | Calcolo dei risultati | 58. | Supponendo che la sostanza in esame sia stata mineralizzata al 100 % in CO2, la produzione massima teorica di carbonio inorganico (ThIC) delle bottiglie di prova in eccesso rispetto ai bianchi è uguale al carbonio organico totale (TOC) aggiunto ad ogni bottiglia all’inizio del saggio, ossia: | La massa totale (mg) di carbonio inorganico (TIC) in ogni bottiglia è: | equazione [1] | dove: | VL | = | volume di liquido nella bottiglia (litro); | CL | = | concentrazione di carbonio inorganico nel liquido (mg/l, espressa in carbonio); | VT | = | volume dello spazio di testa (litro); | CT | = | concentrazione di carbonio inorganico nello spazio di testa (mg/l, espressa in carbonio). | I calcoli del TIC per i due metodi d’analisi utilizzati per misurare il carbonio inorganico nella presente prova sono descritti di seguito nei paragrafi 60 e 61. La percentuale di biodegradazione (% D) in entrambi i casi è data dalla seguente equazione: | equazione [2] | dove: | TICt | = | mg di TIC nella bottiglia di prova al tempo t; | TICb | = | media dei mg di TIC nelle bottiglie dei bianchi al tempo t; | TOC | = | mg di TOC aggiunti inizialmente alla bottiglia di prova. | La percentuale di biodegradazione (% D) è calcolata per le bottiglie di prova (FT), quelle di riferimento (FC) e, se del caso, quelle destinate alla verifica di un’eventuale effetto inibitore (FI), in base alle quantità rispettive di TIC prodotte fino al momento di ogni campionamento. | 59. | Se si osserva un aumento significativo del tenore di TIC nei controlli sterili (FS) durante il periodo di esecuzione della prova, si può giungere alla conclusione che si è verificata una degradazione abiotica della sostanza in esame di cui occorre tener conto nel calcolo di D nell’equazione [2]. | Acidificazione a pH < 3 | 60. | Una volta che l’acidificazione a pH < 3 e il successivo equilibrio hanno dato luogo a un’uniformazione della concentrazione di TIC nella fase liquida e in quella gassosa, basta misurare solo la concentrazione di carbonio inorganico della fase gassosa. Pertanto, in base all’equazione [1] | , dove VB = volume della bottiglia da siero. | Conversione del CO2 in carbonato | 61. | In questo metodo i calcoli sono effettuati in base all’equazione [1], ma senza tenere conto della quantità trascurabile di carbonio inorganico nella fase gassosa, in modo che | e | . | Espressione dei risultati | 62. | Tracciare la curva della biodegradazione in un grafico in cui è rappresentata la percentuale di biodegradazione (D) in funzione del tempo di incubazione, indicando, se possibile, le fasi di latenza, biodegradazione, crescita di 10 giorni e plateau, ossia la fase in cui è stata raggiunta la degradazione massima e la curva presenta un andamento orizzontale. Se per le bottiglie di prova FT saggiate in parallelo si sono ottenuti risultati paragonabili (differenza < 20 %), tracciare la curva media (cfr. appendice 2, fig. 1), altrimenti tracciare una curva per ciascuna bottiglia. Determinare il valore medio della percentuale di biodegradazione nella fase di plateau oppure valutarne il valore massimo (ad esempio, quando la curva scende nella fase di plateau), ma, in quest’ultimo caso, è importante verificare che non sia un valore anomalo (outlier). Questo livello massimo di biodegradazione va indicato nella relazione sulla prova come “grado di biodegradazione della sostanza in esame”. Se il numero delle bottiglie di prova si è rivelato insufficiente ad indicare una fase di plateau, calcolare un valore medio utilizzando i dati misurati dell’ultimo giorno della prova. Quest’ultimo valore, la media di cinque repliche, serve a indicare la precisione con cui è stata determinata la percentuale di biodegradazione. Nella relazione deve anche figurare il valore ottenuto alla fine della fase di crescita di 10 giorni. | 63. | Tracciare, allo stesso modo, una curva per la sostanza chimica di riferimento FC e, eventualmente, per la verifica della degradazione abiotica FS e per il controllo dell’inibizione FI. | 64. | Registrare la quantità di TIC sia dei controlli in bianco (FB) sia delle bottiglie FS (verifica abiotica), se queste ultime sono incluse nella prova. | 65. | Calcolare D per le bottiglie FI in base al rendimento teorico di carbonio inorganico previsto unicamente in base al componente di riferimento della miscela. Se al 28° giorno [(DFC (22) – DFI (23))/DFC] × 100 > 25 %, si può presumere che la sostanza in esame abbia inibito l’attività dell’inoculo, il che può spiegare i bassi valori di DFT ottenuti alle condizioni della prova. In tal caso, la prova può essere ripetuta con una concentrazione sperimentale inferiore e riducendo di preferenza il DIC nell’inoculo e il TIC formato nei controlli in bianco, dal momento che una diminuzione della concentrazione della sostanza in esame comporta anche una minore precisione del metodo. In alternativa si può utilizzare un altro inoculo. Se nella bottiglia FS (degradazione abiotica) si osserva un aumento significativo (> 10 %) della quantità di TIC, è possibile che siano avvenuti processi di degradazione abiotica. | Validità dei risultati | 66. | La prova è considerata valida se: | a) | la percentuale media di degradazione nelle bottiglie FC contenenti la sostanza di riferimento è > 60 % al 14° giorno di incubazione; e | b) | la quantità media di TIC nei controlli in bianco FB alla fine della prova è > 3 mg C/l. | Se questi valori limite non sono raggiunti, occorre ripetere la prova con un inoculo di provenienza diversa e/o rivedere i procedimenti seguiti. Ad esempio, se nel bianco si registra una produzione elevata di carbonio inorganico, è opportuno seguire il procedimento di cui ai paragrafi da 27 a 32. | 67. | Se la sostanza chimica in esame non produce il 60 % di ThIC e ha dimostrato di non esercitare alcun effetto inibitore (paragrafo 65), la prova può essere ripetuta aumentando la concentrazione di inoculo (fino a 30 mg/l di fango attivo e 100 ml di effluente/l), oppure con inoculi di altra provenienza, in particolare se la degradazione è stata di un valore compreso tra 20 % e 60 %. | Interpretazione dei risultati | 68. | Se la sostanza chimica in esame subisce una biodegradazione > 60 % della ThIC nella fase di crescita di 10 giorni nella presente prova significa che è prontamente biodegradabile in condizioni aerobiche. | 69. | Se il valore-soglia di 60 % della ThIC non è raggiunto, misurare il pH del mezzo contenuto nelle bottiglie che non sono state acidificate o alcalinizzate; un valore inferiore a 6,5 potrebbe indicare un’avvenuta nitrificazione. In tal caso, ripetere la prova con una soluzione tampone più concentrata. | Relazione sulla prova | 70. | Disegnare un grafico della percentuale di degradazione (% D) rilevata in ogni bottiglia di prova (FT), di riferimento (FC) e, se prevista, di verifica dell’inibizione (FI) per ciascun giorno di campionamento. Se le repliche danno risultati paragonabili, tracciare la curva della percentuale di degradazione media in funzione del tempo. Annotare la quantità di TIC nei bianchi (FB) e nei controlli sterili (FS), come pure il DOC e/o altri parametri, insieme alla loro percentuale di eliminazione. | 71. | Determinare il valore medio della percentuale di biodegradazione nella fase di plateau, oppure utilizzare il valore massimo se la curva di biodegradazione scende nella fase di plateau, e indicare questo valore come “grado di biodegradazione della sostanza in esame”. È importante garantire che, nell’ultimo caso, non si tratti di un valore anomalo (outlier). | 72. | La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti. | | Sostanza chimica in esame: | — | nome comune, nome chimico, numero CAS, formula strutturale e proprietà fisico-chimiche pertinenti, | — | purezza (presenza di impurità). | | Condizioni sperimentali: | — | riferimento al presente metodo di prova, | — | descrizione del sistema sperimentale utilizzato (ad esempio, volume della bottiglia, rapporto spazio di testa/liquido, metodo di agitazione ecc.), | — | applicazione della sostanza in esame e della sostanza di riferimento nel sistema sperimentale; concentrazione applicata e quantità di carbonio introdotta in ciascuna bottiglia di prova, nonché l’eventuale uso di solventi, | — | ragguagli sull’inoculo utilizzato, sull’eventuale pretrattamento e precondizionamento, | — | temperatura di incubazione, | — | validazione del principio dell’analisi del carbonio inorganico, | — | caratteristiche principali dell’analizzatore di carbonio inorganico (e di ogni altro metodo d’analisi eventualmente impiegato), | — | numero di repliche. | | Risultati: | — | dati grezzi e valori calcolati della biodegradabilità presentati su tabella, | — | grafico della percentuale di degradazione in funzione del tempo per la sostanza in esame e quella di riferimento, fase di latenza, fase di degradazione, fase di crescita di 10 giorni e inclinazione, | — | percentuale di eliminazione nella fase di plateau, all’inizio e alla fine della prova e dopo la fase di crescita di 10 giorni, | — | giustificazione in caso dell’eventuale rigetto dei risultati della prova, | — | qualsiasi altro elemento inerente alla procedura seguita, | — | discussione dei risultati. | BIBLIOGRAFIA | (1) | Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della “pronta” (ready) biodegradabilità — Saggio di sviluppo del CO2 (Metodo C.4-C). | (2) | Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,.Oil Chem Soc. 50: 159-167. | (3) | Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161. | (4) | Larson RJ, Hansmann MA and Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210. | (5) | ISO 9439 (1990; revised 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm). | (6) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (7) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (8) | Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929. | (9) | Weytjens D, Van Ginneken I and Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812. | (10) | Ennis DM and Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185. | (11) | Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53. | (12) | Boatman RJ, Cunningham SL and Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243. | (13) | Struijs J and Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211. | (14) | Birch RR and Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524. | (15) | Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, and Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550. | (16) | ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C02 headspace test). | (17) | Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822. | (18) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC. | (19) | Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR and Starkey M (1999). An «inherent» biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235. | (20) | Capitolo C.4 del presente allegato, Determinazione della “pronta” (ready) biodegradabilità. | (21) | OCSE (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano and M. Takatsuki; CITI). Paris. | (22) | Capitolo C.11 del presente allegato, Fanghi attivi: saggio di inibizione della respirazione. | (23) | Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ and Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327. | (24) | EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, UK. | (25) | ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium. | Appendice 1 | ABBREVIAZIONI E DEFINIZIONI | IC: carbonio inorganico. | ThCO2: produzione teorica di biossido di carbonio (mg), ossia la quantità di biossido di carbonio prodotto calcolato in base al tenore di carbonio noto o misurato della sostanza in esame quando sia stata completamente mineralizzata; espressa anche come mg di biossido di carbonio sviluppati per mg di sostanza in esame. | DOC: carbonio organico disciolto, ossia il carbonio organico presente in soluzione, che passa attraverso un filtro da 0,45 micrometri o che rimane nel surnatante dopo centrifugazione a ± 4 000 g (40 000 m/s-2) per 15 minuti. | DIC: carbonio organico disciolto. | ThIC: produzione teorica di carbonio inorganico. | TIC: carbonio inorganico totale. | Prontamente biodegradabile: classificazione arbitraria delle sostanze chimiche che hanno superato certe prove specifiche di selezione riguardo alla biodegradabilità ultima; data la rigorosità di queste prove, si suppone che tali composti si degradino biologicamente in modo rapido e completo in ambienti acquosi in condizioni aerobiche. | Fase di crescita di 10 giorni: i 10 giorni che seguono immediatamente il momento in cui la percentuale di degradazione raggiunge il 10 %. | Biodegradabilità intrinseca: classificazione delle sostanze chimiche per le quali vi è una dimostrazione inequivocabile di biodegradazione (primaria o completa) in qualsiasi prova di biodegradabilità. | Biodegradazione aerobica completa: livello di degradazione raggiunto quando la sostanza in esame è completamente utilizzata da microorganismi, con la conseguente produzione di biossido di carbonio, acqua, sali minerali e nuovi costituenti cellulari microbici (biomassa). | Mineralizzazione: completa degradazione di un composto organico in CO2 e H2O in condizioni aerobiche, e in CH4, CO2 e H2O in condizioni anaerobiche. | Fase di latenza: periodo che intercorre tra l’inizio della prova e il momento in cui i microrganismi responsabili della degradazione si sono acclimatati e/o adattati e il livello di degradazione della sostanza chimica o della materia organica ha raggiunto un limite rilevabile (per esempio 10 % della biodegradazione teorica massima, o meno, in funzione dell’accuratezza della tecnica di misura). | Fase di degradazione: periodo che intercorre tra la fine della fase di latenza e il momento in cui è raggiunto il 90 % del livello massimo di degradazione. | Fase di plateau: fase in cui è stata raggiunta la degradazione massima e la curva di biodegradazione presenta un andamento orizzontale. | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. | Appendice 2 | Esempio di curva di biodegradazione | Figura 1 | Biodegradazione di 1-ottanolo nella prova del CO2 nello spazio di testa | Legenda | Biodegradazione | Fase di degradazione | Livello massimo di biodegradazione | Fase di plateau | Fase di crescita di 10 giorni | Tempo di prova (giorni) | C.30. BIOACCUMULO NEGLI OLIGOCHETI TERRESTRI | INTRODUZIONE | 1. | Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 317 (2010). Tra i metodi di prova relativi al destino ambientale, quelli intitolati Bioconcentrazione: saggio sui pesci, metodo a flusso continuo (capitolo C.13 del presente allegato) (49) e Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates (53) sono stati pubblicati, rispettivamente, nel 1996 e nel 2008. È difficile, se non impossibile, estrapolare i dati sul bioaccumulo in ambiente acquatico e applicarli a organismi terrestri come i lombrichi. Per valutare il bioaccumulo delle sostanze chimiche nel suolo attualmente si utilizzano modelli calcolati basandosi sulla lipofilia della sostanza in esame (14) e (37), come nel documento tecnico di orientamento dell’UE (19). L’esigenza di un metodo di prova specifico per questo compartimento è già stata sollevata (55), in particolare data l’importanza di poter valutare l’avvelenamento secondario nelle catene alimentari terrestri (4). Esistono vari metodi di prova nazionali che vertono sul bioaccumulo in organismi diversi dai pesci, ad esempio (2) e (72). Un metodo di misurazione del bioaccumulo da suoli contaminati nei lombrichi (Eisenia fetida, Savigny) e negli enchitreidi è stato messo a punto dall’American Society for Testing and Materials (3). Un metodo di prova riconosciuto a livello internazionale per la determinazione del bioaccumulo in un suolo addizionato consentirà di valutare meglio i rischi posti dalle sostanze chimiche per gli ecosistemi terrestri, ad esempio (25) e (29). | 2. | Gli invertebrati detritivori sono esposti alle sostanze chimiche presenti nel suolo. Tra questi animali, gli oligocheti terrestri svolgono un ruolo importante nella struttura e nella funzione del suolo (15) (20). Gli oligocheti terrestri vivono nel suolo e in parte sulla sua superficie (in special modo nella lettiera) e costituiscono spesso la specie più abbondante in termini di biomassa (54). Per la loro azione di bioturbazione e a causa della loro funzione di prede, questi animali possono avere un’influenza determinante sulla biodisponibilità delle sostanze chimiche per altri organismi, come i predatori invertebrati [tra cui acari e coleotteri (64)] e invertebrati (quali volpi e gabbiani) (18) e (62). Alcune specie di oligocheti terrestri attualmente impiegate nelle prove ecotossicologiche sono descritte nell’appendice 5. | 3. | Una fonte di informazioni essenziali che sono servite per l’elaborazione del presente metodo di prova sul bioaccumulo è il manuale dell’ASTM per le prove di laboratorio dedicate alla tossicità del suolo e al bioaccumulo condotte su lombrichi Eisenia fetida ed enchitreidi Enchytraeus albidus (3). Tra gli altri riferimenti utilizzati figurano il capitolo C.13 Bioconcentrazione: saggio sui pesci, metodo a flusso continuo (49) e la linea guida dell’OCSE n. 315 Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochate (53). Fonti di ispirazione altrettanto importanti sono state le esperienze pratiche tratte dagli studi e da diverse pubblicazioni sul bioaccumulo nel suolo, tra cui (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79). | 4. | Il presente metodo di prova è per lo più applicabile a sostanze chimiche organiche neutre stabili, che hanno tendenza ad essere adsorbite sul suolo. Esso consente anche di valutare il bioaccumulo di composti organometallici stabili, associati al suolo. Si applica inoltre ai metalli e ad altri oligoelementi. | PREREQUISITI | 5. | Le prove volte a misurare il bioaccumulo di una sostanza chimica negli oligocheti terrestri sono state eseguite con metalli pesanti [cfr. in particolare (63)] e sostanze organiche persistenti il cui log Kow si situa tra 3,0 e 6,0 (40). Queste prove si applicano anche a: | — | sostanze chimiche con un log Kow superiore a 6,0 (sostanze superidrofobe), | — | sostanze appartenenti alla classe di sostanze organiche note per il loro potenziale di bioaccumulo negli organismi viventi, ad esempio le sostanze fortemente adsorbenti o tensioattive, | — | sostanze che, per le loro caratteristiche strutturali, presentano un potenziale di bioaccumulo, ad esempio analoghi di sostanze chimiche con potenziale di bioaccumulo noto, e | — | metalli. | 6. | Prima di iniziare lo studio occorre disporre di talune informazioni sulla sostanza chimica in esame, quali nome comune, nome chimico (di preferenza il nome IUPAC), formula strutturale, numero CAS, purezza, precauzioni, condizioni di conservazione adeguate e metodi di analisi. È inoltre opportuno conoscerne le seguenti proprietà: | a) | idrosolubilità; | b) | coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua Kow; | c) | coefficiente di ripartizione terreno-acqua, Koc; | d) | tensione di vapore; | e) | degradabilità (nel suolo o nell’acqua); | f) | metaboliti noti. | 7. | È possibile utilizzare sostanze radiomarcate e no, sebbene, per facilitare l’analisi, si raccomanda di utilizzare una sostanza radiomarcata. Questa decisione dipenderà dai limiti di rivelazione o dalla necessità di misurare il composto progenitore e i suoi metaboliti. Se si impiega una sostanza radiomarcata e si misurano i residui radioattivi totali, è importante che i residui radiomarcati sia nel suolo sia negli organismi sperimentali siano caratterizzati in percentuali del composto progenitore e di quello marcato non progenitore, ad esempio in campioni prelevati allo stato stazionario o alla fine della fase di assorbimento, per poter calcolare il fattore di bioaccumulo (BAF) per il composto progenitore e i metaboliti del suolo pertinenti (cfr. paragrafo 50). Può essere necessario modificare il metodo qui descritto, ad esempio per disporre di una biomassa sufficiente a misurare le sostanze in esame organiche non radiomarcate o i metalli. Se si misurano i residui radioattivi totali (per esempio per conteggio in scintillazione liquida dopo estrazione, per combustione o per solubilizzazione dei tessuti), il fattore di bioaccumulo risulta basato sul composto progenitore e sui metaboliti. È preferibile calcolare il BAF in base alla concentrazione del composto progenitore negli organismi e nei residui radioattivi totali. In seguito il fattore di accumulo biota-sedimento (BSAF), normalizzato per il tenore lipidico dei lombrichi e il tenore di carbonio organico (OC), è calcolato a partire dal BAF per garantire la comparabilità dei risultati di diverse prove di bioaccumulo. | 8. | Occorre conoscere la tossicità della sostanza in esame per le specie utilizzate nella prova, in particolare la concentrazione con effetto (ECX) o la concentrazione letale (CLX) per la durata della fase di assorbimento [ad esempio (19)]. La concentrazione scelta per la sostanza in esame deve essere preferibilmente circa l’1 % della sua CL50 acuta asintotica e almeno dieci volte superiore del suo limite di rivelabilità nel suolo con il metodo d’analisi utilizzato. Si devono privilegiare, se disponibili, i valori di tossicità ricavati da studi a lungo termine sugli endpoint subletali (51) (52). Se questi dati non sono disponibili, una prova di tossicità acuta apporterà informazioni utili [cfr. ad esempio, (23)]. | 9. | Per la quantificazione della sostanza in esame nelle soluzioni di prova, nel suolo e nel materiale biologico, oltre ai dettagli relativi alla preparazione e alla conservazione del campione e alle schede dati sulla sicurezza, è necessario disporre di un metodo analitico appropriato, di accuratezza, precisione e sensibilità note. Devono essere noti anche i limiti di rivelazione analitica nel suolo e nei tessuti del lombrico della sostanza in esame. Quando per la prova si utilizza una sostanza marcata con 14C è necessario conoscere la percentuale di radioattività associata alle impurità. La radioattività specifica della sostanza in esame deve essere abbastanza elevata da facilitare l’analisi, e le concentrazioni sperimentali utilizzate non devono provocare effetti tossici. | 10. | La prova può essere realizzata con un terreno artificiale o naturale. Prima dell’inizio della prova è opportuno conoscere le caratteristiche del terreno naturale utilizzato, ad esempio l’origine o i componenti, il pH, il tenore di carbonio organico, la distribuzione granulometrica (percentuale di sabbia, limo e argilla), e la capacità idrica (WHC) (3) (48). | PRINCIPIO DEL METODO | 11. | I parametri che caratterizzano il bioaccumulo di una sostanza chimica in esame consistono nel fattore di bioaccumulo (BAF), la costante di velocità di assorbimento (ks) e la costante di velocità di eliminazione (ke). Le definizioni di questi parametri figurano nell’appendice 1. | 12. | La prova consta di due fasi: la fase di assorbimento (esposizione) e la fase di eliminazione (post-esposizione). Durante la fase di assorbimento varie repliche di gruppi di lombrichi vengono esposte al terreno a cui è stata addizionata la sostanza in esame. Oltre agli animali sperimentali, gruppi di lombrichi di controllo sono mantenuti in condizioni identiche senza la sostanza in esame. Si misura il peso secco e il contenuto di lipidi degli organismi sperimentali, utilizzando eventualmente i lombrichi del gruppo di controllo. I valori di fondo (bianco) possono essere ottenuti analizzando campioni di lombrichi e del terreno di controllo. Per la fase di eliminazione i lombrichi sono trasferiti in un terreno privo della sostanza in esame. A meno che l’assorbimento della sostanza in esame durante la fase di esposizione sia stato insignificante, la fase di eliminazione è sempre necessaria, perché è in questa fase che si raccolgono le informazioni sulla velocità alla quale la sostanza in esame è escreta dagli organismi sperimentali [ad esempio (27)]. Se uno stato stazionario non è stato raggiunto nella fase di assorbimento, è preferibile determinare i parametri cinetici — fattore di bioaccumulo cinetico (BAFK), costanti di velocità di assorbimento ed eliminazione — basandosi sull’adattamento simultaneo dei risultati delle fasi di assorbimento ed eliminazione. La concentrazione della sostanza in esame nei/sui lombrichi è monitorata per l’intera durata delle due fasi della prova. | 13. | Durante la fase di assorbimento, le misurazioni sono effettuate in periodi di campionamento la cui durata massima è di 14 giorni per gli enchitreidi e 21 giorni per i lombrichi, fino a quando non venga raggiunto lo stato stazionario (11) (12) (67). Lo stato stazionario è raggiunto quando, nel tracciato della concentrazione negli organismi sperimentali in funzione del tempo, la curva diviene parallela all’asse del tempo e da tre analisi successive della concentrazione su campioni prelevati a intervalli di almeno due giorni si ottengono valori che non divergono tra loro più del ± 20 % sulla base di raffronti statistici (ad esempio, analisi della varianza, analisi di regressione). | 14. | La fase di eliminazione consiste nel trasferire gli organismi sperimentali in recipienti che contengono lo stesso substrato ma senza la sostanza in esame. In questa fase le misurazioni sono effettuate in periodi di campionamento la cui durata massima è di 14 giorni per gli enchitreidi e 21 giorni per i lombrichi, a meno che un’analisi effettuata prima di questi termini non mostri una diminuzione del 90 % dei residui della sostanza in esame negli organismi sperimentali. La concentrazione della sostanza in esame negli organismi alla fine della fase di eliminazione è riportata nella relazione come residui non eliminati. Il fattore di bioaccumulo allo stato stazionario (BAFSS) è calcolato di preferenza sia come il rapporto tra la concentrazione negli organismi (Ca) e nel suolo (Cs) ad uno stato stazionario apparente, sia come fattore di bioaccumulo cinetico (BAFK), ossia come il rapporto tra la costante di velocità d’assorbimento dal suolo (ks) e la costante di velocità di eliminazione (ke) (cfr. definizioni nell’appendice 1) presupponendo una cinetica di primo ordine (cfr. calcoli nell’appendice 2). Se la cinetica di primo ordine non è manifestamente applicabile è opportuno ricorrere ad altri modelli. | 15. | La costante di velocità di assorbimento, la costante di velocità di eliminazione (o le costanti, se si utilizzano altri modelli), il fattore di bioaccumulo cinetico (BAFK) e, se possibile, gli intervalli di confidenza di ciascuno di questi parametri sono calcolati a partire dalle equazioni dei modelli con l’ausilio di programmi informatici (cfr. appendice 2). La bontà di adattamento di un modello può essere desunta dal coefficiente di correlazione, dal coefficiente di determinazione (coefficienti vicini a 1 indicano un buon adattamento), oppure mediante il test chi quadrato. Anche l’entità dell’errore standard o dell’intervallo di confidenza intorno ai parametri stimati può essere indice della bontà di adattamento del modello. | 16. | Per ridurre la variabilità dei risultati della prova per le sostanze ad elevata lipofilia, i fattori di bioaccumulo devono essere espressi in relazione al contenuto lipidico e al contenuto di carbonio organico [contenuto in kg di carbonio organico (OC) del suolo per contenuto in kg-1 di lipidi degli organismi sperimentali]. Questo approccio si basa sul fatto che per alcune classi di sostanze chimiche esiste una netta relazione tra il potenziale di bioaccumulo e la lipofilia, relazione che è stata stabilita in modo chiaro per i pesci (47), nei quali il contenuto di grassi e il bioaccumulo di queste sostanze sono correlati. Correlazioni analoghe sono state riscontrate negli organismi bentonici, ad esempio (30) (44), e negli oligocheti terrestri, ad esempio (5) (6) (7) (14). Se si dispone di tessuto di lombrico sufficiente, il contenuto lipidico degli animali sperimentali può essere determinato sullo stesso materiale biologico utilizzato per determinare la concentrazione della sostanza in esame, altrimenti questa misurazione può essere fatta sugli animali di controllo. | VALIDITÀ DELLA PROVA | 17. | Affinché una prova sia valida occorre che siano soddisfatti i seguenti criteri, sia per gli animali sperimentali sia per i controlli: | — | alla fine della prova, la mortalità totale durante le fasi di assorbimento e di eliminazione non deve superare il 10 % (lombrichi) o il 20 % (enchitreidi) del numero complessivo degli organismi introdotti nei recipienti, | — | per Eisenia fetida e Eisenia andrei, la perdita di massa media misurata alla fine delle fasi di assorbimento e di eliminazione non deve superare il 20 % del peso iniziale fresco (f.w.) misurato all’inizio di ogni fase. | DESCRIZIONE DEL METODO | Specie sperimentali | 18. | Per le prove di bioaccumulo sono raccomandate varie specie di oligocheti terrestri. Le specie più utilizzate sono Eisenia fetida o Eisenia andrei (Lumbricidi), Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus o Enchytraeus luxuriosus (Enchitreidi), descritte nell’appendice 5. | Apparecchiatura | 19. | Per tutte le parti dell’apparecchiatura, evitare accuratamente l’uso di materiali soggetti a dissoluzione, assorbimento o lisciviatura e che possano avere un effetto dannoso sugli animali sperimentali. Si possono usare normali recipienti rettangolari o cilindrici di materiale chimicamente inerte e di capacità adeguata al tasso di carico, ossia al numero degli animali sperimentali. Per le apparecchiature destinate ad entrare in contatto con il mezzo di prova si può usare acciaio inossidabile, plastica o vetro. I recipienti devono essere debitamente coperti per evitare la fuga degli animali, assicurando nel contempo un sufficiente apporto d’aria. Per sostanze con elevati coefficienti di adsorbimento come i piretroidi sintetici, può essere necessario il vetro silanizzato. In tal caso le apparecchiature non possono venire riutilizzate. Occorre evitare la fuoriuscita delle sostanze radiomarcate e l’evaporazione delle sostanze volatili. Utilizzare delle trappole (ad esempio bottiglie di lavaggio per gas in vetro) contenenti un assorbente per catturare eventuali residui che possano evaporare dai recipienti di prova. | Terreno | 20. | Il terreno sperimentale deve essere di una qualità tale da permettere la sopravvivenza e di preferenza la riproduzione degli organismi sperimentali durante i periodi di acclimatazione e di prova senza che essi presentino un aspetto o un comportamento anomali. I lombrichi devono poter infossarsi nel terreno. | 21. | Per questa prova si raccomanda di utilizzare il terreno artificiale descritto nel metodo di prova C.8 del presente allegato (48). La preparazione del terreno artificiale da utilizzare nelle prove di bioaccumulo e le indicazioni per la sua conservazione figurano nell’appendice 4. Il terreno artificiale asciugato all’aria può essere conservato a temperatura ambiente fino all’utilizzo. | 22. | È tuttavia possibile impiegare come terreno di prova e/o di coltura anche terreno naturale proveniente da siti non inquinati. I terreni naturali sono caratterizzati almeno per i seguenti parametri: origine (sito di prelievo), pH, tenore di carbonio organico, distribuzione granulometrica (percentuale di sabbia, limo e argilla), capacità massima di ritenzione idrica (WHCmax) e tenore di umidità (3). La ricerca di microinquinanti nel terreno o nei suoi componenti, prima del suo utilizzo, fornisce informazioni utili. Se si impiega terreno naturale prelevato da suoli agricoli, è opportuno che non sia stato trattato con fitofarmaci né con letame di animali trattati per almeno un anno prima del prelievo, né con fertilizzanti organici per almeno sei mesi prima del prelievo (50). Le procedure per la manipolazione dei terreni naturali prima del loro utilizzo nelle prove ecotossicologiche di laboratorio con oligocheti sono descritte nel manuale dell’ASTM (3). Il tempo di conservazione dei terreni naturali in laboratorio deve essere il più breve possibile. | Applicazione della sostanza in esame | 23. | La sostanza chimica in esame è incorporata nel terreno, tenendo conto delle proprietà fisico-chimiche di detta sostanza. Una sostanza idrosolubile va disciolta completamente in acqua prima di mescolarla al terreno. Per l’aggiunta delle sostanze poco solubili in acqua, la procedura raccomandata consiste nel rivestire con la sostanza in esame uno o più componenti del terreno (artificiale). Ad esempio, si può impregnare la sabbia di quarzo, o una sua porzione, con una soluzione della sostanza in esame in un solvente organico adatto, che si lascia poi lentamente evaporare a secco. La frazione rivestita può così essere mescolata al terreno umido. Questa procedura ha il grande vantaggio di non introdurre alcun solvente nel terreno. Quando si utilizza un terreno naturale, la sostanza in esame può essere aggiunta arricchendo una porzione di terreno asciugato all’aria come descritto in precedenza per il terreno artificiale, oppure mescolandola al terreno umido, con successiva fase di evaporazione se si utilizza un agente solubilizzante. In linea di principio, il contatto del terreno umido con solventi è da evitarsi per quanto possibile. Va tenuto presente quanto segue: | — | se si utilizza un solvente diverso dall’acqua, è opportuno che sia miscibile con l’acqua e/o che possa essere eliminato (ad esempio, per evaporazione), lasciando sul terreno solo la sostanza in esame, | — | se si utilizza un solvente di controllo, non è necessario alcun controllo negativo. Il solvente di controllo deve contenere la concentrazione massima del solvente aggiunto al terreno e deve provenire dallo stesso lotto utilizzato per preparare la soluzione madre. La tossicità e la volatilità del solvente, nonché la solubilità della sostanza in esame nel solvente prescelto devono costituire i criteri principali per la scelta dell’agente solubilizzante. | 24. | Per le sostanze poco solubili in acqua e nei solventi organici, è possibile mescolare alla quantità di sostanza in esame, ad esempio utilizzando un mortaio e pestello, da 2,0 a 2,5 g di sabbia di quarzo finemente macinata per ottenere la concentrazione sperimentale voluta. Questa miscela di sabbia di quarzo e sostanza in esame è incorporata al terreno preumidificato, mescolando a fondo dopo l’aggiunta della quantità necessaria di acqua deionizzata per raggiungere il grado di umidità richiesto. La miscela finale è distribuita nei recipienti di prova. La procedura è ripetuta per ogni concentrazione sperimentale preparando anche un congruo controllo di 2,0-2,5 g di sabbia di quarzo finemente macinata per recipiente di prova. | 25. | La concentrazione della sostanza in esame nel terreno va determinata dopo la sua addizione al terreno. La distribuzione omogenea della sostanza nel terreno deve essere verificata prima di introdurre gli organismi sperimentali. Il metodo di addizione prescelto e le ragioni di tale scelta devono essere riportati nella relazione (24). | 26. | Idealmente l’equilibrio tra il terreno e l’acqua interstiziale deve essere stabilito prima dell’introduzione degli organismi; si raccomanda un periodo di quattro giorni a 20 °C. Per molte sostanze chimiche organiche poco idrosolubili, il tempo necessario per raggiungere un vero equilibrio tra le parti adsorbite e dissolte può essere dell’ordine di vari giorni o mesi. Secondo la finalità dello studio, ad esempio se si tratta di simulare delle condizioni ambientali, può essere necessario “invecchiare” più a lungo il terreno addizionato [per i metalli, tre settimane a 20 °C (22)]. | Allevamento degli organismi sperimentali | 27. | È preferibile tenere i lombrichi e gli enchitreidi in allevamento di laboratorio permanente. Indicazioni sui metodi di allevamento in laboratorio di Eisenia fetida e Eisenia andrei, e delle specie di enchitreidi figurano nell’appendice 5 [cfr. anche (48) (51) (52)]. | 28. | Gli animali usati nelle prove devono essere esenti da malattie, anomalie e parassiti osservabili. | ESECUZIONE DELLA PROVA | 29. | Gli organismi sperimentali sono esposti alla sostanza in esame durante la fase di assorbimento. La fase di assorbimento dura 14 giorni (enchitreidi) o 21 giorni (lombrichi) salvo dimostrazione che lo stato stazionario è stato raggiunto prima. | 30. | Per la fase di eliminazione, gli animali sono trasferiti in un terreno privo della sostanza in esame. Il primo campione deve essere prelevato da 4 a 24 ore dopo l’inizio della fase di eliminazione. L’appendice 3 contiene qualche esempio di programma di campionamento con fase di assorbimento e fase di eliminazione di 21 giorni ciascuna. | Organismi sperimentali | 31. | In molte specie di enchitreidi terrestri il peso individuale è molto basso (ad esempio, 5-10 mg di peso umido per individuo per Enchytraeus albidus e peso inferiore per Enchytraeus crypticus o Enchytraeus luxuriosus); per misurare il peso ed eseguire l’analisi chimica può essere necessario riunire gli animali dei recipienti delle repliche (si utilizzeranno tutti gli animali di una replica per ottenere un risultato unico per i tessuti analizzati). Si utilizzano almeno tre repliche, ciascuna contenente venti enchitreidi. Se il limite di rivelabilità della sostanza in esame è alto, può essere necessario aggiungere più animali. Per le specie sperimentali con peso individuale più elevato (Eisenia fetida e Eisenia andrei) è possibile allestire repliche costituite ciascuna di un solo individuo. | 32. | I lombrichi impiegati in una prova devono essere di peso simile (Eisenia fetida e Eisenia andrei hanno peso individuale compreso tra 250 e 600 mg). Gli enchitreidi (ad esempio, Enchytraeus albidus) devono misurare circa 1 cm di lunghezza. Tutti gli animali impiegati nella stessa prova devono avere la stessa origine ed essere adulti con clitello (cfr. appendice 5). Poiché il peso e l’età dell’animale possono influire sui valori del BAF (a causa, per esempio, del variare del contenuto lipidico e/o della presenza di uova), questi parametri vanno accuratamente riportati nella relazione e tenuti in considerazione al momento di interpretare i risultati. È inoltre possibile che nel periodo di esposizione compaiano dei bozzoli, anch’essi con un effetto sui valori del BAF. Si raccomanda di pesare un sotto-campione di organismi sperimentali prima della prova per stimare il peso medio secco e umido. | 33. | Per contenere al minimo la riduzione della concentrazione della sostanza in esame durante la fase di assorbimento, occorre utilizzare un rapporto elevato terreno/animali: si raccomanda per Eisenia fetida e Eisenia andrei una quantità minima di 50 g in peso secco di terreno per lombrico, mentre per gli enchitreidi un minimo di 10-20 g in peso secco di terreno per recipiente. Lo strato di terreno nei recipienti ha uno spessore di 2-3 cm (enchitreidi) o 4-5 cm (lombrichi). | 34. | Gli animali utilizzati nella prova sono prelevati dal terreno di allevamento (gli enchitreidi con l’ausilio di pinzette da orafo). Gli animali adulti sono trasferiti in terreno sperimentale non trattato affinché si acclimatino, e qui alimentati (cfr. paragrafo 36). Se le condizioni sperimentali sono diverse dalle condizioni di allevamento, una fase di acclimatazione compresa tra 24 e 72 ore dovrebbe essere sufficiente perché gli animali si adattino alle condizioni sperimentali. Una volta acclimatati, i lombrichi sono trasferiti in piastre di vetro (ad esempio, capsula Petri) contenenti acqua pulita per esservi risciacquati, sono poi pesati e infine deposti sul terreno sperimentale. Prima della pesatura, occorre togliere dagli animali l’acqua in eccesso, passandoli delicatamente sul bordo della piastra o tamponandoli con cura con un fazzoletto di carta leggermente inumidito. | 35. | Occorre osservare e riportare nella relazione il comportamento fossorio. Nelle prove con i lombrichi, gli animali (di controllo e trattati) in genere s’infossano nel terreno nel giro di qualche ora; questo dato va verificato entro 24 ore dall’introduzione degli animali nei recipienti di prova. Se così non fosse (ad esempio più del 10 % di lombrichi non si è infossato per oltre la metà della fase di assorbimento) la causa va ricercata nelle condizioni sperimentali, che potrebbero essere inadeguate, oppure nello stato di salute degli organismi sperimentali, non buono. In tal caso la prova deve essere arrestata e ripetuta. Gli enchitreidi vivono soprattutto nei pori interstiziali del suolo e accade spesso che il loro tegumento sia solo in parte in contatto con il substrato circostante; si presume che l’esposizione degli enchitreidi fossori e non fossori sia equivalente e l’osservazione di enchitreidi non infossati non richiede necessariamente la ripetizione della prova. | Alimentazione | 36. | L’alimentazione degli animali va prevista quando si utilizza un terreno povero in carbonio organico totale. Se il terreno utilizzato è artificiale si raccomanda il seguente regime settimanale (una somministrazione la settimana): per i lombrichi, 7 mg di sterco secco per g di terreno in peso secco; per gli enchitreidi 2-2,5 mg di fiocchi d’avena macinati per g di terreno in peso secco (11). La prima razione è mescolata al terreno subito prima di introdurvi gli organismi sperimentali. Utilizzare di preferenza lo stesso tipo di cibo impiegato durante l’allevamento (cfr. appendice 5). | Illuminazione e temperatura | 37. | Le prove sono condotte in base a un fotoperiodo controllato di 16 ore/8 ore (luce/buio), con un’intensità luminosa di preferenza compresa tra 400 e 800 lx nella zona dei recipienti di prova (3), a una temperatura di 20 ± 2 °C. | Concentrazioni della sostanza in esame | 38. | Si utilizza un’unica concentrazione. I casi in cui è necessario utilizzarne un’altra, o altre, devono essere motivati. Se la tossicità (CEX) della sostanza in esame è prossima al limite di rivelabilità analitica, si raccomanda di utilizzare sostanze di prova radiomarcate con radioattività specifica elevata. Per i metalli, la concentrazione deve essere superiore alla concentrazione di fondo nei tessuti e nel terreno. | Repliche | 39. | Per le misurazioni cinetiche (fasi di assorbimento e di eliminazione), il numero minimo di repliche (recipienti) trattate è tre per punto di campionamento. Il numero complessivo di repliche preparate dovrà essere sufficiente a coprire i campionamenti previsti per le fasi di assorbimento e di eliminazione. | 40. | Per le osservazioni e le misurazioni biologiche (rapporto peso secco/peso umido, tenore lipidico) e per l’analisi delle concentrazioni di fondo negli animali e nel terreno, occorre allestire almeno 12 repliche di controllo negativo (quattro campioni prelevati all’inizio, quattro alla fine della fase di assorbimento e quattro alla fine della fase di eliminazione), se come solvente non è stata utilizzata che acqua. Se per l’applicazione della sostanza in esame si utilizza un agente di solubilizzazione, occorre allestire, oltre alle repliche trattate, delle repliche di controllo con solvente (quattro recipienti campionati all’inizio, quattro alla fine della fase di assorbimento e quattro alla fine della fase di eliminazione) contenenti tutti i componenti tranne la sostanza in esame. In tal caso è possibile allestire anche altre quattro repliche di controllo negativo (senza solvente) per un campionamento facoltativo alla fine della fase di assorbimento. Queste repliche possono essere confrontate biologicamente con quelle di controllo con solvente per ottenere informazioni sull’eventuale influenza del solvente sugli organismi sottoposti alla prova. Si raccomanda di prevedere un numero sufficiente di repliche di riserva (otto recipienti, ad esempio), per gli organismi trattati e per i controlli. | Frequenza delle misure della qualità del terreno | 41. | Il pH e il tasso di umidità del terreno sono misurati all’inizio e alla fine delle fasi di assorbimento e di eliminazione. La temperatura del locale di prova è misurata in continuo. L’umidità del terreno va controllata una volta la settimana pesando i recipienti di prova e confrontandone il peso con il peso rilevato all’inizio della prova. Le perdite di umidità devono essere compensate aggiungendo acqua deionizzata. | Campionamento e analisi degli organismi sperimentali e del terreno | 42. | Nell’appendice 3 figura un esempio di programma di campionamento per le fasi di assorbimento e di eliminazione delle prove di bioaccumulo su lombrichi e enchitreidi. | 43. | Un campione di terreno è prelevato dai recipienti di prova per determinare la concentrazione della sostanza in esame prima dell’introduzione degli animali e durante le fasi di assorbimento e di eliminazione. Durante la prova le concentrazioni della sostanza in esame sono determinate negli animali e nel terreno. In linea di principio, si misurano le concentrazioni totali nel terreno, ma si possono misurare anche le concentrazioni nell’acqua interstiziale, nel qual caso, prima dell’inizio della prova, occorre spiegarne la ragione e descrivere i metodi appropriati previsti, riportando poi tali informazioni nella relazione. | 44. | Gli animali e il terreno sono campionati almeno a sei riprese durante le fasi di assorbimento e di eliminazione. Se la stabilità di una sostanza di prova è dimostrata, il numero di analisi del terreno può essere ridotto. Si raccomanda di analizzare almeno tre repliche all’inizio e alla fine della fase di assorbimento. Se la differenza tra la concentrazione misurata nel terreno alla fine della fase di assorbimento e la concentrazione iniziale è superiore al 30 %, occorre analizzare i campioni di terreno prelevati in altre date. | 45. | Ad ogni campionamento, togliere dal terreno gli animali della replica (ad esempio, dopo aver sparso il terreno della replica su un contenitore poco profondo e prelevato gli animali con pinzette da orafo), sciacquarli rapidamente con acqua in un piatto di vetro o di acciaio e asciugarli dell’acqua in eccesso (cfr. paragrafo 34). Trasferirli delicatamente in un recipiente tarato e pesarli immediatamente, contenuto intestinale compreso. | 46. | Lasciare i lombrichi (Eisenia sp.) evacuare l’intestino per una notte, ad esempio su carta da filtro inumidita su una capsula Petri incoperchiata (cfr. paragrafo 34), poi pesarli per valutare l’eventuale perdita di biomassa durante la prova (si vedano i criteri di validità al paragrafo 17). La pesatura e l’analisi dei tessuti degli enchitreidi sono effettuate senza evacuazione intestinale, operazione tecnicamente difficile a causa delle piccole dimensioni di questi animali. Una volta determinato il peso finale, sopprimere immediatamente gli animali con il metodo più appropriato (ad esempio, con azoto liquido o congelandoli a una temperatura inferiore a - 18 °C). | 47. | Durante la fase di eliminazione, questi animali sostituiscono il contenuto intestinale contaminato con terreno pulito. Ciò significa che le misure relative a un campione di animali a intestino pieno (nella fattispecie gli enchitreidi) eseguite subito prima della fase di eliminazione includono il terreno contaminato ivi presente. Per quanto concerne gli oligocheti acquatici, si presume che dopo le prime 4-24 ore della fase di eliminazione, la maggior parte del contenuto intestinale contaminato sia stato sostituito da sedimento pulito [cfr. ad esempio (46)]. Osservazioni analoghe sono state riferite per i lombrichi in studi sull’accumulo di cadmio e zinco radiomarcati (78). Per quanto riguarda gli enchitreidi con contenuto intestinale intatto, la concentrazione di questo primo campione della fase di eliminazione può essere considerata come la concentrazione dei tessuti dopo evacuazione intestinale. Per tenere conto del fatto che la concentrazione della sostanza in esame viene diluita da terreno non contaminato durante la fase di eliminazione, è possibile stimare il peso del contenuto intestinale in base ai rapporti peso umido degli organismi/peso delle ceneri degli organismi oppure peso secco degli organismi/peso delle ceneri degli organismi. | 48. | È preferibile analizzare i campioni di terreno e di animali subito dopo averli prelevati (ossia entro 1-2 giorni), per evitare il degrado o altre perdite, e si raccomanda di calcolare la velocità approssimativa di assorbimento ed eliminazione durante lo svolgimento della prova. Se l’analisi è posticipata, conservare i campioni in modo idoneo, ad esempio surgelandoli ≤ - 18 °C). | 49. | Controllare che la precisione e la riproducibilità dell’analisi chimica e che il recupero della sostanza in esame dai campioni di terreno e di animali siano soddisfacenti per il metodo in oggetto; riportare nella relazione l’efficacia di estrazione, il limite di rivelabilità (LOD) e il limite di quantificazione. Verificare inoltre che la sostanza in esame non sia rilevabile nei recipienti di controllo in concentrazioni superiori a quella di fondo. Se la concentrazione della sostanza in esame nell’organismo sperimentale, Ca, è > 0 per i controlli, includere questo dato nel calcolo dei parametri cinetici (cfr. appendice 2). Per tutta la durata della prova tutti i campioni devono essere manipolati in modo da ridurre al minimo la contaminazione e le perdite (derivanti, ad esempio, dall’adsorbimento della sostanza in esame sul dispositivo di campionamento). | 50. | Qualora si operi con sostanze radiomarcate, è possibile analizzare il progenitore e i metaboliti. Informazioni importanti si ricavano dalla quantificazione del composto progenitore e dei metaboliti allo stato stazionario o alla fine della fase di assorbimento. I campioni vanno in tal caso “puliti” in modo da poter quantificare separatamente il composto progenitore. Si raccomanda di identificare gli eventuali metaboliti che rappresentano più del 10 % della radioattività totale del/i campione/i analizzato/i. | 51. | Annotare e riferire nella relazione il recupero complessivo e il recupero della sostanza in esame negli animali, nel terreno e, se utilizzate, nelle trappole assorbenti che trattengono la sostanza in esame evaporata. | 52. | È ammesso per gli enchitreidi, perché di dimensioni più piccole dei lombrichi, il raggruppamento di individui prelevati dal recipiente di prova. Se il raggruppamento implica la riduzione del numero di repliche, ciò limita le procedure statistiche che si possono applicare ai dati ricavati dal campionamento. Se sono richieste una potenza ed una procedura statistiche specifiche, includere nella prova un numero adeguato di repliche per tener conto del raggruppamento, della procedura e della potenza desiderati. | 53. | Si raccomanda che il BAF sia espresso sia come funzione del peso secco totale e, se necessario (ad esempio per sostanze chimiche fortemente idrofobe), come funzione del tenore lipidico. Per determinare il tenore lipidico avvalersi di metodi idonei [alcuni dei metodi esistenti, ad esempio (31) e (58), vanno adeguati a tal fine]. Questi metodi si basano su una tecnica di estrazione con cloroformio/metanolo, ma se si vuole evitare l’uso di solventi clorati, utilizzare una versione modificata del metodo di Bligh e Dyer (9) descritta in (17). Poiché i vari metodi possono non fornire valori identici, è importante precisare il metodo usato. Quando possibile, ossia se si dispone di sufficiente tessuto animale, il tenore lipidico è idealmente analizzato sullo stesso campione o estratto che è servito per l’analisi della sostanza in esame, in quanto i lipidi devono spesso venire rimossi dall’estratto prima di poterlo analizzare per via cromatografica (49). In alternativa è possibile misurare il tenore lipidico sugli animali di controllo e il valore ottenuto può essere utilizzato per normalizzare i valori del BAF. Con quest’ultimo approccio la contaminazione dell’apparecchiatura con la sostanza in esame è più contenuta. | DATI E RELAZIONE | Trattamento dei risultati | 54. | La curva di assorbimento della sostanza in esame si ottiene rappresentando graficamente la sua concentrazione nel/sugli animali durante la fase di assorbimento in funzione del tempo su scale aritmetiche. Quando la curva ha raggiunto un plateau, o stato stazionario (cfr. definizioni nell’appendice 1), calcolare il fattore di bioaccumulo allo stato stazionario (BAFSS) secondo la seguente formula: | Ca = concentrazione della sostanza in esame nell’organismo sperimentale | Cs = concentrazione della sostanza in esame nel terreno | 55. | Se la curva non raggiunge lo stato stazionario, invece del BAFSS determinare il BAFK, in base alle costanti di velocità, come indicato di seguito: | — | determinare il fattore di accumulo (BAFK) come rapporto ks/ke, | — | calcolare di preferenza simultaneamente le velocità di assorbimento e di eliminazione (cfr. equazione [11] nell’appendice 2), | — | la costante di velocità di eliminazione (ke) è in genere ricavata dalla curva di eliminazione (ossia dal tracciato della concentrazione della sostanza in esame negli animali durante la fase di eliminazione). Calcolare la costante di velocità di assorbimento ks in funzione di ke e di un valore di Ca che è derivato dalla curva di assorbimento — per la descrizione di questi metodi cfr. appendice 2. Il metodo preferito per ottenere il BAFK e le costanti di velocità ks e ke consiste nell’uso di metodi di stima parametrica non lineare su computer. Se la curva di eliminazione non obbedisce manifestamente a una cinetica di primo ordine si dovrà ricorrere a modelli più complessi. | Relazione sulla prova | 56. | La relazione sulla prova deve comprendere le informazioni seguenti. | | Sostanza chimica in esame: | — | ogni informazione disponibile sulla tossicità acuta o a lungo termine (ad esempio CEX, CLX, NOEC) della sostanza in esame per gli oligocheti terrestri, | — | purezza, natura fisica e proprietà fisico-chimiche, ad esempio log Kow, idrosolubilità, | — | dati di identificazione chimica; provenienza della sostanza in esame, identità e concentrazione di eventuali solventi utilizzati, | — | in caso di utilizzo di una sostanza radiomarcata, posizione esatta degli atomi marcati, radioattività specifica e purezza radiochimica. | | Specie sperimentali: | — | nome scientifico, ceppo, provenienza, eventuali pretrattamenti, acclimatazione, età, dimensioni ecc. | | Condizioni sperimentali: | — | procedura di prova utilizzata, | — | tipo e caratteristiche dell’illuminazione usata e fotoperiodo, | — | disegno sperimentale (ad esempio numero e dimensioni dei recipienti, massa del terreno e spessore dello strato di terreno, numero di repliche, numero di animali per replica, numero di concentrazioni di prova, durata delle fasi di assorbimento e di eliminazione, frequenza di campionamento), | — | motivazione del materiale scelto per i recipienti di prova, | — | metodo di preparazione e applicazione della sostanza di prova, nonché ragioni della scelta di tale metodo, | — | concentrazioni nominali nella prova, medie dei valori misurati e loro deviazioni standard nei recipienti di prova, e metodo mediante cui sono stati ottenuti questi valori, | — | provenienza dei componenti del terreno artificiale oppure, se si utilizza terreno naturale, provenienza del terreno, descrizione degli eventuali pretrattamenti, risultati dei controlli (sopravvivenza, aumento della biomassa, riproduzione), caratteristiche del terreno (pH, tenore di carbonio organico totale, distribuzione granulometrica, percentuale di sabbia, limo e argilla), WHCmax, tenore di umidità all’inizio e alla fine della prova e eventuali altre misurazioni effettuate, | — | informazioni particolareggiate sul trattamento dei campioni di terreno e animali, ivi compresi i dettagli su preparazione, conservazione, procedure di addizione, estrazione e procedure analitiche (e loro precisione) per la sostanza in esame negli animali e nel terreno, il tenore lipidico (se misurato) e i metodi di recupero della sostanza in esame. | | Risultati: | — | mortalità dei controlli e degli organismi trattati in ogni recipiente e eventuali comportamenti anomali osservati (ad esempio, comportamento non fossorio, assenza di riproduzione in una prova di bioaccumulo con enchitreidi), | — | rapporto peso secco/peso umido del terreno e degli organismi sperimentali (utile per la normalizzazione), | — | peso umido degli animali ad ogni campionamento; per i lombrichi, peso umido all’inizio della prova e ad ogni campionamento prima e dopo l’evacuazione intestinale, | — | tenore lipidico degli organismi sperimentali (se determinato), | — | curve che mostrano le costanti cinetiche di assorbimento e di eliminazione della sostanza in esame negli animali e il tempo occorso per raggiungere lo stato stazionario, | — | Ca e Cs (con deviazione standard e intervallo, se necessario) per ogni campionamento (Ca espressa in g kg-1 di peso umido e secco del corpo intero, Cs espressa in g kg-1 di peso umido e secco del terreno). Se è necessario ricavare un fattore di accumulo biota-sedimento (BSAF), (ad esempio per confrontare i risultati di due o più prove realizzate su animali con tenore lipidico diverso), Ca può essere espressa anche come g kg-1 di tenore lipidico dell’organismo e Cs come g kg-1 di carbonio organico (OC) del terreno, | — | BAF (espresso in kg terreno kg-1 di animale), costante di velocità di assorbimento dal terreno ks (espressa in g di terreno kg-1 di animale giorno-1), e costante di velocità di eliminazione ke (espressa in giorno-1); eventualmente anche BSAF (espresso in kg di OC del terreno kg-1 di tenore lipidico dell’animale), | — | se misurate: percentuali del composto progenitore, dei metaboliti e dei residui combinati (ossia la percentuale della sostanza in esame che non può essere estratta con i normali metodi di estrazione) rilevate nel terreno e negli animali sperimentali, | — | metodi usati per le analisi statistiche dei dati. | | Valutazione dei risultati: | — | conformità dei risultati con i criteri di validità di cui al paragrafo 17, | — | risultati imprevisti o insoliti, ad esempio, eliminazione incompleta della sostanza in esame dagli animali sperimentali. | BIBLIOGRAFIA | (1) | Amorim M (2000). 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Il bioaccumulo è il risultato sia dei processi di bioconcentrazione che di quelli di biomagnificazione (cfr. di seguito). | | Bioconcentrazione: aumento di concentrazione della sostanza in esame in o su un organismo, derivante dall’assorbimento della sostanza esclusivamente dall’ambiente circostante (ossia attraverso la superficie corporea e in terreno ingerito), rispetto alla concentrazione della sostanza in esame nell’ambiente circostante. | | Biomagnificazione: aumento di concentrazione della sostanza in esame in o su un organismo, derivante principalmente dall’assorbimento di alimenti o prede contaminate, rispetto alla concentrazione della sostanza in esame nell’alimento o nella preda. La biomagnificazione può comportare un trasferimento o un accumulo della sostanza in esame nelle reti trofiche. | | Eliminazione della sostanza in esame: perdita della sostanza dai tessuti dell’organismo sperimentale mediante processi attivi o passivi che si verificano indipendentemente dalla presenza o dall’assenza della sostanza nell’ambiente circostante. | | Fattore di bioaccumulo (BAF) in qualsiasi momento della fase di assorbimento della prova: concentrazione della sostanza in esame in o sull’organismo sperimentale (Ca in g·kg-1 di peso secco dell’animale) diviso per la concentrazione della sostanza chimica nell’ambiente circostante (Cs espressa in g·kg-1 di peso secco del terreno); il BAF è espresso in kg di terreno·kg-1 di animale. | | Fattore di bioaccumulo allo stato stazionario (BAFSS): BAF allo stato stazionario, che non varia in modo significativo per un lungo periodo, periodo durante il quale la concentrazione della sostanza in esame nell’ambiente circostante (Cs in g·kg-1 di peso secco del terreno) rimane costante. | | Fattori di bioaccumulo cinetico (BAFK): fattori di bioaccumulo calcolati direttamente dal rapporto tra la costante di velocità di assorbimento dal terreno e la costante di velocità di eliminazione (ks and ke, cfr. di seguito). | | Fattore di accumulo biota-sedimento (BSAF): concentrazione normalizzata per il tenore lipidico della sostanza in esame nel o sull’organismo sperimentale divisa per la concentrazione normalizzata per il tenore di carbonio organico della sostanza in esame nel terreno allo stato stazionario. Ca è pertanto espressa in g·kg-1 di tenore in lipidi dell’organismo, e Cs in g·kg-1 di tenore in carbonio organico del terreno; il BSAF è espresso in kg di carbonio organico kg-1 di lipidi. | | Plateau o stato stazionario: equilibrio tra il processo di assorbimento e di eliminazione che si verificano simultaneamente nella fase di esposizione. Lo stato stazionario, nel tracciato del BAF in funzione del tempo, viene raggiunto quando la curva diventa parallela all’asse del tempo e tre analisi successive del BAF su campioni prelevati ad intervalli di almeno due giorni differiscono di non oltre il ± 20 % una dall’altra, e non vi sono differenze statisticamente significative tra i tre periodi di campionamento. Per il controllo di sostanze che vengono assorbite lentamente, intervalli di sette giorni saranno più idonei (49). | | Coefficiente di ripartizione carbone organico-acqua (Koc): rapporto tra la concentrazione di una sostanza chimica nella o sulla frazione di carbonio organico di un terreno e la concentrazione della sostanza all’equilibrio. | | Coefficiente di ripartizione ottanolo-acqua (Kow): rapporto tra la solubilità di una sostanza chimica in n-ottanolo e quella in acqua all’equilibrio, espresso anche come Pow. Il logaritmo di Kow (log Kow) viene usato come indicazione del potenziale di bioaccumulo di una sostanza chimica da parte di organismi acquatici. | | Fase di assorbimento o esposizione: tempo durante il quale gli organismi sperimentali sono esposti alla sostanza chimica in esame. | | Costante di velocità di assorbimento dal terreno (ks): valore numerico che definisce la velocità di aumento della concentrazione della sostanza in esame nel o sull’organismo sperimentale derivante dall’assorbimento dalla fase del terreno. ks è espressa in g di terreno kg-1 di animale giorno-1. | | Fase di eliminazione: tempo, dopo il trasferimento dell’organismo sperimentale da un ambiente contenente la sostanza in esame ad un ambiente esente da tale sostanza, durante il quale viene studiata l’eliminazione (o perdita netta) della sostanza dall’organismo sperimentale. | | Costante di velocità di eliminazione (ke): valore numerico che definisce la velocità di riduzione della concentrazione della sostanza in esame nel o sull’organismo sperimentale dopo il trasferimento di quest’ultimo da un ambiente contenente la sostanza in esame ad un ambiente esente da tale sostanza; ke è espressa in giorno-1. | | Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela saggiata seguendo il presente metodo di prova. | Appendice 2 | Calcolo dei parametri di assorbimento ed eliminazione | Il principale endpoint di una prova di bioaccumulo è il fattore di bioaccumulo BAF. Per calcolare il BAF si divide la concentrazione nell’organismo sperimentale, Ca, per la concentrazione del terreno Cs, allo stato stazionario. Se lo stato stazionario non è raggiunto durante la fase di assorbimento, il BAFK è calcolato a partire dalle costanti di velocità invece che dal BAFSS. Va tuttavia annotato se il BAF si basa o meno sulle concentrazioni allo stato stazionario. | La procedura abituale per ottenere il fattore di bioaccumulo cinetico (BAFK), la costante di velocità di assorbimento dal terreno (ks) e la costante di velocità di eliminazione (ke) consiste nel ricorrere a metodi informatici non lineari di stima dei parametri, ad esempio sulla base dei modelli descritti in (68). Data una serie di valori sequenziali della concentrazione in funzione del tempo e le equazioni dei modelli | 0 < t < tc | equazione [1] | oppure | t > tc | equazione [2] | dove: | Ca | = | concentrazione della sostanza negli animali [g·kg-1 di peso umido o secco] | ks | = | costante di velocità di assorbimento nei tessuti [g di terreno kg-1 di animale giorno-1] | Ca | = | concentrazione della sostanza nel terreno [g·kg-1 di peso umido o secco] | ke | = | costante di velocità di eliminazione [giorno-1] | tc | = | tempo al termine della fase di assorbimento, | questi programmi informatici calcolano i valori di BAFK, ks e ke. | Quando la concentrazione di fondo negli animali non esposti, ad esempio il giorno 0, è significativamente diversa da zero (come può essere il caso dei metalli), tale concentrazione (Ca,0) deve essere inclusa in queste equazioni, come segue: | 0 < t < tc | equazione [3] | e | t > tc | equazione [4] | Se si osserva un forte calo della concentrazione della sostanza di prova nel terreno durante la fase di assorbimento, è possibile utilizzare i seguenti modelli, ad esempio (67) e (79): | equazione [5] | dove: | Cs | = | concentrazione della sostanza nel terreno [g·kg-1 di peso umido o secco] | k0 | = | costante di velocità di degradazione nel terreno [d-1] | C0 | = | concentrazione iniziale della sostanza nel terreno [g·kg-1 di peso umido o secco] | 0 < t < tc | equazione [6] | t > tc | equazione [7] | dove: | Ca | = | concentrazione della sostanza negli animali [g·kg-1 di peso umido o secco] | ks | = | costante di velocità di assorbimento nei tessuti [g di terreno·kg-1 di animale giorno-1] | k0 | = | costante di velocità di degradazione nel terreno [giorno-1] | ke | = | costante di velocità di eliminazione [giorno-1] | tc | = | tempo al termine della fase di assorbimento. | Quando si è raggiunto uno stato stazionario durante la fase di assorbimento (ossia t = ∞), è possibile ridurre l’equazione | 0 < t < tc | equazione [1] | all’equazione: | oppure | equazione [8] | In seguito ks/ke × Cs dà un’approssimazione della concentrazione della sostanza in esame nel tessuto dell’animale allo stato stazionario (Ca,ss). | Il fattore di accumulo biota-sedimento (BSAF) può essere calcolato come segue: | equazione [9] | dove foc è la frazione di carbonio organico nel terreno e flip è la frazione di lipidi negli animali, entrambe determinate di preferenza su campioni prelevati dalla prova, e basate rispettivamente sul peso secco o sul peso umido. | Per modellizzare le costanti cinetiche di eliminazione si possono utilizzare i dati ricavati dalla fase di eliminazione e applicare la seguente equazione del modello e un metodo informatico non lineare di stima dei parametri. Se il tracciato dei dati in funzione del tempo indica una diminuzione esponenziale costante della concentrazione della sostanza in esame negli animali, il decorso dell’eliminazione può essere descritto da un modello a compartimento singolo (equazione [9]). | equazione [10] | I processi di eliminazione paiono talvolta avvenire in due fasi: dapprima una rapida diminuzione di Ca, che nelle fasi successive dell’eliminazione evolve in una perdita più lenta delle sostanze in esame, ad esempio (27) e (68). Le due fasi possono essere interpretate ipotizzando l’esistenza di due compartimenti nell’organismo, a partire dai quali la sostanza in esame è eliminata a velocità diverse. In questi casi è opportuno studiare la letteratura pertinente, ad esempio (38) (39) (40) e (78). | Le equazioni del modello illustrate sopra possono servire a calcolare simultaneamente i parametri cinetici (ks and ke), applicando un modello di cinetica di primo ordine a tutti i dati delle fasi di assorbimento e di eliminazione simultaneamente. Per una descrizione di un metodo che permetta un tale calcolo combinato delle costanti di velocità di assorbimento ed eliminazione, consultare ad esempio (41), (73) e (70). | equazione [11] | NB: | quando i parametri di assorbimento e di eliminazione sono stimati simultaneamente sulla base dei dati combinati di assorbimento ed eliminazione, “m” di cui all’equazione [11] è un descrittore che consente al programma informatico di attribuire i sottotermini dell’equazione alle serie di dati della fase corrispondente e eseguire una valutazione corretta (m = 1 per la fase di assorbimento; m = 2 per la fase di eliminazione). | Ciononostante, queste equazioni di modelli vanno utilizzate con cautela, in particolare se nella prova si verificano cambiamenti della biodisponibilità o della (bio)degradazione della sostanza in esame [cfr. ad esempio (79)]. | Appendice 3 | ESEMPI DI PROGRAMMI PER LE PROVE DI BIOACCUMULO NEL TERRENO | Prova sui lombrichi | a) | Fase di assorbimento con 8 date di campionamento per il calcolo dei parametri cinetici | Giorno | Attività | - 6 | Condizionamento del terreno preparato per 48 ore. | - 4 | Addizione della soluzione della sostanza in esame alla frazione di terreno; evaporazione degli eventuali solventi; miscelazione dei componenti del terreno; distribuzione del terreno nei recipienti di prova; equilibrazione alle condizioni sperimentali per 4 giorni (3 settimane per i terreni addizionati di metalli). | da - 3 a - 1 | Rimozione degli organismi sperimentali dal terreno di allevamento per acclimatazione; preparazione e umidificazione dei componenti del terreno. | 0 | Misurazione della temperatura e del pH del terreno; prelievo di campioni di terreno dai recipienti trattati e dai controlli con solvente per la determinazione della concentrazione della sostanza in esame; introduzione di una razione di cibo; pesatura e distribuzione casuale degli animali nei recipienti di prova; accantonamento di un numero sufficiente di sottocampioni di animali per determinare i valori analitici di fondo, del peso umido e secco e del tenore lipidico; pesatura di tutti i recipienti di prova per il controllo dell’umidità del terreno; controllo del flusso d’aria, se si utilizza un sistema sperimentale chiuso. | 1 | Controllo del flusso d’aria, annotazione del comportamento degli animali e della temperatura; prelievo di campioni di terreno e di animali per determinare la concentrazione della sostanza in esame. | 2 | Idem come il 1o giorno. | 3 | Controllo del flusso d’aria, del comportamento degli animali e della temperatura. | 4 | Idem come il 1o giorno. | 5 - 6 | Idem come il 3o giorno. | 7 | Idem come il 1o giorno; introduzione di una razione di cibo; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e compensando l’acqua evaporata. | 8 - 9 | Idem come il 3o giorno. | 10 | Idem come il 1o giorno. | 11 - 13 | Idem come il 3o giorno. | 14 | Idem come il 1o giorno; introduzione di una razione di cibo; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e compensando l’acqua evaporata. | 15 - 16 | Idem come il 3o giorno. | 17 | Idem come il 1o giorno. | 18 - 20 | Idem come il 3o giorno. | 21 | Idem come il 1o giorno; misurazione della temperatura e del pH del terreno; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti; fine della fase di assorbimento; trasferimento degli animali dalle restanti repliche esposte ai recipienti contenenti terreno pulito per la fase di eliminazione (senza evacuazione dell’intestino); prelievo di campioni di terreno e animali dai controlli con solvente. | | Le attività che precedono l’esposizione (fase di equilibrazione) sono programmate tenendo conto delle proprietà della sostanza chimica in esame. | | Le attività descritte per il 3o giorno sono effettuate quotidianamente (almeno nei giorni lavorativi). | b) | Fase di eliminazione | Giorno | Attività | - 6 | Preparazione e umidificazione dei componenti del terreno; condizionamento del terreno preparato per 48 ore. | - 4 | Miscelazione dei componenti del terreno; distribuzione del terreno nei recipienti di prova; incubazione alle condizioni sperimentali per 4 giorni. | 0 (fine della fase di assorbimento) | Misurazione della temperatura e del pH del terreno; pesatura e distribuzione casuale degli animali nei recipienti di prova; introduzione di una razione di cibo; trasferimento degli animali dalle restanti repliche esposte ai recipienti contenenti terreno pulito; prelievo di campioni di terreno e di animali dopo 4-6 ore per determinare la concentrazione della sostanza in esame. | 1 | Controllo del flusso d’aria, annotazione del comportamento degli animali e della temperatura. prelievo di campioni di terreno e di animali per determinare la concentrazione della sostanza in esame. | 2 | Idem come il 1o giorno. | 3 | Controllo del flusso d’aria, del comportamento degli animali e della temperatura. | 4 | Idem come il 1o giorno. | 5 - 6 | Idem come il 3o giorno. | 7 | Idem come il 1o giorno. introduzione di una razione di cibo; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e compensando l’acqua evaporata. | 8 - 9 | Idem come il 3o giorno. | 10 | Idem come il 1o giorno. | 11 - 13 | Idem come il 3o giorno. | 14 | Idem come il 1o giorno. introduzione di una razione di cibo; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e compensando l’acqua evaporata. | 15 - 16 | Idem come il 3o giorno. | 17 | Idem come il 1o giorno. | 18 - 20 | Idem come il 3o giorno. | 21 | Idem come il 1o giorno. misurazione della temperatura e del pH del terreno; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti; prelievo di campioni di terreno e animali dai controlli con solvente. | | La preparazione del terreno per la fase di eliminazione è eseguita come per la fase di assorbimento. | | Le attività descritte per il 3o giorno sono effettuate quotidianamente (almeno nei giorni lavorativi). | Prova sugli enchitreidi | a) | Fase di assorbimento con 8 date di campionamento per il calcolo dei parametri cinetici | Giorno | Attività | - 6 | Condizionamento del terreno preparato per 48 ore. | - 4 | Addizione della soluzione della sostanza in esame alla frazione di terreno; evaporazione degli eventuali solventi; miscelazione dei componenti del terreno; distribuzione del terreno nei recipienti di prova; equilibrazione alle condizioni sperimentali per 4 giorni (3 settimane per i terreni addizionati di metalli). | da - 3 a - 1 | Rimozione degli organismi sperimentali dal terreno di allevamento per acclimatazione; preparazione e umidificazione dei componenti del terreno. | 0 | Misurazione della temperatura e del pH del terreno; prelievo di campioni di terreno dai recipienti trattati e dai controlli con solvente per la determinazione della concentrazione della sostanza in esame; introduzione di una razione di cibo; pesatura e distribuzione casuale degli animali nei recipienti di prova; accantonamento di un numero sufficiente di sottocampioni di animali per la determinazione dei valori analitici di fondo, del peso umido e secco e del tenore lipidico; pesatura di tutti i recipienti di prova il controllo dell’umidità del terreno; controllo del flusso d’aria, se si utilizza un sistema sperimentale chiuso. | 1 | Controllo del flusso d’aria, annotazione del comportamento degli animali e della temperatura; prelievo di campioni di terreno e di animali per determinare la concentrazione della sostanza in esame. | 2 | Idem come il 1o giorno. | 3 | Controllo del flusso d’aria, del comportamento degli animali e della temperatura. | 4 | Idem come il 1o giorno. | 5 - 6 | Idem come il 3o giorno. | 7 | Idem come il 1o giorno; introduzione di una razione di cibo; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti e compensando l’acqua evaporata. | 9 | Idem come il 1o giorno. | 10 | Idem come il 3o giorno. | 11 | Idem come il 1o giorno. | 12 - 13 | Idem come il 3o giorno. | 14 | Idem come il 1o giorno; introduzione di una razione di cibo; misurazione della temperatura e del pH del terreno; controllo dell’umidità del terreno ripesando i recipienti; fine della fase di assorbimento; trasferimento degli animali dalle restanti repliche esposte ai recipienti contenenti terreno pulito per la fase di eliminazione (senza evacuazione dell’intestino); prelievo di campioni di terreno e animali dai controlli con solvente. | | Le attività che precedono l’esposizione (fase di equilibrazione) sono programmate tenendo conto delle proprietà della sostanza chimica in esame. | | Le attività descritte per il 3o giorno sono effettuate quotidianamente (almeno nei giorni lavorativi). | Appendice 4 | Terreno artificiale — indicazioni per la preparazione e la conservazione | Poiché, nel corso dell’anno, non sempre si può disporre di terreno naturale di una determinata origine e dato che gli organismi indigeni e i microinquinanti in esso presenti possono influire sull’esito della prova, si raccomanda di utilizzare in questa prova il terreno artificiale di cui al capitolo C.8 del presente allegato, Tossicità per i lombrichi (48). Si tratta di un terreno in cui possono sopravvivere, crescere e riprodursi varie specie sperimentali e che offre sia una standardizzazione massima sia la comparabilità intra e interlaboratorio delle condizioni di prova e di allevamento. | Componenti | Torba | 10 % | Torba di sfagno in conformità con la linea guida OCSE n. 207 (48) | Sabbia di quarzo | 70 % | Sabbia di quarzo industriale (asciugata all’aria); granulometria: > 50 % delle particelle comprese tra 50 e 200 μm, ma tutte ≤ 2 mm | Argilla caolinica | 20 % | Tenore di caolinite ≥ 30 % | Carbonato di calcio | ≤ 1 % | CaCO3, in polvere, chimicamente puro | Il tenore di carbonio organico del terreno artificiale può anche essere ridotto, diminuendo, ad esempio, la percentuale di torba al 4-5 % di terreno secco e aumentando proporzionalmente il contenuto di sabbia. Con un tenore inferiore di carbonio organico, può risultare inferiore l’adsorbimento della sostanza in esame nel terreno (carbonio organico) e aumentare la disponibilità della sostanza in esame per gli animali (74). È stato dimostrato che Enchytraeus albidus e Eisenia fetida possono soddisfare i criteri di validità relativi alla riproduzione quando saggiati in terreni naturali con un tenore più basso di carbonio organico, ad esempio 2,7 % (33) e (61), ed è stato sperimentalmente constatato che ciò vale anche con un terreno artificiale contenente 5 % di torba. | Preparazione | Mescolare accuratamente i componenti secchi del terreno (ad esempio in un grande miscelatore da laboratorio), operazione che può essere eseguita circa una settimana prima dell’inizio della prova. Inumidire la miscela con acqua deionizzata almeno 48 ore prima di applicarvi la sostanza in esame per equilibrare/stabilizzare l’acidità. Per determinare il pH, utilizzare una miscela di terreno con una soluzione di 1 M KCl in rapporto 1:5. Se il pH non rientra nell’intervallo richiesto (6,0 ± 0,5), aggiungere al terreno CaCO3 in quantità sufficiente oppure preparare un nuovo lotto di terreno. | Determinare la capacità massima di ritenzione idrica (WHCmax) del terreno artificiale in base alla norma ISO 11268-2 (35). Almeno due giorni prima dell’inizio della prova, inumidire il terreno aggiungendo acqua deionizzata o acqua artificiale in quantità sufficiente a ottenere circa la metà del tenore d’umidità finale. Il tenore di umidità finale deve rappresentare dal 40 % al 60 % della WHCmax. Suddividere, all’inizio della prova, il terreno preinumidito in un numero di lotti pari al numero delle concentrazioni sperimentali e dei controlli da utilizzarsi nella prova, e aggiustare il tenore di umidità al 40 – 60 % della WHCmax aggiungendo la soluzione della sostanza in esame e/o acqua deionizzata o artificiale. Misurare il tenore di umidità all’inizio e alla fine della prova (a 105 °C) per accertarsi che soddisfi in modo ottimale le esigenze delle specie sperimentali (ad esempio, se stringendo leggermente in mano un pugno di terreno, tra le dita compaiono delle goccioline d’acqua). | Conservazione | Conservare i componenti secchi del terreno artificiale a temperatura ambiente fino al momento dell’uso. Conservare il terreno preparato e preinumidito in luogo fresco per tre giorni al massimo prima di addizionarvi la sostanza in esame, avendo cura di ridurre al minimo l’evaporazione d’acqua. Una volta addizionata la sostanza in esame, utilizzare il terreno immediatamente, salvo vi siano informazioni che indicano la possibilità di conservarlo senza alterare la tossicità e la biodisponibilità della sostanza di prova. Conservare fino all’analisi i campioni di terreno addizionato alle condizioni raccomandate per la sostanza in esame. | Appendice 5 | Specie di oligocheti terrestri raccomandate per le prove di bioaccumulo nel suolo | Lombrichi | La specie raccomandata per questa prova è Eisenia fetida (Savigny 1826) della famiglia dei Lumbricidi. Dal 1972, la si suddivide in due sottospecie [Eisenia fetida e Eisenia andrei (10)]. Secondo Jaenike (36), si tratta di due specie a sé stanti. Eisenia fetida è facilmente riconoscibile per le strisce giallo acceso intersegmentarie, mentre Eisenia andrei ha una livrea uniforme color rosso scuro. Probabilmente originarie della regione del Mar Nero, sono oggi diffuse in tutto il mondo, soprattutto in habitat modificati dalle attività antropiche, come i mucchi di compost. Entrambe si prestano ad essere utilizzate nelle prove ecotossicologiche e di bioaccumulo. | Eisenia fetida e Eisenia andrei sono disponibili in commercio, ad esempio come esche per la pesca. Rispetto ad altri lumbricidi, hanno un ciclo di vita breve e raggiungono la maturità in 2-3 mesi (a temperatura ambiente). Prosperano a temperature oscillanti tra i 20 e i 24 °C e prediligono substrati relativamente umidi, con pH pressoché neutro e a forte tenore di materia organica. Dato che si tratta di specie ampiamente utilizzate da 25 anni in prove ecotossicologiche standardizzate, il loro allevamento è ormai diffuso (48) (77). | Entrambe le specie possono essere allevate in deiezioni animali di vario tipo. Il mezzo di allevamento raccomandato dall’ISO (35) è una miscela di letame di equini o bovini e torba in parti uguali. Il mezzo deve avere un pH di circa 6-7 (aggiustato con carbonato di calcio), una conduttività ionica bassa (minore di 6 mS/cm o concentrazione di sali inferiore a 0,5 %) e non essere troppo contaminato da ammoniaca o urina animale. Si può utilizzare anche la terra da giardino che si trova in commercio, priva di additivi, oppure terreno artificiale quale definito dall’OCSE (48), o ancora una miscela di entrambi in parti uguali. Il substrato dovrebbe essere umido ma non troppo bagnato. Le cassette d’allevamento più idonee hanno capacità compresa tra 10 e 50 litri. | Per ottenere una popolazione di lombrichi omogenea per età e massa, è consigliabile iniziare l’allevamento con i bozzoli. A tal fine introdurre una quantità di animali adulti in una cassetta d’allevamento contenente substrato fresco. L’esperienza dimostra che si ottengono buoni tassi di riproduzione con una densità demografica di circa 100 lombrichi adulti per kg di substrato (peso umido). Dopo 28 giorni togliere i lombrichi adulti. I lombrichi nati dai bozzoli sono utilizzati per le prove una volta adulti, ossia dopo almeno 2 mesi dalla schiusa ma non oltre 12 mesi. | Si può ritenere che i lombrichi delle specie qui descritte godano di buona salute se si muovono nel substrato, non tentano di fuggire e si riproducono continuamente. Una certa inazione o una colorazione gialla dell’estremità posteriore (nel caso di Eisenia fetida) sono indici di impoverimento del substrato. In tal caso si raccomanda di utilizzare substrato fresco e/o ridurre il numero di animali per cassetta. | Bibliografia scelta di approfondimento | Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1-58. | Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81. | Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S. | Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55. | Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201. | Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1-171. | Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, London. 331-338 pp. | Enchitreidi | La specie consigliata per questa prova è Enchytraeus albidus (Henle 1837 — verme bianco). Enchytraeus albidus è una delle specie di maggiori dimensioni (fino a 15 mm) della famiglia di anellidi oligocheti degli Enchitreidi ed è diffusa in tutto il mondo (8). La si ritrova in ambiente marino, dulciacquicolo e terrestre, principalmente nella materia organica in putrefazione (alghe, compost), talvolta nei terreni prativi (42). L’ampia valenza ecologica che caratterizza questa specie e alcune sue variazioni morfologiche indicano che potrebbero esistere varie razze. | Enchytraeus albidus è reperibile in commercio, sotto forma di mangime per pesci. Occorre verificare se l’allevamento è contaminato da altre specie, generalmente più piccole (60), nel qual caso gli animali vanno lavati con acqua in una capsula Petri. Per avviare un nuovo allevamento, scegliere gli esemplari adulti di grandi dimensioni (prelevandoli con un microscopio stereoscopico) e scartare tutti gli altri. Il ciclo di vita di questo animale è breve, dato che raggiunge la maturità in un tempo oscillante tra 33 (a 18 °C) e 74 giorni (a 12 °C). Utilizzare per questa prova solo gli animali che siano stati tenuti in laboratorio almeno 5 settimane (una generazione) e che non abbiano mostrato complicazioni. | Anche altre specie del genere Enchytraeus sono adatte per questa prova, in particolare Enchytraeus luxuriosus. Questa specie è prevalentemente terricola, come è stato recentemente descritto in (65). Se si impiegano altre specie di Enchytraeus occorre identificarle in modo chiaro e giustificare tale scelta nella relazione. | La specie Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) appartiene allo stesso gruppo di Enchytraeus luxuriosus. Poiché questa specie è stata descritta solo negli allevamenti di lombrichi e nei mucchi di compost (Römbke 2003), la sua esistenza in natura non è certa e quindi non se ne conoscono le esigenze ecologiche. Pur tuttavia, alcuni studi recenti di laboratorio condotti su vari tipi di terreno hanno confermato la grande tolleranza di questa specie verso caratteristiche del suolo quali ph e struttura (Jänsch et al. 2005). Negli ultimi anni essa è stata spesso utilizzata negli studi ecotossicologici proprio perché semplice da allevare e da saggiare (Kuperman et al. 2003). Presenta tuttavia l’inconveniente delle piccole dimensioni, che, essendo in media da 3 a 12 mm (Westheide & Müller 1996), ne rendono difficoltosa la manipolazione rispetto a Enchytraeus albidus. Quando si utilizza questa specie invece di Enchytraeus albidus, i recipienti di prova possono essere più piccoli, ma non necessariamente. Va inoltre tenuto in considerazione che questa specie si riproduce molto rapidamente, con un tempo di moltiplicazione inferiore a 20 giorni a 20 ± 2 °C (Achazi et al. 1999) se non ancor più basso a temperature più elevate. | Gli enchitreidi della specie Enchytraeus albidus (così come di altre specie di enchitreidi) possono essere allevati in grandi cassette di plastica (di dimensioni, ad esempio, 30 × 60 × 10 cm oppure, per vermi piccoli, 20 × 12 × 8 cm) riempite di una miscela di terreno artificiale e terra da giardino reperibile in commercio, non contaminata e priva di additivi. Il compost è da evitare poiché può contenere sostanze tossiche, come i metalli pesanti. Prima dell’utilizzo, eliminare la fauna indigena dal terreno di allevamento surgelandolo tre volte. È possibile utilizzare un terreno completamente artificiale, tenendo presente che il tasso di riproduzione potrebbe essere più lento rispetto a quello che si osserva con i substrati misti. Il substrato deve avere un pH di 6,0 ± 0,5. Tenere gli animali al buio, in un’incubatrice con temperatura di 15 ± 2 °C, evitando in ogni caso temperature superiori a 23 °C. Il terreno artificiale o naturale deve essere umido, ma non bagnato, tale che, se premuto leggermente con la mano, lasci filtrare in superficie solo qualche gocciolina d’acqua. Evitare di creare condizioni anossiche (se si utilizza un coperchio, accertarsi che abbia un numero di fori sufficienti a garantire un congruo ricambio d’aria). Il terreno va aerato rimescolandolo delicatamente una volta la settimana. | Alimentare gli animali almeno a cadenza settimanale, a volontà, con fiocchi d’avena posti in una cavità sulla superficie del terreno e ricoperti di terra. Se rimane cibo dalla volta precedente, adeguare la nuova razione in funzione della quantità rimasta. Se il cibo restante presenta muffa, sostituirlo con una nuova razione di fiocchi d’avena. Per stimolare la riproduzione, i fiocchi d’avena possono essere sostituiti, ogni due settimane, da una polvere proteica, reperibile in commercio, arricchita di vitamine. Dopo tre mesi trasferire gli animali in un substrato di allevamento fresco. Conservare i fiocchi d’avena in recipienti ermeticamente chiusi e sterilizzarli in autoclave o riscaldarli prima di somministrarli, onde prevenire eventuali infestazioni da acari della farina (ad esempio Glycyphagus sp., Astigmata, Acarina) o da acari predatori [ad esempio Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina]. Una volta disinfettato, macinare l’alimento in modo da poterlo distribuire con facilità sulla superficie del terreno. In alternativa ai fiocchi d’avena si può utilizzare lievito per panificazione o mangime per pesci TetraMin®. | In linea di principio, le condizioni di allevamento sono soddisfacenti se gli animali non cercano di scappare dal substrato, si spostano rapidamente su di esso, presentano una livrea brillante, di colore bianco più o meno intenso, sulla quale le particelle di terreno non aderiscono e sono rappresentati da varie fasce d’età. Di fatto, si può ritenere che gli animali godano di buona salute se si riproducono continuamente. | Bibliografia scelta di approfondimento | Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126. | Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51-83. | Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656. | Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616. | Westheide W and Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479 – 488. | Westheide W and Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267. | » | 10. | dodajo se poglavja C.27, C.28, C.29 in C.30: | „C.27 PRESKUS STRUPENOSTI S TRZAČAMI V SISTEMU VODE IN USEDLINE Z UPORABO USEDLINE S PRIMEŠANO PRESKUSNO SNOVJO | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 218 (2004). Zasnovana je za oceno učinkov daljše izpostavljenosti kemikalijam na ličinke sladkovodne trzače Chironomus sp., ki živijo v usedlinah. Temelji na obstoječih protokolih za preskušanje strupenosti za Chironomus riparius in Chironomus tentans, ki so bili razviti v Evropi (1) (2) (3) in Severni Ameriki (4) (5) (6) (7) (8) ter krožno preskušeni (1) (6) (9). Uporabijo se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trzače, npr. Chironomus yoshimatsui (10) (11). | 2. | Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje preskusne snovi v usedlino. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je odvisna od namena uporabe preskusa. Namen primešanja snovi v usedlino je simulirati nakopičene ravni kemikalij, ki ostajajo v usedlini. Ta sistem izpostavljenosti vključuje primešanje snovi v usedlino v preskusnem sistemu vode in usedline. | 3. | Snovi, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, živečimi v usedlinah, se običajno v tem delu zelo dolgo obdržijo. Organizmi, živeči v usedlinah, so lahko izpostavljeni na številne načine. Relativni pomen vsakega načina izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim učinkom, sta odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije. Pri snoveh, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snoveh, ki se kovalentno vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben način izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih snovi, se lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne snovi. Da bi se upoštevali vsi morebitni načini izpostavljenosti, je ta preskusna metoda osredotočena na dolgoročno izpostavljenost. Preskus za C. riparius in C. yoshimatsui traja 20 do 28 dni, za C. tentans pa 28 do 65 dni. Če so za določen namen potrebni kratkoročni podatki, na primer da se raziščejo učinki nestabilne kemikalije, se lahko dodatne ponovitve umaknejo po 10 dneh. | 4. | Izmerjene končne točke so skupno število preobraženih odraslih osebkov in čas do preobrazbe. Če so potrebni dodatni kratkoročni podatki, je priporočljivo, da se preživetje in rast ličink izmerita šele po 10-dnevnem obdobju, po potrebi z dodatnimi ponovitvami. | 5. | Priporoča se uporaba formulirane usedline. Ta ima pred naravnimi usedlinami več prednosti: | — | variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni ponovljivo ‚standardizirano matrico‘, poleg tega ni več treba iskati nekontaminiranih in čistih virov usedlin, | — | preskusi se lahko začnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno obdelati, da bi se odstranila domorodna favna; s formulirano usedlino se tudi znižajo stroški, povezani z zbiranjem zadostne količine usedline na terenu za rutinsko preskušanje, | — | uporaba formulirane usedline omogoča primerjave strupenosti in ustrezno razvrstitev snovi. | 6. | Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 7. | Ličinke trzače prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije preskusne kemikalije v sistemih vode in usedline. Preskusna snov se primeša v usedlino, ličinke prvega stadija pa se nato vnesejo v preskusne čaše, v katerih so bile koncentracije usedline in vode stabilizirane. Hitrost preobrazbe in razvoja trzač se izmeri ob koncu preskusa. Preživetje in teža ličink se lahko izmerita tudi po 10 dneh, če je to potrebno (z dodatnimi ponovitvami, kot je ustrezno). Ti podatki se analizirajo bodisi z regresijskim modelom, da se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje preobrazbe, ali preživetja, ali rasti ličink (npr. EC15, EC50 itd.), bodisi s preskušanjem statističnih domnev za določitev NOEC/LOEC. Slednje zahteva primerjavo vrednosti učinkov s kontrolnimi vrednostmi, za kar se uporabijo statistični preskusi. | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 8. | Znani morajo biti vodotopnost preskusne snovi, njen parni tlak, izmerjeni ali izračunani koeficient porazdelitve v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. Za določitev količine preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpričano natančnostjo ter mejo zaznave. Koristni informaciji sta tudi strukturna formula in čistost preskusne snovi. Prav tako je koristno poznati obnašanje preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja itd.). Dodatne smernice za preskušanje snovi s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskus otežen, so navedene v (12). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 9. | Redno se lahko preskušajo referenčne kemikalije, da se tako zagotavlja zanesljivost protokola za preskušanje in preskusnih pogojev. Primeri referenčnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in potrditvenih raziskavah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (2) (5) (6) (13). | VELJAVNOST PRESKUSA | 10. | Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: | — | preobrazba v kontrolnih posodah ob koncu preskusa mora biti vsaj 70-odstotna (1) (6), | — | C. riparius in C. yoshimatsui v kontrolnih posodah se morajo v odrasle osebke preobraziti med 12. in 23. dnem po vnosu v posode; C. tentans potrebujejo 20 do 65 dni, | — | ob koncu preskusa je treba v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasičenosti zraka (ASV) pri uporabljeni temperaturi, pH vode nad usedlino pa mora biti v vseh preskusnih posodah med 6 in 9, | — | temperatura vode se ne sme razlikovati za več kot ± 1,0 °C; temperaturo vode bi bilo mogoče nadzorovati z izotermalnim prostorom; v takem primeru je treba temperaturo v prostoru potrjevati v ustreznih časovnih presledkih. | OPIS METODE | Preskusne posode | 11. | Raziskava se izvaja v steklenih 600-mililitrskih čašah z 8-centimetrskim premerom. Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno globino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm2 na ličinko. Razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo mora biti 1 : 4. Preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. teflona). | Izbira vrst | 12. | Če je mogoče, naj se v preskusu uporabi vrsta Chironomus riparius. Chironomus tentans je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva daljše preskusno obdobje. Uporabi se lahko tudi Chironomus yohimatsui. Podrobnosti o metodah gojenja za Chironomus riparius so navedene v Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja so na voljo tudi za druge vrste, npr. Chironomus tentans (4) in Chironomus yoshimatsui (11). Identifikacijo vrst je treba potrditi pred preskusom, ni pa to potrebno pred vsakim preskusom, če organizmi prihajajo iz internega gojišča. | Usedlina | 13. | Če je mogoče, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina). Če se uporabi naravna usedlina, je treba določiti njene lastnosti (vsaj pH in vsebnost organskega ogljika, priporoča se tudi določitev drugih parametrov, kot sta razmerje C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebovati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s trzačami ali jih požrli. Prav tako se priporoča, naj se naravna usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Za uporabo v tem preskusu (1) (15) (16) se priporoča naslednja formulirana usedlina, ki temelji na umetni zemljini, uporabljeni v preskusni metodi C.8 (14): | (a) | 4–5 % (suhe teže) šote: čim bližje vrednosti pH 5,5 do 6,0; pomembno je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno samo na zraku; | (b) | 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %); | (c) | 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, pri katerem je več kot 50 % delcev velikih 50 do 200 μm); | (d) | doda se deionizirana voda, tako da je v končni mešanici vsebnost vlage 30- do 50-odstotna; | (e) | doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO3), da se pH v končni mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5. Vsebnost organskega ogljika v končni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %), uravnava pa se z ustreznimi količinami šote in peska v skladu s točkama (a) in (c). | 14. | Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da sestavine usedline niso kemično onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih kovin, organoklornih spojin, organofosfornih spojin itd.). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad usedlino ne začnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali usedlina zadostno kondicionirana. | Voda | 15. | Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim značilnostim sprejemljive vode za redčenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, naravna voda (površinska ali podzemna voda), obdelana voda (glej Dodatek 2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in preskušanja v njej preživijo brez znakov stresa. Na začetku preskusa mora biti pH preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti višja od 400 mg/l kot CaCO3. Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). Ves čas raziskave je treba uporabljati isto vrsto vode. Lastnosti vode, navedene v Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se morda te lastnosti bistveno spremenile. | Založne raztopine – usedline s primešano preskusno snovjo | 16. | Usedline s primešano preskusno snovjo izbrane koncentracije se običajno pripravijo z dodatkom raztopine preskusne snovi neposredno v usedlino. osnovna raztopina preskusne snovi, raztopljene v deionizirani vodi, se zmeša s formulirano usedlino z valjčnim mlinom, mešalnikom za krmo ali ročno. Če je preskusna snov slabo topna v vodi, se lahko raztopi v čim manjši količini ustreznega organskega topila (npr. heksana, acetona ali kloroforma). Ta raztopina se nato zmeša z 10 g finega kremenovega peska za eno preskusno posodo. Topilo je treba pustiti, da izhlapi, in mora biti v celoti odstranjeno iz peska; pesek se nato zmeša z ustrezno količino usedline na preskusno čašo. Za raztapljanje, razpršitev ali emulgiranje preskusne snovi se lahko uporabijo samo tista sredstva, ki hitro izhlapijo. Ne smemo pozabiti, da je treba pri pripravi usedline upoštevati količino peska, prinesenega z mešanico preskusne snovi in peska (tj. usedlino je torej treba pripraviti z manj peska). Paziti je treba, da je preskusna snov, dodana usedlini, v njej temeljito in enakomerno razporejena. Po potrebi se lahko analizirajo podvzorci, da se ugotovi stopnja homogenosti. | NAČRT PRESKUSA | 17. | Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število ličink na posodo. Opisani so načrti za točkovno oceno EC, oceno NOEC in izvedbo mejnega preskusa. | Načrt za regresijsko analizo | 18. | S koncentracijami, vključenimi v preskus, bi morala biti zajeta efektivna koncentracija (npr. EC15, EC50) in razpon koncentracije, v katerem je zanimiv vpliv preskusne snovi. Na splošno se natančnost in zlasti veljavnost, ki ju je mogoče doseči pri ocenah efektivnih koncentracij (ECx), izboljšata, kadar je efektivna koncentracija v okviru preskušanega razpona koncentracij. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo pozitivno koncentracijo ali veliko nad najvišjo koncentracijo. Kot pomoč pri izbiri razpona koncentracij, ki bo uporabljen (glej odstavek 27), se lahko izvede predhodni preskus za ugotavljanje razpona. | 19. | Če je treba oceniti ECx, je treba preskusiti vsaj 5 koncentracij in izvesti 3 ponovitve za vsako koncentracijo. Vsekakor je priporočljivo uporabiti dovolj preskusnih koncentracij, da se omogoči dobra ocena modela. Faktor med koncentracijami ne sme biti večji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon krivulje odmerek-učinek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s preskusno snovjo se lahko zmanjša, če se poveča število preskusnih koncentracij z različnimi učinki. Povečanje števila ponovitev ali zmanjšanje velikosti razmikov med preskusnimi koncentracijami običajno vodi do ožjih intervalov zaupanja za preskus. Dodatne ponovitve so potrebne, če se ocenjujeta 10-dnevno preživetje in rast ličink. | Načrt za oceno NOEC/LOEC | 20. | Če je treba oceniti LOEC ali NOEC, bi bilo treba uporabiti pet preskusnih koncentracij in izvesti vsaj štiri ponovitve, faktor med koncentracijami pa ne sme biti večji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi ustrezna statistična vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Pri hitrosti razvoja je običajno ustrezna analiza variance (ANOVA), kot sta Dunnettov preskus in Williamsov preskus (17) (18) (19) (20). Pri koeficientu preobrazbe se lahko uporabijo Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov preskus. | Mejni preskus | 21. | Če v predhodnem preskusu za ugotavljanje razpona ni bilo opaženih učinkov, se lahko opravi mejni preskus (ena preskusna koncentracija in kontrolna enota). Namen mejnega preskusa je izvesti preskus pri dovolj visoki koncentraciji, da lahko nosilci odločanja izključijo mogoče strupene učinke preskusne snovi, meja pa je določena pri koncentraciji, za katero ni pričakovati, da bi se pojavila v katerem koli primeru. Priporoča se 1 000 mg/kg (suhe teže). Običajno je potrebnih vsaj šest ponovitev za preskusne in kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statistično vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Kar zadeva učinek na hitrost razvoja in težo, je t-test primerna statistična metoda, če podatki izpolnjujejo zahteve za ta preskus (normalnost, homogenost varianc). Če te zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance ali neparametrični preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus. | POSTOPEK | Pogoji izpostavljenosti | Priprava sistema vode in usedline, v katerem je preskusna snov primešana v usedlino | 22. | Za uporabo preskusne snovi (14) se priporoča postopek primešanja, opisan v preskusni metodi C.8: Strupenost za deževnike. Usedline s primešano preskusno snovjo se vnesejo v posode, nad usedlino pa se doda voda, da nastane volumensko razmerje med usedlino in vodo 1 : 4 (glej odstavka 11 in 15). Plast usedline mora biti debela 1,5 do 3 cm. Da se prepreči ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med točenjem vode prekrije s plastičnim pokrovom, ki se takoj nato odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva. | 23. | Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploščami). Po potrebi se med raziskavo voda dotoči do prvotne količine, da se nadomesti izhlapela voda. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se prepreči kopičenje soli. | Stabilizacija | 24. | Ko je usedlina s primešano preskusno snovjo in vodo nad njo pripravljena, je zaželeno, da se omogoči porazdelitev preskusne snovi iz vodne faze v usedlino (3) (4) (6) (13). To je po možnosti treba storiti v temperaturnih in prezračevalnih pogojih, ki bodo uporabljeni v preskusu. Ustrezen čas za vzpostavitev ravnotežja je odvisen od usedline in kemikalije, lahko pa traja od več ur do več dni in v redkih primerih do več tednov (4 do 5 tednov). Ker bi bil tako na voljo čas za razgradnjo številnih kemikalij, se na vzpostavitev ravnotežja ne sme čakati, ampak se za to priporoča 48-urno obdobje. Po koncu tega dodatnega obdobja za vzpostavitev ravnotežja je treba izmeriti koncentracijo preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini vsaj pri najvišji in nižji koncentraciji (glej odstavek 38). Te analitske določitve preskusne snovi omogočajo izračun masne bilance in izražanje rezultatov na podlagi izmerjenih koncentracij. | Dodajanje preskusnih organizmov | 25. | Od 4 do 5 dni pred vnosom preskusnih organizmov v preskusne posode je treba iz gojišč vzeti jajčna legla in jih vstaviti v majhne posode v gojitvenem mediju. Uporabi se lahko starejši medij iz osnovne kulture ali sveže pripravljeni medij. Če se uporabi slednji, je treba v gojitveni medij dodati majhno količino hrane, npr. zelenih alg in/ali nekaj kapljic filtrata suspenzije iz fino mlete ribje hrane v kosmičih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba samo sveže odložena jajčna legla. Običajno se ličinke izležejo nekaj dni po tem, ko so bila jajčeca odložena (2 do 3 dni za Chironomus riparius pri 20 °C ter 1 do 4 dni za Chironomus tentans pri 23 °C in Chironomus yoshimatsui pri 25 °C), rast ličink pa poteka v 4 stadijih, od katerih vsak traja 4 do 8 dni. V preskusu je treba uporabiti ličinke prvega stadija (2 do 3 ali 1 do 4 dni po tem, ko se izležejo). Stadij trzač se lahko po možnosti preveri z merjenjem širine glave (6). | 26. | 20 ličink prvega stadija se s topo pipeto naključno vnese v vsako preskusno posodo, ki vsebuje usedlino s primešano preskusno snovjo in vodo. Med dodajanjem ličink v preskusne posode je treba ustaviti prezračevanje vode, ki se ne sme izvajati še 24 ur potem, ko so bile ličinke dodane (glej odstavka 25 in 32). Glede na uporabljeni načrt preskusa (glej odstavka 19 in 20) se za točkovno oceno EC uporabi vsaj 60 ličink na koncentracijo, za določitev NOEC pa 80. | Preskusne koncentracije | 27. | Preskus za ugotavljanje razpona je lahko koristen za določitev razpona koncentracij za končni preskus. Za ta namen se uporabi niz široko razmaknjenih koncentracij preskusne snovi. Da se zagotovi enaka gostota površine na trzačo, kot bo uporabljena za končni preskus, se trzače izpostavijo vsaki koncentraciji preskusne snovi za obdobje, ki omogoča oceno ustreznih preskusnih koncentracij, pri čemer ponovitve niso potrebne. | 28. | Preskusne koncentracije za končni preskus se določijo na podlagi rezultata preskusa za ugotavljanje razpona. Izbrati in uporabiti je treba vsaj pet koncentracij, kot je opisano v odstavkih 18 do 20. | Kontrolne enote | 29. | V preskus je treba vključiti kontrolne posode, v katerih ni preskusne snovi, toda ki vsebujejo usedlino, z ustreznim številom ponovitev (glej odstavka 19 in 20). Če je bilo za aplikacijo preskusne snovi uporabljeno topilo (glej odstavek 16), je treba dodati kontrolno posodo, katere usedlina vsebuje tudi topilo. | Preskusni sistem | 30. | Uporabljajo se statični sistemi. Polstatični ali pretočni sistemi z občasnim ali kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino se lahko uporabijo v izjemnih primerih, na primer če specifikacije kakovosti vode postanejo neprimerne za preskusni organizem ali vplivajo na kemijsko ravnotežje (npr. ravni raztopljenega kisika se preveč znižajo, koncentracija izločkov se preveč poviša ali minerali iztekajo iz usedline in vplivajo na pH in/ali trdoto vode). Vendar za izboljšanje kakovosti vode nad usedlino običajno zadoščajo in se prednostno uporabljajo druge metode, kot je prezračevanje. | Hrana | 31. | Ličinke je treba hraniti, po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Za mlade ličinke v prvih desetih dneh ustreza 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za C. yoshimatsui) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. TetraMin ali TetraPhyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na ličinko na dan. Nekoliko več hrane bodo morda potrebovale starejše ličinke: za preostanek preskusa mora zadostovati 0,5–1 mg na ličinko na dan. Obrok hrane je treba zmanjšati v vseh preskusnih in kontrolnih posodah, če se opazi rast glivic ali smrtnost v kontrolnih posodah. Če razvoja glivic ni mogoče ustaviti, je treba preskus ponoviti. Kadar se preskušajo snovi, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snovi, ki se kovalentno vežejo na usedlino, se lahko količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravne rasti organizmov, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije. Za to je treba namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodatek 0,5 % (suhe teže) fino mletih listov npr. velike koprive (Urtica dioica), bele murve (Morus alba), plazeče detelje (Trifolium repens), špinače (Spinacia oleracea) ali drugega rastlinskega materiala (Cerophyl ali alfa celuloza). | Pogoji inkubacije | 32. | Zagotovi se rahlo prezračevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah, po možnosti 24 ur po vnosu ličink, in se izvaja ves čas preskusa (paziti je treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, pritrjene 2 do 3 cm nad plastjo usedline (tj. 1 ali nekaj mehurčkov/s). Kadar se preskušajo hlapne kemikalije, je mogoče razmisliti o tem, da se sistem vode in usedline ne bi prezračeval. | 33. | Preskus se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans in C. yoshimatsui sta priporočeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti 500 do 1 000 lux. | Trajanje izpostavljenosti | 34. | Izpostavljenost se začne z vnosom ličink v posode s primešano preskusno snovjo in kontrolne posode. Najdaljši čas izpostavljenosti za C. riparius in C. yoshimatsui je 28 dni, za C. tentans pa 65 dni. Če se ličinke v odrasle osebke preobrazijo prej, se lahko preskus konča najmanj pet dni po preobrazbi zadnjega odraslega osebka v kontrolni posodi. | Opažanja | Preobrazba | 35. | Določita se čas razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. | 36. | Preskusne posode je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se ugotovi kakršno koli neobičajno obnašanje (npr. zapuščanje usedline, nenavadno plavanje) v primerjavi s kontrolno posodo. V obdobju pričakovane preobrazbe je potrebno dnevno štetje preobraženih trzač. Spol in število v celoti preobraženih trzač se zapišeta dnevno. Po identifikaciji se trzače odstranijo iz posod. Vsa jajčna legla, odložena pred zaključkom preskusa, je treba evidentirati in nato odstraniti, da se prepreči vnovični vnos ličink v usedlino. Evidentira se tudi število vidnih bub, ki se niso preobrazile. Napotek za spremljanje preobrazbe je v Dodatku 5. | Rast in preživetje | 37. | Če je treba zagotoviti podatke o 10-dnevnem preživetju in rasti ličink, je treba na začetku vključiti dodatne preskusne posode, ki se lahko uporabijo pozneje. Usedlina iz teh dodatnih posod se preseje skozi sito z 250 μm velikimi luknjicami, da se zadržijo ličinke. Merili za pogin sta negibnost ali neodzivnost na mehanske dražljaje. Ličinke, ki ostanejo v usedlini, je prav tako treba šteti za mrtve (ličinke, ki so poginile na začetku preskusa, so morda razgradili mikrobi). Določi se suha teža (brez pepela) preživelih ličink na preskusno posodo in izračuna srednja suha teža posamezne ličinke na posodo. Koristno je določiti, v kateri stadij spadajo preživele ličinke; za to se lahko izmeri širina glave vsakega osebka. | Analitske meritve | Koncentracija preskusne snovi | 38. | Pred začetkom preskusa (tj. dodatkom ličink) se za analitsko določitev koncentracije preskusne snovi v usedlini odvzamejo vzorci usedline vsaj iz ene posode na posamezno obdelavo. Priporoča se, da se na začetku in koncu preskusa analizirajo vsaj vzorci vode nad usedlino, porne vode in usedline (glej odstavek 24), in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. Te določitve koncentracije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev preskusne snovi v sistemu vode in usedline. | 39. | Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. 7. dan) in če so za analize potrebni veliki vzorci, ki jih ni mogoče vzeti iz preskusnih posod, ne da bi to vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske določitve izvesti na vzorcih iz dodatnih preskusnih posod, ki se obdelujejo enako (vključno s prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne uporabljajo. | 40. | Za izolacijo intersticijske vode se priporoča 30-minutno centrifugiranje pri npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno snov izkaže, da se ne adsorbira na filtre, je lahko sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca morda ne bo mogoče analizirati. | Fizikalno-kemijski parametri | 41. | Vrednost pH in temperaturo v preskusnih posodah je treba ustrezno meriti (glej odstavek 10). Trdoto in amonij je treba izmeriti v kontrolnih posodah in eni preskusni posodi pri najvišji koncentraciji na začetku in koncu preskusa. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 42. | Namen tega preskusa je določiti učinek preskusne snovi na hitrost razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače oziroma, pri 10-dnevnem preskusu, učinke na preživetje in težo ličink. Če ni znakov o statistično različni občutljivosti spolov, se lahko rezultati za samce in samice za statistične analize združijo. Razlike v občutljivosti med spoloma je mogoče statistično oceniti, na primer s preskusom χ2-r × 2. Po potrebi je treba po 10 dneh določiti preživetje ličink in srednjo suho težo posamezne ličinke na posodo. | 43. | Če je mogoče, se efektivne koncentracije, ki so izražene in temeljijo na suhi teži, izračunajo na podlagi izmerjenih koncentracij v usedlini na začetku preskusa (glej odstavek 38). | 44. | Za točkovno oceno EC50 ali druge ECx se lahko statistični podatki po posodah uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izračunu intervala zaupanja za ECx je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa dokazati, da je ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših kvadratov, je treba statistične podatke po posameznih posodah transformirati, da se izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti ECx izračunati po tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vrednost. | 45. | Kadar je namen statistične analize določiti NOEC/LOEC s preskušanjem domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, npr. z vgnezdeno ANOVO. Alternativno se lahko uporabijo robustnejši preskusi (21), kadar so običajne predpostavke ANOVE kršene. | Koeficient preobrazbe | 46. | Koeficient preobrazbe da odgovor ‚vse ali nič‘ in se lahko analizira s Cochran-Armitageevim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in so ti podatki v skladu s tem pričakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravljenimi p-vrednostmi. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v okviru iste koncentracije večja, kot bi kazala binomska porazdelitev (pogosto imenovana ‚ekstra-binomska‘ variacija), potem je treba uporabiti robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je predlagano v (21). | Vsota preobraženih trzač na posodo ne se določi in deli s številom vnesenih ličink na: | pri čemer je: | ER | = | koeficient preobrazbe, | ne | = | število preobraženih trzač na posodo, | na | = | število vnesenih ličink na posodo. | 47. | Druga možnost, ki je najprimernejša za velike vzorce, kadar obstaja ekstra binomska varianca, je, da se koeficient preobrazbe obravnava kot zvezni odgovor in se uporabijo postopki, kot je Williamsov preskus, kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in kadar je to v skladu s temi podatki o koeficientu preobrazbe. Dunettov preskus je primeren, kadar monotonost ne drži. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobraženih osebkov in število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih več kot pet. | 48. | Za uporabo metod ANOVA je treba vrednosti ER najprej transformirati z arkus sinus-korensko transformacijo ali Freeman-Tukeyevo transformacijo, da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izenačijo. Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabijo, kadar se uporabljajo absolutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izračuna arkus sinus (sin-1) kvadratnega korena ER. | 49. | Za koeficiente preobrazbe se vrednosti ECx izračunajo z regresijsko analizo (ali npr. probit (22), logit, Weibull, ustrezno programsko opremo itd.). Če regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), se uporabijo druge neparametrične metode, kot sta drseče povprečje ali linearna interpolacija. | Hitrost razvoja | 50. | Srednji čas razvoja pomeni srednji časovni razpon med vnosom ličink (dan 0 preskusa) in preobrazbo poskusne kohorte trzač. (Za izračun dejanskega časa razvoja je treba upoštevati starost ličink ob vnosu.) Hitrost razvoja je obratna času razvoja (enota: 1/dan) in predstavlja tisti delež razvoja ličink, ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primernejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homogena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato so učinkoviti parametrični preskusi primernejši za hitrost razvoja kot za čas razvoja.Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odgovor, se lahko vrednosti ECx ocenijo z regresijsko analizo (npr. (23), (24)). | 51. | Za naslednje statistične preskuse se za število trzač, opaženih na dan opazovanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med dnevom × in dnevom x – 1 (l = dolžina intervala opazovanja, običajno 1 dan). Srednja hitrost razvoja na posodo (x) se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | : | srednja hitrost razvoja za posodo, | i | : | indeks intervala opazovanja, | m | : | največje število intervalov opazovanja, | : | število trzač, preobraženih v intervalu opazovanja i, | ne | : | skupno število preobraženih trzač ob koncu poskusa, (= | ) | xi | : | hitrost razvoja trzač, preobraženih v intervalu i. | pri čemer je: | dayi | : | dan opazovanja (dnevi od vnosa), | li | : | dolžina intervala opazovanja i (dnevi, običajno 1 dan). | Poročilo o preskusu | 52. | V poročilu o preskusu morajo biti navedene vsaj naslednje informacije: | | Preskusna snov: | — | fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vodotopnost, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je na voljo), stabilnost v vodi itd.), | — | kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna formula, številka CAS itd.), vključno s čistostjo in analitsko metodo za količinsko določanje preskusne snovi. | | Preskusne vrste: | — | uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji razmnoževanja, | — | informacije o ravnanju z jajčnimi legli in ličinkami, | — | starost preskusnih živali ob vnosu v preskusne posode. | | Preskusni pogoji: | — | uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana, | — | za naravno usedlino lokacija in opis mesta vzorčenja usedline, vključno, če je mogoče, s preteklim onesnaženjem; značilnosti: pH, vsebnost organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija (če je ustrezno), | — | priprava formulirane usedline: sestavine in značilnosti (vsebnost organskega ogljika, pH, vlaga itd. na začetku preskusa), | — | priprava preskusne vode (če se uporablja obdelana voda) in značilnosti (koncentracija kisika, pH, prevodnost, trdota itd. na začetku preskusa), | — | globina usedline in vode nad njo, | — | količina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno vodo in brez nje, | — | preskusne posode (material in velikost), | — | metoda primešanja preskusne snovi v usedlino: uporabljene preskusne koncentracije, število ponovitev in uporaba topila, če je bilo uporabljeno, | — | faza stabilizacije za vzpostavitev ravnotežja sistema vode in usedline: trajanje in pogoji, | — | pogoji inkubacije: temperatura, svetlobni ciklus in jakost svetlobe, prezračevanje (pogostost in jakost), | — | podrobne informacije o hranjenju, vključno z vrsto hrane, pripravo, količino in načinom. | | Rezultati: | — | nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za določitev koncentracije preskusne snovi v preskusni posodi, | — | kakovost vode v preskusnih posodah, tj. pH, temperatura, raztopljeni kisik, trdota in amonij, | — | morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode, | — | število preobraženih samcev in samic trzače na posodo in na dan, | — | število ličink, ki se niso preobrazile v trzače, na posodo, | — | srednja suha teža posamezne ličinke na posodo in po stadijih, če je ustrezno, | — | delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni samci in samice trzače), | — | srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih trzač na ponovitev in stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trzače), | — | ocene strupenih končnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali zaupanja), NOEC in/ali LOEC, ter statistične metode, uporabljene za njihovo določitev, | — | obravnava rezultatov, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode. | VIRI: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Končno poročilo za Evropsko komisijo. Poročilo št.: EC 3738. Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Z delavnice WOSTA, ki je potekala na Nizozemskem. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, str. 1125–1241. V ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Zvezek 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. | (5) | Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. | (6) | US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Druga izdaja. EPA 600/R-99/064. Marec 2000. Sprememba prve izdaje iz junija 1994. | (7) | US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. | (8) | US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. | (9) | Milani, D., Day, K. E., McLeay, D. J., in Kirby, R. S. (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada. | (10) | Sugaya, Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350. | (11) | Kawai, K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47–57. | (12) | OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. | (13) | Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Preskusna metoda C.8 iz te priloge, Strupenost za deževnike. | (15) | Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. | (16) | Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. | (17) | Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121. | (18) | Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482–491. | (19) | Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103–117. | (20) | Williams, D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531. | (21) | Rao, J. N. K., in Scott, A. J. (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577–585. | (22) | Christensen, E. R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213–221. | (23) | Bruce in Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494. | (24) | Slob, W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298–312. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Za to preskusno metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov: | | formulirana usedlina ali rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline; | | voda nad usedlino je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi; | | intersticijska voda ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline in zemljine; | | usedlina s primešano snovjo je usedlina, ki ji je bila dodana preskusna snov; | | preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Priporočila za gojenje Chironomus riparius | 1. | Ličinke Chironomus se lahko gojijo v kristalizirkah ali večjih vsebnikih. Na dno vsebnika se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselguhr (npr. Merck, Art 8117) (zadošča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato se doda primerna voda do globine več cm. Vodo je treba po potrebi dotočiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepreči izsušitev. Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezračevanje. Posode, v katerih se gojijo ličinke, morajo biti v primerni kletki, ki bo preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s stalnim ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem svetlobe (jakost približno 1 000 lux) in 8-urno temo. Po poročilih lahko manj kot 60-odstotna relativna vlažnost zraka ovira razmnoževanje. | Voda za redčenje | 3. | Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sintetična voda. Običajno se uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji (npr. medij Elendt ‚M4‘ ali ‚M7‘, glej spodaj). Vodo je treba pred uporabo prezračiti. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se uporabljena voda iz gojitvenih posod skrbno pretoči ali izsesa, ne da bi pri tem uničili ovoj ličink. | Hranjenje ličink | 4. | Ličinke Chironomus je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v kosmičih (TetraMin®, TetraPhyll® ali druga podobna zaščitena znamka ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmičih se doda 20 ml vode za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko daje v količini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba pretresti). Starejše ličinke lahko dobijo več hrane. | 5. | Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojitveni medij postane ‚moten‘, je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. Premalo hrane bo povzročilo selitev ličink v vodni stolpec, preveč hrane pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje lahko privede do počasnejše rasti. | 6. | Ko se pripravijo nove gojitvene posode, se lahko dodajo tudi celice nekaterih zelenih alg (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). | Hranjenje preobraženih odraslih osebkov | 7. | Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namočena v nasičeno raztopino saharoze. | Preobrazba | 8. | Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje ličink začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. | Jajčna legla | 9. | Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za gojenje ličink trikrat tedensko preveriti zaradi morebitnih odloženih želatinastih jajčnih legel, ki jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jajčna legla se uporabijo za pripravo nove gojitvene posode (npr. 2 do 4 jajčna legla/posodo) ali za preskuse strupenosti. | 10. | Ličinke prvega stadija bi se morale izleči po 2 ali 3 dneh. | Priprava novih gojitvenih posod | 11. | Ko so gojišča vzpostavljena, bi moralo biti mogoče novo gojitveno posodo za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev preskušanja, stare posode pa odstraniti, ko se ličinke preobrazijo v odrasle osebke. S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi osebki. | Priprava preskusnih raztopin ‚M4‘ in ‚M7‘ | 12. | Elendt (1990) je opisal medij ‚M4‘. Medij ‚M7‘ se pripravi kot medij ‚M4‘, z izjemo snovi, navedenih v preglednici 1, za katere so koncentracije pri ‚M7‘ štirikrat nižje kot pri ‚M4‘. Publikacija o mediju ‚M7‘ je v pripravi (Elendt, osebno sporočilo). Preskusna raztopina se ne sme pripraviti po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 in K2HPO4, navedene za pripravo osnovnih raztopin, niso ustrezne. | Priprava medija ‚M7‘ | 13. | Vsaka osnovna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena osnovna raztopina (II) pa se pripravi iz teh osnovnih raztopin (I) (glej preglednico 1). V 50 ml sestavljene osnovne raztopine (II), ki ji je dodana količina vsake osnovne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v preglednici 2, se dolije deionizirana voda do 1 litra, da se pripravi medij ‚M7‘. Založna raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deionizirano vodo, kot je navedeno v preglednici 3, 0,1 ml sestavljene osnovne raztopine vitaminov pa se doda končnemu mediju ‚M7‘ malo pred uporabo. (Založna raztopina vitaminov se shranjuje zamrznjena v majhnih alikvotih.) Medij se prezračuje in stabilizira. | VIRI: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. | Preglednica 1 | Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7 | Založne raztopine (I) | Količina (mg) za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | Za pripravo sestavljene osnovne raztopine (II): zmešajte naslednje količine (ml) osnovnih raztopin (I) in dopolnite do 1 litra z deionizirano vodo | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (15) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (15) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (15) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (15) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (15) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (15) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (15) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (15) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (15) (16) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Preglednica 2 | Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7 | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina osnovnih raztopin makrohranilnih snovi za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Preglednica 3 | Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7. Vse tri raztopine vitaminov so združene v eno. | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina dodane osnovne raztopine vitaminov za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | Tiamin hidroklorid | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianokobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotin | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | VIRI: | Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. | Elendt, B. P. in Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. | Dodatek 3 | PRIPRAVA FORMULIRANE USEDLINE | Sestava usedline | Sestava formulirane usedline mora biti naslednja: | Sestavina | Značilnosti | Delež suhe | teže usedline v % | Šota | Šotni mah, čim bližje pH 5,5 do 6,0, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 1 mm) in sušen na zraku. | 4–5 | Kremenov pesek | Velikost zrn: > 50 % delcev mora biti velikih 50–200 μm. | 75–76 | Kaolinska glina | Vsebnost kaolinita ≥ 30 %. | 20 | Organski ogljik | Uravnava se z dodatkom šote in peska. | 2 (± 0,5) | Kalcijev karbonat | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. | 0,05–0,1 | Voda | Prevodnost ≤ 10 μS/cm. | 30–50 | Priprava | Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva naprava za homogenizacijo. pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj 2 dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sestavinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 do 50 % suhe teže usedline. pH končne mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO3. Vzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. | Shranjevanje | Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava konča. | VIRI: | Poglavje C.8 te priloge. Strupenost za deževnike. | Meller, M., Egeler, P., Rombke, J., Schallnass, H., Nagel, R., Streit, B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. | Dodatek 4 | Kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje | Snov | Koncentracije | Delci | < 20 mg/l | Celotni organski ogljik | < 2 mg/l | Neionizirani amoniak | < 1 μg /l | Trdota kot CaCO3 | < 400 mg/l (17) | Ostanek klora | < 10 μg /l | Skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/1 | Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/1 | Skupni organski klor | < 25 ng/1 | Dodatek 5 | Napotek za spremljanje preobrazbe ličink trzače | Na preskusne čaše se namestijo lovilniki za preobražene osebke. Potrebni so od 20. dne do konca preskusa. Primer lovilnika je narisan spodaj: | A: najlonska mrežica | B: obrnjen plastični lonček | C: poskusna čaša brez ustja | D: mrežasti okenci za izmenjavo vode | E: voda | F: usedlina | C.28 PRESKUS STRUPENOSTI S TRZAČAMI V SISTEMU VODE IN USEDLINE Z UPORABO VODE S PRIMEŠANO PRESKUSNO SNOVJO | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD TG 219 (2004). Zasnovana je za oceno učinkov daljše izpostavljenosti kemikalijam na ličinke sladkovodne trzače Chironomus sp., ki živijo v usedlinah. Temelji predvsem na smernici BBA, v kateri je scenarij izpostavljenosti uporaba sistema vode in usedline, sestavljenega iz umetne zemljine in vodnega stolpca (1). Upošteva tudi obstoječe protokole za preskušanje strupenosti za Chironomus riparius in Chironomus tentans, ki so bili razviti v Evropi in Severni Ameriki (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) ter krožno preskušeni (1) (6) (9). Uporabijo se lahko tudi druge dobro dokumentirane vrste trzače, npr. Chironomus yoshimatsui (10) (11). | 2. | Scenarij izpostavljenosti, uporabljen v tej preskusni metodi, je primešanje preskusne snovi v vodo. Izbira ustreznega scenarija izpostavljenosti je odvisna od namena uporabe preskusa. Scenarij izpostavljenosti, ki vključuje primešanje preskusne snovi v vodni stolpec, je namenjen simulaciji pojava zanašanja pesticidov in zajema začetne najvišje koncentracije v porni vodi. Uporaben je tudi za druge vrste izpostavljenosti (vključno z razlitji kemikalij), razen za procese kopičenja, ki trajajo dlje od preskusnega obdobja. | 3. | Snovi, ki jih je treba preskusiti v zvezi z organizmi, živečimi v usedlinah, se običajno v tem delu zelo dolgo obdržijo. Organizmi, živeči v usedlinah, so lahko izpostavljeni na številne načine. Relativni pomen vsakega načina izpostavljenosti in čas, da ta prispeva k skupnim strupenim učinkom, sta odvisna od fizikalno-kemijskih lastnosti zadevne kemikalije. Pri snoveh, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snoveh, ki se kovalentno vežejo na usedlino, je lahko zaužitje kontaminirane hrane pomemben način izpostavljenosti. Da ne bi podcenili strupenosti visoko lipofilnih snovi, se lahko predvidi uporaba hrane, dodane usedlini pred uporabo preskusne snovi. Da bi se upoštevali vsi morebitni načini izpostavljenosti, je ta preskusna metoda osredotočena na dolgoročno izpostavljenost. Preskus za C. riparius in C. yoshimatsui traja 20 do 28 dni, za C. tentans pa 28 do 65 dni. Če so za določen namen potrebni kratkoročni podatki, na primer da se raziščejo učinki nestabilne kemikalije, se lahko dodatne ponovitve umaknejo po 10 dneh. | 4. | Izmerjene končne točke so skupno število preobraženih odraslih osebkov in čas do preobrazbe. Če so potrebni dodatni kratkoročni podatki, je priporočljivo, da se preživetje in rast ličink izmerita šele po 10-dnevnem obdobju, po potrebi z dodatnimi ponovitvami. | 5. | Priporoča se uporaba formulirane usedline. Ta ima pred naravnimi usedlinami več prednosti: | — | variabilnost pri poskusih je manjša, saj formulirana usedlina pomeni ponovljivo ‚standardizirano matrico‘, poleg tega ni več treba iskati nekontaminiranih in čistih virov usedlin, | — | preskusi se lahko začnejo kadar koli, ne da bi se bilo treba ukvarjati s sezonsko variabilnostjo v preskusni usedlini, poleg tega usedline ni treba predhodno obdelati, da bi se odstranila domorodna favna; s formulirano usedlino se tudi znižajo stroški, povezani z zbiranjem zadostne količine usedline na terenu za rutinsko preskušanje, | — | uporaba formulirane usedline omogoča primerjave strupenosti in ustrezno razvrstitev snovi: podatki o strupenosti iz preskusov z naravnimi in umetnimi usedlinami so bili primerljivi za več kemikalij (2). | 6. | Uporabljene opredelitve pojmov so navedene v Dodatku 1. | NAČELO PRESKUSA | 7. | Ličinke trzače prvega stadija so izpostavljene razponu koncentracije preskusne kemikalije v sistemih vode in usedline. Preskus se začne z vnosom ličink prvega stadija v preskusne čaše, ki vsebujejo sistem vode in usedline, nato pa se preskusna snov primeša v vodo. Hitrost preobrazbe in razvoja trzač se izmerita ob koncu preskusa. Preživetje in teža ličink se lahko izmerita tudi po 10 dneh, če je to potrebno (z dodatnimi ponovitvami, kot je ustrezno). Ti podatki se analizirajo bodisi z regresijskim modelom, da se oceni koncentracija, ki bi povzročila x-odstotno zmanjšanje preobrazbe, preživetja ali rasti ličink (npr. EC15, EC50 itd.), bodisi s preskušanjem statističnih domnev za določitev NOEC/LOEC. Slednje zahteva primerjavo vrednosti učinkov s kontrolnimi vrednostmi, za kar se uporabijo statistični preskusi. | INFORMACIJE O PRESKUSNI SNOVI | 8. | Znani morajo biti vodotopnost preskusne snovi, njen parni tlak, izmerjeni ali izračunani koeficient porazdelitve v usedlini ter stabilnost v vodi in usedlini. Za določitev količine preskusne snovi v vodi nad usedlino, porni vodi in usedlini mora biti na voljo zanesljiva analitska metoda z znano in izpričano natančnostjo in mejo zaznave. Med Koristni informaciji sta tudi strukturna formula in čistost preskusne snovi. Prav tako je koristno poznati obnašanje preskusne snovi v okolju (npr. disipacija, abiotska in biotska razgradnja itd.). Dodatne smernice za preskušanje snovi s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, zaradi katerih je preskušanje oteženo, so navedene v (12). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 9. | Redno se lahko preskušajo referenčne kemikalije, da se tako zagotavlja zanesljivost protokola za preskušanje in preskusnih pogojev. Primeri referenčnih strupenih snovi, ki so bile uspešno uporabljene v krožnih preskusih in potrditvenih raziskavah, so: lindan, trifluralin, pentaklorofenol, kadmijev klorid in kalijev klorid (1) (2) (5) (6) (13). | VELJAVNOST PRESKUSA | 10. | Za veljavnost preskusa morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji: | — | preobrazba v kontrolnih posodah ob koncu preskusa mora biti vsaj 70-odstotna (1) (6), | — | C. riparius in C. yoshimatsui v kontrolnih posodah se morajo v odrasle osebke preobraziti med 12. in 23. dnem po vnosu v posode; C. tentans potrebujejo 20 do 65 dni, | — | ob koncu preskusa je treba v vsaki posodi izmeriti pH in koncentracijo raztopljenega kisika. Koncentracija kisika mora biti vsaj 60 % nasičenosti zraka (ASV) pri uporabljeni temperaturi, pH vode nad usedlino pa mora biti v vseh preskusnih posodah med 6 in 9, | — | temperatura vode se ne sme razlikovati za več kot ± 1,0 °C. Temperaturo vode bi bilo mogoče nadzorovati z izotermalnim prostorom; v takem primeru je treba temperaturo v prostoru potrjevati v ustreznih časovnih presledkih. | OPIS METODE | Preskusne posode | 11. | Raziskava se izvaja v steklenih 600-mililitrskih čašah z 8-centimetrskim premerom. Primerne so tudi druge posode, vendar morajo zagotavljati primerno globino usedline in vode nad njo. Površina usedline mora biti dovolj velika, da zagotavlja 2 do 3 cm2 na ličinko. Razmerje med debelino usedline in globino vode nad njo mora biti 1 : 4. Preskusne posode in druge naprave, ki bodo prišle v stik s preskusnim sistemom, morajo biti v celoti iz stekla ali drugega kemijsko inertnega materiala (npr. teflona). | Izbira vrst | 12. | Če je mogoče, naj se v preskusu uporabi vrsta Chironomus riparius. Chironomus tentans je prav tako primerna, vendar je z njo težje delati in zahteva daljše preskusno obdobje. Uporabi se lahko tudi Chironomus yohimatsui. Podrobnosti o metodah gojenja za Chironomus riparius so navedene v Dodatku 2. Informacije o pogojih gojenja so na voljo tudi za druge vrste, npr. Chironomus tentans (4) in Chironomus yoshimatsui (11). Identifikacijo vrst je treba potrditi pred preskusom, ni pa to potrebno pred vsakim preskusom, če organizmi prihajajo iz internega gojišča. | Usedlina | 13. | Če je mogoče, je treba uporabiti formulirano usedlino (imenovano tudi rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina). Če se uporabi naravna usedlina, je treba določiti njene lastnosti (vsaj pH in vsebnost organskega ogljika, priporoča se tudi določitev drugih parametrov, kot sta razmerje C/N in granulometrija), poleg tega ne sme biti onesnažena in ne sme vsebovati drugih organizmov, ki bi lahko tekmovali s trzačami ali jih požrli. Prav tako se priporoča, naj se naravna usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. Za uporabo v tem preskusu (1) (15) (16) se priporoča naslednja formulirana usedlina, ki temelji na umetni zemljini, uporabljeni v preskusni metodi C.8 (14): | (a) | 4–5 % (suhe teže) šote: čim bližje vrednosti pH 5,5 do 6,0; pomembno je uporabiti fino mleto šoto v prahu (velikost delcev ≤ 1 mm), sušeno samo na zraku; | (b) | 20 % (suhe teže) kaolinske gline (vsebnost kaolinita po možnosti nad 30 %); | (c) | 75–76 % (suhe teže) kremenovega peska (prevladovati mora fini pesek, pri katerem je več kot 50 % delcev velikih 50 do 200 μm); | (d) | doda se deionizirana voda, tako da je v končni mešanici vlaga 30- do 50-odstotna; | (e) | doda se kemijsko čist kalcijev karbonat (CaCO3), da se pH v končni mešanici usedline uravna na 7,0 ± 0,5; | (f) | vsebnost organskega ogljika v končni mešanici mora biti 2 % (± 0,5 %), uravnava pa se z ustreznimi količinami šote in peska v skladu s točkama (a) in (c). | 14. | Vir šote, kaolinske gline in peska mora biti znan. Preveriti je treba, da sestavine usedline niso kemično onesnažene (npr. da ne vsebujejo težkih kovin, organoklornih spojin, organofosfornih spojin itd.). Primer priprave formulirane usedline je opisan v Dodatku 3. Sprejemljiva je tudi mešanica suhih sestavin, če se dokaže, da se sestavine usedline po dodatku vode nad usedlino ne začnejo ločevati (npr. lebdenje šotnih delcev) in da je šota ali usedlina zadostno kondicionirana. | Voda | 15. | Za preskusno vodo je primerna vsaka voda, ki ustreza kemijskim značilnostim sprejemljive vode za redčenje, ki so navedene v dodatkih 2 in 4. Za gojiščno vodo in preskusno vodo je sprejemljiva vsaka primerna voda, naravna voda (površinska ali podzemna voda), obdelana voda (glej Dodatek 2) ali deklorirana vodovodna voda, če trzače čas gojenja in preskušanja v njej preživijo brez znakov stresa. Na začetku preskusa mora biti pH preskusne vode med 6 in 9, skupna trdota pa ne sme biti višja od 400 mg/l kot CaCO3. Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). Ves čas raziskave je treba uporabljati isto vrsto vode. Lastnosti vode, navedene v Dodatku 4, je treba izmeriti vsaj dvakrat na leto ali kadar se sumi, da so se morda te lastnosti bistveno spremenile. | Založne raztopine – voda s primešano preskusno snovjo | 16. | Preskusne koncentracije se izračunajo na podlagi koncentracij v vodnem stolpcu, tj. vodi nad usedlino. Preskusne raztopine izbranih koncentracij se običajno pripravijo z redčenjem osnovne raztopine. Založne raztopine je po možnosti treba pripraviti tako, da se preskusna snov raztopi v preskusnem mediju. V nekaterih primerih bo morda treba uporabiti topila ali disperzijska sredstva, da se pripravi primerno koncentrirana osnovna raztopina. Primerna topila so na primer aceteon, etanol, metanol, etilen glikol monoetil eter, etilen glikol dimetil eter, dimetil formamid in trietilen glikol. Disperzijska sredstva, ki se lahko uporabijo, so Cremaphor RH40, Tween 80, metil celuloza 0,01 % in HCO-40. Koncentracija topila v končnem preskusnem mediju mora biti minimalna (tj. ≤ 0,1 ml/l) in mora biti enaka v vseh posodah s preskusno snovjo. Kadar se uporabi topilo, to ne sme bistveno vplivati na preživetje ličink trzače ali imeti vidnih škodljivih učinkov nanje, kar se pokaže s kontrolno enoto, v kateri je le topilo. Vendar si je treba čim bolj prizadevati, da se taki materiali ne uporabijo. | NAČRT PRESKUSA | 17. | Načrt preskusa se nanaša na izbiro števila preskusnih koncentracij in razmikov med njimi, število posod za vsako koncentracijo in število ličink na posodo. Opisani so načrti za točkovno oceno EC, oceno NOEC in izvedbo mejnega preskusa. Regresijska analiza je primernejša od pristopa s preskušanjem domnev. | Načrt preskusa za regresijsko analizo | 18. | S koncentracijami, vključenimi v preskus, bi morala biti zajeta efektivna koncentracija (npr. EC15, EC50) in razpon koncentracije, v katerem je zanimiv vpliv preskusne snovi. Na splošno se natančnost in zlasti veljavnost, ki ju je mogoče doseči pri ocenah efektivnih koncentracij (ECx), izboljšata, kadar je efektivna koncentracija v okviru preskušanega razpona koncentracij. Izogibati se je treba ekstrapolaciji veliko pod najnižjo pozitivno koncentracijo ali veliko nad najvišjo koncentracijo. Kot pomoč pri izbiri razpona koncentracij, ki bo uporabljen (glej odstavek 27), se lahko izvede predhodni preskus za ugotavljanje razpona. | 19. | Če je treba oceniti ECx, je treba preskusiti vsaj 5 koncentracij in izvesti 3 ponovitve za vsako koncentracijo. Vsekakor je priporočljivo uporabiti dovolj preskusnih koncentracij, da se omogoči dobra ocena modela. Faktor med koncentracijami ne sme biti večji od 2 (izjema je dopustna, kadar naklon krivulje odmerek-učinek ni strm). Število ponovitev na posamezno posodo s preskusno snovjo se lahko zmanjša, če se poveča število preskusnih koncentracij z različnimi učinki. Povečanje števila ponovitev ali zmanjšanje velikosti razmikov med preskusnimi koncentracijami običajno vodi do ožjih intervalov zaupanja za preskus. Dodatne ponovitve so potrebne, če se ocenjujeta 10-dnevno preživetje in rast ličink. | Načrt za oceno NOEC/LOEC | 20. | Če je treba oceniti LOEC/NOEC, bi bilo treba uporabiti pet preskusnih koncentracij in izvesti vsaj štiri ponovitve, faktor med koncentracijami pa ne sme biti večji od 2. Število ponovitev mora zadostovati, da se zagotovi ustrezna statistična vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Pri hitrosti razvoja je običajno ustrezna analiza variance (ANOVA), kot sta Dunnettov preskus in Williamsov preskus (17) (18) (19) (20). Pri koeficientu preobrazbe se lahko uporabijo Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (z Bonferronijevim popravkom) ali Mantel-Haenszelov preskus. | Mejni preskus | 21. | Če v predhodnem preskusu za ugotavljanje razpona ni bilo opaženih učinkov, se lahko opravi mejni preskus (ena preskusna koncentracija in kontrolna enota). Namen mejnega preskusa je pokazati, da je toksična vrednost preskusne snovi večja od preskušene mejne koncentracije. Pri tej preskusni metodi priporočene koncentracije ni mogoče predlagati; to je prepuščeno presoji regulatorjev. Običajno je potrebnih vsaj šest ponovitev za preskusne in kontrolne posode. Izkazati je treba ustrezno statistično vrednost za ugotovitev 20-odstotne razlike v primerjavi s kontrolno enoto pri 5-odstotni stopnji značilnosti (p = 0,05). Kar zadeva učinek na hitrost razvoja in težo, je t-preskus primerna statistična metoda, če podatki izpolnjujejo zahteve tega preskusa (normalnost, homogenost varianc). Če te zahteve niso izpolnjene, se lahko uporabi t-preskus za neenake variance ali neparametrični preskus, kot je Wilcoxon-Mann-Whitneyjev preskus. Pri koeficientu preobrazbe je primeren Fisherjev eksaktni preskus. | POSTOPEK | Pogoji izpostavljenosti | Priprava sistema vode in usedline, v katerem je preskusna snov primešana v vodo | 22. | V preskusne posode se dodajo ustrezne količine formulirane usedline (glej odstavka 13 in 14 ter Dodatek 3), da nastane plast, debela vsaj 1,5 cm. Doda se voda do globine 6 cm (glej odstavek 15). Razmerje med debelino usedline in globino vode ne sme biti večje od 1 : 4, usedlina pa ne sme biti debelejša od 3 cm. Sistem vode in usedline je treba sedem dni rahlo prezračevati, preden se dodajo preskusni organizmi (glej odstavek 14 in Dodatek 3). Da se prepreči ločevanje sestavin usedline in ponovna suspenzija finega materiala med dodajanjem preskusne vode v vodni stolpec, se lahko usedlina med točenjem vode prekrije s plastičnim pokrovom, ki se takoj nato odstrani. Primerna so lahko tudi druga sredstva. | 23. | Preskusne posode je treba pokriti (npr. s steklenimi ploščami). Po potrebi se med raziskavo voda dotoči do prvotne količine, da se nadomesti izhlapela voda. Za to je treba uporabiti destilirano ali deionizirano vodo, da se prepreči kopičenje soli. | Dodajanje preskusnih organizmov | 24. | Od 4 do 5 dni pred vnosom preskusnih organizmov v preskusne posode je treba iz gojišč vzeti jajčna legla in jih vstaviti v majhne posode v gojitvenem mediju. Uporabi se lahko starejši medij iz osnovne kulture ali sveže pripravljeni medij. Če se uporabi slednji, je treba v gojitveni medij dodati majhno količino hrane, npr. zelenih alg in/ali nekaj kapljic filtrata suspenzije iz fino mlete ribje hrane v kosmičih (glej Dodatek 2). Uporabiti je treba samo sveže odložena jajčna legla. Običajno se ličinke izležejo nekaj dni po tem, ko so bila jajčeca odložena (2 do 3 dni za Chironomus riparius pri 20 °C ter 1 do 4 dni za Chironomus tentans pri 23 °C in Chironomus yoshimatsui pri 25 °C), rast ličink pa poteka v 4 stadijih, od katerih vsak traja 4 do 8 dni. V preskusu je treba uporabiti ličinke prvega stadija (2 do 3 ali 1 do 4 dni po tem, ko se izležejo). Stadij trzač se lahko po možnosti preveri z merjenjem širine glave (6). | 25. | 20 ličink prvega stadija se s topo pipeto naključno vnese v vsako preskusno posodo, ki vsebuje usedlino in vodo s primešano preskusno snovjo. Med dodajanjem ličink v preskusne posode je treba ustaviti prezračevanje vode, ki se ne sme izvajati še 24 ur po tem, ko so bile ličinke dodane (glej odstavka 24 in 32). Glede na uporabljeni načrt preskusa (glej odstavka 19 in 20) se za točkovno oceno EC uporabi vsaj 60 ličink na koncentracijo, za določitev NOEC pa 80. | 26. | 24 ur po vnosu ličink se preskusna snov vmeša v vodni stolpec nad usedlino, znova se zagotovi prezračevanje. Pod površino vodnega stolpca se s pipeto vnesejo majhne količine raztopine preskusne snovi. Vodo nad usedlino je nato treba premešati, pri čemer je treba paziti, da se ne premeša še usedlina. | Preskusne koncentracije | 27. | Preskus za ugotavljanje razpona je lahko koristen za določitev razpona koncentracij za končni preskus. Za ta namen se uporabi niz široko razmaknjenih koncentracij preskusne snovi. Da se zagotovi enaka gostota površine na trzačo, kot bo uporabljena za končni preskus, se trzače izpostavijo vsaki koncentraciji preskusne snovi za obdobje, ki omogoča oceno ustreznih preskusnih koncentracij, pri čemer ponovitve niso potrebne. | 28. | Preskusne koncentracije za končni preskus se določijo na podlagi rezultata preskusa za ugotavljanje razpona. Izbrati in uporabiti je treba vsaj pet koncentracij, kot je opisano v odstavkih 18 do 20. | Kontrolne enote | 29. | V preskus je treba vključiti kontrolne posode, v katerih ni preskusne snovi, toda ki vsebujejo usedlino, z ustreznim številom ponovitev (glej odstavka 19 in 20). Če je bilo za aplikacijo preskusne snovi uporabljeno topilo (glej odstavek 16), je treba dodati kontrolno posodo, katere usedlina vsebuje tudi topilo. | Preskusni sistem | 30. | Uporabljajo se statični sistemi. Polstatični ali pretočni sistemi z občasnim ali kontinuiranim obnavljanjem vode nad usedlino se lahko uporabijo v izjemnih primerih, na primer če specifikacije kakovosti vode postanejo neprimerne za preskusni organizem ali vplivajo na kemijsko ravnotežje (npr. ravni raztopljenega kisika se preveč znižajo, koncentracija izločkov se preveč poviša ali minerali iztekajo iz usedline in vplivajo na pH in/ali trdoto vode). Vendar za izboljšanje kakovosti vode nad usedlino običajno zadoščajo in se prednostno uporabljajo druge metode, kot je prezračevanje. | Hrana | 31. | Ličinke je treba hraniti, po možnosti vsak dan ali vsaj trikrat na teden. Za mlade ličinke v prvih desetih dneh ustreza 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg za C. yoshimatsui) ribje hrane (suspenzija v vodi ali fino mleta hrana, npr. TetraMin ali TetraPhyll; glej podrobnosti v Dodatku 2) na ličinko na dan. Nekoliko več hrane bodo morda potrebovale starejše ličinke: za preostanek preskusa mora zadostovati 0,5–1 mg na ličinko na dan. Obrok hrane je treba zmanjšati v vseh preskusnih in kontrolnih posodah, če se opazi rast glivic ali smrtnost v kontrolnih posodah. Če razvoja glivic ni mogoče ustaviti, je treba preskus ponoviti. Kadar se preskušajo snovi, ki se močno adsorbirajo (npr. z log Kow > 5), ali snovi, ki se kovalentno vežejo na usedlino, se lahko količina hrane, potrebna za zagotovitev preživetja in naravne rasti organizmov, doda formulirani usedlini pred obdobjem stabilizacije. Za to je treba namesto ribje hrane uporabiti rastlinski material, npr. dodatek 0,5 % (suhe teže) fino mletih listov npr. velike koprive (Urtica dioica), bele murve (Morus alba), plazeče detelje (Trifolium repens), špinače (Spinacia oleracea) ali drugega rastlinskega materiala (Cerophyl ali alfa celuloza). | Pogoji inkubacije | 32. | Zagotovi se rahlo prezračevanje vode nad usedlino v preskusnih posodah, po možnosti 24 ur po vnosu ličink, in se izvaja ves čas preskusa (paziti je treba, da koncentracija raztopljenega kisika ne pade pod 60 % ASV). Prezračevanje se zagotavlja prek steklene pasteurjeve pipete, pritrjene 2 do 3 cm nad plastjo usedline (tj. 1 ali nekaj mehurčkov/s). Kadar se preskušajo hlapne kemikalije, je mogoče razmisliti o tem, da se sistem vode in usedline ne bi prezračeval. | 33. | Preskus se izvaja pri konstantni temperaturi 20 °C (± 2 °C). Za C. tentans in C. yoshimatsui sta priporočeni temperaturi 23 °C oziroma 25 °C (± 2 °C). Uporablja se 16-urno obdobje osvetljenosti, jakost svetlobe pa mora biti 500 do 1 000 lux. | Trajanje izpostavljenosti | 34. | Izpostavljenost se začne z vnosom ličink v posode s primešano preskusno snovjo in kontrolne posode. Najdaljši čas izpostavljenosti za C. riparius in C. yoshimatsui je 28 dni, za C. tentans pa 65 dni. Če se ličinke v odrasle osebke preobrazijo prej, se lahko preskus konča najmanj pet dni po preobrazbi zadnjega odraslega osebka v kontrolni posodi. | OPAŽANJA | Preobrazba | 35. | Določita se čas razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. | 36. | Preskusne posode je treba opazovati vsaj trikrat na teden, da se ugotovi kakršno koli neobičajno obnašanje (npr. zapuščanje usedline, nenavadno plavanje) v primerjavi s kontrolno posodo. V obdobju pričakovane preobrazbe je potrebno dnevno štetje preobraženih trzač. Spol in število v celoti preobraženih trzač se zapišeta dnevno. Po identifikaciji se trzače odstranijo iz posod. Vsa jajčna legla, odložena pred zaključkom preskusa, je treba evidentirati in nato odstraniti, da se prepreči vnovični vnos ličink v usedlino. Evidentira se tudi število vidnih bub, ki se niso preobrazile. Napotek za spremljanje preobrazbe je v Dodatku 5. | Rast in preživetje | 37. | Če je treba zagotoviti podatke o 10-dnevnem preživetju in rasti ličink, je treba na začetku vključiti dodatne preskusne posode, ki se lahko uporabijo pozneje. Usedlina iz teh dodatnih posod se preseje skozi sito z 250 μm velikimi luknjicami, da se zadržijo ličinke. Merili za pogin sta negibnost ali neodzivnost na mehanske dražljaje. Ličinke, ki ostanejo v usedlini, je prav tako treba šteti za mrtve (ličinke, ki so poginile na začetku preskusa, so morda razgradili mikrobi). Določi se suha teža (brez pepela) preživelih ličink na preskusno posodo in izračuna srednja suha teža posamezne ličinke na posodo. Koristno je določiti, v kateri stadij spadajo preživele ličinke; za to se lahko izmeri širina glave vsakega osebka. | Analitske meritve | Koncentracija preskusne snovi | 38. | Na začetku (po možnosti 1 uro po vnosu preskusne snovi) in koncu preskusa je treba analizirati vsaj vzorce vode nad usedlino, porne vode in usedline, in sicer pri najvišji in nižji koncentraciji. Te določitve koncentracije preskusne snovi pokažejo obnašanje/porazdelitev preskusne snovi v sistemu vode in usedline. Vzorčenje usedline na začetku preskusa lahko vpliva na preskusni sistem (npr. odstranitev preskusnih ličink), zato je treba za analitske določitve na začetku preskusa in med njim po potrebi uporabiti dodatne preskusne posode (glej odstavek 39). Meritve v usedlini morda ne bodo potrebne, če je bila porazdelitev preskusne snovi med vodo in usedlino jasno določena z raziskavo vode/usedline v primerljivih pogojih (npr. razmerje usedline in vode, vrsta uporabe, vsebnost organskega ogljika v usedlini). | 39. | Kadar se izvajajo vmesne meritve (npr. sedmi dan) in če so za analize potrebni veliki vzorci, ki jih ni mogoče vzeti iz preskusnih posod, ne da bi to vplivalo na preskusni sistem, je treba analitske določitve izvesti na vzorcih iz dodatnih preskusnih posod, ki se obdelujejo enako (vključno s prisotnostjo preskusnih organizmov), vendar se za biološka opažanja ne uporabljajo. | 40. | Za izolacijo intersticijske vode se priporoča 30-minutno centrifugiranje pri npr. 10 000 g in 4 °C. Če pa se za preskusno snov izkaže, da se ne adsorbira na filtre, je sprejemljivo tudi filtriranje. V nekaterih primerih morda koncentracij v porni vodi zaradi premajhnega vzorca ne bo mogoče analizirati. | Fizikalno-kemijski parametri | 41. | Vrednost pH, raztopljeni kisik v preskusni vodi in temperaturo preskusnih posod je treba ustrezno meriti (glej odstavek 10). Trdoto in amonij je treba izmeriti v kontrolnih posodah in eni preskusni posodi pri najvišji koncentraciji na začetku in koncu preskusa. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 42. | Namen tega preskusa je določiti učinek preskusne snovi na hitrost razvoja in skupno število v celoti preobraženih samcev in samic trzače oziroma, pri 10-dnevnem preskusu, učinke na preživetje in težo ličink. Če ni znakov o statistično različni občutljivosti spolov, se lahko rezultati za samce in samice za statistične analize združijo. Razlike v občutljivosti med spoloma je mogoče statistično oceniti, na primer s preskusom χ2-r × 2. Po potrebi je treba po 10 dneh določiti preživetje ličink in srednjo suho težo posamezne ličinke na posodo. | 43. | Če je mogoče, se efektivne koncentracije, izražene kot koncentracije v vodi nad usedlino, izračunajo na podlagi izmerjenih koncentracij na začetku preskusa (glej odstavek 38). | 44. | Za točkovno oceno EC50 ali druge ECx se lahko statistični podatki po posameznih posodah uporabijo kot dejanske ponovitve. Pri izračunu intervala zaupanja za ECx je treba upoštevati variabilnost med posodami ali pa dokazati, da je ta zanemarljiva. Če se model prilega po metodi najmanjših kvadratov, je treba statistične podatke po posameznih posodah transformirati, da se izboljša homogenost variance. Vendar je treba vrednosti ECx izračunati po tem, ko so bili rezultati transformirani nazaj na prvotno vrednost. | 45. | Kadar je namen statistične analize določiti NOEC/LOEC s preskušanjem domnev, je treba upoštevati variabilnost med posodami, npr. z vgnezdeno ANOVO. Alternativno se lahko uporabijo robustnejši preskusi (21), kadar so običajne predpostavke ANOVE kršene. | Koeficient preobrazbe | 46. | Koeficient preobrazbe da odgovor ‚vse ali nič‘ in se lahko analizira s Cochran-Armitageevim preskusom, uporabljenim regresivno (step-down), kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in so ti podatki v skladu s tem pričakovanjem. Če niso, se lahko uporabi Fisherjev eksaktni preskus ali Mantel-Haenszelov preskus z Bonferroni-Holmovimi popravljenimi p-vrednostmi. Če se izkaže, da je variabilnost med ponovitvami v okviru iste koncentracije večja, kot bi kazala binomska porazdelitev (pogosto imenovana ‚ekstra-binomska‘ variacija), potem je treba uporabiti robustni Cochran-Armitageev preskus ali Fisherjev eksaktni preskus, kot je predlagano v (21). | 47. | Vsota preobraženih trzač na posodo ne se določi in deli s številom vnesenih ličink na: | pri čemer je: | ER | = | koeficient preobrazbe, | ne | = | število preobraženih trzač na posodo, | na | = | število vnesenih ličink na posodo. | 48. | Druga možnost, ki je najprimernejša za velike vzorce, kadar obstaja ekstra binomska varianca, je, da se koeficient preobrazbe obravnava kot zvezni odgovor in se uporabijo postopki, kot je Williamsov preskus, kadar se pričakuje monotono razmerje odmerek-učinek in kadar podatki ER potrjujejo to predpostavko. Dunettov preskus je primeren, kadar monotonost ne drži. Velik vzorec je tu opredeljen kot število preobraženih osebkov in število nepreobraženih osebkov po posameznih ponovitvah (posodah), pri čemer je obojih več kot pet. | 49. | Za uporabo metod ANOVA je treba vrednosti ER najprej transformirati z arkus sinus-korensko transformacijo ali Freeman-Tukeyevo transformacijo, da se dobi približna normalna porazdelitev in da se variance izenačijo. Cochran-Armitageev preskus, Fisherjev eksaktni preskus (Bonferroni) ali Mantel-Haenszelov preskus se lahko uporabijo, kadar se uporabljajo absolutne pogostosti. Pri arkus sinus-korenski transformaciji se izračuna arkus sinus (sin–1) kvadratnega korena ER. | 50. | Za koeficiente preobrazbe se vrednosti ECx izračunajo z regresijsko analizo (ali npr. probit (22), logit, Weibull, ustrezno programsko opremo itd.). Če regresijska analiza ni uspešna (npr. kadar sta manj kot dva delna odgovora), se uporabijo druge neparametrične metode, kot sta drseče povprečje ali linearna interpolacija. | Hitrost razvoja | 51. | Srednji čas razvoja pomeni srednji časovni razpon med vnosom ličink (dan 0 preskusa) in preobrazbo poskusne kohorte trzač. (Za izračun dejanskega časa razvoja je treba upoštevati starost ličink ob vnosu.) Hitrost razvoja je obratna času razvoja (enota: 1/dan) in predstavlja tisti delež razvoja ličink, ki se zgodi na dan. Za oceno teh raziskav strupenosti v usedlini je primernejša hitrost razvoja, saj je njena varianca manjša, poleg tega je bolj homogena in bližje normalni porazdelitvi v primerjavi s časom razvoja. Zato so učinkoviti parametrični preskusi primernejši za hitrost razvoja kot za čas razvoja. Če se hitrost razvoja obravnava kot zvezni odgovor, se lahko vrednosti ECx ocenijo z regresijsko analizo (npr. (23) (24)). | 52. | Za naslednje statistične preskuse se za število trzač, opaženih na dan opazovanja x, domneva, da so se preobrazile na sredini časovnega intervala med dnevom × in dnevom x – 1 (l = dolžina intervala opazovanja, običajno 1 dan). Srednja hitrost razvoja na posodo (x) se izračuna z enačbo: | pri čemer je: | : | srednja hitrost razvoja na posodo, | i | : | indeks intervala opazovanja, | m | : | največje število intervalov opazovanja, | : | število trzač, preobraženih v intervalu opazovanja i, | ne | : | skupno število preobraženih trzač ob koncu poskusa, (= | ) | x | : | hitrost razvoja trzač, preobraženih v intervalu i. | pri čemer je: | dayi | : | dan opazovanja (dnevi od vnosa), | li | : | dolžina intervala opazovanja i (dnevi, običajno 1 dan). | Poročilo o preskusu | 53. | V poročilu o preskusu morajo biti vsaj naslednje informacije: | | Preskusna snov: | — | fizikalno stanje, in kjer je ustrezno, fizikalno-kemijske lastnosti (vodotopnost, parni tlak, porazdelitveni koeficient v tleh (ali v usedlini, če je na voljo), stabilnost v vodi itd.), | — | kemijski identifikacijski podatki (splošno ime, kemijsko ime, strukturna formula, številka CAS itd.), vključno s čistostjo in analitsko metodo za količinsko določanje preskusne snovi. | | Preskusne vrste: | — | uporabljene preskusne živali: vrsta, znanstveno ime, vir organizmov in pogoji razmnoževanja, | — | informacije o ravnanju z jajčnimi legli in ličinkami, | — | starost preskusnih živali ob vnosu v preskusne posode. | | Preskusni pogoji: | — | uporabljena usedlina, tj. naravna ali formulirana, | — | za naravno usedlino lokacija in opis mesta vzorčenja usedline, vključno, če je mogoče, s preteklim onesnaženjem, značilnosti: pH, vsebnost organskega ogljika, razmerje C/N in granulometrija (če je ustrezno), | — | priprava formulirane usedline: sestavine in značilnosti (vsebnost organskega ogljika, pH, vlaga itd. na začetku preskusa), | — | priprava preskusne vode (če se uporablja obdelana voda) in značilnosti (koncentracija kisika, pH, prevodnost, trdota itd. na začetku preskusa), | — | globina usedline in vode nad njo, | — | količina vode nad usedlino in porne vode; teža mokre usedline s porno vodo in brez nje, | — | preskusne posode (material in velikost), | — | način priprave osnovnih raztopin in preskusnih koncentracij, | — | uporaba preskusne snovi: uporabljene preskusne koncentracije, število ponovitev in uporaba topila, če je bilo uporabljeno, | — | pogoji inkubacije: temperatura, svetlobni ciklus in jakost svetlobe, prezračevanje (pogostost in jakost), | — | podrobne informacije o hranjenju, vključno z vrsto hrane, pripravo, količino in načinom. | | Rezultati: | — | nazivne preskusne koncentracije, izmerjene preskusne koncentracije in rezultati vseh analiz za določitev koncentracije preskusne snovi v preskusni posodi, | — | kakovost vode v preskusnih posodah, tj. pH, temperatura, raztopljeni kisik, trdota in amonij, | — | morebitna nadomestitev izhlapele preskusne vode, | — | število preobraženih samcev in samic trzače na posodo in na dan, | — | število ličink, ki se niso preobrazile v trzače, na posodo, | — | srednja suha teža posamezne ličinke na posodo in po stadijih, če je ustrezno, | — | delež preobrazbe na ponovitev in preskusno koncentracijo (združeni samci in samice trzače), | — | srednja hitrost razvoja v celoti preobraženih trzač na ponovitev in stopnjo koncentracije (združeni samci in samice trzače), | — | ocene strupenih končnih točk, npr. ECx (in s tem povezani intervali zaupanja), NOEC in/ali LOEC, ter statistične metode, uporabljene za njihovo določitev, | — | obravnava rezultatov, vključno z vsemi vplivi na rezultat preskusa, ki izvirajo iz odstopanj od te preskusne metode. | VIRI: | (1) | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. | (2) | Fleming, R., idr. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Končno poročilo za Evropsko komisijo. Poročilo št.: EC 3738. Avgust 1994. WRc, Združeno kraljestvo. | (3) | SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Z delavnice WOSTA, ki je potekala na Nizozemskem. | (4) | ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. V ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 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Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. | (14) | Poglavje C.8 te priloge, Strupenost za deževnike. | (15) | Suedel, B. C., in Rodgers, J. H. (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163–1175. | (16) | Naylor, C., in Rodrigues, C. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303. | (17) | Dunnett, C. W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121. | (18) | Dunnett, C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482–491. | (19) | Williams, D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. 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Sci. 66: 298–312. | Dodatek 1 | OPREDELITEV POJMOV | Za to metodo se uporabljajo naslednje opredelitve pojmov: | | formulirana usedlina ali rekonstituirana, umetna ali sintetična usedlina je zmes snovi, uporabljenih za posnemanje fizičnih sestavin naravne usedline; | | voda nad usedlino je voda, ki se nalije nad usedlino v preskusni posodi; | | intersticijska voda ali porna voda je voda, ki zavzema prostor med delci usedline in zemljine; | | voda s primešano snovjo je preskusna voda, ki ji je bila dodana preskusna snov; | | preskusna kemikalija je snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Priporočila za gojenje Chironomus riparius | 1. | Ličinke Chironomus se lahko gojijo v kristalizirkah ali večjih vsebnikih. Na dno vsebnika se nanese tanka plast finega kremenovega peska (debela približno 5 do 10 mm). Za primeren substrat se je izkazal tudi kieselguhr (npr. Merck, Art 8117) (zadošča tanjša plast, debela samo nekaj mm). Nato se doda primerna voda do globine več cm. Vodo je treba po potrebi dotočiti, da se nadomestijo izgube zaradi izhlapevanja in prepreči izsušitev. Voda se po potrebi lahko zamenja. Zagotoviti je treba rahlo prezračevanje. Posode, v katerih se gojijo ličinke, morajo biti v primerni kletki, ki bo preprečila pobeg odraslih preobraženih osebkov. Kletka mora biti dovolj velika, da lahko preobraženi odrasli osebki rojijo, sicer se lahko zgodi, da ne bo parjenja (najmanjša velikost je približno 30 × 30 × 30 cm). | 2. | Kletke morajo biti v prostoru s sobno temperaturo ali prostoru s stalnim ozračjem pri 20 ± 2 °C s 16-urnim obdobjem svetlobe (jakost približno 1 000 lux) in 8-urno temo. Po poročilih lahko manj kot 60-odstotna relativna vlažnost zraka ovira razmnoževanje. | Voda za redčenje | 3. | Uporabi se lahko vsaka primerna naravna ali sintetična voda. Običajno se uporabljajo voda iz vodnjaka, deklorirana vodovodna voda in umetni mediji (npr. medij Elendt ‚M4‘ ali ‚M7‘, glej spodaj). Vodo je treba pred uporabo prezračiti. Voda za gojenje se lahko po potrebi obnovi, tako da se uporabljena voda iz gojitvenih posod skrbno pretoči ali izsesa, ne da bi pri tem uničili ovoj ličink. | Hranjenje ličink | 4. | Ličinke Chironomus je treba hraniti s približno 250 mg ribje hrane v kosmičih (TetraMin®, TetraPhyll® ali druga podobna zaščitena znamka ribje hrane) na posodo na dan. Hrana se lahko daje v obliki suhega mletega prahu ali kot suspenzija v vodi: 1,0 g hrane v kosmičih se doda 20 ml vode za redčenje in zmeša, da nastane homogena mešanica. Ta pripravek se lahko daje v količini približno 5 ml na posodo na dan (pred uporabo ga je treba pretresti). Starejše ličinke lahko dobijo več hrane. | 5. | Hranjenje se prilagaja kakovosti vode. Če gojitveni medij postane ‚moten‘, je treba hranjenje zmanjšati. Dodajanje hrane je treba skrbno spremljati. Premalo hrane bo povzročilo selitev ličink v vodni stolpec, preveč hrane pa povečano mikrobno dejavnost in zmanjšane koncentracije kisika. Oboje lahko privede do počasnejše rasti. | 6. | Ko se pripravijo nove gojitvene posode, se lahko dodajo tudi celice nekaterih zelenih alg (npr. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris). | Hranjenje preobraženih odraslih osebkov | 7. | Nekateri raziskovalci so predlagali, da se lahko kot hrana za odrasle preobražene osebke uporabi vatna blazinica, namočena v nasičeno raztopino saharoze. | Preobrazba | 8. | Pri 20 ± 2 °C se bo preobrazba v odrasle osebke iz posod za gojenje ličink začela po približno 13 do 15 dneh. Samce je mogoče preprosto prepoznati po pahljačastih tipalkah. | Jajčna legla | 9. | Ko so v kletki za razmnoževanje odrasli osebki, je treba vse posode za gojenje ličink trikrat tedensko preveriti zaradi morebitnih odloženih želatinastih jajčnih legel, ki jih je treba previdno odstraniti. Prenesti jih je treba v majhno posodo, ki vsebuje vzorec vode za razmnoževanje. Jajčna legla se uporabijo za pripravo nove gojitvene posode (npr. 2 do 4 jajčna legla/posodo) ali za preskuse strupenosti. | 10. | Ličinke prvega stadija bi se morale izleči po 2 ali 3 dneh. | Priprava novih gojitvenih posod | 11. | Ko so gojišča vzpostavljena, bi moralo biti mogoče novo gojitveno posodo za ličinke pripraviti vsak teden ali manj pogosto, odvisno od zahtev preskušanja, stare posode pa odstraniti, ko se ličinke preobrazijo v odrasle osebke. S takim sistemom bo najpreprosteje zagotovljena redna oskrba z odraslimi osebki. | Priprava preskusnih raztopin ‚M4‘ in ‚M7‘ | 12. | Elendt (1990) je opisal medij ‚M4‘. Medij ‚M7‘ se pripravi kot medij ‚M4‘, razen za snovi, navedene v preglednici 1, za katere so koncentracije pri ‚M7‘ štirikrat nižje kot pri ‚M4‘. Publikacija o mediju ‚M7‘ je v pripravi (Elendt, osebno sporočilo). Preskusna raztopina se ne sme pripraviti po Elendt in Bias (1990), saj koncentracije NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 in K2HPO4, navedene za pripravo osnovnih raztopin, niso ustrezne. | Priprava medija ‚M7‘ | 13. | Vsaka osnovna raztopina (I) se pripravi posebej, sestavljena osnovna raztopina (II) pa se pripravi iz teh osnovnih raztopin (I) (glej preglednico 1). V 50 ml sestavljene osnovne raztopine (II), ki ji je dodana količina vsake osnovne raztopine makrohranilnih snovi, navedena v preglednici 2, se dolije do 1 litra deionizirana voda, da se pripravi medij ‚M7‘. Založna raztopina vitaminov se pripravi tako, da se trije vitamini dodajo v deionizirano vodo, kot je navedeno v preglednici 3, 0,1 ml sestavljene osnovne raztopine vitaminov pa se doda končnemu mediju ‚M7‘ malo pred uporabo. (Založna raztopina vitaminov se shranjuje zamrznjena v majhnih alikvotih.) Medij se prezračuje in stabilizira. | Preglednica 1 | Založne raztopine elementov v sledeh za medija M4 in M7 | Založne raztopine (I) | Količina (mg) za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | Za pripravo sestavljene osnovne raztopine (II): zmešajte naslednje količine (ml) osnovnih raztopin (I) in dopolnite do 1 litra z deionizirano vodo | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah (mg/l) | M4 | M7 | M4 | M7 | H3BO3 (18) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 | MnCl2 · 4 H2O (18) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 | LiCl (18) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 | RbCl (18) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 | SrCl2 · 6 H2O (18) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 | NaBr (18) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 | Na2MoO4 · 2 H2O (18) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 | CuCl2 · 2 H2O (18) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 | ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 | CaCl2 · 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 | KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 | Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 | NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 | Na2EDTA · 2 H2O (18) (19) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 | FeSO4 · 7 H2O (18) (19) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 | Preglednica 2 | Založne raztopine makrohranilnih snovi za medija M4 in M7 | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina osnovnih raztopin makrohranilnih snovi za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | CaCl2 · 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 | MgSO4 · 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 | KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 | NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 | NaSiO3 · 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 | NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 | KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 | K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 | Preglednica 3 | Založna raztopina vitaminov za medija M4 in M7 | Vse tri raztopine vitaminov so združene v eno. | | Količina za pripravo 1 litra z deionizirano vodo | (mg) | Količina dodane osnovne raztopine vitaminov za pripravo medijev M4 in M7 | (ml/l) | Končne koncentracije v preskusnih raztopinah M4 in M7 | (mg/l) | Tiamin hidroklorid | 750 | 0,1 | 0,075 | Cianokobalamin (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 | Biotin | 7,5 | 0,1 | 0,00075 | VIRI: | BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Uredila M. Streloke in H. Köpp. Berlin 1995. | Elendt, B. P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25–33. | Elendt, B. P., in Bias, W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157–1167. | Dodatek 3 | PRIPRAVA FORMULIRANE USEDLINE | Sestava usedline | Sestava formulirane usedline mora biti naslednja: | Sestavina | Značilnosti | Delež suhe | teže usedline v % | Šota | Šotni mah, čim bližje pH 5,5 do 6,0, brez vidnih ostankov rastlin, fino mlet (velikost delcev ≤ 1 mm) in sušen na zraku. | 4–5 | Kremenov pesek | Velikost zrn: > 50 % delcev mora biti velikih 50–200 μm. | 75–76 | Kaolinska glina | Vsebnost kaolinita ≥ 30 %. | 20 | Organski ogljik | Uravnava se z dodatkom šote in peska. | 2 (± 0,5) | Kalcijev karbonat | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. | 0,05–0,1 | Voda | Prevodnost ≤ 10 μS/cm. | 30–50 | Priprava | Šota se posuši na zraku in zmelje v fin prah. Pripravi se suspenzija potrebne količine šote v prahu v deionizirani vodi, za kar se uporabi visoko zmogljiva naprava za homogenizacijo. pH te suspenzije se s CaCO3 uravna na 5,5 ± 0,5. Suspenzija se vsaj 2 dneva kondicionira z rahlim mešanjem pri 20 ± 2 °C, da se stabilizira pH in vzpostavi stabilna mikrobna komponenta. Vrednost pH se znova izmeri in mora biti 6,0 ± 0,5. Šotna suspenzija se nato zmeša z drugimi sestavinami (peskom in kaolinsko glino) in deionizirano vodo, da nastane homogena usedlina z vsebnostjo vode v razponu 30 do 50 % suhe teže usedline. pH končne mešanice se znova izmeri in po potrebi uravna na 6,5 do 7,5 s CaCO3. Vzamejo se vzorci usedline, da se določita suha teža in vsebnost organskega ogljika. Priporoča se, da se formulirana usedlina pred uporabo v preskusu strupenosti s trzačami 7 dni kondicionira v enakih pogojih, kakršni vladajo v poznejšem preskusu. | Shranjevanje | Suhe sestavine za pripravo umetne usedline se lahko shranjujejo v suhem in hladnem prostoru pri sobni temperaturi. Formulirana (mokra) usedlina se pred uporabo v preskusu ne sme shranjevati. Uporabiti jo je treba takoj po 7-dnevnem obdobju kondicioniranja, s katerim se njena priprava konča. | VIRI: | Poglavje C.8 te priloge. Strupenost za deževnike. | Meller, M., Egeler, P., Rombke, J., Schallnass, H., Nagel, R., Streit, B. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10–20. | Dodatek 4 | Kemijske lastnosti sprejemljive vode za redčenje | Snov | Koncentracije | Delci | < 20 mg/l | Celotni organski ogljik | < 2 mg/l | Neionizirani amoniak | < 1 μg /l | Trdota kot CaCO3 | < 400 mg/l (20) | Ostanek klora | < 10 μg /l | Skupni organofosforni pesticidi | < 50 ng/1 | Skupni organoklorni pesticidi in poliklorirani bifenili | < 50 ng/1 | Skupni organski klor | < 25 ng/1 | Dodatek 5 | Napotek za spremljanje preobrazbe ličink trzače | Na preskusne čaše se namestijo lovilniki za preobražene osebke. Potrebni so od 20. dne do konca preskusa. Primer lovilnika je narisan spodaj: | A | : | najlonska mrežica | B | : | obrnjen plastični lonček | C | : | poskusna čaša brez ustja | D | : | mrežasti okenci za izmenjavo vode | E | : | voda | F | : | usedlina | C.29. DOBRA BIORAZGRADLJIVOST – CO2 V ZAPRTIH POSODAH (PRESKUS NADPROSTORA) | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 310 (2006). Je presejalna metoda za ocenjevanje dobre biološke razgradljivosti kemikalij in daje podobne informacije kot šest preskusnih metod, opisanih v poglavju C.4, A–F, te priloge. Zato se lahko kemikalija, pri kateri so rezultati te preskusne metode pozitivni, šteje za dobro biološko razgradljivo in zato hitro razgradljivo v okolju. | 2. | Uveljavljena metoda z ogljikovim dioksidom (CO2) (1), ki temelji na izvirnem Sturmovem preskusu (2) za ocenjevanje biološke razgradljivosti organskih kemikalij z merjenjem ogljikovega dioksida, ki je nastal zaradi mikrobne dejavnosti, je običajno prva izbira za preskušanje slabo topnih in močno adsorptivnih kemikalij. Izbere se tudi za topne (vendar ne hlapne) kemikalije, ker številni menijo, da je nastajanje ogljikovega dioksida edini nedvoumni dokaz mikrobne dejavnosti. Raztopljeni organski ogljik se lahko odstrani s fizikalno-kemijskimi procesi (adsorpcija, izhlapevanje, obarjanje, hidroliza) in mikrobno dejavnostjo, pri številnih nebioloških reakcijah pa se porablja kisik; CO2 redko nastane abiotsko iz organskih kemikalij. Pri izvirnem in prilagojenem Sturmovem preskusu (1) (2) se CO2 odstrani iz tekoče faze v posode za absorpcijo s prepihovanjem (tj. uvajanjem mehurčkov obdelanega zraka za odstranitev CO2 prek tekočega medija), pri Larsonovi različici (3) (4) pa se CO2 prenese iz reakcijske posode v absorberje s spuščanjem zraka brez CO2 skozi nadprostor in dodatno z nenehnim stresanjem preskusne posode. Reaktorska posoda se stresa samo pri prilagojeni Larsonovi različici; v ISO 9439 (5) in izvirni ameriški različici (6), ki oba določata prepihovanje in ne zamenjave v nadprostoru, je mešanje predpisano samo za netopne snovi. Pri drugi uradni metodi Agencije za varstvo okolja Združenih držav (US EPA) (7), ki temelji na Gledhillovi metodi (8), je reakcijska posoda, ki se stresa, zaprta za ozračje, nastali CO2 pa se zbira v notranjem alkalnem lovilniku neposredno iz plinske faze kot pri klasičnih Warburgovih/Barcroftovih respirometrih. | 3. | Toda pokazalo se je, da se pri uporabi standardnega prilagojenega Sturmovega preskusa pri številnih kemikalijah (9) v mediju nabira anorganski ogljik (IC). Pri razgradnji 20 mg C/l anilina je bila ugotovljena koncentracija IC kar 8 mg/l. Zato zbiranje CO2 v alkalnih lovilnikih ni pravilno pokazalo količine mikrobiološko nastalega CO2 pri vmesnih časih med razgradnjo. Zato pogoja, da je treba za uvrstitev preskusne kemikalije med dobro biološko razgradljive v ‚10-dnevnem obdobju‘ (10 dneh, ki neposredno sledijo dosegu 10-odstotne biološke razgradljivosti) nabrati > 60 % teoretično največje količine nastalega CO2 (ThCO2), ne izpolnjujejo nekatere kemikalije, ki bi se med dobro biološko razgradljive uvrstile ob odstranjevanju raztopljenega organskega ogljika (DOC). | 4. | Kadar je delež razgradnje manjši, kot je bilo pričakovano, se v preskusni raztopini morda nabira IC. V takem primeru se lahko razgradljivost oceni z drugimi preskusi dobre biološke razgradljivosti. | 5. | Zaradi drugih pomanjkljivosti Sturmove metodologije (okornost, dolgotrajnost, nagnjenost k eksperimentalnim napakam in neuporabnost za hlapne kemikalije) se je že prej poleg Gledhillove metode iskala tehnika z zaprtimi posodami, in ne s pretokom plina. Boatman idr. (12) so pregledali prejšnje metode in uporabili zaprt sistem z nadprostorom, pri čemer je bil CO2 sproščen v nadprostor ob koncu inkubacije z zakisanjem medija. CO2 se je meril z analizo s plinsko kromatografijo (GC)/IC v samodejno odvzetih vzorcih iz nadprostora, a se pri tem ni upošteval raztopljeni anorganski ogljik (DIC) v tekoči fazi. Poleg tega so bile uporabljene posode zelo majhne (20 ml) in so vsebovale samo 10 ml medija, kar je povzročalo težave, npr. pri dodajanju nujno zelo majhnih količin netopnih preskusnih kemikalij in/ali pa v inokuliranem mediju ni bilo (dovolj) mikroorganizmov, ki so sposobni razgraditi preskusne kemikalije. | 6. | Te težave so v neodvisnih raziskavah premagali Struijs in Stoltenkamp (13) ter Birch in Fletcher (14), pri čemer so slednja navdihnile njune izkušnje z napravo, ki se uporablja pri preskusu anaerobne biološke razgradnje (15). Pri prvi metodi (13) se CO2 meri v nadprostoru po zakisanju in uravnoteženju, pri drugi (14) pa je bil DIC izmerjen v plinski in tekoči fazi, brez obdelave; več kot 90 % nastalega IC je bilo v tekoči fazi. Obe metodi imata prednosti pred Sturmovim preskusom, ker je preskusni sistem bolj priročen in lažje obvladljiv, ker je mogoče preskusiti hlapne kemikalije in ker je preprečena možnost zakasnitve pri merjenju nastalega CO2. | 7. | Pristopa sta bila združena v standard ISO za CO2 v nadprostoru (16), ki je bil krožno preskušen (17), na njem pa temelji tudi ta preskusna metoda. Podobno sta pristopa uporabljena v metodi US EPA (18). Priporočeni sta dve metodi merjenja CO2, in sicer CO2 v nadprostoru po zakisanju (13) in IC v tekoči fazi po dodajanju presežne baze. Drugo metodo je uvedel Peterson pri krožnem preskusu CONCAWE (19) te metode z nadprostorom, prilagojene za merjenje inherentne biološke razgradljivosti. Spremembe iz revizije teh metod iz leta 1992 (20) v poglavju C.4 te priloge za dobro biološko razgradljivost so bile vključene v to preskusno metodo, tako da so pogoji (medij, trajanje itd.) sicer enaki kot pri revidiranem Sturmovem preskusu (20). Birch in Fletcher (14) sta pokazala, da ta preskus nadprostora daje zelo podobne rezultate, kot so bili za iste kemikalije ugotovljeni v krožnem preskusu OECD (21) revidiranih preskusnih metod. | NAČELO PRESKUSA | 8. | Preskusna kemikalija, običajno 20 mg C/l, se kot edini vir ogljika in energije inkubira v pufrskem mediju z mineralnimi solmi, ki je inokuliran z mešano populacijo mikroorganizmov. Preskus se opravi v zaprtih steklenicah z nadprostorom, v katerem je zrak, ki predstavlja zalogo kisika za aerobno biološko razgradnjo. Nastajanje CO2 zaradi popolne aerobne biološke razgradnje preskusne kemikalije se določi z merjenjem nastalega IC v preskusnih steklenicah, ki presega IC, ki nastane v posodah s slepim vzorcem, ki vsebujejo samo inokuliran medij. Obseg biološke razgradnje se izrazi kot delež teoretično največje količine nastalega IC (ThIC) na podlagi prvotno dodane količine preskusne kemikalije (kot organski ogljik). | 9. | Merita se lahko tudi odstranitev DOC in/ali obseg primarne biološke razgradnje preskusne kemikalije (2). | INFORMACIJE O PRESKUSNI KEMIKALIJI | 10. | Za izračun deleža razgradnje je treba poznati vsebnost organskega ogljika (% w/w) v preskusni kemikaliji, ki se določi na podlagi njene kemične strukture ali z merjenjem. Pri hlapnih preskusnih kemikalijah je izmerjena ali izračunana Henryjeva konstanta koristna za določanje ustreznega volumskega razmerja med nadprostorom in tekočino. Informacije o strupenosti preskusne kemikalije za mikroorganizme so koristne pri izbiri ustrezne preskusne koncentracije in za razlago rezultatov, ki kažejo slabo biološko razgradljivost. Priporoča se vključitev kontrole zaviranja, razen če je znano, da preskusna kemikalija ne zavira mikrobne dejavnosti (glej odstavek 24). | UPORABA METODE | 11. | Preskus se uporablja za vodotopne in netopne preskusne kemikalije, vendar je treba zagotoviti njihovo dobro porazdelitev. S priporočenim volumskim razmerjem med nadprostorom in tekočino 1 : 2 se lahko preskusijo hlapne kemikalije s Henryjevo konstanto do 50 Pa.m3.mol-1, saj delež preskusne kemikalije v nadprostoru ne preseže 1 % (13). Pri preskušanju bolj hlapnih kemikalij se lahko uporabi manjša prostornina nadprostora, vendar je lahko njihova biološka razpoložljivost omejujoča, zlasti če so slabo topne v vodi. Toda uporabniki morajo zagotoviti, da sta volumsko razmerje med nadprostorom in tekočino ter koncentracija preskusne kemikalije taka, da je na voljo dovolj kisika za popolno aerobno biološko razgradnjo (npr. treba se je izogibati visoki koncentraciji substrata in majhni prostornini nadprostora). Navodila glede tega so na voljo v (13) (23). | REFERENČNE KEMIKALIJE | 12. | Za preverjanje preskusnega postopka je treba vzporedno preskusiti referenčno kemikalijo z znano biološko razgradljivostjo. Za ta namen se lahko pri preskušanju vodotopnih preskusnih kemikalij uporabijo anilin, natrijev benzoat ali etilen glikol, pri preskušanju slabo topnih preskusnih kemikalij pa 1-oktanol (13). Biološka razgradnja teh kemikalij mora v 14 dneh doseči > 60 % ThIC. | PONOVLJIVOST | 13. | Pri krožnem preskusu metode po ISO (17) so bili pri priporočenih pogojih, vključno z 20 mg C preskusne kemikalije/l, dobljeni spodnji rezultati. | Preskusna kemikalija | Povprečni delež biološke razgradnje v % | (28d) | Koeficient variacije | (%) | Število laboratorijev | Anilin | 90 | 16 | 17 | 1-oktanol | 85 | 12 | 14 | Variabilnost znotraj preskusa (ponovljivost) pri uporabi anilina je bila majhna, pri čemer koeficienti variacije niso presegli 5 % v skoraj nobeni izvedbi preskusa. V dveh primerih, v katerih je bila ponovljivost slabša, je bilo za večjo variabilnost verjetno krivo večje nastajanje IC v slepih vzorcih. Pri 1-oktanolu je bila ponovljivost slabša, vendar je bila še vedno manjša od 10 % pri 79 % izvedenih preskusov. Za to večjo variabilnost znotraj preskusa so lahko krive napake pri odmerjanju, saj je treba v zaprte preskusne steklenice vbrizgati majhno količino 1-oktanola (3 do 4 μl). Višji koeficienti variacije nastanejo pri nižjih koncentracijah preskusne kemikalije, zlasti pri koncentracijah pod 10 mg C/l. Temu se je mogoče delno izogniti z znižanjem koncentracije skupnega anorganskega ogljika (TIC) v inokulumu. | 14. | Pri krožnem preskusu EU (24) petih površinsko aktivnih snovi, dodanih v 10 mg C/l, so bili dobljeni naslednji rezultati: | Preskusna kemikalija | Povprečni delež biološke razgradnje v % | (28d) | Koeficient variacije | (%) | Število laboratorijev | Tetrapropilen | benzen sulfonat | 17 | 45 | 10 | Diizooktilsulfo-sukcinat | (anionski) | 72 | 22 | 9 | Heksadecil-trimetil (21) | amonijev klorid | (kationski) | 75 | 13 | 10 | Izononilfenol-(etoksilat)9 | (neionski) | 41 | 32 | 10 | Kokoamidopropil | dimetilhidroksi | sulfobetain | (amfoteričen) | 60 | 23 | 11 | Rezultati kažejo, da je bila na splošno variabilnost večja pri slabše razgrajenih površinsko aktivnih snoveh. Variabilnost znotraj poskusa je bila manjša od 15 % v 90 % primerov, dosegla pa je največ 30–40 %. | OPOMBA: | večine površinsko aktivnih snovi ne sestavlja ena sama molekulska vrsta, temveč so mešanica izomerov, homologov itd., ki se razgradijo po različnih značilnih časih prilagajanja in z različno kinetično hitrostjo, zaradi česar nastanejo ‚zabrisane‘ oslabele krivulje, tako da v 10-dnevnem obdobju ni mogoče doseči praga 60 %, čeprav bi vsaka posamezna molekulska vrsta v 10 dneh dosegla > 60 %, če bi se preskušala sama. To je bilo ugotovljeno tudi pri drugih kompleksnih mešanicah. | OPIS METODE | Oprema | 15. | Običajna laboratorijska oprema in: | (a) | steklene serumske steklenice, zatesnjene z zamaški iz butilne gume in stisnjenimi aluminijskimi tesnili. Priporočena velikost je ‚125 ml‘, pri čemer je celotna prostornina takih steklenic 160 ml (v tem primeru bi moralo biti znano, da je prostornina posamezne steklenice 160 ± 1 ml). Manjše steklenice se lahko uporabijo, kadar rezultati izpolnjujejo pogoje iz odstavkov 66 in 67; | (b) | analizator ogljika ali drug instrument (npr. plinski kromatograf) za merjenje anorganskega ogljika; | (c) | zelo natančne brizge za plinaste in tekoče vzorce; | (d) | krožni stresalnik v temperaturno nadzorovanem okolju; | (e) | dotok zraka brez CO2 – pripravi se lahko s spuščanjem zraka skozi zrnca zmesi natrijevega in kalcijevega hidroksida ali z uporabo plinske mešanice 80 % N2 / 20 % 02 (neobvezno) (glej odstavek 28); | (f) | naprava za membransko filtracijo poroznosti od 0,20 do 0,45 μm (neobvezno); | (g) | analizator organskega ogljika (neobvezno). | Reagenti | 16. | Ves čas se uporabljajo analitsko čisti reagenti. | Voda | 17. | Uporabljati je treba destilirano ali deionizirano vodo, ki vsebuje ≤ 1 mg/l skupnega organskega ogljika. To predstavlja ≤ 5 % začetne vsebnosti organskega ogljika, uvedene s priporočenim odmerkom preskusne kemikalije. | Založne raztopine za medij z mineralnimi solmi | 18. | Založne raztopine in medij z mineralnimi solmi so podobni kot pri preskusih ISO 14593 (16) in C.4 ‚dobra biološka razgradljivost‘ (20). Večja koncentracija amonijevega klorida (2,0 g/l namesto 0,5 g/l) bi morala biti potrebna samo v zelo izjemnih primerih, npr. kadar je koncentracija preskusne kemikalije > 40 mg C/l. Založne raztopine je treba hraniti na hladnem in jih zavreči po šestih mesecih ali prej, če se pokažejo znaki obarjanja ali mikrobne rasti. Pripravijo se naslednje osnovne raztopine: | (a) | kalijev dihidrogen fosfat (KH2PO4) 8,50 g | dikalijev hidrogen fosfat (K2HPO4) 21,75 g | dinatrijev hidrogen fosfat dihidrat (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g | amonijev klorid (NH4Cl) 0,50 g | Raztopijo se v vodi in dopolnijo do 1 litra. pH te raztopine mora biti 7,4 (± 0,2). Če ni, je treba pripraviti novo raztopino. | (b) | kalcijev klorid dihidrat (CaCl2.2H2O) 36,40 g | Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra. | (c) | magnezijev sulfat heptahidrat (MgSO4.7H2O) 22,50 g | Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra. | (d) | železov (III) klorid heksahidrat (FeCl3.6H20) 0,25 g | Raztopi se v vodi in dopolni do 1 litra ter doda kapljica koncentrirane HCl. | Priprava mineralnega medija | 19. | Zmeša se 10 ml raztopine (a) in približno 800 ml vode (odstavek 17), nato se doda po 1 ml raztopin (b), (c) in (d) ter dopolni z vodo do 1 litra (odstavek 17). | Drugi reagenti | 20. | Koncentrirana ortofosforna kislina (H3PO4) (> 85 % mase na volumen). | Raztopina natrijevega hidroksida 7M | 21. | 280 g natrijevega hidroksida (NaOH) se raztopi v 1 litru vode (odstavek 17). Določi se koncentracija DIC za to raztopino, ta vrednost pa se upošteva pri izračunu rezultata preskusa (glej odstavka 55 in 61), zlasti ob upoštevanju merila veljavnosti iz odstavka 66(b). Če je koncentracija DIC previsoka, se pripravi sveža raztopina. | Preskusna kemikalija | 22. | Pripravi se osnovna raztopina preskusne kemikalije, ki se dovolj dobro topi v vodi (odstavek 17) ali preskusnem mediju (odstavek 19), s koncentracijo, ki je po možnosti 100-krat višja od končne koncentracije, ki bo uporabljena v preskusu; morda bo treba pH osnovne raztopine prilagoditi. Založno raztopino je treba dodati mineralnemu mediju, da nastane končna koncentracija organskega ogljika, ki znaša med 2 in 40 mg C/l, po možnosti 20 mg C/l. Če se uporabijo nižje koncentracije, se lahko natančnost poslabša. V posode se lahko neposredno z zelo natančnimi brizgami dodajo topne in netopne tekoče kemikalije. Pri slabo topnih in netopnih preskusnih kemikalijah je lahko potrebna posebna obdelava (25). Na izbiro so: | (a) | neposredno dodajanje znanih tehtanih količin; | (b) | ultrazvočno dispergiranje pred dodajanjem; | (c) | dispergiranje z emulgatorji; pred dodajanjem je treba ugotoviti, ali imajo zaviralne ali spodbujevalne učinke na mikrobno dejavnost; | (d) | adsorpcija tekočih preskusnih kemikalij ali raztopine v primernem hlapnem topilu na inertni medij ali nosilec (npr. filter iz steklenih vlaken), ki ji sledi izhlapevanje topila, če je uporabljeno, in neposredno dodajanje znanih količin; | (e) | dodajanje znanih količin raztopine preskusne kemikalije v lahko hlapnem topilu v prazno preskusno posodo, ki mu sledi izhlapevanje topila. | Preskusiti je treba spodbujevalni ali zaviralni učinek sredstev in topil, uporabljenih v (c), (d) in (e), na mikrobno dejavnost (glej odstavek 42(b)). | Referenčna kemikalija | 23. | Pripravi se osnovna raztopina (topne) referenčne kemikalije v vodi (odstavek 17) s koncentracijo, ki je po možnosti 100-krat višja od končne koncentracije, ki bo uporabljena v preskusu (20 mg C/l). | Preverjanje zaviranja | 24. | Preskusne kemikalije pogosto ne pokažejo znatne razgradnje v pogojih, uporabljenih pri ocenjevanjih dobre biološke razgradljivosti. Eden od mogočih vzrokov je ta, da preskusna kemikalija zavira inokulum pri koncentraciji, ki je uporabljena v preskusu. V načrt preskusa se lahko vključi preverjanje zaviranja, da se omogoči ugotavljanje (za nazaj) zaviranja kot mogočega vzroka ali prispevajočega dejavnika. S preverjanjem zaviranja je mogoče tudi ovreči take motnje in pokazati, da se lahko nična ali rahla razgradnja pripiše izključno nedovzetnosti za napad mikrobov v pogojih preskusa. Za pridobitev informacij o strupenosti preskusne kemikalije za (aerobne) mikroorganizme se pripravi raztopina v preskusnem mediju, ki vsebuje enako koncentracijo preskusne kemikalije in referenčne kemikalije (odstavek 19), kot je bila dodana (glej odstavka 22 in 23). | Inokulum | 25. | Inokulum se lahko pridobi iz različnih virov: aktivnega blata, komunalnih odplak (nekloriranih), površinskih voda in tal ali zmesi teh sestavin (20). Biorazgradno aktivnost vira je treba preveriti z referenčno kemikalijo. Ne glede na vir se ne smejo uporabiti mikroorganizmi, ki so bili že prej izpostavljeni preskusni kemikaliji, če se postopek uporablja kot preskus dobre biološke razgradljivosti. | Opozorilo: | aktivno blato, odpadne vode in komunalne odplake vsebujejo patogene organizme, zato je treba z njimi ravnati previdno. | 26. | Glede na izkušnje je optimalna količina inokuluma taka, ki: | — | zadostuje za primerno biološko razgradno aktivnost, | — | razgradi predpisani delež referenčne kemikalije (glej odstavek 66), | — | daje 102 do 105 enot, ki tvorijo kolonije, na mililiter končne mešanice, | — | pri uporabi aktivnega blata običajno daje koncentracijo 4 mg/l neraztopljenih trdnih snovi v končni mešanici; uporabijo se lahko koncentracije do 30 mg/l, vendar lahko te znatno povečajo nastajanje CO2 v slepih vzorcih (26), | — | prispeva manj kot 10 % začetne koncentracije organskega ogljika, uvedenega s preskusno kemikalijo, | — | običajno znaša 1–10 ml inokuluma za 1 liter preskusne raztopine. | Aktivno blato | 27. | Iz prezračevalnega bazena čistilne naprave ali laboratorijske enote, v kateri se čistijo predvsem gospodinjske odplake, se vzame svež vzorec aktivnega blata. Po potrebi se grobi delci odstranijo s presejanjem (npr. s sitom z 1 mm2 velikimi luknjicami), blato pa je treba do uporabe ohranjati v aerobnem stanju. | 28. | Po odstranitvi grobih delcev se lahko tudi pusti, da se usede, ali se centrifugira (npr. 10 minut pri 1 100 × g). Supernatantna tekočina se zavrže. Blato se lahko spere v mineralni raztopini. Koncentrirano blato se suspendira v mineralnem mediju tako, da bo koncentracija neraztopljenih trdnih snovi 3–5 g/l. Nato se prezračuje do uporabe. | 29. | Blato je treba odvzeti iz pravilno delujoče konvencionalne čistilne naprave. Če ga je bilo treba odvzeti iz čistilne naprave z visoko stopnjo čiščenja ali če se domneva, da vsebuje zaviralce, ga je treba sprati. Resuspendirano blato se po temeljitem mešanju pusti, da se usede, ali se centrifugira, supernatantna tekočina se zavrže, sprano blato pa znova suspendira v dodatni količini mineralnega medija. Postopek se ponavlja, dokler se ne šteje, da je blato brez presežnega substrata ali zaviralcev. | 30. | Tik pred uporabo popolnoma resuspendiranega ali neobdelanega blata se odvzame vzorec za določitev suhe teže neraztopljenih trdnih snovi. | 31. | Dodatna možnost je, da se aktivno blato homogenizira (3–5 g neraztopljenih trdnih snovi/l). Blato se 2 minuti obdeluje z Waringovim mešalnikom pri srednji hitrosti. Zmešano blato se mora usedati 30 minut, če je potrebno, pa tudi dlje, nato pa se odlije tekočina, ki se uporabi kot inokulum v koncentraciji približno 10 mg/l mineralnega medija. | 32. | Nastajanje CO2 v slepih vzorcih je mogoče dodatno zmanjšati, če se blato čez noč prezračuje z zrakom brez CO2. Kot koncentracija inokuluma pri tem preskusu (13) se uporabi 4 mg/l aktivnega blata v obliki trdnih snovi. | Sekundarni komunalni iztok | 33. | Inokulum se lahko pridobi tudi iz sekundarnega iztoka iz čistilne naprave ali laboratorijske enote, v katero priteka predvsem gospodinjska odpadna voda. Vzorec se hrani v aerobnih pogojih in uporabi na dan odvzema ali pa se po potrebi aklimatizira. Iztok je treba filtrirati skozi grobi filter, da se odstranijo večji delci, in izmeriti vrednost pH. | 34. | Za zmanjšanje vsebnosti IC se filtrat 1 uro prepihuje z zrakom brez CO2 (odstavek 15(e)) ob ohranjanju vrednosti pH 6,5 z ortofosforno kislino (odstavek 20). Vrednost pH se vrne na prvotno vrednost z natrijevim hidroksidom (odstavek 21). Po približno 1-urnem usedanju se vzame primerna količina supernatanta za inokulacijo. Ta postopek prepihovanja zmanjša vsebnost IC v inokulumu. Ko je bila na primer kot inokulum uporabljena največja priporočena količina filtriranega prepihanega iztoka (100 ml) na liter, je bilo v posodah s slepim kontrolnim vzorcem med 0,4 in 1,3 mg/l IC (14), kar je predstavljalo 2–6,5 % C iz preskusne kemikalije pri 20 mg C/l in 4–13 % pri 10 mg C/l. | Površinske vode | 35. | Vzame se vzorec primerne površinske vode. Hrani se v aerobnih pogojih in uporabi na dan odvzema. Po potrebi se koncentrira s filtriranjem ali centrifugiranjem. Količina inokuluma, ki se uporabi v posamezni preskusni posodi, mora izpolnjevati merila iz odstavka 26. | Tla | 36. | V globini do 20 cm pod površino se vzame vzorec ustreznih tal. Iz njega je treba pred presejanjem skozi sito z 2 mm velikimi luknjicami odstraniti kamne, ostanke rastlin in nevretenčarje (če je vzorec prevlažen za takojšnje presejanje, se za lažje presejanje delno posuši na zraku). Hraniti ga treba v aerobnih pogojih in uporabiti na dan jemanja (če se vzorec prevaža v ohlapno zavezani polietilenski vrečki, se lahko največ en mesec hrani v vrečki pri 2 do 4 °C). | Aklimatizacija inokuluma | 37. | Inokulum se lahko aklimatizira na preskusne pogoje, ne sme pa se prilagoditi na preskusno kemikalijo. Z aklimatizacijo je mogoče zmanjšati nastajanje CO2 v slepem vzorcu. Aklimatizacija vključuje prezračevanje aktivnega blata po razredčitvi v preskusnem mediju na 30 m/l z vlažnim zrakom brez CO2 5–7 dni pri temperaturi preskusa. | PRESKUSNI POSTOPEK | Število steklenic | 38. | Število steklenic (odstavek 15(a)), potrebnih za preskus, je odvisno od pogostosti analize in trajanja preskusa. | 39. | Priporoča se, da se po zadostnem številu časovnih intervalov analizirajo po tri steklenice, tako da je mogoče določiti 10-dnevno obdobje. Ob koncu preskusa se analizira tudi vsaj pet preskusnih steklenic (odstavek 15(a)) iz skupin (a), (b) in (c) (glej odstavek 42), da je mogoče izračunati 95-odstotne intervale zaupanja za srednjo vrednost deleža biološke razgradnje. | Inokulirani medij | 40. | Inokulum se uporabi v koncentraciji 4 mg/l aktivnega blata v obliki suhih trdnih snovi. Tik pred uporabo se pripravi dovolj inokuliranega medija tako, da se na primer 1 litru medija z mineralnimi solmi (odstavek 19) doda 2 ml ustrezno obdelanega aktivnega blata (odstavki 27 do 32) pri 2 000 mg/l. Pri uporabi sekundarnega komunalnega iztoka se v 900 ml medija z mineralnimi solmi (odstavek 19) doda do 100 ml iztoka (odstavek 33) in z medijem razredči na 1 liter. | Priprava steklenic | 41. | Alikvoti inokuliranega medija se odmerijo v ponovitvene steklenice, da nastane razmerje med nadprostorom in tekočino 1 : 2 (npr. v 160-mililitrske steklenice se da 107 ml). Uporabijo se lahko tudi druga razmerja, vendar je treba upoštevati opozorilo iz odstavka 11. Pri uporabi katere koli vrste inokuluma je treba poskrbeti za to, da je inokulirani medij primerno zmešan, tako da se zagotovi njegova enakomerna porazdeljenost po preskusnih steklenicah. | 42. | Pripravijo se skupine steklenic (odstavek 15(a)), ki vsebujejo naslednje: | (a) | preskusne posode (označene s FT), ki vsebujejo preskusno kemikalijo; | (b) | slepe kontrolne vzorce (označene s FB), ki vsebujejo samo preskusni medij in inokulum; dodati je treba tudi vse kemikalije, topila, sredstva ali filtre iz steklenih vlaken, ki se uporabljajo za uvajanje preskusne kemikalije v preskusne posode; | (c) | posode (označene s FC) za preverjanje postopka, ki vsebujejo referenčno kemikalijo; | (d) | po potrebi posode (označene s FI) za preverjanje morebitnega zaviralnega učinka preskusne kemikalije, ki vsebujejo enako koncentracijo preskusne kemikalije in referenčne kemikalije (odstavek 24) kot v steklenicah FT oziroma FC; | (e) | posode (označene s FS) za preverjanje morebitne abiotske razgradnje, enako kot (a) z dodatkom 50 mg/l HgCl2 ali se sterilizirajo drugače (npr. z avtoklaviranjem). | 43. | Vodotopne preskusne kemikalije in referenčne kemikalije se dodajo kot vodne osnovne raztopine (odstavki 22, 23 in 24), da nastane koncentracija 10 do 20 mg C/l. | 44. | Netopne preskusne kemikalije in netopne referenčne kemikalije se dodajo v steklenice na različne načine (glej odstavek 22(a–e)), glede na naravo preskusne kemikalije bodisi pred dodatkom inokuliranega medija ali po njem, odvisno od načina obdelave preskusne kemikalije. Če se uporabi eden od postopkov iz odstavka 22(a–e), je treba s steklenicami FB s slepim vzorcem (odstavek 42(b)) ravnati podobno, vendar brez preskusne kemikalije in referenčne kemikalije. | 45. | Hlapne preskusne kemikalije je treba vbrizgati v zaprte posode (odstavek 47) z mikrobrizgo. Odmerek se izračuna iz vbrizgane količine in gostote preskusne kemikalije. | 46. | Po potrebi je treba v posode dodati vodo, da je v vsaki posodi enaka količina tekočine. Treba je zagotoviti, da sta razmerje med nadprostorom in tekočino (običajno 1 : 2) ter koncentracija preskusne kemikalije taka, da je v nadprostoru na voljo dovolj kisika za popolno biološko razgradnjo. | 47. | Vse steklenice se nato zatesnijo, na primer s septumi iz butilne gume in aluminijastimi pokrovčki. V tej fazi je treba dodati hlapne preskusne kemikalije (odstavek 45). Če je treba spremljati zniževanje koncentracije DOC v preskusni raztopini in če je treba za začetno koncentracijo IC (sterilni kontrolni vzorci, odstavek 42(e)) ali druge determinante opraviti analizo ob času nič, se iz preskusne posode odvzame ustrezni vzorec. Preskusna posoda in njena vsebina se nato zavržeta. | 48. | Zaprte posode se položijo na rotacijski stresalnik (odstavek 15(d)), pri čemer mora biti hitrost stresanja zadostna, da vsebina steklenic ostaja dobro premešana in v obliki suspenzije (npr. 150 do 200 vrtljajev na minuto), ter se inkubirajo v temi pri 20 °C, pri čemer se temperatura ohranja v razponu ± 1 °C. | Vzorčenje | 49. | Način vzorčenja je odvisen od časa prilagajanja in kinetične hitrosti biološke razgradnje preskusne kemikalije. Steklenice se za analizo žrtvujejo na dan vzorčenja, kar bi moralo biti vsaj tedensko ali pogosteje (npr. dvakrat tedensko), če je potrebna popolna krivulja razgradnje. Iz stresalnika se vzame potrebno število ponovitvenih steklenic, ki predstavljajo FT, FB in FC ter FI in FS, če sta uporabljena (glej odstavek 42). Preskus običajno traja 28 dni. Če krivulja biološke razgradnje kaže, da je bila konstantna raven dosežena pred 28. dnem, se lahko preskus konča prej kot v 28 dneh. Vzamejo se vzorci iz petih steklenic, prihranjenih za 28. dan preskusa za analizo, rezultati pa se uporabijo za izračun intervala zaupanja ali koeficienta variacije deleža biološke razgradnje. Steklenic, ki se uporabljajo za preverjanje zaviranja in abiotske razgradnje, ni treba vzorčiti tako pogosto kot druge steklenice; zadostuje vzorčenje 1. in 28. dan. | Analiza anorganskega ogljika (IC) | 50. | Nastajanje CO2 v steklenicah se določi z merjenjem povečanja koncentracije anorganskega ogljika (IC) med inkubacijo. Za merjenje količine IC, ki nastane pri preskusu, sta na voljo dve priporočeni metodi, ki sta opisani spodaj. Ker se lahko njuni rezultati med seboj nekoliko razlikujejo, naj se v posameznem preskusu uporabi samo ena od njiju. | 51. | Metoda (a) je priporočena, če medij verjetno vsebuje ostanke, na primer, filtrirnega papirja iz steklenih vlaken in/ali netopne preskusne kemikalije. Ta analiza se lahko izvede s plinskim kromatografom, če ni na voljo analizator organskega ogljika. Pomembno je, da imajo steklenice pri analizi plina v nadprostoru preskusno temperaturo ali da je njihova temperatura blizu preskusne temperature. Metoda (b) je morda lažja za laboratorije, ki za merjenje IC uporabljajo analizator ogljika. Pomembno je, da je raztopina natrijevega hidroksida (odstavek 21), ki se uporablja za pretvorbo CO2 v karbonat, bodisi sveže pripravljena ali pa je znana vsebnost IC v njej, tako da se ta lahko upošteva pri izračunavanju preskusnih rezultatov (glej odstavek 66(b)). | Metoda (a): zakisanje na pH < 3 | 52. | Pred vsako serijo analiz se analizator IC umeri z ustreznim standardom za IC (npr. 1 % w/w CO2 v N2). Koncentrirana ortofosforna kislina (odstavek 20) se vbrizga skozi septum posamezne vzorčene steklenice, da se pH medija zniža na < 3 (npr. 107 ml preskusnega medija dodamo 1 ml). Steklenice se vrnejo na stresalnik. Po enournem stresanju pri preskusni temperaturi se odstranijo s stresalnika, iz nadprostora posamezne steklenice pa se odvzamejo alikvoti (npr. 1 ml) plina in vbrizgajo v analizator IC. Izmerjene koncentracije IC se zapišejo kot mg C/l. | 53. | Načelo te metode je, da je po zakisanju na pH < 3 in uravnoteženju pri 20 °C konstanta ravnotežja za porazdelitev CO2 med tekočinsko in plinsko fazo v preskusnih steklenicah 1,0, če je merjena kot koncentracija (13). To je treba za preskusni sistem dokazati vsaj enkrat na naslednji način: | Pripravijo se steklenice, ki vsebujejo 5 in 10 mg/l IC, tako da se uporabi raztopina brezvodnega natrijevega karbonata (Na2CO3) v vodi brez CO2, ki se pripravi z zakisanjem vode na pH 6,5 s koncentrirano ortofosforno kislino (odstavek 20), prepihovanjem z zrakom brez CO2 čez noč in povišanjem pH na nevtralno vrednost z bazo. Zagotovi se, da je razmerje med prostornino nadprostora in količino tekočine enako kot pri preskusih (npr. 1 : 2). Tekočina se zakisa in uravnoteži, kot je opisano v odstavku 52, nato se izmerijo koncentracije IC v nadprostoru in tekoči fazi. Preveri se, da sta koncentraciji enaki znotraj preskusne napake. Če nista, bi moral izvajalec pregledati postopke. Porazdelitve IC med tekočo in plinasto fazo ni treba preverjati vsakokrat, ko se izvaja preskus; verjetno se lahko preveri pri umerjanju. | 54. | Če je treba izmeriti odstranjeni DOC (samo pri vodotopnih preskusnih kemikalijah), je treba iz ločenih (nezakisanih) steklenic vzeti vzorce tekoče faze, jih filtrirati skozi membranski filter in vbrizgati v analizator DOC. Te steklenice se lahko po potrebi uporabijo za druge analize za merjenje primarne biološke razgradnje. | Metoda (b): pretvorba CO2 v karbonat | 55. | Pred vsako serijo analiz se analizator IC umeri z ustreznim standardom, na primer raztopino natrijevega bikarbonata (NaHCO3) v vodi brez CO2 (glej odstavek 53) v razponu od 0 do 20 mg/l kot IC. Skozi septum posamezne vzorčene steklenice se vbrizga raztopina natrijevega hidroksida (7M, odstavek 21) (npr. 1 ml se doda 107 ml medija), nato se steklenice eno uro stresajo pri preskusni temperaturi. Pri vseh steklenicah, žrtvovanih na določeni dan, se uporabi enaka raztopina NaOH, ni pa nujno, da se enaka raztopina uporabi pri vsakem vzorčenju v preskusu. Če so pri vseh vzorčenjih potrebne absolutne vrednost IC v slepem vzorcu, je treba ob vsaki uporabi raztopine NaOH v njej določiti IC. Steklenice se odstranijo s stresalnika, da se vsebina usede. Z brizgo se iz vsake posode odvzame ustrezna količina (npr. 50 do 1 000 μl) tekoče faze. Vzorci se vbrizgajo v analizator IC, nato se zapišejo koncentracije IC. Treba je zagotoviti, da je uporabljeni analizator ustrezno opremljen za uporabo bazičnih vzorcev, ki nastanejo pri tej metodi. | 56. | Načelo te metode je, da je koncentracija IC v nadprostoru po dodajanju baze in stresanju zanemarljiva. To je treba za preskusni sistem preveriti vsaj enkrat s standardi za IC, dodajanjem baze in uravnoteženjem ter merjenjem koncentracije IC v nadprostoru in tekoči fazi (glej odstavek 53). Koncentracija v nadprostoru bi morala biti blizu nič. Tega preverjanja skoraj popolne absorpcije CO2 ni treba opravljati pri vsakem preskusu. | 57. | Če je treba izmeriti odstranitev DOC (samo pri vodotopnih preskusnih kemikalijah), je treba iz ločenih steklenic (ki ne vsebujejo dodane baze) vzeti vzorce tekoče faze, jih filtrirati skozi membranski filter in vbrizgati v analizator DOC. Te steklenice se lahko po potrebi uporabijo pri drugih analizah za merjenje primarne biološke razgradljivosti. | PODATKI IN POROČANJE | Izračun rezultatov | 58. | Ob predpostavki, da je mineralizacija preskusne kemikalije v CO2 100-odstotna, je presežni ThIC, ki nastane v slepih kontrolnih vzorcih, enak TOC, dodanemu posamezni preskusni steklenici na začetku preskusa, in sicer: | . | Skupna masa (mg) anorganskega ogljika (TIC) v posamezni steklenici je: | enačba [1], | pri čemer je: | VL | = | količina tekočine v steklenici (l), | CL | = | koncentracija IC v tekočini (ogljik v mg/l), | VH | = | prostornina nadprostora (l), | CH | = | koncentracija IC v nadprostoru (ogljik v mg/l). | Izračuni TIC za dve analitični metodi, uporabljeni za merjenje IC v tem preskusu, so opisani spodaj v odstavkih 60 in 61. Delež biološke razgradnje (% D) v posameznem primeru se dobi na naslednji način: | enačba [2], | pri čemer je: | TICt | = | mg TIC v preskusni steklenici ob času t, | TICb | = | srednja vrednost mg TIC v steklenicah s slepim vzorcem ob času t, | TOC | = | mg TOC, dodanega v preskusno posodo na začetku. | Delež biološke razgradnje % D se izračuna za preskusne steklenice (FT), referenčne steklenice (FC) in kontrolne steklenice za spremljanje zaviranja (FI), če so vključene, iz zadevnih količin TIC, nastalega do posameznega časa vzorčenja. | 59. | Če se je v sterilnih kontrolnih vzorcih (FS) vsebnost TIC v preskusnem obdobju znatno povečala, je mogoče sklepati o abiotski razgradnji preskusne kemikalije, kar je treba upoštevati pri izračunu D v enačbi [2]. | Zakisanje na pH < 3 | 60. | Ker se z zakisanjem na pH < 3 in uravnoteženjem koncentracije TIC v tekoči in plinasti fazi izenači, je treba izmeriti samo koncentracijo IC v plinasti fazi. Tako iz enačbe [1] sledi | , pri čemer je VB = prostornina serumske steklenice. | Pretvorba CO2 v karbonat | 61. | Pri tej metodi se izračuni izvedejo kot pri enačbi [1], vendar se zanemarljiva količina IC v plinasti fazi zanemari, tako da je | , | . | Prikaz rezultatov | 62. | Krivulja biološke razgradnje se dobi z grafičnim prikazom deleža biološke razgradnje D v odvisnosti od časa inkubacije, po možnosti pa se prikažejo faza prilagajanja, faza biološke razgradnje, 10-dnevno obdobje in faza konstantne ravni, ki je faza, v kateri je dosežena največja razgradnja, krivulja biološke razgradnje pa se zravna. Če se za vzporedne preskusne posode FT dobijo primerljivi rezultati (< 20-odstotna razlika), se grafično prikaže srednja krivulja (glej Dodatek 2, slika 1); če ne, se krivulje prikažejo za vsako posamezno posodo. Določi se srednja vrednost deleža biološke razgradnje v fazi konstantne ravni ali oceni najvišja vrednost (npr. kadar krivulja v fazi konstantne vrednosti pada), vendar je pomembno oceniti, da vrednost v slednjem primeru ni izjema. V poročilu o preskusu se ta najvišja raven biološke razgradnje navede kot ‚stopnja biološke razgradnje preskusne kemikalije‘. Če je bilo število preskusnih posod nezadostno za označitev faze konstantne ravni, se za izračun srednje vrednosti uporabijo izmerjeni podatki za zadnji dan preskusa. Ta zadnja vrednost, srednja vrednost petih ponovitev, se uporabi za označitev natančnosti, s katero je bil določen delež biološke razgradnje. Poroča se tudi o vrednosti, dobljeni na koncu 10-dnevnega obdobja. | 63. | Enako se grafično prikaže krivulja za referenčno kemikalijo FC ter preverjanje abiotskega izločanja FS in kontrola zaviranja FI, če sta vključena. | 64. | Količine TIC v slepih kontrolnih vzorcih (FB) in bučkah FS (abiotsko preverjanje) se zapišejo, če so te posode vključene v preskus. | 65. | Na podlagi teoretično nastalega IC, pričakovanega samo glede na referenčno sestavino mešanice, se izračuna D za posode FI. Če je 28. dan [(DFC (22) – DFI (23))/DFC] × 100 > 25 %, je mogoče sklepati, da je preskusna kemikalija zavrla aktivnost inokuluma, kar je lahko razlog za nizke vrednosti DFT, dobljene v pogojih preskusa. V tem primeru se lahko preskus ponovi pri nižji preskusni koncentraciji ter po možnosti z zmanjšanjem DIC v inokulumu in TIC, ki nastane v slepih kontrolnih vzorcih, saj se bo sicer zaradi nižje koncentracije zmanjšala natančnost metode. Uporabiti pa je mogoče tudi drug inokulum. Če je v bučki FS (abiotski) opaženo bistveno povečanje (> 10-odstotno) količine TIC, je morda prišlo do procesa abiotske razgradnje. | Veljavnost rezultatov | 66. | Šteje se, da je preskus veljaven, če: | (a) | je srednji delež razgradnje v posodah FC, ki vsebujejo referenčno kemikalijo, > 60-odstoten do 14. dneva inkubacije, in | (b) | če je srednja količina TIC v slepih kontrolnih vzorcih FB ob koncu preskusa > 3 mg C/l. | Če so te omejitve presežene, je treba preskus ponoviti z inokulumom iz drugega vira in/ali pregledati postopke. Če je na primer težava velika količina nastajanja IC v slepem vzorcu, je treba uporabiti postopek iz odstavkov 27 do 32. | 67. | Če preskusna kemikalija ne doseže 60 % ThIC in zanjo ni dokazan zaviralni učinek (odstavek 65), je mogoče preskus ponoviti s povečano koncentracijo inokuluma (do 30 mg/l aktivnega blata in 100 ml iztoka/l) ali z inokulumi iz drugih virov, zlasti če je bila razgradnja 20- do 60-odstotna. | Razlaga rezultatov | 68. | Če je pri tem preskusu v 10-dnevnem obdobju biološka razgradnja ThIC > 60-odstotna, to pomeni, da je preskusna kemikalija v aerobnih pogojih dobro razgradljiva. | 69. | Če prag 60 % ThIC ni dosežen, se določi vrednost pH v medijih v steklenicah, ki niso bile zakisane ali alkalizirane; vrednost pod 6,5 lahko nakazuje, da je prišlo do nitrifikacije. V tem primeru se preskus ponovi s pufrsko raztopino z višjo koncentracijo. | Poročilo o preskusu | 70. | Oblikuje se preglednica, ki prikazuje odstotni delež D za vsako preskusno steklenico (FT), referenčno steklenico (FC) in steklenico za kontrolo zaviranja (FI), če je vključena, za vsak dan vzorčenja. Če so za ponovitvene steklenice rezultati primerljivi, se grafično prikaže krivulja srednjega odstotnega deleža D v odvisnosti od časa. Zapišejo se količina TIC v slepih vzorcih (FB) in sterilnih kontrolnih vzorcih (FS), DOC in/ali drugi determinanti ter njihov delež odstranitve. | 71. | Določi se srednja vrednost deleža D v fazi konstantne ravni ali uporabi največja vrednost, če krivulja biološke razgradnje v fazi konstantne ravni pada, ter se navede kot ‚stopnja biološke razgradnje preskusne kemikalije‘. Pomembno je zagotoviti, da v slednjem primeru najvišja vrednost ni izjema. | 72. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednji podatki: | | Preskusna kemikalija: | — | splošno ime, kemijsko ime, številka CAS, strukturna formula in pomembne fizikalno-kemijske lastnosti, | — | čistost (nečistote) preskusne kemikalije. | | Preskusni pogoji: | — | sklicevanje na to preskusno metodo, | — | opis uporabljenega preskusnega sistema (npr. prostornina posode, razmerje med nadprostorom in tekočino, način mešanja itd.), | — | uporaba preskusne in referenčne kemikalije v preskusnem sistemu: uporabljena preskusna koncentracija in količina ogljika, odmerjena v posamezno preskusno steklenico, ter morebitna uporaba topil, | — | podrobnosti o uporabljenem inokulumu, morebitna predobdelava in aklimatizacija, | — | inkubacijska temperatura, | — | validacija načela analize IC, | — | glavne značilnosti uporabljenega analizatorja IC (in drugih uporabljenih analitičnih metod), | — | število ponovitev. | | Rezultati: | — | neobdelani podatki in izračunane vrednosti biološke razgradljivosti v obliki preglednice, | — | graf odstotnega deleža razgradnje v odvisnosti od časa za preskusne in referenčne kemikalije, faza prilagajanja, faza razgradnje, 10-dnevno obdobje in naklon, | — | odstotni delež odstranitve v fazi konstantne ravni, ob koncu preskusa in po 10-dnevnem obdobju, | — | razlogi za morebitno zavrnitev rezultatov preskusa, | — | drugi dejavniki, ki so pomembni za uporabljeni postopek, | — | razprava o rezultatih. | VIRI: | (1) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biorazgradljivosti – preskus razvijanja CO2 (metoda C.4-C) | (2) | Sturm, R. N. (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J.A,. Oil Chem Soc. 50: 159–167. | (3) | Larson, R. J. (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161. | (4) | Larson, R. J., Hansmann, M. A. in Bookland, E. A. (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195–1210. | (5) | ISO 9439 (1990; revidiran leta 1999). Kakovost vode – Vrednotenje popolne aerobne biološke razgradljivosti organskih snovi v vodi – Preskus z merjenjem sproščenega ogljikovega dioksida (Sturm) | (6) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (7) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC. | (8) | Gledhill, W. E. (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929. | (9) | Weytjens, D., Van Ginneken, I., in Painter, H. A. (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812. | (10) | Ennis, D. M., in Kramer, A. (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185. | (11) | Ennis, D. M., Kramer, A., Jameson, C. W., Mazzoccki, P. H., in Bailey, P. H. (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53. | (12) | Boatman, R. J., Cunningham, S. L., in Ziegler, D. A. (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243. | (13) | Struijs, J., in Stoltenkamp, J. (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204–211. | (14) | Birch, R. R., in Fletcher, R. J. (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507–524. | (15) | Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W. E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H., in Bontinck, W. J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527–1550. | (16) | ISO 14593 (1999). Kakovost vode – Vrednotenje popolne aerobne biorazgradljivosti organskih spojin v aerobnem mediju – Metoda z analizo anorganskega ogljika v zaprtih posodah (preskus CO2 v nadprostoru). | (17) | Battersby, N. S. (1997). The ISO headspace CO2 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813–1822. | (18) | US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance, Washington, DC. | (19) | Battersby, N. S., Ciccognani, D., Evans, M. R., King, D., Painter, H.A., Peterson, D. R. in Starkey, M. (1999). An ‚inherent‘ biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219–3235. | (20) | Poglavje C.4 te priloge, Določanje ‚dobre‘ biološke razgradljivosti. | (21) | OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biodegradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano in M. Takatsuki; CITI). Pariz. | (22) | Poglavje C.11 te priloge, Preskus zaviranja dihanja aktivnega blata. | (23) | Struijs, J., Stoltenkamp-Wouterse, M. J., in Dekkers, A. L. M. (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319–327. | (24) | EU (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, maj 1999, Medmenham, SL7 2HD, Združeno kraljestvo. | (25) | ISO 10634 (1996). Kakovost vode – Navodilo za pripravo in obdelavo v vodi slabo topnih organskih spojin za nadaljnje vrednotenje njihove biorazgradljivosti v vodi. | Dodatek 1 | OKRAJŠAVE IN OPREDELITEV POJMOV | IC: anorganski ogljik; | ThCO2: teoretični ogljikov dioksid (mg) je količina ogljikovega dioksida, izračunana iz znane ali izmerjene vsebnosti ogljika v preskusni kemikaliji, ki se proizvede ob njeni popolni mineralizaciji; izražena tudi v mg ogljikovega dioksida, nastalega na mg preskusne kemikalije; | DOC: raztopljeni organski ogljik je organski ogljik, ki je prisoten v raztopini, ali gre skozi 0,45-mikrometrski filter, ali ostane v supernatantu po 15-minutnem centrifugiranju pri približno 4 000 g (40 000 m s-2); | DIC: raztopljeni anorganski ogljik; | ThIC: teoretični anorganski ogljik; | TIC: skupni anorganski ogljik; | dobro biološko razgradljivo: arbitrarna razvrstitev kemikalij, ki so uspešno opravile nekatere specifične presejalne preskuse za popolno biološko razgradljivost; ker so ti preskusi dovolj strogi, se predpostavlja, da se bodo take kemikalije v vodnem okolju in aerobnih pogojih hitro in povsem biološko razgradile; | 10-dnevno obdobje: obdobje 10 dni, ki se začne takoj, ko je dosežena 10-odstotna biološka razgradnja; | inherentna biološka razgradljivost: razvrstitev snovi, za katere obstajajo nedvoumni dokazi biološke razgradljivosti (primarni ali popolni) iz katerega koli preskusa biološke razgradljivosti; | popolna aerobna biološka razgradnja: raven biološke razgradnje, ki je dosežena, ko mikroorganizmi povsem porabijo preskusno kemikalijo, pri čemer nastanejo ogljikov dioksid, voda, mineralne soli in nove mikrobne celične sestavine (biomasa); | mineralizacija: popolna razgradnja organske kemikalije v CO2 in H2O v aerobnih pogojih oziroma CH4, CO2 in H2O v anaerobnih pogojih; | faza prilagajanja: čas, ki preteče od začetka preskusa do aklimatizacije in/ali prilagoditve razgradnih mikroorganizmov in do povišanja stopnje biološke razgradnje preskusne kemikalije ali organske snovi do zaznavne ravni (npr. 10 % največje teoretične biološke razgradnje ali manj, odvisno od točnosti merilne tehnike); | faza razgradnje: čas od konca obdobja prilagajanja do trenutka, ko se doseže 90 % najvišje ravni razgradnje; | faza konstantne ravni: faza, v kateri se doseže največja razgradnja, krivulja biološke razgradnje pa se zravna; | preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Primer krivulje biološke razgradnje | Slika 1 | Biološka razgradnja 1-oktanola v preskusu CO2 v nadprostoru | Glosar: | Biološka razgradnja | Faza razgradnje | Najvišja stopnja biološke razgradnje | Faza konstantne ravni | 10-dnevno obdobje | Čas preskusa (dnevi) | C.30 BIOAKUMULACIJA V KOPENSKIH MALOŠČETINCIH | UVOD | 1. | Ta preskusna metoda ustreza Smernici za preskušanje OECD (TG) 317 (2010). Med preskusnimi metodami, ki se nanašajo na okoljsko usodo, je bila leta 1996 objavljena Biokoncentracija: pretočni preskus na ribah (poglavje C.13 te priloge (49)), leta 2008 pa Bioakumulacija v bentoških maloščetincih, ki živijo v usedlinah (53). Ekstrapolacija podatkov o bioakumulaciji v vodnih organizmih na kopenske organizme, kot so deževniki, je zahtevna, če je sploh mogoča. Za ocenjevanje bioakumulacije kemikalij v tleh se trenutno uporabljajo modelni izračuni na podlagi lipofilnosti preskusne kemikalije, npr. (14) (37), kot na primer v tehničnih smernicah EU (19). Potreba po preskusni metodi za posamezna področja se je že začela obravnavati, npr. (55). Taka metoda je zlasti pomembna za ocenjevanje sekundarne zastrupitve v kopenskih prehranjevalnih verigah (4). Več nacionalnih preskusnih metod se ukvarja z vprašanjem bioakumulacije v organizmih, ki niso ribe, npr. (2) in (72). Ameriško združenje za preskušanje in materiale (American Society for Testing and Materials) je razvilo metodo za merjenje bioakumulacije v deževnikih (Eisenia fetida, Savigny) in enhitrejih iz kontaminiranih tal (3). Mednarodno priznana metoda za določanje bioakumulacije v tleh s primešano preskusno snovjo bo izboljšala ocenjevanje tveganja kemikalij v kopenskih ekosistemih, npr. (25) (29). | 2. | Nevretenčarji, ki jedo prst, so izpostavljeni kemikalijam v tleh. Med temi živalmi imajo kopenski maloščetinci pomembno vlogo pri strukturi in funkciji tal (15) (20). Živijo v tleh in delno ob površju (zlasti v plasti rastlinskega odpada); pogosto so najštevilnejša vrsta v biomasi (54). Z bioturbacijo tal in kot plen lahko te živali močno vplivajo na biološko razpoložljivost kemikalij za druge organizme, kot so nevretenčarji (npr. plenilske pršice in hrošči; npr. (64)) ali plenilski vretenčarji (npr. lisice in galebi) (18) (62). Nekatere vrste kopenskih maloščetincev, ki se trenutno uporabljajo pri ekotoksikološkem preskušanju, so opisane v Dodatku 5. | 3. | V Standardnih smernicah ASTM za izvajanje laboratorijskih preskusov strupenosti tal ali bioakumulacije z deževniki Eisenia fetida (Lumbricidae) in enhitrejev Enchytraeus albidus (Enchytraeidae) (3) so navedene številne bistvene in koristne podrobnosti za izvajanje te preskusne metode za bioakumulacijo v tleh. Nadaljnja dokumenta, ki sta navedena v tej preskusni metodi, sta poglavje C.13 te priloge Biokoncentracija: pretočni preskus na ribah (49) in Smernica za preskušanje OECD št. 315: Bioakumulacija v bentoških maloščetincih, ki živijo v usedlinah (53). Za to preskusno metodo so pomembni viri informacij tudi praktične izkušnje iz raziskav o bioakumulaciji v tleh in objave iz virov, npr. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79). | 4. | Ta preskusna metoda se v glavnem uporablja za stabilne nevtralne organske kemikalije, ki se rade adsorbirajo na zemljino. S to preskusno metodo je mogoče preskušanje bioakumulacije stabilnih organokovinskih spojin, vezanih v tleh. Uporabi se lahko tudi za kovine in druge elemente v sledeh. | OSNOVNI POGOJ | 5. | Preskusi za merjenje bioakumulacije kemikalije v kopenskih maloščetincih se izvajajo s težkimi kovinami (glej npr. (63)) in obstojnimi organskimi kemikalijami z vrednostmi log Kow med 3,0 in 6,0, npr. (40). Uporabljajo se tudi za: | — | kemikalije, pri katerih je vrednost log Kow večja od 6,0 (superhidrofobne kemikalije), | — | kemikalije, ki spadajo v razred organskih kemikalij, za katere je znano, da se lahko kopičijo v živih organizmih, npr. površinsko aktivne ali močno adsorptivne kemikalije, | — | kemikalije, katerih strukturne značilnosti kažejo na možnost bioakumulacije, npr. analogi kemikalij z znanim bioakumulacijskim potencialom, in | — | kovine. | 6. | Pred začetkom raziskave je treba pridobiti informacije o preskusni kemikaliji, kot so splošno ime, kemijsko ime (po možnosti ime IUPAC), strukturna formula, registrska številka CAS, čistost, varnostni ukrepi, ustrezni pogoji shranjevanja in analitske metode. Poleg tega bi bilo treba poznati naslednje podatke: | (a) | topnost v vodi; | (b) | koeficient porazdelitve oktanol/voda, Kow; | (c) | koeficient porazdelitve zemljina/voda, izražen kot Koc; | (d) | parni tlak; | (e) | razgradljivost (npr. v tleh, vodi); | (f) | znani metaboliti. | 7. | Uporabiti je mogoče tudi radioaktivno označene in neoznačene preskusne kemikalije. Za lažjo analizo se priporoča uporaba radioaktivno označene preskusne kemikalije. Odločitev se sprejme na podlagi meja zaznavnosti ali zahteve glede merjenja matične preskusne kemikalije in metabolitov. Če se uporabi radioaktivno označena preskusna kemikalija in merijo skupni radioaktivni ostanki, je pomembno, da se radioaktivno označeni ostanki v tleh in preskusnih organizmih opredelijo glede deležev matične preskusne kemikalije in tiste, ki je označena za nematično, npr. v vzorcih, vzetih v stabilnem stanju ali ob koncu faze absorpcije, da je mogoče izračunati bioakumulacijski faktor (BAF) za matično preskusno kemikalijo in zadevne metabolite v tleh (glej odstavek 50). Za merjenje radioaktivno neoznačenih organskih preskusnih kemikalij ali kovin je tu opisano metodo morda treba prilagoditi, npr. za zagotovitev zadostne biomase. Pri merjenju skupnih radioaktivnih ostankov (s tekočinskim scintilacijskim štetjem po ekstrakciji, sežigu ali omogočitvi topnosti tkiva) bioakumulacijski faktor temelji na matični preskusni kemikaliji in metabolitih. Izračun BAF mora po možnosti temeljiti na koncentraciji matične preskusne kemikalije v organizmih in skupnih radioaktivnih ostankov. Nato je treba za primerljivost rezultatov iz različnih preskusov bioakumulacije iz BAF izračunati faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF), normaliziran na vsebnost lipidov v črvih in vsebnost organskega ogljika (OC) v tleh. | 8. | Znana mora biti strupenost preskusne kemikalije za vrsto, uporabljeno v preskusu, npr. koncentracija z učinkom (ECx) ali smrtna koncentracija (LCx) v fazi absorpcije (npr. (19)). Izbrana koncentracija preskusne kemikalije mora biti po možnosti približno 1 % njenega akutnega asimptotičnega LC50 in vsaj desetkrat višja kot meja njenega zaznavanja v tleh z uporabljeno analitsko metodo. Prednost je treba dati vrednostim strupenosti, ki izhajajo iz dolgotrajnih raziskav subletalnih končnih točk, če so na voljo (51) (52). Če taki podatki niso na voljo, je koristne informacije mogoče dobiti s preskusom akutne strupenosti (glej npr. (23)). | 9. | Na voljo mora biti ustrezna analitska metoda znane točnosti, natančnosti in občutljivosti za količinsko opredelitev kemikalije v preskusnih raztopinah, tleh in biološkem materialu, pa tudi podrobnosti o pripravi in shranjevanju vzorcev ter varnostni listi za snov. Znane morajo biti tudi analitske meje zaznavnosti preskusne snovi v tleh in tkivu črvov. Pri uporabi preskusne kemikalije, označene s 14C, je treba poznati specifično radioaktivnost (tj. Bq mol-1) in delež radioaktivnosti, povezan z nečistotami. Specifična radioaktivnost preskusne kemikalije mora biti dovolj visoka, da omogoča analizo, uporabljene preskusne koncentracije pa ne smejo sprožiti strupenih učinkov. | 10. | Preskus se lahko izvaja z umetnimi ali naravnimi zemljinami. Pred začetkom preskusa je treba poznati informacije o značilnostih uporabljene naravne zemljine, npr. izvor zemljine ali njenih sestavin, pH, vsebnost organskega ogljika, velikostno porazdelitev delcev (delež peska, mulja in gline) in zmogljivost zadrževanja vode (WHC) (3) (48). | NAČELO PRESKUSA | 11. | Med parametri, ki so značilni za bioakumulacijo preskusne kemikalije, so bioakumulacijski faktor (BAF), konstanta hitrosti absorpcije (ks) in konstanta hitrosti izločanja (ke). Opredelitve so navedene v Dodatku 1. | 12. | Preskus sestavljata dve fazi: faza absorpcije (izpostavljenosti) in faza izločanja (po izpostavljenosti). V fazi absorpcije so ponovitvene skupine črvov izpostavljene zemljini, ki ji je dodana preskusna kemikalija. Poleg preskusnih živali so v enakih pogojih kontrolne skupine črvov, le brez preskusne kemikalije. Izmerita se suha teža preskusnih organizmov in vsebnost lipidov v njih. Pri tem je mogoče uporabiti črve iz kontrolne skupine. Analitske vrednosti ozadja (slepi vzorec) je mogoče dobiti z analizo kontrolnih vzorcev črvov in tal. Za fazo izločanja se črvi prenesejo v tla, v katerih ni preskusne kemikalije. Faza izločanja je vedno potrebna, razen če je absorpcija preskusne kemikalije v fazi izpostavljenosti zanemarljiva. Faza izločanja zagotavlja informacije o hitrosti, s katero se preskusna kemikalija izloča iz preskusnih organizmov (npr. (27)). Če v fazi absorpcije stabilno stanje ni doseženo, mora določitev kinetičnih parametrov – kinetičnega bioakumulacijskega faktorja BAFk, konstante hitrosti absorpcije in konstante hitrosti izločanja – po možnosti temeljiti na hkratnem prilagajanju rezultatov iz faze absorpcije in faze izločanja. Koncentracija preskusne kemikalije v/na črvih se spremlja ves čas trajanja obeh faz preskusa. | 13. | V fazi absorpcije se meritve opravljajo ob časih vzorčenja do največ 14 dni (enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki), dokler ni doseženo stabilno stanje (11) (12) (67). Stabilno stanje je vzpostavljeno, ko je krivulja koncentracije v črvih v odvisnosti od časa vzporedna s časovno osjo in se tri zaporedne analize koncentracije vzorcev, vzetih v vsaj dvodnevnih intervalih, med seboj ne razlikujejo za več kot ± 20 % glede na statistične primerjave (npr. analiza variance, regresijska analiza). | 14. | V fazi izločanja se preskusni organizmi prenesejo v posode z istim substratom brez preskusne kemikalije. V fazi izločanja se meritve opravljajo 14 dni (enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki) ob časih vzorčenja, razen če je prejšnje analitsko določanje pokazalo 90-odstotno zmanjšanje ostankov preskusne kemikalije v črvih. O koncentraciji preskusne kemikalije v črvih ob koncu faze izločanja se poroča kot o neizločenih ostankih. Bioakumulacijski faktor stabilnega stanja (BAFss) se izračuna po možnosti kot razmerje med koncentracijo v črvih (ca) in tleh (Cs) v očitnem stabilnem stanju ter kot kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK) oziroma razmerje med konstanto hitrosti absorpcije iz tal (ks) in konstanto hitrosti izločanja (ke) (za opredelitve glej Dodatek 1) ob predpostavki kinetike prvega reda (za izračune glej Dodatek 2). Če kinetika prvega reda očitno ni ustrezna, je treba uporabiti druge modele. | 15. | Konstanta hitrosti absorpcije, konstanta hitrosti izločanja (ali konstante pri uporabi drugih modelov), kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK), in kjer je to mogoče, intervali zaupanja za vse te parametre se izračunajo po računalniških modelnih enačbah (za navodila glej Dodatek 2). Ustreznost prileganja modela je mogoče ugotoviti na primer na podlagi korelacijskega koeficienta ali determinacijskega koeficienta (koeficienti blizu ena pomenijo dobro prileganje) ali hi-kvadrata. Kažeta jo lahko tudi velikost standardne napake ali interval zaupanja za ocenjene parametre. | 16. | Za zmanjšanje variabilnosti rezultatov preskusa za preskusne kemikalije z visoko lipofilnostjo je treba bioakumulacijske faktorje izraziti v odvisnosti od vsebnosti lipidov in vsebnosti organskega ogljika (vsebnost organskega ogljika (OC) v kg zemljine, vsebnost lipidov v kg-1 črvov). Ta pristop temelji na dejstvu, da pri nekaterih razredih kemikalij obstaja jasna povezanost med potencialom bioakumulacije in lipofilnostjo; to je že dobro dokazano pri ribah (47). Obstaja povezanost med vsebnostjo lipidov v ribah in bioakumulacijo takih kemikalij. Podobna medsebojna odvisno je bila ugotovljena pri bentoških organizmih, npr. (30) (44), dokazana pa je tudi za kopenske maloščetince, npr. (5) (6) (7) (14). Če je na voljo dovolj črvjega tkiva, je mogoče vsebnost lipidov v preskusnih živalih določiti z uporabo istega biološkega materiala kot za določanje koncentracije preskusne kemikalije. Sicer se lahko za meritev vsebnosti lipidov uporabijo kontrolne živali. | VELJAVNOST PRESKUSA | 17. | Da je preskus veljaven, morajo kontrolni in tretirani vzorci izpolnjevati naslednja merila: | — | ob koncu preskusa skupna smrtnost v fazah absorpcije in izločanja ne sme presegati 10 % (deževniki) oziroma 20 % (enhitreji) skupnega števila uporabljenih črvov, | — | pri Eisenia fetida in Eisenia andrei srednja izguba teže, merjena ob koncu faze absorpcije in ob koncu faze izločanja, ne sme presegati 20 % v primerjavi z začetno svežo težo (f.w.) na začetku posamezne faze. | OPIS METODE | Preskusne vrste | 18. | Za preskušanje bioakumulacije je priporočenih več vrst kopenskih maloščetincev. Največkrat uporabljene vrste Eisenia fetida, ali Eisenia andrei (Lumbricidae), ali Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, ali Enchytraeus luxuriosus (Enchytraeidae) so opisane v Dodatku 5. | Oprema | 19. | Pri vseh delih opreme se je treba izogibati uporabi materialov, ki se lahko raztopijo, adsorbirajo preskusno kemikalijo ali iz katerih se lahko izlužijo druge kemikalije in ki škodljivo učinkujejo na preskusne živali. Uporabiti je mogoče standardne pravokotne ali valjaste posode iz kemijsko inertne snovi in s primerno prostornino, ki ustrezajo stopnji obremenitve, tj. številu preskusnih črvov. Za opremo, ki je v stiku s preskusnimi mediji, se lahko uporabijo nerjavno jeklo, plastika ali steklo. Preskusne posode je treba ustrezno pokriti, da se prepreči uhajanje črvov, hkrati pa omogoči zadosten dotok zraka. Pri kemikalijah z visokimi adsorpcijskimi koeficienti, kot so sintetični piretroidi, je lahko potrebno silanizirano steklo. V teh primerih je treba opremo po uporabi zavreči (49). Preprečiti je treba uhajanje radioaktivno označenih preskusnih snovi in hlapnih kemikalij. Uporabiti je treba lovilnike (npr. steklene plinske izpiralke), ki vsebujejo ustrezne absorbente za zadrževanje morebitnih ostankov, ki izparijo iz preskusnih posod. | Tla | 20. | Tla morajo biti take kakovosti, ki omogoča preživetje in po možnosti razmnoževanje preskusnih organizmov med aklimatizacijo in preskušanjem, ne da bi bili pri tem videti nenormalno ali bi se nenormalno obnašali. Črvi se morajo zariti v tla. | 21. | Umetna zemljina, opisana v poglavju C.8 te priloge (48), je priporočena za uporabo kot substrat v preskusih. V Dodatku 4 so podani opis priprave umetne zemljine za uporabo pri preskusu bioakumulacije in priporočila za shranjevanje umetne zemljine. Na zraku posušena umetna zemljina se lahko do uporabe hrani pri sobni temperaturi. | 22. | Za preskusna tla in/ali tla za gojenje je mogoče uporabiti tudi naravno zemljino z neonesnaženih območij. Pri naravni zemljini je treba opredeliti vsaj izvor (mesto odvzema), pH, vsebnost organskega ogljika, velikostno porazdelitev delcev (delež peska, mulja in gline), največjo zmogljivost zadrževanja vode (WHCmax) in delež vsebnosti vode (3). Analiza tal ali njihovih sestavin, kar zadeva mikro onesnaževala, pred uporabo bi morala dati koristne informacije. Če se uporabi zemljina s kmetijskih zemljišč, se že vsaj eno leto pred vzorčenjem ne smejo obdelovati z izdelki za zaščito pridelka ali gnojem tretiranih živali kot gnojili, z organskimi gnojili pa že vsaj šest mesecev pred vzorčenjem (50). Postopki ravnanja z naravno zemljino pred uporabo v ekotoksikoloških preskusih z maloščetinci v laboratoriju so opisani v (3). Pri naravni zemljini mora biti čas shranjevanja v laboratoriju čim krajši. | Uporaba preskusne kemikalije | 23. | Preskusna kemikalija se vnese v tla. Pri tem je treba upoštevati njene fizikalno-kemijske lastnosti. Preskusno kemikalijo, ki se topi v vodi, je treba pred mešanjem z zemljino povsem raztopiti v vodi. Priporočeni postopek dodajanja preskusnih kemikalij, ki se slabo topijo v vodi, vključuje prekrivanje ene ali več sestavin (umetne) zemljine s preskusno kemikalijo. Kremenov pesek ali del kremenovega peska je mogoče na primer namočiti v raztopini preskusne kemikalije v primernem organskem topilu ter jo nato počasi izpariti do suhega. Prekriti del se lahko nato vmeša v vlažna tla. Velika prednost tega postopka je, da se v tla ne vnese topilo. Pri uporabi naravne zemljine je mogoče preskusno kemikalijo dodati s primešanjem k delu na zraku posušene zemljine, kot je opisano zgoraj za umetno zemljino, ali z vmešanjem preskusne kemikalije v vlažno zemljino, z naknadnim izparevanjem, če je uporabljeno topilo. Na splošno se je treba čim bolj izogibati stiku vlažne zemljine s topili. Treba je upoštevati naslednje (3): | — | če se uporabi topilo, ki ni voda, mora biti tako, da se lahko meša z vodo in/ali da ga je mogoče odstraniti (na primer upariti), tako da v tleh ostane samo preskusna kemikalija, | — | če se uporabi kontrolni vzorec s topilom, negativna kontrola ni potrebna. Kontrolni vzorec s topilom mora vsebovati največjo koncentracijo topila, dodano zemljini, uporabiti pa je treba topilo iz iste šarže kot za osnovno raztopino. Strupenost in hlapnost topila ter topnost preskusne kemikalije v izbranem topilu bi morale biti glavna merila za izbiro primernega topila. | 24. | Pri kemikalijah, ki so slabo topne v vodi in organskih topilih, je mogoče 2,0–2,5 g drobno mletega kremenovega peska na preskusno posodo zmešati z določeno količino preskusne kemikalije, npr. s terilnico in pestilom, da nastane želena preskusna koncentracija. Ta mešanica kremenovega peska in preskusne kemikalije se lahko doda predhodno navlaženi zemljini in temeljito zmeša z ustrezno količino deionizirane vode, da nastane potrebna vsebnost vlage. Končna mešanica se porazdeli v preskusne posode. Postopek se ponovi za vsako preskusno koncentracijo in pripravi tudi ustrezni kontrolni vzorec z 2,0–2,5 g drobno mletega kremenovega peska na preskusno posodo. | 25. | Koncentracijo preskusne kemikalije v tleh je treba določiti po primešanju. Pred uvedbo preskusnih organizmov je treba preveriti homogeno porazdelitev preskusne kemikalije v tleh. Poročati je treba o metodi, uporabljeni za primešanje, in razlogih za izbiro posebnega postopka primešanja (24). | 26. | Idealno je, če se pred dodajanjem organizmov vzpostavi ravnotežje med zemljino in fazo porne vode; priporočeno je štiridnevno obdobje pri 20 °C. Pri številnih organskih kemikalijah, ki so slabo topne v vodi, se lahko čas, potreben za vzpostavitev resničnega ravnotežja med adsorbiranimi in raztopljenimi delci, šteje v dnevih ali mesecih. Glede na namen raziskave, na primer pri posnemanju razmer v okolju, se lahko zemljina s primešano preskusno snovjo ‚stara‘ dlje, npr. pri kovinah tri tedne pri 20 °C (22). | Gojenje preskusnih organizmov | 27. | Črvi se po možnosti gojijo v trajni laboratorijski kulturi. Navodila o metodah laboratorijskega gojenja za vrste Eisenia fetida in Eisenia andrei ter Enchytraeid so podana v Dodatku 5 (glej tudi (48) (51) (52)). | 28. | Črvi, uporabljeni v preskusih, morajo biti brez ugotovljivih bolezni, bolezenskih sprememb in zajedavcev. | IZVEDBA PRESKUSA | 29. | Preskusni organizmi so preskusni kemikaliji izpostavljeni v fazi absorpcije. Ta mora trajati 14 dni (enhitreji) oziroma 21 dni (deževniki), razen če se dokaže, da je bilo vzpostavljeno stabilno stanje. | 30. | Za fazo izločanja se črvi prenesejo v tla, v katerih ni preskusne kemikalije. Prvi vzorec je treba vzeti 4–24 h po začetku faze izločanja. Primeri časovnih razporedov vzorčenja za 21-dnevno fazo absorpcije in 21-dnevno fazo izločanja so podani v Dodatku 3. | Preskusni organizmi | 31. | Pri številnih vrstah kopenskih enhitrejev je teža posameznih osebkov zelo majhna (npr. 5–10 mg mokre teže na posamezno žival vrste Enchytraeus albidus in manj pri vrstah Enchytraeus crypticus ali Enchytraeus luxuriosus); za meritev teže in kemično analizo je včasih treba združevati črve iz ponovitvenih preskusnih posod (tj. uporabijo se vsi črvi iz ponovitvene posode, da se dobi en analitski rezultat za tkivo). Vsaki ponovitvi se doda 20 posameznih enhitrejev, uporabiti pa je treba vsaj tri ponovitve. Če je analitska meja zaznavnosti preskusne kemikalije visoka, je lahko potrebnih več črvov. Pri preskusnih vrstah z večjo težo posameznega osebka (Eisenia fetida in Eisenia andrei) je mogoče uporabiti ponovitvene posode z enim osebkom. | 32. | Deževniki, uporabljeni v preskusu, morajo imeti podobno težo (npr. posamezne živali vrst Eisenia fetida in Eisenia andrei bi morale tehtati 250–600 mg). Enhitreji (npr. Enchytraeus albidus) morajo biti dolgi približno 1 cm. Vsi črvi, uporabljeni v posameznem preskusu, morajo biti iz istega vira in biti odrasle živali s klitelumom (glej Dodatek 5). Ker lahko teža in starost živali vplivata na vrednosti BAF (npr. zaradi različnih vsebnosti lipidov in/ali prisotnosti jajčec), je treba te parametre natančno zapisovati in jih upoštevati pri razlagi rezultatov. Poleg tega lahko živali v obdobju izpostavljenosti odložijo kokone, kar tudi vpliva na vrednosti BAF. Priporočeno je pred preskusom stehtati podvzorec preskusnih črvov, da se ocenita srednja mokra in suha teža. | 33. | Uporabiti je treba visoko razmerje med zemljino in črvi, da se v fazi absorpcije čim bolj zmanjša zniževanje koncentracije preskusne kemikalije v tleh. Za vrsti Eisenia fetida in Eisenia andrei je priporočenih najmanj 50 g suhe teže (d.w.) zemljine na črva, za enhitreje pa najmanj 10–20 g d.w. zemljine na preskusno posodo. Posode morajo vsebovati 2–3-centimetrski (enhitreji) oziroma 4–5-centimetrsko plast zemljine (deževniki). | 34. | Črvi, uporabljeni v preskusu, se odstranijo iz gojišča (npr. enhitreji se odstranijo s pinceto z zaobljeno konico). Odrasle živali se prestavijo v neobdelana preskusna tla za aklimatizacijo in nahranijo (glej odstavek 36). Če se preskusni pogoji razlikujejo od pogojev gojenja, bi morala aklimatizacijska faza, ki traja 24–72 h, zadostovati za prilagoditev črvov na preskusne pogoje. Po aklimatizaciji se deževniki s premestitvijo sperejo v steklene posode (npr. petrijevke), ki vsebujejo čisto vodo, nato pa se stehtajo, preden se dodajo v preskusna tla. Pred tehtanjem je treba odstraniti odvečno vodo s črvov tako, da se nežno pritisnejo ob rob posode ali pa se voda previdno popivna z njih z rahlo navlaženo papirnato brisačo. | 35. | Opazovati in zapisovati je treba obnašanje preskusnih organizmov v zvezi z zarivanjem. Pri preskusih z deževniki se živali (kontrolni in tretirani vzorci) običajno zarijejo v tla v nekaj urah; to je treba preveriti najpozneje 24 h po tem, ko se črvi dajo v preskusne posode. Če se deževniki ne zarijejo v tla (npr. več kot 10 % v več kot polovici faze absorpcije), to pomeni, da preskusni pogoji niso ustrezni ali da preskusni organizmi niso zdravi. V takem primeru je treba preskus ustaviti in ponoviti. Enhitreji večinoma živijo v intersticijskih porah v tleh, njihov integument pa je pogosto samo delno v stiku s substratom v okolju; izpostavljenost enhitrejev, ki se zarijejo v tla, in tistih, ki se ne, se šteje za enakovredno, če se enhitreji ne zarijejo v tla, pa to ne pomeni nujno, da je treba preskus ponoviti. | Hranjenje | 36. | Pri uporabi zemljine z majhno vsebnostjo skupnega organskega ogljika je treba predvideti hranjenje. Pri uporabi umetne zemljine je za deževnike priporočena tedenska količina hrane (črvi naj se hranijo enkrat tedensko), ki znaša 7 mg posušenih iztrebkov na g suhe teže zemljine, za enhitreje pa tedenska količina 2–2,5 mg mletih ovsenih kosmičev na g suhe teže zemljine (11). Prvi obrok hrane je treba primešati v zemljino tik pred dodajanjem preskusnih organizmov. Po možnosti se uporabi ista vrsta hrane kot v gojiščih (glej Dodatek 5). | Svetloba in temperatura | 37. | Preskuse je treba izvajati v kontroliranem ciklusu 16 ur svetlobe in 8 ur teme, po možnosti pri 400–800 lux na mestu s preskusnimi posodami (3). Preskusna temperatura mora biti ves čas preskusa 20 ± 2 °C. | Preskusne koncentracije | 38. | Uporabi se samo ena koncentracija. Uporabo dodatnih koncentracij je treba utemeljiti. Če je strupenost (ECx) preskusne kemikalije blizu analitski meji zaznavnosti, je priporočena uporaba radioaktivno označene preskusne kemikalije z visoko specifično radioaktivnostjo. Pri kovinah mora biti koncentracija nad ravnjo ozadja v tkivu in tleh. | Ponovitve | 39. | Za kinetične meritve (fazi absorpcije in izločanja) morajo biti najmanj tri ponovitvene posode s tretiranim vzorcem na točko vzorčenja. Skupno število pripravljenih ponovitev mora zadostovati za vse čase vzorčenja v fazi absorpcije in fazi izločanja. | 40. | Za biološka opazovanja in meritve (npr. razmerje med suho in mokro težo, vsebnost lipidov) ter analizo koncentracij ozadja v črvih in tleh je treba zagotoviti vsaj 12 ponovitvenih posod z negativnim kontrolnim vzorcem (štiri, vzorčene na začetku, štiri na koncu absorpcije in štiri na koncu izločanja), če se ne uporablja drugo topilo kot voda. Če se za dodajanje preskusne kemikalije uporabi drugo topilo, je treba poleg tretiranih ponovitev pripraviti tudi kontrolni vzorec s topilom (štiri ponovitvene posode je treba vzorčiti na začetku, štiri na koncu faze absorpcije in štiri na koncu faze izločanja), ki vsebuje vse sestavine, razen preskusne snovi. V tem primeru je mogoče uporabiti tudi štiri dodatne ponovitvene posode z negativnim kontrolnim vzorcem (brez topila) za neobvezno vzorčenje na koncu faze absorpcije. Te ponovitve je mogoče biološko primerjati s kontrolnim vzorcem s topilom, da se dobijo informacije o morebitnem vplivu topila na preskusne organizme. Priporočeno je pripraviti zadostno število dodatnih rezervnih ponovitvenih posod (npr. osem) za tretirane in kontrolne vzorce. | Pogostost meritev kakovosti tal | 41. | Na začetku in koncu faz absorpcije in izločanja je treba izmeriti vrednost pH tal, vsebnost vlage v tleh in temperaturo (stalno) v sobi, v kateri se izvaja preskus. Enkrat tedensko je treba preveriti vsebnost vlage v tleh s tehtanjem preskusnih posod in primerjanjem dejanskih tež z začetnimi težami na začetku preskusa. Izgubo vode je treba nadomestiti z dodajanjem deionizirane vode. | Vzorčenje in analiza črvov in tal | 42. | Primer časovne razporeditve faz absorpcije in izločanja v preskusih bioakumulacije v deževnikih in enhitrejih je podan v Dodatku 3. | 43. | Vzorci tal se odvzamejo iz preskusnih posod za določitev koncentracije preskusne kemikalije pred vnosom črvov ter v fazah absorpcije in izločanja. Med preskusom se določajo koncentracije preskusne kemikalije v črvih in tleh. Na splošno se merijo skupne koncentracije v tleh. Mogoče je meriti tudi koncentracije v porni vodi; v takem primeru je treba pred začetkom raziskave podati razloge za to in zagotoviti ustrezne metode ter jih vključiti v poročilo. | 44. | Črvi in tla se vzorčijo vsaj šestkrat v fazah absorpcije in izločanja. Če se dokaže stabilnost preskusne kemikalije, je lahko analiz tal manj. Priporočeno je analizirati vsaj tri ponovitve na začetku in koncu faze absorpcije. Če koncentracija v tleh, izmerjena na koncu faze absorpcije, odstopa od začetne koncentracije za več kot za 30 %, je treba analizirati tudi vzorce tal, vzete v drugih dneh. | 45. | Ob vsakem času vzorčenja se črvi iz ponovitve odstranijo iz tal (npr. ko se zemljina iz ponovitve razporedi na plitev pladenj, se črvi poberejo z mehko pinceto z zaobljeno konico) in na hitro sperejo z vodo v plitvem steklenem ali jeklenem pladnju. Odvečna voda se odstrani (glej odstavek 34). Črvi se pazljivo premestijo v predhodno stehtano posodo in takoj stehtajo, vključno z vsebino prebavil. | 46. | Deževnikom (Eisenia sp.) je nato treba omogočiti, da čez noč praznijo prebavila, npr. na vlažnem filtrirnem papirju v pokriti petrijevki (glej odstavek 34). Po tem je treba določiti težo črvov, da se oceni morebitno zmanjšanje biomase med preskusom (glej merila veljavnosti v odstavku 17). Tkiva enhitrejev se tehtajo in analizirajo brez praznjenja prebavil, saj je to tehnično zahtevno, ker so ti črvi tako majhni. Po določitvi končne teže jih je treba takoj ubiti z najprimernejšo metodo (npr. s tekočim dušikom ali zamrznjenjem pri temperaturi pod –18 °C). | 47. | Črvi v fazi izločanja nadomestijo kontaminirano vsebino prebavil s čisto zemljino. To pomeni, da meritve pri črvih z neizpraznjenimi prebavili (v tem primeru enhitrejih), vzorčenih tik pred fazo izločanja, vključujejo kontaminirano zemljino v prebavilih. Pri vodnih maloščetincih se predpostavlja, da se po začetnih 4–24 h faze izločanja večina kontaminirane vsebine prebavil nadomesti s čistim sedimentom, npr. (46). O podobnih ugotovitvah se je poročalo v zvezi z deževniki v raziskavah o kopičenju radioaktivno označenega kadmija in cinka (78). Pri enhitrejih z neizpraznjenimi prebavili se lahko koncentracija tega prvega vzorca v fazi izločanja šteje za koncentracijo v tkivu po praznjenju prebavil. Da bi upoštevali razredčenje koncentracije preskusne snovi z nekontaminirano zemljino v fazi izločanja, je mogoče oceniti težo vsebnosti prebavil iz razmerja med mokro težo črvov in težo pepela črvov ali razmerja med suho težo črvov in težo pepela črvov. | 48. | Vzorci tal in črvov se po možnosti analizirajo takoj po odstranitvi (tj. v 1–2 dneh), da se preprečijo razgradnja ali druge izgube. Priporočljivo je že med izvajanjem preskusa izračunati približne hitrosti absorpcije in izločanja. Če se analiza odloži, je treba vzorce ustrezno shraniti, npr. z globokim zamrzovanjem (≤ –18 °C). | 49. | Preveriti je treba, ali so natančnost in ponovljivost kemijske analize ter rekuperacija preskusne kemikalije iz vzorcev tal in črvov zadovoljivi za zadevno metodo; poročati je treba o učinkovitosti ekstrakcije, meji zaznavnosti (LOD) in meji količinske opredelitve (LOQ). Poleg tega je treba preveriti, da preskusna kemikalija v kontrolnih posodah ni zaznavna v koncentracijah, ki so višje kot v ozadju. Če je pri kontrolnih črvih koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem organizmu Ca > 0, je to treba vključiti v izračun kinetičnih parametrov (glej Dodatek 2). V celotnem preskusu je treba z vsemi vzorci ravnati tako, da se kontaminacija in izguba čim bolj zmanjšata (npr. zaradi adsorpcije preskusne kemikalije na napravo za vzorčenje). | 50. | Pri delu z radioaktivno označenimi preskusnimi kemikalijami je mogoče analizirati matične snovi in metabolite. Količinska opredelitev matične preskusne kemikalije in metabolitov v stabilnem stanju ali na koncu faze absorpcije vsebuje pomembne informacije. Vzorce je nato treba ‚očistiti‘, da je mogoče matično preskusno kemikalijo količinsko ločeno opredeliti. Če posamezni metaboliti presegajo 10 % skupne radioaktivnosti v analiziranih vzorcih, se priporoča identifikacija teh metabolitov. | 51. | Navesti je treba skupno rekuperacijo ter rekuperacijo preskusne kemikalije v črvih, tleh in lovilnikih, ki vsebujejo absorbente za zadrževanje uparjene preskusne kemikalije, če se uporabijo, in poročati o njiju. | 52. | Združevanje posameznih vzorčenih živali iz dane preskusne posode je sprejemljivo pri enhitrejih, ki so manjši od deževnikov. Če združevanje vključuje zmanjševanje števila ponovitev, to omejuje statistične postopke, ki jih je mogoče uporabiti za podatke. Če sta potrebna posebna statistični postopek in vrednost, je treba v preskus vključiti primerno število ponovitvenih preskusnih posod za prilagoditev želenemu združevanju, postopku in vrednosti. | 53. | Priporoča se, naj se BAF izrazi v odvisnosti od skupne suhe teže, in kadar je to potrebno (tj. pri močno hidrofobnih kemikalijah), v odvisnosti od vsebnosti lipidov. Za določanje vsebnosti lipidov je treba uporabiti primerne metode (za ta namen je treba prilagoditi nekatere obstoječe metode, npr. (31) (58)), pri katerih se uporablja tehnika ekstrakcije s kloroformom/metanolom. Da bi se izognili uporabi kloriranih topil, pa je treba uporabiti prilagojeno metodo Bligha in Dyerja (9), kot je opisana v (17). Ker različne metode ne dajo nujno enakih vrednosti, je pomembno navesti podrobnosti o uporabljeni metodi. Kadar je to mogoče, tj. če je na voljo dovolj črvjega tkiva, je analizo lipidov najbolje opraviti na istem vzorcu ali ekstraktu, na katerem je bila analizirana preskusna kemikalija, ker je treba lipide pogosto odstraniti iz ekstrakta, preden ga je mogoče kromatografsko analizirati (49). Sicer je mogoče za merjenje vsebnosti lipidov uporabiti kontrolne živali, kar je mogoče nato uporabiti za normalizacijo vrednosti BAF. Pri slednjem pristopu se zmanjša kontaminacija opreme s preskusno kemikalijo. | PODATKI IN POROČANJE | Obdelava rezultatov | 54. | Krivulja absorpcije preskusne kemikalije se dobi tako, da se njena koncentracija v/na črvih v fazi absorpcije grafično prikaže v odvisnosti od časa na aritmetični lestvici. Ko krivulja doseže konstantno raven ali stabilno stanje (glej opredelitve v Dodatku 1), se bioakumulacijski faktor stabilnega stanja BAFss izračuna iz: | Ca je koncentracija preskusne kemikalije v preskusnem organizmu, | Cs je koncentracija preskusne kemikalije v tleh. | 55. | Kadar stabilno stanje ni doseženo, je treba namesto BAFss določiti BAFK na podlagi konstant hitrosti, kot je opisano spodaj: | — | akumulacijski faktor (BAFK) se določi kot razmerje med ks in ke, | — | hitrosti absorpcije in izločanja se po možnosti izračunata hkrati (glej enačbo 11 v Dodatku 2), | — | konstanta hitrosti izločanja (ke) se običajno določi na podlagi krivulje izločanja (tj. grafičnega prikaza koncentracije preskusne snovi v črvih v fazi izločanja). Konstanta hitrosti absorpcije ks se nato izračuna iz ke in vrednosti Ca, ki se dobi iz krivulje absorpcije – za opis teh metod glej Dodatek 2. Za izračun faktorja BAFK in konstant hitrosti ks in ke je najbolje uporabiti računalniške metode za ocenjevanje nelinearnih parametrov. Če izločanje očitno ni prvega reda, je treba uporabiti kompleksnejše modele. | Poročilo o preskusu | 56. | V poročilu o preskusu morajo biti naslednje informacije: | | Preskusna kemikalija: | — | vse razpoložljive informacije o akutni ali dolgotrajni strupenosti (npr. ECx, LCx“ NOEC) preskusne kemikalije za maloščetince, ki živijo v tleh, | — | čistost, fizikalno stanje in fizikalno-kemijske lastnosti, npr. log Kow, vodotopnost, | — | kemijski identifikacijski podatki, vir preskusne snovi, identiteta in koncentracija uporabljenega topila, | — | če je uporabljena radioaktivno označena preskusna kemikalija, točen položaj označenih atomov, specifična radioaktivnost in radiokemijska čistost. | | Preskusna vrsta: | — | znanstveno ime, sev, vir, morebitna predobdelava, aklimatizacija, starost, red velikosti itd. | | Preskusni pogoji: | — | uporabljeni preskusni postopek, | — | tip in lastnosti uporabljene svetlobe in obdobja osvetljenosti, | — | načrt preskusa (npr. število in velikost preskusnih posod, teža zemljine in debelina plasti tal, število ponovitev, število črvov na ponovitev, število preskusnih koncentracij, trajanje faz absorpcije in izločanja, pogostost vzorčenja), | — | razlogi za izbiro materiala, iz katerega so preskusne posode, | — | metoda priprave in dodajanja preskusne snovi ter razlogi za izbiro metode, | — | nazivne preskusne koncentracije, srednje izmerjene vrednosti in njihovi standardni odkloni v preskusnih posodah ter metoda, s katero so bile te vrednosti pridobljene, | — | vir sestavin umetne zemljine ali – pri uporabi naravnih medijev – izvor zemljine, opis morebitne predobdelave, rezultati kontrol (preživetje, razvoj biomase, razmnoževanje), lastnosti tal (pH, vsebnost skupnega organskega ogljika, velikostna porazdelitev delcev (odstotni delež peska, mulja in gline), WHCmax, odstotni delež vsebnosti vode na začetku in koncu preskusa ter druge opravljene meritve), | — | podrobne informacije o obdelavi vzorcev tal in črvov, vključno s podrobnostmi o pripravi, shranjevanju, postopkih dodajanja snovi, ekstrakciji in analitskih postopkih (in natančnosti) za preskusno snov v črvih in tleh ter o vsebnosti lipidov (če je bila izmerjena) in rekuperaciji preskusne snovi. | | Rezultati: | — | smrtnost kontrolnih črvov in črvov v vsaki preskusni posodi ter opaženo nenormalno obnašanje (npr. izogibanje tlom, slabo razmnoževanje pri preskusu bioakumulacije v enhitrejih), | — | razmerje med suho in mokro težo zemljine in preskusnih organizmov (koristno za normalizacijo), | — | mokre teže črvov ob vsakem času vzorčenja; za deževnike mokre teže na začetku preskusa ter ob vsakem času vzorčenja pred praznjenjem prebavil in po njem, | — | vsebnost lipidov v preskusnih organizmih (če je bila določena), | — | krivulje, ki prikazujejo kinetiko absorpcije in izločanja preskusne kemikalije pri črvih ter čas do vzpostavitve stabilnega stanja, | — | Ca in Cs (s standardnim odklonom in razponom, če je ustrezno) za vse čase vzorčenja (Ca izražen v g·kg-1 mokre in suhe teže celega telesa, Cs izražen v g·kg-1 mokre in suhe teže zemljine). Če je potreben faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF) (npr. za primerjavo rezultatov dveh ali več preskusov, opravljenih z živalmi z različno vsebnostjo lipidov), je lahko Ca dodatno izražen v g·kg-1 vsebnosti lipidov v organizmu, Cs pa je lahko izražen v g·kg-1 organskega ogljika (OC) v tleh, | — | BAF (izražen v kg zemljine·kg-1 črvov), konstanta hitrosti absorpcije zemljine ks (izražena v g zemljine kg-1 črvov dan-1) in konstanta hitrosti izločanja ke (izražena v dan-1); v poročilu je lahko dodatno naveden BSAF (izražen v kg zemljine OC kg-1 vsebnosti lipidov v črvih), | — | če so bili izmerjeni: odstotni deleži matične kemikalije, metabolitov in vezanih ostankov (tj. odstotni delež preskusne kemikalije, ki ga ni mogoče ekstrahirati z običajnimi metodami ekstrakcije), zaznani v tleh in preskusnih živalih, | — | metode, uporabljene za statistično analizo podatkov. | | Vrednotenje rezultatov: | — | skladnost rezultatov z merili veljavnosti, navedenimi v odstavku 17, | — | nepričakovani ali nenavadni rezultati, npr. nepopolno izločanje preskusne kemikalije iz preskusnih živali. | VIRI: | (1) | Amorim, M. 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Izhaja iz procesov biokoncentracije in biomagnifikacije (glej spodaj); | | biokoncentracija je povečanje koncentracije preskusne kemikalije v organizmu ali na njem zaradi absorpcije kemikalije izključno iz okoliškega medija (tj. prek telesne površine in z zaužitjem), ki je odvisna od koncentracije preskusne kemikalije v okoliškem mediju; | | biomagnifikacija je povečanje koncentracije preskusne kemikalije v organizmu ali na njem predvsem zaradi absorpcije iz kontaminirane hrane ali plena, ki je odvisna od koncentracije preskusne kemikalije v hrani ali plenu. Biomagnifikacija lahko vodi do prenosa ali kopičenja preskusne snovi v prehranjevalnem spletu; | | izločanje preskusne kemikalije je odstranitev te kemikalije iz tkiva preskusnega organizma z aktivnimi ali pasivnimi procesi, ki se pojavijo neodvisno od prisotnosti ali odsotnosti preskusne snovi v okoliškem mediju; | | bioakumulacijski faktor (BAF) ob katerem koli času v fazi absorpcije tega preskusa bioakumulacije je koncentracija preskusne kemikalije v/na preskusnem organizmu (Ca v g·kg-1 suhe teže črva), deljena s koncentracijo kemikalije v okoliškem mediju (Cs v g·kg-1 suhe teže zemljine); BAF se izrazi v enotah kg zemljine·kg-1 črvov; | | bioakumulacijski faktor stabilnega stanja (BAFss) je BAF v stabilnem stanju in se ne spreminja znatno v daljšem časovnem obdobju, saj je koncentracija preskusne kemikalije v okoliškem mediju (Cs v g·kg-1 suhe teže zemljine) v tem obdobju konstantna; | | bioakumulacijski faktorji, izračunani neposredno iz razmerja med konstanto hitrosti absorpcije tal in konstanto hitrosti izločanja (ks in ke, glej spodaj), se imenujejo kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK); | | faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF) je na lipide normalizirana koncentracija preskusne kemikalije v/na preskusnem organizmu, deljena s koncentracijo preskusne kemikalije v tleh v stabilnem stanju, normalizirano na organski ogljik. Ca se tako izrazi kot g·kg-1 vsebnosti lipidov v organizmu, Cs pa kot g·kg-1 vsebnosti organskega ogljika v tleh; BSAF se izrazi v enotah kg OC·kg-1 lipidov; | | konstantna raven ali stabilno stanje je opredeljeno kot ravnotežje med procesoma absorpcije in izločanja, ki potekata hkrati v fazi izpostavljenosti. Stabilno stanje je v grafičnem prikazu BAF v odvisnosti od časa doseženo, ko krivulja postane vzporedna s časovno osjo in se tri zaporedne analize BAF na vzorcih, vzetih v razmiku najmanj dveh dni, druga od druge ne razlikuje za več kot 20 % ter ni statistično značilnih razlik med tremi obdobji vzorčenja. Za preskusne kemikalije, ki se počasi absorbirajo, so primernejši sedemdnevni razmiki (49); | | koeficient porazdelitve organski ogljik/voda (Koc) je razmerje med koncentracijo kemikalije v/na delu tal z organskim ogljikom in koncentracijo kemikalije v vodi v ravnotežju; | | koeficient porazdelitve oktanol/voda (Kow) je uravnoteženo razmerje topnosti kemikalije v n-oktanolu in vodi, včasih izraženo tudi kot Pow. Logaritem Kow (log Kow) se uporablja kot kazalnik potenciala kemikalije za kopičenje v vodnih organizmih; | | faza absorpcije ali izpostavitve je čas, v katerem so preskusni organizmi izpostavljeni preskusni kemikaliji; | | konstanta hitrosti absorpcije tal (ks) je numerična vrednost, ki opredeljuje stopnjo povišanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnem organizmu zaradi absorpcije iz talne faze. Konstanta ks se izrazi v g zemljine kg-1 črvov d-1; | | faza izločanja je čas po prenosu preskusnih organizmov iz kontaminiranega medija v medij brez preskusne snovi, v katerem se preučuje izločanje (ali neto izguba) kemikalije iz preskusnih organizmov; | | konstanta hitrosti izločanja (ke) je numerična vrednost, ki opredeljuje stopnjo znižanja koncentracije preskusne snovi v/na preskusnih organizmih po prenosu preskusnih organizmov iz medija s preskusno snovjo v medij brez kemikalije; ke se izrazi v d-1; | | preskusna kemikalija: snov ali zmes, preskušana z uporabo te preskusne metode. | Dodatek 2 | Izračun parametrov absorpcije in izločanja | Glavni cilj preskusa bioakumulacije je določitev bioakumulacijskega faktorja BAF. Izmerjeni BAF je mogoče izračunati z deljenjem koncentracije v preskusnem organizmu Ca s koncentracijo v tleh Cs v stabilnem stanju. Če v fazi absorpcije stabilno stanje ni doseženo, se BAFK izračuna iz konstant hitrosti namesto iz BAFss. Vendar je treba navesti, ali BAF temelji na koncentracijah v stabilnem stanju ali ne. | Kinetični bioakumulacijski faktor (BAFK), konstanta hitrosti absorpcije tal (ks) in konstanta hitrosti izločanja (ke) se običajno dobijo z računalniškimi metodami za ocenjevanje nelinearnih parametrov, npr. na podlagi modelov, opisanih v (68). Na podlagi skupine podatkov o zaporednih koncentracijah v odvisnosti od časa in modelnih enačb: | 0 < t < tc | [enačba 1] | ali | t > tc | [enačba 2] | pri čemer je: | Ca | = | koncentracija kemikalije v črvih [g·kg-1 mokre ali suhe teže], | ks | = | konstanta hitrosti absorpcije v tkivu [g zemljine kg-1 črvov d-1], | Cs | = | koncentracija kemikalije v tleh [g·kg-1 mokre ali suhe teže], | ke | = | konstanta hitrosti izločanja [d-1], | tc | = | čas na koncu faze absorpcije, | ti računalniški programi izračunajo vrednosti BAFK, ks in ke. | Kadar se koncentracija ozadja pri neizpostavljenih črvih, npr. na dan 0, znatno razlikuje od nič (tako je lahko na primer pri kovinah), mora biti ta koncentracija ozadja (Ca,0) vključena v te enačbe, tako da se glasijo: | 0 < t < tc | [enačba 3] | in | t > tc | [enačba 4] | Kadar se v fazi absorpcije ugotovi znatno zmanjšanje koncentracije preskusne kemikalije v tleh v odvisnosti od časa, je mogoče uporabiti naslednje modele, npr. (67) (79): | [enačba 5] | pri čemer je: | Cs | = | koncentracija kemikalije v tleh [g·kg-1 mokre ali suhe teže], | k0 | = | konstanta hitrosti razgradnje v tleh [d-1], | C0 | = | začetna koncentracija kemikalije v tleh [g·kg-1 mokre ali suhe teže]. | 0 < t < tc | [enačba 6] | t > tc | [enačba 7] | pri čemer je: | Ca | = | koncentracija kemikalije v črvih [g·kg-1 mokre ali suhe teže], | ks | = | konstanta hitrosti absorpcije v tkivu [g zemljine kg-1 črvov d-1], | k0 | = | konstanta hitrosti razgradnje v tleh [d-1], | ke | = | konstanta hitrosti izločanja [d-1], | tc | = | čas na koncu faze absorpcije. | Kadar je v fazi absorpcije doseženo stabilno stanje (tj. t = ∞), je mogoče enačbo 1 | 0 < t < tc | [enačba 1] | skrajšati na: | ali | [enačba 8] | Nato je ks/ke x Cs pristop za ugotavljanje koncentracije preskusne snovi v črvjem tkivu v stabilnem stanju (Ca,ss). | Faktor akumulacije v organizmih glede na tla (BSAF) je mogoče izračunati na naslednji način: | [enačba 9] | pri čemer je foc del organskega ogljika v tleh, flip pa del lipidov v črvih, pri čemer sta oba po možnosti določena na vzorcih, vzetih v preskusu, ter temeljita na suhi teži oziroma mokri teži. | Model kinetike izločanja je mogoče oblikovati na podlagi podatkov iz faze izločanja ter z uporabo spodnje modelne enačbe in računalniške metode za ocenjevanje nelinearnih parametrov. Če podatkovne točke, grafično prikazane v odvisnosti od časa, nakazujejo konstantno eksponentno padanje koncentracije preskusne snovi v živalih, je mogoče za opis časovnega poteka izločanja uporabiti enodelni model (enačba 9). | [enačba 10] | Procesi izločanja so včasih videti dvofazni, pri čemer v zgodnjih fazah Ca hitro upada, kar se v poznejših fazah izločanja spremeni v počasnejšo izgubo preskusnih snovi, npr. (27) (68). Dve fazi je mogoče razložiti s predpostavko, da sta v organizmu dva različna dela, iz katerih se preskusna snov izloča z različno hitrostjo. V takih primerih je treba preučiti posebne vire, npr. (38) (39) (40) (78). | Z zgornjimi modelnimi enačbami je mogoče kinetična parametra (ks in ke) izračunati tudi naenkrat z modelom kinetike prvega reda za vse podatke iz faz absorpcije in izločanja hkrati. Opis metode, ki lahko omogoča tak združeni izračun konstant hitrosti absorpcije in izločanja, je na voljo v virih (191), (223) in (220). | [enačba 11] | Opomba: | kadar se parametra absorpcije in izločanja ocenjujeta hkrati iz združenih podatkov o absorpciji in izločanju, je ‚m‘, kot je prikazan v enačbi 11, deskriptor, ki računalniškemu programu omogoča, da podizraze v enačbi pripiše skupinam podatkov iz zadevne faze in da pravilno izvede ocenjevanje (m = 1 za fazo absorpcije; m = 2 za fazo izločanja). | Vseeno je treba te modelne enačbe uporabljati previdno, zlasti kadar se med preskusom pojavijo spremembe v biološki razpoložljivosti preskusne kemikalije ali (biološki) razgradnji (glej npr. (79)). | Dodatek 3 | PRIMERI ČASOVNIH RAZPOREDOV ZA PRESKUSE BIOAKUMULACIJE V TLEH | Preskus z deževniki | (a) | Faza absorpcije z 8 datumi vzorčenja za izračun kinetike | Dan | Dejavnost | – 6 | 48-urno kondicioniranje pripravljene zemljine; | – 4 | dodajanje raztopine preskusne kemikalije v del zemljine; izparevanje morebitnega topila; mešanje sestavin zemljine; razporejanje zemljine v preskusne posode; 4-dnevno vzpostavljanje ravnotežja v preskusnih pogojih (3 tedne za zemljine s primešano kovino); | – 3 do – 1 | izločevanje preskusnih organizmov iz gojišča za aklimatizacijo; priprava in vlaženje sestavin zemljine; | 0 | merjenje temperature in vrednosti pH tal; odstranjevanje vzorcev tal iz tretiranih posod in kontrolnih vzorcev s topilom za določitev koncentracije preskusne kemikalije; dodajanje obroka hrane; tehtanje in naključna razporeditev črvov v preskusne posode; zadržanje zadostnih podvzorcev črvov za določanje analitskih vrednosti ozadja, mokre in suhe teže ter vsebnosti lipidov; tehtanje vseh preskusnih posod za kontrolo vlage v tleh; kontrola dotoka zraka, če se uporabi zaprt preskusni sistem; | 1 | kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in temperature; jemanje vzorcev tal in črvov za določitev koncentracije preskusne snovi; | 2 | enako kot 1. dan; | 3 | kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; | 4 | enako kot 1. dan; | 5–6 | enako kot 3. dan; | 7 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 8–9 | enako kot 3. dan; | 10 | enako kot 1. dan; | 11–13 | enako kot 3. dan; | 14 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 15–16 | enako kot 3. dan; | 17 | enako kot 1. dan; | 18–20 | enako kot 3. dan; | 21 | enako kot 1. dan; merjenje temperature in vrednosti pH tal; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod; konec faze absorpcije; premestitev črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto zemljino za fazo izločanja (brez praznjenja prebavil); vzorčenje tal in črvov iz kontrolnih vzorcev s topilom. | | Dejavnosti pred izpostavljenostjo (faza uravnoteženja) je treba časovno načrtovati ob upoštevanju lastnosti preskusne kemikalije. | | Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob delovnikih). | (b) | Faza izločanja | Dan | Dejavnost | – 6 | Priprava in vlaženje sestavin zemljine; 48-urno kondicioniranje pripravljene zemljine; | – 4 | mešanje sestavin zemljine; razporejanje zemljine v preskusne posode; 4-dnevna inkubacija v preskusnih pogojih; | 0 (konec faze absorpcije) | merjenje temperature in vrednosti pH tal; tehtanje in naključna razporeditev črvov v preskusne posode; dodajanje obroka hrane; premestitev črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto zemljino; jemanje vzorcev tal in črvov po 4–6 urah za določitev koncentracije preskusne kemikalije; | 1 | kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in temperature; jemanje vzorcev tal in črvov za določitev koncentracije preskusne kemikalije; | 2 | enako kot 1. dan; | 3 | kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; | 4 | enako kot 1. dan; | 5–6 | enako kot 3. dan; | 7 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 8–9 | enako kot 3. dan; | 10 | enako kot 1. dan; | 11–13 | enako kot 3. dan; | 14 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 15–16 | enako kot 3. dan; | 17 | enako kot 1. dan; | 18–20 | enako kot 3. dan; | 21 | enako kot 1. dan; merjenje temperature in vrednosti pH tal; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod; vzorčenje tal in črvov iz kontrolnih vzorcev s topilom. | | Tla pred začetkom faze izločanja je treba pripraviti enako kot pred fazo absorpcije. | | Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob delovnikih). | Preskus z enhitreji | (a) | Faza absorpcije z 8 datumi vzorčenja za izračun kinetike | Dan | Dejavnost | – 6 | 48-urno kondicioniranje pripravljene zemljine; | – 4 | dodajanje raztopine preskusne kemikalije v del zemljine; izparevanje morebitnega topila; mešanje sestavin zemljine; razporejanje zemljine v preskusne posode; 4-dnevno vzpostavljanje ravnotežja v preskusnih pogojih (3 tedne za zemljinela s primešano kovino); | –3 do –1 | izločevanje preskusnih organizmov iz gojišča za aklimatizacijo; priprava in vlaženje sestavin zemljine; | 0 | merjenje temperature in vrednosti pH tal; odstranjevanje vzorcev tal iz tretiranih posod in kontrolnih vzorcev s topilom za določitev koncentracije preskusne kemikalije; dodajanje obroka hrane v tla; tehtanje in naključna razporeditev črvov v preskusne posode; zadržanje zadostnih podvzorcev črvov za določanje analitskih vrednosti ozadja, mokre in suhe teže ter vsebnosti lipidov; tehtanje vseh preskusnih posod za kontrolo vlage v tleh; kontrola dotoka zraka, če se uporabi zaprt preskusni sistem; | 1 | kontrola dotoka zraka, zapisovanje obnašanja črvov in temperature; jemanje vzorcev tal in črvov za določitev koncentracije preskusne snovi; | 2 | enako kot 1. dan; | 3 | kontrola dotoka zraka, obnašanja črvov in temperature; | 4 | enako kot 1. dan; | 5–6 | enako kot 3. dan; | 7 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane v tla; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod in nadomeščanje izhlapele vode; | 9 | enako kot 1. dan; | 10 | enako kot 3. dan; | 11 | enako kot 1. dan; | 12–13 | enako kot 3. dan; | 14 | enako kot 1. dan; dodajanje obroka hrane v tla; merjenje temperature in vrednosti pH tal; kontrola vlage v tleh s ponovnim tehtanjem preskusnih posod; konec faze absorpcije; premestitev črvov iz preostalih izpostavljenih ponovitev v posode s čisto zemljino za fazo izločanja (brez praznjenja prebavil); vzorčenje tal in črvov iz kontrolnih vzorcev s topilom. | | Dejavnosti pred izpostavljenostjo (faza uravnoteženja) je treba časovno načrtovati ob upoštevanju lastnosti preskusne kemikalije. | | Dejavnosti, opisane za 3. dan, je treba izvajati dnevno (vsaj ob delovnikih). | Dodatek 4 | Umetna zemljina – priporočila glede priprave in shranjevanja | Ker naravna zemljina iz določenega vira ni nujno na voljo vse leto in ker lahko domorodni organizmi in prisotna mikroonesnaževala vplivajo na preskus, se za ta preskus priporoča umetni substrat – umetna zemljina v skladu s poglavjem C.8 te priloge, Strupenost za deževnike (48). V takih tleh lahko preživi, raste in se razmnožuje več preskusnih vrst, zagotovljeni pa so tudi največja mogoča standardizacija ter primerljivost preskusnih pogojev in pogojev gojenja znotraj laboratorija in med laboratoriji. | Sestavine zemljine | Šota: | 10 % | Šotni mah, v skladu s smernico OECD 207 (48). | Kremenov pesek: | 70 % | Industrijski kremenov pesek (sušen na zraku); velikost zrnc: več kot 50 % delcev mora biti velikih 50 do 200 μm, vsi delci pa morajo biti ≤ 2 mm. | Kaolinska glina: | 20 % | Vsebnost kaolinita ≥ 30-odstotna. | Kalcijev karbonat: | ≤ 1 % | CaCO3, zdrobljen v prah, kemijsko čist. | Lahko se tudi zmanjša vsebnost organskega ogljika v umetni zemljini, npr. z zmanjšanjem vsebnosti šote na 4–5 % suhe zemljine in ustreznim povečanjem vsebnosti peska. S takim zmanjšanjem vsebnosti organskega ogljika se lahko zmanjšajo možnosti adsorpcije preskusne kemikalije na zemljino (organski ogljik), razpoložljivost preskusne kemikalije za črve pa se lahko poveča (74). Dokazano je, da lahko Enchytraeus albidus in Eisenia fetida izpolnjujeta merila veljavnosti v zvezi z razmnoževanjem, če se preskus izvaja z naravno zemljino z manjšo vsebnostjo organskega ogljika, npr. 2,7 % (33), (211), izkušnje pa kažejo, da je to mogoče doseči tudi pri umetni zemljini s 5 % šote. | Priprava | Suhe sestavine zemljine se temeljito premešajo (npr. v velikem laboratorijskem mešalniku). To je treba storiti približno en teden pred začetkom preskusa. Zmešane suhe sestavine zemljine je treba navlažiti z deionizirano vodo vsaj 48 h pred primešanjem preskusne snovi, da se kislost uravnoteži/stabilizira. Za določitev pH se uporabi mešanica zemljine in 1 M raztopine KCl v razmerju 1 : 5. Če vrednost pH ni znotraj zahtevanega obsega (6,0 ± 0,5), se zemljini doda zadostna količina CaCO3 ali pripravi nova šarža zemljine. | Največja zmogljivost zadrževanja vode (WHC) v umetni zemljini se določi v skladu z ISO 11268-2 (35). Vsaj dva dneva pred začetkom preskusa se suha umetna zemljina navlaži z dovolj deionizirane ali rekonstituirane vode, da nastane približno polovica končne vsebnosti vode. Končna vsebnost vode mora biti med 40 in 60 % največje WHC. Na začetku preskusa se predhodno navlažena zemljina razdeli na toliko šarž, kot je preskusnih koncentracij in kontrolnih vzorcev, uporabljenih v preskusu, vsebnost vlage pa se prilagodi na 40–60 % WHCmax z raztopino preskusne snovi in/ali dodajanjem deionizirane ali rekonstituirane vode. Vsebnost vlage se določi na začetku in koncu preskusa (pri 105 °C). Biti mora optimalna za potrebe uporabljenih vrst živali (vsebnost vlage je mogoče preveriti tudi na naslednji način: če se zemljina nežno stisne v roki, se morajo med prsti pojaviti majhne kapljice vode). | Shranjevanje | Suhe sestavine umetne zemljine se lahko do uporabe hranijo pri sobni temperaturi. Pripravljena predhodno navlažena zemljina se lahko hrani na hladnem do tri dni pred primešanjem preskusne kemikalije; paziti je treba, da je izhlapevanje vode čim manjše. Zemljino s primešano preskusno snovjo je treba uporabiti takoj, razen če obstajajo podatki o tem, da je mogoče določeno zemljino shranjevati, ne da bi to vplivalo na strupenost in biološko razpoložljivost preskusne snovi. Vzorci zemljine s primešano preskusno snovjo se lahko nato do analize hranijo v pogojih, priporočenih za zadevno preskusno snov. | Dodatek 5 | Vrste kopenskih maloščetincev, priporočene za preskušanje bioakumulacije iz tal | Deževniki | Priporočena preskusna vrsta je Eisenia fetida (Savigny 1826), ki spada v družino Lumbricidae. Od leta 1972 se deli na dve podvrsti (Eisenia fetida in Eisenia andrei (10)). Jaenike trdi (36), da sta to pravi ločeni vrsti. Vrsto Eisenia fetida je mogoče brez težav prepoznati po svetlih rumenih črtah med kolobarji, Eisenia andrei pa je enotne temno rdeče barve. Izvirajo verjetno iz črnomorske regije, danes pa so razširjeni po vsem svetu, zlasti v antropogeno prilagojenih habitatih, kot so kompostni kupi. Obe podvrsti je mogoče uporabljati za ekotoksikološke in bioakumulacijske preskuse. | Eisenia fetida in Eisenia andrei sta komercialno dostopni vrsti, npr. kot vaba za ribe. V primerjavi z drugimi deževniki iz družine Lumbricidae imajo kratek življenjski ciklus in dosežejo zrelost pri približno 2–3 mesecih (pri sobni temperaturi). Njihova optimalna temperatura je približno 20–24 °C. Najraje imajo razmeroma vlažne substrate s skoraj nevtralno vrednostjo pH in visoko vsebnostjo organske snovi. Ker se ti vrsti zelo pogosto uporabljata v standardiziranih ekotoksikoloških preskusih že približno 25 let, je njuno gojenje dobro uveljavljeno (48) (77). | Obe vrsti je mogoče gojiti v zelo različnih živalskih odpadkih. Medij za gojenje, priporočen v ISO (35), je mešanica konjskega ali govejega gnoja in šote v razmerju 50: 50. Medij mora imeti vrednost pH približno 6–7 (uravnavano s kalcijevim karbonatom), majhno ionsko prevodnost (manj kot 6 mS/cm ali manj kot 0,5-odstotna koncentracija soli) in ne sme biti pretirano kontaminiran z amonijem ali živalskim urinom. Uporabiti je mogoče tudi komercialno vrtno prst brez aditivov ali umetno zemljino v skladu z OECD (48) ali mešanico obeh v razmerju 50: 50. Substrat mora biti vlažen, vendar ne preveč moker. Primerne so škatle za gojenje s prostornino 10 do 50 litrov. | Za črve standardne starosti in teže je gojenje najbolje začeti s kokoni. Zato se v škatle za gojenje s svežim substratom dajo odrasli črvi, da naredijo kokone. Praktične izkušnje so pokazale, da so pri gostoti populacije približno 100 odraslih črvov na kg substrata (mokra teža) dobre stopnje razmnoževanja. Po 28 dneh se odrasli črvi odstranijo. Deževniki, ki se izležejo iz kokonov, se uporabijo za preskušanje, ko so zreli, po vsaj 2 mesecih, vendar prej kot v 12 mesecih. | Črve zgoraj opisanih vrst je mogoče šteti za zdrave, če se premikajo skozi substrat, ga ne poskušajo zapustiti in se stalno razmnožujejo. Zelo počasno premikanje ali rumen zadnji del (pri vrsti Eisenia fetida) kaže na izčrpanje substrata. V tem primeru se priporoča svež substrat in/ali manjše število živali na škatlo. | Dodatni izbrani viri | Gerard, B. M. (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. London, 6: 1–58. | Graff, O. (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1–81. | Römbke, J., Egeler, P., Füll, C. (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S. | Rundgren, S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49–55. | Satchell, J. E. (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180–201. | Sims, R. W., in Gerard, B. M. (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. London 31: 1–171. | Tomlin, A. D. (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ur.), Chapman & Hall, London. str. 331–338. | Enhitreji | Priporočena preskusna vrsta je Enchytraeus albidus Henle 1837 (enhitrej). Enchytraeus albidus je ena od največjih (do 15 mm) vrst maloščetinarjev kolobarnikov iz družine Enchytraeidae in je razširjena po vsem svetu, npr. (8). Živi v morskih, sladkovodnih in kopenskih habitatih, večinoma v razpadajoči organski snovi (morske alge, kompost), redko pa na travnikih (42). Ta široka ekološka toleranca in nekatere morfološke variacije kažejo na to, da morda obstajajo različne podvrste te vrste. | Enchytraeus albidus je komercialno dostopna vrsta in se prodaja kot hrana za ribe. Treba je preveriti, ali je kultura kontaminirana z drugimi, običajno manjšimi vrstami (60). Ob kontaminaciji je treba vse črve oprati z vodo v petrijevki. Nato se (s stereomikroskopom) izberejo veliki odrasli osebki vrste Enchytraeus albidus, da se iz njih vzgoji nova kultura. Vsi drugi črvi se zavržejo. Življenjski ciklus enhitrejev je kratek, saj zrelost dosežejo v starosti med 33 dnevi (pri 18 °C) in 74 dnevi (pri 12 °C). Za preskus se uporabijo samo kulture, ki so bile v laboratoriju brez težav že vsaj 5 tednov (ena generacija). | Primerne so tudi druge vrste rodu Enchytraeus, zlasti Enchytraeus luxuriosus. Ta vrsta je pravi prebivalec tal, ki je bil na novo opisan v (65). Če se uporabijo druge vrste Enchytraeus, jih je treba jasno identificirati in poročati o razlogih za izbiro. | Enchytraeus crypticus (Westheide in Graefe 1992) je vrsta, ki spada v isto skupino kot Enchytraeus luxuriosus. Ni bilo nedvomno ugotovljeno, da obstaja v naravnem okolju, saj je bila opisana samo v kulturah deževnikov in kompostnih kupih (Römbke 2003). Njene izvirne ekološke potrebe zato niso znane. Toda nedavne laboratorijske raziskave z različnimi naravnimi zemljinami so potrdile, da ta vrsta dobro prenaša različne lastnosti tal, kot so pH in tekstura (Jänsch idr. 2005). V zadnjih letih se ta vrsta pogosto uporablja v ekotoksikoloških raziskavah, ker jo je preprosto gojiti in preskušati, npr. Kuperman idr. 2003. Vendar so te živali majhne (3–12 mm; povprečno 7 mm (Westheide in Müller 1996)), zato je z njimi težje ravnati kot z vrsto Enchytraeus albidus. Če se uporablja ta vrsta namesto vrste Enchytraeus albidus, je lahko preskusna posoda manjša, ni pa to nujno. Poleg tega je treba upoštevati, da se ta vrsta zelo hitro razmnožuje in da je obdobje ene generacije krajše od 20 dni pri 20 ± 2 °C (Achazi idr. 1999), pri višjih temperaturah pa še krajše. | Enchytraeidae vrste Enchytraeus albidus (in druge vrste roda Enchytraeus) je mogoče gojiti v velikih plastičnih škatlah (npr. 30 × 60 × 10 cm ali 20 × 12 × 8 cm, kar je primerno za kulturo majhnih črvov), napolnjenih z mešanico umetne zemljine in komercialne dostopne nekontaminirane vrtne prsti brez aditivov. Kompostnemu materialu se je treba izogibati, saj lahko vsebuje strupene kemikalije, kot so težke kovine. Živali je treba pred uporabo odstraniti iz zemljine za gojenje s trikratnim globokim zamrzovanjem. Uporabiti je mogoče tudi čisto umetno zemljino, vendar je lahko razmnoževanje počasnejše v primerjavi z mešanimi substrati. Substrat mora imeti pH 6,0 ± 0,5. Kultura se goji v inkubatorju pri temperaturi 15 ± 2 °C brez svetlobe. Vsekakor se je treba izogibati temperaturi, višji od 23 °C. Umetna/naravna zemljina mora biti vlažna, vendar ne mokra. Če se nežno stisne v roki, bi se morale pojaviti samo majhne kaplje vode. Vsekakor se je treba izogibati anoksičnim pogojem (npr. če se uporabi pokrov, mora število lukenj v pokrovu zadostovati za zadostno izmenjavo zraka). Tla za gojenje je treba enkrat tedensko prezračevati s pazljivim mešanjem. | Črve je treba vsaj enkrat tedensko hraniti ad libitum z ovsenimi kosmiči, položenimi v luknjo na površini tal in pokritimi s prstjo. Če hrana, dodana na zadnji datum hranjenja, ostane v posodi, je treba količino hrane ustrezno prilagoditi. Če na preostali hrani zrasejo glive, jo je treba nadomestiti z novo količino ovsenih kosmičev. Za spodbujanje razmnoževanja se lahko ovsenim kosmičem vsaka dva tedna doda komercialno dostopen proteinski prah, obogaten z vitamini. Po treh mesecih se živali premestijo v sveže pripravljeno gojišče ali substrat za gojenje. Ovsene kosmiče, ki morajo biti shranjeni v zatesnjenih posodah, je treba pred uporabo avtoklavirati ali segreti, da se preprečijo okužbe s pršicami iz moke (npr. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) ali predatorskimi pršicami (npr. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Ko je hrana razkužena, jo je treba zmleti, da jo je mogoče z lahkoto potresti po površini tal. Vir hrane je lahko tudi pekovski kvas ali hrana za ribe TetraMin®. | Na splošno so pogoji gojenja zadovoljivi, če črvi ne poskušajo zapustiti substrata, se skozi tla hitro gibljejo, imajo bleščečo zunanjo površino brez delcev zemljine, ki bi se je držali, in so bolj ali manj belkaste barve ter če so vidni črvi različnih starosti. Dejansko je mogoče črve šteti za zdrave, če se stalno razmnožujejo. | Dodatni izbrani viri | Achazi, R. K., Fröhlich, E., Henneken, M., Pilz, C. (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126. | Jänsch, S., Amorim, M. J. B., Römbke, J. (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83. | Kuperman, R. G., Checkai, R. T., Simini, M., Phillips, C. T., Kolakowski, J. E., Kurnas, C. W., Sunahara, G. I. (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656. | Römbke, J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607–616. | Westheide, W., in Graefe, U. (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488. | Westheide, W., in Müller, M. C. (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267. | “ |
| (1) Questa informazione è fornita soltanto a titolo indicativo. Possono essere utilizzati altri software equivalenti se è dimostrato che producono gli stessi risultati. | (1) Te informacije so navedene samo za usmerjanje uporabnikov. Uporabijo se lahko tudi drugi enakovredni računalniški programi, če je mogoče dokazati, da dajejo enake rezultate. |
| (2) Se non sono disponibili informazioni sulla sensibilità di ciascun sesso, si utilizzeranno ratti di entrambi i sessi, ossia 1 animale di ciascun sesso per concentrazione. In base alle informazioni disponibili o se nel corso della sessione di esposizione risulta che uno dei due sessi è più sensibile, per le prove successive si utilizzeranno 10 animali di questo sesso (2 animali per punto concentrazione/tempo) a ciascun livello di concentrazione. | (2) Če informacije o občutljivosti glede na spol niso na voljo, se uporabijo podgane obeh spolov, tj. 1 žival/spol na koncentracijo. Na podlagi obstoječih informacij ali če se med to izpostavitvijo izkaže, da je en spol občutljivejši, se v nadaljnjem preskušanju uporabi 10 živali občutljivejšega spola (2 živali na koncentracijo/časovno točko) pri vsaki koncentraciji. |
| (3) Quando si utilizza il regolamento (CE) n. 1272/2008, le concentrazioni limite per i gas, i vapori e gli aerosol sono rispettivamente di 20 000 ppm, 20 mg/l e 5 mg/l. Qualora si preveda una tossicità o se i risultati dello studio di osservazione lo consigliano, si deve optare per concentrazioni iniziali inferiori. Per esigenze normative o scientifiche, si possono utilizzare concentrazioni più elevate. | (3) Kadar se uporablja Uredba (ES) št. 1272/2008, so mejne koncentracije za pline, hlape in aerosole 20 000 ppm, 20 mg/l oziroma 5 mg/l. Nižje začetne koncentracije je treba izbrati, če se pričakuje strupenost ali na podlagi rezultatov opazovalne študije. V primeru zakonodajnih ali znanstvenih potreb se lahko uporabijo višje koncentracije. |
| (4) Idealmente, l’esposizione al livello di concentrazione superiore deve essere ritardata fino a quando non si abbia la ragionevole certezza che gli animali già sottoposti alla prova siano sopravvissuti. Il responsabile dello studio può in tal caso adeguare la concentrazione “bersaglio” per la sessione di esposizione successiva. | (4) Po možnosti je treba z izpostavljanjem živali naslednji ravni koncentracije počakati, dokler ni mogoče z razumno gotovostjo sklepati o preživetju predhodno tretiranih živali. Tako lahko vodja študije prilagodi ciljno koncentracijo in obdobja za naslednjo izpostavitev. |
| (5) La dose minima (concentrazione × tempo) che provoca mortalità nel corso della prova alla concentrazione iniziale (prima sessione di esposizione) fungerà da riferimento per stabilire la combinazione successiva di concentrazione e durate di esposizione. In genere la concentrazione è dimezzata (1/2L) e gli animali sono esposti per periodi meno distanziati, distribuiti in una serie geometrica di un fattore 1,4 (√2; cfr. riferimento bibliografico 11) intorno al tempo corrispondente alla dose letale minima (tempo × concentrazione) osservato nel corso della prima esposizione. Nella figura 1, nel corso della sessione di esposizione I la mortalità è stata osservata per la prima volta dopo 15 minuti. Le durate nel corso della sessione II sono pertanto incentrate su 30 minuti, e sono di 15, 21, 30, 42 e 60 min. Dopo le prime due esposizioni, si raccomanda vivamente di tracciare i risultati in un grafico analogo a quello della figura 1, e di verificare se il rapporto tra concentrazione e tempo definisce un angolo di 45 gradi (n = 1) o se la curva del rapporto-concentrazione-tempo-risposta è meno ripida (n = 2, ad esempio) o più ripida (n = 0,8 ad esempio). In quest’ultimo caso, è vivamente consigliato di adeguare le concentrazioni e le durate successive. | (5) Minimalni odmerek (koncentracija × čas), ki je povzročil smrtnost med preskušanjem pri začetni koncentraciji (prva izpostavitev), se upošteva kot smernica za določitev naslednje kombinacije koncentracije in obdobij izpostavljenosti. Običajno se koncentracija prepolovi (1/2 L), živali pa se izpostavijo v novem časovnem razponu z drobnejšo mrežo, ki vključuje geometrično razporeditev obdobij izpostavljenosti glede na faktor 1,4 (√2; glej vir (11)) okoli časa v skladu z minimalno smrtno velikostjo odmerka (čas × koncentracija), opaženo pri prvi izpostavitvi. Na zgornji sliki (slika 1) je bila smrtnost pri izpostavitvi I najprej opažena pri 15 min, zato se obdobja v izpostavitvi II razporedijo okoli 30 min, tako da znašajo 15, 21, 30, 42 in 60 min. Po prvih dveh izpostavitvah se močno priporoča, da se podatki prikažejo v podobnem diagramu, kot je prikazan na zgornji sliki, ter da se preveri, ali ima razmerje med koncentracijo in časom kót 45 stopinj (n = 1) oziroma ali je razmerje koncentracija-čas-odziv manj strmo (npr. n = 2) oziroma strmejše (npr. n = 0,8). V zadnjih dveh primerih se močno priporoča, naj se naslednje koncentracije in obdobja ustrezno prilagodijo. |
| (6) A volte può essere necessario aumentare la concentrazione (2L) su una scala temporale diversa, con periodi di esposizione ancora meno distanziati secondo una progressione geometrica di fattore 1,4 (√2) incentrata sul tempo corrispondente al livello di dose letale minimo osservato al momento della prima esposizione. La durata minima di esposizione deve preferibilmente superare 5 minuti; la durata massima non deve superare 8 ore. | (6) V nekaterih primerih je morda treba povečati koncentracijo (2 L) v novem časovnem razponu s še drobnejšo mrežo, ki vključuje geometrično razporeditev obdobij izpostavljenosti glede na faktor 1,4 (√2) okoli časa v skladu z minimalno smrtno koncentracijo, opaženo v prvi izpostavitvi. Po možnosti mora biti najkrajše obdobje izpostavljenosti daljše od 5 minut, najdaljše obdobje izpostavljenosti pa ne sme presegati 8 ur.; |
| (7) Per svariate misurazioni del siero e del plasma, e soprattutto per il glucosio, sarebbe preferibile mantenere il digiuno per tutta la notte. Il motivo principale è che l’aumento della variabilità dovuto inevitabilmente al mancato digiuno tenderebbe a mascherare effetti meno evidenti rendendo più difficile l’interpretazione. D’altro lato, però, il digiuno notturno può interferire con il metabolismo generale degli animali e, soprattutto negli studi sull’alimentazione, può incidere sull’esposizione quotidiana alla sostanza in esame. Se si opta per il digiuno notturno, gli esami biochimico-clinici dovranno essere effettuati dopo le osservazioni funzionali della quarta settimana. | (7) Za številne preiskave seruma in plazme, zlasti za določanje glukoze, se priporoča postenje čez noč. Glavni razlog za to je, da bi povečana spremenljivost, ki bi se zagotovo pojavila, če se žival ne bi postila, lahko prikrila manj opazne učinke in otežila razlago. Po drugi strani pa lahko postenje čez noč spremeni splošni metabolizem živali in lahko zlasti pri študijah prehranjevanja povzroči motnje v dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji. Če se uporabi postenje čez noč, je treba klinične biokemične preiskave izvesti po zaključku funkcionalnih opazovanj v četrtem tednu študije. |
| (8) Il responsabile dello studio deciderà se per gli animali è necessario un periodo di digiuno, in quanto un lungo periodo di digiuno può portare a misurazioni del glucosio parzialmente errate negli animali esposti rispetto agli animali del gruppo di controllo. Se si ricorre al digiuno, occorre che il periodo sia adeguato in funzione della specie utilizzata; per il ratto può essere di 16 ore (digiuno notturno). La determinazione della glicemia a digiuno può essere effettuata dopo il digiuno notturno, nel corso dell’ultima settimana di esposizione, o dopo la notte di digiuno notturno precedente l’autopsia (in tal caso insieme a tutti gli altri parametri di patologia clinica). | (8) Ker lahko dolgotrajno obdobje postenja vpliva na meritve glukoze pri tretiranih živalih glede na kontrolne živali, mora vodja študije odločiti, ali je živali primerno postiti. Če se uporabi obdobje postenja, mora to ustrezati uporabljeni živalski vrsti; za podgane lahko traja 16 h (postenje čez noč). Določanje glukoze na tešče se lahko izvede po postenju čez noč v zadnjem tednu izpostavljenosti ali po postenju čez noč pred obdukcijo (v zadnjem primeru skupaj z vsemi drugimi kliničnimi patološkimi parametri). |
| (9) Il responsabile dello studio deciderà se un periodo di digiuno è necessario per gli animali, in quanto un lungo periodo di digiuno può portare a misurazioni del glucosio parzialmente errate negli animali esposti rispetto agli animali del gruppo di controllo. Se si ricorre al digiuno, occorre che il periodo sia adeguato in funzione della specie utilizzata; per il ratto può essere di 16 ore (digiuno notturno). La determinazione della glicemia a digiuno può essere effettuata dopo il digiuno notturno, nel corso dell’ultima settimana di esposizione, o dopo la notte di digiuno notturno precedente l’autopsia (in tal caso insieme a tutti gli altri parametri di patologia clinica). | (9) Ker lahko dolgotrajno obdobje postenja vpliva na meritve glukoze pri tretiranih živalih glede na kontrolne živali, mora vodja študije odločiti, ali je živali primerno postiti. Če se uporabi obdobje postenja, mora to ustrezati uporabljeni živalski vrsti; za podgane lahko traja 16 h (postenje čez noč). Določanje glukoze na tešče se lahko izvede po postenju čez noč v zadnjem tednu izpostavljenosti ali po postenju čez noč pred obdukcijo (v zadnjem primeru skupaj z vsemi drugimi kliničnimi patološkimi parametri). |
| (10) Per svariate misurazioni del siero e del plasma, e soprattutto per il glucosio, è preferibile mantenere il digiuno per tutta la notte. Il motivo principale è che l’aumento della variabilità dovuto inevitabilmente al mancato digiuno tenderebbe a mascherare effetti meno evidenti rendendo più difficile l’interpretazione. D’altro lato, però, il digiuno notturno può interferire con il metabolismo generale degli animali e, soprattutto negli studi sull’alimentazione, può incidere sull’esposizione quotidiana alla sostanza in esame. Tutti gli animali valutati dovrebbero essere nella stessa situazione fisiologica e pertanto esami approfonditi di tipo neurologico dovrebbero essere svolti in un giorno diverso dai campionamenti biochimico-clinici. | (10) Za številne preiskave seruma in plazme, zlasti za določanje glukoze, se priporoča postenje čez noč. Glavni razlog za to je, da bi povečana spremenljivost, ki bi se zagotovo pojavila, če se žival ne bi postila, lahko prikrila manj opazne učinke in otežila razlago. Vendar je treba opozoriti, da lahko postenje čez noč spremeni splošni metabolizem živali in lahko zlasti pri študijah prehranjevanja povzroči motnje v dnevni izpostavljenosti preskusni kemikaliji. Vse živali je treba ocenjevati v enakem fiziološkem stanju, zato se podrobne ali nevrološke ocene po možnosti izvedejo drug dan kot jemanje vzorcev za klinične biokemične preiskave. |
| (11) La valutazione della corrosività può fondarsi sul parere di esperti che tenga conto di dati sperimentali sull’uomo e su animali, dati (in vitro) esistenti (ad esempio capitolo B.40 (10) e B.40 bis (11) del presente allegato, oppure linea guida OCSE n. 435 (12), valori del pH, informazioni concernenti sostanze simili od ogni altro dato pertinente. | (11) Ocena jedkosti lahko temelji na strokovni presoji, v kateri se uporabijo dokazi, kot so: izkušnje pri ljudeh in živalih, obstoječi podatki (in vitro), npr. poglavji B.40 (10) ali B.40 bis te priloge (11) ali Smernica za preskušanje OECD št. 435 (12), vrednosti pH, informacije o podobnih kemikalijah ali drugi ustrezni podatki. |
| (12) Le tabelle seguenti fanno riferimento al sistema GHS (Sistema mondiale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche). L’equivalente nell’Unione europea è il regolamento (CE) n. 1272/2008 (9), che non prevede la categoria 5 per la tossicità acuta per inalazione. | (12) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5. |
| (13) Le tabelle seguenti fanno riferimento al sistema GHS (Sistema mondiale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche). L’equivalente nell’Unione europea è il regolamento (CE) n. 1272/2008 (9), che non prevede la categoria 5 per la tossicità acuta per inalazione. | (13) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5. |
| (14) Le tabelle seguenti fanno riferimento al sistema GHS (Sistema mondiale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche). L’equivalente nell’Unione europea è il regolamento (CE) n. 1272/2008 (9), che non prevede la categoria 5 per la tossicità acuta per inalazione. | (14) Spodnje preglednice vsebujejo sklicevanja na globalno usklajeni sistem za razvrščanje in označevanje kemikalij (GHS). V EU se enakovreden sistem izvaja z Uredbo (ES) št. 1272/2008. V primeru akutne strupenosti pri vdihavanju se z Uredbo (ES) št. 1272/2008 (9) ne izvaja kategorija 5. |
| (15) Queste sostanze sono presenti in dosi diverse in M4 e M7, come indicato sopra. | (15) Te snovi se pri M4 in M7 razlikujejo, kot je navedeno zgoraj. |
| (16) Queste soluzioni sono preparate separatamente, mescolate e messe immediatamente in autoclave. | (16) Te raztopine se pripravijo posamezno, nato zlijejo skupaj in takoj avtoklavirajo. |
| (17) Utilizzare un’acqua meno dura se si sospetta il rischio di un’interazione tra gli ioni che provocano la durezza e la sostanza in esame (nel qual caso il mezzo Elendt M4 non può essere usato). | (17) Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). |
| (18) Queste sostanze sono presenti in dosi diverse in M4 e M7, come indicato sopra. | (18) Te snovi se pri M4 in M7 razlikujejo, kot je navedeno zgoraj. |
| (19) Queste soluzioni sono preparate separatamente, mescolate e messe immediatamente in autoclave. | (19) Te raztopine se pripravijo posamezno, nato zlijejo skupaj in takoj avtoklavirajo. |
| (20) Utilizzare un’acqua meno dura se si sospetta il rischio di un’interazione tra gli ioni che provocano la durezza e la sostanza in esame (nel qual caso il mezzo Elendt M4 non può essere usato). | (20) Če se domneva, da bo prišlo do interakcije med ioni, ki povzročajo trdoto vode, in preskusno snovjo, je treba uporabiti vodo z manjšo trdoto (v takem primeru se torej ne sme uporabiti medij Elendt M4). |
| (21) Il SiO2 è stato aggiunto per neutralizzare la tossicità. | (21) SiO2 je bil dodan za nevtralizacijo strupenosti. |
| (22) La percentuale di degradazione nelle bottiglie FC contenenti la sostanza di riferimento. | (22) Odstotni delež razgradnje v posodah FC, ki vsebujejo referenčno snov. |
| (23) La percentuale di degradazione nelle bottiglie FI | (23) Odstotni delež razgradnje v posodah FI. |
