►B

A BIZOTTSÁG MÁSODIK IRÁNYELVE

(1982. május 14.)

a kozmetikai termékek összetételének ellenőrzéséhez szükséges vizsgálati módszerekre vonatkozó tagállami jogszabályok közelítéséről

(82/434/EGK)

(HL L 185, 30.6.1982, p.1)

Hivatalos Lap

  No

page

date

►M1

A Bizottság irányelve 90/207/EGK (1990. április 4.)

  L 108

92

28.4.1990

2.1.

A következő vegyületek 0,5 %-os (m/V) vizes referenciaoldata:

2.2.

Előhívó oldószer A, 80 %-os (v/v) etanol

2.3.

Előhívó oldószer B, benzol – metanol – 3-metil-bután-1-ol – víz (34:38:18:10 térfogatarányban)

2.4.

Detektor A, kálium-jodid 10 %-os (m/V) vizes oldata

2.5.

Detektor B, keményítő 1 %-os (m/V) vizes oldata

2.6.

Detektor C, 10 %-os sósav (m/m)

2.7.

4N sósav

3.1.

Kromatográfiás papír (Whatman-papír 3. és 4., vagy ezekkel egyenértékű)

3.2.

1 μl-es mikropipetta

3.3.

100 ml-es mérőlombik

3.4.

Redős szűrő

3.5.

Leszálló papírkromatográfia eszközei

4.2.1.

Mérjünk be külön-külön 1 g és 5 g terméket, szuszpendáljuk 50 ml vízben, egészítsük ki 100 ml-re vízzel mindkettőt, és keverjük össze a mintákat. Szűrjük le a szuszpenziókat redős szűrőn (3.4.), és az 5. szakaszban leírt papír-kromatográfia végrehajtásához a szűrletek mindegyikéből 1 μl-t használjunk.

4.2.2.

Szuszpendáljuk újra az 1 g és 5 g terméket 50 ml vízben, savanyítsuk meg híg sósavval (2.7.), egészítsük ki vízzel 100 ml-re, és keverjük össze. Szűrjük le a szuszpenziókat redős szűrőn (3.4.), és az 5. pontban leírt papír-kromatográfia végrehajtásához a szűrletek mindegyikéből 1 μl-t használjunk.

5.1.

A leszálló papírkromatográfia végrehajtásához tegyünk megfelelő mennyiségű A (2.2.) és B (2.3.) oldószert egy-egy kromatográfiás kádba. Legalább 24 órán át telítsük a kromatográfiás kádakat oldószergőzökkel.

5.2.

Vigyünk fel 1-1 μl-t a 4. és 2.1. pontnak megfelelően előkészített minta- és referenciaoldatokból egy 40 cm hosszúságú és 20 cm szélességű vagy más megfelelő méretű kromatográfiás papírcsík (3.1.) (Whatman-3 vagy ezzel egyenértékű) kiindulási pontjaira, majd párologtassuk el az oldószert levegőn.

5.3.

Helyezzük a kromatográfiás (5.2.) papírcsíkot az A előhívó oldószert (5.1.) tartalmazó kromatográfiás kádba, és addig fejlesszük, amíg az oldószerfront az alapvonaltól 35 cm-re távolodik (körülbelül 15 óra).

5.4.

Ismételjük az 5.2. és 5.3. pontban leírt eljárást (Whatman-4 vagy ezzel egyenértékű) kromatográfiás papírral (3.1.) a B előhívó oldószerben. Kromatografáljuk, amíg az oldószerfront 35 cm-re távolodik az alapvonaltól (körülbelül 5 óra).

5.5.

A előhívás után vegyük ki a kádból a kromatográf-papírcsíkokat, és szárítsuk meg levegőn.

5.6.

A foltok előhívásához fújjuk le a kromatogramot sorrendben:

5.7.

Az A (2.2.) és B (2.3.) előhívó oldószerekre vonatkozó, fent említett körülmények között az referenciaanyagok (2.1.) Rf-értékei hozzávetőlegesen a következők:

2.1.

Metanol

2.2.

36 %-os (m/m) tömény sósav

2.3.

6N sósav

2.4.

4N kénsav

2.5.

Rodizonsav-dinátrium só

2.6.

Bárium-klorid (BaCl2 ·2H2O)

2.7.

Vízmentes nátrium-karbonát

2.8.

Bárium-klorid 1 %-os (m/V) vizes oldata

2.9.

Előhívó oldószer, amely metanolt, tömény sósavat (koncentráció 36 %) és vizet tartalmaz (80:10:10 térfogatarányban)

2.10.

Detektor, rodizonsav dinátriumsójának 0,1 %-os (m/V) vizes oldata, amelyet felhasználás előtt frissen kell készíteni.

3.1.

5 μl-es mikropipetta

3.2.

Platinatégely

3.3.

100 ml-es mérőlombik

3.4.

Schleicher és Schull 2043 b vagy ezzel egyenértékű kromatográfiás papír. Helyezzük a papírt egy éjszakán keresztül a (B.2.9.) előhívó oldószert tartalmazó (A.3.5.) leszálló kromatográfiás kádba, majd szárítsuk meg.

3.5.

Redős szűrő

3.6.

Felszálló papírkromatográfia szokásos eszközei

4.1.1.

Szuszpendáljunk 2 g terméket 50 ml vízben, és sósavval (B.2.3.) állítsuk be a pH-ját 1 körüli értékre.

4.1.2.

Mossuk át a szuszpenziót vízzel egy 100 ml-es mérőlombikba, töltsük fel a jelig, és keverjük össze. Ezt a szuszpenziót használjuk az 5. pontban leírt papírkromatográfiás vizsgálat és a bárium-szulfát-csapadék kicsapatásán alapuló azonosítás során.

4.2.1.

Szuszpendáljunk 2 g terméket 100 ml vízben, és szűrjük le.

4.2.2.

Adjunk a szárított maradékhoz tömege hét-tízszeresének megfelelő mennyiségű nátrium-karbonátot (B.2.7.), keverjük össze, és olvasszuk a keveréket egy platinatégelyben (B.3.2.) fél órán keresztül.

4.2.3.

Hűtsük le az olvadékot szoba-hőmérsékletűre, oldjuk fel 50 ml vízben, és szűrjük le (B.3.5.).

4.2.4.

Oldjuk fel az olvadékból származó maradékot sósavban (B.2.3.), töltsük föl 100 ml-re vízzel. Ezt a szuszpenziót használjuk az 5. pontban leírt papírkromatográfiás vizsgálat és a bárium-szulfát-csapadék lecsapatásán alapuló azonosítás során.

5.1.

Tegyünk megfelelő mennyiségű előhívó oldószert (B.2.9.) egy felszálló papírkromatográfiás kádba, és telítsük a kádat legalább 15 órán keresztül.

5.2.

A B.3.4. pontban leírt módon előkészített kromatográfiás papírra három kiindulási pontban vigyünk fel 5-5 μl-t a B.4.1.2. és a B.4.2.4. pontnak megfelelően előkészített oldatokból és a B.2.8. pont szerinti referenciaoldatból.

5.3.

Szárítsuk meg a minta- és referenciafoltokat levegőn. A kromatogram előhívását addig folytassuk, amíg az oldószerfront a függőleges irányban 30 cm magasságig emelkedik.

5.4.

Vegyük ki a kromatogramokat a kádból, és szárítsuk meg levegőn.

5.5.

A foltok előhívása céljából fújjuk le a papírt a B.2.10. előhívó szerrel. Bárium jelenlétében, körülbelül 0,10 Rf-értéknél a kromatogramon piros foltok jelennek meg.

3.1.

2N kénsav

3.2.

Kálium-jodid

3.3.

Ammónium-molibdát

3.4.

0,1 N nátrium-tioszulfát

3.5.

10 %-os (m/V) kálium-jodid-oldat, közvetlenül felhasználás előtt kell készíteni

3.6.

20 %-os (m/V) ammónium-molibdát-oldat

3.7.

1 %-os (m/V) keményítőoldat

4.1.

100 ml-es főzőpohár

4.2.

50 ml-es büretta

4.3.

250 ml-es mérőlombik

4.4.

25 ml-es és 100 ml-es mérőhenger

4.5.

10 ml-es egyjelű pipetta

4.6.

250 ml-es Erlenmeyer-lombik

5.1.

Mérjünk be 10 g (m), körülbelül 0,6 g hidrogén-peroxidot tartalmazó terméket egy 100 ml-es főzőpohárba. Egy kis vízzel mossuk a főzőpohár tartalmát egy 250 ml-es mérőlombikba, töltsük fel a jelig vízzel, és keverjük össze.

5.2.

Pipettázzuk az (5.1.) mintaoldat 10 ml-ét egy 250 ml-es mérőlombikba (4.6.), és adjunk hozzá 100 ml 2 N kénsavat (3.1.), 20 ml kálium-jodid (3.5.) -oldatot és három csepp ammónium-molibdát (3.6.) -oldatot.

5.3.

Titráljuk azonnal a keletkező jódot (3.4.) 0,1 N nátrium-tioszulfát-oldattal, közvetlenül a végpont előtt indikátorként adjunk hozzá néhány csepp keményítő (3.7.) -oldatot. Jegyezzük fel a 0,1 N nátrium-tioszulfát (3.4.) fogyását milliliterben (V).

5.4.

Az 5.2. és 5.3. szakaszokban leírt módon végezzünk vakpróbát, a 10 ml mintaoldat helyett használjunk 10 ml vizet. Jegyezzük fel a 0,1 N nátrium-tioszulfát fogyását a vak meghatározásban (Vo ml).

m

=

a vizsgált termék mennyisége (5.1.),

Vo

=

a 0,1 N tioszulfát fogyása a vakpróbában (5.4.) milliliterben,

V

=

a 0,1 N tioszulfát fogyása a mintaoldat titrálása (5.3.) során, milliliterben.

3.1.

Vízmentes etanol

3.2.

Aceton

3.3.

96 %-os etanol, v/v

3.4.

3.5.

L(+)-aszkorbinsav

3.6.

Kloroform

3.7.

Ciklohexán

3.8.

Technikai minőségű nitrogén

3.9.

Toluol

3.10.

Benzol

3.11.

n-butanol

3.12.

Bután-2-ol

3.13.

50 %-os (v/v) hipofoszforos savoldat

3.14.

Diazo reagens. Vagy:

vagy azzal egyenértékű.

3.15.

Ezüst-nitrát

3.16.

p-dimetil-amino-benzaldehid

3.17.

2,5-dimetil-fenol

3.18.

Vas-klorid-hexahidrát

3.19.

10 %-os (m/v) sósavoldat

3.20.

A referenciaanyagok felsorolását az I. cím alatt a „Cél és alkalmazási terület” tartalmazza. Amin-vegyületek esetében a referenciaanyag kizárólag hidroklorid forma (mono- vagy di-) vagy a szabad bázis.

3.21.

Készítsük el a 3.20. pontban hivatkozott referenciaanyagok 0,5 %-os (m/v) oldatát.

Mérjünk be 50 mg ± 1 mg referenciaanyagot egy 10 ml-es mérőlombikba.

Adjunk hozzá 5 ml 96 %-os etanolt (3.3.) és 250 mg aszkorbinsavat (3.5.).

Lúgosítsuk az oldatot ammóniaoldat (3.4.) hozzáadásával, hogy a pH 10 körüli értéken legyen (ellenőrizzük indikátorpapírral).

Töltsük 10 ml-ig a lombikot 96 %-os (3.3.) etanollal, és keverjük össze.

Az oldatok fénytől védve hűvös helyen egy hétig eltarthatók.

Előfordulhat, hogy az aszkorbinsav és az ammónia hozzáadása után csapadék képződik. Ilyenkor hagyjuk kiülepedni a csapadékot, és csak ezután folytassuk az eljárást.

3.22.

3.23.

3.23.1.   Diazo reagens

Készítsük el a kiválasztott reagens (3.14.) 5 %-os (m/v) vizes oldatát. Ezt az oldatot közvetlenül használat előtt kell készíteni.

3.23.2.   Ehrlich-reagens

Oldjunk fel 2 g (3.16.) p-dimetilamino-benzaldehidet 100 ml (3.19.) sósav 10 %-os (m/v) vizes oldatában.

3.23.3.   2,5-dimetil-fenol – vas-klorid-hexahidrát

1. oldat: Oldjunk fel 1 g dimetil-fenolt (3.17.) 100 ml 96 %-os etanolban (3.3.).

2. oldat: Oldjunk fel 4 g vas-klorid-hexahidrátot (3.18.) 100 ml 96 %-os etanolban (3.3.).

Az előhíváskor ezeket az oldatokat külön kell alkalmazni, előbb az 1. oldatot, majd a 2.-at.

3.23.4.   Ammóniás ezüst-nitrát

Adjunk annyi 25 %-os ammóniát (3.4.) ezüst-nitrát (3.15.) 5 %-os (m/V) vizes oldatához, hogy a csapadék éppen föloldódjon. A reagenst közvetlenül felhasználás előtt kell készíteni.

Nem tárolható.

4.1.

A vékonyréteg-kromatográfia szokásos laboratóriumi eszközei.

4.2.

4 000 ford/perc fordulatszámú centrifuga.

4.3.

10 ml-es, PTFE bevonatú menetes kupakkal rendelkező centrifugacsövek vagy ezekkel egyenértékű csövek.

6.1.1.

β-naftol (β-N)

6.1.2.

2-amino-fenol (OAP)

6.1.3.

3-amino-fenol (MAP)

6.1.4.

4-amino-fenol (PAP)

6.1.5.

2-nitro-1,4-fenilén-diamin (2-NPPD)

6.1.6.

4-nitro-1,2-fenilén-diamin (4-NOPD)

Készítsük el a kiegészítő referenciaanyagok 0,5 %-os (m/V) oldatát a 3.21. pontban leírt módon.

6.2.1.

Etil-acetát – ciklohexán – 25 %-os ammónia-oldat, (65:30:0,5 térfogatarányban)

6.4.1.

Az 1. ábrán látható módon húzzunk két merőleges vonalat a vékonyréteg-lapon (4.1.3.), az abszorbens felületén.

6.4.2.

A lapot nitrogén-atmoszféra (4.1.1.) alatt tartva vigyünk fel az 1. ábra szerinti, az 1 jelű kiindulási pontba 1–4 μl kivonatot (5.1.). A kivonat mennyisége az 5.2. szakaszban kapott kromatogramokon megjelenő foltok intenzitásától függ.

6.4.3.

Osszuk el a 2 és 3 jelű pont között (1. ábra) az 5.2. szakaszban azonosított vagy az 5.2. szakasz alapján feltételezett oxidáló színezékeket (a pontok közötti távolság 1,5 cm). Vigyünk fel valamennyi referenciaoldatból 2-2 μl-t a DAP kivételével, amelyből 6 μl-t vigyünk fel a lapra. A műveletet nitrogén (6.4.2.) alatt végezzük.

6.4.4.

Ismételjük meg a 6.4.3. szakaszban leírt műveletet a 4 és 5 jelű kiindulási pontokban (1. ábra) (a pontok közötti távolság 1,5 cm), és tartsuk a lapot nitrogén alatt, amíg a kromatográfia meg nem kezdődik.

6.4.5.

Öblítsünk át egy kromatográfiás kádat nitrogénnel (3.8.), majd öntsünk bele megfelelő mennyiségű 3.22.2. előhívó oldószert. Tegyük a (6.4.4.) lapot a kádba, és hívjuk elő fénytől védve az első elúciós irányba (1. ábra).

A kromatografálást addig végezzük, amíg az oldószerfront eltávolodott körülbelül 13 cm-re.

6.4.6.

Vegyük ki a lapot a kádból, helyezzük egy előzetesen nitrogénnel átöblített kádba, és szárítsuk legalább 60 percen át, hogy az eluáló oldószer elpárologjon.

6.4.7.

Egy térfogatmérésre alkalmas próbacsővel mérjünk be megfelelő mennyiségű eluáló oldószert (6.2.1.) egy előzetesen nitrogénnel (3.8.) átöblített kádba, tegyük be a (6.4.6.) kádba a lapot az előző helyzetéhez képest 90°-kal elforgatva, és addig végezzük a kromatografálást a másik irányban ugyancsak fénytől védve, amíg az oldószerfront el nem éri az abszorbens felületén húzott vonalat. Vegyük ki a lapot a kádból, és szárítsuk meg levegőn.

6.4.8.

Tegyük be a lapot 10 percre a jódgőzökkel (6.3.) telített kromatográfiás kádba, és értékeljük a kétdimenziós kromatogramot az egyidejűleg kromatografált referenciaanyagok Rf értéke és színe alapján. (A II. táblázat tájékoztató jelleggel ismerteti az Rf-értékeket és a színeket).

Megjegyzés:

A foltok színének maximális intenzitása úgy biztosítható, ha a kromatogramot az előhívás után fél órán keresztül hagyjuk levegőn állni.

6.4.9.

A 6.4.8. pontban azonosított oxidáló színezékek jelenléte egyértelműen igazolható, ha a 6.4.1.–6.4.8. pontban írt műveletsort úgy ismételjük meg, hogy a 6.4.2. pontban az 1 jelű kiindulási pontban felvitt mennyiségen felül 1-1 μl-t felviszünk a 6.4.8. pontban azonosított színezékek referenciaoldatából is. Ha ebben a műveletsorban a 6.4.8. ponthoz képest nem jelenik meg új folt, a kromatogramnak a 6.4.8. szerinti értékelése helyes.

3.1.

3.2.

3.3.

Metanol

3.4.

2-amino-benzaldehid-fenilhidrazon (Nitrine R reagens) metanolos oldata.

Mérjünk ki pontosan 2,0 g Nitrine R-t, vigyük át veszteség nélkül egy 100 ml-es mérőlombikba. Csepegtessünk hozzá 4 ml hígított sósavat (3.2.), és rázzuk össze. Töltsük fel a jelig metanollal, és addig keverjük, amíg az oldat teljesen ki nem tisztul. Az oldatot barna üvegpalackban (4.3.) tároljuk.

4.1.

50 ml-es főzőpohár

4.2.

100 ml-es mérőlombik

4.3.

125 ml-es barna üvegpalack

4.4.

10 x 10 cm-es üveglap

4.5.

Műanyag spatula

4.6.

10 x 10 cm-es szűrőpapír,

5.1.

Egyenletesen terítsük szét a vizsgálandó minta egy részét egy üveglapon (4.4.) ügyelve arra, hogy a lap felületét legfeljebb 1 cm vastagságban borítsa be.

5.2.

Itassunk át egy szűrőpapír (4.6.) -lapot desztillált vízzel. Helyezzük a szűrőpapírt a mintára, és nyomkodjuk le a műanyag spatulával (4.5.).

5.3.

Várjunk körülbelül egy percet, majd a szűrőpapír közepére vigyünk fel:

5.4.

Öt-tíz másodperc múlva vegyük le a szűrőpapírt, és vizsgáljuk meg a fénnyel szemben tartva. A nitrit jelenlétét vörösesbíbor színeződés jelzi.

Ha a minta nitrittartalma alacsony, a vörösesbíbor szín öt-tizenöt másodperc után sárgára változik. Nagyobb mennyiségű nitrit jelenlétében ez a színátmenet csak egy-két perc múltán megy végbe.

4.1.

Derítő reagensek: ezek a reagensek készítésük után legföljebb egy hétig használhatók.

4.2.

Nátrium-nitrit-oldat:

Oldjunk fel 0,500 g nátrium-nitritet desztillált vízben egy 1 000 ml-es mérőlombikban, és vízzel töltsük fel a jelig. Az így elkészített standard törzsoldat 10,0 ml-ét hígítsuk 500 ml-re; utóbbi oldat egy ml-e 10 mikrogramm NaNO2-ot tartalmaz.

4.3.

1N nátrium-hidroxid-oldat

4.4.

0,2 % szulfanil-amid-hidroklorid-oldat:

Oldjunk fel 2,0 g szulfanil-amidot 800 ml vízben melegítés közben. Hűtsük le, és keverés közben adjunk hozzá 100 ml tömény sósavat. Hígítsuk vízzel 1 000 ml-re.

4.5.

5N sósav

4.6.

N-1-naftil reagens

Ezt az oldatot a felhasználás napján kell készíteni. Oldjunk fel 0,1 g N-1-naftil-etilén-diamin-dihidrokloridot vízben, és hígítsuk vízzel 100 ml-re.

5.1.

Analitikai mérleg

5.2.

100, 250, 500 és 1 000 ml-es mérőlombik

5.3.

Hasas vagy mérőpipetta

5.4.

100 ml-es mérőhenger

5.5.

15 cm átmérőjű, nitritmentes, redős szűrőpapír

5.6.

Vízfürdő

5.7.

Spektrofotométer 1 cm-es úthosszúságú optikai cellával

5.8.

pH-mérő

5.9.

10 ml-es mikrobüretta

5.10.

250 ml-es főzőpohár

6.1.

Mérjünk ki körülbelül 0,5 g-ot (m) 0,1 mg pontossággal a homogenizált mintából, forró desztillált vízzel veszteség nélkül mossuk át egy 250 ml-es főzőpohárba (5.10.), majd forró desztillált vízzel egészítsük ki körülbelül 150 ml-re. Tegyük a főzőpoharat (5.10.) fél órára 80 °C-os (5.6.) vízfürdőbe. Közben időnként rázzuk össze a pohár tartalmát.

6.2.

Hűtsük le szobahőmérsékletre, és ezután keverés közben adjunk hozzá 2 ml Carrez I (4.1.1.) reagenst és 2 ml Carrez II reagenst (4.1.2.).

6.3.

1N nátrium-hidroxiddal (4.3.) állítsuk be az anyag pH-ját 8,3-ra. Használjuk a pH-mérőt (5.8.). Vigyük át veszteség nélkül egy 250 ml-es mérőlombikba (5.2.), és töltsük fel a jelig desztillált vízzel.

6.4.

Keverjük össze a lombik tartalmát, és redős szűrőn (5.5.) szűrjük a mintát.

6.5.

A tiszta szűrletből pipettázzunk (5.3.) megfelelő mennyiséget, de legföljebb 25 ml-t egy 100 ml-es mérőlombikba (5.2.), és desztillált vízzel egészítsük ki a térfogatát 60 ml-re.

6.6.

Az összekeverést követően adjunk hozzá 10,0 ml szulfanil-amid-hidroklorid-oldatot (4.4.), majd 6,0 ml 5N sósavat (4.5.). Keverjük össze, és hagyjuk állni az oldatot öt percig. Adjunk hozzá 2,0 ml N-1-naftil reagenst (4.6.), keverjük össze, és hagyjuk állni három percig. Hígítsuk vízzel jelig, és keverjük össze.

6.7.

A vakpróba készítéséhez ismételjük a 6.5. és 6.6. műveletet az N-1-naftil reagensnek (4.6.) az oldathoz történő hozzáadása nélkül.

6.8.

Mérjük (5.7.) a 6.6. műveletben kapott oldat optikai sűrűségét 538 nm-en, referenciaként a vakoldatot (6.7.) használjuk.

6.9.

A kalibrációs görbéről (6.10.) olvassuk le a minta 6.8. pontban mért optikai sűrűségnek megfelelő nátrium-nitrit-tartalmat mikrogramm/100 ml koncentráció egységben (m1 mikrogramm).

6.10.

A 10 μg/ml koncentrációjú nátrium-nitrit (4.2.) -oldat felhasználásával készítsünk 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg nátrium-nitrát/100 ml koncentrációjú oldatokat, és vegyük fel a nátrium-nitrit kalibrációs egyenesét.

m

=

a vizsgálatra kivett minta tömege grammban (6.1.),

m1

=

a 6.9. pontban meghatározott nátrium-nitrit-tartalom mikrogrammban,

V

=

a méréshez (6.5.) felhasznált szűrlet térfogata ml-ben.

3.2.1.

Fukszin

3.2.2.

7 H2O-val hidratált nátrium-szulfit

3.2.3.

Tömény sósav (d = 1,19)

3.2.4.

Kénsav, kb. 1 M

3.2.5.

Mérjünk be 100 mg fukszint (3.2.1.) egy főzőpohárba és oldjuk fel 75 ml vízben, 80°C-on. Lehűlés után adjunk hozzá 2,5 g nátrium-szulfitot (3.2.2.). Töltsük fel 100 ml-re.

Két hétig eltartható.

3.3.1.

Mérjünk be 2 g mintát egy 10 ml-es főzőpohárba.

3.3.2.

Adjunk hozzá két csepp kénsavat (3.2.4.) és 2 ml Schiff reagenst (3.2.5.). Ennek a reagensnek alkalmazáskor teljesen színtelennek kell lennie.

Rázzuk össze és hagyjuk állni öt percig.

3.3.3.

Ha öt perc alatt rózsaszínű vagy mályvaszínű elszíneződés észlelhető, akkor a formaldehid 0,01 %-ot meghaladó mennyiségben van jelen. Ebben az esetben a szabad és az összetett formaldehidet a (4.) módszer, valamint szükség esetén az (5.) módszer szerint kell meghatározni.

4.2.1.

Vízmentes ammónium-acetát

4.2.2.

Tömény ecetsav, d20 4 = 1,05

4.2.3.

Alacsony nyomáson, 25 mm Hg, 25o-on frissen desztillált 2,4-pentándion – nem mutathat semennyi abszorpciót 410nm-en.

4.2.4.

Butan-1-ol

4.2.5.

Sósav, 1 M

4.2.6.

Sósav, kb. 0,1 M

4.2.7.

Nátrium-hidroxid, 1 M

4.2.8.

Frissen készített keményítő oldat, amely megfelel az Európai gyógyszerkönyv 1980-as 2. kiadása I-VII-1-1 részének (1g/50ml víz)

4.2.9.

37-40 %-os formaldehid

4.2.10.

Jód mérőoldat, 0,05 M

4.2.11.

Nátrium-tioszulfát mérőoldat, 0,1 M

4.2.12.

Oldjunk fel egy 1000ml-es mérőlombikban:

Töltsük fel 1000ml-re vízzel (az oldat pH-ja 6,4 körül van).

Ezt a reagenst frissen kell készíteni

4.2.13.

2,4-pentándion nélküli reagens (4.2.12. pont)

4.2.14.

Öntsünk 5 g formaldehidet (4.2.9. pont) egy 1000 ml-es mérőlombikba és töltsük fel vízzel 1000 ml-re.

Állapítsuk meg az oldat erősségét a következőképpen:

Vegyünk ki 10,00 ml-t; adjunk hozzá 25,00 ml jód mérőoldatot (4.2.10. pont) és 10,00 ml nátrium-hidroxid oldatot (4.2.7. pont).

Hagyjuk állni öt percig.

Savanyítsuk meg 11,00 ml HCl oldattal (4.2.5. pont) és határozzuk meg a jódfelesleget nátrium-tioszulfát oldattal (4.2.11. pont) keményítő oldat (4.2.8. pont), mint indikátor jelenlétében.

1 ml 0,05 M jód (4.2.10. pont) fogyása megfelel 1,5 mg formaldehidnek.

4.2.15.

Hígítsuk fel a formaldehid törzsoldatot először 1/20 majd 1/100 arányban vízzel.

Ez az oldatnak milliliterenként körülbelül 1 μg formaldehidet tartalmaz.

Számítsuk ki a pontos tartalmat.

4.3.1.

Szokásos laboratóriumi felszerelés

4.3.2.

Fáziselválasztó szűrő, Whatman 1 PS (vagy ezzel egyenértékű)

4.3.3.

Centrifuga

4.3.4.

Vízfürdő készlet 60°C-ra állítva

4.3.5.

Spektrofotométer

4.3.6.

Üveg küvetta, 1 cm-es optikai úthosszal.

4.4.4.1.

A 4.4.1., 4.4.2. és a 4.4.3. pont szerinti keverékeket rázzuk össze. Állítsuk az Erlenmeyer lombikokat 60oC-os vízfürdőbe pontosan tíz percre. Hagyjuk hűlni két percig jeges vízzel teli fürdőben.

4.4.4.2.

Vigyük át egy 50 ml-es választótölcsérbe, amely 10 ml 1-butanolt (4.2.4. pont) tartalmaz. Öblítsük át mindegyik lombikot 3–5 ml vízzel. Rázzuk erősen a keveréket pontosan 30 másodpercig. Hagyjuk a fázisokat szétválni.

4.4.4.3.

Szűrjük le a bután-1-olos fázist a mérőlombikba (4.3.2. pont) fáziselválasztó szűrőn keresztül. Centrifugálás (3000 g, 5 perc) is alkalmazható.

4.4.4.4.

Mérjük meg a 4.4.1. pont szerinti mintaoldat kivonatának A1 abszorbanciáját 410 nm-nél a 4.4.2. pont szerinti referencia oldat kivonatához képest.

4.4.4.5.

Hasonlóképpen mérjük meg a 4.4.3. szerinti vakoldat kivonatának A2 abszorbanciáját bután -1-olhoz képest.

MEGJEGYZÉS: Az összes fenti műveletet attól a pillanattól számított 25 percen belül kell elvégezni, amikor az Erlenmeyer lombikot a 60oC-os vízfürdőbe helyeztük.

4.4.5.1.

Tegyük egy 50 ml-es Erlenmeyer lombikba a következőket:

4.4.5.2.

Folytassuk a 4.4.4. pontban leírtaknak megfelelően és mérjük meg az abszorbanciát bután -1-olhoz (4.2.4.) képest.

4.4.5.3.

Ismételjük meg az eljárást 10, 15, 20 és 25 ml hígított standard oldat (4.2.15.) felhasználásával.

4.4.5.4.

A nullapont meghatározásához (amely a reagensek színezettségének felel meg) járjunk el a 4.4.4.5. pontban megadottak szerint.

4.4.5.5.

Szerkesszük meg a kalibrációs görbét, miután kivontuk a nullapont értékét a 4.4.5.1 és 4.4.5.3. pont szerint kapott egyes abszorbanciákból. A Beer törvény 30 μg formaldehid mennyiségig érvényes.

4.5.1.

Vonjuk ki A2-t A1-ből és olvassuk le a kalibrációs görbéről (4.4.5.5. pont) azt a μg-ban kifejezett C mennyiséget, amely a mintaoldatban jelen lévő formaldehidnek felel meg (4.4.1.).

4.5.2.

Számítsuk ki a mintaformaldehid tartalmát (% m/m) a következő képlet segítségével:

ahol:

5.2.1.

HPLC tisztaságú vagy azzal megegyező minőségű víz

5.2.2.

Vízmentes ammónium-acetát

5.2.3.

Tömény ecetsav

5.2.4.

2,4-pentándion (4oC-on tartva)

5.2.5.

Vízmentes dinátrium-foszfát

5.2.6.

85 %-os ortofoszforsav (d = 1,7)

5.2.7.

HPLC minőségű metanol

5.2.8.

Diklór-metán

5.2.9.

37–40 %-os (w/v) formaldehid

5.2.10.

Nátrium-hidroxid, 1 M

5.2.11.

Sósav, 1 M

5.2.12.

Sósav, 0,002 M

5.2.13.

Frissen készített keményítő oldat, amely megfelel az Európai gyógyszerkönyvnek (lásd 4.2.8.pont)

5.2.14.

Jód mérőoldat, 0,05 M

5.2.15.

Nátrium-tioszulfát mérőoldat, 0,1 M

5.2.16.

Dinátrium-foszfát (5.2.5.) vizes oldata, 0,006 M, ortofoszforsavval (5.2.6.) pH 2,1 értékre beállított;

5.2.17.

Oldjunk fel egy 1000 ml-es mérőlombikban:

Töltsük fel 1000 ml-re vízzel (5.2.1.).

Ezt a reagenst tartsuk távol a fénytől.

Eltarthatóság 25oC-on legfeljebb 3 nap.

Az oldat színe nem változhat meg;

5.2.18.

Öntsünk 10 g formaldehidet (5.2.9.) egy 1000 ml-es mérőlombikba és töltsük fel 1000 ml-re vízzel.

Állapítsuk meg ennek az oldatnak az erősségét a következőképpen:

Vegyünk ki 5,00 ml-t; adjunk hozzá 25,00 ml jód mérőoldatot (5.2.14.) és 10 ml nátrium-hidroxid oldatot (5.2.10.).

Hagyjuk állni öt percig.

Savanyítsuk meg 11,00 ml HCl oldattal (5.2.11.) és határozzuk meg a jód mérőoldat feleslegét nátrium-tioszulfát oldattal (5.2.15.) titrálva, használjunk keményítő oldat (5.2.13.) indikátorként.

1 ml jód oldat (5.2.14.) megfelel 1,5 mg formaldehidnek.

5.2.19.

Hígítsuk fel a törzsoldatot kezdeti erősségéhez képest 1/100 arányban a mozgó fázissal.

Ennek az oldatnak 1 ml-e kb. 37 mg formaldehidet tartalmaz.

Számítsuk ki a pontos tartalmat.

5.3.1.

Szokásos laboratóriumi felszerelés

5.3.2.

Ingadozásmentes HPLC pumpa

5.3.3.

Alacsony nyomású ingadozásmentes pumpa a reagens számára (vagy egy második HPLC pumpa)

5.3.4.

Befecskendező szelep 10 μl-es hurokkal

5.3.5.

Oszlopkimenethez illeszthető reaktor a következő összetevőkkel:

5.3.6.

Membránszűrő, 0,45 μm-es pórusmérettel

5.3.7.

SEP-PAKR C18 vagy azzal egyenértékű töltet

5.3.8.

Használatra kész oszlopok:

5.3.9.

Bischoff K1 hypersil RP 18 (K1 G 6301 1805 hivatkozás)

(5 μm, hossz = 10 mm, vagy ezzel egyenértékű).

5.3.10.

Az oszlop és az előoszlop Ecotube-rendszer segítségével van összekötve (A 15020508 Bischoff hivatkozás) vagy ezzel egyenértékű.

5.3.11.

Szereljük össze a készüléket (5.3.5.) a 2. függelék diagramján bemutatottak szerint.

A befecskendező érték utáni csatlakozásokat a lehető legrövidebbre kell méretezni. Ebben az esetben a reaktor kivezetése és a detektor bevezetése közötti rozsdamentes acélcső a keverék mérés előtti hűtése céljából van elhelyezve, és a hőmérséklet a detektorban ismeretlen, de állandó.

5.3.12.

UV látható detektor

5.3.13.

Adatrögzítő

5.3.14.

Centrifuga

5.3.15.

Ultrahangos fürdő

5.3.16.

Rotációs keverő (vortex vagy azzal egyenértékű)

m

=

a vizsgálati minta tömege g-ban (5.4.2.1.),

C

=

formaldehid koncentráció μg/100ml-ben a kalibrációs görbéről leolvasva (5.4.1.).

4.1.

25 %-os (m/m) sósav

4.2.

Metanol

4.3.

96 %-os (v/v) etanol

4.4.

Készre gyártott szilikagél VRK lapok (műanyag vagy alumínium) fluoreszcens indikátorral. Hatástalanítsuk a következők szerint: fújjuk le a közönséges, előre bevont szilikagél lapokat vízzel, amíg fényessé nem válnak. Hagyjuk szobahőmérsékleten egy-három órán keresztül száradni a lefújt lapokat.

Megjegyzés:

A lap hatástalanítása nélkül a rezorcin szilikagélen történő irreverzibilis abszorpciója miatt veszteség léphet föl.

4.5.

Előhívó oldószer: aceton – kloroform – ecetsav (20:75:5 térfogatarányban).

4.6.

Rezorcin-standard-oldat: oldjunk fel 400 mg rezorcint 100 ml 96 %-os etanolban (4.3.) (1 ml 4 000 μg rezorcint tartalmaz).

4.7.

Belső standard oldat: oldjunk fel 400 mg 3,5-dihidroxi-toluolt (DHT) 100 ml 96 %-os etanolban (4.3.) (1 ml 4 000 μg DHT-t tartalmaz).

4.8.

Standard elegy: elegyítsünk 10 ml 4.6. és 10 ml 4.7. szerinti oldatot egy 100 ml-es mérőlombikban, töltsük a jelig 96 %-os etanollal (4.3.), és keverjük össze (1 ml 400 μg rezorcint és 400 μg DHT-t tartalmaz).

4.9.

Szililezőszerek:

5.1.

A vékonyréteg-kromatográfia és a gázkromatográfia szokásos felszerelései

5.2.

Üvegeszközök

6.1.1.

Egy 150 ml-es főzőpohárba a termékből mérjünk be annyi vizsgálati mintát (m gramm), amely körülbelül 20–50 mg rezorcint tartalmaz.

6.1.2.

Adjunk hozzá sósavat (4.1.), amíg a keverék savassá nem válik (mintegy 2–4 ml szükséges), és adjunk hozzá 10 ml (40 mg DHT) belső standard oldatot (4.7.), és keverjük össze. Etanollal (4.3.) mossuk át egy 100 ml-es mérőlombikba, töltsük fel a jelig etanollal, és keverjük össze.

6.1.3.

Vigyünk fel 250 μl (6.1.2) oldatot egy deaktivált szilikagél lapra (4.4.) egy 8 cm hosszú, folyamatos egyenes mentén. Ügyeljünk arra, hogy az egyenes minél vékonyabb legyen.

6.1.4.

Ugyanígy vigyünk fel a standard elegyből (4.8.) 250 μl-t ugyanarra a lapra (6.1.3.).

6.1.5.

Az előhívást követő azonosítás egyszerűsítése céljából ugyanazon a lapon vigyünk fel párhuzamosan az alapvonalra két pontban 5-5 μl-t a 4.6. és a 4.7. oldatból.

6.1.6.

Fejlesszük ki a lapot az előhívó szerrel (4.5.) megtöltött telítetlen kádban, amíg az oldószerfront el nem távolodik az alapvonaltól 12 cm-re, ez általában körülbelül 45 percet vesz igénybe. Szárítsuk meg levegőn a lapot, és állapítsuk meg a rezorcin/DHT-zóna helyét rövidhullámú UV fényben (254 nm). A két vegyület Rf-értéke nagyjából megegyezik. A sávok sötét külső határvonalától két mm-re egy ceruzával rajzoljuk körbe a sávokat. Kaparjuk le ezeket a zónákat, és az egyes sávokat tartalmazó abszorbenst külön-külön 10 ml-es palackokban gyűjtsük.

6.1.7.

Vonjuk ki a mintát és a standard elegyet tartalmazó abszorbenst a következőképpen:

adjunk hozzá 2 ml metanolt (4.2.), és állandó keverés mellett egy órán keresztül vonjuk ki. Szűrjük a keveréket, majd ismételjük meg a műveletet 2 ml metanollal 15 percig extrahálva.

6.1.8.

Egyesítsük a metanolos kivonatokat, és megfelelő szárítószerrel töltött vákuum-deszikkátorban egy éjszakán át szárítva párologtassuk el az oldószert. Semmiképpen ne melegítsük a mintákat.

6.1.9.

A maradékkal végezzük el (6.1.8.) a szililezését a 6.1.9.1. vagy pedig a 6.1.9.2. alatt leírt módon.

r1 és r2

=

két csúcs retenciós ideje percben,

w1 és w2

=

ugyanezen csúcsoknak a magasság felénél mért szélessége mm-ben,

d’

=

a diagrampapír sebessége mm/percben.

6.2.2.

Fecskendezzünk a 6.1.9. pont szerint elkészített oldatokból 1–3 μl-t a gázkromatográfra. Minden (6.1.9.) oldatból ötször fecskendezzünk, mérjük az egy anyaghoz tartozó csúcsterületeket, átlagoljuk ezeket, és számítsuk ki a csúcsterületarányt, S-t. S = rezorcin-csúcsterület/DHT-csúcsterület.

M

=

vizsgálati minta tömege grammban (6.1.1.),

Sminta

=

a 6.2.2. alapján számított, a mintaoldatra vonatkozó átlag csúcsterületarány,

Sstandard elegy

=

a 6.2.2. alapján számított, a standard elegyre vonatkozó átlag csúcsterületarány.

4.1.

Metanol

4.2.

Abszolút etanol

4.3.

Propán-2-ol

4.4.

Vízzel alkoholmentesített kloroform

5.1.

Gázkromatográf:

5.2.

100 ml-es mérőlombikok

5.3.

2 ml-es, 20 ml-es, és 0–1 ml-es tartományú pipetták

5.4.

0–100 μl-es és 0–5 μl-es mikrofecskendők

és (csak aeroszol minták adagolására) különleges gázzáró fecskendő tolattyúval (lásd a mintavételi eljárásról szóló 5. ábrát ( 9 )).

6.1.1.

Az aeroszol készítményeket az 1980. december 22-i 80/1335/EGK ( 10 ) bizottsági irányelv mellékletének II. fejezete alapján mintázzuk, majd gázkromatográfiásan vizsgáljuk a 6.2.1. pontban leírt körülményeknek megfelelően.

6.1.2.

Az említett II. fejezetnek megfelelően mintavételezett nem aeroszol termékeket vízzel 1–2 %-os etanol- vagy propán-2-ol-tartalomra hígítjuk, majd gázkromatográfiásan vizsgáljuk a 6.2.2. pontban leírt körülményeknek megfelelően.

6.2.1.

Aeroszol minták esetén hővezetési detektort használunk.

6.2.2.

Nem aeroszol minták

7.1.

A 6.2.1. szakasz szerinti gázkromatográfiás eljárás végrehajtása (Hallcomid M18 oszlop) esetén készítsük el az alábbi táblázatban felsorolt standard elegyeket. A készítés során a komponenseket pipettával adjuk az elegyhez, de a pontos bemérést úgy határozzuk meg, hogy minden egyes hozzáadást követően lemérjük a pipettát vagy a lombikot.

Injektáljunk 2–3 μl-t a gázkromatográfra a 6.2.1. szerinti körülmények beállítása mellett.

Számítsuk ki valamennyi elegyre a (metanol/etanol-) vagy a (metanol/propán-2-ol-) csúcsterületarányt. Ábrázoljuk a standard görbét a következőket feltüntetve:

7.2.

A 6.2.2. pontban leírt gázkromatográfiás eljárás végrehajtása (Porapak QS vagy Chromosorb 105) esetén készítsük el az alábbi táblázatban felsorolt standard elegyeket. A készítés során a komponenseket pipettával vagy mikrofecskendővel adjuk az elegyhez, de a pontos mennyiséget minden esetben úgy határozzuk meg, hogy a hozzáadást követően lemérjük a pipettát vagy a lombikot.

Injektáljunk 2–3 μl-t a gázkromatográfra a 6.2.2. pontban írt körülmények beállítása mellett.

Számítsuk ki valamennyi elegyre a (metanol/etanol-) vagy a (metanol/propán-2-ol-) csúcsterület arányt. Ábrázoljuk a standard görbén a következőket feltüntetve:

7.3.

A standard kalibrációs görbének lineárisnak kell lennie.

1

=

HPLC pumpa

2

=

Befecskendező szelep

3

=

Oszlop előtét oszloppal

4

=

Reagens pumpa

5

=

T-darab holttérfogat nélkül

5’

=

T-darab (Vortex)

6-6’

=

Csatlakozó holttérfogat nélkül

7

=

„Csomózás”

7’

=

Reaktor

8

=

Háromnyakú lombik forró vízzel

9

=

Melegítőkráter

10

=

Hűtő

11

=

Hőcserélő cső rozsdamentes acélból

11’

=

Hőcserélő

12

=

Látható-UV detektor

13

=

PCRS 520 oszlop utáni modul

13

=

PCRS 520 utóoszlop modul