„B.   ODREĐIVANJE KOLIČINA DIOKSINA (PCDD/PCDF) I PCB-a

POGLAVLJE I.

Metode uzorkovanja i tumačenje rezultata analize

1.   Svrha i opseg primjene

Uzorci namijenjeni za službenu kontrolu količine polikloriranih dibenzo-p-dioksina (PCDD-a), polikloriranih dibenzofurana (PCDF), dioksinu sličnih polikloriranih bifenila (PCB-a) (1) i PCB-a koji nisu slični dioksinu u hrani za životinje, uzimaju se u skladu odredbama Priloga I. Primjenjuju se količinski zahtjevi za kontrolu tvari ili proizvoda ravnomjerno raspoređenih u hrani za životinje kako je predviđeno u točki 5.A Priloga I. Skupni uzorci dobiveni na taj način smatraju se reprezentativnim za serije ili podserije iz kojih su uzeti. Sukladnost najvećih dopuštenih količina određenih u Direktivi 2002/32/EZ utvrđuje se na temelju količina utvrđenih u laboratorijskim uzorcima.

Za potrebe ovog dijela Priloga V., primjenjuju se definicije utvrđene u Prilogu I. Odluci Komisije 2002/657/EZ od 14. kolovoza 2002. o primjeni Direktive Vijeća 96/23/EZ o provođenju analitičkih metoda i tumačenja rezultata (2).

2.   Sukladnost serije ili podserije sa specifikacijom

2.1   U pogledu PCB-a koji nisu slični dioksinu

Serija je sukladna sa specifikacijom ako rezultat analize ne prelazi najveću dopuštenu količinu PCB-a koji nisu slični dioksinu utvrđenu Direktivom 2002/32/EZ, uzimajući u obzir mjernu nesigurnost.

Serija je nesukladna sa specifikacijom ako rezultat analize na gornjoj granici (3), potvrđen dvostrukom analizom (4), prelazi najveću dopuštenu količinu utvrđenu Direktivom 2002/32/EZ, uzimajući u obzir mjernu nesigurnost.

Mjerna nesigurnost uzima se u obzir sukladno jednom od sljedećih pristupa:

—	izračunom proširene nesigurnosti, upotrebom obuhvatnog faktora 2, čime se postiže razina pouzdanosti od približno 95 %. Serija ili podserija nije sukladna ako je izmjerena vrijednost minus U iznad najveće dopuštene količine,

—	utvrđivanjem granične koncentracije analita (CCα) u skladu s točkom 3.1.2.5 Priloga I. Odluci 2002/657/EZ. Serija ili podserija nije sukladna ako je izmjerena vrijednost jednaka ili veća od CCα.

Ova tumačenja pravila primjenjuju se na rezultat analize dobiven na uzorku za službenu kontrolu. U slučaju analize u zaštitne ili referentne svrhe, primjenjuju se nacionalna pravila.

2.2   U pogledu PCDD/F-a i dioksinu sličnih PCB-a

Serija je u skladu sa specifikacijama ako rezultat pojedinačne analize,

—	izvedene orijentacijskom metodom sa udjelom lažno negativnih rezultata manjim od 5 % pokaže da količina ne prelazi odgovarajuće najveće dopuštene količine za PCDD/PCDF i za zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a, koje su utvrđene Direktivom 2002/32/EZ,

—	izvedene potvrdnom metodom ne prelazi odgovarajuće najveće dopuštene količine za PCDD/PCDF i za zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a, koje su utvrđene Direktivom 2002/32/EZ, uzimajući u obzir mjernu nesigurnost.

Za orijentacijske analize utvrđuje se granična vrijednost za odlučivanje o sukladnosti uzorka s odgovarajućim ciljnim razinama određenim za PCDD/PCDF ili za zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a.

Serija nije u skladu sa specifikacijom ako rezultat analize na gornjoj granici (5), dobiven potvrdnom metodom i potvrđen dvostrukom analizom, prelazi najveću dopuštenu količinu utvrđenu Direktivom 2002/32/EZ, uzimajući u obzir mjernu nesigurnost (6).

Mjerna nesigurnost uzima se u obzir u skladu s jednim od sljedećih pristupa:

—

izračunom proširene nesigurnosti, upotrebom obuhvatnog faktora 2, čime se postiže razina pouzdanosti od približno 95 %. Serija ili podserija nije sukladna ako je izmjerena vrijednost minus U iznad najveće dopuštene količine. U slučaju odvojenog određivanja PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a, za zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a koristi se zbroj procijenjene proširene nesigurnosti odvojenih analitičkih rezultata PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a,

—	utvrđivanjem granične koncentracije analita (CCα) u skladu s točkom 3.1.2.5 Priloga I. Odluci 2002/657/EZ. Serija ili podserija nije sukladna ako je izmjerena vrijednost jednaka ili veća od CCα.

Ova tumačenja pravila primjenjuju se na rezultat analize dobiven na uzorku za službenu kontrolu. U slučaju analize u zaštitne ili referentne svrhe, primjenjuju se nacionalna pravila.

3.   Rezultati koji prelaze pragove za poduzimanje mjera, kako je utvrđeno u Prilogu II. Direktivi 2002/32/EZ

Pragovi za poduzimanje mjera služe kao pomagalo za odabir uzoraka u onim slučajevima u kojima je potrebno identificirati izvor kontaminacije i poduzeti mjere za njezino smanjivanje ili otklanjanje. Granične vrijednosti za odabir ovih uzoraka određuju se orijentacijskim metodama. Postupci potrebni za utvrđivanje izvora i za smanjivanje ili otklanjanje kontaminacije, provode se samo ako se premašivanje pragova za poduzimanje mjera potvrdi dvostrukom analizom upotrebom potvrdne metode i uzimajući u obzir mjernu nesigurnost (7).

POGLAVLJE II.

Priprema uzorka i zahtjevi u pogledu analitičke metode za službenu kontrolu količine dioksina (PCDD/PCDF) i dioksinu sličnih PCB-a u hrani za životinje

1.   Područje primjene

Zahtjevi navedeni u ovom Prilogu primjenjuju se kada se hrana za životinje analizira za službenu kontrolu količine 2,3,7,8-supstituiranih polikloriranih dibenzo-p-dioksina i polikloriranih dibenzofurana (PCDD/F) te dioksinu sličnih polikloriranih bifenila (dioksinu slični PCB-i), i za regulatorne namjene.

Nadzor u pogledu prisutnosti PCDD/F-a i dioksinu sličnih PCB-a u hrani za životinje može se provoditi s dva različita cilja:

(a)

Odabir onih uzoraka kod kojih količine PCDD/F-a i dioksinu sličnih PCB-a premašuju najveće dopuštene količine ili pragove za poduzimanje mjera. Ovaj pristup može uključivati orijentacijsku metodu koja omogućava financijski isplativ veliki protok uzoraka, čime se povećava mogućnost otkrivanja novih incidenata s visokom izloženošću i rizikom za zdravlje potrošača. Orijentacijske metode mogu uključivati bioanalitičke i GC/MS metode. Pri njihovoj primjeni treba težiti izbjegavanju lažno negativnih rezultata. Koncentracija PCDD/F-a i zbroja PCDD/F-a i dioksinu sličnih PCB-a u uzorcima sa značajnim razinama, mora se odrediti/potvrditi potvrdnom metodom.

(b)

Određivanje količine PCDD/F-a i dioksinu sličnih PCB-a u uzorcima hrane za životinje u rasponu niske razine prisutnosti. To je važno za praćenje vremenskih trendova, za ocjenu izloženosti populacije i za stvaranje baze podataka za moguću ponovnu procjenu pragova za poduzimanje mjera i najvećih dopuštenih količina. Ovaj se cilj može postići potvrdnim metodama koje omogućavaju identifikaciju i nedvojbeno količinsko određivanje PCDD/F-a i PCB-a na ciljnoj razini. Ove se metode mogu koristiti za potvrđivanje rezultata dobivenih orijentacijskim metodama i za određivanje niske pozadinske razine pri nadzoru hrane za životinje. One su također važne za određivanje uzoraka kongenera, kako bi se identificirao izvor mogućeg onečišćenja. Trenutačno se pri takvim metodama koristi visoko djelatna plinska kromatografija/visoko djelatne masene spektrometrije (HRGC/HRMS).

2.   Klasifikacija metoda prema njihovom stupnju kvantifikacije  (8)

2.1   Kvalitativne metode daju odgovor tipa da/ne na prisutnost ciljnih analita, bez količinskog navođenja koncentracije navodnog analita. Kvalitativne metode mogu davati polukvantitativne rezultate, ali se upotrebljavaju samo za izvješće o odluci tipa ‚da/ne’ kao pokazatelj razina iznad ili ispod određenih raspona, npr. granica detekcije, granica kvantifikacije, granične vrijednosti.

Za kontrolu najvećih dopuštenih količina i pragova za poduzimanje mjera u pogledu PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a u hrani za životinje, mogu se primijeniti orijentacijske metode koje se temelje na usporedbi analitičkih rezultata s graničnom vrijednošću i koje daju odluku tipa ‚da/ne’ za ukazivanje na moguće premašivanje značajne vrijednosti.

2.2   Polukvantitativne metode su metode koje daju približnu indikaciju koncentracije navodnog analita, iako numerički rezultat ne ispunjava zahtjeve za kvantitativne metode. Mogu se koristiti za davanje informacija o rasponu koncentracije analita kako bi analitičar mogao odlučiti o rasponu kalibracije za potvrdni test koji se izvodi naknadno i za potrebe kontrole kvalitete. Sljedeće se metode mogu, na primjer, smatrati polukvantitativnim metodama:

(a)

metode koje se temelje na upotrebi bioloških načela, poput staničnih biotestova, receptorskih testova ili imunotestova, dalje u tekstu bioanalitičke metode, kojima se mogu otkriti ciljni analiti, uključuju kalibracijsku krivulju, daju odluku tipa ‚da/ne’ kao indikaciju mogućeg premašivanja značajne vrijednosti i omogućavaju izvješćivanje rezultata kao bioanalitičkih ekvivalenata (BEQ) koji su indikacija vrijednosti TEQ-a u uzorku;

(b)	fizikalno-kemijski test (npr. plinska kromatografija-masena spektrometrija/masena spektrometrija (GC-MS/MS) ili plinska kromatografija/nisko djelatna masena spektrometrija (GC/LRMS), kod kojih karakteristike izmjerene preciznosti metode ne ispunjavaju zahtjeve za kvantitativne testove.

2.3   Kvantitativne metode ispunjavaju iste zahtjeve u pogledu točnosti, dinamičkog raspona i preciznosti, kao potvrdne metode. Kada je potrebna kvantifikacija, kvantitativne metode se vrednuju kao potvrdne metode.

3.   Kontekst

Za izračunavanje koncentracija ekvivalenta toksičnosti (TEQ), koncentracije pojedinačnih tvari u danom uzorku množe se s njihovim odgovarajućim toksičnim ekvivalentnim faktorom (TEF), koje je odredila Svjetska zdravstvena organizacija i koji su navedeni u Dodatku ovom Prilogu, te se nakon toga zbrajaju kako bi se dobila ukupna koncentracija dioksinu sličnih spojeva, izražena kao TEQ.

Za potrebe ovog dijela B Priloga V., prihvaćena specifična granica kvantifikacije pojedinačnog kongenera je koncentracija analita u ekstraktu uzorka, koja proizvodi odgovor instrumenta na dva različita iona koji se prate omjerom S/Š (signal/šum) 3:1 za manje intenzivan signal i ispunjavanje temeljnih kriterija kako su opisani, na primjer, u standardu prEN 16215 (Hrana za životinje – određivanje dioksina i dioksinu sličnih PCB-a plinskom kromatografijom/visokog udjela masene spektrometrije (GC/HRMS) i indikatora PCB-a pomoću GC/HRMS) i/ili u metodi EPA 1613 reviziji B.

Bioanalitičke orijentacijske metode ne daju rezultate na razini kongenera nego samo indikaciju (9) razine TEQ-a, izraženu u bioanalitičkim ekvivalentima (BEQ), kako bi se potvrdila činjenica da svi spojevi koji su prisutni u ekstraktu uzorka i pokazuju odgovor pri testiranju možda ne ispunjavaju sve zahtjeve načela TEQ-a.

Orijentacijske i potvrdne metode mogu se upotrijebiti za kontrolu određene matrice samo ako su dovoljno osjetljive za pouzdano utvrđivanje količina koje su na ciljnoj razini (prag za poduzimanje mjera ili najveća dopuštena količina).

4.   Zahtjevi za osiguranje kvalitete

4.1   Potrebno je poduzeti mjere kako bi se izbjegla unakrižna kontaminacija u svakoj fazi postupka uzorkovanja i analize.

4.2   Uzorke treba čuvati i prenositi u staklenim, aluminijskim, polipropilenskim ili polietilenskim posudama, koje su primjerene za skladištenje i ne utječu na količine PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a u uzorku. Iz posude za uzorke treba odstraniti tragove papirne prašine.

4.3   Skladištenje i prenošenje uzorka provodi se na način kojim se održava cjelovitost uzorka hrane za životinje.

4.4   Koliko je to relevantno, svaki se laboratorijski uzorak sitno melje i temeljito promiješa upotrebom postupka za koji je dokazano da se njime postiže potpuna homogenizacija (na primjer, mljevenje do takve veličine da prolazi kroz sito s otvorima veličine 1 mm). Ako je sadržaj vlage previsok, uzorci se prije mljevenja suše.

4.5   Izvodi se kontrola reagensa, staklenih posuda i opreme, radi mogućeg utjecaja na rezultate temeljene na TEQ-u ili BEQ-u.

4.6   Izvodi se slijepa proba, tako da se provede cjelokupan analitički postupak, ali bez uzorka.

4.7   Za bioanalitičke metode, testiraju se sve staklene posude i otapala koji se upotrebljavaju u analizi, kako bi se provjerilo da ne sadrže spojeve koji utječu na otkrivanje ciljnih spojeva u radnom području. Staklene posude se ispiru otapalima ili se zagrijavaju na temperaturama primjerenim za otklanjanje tragova PCDD/PCDF-a, dioksinu sličnih spojeva i ometajućih spojeva s njihove površine.

4.8   Količina uzorka koji se koristi za ekstrakciju mora biti dovoljna kako bi se ispunili zahtjevi u pogledu dovoljno niskog radnog područja uključujući značajne vrijednosti.

4.9   Posebni postupci za pripremu uzorka koji se koriste za predmetne proizvode, moraju biti u skladu s međunarodno prihvaćenim smjernicama.

5.   Zahtjevi za laboratorije

5.1   U skladu s odredbama Uredbe (EZ) br. 882/204, laboratorije akreditira priznato tijelo za akreditaciju koje djeluje u skladu sa smjernicama ISO Guide 58, kako bi se osiguralo da primjenjuju mjere osiguranja kvalitete analize. Laboratoriji se akreditiraju u skladu s normom EN ISO/IEC 17025.

5.2   Kvaliteta rada laboratorija dokazuje se stalnim uspješnim sudjelovanjem u međulaboratorijskim studijama za određivanje PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a u relevantnim matricama hrane za životinje i rasponima koncentracije.

5.3   Laboratoriji koji primjenjuju orijentacijske metode za rutinsku kontrolu uzoraka moraju uspostaviti blisku suradnju s laboratorijima koji primjenjuju potvrdnu metodu, kako za kontrolu kvalitete, tako i za potvrđivanje rezultata analize sumnjivih uzoraka.

6.   Osnovni zahtjevi za analitičke postupke za dioksine (PCDD/PCDF-e) i dioksinu slične PCB-e

6.1   Nisko radno područje i granice kvantifikacije

Za PCDD/PCDF-e, količine koje se mogu otkriti moraju biti u gornjem femtogramskom području (10–15 g) zbog visoke toksičnosti nekih od navedenih spojeva. Za većinu kongenera PCB-a dovoljna je granica kvantifikacije u području nanograma (10–9 g). Za mjerenje toksičnijih kongenera dioksinu sličnih PCB-a (posebno ne-orto supstituiranih kongenera) donji dio radnog područja treba doseći donje pikogramske razine (10–12 g). Za sve druge kongenere PCB-a, dovoljna je razina kvantifikacije u nanogramskom rasponu (10–9 g).

6.2   Visoka selektivnost (specifičnost)

6.2.1   Potrebno je razlikovati između PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a i mnogobrojnih drugih, istodobno ekstrahiranih i vjerojatno interferentnih spojeva, prisutnih u koncentracijama koje su nekoliko redova veličine veće od koncentracija predmetnih analita. Kod GC/MS metoda nužno je razlikovati između različitih kongenera, na primjer između toksičnih (npr. sedamnaest 2,3,7,8-supstituiranih PCDD-a/PCDF-a i dvanaest dioksinu sličnih PCB-a) i drugih kongenera.

6.2.2   Bioanalitičke metode moraju omogućiti otkrivanje ciljnih spojeva kao zbroj PCDD/PCDF-a i/ili dioksinu sličnih PCB-a. Cilj pročišćavanja uzorka je da se odstrane spojevi koji uzrokuju lažne pozitivne rezultate ili spojevi koji mogu smanjiti odgovor i tako uzrokovati lažne negativne rezultate.

6.3   Visoka točnost (istinitost i preciznost, očigledno iskorištenje bioanalize)

6.3.1   Kod GC/MS metoda, postupak određivanja mora dati valjanu procjenu prave koncentracije u uzorku. Potrebna je visoka točnost kako bi se spriječilo odbacivanje rezultata analize uzorka na temelju slabe pouzdanosti procjene TEQ-a. Točnost se iskazuje kao istinitost (razlika između srednje vrijednosti koja je izmjerena za analit u certificiranom materijalu i njegove certificirane vrijednosti, iskazano kao postotak te vrijednosti) i preciznost (RSDR, relativna standardna devijacija izračunata iz rezultata dobivenih pod uvjetima obnovljivosti).

6.3.2   Kod bioanalitičkih metoda utvrđuje se očigledno iskorištenje bioanalize. Očigledno iskorištenje bioanalize znači razina BEQ-a izračunata iz kalibracijske krivulje TCDD-a ili PCB-a 126, korigirana za slijepe vrijednosti i zatim podijeljena s vrijednosti TEQ-a, koja je određena pomoću GC/HRMS-a. Njegova je namjena ispravljanje faktora poput gubitka PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih spojeva tijekom postupka ekstrakcije i pročišćavanja, povećavanje ili smanjivanje odgovora koekstrahiranih spojeva (agonistički i antagonistički učinci), kvaliteta prilagođavanja krivulje, ili razlike između vrijednosti faktora ekvivalenta toksičnosti (TEF) i relativne potencije (REP). Očigledno iskorištenje bioanalize izračunava se iz odgovarajućih referentnih uzoraka, koji imaju reprezentativnu raspodjelu kongenera u blizini predmetne razine.

6.4   Validacija u rasponu predmetne količine i opće mjere za kontrolu kvalitete

6.4.1   Laboratoriji trebaju prikazati učinkovitost metode u području značajne vrijednosti, npr. na razini jednakoj 0,5 ×, 1 × i 2 × s prihvatljivim koeficijentom varijacije za ponovljenu analizu, tijekom postupka validacije i tijekom rutinske analize.

6.4.2   Redovite slijepe kontrole i eksperimenti s dodanim standardom ili analize kontrolnih uzoraka (po mogućnosti, dobro je da to bude certificirani referentni materijal), izvode se kao unutarnje mjere kontrole kvalitete. Za slijepe kontrole, eksperimente s dodanim standardom ili analize kontrolnih uzoraka, vode se i provjeravaju dijagrami kontrole kvalitete kako bi se osiguralo da učinkovitost analize bude u skladu sa zahtjevima.

6.5   Granica kvantifikacije

6.5.1   Za bioanalitičku orijentacijsku metodu utvrđivanje granice kvantifikacije (LOQ) nije neophodan zahtjev, ali se mora dokazati da se metodom može razlikovati između slijepih i graničnih vrijednosti. Pri određivanju razine BEQ-a, određuje se razina izvješćivanja za uzorke koji pokazuju odgovor ispod ove razine. Potrebno je dokazati da se razina izvješćivanja razlikuje od slijepih uzoraka u postupku, najmanje za faktor 3, s odgovorom ispod radnog područja. Stoga se ona izračunava iz uzoraka koji sadrže predmetne spojeve oko zahtijevane minimalne razine, a ne iz omjera S/N ili iz slijepog testa.

6.5.2   LOQ za potvrdnu metodu mora biti oko jedne petine predmetne količine.

6.6   Kriteriji analize

Za pouzdane rezultate potvrdnih ili orijentacijskih metoda, moraju biti ispunjeni sljedeći kriteriji za vrijednost TEQ-a ili BEQ-a, bez obzira da li je utvrđen kao ukupni TEQ (kao zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a) ili zasebni za PCDD/PCDF-e i za dioksinu slične PCB-e:

	Bioanalitičke ili fizikalno-kemijske orijentacijske metode	Potvrdne metode
Udio lažno negativnih rezultata (10)	< 5 %
Istinitost		– 20 % do + 20 %
Ponovljivost (RSDr)	< 20 %
Unutarlaboratorijska obnovljivost (RSDR)	< 25 %	< 15 %

6.7   Posebni zahtjevi za orijentacijske metode

6.7.1   Za orijentaciju se mogu upotrebljavati GC/MS metode i bioanalitičke metode. Za GC/MS metode moraju biti ispunjeni zahtjevi utvrđeni u točki 7. Za stanične biotestove, utvrđeni su posebni zahtjevi u točki 8.

6.7.2   Laboratoriji koji primjenjuju orijentacijske metode za rutinsku kontrolu uzoraka, moraju uspostaviti blisku suradnju s laboratorijima koji primjenjuju potvrdnu metodu.

6.7.3   Tijekom rutinske analize potrebno je provjeravanje učinkovitosti orijentacijske metode, pomoću kontrole kvalitete analize i validacijske metode koja je u upotrebi. Mora postojati trajni program za kontrolu negativnih rezultata.

6.7.4   Provjera moguće supresije staničnog odgovora i citotoksičnosti:

Za provjeru da li je došlo do moguće supresije odgovora radi ometajućih tvari u ekstraktu uzorka, mjeri se 20 % ekstrakata uzoraka u rutinskom probiru bez dodanog i s dodanim 2,3,7,8-TCDD-om koji odgovara značajnoj vrijednosti. Izmjerena koncentracija u uzorku s dodanim standardom uspoređuje se sa zbrojem koncentracije ekstrakta bez dodanog standarda i koncentracije s dodanim standardom. Ako je ova izmjerena koncentracija za više od 25 % niža od izračunate koncentracije (zbroja), to je pokazatelj moguće supresije signala te se dotični uzorak podvrgava potvrdnoj analizi primjenom GC/HRMS-a. Rezultati se prate na dijagramima kontrole kvalitete.

6.7.5   Kontrola kvalitete koja se provodi na negativnim uzorcima

Približno 2 do 10 % sukladnih uzoraka, ovisno o matrici uzorka i iskustvu laboratorija, potvrđuje se primjenom GC/HRMS-a.

6.7.6   Utvrđivanje udjela lažno negativnih rezultata kontrole kvalitete:

Utvrđuje se udio lažno negativnih rezultata iz probirnih uzoraka koji su iznad i ispod najveće dopuštene količine ili praga za poduzimanje mjera. Stvarni udio lažno negativnih rezultata mora biti ispod 5 %. Kada je u negativnim uzorcima obuhvaćenim kontrolom kvalitete najmanje 20 potvrđenih rezultata po matrici/grupi matrica, zaključci o udjelu lažno negativnih rezultata izvode se iz ove baze podataka. Rezultati iz uzoraka analiziranih u međulaboratorijskim ispitivanjima ili tijekom incidenata onečišćenja, koji obuhvaćaju raspon koncentracija do, na primjer, 2 × najveća dopuštena količina (ML), mogu se također uključiti u minimum od 20 rezultata za procjenu udjela lažno negativnih rezultata. Uzorci moraju obuhvaćati najčešću raspodjelu kongenera, koja predstavlja različite izvore.

Iako orijentacijske analize prvenstveno teže otkrivanju uzoraka koji premašuju prag za poduzimanje mjera, kriterij za utvrđivanje udjela lažno negativnih rezultata je najveća dopuštena količina, uzimajući u obzir mjernu nesigurnost potvrdne metode.

6.7.7   Uzorci iz provedenih orijentacijskih metoda za koje su sumnja da su nesukladni, uvijek se provjeravaju potvrdnom analitičkom metodom (GC/HRMS). Ti se uzorci također mogu upotrijebiti za procjenu udjela lažno pozitivnih rezultata. Za orijentacijske metode, stopa lažno pozitivnih rezultata je dio rezultata za koje je potvrdnom analizom primjenom GC/HRMS-a potvrđeno da su negativni, dok je u prethodnoj orijentacijskoj metodi za taj uzorak izjavljena sumnja da je nesukladan. Ocjena korisnosti orijentacijske metode temelji se na usporedbi lažno pozitivnih uzoraka s ukupnim brojem pregledanih uzoraka. Ovaj udio mora biti dovoljno malen, da bi orijentacijska metoda bila korisna.

6.7.8   Bioanalitičke metode, najmanje u uvjetima validacije, trebaju dati valjanu indikaciju razine TEQ-a, izračunate i izražene kao BEQ.

Također, za bioanalitičke metode izvedene u uvjetima ponovljivosti, interni laboratorijski RSDr bi trebao uobičajeno biti manji od obnovljivosti RSDR.

7.   Posebni zahtjevi koje moraju ispunjavati GC/MS metode koje se koriste za svrhe orijentacije ili potvrđivanja

7.1   Opći zahtjevi

Razlika između količine na gornjoj granici i količine na donjoj granici ne smije biti veća od 20 % za hranu za životinje s onečišćenjem od oko 1 ng WHO-TEQ/kg proizvoda s udjelom vlage od 12 % (na temelju zbroja PCDD/F-a i dioksinu sličnih PCB-a). Za niže razine onečišćenja, na primjer 0,5 ng WHO-TEQ/kg proizvoda, razlika između količine na gornjoj granici i količine na donjoj granici može biti u rasponu od 25 % do 40 %.

7.2   Kontrola iskorištenja

7.2.1   Dodavanje 13C-obilježenog izotopa 2,3,7,8-klor supstituiranih unutarnjih standarda PCDD/PCDF-a i 13C-obilježenog izotopa unutarnjih standarda dioksinu sličnih PCB-a, izvodi se na samom početku analitičke metode, npr. prije ekstrakcije za validaciju analitičkog postupka. Dodaje se najmanje po jedan kongener za svaku tetra do okta-kloriranu homolognu skupinu za PCDD/PCDF-e i najmanje po jedan kongener za svaku od homolognih skupina za dioksinu slične PCB-e (ili alternativno, najmanje po jedan kongener za svaki izabrani ion u spektrometriji masa s funkcijom evidentiranja, koji se koristi za praćenje PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a). U slučaju potvrdnih metoda, upotrebljava se svih 17 13C-obilježenih izotopa 2,3,7,8-klor supstituiranih unutarnjih standarda PCDD/PCDF-a i svih 12 13C- obilježenih izotopa unutarnjih standarda dioksinu sličnih PCB-a.

7.2.2   Relativne faktore odgovora treba utvrditi i za one kongenere za koje se ne dodaje analog obilježen izotopom 13C, upotrebom odgovarajućih kalibracijskih otopina.

7.2.2   Relativne faktore odgovora treba utvrditi i za one kongenere za koje se ne dodaje analog obilježen izotopom 13C, upotrebom odgovarajućih kalibracijskih otopina.

7.2.3   Za hranu za životinje biljnog podrijetla i životinjskoga podrijetla koja sadrži manje od 10 % masti, interni se standardi obvezno dodaju prije ekstrakcije. Za hranu za životinje životinjskoga podrijetla koja sadrži više od 10 % masti, unutarnji se standardi mogu dodati prije ili poslije ekstrakcije masti. Izvodi se odgovarajuća validacija učinkovitosti ekstrakcije, ovisno o fazi u kojoj se dodaju unutarnji standardi te o tome iskazuju li se rezultati s obzirom na udio masti u uzorku ili s obzirom na cijeli uzorak.

7.2.4   Prije analize GC/MS dodaje se 1 ili 2 (surogat) standarda radi provjere iskorištenja.

7.2.5   Zahtijeva se kontrola iskorištenja. Za potvrdne metode iskorištenje pojedinačnih internih standarda mora biti u rasponu od 60 % do 120 %. Prihvatljivo je manje ili veće iskorištenje za pojedinačne kongenere, posebno za neke hepta- i okta-klorirane dibenzo-p-dioksine i dibenzofurane, pod uvjetom da njihov doprinos vrijednosti TEQ-a nije veći od 10 % od ukupne vrijednosti TEQ-a (dobivene na temelju zbroja PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a). Za orijentacijske metode iskorištenje mora biti u rasponu od 30 % do 140 %.

7.3   Odstranjivanje ometajućih tvari

—	Razdvajanje PCDD/PCDF-a od ometajućih kloriranih spojeva, poput PCB-a koji nisu slični dioksinu i kloriranih difenil etera, izvodi se odgovarajućim kromatografskim tehnikama (najbolje pomoću kolone s florisilom, aluminijevim oksidom i/ili aktivnim ugljenom).

—	Razdvajanje izomera plinskom kromatografijom mora biti < 25 % od pika do pika između 1,2,3,4,7,8-HxCDF i 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

7.4   Kalibriranje standardnom krivuljom

Raspon kalibracijske krivulje pokriva relevantni raspon značajne vrijednosti.

8.   Posebni zahtjevi za bioanalitičke metode

Bioanalitičke metode su metode koje se temelje na biološkim načelima poput staničnih biotestova, receptorskih testova ili imunotestova. U ovoj točki 8. utvrđuju se opći zahtjevi za bioanalitičke metode.

Orijentacijskom metodom u načelu se uzorak klasificira kao negativan ili kao uzorak za koji se sumnja da je pozitivan. U tu svrhu, izračunata razina BEQ-a se uspoređuje s graničnom vrijednošću (vidjeti točku 8.3.). Uzorci ispod granične vrijednosti proglašavaju se negativnima, a za uzorke jednake graničnoj vrijednosti ili veće od granične vrijednosti postoji sumnja da su pozitivni te se za njih zahtijeva analiza potvrdnom metodom. U praksi, razina BEQ-a koja odgovara 2/3 najveće dopuštene količine, može poslužiti kao najprimjerenija granična vrijednost kojom se osigurava udio lažno negativnih rezultata manji od 5 % i prihvatljivi udio lažno pozitivnih rezultata. S posebnim najvećim dopuštenim količinama za PCDD/F-e i za zbroj PCDD/F-a i dioksinu sličnih PCB-a, provjera jesu li uzorci negativni bez frakcioniranja zahtijeva odgovarajuće granične vrijednosti bioanalize za PCDD/F-e. Za provjeru uzoraka koji premašuju prag za poduzimanje mjera, kao granična vrijednost može se upotrijebiti primjereni postotak odgovarajuće značajne vrijednosti.

Osim toga, kod nekih bioanalitičkih metoda, za uzorke u radnom području koji premašuju granicu za obavješćivanje, može se dati okvirna količina izražena u BEQ-ima (vidjeti točke 8.1.1 i 8.1.6).

8.1   Ocjena odgovora testa

8.1.1   Opći zahtjevi

—

Kod izračunavanja koncentracija iz kalibracijske krivulje TCDD-a, vrijednosti na donjem i gornjem kraju krivulje pokazuju visoku varijaciju (visoki koeficijent varijacije (CV)). Radno područje je područje u kojem je CV manji od 15 %. Donji kraj radnog područja (granica za izvješćivanje) postavlja se najmanje primjenom faktora 3 iznad postupka sa slijepim uzorcima. Gornji kraj radnog područja je obično predstavljen vrijednošću EC70 (70 % najveće učinkovite koncentracije), ali je ta vrijednost niža ako je CV u tom rasponu veći od 15 %. Radno područje se određuje tijekom validacije. Granične vrijednosti (vidjeti točku 8.3.) moraju biti unutar radnog područja.

—	Standardne otopine i ekstrakti uzorka ispituju se najmanje u duplikatu. Kada se koriste duplikati, standardna otopina ili kontrolni ekstrakt koji se ispituju u 4 do 6 udubina raspoređenih na ploči, pokazuju odgovor ili koncentraciju (što je moguće samo u radnom području) na temelju CV < 15 %.

8.1.2   Kalibracija

8.1.2.1    Kalibracija sa standardnom krivuljom

—	Razine u uzorku procjenjuju se uspoređivanjem odgovora testa s kalibracijskom krivuljom TCDD-a (ili PCB-a 126 ili standardne mješavine dioksinu sličnog PCDD/PCDF/PCB-a), za izračun razine BEQ-a u ekstraktu i kasnije u uzorku.

—

Kalibracijske krivulje sadrže 8 do 12 koncentracija (najmanje u duplikatu), s dovoljno koncentracija u donjem dijelu krivulje (radno područje). Posebnu pažnju treba obratiti na kvalitetu prilagodbe krivulje u radnom području. Kao takva, vrijednost R2 je od male ili nikakve koristi pri izračunu kvalitete prilagodbe u nelinearnoj regresiji. Bolja prilagodba se postiže minimiziranjem razlike između izračunatih i zapaženih razina u radnom području krivulje, na primjer, minimiziranjem zbroja kvadrata ostataka.

—

Procijenjena razina u ekstraktu uzorka kasnije se ispravlja za razinu BEQ-a izračunatu za slijepi uzorak matrice/otapala (kako bi se uzele u obzir nečistoće iz upotrijebljenih otapala i kemikalija) i za očigledno iskorištenje (izračunato iz razine BEQ-a odgovarajućih referentnih uzoraka s reprezentativnim raspodjelama kongenera u blizini predmetne razine). Za korekciju za iskorištenja, očigledno iskorištenje mora biti unutar zahtijevanog raspona (vidjeti točku 8.1.4). Referentni uzorci koji se upotrebljavaju za korekciju za iskorištenje moraju biti u skladu sa zahtjevima utvrđenim u točki 8.2.

8.1.2.2    Kalibracija s referentnim uzorcima

Alternativno se može upotrijebiti kalibracijska krivulja pripremljena od najmanje četiri referentna uzorka oko značajne vrijednosti (vidjeti točku 8.2.4.: jedna slijepa matrica plus tri referentna uzorka na značajnu vrijednost × 0,5, × 1,0 i × 2,0), čime se uklanja potreba za korekcijom za slijepe vrijednosti i iskorištenje. U ovom se slučaju odgovor testa koji odgovara 2/3 najveće dopuštene količine (vidjeti točku 8.3.), može izračunati izravno iz ovih uzoraka i upotrijebiti kao granična vrijednost. Za provjeru uzoraka koji prelaze pragove za poduzimanje mjera, kao granična vrijednost može biti prikladan odgovarajući postotak tih pragova za poduzimanje mjera.

8.1.3   Posebno određivanje PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a

Ekstrakti se mogu podijeliti na frakcije koje sadrže PCDD/PCDF-e i dioksinu slične PCB-e, omogućavajući tako razdvojenu indikaciju razina TEQ-a (u BEQ-ima) za PCDD/PCDF-e i za dioksinu sličan PCB. Daje se prednost upotrebi standardne kalibracijske krivulje PCB 126 za procjenu rezultata za frakciju koja sadrži dioksinu slične PCB-e.

8.1.4   Očigledna iskorištenja bioanalize

‚Očigledno iskorištenje bioanalize’ izračunava se iz prikladnih referentnih uzoraka s reprezentativnim raspodjelama kongenera u blizini značajne vrijednosti i izražava se kao postotak razine BEQ-a u usporedbi s razinom TEQ-a. Ovisno o vrsti analize i TEF-ovima (11) koji su upotrijebljeni, razlike između faktora TEF-a i REP-a za dioksinu slične PCB-e mogu uzrokovati niska očigledna iskorištenja za dioksinu slične PCB-e u usporedbi s PCDD/PCDF-ima. Stoga, ako se izvodi posebno određivanje PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a, očigledna iskorištenja bioanalize su: za dioksinu slične PCB-e 25 % do 60 %, za PCDD/PCDF-e 50 % do 130 % (raspon se odnosi na kalibracijsku krivulju TCDD-a). Budući da se doprinos dioksinu sličnih PCB-a zbroju PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a može razlikovati pri različitim matricama i uzorcima, očigledna iskorištenja bioanalize za zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a odražavaju ove raspone i iznose između 30 % i 130 %. Bilo koja implikacija bitno revidiranih vrijednosti TEF-a na zakonodavstvo Unije za PCDD/PCDF-e i dioksinu slične PCB-e zahtijeva reviziju ovih raspona.

8.1.5   Kontrola iskorištenja pri pročišćavanju

Gubitak spojeva tijekom pročišćavanju provjerava se tijekom validacije. Slijepi uzorak s dodanom mješavinom različitih kongenera podvrgava se pročišćavanju (najmanje n = 3) te se pomoću GC/HRMS analiza provjeravaju iskorištenje i varijabilnost. Iskorištenje mora biti između 60 % i 120 %, posebno za kongenere koji doprinose više od 10 % razini TEQ-a u različitim mješavinama.

8.1.6   Granica za izvješćivanje

Što se tiče izvješćivanja o razinama BEQ-a, granica za izvješćivanje određuje se iz relevantnih uzoraka matrice koji uključuju uobičajene raspodjele kongenera, a ne iz kalibracijske krivulje standarda, radi niske preciznosti u donjem rasponu krivulje. Treba uzeti u obzir učinke ekstrakcije i pročišćavanja. Granica za izvješćivanje postavlja se najmanje za faktor 3 iznad postupaka sa slijepim uzorcima.

8.2   Upotreba referentnih uzoraka

8.2.1   Referentni uzorci predstavljaju matricu uzorka, raspodjele kongenera i raspone koncentracija za PCDD/PCDF-e i dioksinu slične PCB-e u blizini značajne vrijednosti.

8.2.2   U svaku seriju testova uključuje se slijepa matrica, a kada to nije moguće, slijepi postupak i referentni uzorak značajne vrijednosti. Ti se uzorci ekstrahiraju i testiraju u isto vrijeme pod identični uvjetima. Referentni uzorak mora pokazivati jasno povišeni odgovor u usporedbi sa slijepim uzorkom, čime se osigurava primjerenost testa. Ovi se uzorci mogu upotrijebiti za korekcije za slijepe vrijednosti i za iskorištenje.

8.2.3   Referentni uzorci odabrani za korekciju za iskorištenje moraju biti reprezentativni za testne uzorke, što znači da raspodjela kongenera ne može dovesti do preniske procjene razina.

8.2.4   Mogu se uključiti dodatni referentni uzorci na, na primjer, značajne vrijednosti.× 0,5 i × 2, kako bi se pokazala primjerena učinkovitost testa u ciljnom rasponu za kontrolu značajne vrijednosti. Ti se uzorci zajedno mogu upotrijebiti za izračun razina BEQ-a u testnim uzorcima (vidjeti točku 8.1.2.2.).

8.3   Određivanje graničnih vrijednosti

Utvrđuje se odnos između bioanalitičkih rezultata u BEQ-ovima i rezultata GC/HRMS-a u TEQ-ovima, na primjer, pomoću pokusa s matrično usklađenom kalibracijom koja uključuje referentne uzorke s dodanim standardom na najvećim dopuštenim količinama 0, × 05, × 1 i × 2, sa 6 ponavljanja na svakoj razini (n = 24). Iz ovog se odnosa mogu procijeniti faktori korekcije (za slijepu vrijednost i za iskorištenje), ali se moraju provjeriti u skladu s točkom 8.2.2.

Uspostavljaju se granične vrijednosti za odluke jesu li uzorci negativni s najvećim dopuštenim količinama ili za kontrolu pragova za poduzimanje mjera, ako je to relevantno, s odgovarajućim značajnim vrijednostima postavljenim za PCDD/PCDF-e i za dioksinu slične PCB-e pojedinačno, ili za zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a. Prikazuju se točkom na donjem kraju distribucije bioanalitičkih rezultata (ispravljenih za slijepe vrijednosti i iskorištenje) koja odgovara graničnoj količini analita GC/HRMS-a na temelju razine pouzdanosti 95 %, što znači da je stopa lažno negativnih rezultata < 5 % i na temelju RSDR < 25 %. Granična količina analita GC/HRMS-a je najveća dopuštena količina, uzimajući u obzir mjernu nesigurnost.

Granična vrijednost (u BEQ-ovima) može se izračunati u skladu s jednim od pristupa navedenih u točkama 8.3.1, 8.3.2. i 8.3.3. (vidjeti sliku 1.):

8.3.1   Upotreba donjeg pojasa 95-postotnog prognostičkog intervala pri graničnoj količini analita GC/HRMS-a:

pri čemu je:

BEQDL	BEQ koji odgovara graničnoj količini analita GC/HRMS-a, što je najveća dopuštena količina uključujući mjernu nesigurnost
Sy,x	standardna devijacija rezidue
t α,f = m–2	Studentov faktor (α = 5 %, f = stupnjevi slobode, jednostrani)
m	ukupan broj kalibracijskih točaka (indeks j)
n	broj ponavljanja na svakoj razini
xi	koncentracija uzorka GC/HRMS-a (u TEQ-ovima) kalibracijske točke i
	srednja vrijednost koncentracija (u TEQ-ovima) svih kalibracijskih uzoraka
Q	parametar zbroja kvadrata, i = indeks za kalibracijsku točku i

parametrul sumei la pătrat, i = indice pentru punctul de calibrare i

8.3.2.   Izračun iz bioanalitičkih rezultata (ispravljenih za slijepe vrijednosti i iskorištenje) iz višekratnih analiza uzoraka (n ≥ 6) onečišćenih na graničnoj količini analita GC/HRMS-a, kao donja krajnja točka distribucije pri odgovarajućoj srednjoj vrijednosti BEQ-a:

pri čemu je:

SDR	standardna devijacija rezultata biotesta pri BEQDL, izmjerenih u uvjetima unutarlaboratorijske obnovljivosti

8.3.3   Izračun kao srednja vrijednost bioanalitičkih rezultata (u BEQ-ima, ispravljenih za slijepe vrijednosti i iskorištenje) iz višekratnih analiza uzoraka (n ≥ 6) onečišćenih na 2/3 značajne vrijednosti, na temelju zapažanja da će ta razina biti oko granične vrijednosti utvrđene u skladu s točkom 8.3.1. ili 8.3.2.:

Slika 1.

Izračun graničnih vrijednosti na temelju razine pouzdanosti 95 %, što znači da je stopa lažno negativnih rezultata < 5 % i na temelju RSDR < 25 %: 1. iz donjeg pojasa 95-postotnog prognostičkog intervala pri graničnoj količini analita HRGC/HRMS-a; 2. iz višekratnih analiza uzoraka (n ≥ 6) onečišćenih na graničnoj količini analita HRGC/HRMS-a, kao donja krajnja točka distribucije podataka (koji su na slici prikazani krivuljom u obliku zvona) pri odgovarajućoj srednjoj vrijednosti BEQ-a.

8.3.4   Ograničenja u pogledu graničnih vrijednosti:

Granične vrijednosti temeljene na BEQ-u, izračunate iz RSDR, postignutog tijekom validacije upotrebom ograničenog broja uzoraka s različitim shemama matrice/kongenera, mogu biti više od značajne vrijednosti temeljenih na TEQ-u radi bolje preciznosti od one koja se može doseći u postupku kada treba kontrolirati nepoznati spektar mogućih raspodjela kongenera. U takvim slučajevima, granične se vrijednosti izračunavaju iz RSDR = 25 % ili se preferira dvije trećine značajne vrijednosti.

8.4   Karakteristike učinkovitosti

8.4.1   Za dobivanje informacija o standardnoj devijaciji unutar i između serija testova, izvode se testovi ponovljivosti bioanalitičkih metoda. Ponovljivost mora biti ispod 20 %, a unutarlaboratorijska obnovljivost ispod 25 %. To se temelji na izračunatim razinama u BEQ-ovima nakon korekcije za slijepe vrijednosti i za iskorištenje.

8.4.2   Kao dio procesa validacije, dokazuje se da test razlikuje između slijepog uzorka i razine na graničnoj vrijednosti, čime se omogućava identifikacija uzoraka koji su iznad odgovarajuće granične vrijednosti (vidjeti točku 8.1.2.).

8.4.3   Definiraju se ciljni spojevi, moguća ometanja i maksimalne prihvatljive slijepe vrijednosti.

8.4.4   Postotna standardna devijacija u odgovoru ili koncentraciji izračunatoj iz odgovora (moguće samo u radnom području) pri trostrukom određivanju ekstrakta uzorka ne smije biti veća od 15 %.

8.4.5   Za ocjenu učinkovitosti bioanalitičke metode, upotrebljavaju se nekorigirani rezultati referentnog uzorka (referentnih uzoraka) izraženi u BEQ-ovima (slijepa vrijednost i ciljna količina) u stalnom vremenskom razdoblju.

8.4.6   Izrađuju se i provjeravaju dijagrami kontrole kvalitete za postupke sa slijepim uzorcima i za svaku vrstu referentnog uzorka, kako bi se osiguralo da je performansa analize u skladu sa zahtjevima, posebno, za postupke sa slijepim uzorcima, u odnosu na zahtijevanu minimalnu razliku prema donjem dijelu radnog područja, a za referentne uzorke, u odnosu na unutarlaboratorijsku obnovljivost. Postupci sa slijepim uzorcima kontroliraju se na takav način da se mogu izbjeći lažno negativni rezultati pri oduzimanju.

8.4.7   Rezultati GC/HRMS analiza sumnjivih uzoraka i 2 do 10 % negativnih uzoraka (najmanje 20 uzoraka po matrici), prikupljaju se i upotrebljavaju za ocjenu učinkovitosti orijentacijske metode i odnosa između BEQ-a i TEQ-a. Ova se baza podataka može koristiti za ponovnu ocjenu graničnih vrijednosti koje se primjenjuju na rutinske uzorke za validacija matrica.

8.4.8   Učinkovitost metode može se također dokazati sudjelovanjem u međulaboratorijskim ispitivanjima. Rezultati iz uzoraka analiziranih u međulaboratorijskim ispitivanjima, koji obuhvaćaju raspon koncentracija do, na primjer, × 2 najveća dopuštena količina, mogu se uključiti u procjenu stope lažno pozitivnih rezultata, ako laboratorij može dokazati svoju učinkovitost. Uzorci obuhvaćaju najučestalije raspodjele kongenera, koji predstavljaju različite izvore.

8.4.9   Tijekom incidenata, granične se vrijednosti mogu ponovno ocijeniti, kako bi se uvažile specifične sheme matrice i kongenera pojedinačnog incidenta.

9.   Izvješćivanje o rezultatima

9.1   Potvrdne metode

9.1.1   Ako upotrijebljeni analitički postupak to omogućuje, analitički rezultati obuhvaćaju količine pojedinačnih kongenera PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a, za koje treba navesti jesu li na donjoj granici, na gornjoj granici ili na srednjoj granici, kako bi se u izvješće o rezultatima uključila maksimalna količina podataka i time omogućilo tumačenje rezultata u skladu s posebnim zahtjevima.

9.1.2   Izvješće uključuje metodu upotrijebljenu za ekstrakciju PCDD/PCDF-a, dioksinu sličnih PCB-a i lipida.

9.1.3   Iskorištenja pojedinačnih unutarnjih standarda navode se u izvješću, ako su iskorištenja izvan raspona navedenog u točki 7.2.5, ako je premašena najveća dopuštena količina i u drugim slučajevima na zahtjev.

9.1.4   Kako pri odluci o negativnosti uzorka treba uzeti u obzir mjernu nesigurnost, ovaj se parametar također navodi u izvješću. Stoga se rezultati analize prikazuju kao x +/- U, gdje je x rezultat analize, a U je proširena mjerna nesigurnost uz faktor obuhvata 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od oko 95 %. U slučaju posebnog određivanja PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a, zbroj procijenjene proširene nesigurnosti pojedinačnih rezultata analize PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a, upotrebljava se za zbroj PCDD/PCDF-a i dioksinu sličnih PCB-a.

9.1.5   Ako se mjerna nesigurnost uzima u obzir primjenom CCα (kako je opisano u točki 2.2) tada se navodi i taj parametar.

9.1.6   Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i najmanje s istim brojem značajnih znamenki kao i najveće dopuštene količine utvrđene u Direktivi 2002/32/EZ.

9.2   Bioanalitičke orijentacijske metode

9.2.1   Rezultat orijentacije izražava se kao ‚negativan’ ili ‚postoji sumnja na pozitivnost’ (‚sumnjiv’).

9.2.2.   Osim toga, može se dati rezultat za PCDD/PCDF i/ili dioksinu slične PCB-e, izražen u BEQ-u, a ne u TEQ-u.

9.2.3   Ako se navodi mjerna nesigurnost za izračunatu razinu BEQ-a, na primjer kao standardna devijacija, ona se mora temeljiti na najmanje trostrukoj analizi uzorka, uključujući ekstrakciju, pročišćavanje i utvrđivanje odgovora testa.

9.2.4   Za uzorke s odgovorom ispod granice za izvješćivanje, navodi se ‚ispod granice za izvješćivanje’.

9.2.5   Za svaku vrstu matrice uzorka, u izvješću se navodi ciljna razina na kojoj se temelji ocjena.

9.2.6   U izvješću se navodi vrsta primijenjenog testa, osnovno načelo testa i vrsta kalibracije.

9.2.7   Izvješće uključuje metodu upotrijebljenu za ekstrakciju PCDD/PCDF-a, dioksinu sličnih PCB-a i lipida.

POGLAVLJE III.

Priprema uzorka i zahtjevi za analitičke metode koje se koriste za službenu kontrolu količine PCB-a koji nisu slični dioksinu (PCB # 28, 52, 101, 138, 153, 180)

1.   Primjenjive metode detekcije

Plinska kromatografija/elektron apsorpcijska detekcija (GC/ECD), GC/LRMS, GC/MS-MS, GC/HRMS ili jednakovrijedne metode.

2.   Identifikacija i potvrđivanje predmetnog analita

2.1   Relativno vrijeme retencije u odnosu na unutarnje standarde ili referentne standarde (prihvatljiva devijacija +/- 0,25 %).

2.2   Plinsko kromatografsko razdvajanje svih šest indikatorskih PCB-a (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 i PCB 180) od ometajućih tvari, posebno istodobno koeluiranih PCB-a, posebno ako količine uzorka nisu u rasponu zakonskih granica i treba potvrditi da je uzorak pozitivan.

Napomena:

Kongeneri za koje se često utvrđuje da koeluiraju su, na primjer, PCB 28/31, PCB 52/69 i PCB 138/163/164. Za GC/MS treba također uzeti u obzir ometanja koja proizvode fragmenti viših kloriranih kongenera.

2.3   Zahtjevi za GC/MS tehnike

Treba pratiti najmanje:

(a)	dva specifična iona za HRMS;

(b)	dva specifična iona za m/z > 200 ili tri specifična iona za m/z > 100, za LRMS;

(c)	1 ion prekursor i 2 iona produkata za MS-MS.

Najveće dozvoljeno odstupanje za omjere brojnosti za odabrane fragmente mase:

Relativna devijacija omjera brojnosti odabranih fragmenata mase u odnosu na teoretsku brojnost ili kalibracijski standard za ciljni ion (praćeni ion s najvećom brojnosti) i kvalifikacijski(-e) ion(-e):

Relativni intenzitet kvalifikacijskog(-ih) iona u usporedbi s ciljnim ionom	GC-EI-MS (relativna devijacija)	GC-CI-MS, GC-MSn (relativna devijacija)
> 50 %	± 10 %	± 20 %
> 20 % do 50 %	± 15 %	± 25 %
> 10 % do 20 %	± 20 %	± 30 %
≤ 10 %	± 50 % (12)	± 50 % (12)

2.4   Zahtjevi za GC/ECD tehnike

Rezultati koji prelaze dopušteno odstupanje potvrđuju se dvjema GC kolonama sa stacionarnim fazama različitog polariteta.

3.   Dokazivanje učinkovitosti metode

Učinkovitost metode se validira u rasponu značajne vrijednosti (0,5 do 2 puta značajna vrijednost) s primjenjivim koeficijentom varijacije za ponovljenu analizu (vidjeti zahtjeve za intermedijarnu preciznost u točki 8.).

4.   Granica kvantifikacije

Slijepe vrijednosti ne smiju biti veće od 30 % razine koncentracije koja odgovara najvišoj dopuštenoj količini (13).

5.   Kontrola kvalitete

Redovite slijepe kontrole, analiza uzoraka s dodanim standardom, uzorci za kontrolu kvalitete, sudjelovanje u međulaboratorijskim ispitivanjima na relevantnim matricama.

6.   Kontrola iskorištenja

6.1   Upotrebljavaju se odgovarajući unutarnji standardi s fizikalno-kemijskim osobinama primjerenim predmetnim analitima.

6.2   Dodavanje unutarnjih standarda:

Dodavanje proizvodima (prije procesa ekstrakcije i pročišćavanja).

6.3   Zahtjevi za metode u kojima se koristi svih šest izotopno označenih kongenera indikatorskih PCB-a:

(a)	rezultati se korigiraju za iskorištenja unutarnjih standarda;

(b)	iskorištenja izotopski označenih unutarnjih standarda su između 50 i 120 %;

(c)	prihvatljiva su niža ili viša iskorištenja za pojedinačne kongenere čiji je doprinos zbroju šest indikatorskih PCB-a manji od 10 %.

6.4   Zahtjevi za metode, pri kojima se ne upotrebljava svih šest obilježenih izotopa unutarnjih standarda ili pri kojima se upotrebljavaju drugi unutarnji standardi:

(a)	iskorištenje unutarnjeg(-ih) standarda kontrolira se za svaki uzorak;

(b)	iskorištenja unutarnjeg(-ih) standarda je između 60 i 120 %;

(c)	rezultati se korigiraju za iskorištenja unutarnjih standarda.

6.5   Iskorištenja neoznačenih kongenera provjeravaju se uzorcima s dodanim standardom ili uzorcima za kontrolu kvalitete s koncentracijama u rasponu značajne vrijednosti. Iskorištenja za ove kongenere smatraju se prihvatljivima, ako su između 70 i 120 %.

7.   Zahtjevi za laboratorije

U skladu s odredbama Uredbe (EZ) br. 882/2004, laboratorije akreditira akreditacijsko tijelo koje djeluje u skladu sa smjernicama ISO Guide 58, kako bi se osiguralo da primjenjuju mjere osiguranja kvalitete analize. Laboratoriji se akreditiraju u skladu sa standardom EN ISO/IEC 17025.

8.   Karakteristike učinkovitosti: kriteriji za zbroj šest indikatorskih PCB-a značajne vrijednosti

Istinitost	– 30 do + 30 %
Intermedijarna preciznost (RSD%)	≤ 20 %
Razlika između izračuna na gornjoj i na donjoj granici	≤ 20 %

9.   Izvješćivanje o rezultatima

9.1

Ako upotrijebljeni analitički postupak to omogućuje, rezultati analize obuhvaćaju količine pojedinačnih kongenera PCB-a, za koje treba navesti jesu li na donjoj granici, na gornjoj granici ili na srednjoj granici, kako bi se u izvješće o rezultatima uključila maksimalna količina podataka i time omogućilo tumačenje rezultata u skladu s posebnim zahtjevima.

9.2	Izvješće uključuje metodu upotrijebljenu za ekstrakciju PCB-a i lipida.

9.3	Iskorištenja pojedinačnih unutarnjih standarda navode se u izvješću, ako su iskorištenja izvan raspona navedenog u točki 6., ako je premašena najveća dopuštena količina i u drugim slučajevima na zahtjev.

9.4

Kako pri odluci o sukladnosti uzorka treba uzeti u obzir mjernu nesigurnost, ovaj se parametar također navodi u izvješću. Stoga se rezultati analize prikazuju kao x +/- U, gdje je x rezultat analize, a U je proširena mjerna nesigurnost uz faktor obuhvata 2, čime se dobiva razina pouzdanosti od oko 95 %.

9.5	Ako se mjerna nesigurnost uzima u obzir primjenom CCα (kako je opisano u točki 2.1. poglavlja I.), tada se navodi i taj parametar.

9.6	Rezultati se izražavaju u istim jedinicama i najmanje s istim brojem značajnih znamenki kao i najveće dopuštene količine utvrđene u Direktivi 2002/32/EZ.”