►B

DRUGA DIREKTIVA KOMISIJE

od 14. svibnja 1982.

o usklađivanju zakonodavstava država članica u odnosu na metode analize potrebne za provjeru sastava kozmetičkih proizvoda

(82/434/EEZ)

( L 185, 30.6.1982, p.1)

  No

page

date

►M1

Direktiva Komisije 90/207/EEZ od 4. travnja 1990.

  L 108

92

28.4.1990

2.1.

0,5 % (m/v) referentne vodene otopine sljedećih spojeva:

2.2.

Otapalo za razvijanje A, 80 % (v/v) etanol

2.3.

Otapalo za razvijanje B, benzen –metanol – 3metil butan-1-ol – voda (34: 38: 18: 10 po volumenu)

2.4.

Sredstvo za detekciju A, 10 % (m/v) vodena otopina kalijeva jodida

2.5.

Sredstvo za detekciju B, 1 % (m/v) vodena otopina škroba

2.6.

Sredstvo za detekciju C, 10 % (m/m) klorovodična kiselina

2.7.

4N klorovodična kiselina

3.1.

Kromatografski papir (Whatman papir br. 3 i br. 4 ili njihovi ekvivalenti)

3.2.

Mikropipeta, 1 μL

3.3.

Standardne tikvice, 100 ml

3.4.

Naborani filtrirni papiri

3.5.

Aparatura za silaznu papirnu kromatografiju

4.2.1.

Izvaže se 1 g i 5 g uzorka i dispergira u 50 mL vode, nadopuni se u oba slučaja do 100 ml vodom i u oba slučaja miješa. Kako bi se provela papirna kromatografija opisana u odjeljku 5., obje disperzije se profiltriraju preko naboranog filtrirnog papira (3.4.) te se uporabi 1 μL svakog od filtrata.

4.2.2.

Ponovno se pripreme dvije disperzije od svakog uzorka disperzijom 1 g i 5 g u 50 ml vode, zakiseli se razrijeđenom klorovodičnom kiselinom (2.7.), nadopuni vodom do 100 ml i miješa. Kako bi se provela papirna kromatografija opisana u odjeljku 5., disperzije se profiltriraju preko naboranog filtrirnog papira (3.4.) te se uporabi 1 μL svakog od filtrata.

5.1.

Kako bi se provela silazna papirna kromatografija, prikladna količina otapala A (2.2) i B (2.3) stavi se u dvije odvojene posude za kromatografiju. Posude za kromatografiju zasićuju se parama otapala najmanje 24 sata.

5.2.

Stavi se 1μL otopine jednog uzorka i jedne referentne otopine pripremljene u skladu s odjeljcima 4. i 2.1. na svaku početnu točku trake kromatografskog papira (Whatman br. 3 ili ekvivalent), duljine 40 cm i širine 20 cm (3.1.), ili drugog pogodnog formata te se otopina isparava na zraku.

5.3.

Kromatografska traka (5.2.) se stavi u kromatografsku posudu napunjenu otapalom za razvijanje A (5.1.) i razvija se dok fronta otapala ne dosegne 35 cm (oko 15 sati).

5.4.

Ponovi se postupak opisan u odjeljcima 5.2. i 5.3., rabeći kromatografski papir (Whatman br. 4 ili ekvivalent) (3.1.) i otapalo za razvijanje B. Razvija se dok fronta otapala ne dosegne 35 cm (oko pet sati).

5.5.

Nakon razvijanja kromatogrami se maknu i suše na zraku.

5.6.

Mrlje na kromatogramu prikažu se ako se uzastopno prska:

5.7.

U gore opisanim uvjetima koji se odnose na sredstva za razvijanje A (2.2.) i B (2.3.), Rf vrijednosti referentnih tvari (2.1.) su približno jednake kako slijedi:

2.1.

Metanol

2.2.

36 % (m/m) koncentrirana klorovodična kiselina

2.3.

6N klorovodična kiselina

2.4.

4N sumporna kiselina

2.5.

Dinatrijeva sol rodizonske kiseline

2.6.

Barijev klorid (BaCl2 × 2 H2O)

2.7.

Bezvodni natrijev karbonat

2.8.

1 % (m/v) vodena otopina barijeva klorida

2.9.

Otapalo za razvijanje koje se sastoji od metanola, koncentrirane klorovodične kiseline (koncentracija 36 %) i vode (80: 10: 10 po volumenu)

2.10.

Sredstvo za detekciju, 0,1 % (m/v) vodena otopina dinatrijeve soli rodizonske kiseline, pripravljena neposredno prije uporabe.

3.1.

Mikropipeta, 5μL

3.2.

Platinski lončići

3.3.

Standardne tikvice, 100 ml

3.4.

Kromatografski papir Schleicher i Schull 2043 b ili ekvivalent. Papir se očisti razvijanjem preko noći u posudi za silaznu kromatografiju (A.3.5.), koja sadrži otapalo za razvijanje (B.2.9.), te se zatim posuši.

3.5.

Naborani filtrirni papir

3.6.

Uobičajena aparatura za provođenje uzlazne papirne kromatografije

4.1.1.

Dispergira se 2 g proizvoda u 50 ml vode i podesi pH disperzije klorovodičnom kiselinom (B.2.3.) na oko 1.

4.1.2.

Disperzija se vodom prenese u standardnu tikvicu od 100 ml, tikvica nadopuni vodom do oznake i miješa se. Ta se disperzija uporabi za papirnu kromatografsku analizu opisanu u odjeljku 5., a za identifikaciju barija taloženjem sulfata.

4.2.1.

Dispergira se 2 g proizvoda u 100 ml vode i filtrira.

4.2.2.

Osušenom ostatku doda se sedam do 10 puta veća masa natrijeva karbonata (B.2.7.), miješa se te se smjesa otapa u platinskom lončiću (B.3.2.) pola sata.

4.2.3.

Ohladi se na sobnu temperaturu, taljevina se otopi u 50 ml vode i filtrira (B.3.5.).

4.2.4.

Ostatak od taljenja otopi se u klorovodičnoj kiselini (B.2.3.) i otopina nadopuni na 100 ml vodom. Ta otopina uporabi se za papirnu kromatografsku analizu opisanu u odjeljku 5., a za identifikaciju barija taloženjem sulfata.

5.1.

Stavi se prikladna količina otapala za razvijanje (B.2.9.) u posudu za uzlaznu kromatografiju i posuda zasićuje najmanje 15 sati.

5.2.

Na komad kromatografskog papira-predobrađenog kao što je opisano u odjeljku B.3.4.- na tri početne točke nanese se 5 μL svake od otopina pripremljenih u skladu s odjeljcima B.4.1.2. i B.4.2.4. i referentna otopina B.2.8.

5.3.

Uzorak i referentne točke osuše se na zraku. Razvija se kromatogram dok fronta otapala ne dosegne 30 cm.

5.4.

Kromatogram se makne iz posude i osuši na zraku.

5.5.

Mrlje se na kromatogramu prikažu ako se prska papir sredstvom za detekciju B.2.10. U prisustvu barija, na kromatogramu se pojave crvene mrlje s vrijednošću Rf oko 0,10.

3.1.

2N sumporna kiselina

3.2.

Kalijev jodid

3.3.

Amonijev molibdat

3.4.

0,1 N natrijev tiosulfat

3.5.

10 % (m/v) otopina kalijeva jodida, pripremljena neposredno prije uporabe

3.6.

20 % (m/v) otopina amonijeva molibdata

3.7.

1 % (m/v) otopina škroba

4.1.

Čaše, 100 ml

4.2.

Bireta, 50 ml

4.3.

Standardne tikvice, 250 ml

4.4.

Menzure, 25 i 100 ml

4.5.

Pipete s jednom oznakom, 10 ml

4.6.

Erlenmeyerove tikvice, 250 ml

5.1.

U čašu od 100 ml odvaže se 10 g (m grama) proizvoda, koji sadrži oko 0,6 g vodikova peroksida. Sadržaj se prenese s vodom u standardnu tikvicu od 250 ml, tikvica se nadopuni do oznake vodom i miješa.

5.2.

Otpipetira se 10 ml otopine uzorka (5.1.) u Erlenmeyer tikvicu od 250 ml (4.6.) i doda se uzastopno 100 ml 2N sumporne kiseline (3.1.), 20 ml otopine kalijeva jodida (3.5.) i tri kapi otopine amonijeva molibdata (3.6.).

5.3.

Nastali jod se odmah titrira otopinom 0,1N natrijev tiosulfata (3.4.) i neposredno prije točke završetka doda se nekoliko mililitara škroba kao indikatora (3.7.). Zapiše se utrošak 0,1 N natrijev tiosulfata (3.4.) u mililitrima (V).

5.4.

Na način opisan u odjeljcima 5.2. i 5.3. izvede se slijepa proba, tako da se zamijeni 10 mL uzorka s 10 ml vode. Zapiše se utrošak 0,1 N natrijev tiosulfata za slijepu probu (Vo ml).

m

=

količina analiziranog uzorka u gramima (5.1.),

Vo

=

utrošak 0,1 N otopine natrijeva tiosulfata u mililitrima za slijepu probu (5.4.),

V

=

utrošak 0,1 N otopine natrijeva tiosulfata u mililitrima za titraciju otopine uzorka (5.3.).

3.1.

Bezvodni etanol

3.2.

Aceton

3.3.

Etanol, 96 % v/v

3.4.

3.5.

L(+)-askorbinska kiselina

3.6.

Kloroform

3.7.

Cikloheksan

3.8.

Dušik, tehničke čistoće

3.9.

Toluen

3.10.

Benzen

3.11.

N-butanol

3.12.

Butan-2-ol

3.13.

Hipofosforna kiselina, 50 % otopina v/v

3.14.

Diazo reagens: ili

ili ekvivalent.

3.15.

Srebrov nitrat

3.16.

p-dimetilaminobenzaldehid

3.17.

2,5-dimetilfenol

3.18.

Željezov(III) klorid heksahidrat

3.19.

Klorovodična kiselina, 10 % otopina m/v

3.20.

Referentne tvari su one prikazane u odjeljku 1. „Svrha i cilj”. U slučaju aminospojeva, referentna tvar mora biti ili hidroklorid (mono ili di) ili slobodna baza.

3.21.

Pripremi se 0,5 % otopina svake od referentnih tvari iz odjeljka 3.20.

Odvaže se 50 mg ± 1 mg referentne tvari u standardnu tikvicu od 10 ml. Doda se 5 ml 98 % etanola (3.3.) i 250 mg askorbinske kiseline (3.5.). Otopina se zaluži dodatkom otopine amonijaka (3.4.) na oko pH 10 (provjeri se indikator papirom). Nadopuni se do 10 ml 96 % etanolom (3.3.) i miješa. Otopine se mogu držati tjedan dana na hladnom i tamnom mjestu. Ponekad nakon dodatka askorbinske kiseline i amonijaka može nastati talog. Prije nastavka rada, potrebno je pustiti da se talog slegne.

3.22.

3.23.

3.23.1.    Diazo reagens

Pripremi se 5 % (m/v) vodena otopina odabranog reagensa (3.14.). Otopina mora biti svježe pripremljena, neposredno prije uporabe.

3.23.2.    Ehrilchov reagens

Otopi se 2 g p-diametilaminobenzaldehida (3.16.) u 100 ml 10 % (m/v) vodene otopine klorovodične kiseline (3.19.).

3.23.3.    2,5-dimetilfenol – željezov(III) klorid heksahidrat

Otopina 1: Otopi se 1 g dimetilfenola (3.17.) u 100 ml 96 % etanola (3.3.).

Otopina 2: Otopi se 4 g željezova(III) klorida heksahidrata (3.18.) u 100 ml 96 % etanola (3.3.).

Za razvijanje se te otopine raspršuju odvojeno, najprije otopina 1, zatim otopina 2.

3.23.4.    Amonijakalni srebrov nitrat

25 % amonijak (3.4.) se doda u 5 % (m/v) vodenu otopinu srebrova nitrata (3.15.) dok se talog ne otopi. Taj reagens mora biti pripremljen neposredno prije uporabe. Reagens se ne čuva.

4.1.

Uobičajena laboratorijska oprema za tankoslojnu kromatografiju.

4.2.

Centrifuga, 4 000 okretaja/minuta

4.3.

Kivete za centrifugiranje, 10 ml s PTFE-obloženim kapicama s navojima, ili ekvivalent

6.1.1.

β-naftol (β-N)

6.1.2.

2-aminofenol (OAP)

6.1.3.

3-aminofenol (MAP)

6.1.4.

4-aminofenol (PAP)

6.1.5.

2-nitro-1,4,-fenilendiamin (2-NPPD)

6.1.6.

4-nitro-1,2,-fenilendiamin (4-NOPD). Pripremi se 0,5 % m/v otopina svake od dodatnih referentnih tvari kako je opisano u 3.21.

6.2.1.

Etil acetat – cikloheksan – otopina amonijaka, 25 % (65: 30: 0,5 po volumenu)

6.4.1.

Na površinu apsorbenta na tankoslojnoj ploči (4.1.3.). ucrtaju se dvije linije, kako pokazuje slika 1.

6.4.2.

U atmosferi dušika (4.1.1.) nanese se 1 do 4 μL ekstrakta (5.1.) na osnovnu točku 1 (Slika 1.) koja je na 2 cm od obje strane. Količina ekstrakta ovisi o intenzitetu mrlja na kromatogramima 5.2.

6.4.3.

Između točaka 2 i 3 (Slika 1.) podijele se oksidacijska bojila koja su identificirana ili se trebaju identificirati prema 5.2. (udaljenost između točaka 1,5 cm). Nanese se 2 μL svake od referentnih otopina – osim DAP kojega mora biti 6 μL. Provede se postupak pod dušikom (6.4.2.).

6.4.4.

Ponovi se postupak iz 6.4.3. na osnovnim točkama 4 i 5 (Slika 1.) i drži ploča pod dušikom do trenutka kromatografiranja (udaljenost točaka 1,5 cm).

6.4.5.

Posuda za kromatografiranje ispere se dušikom (3.8.) i stavi u nju prikladna količina otapala za razvijanje 3.22.2. Ploča (6.4.4.) se stavi u posudu i razvija u mraku u prvom smjeru elucije (Slika1.). Eluira se sve dok fronta otapala ne dosegne liniju označenu na ploči (približno 13 cm).

6.4.6.

Ploča se makne iz posude i stavi se u posudu za kromatografiju, prethodno ispranu dušikom, kako bi eluacijsko otapalo isparilo za najviše 60 minuta.

6.4.7.

Graduiranom epruvetom za testiranje stavi se prikladna količina eluacijskog otapala (6.2.) u posudu ispranu dušikom (3.8.), stavi se ploča, zarotirana za 90° u posudu (6.4.6.) i kromatografira se u drugom smjeru (također u mraku), dok fronta otapala ne dosegne liniju ucrtanu na površinu apsorbenta. Ploča se makne iz posude i eluacijsko otapalo se isparava na zraku.

6.4.8.

Ploča se stavi na 10 minuta u kromatografsku posudu s parama joda (6.3.) i interpretiraju se dvosmjerni kromatogrami pomoću Rf vrijednosti i boje referentnih tvari, kromatografiranih u isto vrijeme (Tablica II. prikazuje vodič za Rf vrijednosti i boje).

Napomena

Kako bi se dobilo najjače obojenje mrlja, ostavi se kromatogram izložen atmosferi pola sata nakon razvijanja.

6.4.9.

Prisustvo oksidacijskih bojila, pronađenih u 6.4.8. može se definitivno potvrditi ponavljanjem postupka opisanog u 6.4.1.do 6.4.8. i dodatkom 1 μL referentne tvari identificirane u 6.4.8. na osnovnu točku 1, na vrh količine ekstrakta specificiranog u 6.4.2.

Ako se u usporedbi s kromatogramom dobivenim u 6.4.8. ne nađe drugih mrlja, interpretacija kromatograma 6.4.8. je ispravna.

3.1.

3.2.

3.3.

Metanol

3.4.

Otopina 2-aminobenzaldehid fenilhidrazona (Nitrin ® reagens) u metanolu.

Odvaže se 2,0 g Nitrina ® i kvantitativno se prenese u standardnu tikvicu od 100 ml. Kap po kap se dodaje 4 ml razrijeđene klorovodične kiseline (3.2.) i protrese se. Do oznake se dopuni metanolom i promiješa, dok otopina ne postane potpuno bistra. Otopina se spremi u smeđu staklenu bocu (4.3.).

4.1.

Čaše, 50 ml

4.2.

Standardne tikvice, 100 ml

4.3.

Smeđa staklena boca, 125 ml

4.4.

Staklena ploča, 10 × 10 cm

4.5.

Plastična lopatica (spatula)

4.6.

Filtrirni papir, 10 × 10 cm

5.1.

Preko staklene ploče (4.4.) se ravnomjerno rasprostre dio uzorka koji treba analizirati, tako da pokrivni sloj ne bude deblji od 1 cm.

5.2.

Namoči se list filtrirnog papira (4.6.) u destiliranu vodu. Položi ga se na uzorak i pritisne prema dolje plastičnom lopaticom (spatulom) (4.5.).

5.3.

Pričeka se oko jedne minute i nanese se u središte filtrirnog papira:

5.4.

Nakon 5 do 10 sekundi ukloni se filtrirni papir te ga se ispita i na dnevnom svjetlu. Na prisutnost nitrita ukazuje crveno ljubičasto (grimizno) obojenje.

Ako je sadržaj nitrita nizak, crveno ljubičasta boja se nakon pet do 15 sekundi mijenja u žutu. Ako su prisutne velike količine nitrita, do promjene boje dolazi tek nakon jedne do dvije minute.

4.1.

Reagensi za bistrenje: ti reagensi ne trebaju se koristiti dulje od tjedan dana nakon priprave.

4.2.

Otopina natrijeva nitrita:

Otopi se 0,500 g natrijeva nitrita u destiliranoj vodi u odmjernoj tikvici od 1 000 ml i razrijedi vodom do oznake. Razrijedi se 10,00 ml te osnovne standardne otopine na 500 ml.; 1 ml posljednje otopine = 10 mikrograma NaNO2.

4.3.

1N otopina natrijeva hidroksida

4.4.

0,2 % otopina sulfanilamid hidroklorida:

Otopi se 2,0 g sulfanilamida u 800 ml vode uz zagrijavanje. Ohladi se i doda 100 ml koncentrirane klorovodične kiseline uz miješanje. Razrijedi se vodom na 1 000 ml.

4.5.

5N klorovodična kiselina

4.6.

N-1-naftil reagens

Ta otopina mora biti pripravljena na dan uporabe. Otopi se 0,1 g N-1- naftiletilendiamina dihidroklorida u vodi i razrijedi vodom na 100 ml.

5.1.

Analitička vaga

5.2.

Odmjerne tikvice od 100, 250, 500 i 1 000 ml

5.3.

Trbušaste ili graduirane pipete

5.4.

Menzure od 100 ml

5.5.

Naborani filtrirni papir bez nitrita, promjera 15 cm

5.6.

Vodena kupelj

5.7.

Spektrofotometar s optičkom ćelijom (kivetom) duljine puta 1 cm

5.8.

pH metar

5.9.

Mikrobireta od 10 ml

5.10.

Čaše od 250 ml

6.1.

Odvaže se oko 0,5 g (m grama) s točnošću od 0,1 mg homogeniziranog uzorka, prenese se vrućom destiliranom vodom kvantitativno u čašu od 250 ml (5.10.) i nadopuni vrućom destiliranom vodom na približno 150 ml. Čaša (5.10.) se stavi na pola sata u vodenu kupelj (5.6.) na 80 °C. Tijekom tog vremena sadržaj se povremeno protrese.

6.2.

Ohladi se na sobnu temperaturu i doda se uzastopno, uz miješanje, 2 ml Carrez I. reagensa (4.1.1.) i 2 ml Carrez II. reagensa (4.1.2.).

6.3.

Doda se 1N natrijeva hidroksida, kako bi se pH podesio na 8,3. (Pritom se rabi pH metar (5.8.)). Sadržaj se kvantitativno prenese u odmjernu tikvicu od 250 ml (5.2.) i nadopuni do oznake destiliranom vodom.

6.4.

Sadržaj se miješa i filtrira preko naboranog filtrirnog papira (5.5.).

6.5.

Odpipetira se (5.3.) najviše 25 ml bistrog filtrata u odmjernu tikvicu od 100 ml (5.2.) i doda destilirane vode do volumena od 60 ml.

6.6.

Nakon miješanja doda se 10,0 ml otopine sulfanilamid hidroklorida (4.4.), pa zatim 6,0 ml 5N klorovodične kiseline (4.5.). Promiješa se i pusti stajati pet minuta. Doda se 2,0 ml N-1-naftil reagensa (4.6.), promiješa i pusti stajati tri minute. Razrijedi se vodom do oznake i promiješa.

6.7.

Pripremi se slijepa proba ponavljanjem postupaka 6.5. i 6.6., bez dodatka N-1-naftil reagensa (4.6.).

6.8.

Izmjeri se (5.7.) optička gustoća otopine dobivene u 6.6., uz slijepu probu kao referentnu otopinu, na 538 nm.

6.9.

Iz kalibracijskog grafa (6.10.) očita se sadržaj natrijev nitrita u mikrogramima na 100 ml otopine (m1 mikrograma), što odgovara optičkoj gustoći izmjerenoj u 6.8.

6.10.

Uporabivši 10 μg po ml otopine natrijeva nitrita (4.2.), pripremi se kalibracijski graf za koncentracije od 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg natrijeva nitrita na 100 ml.

m

=

masa uzorka, odvaganog za analizu, u gramima (6.1),

m1

=

količina natrijeva nitrita, određenog u 6.9, u mikrogramima,

V

=

broj mililitara filtrata, uporabljenoga za mjerenje (6.5).

3.2.1.

Fuksin;

3.2.2

Natrijev sulfit hidratiziran s 7H2O;

3.2.3.

Koncentrirana klorovodična kiselina (d = 1,19);

3.2.4.

Sumporna kiselina, oko 1M;

3.2.5.

100 fuksina (3.2.1.) se odvaže u čašu i otopi u 75 ml vode na 80 °C. Nakon hlađenja se dodaje 2,5 g natrijeva sulfita (3.2.2.) Nadopuni se na 100 ml.

Upotrijebiti u roku od dva tjedna.

3.3.1.

Odvaže se 2 g uzorka u čašu od 10 ml.

3.3.2.

Dodaju se dvije kapi sumporne kiseline (3.2.4.) i 2 ml Schiffovog reagensa (3.2.5.). Taj reagens pri uporabi mora biti potpuno bezbojan.

Protrese se i ostavi stajati pet minuta.

3.3.3.

Ako se u roku od pet minuta opazi ružičasta ili svjetloljubičasta boja, formaldehid je prisutan u više od 0,01 % i treba se odrediti slobodnom i kombiniranom metodom (4) i postupkom (5) ako je potrebno.

4.2.1.

Bezvodni amonijev acetat;

4.2.2.

Koncentrirana octena kiselina d20 4 = 1,05;

4.2.3.

Pentan-2,4-dion svježe destiliran pod sniženim tlakom 25 mm Hg 25° - ne smije pokazivati nikakvu apsorpciju pri 410 nm;

4.2.4.

Butan-1-ol;

4.2.5.

Klorovodična kiselina, 1 M;

4.2.6.

Klorovodična kiselina, približno 0,1 M;

4.2.7.

Natrijev hidroksid, 1 M;

4.2.8.

Svježe pripremljena otopina škroba u skladu s europskom farmakopejom (1 g/50 ml vode), drugo izdanje 1980., dio I-VII-1-1;

4.2.9.

Formaldehid masenog udjela 37 do 40 %;

4.2.10.

Standardna otopina joda, 0,05 M;

4.2.11.

Standardna otopina natrijeva tiosulfata, 0,1 M;

4.2.12.

U odmjernoj tikvici od 1 000 ml otopi se:

Nadopuni se do 1 000 ml vodom (pH otopine oko 6,4).

Reagens mora biti svježe pripremljen;

4.2.13.

Reagens (4.2.12.) bez pentan-2,4-diona;

4.2.14.

Stavi se 5 g formaldehida (4.2.9.) u mjernu tikvicu od 1 000 ml i nadopuni vodom do 1 000 ml.

Odredi se jakost dobivene otopine kako slijedi:

Ukloni se 10,00 ml; doda se 25,00 ml standardne otopine joda (4.2.10.) i 10,00 ml otopine natrijeva hidroksida (4.2.7.).

Ostavi se da stoji pet minuta.

Zakiseli se s 11,00 ml HCl (4.2.5.) i odredi suvišak joda sa standardnom otopinom natrijeva tiosulfata (4.2.11.), uz otopinu škroba (4.2.8.) kao indikatora.

1 ml 0,05 M utrošenog joda (4.2.10.) jednako je 1,5 mg formaldehida;

4.2.15.

Ishodišna otopina formaldehida razrijedi se redom na 1/20 i zatim 1/100 vodom.

1 ml te otopine sadrži oko 1 μg formaldehida.

Izračuna se točan sadržaj.

4.3.1.

Standardna laboratorijska aparatura;

4.3.2.

Filtar za odvajanje faza, Whatman 1 PS (ili ekvivalent);

4.3.3.

Centrifuga;

4.3.4.

Vodena kupelj podešena na 60 °C;

4.3.5.

Spektrofotometar;

4.3.6.

Staklene ćelije s optičkim putom duljine 1 cm.

4.4.4.1.

Protresu se smjese iz 4.4.1., 4.4.2. i 4.4.3. Erlenmeyerove tikvice se urone u vodenu kupelj pri 60 °C na točno 10 minuta. Pusti se hladiti dvije minute u kupelji ledene vode.

4.4.4.2.

Prenese se u lijevke za odjeljivanje od 50 ml koji sadrže 10 ml butan-1-ola (4.2.4.). Svaka tikvica se ispere s 3 do 5 ml vode. Smjesa se snažno protresa točno 30 sekundi. Pusti se da se faze odvoje.

4.4.4.3.

Butan-1-ol faza se filtrira u mjernu ćeliju (4.3.2.) kroz filtar za odvajanje faza. Može se i centrifugirati (3 000 gn tijekom pet minuta).

4.4.4.4.

Na 410 nm se mjeri apsorbanca A1 ekstrakta otopine uzorka iz 4.4.1. prema ekstraktu referentne otopine 4.4.2.

4.4.4.5.

Jednako se mjeri apsorbanca A2 ekstrakta otopine slijepe probe iz 4.4.3. prema butan-1-olu.

Napomena: Svi postupci se moraju provesti u roku od 25 minuta od trenutka u kojem su Erlenmeyerove tikvice stavljene u vodenu kupelj pri 60 °C.

4.4.5.1.

U Erlenmeyerovu tikvicu od 50 ml stavi se:

4.4.5.2.

Nastavi se kako je opisano u 4.4.4. i mjeri se apsorbanca prema butan-1-olu (4.2.4.).

4.4.5.3.

Postupak se ponovi s 10, 15, 20 i 25 ml razrijeđene standardne otopine (4.2.15).

4.4.5.4.

Kako bi se dobila nulta vrijednost (koja odgovara obojenju reagensa) nastavi se kao u 4.4.4.5.

4.4.5.5.

Konstruira se kalibracijska krivulja nakon oduzimanja nulte vrijednosti od svake apsorbance dobivene u 4.4.5.1. i 4.4.5.3. Beerov zakon vrijedi do 30 μg formaldehida.

4.5.1.

Oduzme se A2 od A1 i očita iz kalibracijske krivulje (4.4.5.5.) u μg količina C formaldehida u otopini uzorka (4.4.1.).

4.5.2.

gdje je:

m = masa dijela za testiranje u 9.

5.2.1.

Voda primjerena za HPLC ili voda ekvivalentne kakvoće;

5.2.2.

Bezvodni amonijev acetat;

5.2.3.

Koncentrirana octena kiselina;

5.2.4.

Pentan-2,4-dion (drži se pri 4 °C);

5.2.5.

Bezvodni dinatrijev fosfat;

5.2.6.

85 %-tna ortofosforna kiselina (d = 1,7);

5.2.7.

Metanol primjeren za HPLC;

5.2.8.

Diklorometan;

5.2.9.

Formaldehid masenog udjela 37 do 40 %;

5.2.10.

Natrijev hidroksid, 1 M;

5.2.11.

Klorovodična kiselina, 1 M;

5.2.12.

Klorovodična kiselina, 0,002 M;

5.2.13.

Otopina škroba, svježe pripremljena prema europskoj farmakopeji (vidjeti 4.2.8.);

5.2.14.

Standardna otopina joda, 0,05 M;

5.2.15.

Standardna otopina natrijeva tiosulfata, 0,1 M;

5.2.16.

Vodena otopina dinatrijeva fosfata (5.2.5.), 0,006 M podešena na pH 2,1 s ortofosfornom kiselinom (5.2.6.);

5.2.17.

U odmjernoj tikvici od 1 000 ml otopi se:

Nadopuniti do 1 000 ml vodom (5.2.1.).

Reagens se čuva na tamnom mjestu.

Vrijeme čuvanja: najviše tri dana pri 25 °C.

Ne smije se promijeniti boja.

5.2.18.

Stavi se 10 g formaldehida (5.2.9.) u odmjernu tikvicu od 1 000 ml i nadopuni na 1 000 ml vodom.

Odredi se jakost dobivene otopine kako slijedi:

Ukloni se 5,00 ml; doda se 25,00 ml standardne otopine joda (5.2.14.) i 10,00 ml otopine natrijeva hidroksida (5.2.10.).

Pusti se stajati pet minuta.

Zakiseli se s 11,00 ml HCl (5.2.11.) i titrira suvišak standardne otopine joda standardnom otopinom natrijeva tiosulfata (5.2.15.), uz otopinu škroba (5.2.13.) kao indikatora.

1 ml otopine joda (5.2.14.) je ekvivalentno s 1,5 mg formaldehida;

5.2.19.

Razrijedi se ishodišna otopina na 1/100 dio početne jakosti u pokretnoj fazi (5.2.16.).

1 ml te otopine sadrži oko 37 mg formaldehida.

Izračuna se točan sadržaj.

5.3.1.

Standardna laboratorijska aparatura;

5.3.2.

HPLC pumpa, bez tresenja;

5.3.3.

Niskotlačna pumpa bez tresenja za reagens (ili druga HPLC pumpa);

5.3.4.

Injekcijski ventil s 10 μL petljom;

5.3.5.

Postkolonski reaktor sa sljedećim komponentama:

5.3.6.

Membranski filtar, veličine pora 0,45 μm;

5.3.7.

SEP-PAKR C18 čahura (uložak) ili ekvivalent;

5.3.8.

Kolone spremne za uporabu:

5.3.9.

Bischoff K1 hypersil RP 18 (referenca K1 G 6301 1805)

(5 μm, duljina = 10 mm, ili ekvivalent);

5.3.10.

Kolona i predkolona su povezane pomoću Ecotube sustava (referenca A 15020508 Bischoff) ili ekvivalent;

5.3.11.

Aparatura (5.3.5.) se sastavi kako je prikazano u shemi u Dodatku 2.

Spojnice nakon injekcijskog ventila moraju biti najkraće moguće. U tom slučaju čelična cijev između izlaza iz reaktora i ulaza u detektor hladi smjesu prije određivanja, a temperatura u detektoru je nepoznata ali je konstantna;

5.3.12.

UV vidljivi detektor;

5.3.13.

Pisač;

5.3.14.

Centrifuga;

5.3.15.

Ultrazvučna kupelj;

5.3.16.

Vibrirajući mješač (vortex ili ekvivalent).

4.1.

25 % klorovodična kiselina (m/m)

4.2.

Metanol

4.3.

96 % etanol (v/v)

4.4.

Već pripravljene TLC silika gel ploče (plastične ili aluminijske) s fluorescentnim indikatorom. Deaktivira se kako slijedi: već obično unaprijed pokrivene silika ploče se poprskaju vodom dok ne postanu glazirane. Pusti se poprskane ploče da se suše na sobnoj temperaturi jedan do tri sata.

Napomena

Ako ploče nisu deaktivirane, može doći do gubitaka rezorcinola zbog ireverzibilne adsorpcije na siliki.

4.5.

Otapalo za razvijanje; aceton – kloroform – octena kiselina (20: 75: 5 po volumenu)

4.6.

Standardna otopina rezorcinola; otopi se 400 mg rezorcinola u 100 ml 96 % etanola (4.3.) (1 ml odgovara 4 000 μg rezorcinola).

4.7.

Unutarnja standardna otopina; otopi se 400 mg 3,5-dihidrotoluena (DHT) u 100 ml 98 % etanola (4.3.) (1 ml odgovara 4 000 μg DHT).

4.8.

Standardna smjesa; u odmjernoj tikvici od 100 ml pomiješa se 10 ml otopine 4.6. i 10 ml otopine 4.7., nadopuni do oznake 96 % etanolom (4.3.) i promiješa (1 ml odgovara 400 μg rezorcinola i 400 μg DHT).

4.9.

Tvari za siliranje:

5.1.

Uobičajena oprema za plinsku kromatografiju

5.2.

Stakleno posuđe

6.1.1.

U čašu od 150 ml odvaže se točno dio proizvoda za testiranje (m grama), koji sadrži približno 20 do 50 mg rezorcinola.

6.1.2.

Zakiseli se klorovodičnom kiselinom dok smjesa ne postane kisela (potrebno je oko 2 do 4 ml), doda se 10 ml (40 mg DHT) otopine unutarnjeg standarda (4.7.) i miješa. Etanolom (4.3.) se prenese u odmjernu tikvicu od 100 ml, nadopuni etanolom do oznake i miješa.

6.1.3.

Kao neprekinuta linija duljine oko 8 cm, nanese se 250 μL otopine (6.1.2.) na deaktiviranu ploču silike (4.4.). Pazi se da linija bude što tanja.

6.1.4.

Na istu ploču nanese se na jednaki način (6.1.3.) 250 μL standardne smjese (4.8.).

6.1.5.

Na dvije točke početne linije nanese se 5 μL svake od otopina 4.6. i 4.7. da se olakša lokaliziranje nakon razvijanja ploče.

6.1.6.

Ploča se razvija u (nezasićenoj) posudi napunjenoj otapalom za razvijanje 4.5. dok fronta otapala ne dosegne liniju udaljenu 12 cm od početne linije; to obično traje oko 45 minuta. Ploča se suši na zraku te se pod kratkovalnim UV svjetlom (254 nm) lokalizira rezorcinol/DHT-područje. Oba spoja imaju približno jednake Rf vrijednosti. Olovkom se označe pojasevi na 2 mm udaljenosti od vanjske tamne granične linije pojaseva. Maknu se ta područja i sakupi se adsorbent svakog pojasa u bočicu od 10 ml.

6.1.7.

Ekstrahira se adsorbent koji sadrži uzorak i adsorbent koji sadrži standardnu smjesu na sljedeći način:

Doda se 2 ml metanola (4.2.) i ekstrahira jedan sat uz neprekidno miješanje. Smjesa se filtrira i ekstrakcija se ponovi s 2 ml metanola još 15 minuta.

6.1.8.

Ekstrakti se spoje i ispari se otapalo tijekom noći u vakuum eksikatoru napunjenom prikladnim sredstvom za sušenje. Ne zagrijava se.

6.1.9.

Ostaci se siliraju (6.1.8.) ili kako je opisano u 6.1.9.1. ili u 6.1.9.2.

r1 i r2

=

retencijsko vrijeme dvaju vrhova u minutama,

w1 i w2

=

širina istih vrhova na polovini visine u mm,

d′

=

brzina dijagrama (papira) u mm u minuti

6.2.2.

U plinski kromatograf uštrca se 1 do 3 μL otopina dobivenih pod 6.1.9. Provede se pet uštrcaja za svaku otopinu (6.1.9.), izmjere se površine ispod vrhova, izračuna prosječna vrijednost i izračuna omjer površine vrhova: S = površina vrha rezorcinola/površina vrha DHT.

M

=

dio uzorka za testiranje u gramima (6.1.1),

Suzorka

=

srednja vrijednost površine vrha s obzirom na 6.2.2 za otopinu uzorka,

Sstandardne smjese

=

srednja vrijednost površine vrha s obzirom na 6.2.2 za standardnu smjesu.

4.1.

Metanol

4.2.

Apsolutni etanol

4.3.

Propan-2-ol

4.4.

Kloroform, oslobođen alkohola ispiranjem vodom

5.1.

Plinski kromatograf

5.2.

Odmjerne tikvice, 100 ml

5.3.

Pipete, 1 ml, 20 mL 0 do 1 ml

5.4.

Mikrošprice 0 do 100 μL i 0 do 5 μL

i (samo za aerosolne uzorke) posebne plinsko nepropusne šprice s klizajućim ventilom (vidjeti postupak uzorkovanja, Slika 5 ( 9 ))

6.1.1.

Aerosolni proizvodi se uzorkuju u skladu s Poglavljem II. Priloga Direktivi Komisije 80/1335/EEZ od 22. prosinca 1980. ( 10 ) i tada se analiziraju plinskom kromatografijom pod uvjetima 6.2.1.

6.1.2.

Neaerosolni proizvodi uzorkovani u skladu s gore spomenutim Poglavljem II se razrijede vodom do razine od 1 do 2 % etanola ili propan-2-ola i tada analiziraju plinskom kromatografijom pod uvjetima 6.2.2.

6.2.1.

Za aerosolne uzorke rabi se katarometarski detektor.

6.2.2.

Za neaerosolne uzorke:

7.1.

Za postupak plinske kromatografije 6.2.1. (Hallcomid M18 kolona) rabe se sljedeće standardne smjese. Te smjese se pripremaju odmjeravanjem pipetama, ali se točna količina određuje momentalnim vaganjem pipete ili tikvice nakon svakog dodatka.

Ubrizga se 2 do 3 μL u kromatograf pod uvjetima iz 6.2.1.

Izračuna se omjer površina vrhova (metanol/etanol) ili (metanol/propan-2-ol) svake smjese. Nacrta se standardni graf:

7.2.

Za postupak plinske kromatografije 6.2.2. (Porapak QS ili Chromosorb 105) uporabe se sljedeće standardne otopine. Te smjese se pripremaju odmjeravanjem pipetama, ali se točna količina određuje momentalnim vaganjem pipete ili tikvice nakon svakog dodatka.

Ubrizga se od 2 do 3 μL u kromatograf pod uvjetima iz 6.2.2.

Izračuna se omjer površina vrhova (metanol/etanol) ili (metanol/propan-2-ol) svake smjese. Nacrta se standardni graf:

7.3.

Standardni graf mora biti pravac.

1

=

HPLC pumpa

2

=

Injekcijski ventil

3

=

Kolona s predkolonom

4

=

Pumpa za reagens

5

=

T-dio bez nefunkcionalnog volumena

5′

=

T-dio (Vortex)

6-6′

=

Jedinica bez nefunkcionalnog volumena

7

=

„Francusko pletenje”

7′

=

Reaktor

8

=

Tikvica s tri grla s vrijućom vodom

9

=

Grijač tikvice

10

=

Hladilo

11

=

Cijev od nehrđajućeg čelika za izmjenu topline

11′

=

Izmjenjivač topline

12

=

Vidljivi UV detektor

13

=

PCRS 520 postkolonski modul

5.3.5.:

5.3.6.: