„PRILOG IX.

SPEKTROFOTOMETRIJSKO ISPITIVANJE U ULTRALJUBIČASTOM PODRUČJU

UVOD

Spektrofotometrijskim ispitivanjem u ultraljubičastom području mogu se dati informacije o kvaliteti masti, njezinoj očuvanosti i promjenama koje su uzrokovane tehnološkim procesima. Do apsorpcija na valnim duljinama utvrđenima u ovoj metodi dolazi zbog prisutnosti konjugiranih dienskih i trienskih sustava koji nastaju kao posljedica oksidacijskih procesa i/ili postupaka rafiniranja. Te se apsorpcije iskazuju kao specifične ekstinkcije (ekstinkcija 1 %-tnog masenog udjela otopine masti u određenom otapalu, u kiveti od 10 mm) što se uobičajeno označava s K (naziva se i ‚koeficijentom ekstinkcije’).

1.   OPSEG

U ovom se Prilogu opisuje postupak provođenja spektrofotometrijske analize maslinovog ulja u ultraljubičastom području.

2.   PRINCIP METODE

Uzorak se otapa u propisanom otapalu, a sposobnost apsorpcije otopine mjeri se na utvrđenim valnim duljinama u odnosu na čisto otapalo.

Specifične ekstinkcije na 232 nm i 268 nm u izo-oktanu ili na 232 nm i 270 nm u cikloheksanu izračunavaju se za koncentraciju 1 %-tnog masenog udjela u kiveti od 10 mm.

3.   OPREMA

3.1.   Spektrofotometar pogodan za mjerenja na valnim duljinama ultraljubičaste svjetlosti (220 nm do 360 nm), s mogućnošću očitavanja pojedinačnih nanometrijskih jedinica. Preporučuju se redovite provjere radi postizanja točnosti i obnovljivosti sposobnosti apsorpcije i ljestvica valnih duljina te za rasipnu svjetlost.

3.1.1.   Ljestvica valnih duljina: Ona se može provjeriti upotrebom referentnog materijala koji se sastoji od filtra od optičkog stakla koje sadržava holmijev oksid ili otopinu holmijevog oksida (zapečaćen ili nezapečaćen) s jasnim apsorpcijskim frekvencijama. Referentni materijali namijenjeni su provjeri i baždarenju ljestvica valnih duljina vidljivih i ultraljubičastih spektrofotometara s nominalnim spektralnim frekvencijskim širinama od 5 nm ili manje. Mjerenja se provode u odnosu na zrak kao slijepu probu u intervalu valnih duljina od 640 do 240 nm, u skladu s uputama priloženim referentnim materijalima. Provodi se ispravljanje bazne linije s praznim putem snopa pri svakoj promjeni širine procjepa. Standardne valne duljine navedene su u certifikatu referentnog materijala.

3.1.2.   Ljestvica apsorpcije: Ona se može provjeriti upotrebom komercijalno dostupnog zapečaćenog referentnog materijala koji se sastoji od kisele otopine kalijeva dikromata u određenim koncentracijama i potvrđenim vrijednostima apsorpcije pri njihovim λmax (četiri otopine kalijeva dikromata u perklornoj kiselini zapečaćenog u četiri UV kvarcne kivete za mjerenje referentne vrijednosti linearnosti i fotometrijske točnosti u UV-području). Otopine kalijevog dikromata mjere se u odnosu na slijepu probu kiseline koja se primjenjuje nakon ispravljanja bazne linije u skladu s uputama priloženim referentnom materijalu. Vrijednosti apsorpcije navedene su u certifikatu referentnog materijala.

U cilju provjeravanja odziva fotoćelije i fotomultiplikatora druga je mogućnost postupiti na sljedeći način: odvagnuti 0,2000 g čistog kalijevog kromata za spektrofotometriju i otopiti ga u 0,05 mol/l otopini kalijevog hidroksida u graduiranoj tikvici volumena 1 000 ml i nadopuniti do oznake. Uzeti točno 25 ml dobivene otopine, staviti ju u graduiranu tikvicu volumena 500 ml i razrijediti do oznake upotrebljavajući istu otopinu kalijevog hidroksida.

Izmjeriti ekstinkciju tako dobivene otopine na 275 nm, upotrebljavajući otopinu kalijevog hidroksida kao referentnu. Ekstinkcija izmjerena upotrebom kivete od 1 cm treba biti 0,200 ± 0,005.

3.2.   Pravokutne kvarcne kivete, s poklopcima, pogodne za mjerenja na valnim duljinama ultraljubičaste svjetlosti (220 do 360 nm) s duljinom optičke putanje od 10 mm. Kivete napunjene vodom ili drugim prikladnim otapalom ne bi trebale pokazivati međusobne razlike u ekstinkciji veće od 0,01 ekstinkcijskih jedinica.

3.3.   Odmjerne tikvice od 25 ml s jednom oznakom, klase A.

3.4.   Analitička vaga s mogućnošću očitanja uz odstupanje do 0,0001 g

4.   REAGENSI

Tijekom analize, osim ako nije drukčije navedeno, upotrebljavati isključivo reagense priznate analitičke čistoće te destiliranu ili demineraliziranu vodu ili vodu jednakovrijedne čistoće.

Otapalo: Izo-oktan (2,2,4-trimetilpentan) za mjerenja na 232 nm i 268 nm i cikloheksan za mjerenja na 232 nm i 270 nm, sa sposobnošću apsorpcije manjom od 0,12 na 232 nm i manjom od 0,05 na 270 nm u odnosu na destiliranu vodu, izmjereno u kiveti od 10 mm.

5.   POSTUPAK

5.1.   Uzorak mora biti savršeno homogen i bez lebdećih nečistoća. U protivnom, mora ga se profiltrirati kroz papir na temperaturi od približno 30 °C.

5.2.   Od tako pripremljenog uzorka precizno odvagnuti približno 0,25 g (uz odstupanje do 1 mg) tako pripremljenog uzorka u graduiranoj tikvici od 25 ml, nadopuniti propisanim otapalom do oznake i homogenizirati. Dobivena otopina mora biti savršeno bistra. Ako je došlo do opalescencije ili zamućenosti, brzo profiltrirati kroz papir.

NAPOMENA: U pravilu je masa od 0,25 – 0,30 g dostatna za mjerenja sposobnosti apsorpcije djevičanskog ili ekstra djevičanskog maslinovog ulja na 268 nm i 270 nm. Za mjerenja na 232 nm uobičajeno je potrebno 0,05 g uzorka te se tako u pravilu pripremaju dvije različite otopine. Za mjerenja sposobnosti apsorpcije ulja komine maslina, rafiniranih maslinovih ulja i krivotvorenih maslinovih ulja, a zbog njihove veće sposobnosti apsorpcije, u pravilu je potrebna manja količina uzorka, npr. 0,1 g.

5.3.   Prema potrebi ispraviti baznu liniju (220 – 290 nm) otapalom u obje kvarcne kivete (uzorak i referenca), potom napuniti kvarcnu kivetu uzorka dobivenom ispitnom otopinom i izmjeriti ekstinkcije na 232, 268 ili 270 nm u odnosu na otapalo koje je upotrijebljeno kao referenca.

Očitane vrijednosti ekstinkcije moraju biti unutar intervala od 0,1 do 0,8 ili unutar linearnog raspona spektrofotometra koji treba provjeriti. Ako nije tako, mjerenja se moraju ponoviti upotrebljavajući, prema potrebi, otopine veće ili manje koncentracije.

5.4.   Nakon mjerenja sposobnosti apsorpcije na 268 ili 270 nm izmjeriti sposobnost apsorpcije pri λmax, λmax + 4 i λmax – 4. Te se vrijednosti sposobnosti apsorpcije upotrebljavaju radi određivanja odstupanja u specifičnoj ekstinkciji (ΔΚ).

NAPOMENA: smatra se da λmax iznosi 268 nm za izo-oktan koji se upotrebljava kao otapalo te 270 nm za cikloheksan.

6.   ISKAZIVANJE REZULTATA

6.1.   Zabilježiti specifične ekstinkcije (koeficijente ekstinkcije) na različitim valnim duljinama, izračunate kako slijedi:

pri čemu je:

Kλ	=	specifična ekstinkcija na valnoj duljini λ;
Eλ	=	ekstinkcija mjerena na valnoj duljini λ;
c	=	koncentracija otopine u g/100 ml;
s	=	duljina puta kvarcne kivete u cm;

iskazano s dva decimalna mjesta.

6.2.   Odstupanje specifične ekstinkcije (ΔΚ)

Odstupanje apsolutne vrijednosti ekstinkcije (ΔΚ) iskazuje se kao:

pri čemu je Km specifična ekstinkcija na valnoj duljini za maksimalnu apsorpciju na 270 nm i 268 nm ovisno o upotrijebljenom otapalu.

Rezultati trebaju biti iskazani s dva decimalna mjesta.”

PRILOG X.

ODREĐIVANJE METILNIH ESTERA MASNIH KISELINA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1.   OPSEG

Ovim se Prilogom daju smjernice za određivanje plinskom kromatografijom slobodnih i vezanih masnih kiselina u biljnim mastima i uljima nakon njihovog pretvaranja u metilne estere masnih kiselina (engl. fatty acid methyl esters – FAME).

Vezane masne kiseline triacilglicerola (engl. triacylglycerols – TAGs) te, ovisno o metodi esterifikacije, slobodne masne kiseline (engl. free fatty acids – FFA) pretvaraju se u metilne estere masnih kiselina (FAME) koji se određuju kapilarnom plinskom kromatografijom.

Metodom koja je opisana u ovom Prilogu dozvoljava se određivanje FAME-a od C12 do C24, uključujući zasićene, cis- i trans-jednostruko nezasićene i cis- i trans-višestruko nezasićene metilne estere masnih kiselina.

2.   PRINCIP

Plinska kromatografija (engl. Gas chromatography – GC) upotrebljava se za kvantitativnu analizu FAME-a. Metilne estere masnih kiselina (FAME) priprema se u skladu s dijelom A. Zatim ih se injektira u injektor u kojem isparavaju. Odjeljivanje FAME-a izvršava se na analitičkoj koloni specifičnog polariteta i duljine. Plameno-ionizacijski detektor (engl. Flame Ionisation Detector – FID) upotrebljava se za uočavanje FAME-a. Uvjeti analize navedeni su u dijelu B.

Vodik ili helij mogu se upotrebljavati kao plin nosač (mobilna faza) u plinskoj kromatografiji FAME-a s FID-om. Vodik ubrzava odjeljivanje i daje oštrije pikove. Stacionarna faza je mikroskopski sloj tankog tekućeg filma na inertnoj čvrstoj površini od kvarca.

Kako prolaze kroz kapilarnu kolonu, hlapivi spojevi koje se analizira međusobno djeluju sa stacionarnom fazom ostavljajući premaz na unutarnjoj površini kolone. Zbog takvog različitog međusobnog djelovanja različitih spojeva oni eluiraju u različito vrijeme koje se naziva retencijskim vremenom spoja za dani skup analitičkih parametara. Usporedba retencijskih vremena upotrebljava se za identifikaciju različitih spojeva.

DIO A.

PRIPREMA METILNIH ESTERA MASNIH KISELINA IZ MASLINOVOG ULJE I ULJA KOMINE MASLINA

1.   OPSEG

U ovom se dijelu navodi način pripreme metilnih estera masnih kiselina. Njime su obuhvaćene metode pripreme metilnih estera masnih kiselina iz maslinovog ulja i ulja komine maslina.

2.   PODRUČJE PRIMJENE

Priprema metilnih estera masnih kiselina iz maslinovog ulja i ulja komine maslina vrši se postupkom transesterifikacije s otopinom kalijevog hidroksida u metanolu na sobnoj temperaturi. Pitanje potrebe za pročišćavanjem uzorka prije transesterifikacije ovisi o sadržaju slobodnih masnih kiselina u uzorku i analitičkom parametru koji treba odrediti, a koji je moguće odabrati u skladu sa sljedećom tablicom:

Kategorija ulja	Metoda
Djevičansko maslinovo ulje kiselosti ≤ 2,0 %	1. Masne kiseline 2. Trans-masne kiseline 3. ΔECN42 (nakon pročišćavanja silikagelom ekstrakcijom na čvrstoj fazi)
Rafinirano maslinovo ulje
Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranog maslinovog ulja i djevičanskih maslinovih ulja
Rafinirano ulje komine maslina
Ulje komine maslina
Djevičansko maslinovo ulje kiselosti > 2,0 % Sirovo ulje komine maslina	1. Masne kiseline (nakon pročišćavanja silikagelom ekstrakcijom na čvrstoj fazi) 2. Trans-masne kiseline (nakon pročišćavanja silikagelom ekstrakcijom na čvrstoj fazi) 3. ΔECN42 (nakon pročišćavanja silikagelom ekstrakcijom na čvrstoj fazi)

3.   METODOLOGIJA

3.1.   Transesterifikacija s otopinom kalijevog hidroksida u metanolu na sobnoj temperaturi

3.1.1.   Princip

Metilni esteri formiraju se transesterifikacijom s otopinom kalijevog hidroksida u metanolu, kao međuprodukti prije nego što nastupi saponifikacija.

3.1.2.   Reagensi

3.1.2.1.   Metanol koji ne sadržava više od 0,5 % (m/m) vode.

3.1.2.2.   Heksan, kromatografske čistoće.

3.1.2.3.   Heptan, kromatografske čistoće.

3.1.2.4.   Dietilni eter, stabiliziran za analizu.

3.1.2.5.   Aceton, kromatografske čistoće.

3.1.2.6.   Otapalo za eluiranje za čišćenje ulja kolonskom/SPE kromatografijom, smjesa heksana/dietil etera 87/13 (v/v).

3.1.2.7.   Kalijev hidroksid, otopina u metanolu koncentracije oko 2 mol/l: otopiti 11,2 g kalijevog hidroksida u 100 ml metanola.

3.1.2.8.   Silikagel ulošci, 1 g (6 ml) za ekstrakciju na čvrstu fazu.

3.1.3.   Oprema

3.1.3.1.   Epruvete volumena 5 ml s navojnim čepom s PTFE spojem.

3.1.3.2.   Graduirane ili automatske pipete od 2 ml i 0,2 ml.

3.1.4.   Pročišćavanje uzoraka ulja

Prema potrebi se uzorak pročišćava prolaskom ulja kroz silikagel uloške za ekstrakciju na čvrstu fazu. Silikagel uložak (3.1.2.8.) se stavi u vakuumski instrument za eluaciju i ispere pod vakuumom sa 6 ml heksana (3.1.2.2.); ispiranje se odvija bez vakuuma. Zatim se otopina ulja (približno 0,12 g) u 0,5 ml heksana (3.1.2.2.) stavi u kolonu. Kad otopina prodre u silikagel, eluira se pod vakuumom s 10 ml smjese heksana/dietil etera (87:13 v/v) (3.1.2.6.). Ukupni eluat se homogenizira i podjeli na dva po volumenu približno jednaka dijela. Alikvot se upari do suhoće rotirajućim isparivačem pod sniženim tlakom na sobnoj temperaturi. Ostatak se otopi u 1 ml heptana te je otopina spremna za analizu masnih kiselina plinskom kromatografijom. Drugi alikvot se upari, a ostatak otopi u 1 ml acetona za analizu triglicerida HPLC metodom, ako je potrebno.

3.1.5.   Postupak

U epruvetu s navojnim čepom volumena 5 ml (3.1.3.1.) odvagati oko 0,1 g uzorka ulja. Dodati 2 ml heptana (3.1.2.2.) i protresti. Dodati 0,2 ml otopine kalijevog hidroksida u metanolu (3.1.2.7.), zatvoriti čepom s PTFE spojem, čvrsto zatvoriti i jako tresti 30 sekundi. Ostaviti da se slegne dok se gornja otopina ne razbistri. Dekantirati gornji sloj koji sadržava metilne estere. Heptanska otopina spremna je za injektiranje u plinski kromatograf. Preporučuje se čuvanje otopine u hladnjaku do plinsko-kromatografske analize. Ne preporučuje se čuvanje otopine dulje od 12 sati.

DIO B.

ANALIZA METILNIH ESTERA MASNIH KISELINA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1.   OPSEG

U ovom se dijelu daju opće smjernice za primjenu kapilarne plinske kromatografije radi utvrđivanja kvalitativnog i kvantitativnog sastava smjese metilnih estera masnih kiselina dobivenih u skladu s metodom utvrđenom u dijelu A.

Ovaj se dio ne primjenjuje na polimerizirane masne kiseline.

2.   REAGENSI

2.1.   Plin nosač

Inertni plin (helij ili vodik), temeljito osušen, sa sadržajem kisika manjim od 10 mg/kg.

Napomena 1.:

Vodikom se može udvostručiti brzina analize, no opasan je. Dostupni su sigurnosni uređaji.

2.2.   Pomoćni plinovi

2.2.1.   Vodik (čistoće ≥ 99,9 %), bez organskih nečistoća.

2.2.2.   Zrak ili kisik, bez organskih nečistoća.

2.2.3.   Dušik (čistoće > 99 %).

2.3.   Referentni standard

Smjesa metilnih estera čistih masnih kiselina ili metilnih estera masti poznatog sastava, po mogućnosti nalik onoj masne tvari koju se analizira. Cis-izomeri i trans-izomeri oktadecenoičnih, oktadekadienoičnih i oktadekatrienoičnih metilnih estera korisni su za identifikaciju trans-izomera nezasićenih kiselina.

Posebnu pažnju potrebno je posvetiti sprečavanju oksidacije višestruko nezasićenih masnih kiselina.

3.   OPREMA

Navedene upute odnose se na uobičajenu opremu koja se upotrebljava za plinsku kromatografiju, uključujući kapilarne kolone i plameno-ionizacijski detektor.

3.1.   Plinski kromatograf

Plinski kromatograf treba sadržavati sljedeće elemente.

3.1.1.   Sustav za injektiranje

Upotrijebiti sustav za injektiranje s kapilarnim kolonama, u kojem slučaju sustav za injektiranje treba biti izrađen posebno za upotrebu s takvim kolonama. Po vrsti injektor može biti s dijeljenjem uzorka ili bez dijeljenja uzorka u koloni.

3.1.2.   Peć

Peć je u stanju zagrijati kapilarnu kolonu na temperaturu od najmanje 260 °C i održavati željenu temperaturu unutar 0,1 °C. Ovaj posljednji zahtjev posebno je važan kad se upotrebljava kvarcna cijev.

U svim se slučajevima preporučuje upotreba zagrijavanja programiranom temperaturom, a posebno za masne kiseline koje imaju manje od 16 atoma ugljika.

3.1.3.   Kapilarna kolona

3.1.3.1.   Cijev, izrađena od materijala koji je inertan u odnosu prema tvari koja će se analizirati (uobičajeno, staklo ili kvarc). Unutarnji promjer je između 0,20 i 0,32 mm. Unutarnju površinu obrađuje se na odgovarajući način (na primjer pripremanje površine, deaktiviranje) prije nanošenja premaza stacionarne faze. Za masne kiseline i cis- i trans-izomere masnih kiselina dostatna je duljina od 60 m.

3.1.3.2.   Prikladne su i vezane odnosno umrežene stacionarne faze tipa polarni polisiloksan (cijanosilikoni).

Napomena 2.:

Postoji opasnost od mogućnosti da polarni polisiloksani prouzroče poteškoće pri identificiranju i odjeljivanju linolenske kiseline i C20 kiselina.

Premazi su tanki, odnosno, od 0,1 do 0,2 μm.

3.1.3.3.   Sastavljanje i kondicioniranje kolone

Uvažavati normalne mjere predostrožnosti pri sastavljanju kapilarnih kolona, odnosno namještanje kolone u peći (nositelj), odabir i sastavljanje priključaka (čvrsto zabrtvljeni da ne bi došlo do curenja), pozicioniranje krajeva kolone u injektoru i na detektoru (smanjivanje slobodnog (neiskorištenog) volumena). Kolonu staviti pod struju plina nosača (na primjer 0,3 bar (30 kPa) za kolonu duljine 25 m i unutarnjeg promjera 0,3 mm).

Kolonu kondicionirati temperaturnim programiranjem peći na 3 °C/min od temperature okoline na temperaturu koja je 10 °C niža od granične temperature raspadanja stacionarne faze. Održavati ovu temperaturu peći jedan sat, dok se bazna linija ne stabilizira. Vratiti ju na 180 °C da bi radila u izotermnim uvjetima.

Napomena 3.:

Odgovarajuće unaprijed kondicionirane kolone dostupne su u slobodnoj trgovini.

3.1.4.   Plameno-ionizacijski detektor i pretvarač s pojačalom

3.2.   Štrcaljka

Štrcaljka ima maksimalni volumen 10 μl i graduirana je s podjelom po 0,1 μl.

3.3.   Sustav prikupljanja podataka

Sustav prikupljanja podataka internetski povezan s detektorima i u kojem se upotrebljava računalni program prikladan za integraciju i normalizaciju pika.

4.   POSTUPAK

Aktivnosti opisane u točkama od 4.1. do 4.3. odnose se na upotrebu plameno-ionizacijskog detektora.

4.1.   Uvjeti ispitivanja

4.1.1.   Odabir optimalnih radnih uvjeta za kapilarne kolone

Zbog učinkovitosti i propusnosti kapilarne kolone odjeljivanje sastojaka i trajanje analize uvelike ovise o brzini protoka plina nosača kroz kolonu. Stoga je potrebno optimizirati radne uvjete djelovanjem na ovaj parametar (ili, jednostavnije, na glavni gubitak kolone), ovisno o tome želi li se poboljšati odjeljivanje ili ubrzati analiza.

Sljedeći su se uvjeti pokazali prikladni za odjeljivanje FAME-ova (C4 do C26). Primjeri kromatograma prikazani su u Dodatku B:

Temperatura injektora:	250 °C
Temperatura detektora:	250 °C
Temperatura peći:	165 °C (8 min) do 210 °C na 2 °C/min
Plin nosač vodik:	pritisak na vrhu kolone, 179 kPa
Ukupni protok:	154,0 ml/min
Omjer razdvajanja:	1:100
Volumen injektiranja:	1 μl

4.1.2.   Određivanje rezolucije (vidi Dodatak A)

Izračunati rezoluciju R dva susjedna pika I i II upotrebljavajući sljedeću formulu:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) or R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (engl. United States Pharmacopeia),

ili

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB) (JP (engl. Japanese Pharmacopeia), EP (fr. Pharmacopée Européenne), BP (engl. British Pharmacopeia))

pri čemu je:

d r(I)	retencijska udaljenost pika I;
d r(II)	retencijska udaljenost pika II;
t r(I)	retencijsko vrijeme pika I;
t r(II)	retencijsko vrijeme pika II;
ω(I)	širina baze pika I;
ω(II)	širina baze pika II;
ω0,5	širina pika određenog spoja, na srednjoj visini pika;

Ako je ω(I) ≈ ω(II), izračunati R upotrebljavajući sljedeće formule:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

pri čemu je:

σ	standardno odstupanje (vidi Dodatak A, sliku 1.).

Ako je udaljenost dr između dva pika dr(II) - dr(I) jednaka 4σ, faktor rezolucije R = 1.

Ako dva pika nisu u potpunosti razdvojena, tangente na točkama infleksije dva pika križaju se u točki C. Radi potpunog razdvajanja dva pika udaljenost između dva pika mora biti jednaka:

d r(II) – d r(I) = 6 σ iz čega je R = 1,5 (vidi Dodatak A, sliku 3.).

5.   ISKAZIVANJE REZULTATA

5.1.   Kvalitativna analiza

Identificirati pikove metilnog estera za uzorak iz kromatograma u Dodatku B., slici 1., ako je potrebno interpolacijom ili njihovom usporedbom s referentnim mješavinama smjesa metilnih estera (kako je navedeno u točki 2.3.).

5.2.   Kvantitativna analiza

5.2.1.   Određivanje sastava

Izračunati odlomke mase w i pojedinačnih metilnih estera masnih kiselina, iskazane kao maseni udio metilnih estera, kako slijedi:

5.2.2.   Metoda izračunavanja

5.2.2.1.   Općeniti slučaj

Izračunati sadržaj danog sastojka i, iskazan kao maseni udio metilnih estera, određivanjem postotka kojega predstavlja površina odgovarajućeg pika u odnosu na zbroj površina svih pikova, upotrebljavajući sljedeću formulu:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemu je:

Ai	površina ispod pika pojedinačnih metilnih estera masnih kiselina i;
ΣA	zbroj površina pod svim pikovima svih pojedinačnih metilnih estera masnih kiselina.

Rezultate se iskazuje s dva decimalna mjesta.

Napomena 4.:

Za masti i ulja odlomak mase metilnih estera masnih kiselina jednak je odlomku mase triacilglicerola u gramima na 100 g. U slučajevima u kojima ova pretpostavka nije dopuštena, vidi točku 5.2.2.2.

5.2.2.2.   Upotreba korekcijskih faktora

U određenim slučajevima, na primjer kad su prisutne masne kiseline s manje od osam atoma ugljika ili kiselina sa sekundarnim skupinama, vrše se korekcije površine s pomoću specifičnih korekcijskih faktora (Fci). Te se faktore određuje za svaki pojedinačni instrument. U tu se svrhu upotrebljavaju prikladni referentni materijali čiji je sastav masnih kiselina odgovarajućeg raspona.

Napomena 5.:

Ti korekcijski faktori nisu identični teoretskim korekcijskim faktorima FID-a koji su navedeni u Dodatku A s obzirom na to da uključuju i radnu učinkovitost sustava za injektiranje itd. Međutim, u slučaju većih razlika treba provjeriti radnu učinkovitost cijelog sustava.

Za ovu referentnu smjesu maseni udio FAME i zadan je sljedećom formulom:

wi = (mi /Σm) × 100

pri čemu je:

m i	masa FAME i u referentnoj smjesi;
Σm	zbroj masa raznih sastojaka kao FAME-ovi referentne smjese.

Iz kromatograma referentne smjese izračunati postotak po površini za FAME i kako slijedi:

wi = (Ai/ΣA) × 100

pri čemu je:

Ai	površina FAME i u referentnoj smjesi;
ΣA	zbroj svih površina svih FAME-ova referentne smjese.

Korekcijski faktor Fc tada je

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Za uzorak maseni udio svakog FAME i je:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Rezultate se iskazuje s dva decimalna mjesta.

Napomena 6.:

Izračunata vrijednost odgovara masenom udjelu pojedinačnih masnih kiselina izračunatih kao triacilgliceroli na 100 g masti.

5.2.2.3.   Upotreba internog standarda

U nekim analizama (na primjer gdje nisu sve masne kiseline kvantificirane, kao kad su prisutne kiseline sa četiri i šest ugljika zajedno s kiselinama sa 16 i 18 ugljika, ili kad je potrebno odrediti apsolutnu količinu masnih kiselina u nekom uzorku) potrebno je upotrebljavati interni standard. Često se upotrebljavaju masne kiseline s 5, 15 ili 17 ugljika. Potrebno je odrediti korekcijski faktor (ako postoji) za interni standard.

Maseni udio sastojka i, iskazan kao metilni esteri, zadan je formulom:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

pri čemu je:

A i je površina FAME i;

A IS je površina internog standarda;

F i je korekcijski faktor masne kiseline i, iskazan kao FAME;

F IS je korekcijski faktor internog standarda;

m je masa uzorka za ispitivanje u miligramima;

m IS je masa internog standarda u miligramima.

Rezultate se iskazuje s dva decimalna mjesta.

6.   IZVJEŠĆE O ISPITIVANJU

U izvješću o ispitivanju navode se metode upotrijebljene za pripremu metilnih estera i za plinsku kromatografsku analizu. Sadržava i sve pojedinosti djelovanja koje nisu navedene u ovoj standardnoj metodi ili se smatraju opcionalnima zajedno s pojedinostima o bilo kojem događaju koji je mogao utjecati na rezultate.

Izvješće o ispitivanju uključuje sve informacije potrebne za potpunu identifikaciju uzorka.

7.   PRECIZNOST

7.1.   Rezultati međulaboratorijskog ispitivanja

Pojedinosti međulaboratorijskog ispitivanja o preciznosti metode navedene se u Prilogu C normi IOC/T.20/dok. br. 33. Vrijednosti izvedene iz ovog međulaboratorijskog ispitivanja možda neće biti primjenjive na raspone koncentracija i matrice koji se razlikuju od zadanih.

7.2.   Ponovljivost

Apsolutna razlika između rezultata dvaju nezavisnih pojedinačnih ispitivanja koje je primjenom iste metode na jednakom ispitnom materijalu u istom laboratoriju u kratkom vremenskom intervalu izvršio isti analitičar upotrebljavajući istu opremu ne smije u više od 5 % slučajeva biti veća od r zadanog u tablicama 1. do 14. u Prilogu C normi IOC/T.20/dok. br. 33.

7.3.   Obnovljivost

Apsolutna razlika između rezultata dvaju nezavisnih pojedinačnih ispitivanja koja su primjenom iste metode na jednakom ispitnom materijalu u različitim laboratorijima izvršili različiti analitičari upotrebljavajući različitu opremu ne smije u više od 5 % slučajeva biti veća od R zadanog u tablicama 1. do 14. u Prilogu C normi IOC/T.20/dok. br. 33.