02021R0808 — FR — 10.06.2021 — 001.002

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RÈGLEMENT D’EXÉCUTION (UE) 2021/808 DE LA COMMISSION du 22 mars 2021 concernant les performances des méthodes d’analyse des résidus de substances pharmacologiquement actives utilisées chez les animaux producteurs d’aliments et l’interprétation des résultats ainsi que les méthodes à employer pour l’échantillonnage et abrogeant les décisions 2002/657/CE et 98/179/CE (Texte présentant de l’intérêt pour l’EEE) (JO L 180 du 21.5.2021, p. 84)

Modifié par:

		Journal officiel
		n°	page	date
►M1	RÈGLEMENT D’EXÉCUTION (UE) 2021/810 DE LA COMMISSION du 20 mai 2021	L 180	112	21.5.2021

Rectifié par:

C1	Rectificatif, JO L 186 du 27.5.2021, p.  33 (2021/810)

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RÈGLEMENT D’EXÉCUTION (UE) 2021/808 DE LA COMMISSION

du 22 mars 2021

concernant les performances des méthodes d’analyse des résidus de substances pharmacologiquement actives utilisées chez les animaux producteurs d’aliments et l’interprétation des résultats ainsi que les méthodes à employer pour l’échantillonnage et abrogeant les décisions 2002/657/CE et 98/179/CE

(Texte présentant de l’intérêt pour l’EEE)

Article premier

Objet et champ d’application

Le présent règlement établit des règles concernant les méthodes d’analyse à employer pour le prélèvement d’échantillons et les analyses en laboratoire relatives aux résidus de substances pharmacologiquement actives dans les animaux vivants producteurs de denrées alimentaires, leurs parties et fluides corporels, les excréments, les tissus, les produits d’origine animale, les sous-produits animaux, les aliments pour animaux et l’eau. Il fixe également des règles concernant l’interprétation des résultats de ces analyses de laboratoire.

Le présent règlement s’applique aux contrôles officiels visant à vérifier le respect des exigences relatives à la présence de résidus de substances pharmacologiquement actives.

Article 2

Définitions

Aux fins du présent règlement, les définitions figurant à l’article 2 du règlement délégué (UE) 2019/2090 de la Commission ( 1 ), dans le règlement (UE) 2019/1871 de la Commission ( 2 ), à l’article 2 du règlement (CE) no 470/2009 du Parlement européen et du Conseil ( 3 ) et dans le règlement (CEE) no 315/93 du Conseil ( 4 ) s’appliquent.

En outre, on entend par:

Article 3

Méthodes d’analyse

Les États membres veillent à ce que les échantillons prélevés en application de l’article 34 du règlement (UE) 2017/625 soient analysés à l’aide de méthodes répondant aux exigences suivantes:

Article 4

Contrôle de la qualité

Les États membres veillent à la qualité des résultats des analyses effectuées en application du règlement (UE) 2017/625, notamment en contrôlant les essais ou les résultats d’étalonnage conformément à la norme ISO/IEC 17025:2017 Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnages et d’essais, et conformément aux exigences en matière de contrôle de la qualité lors des analyses de routine énoncées à l’annexe I, chapitre 3, du présent règlement.

Article 5

Interprétation des résultats

Article 6

Méthodes d’échantillonnage

Les États membres veillent à ce que les échantillons soient prélevés, manipulés et étiquetés conformément aux modalités d’échantillonnage énoncées à l’annexe II du présent règlement.

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Article 7

Abrogations et mesures transitoires

Les décisions 2002/657/CE et 98/179/CE sont abrogées à compter de la date d’entrée en vigueur du présent règlement.

Toutefois, jusqu’au 10 juin 2026, les exigences énoncées à l’annexe I, parties 2 et 3, de la décision 2002/657/CE continuent de s’appliquer aux méthodes qui ont été validées avant la date d’entrée en vigueur du présent règlement.

Aux fins visées à l’article 8, deuxième alinéa, du règlement (UE) 2019/1871, l’annexe II de la décision 2002/657/CE continue de s’appliquer jusqu’au 27 novembre 2022.

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Article 8

Entrée en vigueur

Le présent règlement entre en vigueur le vingtième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel de l’Union européenne.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

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ANNEXE I

CHAPITRE 1

CRITÈRES DE PERFORMANCES ET AUTRES EXIGENCES APPLICABLES AUX MÉTHODES D’ANALYSE

1.1.    Exigences applicables aux méthodes de dépistage

1.1.1.    Catégories de méthodes de dépistage appropriées

Des méthodes qualitatives, semi-quantitatives ou quantitatives sont utilisées comme méthodes de dépistage.

1.1.2.   Exigences applicables aux méthodes de dépistage biologique, biochimique ou physico-chimique

Pour les substances interdites ou non autorisées, la CCβ doit être aussi faible que raisonnablement possible et, en tout état de cause, inférieure à la valeur de référence (VR), pour les substances pour lesquelles de telles valeurs sont établies en vertu du règlement (UE) 2019/1871.

Pour les substances pharmacologiquement actives autorisées, la CCβ doit être inférieure à la LMR ou à la TM.

Seules les méthodes d’analyse dont on peut démontrer, sur la base de preuves identifiables, qu’elles sont validées et présentent un taux de faux conformes inférieur ou égal à 5 % (erreur β) doivent être appliquées aux fins du dépistage. En cas de suspicion de résultat non conforme, ledit résultat doit être confirmé par une méthode de confirmation.

Les méthodes de dépistage quantitatives utilisées à la fois pour le dépistage et pour la confirmation doivent satisfaire aux exigences en matière d’exactitude, d’intervalle et de fidélité décrites aux points 1.2.2.1 et 1.2.2.2.

1.2.    Exigences applicables aux méthodes de confirmation

1.2.1.    Exigences générales applicables aux méthodes de confirmation

Pour les substances interdites ou non autorisées, la CCα doit être aussi faible que raisonnablement possible. Pour les substances interdites ou non autorisées pour lesquelles une VR est établie en vertu du règlement (UE) 2019/1871, la CCα doit être inférieure ou égale à ladite valeur de référence.

Pour les substances autorisées, la CCα doit être supérieure à la LMR ou à la TM, tout en étant aussi proche que possible.

Aux fins de la confirmation, seules sont utilisées des méthodes d’analyse dont on peut démontrer, sur la base de preuves identifiables, qu’elles sont validées et présentent un taux de faux non conformes (erreur α) inférieur ou égal à 1 % pour les substances interdites ou non autorisées, ou inférieur ou égal à 5 % pour les substances autorisées.

Les méthodes de confirmation doivent fournir des indications sur la composition chimique structurelle de l’analyte. Par conséquent, les méthodes de confirmation fondées uniquement sur l’analyse chromatographique et ne prévoyant pas l’utilisation d’une détection par spectrométrie de masse ne conviennent pas à elles seules comme méthodes de confirmation pour les substances pharmacologiquement actives interdites ou non autorisées. Dans le cas où la spectrométrie de masse ne convient pas à des substances autorisées, d’autres méthodes telles que la CLHP-DAD, la CLHP-DFL, ou une combinaison de ces méthodes, peuvent être appliquées.

Lorsque la méthode de confirmation l’exige, un étalon interne approprié est ajouté à la fraction à analyser au début de l’extraction. En fonction des disponibilités, il y a lieu d’utiliser soit des formes de l’analyte marquées d’un isotope stable qui conviennent particulièrement à la détection par spectrométrie de masse, soit des composés analogues fortement apparentés structurellement à l’analyte. S’il n’est pas possible d’utiliser un étalon interne approprié, l’identification de l’analyte est de préférence confirmée par cochromatographie ( 16 ). Dans ce cas, un seul pic doit être obtenu, l’augmentation de la hauteur (ou aire) du pic correspondant à la quantité d’analyte ajoutée. Si cela n’est pas réalisable, il convient d’utiliser des étalons avec adaptation matricielle ou avec supplémentation matricielle.

1.2.2.    Critères de performances généraux applicables aux méthodes de confirmation

1.2.2.1.   Justesse par récupération

Pour les analyses répétées d’un matériau de référence certifié, l’écart entre, d’une part, la fraction massique moyenne corrigée de la récupération déterminée expérimentalement et, d’autre part, la valeur certifiée doit être conforme aux intervalles de justesse minimale présentés dans le tableau 1.

Lorsque aucun matériau de référence certifié n’est disponible, on peut admettre que la justesse des mesures soit évaluée d’une autre manière, par exemple à l’aide de matériaux disposant de valeurs assignées provenant d’études interlaboratoires ou par ajout de quantités connues du ou des analytes à un blanc de matrice.

1.2.2.2.   Fidélité

Le coefficient de variation (CV) pour l’analyse répétée d’un matériau de référence ou supplémenté dans des conditions de reproductibilité intralaboratoire ne doit pas dépasser le niveau calculé par l’équation d’Horwitz. Cette équation s’énonce comme suit:

CV = 2(1 – 0,5 log C)

où C représente la fraction de la masse exprimée en puissances (exposant) de 10 (par exemple 1 mg/g = 10-3). Pour les fractions massiques inférieures à 120 μg/kg, l’application de l’équation d’Horwitz résulte en des valeurs inacceptables car trop élevées. Par conséquent, le coefficient de variation maximal autorisé ne doit pas être supérieur aux valeurs présentées dans le tableau 2.

Pour les analyses effectuées dans des conditions de répétabilité, le coefficient de variation en conditions de répétabilité doit être égal ou inférieur aux deux tiers des valeurs indiquées dans le tableau 2.

1.2.3.    Exigences applicables à la séparation chromatographique

Pour les chromatographies liquide (CL) ou en phase gazeuse (CG), le temps de rétention minimal admissible pour l’analyte ou les analytes étudiés doit être de deux fois le temps de rétention correspondant au volume vide de la colonne. Le temps de rétention de l’analyte dans l’extrait doit correspondre à celui de l’étalon, d’un étalon avec adaptation matricielle ou d’un étalon avec supplémentation matricielle, avec une tolérance de ± 0,1 minute. Pour la chromatographie rapide, lorsque le temps de rétention est inférieur à 2 minutes, un écart de moins de 5 % du temps de rétention est admissible. En cas d’utilisation d’un étalon interne, le rapport entre le temps de rétention chromatographique de l’analyte et celui de l’étalon interne, c’est-à-dire le temps de rétention relatif de l’analyte, doit correspondre à celui de l’étalon, de l’étalon avec adaptation matricielle ou de l’étalon avec supplémentation matricielle, avec un écart maximal de 0,5 % pour la chromatographie en phase gazeuse et de 1 % pour la chromatographie liquide pour les méthodes validées à partir de la date d’entrée en vigueur du présent règlement.

1.2.4.    Critères de performances spécifiques applicables à la spectrométrie de masse

1.2.4.1.   Détection par spectrométrie de masse

Il convient d’effectuer la détection par spectrométrie de masse en recourant à l’une des options suivantes:

La spectrométrie de masse à basse résolution (SMBR, à la résolution de masse unitaire) comme la spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR), notamment les secteurs à double focalisation, les instruments à temps de vol (TOF) et les instruments Orbitrap, sont acceptés.

Pour confirmer l’identité d’un analyte en spectrométrie de masse à haute résolution (SMHR), l’écart de masse de tous les ions diagnostiques doit être inférieur à 5 ppm (ou, si m/z < 200, inférieur à 1 mDa). Sur cette base, la résolution effective devrait être choisie pour être adaptée à l’usage prévu, la résolution devant généralement être supérieure à 10 000 pour toute la plage de masse avec une vallée de 10 %, ou 20 000 de largeur à mi-hauteur (LMH).

Lorsque la détermination par spectrométrie de masse est effectuée par enregistrement de spectres complets (SMBR et SMHR), seuls les ions diagnostiques ayant une intensité relative supérieure à 10 % dans le spectre de référence de l’étalon, de l’étalon avec adaptation matricielle ou des étalons avec supplémentation matricielle sont acceptables. Les ions diagnostiques doivent inclure l’ion moléculaire (s’il est présent à une intensité ≥ 10 % du pic de base) et des ions fragments ou produits caractéristiques.

Sélection d’ions précurseurs: Lorsque la détermination par spectrométrie de masse est effectuée par fragmentation après sélection d’ions précurseurs, cette sélection est effectuée à la résolution de masse unitaire ou à une meilleure résolution. L’ion précurseur sélectionné doit être l’ion moléculaire, les adduits caractéristiques de l’ion moléculaire, les ions produits caractéristiques ou l’un de leurs ions isotopes. Si la sélection du précurseur comporte une fenêtre de sélection de masse de plus d’un Dalton (par exemple, dans le cas d’une acquisition indépendante de données), la technique est considérée comme une analyse de confirmation par balayage complet.

Ions fragments et produits: Les ions fragments ou produits sélectionnés doivent être des fragments diagnostiques de l’analyte ou du produit mesuré. Les transitions non sélectives (par exemple le cation tropylium ou la perte d’eau) sont omises dans la mesure du possible. L’abondance des ions diagnostiques est déterminée à partir de l’aire ou de la hauteur de pic des chromatogrammes d’ions extraits intégrés. Cette règle s’applique également lorsque des mesures par balayage complet sont utilisées pour l’identification. Le rapport signal-bruit (S/N) de tous les ions diagnostiques doit être supérieur ou égal à trois pour un (3:1).

Intensités relatives: Les intensités relatives des ions diagnostiques (rapport ionique) sont exprimées en pourcentage de l’intensité de l’ion le plus abondant ou de la transition la plus abondante. Il convient de déterminer le rapport ionique en comparant les spectres ou en intégrant les signaux des traces de masse des ions extraits. Le rapport ionique de l’analyte à confirmer doit correspondre à celui des étalons avec adaptation matricielle, des étalons avec supplémentation matricielle ou des solutions étalons à des concentrations comparables, mesuré dans les mêmes conditions, avec un écart relatif de ± 40 %.

Pour toute analyse par spectrométrie de masse, au moins un rapport ionique doit être déterminé. Il concerne de préférence des ions obtenus dans un même balayage, ou éventuellement dans différents balayages relatifs à une même injection (c’est-à-dire balayage complet et balayage de fragmentation).

1.2.4.2.   Identification

Un système de points d’identification est utilisé pour sélectionner les modes d’acquisition et les critères d’évaluation adéquats Pour confirmer l’identité d’une substance dans une matrice pour laquelle une LMR est établie (usage autorisé), un minimum de quatre points d’identification est requis. Pour les substances non autorisées ou interdites, cinq points d’identification sont requis. Un point peut être obtenu pour la séparation chromatographique. Le tableau 3 indique le nombre de points d’identification que permet d’obtenir chacune des techniques. Des points d’identification obtenus avec des techniques différentes peuvent être additionnés pour atteindre le nombre de points requis pour la confirmation.

1.2.5.    Critères de performances spécifiques applicables à la détermination d’un analyte par chromatographie liquide associée à des techniques de détection autres que la spectrométrie de masse

Pour les substances autorisées uniquement, les techniques suivantes peuvent être utilisées comme solution de remplacement aux méthodes fondées sur la spectrométrie de masse, pour autant que les critères applicables à ces techniques soient remplis:

La chromatographie liquide avec détection UV/VIS (longueur d’onde unique) ne convient pas à elle seule comme méthode de confirmation.

1.2.5.1.   Critères de performances applicables à la spectrophotométrie à réseau de diodes en balayage complet

Les critères de performances applicables à la séparation chromatographique visés au point 1.2.3 doivent être remplis.

Les longueurs d’onde d’absorption maximales de l’analyte dans le spectre UV doivent être identiques à celles de l’étalon dans la matrice avec une marge maximale déterminée par la résolution du système de détection. Pour la détection par barrettes de diodes, cette marge maximale est généralement de ± 2 nm. Pour les parties des deux spectres dont l’absorbance relative est supérieure ou égale à 10 %, le spectre de l’analyte au-dessus de 220 nm ne doit pas être différent visuellement du spectre de l’étalon. Ce critère est rempli lorsque, d’une part, les mêmes maxima sont présents et, d’autre part, lorsque la différence des deux spectres n’est en aucun point supérieure à 10 % de l’absorbance de l’étalon. En cas de recherche et de comparaison en bibliothèque assistée par ordinateur, la comparaison des données spectrales des échantillons officiels avec celles de la solution d’étalonnage doit dépasser un facteur de correspondance critique. Ce facteur est déterminé au cours de la procédure de validation pour chaque analyte sur la base des spectres pour lesquels les critères ci-dessus sont remplis. La variabilité des spectres induite par la matrice d’échantillonnage et les performances du détecteur doit être vérifiée.

1.2.5.2.   Critères de performance pour la spectrophotométrie avec détecteur fluorimétrique

Les critères de performances applicables à la séparation chromatographique visés au point 1.2.3 doivent être remplis.

La sélection des longueurs d’onde d’excitation et d’émission associées aux conditions chromatographiques doit être effectuée de manière à réduire à un minimum les effets des composants interférents dans les extraits de blancs. Il devrait y avoir un minimum de 50 nanomètres entre la longueur d’onde d’excitation et la longueur d’onde d’émission.

Le maximum du pic le plus proche dans le chromatogramme doit être séparé du pic de l’analyte désigné par au moins une largeur totale de pic à 10 % de la hauteur maximale du pic de l’analyte.

Cela s’applique aux molécules ayant une fluorescence naturelle et aux molécules qui présentent une fluorescence après la transformation ou la dérivatisation.

CHAPITRE 2

VALIDATION

2.1.    Détermination des caractéristiques de performances des méthodes d’analyse

La validation d’une méthode d’analyse doit démontrer que cette dernière est conforme aux critères applicables pour les caractéristiques de performances correspondantes. Des objectifs de contrôle différents exigent des catégories de méthodes différentes. Le tableau 5 détermine quelle caractéristique de performance doit être vérifiée pour quel type de méthode; une explication complémentaire de chaque paramètre est donnée dans le présent chapitre.

2.2.    Justesse, répétabilité et reproductibilité intralaboratoire

Le présent point contient des exemples et des références concernant les procédures de validation. D’autres approches peuvent être utilisées pour démontrer que la méthode répond aux critères de performances pour autant qu’elles fournissent un niveau et une qualité d’information équivalents.

2.2.1.    Validation classique

Le calcul des paramètres selon les méthodes classiques exige de réaliser plusieurs expériences. Chaque caractéristique de performance doit être déterminée pour chaque variation importante (voir point 2.4). Pour les méthodes multianalytes, plusieurs analytes peuvent être analysés simultanément pour autant que les éventuelles interférences non négligeables aient été écartées. Plusieurs caractéristiques de performances peuvent être déterminées de la même manière. Par conséquent, pour réduire la charge de travail, il est recommandé de combiner autant que possible les expériences (par exemple répétabilité et reproductibilité intralaboratoire avec spécificité, analyse des blancs pour déterminer la limite de décision aux fins de la confirmation et essai de spécificité).

2.2.1.1.   Justesse sur la base d’un matériau de référence certifié

Il est préférable de déterminer la justesse d’une méthode d’analyse au moyen d’un matériau de référence certifié (MRC). La procédure à cet égard est décrite dans la norme ISO 5725-4:1994 ( 17 ).

En voici un exemple:

Justesse (%) = concentration moyenne détectée corrigée de la récupération × 100/valeur certifiée

2.2.1.2.   Justesse sur la base d’échantillons supplémentés

Si aucun matériau de référence certifié n’est disponible, la justesse de la méthode doit être déterminée par des expériences utilisant un blanc de matrice supplémenté, suivant a minima le schéma suivant:

Justesse (%) = concentration moyenne détectée corrigée de la récupération × 100/niveau d’enrichissement

Pour les méthodes appliquées aux substances autorisées validées avant la date d’application du présent règlement, il suffit de déterminer la justesse de la méthode à l’aide de 6 aliquotes supplémentées à 0,5, 1,0 et 1,5 fois la LMR ou la TM.

2.2.1.3.   Répétabilité

Pour les méthodes validées avant la date d’entrée en vigueur du présent règlement qui sont appliquées aux substances autorisées, il suffit de déterminer la répétabilité à l’aide de matrices supplémentées à des concentrations de 0,5, 1,0 et 1,5 fois la LMR ou la TM.

Le calcul de la répétabilité peut également être effectué conformément à la norme ISO 5725-2:2019 ( 22 ).

2.2.1.4.   Reproductibilité intralaboratoire

Pour les méthodes validées avant la date d’entrée en vigueur du présent règlement qui sont appliquées aux substances autorisées, il suffit de déterminer la reproductibilité intralaboratoire à l’aide de matrices supplémentées à des concentrations de 0,5, 1,0 et 1,5 fois la LMR ou la TM.

Le calcul de la reproductibilité intralaboratoire/de la fidélité intermédiaire peut également être effectué conformément aux normes ISO 5725-2:2019, ISO 11843-1:1997 ( 23 ), et aux directives Codex CAC/GL 59-2006 ( 24 ).

2.2.2.    Validation sur la base d’autres modèles

Le calcul des paramètres sur la base d’autres modèles exige d’exécuter un plan d’expérience. Le plan d’expérience doit être établi en fonction du nombre d’espèces et de facteurs différents à étudier. Par conséquent, la première étape de la procédure de validation consiste à examiner les populations d’échantillons qui seront ensuite analysées en laboratoire de manière à déterminer les espèces les plus importantes et les facteurs susceptibles d’influer sur les résultats de mesure. L’approche factorielle permet d’évaluer l’incertitude de mesure des résultats d’essai obtenus dans diverses conditions d’essai dans un laboratoire donné, tels que des analystes différents, des instruments différents, des lots de réactifs différents, des matrices différentes, des durées d’essai et des températures d’essai différentes. Par la suite, la plage de concentration doit être choisie d’une manière adaptée à sa finalité en fonction de la LMR ou de la TM, pour les substances autorisées, ou en fonction de la VR ou du LCL, pour les substances interdites ou non autorisées.

L’approche factorielle vise à établir des données de fidélité et des données de mesure fiables lors de la variation simultanée et contrôlée des facteurs sélectionnés. Elle permet d’évaluer l’incidence combinée des effets factoriels et des effets aléatoires. Le plan d’expérience permet également d’étudier la robustesse ( 25 ) de la méthode d’analyse et de déterminer l’écart type de reproductibilité interne entre les matrices.

Un exemple de méthode de remplacement s’appuyant sur un plan d’expérience orthogonal est présenté ci-après.

Il est possible d’examiner jusqu’à sept facteurs (facteurs de bruit). L’étude est conçue de manière que la fidélité, la justesse (sur la base d’échantillons supplémentés), la sensibilité, l’incertitude de mesure et les concentrations critiques puissent être déterminées simultanément par la mise en œuvre du plan d’expérience.

Le calcul des caractéristiques de la méthode doit être effectué selon la description de Jülicher et al. ( 26 ).

2.2.3.    Autres approches de validation

D’autres approches peuvent être utilisées pour démontrer que la méthode répond aux critères de performances applicables aux caractéristiques de performances, pour autant qu’elles fournissent un niveau et une qualité d’information équivalents. On peut aussi effectuer la validation en procédant à une étude interlaboratoire telle que définie par le Codex alimentarius, l’ISO ou l’IUPAC ( 27 ), ou par d’autres méthodes telles que des études monolaboratoires ou une validation interne ( 28 ). Lorsque d’autres méthodes de validation sont appliquées, il y a lieu de définir le modèle et la stratégie de base avec les prérequis, les hypothèses et les formules correspondantes dans le protocole de validation ou au moins d’en indiquer les références.

2.3.    Sélectivité/Spécificité

La capacité de discrimination entre l’analyte et des substances proches doit être déterminée dans toute la mesure du possible. Il convient de déterminer les interférences d’homologues, d’isomères, de produits de dégradation, de substances endogènes, d’analogues, de métabolites du résidu considéré, de composés matriciels ou de toute autre substance potentiellement interférente et, si nécessaire, de modifier la méthode appliquée pour éviter les interférences recensées. Afin de déterminer la spécificité de la méthode, l’approche suivante est utilisée:

2.4.    Robustesse

La méthode d’analyse doit être soumise à des essais visant à déterminer si ses performances sont maintenues dans des conditions expérimentales différentes, pouvant inclure notamment des conditions d’échantillonnage différentes et des variations mineures susceptibles de survenir lors des essais de routine. Pour tester la robustesse de la méthode, les variations introduites dans les conditions expérimentales doivent être mineures. L’importance de ces variations doit être évaluée. Chaque caractéristique de performance doit être déterminée pour toutes les variations mineures pour lesquelles un effet notable sur les performances de l’essai a été démontré.

2.5.    Stabilité

La stabilité de l’étalon, de l’étalon avec adaptation matricielle et/ou des étalons avec supplémentation matricielle ainsi que de l’analyte ou des constituants de la matrice de l’échantillon pendant l’entreposage ou l’analyse doit être déterminée, car les instabilités peuvent influencer les résultats des essais.

Généralement, la stabilité de l’analyte est bien caractérisée dans différentes conditions d’entreposage. Les expériences réalisées pour contrôler les conditions d’entreposage des étalons et des échantillons, qui sont réalisées dans le cadre du système normal d’accréditation et de contrôle de la qualité des laboratoires, peuvent fournir les informations requises. Si des données de stabilité sont disponibles pour les analytes de la matrice (par exemple sur la base des informations des LRUE, des données publiées, etc.), il n’est pas nécessaire que ces données soient déterminées par chaque laboratoire. Toutefois, le renvoi aux données disponibles en matière de stabilité des analytes en solution et dans la matrice n’est acceptable que si des conditions identiques sont appliquées.

Si les données de stabilité requises ne sont pas disponibles, les approches suivantes devraient être appliquées.

2.5.1.    Détermination de la stabilité de l’analyte en solution

Analyte restant (%) = Ci × 100/Cfraîche

Ci = concentration à l’instant i considéré

Cfraîche = concentration de la solution fraîche.

La valeur moyenne de cinq solutions répliquées ayant été entreposées ne doit pas s’écarter de plus de 15 % de la valeur moyenne de cinq solutions répliquées fraîchement préparées. La valeur moyenne des cinq solutions fraîchement préparées sert de base au calcul de la différence en pourcentage.

2.5.2.    Détermination de la stabilité du ou des analytes dans la matrice

La valeur moyenne de cinq solutions répliquées ayant été entreposées et la valeur moyenne de cinq solutions répliquées fraîchement préparées ne peuvent au plus différer que de la reproductibilité intralaboratoire de la méthode. La valeur moyenne des cinq solutions fraîchement préparées sert de base au calcul de la différence en pourcentage.

2.6.    Limite de décision aux fins de la confirmation (CCα)

La CCα est déterminée pour les méthodes de confirmation. La CCα doit être établie dans des conditions conformes aux exigences en matière d’identification ou en matière d’identification et de quantification définies dans les «Critères de performances et autres exigences applicables aux méthodes d’analyse» énoncés au chapitre 1.

Pour le contrôle de la conformité des échantillons, l’incertitude type composée a déjà été prise en compte dans la valeur CCα (limite de décision aux fins de la confirmation).

2.7.    Capacité de détection aux fins du dépistage (CCβ)

La CCβ est déterminée pour les méthodes de dépistage. La CCβ doit être établie conformément aux «Critères de performances et autres exigences applicables aux méthodes d’analyse» énoncés au chapitre 1 de la présente annexe et conformément aux exigences énoncées dans le tableau 5. Toutefois, il n’est pas nécessaire d’appliquer l’ensemble des exigences d’identification (points 1.2.3, 1.2.4 et 1.2.5) aux méthodes de dépistage.

2.8.    Courbes d’étalonnage

Lorsque des courbes d’étalonnage sont utilisées pour la quantification:

Pour les courbes d’étalonnage fondées sur une solution étalon ou sur des étalons avec adaptation matricielle ou avec supplémentation matricielle, les plages acceptables doivent être indiquées pour les paramètres de la courbe d’étalonnage qui peuvent varier d’une série à l’autre.

2.9.    Rendement absolu

Le rendement absolu de la méthode est déterminé lorsque aucun étalon interne ou aucun étalonnage avec supplémentation matricielle n’est utilisé.

Lorsque les exigences de justesse énoncées dans le tableau 1 sont remplies, un facteur de correction fixe peut être utilisé. Dans le cas contraire, le facteur de récupération obtenu pour ce lot spécifique doit être utilisé. Il est également possible de recourir à la procédure d’ajout dosé ( 31 ) ou à un étalon interne au lieu d’un facteur de correction de récupération.

Le rendement absolu est calculé pour au moins six lots représentatifs de la matrice.

Une aliquote du blanc de matrice doit être supplémentée avec l’analyte avant extraction et une seconde aliquote du blanc de matrice doit être supplémentée après la préparation de l’échantillon à un niveau de concentration approprié et la concentration de l’analyte doit être déterminée.

La récupération est calculée comme suit:

Rec (analyte) = (étalon avec supplémentation matricielle)/(étalon avec adaptation matricielle) × 100

2.10.    Effets de matrice relatifs

L’effet de matrice relatif doit être déterminé dans tous les cas. Cette détermination peut se faire soit dans le cadre de la validation, soit dans le cadre d’expériences distinctes. Le calcul de l’effet de matrice relatif doit être effectué pour au moins 20 lots blancs différents (matrice/espèce), selon le champ d’application de la méthode, par exemple les différentes espèces à couvrir.

Le blanc de matrice doit être supplémenté après extraction avec l’analyte à la VR, à la LMR ou à la TM et analysé parallèlement à une solution pure de l’analyte.

L’effet de matrice relatif ou le facteur de matrice (FM) est calculé comme suit:

EI = : étalon interne

EAM = : étalon avec adaptation matricielle

Le coefficient de variation ne doit pas être supérieur à 20 % pour le FM (étalon normalisé pour l’EI).

CHAPITRE 3

CONTRÔLE DE LA QUALITÉ LORS DES ANALYSES DE ROUTINE — VÉRIFICATION CONTINUE DES PERFORMANCES DE LA MÉTHODE

Les exigences d’assurance de la qualité des résultats d’analyse énoncées au chapitre 7.7 de la norme ISO/IEC 17025:2017 ( 32 ) doivent être respectées.

Lors de l’analyse de routine, l’analyse des matériaux de référence certifiés (MRC) est l’option à privilégier pour obtenir des preuves des performances de la méthode. Étant donné qu’il est rare de disposer de MRC contenant les analytes pertinents aux niveaux de concentration requis, il est également possible d’utiliser des matériaux de référence fournis et caractérisés par les LRUE ou les laboratoires titulaires d’une accréditation ISO/IEC 17043:2010 ( 33 ). Des matériaux de référence internes, qui font l’objet d’un contrôle régulier, peuvent également être utilisés.

La vérification continue des performances de la méthode par une analyse de routine doit être effectuée tant au stade du dépistage qu’au stade de la confirmation.

L’ordre suivant est recommandé pour les échantillons de contrôle de la qualité: échantillon de contrôle de l’adéquation de l’instrument, échantillon de contrôle conforme, échantillon(s) à confirmer, à nouveau échantillon de contrôle conforme et échantillons de contrôle de la qualité supplémentés (échantillons de contrôle non conformes).

Pour les méthodes quantitatives, avec chaque lot d’échantillons officiels, une courbe d’étalonnage doit être analysée et mesurée avant ou après les échantillons énumérés ci-dessus.

Dans la mesure du possible, la justesse (sur la base d’échantillons supplémentés) de tous les analytes cibles présents dans les échantillons de contrôle non conformes doit être évaluée au moyen de cartes de contrôle qualité conformément au chapitre 7.7 de la norme ISO/IEC 17025:2017. Si cela nécessite un nombre disproportionné de déterminations de la justesse, le nombre d’analytes peut être réduit à un nombre d’analytes représentatifs.

CHAPITRE 4

EXTENSION DU CHAMP D’APPLICATION VALIDÉ D’UNE MÉTHODE PRÉCÉDEMMENT VALIDÉE

Il est parfois nécessaire d’étendre le champ d’application d’une méthode entièrement validée précédemment. Dans ces cas, le champ d’application devrait être étendu d’une manière efficace et rigoureuse sur le plan analytique. Pour ce faire, il est possible de procéder à une validation sur un nombre réduit d’échantillons (par exemple, la moitié des échantillons) par rapport à une validation complète.

Néanmoins, le type et le nombre de modifications à valider dans un unique plan de validation réduit doivent toujours être fondés sur les connaissances d’experts et les expériences antérieures: par exemple, un changement de technique de détection nécessiterait en tout état de cause une validation complète.

D’une manière générale, pour assurer la validité permanente de la méthode, ses performances doivent être contrôlées en continu et comparées aux paramètres de validation initialement obtenus. Idéalement, ce contrôle continu des performances de la méthode est conçu de manière que les données manquantes pour une validation complète puissent être collectées au fil du temps (par exemple, avec quelques données provenant d’échantillons de contrôle qualité à chaque série d’analyses).

4.1.    Extension des méthodes en ce qui concerne la plage de concentrations

Lors de la modification des LMR, des TM et des VR, il peut s’avérer nécessaire d’ajuster la plage de concentrations pour laquelle une méthode est validée. Dans ce cas, l’application d’un plan de validation réduit est acceptable.

Les courbes d’étalonnage relatives à la plage modifiée doivent être préparées conformément à la procédure validée. Il convient d’analyser différents lots supplémentés à des niveaux de concentration différents (voir points 2.2.1 et 2.2.2). La justesse, la répétabilité et la reproductibilité intralaboratoire/fidélité intermédiaire doivent se situer dans une plage acceptable par rapport à la méthode initialement validée. Le cas échéant, un nouveau calcul de la CCβ (pour les méthodes de dépistage) et la CCα (pour les méthodes de confirmation) doit être effectué.

4.2.    Extension des méthodes en ce qui concerne des substances supplémentaires

De manière générale, l’extension d’une méthode à d’autres composés n’est possible que pour des analytes comparables, en matière de structure et de caractéristiques, aux analytes déjà couverts par la méthode d’analyse. Dans ce cas, l’application d’un plan de validation réduit est acceptable. De même, aucun écart n’est autorisé par rapport à la description de la méthode.

Les courbes d’étalonnage des substances supplémentaires doivent être préparées conformément à la procédure validée. Il convient d’analyser différents lots de matériaux matriciels, supplémentés à des niveaux de concentration différents (voir points 2.2.1 et 2.2.2). La justesse, la répétabilité et la reproductibilité intralaboratoire/fidélité intermédiaire doivent se situer dans une plage comparable à celle des autres analytes de la méthode initialement validée et être conformes aux exigences énoncées au point 1.2.2. Il convient de procéder au calcul de la CCβ (pour les méthodes de dépistage) et de la CCα (pour les méthodes de confirmation) pour les nouveaux analytes.

4.3.    Extension des méthodes en ce qui concerne des matrices/espèces

La décision d’inclure de nouvelles matrices ou espèces pour une méthode d’analyse déjà validée doit toujours être prise au cas par cas sur la base des connaissances et de l’expérience acquises à ce jour avec la méthode en question et des expériences préliminaires évaluant les effets de matrice et les interférences potentiels. De manière générale, une telle extension ne sera possible que pour les matrices présentant des propriétés similaires et pour les analytes non critiques (stabilité, détectabilité).

Les courbes d’étalonnage (étalon ou matrice) doivent être préparées conformément à la procédure validée. Il convient d’analyser différents lots de matériau matriciel, supplémentés à des niveaux de concentration différents (voir points 2.2.1 et 2.2.2). La justesse, la répétabilité et la reproductibilité intralaboratoire/fidélité intermédiaire doivent se situer dans une plage acceptable par rapport à la méthode initialement validée et être conformes aux exigences énoncées au point 1.2.2. En fonction de la méthode de validation, un nouveau calcul de la CCβ (pour les méthodes de dépistage) ou de la CCα (pour les méthodes de confirmation) peut s’avérer nécessaire.

Si les résultats ne se situent pas dans une plage acceptable par rapport aux valeurs de la matrice initiale, une nouvelle validation complète sera nécessaire pour déterminer les paramètres de performances spécifiques de la matrice/l’espèce.

Dans les cas où les LMR d’une substance spécifique diffèrent pour certaines matrices, il sera vraisemblablement difficile d’adapter le champ d’application de la méthode à la nouvelle matrice/espèce et à la concentration, étant donné que, dans ce cas, deux variations doivent être prises en considération. Dans ce cas, une validation complète est recommandée.

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ANNEXE II

PROCÉDURES D’ÉCHANTILLONNAGE ET TRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS OFFICIELS

1.    Quantité de l’échantillon

La quantité minimale de l’échantillon est définie dans le programme national de surveillance des résidus. Elle est suffisante pour permettre aux laboratoires agréés d’effectuer les procédures analytiques nécessaires pour réaliser les analyses de dépistage et de confirmation. En ce qui concerne spécifiquement les volailles, l’aquaculture, les lapins, le gibier d’élevage, les reptiles et les insectes, un échantillon est constitué d’un ou plusieurs animaux, selon les exigences applicables aux méthodes d’analyse. En ce qui concerne les œufs, la taille de l’échantillon est au moins de 12 œufs ou plus selon la méthode d’analyse utilisée. Si plusieurs catégories de substances doivent être analysées dans un même échantillon au moyen de méthodes d’analyse différentes, la taille de l’échantillon est augmentée en conséquence.

2.    Division en sous-échantillons

Sauf impossibilité technique ou absence de prescription en ce sens dans la législation nationale, tout échantillon est divisé en au moins deux sous-échantillons équivalents permettant chacun la réalisation de la procédure analytique complète. La subdivision peut être effectuée sur le lieu d’échantillonnage ou en laboratoire.

3.    Traçabilité

Chaque échantillon est prélevé de telle sorte qu’il soit toujours possible de remonter jusqu’à l’exploitation d’origine et au lot d’animaux ou à l’animal particulier, le cas échéant. En particulier, pour le lait, selon le choix de l’État membre, les échantillons peuvent être prélevés dans l’un ou l’autre des lieux suivants:

4.    Récipients contenant les échantillons

Les échantillons sont collectés dans des récipients appropriés de nature à assurer l’intégrité et la traçabilité de l’échantillon. En particulier, les récipients sont conçus pour éviter la substitution, la contamination croisée et la détérioration des échantillons. Les récipients sont scellés officiellement.

5.    Rapport de prélèvement

Un rapport est établi à l’issue de chaque procédure d’échantillonnage.

L’inspecteur consigne au moins les données suivantes dans le rapport de prélèvement:

Le nombre de copies imprimées ou électroniques du rapport à fournir varie en fonction de la procédure d’échantillonnage. Le rapport de prélèvement et ses copies sont remplis de manière à en garantir l’authenticité et la validité juridique, ce qui peut nécessiter que ces documents soient signés par l’inspecteur. En cas de prélèvement en exploitation, l’agriculteur ou son représentant peut être invité à signer l’original du rapport de prélèvement.

L’original du rapport de prélèvement est conservé par l’autorité compétente, qui doit s’assurer qu’aucune personne non autorisée ne peut avoir accès à cet original.

Le cas échéant, l’exploitant ou le propriétaire de l’établissement peut être informé du prélèvement d’échantillons.

6.    Rapport de prélèvement destiné au laboratoire

Le rapport de prélèvement établi par les autorités compétentes à l’attention du laboratoire est conforme aux exigences énoncées au chapitre 7 de la norme ISO/IEC 17025:2017 ( 34 ) et contient au moins les informations suivantes:

Le rapport de prélèvement destiné au laboratoire accompagne l’échantillon lors de l’envoi de celui-ci au laboratoire.

7.    Transport et entreposage

Les programmes de surveillance des résidus définissent les conditions appropriées d’entreposage et de transport pour chaque combinaison analyte/matrice afin d’assurer la stabilité de l’analyte et l’intégrité de l’échantillon. La durée de transport est aussi courte que possible et la température pendant le transport est propre à garantir la stabilité de l’analyte.

Une attention particulière est à réserver aux caisses de transport, à la température et aux délais de livraison au laboratoire compétent.

En cas de non-respect des prescriptions du programme de surveillance, le laboratoire en informe immédiatement l’autorité compétente.

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( 1 ) Règlement délégué (UE) 2019/2090 de la Commission du 19 juin 2019 complétant le règlement (UE) 2017/625 du Parlement européen et du Conseil en ce qui concerne les cas de non-conformité, établie ou soupçonnée, aux règles de l’Union applicables à l’utilisation ou aux résidus de substances pharmacologiquement actives autorisées dans les médicaments vétérinaires ou en tant qu’additifs destinés à l’alimentation des animaux, ou aux règles de l’Union applicables à l’utilisation ou aux résidus de substances pharmacologiquement actives interdites ou non autorisées (JO L 317 du 9.12.2019, p. 28).

( 2 ) Règlement (UE) 2019/1871 de la Commission du 7 novembre 2019 relatif aux valeurs de référence pour les substances pharmacologiquement actives non autorisées présentes dans les denrées alimentaires d’origine animale et abrogeant la décision 2005/34/CE (JO L 289 du 8.11.2019, p. 41).

( 3 ) Règlement (CE) no 470/2009 du Parlement européen et du Conseil du 6 mai 2009 établissant des procédures communautaires pour la fixation des limites de résidus des substances pharmacologiquement actives dans les aliments d’origine animale, abrogeant le règlement (CEE) no 2377/90 du Conseil et modifiant la directive 2001/82/CE du Parlement européen et du Conseil et le règlement (CE) no 726/2004 du Parlement européen et du Conseil (JO L 152 du 16.6.2009, p. 11).

( 4 ) Règlement (CEE) no 315/93 du Conseil du 8 février 1993 portant établissement des procédures communautaires relatives aux contaminants dans les denrées alimentaires (JO L 37 du 13.2.1993, p. 1).

( 5 ) ISO 3534-1: 2006 Statistique — Vocabulaire et symboles — Partie 1: Termes statistiques généraux et termes utilisés en calcul des probabilités (Chapitre 1).

( 6 ) Directive 2001/82/CE du Parlement européen et du Conseil du 6 novembre 2001 instituant un code communautaire relatif aux médicaments vétérinaires (JO L 311 du 28.11.2001, p. 1).

( 7 ) JCGM 200:2008, Vocabulaire international de métrologie — concepts fondamentaux et généraux et termes associés (VIM), troisième édition 2008: https://www.iso.org/sites/JCGM/VIM-JCGM200.htm [chapitre 5 Normes de mesure (Étalons)].

( 8 ) Règlement (CE) no 124/2009 de la Commission du 10 février 2009 établissant des valeurs maximales pour la présence dans les denrées alimentaires de coccidiostatiques ou d’histomonostatiques résultant du transfert inévitable de ces substances vers des aliments pour animaux non cibles (JO L 40 du 11.2.2009, p. 7).

( 9 ) Règlement (UE) no 37/2010 de la Commission du 22 décembre 2009 relatif aux substances pharmacologiquement actives et à leur classification en ce qui concerne les limites maximales de résidus dans les aliments d’origine animale (JO L 15 du 20.1.2010, p. 1).

( 10 ) Commission du Codex Alimentarius, Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture/Organisation mondiale de la santé, directives sur la terminologie analytique (CAC/GL 72-2009).

( 11 ) ISO 5725-1:1994 Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure — Partie 1: Principes généraux et définitions (chapitre 3).

( 12 ) ISO 80000-1:2009 Grandeurs et unités — Partie 1: Généralités (Introduction).

( 13 ) Directive 80/181/CEE du Conseil du 20 décembre 1979 concernant le rapprochement des législations des États membres relatives aux unités de mesure et abrogeant la directive 71/354/CEE (JO L 39 du 15.2.1980, p. 40).

( 14 ) ISO/CEI 17025:2017, Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnages et d’essais (chapitre 3).

( 15 ) ISO 78-2: 1999 Chimie — Plans de normes — Partie 2: Méthodes d’analyse chimique (Annexes).

( 16 ) La cochromatographie est une méthode dans laquelle l’échantillon extrait à tester avant la ou les étapes chromatographiques est divisé en deux fractions. Une fraction fait l’objet d’une chromatographie en l’état. La deuxième fraction est mélangée avec l’analyte étalon à mesurer. Ce mélange est ensuite chromatographié. La quantité d’analyte étalon ajoutée doit être comparable à la quantité estimée de l’analyte contenue dans l’extrait. L’utilisation de la cochromatographie vise à améliorer l’identification d’un analyte par des méthodes chromatographiques, en particulier lorsqu’il est impossible d’utiliser un étalon interne approprié.

( 17 ) ISO 5725-4:2020 Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure – Partie 4: Méthodes de base pour la détermination de la justesse d’une méthode de mesure normalisée (Chapitre 3).

( 18 ) Lorsque, pour une substance pharmacologiquement active non autorisée, la validation d’une concentration de 0,5 fois la VR n’est pas raisonnablement possible, cette valeur peut être remplacée par la concentration la plus faible, comprise entre 0,5 et 1,0 fois la VR, que l’on peut raisonnablement atteindre.

( 19 ) Lorsque, pour une substance pharmacologiquement active spécifique, la validation d’une concentration de 0,1 fois la LMR n’est pas raisonnablement possible, cette valeur peut être remplacée par la concentration la plus faible, comprise entre 0,1 et 0,5 fois la LMR, que l’on peut raisonnablement atteindre.

( 20 ) Lorsque, pour une substance pharmacologiquement active non autorisée, la validation d’une concentration de 0,5 fois la VR n’est pas raisonnablement possible, cette valeur peut être remplacée par la concentration la plus faible comprise, entre 0,5 et 1,0 fois la VR, que l’on peut raisonnablement atteindre.

( 21 ) Lorsque, pour une substance pharmacologiquement active spécifique, la validation d’une concentration de 0,1 fois la LMR n’est pas raisonnablement possible, cette valeur peut être remplacée par la concentration la plus faible, comprise entre 0,1 et 0,5 fois la LMR, que l’on peut raisonnablement atteindre.

( 22 ) ISO 5725-2:2019 Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure – Partie 2: Méthode de base pour la détermination de la répétabilité et de la reproductibilité d’une méthode de mesure normalisée (Chapitre 3).

( 23 ) ISO 11843-1:1997 Capacité de détection – Partie 1: Termes et définitions.

( 24 ) Commission du Codex Alimentarius, Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture/Organisation mondiale de la santé, directives pour l’estimation de l’incertitude des résultats (CAC/GL 59-2006).

( 25 ) Les variations de conditions expérimentales qui y sont mentionnées peuvent porter sur les matériaux échantillonnés, les analytes, les conditions d’entreposage, l’environnement et/ou la préparation de l’échantillon. Pour toutes les conditions d’expérience qui, dans la pratique, sont sujettes à des variations (par exemple: stabilité des réactifs, composition de l’échantillon, pH, température), toutes les variations pouvant influencer le résultat de l’analyse doivent être indiquées.

( 26 ) Jülicher, B., Gowik, P. et Uhlig, S. (1998), Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 120, 173.

( 27 ) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.

( 28 ) Gowik, P., Jülicher, B. et Uhlig, S. (1998), Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221.

( 29 ) ISO 11843-1:1997 Capacité de détection — Partie 1: Termes et définitions.

( 30 ) Règlement d’exécution (UE) 2018/470 de la Commission du 21 mars 2018 portant dispositions détaillées sur les limites maximales de résidus applicables aux fins des contrôles de denrées alimentaires issues d’animaux traités dans l’Union européenne en application de l’article 11 de la directive 2001/82/CE (JO L 79 du 22.3.2018, p. 16).

( 31 ) La quantité d’analyte étalon ajoutée peut se situer par exemple entre deux et cinq fois la quantité estimée de l’analyte contenue dans l’échantillon. Cette procédure permet de déterminer le contenu d’un analyte dans un échantillon compte tenu de la récupération de la procédure d’analyse.

( 32 ) ISO/IEC 17025: 2017 Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnages et d’essais (Chapitre 7.7).

( 33 ) ISO/IEC 17043:2010 Évaluation de la conformité — Exigences générales concernant les essais d’aptitude.

( 34 ) ISO/IEC 17025: 2017 Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnages et d’essais (Chapitre 7.7).