►B

ВТОРА ДИРЕКТИВА НА КОМИСИЯТА

от 14 май 1982 година

за сближаване на законодателството на държавите-членки относно методите за анализ, необходими за контрола върху състава на козметичните продукти

(82/434/ЕИО)

(ОВ L 185, 30.6.1982, p.1)

Официален вестник

  No

page

date

►M1

Директива на Комисията 90/207/ЕИО от 4 април 1990 година

  L 108

92

28.4.1990

2.1.

0,.5 % (m/v) водни контролни разтвори на следните съединения:

2.2.

Проявяващ разтворител А, 80 % (v/v) етанол

2.3.

Проявяващ разтворител Б, бензол-метанол-3-метил бутан-1-ол–вода (34:38:18:10 обемни)

2.4.

Проявител А, 10 % (m/v) воден разтвор на калиев йодид

2.5.

Детектор Б, 1 % (m/v) воден разтвор на нишесте

2.6.

Детектор В, 10 % (m/m) солна киселина

2.7.

4N солна киселина

3.1.

Хроматографска хартия (хартия Whatman № 3 и № 4 или еквивалентна)

3.2.

Микропипета, 1 μl

3.3.

Пикнометри, 100 мл

3.4.

Нагънати филтри

3.5.

Апаратура за низходяща хартиена хроматография

4.2.1.

Претеглят се 1 г и 5 г от пробата и се диспергират в 50 мл вода, всяка една се долива до 100 мл с вода и се разбърква. Двете дисперсии се филтрират посредством нагънат филтър (точка 3.4) и от всеки от филтратите се използва по 1 μl за провеждането на описаната в раздел 5 хартиена хроматография.

4.2.2.

От всяка проба се приготвят отново две дисперсии чрез диспергиране на 1 г и 5 г в 50 мл вода, извършва се подкисляване с разредена солна киселина (точка 2.7), долива се с вода до 100 мл и се разбърква. Дисперсиите се филтрират посредством нагънат филтър (точка 3.4) и от всеки от филтратите се използва по 1 μl за провеждането на описаната в точка 5 хартиена хроматография.

5.1.

В две различни хроматографски камери се слагат подходящи количества от проявяващи разтворители А (точка 2.2) и Б (точка 2.3) за провеждане на низходяща хартиена хроматография. С пари от разтворителите се извършва насищане на хроматографските камери в продължение на 24 часа.

5.2.

Върху предназначената за хроматографията хартиена лента (Whatman № 3 или еквивалентна) с дължина 40 см и ширина 20 см (точка 3.1), или друг подходящ формат, във всяка от изходните позиции се нанасят по 1 μl от разтвора от едната проба и единия от приготвените в съответствие с точка 4 и точка 2.1 еталонни разтвори и разтворите се изпаряват във въздуха.

5.3.

Хроматографската лента (точка 5.2) се поставя в хроматографската вана, запълнена с проявяващ разтворител (точка 5.1) и се извършва развиване до придвижване на фронта на разтворителя с 35 см (около 15 часа).

5.4.

Описаните в точка 5.2 и точка 5.3 процедури се повтарят с хроматографска хартия (Whatman № 4 или еквивалентна) (точка 3.1) и с проявяващ разтворител Б. Хроматографира се до придвижване на фронта на разтворителя с 35 см (около пет часа).

5.5.

След проявяването хроматограмите се изваждат и сушат на въздуха.

5.6.

Петната върху хроматограмите се открояват чрез последователно напръскване със:

5.7.

При горепосочените условия, отнасящи се до проявяващите разтворители А (точка 2.2) и Б (точка 2.3), Rf стойностите на еталонните разтвори (точка 2.1) са приблизително, както следва:

2.1.

Метанол

2.2.

Концентрирана солна киселина 36 % (m/m)

2.3.

Солна киселина 6N

2.4.

Сярна киселина 4N

2.5.

Динатриева сол на родизоновата киселина

2.6.

Бариев хлорид (BaCl2.2H2O)

2.7.

Безводен натриев карбонат

2.8.

Воден разтвор на бариев хлорид 1 % (m/v)

2.9.

Проявяващ разтворител, състоящ се от метанол, концентрирана солна киселина (концентрация 36 %) и вода (80:10:10 обемно съотношение)

2.10.

Детектор, 0,1 % (m/v) воден разтвор на динатриева сол на родизоновата киселина, приготвя се непосредствено преди употреба

3.1.

Микропипета, 5 μl

3.2.

Платинени тигели

3.3.

Пикнометри от 100 мл

3.4.

Хроматографска хартия Schleiсher и Schull 2043b или еквивалентна. Хартията се почиства чрез проявяване за една нощ във ваната за низходящо хроматографиране (заглавие А, точка 3.5), съдържаща проявяващ разтворител (заглавие Б, точка 2.9), и подсушаване.

3.5.

Нагънат филтър

3.6.

Обичайната апаратура за низходящата хартиена хроматография

4.1.1.

2 г от продукта се диспергират в 50 мл вода и pH на дисперсията се довежда до около 1 с помощта на солна киселина (заглавие Б, точка 2.3).

4.1.2.

Дисперсията се прехвърля с вода в 100-милилитровия пикнометър, долива се до марката с вода и се разбърква. Така приготвената дисперсия се използва за анализ чрез хартиена хроматография (анализ, описан в точка 5) и за откриването на бария посредством преципитацията на сулфата.

4.2.1.

Диспергират се 2 г от продукта в 100 мл вода и се филтрират.

4.2.2.

Към изсушения остатък се прибавя натриев карбонат (заглавие Б, точка 2.7) в количество, седем до десет пъти по-голямо от теглото на остатъка, разбърква се и сместа се стапя в платинен тигел (заглавие Б, точка 3.2) в продължение на половин час.

4.2.3.

Охлажда се до стайна температура, стопилката се разтваря в 50 мл вода и се филтрира (заглавие Б, точка 3.5).

4.2.4.

Остатъкът от стопилката се разтваря в солна киселина (заглавие Б, точка 2.3) и се долива с вода до 100 мл. Този разтвор се използва за провеждане на описаната в точка 5 хартиена хроматография и за откриването на бария чрез утаяване на сулфата.

5.1.

Подходящо количество от проявяващия разтворител (заглавие Б, точка 2.9) се поставя във ваната за възходяща хартиена хроматография и се извършва насищане на ваната в продължение на най-малко 15 часа.

5.2.

Върху три стартови точки върху лист хроматографската хартия — обработена предварително по начина, описан в заглавие Б, точка 3.4 — се нанасят по 5 μl от всеки от разтворите, приготвени в съответствие със заглавие Б, точка 4.1.2 и заглавие Б, точка 4.2.4, и еталонния разтвор, описан в заглавие Б, точка 2.8.

5.3.

Пробата се изсушава на въздух и петната се идентифицират. Хроматографира се до достигане на фронта на разтворителя с 30 см в посока нагоре.

5.4.

Хроматограмата се изважда от ваната и се изсушава на въздух.

5.5.

Петната върху хроматограмата се открояват чрез напръскване на хартията с проявител, заглавие Б, точка 2.10; при наличие на барий върху хроматограмата се появяват червени петна с Rf стойност около 0,10.

3.1.

Сярна киселина 2N

3.2.

Калиев йодид

3.3.

Амониев молибдат

3.4.

Натриев тиосулфат 0,1 N

3.5.

Разтвор на калиев йодид, приготвя се непосредствено преди използване, 10 % (m/v)

3.6.

Разтвор на амониев молибдат 20 % (m/v)

3.7.

Разтвор на нишесте 1 % (m/v)

4.1.

Бехерови чаши от 100 мл

4.2.

Бюрета от 50 мл

4.3.

Пикнометри от 250 мл

4.4.

Мерителни цилиндри от 25 и 100 мл

4.5.

Едномаркови пипети, 10 мл

4.6.

Конични колби, 250 мл

5.1.

В 100 милилитрова бехерова чаша се претеглят 10 г. (m gram) от продукта, съдържащи около 0,6 г водороден прекис. Съдържанието се прехвърля с вода в 250-милилитрова стандартна колба, долива се до марката с вода и се разбърква.

5.2.

С пипета в 250 милилитрова конична колба (точка 4.6), се прехвърлят 10 мл от разтвора на пробата (точка 5.1) и се добавят последователно 100 мл сярна киселина 2N (точка 3.1), 20 мл от разтвора на калиевия йодид (точка 3.5) и три капки от разтвора на амониевия молибдат (точка 3.6).

5.3.

Образувалият се йод се титрува веднага с разтвор на натриев тиосулфат 0,1 N (3.4) и, непосредствено преди достигане до крайната точка се добавят няколко милилитра от разтвора на нишестето в качеството му на индикатор (точка 3.7). Записва се величината на изразходваното количество от разтвор на натриевия тиосулфат 0,1 N (точка 3.4) в милилитри (V).

5.4.

По начина, описан в точки 5.2 и 5.3, се извършва контролно определяне чрез замяна на 10 мл от разтвора на пробата с 10 мл вода. Записва се величината на изразходваното количество от 0,1 N разтвор на натриевия тиосулфат в хода на контролното определяне (Vо мл).

m

=

количеството на анализирания продукт в грамове (точка 5.1);

Vo

=

изразходваното количество в милилитри на разтвор на тиосулфата 0,1 N при дозировката на празната проба (точка 5.4),

V

=

изразходваното количество в милилитри на разтвор на тиосулфат 0,1 N за титруването на разтвора на пробата (точка 5.3)

3.1.

Етанол, безводен

3.2.

Ацетон

3.3.

Етанол, 96 % v/v

3.4.

3.5.

L (+)-аскорбинова киселина

3.6.

Хлороформ

3.7.

Циклохексан

3.8.

Азот, технически

3.9.

Толуен

3.10.

Бензол

3.11.

n-Бутанол

3.12.

Бутан-2-ол

3.13.

Хипофосфорна киселина, 50 % v/v разтвор

3.14.

Диазо-реактив. Може да бъде:

3.15.

Сребърен нитрат

3.16.

п-Диметиламинобензалдехид

3.17.

2,5-Диметилфенол

3.18.

Железен хлорид хексахидрат 6 Н2О

3.19.

Солна киселина, 10 % m/v разтвор

3.20.

Еталонните субстанции са като описаните в точка 1 „Цел и приложно поле“. При аминосъединения еталонната субстанция трябва да бъде или хидрохлорид (моно- или ди-), или свободната основа.

3.21.

Приготвя се 0,5 % (m/v) разтвор от всяка от еталонните субстанции от точка 3.20.

В 10-милилитров пикнометър се претеглят 50 мг ± 1 мг от еталонната субстанция.

Добавят се 5 мл 96 % етанол (точка 3.3) и 250 мг аскорбинова киселина (точка 3.5).

Разтворът се алкализира с амонячен разтвор (точка 3.4) до получаване на видимо pH 10 (проверява се с индикаторна хартия).

Долива се до 10 мл с 96 % етанол (точка 3.3) и се разбърква.

Разтворите могат да се съхраняват до една седмица на студено и тъмно място.

В някои случаи след добавянето на аскорбиновата киселина и амоняка може да се образува утайка. Тогава следва да се остави да се утаи, преди да се вземе пробата.

3.22.

3.23.

3.23.1.   Диазо-реактив

Приготвя се 5 % (m/v) воден разтвор от избрания реактив (3.14). Този разтвор трябва да се приготвя непосредствено преди извършването на анализа.

3.23.2.   Реактив на Ерлих

2 г от п-диаметиламинобензалдехида (точка 3.16) се разтварят в 100 мл 10 % (m/v) воден разтвор на солна киселина (точка 3.19).

3.23.3.   2,5-диметилфенол — железен хлорид хексахидрат

Разтвор 1: Разтваря се 1 г диметилфенол (точка 3.17) в 100 мл 96 % етанол (точка 3.3).

Разтвор 2: Разтварят се 4 г железен хлорид хексахидрат (точка 3.18) в 100 мл 96 % етанол (точка 3.3).

При проявяването поотделно се пръска първо с разтвор 1 и след това с разтвор 2.

3.23.4.   Амонячен сребърен нитрат

25 % амоняк (точка 3.4) се добавя към 5 % (m/v) воден разтвор на сребърен нитрат (точка 3.15) до разтварянето на утайката. Този реактив трябва да се приготвя непосредствено преди употреба.

Да не се съхранява.

4.1.

Обичайно лабораторно оборудване за тънкослойна хроматография.

4.2.

Центрофуга, 4 000 оборота/минута

4.3.

Центрофужни епруветки, 10 мл, с резбови запушалки с покритие от политетрафлуоретан, или еквивалентни.

6.1.1.

β-нафтол (β-N)

6.1.2.

2-аминофенол (о-АФ)

6.1.3.

3-аминофенол (м-АФ)

6.1.4.

4-аминофенол(п-АФ)

6.1.5.

2-нитро-1,4-фенилендиамин (2-НПФДА)

6.1.6.

4-нитро-1,2-фенилендиамин (4-НОФДА)

От всяко от допълнителните контролни вещества се приготвя 0,5 % m/v разтвор съгласно описанието в точка 3.21.

6.2.1.

Етилацетат-циклохексан-амонячен разтвор, 25 % (65:30:0,5 обемни)

6.4.1.

Върху абсорбиращата повърхност на плаката за тънкослойна хроматография (точка 4.1.3) се начертават две линии, така както е показано на фигура 1.

6.4.2.

В атмосфера от азот (точка 4.1.1), в стартовата точка (фигура 1), която отстои на 2 см от двете страни, се нанасят между 1 и 4 μl екстракт (точка 5.1). Количеството на екстракта зависи от интензивността на петната върху хроматограмите (точка 5.2).

6.4.3.

Разделят се между точки 2 и 3 (фигура 1) идентифицираните окислителни багрила или багрилата, за които се допуска, че ще бъдат идентифицирани, чрез процедурата в точка 5.2 (разстояние между точките 1,5 см). Нанасят се по 2 μl от всеки от еталонните разтвори — с изключение на ДАФ, от който трябва да се нанесат 6 μl. Тези действия се извършват в атмосфера от азот (точка 6.4.2).

6.4.4.

Операцията от точка 6.4.3 се повтаря в стартовите точки 4 и 5 (фигура 1) и плаката се съхранява в атмосфера от азот до момента на хроматографиране (разстояние между точките 1,5 см).

6.4.5.

Хроматографската вана се продухва с азот (точка 3.8) и се вкарва подходящо количество от проявяващия разтворител 3.22.2. Плаката се поставя (точка 6.4.4) във ваната и се хроматографира в първата посока на елюиране (фигура 1) на тъмно.

Елюирането продължава, докато фронтът на разтворителя достигне линията, маркирана върху плаката (приблизително 13 см).

6.4.6.

Плаката се изважда от ваната и се поставя в предварително продуханата с азот хроматографска вана за изпаряване на елюиращия разтворител в продължение на най-малко 60 минути.

6.4.7.

С помощта на градуирана епруветка в продуханата с азот вана (точка 3.8) се поставя подходящо количество от елюиращия разтворител (точка 6.2), плаката се поставя обърната на 90° във ваната (точка 6.4.6) и се хроматографира във втората посока (също на тъмно), докато фронтът на разтворителя достигне до начертаната върху абсорбиращата повърхност линия. Плаката се изважда от ваната и елюиращият разтворител се изпарява на въздуха.

6.4.8.

Плаката се поставя за 10 минути в хроматографската вана с йодни пари (точка 6.3) и двупосочната хроматограма се разчита с помощта на Rf и стойностите за цветовете на хроматографираните по същото време еталонни субстанции. Таблица II предоставя указания относно Rf -стойностите и цветовете.

Забележка:

За постигане на максимално оцветяване на петната хроматограмата се оставя на въздух за половин час след проявяването.

6.4.9.

Наличието на окислителни багрила, открити в точка 6.4.8, може да бъде потвърдено окончателно с повторение на операциите, описани в точки от 6.4.1 до 6.4.8 и добавяне в стартовата точка 1 на излишък над количеството екстракт, посочено в точка 6.4.2, равен на 1 μl от еталонните субстанции, идентифицирани в точка 6.4.8. Ако при сравняването с хроматограмата, получена в точка 6.4.8, не бъде засечено друго петно, разчитането на хроматограмата от точка 6.4.8 е правилно.

3.1.

3.2.

3.3.

Метанол

3.4.

Разтвор на 2-аминобензалдехид фенилхидразон (реактив Nitrin®) в метанол.

Претеглят се 2,0 г Nitrin ® и се прехвърлят в 100-милилитров пикнометър. На капки се прибавят 4 мл разредена солна киселина (точка 3.2) и се разклаща. Долива се до марката с метанол и се разбърква до пълно избистряне. Разтворът се съхранява в бутилка от кафяво стъкло (точка 4.3).

4.1.

Бехерови чаши, 50 мл

4.2.

Пикнометър от 100 мл

4.3.

Бутилка от кафяво стъкло от 125 мл

4.4.

Стъклена плоча, 10 × 10 см

4.5.

Пластмасова шпатула

4.6.

Филтърна хартия, 10 × 10 см

5.1.

Част от подлежащата на анализ проба се разстила равномерно върху стъклената плочка (точка 4.4), така че повърхността да се покрие със слой с дебелина не по-голяма от 1 см.

5.2.

Лист от филтърната хартия (точка 4.6) се потапя в дестилирана вода. Листът се полага върху пробата и филтърната хартия се притиска надолу с помощта на пластмасовата шпатула (точка 4.5).

5.3.

Изчаква се около една минута и в средата на филтърната хартия се нанасят:

5.4.

След пет до десет секунди филтърната хартия се отстранява и се разглежда на дневна светлина. За наличието на нитрит свидетелства получилото се червеникаво-пурпурно оцветяване.

Ако нитритното съдържание е ниско, червеникаво-пурпурното оцветяване се променя до жълто след изтичането на 5 до 15 секунди. Промяната на цвета настъпва едва след една до две минути при наличие на големи количества нитрит.

4.1.

Реактиви за избистряне: тези реактиви не могат да се използват повече от една седмица след приготвянето им.

4.2.

Разтвор на натриев нитрит

0,500 г натриев нитрит се разтварят в дестилирана вода в 1 000-милилитров пикнометър и се доливат с вода до марката. 10,0 мл от този изходен стандартен разтвор се разреждат до 500 мл; 1 мл от последния разтвор съответства на 10 микрограма NaNO2.

4.3.

1N разтвор на натриева основа

4.4.

0,2 % разтвор на сулфаниламид хидрохлорид

2,0 г сулфаниламид се разтварят в 800 мл вода при подгряване. Извършва се охлаждане и се добавят 100 мл концентрирана солна киселина, като успоредно с това се разбърква. Разрежда се с вода до 1 000 мл.

4.5.

5N разтвор на солна киселина

4.6.

N-1-нафтилов реактив:

Този разтвор трябва да се приготвя в деня, в който ще бъде употребен. 0,1 г от N-1-нафтилетилендиамин дихидрохлорида се разтварят във вода и се разреждат с вода до 100 мл.

5.1.

Аналитична везна

5.2.

Мерителни колби от 100, 250, 500 и 1 000 мл

5.3.

Газови или градуирани пипети

5.4.

Мерителни цилиндри за 100 мл

5.5.

Нагънати филтърни хартии, свободни от нитрити, с диаметър 15 см

5.6.

Водна баня

5.7.

Спектрофотометър с кювети с дължина на траекторията 1 см

5.8.

pH метър

5.9.

Микробюрета за 10 мл

5.10.

Бехерови чаши за 250 мл

6.1.

От хомогенизираната проба се претеглят около 0,5 г (m gram) с точност до 0.1 мг, прехвърлят се количествено с топла дестилирана вода в 250 милилитрова бехерова чаша (точка 5.10) и обемът се довежда до приблизително 150 мл с топла дестилирана вода. Чашата (точка 5.10) се поставя във водна баня (точка 5.6) при 80 °С за половин час. През това време съдържанието се разклаща периодично.

6.2.

Съдържанието се охлажда до стайна температура и последователно, при разбъркване, се добавят 2 мл от реактив Carrez I (точка 4.1.1) и 2 мл от реактив Carrez II (точка 4.1.2).

6.3.

Прибавя се 1N разтвор на натриева основа (точка 4.3) за довеждане на pH до точка 8.3. (Използва се pH-метърът (точка 5.8). Съдържанието се прехвърля количествено в 250 милилитров пикнометър (точка 5.2) и се долива до марката с дестилирана вода.

6.4.

Съдържанието се разбърква и филтрира през нагънатата филтърна хартия (точка 5.5).

6.5.

С пипета (точка 5.3) в 100-милилитров пикнометър (точка 5.2) се прехвърля подходяща аликвотна част (V мл), но не повече от 25 мл, от бистрия разтвор и се добавя дестилирана вода за довеждане на обема до 60 мл.

6.6.

След разбъркване се добавят 10,0 мл разтвор на сулфаниламид хидрохлорид (точка 4.4) и после 6,0 мл от 5N солната киселина (точка 4.5). Сместа се разбърква и се оставя да престои в продължние на пет минути. Добавят се 2,0 мл N-1-нафтил реактив (точка 4.6), разбърква се и разтворът се оставя да престои в продължение на три минути. Разрежда се с вода до марката и се разбърква.

6.7.

Подготвя се изпитване на празна проба, като се повтарят операциите от точка 6.5 и точка 6.6, без да се прибавя N-1-нафтил реактив (точка 4.6).

6.8.

Измерва се (точка 5.7) оптическата плътност на получения в съответствие с точка 6.6 разтвор при 538 nm спрямо празната проба (точка 6.7).

6.9.

От калибровъчната крива (точка 6.10) се отчита съдържанието на натриев нитрит в 100 мл от разтвора (m1 микрограма), което съответства на оптическата плътност, измерена в точка 6.8.

6.10.

С помощта на 10 μg/мл разтвор на натриев нитрит (точка 4.2) се получават калибровъчни криви за концентрации 0, 20, 40, 60, 80 и 100 микрограма натриев нитрит за 100 мл.

m

=

масата на пробата, взета за анализ, в грамове (точка 6.1),

m1

=

съдържанието на натриев нитрит, открито в точка 6.9, в микрограмове,

V

=

броят милилитри от филтрата, използвани за измерването (точка 6.5).

3.2.1.

Фуксин;

3.2.2.

натриев сулфит, хидратиран със 7 Н2О;

3.2.3.

Концентрирана солна киселина (d = 1,19);

3.2.4.

Сярна киселина около 1 М;

3.2.5.

В бехерова чаша с обем 10 мл се претегля 0,1 г фуксин (точка 3.2.1) и се разтваря в 75 cм3 (мл) вода при 80 °С. След охлаждане се прибавят 2,5 г натриев сулфит (3.2.2). Долива се до 100 cм3 (мл).

Продължителност на съхранение: две седмици.

3.3.1.

В бехерова чаша с обем 10 cм3 (мл) се претеглят 2 г от пробата.

3.3.2.

Прибавят се две капки сярна киселина (точка 3.2.4) и 2 cм3 (мл) реактив на Schiff (точка 3.2.5). При употреба този реактив трябва да е абсолютно безцветен.

Разклаща се и се оставя да престои 5 мин.

3.3.3.

Ако през тези 5 мин се наблюдава розово или лилаво оцветяване, формалдехидът присъства в количество, по-голямо от 0,01 % и трябва да се определи по метода за свободен и свързан формалдехид съгласно точка 4 и ако е необходимо, съгласно точка 5.

4.2.1.

Безводен амониев ацетат;

4.2.2.

Концентрирана оцетна киселина, d20 4 = 1,05;

4.2.3.

Пентан-2,4-дион, прясно дестилиран при намалено налягане 25 мм Hg 25o, като не трябва да има никаква абсорбция при 410 nm;

4.2.4.

Бутан-1-ол;

4.2.5.

Солна киселина, 1 М;

4.2.6.

Солна киселина около 0,1 М;

4.2.7.

Натриев хидроксид, 1 М;

4.2.8.

Разтвор на скорбяла, приготвен непосредствено преди употреба, съгласно Европейската фармакопея (1 г/50 cм3 (мл) вода), второ издание 1980, Част I-VII-1-1;

4.2.9.

Формалдехид, 37 % до 40 % (м/о);

4.2.10.

Стандартен разтвор на йод, 0,05 М;

4.2.11.

Стандартен разтвор на натриев тиосулфат, 0,1 М;

4.2.12.

В мерителна колба 1 000 cм3 (мл) се разтварят:

Долива се с вода до 1 000 мл (рН на разтвора — около 6,4).

Реактивът трябва да бъде приготвен непосредствено преди употреба;

4.2.13.

Реактив (точка 4.2.12) без пентан-2,4-дион;

4.2.14.

В пикнометър с обем от 1 000 cм3 (мл) се наливат 5г формалдехид (точка 4.2.9) и се долива с вода до 1 000 мл.

Концентрацията на разтвора се определя, както следва:

Вземат се 10 cм3 (мл), прибавят се 25 cм3 (мл) от стандартния разтвор на йод (точка 4.2.10) и 10 cм3 (мл) разтвор на натриев хидроксид (точка 4.2.7).

Оставя се да престои 5 мин.

Подкислява се с 11 cм3 (мл) HCL (точка 4.2.5) и се определя излишъкът от йод със стандартен разтвор на натриев тиосулфат (точка 4.2.11), като се използва разтвор на скорбяла (точка 4.2.8) като индикатор.

1 cм3 (мл) 0,05 М изразходван разтвор на йод (точка 4.2.10) е еквивалентен на 1,5 мг формалдехид;

4.2.15.

Основният разтвор на формалдехид се разрежда последователно 1/20 и 1/100 с вода.

1 cм3 (мл) от този разтвор съдържа около 1,0 мкг формалдехид.

Изчислява се точното съдържание.

4.3.1.

Стандартно лабораторно оборудване;

4.3.2.

Филтър за разделяне на фазите, Whatman 1 PS (или еквивалентен);

4.3.3.

Центрофуга;

4.3.4.

Водна баня, нагласена на 60 °С;

4.3.5.

Спектрофотометър;

4.3.6.

Стъклени кювети с оптичен път 1,0 cм.

4.4.4.1.

Готовите смеси от точки 4.4.1, 4.4.2 и 4.4.3 се разклащат. Ерленмайеровите колби се потапят във водна баня при 60 °С точно за 10 мин. Охлаждат се за 2 мин в ледена баня.

4.4.4.2.

Прехвърлят се в делителни фунии от 50 см3 (мл), които съдържат по 10 см3 (мл) бутан-1-ол (точка 4.2.4). Всяка колба се промива с 3 до 5 см3 (мл) вода. Сместа се разбърква енергично в продължение на точно 30 сек. Оставя се да се разслои.

4.4.4.3.

Бутан-1-ол фазата се филтрува в кюветите на спектрофотометъра през филтър за разделяне на фазите (4.3.2). Може да се използва и центрофугиране (3 000 rpm за 5 мин).

4.4.4.4.

Измерва се абсорбцията А1 на пробата (точка 4.4.1) спрямо стандартния разтвор (точка 4.4.2) при 410 nm.

4.4.4.5.

По същия начин се измерва абсорбцията А2 на празната проба (точка 4.4.3) срещу бутан-1-ол.

Всички тези операции трябва да бъдат проведени в рамките на 25 мин от момента, в който ерленмайеровите колби са поставени във водната баня при 60 °С.

4.4.5.1.

В ерленмайерова колба 50 см3 (мл) се прибавят:

4.4.5.2.

Продължава се по указанията в точка 4.4.4 и се измерва абсорбцията срещу бутан-1-ол (точка 4.2.4).

4.4.5.3.

Процедурата се повтаря с 10, 15, 20 и 25 см3 (мл) от разредения стандартен разтвор (точка 4.2.15).

4.4.5.4.

За получаване на нулевата стойност (съответстваща на оцветяването на реактивите) се процедира както в точка 4.4.4.5.

4.4.5.5.

Построява се стандартна крива, след като от всяка от абсорбциите, получени в точка 4.4.5.1 и точка 4.4.5.3, се извади нулевата стойност. Законът на Beer е валиден до 30 мкг формалдехид.

4.5.1.

Изважда се А2 от А1 и от стандартната крива (точка 4.4.5.5) се отчита количеството С на формалдехида в разтвора на пробата (точка 4.4.1) в мкг.

4.5.2.

Изчислява се количеството на формалдехида в пробата (% м/м) с помощта на следната формула:

където:

m = масата на количеството за изпитване в г;

5.2.1.

Вода с качество за ВЕТХ или с еквивалентно качество;

5.2.2.

Безводен амониев ацетат;

5.2.3.

Концентрирана оцетна киселина;

5.2.4.

Пентан-2,4-дион (съхраняван при 4 °С);

5.2.5.

Безводен динатриев фосфат;

5.2.6.

Ортофосфорна киселина, 85 % (d = 1,7);

5.2.7.

Метанол с качество за ВЕТХ;

5.2.8.

Дихлорметан;

5.2.9.

Формалдехид, 37 до 40 % (м/о);

5.2.10.

Натриев хидроксид, 1 М;

5.2.11.

Солна киселина, 1 М;

5.2.12.

Солна киселина, 0,002 М;

5.2.13.

Разтвор на скорбяла, приготвен непосредствено преди употреба съгласно Европейската фармакопея (виж 4.2.8);

5.2.14.

Стандартен разтвор на йод, 0,05 М;

5.2.15.

Стандартен разтвор на натриев тиосулфат, 0,1 М;

5.2.16.

Воден разтвор на динатриев фосфат (точка 5.2.5), 0,006 М, доведен до рН 2,1 с ортофосфорна киселина (точка 5.2.6);

5.2.17.

В пикнометър от 1 000 см3 (мл) се разтварят:

Долива се с вода до 1 000 мл (точка 5.2.1).

Този реактив се съхранява на тъмно.

Време за съхранение: максимум 3 дни при 25 °С.

Не трябва да се наблюдават промени в цвета;

5.2.18.

В пикнометър от 1 000 см3 (мл) се наливат 10 г формалдехид (точка 5.2.9) и се долива с вода до 1 000 мл.

Концентрацията на разтвора се определя, както следва:

вземат се 5 см3 (мл) от разтвора, прибавят се 25 см3 (мл) от стандартния разтвор на йод (точка 5.2.14) и 10 см3 (мл) разтвор на натриев хидроксид (точка 5.2.10).

Оставя се да престои 5 мин.

Подкислява се с 11 см3 (мл) HCL (точка 5.2.11) и се титрува излишъкът от стандартния разтвор на йод със стандартен разтвор на натриев тиосулфат (точка 5.2.15) в присъствие на разтвор на скорбяла (точка 5.2.13) като индикатор.

1 см3 (мл) разтвор на йод (точка 5.2.14) е еквивалентен на 1,5 мг формалдехид;

5.2.19.

Основният разтвор се разрежда с подвижна фаза (точка 5.2.16)

до 1/100-на от неговата първоначална концентрация. 1 см3 (мл) от този разтвор съдържа около 37 мг формалдехид.

Изчислява се точното съдържание.

5.3.1.

Стандартно лабораторно оборудване;

5.3.2.

Помпа за ВЕТХ, без пулсации;

5.3.3.

Помпа без пулсации за ниско налягане за реактивите (или втора ВЕТХ помпа);

5.3.4.

Инжекционен дозаторен кран с 10 мкл капиляра;

5.3.5.

Следколонен реактор, състоящ се от следните компоненти:

5.3.6.

Мембранен филтър с размер на порите 0,45 мкм;

5.3.7.

SEP-PAKR С18 cartridge (филтриращ патрон) или еквивалентен;

5.3.8.

Готови за употреба колони:

5.3.9.

Bischoff К1 hypersil RP 18 (ref. К1 G 6301 1805) (5 мкм, дължина 10 мм или еквивалентна).

5.3.10.

Колоната и предколоната са свързани посредством система Ecotube (ref. A 15020508 Bischoff) или еквивалентна.

5.3.11.

Апаратурата (точка 5.3.5) се сглобява, както е показано на блок-схемата в допълнение 2.

Връзките след дозатора трябва да са възможно най-къси. Стоманената капиляра между изхода на реактора и входа на детектора е предназначена да охлажда реакционната смес преди измерването и температурата в детектора не е известна, но е постоянна;

5.3.12.

Детектор за УВ и видимата област;

5.3.13.

Пишещо устройство;

5.3.14.

Центрофуга;

5.3.15.

Ултразвукова вана;

5.3.16.

Вибрационна бъркалка (Vortex или еквивалентна).

m

=

масата на анализираната проба (точка5.4.2.1) в г,

С

=

концентрацията на формалдехида, отчетена от стандартната крива (точка 5.4.1), в мкг/100 cм3 (мл).

4.1.

Солна киселина 25 % (m/m)

4.2.

Метанол

4.3.

Етанол 96 % (v/v)

4.4.

Готови плаки за тънкослойна хроматография с покритие от силикагел (пластмасови или алуминиеви) с флуоресцентен индикатор. Дезактивират се, както следва: обикновените, с предварително нанесено покритие от силикагел плаки се напръскват с вода до заглаждане. Напръсканите плаки се оставят да съхнат на въздух при стайна температура в продължение на един до три часа.

Забележка.

Ако плаките не са дезактивирани, могат да се получат загуби на резорцин в резултат на необратима адсорбция върху силикагела.

4.5.

Проявяващ разтворител; ацетон-хлороформ-оцетна киселина (20:75:5 обемни).

4.6.

Стандартен разтвор на резорцин; 400 мг резорцин се разтварят в 100 мл 96 % етанол (точка 4.3) (1 мл съответства на 4 000 μg резорцин).

4.7.

Разтвор на вътрешен стандарт; разтварят се 400 мг 3,5-дихидрокситолуол (ДХТ) в 100 мл 96 % етанол (точка 4.3) (1 мл съответства на 4 000 μg ДХТ).

4.8.

Стандартна смес; смесват се 10 мл от разтвора от точка 4.6 с 10 мл от разтвора от точка 4.7 в 100-милилитров пикнометър, долива се до марката с 96 % етанол (точка 4.3) и сместа се разбърква (1 мл съответства на 400 μg резорцин и 400 μg ДХТ).

4.9.

Силилиращи агенти

5.1.

Стандартно оборудване за тънкослойна и газова хроматография

5.2.

Стъклени съдове

6.1.1.

В 150-милилтрова бехерова чаша се претегля прецизно проба за анализ (m грама) от продукта, която съдържа приблизително от 20 до 50 мг резорцин.

6.1.2.

Извършва се подкисляване със солна киселина (точка 4.1), докато сместа придобие киселинен характер (необходими са приблизително между 2 и 4 мл), добавят се 10 мл (40 мг ДХТ) от вътрешния стандартен разтвор (точка 4.7) и се разбърква. Съдържанието се прехвърля в 100-милилитров пикнометър с етанол (точка 4.3), долива се до марката с етанол и се разбърква.

6.1.3.

Върху дезактивираната плака с покритие от силикагел (точка 4.4) се нанасят 250 μl от разтвора (точка 6.1.2) като непрекъсната линия с приблизителна дължина 8 cм. Необходимо е линията да бъде възможно най-тънка.

6.1.4.

250 μl от стандартната смес (точка 4.8) се нанасят върху същата плака по същия начин (точка 6.1.3).

6.1.5.

В две точки от стартовата линия се нанасят по 5 μl от всеки от разтворите от точка 4.6 и точка 4.7, за да се подпомогне локализирането след проявяването на плаката.

6.1.6.

Плаката се развива в ненаситена с пари на разтворителя вана, запълнена с проявяващ разтворител от точка 4.5, докато фронтът на разтворителя достигне линия на 12 см от стартовата линия; обикновено това отнема около 45 минути. Плаката се изсушава на въздух и се локализира на зоната на резорцина/ДХТ на късовълнова ултравиолетова светлина (254 nm). Двете съединения имат приблизително еднакви Rf стойности. Ивиците се обозначават с молив на 2 мм разстояние от външната тъмна гранична линия на ивиците. Тези зони се отстраняват и адсорбентът на всяка от ивиците се събира в 10-милилитров пикнометър.

6.1.7.

Адсорбентът, съдържащ пробата, и адсорбентът, съдържащ стандартната смес, се екстрахират по следния начин:

прибавят се 2 мл метанол (точка 4.2) и се екстрахират в продължение на един час при непрекъснато разбъркване. Сместа се филтрира и екстракцията се повтаря за още 15 минути с 2 мл метанол.

6.1.8.

Екстрактите се събират и разтворителят се изпарява чрез сушене в продължение на една нощ във вакуум-ексикатор, зареден с подходящ сушилен агент. Не трябва да се подава топлина.

6.1.9.

Остатъците (точка 6.1.8) се силилират, както е посочено в точка 6.1.9.1 или точка 6.1.9.2.

r1 и r2

=

времена на задържане за два пика, в минути,

w1 и w2

=

ширини на същите пикове при полувисочината, в мм,

d′

=

скорост на въртене на хартията, в мм за минута.

6.2.2.

В газ-хроматографа се въвеждат от 1 до 3 μl от разтворите, получени в съответствие с точка 6.1.9. От всеки разтвор (точка 6.1.9) се извършват по пет впръсквания, измерва се площта на пиковете, получените стойности се усредняват и се изчислява съотношението между площта на пиковете: S = площ на пика на резорцина/площ на пика на ДХТ.

М

=

изследваната порция в грамове (точка 6.1.1),

Sпроба

=

средното съотношение между площта на пиковете съгласно точка 6.2.2 за разтвора на пробата,

Sстандартна смес

=

средното съотношение между площта на пиковете съгласно точка 6.2.2 за стандартната смес.

4.1.

Метанол

4.2.

Етанол, абсолютен

4.3.

Пропан-2-ол

4.4.

Хлороформ, свободен от алкохоли чрез промиване с вода

5.1.

Газхроматограф:

5.2.

Пикнометри, 100 мл

5.3.

Пипети, 2 мл, 20 мл, 0—1 мл

5.4.

Микроспринцовки от 0 до 100 μl и от 0 до 5 μl

и (само за аерозолните проби) специална газонепроницаема спринцовка с плъзгащ вентил, (виж процедурата за вземане на проби, фигура 5) ( 9 ).

6.1.1.

Пробите от аерозолните продукти се вземат в съответствие с глава II от приложението към Директива на Комисията 80/1335/ЕИО от 22 декември 1980 ( 10 ), след което се анализират чрез газова хроматография при условията от точка 6.2.1.

6.1.2.

Неаерозолните продукти, от които са взети проби в съответствие с горецитираната глава II, се разреждат с вода до концентрация на етанола или пропан-2-ола от порядъка на 1—2 %, след което се анализират чрез газова хроматография при условията от точка 6.2.2.

6.2.1.

При аерозолните проби се работи с катарометъра.

6.2.2.

За неаерозолни проби:

7.1.

За газхроматографската процедура от точка 6.2.1 (колона Hallcomid M18) се използват долупосочените стандартни смеси. Смесите се приготвят посредством дозиране с пипети, като точните количества се установяват чрез претегляне на пипетата или колбата непосредствено след всяко добавяне.

В хроматографа се впръскват между 2 и 3 μl при спазване на условията от точка 6.2.1.

Изчислява се съотношението между площите на пиковете (метанол/етанол) или (метанол/пропан-2-ол) за всяка смес. Начертава се стандартна крива, като се използва:

7.2.

За газхроматографската процедура от точка 6.2.2 (Porapak QS или Chromosorb 105) се използват долупосочените стандартни смеси. Смесите се приготвят чрез дозиране с микроспринцовка и пипета, като точното количество се установява чрез претегляне на пипетата или колбата непосредствено след всяко добавяне.

В хроматографа се впръскват между 2 и 3 μl при спазване на условията от точка 6.2.2.

Изчислява се съотношението между площите на пиковете (метанол/етанол) или (метанол/пропан-2-ол) за всяка смес. Начертава се стандартна крива, като се използва:

7.3.

При двата случая стандартната крива трябва да бъде права линия

1

=

HPLC-помпа

2

=

Инжектор

3

=

Колона с предколона

4

=

Помпа за реагенти

5

=

Т-разклонител без мъртъв обем

5′

=

Т-разклонител (Vortex)

6-6′

=

Съединител без мъртъв обем

7

=

„Френска плетка“

7′

=

Реактор

8

=

Тригърлена колба с кипяща вода

9

=

Нагревател на колбата

10

=

Хладник

11

=

Стоманена топлообменна капиляра

11′

=

Топлообменник

12

=

UV-VIS-детектор

13

=

Следколонен модул PCRS 520

5.3.5

5.3.6.