02009R0152 — FI — 16.11.2020 — 007.001

---

Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentoinnin apuväline eikä sillä ole oikeudellista vaikutusta. Unionin toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä. Säädösten todistusvoimaiset versiot on johdanto-osineen julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä ja ne ovat saatavana EUR-Lexissä. Näihin virallisiin teksteihin pääsee suoraan tästä asiakirjasta siihen upotettujen linkkien kautta.

►B	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 152/2009, annettu 27 päivänä tammikuuta 2009, näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista valvontaa varten (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti) (EUVL L 054 26.2.2009, s. 1)

Muutettu:

		Virallinen lehti
		N:o	sivu	päivämäärä
M1	KOMISSION ASETUS (EU) N:o 278/2012, annettu 28 päivänä maaliskuuta 2012,	L 91	8	29.3.2012
►M2	KOMISSION ASETUS (EU) N:o 51/2013, annettu 16 päivänä tammikuuta 2013,	L 20	33	23.1.2013
►M3	KOMISSION ASETUS (EU) N:o 691/2013, annettu 19 päivänä heinäkuuta 2013,	L 197	1	20.7.2013
M4	KOMISSION ASETUS (EU) N:o 709/2014, annettu 20 päivänä kesäkuuta 2014,	L 188	1	27.6.2014
M5	KOMISSION ASETUS (EU) 2017/645, annettu 5 päivänä huhtikuuta 2017,	L 92	35	6.4.2017
►M6	KOMISSION ASETUS (EU) 2017/771, annettu 3 päivänä toukokuuta 2017,	L 115	22	4.5.2017
►M7	KOMISSION TÄYTÄNTÖÖNPANOASETUS (EU) 2020/1560, annettu 26 päivänä lokakuuta 2020,	L 357	17	27.10.2020

---

▼B

KOMISSION ASETUS (EY) N:o 152/2009,

annettu 27 päivänä tammikuuta 2009,

näytteenotto- ja määritysmenetelmistä rehujen virallista valvontaa varten

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

▼M3

1 artikla

Rehujen virallisessa valvonnassa suoritettava näytteenotto, erityisesti rehun sisältämien ainesosien, mukaan lukien ainekset, jotka sisältävät muuntogeenisiä organismeja (GMO) tai koostuvat tai on valmistettu niistä, Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 1831/2003 ( 1 ) määriteltyjen rehun lisäaineiden ja Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivissä 2002/32/EY ( 2 ) määriteltyjen haitallisten aineiden määrittämiseksi, on suoritettava liitteessä I vahvistettujen menetelmien mukaisesti.

Liitteessä I vahvistettua näytteenottomenetelmää sovelletaan rehun valvonnassa Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 396/2005 ( 3 ) määriteltyjen torjunta-ainejäämien määrittämiseksi sekä asetuksen (EU) N:o 619/2011 noudattamisen valvonnassa.

▼B

2 artikla

Näytteet on valmistettava määritystä varten ja tulokset on ilmoitettava liitteessä II esitettyjen menetelmien mukaisesti.

3 artikla

Rehujen virallista tarkastusta varten tehtävissä määrityksissä on noudatettava menetelmiä, jotka on vahvistettu liitteessä III (Rehuaineiden ja rehuseosten koostumuksen valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät), liitteessä IV (Rehujen sisältämien sallittujen lisäaineiden valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät), liitteessä V (Rehujen sisältämien haitallisten aineiden valvonnassa käytettävät määritysmenetelmät) ja liitteessä VI (Rehujen sisältämien eläinperäisten ainesosien määritysmenetelmät rehujen virallista valvontaa varten).

4 artikla

Siipikarjan rehuseosten energia-arvo on laskettava liitteen VII mukaisesti.

5 artikla

Liitteessä VIII vahvistettuja määritysmenetelmiä sellaisten laittomien lisäaineiden osoittamiseksi, jotka eivät enää ole sallittuja rehuissa, käytetään varmistustarkoituksiin.

6 artikla

Kumotaan direktiivit 71/250/ETY, 71/393/ETY, 72/199/ETY, 73/46/ETY, 76/371/ETY, 76/372/ETY, 78/633/ETY, 81/715/ETY, 84/425/ETY, 86/174/ETY, 93/70/ETY, 93/117/EY, 98/64/EY, 1999/27/EY, 1999/76/EY, 2000/45/EY, 2002/70/EY ja 2003/126/EY.

Viittauksia kumottuihin direktiiveihin pidetään viittauksina tähän asetukseen liitteessä IX olevien vastaavuustaulukoiden mukaisesti.

7 artikla

Tämä asetus tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

Sitä sovelletaan 26 päivästä elokuuta 2009.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

▼M3

---

LIITE I

NÄYTTEENOTTOMENETELMÄT

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Rehujen virallisessa valvonnassa käytettävät näytteet on otettava seuraavassa esitettyjen menetelmien mukaisesti. Näin saatujen näytteiden katsotaan edustavan koko tutkittavaa erää.

Edustavan näytteenoton tarkoituksena on ottaa erästä pieni osaerä siten, että osaerästä määritettävä tekijä edustaa keskimääräisesti koko tutkittavaa rehuerää. Erästä tulee ottaa osanäytteitä kauttaaltaan useista kohdista erää. Nämä osanäytteet yhdistetään sekoittamalla kokoomanäytteeksi, josta muodostetaan edustavan jakomenettelyn avulla erää edustavat lopulliset näytteet.

Jos rehuerän visuaalisessa tarkastuksessa todetaan, että näytteenoton kohteena oleva rehuerän osa eroaa laadultaan muusta rehusta niin se käsitellään erillisenä osaeränä. Jos rehua ei ole mahdollista jakaa erillisiin osaeriin, sitä käsitellään yhtenä eränä. Tällöin asia mainitaan näytteenottoraportissa.

Jos todetaan, että rehu, josta on otettu näytteet tämän asetuksen säännösten mukaisesti, ei täytä EU:n vaatimuksia ja kyseinen rehu on osa samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää, on oletettava, että tämä säädöstenvastaisuus koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

2.   MÄÄRITELMÄT

—

Erä : tunnistettava määrä rehua, jolla on määritetty olevan yhteisiä ominaisuuksia kuten alkuperä, lajike, pakkaustapa, pakkaaja, lähettäjä tai pakkausmerkinnät, jos kyse on tuotantoprosessista, yksittäisessä laitoksessa samoja tuotantoparametreja käyttäen tuotettu tuotantoerä tai useita tällaisia tuotantoeriä, jos ne on tuotettu yhtäjaksoisesti ja varastoidaan yhdessä.

—	Tutkittava erä : erä tai tunnistettava osa erästä tai osaerästä.

—	Sinetöity näyte : näyte, joka on sinetöity siten, ettei näytteeseen pääse käsiksi rikkomatta tai poistamatta sinettiä.

—	Osanäyte : määrä, joka on otettu tutkittavan erän yhdestä kohdasta.

—	Kokoomanäyte : tutkittavan erän eri kohdista otetuista osanäytteistä muodostettu yhteisnäyte.

—	Supistettu näyte : kokoomanäytteen osa, joka on saatu kokoomanäytteestä edustavasti supistamalla.

—	Lopullinen näyte : supistetun näytteen osa tai homogenisoidun kokoomanäytteen osa.

—	Laboratorionäyte : laboratoriolle tarkoitettu näyte (laboratorion vastaanottama näyte), joka voi olla lopullinen näyte, supistettu näyte tai kokoomanäyte.

3.   YLEISET SÄÄNNÖKSET

4.   VÄLINEISTÖ

4.1	Näytteenottovälineiden on oltava valmistettu materiaaleista, jotka eivät aiheuta kontaminaatiota tuotteista otettuihin näytteisiin. Laitteistojen, joita käytetään useita kertoja, tulee olla ristiinkontaminaation välttämiseksi helppoja puhdistaa.

4.2

Kiinteiden rehujen näytteenottoon suositellut välineet 4.2.1    Manuaalinen näytteenotto 4.2.1.1   Tasapohjainen kauha, jossa on pystysuorat sivuseinämät. 4.2.1.2 Näytteenottokaira, jossa on pitkä ura tai osastoja. Kairan mittojen on oltava oikeassa suhteessa tutkittavaan erään (esim. säiliön syvyys, säkin mitat) sekä rehun raekokoon. Jos näytteenottokairassa on useita aukkoja, tulee aukkojen olla kairassa osastoittain jaettuna tai aueta eriaikaisesti, jotta voidaan varmistaa, että näytettä saadaan kerättyä koko kairan pituudelta. 4.2.2    Mekaaninen näytteenotto Asianmukaista mekaanista laitetta voidaan käyttää otettaessa näytteitä liikkeessä olevasta rehuerästä. Asianmukaisella tarkoitetaan sitä, että näytettä otetaan ainakin liikkeessä olevan rehun koko kerrostumasta. Rehun ollessa liikkeessä (voimakkaasti virtaavana) rehuerän näytteenotossa voidaan käyttää automaattisia näytteenkerääjiä. 4.2.3    Näytteenjakolaite Supistettujen näytteiden valmistukseen edustavasti olisi käytettävä laitetta, joka on suunniteltu jakamaan näyte suunnilleen yhtä suuriin osiin, jos se on mahdollista ja asianmukaista.

5.   OSANÄYTTEIDEN LUKUMÄÄRÄÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET

5.1    Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset sellaisten ainesosien tai tuotteiden valvonnan osalta, jotka ovat tasaisesti jakautuneina rehussa

5.1.1    Kiinteä irtorehu

5.1.2    Nestemäinen irtorehu

5.1.3    Pakattu rehu

Rehu (kiinteä ja nestemäinen) voidaan pakata pusseihin, säkkeihin, tölkkeihin, tynnyreihin jne., joihin viitataan taulukossa yksikköinä. Näytteet suurista yksiköistä (≥ 500 kiloa tai litraa) on otettava irtorehua koskevien säännösten mukaisesti (katso 5.1.1 ja 5.1.2. kohta).

5.1.4    Rehukakut ja nuolukivet

Näyte on otettava vähintään yhdestä rehukakusta tai yhdestä nuolukivestä tutkittavan erän jokaista 25 yksikköä kohti, kuitenkin enintään 4 rehukakusta tai nuolukivestä.

Jos rehukakun tai nuolukiven paino on enintään yksi kilo, osanäyte on yhden rehukakun tai yhden nuolukiven sisältö.

5.1.5    Karkearehu/nurmirehu

5.2    Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset sellaisten ainesosien tai tuotteiden valvonnan osalta, jotka todennäköisesti ovat epätasaisesti jakautuneina rehussa

Näitä osanäytteitä koskevia määrällisiä vaatimuksia käytetään seuraavissa tilanteissa:

Jos valvontaviranomaisella on vahva epäilys siitä, että tällaista epätasaista jakautumista tapahtuu myös rehuseoksen sisältämän ainesosan tai aineen ristikontaminaatiotapauksessa, voidaan soveltaa jäljempänä olevassa taulukossa olevia määrällisiä vaatimuksia.

5.3    Osanäytteitä koskevat määrälliset vaatimukset hyvin suurten erien osalta

Jos kyseessä ovat suuret tutkittavat erät (tutkittavat erät > 500 tonnia), otettavien osanäytteiden lukumäärä = 40 osanäytettä + √ tonnia sellaisten aineiden tai tuotteiden valvonnan osalta, jotka ovat tasaisesti jakautuneina rehussa tai 100 osanäytettä + √ tonnia sellaisten ainesosien tai aineiden valvonnan osalta, jotka ovat todennäköisesti epätasaisesti jakautuneina rehuaineissa.

6.   KOKOOMANÄYTETTÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET

7.   LOPULLISIA NÄYTTEITÄ KOSKEVAT MÄÄRÄLLISET VAATIMUKSET

Lopulliset näytteet

Analyysi tehdään vähintään yhdestä lopullisesta näytteestä. Analyysia varten valmistetun lopullisen näytteen määrän on oltava vähintään:

8.   NÄYTTEENOTTOMENETELMÄ ERITTÄIN SUURIA ERIÄ TAI SELLAISIA ERIÄ VARTEN, JOTKA VARASTOIDAAN TAI KULJETETAAN SITEN, ETTÄ NÄYTTEENOTTO KOKO ERÄSTÄ EI OLE TOTEUTETTAVISSA

8.1    Yleiset periaatteet

Jos erän kuljetus- tai varastointitapa on sellainen, ettei osanäytettä voida ottaa koko erästä, suositetaan näytteenotto tehtäväksi silloin kuin rehuerä on liikkeessä.

Jos kyse on suurista rehun varastointiin tarkoitetuista varastoista, toimijoita olisi rohkaistava asentamaan varastoon sellaiset laitteet, joilla on mahdollista ottaa näytteet (koneellinen näytteenottolaite) koko varastoidusta erästä.

Jos sovelletaan tässä 8 luvussa säädettyjä näytteenottomenetelmiä, rehualan toimijalle tai sen edustajalle on ilmoitettava näytteenottomenetelmästä. Jos rehualan toimija tai sen edustaja kyseenalaistaa tämän näytteenottomenetelmän, rehualan toimijan tai sen edustajan on annettava toimivaltaiselle viranomaiselle mahdollisuus ottaa näytteet koko erästä rehualan toimijan tai sen edustajan kustannuksella.

8.2    Laivalla kuljetettavat suuret erät

8.2.1    Dynaaminen näytteenotto laivalla kuljetettavista suurista eristä

Näytteenotto laivalla kuljetettavista suurista eristä suoritetaan mieluiten silloin, kun rehuerä on liikkeessä (dynaaminen näytteenotto).

Näytteenotto suoritetaan lastiruumakohtaisesti (yksikkö, joka voidaan erottaa fyysisesti). Lastiruumat tyhjennetään kuitenkin osittain yksi toisensa jälkeen siten, että alkuperäinen fyysinen erottelu ei enää varastotiloihin siirron jälkeen ole voimassa. Näytteenotto voidaan sen vuoksi suorittaa alkuperäisen fyysisen erottamisen mukaan tai varastotiloihin siirron jälkeisen erottamisen mukaan.

Laivan lastin purku voi kestää useita päiviä. Näytteenotto on yleensä suoritettava säännöllisin väliajoin koko purkamisen keston ajan. Virallisen tarkastajan läsnäolo näytteenotossa koko purkamisen keston ajan ei kuitenkaan välttämättä aina ole toteutettavissa tai tarkoituksenmukaista. Näytteet voidaan sen vuoksi ottaa koko erän (tutkittava erä) osasta. Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan.

Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

Vaikka virallinen näyte otetaan automaattisesti, tarkastajan läsnäolo on tarpeen. Jos automaattisessa näytteenotossa käytetään kuitenkin ennalta asetettuja parametreja, joita ei voida muuttaa näytteenoton aikana ja jos osanäytteet kerätään sinetöityyn astiaan, joka estää mahdolliset väärinkäytökset, tarkastajan läsnäolo vaaditaan ainoastaan näytteenoton alussa, aina kun astia on tarpeen vaihtaa ja näytteenoton lopussa.

8.2.2    Staattinen näytteenotto laivalla kuljetettavista eristä

Jos näytteenotossa käytetään staattista tapaa, on sovellettava samaa menetelmää kuin ylhäältä käsin päästävien varastointitilojen (siilot) ollessa kyseessä (katso 8.4.1 kohta).

Näytteenotto on suoritettava erän/lastiruuman siitä osasta, johon on pääsy (yläpuolelta). Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.3    Näytteenotto varastoihin sijoitetuista suurista eristä

Näytteenotto on suoritettava erän siitä osasta, johon on pääsy. Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.4    Näytteenotto varastotiloista (siilot)

8.4.1    Näytteenotto siiloista, joihin on (helppo) pääsy yläpuolelta

Näytteenotto on suoritettava erän siitä osasta, johon on pääsy. Osanäytteiden lukumäärä määritetään tutkittavan erän koon mukaan. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.4.2    Näytteenotto siiloista, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot)

8.4.2.1    Siilot, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot) ja joiden koko on > 100 tonnia

Tällaisiin siiloihin varastoiduista rehuista ei voida ottaa näytteitä staattisesti. Jos siilossa olevasta rehusta on otettava näyte, eikä lähetystä ole mahdollista siirtää, on sovittava toimijan kanssa siitä, että toimija ilmoittaa tarkastajalle, milloin siilo tyhjennetään, jotta näytteenotto voidaan suorittaa liikkuvasta rehusta.

8.4.2.2    Siilot, joihin ei ole pääsyä yläpuolelta (suljetut siilot) ja joiden koko on < 100 tonnia

Menettelyssä näyte otetaan kaatamalla 50–100 kilon suuruinen määrä astiaan, josta näyte otetaan. Kokoomanäytteen koko vastaa koko erää ja osanäytteiden lukumäärä liittyy siilosta astiaan näytteenottoa varten kaadettuun määrään. Jos näyte otetaan osasta samaan luokkaan kuuluvaa tai samaa kuvausta vastaavaa rehuerää ja on todettu, että kyseinen erän osa ei täytä EU:n vaatimuksia, on oletettava, että sama koskee koko rehuerää, ellei yksityiskohtaisesta arvioinnista ilmene, että ei ole mitään näyttöä siitä, että loppuosa erästä ei täyttäisi EU:n vaatimuksia.

8.5    Näytteenotto suurissa suljetuissa säiliöissä olevasta irtorehusta

Tällaisista eristä voidaan usein ottaa näytteet vain purkamisen yhteydessä. Joissakin tapauksissa, kun rehuerän purkua ei ole mahdollista suorittaa tuonti- ja tarkastuspaikassa, olisi näytteet otettava tällaisten säiliöiden purun yhteydessä.

9.   NÄYTTEIDEN OTTAMISTA, VALMISTAMISTA JA PAKKAAMISTA KOSKEVAT OHJEET

9.1    Yleistä

Näytteet on otettava ja valmistettava viipymättä noudattaen varotoimenpiteitä, joilla varmistetaan, ettei tuote muutu tai saastu. Kaikkien näytteiden kanssa kosketuksiin joutuvien välineiden sekä pintojen ja säiliöiden on oltava puhtaita ja kuivia.

9.2    Osanäytteet

Osanäytteet on otettava satunnaisesti koko tutkittavasta erästä, ja niiden on oltava suunnilleen samansuuruisia.

Osanäytteen koon on oltava vähintään 100 grammaa tai karkearehun/nurmirehun tapauksessa vähintään 25 grammaa johtuen tällaisen rehun pienestä ominaispainosta.

Jos 8 kohdassa vahvistetun näytteenottomenetelmän sääntöjen mukaisesti on otettava alle 40 osanäytettä, niin osanäytteiden koon on oltava suhteessa vaadittuun kokoomanäytteen vähimmäiskokoon (katso 6 kohta).

Jos kyse on pakattujen rehujen näytteenotosta pienistä eristä, jolloin määrällisten vaatimusten mukaan on otettava rajallinen määrä osanäytteitä, osanäyte on yhden alkuperäisen yksikön sisältö, joka ei ylitä yhtä kiloa tai yhtä litraa.

Jos kyse on pakattujen rehujen näytteenotosta pienistä yksiköistä (esim. < 250 g), niin osanäytteen koko riippuu yksikön koosta.

9.2.1    Irtorehu

Näytteenotto voidaan tarvittaessa tehdä rehuerää siirrettäessä (lastauksen tai purkamisen yhteydessä).

9.2.2    Pakattu rehu

Kun 5 luvun mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, kunkin yksikön sisällöstä otetaan osa kairaa tai kauhaa käyttäen. Tarvittaessa näytteet otetaan vasta, kun yksiköt on erikseen tyhjennetty.

9.2.3    Homogeeniset ja homogenoituvat nestemäiset tai puolijuoksevat rehut

Kun 5 luvun mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, sisältö on tarvittaessa homogenoitava ja vaadittava määrä näytettä otettava kustakin yksiköstä.

Osanäytteet voidaan ottaa myös sisältöä tyhjennettäessä.

9.2.4    Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut, joita ei voi homogenoida

Kun 5 luvun mukainen lukumäärä yksiköitä on valittu näytteenottoa varten, on näytettä otettava rehun eri kerroksista.

Osanäytteet voidaan ottaa myös sisältöä tyhjennettäessä, kuitenkin siten, että ensimmäisiä fraktioita ei oteta talteen.

Kummassakin tapauksessa näytteen kokonaismäärän on oltava vähintään 10 litraa.

9.2.5    Rehukakut ja nuolukivet

Kun 5 luvun mukainen lukumäärä rehukakkuja tai nuolukiviä on valittu näytteenottoa varten, niin jokaisesta kakusta tai kivestä voidaan ottaa pala. Jos epäillään, että rehukakku tai nuolukivi on epähomogeeninen, näytteeksi voidaan ottaa koko rehukakku tai nuolukivi.

Jos rehukakun tai nuolukiven paino on enintään yksi kilo, niin osanäyte on yhden rehukakun tai yhden nuolukiven sisältö.

9.3    Kokoomanäytteen koostaminen

Kokoomanäyte muodostetaan sekoittamalla osanäytteet keskenään.

9.4    Lopullisen näytteen valmistaminen

Kokoomanäytteen sisältämä näytemateriaali on sekoitettava huolellisesti ( 4 ).

9.5    Näytteiden pakkaaminen

Säiliöt tai pakkaukset sinetöidään ja varustetaan etiketillä siten, ettei niitä voi avata vahingoittamatta sinettiä. Koko etiketin on oltava suljettu sinetillä.

9.6    Näytteiden toimittaminen laboratorioon

Näyte lähetetään viipymättä nimettyyn viralliseen laboratorioon yhdessä analyysin suorittajan tarvitsemien tietojen kanssa.

10.   NÄYTTEENOTTOPÖYTÄKIRJA

Jokaisesta näytteenotosta on laadittava näytteenottopöytäkirja, josta jokainen tutkittava erä ja sen määrä voidaan yksiselitteisesti tunnistaa.

Näytteenottopöytäkirjassa on mainittava myös mahdolliset poikkeamat tässä asetuksessa säädetystä näytteenottomenettelystä.

Sen lisäksi, että näytteenottopöytäkirja toimitetaan virallisen tutkimuslaboratorion saataville, se toimitetaan rehualan toimijan saataville ja/tai rehualan toimijan nimeämän laboratorion saataville.

---

LIITE II

REHUJEN MÄÄRITYSMENETELMIÄ KOSKEVAT YLEISET SÄÄNNÖKSET

A.   NÄYTTEIDEN VALMISTAMINEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN

1.    Tarkoitus

Seuraavassa esitettävät menetelmät koskevat näytteiden valmistusta määritystä varten; näytteet lähetetään tutkimuslaboratorioihin sen jälkeen, kun ne on otettu liitteessä I vahvistettujen säännösten mukaisesti.

Laboratorionäytteet on valmistettava siten, että määritysmenetelmää varten punnittava määrä näytettä on homogeeninen ja edustaa tutkittavaa lopullista näytettä.

2.    Varotoimenpiteet

Näytteen valmistuksessa noudatettava menettely riippuu käytettävistä määritysmenetelmistä ja valvonnan kohteena olevista ainesosista tai aineista. Tästä syystä on olennaisen tärkeää varmistaa, että näytteiden esikäsittely on käytettävien määritysmenetelmien ja valvonnan kohteena olevien ainesosien tai aineiden kannalta asianmukainen.

Kaikki toimenpiteet on suoritettava siten, että vältetään mahdollisimman hyvin näytteen saastuminen ja sen koostumuksen muuttuminen.

Näyte on jauhettava, sekoitettava ja seulottava viipymättä siten, että se altistuu ilmalle ja valolle mahdollisimman vähän. Sellaisia myllyjä ja jauhatuslaitteita, joissa näytteen huomattava lämpeneminen on todennäköistä, ei pidä käyttää.

On suositeltavaa jauhaa erityisen lämmönarat rehut käsin. Lisäksi on huolehdittava siitä, ettei itse välineistö ole kontaminaation lähde.

Jos näytettä ei voida valmistaa ilman, että sen kosteuspitoisuus muuttuu merkittävästi, on kosteuspitoisuus määritettävä ennen valmistusta ja sen jälkeen liitteessä III olevassa A osassa säädetyn menetelmän mukaisesti.

3.    Menettely

3.1    Yleinen menettely

Näyte määritysmenetelmää varten otetaan lopullisesta näytteestä. Kartiomurskaimen ja neljännesmenetelmän käyttöä ei suositella, koska ne saattavat aiheuttaa suuren jakovirheriskin.

3.1.1    Sellaisenaan jauhettavat rehut

3.1.2    Kuivauksen jälkeen jauhettavat rehut

3.1.3    Nestemäiset tai puolijuoksevat rehut

3.1.4    Muut rehut

3.2    Erityismenettely, jos kyse on visuaalisesta tarkastuksesta tai mikroskooppitutkimuksesta tai jos koko kokoomanäyte homogenoidaan

4.    Näytteiden säilytys

Näytteet on säilytettävä lämpötilassa, jossa niiden koostumus ei muutu. Vitamiinien tai valolle erityisen herkkien aineiden määritykseen tarkoitetut näytteet on varastoitava olosuhteissa, joissa valo ei pääse vaikuttamaan niihin haitallisesti.

B.   MÄÄRITYSMENETELMISSÄ KÄYTETTÄVIÄ REAGENSSEJA JA VÄLINEITÄ KOSKEVAT SÄÄNNÖKSET

C.   MÄÄRITYSMENETELMIEN KÄYTTÖ JA TULOSTEN ILMOITTAMINEN

1.    Uuttomenettely

Useat menetelmät edellyttävät erityistä uuttomenetelmää. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita uuttomenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetyn menettelyn uuttoteho on analysoitavan materiaalin osalta samantasoinen kuin menetelmässä kuvatun menettelyn uuttoteho.

2.    Puhdistusmenettely

Useat menetelmät edellyttävät erityistä puhdistusmenettelyä. Pääsääntöisesti voidaan soveltaa myös muita puhdistusmenettelyjä kuin menetelmän kuvauksessa tarkoitettu menettely, jos voidaan osoittaa, että käytetty puhdistusmenettely johtaa tutkittavaa materiaalia analysoitaessa analyysituloksiin, jotka vastaavat menetelmässä mainittua menettelyä käytettäessä saatuja tuloksia.

3.    Määritysten lukumäärä

Jos haitallisten aineiden määrityksessä ensimmäisen määrityksen tulos on merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Muissa tapauksissa rinnakkaismääritys (toinen määritys) on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Sääntöjenmukaisuuden varmistamiseen käytetään näiden kahden määrityksen keskiarvoa, mittausepävarmuus huomioon ottaen.

Jos kyse on aineen tai ainesosan ilmoitetun pitoisuuden valvonnasta ja jos ensimmäisen määrityksen tulos vahvistaa ilmoitetun pitoisuuden eli määrityksen tulos on ilmoitetun pitoisuuden hyväksyttävällä vaihteluvälillä, lisämääritykset eivät ole tarpeen edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu. Muissa tapauksissa kaksoismääritys (toinen määritys) on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Sääntöjenmukaisuuden varmistamiseen käytetään näiden kahden määrityksen keskiarvoa, mittausepävarmuus huomioon ottaen.

Joissain tapauksissa hyväksyttävä vaihteluväli määritellään lainsäädännössä, esimerkiksi rehun markkinoille saattamisesta ja käytöstä, Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1831/2003 muuttamisesta sekä neuvoston direktiivin 79/373/ETY, komission direktiivin 80/511/ETY, neuvoston direktiivien 82/471/ETY, 83/228/ETY, 93/74/ETY, 93/113/EY ja 96/25/EY ja komission päätöksen 2004/217/EY kumoamisesta 13 päivänä heinäkuuta 2009 annetussa Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksessa (EY) N:o 767/2009 ( 7 ).

4.    Käytetyn määritysmenetelmän ilmoittaminen

Tutkimustodistuksessa on mainittava käytetty määritysmenetelmä.

5.    Määritystuloksen ilmoittaminen

Analyysitulos on ilmaistava määritysmenetelmässä vahvistetulla tavalla asianmukaisella merkitsevien numeroiden tarkkuudella, ja tulos on tarvittaessa korjattava sen mukaan, mikä lopullisen näytteen kosteuspitoisuus oli ennen näytteen valmistamista.

6.    Mittausepävarmuus ja saanto haitallisten aineiden määrityksessä

Direktiivissä 2002/32/EY tarkoitettujen haitallisten aineiden ollessa kyseessä eläinten rehuksi tarkoitettua tuotetta ei pidetä vahvistetun enimmäispitoisuuden mukaisena, kun kyse on kosteuspitoisuudeltaan 12 prosentin rehusta, jos analyysituloksen katsotaan ylittävän enimmäispitoisuuden, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus ja korjaus saannon suhteen. Vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta, joka on korjattu saannon suhteen ja josta on vähennetty laajennettu mittausepävarmuus. Tätä menettelyä sovelletaan ainoastaan silloin, kun määritysmenetelmässä voidaan arvioida mittausepävarmuus ja korjata tulos saannon suhteen (esimerkiksi mikroskooppitutkimuksessa tämä ei ole mahdollista).

Analyysitulos on esitettävä seuraavalla tavalla (sikäli kuin käytetty määritysmenetelmän mittausepävarmuus voidaan arvioida ja tulos korjata saannon suhteen):

Jos analyysitulos on kuitenkin merkittävästi (> 50 %) valvottavaa arvoa alempi ja edellyttäen, että asianmukaisia laatumenettelyjä on sovellettu ja määrityksen ainoana tarkoituksena on todeta säännösten noudattaminen, analyysitulos voidaan ilmoittaa ilman korjausta saannon suhteen, ja saantoaste ja mittausepävarmuus voidaan näissä tapauksissa jättää pois.

▼B

---

LIITE III

REHUAINEIDEN JA REHUSEOSTEN KOOSTUMUKSEN VALVONNASSA KÄYTETTÄVÄT MÄÄRITYSMENETELMÄT

A.   KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehun kosteuspitoisuus. Jos rehu sisältää haihtuvia aineita, kuten orgaanisia happoja, on huolehdittava siitä, että kosteuspitoisuuden kanssa määritetään myös merkittäviä määriä haihtuvia aineita.

Menetelmä ei koske suoraan rehuina käytettäviä maitotuotteita, kivennäisaineita ja pääasiassa kivennäisaineista koostuvia seoksia, eläin- ja kasvirasvoja ja -öljyjä tai öljysiemeniä ja öljypitoisia hedelmiä.

2.   Periaate

Näyte kuivataan määrätyissä olosuhteissa, jotka vaihtelevat rehun laadun mukaan. Painohäviö määritetään punnitsemalla. Hyvin kosteat, kiinteät rehunäytteet on syytä esikuivata ennen varsinaista kosteusmääritystä.

3.   Välineistö

4.   Menettely

Huomautus:

Tässä jaksossa kuvatut toimenpiteet on suoritettava välittömästi näytelähetyksen avaamisen jälkeen. Määritykset on suoritettava ainakin kahtena rinnakkaismäärityksenä.

4.1   Valmistaminen

4.1.1    Muut kuin 4.1.2 ja 4.1.3 kohdassa tarkoitetut rehut

Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Tarvittaessa se jauhetaan tai jaetaan sopivalla tavalla kosteuspitoisuuden muuttumista välttäen (ks. 6 kohta).

4.1.2    Vilja ja suurimot

Punnitaan vähintään 50 g näytettä. Se jauhetaan niin hienoksi, että vähintään 50 % näytteestä läpäisee seulan, jonka reikien koko 0,5 mm, eikä 1 mm:n pyöreäreikäistä seulaa jää läpäisemättä yli 10 % näytteestä.

4.1.3    Nestemäiset ja liisterimäiset rehut sekä pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvat rehut

Punnitaan noin 25 g näytettä 10 mg:n tarkkuudella, lisätään sopiva määrä 10 mg:n tarkkuudella punnittua vedetöntä hiekkaa ja sekoitetaan kunnes saadaan homogeeninen seos.

4.2   Kuivaus

4.2.1    Muut kuin 4.2.2 ja 4.2.3 kohdassa tarkoitetut rehut

Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 1 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 103 oC:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua neljän tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 103 oC. Astia suljetaan kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

Pääasiassa öljyistä ja rasvoista koostuvia rehuja kuivataan lämpökaapissa 130 oC:ssa vielä 30 minuutin ajan. Kahden punnituksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,1 % kosteudesta.

4.2.2    Vilja, jauhot, suurimot ja rouheet

Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta 130 oC:ssa olevaan lämpökaappiin. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti. Annetaan kuivua kahden tunnin ajan laskettuna siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 130 oC. Astia suljetaan kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

Näyteastia (3.3) punnitaan kansineen 0,5 mg:n tarkkuudella. Siihen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g hienonnettua näytettä, joka levitetään tasaisesti. Astia asetetaan ilman kantta vakuumilämpökaappiin (3.5), joka on kuumennettu 80–85 oC:seen. Kaapin lämpötilan tarpeettoman laskun välttämiseksi astia viedään sen sisään mahdollisimman nopeasti.

Paine säädetään 100 torriksi ja annetaan kuivua vielä neljän tunnin ajan tässä paineessa joko kuumassa, kuivassa ilmavirrassa tai kuivausainetta käyttäen (noin 300 g 20:tä näytettä kohden). Jälkimmäisessä tapauksessa vakuumipumppu kytketään pois päältä, kun vaadittu paine on saavutettu. Kuivausaika lasketaan siitä hetkestä, kun lämpökaapin lämpötila on uudelleen saavuttanut 80–85 oC. Kuivausajan päätyttyä lämpökaapin paine palautetaan varovasti normaalipaineeseen. Lämpökaappi avataan, näyteastia suljetaan välittömästi kannella, otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä 30–45 minuuttia eksikkaattorissa (3.6) ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella. Näytteen annetaan kuivua vielä 30 minuuttia vakuumilämpökaapissa 80–85 oC:ssa ja se punnitaan uudelleen. Kahden punnituksen välinen ero ei saa ylittää 0,1 %:a kosteudesta.

4.3   Esikuivaus

4.3.1    Muut kuin 4.3.2 kohdassa tarkoitetut rehut

Kiinteille, vaikeasti jauhettaville rehunäytteille, joiden kosteuspitoisuus on suuri, suoritetaan esikuivaus seuraavasti:

Punnitaan 50 g hienontamatonta näytettä (puristetut tai kokkareina olevat rehut voidaan tarvittaessa hienontaa karkeiksi) 10 mg:n tarkkuudella sopivaan astiaan (esim. 0,5 cm:n reunalla varustettu 20 x 12 cm:n alumiiniastia). Annetaan kuivua lämpökaapissa 60–70 oC:ssa, kunnes kosteuspitoisuus on laskenut 8–12 prosenttiin. Näyteastia otetaan pois lämpökaapista, annetaan jäähtyä avoimena laboratoriossa tunnin ajan ja punnitaan 10 mg:n tarkkuudella. Näyte jauhetaan välittömästi 4.1.1 kohdassa esitetyllä tavalla ja kuivataan rehutyypin mukaan 4.2.1 tai 4.2.3 kohdassa esitetyllä tavalla.

4.3.2    Viljat

Jyvät, joiden kosteuspitoisuus on yli 17 %, on esikuivattava seuraavasti:

Punnitaan 50 g jauhamattomia jyviä 10 mg:n tarkkuudella sopivaan astiaan (esim. 0,5 cm:n reunalla varustettu 20 × 12 cm:n alumiiniastia). Annetaan kuivua lämpökaapissa 130 oC:ssa 5–7 minuuttia. Astia poistetaan lämpökaapista, annetaan jäähtyä avoimena laboratoriossa 2 tunnin ajan ja punnitaan 10 mg:n tarkkuudella. Jyvät jauhetaan välittömästi 4.1.2 kohdassa esitetyllä tavalla ja kuivataan 4.2.2 kohdan mukaisesti.

5.   Tulosten laskeminen

Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, lasketaan käyttäen seuraavia kaavoja:

5.1   Kosteuspitoisuus ilman esikuivausta

jossa:

m

=

näytteen alkuperäinen paino grammoina,

m0

=

näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

5.2   Kosteuspitoisuus esikuivausta käyttäen

jossa:

m

=

näytteen alkuperäinen paino grammoina,

m1

=

näytteen paino grammoina esikuivauksen jälkeen,

m2

=

näytteen paino grammoina hienontamisen tai jauhamisen jälkeen,

m0

=

näytteen paino grammoina kuivauksen jälkeen.

5.3   Toistettavuus

Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 0,2 % kosteuden absoluuttisesta arvosta.

6.   Huomautus

Jos jauhaminen on tarpeen ja sen havaitaan muuttavan tuotteen kosteuspitoisuutta, rehun komponenttien määritystulokset on korjattava alkuperäisen näytteen kosteuspitoisuuden perusteella.

B.   ELÄIN- JA KASVIRASVOJEN JA ÖLJYJEN KOSTEUDEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää eläin- ja kasvirasvojen ja öljyjen vesipitoisuus ja haihtuvien aineiden pitoisuus.

2.   Periaate

Näyte kuivataan vakiopainoon 103 oC:ssa (kahden peräkkäisen punnituksen välisen painoeron on oltava alle 1 mg). Painohäviö määritetään punnitsemalla.

3.   Välineistö

4.   Menettely

Punnitaan mg:n tarkkuudella noin 20 g homogenisoitua näytettä kuivaan punnittuun astiaan (3.1), jossa on lämpömittari (3.2). Näytettä kuumennetaan hiekkahauteella tai sähkölevyllä (3.3), sekoittaen jatkuvasti lämpömittarilla niin, että lämpötila saavuttaa 90 oC:n noin 7 minuutissa.

Lämpöä vähennetään pitäen silmällä lautasen pohjasta nousevien kuplien syntymisnopeutta. Lämpötila ei saa nousta yli 105 oC:n. Sekoitusta jatketaan astian pohjaa raaputtaen, kunnes kuplien muodostus lakkaa.

Kosteuden täydellisen poistumisen varmistamiseksi kuumennetaan useita kertoja 103 ± 2 oC:seen jäähdyttäen peräkkäisten kuumennusten välillä 93 oC:seen. Sen jälkeen astian sisältöineen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan eksikkaattorissa (3.4) ja punnitaan. Tämä menettely toistetaan niin monta kertaa, että kahden peräkkäisen punnituksen välinen ero ei ole yli 2 mg:aa.

Huomautus

:

Näytteen painon kasvu toistettujen kuumennusten jälkeen viittaa rasvan hapettumiseen, ja tällaisessa tapauksessa tulos lasketaan siitä punnituksesta, joka on tehty välittömästi ennen kuin paino on alkanut kasvaa.

5.   Tulosten laskeminen

Kosteuspitoisuus (X), joka ilmoitetaan prosentteina näytteestä, saadaan seuraavasta kaavasta:

joissa:

m

=

näytteen paino grammoina,

m1

=

astian paino sisältöineen grammoina ennen kuumennusta,

m2

=

astian paino sisältöineen grammoina kuumennuksen jälkeen.

Tulokset, jotka ovat pienempiä kuin 0,05 %, on varustettava merkinnällä ”alle 0,05 %”.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden samanaikaisen rinnakkaismäärityksen ero ei saa absoluuttisena arvona ilmoitettuna olla yli 0,05 %.

C.   RAAKAVALKUAISPITOISUUDEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan laskea Kjeldahlin menetelmän mukaan saadusta typpipitoisuudesta rehujen raakavalkuaispitoisuus.

2.   Periaate

Näyte hajotetaan rikkihapolla katalysaattorin läsnä ollessa. Hapan liuos tehdään emäksiseksi natriumhydroksidiliuoksella. Ammoniakki tislataan ja kerätään mitattuun määrään rikkihappoa, ja ylimääräinen rikkihappo titrataan natriumhydroksidin standardiliuoksella.

Vaihtoehtoisesti vapautunut ammoniakki tislataan ylimäärään boorihappoliuosta, jonka jälkeen se titrataan kloorivetyhappo- tai rikkihappoliuoksella.

3.   Reagenssit

Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, boorihappoliuoksiin on lisättävä metyylipuna- ja bromokresoli-indikaattoreita. Kun boorihappoliuosta valmistetaan 1 litra, siihen on ennen tilavuuden säätämistä lisättävä 7 ml metyylipunaindikaattoriliuosta (3.16) ja 10 ml bromikresolivihreäliuosta (3.17).

Käytetystä vedestä johtuen boorihappoliuoksen pH saattaa vaihdella erien välillä. Usein on lisättävä vähän emästä, jotta nollanäyte saadaan positiiviseksi.

Huomautus

:

Säätäminen onnistuu yleensä lisäämällä noin 3–4 ml NaOH:ta (3.11) 1 litraan boorihappoa, jonka pitoisuus on 10 g/l. Liuos säilytetään huoneen lämpötilassa suojattuna valolta ja ammoniakkihöyryiltä.

Huomautus

:

Myös muita standardiliuosten konsentraatioita (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ja 3.19) voidaan käyttää, jos konsentraatio korjataan laskelmissa. Konsentraatiot on aina ilmaistava neljän desimaalin tarkkuudella.

4.   Välineistö

Välineet näytteen hajottamista, tislausta ja titrausta varten Kjeldahlin menetelmän mukaan.

5.   Menettely

5.1   Hajotus

Punnitaan 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella Kjeldahl-kolviin hajotuspolttoa varten. Lisätään 15 g kaliumsulfaattia (3.1), sopiva määrä katalysaattoria (3.2) (0,3 –0,4 g kupari(II)oksidia tai 0,9 –1,2 g kupari(II)sulfaattipentahydraattia, 25 ml rikkihappoa (3.4) ja tarvittaessa muutamia kiehumakiviä (3.12) ja sekoitetaan.

Kolvia kuumennetaan varovasti tarvittaessa ajoittain pyörittäen, kunnes massa on hiiltynyt ja kuohu hävinnyt. Tämän jälkeen kuumennetaan voimakkaammin, kunnes neste kiehuu tasaisesti. Kuumennus on sopiva, jos kiehuva happo tiivistyy kolvin seinämiin. Kolvin seinämien ylikuumennusta ja orgaanisen aineksen tarttumista kolvin seinämiin on vältettävä.

Kun liuos on muuttunut kirkkaaksi ja kirkkaanvihreäksi, keittämistä jatketaan vielä kahden tunnin ajan; tämän jälkeen kolvin annetaan jäähtyä.

5.2   Tislaus

Kolviin lisätään varovasti riittävä määrä vettä, jotta sulfaatit liukenisivat täysin. Annetaan jäähtyä ja lisätään tarvittaessa muutama sinkkirae (3.3). Jatketaan 5.2.1 tai 5.2.2 kohdan mukaisesti.

5.2.1    Tislaus rikkihappoon

Tislauslaitteen keräilyastiaan lisätään oletetun typpipitoisuuden mukaan 25 ml rikkihappoa (3.5) tai (3.7) tarkasti mitattuna. Lisätään muutama pisara metyylipunaindikaattoria (3.8).

Kolvi yhdistetään tislauslaitteen jäähdyttimeen ja jäähdyttimen pää upotetaan keräilyastiassa olevaan liuokseen vähintään 1 cm:n syvyyteen (ks. 8.3 huomautus). Kolviin lasketaan hitaasti 100 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9) siten, ettei ammoniakkia katoa (ks. 8.1 huomautus). Kolvia kuumennetaan siten, että ammoniakki tislautuu kokonaan.

5.2.2    Tislaus boorihappoon

Kun tisleestä titrataan ammoniakki manuaalisesti, noudatetaan alla olevaa menettelyä. Jos tislauslaite on täysin automaattinen ja suorittaa ammoniakin titraamisen tisleestä, noudatetaan valmistajan käyttöohjeita.

Keräilyastia, joka sisältää 25–30 ml boorihappoliuosta (3.18), asetetaan jäähdyttimen ulostulon alle siten, että poistoputki jää boorihappoliuoksen pinnan alapuolelle. Tislauslaite säädetään annostelemaan 50 ml natriumhydroksidiliuosta (3.9). Tislauslaitetta käytetään valmistajan ohjeiden mukaan ja tislataan pois natriumhydroksidiliuoksen lisäyksen tuloksena vapautunut ammoniakki. Tisle kerätään boorihappoa sisältävään vastaanottoliuokseen. Tisleen määrä (vesihöyrytislauksen aika) riippuu näytteen sisältämän typen määrästä. Valmistajan ohjeita noudatetaan.

Huomautus

:

Puoliautomaattisessa tislauslaitteessa natriumhydroksidiylimäärän lisäys ja vesihöyrytislaus tapahtuvat automaattisesti.

5.3   Titraus

Jatketaan 5.3.1 tai 5.3.2 kohdan mukaisesti.

5.3.1    Rikkihappo

Keräilyastiassa oleva rikkihappoylimäärä titrataan käytetyn rikkihapon konsentraation mukaan natriumhydroksidiliuoksella (3.10 tai 3.11), kunnes loppupiste saavutetaan.

5.3.2    Boorihappo

Keräilyastian sisältö titrataan kloorivetyhapon standardiliuoksella (3.19) tai rikkihapon standardiliuoksella (3.6) byrettiä käyttäen ja todetaan käytetyn titrausliuoksen määrä.

Jos loppupisteen toteamiseksi käytetään kolorimetristä menetelmää, loppupiste on saavutettu, kun sisältöön alkaa ilmestyä vaaleanpunaista väriä. Byretin lukema arvioidaan 0,05 ml:n tarkkuudella. Loppupisteen havaitseminen saattaa olla helpompaa valaistun magneettisekoittimen tai fotometrisen detektorin avulla.

Tämä voidaan tehdä automaattisesti vesihöyrytislaimella, jossa on automaattinen titraus.

Tislauslaitteen tai tislaus/titrauslaitteen käytössä noudatetaan valmistajan ohjeita.

Huomautus

:

Kun käytetään automaattista titrausjärjestelmää, titraus alkaa välittömästi tislauksen alettua ja kun 1-prosenttinen boorihappoliuos (3.18) on kulunut. Käytettäessä täysin automaattista tislausyksikköä ammoniakki voidaan titrata automaattisesti ja loppupiste detektoida käyttämällä potentiometristä pH-järjestelmää. Tässä tapauksessa käytetään automaattista titrauslaitetta, jossa on pH-mittari. pH-mittari on kalibroitava asianmukaisesti välille pH 4–7 noudattaen tavanomaisia laboratorioiden pH-kalibrointimenettelyjä. Titrauksen pH-loppupiste saavutetaan, kun pH on 4,6 , mikä on titrauskäyrän jyrkin kohta (käännekohta).

5.4   Nollakoe

Reagenssien typettömyyden varmistamiseksi suoritetaan nollakoe (hajotus, tislaus ja titraus) käyttämällä 1 g sakkaroosia (3.14) näytteen sijasta.

6.   Tulosten laskeminen

Tulokset lasketaan 6.1 tai 6.2 kohdan mukaisesti.

6.1   Tuloksen laskeminen 5.3.1 kohdan mukaisessa titrauksessa

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavaa kaavaa käyttäen:

jossa:

V0

=

nollakokeessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml),

V1

=

näytteen titrauksessa kulunut NaOH:n (3.10 tai 3.11) määrä (ml),

c

=

natriumhydroksidin (3.10 tai 3.11) konsentraatio (mol/l),

m

=

näytteen paino (g).

6.2   Tuloksen laskeminen 5.3.2 kohdan mukaisessa titrauksessa

6.2.1    Titraus kloorivetyhapolla

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

m

=

näytteen paino (g),

c

=

kloorivetyhapon standardiliuoksen (3.19) konsentraatio (mol/l),

V0

=

nollakokeessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml),

V1

=

näytteen titrauksessa kuluneen kloorivetyhapon määrä (ml).

6.2.2    Titraus rikkihapolla

Raakavalkuaispitoisuus ilmaistuna painoprosentteina lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

m

=

näytteen paino (g),

c

=

rikkihapon standardiliuoksen (3.6) konsentraatio (mol/l),

V0

=

nollakokeessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml),

V1

=

näytteen titrauksessa kuluneen rikkihapon (3.6) määrä (ml).

7.   Menetelmän varmistus

7.1   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin:

7.2   Tarkkuus

Määritys (hajotus, tislaus ja titraus) tehdään 1,5 –2,0 grammalla asetanilidia (3.13) siten, että läsnä on 1 grammaa sakkaroosia (3.14); 1 g asetanilidia kuluttaa 14,80 ml rikkihappoa (3.5). Saannon on oltava vähintään 99 %.

8.   Huomautukset

D.   UREAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen ureapitoisuus.

2.   Periaate

Näyte suspendoidaan veteen sellaisen aineen läsnä ollessa, joka saa suspension kirkastumaan. Suspensio suodatetaan. Suodoksen ureamäärä määritetään sen jälkeen kun siihen on lisätty 4-dimetyyliaminobentsaldehydiä (4-DMAB) mittaamalla liuoksen absorbanssi 420 nm:n aallonpituudella.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Näytteen määritys

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2 g näytettä sekä 1 g aktiivihiiltä (3.4) 500 ml:n mittapulloon. Lisätään 400 ml vettä ja 5 ml Carrez I -liuosta (3.2), sekoitetaan noin 30 sekunnin ajan ja lisätään 5 ml Carrez II -liuosta (3.3). Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään vettä merkkiin asti, sekoitetaan ja suodatetaan.

Läpinäkyvästä, värittömästä suodoksesta pipetoidaan 5 ml lasihiostulpallisiin koeputkiin, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1) ja sekoitetaan. Putket asetetaan 20 C:ssa (+/– 4 C) olevaan vesihauteeseen. Viidentoista minuutin kuluttua mitataan näyteliuoksen absorbanssi spektrofotometrillä 420 nm:n aallonpituudella. Lukemaa verrataan reagensseista valmistettuun nollakoeliuokseen.

5.2   Kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 100 ml:n mittapulloihin 1, 2, 4, 5 ja 10 ml urealiuosta (3.5) ja täytetään merkkiin asti vedellä. Kutakin liuosta pipetoidaan koeputkiin 5 ml, lisätään 5 ml 4-DMAB -liuosta (3.1), homogenoidaan ja niiden absorbanssi mitataan edellä kuvatulla tavalla verrattuna kontrolliliuokseen, joka sisältää 5 ml 4-DMAB:ta ja 5 ml vettä ja jossa ei ole ureaa. Piirretään kalibrointikäyrä.

6.   Tulosten laskeminen

Urean määrä näytteessä määritetään kalibrointikäyrää käyttäen.

Tulokset ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Huomautukset

E.   HAIHTUVIEN TYPPIPITOISTEN EMÄSTEN MÄÄRITYS

I   MIKRODIFFUUSIO

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehuista haihtuvien typpipitoisten emästen pitoisuus ammoniakkina ilmoitettuna.

2.   Periaate

Näyte uutetaan vedellä, liuos kirkastetaan ja suodatetaan. Haihtuvat typpipitoiset emäkset vapautetaan mikrodiffuusiolla käyttäen kaliumkarbonaattiliuosta, sidotaan boorihappoliuokseen ja titrataan rikkihapolla.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

Punnitaan 10 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon, johon lisätään 100 ml vettä. Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään 50 ml trikloorietikkahappoliuosta (3.1), täytetään merkkiin asti vedellä, ravistellaan voimakkaasti ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi.

Pipetoidaan Conway-maljan keskiympyrään 1 ml boorihappoliuosta (3.3) ja reunaympyrään 1 ml näytemaljasuodosta. Peitetään osittain rasvatulla kannella. Reunaympyrään lisätään nopeasti 1 ml kyllästettyä kaliumkarbonaattiliuosta (3.4) ja kansi suljetaan ilmatiiviisti. Maljaa pyöritetään varovasti vaakasuorassa tasossa siten, että nämä kaksi reagenssia sekoittuvat. Inkuboidaan vähintään neljä tuntia huoneenlämmössä tai yksi tunti 40 oC:ssa.

Boorihappoliuoksessa olevat haihtuvat emäkset titrataan rikkihapolla (3.5) mikrobyrettiä (4.3) käyttäen.

Nollakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä.

6.   Tulosten laskeminen

1 ml H2SO4:ää, 0,01 mol/l, vastaa 0,34 mg:aa ammoniakkia.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

7.   Huomautus

Jos näytteen ammoniakkipitoisuus ylittää 0,6 %, on alkuperäinen suodos laimennettava.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II   TISLAUSMENETELMÄ

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää haihtuvien typpipitoisten emästen pitoisuus ammoniakkina ilmoitettuna kalajauhosta, joka ei käytännöllisesti katsoen sisällä ureaa. Menetelmä soveltuu ainoastaan näytteisiin, joiden ammoniakkipitoisuus on alle 0,25 %.

2.   Periaate

Näyte uutetaan vedellä, liuos kirkastetaan ja suodatetaan. Haihtuvat typpipitoiset emäkset vapautuvat keitettäessä näyteliuosta magnesiumoksidin kanssa ja ne sidotaan tunnettuun määrään rikkihappoa, jonka ylimäärä titrataan takaisin natriumhydroksidiliuoksella.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

Punnitaan 10 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon, johon lisätään 100 ml vettä. Pidetään sekoittimessa 30 minuutin ajan. Lisätään 50 ml trikloorietikkahappoliuosta (3.1), täytetään merkkiin asti vedellä, ravistellaan voimakkaasti ja suodatetaan laskostetun suodatinpaperin läpi.

Otetaan kirkasta liuosta sopiva määrä haihtuvien typpipitoisten emästen oletetun pitoisuuden kannalta (100 ml on yleensä sopiva määrä). Laimennetaan 200 ml:ksi ja lisätään 2 g magnesiumoksidia (3.2) ja muutama pisara kuohunestoainetta (3.3). Liuoksen on oltava lakmuspaperilla määritettynä emäksinen; muussa tapauksessa siihen lisätään hieman magnesiumoksidia (3.2). Jatketaan raakavalkuaispitoisuuden määrityksessä käytettävän menetelmän 5.2 ja 5.3 kohdan mukaisesti (tämän liitteen C osa).

Nollakoe suoritetaan samalla tavalla, mutta ilman määritettävää näytettä.

6.   Tulosten laskeminen

1 ml H2SO4:ää, 0,05 mol/l, vastaa 1,7 mg:aa ammoniakkia.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Kahden samasta näytteestä suoritetun rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla suhteellisena arvona ilmoitettuna suurempi kuin 10 % ammoniakkimäärästä.

F.   AMINOHAPPOJEN MÄÄRITYS (TRYPTOFAANIA LUKUUN OTTAMATTA)

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen vapaat aminohapot (synteettiset ja luonnon aminohapot) ja kokonaisaminohapot (peptideihin kiinnittyneet ja vapaat) aminohappoanalysaattorilla. Se sopii seuraaviin aminohappoihin: kyst(e)iini, metioniini, lysiini, treoniini, alaniini, arginiini, asparagiinihappo, glutamiinihappo, glysiini, histidiini, isoleusiini, leusiini, fenyylialaniini, proliini, seriini, tyrosiini ja valiini.

Menetelmällä ei eroteta toisistaan aminohappojen suoloja eikä aminohappojen D- ja L-muotoja. Se ei sovellu tryptofaanin eikä aminohappojen hydroksianalogien määritykseen.

2.   Periaate

2.1   Vapaat aminohapot

Vapaat aminohapot uutetaan laimealla kloorivetyhapolla. Mukana uuttuneet typpipitoiset makromolekyylit saostetaan sulfosalisyylihapolla ja poistetaan suodattamalla. Suodatetun liuoksen pH säädetään arvoon 2,20 . Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm.

2.2   Kokonaisaminohapot

Menetelmä valitaan tutkittavien aminohappojen mukaan. Kyst(e)iini ja metioniini on hapetettava kysteiinihapoksi ja metioniinisulfoniksi ennen hydrolyysiä. Tyrosiini on määritettävä näytteistä, joita ei hapeteta ennen hydrolyysiä. Kaikki muut 1 kohdassa mainitut aminohapot voidaan määrittää joko hapetetusta tai hapettamattomasta näytteestä.

Hapettaminen tapahtuu 0 oC:ssa permuurahaishapon ja fenolin seoksella. Hapetusreagenssin ylimäärä hajotetaan natriumdisulfiitin avulla. Hapetettu tai hapettamaton näyte hydrolysoidaan kloorivetyhapolla (3.20) avulla 23 tunnin ajan. Hydrolyysituotteen pH säädetään arvoon 2,20 . Aminohapot erotetaan ioninvaihtokromatografialla ja määritetään fotometrillä ninhydriinijohdoksina aallonpituudella 570 nm (proliini 440 nm).

3.   Reagenssit

Veden on oltava kaksoistislattua tai vastaavan laatuista (johtokyky < 10 μS).

liuotetaan 300 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi.

liuotetaan 40 g NaOH:ta (3.5) veteen ja laimennetaan 1 litraksi.

sekoitetaan 889 g muurahaishappoa (3.2) ja 111 g vettä ja lisätään 4,73 g fenolia (3.3).

lisätään 1 g fenolia (3.3) 492 ml:aan HCl (3.7) ja laimennetaan vedellä 1 litraksi.

Liuotetaan 60 g 5-sulfosalisyylihappoa (3.6) veteen ja laimennetaan vedellä litraksi.

sekoitetaan 0,5 ml vetyperoksidia (3.1) 4,5 ml:aan muurahaishappo-fenoliliuosta (3.19) pienessä dekantterilasissa. Inkuboidaan 20–30 oC:ssa tunnin ajan, jotta saadaan permuurahaishappoa, annetaan sitten jäähtyä jäävesihauteessa (15 min) ennen näytteeseen lisäämistä.

Varoitus: vältettävä ihokosketusta ja käytettävä suojavaatteita.

liuotetaan 19,61 g natriumsitraattia (3.8), 5 ml tiodiglykolia (3.9), 1 g fenolia (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) noin 800 ml:aan vettä. Säädetään pH arvoon 2,20 . Laimennetaan vedellä yhdeksi litraksi.

c = 2,5 μmol/ml kutakin aminohappoa kloorivetyhapossa.

Saatavana kaupallisesti.

Liuotetaan 0,2115 g kysteiinihappoa (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinisulfonia (3.16.3) sitraattipuskuriin (3.24) litran mittapullossa ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla. Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 12 kuukautta. Tätä liuosta ei tarvita, jos standardin kantaliuos (3.27.1) sisältää kysteiinihappoa ja metioniinisulfonia.

Liuotetaan 0,6560 g norleusiinia (3.13) sitraattipuskuriin (3.24) mittapullossa ja täytetään 250,0 ml:ksi sitraattipuskurilla (3.24). Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 6 kuukautta.

Siirretään kvantitatiivisesti 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24) ja sekoitetaan.

Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta.

Katso myös huomautukset 9.1 kohdassa.

Säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa enintään 3 kuukautta.

4.   Välineistö

Kolonni täytetään sellaisella sulfonoidulla polystyreenihartsilla, jolla voidaan erottaa eri aminohapot toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista yhdisteistä. Puskuri- ja ninhydriinipumpun virtausnopeuden stabiilisuuden tulee olla ±0,5 % ajanjaksona, jona analysoidaan sekä standardiliuos että näyte.

Tietyissä aminohappoanalysaattoreissa voidaan käyttää hydrolyysimenetelmää, jossa hydrolysaatin natriumpitoisuus on c = 0,8 mol/l ja se sisältää näin kaiken hapetuksessa jäljelle jääneen muurahaishapon. Muut laitteet eivät erota tyydyttävästi tiettyjä aminohappoja, jos hydrolysaatti sisältää liikaa muurahaishappoa ja/tai natriumionipitoisuus on suuri. Tässä tapauksessa hapon määrää vähennetään haihduttamalla hydrolysaatti noin 5 ml:aan ennen pH:n säätämistä. Haihduttamisen on tapahduttava tyhjiössä enintään 40 oC:ssa.

5.   Menettely

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joiden kosteuspitoisuus on suuri, on ilmakuivattava korkeintaan 50 oC:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joiden rasvapitoisuus on suuri, on uutettava petrolieetterillä (3.12) ennen jauhamista.

5.2   Vapaiden aminohappojen määrittäminen rehuista ja esiseoksista

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin ja lisätään 100,0 ml uuttoseosta (3.21). Ravistellaan seosta 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.8). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin.

Lisätään koko ajan sekoittaen 5,0 ml sulfosalisyylihappoliuosta (3.22) ja jatketaan sekoittamista 5 minuutin ajan magneettisekoittimella. Suodatetaan tai sentrifugoidaan liuos mahdollisen sakan erottamiseksi. Pipetoidaan 10,0 ml saatua liuosta 100 ml:n dekantterilasiin, säädetään pH arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18), huuhdotaan sopivan kokoiseen mittapulloon sitraattipuskurilla (3.24) ja täytetään merkkiin asti puskuriliuoksella (3.24).

Jos käytetään sisäistä standardia (3.27.3), sitä lisätään 1,00 ml lopullisen liuoksen kutakin 100 ml:aa kohden ja täytetään merkkiin asti purskuriliuoksella (3.24).

Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, uutteet säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa.

5.3   Kokonaisaminohappojen määrittäminen

5.3.1    Hapettaminen

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1 –1 g valmistettua näytettä (5.1):

Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg ja kosteuspitoisuuden enintään 100 mg.

Asetetaan pyörökolvi tai pullo jää-vesihauteeseen ja jäähdytetään 0 oC:seen, lisätään 5 ml hapetusseosta (3.23) ja sekoitetaan kaarevakärkisellä lasilastalla. Suljetaan kolvi/pullo lastoineen ilmatiiviin kalvon avulla, asetetaan jää-vesihaude näin suljettuine astioineen jääkaappiin, jonka lämpötila on 0 oC, ja jätetään sinne 16 tunniksi. Tämän jälkeen se otetaan jääkaapista ja hajotetaan hapetusreagenssin ylimäärä lisäämällä 0,84 g natriumdisulfiittia (3.4).

Siirrytään 5.3.2.1 kohtaan.

5.3.2    Hydrolyysi

5.3.2.1    Hapetettujen näytteiden hydrolyysi

Edellä 5.3.1. kohdan mukaisesti valmistettuun hapetettuun näytteeseen lisätään 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) huolehtien siitä, että astian seinämiin ja lastaan jäänyt näyte huuhdellaan pois.

Jatketaan valitun hydrolyysimenetelmän mukaan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta.

5.3.2.2    Hapettamattomien näytteiden hydrolyysi

Punnitaan 100 ml:n tai 200 ml:n pyörökolviin (4.1) tai 100 ml:n kierrekorkilliseen pulloon (4.2) 0,1 –1,0 g valmistettua näytettä (5.1) 0,2 mg:n tarkkuudella. Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään varovasti 25 ml hydrolyysiseosta (3.20) ja sekoitetaan näytteeseen. Jatketaan joko 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdasta.

5.3.2.3    Avoin hydrolyysi

Lisätään kolme lasihelmeä kolvissa olevaan seokseen (valmistettu 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti) ja keitetään tasaisesti kuplittaen palautusjäähdyttimen alla 23 tuntia. Hydrolyysin jälkeen huuhdellaan jäähdytin 5 ml:lla sitraattipuskuria (3.24). Kolvi irrotetaan ja jäähdytetään jäähauteessa.

Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti.

5.3.2.4    Suljettu hydrolyysi

Asetetaan 5.3.2.1 tai 5.3.2.2 kohdan mukaisesti valmistettua näyteseosta sisältävä pullo uuniin (4.3) 110 oC:seen. Ensimmäisen tunnin aikana pidetään kierrekorkki sulkematta pullon päällä, jottei kaasun muodostuksen vuoksi syntyisi painetta ja jotta vältyttäisiin räjähdyksiltä. Pulloa ei saa sulkea korkilla. Tunnin kuluttua pullo suljetaan kierrekorkilla ja sen annetaan olla uunissa (4.3) 23 tunnin ajan. Hydrolyysin jälkeen pullo otetaan uunista, avataan korkki varovasti ja asetetaan pullo jää-vesihauteeseen. Annetaan jäähtyä.

Riippuen tavasta, jolla pH säädetään (5.3.3), siirretään pullon sisältö kvantitatiivisesti sitraattipuskurin avulla (3.24) 250 ml:n dekantterilasiin tai 250 ml:n pyörökolviin.

Jatketaan 5.3.3 kohdan mukaisesti.

5.3.3    pH:n säätäminen

Aminohappoanalysaattorin (4.9) natriuminsietokyvyn mukaan noudatetaan 5.3.3.1 tai 5.3.3.2 kohtaa pH:n säätämiseksi.

5.3.3.1    Kromatografit (4.9), jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta

On suositeltavaa käyttää sisäisen standardin perusliuosta (3.27.3), jos käytetään aminohappoanalysaattoreita, jotka edellyttävät alhaista natriumpitoisuutta (kun hapon määrää on vähennettävä).

Tässä tapauksessa lisätään 2,00 ml sisäisen standardin perusliuosta (3.27.3) hydrolysaattiin ennen haihdutusta tai sen jälkeen.

Lisätään 2 tippaa 1-oktanolia (3.15) 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 kohdan mukaisesti saatuun hydrolysaattiin.

Haihdutetaan näyte 5–10 ml:aan pyöröhaihduttimella (4.7), jonka hauteen lämpötila on 40 oC. Jos tilavuus pienenee vahingossa alle viiden millilitran, hydrolysaatti on hylättävä ja analyysi aloitettava uudelleen.

pH säädetään arvoon 2,20 natriumhydroksidiliuoksella (3.18) ja jatketaan kohdasta 5.3.4.

5.3.3.2    Muut aminohappoanalysaattorit (4.9):

Kohdan 5.3.2.3 tai 5.3.2.4 mukaisesti saatu hydrolysaatti neutraloidaan osittain lisäämällä varovasti koko ajan sekoittaen 17 ml natriumhydroksidiliuosta (3.17) ja huolehditaan siitä, että lämpötila on alle 40 oC.

Lopullinen pH:n säätäminen 2,20 :een tapahtuu huoneen lämpötilassa 3.17 kohdan mukaisen natriumhydroksidiliuoksen avulla ja lopuksi 3.18 kohdan mukaisella natriumhydroksidiliuoksella. Siirrytään 5.3.4 kohtaan.

5.3.4    Näyteliuos kromatografiaa varten

Siirretään kvantitatiivisesti hydrolysaatti, jonka pH on säädetty (5.3.3.1 tai 5.3.3.2.), sitraattipuskurilla (3.24) 200 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti puskurilla (3.24).

Jos sisäistä standardia ei ole vielä käytetty, lisätään sitä 2,00 ml (3.27.3) ja täytetään merkkiin asti sitraattipuskurilla (3.24). Sekoitetaan huolellisesti.

Siirrytään kromatografiavaiheeseen (5.4).

Jos kromatografiaa ei tehdä samana päivänä, näyteliuokset säilytetään alle 5 oC:n lämpötilassa.

5.4   Kromatografia

Annetaan uutteen (5.2) tai hydrolysaatin (5.3.4) tasoittua huoneenlämpöisiksi ennen kromatografiaa. Ravistellaan seosta ja suodatetaan sopiva määrä 0,2 μm:n kalvosuodattimen läpi (4.5). Saatu kirkas liuos analysoidaan aminohappoanalysaattorilla käyttäen ioninvaihtokromatografiaa (4.9).

Injektio voidaan suorittaa käsin tai automaattisesti. On tärkeää, että kolonniin lisätään aina sama määrä (±0,5 %) vertailu- tai näyteliuosta, paitsi silloin kun käytetään sisäistä standardia, ja että natriumin ja aminohappojen suhde standardi- ja näyteliuoksissa on mahdollisimman lähellä toisiaan.

Kalibrointiajojen tiheys riippuu ninhydriinireagenssin ja analysaattorin toiminnan stabiilisuudesta. Standardi- tai näyteliuosta laimennetaan sitraattipuskurilla (3.24), siten, että standardiliuoksen antama piikin pinta-ala on 30–200 % näytteen aminohapon antaman piikin pinta-alasta.

Aminohappojen kromatografia vaihtelee jonkin verran käytetyn analysaattorin tyypin ja käytetyn hartsin mukaan. Valitun menetelmän on mahdollistettava aminohappojen erottaminen toisistaan ja muista ninhydriinin kanssa reagoivista aineista. Pylvääseen ruiskutettujen yhdisteiden pitoisuuden muutosten on käyttöalueella annettava lineaarinen vaste.

Analysoitaessa aminohappojen ekvimolaarisia liuoksia sovelletaan seuraavassa kappaleessa määriteltyjä laakson ja piikin välisiä suhteita. Ekvimolaarisen liuoksen tulee sisältää vähintään 30 % kunkin aminohapon siitä enimmäismäärästä, joka voidaan määrittää tarkasti käytetyllä aminohappoanalysaattorilla (4.9).

Kromatogrammissa treoniinin ja seriinin osittain päällekkäisten piikkien välisen laakson suhde matalamman piikin korkeuteen ei saa olla suurempi kuin 2:10. (Jos määritetään ainoastaan kyst(e)iiniä, metioniiniä, treoniiniä ja lysiiniä, vierekkäisten piikkien riittämätön erottuminen toisistaan häiritsee määritystä.) Muiden aminohappojen osalta erottumisen on oltava parempi kuin 1:10.

Kromatografiajärjestelmän on pystyttävä erottamaan lysiini lysiiniartefaktoista ja ornitiinistä.

6.   Tulosten laskeminen

Näytteen ja vertailuliuoksen piikkien pinta-ala mitataan kunkin yksittäisen aminohapon osalta ja määrä (X) lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti; tulos ilmoitetaan grammoina aminohappoa näytekiloa kohden.

Jos sisäistä standardia käytetään, kerrotaan kaava vielä termillä

A

=

analysoitavan piikin pinta-ala, hydrolysaatti tai uute

B

=

analysoitavan piikin pinta-ala, standardiliuos

C

=

sisäisen standardin piikin pinta-ala hydrolysaatissa tai uutteessa

D

=

sisäisen standardin piikin pinta-ala kalibrointiliuoksessa

M

=

analysoitavan aminohapon molekyylipaino

c

=

standardin konsentraatio μmol/ml

m

=

näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu tai rasva poistettu)

V

=

ml kokonaishydrolysaattia (5.3.4) tai ml uutteen laskettua kokonaislaimennosta (6.1).

Sekä kystiini että kysteiini määritetään kysteiinihappona hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta ne lasketaan kystiiniksi (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) käyttäen molekyylipainoa 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metioniini määritetään metioniinisulfonina hapetetun näytteen hydrolysaateista, mutta lasketaan metioniiniksi käyttäen metioniinin molekyylipainoa 149,21 g/mol.

Lisätty vapaa metioniini määritetään uuttamisen jälkeen metioniinina; laskennassa käytetään samaa molekyylipainoa.

V

=

lopullisen uutteen määrä.

7.   Menetelmän arviointi

Menetelmä on testattu vuonna 1990 tehdyssä kansainvälisessä laboratorioiden välisessä vertailussa käyttäen neljää eri rehua (sikojen täysrehu, broilereiden täysrehu, valkuaistiiviste ja esiseos). Tulosten keskiarvo ja standardipoikkeama poikkeavien arvojen poissulkemisen jälkeen on esitetty tämän kohdan taulukoissa.

7.1   Toistettavuus

Toistettavuus edellä mainitussa laboratorioiden välisessä vertailussa on ilmaistu muodossa ”laboratorion sisäinen standardipoikkeama” alla olevassa taulukossa.

7.2   Uusittavuus

Edellä mainitun vertailun laboratorioiden välisten standardipoikkeamien tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.

8.   Vertailumateriaalin käyttö

Menetelmän oikea soveltaminen tarkistetaan sertifioidulla vertailumateriaalilla, jos sellainen on saatavilla, tehdyllä kaksoismäärityksellä. Kalibrointi sertifioidulla aminohappojen kalibrointiliuoksella on suotavaa.

9.   Huomautukset

Laitteiston lineaarisen vasteen alue on tarkistettava kaikkien aminohappojen osalta.

Standardiliuos laimennetaan sitraattipuskurilla siten, että piikit sijoittuvat alueen keskivaiheille.

G.   TRYPTOFAANIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmän avulla voidaan määrittää rehuissa olevan tryptofaanin kokonaismäärä ja vapaan tryptofaanin määrä. Menetelmällä ei voi erottaa D- ja L-muotoja toisistaan.

2.   Periaate

Tryptofaanin kokonaismäärän määrittämiseksi näyte hydrolysoidaan emäksisissä olosuhteissa kyllästetyllä bariumhydroksidiliuoksella ja kuumennetaan 110 oC:ssa 20 tuntia. Hydrolyysin jälkeen lisätään sisäinen standardi.

Vapaan tryptofaanin määrittämiseksi näytettä uutetaan lievästi happamissa olosuhteissa yhdessä sisäisen standardin kanssa.

Tryptofaani ja sisäinen standardi hydrolysaatissa tai uutteessa määritetään HPLC:llä käyttäen fluoresenssidetektoria.

3.   Reagenssit

Liuotetaan 40,0 g NaOH:ta (3.5) veteen ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1).

Mitataan 492 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

Mitataan 82 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

Mitataan 8,2 ml HCl:ää (3.7) ja täytetään 1 litraksi vedellä.

Mitataan 34 ml ortofosforihappoa (3.6) ja täytetään 1 litraksi vedellä (3.1).

Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2553 g tryptofaania (3.2) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 oC:ssa enintään 4 viikkoa.

Liuotetaan 500 ml:n mittapullossa 0,2728 g α-metyylitryptofaania (3.3) kloorivetyhappoon (3.13) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla (3.13). Säilyy –18 oC:ssa enintään 4 viikkoa.

Mitataan 2,00 ml konsentroitua tryptofaaniliuosta (3.15) ja 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin (α-metyylitryptofaanin) liuosta (3.16). Laimennetaan vedellä (3.1) ja metanolilla (3.8) siten, että liuoksen tilavuus ja metanolipitoisuus on suunnilleen sama kuin valmiin hydrolysaatin (metanolia 10–30 %).

Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Liuos suojataan suoralta auringonvalolta valmistuksen aikana.

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Näytteiden valmistaminen

Näyte jauhetaan siten, että se läpäisee 0,5 mm:n seulan. Näytteet, joilla on suuri kosteuspitoisuus, on ilmakuivattava korkeintaan 50 oC:n lämpötilassa tai kylmäkuivattava ennen jauhamista. Näytteet, joilla on suuri rasvapitoisuus, on uutettava petrolieetterillä (3.9) ennen jauhamista.

5.2   Vapaan tryptofaanin määritys (uutteesta)

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella sopiva määrä (1–5 g) valmistettua näytettä (5.1) erlenmeyerkolviin. Lisätään 100,0 ml kloorivetyhappoa (3.13) ja 5,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (3.16). Ravistellaan tai sekoitetaan 60 minuuttia mekaanisella ravistelijalla tai magneettisekoittimella (4.7). Annetaan sakan laskeutua ja pipetoidaan 10,0 ml supernatanttiliuosta dekantterilasiin. Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Säädetään pH arvoon 3 natriumhydroksidilla (3.10). Lisätään metanolia (3.8) niin että lopputilavuudessa on 10–30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (suunnilleen sama tilavuus kuin kalibrointistandardiliuoksella (3.17)).

Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Standardiliuos ja uutteet suojataan suoralta auringonvalolta. Jos näyteliuoksia ei voida analysoida samana päivänä, uutteita voi säilyttää 5 oC:ssa enintään 3 päivää.

5.3   Tryptofaanin kokonaismäärän määritys (hydrolysaatista)

Punnitaan 0,2 mg:n tarkkuudella 0,1 –1 g valmistettua näytettä (5.1) polypropyleenipulloon (4.4). Punnitun näytemäärän typpipitoisuuden on oltava noin 10 mg. Lisätään 8,4 g bariumhydroksidioktahydraattia (3.4) ja 10 ml vettä. Sekoitetaan vortex-sekoittimella (4.8) tai magneettisekoittimella (4.7). Teflon-päällystetty magneetti jätetään seokseen. Huuhdotaan pullon seinämät 4 ml:lla vettä. Pullo suljetaan löyhästi kierrekorkilla. Pullo pannaan autoklaaviin (4.6), jossa on kiehuvaa vettä, ja autoklavoidaan 30–60 minuutin ajan. Suljetaan autoklaavi ja autoklavoidaan 110 (± 2) oC:ssa 20 tuntia.

Lämpötila on laskettava juuri alle 100 oC:seen, ennen kuin autoklaavi avataan. Jotta Ba(OH)2 · 8 H2O ei kiteytyisi, lämpimään seokseen lisätään 30 ml huoneenlämpöistä vettä. Ravistellaan tai sekoitetaan varovasti. Lisätään 2,00 ml konsentroitua sisäisen standardin liuosta (α-metyylitryptofaania, 3.16). Jäähdytetään pulloja vesi/jäähauteessa 15 minuuttia.

Lisätään 5 ml ortofosforihappoa (3.14). Pullo pidetään jäähdytyshauteessa ja liuos neutraloidaan HCl:llä (3.11) sekoittaen samalla, ja pH säädetään arvoon 3,0 HCl:llä (3.12). Lisätään metanolia niin että lopputilavuudessa on 10–30 % metanolia. Siirretään liuos sopivankokoiseen mittapulloon ja laimennetaan vedellä tiettyyn sopivaan tilavuuteen kromatografiaa varten (esim. 100 ml). Metanolin lisääminen ei saa aiheuttaa saostumista.

Suodatetaan muutama ml liuosta 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.5) läpi ennen HPLC-kolonniin injektointia. Siirrytään kromatografiavaiheeseen 5.4 kohdan mukaisesti.

Standardiliuos ja hydrolysaatit suojataan suoralta auringonvalolta. Jos hydrolysaatteja ei voida analysoida samana päivänä, niitä voi säilyttää 5 oC:ssa enintään 3 päivää.

5.4   HPLC-määritys

Seuraavat isokraattisen erotuksen olosuhteet ovat ohjeellisia; ajo voidaan suorittaa muissa olosuhteissa, jos niillä saadaan samanlaiset tulokset (ks. myös huomautukset 9.1 ja 9.2):

6.   Tulosten laskeminen

Lasketaan tryptofaanin määrä (X) grammoina 100 grammassa näytettä.

A

=

sisäisen standardin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17)

B

=

tryptofaanin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3)

V1

=

kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) tilavuus ml (2 ml)

c

=

kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun tryptofaaniliuoksen (3.15) pitoisuus μmol/ml (= 2,50 )

V2

=

uuttovaiheessa (5.2) lisätyn (= 5,00 ml) tai hydrolysaattiin (5.3) lisätyn (= 2,00 ml) konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml

C

=

sisäisen standardin piikin pinta-ala, uute (5.2) tai hydrolysaatti (5.3)

D

=

tryptofaanin piikin pinta-ala, kalibrointistandardiliuos (3.17)

V3

=

kalibrointiliuokseen (3.17) lisätyn konsentroidun sisäisen standardiliuoksen (3.16) tilavuus ml (= 2,00 ml)

m

=

näytteen paino grammoina (korjataan alkuperäiseen painoon, jos kuivattu ja/tai rasva poistettu)

M

=

tryptofaanin molekyylipaino (= 204,23 g/mol).

7.   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 10 % suuremmasta tuloksesta.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Järjestetyssä EY-vertailussa (4. vertailututkimus) 12 laboratoriota analysoi kolme näytettä hydrolyysimenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä)

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

SR

=

uusittavuuden keskihajonta

r

=

toistettavuus

R

=

uusittavuus

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin, %

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin, %.

Toisessa EY-vertailussa (3. vertailututkimus) 13 laboratoriota analysoi kaksi näytettä vapaan tryptofaanin uuttomenetelmän varmentamiseksi. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu suuresti poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä)

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

SR

=

uusittavuuden keskihajonta

r

=

toistettavuus

R

=

uusittavuus

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin, %

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin, %.

Vielä järjestettiin EY-vertailututkimus, jossa seitsemän laboratoriota analysoi neljä näytettä, tarkoituksena tryptofaanin varmentaminen hydrolyysissä. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa. Kustakin näytteestä tehtiin viisi rinnakkaismääritystä.

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

keskiarvoon mukaan otettujen yksittäisten tulosten lukumäärä, kun on poistettu suuresti poikkeavat arvot (tunnistettu Cochranin ja Dixonin poikkeavien arvojen testillä)

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

SR

=

uusittavuuden keskihajonta

r

=

toistettavuus

R

=

uusittavuus

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin, %

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin, %.

9.   Huomautukset

Isokraattinen erotus, jonka jälkeen kolonni puhdistetaan gradienteilla:

Kromatografiajärjestelmän vasteen on oltava lineaarinen toiminta-alueella. Lineaarinen vaste on mitattava sisäisen standardin vakiopitoisuudella (normaalilla pitoisuudella) ja erilaisilla tryptofaanipitoisuuksilla. On tärkeää, että sekä tryptofaanin että sisäisen standardin piikkien koot ovat HPLC-fluoresenssijärjestelmän lineaarisella alueella. Jos joko tryptofaanin ja/tai sisäisen standardin piikki on liian pieni tai liian suuri (piikit ovat liian pienet tai suuret), analyysi on toistettava käyttäen erilaista näytemäärää ja/tai muuttaen lopputilavuutta.

Bariumhydroksidi tulee vanhetessaan vaikealiukoisemmaksi. HPLC-määritystä varten tehty liuos voi sen vuoksi olla samea, minkä vuoksi voidaan saada alhaisia tryptofaanituloksia.

H.   RAAKARASVAN JA RAAKAÖLJYN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä määritetään rehuissa olevan raakarasvan ja -öljyn määrä. Se ei koske öljysiementen ja öljypitoisten hedelmien määrityksiä.

Jäljempänä kuvattavan kahden menettelytavan käyttö riippuu rehun luonteesta ja koostumuksesta sekä määrityksen käyttötarkoituksesta.

1.1   Menettelytapa A — Suoraan uutettavissa oleva raakarasva ja -öljy

Tätä menetelmää voidaan käyttää kasviperäisiin rehuihin lukuun ottamatta niitä, jotka kuuluvat menettelytavan B soveltamisalaan.

1.2   Menettelytapa B — Raakarasvan ja -öljyn kokonaismäärä

Menetelmää voidaan soveltaa eläinperäisiin rehuihin sekä kaikkiin rehuseoksiin. Sitä käytetään kaikkiin sellaisiin rehuihin, joista rasvaa ja öljyä ei voida täysin uuttaa ilman sitä edeltävää hydrolysointia (esim. gluteenit, hiiva, perunaproteiinit ja tuotteet, joita on käsitelty muun muassa ekstrudoimalla, kuumentamalla tai hiutaleiksi tekemällä).

1.3   Tulosten tulkitseminen

Aina, kun menettelytapaa B käyttäen saadaan suurempi tulos kuin menettelytapaa A käyttäen, menettelytavalla B saatua tulosta pidetään todellisena arvona.

2.   Periaate

2.1   Menettelytapa A

Näyte uutetaan petrolieetterillä. Liuotin tislataan pois ja jäännös kuivataan ja punnitaan.

2.2   Menettelytapa B

Näyte käsitellään kuumentamalla sitä kloorivetyhapon kanssa. Seos jäähdytetään ja suodatetaan. Jäännös pestään ja kuivataan ja määritystä jatketaan menettelytavan A mukaisesti.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Menettelytapa A (katso 8.1 kohta)

Näytettä punnitaan 5 g 1 mg:n tarkkuudella uuttohylsyyn (4.2) ja se peitetään rasvattomalla puuvillavanulla.

Hylsy asetetaan uuttolaitteeseen (4.1) ja sitä uutetaan kuusi tuntia petrolieetterillä (3.1). Petrolieetteriuute otetaan talteen kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää kiehumakiviä ( 9 ).

Liuotin tislataan pois. Pullon ja sen sisältämän jäännöksen annetaan kuivua puolentoista tunnin ajan lämpökaapissa (4.3). Pullon jäännöksineen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja se punnitaan. Kuivausta jatketaan edelleen 30 minuutin ajan sen varmistamiseksi, että rasvan ja öljyn paino pysyy vakiona (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 1 mg).

5.2   Menettelytapa B

Näytettä punnitaan 2,5 g 1 mg:n tarkkuudella (ks. 8.2 kohta) 400 ml:n dekantterilasiin tai 300 ml:n erlenmeyerkolviin ja astiaan lisätään 100 ml kloorivetyhappoa (3.3) ja kiehumakiviä. Dekantterilasi peitetään kellonlasilla tai erlenmeyerkolvi yhdistetään palautusjäähdyttimeen. Seos saatetaan varovasti kiehuvaksi käyttäen pientä liekkiä tai sähkölevyä ja seoksen annetaan kiehua hiljalleen tunnin ajan. Näytteen tarttumista astian seinämiin tulee välttää.

Astian sisällön annetaan jäähtyä ja lisätään suodatuksen apuainetta (3.4) sen verran, ettei rasvaa ja öljyä häviä suodatuksessa. Suodatukseen käytetään kostutettua, rasvatonta, kaksinkertaista suodatinpaperia. Jäännös pestään kylmällä vedellä, kunnes saadaan neutraali suodos. Tarkastetaan, ettei suodos sisällä öljyä tai rasvaa. Jos sitä esiintyy, näyte on ennen hydrolysointia uutettava petrolieetterillä menettelytapaa A käyttäen.

Jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi asetetaan kellonlasille ja sen annetaan kuivua puolitoista tuntia 100 ± 3 oC:ssa lämpökaapissa (4.3).

Kuivan jäännöksen sisältävä kaksinkertainen suodatinpaperi pannaan uuttohylsyyn (4.2) ja peitetään rasvattomalla puuvillavanulla. Hylsy pannaan uuttolaitteeseen (4.1) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa esitetyllä tavalla.

6.   Tuloksen ilmoittaminen

Jäännöksen paino ilmoitetaan prosentteina näytteen painosta.

7.   Toistettavuus

Samasta näytteestä saman henkilön suorittaman kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

8.   Huomautukset

Näytettä punnitaan 20 g 1 mg:n tarkkuudella ja siihen sekoitetaan vähintään 10 g vedetöntä natriumsulfaattia (3.2). Sitä uutetaan petrolieetterillä (3.1) 5.1 kohdassa esitetyllä tavalla. Saadun uutteen tilavuus täydennetään 500 ml:ksi petrolieetterillä (3.1) ja se sekoitetaan. Liuosta otetaan 50 ml ja kaadetaan pieneen, kuivaan, punnittuun pulloon, joka sisältää kiehumakiviä. Liuotin tislataan pois, jäännös kuivataan ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan viimeisessä kappaleessa kuvatulla tavalla.

Liuottimen annetaan haihtua hylsyssä olevasta uuttojäännöksestä, jäännös jauhetaan 1 mm raekokoon ja siirretään takaisin hylsyyn (lisäämättä natriumsulfaattia) ja määritystä jatketaan 5.1 kohdan toisessa ja kolmannessa kappaleessa kuvatulla tavalla.

Rasvan ja öljyn pitoisuus prosentteina näytteestä lasketaan seuraavalla kaavalla:

(10m1 + m2) × 5

jossa:

m1

=

ensimmäisen uuton jälkeen saadun jäännöksen (määräosa uutteesta) paino grammoina,

m2

=

toisen uuton jälkeen saadun jäännöksen paino grammoina.

I.   RAAKAKUIDUN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehusta sen rasvaton orgaaninen aines, joka ei liukene happo- ja emäsliuoksen kanssa keitettäessä ja jota kutsutaan sovitusti raakakuiduksi.

2.   Periaate

Näyte, josta tarvittaessa on poistettu rasva, käsitellään peräkkäin tietyn väkevyisillä kiehuvilla rikkihappo- ja kaliumhydroksidiliuoksilla. Jäännös erotetaan suodattamalla näyte lasisintterisuodattimella, se pestään, kuivataan, punnitaan ja poltetaan tuhkaksi 475–500 oC:ssa. Tuhkaamisesta aiheutuva painohäviö vastaa näytteen raakakuitupitoisuutta.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 1 g esikäsiteltyä näytettä upokkaaseen (4.2) (ks. huomautukset 8.1, 8.2 ja 8.3) ja lisätään 1 g suodatuksen apuainetta (3.3).

Liitetään suodatinupokas (4.2) lämmityslaitteistoon (4.1), ja tämän jälkeen liitetään sylinteri (4.3) upokkaaseen. Sylinteri-upokasyhdistelmä täytetään 150 ml:lla kiehuvaa rikkihappoa (3.1) ja tarvittaessa lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.2).

Neste saatetaan kiehuvaksi 5 ± 2 minuutissa ja annetaan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia.

Avataan poistoletkun venttiili (4.1), ja suodatetaan rikkihappo tyhjössä suodatinupokkaan läpi ja pestään jäännös kolme kertaa peräkkäin 30 ml:lla kiehuvaa vettä huolehtien siitä, että jäännös suodatetaan kuivaksi jokaisen pesukerran jälkeen.

Suljetaan tyhjennysventtiili, kaadetaan 150 ml kiehuvaa kaliumhydroksidiliuosta (3.7) sylinteriupokasyhdistelmään ja lisätään muutama pisara kuohunestoainetta (3.2). Neste saatetaan kiehuvaksi 5 ± 2 minuutissa ja annetaan kiehua voimakkaasti tarkalleen 30 minuuttia. Suodatetaan ja toistetaan pesumenettelyt samalla tavoin kuin rikkihapon kanssa.

Viimeisen pesun ja kuivauksen jälkeen upokas sisältöineen irrotetaan ja upokas yhdistetään uudelleen kylmäuuttoyksikköön (4.6). Poistetaan ilma ja pestään jäännös upokkaassa kolme kertaa peräkkäin 25 ml:lla asetonia (3.4) huolehtien siitä, että jäännös kuivuu jokaisen pesukerran jälkeen.

Annetaan upokkaan kuivua vakiopainoon lämpökaapissa, jonka lämpötila on 130 oC. Jokaisen kuivauksen jälkeen jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan nopeasti. Upokas asetetaan muhveliuuniin, jossa näytteen annetaan palaa tuhkaksi vakiopainoon (kahden peräkkäisen punnituksen välinen painoero saa olla enintään 2 mg) 475–500 oC:ssa vähintään 30 minuuttia.

Jokaisen kuumennuksen jälkeen upokkaan annetaan jäähtyä ensin uunissa ja tämän jälkeen eksikkaattorissa ennen punnitusta.

Nollakoe suoritetaan ilman näytettä. Tuhkaamisesta johtuva painohäviö ei saa olla yli 4 mg:aa.

6.   Tulosten laskeminen

Raakakuitupitoisuus prosentteina näytteestä saadaan seuraavasti:

jossa:

m

=

näytteen paino grammoina,

m0

=

määrityksen aikana näytteen polttamisesta aiheutuva painohäviö grammoina,

m1

=

nollakokeessa polttamisesta aiheutuva painohäviö grammoina.

7.   Toistettavuus

Kahden samasta näytteestä suoritetun määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

8.   Huomautukset

J.   SOKERIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää pelkistävien sokerien ja kokonaissokerien määrä invertoinnin jälkeen glukoosina, tai tarvittaessa sakkaroosina käyttäen muunnoskerrointa 0,95 . Menetelmä soveltuu rehuseoksiin. Muita rehuja varten on säädetty erityismenetelmistä. Laktoosi on tarvittaessa mitattava erikseen ja otettava huomioon tuloksia laskettaessa.

2.   Periaate

Sokerit uutetaan laimeaan etanoliin ja liuos kirkastetaan Carrez-liuoksilla I ja II. Etanolin poiston jälkeen määritykset suoritetaan ennen invertointia ja sen jälkeen saadut Luff-Schoorl-menetelmällä.

3.   Reagenssit

Kaadetaan sitruunahappoliuos (3.8.2) natriumkarbonaattiliuokseen (3.8.3) varovasti sekoittaen. Tämän jälkeen lisätään kuparisulfaattiliuos (3.8.1) ja täytetään 1 litraksi vedellä. Annetaan seistä yön yli ja suodatetaan.

Näin saadun reagenssin (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l) konsentraatio tarkistetaan; ks. 5.4 kohdan viimeinen kappale. Liuoksen pH:n on oltava noin 9,4 .

4.   Välineistö

Sekoitin: noin 35–40 kierr./min.

5.   Menettely

5.1   Näytteen uutto

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2,5 g näytettä 250 ml:n mittapulloon. Lisätään 200 ml etanolia (3.1) ja sekoitetaan sekoittajassa yhden tunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.2) ja sekoitetaan noin 30 sekunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.3) ja sekoitetaan uudelleen yhden minuutin ajan. Täytetään pullo etanolilla (3.1), homogenoidaan ja suodatetaan. Otetaan 200 ml suodosta ja haihdutetaan se noin puoleen tilavuuteen, jotta saadaan poistetuksi suurin osa etanolista. Haihdutusjäännös siirretään kvantitatiivisesti 200 ml:n mittapulloon käyttäen lämmintä vettä, jäähdytetään, täytetään vedellä merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan tarvittaessa. Tätä liuosta käytetään pelkistävien sokerien määrittämiseksi ja invertointireaktion jälkeen kokonaissokerien määrittämiseksi.

5.2   Pelkistävien sokerien määritys

Pipetoidaan enintään 25 ml liuosta, joka sisältää alle 60 mg glukoosina ilmoitettuja pelkistäviä sokereita. Tarvittaessa tilavuus säädetään 25 ml:ksi tislatulla vedellä ja pelkistävien sokerien pitoisuus määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä. Tulos ilmoitetaan glukoosiprosenttina.

5.3   Kokonaissokerien määritys invertointireaktion jälkeen

Pipetoidaan 50 ml liuosta 100 ml:n mittapulloon. Lisätään muutama pisara metyylioranssiliuosta (3.4) ja tämän jälkeen lisätään varovasti ja jatkuvasti sekoittaen kloorivetyhappoa (3.5), kunnes neste muuttuu selvästi punaiseksi. Lisätään 15 ml kloorivetyhappoa (3.6), pullo upotetaan voimakkaasti kiehuvaan vesihauteeseen ja pidetään siinä 30 minuutin ajan. Jäähdytetään nopeasti noin 20 oC:seen ja lisätään 15 ml natriumhydroksidiliuosta (3.7). Tilavuus säädetään 100 ml:ksi vedellä ja homogenoidaan. Otetaan enintään 25 ml:n erä, joka sisältää alle 60 mg glukoosina ilmoitettuja pelkistäviä sokereita. Tarvittaessa tilavuus säädetään 25 ml:ksi tislatulla vedellä, ja pelkistävien sokerien pitoisuus määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä. Tulos ilmoitetaan glukoosiprosenttina tai tarvittaessa sakkaroosina kertomalla kertoimella 0,95 .

5.4   Titraus Luff-Schoorl-menetelmällä

Pipetoidaan 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.8) 300 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään tarkalleen 25 ml kirkastettua sokeriliuosta. Lisätään kaksi kiehumakiveä (3.13), lämmitetään keskikokoisen liekin yläpuolella käsin ravistaen ja kuumennetaan neste kiehumapisteeseen noin kahdessa minuutissa. Erlenmeyerkolvi asetetaan välittömästi asbestiverkolle, jossa on noin 6 cm:n läpimittainen reikä ja verkon alla on etukäteen sytytetty liekki. Säädetään liekki sellaiseksi, että erlenmeyerkolvi kuumenee ainoastaan pohjastaan. Tämän jälkeen erlenmeyerkolviin kiinnitetään palautusjäähdytin. Keitetään tarkalleen 10 minuutin ajan. Jäähdytetään välittömästi kylmässä vedessä ja noin viiden minuutin kuluttua titrataan seuraavasti:

Lisätään 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.12) ja välittömästi tämän jälkeen (varoen, koska liuos voi vaahdota runsaasti) lisätään 25 ml rikkihappoa (3.11). Titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (3.9) kunnes väri muuttuu samean keltaiseksi, lisätään tärkkelysindikaattori (3.10) ja titraus suoritetaan loppuun.

Sama titraus suoritetaan liuoksesta, jossa on tarkasti mitattuna 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.8) ja 25 ml vettä, sen jälkeen kun 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.12) ja 25 ml rikkihappoa (3.11) on lisätty kohottamatta lämpötilaa kiehumispisteeseen.

6.   Tulosten laskeminen

Oheisen taulukon avulla määritetään milligrammoissa se glukoosimäärä, joka vastaa näiden kahden titrauksen erotusta ilmaistuna milligrammoina natriumtiosulfaattia, 0,1 mol/l. Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Menettely erityistapauksissa

Homogenoidaan ja suodatetaan. Poistetaan etanoli 5.1 kohdan mukaisesti. Jos yhtään dekstrinoitua tärkkelystä ei esiinny, täytetään merkkiin asti tislatulla vedellä.

8.   Huomautukset

Molemmissa tapauksissa sokerin määrä määritetään Luff-Schoorl-menetelmällä ja lasketaan milligrammoina glukoosia. Arvot vähennetään toisistaan ja erotus ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Esimerkki

Kaksi tilavuutta vastaa 250 mg:n näytteestä tehtyjä määrityksiä.

Ensimmäisessä tapauksessa on kulunut 17 ml natriumtiosulfaattiliuosta, 0,1 mol/l, joka vastaa 44,2 mg:aa glukoosia; toisessa tapauksessa 11 ml, joka vastaa 27,6 mg:aa glukoosia.

Erotus on 16,6 mg glukoosia.

Pelkistävien sokerien, laktoosia lukuun ottamatta, glukoosina laskettu määrä on:

K.   LAKTOOSIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää laktoosin pitoisuus rehuissa, jotka sisältävät yli 0,5 % laktoosia.

2.   Periaate

Sokerit liuotetaan veteen. Liuokselle suoritetaan fermentointi käyttäen Saccharomyces cerevisiae -hiivaa, joka ei kuluta laktoosia. Selkeyttämisen ja suodatuksen jälkeen määritetään suodoksen laktoosipitoisuus Luff-Schoorl-menetelmällä.

3.   Reagenssit

Kaadetaan sitruunahappoliuos (3.4.2) natriumkarbonaattiliuokseen (3.4.3) sekoittaen varovasti lisäyksen aikana. Tämän jälkeen lisätään kuparisulfaattiliuos (3.4.1) ja täytetään 1 litraksi vedellä. Annetaan seistä yön yli ja suodatetaan. Näin saadun reagenssin (Cu 0,05 mol/l; Na2CO3 1 mol/l) konsentraatio tarkistetaan. Liuoksen pH:n on oltava noin 9,4 .

4.   Välineistö

Vesihaude, jonka termostaatti on säädetty 38–40 oC:seen.

5.   Menettely

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 1 g näytettä 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 25–30 ml vettä. Pullo asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen 30 minuutin ajaksi ja tämän jälkeen se jäähdytetään noin 35 oC:seen. Lisätään 5 ml hiivasuspensiota (3.1) ja homogenoidaan. Annetaan pullon seistä kaksi tuntia vesihauteessa 38–40 oC:n lämpötilassa. Jäähdytetään noin 20 oC:seen.

Lisätään 2,5 ml Carrez-liuosta I (3.2) ja sekoitetaan 30 sekuntia, tämän jälkeen lisätään 2,5 ml Carrez-liuosta II (3.3) ja sekoitetaan uudelleen 30 sekuntia. Täytetään 100 ml:ksi vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan. Suodosta pipetoidaan 300 ml:n erlenmeyerkolviin sellainen määrä, joka sisältää 40–80 mg laktoosia, korkeintaan 25 ml. Tarvittaessa täytetään vedellä 25 ml:ksi.

Nollakoe suoritetaan samalla tavoin käyttäen 5 ml hiivasuspensiota (3.1). Laktoosimäärä määritetään Luff-Schoorlin mukaan seuraavasti. Lisätään tarkalleen 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.4) ja kaksi kiehumakiveä (3.5). Lämmitetään keskikokoisen liekin yläpuolella käsin ravistellen ja kuumennetaan neste kiehumispisteeseen noin kahdessa minuutissa. Erlenmeyerkolvi asetetaan välittömästi asbestiverkolle, jossa on noin 6 cm:n läpimittainen reikä ja verkon alla on etukäteen sytytetty liekki. Säädetään liekki sellaiseksi, että erlenmeyerkolvi kuumenee ainoastaan pohjastaan. Tämän jälkeen erlenmeyerkolviin kiinnitetään pystyjäähdytin. Keitetään tarkalleen 10 minuutin ajan. Jäähdytetään välittömästi kylmässä vedessä ja noin viiden minuutin kuluttua titrataan seuraavasti:

Lisätään 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.6) ja välittömästi tämän jälkeen (varovasti, koska liuos voi vaahdota voimakkaasti) lisätään 25 ml rikkihappoa (3.7). Titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (3.8) kunnes väri muuttuu samean keltaiseksi, lisätään tärkkelysindikaattori (3.9) ja titraus suoritetaan loppuun.

Sama titraus suoritetaan liuoksesta, johon pipetoidaan tarkalleen mitattuna 25 ml Luff-Schoorl-reagenssia (3.4) ja 25 ml vettä, sen jälkeen kun 10 ml kaliumjodidiliuosta (3.6) ja 25 ml rikkihappoa (3.7) on lisätty ilman keittämistä.

6.   Tulosten laskeminen

Oheisen taulukon avulla määritetään milligrammoina se laktoosimäärä, joka vastaa näiden kahden titraustuloksen erotusta ilmaistuna natriumtiosulfaattia, 0,1 mol/l, millilitroissa.

Tulos ilmoitetaan vedettömän laktoosin prosentteina näytteestä.

7.   Huomautus

Yli 40 % fermentoituvaa sokeria sisältäville tuotteille käytetään yli 5 ml hiivasuspensiota (3.1).

L.   TÄRKKELYKSEN MÄÄRITYS

POLARIMETRINEN MENETELMÄ

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää tärkkelyksen ja tärkkelyksen suurimolekyylisten pilkkoutumistuotteiden pitoisuus rehuissa tarkoituksena todeta, onko niiden ilmoitettu energiamäärä liitteen VII mukainen ja ovatko ne neuvoston direktiivin 96/25/EY ( 10 ) säännösten mukaisia.

2.   Periaate

Menetelmä perustuu kahteen määritykseen. Ensimmäisessä määrityksessä näyte käsitellään laimealla kloorivetyhapolla. Kun liuos on saatu kirkkaaksi ja suodatettu, liuoksen optinen kiertokyky mitataan polarimetrisesti.

Toisessa määrityksessä näyte uutetaan 40-prosenttisella etanolilla. Kun suodos on tehty happamaksi kloorivetyhapolla ja se on saatu kirkkaaksi ja suodatettu, optinen kiertokyky mitataan kuten ensimmäisessä määrityksessä.

Kun näiden kahden mittauksen erotus kerrotaan tunnetulla kertoimella, saadaan näytteen tärkkelyspitoisuus.

3.   Reagenssit

Konsentraatio on tarkistettava titraamalla natriumhydroksidiliuoksella 0,1 mol/l, indikaattorina 0,1 % (w/v) metyylipuna 94 % (v/v) etanolissa. 10 ml:n neutralointiin tarvitaan 30,94 ml NaOH:ta, 0,1 mol/l.

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan niin hienoksi, että se läpäisee kokonaan 0,5 mm:n pyöreäreikäisen seulan.

5.2   Optisen kokonaiskiertokyvyn (P tai S) määritys (ks. huomautus 7.1)

Punnitaan 2,5 g hienoksi jauhettua näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon. Lisätään 25 ml kloorivetyhappoa (3.2), ravistellaan kunnes näyte on jakaantunut tasaisesti, sen jälkeen lisätään vielä 25 ml kloorivetyhappoa (3.2). Pullo pannaan kiehuvaan vesihauteeseen ja sitä ravistellaan voimakkaasti ja yhtäjaksoisesti ensimmäisten kolmen minuutin ajan kokkaroitumisen estämiseksi. Vesihauteen vesimäärän on oltava riittävän suuri, jotta haude pysyy kiehuvana kun pullo upotetaan siihen. Pulloa ravisteltaessa sitä ei saa ottaa pois hauteesta. Tarkalleen 15 minuutin kuluttua pullo otetaan hauteesta, lisätään 30 ml kylmää vettä ja jäähdytetään välittömästi 20o:seen.

Lisätään 5 ml Carrez-liuosta I (3.3) ja ravistellaan noin 30 sekunnin ajan. Lisätään 5 ml Carrez-liuosta II (3.4) ja ravistellaan uudestaan 30 sekunnin ajan. Täytetään merkkiin asti vedellä, sekoitetaan ja suodatetaan. Jos suodos ei ole täysin kirkas (mikä tapahtuu harvoin), määritys uusitaan käyttäen suurempaa määrää Carrez-liuoksia I ja II (esimerkiksi 10 ml).

Liuoksen optinen kiertokyky mitataan 200 mm:n putkessa polarimetrillä tai sakkarimetrillä.

5.3   40-prosenttiseen etanoliin liukoisten yhdisteiden optisen kiertokyvyn (P' tai S') määritys

Punnitaan 5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon ja lisätään noin 80 ml etanolia (3.5) (ks. huomautus 7.2). Mittapullon annetaan seistä yhden tunnin ajan huoneenlämmössä; tänä aikana sitä ravistellaan voimakkaasti kuusi kertaa siten, että näyte sekoittuu perusteellisesti etanoliin. Täytetään merkkiin asti etanolilla (3.5), sekoitetaan ja suodatetaan.

Pipetoidaan 50 ml suodosta (vastaa 2,5 :tä grammaa näytettä) 250 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään 2,1 ml kloorivetyhappoa (3.1) ja ravistellaan voimakkaasti. Erlenmeyerkolviin kiinnitetään pystyjäähdytin ja pullo pannaan kiehuvaan vesihauteeseen. Tarkalleen 15 minuutin kuluttua erlenmeyerkolvi otetaan hauteesta ja liuos siirretään 100 ml:n mittapulloon huuhtomalla pienellä määrällä kylmää vettä ja jäähdytetään 20 oC:seen.

Tämän jälkeen näyteliuos tehdään kirkkaaksi Carrez-liuoksilla I (3.3) ja II (3.4), täytetään merkkiin asti vedellä, sekoitetaan, suodatetaan ja mitataan optinen kiertokyky 5.2 kohdan toisessa ja kolmannessa alakohdassa esitetyllä tavalla.

6.   Tulosten laskeminen

Tärkkelyspitoisuus (%) lasketaan seuraavalla tavalla:

6.1   Polarimetriset mittaukset

P

=

optinen kokonaiskiertokyky asteina

P'

=

40-prosenttiseen etanoliin (V/V) liukoisten yhdisteiden optinen kiertokyky asteina

=

puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky. Tälle on sovittu seuraavat numeeriset arvot: +185,9 o: riisitärkkelys +185,7 o: perunatärkkelys +184,6 o: maissitärkkelys +182,7 o: vehnätärkkelys +181,5 o: ohratärkkelys +181,3 o: kauratärkkelys +184,0 o: muut tärkkelyslajit sekä tärkkelysseokset rehuseoksissa.

6.2   Sakkarimetriset mittaukset

S

=

optinen kokonaiskiertokyky sakkarimetrin asteina

S'

=

40-prosenttiseen (v/v) etanoliin liukoisten yhdisteiden optinen kiertokyky asteina

N

=

sellainen sakkaroosin määrä grammoina, jonka optinen kiertokyky on 100 sakkarimetrin astetta 100 ml:ssa vettä ja 200 mm:n putkessa mitattuna 16,29 g ranskalaisella sakkarimetrillä 26,00 g saksalaisella sakkarimetrillä 20,00 g muilla sakkarimetreillä. = puhtaan tärkkelyksen ominaiskiertokyky (ks. 6.1).

6.3   Toistettavuus

Samasta näytteestä tehdyn kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa ylittää 0,4 :ää prosenttiyksikköä, jos tärkkelyspitoisuus on alle 40 %, eikä 1:tä prosenttia tärkkelyspitoisuudesta suhteellisena arvona, jos tärkkelyspitoisuus on 40 % tai suurempi.

7.   Huomautukset

M.   RAAKATUHKAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen raakatuhkapitoisuus.

2.   Periaate

Näyte poltetaan tuhkaksi 550 oC:ssa, jäännös punnitaan.

3.   Reagenssit

Ammoniumnitraattiliuos, 20 % (w/v).

4.   Välineistö

5.   Menettely

Noin 5 grammaa näytettä (2,5 g sellaisia tuotteita, joilla on pyrkimys turvota) punnitaan 1 mg:n tarkkuudella hehkutusupokkaaseen, joka on ensin hehkutettu 550 oC:seen, jäähdytetty ja taarattu. Upokas asetetaan sähkölevylle ja sitä kuumennetaan vähitellen kunnes aine hiiltyy. Tuhkataan 5.1 tai 5.2 kohdan mukaisesti.

6.   Tulosten laskeminen

Jäännöksen paino lasketaan vähentämällä taarapaino.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Huomautukset

N.   KLOORIVETYHAPPOON LIUKENEMATTOMAN TUHKAN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää kloorivetyhappoon liukenemattomien kivennäisainesten pitoisuus rehuissa. Näytteen laadun mukaan voidaan käyttää kahta eri menetelmää.

2.   Periaate

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Menetelmä A:

Näyte poltetaan tuhkaksi raakatuhkan määritystä varten esitettyä menetelmää käyttäen. Myös tästä määrityksestä saatua tuhkaa voidaan käyttää.

Tuhka siirretään 250–400 ml:n dekantterilasiin käyttäen 75 ml kloorivetyhappoa (3.1). Liuos kuumennetaan hitaasti kiehumapisteeseen ja sitä keitetään varovasti 15 minuuttia. Lämmin liuos suodatetaan tuhkattoman suodatinpaperin läpi ja jäännös pestään lämpimällä vedellä kunnes pesuvesi ei enää ole hapan. Jäännöksen sisältävä suodatinpaperi kuivataan ja poltetaan tuhkaksi taaratussa upokkaassa 550–700 oC:n lämpötilassa. Sen annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja se punnitaan.

5.2   Menetelmä B:

Punnitaan 5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella 250–400 ml:n dekantterilasiin. Siihen lisätään ensin 25 ml vettä ja sen jälkeen 25 ml kloorivetyhappoa (3.1), sekoitetaan ja odotetaan kunnes kuohuminen lakkaa. Lisätään vielä 50 ml kloorivetyhappoa (3.1). Kun kaasuja ei enää muodostu, dekantterilasi asetetaan kiehuvaan vesihauteeseen ja pidetään siinä 30 minuuttia tai tarvittaessa pitempään, jotta mahdollinen jäljellä oleva tärkkelys tulisi kokonaan hydrolysoiduksi. Liuos suodatetaan lämpimänä käyttäen tuhkatonta suodatinpaperia, joka pestään 50 ml:lla lämmintä vettä (ks. 7 kohdan huomautus). Suodatinpaperi jäännöksineen siirretään hehkutusupokkaaseen, kuivataan ja poltetaan tuhkaksi 550–700 oC:n lämpötilassa. Tuhka siirretään 250–400 ml:n dekantterilasiin käyttäen 75 ml kloorivetyhappoa (3.1) ja jatketaan 5.1 kohdan toisen alakohdan mukaan.

6.   Tulosten laskeminen

Jäännöksen paino lasketaan vähentämällä taarapaino. Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

7.   Huomautus

Jos suodatus osoittautuu vaikeaksi, suoritetaan määritys uudelleen korvaamalla 50 ml kloorivetyhappoa 50 ml:lla 20-prosenttista trikloorietikkahappoa (3.2) ja suodatinpaperin pesuun käytetään lämmintä 1-prosenttista trikloorietikkahappoliuosta (3.3).

O.   KARBONAATTIEN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää useimpien rehujen karbonaatit, jotka tavanomaisesti ilmoitetaan kalsiumkarbonaattina.

Tietyissä tapauksissa (esim. rautakarbonaatin osalta) on kuitenkin käytettävä erityismenetelmää.

2.   Periaate

Karbonaatit hajotetaan kloorivetyhapossa, vapautunut hiilidioksidi kerätään talteen asteikolla varustettuun putkeen ja sen tilavuutta verrataan tilavuuteen, jonka tunnettu määrä kalsiumkarbonaattia vapauttaa samoissa olosuhteissa.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

Scheibler-Dietrich-laite (ks. kaavio) tai vastaava laite.

5.   Menettely

Näytettä punnitaan karbonaattipitoisuuden mukaan seuraavasti:

Punnittu näyte pannaan laitteeseen kuuluvaan pulloon (4), jossa on pieni murtumattomasta materiaalista valmistettu koeputki, joka sisältää 10 ml kloorivetyhappoa (3.1), ja pullo liitetään laitteeseen. Käännetään kolmitiehanaa (5) siten, että putki (1) on auki laitteen ulkopuolelle. Käyttäen liikkuvaa putkea (2), joka on täytetty värjätyllä rikkihapolla (3.3) ja liitetty asteikolla varustettuun putkeen (1), säädetään nesteen taso nollamerkkiin. Käännetään hanaa (5) putkien (1) ja (3) yhdistämiseksi ja tarkastetaan, että taso säilyy nollassa.

Kaadetaan kloorivetyhappo (3.1) koeputkesta hitaasti näyte-erän päälle pulloa (4) kallistaen. Paine tasoitetaan laskemalla putki (2) alemmaksi. Pulloa (4) ravistellaan kunnes hiilidioksidin kehittyminen on kokonaan lakannut.

Paine palautetaan alkuperäiseksi tuomalla neste samalle tasolle putkissa (1) ja (2). Lukema otetaan muutaman minuutin kuluttua siitä, kun kaasutilavuus on saavuttanut vakiotason.

Kontrollikoe suoritetaan samoissa olosuhteissa käyttäen 0,5 g kalsiumkarbonaattia (3.2).

6.   Tulosten laskeminen

Karbonaattipitoisuus kalsiumkarbonaattina ilmaistuna lasketaan kaavasta:

jossa:

X

=

karbonaatti prosentteina (w/w) näytteestä, ilmaistuna kalsiumkarbonaattina,

V

=

ml CO2:ta, jonka punnittu näytemäärä on vapauttanut,

V1

=

ml CO2:ta, jonka 0,5 g CaCO3:a on vapauttanut,

m

=

näytteen paino grammoina.

7.   Huomautukset

P.   KOKONAISFOSFORIN MÄÄRITYS

FOTOMETRINEN MENETELMÄ

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen kokonaisfosforipitoisuus. Se soveltuu erityisesti alhaisten fosforipitoisuuksien analysoimiseen. Tietyissä tapauksissa (runsaasti fosforia sisältävät tuotteet) voidaan käyttää gravimetristä menetelmää.

2.   Periaate

Näyte mineralisoidaan joko polttamalla kuivana ja liuottamalla happoon (orgaaniset rehut) tai happokeiton avulla (mineraaliyhdisteet ja nestemäiset rehut), ja se siirretään happamaan liuokseen. Liuos käsitellään molybdovanadaattireagenssilla. Muodostuneen keltaisen liuoksen optinen tiheys mitataan spektrofotometrissä 430 nm:ssä.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Liuoksen valmistaminen

Näytteen pitoisuuden mukaan valmistetaan 5.1.1 tai 5.1.2 kohdassa esitetty liuos.

5.1.1    Tavallinen menettely

Punnitaan vähintään 1 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella. Näyte pannaan Kjeldahl-kolviin, lisätään 20 ml rikkihappoa (3.5), ravistellaan, jotta happo imeytyisi aineeseen täydellisesti eikä aine tarttuisi pullon seinämiin, kuumennetaan ja pidetään kiehuvana 10 minuutin ajan. Annetaan jäähtyä hieman, lisätään 2 ml typpihappoa (3.4), kuumennetaan varovasti, annetaan jäähtyä hieman, lisätään uudelleen hieman typpihappoa (3.4) ja kohotetaan lämpötila jälleen kiehumispisteeseen. Tämä menettely toistetaan kunnes saadaan väritön liuos. Jäähdytetään, lisätään hieman vettä, neste dekantoidaan 500 ml:n mittapulloon huuhtomalla Kjeldahl-kolvi kuumalla vedellä. Annetaan jäähtyä, täytetään merkkiin asti vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.2    Orgaanisia aineita sisältävät näytteet, jotka eivät sisällä kalsium- ja magnesiumdivetyfosfaatteja

Hehkutusupokkaaseen punnitaan noin 2,5 g näytettä 1 mg:n tarkkuudella. Näytteeseen lisätään 1 g kalsiumkarbonaattia (3.1) ja sekoitetaan kunnes se on täysin sekoittunut näytteeseen. Poltetaan tuhkaksi uunissa 550 oC:ssa kunnes saadaan valkoista tai harmaata tuhkaa (pieni määrä hiiltä ei häiritse). Tuhka siirretään 250 ml:n dekantterilasiin. Lisätään 20 ml vettä ja kloorivetyhappoa (3.2) kunnes kuohuminen lakkaa. Lisätään vielä 10 ml kloorivetyhappoa (3.2). Dekantterilasi asetetaan hiekkahauteelle ja haihdutetaan kuivaksi piin saostamiseksi. Jäännös liuotetaan uudelleen 10 ml:aan typpihappoa (3.3) ja keitetään hiekkahauteella tai sähkölevyllä 5 minuuttia haihduttamatta sitä kuivaksi. Neste dekantoidaan 500 ml:n mittapulloon huuhtomalla dekantterilasi useaan kertaan kuumalla vedellä. Annetaan jäähtyä, täytetään merkkiin asti vedellä, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.2   Värin kehitys ja optisen tiheyden mittaus

Laimennetaan 5.1.1 tai 5.1.2 kohdassa saatu suodos siten, että fosforipitoisuus on enintään 40 μg/ml. Pipetoidaan 10 ml tätä liuosta koeputkeen (4.6) ja lisätään siihen 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6). Homogenoidaan ja annetaan seistä ainakin 10 minuuttia 20 oC:ssa. Mitataan optinen tiheys spektrofotometrissä 430 nm:ssä liuosta vastaan, joka on saatu lisäämällä 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6) 10 ml:aan vettä.

5.3   Kalibrointikäyrä

Standardiliuoksesta (3.7) valmistetaan liuokset, joissa on 5, 10, 20, 30 tai 40 μg fosforia/ml. Kaikista liuoksista otetaan 10 ml:n erä ja siihen lisätään 10 ml molybdovanadaattireagenssia (3.6). Homogenoidaan ja annetaan seistä ainakin 10 minuuttia 20 oC:ssa. Optinen tiheys mitataan 5.2 kohdan mukaisesti. Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä vastaavia fosforimääriä esittävä kuvaaja. Käyrä on lineaarinen välillä 0–40 μg/ml olevien konsentraatioiden osalta.

6.   Tulosten laskeminen

Tutkittavassa näytteessä oleva fosforimäärä määritetään kalibrointikäyrää käyttäen.

Tulos ilmoitetaan prosentteina näytteestä.

Toistettavuus

Samasta näytteestä suoritetun kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

Q.   KLORIDIEN MÄÄRITYS REHUISTA

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää vesiliukoisten kloridien määrä; tulokset ilmoitetaan yleensä natriumkloridina. Menetelmä soveltuu käytettäväksi kaikkiin rehuihin.

2.   Periaate

Kloridit liuotetaan veteen. Jos tuote sisältää orgaanista ainetta, se kirkastetaan. Liuos tehdään hieman happamaksi typpihapolla ja kloridit saostetaan hopeakloridin muodossa hopeanitraattiliuosta käyttäen. Hopeanitraatin ylimäärä titrataan ammoniumtiosyanaattiliuoksella Volhardin menetelmän mukaan.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

Sekoittaja: noin 35–40 kierr./min.

5.   Menettely

5.1   Liuoksen valmistaminen

Näytteen mukaan valmistetaan 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdassa esitetty liuos.

Samanaikaisesti suoritetaan nollakoe, josta määritettävä näyte on jätetty pois.

5.1.1    Näytteet, joissa ei ole orgaanista ainesta

Punnitaan milligramman tarkkuudella enintään 10 g näytettä, joka sisältää alle 3 g kloridien muodossa olevaa klooria. Lisätään 500 ml:n mittapulloon näyte ja 400 ml noin 20 oC:n lämpöistä vettä. Sekoitetaan 30 minuuttia sekoittajassa, täytetään merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.2    Orgaanista ainesta sisältävät näytteet, paitsi 5.1.3 kohdassa luetellut tuotteet.

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella noin 5 g näytettä sekä 1 g aktiivihiiltä 500 ml:n mittapulloon. Lisätään 400 ml noin 20 oC:n lämpöistä vettä ja 5 ml Carrez I -liuosta (3.7), sekoitetaan 30 sekunnin ajan ja tämän jälkeen lisätään 5 ml Carrez II -liuosta (3.8). Sekoitetaan 30 minuuttia sekoittajassa, täytetään merkkiin asti, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.1.3    Keitetyt rehut, pellavansiemenkakut ja -jauho, pellavajauhoa runsaasti sisältävät tuotteet ja muut tuotteet, joissa on runsaasti lima-ainesta tai kolloidisia aineksia (esim. dekstrinoitu tärkkelys).

Valmistetaan liuos 5.1.2 kohdassa esitetyllä tavalla, mutta sitä ei suodateta. Dekantoidaan (tarvittaessa sentrifugoidaan), siirretään 100 ml supernatanttia 200 ml:n mittapulloon. Sekoitetaan asetonin (3.6) kanssa ja täytetään merkkiin asti asetonilla, homogenoidaan ja suodatetaan.

5.2   Titraus

Pipetoidaan erlenmeyerkolviin 25–100 ml suodosta (oletetun klooripitoisuuden mukaan), joka on saatu 5.1.1, 5.1.2 tai 5.1.3 kohdassa esitetyllä tavalla. Pipetoitu erä saa sisältää korkeintaan 150 mg klooria (Cl). Laimennetaan tarvittaessa vähintään 50 ml:ksi vedellä, lisätään 5 ml typpihappoa (3.4), 20 ml kyllästettyä ammoniumferrisulfaattiliuosta (3.3) ja kaksi tippaa ammoniumtiosyanaattiliuosta (3.1), joka annostellaan nollamerkkiin täytetystä byretistä. Byrettiä käyttäen lisätään hopeanitraattiliuosta (3.2) siten, että saadaan 5 ml:n ylimäärä. Lisätään 5 ml dietyylieetteriä (3.5) ja ravistellaan voimakkaasti saostuman koaguloimiseksi. Ylimäärä hopeanitraattia titrataan ammoniumtiosyanaattiliuoksella (3.1) kunnes punaruskea väri säilyy noin yhden minuutin ajan.

6.   Tulosten laskeminen

Kloorimäärä (X), joka ilmoitetaan natriumkloridiprosentteina, lasketaan seuraavaa kaavaa käyttäen:

jossa:

V1

=

lisätyn hopeanitraattiliuoksen 0,1 mol/l määrä millilitroina

V2

=

itraukseen käytetyn ammoniumtiosyanaatin 0,1 mol/l määrä millilitroina.

m

=

näytteen paino.

Jos hopeanitraattiliuosta, 0,1 mol/l, on kulunut nollakoetta titrattaessa, kuluneen liuoksen määrä vähennetään tilavuudesta (V1 – V2).

7.   Huomautukset

---

LIITE IV

REHUJEN SISÄLTÄMIEN SALLITTUJEN LISÄAINEIDEN VALVONNASSA KÄYTETTÄVÄT MÄÄRITYSMENTELMÄT

A.   A-VITAMIININ MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää A-vitamiinin (retinolin) pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. A-vitamiini käsittää all-trans-retinyylialkoholin ja sen cis-isomeerit, jotka saadaan määritetyiksi tällä menetelmällä. A-vitamiinipitoisuus ilmoitetaan kansainvälisinä yksikköinä (ky) kilogrammaa kohti. Yksi ky vastaa aktiivisuutta, joka on 0,300 μg:lla all-trans-A-vitamiinialkoholia tai 0,344 μg:lla all-trans-A-vitamiiniasetaattia tai 0,550 μg:lla all-trans-A-vitamiinipalmitaattia.

Määritysraja on 2 000 ky A-vitamiinia/kg.

2.   Periaate

Näyte hydrolysoidaan etanoli-kaliumhydroksidiliuoksella, ja A-vitamiini uutetaan petrolieetteriin. Liuotin haihdutetaan pois, haihdutusjäännös liuotetaan metanoliin ja laimennetaan tarvittaessa halutulle pitoisuusalueelle. A-vitamiinipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (RP-HPLC) UV- tai fluoresenssidetektoria käyttäen. Kromatografian ajo-olosuhteet valitaan siten, että all-trans-A-vitamiinialkoholi ja sen cis-isomeerit eivät erotu toisistaan.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

Huomautus:

A-vitamiini on herkkä (UV-)valolle ja hapettumiselle. Kaikki toimenpiteet on suoritettava valolta suojattuna (käyttäen ruskeita tai alumiinifoliolla suojattuja lasitarvikkeita) ja hapelta suojattuna (typpivirtauksessa). Uuton aikana nestepinnan yläpuolella oleva ilma on korvattava typellä (ylipaineen muodostuminen estettävä raottamalla tulppaa silloin tällöin).

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan niin että se läpäisee 1 mm:n seulan; näytteen lämpenemistä on vältettävä. Näytteen jauhaminen on tehtävä välittömästi ennen punnitusta ja saippuointia A-vitamiinin hajoamisen välttämiseksi.

5.2   Saippuointi

A-vitamiinipitoisuudesta riippuen punnitaan 1 mg:n tarkkuudella 2–25 g näytettä 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1). Lisätään peräkkäin kolvia pyörittäen 130 ml etanolia (3.1), noin 100 mg BHT:tä (3.13), 2 ml natriumaskorbaattiliuosta (3.5) ja 2 ml natriumsulfidiliuosta (3.6). Kiinnitetään jäähdytin (4.3) kolviin, ja kolvi pannaan vesihauteeseen, jossa on magneettisekoitin (4.7). Kuumennetaan kiehumispisteeseen ja annetaan kiehua 5 minuuttia. Lisätään 25 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) jäähdyttimen läpi (4.3) ja annetaan kiehua vielä 25 minuuttia sekoittaen hitaassa typpivirrassa. Jäähdytin huuhdellaan noin 20 ml:lla vettä ja kolvin sisältö jäähdytetään huoneenlämpötilaan.

5.3   Uutto

Saippuointiliuos siirretään dekantoimalla kvantitatiivisesti, huuhtomalla kaikkiaan 250 ml:lla vettä, 1 000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3) tai uuttolaitteeseen (4.8). Saippuointikolvi huuhdotaan ensin 25 ml:lla etanolia (3.1) ja sitten 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja huuhteluliuos siirretään erotussuppiloon tai uuttolaitteeseen. Veden ja etanolin lopputilavuuksien suhteen on oltava noin 2:1. Ravistellaan voimakkaasti 2 minuuttia ja annetaan laskeutua 2 minuuttia.

5.3.1    Uutto erotussuppiloa (4.2.3) käyttäen

Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), petrolieetterikerros siirretään toiseen erotussuppiloon (4.2.3). Uutto toistetaan kahdesti 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2).

Yhdistetyt uutteet pestään erotussuppilossa, pyörittäen varovasti (emulsion muodostumisen välttämiseksi), kahdesti 100 ml:lla vettä ja sitten toistuvasti ravistelemalla edelleen 100 ml:lla vettä kerrallaan, kunnes pesuvesi on väritön lisättäessä fenolftaleiiniliuosta (3.7) (neljä pesukertaa riittää yleensä). Pesty uute suodatetaan suspendoitujen vesijäämien poistamiseksi kuivan laskostetun faasinerotussuodatinpaperin läpi (4.4) 500 ml:n mittapulloon (4.2.2). Erotussuppilo ja suodatinpaperi huuhdotaan 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2), täytetään merkkiin asti petrolieetterillä (3.2) ja sekoitetaan hyvin.

5.3.2    Uutto uuttolaitteella (4.8)

Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), pannaan lasisylinterin (4.8.1) tulpan tilalle lasihiosliitin (4.8.2) ja asetetaan liikuteltavan putken U:n muotoinen alapää siten, että se on juuri faasien rajakohdan yläpuolella. Johtamalla paineistettua typpeä sivuputkeen siirretään ylempi petrolieetterikerros 1 000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3). Lisätään 100 ml petrolieetteriä (3.2) lasisylinteriin, suljetaan tulpalla ja ravistellaan hyvin. Annetaan faasien erottua ja siirretään ylempi kerros erotussuppiloon kuten edellä. Uutto toistetaan vielä 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja petrolieetterikerrokset siirretään erotussuppiloon.

Yhdistetyt petrolieetteriuutteet pestään kuten 5.3.1 kohdassa ja jatketaan kuten kyseisessä kohdassa kerrottu.

5.4   Näyteliuoksen valmistaminen HPLC-ajoja varten

Pipetoidaan tietty määrä petrolieetteriliuosta (joka on saatu kohdassa 5.3.1 tai 5.3.2) 250 ml:n päärynänmuotoiseen kolviin (4.2.4). Liuotin haihdutetaan lähes kuiviin pyöröhaihduttimella (4.1) alennetussa paineessa; vesihauteen lämpötila saa olla korkeintaan 40 oC. Ilmanpaine palautetaan normaaliksi typellä (3.10) ja kolvi otetaan pois pyöröhaihduttimesta. Jäljellä oleva liuotin haihdutetaan typpivirrassa (3.10) ja jäännös liuotetaan välittömästi tunnettuun tilavuuteen (10–100 ml) metanolia (3.3) (A-vitamiinipitoisuuden on oltava välillä 5–30 ky/ml).

5.5   Määritys HPLC:llä

A-vitamiini erotetaan C18-käänteisfaasikolonnilla (4.5.1) ja sen pitoisuus mitataan UV-detektorilla (325 nm) tai fluoresenssidetektorilla (eksitaatio: 325 nm, emissio: 475 nm) (4.5.2).

Injektoidaan tietty määrä (esim. 20 μl) kohdassa 5.4 saatua metanoliliuosta ja eluoidaan liikkuvalla faasilla (3.9). Lasketaan useiden saman näyteliuoksen injektioiden sekä useiden kalibrointiliuosten (5.6.2) injektioiden piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo.

HPLC-ajo-olosuhteet

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia; muita ajo-olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset.

5.6   Kalibrointi

5.6.1    Käyttöstandardiliuosten valmistaminen

Pipetoidaan 20 ml A-vitamiiniasetaatin kantaliuosta (3.11.1) tai 20 ml A-vitamiinipalmitaatin kantaliuosta (3.12.1) 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin 4.2.1) ja hydrolysoidaan kuten kohdassa 5.2, mutta ilman BHT-lisäystä. Tämän jälkeen uutetaan petrolieetterillä (3.2) kohdan 5.3 mukaisesti ja täytetään 500 ml:aan petrolieetterillä (3.2). Haihdutetaan 100 ml tätä uutetta pyöröhaihduttimella (ks. 5.4) lähes kuiviin, jäljellä oleva liuotin poistetaan typpivirralla (3.10) ja jäännös liuotetaan 10,0 ml:aan metanolia (3.3). Tämän liuoksen nimellinen A-vitamiinipitoisuus on 560 ky/ml. Tarkka pitoisuus on määritettävä kohdan 5.6.3.3 mukaisesti. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä.

Pipetoidaan 2,0 ml tätä käyttöstandardiliuosta 20 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Tämän laimennetun käyttöstandardiliuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia.

5.6.2    Kalibrointiliuosten valmistaminen ja kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 1,0 , 2,0 , 5,0 ja 10,0 ml laimennettua käyttöstandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,8 , 5,6 , 14,0 ja 28,0 ky/ml A-vitamiinia.

Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja, ottaen huomioon UV-spektrin tarkistuksen tulokset (5.6.3.3).

5.6.3    Standardiliuosten UV-standardisointi

5.6.3.1    A-vitamiiniasetaattikantaliuos

Pipetoidaan 2,0 ml A-vitamiiniasetaattikantaliuosta (3.11.1) 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia. Pipetoidaan 3,0 ml tätä laimennettua A-vitamiiniasetaattiliuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300–400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325–327 nm.

A-vitamiinipitoisuuden laskeminen:

ky/ml A-vitamiinia = E326 × 19,0

(A-vitamiiniasetaatin

= 1 530 aallonpituudella 326 nm 2-propanolissa)

5.6.3.2    A-vitamiinipalmitaattikantaliuos

Pipetoidaan 2,0 ml A-vitamiinipalmitaattikantaliuosta (3.12.1) 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 56 ky/ml A-vitamiinia. Pipetoidaan 3,0 ml tätä laimennettua A-vitamiinipalmitaattiliuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300–400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325–327 nm.

A-vitamiinipitoisuuden laskeminen:

ky/ml A-vitamiinia = E326 × 19,0

(A-vitamiinipalmitaatin

= 957 aallonpituudella 326 nm 2-propanolissa)

5.6.3.3    A-vitamiinin käyttöstandardiliuos

Pipetoidaan 3,0 ml laimentamatonta A-vitamiinin käyttöstandardiliuosta, joka on valmistettu kohdan 5.6.1 mukaisesti, 50 ml:n mittapulloon (4.2.2) ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Pipetoidaan 5,0 ml tätä liuosta 25 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin asti 2-propanolilla (3.8). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 6,72 ky/ml A-vitamiinia. Mitataan liuoksen UV-spektri 2-propanolia (3.8) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 300–400 nm. Ekstinktiomaksimin on oltava välillä 325–327 nm.

A-vitamiinipitoisuuden laskeminen:

ky/ml A-vitamiinia = E325 × 18,3

(A-vitamiinialkoholin

= 1 821 aallonpituudella 325 nm 2-propanolissa)

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen A-vitamiinipitoisuus (ky/ml) lasketaan näyteliuoksen A-vitamiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.6.2) avulla.

Näytteen A-vitamiinipitoisuus w (ky/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla:

[IU/kg]

jossa:

c

=

näyteliuoksen (5.4) A-vitamiinipitoisuus (ky/ml),

V1

=

näyteliuoksen (5.4) tilavuus (ml),

V2

=

kohdassa 5.4 otetun näyteliuoksen tilavuus (ml),

m

=

näyte-erän paino (g).

7.   Huomautukset

Ylimääräisellä näyte-erällä tehtävällä saantokokeella varmistetaan, että käytetty menetelmä tuottaa luotettavat tulokset tällä materiaalilla (maidonkorvikkeella). Jos saantoaste on alempi kuin 80 %, määrityksen tulosta on korjattava saannon suhteen.

8.   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta arvosta.

9.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset ( 11 )

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

yksittäisten arvojen lukumäärä

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

sR

=

uusittavuuden keskihajonta

r

=

toistettavuus

R

=

uusittavuus

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin

B.   E-VITAMIININ MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää E-vitamiinin pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. E-vitamiinipitoisuus ilmoitetaan mg/kg DL-α-tokoferoliasetaattia. 1 mg DL-α-tokoferoliasetaattia vastaa 0,91 mg:aa DL-α-tokoferolia (E-vitamiinia).

Määritysraja on 2 mg E-vitamiinia/kg. Tämä määritysraja voidaan saavuttaa ainoastaan fluoresenssi-detektorilla. UV-detektoria käytettäessä määritysraja on 10 mg/kg.

2.   Periaate

Näyte hydrolysoidaan etanoli-kaliumhydroksidiliuoksella ja E-vitamiini uutetaan petrolieetteriin. Liuotin haihdutetaan pois, haihdutusjäännös liuotetaan metanoliin ja laimennetaan tarvittaessa halutulle pitoisuusalueelle. E-vitamiinipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (RP-HPLC) fluoresenssi- tai UV-detektoria käyttäen.

3.   Reagenssit

4.   Välineistö

5.   Menettely

Huomautus:

E-vitamiini on herkkä (UV-)valolle ja hapettumiselle. Kaikki toimenpiteet on suoritettava valolta suojattuna (käyttäen ruskeita tai alumiinifoliolla suojattuja lasitarvikkeita) ja hapelta suojattuna (typpivirtauksessa). Uuton aikana nestepinnan yläpuolella oleva ilma on korvattava typellä (ylipaineen muodostuminen estettävä raottamalla tulppaa silloin tällöin).

5.1   Näytteen valmistaminen

Näyte jauhetaan niin että se läpäisee 1 mm:n seulan; näytteen lämpenemistä on vältettävä. Näytteen jauhaminen on tehtävä välittömästi ennen punnitusta ja saippuointia E-vitamiinin hajoamisen välttämiseksi.

5.2   Saippuointi

E-vitamiinipitoisuudesta riippuen punnitaan 0,01 g:n tarkkuudella 2–25 g näytettä 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1). Lisätään peräkkäin kolvia pyörittäen 130 ml etanolia (3.1), noin 100 mg BHT:tä (3.12), 2 ml natriumaskorbaattiliuosta (3.5) ja 2 ml natriumsulfidiliuosta (3.6). Kiinnitetään jäähdytin (4.3) kolviin ja kolvi pannaan vesihauteeseen, jossa on magneettisekoitin (4.7). Kuumennetaan kiehumispisteeseen ja annetaan kiehua 5 minuuttia. Lisätään 25 ml kaliumhydroksidiliuosta (3.4) jäähdyttimen läpi (4.3) ja annetaan kiehua vielä 25 minuuttia sekoittaen hitaassa typpivirrassa. Jäähdytin huuhdellaan noin 20 ml:lla vettä ja kolvin sisältö jäähdytetään huoneenlämpötilaan.

5.3   Uutto

Saippuointiliuos siirretään dekantoimalla kvantitatiivisesti, huuhtomalla kaikkiaan 250 ml:lla vettä, 1 000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3) tai uuttolaitteeseen (4.8). Saippuointikolvi huuhdotaan ensin 25 ml:lla etanolia (3.1) ja sitten 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja huuhteluliuos siirretään erotussuppiloon tai uuttolaitteeseen. Veden ja etanolin lopputilavuuksien suhteen pitää olla noin 2:1. Ravistellaan voimakkaasti 2 minuuttia ja annetaan laskeutua 2 minuuttia.

5.3.1    Uutto erotussuppiloa (4.2.3) käyttäen

Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), petrolieetterikerros siirretään toiseen erotussuppiloon (4.2.3). Uutto toistetaan kahdesti 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2).

Yhdistetyt uutteet pestään erotussuppilossa, pyörittäen varovasti (emulsion muodostumisen välttämiseksi), kahdesti 100 ml:lla vettä ja sitten toistuvasti ravistelemalla edelleen 100 ml:lla vettä kerrallaan, kunnes pesuvesi on väritön lisättäessä fenolftaleiiniliuosta (3.7) (neljä pesukertaa riittää yleensä). Pesty uute suodatetaan suspendoitujen vesijäämien poistamiseksi kuivan laskostetun suodatinpaperin läpi (4.4) 500 ml:n mittapulloon (4.2.2). Erotussuppilo ja suodatinpaperi huuhdotaan 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2), täytetään merkkiin asti petrolieetterillä (3.2) ja sekoitetaan hyvin.

5.3.2    Uutto uuttolaitteella (4.8)

Kun kerrokset ovat erottuneet (ks. huomautus 7.3), pannaan lasisylinterin (4.8.1) tulpan tilalle lasihiosliitin (4.8.2) ja asetetaan liikuteltavan putken U:n muotoinen alapää siten, että se on juuri faasien rajakohdan yläpuolella. Johtamalla paineistettua typpeä sivuputkeen siirretään ylempi petrolieetterikerros 1 000 ml:n erotussuppiloon (4.2.3). Lisätään 100 ml petrolieetteriä (3.2) lasisylinteriin, suljetaan tulpalla ja ravistellaan hyvin. Annetaan faasien erottua ja siirretään ylempi kerros erotussuppiloon kuten edellä. Uutto toistetaan vielä 100 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja kahdesti 50 ml:lla petrolieetteriä (3.2) ja petrolieetterikerrokset siirretään erotussuppiloon.

Yhdistetyt petrolieetteriuutteet pestään kuten 5.3.1 kohdassa ja jatketaan kuten kyseisessä kohdassa kerrottu.

5.4   Näyteliuoksen valmistaminen HPLC-ajoja varten

Pipetoidaan tietty määrä petrolieetteriliuosta (joka on saatu kohdassa 5.3.1 tai 5.3.2) 250 ml:n päärynänmuotoiseen kolviin (4.2.4). Liuotin haihdutetaan lähes kuiviin pyöröhaihduttimella (4.1) alennetussa paineessa; vesihauteen lämpötila saa olla korkeintaan 40 oC. Ilmanpaine palautetaan normaaliksi typellä (3.9) ja kolvi otetaan pois pyöröhaihduttimesta. Jäljellä oleva liuotin haihdutetaan typpivirrassa (3.9) ja jäännös liuotetaan välittömästi tunnettuun tilavuuteen (10–100 ml) metanolia (3.3) (DL-α-tokoferolipitoisuuden on oltava välillä 5–30 μg/ml).

5.5   Määritys HPLC:llä

E-vitamiini erotetaan C18-käänteisfaasikolonnilla (4.5.1) ja sen pitoisuus mitataan fluoresenssidetektorilla (eksitaatio: 295 nm, emissio: 330 nm) tai UV-detektorilla (292 nm) (4.5.2).

Injektoidaan tietty määrä (esim. 20 μl) kohdassa 5.4 saatua metanoliliuosta ja eluoidaan liikkuvalla faasilla (3.8). Lasketaan useiden saman näyteliuoksen injektioiden sekä useiden kalibrointiliuosten (5.6.2) injektioiden piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo.

HPLC-ajo-olosuhteet

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia; muita ajo-olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset.

5.6   Kalibrointi (DL-α-tokoferoliasetaatti tai DL-α-tokoferoli)

5.6.1    DL-α-tokoferoliasetaattistandardi

5.6.1.1    Käyttöstandardiliuoksen valmistaminen

Pipetoidaan 25 ml DL-α-tokoferoliasetaattikantaliuosta (3.10.1) 500 ml:n tasapohjaiseen tai pyöreäpohjaiseen kolviin (4.2.1) ja hydrolysoidaan kuten kohdassa 5.2. Tämän jälkeen uutetaan petrolieetterillä (3.2) kohdan 5.3 mukaisesti ja täytetään 500 ml:aan petrolieetterillä. Haihdutetaan 25 ml tätä uutetta pyöröhaihduttimella (ks. 5.4) lähes kuiviin, jäljellä oleva liuotin poistetaan typpivirralla (3.9) ja jäännös liuotetaan 25,0 ml:aan metanolia (3.3). Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 45,5 μg/ml DL-α-tokoferolia, mikä vastaa 50 μg/ml:aa DL-α-tokoferoliasetaattia. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä.

5.6.1.2    Kalibrointiliuosten valmistaminen ja kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 1,0 , 2,0 , 4,0 ja 10,0 ml kantastandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,5 , 5,0 , 10,0 ja 25,0 μg/ml DL-α-tokoferoliasetaattia eli 2,28 , 4,55 , 9,10 μg/ml ja 22,8 μg/ml DL-α-tokoferolia.

Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja.

5.6.1.3    DL-α-tokoferoliasetaattikantaliuoksen (3.10.1) UV-standardisointi

Laimennetaan 5,0 ml DL-α-tokoferoliasetaattikantaliuosta (3.10.1) 25,0 ml:ksi etanolilla ja mitataan tämän liuoksen UV-spektri etanolia (3.1) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 250–320 nm.

Absorptiomaksimin pitää olla aallonpituudella 284 nm:

= 43,6 aallonpituudella 284 nm etanolissa

Tällä laimennuksella pitää saada ekstinktioarvo 0,84 –0,88 .

5.6.2    DL-α-tokoferolistandardi

5.6.2.1    Käyttöstandardiliuoksen valmistaminen

Pipetoidaan 2 ml DL-α-tokoferolikantaliuosta (3.11.1) 50 ml:n mittapulloon, liuotetaan metanoliin (3.3) ja täytetään merkkiin asti metanolilla. Tämän liuoksen nimellinen pitoisuus on 40 μg/ml DL-α-tokoferolia, mikä vastaa 44,0 μg/ml:aa DL-α-tokoferoliasetaattia. Käyttöstandardiliuos valmistetaan juuri ennen käyttöä.

5.6.2.2    Kalibrointiliuosten valmistaminen ja kalibrointikäyrä

Pipetoidaan 1,0 , 2,0 , 4,0 ja 10,0 ml kantastandardiliuosta 20 ml:n mittapulloihin, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten nimelliset pitoisuudet ovat 2,0 , 4,0 , 8,0 ja 20,0 μg/ml DL-α-tokoferolia eli 2,20 , 4,40 , 8,79 μg/ml ja 22,0 μg/ml DL-α-tokoferoliasetaattia.

Injektoidaan 20 μl kutakin kalibrointiliuosta useita kertoja ja määritetään piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä käyttäen piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvoja.

5.6.2.3    DL-α-tokoferolikantaliuoksen (3.11.1) UV-standardisointi

Laimennetaan 2,0 ml DL-α-tokoferolikantaliuosta (3.11.1) 25,0 ml:ksi etanolilla ja mitataan tämän liuoksen UV-spektri etanolia (3.1) vastaan spektrofotometrillä (4.6) välillä 250–320 nm. Absorptiomaksimin pitää olla aallonpituudella 292 nm:

= 75,8 aallonpituudella 292 nm etanolissa

Tällä laimennuksella pitää saada ekstinktioarvo 0,6 .

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen E-vitamiinipitoisuus μg/ml (laskettuna α-tokoferoliasetaattina) määritetään näyteliuoksen E-vitamiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.6.1.2 tai 5.6.2.2) avulla.

Näytteen E-vitamiinipitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla:

[mg/kg]

jossa:

c

=

näyteliuoksen (5.4) E-vitamiinipitoisuus (α-tokoferoliasetaattina) (μg/ml);

V1

=

näyteliuoksen (5.4) tilavuus (ml);

V2

=

näyteliuoksen (5.4) tilavuus (ml);

m

=

näyte-erän paino (g).

7.   Huomautukset

8.   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta arvosta.

9.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset ( 12 )

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

yksittäisten arvojen lukumäärä

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

sR

=

uusittavuuden keskihajonta

r

=

toistettavuus

R

=

uusittavuus

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin.

C.   RAUDAN, KUPARIN, MANGAANIN JA SINKIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehuista hivenaineet rauta, kupari, mangaani ja sinkki. Määritysrajat ovat:

2.   Periaate

Näytteet liuotetaan kloorivetyhappoon sen jälkeen, kun siinä mahdollisesti esiintyvät orgaaniset aineet on tuhottu. Alkuaineet rauta, kupari, mangaani ja sinkki määritetään sopivan laimennuksen jälkeen atomiabsorbtiospektrometrillä.

3.   Reagenssit

Alustavat huomautukset

Reagenssien ja analyysiliuosten valmistuksessa käytetään määritettävistä kationeista vapaata vettä, joka on saatu joko tislaamalla se kaksi kertaa borosilikaattilasista tai kvartsista valmistetussa tislauslaitteessa tai käsittelemällä se kaksi kertaa ioninvaihtohartsilla.

Reagenssien on oltava vähintään analyysilaatua. Nollakokeella tarkistetaan, ettei määritettävää alkuainetta esiinny. Tarvittaessa reagensseja on puhdistettava lisää.

Seuraavassa kuvattujen standardiliuosten tilalla voidaan käyttää kaupallisesti saatavilla olevia standardiliuoksia, jos ne ovat takuulaatua ja ne on tarkistettu ennen käyttöä.

4.   Välineistö

5.   Menettely ( 13 )

5.1   Orgaanista ainetta sisältävät näytteet

5.1.1    Polttaminen tuhkaksi ja analyysiin tarvittavan liuoksen valmistaminen ( 14 )

Tuhka kostutetaan vedellä ja siirretään 250 ml:n dekantterilasiin. Upokas pestään yhteensä noin 5 ml:lla kloorivetyhappoa (3.1), happo lisätään hitaasti ja varovasti dekantterilasiin (tällöin voi esiintyä voimakas reaktio, joka johtuu CO2:n muodostumisesta). Lisätään kloorivetyhappoa (3.1) pisaroittain samalla sekoittaen kunnes kupliminen on kokonaan lakannut. Haihdutetaan kuivaksi ajoittain lasisauvalla sekoittaen.

Jäännökseen lisätään 15 ml kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), ja noin 120 ml vettä. Sekoitetaan lasisauvalla, joka jätetään dekantterilasiin, ja peitetään astia kellonlasilla. Kuumennetaan varovasti kiehumispisteeseen ja pidetään kiehumispisteessä kunnes enempää tuhkaa ei havaita liukenevan. Suodatetaan tuhkattomalla suodatinpaperilla ja suodos kerätään talteen 250 ml:n mittapulloon. Dekantterilasi ja suodatin pestään 5 ml:lla kuumaa kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), sekä kaksi kertaa kiehuvalla vedellä. Mittapullo täytetään merkkiin asti vedellä (HCl-konsentraatio noin 0,5 mol/l).

Huomautukset:

5.1.2    Spektrofotometrinen määritys

5.1.2.1    Kalibrointiliuosten valmistaminen

Kutakin määritettävää alkuainetta varten valmistetaan 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.1.10 kohdassa mainituista käyttöstandardiliuoksista sarja standardiliuoksia siten, että kunkin standardiliuoksen HCl-konsentraatio on noin 0,5 mol/l ja lantaanikloridikonsentraatio sellainen, joka vastaa 0,1 %:a (w/v) lantaania.

Valittujen hivenainekonsentraatioiden on oltava käytetyn spektrofotometrin herkkyysalueella. Seuraavissa taulukoissa annetaan esimerkiksi erilaisia standardiliuoskoostumuksia; käytetyn spektrofotometrin tyypistä ja herkkyydestä riippuen voi kuitenkin olla tarpeen valita muita pitoisuuksia.

Rauta

Kupari

Mangaani

Sinkki

5.1.2.2    Liuoksen valmistaminen määritystä varten

Kuparin määritystä varten voidaan 5.1.1 kohdassa valmistettua liuosta käyttää yleensä suoraan. Tarvittaessa sen pitoisuus tuodaan kalibrointiliuosten alueelle, tästä otettu erä voidaan pipetoida 100 ml:n mittapulloon ja täyttää merkkiin asti kloorivetyhapolla, 0,5 mol/l (3.3).

Raudan, mangaanin ja sinkin määritystä varten pipetoidaan erä 5.1.1 kohdassa valmistettua liuosta 100 ml:n mittapulloon, lisätään 10 ml lantaanikloridiliuosta (3.11) ja täytetään merkkiin asti kloorivetyhapolla, 0,5 mol/l (3.3.) (ks. myös 8 kohdan huomautus).

5.1.2.3    Nollakoe

Nollakoe suoritetaan samalla tavalla mutta ilman määritettävää näytettä. Standardiliuosta ’0’ ei saa käyttää nollanäytteenä.

5.1.2.4    Atomiabsorptiomittaus

Standardiliuosten ja määritettävän liuoksen atomiabsorptio mitataan hapettavalla ilma-asetyleeniliekillä seuraavilla aallonpituuksilla:

Kukin mittaus suoritetaan neljä kertaa.

5.2   Kivennäisrehut

Jos näyte ei sisällä orgaanista ainetta, sitä ei ole tarpeen polttaa tuhkaksi. Suoritusta jatketaan 5.1.1.1 kohdan toisesta kappaleesta. Haihdutus fluorivetyhapolla voidaan jättää pois.

6.   Tulosten laskeminen

Määritettävässä liuoksessa oleva hivenainepitoisuus lasketaan kalibrointikäyrältä ja tulos ilmoitetaan milligrammoina hivenainetta kilogrammassa näytettä (ppm).

7.   Toistettavuus

Samasta näytteestä saman henkilön tekemän kahden rinnakkaismäärityksen tulosten välinen ero ei saa olla yli:

8.   Huomautus

Suuret fosfaattimäärät voivat häiritä raudan, mangaanin ja sinkin määritystä. Tällainen häiriö on korjattava lantaanikloridiliuosta (3.11) lisäämällä. Jos näytteessä painosuhde Ca + Mg / P on > 2, voidaan lantaanikloridiliuoksen (3.11) lisäys määritettävään liuokseen ja standardiliuoksiin jättää pois.

D.   HALOFUGINONIN MÄÄRITTÄMINEN

DL-trans-7-bromi-6-kloori-3-[3-(3-hydroksi-2-piperidyyli)asetonyyli]-kinatsoliini-4-(3H)-oni-hydrobromidi

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen halufuginonipitoisuus. Määritysraja on 1 mg/kg.

2.   Periaate

Näytettä käsitellään kuumalla vedellä ja halofuginoni uutetaan tämän jälkeen vapaana emäksenä etyyliasetaattiin ja erotetaan hydrokloridina happamaan vesiliuokseen. Uute puhdistetaan ioninvaihtokromatografialla. Halofuginonipitoisuus määritetään suuren erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) UV-detektoria käyttäen.

3.   Reagenssit

Mitataan 500 ml:n mittapulloon 50 mg (0,1 mg:n tarkkuudella) halofuginonia (3.6), liuotetaan ammoniumasetaattipuskuriliuokseen (3.18), täytetään merkkiin asti puskuriliuoksella ja sekoitetaan. Tämä liuos säilyy 5 oC:ssa kolmen viikon ajan, jos sitä säilytetään valolta suojattuna.

Mitataan sarjaan 100 ml:n mittapulloja 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 ja 6,0 ml standardikantaliuosta (3.6.1). Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.21) ja sekoitetaan. Näiden liuosten halofuginonipitoisuudet ovat 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 ja 6,0 μg/ml. Liuokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Liuotetaan 50 g natriumkarbonaattia (3.11) veteen, täytetään 1 litraksi ja lisätään natriumkloridia (3.12), kunnes liuos on kyllästetty.

Laimennetaan 10 ml kloorivetyhappoa (3.7) vedellä 1 litraksi.

Liuotetaan 19,3 g ammoniumasetaattia (3.3) ja 30 ml etikkahappoa (3.5) veteen (3.14) ja laimennetaan 1 litraksi.

Pestään sopivaa määrää Amberlitea (3.2) vedellä, kunnes pesuun käytetyssä vesifaasissa hopeanitraatilla (3.20) tehtävä koe osoittaa, että kloridi-ioneita ei enää ole. Tämän jälkeen hartsi pestään 50 ml:lla metanolia (3.8), tämä metanoli heitetään pois ja hartsia säilytetään puhtaassa metanolissa.

Liuotetaan 0,17 g hopeanitraattia (3.9) 10 ml:aan vettä.

Sekoitetaan 500 ml asetonitriiliä (3.1) 300 ml:aan ammoniumasetaattipuskuriliuosta (3.18) ja 1 200 ml:aan vettä (3.14). Säädetään pH arvoon 4,3 etikkahapolla (3.5). Suodatetaan 0,22 μm:n suodattimen (4.8) läpi ja poistetaan kaasut liuoksesta (esimerkiksi 10 minuutin ultraäänikäsittelyllä). Tämä liuos säilyy yhden kuukauden ajan, jos sitä säilytetään suljetussa astiassa valolta suojattuna.

4.   Välineistö

5.   Menettely

Huomautus:

Vapaana emäksenä halofuginoni on epästabiili alkalisissa liuoksissa ja etyyliasetaattiliuoksissa. Se ei saa olla etyyliasetaatissa yli 30 minuuttia.

5.1   Yleistä

Huomautus:

Tätä menetelmää käytettäessä nollarehun on vastattava koostumukseltaan näytettä, ja halofuginonia ei saa havaita määrityksessä.

5.2   Uutto

Punnitaan 0,1 gramman tarkkuudella 10 g valmistettua näytettä 200 ml:n sentrifugiputkeen, lisätään 0,5 g natriumaskorbaattia (3.10), 0,5 g EDTA:a (3.13) ja 20 ml vettä; sekoitetaan. Asetetaan putki vesihauteeseen (80 oC) 5 minuutiksi. Annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan, jonka jälkeen lisätään 20 ml natriumkarbonaattiliuosta (3.15) ja sekoitetaan. Lisätään viipymättä 100 ml etyyliasetaattia (3.4) ja ravistellaan käsin voimakkaasti 15 sekunnin ajan. Tämän jälkeen putki sijoitetaan kolmeksi minuutiksi ultraäänihauteeseen (4.1) ja korkkia höllennetään. Sentrifugoidaan 2 minuuttia ja dekantoidaan etyyliasetaattifaasi lasikuitusuodattimen (4.6) läpi 500 ml:n erotussuppiloon. Toistetaan näytteen uutto toisella 100 ml:n etyyliasetaattiannoksella. Pestään yhdistettyjä uutteita 1 minuutin ajan 50 ml:lla natriumkloridilla kyllästettyä natriumkarbonaattiliuosta (3.16) ja poistetaan vesifaasi.

Uutetaan orgaanista kerrosta 50 ml:lla kloorivetyhappoa (3.17) 1 minuutin ajan. Juoksutetaan alempi happokerros 250 ml:n erotussuppiloon. Uutetaan orgaanista kerrosta vielä 50 ml:lla kloorivetyhappoa 1,5 minuutin ajan ja yhdistetään uutteet. Pestään yhdistetyt happouutteet heiluttamalla niitä noin 10 sekunnin ajan 10 ml:n etyyliasetaattimäärän kanssa (3.4).

Siirretään vesikerros kvantitatiivisesti 250 ml:n pyörökolviin ja heitetään orgaaninen faasi pois. Haihdutetaan pyörivällä kalvohaihduttimella (4.2) kaikki etyyliasetaattijäämät happoliuoksesta. Vesihauteen lämpötila ei saa olla yli 40:tä oC. Noin 25 mbar:n tyhjössä etyyliasetaattijäämät poistuvat 5 minuutissa 38 oC:ssa.

5.3   Puhdistaminen

5.3.1    Amberlite-kolonnin valmistaminen

Kullekin näyteuutteelle valmistetaan XAD-2-kolonni. Siirretään metanolilla (3.8) 10 g esikäsiteltyä Amberlitea (3.19) lasikolonniin (4.5). Lisätään pieni lasivillatuppo hartsikerroksen päälle. Juoksutetaan metanoli kolonnista ja pestään hartsi 100 ml:lla vettä ja pysäytetään virtaus, kun neste yltää hartsikerroksen yläosaan. Annetaan kolonnin stabiloitua 10 minuuttia ennen sen käyttöä. Kolonnin ei saa koskaan antaa kuivua.

5.3.2    Näytteen puhdistaminen

Siirretään uute (5.2) kvantitatiivisesti valmistetun Amberlite-kolonnin (5.3.1) yläosaan, eluoidaan ja heitetään eluaatti pois. Eluointinopeus ei saa olla yli 20 ml:aa minuutissa. Huuhdellaan pyörökolvi 20 ml:lla kloorivetyhappoa (3.17) ja käytetään tätä liuosta hartsikolonnin pesemiseen. Poistetaan happoliuosjäämä ilmavirralla. Heitetään pesuliuokset pois. Lisätään kolonniin 100 ml metanolia (3.8) ja annetaan eluoitua 5–10 ml ja kerätään eluaatti 250 ml:n pyörökolviin. Annetaan jäljelle jääneen metanolin stabiloitua hartsin kanssa 10 minuutin ajan, jatketaan eluointia alle 20 ml minuutissa olevalla nopeudella ja kerätään eluaatti samaan pyörökolviin. Haihdutetaan metanoli pyöröhaihduttimella (4.2) huolehtien siitä, että vesihauteen lämpötila ei ole yli 40 oC. Siirretään jäännös kvantitatiivisesti 10 ml:n mittapulloon käyttäen liikkuvaa faasia (3.21). Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla ja sekoitetaan. Suodatetaan näyte kalvosuodattimen (4.7) läpi. Säilytetään tämä liuos HPLC-määritystä (5.4) varten.

5.4   HPLC-määritys

5.4.1    Muuttujat

Seuraavat edellytykset ovat ohjeellisia; muita määritysolosuhteita voidaan käyttää sillä edellytyksellä, että niillä saadaan vastaavat tulokset.

Nestekromatografiakolonni (4.4.1)

HPLC:n liikkuva faasi (3.21)

Virtausnopeus: 1,5 –2 ml/min

Detektioaallonpituus: 243 nm

Injektiotilavuus: 40–100 μl.

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus on tarkistettava injektoimalla useita kertoja kalibrointiliuosta (3.6.2), jonka pitoisuus on 3,0 μg/ml, kunnes piikkien korkeudet (pinta-alat) ja retentioajat eivät muutu.

5.4.2    Kalibrointikäyrä

Injektoidaan jokaista kalibrointiliuosta (3.6.2) useita kertoja ja mitataan piikkien korkeudet (pinta-alat) jokaiselle pitoisuudelle. Kalibrointikäyrä piirretään siten, että y-akselilla ovat kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta alojen) keskiarvot ja x-akselilla vastaavat konsentraatiot (μg/ml).

5.4.3    Näyteliuos

Injektoidaan useita kertoja näyteuutetta (5.3.2) käyttäen samaa tilavuutta kuin kalibrointiliuoksille ja määritetään halofuginonin piikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Määritetään näyteliuoksen pitoisuus (μg/ml) näyteliuoksen halofuginonin piikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.4.2) avulla.

Näytteessä olevan halofuginonin määrä w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

c

=

näyteliuoksen halofuginonipitoisuus, μg/ml,

m

=

näyte-erän paino grammoina.

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Tutkittavan aineen tunnistaminen voidaan varmistaa yhteiskromatografialla tai käyttämällä diodirividetektoria, jolla voidaan verrata näyteuutteen ja halofuginonia 6,0 μg/ml sisältävän kalibrointiliuoksen (3.6.2) spektrejä.

7.1.1    Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.6.2). Lisätyn halofuginonimäärän on vastattava näyteuutteesta todetun halofuginonin arvioitua määrää.

Ainoastaan halofuginonipiikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä halofuginonia että näyteliuoksen laimeneminen. Piikin puolivälissä sen leveyden on oltava ± 10 % lähtöleveydestä.

7.1.2    Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla yli 0,5 mg/kg, kun halofuginonipitoisuudet ovat enintään 3 mg/kg.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 80 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Laboratorioiden välisessä tutkimuksessa ( 15 ) analysoitiin kolme näytettä kahdeksassa laboratoriossa.

ND

=

ei havaittu

SR

=

uusittavuuden keskihajonta

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin, %

Rec.

=

saanto ( %).

E.   ROBENIDIININ MÄÄRITTÄMINEN

1,3-bis[(4-kloori-bentsylideeni)amino]guanidiinihydrokloridi

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää robenidiinin pitoisuus rehuissa. Määritysraja on 5 mg/kg.

2.   Periaate

Näyte uutetaan happamoidulla metanolilla. Uute kuivataan ja määräosa puhdistetaan alumiinioksidikolonnissa. Robenidiini eluoidaan kolonnista metanolilla, konsentroidaan ja saatetaan sopivaksi tilavuudeksi liikkuvalla faasilla. Robenidiinipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) UV-detektoria käyttäen.

3.   Reagenssit

Siirretään 4,0 ml kloorivetyhappoa (ρ20 = 1,18 g/ml) 500 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.1) ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Tyyppiä 3A, 8–12 meshin helmiä (1,6 –2,5 mm:n helmiä, kiteistä alumiinisilikaattia, huokosten halkaisija 0,3 mm).

Siirretään 100 grammaa alumiinioksidia sopivaan astiaan ja lisätään 2,0 ml vettä. Suljetaan ja ravistellaan noin 20 minuutin ajan. Säilytetään hyvin suljetussa astiassa.

Liuotetaan 3,40 g kaliumdivetyfosfaattia veteen (HPLC-laatua) 1 000 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin asti ja sekoitetaan.

Liuotetaan 3,55 g vedetöntä (tai 4,45 g dihydraattia tai 8,95 g dodekahydraattia) dinatriumvetyfosfaattia veteen (HPLC-laatua vastaava) litran mittapullossa, täytetään merkkiin asti ja sekoitetaan.

Sekoitetaan seuraavat reagenssit:

Suodatetaan 0,22 μm:n suodattimen (4.6) läpi ja poistetaan kaasut liuoksesta (esimerkiksi 10 minuutin ultraäänikäsittelyllä).

Puhdas robenidiini: 1,3 -bis[(4-klooribentsylideeni)amino]guanidiinihydrokloridi.

Punnitaan 30 mg 0,1 mg:n tarkkuudella robenidiinin standardiyhdistettä (3.9). Liuotetaan happamoituun metanoliin (3.2) 100 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin asti samalla liuottimella ja sekoitetaan. Kääritään pullo alumiinifolioon ja säilytetään valolta suojattuna.

Siirretään 10,0 ml standardikantaliuosta (3.9.1) 250 ml:n pulloon, täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.8) ja sekoitetaan. Kääritään pullo alumiinifolioon ja säilytetään valolta suojattuna.

Siirretään sarjassa 50 ml:n mittapulloihin 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 ja 25,0 ml standardin välimuotoliuosta (3.9.2). Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.8) ja sekoitetaan. Näiden liuosten robenidiinipitoisuudet ovat vastaavasti 1,2 , 2,4 , 3,6 , 4,8 ja 6,0 μg/ml. Liuokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.

4.   Välineistö

Valmistettu ruskeasta lasista, varustettu hanalla ja säiliöllä, jonka tilavuus on noin 150 ml, sisähalkaisija 10–15 mm, pituus 250 mm.

5.   Menettely

Huomautus:

Robenidiini on herkkä valolle. Kaikissa toiminnoissa on käytettävä ruskeaa lasia.

5.1   Yleistä

Huomautus:

Tätä menetelmää käytettäessä nollarehun on vastattava tyypiltään näytettä, ja robenidiinia ei saa havaita määrityksessä.

5.2   Uutto

Punnitaan 0,01 g:n tarkkuudella noin 15 g valmistettua näytettä. Siirretään 250 ml:n erlenmeyerkolviin ja lisätään 100,0 ml happamoitua metanolia (3.2), suljetaan astia ja ravistellaan tunnin ajan ravistelijalla (4.2). Suodatetaan liuos lasikuitusuodatinpaperin (4.5) läpi ja koko suodos kerätään talteen 150 ml:n erlenmeyerkolviin. Lisätään 7,5 g molekyyliseulaa (3.4), suljetaan astia ja ravistellaan viisi minuuttia. Suodatetaan välittömästi lasikuitusuodatinpaperin läpi. Tämä liuos säilytetään puhdistusta (5.3) varten.

5.3   Puhdistus

5.3.1    Alumiinioksidikolonnin valmistaminen

Lasikolonnin (4.1) alapäähän laitetaan pieni tuppo lasivillaa ja tiivistetään se lasisauvaa käyttäen. Punnitaan 11,0 g valmistettua alumiinioksidia (3.5) ja siirretään kolonniin. Tässä vaiheessa on pidettävä huolta siitä, että altistuminen ilmalle on mahdollisimman vähäistä. Taputellaan täytetyn kolonnin alapäätä kevyesti, jotta alumiinioksidi tiivistyy sopivasti.

5.3.2    Näytteen puhdistus

Pipetoidaan kolonniin 5,0 ml valmistettua näyteuutetta (5.2). Annetaan pipetin kärjen levätä kolonnin seinää vasten ja liuoksen absorboitua alumiinioksidiin. Eluoidaan robenidiini kolonnista 100 ml:lla metanolia (3.1) virtausnopeudella 2–3 ml/min ja kerätään eluaatti 250 ml:n pyörökolviin. Haihdutetaan metanoliliuos kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttimessa (4.3) lämpötilan ollessa 40 oC. Liuotetaan jäännös uudelleen 3–4 ml:aan liikkuvaa faasia (3.8) ja siirretään kvantitatiivisesti 10 ml:n mittapulloon. Huuhdellaan pullo usealla 1–2 ml:n annoksella liikkuvaa faasia ja siirretään nämä huuhteluliuokset mittapulloon. Täytetään merkkiin asti samalla liuottimella ja sekoitetaan. Suodatetaan näyte 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.7) läpi. Tämä liuos säilytetään HPLC-määritystä (5.4) varten.

5.4   HPLC-määritys

5.4.1    Muuttujat

Seuraavat olosuhteet ovat ohjeellisia, ja myös muita olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset:

Nestekromatografiakolonni (4.4.1)

HPLC:n liikkuva faasi (3.8)

Virtausnopeus: 1,5 –2 ml/min

Detektioaallonpituus: 317 nm

Injektiotilavuus: 20–50 μl.

Kromatografisen järjestelmän stabiilisuus tarkastetaan injektoimalla useita kertoja kalibrointiliuosta (3.9.3), jonka pitoisuus on 3,6 μg/ml, kunnes saadaan piikkejä, joiden korkeudet (pinta-alat) ja retentioajat pysyvät vakioina.

5.4.2    Kalibrointikäyrä

Injektoidaan useita kertoja kutakin kalibrointiliuosta (3.9.3) ja mitataan kunkin pitoisuuden piikkien korkeudet (pinta-alat). Kalibrointikäyrä piirretään siten, että y-akselilla ovat kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta alojen) keskiarvot ja x-akselilla vastaavat konsentraatiot μg/ml.

5.4.3    Näyteliuos

Injektoidaan useita kertoja näyteuutetta (5.3.2) käyttäen samaa määrää kuin kalibrointiliuoksille, ja määritetään robenidiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen robenidiinipitoisuus μg/ml lasketaan robenidiinipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.4.2) avulla.

Näytteen robenidiinipitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

c

=

näyteliuoksen robenidiinipitoisuus, μg/ml,

m

=

näyte-erän paino grammoina.

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Määritettävän aineen tunnistaminen voidaan varmistaa yhteiskromatografialla tai diodirividetektorilla, joka mahdollistaa näyteuutteen ja 6 μg/ml robenidiinia sisältävän kalibrointiliuoksen (3.6.3) spektrien vertailun.

7.1.1    Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.9.3). Lisätyn robenidiinin määrän on vastattava näyteuutteessa olevan robenidiinin arvioitua määrää.

Ainoastaan robenidiinipiikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä että uutteen laimeneminen. Piikin leveyden, sen puolikorkeudella, on oltava noin 10 % sen alkuperäisestä leveydestä.

7.1.2    Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaisen, samasta näytteestä tehdyn määrityksen tulosten välinen ero ei saa olla suurempi kuin 10 % suuremmasta tuloksesta, kun robenidiinipitoisuus on yli 15 mg/kg.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 85 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Euroopan yhteisön laboratorioiden välisessä tarkastelussa 12 laboratoriota määritti neljä jauhon tai rakeiden muodossa olevaa kani- ja siipikarjarehunäytettä. Kukin näyte määritettiin kaksi kertaa. Tulokset esitetään alla olevassa taulukossa:

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin, %

SR

=

uusittavuuden keskihajonta

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin, %.

F.   DIKLATSURIILIN MÄÄRITYS

(+)-4-kloorifenyyli-[2,6-dikloori-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-diokso-1,2,4-triatsin-2-yyli)fenyyli]asetonitriili

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää diklatsuriilin pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. Toteamisraja on 0,1 mg/kg ja määritysraja 0,5 mg/kg.

2.   Periaate

Sisäisen standardin lisäyksen jälkeen näyte uutetaan happamoidulla metanolilla. Osa rehunäytteen uutteesta puhdistetaan C18-kiinteäfaasiuuttopylväällä. Diklatsuriili eluoidaan pylväästä happamoidun metanolin ja veden seoksella. Haihdutuksen jälkeen jäännös liuotetaan DMF-vesiseokseen. Esiseoksista saadut uutteet haihdutetaan ja jäännös liuotetaan DMF-vesiseokseen. Diklatsuriilipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (RP-HPLC) käyttäen ternaarigradienttia ja UV-detektoria.

3.   Reagenssit

Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 25 mg diklatsuriilistandardia (3.8) 50 ml:n mittapulloon. Liuotetaan DMF:ään (3.6), täytetään merkkiin asti DMF:llä (3.6) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

Pipetoidaan 5,00 ml standardin kantaliuosta (3.8.1) 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti DMF:llä (3.6) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella noin 25 mg sisäistä standardia (3.9) 50 ml:n mittapulloon. Liuotetaan DMF:ään (3.6), täytetään merkkiin asti DMF:llä (3.6) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

Pipetoidaan 5,00 ml sisäisen standardin kantaliuosta (3.9.1) 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti DMF:llä (3.6) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

(p = diklatsuriilin nimellispitoisuus esiseoksessa, mg/kg)

Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 10 mg sisäistä standardia 100 ml:n mittapulloon, liuotetaan DMF:ään (3.6) ultraäänihauteessa (4.6), täytetään merkkiin asti DMF:llä ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa. pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

Pipetoidaan 2,00 ml diklatsuriilin standardiliuosta (3.8.2) ja 2,00 ml sisäistä standardiliuosta (3.9.2) 50 ml:n mittapulloon. Lisätään 16 ml DMF:ää (3.6), täytetään merkkiin asti vedellä ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Pipetoidaan 5,0 ml suolahappoa (3.7) 1 000 ml:aan metanolia (3.5) ja sekoitetaan.

Liuotetaan 5 g ammoniumasetaattia (3.2) ja 3,4 g TBHS:ää (3.3) 1 000 ml:aan vettä (3.1) ja sekoitetaan.

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Yleistä

5.1.1    Nollarehu

Nollanäyte on analysoitava, jotta varmistetaan, ettei se sisällä diklatsuriilia tai mittausta häiritseviä aineita. Nollanäytteen on oltava näytteen kaltainen, eikä siinä saa olla havaittavia määriä diklatsuriilia tai häiritseviä aineita.

5.1.2    Saantokoe

Saanto on määritettävä analysoimalla nollanäyte, johon on lisätty näytteen diklatsuriilipitoisuutta vastaava määrä diklatsuriilia. Jotta saadaan konsentraatio, joka vastaa arvoa 1 mg/kg diklatsuriilia, siirretään 0,1 ml standardin kantaliuosta (3.8.1) 50 grammaan nollanäytettä, sekoitetaan perusteellisesti ja annetaan tasoittua 10 minuuttia sekoittaen useita kertoja ennen uuttovaiheeseen siirtymistä (5.2).

Jos saatavilla ei ole näytteen kaltaista nollanäytettä (katso 5.1.1), voidaan saantokoe suorittaa vaihtoehtoisesti standardinlisäysmenetelmällä. Tällöin analysoitavaan näytteeseen lisätään suunnilleen näytteiden jo sisältämä määrä diklatsuriilia. Tämä näyte analysoidaan yhdessä varsinaisen näytteen kanssa, ja saanto voidaan laskea vähennyslaskulla.

5.2   Uutto

5.2.1    Rehut

Punnitaan noin 50 g näytettä 0,01 gramman tarkkuudella. Siirretään 500 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään 1,00 ml sisäistä standardiliuosta (3.9.2), 200 ml uuttoliuosta (3.12) ja suljetaan kolvi tulpalla. Seosta ravistellaan ravistelijalla (4.1) yli yön. Annetaan laskeutua 10 minuuttia. Siirretään 20 ml supernatantista sopivaan lasiastiaan ja laimennetaan 20 ml:lla vettä. Siirretään liuos uuttohylsyyn (3.11) ja imetään liuos sen läpi vakuumilla (4.5). Pestään hylsy 25 ml:lla uuttoliuoksen (3.12) ja veden seosta, 65 + 35 (V + V). Kerätyt fraktiot heitetään pois ja määritettävät aineet eluoidaan 25 ml:lla uuttoliuoksen (3.12) ja veden seosta, 80 + 20 (V + V). Tämä fraktio haihdutetaan pyöröhaihduttimella (4.3) 60 oC:ssa niin, että se on juuri ja juuri kuivunut. Jäännös liuotetaan 1,0 ml:aan DMF:ää (3.6), lisätään 1,5 ml vettä (3.1) ja sekoitetaan. Suodatetaan kalvosuodattimella (4.4). Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.2.2    Esiseokset

Punnitaan noin 1 g näytettä 0,001 gramman tarkkuudella. Siirretään 500 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään 1,00 ml sisäistä standardiliuosta (3.9.3), 200 ml uuttoliuosta (3.12) ja suljetaan kolvi tulpalla. Seosta ravistellaan yli yön ravistelijalla (4.1). Annetaan laskeutua 10 minuuttia. Siirretään 10 000 /p ml:n (p = diklatsuriilin nimellispitoisuus esiseoksessa mg/kg) erä supernatanttia sopivankokoiseen keittokolviin. Haihdutetaan alipaineessa pyöröhaihduttimella (4.3) 60 oC:ssa niin, että se on juuri ja juuri kuivunut. Jäännös liuotetaan uudelleen 10,0 ml:aan DMF:ää (3.6), lisätään 15,0 ml vettä (3.1) ja sekoitetaan. Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.3   HPLC-määritys

5.3.1    Muuttujat

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia ja niitä voidaan muuttaa, mikäli ne antavat vastaavanlaiset tulokset.

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus tarkistetaan injektoimalla useita kertoja kalibrointiliuosta (3.10), jonka konsentraatio on 2 μl/ml, kunnes piikkien korkeudet ja retentioajat ovat vakiot.

5.3.2    Kalibrointiliuos

Injektoidaan 20 μl kalibrointiliuosta (3.10) useita kertoja ja määritetään diklatsuriilin ja sisäisen standardin piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot.

5.3.3    Näyteliuos

Injektoidaan 20 μl näyteliuosta (5.2.1 tai 5.2.2) useita kertoja ja määritetään diklatsuriilin ja sisäisen standardin piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot.

6.   Tulosten laskeminen

6.1   Rehut

Näytteen diklatsuriilipitoisuus w (mg/kg) saadaan seuraavasta kaavasta:

[mg/kg]

jossa:

hd, s

=

näyteliuoksen (5.2.1) diklatsuriilin piikin korkeus (pinta-ala),

hi, s

=

näyteliuoksen (5.2.1) sisäisen standardin piikin korkeus (pinta-ala),

hd, c

=

kalibrointiliuoksen (3.10) diklatsuriilin piikin korkeus (pinta-ala),

hi, c

=

kalibrointiliuoksen (3.10) sisäisen standardin piikin korkeus (pinta-ala),

cd, c

=

kalibrointiliuoksen (3.10) diklatsuriilipitoisuus, μg/ml,

m

=

näyte-erän paino (g),

V

=

5.2.1 kohdan mukaisesti valmistetun näyteuutteen tilavuus (2,5 ml).

6.2   Esiseokset

Näytteen diklatsuriilipitoisuus w (mg/kg) saadaan seuraavasta kaavasta:

[mg/kg]

jossa:

hd, c

=

kalibrointiliuoksen (3.10) diklatsuriilin piikin korkeus (pinta-ala),

hi, c

=

kalibrointiliuoksen (3.10) sisäisen standardin piikin korkeus (pinta-ala),

hd, s

=

näyteliuoksen (5.2.2) diklatsuriilin piikin korkeus (pinta-ala),

hi, s

=

näyteliuoksen (5.2.2) sisäisen standardin piikin korkeus (pinta-ala),

cd, c

=

kalibrointiliuoksen (3.10) diklatsuriilipitoisuus, μg/ml,

m

=

näyte-erän paino (g),

V

=

5.2.2 kohdan mukaisesti valmistetun näyteuutteen tilavuus (25 ml),

p

=

diklatsuriilin nimellispitoisuus esiseoksessa, mg/kg.

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Analyytin tunnistaminen voidaan varmentaa yhteiskromatografialla tai käyttämällä diodirividetektoria, jolla verrataan näyteuutteen (5.2.1 tai 5.2.2) ja kalibrointiliuoksen (3.10) spektrejä.

7.1.1    Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen (5.2.1 tai 5.2.2) lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.10). Lisätyn diklatsuriilin määrän on oltava samaa suuruusluokkaa kuin näytteessä todettu diklatsuriilin määrä.

Ainoastaan diklatsuriilin ja sisäisen standardin piikit saavat kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä että uutteen laimentaminen. Piikin leveys puolivälissä piikin korkeutta on oltava ± 10 % sellaisen näyteuutteen alkuperäisen diklatsuriilipiikin tai sisäisen standardin piikin leveydestä, johon ei ole tehty lisäystä.

7.1.2    Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty mitattavaa ainetta, on oltava vähintään 80 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Laboratorioiden välisessä tutkimuksessa analysoitiin viisi näytettä 11 laboratoriossa. Näytteistä kaksi oli esiseoksia. Toiseen sekoitettiin orgaanista materiaalia (O 100) ja toiseen epäorgaanista materiaalia (A 100). Teoreettinen pitoisuus on 100 mg diklatsuriilia kilogrammassa. Näitä kolmea siipikarjan rehuseosta valmisti kolme eri valmistajaa (L1/Z1/K1) (NL). Teoreettinen pitoisuus on 1 mg diklatsuriilia kilogrammassa. Laboratorioita pyydettiin analysoimaan kukin näyte kerran tai kaksoismäärityksinä. (Tarkempia tietoja tästä laboratorioiden välisestä tutkimuksesta saa julkaisusta Journal of AOAC International, Volume 77, n:o 6, 1994, s. 1 359–1 361.) Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

yksittäisten arvojen lukumäärä

Sr

=

toistettavuuden keskihajonta

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin

SR

=

uusittavuuden keskihajonta

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin.

9.   Huomautukset

Diklatsuriilivasteen lineaarisuus on osoitettava etukäteen ao. konsentraatioalueilla.

G.   LASALOSID-NATRIUMIN MÄÄRITTÄMINEN

Streptomyces lasaliensis -bakteerin tuottama polyeetterimonokarboksyylihapon natriumsuola

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää lasalosid-natriumin pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. Toteamisraja on 5 mg/kg ja määritysraja 10 mg/kg.

2.   Periaate

Lasalosid-natrium uutetaan näytteestä happamoituun metanoliin ja määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) käyttäen spektrofluorimetridetektoria.

3.   Reagenssit

Laimennetaan 23,5 ml ortofosforihappoa (3.2) vedellä 100 ml:aan.

Liuotetaan 1,36 g kaliumdivetyfosfaattia (3.1) 500 ml:aan vettä (3.11), lisätään 3,5 ml ortofosforihappoa (3.2) ja 10,0 ml 6-metyyli-2-heptyyliamiinia (3.4). Säädetään pH ortofosforihappoliuoksen avulla arvoon 4,0 ja laimennetaan vedellä (3.11) 1 000 ml:aan.

Pipetoidaan 5,0 ml suolahappoa (3.6) 1 000 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.5) ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Sekoitetaan 5 ml fosfaattipuskuriliuosta (3.7) ja 95 ml metanolia (3.5).

Punnitaan 50 mg lasalosid-natriumia (3.10) 0,1 mg:n tarkkuudella 100 ml:n mittapulloon, liuotetaan happamoituun metanoliin (3.8), täytetään merkkiin asti samalla liuottimella ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava välittömästi ennen käyttöä.

Pipetoidaan 10,0 ml standardin kantaliuosta (3.10.1) 100 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti happamoidulla metanolilla (3.8) ja sekoitetaan. Tämä liuos on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Pipetoidaan 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 ja 10,0 ml standardin välimuotoliuosta (3.10.2) 50 ml:n mittapulloihin. Täytetään merkkiin asti happamoidulla metanolilla (3.8) ja sekoitetaan. Nämä liuokset vastaavat konsentraatioita 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 ja 10,0 μg/ml lasalosid-natriumia. Nämä liuokset on valmistettava aina juuri ennen käyttöä.

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Yleistä

5.1.1    Nollarehu

Saantokokeen (5.1.2) suorittamista varten analysoidaan nollanäyte, jotta varmistetaan, ettei se sisällä lasalosid-natriumia tai mittausta häiritseviä aineita. Nollanäytteen on oltava näytteen kaltainen, eikä siinä saa olla havaittavia määriä lasalosid-natriumia tai häiritseviä aineita.

5.1.2    Saantokoe

Saanto on määritettävä analysoimalla nollanäyte, johon on lisätty näytteen lasalosid-natriumia vastaava määrä lasalosid-natriumia. Jotta saadaan liuos, jossa on 100 mg/kg lasalosid-natriumia vastaava lisäys, siirretään 10,0 ml standardin kantaliuosta (3.10.1) 250 ml:n erlenmeyerkolviin ja haihdutetaan noin 0,5 ml:aan. Lisätään 50 g nollanäytettä, sekoitetaan huolellisesti, annetaan tasoittua 10 minuuttia sekoittaen useita kertoja ennen uuttovaiheeseen siirtymistä (5.2).

Jos saatavilla ei ole näytteen kaltaista nollanäytettä (katso 5.1.1), voidaan saantokoe suorittaa vaihtoehtoisesti standardinlisäysmenetelmällä. Tällöin analysoitavaan näytteeseen lisätään näytteiden jo sisältämää määrää vastaava määrä lasalosid-natriumia. Tämä näyte analysoidaan yhdessä varsinaisen näytteen kanssa, ja saanto voidaan laskea vähennyslaskulla.

5.2   Uutto

5.2.1    Rehut

Punnitaan 5–10 g näytettä 0,01 gramman tarkkuudella 250 ml:n tulpalliseen erlenmeyerkolviin. Lisätään pipetillä 100,0 ml happamoitua metanolia (3.8). Suljetaan löyhästi tulpalla ja sekoitetaan kunnes näyte on liuennut. Asetetaan pullo noin 40-asteiseen ultraäänihauteeseen (4.1) 20 minuutiksi, otetaan pois ja jäähdytetään huoneenlämpöiseksi. Annetaan laskeutua noin tunnin ajan ja suodatetaan määräosa 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.2) läpi sopivaan astiaan. Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.2.2    Esiseokset

Punnitaan 2 g jauhamatonta esiseosta 0,001 gramman tarkkuudella 250 ml:n mittapulloon. Lisätään 100,0 ml happamoitua metanolia (3.8) ja sekoitetaan kunnes esiseos on liuennut. Laitetaan pullo sisältöineen noin 40-asteiseen ultraäänihauteeseen (4.1) 20 minuutiksi, otetaan pois ja jäähdytetään huoneenlämpöiseksi. Täytetään merkkiin asti happamoidulla metanolilla (3.8) ja sekoitetaan hyvin. Annetaan laskeutua tunnin ajan ja suodatetaan määräosa 0,45 μm:n kalvosuodattimen (4.2) läpi sopivaan astiaan. Laimennetaan sopiva määrä kirkasta suodosta happamoidulla metanolilla (3.8) siten, että lopullisessa koeliuoksessa on lasalosid-natriumia noin 4 μg/ml. Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.3   HPLC-määritys

5.3.1    Muuttujat

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia; ajo voidaan suorittaa muissa olosuhteissa, jos niillä saadaan samat tulokset:

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus tarkistetaan injektoimalla useita kertoja 4,0 μg/ml:n kalibrointiliuosta (3.10.3), kunnes piikkien korkeudet (tai pinta-alat) ja retentioajat pysyvät vakioina.

5.3.2    Kalibrointikäyrä

Injektoidaan kutakin kalibrointiliuosta (3.10.3) useita kertoja ja lasketaan kutakin konsentraatiota vastaavat piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä merkiten piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot y-akselille ja vastaavat konsentraatiot (μg/ml) x-akselille.

5.3.3    Näyteliuos

Injektoidaan 5.2.1 tai 5.2.2 kohdassa saatuja näyteuutteita useita kertoja käyttäen samaa tilavuutta kuin kalibrointiliuoksille ja määritetään lasalosid-natriumpiikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuosta (5.3.3) injektoimalla saatujen piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvosta määritetään lasalosid-natriumkonsentraatio (μg/ml) kalibrointikäyrän avulla.

6.1   Rehut

Näytteen lasalosid-natriumpitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

[mg/kg]

jossa:

c

=

näyteliuoksen (5.2.1) lasalosid-natriumkonsentraatio (μg/ml),

V1

=

5.2.1 kohdan mukaisesti valmistetun näyteuutteen tilavuus (ts. 100 ml),

m

=

näyte-erän paino (g).

6.2   Esiseokset

Näytteen lasalosid-natriumpitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

[mg/kg]

jossa:

c

=

näyteliuoksen (5.2.2) lasalosid-natriumkonsentraatio (μg/ml),

V2

=

5.2.2 kohdan mukaisesti valmistetun näyteuutteen tilavuus (ts. 250 ml),

f

=

5.2.2 kohdan mukainen laimennuskerroin,

m

=

näyte-erän paino (g).

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Spektrofluorimetriaan perustuvissa menetelmissä on vähemmän häiriömahdollisuuksia kuin UV-mittauksissa. Tutkittavan aineen tunnistaminen voidaan varmentaa yhteiskromatografialla.

7.1.1    Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen (5.2.1 tai 5.2.2) lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.10.3). Lisätyn lasalosid-natriummäärän on oltava suunnilleen sama kuin näyteliuoksesta määritetty lasalosid-natriummäärä. Ainoastaan lasalosid-natriumpiikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä lasalosid-natriumia että näyteliuoksen laimeneminen. Piikin leveyden tulisi olla puolikorkeudessa ± 10 % sellaisen näyteliuoksen piikin leveydestä, johon ei ole lisätty lasalosid-natriumia.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 80 %. Sellaisen esiseosnäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, saannon on oltava vähintään 90 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Laboratorioiden välinen vertailu ( *1 ) järjestettiin siten, että 12 laboratoriossa tutkittiin 2 esiseosta (näytteet 1 ja 2) ja 5 rehua (näytteet 3–7). Kukin näyte määritettiin kaksi kertaa. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa:

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

yksittäisten tulosten lukumäärä

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

sR

=

uusittavuuden keskihajonta

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin, %

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin, %.

---

LIITE V

REHUJEN SISÄLTÄMIEN HAITALLISTEN AINEIDEN VALVONNASSA KÄYTETTÄVÄT MÄÄRITYSMENETELMÄT

A.   VAPAAN GOSSYPOLIN JA KOKONAISGOSSYPOLIN MÄÄRITYS

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää vapaan gossypolin, kokonaisgossypolin ja niitä kemiallisesti lähellä olevien aineiden pitoisuus puuvillansiemenissä, puuvillansiemenjauhossa ja puuvillansiemenkakussa sekä näitä rehuaineita sisältävissä rehuseoksissa; vapaan gossypolin, kokonaisgossypolin ja niitä kemiallisesti lähellä olevien aineiden määrityksen alaraja on 20 mg/kg.

2.   Periaate

Gossypoli uutetaan 3-amino-1-propanolin läsnä ollessa joko isopropanolin ja heksaanin seoksella vapaan gossypolin määrittämiseksi tai dimetyyliformamidilla kokonaisgossypolin määrittämiseksi. Gossypoli muutetaan aniliinilla gossypolidianiliiniksi, jonka optinen tiheys mitataan 440 nm:ssä.

3.   Reagenssit

Gossypolin standardiliuokset A ja B säilyvät 24 tuntia valolta suojattuina.

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1    Näyte

Punnitusmäärä riippuu näytteen oletetusta gossypolipitoisuudesta. On suositeltavaa käyttää pientä punnitusmäärää ja suhteellisen suurta suodosmäärää, jotta gossypolin määrä saataisiin riittävän suureksi tarkan spektrofotometrisen mittauksen suorittamiseen. Näyte ei saa olla suurempi kuin 1 g määritettäessä vapaan gossypolin pitoisuutta puuvillansiemenistä, puuvillansiemenjauhosta tai puuvillansiemenkakusta; jos määritys tapahtuu rehuseoksesta, näytekoko voi olla jopa 5 g. Useimmissa tapauksissa riittää 10 ml suodosta; suodoksen pitää sisältää 50–100 μg gossypolia. Kokonaisgossypolin määrittämiseen punnitusmäärän pitää olla 0,5 –5 g siten, että 2 ml:n määrä suodosta sisältää 40–200 μg gossypolia.

Määritys on suoritettava noin 20 oC:n huoneenlämmössä.

5.2    Vapaan gossypolin määritys

Sopiva määrä näytettä punnitaan hiokselliseen, lasitulpalla suljettavaan 250 ml:n keittokolviin, jonka pohjalla on lasimurskaa. Lisätään pipetillä kolviin 50 ml liuotinseosta A (3.2), suljetaan kolvi tulpalla ja sekoitetaan yhden tunnin ajan sekoittajassa. Suodatetaan kuivan suodattimen läpi pieneen, hiokselliseen kolviin. Suodatinsuppilo peitetään kellonlasilla suodatuksen ajaksi.

Pipetoidaan kahteen 25 ml:n mittapulloon (A ja B) sama määrä suodosta, joka sisältää 50–100 μg gossypolia. Tarvittaessa täytetään 10 ml:aan liuotinseoksella A (3.2). Tämän jälkeen mittapullo (A) täytetään merkkiin asti isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1). Tätä liuosta käytetään referenssiliuoksena näyteliuoksen mittauksessa.

Pipetoidaan 10 ml liuotinseosta A (3.2) kahteen 25 ml:n mittapulloon (C ja D). Toinen mittapullo (C) täytetään merkkiin asti isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1). Tätä liuosta käytetään referenssiliuoksena nollakoeliuoksen mittauksessa.

Pipetoidaan mittapulloihin D ja B 2 ml aniliiniliuosta (3.4). Lämmitetään 30 minuutin ajan kiehuvalla vesihauteella värin kehittymiseksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin asti isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä yhden tunnin ajan.

Mitataan nollakoeliuoksen (D) optinen tiheys spektrometrillä 440 nm:ssä 1 cm:n lasikyvetissä vertailuliuosta (C) vastaan, ja näyteliuoksen (B) optinen tiheys vertailuliuosta (A) vastaan.

Nollakoeliuoksen optinen tiheys vähennetään näyteliuoksen optisesta tiheydestä (= korjattu optinen tiheys). Tästä arvosta lasketaan vapaan gossypolin pitoisuus 6 kohdassa kuvatulla tavalla.

5.3    Kokonaisgossypolin määritys

Näytemäärä, joka sisältää 1–5 mg gossypolia, punnitaan 50 ml:n mittapulloon ja siihen lisätään 10 ml liuotinseosta B (3.3). Samanaikaisesti valmistetaan nollakoeliuos pipetoimalla 10 ml liuotinseosta B (3.3) toiseen 50 ml:n mittapulloon. Molemmat mittapullot asetetaan kiehuvalle vesihauteelle 30 minuutin ajaksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön ja täytetään merkkiin asti isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1). Homogenoidaan ja annetaan seistä 10–15 minuuttia, suodatetaan hioksellisiin pulloihin.

Sekä suodatettua näyteliuosta että suodatettua nollakoeliuosta pipetoidaan 2 ml 25 ml:n mittapulloihin. Toinen näyteliuosta ja toinen nollakoeliuosta sisältävä mittapullo täytetään merkkiin asti isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1). Näitä liuoksia käytetään vertailuliuoksina.

Jäljelle jääneisiin kahteen mittapulloon lisätään 2 ml aniliiniliuosta (3.4). Lämmitetään 30 minuutin ajan kiehuvalla vesihauteella värin kehittymiseksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään 25 ml:aan isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä yhden tunnin ajan.

Optinen tiheys mitataan 5.2 kohdan mukaisesti kuten vapaan gossypolin optinen tiheys. Tästä arvosta lasketaan kokonaisgossypolipitoisuus 6 kohdassa esitetyllä tavalla.

6.   Tulosten laskeminen

Tulokset voidaan laskea joko optista ominaistiheyttä (6.1) tai kalibrointikäyrää (6.2) käyttäen.

6.1    Optinen ominaistiheys

Optinen ominaistiheys on annetuissa olosuhteissa seuraava:

Näytteen vapaan gossypolin tai kokonaisgossypolin pitoisuus lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

E

=

korjattu optinen tiheys määritettynä 5.2 kohdan mukaisesti,

p

=

punnittu näytemäärä grammoina,

a

=

suodosmäärä millilitroina.

6.2    Kalibrointikäyrän avulla

6.2.1    Vapaa gossypoli

Valmistetaan kaksi viiden 25 ml:n mittapullon sarjaa. Molempiin mittapullosarjoihin pipetoidaan 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 ja 10,0 ml gossypolistandardiliuosta A (3.5). Täytetään 10 ml:aan liuotinseoksella A (3.2). Molempiin sarjoihin otetaan mukaan 25 ml:n mittapullo, joka sisältää vain 10 ml liuotinseosta A (3.2) (nollakoe).

Toinen sarja mittapulloja (myös nollakokeessa käytettävä pullo) täytetään 25 ml:aan isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1) (vertailusarja).

Toiseen mittapullosarjaan (myös nollakokeeseen) lisätään 2 ml aniliiniliuosta (3.4). Lämmitetään 30 minuutin ajan kiehuvalla vesihauteella värin kehittymiseksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin asti isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä yhden tunnin ajan (standardisarja).

Mitataan 5.2 kohdassa mainituissa olosuhteissa standardisarjan liuosten optinen tiheys vertailusarjan vastaavia liuoksia vastaan. Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä vastaavia gossypolimääriä (mikrogrammoina) esittävä kuvaaja.

6.2.2    Kokonaisgossypoli

Valmistetaan kuuden 50 ml:n mittapullon sarja. Ensimmäiseen mittapulloon pipetoidaan 10 ml liuotinseosta B (3.3) ja muihin 2,0 ; 4,0 ; 6,0 ; 8,0 ja 10,0 ml gossypolistandardiliuosta B (3.6). Pullojen tilavuus säädetään 10 ml:ksi liuotinseoksella B (3.3). Lämmitetään kiehuvalla vesihauteella 30 minuuttia. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin asti isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1) ja homogenoidaan.

Kuhunkin kahden sarjan kuuteen 25 ml:n mittapulloon pipetoidaan 2,0 ml tätä liuosta. Ensimmäisen sarjan pullot täytetään 25 ml:ksi isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1) (vertailusarja).

Kuhunkin toisen sarjan mittapulloon lisätään 2 ml aniliiniliuosta (3.4). Lämmitetään kiehuvalla vesihauteella 30 minuuttia. Annetaan jäähtyä huoneenlämpöön, täytetään merkkiin asti isopropanoli-heksaaniseoksella (3.1), homogenoidaan ja annetaan seistä yhden tunnin ajan (standardisarja).

Mitataan 5.2 kohdassa mainituissa olosuhteissa standardisarjan liuosten optinen tiheys vertailusarjan vastaavia liuoksia vastaan. Kalibrointikäyrä laaditaan piirtämällä optisia tiheyksiä ja näitä vastaavia gossypolimääriä (mikrogrammoina) esittävä kuvaaja.

6.3    Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin

▼M6

B.   DIOKSIINIEN (PCDD/PCDF) JA PCB-YHDISTEIDEN PITOISUUKSIEN MÄÄRITTÄMINEN

I LUKU

Näytteenottomenetelmät ja määritystulosten tulkinta

1.    Soveltamisala ja määritelmät

Rehussa olevien polykloorattujen dibentso-para-dioksiinien (PCDD-yhdisteiden), polykloorattujen dibentsofuraanien (PCDF-yhdisteiden), dioksiinien kaltaisten polykloorattujen bifenyylien (PCB-yhdisteiden) ( 16 ) ja muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien viralliseen tarkastukseen tarkoitetut näytteet on otettava liitteessä I vahvistettujen säännösten mukaisesti. Rehuun tasaisesti jakautuneiden aineiden tai tuotteiden valvontaan on sovellettava liitteessä I olevassa 5.1 kohdassa vahvistettuja määrää koskevia vaatimuksia. Tällä tavoin saatujen kokoomanäytteiden katsotaan edustavan eriä tai osaeriä, joista ne on otettu. Laboratorionäytteistä määritettyjen pitoisuuksien perusteella arvioidaan, noudattavatko tutkittavat erät niitä enimmäismääriä, jotka on vahvistettu direktiivissä 2002/32/EY.

Tässä B osassa sovelletaan komission päätöksen 2002/657/EY ( 17 ) liitteessä I vahvistettuja määritelmiä.

Kyseisten määritelmien lisäksi tässä B osassa sovelletaan seuraavia määritelmiä:

2.    Erän tai osaerän enimmäismäärää koskevien vaatimusten mukaisuus

2.1    Muut kuin dioksiinien kaltaiset PCB-yhdisteet

Erä tai osaerä on enimmäismäärän mukainen, jos PCB 28:n, PCB 52:n, PCB 101:n, PCB 138:n, PCB 153:n ja PCB 180:n, jäljempänä ”muut kuin dioksiinien kaltaiset PCB-yhdisteet”, summaa koskeva määritystulos ei ylitä direktiivissä 2002/32/EY vahvistettua enimmäismäärää, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus ( 18 ). Erä tai osaerä ei ole direktiivissä 2002/32/EY vahvistetun enimmäismäärän ( 19 ) mukainen, jos rinnakkaismäärityksellä ( 20 ) saatujen kahden suurimman määritystuloksen keskiarvo ylittää enimmäismäärän selvästi, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus, toisin sanoen vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta, josta on vähennetty laajennettu mittausepävarmuus.

Laajennettu mittausepävarmuus lasketaan käyttäen kattavuuskerrointa 2, jolloin luotettavuustaso on noin 95 prosenttia. Erä tai osaerä ei ole vaatimustenmukainen, jos mitattujen arvojen keskiarvo, josta on vähennetty keskiarvon laajennettu mittausepävarmuus, ylittää enimmäismäärän.

Edellä tässä kohdassa mainittuja sääntöjä sovelletaan virallista valvontaa varten otettujen näytteiden määritystuloksiin. Suoja- ja riitojenratkaisutoimenpiteitä varten suoritettaviin määrityksiin sovelletaan kansallisia sääntöjä.

2.2    PCDD/PCDF-yhdisteet ja dioksiinien kaltaiset PCB-yhdisteet

Erä tai osaerä on enimmäismäärän mukainen, jos tulos yhdestä analyysistä,

Seulontamääritysten osalta on vahvistettava cut-off-arvo sen määrittämiseksi, noudattaako näyte niitä enimmäismääriä, jotka on vahvistettu joko PCDD/PCDF-yhdisteille tai PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summalle.

Erä tai osaerä ei ole direktiivissä 2002/32/EY vahvistetun enimmäismäärän mukainen, jos varmistusmenetelmää käyttäen rinnakkaismäärityksellä ( 21 ) saatujen kahden suurimman ( 22 ) määritystuloksen keskiarvo ylittää enimmäismäärän selvästi, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus, toisin sanoen vaatimustenmukaisuuden arvioinnissa käytetään määritettyä pitoisuutta, josta on vähennetty laajennettu mittausepävarmuus.

Laajennettu mittausepävarmuus lasketaan käyttäen kattavuuskerrointa 2, jolloin luotettavuustaso on noin 95 prosenttia. Erä tai osaerä ei ole vaatimustenmukainen, jos mitattujen arvojen keskiarvo, josta on vähennetty keskiarvon laajennettu mittausepävarmuus, ylittää enimmäismäärän.

PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden erillisten määritystulosten yhteenlaskettua arvioitua laajennettua epävarmuutta on käytettävä PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien summana.

Edellä tässä kohdassa mainittuja sääntöjä sovelletaan virallista valvontaa varten otettujen näytteiden määritystuloksiin. Suoja- ja riitojenratkaisutoimenpiteitä varten suoritettaviin määrityksiin sovelletaan kansallisia sääntöjä.

3.    Tulokset, jotka ylittävät Direktiivin 2002/32/EY Liitteessä II vahvistetut toimintarajat

Toimintarajojen avulla voidaan valita näytteet niissä tapauksissa, joissa on tarpeen tunnistaa saastumisen lähde ja toteuttaa toimia sen vähentämiseksi tai poistamiseksi. Seulontamenetelmillä määritetään tarkoituksenmukaiset cut-off-arvot näiden näytteiden valitsemiseksi. Jos lähteen tunnistamiseksi ja saastumisen vähentämiseksi tai poistamiseksi tarvitaan huomattavia ponnistuksia, toimintarajan ylittyminen on aiheellista vahvistaa rinnakkaismäärityksellä käyttäen varmistusmenetelmää ja ottaen huomioon laajennettu mittausepävarmuus ( 23 ).

II LUKU

Näytteiden valmistus ja vaatimukset, jotka rehussa olevien dioksiinien (PCDD/PCDF) ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien virallisessa valvonnassa käytettyjen määritysmenetelmien on täytettävä

1.    Soveltamisala

Tässä luvussa vahvistettuja vaatimuksia on sovellettava analysoitaessa rehua 2,3,7,8-substituoitujen polykloorattujen dibentso-para-dioksiinien (PCDD:t) ja polykloorattujen dibentsofuraanien (PCDF:t) ja dioksiinien kaltaisten polykloorattujen bifenyylien (dioksiinien kaltaiset PCB:t) pitoisuuksien virallista valvontaa varten ja kun on kyse näytteiden valmistuksesta ja määritysvaatimuksista muita sääntelytarkoituksia varten, mihin kuuluu myös rehualan toimijan suorittama valvonta Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 183/2005 ( 24 ) säännösten mukaisuuden varmistamiseksi.

PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden esiintymistä rehussa voidaan valvoa kahdella erityyppisellä määritysmenetelmällä:

2.    Tausta

TEQ-pitoisuudet lasketaan siten, että tietyssä näytteessä olevien yksittäisten aineiden pitoisuudet kerrotaan kunkin aineen toksisuusekvivalenssikertoimella (TEF) (ks. alaviite 1 luvussa I) ja saadut määrät lasketaan yhteen, jolloin tulokseksi saadaan dioksiinien kaltaisten yhdisteiden kokonaispitoisuus toksisuusekvivalentteina ilmaistuna.

Tässä B osassa yksittäisen kongeneerin hyväksytyllä määritysrajalla tarkoitetaan matalinta analyytin pitoisuutta, joka voidaan mitata kohtuullisella tilastollisella varmuudella ja joka täyttää tunnistamista koskevat kriteerit, jotka on kuvattu kansainvälisesti tunnustetuissa standardeissa, esimerkiksi standardissa EN 16215:2012 (Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS) ja/tai tarkistetuissa EPA-menetelmissä 1613 ja 1668.

Yksittäisen kongeneerin hyväksytty määritysraja voi olla

Bioanalyyttisillä seulontamenetelmillä ei saada tuloksia kongeneeritasolla, vaan ainoastaan viite ( 25 ) TEQ-tasosta BEQ-arvona ilmaistuna sen vuoksi, että kaikki testivasteen tuottavassa näyteuutteessa olevat yhdisteet eivät täytä kaikkia TEQ-periaatteen vaatimuksia.

Seulonta- ja varmistusmenetelmiä voidaan käyttää tietyn matriisin tarkastuksessa ainoastaan, jos menetelmät ovat riittävät herkkiä ja kykenevät luotettavasti havaitsemaan määrät toimintarajalla tai enimmäismäärällä.

3.    Laadunvarmistusta koskevat vaatimukset

3.1	On toimittava ristikontaminaation välttämiseksi kussakin näytteenoton ja analyysin vaiheessa.

3.2

Näytteet on varastoitava ja kuljetettava varastointiin soveltuvissa lasista, alumiinista, polypropyleenistä tai polyetyleenistä valmistetuissa säiliöissä, jotka eivät vaikuta PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksiin näytteissä. Paperipölyjäämät on poistettava näytesäiliöstä.

3.3	Näytteiden varastointi ja kuljetus on järjestettävä niin, että rehunäyte pysyy koskemattomana.

3.4	Jokainen laboratorionäyte jauhetaan tarvittaessa hienoksi ja sekoitetaan huolellisesti käyttäen menetelmää, jonka on osoitettu homogenoivan näytteen täydellisesti (esim. hienonnus 1 mm:n siivilän läpäiseviksi hiukkasiksi). Liian kosteat näytteet on kuivattava ennen hienontamista.

3.5	Reagenssit, lasitavarat ja laitteet on tarkistettava sen varalta, että ne voivat osaltaan vaikuttaa TEQ- ja BEQ-arvoihin perustuviin tuloksiin.

3.6	On suoritettava ilman näytettä tehtävä nolla-analyysi, jossa käydään läpi kaikki analyysin vaiheet.

3.7

Bioanalyyttisten menetelmien osalta määrityksessä käytettävät lasitavarat ja liuottimet on testattava sen toteamiseksi, ettei niissä ole yhdisteitä, jotka voivat häiritä kohdeyhdisteiden havaitsemista mittausalueella. Lasitavarat on huuhdeltava liuottimilla tai kuumennettava lämpötiloihin, jotka soveltuvat PCDD/PCDF-yhdisteiden, dioksiinien kaltaisten yhdisteiden ja lasitavaroiden pinnalta peräisin olevien häiriöitä aiheuttavien yhdisteiden poistamiseen.

3.8	Uuttamisessa käytettävän näytteen määrän on oltava riittävä, jotta täytetään vaatimukset, jotka koskevat riittävän matalaa mittausaluetta, joka käsittää enimmäismäärien tai toimintarajojen suuruiset pitoisuudet.

3.9	Tarkasteltavien tuotteiden yhteydessä käytettäviin näytteiden valmistusmenetelmiin on sovellettava kansainvälisesti hyväksyttyjä suuntaviivoja.

4.    Laboratorioita koskevat vaatimukset

4.1

Asetuksen (EY) N:o 882/2004 säännösten mukaisesti laboratorioiden on oltava ISO-oppaan 58 mukaisesti toimivan tunnustetun laitoksen hyväksymiä, millä varmistetaan, että laboratoriot soveltavat analyyttistä laadunvarmistusta. Laboratorioiden hyväksyntä on tehtävä EN ISO/IEC 17025 -standardin mukaisesti. Tarvittaessa on noudatettava asiakirjassa ”Technical Guidelines for the estimation of measurement uncertainty and limits of quantification for PCDD/F and PCB analysis” kuvattuja periaatteita ( 26 ).

4.2	Laboratorion pätevyys osoitetaan sen osallistumisella jatkuvasti hyvin tuloksin laboratorioiden välisiin tutkimuksiin, jotka koskevat PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden määrittämistä asianmukaisissa rehumatriiseissa ja pitoisuusalueilla.

4.3	Seulontamenetelmiä näytteiden rutiinitarkastuksissa käyttävien laboratorioiden on tehtävä tiivistä yhteistyötä varmistusmenetelmää käyttävien laboratorioiden kanssa laadunvalvonnan ja vaatimustenvastaisiksi epäiltyjen näytteiden määritystuloksen varmistuksen osalta.

5.    Perusvaatimukset dioksiinien (PCDD/PCDF) ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden määritysmenettelylle

5.1    Matala mittausalue ja määritysrajat

Koska osa PCDD/PCDF-yhdisteistä on erittäin toksisia, ne on pystyttävä havaitsemaan jo femtogrammoina (10–15 g) ilmaistavan alueen ylemmillä arvoilla. Useimpien PCB-kongeneerien osalta määritysrajaksi riittää nanogrammoina (10–9 g) ilmaistava alue. Toksisempien dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden (erityisesti non-orto-substituoitujen yhdisteiden) mittauksessa mittausalueen ala-arvojen on oltava pikogrammoina (10–12 g) ilmaistavan alueen alimpia arvoja. Kaikkien muiden PCB-yhdisteiden osalta määritysrajaksi riittää nanogrammoina (10–9 g) ilmaistava alue.

5.2    Hyvä selektiivisyys (spesifisyys)

5.2.1

PCDD/PCDF-yhdisteet sekä dioksiinien kaltaiset PCB-yhdisteet on voitava erottaa lukuisista muista uuttamisessa mukana tulevista ja mahdollisesti häiriöitä aiheuttavista yhdisteistä, joiden pitoisuudet voivat olla moninkertaisia verrattuna tarkasteltavien analyyttien pitoisuuksiin. GC-MS-menetelmissä on pystyttävä erottelemaan eri kongeneerit, kuten toksiset kongeneerit (esim. seitsemäntoista 2,3,7,8-substituoitua PCDD/PCDF-yhdistettä ja kaksitoista dioksiinien kaltaista PCB-yhdistettä) muista kongeneereista.

5.2.2

Bioanalyyttisten menetelmien on kyettävä havaitsemaan kohdeyhdisteet PCDD/PCDF-yhdisteiden ja/tai dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summana. Näytteen puhdistamisella pyritään poistamaan yhdisteet, jotka voivat aiheuttaa vääriä vaatimustenvastaisia tuloksia, tai yhdisteet, jotka voivat heikentää vastetta ja johtaa vääriin vaatimustenmukaisiin tuloksiin.

5.3    Hyvä tarkkuus (oikeellisuus ja täsmällisyys, biotestin korjattu saanto)

5.3.1

GC-MS-menetelmien osalta määrityksessä on pystyttävä antamaan pätevä arvio aineen todellisesta pitoisuudesta näytteessä. Hyvä tarkkuus on välttämätön, jotta voidaan välttää näytteen määritystuloksen hylkääminen sen perusteella, että määritetyn TEQ-arvon luotettavuus on heikko. Tarkkuus ilmaistaan oikeellisuutena (sertifioidusta materiaalista mitatun tutkittavan aineen määrän keskiarvon ja sertifioidun arvon erotus prosentteina tästä arvosta) ja täsmällisyytenä (RSDR on uusittavissa olosuhteissa saaduista tuloksista laskettu suhteellinen standardipoikkeama).

5.3.2

Bioanalyyttisten menetelmien osalta on määritettävä biotestin korjattu saanto. Biotestin korjatulla saannolla tarkoitetaan BEQ-arvoa, joka on laskettu TCDD:n tai PCB 126:n kalibrointikäyrästä korjattuna nollanäytteelle ja sen jälkeen jaettu varmistusmenetelmällä määritetyllä TEQ-arvolla. Sillä pyritään korjaamaan sellaisia tekijöitä kuin PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten yhdisteiden hävikkiä uuttamis- ja puhdistusvaiheissa, sellaisten mukana uuttuneiden yhdisteiden vaikutusta, jotka voivat voimistaa tai heikentää vastetta (agonistiset ja antagonistiset vaikutukset), käyrän sovituksen laatua tai TEF-arvojen ja suhteellisen voimakkuuden (REP) arvojen välisiä eroja. Biotestin korjattu saanto lasketaan soveltuvista vertailunäytteistä, joissa on edustava kongeneerijakauma lähellä merkittävänä pidettyä tasoa olevissa pitoisuuksissa.

5.4    Validointi enimmäispitoisuusalueella ja yleiset laadunvalvontatoimet

5.4.1

Laboratorioiden on osoitettava menetelmän suorituskyky enimmäispitoisuuksilla, esimerkiksi 0,5 ×, 1 × ja 2 × enimmäismäärä, ja rinnakkaismittausten hajonnan on oltava hyväksyttävä validointimenettelyn ja rutiinianalyysin aikana.

5.4.2

Sisäistä laadunvalvontaa varten on analysoitava säännöllisesti nollanäytteitä ja näytteitä, joihin on lisätty analyyttiä, tai kontrollinäytteitä (mieluiten sertifioiduilla vertailuaineilla, jos niitä on saatavilla). Nollanäytteiden, näytteiden, joihin on lisätty analyyttiä, tai kontrollinäytteiden tulokset on kirjattava laadunvalvontakortteihin. Tulosten avulla on varmistettava, että määritysmenetelmien suorituskyky täyttää vaatimukset.

5.5    Määritysraja

5.5.1

Määritysrajan (LOQ) vahvistaminen ei ole bioanalyyttisessä seulontamenetelmässä välttämätöntä, mutta menetelmällä on pystyttävä erottamaan toisistaan nolla- ja cut-off-arvo. BEQ-arvon ilmoittamista varten on vahvistettava raportointipitoisuus, jotta voidaan käsitellä näytteitä, joiden vaste alittaa tätä pitoisuutta vastaavan vasteen. On osoitettava, että raportointipitoisuus eroaa vähintään kertoimella kolme sellaisen nollanäytteen pitoisuudesta, jonka vaste on mittausalueen alarajan alapuolella. Siksi se lasketaan näytteistä, jotka sisältävät kohdeyhdisteitä noin vaaditun vähimmäispitoisuuden verran, eikä signaali-kohinasuhteesta tai nollamäärityksestä.

5.5.2

Varmistusmenetelmän määritysrajan (LOQ) on oltava noin yksi viidesosa enimmäismäärästä.

5.6    Analyyttiset vaatimukset

Varmistus- tai seulontamenetelmistä saatujen luotettavien tulosten osalta TEQ- tai BEQ-arvon on täytettävä seuraavat vaatimukset enimmäismäärillä, määritettiin ne sitten TEQ-kokonaisarvoina tai BEQ-kokonaisarvoina (eli PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summana) tai erikseen PCDD/PCDF-yhdisteille ja dioksiinien kaltaisille PCB-yhdisteille:

5.7    Seulontamenetelmiä koskevat erityisvaatimukset

5.7.1

Seulontaan voidaan käyttää sekä GC-MS-menetelmiä että bioanalyyttisiä menetelmiä. GC-MS-menetelmien on täytettävä 6 kohdassa esitetyt vaatimukset. Solupohjaisten bioanalyyttisten menetelmien erityisvaatimukset esitetään 7 kohdassa.

5.7.2

Seulontamenetelmiä näytteiden rutiinitarkastuksissa käyttävien laboratorioiden on tehtävä tiivistä yhteistyötä varmistusmenetelmää käyttävien laboratorioiden kanssa.

5.7.3

Seulontamenetelmän suorituskyky on tarkistettava rutiinianalyysin aikana analyyttisellä laadunvalvonnalla ja menetelmän jatkuvalla validoinnilla. Vaatimustenmukaisia tuloksia on valvottava jatkuvalla ohjelmalla.

5.7.4

Soluvasteen mahdollinen vaimentuminen ja sytotoksisuus on tarkistettava: Rutiiniseurannassa 20 prosenttia näyteuutteista mitataan sekä siten, että niihin on lisätty enimmäismäärää tai toimintarajaa vastaava pitoisuus 2,3,7,8-TCDD-yhdistettä, että lisäämättä kyseistä yhdistettä, millä tarkistetaan, vaimentavatko näyteuutteessa olevat häiritsevät yhdisteet mahdollisesti määritysmenetelmän vastetta. Mitattua lisäysnäytteen pitoisuutta verrataan sellaisen näytteen pitoisuuden, johon ei ole lisätty analyyttiä, ja lisätyn pitoisuuden summaan. Jos tämä mitattu pitoisuus on enemmän kuin 25 prosenttia matalampi kuin laskettu pitoisuuksien summa, se on indikaatio mahdollisesta signaalin vaimentumisesta, jolloin kyseiselle näytteelle on tehtävä GC-HRMS-varmistusanalyysi. Tuloksia seurataan laadunvalvontakorteilla.

5.7.5

Vaatimustenmukaisten näytteiden laadunvalvonta: Noin 2–10 prosenttia vaatimustenmukaisista näytteistä on varmistettava GC-HRMS-analyysillä näytematriisista ja laboratoriosta saadun kokemuksen mukaan.

5.7.6

Väärien vaatimustenmukaisten näytteiden osuuden määrittäminen laadunvalvontatiedoista: Enimmäismäärän tai toimintarajan ylittävien ja alittavien väärien vaatimustenmukaisten tulosten osuus näytteiden seulonnassa on määritettävä. Todellisten väärien vaatimustenmukaisten tulosten osuuden on oltava alle 5 prosenttia. Kun vaatimustenmukaisten näytteiden laadunvalvonnasta on saatavissa vähintään 20 vahvistettua tulosta matriisia tai matriisiryhmää kohti, väärien vaatimustenmukaisten näytteiden osuutta koskevat johtopäätökset on tehtävä kyseisestä tietokannasta. Väärien vaatimustenmukaisten näytteiden osuuden arviointia varten tarvittavaan 20 tuloksen vähimmäismäärään voidaan sisällyttää myös vertailutesteissä tai kontaminaatiotapausten yhteydessä analysoitujen näytteiden ne tulokset, joissa pitoisuudet ovat enimmillään esim. 2 × enimmäismäärä. Näytteiden on katettava eri näytelähteitä edustavat yleisimmät kongeneerijakaumat. Vaikka seulontamäärityksissä on mieluiten pyrittävä havaitsemaan toimintarajan ylittävät näytteet, väärien vaatimustenmukaisten näytteiden osuuden määrittämisen kriteerinä on enimmäistaso, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus varmistusmenetelmässä.

5.7.7

Seulonnan mahdollisesti vaatimustenvastaiset tulokset on aina tarkistettava tekemällä alkuperäisestä näytteestä täydellinen uusi analyysi varmistusmenetelmällä. Näitä näytteitä voidaan myös käyttää väärien vaatimustenvastaisten tulosten osuuden arvioimiseen. Seulontamenetelmien osalta väärien vaatimustenvastaisten tulosten osuuden muodostavat ne tulokset, joiden on varmistusmenetelmällä vahvistettu olevan vaatimustenmukaisia, vaikka edeltävän seulonnan perusteella näytteen on ilmoitettu olevan mahdollisesti vaatimustenvastainen. Seulontamenetelmän hyötyjen arvioinnin on perustuttava siihen, että väärien vaatimustenvastaisten näytteiden määrää verrataan tarkistettujen näytteiden kokonaismäärään. Tämän osuuden pitää olla niin pieni, että seulontavälineen käytöstä on hyötyä.

5.7.8

Bioanalyyttisten menetelmien on validointiolosuhteissa tuotettava pätevä indikaatio TEQ-tasosta, laskettuna ja ilmaistuna BEQ-arvona. Bioanalyyttisten menetelmien laboratorionsisäisen RSDr:n tulisi toistetuissa olosuhteissa tyypillisesti olla pienempi kuin uusittavuus RSDR.

6.    Seulonnassa tai varmistuksessa käytettäviä GC-MS-menetelmiä koskevat erityisvaatimukset

6.1    WHO-TEQ-tulosten suurimman ja pienimmän arvon hyväksyttävät erot

Enimmäismäärän tai tarvittaessa toimintarajojen ylityksen varmistuksessa suurimman ja pienimmän arvon ero saa olla enintään 20 prosenttia.

6.2    Saantojen valvonta

6.2.1

Määritysmenetelmän validoimiseksi on aivan menetelmän alussa eli esimerkiksi ennen uuttamista lisättävä 13C-leimattuja 2,3,7,8-kloorisubstituoituja sisäisiä PCDD/PCDF-standardeja ja 13C-leimattuja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden sisäisiä standardeja. On lisättävä vähintään yhtä kongeneeria kutakin tetra–oktakloorattua PCDD/PCDF-homologiryhmää kohden ja vähintään yhtä kongeneeria kutakin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden homologiryhmää kohden (tai vaihtoehtoisesti vähintään yhtä kongeneeria kutakin PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden valvonnassa käytettyä massaspektrometrillä määritettyä ionia kohden). Varmistusmenetelmien yhteydessä on käytettävä kaikkia 17:ää 13C-leimattua 2,3,7,8-kloorisubstituoitua sisäistä PCDD/PCDF-standardia ja kaikkia 12:ta 13C-leimattua dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden sisäistä standardia.

6.2.2

Suhteelliset vastekertoimet on asianmukaista kalibrointiliuosta käyttäen määritettävä myös niille kongeneereille, joiden osalta ei lisätä 13C-leimattua analogia.

6.2.3

Kasviperäisistä rehuista ja alle 10 prosenttia rasvaa sisältävistä eläinperäisistä rehuista otettuihin näytteisiin on lisättävä sisäiset standardit ennen uuttamista. Yli 10 prosenttia rasvaa sisältävistä eläinperäisistä rehuista otettuihin näytteisiin ne on lisättävä joko ennen uuttamista tai rasvojen uuttamisen jälkeen. Uuttamisen tehokkuus on validoitava asianmukaisesti sen mukaan, missä vaiheessa sisäiset standardit lisätään.

6.2.4

Ennen GC-MS-analyysia on lisättävä 1 tai 2 saantostandardia.

6.2.5

Saantojen valvonta on välttämätöntä. Varmistusmenetelmissä yksittäisten sisäisten standardien saantojen on oltava 60–120 prosenttia. Yksittäisten kongeneerien pienemmät tai suuremmat saantoarvot voidaan hyväksyä erityisesti joidenkin hepta- ja oktakloorattujen dibentso-para-dioksiinien ja dibentsofuraanien osalta edellyttäen, että niiden vaikutus TEQ-arvoon on enintään 10 prosenttia TEQ-arvon kokonaismäärästä (perustana PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summa). GC-MS-seulontamenetelmissä saantojen on oltava 30–140 prosenttia.

6.3    Häiritsevien aineiden poistaminen

6.4    Kalibrointi standardikäyrän avulla

Kalibrointikäyrän vaihteluvälin laajuuden on oltava riittävä kattaakseen enimmäismäärien tai toimintarajojen relevantin vaihteluvälin.

6.5    Varmistusmenetelmiä koskevat erityisvaatimukset

7.    Bioanalyyttisia menetelmiä koskevat erityisvaatimukset

Bioanalyyttiset menetelmät ovat menetelmiä, jotka perustuvat biologisiin periaatteisiin, esimerkiksi solupohjaiset määritykset, reseptorimääritykset tai immunomääritykset. Tässä 7 kohdassa vahvistetaan bioanalyyttisia menetelmiä koskevat yleiset vaatimukset.

Seulontamenetelmän perusteella periaatteessa luokitellaan, onko näyte vaatimusten mukainen vai epäilläänkö, ettei se täytä vaatimuksia. Laskettua BEQ-arvoa verrataan tätä varten cut-off-arvoon (ks. 7.3 kohta). Jos näytteen arvo on alle cut-off-arvon, sitä pidetään vaatimustenmukaisena. Jos näytteen arvo on yhtä suuri tai suurempi kuin raja-arvo, näytteen epäillään olevan vaatimusten vastainen, ja sille on tehtävä analyysi varmistusmenetelmällä. Käytännössä cut-off-arvona voidaan pitää BEQ-arvoa, joka on kaksi kolmasosaa enimmäismäärästä, edellyttäen, että väärien vaatimustenmukaisten tulosten osuus jää alle 5 prosentin ja että väärien vaatimustenvastaisten tulosten osuus on hyväksyttävä. Koska PCDD/PCDF-yhdisteillä sekä PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summalla on erilliset enimmäismäärät, näytteiden vaatimustenmukaisuuden tarkistaminen ilman fraktiointitislausta edellyttää, että PCDD/PCDF-yhdisteillä on tarkoituksenmukaiset cut-off-arvot biotestejä varten. Toimintarajat ylittävien näytteiden tarkastuksen yhteydessä cut-off-arvoksi soveltuu tarkoituksenmukainen prosenttiosuus kustakin toimintarajasta.

Jos indikatiivinen määrä on ilmaistu BEQ-arvona, näytteiden on sisällyttävä mittausalueelle ja ylitettävä raportointiraja (ks. 7.1.1 ja 7.1.6 kohta).

7.1    Testivasteen arviointi

7.1.1    Yleiset vaatimukset

7.1.2    Kalibrointi

7.1.2.1   Kalibrointi standardikäyrän avulla

7.1.2.2   Kalibrointi vertailunäytteiden avulla

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kalibrointikäyrää, joka on tuotettu vähintään neljän vertailunäytteen avulla (ks. 7.2.4 kohta): yksi matriisinolla ja kolme vertailunäytettä, joiden pitoisuudet ovat 0,5 ×, 1 × ja 2 × enimmäismäärä tai toimintaraja, jolloin nollanäytettä ja saantoa ei tarvitse korjata, jos vertailunäytteiden matriisin ominaisuudet ovat samat kuin tuntemattomien näytteiden. Tällöin testivaste, joka vastaa kaksi kolmasosaa enimmäismäärästä (ks. 7.3 kohta), voidaan laskea suoraan näistä näytteistä ja sitä voidaan käyttää cut-off-arvona. Toimintarajat ylittävien näytteiden tarkastuksen yhteydessä cut-off-arvoksi soveltuu tarkoituksenmukainen prosenttiosuus kustakin toimintarajasta.

7.1.3    PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden erillinen määrittäminen

Uutteet voidaan jakaa PCDD/PCDF-yhdisteitä ja dioksiinien kaltaisia PCB-yhdisteitä sisältäviin fraktioihin, jotta PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden TEQ-arvot (BEQ:ina) voidaan ilmoittaa erillisinä. Dioksiinien kaltaisia PCB-yhdisteitä sisältävän fraktion tulosten arvioinnissa olisi käytettävä PCB 126:n standardilla tuotettua kalibrointikäyrää.

7.1.4    Biotestien korjatut saannot

”Biotestin korjattu saanto” on laskettava soveltuvista vertailunäytteistä, joissa kongeneerijakauma on lähellä enimmäismäärää tai toimintarajaa, ja se ilmaistaan prosenttiosuutena BEQ-arvosta verrattuna TEQ-arvoon. Sen mukaan, minkä tyyppistä testiä ja TEF-arvoa ( 27 ) käytetään, dioksiinien kaltaisiin PCB-yhdisteisiin sovellettavien TEF- ja REP-kertoimien väliset erot voivat johtaa siihen, että dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden korjatut saannot ovat matalia PCDD/PCDF-yhdisteisiin verrattuna. Jos PCDD/PCDF-yhdisteille ja dioksiinien kaltaisille PCB-yhdisteille tehdään erillinen määritys, biotestien korjatut saannot ovat sen vuoksi seuraavat: dioksiinien kaltaisille PCB-yhdisteille 20–60 prosenttia ja PCDD/PCDF-yhdisteille 50–130 prosenttia (vaihteluvälejä sovelletaan TCDD:n kalibrointikäyrään). Koska dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden vaikutus PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summaan voi vaihdella eri matriisien ja näytteiden välillä, biotestin korjatut saannot PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summan osalta heijastavat näitä vaihteluvälejä ja niiden on oltava 30–130 prosenttia. Jos unionin lainsäädännössä ilmenee merkittävästi muutettuja PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden TEF-arvoja, kyseiset vaihteluvälit on tarkistettava.

7.1.5    Saantojen valvonta puhdistusta varten

Yhdisteiden hävikki puhdistuksen aikana on tarkistettava validoinnin yhteydessä. Nollanäyte, johon on lisätty eri kongeneerien seosta, on puhdistettava (vähintään n = 3), ja saanto ja vaihtelevuus on tarkistettava varmistusmenetelmällä. Saannon on oltava 60–120 prosenttia etenkin niiden yhdisteiden osalta, joiden vaikutus eri seosten TEQ-arvoon on enemmän kuin 10 prosenttia.

7.1.6    Raportointiraja

BEQ-arvoista raportoimista varten on määritettävä raportointiraja relevanttien matriisinäytteiden perusteella, joilla on tyypillinen kongeneerijakauma, mutta ei standardien kalibrointikäyrän perusteella, koska käyrän ala-arvojen tarkkuus ei ole riittävä. Uuttamisen ja puhdistuksen vaikutukset on otettava huomioon. Raportointiraja on asetettava nollanäytettä korkeammaksi soveltamalla vähintään kerrointa kolme.

7.2    Vertailunäytteiden käyttö

7.2.1

Vertailunäytteiden on edustettava näytematriisia, kongeneerijakaumia ja pitoisuusalueita PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden osalta lähellä enimmäismäärää tai toimintarajaa olevilla pitoisuuksilla.

7.2.2

Kuhunkin testisarjaan on sisällytettävä matriisinolla tai, jos se ei ole mahdollista, nollanäyte sekä viitenäyte, jonka pitoisuus vastaa enimmäismäärää tai toimintarajaa. Nämä näytteet on uutettava ja testattava samanaikaisesti identtisissä oloissa. Vertailunäytteen vasteen on oltava selvästi kohonnut verrattuna nollanäytteeseen, jotta testin soveltuvuus olisi taattu. Tällaisia näytteitä voidaan käyttää nolla- ja saantokorjauksiin.

7.2.3

Saantokorjauksen suorittamiseen valittujen vertailunäytteiden on edustettava testinäytteitä, eli näytteiden kongeneerijakaumat eivät saa johtaa määrien aliarvioimiseen.

7.2.4

Lisäksi voidaan käyttää esimerkiksi 0,5- ja 2-kertaista enimmäismäärää tai toimintarajaa edustavia ylimääräisiä vertailunäytteitä, joilla osoitetaan testin toimivuus halutulla mittausalueella enimmäismäärän tai toimintarajan valvontaa varten. Yhdessä näitä näytteitä voidaan käyttää testinäytteiden BEQ-arvojen laskemiseen (ks. 7.1.2.2 kohta).

7.3    Cut-off-arvojen määrittäminen

BEQ-arvoina ilmaistujen bioanalyyttisten tulosten ja TEQ-arvoina ilmaistujen varmistusmenetelmän tulosten välinen suhde on määritettävä esimerkiksi kalibroinnilla, jossa vertailunäytteisiin, joissa on samanlainen matriisi, on lisätty analyyttiä 0 ×, 0,5 ×, 1 × ja 2 × enimmäismäärä, ja jossa kukin näyte määritetään 6 kertaa (n = 24). Korjauskertoimet (nolla ja saanto) voidaan arvioida tämän suhteen perusteella, mutta ne on tarkistettava 7.2.2 kohdan mukaisesti.

Cut-off-arvot on määritettävä sen arvioimiseksi, vastaako näyte enimmäismääriä koskevia vaatimuksia, tai tarvittaessa toimintarajojen valvontaa varten, ja vastaavat enimmäismäärät tai toimintarajat on vahvistettava joko erikseen PCDD/PCDF-yhdisteille ja dioksiinien kaltaisille PCB-yhdisteille taikka PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summalle. Niitä edustaa bioanalyyttisten tulosten jakauman alempi piste (korjattuna nollanäytteelle ja saannolle), joka vastaa varmistusmenetelmän päätösrajaa 95 prosentin luottamusrajalla, mikä tarkoittaa, että väärien vaatimustenmukaisten tulosten osuus on < 5 prosenttia ja RSDR < 25 prosenttia. Varmistusmenetelmän päätösraja on sama kuin enimmäismäärä, kun otetaan huomioon laajennettu mittausepävarmuus.

Cut-off-arvo (BEQ-arvona ilmaistuna) voidaan laskea 7.3.1, 7.3.2 tai 7.3.3 kohdassa esitetyn mallin avulla. (Katso kuvio 1.)

7.3.1

Kun käytetään 95 prosentin ennustevälin alempaa kaistaa varmistusmenetelmän päätösrajalla jossa BEQDL varmistusmenetelmän päätösrajaa vastaava BEQ, joka vastaa enimmäismäärää laajennettu mittausepävarmuus huomioon ottaen sy,x jäännöksen keskihajonta t α,f = m-2 Studentin kerroin** (α = 5 %, f = vapausasteet, yksipuoliset) m kalibrointipisteiden kokonaismäärä (indeksi j) n toistojen lukumäärä kullakin tasolla xi näytteen pitoisuus (TEQ-arvona) kalibrointipisteessä i varmistusmenetelmällä määritettynä kaikkien kalibrointinäytteiden pitoisuuksien keskiarvo (TEQ-arvona) neliösummamuuttuja, i = kalibrointipisteen i indeksi

7.3.2

Laskeminen (nollan ja saannon suhteen korjatuista) bioanalyyttisistä tuloksista, kun on analysoitu useita näytteitä (n ≥ 6), jotka on kontaminoitu varmistusmenetelmän päätösrajalla, joka on mittaustulosten jakauman alempi piste vastaavalla BEQ:n keskiarvolla: Cut-off-arvo = BEQDL – 1,64 × SDR jossa SDR biologisten määritystulosten keskihajonta kohdassa BEQDL, mitattuna laboratorionsisäisissä uusittavuusoloissa

7.3.3

Laskeminen bioanalyyttisten tulosten keskiarvona (BEQ-arvona, korjattuna nollan ja saannon suhteen), kun on analysoitu useita näytteitä (n ≥ 6), jotka on kontaminoitu tasolla kaksi kolmasosaa enimmäismäärästä tai toimintarajasta. Tämä perustuu havaintoon siitä, että kyseinen pitoisuus on 7.3.1 tai 7.3.2 kohdan mukaan määritetyn cut-off-arvon lähistöllä: 95 prosentin luottamustasoon perustuva cut-off-arvon laskenta, mikä tarkoittaa, että väärien vaatimustenmukaisten tulosten osuus on < 5 prosenttia ja RSDR < 25 prosenttia: 1)  kun käytetään 95 prosentin ennustevälin alempaa kaistaa varmistusmenetelmän päätösrajalla. 2)  kun on analysoitu useita näytteitä (n ≥ 6), jotka on kontaminoitu varmistusmenetelmän päätösrajalla, joka on mittaustulosten jakauman alempi piste (jota kuvassa esittää kellonmuotoinen käyrä) vastaavalla BEQ:n keskiarvolla. Kuva 1

7.3.4

Cut-off-arvoja koskevat rajoitukset BEQ-arvoihin perustuvat cut-off-arvot, jotka on laskettu validoinnin aikana saadusta RSDR-arvosta käyttämällä rajallista määrää näytteitä, joiden matriisit ja/tai kongeneerijakaumat ovat erilaisia, saattavat olla korkeammat kuin TEQ-arvoihin perustuvat enimmäismäärät tai toimintarajat, koska tarkkuus on tällöin parempi kuin rutiinitesteissä, kun mahdollisten kongeneerijakaumien tuntematon spektri on tarkastettava. Tällöin cut-off-arvot on laskettava siten, että RSDR = 25 prosenttia, tai mieluiten on käytettävä kaksi kolmasosaa enimmäismäärästä tai toimintarajasta.

7.4    Suorituskykyä koskevat tiedot

7.4.1

Koska bioanalyyttisissä menetelmissä ei voida käyttää sisäisiä standardeja, bioanalyyttisten menetelmien toistettavuus on testattava, jotta saadaan tietoja yksittäisen koesarjan sisäisestä ja koesarjojen välisestä keskihajonnasta. Toistettavuuden on oltava alle 20 prosenttia ja laboratorionsisäisen uusittavuuden on oltava alle 25 prosenttia. Tämän on perustuttava BEQ-arvona ilmaistuihin laskettuihin määriin nolla- ja saantokorjauksen jälkeen.

7.4.2

Validointiprosessin yhteydessä on osoitettava, että testillä pystytään erottamaan toisistaan nolla- ja cut-off-arvo, jolloin vastaavan cut-off-arvon ylittävät näytteet voidaan tunnistaa (ks. 7.1.2 kohta).

7.4.3

On määriteltävä kohdeyhdisteet, mahdolliset häiriöt sekä suurimmat hyväksyttävät nollatasot.

7.4.4

Vasteen tai vasteesta lasketun pitoisuuden (mahdollista ainoastaan mittausalueella) prosentuaalinen keskihajonta kunkin näyteuutteen kolminkertaisessa määrityksessä saa olla enintään 15 prosenttia.

7.4.5

BEQ-arvoina ilmaistuja vertailunäytte(id)en korjaamattomia tuloksia (nollanäyte ja enimmäistasolla tai toimintarajalla) käytetään bioanalyyttisen menetelmän suorituskyvyn arviointiin vakiomittaisella ajanjaksolla.

7.4.6

Nollanäytteille ja kullekin vertailunäytetyypille on luotava laadunvalvontakortit, jotka on tarkastettava. Näin varmistetaan, että analyyttinen suorituskyky vastaa vaatimuksia. Tämä koskee etenkin nollanäytteiden ja mittausalueen ala-arvojen välistä vähimmäiseroa ja vertailunäytteiden laboratorionsisäistä uusittavuutta. Nollanäytteet on tarkastettava huolellisesti, jotta vältetään väärät vaatimustenmukaiset tulokset vähentämisen yhteydessä.

7.4.7

Vaatimustenvastaisiksi epäillyille näytteille ja 2–10 prosentille vaatimustenmukaisista näytteistä (vähintään 20 näytettä matriisia kohden) tehtyjen varmistusmenetelmien tulokset on koottava, ja niitä on käytettävä seulontamenetelmän suorituskyvyn ja BEQ-arvon ja TEQ-arvon välisen suhteen arvioimisessa. Tätä tietokantaa voidaan hyödyntää rutiininäytteisiin sovellettavien cut-off-arvojen uudelleen arvioinnissa validoitujen matriisien osalta.

7.4.8

Menetelmän hyvä suorituskyky voidaan osoittaa myös osallistumalla vertailutesteihin. Jos laboratorio kykenee osoittamaan hyvän suorituskykynsä, vertailutesteissä analysoitujen näytteiden tulokset, joissa pitoisuudet ovat enimmillään esim. 2 × enimmäismäärä, voidaan sisällyttää väärien vaatimustenmukaisten näytteiden osuuden arviointiin. Näytteiden on katettava eri näytelähteitä edustavat yleisimmät kongeneerijakaumat.

7.4.9

Kontaminaatiotapauksissa cut-off-arvot voidaan arvioida uudelleen ottaen huomioon näytematriisi ja tapauksessa esiintyneet kongeneerijakaumat.

8.    Tulosten raportointi

8.1    Varmistusmenetelmät

8.1.1

Määritystuloksiin on sisällyttävä yksittäisten PCDD/PCDFF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuudet ja TEQ-arvot on ilmoitettava pienimpinä, suurimpina ja väliarvoina, jotta tulosten raportointiin saadaan mukaan mahdollisimman paljon tietoja. Näin tuloksia pystytään tulkitsemaan kulloistenkin vaatimusten mukaisesti.

8.1.2

Raportissa on myös ilmoitettava PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden uuttamisessa käytetty menetelmä.

8.1.3

Yksittäisten sisäisten standardien saantotiedot on ilmoitettava, jos saantojen arvot ovat 6.2.5 kohdassa mainitun alueen ulkopuolella tai jos enimmäismäärä ylittyy (tällöin on ilmoitettava jommankumman rinnakkaismäärityksen saantotiedot). Muissa tapauksissa ne on toimitettava pyydettäessä.

8.1.4

Koska laajennettu mittausepävarmuus on otettava huomioon päätettäessä näytteen vaatimustenmukaisuudesta, tiedot tästä muuttujasta on ilmoitettava. Siksi määritystulos on ilmoitettava muodossa x +/- U, jossa x on määritystulos ja U on laajennettu mittausepävarmuus, jossa käytetään kattavuuskerrointa 2, jolloin luotettavuustaso on noin 95 prosenttia. Jos PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuudet määritetään erikseen, PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden erillisten määritystulosten yhteenlaskettua arvioitua laajennettua epävarmuutta on käytettävä PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien summana.

8.1.5

Tulokset on ilmaistava samoina yksikköinä ja vähintään yhtä monen merkitsevän numeron tarkkuudella kuin direktiivillä 2002/32/EY vahvistetut enimmäismäärät.

8.2    Bioanalyyttiset seulontamenetelmät

8.2.1

Seulonnan tuloksen perusteella näytteen ilmoitetaan olevan ”vaatimustenmukainen” tai sen ”epäillään olevan vaatimustenvastainen”.

8.2.2

Lisäksi indikatiivinen tulos voidaan ilmaista PCDD/PCDF-yhdisteiden ja/tai dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden osalta BEQ-arvona eikä TEQ-arvona.

8.2.3

Jos näytteen vaste on raportointirajan alapuolella, näytteellä ilmoitetaan olevan ”raportointirajaa matalampi arvo”. Jos näytteen vaste on mittausalueen yläpuolella, näytteellä ilmoitetaan olevan ”mittausalueen ylittävä arvo” ja mittausalueen yläarvoa vastaava pitoisuus ilmaistaan BEQ-arvona.

8.2.4

Kunkin näytematriisityypin osalta raportissa on mainittava enimmäismäärä tai toimintaraja, johon arviointi perustuu.

8.2.5

Raportissa on mainittava käytetyn testin tyyppi, testin perusperiaate ja kalibrointimenetelmä.

8.2.6

Raportissa on myös ilmoitettava PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden uuttamisessa käytetty menetelmä.

8.2.7

Jos näytteiden epäillään olevan vaatimusten vastaisia, raporttiin on liitettävä selvitys toteutettavista toimenpiteistä. Jos näytteissä on merkittäviä PCDD/PCDF-pitoisuuksia sekä PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summan pitoisuuksia, kohonneet pitoisuudet on määritettävä tai vahvistettava varmistusmenetelmän avulla.

8.2.8

Vaatimustenvastaiset tulokset on ilmoitettava vain varmistusmäärityksestä.

8.3    Fysikaaliskemialliset seulontamenetelmät

8.3.1

Seulonnan tuloksen perusteella näytteen ilmoitetaan olevan ”vaatimustenmukainen” tai sen ”epäillään olevan vaatimustenvastainen”.

8.3.2

Kunkin näytematriisityypin osalta raportissa on mainittava enimmäismäärä tai toimintaraja, johon arviointi perustuu.

8.3.3

Lisäksi voidaan antaa yksittäisten PCDD/PCDF-kongeneerien ja /tai dioksiinien kaltaisten PCB-kongeneerien pitoisuudet ja TEQ-arvot ilmoitettuina pienimpinä, suurimpina ja väliarvoina. Tulokset on ilmaistava samoina yksikköinä ja vähintään yhtä monen merkitsevän numeron tarkkuudella kuin direktiivillä 2002/32/EY vahvistetut enimmäismäärät.

8.3.4

Yksittäisten sisäisten standardien saantotiedot on ilmoitettava, jos saantojen arvot ovat 6.2.5 kohdassa mainitun alueen ulkopuolella tai jos enimmäismäärä ylittyy (tällöin on ilmoitettava jommankumman rinnakkaismäärityksen saantotiedot). Muissa tapauksissa ne on toimitettava pyydettäessä.

8.3.5

Raportissa on mainittava sovellettu GC-MS-menetelmä.

8.3.6

Raportissa on myös ilmoitettava PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden uuttamisessa käytetty menetelmä.

8.3.7

Jos näytteiden epäillään olevan vaatimusten vastaisia, raporttiin on liitettävä selvitys toteutettavista toimenpiteistä. Jos näytteissä on merkittäviä PCDD/PCDF-pitoisuuksia sekä PCDD/PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summan pitoisuuksia, kohonneet pitoisuudet on määritettävä tai vahvistettava varmistusmenetelmän avulla.

8.3.8

Vaatimustenvastaisuus voidaan vahvistaa vasta varmistusmäärityksen jälkeen.

III LUKU

Näytteiden valmistus ja vaatimukset, jotka rehussa olevien muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden virallisessa valvonnassa käytettyjen määritysmenetelmien on täytettävä

1.    Soveltamisala

Tässä luvussa vahvistettuja vaatimuksia on sovellettava analysoitaessa rehua muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien virallista valvontaa varten ja kun on kyse näytteiden valmistuksesta ja määritysvaatimuksista muita sääntelytarkoituksia varten, mihin kuuluvat myös rehualan toimijan suorittamat tarkastukset asetuksen (EY) N:o 183/2005 säännösten mukaisuuden varmistamiseksi.

2.    Soveltuvat osoitusmenetelmät

Kaasukromatografia-elektronisieppausdetektio (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS tai vastaavat menetelmät.

3.    Tarkasteltavana olevien analyyttien tunnistus ja varmistus

3.1	Suhteellinen retentioaika verrattuna sisäisiin standardeihin tai vertailustandardeihin (hyväksyttävä poikkeama +/– 0,25 %).

3.2	Muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden erottaminen mittausta häiritsevistä aineista ja eritoten mukana eluoituvista PCB-yhdisteistä kaasukromatografian avulla, erityisesti jos näytteiden pitoisuudet ovat laillisissa rajoissa, ja vaatimustenvastaisuus on vahvistettava ( 28 ).

3.3

GC-MS-tekniikkaa koskevat vaatimukset Vähintään seuraavan molekyyli-ionien tai molekyyliklusterin tunnusomaisten ionien lukumäärän valvonta: a)  kaksi spesifistä ionia HRMS-menetelmässä, b)  kolme spesifistä ionia LRMS-menetelmässä, c)  kaksi spesifistä prekursori-ionia, joista kummallakin on yksi spesifinen vastaava siirtymätuoteioni, MS-MS-menetelmässä. Suurimmat sallitut toleranssit valikoitujen massafragmenttien määrien suhteille: Valikoitujen massafragmenttien määräsuhteen suhteellinen poikkeama teoreettisesta määrästä tai kohdeionin (runsaimmin esiintyvä mitattu ioni) ja sekundaaris(t)en ioni(e)n kalibrointistandardista: ± 15 prosenttia

3.4	GC-ECD-tekniikoita koskevat vaatimukset Enimmäismäärän ylittävät tulokset on varmistettava kahdella kaasukromatografikolonnilla, joiden stationäärifaasin polariteetti on erilainen.

4.    Menetelmän suorituskyvyn osoittaminen

Menetelmän suorituskyky on validoitava enimmäismäärän vaihteluvälillä (0,5–2 × enimmäismäärä), ja toistettujen mittausten variaatiokertoimen on oltava hyväksyttävä (ks. 9 kohta, kohtalaista tarkkuutta koskevat vaatimukset).

5.    Määritysraja

Muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden LOQ-arvojen summa ( 29 ) ei saa olla suurempi kuin kolmasosa enimmäismäärästä ( 30 ).

6.    Laadunvalvonta

Nollanäytteiden säännöllinen mittaus; sellaisten näytteiden analyysi, joihin on lisätty analyyttiä; laadunvalvontanäytteet; osallistuminen asianomaisia matriiseja koskeviin laboratorioiden välisiin tutkimuksiin.

7.    Saantojen valvonta

7.1	On käytettävä sopivia sisäisiä standardeja, joiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ovat vastaavat kuin tarkasteltavana olevilla analyyteillä.

7.2	Sisäisten standardien lisääminen: Lisääminen tuotteisiin (ennen uuttoa ja puhdistusta).

7.3

Vaatimukset menetelmille, joissa käytetään kaikkia kuutta isotooppileimattua muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden kongeneeria a)  tulokset on oikaistava sisäisten standardien saantojen suhteen, b)  isotooppileimattujen sisäisten standardien saantojen on oltava 60–120 prosenttia; c)  pienemmät tai suuremmat saannot voidaan hyväksyä yksittäisille kongeneereille, jos niiden osuus muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden yhteismäärästä on alle 10 prosenttia.

7.4

Vaatimukset menetelmille, joissa ei käytetä kaikkia kuutta isotooppileimattua sisäistä standardia tai muuta sisäistä standardia: a)  sisäisten standardien saannot on tarkastettava kaikista näytteistä, b)  sisäisten standardien saantojen on oltava 60–120 prosenttia; c)  tulokset on oikaistava sisäisten standardien saantojen suhteen.

7.5	Leimaamattomien kongeneerien saannot tarkastetaan sellaisten näytteiden avulla, joihin on lisätty analyyttiä, tai laadunvalvontanäytteiden avulla, joiden pitoisuudet ovat enimmäismäärän vaihteluvälillä. Näiden yhdisteiden hyväksyttävät saannot ovat 60–120 prosenttia.

8.    Laboratorioita koskevat vaatimukset

Asetuksen (EY) N:o 882/2004 säännösten mukaisesti laboratorioiden on oltava ISO-oppaan 58 mukaisesti toimivan tunnustetun laitoksen hyväksymiä, millä varmistetaan, että laboratoriot soveltavat analyyttistä laadunvarmistusta. Laboratorioiden hyväksyntä on tehtävä EN ISO/IEC 17025 -standardin mukaisesti. Lisäksi tarvittaessa on noudatettava asiakirjassa ”Technical Guidelines for the estimation of measurement uncertainty and limits of quantification for PCB analysis” kuvattuja periaatteita ( 31 ).

9.    Suorituskykyä koskevat tiedot: kriteerit, jotka koskevat muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden summaa enimmäismäärän tasolla

10.    Tulosten raportointi

10.1

Määritystuloksiin on sisällyttävä yksittäisten muiden kuin dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuudet ja kyseisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien summa on ilmoitettava pienimpinä, suurimpina ja väliarvoina, jotta tulosten raportointiin saadaan mukaan mahdollisimman paljon tietoja. Näin tuloksia pystytään tulkitsemaan kulloistenkin vaatimusten mukaisesti.

10.2	Raportissa on ilmoitettava PCB-yhdisteiden uuttamisessa käytetty menetelmä.

10.3	Yksittäisten sisäisten standardien saantotiedot on toimitettava, jos saantojen arvo on 7 kohdassa tarkoitetun alueen ulkopuolella tai jos enimmäismäärä ylittyy. Muissa tapauksissa ne on toimitettava pyydettäessä.

10.4

Koska laajennettu mittausepävarmuus on otettava huomioon päätettäessä näytteen vaatimustenmukaisuudesta, tiedot kyseisestä muuttujasta on myös ilmoitettava. Siksi määritystulos on ilmoitettava muodossa x +/- U, jossa x on määritystulos ja U on laajennettu mittausepävarmuus, jossa käytetään kattavuuskerrointa 2, jolloin luotettavuustaso on noin 95 prosenttia.

10.5	Tulokset on ilmaistava samoina yksikköinä ja vähintään yhtä monen merkitsevän numeron tarkkuudella kuin direktiivillä 2002/32/EY vahvistetut enimmäismäärät.

▼M2

---

LIITE VI

REHUJEN SISÄLTÄMIEN ELÄINPERÄISTEN AINESOSIEN MÄÄRITYSMENETELMÄT REHUJEN VIRALLISTA VALVONTAA VARTEN

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Rehujen eläinperäiset ainesosat olisi määritettävä valomikroskopialla tai polymeraasiketjureaktiolla (PCR) tässä liitteessä vahvistettujen säännösten mukaisesti.

Näillä kahdella menetelmällä on mahdollista havaita eläinperäisten ainesosien esiintyminen rehuaineissa ja rehuseoksissa. Niillä ei kuitenkaan ole mahdollista laskea kyseisten ainesosien määrää rehuaineissa ja rehuseoksissa. Kummankin menetelmän toteamisraja on alle 0,1 % (w/w).

PCR-menetelmän ansiosta rehuaineissa ja rehuseoksissa esiintyvien eläinperäisten ainesosien taksonominen ryhmä on mahdollista tunnistaa.

Näitä menetelmiä on käytettävä valvottaessa asetuksen (EY) N:o 999/2001 7 artiklan 1 kohdassa ja liitteessä IV sekä asetuksen (EY) N:o 1069/2009 11 artiklan 1 kohdassa säädettyjen kieltojen täytäntöönpanoa.

Näitä menetelmiä voidaan käyttää joko yksin tai yhdessä testattavasta rehutyypistä riippuen yhden operatiivisen protokollan puitteissa rehuissa esiintyvää eläinproteiinia käsittelevän EU:n vertailulaboratorion (EURL-AP) laatimien ja verkkosivuillaan julkaisemien toimintaohjeiden (Standard Operating Procedures, SOP) ( 32 ) mukaisesti.

2.   MENETELMÄT

2.1    Valomikroskopia

2.1.1    ►M7  Periaate

Määritettäväksi lähetetyissä rehuaineissa ja rehuseoksissa mahdollisesti esiintyvät eläinperäiset ainesosat tunnistetaan tyypillisten mikroskooppisesti tunnistettavissa olevien ominaisuuksien, kuten lihassäikeiden ja muiden lihan palojen, ruston, luiden, sarvien, karvojen, harjasten, veren, maidon rasvapallosten, laktoosikiteiden, höyhenten, munankuorten, kalanluiden ja suomujen, perusteella. ◄

2.1.2    Reagenssit ja laitteet

2.1.2.1   Reagenssit

2.1.2.1.1   Konsentrointireagenssi

2.1.2.1.1.1   Tetrakloorietyleeni (suhteellinen tiheys 1,62).

2.1.2.1.2   Värjäysreagenssi

2.1.2.1.2.1

Alitsariinipunaliuos (laimennetaan 2,5 ml:aa 1 M:n kloorivetyhappoa 100 ml:aan vettä ja lisätään liuokseen 200 mg alitsariinipunaista).

2.1.2.1.3   Kiinnitysreagenssit

2.1.2.1.3.1   Lipeä (NaOH 2,5 % w/v tai KOH 2,5 % w/v).

2.1.2.1.3.2    ►M7  Glyseroli (laimentamaton, viskositeetti: 1 490 cP) tai kiinnitysreagenssi, jolla on muun kuin kestopreparaatin valmisteluun soveltuvat ominaisuudet. ◄

2.1.2.1.3.3   Norland ® Optical Adhesive 65 (viskositeetti: 1 200 cP) tai hartsi, jolla on kestopreparaatin valmistukseen soveltuvat ominaisuudet.

2.1.2.1.4   Kiinnitysreagenssit, joilla on värjäysominaisuuksia

2.1.2.1.4.1

Lugolin liuos (2 g kaliumjodidia liuotetaan 100 ml:aan vettä ja lisätään 1 g jodia ja sekoitetaan useita kertoja).

2.1.2.1.4.2

Kystiinireagenssi (2 g lyijyasetaattia, 10 g NaOH/100 ml vettä).

2.1.2.1.4.3

Fehlingin liuos (valmistetaan ennen käyttöä kahdesta samansuuruisesta osasta (1/1) varastoliuosta A ja B. Liuos A: liuotetaan 6,9 g:aa kupari(II)sulfaattipentahydraattia 100 ml:aan vettä. Liuos B: liuotetaan 34,6 g:aa kaliumnatriumtartraattitetrahydraattia ja 12 g:aa NaOH:ta 100 ml:aan vettä).

2.1.2.1.4.4

Tetrametyylibentsidiini/vetyperoksidi (liuotetaan 1 g 3,3’,5,5’-tetrametyylibentsidiiniä (TMB) 100 ml:aan jääetikkaa ja 150 ml:aan vettä. Ennen käyttöä 4 osaa TMB-liuosta sekoitetaan yhteen osaan 3-prosenttista vetyperoksidia.

2.1.2.1.5   Pesureagenssit

2.1.2.1.5.1   Etanoli ≥ 96 % (tekninen laatu).

2.1.2.1.5.2   Asetoni (tekninen laatu).

2.1.2.1.6   Värinpoistoreagenssi

2.1.2.1.6.1   Kaupallinen natriumhypokloriittiliuos (9–14 % aktiivista klooria).

2.1.2.2   Laitteet

2.1.2.2.1   Analyysivaaka, tarkkuus 0,001 g.

2.1.2.2.2    ►M7  Jauhamisvälineet: veitsimylly tai roottorimylly. Jos käytetään roottorimyllyä, kielletään seulat, jotka ovat ≤ 0,5 mm. ◄

2.1.2.2.3    ►M7  Seulat, joissa on neliönmuotoiset reiät, silmäkoko 0,25 mm ja 1 mm. Näytteen esiseulontaa lukuun ottamatta seulojen halkaisija ei saisi olla suurempi kuin 10 cm, jotta aineksia ei katoa. Seuloja ei tarvitse kalibroida. ◄

2.1.2.2.4

Kartiomainen erotussuppilo, lasia, 250 ml, jonka pohjalla on teflon- tai lasihioshana sulkutulppana. Sulkutulpan halkaisijan on oltava avattuna ≥ 4 mm. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kartiopohjaista selkeytysastiaa, jos laboratorio on osoittanut, että toteamisrajat ovat vastaavia kuin lasista kartionmuotoista erotussuppiloa käytettäessä. Erotussuppilo

2.1.2.2.5

Stereomikroskooppi, jonka suurennusväli on ainakin 6,5×–40×.

2.1.2.2.6

Läpivalaisumikroskooppi, jonka suurennusväli on vähintään 100×–400×. Lisäksi voidaan käyttää polarisoitua valomikroskopiaa ja differentiaali-interferenssikontrastimikroskopiaa.

2.1.2.2.7

Tavanomaiset laboratorion lasiastiat

2.1.2.2.8

Objektilasien valmisteluvälineet: tavalliset objektilasit, objektilasit, joissa on syvennys, peitelasit (20 × 20 mm), pinsetit, ohut spaatteli.

▼M7

2.1.2.2.9

Laboratoriouuni

2.1.2.2.10

Sentrifugi

2.1.2.2.11

Suodatinpaperi: Kvalitatiivinen selluloosasuodatin (huokoskoko 4–11 μm)

▼M2

2.1.3    Näytteenotto ja näytteiden valmistelu

2.1.3.1    ►M7  Näytteenotto

Käytetään tämän asetuksen liitteen I säännösten mukaisesti otettua edustavaa näytettä. ◄

2.1.3.2   Varotoimenpiteet

Ristikontaminaation välttämiseksi laboratoriossa kaikki uudelleenkäytettävät välineet on puhdistettava huolellisesti ennen käyttöä. Erotussuppilon osat on irrotettava ennen puhdistusta. Erotussuppilon osat ja lasiastiat on esipestävä käsin ja sen jälkeen pestävä astianpesukoneessa. Seulat on puhdistettava jäykkäharjaksisella synteettisellä harjalla. Rasvaisten ainesten, kuten kalajauhon, seulonnan jälkeen suositetaan, että seulat puhdistetaan asetonilla ja paineilmalla.

2.1.3.3   Muiden kuin rasva- tai öljynäytteiden esikäsittely

2.1.3.3.1

►M7  Näytteen kuivaus: Näytteet, joiden kosteuspitoisuus on > 14 %, on kuivattava ennen tämän asetuksen liitteen III mukaista käsittelyä. ◄

2.1.3.3.2

►M7  Näytteen esiseulonta: Jotta rehussa olevista mahdollisista ympäristön epäpuhtauksista saadaan tietoa, suositetaan, että pelletoitu rehu ja jyvät esiseulotaan seulalla, jonka silmäkoko on 1 mm, ja saadut kaksi fraktiota, joita on pidettävä erillisinä näytteinä, valmistetaan ja määritetään erikseen ja niistä raportoidaan erikseen. ◄

2.1.3.3.3

Osanäytteen otto ja jauhaminen: Osanäytteeksi otetaan vähintään 50 g näytteestä ja jauhetaan.

2.1.3.3.4

Sedimentin uutto ja valmistus: 10 g:n annos (0,01 g:n tarkkuudella) jauhettua osanäytettä siirretään erotussuppiloon tai kartiopohjaiseen selkeytysastiaan, minkä jälkeen siihen lisätään 50 ml tetrakloorietyleeniä. Erotussuppiloon siirrettävä annos saa olla enintään 3 g, jos kyseessä on kalajauho tai muu puhtaasti eläintuote, kivennäisainesosa tai esiseos, joka tuottaa yli 10 prosenttia sedimenttiä. Seosta ravistetaan voimakkaasti ainakin 30 sekuntia, minkä jälkeen siihen lisätään varovasti vähintään 50 ml tetrakloorietyleeniä samalla kun suppilon sisäpinta pestään siihen mahdollisten tarttuneiden partikkelien poistamiseksi. Saadun seoksen annetaan laskeutua astian pohjalle vähintään viisi minuuttia, minkä jälkeen sedimentti erotetaan avaamalla sulkutulppa. Jos käytetään kartiopohjasta selkeytysastiaa, seosta sekoitetaan voimakkaasti vähintään 15 sekunnin ajan ja mahdolliset astian seinämien sisäpintaan tarttuneet partikkelit pestään huolellisesti pois vähintään 10 ml:lla puhdasta tetrakloorietyleeniä. Seoksen annetaan laskeutua kolmen minuutin ajan, minkä jälkeen sitä sekoitetaan taas 15 sekunnin ajan ja mahdolliset astian seinämien sisäpintaan tarttuneet partikkelit pestään huolellisesti pois vähintään 10 ml:lla puhdasta tetrakloorietyleeniä. Saadun seoksen annetaan laskeutua vähintään 5 minuutin ajan, minkä jälkeen nestemäinen fraktio poistetaan ja heitetään pois huolellisesti dekantoimalla samalla kun huolehditaan siitä, ettei sedimenttiä menetetä. ▼M7 Sedimentti kerätään suppiloon asetettuun suodatinpaperiin, jotta jäljelle jäävä tetrakloorietyleeni voidaan erottaa ja samalla välttää rasvan laskeutuminen sedimenttiin. Sedimentti kuivataan. Sedimentaatiovaiheen tarkastamiseksi on sen jälkeen suositeltavaa punnita sedimentti (0,001 gramman tarkkuudella). Lopuksi sedimentti seulotaan seulalla, jonka silmäkoko on 0,25 mm, ja saadut kaksi fraktiota tutkitaan, paitsi jos seulontaa ei pidetä tarpeellisena. ▼M2

2.1.3.3.5

Näytteen kelluvan osan, flotaatin, erottaminen ja esikäsittely: Edellä kuvatulla menetelmällä tehdyn sedimentin talteenoton jälkeen erotussuppiloon pitäisi jäädä kaksi osaa: tetrakloorietyleenistä koostuva nestemäinen osa ja kelluvasta aineksesta muodostuva kiinteä osa. Tätä kiinteää osaa kutsutaan flotaatiksi, ja se otetaan talteen avaamalla suppilon tulppa ja kaatamalla tetrakloorietyleeni pois. Erotussuppilo käännetään ylösalaisin ja flotaatti siirretään suureen petrimaljaan ja kuivataan ilmassa vetokaapissa. Jos yli viisi prosenttia flotaatista koostuu partikkeleista, jotka ovat > 0,50 mm, se seulotaan seulalla, jonka silmäkoko on 0,25 mm, ja saadut kaksi fraktiota tutkitaan.

2.1.3.3.6

Raaka-aineen esikäsittely: Valmistetaan vähintään 5 g:n annos jauhettua osanäytettä. Jos yli viisi prosenttia aineksesta koostuu partikkeleista, jotka ovat > 0,50 mm, se seulotaan 0,25 mm:n seulalla ja saadut kaksi fraktiota tutkitaan.

2.1.3.4   Rasvasta tai öljystä koostuvien näytteiden esikäsittely

Rasvasta tai öljystä koostuvien näytteiden esikäsittelyssä on noudatettava seuraavaa menettelyä:

2.1.3.5   Värjäysreagenssien käyttö

Eläinperäisten ainesosien oikean tunnistamisen helpottamiseksi laboratorio voi käyttää näytteen valmistelussa värjäysreagensseja EURL-AP:n laatimien ja verkkosivuillaan julkaisemien ohjeiden mukaisesti.

Jos sedimentin värjäämiseen käytetään alitsariinipunaliuosta, noudatetaan seuraavaa menettelyä:

2.1.4    Mikroskooppitutkimus

2.1.4.1   Objektilasin valmistelu

▼M7

Objektilasit valmistellaan sedimentistä ja laboratorion valinnan mukaan joko flotaatista tai raaka-aineesta.

▼M2

Objektilaseja on valmisteltava riittävä määrä sen varmistamiseksi, että 2.1.4.2 kohdassa säädettyä tutkimusprotokollaa voidaan noudattaa kokonaisuudessaan.

Objektilaseilla on käytettävä riittävästi kiinnitysreagenssia EURL-AP:n laatimien ja verkkosivuillaan julkaisemien toimintaohjeiden mukaisesti. Objektilaseilla käytetään peitinlaseja.

▼M7

2.1.4.2   Vuokaaviot rehuseosten ja rehuaineiden sisältämien eläimestä peräisin olevien partikkelien havaitsemiseksi

Valmisteltuja objektilaseja on tutkittava mikroskoopilla noudattaen kaavioissa 1 ja 2 esitettyjä vuokaavioita.

Mikroskooppitutkimus suoritetaan läpivalaisumikroskoopilla tutkimalla sedimenttiä ja laboratorion valinnan mukaan flotaattia tai raaka-ainetta. Karkeita fraktioita voidaan läpivalaisumikroskoopin lisäksi tutkia stereomikroskoopilla. Jokainen objektilasi tutkitaan läpikotaisin eri suurennuksilla. Tarkat selitykset vuokaavioiden käytöstä annetaan EURL-AP:n laatimissa ja verkkosivuillaan julkaisemissa SOP-toimintaohjeissa (Standard Operating Procedures).

Vuokaavion kussakin vaiheessa havainnoitavien objektilasien vähimmäismäärää on noudatettava tarkasti, paitsi jos määrättyä objektilasimäärää ei ole mahdollista saavuttaa fraktioaineksen koon vuoksi, esimerkiksi jos sedimenttiä ei saada. Partikkelien määrän kirjaamiseen saa käyttää enintään kuusi objektilasia määritystä kohti.

Valmisteltaessa lisäobjektilaseja joko flotaatista tai raaka-aineesta käyttäen 2.1.2.1.4 kohdassa tarkoitettuja erityisiä kiinnitysreagensseja, joilla on värjäysominaisuuksia, kun pyritään saamaan lisää tietoa sellaisista rakenteista (kuten sulat, karva, lihas tai veripartikkelit), jotka on havaittu 2.1.2.1.3 kohdassa tarkoitetuilla muilla kiinnitysreagensseilla valmistelluilla objektilaseilla, partikkelien määrä lasketaan määritystä kohti käytettävien objektilasien määrän perusteella, joka voi olla enintään kuusi, mukaan lukien lisäobjektilasit, joissa käytetään erityistä kiinnitysreagenssia.

Jotta partikkelien tyyppi ja alkuperä olisi helpompi tunnistaa, laboratorio voi käyttää apuvälineitä, esimerkiksi päätöksentekoa tukevia järjestelmiä, kuvakirjastoja ja vertailunäytteitä.

Kaavio 1
Vuokaavio rehuseosten ja rehuaineiden sisältämien eläimestä peräisin olevien partikkelien havaitsemiseksi ensimmäisessä määrityksessä
(D1 ja D2 viittaavat ensimmäiseen ja toiseen määritykseen; *: maalla elävät selkärankaiset, kalat)

Kaavio 2
”Vuokaavio rehuseosten ja rehuaineiden sisältämien eläimestä peräisin olevien partikkelien havaitsemiseksi toisessa määrityksessä
(D1 ja D2 viittaavat ensimmäiseen ja toiseen määritykseen; *: maalla elävät selkärankaiset, kalat)

▼M2

2.1.4.3    ►M7  Määritysten lukumäärä

Määritykset on tehtävä erilaisista 50 gramman osanäytteistä.

Jos kaaviossa 1 vahvistetun vuokaavion mukaisesti suoritetun ensimmäisen määrityksen jälkeen ei havaita eläinperäisiä partikkeleita, lisämääritys ei ole tarpeen, ja määrityksen tulos raportoidaan 2.1.5.1 kohdassa vahvistettua terminologiaa käyttäen.

Jos kaaviossa 1 vahvistetun vuokaavion mukaisesti suoritetun ensimmäisen määrityksen jälkeen kyseisentyyppisiä eläinperäisiä partikkeleita (esim. maalla eläviä selkärankaisia tai kaloja) havaitaan yksi tai useampi ja havaitut partikkelit vahvistavat näytteen ilmoitetun pitoisuuden, toista määritystä ei tarvita. Jos tämän ensimmäisen määrityksen aikana havaittujen kyseisentyyppisten eläinperäisten partikkelien määrä on suurempi kuin viisi, määrityksen tulos ilmoitetaan eläintyypeittäin 2.1.5.3 kohdassa vahvistettua terminologiaa käyttäen. Muussa tapauksessa määrityksen tulos ilmoitetaan eläintyypeittäin 2.1.5.2 kohdassa vahvistettua terminologiaa käyttäen.

Muissa tapauksissa, mukaan lukien tilanteet, joissa laboratoriolle ei ole toimitettu pitoisuutta koskevaa ilmoitusta, tehdään toinen määritys uudesta osanäytteestä.

Jos kaaviossa 2 vahvistetun vuokaavion mukaisesti tehdyn toisen määrityksen jälkeen näissä kahdessa määrityksessä havaittujen kyseisentyyppisten eläinperäisten partikkelien summa on yhteensä suurempi kuin kymmenen, määrityksen tulos ilmoitetaan eläintyypeittäin 2.1.5.3 kohdassa vahvistettua terminologiaa käyttäen. Muussa tapauksessa määrityksen tulos ilmoitetaan eläintyypeittäin 2.1.5.2 kohdassa vahvistettua terminologiaa käyttäen. ◄

2.1.5    ►M7  Tulosten ilmoittaminen

Laboratorion on tuloksista raportoidessaan ilmoitettava mistä aineksesta määritys on tehty (sedimentti, flotaatti, raaka-aine). Raportoinnista on käytävä selvästi ilmi, kuinka monta määritystä on tehty ja onko fraktioita seulottu edellä olevan 2.1.3.3.4 kohdan viimeisen alakohdan mukaisesti ennen objektilasin valmistusta.

Laboratorion raportin on sisällettävä ainakin tieto maalla elävistä selkärankaisista ja kalasta peräisin olevien ainesosien esiintymisestä.

Eri tuloksista raportoidaan seuraavasti:

2.2    Polymeraasiketjureaktio (PCR)

2.2.1    Periaate

Eläinperäisiä deoksiribonukleiinihapon (DNA) fragmentteja, joita rehuaineissa ja rehuseoksissa saattaa esiintyä, havainnoidaan geneettisellä amplifikaatiotekniikalla (PCR-tekniikalla), joka kohdennetaan lajikohtaisiin DNA-sekvensseihin.

PCR-menetelmä edellyttää ensiksi DNA:n eristysvaihetta. Seuraavassa vaiheessa näin eristetty DNA amplifioidaan määrityksen kohteena olevan eläinlajin havaitsemiseksi.

2.2.2    Reagenssit ja välineet

2.2.2.1   Reagenssit

2.2.2.1.1   Reagenssit DNA:n eristysvaihetta varten

Ainoastaan reagensseja, jotka EURL-AP on hyväksynyt ja verkkosivuillaan julkaissut, saa käyttää.

2.2.2.1.2   Reagenssit geneettistä amplifikaatiovaihetta varten

2.2.2.1.2.1   Alukkeet ja koettimet

Ainoastaan alukkeita ja koettimia, joiden oligonukleotidisekvenssit EURL-AP on validoinut, saa käyttää ( 34 ).

2.2.2.1.2.2   Master Mix

Ainoastaan Master Mix -liuoksia, jotka eivät sisällä reagensseja, jotka saattavat johtaa eläin-DNA:n esiintymisen vuoksi vääriin tuloksiin, saa käyttää ( 35 ).

2.2.2.1.2.3   Dekontaminaatioreagenssit.

2.2.2.1.2.3.1   Suolahappoliuos (0,1N).

2.2.2.1.2.3.2   Natriumhypokloriittiliuos (0,15 % aktiivista klooria).

2.2.2.1.2.3.3   Syövyttämättömät reagenssit kalliiden laitteiden, kuten analyysivaakojen (esim. MP Biomedicals -yrityksen tuote DNA EraseTM) dekontaminointiin.

2.2.2.2   Laitteet

2.2.2.2.1   Analyysivaaka, tarkkuus 0,001 g.

2.2.2.2.2   Jauhamisvälineet.

2.2.2.2.3   Lämpöblokki, joka mahdollistaa reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion (PCR)

2.2.2.2.4   Mikrosentrifugi mikrofugiputkia varten.

2.2.2.2.5   Mikropipettejä, joilla voidaan pipetoida tilavuudeltaan 1–1 000 μl:n näytteitä.

2.2.2.2.6

Molekyylibiologiassa käytettävät tavanomaiset muoviastiat: mikrofugiputket, suodattimelliset mikropipettien muovikärjet, lämpöblokkiin soveltuvat levyt.

2.2.2.2.7

Pakastimet näytteiden ja reagenssien säilytystä varten.

2.2.3    Näytteenotto ja näytteiden valmistus

2.2.3.1   Näytteenotto

Käytetään liitteen I säännösten mukaisesti otettua edustavaa näytettä.

2.2.3.2   Näytteen valmistus

Laboratorionäytteet on esikäsiteltävä DNA:n eristämistä varten liitteessä II vahvistettujen vaatimusten mukaisesti. Vähintään 50 grammaa näytettä on jauhettava määritystä varten.

Näytteen valmistus on tehtävä eri huoneissa kuin DNA:n eristys ja geneettinen amplifikaatioreaktio ISO 24276 -standardissa kuvatulla tavalla.

Valmistetaan vähintään kaksi 100 mg:n suuruista testinäytettä.

2.2.4    DNA:n eristäminen

DNA eristetään näytteistä, jotka on esikäsitelty EURL-AP:n laatimien ja verkkosivuillaan julkaisemien toimintaohjeiden mukaisesti.

Jokaista DNA:n eristyskertaa kohti tehdään kaksi eristyskontrollia ISO 24276 -standardissa kuvatulla tavalla:

2.2.5    Geneettinen amplifikaatio

Geneettinen amplifikaatio suoritetaan kullekin tunnistettavalle lajille validoitua menetelmää käyttäen. Nämä menetelmät on vahvistettu EURL-AP:n laatimissa ja verkkosivullaan julkaisemissa toimintaohjeissa. Kukin eristetty DNA on määritettävä vähintään kahtena eri laimennoksena, jotta inhibitio voidaan arvioida.

Jokaista kohdelajia kohti tehdään kaksi amplifikaatiokontrollia ISO 24276 -standardissa kuvatulla tavalla:

2.2.6    Tulosten tulkinta ja esittäminen

Laboratorion on tuloksista raportoidessaan ilmoitettava ainakin käytettyjen testinäytteiden paino, käytetty eristystekniikka, suoritettujen määritysten määrä ja menetelmän toteamisraja.

Tuloksia ei saa tulkita eikä raportoida, jos testin kohteesta ei positiivisessa DNA-eristyskontrollissa ja kohteen positiivisessa DNA-kontrollissa saada positiivisia tuloksia kun taas amplifikaation reagenssikontrolli on negatiivinen.

Jos kahdesta testinäytteestä saadut tulokset eivät ole yhdenmukaisia, ainakin geneettinen amplifikaatio on toistettava. Jos laboratorio epäilee, että epäyhdenmukaisuus voi johtua eristetystä DNA:sta, DNA:n eristys ja geneettinen amplifikaatio on tehtävä uudelleen ennen tulosten tulkitsemista.

Lopullisten raportoitavien tulosten on perustuttava kyseisestä kahdesta testinäytteestä saatujen tulosten yhdistämiseen ja tulkintaan EURL-AP:n laatimien ja verkkosivuillaan julkaisemien toimintaohjeiden mukaisesti.

2.2.6.1   Negatiivinen tulos

Negatiivinen tulos on raportoitava seuraavasti:

Laboratorioon toimitetussa näytteessä ei todettu yhtään X:n DNA:ta (X on testin kohteena oleva eläinlaji tai eläinlajiryhmä).

2.2.6.2   Positiivinen tulos

Positiivinen tulos raportoidaan seuraavasti:

Laboratorioon toimitetussa näytteessä todettiin X:n DNA:ta (X on testin kohteena oleva eläinlaji tai eläinlajiryhmä).

▼B

---

LIITE VII

SIIPIKARJAN REHUJEN ENERGIA-ARVON LASKENTAMENETELMÄ

1.   Energia-arvon laskentamenetelmä ja ilmoittaminen

Siipikarjan rehuseosten energia-arvo on laskettava jäljempänä olevan kaavan mukaisesti tiettyjen rehun ravintoaineiden prosenttiosuuksien perusteella. Energia-arvo ilmoitetaan typen suhteen korjattuna muuntokelpoisena energiana (ME) käyttäen yksikköä megajoule (MJ) rehuseoskiloa kohti:

MJ/kg ME:tä = 0,1551 × raakavalkuaisprosentti + 0,3431 × raakarasvaprosentti + 0,1669 × tärkkelysprosentti + 0,1301 × kokonaissokeriprosentti (sakkaroosina ilmaistuna).

2.   Sallitut poikkeamat ilmoitetuista energia-arvoista

Jos virallisessa tarkastuksessa käy ilmi, että tarkastuksen perusteella saatu ja ilmoitettu energia-arvo poikkeavat toisistaan (pienempi tai suurempi kuin ilmoitettu energia-arvo), sallitaan ME:ssä 0,4 MJ/kg:n suuruinen enimmäispoikkeama.

3.   Tuloksen ilmoittaminen

Edellä olevan laskukaavan mukaisesti saatu energia-arvo ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

4.   Näytteenotto- ja määritysmenetelmät

Näytteenotto rehuseoksesta ja laskentakaavassa esiintyvien ravintoainepitoisuuksien määrittäminen on suoritettava yhteisön näytteenottomenetelmien ja virallisen rehuvalvonnan määritysmenetelmien mukaisesti.

Seuraavia menetelmiä on käytettävä:

---

LIITE VIII

MÄÄRITYSMENETELMÄT SELLAISTEN LISÄAINEIDEN OSOITTAMISEKSI, JOTKA EIVÄT ENÄÄ OLE SALLITTUJA REHUISSA

A.   METYYLIBENTSOKVAATTIPITOISUUDEN MÄÄRITYS

7-Bentsyloksi-6-butyyli-3-metoksikarbonyyli-4-kinoloni

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen metyylibentsokvaattipitoisuus. Määritysraja on 1 mg/kg.

2.   Periaate

Metyylibentsokvaatti uutetaan näytteestä metanolisella metaanisulfonihappoliuoksella. Uute puhdistetaan dikloorimetaanilla, sitten ioninvaihtokromatografialla ja sen jälkeen uudelleen dikloorimetaanilla. Metyylibentsokvaattipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) ja UV-detektorilla.

3.   Reagenssit

Metanolin (3.2) ja veden (HPLC-laatua vastaava) seos 75 + 25 (v + v).

Suodatetaan 0,22 μm:n suodattimen (4.5) läpi ja poistetaan liuoksesta kaasut (esimerkiksi 10 minuutin ultraäänikäsittelyllä).

Laimennetaan 20,0 ml metaanisulfonihappoa 1 000 ml:ksi metanolilla (3.2).

Laimennetaan 100 ml kloorivetyhappoa (ρ20 noin 1,18 g/ml) 1 000 ml:ksi vedellä.

Hartsi esikäsitellään ennen käyttöä: sekoitetaan 100 g hartsia 500 ml:aan kloorivetyhappoliuosta (3.5) ja saatetaan seos kiehuvaksi lämpölevyllä koko ajan sekoittaen. Annetaan jäähtyä ja dekantoidaan happo pois. Suodatetaan tyhjiössä suodatinpaperin läpi. Pestään hartsi kahdesti 500 ml:n annoksella vettä ja sen jälkeen 250 ml:lla metanolia (3.2). Huuhdellaan hartsi uudelleen 250 ml:lla metanolia (3.2) ja kuivataan johtamalla ilmavirta suodatuskakun läpi. Kuivattu hartsi säilytetään suljetussa pullossa.

Punnitaan 50 mg standardiyhdistettä (3.7) 0,1 mg:n tarkkuudella, liuotetaan metaanisulfonihappoliuokseen (3.4) 100 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin asti ja sekoitetaan.

Siirretään 5,0 ml standardin kantaliuosta (3.7.1) 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti metanolilla (3.2) ja sekoitetaan.

Siirretään 25 ml:n mittapulloihin 1,0 , 2,0 , 3,0 , 4,0 ja 5,0 ml standardin välimuotoliuosta (3.7.2). Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.3) ja sekoitetaan. Näiden liuosten metyylibentsokvaattipitoisuudet ovat vastaavasti 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 ja 10,0 μg/ml. Liuokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Yleistä

Huomautus: Tätä menetelmää käytettäessä nollarehun on vastattava tyypiltään näytettä, ja metyylibentsokvaattia ei saa havaita määrityksessä.

5.2   Uutto

Punnitaan 0,01 g:n tarkkuudella noin 20 g valmistettua näytettä ja siirretään 250 ml:n erlenmeyerkolviin. Lisätään 100,0 ml metaanisulfonihappoa (3.4) ja ravistellaan mekaanisesti (4.1) 30 minuutin ajan. Suodatetaan liuos suodatinpaperin läpi ja suodos säilytetään neste-neste-erotusta (5.3) varten.

5.3   Neste-neste-erotus

Siirretään 25 ml suodosta (5.2) 500 ml:n erotussuppiloon, joka sisältää 100 ml kloorivetyhappoliuosta (3.5). Lisätään 100 ml dikloorimetaania (3.1) suppiloon ja ravistellaan yhden minuutin ajan. Faasien erottumisen jälkeen valutetaan alempi faasi (dikloorimetaani) 500 ml:n pyörökolviin. Toistetaan vesifaasin uutto vielä kahdella 40 ml:n annoksella dikloorimetaania ja yhdistetään nämä ensimmäiseen uutteeseen pyörökolvissa. Dikloorimetaaniuute haihdutetaan täysin kuivaksi pyöröhaihduttimessa (4.2), joka toimii 40 oC:n lämpötilassa ja alennetussa paineessa. Liuotetaan jäännös 20–25 ml:aan metanolia (3.2), suljetaan kolvi tulpalla ja säilytetään koko uute ioninvaihtokromatografiaa (5.4) varten.

5.4   Ioninvaihtokromatografia

5.4.1    Kationinvaihtokolonnin valmistelu

Laitetaan pieni tuppo lasivillaa lasikolonnin (4.3) alapäähän. Valmistetaan 5 grammasta käsiteltyä kationinvaihtohartsia (3.6) ja 50 ml:sta vetykloridihappoa (3.5) seos, joka kaadetaan kolonniin; annetaan asettua. Annetaan ylimääräisen hapon valua kolonnista siten, että sen pinta jää juuri ja juuri hartsipinnan yläpuolelle ja pestään kolonni vedellä, kunnes ulos virtaava liuos on lakmuspaperilla mitattuna neutraalia. Siirretään 50 ml metanolia (3.2) kolonniin ja annetaan valua, kunnes se saavuttaa hartsipinnan.

5.4.2    Pylväskromatografia

Pipetoidaan saatua uutetta (5.3) varovasti kolonniin. Huuhdellaan pyörökolvi kahdella 5–10 ml:n annoksella metanolia (3.2) ja siirretään nämä pesuliuokset kolonniin. Annetaan uutteen valua hartsipintaan ja pestään kolonni 50 ml:lla metanolia valvoen, ettei virtausnopeus ylitä 5 ml:aa minuutissa. Heitetään ulos valunut liuos pois. Metyylibentsokvaatti eluoidaan kolonnista käyttäen 150 ml:aa metaanisulfonihappoliuosta (3.4) ja kerätään eluaatti kolonnista 250 ml:n erlenmeyerkolviin.

5.5   Neste-neste-erotus

Siirretään saatu eluaatti (5.4.2) 1 litran erotussuppiloon. Huuhdellaan erlenmeyerkolvi 5–10 ml:lla metanolia (3.2) ja yhdistetään pesuliuos erotussuppilon sisällön kanssa. Lisätään 300 ml kloorivetyhappoliuosta (3.5) ja 130 ml dikloorimetaania (3.1). Ravistellaan yhden minuutin ajan ja annetaan faasien erottua. Valutetaan alempi faasi (dikloorimetaani) 500 ml:n pyörökolviin. Toistetaan vesifaasin uutto kahdella uudella 70 ml:n annoksella dikloorimetaania ja yhdistetään nämä uutteet ensimmäisen, pyörökolvissa olevan uutteen kanssa.

Dikloorimetaaniuute haihdutetaan täysin kuivaksi pyöröhaihduttimessa (4.2), joka toimii 40 oC:n lämpötilassa ja alennetussa paineessa. Liuotetaan kolvin jäännös noin 50 ml:aan metanolia (3.2) ja siirretään tämä liuos kvantitatiivisesti 10 ml:n mittapulloon. Pyörökolvi huuhdellaan kahdella uudella 1–2 ml:n annoksella metanolia ja siirretään liuos mittapulloon. Täytetään merkkiin asti metanolilla ja sekoitetaan. Suodatetaan määräosa kalvosuodattimen (4.6) läpi. Tämä liuos säilytetään HPLC-määritystä (5.6) varten.

5.6   HPLC-määritys

5.6.1    Muuttujat

Seuraavat olosuhteet annetaan viitteeksi; muita olosuhteita voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset.

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus on tarkastettava injektoimalla useita kertoja kalibrointiliuosta (3.7.3), jonka pitoisuus on 4 μg/ml, kunnes saadaan piikkejä, joiden korkeudet (pinta-alat) ja retentioajat pysyvät vakioina.

5.6.2    Kalibrointikäyrä

Injektoidaan useita kertoja kutakin kalibrointiliuosta (3.7.3) ja mitataan kunkin pitoisuuden piikkien korkeudet (pinta-alat). Piirretään kalibrointikäyrä siten, että y-akselilla ovat kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta alojen) keskiarvot ja x-akselilla vastaavat konsentraatiot (μg/ml).

5.6.3    Näyteliuos

Injektoidaan useita kertoja näyteuutetta (5.5) käyttäen samaa tilavuutta kuin kalibrointiliuoksille, ja määritetään metyylibentsokvaattipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen metyylibentsokvaattipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta määritetään näyteliuoksen pitoisuus μg/ml:na käyttäen kalibrointikäyrää (5.6.2).

Näytteessä olevan metyylibentsokvaatin määrä w (mg/kg) lasketaan seuraavalla kaavalla:

jossa:

c

=

näyteliuoksen metyylibentsokvaattipitoisuus μg/ml:na,

m

=

näyte-erän paino grammoina.

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Tutkittavan aineen tunnistaminen voidaan varmentaa yhteiskromatografialla tai diodirividetektorilla, joilla näyteuutteen ja 10 μg/ml metyylibentsokvaattia sisältävän kalibrointiliuoksen (3.7.3) spektrejä voidaan verrata.

7.1.1    Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen lisätään sopiva määrä standardin välimuotoliuosta (3.7.2). Lisätyn metyylibentsokvaatin määrän on vastattava näyteuutteessa olevan metyylibentsokvaatin arvioitua määrää.

Ainoastaan metyylibentsokvaatin piikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä että uutteen laimeneminen. Piikin leveyden on oltava sen puolikorkeudella noin 10 % sen alkuperäisestä leveydestä.

7.1.2    Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ero ei saa olla suurempi kuin 10 % suuremmasta tuloksesta, kun metyylibentsokvaattipitoisuudet ovat välillä 4–20 mg/kg.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 90 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Laboratorioiden välisessä tutkimuksessa analysoitiin viisi näytettä 10 laboratoriossa. Kukin näyte määritettiin kaksi kertaa.

Ei hav.

=

Ei havaittu

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin, %

sR

=

uusittavuuden keskihajonta

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin, %.

B.   OLAKVINDOKSIN MÄÄRITYS

(2-[N-2′-(hydroksietyyli)karbamoyyli]-3-metyylikinoksaliini-N 1 ,N 4 -dioksidi

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää rehujen olakvindoksipitoisuus. Määritysraja on 5 mg/kg.

2.   Periaate

Näyte uutetaan vesi-metanoliseoksella. Olakvindoksipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) UV-detektoria käyttäen.

3.   Reagenssit

Vesi (3.3)-metanoli (3.2)-seos, 900 + 100 (V + V).

Punnitaan 50 mg olakvindoksia (3.5) 0,1 mg:n tarkkuudella 200 ml:n mittapulloon ja lisätään noin 190 ml vettä. Asetetaan pullo 20 minuutiksi ultraäänihauteeseen (4.1). Ultraäänikäsittelyn jälkeen liuoksen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan, täytetään merkkiin asti vedellä ja sekoitetaan. Kääritään pullo alumiinifolioon ja säilytetään jääkaapissa. Liuos on valmistettava kuukausittain.

Pipetoidaan 10,0 ml kantaliuosta (3.5.1) 100 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.4) ja sekoitetaan. Kääritään pullo alumiinifolioon ja säilytetään jääkaapissa. Liuos on valmistettava päivittäin.

Pipetoidaan 50 ml:n mittapulloihin 1,0 , 2,0 , 5,0 , 10,0 , 15,0 ja 20,0 ml standardin välimuotoliuosta (3.5.2). Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.4) ja sekoitetaan. Kääritään pullot alumiinifolioon. Nämä liuokset sisältävät vastaavasti 0,5 , 1,0 , 2,5 , 5,0 , 7,5 ja 10,0 μg/ml olakvindoksia.

Liuokset on valmistettava päivittäin.

4.   Välineistö

5.   Menettely

Huomautus:

Olakvindoksi on valoherkkää. Kaikki toimenpiteet on tehtävä himmennetyssä valaistuksessa tai ruskeita lasiastioita käyttäen.

5.1   Yleistä

Huomautus:

Tätä menetelmää käytettäessä nollanäytteen on oltava tyypiltään samanlaista kuin näyte, eikä siinä saa esiintyä havaittavaa määrää olakvindoksia.

5.2   Uutto

Punnitaan noin 50 g näytettä 0,01 g:n tarkkuudella. Siirretään 1 000 ml:n erlenmeyerkolviin, lisätään 100 ml metanolia (3.1) ja asetetaan kolvi 5 minuutiksi ultraäänihauteeseen (4.1). Lisätään 410 ml vettä ja annetaan olla ultraäänihauteessa vielä 15 minuuttia. Otetaan kolvi ultraäänihauteesta, ravistellaan 30 minuutin ajan ravistelijassa (4.2) ja suodatetaan taitellun suodatinpaperin läpi. Pipetoidaan 10,0 ml suodosta 20 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti vedellä ja sekoitetaan. Suodatetaan näyte kalvosuodattimen (4.4) läpi (ks. huomautus 9). Jatketaan HPLC-määrityksellä (5.3).

5.3   HPLC-määritys

5.3.1    Muuttujat:

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia ja niitä voidaan muuttaa, mikäli ne antavat vastaavanlaiset tulokset.

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus tarkistetaan injektoimalla useita kertoja 2,5 μg/ml olakvindoksia sisältävää kalibrointiliuosta (3.5.3), kunnes piikkien korkeudet ja retentioajat pysyvät vakioina.

5.3.2    Kalibrointikäyrä

Injektoidaan kutakin kalibrointiliuosta (3.5.3) useita kertoja ja lasketaan kutakin konsentraatiota vastaavat piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä siten, että y-akselilla ovat kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta alojen) keskiarvot ja x-akselilla vastaavat konsentraatiot (μg/ml).

5.3.3    Näyteliuos

Injektoidaan useita kertoja näyteliuosta (5.2) sama määrä kuin kalibrointiliuoksia ja lasketaan olakvindoksipiikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen olakvindoksipitoisuus (μg/ml) lasketaan olakvindoksin piikkien korkeuden (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.3.2) avulla.

Näytteen olakvindoksipitoisuus w (mg/kg) saadaan seuraavasta kaavasta:

jossa:

c

=

näyteliuoksen (5.2) olakvindoksipitoisuus (μg/ml),

m

=

näyte-erän paino grammoina (5.2).

7.   Tulosten validointi

7.1   Tutkittavan aineen tunnistaminen

Tutkittavan aineen tunnistaminen voidaan varmentaa yhteiskromatografialla tai diodirividetektorilla vertaamalla näyteliuoksen (5.2) ja 5,0 μg/ml olakvindoksia sisältävän kalibrointiliuoksen (3.5.3) spektrejä.

7.1.1    Yhteiskromatografia

Näyteliuokseen (5.2) lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.5.3). Lisätyn olakvindoksimäärän on oltava samaa luokkaa kuin näyteliuoksesta analysoitu olakvindoksin määrä.

Vain olakvindoksipiikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä että olakvindoksin näyteliuoksen laimeneminen. Piikin leveyden puolivälissä sen korkeutta on oltava ± 10 prosenttia alkuperäisen näyteliuoksen olakvindoksipiikin leveydestä.

7.1.2    Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kun olakvindoksipitoisuus on 10–200 mg/kg, näytteen kahden rinnakkaisen määrityksen välinen ero ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta rinnakkaistuloksesta.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 90 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

EY:n laboratorioiden välisessä menetelmävertailussa 13 laboratoriossa analysoitiin neljä porsaanrehunäytettä, joista yksi oli nollanäyte. Tulokset olivat seuraavat:

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

yksittäisten arvojen lukumäärä

Sr

=

toistettavuuden keskihajonta

SR

=

uusittavuuden keskihajonta

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin.

9.   Huomautus

Vaikka menetelmää ei ole validoitu rehuille, joissa on yli 100 mg/kg olakvindoksia, sillä on mahdollista saada tyydyttäviä tuloksia käyttämällä pienempää näytemäärää ja/tai laimentamalla näyteliuosta (5.2), jotta päästäisiin kalibrointikäyrän pitoisuusalueelle (5.3.2).

C.   AMPROLIUMIN MÄÄRITYS

1 [(4-amino-2-propyylipyrimidin-5-yyli)metyyli]-2-metyylipyridiniumkloridihydrokloridi

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää amproliumin pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. Toteamisraja on 1 mg/kg ja määritysraja 5 mg/kg.

2.   Periaate

Näyte uutetaan metanoli-vesiseoksella. Uute laimennetaan liikkuvalla faasilla, suodatetaan kalvosuodattimella, ja amprolium määritetään korkean erotuskyvyn kationinvaihtonestekromatografialla (HPLC) ja UV-detektorilla.

3.   Reagenssit

Liuotetaan 13,80 g natriumdivetyfosfaattimonohydraattia veteen (3.3) 1 000 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin asti vedellä (3.3) ja sekoitetaan.

Liuotetaan 224,74 g natriumperkloraattimonohydraattia veteen (3.3) 1 000 ml:n mittapullossa, täytetään merkkiin asti vedellä (3.3) ja sekoitetaan.

Asetonitriilin (3.2), natriumdivetyfosfaattiliuoksen (3.4) ja natriumperkloraattiliuoksen (3.5) seos, 450 + 450 + 100 (v + v + v). Suodatetaan ennen käyttöä 0,22 μm:n kalvosuodattimella (4.3) ja poistetaan kaasut (esim. ultraäänihauteessa (4.4) vähintään 15 min).

Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 50 mg amproliumia (3.7) 100 ml:n mittapulloon, liuotetaan 80 ml:aan metanolia (3.1), ja pullo pannaan 10 minuutiksi ultraäänihauteeseen (4.4). Ultraäänikäsittelyn jälkeen liuoksen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan, täytetään merkkiin asti vedellä ja sekoitetaan. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

Pipetoidaan 5,0 ml standardin kantaliuosta (3.7.1) 50 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti uuttoliuoksella (3.8) ja sekoitetaan. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

Siirretään 0,5 , 1,0 ja 2,0 ml standardin välimuotoliuosta (3.7.2) 50 ml:n mittapulloihin. Täytetään merkkiin asti liikkuvalla faasilla (3.6) ja sekoitetaan. Nämä liuokset vastaavat 0,5 , 1,0 ja 2,0 μg/ml amproliumia. Liuokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Metanoli (3.1) -vesiseos 2 + 1 (v + v).

4.   Välineistö

5.   Menettely

5.1   Yleistä

5.1.1    Nollarehu

Saantokokeen (5.1.2) toimivuuden määrittämiseksi on analysoitava nollarehu (nollanäyte), jotta varmistetaan, ettei se sisällä amproliumia tai mittausta häiritseviä aineita. Nollanäytteen on oltava näytteen kaltainen, eikä siinä saa olla havaittavia määriä amproliumia tai häiritseviä aineita.

5.1.2    Saantokoe

Saanto on määritettävä analysoimalla nollanäyte, johon on lisätty näytteen amproliumia näytteen amproliumpitoisuutta vastaava määrä. Jotta saadaan 100 mg/kg amproliumia vastaava näyteliuos, siirretään 10,0 ml standardin kantaliuosta (3.7.1) 250 ml:n erlenmeyerkolviin, ja liuos haihdutetaan noin 0,5 ml:ksi. Lisätään 50 g nollanäytettä, sekoitetaan huolellisesti ja annetaan tasoittua 10 min sekoittaen useita kertoja ennen uuttovaiheeseen siirtymistä (5.2).

Jos saatavilla ei ole näytteen kaltaista nollanäytettä (katso 5.1.1), voidaan saantokoe suorittaa vaihtoehtoisesti standardinlisäysmenetelmällä. Tällöin analysoitavaan näytteeseen lisätään suunnilleen näytteiden jo sisältämä määrä amproliumia. Tämä näyte analysoidaan yhdessä varsinaisen näytteen kanssa, ja saanto voidaan laskea vähennyslaskulla.

5.2   Uutto

5.2.1    Esiseokset (amproliumpitoisuus < 1 %) ja rehut

Punnitaan 0,01 gramman tarkkuudella 5–40 g näytettä, riippuen sen amproliumpitoisuudesta, 500 ml:n erlenmeyerkolviin ja lisätään 200 ml uuttoliuosta (3.8). Kolvi pannaan ultraäänihauteeseen (4.4) 15 minuutiksi. Otetaan kolvi ultraäänihauteesta, ravistellaan 1 minuutin ajan ravistelijassa tai sekoitetaan magneettisekoittimella (4.5). Uutteesta otettu erä laimennetaan liikkuvalla faasilla (3.6) siten, että sen amproliumpitoisuus on 0,5 –2 μg/ml, ja sekoitetaan (katso 9.3). Suodatetaan 5–10 ml tätä laimennettua liuosta kalvosuodattimella (4.2). Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.2.2    Esiseokset (amproliumpitoisuus ≥ 1 %)

Punnitaan 0,01 gramman tarkkuudella 1–4 g esiseosta, riippuen sen amproliumpitoisuudesta, 500 ml:n erlenmeyerkolviin ja lisätään 200 ml uuttoliuosta (3.8). Kolvi pannaan ultraäänihauteeseen (4.4) 15 minuutiksi. Otetaan kolvi ultraäänihauteesta, ravistellaan 1 minuutin ajan ravistelijassa tai sekoitetaan magneettisekoittimella (4.5). Uutteesta otettu erä laimennetaan liikkuvalla faasilla (3.6) siten, että sen amproliumpitoisuus on 0,5 –2 μg/ml, ja sekoitetaan. Suodatetaan 5–10 ml tätä laimennettua liuosta kalvosuodattimella (4.2). Tehdään HPLC-määritys (5.3).

5.3   HPLC-määritys

5.3.1    Muuttujat:

Seuraavat ajo-olosuhteet ovat ohjeellisia ja niitä voidaan muuttaa, mikäli ne antavat vastaavanlaiset tulokset.

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus tarkistetaan injektoimalla useita kertoja kalibrointiliuosta (3.7.3), jonka konsentraatio on 1,0 μg/ml, kunnes piikkien korkeudet ja retentioajat pysyvät vakioina.

5.3.2    Kalibrointikäyrä

Injektoidaan kutakin kalibrointiliuosta (3.7.3) useita kertoja ja lasketaan kutakin konsentraatiota vastaavat piikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvot. Piirretään kalibrointikäyrä siten, että y-akselilla ovat kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta alojen) keskiarvot ja x-akselilla vastaavat konsentraatiot (μg/ml).

5.3.3    Näyteliuos

Injektoidaan näyteliuosta (5.2) useita kertoja käyttäen samaa injektiotilavuutta kuin kalibrointiliuoksille ja määritetään amproliumpiikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen amproliumkonsentraatio (μg/ml) lasketaan piikkien korkeuksien (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.3.2) avulla.

Näytteen amproliumpitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla:

[mg/kg]

jossa:

V

=

uuttoliuoksen (3.8) tilavuus (ml) 5.2 kohdan mukaisesti (ts. 200 ml),

c

=

näyteliuoksen (5.2) amproliumpitoisuus (μg/ml),

f

=

5.2 kohdan mukainen laimennuskerroin,

m

=

näyte-erän paino (g).

7.   Tulosten validointi

7.1   Tunnistaminen

Tutkittavan aineen tunnistaminen voidaan varmentaa yhteiskromatografialla tai käyttämällä diodirividetektoria, jolla verrataan näyteuutteen (5.2) ja 2,0 μg/ml sisältävän kalibrointiliuoksen (3.7.3) spektrejä.

7.1.1    Yhteiskromatografia

Näyteuutteeseen (5.2) lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.7.3). Lisätyn amproliumin määrän on oltava samaa suuruusluokkaa kuin näyteuutteessa todettu amproliumin määrä.

Ainoastaan amproliumin piikki saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä että uutteen laimennus. Piikin leveyden puolivälissä sen korkeutta on oltava ± 10 % alkuperäisen näyteuutteen olakvindoksipiikin leveydestä.

7.1.2    Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviointiperusteiden mukaisesti:

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kahden rinnakkaismäärityksen välinen ero samasta näytteestä ei saa olla suurempi kuin

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 90 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Eri laboratorioissa analysoitiin kolme siipikarjan rehua (näytteet 1–3), yksi kivennäisrehu (näyte 4) ja yksi esiseos (näyte 5). Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa.

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

yksittäisten arvojen lukumäärä

sr

=

toistettavuuden keskihajonta

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin

sR

=

uusittavuuden keskihajonta

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin.

9.   Huomautukset

D.   KARBADOKSIN MÄÄRITYS

Metyyli-3-(2-kinoksalinyylimetyleeni)-karbatsaatti-N 1 ,N 4 -dioksidi

1.   Tarkoitus ja soveltamisala

Menetelmällä voidaan määrittää karbadoksin pitoisuus rehuissa ja esiseoksissa. Toteamisraja on 1 mg/kg. Määritysraja on 5 mg/kg.

2.   Periaate

Näytteeseen lisätään vettä ja se uutetaan metanoli-asetonitriilillä. Rehuseosnäytteiden suodatetusta uutteesta puhdistetaan tietty tilavuusosa alumiinioksikolonnilla. Esiseosnäytteiden ja rehun lisäainevalmistenäytteiden suodatetusta uutteesta tietty tilavuusosa laimennetaan sopivalle pitoisuusalueelle vedellä, metanolilla ja asetonitriilillä. Karbadoksipitoisuus määritetään korkean erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla (HPLC) UV-detektoria käyttäen.

3.   Reagenssit

Sekoitetaan 500 ml metanolia (3.1) ja 500 ml asetonitriiliä (3.2).

Laimennetaan 10 ml etikkahappoa (3.3) 100 ml:aan asti vedellä.

Liuotetaan 0,82 g natriumasetaattia (3.7) 700 ml:aan vettä (3.8) ja pH säädetään arvoon 6,0 etikkahapolla (3.6). Siirretään 1 000 ml:n mittapulloon, täytetään merkkiin asti vedellä (3.8) ja sekoitetaan.

Sekoitetaan 825 ml asetaattipuskuriliuosta (3.9) ja 175 ml asetonitriiliä (3.2).

Suodatetaan 0,22 μm:n suodattimen (4.5) läpi ja poistetaan liuoksesta kaasut (esimerkiksi 10 minuutin ultraäänikäsittelyllä).

Puhdas karbadoksi: Metyyli-3-(2-kinoksalinyylimetyleeni)-karbatsaatti-N1,N4-dioksidi, E 850.

Punnitaan 25 mg karbadoksia (3.11) 0,1 mg:n tarkkuudella 250 ml:n mittapulloon. Liuotetaan metanoli-asetonitriiliin (3.5) käsittelemällä ultraäänihauteessa (4.7). Ultraäänikäsittelyn jälkeen liuos jäähdytetään huoneen lämpötilaan, täytetään merkkiin asti metanoli-asetonitriilillä (3.5) ja sekoitetaan. Pullo kääritään alumiinifolioon tai käytetään tummaa pulloa ja säilytetään jääkaapissa. Liuos säilyy ≤ 4 oC:n lämpötilassa yhden kuukauden.

Pipetoidaan 2,0 , 5,0 , 10,0 ja 20,0 ml standardin kantaliuosta (3.11.1) 100 ml:n mittapulloihin. Lisätään 30 ml vettä, täytetään merkkiin asti metanoli-asetonitriilillä (3.5) ja sekoitetaan. Kääritään pullot alumiinifolioon. Nämä liuokset sisältävät vastaavasti 2,0 , 5,0 , 10,0 ja 20,0 μg/ml karbadoksia.

Kalibrointiliuokset on valmistettava juuri ennen käyttöä.

Huomautus:

Kun määritetään karbadoksia rehuista, jotka sisältävät vähemmän kuin 10 mg/kg karbadoksia, on valmistettava kalibrointiliuos, jonka konsentraatio on pienempi kuin 2,0 μg/ml.

Sekoitetaan 300 ml vettä ja 700 ml metanoli-asetonitriiliseosta (3.5).

4.   Välineistö

Huomautus:

Voidaan käyttää myös tulpalla varustettua lasikolonnia tai lasikolonnia, jonka pää suippenee; tällöin kolonnin alapäähän pannaan pieni lasivillatuppo, joka tiivistetään lasisauvalla.

5.   Menettely

Huomautus:

Karbadoksi on valonarkaa. Kaikki toimenpiteet on suoritettava himmennetyssä valaistuksessa, tai on käytettävä ruskeita tai alumiinifolioon käärittyjä lasitavaroita.

5.1   Yleistä

5.1.1    Nollarehu

Saantokokeen (5.1.2) suorittamista varten analysoidaan nollarehu, jotta varmistetaan, ettei se sisällä karbadoksia tai häiritseviä aineita. Nollarehun on oltava näytteen kaltainen, eikä siinä saa olla havaittavia määriä karbadoksia tai häiritseviä aineita.

5.1.2    Saantokoe

Saantokoe suoritetaan analysoimalla nollarehu (5.1.1), johon on lisätty näytteessä esiintyvää määrää vastaava määrä karbadoksia. Lisäyksen saamiseksi tasolle 50 mg/kg karbadoksia pipetoidaan 5,0 ml standardin kantaliuosta (3.11.1) 200 ml:n erlenmeyerkolviin. Liuos haihdutetaan noin 0,5 ml:ksi typpivirrassa. Lisätään 10 g nollarehua, sekoitetaan ja odotetaan 10 minuuttia ennen siirtymistä uuttovaiheeseen (5.2).

Jos saatavilla ei ole näytteen kaltaista nollanäytettä (katso 5.1.1), voidaan saantokoe suorittaa vaihtoehtoisesti standardinlisäysmenetelmällä. Tällöin analysoitavaan näytteeseen lisätään suunnilleen näytteiden ennestään sisältämä määrä karbadoksia. Tämä näyte analysoidaan yhdessä varsinaisen näytteen kanssa, ja saanto voidaan laskea vähennyslaskulla.

5.2   Uutto

5.2.1    Rehut

Punnitaan 10 g näytettä 0,01 gramman tarkkuudella ja siirretään 200 ml:n erlenmeyerkolviin. Lisätään 15,0 ml vettä, sekoitetaan ja annetaan seistä 5 minuuttia. Lisätään 35,0 ml metanoli-asetonitriiliseosta (3.5), suljetaan tulpalla ja ravistellaan 30 minuuttia ravistelijalla tai sekoitetaan magneettisekoittimella (4.1). Suodatetaan liuos lasikuitusuodatinpaperin läpi (4.2). Tämä liuos säilytetään puhdistusta (5.3) varten.

5.2.2    Esiseokset (karbadoksipitoisuus 0,1 –2,0 %)

Punnitaan 1 g jauhamatonta näytettä 0,001 gramman tarkkuudella ja siirretään 200 ml:n erlenmeyerkolviin. Lisätään 15,0 ml vettä, sekoitetaan ja annetaan seistä 5 minuuttia. Lisätään 35,0 ml metanoli-asetonitriiliseosta (3.5), suljetaan tulpalla ja ravistellaan 30 minuuttia ravistelijalla tai sekoitetaan magneettisekoittimella (4.1). Suodatetaan liuos lasikuitusuodatinpaperin läpi (4.2).

Pipetoidaan määräosa suodoksesta 50 ml:n mittapulloon. Lisätään 15,0 ml vettä, täytetään merkkiin asti metanoli-asetonitriilillä (3.5) ja sekoitetaan. Lopullisen liuoksen karbadoksipitoisuuden pitää olla noin 10 μg/ml. Suodatetaan osa 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi (4.6).

Tehdään HPLC-määritys (5.4).

5.2.3    Lisäainevalmisteet (karbadoksipitoisuus > 2 %)

Punnitaan 0,2 g jauhamatonta näytettä 0,001 gramman tarkkuudella ja siirretään 250 ml:n erlenmeyerkolviin. Lisätään 45,0 ml vettä, sekoitetaan ja annetaan seistä 5 minuuttia. Lisätään 105,0 ml metanoli-asetonitriiliseosta (3.5), suljetaan tulpalla ja homogenoidaan. Pidetään näytettä ultraäänihauteessa (4.7) 15 minuuttia, minkä jälkeen liuosta ravistellaan tai sekoitetaan 15 minuuttia (4.1). Suodatetaan liuos lasikuitusuodatinpaperin läpi (4.2).

Laimennetaan määräosa suodosta vesi-metanoli-asetonitriiliseoksella (3.12) siten, että lopullisen liuoksen karbadoksipitoisuus on 10–15 μg/ml (10-prosenttisen lisäainevalmisteen laimennuskerroin on 10). Suodatetaan osa 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi (4.6).

Tehdään HPLC-määritys (5.4).

5.3   Puhdistus

5.3.1    Alumiinioksidikolonnin valmistus

Punnitaan 4 g alumiinioksidia (3.4) ja siirretään se lasikolonniin (4.3).

5.3.2    Näytteen puhdistus

Lisätään 15 ml suodatettua uutetta (5.2.1) alumiinioksidikolonniin; ensimmäiset 2 ml eluaattia heitetään pois. Seuraavat 5 ml otetaan talteen ja suodatetaan osa 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi (4.6).

Tehdään HPLC-määritys (5.4).

5.4   HPLC-määritys

5.4.1    Muuttujat

Seuraavat olosuhteet ovat ohjeellisia, ja myös muita muuttujia voidaan käyttää, jos niillä saadaan vastaavat tulokset:

Kromatografiajärjestelmän stabiilisuus tarkistetaan injektoimalla useita kertoja 5,0 μg/ml karbadoksia sisältävää kalibrointiliuosta (3.11.2), kunnes piikkien korkeudet (pinta-alat) ja retentioajat pysyvät vakioina.

5.4.2    Kalibrointikäyrä

Injektoidaan jokaista kalibrointiliuosta (3.11.2) useita kertoja ja mitataan kutakin konsentraatiota vastaavat karbadoksipiikkien korkeudet (pinta-alat). Kalibrointikäyrä piirretään siten, että y-akselilla ovat kalibrointiliuosten piikkien korkeuksien (pinta alojen) keskiarvot ja x-akselilla vastaavat konsentraatiot μg/ml.

5.4.3    Näyteliuos

Injektoidaan näyteuutetta (rehuseosten (5.3.2), esiseosten (5.2.2) ja lisäainevalmisteiden (5.2.3)) useita kertoja ja määritetään karbadoksipiikkien korkeuksien (pinta-alojen) keskiarvo.

6.   Tulosten laskeminen

Näyteliuoksen karbadoksipitoisuus μg/ml lasketaan karbadoksipiikkien korkeuksien (pinta-alan) keskiarvosta kalibrointikäyrän (5.4.2) avulla.

6.1   Rehut

Näytteen karbadoksipitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla:

[mg/kg]

jossa:

c

=

näyteuutteen (5.3.2) karbadoksipitoisuus (μg/ml),

V1

=

uuttoliuoksen tilavuus (ml) (ts. 50),

m

=

näyte-erän paino (g).

6.2   Esiseokset ja lisäainevalmisteet

Näytteen karbadoksipitoisuus w (mg/kg) lasketaan seuraavan kaavan avulla:

[mg/kg]

jossa:

c

=

näyteuutteen (5.2.2 tai 5.2.3) karbadoksipitoisuus (μg/ml),

V2

=

uuttoliuoksen tilavuus (ml) (ts. 50 esiseoksille, 150 lisäainevalmisteille),

f

=

laimennuskerroin 5.2.2 kohdan (esiseokset) tai 5.2.3 kohdan (lisäainevalmisteet) mukaisesti,

m

=

näyte-erän paino (g).

7.   Tulosten validointi

7.1   Tutkittavan aineen tunnistaminen

Tutkittavan aineen tunnistaminen voidaan varmentaa yhteiskromatografialla tai diodirividetektorilla, mikä mahdollistaa näytteen uuttoliuoksen ja 10,0 μl/ml karbadoksia sisältävän kalibrointiliuoksen (3.11.2) spektrien vertailun.

7.1.1    Yhteiskromatografia

Näytteen uuttoliuokseen lisätään sopiva määrä kalibrointiliuosta (3.11.2). Lisätyn karbadoksimäärän on oltava suunnilleen sama kuin näyteliuoksen karbadoksin määrä.

Ainoastaan karbadoksipiikin korkeus saa kasvaa, kun otetaan huomioon sekä lisätty määrä karbadoksia että näyteliuoksen laimeneminen. Piikin leveyden on oltava sen puolikorkeudella noin 10 % sen alkuperäisestä leveydestä.

7.1.2    Diodirividetektorimääritys

Tulokset arvioidaan seuraavien arviontiperusteiden mukaisesti:

Jos jokin näistä edellytyksistä ei täyty, tutkittavan aineen esiintymistä ei ole vahvistettu.

7.2   Toistettavuus

Kun karbadoksipitoisuus on 10 mg/kg tai suurempi, kahden rinnakkaisen samasta näytteestä tehdyn määrityksen tulosten ero ei saa olla suurempi kuin 15 % suuremmasta rinnakkaistuloksesta.

7.3   Saanto

Sellaisen nollanäytteen saannon, johon on lisätty määritettävää ainetta, on oltava vähintään 90 %.

8.   Laboratorioiden välisen vertailun tulokset

Laboratorioiden välisessä tutkimuksessa analysoitiin 6 rehuseosta, 4 esiseosta ja 3 lisäainevalmistetta kahdeksassa laboratoriossa. Kukin näyte määritettiin kaksi kertaa. (Tarkempia tietoja tästä laboratorioiden välisestä tutkimuksesta löytyy julkaisusta Journal of AOAC International, Volume 71, 1988, s. 484–490.) Tulokset (lukuun ottamatta poikkeavia arvoja) olivat seuraavat:

L

=

laboratorioiden lukumäärä

n

=

yksittäisten arvojen lukumäärä

Sr

=

toistettavuuden keskihajonta

CVr

=

toistettavuuden variaatiokerroin

SR

=

uusittavuuden keskihajonta

CVR

=

uusittavuuden variaatiokerroin.

---

LIITE IX

6 ARTIKLASSA TARKOITETUT VASTAAVUUSTAULUKOT

1.   Direktiivi 71/250/ETY

2.   Direktiivi 71/393/ETY

3.   Direktiivi 72/199/ETY

4.   Direktiivi 73/46/ETY

5.   Direktiivi 76/371/ETY

6.   Direktiivi 76/372/ETY

7.   Direktiivi 78/633/ETY

8.   Direktiivi 81/715/ETY

9.   Direktiivi 84/425/ETY

10.   Direktiivi 86/174/ETY

11.   Direktiivi 93/70/ETY

12.   Direktiivi 93/117/EY

13.   Direktiivi 98/64/EY

14.   Direktiivi 1999/27/EY

15.   Direktiivi 1999/76/EY

16.   Direktiivi 2000/45/EY

17.   Direktiivi 2002/70/EY

18.   Direktiivi 2003/126/EY

---

( 1 ) EUVL L 268, 18.10.2003, s. 29.

( 2 ) EYVL L 140, 30.5.2002, s. 10.

( 3 ) EUVL L 70, 16.3.2005, s. 1.

( 4 ) Kaikki kokkareet on hienonnettava (tarvittaessa ottamalla ne erilleen näytteestä ja panemalla ne hienonnettuna näytteeseen takaisin).

( 5 ) Paitsi jos kyse on karkearehusta tai nurmirehusta, jonka ominaispaino on pieni.

( 6 ) Paitsi jos kyse on karkearehusta tai nurmirehusta, jonka ominaispaino on pieni.

( 7 ) EUVL L 229, 1.9.2009, s. 1.

( 7 ) Viljan, jauhojen, suurimoiden ja rouheiden kuivaamiseen lämpökaapin lämpökapasiteetin on oltava sellainen, että 13 oC:seen etukäteen säädettynä kaapin lämpötila palautuu ennalleen alle 45 minuutissa sen jälkeen, kun siellä on samanaikaisesti suurin mahdollinen määrä näytteitä. Kaapin tuuletuksen on oltava sellainen, että kun siinä kahden tunnin ajan kuivataan niin monta vehnänäytettä kuin sinne mahtuu, tulokset eroavat neljän tunnin ajan suoritetun kuivauksen tuloksista alle 0,15 %.

( 7 ) Jos rasvalle tai öljylle tehdään vielä tämän jälkeen sen laatuun liittyviä määräyksiä, kiehumakivet korvataan lasihelmillä.

( 7 ) EYVL L 125, 23.5.1996, s. 35.

( 7 ) Vertailun järjestäjä: Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA), rehutyöryhmä.

( 7 ) Vertailun järjestäjä: Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA), rehutyöryhmä.

( 7 ) Myös muita hajotusmenetelmiä (kuten mikroaaltouunihajotusta paineen alaisena) voidaan käyttää sillä edellytyksellä, että niiden on osoitettu antavan samanlaiset tulokset.

( 7 ) Vihreisiin rehuihin (tuoreisiin tai kuivattuihin) oletetaan sisältyvän suuria määriä kasvisperäisiä piiyhdisteitä, jotka saattavat sitoa mikromineraaleja, ja jotka on siksi poistettava. Sellaisten rehujen tarkastuksessa on siksi sovellettava seuraavaa muutettua menettelyä. Menetellään 5.1.1.1 alakohdassa esitetyllä tavalla aina suodattamisvaiheeseen asti. Pestään suodatinpaperi, jossa on liukenemattomat jäämät, kahteen kertaan kiehuvalla vedellä ja siirretään ne kvartsi- tai platinaupokkaaseen. Poltetaan tuhkaksi muhveliuunissa (4.1) alle 550 oC:ssa kunnes kaikki hiilipitoinen aines on hävinnyt kokonaan. Annetaan jäähtyä, lisätään muutama tippa vettä ja sen jälkeen 10–15 ml fluorivetyhappoa (3.4) ja haihdutetaan kuivaksi noin 150 oC:ssa. Jos jäännökseen jää piiyhdisteitä, se liuotetaan uudelleen muutamaan millilitraan fluorivetyhappoa (3.4) ja haihdutetaan kuivaksi. Lisätään viisi tippaa rikkihappoa (3.5) ja kuumennetaan kunnes valkoinen savu on haihtunut. Lisätään viisi tippaa kloorivetyhappoa, 6 mol/l (3.2), ja noin 30 ml vettä, kuumennetaan ja suodatetaan liuos 250 ml:n vetoiseen mittapulloon ja täytetään merkkiin asti vedellä (HCl-pitoisuus on noin 0,5 mol/l). Sen jälkeen jatketaan menettelyä 5.1.2 kohdasta alkaen.

( 7 ) The Analyst 108, 1983, s. 1 252–1 256.

( *1 ) Analyst, 1995, 120, 2175–2180.

( 8 ) PCDD-yhdisteiden, PCDF-yhdisteiden ja dioksiinien kaltaisten PCB-yhdisteiden toksisuusekvivalenssikertoimia (Toxic Equivalency Factor, TEF) koskeva taulukko: Ihmisille aiheutuvan riskin arvioinnissa käytettävät WHO:n toksisuusekvivalenssikertoimet (TEF) perustuvat Genevessä kesäkuussa 2005 pidetyn Maailman terveysjärjestön (WHO) asiantuntijakokouksen päätelmiin (Martin van den Berg et al., The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds. Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Käytetyt lyhenteet: T = tetra; Pe = penta; Hx = heksa; Hp = hepta; O = okta; CDD = klooridibentsodioksiini; CDF = klooridibentsofuraani; CB = klooribifenyyli.

( 9 ) Komission päätös 2002/657/EY, tehty 14 päivänä elokuuta 2002, neuvoston direktiivin 96/23/EY täytäntöönpanosta määritysmenetelmien suorituskyvyn ja tulosten tulkinnan osalta (EYVL L 221, 17.8.2002, s. 8).

( 10 ) Tarvittaessa on noudatettava asiakirjassa ”Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en) kuvattuja periaatteita.

( 11 ) Suurimmat arvot: kunkin määrittämättä jääneen kongeneerin arvon oletetaan olevan määritysrajaa vastaava arvo. Pienimmät arvot: kunkin määrittämättä jääneen kongeneerin arvon oletetaan olevan nolla. Väliarvot: kunkin määrittämättä jääneen kongeneerin arvon oletetaan olevan puolet määritysrajaa vastaavasta arvosta. Rinnakkaismääritys: tarkasteltavien analyyttien erillinen määrittäminen käyttäen toista osaa samasta homogenoidusta näytteestä.

( 12 ) Yleisesti sovelletaan liitteessä II olevan C luvun 3 kohdassa vahvistettuja rinnakkaismääritystä koskevia vaatimuksia. Kuitenkin menetelmissä, joissa käytetään 13C-leimattua sisäistä standardia asianomaisten analyyttien osalta, rinnakkaismääritys on tarpeen ainoastaan, jos ensimmäisen määrityksen tulos ei ole vaatimustenmukainen. Rinnakkaismääritys on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Jos määritys suoritetaan kontaminaatiotapauksen yhteydessä, varmistus rinnakkaismäärityksellä voidaan jättää tekemättä, mikäli määritykseen valitut näytteet liittyvät jäljitettävyyden perusteella kontaminaatiotapaukseen ja havaittu määrä ylittää huomattavasti enimmäismäärän.

( 13 ) Yleisesti sovelletaan liitteessä II olevan C luvun 2 kohdassa vahvistettuja rinnakkaismääritystä koskevia vaatimuksia. Kuitenkin varmistusmenetelmissä, joissa käytetään 13C-leimattua sisäistä standardia asianomaisten analyyttien osalta, rinnakkaismääritys on tarpeen ainoastaan, jos ensimmäisen määrityksen tulos ei ole vaatimustenmukainen. Rinnakkaismääritys on tarpeen, jotta voidaan sulkea pois mahdollinen sisäinen ristikontaminaatio tai näytteiden sekoittuminen vahingossa. Jos määritys suoritetaan kontaminaatiotapauksen yhteydessä, varmistus rinnakkaismäärityksellä voidaan jättää tekemättä, mikäli määritykseen valitut näytteet liittyvät jäljitettävyyden perusteella kontaminaatiotapaukseen ja havaittu määrä ylittää huomattavasti enimmäismäärän.

( 14 ) Toimintarajojen tarkistukseen liittyvään rinnakkaismääritykseen sovelletaan samoja kriteerejä ja vaatimuksia kuin enimmäismääriin, ks. edellä oleva alaviite 2.

( 15 ) Toimintarajojen tarkistukseen liittyvään rinnakkaismääritykseen sovelletaan samoja kriteerejä ja vaatimuksia kuin enimmäismääriin, ks. alaviite 7.

( 16 ) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 183/2005, annettu 12 päivänä tammikuuta 2005, rehuhygieniaa koskevista vaatimuksista (EUVL L 35, 8.2.2005, s. 1).

( 17 ) Bioanalyyttiset menetelmät eivät kohdistu suoraan TEF-järjestelmään sisältyviin kongeneereihin. Näyteuutteessa voi olla muita rakenteellisesti samankaltaisia AhR-aktiivisia yhdisteitä, jotka vaikuttavat kokonaisvasteeseen. Sen vuoksi bioanalyyttisillä menetelmillä saadut tulokset eivät ole arvio näytteen TEQ-arvosta vaan viite siitä.

( 18 ) ”Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en), ”Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 19 ) Nykyiset vaatimukset perustuvat seuraavassa asiakirjassa julkaistuihin TEF-arvoihin: M. Van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 20 ) Mukana eluoituvia samantyyppisiä kongeneereja ovat usein esimerkiksi PCB 28/31, PCB 52/69 ja PCB 138/163/164. GC-MS-menetelmien osalta on otettava huomioon myös mahdolliset useampia klooriatomeja sisältävien molekyylien osien aiheuttamat häiriöt.

( 21 ) Tarvittaessa on noudatettava asiakirjassa ”Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en) kuvattuja periaatteita.

( 22 ) On erittäin suositeltavaa, että reagenssinolla vaikuttaa vain vähän näytteessä olevan kontaminantin tasoon. Laboratorion on seurattava nollatasojen vaihtelua etenkin, jos nollatasot vähennetään mittausarvoista.

( 23 ) Nykyiset vaatimukset perustuvat seuraavassa asiakirjassa julkaistuihin TEF-arvoihin: M. Van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 24 ) http://eurl.craw.eu/

( 25 ) http://eurl.craw.eu/

( 26 ) Luettelo näistä määrityksen kohteena oleville kullekin eläinlajille vahvistetuista koettimista ja alukkeista on saatavana EURL-AP:in verkkosivustolla.

( 27 ) Esimerkkejä toimivista Master Mix -liuoksista on saatavana EURL-AP:n verkkosivustolla.