1991R2568 — FI — 16.10.2015 — 028.001

---

Tämä asiakirja on ainoastaan dokumentointitarkoituksiin. Toimielimet eivät vastaa sen sisällöstä.

►B	KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91, annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991, oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä (EUVL L 248 5.9.1991, s. 1)

Muutettu:

		Virallinen lehti
		N:o	sivu	päivämäärä
►M1	KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 3682/91, annettu 17 päivänä joulukuuta 1991,	L 349	36	18.12.1991
M2	KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 1429/92, annettu 26 päivänä toukokuuta 1992,	L 150	17	2.6.1992
M3	KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 1683/92, annettu 29 päivänä kesäkuuta 1992,	L 176	27	30.6.1992
M4	KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 1996/92, annettu 15 päivänä heinäkuuta 1992,	L 199	18	18.7.1992
►M5	KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 3288/92, annettu 12 päivänä marraskuuta 1992,	L 327	28	13.11.1992
►M6	KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 183/93, annettu 29 päivänä tammikuuta 1993,	L 22	58	30.1.1993
M8	KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 620/93, annettu 17 päivänä maaliskuuta 1993,	L 66	29	18.3.1993
M9	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 177/94, annettu 28 päivänä tammikuuta 1994,	L 24	33	29.1.1994
M10	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 2632/94, annettu 28 päivänä lokakuuta 1994,	L 280	43	29.10.1994
►M11	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 656/95, annettu 28 päivänä maaliskuuta 1995,	L 69	1	29.3.1995
M12	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 2527/95, annettu 27 päivänä lokakuuta 1995,	L 258	49	28.10.1995
M13	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 2472/97, annettu 11 päivänä joulukuuta 1997,	L 341	25	12.12.1997
M14	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 282/98, annettu 3 päivänä helmikuuta 1998,	L 28	5	4.2.1998
M15	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 2248/98, annettu 19 päivänä lokakuuta 1998,	L 282	55	20.10.1998
M16	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 379/1999, annettu 19 päivänä helmikuuta 1999,	L 46	15	20.2.1999
M17	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 455/2001, annettu 6 päivänä maaliskuuta 2001,	L 65	9	7.3.2001
M18	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 2042/2001, annettu 18 päivänä lokakuuta 2001,	L 276	8	19.10.2001
►M19	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 796/2002, annettu 6 päivänä toukokuuta 2002,	L 128	8	15.5.2002
►M20	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 1989/2003, annettu 6 päivänä marraskuuta 2003,	L 295	57	13.11.2003
►M21	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 702/2007, annettu 21 päivänä kesäkuuta 2007,	L 161	11	22.6.2007
M22	KOMISSION ASETUS (EY) N:o 640/2008, annettu 4 päivänä heinäkuuta 2008,	L 178	11	5.7.2008
►M23	KOMISSION ASETUS (EU) N:o 61/2011, annettu 24 päivänä tammikuuta 2011	L 23	1	27.1.2011
M24	KOMISSION TÄYTÄNTÖÖNPANOASETUS (EU) N:o 661/2012, annettu 19 päivänä heinäkuuta 2012,	L 192	3	20.7.2012
►M25	KOMISSION TÄYTÄNTÖÖNPANOASETUS (EU) N:o 299/2013, annettu 26 päivänä maaliskuuta 2013,	L 90	52	28.3.2013
►M26	KOMISSION TÄYTÄNTÖÖNPANOASETUS (EU) N:o 1348/2013, annettu 16 päivänä joulukuuta 2013,	L 338	31	17.12.2013
►M27	KOMISSION DELEGOITU ASETUS (EU) 2015/1830, annettu 8 päivänä heinäkuuta 2015,	L 266	9	13.10.2015
►M28	KOMISSION TÄYTÄNTÖÖNPANOASETUS (EU) 2015/1833, annettu 12 päivänä lokakuuta 2015,	L 266	29	13.10.2015

Oikaisu

C1	Oikaisu, EUVL L 078, 24.3.2011, s.  71 (61/2011,)

(*)	Tätä asiakirjaa ei ole julkaistu suomenkielisenä.

---

▼B

KOMISSION ASETUS (ETY) N:o 2568/91,

annettu 11 päivänä heinäkuuta 1991,

oliiviöljyn ja uutetun oliiviöljyn ominaisuuksista sekä niiden määritysmenetelmistä

▼M20

1 artikla

1.  Öljyjä, joiden ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 1 ja 2 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevan 1 kohdan a ja b alakohdassa tarkoitettuina neitsytoliiviöljyinä.

2.  Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 3 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 1 c kohdassa tarkoitettuna oliivilamppuöljynä.

3.  Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 4 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 2 kohdassa tarkoitettuna jalostettuna oliiviöljynä.

4.  Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 5 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 3 kohdassa tarkoitettuna jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettuna oliiviöljynä.

5.  Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 6 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 4 kohdassa tarkoitettuna raakana oliivin puristemassaöljynä.

6.  Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 7 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 5 kohdassa tarkoitettuna jalostettuna oliivin puristemassaöljynä.

7.  Öljyä, jonka ominaisuudet ovat tämän asetuksen liitteessä I olevassa 8 kohdassa määritettyjen ominaisuuksien mukaiset, pidetään asetuksen N:o 136/66/ETY liitteessä olevassa 6 kohdassa tarkoitettuna oliivin puristemassaöljynä.

▼M26

2 artikla

1.  Liitteessä I säädettyjen öljyjen ominaisuudet määritetään seuraavilla määritysmenetelmillä:

▼M28

▼M26

▼M28

▼M26

▼M28 —————

▼M26

2.  Kansallisilta viranomaisilta tai näiden edustajilta edellytettävistä neitsytoliiviöljyjen aistinvaraisten ominaisuuksien tarkistuksesta vastaavat jäsenvaltioiden hyväksymät maistajaraadit.

Ensimmäisessä kohdassa tarkoitetun oliiviöljyn aistinvaraisten ominaisuuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitetun oliiviöljyluokan kanssa, jos asianomaisen jäsenvaltion hyväksymä raati vahvistaa kyseisen luokituksen.

Jos raati ei vahvista ilmoitusta ilmoitetun oliiviöljyluokan aistinvaraisten ominaisuuksien osalta, kansalliset viranomaiset tai niiden edustajat teettävät asianomaisen pyynnöstä viipymättä muilla hyväksytyillä raadeilla kaksi seurantamääritystä, joista ainakin toisen tekee asianomaisen tuottajajäsenvaltion hyväksymä raati. Kyseisten ominaisuuksien katsotaan olevan yhdenmukaisia ilmoitettujen ominaisuuksien kanssa, jos ilmoitettu luokitus vahvistetaan molemmissa seurantamäärityksissä. Päinvastaisessa tapauksessa seurantamäärityksen kustannuksista vastaa asianomainen.

3.  Kun on kyse kansallisten viranomaisten tai niiden edustajien tekemästä 1 kohdan mukaisesta öljyn ominaisuuksien toteamisesta, näytteenotto tehdään koenäytteen valmistelua ja näytteenottoa koskevia kansainvälisiä standardeja EN ISO 661 ja EN ISO 5555 noudattaen. Poiketen siitä, mitä standardissa EN ISO 5555 olevassa 6.8 kohdassa määrätään, silloin kun kyseessä ovat tällaiset pakkaukseen suorassa kosketuksessa olevat öljyt, näytteenotto tehdään kuitenkin tämän asetuksen liitteen I a mukaisesti. Kun kyseessä on pakkaamaton öljy, josta ei voida ottaa näytettä standardin EN ISO 5555 mukaisesti, näytteenotto tehdään jäsenvaltion toimivaltaisen viranomaisten ohjeiden mukaisesti.

Rajoittamatta standardin EN ISO 5555 ja standardissa EN ISO 661 olevan 6 luvun määräysten soveltamista näytteet on sijoitettava viipymättä valolta ja lämmöltä suojattuun paikkaan ja lähetettävä laboratorioon määritettäviksi viimeistään näytteenottoa seuraavana viidentenä työpäivänä; muussa tapauksessa näytteet on säilytettävä niin, että ne eivät heikenny tai vahingoitu kuljetuksen tai varastoinnin aikana ennen laboratorioon lähettämistä.

4.  Edellä 3 kohdassa tarkoitettua todentamista varten liitteissä II, III, IX, XII ja XX tarkoitetut määritykset ja tapauksen mukaan kansallisessa lainsäädännössä säädetyt vastamääritykset on tehtävä ennen vähimmäissäilymisajan päättymistä, kun kyseessä ovat pakatut tuotteet. Kun kyseessä ovat pakkaamattomat öljyt, määritykset on tehtävä kuuden kuukauden kuluessa näytteenottokuukaudesta.

Muihin tässä asetuksessa säädettyihin määrityksiin ei sovelleta määräaikoja.

Jos määritysten tulokset eivät vastaa oliiviöljyn tai oliivin puristemassaöljyn ilmoitetun luokan ominaisuuksia, asianomaisen on ilmoitettava asiasta kuukauden kuluessa ensimmäisessä alakohdassa tarkoitetun määräajan päättymisestä, paitsi jos näyte on otettu vähimmäissäilymisajan päättymistä edeltävien kahden kuukauden kuluessa.

5.  Määritystuloksia verrataan suoraan tässä asetuksessa säädettyihin rajoihin oliiviöljyjen ominaisuuksien määrittelemiseksi 1 kohdan ensimmäisessä alakohdassa säädettyjä menetelmiä noudattaen.

▼M25

2 a artikla

1.  Tämän artiklan soveltamiseksi ”kaupan pidetyllä oliiviöljyllä” tarkoitetaan jäsenvaltion oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn kokonaismäärää, joka kulutetaan kyseisessä jäsenvaltiossa tai viedään sieltä.

2.  Jäsenvaltioiden on sen varmistamiseksi, että kaupan pidetty oliiviöljy on ilmoitetun luokan mukaista, huolehdittava, että vaatimustenmukaisuustarkastukset tehdään valikoivasti riskianalyysin perusteella ja asianmukaisin aikavälein.

3.  Riskien arviointiperusteisiin voi kuulua myös

4.  Jäsenvaltioiden on vahvistettava etukäteen

Tuhatta jäsenvaltiossa kaupan pidettyä oliiviöljytonnia kohden on tehtävä vuosittain vähintään yksi vaatimustenmukaisuustarkastus.

5.  Jäsenvaltioiden on varmistettava vaatimustenmukaisuus

▼M19 —————

▼M25

3 artikla

Jos havaitaan, ettei öljy vastaa luokan kuvausta, asianomaisen jäsenvaltion on sovellettava tehokkaita, oikeasuhteisia ja varoittavia seuraamuksia, jotka vahvistetaan havaitun poikkeaman vakavuuden mukaisesti, sanotun kuitenkaan rajoittamatta muiden mahdollisten seuraamusten soveltamista.

Jos tarkastuksissa havaitaan merkittäviä poikkeamia, jäsenvaltion on lisättävä kaupanpitämisen vaiheen, öljyluokan, alkuperän tai muiden seikkojen tarkastuksia.

▼M5

4 artikla

▼M19

1.  Jäsenvaltiot voivat hyväksyä maistajaraateja, jotta kansalliset viranomaiset tai niiden edustajat voivat arvioida ja valvoa aistinvaraisia ominaisuuksia.

Jäsenvaltioiden on vahvistettava hyväksymistä koskevat edellytykset etenkin siten, että:

Kunkin jäsenvaltion on toimitettava komissiolle luettelo hyväksytyistä raadeista ja tämän kohdan mukaisesti toteutetuista toimenpiteistä.

▼M5

2.  Jos jäsenvaltiolla on vaikeuksia maistajien raadin perustamisessa omalle alueelleen, se voi käyttää toisen jäsenvaltion hyväksyttyä maistajien raatia.

3.  Kunkin jäsenvaltion on laadittava luettelo ammattijärjestöjen tai ammattien välisten järjestöjen 1 kohdan edellytysten mukaisesti perustamista maistajien raadeista ja niiden on valvottava näiden edellytysten noudattamista.

▼M19 —————

▼B

6 artikla

1.  Oliiviöljyn erottamisesta syntyneen öljykakun ja muiden yhdistetyn nimikkeistön CN-koodeihin 2306 90 11 ja 2306 90 19 kuuluvien jätteiden öljypitoisuus määritetään liitteen XV menetelmän mukaisesti.

2.  Edellä 1 kohdassa tarkoitettu öljypitoisuus ilmaistaan öljyn painoprosenttina kuiva-aineesta.

▼M20

7 artikla

Haitallisten aineiden osalta sovelletaan niiden esiintymistä koskevia yhteisön säännöksiä.

Halogeeniliuottimien pitoisuuden osalta raja-arvot ovat kaikkien oliiviöljyluokkien osalta seuraavat:

▼M25

7 a artikla

Luonnollisten henkilöiden, oikeushenkilöiden tai henkilöryhmittymien, joilla on hallussaan oliiviöljyä tai oliivin puristemassaöljyä jossakin vaiheessa puristamosta pullotusvaiheeseen mihin tahansa ammatillisiin tai kaupallisiin tarkoituksiin, on pidettävä jokaisen öljyluokan osalta kirjaa varastoonvienneistä ja varastostapoistoista.

Jäsenvaltion on varmistettava, että ensimmäisessä kohdassa säädettyä velvollisuutta noudatetaan asianmukaisesti.

▼M25

8 artikla

1.  Jäsenvaltioiden on annettava tämän asetuksen täytäntöönpanotoimenpiteet komissiolle tiedoksi. Niiden on ilmoitettava komissiolle kaikista myöhemmistä muutoksista.

2.  Jäsenvaltioiden on vuosittain viimeistään 31 päivänä toukokuuta annettava komissiolle kertomus tämän asetuksen täytäntöönpanosta edellisenä kalenterivuonna. Kertomuksessa on oltava vähintään oliiviöljyille tehtyjen vaatimustenmukaisuustarkastusten tulokset, jotka on ilmoitettava liitteessä XXI esitetyn mallin mukaisesti.

3.  Tässä asetuksessa tarkoitetut ilmoitukset on tehtävä komission asetuksen (EY) N:o 792/2009 ( 5 ) mukaisesti.

▼B

9 artikla

Kumotaan asetus (ETY) N:o 1058/77.

10 artikla

1.  Tämä asetus tulee voimaan seuraavana päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteisöjen virallisessa lehdessä. Liitteen XII menetelmä on kuitenkin otettava käyttöön ►M1  1 päivästä marraskuuta 1992 ◄ , interventioon liittyviä toimia lukuun ottamatta.

▼M5

Tämä menetelmä ei koske ennen 1 päivää marraskuuta 1992 pakattuja neitsytoliiviöljyjä.

▼B

2.  Tämä asetus ei koske ennen tämän asetuksen voimaantuloa pakattua ja 31 päivään lokakuuta 1992 asti kaupan pidettyä oliiviöljyä tai uutettua oliiviöljyä.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

---

LIITTEET

Yhteenveto

▼M27

---

LIITE I

OLIIVIÖLJYJEN OMINAISUUDET

Huomautukset:

---

Lisäys

PÄÄTÖKSENTEKOJÄRJESTELMÄ

Kampesterolia koskeva päätöksentekokaavio neitsytoliiviöljyä ja ekstra-neitsytoliiviöljyä varten:

Muiden parametrien on vastattava asetuksen mukaisia rajoja.

δ-7-stigmastenolia koskeva päätöksentekojärjestelmä:

Muiden parametrien on vastattava asetuksen mukaisia rajoja.

▼M26

---

LIITE I a

NÄYTTEENOTTO OLIIVIÖLJYISTÄ TAI OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYISTÄ, JOTKA TOIMITETAAN TUOTTEESEEN SUORASSA KOSKETUKSESSA OLEVISSA PAKKAUKSISSA

Tätä näytteenottomenetelmää sovelletaan oliiviöljy- tai oliivin puristemassaöljyeriin, jotka toimitetaan suorassa kosketuksessa tuotteeseen olevissa pakkauksissa. Näytteenottomenetelmä vaihtelee sen mukaan, onko suorassa kosketuksessa tuotteeseen olevan pakkauksen vetoisuus yli viisi litraa vai ei.

Ilmaisulla ”erä” tarkoitetaan kaikkia myyntiyksiköitä, jotka on tuotettu, valmistettu ja pakattu sellaisissa olosuhteissa, että kunkin tällaisen myyntiyksikön sisältämää öljyä pidetään yhdenmukaisena kaikkien analyyttisten ominaisuuksien osalta. Erä on yksilöitävä Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivin 2011/91/EU ( 6 ) mukaisesti.

”Näyteyksiköllä” tarkoitetaan tuotteeseen kosketuksessa olevaan pakkaukseen sisältyvää öljymäärää, joka otetaan erästä satunnaisotannalla.

1.   PERUSNÄYTTEEN SISÄLTÖ

1.1.    Tuotteeseen kosketuksessa olevat, vetoisuudeltaan enintään viiden litran pakkaukset

Tuotteeseen kosketuksessa olevista, vetoisuudeltaan enintään viiden litran pakkauksista otetulla ”perusnäytteellä” tarkoitetaan erästä taulukon 1 mukaisesti otettujen näyteyksiköiden lukumäärää.

Jokainen jäsenvaltio voi lisätä perusnäytteen muodostavien taulukossa 1 tarkoitettujen pakkausten määrää omien tarpeidensa mukaan (esimerkiksi, jotta aistinvaraisen arvioinnin voi tehdä eri laboratorio kuin kemialliset analyysit, vastamäärityksiä varten jne.).

1.2.    Tuotteeseen kosketuksessa olevat, vetoisuudeltaan yli viiden litran pakkaukset

Tuotteeseen kosketuksessa olevista, vetoisuudeltaan yli viiden litran pakkauksista otetulla ”perusnäytteellä” tarkoitetaan edustavaa otosta kaikista näyteyksiköistä, jotka on saatu jakomenettelyn avulla ja taulukon 2 mukaisesti. Perusnäyte on muodostettava useista kappaleista.

Perusnäytteen ”kappaleella” tarkoitetaan kutakin perusnäytteeseen kuuluvaa pakkausta.

Jotta tuotteeseen kosketuksessa olevien pakkausten näytteenoton määrää voidaan pienentää, näyteyksiköiden sisältö homogenisoidaan perusnäytteen valmistamiseksi. Eri näyteyksiköiden annokset kaadetaan yhteen säiliöön ja homogenisoidaan sekoittamalla siten, että näyte suojataan ilmalta mahdollisimman hyvin.

Perusnäytteen sisältö kaadetaan useisiin, vetoisuudeltaan vähintään 1,0 litran pakkauksiin, joista jokainen muodostaa perusnäytteen kappaleen.

Jokainen jäsenvaltio voi lisätä perusnäytteiden lukumäärää omien tarpeidensa mukaan (esimerkiksi, jotta aistinvaraisen arvioinnin voi tehdä eri laboratorio kuin kemialliset analyysit, vastamäärityksiä varten jne.).

Jokainen pakkaus on täytettävä siten, että pintaan jäävä ilmakerros on mahdollisimman pieni, ja pakkaus on suljettava asianmukaisesti ja sinetöitävä sen varmistamiseksi, että tuotetta ei voida muuttaa.

Kappaleet on merkittävä siten, että ne voidaan tunnistaa virheettömästi.

2.   MÄÄRITYKSET JA TULOKSET

3.   ERÄN LUOKAN TARKISTAMINEN

---

LIITE I b

PÄÄTÖKSENTEKOJÄRJESTELMÄ SEN TODENTAMISEKSI, ONKO OLIIVIÖLJYNÄYTE ILMOITETUN LUOKAN MUKAINEN

Taulukko 1

Taulukko 2

Taulukko 3

---

Lisäys 1

▼B

---

LIITE II

▼M21

VAPAIDEN RASVAHAPPOJEN MÄÄRITTÄMINEN KYLMÄMENETELMÄLLÄ

▼B

1   TARKOITUS

Vapaiden rasvahappojen määrittäminen oliiviöljyistä. Vapaiden rasvahappojen pitoisuus ilmaistaan tavanomaisesti laskettuna happamuutena.

1.1   Periaate

Näyte liuotetaan liuotinseokseen ja vapaat rasvahapot titrataan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella.

1.2   Reagenssit

Kaikkien reagenssien on oltava määritykseen hyväksyttyä analyysilaatua ja veden on oltava joko tislattua tai vastaavaa puhtausastetta.

1.2.1

Dietyylieetteri ja 95-prosenttinen etanoli (V/V), yhtä suuret tilavuusosat kumpaakin. Huom.: Dietyylieetteri on helposti syttyvää ja voi muodostaa räjähtäviä peroksideja. Sen käytössä on oltava erittäin varovainen. Seos, johon on lisätty 0,3 ml fenoliftaleiiniliuosta (1.2.3) 100 ml:aan, neutraloidaan juuri ennen käyttöä kaliumhydroksidiliuoksella (1.2.2), Huom.: Jos ei voida käyttää dietyylieetteriä, voidaan käyttää etanolin ja tolueenin seosta. Etanoli voidaan tarvittaessa korvata 2-propanolilla.

1.2.2

Kaliumhydroksidi titrattuna etanoliliuoksena, c(KOH) noin 0,1 mol/l tai tarvittaessa c(KOH) noin 0,5 mol/l. Kaliumhydroksidin etanoliliuoksen tarkka väkevyys on tunnettava ja tarkistettava juuri ennen käyttöä. Käytetään liuosta, joka on valmistettu vähintään viisi vuorokautta ennen käyttöä ja dekantoitu ruskeaan lasipulloon, jossa on kumitulppa. Liuoksen on oltava väritöntä tai oljenkeltaista. Huom.: Väritön, stabiili kaliumhydroksidiliuos voidaan valmistaa seuraavasti. Kuumennetaan kiehuvaksi 1 000 ml etanolia, johon on lisätty 8 g kaliumhydroksidia ja 0,5 g alumiinilastuja, ja keitetään seosta yksi tunti palautusjäähdyttimen kanssa. Tislataan välittömästi. Tisleeseen liuotetaan tarvittava määrä kaliumhydroksidia. Annetaan seistä useita vuorokausia ja dekantoidaan kirkas neste, joka on kaliumkarbonaattisakan yläpuolella. Liuos voidaan myös valmistaa ilman tislausta seuraavasti: lisätään 4 ml alumiinibutylaattia 1 000 ml:aan etanolia ja seoksen annetaan seistä joitakin vuorokausia. Dekantoidaan sakan yläpuolinen neste ja liuotetaan siihen tarvittava määrä kaliumhydroksidia. Liuos on käyttövalmis.

1.2.3

Fenoliftaleiini, 10 g liuotettuna litraan 95- tai 96-prosenttista etanolia (V/V) tai, jos rasva on kovin tummaa, alkalisini, 20 g liuotettuna litraan 95- tai 96-prosenttista etanolia (V/V).

1.3   Välineistö

Tavanomainen laboratoriovälineistö ja erityisesti:

1.3.1

Analyysivaaka

1.3.2

Erlenmeyerpullo, 250 ml

1.3.3

Byretti, 10 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,05 ml.

1.4   Suoritus

1.4.1

Näytteen esikäsittely määritystä varten Määritys tehdään suodatetusta näytteestä. Jos veden ja epäpuhtauksien kokonaispitoisuus on pienempi kuin 1 %, voidaan määritys tehdä näytteestä sellaisenaan.

1.4.2

Näytteenotto Näyte otetaan oletetun happamuuden perusteella seuraavan taulukon mukaan: Oletettu happoluku Näytemäärä (g) Näytteen punnitustarkkuus (g) < 1 20 0,05 1—4 10 0,02 4—15 2,5 0,01 15—75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Näyte punnitaan erlenmeyerpullossa (1.3.2).

1.4.3

Määritys Näyte (1.4.2) liuotetaan 50—150 ml:aan ennalta neutraloitua dietyylieetteri/etanoli-seosta (1.2.1). Titrataan, koko ajan sekoittaen, 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuoksella (1.2.2) (ks. Huom. 2), kunnes indikaattorin väri muuttuu (fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri säilyy vähintään 10 sekunnin ajan). Huom. 1 Titrattu kaliumhydroksidin etanoliliuos (1.2.2) voidaan korvata kalium- tai natriumhydroksidin vesiliuoksella, jos lisätty vesi ei aiheuta faasien erottumista. Huom. 2 Jos 0,1 mol/l kaliumhydroksidiliuosta tarvitaan enemmän kuin 10 ml, käytetään 0,5 mol/l liuosta. Huom. 3 Jos liuos samenee titrattaessa, liuotinseosta (1.2.1) lisätään tarpeen mukaan, kunnes liuos on kirkasta.

1.5   Happamuus: ilmaistuna oleiinihappoprosentteina

Happamuus painoprosentteina ilmaistuna on:

jossa:

V = titratun kaliumhydroksidiliuoksen tilavuus millilitroina;

c = titratun kaliumhydroksidiliuoksen tarkka pitoisuus moolia/litra;

M = tuloksen ilmaisemiseen käytetyn hapon moolimassa g/mol (= 282);

m = näytteen massa grammoina.

Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.

---

LIITE III

PEROKSIDILUVUN MÄÄRITTÄMINEN

1   TARKOITUS

Tämä standardi kuvaa rasvojen ja öljyjen peroksidiluvun määritysmenetelmän.

2   SOVELTAMISALA

Tämä standardi soveltuu eläin-ja kasvirasvojen sekä -öljyjen tutkimiseen.

3   MÄÄRITELMÄ

Peroksidiluku ilmaisee näytteessä olevien kaliumjodidia hapettavien aineiden määrän (ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti) tässä kuvatuissa koeolosuhteissa.

4   PERIAATE

Näyte liuotetaan etikkahapon ja kloroformin seokseen ja käsitellään kaliumjodidilla. Vapautuva jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella.

5   VÄLINEISTÖ

Käytettävien laitteiden on oltava puhtaita siten, että niissä ei ole mitään hapettavia tai pelkistäviä aineita.

Huom.:

Hiottuja lasipintoja ei saa rasvata.

5.1	Punnituslasi, 3 ml.

5.2	Lasipulloja, vetoisuus noin 250 ml, hiotut suut ja tulpat, etukäteen kuivattu ja täytetty puhtaalla, kuivalla inerttikaasulla (typellä tai mieluummin hiilidioksidilla).

5.3	Byretti, 25 tai 50 ml, mitta-asteikon jakoväli 0,1 ml.

6   REAGENSSIT

6.1	Analyysilaatuinen kloroformi, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.

6.2	Analyysilaatuinen jääetikka, josta happi on poistettu puhtaalla, kuivalla inerttikaasuvirralla tapahtuvalla kaasuhuuhtelulla.

6.3	Kaliumjodidin tuore, kyllästetty vesiliuos, joka ei sisällä jodia eikä jodaatteja.

6.4	Natriumtiosulfaatin vesiliuos, 0,01 tai 0,002 N, normalisoitu huolellisesti juuri ennen käyttöä.

6.5	Tärkkelysliuos, 10 g/l vesidispersio, liukoisesta luonnon tärkkelyksestä valmistettu tuore liuos.

7   NÄYTE

Huolehditaan siitä, että näyte otetaan ja säilytetään pimeässä ja kylmässä, ja että sen lasisissa säilytysastioissa ei ole tyhjää tilaa. Astiat on suljettava ilmatiiviisti joko hiotuilla lasitulpilla tai korkilla.

8   SUORITUS

Määritys tehdään hajapäivänvalossa tai keinovalossa. Näyte punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1) tai, ellei sellaista ole, pullossa (5.2). Tarvittava näytemäärä riippuu oletetusta peroksidiluvusta seuraavan taulukon mukaan:

Avataan pullo (5.2) ja asetetaan sisään punnituslasi, jossa on näyte. Lisätään 10 ml kloroformia (6.1). Liuotetaan näyte nopeasti sekoittaen. Lisätään 15 ml etikkahappoa (6.2), sitten 1 ml kaliumjodidiliuosta (6.3). Suljetaan pullo nopeasti, ravistetaan yksi minuutti ja annetaan seistä tasan viisi minuuttia pimeässä 15—25 °C:n lämpötilassa.

Lisätään noin 75 ml tislattua vettä. Vapautunut jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella (6.4) (jos oletettu peroksidiluku on alle 12, käytetään 0,002 N liuosta ja jos se on yli 12, käytetään 0,01 N liuosta) voimakkaasti sekoittaen ja indikaattorina käytetään tärkkelysliuosta (6.5).

Samasta näytteestä tehdään kaksi määritystä.

Sokeakoe tehdään samanaikaisesti. Jos sen tulos on suurempi kuin 0,05 ml 0,01 N natriumtiosulfaattiliuosta (6.4), ovat reagenssit olleet epäpuhtaita ja ne on vaihdettava.

9   TULOSTEN ESITTÄMINEN

Peroksidiluku (PV), ilmaistuna aktiivisen hapen milliekvivalentteina kilogrammaa kohti, saadaan kaavasta:

jossa:

V = määritykseen käytetyn normalisoidun natriumtiosulfaattiliuoksen (6.4) määrä millilitroina, korjattuna sokeakokeen tuloksilla;

T = määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (6.4) tarkka normaalisuus;

m = näytteen massa grammoina.

Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo.

▼M21

---

LIITE IV

VAHAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1.   TARKOITUS

Tällä menetelmällä määritetään oliiviöljyjen vahapitoisuus. Vahat eroavat toisistaan hiiliatomien lukumäärän suhteen. Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti tekemään ero puristamalla saadun oliiviöljyn ja puristemassasta saadun öljyn välillä.

2.   PERIAATE

Rasva, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kromatografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa; koeolosuhteissa ensimmäisenä eluoitunut jae (jonka polaarisuus on triglyseridien polaarisuutta heikompi) otetaan talteen ja määritetään suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.

3.   VÄLINEISTÖ

3.1	Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2	Lasikolonni kaasukromatografiaa varten, sisähalkaisija 15,0 mm ja pituus 30–40 cm, varustettu hanalla.

3.3

Soveltuva kaasukromatografialaitteisto, joka toimii kapillaarikolonnin kanssa ja jossa on suoraan kolonniin johtava näytteensyöttöjärjestelmä. Laitteiston osat ovat: 3.3.1 termostaattisäätöinen lämpötilaohjelmoitu uuni kolonnille, 3.3.2 kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin, 3.3.3 liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin, 3.3.4 integroiva piirturi, joka toimii muuntajavahvistimen (3.3.3) kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää. (On myös mahdollista käyttää tietokonepohjaisia järjestelmiä, joissa kaasukromatografin tiedot saadaan tietokoneen avulla.) 3.3.5 lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty stationäärifaasilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm. (Käyttövalmiina ostettavat stationäärifaasit ovat tyyppiä SE 52 tai SE 54.)

3.4	Mikroruisku, kolonniin suoraan syöttämiseksi, 10 μl, jossa on kiinteä neula.

3.5	Sähkökäyttöinen sekoittaja.

3.6	Pyöröhaihduttaja.

3.7	Muhveliuuni.

3.8	Analyysivaaka, jonka tarkkuus ± 0,1 mg.

3.9	Laboratorion tavanomaiset lasivälineet.

4.   REAGENSSIT

4.1	Silikageeliä, jonka hiukkaskoko 60–200 μm. Silikageeli laitetaan uuniin 500 °C:n lämpötilaan vähintään 4 tunniksi. Jäähdytetään ja lisätään vettä 2 % silikageelin määrästä. Sekoitetaan massan homogenoimiseksi. Säilytetään pimeässä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

4.2	N-heksaani, kromatografialaatua.

4.3	Etyylieetteriä, kromatografialaatua.

4.4	N-heptaani, kromatografialaatua.

4.5	Lauryyliarakidaatin standardiliuos, 0,1 % (m/V) liuos heksaanissa (sisäinen standardi). (On myös mahdollista käyttää palmityylipalmitaattia tai myristyylistearaattia.) 4.5.1 Sudan 1 (1-fenyyliatso)-2-naftoli).

4.6	Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.7	Apukaasut: — puhdas vety, kaasukromatografialaatua, — puhdas ilma, kaasukromatografialaatua.

5.   SUORITUS

5.1   Kromatografiakolonnin esikäsittely

Suspendoidaan 15 g silikageeliä (4.1) n-heksaaniin (4.2) ja laitetaan kolonniin (3.2). Annetaan laskeutua itsestään ja autetaan laskeutumista sähkökäyttöisellä sekoittajalla (3.5), jotta saadaan homogeenisempi kromatografiakerros. Suodatetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Punnitaan vaa’alla (3.8) tarkasti 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyerpulloon (3.1), lisätään sopiva määrä sisäistä standardia (4.5) oletetun vahapitoisuuden mukaan. Esimerkiksi: lauryyliarakidaattia lisätään 0,1 mg, jos on kyse oliiviöljystä, ja 0,25–0,5 mg, jos kyse on puristemassaöljystä. Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen avulla kromatografiakolonniin (4.2).

Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorboimisaineen pinnan yläpuolella, minkä jälkeen suodatetaan läpi 70 ml n-heksaania luonnostaan esiintyvien n-alkaanien poistamiseksi. Aloitetaan kromatografinen eluointi keräämällä 180 ml n-heksaani/etyylieetteriseosta, suhde 99:1, valumisnopeuden ollessa noin 15 tippaa 10 sekunnissa. Näyte eluoidaan lämpötilassa 22 °C ± 4.

Huom.

Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa (3.6), kunnes lähes kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 ml liuotinta poistetaan heikon typpivirtauksen avulla, minkä jälkeen lisätään 2–4 ml n-heptaania.

5.2   Kaasukromatografinen määritys

5.2.1   Esivalmistelut

Kolonni asennetaan kaasukromatografiin (3.3) siten, että alkupää yhdistetään on-column -järjestelmään ja loppupää detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografialaitteiden toimivuus (kaasuliitäntöjen kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän suoritusteho jne.).

Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Kevyt kaasuvirtaus johdetaan kolonnin läpi ja kaasukromatografi käynnistetään. Lämmitetään asteittain siten, että lämpötila on noin neljän tunnin kuluttua kohonnut 350 °C:een. Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, jonka jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö, liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin (3.3.4), uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin lämpötilasäätö jne.) ja signaali säädetään niin, että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin on arvioitu määrityksessä tarvittavan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.

Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuotamisesta; positiivinen ryömintä johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta.

5.2.2   Toimintaolosuhteiden valinta

Yleisesti kromatografia tehdään seuraavissa käyttöolosuhteissa:

Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien perusteella, jotta kaikki vahat saadaan erotettua, jotta piikkien erotuskyky on riittävä (ks. kuva) ja jotta sisäisen standardin C32 retentioaika on 18 ± 3 minuuttia. Edustavimpien vahojen piikin on oltava vähintään 60 % asteikon pohjasta.

Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että huomioon otettavien piikkien pinta-alat voidaan arvioida oikein.

Huom.Koska lopullinen lämpötila on korkea, sallitaan positiivinen siirtymä, joka saa kuitenkin olla enintään 10 % asteikon alarajasta.

5.3   Määritys

Imetään 10 μl:n mikroruiskuun 1 μl liuosta; vedetään männällä neula tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1–2 sekunnin kuluttua injektoidaan nopeasti; noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti pois.

Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat ovat eluoituneet täydellisesti.

Pohjaviivan on koko ajan oltava vaatimusten mukainen.

5.4   Piikkien tunnistaminen

Eri piikkien tunnistaminen suoritetaan retentioaikojen perusteella ja vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen seoksiin, joiden retentioajat tunnetaan.

Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia.

5.5   Kvantitatiivinen arviointi

Sisäisen standardin ja C40–C46 -alifaattisten esterien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla.

Lasketaan kunkin esterin vahapitoisuus, ilmoitettuna mg/kg rasvaa, seuraavasti:

jossa:

Ax

=

kunkin esterin piikin pinta-ala neliömillimetreinä

As

=

kunkin sisäisen standardin piikin pinta-ala neliömillimetreinä

ms

=

lisätyn sisäisen standardin massa milligrammoina

m

=

määritystä varten otetun näytteen massa grammoina.

6.   TULOSTEN ILMOITTAMINEN

C40–C46:n eri vahojen pitoisuuksien summa ilmoitetaan mg/kg rasvaa (ppm).

Huom.Määritetään piikkien pinta-aloista niiden komponenttien määrät, joissa on parillinen määrä C-atomeja välillä C40–C46, jäljempänä olevassa kuvassa esitetyn oliiviöljyn vahojen kromatogrammin mukaisesti. Jos C46-esteri esiintyy kahtena piikkinä, sen tunnistamiseksi on syytä analysoida oliivinpuristemassaöljyn vahojen jae, jossa C46:n piikki on helppo tunnistaa, koska se on selvästi hallitsevin.

Tulokset ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

KUVA

Oliiviöljyn vahojen kromatogrammi ( 7 )

Merkkien selitykset::

I.S.

=

lauryyliarakidaatti

1

=

diterpeeniesterit

2 + 2′

=

C40-esterit

3 + 3′

=

C42-esterit

4 + 4′

=

esterit C44

5

=

C46-esterit

6

=

steroliesterit ja triterpeenialkoholi.

---

Lisäys

Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen

Injektoidaan 1–3 μl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Mitataan aika, jonka kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).

Lineaarinopeus, cm/s, saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on aika sekunteina sekuntikellolla mitattuna.

▼M26

---

LIITE V

STEROLIEN JA TRITERPEENIDIALKOHOLIEN RAKENTEEN JA PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1.   TARKOITUS

Tällä menetelmällä voidaan määrittää yksittäisten sterolien ja triterpeenidialkoholien määrät ja niiden kokonaismäärä oliiviöljyissä ja oliivin puristemassaöljyissä.

2.   PERIAATE

Öljy, johon on lisätty α-kolestanoli sisäiseksi standardiksi, saippuoidaan kaliumhydroksidin etanoliliuoksella ja saippuoitumaton aines uutetaan etyylieetterillä.

Steroli- ja triterpeenidialkoholifraktio erotetaan saippuoitumattomasta aineksesta ohutkerroskromatografialla käyttämällä emäksistä silikageelilevyä. Silikageelistä saadut fraktiot muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään sen jälkeen kapillaarikaasukromatografialla.

3.   VÄLINEISTÖ

Tavalliset laboratoriovälineet, erityisesti seuraavat:

4.   REAGENSSIT

5.   MENETTELY

5.1.

Saippuoitumattomien aineiden esikäsittely 5.1.1. 250 ml:n pulloon (3.1 kohta) lisätään 500 μl:n mikroruiskulla (3.6 kohta) sellainen tilavuusmäärä α-kolestanolin sisäisen standardin mukaista liuosta (4.20 kohta) jonka sisältämä kolestanolin määrä on noin 10 prosenttia sterolin määrästä näytteessä. Esimerkiksi 5 gramman oliiviöljynäytteeseen lisätään 500 μl α-kolestanoliliuosta (4.20 kohta), ja jos näytteenä on oliivin puristemassaöljyä, lisätään 1 500 μl α-kolestanoliliuosta. Haihdutetaan kuiviin kevyessä typpivirrassa lämpimässä vesihauteessa ja pullon jäähdyttyä punnitaan 5 ± 0,01 g kuivattua, suodatettua näytettä samaan pulloon. Huom. 1: Eläin- ja kasviperäiset rasvat ja öljyt, jotka sisältävät paljon kolesterolia, voivat tuottaa piikin, jonka retentioaika on lähes sama kuin kolestanolin. Jos käy näin, sterolifraktio on määritettävä kahdesti niin, että toisella kertaa käytetään sisäistä standardia ja toisella ei. 5.1.2. Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta (4.2 kohta) ja hohkakiveä, käynnistetään palautusjäähdytin ja kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapahtunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuuttia, sitten lisätään 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen yläpäästä, irrotetaan jäähdytin ja jäähdytetään pullo noin 30 °C:n lämpötilaan. 5.1.3. Pullon sisältämä seos siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon (3.2 kohta) käyttämällä useita annoksia tislattua vettä (50 ml). Lisätään noin 80 ml etyylieetteriä (4.10 kohta), ravistetaan voimakkaasti noin 60 sekunnin ajan siten, että paine poistetaan ajoittain kääntämällä erotussuppilo ylösalaisin ja avaamalla tulppa. Annetaan seistä, kunnes kaksi faasia ovat täysin erottuneet (huomautus 2). Sen jälkeen saippualiuos otetaan mahdollisimman tarkoin toiseen erotussuppiloon. Vesi-alkoholifaasi uutetaan vielä kaksi kertaa samalla tavoin käyttämällä 60–70 ml etyylieetteriä (4.10 kohta). Huom. 2: Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä etanolia (4.11 kohta). 5.1.4. Yhdistetään kolme eetteriuutetta yhteen erotussuppiloon, joka sisältää 50 ml vettä. Pestään vedellä (50 ml kerralla), kunnes pesuvesi ei enää saa vaaleanpunaista väriä, kun siihen lisätään tippa fenoliftaleiiniliuosta (4.21 kohta). Kun pesuvesi on poistettu, suodatetaan vedettömän natriumsulfaatin (4.5 kohta) läpi etukäteen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä määrillä etyylieetteriä (4.10 kohta). 5.1.5. Liuotin haihdutetaan haihduttimessa 30 °C lämpötilassa tyhjiössä. Lisätään 5 ml asetonia, ja haihtuva liuotin poistetaan kokonaan kevyessä ilmavirrassa. Jäännöstä kuivatetaan lämpökaapissa 103 ± 2 °C:n lämpötilassa 15 minuutin ajan. Jäähdytetään eksikkaattoreissa ja punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella.

5.2.

Steroli- ja triterpeenidialkoholifraktion (erytrodioli + uvaoli) erottaminen 5.2.1. Emäksisten levyjen valmistelu ohutkerroskromatografiaa varten: silikageelilevyt (4.6 kohta) upotetaan kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5 kohta) noin neljän senttimetrin syvyyteen kymmeneksi sekunniksi, minkä jälkeen niiden annetaan kuivua kaksi tuntia vetokaapissa ja lopuksi yksi tunti 100 °C:ssa lämpökaapissa. Kun levyt on otettu lämpökaapista, niitä säilytetään kalsiumkloridia sisältävässä eksikkaattorissa (3.13 kohta) käyttöhetkeen saakka (näin käsitellyt levyt on käytettävä 15 päivän kuluessa). Huom. 3: Kun sterolifraktion erottamiseen käytetään emäksisiä silikageelilevyjä, ei ole tarpeen käsitellä saippuoitumattomia aineita alumiinioksidilla. Näin kaikki happamat aineet (rasvahapot ja muut hapot) jäävät lähtöviivalle. Sterolivyöhyke erottuu selvästi alifaattisten ja triterpeenisten alkoholien vyöhykkeestä. 5.2.2. Heksaani-etyylieetteriseosta (4.24 kohta) (huomautus 4) kaadetaan kehitysastiaan niin, että sitä on noin 1 cm. Kehitysastia suljetaan sopivalla kannella ja annetaan seistä avaamatta vähintään puoli tuntia, jotta syntyy neste-höyrytasapaino. Astian sisäseinille voidaan kiinnittää suodatinpaperisuikaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen. Tämä lyhentää kehitysaikaa lähes kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin. Huom. 4: Kehitysliuos on vaihdettava uuteen ennen jokaista koetta, jotta eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa. Vaihtoehtoisena liuottimena voidaan käyttää n-heksaani-etyylieetteriseosta (50:50, v/v). 5.2.3. Saippuoitumattomista aineista (5.1.5 alakohta) valmistetaan noin 5-prosenttinen etyyliasetaattiliuos (4.12 kohta), jota levitetään 0,3 ml ohuena ja tasaisena nauhana 100 μl:n mikroruiskulla kromatografialevyn (5.2.1 alakohta) alareunaan (2 cm). Asetetaan 2–3 μl aineiden vertailuliuosta (4.13 kohta) lähtöviivan tasalle niin, että steroli ja triterpeenidialkoholit voidaan tunnistaa kehityksen jälkeen. 5.2.4. Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 alakohdan ohjeiden mukaan. Ympäristön lämpötilan on oltava 15–20 °C (huomautus 5). Astian kansi suljetaan heti ja annetaan levyn eluoitua, kunnes liuotinrintama on siirtynyt noin 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai panemalla levy joksikin aikaa vetokaappiin. Huom. 5: Korkeampi lämpötila voi haitata erottelua. 5.2.5. Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloorifluoreseiiniliuosta (4.14 kohta), ja se jätetään kuivumaan. Sterolin ja triterpeenidialkoholien vyöhykkeet voidaan tunnistaa ultraviolettivalossa kohdistamalla ne vertailuliuoksesta (4.13 kohta) syntyneisiin pisteisiin. Vyöhykkeiden ääriviivat merkitään mustalla kynällä fluoresenssin rajoja seuraten (ks. kuva 3, TLC-levy). 5.2.6. Silikageelikerros raaputetaan merkityltä alueelta metallilastalla. Saatu aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7 kohta), lisätään 10 ml kuumaa etyyliasetaattia (4.12 kohta), sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodatetaan tyhjiössä. Suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn erlenmeyerpulloon (3.8 kohta). Pulloon jäänyt aines pestään kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieetteriä (4.3 kohta), ja suodos kerätään samaan, suodatinsuppiloon liitettyyn pulloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4–5 ml, ja jäännösliuos kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9 kohta). Liuosta kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan muutamaan tippaan asetonia (4.8 kohta) ja kuivataan jälleen. Koeputkessa olevan jäännöksen on sisällettävä steroli- ja triterpeenidialkoholifraktio.

5.3.

Trimetyylisilyylieettereiden valmistus 5.3.1. Koeputkessa olevaan steroli- ja triterpeenifraktioon lisätään 50 μl silylointireagenssia (4.25 kohta) (huomautus 6) jokaista koeputkessa olevaa sterolien ja triterpeenidialkoholien milligrammaa kohti niin, että kosteutta ei pääse mukaan (huomautus 7). Huom. 6: Käyttövalmiita liuoksia on kaupan. Saatavana on myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bistrimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä. Pyridiini voidaan korvata samalla määrällä asetonitriiliä. 5.3.2. Koeputki suljetaan tulpalla, ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes yhdisteet ovat täysin liuenneet. Annetaan seistä vähintään 15 minuuttia huoneenlämmössä ja sentrifugoidaan sitten muutaman minuutin ajan; kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten. Huom. 7: Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiutaleet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee, koe on uusittava (ainoastaan käytettäessä heksametyylidisilatsaania tai trimetyylikloorisilaania).

5.4.

Kaasukromatografinen määritys 5.4.1. Esivalmistelut ja kapillaarikolonnin valmistelu 5.4.1.1. Kolonni (3.11 kohta) asennetaan kaasukromatografialaitteistoon kiinnittämällä kolonnin alkupää jakoinjektoriin ja kolonnin loppupää detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus, jne.) 5.4.1.2. Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi, käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittäminen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 °C korkeammaksi kuin käyttölämpötila (huomautus 8). Korkeaa lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialaitteisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö, liekinsytytys, tietojärjestelmän kytkeminen, kolonnin, detektorin ja injektorin säätö jne.) ja signaalia rekisteröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan. Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta. Huom. 8: Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 °C alempi kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila. 5.4.2. Toimintaolosuhteiden valinta 5.4.2.1. Käyttöolosuhteiden ohjearvot ovat seuraavat: — kolonnin lämpötila: 260 ± 5 °C, — injektorin lämpötila: 280–300 °C, — detektorin lämpötila: 280–300 °C, — kantajakaasun lineaarinopeus: heliumille 20–35 cm/s ja vedylle 30–50 cm/s, — jakosuhde: 1:50–1:100, — laitteiston herkkyys: 4–16 kertaa vähimmäisvaimennus, — rekisteröintiherkkyys: 1–2 mV täydestä asteikosta, — injektoidun aineen määrä: 0,5–1 μl TMSE-liuosta. Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien mukaan niin, että saadaan seuraavat vaatimukset täyttävä kromatogrammi: — β-sitosterolipiikin retentioaika on 20 ± 5 minuuttia, — kampesterolipiikki: oliiviöljylle (pitoisuus keskimäärin 3 %) 20 ± 5 % täydestä asteikosta, soijaöljylle (pitoisuus keskimäärin 20 %) 80 ± 10 % täydestä asteikosta, — kaikki mukana olevat sterolit on voitava erottaa toisistaan. Lisäksi kunkin piikin jälkeen piirturin tulee palata perusviivalle ennen uuden piikin alkua. Tämä ei ole kuitenkaan tarpeen, jos suhteellisen retentioajan (RRT) 1,02 piikki (sitostanoli) pystytään mittaamaan kohtisuoraan. 5.4.3. Määritys 5.4.3.1. Imetään 10 μl:n mikroruiskuun 1 μl heksaania, sitten 0,5 μl ilmaa ja tämän jälkeen 0,5–1 μl näyteliuosta; lopuksi männällä vedetään vielä neula tyhjäksi. Neula työnnetään septumin läpi injektoriin ja 1–2 sekunnin kuluttua seos injektoidaan nopeasti, odotetaan noin viisi sekuntia, jonka jälkeen neula vedetään pois hitaasti. Myös automaattista injektoria voidaan käyttää. 5.4.3.2. Rekisteröintiä jatketaan, kunnes näytteessä olevien triterpeenidialkoholien TMSE on kokonaan eluoitunut. Perusviivan on koko ajan oltava 5.4.1.2 alakohdan vaatimusten mukainen. 5.4.4. Piikkien tunnistaminen Yksittäiset piikit tunnistetaan niiden retentioajan perusteella sekä vertaamalla sterolien ja triterpeenidialkoholien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa olosuhteissa (ks. lisäys). Sterolit ja triterpeenidialkoholit eluoituvat seuraavassa järjestyksessä: kolesteroli, brassikasteroli, ergosteroli, 24-metyleenikolesteroli, kampesteroli, kampestanoli, stigmasteroli, δ-7-kampesteroli, δ-5,23-stigmastadienoli, klerosteroli, β-sitosteroli, sitostanoli, δ-5-avenasteroli, δ-5,24-stigmastadienoli, δ-7-sigmastenoli, δ-7-avenasteroli, erytrodioli ja uvaoli. ß-Sitosterolin retentioajat SE-52- ja SE-54-kolonneille on esitetty taulukossa 1. Kuvat 1 ja 2 esittävät eräiden öljyjen tyypillisiä kromatogrammeja. 5.4.5. Kvantitatiivinen arviointi 5.4.5.1. Lasketaan α-kolestanolin sekä sterolien ja triterpeenidialkoholien piikkien pinta-alat tietojärjestelmän avulla. Sellaisten aineiden piikit jätetään huomiotta, jotka eivät esiinny taulukossa 1 (ergosterolin piikkiä ei lasketa). α-Kolestanolin vastekerroin on 1. 5.4.5.2. Lasketaan yksittäisten sterolien pitoisuus mg/kg:ssa rasvaa tai öljyä seuraavasta kaavasta: jossa: Ax = x-sterolin piikin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; As = α-kolestanolin piikin pinta-ala, tietojärjestelmällä laskettuna; ms = lisätyn α-kolestanolin massa milligrammoina; m = määritykseen käytetyn näytteen massa grammoina.

6.   TULOSTEN ESITTÄMINEN

▼M28

▼M26

---

Lisäys

Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen

Kaasukromatografialaitteisto säädetään tavallisia käyttöolosuhteita vastaavaksi, injektoidaan 1–3 μl metaania (tai propaania) ja mitataan aika, jonka kuluessa kaasu kulkee kolonnin läpi, injektointihetkestä piikin muodostumiseen (tM).

Lineaarinopeus cm/s saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on mitattu aika sekunteina.

Kuva 1

Lamppuoliiviöljyn steroli- ja triterpeenidialkoholifraktion kaasukromatogrammi (jossa näkyy sisäisen standardin huippu)

Kuva 2

Puhdistetun oliiviöljyn steroli- ja triterpeenidialkoholifraktion kaasukromatogrammi (jossa näkyy sisäisen standardin huippu)

Kuva 3

Oliivin puristemassaöljyn TLC-levyn vyöhyke, joka on raaputettava sterolien ja triterpeenialkoholien määrittämiseksi.

▼M26 —————

▼M21

---

LIITE VII

2-GLYSERYYLIMONOPALMITAATIN PROSENTTIOSUUDEN MÄÄRITTÄMINEN

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tällä menetelmällä määritetään triglyseridin 2-asemassa olevan palmitiinihapon prosenttiosuus 2-glyseryylimonopalmitaatin määrityksen avulla.

Menetelmää sovelletaan kasviöljyihin, jotka ovat nestemäisiä huoneenlämmössä (20 °C).

2.   PERIAATE

Öljynäyte valmistellaan ja käsitellään haimalipaasin avulla: kun triglyseridimolekyyli hydrolysoidaan osittain ja spesifisesti 1- ja 3-asemassa, jäävät jäljelle 2-asemassa olevat monoglyseridit. 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus monoglyseridijakeessa määritetään silyloinnin jälkeen käyttäen kapillaarikaasukromatografista määritystä.

3.   VÄLINEISTÖ

3.1	Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2	Dekantterilaseja, 100, 250 ja 300 ml.

3.3	Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 21–23 mm, pituus 400 mm), varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla.

3.4	Koeputkia, 10, 50, 100 ja 200 ml.

3.5	Kolveja, 100 ja 250 ml.

3.6	Pyöröhaihduttaja.

3.7	Kartiopohjaisia sentrifugiputkia, 10 ml, hiottu tulppa.

3.8	Sentrifugi 10 ja 100 ml:n putkia varten.

3.9	Termostaatti, joka ylläpitää lämpötilaa 40 °C ± 0,5 °C.

3.10	Mittapipettejä, 1 ja 2 ml.

3.11	Injektioruisku, 1 ml.

3.12	Mikroruisku, 100 μl.

3.13	Suppilo, 1 000 ml

3.14	Kapillaarikolonnilla varustettu kaasukromatografi, jossa on kolonniin liitetty kylmäinjektori, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan koloniin, sekä uuni, joka pysyy valitussa lämpötilassa yhden celsiusasteen tarkkuudella.

3.15	Kolonniin liitetty kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin.

3.16	Liekki-ionisaatiodetektori ja analysaattori.

3.17.

Integroiva piirturi, joka toimii analysaattorin kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää.

3.18

Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty 5-prosenttisella metyylipolysiloksaanilla tai fenyylimetyylipolysiloksaanilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm, ja jota voidaan käyttää 370 °C:n lämpötilassa.

3.19	Mikroruisku, 10 μl, jossa on vähintään 7,5 cm:n kiinteä neula, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan kolonniin.

4.   REAGENSSIT

4.1

Silikageeli, jonka hiukkaskoko 0,063–0,200 mm (70/280 mesh) ja joka valmistetaan seuraavasti: Silikageeli pannaan posliiniastiaan, kuivataan lämpökaapissa 160 °C:n lämpötilassa neljän tunnin ajan, minkä jälkeen jäädytetään eksikkaattorissa huoneenlämmössä. Lisätään vettä 5 % silikageelin painosta seuraavasti: punnitaan 500 ml:n erlenmeyer-pulloon 152 g silikageeliä, lisätään 8 g tislattua vettä, suljetaan pullo ja ravistetaan varovasti siten, että vesi jakautuu tasaisesti. Säilytetään vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

4.2	N-heksaani, kromatografialaatua.

4.3	Isopropanoli

4.4	Isopropanoli, vesiliuos 1/1 (V/V)

4.5	Haimalipaasi. Käytettävän lipaasiaktiivisuuden on oltava 2,0–10 lipaasiyksikköä/mg. (Haimalipaasia, jonka aktiivisuus on 2–10 yksikköä/mg, on saatavilla valmiina.)

4.6	Tri-hydroksimetyyliaminometaani-puskuriliuos: lisätään vesiliuokseen suolahappoa 1 M, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä) (1/1 V/V)

4.7	Natriumkolaatti (entsyymilaatua), 0,1 % vesiliuos (käytettävä 15 päivän kuluessa valmistamisesta).

4.8	Kalsiumkloridi, vesiliuos 22 %.

4.9	Dietyylieetteri, kromatografialaatua.

4.10	Kehitysliuos: n-heksaani/etyylieetteriseos (87/13) (V/V)

4.11	Natriumhydroksidi, 12-painoprosenttinen liuos.

4.12	1-prosenttinen fenoliftaleiiniliuos etanolissa.

4.13	Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.14	Apukaasut: vety, vähintään 99-prosenttinen, kuiva ja ilman orgaanisia aineita, ja vesi kaasukromatografista laatua, sama puhtausaste.

4.15

Silylointireagenssi: Pyridiinin, heksametyylidisilatsaanin ja trimetyylikloorisilaanin seos 9/3/1 (V/V/V). (Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana. Voidaan käyttää myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.)

4.16	Standardit: puhtaat monoglyseridit tai monoglyseridien seokset, joiden prosenttiosuuksien mukainen tunnettu koostumus on samanlainen kuin näytteen.

5.   MENETTELY

5.1   Näytteen valmistelu

5.1.1

Öljyjä, joiden vapaiden happojen pitoisuus on alle 3 %, ei tarvitse neutraloida ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Öljyt, joiden vapaiden happojen pitoisuus on yli 3 %, on neutraloitava 5.1.1.1 kohdan mukaisesti. 5.1.1.1 1 000 ml:n suppiloon (3.13) kaadetaan 50 g öljyä ja 200 ml n-heksaania. Lisätään 100 ml isopropanolia ja 12-prosenttista natriumhydroksidiliuosta (4.11) määrä, joka vastaa öljyn vapaiden rasvahappojen määrää lisättynä 5 prosentilla. Ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan. Lisätään 100 ml tislattua vettä, ravistetaan uudelleen ja annetaan seistä. Kun erottuminen on tapahtunut, pohjalla oleva saippuoitunut kerros poistetaan. Myös mahdolliset välikerrokset (liimamaiset ja liukenemattomat aineet) poistetaan. Neutraalin öljyn heksaaniliuos pestään useita kertoja isopropanolin ja tislatun veden liuoksella, 50–60 ml, suhteessa 1:1 (V/V) (4.4), kunnes fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri on hävinnyt. Poistetaan suurin osa heksaania höyrystämällä tyhjiössä (käyttäen esim. kiertohaihdutinta) ja siirretään öljy 100 ml:n kolviin (3.5). Kuivataan öljy tyhjiössä, kunnes liuotin on kokonaan haihtunut. Tämän vaiheen jälkeen öljyn happopitoisuuden on oltava alle 0,5 %.

5.1.2

Kaadetaan 1,0 g edellä kuvatulla tavalla käsiteltyä öljyä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) ja liuotetaan se 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Liuoksen annetaan seistä vähintään 15 minuuttia ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Jos liuos on sameaa, se sentrifugoidaan optimaalisten edellytysten varmistamiseksi kromatografiaa varten. (Voidaan käyttää käyttövalmiita 500 mg:n SPE-silikageelipatruunoita.)

5.1.3

Kromatografiakolonnin esikäsittely Kolonniin (3.3) kaadetaan noin 30 ml kehitysliuosta (4.10) ja kolonnin alaosaan työnnetään lasisauvalla pumpulituppo; painetaan tuppoa ilman poistamiseksi. Valmistetaan dekantterilasissa suspensio, jossa on 25 g silikageeliä (4.1) ja noin 80 ml kehitysliuosta, ja kaadetaan se suppilon avulla kolonniin. Varmistetaan, että kaikki silikageeli on syötetty kolonniin; pestään kehitysliuoksella (4.10), avataan hana ja annetaan nesteen tulla pylväästä, kunnes sen pinta on noin 2 mm piihappogeelin yläpinnan yläpuolella.

5.1.4

Kolonnikromatografia Punnitaan 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) tarkasti 1,0 g 5.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä. Liuotetaan näyte 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Kaadetaan liuos 5.1.3 kohdan mukaisesti valmisteltuun kromatografikolonniin. Vältetään koskemasta kolonnin pintaa. Hana avataan ja liuottimen annetaan tulla pylväästä, kunnes sen pinta on silikageelin pinnan tasolla. Annetaan kehittyä 150 ml:ssa kehitysliuosta. Säädetään virtaukseksi 2 ml/minuutissa (siten että 150 ml valuu 60–70 minuutissa). Eluaatti kerätään 250 ml:n taarattuun kolviin. Liuotin haihdutetaan tyhjiössä ja sen jäänteet poistetaan typpivirtauksen avulla. Punnitaan pullo ja lasketaan kerätty uute. (Jos käytetään käyttövalmiita SPE-silikageelipatruunoita, toimitaan seuraavasti: Lisätään 1 ml liuosta (5.1.2) patruunoihin, jotka on etukäteen käsitelty 3 ml:lla n-heksaania. Kun liuos on suodattunut, annetaan kehittyä 4 ml:ssa n-heksaania/dietyylietteriä 9/1 (V/V). Eluaatti kerätään 10 ml:n putkeen ja haihdutetaan kuiviin typpivirtauksen alla. Kuiva jäännös käsitellään haimalipaasin (5.2) avulla. Rasvahappokoostumus on ehdottomasti tarkistettava sekä ennen SPE-patruunan käyttöä että sen jälkeen.

5.2   Hydrolyysi haimalipaasin avulla

5.2.1

Mitataan sentrifugin putkeen 0,1 g 5.1 kohdan mukaisesti valmisteltua öljyä. Lisätään 2 ml puskuriliuosta (4.6), 0,5 ml natriumkolaattiliuosta (4.7) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta sekoittaen hyvin jokaisen lisäyksen jälkeen. Putki suljetaan hiotulla tulpalla ja asetetaan heti termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 40 °C ± 0,5.

5.2.2

Putkeen lisätään 20 mg lipaasia, ravistetaan varovasti (niin että tulppa ei pääse kastumaan), asetetaan putki termostoituun hauteeseen tasan 2 minuutiksi ja poistetaan, minkä jälkeen ravistetaan voimakkaasti tasan 1 minuutti ja annetaan jäähtyä.

5.2.3

Lisätään 1 ml dietyylieetteriä, suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti, sentrifugoidaan ja siirretään eetteriliuos mikroruiskulla puhtaaseen ja kuivaan putkeen.

5.3   Silanoitujen johdannaisten ja kaasukromatografian valmistelu

5.3.1

Lisätään mikroruiskulla 10 ml:n kartiopohjaiseen putkeen 100 μl liuosta (5.2.3).

5.3.2

Liuotin haihdutetaan heikossa typpivirrassa, lisätään 20 μl silylointireagenssia (4.15), suljetaan putki tulpalla ja annetaan seistä 20 minuuttia.

5.3.3

Lisätään 1–5 ml n-heksaania (kromatografiaolosuhteiden mukaisesti). Tuloksena on liuos kaasukromatografiaa varten.

5.4   Kaasukromatografia

Käyttöolosuhteet ovat seuraavat:

5.4.1   Piikkien tunnistaminen

Yksittäiset monoglyseridit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja suhteessa niihin, jotka on saatu samoissa olosuhteissa määritetyillä monoglyseridien standardiseoksilla.

5.4.2   Kvantitatiivinen arviointi

Jokaisen piikin pinta-ala lasketaan elektronisen integraattorin avulla.

6.   TULOSTEN ESITTÄMINEN

Glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus lasketaan sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien monoglyseridien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta (ks. kuva 2) seuraavan kaavan mukaisesti:

Glycéril monopalmitate (%):

NdT: Glycéril monopalmitate = glyseryylimonopalmitaatti jossa:

Ax

=

glyseryylimonopalmitaatin piikin pinta-ala

ΣA

=

kaikkien monoglyseridien piikkien pinta-alojen summa.

Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

7.   MÄÄRITYSSELOSTE

Määritysselosteessa on oltava:

Kuva 1

Kromatogrammi silylointireaktion tuotteista, saatu lipaasikäsittelyllä jalostetusta oliiviöljystä, johon lisätty 20 % esteröityä öljyä (100 %).

Selityksiä:: Acides gras libres = vapaat rasvahapot Huile d’olive raffinée = jalostettu oliiviöljy + 20 % huile estérifiée = + 20 % esteröityä öljyä 1–2 monopalmitine = 1–2-monopalmitiini 1–2 mono C18 insat. = tyydyttymätön C18, 1–2-mono- Squalene = skvaleeni

Kuva 2

Kromatogrammi:

A)

esteröimätön oliiviöljy, lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 %. Merkkien selitykset:: 1 = Vapaat rasvahapot 2 = Monoglyseridit 3 = Diglyseridit 4 = Triglyseridit * = 2-monopalmitiini ** = C54-triglyseridi

Kromatogrammi:

B)

esteröity öljy lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen. Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 % Merkkien selitykset: 1 = Vapaat rasvahapot 2 = Monoglyseridit 3 = Diglyseridit 4 = Triglyseridit * = 2-monopalmitiini ** = C54-triglyseridi

8.   SELITYKSIÄ

LIPAASIN VALMISTUS

Myynnissä on lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa seuraavasti:

Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 °C:seen. Poistetaan ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin, että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä asetonia ja sekoitetaan 4–6 tuntia, minkä jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme kertaa samalla tilavuusmäärällä vedetöntä asetonia, sitten kaksi kertaa asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa dietyylieetterillä.

Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe, joka säilyy kauan jääkaapissa ja kuivissa olosuhteissa.

LIPAASIAKTIIVISUUDEN TARKISTAMINEN

Valmistetaan oliiviöljyemulsio seuraavasti:

Sekoitetaan 165 ml arabikumiliuosta (100 g/l), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä sekoittimella.

Lisätään 50 ml:n dekantterilasiin 10 ml tätä emulsiota, sitten 0,3 ml natriumkolaattiliuosta (0,2 g/ml) ja sitten 20 ml tislattua vettä.

Dekantterilasi asetetaan termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 37 °C. Upotetaan pH-mittarin elektrodit nesteeseen ja asetetaan spiraalisekoitin paikoilleen.

Lisätään natriumhydroksidiliuosta (0,1 N) tipoittain byretin avulla, kunnes pH on 8,3.

Lisätään sama tilavuusmäärä lipaasijauheen vesisuspensiota (0,1 g/ml lipaasia). Heti kun pH on 8,3, käynnistetään sekuntikello ja aloitetaan natriumhydroksidiliuoksen tiputtaminen sellaisella nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Liuoksen kulutus luetaan joka minuutti.

Tiedot kirjataan koordinaatistoon, jossa x-akselilla on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan emäsliuoksen määrä millilitroina. Tuloksena on oltava lineaarinen kuvaaja.

Lipaasiaktiviteetti, joka mitataan lipaasiyksikköinä mg:aa kohden, saadaan seuraavasti:

jossa:

A	aktiviteetti lipaasiyksikköä/mg

V	natriumhydroksidiliuoksen (0,1 N) määrä millilitroina minuutissa (kuvaajasta laskettuna)

N	natriumhydroksidiliuoksen normaalisuus

m	lipaasinäytteen paino mg:oina.

Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapauttamaan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa.

▼M20 —————

▼M28

---

LIITE IX

SPEKTROFOTOMETRINEN MÄÄRITYS ULTRAVIOLETTIVALOSSA

JOHDANTO

Spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa antaa tietoa rasvan laadusta ja säilymisestä sekä muutoksista, joita käsittelyt ovat siinä aiheuttaneet. Tässä menetelmässä käytetyillä aallonpituuksilla tapahtuva absorptio johtuu konjugoiduista dieeni- ja trieenijärjestelmistä, jotka ovat peräisin hapetusprosesseista ja/tai puhdistusmenetelmistä. Nämä absorptiot ilmaistaan ominaisekstinktiona

(ekstinktio, joka tapahtuu tiettyyn liuottimeen valmistetun 1-prosenttisen w/v-rasvaliuoksen 10 mm:n paksuisessa kerroksessa), josta tavallisesti käytetään merkkiä K (kutsutaan myös ekstinktiokertoimeksi).

1.   SOVELTAMISALA

Tässä liitteessä kuvataan menetelmä, jolla oliiviöljylle tehdään spektrofotometrinen määritys ultraviolettivalossa.

2.   MENETELMÄN PERIAATE

Näyte liuotetaan määrättyyn liuottimeen ja liuoksen absorbanssi mitataan tietyllä aallonpituudella käyttäen vertailuliuoksena puhdasta liuotinta.

Lasketaan spesifinen ekstinktio iso-oktaanissa aallonpituuksilla 232 nm ja 268 nm tai sykloheksaanissa aallonpituuksilla 232 nm ja 270 nm, kun pitoisuus on 1 % w/v 10 mm:n kyvetissä.

3.   VÄLINEISTÖ

3.1

Spektrometri, jolla voidaan mitata ultraviolettivalon aallonpituuksia (220–360 nm) yhden nanometrin tarkkuudella. Spektrometrin aallonpituus- ja absorbanssiasteikkojen tarkkuuden ja uusittavuuden sekä hajavalon osalta suositellaan säännöllisiä tarkastuksia. 3.1.1 Aallonpituusasteikko Voidaan tarkistaa käyttämällä vertailumateriaalia, joka muodostuu holmiumoksidia tai holmiumoksidiliuosta (sinetöity tai ei) sisältävästä optisesta lasisuodattimesta, jossa on selvät absorptiokaistat. Vertailumateriaali on tarkoitettu UV/VIS-spektrofotometrien, joiden spektrikaistan nominaaliset leveydet ovat enintään 5 nm, aallonpituusasteikkojen tarkistamiseen ja kalibrointiin. Mittaukset tehdään vertaamalla ilmanollanäytteeseen aallonpituudella 640–240 nm vertailumateriaalin ohjeiden mukaisesti. Perusviivan korjaus tehdään tyhjällä säteen reitillä jokaisessa raon leveyden muutoksessa. Standardin aallonpituudet on lueteltu vertailumateriaalin sertifikaatissa. 3.1.2 Absorbanssiasteikko Voidaan tarkistaa käyttäen kaupallisesti saatavilla olevaa sinetöityä vertailumateriaalia, jossa on hapanta kaliumdikromaattiliuosta tiettyinä pitoisuuksina ja sertifioidut absorbanssin arvot aallonpituudella λmax (4 kaliumdikromaattiliuosta perkloorihapossa sinetöityinä 4:ään UV-kvartsikyvettiin lineaarisuuden ja fotometrisen tarkkuuden vertailuarvon mittaamiseksi ultraviolettivalossa). Kaliumdikromaattiliuokset mitataan käytettyä happoa vastaan perusviivan korjauksen jälkeen vertailumateriaalin ohjeiden mukaisesti. Absorbanssiarvot on lueteltu vertailumateriaalin sertifikaatissa. Toinen mahdollisuus tarkistaa valokennon ja valomonistimen vastaus on seuraavanlainen: Punnitaan 0,2000 g spektrofotometrisesti puhdasta kaliumkromaattia ja liuotetaan se 0,05 N kaliumhydroksidiliuokseen 1 000 ml:n mittapulloon niin, että liuosta on 1 000 ml. Mitataan tasan 25 ml tätä liuosta 500 ml:n mittapulloon ja täytetään pullo kaliumhydroksidiliuoksella. Näin saadun liuoksen ekstinktio mitataan aallonpituudella 275 nm ja käytetään kaliumhydroksidiliuosta vertailuliuoksena. Mitatun ekstinktion on oltava 0,200 ± 0,005, kun käytetään 1 cm:n optista kyvettiä.

3.2	Suorakaiteen muotoisia kvartsikyvettejä kansineen, optinen väli 10 mm, joilla voidaan mitata ultraviolettivalon aallonpituuksia (220–360 nm). Vedellä tai muulla sopivalla liuottimella täytettynä kyvettien antamien lukemien ero saa olla enintään 0,01 ekstinktioyksikköä.

3.3	A-luokan mittapulloja, 25 ml.

3.4	Analyysivaaka, jonka tarkkuus 0,0001 g.

4.   REAGENSSIT

Kaikkien määrityksessä käytettävien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua, jollei toisin mainita, ja veden on oltava joko tislattua tai demineralisoitua tai vastaavaa puhtausastetta.

Liuotin: Iso-oktaani (2,2,4-trimetyylipentaani) mitattavaksi aallonpituudella 232 nm ja 268 nm ja sykloheksaani mitattavaksi aallonpituudella 232 nm ja 270 nm; liuottimen absorbanssin on oltava alle 0,12 aallonpituudella 232 nm ja alle 0,05 aallonpituudella 270 nm suhteessa tislattuun veteen, mitattuna 10 mm:n kyvettiin.

5.   MENETTELY

5.1	Näytteen on oltava täysin homogeenista eikä siinä saa olla suspendoituneita epäpuhtauksia. Jos näin ei ole, näyte suodatetaan paperin läpi noin 30 °C:ssa.

5.2

Punnitaan noin 0,25 g näytettä (1 mg:n tarkkuudella), joka on esikäsitelty edellä kuvatulla tavalla, 25 ml:n mittapulloon, joka täytetään merkkiin liuottimella ja homogenoidaan. Syntyvän liuoksen on oltava täysin kirkasta. Jos ilmenee sameutta tai sakkaa, liuos suodatetaan nopeasti paperin läpi. HUOM. Yleensä 0,25–0,30 g:n massa on riittävä neitsyt- ja ekstraneitsytoliiviöljyjen absorbanssimittauksiin aallonpituuksilla 268 ja 270 nm. Aallonpituudella 232 nm tehtäviin mittauksiin näytettä tarvitaan yleensä 0,05 g, joten tavallisesti valmistetaan kaksi erillistä liuosta. Oliivin puristemassaöljyjen, jalostettujen oliiviöljyjen ja väärennettyjen oliiviöljyjen absorbanssimittauksiin tarvitaan niiden suuremman absorbanssin vuoksi yleensä pienempi näyte, esim. 0,1 g.

5.3

Tarvittaessa korjataan perusviiva (220–290 nm) molemmissa kvartsikyveteissä (näyte ja vertailuliuos), täytetään näytteen sisältävä kvartsikyvetti testiliuoksella ja mitataan ekstinktiot aallonpituuksilla 232, 268 ja 270 nm vertailuliuoksena käytettyä liuotinta vastaan. Saatujen ekstinktioarvojen on oltava 0,1–0,8 tai spektrofotometrin lineaarisuusalueella, joka on tarkistettava. Jollei tällaisia tuloksia saada, koe on uusittava käyttäen vahvempia tai laimeampia liuoksia tarpeen mukaan.

5.4

Kun absorbanssi on mitattu aallonpituudella 268 tai 270 nm, mitataan aallonpituudet λmax, λmax + 4 ja λmax – 4. Näitä absorbanssiarvoja käytetään ominaisekstinktion variaation (ΔΚ) määrittämiseksi. HUOM. Aallonpituutena λmax pidetään liottimena käytetyn isotaanin osalta 268 nm ja sykloheksaanin osalta 270 nm.

6   TULOSTEN ESITTÄMINEN

6.1

Lasketaan ominaisekstinktiot (ekstinktiokertoimet) eri aallonpituuksilla seuraavasta kaavasta: jossa Kλ = ominaisekstinktio aallonpituudella λ Eλ = aallonpituudella λ mitattu ekstinktio c = liuoksen väkevyys g/100 ml s = kvartsikyvetin valotie senttimetreinä ilmaistuna kahden desimaalin tarkkuudella.

6.2	Ominaisekstinktion variaatio (ΔΚ) Ominaisekstinktion absoluuttisen arvon variaatio (ΔΚ) saadaan seuraavalla kaavalla: jossa Km on ominaisekstinktio maksimiabsorbtion aallopituuden ollessa 270 ja 268 nm käytetystä liuottimesta riippuen. Tulokset ilmaistaan kahden desimaalin tarkkuudella.

---

LIITE X

RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN MÄÄRITTÄMINEN KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1.   SOVELTAMISALA

Tässä liitteessä esitetään ohjeet kasvirasvoissa ja -öljyissä esiintyvien vapaiden ja sidottujen rasvahappojen määrittämiseksi kaasukromatografisella menetelmällä sen jälkeen kun ne on muunnettu rasvahappojen metyyliestereiksi.

Triasyyliglyseridien sidotut rasvahapot ja esteröintimenetelmästä riippuen vapaat rasvahapot muunnetaan rasvahappojen metyyliestereiksi, jotka määritetään kaasukromatografisella menetelmällä.

Tässä liitteessä kuvatun menetelmän avulla voidaan määrittää rasvahappojen metyyliesterit C12–C24, mukaan lukien tyydyttyneet, cis-kertatyydyttymättömät ja trans-kertatyydyttymättömät sekä cis-monityydyttymättömät ja trans-monityydyttymättömät rasvahappojen metyyliesterit.

2.   PERIAATE

Rasvahappojen metyyliesterien kvantitatiiviseen määritykseen käytetään kaasukromatografista menetelmää. Rasvahappojen metyyliesterit valmistellaan A osan mukaisesti. Ne syötetään injektoriin ja höyrystetään. Rasvahappojen metyyliesterit erotetaan analyyttisissä kolonneissa, joilla on tietty polariteetti ja pituus. Rasvahappojen metyyliesterien havaitsemiseksi käytetään liekki-ionisaatiodetektoria. Määritysedellytykset esitetään B osassa.

Kun rasvahappojen metyyliestereitä määritetään liekki-ionisaatiodetektorin avulla, kantajakaasuna (liikkuva faasi) voidaan käyttää vetyä tai heliumia. Vety nopeuttaa erottumista ja antaa terävämmät piikit. Stationäärifaasi on mikroskooppisen ohut nestekerros kvartsilasista tehdyn inertin kiinteän pinnan päällä.

Kun analysoitavat haihtuvat yhdisteet kulkevat kapillaarikolonnissa, ne joutuvat vuorovaikutukseen kolonnin sisäpintaa verhoavan stationäärifaasin kanssa. Koska eri yhdisteiden vuorovaikutus on erilainen, ne eluoituvat eri aikaan. Tätä kutsutaan yhdisteen retentioajaksi tietyn määritysparametriyhdistelmän osalta. Eri yhdisteet tunnistetaan retentioaikoja vertaamalla.

A OSA

OLIIVIÖLJYN JA OLIIVIN PURISTEMASSAÖLJYN RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN VALMISTAMINEN

1.   SOVELTAMISALA

Tässä osassa kuvataan rasvahappojen metyyliesterien valmistamista. Siihen sisältyy menetelmät oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn rasvahappojen metyyliesterien valmistamiseksi.

2.   SOVELTAMISALA

Oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn rasvahappojen metyyliesterit valmistetaan transesteröimällä kaliumhydroksidin metanoliliuoksella huoneenlämmössä. Näytteen puhdistustarve ennen transesteröintiä riippuu näytteen vapaiden rasvahappojen pitoisuudesta ja määriteltävästä analyyttisestä parametrista, ja menetelmä voidaan valita seuraavan taulukon mukaisesti:

3.   MENETELMÄ

3.1    Transesteröinti kaliumhydroksidin metanoliliuoksella huoneenlämmössä

3.1.1    Periaate

Metyyliesterit muodostuvat transesteröitymällä kaliumhydroksidin metanoliliuoksessa välivaiheessa ennen saippuointia.

3.1.2    Reagenssit

3.1.2.1

Metanolia, jossa enintään 0,5 % (m/m) vettä.

3.1.2.2

Heksaania kromatografiaa varten

3.1.2.3

Heptaania kromatografiaa varten.

3.1.2.4

Dietyylieetteri, stabiloitu analyysia varten.

3.1.2.5

Asetonia kromatografiaa varten.

3.1.2.6

Eluutioliuotin öljyn puhdistamiseksi kolonni-/SPE-kromatografialla: heksaanin ja dietyylieetterin seos 87/13 (v/v).

3.1.2.7

Kaliumhydroksidi, noin 2 M metanoliliuos: Liuotetaan 11,2 g kaliumhydroksidia 100 ml:aan metanolia.

3.1.2.8

Piihappopatruunoita, 1 g (6 ml) kiinteäfaasiuuttoa varten.

3.1.3    Välineistö

3.1.3.1

Kierrekorkkisia koeputkia (tilavuus 5 ml), joiden korkissa PTFE-liitos.

3.1.3.2

Mitta- tai automaattipipetit, 2 ml ja 0,2 ml.

3.1.4    Öljynäytteiden puhdistaminen

Näytteet on tarvittaessa puhdistettava ajamalla öljy piihappopatruunan läpi kiinteäfaasiuuttona. Piihappopatruuna (3.1.2.8) pannaan tyhjiöeluutiolaitteeseen ja pestään 6 ml:lla heksaania (3.1.2.2) ilman tyhjiötä. Kolonniin pannaan öljyliuos (noin 0,12 g) 0,5 ml:ssa heksaania (3.1.2.2). Imeytetään liuos piihappoon ja eluoidaan 10 ml:lla heksaania/dietyylioksidia (87:13 v/v) (3.1.2.6). Homogenoidaan eluaatti kokonaan ja jaetaan se kahdeksi yhtä suureksi näytteeksi. Toinen näyte haihdutetaan kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttajassa huoneenlämmössä. Jäännös liotetaan 1 ml:aan heptaania. Saadusta liuoksesta voidaan määrittää rasvahapot kaasukromatografialla. Toinen näyte haihdutetaan ja liuotetaan jäännös 1 ml:aan asetonia triglyseridien määrittämiseksi tarvittaessa HPCL-menetelmällä.

3.1.5    Menettely

Mitataan 5 ml:n kierrekorkilliseen koeputkeen (3.1.3.1) noin 0,1 grammaa näyteöljyä. Lisätään 2 ml heptaania (3.1.2.2) ja ravistetaan. Lisätään 0,2 ml kaliumhydroksidin metanoliliuosta (3.1.2.7), suljetaan tiiviisti PTFE-liitoksella varustetulla korkilla, ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia. Putken annetaan seistä kunnes liuoksen pintakerros kirkastuu. Erotetaan pintakerros, jossa metyyliesterit ovat. Heptaaniliuos voidaan injektoida kromatografiin. Liuos on syytä säilyttää jääkaapissa kunnes se määritetään kromatografilla. Liuosta ei suositella säilytettäväksi yli 12:ta tuntia.

B OSA

RASVAHAPPOJEN METYYLIESTERIEN ANALYSOINTI KAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1.   SOVELTAMISALA

Tässä osassa annetaan yleisohjeita kapillaarikaasukromatografian käyttöön, kun tarkoituksena on määrittää A osassa kuvatulla menetelmällä saadun rasvahappojen metyyliesterien seoksen koostumus kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti.

Tätä osaa ei sovelleta polymeroitujen rasvahappojen tutkimiseen.

2.   REAGENSSIT

2.1    Kantajakaasu

Inertti kaasu (helium tai vety), huolellisesti kuivattu; ei saa sisältää happea yli 10 mg/kg.

2.2    Apukaasut

2.2.1

Vety (puhtaus ≥ 99,9 %), ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.

2.2.2

Ilmaa tai happea, ei saa sisältää orgaanisia epäpuhtauksia.

2.2.3

Typpi (puhtaus > 99 %).

2.3    Vertailustandardi

Rasvahappojen puhtaiden metyyliestereiden seos tai sellaisen tunnetun rasvan metyyliesterit, jotka ovat mahdollisimman samanlaisia kuin tutkittava rasva. Oktadekeeni-, oktadekadieeni- ja oktadekatrieenihappojen metyyliesterien cis- ja trans-isomeerit ovat hyödyllisiä tyydyttymättömien happojen trans-isomeerien havaitsemiseksi.

Monityydyttymättömien rasvahappojen hapettumista on vältettävä.

3.   VÄLINEISTÖ

Nämä ohjeet koskevat tavallista kapillaarikolonnilla varustettua kaasukromatografista laitteistoa sekä liekki-ionisaatiodetektoria.

3.1    Kaasukromatografi

Kaasukromatografissa on oltava seuraavat osat.

3.1.1    Injektiojärjestelmä

On käytettävä injektiojärjestelmää, jossa on kapillaarikolonnit, jolloin injektiojärjestelmän on oltava erityisesti suunniteltu tällaisten kolonnien kanssa käytettäväksi. Järjestelmä voi olla jakajatyyppiä tai jakajaton, kolonniin liitetty (on-column) injektori.

3.1.2    Uuni

Uunin tulee pystyä lämmittämään kolonni vähintään 260 °C:n lämpötilaan ja pitämään se valitussa lämpötilassa 0,1 °C:n tarkkuudella. Viimeksi mainittu vaatimus on erittäin tärkeä, jos käytetään kvartsilasiputkea.

Lämpötilaohjelmoidun laitteen käyttöä suositellaan kaikissa tapauksissa ja erityisesti rasvahapoille, joissa on alle 16 hiiliatomia.

3.1.3    Kapillaarikolonni

3.1.3.1

Putki, joka on valmistettu analysoitaville aineille inertistä aineesta (tavallisesti lasista tai kvartsilasista). Sisähalkaisijan on oltava 0,20–0,32 mm. Sisäpinta on käsiteltävä sopivalla menetelmällä (esim. pintakäsittely, inaktivointi) ennen kuin se päällystetään stationäärifaasikerroksella. Riittävä pituus rasvahapoille ja rasvahappojen cis- ja trans-isomeereille on 60 m.

3.1.3.2

Stationäärifaasi, polaarista polysiloksaanityyppiä (syanosilikonit) olevat kytketyt kolonnit (kolonniverkot) ovat sopivia. Huomautus 2:  On olemassa vaara, että polaariset polysiloksaanit vaikeuttavat linoleenihapon ja C20-happojen erottumista ja tunnistamista. Päällysteen on oltava ohut, 0,1–0,2 μm.

3.1.3.3

Kolonnin kokoaminen ja esivalmistelut Tavanomaisia varotoimenpiteitä on noudatettava kapillaarikolonnien kokoamisessa, ts. kolonnin sijoittelu uuniin (tukirakenteet), liitosten valinta ja asennus (tiiviys), kolonnin päiden liittäminen injektiojärjestelmään ja detektoriin (mahdollisimman vähän kuollutta tilaa). Kantajakaasuvirta johdetaan kolonnin läpi (esimerkiksi 0,3 baaria, 30 kPa, 25 m pitkään kolonniin, jonka sisähalkaisija on 0,3 mm). Kolonni esilämmitetään ohjelmoimalla uuni niin, että lämpötila nousee 3 °C minuutissa huoneenlämmöstä sellaiseen lämpötilaan, joka on 10 °C alhaisempi kuin stationäärifaasin hajoamislämpötila. Uuni pidetään tässä lämpötilassa yhden tunnin ajan, kunnes perusviiva on tasoittunut. Lämpötila palautetaan 180 °C:seen ja työskentelyä jatketaan vakiolämpötilassa. Huomautus 3:  Esivalmisteltuja kolonneja voi myös ostaa.

3.1.4    Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntaja-vahvistin

3.2    Ruisku

Ruiskun enimmäistilavuuden on oltava 10 μl ja jakovälin 0,1 μl.

3.3    Tiedonkeruujärjestelmä

Verkkoon yhdistettävä tiedonkeruujärjestelmä detektoreineen sekä ohjelmisto piikkien integroimiseksi ja standardoimiseksi.

4.   MENETTELY

Toimenpiteet kohdissa 4.1–4.3 koskevat liekki-ionisaatiodetektorin käyttöä.

4.1    Testiolosuhteet

4.1.1    Optimaalisten koeolosuhteiden valinta kapillaarikolonneille

Kapillaarikolonnien tehokkuus- ja permeabiliteettiominaisuuksien vuoksi aineosien erottuminen ja määrityksen kesto riippuvat voimakkaasti kantajakaasun virtausnopeudesta kolonnissa. Sen vuoksi koeolosuhteet on optimoitava muuttamalla tätä parametria (eli kolonnin täytehäviötä) sen mukaan, halutaanko parantaa erotuskykyä vai saada tulos nopeasti.

Seuraavat olosuhteet ovat osoittautuneet sopiviksi rasvahappojen metyyliesterien (C4–C26) erottamiseen. Esimerkkejä kromatogrammeista esitetään lisäyksessä B:

4.1.2    Resoluution määrittäminen (ks. lisäys A)

Viereisten piikkien I ja II resoluutio (R) lasketaan seuraavalla kaavalla:

R = 2 × ((dr(II) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) tai R = 2 × ((tr(II) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia),

tai

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia))

jossa

Jos ω(I) ≈ ω(II), R lasketaan seuraavilla kaavoilla:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

jossa

σ on keskihajonta (ks. lisäys A, kuvio 1).

Jos piikkien d r(II) – d r(I) välinen etäisyys dr on yhtä suuri kuin 4σ, resoluutiotekijä R = 1.

Jos piikit eivät ole erottuneet toisistaan kokonaan, piikkien käännepisteisiin piirretyt tangentit leikkaavat kohdan C. Jotta piikit saadaan erottumaan täysin, niiden välisen etäisyyden on oltava

d r(II) – d r(I) = 6 σ josta R = 1,5 (ks. lisäys A, kuvio 3).

5.   TULOSTEN ILMOITTAMINEN

5.1    Kvalitatiivinen analyysi

Näytteen metyyliesteripiikit tunnistetaan lisäyksessä B, kuva 1, esitetyn kromatogrammin avulla, tarvittaessa interpoloimalla tai vertaamalla vertailuseosten vastaaviin metyyliesteripiikkeihin (kuten 2.3 kohdassa esitetään).

5.2    Kvantitatiivinen analyysi

5.2.1    Koostumuksen määrittäminen

Lasketaan yksittäisten rasvahappojen metyyliesterien massaosuus wi ilmaistuna prosenttiosuutena metyyliesterien massasta seuraavasti:

5.2.2    Laskentamenetelmä

5.2.2.1   Yleinen tapaus

Lasketaan tietyssä aineosassa i olevien metyyliesterien pitoisuus massaprosentteina määrittämällä piikin pinta-alan suhteellinen osuus kaikkien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta seuraavan kaavan avulla:

wi = (Ai/ΣA) × 100

jossa

Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

5.2.2.2   Korjauskertoimien käyttö

Joissakin tapauksissa, esimerkiksi silloin kun rasvahapossa on vähemmän kuin 8 hiiliatomia tai hapossa on sekundaarisia ryhmiä, pinta-alat on korjattava soveltamalla erityisiä korjauskertoimia (Fci). Nämä tekijät on määriteltävä jokaisen yksittäisen välineen osalta. Tähän on käytettävä sopivia vertailumateriaaleja, joiden rasvahappokoostumus on sertifioitu vastaavilla vertailuväleillä.

Vertailuseoksen rasvahappojen metyyliesterien i prosentuaalinen massaosuus saadaan kaavasta:

wi = (mi /Σm) × 100

jossa

Lasketaan vertailuseoksen kromatogrammista rasvahappojen metyyliesterien i prosentuaalinen pinta-ala:

wi = (Ai/ΣA) × 100

jossa

Näin ollen korjauskerroin Fc on

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Näytteen jokaisen rasvahappojen metyyliesterin i prosentuaalinen massaosuus on:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

5.2.2.3   Sisäisen standardin käyttö

Tietyissä määrityksissä (esimerkiksi jos kaikkien rasvahappojen määriä ei tunneta, kuten silloin kun 16 ja 18 hiiliatomia sisältävien rasvahappojen ohella esiintyy neljä ja kuusi hiiliatomia sisältäviä happoja tai kun on tarpeen määrittää näytteessä olevien rasvahappojen absoluuttinen määrä) on tarpeen käyttää sisäistä standardia. Usein käytetään rasvahappoja, joissa on 5, 15 tai 17 hiiliatomia. Sisäisen standardin korjauskerroin on määritettävä tarvittaessa.

Aineen i prosentuaalinen massaosuus metyyliestereinä ilmaistuna saadaan kaavasta:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

jossa

Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

6.   KOESELOSTE

Koeselosteessa on ilmoitettava metyyliestereiden valmistusmenetelmät ja käytetty kaasukromatografinen menetelmä. Siinä on myös mainittava kaikki menettelylliset yksityiskohdat, joista ei määrätä tässä standardimenetelmässä, tai joita pidetään valinnaisina, sekä kaikki tapahtumat, jotka ovat voineet vaikuttaa tuloksiin.

Koeselosteessa on oltava kaikki tarpeelliset tiedot, jotka tarvitaan näytteen täydelliseen tunnistamiseen.

7.   TARKKUUS

7.1    Monilaboratoriotestin tulokset

Yksityiskohtaiset tiedot menetelmän tarkkuutta koskevasta monilaboratoriotestistä esitetään standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C. Tästä monilaboratoriotestistä saatuja arvoja ei välttämättä voi soveltaa muihin kuin esitettyihin pitoisuusalueisiin ja matriiseihin.

7.2    Toistettavuus

Kahden riippumattoman yksittäisen testituloksen, jotka sama henkilö on saanut samassa laboratoriossa samalla menetelmällä ja samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille lyhyen ajan kuluessa, absoluuttinen ero saa korkeintaan 5 prosentissa tapauksista olla suurempi kuin standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C olevissa taulukoissa 1–14 esitetty r.

7.3    Uusittavuus

Kahden yksittäisen testituloksen, jotka eri henkilöt ovat saaneet eri laboratorioissa samalla menetelmällä mutta eri välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, absoluuttinen ero saa korkeintaan 5 prosentissa tapauksista olla suurempi kuin standardin IOC/T.20/Asiak. nro 33 liitteessä C olevissa taulukoissa 1–14 esitetty R.

---

Lisäys A

Kuvio 1

Leveys ω0,5 kolmion (ABC) puolen välin korkeudella ja leveys b kolmion (NPM) puolen välin korkeudella.

---

Lisäys B

Kuvio 1

Metylaatiomenetelmällä kylmässä saatu oliivin puristemassaöljyn kromatogrammi

Kromatogrammin piikit vastaavat metyyliestereitä, ellei toisin mainita.

▼B

---

LIITE XI

HAIHTUVIEN HALOGEENILIUOTTIMIEN PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN OLIIVIÖLJYSTÄ

1   PERIAATE

Kaasukromatografinen määritys kaasutilatekniikalla (head space).

2   VÄLINEISTÖ

2.1	Kaasukromatografialaitteisto, johon kuuluu elektroninkaappausdetektori (ECD).

2.2	Kaasutilalaitteisto (head space).

2.3	Kaasukromatografiakolonni, lasinen, pituus 2 m, halkaisija 2 mm, stationäärifaasi. OV101 10 % tai vastaava, kalsinoituun, happopestyyn ja silanoituun piimaahan imeytettynä, hiukkaskoko 80—100 mesh.

2.4	Kantaja- ja apukaasu: kaasukromatografiaan tarkoitettua typpeä, joka soveltuu elektroninkaappausdetektorille.

2.5	Teflonpinnoitteisia lasipulloja, 10—15 ml, varustettu alumiinitulpalla, jossa on sovitus näytteenottoruiskua varten.

2.6	Ilmatiiviisti sulkevat puristimet

2.7	Kaasuruisku, 0,5—2 ml.

3   REAGENSSIT

Standardi: kaasukromatografista laatua olevia haihtuvia halogeeniliuottimia.

4   SUORITUS

4.1

Punnitaan tarkasti noin 3 g öljyä lasipulloon, jota ei enää käytetä uudestaan; suljetaan se ilmatiiviisti. Pullo asetetaan termostaattiin 70 °C:seen yhdeksi tunniksi. Imetään ruiskulla varovasti 0,2—0,5 ml kaasutilaa. Injektoidaan tämä näyte kaasukromatografialaitteiston kolonniin, joka on säädetty seuraavasti: — injektorin lämpötila: 150 °C, — kolonnin lämpötila: 70—80 °C, — detektorin lämpötila: 200—250 °C.

4.2	Vertailuliuokset. Valmistetaan standardiliuoksia puhdistetusta oliiviöljystä, jossa ei ole lainkaan liuottimia, pitoisuudeltaan 0,05 — 1 ppm (mg/kg), jotka vastaavat näytteen oletettua pitoisuutta. Halogeeniliuottimia voidaan tarvittaessa laimentaa pentaanilla.

4.3

Kvantitatiivinen määritys. Verrataan toisiinsa näytteen piikkien korkeuksia tai pinta-aloja sekä sen standardiliuoksen piikkien korkeuksia ja pinta-aloja, jonka pitoisuuden oletetaan olevan lähinnä näytteen pitoisuutta. Jos suhteellinen poikkeama on suurempi kuin 10 %, määritys on tehtävä uudestaan käyttämällä eri standardiliuosta, kunnes suhteellinen poikkeama on alle 10 %. Määrä lasketaan yksittäisten injektioiden keskiarvon perusteella.

4.4	Tulosten esittäminen: ppm (mg/kg). Toteamisraja tässä menetelmässä on 0,01 mg/kg.

▼M26

---

LIITE XII

KANSAINVÄLISEN OLIIVINEUVOSTON MENETELMÄ NEITSYTOLIIVIÖLJYJEN AISTINVARAISTA ARVIOINTIA VARTEN

▼M28

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tässä liitteessä kuvatulla kansainvälisellä menetelmällä on tarkoitus määrittää menettely, jota käytetään Euroopan unionin ja neuvoston asetuksen (EU) N:o 1308/2013 ( 8 ) liitteessä VII olevan VIII osan 1 kohdassa tarkoitettujen neitsytoliiviöljyjen aistinvaraisten ominaisuuksien arvioinnissa, ja vahvistaa menetelmä neitsytoliiviöljyjen luokittelemiseksi kyseisten ominaisuuksien perusteella. Siinä annetaan myös valinnaisia pakkausmerkintöjä koskevia ohjeita.

Kuvattua menetelmää sovelletaan ainoastaan neitsytoliiviöljyihin ja niiden luokitteluun tai niiden pakkausmerkintöihin raadissa havaittujen virheiden ja hedelmäisyyden voimakkuuden perusteella. Raadin muodostaa ryhmä valikoituja, koulutettuja ja valvottuja maistajia.

Tässä liitteessä mainituista kansainvälisen oliivineuvoston standardeista käytetään niiden viimeisintä saatavilla olevaa versiota.

▼M26

2.   YLEINEN PERUSSANASTO AISTINVARAISTA ARVIOINTIA VARTEN

Viitataan standardiin IOC/T.20 / Asiak. nro 4 Sensory Analysis: General Basic Vocabulary (Aistinvarainen arviointi: yleinen perussanasto).

3.   ERITYISSANASTO

3.1.    Negatiiviset ominaisuudet

▼M28

3.1.1    Muut negatiiviset ominaisuudet

3.2    Positiiviset ominaisuudet

3.3    Valinnaiset termit pakkausmerkintöjä varten

Raadin puheenjohtaja voi pyynnöstä todistaa, että arvioidut öljyt ovat ominaisuuksien voimakkuuden ja havaitsemisen osalta seuraavia ilmauksia ja adjektiiveja vastaavien määritelmien ja vertailuvälien mukaisia:

Positiiviset ominaisuudet (hedelmäinen, karvas ja pistävä): Aistimuksen voimakkuuden mukaan:

▼M26

4.   LASI ÖLJYN MAISTAMISTA VARTEN

Viitataan standardiin IOC/T.20 / Asiak. nro 5, Glass for Oil Tasting (Öljynmaistamislasi).

5.   MAISTAMISHUONE

Viitataan standardiin IOC/T.20 / Asiak. nro 6, Guide for the Installation of a Test Room (Maistamishuoneen suunnittelu).

6.   TARVIKKEET

Seuraavien tarvikkeiden, joita maistaja tarvitsee voidakseen suoriutua tehtävästään, on oltava jokaisessa arvostelukopissa käden ulottuvilla:

7.   RAADIN PUHEENJOHTAJA JA MAISTAJAT

7.1.    Raadin puheenjohtaja

Raadin puheenjohtajalla on oltava asianmukainen koulutus ja asiantuntemusta niistä öljyistä, joita työn kuluessa tulee käsiteltäväksi. Puheenjohtaja on raadin avainhenkilö ja vastaa sen organisaatiosta ja toiminnasta.

Raadin puheenjohtajan työ edellyttää peruskoulutusta aistinvaraisen arvioinnin välineisiin, aistinvaraisia taitoja, huolellisuutta kokeiden valmistelussa, järjestämisessä ja toteuttamisessa sekä taitoa ja kärsivällisyyttä suunnitella ja toteuttaa kokeet tieteellisellä tavalla.

Puheenjohtaja on yksin vastuussa maistajien valinnasta, koulutuksesta ja valvonnasta, jotta näiden soveltuvuus tehtäväänsä säilyy riittävän hyvänä. Puheenjohtaja vastaa siten myös maistajien arvioinnista, jonka on aina oltava objektiivista ja jota varten puheenjohtajien on kehitettävä erityiset kokeisiin perustuvat menettelyt ja hyvin perustellut hyväksyntä- ja hylkäämisperusteet. Viitataan standardiin IOC/T.20 / Asiak. nro 14, Guide for the selection, training and monitoring of skilled virgin olive oil tasters (Neitsytoliiviöljyn pätevien maistajien valinta-, koulutus- ja valvontaopas).

Raadin puheenjohtaja on vastuussa raadin toiminnasta ja siten sen suorittamasta arvioinnista, josta puheenjohtajan on esitettävä luotettavaa ja objektiivista näyttöä. Puheenjohtajan on kaikissa tapauksissa aina voitava osoittaa, että menetelmä ja maistajat ovat hänen hallinnassaan. Suositellaan, että raati kalibroidaan määräajoin (IOC/T.20 / Asiak. nro 14, 5 §).

Puheenjohtaja on viime kädessä vastuussa raadin asiakirjojen säilyttämisestä. Asiakirjojen on aina oltava jäljitettävissä. Hänen on noudatettava aistinvaraisen arvioinnin varmistamista ja laatua koskevien kansainvälisten standardien vaatimuksia ja varmistettava aina näytteiden nimettömyys.

Puheenjohtaja vastaa välineistön ja tarvittavien laitteiden inventoinnista ja siitä, että ne ovat tämän menetelmän edellyttämien eritelmien mukaisia sekä asianmukaisesti puhdistettuja ja huollettuja. Hänen on varmistettava, että siitä säilytetään kirjalliset todisteet, samoin kuin koeolosuhteiden vaatimustenmukaisuudesta.

Puheenjohtaja vastaa näytteiden vastaanotosta ja säilyttämisestä sen jälkeen, kun ne saapuvat laboratorioon, samoin kuin niiden varastoinnista kokeiden jälkeen. Puheenjohtajan on edellä mainituissa toimissa aina varmistettava, että näytteet pysyvät nimettöminä ja että niitä säilytetään asianmukaisesti. Hänen on laadittava sitä varten kirjalliset menettelyt, joilla varmistetaan koko prosessin jäljitettävyys ja takeet vaatimustenmukaisuudesta.

Lisäksi puheenjohtaja vastaa näytteiden valmistelusta, merkinnästä ja esittelystä maistajille noudattamalla ennalta vahvistettujen protokollien mukaista asiaankuuluvaa koesuunnitelmaa sekä maistajilta saatavien tietojen kokoamisesta ja tilastollisesta käsittelystä.

Puheenjohtaja vastaa myös kaikkien muiden sellaisten menettelyjen kehittelystä ja laatimisesta, joita saatetaan tarvita täydentämään tätä standardia ja varmistamaan, että raati toimii asianmukaisesti.

Hänen on pohdittava keinoja, joilla raadin tuloksia voidaan verrata muiden neitsytoliiviöljyä arvioivien raatien tuloksiin sen varmistamiseksi, että raati toimii asianmukaisesti.

Raadin puheenjohtajan velvollisuus on motivoida raadin jäseniä luomalla heidän keskuudessaan innostunut, utelias ja kilpaileva henki. Tätä varten suositellaan voimakkaasti, että sujuva vuorovaikutus raadin jäsenten kanssa varmistetaan pitämällä jäsenet ajan tasalla kaikista tehtävistä, joita he suorittavat, sekä saaduista tuloksista. Lisäksi puheenjohtajan on varmistettava, että hänen oma mielipiteensä ei ole tiedossa, jotta hän ei siirrä omia perusteitaan muille maistajille.

Puheenjohtaja kutsuu maistajat koolle riittävän ajoissa ja vastaa mahdollisiin kysymyksiin kokeiden suorittamisesta, mutta hän ei saa esittää näytettä koskevia näkemyksiä.

▼M28

7.1.1    Raadin varapuheenjohtaja

Raadin puheenjohtajan voi perustellusta syystä korvata varapuheenjohtaja, joka hoitaa testauksen suorittamiseen liittyvät tehtävät. Tällä varahenkilöllä on oltava kaikki puheenjohtajana toimimiseksi tarvittavat taidot.

▼M28

7.2.    Maistajat

Oliiviöljyjä koskevissa aistinvaraisissa kokeissa maistajina toimivien henkilöiden on oltava vapaaehtoisia. Tästä syystä on suositeltavaa, että ehdokkaat tekevät kirjallisen hakemuksen. Raadin puheenjohtaja valitsee ja kouluttaa maistajaehdokkaat ja valvoo heidän taitoaan erottaa samanlaisia näytteitä. On muistettava, että koulutus lisää maistajien tarkkuutta.

Maistajan on toimittava todellisen aistinvaraisen havainnoitsijan tavoin, jätettävä syrjään oma henkilökohtainen makunsa ja raportoitava pelkästään havaitsemistaan aistimuksista. Tätä varten työ on aina tehtävä hiljaisuudessa, rennosti ja kiirehtimättä, jotta aistit voidaan kokonaan suunnata maistettavaan näytteeseen.

Jokaiseen kokeeseen tarvitaan 8–12 maistajaa, vaikka on aina hyvä pitää varalla muutama ylimääräinen maistaja, jotta mahdollisesti poisjääneet voidaan korvata.

▼M26

8.   KOEOLOSUHTEET

8.1.    Näytteen esittely

Arvioitava öljynäyte esitellään standardin IOC/T.20 / Asiak. nro 5, Glass for Oil Tasting mukaisessa maistamislasissa.

Lasissa on 14–16 ml öljyä tai 12,8–14,6 g, jos näytteet punnitaan. Ne on peitetty kellolasilla.

Jokainen lasi on merkitty tunnuksella, joka koostuu kahdesta satunnaisesta numerosta tai numeroista ja kirjaimista. Merkinnät on tehtävä hajuttomalla tavalla.

8.2.    Kokeen ja näytteen lämpötila

Maistettavaksi tarkoitetut öljynäytteet on koko kokeen ajan säilytettävä laseissa 28 ± 2 °C:n lämpötilassa. Tämä lämpötila on valittu siksi, että siinä on helpompi havaita aistinvaraisia eroja kuin huonelämpötilassa. Toinen syy tämän lämpötilan valintaan on, että kylmemmässä öljyn aromaattiset aineet tuskin pääsevät haihtumaan ja korkeammassa lämpötilassa haihtuu aineita, jotka ovat ominaisia kuumennetulle öljylle. Näytteen lämmittämiseen lasissa käytettävä menetelmä on esitetty standardissa IOC/T.20 / Asiak. nro 5, Glass for Oil Tasting.

Maistamishuoneen lämpötilan on oltava 20–25 °C (ks. IOC/T.20 / Asiak. nro 6).

8.3.    Kokeen ajankohta

Aamupäivä on parasta aikaa maistaa öljyjä: on todettu, että päivän aikana on jaksoja, jolloin maku- ja hajuaistimukset havaitaan parhaiten. Maku- ja hajuherkkyys kohoavat ennen aterioita ja vähenevät aterioiden jälkeen.

Tätä seikkaa ei saa kuitenkaan korostaa liikaa niin, että maistajat kärsivät nälän tunteesta, joka häiritsee heitä ja vaikuttaa erottelukykyyn. Siitä syystä maistamistilaisuudet suositellaan järjestettäviksi klo 10–12 aamupäivällä.

8.4.    Maistajat: yleiset käyttäytymissäännöt

Maistajien työskentelyyn sovelletaan seuraavia käyttäytymissuosituksia.

Kun raadin puheenjohtaja kutsuu osallistumaan aistinvaraiseen arviointiin, maistajan olisi voitava osallistua etukäteen sovittuna ajankohtana ja noudattaa seuraavia ohjeita:

9.   AISTINVARAINEN ARVIOINTIMENETTELY JA NEITSYTOLIIVIÖLJYN LUOKITTELU

9.1.    Maistamistekniikka

9.2.    Miten maistaja käyttää profiililomaketta

Maistajan käyttämä profiililomake on esitetty yksityiskohtaisesti tämän liitteen kuvassa 1.

Jokainen raatiin kuuluva maistaja haistaa ja maistaa ( 9 ) tarkasteltavaa öljyä. Sen jälkeen hänen on merkittävä profiililomakkeessa oleviin 10 cm:n asteikkoihin kunkin havaitsemansa negatiivisen ja positiivisen ominaisuuden voimakkuus.

Jos maistaja havaitsee negatiivisia ominaisuuksia, joita ei ole lueteltu 4 kohdassa, ne merkitään kohtaan ”muut” käyttämällä ilmauksia, jotka täsmällisimmin kuvaavat kyseisiä ominaisuuksia.

▼M28

9.3.    Miten raadin puheenjohtaja käyttää tietoja

Raadin puheenjohtaja kerää kunkin maistajan täyttämät profiililomakkeet ja tarkastaa eri ominaisuuksille osoitetut voimakkuusasteet. Jos havaitaan poikkeavuuksia, puheenjohtaja pyytää maistajaa tarkistamaan profiililomakkeensa ja tarvittaessa toistamaan kokeen.

Raadin puheenjohtaja vie raadin jäsenten arviointitiedot (standardin IOC/T.20/Asiak. nro 15 mukaiseen) tietokonesovellukseen, jotta arvioinnin tulokset voidaan laskea tilastollisesti niiden mediaanin perusteella. Ks. tämän liitteen 9.4 kohta ja lisäys. Tiettyä näytettä koskevat tiedot kirjataan yhdeksän saraketta käsittävän matriisin avulla. Sarakkeet edustavat yhdeksää aistimusominaisuutta. Matriisissa on n riviä, jotka edustavat käytettyjen raadin jäsenten lukumäärää n.

Jos vähintään 50 prosenttia raadin jäsenistä on merkinnyt havaitsemansa virheen kohtaan ”muut”, kyseisen virheen mediaani lasketaan ja öljy luokitellaan vastaavasti.

Robusti variaatiokerroin (voimakkuudeltaan voimakkain virhe ja hedelmäinen ominaisuus), joka määrittää luokituksen, saa olla enintään 20 prosenttia.

Jos näin ei ole, raadin puheenjohtajan on toistettava kyseisen näytteen arviointi toisessa maistamistilaisuudessa.

Jos tällainen tilanne toistuu usein, raadin puheenjohtajan on suositeltavaa antaa maistajille erityistä lisäkoulutusta (IOC/T.20/Asiak. nro 14, 5 §) ja käyttää toistettavuusindeksiä ja poikkeamaindeksiä maistajan suorituksen tarkastamiseen (IOC/T.20/Asiak. nro 14, 6 §).

9.4.    Öljyn luokittelu

Öljy luokitellaan jäljempänä esitettyihin luokkiin virheen mediaanin ja hedelmäisyyden ominaisuuden mediaanin mukaan. Virheen mediaanilla tarkoitetaan voimakkaimmin havaitun virheen mediaania. Virheen mediaani ja hedelmäisyyden mediaani ilmaistaan yhden desimaalin tarkkuudella.

Öljy luokitellaan vertaamalla virheen mediaanin ja hedelmäisyyden mediaanin arvoa jäljempänä esitettyihin vertailuväleihin. Koska vertailuvälien rajoja määriteltäessä on otettu huomioon menetelmän virhe, niitä on pidettävä absoluuttisina. Luokittelu voidaan esittää tietokonesovelluksien avulla visuaalisesti tilastotiedoista koottuna taulukkona tai kaaviona.

Jos kyse on vaatimustenmukaisuustarkastuksina tehdyistä analyyseistä, on tehtävä koe. Jos kyse on vasta-analyyseistä, raadin puheenjohtajan on teetettävä analyysi kahteen kertaan eri tilaisuuksissa; ominaisuuksien mediaani lasketaan molempien testien kaikkien profiililomakkeiden tietojen perusteella.

▼M26

---

Lisäys

Mediaanin ja luottamusvälin laskutapa

Mediaani

Mediaanilla tarkoitetaan reaalilukua Xm, joka osoittaa, että todennäköisyys (p) siihen, että jakauman arvot (X) ovat pienempiä kuin Xm, on enintään 0,5 ja että samanaikaisesti todennäköisyys (p) siihen, että jakauman arvot (X) ovat enintään Xm, on vähintään 0,5. Käytännönläheisemmän määritelmän mukaan mediaani on 50. prosenttipiste suuruusjärjestykseen asetetuista luvuista. Yksinkertaisemmin sanottuna mediaani on keskimmäinen suuruusjärjestykseen asetetuista luvuista, jos niitä on pariton määrä, tai kahden keskimmäisen luvun keskiarvo, jos suuruusjärjestykseen asetettuja lukuja on parillinen määrä.

Robusti keskihajonta

Jotta mediaanin variaatiosta saataisiin luotettava arvio, on käytettävä Stuartin ja Kendallin (4) arviointimenetelmää robustin keskihajonnan määrittämiseksi. Seuraavalla kaavalla saadaan asymptoottinen keskihajonta eli kyseessä olevien tietojen variaation robusti arvio, jossa N on havaintojen lukumäärä ja IQR kvartiilivälin pituus, joka sisältää täsmälleen 50 prosenttia tietyn todennäköisyysjakauman havainnoista.

Kvartiiliväli lasketaan laskemalla 75. ja 25. prosenttipisteen ero.

Prosenttipiste on arvo Xpc, joka osoittaa, että todennäköisyys (p) siihen, että jakauman arvot ovat pienempiä kuin Xpc, on enintään tietty prosentti, ja että samanaikaisesti todennäköisyys (p) siihen, että jakauman arvot ovat enintään Xpc, on vähintään kyseinen prosentti. Prosentti ilmoittaa tietyn jakauman fraktiilin. Kun kyseessä on mediaani, se on 50/100.

Käytännössä prosenttipiste on jakauman arvo, joka vastaa tiettyä jakauman tai tiheyden kaarelta rajattua aluetta. Esimerkiksi 25. prosenttipiste edustaa jakauman arvoa, joka vastaa aluetta 0,25 tai 25/100.

Tässä menetelmässä prosenttipisteet lasketaan tietomatriisissa olevien todellisten arvojen perusteella (prosenttipisteiden laskentamenettely).

Robusti variaatiokerroin (%)

Robusti variaatiokerroin CVr% on puhdas luku, joka osoittaa analysoitavan lukujoukon variaation prosenttiosuuden. Tämän vuoksi se on erittäin hyödyllinen raadin jäsenten luotettavuuden tarkistamiseksi.

95 prosentin luottamusväli suhteessa mediaaniin

95 prosentin luottamusväli (ensimmäisen lajin virheen arvo on 0,05 tai 5 prosenttia) kuvaa väliä, jolla mediaanin arvo voi vaihdella, jos koe olisi mahdollista toistaa lukemattomia kertoja. Käytännössä luottamusväli osoittaa kokeen vaihteluväliä valituissa toimintaolosuhteissa, jos oletetaan, että koe voitaisiin toistaa useita kertoja. Luottamusvälin kuten robustin variaatiokertoimenkin avulla voidaan arvioida kokeen luotettavuus.

jossa c = 1,96, kun luottamusväli on 95 prosentin tasolla.

Standardin IOC/T 20 / Asiak. nro 15 liitteessä I on esitetty esimerkkilaskelma.

Kirjallisuus

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

LIITE XV

1   OLIIVIJÄTTEEN ÖLJYPITOISUUS

1.1   Välineistö

1.2   Reagenssi

Teknistä n-heksaania, josta jää täydellisesti haihdutettuna alle 0,002 g jäännöstä/100 ml.

2   SUORITUS

2.1   Näytteen esikäsittely

Käytetään tarvittaessa mekaanista jauhinta näytteen jauhamiseksi niin hienoksi, että se menee kokonaan seulan läpi; jauhin on ensin hyvin puhdistettava.

Näytteestä käytetään noin 1/20 jauhatuslaitteen puhdistamiseen, heitetään pois syntynyt jauhos, jauhetaan loput näytteestä ja kerätään se, sekoitetaan huolellisesti ja määritetään viipymättä.

2.2   Näytteenotto

Heti kun jauhaminen on päättynyt, punnitaan noin 10 g näytettä 0,01 g:n tarkkuudella koetta varten.

2.3   Uuttohylsyn esikäsittely

Näyte pannaan uuttohylsyyn, joka suljetaan hydrofiilisellä pumpulitupolla. Jos käytetään suodatinpaperia, jauhettu näyte kääritään siihen.

2.4   Esikuivaus

Jos oliivijäännös on hyvin kosteata (ts. kosteutta ja haihtuvia aineita on yli 10 %), näyte kuivataan asettamalla täytetty uuttohylsy (tai paperiin kääritty näyte) lämpökaappiin sopivaksi ajaksi korkeintaan 80 °C:seen, jotta kosteus ja haihtuvat aineet vähenisivät alle 10 %:iin.

2.5   Pyöreäpohjaisen pullon esikäsittely

Punnitaan 1 mg:n tarkkuudella pullo, jossa on pari hohkakivikappaletta. Hohkakivi kuivataan ensin uunissa 103 ± 2 °C:ssa ja jäähdytetään eksikkaattorissa vähintään tunnin ajan.

2.6   Ensimmäinen uutto

Uuttohylsy näytteineen (tai paperiin kääritty näyte) sijoitetaan uuttolaitteistoon. Pulloon kaadetaan tarpeellinen määrä heksaania. Pullo liitetään uuttolaitteistoon ja asetetaan kokonaisuus sähkökäyttöiseen lämpöhauteeseen. Lämpö säädetään niin, että refluksointinopeus on vähintään kolme tippaa sekunnissa (kohtalainen, ei kova kiehuminen).

Neljän tunnin uuton jälkeen annetaan jäähtyä. Hylsy irrotetaan uuttolaitteistosta ja pannaan ilmavirtaan, jotta suurin osa imeytyneestä liuottimesta haihtuisi.

2.7   Toinen uutto

Hylsyn sisältö siirretään mikrojauhatuslaitteeseen ja jauhetaan niin hienoksi kuin mahdollista. Jauhettu näyte kootaan tarkoin ja pannaan takaisin hylsyyn, joka liitetään taas uuttolaitteistoon.

Jatketaan uuttoa vielä kaksi tuntia käyttäen samaa pyöreäpohjaista pulloa, jossa on ensimmäinen uute.

Uuttopulloon kertyvän liuoksen on oltava kirkasta. Ellei näin ole, se suodatetaan paperin läpi ja pullo ja suodatinpaperi pestään useaan kertaan heksaanilla. Suodos ja pesuliuotin kerätään toiseen kuivattuun 1 mg:n tarkkuudella taarattuun pulloon.

2.8   Liuottimen poistaminen ja uutteen punnitseminen

Tislataan pois enin osa liuottimesta haihduttamalla sähkökäyttöisessä hauteessa. Liuottimen jäänteet poistetaan kuumentamalla pulloa 20 minuuttia uunissa 103 ± 2 °C:ssa. Liuottimen haihtumista voidaan edistää puhaltamalla ajoittain uuniin ilmaa tai mieluummin inerttiä kaasua tai käyttämällä alipainetta.

Pullo asetetaan eksikkaattoriin jäähtymään vähintään tunniksi ja punnitaan 1 mg:n tarkkuudella.

Kuumennetaan uudestaan samoissa olosuhteissa 10 minuuttia, jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan uudelleen.

Näiden kahden punnitustuloksen ero saa olla enintään 10 mg. Ellei tähän päästä, kuumennetaan jälleen 10 minuuttia, jäähdytetään ja punnitaan, kunnes massan ero edelliseen on enintään 10 mg. Viimeisen punnituksen tulos merkitään muistiin.

Samasta näytteestä tehdään kaksi eri määritystä.

3   TULOSTEN ESITTÄMINEN

3.1   Laskutapa ja kaava

3.2   Toistettavuus

Saman kokeen tekijän peräkkäisten tai samanaikaisten rinnakkaiskokeiden tulosten välinen ero ei saa olla yli 0,2 g heksaaniuutetta/100 g näytettä.

Jos tämä ehto ei täyty, koe toistetaan kahdella uudella näytteellä. Jos ero on yhä suurempi kuin 0,2 g, tulos on tehdyn neljän määrityksen aritmeettinen keskiarvo.

---

LIITE XVI

JODILUVUN MÄÄRITTÄMINEN

1   TARKOITUS

Tämä kansainvälinen standardi kuvaa menetelmän jodiluvun määrittämiseksi eläin-ja kasvirasvoista sekä -öljyistä, joihin tästedes viitataan sanalla rasva.

2   MÄÄRITELMÄ

Tätä kansainvälistä standardia varten määritellään seuraavat käsitteet:

2.1	Jodiluku. u:näytteen absorboiman jodin massa tässä kansainvälisessä standardissa määrätyissä olosuhteissa. Jodiluku ilmoitetaan grammoina jodia/100 g näytettä.

3   PERIAATE

Näyte liuotetaan liuottimeen ja lisätään Wijsin reagenssia. Tietyn ajan kuluttua lisätään kaliumjodidin vesiliuosta ja vapautunut jodi titrataan natriumtiosulfaattiliuoksella.

4   REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava hyväksyttyä analyysilaatua.

4.1	Kaliumjodidiliuos, 100 g/l, ei saa sisältää jodaatteja eikä vapaata jodia.

4.2	Tärkkelysliuos. Lisätään 5 g liukoista tärkkelystä 30 ml:aan vettä, lisätään tämä seos 1 000 ml:aan kiehuvaa vettä; annetaan kiehua kolme minuuttia ja jäähdytetään.

4.3	Natriumtiosulfaatti, standardi titrausliuos c(Na2S2O3 . 5H2O) = 0,1 mol/l, standardoitu enintään seitsemän päivää ennen käyttöä.

4.4	Liuotin, valmistettu sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet sykloheksaania ja etikkahappoa.

4.5	Wijsin reagenssi, joka sisältää jodimonokloridia etikkahapossa. On käytettävä valmiina saatavaa Wijsin reagenssia. Huom: Reagenssi sisältää 9 g ICI3:a ja 9 g I:a etikkahapossa.

5   VÄLINEISTÖ

Tavallinen laboratoriovälineistö ja erityisesti seuraavat:

5.1	Punnituslaseja, jotka sopivat näytemäärän punnitsemiseen ja pulloon (5.2) siirtämiseen.

5.2	Erlenmeyerpulloja, 500 ml, hiotut lasitulpat, täysin kuivia.

6   NÄYTTEEN VALMISTAMINEN

Homogenoitu näyte kuivatetaan natriumsulfaatilla ja suodatetaan.

7   SUORITUS

7.1	Näytteenotto Näytemäärä määräytyy oletetun jodiluvun perusteella taulukon 1 mukaisesti. Taulukko 1 Oletettu jodiluku Näytteen määrä (g) alle 5 3,00 5—20 1,00 21—50 0,40 51—100 0,20 101—150 0,13 151—200 0,10 Näytemäärä punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella punnituslasissa (5.1).

7.2

Määritys Näyte pannaan 500 ml:n pulloon (5.2). Lisätään 20 ml liuotinta (4.5) rasvan liuottamiseksi. Lisätään tasan 25 ml Wijsin reagenssia (4.6), suljetaan tulpalla, ravistetaan ja jätetään pullo pimeään. Wijsin reagenssin kanssa ei saa käyttää suupipettiä. Sokeakoe valmistellaan samalla tavalla käyttäen liuotinta ja reagenssia ilman näytettä. Pullot jätetään pimeään tunniksi, jos näytteen oletettu jodiluku on alle 150; jos oletettu jodiluku on yli 150 tai tuote on polymeroitunut tai hyvin hapettunut, pullot jätetään pimeään kahdeksi tunniksi. Ajan päätyttyä lisätään 20 ml kaliumjodidiliuosta (4.2) ja 150 ml vettä (4.1) kuhunkin pulloon. Titrataan standardilla natriumtiosulfaatin titrausliuoksella (4.4), kunnes jodin aiheuttama keltainen väri on melkein hävinnyt. Lisätään pari tippaa tärkkelysliuosta (4.3) ja jatketaan titraamista, kunnes sininen väri juuri katoaa liuosta voimakkaasti ravistettaessa. Huom. Myös potentiometrinen titrauksen loppupisteen määrittäminen on sallittua.

7.3	Määritysten lukumäärä Samasta näytteestä tehdään kaksi määritystä.

8   TULOSTEN ESITTÄMINEN

Jodiluku saadaan kaavasta

jossa:

c = käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tarkka pitoisuus, moolia/litra;

V1 = sokeakokeeseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tilavuus millilitroina;

V2 = määritykseen käytetyn natriumtiosulfaattiliuoksen (4.4) tilavuus millilitroina;

m = näytemäärä (7.1) grammoina.

Tulos on kahden määrityksen tulosten aritmeettinen keskiarvo sillä ehdolla, että toistettavuusehto täyttyy.

▼M11

---

LIITE XVII

MENETELMÄ STIGMASTADIEENIEN MÄÄRITTÄMISEKSI KASVIÖLJYISTÄ

1.   TARKOITUS

Stigmastadieenien määritys kasviöljyistä, joissa näiden hiilivetyjen pitoisuudet ovat pieniä, kuten neitsytoliiviöljystä ja oliivin puristusjätteestä saadusta raakaöljystä.

2.   SOVELTAMISALA

Tätä standardia voidaan soveltaa kaikkiin kasviöljyihin; mittaustulokset ovat kuitenkin luotettavia ainoastaan, jos näiden hiilivetyjen pitoisuus on 0,01—4,0 mg/kg. Menetelmä soveltuu erityisesti puhdistettujen kasviöljyjen (oliivi, oliivin puristusjäte, auringonkukka, palmu tms.) toteamiseen neitsytoliiviöljystä, sillä puhdistetut öljyt sisältävät stigmastadieeneja, mutta neitsytöljyt eivät sisällä niitä.

3.   PERIAATE

Saippuoitumattoman aineksen erottaminen. Steroidihiilivetyfraktion erottaminen pylväskromatografian avulla käyttäen silikageeliä ja kapillaarikaasukromatografista määritystä.

4.   LAITTEISTO

4.1	250 ml:n pulloja, joita voi käyttää palautusjäähdyttimen kanssa.

4.2	Erotussuppiloita, joiden vetoisuus on 500 ml.

4.3	Pyöreäpohjaisia 100 ml:n pulloja.

4.4	Pyöröhaihdutin (”rotavapori”).

4.5

Lasinen kromatografiakolonni (sisähalkaisija 1,5—2,0 cm, pituus 50 cm), jossa on teflonhana ja jonka pohjalla on lasivillatulppa tai lasisintterievy. Silikageelikolonni valmistellaan kaatamalla kromatografiakolonniin n. 5 cm kerros heksaania ja täyttämällä sen jälkeen kolonni silikageelin heksaanilietteellä (15 g en 40 ml:ssa) käyttäen apuna heksaaniannoksia. Annetaan seistä ja viimeistellään asettuminen kevyellä tärytyksellä. Lisätään vedetöntä natriumsulfaattia noin 0,5 cm:n kerros ja eluoidaan lopuksi liika heksaani.

4.6	Kaasukromatografi, jossa on liekki-ionisaatiodetektori, jakajatyyppinen tai kylmä kolonniin liittyvä (on-column) injektori sekä uuni, joka on ohjelmoitavissa ± 1 celsiusasteen tarkkuudella.

4.7	Kaasukromatografinen kvartsilasikapillaarikolonni (sisähalkaisija 0,25 tai 0,32 mm, pituus 25 m), joka on pinnoitettu 5-prosenttisella fenyylimetyylisilikonifaasilla, jonka kerrospaksuus on 0,25 μm. Huomautus 1: Voidaan käyttää myös muita kolonneja, joiden polaarisuus on sama tai pienempi.

4.8	Tallentava integraattori, jolla voidaan integroida pohjasta pohjaan.

4.9	Liimatulla neulalla varustettu 5—10 μl:n mikroruisku kaasukromatografiaa varten.

4.10	Sähköinen kuumennusvaippa tai lämpölevy.

5.   REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua, ellei toisin määrätä. Käytettävän veden tulee olla tislattua vettä tai puhtaudeltaan vähintään vastaavaa.

5.1	Heksaania tai alkaaniseos, jonka aineosien kiehumispisteet ovat 65—70° C ja joka on tislattu rektifioimiskolonnilla. Huomautus 2: Liuotin on tislattava epäpuhtauksien poistamiseksi.

5.2	96-prosenttista (v/v) etanolia.

5.3	Vedetöntä natriumsulfaattia.

5.4

Kaliumhydroksidin 10-prosenttista alkoholiliuosta. Lisätään 10 ml vettä 50 g:aan kaliumhydroksidia, sekoitetaan ja liuotetaan seos 500 ml:aan etanolia. Huomautus 3: Kalilipeän alkoholiliuos muuttuu seistessään ruskeaksi. Liuos on valmistettava uudelleen joka päivä ja pidettävä hyvin suljetuissa ruskeissa lasipulloissa.

5.5

Silikageeliä 60 kaasukromatografiaa varten, 70—230 mesh (Merck ref. 7734 tai samanlainen). Huomautus 4: Silikageeli voidaan yleensä ottaa käyttöön suoraan pakkauksesta ilman mitään käsittelyä. Joissakin valmistuserissä esiintyy kuitenkin alhaista aktiivisuutta, joka johtaa huonoon kromatografiseen erottumiseen. Tällöin silikageeli on käsiteltävä seuraavasti: Silikageeli aktivoidaan kuumentamalla sitä vähintään neljä tuntia 550° C:n lämpötilassa. Kuumentamisen jälkeen silikageelin annetaan jäähtyä eksikkaattorissa ja pannaan sitten tulpalla suljettuun pulloon. Lisätään 2 % vettä ja ravistetaan, kunnes paakkuja ei näy ja jauhe virtaa vapaasti. Jos silikageelin valmistuserä on sellainen, että se aiheuttaa kromatogrammiin toisiaan häiritseviä huipuja, silikageeli on käsiteltävä edellä esitetyllä tavalla. Vaihtoehtoinen tapa on käyttää erikoispuhdasta silikageeliä 60 (Merck, ref. 7754).

5.6	Kolesta-3,5-dieenin (Sigma, 99-prosenttinen puhtaus) varastoliuos (200 ppm) heksaanissa (10 mg 50 ml:ssa).

5.7	Kolesta-3,5-dieenin standardiliuos heksaanissa, pitoisuus 20 ppm, saadaan laimentamalla edellä mainitusta liuoksesta. Huomautus 5: 5.6 ja 5.7 kohdassa tarkoitetut liuokset säilyvät huononematta vähintään neljä kuukautta, jos niitä säilytetään alle 4° C:n lämpötilassa.

5.8	n-nonakosaanin heksaaniliuos, pitoisuus n. 100 ppm.

5.9	Kantajakaasu kromatografiaa varten: helium tai vety, puhtaus 99,9990 %.

5.10	Apukaasut liekki-ionisaatiodetektoria varten: vety, jonka puhtaus on 99,9990 %, ja puhdistettu ilma.

6.   MENETTELY

6.1   Saippuoitumattoman aineksen valmistelu:

6.1.1

Punnitaan 20 ± 0,1 g öljyä 250 ml:n pulloon (4.1), lisätään 1 ml kolesta-3,5-dieenin (20 μg) standardiliuosta ja 75 ml kalilipeän 10-prosenttista alkoholiliuosta, kiinnitetään palautusjäähdytin ja keitetään hiljalleen 30 minuuttia. Otetaan näytteen sisältävä pullo pois lämpölähteestä ja annetaan liuoksen jäähtyä hieman (liuos ei saa jäähtyä kokonaan, sillä tällöin näyte erottuu). Lisätään 100 ml vettä ja siirretään lios erotussuppiloon (4.2) 100 ml:lla heksaania. Seosta ravistetaan voimakkaasti 30 sekuntia, minkä jälkeen sen annetaan erottua kerroksiksi. huomautus 6: Jos muodostuu emulsio, joka ei häviä nopeasti, lisätään hieman etanolia.

6.1.2

Pohjalle jäävä vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon ja uutetaan uudelleen 100 ml:lla heksaania. Pohjalle jäävä osa juoksutetaan taas pois ja heksaaniuute (yhdistettynä toisen erotussuppilon ainekseen) pestään kolme kertaa 100 ml:lla etanoli-vesiseoksella (1:1), kunnes pH on neutraali.

6.1.3

Heksaaniliuos johdetaan vedettömän natriumsulfaatin (50 g) läpi, pestään 20 ml:lla heksaania ja haihdutetaan kuivaksi pyöröhaihduttimessa 30° C:n lämpötilassa matalassa paineessa.

6.2   Steroidihiilivetyjakeen erottaminen:

6.2.1

Jäännös siirretään fraktiointikolonniin käyttäen kahta yhden millilitran heksaaniannosta, näyte johdetaan kolonniin antaen liuoksen pinnan vajota natriumsulfaattikerroksen pinnan tasalle ja aloitetaan kromatografinen eluointi heksaanilla käyttäen virtausnopeutta, joka on n. 1 ml/min. Eluaatin ensimmäiset 20—30 ml heitetään pois ja seuraava 40 ml:n jae otetaan talteen. Talteen otettu jae siirretään 100 ml:n pyöreäpohjaiseen pulloon (4.3). Huomautus 7: Ensimmäinen jae sisältää tyydyttyneitä hiilivetyjä (kuva 1a) ja toinen jae steroidihiilivetyjä. Lisäeluointi tuottaa skvaleenia ja vastaavia yhdisteitä. Jotta saavutetaan tyydyttyneiden ja steroidihiilivetyjen tarkka erottuminen, jakeiden tilavuudet on määritettävä ihanteellisiksi. Tätä varten ensimmäisen jakeen tilavuus on valittava siten, että toista jaetta määritettäessä tyydyttyneiden hiilivetyjen huippu on matala (ks. kuva 1c); jos niitä ei ilmene ja standardihuippu on heikko, tilavuutta on pienennettävä. Joka tapauksessa on tarpeetonta erottaa täysin ensimmäisen ja toisen jakeen osia, sillä kaasukromatografisessa määrityksessä ei esiinny päällekkäisiä huippuja, jos kaasukromatografiaolosuhteet säädetään 6.3.1 kohdan mukaisesti. Toisen jakeen ihannetilavuutta ei yleensä tarvitse etsiä, sillä myöhemmät osat erottuvat hyvin. Jos kutenkin esiintyy suuri huippu, jonka retentioaika on n. 1,5 minuuttia lyhyempi kuin standardin, tämä johtuu skvaleenista ja osoittaa huonoa erotuskykyä.

6.2.2

Toinen jae haihdutetaan kuivaksi haihduttimessa 30° C lämpötilassa matalassa paineessa, ja jäännös liuotetaan välittömästi 0,2 ml:aan heksaania. Liuos säilytetään jääkaapissa määritykseen asti. Huomautus 8: 6.1.3 ja 6.2.2 kohdassa tarkoitettuja jakeita ei pidä säilyttää kuivana eikä huoneenlämpötilassa. Liuotin on lisättävä heti kun jäännös on saatu, ja liuoksia on tämän jälkeen säilytettävä jääkaapissa.

6.3   Kaasukromatografia

6.3.1

Työskentelyolosuhteet jakajakatyyppistä injektoria varten: — Injektorin lämpötila: 300° C. — Detektorin lämpötila: 320° C. — Tallentava intergraattori: integrointiparametrit on valittava siten, että pinta-alat arvioidaan oikein. Integrointi pohjasta pohjaan on suositeltavaa. — Herkkyys: noin 16 kertaa vähimmäisvaimennus. — Injektoitava liuosmäärä: 1μl. — Uunin lämpötilaohjelma: alussa 235° C 6 minuutin ajan, sen jälkeen lämpötilaa kohotetaan 2° C/min, kunnes lämpötila on 285° C. — Injektori, jossa on virtauksenjakaja 1:15. — Kantajakaasu: helium tai vety, paine n. 120 kPa. Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kromatografin ja kolonnin ominaisuuksien mukaan, jotta saavutetaan seuraavien vaatimusten mukainen kromatogrammi: sisäisen standardin huippu n. 5 minuutin tarkkuudella 6.3.2 kohdassa tarkoitetussa ajassa; sisäisen standardin huipun on oltava vähintään 80 prosenttia täydestä asteikosta. Kaasukromatografijärjestelmä on tarkistettava ruiskuttamalla kolestadieenin (5.6) varastoliuoksen ja n-nonakosaaniliuoksen (5.8) seosta. Kolesta-3,5-dieenin huippu tulee esiintyä ennen n-notakosaanin huipua (kuva1c); jos näin ei käy, voidaan menetellä kahdella tavalla: alentaa uunin lämpötilaa ja/tai käyttää polaarisuudeltaan pienempää kolonnia.

6.3.2

Huipun tunnistaminen Sisäisen standardin huippu esiintyy n. 19 minuutin kuluttua ja stigmasta-3,5-dieenin huippu suhteellisella retentioajalla, joka on n. 1,29 (ks. kuva 1b). Stigmasta-3,5-dieenin mukana kulkee pieni määrä isomeeria, ja yleensä molemmat sisältyvät samaan huippuun. Jos kolonni on kuitenkin liian polaarinen tai sen erotuskyky on suuri, isomeerin huippu saattaa näkyä erillisenä pinenä stigmasta-3,5-dieenihuippua välittömästi edeltävänä huippuna (kuva 2). Jotta voidaan varmistaa, että eluoituvat stigmastadieenit muodostavat vain yhden huipun, on suotavaa vaihtaa kolonnin tilalle vähemmän polaarinen tai sisähalkaisijaltaan suurempi kolonni. Huomautus 9: Stigmastadieeneja voidaan saada kromatografista vertailua varten määrittämällä puhdistettua kasviöljyä ja käyttämällä pinempää näytettä (1—2 g). Stigmastadieenit tuottavat voimakkaan ja helposti tunnistettava huipun.

6.3.3

Kvantitatiivinen märitys Stigmastadieenipitoisuus määritetään seuraavan kaavan avulla: stigmastadieenipitoisuus mg/kg = jossa As = stigmastadieenien huipun pinta-ala (jos huippu jakaantuu kahden isomeerin huipuksi, näiden kahden huipun pinta-alojen summa) Ac = sisäisen standardin (kolestadieeni) huipun pinta-ala Mc = lisätyn standardin massa mikrogrammoina Mo = öljyn massa grammoina Toteamisraja: noin 0,01 mg/kg.

Kuva 1

Kaasukromatogrammi, joka on saatu oliiviöljynäytteistä, jotka on määritetty kvartsilasikapillaarikolonnissa (sisähalkaisija 0,25, pituus 25 m); kolonni on pinnoitettu 5-prosenttisella fenyylimetyylisilikonillaa, kerrospaksuus 0,25 μm.

Kuva 2

Kaasukromatogrammi, joka on saatu DB-5-kolonnilla määritetystä puhdistetun oliiviöljyn näytteestä; kromatogrammissa näkyy stigmasta-3,5-dieenin isomeeri.

▼M25

---

LIITE XVIII

ECN42-TRIASYYLIGLYSEROLIEN TEOREETTISEN KOOSTUMUKSEN JA TODELLISEN KOOSTUMUKSEN VÄLISEN ERON MÄÄRITYS

1.   SOVELTAMISALA

Seuraavien arvojen välisen absoluuttisen eron määrittäminen: triasyyliglyserolien (TAG), joiden ekvivalenttihiililuku on 42 (ECN42HPLC), kokeelliset arvot, jotka saadaan määrittämällä ne öljyssä suuren erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografialla, ja triasyyliglyserolien, joiden ekvivalenttihiililuku on 42 (ECN 42theoretical), teoreettinen arvo, joka saadaan laskemalla rasvahappokoostumuksesta.

2.   SOVELTAMISALA

Standardia sovelletaan oliiviöljyihin. Menetelmä soveltuu pienten siemenöljymäärien (joissa on paljon linolihappoa) osoittamiseen kaikissa oliiviöljyissä.

3.   PERIAATE

Aitojen oliiviöljyjen ECN42-triasyyliglyserolien HPLC-analyysillä määritetty ja ECN42-triasyyliglyserolien teoreettinen koostumus (joka lasketaan rasvahappokoostumuksen GLC-määrityksen perusteella) vastaavat tietyissä rajoissa toisiaan. Jos erotus on suurempi kuin öljytyypille vahvistettu arvo, on öljyssä todennäköisesti siemenöljyjä.

4.   MENETELMÄ

Menetelmä ECN42-triasyyliglyserolien teoreettisen pitoisuuden ja HPLC-määrityksen tulosten välisen erotuksen laskemiseksi perustuu pääasiallisesti muilla menetelmillä saatujen analyyttisten tietojen koordinointiin. Tässä voidaan erottaa kolme vaihetta: rasvahappokoostumuksen määritys kapillaarikaasukromatografialla, ECN42-triasyyliglyserolien teoreettisen koostumuksen laskeminen ja ECN42-triasyyliglyserolien HPLC-määritys.

4.1    Välineistö

4.1.1

Pyörökolveja, 250 ml ja 500 ml

4.1.2

Dekanttilaseja, 100 ml

4.1.3

Lasinen kromatografiapylväs, sisähalkaisija 21 mm, pituus 450 mm, jossa on tulppa ja standardoitu naaraspuolinen hios yläpäässä

4.1.4

Erotussuppiloita, 250 ml, joissa on standardoitu koiraspuolinen hios alapäässä ja joka voidaan liittää pylvään yläpäähän

4.1.5

Lasisauva, pituus 600 mm

4.1.6

Lasisuppilo, halkaisija 80 mm

4.1.7

Mittapulloja, 50 ml

4.1.8

Mittapulloja, 20 ml

4.1.9

Pyöröhaihdutin

4.1.10

Korkean suorituskyvyn nestekromatografi, jonka pylväs voidaan termostoida

4.1.11

Injektiolaite, jolla voidaan injisoida 10 μl

4.1.12

Detektori: differentiaalirefraktometri. Koko asteikon herkkyyden pitäisi olla vähintään 10–4 taitekerroinyksikköä.

4.1.13

Pylväs: ruostumatonta terästä, pituus 250 mm ja sisähalkaisija 4,5 mm, johon pakattu 5 μm:n piihappopartikkeleja, jotka sisältävät 22–23 % hiiltä oktadekyylisilaanin muodossa.

4.1.14

Tietokoneohjelma tulosten käsittelyyn

4.1.15

Suppiloita, noin 2 ml, joissa teflon-septumit ja kierrekorkit.

4.2    Reagenssit

Reagenssien on oltava analyysipuhtausluokkaa. Eluointiliuottimista on poistettava kaasut, ja niitä voi käyttää useaan kertaan ilman että se vaikuttaa erotuksiin.

4.2.1

Petrolieetteri 40–60 °C, kromatografialaatua, tai heksaani

4.2.2

Etyylieetteri, peroksidivapaa, tislattu juuri ennen käyttöä

4.2.3

Eluutioliuotin öljyn puhdistamiseksi kolonnikromatografialla: petrolieetterin ja etyylieetterin seos 87/13 (v/v)

4.2.4

Piihappogeeli, 70–230 mesh, tyyppiä Merck 7734, jonka vesipitoisuus on standardoitu 5 prosenttiin (w/w)

4.2.5

Lasivilla

4.2.6

Asetoni HPLC-määritystä varten

4.2.7

Asetonitriili tai propionitriili HPLC-määritystä varten

4.2.8

HPLC-eluutioliuotin: asetonitriili + asetoni (osuudet säädetään siten että saadaan haluttu erotus; aloitetaan 50:50-seoksella) tai propionitriili

4.2.9

Liuottamisliuotin: asetoni

4.2.10

Vertailutriglyseridit: joko käytetään kaupallisia triglyseridejä (tripalmitiini, trioleiini jne.) ja kuvataan retentioajat ekvivalenttihiililuvun funktiona tai tehdään vertailukromatogrammit soijaöljy-oliiviöljyseoksella suhteessa 30:70 ja puhtaalla oliiviöljyllä (ks. huomautukset 1 ja 2 sekä kuvat 1–4).

4.2.11

Kiinteäfaasiuuttopylväs, jossa on piihappofaasi 1 g, 6 ml

4.3    Näytteen valmistus

Koska monet aineet voivat antaa vääriä positiivisia tuloksia, näyte on aina puhdistettava paistorasvoissa esiintyvien polaaristen yhdisteiden määrittämiseen tarkoitetulla IUPAC-menetelmällä 2.507.

4.3.1    Kromatografiapylvään valmistelu

Pylväs (4.1.3) täytetään noin 30 ml:lla eluutioliuosta (4.2.3), siihen pannaan hiukan lasivillaa (4.2.5), joka työnnetään pylvään pohjaan lasisauvalla (4.1.5).

Suspendoidaan 100 ml:n dekanterilasiin 25 g piihappogeeliä (4.2.4) 80 ml:ssa eluutioliuosseosta (4.2.3), joka lisätään pylvääseen lasisuppilon (4.1.6) avulla.

Jotta piihappogeeli saadaan kokonaan siirretyksi pylvääseen, dekanterilasia pestään eluutioliuoksella ja pesunesteet lisätään pylvääseen.

Tulppa avataan ja liuottimen annetaan valua pylväästä, kunnes sen pinta on noin 1 cm piihappogeelin pinnan yläpuolella.

4.3.2    Pylväskromatografia

Punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella 2,5 ± 0,1 g öljyä, joka on etukäteen suodatettu ja homogenoitu ja josta on tarvittaessa poistettu vesi, 50 ml:n mittapulloon (4.1.7).

Öljy liuotetaan noin 20 ml:aan eluutioliuotinta (4.2.3). Lämmitetään tarvittaessa liuottamisen helpottamiseksi. Annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan, ja tilavuus säädetään merkkiin eluutioliuottimella.

20 ml tätä liuosta siirretään volymetrisellä pipetillä kohdan 4.3.1 mukaisesti valmisteltuun pylvääseen. Tulppa aukaistaan ja liuottimen annetaan valua piihappogeelin pinnan tasolle.

Eluoidaan 150 ml:lla eluutioliuotinta (4.2.3). Eluutionopeus noin 2 ml/min (150 ml menee pylvään läpi noin 60–70 minuutissa).

Eluaatti kerätään 250 ml:n pyörökolviin (4.1.1), joka on taarattu uunissa ja punnittu tarkasti. Liuotin haihdutetaan alipaineessa pyöröhaihduttimessa ja jäännös punnitaan. Siitä tehdään HPLC-analyysiin ja metyyliesterin valmistukseen käytettävä liuos.

Pylväästä on saatava talteen vähintään 90 % näytteestä, kun kyseessä ovat ekstraneitsytoliiviöljyn, neitsytoliiviöljyn, puhdistetun oliiviöljyn ja oliiviöljyn luokat, ja vähintään 80 %, kun kyseessä ovat lamppuöljyt ja oliivin puristemassaöljyt.

4.3.3    Puhdistus kiinteäfaasiuuttona

Kiinteäfaasiuuttopiihappopylväs aktivoidaan 6 ml heksaanilla (4.2.3) tyhjiössä kuivumista välttäen.

Punnitaan 0,001 g:n tarkkuudella 0,12 g 2 ml:n pulloon (4.1.15) ja liuotetaan 0,5 ml:lla heksaania (4.2.3).

Täytetään kiinteäfaasiuuttopylväs liuoksella ja eluoidaan tyhjiössä 10 ml:lla heksaania/dietyylioksidia (87:13 v/v) (4.2.3).

Kerätty jae haihdutetaan kuiviin alipaineessa pyöröhaihduttajassa (4.1.9) huoneenlämmössä. Haihdutusjäännös liuotetaan 2 ml:aan asetonia (4.2.6) triasyyliglyserolien määritystä varten.

4.4    HPLC-määritys

4.4.1    Näytteiden valmistus kromatografiaan

Analysoitavasta näytteestä valmistetaan 5-prosenttinen liuos punnitsemalla 0,5 ± 0,001 g näytettä 10 ml:n asteikolliseen pulloon ja täyttämällä 10 ml:ksi liuottamisliuottimella (4.2.9).

4.4.2    Menettely

Kootaan kromatografialaitteisto. Eluutioliuotinta (4.2.8) pumpataan nopeudella 1,5 ml/min laitteiston puhdistamiseksi. Odotetaan, kunnes perusviiva on tasainen.

Injisoidaan 10 μl näytettä, joka on valmistettu kuten kohdassa 4.3 selostetaan.

4.4.3    Tulosten laskeminen ja ilmoittaminen

Käytetään sisäisen standardin menetelmää, ts. oletetaan, että TAGien (ECN42-triglyserideistä ECN52-triglyserideihin) piikkien yhteenlasketut pinta-alat ovat 100 %.

Kunkin triglyseridin suhteellinen prosenttiosuus lasketaan kaavalla:

.

Tulokset on ilmoitettava vähintään kahden desimaalin tarkkuudella.

Ks. alaviitteet 1–4.

4.5    Triasyyliglyseridien koostumuksen laskeminen (mooli-%) rasvahappokoostumusta koskevista tiedoista (pinta-ala-%)

4.5.1    Rasvahappokoostumuksen määritys

Rasvahappokoostumus määritetään ISO 5508 -standardia noudattaen kapillaarikolonnilla. Metyyliesterit valmistetaan asiakirjan COI/T.20/Doc. No 24 mukaisesti.

4.5.2    Laskemisessa huomioon otettavat rasvahapot

Glyseridit ryhmitellään niiden ekvivalenttihiililuvun (ECN) mukaan ottaen huomioon seuraavat vastaavuudet ECN:n ja rasvahappojen välillä. Huomioon otetaan ainoastaan 16 ja 18 hiiliatomia sisältävät rasvahapot, koska niillä on merkitystä oliiviöljylle. Rasvahapot olisi standardoitava 100 %:iin.

4.5.3    Pinta-alaprosenttien muuntaminen mooleiksi, kaikki rasvahapot (1)

4.5.4    Rasvahappomoolien standardoiminen 100 %:iin (2)

Tulos ilmoittaa kunkin rasvahapon prosenttiosuuden mooliprosentteina TAGien 1,2,3-asemassa.

Sitten lasketaan tyydyttyneiden rasvahappojen P ja S (SFA) ja tyydyttymättömien rasvahappojen Po, O, L ja Ln (UFA) summa (3):

4.5.5    Rasvahappokoostumuksen laskeminen TAGien 2- sekä 1- ja 3-asemassa

Rasvahapot jakautuvat kolmeen ryhmään seuraavasti: yksi 2-asemalle ja kaksi samanlaista 1- ja 3-asemille siten, että tyydyttyneillä (P ja S) ja tyydyttymättömillä hapoilla (Po, O, L ja Ln) on eri kertoimet.

4.5.5.1   Tyydyttyneet rasvahapot 2-asemassa [P(2) ja S(2)] (4)

4.5.5.2   Tyydyttymättömät rasvahapot 2-asemassa [Po(2), O(2), L(2) ja Ln(2)] (5):

4.5.5.3   Rasvahapot 1,3-asemassa [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (6):

4.5.6    Triasyyliglyserolien laskeminen

4.5.6.1   TAGit, joissa on yksi rasvahappo (AAA, tässä LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2   TAGit, joissa on kaksi rasvahappoa (AAB, tässä PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3   TAGit, joissa on kolme eri rasvahappoa (ABC, tässä OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4   ECN42-triasyyliglyserolit

ECN42-triasyyliglyserolit lasketaan yhtälöistä 7, 8 ja 9, ja tulokset annetaan HPLC:n odotetussa eluutiojärjestyksessä (tavallisesti vain kolme piikkiä).

ECN42-triasyyliglyseridit saadaan näiden yhdeksän triasyyliglyserolin ja niiden paikkaisomeerien summana. Tulokset on ilmoitettava vähintään kahden desimaalin tarkkuudella.

5.   TULOSTEN ARVIOINTI

Verrataan laskemalla saatua teoreettista koostumusta ja HPLC:llä määritettyä koostumusta. Jos absoluuttisten HPLC-tulosten ja teoreettisten tulosten välinen erotus on suurempi kuin kyseiselle öljyluokalle kaupan pitämisen vaatimuksissa vahvistetut arvot, näyte sisältää siemenöljyä.

Tulokset ilmoitetaan kahden desimaalin tarkkuudella.

6.   ESIMERKKI (NUMEROT VIITTAAVAT MENETELMÄÄ SELOSTAVAN TEKSTIN KOHTIIN)

— 4.5.1    Rasvahappojen mooliprosenttien laskeminen GLC-tuloksista (standardisoitu pinta-ala-%)

GLC:llä saadaan rasvahappokoostumukselle seuraavat tulokset:

— 4.5.3    Pinta-ala-prosenttien muuntaminen mooleiksi kaikille rasvahapoille (ks. kaava 1)

moolia P

=

moolia S

=

moolia Po

=

moolia O

=

moolia L

=

moolia Ln

=

Yhteensä

=

0,35821 moolia TAG

— 4.5.4    Rasvahappomoolien standardoiminen 100 %:iin (ks. kaava 2)

mooli-% P(1,2,3)

=

mooli-% S(1,2,3)

=

mooli-% Po(1,2,3)

=

mooli-% O(1,2,3)

=

mooli-% L(1,2,3)

=

mooli-% Ln(1,2,3)

=

Yhteensä mooli-%

=

100 %

Tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien rasvahappojen summa TAGien 1,2,3-asemassa (ks. kaava 3):

— 4.5.5    Rasvahappokoostumuksen laskeminen TAGien 2- ja 1,3-asemassa

— 4.5.5.1   Tyydyttyneet rasvahapot 2-asemassa [P(2) ja S(2)] (ks. kaava 4):

— 4.5.5.2   Tyydyttymättömät rasvahapot 2-asemassa [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (ks. kaava 5)

— 4.5.5.3   Rasvahapot 1,3-asemassa [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) ja Ln(1,3)] (ks. kaava 6)

— 4.5.6    Triasyyliglyserolien laskeminen

Lasketusta rasvahappokoostumuksesta sn-2 ja sn-1,3-asemassa:

lasketaan seuraavat triasyyliglyserolit:

— 4.5.6.1   TAGit, joissa on yksi rasvahappo (LLL, PoPoPo) (ks. kaava 7)

, = 0,09706 moolia LLL

— 4.5.6.2   TAGit, joissa on kaksi rasvahappoa (PoLL, SLnLn, PoPoL) (ks. kaava 8)

0,03210 moolia PoLL

0,00094 moolia SLnLn

0,00354 moolia PoPoL

— 4.5.6.3   TAGit, joissa on kolme eri rasvahappoa (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) (ks. kaava 9)

0,00761 moolia PPoLn

0,43655 moolia OLLn

0,06907 moolia PLLn

0,04812 moolia PoOLn

ECN42 = 0,69512 moolia TAGs

Huomautus 1: Eluutiojärjestys voidaan määrittää laskemalla ekvivalenttihiililuvut, jotka määräytyvät usein yhtälön perusteella, jossa CN on hiililuku ja n on kaksoissidosten määrä; se voidaan laskea tarkemmin ottamalla huomioon kaksoissidoksen alkuperä. Jos no, nl ja nln ovat öljyhapon, linolihapon ja linoleenihapon kaksoissidokset, ekvivalenttilihiililuku voidaan laskea yhtälöstä

jossa kertoimet do, dl ja dln voidaan laskea vertailutriglyseridien avulla. Tässä menetelmässä eritellyissä oloissa suhde on lähellä seuraavaa:

Huomautus 2: Usean triglyseridin avulla voi myös laskea erotuskyvyn trioleiinin suhteen:

trioleinkäyttämällä redusoitua retentioaikaa

.

Log α:aa f:n funktiona (jossa f on kaksoissidosten määrä) esittävän kuvaajan avulla voidaan määrittää retentioarvot kaikille vertailutriglyserideihin sisältyvien rasvahappojen triglyserideille; katso kuvio 1.

Huomautus 3: Pylvään pitäisi olla niin tehokas, että trilinoleiinipiikki erottuu selvästi niiden triglyseridien piikeistä, joiden retentioajat ovat sitä lähellä. Eluutiota jatketaan aina ECN52:een asti.

Huomautus 4: Jotta saataisiin sellainen kromatogrammi, että kaikkien tärkeiden piikkien pinta-alat voidaan mitata luotettavasti, on ECN50-triglyseridiä vastaavan toisen piikin korkeuden oltava 50 % koko asteikosta.

Kuvio 1

Log α:aa f:n funktiona (jossa f on kaksoissidosten määrä) esittävä kuvaaja

Kaksoissidosten määrä

La: lauriinihappo; My: myristiinihappo; P: palmitiinihappo; S: steariinihappo; O: öljyhappo; L: linolihappo; Ln: linoleenihappo.

Kuvio 2

Vähän linolihappoa sisältävä oliiviöljy

a

Liuottimena asetoni/asetonitriili

PROFIILI a: Kromatogrammin piikkien tärkeimmät komponentit: ECN42: (1) LLL + PoLL; (2) OLLn + PoOLn; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL + PoOL; (5) OOLn + PLL; (6) POLn + PPoPo; (7) OOL + PoOO; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14 + 15) SOL + POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS.

b

Liuottimena propionitriili

PROFIILI b: Kromatogrammin piikkien tärkeimmät komponentit: ECN42: (1) LLL; (2) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; (12) PLP; ECN48: (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS

Kuvio 3

Paljon linolihappoa sisältävä oliiviöljy

a

Liuottimena asetoni/asetonitriili (50:50)

Profiili a: Kromatogrammin piikkien tärkeimmät komponentit: ECN42: (1’) LLL + PoLL; (2’) OLLn + PoOLn; (3’) PLLn; ECN44: (4’) OLL + PoOL; (5’) OOLn + PLL; (6’) POLn + PPoPo; ECN46: (7’) OOL + PoOO; (8’) PLO + SLL + PoOP; (9’) PLP + PoPP; ECN48: (10’) OOO; (11’) POO + SLL + PPoO; (12’) POP + PLS; ECN50: (13’) SOO; (14’) POS + SLS

b

Liuottimena propionitriili

Profiili b: Kromatogrammin piikkien tärkeimmät komponentit: ECN42: (1) LLL; (2 + 2’) OLLn + PoLL; (3) PLLn; ECN44: (4) OLL; (5) OOLn + PoOL; (6) PLL + PoPoO; (7) POLn + PPoPo + PPoL; ECN46: (8) OOL + LnPP; (9) PoOO; (10) SLL + PLO; (11) PoOP + SPoL + SOLn + SPoPo; ECN48: (12) PLP; (13) OOO + PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; ECN50: (17) SOO; (18) POS + SLS; ECN52: (19) AOO.

▼M19

---

LIITE XIX

▼M28

ALIFAATTISTEN ALKOHOLIEN JA TRITERPEENIALKOHOLIEN PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1.   AIHE

Tässä liitteessä kuvataan menetelmä rasvojen tai öljyjen sisältämien alifaattisten alkoholien ja triterpeenialkoholien pitoisuuden määrittämiseksi.

▼M19

2   MENETELMÄN PERIAATE

Rasva tai öljy, johon on lisätty 1-eikosanolia sisäiseksi standardiksi, saippuoidaan kaliumhydroksidin avulla etanoliliuoksessa ja saippuoitumattomat osat uutetaan eetterillä. Alkoholifraktio erotetaan saippuoitumattomasta uutteesta kromatografian avulla emäksisellä silikageelilevyllä; silikageelistä saadut alkoholit muutetaan trimetyylisilyylieettereiksi ja määritetään kapillaarikaasukromatografian avulla.

3   VÄLINEISTÖ

4   REAGENSSIT

▼M28

▼M19

5   MENETTELY

5.1   Saippuoitumattoman osan esikäsittely

5.1.1

250 ml:n pulloon lisätään 500 μl:n mikroruiskulla sellainen tilavuusmäärä 0,1-prosenttista 1-eikosanolin kloroformiliuosta (4.17), jonka sisältämä 1-eikosanolin määrä on suunnilleen 10 % määritystä varten otettavan näytteen alifaattisten alkoholien määrästä. Esimerkiksi, jos näytettä on 5 g ja se on oliiviöljyä, lisätään 250 μl 0,1-prosenttista 1-eikosanoliliuosta, ja jos se on uutettua oliiviöljyä, lisätään 1 500 μl liuosta. Haihdutetaan liuos kuiviin typpivirrassa ja punnitaan tarkalleen 5 g kuivaa, suodatettua näytettä samaan pulloon.

5.1.2

Lisätään 50 ml kaliumhydroksidin 2 N etanoliliuosta, palautusjäähdytin käynnistetään ja liuosta kuumennetaan vesihauteessa hiljalleen kiehuvaksi koko ajan voimakkaasti sekoittaen, kunnes saippuoituminen on tapahtunut (liuos kirkastuu). Kuumentamista jatketaan vielä 20 minuutin ajan ja lisätään sitten 50 ml tislattua vettä jäähdyttimen läpi. Sen jälkeen palautusjäähdytin irrotetaan ja pullo jäähdytetään noin 30 °C:n lämpötilaan.

5.1.3

Pullon sisältö siirretään kvantitatiivisesti 500 ml:n erotussuppiloon käyttämällä huuhteena yhteensä noin 50 ml tislattua vettä. Lisätään noin 80 ml etyylieetteriä, ravistetaan voimakkaasti noin 30 sekuntia ja annetaan seistä niin että kerrokset erottuvat (Huom. 1). Pohjalla oleva vesifaasi siirretään toiseen erotussuppiloon. Vesifaasi uutetaan vielä kaksi kertaa kuten edellä, käyttäen molemmilla kerroilla 60—70 ml etyylieetteriä. Huom. 1: Mahdollinen emulsio voidaan hajottaa lisäämällä pieni määrä etanolia tai metanolia suihkeena.

5.1.4

Eetteriuutteet yhdistetään yhteen erotussuppiloon ja pestään tislatulla vedellä (50 ml kerrallaan), kunnes pesuvesi on neutraalia. Pesuvesi heitetään pois, eetteriuutteet kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla ja suodatetaan etukäteen punnittuun 250 ml:n pulloon ja pestään suppilo ja suodatin pienillä määrillä etyylieetteriä.

5.1.5

Eetteriä haihdutetaan, kunnes sitä on hyvin vähän jäljellä, ja kuivataan heikossa alipaineessa tai typpivirrassa; lopuksi kuivataan lämpökaapissa 100 °C:ssa noin 15 min, jäännös jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan.

5.2   Alkoholifraktioiden erottaminen

5.2.1

Emäksisten levyjen valmistelu: silikageelilevyt (4.4) upotetaan kokonaan kaliumhydroksidin 0,2 N etanoliliuokseen (4.5) 10 sekunniksi, minkä jälkeen niiden annetaan kuivua vetokaapissa kahden tunnin ajan ja lopuksi yhden tunnin ajan lämpökaapissa 100 °C:ssa. Levyt otetaan lämpökaapista ja säilytetään kalsiumkloridia sisältävässä eksikkaattorissa käyttöhetkeen asti (näin käsitellyt levyt on käytettävä kahden viikon kuluessa). Huom. 2: Kun käytetään emäksisiä silikageelilevyjä alkoholifraktion erottamiseen, saippuoitumattomia aineita ei tarvitse käsitellä alumiinilla. Täten kaikki happamat yhdisteet (rasvahapot ja muut hapot) jäävät lähtöviivalle. Tällöin saadaan sekä alifaattisten alkoholien vyöhyke että terpeenisten alkoholien vyöhyke, jotka molemmat erottuvat selvästi sterolivyöhykkeestä.

5.2.2

Heksaanin ja etyylieetterin seos, 65:35 (V/V), kaadetaan kehitysastiaan niin että sitä on noin 1 cm ( 10 ). Astia suljetaan sopivalla kannella ja annetaan olla vähintään puoli tuntia suljettuna, jotta neste ja höyry saavuttavat tasapainon. Suodatinpaperisuikaleita, jotka ulottuvat eluointiaineeseen, voidaan kiinnittää astian sisäseinään. Näin kehitysaika lyhenee noin kolmanneksella ja aineosat eluoituvat tasaisemmin. Huom. 3: Seos on vaihdettava uuteen jokaista määritystä varten, jotta eluointiolosuhteet olisivat täysin toistettavissa.

5.2.3

Saippuoitumattomasta osasta (5.1.5) valmistetaan noin 5-prosenttinen kloroformiliuos ja 0,3 ml liuosta levitetään mahdollisimman ohuena ja tasaisena nauhana käyttäen 100 μl:n mikroruiskua, noin 2 cm:n päähän lasilevyn alareunasta. Asetetaan yhdelle levyn reunoista 2—3 μl alifaattisten alkoholien vertailuliuosta (4.11) lähtöviivan tasalle, jotta alifaattisten alkoholien vyöhyke olisi helppo tunnistaa kehittämisen jälkeen.

5.2.4

Levy asetetaan kehitysastiaan, joka on valmisteltu 5.2.2 kohdan mukaisesti. Ympäristön lämpötilan on oltava 15—20 °C. Astia suljetaan kannella välittömästi, minkä jälkeen näytteen annetaan eluoitua, kunnes liuotinrintama on noussut 1 cm:n päähän levyn yläreunasta. Levy otetaan kehitysastiasta ja liuotin haihdutetaan kuumassa ilmavirrassa tai levy jätetään joksikin aikaa kuivumaan vetokaappiin.

▼M28

5.2.5

Levylle suihkutetaan ohuelti ja tasaisesti 2,7-dikloori-fluoreseiiniliuosta. Alifaattisten alkoholien vyöhyke erottuu ultraviolettivalossa tarkasteltuna vertailuliuostäplään verrattaessa; alifaattisten alkoholien vyöhykkeen ja välittömästi sen yläpuolella olevan, terpeenialkoholeja vastaavan vyöhykkeen muodostaman kokonaisuuden ympärille piirretään viiva mustalla kynällä (Huomautus 4). Huomautus 4: Koska terpeenialkoholien vyöhykkeeseen on saattanut siirtyä joitakin alifaattisia alkoholeja, molemmat vyöhykkeet on kerättävä talteen yhdessä. Lisäyksen kuviossa 1 esitetään esimerkki ohutkerroskromatografialla tehdystä erottelusta.

5.2.6

Silikageelikerros raaputetaan rajatulta alueelta metallilastalla. Saatu aines hienonnetaan, siirretään suodatinsuppiloon (3.7), lisätään 10 ml kuumaa etyyliasetaattia, sekoitetaan huolellisesti metallilastalla ja suodatetaan tyhjiössä. Suodos kerätään suodatinsuppiloon liitettyyn tyhjiöimupulloon (3.8). Pestään silikageeli pullossa kolme kertaa noin 10 ml:lla etyylieetteriä, ja suodos kerätään samaan pulloon, joka on liitetty suodatinsuppiloon. Suodosta haihdutetaan, kunnes sen tilavuus on noin 4–5 ml ja jäännösliuos kaadetaan etukäteen punnittuun 10 ml:n koeputkeen (3.9). Liuosta kuivataan alhaisella lämmöllä kevyessä typpivirrassa; jäännös liuotetaan muutamaan tippaan asetonia, kuivataan jälleen ja pidetään kymmenisen minuuttia 105 °C:ssa lämpökaapissa, jäähdytetään eksikkaattorissa ja punnitaan. Koeputkessa oleva jäännös sisältää alkoholifraktion.

▼M19

5.3   Trimetyylisilyylieetterien valmistelu

5.3.1

Koeputkessa olevaan alkoholifraktioon lisätään silylointireagenssi niin, että kosteutta ei pääse mukaan (Huom. 6); mainittu reagenssi on seos, jossa on tilavuussuhteessa 9:3:1 pyridiiniä, heksametyylidisilatsaania ja trimetyylikloorisilaania (Huom. 5); seosta tarvitaan 50 μl jokaista alifaattisten alkoholien milligrammaa kohti. Huom. 5: Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana; lisäksi muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä. Huom. 6: Lievä sameus on tavallista eikä ole haitaksi. Valkoiset hiutaleet tai vaaleanpunaiseksi värjäytyminen ovat merkkejä kosteudesta tai reagenssien muuttumisesta. Jos näitä ilmenee, koe on uusittava.

5.3.2

Koeputki suljetaan tulpalla ja sitä ravistetaan varovasti (ei ylösalaisin), kunnes alifaattiset alkoholit ovat täysin liuenneet. Putken annetaan seistä vähintään 15 minuuttia huoneenlämmössä ja sen jälkeen sitä sentrifugoidaan muutaman minuutin ajan; kirkas liuos on nyt valmis kaasukromatografista määritystä varten.

5.4   Kaasukromatografinen määritys

5.4.1   Esivalmistelut ja kolonnin valmistelu

5.4.1.1

Kapillaarikolonni asennetaan kaasukromatografialaitteistoon niin, että kolonnin alkupää kiinnitetään injektoriin, joka on liitetty virtauksenjakojärjestelmään, ja kolonnin loppupää kiinnitetään detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toiminta (kaasuliitännän tiiviys, detektorin, virtauksenjakojärjestelmän ja piirturin toimivuus jne.)

5.4.1.2

Jos kapillaarikolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Pieni määrä kaasua johdetaan kolonnin läpi, käynnistetään kaasukromatografi ja aloitetaan asteittainen lämmittäminen, jota jatketaan, kunnes lämpötila on kohonnut vähintään 20 °C korkeammaksi kuin käyttölämpötila (Huom. 7). Korkeaa lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, minkä jälkeen kromatografialaitteisto saatetaan käyttövalmiiksi (kaasuvirran ja erotuksen säätö, liekinsytytys, elektronisen piirturin kytkeminen, uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin ja injektorin säätö jne.) ja signaalia rekisteröidään herkkyydellä, joka on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä käytettävä. Saadun perusviivan on oltava suora, eikä siinä saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä siirtymää mihinkään suuntaan. Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista siirtymää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuodosta, ja jos ilmenee positiivista siirtymää, se johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta. Huom. 7: Esivalmistelulämpötilan on aina oltava vähintään 20 °C alempi kuin käytetyn stationäärifaasin korkein lämpötila. 5.4.2

5.4.2   Käyttöolosuhteiden valinta

5.4.3   Määritys

▼M28

5.4.4    Piikkien tunnistaminen

Yksittäiset piikit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja vertaamalla alifaattisten alkoholien TMSE-seokseen, joka on määritetty samoissa olosuhteissa.

Lisäyksen kuvioissa 2 ja 3 esitetään esimerkkejä jalostetun oliiviöljyn alkoholifraktion kromatogrammeista.

▼M19

5.4.5   Kvantitatiivinen arviointi

6   TULOSTEN ESITTÄMINEN

Ilmoitetaan yksinkertaisten alifaattisten alkoholien pitoisuudet milligrammoina 1 000 g:ssa öljyä tai rasvaa sekä pitoisuuksien summa alifaattisten alkoholien yhteenlaskettuna määränä.

▼M28

---

Lisäys

Esimerkki ohutkerroskromatografialla tehdystä erottelusta ja esimerkkejä kromatogrammeista

Kuvio 1.

Heksaanilla/etyylieetterillä (65/35) eluoidusta oliiviöljystä saatujen saippuoitumattomien ainesten ohutkerroskromatografialevy

Kuvio 2.

Puhdistetun oliiviöljyn alkoholifraktion kromatogrammi

Kuvio 3.

Puhdistetun oliiviöljyn alifaattiset alkoholit ja triterpeenialkoholit sekä toisen sentrifugoinnin oliiviöljy

▼M23

---

LIITE XX

Menetelmä vahojen, rasvahappojen etyyliestereiden ja rasvahappojen metyyliestereiden pitoisuuksien määrittämiseksi kapillaarikaasukromatografian avulla

1.   TARKOITUS

Tällä menetelmällä määritetään vahojen, rasvahappojen metyyliestereiden ja rasvahappojen etyyliestereiden pitoisuudet oliiviöljyissä. Vahat ja alkyyliesterit eroavat toisistaan hiiliatomien lukumäärän perusteella. Menetelmää suositellaan käytettävän välineenä oliiviöljyn ja oliivin puristemassaöljyn erottamiseksi toisistaan sekä ekstra-neitsytoliiviöljyn laatuparametrina, jonka avulla voidaan havaita, onko ekstra-neitsytoliiviöljyyn vilpillisesti sekoitettu heikompilaatuisia öljyjä (neitsyt- tai lamppuöljyjä tai eräitä hajuttomiksi tehtyjä öljyjä).

2.   PERIAATE

Öljy, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kromatografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa. Koeolosuhteissa eluoitunut jae (jonka polaarisuus on triasyyliglyserolien polaarisuutta heikompi) otetaan talteen ja määritetään suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.

3.   LAITTEISTO

3.1.	Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2.	Lasikolonni nestekromatografiaa varten, sisähalkaisija 15 mm ja pituus 30–40 cm, varustettu hanalla.

3.3.

Kaasukromatografi, jota voidaan käyttää kapillaarikolonnin kanssa ja johon kuuluu kolonniin suoraan injektointia varten sellainen järjestelmä, jonka osat ovat: 3.3.1. Termostaattisäätöinen lämpötilaohjelmoitu uuni 3.3.2. Kolonniin liitetty kylmäinjektori, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan kolonniin 3.3.3. Liekki-ionisaatiodetektori ja muuntaja-vahvistin 3.3.4. Integroiva piirturi (Huomautus 1), joka sopii käytettäväksi muuntaja-vahvistimen (kohta 3.3.3) kanssa. Huomautus 1:  Voidaan käyttää myös tietokonepohjaisia järjestelmiä, joissa kaasukromatografin tiedot syötetään tietokoneen avulla. 3.3.5. Kvartsilasinen kapillaarikolonni (vahojen sekä metyyli- ja etyyliesterien määrittämiseksi), jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty nestefaasilla (Huomautus 2) siten, että nestekerroksen paksuus on tasaisesti 0,10–0,30 μm (Huomautus 2). Huomautus 2:  Soveltuvia kaupallisia nestefaaseja ovat muun muassa SE52, SE54, jne.

3.4.	Mikroruisku, 10 μl, jossa on karkaistu neula, jonka avulla näyte voidaan injektoida suoraan kolonniin.

3.5.	Sähkökäyttöinen ravistelija.

3.6.	Pyöröhaihdutin

3.7.	Muhveliuuni

3.8.	Analyysivaaka, jonka tarkkuus ± 0,1 mg

3.9.	Tavanomaiset laboratorion lasivälineet.

4.   REAGENSSIT

4.1.	Silikageeli, 60–200 μm mesh. Silikageeli pannaan muhveliuuniin 500 °C:n lämpötilaan vähintään 4 tunniksi. Jäähdytetään ja lisätään vettä 2 % silikageelin määrästä. Sekoitetaan massan homogenisoimiseksi ja säilytetään eksikkaattorissa vähintään 12 tunnin ajan ennen käyttöä.

4.2.

n-heksaani, kromatografialaatua tai jäämien määritykseen soveltuvaa laatua (puhtausaste on tarkistettava). VAROITUS: Höyryt ovat herkästi syttyviä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varottava höyryjen syntymistä. Poistettava tulipaloriskin mahdollisesti aiheuttavat laitteet, kuten lämmittimet tai sähkölaitteet, joita ei ole valmistettu syttymättömästä materiaalista. Haitallista hengitettynä: voi vahingoittaa hermosoluja. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Tarvittaessa on käytettävä asianmukaisia hengityssuojaimia. Varottava aineen joutumista silmiin tai iholle.

4.3.

Etyylieetteri, kromatografialaatua. VAROITUS: Erittäin helposti syttyvä ja kohtalaisen myrkyllinen. Ärsyttää ihoa. Haitallista hengitettynä. Saattaa aiheuttaa silmävaurioita. Vaikutukset voivat ilmaantua viipeellä. Saattaa muodostua räjähtäviä peroksideja. Höyryt voivat syttyä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varottava höyryjen syntymistä. Poistettava tulipaloriskin mahdollisesti aiheuttavat laitteet, kuten lämmittimet tai sähkölaitteet, joita ei ole valmistettu syttymättömästä materiaalista. Ei saa haihduttaa kuivaksi tai lähes kuivaksi. Veden tai muun sopivan aineen lisäys vähentää peroksidien muodostumista. Ei saa niellä. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Varottava pitkäaikaista tai toistuvaa ihokosketusta.

4.4.

n-heptaani, kromatografialaatua, tai iso-oktaani. VAROITUS: Syttyvää. Haitallista hengitettynä. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä. Pullot on pidettävä aina asianmukaisesti suljettuina. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Vältettävä höyryjen hengittämistä. Varottava pitkäaikaista tai toistuvaa ihokosketusta.

4.5.	Lauryyliarakidaatin standardiliuos (Huomautus 3), 0,05 % (m/V) liuos heksaanissa (sisäinen standardi vahoille). Huomautus 3:  Voidaan käyttää myös palmityylipalmitaattia, myristyylistearaattia tai lauryyliarakidaattia.

4.6.	Metyyliheptadekanoaatin standardiliuos, 0,02 % (m/V) heksaanissa (sisäinen standardi metyyli- ja etyyliestereille).

4.7.	Sudan 1 (1-fenyyliatso)-2-naftoli).

4.8.

Kantajakaasut: vety tai helium, puhdasta kaasukromatografista laatua. VAROITUS Vety. Erittäin helposti syttyvä puristettuna. Eristettävä lämmönlähteistä, kipinöistä ja avoliekeistä tai sähkölaitteista, joita ei ole valmistettu syttymättömistä materiaaleista. On varmistettava, että pullon venttiili on kiinni aina, kun se ei ole käytössä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Vetyä ei saa siirtää pullosta toiseen. Kaasua ei saa sekoittaa pullossa. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää. Helium. Korkeassa paineessa puristettu kaasu. Se pienentää hengitettävän hapen määrää. Pullo on pidettävä suljettuna. Riittävästä ilmanvaihdosta käytön aikana on huolehdittava. Varastointitiloihin, jotka eivät ole asianmukaisesti tuuletettuja, ei pidä mennä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Kaasua ei saa siirtää pullosta toiseen. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää. Ei saa hengittää. Käytetään yksinomaan teknisiin tarkoituksiin.

4.9.

Apukaasut: — Vety, puhdasta kaasukromatografista laatua. — Paineilma, puhdasta kaasukromatografista laatua. VAROITUS Paineilma. Korkeassa paineessa puristettu kaasu. Käytettävä varoen syttyvien aineiden lähistöllä, sillä useimpien paineilman sisältämien orgaanisten yhdisteiden itsesyttymislämpötila on suuressa paineessa huomattavasti alhaisempi. On varmistettava, että pullon venttiili on kiinni, kun se ei ole käytössä. Paineenalenninta on aina käytettävä. Jousen paine päästetään pois ennen pullon venttiilin avaamista. Älä seiso pullon edessä venttiiliä avatessasi. Kaasua ei saa siirtää pullosta toiseen. Älä sekoita kaasua pullossa. Pullot on kiinnitettävä kaatumisen estämiseksi. Säilytettävä auringonvalolta ja lämmönlähteiltä suojattuna. Varastointipaikan on oltava sellainen, ettei siellä voi tapahtua syöpymistä. Vaurioituneita tai merkitsemättömiä pulloja ei saa käyttää. Teknisiin tarkoituksiin tarkoitettua paineilmaa ei saa käyttää hengittämiseen tai hengityslaitteissa.

5.   MENETTELY

5.1.    Kromatografiakolonnin esikäsittely

Suspendoidaan 15 g silikageeliä (kohta 4.1) n-heksaaniin (kohta 4.2) ja lisätään kolonniin (kohta 3.2). Annetaan laskeutua itsestään. Autetaan laskeutumista sähkökäyttöisellä sekoittajalla, jotta saadaan homogeenisempi kromatografiakerros. Valutetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Punnitaan analyysivaa’alla (kohta 3.8) tarkasti noin 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (kohta 3.1) ja lisätään sopiva määrä sisäistä standardia (kohta 4.5) oletetun vahapitoisuuden mukaan. Esimerkki: oliiviöljyyn lisätään lauryyliarakidaattia 0,1 mg ja oliivin puristemassaöljyyn 0,25–0,50 mg, tai oliiviöljyihin (kohta 4.6) 0,05 mg metyyliheptadekanoaattia.

Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen avulla kromatografiakolonniin.

Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorbentin pinnan yläpuolella. Valutetaan vielä n-heksaani/etyylieetteriseosta (suhde 99:1) ja kerätään 220 ml valumisnopeuden ollessa noin 15 pisaraa 10 sekunnissa. (Tämä jae sisältää metyyli- ja etyyliestereitä ja vahoja). (Huomautus 4) (Huomautus 5).

Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa, kunnes lähes kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 ml poistetaan heikon typpivirtauksen avulla. Kerätään metyyli- ja etyyliestereitä sisältävä jae 2–4 ml:lla n-heptaania tai iso-oktaania.

5.2.    Kaasukromatografinen analyysi

5.2.1.    Esivalmistelut

Kolonni liitetään kaasukromatografiin (kohta 3.3) siten, että injektioportti yhdistetään on-column -järjestelmään ja ulostulo detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografisten laitteiden toimivuus (kaasusilmukoiden kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän tehokkuus jne.).

Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin esikäsiteltävä. Kolonnin läpi johdetaan kevyt kaasuvirtaus ja kaasukromatografi käynnistetään. Lämmitetään asteittain, kunnes lämpötila on noin neljän tunnin kuluttua kohonnut 350 °C:een.

Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään 2 tunnin ajan. Sen jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö, liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin (kohta 3.3.4), uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin säätö jne.). Signaali säädetään niin, että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin määrityksessä tarvitaan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.

Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin liitäntöjen viasta. Positiivinen ryömintä johtuu kolonnin riittämättömästä esikäsittelystä.

5.2.2.    Toimintaolosuhteiden valinta vahoille sekä metyyli- ja etyyliestereille (Huomautus 6)

Kromatografia tehdään yleensä seuraavissa käyttöolosuhteissa:

—	Kolonnin lämpötila : 20 °C minuutissa 5 °C minuutissa aluksi 80 °C (1′) 140 °C 335 °C (20)

—	Detektorin lämpötila : 350 °C

—	Injektoidun aineen määrä : 1 μl n-heptaaniliuosta (2–4 ml)

—	Kantajakaasu : helium tai vety valitun kaasun optimaalisella lineaarisella nopeudella (ks. lisäys A)

—	Laitteen herkkyys : siten, että edellä mainitut edellytykset täyttyvät.

Kyseisiä käyttöolosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien perusteella, jotta kaikki vahat ja rasvahappojen metyyli- ja etyyliesterit saadaan erotettua ja piikkien erotus on riittävä (ks. kuvat 2, 3 ja 4) ja jotta sisäisen lauryyliarakidaattistandardin retentioaika on 18 ± 3 minuuttia. Vahojen edustavimman piikin on oltava yli 60 % huippuarvosta; metyyli- ja etyyliestereiden osalta käytettävän sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin on saavutettava huippuarvo.

Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että haluttujen piikkien pinta-alat voidaan arvioida oikein.

5.3.    Määritys

10 μl:n mikroruiskuun vedetään 10 μl liuosta; vedetään männällä neula tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1–2 sekunnin kuluttua injektoidaan nopeasti. Noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti pois.

Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat tai stigmastadieenit (riippuen analysoitavasta jakeesta) ovat eluoituneet täydellisesti.

Pohjaviivan on koko ajan oltava vaatimusten mukainen.

5.4.    Piikkien tunnistus

Piikit tunnistetaan retentioaikojen perusteella vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen, joiden retentioajat tunnetaan, seoksiin. Alkyyliesterit tunnistetaan oliiviöljyjen tärkeimpien rasvahappojen (palmitiini- ja oleiinihappo) metyyli- ja etyyliesterien perusteella.

Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia. Kuvissa 2 ja 3 on kahden vähittäismyytävän ekstra-neitsytoliiviöljyn kromatogrammit; ensimmäinen metyyli- ja etyyliesterien kanssa ja toinen ilman niitä. Kuvassa 4 on kromatogrammit huippulaatuisesta ekstra-neitsytoliiviöljystä ja samasta öljystä, johon on sekoitettu 20 % hajuttomaksi tehtyä öljyä.

5.5.    Vahojen kvantitatiivinen määritys

Sisäisen lauryyliarakidaattistandardin ja C 40 – C 46 -alifaattisten esterien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla.

Kokonaisvahapitoisuus (mg/kg rasvaa) lasketaan muodostamalla yksittäisten vahojen summa seuraavasti:

jossa:

Ax

=

kunkin esterin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna

As

=

sisäisen lauryyliarakidaattistandardin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna

ms

=

lisätyn sisäisen lauryyliarakidaattistandardin massa milligrammoina

m

=

määritettävän näytteen massa grammoina.

5.5.1.    Metyyli- ja etyyliesterien kvantitatiivinen määritys

Sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin, C16- ja C18-rasvahappojen metyyliesterien ja C16- ja C18-rasvahappojen etyyliesterien piikkien pinta-alat määritetään integraattorin avulla.

Lasketaan kunkin alkyyliesterin pitoisuus (mg/kg rasvaa) seuraavasti:

jossa:

Ax

=

kunkin C16- ja C18-esterin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna

As

=

sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin piikin pinta-ala tietokoneella laskettuna

ms

=

lisätyn sisäisen metyyliheptadekanoaattistandardin massa milligrammoina

m

=

määritettävän näytteen massa grammoina.

6.   TULOSTEN ILMOITTAMINEN

C40–C46:n (Huomautus 7) eri vahojen pitoisuuksien summa ilmoitetaan mg/kg rasvaa.

Ilmoitetaan C16–C18-rasvahappojen metyyli- ja etyyliesterien pitoisuuksien summa ja molempien yhteismäärä.

Tulokset ilmoitetaan mg/kg:n tarkkuudella.

Ilmoitetaan etyyli- ja metyyliesterien välinen suhde.

Kuva 1

Esimerkki oliiviöljyn vahajakeen kaasukromatogrammista ( 11 )

Niiden rasvahappojen metyyli- ja etyyliesterien piikit, joiden retentioajat ovat välillä 5–8 minuuttia

Merkkien selitykset:

I.S.

=

lauryyliarakidaatti

1

=

diterpeeniesterit

2+2′

=

C40-esterit

3+3′

=

C42-esterit

4+4′

=

C44-esterit

5

=

C46-esterit

6

=

steroliesterit ja triterpeenialkoholit.

Kuva 2

Metyyliesterit, etyyliesterit ja vahat neitsytoliiviöljyssä

Merkkien selitykset:

1

–

C16-metyyli

2

–

C16-etyyli

3

–

metyyliheptadekanoaatti I.S.

4

–

C18-metyyli

5

–

C18-etyyli

6

–

skvaleeni

7

–

lauryyliarakidaatti I.S

A

–

diterpeeniesterit

B

–

vahat

C

–

steroliesterit ja triterpeeniesterit

Kuva 3

Metyyliesterit, etyyliesterit ja vahat ekstra-neitsytoliiviöljyssä

Merkkien selitykset:

1

–

metyyliheptadekanoaatti I.S

2

–

C18-metyyli

3

–

C18-etyyli

4

–

skvaleeni

5

–

lauryyliarakidaatti I.S.

A

–

diterpeeniesterit

B

–

vahat

C

–

steroliesterit ja triterpeeniesterit

Kuva 4

Kromatogrammit ekstra-neitsytoliiviöljystä ja samasta öljystä, johon on sekoitettu 20 % hajuttomaksi tehtyä öljyä

Merkkien selitykset:

1

–

metyylimyristaatti I.S.

2

–

metyylipalmitaatti

3

–

etyylipalmitaatti

4

–

metyyliheptadekanoaatti I.S.

5

–

metyylilinoleaatti

6

–

metyylioleaatti

7

–

metyylistearaatti

8

–

etyylilinoleaatti

9

–

etyylioleaatti

10

–

etyylistearaatti

---

Lisäys A

Lineaarisen kaasuvirtausnopeuden määritys

Injektoidaan 1:3 μl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Otetaan tarkka aika siitä, miten kauan kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).

Lineaarinen nopeus (cm/s) saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on sekunteina mitattu aika.

▼M28 —————

▼M25

---

LIITE XXI

---

( 1 ) EYVL N:o 172, 30.9.1966, s. 3025/66

( 2 ) EYVL N:o L 353, 17.12.1990, s. 23

( 3 ) EYVL N:o L 128, 24.5.1977, s. 6

( 4 ) EYVL N:o L 166, 1.7.1988, s. 10

( 5 ) EUVL L 228, 1.9.2009, s. 3.

( 6 ) Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2011/91/EU, annettu 13 päivänä joulukuuta 2011, elintarvike-erän tunnistamismerkinnöistä (EUVL L 334, 16.12.2011, s. 1).

( 7 ) Kun steroliesterit ovat eluoituneet, kromatogrammissa ei saa olla merkittäviä piikkejä (triglyseridit).

( 8 ) Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EU) N:o 1308/2013, annettu 17 päivänä joulukuuta 2013, maataloustuotteiden yhteisestä markkinajärjestelystä ja neuvoston asetusten (ETY) N:o 922/72, (ETY) N:o 234/79, (EY) N:o 1037/2001 ja (EY) N:o 1234/2007 kumoamisesta (EUVL L 347, 20.12.2013, s. 671).

( 9 ) 1 Maistaja voi kieltäytyä maistamasta öljyä, jos hän havaitsee suoraan hajuaistimuksen perusteella jonkin äärimmäisen voimakkaan negatiivisen ominaisuuden. Hänen on merkittävä tällainen poikkeuksellinen TILANNE profiililomakkeeseen.

( 10 ) Erityisesti tällaisissa tapauksissa on käytettävä bentseenin ja asetonin eluointiseosta 95:5 (V/V), jotta vyöhykkeet eroaisivat hyvin.

( 11 ) Kun steroliesterit ovat eluoituneet, kromatogrammissa ei pitäisi olla merkittäviä piikkejä (triasyyliglyseroleja).