3.
|
Lisatakse järgmised peatükid:
„B.49.
IN VITRO IMETAJARAKKUDE MIKROTUUMA KATSE
SISSEJUHATUS
1.
|
In vitro mikrotuuma katse (micronucleus, MNvit) on genotoksilisuskatse, milles uuritakse mikrotuumade (MN) esinemist interfaasis olevate rakkude tsütoplasmas. Mikrotuum võib tekkida atsentrilisest kromosoomifragmendist (st milles ei ole tsentromeeri) või tervest kromosoomist, mis ei suuda migreeruda pooluseni raku jagunemise anafaasietapil. Katsega määratakse klastogeensete ja aneugeensete kemikaalide (ainete ja segude) aktiivsus (1, 2) rakkudes, mis on uuritava ainega kokkupuute ajal või pärast seda jagunenud. Käesolev katsemeetod võimaldab kasutada nii aktiini polümerisatsiooni inhibiitori tsütohalasiin B (tsütoB) kasutamisel põhinevaid katse-eeskirju kui ka selliseid, milles tsütoB-d ei kasutata. TsütoB lisamine enne valitud mitoosi võimaldab kindlaks teha ja selektiivselt analüüsida mikrotuumade esinemise sagedust rakkudes, mis on lõpetanud ühe mitoosi, kuna sellised rakud on kahetuumsed (3, 4). Käesolev katsemeetod võimaldab kasutada ka tsütokineesiblokiga katse-eeskirju, kui on tõendatud, et uuritud rakupopulatsioon on läbinud mitoosi.
|
2.
|
Lisaks MNvit-katse kasutamisele mikrotuumi tekitavate kemikaalide (ainete või segude) kindlakstegemiseks võib teavet kromosoomikahjustuste ja mikrotuumade tekkimise kohta saada veel tsütokineesibloki, kinetokooride immunokeemilise märgistamisega või tsentromeeri-/telomeerisondidega hübridiseerimisega (fluorestents in situ hübridisatsiooniga (FISH)) kasutamisega (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16). Märgistamist ja hübridiseerimist võib kasutada, kui on tekkinud rohkesti mikrotuumi ja uurija tahab kindlaks teha, kas nende tekkimise põhjuseks on klastogeenne ja/või aneugeenne protsess.
|
3.
|
Mikrotuumad kujutavad endast kahjustust, mis on edasi antud tütarrakkudele, samal ajal kui metafaasis olevates rakkudes kogunenud kromosoomihälbeid edasi ei anta. Kuna interfaasis olevate rakkude mikrotuumi võib küllalt objektiivselt hinnata, peab katse tegija üksnes määrama, kas rakud on läbinud jagunemise või ei ole ning kui paljudes rakkudes on mikrotuum. Selle tulemusel saab preparaate hinnata suhteliselt kiiresti ja analüüsi saab automatiseerida. Seepärast tasub iga töötlemisega seoses hinnata tuhandeid rakke, mitte sadu; see suurendab katse tõhusust. Lõpuks, kuna mikrotuumad võivad tekkida mahajäänud kromosoomidest, avaneb võimalus kindlaks teha aneuploidsust tekitavaid mõjureid, mida on raske uurida tavaliste kromosoomihälbekatsetega, näiteks OECD katsejuhendiga 473 (käesoleva lisa peatükk B.10) (17). Kuid MNvit-katse ei võimalda eristada polüploidsust tekitavaid kemikaale klastogeensetest kemikaalidest, kui ei kasutata selliseid erimeetodeid nagu punktis 2 kirjeldatud FISH.
|
4.
|
MNvit-katse on in vitro meetod, milles tavaliselt kasutatakse inimese või näriliste kultuuris kasvatatud rakke. Meetod võimaldab kromosoomikahjustuste tekitamise võimet igakülgselt in vitro uurida, kuna sellega saab määrata nii aneugeene kui ka klastogeene.
|
5.
|
MNvit-katse on töökindel ja tõhus paljude rakutüüpide puhul ja nii tsütoB juuresolekul kui ka puudumisel. MNvit-katse kehtivus on tõendatud paljude andmetega, mis on saadud näriliste mitme rakuliiniga (CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y) ja inimese lümfotsüütidega (18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31). Need hõlmavad eelkõige rahvusvahelisi valideerimisuuringuid, mida koordineeris Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18, 19, 20, 21, 22), ja rahvusvahelise genotoksilisuse määramise rahvusvahelise seminari ettekandeid (4, 16). Euroopa Komisjoni alternatiivmeetodite valideerimise Euroopa keskus (ECVAM) on tõendite kaalukusel põhineva tagasihaarava valideerimisuuringuga olemasolevaid andmeid ka uuesti hinnanud ning katsemeetodi teaduslikku õigsust on toetanud ECVAMi teadusnõustajate komitee (ESAC) (32, 33, 34). On kirjeldatud inimese TK6-lümfoblastoidrakuliini (35), HepG2-rakkude (36, 37) ja primaarsete Süüria hamstri looterakkude (38) kasutamist, kuid valideerimisuuringutes neid ei kasutatud.
|
MÕISTED
6.
|
Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
|
ALGSED KAALUTLUSED
7.
|
In vitro tehtavad katsed nõuavad üldjuhul välist metaboolse aktiveerimise allikat, kui rakud ei ole uuritavate kemikaalide suhtes metaboolselt kompetentsed. Välise metaboolse aktiveerimise süsteem ei ole täielikult sarnane in vivo tingimustega. Tuleb hoolitseda, et välditaks valepositiivseid tulemusi põhjustavaid tingimusi, mis ei peegelda looduslikku mutageensust ja võivad tuleneda pH või osmolaalsuse suurtest muutustest või tsütotoksilisuse kõrgest tasemest (39, 40, 41). Kui uuritav kemikaal tekitab lisamisel keskkonna pH muutuse, tuleb pH õigeks seada, eelistatult varulahusesse puhvri lisamisega, nii et kõik ruumalad kõikides katsetingimustes ja kõikide kontrollproovidega jääksid samaks.
|
8.
|
Mikrotuumade tekkimise induktsiooni analüüsimiseks on väga tähtis, et mitoos oleks toimunud nii uuritava kemikaaliga töödeldud kultuurides kui ka töötlemata kultuurides. Kõige informatiivsem mikrotuumade tekke hindamise seisukohast on olukord, kus rakud on lõpetanud ühe mitoosi uuritava kemikaaliga töötlemise ajal või pärast seda.
|
KATSE PÕHIMÕTE
9.
|
Inimpäritoluga või imetajast saadud rakukultuurid viiakse kokkupuutesse uuritava ainega nii metaboolse aktivatsiooni välise allika juuresolekul kui ka puudumisel, kui ei kasutata vajaliku metaboliseerimisvõimega rakke. Igas katses tehakse paralleelsed katsed ka lahusti/pealekandmisvahendi kontrolli ja positiivse kontrolli kemikaalidega.
|
10.
|
Uuritava kemikaaliga kokkupuute ajal või pärast seda kasvatatakse rakke piisavalt kaua, et kromosoomi- või värtnakahjustus võiks viia mikrotuumade tekkimiseni interfaasis olevates rakkudes. Aneuploidsuse tekitamiseks peaks uuritav aine tavaliselt olema mitoosi ajal juures. Kogutud ja värvitud interfaasirakke uuritakse mikrotuumade olemasolu kindlakstegemiseks. Ideaaljuhul tuleks mikrotuumad arvesse võtta üksnes sellistes rakkudes, mis on lõpetanud mitoosi kas uuritava ainega kokkupuute ajal või kokkupuutejärgse aja jooksul, kui seda kasutatakse. Tsütokineesiblokkeriga töödeldud kultuurides saavutatakse see ainult kahetuumsete rakkude arvessevõtmisega. Tsütokineesiblokkeri puudumise korral on oluline tõendada, et uuritud rakud tõenäoliselt läbisid raku jagunemise uuritava ainega kokkupuute ajal või pärast seda. Kõigi katse-eeskirjade puhul on oluline tõendada, et rakkude paljunemine on toimunud nii kontrollkultuurides kui ka uuritava ainega töödeldud kultuurides, ning vaja on hinnata ainest tingitud tsütotoksilisust või tsütostaasi kultuurides (või paralleelkultuurides), mida uuritakse mikrotuumade esinemise suhtes.
|
KATSE KIRJELDUS
Ettevalmistused
11.
|
Võib kasutada primaarsete inimese perifeerse vere lümfotsüütide rakukultuuri (5, 19, 42, 43) ja mitmeid näriliste rakuliine nagu CHO, V79, CHL/IU ja L5178Y (18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 27, 28, 30). Muude rakuliinide ja -tüüpide kasutamist tuleb põhjendada, nagu on kirjeldatud katse kehtivuse kriteeriumide punktis, tõendades, et katse annab nendega usaldusväärseid tulemusi. Kuna mikrotuumade esinemise taustsagedus mõjutab katse tundlikkust, soovitatakse kasutada rakutüüpe, millel mikrotuumade moodustumise taustsagedus on madal ja stabiilne.
|
12.
|
Inimese perifeerse vere lümfotsüüdid tuleb saada noorelt (ligikaudu 18–35-aastaselt), tervelt mittesuitsetavalt isikult, kes teadaolevalt ei ole hiljuti genotoksiliste kemikaalide ega radiatsiooniga kokku puutunud. Kui eri doonoritelt kogutud rakud kasutamiseks ühendatakse, tuleb esitada doonorite arv. Mikrotuumade esinemise sagedus suureneb vanusega; see tendents on märgatavam naiste kui meeste puhul (44) ning seda tuleks ühendatavate doonorirakkude valimisel arvesse võtta.
|
Kasvukeskkonnad ja kultiveerimistingimused
13.
|
Rakukultuuride säilitamiseks tuleks kasutada sobivat kasvukeskkonda ja inkubeerimistingimusi (kasvunõud, CO2 kontsentratsioon, temperatuur ja niiskus). Püsivaid rakuliine ja -tüvesid tuleb korrapäraselt kontrollida modaalse kromosoomiarvu stabiilsuse ning mükoplasmaga saastumise puudumise suhtes; ei tohiks kasutada rakuliine või -tüvesid, mis on saastunud või mille modaalne kromosoomide arv on muutunud. Kasutatavate rakkude normaalse rakutsükli kestus katselabori kasvutingimustes peaks olema teada. Kui kasutatakse blokeeritud tsütokineesi meetodit, tuleb tsütokineesi inhibiitori kontsentratsioon konkreetse rakutüübi jaoks optimeerida ja näidata, et see annab hindamiseks vajalike kahetuumsete rakkude hea saagise.
|
Kultuuride ettevalmistamine
14.
|
Püsivad rakuliinid ja -tüved: rakud paljundatakse tüvikultuuridest, mis on külvatud kasvukeskkonda sellise tihedusega, et rakukultuur ei jõua monokihi puhul söödet täielikult katta enne kogumisaega ning suspensioonkultuuri puhul ei muutu liiga tihedaks, ja inkubeeritakse 37 °C juures.
|
15.
|
Lümfotsüüdid: antikoagulandiga (näiteks hepariiniga) töödeldud täisverd või eraldatud lümfotsüüte kasvatatakse enne uuritava aine ja tsütoB-ga kokkupuudet mitogeeni, näiteks fütohemaglutiniini juuresolekul.
|
Metaboolne aktivatsioon
16.
|
Kui kasutatakse puuduliku endogeense metabolismivõimega rakke, tuleks kasutada välist metaboliseerivat süsteemi. Enimkasutatav süsteem on näriliste ensüüme indutseerivate ainete, nt Aroclor 1254-ga (45, 46) või fenobarbitooni ja β-naftoflavooniga (46, 47, 48, 49), töödeldud maksa postmitokondriaalne fraktsioon (S9), mida on täiendatud kofaktoritega. Fenobarbitooni ja β-naftoflavooni kasutamine ei ole vastuolus püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsiooniga (50) ega määrusega (EÜ) nr 850/2004 (püsivate orgaaniliste saasteainete kohta) (66) ning on tõendatud, et see on segafunktsiooniga oksüdaaside indutseerimisel sama tõhus kui Aroclor 1254 (46, 47, 48, 49). Postmitokondriaalset fraktsiooni kasutatakse tavaliselt kontsentratsioonis 1–10 mahuprotsenti lõplikus katsekeskkonnas. Metaboolse aktivatsiooni süsteemi tingimuste valik võib sõltuda uuritava aine keemilisest aineklassist ja mõnel juhul võib olla sobiv kasutada rohkem kui ühte S9 kontsentratsiooni.
|
17.
|
Katse tegemiseks võib kasutada geneetiliselt muundatud rakuliine, milles töötavad konkreetsed inimese või närilise aktiveerivad ensüümid; sel juhul ei ole välist metaboolse aktivatsiooni süsteemi vaja. Sel juhul peab rakuliini valik olema teaduslikult põhjendatud, näiteks sellega, et segafunktsiooniga oksüdaasid on seotud uuritava aine metabolismiga (51) ja on tundlikud teadaolevate klastogeenide ja aneugeenide toime suhtes (vt katse kehtivuse kriteeriume käsitlev punkt). Tuleb endale aru anda, et rakus töötav(ad) segafunktsiooniga oksüdaas(id) ei tarvitse uuritavat ainet metaboliseerida; sellisel juhul katse negatiivne tulemus ei tõenda, et uuritav aine ei suuda tekitada mikrotuumi.
|
Uuritava aine ettevalmistamine
18.
|
Tahke uuritav aine tuleb lahustada sobivas lahustis või kandeaines ja vajaduse korral lahjendada enne rakkude töötlemist. Vedelat kemikaali võib lisada otse katsesüsteemi ja/või lahjendada enne töötlemist. Gaasi või lenduva kemikaali uurimiseks tuleks tavalist katse-eeskirja sobivalt muuta, näiteks töödelda suletud anumas (52, 53). Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, välja arvatud siis, kui andmed püsivuse kohta näitavad, et säilitamine on aktsepteeritav.
|
Katse tingimused
Lahusti/kandeaine
19.
|
Lahusti/kandeaine ei tohiks uuritava ainega reageerida ega kasutatavas kontsentratsioonis oluliselt kahjustada rakkude eluvõimet või S9 aktiivsust. Kui kasutatakse muid aineid peale tunnustatud lahustite/kandeainete (vesi, rakukultuuri kasvukeskkond, dimetüülsulfoksiid), tuleb esitada tõendavad andmed, et aine sobib uuritava ainega kasutamiseks ega ole genotoksiline. Soovitatav on võimaluse korral alati kõigepealt kaaluda vee kui lahusti/kandeaine kasutamist.
|
TsütoB kui tsütokineesi blokeerija kasutamine
20.
|
Üks olulisemaid asju MNvit-katse tegemisel on tagada, et loendatud rakud oleksid uuritava ainega töötlemise või töötlemisjärgse inkubeerimise ajal (kui rakke pärast töötlemist inkubeeritakse) lõpetanud mitoosi. Tsütokineesi blokeerimiseks on kõige rohkem kasutatud tsütoB-d, kuna see inhibeerib aktiini polümerisatsiooni, hoiab sellega ära tütarrakkude eraldumise pärast mitoosi, mille tagajärjel tekivad kahetuumsed rakud (5, 54, 55). Mikrotuumade loendamise saab seepärast piirata üksnes selliste rakkudega, mis on töötlemise ajal või pärast seda läbinud mitoosi. Samal ajal võib mõõta uuritava aine mõju raku paljunemise kineetikale. Kui kasutatakse inimese lümfotsüüte, tuleks tsütokineesi blokeerimiseks kasutada tsütoB-d, kuna tsükli aeg sõltub kultuurist ja doonorist ning kuna fütohemaglutiniin ei toimi kõikidele lümfotsüütidele. Rakuliinide katsetamisel on kasutatud ka muid meetodeid, et teha kindlaks, kas loendatavad rakud on jagunenud; neid meetodeid on käsitletud punktis 26.
|
21.
|
Labor peaks iga rakutüübi jaoks määrama tsütoB sobiva kontsentratsiooni, et saavutada lahusti/kandeaine kontrollkultuuris kahetuumsete rakkude optimaalne sagedus. TsütoB sobiv kontsentratsioon on tavaliselt vahemikus 3–6 μg/ml.
|
Rakkude paljunemise ja tsütotoksilisuse mõõtmine ning kokkupuutekontsentratsiooni valimine
22.
|
Katsetes kasutatava uuritava aine suurima kontsentratsiooni kindlaksmääramisel tuleks vältida kontsentratsioone, mis võivad tekitada kunstlikult positiivseid tulemusi, näiteks kontsentratsioone, mis on liiga tsütotoksilised, põhjustavad sadenemist kasvukeskkonnas ja pH või osmolaalsuse olulist muutust (39, 40, 41).
|
23.
|
Rakkude paljunemise mõõtmisega tõendatakse, et töödeldud rakud on katse ajal läbinud mitoosi ja et töötlusi tehakse lubatava tsütotoksilisustaseme juures (vt punkt 29). Metaboolset aktivatsiooni vajavate rakkude puhul tuleks tsütotoksilisus määrata metaboolse aktivatsiooniga ja ilma aktivatsioonita, kasutades rakkude arvukuse suhtelist suurenemist (relative increase in cell counts, RICC) või suhtelist rakupopulatsiooni kahekordistumist (relative population doubling, RPD) (vt võrrandid, 2. liide), kui ei kasutata tsütoB-d. TsütoB kasutamise korral võib tsütotoksilisuse määrata replikatsiooniindeksi (replication index, RI) abil (vt võrrand, 2. liide).
|
24.
|
Rakukultuuride töötlemine tsütoB-ga ning ühe-, kahe- ja paljutuumsete rakkude suhtelise esinemissageduse määramine kultuuris on täpne meetod, millega saab mõõta rakkude töötlemise mõju rakkude paljunemisele, samuti töötlemise tsütotoksilist või tsütostaatilist mõju (5), ja tagada, et loendatakse ainult töötlemise ajal või pärast seda jagunenud rakke.
|
25.
|
TsütoB-ga tehtavates katsetes saab tsütostaasi/tsütotoksilisust mõõta tsütokineesi blokiga paljunemise indeksi (cytokinesis-block proliferation index, CBPI) järgi (5, 26, 56) või tuletada selle näitaja kultuuri vähemalt 500 raku replikatsiooniindeksist (RI) (vt võrrand, 2. liide). Kui rakkude paljunemise hindamiseks kasutatakse tsütoB-d, tuleks CBPI või RI määrata vähemalt 500 rakust kultuuri kohta. Selliseid mõõtmisi võib töödeldud ja kontrollkultuuri võrdlemise abil muu hulgas kasutada tsütotoksilisuse hindamiseks. Muude tsütotoksilisuse näitajate (näiteks pinna katmine, rakkude arvu, apoptoosi, nekroosi ja metafaasi loendamine) hindamine võib anda kasulikku teavet.
|
26.
|
Ilma tsütoB-ta tehtavates katsetes on vaja tõendada, et kultuuris loendatavad rakud on läbinud raku jagunemise uuritava ainega kokkupuute ajal või pärast seda, muidu võidakse saada valenegatiivne tulemus. Üksnes jagunenud rakkude loendamise tagamiseks on kasutatud selliseid meetodeid nagu bromodesoksüuridiini (BrdU) viimine rakkudesse ja järgnev määramine, et kindlaks teha replitseerunud rakud (57), kloonide moodustamine, kui püsivate rakuliinide rakke töödeldakse ja loendatakse kohapeal mikroskoobipreparaadis (paljunemisindeks, PI) (25, 26, 27, 28), rakupopulatsiooni suhtelise kahekordistumise (RPD) või rakkude arvukuse suhtelise suurenemise (RICC) mõõtmine või muud usaldusväärsed meetodid (16, 56, 58, 59) (vt võrrandid, 2. liide). Muude tsütotoksilisuse või tsütostaasi näitajate (näiteks pinna katmine, rakkude arvu, apoptoosi, nekroosi ja metafaasi loendamine) hindamine võib anda kasulikku teavet.
|
27.
|
Tuleks hinnata vähemalt kolme analüüsitavat kontsentratsiooni. Selle saavutamiseks võib olla tarvis teha katseid suure arvu lähedaste kontsentratsioonidega ja määrata mikrotuuma moodustumine sellistel kontsentratsioonidel, mille tsütotoksilisus on lubatavas vahemikus. Teine võimalus on teha eelnev tsütotoksilisuse katse, et piirata otsustava katse kontsentratsioonivahemikku.
|
28.
|
Suurima kontsentratsiooni tsütotoksilisus peaks olema 55 ± 5 %. Suuremal kontsentratsioonil võivad kromosoomikahjustused tekkida tsütotoksilisuse kõrvalnähuna (60). Tsütotoksilisuse esinemise korral peaksid katse tegemiseks valitud kontsentratsioonid katma vahemiku 55 ± 5 % tsütotoksilisuse tekitamisest kuni vähese või puuduva tsütotoksilisuseni.
|
29.
|
Kui tsütotoksilisust ega sadenemist ei esine, peaks suurim katses kasutatav kontsentratsioon olema 0,01 M, 5 mg/ml või 5 μl/ml, olenevalt sellest, mis on kõige väiksem. Analüüsiks valitud kontsentratsioonid ei tohiks üldiselt olla suuremate vahedega kui 10 korda. Järsu kontsentratsiooni-mõju sõltuvusega uuritava aine puhul võib olla vajalik kasutada väiksemat uuritava aine kontsentratsioonide vahet, et loendada kultuure ka mõõduka või vähese toksilisuse vahemikus.
|
30.
|
Kui piiravaks teguriks on lahustuvus, peaks suurim uuritav kontsentratsioon olema selline, mille juures kultuuris on näha väga nõrka sadet, kui see ei takista loendamist ja kui piiravaks ei muutu tsütotoksilisus. Sadenemist tuleks hinnata selliste meetoditega nagu valgusmikroskoopia, märkides ära püsima jääva või rakkude kasvatamise ajal (töötlemise lõpuks) tekkiva sademe.
|
Kontrollkatsed
31.
|
Igas uuringus kasutatakse paralleelseid positiivseid ja lahusti/kandeaine kontrollkatseid metaboolse aktivatsiooniga ja ilma selleta.
|
32.
|
Positiivne kontroll on vajalik selle tõendamiseks, et kasutatavad rakud ja katse-eeskiri võimaldavad teha kindlaks klastogeene ja aneugeene ning kinnitada S9 valmistise metabolismivõimet. Positiivse kontrolli katses tuleks kasutada teadaolevaid mikrotuuma moodustumist põhjustavaid aineid sellisel kontsentratsioonil, mis põhjustab taustaga võrreldes väikese, kuid korratava mikrotuuma esinemissageduse suurenemise ja tõendab katsesüsteemi tundlikkust. Positiivse kontrolli kemikaali kontsentratsioon valitakse nii, et mõju oleks selge, kuid et loendaja kohe ei taipaks, millised kodeeritud mikroskoobipreparaatidest on positiivse kontrolli katsed.
|
33.
|
Tuleks kasutada metaboolset aktivatsiooni vajavat klastogeeni (näiteks tsüklofosfamiid, benso[a]püreen), kuna nii on võimalik tõendada katsesüsteemi metaboolset kompetentsust ja suutlikkust teha kindlaks klastogeene. Kasutada võib ka muid positiivse kontrolli kemikaale, kui see on õigustatud. Kuna mõni metaboolset aktivatsiooni vajav positiivse kontrolli kemikaal võib teatud töötlemistingimustes või teatava rakuliini puhul olla aktiivne ilma välise metaboolse aktivatsioonita, on valitud rakuliini ja kontsentratsiooni puhul vaja kontrollida metaboolse aktivatsiooni vajalikkust ja S9 valmistise aktiivsust.
|
34.
|
Praegu ei teata ühtegi aneugeeni, mille genotoksilisuse avaldumiseks oleks vaja metaboolset aktivatsiooni (16). Praegu on aneugeense aktiivsuse positiivse kontrolli kemikaalideks tunnistatud näiteks kolhitsiin ja vinblastiin. Võib kasutada muid kemikaale, kui need tekitavad mikrotuumi kas üksnes või peamiselt aneugeense toime kaudu. Kahe positiivse kontrolli (klastogeensuse ja aneugeensuse kontroll) vajaduse vältimiseks ilma metaboolse aktivatsioonita võib aneugeensuse kontrolli kasutada positiivse kontrollina ilma S9-ta ja klastogeensuse kontrolli võib kasutada selleks, et kontrollida kasutatud metaboolse aktivatsiooni süsteemi adekvaatsust. S9 juuresolekut mittevajavate rakkude puhul tuleb kasutada nii klastogeensuse kui ka aneugeensuse positiivset kontrolli. Soovitatavad positiivse kontrolli kemikaalid on 3. liites.
|
35.
|
Võib kaaluda samasse keemiliste ainete klassi kuuluva positiivse kontrolli kemikaali kasutamist, kui sobiv aine on kättesaadav. Kõik kasutatud positiivse kontrolli kemikaalid peaksid sobima rakutüübile ja aktivatsioonitingimustele.
|
36.
|
Lahusti/kandeaine kontrollkatsed tuleb teha kultuuri iga kogumisaja jaoks. Lisaks tuleb kasutada ka töötlemata negatiivset kontrolli (ei sisalda lahustit/kandeainet), kui avaldatud andmete või labori varasemate kontrollikatsetega ei ole tõendatud, et valitud lahustil ei ole kasutatava kontsentratsiooni juures kahjulikku ega genotoksilist mõju.
|
KATSE KÄIK
Töötlemiskava
37.
|
Selleks et suurendada konkreetsel rakutsükli etapil toimiva aneugeeni või klastogeeni kindlakstegemise tõenäosust, on väga oluline, et uuritava ainega töödeldaks piisavalt palju rakke nende rakutsükli igal etapil. Rakuliinide ja primaarsete rakkude kultuuride töötlemise kava võib seepärast mõnevõrra erineda kavast, mida kasutatakse lümfotsüütide puhul, mille rakutsükli alustamiseks on vaja mitogeenset stimulatsiooni, vt lähemalt punktid 41–43 (16).
|
38.
|
Teoreetilistest kaalutlustest ja avaldatud andmetest (18) tuleneb, et enamiku aneugeene ja klastogeene võib kindlaks teha lühiajalise töötlemisega (3–6 tundi) S9 juuresolekul ja puudumisel, millele järgneb uuritava aine eemaldamine ja rakkude kasvatamine 1,5 kuni 2,0 rakutsükli jooksul (6). Rakud kogutakse kas siis, kui töötlemise algusest on möödunud ajavahemik, mis vastab umbes 1,5–2,0 rakutsüklile normaalsete (see tähendab töötlemata) rakkude puhul, või töötlemise lõpus (vt tabel 1). Proovide võtmise või kogumise aega võib pikendada, kui on teada või võib oletada, et uuritav aine mõjutab rakutsükli pikkust (näiteks nukleosiidianaloogide puhul).
|
39.
|
Kuna S9 valmistis võib kultuuris kasvatatava imetajaraku jaoks olla toksiline, kasutatakse pikendatud kokkupuuteajaga (1,5–2,0 normaalse rakutsükli kestust) töötlemist üksnes S9 puudumisel. Pikendatud töötlemisaja puhul võib valida, kas töödelda rakke uuritava kemikaaliga tsütoB puudumisel või juuresolekul. Need valikvariandid on ette nähtud olukorra jaoks, kus võib karta, et uuritav aine ja tsütoB mõjutavad teineteist.
|
40.
|
Pakutavad rakkude töötlemise kavad on esitatud tabelis 1. Esitatud üldisi töötlemiskavu võib muuta, et võtta arvesse uuritava aine stabiilsust või reaktsioonivõimet või kasutatavate rakkude konkreetseid kasvunäitajaid. Töötlemine peab alati algama ja lõppema rakkude eksponentsiaalse kasvu ajal. Töötlemiskavu on täpsemalt kirjeldatud punktides 41–47.
Tabel 1
Rakkude töötlemise ja kogumise ajad MNvit-katse puhul
Lümfotsüüdid, primaarsed rakud ja rakuliinid, mida töödeldakse tsütoB lisamisega
|
+ S9
|
Töödeldakse 3–6 tundi S9 juuresolekul;
eemaldatakse S9 ja töötlemiskeskkond;
lisatakse uus kasvukeskkond ja tsütoB;
rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
|
– S9
Lühiajaline kokkupuude
|
Töödeldakse 3–6 tundi;
eemaldatakse töötlemiskeskkond;
lisatakse uus kasvukeskkond ja tsütoB;
rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
|
– S9
Pikendatud kokkupuude
|
Variant A: töödeldakse tsütoB juuresolekul 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja jooksul;
rakud kogutakse kokkupuuteaja lõpus.
Variant B: töödeldakse 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja jooksul;
eemaldatakse uuritav aine;
lisatakse uus kasvukeskkond ja tsütoB;
rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
|
Rakuliinid, mida töödeldakse tsütoB lisamiseta
(Kõik toimub eespool esitatud kavade kohaselt, ainult tsütoB-d ei lisata.)
|
|
Lümfotsüüdid, primaarsed rakud ja rakuliinid, mida töödeldakse tsütoB lisamisega
41.
|
Kõige tõhusam lähenemisviis lümfotsüütide puhul on alustada uuritava ainega kokkupuudet pärast 44–48 tunni möödumist fütohemaglutiniiniga stimuleerimisest, kui tsükli sünkronisatsioon on kadunud (5). Esialgses katses töödeldakse rakke 3–6 tundi uuritava ainega S9 puudumisel ja juuresolekul. Töötlemiskeskkond eemaldatakse ja asendatakse värske kasvukeskkonnaga, mis sisaldab tsütoB-d, ning rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
|
42.
|
Kui mõlemad esialgsed lühiajalise töötlemise (3–6 tundi) katsed annavad negatiivse või ebaselge tulemuse, kasutatakse järgnevat pikendatud töötlemis- või kokkupuuteaega ilma S9-ta. Kasutada võib kahte töötlemise varianti, mis on võrdselt lubatavad. Stimuleeritud lümfotsüütide puhul on siiski vahest sobivam kasutada varianti A, kuna eksponentsiaalne kasv võib 96 tundi pärast stimuleerimist olla juba vähenemas. Variandi B puhul ei tohiks rakukultuurid lõpliku kogumise ajaks jõuda pinna kinnikatmiseni.
—
|
Variant A: rakke töödeldakse uuritava ainega 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja jooksul ja kogutakse töötlemisaja lõpus.
|
—
|
Variant B: rakke töödeldakse uuritava ainega 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja jooksul. Töötlemiskeskkond eemaldatakse ja asendatakse värske kasvukeskkonnaga ning rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
|
|
43.
|
Primaarseid rakke ja rakuliine tuleks töödelda samuti kui lümfotsüüte, kuid esimesi ei ole vaja stimuleerida 44–48 tundi fütohemaglutiniiniga. Muid rakke kui lümfotsüüte tuleks töödelda uuritava ainega nii, et katse lõpetamise ajal on rakud ikka veel logaritmilises kasvufaasis.
|
Rakuliinid, mida töödeldakse ilma tsütoB lisamiseta
44.
|
Rakke tuleks töödelda 3–6 tunni jooksul S9 juuresolekul ja puudumisel. Töötlemiskeskkond eemaldatakse ja asendatakse värske kasvukeskkonnaga ning rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
|
45.
|
Kui mõlemad esialgsed lühiajalise töötlemise (3–6 tundi) katsed annavad negatiivse või ebaselge tulemuse, kasutatakse järgnevat pikendatud töötlemis- või kokkupuuteaega (ilma S9-ta). Kasutada võib kahte töötlemise varianti, mis on võrdselt lubatavad:
—
|
variant A: rakke töödeldakse uuritava ainega 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja jooksul ja kogutakse töötlemisaja lõpus;
|
—
|
variant B: rakke töödeldakse uuritava ainega 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja jooksul. Töötlemiskeskkond eemaldatakse ja asendatakse värske kasvukeskkonnaga ning rakud kogutakse pärast 1,5–2,0 normaalse rakutsükliaja möödumist.
|
|
46.
|
Monokihtides võib pärast 3–6-tunnise töötlemise lõppu olla mitoosifaasi rakke (mida võib ära tunda selle järgi, et need on ümmargused ja tulevad pinna küljest lahti). Kuna mitoosifaasis rakud tulevad kergesti lahti, võivad need uuritavat ainet sisaldava keskkonna eemaldamisel minna kaotsi. Need tuleb kultuuri pesemisel kokku koguda ja kultuuri tagasi panna, et vältida mitoosifaasi jõudnud ja võimalikke mikrotuumi sisaldavate rakkude kaotsiminekut kogumise ajal.
|
Rakukultuuride arv
47.
|
Uuritava aine iga kontsentratsiooni juures, samuti lahusti/kandeaine kontrolli ja negatiivse kontrolli puhul, tuleks alati kasutada kaht paralleelkultuuri. Kui labori varasemad andmed näitavad, et paralleelkultuuride erinevus on väike, võib olla vastuvõetav ühe kultuuri kasutamine. Üksikkultuuride kasutamisel tuleks kasutada suuremat arvu kontsentratsioone.
|
Rakkude kogumine ja mikroskoobipreparaadi ettevalmistamine
48.
|
Iga rakukultuur kogutakse ja töödeldakse eraldi. Rakkude ettevalmistamine võib hõlmata hüpotoonilist töötlust, kuid see etapp ei ole vajalik, kui vajalik rakkude laotus saadakse muul viisil. Mikroskoobipreparaadi ettevalmistamiseks võib kasutada mitmesuguseid meetodeid, kui on saadud kvaliteetsed, loendamiseks sobivad rakkude valmistised. Säilitada tuleks rakkude tsütoplasma, et oleks võimalik määrata mikrotuumi ja (blokeeritud tsütokineesi meetodi puhul) usaldusväärselt kindlaks teha kahetuumseid rakke.
|
49.
|
Mikroskoobipreparaate võib värvida mitme meetodiga, nagu näiteks Giemsa meetodiga või fluorestseerivate DNA-spetsiifiliste värvainetega (59). DNA-spetsiifilise värvaine kasutamine (nt akridiinoranž (61) või Hoechst 33258 + püroniin-Y (62)) võib kõrvaldada mõne muude kui DNA-spetsiifiliste värvainete kasutamisega seotud artefakti. Kui soovitakse saada teavet mikrotuumade moodustumise mehhanismi kohta, võib mikrotuumade sisalduse (kromosoom/kromosoomifragment) kindlakstegemiseks kasutada kinetokoorivastaseid antikehi, fluorestentsi in situ hübridisatsiooniga (FISH) pantsentromeersete DNA-sondidega või praimitud in situ märgistamist pantsentromeerispetsiifilise praimeriga koos DNA sobiva vastandvärvimisega. Klastogeenide ja aneugeenide eristamiseks võib kasutada muid meetodeid, mille kohta on tõendatud, et need on tõhusad.
|
Analüüs
50.
|
Kõik mikroskoobipreparaadid, sh lahusti/kandeaine ning positiivse ja negatiivse kontrolli omad, kodeeritakse sõltumatult enne mikroskoopilist analüüsi. Kodeeritud proovide analüüsimiseks võib kasutada ka valideeritud automaatseid voolutsütomeetria või kujutise analüüsi süsteeme.
|
51.
|
TsütoB-ga töödeldud kultuuride puhul tuleks mikrotuumade sagedust analüüsida vähemalt 2 000 kahetuumses rakus iga kontsentratsiooni kohta (vähemalt 1 000 kahetuumses rakus iga kultuuri kohta; kaks kultuuri igal kontsentratsioonil). Üheainsa kultuuri kasutamisel tuleks kõnealuse kultuuri kohta loendada vähemalt 2 000 kahetuumset rakku igal kontsentratsioonil. Kui igal kontsentratsioonil on loendamiseks kättesaadav oluliselt vähem kui 1 000 kahetuumset rakku või üheainsa kultuuri kasutamisel 2 000 rakku ja kui olulist mikrotuumade esinemissageduse suurenemist ei täheldata, tuleb katset korrata suurema rakkude arvuga või vähem mürgise kontsentratsiooniga, olenevalt sellest, kumb on sobivam. Tuleks jälgida, et ei loendataks ebakorrapärase kujuga kahetuumseid rakke või rakke, mille kaks tuuma on oluliselt erineva suurusega; samuti ei tohiks kahetuumseid rakke segi ajada halvasti eraldunud paljutuumsete rakkudega. Rakke, mis sisaldavad rohkem kui kahte peamist tuuma, ei tuleks mikrotuumade loendamisel arvesse võtta, kuna sellistes rakkudes võib mikrotuumade esinemise taustsagedus olla suurem (63, 64). Ühetuumsete rakkude loendamine võib olla lubatav, kui on näidatud, et uuritav aine segab tsütoB toimet.
|
52.
|
TsütoB-ga töötlemata kultuuride puhul tuleks mikrotuumade sagedust analüüsida vähemalt 2 000 rakus iga kontsentratsiooni kohta (vähemalt 1 000 rakus iga kultuuri kohta; kaks kultuuri igal kontsentratsioonil). Kui kasutatakse ühtainukest kultuuri igal kontsentratsioonil, tuleks kõnealusest kultuurist loendada vähemalt 2 000 rakku.
|
53.
|
Kui kasutatakse tsütoB-d, tuleks määrata tsütokineesi blokiga paljunemise indeks (CBPI) või replikatsiooniindeks (RI) (vt 2. liide), kasutades vähemalt 500 rakku kultuuri kohta. Kui töötlemine toimub ilma tsütoB juuresolekuta, on oluline tõendada, et loendatud rakud on paljunenud (vt punktid 24–27).
|
Katse kehtivuse kriteeriumid
54.
|
Käesolevas katsemeetodis kirjeldatud MNvit-katse kasutamist kavandav labor peaks tõendama, et suudab usaldusväärselt ja õigesti määrata teadaoleva aneugeense või klastogeense mõjuga kemikaale koos metaboolse aktivatsiooniga ja ilma selleta, samuti teadaolevalt ilma sellise toimeta kemikaale, kasutades 3. liites esitatud võrdluskemikaale. Tõendina oma suutlikkusest käesolevat katsemeetodit korralikult rakendada peaks labor esitama tõendid, et mikrotuumade moodustumise seisukohast loendatavad rakud on läbinud ühe rakujagunemise, kui katse tehakse ilma tsütoB kasutamiseta.
|
55.
|
Võrdluskemikaalidena soovitatakse kasutada 3. liites esitatud kemikaale. Võib kasutada ka asendavaid või täiendavaid kemikaale, kui nende toime on teada ja need tekitavad mikrotuumi sama toimemehhanismi kaudu ning on näidatud, et need on asjakohased MNvit-eeskirja järgi uuritavate kemikaalide puhul. Põhjendus võiks hõlmata paljude erinevate ainetega tehtud valideerimisuuringut või valideerimisuuringut, mis on suunatud kitsamale aineteringile, mis on seotud uuritava aine kemikaaliklassiga või uuritava kahjustusmehhanismiga.
|
56.
|
Lahusti/kandeaine kontrollid ja töötlemata kultuurid peaksid andma reprodutseeritavalt madalad ja kooskõlalised mikrotuumade tekke sagedused (punktis 11 nimetatud rakutüüpide puhul tavaliselt 5–25 mikrotuuma 1 000 raku kohta). Muul rakutüübil võib olla teistsugune tulemustevahemik, mis tuleks kindlaks teha, kui rakutüüpi valideeritakse MNvit-katses kasutamiseks. Negatiivse kontrolli, lahusti ja positiivse kontrolli andmeid tuleks kasutada varasematel andmetel põhinevate kontrollvahemike kindlakstegemiseks. Osutatud väärtusi tuleks kasutada selleks, et otsustada, kas katse paralleelsed negatiivse ja positiivse kontrolli tulemused on adekvaatsed.
|
57.
|
Kui katse-eeskirjas tehakse väike muudatus (näiteks kasutatakse automaatset loendamist käsitsi loendamise meetodite asemel, kasutatakse uut rakutüüpi), tuleks enne muudetud katse-eeskirja lubatavaks lugemist tõendada, et ka muudetud katse on tõhus. Tõhususe tõendamiseks tuleb muu hulgas tõendada, et on võimalik kindlaks teha peamisi kromosoomide katkemise, lisandumise või kaotsimineku mehhanisme ja et on võimalik saada sobivad positiivse ja negatiivse kontrolli tulemused üksiku uuritava aine kemikaaliklassi või paljude uuritavate ainete puhul.
|
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
Tulemuste käsitlemine
58.
|
Kui kasutatakse tsütokineesibloki meetodit, võetakse mikrotuumade hindamisel arvesse ainult kahetuumsetes rakkudes leitud mikrotuumade esinemise sagedust (sõltumatult mikrotuumade arvust ühe raku kohta). Ühe või kahe mikrotuumaga või suurema mikrotuumade arvuga rakkude arvu loendamine võib anda kasulikku teavet, kuid ei ole kohustuslik.
|
59.
|
Paralleelselt tuleks mõõta kõikide töödeldud kultuuride ja lahusti/kandeaine kontrollikultuuride juures avalduv tsütotoksiline ja/või tsütostaatiline mõju (58). Kui kasutatakse tsütokineesi bloki meetodit, tuleks rakutsükli hilinemise mõõtmise järgi arvutada kõikide töödeldud ja kontrollikultuuride puhul tsütokineesi blokiga paljunemise indeks (CBPI) ja replikatsiooniindeks (RI). TsütoB puudumise korral tuleks kasutada kas RPDd, RICCi või PId (vt 2. liide).
|
60.
|
Tulemused esitatakse iga üksiku kultuuri kohta. Lisaks esitatakse kokkuvõte kõikidest tulemustest tabeli kujul.
|
61.
|
Mikrotuumade tekkimist MNvit-katses võivad kemikaalid põhjustada sellega, et nende tõttu kromosoomid katkevad, lähevad kaotsi või esinevad mõlemad variandid korraga. Võib kasutada kinetokoorivastaseid antikehi, tsentromeerispetsiifilisi in situ sonde või muid meetodeid, et määrata kindlaks, kas mikrotuumade tekkemehhanism on seotud klastogeense ja/või aneugeense toimega.
|
Tulemuste hindamine ja tõlgendamine
62.
|
Selget positiivset või negatiivset vastust ei ole vaja täiendava katsega kontrollida. Ebamäärast tulemust võib selgitada veel 1 000 raku vaatlemisega kõikidest kultuuridest, et vältida kultuuride kodeerimise mõttetuks muutumist. Kui see lähenemisviis ei võimalda tulemust selgitada, tuleks teha edasisi katseid. Järelkatsete tegemisel tuleks kaaluda katse parameetrite muutmist laiendatud või kitsamaks muudetud katsetingimuste vahemikus. Katse parameetrid, mida võidakse muuta, hõlmavad kasutatavate kontsentratsioonide jaotust, töötlemise ja rakkude kogumise ajastust ja/või metaboolse aktiveerimise tingimusi.
|
63.
|
Positiivse tulemuse määramiseks on mitmeid kriteeriume, näiteks mikrotuumi sisaldavate rakkude arvu kontsentratsioonist sõltuv suurenemine või statistiliselt oluline suurenemine. Esmalt tuleks arvesse võtta tulemuste bioloogilist tähtsust. Vastuse bioloogilise olulisuse hindamisel võib juhinduda sellest, kas leitud väärtused on varasemate kontrollkatsete vahemikus või väljaspool seda vahemikku. Katsetulemuste hindamisel võib abivahendina kasutada sobivaid statistilisi meetodeid (65). Kuid statistiliste katsete tulemusi tuleks hinnata, võttes arvesse saadava tulemuse sõltuvust annusest. Samuti tuleks arvesse võtta reprodutseeritavust ja varasemaid andmeid.
|
64.
|
Kuigi enamik katseid annab selge positiivse või negatiivse tulemuse, ei ole mõnel harval juhul võimalik andmete alusel teha kindlat otsust uuritava aine mõju kohta. Tulemused võivad jääda ebaselgeks või küsitavaks, olenemata sellest, kui palju katset korratakse.
|
65.
|
MNvit-katse positiivne tulemus näitab, et uuritav aine tekitab imetajarakkude kultuuris kromosoomide katkemist või kadu. Negatiivne tulemus näitab, et konkreetsetes katsetingimustes ei põhjusta uuritav aine imetajarakkude kultuuris kromosoomide katkemist ega/või lisandumist või kadu.
|
Katseprotokoll
66.
|
Katseprotokollis tuleks esitada vähemalt järgmine teave, kui see on uuringu läbiviimise seisukohast asjakohane.
|
Uuritav kemikaal
—
|
Identifitseerimisandmed, Chemical Abstract Services Registry ehk CASi nr ja EÜ nr;
|
—
|
füüsikaline olek ja puhtus;
|
—
|
uuringu tegemisel olulised füüsikalis-keemilised omadused;
|
—
|
uuritava aine võime reageerida lahusti/kandeainega või rakukultuuri keskkonnaga.
|
|
|
Lahusti/kandeaine
—
|
Lahusti/kandeaine valiku põhjendus;
|
—
|
uuritava aine lahustuvus ja püsivus lahustis/kandeaines.
|
|
|
Rakud
—
|
Kasutatud rakkude tüüp ja päritolu;
|
—
|
kasutatud rakutüübi sobivus;
|
—
|
mükoplasma puudumine, vajaduse korral;
|
—
|
teave rakutsükli pikkuse kohta, pooldumisaeg või paljunemisindeks;
|
—
|
lümfotsüütide kasutamise korral veredoonorite arv, sugu ja vanus, vajaduse korral;
|
—
|
lümfotsüütide kasutamise korral näidatakse, kas uuritava ainega viidi kokkupuutesse kogu veri või eraldatud lümfotsüüdid;
|
—
|
ümberkülvide arv, vajaduse korral;
|
—
|
rakukultuuri säilitamise meetodid, vajaduse korral;
|
—
|
kromosoomide modaalarv;
|
—
|
normaalse (negatiivse kontrolli) rakutsükli kestus.
|
|
|
Katsetingimused
—
|
Tsütokineesi blokeeriv aine (nt tsütoB), kui seda kasutatakse, selle kontsentratsioon ja rakkude selle ainega kokkupuute kestus;
|
—
|
kontsentratsioonide ja rakukultuuride arvu valimise põhimõtted, sh nt tsütotoksilisuse andmed ja lahustuvuse piirangud, kui need on olemas;
|
—
|
kasvukeskkonna koostis, CO2 kontsentratsioon, vajaduse korral;
|
—
|
uuritava aine kontsentratsioonid;
|
—
|
lisatud kandeaine ja uuritava aine kontsentratsioon ja kogus (ja/või ruumala);
|
—
|
inkubatsiooni temperatuur ja kestus;
|
—
|
uuritava ainega töötlemise kestus;
|
—
|
ajavahemik töötlemisest kuni rakkude kogumiseni;
|
—
|
rakkude tihedus külvamisel, vajaduse korral;
|
—
|
metaboolse aktiveerimise süsteemi tüüp ja koostis, sh selle heakskiitmise kriteeriumid;
|
—
|
positiivse kontrolli kemikaalid ja negatiivsed kontrollid;
|
—
|
mikroskoobipreparaatide valmistamise meetodid ja kasutatud värvimismeetodid;
|
—
|
mikrotuuma kindlakstegemise kriteeriumid;
|
—
|
analüüsitud rakkude arv;
|
—
|
tsütotoksilisuse mõõtmise meetodid;
|
—
|
igasugune täiendav teave tsütotoksilisuse kohta;
|
—
|
kriteeriumid, mille alusel uuringutulemus klassifitseeritakse positiivseks, negatiivseks või ebaselgeks;
|
—
|
kasutatud statistilise analüüsi meetod(id);
|
—
|
vajaduse korral meetodid, millega uuriti, kas mikrotuum sisaldab terveid kromosoome või nende fragmente, näiteks kinetokoori antikeha.
|
|
|
Tulemused
—
|
Tsütotoksilisuse määramise meetod, mida kasutati tsütokineesi bloki meetodi kasutamise puhul, näiteks CBPI või RI; RICC, RPD või PI, kui tsütokineesi bloki meetodeid ei kasutatud; vajaduse korral muud tähelepanekud, näiteks pinna katmine, apoptoos, nekroos, metafaaside loendamine, kahetuumsete rakkude esinemise sagedus;
|
—
|
teave kasvukeskkonna pH ja osmolaalsuse kohta, kui see on määratud;
|
—
|
analüüsi jaoks kõlblike rakkude määratlus;
|
—
|
ühe-, kahe- ja paljutuumsete rakkude jaotus, kui kasutatakse tsütokineesi bloki meetodit;
|
—
|
mikrotuumadega rakkude arv eraldi igas töödeldud ja kontrollkultuuris; vajaduse korral peab olema näidatud, kas on määratud kahetuumsetest või ühetuumsetest rakkudest;
|
—
|
kontsentratsiooni ja toime vaheline sõltuvus, võimaluse korral;
|
—
|
paralleelse negatiivse (lahusti/kandeaine) ja positiivse kontrolli kemikaalide andmed (kontsentratsioonid ja lahustid);
|
—
|
varasemate negatiivsete (lahusti/kandeaine) ja positiivsete kontrollide andmed, sh vahemik, keskväärtused ja standardhälbed ning 95 % usaldusvahemik;
|
—
|
statistiline analüüs; p-väärtused vajaduse korral.
|
|
|
KIRJANDUS
1)
|
Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1–4.
|
2)
|
Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3–15.
|
3)
|
Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233–246.
|
4)
|
Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167–172.
|
5)
|
Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104.
|
6)
|
Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193–198.
|
7)
|
Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34–43.
|
8)
|
Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9–20.
|
9)
|
Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297–302.
|
10)
|
Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329–334.
|
11)
|
Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205–213.
|
12)
|
Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519–525.
|
13)
|
Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9–20.
|
14)
|
Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233–245.
|
15)
|
Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211–219.
|
16)
|
Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153–163.
|
17)
|
OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: www.oecd.org/env/testguidelines
|
18)
|
Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13–36.
|
19)
|
Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37–60.
|
20)
|
Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61–87.
|
21)
|
Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88–124.
|
22)
|
Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125–152.
|
23)
|
Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187–208.
|
24)
|
Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45–59.
|
25)
|
Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81–116.
|
26)
|
Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183–190.
|
27)
|
Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55–71.
|
28)
|
von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137–163.
|
29)
|
Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123–134.
|
30)
|
Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569–580.
|
31)
|
Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1–152.
|
32)
|
ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16–17 November, 2006. Vt: http://ecvam.jrc.it/index.htm
|
33)
|
ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel. Vt: http://ecvam.jrc.it/index.htm
|
34)
|
Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271–283.
|
35)
|
Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105–115.
|
36)
|
Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257–260.
|
37)
|
Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315–328.
|
38)
|
Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61–70.
|
39)
|
Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147–205.
|
40)
|
Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297–305.
|
41)
|
Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789–886.
|
42)
|
Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29–36.
|
43)
|
Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11–18.
|
44)
|
Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen.
37, 31–45.
|
45)
|
Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173–215.
|
46)
|
Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55–65.
|
47)
|
Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175–177.
|
48)
|
Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85–88.
|
49)
|
Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51–59.
|
50)
|
UNEP (2001), püsivate orgaaniliste saasteainete Stockholmi konventsioon, ÜRO keskkonnaprogramm (UNEP). Vt: http://www.pops.int/
|
51)
|
Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247–274.
|
52)
|
Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91–103.
|
53)
|
Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795–801.
|
54)
|
Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35–44.
|
55)
|
Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103–112.
|
56)
|
Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the in vitro micronucleus assay working group”, Mutation Res., 564, 97–100.
|
57)
|
Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61–65.
|
58)
|
Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1–3.
|
59)
|
Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169–184.
|
60)
|
Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191–201.
|
61)
|
Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241–247.
|
62)
|
MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269–275.
|
63)
|
Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241–247.
|
64)
|
Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65–75.
|
65)
|
Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463–467.
|
66)
|
Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrus (EÜ) nr 850/2004, 29. aprill 2004, püsivate orgaaniliste saasteainete kohta ning millega muudetakse direktiivi 79/117/EMÜ, ELT L 229, 30.4.2004, lk 5.
|
1. liide
Mõisted
Aneugeen: iga aine või protsess, mis raku mitootilise või meiootilise jagunemise tsükli komponentidega interakteerudes tekitab rakkudes või organismides aneuploidsust.
Aneuploidsus: iga kõrvalekalle normaalsest diploidsest (või haploidsest) kromosoomiarvust ühe või enama kromosoomi võrra, kuid mitte terve(te) kromosoomikomplekti(de) võrra (polüploidia).
Apoptoos: programmeeritud rakusurm, mida iseloomustab rida astmeid, mis viivad raku lagunemiseni membraaniga seotud osakesteks, mis kõrvaldatakse fagotsütoosi või väljutamisega.
Rakkude paljunemine: rakkude arvu suurenemine mitootilise rakujagunemise tagajärjel.
Tsentromeer: kromosoomi DNA-piirkond, kus mõlemaid kromatiide hoitakse koos ja mille külge teineteise kõrvale kinnituvad mõlemad kinetokoorid.
Klastogeen: iga aine või protsess, mis tekitab rakkude või organismide populatsioonides struktuurseid kromosoomihälbeid.
Tsütokinees: mitoosile vahetult järgnev rakujagunemise protsess, mille tulemusel tekivad kaks tütarrakku, millest kummaski on üksainus tuum.
Tsütokineesi blokiga paljunemise indeks (cytokinesis-block proliferation index, CBPI): teise rakujagunemise rakkude osakaal töödeldud rakupopulatsioonis, võrreldes töötlemata kontrolliga (vt võrrand, 2. liide).
Tsütostaas: rakkude kasvu inhibeerimine (vt võrrand, 2. liide).
Tsütotoksilisus: kahjulik mõju raku struktuurile või funktsioonidele, mis lõpuks põhjustab raku surma.
Genotoksiline: üldine termin, mis hõlmab DNA või kromosoomide igasugust kahjustust, sealhulgas katkemisi, aduktidega seotud ümberkorraldumist, mutatsioone, kromosoomihälbeid ja aneuploidsust. Mitte kõik genotoksilised efektid ei anna tulemuseks mutatsioone või püsivat kromosoomikahjustust.
Interfaasirakud: rakud, mis ei ole mitoosifaasis.
Kinetokoor: valke sisaldav struktuur, mis koondub kromosoomi tsentromeeri juures, millele raku jagunemise ajal kinnituvad kääviniidid, võimaldades tütarkromosoomidel korrastatult liikuda tütarrakkude poolustele.
Mikrotuum: väike tuum, mis on raku põhituumast eraldi ja lisandunud põhituumale, see on moodustunud mitoosi või meioosi telofaasi ajal mahajäänud kromosoomifragmentidest või tervetest kromosoomidest.
Mitoos: rakutuuma jagunemine, mida tavaliselt jagatakse profaasiks, prometafaasiks, metafaasiks, anafaasiks ja telofaasiks.
Mitootiline indeks: metafaasis olevate rakkude arv jagatakse rakupopulatsioonis vaadeldud rakkude koguarvuga; näitab rakkude paljunemise astet kõnealuses populatsioonis.
Mutageenne: tekitab päriliku muutuse geenide DNA alusepaaride järjestuses või kromosoomide struktuuris (kromosoomihälve).
Mitteeraldumine: paardunud kromatiidid ei eraldu teineteisest ega liigu kujunevatesse tütarrakkudesse nii, nagu see peaks normaalselt toimuma; tulemuseks on ebanormaalse kromosoomide arvuga tütarrakud.
Polüploidsus: rakkude või organismi numbriline kromosoomihälve, mis hõlmab terveid kromosoomikomplekte; vastandub aneuploidsusele, mille puhul kromosoomihälve hõlmab üht või mitut kromosoomi.
Paljunemisindeks (Proliferation Index, PI): tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, kui tsütoB-d ei kasutata (vt võrrand, 2. liide).
Rakkude arvukuse suhteline suurenemine (Relative Increase in Cell Count, RICC): tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, kui tsütoB-d ei kasutata (vt võrrand, 2. liide).
Rakupopulatsiooni suhteline kahekordistumine (Relative Population Doubling, RPD): tsütotoksilisuse mõõtmise meetod, kui tsütoB-d ei kasutata (vt võrrand, 2. liide).
Replikatsiooniindeks (Replication Index, RI): lõpuni kulgenud rakujagunemistsüklite osakaal töödeldud rakukultuuris, võrreldes töötlemata kontrolliga, rakkude töötlemise ja toibumise ajal (vt võrrand, 2. liide).
Uuritav kemikaal (ka „uuritav aine”): iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
2. liide
Tsütotoksilisuse hindamise võrrandid
1.
|
Kui kasutatakse tsütoB-d, peaks tsütotoksilisus põhinema tsütokineesi blokiga paljunemise indeksil (cytokinesis-block proliferation index, CBPI) või replikatsiooniindeksil (RI) (16, 58). CBPI näitab rakutsüklite keskmist arvu raku kohta tsütoB-ga kokkupuutumise aja jooksul ja seda võib kasutada raku paljunemise arvutamiseks. Replikatsiooniindeks RI näitab tuumade suhtelist arvu töödeldud kultuurides võrrelduna kontrollkultuuridega ja seda võib kasutada tsütostaasi protsendi arvutamiseks:
tsütostaasi % = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)}
ning
T
|
=
|
uuritava kemikaaliga töödeldud kultuur
|
C
|
=
|
kandeaine kontrolli kultuur
|
siis:
Seega vastab CBPI väärtus 1 (kõik rakud on ühetuumsed) 100 % tsütostaasile.
Tsütostaas = 100 – RI
T
|
=
|
töödeldud kultuurid
|
C
|
=
|
kontrollkultuurid
|
|
2.
|
RI = 53 % tähendab seega, et kui kontrollkultuurides on teatav arv rakke jagunenud ja moodustanud kahetuumseid ja paljutuumseid rakke, siis töödeldud kultuuris on jagunenud kõigest 53 % sellest arvust, see tähendab 47 % oli tsütostaasi.
|
3.
|
Kui tsütoB-d ei kasutata, soovitatakse tsütotoksilisust hinnata rakkude arvukuse suhtelise suurenemise (Relative Increase in Cell Counts, RICC) või rakupopulatsiooni suhtelise kahekordistumise (Relative Population Doubling, RPD) järgi (58), kuna mõlema näitaja puhul võetakse arvesse jagunenud rakkude osakaalu rakupopulatsioonis.
kus:
populatsiooni kahekordistumine = [log (rakkude arv pärast töötlust ÷ esialgne rakkude arv)] ÷ log 2
|
4.
|
Seega tähendab 53 % RICC või RPD, et 47 % oli tsütotoksilisust/tsütostaasi.
|
5.
|
Tsütotoksilisust võib hinnata 1 rakust koosnevate kloonide (cl1), 2 rakust koosnevate kloonide (cl2), 3–4 rakust koosnevate kloonide (cl4) ja 5–8 rakust koosnevate kloonide (cl8) loendamise ja paljunemisindeksi (PI) kasutamisega:
|
6.
|
PI-d on kasutatud tsütotoksilisuse väärtusliku ja usaldusväärse näitajana ka rakuliinide puhul, mida on kultiveeritud in situ tsütoB puudumisel (25, 26, 27, 28).
|
3. liide
Tulemuslikkuse hindamiseks soovitatavad võrdluskemikaalid
(16)
Kategooria
|
Kemikaal
|
CASi nr
|
EÜ nr
|
1. Ilma metaboolse aktivatsioonita toimivad klastogeenid
|
|
tsütosiinarabinosiid
|
147-94-4
|
205-705-9
|
|
mitomütsiin C
|
50-07-7
|
200-008-6
|
2. Metaboolset aktivatsiooni vajavad klastogeenid
|
|
benso(a)püreen
|
50-32-8
|
200-028-5
|
|
tsüklofosfamiid
|
50-18-0
|
200-015-4
|
3. Aneugeenid
|
|
kolhitsiin
|
64-86-8
|
200-598-5
|
|
vinblastiin
|
143-67-9
|
205-606-0
|
4. Negatiivsed ained
|
|
di-(2-etüülheksüül)ftalaat
|
117-81-7
|
204-211-0
|
|
nalidikshape
|
389-08-2
|
206-864-7
|
|
püreen
|
129-00-0
|
204-927-3
|
|
naatriumkloriid
|
7647-14-5
|
231-598-3
|
B.50. NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕLMEDE KATSE: DA
SISSEJUHATUS
1.
|
OECD kemikaalide katsetamise juhendeid ja ELi katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaolu. Esialgne katsemeetod (B.42) naha sensibiliseerimise määramiseks hiirtel lokaalsete lümfisõlmede katsega (Local Lymph Node Assay – LLNA; OECD katsejuhend 429) on läbi vaadatud (1). Kirjanduses on avaldatud LLNA valideerimise üksikasjad ja ülevaade sellega seotud töödest (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9). LLNA-meetodi järgi kasutatakse lümfotsüütide paljunemise määramiseks radioaktiivse isotoobiga märgistatud tümidiini või joodi ja seepärast ei saa katset kasutada, kui radioaktiivsete ühendite hankimine, kasutamine või kõrvaldamine tekitab probleeme. LLNA: DA (mille töötas välja Daicel Chemical Industries, Ltd.) on LLNA variant, mis on vaba radioaktiivsusest ja milles lümfotsüütide paljunemise näitajana kasutatav adenosiintrifosfaadi (ATP) sisaldus määratakse bioluminestsentsi abil. Katsemeetod LLNA: DA on valideeritud ja läbi vaadatud ning rahvusvaheline eksperdihinnangu komisjon soovitab seda, kuna leiab, et see sobib naha sensibiliseerumist põhjustavate ja mittepõhjustavate kemikaalide kindlakstegemiseks, arvestades teatavaid piiranguid (10, 11, 12, 13). Käesolev katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata katseloomadel kemikaalide (ainete ja segude) võimet sensibiliseerida nahka. Käesoleva lisa peatükis B.6 ja OECD katsejuhendis 406 kasutatakse merisigu, nimelt merisigade maksimeerimise katset ja Buehleri katset (14). LLNAd (käesoleva lisa peatükk B.42, OECD katsejuhis 429) ja selle kahte radioaktiivsuse kasutamiseta versiooni, need on LLNA: DA (käesoleva lisa peatükk B.50, OECD katsejuhis 442 A) ja LLNA: BrdU-ELISA (käesoleva lisa peatükk B.51, OECD katsejuhis 442 B), tuleb eelistada meriseakatsetele peatükis B.6, OECD katsejuhis 406 (14), kuna nendega vähendatakse ja täiustatakse katseloomade kasutamist.
|
2.
|
Nii nagu LLNA puhul, uuritakse LLNA: DA katsetes naha sensibiliseerimise induktsioonifaasi ja saadakse kvantitatiivseid andmeid immuunvastuse annusest sõltuvuse hindamiseks. Lisaks kõrvaldab võimalus määrata naha sensibiliseerijaid ilma DNA radioaktiivset märgist kasutamata tööalase kokkupuute radioaktiivsusega ja radioaktiivsete jäätmete probleemi. See omakorda võimaldab naha sensibiliseerijate määramiseks kasutada rohkem hiiri, millega võiks veelgi väheneda merisigade kasutamine (s.o peatükk B.6, OECD katsejuhis 406) (14) selleks otstarbeks.
|
MÕISTED
3.
|
Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
|
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
4.
|
LLNA: DA on muudetud LLNA-meetod võimalike nahka sensibiliseerivate kemikaalide kindlakstegemiseks, millel on aga teatavad piirangud. See ei tähenda tingimata, et kõikidel juhtudel tuleks kasutada LLNA või merisigadega tehtavate katsete (B.6 ja OECD katsejuhend 406) (14) asemel LLNA: DAd, vaid pigem, et uuring on sama hea ja seda võib kasutada alternatiivina, mille positiivsed või negatiivsed tulemused üldiselt ei vaja täiendavat kinnitamist (10, 11). Katselabor võtab arvesse kogu uuritava aine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave hõlmab aine nimetust ja keemilist struktuuri, füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainetega in vitro või in vivo tehtud toksilisuskatsete tulemusi ja struktuurilt samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid. Osutatud teavet tuleb analüüsida, et määrata kindlaks, kas LLNA: DA sobib kõnealuse aine puhul (arvestades LLNA: DA sobimatust teatavate piiratud kemikaalitüüpide puhul, vt punkt 5) ning valida sobivad annused.
|
5.
|
LLNA: DA on in vivo meetod ja seetõttu ei lõpeta see loomade kasutamist naha allergilise sensibiliseerimise hindamisel. Sellega on siiski võimalik vähendada katseloomade kasutamist selleks otstarbeks, võrreldes merisigadega tehtavate katsetega (B.6, OECD katsejuhis 406) (14). Lisaks võimaldab LLNA: DA oluliselt parandada viisi, kuidas loomi kasutatakse naha allergilise sensibiliseerimise määramiseks (vähem tekitatakse valu ja kannatusi), kuna erinevalt B.6st ja OECD katsejuhendist 406 ei eelda LLNA: DA, et naha ärritamisega tekitataks ülitundlikkusreaktsioone. Hoolimata LLNA: DA eelistest B.6 või OECD katsejuhendi 406 (14) kohaste katsetega võrreldes on teatud piirangud, mis võivad tingida B.6 või OECD katsejuhendi kohaste katsete 406 kasutamist (nt teatavate metallide katsetamine, valepositiivid teatavate nahaärritajate puhul (näiteks teatavat tüüpi pindaktiivsed kemikaalid) (6) (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42), uuritavate ainete lahustuvus). Lisaks võib teatavate kemikaaliklasside või ainete puhul, mis sisaldavad segavat toimet avaldada võivaid funktsionaalseid rühmi (16), olla vaja kasutada meriseakatseid (st B.6 või OECD katsejuhendit 406 (14)). LLNA puhul kindlaks tehtud piiranguid (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42) on peetud kehtivateks ka LLNA: DA puhul (10). Lisaks ei tarvitse LLNA: DA kasutamine olla sobiv selliste ainete uurimiseks, mis mõjutavad ATP taset (näiteks ATP inhibiitorina toimivad ained) või segavad rakusisese ATP täpset määramist (nt ATPd lagundavate ensüümide juuresolek, rakuvälise ATP olemasolu lümfisõlmes). Selliste teadaolevate piirangute arvestamisega peaks LLNA: DA olema kohaldatav igasuguste ainete uurimiseks, millel ei ole omadusi, mis võiksid mõjutada LLNA: DAga saadavate tulemuste õigsust. Lisaks sellele tuleks kaaluda piiripealse positiivse tulemuse võimalust, kui stimulatsiooniindeksi (SI) väärtus tuleb vahemikku 1,8–2,5 (vt punktid 31–32). See tugineb 44 ainest koosnevale valideerimise andmebaasile, milles kasutati SI väärtusi ≥ 1,8 (vt punkt 6), millest LLNA: DA võimaldas õigesti kindlaks teha kõik 32 LLNA järgi sensibiliseerijat, kuid mis andis vale tulemuse kolme aine puhul 12st LLNA järgi mitte sensibiliseerivast ainest, mille SI oli 1,8–2,5 (st piiripealsed positiivsed tulemused) (10). Kuid kuna samu andmeid kasutati SI väärtuste kindlaksmääramiseks ja katsemeetodi ennustusvõime arvutamiseks, võivad esitatud tulemused viia tegeliku ennustusvõime ülehindamisele.
|
KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
6.
|
LLNA: DA põhimõte seisneb selles, et sensibilisaatorid kutsuvad esile lümfotsüütide vohamise lähimates lümfisõlmedes, mis dreenivad uuritava aine pealekandmise paika. Vohamine on võrdeline pealekantud allergeeni annuse ja allergiatekitamisvõimega ning see võimaldab lihtsa meetodiga sensibiliseerimist kvantitatiivselt mõõta. Vohamist mõõdetakse nii, et keskmist vohamist igas katserühmas võrreldakse keskmise vohamisega kandeaine-kontrollrühmas, mille liikmeid on töödeldud üksnes kandeainega (vehicle treated control – VC). Määratakse igas uuritava ainega töödeldud rühmas leitud keskmise vohamise ja paralleelselt kandeaine-kontrollrühmas leitud keskmise vohamise suhtarv, mida nimetatakse stimulatsiooniindeksiks (SI); SI peab olema vähemalt 1,8 selleks, et katseaine kui naha võimaliku sensibiliseerija edasine hindamine oleks vajalik. Siin kirjeldatud meetod põhineb sellel, et bioluminestsentsi järgi mõõdetakse ATP sisaldust ja (kuna see korreleerub elusrakkude arvuga) (17) hinnatakse selle järgi paljunevate rakkude arvu suurenemist kõrvalesta dreenivates lümfisõlmedes (18, 19). Bioluminestsentsi meetodis kasutatakse ensüümi lutsiferaasi, mis katalüüsib valguse tekkimist ATPst ja lutsiferiinist vastavalt järgmisele reaktsioonile:
ATP + lutsiferiin + O
2
oksülutsiferiin + AMP + PPi
+ CO
2 + valgus
Eralduva valguse intensiivsus on lineaarselt seotud ATP kontsentratsiooniga ja seda mõõdetakse luminomeetriga. Lutsiferiini-lutsiferaasi katse on tundlik meetod ATP kvantitatiivseks mõõtmiseks ja seda kasutatakse paljudes meetodites (20).
|
KATSE KIRJELDUS
Loomaliigi valimine
7.
|
Käesoleva katse jaoks valitud liik on hiir. LLNA: DA valideerimisuuringud tehti ainult CBA/J-liini hiirtega, mida seepärast peetakse eelistatavaks liiniks (12, 13). Kasutatakse noori täiskasvanud emashiiri, kes ei ole poeginud ega tiined. Katse alguses peaksid loomad olema 8–12 nädalat vanad ning loomade kehamassi varieerumine peaks olema minimaalne ja mitte ületama 20 % keskmisest massist. Võib kasutada ka muid liine ja isasloomi, kui on olemas piisavalt andmeid selle tõendamiseks, et LLNA: DA immuunvastuses ei ole olulisi liini- ja/või soospetsiifilisi erinevusi.
|
Pidamis- ja söötmistingimused
8.
|
Hiiri tuleks pidada rühmapuurides (21), kui ei esitata nõuetekohast teaduslikku põhjendust üksikpuuris pidamise kasuks. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, on eesmärk hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata.
|
Loomade ettevalmistamine
9.
|
Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks (kuid mitte kõrvamärkidega) ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise algust, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega. Enne katse alustamist uuritakse kõiki loomi, et neil ei oleks nähtavaid nahakahjustusi.
|
Annustamislahuste valmistamine
10.
|
Tahke uuritav aine tuleb lahustada või suspendeerida lahustis või kandeaines ja vajaduse korral lahjendada enne hiire kõrvalestale määrimist. Vedelaid kemikaale võib annustada puhtal kujul või lahjendada enne annustamist. Lahustumatuid keemilisi aineid, näiteks aineid, mida kasutatakse meditsiiniseadmetes, tuleb enne hiire kõrvalestale kandmist sobiva solvendiga tõhusalt ekstraheerida, et teha kindlaks kõik ekstraheeritavad koostisained, mille mõju tuleks uurida. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, kui ei ole stabiilsusandmetega tõendatud, et säilitamine on lubatav.
|
Usaldusväärsuse kontroll
11.
|
Positiivse kontrolli kemikaale kasutatakse selleks, et tõendada katsemeetodi vajalikku tulemuslikkust: sensibiliseerivate uuritavate ainetega, mille puhul immuunvastuse ulatus on hästi kirjeldatud, saadakse õige ja korratav tulemus. Soovitatakse teha paralleelselt positiivse kontrolli katse, kuna see tõendab labori võimet teha iga katse õigesti ning võimaldab hinnata laborisisest ja laboritevahelist korratavust ja võrreldavust. Mõned reguleerivad asutused nõuavad positiivset kontrolli iga uuringu puhul ja seepärast soovitatakse käesoleva meetodi kasutajatel konsulteerida enne LLNA: DA tegemist asjakohaste asutustega. Seepärast soovitatakse alati teha paralleelselt positiivse kontrolli katsed, et vältida vajadust teha täiendavaid loomkatseid, et täita nõudeid, mis võivad tekkida perioodilise positiivse kontrolli kasutamise puhul (vt punkt 12). Positiivne kontroll peaks andma positiivse LLNA: DA immuunvastuse kokkupuutetasemel, mis eeldatavasti suurendab stimulatsiooniindeksit (SI) 1,8 korda või enam, võrreldes negatiivse kontrollrühmaga. Positiivse kontrolli annus tuleks valida nii, et see ei põhjustaks ulatuslikku nahaärritust või süsteemset mürgitust ja tekitatav mõju oleks korratav, kuid mitte liiga suur (näiteks stimulatsiooniindeksit üle 10 peetakse liiga suureks). Eelistatud positiivse kontrolli ained on 25 % heksüülkaneelaldehüüd (Chemical Abstracts Service (CASi) number 101-86-0) ja 25 % eugenool (CASi number 97-53-0) atsetooni-oliiviõli segus (4: 1, v/v). Võib olla olukordi, kus piisavalt põhjendatult võib kasutada muid positiivse kontrolli aineid, mis vastavad eespool esitatud kriteeriumidele.
|
12.
|
Kuigi igas katses soovitatakse paralleelselt teha katsed ka positiivse kontrolli rühmaga, võib esineda olukordi, kus labori jaoks, milles korrapäraselt (st vähemalt kord kuus) tehakse LLNA: DAd ja on olemas varasemate positiivse kontrolli katsete andmebaas, mis tõendab labori võimet saada korratavaid ja õigeid positiivse kontrolli tulemusi, võib sobiv olla perioodiline positiivse kontrolli tegemine (näiteks kuni kuue kuu järel). Vajalikku oskuste taset LLNA: DA alal võib tõendada vähemalt kümne sõltumatu ja omavahel kooskõlas oleva positiivse kontrolli katsega, mis on tehtud mõistliku ajavahemiku (vähem kui aasta) jooksul.
|
13.
|
Paralleelset positiivse kontrolli rühma tuleb alati kasutada siis, kui muutub LLNA: DA läbiviimine (näiteks uued väljaõppe saanud töötajad, katsemeetodi materjalide ja/või reaktiivide muutus, katsemeetodi läbiviimise tehniliste vahendite muutus, uus katseloomade tarnija), ja sellised muutused tuleb laboriprotokollis dokumenteerida. Tuleb analüüsida selliste muutuste mõju varasemate katsetega loodud andmebaasi järjepidevusele ja otsustada, kas on vaja teha uus andmebaas, et dokumenteerida kooskõla varasemate positiivse kontrolli tulemustega.
|
14.
|
Meetodi kasutajad peaksid teadma, et otsus kasutada positiivset kontrolli perioodiliselt, mitte paralleelselt, mõjutab perioodilise positiivse kontrolli vahepealsel ajal ilma positiivse kontrollita saadud negatiivsete uuringutulemuste adekvaatsust ja vastuvõetavust. Kui perioodilise positiivse kontrolli katses saadakse näiteks valenegatiiv, võib ajavahemikus viimasest vastuvõetavast positiivse kontrolli katsest kuni vastuvõetamatu kontrollkatseni uuritavate ainetega saadud negatiivsed tulemused panna kahtluse alla. Selliste tulemuste tähendust tuleks hoolikalt analüüsida, kui otsustatakse, kas teha positiivse kontrolli katseid paralleelselt või üksnes perioodiliselt. Mõelda tuleb ka, kuidas kasutada vähem loomi paralleelses positiivse kontrolli rühmas, kui see on teaduslikult põhjendatud ja kui labor tõendab oma varasemate andmetega, et on võimalik kasutada vähem hiiri (22).
|
15.
|
Kuigi positiivset kontrollainet tuleks uurida kandeaines, mis teatavasti annab teatava kindla immuunvastuse (nt atsetoon-oliiviõli, suhtes 4: 1, v/v), võib esineda teatavaid regulatiivseid olukordi, milles on vaja teha katseid ka ebatavalise kandeainega (kliiniliselt või keemiliselt asjakohane segu) (23). Kui paralleelset positiivse kontrolli katset tehakse muu kandeainega kui uuritava aine puhul, on vaja moodustada eraldi veel positiivse kontrolli kandeaine-kontrollrühm.
|
16.
|
Kui uuritakse teatava keemiliste ühendite klassi aineid või mõõdetakse nende poolt esile kutsutava immuunvastuse vahemikku, võib olla kasulik mõõta teatavaid võrdlusaineid, millega tõendatakse, et katse võimaldab õigesti määrata kõnealuste ühenditüüpide võimet nahka sensibiliseerida. Sobival võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused:
—
|
struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega;
|
—
|
teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused;
|
—
|
varasemad toetavad LLNA: DA andmed;
|
—
|
toetavad andmed muude katseloomade ja/või inimese kohta.
|
|
KATSE KÄIK
Loomade arv ja annusemäärad
17.
|
Ühes annuserühmas on vähemalt neli looma, kasutatakse vähemalt kolme uuritava aine kontsentratsiooni ja paralleelselt negatiivset kontrollrühma, keda töödeldakse üksnes kandeainega, mida kasutatakse uuritava aine puhul, ning positiivse kontrolli rühma (kas paralleelne või hiljutine positiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–15). Tuleb kaaluda positiivse kontrolli tegemist mitme annusega, eriti kui positiivset kontrolli tehakse aeg-ajalt. Kontrollrühma loomi koheldakse ja töödeldakse nii nagu katserühma loomi, välja arvatud töötlemine uuritava ainega.
|
18.
|
Annuse ja kandeaine valik peaks põhinema viidetes 2 ja 24 antud soovitustel. Tavaliselt valitakse järjestikused annused sobivast kontsentratsioonide reast, näiteks 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. Kasutatava kontsentratsioonide rea valimisel peaks olema asjakohane teaduslik põhjendus. Tuleks arvesse võtta kõik olemasolevad toksikoloogiaandmed (nt ägeda toksilisuse ja nahaärrituse kohta) ning andmed uuritava aine struktuuri ja füüsikalis-keemiliste omaduste kohta ning valida kolm järjestikust kontsentratsiooni nii, et kõrgeim kontsentratsioon tagab maksimaalse võimaliku kokkupuute, kuid selle puhul ei avaldu süsteemset toksilisust ega liiga suurt paikset nahaärritust (24, 25). Sellise teabe puudumisel võib olla vajalik teha esialgne sõelkatse (vt punktid 21–24).
|
19.
|
Kandeaine ei tohiks segada katse tegemist ega muuta katse tulemust ja tuleks valida nii, et viia lahustuvus maksimumini, et kasutada kõrgeimat võimalikku kontsentratsiooni ja saada ühtlasi uuritava aine pealekandmiseks sobiv lahus või suspensioon. Soovitatavad kandeained on atsetoon-oliiviõli (4: 1, v/v), N,N-dimetüülformamiid, metüületüülketoon, propüleenglükool ja dimetüülsulfoksiid (6), kuid võib kasutada ka muid kandeaineid, kui esitada selleks piisav teaduslik põhjendus. Teatud olukorras võib osutuda vajalikuks kasutada täiendavaks kontrolliks kliiniliselt asjakohast lahustit või kaubanduslikku valmistist, milles uuritavat ainet turustatakse. Tuleks jälgida, et hüdrofiilsed ained kantaks peale kandeainesüsteemi abil, mis märgab nahka ega voola nahalt kohe maha; selleks lisatakse sobivaid solubiliseerijaid (nt 1 % Pluronic® L92). Seepärast tuleks täielikku vesilahust vältida.
|
20.
|
Iga üksiku hiire lümfisõlmede töötlemine võimaldab hinnata loomadevahelist varieeruvust ja statistiliselt võrrelda uuritavate ainetega tehtud mõõtmiste ja kandeaine-kontrollrühma mõõtmiste erinevust (vt punkt 33). Lisaks saab positiivse kontrolli rühma hiirte arvu vähendamise võimalikkust hinnata siis, kui kogutakse iga üksiku hiire andmeid (22). Lisaks nõuavad mõned reguleerivad asutused iga üksiku looma andmete kogumist. Üksikuid loomi käsitlevate andmete korrapärane kogumine annab loomade heaoluga seotud eelise, kuna võimaldab vältida korduvate uuringute tegemist, mis oleks hädavajalik, kui uuritavate ainete tulemusi, mis algselt on kogutud ühel viisil (näiteks loomade andmete ühendamisega), peaks reguleeriv asutus hiljem vaatlema teiste nõuete alusel (näiteks üksikloomade andmete põhjal).
|
Esialgne sõelkatse
21.
|
Kui ei ole andmeid suurima uuritava annuse kindlaksmääramiseks (vt punkt 18), tuleks teha esialgne sõelkatse, et leida LLNA: DA jaoks sobiv annuste vahemik. Esialgse sõelkatse eesmärk on saada andmeid, mille järgi määrata suurim LLNA: DA põhikatses kasutatav annus, kui ei ole teada kontsentratsioon, millel avaldub süsteemne toksilisus (vt punkt 24) ja/või tekib ülemäärane nahaärritus (vt punkt 23). Suurim uuritav annus peab olema 100 % vedela katseaine puhul või kõrgeim võimalik kontsentratsioon tahke aine või suspensiooni puhul.
|
22.
|
Esialgne sõelkatse tehakse samades tingimustes kui LLNA: DA põhikatse, kuid ei hinnata lümfisõlmede vohamist ja annuserühma kohta võidakse kasutada vähem katseloomi. Annuserühmas on soovitatavalt üks või kaks hiirt. Kõiki hiiri vaadeldakse iga päev, et leida süsteemse toksilisuse kliinilisi ilminguid või paikset nahaärritust pealekandmiskohas. Registreeritakse kehakaal enne katset ja enne katse lõppu (8. päev). Iga hiire kumbagi kõrvalesta uuritakse punetuse suhtes ja hinnatakse selle aste, kasutades tabelit 1 (25). Kõrvalesta paksust mõõdetakse paksusemõõtja (nt digitaalne mikromeeter või paksusemõõtja Peacock Dial) abil 1. päeval (enne annustamist), 3. päeval (ligikaudu 48 tundi pärast esimest annust), 7. päeval (24 tundi enne katse lõpetamist) ja 8. päeval. Lisaks võib 8. päeval mõõta kõrvalesta paksuse, milleks pärast looma humaanset surmamist lüüakse kõrvalestast mulgustajaga välja tükk ja kaalutakse. Ulatuslikku paikset nahaärritust näitab vähemalt hindele 3 vastav punetus ja/või kõrvalesta paksuse suurenemine vähemalt 25 % mõnel mõõtmispäeval (26, 27). LLNA: DA põhikatse jaoks valitud suurim annus on järgmine väiksem annus esialgse sõelkatse kontsentratsioonide reas (vt punkt 18), mille puhul ei avaldu süsteemne toksilisus ega teki ülemäärast nahaärritust.
Tabel 1
Punetuse hinne
Nähud
|
Hinne
|
Nahapunetust ei esine
|
0
|
Väga nõrk (vaevumärgatav) nahapunetus
|
1
|
Selgesti nähtav nahapunetus
|
2
|
Mõõdukas kuni tugev nahapunetus
|
3
|
Tugev nahapunetus (meenutab peeti) kuni kooriku tekkimine, mis takistab nahapunetuse astme edasist täpsustamist
|
4
|
|
23.
|
Lisaks kõrvalesta paksuse 25 % suurenemisele (26, 27) on ärritust tekitavate ainete kindlakstegemiseks LLNA abil kasutatud ka kõrvalesta paksuse statistiliselt olulist suurenemist töödeldud hiirtel, võrreldes kontrollrühma hiirtega (28, 29, 30, 31, 32, 33, 34). Ent kuigi statistiliselt oluline kõrvalesta paksuse suurenemine võib olla ka väiksem kui 25 %, ei ole selline paksuse suurenemine konkreetselt seotud ülemäärase nahaärritusega (30, 31, 32, 33, 34).
|
24.
|
Kui kliinilisi uuringuid kasutatakse LLNA: DA põhikatses kasutatava suurima annuse hindamise osana, siis süsteemset toksilisust (35) võivad näidata järgmised kliinilised tunnused: närvisüsteemi talitluse muutused (nt karva püstitõusmine, liigutuste koordinatsiooni kadu, värin ja krambid), käitumise muutused (nt agressiivsus, muutus oma karvkatte hooldamises, liikumisaktiivsuse oluline muutus), hingamise muutused (s.o hingamissageduse ja -sügavuse muutused, nagu raskendatud hingamine, õhuahmimine, räginad) ning muutused toidu ja vee tarbimises. Lisaks tuleb hindamisel arvestada letargia ja/või mittereageerimise märke ning rohkem kui kerge või lühiajalise valu või ebamugavustunde kliinilisi tunnuseid, samuti rohkem kui 5 % kehakaalu vähenemist ajavahemikus 1.–8. päevani ning suremust. Suremas olevad loomad ja loomad, kes näitavad suure valu või kannatuste tunnuseid, tuleks humaanselt surmata (36).
|
Põhiuuringu katse ajakava
25.
|
Katse ajakava on järgmine.
— 1. päev: määratakse iga üksiku looma mass ja registreeritakse koos kõigi võimalike kliiniliste tähelepanekutega. Kummagi kõrvalesta välisküljele kantakse naatriumlaurüülsulfaadi (SLS) 1 % vesilahust, kasutades SLSi lahusesse kastetud pintslit ja kattes kogu kõrvalesta väliskülje nelja-viie pintslitõmbega. Üks tund pärast SLSiga töötlemist kantakse kummagi kõrvalesta välisküljele 25 μl sobivalt lahjendatud uuritavat ainet, üksnes kandeainet või positiivse kontrolli ainet (paralleelne või hiljutine perioodiline positiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–15).
— 2., 3. ja 7. päev: korratakse 1. päeval tehtud eeltöötlust SLSi 1 % vesilahusega ja uuritava aine pealekandmist.
— 4., 5. ja 6. päev: loomi ei töödelda.
— 8. päev: määratakse iga looma mass ja registreeritakse koos kõigi võimalike kliiniliste tähelepanekutega. Ligikaudu 24–30 tundi pärast 7. päeval toimunud uuritava aine pealekandmise algust surmatakse loomad humaanselt. Igal hiirel lõigatakse välja kumbagi kõrvalesta dreenivad lümfisõlmed ja töödeldakse eraldi iga hiire lümfisõlmi fosfaatpuhvriga soolalahuses. Lümfisõlmede leidmise ja väljalõikamise üksikasjad ja joonised on esitatud viites (22). Paiksete naha immuunvastuste edasiseks jälgimiseks põhikatses võib katseprotokolli kanda ka täiendavad näitajad, nagu kõrvalesta punetuse hinnang või kõrvalesta paksuse mõõtmise andmed (mis saadakse kas paksusemõõtjaga või pärast surmamist kõrvalestast mulgustajaga välja löödud tüki massi mõõtmisega).
|
Rakususpensioonide valmistamine
26.
|
Valmistatakse iga hiire mõlemalt küljelt välja lõigatud lümfisõlmerakkude üherakuline suspensioon, milleks lümfisõlmed pannakse kahe objektiklaasi vahele ja purustatakse klaaside kerge surumisega üksteise vastu. Pärast selle kontrollimist, kas kude on jaotunud õhukese kihina, eraldatakse objektiklaasid teineteisest. Mõlemal objektiklaasil olev kude suspendeeritakse fosfaatpuhvriga soolalahuses, milleks kumbagi objektiklaasi hoitakse kaldu Petri tassi kohal ja loputatakse puhverlahusega, kraapides samal ajal rakukaabitsaga kudet klaasi küljest lahti. Negatiivse kontrolli loomade lümfisõlmed on väiksed, seepärast on tähtis tegutseda ettevaatlikult, et vältida igasugust kõrvalist mõju SI väärtustele. Kokku tuleks mõlema objektiklaasi loputamiseks kasutada 1 ml fosfaatpuhvriga soolalahust. Lümfisõlmerakkude suspensioon Petri tassil tuleb rakukaabitsaga kergelt homogeniseerida. Seejärel võetakse mikropipetiga 20 μl alikvoot lümfisõlmerakkude suspensioonist, püüdes mitte võtta silmaga nähtavat membraani, ja segatakse siis 1,98 ml fosfaatpuhvriga soolalahusega, nii et kokku saadakse 2 ml proovi. Samal viisil valmistatakse siis teine 2 ml proov, nii et iga looma kohta saadakse kaks proovi.
|
Rakkude vohamise määramine (lümfotsüütide ATP-sisalduse mõõtmine)
27.
|
Lümfisõlmede ATP-sisalduse suurenemine määratakse lutsiferiin-lutsiferaasi meetodiga, kasutades ATP mõõtmise komplekti, millega bioluminestsents määratakse suhtelistes luminestsentsi ühikutes (RLU). Katse tegemise aeg looma tapmisest kuni ATP-sisalduse mõõtmiseni peaks iga üksiku looma puhul olema ühesugune, umbes 30 minuti piires, kuna ATP-sisaldus pärast looma tapmist möödunud ajaga järk-järgult väheneb (12). Seega tuleks kogu tegevus kõrvalesta lümfisõlmede väljalõikamisest kuni ATP mõõtmiseni lõpetada 20 minuti jooksul vastavalt ettemääratud ajakavale, mis on kõikide loomade puhul ühesugune. ATP luminestsents tuleks mõõta kummaski 2 ml proovis, nii et kokku saadakse iga looma kohta kaks ATP mõõtmist. Seejärel määratakse kindlaks keskmine ATP luminestsents ja kasutatakse seda edasistes arvutustes (vt punkt 30).
|
TÄHELEPANEKUD
Kliinilised tähelepanekud
28.
|
Vähemalt kord päevas tuleks igal loomal hoolikalt vaadelda kliiniliste tunnuste esinemist – kas annustamiskoha paikset ärritust või süsteemset toksilisust. Iga hiire kohta registreeritakse süstemaatiliselt kõik tähelepanekud. Jälgimiskavas tuleks ette näha kriteeriumid, mille alusel tehakse kiiresti kindlaks ja surmatakse valutult hiired, kellel avaldub süsteemne toksilisus, ülemäärane paikne nahaärritus või -söövitus (36).
|
Kehamass
29.
|
Vastavalt punktile 25 tuleks mõõta iga looma kehamass katse alguses ja pärast ettemääratud humaanset surmamist.
|
TULEMUSTE ARVUTAMINE
30.
|
Iga katserühma tulemused väljendatakse keskmise stimulatsiooniindeksi (SI) kaudu. SI leidmiseks jagatakse iga uuritava aine rühma ja positiivse kontrollrühma keskmine RLU hiire kohta lahusti-/kandeaine-kontrollrühma keskmise RLU-ga hiire kohta. Keskmine SI kandeaine-kontrollrühmade puhul on seega 1.
|
31.
|
Otsustamisel peetakse tulemust positiivseks, kui SI on vähemalt 1,8 (10). Kuid piiripealse tulemuse (SI väärtus vahemikus 1,8–2,5) positiivseks leiuks kuulutamise otsuse tegemisel võib kasutada ka annuse-immuunvastuse sõltuvuse tugevust, statistilist olulisust ja lahusti/kandeaine ning positiivse kontrolli tulemuste kooskõlalisust (2, 3, 37).
|
32.
|
Kui SI on vahemikus 1,8–2,5, st tegemist on piiripealse positiivse tulemusega, võivad meetodi kasutajad võtta koos SI väärtusega arvesse lisateavet, nagu annuse-immuunvastuse sõltuvus, tõendid süsteemse toksilisuse või tugeva nahaärrituse kohta ja vajaduse korral statistilist olulisust, mis kinnitavad positiivset tulemust (10). Arvesse tuleks võtta ka uuritava aine mitmesuguseid omadusi, sealhulgas struktuurilist sarnasust teadaolevate naha sensibilisaatoritega, omadust põhjustada hiirel tugevat paikset nahaärritust ning annuse-immuunvastuse sõltuvuse laadi. Neid ja muid kaalutlusi on üksikasjalikult arutatud mujal (4).
|
33.
|
Andmete kogumine üksiku hiire tasandil võimaldab statistiliselt analüüsida, kas andmetes on näha annuse-immuunvastuse vahelist sõltuvust ja kui tugev see on. Iga statistiline hindamine peaks hõlmama annuse-immuunvastuse sõltuvuse hindamist ja katserühmade läbimõeldud võrdlemist (näiteks paariviisiline annuserühmade ja paralleelsete lahuse-/kandeaine-kontrollrühmade võrdlemine). Statistiline analüüs võib hõlmata näiteks lineaarset regressiooni või Williami testi annuse-immuunvastuse sõltuvuste hindamiseks ja Dunnetti paariviisiliste võrdluste testi. Statistilise analüüsi sobiva meetodi valimisel peaks uurija kogu aeg arvesse võtma võimalikku dispersioonide ebavõrdsust ja muid seonduvaid probleeme, mille tõttu võib vaja minna andmete teisendamist või mitteparameetrilist statistilist analüüsi. Igal juhul võib uurijal olla vaja teha SI arvutusi ja statistilist analüüsi kõigi andmepunktidega ja siis mõne andmepunkti kõrvalejätmisega (nn võõrväärtused).
|
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
Andmed
34.
|
Andmed tuleks kokku võtta tabeli vormis; tabelis esitatakse iga üksiklooma RLU väärtused, rühma keskmine suhte RLU/katseloom väärtus, selle viga (näiteks standardhälve, standardviga) ja iga annuserühma keskmine SI, võrrelduna paralleelse lahusti/kandeaine-kontrollrühma SI-ga.
|
Katsearuanne
35.
|
Katsearuandes esitatakse järgmine teave:
|
uuritavad kemikaalid ja kontrollkemikaalid:
—
|
tunnusandmed (näiteks CASi ja EÜ numbrid, kui on teada; allikas; puhtus; teadaolevad lisandid; partii number);
|
—
|
füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt lenduvus, stabiilsus, lahustuvus);
|
—
|
kui tegemist on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad;
|
|
|
lahusti/kandeaine:
—
|
tunnusandmed (puhtus; kontsentratsioon (vajaduse korral); kasutatud ruumala);
|
—
|
kandeaine valiku põhjendus;
|
|
|
katseloomad:
—
|
CBA-liini hiirte allikas;
|
—
|
loomade mikrobioloogiline staatus, kui see on teada;
|
—
|
loomade päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
|
|
|
katsetingimused:
—
|
ATP määramise komplekti tootja, partiinumber ja tootja esitatud kvaliteeditagamise/kvaliteedikontrolli andmed ATP määramise komplekti kohta;
|
—
|
uuritava aine ettevalmistamise ja annustamise üksikasjad;
|
—
|
annuse valiku põhjendus (sealhulgas esialgse sõelkatse tulemused, kui see tehti);
|
—
|
kandeaine ja uuritava aine kontsentratsioonid ning uuritava aine manustatud üldkogus;
|
—
|
toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);
|
—
|
annustamis- ja proovivõtukava üksikasjalik kirjeldus;
|
—
|
toksilisuse mõõtmise meetodid;
|
—
|
kriteeriumid, mille järgi uuringutulemus loeti positiivseks või negatiivseks;
|
—
|
kõikide katse-eeskirjast kõrvalekaldumiste üksikasjad ja selgitus, kuidas kõrvalekaldumine mõjutab uuringu korraldust ja tulemusi;
|
|
|
usaldusväärsuse kontroll:
—
|
kokkuvõte viimase usaldusväärsuskontrolli tulemustest, sealhulgas teave kasutatud aine, kontsentratsiooni ja kandeaine kohta;
|
—
|
katselabori paralleelselt saadud ja/või varasemad positiivse kontrolli ja paralleelse negatiivse (lahusti/kandeaine) kontrolli andmed;
|
—
|
kui paralleelset positiivse kontrolli katset ei tehtud, siis kõige viimase korrapärase positiivse kontrolli uuringu kuupäev ja laboriaruanne ning aruanne, milles esitatakse labori varasemad positiivse kontrolli andmed, mis põhjendavad paralleelse positiivse kontrolli katse tegematajätmist;
|
|
|
tulemused:
—
|
iga looma mass annustamise alguses ja pärast ettemääratud surmamist; samuti iga katserühma keskväärtus ja selle viga (näiteks standardhälve, standardviga);
|
—
|
iga looma puhul toksilisuse ilmnemise algus ja nähud, sealhulgas võimalik nahaärritus annustamiskohas;
|
—
|
iga katselooma surmamise aeg ja tema proovidest ATP mõõtmise aeg;
|
—
|
tabelina iga üksiku hiire RLU väärtused ja iga katserühma SI väärtused;
|
—
|
iga katserühma RLU/hiire keskväärtus ja selle viga (näiteks standardhälve, standardviga) ning iga katserühma võõrväärtuste analüüsi tulemused;
|
—
|
arvutatud SI ja sobiv hajuvuse näitaja, millega võetakse arvesse eri loomadega saadud tulemuste hajuvust uuritava aine rühmas ja kontrollrühmas;
|
—
|
annuse-immuunvastuse sõltuvus;
|
—
|
vajaduse korral statistilised analüüsid;
|
|
|
tulemuste arutelu:
—
|
lühike kommentaar tulemuste, annuse-immuunvastuse sõltuvuse analüüsi ja vajaduse korral statistilise analüüsi kohta ning järeldused selle kohta, kas uuritud ainet tuleks pidada naha sensibilisaatoriks.
|
|
|
KIRJANDUS
1)
|
OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
2)
|
Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002.
|
3)
|
Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985–997.
|
4)
|
Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327–333.
|
5)
|
Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49–59.
|
6)
|
ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf
|
7)
|
Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258–273.
|
8)
|
Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274–286.
|
9)
|
Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249–257.
|
10)
|
ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551 A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm
|
11)
|
ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf.
|
12)
|
Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1–10.
|
13)
|
Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11–26.
|
14)
|
OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
15)
|
Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
|
16)
|
Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96.
|
17)
|
Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81–88.
|
18)
|
Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127–132.
|
19)
|
Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27–34.
|
20)
|
Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346–370.
|
21)
|
ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
|
22)
|
ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf
|
23)
|
McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89.
|
24)
|
Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31.
|
25)
|
OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
26)
|
Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
|
27)
|
ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf.
|
28)
|
Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195–206.
|
29)
|
Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.
|
30)
|
Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.
|
31)
|
Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491–506.
|
32)
|
Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60–68.
|
33)
|
Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.
|
34)
|
Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.
|
35)
|
ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm
|
36)
|
OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
37)
|
Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53 563–79.
|
38)
|
OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
1. liide
MÕISTED
Täpsus: katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse (38).
Võrdlusaine: sensibiliseeriv või muu aine, mida kasutatakse standardina võrdlemiseks uuritava ainega. Võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega; iii) teadaolevad füüsikalis-keemilised omadused; iv) täiendavad andmed teadaolevate mõjude kohta ja v) teadaolev mõjusus soovitavas immuunvastuse tugevuse vahemikus.
Valenegatiiv: aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud negatiivseks või toimetuks, kui see tegelikult on positiivne või sensibiliseeriva toimega.
Valepositiiv: aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud positiivseks või sensibiliseerivat toimet omavaks, kui see tegelikult on negatiivne või sensibiliseeriva toimeta.
Oht: kahjustava tervise- või ökoloogilise mõju võimalikkus. Kahjustav mõju avaldub üksnes piisaval tasemel kokkupuute puhul.
Laboritevaheline reprodutseeritavus: suurus, mis näitab, millisel määral suudavad erinevad kvalifitseeritud laborid, kasutades sama katse-eeskirja ja uurides samu uuritavaid aineid, saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt sarnaseid tulemusi. Laboritevaheline reprodutseeritavus määratakse valideerimiseelsete ja valideerimisega seotud menetlustega ja see näitab, millisel määral võib uurimismeetodit edukalt üle viia ühest laborist teise (38).
Laborisisene reprodutseeritavus: suurus, mis näitab, millisel määral suudavad sama labori kvalifitseeritud töötajad konkreetset katse-eeskirja kasutades saada kordusuuringutes eri aegadel samasuguseid tulemusi (38).
Võõrväärtus: võõrväärtus on katsetulemus, mis oluliselt erineb populatsiooni juhuvalimi muudest väärtustest.
Kvaliteedi tagamine: juhtimisprotsess, mille puhul katsete tegemises osalevatest isikutest sõltumatud isikud hindavad labori katsestandarditest, nõuetest ja tegevuse registreerimise korrast kinnipidamist ning andmeedastuse õigsust.
Usaldusväärsus: mõiste, mis iseloomustab katsemeetodi tulemuste reprodutseeritavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus (38).
Naha sensibiliseerimine: immunoloogiline protsess, mis avaldub, kui tundlik olend viiakse paikselt kokkupuutesse keemilise allergeeniga, mis kutsub esile naha immuunvastuse, mis võib areneda kontaktsensibiliseerimiseks.
Stimulatsiooniindeks (SI): arvutatud väärtus, mis näitab uuritava aine võimet tekitada naha sensibiliseerimist ning mis on töödeldud rühmades ja paralleelselt uuritud kandeaine-kontrollrühmas jälgitud lümfotsüütide vohamise näitajate suhtarv.
Uuritav aine (uuritav kemikaal): iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
B.51. NAHA SENSIBILISEERIMINE: LOKAALSETE LÜMFISÕLMEDE KATSE: BRDU-ELISA
SISSEJUHATUS
1.
|
OECD kemikaalide katsetamise juhendeid ja ELi katsemeetodeid vaadatakse korrapäraselt läbi, et võtta arvesse teaduse arengut, muutuvaid regulatiivseid vajadusi ja loomade heaolu. Esialgne katsemeetod (B.42) naha sensibiliseerimise määramiseks hiirtel lokaalsete lümfisõlmede katsega (Local Lymph Node Assay – LLNA; OECD katsejuhend 429) on läbi vaadatud (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42). LLNA valideerimise üksikasjad ja sellega seotud töö ülevaade on avaldatud (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9). LLNA-meetodi järgi kasutatakse lümfotsüütide paljunemise määramiseks radioaktiivse isotoobiga märgistatud tümidiini või joodi ja seepärast ei saa katset kasutada, kui radioaktiivsete ühendite hankimine, kasutamine või kõrvaldamine tekitab probleeme. LLNA: BrdU-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA – ensüümimmuunsorptsioonanalüüs) on LLNA katse-eeskirja modifikatsioon, milles ei kasutata radioaktiivsust ja lümfotsüütide vohamise mõõtmiseks ELISA-põhise katsesüsteemiga kasutatakse radioaktiivselt märgistamata 5-bromo-2-desoksüuridiini (BrdU, Chemical Abstracts Service’i (CASi) nr 59-14-3). Katsemeetod LLNA: BrdU-ELISA on valideeritud ja läbi vaadatud ning rahvusvaheline sõltumatu teaduslik eksperdihinnangu komisjon soovitab seda, kuna leiab, et see sobib naha sensibiliseerumist põhjustavate ja mittepõhjustavate kemikaalide kindlakstegemiseks, arvestades teatavaid piiranguid (10, 11, 12). Käesolev katsemeetod on kavandatud selleks, et hinnata katseloomadel kemikaalide (ainete ja segude) võimet sensibiliseerida nahka. Käesoleva lisa peatükis B.6 ja OECD katsejuhendis 406 kasutatakse merisigu, nimelt merisigade maksimeerimise katset ja Buehleri katset (13). LLNAd (käesoleva lisa peatükk B.42, OECD katsejuhis 429) ja selle kahte radioaktiivsuse kasutamiseta versiooni, need on LLNA: BrdU-ELISA (käesoleva lisa peatükk B.51, OECD katsejuhis 442 B) ja LLNA: DA (käesoleva lisa peatükk B.50, OECD katsejuhis 442 A), tuleb eelistada meriseakatsetele peatükis B.6, OECD katsejuhis 406 (13), kuna nendega vähendatakse ja täiustatakse katseloomade kasutamist.
|
2.
|
Nii nagu LLNA puhul, uuritakse LLNA: BrdU-ELISA katsetes naha sensibiliseerimise induktsioonifaasi ja saadakse kvantitatiivseid andmeid immuunvastuse annusest sõltuvuse hindamiseks. Lisaks kõrvaldab võimalus määrata naha sensibiliseerijaid ilma DNA radioaktiivset märgist kasutamata tööalase kokkupuute radioaktiivsusega ja radioaktiivsete jäätmete probleemi. See omakorda võimaldab naha sensibiliseerijate määramiseks kasutada rohkem hiiri, millega võiks veelgi väheneda merisigade kasutamine (s.o peatükk B.6, OECD katsejuhis 406) selleks otstarbeks (13).
|
MÕISTED
3.
|
Kasutatud mõisted on esitatud 1. liites.
|
LÄHTEKAALUTLUSED JA PIIRANGUD
4.
|
LLNA: BrdU-ELISA on muudetud LLNA-meetod võimalike nahka sensibiliseerivate kemikaalide kindlakstegemiseks, millel on aga teatavad piirangud. See ei tähenda tingimata, et kõikidel juhtudel tuleks kasutada LLNA või merisigadega tehtavate katsete (B.6 ja OECD katsejuhend 406) (13) asemel LLNA: BrdU-ELISAt, vaid pigem, et uuring on sama hea ja seda võib kasutada alternatiivina, mille positiivsed või negatiivsed tulemused üldiselt ei vaja täiendavat kinnitamist (10, 11). Katselabor võtab arvesse kogu uuritava aine kohta kättesaadava teabe enne uuringu tegemist. Selline teave sisaldab uuritava aine nimetust ja keemilist struktuuri, füüsikalis-keemilisi omadusi, muude ainega in vitro või in vivo tehtud toksilisuskatsete tulemusi, struktuurilt samalaadsete ainete toksikoloogilisi andmeid. Osutatud teavet tuleb analüüsida, et määrata kindlaks, kas LLNA: BrdU-ELISA sobib kõnealuse aine puhul (arvestades LLNA: BrdU-ELISA sobimatust teatavate piiratud kemikaalitüüpide puhul, vt punkt 5) ning valida sobivad annused.
|
5.
|
LLNA: BrdU-ELISA on in vivo meetod ja seetõttu ei lõpeta see loomade kasutamist naha allergilise sensibiliseerimise hindamisel. Sellega on siiski võimalik vähendada katseloomade kasutamist selleks otstarbeks, võrreldes merisigadega tehtavate katsetega (B.6, OECD katsejuhis 406) (13). Lisaks võimaldab LLNA: BrdU-ELISA oluliselt parandada viisi, kuidas loomi kasutatakse naha allergilise sensibiliseerimise määramiseks, kuna erinevalt B.6st ja OECD katsejuhendist 406 ei eelda LLNA: BrdU-ELISA, et naha ärritamisega tekitataks ülitundlikkusreaktsioone. Samuti ei eelda LLNA: BrdU-ELISA adjuvandi kasutamist, nagu seda tehakse merisigadega tehtava maksimeerimiskatse puhul (käesoleva lisa peatükk B.6, 13). Seega vähendab LLNA: BrdU-ELISA loomade kannatusi. Hoolimata LLNA: BrdU-ELISA eelistest B.6 või OECD katsejuhendi 406 (13) kohaste katsetega võrreldes on teatud piirangud, mis võivad nõuda B.6 või OECD katsejuhendi 406 kohaste katsete (13) kasutamist (nt teatavate metallide katsetamine, valepositiivid teatavate nahaärritajate puhul (näiteks teatavat tüüpi pindaktiivsed kemikaalid) (6) (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42), uuritavate ainete lahustuvus). Lisaks võib teatavate kemikaaliklasside või ainete puhul, mis sisaldavad segavat toimet avaldada võivaid funktsionaalseid rühmi (15), olla vaja kasutada meriseakatseid (st B.6 või OECD katsejuhend 406 (13)). LLNA puhul kindlaks tehtud piiranguid (1 ja käesoleva lisa peatükk B.42) on peetud kehtivateks ka LLNA: BrdU-ELISA puhul (10). Selliste teadaolevate piirangute arvestamisega peaks LLNA: BrdU-ELISA olema kohaldatav igasuguste kemikaalide uurimiseks, millel ei ole omadusi, mis võiksid mõjutada LLNA: BrdU-ELISAga saadavate tulemuste õigsust. Lisaks sellele tuleks kaaluda piiripealse positiivse tulemuse võimalust, kui stimulatsiooniindeksi (SI) väärtus tuleb vahemikku 1,6–1,9 (vt punktid 31–32). See tugineb 43 ainest koosnevale valideerimise andmebaasile, milles kasutati SI väärtusi ≥ 1,6 (vt punkt 6), millest LLNA: BrdU-ELISA võimaldas õigesti kindlaks teha kõik 32 LLNA järgi sensibiliseerijat, kuid mis andis vale tulemuse kahe aine puhul 11st LLNA järgi mitte sensibiliseerivast ainest, mille SI oli 1,6–1,9 (st piiripealsed positiivsed tulemused) (10). Kuid kuna samu andmeid kasutati SI väärtuste kindlaksmääramiseks ja katsemeetodi ennustusvõime arvutamiseks, võivad esitatud tulemused viia tegeliku ennustusvõime ülehindamisele.
|
KATSEMEETODI PÕHIMÕTE
6.
|
LLNA: BrdU-ELISA põhimõte seisneb selles, et sensibilisaatorid kutsuvad esile lümfotsüütide vohamise lähimates lümfisõlmedes, mis dreenivad uuritava aine pealekandmise paika. Vohamine on võrdeline pealekantud allergeeni annuse ja allergiatekitamisvõimega ning see võimaldab lihtsa meetodiga sensibiliseerimist kvantitatiivselt mõõta. Vohamist mõõdetakse nii, et keskmist vohamist igas katserühmas võrreldakse keskmise vohamisega kandeaine-kontrollrühmas, mille liikmeid on töödeldud üksnes kandeainega (vehicle treated control – VC). Määratakse igas uuritava ainega töödeldud rühmas leitud keskmise vohamise ja paralleelselt kandeaine-kontrollrühmas leitud keskmise vohamise suhtarv, mida nimetatakse stimulatsiooniindeksiks (SI); SI peab olema vähemalt 1,6 selleks, et katseaine kui naha võimaliku sensibiliseerija edasine hindamine oleks vajalik. Siin kirjeldatud meetodid põhinevad BrdU-sisalduse mõõtmisel; selle meetodiga mõõdetakse vohavate rakkude arvu suurenemist kõrvalesta dreenivates lümfisõlmedes. BrdU on tümidiini analoog ja vohavad rakud kasutavad seda DNA sünteesil sarnaselt tümidiiniga. BrdU sisenemist DNAsse mõõdetakse ELISA abil, milles kasutatakse BrdU-spetsiifilist peroksidaasiga märgistatud antikeha. Substraadi lisamisel reageerib peroksidaas substraadiga ning tekib värviline reaktsioonisaadus, mille kogus mõõdetakse neeldumise järgi teataval lainepikkusel, kasutades mikrotiiterplaadi lugejat.
|
KATSE KIRJELDUS
Loomaliigi valimine
7.
|
Käesoleva katse jaoks valitud liik on hiir. LLNA: BrdU-ELISA valideerimisuuringud tehti ainult CBA/JN-liini hiirtega, mida seepärast peetakse eelistatavaks liiniks (10, 12). Kasutatakse noori täiskasvanud emashiiri, kes ei ole poeginud ega tiined. Katse alguses peaksid loomad olema 8–12 nädalat vanad ning loomade kehamassi varieerumine peaks olema minimaalne ja mitte ületama 20 % keskmisest massist. Võib kasutada ka muid liine ja isasloomi, kui on olemas piisavalt andmeid selle tõendamiseks, et LLNA: BrdU-ELISA immuunvastuses ei ole olulisi liini- ja/või soospetsiifilisi erinevusi.
|
Pidamis- ja söötmistingimused
8.
|
Hiiri tuleks pidada rühmapuurides (16), kui ei esitata nõuetekohast teaduslikku põhjendust üksikpuuris pidamise kasuks. Loomade katseruumi temperatuur peaks olema 22 ± 3 °C. Kuigi suhteline niiskus peaks olema vähemalt 30 % ja soovitatavalt mitte üle 70 %, välja arvatud ruumi puhastamise ajal, on eesmärk hoida see vahemikus 50–60 %. Valgustus peab olema kunstlik, 12 tundi valgust ja 12 tundi pimedust. Söötmisel võib kasutada tavapärast labori söödavalikut; joogivee kogust ei piirata.
|
Loomade ettevalmistamine
9.
|
Loomad valitakse juhuvaliku teel, tähistatakse individuaalse identifitseerimise võimaldamiseks (kuid mitte kõrvamärkidega) ning hoitakse oma puurides vähemalt viis päeva enne annustamise algust, et võimaldada neil kohaneda laboritingimustega. Enne katse alustamist uuritakse kõiki loomi, et neil ei oleks nähtavaid nahakahjustusi.
|
Annustamislahuste valmistamine
10.
|
Tahke uuritav aine tuleb lahustada või suspendeerida lahustis või kandeaines ja vajaduse korral lahjendada enne hiire kõrvalestale määrimist. Vedelaid kemikaale võib annustada puhtal kujul või lahjendada enne annustamist. Lahustumatuid keemilisi aineid, näiteks aineid, mida kasutatakse meditsiiniseadmetes, tuleb enne hiire kõrvalestale kandmist sobiva solvendiga tõhusalt ekstraheerida, et teha kindlaks kõik ekstraheeritavad koostisained, mille mõju tuleks uurida. Tuleks kasutada uuritava aine värskeid preparaate, kui ei ole stabiilsusandmetega tõendatud, et säilitamine on lubatav.
|
Usaldusväärsuse kontroll
11.
|
Positiivse kontrolli kemikaale kasutatakse selleks, et tõendada katsemeetodi vajalikku tulemuslikkust: sensibiliseerivate uuritavate ainetega, mille puhul immuunvastuse ulatus on hästi kirjeldatud, saadakse õige ja korratav tulemus. Soovitatakse teha paralleelselt positiivse kontrolli katse, kuna see tõendab labori võimet teha iga katse õigesti ning võimaldab hinnata laborisisest ja laboritevahelist korratavust ja võrreldavust. Mõned regulatiivasutused nõuavad positiivset kontrolli iga uuringu puhul ja seepärast soovitatakse käesoleva meetodi kasutajatel konsulteerida enne LLNA: BrdU-ELISA tegemist asjakohaste asutustega. Seepärast soovitatakse alati teha paralleelselt positiivse kontrolli katseid, et vältida vajadust teha täiendavaid loomkatseid, et täita nõudeid, mis võivad tekkida perioodilise positiivse kontrolli kasutamise puhul (vt punkt 12). Positiivne kontroll peaks andma positiivse LLNA: BrdU-ELISA immuunvastuse kokkupuutetasemel, mis eeldatavasti suurendab stimulatsiooniindeksit (SI) 1,6 korda või enam, võrreldes negatiivse kontrollrühmaga. Positiivse kontrolli annus tuleks valida nii, et see ei põhjustaks ulatuslikku nahaärritust või süsteemset mürgitust ja tekitatav mõju oleks korratav, kuid mitte liiga suur (näiteks stimulatsiooniindeksit üle 14 peetakse liiga suureks). Eelistatud positiivse kontrolli ained on 25 % heksüülkaneelaldehüüd (CASi number 101-86-0) ja 25 % eugenool (CASi number 97-53-0) atsetooni-oliiviõli segus (4: 1, v/v). Võib olla olukordi, kus piisavalt põhjendatult võib kasutada muid positiivse kontrolli aineid, mis vastavad eespool esitatud kriteeriumidele.
|
12.
|
Kuigi igas katses soovitatakse paralleelselt teha katsed ka positiivse kontrolli rühmaga, võib esineda olukordi, kus labori jaoks, milles korrapäraselt (st mitte enam kui kuue kuu järel) tehakse LLNA: BrdU-ELISAt ja on olemas varasemate positiivse kontrolli katsete andmebaas, mis tõendab labori võimet saada korratavaid ja õigeid positiivse kontrolli tulemusi, võib sobiv olla perioodiline positiivse kontrolli tegemine (näiteks kuni kuue kuu järel). Vajalikku oskuste taset LLNA: BrdU-ELISA alal võib tõendada vähemalt kümne sõltumatu ja omavahel kooskõlas oleva positiivse kontrolli katsega, mis on tehtud mõistliku ajavahemiku (vähem kui aasta) jooksul.
|
13.
|
Paralleelset positiivse kontrolli rühma tuleb alati kasutada siis, kui muutub LLNA: BrdU-ELISA läbiviimine (näiteks uued väljaõppe saanud töötajad, katsemeetodi materjalide ja/või reaktiivide muutus, katsemeetodi läbiviimise tehniliste vahendite muutus, uus katseloomade tarnija), ja sellised muutused tuleb laboriprotokollis dokumenteerida. Tuleb analüüsida selliste muutuste mõju varasemate katsetega loodud andmebaasi järjepidevusele ja otsustada, kas on vaja teha uus andmebaas, et dokumenteerida kooskõla varasemate positiivse kontrolli tulemustega.
|
14.
|
Meetodi kasutajad peaksid teadma, et otsus kasutada positiivset kontrolli perioodiliselt, mitte paralleelselt, mõjutab perioodilise positiivse kontrolli vahepealsel ajal ilma positiivse kontrollita saadud negatiivsete uuringutulemuste adekvaatsust ja vastuvõetavust. Kui perioodilise positiivse kontrolli katses saadakse näiteks valenegatiiv, võib ajavahemikus viimasest vastuvõetavast positiivse kontrolli katsest kuni vastuvõetamatu kontrollkatseni uuritavate ainetega saadud negatiivsed tulemused panna kahtluse alla. Selliste tulemuste tähendust tuleks hoolikalt analüüsida, kui otsustatakse, kas teha positiivse kontrolli katseid paralleelselt või üksnes perioodiliselt. Mõelda tuleb ka, kuidas kasutada vähem loomi paralleelses positiivse kontrolli rühmas, kui see on teaduslikult põhjendatud ja kui labor tõendab oma varasemate andmetega, et on võimalik kasutada vähem hiiri (17).
|
15.
|
Kuigi positiivset kontrollainet tuleks uurida kandeaines, mis teatavasti annab teatava kindla immuunvastuse (nt atsetoon-oliiviõli, suhtes 4: 1, v/v), võib esineda teatavaid regulatiivseid olukordi, milles on vaja teha katseid ka ebatavalise kandeainega (kliiniliselt või keemiliselt asjakohane segu) (18). Kui paralleelset positiivse kontrolli katset tehakse muu kandeainega kui uuritava aine puhul, on vaja moodustada eraldi veel positiivse kontrolli kandeaine-kontrollrühm.
|
16.
|
Kui uuritakse teatava keemiliste ühendite klassi aineid või mõõdetakse nende poolt esile kutsutava immuunvastuse vahemikku, võib olla kasulik mõõta teatavaid võrdlusaineid, millega tõendatakse, et katse võimaldab õigesti määrata kõnealuste ühenditüüpide võimet nahka sensibiliseerida. Sobival võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused:
—
|
struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega;
|
—
|
teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused;
|
—
|
varasemad toetavad LLNA: BrdU-ELISA andmed;
|
—
|
toetavad andmed muude katseloomade ja/või inimese kohta.
|
|
KATSE KÄIK
Loomade arv ja annusemäärad
17.
|
Ühes annuserühmas on vähemalt neli looma, kasutatakse vähemalt kolme uuritava aine kontsentratsiooni ja paralleelselt negatiivset kontrollrühma, keda töödeldakse üksnes kandeainega, mida kasutatakse uuritava aine puhul, ning positiivse kontrolli rühma (kas paralleelne või hiljutine positiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–15). Tuleb kaaluda positiivse kontrolli tegemist mitme annusega, eriti kui positiivset kontrolli tehakse aeg-ajalt. Kontrollrühma loomi koheldakse ja töödeldakse nii nagu katserühma loomi, välja arvatud töötlemine uuritava ainega.
|
18.
|
Annuse ja kandeaine valik peaks põhinema viidetes 2 ja 19 antud soovitustel. Tavaliselt valitakse järjestikused annused sobivast kontsentratsioonide reast, näiteks 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % jne. Kasutatava kontsentratsioonide rea valimisel peaks olema asjakohane teaduslik põhjendus. Tuleks arvesse võtta kõik olemasolevad toksikoloogiaandmed (nt ägeda toksilisuse ja nahaärrituse kohta) ning andmed uuritava aine struktuuri ja füüsikalis-keemiliste omaduste kohta ning valida kolm järjestikust kontsentratsiooni nii, et suurim kontsentratsioon tagab maksimaalse võimaliku kokkupuute, kuid selle puhul ei avaldu süsteemset toksilisust ega liiga suurt paikset nahaärritust (19, 20 ja käesoleva lisa peatükk B.4). Sellise teabe puudumisel võib olla vajalik teha esialgne sõelkatse (vt punktid 21–24).
|
19.
|
Kandeaine ei tohiks segada katse tegemist ega muuta katse tulemust ja tuleks valida nii, et viia lahustuvus maksimumini, et kasutada suurimat võimalikku kontsentratsiooni ja saada ühtlasi uuritava aine pealekandmiseks sobiv lahus või suspensioon. Soovitatavad kandeained on atsetoon-oliiviõli (4: 1, v/v), N,N-dimetüülformamiid, metüületüülketoon, propüleenglükool ja dimetüülsulfoksiid (6), kuid võib kasutada ka muid kandeaineid, kui esitada selleks piisav teaduslik põhjendus. Teatud olukorras võib osutuda vajalikuks kasutada täiendavaks kontrolliks kliiniliselt asjakohast lahustit või kaubanduslikku valmistist, milles uuritavat ainet turustatakse. Tuleks jälgida, et hüdrofiilsed uuritavad ained kantaks peale kandeainesüsteemi abil, mis märgab nahka ega voola nahalt kohe maha; selleks lisatakse sobivaid solubiliseerijaid (nt 1 % Pluronic® L92). Seepärast tuleks täielikku vesilahust vältida.
|
20.
|
Iga üksiku hiire lümfisõlmede töötlemine võimaldab hinnata loomadevahelist varieeruvust ja statistiliselt võrrelda uuritavate ainetega tehtud mõõtmiste ja kandeaine-kontrollrühma mõõtmiste erinevust (vt punkt 33). Lisaks saab positiivse kontrolli rühma hiirte arvu vähendamise võimalikkust hinnata siis, kui kogutakse iga üksiku hiire andmeid (17). Lisaks nõuavad mõned reguleerivad asutused iga üksiku looma andmete kogumist. Üksikuid loomi käsitlevate andmete korrapärane kogumine annab loomade heaoluga seotud eelise, kuna võimaldab vältida korduvate uuringute tegemist, mis oleks hädavajalik, kui uuritavate ainete tulemusi, mis algselt on kogutud ühel viisil (näiteks loomade andmete ühendamisega), peaks reguleeriv asutus hiljem vaatlema teiste nõuete alusel (näiteks üksikloomade andmete põhjal).
|
Esialgne sõelkatse
21.
|
Kui ei ole andmeid suurima uuritava annuse kindlaksmääramiseks (vt punkt 18), tuleks teha esialgne sõelkatse, et leida LLNA: BrdU-ELISA jaoks sobiv annuste vahemik. Esialgse sõelkatse eesmärk on saada andmeid, mille järgi määrata suurim LLNA: BrdU-ELISA põhikatses kasutatav annus, kui ei ole teada kontsentratsioon, millel avaldub süsteemne toksilisus (vt punkt 24) ja/või tekib ülemäärane nahaärritus (vt punkt 23). Suurim uuritav annus peab olema 100 % kontsentratsioon vedela katseaine puhul või suurim võimalik kontsentratsioon tahke aine või suspensiooni puhul.
|
22.
|
Esialgne sõelkatse tehakse samades tingimustes kui LLNA: BrdU-ELISA põhikatse, kuid ei hinnata lümfisõlmede vohamist ja annuserühma kohta võidakse kasutada vähem katseloomi. Annuserühmas on soovitatavalt üks või kaks hiirt. Kõiki hiiri vaadeldakse iga päev, et leida süsteemse toksilisuse kliinilisi ilminguid või paikset nahaärritust pealekandmiskohas. Registreeritakse kehakaal enne katset ja enne katse lõppu (6. päev). Iga hiire kumbagi kõrva uuritakse punetuse suhtes ja hinnatakse selle aste, kasutades tabelit 1 (20, ja käesoleva lisa peatükk B.4). Kõrvalesta paksust mõõdetakse paksusemõõtja (nt digitaalne mikromeeter või paksusemõõtja Peacock Dial) abil 1. päeval (enne annustamist), 3. päeval (ligikaudu 48 tundi pärast esimest annust) ja 6. päeval. Lisaks võib 6. päeval mõõta kõrva paksuse, milleks pärast looma humaanset surmamist lüüakse kõrvalestast mulgustajaga välja tükk ja kaalutakse. Ulatuslikku paikset nahaärritust näitab vähemalt hindele 3 vastav punetus ja/või kõrvalesta paksuse suurenemine vähemalt 25 % mõnel mõõtmispäeval (21, 22). LLNA: BrdU-ELISA põhikatse jaoks valitud suurim annus on järgmine väiksem annus esialgse sõelkatse kontsentratsioonide reas (vt punkt 18), millel ei avaldu süsteemne toksilisus ega teki ülemäärast nahaärritust.
Tabel 1
Punetuse hinne
Nähud
|
Hinne
|
Nahapunetust ei esine
|
0
|
Väga nõrk (vaevumärgatav) nahapunetus
|
1
|
Selgesti nähtav nahapunetus
|
2
|
Mõõdukas kuni tugev nahapunetus
|
3
|
Tugev nahapunetus (meenutab peeti) kuni kooriku tekkimine, mis takistab nahapunetuse astme edasist täpsustamist
|
4
|
|
23.
|
Lisaks kõrvalesta 25 % suurenemisele (21, 22) on ärritust tekitavate ainete kindlakstegemiseks LLNA abil kasutatud ka kõrvalesta paksuse statistiliselt olulist suurenemist töödeldud hiirtel, võrreldes kontrollrühma hiirtega (22, 23, 24, 25, 26, 27, 28). Ent kuigi statistiliselt oluline kõrvalesta paksuse suurenemine võib olla ka väiksem kui 25 %, ei ole selline paksuse suurenemine konkreetselt seotud ülemäärase nahaärritusega (25, 26, 27, 28, 29).
|
24.
|
Kui kliinilisi uuringuid kasutatakse LLNA: BrdU-ELISA põhikatses kasutatava suurima annuse hindamise osana, siis süsteemset toksilisust (30) võivad näidata järgmised kliinilised tunnused: närvisüsteemi talitluse muutused (nt karva püstitõusmine, liigutuste koordinatsiooni kadu, värin ja krambid), käitumise muutused (nt agressiivsus, muutus oma karvkatte hooldamises, liikumisaktiivsuse oluline muutus), hingamise muutused (s.o hingamissageduse ja -sügavuse muutused, nagu raskendatud hingamine, õhuahmimine, räginad) ning muutused toidu ja vee tarbimises. Lisaks tuleb hindamisel arvestada letargia ja/või mittereageerimise märke ning rohkem kui kerge või lühiajalise valu või ebamugavustunde kliinilisi tunnuseid, samuti rohkem kui 5 % kehakaalu vähenemist ajavahemikus 1. kuni 6. päevani ning suremust. Suremas olevad loomad ja loomad, kes näitavad suure valu või kannatuste tunnuseid, tuleks humaanselt surmata (31).
|
Põhiuuringu katse ajakava
25.
|
Katse ajakava on järgmine.
— 1. päev: määratakse iga üksiku looma mass ja registreeritakse koos kõigi võimalike kliiniliste tähelepanekutega. Kummagi kõrva välisküljele kantakse 25 μl sobivalt lahjendatud uuritavat ainet, üksnes kandeainet või positiivse kontrolli ainet (paralleelne või perioodiline positiivne kontroll, olenevalt labori valikust, arvestades punkte 11–15).
— 2. ja 3. päev: korratakse 1. päeval tehtud pealekandmist.
— 4. päev: loomi ei töödelda.
— 5. päev: hiire kõhukelmesse süstitakse 0,5 ml (5 mg hiire kohta) BrdU lahust (10 mg/ml).
— 6. päev: määratakse iga looma mass ja registreeritakse koos kõigi võimalike kliiniliste tähelepanekutega. Umbes 24 tundi pärast BrdU süsti surmatakse loomad humaanselt. Igal hiirel lõigatakse välja kumbagi kõrvalesta dreenivad lümfisõlmed ja töödeldakse eraldi iga hiire lümfisõlmi fosfaatpuhvriga soolalahuses. Lümfisõlmede leidmise ja väljalõikamise üksikasjad ja joonised on esitatud viites 17. Paiksete naha immuunvastuste edasiseks jälgimiseks põhikatses võib katseprotokolli kanda ka täiendavad näitajad, nagu kõrvalesta punetuse hinnang või kõrvalesta paksuse mõõtmise andmed (mis saadakse kas paksusemõõtjaga või pärast surmamist kõrvalestast mulgustajaga välja löödud tüki massi mõõtmisega).
|
Rakususpensioonide valmistamine
26.
|
Valmistatakse iga looma mõlemalt poolelt välja lõigatud ühendatud lümfisõlmede üksikrakususpensioon, milleks rakud eraldatakse üksteisest ettevaatliku mehaanilise töötlemisega, filtrides läbi 200 μm avaga roostevabast terasest võrgu, või kasutatakse üksikrakususpensiooni valmistamiseks muud sobivat võtet (näiteks purustatakse lümfisõlmed ühekordselt kasutatava plastikuhmrinuiaga ja lastakse seejärel läbi nailonvõrgu avasuurusega nr 70). Lümfisõlmerakkude suspensiooni valmistamine on selle katse puhul otsustava tähtsusega ja metoodika iga kasutaja peaks eelnevalt omandama selle oskuse. Negatiivse kontrolli loomade lümfisõlmed on väiksed, seepärast on tähtis tegutseda ettevaatlikult, et vältida igasugust kõrvalist mõju SI väärtustele. Igal juhul tuleb lümfisõlmerakkude suspensiooni lõppruumala viia kindlaksmääratud optimeeritud ruumalani (ligikaudu 15 ml). Optimeeritud ruumala määratakse nii, et negatiivse kontrolli rühmas saavutataks keskmine optiline neeldumine (tihedus) vahemikus 0,1–0,2.
|
Rakkude vohamise määramine (BrdU sisalduse mõõtmine lümfotsüütide DNAs)
27.
|
BrdU määratakse ELISA meetodiga, kasutades müügil olevat komplekti (näiteks Roche Applied Science, Mannheim, Saksamaa, katalooginumber 11 647 229 001). Lühidalt, 100 μl lümfisõlmerakkude suspensiooni kantakse kolme lamedapõhjalise mikrotiiterplaadi süvendisse. Lümfisõlmerakud fikseeritakse ja denatureeritakse ning lisatakse siis igasse süvendisse BdrU-vastaseid antikehi. Seejärel eemaldatakse BrdU-vastased antikehad pesemisega ja lisatakse substraadi lahus ning lastakse tekkida kromogeenil. Määratakse optiline neeldumine 370 nm juures võrdluslainepikkuse 492 nm suhtes. Kõigil juhtudel on katsetingimusi vaja optimeerida (vt punkt 26).
|
TÄHELEPANEKUD
Kliinilised tähelepanekud
28.
|
Vähemalt kord päevas tuleks igal loomal hoolikalt vaadelda kliiniliste tunnuste esinemist – kas annustamiskoha paikset ärritust või süsteemset toksilisust. Iga hiire kohta registreeritakse süstemaatiliselt kõik tähelepanekud. Jälgimiskavas tuleks ette näha kriteeriumid, mille alusel tehakse kiiresti kindlaks ja surmatakse valutult hiired, kellel avaldub süsteemne toksilisus, ülemäärane paikne nahaärritus või -söövitus (31).
|
Kehamass
29.
|
Vastavalt punktile 25 tuleks mõõta iga looma kehamass katse alguses ja pärast ettemääratud humaanset surmamist.
|
TULEMUSTE ARVUTAMINE
30.
|
Iga katserühma tulemused väljendatakse keskmise stimulatsiooniindeksi (SI) kaudu. SI leidmiseks jagatakse iga uuritava aine rühma ja positiivse kontrollrühma keskmine BrdU-märgistusindeks hiire kohta lahusti-/kandeaine-kontrollrühma keskmise BrdU-märgistusindeksiga hiire kohta. Keskmine SI kandeaine-kontrollrühmade puhul on seega 1.
BrdU-märgistusindeks on määratletud järgmiselt:
BrdU-märgistusindeks = (ABSem – ABS tühikatseem) – (ABSref – ABS tühikatseref),
kus: em = emissioonlainepikkus ja ref = võrdluslainepikkus.
|
31.
|
Otsustamisel peetakse tulemust positiivseks, kui SI on vähemalt 1,6 (10). Kuid piiripealse tulemuse (SI väärtus vahemikus 1,6–1,9) positiivseks leiuks kuulutamise otsuse tegemisel võib kasutada ka annuse-immuunvastuse sõltuvuse tugevust, statistilist olulisust ja lahusti/kandeaine ning positiivse kontrolli tulemuste kooskõlalisust (3, 6, 32).
|
32.
|
Kui SI on vahemikus 1,6–1,9, st tegemist on piiripealse positiivse tulemusega, võivad meetodi kasutajad võtta koos SI väärtusega arvesse sellist lisateavet nagu annuse-immuunvastuse sõltuvus, tõendid süsteemse toksilisuse või ülemäärase ärrituse kohta ja vajaduse korral statistilist olulisust, mis kinnitavad positiivset tulemust (10). Arvesse tuleks võtta ka uuritava aine mitmesuguseid omadusi, sealhulgas struktuurilist sarnasust teadaolevate naha sensibilisaatoritega, omadust põhjustada hiirel tugevat paikset nahaärritust ning annuse-immuunvastuse sõltuvuse laadi. Neid ja muid kaalutlusi on arutatud üksikasjalikult viites 4.
|
33.
|
Andmete kogumine üksiku hiire tasandil võimaldab statistiliselt analüüsida, kas andmetes on näha annuse-immuunvastuse vahelist sõltuvust ja kui tugev see on. Iga statistiline hindamine peaks hõlmama annuse-immuunvastuse sõltuvuse hindamist ja katserühmade läbimõeldud võrdlemist (näiteks paariviisiline annuserühmade ja paralleelsete lahuse-/kandeaine-kontrollrühmade võrdlemine). Statistiline analüüs võib hõlmata näiteks lineaarset regressiooni või Williami testi annuse-immuunvastuse sõltuvuste hindamiseks ja Dunnetti paariviisiliste võrdluste testi. Statistilise analüüsi sobiva meetodi valimisel peaks uurija kogu aeg arvesse võtma võimalikku dispersioonide ebavõrdsust ja muid seonduvaid probleeme, mille tõttu võib vaja minna andmete teisendamist või mitteparameetrilist statistilist analüüsi. Igal juhul võib uurijal olla vaja teha SI arvutusi ja statistilist analüüsi kõigi andmepunktidega ja siis mõne andmepunkti kõrvalejätmisega (nn võõrväärtused).
|
KATSEANDMED JA PROTOKOLLI KOOSTAMINE
Andmed
34.
|
Andmed tuleks kokku võtta tabeli vormis; tabelis esitatakse iga üksiklooma BrdU-märgistusindeksi väärtused, rühma keskmine suhte BrdU-märgistusindeks/katseloom väärtus, selle viga (näiteks standardhälve, standardviga) ja iga annuserühma keskmine SI, võrrelduna paralleelse lahusti-/kandeaine-kontrollrühma SI-ga.
|
Katsearuanne
35.
|
Katsearuandes esitatakse järgmine teave:
|
uuritavad kemikaalid ja kontrollkemikaalid:
—
|
tunnusandmed (näiteks CASi ja EÜ numbrid, kui on teada; allikas; puhtus; teadaolevad lisandid; partii number);
|
—
|
füüsikaline laad ja füüsikalis-keemilised omadused (nt lenduvus, stabiilsus, lahustuvus);
|
—
|
kui tegemist on seguga, selle koostis ja koostisosade suhtelised protsendimäärad;
|
|
|
lahusti/kandeaine:
—
|
tunnusandmed (puhtus; kontsentratsioon (vajaduse korral); kasutatud ruumala);
|
—
|
kandeaine valiku põhjendus.
|
|
|
katseloomad:
—
|
CBA-liini hiirte allikas;
|
—
|
loomade mikrobioloogiline staatus, kui see on teada;
|
—
|
loomade päritolu, pidamistingimused, söötmine jne;
|
|
|
katsetingimused:
—
|
ELISA määramise komplekti tootja, partiinumber ja tootja esitatud kvaliteeditagamise/kvaliteedikontrolli andmed komplekti kohta (antikeha tundlikkus ja spetsiifilisus ning määramispiir);
|
—
|
uuritava aine ettevalmistamise ja annustamise üksikasjad;
|
—
|
annuse valiku põhjendus (sealhulgas esialgse sõelkatse tulemused, kui see tehti);
|
—
|
kandeaine ja uuritava aine kontsentratsioonid ning uuritava aine manustatud üldkogus;
|
—
|
toidu ja vee kvaliteedi üksikasjad (sh sööda tüüp/allikas, vee allikas);
|
—
|
annustamis- ja proovivõtukava üksikasjalik kirjeldus;
|
—
|
toksilisuse mõõtmise meetodid;
|
—
|
kriteeriumid, mille järgi uuringutulemus loeti positiivseks või negatiivseks;
|
—
|
kõikide katse-eeskirjast kõrvalekaldumiste üksikasjad ja selgitus, kuidas kõrvalekaldumine mõjutab uuringu korraldust ja tulemusi;
|
|
|
usaldusväärsuse kontroll:
—
|
kokkuvõte viimase usaldusväärsuskontrolli tulemustest, sealhulgas teave kasutatud aine, kontsentratsiooni ja kandeaine kohta;
|
—
|
katselabori paralleelselt saadud ja/või varasemad positiivse kontrolli ja paralleelse negatiivse (lahusti/kandeaine) kontrolli andmed;
|
—
|
kui paralleelset positiivse kontrolli katset ei tehtud, siis kõige viimase korrapärase positiivse kontrolli uuringu kuupäev ja laboriaruanne ning aruanne, milles esitatakse labori varasemad positiivse kontrolli andmed, mis põhjendavad paralleelse positiivse kontrolli katse tegematajätmist;
|
|
|
tulemused:
—
|
iga looma mass annustamise alguses ja pärast ettemääratud humaanset surmamist; samuti iga katserühma keskväärtus ja selle viga (näiteks standardhälve, standardviga);
|
—
|
iga looma puhul toksilisuse ilmnemise algus ja nähud, sealhulgas võimalik nahaärritus annustamiskohas;
|
—
|
tabelina iga üksiku hiire BrdU-märgistusindeksi väärtused ja iga katserühma SI väärtused;
|
—
|
iga katserühma BrdU-märgistusindeksi/hiire keskväärtus ja selle viga (näiteks standardhälve, standardviga) ning iga katserühma võõrväärtuste analüüsi tulemused;
|
—
|
arvutatud SI ja sobiv hajuvuse näitaja, millega võetakse arvesse eri loomadega saadud tulemuste hajuvust uuritava aine rühmas ja kontrollrühmas;
|
—
|
annuse-immuunvastuse sõltuvus;
|
—
|
vajaduse korral statistilised analüüsid;
|
|
|
tulemuste arutelu:
—
|
lühike kommentaar tulemuste, annuse-immuunvastuse sõltuvuse analüüsi ja vajaduse korral statistilise analüüsi kohta ning järeldused selle kohta, kas uuritud ainet tuleks pidada naha sensibilisaatoriks.
|
|
|
KIRJANDUS
1)
|
OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
2)
|
Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.
|
3)
|
Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985–997.
|
4)
|
Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327–33.
|
5)
|
Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49–59.
|
6)
|
ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf
|
7)
|
Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258–273.
|
8)
|
Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274–286.
|
9)
|
Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249–257.
|
10)
|
ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552 A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/TMER.htm
|
11)
|
ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf
|
12)
|
Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129–134.
|
13)
|
OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
14)
|
Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
|
15)
|
Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96.
|
16)
|
ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
|
17)
|
ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt:
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf
|
18)
|
McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89.
|
19)
|
Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13–31.
|
20)
|
OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
21)
|
Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
|
22)
|
ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf.
|
23)
|
Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195–206.
|
24)
|
Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.
|
25)
|
Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.
|
26)
|
Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506.
|
27)
|
Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60–68.
|
28)
|
Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.
|
29)
|
Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.
|
30)
|
ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Vt: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm.
|
31)
|
OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
32)
|
Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563–79.
|
33)
|
OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. Vt: http://www.oecd.org/env/testguidelines
|
1. liide
MÕISTED
Täpsus: katsemeetodi tulemuste ja kinnitatud võrdlusväärtuste kooskõla määr. Täpsus näitab katsemeetodi tulemuslikkust ja on üks asjakohastest aspektidest. Seda terminit kasutatakse ka vastavuse tähenduses ja see näitab, kui sageli annab katsemeetod õige tulemuse (33).
Võrdlusaine: sensibiliseeriv või muu aine, mida kasutatakse standardina võrdlemiseks uuritava ainega. Võrdlusainel peaksid olema järgmised omadused: i) pidev ja usaldusväärne tarnija; ii) struktuuriline ja funktsionaalne sarnasus uuritava ainega; iii) teadaolevad füüsikalised ja keemilised omadused; iv) täiendavad andmed teadaolevate mõjude kohta ja v) teadaolev mõjusus soovitavas mõju tugevuse vahemikus.
Valenegatiiv: uuritav aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud negatiivseks või toimetuks, kui see tegelikult on positiivne või sensibiliseeriva toimega (33).
Valepositiiv: uuritav aine, mis on katsemeetodiga ekslikult tunnistatud positiivseks või sensibiliseerivat toimet omavaks, kui see tegelikult on negatiivne või sensibiliseeriva toimeta (33).
Oht: kahjustava tervise- või ökoloogilise mõju võimalikkus. Kahjustav mõju avaldub üksnes piisaval tasemel kokkupuute puhul.
Laboritevaheline reprodutseeritavus: suurus, mis näitab, millisel määral suudavad erinevad kvalifitseeritud laborid, kasutades sama katse-eeskirja ja uurides sama ainet, saada kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt sarnaseid tulemusi. Laboritevaheline reprodutseeritavus määratakse valideerimiseelsete ja valideerimisega seotud menetlustega ja see näitab, millisel määral võib uurimismeetodit edukalt üle viia ühest laborist teise (33).
Laborisisene reprodutseeritavus: suurus, mis näitab, millisel määral suudavad sama labori kvalifitseeritud töötajad konkreetset katse-eeskirja kasutades saada kordusuuringutes eri aegadel samasuguseid tulemusi (33).
Võõrväärtus: võõrväärtus on katsetulemus, mis oluliselt erineb populatsiooni juhuvalimi muudest väärtustest.
Kvaliteedi tagamine: juhtimisprotsess, mille puhul katsete tegemises osalevatest isikutest sõltumatud isikud hindavad labori katsestandarditest, nõuetest ja tegevuse registreerimise korrast kinnipidamist ning andmeedastuse õigsust.
Usaldusväärsus: mõiste, mis iseloomustab katsemeetodi tulemuste reprodutseeritavust, kui meetodit rakendatakse ühe ja sama katse-eeskirja alusel ühes laboris ja eri laborites pikema aja jooksul. Usaldusväärsuse hindamiseks arvutatakse laborisisene ja laboritevaheline reprodutseeritavus (33).
Naha sensibiliseerimine: immunoloogiline protsess, mis avaldub, kui tundlik olend viiakse paikselt kokkupuutesse keemilise allergeeniga, mis kutsub esile naha immuunvastuse, mis võib areneda kontaktsensibiliseerimiseks.
Stimulatsiooniindeks (SI): arvutatud väärtus, mis näitab uuritava aine võimet tekitada naha sensibiliseerimist ning mis on töödeldud rühmades ja paralleelselt uuritud kandeaine-kontrollrühmas jälgitud lümfotsüütide vohamise näitajate suhtarv.
Uuritav aine (uuritav kemikaal): iga aine või segu, mida uuritakse käesoleva katsemeetodi abil.
” |