02009R0152 — ET — 16.11.2020 — 007.001

---

Käesolev tekst on üksnes dokumenteerimisvahend ning sel ei ole mingit õiguslikku mõju. Liidu institutsioonid ei vastuta selle teksti sisu eest. Asjakohaste õigusaktide autentsed versioonid, sealhulgas nende preambulid, on avaldatud Euroopa Liidu Teatajas ning on kättesaadavad EUR-Lexi veebisaidil. Need ametlikud tekstid on vahetult kättesaadavad käesolevasse dokumenti lisatud linkide kaudu

►B	KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 152/2009, 27. jaanuar 2009, milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks (EMPs kohaldatav tekst) (ELT L 054 26.2.2009, lk 1)

Muudetud:

		Euroopa Liidu Teataja
		nr	lehekülg	kuupäev
M1	KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 278/2012, 28. märts 2012,	L 91	8	29.3.2012
►M2	KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 51/2013, 16. jaanuar 2013,	L 20	33	23.1.2013
►M3	KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 691/2013, 19. juuli 2013,	L 197	1	20.7.2013
M4	KOMISJONI MÄÄRUS (EL) nr 709/2014, 20. juuni 2014,	L 188	1	27.6.2014
M5	KOMISJONI MÄÄRUS (EL) 2017/645, 5. aprill 2017,	L 92	35	6.4.2017
►M6	KOMISJONI MÄÄRUS (EL) 2017/771, 3. mai 2017,	L 115	22	4.5.2017
►M7	KOMISJONI RAKENDUSMÄÄRUS (EL) 2020/1560, 26. oktoober 2020,	L 357	17	27.10.2020

---

▼B

KOMISJONI MÄÄRUS (EÜ) nr 152/2009,

27. jaanuar 2009,

milles sätestatakse proovivõtu- ja analüüsimeetodid sööda ametlikuks kontrolliks

(EMPs kohaldatav tekst)

▼M3

Artikkel 1

Proovide võtmine sööda ametlikuks kontrollimiseks, eriti sööda koostisosade määramiseks, sealhulgas geneetiliselt muundatud organisme (GMO) sisaldavate või neist toodetud koostisosade, Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruses (EÜ) nr 1831/2003 ( 1 ) määratletud söödalisandite ning Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivis 2002/32/EÜ ( 2 ) määratletud soovimatute ainete määramiseks tuleb teha I lisas sätestatud meetoditega.

I lisas sätestatud proovivõtumeetodit kasutatakse sööda kontrollimiseks, et määrata Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruses (EÜ) nr 396/2005 ( 3 ) määratletud pestitsiidijääke ning kontrollida sööda vastavust määrusele (EL) nr 619/2011.

▼B

Artikkel 2

Proovide analüüsiks ettevalmistamine ja tulemuste esitamine toimub kooskõlas II lisas sätestatud meetoditega.

Artikkel 3

Analüüse sööda ametlikuks kontrolliks tehakse vastavalt III lisas (Analüüsimeetodid söödatooraine ja segajõusööda koostise kontrollimiseks), IV lisas (Analüüsimeetodid lubatud söödalisandite taseme kontrollimiseks söödas), V lisas (Analüüsimeetodid soovimatute ainete sisalduse kontrollimiseks söödas) ja VI lisas (Analüüsimeetodid loomse päritoluga komponentide määramiseks sööda ametlikul kontrollimisel) sätestatud meetoditele.

Artikkel 4

Kodulindude segasööda energiasisaldus arvutatakse vastavalt VII lisale.

Artikkel 5

Analüüsimeetodeid selliste VIII lisas sätestatud lisandite ebaseadusliku sisalduse kontrollimiseks, mida ei ole enam lubatud söödas kasutada, kasutatakse kinnituse saamiseks.

Artikkel 6

Direktiivid 71/250/EMÜ, 71/393/EMÜ, 72/199/EMÜ, 73/46/EMÜ, 76/371/EMÜ, 76/372/EMÜ, 78/633/EMÜ, 81/715/EMÜ, 84/425/EMÜ, 86/174/EMÜ, 93/70/EMÜ, 93/117/EÜ, 98/64/EÜ, 1999/27/EÜ, 1999/76/EÜ, 2000/45/EÜ, 2002/70/EÜ ja 2003/126/EÜ tunnistatakse kehtetuks.

Viiteid kehtetuks tunnistatud direktiividele käsitatakse viidetena käesolevale määrusele ja loetakse vastavalt XI lisa vastavustabelitele.

Artikkel 7

Käesolev määrus jõustub kahekümnendal päeval pärast selle avaldamist Euroopa Liidu Teatajas.

Käesolevat määrust kohaldatakse alates 26. augustist 2009.

Käesolev määrus on tervikuna siduv ja vahetult kohaldatav kõikides liikmesriikides.

▼M3

---

I LISA

PROOVIVÕTUMEETODID

1.   EESMÄRK JA REGULEERIMISALA

Sööda ametlikuks kontrolliks ettenähtud proovid võetakse allpool kirjeldatud meetodite kohaselt. Selliselt saadud proove käsitatakse proovipartii esindusliku proovina.

Esindusliku proovi võtmise eesmärk saada partiist väike osa nii, et iga selle osa konkreetne näitaja kujutaks endast partii näitajate keskmist väärtust. Partii eri kohtadest võetakse korduvalt üksikproove. Üksikproovide kokkusegamisega saadakse koondproov, millest võetakse esindusliku jagamise teel esinduslikud lõpp-proovid.

Kui vaatlusel ilmneb, et osa samast söödapartiist on erineva kvaliteediga, eraldatakse sellised osad ja neid käsitletakse kui alampartiisid. Kui söödapartiid ei ole võimalik jagada alampartiideks, tuleb seda käsitada ühe partiina, kuid selle kohta tuleb teha märkus proovivõtuaruandesse.

Kui tehakse kindlaks, et käesoleva määruse sätete kohaselt võetud söödaproov ei vasta ELi nõuetele ja kui tegemist on sama tooteklassi või -liigi söödapartii osaga, siis tuleb eeldada, et kogu selle partii sööt ei vasta nõuetele, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

2.   MÕISTED

—

Partii : identifitseeritav söödakogus, millel on ühised tunnused näiteks päritolu, sort, pakendi tüüp, pakendaja, kaubasaatja või märgistus; tootmisprotsessi kontekstis on partii toodanguühik, mida toodetakse samas ettevõttes ühesuguseid tootmisparameetreid järgides, või mitu sellist ühikut, kui need on toodetud järjest ja koos ladustatud.

—	Proovipartii : partii või identifitseeritav osa partiist või alampartiist.

—	Pitseeritud proov : proov, mis on pitseeritud niimoodi, et on välistatud juurdepääs proovile ilma pitserit purustamata või eemaldamata.

—	Üksikproov : proovipartii ühest punktist võetud kogus.

—	Koondproov : ühe ja sama proovipartii üksikproovidest kogutud proov.

—	Vähendatud proov : koondproovi osa, mis on saadud koondproovi esindusliku vähendamise teel.

—	Lõpp-proov : vähendatud proovi või homogeenitud koondproovi osa.

—	Laboratoorne proov : laboratooriumis kasutamiseks ettenähtud proov (mis on toimetatud laboratooriumi), mis võib olla lõpp-proov, vähendatud proov või koondproov.

3.   ÜLDSÄTTED

4.   SEADMED

4.1.	Proovivõtuseadmed peavad olema materjalist, mis ei saasta tooteid, millest proove võetakse. Korduvaks kasutamiseks ettenähtud seadmed peavad olema kergesti puhastatavad, et hoida ära ristsaastumist.

4.2.

Soovitatavad seadmed proovide võtmiseks tahkest söödast 4.2.1.    Käsitsi proovivõtmine 4.2.1.1.   Lamedapõhjaline püstiste servadega kühvel. 4.2.1.2. Proovivõtupuur pika ava või lahtritega. Proovivõtupuuri mõõtmed peavad vastama proovipartii näitajatele (mahuti sügavus, koti mõõtmed jms) ja söödaosakeste suurusele. Kui proovivõtupuur on mitme avaga, et proovi saaks võtta mitmest kohast puurimise teekonnal, peavad avad olema lahtrite kaupa või astmeliste vaheseintega eraldatud. 4.2.2.    Mehaaniline proovivõtmine Laaditavast söödast proovide võtmiseks võib kasutada asjakohaseid mehaanilisi proovivõtuseadmeid. Asjakohane tähendab seda, et proove võetakse kogu söödavoo läbilõikest. Suure kiirusega liikuvast söödast võib proove võtta automaatse seadmega. 4.2.3.    Jagaja Esinduslikult vähendatud proovide valmistamiseks tuleks võimaluse ja vajaduse korral kasutada seadet, millega jagatakse proov ligikaudu võrdseteks osadeks.

5.   ÜKSIKPROOVIDE ARVU NÕUDED

5.1.    Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimiseks võetavate üksikproovide arvu nõuded

5.1.1.    Lahtine tahke sööt

5.1.2.    Lahtine vedel sööt

5.1.3.    Pakendatud sööt

Sööt (tahke ja vedel) võib olla pakendatud kottidesse, kanistritesse, mahutitesse jne, millele tabelis viidatakse kui pakkeühikutele. Suurtest pakkeühikutest (≥ 500 kg või liitrit) tuleb võtta proove lahtise sööda kohta kehtivate sätete kohaselt (vt punktid 5.1.1. ja 5.1.2.)

5.1.4.    Söödabriketid ja lakukivid

Proov võetakse vähemalt ühest briketist või kivist 25 pakkeühikust koosneva proovipartii kohta, kuid mitte rohkem kui neljast briketist või kivist.

Kui iga briketi või lakukivi kaal on kuni 1 kg, loetakse üksikprooviks ühe kivi või briketi sisu.

5.1.5.    Koresööt

5.2.    Üksikproovide arvu nõuded juhul, kui kontrollitavad koostisosad või ained on söödas tõenäoliselt ebaühtlaselt jaotunud

Kõnealused üksikproovide proovide arvu nõuded kehtivad järgmistel kontrollijuhtudel:

Kui kontrollival asutusel on tugev kahtlus, et selline ebaühtlane jaotumine esineb segasööda koostisosa või aine ristsaastumise korral, võib võtta proove järgmises tabelis esitatud arvul.

5.3.    Proovide arvu nõuded väga suurte partiide üksikproovide korral

Väga suurte proovipartiide korral (proovipartii > 500 tonni) on võetavate üksikproovide arv 40 üksikproovi + √ tonnide arv, kui ained või tooted on ühtlaselt jaotunud kogu söödas, või 100 üksikproovi + √ tonnide arv, kui koostisosad või ained on ebaühtlaselt jaotunud kogu söödamaterjalis.

6.   KOONDPROOVI KOGUSELISED NÕUDED

7.   LÕPP-PROOVI KOGUSELISED NÕUDED

Lõpp-proovid

Analüüsida tuleb vähemalt üht lõpp-proovi. Analüüsitavas lõpp-proovis sisalduv kogus ei tohi olla väiksem järgmistest näitajatest:

8.   PROOVIVÕTUMEETOD VÄGA SUURTE PARTIIDE JAOKS JA SELLISTE PARTIIDE JAOKS, MIDA LADUSTATAKSE VÕI TRANSPODITAKSE NII, ET KOGU PARTII ULATUSES EI OLE VÕIMALIK PROOVE VÕTTA

8.1.    Üldpõhimõtted

Kui partii ladustamine või transportimine ei võimalda võtta üksikproove kogu partiist, tuleks eelistatult võtta sellisest partiist proove laadimise ajal.

Suurtesse sööda hoidmiseks ettenähtud ladudesse tuleks soovitada söödakäitlejatel paigaldada (automaatsed) proovivõtuseadmed, millega on võimalik võtta proove kogu ladustatud partiist.

Kui proove võetakse 8. peatükis sätestatud viisil, tuleb söödakäitlejat või tema esindajat teavitada proovivõtumenetlusest. Kui söödakäitleja või tema esindaja seab kahtluse alla kõnealuse proovivõtumeetodi, peab söödakäitleja või tema esindaja lubama pädeval asutusel võtta proove kogu partiist ja katma kulud.

8.2.    Laevaga transporditavad suured partiid

8.2.1.    Laevaga transporditavast partiist liikuvast tootest proovide võtmine

Suurtest partiidest, mida transporditakse laevaga, võetakse eelistatult proove laadimise ajal (kui toode on liikuv).

Proove võetakse igast lastiruumiosast (osast, mida on võimalik füüsiliselt eraldada) Kuna lastiruumi osi tühjendatakse eraldi, kaob lattu laadimise käigus osade füüsiline eraldatus. Proove võib võtta kas algse füüsilise eraldatuse olukorras või pärast lattu viimist.

Laeva lossimine võib kesta mitu päeva. Proove tuleks tavaliselt võtta korrapäraste ajavahemike järel kogu lossimise ajal. Alati ei ole aga mõistlik ega asjakohane, et ametlik inspektor on proovivõtuks kohal kogu lossimise ajal. Seepärast on lubatud proove võtta kogu partii ühest osast (proovipartiist). Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele.

Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu selle partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

Ka siis, kui ametlikud proovid võetakse automaatselt, on inspektori kohalolek vajalik. Kui proovid võetakse automaatselt ja vastavalt eelnevalt kindlaks määratud näitajatele, mida ei saa muuta proovide võtmise ajal, ning kui üksikproovid kogutakse pitseeritavasse anumasse, nii et sedasi hoitakse ära igasugused pettused, peab inspektor olema kohal ainult proovivõtu alguses, iga kord, kui proovianumat vahetatakse, ja proovivõtu lõpus.

8.2.2.    Laevaga transporditavast partiist liikumatust tootest proovide võtmine

Kui proove võetakse liikumatust tootest, tuleb kasutada sama menetlust, mis on ette nähtud ülalt ligipääsetavatest ladudest (sööda tornhoidlatest) proovide võtmiseks (vt punkti 8.4.1).

Proove tuleb võtta partii (lastiruumi) ligipääsetavast osast (ülalt). Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.3.    Proovide võtmine laos hoitavast suurest partiist

Proove tuleb võtta partii ligipääsetavast osast. Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.4.    Proovide võtmine hoidlatest (sööda tornhoidlatest)

8.4.1.    Proovide võtmine ülalt (kergesti) ligipääsetavatest mahutitest

Proove tuleb võtta partii ligipääsetavast osast. Üksikproovide arv määratakse vastavalt proovipartii suurusele. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.4.2.    Proovide võtmine hoidlatest, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid)

8.4.2.1.    Hoidlad, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid), mahuga > 100 tonni

Sellistest mahutitest ei ole võimalik paigalseisvast söödast proove võtta. Kui on vaja proove võtta mahutis olevast söödast, mida ei saa liigutada, tuleb käitlejaga kokku leppida, et ta teatab, kui mahutist hakatakse sööta välja laadima, et siis söödast proove võtta.

8.4.2.2.    Hoidlad, millele puudub juurdepääs ülalt (suletud mahutid), mahuga < 100 tonni

Proovivõtuks tuleb anumasse võtta 50–100 kg toodet ja proove tuleb võtta sellest kogusest. Koondproovi suurus sõltub kogu partii suurusest ning üksikproovide arv sõltub proovivõtuks anumasse võetud toote kogusest. Kui proovid võetakse söödast, mis on sama klassi või sama kirjeldusega söödapartii osa ja kui on kindlaks tehtud, et kõnealune alampartii ei vasta ELi nõuetele, tuleb eeldada, et kogu partii sööt on ühesugune, välja arvatud juhul, kui üksikasjaliku hindamise käigus selgub, et puuduvad tõendid selle kohta, et ülejäänud osa partiist ei vasta ELi nõuetele.

8.5.    Proovide võtmine suurtes suletud mahutites olevast lahtisest söödast

Sellistest partiidest saab sageli proove võtta alles siis, kui toode on välja laaditud. Mõnikord ei ole võimalik toodet välja laadida impordi- või kontrollipunktis ja proove tuleb võtta väljalaadimiskohas.

9.   PROOVIDE VÕTMISE, ETTEVALMISTAMISE JA PAKENDAMISE JUHISED

9.1.    Üldkirjeldus

Proovid tuleb võtta ja ette valmistada liigse viivituseta ning võtta toote muutumise ja saastumise vältimiseks vajalikud ettevaatusabinõud. Töövahendid ja -pinnad ning proovide hoidmiseks ettenähtud anumad peavad olema puhtad ja kuivad.

9.2.    Üksikproovid

Üksikproove võetakse pisteliselt kogu proovipartii ulatuses ja need peavad olema ligikaudu võrdse suurusega.

Üksikproov peab olema vähemalt 100 g või kerge koresööda puhul 25 g.

Kui punktis 8 sätestatud proovivõtueeskirjade kohaselt tuleb võtta vähem kui 40 üksikproovi, määratakse üksikproovi suurus vastavalt nõutava koondproovi suurusele (vt punkti 6).

Kui proove võetakse väikestest pakendatud sööda partiidest, mille puhul on vaja võtta väike arv üksikproove, peab üksikproov olema ühe originaalpakkeühiku sisu, kui pakkeühik ei ole suurem kui 1 kg või 1 l.

Kui söödapakendid on väikesed (nt < 250 g), sõltub üksikproovi suurus pakendi suurusest.

9.2.1.    Lahtine sööt

Vajaduse korral võib proove võtta partii liikumise (peale- või mahalaadimise) ajal.

9.2.2.    Pakendatud sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv pakendeid välja valitud, võetakse puuri või kühvli abil osa iga pakendi sisust. Vajaduse korral võetakse proovid pärast seda, kui pakendid on ükshaaval tühjendatud.

9.2.3.    Homogeenne või homogeenitav vedel või poolvedel sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on punkti 5. peatüki kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, homogeenitakse vajaduse korral nende sisu ja võetakse vajalik kogus igast mahutist.

Üksikproove võib võtta mahutite tühjendamise ajal.

9.2.4.    Mittehomogeenitav vedel või poolvedel sööt

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv mahuteid välja valitud, võetakse proovid eri tasemetelt.

Proove võib võtta ka mahutite tühjendamise ajal, kuid mitte esimestest kihtidest.

Mõlemal juhul peab võetav kogus olema vähemalt 10 liitrit.

9.2.5.    Söödabriketid ja lakukivid

Pärast seda, kui proovivõtmiseks on 5. peatüki kohaselt vajalik arv brikette või kive välja valitud, võetakse osa igast briketist või kivist. Kui on kahtlusi, et kivi või brikett ei ole ühtlase koostisega, võetakse prooviks kogu brikett või kivi.

Kui iga briketi või lakukivi kaal on kuni 1 kg, loetakse üksikprooviks ühe kivi või briketi sisu.

9.3.    Koondproovide ettevalmistamine

Ühtne koondproov saadakse üksikproovide kokkusegamise abil.

9.4.    Lõpp-proovide ettevalmistamine

Koondproovi materjal segatakse hoolega ( 4 ).

9.5.    Proovi pakendamine

Mahutid ja pakendid peavad olema pitseeritud niimoodi, et ilma pitserit lõhkumata ei oleks võimalik neid avada. Pitser peab hõlmama kogu märgist.

9.6.    Proovide saatmine laboratooriumi

Proov koos analüüsiks vajaliku teabega tuleb viivitamata saata kindlaksmääratud laboratooriumi analüüsimiseks.

10.   PROOVIVÕTUARUANNE

Iga proovivõtu kohta tuleb teha aruanne, mis võimaldab iga proovipartiid ja selle suurust üheselt kindlaks teha.

Aruandesse tuleb kanda ka kõik kõrvalekalded käesolevas määruses sätestatud proovivõtumenetlusest.

Aruanne tuleb teha kättesaadavaks nii ametlikule kontrollilaboratooriumile kui ka söödakäitlejale ja/või söödakäitleja määratud laboratooriumile.

---

II LISA

SÖÖDA ANALÜÜSIMEETODITE ÜLDSÄTTED

A.   PROOVIDE ETTEVALMISTAMINE ANALÜÜSIKS

1.    Eesmärk

Allpool kirjeldatud menetlused on ette nähtud kontrollilaboratooriumidesse saadetud proovide ettevalmistamiseks analüüsiks pärast proovi võtmist I lisa sätete kohaselt.

Laboratoorsed proovid tuleb ette valmistada nii, et analüüsimeetodites sätestatud viisil kaalutud kogused oleksid ühtlased ja esindaksid lõpp-proove.

2.    Ettevaatusabinõud

Proovide ettevalmistamine sõltub kasutatavatest analüüsimeetoditest ning koostisosadest ja ainetest, mida on vaja uurida. Seepärast on väga oluline tagada, et proov valmistataks ette vastavalt kasutatavale analüüsimeetodile ning koostisosadele ja ainetele, mida on vaja uurida.

Kõik vajalikud toimingud tuleb teha nii, et vältida proovi saastumist ja selle koostise muutumist.

Jahvatada, segada ja sõeluda tuleb viivitamata, et proovi kokkupuude õhu ja valgusega oleks minimaalne. Kasutada ei tohi veskeid ega jahvatajaid, mis proovi märgatavalt kuumendavad.

Kuumuse suhtes eriti tundlikku sööta soovitatakse jahvatada käsitsi. Samuti tuleb tagada, et seadmed ise ei oleks saastumisallikaks.

Kui proovi ei ole võimalik ette valmistada nii, et selle niiskusesisalduses oluliselt ei muutu, määratakse niiskusesisaldus enne ja pärast ettevalmistamist III lisa A osas sätestatud meetodil.

3.    Menetlus

3.1.    Üldmenetlus

Uuritav kogus võetakse lõpp-proovist. Jagamiseks ei soovitata koonusekujulist proovijagajat ega nn jagamisristi, s o neljaks jagamise (kvarteerimise) meetodit, sest sellega võib kaasneda alamproovide jaotuses suur viga.

3.1.1.    Sööt, mida saab kohe jahvatada

3.1.2.    Sööt, mida saab jahvatada pärast kuivatamist

3.1.3.    Vedel või poolvedel sööt

3.1.4.    Muu sööt

3.2.    Erimenetlus uurimiseks vaatluse teel või mikroskoobiga või juhul, kui kogu koondproov on homogeenitud

4.    Proovide hoidmine

Proove tuleb hoida temperatuuril, mis ei muuda nende koostist. Vitamiinide või eriti valgustundlike ainete analüüsiks ettenähtud proove tuleb hoida nii, et valgus proove ei kahjustaks.

B.   SÄTTED ANALÜÜSIMEETODITES KASUTATAVATE REAKTIIVIDE JA SEADMETE KOHTA

C.   ANALÜÜSIMEETODITE KASUTAMINE JA TULEMUSTE ESITAMINE

1.    Ekstraktsioonimenetlus

Mitmete meetodite puhul on määratud eraldi ekstraktsioonimenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi ekstraktsioonimenetlusi kasutada juhul, kui on tõendatud, et kasutatav ekstraktsioonimenetlus on põhiaine analüüsiks sama tõhus kui meetodis nimetatud menetlus.

2.    Puhastusmenetlus

Mitme meetodi puhul on määratud eraldi puhastusmenetlus. Üldjuhul võib peale meetodis viidatud menetluse teisi puhastusmenetlusi kasutada juhul, kui on tõendatud, et kasutatav puhastusmenetlus annab uuritava aine analüüsimisel meetodis nimetatud menetlusega samaväärsed analüüsitulemused.

3.    Määramiste arv

Kui soovimatute ainete analüüsimisel on esimese määramise tulemus oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitavas tootekirjelduses, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi. Muudel juhtudel on vajalik kordusanalüüs (teistkordne määramine), et välistada sisemise ristsaastumise ja juhusliku proovide segunemise võimalust. Mõõtemääramatust arvesse võttes kasutatakse nõuetele vastavuse hindamisel kahe analüüsi keskmist.

Kui aine või koostisosa deklareeritud sisalduse kontrollimisel kinnitab esimese määramise tulemus deklareeritud sisaldust, st analüüsitulemus jääb deklareeritud sisalduse lubatud kõrvalekalde piiresse, ei ole vaja teha enam täiendavaid määramisi, juhul kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi. Muudel juhtudel on vajalik kordusanalüüs (teistkordne määramine), et välistada sisemise ristsaastumise ja juhusliku proovide segunemise võimalust. Mõõtemääramatust arvesse võttes kasutatakse nõuetele vastavuse hindamisel kahe analüüsi keskmist.

Teatavatel juhtudel on lubatud kõrvalekalde vahemik kindlaks määratud õigusaktis, näiteks Euroopa Parlamendi ja nõukogu 13. juuli 2009. aasta määruses (EÜ) nr 767/2009 sööda turuleviimise ja kasutamise kohta, millega muudetakse Euroopa Parlamendi ja nõukogu määrust (EÜ) nr 1831/2003 ning tunnistatakse kehtetuks nõukogu direktiivid 79/373/EMÜ, 82/471/EMÜ, 83/228/EMÜ, 93/74/EMÜ, 93/113/EÜ ja 96/25/EÜ, komisjoni direktiiv 80/511/EMÜ ning komisjoni otsus 2004/217/EÜ ( 7 ).

4.    Kasutatavast analüüsimeetodist teatamine

Analüüsiaruandes peab olema nimetatud, millist analüüsimeetodit kasutatakse.

5.    Aruandlus analüüsitulemuste kohta

Analüüsitulemused esitatakse analüüsimeetodis kehtestatud viisil sobiva arvu tüvenumbritega ja vajaduse korral parandatakse seda vastavalt lõpp-proovi niiskusesisaldusele enne ettevalmistamist.

6.    Mõõtemääramatus ja saagis soovimatute ainete analüüsil

Silmas pidades Euroopa Parlamendi ja nõukogu direktiivi 2002/32/EÜ tähenduses soovimatuid aineid, loetakse söödaks ettenähtud tooted kehtestatud piirnormile mittevastavaks, kui niiskusesisaldusele 12 % vastav analüüsitulemus ületab piirmäära, võttes arvesse laiendmääramatust ja saagise parandit. Vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud ja saagise parandiga parandatud sisaldust, millest on lahutatud laiendmääramatus. Seda menetlust võib kasutada vaid juhul, kui analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagise parandit (nt ei ole see võimalik mikroskoopilise analüüsi puhul).

Analüüsitulemus esitatakse järgmiselt (kuivõrd kasutatud analüüsimeetod võimaldab hinnata mõõtemääramatust ja saagist):

Kui analüüsi tulemus on oluliselt (> 50 %) väiksem kui kontrollitava näitaja väärtus ja kui kasutatakse asjakohaseid kvaliteedimenetlusi ning analüüsi eesmärk on vaid kontrollida vastavust õigusnormidele, ei ole analüüsitulemuses vaja esitada saagise parandit ning saagise ja mõõtemääramatuse võib sel juhul ära jätta.

▼B

---

III LISA

SÖÖDATOORAINE JA SEGAJÕUSÖÖDA KOOSTISE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A.   NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata sööda niiskusesisaldust. Lenduvaid aineid, näiteks orgaanilisi happeid sisaldava sööda puhul tuleb jälgida, et koos niiskusesisaldusega määrataks ka oluline osa lenduvatest ainetest.

See ei hõlma piimatoodete kui söödatooraine analüüsi, mineraalainete ja peamiselt mineraalainetest koosnevate segude analüüsi, loomsete ja taimsete rasvade ja õlide analüüsi ega õliseemnete ja õliviljade analüüsi.

2.   Põhimõte

Proov kuivatatakse kindlaksmääratud tingimustel, mis varieeruvad sõltuvalt sööda laadist. Massikadu määratakse kaalumise teel. Suure niiskusesisaldusega tahket sööta tuleb eelnevalt kuivatada.

3.   Seadmed

4.   Töö käik

NB

!

Käesolevas punktis kirjeldatud toimingud tuleb teha kohe pärast proovi sisaldavate pakendite avamist. Tuleb teha vähemalt kaks analüüsi.

4.1.   Ettevalmistus

4.1.1.    Muu sööt kui punktides 4.1.2 ja 4.1.3 nimetatud sööt

Võetakse vähemalt 50 g proovi. Vajaduse korral proov purustatakse või tehakse tükkideks, et vältida niiskusesisalduse kõikumist (vt punkt 6).

4.1.2.    Teravili ja tangud

Võetakse vähemalt 50 g proovi. Proov jahvatatakse osakesteks, millest vähemalt 50 % pudeneb läbi sõela, mille avade suurus on 0,5 mm, ja sõelale, mille ümmarguste avade suurus on 1 mm, ei jää rohkem kui 10 %.

4.1.3.    Vedel või pastataoline sööt, peamiselt õlidest ja rasvadest koosnev sööt

Võetakse umbes 25 g proovi, kaalutakse see 10 mg täpsusega, lisatakse vajalik kogus 10 mg täpsusega kaalutud veevaba liiva ja segatakse kuni ühtlase toote saamiseni.

4.2.   Kuivatamine

4.2.1.    Muu sööt kui punktides 4.2.2 ja 4.2.3 nimetatud sööt

Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 1 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 103 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada neli tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 103 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega.

Peamiselt õlidest ja rasvadest koosneva sööda puhul kuivatatakse proovi kuivatuskapis temperatuuril 130 oC täiendavalt 30 minutit. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust.

4.2.2.    Teravili, jahu, tangud ja manna

Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g peenestatud proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 130 oC kuumutatud kuivatuskappi. Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist. Lastakse kuivada kaks tundi, mida arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 130 oC. Kaas asetatakse tagasi anumale, anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse 30–45 minutit eksikaatoris (3.6) jahtuda ja kaalutakse 1 mg täpsusega.

Kaanega anum (3.3) kaalutakse täpsusega 0,5 mg. Teadaoleva kaaluga anumasse pannakse umbes 5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega, ja laotatakse see ühtlaselt laiali. Kaaneta anum pannakse eelnevalt temperatuurini 80–85 oC kuumutatud vaakumkuivatuskappi (3.5). Anum asetatakse kuivatuskappi võimalikult kiiresti, et vältida kuivatuskapi jahtumist.

Rõhk tõstetakse 100 torrini ja proovil lastakse sellise rõhu all kas kuuma ja kuiva õhu voolus või kuivatusaine juuresolekul (umbes 300 g 20 proovi kohta) umbes neli tundi kuivada. Kui kasutatakse kuivatusainet, ühendatakse vaakumpump pärast ettenähtud rõhu saavutamist lahti. Kuivamisaega arvestatakse alates hetkest, mil kuivatuskapi temperatuur on jälle 80–85 oC. Ettevaatlikult taastatakse kuivatuskapis atmosfäärirõhk. Kuivatuskapp avatakse, kaas asetatakse kohe anumale, anum võetakse kapist välja, lastakse jahtuda eksikaatoris (3.6) 30–45 minutit ja kaalutakse 1 mg täpsusega. Kuivatatakse veel 30 minutit vaakumkuivatuskapis temperatuuril 80–85 oC ning kaalutakse uuesti. Kahe kaalumistulemuse erinevus ei tohi olla suurem kui 0,1 % niiskust.

4.3.   Eelkuivatamine

4.3.1.    Muu sööt kui punktis 4.3.2 nimetatud sööt

Tahket sööta, mille purustamist suur niiskusesisaldus raskendab, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada:

50 g purustamata proovi (pressitud või aglomeeritud sööda võib vajaduse korral tükkideks teha) kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5 cm serv). Lastakse kuivatuskapis temperatuuril 60–70 oC kuivada, kuni niiskusesisaldus on 8–12 %. Anum võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis üks tund ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Purustatakse viivitamata punkti 4.1.1 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.1 või 4.2.3 kohaselt vastavalt sööda laadile.

4.3.2.    Teravili

Terasid, mille niiskusesisaldus on üle 17 %, tuleb järgmisel viisil eelnevalt kuivatada:

50 g jahvatamata teri kaalutakse 10 mg täpsusega ja pannakse sobivasse anumasse (nt 20 cm × 12 cm alumiiniumplaat, millel on 0,5 cm serv). Lastakse 5–7 minutit kuivatuskapis temperatuuril 130 oC kuivada. Võetakse kuivatuskapist välja, lastakse laboratooriumis kaks tundi ilma kaaneta jahtuda ja kaalutakse 10 mg täpsusega. Jahvatatakse viivitamata punkti 4.1.2 kohaselt ja kuivatatakse punkti 4.2.2 kohaselt.

5.   Tulemuste arvutamine

Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmiste valemite abil.

5.1.   Kuivatamine ilma eelkuivatamiseta

kus:

m

=

analüüsitava proovi esialgne mass grammides,

m0

=

kuiva analüüsitava proovi mass grammides.

5.2.   Kuivatamine koos eelkuivatamisega

kus:

m

=

analüüsitava proovi esialgne mass grammides,

m1

=

analüüsitava proovi mass grammides pärast eelkuivatamist,

m2

=

analüüsitava proovi mass grammides pärast purustamist või jahvatamist,

m0

=

kuiva analüüsitava proovi mass grammides.

5.3.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 0,2 % niiskuse absoluutväärtusest.

6.   Tähelepanek

Kui purustamine osutub vajalikuks ja kui sellega muutub toote niiskusesisaldus, tuleb sööda koostisosade analüüside tulemusi korrigeerida esialgsel kujul proovi niiskusesisalduse põhjal.

B.   LOOMSETE JA TAIMSETE RASVADE JA ÕLIDE NIISKUSESISALDUSE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata loomsete ja taimsete rasvade ja õlide veesisaldust ja lenduvate ainete sisaldust.

2.   Põhimõte

Proov kuivatatakse temperatuuril 103 oC püsimassini (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle). Massikadu määratakse kaalumise teel.

3.   Seadmed

4.   Töö käik

1 mg täpsusega kaalutud umbes 20 g homogeenitud proovi pannakse kuiva kaalutud anumasse (3.1), milles on termomeeter (3.2). Kuumutatakse liivavannil või kuumutusplaadil (3.3) termomeetriga pidevalt segades, nii et temperatuur tõuseb umbes 7 minutiga 90 oC-ni.

Kuumust vähendatakse, jälgides anuma põhjast kerkivate mullide sagedust. Temperatuur ei tohi tõusta üle 105 oC. Segamist jätkatakse anuma põhja kaapides, kuni mullide tekkimine lõpeb.

Niiskuse täielikuks kõrvaldamiseks kuumutatakse proovi mitu korda temperatuurini 103 ± 2 oC, jahutades kuumutamiste vahel proovi temperatuurini 93 oC. Lastakse jahtuda eksikaatoris (3.4) toatemperatuurini ja kaalutakse. Protseduuri korratakse, kuni massikadu kahel järjestikusel kaalumisel ei ole üle 2 mg.

NB

!

Proovi massi suurenemine pärast korduvat kuumutamist viitab rasva oksüdeerumisele, sel juhul arvutatakse tulemus enne massi suurenemist tehtud kaalumisel.

5.   Tulemuste arvutamine

Niiskusesisaldus (X) arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

kus:

m

=

analüüsitava proovi mass grammides;

m1

=

anuma ja selle sisu mass grammides enne kuumutamist;

m2

=

anuma ja selle sisu mass grammides pärast kuumutamist.

Tulemused, mis on väiksemad kui 0,05 %, tuleb registreerida kujul „alla 0,05 %”.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahel paralleelsel määramisel saadud niiskusesisalduste erinevus ei tohi ületada absoluutväärtuses 0,05 %.

C.   TOORVALGUSISALDUSE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab määrata toorvalgusisaldust söödas lämmastikusisalduse alusel, mis määratakse Kjeldahli meetodiga.

2.   Põhimõte

Proov lagundatakse väävelhappega katalüsaatori manulusel. Happelahus leelistatakse naatriumhüdroksiidi lahusega. Ammoniaak destilleeritakse ja kogutakse mõõdetud väävelhappekogusesse, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi standardlahusega.

Teise võimalusena destilleeritakse vabanenud ammoniaak boorhappe lahuse ülejääki, millele järgneb tiitrimine soolhappe või väävelhappe lahusega.

3.   Reaktiivid

Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, tuleb metüülpunase ja bromokresoolrohelise indikaatorid lisada boorhappe lahustesse. Kui 1 liiter boorhappe lahust on ette valmistatud, tuleb enne vajaliku mahuni korrigeerimist lisada 7 ml metüülpunase indikaatorlahust (3.16) ja 10 ml bromokresoolrohelise lahust (3.17).

Olenevalt sellest, millist vett kasutatakse, võib boorhappe lahuse pH-tase olla eri partiides erinev. Sageli on positiivse tulemuse saamiseks vaja korrigeerida väikse leelisekogusega.

MÄRKUS

:

umbes 3–4 ml NaOH (3.11) lisamine 1 liitrisse 10 g/l boorhappesse annab tavaliselt häid tulemusi. Lahust tuleb hoida toatemperatuuril ja kaitsta valguse ning ammoniaagiaurude eest.

MÄRKUS

:

kasutada võib ka teisi tiitrimislahuste (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, ja 3.19) kontsentratsioone, kui arvutustes tehakse vastavad parandused. Kontsentratsioonid tuleb alati esitada nelja kümnendkoha täpsusega.

4.   Seadmed

Seadmed, mis sobivad Kjeldahli meetodis ettenähtud lagundamise, destilleerimise ja tiitrimise läbiviimiseks.

5.   Töö käik

5.1.   Lagundamine

1 g proovi kaalutakse 0,001 g täpsusega ja pannakse see mineraliseerimisaparaadi kolbi. Lisatakse 15 g kaaliumsulfaati (3.1), sobiv kogus katalüsaatorit (3.2) (0,3 –0,4 g vask(II)oksiidi või 0,9 –1,2 g vask(II)sulfaadi pentahüdraati), 25 ml väävelhapet (3.4) ja vajadusel mõned pimsskivigraanulid (3.12) ning segatakse.

Kolbi kuumutatakse esialgu mõõdukalt, aeg-ajalt loksutades, kuni mass on söestunud ja vaht kadunud; seejärel kuumutatakse intensiivsemalt vedeliku püsiva keemiseni. Kuumutamine on küllaldane, kui keev hape kondenseerub kolvi seinale. Tuleb vältida seinte liigset kuumutamist ja orgaanilise aine kleepumist seintele.

Kui lahus muutub selgeks ja heleroheliseks, jätkatakse keetmist veel kahe tunni jooksul, seejärel jahutatakse.

5.2.   Destilleerimine

Lisatakse ettevaatlikult piisav kogus vett, et tagada sulfaatide täielik lahustumine. Lastakse jahtuda ja seejärel lisatakse vajadusel mõned graanulid tsinki (3.3). Edasi toimida vastavalt punktile 5.2.1 või 5.2.2.

5.2.1.    Destilleerimine väävelhappeks

Destilleerimisaparaadi kogumiskolbi pannakse täpselt mõõdetud 25 ml väävelhapet (3.5) või (3.7), sõltuvalt eeldatavast lämmastikusisaldusest. Lisatakse mõni tilk metüülpunast indikaatorit (3.8).

Mineraliseerimiskolb ühendatakse destilleerimisaparaadi jahutiga ja jahuti ots viiakse kogumiskolvis olevasse vedelikku vähemalt 1 cm sügavusele (vt tähelepanek 8.3). Mineraliseerimiskolbi valatakse aeglaselt 100 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.9), vältides ammoniaagi kadu (vt tähelepanek 8.1). Kolbi kuumutatakse, kuni ammoniaak on üle destilleeritud.

5.2.2.    Destilleerimine boorhappeks

Kui destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimine toimub käsitsi, siis rakendatakse allpool nimetatud menetlust. Kui destilleerimisseade on täisautomaatne ning hõlmab ka destillaadi ammoniaagisisalduse tiitrimist, siis järgitakse tootja koostatud destilleerimisseadme kasutusjuhendit.

Kogumiskolb, mis sisaldab 25–30 ml boorhappe lahust (3.18), pannakse jahuti väljalaskeava alla selliselt, et sissevoolutoru jääb allapoole boorhappe lahuse ülejäägi pinda. Destilleerimisseade korrigeeritakse 50 ml naatriumhüdroksiidi lahuse (3.9) väljastamiseks. Destilleerimisseadet kasutatakse vastavalt tootja kasutusjuhendile ja destilleeritakse naatriumhüdroksiidi lahuse lisamisel vabanenud ammoniaak välja. Destillaat kogutakse boorhappe vastuvõtulahusesse. Destillaadi kogus (veeaurdestillatsiooni aeg) sõltub proovis sisalduva lämmastiku hulgast. Järgitakse tootja kasutusjuhendit.

MÄRKUS

:

poolautomaatses destilleerimisseadmes toimuvad naatriumhüdroksiidi ülejäägi lisamine ja veeaurdestillatsioon automaatselt.

5.3.   Tiitrimine

Toimida vastavalt punktile 5.3.1 või 5.3.2.

5.3.1.    Väävelhape

Väävelhappe ülejääk tiitritakse kogumiskolvis naatriumhüdroksiidi lahusega (3.10 või 3.11), sõltuvalt kasutatud väävelhappe kontsentratsioonist, kuni on saavutatud tiitrimise lõpp-punkt.

5.3.2.    Boorhape

Kogumiskolvi sisu tiitritakse soolhappe standardse tiitrimislahusega (3.19) või väävelhappe standardse tiitrimislahusega (3.6), kasutades büretti, ning loetakse kokku kasutatud titrandi kogus.

Kui rakendatakse kolorimeetrilist lõpp-punkti leidmist, on lõpp-punkt saavutatud, kui ainesse ilmuvad esimesed roosa värvi jäljed. Büreti näitu hinnatakse 0,05 ml täpsusega. Lõpp-punkti nähtavust võib parandada valgustatud magnetseguri plaadi või valgusmõõturi abil.

Seda võib teha automaatselt, kasutades automaatselt tiitrivat veeaurdestillaatorit.

Eri destillaatori või destillaatori/titraatori kasutamisel järgitakse tootja kasutusjuhendeid.

MÄRKUS

:

kui kasutatakse automaatset tiitrimissüsteemi, algab tiitrimine vahetult pärast destilleerimise algust ja kasutatakse 1 % boorhappe lahust (3.18). Kui kasutatakse täisautomaatset destilleerimisseadet, võib ammoniaagi automaatset tiitrimist läbi viia ka lõpp-punkti määramisega, kasutades potentsiomeetrilist pH-süsteemi. Sel juhul kasutatakse pH mõõtjaga automaatset titraatorit. PH-meeter tuleb korralikult kalibreerida vahemikus pH 4 kuni pH 7, järgides tavapärast laboratoorset pH kalibreerimise menetlust. Tiitrimise pH lõpp-punkt saavutatakse pH 4,6 juures, mis on titreerimiskõvera kõige järsem punkt (murdepunkt).

5.4.   Pimekatse

Et kontrollida, kas reaktiivid on lämmastikuvabad, viiakse läbi pimekatse (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine), kasutades proovi asemel 1 g sahharoosi (3.14).

6.   Tulemuste arvutamine

Arvutused tehakse vastavalt punktile 6.1 või 6.2.

6.1.   Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.1

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

Vo

=

pimekatses kasutatud NaOH (3.10 või 3.11) maht (ml),

V1

=

proovi tiitrimisel kasutatud NaOH (3.10 või 3.11) maht (ml),

c

=

naatriumhüdroksiidi (3.10 või 3.11) kontsentratsioon (mol/l),

m

=

proovi mass (g).

6.2.   Tiitrimise arvutamine vastavalt punktile 5.3.2

6.2.1.    Tiitrimine soolhappega

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

m

=

kaalutise mass grammides,

c

=

soolhappe (3.19) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l),

V0

=

pimekatses kasutatud soolhappe maht (ml),

V1

=

kaalutises kasutatud soolhappe maht (ml).

6.2.2.    Tiitrimine väävelhappega

Toorvalgu sisaldus, väljendatuna protsendina massist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

m

=

kaalutise mass grammides,

c

=

väävelhappe (3.6) standardse tiitrimislahuse kontsentratsioon (mol/l),

V0

=

pimekatses kasutatud väävelhappe (3.6) maht (ml),

V1

=

kaalutises kasutatud väävelhappe (3.6) maht (ml).

7.   Meetodi kontrollimine

7.1.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

7.2.   Täpsus

Analüüs (lagundamine, destilleerimine ja tiitrimine) viiakse läbi 1,5 –2,0 g atseetaniliidiga (3.13) 1 g sahharoosi (3.14) manulusel; 1 g atseetaniliidi tarbib 14,80 ml väävelhapet (3.5). Saagis peab olema vähemalt 99 %.

8.   Tähelepanekud

D.   KARBAMIIDI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata karbamiidi taset söödas.

2.   Põhimõte

Proov suspendeeritakse vees selitava ainega. Suspensioon filtreeritakse. Filtraadi karbamiidisisaldus määratakse pärast 4-dimetüülaminobensaldehüüdi (4-DMAB) lisamist optilise tiheduse mõõtmise teel lainepikkusel 420 nm.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Proovi analüüs

1 mg täpsusega kaalutud 2 g proovi pannakse 1 g aktiivsöega (3.4) 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett ja 5 ml Carrezi lahust I (3.2), segatakse umbes 30 sekundit ja lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.3). Segatakse trumlis 30 minutit. Täidetakse veega kuni märgini, loksutatakse ja filtreeritakse.

Eemaldatakse 5 ml läbipaistvat värvitut filtraati, pannakse see lihvkorgiga katseklaasidesse, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1) ja segatakse. Katseklaasid asetatakse 20 oC (+/- 4 oC) veetemperatuuriga veevanni. Viieteistkümne minuti pärast mõõdetakse proovilahuse optiline tihedus spektrofotomeetriga lainepikkusel 420 nm. Võrreldakse reaktiivide kontroll-lahustega.

5.2.   Kalibreerimiskõver

Võetakse 1, 2, 4, 5 ja 10 ml kogused karbamiidilahust (3.5), pannakse 100 ml mõõtekolbidesse ja täidetakse veega kuni märgini. Igast lahusest võetakse ära 5 ml, lisatakse 5 ml 4-DMAB lahust (3.1), homogeenitakse ja mõõdetakse eespool kirjeldatud viisil optiline tihedus võrrelduna kontroll-lahusega, mis sisaldab 5 ml 4-DMAB lahust ja 5 ml karbamiidivaba vett. Koostatakse kalibreerimiskõver.

6.   Tulemuste arvutamine

Proovis sisalduv karbamiidikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Tähelepanekud

E.   LENDUVATE LÄMMASTIKALUSTE MÄÄRAMINE

I.   MIKRODIFUSIOON

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust söödas.

2.   Põhimõte

Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse kaaliumkarbonaadi lahust kasutades mikrodifusiooni abil, kogutakse boorhappe lahusesse ja tiitritakse väävelhappega.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri.

Pipetti kasutades viiakse 1 ml boorhappe lahust (3.3) Conway anuma keskmisse ossa ja 1 ml filtraati anuma välimisse ossa. Kaetakse osaliselt rasvatatud kaanega. Välimisse osasse tilgutatakse kiiresti 1 ml kaaliumkarbonaadi küllastunud lahust (3.4) ja kaas suletakse õhukindlalt. Anumat pööratakse hoolikalt horisontaaltasandis nii, et kaks reaktiivi segunevad. Lastakse haududa kas vähemalt neli tundi toatemperatuuril või üks tund temperatuuril 40 oC.

Mikrobüretti (4.3) kasutades tiitritakse lenduvad lämmastikalused boorhappe lahuses väävelhappe (3.5) abil.

Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita.

6.   Tulemuste arvutamine

1 ml H2SO40,01 mol/l vastab 0,34 mg ammoniaagile.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

7.   Tähelepanek

Kui proovi ammoniaagisisaldus on suurem kui 0,6 %, lahjendatakse esialgset lahust.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II.   DESTILLEERIMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata ammoniaagina väljendatud lenduvate lämmastikaluste sisaldust peaaegu karbamiidivabas kalajahus. Meetodit kohaldatakse üksnes juhul, kui ammoniaagisisaldus on väiksem kui 0,25 %.

2.   Põhimõte

Proov ekstraheeritakse veega ning lahus selitatakse ja filtreeritakse. Lenduvad lämmastikalused vabastatakse keemistemperatuuril magneesiumoksiidi lisamise teel ja kogutakse teatava koguse väävelhappega, mille ülejääk tiitritakse naatriumhüdroksiidi lahuse abil tagasi.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

10 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse koos 100 ml veega 200 ml mõõtekolbi. Segatakse trumlis 30 minutit. Lisatakse 50 ml trikloroäädikhappe lahust (3.1), täidetakse kuni märgini veega, loksutatakse tugevalt ja filtreeritakse läbi kurdfiltri.

Vastavalt lenduvate lämmastikaluste eeldatavale sisaldusele võetakse vajalik kogus selget filtraati (tavaliselt 100 ml). Lahjendatakse 200 milliliitrini ning lisatakse 2 g magneesiumoksiidi (3.2) ja mõned tilgad vahutamisvastast emulsiooni (3.3). Lahus peaks olema lakmuspaberi abil määratuna aluseline, vastasel korral lisatakse veidi magneesiumoksiidi (3.2). Edasi toimitakse vastavalt toorvalgu sisalduse määramise analüüsi meetodi punktidele 5.2 ja 5.3 (käesoleva lisa C osa).

Sama menetluse abil tehakse pimekatse, kuid ilma analüüsitava proovita.

6.   Tulemuste arvutamine

1 ml H2SO40,05 mol/l vastab 1,7 mg ammoniaagile.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi olla suurem kui 10 % ammoniaagi massist suhtelise väärtusena väljendatult.

F.   AMINOHAPETE (VÄLJA ARVATUD TRIPTOFAANI) MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab aminohappeanalüsaatoriga määrata söödas vabu aminohappeid (sünteetilisi ja looduslikke) ning üldaminohappeid (peptiidsidemetega ja vabu). Meetodit saab kasutada järgmiste aminohapete puhul: tsüst(e)iin, metioniin, lüsiin, treoniin, alaniin, arginiin, asparagiinhape, glutamiinhape, glütsiin, histidiin, isoleutsiin, leutsiin, fenüülalaniin, proliin, seriin, türosiin ja valiin.

Meetod ei erista aminohapete sooli ega aminohapete D- ja L-vorme. See ei sobi trüptofaani ega aminohapete hüdroksüanaloogide määramiseks.

2.   Põhimõte

2.1.   Vabad aminohapped

Vabad aminohapped ekstraheeritakse lahjendatud soolhappega. Kaasa ekstraheerunud lämmastikku sisaldavad makromolekulid sadestatakse sulfosalitsüülhappega ning eemaldatakse filtreerides. Filtreeritud lahuse pH korrigeeritakse 2,20 -le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetrilise määramise teel reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm.

2.2.   Üldaminohapped

Valitav protseduur sõltub uuritavatest aminohapetest. Tsüst(e)iin ja metioniin tuleb enne hüdrolüüsi oksüdeerida vastavalt tsüsteiinhappeks ja metioniinsulfooniks. Türosiin tuleb määrata oksüdeerimata proovide hüdrolüsaatides. Kõiki teisi punktis 1 osutatud aminohappeid saab määrata kas oksüdeeritud või oksüdeerimata proovides.

Oksüdeerimine viiakse läbi persipelghappe ja fenooli seguga 0 oC juures. Ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse naatriumdisulfitiga. Oksüdeeritud või oksüdeerimata proovi hüdrolüüsitakse soolhappega (3.20) 23 tundi. Hüdrolüsaadi pH korrigeeritakse 2,20 -le. Aminohapped eraldatakse ioonvahetuskromatograafia teel ning määratakse fotomeetriliselt reaktsioonis ninhüdriiniga lainepikkusel 570 nm (proliini puhul 440 nm).

3.   Reaktiivid

Tuleb kasutada bidestilleeritud või samaväärse kvaliteediga vett (juhtivus < 10 μS).

300 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

40 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

889 g sipelghapet (3.2) segatakse 111 g veega ja lisatakse 4,73 g fenooli (3.3).

1 g fenooli (3.3) lisatakse 492 milliliitrile HCl-le (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

60 g 5-sulfosalitsüülhapet (3.6) lahustatakse vees ja täidetakse veega 1 liitrini.

0,5 ml vesinikperoksiidi (3.1) segatakse 4,5 ml sipelghappe ja fenooli lahusega (3.19) väikses keeduklaasis. Inkubeeritakse 20–30 oC juures ühe tunni jooksul, et moodustuks persipelghape, seejärel jahutatakse jääveevanni kohal (15 min) enne proovile lisamist.

Ettevaatust: vältida kokkupuudet nahaga ja kanda kaitserõivaid.

19,61 g naatriumtsitraati (3.8), 5 ml tiodiglükooli (3.9), 1 g fenooli (3.3) ja 16,50 ml HCl (3.7) lahustatakse umbes 800 ml vees. pH korrigeeritakse 2,20 -le. Täidetakse veega 1 liitrini.

c = 2,5 μmol/ml iga lahuse kohta soolhappes.

On võimalik osta.

0,2115 g tsüsteiinhapet (3.16.2) ja 0,2265 g metioniinsulfooni (3.16.3) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) üheliitrises mõõtekolbis ning täidetakse kolb tsitraatpuhvriga märgini. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 12 kuu. Seda lahust ei kasutata, kui põhistandardlahus (3.27.1) sisaldab tsüsteiinhapet ja metioniinsulfooni.

0,6560 g norleutsiini (3.13) lahustatakse tsitraatpuhvris (3.24) mõõtekolbis ning kolb täidetakse tsitraatpuhvriga 250 ml-ni. Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle kuue kuu.

Kallatakse kvantitatiivselt 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) kuni märgini ja segatakse.

Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu.

Vaata ka punkti 9.1 tähelepanekut.

Säilitatakse temperatuuril alla 5 oC mitte üle 3 kuu.

4.   Seadmed

Kolonn täidetakse sulfoneeritud polüstüreenvaikudega, mis on võimelised eraldama aminohappeid üksteisest ja teistest ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Puhvri ja ninhüdriini jadas tekitatakse vool pumpadega, mille vooluühtlus on ±0,5 % nii standardkalibreerimise kui proovi analüüsi ajal.

Mõnede aminohapete analüsaatoritega võib kasutada hüdrolüüsimenetlusi, mille puhul on hüdrolüsaadi naatriumikontsentratsioon c = 0,8 mol/l ja mis sisaldab oksüdatsioonietapi kõiki sipelghappe jääke. Teised analüsaatorid ei võimalda teatavaid aminohappeid rahuldaval määral eraldada, kui hüdrolüsaat sisaldab liigselt sipelghapet ja/või kui naatriumioonide kontsentratsioon on kõrge. Sellisel juhul vähendatakse pärast hüdrolüüsi ja enne pH korrigeerimist happe mahtu aurustamisega kuni umbes 5 milliliitrini. Aurustamine peab toimuma vaakumitingimustes temperatuuril kuni 40 oC.

5.   Töö käik

5.1.   Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.12).

5.2.   Vabade aminohapete määramine söödas ja eelsegudes

Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 0,2 mg täpsusega koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml ekstraheerimissegu (3.21). Segu raputatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.8). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle 100 ml keeduklaasi.

Lisatakse loksutades 5,0 ml sulfosalitsüülhappe lahust (3.22) ning jätkatakse loksutamist 5 min vältel, kasutades magnetsegurit. Supernatant filtreeritakse või tsentrifuugitakse sademe eemaldamiseks. 10,0 ml saadud lahust pannakse 100 ml keeduklaasi ja korrigeeritakse pH-taset 2,20 -ni, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.18), sobiv kogus valatakse tsitraatpuhvri (3.24) abil mõõtekolbi ja kolb täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini.

Kui kasutatakse sisestandardit, lisatakse 1,00 ml sisestandardit (3.27.3) igasse 100 ml valmis lahusesse ja täidetakse puhverlahusega (3.24) kuni märgini.

Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Kui ekstrakte ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC.

5.3.   Üldaminohapete määramine

5.3.1.    Oksüdeerimine

0,2 mg täpsusega kaalutakse 0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1):

Kaalutud proovi lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg ja niiskusesisaldus kuni 100 mg.

Kolb/pudel asetatakse jääveevanni ja jahutatakse kuni temperatuurini 0 oC, lisatakse 5 ml oksüdatsiooniegu (3.23) ning segatakse painutatud otsaga klaasspaatli abil. Spaatlit sisaldav kolb/pudel pitseeritakse õhukindla kilega, pitseeritud nõud sisaldav jääveevann asetatakse 16 tunniks külmikusse temperatuuril 0 oC. 16 tunni möödudes võetakse see külmikust välja ja ülemäärane oksüdatsioonireaktiiv lagundatakse, lisades 0,84 g naatriumdisulfitit (3.4).

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.1.

5.3.2.    Hüdrolüüs

5.3.2.1.    Oksüdeeritud proovide hüdrolüüs

Vastavalt punktile 5.3.1 valmistatud oksüdeeritud proovile lisatakse 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20), pestes hoolikalt maha anuma ja spaatli külge kleepunud proovijäägid.

Olenevalt sellest, millist hüdrolüüsimenetlust kasutatakse, jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.

5.3.2.2.    Oksüdeerimata proovide hüdrolüüs

100 ml või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi (4.1) või 100 ml keermestatud korgiga pudelisse (4.2) kaalutakse 0,2 mg täpsusega 0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse hoolikalt 25 ml hüdrolüüsisegu (3.20) ja segatakse prooviga. Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4.

5.3.2.3.    Lahtine hüdrolüüs

Kolbis olevale segule (mis on valmistatud vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2) lisatakse 3 klaashelmest ja keedetakse püstjahutiga kolvis 23 tundi pideval mullidega keemisel. Pärast hüdrolüüsi teostamist pestakse jahuti maha 5 ml tsitraatpuhvriga (3.24). Kolb võetakse lahti ja jahutatakse jäävannis.

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.

5.3.2.4.    Kinnine hüdrolüüs

Vastavalt punktile 5.3.2.1 või 5.3.2.2 valmistatud segu sisaldav pudel asetatakse kuivatuskappi (4.3) temperatuuril 110 oC. Et vältida rõhu suurenemist (gaasiliste ainete tekkimise tõttu) ja ära hoida plahvatust, asetatakse esimeseks tunniks surveanuma peale keermestatud kork. Surveanumat ei tohi korgiga sulgeda. Ühe tunni möödudes suletakse surveanum korgiga ja jäetakse 23 tunniks kuivatuskappi (4.3). Pärast hüdrolüüsi lõpuleviimist võetakse pudel kuivatuskapist välja, avatakse ettevaatlikult pudelikork ja asetatakse pudel jääveevanni. Jahutatakse.

Olenevalt sellest, millist pH korrigeerimise menetlust (5.3.3) kasutatakse, valatakse pudeli sisu kvantitatiivselt 250 ml keeduklaasi või 250 ml ümarapõhjalisse kolbi, kasutades tsitraatpuhvrit (3.24).

Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.3.

5.3.3.    pH korrigeerimine

Olenevalt aminohappe analüsaatori (4.9) naatriumitaluvusest toimitakse pH korrigeerimisel vastavalt punktile 5.3.3.1 või 5.3.3.2.

5.3.3.1.    Kromatograafilised süsteemid (4.9), mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus

Soovitatav on kasutada sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3), juhul kui kasutatakse aminohappe analüsaatorit, mille puhul on nõutav väike naatriumisisaldus (kui happe kogust tuleb vähendada).

Sellisel juhul lisatakse enne aurustamist hüdrolüsaadile 2,00 ml sisestandardi põhistandardlahust (3.27.3).

Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadile lisatakse 2 tilka 1-oktanooli (3.15).

Hüdrolüsaadi kogust vähendatakse vaakumpöördaurusti (4.7) abil 5–10 milliliitrini vaakumitingimustes temperatuuril 40 oC. Kui kogust vähendatakse kogemata vähem kui 5 milliliitrini, tuleb hüdrolüsaat välja praakida ja analüüsi tuleb uuesti alustada.

pH-taset korrigeeritakse 2,20 -ni naatriumhüdroksiidi lahusega (3.18) ja jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.

5.3.3.2.    Kõik teised aminohappe analüsaatorid (4.9)

Vastavalt punktile 5.3.2.3 või 5.3.2.4 saadud hüdrolüsaadid neutraliseeritakse osaliselt, lisades hoolikalt loksutades 17 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.17), jälgides, et temperatuur püsiks allpool 40 oC.

pH korrigeeritakse 2,20 -ni toatemperatuuril, kasutades naatriumhüdroksiidi lahust (3.17) ja lõpuks naatriumhüdroksiidi lahust (3.18). Jätkatakse vastavalt punktile 5.3.4.

5.3.4.    Proovilahus kromatograafia jaoks

Korrigeeritud pH-tasemega hüdrolüsaat (5.3.3.1 või 5.3.3.2) kallatakse kvantitatiivselt koos tsitraatpuhvriga (3.24) 200 ml mõõtekolbi ja täidetakse puhvriga (3.24) märgini.

Kui sisestandardit ei ole veel kasutatud, lisatakse 2,00 ml sisestandardit (3.27.3) ja täidetakse tsitraatpuhvriga (3.24) märgini. Segatakse hoolikalt.

Seejärel alustatakse kromotograafiat (5.4).

Kui proovilahuseid ei analüüsita samal päeval, tuleb neid säilitada temperatuuril alla 5 oC.

5.4.   Kromatograafia

Enne kromotograafiat viiakse ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3.4) toatemperatuurile. Segu loksutatakse ja filtreeritakse sobiv kogus läbi 0,22 μm membraanfiltri (4.5). Saadud selge lahusega tehakse ioonvahetuskromatograafia, kasutades aminohappe analüsaatorit (4.9).

Sissesüstimist võib teostada käsitsi või automaatselt. On oluline, et standardite ja proovide analüüsiks lisataks kolonni sama kogus lahust ± 0,5 %, välja arvatud sisestandardi kasutamisel, ning et naatriumi ja aminohapete vahekord standard- ja proovilahustes oleks võimalikult sarnane.

Üldiselt sõltub kalibreerimiskatsete sagedus ninhüdriini reaktiivi stabiilsusest ja analüütilisest süsteemist. Standard või proov lahjendatakse tsitraapuhvriga (3.24), et saavutada standardi piigipindalaks 30–200 % proovi aminohappe piigipindalast.

Aminohapete kromatograafia varieerub kergelt vastavalt sellele, millist tüüpi analüsaatorit ja millist vaiku kasutatakse. Valitud süsteem peab suutma eraldada aminohapped üksteisest ja ninhüdriinpositiivsetest materjalidest. Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma lineaarselt kolonni lisatud aminohapete muutustest.

Kromatograafia etapil kehtivad (määratavate aminohapete) ekvimolaarlahuse analüüsimisel allpool esitatud miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekorrad. Ekvimolaarlahus peab sisaldama vähemalt 30 % iga aminohappe maksimumkogusest, mida on võimalik täpselt mõõta aminohappe analüüsisüsteemi (4.9) abil.

Treoniini-seriini eraldamiseks ei tohi kahest kattuvast aminohappest madalama aminohappe miinimumtaseme ja piigi kõrguse vahekord kromatogrammil ületada suhet 2:10. (Kui määratakse vaid tsüst(e)iini, metioniini, treoniini ja lüsiini, kahjustab nende määramist ebapiisav eraldamine külgnevatest piikidest.). Kõigi teiste aminohapete puhul peab eraldatus olema parem kui suhe 1:10.

Süsteem peab tagama lüsiini eraldamise „lüsiini artefaktidest” ja ornitiinist.

6.   Tulemuste arvutamine

Proovi ja standardi piikide pindala mõõdetakse iga üksiku aminohappe kohta ning arvutatakse kogus (X) ühes grammis aminohappes proovi kilo kohta.

Kui kasutatakse sisestandardit, korrutatakse tulemus liikmega

A

=

piigipindala, hüdrolüsaat või ekstrakt

B

=

piigipindala, kalibreerimisstandardlahus

C

=

piigipindala, sisestandard hüdrolüsaadis või ekstraktis

D

=

piigipindala, sisestandard, kalibreerimisstandardlahus

M

=

määratava aminohappe molaarmass

c

=

standardi kontsentratsioon μmol/ml

m

=

proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud)

V

=

hüdrolüsaat (5.3.4) kokku milliliitrites või ekstrakti (6.1) lahjenduse koguruumala milliliitrites

Tsüstiin ja tsüsteiin määratakse mõlemad tsüsteiinhappena oksüdeeritud proovide hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse tsüstiiniks (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), kasutades M väärtust 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metioniin määratakse metioniinsulfoonina oksüdeeritud proovi hüdrolüsaatides, kuid arvutatakse metioniinina, kasutades metioniini M väärtust: 149,21 g/mol.

Lisatud vaba metioniin määratakse pärast ekstraheerimist metioniinina, arvutamisel kasutatakse sama M väärtust.

V

=

lõppekstrakti ruumala

7.   Meetodi hindamine

Meetodit on katsetatud rahvusvahelises võrdluskatses 1990. aastal, kasutades nelja erinevat sööta (sigade segasööt, broilerite segasööt, valgukontsentraat, eelsegu). Tulemuste keskväärtused ja standardhälbed pärast võõrväärtuste elimineerimist on esitatud käesoleva punkti tabelis.

7.1.   Korratavus

Eespool nimetatud võrdluskatse korratavus on väljendatud laborisisese standardhälbena ja esitatud järgmistes tabelites.

7.2.   Reprodutseeritavus

Eespool nimetatud võrdluskatse laboritevahelise standardhälbe tulemused on esitatud järgmises tabelis:

8.   Etalonainete kasutamine

Meetodi õige rakendamise kontrollimiseks tehakse korduvaid mõõtmisi sertifitseeritud etalonainetega, kui need ained on kättesaadavad. Soovitatav on kalibreerida aminohapete sertifitseeritud kalibreerimislahusega.

9.   Tähelepanekud

Kõigi aminohapete puhul tuleb kontrollida aparatuuri lineaarse ala vahemikku.

Standardlahus lahjendatakse tsitraatpuhvriga, et piigialad oleksid vahemiku keskel.

G.   TRÜPTOFAANI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata trüptofaani üldsisaldust ja vaba trüptofaani sisaldust söödas. Meetod ei erista D- ja L-vormi.

2.   Põhimõte

Trüptofaani üldsisalduse määramiseks hüdrolüüsitakse proovi leeliselises keskkonnas küllastunud baariumhüdroksiidi lahusega ja kuumutatakse 110 oC juures 20 tundi. Pärast hüdrolüüsimist lisatakse sisestandard.

Vaba trüptofaani määramiseks ekstraheeritakse proovi nõrgalt happelistes tingimustes sisestandardi juuresolekul.

Trüptofaan ja sisestandard määratakse hüdrolüsaadis või ekstraktis HPLC-ga fluorestsentsdetektori abil.

3.   Reaktiivid

40,0 g NaOH (3.5) lahustatakse vees ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini.

Võetakse 492 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

Võetakse 82 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

Võetakse 8,2 ml HCl (3.7) ja täidetakse veega 1 liitrini.

Võetakse 34 ml ortofosforhapet (3.6) ja täidetakse veega (3.1) 1 liitrini.

500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2553 g trüptofaani (3.2) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat.

500 ml mõõtkolvis lahustatakse 0,2728 g α-metüültrüptofaani (3.3) soolhappes (3.13) ja täidetakse soolhappega (3.13) märgini. Säilitatakse temperatuuril –18 oC kuni neli nädalat.

Võetakse 2,00 ml trüptofaani kontsentreeritud lahust (3.15) ja 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Lahjendatakse veega (3.1) ja metanooliga (3.8) umbes sama ruumalani ja umbes sama metanooli kontsentratsioonini (10–30 %), nagu on valmis hüdrolüsaadil.

Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

Valmistamise ajal vältida otsest päikesevalgust.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Proovide ettevalmistamine

Proov jahvatatakse nii peeneks, et see läheks läbi 0,5-millimeetriste avadega sõela. Suure niiskusesisaldusega proovid tuleks enne jahvatamist kas kuivatada õhu käes temperatuuril kuni 50 oC või külmkuivatada. Suure rasvasisaldusega proove tuleb enne jahvatamist ekstraheerida petrooleetriga (3.9).

5.2.   Vaba trüptofaani määramine (ekstrakt)

Ettevalmistatud proovi (5.1) sobiv kogus (1–5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml soolhapet (3.13), c = 0,1 mol/l, ja 5,00 ml kontsentreeritud sisestandardlahust (3.16). Raputatakse või segatakse 60 min, kasutades mehaanilist loksutit või magnetsegurit (4.7). Settel lastakse settida ja 10,0 ml supernatanti viiakse pipetiga üle keeduklaasi. Lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Naatriumhüdroksiidi (3.10) abil korrigeeritakse pH 3-le. Lisatakse piisavalt metanooli (3.8), et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 protsendini. Lahus viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kuni kromatograafiaks sobiva koguseni (umbes sama kogus kui kalibreerimisstandardlahusel (3.17)).

Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Standardlahust ja ekstrakte tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui ekstrakte ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva.

5.3.   Trüptofaani üldsisalduse määramine (hüdrolüsaat).

0,1 –1 g ettevalmistatud proovi (5.1) kaalutakse 0,2 mg täpsusega polüropüleenkolbi (4.4). Kaalutud proovipartii lämmastikusisaldus peab olema umbes 10 mg. Lisatakse 8,4 g baariumhüdroksiidi oktahüdraati (3.4) ja 10 ml vett. Segatakse pöörissegajaga (4.8) või magnetseguriga (4.7). Tefloniga kaetud magnet jäetakse segusse. Nõu seinad loputatakse üle 4 ml veega. Keeratav kork pannakse peale ja kolb suletakse lõdvalt. Kolb pannakse autoklaavi (4.6) ja kuumutatakse keevas vees ja aurus 30–60 minutit. Autoklaav suletakse ja kuumutatakse 20 tundi 110 (±2) oC juures.

Enne autoklaavi avamist langetatakse temperatuur natuke alla 100 oC kraadi. Ba(OH)2 .8 H2O kristalliseerumise vältimiseks lisatakse soojale segule 30 ml toatemperatuuril olevat vett. Raputatakse või segatakse kergelt. Lisatakse 2,00 ml sisestandardi (α-metüültrüptofaani) kontsentreeritud lahust (3.16). Nõusid jahutatakse vee-/jäävannis 15 minutit.

Seejärel lisatakse 5 ml ortofosforhapet (3.14). Nõu hoitakse jahutusvannis ja neutraliseeritakse segamisel HCl-iga (3.11) ning pH korrigeeritakse 3,0 -ni HCl (3.12) abil. Lisatakse piisavalt metanooli, et viia metanooli kontsentratsioon lõpplahuses 10–30 %ni. Viiakse üle sobiva suurusega mõõtekolbi ja lahjendatakse veega kindla, kromatograafiaks sobiva ruumalani (näiteks 100 ml). Metanooli lisamine ei tohi tekitada sadenemist.

Enne HPLC-kolonni süstimist filtreeritakse mõned milliliitrid lahust läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.5). Jätkatakse kromatograafiaga vastavalt punktile 5.4.

Standardlahust ja hüdrolüsaate tuleb kaitsta otsese päikesevalguse eest. Kui hüdrolüsaate ei ole võimalik samal päeval analüüsida, siis võib neid hoida temperatuuril 5 oC kuni kolm päeva.

5.4.   HPLC määramine

Soovitatakse juhinduda järgmistest isokraatilise elueerimise tingimustest. Muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused (vt ka tähelepanekuid 9.1 ja 9.2):

6.   Tulemuste arvutamine

Arvutatakse trüptofaani (X) kogus grammides 100 g proovi kohta.

A

=

sisestandardi piipindala, kalibreerimisstandardlahus (3.17)

B

=

trüptofaani piigipindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3)

V1

=

kalibreerimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kogus milliliitrites (2 ml)

c

=

kalibreerimislahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud trüptofaani lahuse (3.15) kontsentratsioon, μmol/ml (= 2,50 )

V2

=

kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites, mis on lisatud ekstraheerimisel (5.2) (= 5,00 ml) või hüdrolüsaadile (5.3) (= 2,00 ml)

C

=

sisestandardi piigipindala, ekstrakt (5.2) või hüdrolüsaat (5.3)

D

=

trüptofaani piigipindala, kalibreerimisstandardlahus (3.17)

V3

=

kalibreerimisstandardlahusele (3.17) lisatud kontsentreeritud sisestandardlahuse (3.16) kogus milliliitrites (= 2,00 ml)

m

=

proovi mass grammides (korrigeeritud esialgsele massile, kui proovi on kuivatatud ja/või rasvatustatud)

M

=

trüptofaani molaarmass (= 204,23 g/mol)

7.   Korratavus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 10 % suuremast tulemusest.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühendusesisene ühisuurimine (neljas võrdlusuuring), mille käigus kuni 12 laborit analüüsisid hüdrolüüsimeetodi sertifitseerimiseks kolme proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

L

=

tulemused esitanud laborite arv

n

=

üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

r

=

korratavus

R

=

reprodutseeritavus

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja, %

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

Teise ühendusesisese ühisuurimise (kolmanda võrdlusuuringu) käigus analüüsisid kuni 13 laborit vaba trüptofaani ekstraheerimise meetodi sertifitseerimiseks kahte proovi. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

L

=

tulemused esitanud laborite arv

n

=

üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

r

=

korratavus

R

=

reprodutseeritavus

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja, %

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

Veel ühe ühendusesisese võrdlusuuringu käigus analüüsisid kuni seitse laborit trüptofaani hüdrolüüsi sertifitseerimise eesmärgiga nelja proovi. Tulemused on esitatud allpool. Kõigile proovidele tehti kordusanalüüsid (5).

L

=

tulemused esitanud laborite arv

n

=

üksiktulemuste arv pärast võõrväärtuste väljajätmist (Cochrani-Dixoni võõrväärtuste testi alusel)

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

r

=

korratavus

R

=

reprodutseeritavus

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja, %

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

9.   Tähelepanekud

Isokraatiline elueerimine, millele järgneb kolonni gradientpuhastus:

Kasutatavate kontsentratsioonide vahemikus peavad kromatograafilise süsteemiga saadavad tulemused sõltuma kontsentratsioonist lineaarselt. Tulemuste lineaarsust tuleks kontrollida sisestandardi konstantsel (normaalsel) kontsentratsioonil erinevate trüptofaani kontsentratsioonidega. On oluline, et nii trüptofaani kui ka sisestandardi piigid oleksid HPLC-/fluorestsentssüsteemi lineaarses alas. Kui trüptofaani või sisestandardi piigid on liiga väikesed või liiga suured, siis tuleks analüüsi korrata teistsuguse proovi suurusega ja/või teistsuguse lõppruumalaga.

Baariumhüdroksiidi lahustamine raskeneb baariumhüdroksiidi vananemisel. Selle tulemusel saadakse HPLC-ga määramiseks hägune lahus, mis võib vähendada trüptofaani määramisel saadavaid tulemusi.

H.   TOORÕLI JA -RASVA MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

See meetod võimaldab määrata toorõli ja -rasva sisaldust söödas. See ei hõlma õliseemnete ja õliviljade analüüsi.

Allpool kirjeldatud kahe meetodi kasutamine sõltub sööda laadist ja koostisest ning analüüsi tegemise põhjusest.

1.1.   Meetod A – otse ekstraheeritav toorõli ja -rasv

Seda meetodit kohaldatakse taimsete söödatoorainete puhul, välja arvatud meetodiga B hõlmatud ainete puhul.

1.2.   Meetod B – kogu toorõli ja -rasv

Seda meetodit kohaldatakse loomsete söödatoorainete ja kõigi segajõusöötade puhul. Seda kasutatakse kõigi ainete puhul, millest ei ole ilma eelneva hüdrolüüsita võimalik õli ja rasva ekstraheerida (nt gluteenid, pärm, kartulivalgud ning tooted, mille puhul kasutatakse muu hulgas pressimist, helvestamist või kuumutamist).

1.3.   Tulemuste tõlgendamine

Kõigil juhtudel, kui meetodiga B saadakse suurem tulemus kui meetodiga A, loetakse meetodiga B saadud tulemus õigeks väärtuseks.

2.   Põhimõte

2.1.   Meetod A

Proov ekstraheeritakse petrooleetriga. Solvent destilleeritakse välja ning jääk kuivatatakse ja kaalutakse.

2.2.   Meetod B

Proovi töödeldakse kuumalt soolhappega. Segu jahutatakse ja filtreeritakse. Jääk pestakse, kuivatatakse ja määratakse vastavalt meetodile A.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Meetod A (vt punkt 8.1)

5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse ekstraheerimishülssi (4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga.

Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (4.1) ja ekstraheeritakse petrooleetriga (3.1) kuus tundi. Petrooleetri ekstrakt kogutakse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid ( 9 ).

Solvent destilleeritakse välja. Jääk koos kolviga asetatakse poolteiseks tunniks kuivatuskappi (4.3) kuivama. Lastakse eksikaatoris jahtuda ning kaalutakse. Kuivatatakse veel 30 minutit, et veenduda, et õli ja rasva mass jääb samaks (massikadu kahe järjestikuse kaalumise vahel peab olema 1 mg või alla selle).

5.2.   Meetod B

2,5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega (vt punkt 8.2), pannakse 400 ml keeduklaasi või 300 ml Erlenmeyeri kolbi ning lisatakse 100 ml soolhapet (3.3) ja pimsskivitükke. Keeduklaas kaetakse kellaklaasiga või pannakse Erlenmeyeri kolbi külge püstjahuti. Segu kuumutatakse madala leegi või kuumutusplaadi kohal keemiseni ja keedetakse nõrgalt tund aega. Tuleb vältida toote sadestumist nõu seinte külge.

Jahutatakse ja lisatakse selline kogus filterainet (3.4), mis on piisav õli- ja rasvakao vältimiseks filtreerimisel. Lahus filtreeritakse läbi niisutatud rasvavaba kahekordse filterpaberi. Jääki pestakse külmas vees kuni filtraadi neutraalse reaktsioonini. Kontrollitakse, et filtraat ei sisalda õli ega rasva. Kui filtraat sisaldab õli või rasva, tuleb proov enne hüdrolüüsi petrooleetriga ekstraheerida, kasutades meetodit A.

Kahekordne filterpaber koos jäägiga asetatakse kellaklaasile ja kuivatatakse poolteist tundi ventileeritavas kuivatuskapis (4.3) 100 ± 3 oC juures.

Kahekordne filterpaber koos kuivjäägiga asetatakse ekstraheerimishülssi (4.2) ja kaetakse rasvavaba vatiga. Hülss asetatakse ekstraheerimisaparaati (4.1) ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule.

6.   Tulemuste väljendamine

Jäägi mass väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Korratavus

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

8.   Tähelepanekud

20 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja segatakse vähemalt 10 g veevaba naatriumsulfaadiga (3.2). Segu ekstraheeritakse petrooleetriga (3.1) vastavalt punktile 5.1. Saadud ekstrakti täidetakse petrooleetriga (3.1) 500 ml-ni ja segatakse. 50 ml lahust pannakse väiksesse kuiva kaalutud kolbi, milles on pimsskivitükid (1). Solvent destilleeritakse välja, segu kuivatatakse ja jätkatakse vastavalt punkti 5.1 viimasele lõigule.

Hülssi jäänud ekstraheerimisjäägist eemaldatakse solvent, peenestatakse jääk 1 mm osakesteks, pannakse see tagasi ekstraheerimishülssi (ilma naatriumsulfaati lisamata) ning jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele ja kolmandale lõigule.

Õli- ja rasvasisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

(10m1 + m2) × 5

kus:

m1

=

jäägi mass grammides pärast esimest ekstraheerimist (alikvootne osa ekstraktist),

m2

=

jäägi mass grammides pärast teist ekstraheerimist.

I.   KOGUKIU MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata söödas happelises ja leeliselises keskkonnas lahustumatuid rasvavabu orgaanilisi aineid, mida harilikult nimetatakse kogukiuks.

2.   Põhimõte

Proovi, mis on vajaduse korral rasvatustatud, töödeldakse mitu korda järjest teatava kontsentratsiooniga väävelhappe ja kaaliumhüdroksiidi keevate lahustega. Jääk eraldatakse filtreerimise abil paagutatud klaasfiltril ning pestakse, kuivatatakse, kaalutakse ja tuhastatakse temperatuuril vahemikus 475–500 oC. Tuhastamisest tulenev massikadu vastab uuritavas proovis sisalduvale kogukiule.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

1 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ja pannakse see tiiglisse (4.2) (vt tähelepanekud 8.1, 8.2 ja 8.3) ning lisatakse 1 g filterainet (3.3).

Kuumutusseade (4.1) ja filtertiigel (4.2) ühendatakse ning seejärel kinnitatakse silinder (4.3) tiigli külge. 150 ml keevat väävelhapet (3.1) valatakse ühendatud silindrisse ja tiiglisse ning vajadusel lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (3.2).

Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit.

Väljalasketoru (4.1) klapp avatakse, väävelhape filtreeritakse vaakumitingimustel läbi filtertiigli ning jääki pestakse kolm korda järjest 30 ml keeva veega, tagades, et pärast iga pesemist filtreeritakse jääk kuivaks.

Äravooluklapp suletakse ning ühendatud silindrisse ja tiiglisse valatakse 150 ml keevat kaaliumhüdroksiidi lahust (3.7) ning lisatakse mõned tilgad vahutamisvastast ainet (3.2). Vedelik aetakse keema 5 ± 2 minutiga ja keedetakse tugevalt täpselt 30 minutit. Filtreeritakse ja korratakse pesemisprotseduuri, mida kasutati väävelhappe juures.

Pärast lõplikku pesemist ja kuivatamist ühendatakse tiigel ja selle sisu lahti ning ühendatakse see külmekstraheerimisseadmega (4.6). Jääki pestakse tiiglis vaakumitingimustel kolm korda järjest 25 ml atsetooniga (3.4), tagades, et pärast iga pesemist filtreeritakse jääk kuivaks.

Tiigel kuivatakse püsikaaluni kuivatuskapis temperatuuril 130 oC. Pärast iga kuivatamist jahutatakse tiiglit eksikaatoris ja kaalutakse kiiresti. Tiigel asetatakse muhvelahju ja tuhastatakse püsikaaluni (massikadu peab kahe järjestikuse kaalumise vahel olema 2 mg või alla selle) temperatuuril 475 oC kuni 500 oC vähemalt 30 minutit.

Pärast iga kuumutamist jahutatakse tiiglit enne kaalumist kõigepealt ahjus ja seejärel eksikaatoris.

Teostatakse ilma proovita pimekatse. Tuhastamisest tingitud massikadu ei tohi olla üle 4 mg.

6.   Tulemuste arvutamine

Kogu kiu sisaldus arvutatakse protsendimäärana proovist järgmise valemi abil:

kus:

m

=

proovi mass grammides;

m0

=

massikadu pärast tuhastamist määramise ajal, grammides;

m1

=

massikadu pärast tuhastamist pimekatse ajal, grammides.

7.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

8.   Tähelepanekud

J.   SUHKRU MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata redutseerivate suhkrute hulka ja pärast inversiooni üldsuhkru hulka, väljendatuna glükoosina või sõltuvalt olukorrast sahharoosina, kasutades ümberarvestustegurit 0,95 . Seda meetodit kasutatakse segajõusöötade puhul. Muude söötade puhul on sätestatud erimeetodid. Vajaduse korral tuleb laktoosi hulk mõõta eraldi ja tulemuste arvutamisel seda arvesse võtta.

2.   Põhimõte

Suhkrud ekstraheeritakse lahjendatud etanoolis; lahus selitatakse Carrezi lahustega I ja II. Pärast etanooli eemaldamist määratakse kogused enne ja pärast inversiooni Luff-Schoorli meetodi abil.

3.   Reaktiivid

Ettevaatlikult segades valatakse sidrunhappe lahus (3.8.2) naatriumkarbonaadi lahusesse (3.8.3). Lisatakse vasksulfaadi lahus (3.8.1) ja ja täidetakse veega 1 liitrini. Lastakse öö läbi settida ja filtreeritakse.

Selliselt saadud reaktiivi kontsentratsioooni (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 1 mol/l) kontrollitakse, vt punkti 5.4 viimast lõiku. Lahuse pH on umbes 9,4 .

4.   Seadmed

Segisti (trummel): umbes 35 kuni 40 p/min.

5.   Töö käik

5.1.   Proovi ekstraheerimine

2,5 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 250 ml mõõtekolbi. Lisatakse 200 ml etanooli (3.1) ning segatakse trumlis tund aega. Lisatakse 5 ml Carrezi lahust I (3.2) ja segatakse umbes 30 sekundit. Lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.3) ja segatakse veel üks minut. Täidetakse etanooliga (3.1) märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse. Eemaldatakse 200 ml filtraati ja aurustatakse ligikaudu poole mahuni, et vabaneda enamikust etanoolist. Aurustamise jääk kantakse sooja vett kasutades kvantitatiivselt 200 ml mõõtekolbi, jahutatakse, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja vajaduse korral filtreeritakse. Seda lahust kasutatakse redutseerivate suhkrute hulga ja pärast inversiooni üldsuhkru hulga määramiseks.

5.2.   Redutseerivate suhkrute määramine

Pipetiga eemaldatakse kuni 25 ml lahust, mis sisaldab alla 60 mg redutseerivaid suhkruid, mis on väljendatud glükoosina. Vajaduse korral täidetakse destilleeritud veega 25 ml-ni ja määratakse redutseerivate suhkrute hulk Luff-Schoorli meetodi abil. Tulemus väljendatakse glükoosisisalduse protsendimäärana proovist.

5.3.   Üldsuhkru määramine pärast inversiooni

Pipetiga võetakse 50 ml lahust ja kantakse see 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse mõni tilk metüüloranži lahust (3.4) ning seejärel lisatakse hoolikalt ja samal ajal pidevalt segades soolhapet (3.5), kuni vedelik värvub selgelt punaseks. Lisatakse 15 ml soolhapet (3.6), asetatakse kolb tugevalt keeva veega vanni ning hoitakse seal 30 minutit. Jahutatakse kiiresti umbes 20 oC-ni ja lisatakse 15 ml naatriumhüdroksiidi lahust (3.7). Täidetakse veega 100 ml-ni ja homogeenitakse. Eemaldatakse kuni 25 ml lahust, mis sisaldab alla 60 mg redutseerivaid suhkruid, mis on väljendatud glükoosina. Vajaduse korral täidetakse destilleeritud veega 25 ml-ni ja määratakse redutseerivate suhkrute hulk Luff-Schoorli meetodi abil. Tulemus väljendatakse glükoosi protsendimäärana või sõltuvalt olukorrast sahharoosi protsendimäärana, korrutades tulemuse teguriga 0,95 .

5.4.   Tiitrimine Luff-Schoorli meetodi järgi

Pipetiga võetakse 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.8) ja kantakse see 300 ml Erlenmeyeri kolbi; lisatakse täpselt 25 ml selitatud suhkrulahust. Lisatakse 2 pimsskivigraanulit (3.13), kuumutatakse käsitsi segades keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja segu kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Erlenmeyeri kolb asetatakse viivitamatult asbestkattega traatvõrgule, milles on umbes 6 cm läbimõõduga auk ning mille all on eelnevalt süüdatud leek. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutataks üksnes Erlenmeyeri kolvi põhja. Erlenmeyeri kolvi külge pannakse püstjahuti. Keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitritakse järgmiselt.

Lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.12) ja kohe seejärel lisatakse (intensiivse vahutamise ohu tõttu ettevaatlikult) 25 ml väävelhapet (3.11). Tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (3.9) kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, lisatakse tärkliseindikaator (3.10) ja viiakse tiitrimine lõpule.

Sama tiitrimine ilma keetmata tehakse seguga, milles on täpselt mõõdetud 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.8) ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.12) ja 25 ml väävelhapet (3.11).

6.   Tulemuste arvutamine

Tabeli abil määratakse glükoosi hulk milligrammides, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel väljendatuna naatriumtiosulfaadi milligrammides (0,1 mol/l). Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Erimenetlused

Homogeenitakse ja filtreeritakse. Etanool eemaldatakse punkti 5.1 kohaselt. Kui dekstriinitud tärklist ei ole, täidetakse destilleeritud veega kuni märgini.

8.   Tähelepanekud

Mõlemal juhul määratakse proovis sisalduv suhkur Luff-Schoorli meetodi abil ja arvutatakse glükoosi milligrammideks. Üks väärtus lahutatakse teisest ja vahe väljendatakse protsendimäärana proovist.

Näide

Võetud kogused vastavad mõlema määramise puhul 250 mg massiga proovile.

Esimesel juhul tarbitakse 17 ml naatriumtiosulfaadi lahust (0,1 mol/l), mis vastab 44,2 mg glükoosile; teisel juhul tarbitakse 11 ml, mis vastab 27,6 mg glükoosile.

Vahe on 16,6 mg glükoosi.

Redutseerivate suhkrute (v.a laktoosi) sisaldus glükoosiks arvutatuna on seega:

K.   LAKTOOSI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata laktoosi taset söödas, mis sisaldab laktoosi üle 0,5 %.

2.   Põhimõte

Suhkrud lahustatakse vees. Lahus kääritatakse Saccharomyces cerevisiae pärmiga, mis jätab laktoosi esialgsele kujule. Pärast selitamist ja filtreerimist määratakse filtraadi laktoosisisaldus Luff-Schoorli meetodi abil.

3.   Reaktiivid

Ettevaatlikult segades valatakse sidrunhappe lahus (3.4.2) naatriumkarbonaadi lahusesse (3.4.3). Lisatakse vasksulfaadi lahus (3.4.1) ja täidetakse veega 1 liitrini. Lastakse öö läbi settida ja filtreeritakse. Selliselt saadud reaktiivi kontsentratsioooni (Cu 0,05 mol/l; Na2 CO3 2 mol/l). Lahuse pH on umbes 9,4 .

4.   Seadmed

Temperatuurile 38–40 oC seatud termostaadiga veevann.

5.   Töö käik

1 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse selline kogus proovi 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25–30 ml vett. Kolb asetatakse kolmekümneks minutiks keeva vee vanni ning jahutatakse seejärel umbes 35 oC-ni. Lisatakse 5 ml pärmisuspensiooni (3.1) ja homogeenitakse. Lastakse kolvil seista kaks tundi veevannis temperatuuril 38–40 oC. Jahutatakse umbes 20 oC-ni.

Lisatakse 2,5 ml Carrezi lahust I (3.2) ja segatakse 30 sekundit, seejärel lisatakse 2,5 ml Carrezi lahust II (3.3) ja segatakse veel 30 sekundit. Täidetakse veega 100 milliliitrini, segatakse ja filtreeritakse. Pipetiga eemaldatakse filtraadikogus, mis ei ületa 25 ml ja mis soovitavalt sisaldab 40–80 mg laktoosi, ning kantakse see 300 ml Erlenmeyeri kolbi. Vajaduse korral täidetakse veega 25 ml-ni.

5 ml pärmisuspensiooniga (3.1) tehakse samal viisil pimekatse. Laktoosisisaldus määratakse Luff-Schoorli meetodi abil järgmiselt: lisatakse täpselt 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.4) ja kaks pimsskivigraanulit (3.5). Segatakse käsitsi keskmise kõrgusega lahtise leegi kohal ja segu kuumutatakse keemiseni umbes kahe minuti jooksul. Erlenmeyeri kolb asetatakse viivitamatult asbestkattega traatvõrgule, milles on umbes 6 cm läbimõõduga auk ning mille all on eelnevalt süüdatud leek. Leeki reguleeritakse nii, et kuumutataks üksnes Erlenmeyeri kolvi põhja. Erlenmeyeri kolvi külge pannakse püstjahuti. Keedetakse täpselt kümme minutit. Jahutatakse kohe külmas vees ja umbes viie minuti möödudes tiitritakse järgmiselt.

Lisatakse 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.6) ja kohe seejärel lisatakse (intensiivse vahutamise ohu tõttu ettevaatlikult) 25 ml väävelhapet (3.7). Tiitritakse naatriumtiosulfaadi lahusega (3.8) kuni kahvatukollase värvuse tekkimiseni, lisatakse tärkliseindikaator (3.9) ja viiakse tiitrimine lõpule.

Sama tiitrimine ilma keetmata tehakse seguga, milles on täpselt mõõdetud 25 ml Luff-Schoorli reaktiivi (3.4) ja 25 ml vett ning millele on eelnevalt lisatud 10 ml kaaliumjodiidi lahust (3.6) ja 25 ml väävelhapet (3.7).

6.   Tulemuste arvutamine

Juuresoleva tabeli abil määratakse laktoosi hulk milligrammides, mis vastab erinevusele kahe tiitrimise tulemuste vahel väljendatuna naatriumtiosulfaadi milligrammides (0,1 mol/l).

Veevabale laktoosile vastav tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Tähelepanek

Toodete puhul, mis sisaldavad üle 40 % fermenteeritavat suhkrut, kasutatakse rohkem kui 5 ml pärmisuspensiooni (3.1).

L.   TÄRKLISE MÄÄRAMINE

POLARIMEETRILINE MEETOD

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodi abil on võimalik kindlaks määrata tärklise ja suure molekulmassiga tärklise lagunemisproduktide taset söödas, et kontrollida deklareeritud energiasisalduse (VII lisa sätted) ja nõukogu direktiivi 96/25/EÜ ( 10 ) järgimist.

2.   Põhimõte

Meetod hõlmab kahte määramist. Esimese puhul töödeldakse proovi lahjendatud soolhappega. Pärast selitamist ja filtreerimist mõõdetakse polarimeetrilisel teel lahuse optiline pöörang.

Teise määramise puhul ekstraheeritakse proovi 40 % etanooliga. Pärast filtraadi hapestamist soolhappega, selitamist ja filtreerimist mõõdetakse lahuse optiline pöörang esimese määramisega analoogsel viisil.

Proovi tärklisesisaldus saadakse nimetatud kahe määramise vahe korrutamisel teadaoleva koefitsiendiga.

3.   Reaktiivid

Kontsentratsiooni tuleb kontrollida tiitrimise teel, kasutades 0,1 mol/l naatriumhüdroksiidi lahust koos 0,1 % (w/v) metüülpunasega 94 % etanoolis (v/v). 10 ml neutraliseerimiseks on vaja 30,94 ml NaOH (0,1 mol/l).

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Proovi ettevalmistamine

Peenestada proov nii, et see läbib täielikult 0,5 mm ümaravadega sõela.

5.2.   Polarisatsioonitasandi optilise kogupöörangu (P või S) määramine (vt tähelepanek 7.1)

2,5 g peenestatud proovi kaalutakse 1 mg täpsusega ning pannakse see 100 ml mõõtekolbi. Lisatakse 25 ml soolhapet (3.2), loksutatakse proovi ühtlase jaotumise saavutamiseks ning lisatakse veel 25 ml soolhapet (3.2). Kolb asetatakse keeva vee vanni, loksutades seda esimesed kolm minutit tugevasti ja ühtlaselt, et vältida klompide teket. Vannis peab olema piisavalt vett, et vesi säilitaks kolvi vanni asetamisel keemistemperatuuri. Kolbi ei tohi loksutamise ajal vannist välja võtta. Täpselt 15 minuti möödudes võetakse kolb vannist välja, lisatakse 30 ml külma vett ja jahutatakse otsekohe temperatuurini 20 oC.

Lisatakse 5 ml Carrezi lahust I (3.3) ja loksutatakse umbes 30 sekundit. Seejärel lisatakse 5 ml Carrezi II lahust (3.4) ja jätkatakse loksutamist veel 30 sekundi jooksul. Täidetakse veega märgini, segatakse ja filtreeritakse. Kui filtraat ei ole täiesti selge (seda juhtub harva), korratakse määramist, kasutades rohkem Carrezi I ja II lahust (näiteks 10 ml).

Lahuse optiline pöörang mõõdetakse 200 mm torus polarimeetri või sahharimeetri abil.

5.3.   4 % etanoolis lahustuvate ainete optilise pöörangu (P' või S') määramine

5 g proovi kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse see 100 ml mõõtekolbi ning lisatakse umbes 80 ml etanooli (3.5) (vt tähelepanek 7.2). Kolb jäetakse üheks tunniks toatemperatuurile seisma; selle aja jooksul loksutatakse kolbi kuus korda tugevasti, nii et proov seguneks põhjalikult etanooliga. Täidetakse etanooliga (3.5) märgini, segatakse ja filtreeritakse.

50 ml filtraati (vastab 2,5 g proovile) pipetitakse 250 ml Erlenmeyeri kolbi, lisatakse 2,1 ml soolhapet (3.1) ja loksutatakse tugevasti. Püstjahuti ühendatakse Erlenmeyeri kolviga ja kolb asetatakse keeva vee vanni. Täpselt 15 minuti möödudes eemaldatakse Erlenmeyeri kolb vannist, viiakse selle sisu 100 ml mõõtekolbi, loputatakse vähese külma veega ja jahutatakse temperatuurini 20 oC.

Selitatakse Carrezi I (3.3) ja II (3.4) lahuse abil, täidetakse veega märgini, segatakse, filtreeritakse ja mõõdetakse optiline pöörang punkti 5.2 teises ja kolmandas lõigus kirjeldatud viisil.

6.   Tulemuste arvutamine

Tärklisesisaldus (%) arvutatakse järgmiselt:

6.1.   Mõõtmine polarimeetriga

P

=

optiline kogupöörang kraadides

P’

=

40 % etanoolis (v/v) lahustuvate ainete optiline pöörang kraadides;

=

puhta tärklise optiline eripöörang. Selle teguri puhul tavaliselt aktsepteeritavad arvulised väärtused on järgmised: +185,9 o: riisitärklis +185,7 o: kartulitärklis +184,6 o: maisitärklis +182,7 o: nisutärklis +181,5 o: odratärklis +181,3 o: kaeratärklis +184,0 o: muud tärkliseliigid ja tärklisesegud segajõusöödas

6.2.   Mõõtmine sahharimeetriga

S

=

optiline kogupöörang sahharimeetri kraadides

S'

=

40 % etanoolis (v/v) lahustuvate ainete optiline pöörang sahharimeetri kraadides

N

=

sahharoosi mass (grammides) 100 ml vees, mis annab optiliseks pööranguks 100 sahharimeetri kraadi, kui mõõtmisel kasutatakse 200 mm toru: 16,29 g prantsuse sahharimeetrite puhul; 26,00 g saksa sahharimeetrite puhul; 20,00 g muude sahharimeetrite puhul; = puhta tärklise optiline eripöörang (vt punkt 6.1).

6.3.   Korratavus

Sama prooviga läbi viidud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevuse absoluutväärtus ei tohi alla 40 % tärklisesisalduse puhul ületada 0,4 ning suhteline erinevus 40 % või suurema tärklisesisalduse puhul 1 %.

7.   Tähelepanekud

M.   KOGUTUHA MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata sööda kogutuha sisaldust.

2.   Põhimõte

Proov tuhastatakse 550 oC juures; jääk kaalutakse.

3.   Reaktiivid

Ammooniumnitraadi 20 % lahus (w/v)

4.   Seadmed

5.   Töö käik

Umbes 5 g proovi (toodete puhul, millel on kalduvus paisuda, 2,5 g) kaalutakse 1 mg täpsusega, pannakse tuhastamistiiglisse, mis on eelnevalt kuumutatud temperatuurini 550 oC, maha jahutatud ja tareeritud. Tiigel asetatakse kuumutusplaadile ja kuumutatakse järk-järgult kuni aine söestumiseni. Tuhastatakse vastavalt punktile 5.1 või 5.2.

6.   Tulemuste arvutamine

Jäägi massi arvutamiseks lahutatakse nõu mass.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Tähelepanekud

N.   SOOLHAPPES LAHUSTUMATU TUHA MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata soolhappes lahustumatute mineraalainete taset söödas. Proovi laadist sõltuvalt võib kasutada kahte meetodit.

2.   Põhimõte

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Meetod A

Proov tuhastatakse kogutuha määramiseks ettenähtud meetodi järgi. Kasutada võib ka kõnealusel analüüsil saadud tuhka.

Tuhk pannakse 250–400 ml keeduklaasi, kasutades 75 ml soolhapet (3.1). Segu aetakse aeglaselt keema ja keedetakse vaikselt 15 minutit. Soe lahus filtreeritakse läbi tuhavaba filterpaberi ja jääk pestakse sooja veega, kuni happe reaktsioon ei ole enam nähtav. Filter jäägiga kuivatatakse ja tuhastatakse tareeritud tiiglis temperatuuril mitte alla 550 oC ja mitte üle 700 oC. Jahutatakse eksikaatoris ja kaalutakse.

5.2.   Meetod B

Umbes 5 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 250–400 ml keeduklaasi. Lisatakse üksteise järel 25 ml vett ja 25 ml soolhapet (3.1), segatakse ning oodatakse, kuni kihisemine on lõppenud. Lisatakse veel 50 ml soolhapet (3.1). Oodatakse gaaside eraldumise lõppemiseni, seejärel asetatakse keeduklaas keeva vee vanni ja hoitakse seal kolmkümmend minutit või vajaduse korral kauem lahuses sisalduva tärklise täielikuks hüdrolüüsiks. Filtreeritakse soojalt läbi tuhavaba filtri ning filter pestakse 50 ml soojas vees (vt tähelepanek 7). Filter jäägiga asetatakse tuhastamiseks ettenähtud tiiglisse, kuivatatakse ja tuhastatakse temperatuuril mitte alla 550 oC ja mitte üle 700 oC. Tuhk pannakse 250–400 ml keeduklaasi, kasutades 75 ml soolhapet (3.1); jätkatakse vastavalt punkti 5.1 teisele lõigule.

6.   Tulemuste arvutamine

Jäägi massi arvutamiseks lahutatakse nõu mass. Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

7.   Tähelepanek

Kui filtreerimine osutub raskeks, tehakse analüüs uuesti, sealjuures asendatakse 50 ml soolhapet (3.1) 50 ml 20 % trikloroäädikhappega (3.2) ja pestakse filter soojas 1 % trikloroäädikhappe lahuses (3.3).

O.   KARBONAATIDE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata harilikult kaltsiumkarbonaadina väljendatavate karbonaatide sisaldust enamikus söötades.

Teatavatel juhtudel (näiteks raudkarbonaadi puhul) tuleb kasutada erimeetodit.

2.   Põhimõte

Karbonaadid lagundatakse soolhappes; tekkiv süsinikdioksiid kogutakse büretti ja gaasi ruumala võrreldakse ruumalaga, mis tekib samadel tingimustel teadaolevast kogusest kaltsiumkarbonaadist.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

Scheibler-Dietrichi aparaat (vt joonis) või samaväärne aparaat.

5.   Töö käik

Sõltuvalt proovi karbonaadisisaldusest, kaalutakse järgmine osa proovist:

Proovi osa pannakse aparaadi spetsiaalsesse kolbi (4), mille küljes on väike purunematust materjalist toru ja mis sisaldab 10 ml soolhapet (3.1), ning kolb ühendatakse aparaadiga. Kraan (5) keeratakse nii, et toru (1) oleks ühenduses välisõhuga. Kasutades tõstetavat toru (2), mis on täidetud värvitud väävelhappega (3.3) ja ühendatud büreti (1) külge, viiakse vedeliku tase nullmärgini. Torude (1) ja (3) ühendamiseks keeratakse kraani (5) ning kontrollitakse, et vedeliku tase on nullis.

Soolhape (3.1) juhitakse kolbi (4) kallutades aeglaselt proovi osa peale. Rõhu võrdsustamiseks langetatakse toru (2). Kolbi (4) raputatakse, kuni süsinikdioksiidi eraldumine on täielikult lõppenud.

Rõhu taastamiseks viiakse vedelik torudes (1) ja (2) samale tasemele. Mõne minuti möödudes, kui gaasi hulk on konstantne, loetakse tulemus.

Samades tingimustes tehakse kontrollkatse 0,5 g kaltsiumkarbonaadiga (3.2).

6.   Tulemuste arvutamine

Kaltsiumkarbonaadina väljendatud karbonaatide sisaldus arvutatakse järgmise valemi abil:

kus:

X

=

kaltsiumkarbonaadina väljendatud karbonaatide protsendimäär (w/w) proovis;

V

=

proovi osast saadud CO2 milliliitrites;

V1

=

0,5 g CaCO3-st saadud CO2 milliliitrites;

m

=

proovi osa mass grammides.

7.   Tähelepanekud

P.   ÜLDFOSFORI MÄÄRAMINE

FOTOMEETRILINE MEETOD

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata üldfosfori sisaldust söötades. See sobib eriti hästi väikese fosforisisaldusega toodete analüüsimiseks. Teatavatel juhtudel (suure fosforisisaldusega toodete puhul) võib kasutada gravimeetrilist meetodit.

2.   Põhimõte

Proov mineraliseeritakse kas kuivtuhastamise (orgaanilise sööda puhul) või märgtuhastamise (mineraalsete ühendite ja vedelsööda puhul) teel ja pannakse happelahusesse. Lahust töödeldakse molübdovanadaatreaktiiviga. Sel viisil saadud kollase lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Lahuse valmistamine

Sõltuvalt proovi laadist valmistatakse lahus punkti 5.1.1 või 5.1.2 kohaselt.

5.1.1.    Tavaline menetlus

1 g või rohkem proovi kaalutakse täpsusega 1 mg. Uuritav proov pannakse Kjeldahli kolbi, lisatakse 20 ml väävelhapet (3.5), raputatakse, et aine seguneks täielikult happega ja et see ei sadestuks kolvi seinte külge, kuumutatakse ja hoitakse 10 minutit keemistemperatuuril. Lastakse veidi jahtuda, lisatakse 2 ml lämmastikhapet (3.4), kuumutatakse kergelt, lastakse veidi jahtuda, lisatakse veel veidi lämmastikhapet (3.4) ja viiakse tagasi keemistemperatuurile. Menetlust korratakse värvusetu lahuse saamiseni. Jahutatakse, lisatakse veidi vett, vedelik dekanteeritakse 500 ml mõõtekolbi, loputades Kjeldahli kolbi sooja veega. Lastakse jahtuda, täidetakse kuni märgini veega, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.1.2.    Proovid, mis sisaldavad orgaanilisi aineid ja milles ei leidu kaltsiumdivesinikfosfaati ega magneesiumdivesinikfosfaati

Tuhastustiiglisse pannakse umbes 2,5 g proovi, mis on kaalutud 1 mg täpsusega. Uuritavat proovi segatakse, kuni see on täielikult segunenud 1g kaltsiumkarbonaadiga (3.1). Tuhastatakse temperatuurile 550 oC seatud kuivatuskapis kuni valge või halli tuha saamiseni (võib sisaldada veidi sütt). Tuhk pannakse 250 ml keeduklaasi. Lisatakse 20 ml vett ja soolhapet (3.2) kuni kihisemise lakkamiseni. Lisatakse veel 10 ml soolhapet (3.2). Keeduklaas pannakse liivavannile ja aurustatakse kuivaks, et silikaadid muutuksid lahustumatuks. Jääk lahustatakse uuesti 10 ml lämmastikhappes (3.3) ja keedetakse liivavannil või kuumutusplaadil 5 minutit, ilma et see kuivaks aurustuks. Vedelik dekanteeritakse 500 ml mõõtekolbi, loputades keeduklaasi mitu korda kuuma veega. Lastakse jahtuda, täidetakse kuni märgini veega, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.2.   Värvuse arendamine ja optilise tiheduse mõõtmine

Punkti 5.1.1 või 5.1.2 kohaselt saadud filtraadi alikvoot lahjendatakse nii, et fosfori kontsentratsioon oleks kuni 40 μg/ml. 10 ml seda lahust pannakse katseklaasi (4.6) ja lisatakse 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6). Homogeenitakse ja lastakse seista temperatuuril 20 oC vähemalt 10 minutit. Saadud lahuse optilist tihedust mõõdetakse spektrofotomeetriga lainepikkusel 430 nm, lisades 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6) 10 ml veele.

5.3.   Kalibreerimiskõver

Standardlahusest (3.7) valmistatakse lahused, mis sisaldavad 1 ml kohta 5, 10, 20, 30 ja 40 μg fosforit. Igast lahusest võetakse 10 ml ja lisatakse sellele 10 ml molübdovanadaatreaktiivi (3.6). Homogeenitakse ja lastakse seista temperatuuril 20 oC vähemalt 10 minutit. Optiline tihedus mõõdetakse punkti 5.2 kohaselt. Optiliste tiheduste ja vastavate fosforikoguste põhjal joonestatakse kalibreerimiskõver. Kontsentratsioonide puhul, mis jäävad vahemikku 0–40 μg/ml, on kõver lineaarne.

6.   Tulemuste arvutamine

Uuritavas proovis sisalduv fosforikogus määratakse kalibreerimiskõvera abil.

Tulemus väljendatakse protsendimäärana proovist.

Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

Q.   KLORIIDIDEST PÄRIT KLOORI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata kloori kogust vees lahustuvates kloriidides, mida harilikult väljendatakse naatriumkloriidina. Meetodit kasutatakse kõigi söötade puhul.

2.   Põhimõte

Kloriidid lahustatakse vees. Kui toode sisaldab orgaanilisi aineid, see selitatakse. Lahus hapestatakse kergelt lämmastikhappega ja kloriidid sadestatakse hõbekloriidina hõbenitraadilahuse abil. Hõbenitraadi ülekogus tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega, kasutades Volhardi meetodit.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

Segisti (trummel): umbes 35 kuni 40 p/min.

5.   Töö käik

5.1.   Lahuse valmistamine

Sõltuvalt proovi laadist valmistatakse lahus punkti 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kohaselt.

Samal ajal tehakse pimekatse, jättes välja analüüsitava proovi.

5.1.1.    Proovid, mis ei sisalda orgaanilisi aineid

Alla 10 g proovi, mis ei sisalda kloriididena rohkem kui 3 g kloori, kaalutakse täpsusega 1 mg. See pannakse 400 ml veega 500 ml mõõtekolbi temperatuuril ligikaudu 20 oC. Segatakse trumlis 30 minutit, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.1.2.    Orgaanilist ainet sisaldavad proovid, välja arvatud punktis 5.1.3 loetletud tooted

Umbes 5 g proovi kaalutakse täpsusega 1 mg ja pannakse 1 g aktiivsöega 500 ml mõõtekolbi. Lisatakse 400 ml vett temperatuuriga ligikaudu 20 oC ja 5 ml Carrezi lahust I (3.7), segatakse ning lisatakse 5 ml Carrezi lahust II (3.8). Segatakse trumlis 30 minutit, täidetakse veega kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.1.3.    Kuumtöödeldud söödad, linakoogid ja -jahu, linajahurikkad tooted ja muud taimeliimi- või kolloidaineterikkad tooted (näiteks dekstriinitud tärklis)

Lahus valmistatakse punkti 5.1.2 kohaselt, kuid seda ei filtreerita. Dekanteeritakse (vajaduse korral tsentrifuugitakse), eemaldatakse 100 ml supernatanti ja kantakse 200 ml mõõtekolbi. Segatakse atsetooniga (3.6), täidetakse lahustiga kuni märgini, homogeenitakse ja filtreeritakse.

5.2.   Tiitrimine

Sõltuvalt arvatavast kloorisisaldusest kantakse pipeti abil Erlenmeyeri kolbi 25–100 ml punkti 5.1.1, 5.1.2 või 5.1.3 kohaselt saadud filtraati. Alikvoot ei tohi sisaldada rohkem kui 150 mg kloori (Cl). Vajaduse korral lahjendatakse vähemalt 50 ml veega, lisatakse 5 ml lämmastikhapet (3.4), 20 ml ammooniumraudsulfaadi küllastunud lahust (3.3) ja nullmärgini täidetud büreti abil kaks tilka ammooniumtiotsüanaadi lahust (3.1). Büreti abil lisatakse hõbenitraadi lahust (3.2), nii et saadakse ülekogus 5 ml. Lisatakse 5 ml dietüüleetrit (3.5) ja loksutatakse tugevalt sademe koaguleerimiseks. Hõbenitraadi ülekogus tiitritakse ammooniumtiotsüanaadi lahusega (3.1), kuni punakaspruun värvus püsib ühe minuti.

6.   Tulemuste arvutamine

Koriini (X) kogus, väljendatuna protsendimäärana naatriumkloriidist, arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

V1

=

lisatud 0,1 mol/l hõbenitraadi lahuse kogus milliliitrites;

V2

=

tiitrimiseks kasutatud 0,1 mol/l ammooniumtiotsüanaadi lahuse kogus milliliitrites;

m

=

proovi mass.

Kui pimekatse näitab 0,1 mol/l hõbenitraadi lahuse tarbimist, lahutatakse see väärtus kogusest (V1 – V2).

7.   Tähelepanekud

---

IV LISA

SÖÖDAS LUBATUD SÖÖDALISANDITE TASEME KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A.   A-VITAMIINI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata A-vitamiini (retinooli) kogust söödas ja eelsegudes. A-vitamiini all mõistetakse täielikult trans-konfiguratsioonis retinüülalkoholi ja selle cis-isomeere, nii nagu need määratakse käesoleva meetodiga. A-vitamiini sisaldust väljendatakse rahvusvahelistes ühikutes (RÜ) kilogrammi kohta. Üks RÜ vastab 0,300 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkoholi või 0,344 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini atsetaadi või 0,550 μg täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini palmitaadi aktiivsusele.

Kvantifikatsiooni piir on 2 000 RÜ A-vitamiini kilogrammi kohta.

2.   Põhimõte

Proov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja A-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. A-vitamiini sisaldus määratakse pööratud faasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit. Kromatograafilised parameetrid valitakse nii, et täielikult trans-konfiguratsioonis A-vitamiini alkohol ja selle cis-isomeerid jääksid lahutamata.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

Märkus:

A-vitamiin on tundlik (UV-) valguse ja oksüdeerumise suhtes. Kõik toimingud tuleb teostada valguse ja hapniku juurdepääsuta (kasutades tumedast klaasist või alumiiniumfooliumiga kaetud nõusid ja voolutades lämmastikuga). Ekstraheerimise ajal tuleb vedeliku kohal olev õhk asendada lämmastikuga (ülerõhu vältimiseks tuleb korki aeg-ajalt kergitada).

5.1.   Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1 mm avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda A-vitamiini kadusid.

5.2.   Seebistamine

500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) kaalutakse 1 mg täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt A-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (3.1), umbes 100 mg BHT (3.13), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (3.6). Kolvi otsa ühendatakse tagasivoolujahuti (4.3) ja kolb pannakse magnetseguriga veevanni (4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.

5.3.   Ekstraheerimine

Seebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (3.1) ja 100 ml petrooleetriga (3.2) ja viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peab olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.

5.3.1.    Ekstraheerimine jaotuslehtriga (4.2.3)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (3.2).

Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergelt loksutades (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100 ml veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100 ml veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtreeritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (4.4) 500 ml mõõtekolbi (4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (3.2), täidetakse petrooleetriga (3.2) märgini ja segatakse hästi.

5.3.2.    Ekstraheerimine ekstraktsiooniseadmega (4.8)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), pannakse klaassilindri (4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (3.2), siis kaks korda 50 ml petrooleetri (3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.

Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.

5.4.   Proovilahuse valmistamine HPLC jaoks

Petrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250 ml pirnkolbi (4.2.4). Vaakumpöördaurustiga (4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks veevanni temperatuuril mitte üle 40 oC. Kolbi lastakse lämmastik (3,10 ) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumpöördaurustist. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.10) voolutades ja jääk lahustatakse kohe teadaoleva koguse (10–100 ml) metanooliga (3.3) (A-vitamiini kontsentratsioon peab jääma vahemikku 5–30 RÜ/ml).

5.5.   Määramine HPLC-ga

A-vitamiin eraldatakse C18 pöördfaaskolonnil (4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon UV-detektori (325 nm) või fluorestsentsdetektori (ergastamine: 325 nm, emissioon: 475 nm) (4.5.2) abil.

Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (3.9). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kalibreerimislahuste (5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).

HPLC tingimused

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).

5.6.   Kalibreerimine

5.6.1.    Standardtöölahuste ettevalmistamine

20 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (3.11.1) või 20 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (3.12.1) pipetitakse 500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktile 5.2, kuid ilma BHT-d lisamata. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (3.2) vastavalt punktile 5.3 ja täidetakse kuni 500 ml-ni petrooleetriga (3.2). 100 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumpöördaurustil (vt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3,10 ) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 10,0 ml metanooliga (3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 560 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Täpne sisaldus määratakse vastavalt punktile 5.6.3.3. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

2,0 ml kõnealust standardtöölahust pipetitakse 20 ml mõõtekolbi, täidetakse metanooliga (3.3) kuni märgini ja segatakse. Selle lahjendatud standardtöölahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini ml kohta.

5.6.2.    Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0 , 2,0 , 5,0 ja 10,0 ml lahjendatud standardtöölahust viiakse üle 20 ml mõõtekolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,8 , 5,6 , 14,0 ja 28,0 RÜ A-vitamiini ml kohta.

Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid) ja arvestades UV-kontrolli (5.6.3.3) tulemusi.

5.6.3.    Standardlahuste UV-standardiseerimine

5.6.3.1.    A-vitamiini atsetaadi põhilahus

2,0 ml A-vitamiini atsetaadi põhilahust (3.11.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. 3,0 ml A-vitamiini atsetaadi lahjendatud lahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E326 × 19,0

(

A-vitamiini atsetaadi puhul = 1 530 lainepikkusel 326 nm 2-propanoolis)

5.6.3.2.    A-vitamiini palmitaadi põhilahus

2,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust (3.12.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 56 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. 3,0 ml A-vitamiini palmitaadi põhilahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E326 × 19,0

(

A-vitamiini palmitaadi puhul = 957 lainepikkusel 326 nm 2-propanoolis)

5.6.3.3.    A-vitamiini standardtöölahus

3,0 ml A-vitamiini lahjendamata standardtöölahust, mis on valmistatud vastavalt punktile 5.6.1, pipetitakse 50 ml mõõtekolbi (4.2.2) ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. 5,0 ml seda lahust pipetitakse 25 ml mõõtekolbi ja täidetakse 2-propanooliga (3.8) märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 6,72 RÜ A-vitamiini milliliitri kohta. Spektrofotomeetriga (4.6) mõõdetakse selle lahuse UV-spekter 2-propanooli (3.8) suhtes vahemikus 300–400 nm. Ekstinktsioonimaksimum peab olema vahemikus 325–327 nm.

A-vitamiini sisalduse arvutamine:

RÜ A-vitamiini milliliitri kohta = E325 × 18,3

(

A-vitamiini alkoholi puhul = 1 821 lainepikkusel 325 nm 2-propanoolis)

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse A-vitamiini piigi keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kalibreerimisgraafiku (5.6.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon RÜ-des milliliitri kohta.

Proovi A-vitamiini sisaldus w RÜ-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

c

=

A-vitamiini kontsentratsioon proovilahuses (5.4) RÜ/ml;

V1

=

proovilahuse (5.4) kogus milliliitrites;

V2

=

vastavalt punktile 5.4 võetud alikvoodi kogus milliliitrites;

m

=

kaalutise mass grammides.

7.   Tähelepanekud

Et kontrollida rakendatud analüüsimeetodi tulemuste usaldusväärsust kõnealuse spetsiifilise põhiaine (piimaasendaja) puhul, tuleb täiendava kaalutisega teha saagisekatse. Kui saagise määr on alla 80 %, esitatakse analüüsi tulemus saagisekorrektsiooniga.

8.   Korratavus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % suuremast tulemusest.

9.   Ühisuuringu tulemused ( 11 )

L

=

laboratooriumide arv

n

=

üksikmääramiste arv

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

r

=

korratavus

R

=

reprodutseeritavus

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja

B.   E-VITAMIINI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata E-vitamiini kogust söödas ja eelsegudes. E-vitamiini sisaldust väljendatakse DL-α-tokoferoolatsetaadi milligrammides kilogrammi kohta. 1 mg DL-α-tokoferoolatsetaati vastab 0,91 mg DL-α-tokoferoolile (E-vitamiin).

Kvantifitseerimispiir on 2 mg E-vitamiini kilogrammi kohta. See kvantifitseerimispiir on saavutatav vaid fluorestsentsdetektoriga. UV-detektoriga on kvantifitseerimispiir 10 mg/kg.

2.   Põhimõte

Proov hüdrolüüsitakse kaaliumhüdroksiidi etanoolilahusega ja E-vitamiin ekstraheeritakse petrooleetrisse. Lahusti aurustatakse ja jääk lahustatakse metanoolis ning vajadusel lahjendatakse nõutud kontsentratsioonini. E-vitamiini sisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (RP-HPLC) meetodiga, kasutades UV- või fluorestsentsdetektorit.

3.   Reaktiivid

4.   Seadmed

5.   Töö käik

Märkus:

E-vitamiin on tundlik (UV-) valguse ja oksüdeerumise suhtes. Kõik toimingud tuleb teostada valguse ja hapniku juurdepääsuta (kasutades tumedast klaasist või alumiiniumfooliumiga kaetud nõusid ja voolutades lämmastikuga). Ekstraheerimise ajal tuleb vedeliku kohal olev õhk asendada lämmastikuga (ülerõhu vältimiseks tuleb korki aeg-ajalt kergitada).

5.1.   Proovi ettevalmistamine

Proov jahvatatakse kuumenemist vältides nii peeneks, et see läheks läbi 1 mm avadega sõela. Jahvatamine peab toimuma vahetult enne kaalumist ja seebistamist, vastasel juhul võib esineda E-vitamiini kadusid.

5.2.   Seebistamine

500 ml lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) kaalutakse 0,01 g täpsusega 2–25 g proovi, sõltuvalt E-vitamiini sisaldusest. Seejärel lisatakse ringliigutustega segades 130 ml etanooli (3.1), umbes 100 mg BHT (3.12), 2 ml naatriumaskorbaadi lahust (3.5) ja 2 ml naatriumsulfiidi lahust (3.6). Kolvi otsa ühendatakse jahuti (4.3) ja kolb pannakse magnetseguriga veevanni (4.7). Kuumutatakse keemiseni ja keedetakse tagasivoolujahuti all 5 minutit. Seejärel lisatakse läbi jahuti (4.3) 25 ml kaaliumhüdroksiidi lahust (3.4) ja lastakse segamisel keeda tagasivoolujahuti all veel 25 minutit, voolutades nõrgalt lämmastikuga. Seejärel loputatakse jahutit umbes 20 ml veega ja jahutatakse kolvi sisu toatemperatuurini.

5.3.   Ekstraheerimine

Seebistamislahus viiakse dekanteerimise teel kvantitatiivselt üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3) või ekstraktsiooniseadmesse (4.8), loputades kokku 250 ml veega. Seebistamiskolbi loputatakse järjest 25 ml etanooli (3.1) ja 100 ml petrooleetriga (3.2) ja viiakse ka need vedelikukogused üle jaotuslehtrisse või ekstraktsiooniseadmesse. Vee ja etanooli vahekord ühendatud lahuses peab olema umbes 2:1. Raputatakse tugevasti kaks minutit ja lastakse kaks minutit selgineda.

5.3.1.    Ekstraheerimine jaotuslehtriga (4.2.3)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), kantakse petrooleetri kiht üle teise jaotuslehtrisse (4.2.3). Seda ekstraheerimist korratakse kaks korda 100 ml petrooleetriga (3.2) ja kaks korda 50 ml petrooleetriga (3.2).

Ühendatud ekstrakte pestakse jaotuslehtris kergelt loksutades (et vältida emulsiooni tekkimist) kaks korda 100 ml veekogustega ja seejärel korduval raputamisel veel 100 ml veekogustega, kuni vesi ei muuda enam värvust fenoolftaleiini lahuse (3.7) lisamisel (tavaliselt piisab neljakordsest pesemisest). Emulgeerunud vee kõrvaldamiseks filtreeritakse pestud ekstrakt läbi kuiva faasieraldusfiltri (4.4) 500 ml mõõtekolbi (4.2.2). Jaotuslehtrit ja filtrit loputatakse 50 ml petrooleetriga (3.2), täidetakse petrooleetriga (3.2) märgini ja segatakse hästi.

5.3.2.    Ekstraheerimine ekstraktsiooniseadmega (4.8)

Kui kihid on eraldunud (vt tähelepanek 7.3), pannakse klaassilindri (4.8.1) korgi asemele lihviga klaasotsak (4.8.2) ja seatakse nihutatava toru U-kujuline alumine ots nii, et see oleks täpselt faaside eralduspinna kohal. Tõstes gaasivooliku kaudu kõrvaltorusse juhitava lämmastiku rõhku, viiakse ülemine petrooleetri kiht üle 1 000 ml jaotuslehtrisse (4.2.3). Klaassilindrisse lisatakse 100 ml petrooleetrit (3.2), suletakse korgiga ja raputatakse tugevasti. Kihtidel lastakse eralduda ja ülemine kiht viiakse üle jaotuslehtrisse nagu ennegi. Ekstraheerimist korratakse järgmise 100 ml petrooleetriga (3.2), siis kaks korda 50 ml petrooleetri (3.2) kogustega ja viiakse petrooleetri kihid üle jaotuslehtrisse.

Ühendatud petrooleetri ekstrakte pestakse, nagu on kirjeldatud punktis 5.3.1, ja jätkatakse, nagu seal on kirjeldatud.

5.4.   Proovilahuse valmistamine HPLC jaoks

Petrooleetri lahuse (punktist 5.3.1 või 5.3.2) alikvoot viiakse pipetiga 250 ml pirnkolbi (4.2.4). Vaakumpöördaurustiga (4.1) aurustatakse lahusti vaakumis peaaegu kuivaks veevanni temperatuuril mitte üle 40 oC. Kolbi lastakse lämmastik (3.9) kuni atmosfäärirõhuni ja kolb eemaldatakse vaakumpöördaurustist. Järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.9) voolutades ja jääk lahustatakse kohe teadaoleva koguse (10–100 ml) metanooliga (3.3) (DL-α-tokoferooli kontsentratsioon peab jääma vahemikku 5–30 μg/ml).

5.5.   Määramine HPLC-ga

E-vitamiin eraldatakse C18 pöördfaasikolonnil (4.5.1) ja mõõdetakse selle kontsentratsioon fluorestsentsdetektori (ergastamine: 295 nm, emissioon: 330 nm) (4.5.2) abil või UV-detektoriga (292 nm) (4.5.2).

Punktis 5.4 saadud metanoolilahuse alikvoot (nt 20 μl) süstitakse kolonni ja elueeritakse liikuva faasiga (3.8). Arvutatakse sama proovilahuse erinevate süstide keskmine piigi kõrgus (pindala) ja kalibreerimislahuste (5.6.2) mitme süsti keskmised piigi kõrgused (pindalad).

HPLC tingimused

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).

5.6.   Kalibreerimine (DL-α-tokoferoolatsetaat või DL-α-tokoferool)

5.6.1.    DL-α-tokoferoolatsetaadi standard

5.6.1.1.    Standardtöölahuse valmistamine

25 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.10.1) viiakse pipetiga 500-milliliitrisesse lamedapõhjalisse või koonilisse kolbi (4.2.1) ja hüdrolüüsitakse vastavalt punktis 5.2 kirjeldatule. Seejärel ekstraheeritakse petrooleetriga (3.2) vastavalt punktis 5.3 kirjeldatule ja täidetakse petrooleetriga 500 milliliitrini. 25 ml seda ekstrakti aurustatakse vaakumpöördaurustil (vt 5.4) peaaegu kuivaks, järelejäänud lahusti eemaldatakse lämmastikuga (3.9) voolutades ja jääk lahustatakse uuesti 25,0 ml metanooliga (3.3). Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 45,5 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 50 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

5.6.1.2.    Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0 , 2,0 , 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20-milliliitristesse mõõtkolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,5 , 5,0 , 10,0 ja 25,0 μg/ml DL-α-tokoferoolatsetaati, s.o 2,28 , 4,55 , 9,10 ja 22,8 μg/ml DL-α-tokoferooli.

Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid), koostatakse kalibreerimisgraafik.

5.6.1.3.    DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahuse (3.10.1) UV-standardiseerimine

5,0 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.10.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (3.1) suhtes.

Neeldumismaksimum peaks olema 284 nm:

= 43,6 etanoolis 284 nm juures

Sellisel lahjendusel peaks ekstinktsiooni väärtus olema vahemikus 0,84 –0,88 .

5.6.2.    DL-α-tokoferooli standard

5.6.2.1.    Standardtöölahuse valmistamine

2 ml DL-α-tokoferooli põhilahust (3.11.1) viiakse pipetiga 50 ml mõõtekolbi, lahustatakse metanoolis (3.3) ja täidetakse metanooliga märgini. Selle lahuse nominaalne kontsentratsioon on 40 μg DL-α-tokoferooli ml kohta, mis on ekvivalentne 44,0 μg DL-α-tokoferoolatsetaadiga ml kohta. Standardtöölahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

5.6.2.2.    Kalibreerimislahuste valmistamine ja kalibreerimisgraafiku koostamine

1,0 , 2,0 , 4,0 ja 10,0 ml standardtöölahust viiakse üle 20-milliliitristesse mõõtkolbidesse, täidetakse metanooliga (3.3) märgini ja segatakse. Nende lahuste nominaalsed kontsentratsioonid on 2,0 , 4,0 , 8,0 ja 20,0 μg/ml DL-α-tokoferooli, s.o 2,20 , 4,40 , 8,79 ja 22,0 μg/ml DL-α-tokoferoolatsetaati.

Igast kalibreerimislahusest süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse keskmised piigi kõrgused (pindalad). Kasutades keskmisi piigi kõrgusi (pindalasid), koostatakse kalibreerimisgraafik.

5.6.2.3.    DL-α-tokoferooli põhilahuse (3.11.1) UV-standardiseerimine

2,0 ml DL-α-tokoferoolatsetaadi põhilahust (3.11.1) lahjendatakse etanooliga 25,0 milliliitrini ja mõõdetakse spektrofotomeetriga (4.6) selle lahuse UV-spekter vahemikus 250–320 nm etanooli (3.1) suhtes. Neeldumismaksimum peaks olema 292 nm:

= 75,8 etanoolis 292 nm juures

Sellisel lahjendusel peab ekstinktsiooni väärtus olema 0,6 .

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse E-vitamiini piikide keskmisest kõrgusest (pindalast) määratakse kalibreerimisgraafiku (5.6.1.2 või 5.6.2.2) järgi proovilahuse kontsentratsioon μg-des milliliitri kohta (arvutatuna α-tokoferoolatsetaadina).

Proovi E-vitamiini sisaldus w mg-des kilogrammi kohta arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

c

=

E-vitamiini kontsentratsioon (α-tokoferoolatsetaadina) μg-des milliliitri kohta proovilahuses (5.4);

V1

=

proovilahuse (5.4) kogus milliliitrites;

V2

=

punktis 5.4 võetud alikvoodi ruumala milliliitrites;

m

=

kaalutise mass grammides.

7.   Tähelepanekud

8.   Korratavus

Sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada 15 % suuremast tulemusest.

9.   Ühisuuringu tulemused ( 12 )

L

=

laboratooriumide arv

n

=

üksikmääramiste arv

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

sR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

r

=

korratavus

R

=

reprodutseeritavus

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja

C.   MIKROELEMENTIDE RAUA, VASE, MANGAANI JA TSINGI MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata söödas mikroelemente: rauda, vaske, mangaani ja tsinki. Kvantifikatsioonipiirid on:

2.   Põhimõte

Proov lahustatakse soolhappes pärast võimaliku orgaanilise aine hävitamist. Elemendid raud, vask, mangaan ja tsink määratakse aatomabsorptsioonspektromeetriaga pärast asjakohast lahjendamist.

3.   Reaktiivid

Sissejuhatavad märkused

Reaktiivide ja analüütiliste lahuste ettevalmistamiseks kasutatakse katioonivaba vett, mis on saadud kas vee bidestilleerimisel borosilikaat- või kvartsklaasist destillaatoris või kahekordsel töötlemisel ioonvahetusvaikudega.

Reaktiivid peavad olema vähemalt analüütiliselt puhtad. Määratava elemendi puudumist tuleb kontrollida pimekatse abil. Vajaduse korral tuleb reaktiive täiendavalt puhastada.

Allpool kirjeldatud standardlahuste asemel võib kasutada müügil olevaid standardlahuseid, tingimusel, et neil on garantii ning neid on enne kasutamist kontrollitud.

4.   Seadmed

5.   Töö käik ( 13 )

5.1.   Orgaanilist ainet sisaldavad proovid

5.1.1.    Tuhastamine ja lahuse analüüsiks ettevalmistamine ( 14 )

Tuhka niisutatakse veega ja viiakse üle 250 ml keelduklaasi. Tiigel pestakse ligikaudu 5 ml soolhappega (3.1) ning soolhape lisatakse aeglaselt ja ettevaatlikult keeduklaasi (CO2 moodustumise tõttu võib tekkida tugev reaktsioon). Soolhape (3.1) lisatakse tilkhaaval ja loksutades kuni kihisemise lakkamiseni. Aurustatakse kuivaks, aeg-ajalt klaaspulgaga segades.

Järgmisena lisatakse jäägile 15 ml 6 mol/l soolhapet (3.2) ning ligikaudu 120 ml vett. Segatakse klaaspulgaga, mis jäetakse keeduklaasi, ning keeduklaas kaetakse kellaklaasiga. Segu lastakse aeglaselt keema ning hoitakse keemistemperatuuril, kuni lahustuvat tuhka ei ole enam näha. Filtreeritakse läbi tuhavaba filterpaberi ning filtraat kogutakse 250 ml mõõtekolbi. Keeduklaas ja filter pestakse 5 ml kuuma 6 mol/l soolhappega (3.2) ning kaks korda keeva veega. Mõõtekolb täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 mol/l).

Märkused

5.1.2.    Spektrofotomeetriline määramine

5.1.2.1.    Kalibreerimislahuste valmistamine

Iga määratava elemendi jaoks valmistatakse punktides 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ja 3.10.1 osutatud standardtöölahustest kalibreerimislahused, millest iga lahuse HCl kontsentratsioon on ligikaudu 0,5 mol/l ning (raua, mangaani ja tsingi korral) lantaankloriidi kontsentratsioon on samaväärne 0,1 % lantaaniga (w/v).

Valitud mikroelementide kontsentratsioonid peavad jääma kasutatava spektrofotomeetri tundlikkuse piiresse. Järgmistes tabelites on näitena esitatud tavapäraste kalibreerimislahuste koostised, kuid sõltuvalt kasutatava spektrofotomeetri tüübist ja tundlikkusest võib osutuda vajalikuks valida muud kontsentratsioonid.

Raud

Vask

Mangaan

Tsink

5.1.2.2.    Lahuse ettevalmistamine analüüsiks

Vase määramiseks saab vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahust tavaliselt kohe kasutada. Kui lahuse kontsentratsioon on vaja viia kalibreerimislahuste piiresse, võib lahuse alikvoodi pipettida 100 ml mõõtekolbi ning täita märgini 0,5 mol/l soolhappega (3.3).

Raua, mangaani ja tsingi määramiseks pipetitakse vastavalt punktile 5.1.1 valmistatud lahuse alikvoot 100 ml mõõtekolbi, lisatakse 10 ml lantaankloriidilahust (3.11) ning täidetakse märgini 0,5 mol/l soolhappega (3.3) (vt ka punkt 8 „Tähelepanekud”).

5.1.2.3.    Pimekatse

Pimekatse peab hõlmama kõiki protseduuri ettenähtud etappe, välja arvatud see, et proovimaterjal jäetakse välja. Pimekatsel ei tohi kasutada kalibreerimislahust 0.

5.1.2.4.    Aatomabsorptsiooni mõõtmine

Kalibreerimislahuste ja analüüsitava lahuse aatomabsorptsiooni mõõdetakse oksüdeerivat õhk-atsetüleenleeki kasutades järgmistel lainepikkustel:

Iga mõõtmist tuleb teha neli korda.

5.2.   Mineraalsööt

Kui proov ei sisalda orgaanilist ainet, ei ole eelnev tuhastamine vajalik. Toimitakse vastavalt punkti 5.1.1.1, alustades teisest lõigust. Vesinikfluoriidhappega aurustamise võib ära jätta.

6.   Tulemuste arvutamine

Mikroelementide kontsentratsioon analüüsitavas lahuses arvutatakse kalibreerimiskõverat kasutades ning tulemus väljendatakse mikroelementide milligrammides ühe kilogrammi proovi kohta (miljondikkudes).

7.   Korratavus

Sama analüüsija poolt sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

8.   Tähelepanekud

Suure koguse fosfaadi sisaldus võib takistada raua, mangaani ja tsingi määramist. See takistus tuleb kõrvaldada, lisades proovi lantaankloriidilahust (3.11). Kuid kui proovis on massi vahekord Ca + Mg/P > 2, siis võib lantaankloriidilahuse (3.11) lisamise analüüsitavale lahusele ja kalibreerimislahusele ära jätta.

D.   HALOFUGINOONI MÄÄRAMINE

DL-trans-7-bromo-6-kloro-3-[3-(3-hüdroksü-2-piperidüül)atsetonüül]-kinasoliin-4-(3H)-oon-vesinikbromiid

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata halofuginooni kogust söödas. Määramispiir on 1 mg/kg.

2.   Põhimõte

Pärast kuuma veega töötlemist ekstraheeritakse halofuginoon vaba alusena etüülatsetaati ning eraldatakse hüdrokloriidina happe vesilahusesse. Ekstrakt puhastatakse ioonvahetuskromatograafia abil. Halofuginoonisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3.   Reaktiivid

50 mg halofuginooni (3.6) kaalutakse 0,1 mg täpsusega 500 ml mõõtekolbi, lahustatakse ammooniumatsetaadi puhverlahuses (3.18), täidetakse kuni märgini puhverlahusega ja segatakse. See lahus säilib pimedas 5 oC juures kolm nädalat.

100 ml mõõtekolbidesse kantakse 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ja 6,0 ml põhistandardlahust (3.6.1). Täidetakse kuni märgini liikuva faasiga (3,21 ) ja segatakse. Nende lahuste halofuginoonikontsentratsioonid on vastavalt 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ja 6,0 μg/ml. 8,0 ja 10,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

50 g naatriumkarbonaati (3.11) lahustatakse vees, lahjendatakse 1 liitrini ja lisatakse kuni lahuse küllastumiseni naatriumkloriidi (3.12).

10 ml soolhapet (3.7) lahjendatakse kuni 1 liitrini veega.

19,3 g ammooniumatsetaati (3.3) ja 30 ml äädikhapet (3.5) lahustatakse vees (3.14) ja lahjendatakse kuni 1 liitrini.

Asjakohane kogus Amberlite'i (3.2) pestakse veega, kuni äravalatud vesifaasile tehtud hõbenitraadi (3.20) test näitab, et kõik klooriioonid on eemaldatud. Vaiku pestakse 50 ml metanooliga (3.8), metanool valatakse ära ja vaik säilitatakse värskes metanoolis.

0,17 g hõbenitraati (3.9) lahustatakse 10 ml vees.

500 ml atsetonitriili (3.1) segatakse 300 ml ammooniumatsetaadi puhverlahusega (3.18) ja 1 200 ml veega (3.14). Äädikhappe (3.5) abil korrigeeritakse pH 4,3 -le. Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4,8 ) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit). See lahus säilib suletud mahutis pimedas hoituna üks kuu.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

Märkus:

halofuginoon on vaba alusena leelistes ja etüülatsetaadi lahustes ebastabiilne. Seda ei tohi hoida etüülatsetaadis üle 30 minuti.

5.1.   Üldsätted

Märkus:

selle meetodi puhul peab võrdlussööt olema prooviga samalaadne ja analüüsimisel ei tohi selles leiduda halofuginooni.

5.2.   Ekstraheerimine

10 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,1 g täpsusega 200 ml tsentrifuugiküvetti, lisatakse 0,5 g naatriumaskorbaati (3.10), 0,5 g EDTAd (3.13) ja 20 ml vett ning segatakse. Küvett asetatakse 5 minutiks veevanni (80 oC). Pärast toatemperatuurini jahutamist lisatakse 20 ml naatriumkarbonaadi lahust (3.15) ja segatakse. Lisatakse kohe 100 ml etüülatsetaati (3.4) ja loksutatakse käes tugevalt 15 sekundit. Küvett asetatakse kolmeks minutiks ultrahelivanni (4.1) ning avatakse kork. Tsentrifuugitakse kaks minutit ja dekanteeritakse etüülatsetaadi faas läbi klaaskiudfiltri (4.6) 500 ml jaotuslehtrisse. Proovi ekstraheerimist korratakse teise 100 ml etüülatsetaadi kogusega. Kogutud ekstrakte pestakse üks minut 50 ml naatriumkloriidiga küllastatud naatriumkarbonaadi lahusega (3.16) ja veekiht valatakse ära.

Orgaanilist kihti ekstraheeritakse 1 minut 50 ml soolhappega (3.17). Alumine happekiht kallatakse 250 ml jaotuslehtrisse. Orgaanilist kihti ekstraheeritakse uuesti 1,5 minutit täiendava 50 ml soolhappega ja lisatakse esimesele ekstraktile. Kogutud happeekstrakte pestakse 10 ml etüülatsetaadiga (3.4) loksutades umbes 10 sekundit.

Veekiht kantakse kvantitatiivselt 250 ml ümarkolbi ja orgaaniline faas valatakse ära. Happelahusest aurustatakse filter-pöördaurusti (4,2 ) abil kogu allesjäänud etüülatsetaat. Veevanni temperatuur ei tohi olla üle 40 oC. Umbes 25-millibaarises vaakumis eemaldatakse 5 minutiga temperatuuril 38 oC kogu allesjäänud etüülatsetaat.

5.3.   Puhastamine

5.3.1.    Amberlite'i kolonni ettevalmistamine

XAD-2 kolonn valmistatakse ette eraldi iga proovi ekstrakti jaoks. 10 g valmistatud Amberlite'i (3.19) kantakse metanooliga (3.8) klaaskolonni (4.5). Vaigukihi peale pannakse väike klaasvillatropp. Metanool kallatakse kolonnist välja ja vaiku pestakse 100 ml veega, peatades voolu, kui vedelik jõuab vaigukihi ülemise piirini. Kolonnil lastakse enne kasutamist 10 minutit tasakaalustuda. Kolonni ei tohi kunagi lasta ära kuivada.

5.3.2.    Proovi puhastamine

Ekstrakt (5.2) kantakse kvantitatiivselt ettevalmistatud Amberlite'i kolonni (5.3.1), elueeritakse, valades eluaadi ära. Elueerimiskiirus ei tohi ületada 20 ml/min. Ümarkolb loputatakse 20 ml soolhappega (3.17) ja seda lahust kasutatakse vaigukolonni pesemiseks. Allesjäänud happelahus kõrvaldatakse õhuvoolu abil. Pesulahused valatakse ära. Kolonni lisatakse 100 ml metanooli (3.8) ja lastakse elueerida 5–10 ml, kogudes eluaadi 250 ml ümarkolbi. Allesjäänud metanoolil lastakse 10 minutit vaiguga tasakaalustuda ja jätkatakse elueerimist kiirusel kuni 20 ml/min, kogudes eluaadi samasse ümarkolbi. Metanool aurustatakse filter-pöördaurusti (4.2) abil, veevanni temperatuur ei tohi olla üle 40 oC. Jääk kantakse liikuva faasi (3.21) abil kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Täidetakse liikuva faasiga kuni märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.7). See lahus hoitakse HPLC määramise (5.4) jaoks.

5.4.   HPLC määramine

5.4.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):

Vedelikkromatograafia kolonn (4.4.1)

HPLC liikuv faas (3.21)

Voolukiirus: 1,5 –2 ml/min.

Avastamise lainepikkus: 243 nm

Sissesüstitav ruumala: 40 kuni 100 μl.

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides korduvalt kalibreerimislahust (3.6.2) kontsentratsiooniga 3,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused (pindalad) ja retentsiooniajad.

5.4.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.6.2) süstitakse korduvalt ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.4.3.    Proovilahus

Prooviekstrakti (5.3.2) süstitakse mitu korda samas mahus kui kalibreerimislahuste puhul ja määratakse halofuginoonipiikide keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse halofuginoonipiikide keskmise kõrguse (pindala) alusel määratakse kalibreerimisgraafiku (5.4.2) abil proovilahuse kontsentratsioon (μg/ml).

Halofuginoonisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c

=

proovilahuse halofuginoonikontsentratsioon (μg/ml);

m

=

kaalutise mass grammides.

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6,0 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.6.2) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.6.2). Lisatud halofuginoonikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud halofuginoonikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes halofuginoonipiigi kõrgus. Piigi laius poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti halofuginoonipiigi laiusest.

7.1.2.    Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi kuni 3 mg/kg suuruste halofuginoonisisalduste puhul ületada 0,5 mg/kg.

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühisuuring, ( 15 ) mille käigus kaheksas laboratooriumis analüüsiti kolme proovi.

ND

=

allpool avastamisläve

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja (%)

Sg

=

saagis (%)

E.   ROBENIDIINI MÄÄRAMINE

1,3-bis[(p-klorobensülideen)amino]guanidiinhüdrokloriid

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata robenidiini kogust söödas. Määramispiir on 5 mg/kg.

2.   Põhimõte

Proov ekstraheeritakse hapestatud metanooliga. Ekstrakt kuivatatakse ja selle alikvootne osa puhastatakse alumiiniumoksiidi kolonnis. Robenidiin elueeritakse kolonnist metanooliga, kontsentreeritakse ja viiakse liikuva faasiga sobiva mahuni. Robenidiinisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3.   Reaktiivid

4,0 ml soolhapet (ρ20 = 1,18 g/ml) viiakse 500 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse kuni märgini metanooliga (3.1) ja segatakse. See lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

Tüüp 3A, 8–12 mešši (1,6 –2,5 mm osakesed, kristalne alumosilikaat, pooride läbimõõt 0,3 mm)

100 g alumiiniumoksiidi viiakse sobivasse anumasse ja lisatakse 2,0 ml vett. Suletakse ja loksutatakse ligikaudu 20 minutit. Hoitakse korralikult suletud anumas.

1 000 ml mõõtekolvis lahustatakse 3,40 g kaaliumdivesinikfosfaati vees (HPLC-puhtusastmega), kolb täidetakse märgini ja segatakse.

Üheliitrises mõõtekolvis lahustatakse 3,55 g veevaba dinaatriumvesinikfosfaati (või 4,45 g dihüdraati või 8,95 g dodekahüdraati) vees (HPLC-puhtusastmega), kolb täidetakse märgini veega ja segatakse.

Segada järgmised reaktiivid:

Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4.6) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit).

Puhas robenidiin: 1,3 -bis[(p-klorobensülideen) amino]guanidiinhüdrokloriid.

30 mg robenidiini standardainet (3.9) kaalutakse 0,1 mg täpsusega. Lahustatakse hapestatud metanooliga 100 ml mõõtekolvis (3.2), täidetakse kolb märgini sama lahustiga ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja hoitakse pimedas kohas.

Valatakse 10,0 ml põhistandardlahust (3.9.1) 250 ml mõõtekolbi, täidetakse see liikuva faasiga (3.8) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja hoitakse pimedas kohas.

50 ml mõõtekolbidesse viiakse 5,0 , 10,0 , 15,0 , 20,0 ja 25,0 ml vahestandardlahust (3.9.2). Täidetakse kuni märgini liikuva faasiga (3.8) ja segatakse. Lahuste robenidiinisisaldused on vastavalt 1,2 ; 2,4 ; 3,6 ; 4,8 ja 6,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

4.   Seadmed

Valmistatud tumedast klaasist, korkkraaniga, ligikaudu 150 ml reservuaariga, sisemine läbimõõt 10–15 mm, kõrgus 250 mm.

5.   Töö käik

Märkus:

robenidiin on valgustundlik. Kõikide operatsioonide puhul tuleb kasutada tumedast klaasist anumaid.

5.1.   Üldsätted

Märkus:

selle meetodi puhul peab võrdlussööt olema prooviga samalaadne ja analüüsimisel ei tohi selles leiduda halofuginooni.

5.2.   Ekstraheerimine

Umbes 15 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega. Proov pannakse 250 ml koonilisse kolbi ja lisatakse 100,0 ml hapestatud metanooli (3.2), kolb suletakse ja loksutatakse üks tund loksutil (4.2). Lahus filtreeritakse läbi klaaskiudfilterpaberi (4.5) ja kogu filtraat kogutakse 150 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 7,5 g molekulaarsõela (3.4), suletakse ja loksutatakse viis minutit. Filtreeritakse kohe läbi klaaskiudfilterpaberi. See lahus säilitatakse puhastamiseks (5.3).

5.3.   Puhastamine

5.3.1.    Alumiiniumoksiidi kolonni ettevalmistamine

Klaaskolonni (4.1) põhja asetatakse väike klaasvatist tropp ja surutakse see klaaspulka kasutades kokku. Kaalutakse 11,0 g ettevalmistatud alumiiniumoksiidi (3.5) ja pannakse kolonni. Tuleb jälgida, et kokkupuutumine õhuga oleks selles etapis minimaalne. Koputatakse kergelt vastu kolonni alumist otsa, et alumiiniumoksiid paigutuks ühtlaselt.

5.3.2.    Proovi puhastamine

Kolonni pipetitakse 5,0 ml vastavalt punktile 5.2 ettevalmistatud prooviekstrakti. Pipeti ots asetatakse tihedalt kolonni seina vastu ja lastakse lahusel absorbeeruda alumiiniumoksiidi. Robenidiin elueeritakse kolonnist, kasutades 100 ml metanooli (3.1) voolukiirusel 2–3 ml/min, ja eluaat kogutakse 250 ml ümarkolbi. Metanoolilahus aurustatakse filter-pöördaurusti (4.3) abil kuivaks vähendatud rõhul, temperatuuril 40 oC. Jääk lahustatakse uuesti 3–4 ml liikuvas faasis (3.8) ja viiakse kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Kolbi loputatakse mitme 1–2 ml koguse liikuva faasiga ja pannakse need loputusvedelikud mõõtekolbi. Kolb täidetakse sama lahustiga märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtreeritakse läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.7). Seda lahust hoitakse HPLC määramiseks (5.4).

5.4.   HPLC määramine

5.4.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need annavad samaväärsed tulemused):

Vedelikkromatograafia kolonn (4.4.1)

HPLC liikuv faas (3.8)

Voolukiirus: 1,5 –2 ml/min

Detektori lainepikkus: 317 nm,

Sissesüstitav ruumala: 20–50 μl.

Kromatograafilise süsteemi stabiilsust kontrollitakse, süstides 3,6 μg/ml sisaldavat kalibreerimislahust (3.9.3) mitu korda, kuni saavutatakse konstantsed piigi kõrgused ja retentsiooniajad.

5.4.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.9.3) süstitakse korduvalt ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimiskõver, kasutades kalibreerimislahuste keskmisi piigi kõrgusi või pindalasid ordinaatidena ja vastavaid kontsentratsioone μg/ml abstsissidena.

5.4.3.    Proovilahus

Prooviekstrakti (5.3.2) süstitakse mitu korda, kasutades sama mahtu nagu kalibreerimislahuste puhul, ja määratakse robenidiini piikide keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse robenidiini piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi määratakse proovilahuse kontsentratsioon μg/ml, kasutades kalibreerimisgraafikut (5.4.2).

Robenidiini sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c

=

proovilahuse robenidiinikontsentratsioon (μg/ml);

m

=

kaalutise mass grammides.

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 6 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.9.3) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.9.3). Lisatav robenidiinikogus peab olema ligikaudu võrdne prooviekstrakti analüüsimisel leitud robenidiini kogusega.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma ainult robenidiinipiigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti robenidiinipiigi laiusest.

7.1.2.    Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Robenidiinisisalduse puhul, mis on suurem kui 15 mg/kg, ei tohi sama proovi kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ületada 10 % suuremast tulemusest.

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 85 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühenduse ühisuuring, milles 12 laboratooriumi analüüsisid nelja kodulindude ja küülikute söödajahu või -graanulite proovi. Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi. Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja, %

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

F.   DIKLASURIILI MÄÄRAMINE

(+)-4-klorofenüül [2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahüdro-3,5-diokso-1,2,4-triasiin-2-üül) fenüül] atsetonitriil

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata diklasuriili kogust söödas ja eelsegudes. Avastamispiir on 0,1 mg/kg, määramispiir 0,5 mg/kg.

2.   Põhimõte

Pärast sisestandardi lisamist ekstraheeritakse proov hapestatud metanooliga. Söötade puhul puhastatakse ekstrakti alikvoot tahkefaasilises C18-ekstraktsioonihülsis. Diklasuriil elueeritakse ekstraheerimishülsist välja hapestatud metanooli ja vee seguga. Pärast lahuse aurustamist lahustatakse jääk N, N-dimetüülformamiidi vesilahuses. Eelsegude puhul aurustatakse ekstrakt kohe ja jääk lahustatakse N, N-dimetüülformamiidi vesilahuses. Diklasuriilisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades kolmekomponendilist gradienti ja UV-detektorit.

3.   Reaktiivid

25 mg diklasuriili standardainet (3.8) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja viiakse 50 ml mõõtekolbi. Lahustatakse N, N-dimetüülformamiidis (3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

5,00 ml põhistandardlahust (3.8.1) pannakse 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

25 mg sisestandardainet (3.9) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja pannakse 50 ml mõõtekolbi. Lahustatakse N, N-dimetüülformamiidis (3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

5,00 ml sisepõhistandardlahust (3.9.1) pannakse 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga (3.6) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

(p = diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus (mg/kg))

p/10 mg sisestandardlahust kaalutakse täpsusega 0,1 mg, pannakse 100 ml mõõtekolbi, lahustatakse ultrahelivannis (4.6) N, N-dimetüülformamiidis (3.6), kolb täidetakse N, N-dimetüülformamiidiga kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat kolbi ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

2,00 ml diklasuriili standardlahust (3.8.2) ja 2,00 ml sisestandardlahust (3.9.2) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi. Lisatakse 16 ml N, N-dimetüülformamiidi (3.6), täidetakse kolb veega kuni märgini ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

5,0 ml soolhapet (3.7) pipetitakse 1 000 ml metanooli (3.5) ja segatakse.

5 g ammooniumatsetaati (3.2) ja 3,4 g tetrabutüülammooniumvesiniksulfaati (3.3) lahustatakse 1 000 ml vees (3.1) ja segatakse.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Üldsätted

5.1.1.    Võrdlussööt

Tuleb analüüsida võrdlussööta, veendumaks, et selles ei ole ei diklasuriili ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ja selles tohi leiduda diklasuriili ega segavaid aineid.

5.1.2.    Saagisekatse

Saagisekatses analüüsitakse võrdlusööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus diklasuriili. Et saada kontsentratsiooni 1 mg/kg, kantakse 50 g võrdlussöödale 0,1 ml põhistandardlahust (3.8.1), segatakse hoolikalt ja jäetakse 10 minutiks seisma, segades veel mitu korda enne katse jätkamist vastavalt punktile 5.2.

Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse analüüsitavale proovile ligikaudu sama suur diklasuriilikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.

5.2.   Ekstraheerimine

5.2.1.    Sööt

Umbes 50 g proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega. See pannakse 500 ml koonilisse kolbi, lisatakse 1,00 ml sisestandardlahust (3.9.2) ja 200 ml ekstrahenti (3.12) ning korgitakse kolb kinni. Segu loksutatakse öö jooksul loksutil (4.1). Lastakse 10 minutit settida. Kantakse 20 ml supernatandi alikvooti sobivasse klaasanumasse ja lahjendatakse 20 ml veega. Lahus kantakse ekstraktsioonihülsile (3.11) ja juhitakse sellest läbi vaakumi abil (4.5). Hülssi pestakse 25 ml ekstrahendi (3.12) ja vee seguga, 65 + 35 (v + v). Kogutud fraktsioonid visatakse ära ning elueeritakse ühendid, kasutades 25 ml ekstrahendi (3.12) ja vee segu 80 + 20 (v + v). Seda fraktsiooni aurustatakse 60 oC juures pöördaurustil (4.3), kuni see saab kuivaks. Jääk lahustatakse 1,0 ml N, N-dimetüülformamiidis (3.6), lisatakse 1,5 ml vett (3.1) ja segatakse. Filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.4). Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).

5.2.2.    Eelsegud

Umbes 1 g proovi kaalutakse 0,001 g täpsusega. See pannakse 500 ml koonilisse kolbi, lisatakse 1,00 ml sisestandardlahust (3.9.3) ja 200 ml ekstrahenti (3.12) ning korgitakse kolb kinni. Segu loksutatakse öö jooksul loksutil (4.1). Lastakse 10 minutit settida. Kantakse 10 000 /p ml (p = diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus mg/kg) supernatandi alikvooti sobiva suurusega ümarkolbi. Aurustatakse pöördaurustis (4.3) alandatud rõhu ja 60 oC juures, kuni proov saab kuivaks. Jääk lahustatakse uuesti 10,0 ml N, N-dimetüülformamiidis (3.6), lisatakse 15,0 ml vett (3.1) ja segatakse. Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).

5.3.   HPLC määramine

5.3.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides mitu korda kolonni kalibreerimislahust (3.10) kontsentratsiooniga 2 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused ja retentsiooniajad.

5.3.2.    Kalibreerimislahus

Kalibreerimislahusest (3.10) süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse diklasuriili ning sisestandardi piikide keskmine kõrgus (pindala).

5.3.3.    Proovilahus

Proovilahusest (5.2.1 või 5.2.2) süstitakse 20 μl mitu korda kolonni ja määratakse diklasuriili ning sisestandardi piikide keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

6.1.   Söödad

Diklasuriilisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

hd, s

=

diklasuriili piigi kõrgus (pindala) proovilahuses (5.2.1);

hi, s

=

sisestandardi piigi kõrgus (pindala) proovilahuses (5.2.1);

hd, c

=

diklasuriili piigi kõrgus (pindala) kalibreerimislahuses (3.10);

hi, c

=

sisestandardi piigi kõrgus (pindala) kalibreerimislahuses (3.10);

cd, c

=

diklasuriili kontsentratsioon (μg/ml) kalibreerimislahuses (3.10);

m

=

kaalutise mass grammides;

V

=

prooviekstrakti maht vastavalt punktile 5.2.1 (s.o 2,5 ml).

6.2.   Eelsegud

Diklasuriilisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

hd, c

=

diklasuriili piigi kõrgus (pindala) kalibreerimislahuses (3.10);

hi, c

=

sisestandardi piigi kõrgus (pindala) kalibreerimislahuses (3.10);

hd, s

=

diklasuriili piigi kõrgus (pindala) proovilahuses (5.2.2);

hi, s

=

sisestandardi piigi kõrgus (pindala) proovilahuses (5.2.2);

cd, c

=

diklasuriili kontsentratsioon (μg/ml) kalibreerimislahuses (3.10);

m

=

kaalutise mass grammides;

V

=

prooviekstrakti maht vastavalt punktile 5.2.2 (s.o 25 ml);

p

=

diklasuriili nominaalsisaldus eelsegus (mg/kg).

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti (5.2.1 või 5.2.2) ja kalibreerimislahuse (3.10) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile (5.2.1 või 5.2.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.10). Lisatud diklasuriilikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud diklasuriilikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes diklasuriilipiigi ja sisestandardi piigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti diklasuriili piigi või sisestandardi piigi laiusest.

7.1.2.    Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt.

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)proovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühisuuring, mille käigus 11 laboratooriumis analüüsiti 5 proovi. Proovideks olid kaks eelsegu: üht oli segatud orgaanilise maatriksiga (O 100) ja teist anorgaanilise maatriksiga (A 100). Teoreetiline diklasuriilisisaldus on 100 mg/kg. Kolm eri tootjat (NL) (L1/Z1/K1) valmistasid kolm kodulindude söödasegu. Teoreetiline diklasuriilisisaldus on 1 mg/kg. Laboratooriumidele tehti ülesandeks iga proovi üks kord või kaks korda analüüsida. (Üksikasjalikumat teavet selle ühisuuringu kohta võib leida ajakirjas Journal of AOAC International, köide 77, nr 6, 1994, lk 1359–1361.) Tulemused on esitatud järgmises tabelis.

L

=

laboratooriumide arv

n

=

üksikmääramiste arv

Sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja

9.   Tähelepanekud

Eelnevalt peab olema näidatud, et diklasuriili piigi kõrgus (pindala) on mõõdetavas vahemikus lineaarses sõltuvuses kontsentratsioonist.

G.   NAATRIUMLASALOTSIIDI MÄÄRAMINE

Polüeetermonokarboksüülhappe naatriumsool, saadud Streptomyces lasaliensis'est

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata naatriumlasalotsiidi kogust söödas ja eelsegudes. Avastamiskünnis on 5 mg/kg, määramispiir 10 mg/kg.

2.   Põhimõte

Naatriumlasalotsiid ekstraheeritakse proovist hapestatud metanooliga ja määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades spektrofluoromeetrilist detektorit.

3.   Reaktiivid

23,5 ml ortofosforhapet (3.2) lahjendatakse veega 100 milliliitrini.

1,36 g KH2PO4 (3.1) lahustatakse 500 ml vees (3.11), lisatakse 3,5 ml ortofosforhapet (3.2) ja 10,0 ml 6-metüül-2-heptüülamiini (3.4). pH korrigeeritakse ortofosforhappe lahusega (3.3) 4,0 -ni ja lahjendatakse veega (3.11) 1 000 milliliitrini.

5,0 ml soolhapet (3.6) pannakse 1 000 ml mõõtekolbi, täidetakse kolb metanooliga (3.5) kuni märgini ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

5 ml fosfaatpuhverlahust (3.7) segatakse 95 ml metanooliga (3.5).

50 mg naatriumlasalotsiidi (3.10) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja pannakse 100 ml mõõtekolbi, lahustatakse hapestatud metanoolis (3.8), täidetakse kolb sama lahustiga kuni märgini ja segatakse. See lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

10,0 ml põhistandardlahust (3.10.1) pipetitakse 100 ml mõõtekolbi, täidetakse kolb hapestatud metanooliga (3.8) kuni märgini ja segatakse. Lahus tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 ja 10,0 ml vahestandardlahust pannakse (3.10.2) 50 ml mõõtekolbidesse. Kolvid täidetakse hapestatud metanooliga (3.8) kuni märgini ja segatakse. Nende lahuste naatriumlasalotsiidisisaldus on vastavalt 1,0 , 2,0 , 4,0 , 5,0 ja 10,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Üldsätted

5.1.1.    Võrdlussööt

Selleks, et teha saagisekatset (5.1.2), tuleb eelnevalt teha võrdlussööda analüüs, veendumaks, et selles ei ole naatriumlasalotsiidi ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ning selles ei tohi leiduda naatriumlasalotsiidi ega segavaid aineid.

5.1.2.    Saagisekatse

Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus naatriumlasalotsiidi. Et saada kontsentratsiooni 100 mg/kg, kantakse 10,0 ml põhistandardlahust (3.10.1) 250 ml koonilisse kolbi ja aurustatakse lahus ligikaudu 0,5 milliliitrini. Lisatakse 50 g võrdlussööta, segatakse põhjalikult ja jäetakse 10 minutiks seisma, segades enne ekstraheerima (5.2) asumist veel mitu korda.

Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse analüüsitavale proovile ligikaudu sama suur naatriumlasalotsiidikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.

5.2.   Ekstraheerimine

5.2.1.    Sööt

5–10 g proovi kaalutakse täpsusega 0,01 g ja pannakse 250 ml koonilisse korgiga kolbi. Lisatakse pipetiga 100,0 ml hapestatud metanooli (3.8). Korgitakse kinni ja raputatakse segi. Kolb pannakse 20 minutiks ligikaudu 40 oC ultrahelivanni (4.1), seejärel võetakse sealt välja ja jahutatakse toatemperatuurini. Lastakse umbes 1 tund seista, kuni heljuv aine on settinud, siis filtreeritakse alikvoot läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.2) sobivasse anumasse. Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).

5.2.2.    Eelsegud

Umbes 2 g jahvatamata eelsegu kaalutakse täpsusega 0,001 g ja pannakse 250 ml mõõtekolbi. Lisatakse 100,0 ml hapestatud metanooli (3.8) ja raputatakse segi. Kolb koos sisuga pannakse 20 minutiks ligikaudu 40 oC ultrahelivanni (4.1), seejärel võetakse sealt välja ja jahutatakse toatemperatuurini. Lahjendatakse hapestatud metanooliga (3.8) kuni märgini ja segatakse hoolikalt. Lastakse tund aega seista, kuni heljuv aine on settinud, siis filtreeritakse alikvoot läbi 0,45 μm membraanfiltri (4.2). Vajalik kogus selginud filtraati lahjendatakse hapestatud metanooliga (3.8), et saada lõplik katselahus, mis sisaldab umbes 4 μg/ml naatriumlasalotsiidi. Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).

5.3.   HPLC määramine

5.3.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused).

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides kolonni mitu korda kalibreerimislahust (3.10.3) kontsentratsiooniga 4,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused (pindalad) ja retentsiooniajad.

5.3.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.10.3) süstitakse mitu korda ja määratakse igale kontsentratsioonile vastavad keskmised piigikõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.3.3.    Proovilahus

Punktide 5.2.1 või 5.2.2 kohaselt saadud prooviekstrakte süstitakse mitu korda samas mahus, mis kalibreerimislahuse puhul, ja määratakse naatriumlasalotsiidipiikide keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse (5.3.3) süstimisega saadud piikide keskmise kõrguse (pindala) alusel leitakse kalibreerimisgraafiku abil naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml).

6.1.   Sööt

Naatriumlasalotsiidi sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

c

=

naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml) proovilahuses (5.2.1);

V1

=

prooviekstrakti maht milliliitrites vastavalt punktile 5.2.1 (s.o 100);

m

=

kaalutise mass grammides.

6.2.   Eelsegud

Naatriumlasalotsiidi sisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

c

=

naatriumlasalotsiidi kontsentratsioon (μg/ml) proovilahuses (5.2.2);

V2

=

prooviekstrakti maht milliliitrites vastavalt punktile 5.2.2 (s.o 250);

f

=

punkti 5.2.2 kohane lahjendusfaktor;

m

=

kaalutise mass grammides.

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Spektrofluoromeetrilised meetodid on vähem tundlikud kõrvaliste lisandite suhtes kui UV-meetodid. Analüüsitava proovi identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile (5.2.1 või 5.2.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.10.3). Lisatud naatriumlasalotsiidikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud naatriumlasalotsiidi kogus. Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes naatriumlasalotsiidipiigi kõrgus. Piigi laius poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui ± 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti naatriumlasalotsiidipiigi laiusest.

7.2.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)söödaproovi puhul peab saagis olema vähemalt 80 %. Suurendatud kontsentratsiooniga eelseguproovi puhul peab saagis olema vähemalt 90 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühisuuring, ( *1 ) mille käigus 12 laboratooriumis analüüsiti kahte eelsegu (proovid 1 ja 2) ja viit sööta (proovid 3–7). Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi. Tulemused on esitatud alljärgnevas tabelis:

L

=

laboratooriumide arv

n

=

üksiktulemuste arv

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

sR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja, %

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

---

V LISA

SÖÖDAS SOOVIMATUTE AINETE SISALDUSE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A.   VABA GOSSÜPOLI JA GOSSÜPOLI ÜLDSISALDUSE MÄÄRAMINE

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata sisaldust puuvillaseemnetes, puuvillaseemnejahus ja puuvillakoogis ning neid söödatooraineid sisaldavates segasöötades, kui need sisaldavad 20 mg/kg vaba gossüpoli, üldgossüpoli ja gossüpolile keemiliselt sarnaseid aineid.

2.   Põhimõte

Gossüpol ekstraheeritakse 3-aminopropaan-1-ooli manulusel kas propaan-2-ooli ja heksaani seguga, et määrata vaba gossüpoli sisaldus, või dimetüülformamiidiga, et määrata gossüpoli üldsisaldus. Gossüpol muundatakse aniliini abil gossüpol-dianiliiniks, mille optiline tihedus mõõdetakse lainepikkusel 440 nm.

3.   Reaktiivid

Valguse eest kaitstult püsivad gossüpoli standardlahused A ja B 24 tundi.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.    Analüüsitav proov

Proovi kasutatav kogus sõltub proovi eeldatavast gossüpolisisaldusest. Eelistatav on töötada väikese prooviga ja filtraadi suhteliselt suure alikvootse osaga, et saada piisavalt gossüpoli täpseks fotomeetriliseks mõõtmiseks. Vaba gossüpoli määramiseks puuvillaseemnetes, puuvillaseemnejahus ja puuvillakoogis ei tohi proov olla suurem kui 1 g, segasööda puhul võib see olla kuni 5 g. Enamikul juhtudest sobib filtraadi alikvootne osa mahuga 10 ml; see peab sisaldama 50–100 μg gossüpoli. Gossüpoli üldsisalduse määramiseks peab proovi suurus olema 0,5 –5 g, et filtraadi alikvootne osa 2 ml sisaldaks 40–200 μg gossüpoli.

Analüüs tuleb läbi viia toatemperatuuril umbes 20 oC juures.

5.2.    Vaba gossüpoli määramine

Proov pannakse lihvitud kaelaga 250 ml kolbi, mille põhi on kaetud purustatud klaasiga. Lisatakse pipeti abil 50 ml lahustit A (3.2), kolb suletakse korgiga ja segatakse segistis üks tund. Filtreeritakse läbi kuiva filtri ja kogutakse filtraat väiksesse lihvitud kaelaga kolbi. Filtreerimise ajal kaetakse lehter kellaklaasiga.

Pipetiga viiakse kahte 25 ml mõõtekolbi (A ja B) filtraadi ühesugused alikvootsed osad, mis sisaldavad 50–100 μg gossüpoli. Vajaduse korral täidetakse lahustiga A (3.2) 10 milliliitrini. Seejärel täidetakse kolb A propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Saadud lahust kasutatakse võrdluslahusena, mille suhtes mõõdetakse proovilahust.

Kahte teise 25 ml mõõtekolbi (C ja D) viiakse pipetiga kummassegi 10 ml lahustit A (3.2). Kolb C täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Saadud lahust kasutatakse võrdluslahusena, mille suhtes mõõdetakse pimekatse lahust.

Kolbidesse D ja B lisatakse kummassegi 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Kolvid jahutatakse toatemperatuurini, täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista

Spektrofotomeetriga määratakse sentimeetristes klaasküvettides lainepikkusel 440 nm pimekatse lahuse (D) optiline tihedus võrdluslahuse (C) suhtes ning proovi lahuse (B) optiline tihedus võrdluslahuse (A) suhtes.

Proovilahuse optilisest tihedusest lahutatakse pimekatse lahuse optiline tihedus (= korrigeeritud optiline tihedus). Selle väärtuse põhjal arvutatakse vaba gossüpoli sisaldus, nagu on näidatud punktis 6.

5.3.    Gossüpoli üldsisalduse määramine

1–5 mg gossüpoli sisaldav proov pannakse 50 ml mõõtekolbi ja lisatakse 10 ml lahustit B (3.3). Samal ajal valmistatakse ette pimekatse, pannes teise 50 ml mõõtekolbi 10 ml lahustit B (3.3). Neid kahte kolbi kuumutatakse keeval veevannil 30 minutit. Jahutatakse toatemperatuurini ning täidetakse mõlemad kolvid propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini. Segatakse ja jäetakse 10–15 minutiks selginema, seejärel filtreeritakse ja kogutakse filtraadid lihvitud kaelaga kolbidesse.

Kahte 25 ml mõõtekolbi viiakse kummassegi pipetiga 2 ml proovi filtraati ning kahte teise 25 ml mõõtekolbi kummassegi 2 ml pimekatse filtraati. Kummagi seeria üks kolb täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) 25 milliliitrini. Saadud lahuseid kasutatakse võrdluslahustena.

Kahte teise kolbi lisatakse kummassegi 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) 25 milliliitrini, segatakse ja lastakse üks tund seista.

Määratakse optiline tihedus, nagu on kirjeldatud vaba gossüpoli määramise eeskirja punktis 5.2. Saadud väärtusest arvutatakse gossüpoli üldsisaldus vastavalt punktile 6.

6.   Tulemuste arvutamine

Tulemused võib arvutada kas optilise eritiheduse (6.1) või kalibreerimiskõvera 6.2) järgi.

6.1.    Optilise eritiheduse järgi

Eespool kirjeldatud tingimustel on optilised eritihedused järgmised:

Vaba gossüpoli sisaldus või gossüpoli üldsisaldus proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

E

=

korrigeeritud optiline tihedus, mis on määratud vastavalt punktile 5.2;

p

=

proovi mass (g);

a

=

filtraadi alikvootse osa ruumala (ml)

6.2.    Kalibreerimisgraafiku järgi

6.2.1.    Vaba gossüpoli sisaldus

Valmistatakse ette kaks seeriat mõõtekolbe, kummaski viis 25 ml kolbi. Mõlema seeria kolbidesse viiakse pipetiga gossüpoli standardlahuse A (3.5) alikvootsed osad 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 ja 10,0 ml. Täidetakse lahustiga A (3.5) 10 milliliitrini. Mõlemad seeriad lõpetatakse 25 ml mõõtekolviga, mis sisaldab üksnes 10 ml lahustit A (3.2) (pimekatse).

Esimese seeria kolvid (kaasa arvatud kolb pimekatsega) täidetakse 25 milliliitrini propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) (võrdlusseeria).

Teise seeria igasse kolbi (kaasa arvatud kolb pimekatsega) lisatakse 2 ml aniliini (3.4). Värvuse tekkimiseks kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, kolvid täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista (standardseeria).

Vastavalt punktile 5.2 määratakse standardseeria lahuste optiline tihedus vastavate võrdlusseeria lahuste suhtes. Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes sellele gossüpoli kogused μg-des ja neile vastavad optilised tihedused.

6.2.2.    Gossüpoli üldsisaldus

Valmistatakse ette kuus 50 ml mõõtekolbi. Esimesse kolbi viiakse 10 ml lahustit B (3.3) ja teistesse vastavalt 2,0 , 4,0 , 6,0 , 8,0 ja 10,0 ml gossüpoli standardlahust B (3.6). Lahuse maht igas kolvis viiakse lahusti B (3.3) lisamisega 10 milliliitrini. Kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini ja homogeenitakse.

2,0 ml neid lahuseid pannakse kahe kuuest 25 ml mõõtekolvist koosneva seeria igasse kolbi. Esimese seeria kolvid täidetakse märgini propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) (võrdlusseeria).

Teise seeria igasse kolbi lisatakse 2 ml aniliini (3.4). Kuumutatakse 30 minutit keeval veevannil. Jahutatakse toatemperatuurini, kolvid täidetakse propaan-2-ooli ja heksaani seguga (3.1) märgini, segatakse ja lastakse üks tund seista (standardseeria).

Vastavalt punktile 5.2 määratakse standardseeria lahuste optiline tihedus vastavate võrdlusseeria lahuste suhtes. Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes sellele gossüpoli kogused μg-des ja neile vastavad optilised tihedused.

6.3.    Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

▼M6

B.   DIOKSIINIDE (PCDD/PCDF) JA PCBde SISALDUSE MÄÄRAMINE

I PEATÜKK

Proovivõtumeetodid ja analüüsitulemuste tõlgendamine

1.    Kohaldamisala ja mõisted

Proovid polüklorodibenso-p-dioksiinide (PCDDd), polüklorodibensofuraanide (PCDFid), dioksiinitaoliste polüklooritud bifenüülide (PCBd) ( 16 ) ja mittedioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks söödas võetakse I lisa sätete kohaselt. Söödas ühtlaselt jaotunud ainete või toodete kontrollimise kvantitatiivseid nõudeid kohaldatakse, nagu on sätestatud I lisa punktis 5.1. Selliselt võetud koondproove käsitatakse selle partii või osapartii esinduslike proovidena, millest need on võetud. Direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormidele vastavust kontrollitakse laboriproovides määratud sisalduste alusel.

Käesolevas B osas kohaldatakse komisjoni otsuse 2002/657/EÜ ( 17 ) I lisas esitatud mõisteid.

Lisaks neile mõistetele kasutatakse käesolevas B osas järgmisi mõisteid.

2.    Partii või osapartii vastavus piirnormile

2.1.    Mittedioksiinitaoliste PCBde puhul

Partii või osapartii vastab piirnormile, kui PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 ja PCB 180 (edaspidi „mittedioksiinitaolised PCBd”) summaarse sisalduse analüüsi tulemus ei ületa direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormi, võttes arvesse mõõtmise laiendmääramatust ( 18 ). Partii või osapartii ei vasta direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormile, kui ülemise tõkke põhimõtte ( 19 ) kohase kahe analüüsitulemuse põhjal on kordusanalüüsiga ( 20 ) saadud aritmeetiline keskmine, mis ületab mõõtmise laiendmääramatust arvesse võttes kahtluseta piirnormi, st vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud kontsentratsiooni väärtust, millest on lahutatud mõõtmise laiendmääramatus.

Mõõtmise laiendmääramatuse arvutamiseks kasutatakse kattetegurit 2, millega tagatakse umbes 95 % usaldusnivoo. Partii või osapartii ei vasta nõuetele, kui mõõtmistulemuste keskväärtusest laiendmääramatuse lahutamisega saadud väärtus ületab piirnormi.

Käesoleva punkti eespool esitatud lõikudes nimetatud eeskirju kohaldatakse ametlikuks kontrolliks ette nähtud proovide analüüsitulemuste suhtes. Kaitse- või vahekohtumenetluse eesmärgil tehtud analüüside suhtes kohaldatakse siseriiklikke eeskirju.

2.2.    PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde puhul

Partii või osapartii vastab piirnormile, kui ühe analüüsi tulemus,

Sõeluuringu puhul määratakse läviväärtus, mille alusel otsustatakse, kas proov vastab PCDD/Fide jaoks kehtestatud piirnormile või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa jaoks kehtestatud piirnormile.

Partii või osapartii ei vasta direktiivis 2002/32/EÜ sätestatud piirnormile, kui ülemise tõkke põhimõtte ( 21 ) kohase kahe analüüsitulemuse põhjal on kinnitava meetodiga tehtud kordusanalüüsiga ( 22 ) saadud aritmeetiline keskmine, mis ületab mõõtmise laiendmääramatust arvesse võttes kahtluseta piirnormi, st vastavuse hindamiseks kasutatakse analüüsiga määratud kontsentratsiooni väärtust, millest on lahutatud mõõtmise laiendmääramatus.

Mõõtmise laiendmääramatuse arvutamiseks kasutatakse kattetegurit 2, millega tagatakse umbes 95 % usaldusnivoo. Partii või osapartii ei vasta nõuetele, kui mõõtmistulemuste keskväärtusest laiendmääramatuse lahutamisega saadud väärtus ületab piirnormi.

PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa puhul tuleb kasutada PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi määramise analüüsitulemuste hinnanguliste laiendmääramatuste summat.

Käesoleva punkti eespool esitatud lõikudes nimetatud eeskirju kohaldatakse ametlikuks kontrolliks ette nähtud proovide analüüsitulemuste suhtes. Kaitse- või vahekohtumenetluse eesmärgil tehtud analüüside suhtes kohaldatakse siseriiklikke eeskirju.

3.    Direktiivi 2002/32/EÜ II lisas sätestatud häiretasemeid ületavad tulemused

Häiretasemeid kasutatakse proovide valimiseks juhul, kui on vaja kindlaks teha saasteallikas ja võtta meetmeid saastumise vähendamiseks või kõrvaldamiseks. Sõeluuringumeetoditega tehakse kindlaks selliste proovide valimiseks sobivad läviväärtused. Kui saasteallika kindlakstegemiseks ja saaste vähendamiseks või kõrvaldamiseks on vaja suuri pingutusi, on asjakohane kontrollida häiretaseme ületamist kinnitaval meetodil kordusanalüüsiga ja võtta seejuures arvesse mõõtmise laiendmääramatust ( 23 ).

II PEATÜKK

Proovi ettevalmistamine ja nõuded analüüsimeetoditele, mida kasutatakse dioksiinide (PCDD/Fide) ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks söödas

1.    Kohaldamisala

Käesolevas peatükis sätestatud nõudeid kohaldatakse sööda analüüsimisel 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks, samuti seoses proovide ettevalmistamise ja analüüsimisega muul regulatiivsel eesmärgil, sealhulgas kontrollide puhul, mida söödakäitlejad teevad, et tagada vastavus Euroopa Parlamendi ja nõukogu määruse (EÜ) nr 183/2005 ( 24 ) sätetele.

PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde esinemist söödas võib kontrollida kaht liiki analüüsimeetoditega:

2.    Taustteave

Toksilisusekvivalentides (TEQdes) väljendatud kontsentratsioonide arvutamiseks korrutatakse üksikainete kontsentratsioonid asjaomases proovis vastava toksilisusfaktoriga (TEF) (vt I peatüki allmärkus 1) ja liidetakse seejärel kokku, et saada TEQdes väljendatud dioksiinitaoliste ühendite üldkontsentratsioon.

Käesolevas B osas tähendab üksikanaloogi aktsepteeritav määramispiir väikseimat analüüdisisaldust, mida saab mõistliku statistilise usaldusväärsusega mõõta ning mis vastab määramiskriteeriumidele, mis on sätestatud rahvusvaheliselt tunnustatud standardites, nagu standard EN 16215:2012 „Animal feed – Determination of dioxins and dioxin-like PCBs by GC-HRMS and of indicator PCBs by GC-HRMS” (Loomasööt – dioksiinide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse määramine gaasikromatograafia ja kõrglahutus-massispektromeetria (GC-HRMS) abil ning indikaator-PCBde sisalduse määramine GC-HRMSi abil) ja/või EPA meetodid 1613 ja 1668 (läbivaadatud).

Üksikanaloogi määramispiiri võib määratleda järgmiselt:

Bioanalüütilised sõeluuringumeetodid ei anna tulemusi analoogi tasemel, vaid näitavad ( 25 ) üksnes TEQ väärtust, väljendatuna BEQdes, millega võetakse arvesse asjaolu, et kõik prooviekstraktis leiduvad ühendid, mis katses vastuse annavad, ei tarvitse vastata kõikidele TEQ-põhimõtte nõuetele.

Sõeluuringu- ja kinnitavaid meetodeid võib teatavas maatriksis sisalduse kontrollimiseks kasutada vaid juhul, kui kõnealused meetodid on piisavalt tundlikud, et häiretasemele või piirnormile vastavat sisaldust usaldusväärselt määrata.

3.    Kvaliteedi tagamise nõuded

3.1.	Igas proovivõtu- ja analüüsietapis tuleb võtta meetmed ristsaastumise vältimiseks.

3.2.	Proove tuleb säilitada ja transportida säilitamiseks sobivates klaas-, alumiinium-, polüpropüleen- või polüetüleennõudes, mis ei mõjuta proovide PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisaldust. Paberitolmu jäägid tuleb proovinõust eemaldada.

3.3.	Proove tuleb säilitada ja transportida nii, et söödaproovi koostis ei muutuks.

3.4.	Vajaduse korral iga laboriproov jahvatatakse peeneks ja segatakse põhjalikult meetodil, mis tagab tõendatult täielikult homogeense proovi (näiteks jahvatatakse proov nii peeneks, et see läbiks 1 mm suuruste avadega sõela). Liiga suure niiskusesisaldusega proove tuleb enne jahvatamist kuivatada.

3.5.	Oluline on kontrollida, et reaktiivid, klaasnõud ja seadmed ei mõjutaks TEQdes või BEQdes väljendatud tulemusi.

3.6.	Tuleb teha tühikatse, mille puhul tehakse läbi kõik analüüsietapid ilma proovita.

3.7.

Bioanalüütiliste meetodite puhul tuleb kontrollida, et ükski analüüsis kasutatav klaasnõu või lahusti ei sisaldaks ühendeid, mis segavad uuritavate ühendite avastamist meetodi töövahemikus. Klaasnõu tuleb loputada lahustiga või kuumutada temperatuuril, mis sobib selle pinnalt PCDD/Fide, dioksiinitaoliste ühendite ja segavate ühendite jääkide eemaldamiseks.

3.8.	Ekstraheeritava proovi kogus peab olema piisav, et see vastaks nõuetele, mida kohaldatakse piisavalt väikestele kontsentratsioonidele vastavas töövahemikus, sh piirnormile ja häiretasemele vastavas kontsentratsioonide vahemikus.

3.9.	Uuritavatest toodetest võetud proovide ettevalmistamiseks kasutatavate konkreetsete meetodite puhul tuleb järgida rahvusvaheliselt tunnustatud suuniseid.

4.    Nõuded laboritele

4.1.

Vastavalt määrusele (EÜ) nr 882/2004 peavad laborid olema ISO juhendi 58 kohaselt tegutseva tunnustatud asutuse poolt akrediteeritud, millega tagatakse, et laborid kohaldavad analüüsimisel kvaliteeditagamissüsteemi. Laborid tuleb akrediteerida standardi EN ISO/IEC 17025 kohaselt. Vajaduse korral järgitakse põhimõtteid, mida on kirjeldatud tehnilistes suunistes, milles käsitletakse mõõtemääramatuse ja määramispiiride hinnangulise väärtuse leidmist PCDD/Fide ja PCBde analüüsimisel ( 26 ).

4.2.	Labori pädevust tuleb tõendada pideva eduka osalemisega laboritevahelistes uuringutes, mida korraldatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kontsentratsiooni määramiseks asjakohastes söödamaatriksites ja kontsentratsioonivahemikes.

4.3.	Laborid, kus kasutatakse proovide tavakontrolliks sõeluuringumeetodeid, peavad tegema nii kvaliteedi kontrollimisel kui ka saastekahtlusega proovide analüüsitulemuste kinnitamisel tihedat koostööd kinnitavat meetodit kasutavate laboritega.

5.    Põhinõuded dioksiinide (PCDDde/PCDFide) ja dioksiinitaoliste PCBde analüüsile

5.1.    Väikeste kontsentratsioonidega töövahemik ja määramispiirid

Kuna osa kõnealustest ühenditest on äärmiselt toksilised, peavad tuvastatavad PCDD/Fide kogused olema femtogrammi (10– 15 g) ülemises vahemikus. Enamiku PCBde analoogide puhul piisab nanogrammi täpsusega (10– 9 g) määramispiirist. Toksilisemate dioksiinitaoliste PCBde analoogide (eriti ortoasendamata analoogide) sisalduse määramiseks peab töövahemiku alumine osa ulatuma pikogrammi (10– 12 g) alumiste väärtusteni. Kõigi muude PCBde analoogide puhul piisab nanogrammi (10– 9 g) täpsusega määramispiirist.

5.2.    Suur selektiivsus (spetsiifilisus)

5.2.1.

PCDD/Fisid ja dioksiinitaolisi PCBsid peab olema võimalik eristada paljudest muudest kaasa ekstraheeruvatest ja segada võivatest ühenditest, mille kontsentratsioon võib olla mitu suurusjärku suurem kui uuritavate analüütide kontsentratsioon. GC-MS-meetodite korral peab olema võimalik eristada eri analooge, näiteks toksilisi analooge (nt seitseteist 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fi ning kaksteist dioksiinitaolist PCBd) muudest analoogidest.

5.2.2.

Bioanalüütiliste meetoditega peab olema võimalik määrata uuritavaid ühendeid PCDD/Fide ja/või dioksiinitaoliste PCBde summana. Proove tuleb puhastada, et kõrvaldada valepositiivseid tulemusi põhjustavad ühendid ja ühendid, mis võivad signaali vähendada, põhjustades valenegatiivseid tulemusi.

5.3.    Suur mõõtetäpsus (tõesus ja kordustäpsus, bioanalüüsi näiline saagis)

5.3.1.

GC-MS-meetodite puhul peab määramine tagama kehtiva hinnangu aine tegeliku kontsentratsiooni kohta proovis. Suur mõõtetäpsus on vajalik, et vältida analüüsitulemuse tagasilükkamist määratud TEQ väärtuse vähese usaldusväärsuse tõttu. Mõõtetäpsust väljendatakse tõesuse (sertifitseeritud materjalis sisalduva analüüdi mõõdetud keskmise väärtuse ja analüüdi sertifitseeritud väärtuse erinevus protsentides) ja kordustäpsusena (RSDR on suhteline standardhälve, mis arvutatakse korratavuse tingimustes saadud tulemuste põhjal).

5.3.2.

Bioanalüütiliste meetodite korral määratakse bioanalüüsi näiline saagis. „Bioanalüüsi näiline saagis” tähendab BEQ väärtust, mis arvutatakse 2,3,7,8-tetraklorodibenso-p-dioksiini (TCDD) või PCB 126 kaliibrimiskõvera alusel, mida korrigeeritakse tühiprooviga ja jagatakse seejärel kinnitava meetodi abil määratud TEQ väärtusega. Sellega püütakse korrigeerida selliseid tegureid nagu PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste ühendite kadu ekstraheerimisel ja puhastamisel, kaasa ekstraheeruvad ühendid, mis suurendavad või vähendavad tulemust (agonistlik ja antagonistlik mõju), kalibreerimiskõvera sobivus ning toksilisusfaktori (TEF) ja suhtelise potentsuse (REP) väärtuste erinevused. Bioanalüüsi näiline saagis arvutatakse sobivate võrdlusproovide alusel, milles analoogide kombinatsioon on representatiivne ja nende sisaldus vastab ligikaudu huvipakkuvale sisalduste vahemikule.

5.4.    Valideerimine piirnormi vahemikus ja kvaliteedikontrolli üldmeetmed

5.4.1.

Labor peab tõendama valideerimismenetluse ja tavaanalüüsiga meetodi tulemuslikkust piirnormi hõlmavas vahemikus, nt piirnormi 0,5-, 1- ja 2-kordsele väärtusele vastava sisalduse juures, kordusanalüüsi puhul peab variatsioonikordaja väärtus olema vastuvõetav.

5.4.2.

Sisemiste kvaliteedikontrolli meetmetena tuleb teha regulaarseid tühiproovidega ja rikastatud proovidega katseid või analüüsida kontrollproove (võimaluse korral tuleb eelistada sertifitseeritud etalonaineid). Tühiproovide ja rikastatud proovidega katsete ning kontrollproovide analüüsi kohta tuleb koostada kvaliteedikontrolli kaardid, mille alusel kontrollitakse, kas analüüside tulemuslikkus vastab nõuetele.

5.5.    Määramispiir

5.5.1.

Bioanalüütilise sõeluuringumeetodi puhul ei ole määramispiiri tingimata vaja kindlaks määrata, kuid tuleb tõendada, et meetodiga on võimalik eristada tühiproovi väärtust läviväärtusest. BEQ väärtuse esitamise korral määratakse kindlaks teatamiskünnis, et oleks võimalik eristada proove, mille puhul saadud väärtus on sellest künnisest väiksem. Tuleb tõendada, et teatamiskünnis erineb tühiproovide väärtusest vähemalt kolm korda ja tulemus jääb töövahemikust allapoole. Seepärast arvutatakse see proovide alusel, mis sisaldavad uuritavaid ühendeid ligikaudu nõutud miinimumkoguses, mitte signaali-müra suhte või tühikatse põhjal.

5.5.2.

Kinnitava meetodi puhul peab määramispiir olema ligikaudu üks viiendik piirnormist.

5.6.    Analüüsikriteeriumid

Kinnitava meetodi või sõeluuringumeetodi abil usaldusväärsete tulemuste saamiseks peavad piirnormile vastavasse vahemikku jääva TEQ väärtuse ja vastava BEQ väärtuse puhul olema täidetud järgmised kriteeriumid, olenemata sellest, kas TEQ või BEQ määratakse summaarsena (PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarse sisalduse alusel) või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kohta eraldi.

5.7.    Sõeluuringumeetodi erinõuded

5.7.1.

Sõeluuringuks võib kasutada nii GC-MS-meetodeid kui ka bioanalüütilisi meetodeid. GC-MS-meetodite suhtes kohaldatakse punktis 6 sätestatud nõudeid. Rakupõhiste bioanalüütiliste meetodite erinõuded on sätestatud punktis 7.

5.7.2.

Laborid, kus proovide tavakontrolliks kasutatakse sõeluuringumeetodeid, peavad tegema tihedat koostööd kinnitavat meetodit kasutavate laboritega.

5.7.3.

Tavaanalüüside käigus tuleb kontrollida sõeluuringumeetodi tulemuslikkust analüüsi kvaliteedi kontrollimise ja meetodi pideva valideerimise teel. Nõuetele vastavate tulemuste kontrollimiseks peab olema kehtestatud pidev kava.

5.7.4.

Raku reaktsiooni võimaliku pärssimise ja tsütotoksilisuse kontroll 20 % prooviekstraktidest tuleb kontrollida tavapärase sõeluuringuga, lisades neile või jättes lisamata piirnormile või häiretasemele vastavas koguses 2,3,7,8-TCDDd, et kontrollida, kas prooviekstraktis esinevad segavad ained võivad reaktsiooni pärssida. Rikastatud proovis mõõdetud kontsentratsiooni võrreldakse rikastamata ekstraktis määratud kontsentratsiooni ja rikastamisel kasutatud kontsentratsiooni summaga. Kui kõnealune mõõdetud kontsentratsioon on arvutatud (summaarsest) kontsentratsioonist üle 25 % väiksem, viitab see signaali võimalikule pärssimisele ning asjaomast proovi tuleb analüüsida GC-HRMS-meetodil tehtava kinnitava analüüsiga. Tulemusi kontrollitakse kvaliteedikontrolli kaartide põhjal.

5.7.5.

Nõuetele vastavate proovide kvaliteedikontroll Ligikaudu 2–10 % nõuetele vastavate proovide tulemustest tuleb olenevalt proovi maatriksist ja labori kogemustest kinnitada GC-HRMS-meetodiga.

5.7.6.

Valenegatiivsete tulemuste osakaalu arvutamine kvaliteedikontrolli andmete põhjal Määratakse, kui suur on valenegatiivsete tulemuste osakaal, mis on saadud alla- ja ülespoole piirnormi või häiretaset jäävate proovide sõeluuringul. Valenegatiivsete tulemuste tegelik osakaal peab jääma alla 5 %. Kui proovi maatriksi või maatriksite rühma kohta on olemas vähemalt 20 nõuetele vastava proovi kvaliteedikontrolliga kinnitatud tulemused, arvutatakse nende andmete põhjal valenegatiivsete tulemuste osakaal. Valenegatiivsete tulemuste osakaalu hindamiseks vajaliku 20 tulemuse hulka võib arvata ka laboritevahelistes võrdluskatsetes või seoses saastamisjuhtumiga analüüsitud proovide tulemused, milles määratava aine kontsentratsioon ületab piirnormi näiteks kuni kaks korda. Proovid peavad hõlmama kõige levinumaid analoogide kombinatsioone, mis esindavad eri allikaid. Ehkki sõeluuringu esmane eesmärk on teha kindlaks häiretaset ületava sisaldusega proovid, lähtutakse valenegatiivsete tulemuste osakaalu kindlakstegemisel piirnormist ning seejuures võetakse arvesse kinnitava meetodi kohast mõõtmise laiendmääramatust.

5.7.7.

Sõeluuringuga tuvastatud võimalikke nõuetele mittevastavaid tulemusi tuleb alati kontrollida esialgse proovi täieliku kordusanalüüsiga, kasutades kinnitavat meetodit. Neid proove võib kasutada ka valepositiivsete tulemuste osakaalu hindamiseks. Sõeluuringumeetodite puhul on valepositiivsete tulemuste osakaal selliste tulemuste osakaal, mis tunnistatakse kinnitava analüüsiga nõuetele vastavaks, kuigi varasemal sõeluuringul on proov osutunud nõuetele mittevastavuse kahtlusega prooviks. Sõeluuringumeetodi eeliste hindamisel tuleb valepositiivse tulemuse andnud proovide arvu võrrelda kontrollitud proovide koguarvuga. See osakaal peab olema piisavalt väike, et sõeluuringumeetodit oleks mõtet kasutada.

5.7.8.

Bioanalüütilised meetodid peavad valideerimistingimustes võimaldama usaldusväärselt viidet TEQ võimalikule tasemele, arvutatud ja väljendatud BEQna. Ka korduvuse tingimustes kasutatavate bioanalüütiliste meetodite puhul peaks laborisisene RSDr olema üldjuhul väiksem kui korratavuse tingimustes (RSDR).

6.    GC-MS-meetodite erinõuded, mida tuleb täita sõeluuringu või kinnitava analüüsi puhul

6.1.    WHO-TEQ tulemuste ülemise tõkke ja alumise tõkke vaheline vastuvõetav erinevus

Ülemise ja alumise tõkke vaheline erinevus ei tohi piirnormi ja vajaduse korral häiretaseme ületamise kinnitamiseks olla suurem kui 20 %.

6.2.    Saagiste kontroll

6.2.1.

Analüüsimeetodi valideerimiseks tuleb 13C-märgistatud 2,3,7,8-klooritud PCDD/Fide sisestandardid ja 13C-märgistatud dioksiinitaoliste PCBde sisestandardid lisada kohe analüüsi alguses, näiteks enne ekstraheerimist. Iga tetra- kuni oktaklooritud PCDD/Fide homoloogilise rühma kohta ning iga dioksiinitaoliste PCBde homoloogilise rühma kohta tuleb lisada vähemalt üks analoog (alternatiivina võib lisada vähemalt ühe analoogi iga valitud iooni massispektromeetrilise registreerimise funktsiooni kohta, mida kasutatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde sisalduse kontrolliks). Kinnitavate meetodite puhul tuleb kasutada kõiki seitsetteist 13C-märgistatud 2,3,7,8-asendatud PCDD/Fide sisestandardit ja kõiki kahtteist 13C-märgistatud dioksiinitaoliste PCBde sisestandardit.

6.2.2.

Asjakohaseid kalibreerimislahuseid kasutades tuleb määrata suhtelised kalibreerimistegurid ka neile analoogidele, mille puhul 13C-märgistatud analoogi ei lisata.

6.2.3.

Alla 10 % rasvasisaldusega taimse ja loomse sööda puhul tuleb sisestandardid kindlasti lisada enne ekstraheerimist. Üle 10 % rasvasisaldusega loomse sööda puhul tuleb sisestandardid lisada kas enne või pärast rasva ekstraheerimist. Ekstraheerimise tõhusus tuleb valideerida sobival viisil olenevalt sellest, millises etapis sisestandardid lisatakse.

6.2.4.

Enne GC-MS-analüüsi tuleb lisada 1 või 2 saagise (surrogaat)standardit.

6.2.5.

Saagise kogust tuleb kontrollida. Kinnitava meetodi puhul peavad individuaalsete sisestandardite saagised olema vahemikus 60–120 %. Individuaalsete analoogide, eriti mõne hepta- või oktaklooritud dibenso-p-dioksiini ja dibensofuraani puhul on lubatud väiksemad või suuremad saagised, kui nende panus TEQ väärtusesse ei ületa 10 % TEQ koguväärtusest (PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa alusel). GC-MS-sõeluuringumeetodite puhul peavad saagised olema vahemikus 30–140 %.

6.3.    Segavate ainete eemaldamine

6.4.    Kalibreerimine standardkõveraga

Kalibreerimiskõvera vahemik peab hõlmama asjakohast piirnormi või häiretaset.

6.5.    Kinnitavate meetodite erikriteeriumid

7.    Bioanalüütilistele meetoditele esitatavad erinõuded

Bioanalüütilised meetodid on bioloogilistele põhimõtetele tuginevad meetodid, nagu rakupõhine, retseptor- ja immuunanalüüs. Käesolevas punktis 7 sätestatakse bioanalüütiliste meetodite üldnõuded.

Sõeluuringumeetodiga liigitatakse proov põhimõtteliselt nõuetele vastavaks või nõuetele mittevastavuse kahtlusega prooviks. Sel otstarbel võrreldakse arvutatud BEQ väärtust läviväärtusega (vt punkt 7.3). Läviväärtusest allapoole jäävad proovid tunnistatakse nõuetele vastavaks, läviväärtusega võrdsed või seda ületavad proovid loetakse mittevastavuse kahtlusega proovideks ning neid tuleb analüüsida kinnitava meetodiga. Praktikas võib kõige sobivamaks läviväärtuseks olla BEQ väärtus, mis vastab 2/3 piirnormist, eeldusel, et on tagatud valenegatiivsete tulemuste osakaal alla 5 % ja vastuvõetav valepositiivsete tulemuste osakaal. Kui PCDD/Fide piirnorm ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa piirnorm on erinevad, on proovide nõuetele vastavuse kontrollimiseks ilma fraktsioneerimata vaja PCDD/Fide jaoks asjakohaseid bioanalüüsi läviväärtusi. Häiretaset ületavate proovide kontrollimisel on sobivaks läviväärtuseks asjakohane protsent vastavatest häiretasemetest.

Kui hinnangulist sisaldust väljendatakse BEQna, peavad proovi analüüsitulemused jääma töövahemikku ja ületama teatamiskünnise (vt punktid 7.1.1 ja 7.1.6).

7.1.    Analüüsitulemuste hindamine

7.1.1.    Üldised nõuded

7.1.2.    Kalibreerimine

7.1.2.1.   Kalibreerimine standardkõveraga

7.1.2.2.   Kalibreerimine võrdlusproovide abil

Teise võimalusena võib kasutada vähemalt nelja võrdlusproovi alusel koostatud kalibreerimiskõverat (vt punkt 7.2.4): üks maatriksiga tühiproov ning kolm võrdlusproovi sisaldustega, mis võrduvad 0,5-, 1- ja 2-kordse piirnormi või häiretasemega; kui võrdlusproovide maatriksi omadused kattuvad tundmatute proovide maatriksi omadustega, ei ole vaja arvestada tühikatse ja saagise parandit. Sellisel juhul võib otse nende proovide alusel arvutada analüüsitulemuse, mis vastab 2/3 piirnormist (vt punkt 7.3), ja kasutada seda läviväärtusena. Häiretaset ületavate proovide kontrollimisel on sobivaks läviväärtuseks asjakohane protsent sellistest häiretasemetest.

7.1.3.    PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi määramine

Ekstraktid võib jagada PCDD/Fisid ja dioksiinitaolisi PCBsid sisaldavateks fraktsioonideks, mis võimaldab eraldi määrata PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde TEQ väärtused (väljendatuna BEQna). Dioksiinitaolisi PCBsid sisaldava fraktsiooni analüüsimise tulemuste hindamiseks tuleb eelistatavalt kasutada standardiga PCB 126 saadud kalibreerimiskõverat.

7.1.4.    Bioanalüüsi näilised saagised

Bioanalüüsi näiline saagis arvutatakse sobivate võrdlusproovide alusel, mille representatiivne analoogide kombinatsioon vastab ligikaudu piirnormile või häiretasemele, ja seda väljendatakse BEQ väärtuse protsendina TEQ väärtusest. Olenevalt analüüsi liigist ja kasutatud TEFidest ( 27 ) võib dioksiinitaoliste PCBde TEF- ja REP-kordajate erinevuse tõttu dioksiinitaoliste PCBde näiline saagis olla PCDD/Fide näilise saagisega võrreldes väike. Seepärast peab PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi määramisel bioanalüüsi näiline saagis olema järgmine: dioksiinitaoliste PCBde puhul 20–60 % ja PCDD/Fide puhul 50–130 % (vahemik kehtib TCDD kalibreerimiskõvera kasutamisel). Dioksiinitaoliste PCBde osakaal PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summas võib eri maatriksite ja proovide puhul erineda; need vahemikud kajastuvad PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa bioanalüüsi näilises saagises, mis peab olema 30–130 %. Kui liidu õigusaktides muudetakse oluliselt PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde TEFide väärtusi, tuleb need vahemikud läbi vaadata.

7.1.5.    Saagiste kontroll puhastamisel

Valideerimise käigus kontrollitakse ühendite kadu puhastamisel. Analoogide seguga rikastatud tühiproov (korduskatsete arv n on vähemalt 3) puhastatakse ning saagist ja varieeruvust kontrollitakse kinnitava meetodiga. Saagis peab olema vahemikus 60–120 %, eelkõige selliste analoogide puhul, mis moodustavad eri segude TEQ väärtusest üle 10 %.

7.1.6.    Teatamiskünnis

BEQ väärtustest teatamisel tuleb teatamiskünnis kindlaks määrata tüüpilisi analoogide kombinatsioone sisaldavast asjakohasest maatriksist võetud proovide alusel, mitte standarditel põhineva kalibreerimiskõvera alusel, kuna kõvera alumises osas on täpsus väike. Arvestada tuleb ekstraheerimise ja puhastamise mõju. Teatamiskünnis peab olema tühikatsete tulemusest vähemalt kolm korda suurem.

7.2.    Võrdlusproovide kasutamine

7.2.1.

Võrdlusproovid peavad esindama proovi maatriksit, analoogide kombinatsioone ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde kontsentratsioone vahemikus, mis vastab piirnormile või häiretasemele.

7.2.2.

Igas katseseerias tuleb kasutada tühikatset, eelistatavalt maatriksiga tühiproovi, ja piirnormile või häiretasemele vastava sisaldusega võrdlusproovi. Neid proove tuleb ekstraheerida ja analüüsida samal ajal ja samades tingimustes. Võrdlusprooviga saadud väärtus peab olema selgelt suurem tühiprooviga saadud väärtusest, mis tõendab katsemeetodi sobivust. Kõnealuseid proove võib kasutada tühikatset ja saagist arvestava parandi tegemisel.

7.2.3.

Saagist arvestava parandi tegemiseks valitud võrdlusproovid peavad olema analüüsitava proovi suhtes representatiivsed, st analoogide kombinatsioonid ei tohi põhjustada sisalduse alahindamist.

7.2.4.

Et tõendada analüüsi nõuetekohast tulemuslikkust huvipakkuvas sisalduste vahemikus piirnormi või häiretaseme kontrollimiseks, võib kasutada täiendavaid võrdlusproove, milles uuritava aine sisaldus vastab näiteks piirnormi või häiretaseme 0,5- ja 2-kordsele väärtusele. Üheskoos võib neid proove kasutada analüüsitavate proovide BEQ väärtuste arvutamiseks (vt punkt 7.1.2.2).

7.3.    Läviväärtuste määramine

Tuleb teha kindlaks BEQ väärtustes väljendatud bioanalüütiliste tulemuste ja TEQ väärtustes väljendatud kinnitava meetodi tulemuste vaheline seos (nt asjakohase maatriksiga tehtud kalibreerimiskatsetega, milles kasutatakse võrdlusproove, mille rikastustasemed on 0, 0,5-, 1- ja 2-kordne piirnorm, ja mida korratakse igal tasemel 6 korda (n = 24)). Selle seose alusel saab hinnata (tühiproovi ja saagise) parandeid, kuid neid tuleb kontrollida punkti 7.2.2 kohaselt.

Läviväärtused tuleb määrata selleks, et otsustada, kas proov vastab piirnormile, või vajaduse korral häiretaseme kontrollimiseks, kusjuures asjaomased piirnormid või häiretasemed on kehtestatud kas ainult PCDD/Fide või dioksiinitaoliste PCBde jaoks või PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa jaoks. Läviväärtus on bioanalüüsi tulemuste (mida on parandatud tühikatse ja saagise arvestamiseks) jaotuse alumine piir, mis vastab 95 % usaldusnivooga kinnitava meetodi otsustuspiirile (eeldades, et valenegatiivsete tulemuste osakaal on < 5 % ja RSDR < 25 %). Kinnitava meetodi otsustuspiir on piirnorm, mille puhul on arvesse võetud mõõtmise laiendmääramatust.

Läviväärtuse (BEQdes) võib arvutada, kasutades üht punktides 7.3.1, 7.3.2 ja 7.3.3 sätestatud lähenemisviisidest (vt joonis 1).

7.3.1.

95 % usaldusnivoole vastava usaldusvahemiku alumise piiri kasutamine, mis vastab kinnitava meetodi otsustuspiirile: kus BEQDL on BEQ, mis vastab kinnitava meetodi otsustuspiirile, mis on piirnorm, mille puhul on arvesse võetud mõõtmise laiendmääramatust, sy,x on jääkstandardhälve, t α,f = m – 2 on Studenti tegur (α = 5 %, f = vabadusastmete arv, ühepoolse piiranguga), m on kalibreerimispunktide koguarv (indeks j), n on korduste arv igal tasemel, xi on kinnitava meetodiga määratud, TEQna väljendatud kontsentratsioon proovis kaliibrimispunktis i, on kõikide kaliibrimisproovide kontsentratsioonide keskväärtus (TEQdes), on ruutude summa parameeter, i – kalibreerimispunkti i indeks.

7.3.2.

Arvutamine kinnitava meetodi otsustuspiirile vastava saastumisega proovide korduval analüüsimisel (n ≥ 6) saadud (tühikatse ja saagise arvestamiseks parandatud) bioanalüütiliste tulemuste põhjal; see on jaotuse alumine piir vastava keskmise BEQ väärtuse korral: Läviväärtus = BEQDL – 1,64 × SDR kus SDR on bioanalüüsi tulemuste standardhälve BEQDL korral, mõõdetuna laborisisese korratavuse tingimustes.

7.3.3.

Arvutamine 2/3 piirnormi või häiretaseme väärtusele (põhineb tähelepanekul, et kõnealune tase vastab umbkaudu punkti 7.3.1 või 7.3.2 alusel kindlaks määratud läviväärtusele) vastava saastumisega proovide korduval analüüsimisel (n ≥ 6) saadud bioanalüütiliste tulemuste (BEQdes, parandatud tühikatse ja saagise arvestamiseks) keskväärtusena: Läviväärtuste arvutamine 95 % usaldusnivoo korral eeldusel, et valenegatiivsete tulemuste osakaal on < 5 % ja RSDR < 25 %: 1)  95 % usaldusnivoole vastava usaldusvahemiku alumise piiri alusel, mis vastab kinnitava meetodi otsustuspiirile; 2)  kinnitava meetodi otsustuspiirile vastava saastumisega proovide korduva analüüsimise (n ≥ 6) alusel saadud tulemuste jaotuse (joonisel kellukesekujuline kõver) alumise piiri järgi sellekohase keskmise BEQ väärtuse juures. Joonis 1

7.3.4.

Läviväärtustele kehtestatud piirangud BEQ-põhised läviväärtused, mis on arvutatud valideerimise käigus saadud RSDR alusel, kasutades piiratud arvu proove erinevate maatriksite ja analoogide kombinatsiooniga, võivad olla suuremad kui TEQ-põhised piirnormile või häiretasemele vastavad sisaldused, kuna valideerimisel saavutatakse suurem kordustäpsus kui tavaolukorras, kus tuleb kontrollida võimalike analoogide kombinatsioonide tundmatut spektrit. Sellisel juhul võetakse läviväärtuse arvutamisel aluseks kas RSDR = 25 % või eelistatakse sisaldust, mis on 2/3 piirnormi või häiretaseme väärtusest.

7.4.    Tulemuslikkuse näitajad

7.4.1.

Bioanalüütiliste meetodite puhul ei ole võimalik kasutada sisestandardeid, mistõttu tuleb katseseeriasisese ja katseseeriatevahelise standardhälbe kohta andmete saamiseks teha katsed bioanalüütiliste meetodite korduvuse kohta. Korduvus peab jääma alla 20 % ja laborisisene korratavus alla 25 %. See peab põhinema arvutatud BEQ väärtustel pärast tühikatse- ja saagiseparandi arvessevõtmist.

7.4.2.

Valideerimise käigus tõendatakse, et analüüs võimaldab eristada tühiproovi ja läviväärtusele vastavat sisaldust, mis võimaldab kindlaks teha proovid, milles asjaomane läviväärtus on ületatud (vt punkt 7.1.2).

7.4.3.

Määratakse uuritavad ühendid, võimalikud segavad tegurid ja tühiproovi suurimad lubatud väärtused.

7.4.4.

Ühe prooviekstrakti kolmekordsel analüüsimisel ei tohi protsentides väljendatud standardhälve olla suurem kui 15 % analüüsitulemusest või selle alusel arvutatud sisaldusest (võimalik üksnes töövahemikus).

7.4.5.

Bioanalüütilise meetodi tulemuslikkuse hindamiseks kindlas ajavahemikus kasutatakse võrdlusproovi(de) (tühiproov ning piirnormile ja häiretasemele vastava sisaldusega proov) korrigeerimata tulemusi, mis on väljendatud BEQdes.

7.4.6.

Tühiproovide ja iga tüüpi võrdlusproovide kohta tuleb koostada kvaliteedikontrolli kaardid ja kontrollida, kas analüüsi tulemuslikkus vastab nõuetele; eelkõige on nõutav teatava miinimumerinevuse olemasolu tühiproovide ja töövahemiku alumise piiri vahel ning võrdlusproovide puhul on nõutav laborisisene korratavus. Tühikatseid tuleb põhjalikult kontrollida, et vältida valenegatiivsete tulemuste saamist pärast tühiproovi tulemuse lahutamist.

7.4.7.

Nõuetele mittevastavuse kahtlusega proovide ja 2–10 % nõuetekohaste proovide (vähemalt 20 proovi iga maatriksi kohta) kinnitava meetodiga saadud tulemused tuleb koondada ning kasutada sõeluuringumeetodi tulemuslikkuse ning BEQ ja TEQ vahelise seose hindamiseks. Neid andmeid võib kasutada asjaomase valideeritud maatriksiga tavaproovide suhtes kohaldatavate läviväärtuste ümberhindamiseks.

7.4.8.

Meetodi tulemuslikkust võib tõendada ka laboritevahelistes võrdluskatsetes osalemisega. Võrdluskatsete käigus analüüsitud proovid hõlmavad nt kuni kahekordse piirnormini ulatuvat kontsentratsioonide vahemikku ja nende tulemusi võib kasutada valenegatiivsete tulemuste osakaalu hindamisel, kui labor suudab tõendada meetodi tulemuslikkust asjaomases laboris. Proovid peavad hõlmama kõige levinumaid analoogide kombinatsioone, mis esindavad eri allikaid.

7.4.9.

Saastumisjuhtumite korral võidakse läviväärtused ümber hinnata, võttes arvesse asjaomase juhtumiga seotud konkreetse maatriksi omadusi ja esinevaid analoogide kombinatsioone.

8.    Tulemuste esitamine

8.1.    Kinnitavad meetodid

8.1.1.

Analüüsitulemused peavad hõlmama iga üksiku PCDD/Fi ja dioksiinitaolise PCB analoogi sisaldusi ning TEQ väärtus tuleb esitada nii alumise ja ülemise tõkke kui ka vaheväärtuse põhisena, et tagada võimalikult suure hulga andmete olemasolu katseprotokollis ja võimaldada tulemuste tõlgendamist lähtuvalt konkreetsetest nõuetest.

8.1.2.

Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod.

8.1.3.

Üksikute sisestandardite saagised tuleb esitada juhul, kui need jäävad väljapoole punktis 6.2.5 nimetatud vahemikku ja kui on ületatud piirnorm (sellisel juhul ühe korduskatse saagised) või kui nõutakse neist teatamist.

8.1.4.

Kuna proovi nõuetekohasuse hindamisel tuleb arvestada mõõtmise laiendmääramatust, esitatakse ka see näitaja. Analüüsitulemused tuleb seega esitada kujul x +/– U, kus x on analüüsitulemus ja U on mõõtmise laiendmääramatus, kusjuures arvutamisel kasutatakse kattetegurit 2, mis annab ligikaudu 95 % usaldusnivoo. Kui PCDD/Fid ja dioksiinitaolised PCBd määratakse eraldi, tuleb PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summa kohta kasutada PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde eraldi saadud analüüsitulemuste hinnanguliste laiendmääramatuste summat.

8.1.5.

Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on esitatud direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid.

8.2.    Bioanalüütilised sõeluuringumeetodid

8.2.1.

Sõeluuringu tulemus esitatakse järgmisel kujul: nõuetele vastav või nõuetele mittevastavuse kahtlusega („kahtlane”).

8.2.2.

Lisaks sellele võib PCDDde/Fide ja/või dioksiinitaoliste PCBde esialgse sisalduse esitada BEQdes, mitte TEQdes.

8.2.3.

Allapoole teatamiskünnist jääva tulemusega proovi kohta märgitakse „allpool teatamiskünnist”. Töövahemiku ülempiirist suurema sisaldusega proovi puhul esitatakse tulemus kujul „ületab töövahemiku ülempiiri” ning märgitakse töövahemiku ülempiirile vastav BEQ väärtus.

8.2.4.

Katseprotokollis tuleb iga proovimaatriksi tüübi kohta esitada piirnorm või häiretase, millel hindamine põhineb.

8.2.5.

Protokollis esitatakse kasutatud analüüsimeetodi liik, analüüsimise aluspõhimõtted ja kalibreerimise viis.

8.2.6.

Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod.

8.2.7.

Mittevastavuse kahtlusega proovide puhul tuleb protokolli lisada märkus võetavate meetmete kohta. Suurema sisaldusega proovides tuleb PCDD/Fide kontsentratsioon ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarne kontsentratsioon määrata/kinnitada kinnitava meetodi abil.

8.2.8.

Esitatakse üksnes kinnitava analüüsiga saadud nõuetele mittevastavad tulemused.

8.3.    Füüsikalis-keemilised sõeluuringumeetodid

8.3.1.

Sõeluuringu tulemus esitatakse järgmisel kujul: nõuetele vastav või nõuetele mittevastavuse kahtlusega („kahtlane”).

8.3.2.

Katseprotokollis tuleb iga proovimaatriksi tüübi kohta esitada piirnorm või häiretase, millel hindamine põhineb.

8.3.3.

Peale selle võib esitada iga üksiku PCDD/Fi ja dioksiinitaolise PCB analoogi sisalduse ning TEQ väärtuse alumise tõkke, ülemise tõkke ja vaheväärtuse järgi. Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid.

8.3.4.

Üksikute sisestandardite saagised tuleb esitada juhul, kui need jäävad väljapoole punktis 6.2.5 nimetatud vahemikku ja kui on ületatud piirnorm (sellisel juhul ühe korduskatse saagised) või kui nõutakse neist teatamist.

8.3.5.

Katseprotokollis märgitakse, millist GC-MSi meetodit kasutati.

8.3.6.

Protokollis esitatakse PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod.

8.3.7.

Mittevastavuse kahtlusega proovide puhul tuleb protokolli lisada märkus võetavate meetmete kohta. Suurema sisaldusega proovides tuleb PCDD/Fide kontsentratsioon ning PCDD/Fide ja dioksiinitaoliste PCBde summaarne kontsentratsioon määrata/kinnitada kinnitava meetodi abil.

8.3.8.

Otsuse nõuetele mittevastavuse kohta võib teha üksnes pärast kinnitavat analüüsi.

III PEATÜKK

Proovi ettevalmistamine ja nõuded analüüsimeetoditele, mida kasutatakse mittedioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks söödas

1.    Kohaldamisala

Käesolevas peatükis sätestatud nõudeid kohaldatakse sööda analüüsimisel mittedioksiinitaoliste PCBde sisalduse ametlikuks kontrolliks, samuti seoses proovide ettevalmistamise ja analüüsimisega muul regulatiivsel eesmärgil, sealhulgas kontrollide puhul, mida söödakäitlejad teevad määruse (EÜ) nr 183/2005 sätetele vastavuse tagamiseks.

2.    Kasutatavad tuvastamismeetodid

Gaasikromatograafia koos elektronhaarde detekteerimisega (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS või samaväärsed meetodid.

3.    Uuritavate analüütide määramine ja kinnitamine

3.1.	Suhteline retentsiooniaeg vastavalt sisestandarditele või võrdlusstandarditele (lubatud hälve +/– 0,25 %).

3.2.	Mittedioksiinitaoliste PCBde gaasikromatograafiline lahutamine segavatest ainetest, eelkõige nendega koos elueeruvatest PCBdest, eriti juhul, kui sisaldus proovis on ligikaudselt võrreldav kehtiva piirnormiga, ning on vaja kinnitada nõuetele mittevastavust ( 28 ).

3.3.

Nõuded GC-MSi meetoditele Vähemalt järgmise arvu molekulaarioonide või asjaomasesse molekulirühma kuuluvate iseloomulike ioonide jälgimine: a)  HRMSi puhul kaks spetsiifilist iooni; b)  LRMSi puhul kolm spetsiifilist iooni; c)  MS-MSi puhul kaks spetsiifilist eellasiooni, millest kummalgi on üks neile vastav üleminekul tekkinud spetsiifiline järglasioon. Valitud massiga fragmentide isotoopsuhte suurimad lubatud hälbed: valitud massiga fragmentide isotoopsuhte suhteline hälve teoreetilisest isotoopide kogusest või uuritava iooni (kõige levinum jälgitav ioon) ja iseloomuliku iooni (iseloomulike ioonide) kalibreerimisstandardist: ± 15 %.

3.4.	Nõuded GC-ECD meetoditele Piirnormi ületavaid tulemusi tuleb kinnitada kahe GC-kolonniga, millel on eri polaarsusega statsionaarne faas.

4.    Meetodi tulemuslikkuse tõendamine

Meetodi tulemuslikkus valideeritakse piirnormile vastava sisalduse vahemikus (0,5- kuni 2-kordsele piirnormile vastava sisaldusega); tõendatakse, et korduvanalüüsi variatsioonikordaja on vastuvõetav (vt vahetäpsuse nõuded, punkt 9).

5.    Määramispiir

Mittedioksiinitaoliste PCBde määramispiiride summa ( 29 ) ei tohi ületada ühte kolmandikku piirnormi väärtusest ( 30 ).

6.    Kvaliteedikontroll

Korrapärane tühiproovide, rikastatud proovide ja kvaliteedikontrolli proovide analüüsimine, osalemine asjaomaste maatriksitega tehtavates laboritevahelistes uuringutes.

7.    Saagiste kontroll

7.1.	Kasutatakse sobivaid sisestandardeid, mille füüsikalis-keemilised omadused on võrreldavad uuritavate analüütide omadega.

7.2.	Sisestandardite lisamine: lisamine toodetele (enne ekstraheerimist ja puhastamist).

7.3.

Nõuded meetoditele, mille puhul kasutatakse kõiki kuut isotoopmärgistatud mittedioksiinitaolise PCB analoogi: a)  tulemustesse viiakse sisse sisestandardite saagiseid arvestav parand; b)  isotoopmärgistatud sisestandardi saagis peab olema 60–120 %; c)  individuaalsetel analoogidel, mille osatähtsus mittedioksiinitaoliste PCBde summas on alla 10 %, võivad olla väiksemad või suuremad saagised.

7.4.

Nõuded meetoditele, mille puhul ei kasutata kõiki kuut isotoopmärgistatud sisestandardit või kasutatakse muid sisestandardeid: a)  kontrollitakse iga proovi sisestandardi(te) saagist; b)  sisestandardi(te) saagis peab olema 60–120 %; c)  tulemustesse viiakse sisse sisestandardite saagiseid arvestav parand.

7.5.	Märgistamata analoogide saagiseid kontrollitakse rikastatud proovide või kvaliteedikontrolli proovidega, milles uuritava aine kontsentratsioon on piirnormi lähedane. Selliste analoogide aktsepteeritavad saagised on 60–120 %.

8.    Nõuded laboritele

Vastavalt määrusele (EÜ) nr 882/2004 peavad laborid olema ISO juhendi 58 kohaselt tegutseva tunnustatud asutuse poolt akrediteeritud, millega tagatakse, et laborid kohaldavad analüüsimisel kvaliteeditagamissüsteemi. Laborid tuleb akrediteerida standardi EN ISO/IEC 17025 kohaselt. Peale selle järgitakse vajaduse korral põhimõtteid, mida on kirjeldatud tehnilistes suunistes, milles käsitletakse mõõtemääramatuse ja määramispiiride hinnangulise väärtuse määramist PCBde analüüsimisel ( 31 ).

9.    Tulemuslikkuse näitajad: piirnormile vastava mittedioksiinitaoliste PCBde summaarse sisalduse suhtes kohaldatavad kriteeriumid

10.    Tulemuste esitamine

10.1.

Selleks et katseprotokoll sisaldaks võimalikult palju andmeid ja võimaldaks tulemuste tõlgendamist konkreetsetest nõuetest lähtuvalt, peavad analüüsitulemused hõlmama iga üksiku mittedioksiinitaolise PCB sisaldust ja nende PCB analoogide summaarset sisaldust ning olema esitatud alumise ja ülemise tõkke ning vaheväärtusena.

10.2.

Protokollis esitatakse PCBde ekstraheerimiseks kasutatud meetod.

10.3.

Üksikute sisestandardite saagised tuleb esitada juhul, kui need jäävad väljapoole punktis 7 nimetatud vahemikku, kui on ületatud piirnorm või muudel juhtudel, kui nõutakse teatamist.

10.4.

Kuna proovi nõuetekohasuse hindamisel tuleb arvestada mõõtmise laiendmääramatust, esitatakse ka see näitaja. Analüüsitulemused tuleb seega esitada kujul x +/– U, kus x on analüüsitulemus ja U on mõõtmise laiendmääramatus, kusjuures arvutamisel kasutatakse kattetegurit 2, mis annab ligikaudu 95 % usaldusnivoo.

10.5.

Tulemused tuleb esitada samades ühikutes ja vähemalt sama tüvenumbrite arvuga, nagu on direktiiviga 2002/32/EÜ sätestatud piirnormid.

▼M2

---

VI LISA

ANALÜÜSIMEETODID LOOMSE PÄRITOLUGA OSAKESTE MÄÄRAMISEKS SÖÖDA AMETLIKUL KONTROLLIMISEL

1.   EESMÄRK JA REGULEERIMISALA

Loomse päritoluga komponendid söödas määratakse valgusmikroskoopia või polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) abil vastavalt käesolevas lisas esitatud sätetele.

Nende kahe meetodi abil on võimalik tuvastada loomse päritoluga osakeste esinemist söödamaterjalides ja segajõusöödas. Nende meetodite abil ei ole siiski võimalik arvutada selliste osakeste hulka söödamaterjalides või segajõusöödas. Mõlema meetodi avastamispiir on alla 0,1 massiprotsendi.

Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetodi abil on võimalik tuvastada, millisesse taksonoomilisse rühma kuuluvad söödamaterjalides ja segajõusöödas esinevad loomse päritoluga osakesed.

Neid meetodeid kasutatakse määruse (EÜ) nr 999/2001 artikli 7 lõikes 1 ja IV lisas ning määruse (EÜ) nr 1069/2009 artikli 11 lõikes 1 sätestatud keeldude kohaldamise kontrolliks.

Sõltuvalt kontrollitava sööda liigist võib neid meetodeid kasutada ühe katse-eeskirja raames kas eraldi või koos vastavalt ELi referentlabori poolt kehtestatud ja labori veebisaidil avaldatud standardsele töökorrale söödas leiduvate loomsete valkude määramiseks (EURL-AP) ( 32 ).

2.   MEETODID

2.1.    Valgusmikroskoopia

2.1.1.    ►M7  Põhimõte

Loomse päritoluga osakesed, mis võivad esineda analüüsimiseks saadetud söödamaterjalides ja segasöödas, tehakse kindlaks tüüpiliste mikroskoobiga nähtavate tunnuste alusel (nt lihaskiud ja muud lihaosakesed, kõhr, luu- või sarveosakesed, karvad, harjased, veri, piima gloobulid, laktoosikristallid, suled, munakoored, kalaluud, soomused). ◄

2.1.2.    Reaktiivid ja seadmed

2.1.2.1.   Reaktiivid

2.1.2.1.1.   Kontsentreeriv aine

2.1.2.1.1.1.   Tetrakloroetüleen (tihedus 1,62)

2.1.2.1.2.   Värvimisreaktiiv

2.1.2.1.2.1.

Alisariinpunase lahus (lahjendada 2,5 ml 1 M soolhapet 100 ml vees ja lisada saadud lahusele 200 mg alisariinpunast)

2.1.2.1.3.   Kinnitid

2.1.2.1.3.1.   Leelis (NaOH 2,5 % w/v või KOH 2,5 % w/v)

2.1.2.1.3.2.    ►M7  Glütserool (lahjendamata, viskoossus: 1 490 cP) või kinniti, millel on võrdväärsed omadused mittepüsiva vaatluspreparaadi valmistamiseks. ◄

2.1.2.1.3.3.   Norland ® Optical Adhesive 65 (viskoossus: 1 200 cP) või vaik, millel on nimetatud vahendiga võrdväärsed omadused objektiklaasil püsipreparaadi valmistamiseks.

2.1.2.1.4.   Värvivate omadustega kinnitid

2.1.2.1.4.1.

Lugoli lahus (lahustada 2 g kaaliumjodiidi 100 ml vees ja lisada pidevalt loksutades 1 g joodi)

2.1.2.1.4.2.

Tsüstiini määramise reaktiiv (2 g pliiatsetaati, 10 g NaOH 100 ml vees)

2.1.2.1.4.3.

Fehlingi reaktiiv (valmistatakse enne kasutamist põhilahuste A ja B võrdsetest kogustest (1/1). Lahus A: lahustada 6,9 g vask(II)sulfaatpentahüdraati 100 ml vees. Lahus B: lahustada 34,6 g kaaliumnaatriumtartraattetrahüdraati ja 12 g NaOH 100 ml vees)

2.1.2.1.4.4.

Tetrametüülbensidiin/vesinikperoksiid (lahustada 1 g 3,3′,5,5′ tetrametüülbensidiini (TMB) 100 ml jää-äädikhappes ja 150 ml vees. Enne kasutamist segada 4 osa saadud TMB lahust 1 osa 3-protsendilise vesinikperoksiidiga)

2.1.2.1.5.   Loputusained

2.1.2.1.5.1.   Etanool ≥ 96 % (tehniline)

2.1.2.1.5.2.   Atsetoon (tehniline)

2.1.2.1.6.   Pleegitav reaktiiv

2.1.2.1.6.1.   Kaubanduslik naatriumhüpokloriti lahus (9–14 % aktiivkloori)

2.1.2.2.   Seadmed

2.1.2.2.1.   Analüütiline kaal täpsusega 0,001 g

2.1.2.2.2.    ►M7  Jahvatusseade: lõiketeradega või rootorveski. Kui kasutatakse rootorveskit, ei tohi kasutada sõelasid, mille võrguava on ≤ 0,5 mm ◄

2.1.2.2.3.    ►M7  0,25 mm ja 1 mm ruudukujuliste võrguavadega sõelad. Materjalikao vältimiseks ei tohiks sõelade diameeter ületada 10 cm, välja arvatud proovi eelsõelumisel. Sõelade kalibreerimine ei ole nõutav ◄

2.1.2.2.4.

250 ml kooniline klaasist jaotuslehter, mille koonuse põhjas on teflonist või lihvklaasist korkkraan. Korkkraani ava läbimõõt peab olema ≥ 4 mm. Alternatiivina võib kasutada koonilise põhjaga selitusklaasi, kui labor on tõestanud, et tuvastatav kontsentratsioon on sama kui koonilise klaasist jaotuslehtri kasutamise puhul. Jaotuslehter

2.1.2.2.5.

Vähemalt 6,5–40-kordse suurendusvahemikuga stereomikroskoop

2.1.2.2.6.

Vähemalt 100–400-kordse suurendusvahemikuga kombineeritud mikroskoop, mida saab kasutada vaatluseks läbiva valgusega valgevälja meetodil. Lisaks võib kasutada polariseeritud valgust ja diferentsiaalset interferentskontrasti

2.1.2.2.7.

Tavalised klaasist laborinõud

2.1.2.2.8.

Vaatluspreparaadi valmistamise vahendid: tavalised mikroskoobi objektiklaasid, süvendiga objektiklaasid, katteklaasid (20 × 20 mm), pintsetid, õhuke spaatel

▼M7

2.1.2.2.9.

Laboriahi

2.1.2.2.10.

Tsentrifuug

2.1.2.2.11.

Filterpaber: kvalitatiivseks analüüsiks sobiv tselluloosfilter (poori suurus 4–11 μm)

▼M2

2.1.3.    Proovi võtmine ja ettevalmistamine

2.1.3.1.    ►M7  Proovi võtmine

Määramiseks kasutatakse käesoleva määruse I lisa sätete kohaselt võetud representatiivset proovi. ◄

2.1.3.2.   Ettevaatusabinõud

Laboratoorse ristsaastumise vältimiseks tuleb kõik taaskasutatavad seadmed enne kasutamist hoolikalt puhastada. Jaotuslehtri osad tuleb enne puhastamist lahti võtta. Jaotuslehtri osad ja klaasnõud pestakse kõigepealt käsitsi ja seejärel pesumasinas. Sõelu tuleb puhastada jäikade harjastega sünteetilise harjaga. Pärast rasvaste materjalide, näiteks kalajahu sõelumist on soovitav sõelu puhastada atsetooni ja suruõhuga.

2.1.3.3.   Muude kui rasva- ja õliproovide ettevalmistamine

2.1.3.3.1.

►M7  Proovide kuivatamine: proovid niiskusesisaldusega > 14 % kuivatatakse enne käitlemist vastavalt käesoleva määruse III lisale. ◄ .

2.1.3.3.2.

►M7  Proovide eelsõelumine: selleks et koguda teavet sööda võimaliku keskkonnatekkelise saastumise kohta, on soovitav granuleeritud söötasid ja seemneid läbi 1 mm ava eelsõeluda ja seejärel kaks saadud fraktsiooni, mida tuleb käsitada eraldiseisvate proovidena, ette valmistada, analüüsida ja nende kohta aruanne koostada. ◄

2.1.3.3.3.

Osaproovide võtmine ja peenestamine: vähemalt 50 g proovist võetakse analüüsimiseks ja peenestatakse.

2.1.3.3.4.

Sademe ekstraheerimine ja ettevalmistamine: 10 g (täpsusega 0,01 g) suurune kogus jahvatatud osaproovist pannakse jaotuslehtrisse või koonilise põhjaga selitusklaasi ja lisatakse 50 ml tetrakloroetüleeni. Lehtrisse viidav kogus on maksimaalselt 3 g, kui tegemist on kalajahu või muu puhtalt loomse saaduse, mineraalse komponendi või eelseguga, mis tekitab rohkem kui 10 % sadet. Segu loksutatakse tugevasti vähemalt 30 sekundit ja seejärel lisatakse ettevaatlikult veel vähemalt 50 ml tetrakloroetüleeni, loputades sellega lehtri sisepinda, et eemaldada kõik sellele jäänud osakesed. Saadud segul lastakse seista vähemalt 5 minutit, enne kui sade eraldatakse korkkraani avamisega. Koonilise põhjaga selitusklaasi kasutamisel segatakse segu tugevasti vähemalt 15 sekundit ja pestakse klaasi sisepinnalt vähemalt 10 ml tetrakloroetüleeniga hoolikalt maha kõik kinni jäänud osakesed. Segul lastakse 3 minutit seista ja segatakse uuesti 15 sekundit ning pestakse klaasi sisepinnalt vähemalt 10 ml puhta tetrakloroetüleeniga hoolikalt maha kõik kinni jäänud osakesed. Saadud segul lastakse seista vähemalt 5 minutit ning seejärel vedel osa eemaldatakse ja valatakse ära hoolika dekanteerimisega, jälgides, et sade jääks täielikult alles. ▼M7 Sade kogutakse lehtrisse asetatud filterpaberile, et võimaldada ülejäänud tetrakloroetüleeni eraldamist, vältides samal ajal sademes rasva kogunemist. Sade kuivatatakse. Seejärel on soovitatav sade kaaluda (täpsusega 0,001 g), et määrata sadestumise aste. Lõpuks sõelutakse sade 0,25 mm sõelaga ja uuritakse kahte saadud fraktsiooni, välja arvatud juhul, kui sõelumist ei peeta vajalikuks. ▼M2

2.1.3.3.5.

Heljumi ekstraheerimine ja ettevalmistamine: pärast sademe eraldamist eespool kirjeldatud meetodi abil peab jaotuslehtrisse jääma kaks faasi: vedel faas, mis koosneb tetrakloroetüleenist, ja heljumist saadud tahke faas. Tahke faas on heljum ja selle saamiseks lastakse tetrakloroetüleen lehtrist täielikult välja korkkraani avamisega. Jaotuslehter pööratakse ümber ja valatakse heljum suurde Petri tassi ning kuivatatakse õhu käes tõmbe all. Kui heljumis on rohkem kui 5 % osakesi suurusega > 0,50 mm, sõelutakse see 0,25 mm sõelaga ja uuritakse mõlemat saadud fraktsiooni.

2.1.3.3.6.

Lähtematerjali ettevalmistamine: valmistatakse ette vähemalt 5 g suurune jahvatatud osaproov. Kui rohkem kui 5 % materjalist koosneb osakestest suurusega > 0,50 mm, sõelutakse see 0,25 mm sõelaga ja uuritakse mõlemat saadud fraktsiooni.

2.1.3.4.   Rasvast ja õlist koosnevate proovide ettevalmistamine

Rasvast ja õlist koosnevate proovide ettevalmistamiseks võib kasutada järgmist eeskirja:

2.1.3.5.   Värvimisreaktiivide kasutamine

Loomset päritolu osakeste nõuetekohase kindlakstegemise hõlbustamiseks võib katse teostaja kasutada proovide ettevalmistamisel värvimisreaktiive kooskõlas EURL-AP koostatud juhistega, mis on avaldatud labori veebisaidil.

Kui sademe värvimiseks kasutatakse alisariinpunase lahust, kasutatakse järgmist eeskirja:

2.1.4.    Mikroskoopiline uurimine

2.1.4.1.   Vaatluspreparaadi ettevalmistamine

▼M7

Sademest ja katse teostaja valikul kas heljumist või lähteainest valmistatakse vaatluspreparaadid.

▼M2

On vaja ette valmistada piisav arv vaatluspreparaate, et tagada punktis 2.1.4.2 esitatud uurimiseeskirja täies ulatuses teostamine.

Vaatluspreparaadid peavad olema kinnitatud nõuetekohaste kinnitite abil vastavalt EURL-AP standardsele töökorrale, mis on avaldatud labori veebisaidil. Vaatluspreparaadid peavad olema kaetud katteklaasidega.

▼M7

2.1.4.2.   Vaatluse voodiagramm loomse päritoluga osakeste tuvastamiseks segasöödas ja söödamaterjalis

Mikroskoobiga vaatlemiseks ettevalmistatud preparaate vaadeldakse vastavalt joonistel 1 ja 2 esitatud vaatluse voodiagrammidele.

Sademe mikroskoobiga vaatlemiseks kasutatakse kombineeritud mikroskoopi ja sõltuvalt katse teostaja valikust uuritakse kas heljumit või lähtematerjali. Jämedama fraktsiooni uurimiseks võib peale kombineeritud mikroskoobi kasutada ka stereomikroskoopi. Kõiki vaatluspreparaate uuritakse põhjalikult, kasutades erinevaid suurendusi. Täpsed selgitused vaatluse voodiagrammide kasutamise kohta esitatakse standardses töökorras, mille on koostanud ja oma veebisaidil avaldanud loomasöödas sisalduvate loomsete valkude liidu referentlabor.

Vaatluse voodiagrammi igas etapis vaadeldavate vaatluspreparaatide miinimumarvust tuleb rangelt kinni pidada, välja arvatud juhul, kui kogu fraktsiooni materjalist ei ole võimalik saada nõutavat arvu vaatluspreparaate, näiteks juhul, kui sadet ei saadud. Osakeste arvu registreerimiseks vaadeldakse ühe määramise käigus kuni kuut vaatluspreparaati.

Kui heljumist või lähtematerjalist valmistatakse täiendavad vaatluspreparaadid, kasutades spetsiifilisemat punktis 2.1.2.1.4 nimetatud värvivate omadustega kinnitit, et täpsemalt iseloomustada struktuure (nt suled, karvad, lihaskiud või vereosakesed), mis on avastatud muude punktis 2.1.2.1.3 nimetatud kinnitite abil valmistatud vaatluspreparaatidel, loendatakse osakesed, võttes ühe määramise käigus arvesse kuni kuut vaatluspreparaati, mille hulgas on spetsiifilisema kinnitiga täiendavad vaatluspreparaadid.

Katse teostaja võib osakeste laadi ja päritolu kindlakstegemise hõlbustamiseks kasutada abivahendeid, näiteks otsustamise tugisüsteeme, fotoarhiive ja etalonproove.

Joonis 1
Vaatluse voodiagramm loomse päritoluga osakeste tuvastamiseks segasöödas ja söödamaterjalis esimesel määramisel
(D1 ja D2 viitavad esimesele ja teisele määramisele; *: selgroogsed maismaaloomad, kalad)

Joonis 2
Vaatluse voodiagramm loomse päritoluga osakeste tuvastamiseks segasöödas ja söödamaterjalis teisel määramisel
(D1 ja D2 viitavad esimesele ja teisele määramisele; *: selgroogsed maismaaloomad, kalad)

▼M2

2.1.4.3.    ►M7  Määramiste arv

Määramised tehakse eri osaproovidega, millest igaüks kaalub 50 g.

Kui joonisel 1 esitatud vaatluse voodiagrammi kohaselt tehtud esimese määramise tulemusena ei tuvastata loomse päritoluga osakesi, ei ole täiendav määramine vajalik ning analüüsi tulemus esitatakse, kasutades punkti 2.1.5.1 sõnastust.

Kui joonisel 1 esitatud vaatluse voodiagrammi kohaselt tehtud esimese määramise tulemusena tuvastatakse üks või mitu teatavat laadi loomse päritoluga osakest (st selgroogsetelt maismaaloomadelt või kaladelt pärit osakesed) ning leitud osakeste laad vastab proovi kohta deklareeritud sisaldusele, ei ole teistkordset määramist vaja. Kui teatavat laadi loomse päritoluga osakeste arv on esimesel määramisel suurem kui 5, esitatakse analüüsi tulemus loomse osakese laadi kaupa, kasutades punkti 2.1.5.3 sõnastust. Muudel juhtudel esitatakse analüüsi tulemus loomse osakese laadi kaupa, kasutades punkti 2.1.5.2 sõnastust.

Muudel juhtudel, sealhulgas juhul, kui laborile ei ole deklareeritud sisaldust, tehakse uus määramine uue osaproovi põhjal.

Kui joonisel 2 esitatud vaatluse voodiagrammi kohaselt tehtud teise määramise tulemusena on kahe määramisega tuvastatud vastavat laadi loomse päritoluga osakeste summa suurem kui 10, esitatakse analüüsi tulemus, kasutades punkti 2.1.5.3 sõnastust. Muudel juhtudel esitatakse analüüsi tulemus, kasutades punkti 2.1.5.2 sõnastust. ◄

2.1.5.    ►M7  Tulemuste esitamine

Tulemuste esitamisel teatab labor, millist tüüpi materjali analüüsiti (sade, heljum või lähteaine). Aruandes näidatakse selgelt, mitu määramist on tehtud ja kas vaatluspreparaatide ettevalmistamisele eelnev fraktsioonide sõelumine vastavalt punkti 2.1.3.3.4 viimasele lõigule on ära jäetud.

Labori aruanne peab sisaldama vähemalt teavet selgroogsetest maismaaloomadest ja kalast pärit osakeste leidumise kohta.

Erinevad tulemused esitatakse järgmiselt.

2.2.    Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR)

2.2.1.    Põhimõte

Loomse päritoluga desoksüribonukleiinhappe (DNA) fragmendid, mis võivad esineda söödamaterjalides ja segajõusöödas, tuvastatakse polümeraasi ahelreaktsiooni abil geeni kordistamise meetodiga, mis on suunatud liigispetsiifilise DNA-järjestuse tuvastamisele.

PCR-meetodi puhul on kõigepealt nõutav DNA eraldamine. Selliselt saadud DNAga tehakse geeni kordistamine, et tuvastada katsega kontrollitavaid loomaliike.

2.2.2.    Reaktiivid ja seadmed

2.2.2.1.   Reaktiivid

2.2.2.1.1.   DNA eraldamise reaktiivid

Kasutatakse ainult EURL-AP labori poolt heaks kiidetud ja labori veebisaidil avaldatud reaktiive.

2.2.2.1.2.   Geeni kordistamise reaktiivid

2.2.2.1.2.1.   Praimerid ja sondid

Kasutatakse ainult EURL-AP poolt valideeritud oligonukleotiidide järjestusega praimereid ja sonde ( 34 ).

2.2.2.1.2.2.   Master Mix

Kasutatakse ainult neid Master Mix’i lahuseid, mis ei sisalda reaktiive, mis loomse DNA juuresoleku tõttu võivad anda vale tulemuse ( 35 ).

2.2.2.1.2.3.   Saastusest puhastamise reaktiivid

2.2.2.1.2.3.1.   Soolhappe lahus (0,1N).

2.2.2.1.2.3.2.   Pleegitav reaktiiv (0,15 % aktiivklooriga naatriumhüpokloriti lahus)

2.2.2.1.2.3.3.   Kallite seadmete, nagu analüütiliste kaalude (näiteks MP Biomedicals DNA EraseTM) saastusest puhastamiseks ettenähtud mittesöövitavad reaktiivid

2.2.2.2.   Seadmed

2.2.2.2.1.   Analüütilised kaalud täpsusega 0,001 g

2.2.2.2.2.   Jahvatusseadmed

2.2.2.2.3.   Reaalajas PCR tegemist võimaldav termotsükler

2.2.2.2.4.   Mikrotsentrifuug mikrotsentrifuugitopside jaoks

2.2.2.2.5.   1 μl – 1 000 μl pipeteerimist võimaldavad mikropipetid

2.2.2.2.6.

Standardsed plastikust molekulaarbioloogia vahendid: mikrotsentrifuugitopsid, mikropipettide filtriga plastikotsikud, termotsükleri plaadid.

2.2.2.2.7.

Proovide ja reaktiivide hoidmiseks ettenähtud külmikud

2.2.3.    Proovi võtmine ja proovi ettevalmistamine

2.2.3.1.   Proovi võtmine

Määramiseks kasutatakse I lisa kohaselt võetud representatiivset proovi.

2.2.3.2.   Proovi ettevalmistamine

Laboriproovide ettevalmistamine kuni DNA eraldamiseni teostatakse vastavalt II lisas sätestatud nõuetele. Vähemalt 50 g proovist võetakse analüüsimiseks osaproovid ja peenestatakse.

Proovi ettevalmistamine teostatakse muudes ruumides kui DNA eraldamiseks ja geeni kordistamiseks ettenähtud ruumid vastavalt standardile ISO 24276.

Ette valmistatakse kaks proovi suurusega vähemalt 100 mg.

2.2.4.    DNA eraldamine

Iga proovi DNA eraldatakse vastavalt ELi referentlabori EURL-AP kehtestatud ja labori veebisaidil avaldatud standardsele töökorrale.

Iga eraldamise puhul tehakse kaks eraldamise kontrollkatset vastavalt standardile ISO 24276:

2.2.5.    Geeni kordistamine

Geeni kordistamine teostatakse kõikide kontrollimist vajavate liikide jaoks valideeritud meetodite abil. Need meetodid on esitatud ELi referentlabori EURL-AP poolt kehtestatud ja labori veebisaidil avaldatud standardses töökorras. Iga eraldatud DNA-proovi analüüsitakse vähemalt kahe erineva lahjendusega, et hinnata inhibeerimist.

Iga sihtliigi kohta tehakse kaks kordistamise kontrollkatset vastavalt standardis ISO 24276 kirjeldatud meetodile:

2.2.6.    Tulemuste tõlgendamine ja esitamine

Tulemuste esitamisel teatab labor vähemalt kasutatud proovide massi, kasutatud ekstraheerimismeetodi, teostatud määramiste arvu ja meetodi avastamispiiri.

Tulemusi ei tõlgendata ega esitata, kui DNA eraldamise positiivne kontrollproov ja DNA positiivne sihtkontrollproov ei anna katsega kontrollitava sihtliigi puhul positiivseid tulemusi, samas kui kordistamisreaktiivi kontroll on negatiivne.

Kui kahe proovi tulemused ei ole kooskõlas, korratakse vähemalt geeni kordistamist. Kui labor kahtlustab, et nimetatud lahkumineku põhjuseks võib olla DNA eraldamine, tehakse enne tulemuste tõlgendamist uus DNA eraldamine ja seejärel geeni kordistamine.

Tulemuste lõplik väljendamine peab põhinema kahe proovi tulemuste ühendamisel ja tõlgendamisel vastavalt ELi referentlabori EURL-AP poolt kehtestatud ja labori veebisaidil avaldatud standardsele töökorrale.

2.2.6.1.   Negatiivne tulemus

Negatiivne tulemus esitatakse järgmiselt:

Analüüsimiseks esitatud proovis ei tuvastatud Xst pärinevat DNAd (X on katsega kontrollitav loomaliik või liikide rühm).

2.2.6.2.   Positiivne tulemus

Positiivne tulemus esitatakse järgmiselt:

Analüüsimiseks esitatud proovis tuvastati Xst pärinev DNA (X on katsega kontrollitav loomaliik või liikide rühm).

▼B

---

VII LISA

KODULINDUDE SÖÖDA ENERGIASISALDUSE ARVUTAMISE MEETOD

1.   Energiasisalduse arvutamine ja väljendamine

Kodulindude segasööda energiasisaldus tuleb arvutada teatavate söödas sisalduvate analüütiliste koostisosade protsendimäära põhjal vastavalt allpool esitatud valemile. Energiasisaldus väljendatakse ainevahetuses tekkiva energiana (ME) (lämmastiku suhtes korrigeerituna) megadžaulides (MJ) segasööda kilogrammi kohta:

Ainevahetuses tekkiv energia (MJ/kg) = 0,1551 × kogu valgu protsent + 0,3431 × kogu rasva protsent + 0,1669 × tärklise protsent + 0,1301 × sahharoosina väljendatud üldsuhkru protsent

2.   Avaldatud väärtuse lubatud hälbed

Kui ametlikul kontrollimisel ilmneb erinevus (sööda energiasisaldus on suurem või väiksem) kontrollitulemuste ja avaldatud energiasisalduse vahel, on ainevahetuses tekkiva energia lubatud minimaalne hälve 0,4 MJ/kg.

3.   Tulemuste väljendamine

Eespool esitatud valemit kasutades saadud tulemus tuleb esitada ühe kümnendkoha täpsusega.

4.   Proovivõtu- ja analüüsimeetodid

Proovid tuleb segasöödast võtta ja arvutusmeetodis märgitud analüütiliste koostisosade sisaldus tuleb kindlaks määrata vastavalt sööda ametlikuks kontrolliks ettenähtud ühenduse proovivõtu- ja analüüsimeetoditele.

Kasutatakse järgmisi meetodeid:

---

VIII LISA

SÖÖDAS MITTE ENAM LUBATUD LISANDITE EBASEADUSLIKU SISALDUSE KONTROLLIMISE ANALÜÜSIMEETODID

A.   METÜÜLBENSOKAADI MÄÄRAMINE

7-bensüüloksü-6-butüül-3-metoksükarbonüül-4-kinoloon

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata metüülbensokaadi taset söödas. Määramispiir on 1 mg/kg.

2.   Põhimõte

Metüülbensokaat ekstraheeritakse proovist metaansulfoonhappe metanoolilahusega. Ekstrakt puhastatakse diklorometaaniga ioonvahetuskromatograafia abil ja seejärel uuesti diklorometaaniga. Metüülbensokaadi sisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3.   Reaktiivid

metanooli (3.2) ja vee (HPLC-puhtusastmega) segu 75/25 (v + v).

Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4,5 ) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit).

20,0 ml metaansulfoonhapet lahjendatakse metanooliga (3.2) 1 000 ml-ni.

100 ml soolhapet (ρ20 = 1,18 g/ml) lahjendatakse veega 1 000 ml-ni.

Vaiku töödeldakse enne kasutamist 100 g vaiku immutatakse 500 ml soolhappe lahusega (3.5) ja kuumutatakse kuumal plaadil pidevalt segades keemiseni. Lastakse jahtuda ja hape dekanteeritakse. Filtreeritakse läbi filterpaberi, kasutades vaakumit. Vaiku pestakse kaks korda 500 ml veeportsjonitega ja seejärel 250 ml metanooliga (3.2). Vaiku loputatakse veel 250 ml metanooliga ja kuivatatakse filtrikoogist õhku läbi lastes. Kuivatatud vaiku hoitakse korgiga suletud pudelis.

50 mg standardainet (3.7) kaalutakse 0,1 mg täpsusega, lahustatakse 100 ml mõõtekolbis metaansulfoonhappe lahuses (3.4), kolb täidetakse märgini ja segatakse.

5,0 ml metüülbensokaadi põhistandardlahust (3.7.1) viiakse 50 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse metanooliga (3.2) märgini ja segatakse.

Vastavalt 1,0 ; 2,0 ; 3,0 ; 4,0 ja 5,0 ml metüülbensokaadi vahestandardlahust (3.7.2) viiakse 25 ml mõõtekolbidesse. Kolvid täidetakse liikuva faasiga (3,3 ) märgini ja segatakse. Lahuste metüülbensokaadi kontsentratsioonid on vastavalt 2,0 ; 4,0 ; 6,0 ; 8,0 ja 10,0 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Üldsätted

Märkus: selle meetodi rakendamiseks peab võrdlussööt olema tüübilt sarnane prooviga ja analüüsi tulemusena ei tohi sellest leida metüülbensokaati.

5.2.   Ekstraheerimine

Umbes 20 g ettevalmistatud proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega ja viiakse 250 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 100,0 ml metaansulfoonhappe lahust (3.4) ja loksutatakse mehaaniliselt (4.1) 30 minutit. Lahus filtreeritakse läbi filterpaberi ja filtraat hoitakse vedelik-vedelik ekstraktsiooniks (5.3).

5.3.   Vedelik-vedelik-ekstraktsioon

500 ml jaotuslehtrisse, mis sisaldab 100 ml soolhappe lahust (3.5), viiakse 25,0 ml punktis 5.2 saadud filtraati. Lehtrisse lisatakse 100 ml diklorometaani (3.1) ja loksutatakse üks minut. Kihtidel lastakse eralduda ning alumine (diklorometaani) kiht viiakse 500 ml ümarkolbi. Veefaasi ekstraheerimist korratakse veel kahe 40 ml portsjoni diklorometaaniga ja need ühendatakse esimese ekstraktiga ümarkolvis. Diklorometaani ekstrakt aurustatakse pöördaurusti (4.2) abil kuivaks vähendatud rõhul, temperatuuril 40 oC. Jääk lahustatakse 20–25 ml metanoolis (3.2), kolb suletakse ja kogu ekstrakt hoitakse ioonvahetuskromatograafiaks (5.4).

5.4.   Ioonvahetuskromatograafia

5.4.1.    Katioonvahetuskolonni ettevalmistamine

Klaasvatist tropp asetatakse klaaskolonni (4.3) põhja. 5,0 g töödeldud katioonvahetusvaiku (3.6) immutatakse 50 ml soolhappega (3.5), valatakse klaaskolonni ja lastakse settida. Liigsel happel lastakse läbi kolonni voolata, kuni happe nivoo on jõudnud vaigu ülemise pinnani, ja kolonni pestakse veega, kuni väljavoolav pesuvesi on lakmuse suhtes neutraalne. 50 ml metanooli (3.2) viiakse kolonni ja lastakse läbi kolonni voolata, kuni metanooli nivoo on jõudnud vaigu pinnani.

5.4.2.    Kolonnkromatograafia

Pipeti abil viiakse punktis 5.3 saadud ekstrakt ettevaatlikult kolonni. Ümarkolbi loputatakse kahe 5–10 ml metanooli (3.2) portsjoniga ja need pesuvedelikud viiakse kolonni. Ekstraktil lastakse läbi kolonni voolata, kuni ekstrakti nivoo on jõudnud vaigu pinnani, ja kolonni pestakse 50 ml metanooliga nii, et voolu kiirus ei ületaks 5 ml minutis. Väljavoolanud vedelik kallatakse ära. Metüülbensokaat elueeritakse kolonnist, kasutades 150 ml metaansulfoonhapet (3.4), ja kolonni eluaat kogutakse 250 ml koonilisse kolbi.

5.5.   Vedelik-vedelik-ekstraktsioon

Punktis 5.4.2 saadud eluaat viiakse liitrisesse jaotuslehtrisse. Koonilist kolbi loputatakse 5–10 ml metanooliga (3.2) ja lisatakse loputusvedelikud samasse jaotuslehtrisse. Lisatakse 300 ml soolhappe lahust (3.5) ja 130 ml diklorometaani (3.1). Loksutatakse üks minut ja lastakse faasidel eralduda. Alumine (diklorometaani) kiht viiakse 500 ml ümarkolbi. Veefaasi ekstraheerimist korratakse veel kahe 70 ml portsjoni diklorometaaniga ja need ekstraktid ühendatakse esimesega ümarkolvis.

Diklorometaani ekstrakt aurustatakse pöördaurusti (4.2) abil kuivaks vähendatud rõhul, temperatuuril 40 oC. Jääk lahustatakse kolvis umbes 5 ml metanoolis (3.2) ning saadud lahus viiakse kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Ümarkolbi loputatakse veel kahe portsjoni 1–2 ml metanooliga ja viiakse need mõõtekolbi. Kolb täidetakse metanooliga märgini ja segatakse. Lahuse alikvootne osa filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.6). Lahust hoitakse HPLC määramiseks (5.6).

5.6.   HPLC määramine

5.6.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need annavad samaväärsed tulemused):

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides kolonni mitu korda kalibreerimislahust (3.7.3) kontsentratsiooniga 4 g/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused või pindalad ja retentsiooniajad.

5.6.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.7.3) süstitakse mitu korda ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.6.3.    Proovilahus

Prooviekstrakti (5.5) süstitakse mitu korda, kasutades sama mahtu nagu kalibreerimislahuste puhul, ning määratakse metüülbensokaadi piigi keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse kontsentratsioon määratakse μg/ml proovilahuse metüülbensokaadi piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi, kasutades kalibreerimisgraafikut (5.6.2).

Proovi metüülbensokaadi sisaldus w (mg/kg) arvutatakse järgmise valemi järgi:

kus:

c

=

proovilahuse metüülbensokaadi kontsentratsioon μg/ml;

m

=

kaalutise mass grammides.

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 10 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.7.3) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstrakti metüülbensokaadi kontsentratsiooni suurendatakse, lisades vahestandardlahust (3.7.2) sobivas koguses. Lisatav metüülbensokaadi kogus peab olema sarnane prooviekstrakti analüüsil leitud metüülbensokaadi kogusega.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma ainult metüülbensokaadi piigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti metüülbensokaadi piigi laiusest.

7.1.2.    Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada: 10 % suuremast tulemusest metüülbensokaadisisalduse puhul, mis jääb 4–20 mg/kg vahele.

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 90 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

10 laboratooriumi analüüsisid viit proovi. Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi.

ND

=

allpool avastamisläve

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja, %

sR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja, %

B.   OLAKVINDOKSI MÄÄRAMINE

(2-[N-2'-(hüdroksüetüül)karbamoüül]-3-metüülkinoksaliin-N1,N4-dioksiid)

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata olakvindoksi taset söödas. Määramispiir on 5 mg/kg.

2.   Põhimõte

Proov ekstraheeritakse metanooli vesilahuses. Olakvindoksisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades ultraviolettdetektorit.

3.   Reaktiivid

Vee (3.3) ja metanooli (3.2) segu, 900 +100 (V + V).

50 mg olakvindoksi (3.5) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ning asetatakse 200 ml mõõtekolbi ja lisatakse ligikaudu 190 ml vett. Kolb asetatakse 20 minutiks ultrahelivanni (4.1). Pärast ultraheliga mõjutamist viiakse lahuse temperatuur toatemperatuurini, täidetakse kolb veega kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja säilitatakse külmikus. See lahus tuleb igal kuul uuesti valmistada.

10,0 ml põhistandardlahust (3.5.1) valatakse 100 ml mõõtekolbi, täidetakse see liikuva faasiga (3.4) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi ja säilitatakse külmikus. See lahus tuleb iga päev uuesti valmistada.

50 ml mõõtekolbidesse pannakse 1,0 , 2,0 , 5,0 , 10,0 , 15,0 ja 20,0 ml vahestandardlahust (3.5.2). Kolvid täidetakse liikuva faasiga (3,4 ) märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi. Nende lahuste olakvindoksisisaldus on vastavalt 0,5 , 1,0 , 2,5 , 5,0 , 7,5 ja 10,0 μg/ml.

Need lahused tuleb iga päev uuesti valmistada.

4.   Seadmed

5.   Töö käik

Märkus:

olakvindoks on valgustundlik. Kõik protseduurid tehakse nõrgas valguses või kasutatakse tumedast klaasist anumaid.

5.1.   Üldsätted

Märkus:

selle meetodi puhul peab võrdlussööt olema prooviga samalaadne ja selles ei tohi leiduda olakvindoksit.

5.2.   Ekstraheerimine

Umbes 50 g proovi kaalutakse 0,01 g täpsusega ning viiakse 1 000 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 100 ml metanooli (3.1) ja asetatakse kolb 5 minutiks ultrahelivanni (4.1). Lisatakse 410 ml vett ja hoitakse kolbi ultrahelivannis veel 15 minutit. Kolb võetakse ultrahelivannist välja, loksutatakse 30 minutit loksutil (4.2) ja filtreeritakse läbi kurdfiltri. 10,0 ml filtraati kallatakse 20 ml mõõtekolbi, täidetakse veega kuni märgini ja segatakse. Alikvootne osa filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.4). (vt tähelepanek 9). Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).

5.3.   HPLC määramine

5.3.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides kolonni mitu korda kalibreerimislahust (3.5.3) kontsentratsiooniga 2,5 g/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused ja retentsiooniajad.

5.3.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.5.3) süstitakse mitu korda ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigi kõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.3.3.    Proovilahus

Prooviekstrakti (5.2) süstitakse mitu korda, kasutades sama mahtu nagu kalibreerimislahuste puhul, ning määratakse olakvindoksi piigi keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse olakvindoksipiikide keskmise kõrguse (pindala) alusel leitakse kalibreerimisgraafiku (5.3.2) abil proovilahuse kontsentratsioon (μg/ml).

Proovi olakvindoksisisaldus w (mg/kg) arvutatakse järgmise valemi alusel:

kus:

c

=

olakvindoksi kontsentratsioon (μg/ml) prooviekstraktis (5.2);

m

=

kaalutise mass grammides (5.2).

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti (5.2) ja 5,0 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.5.3) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile (5.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.5.3). Lisatud olakvindoksikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud olakvindoksikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes olakvindoksipiigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti olakvindoksipiigi laiusest.

7.1.2.    Kontrollimine dioodireadetektori abil

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Kui olakvindoksisisaldus on 10–200 mg/kg, ei tohi sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ületada 15 % suuremast tulemusest.

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga fooniproovi puhul peab saagis olema vähemalt 90 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati EÜ ühisuuring, mille käigus kuni 13 laborit analüüsisid nelja põrsasööda proovi, millest üks oli võrdlussööt. Tulemused olid järgmised:

L

=

laboratooriumide arv

n

=

üksikmääramiste arv

Sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja

9.   Tähelepanek

Kuigi meetodit ei ole kontrollitud söötade suhtes, mille olakvindoksisisaldus on üle 100 mg/kg, võib saavutada rahuldavaid tulemusi, kasutades väiksema massiga proove ja/või lahjendades ekstrakti (5.2) kalibreerimisgraafiku (5.3.2) vahemikku jääva kontsentratsiooni saamiseks.

C.   AMPROOLIUMI MÄÄRAMINE

1-[(4-amino-2-propüülpürimidiin-5-üül)metüül]-2-metüülpüridiiniumkloriidhüdrokloriid

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata amprooliumi kogust söödas ja eelsegudes. Avastamiskünnis on 1 mg/kg, määramispiir 5 mg/kg.

2.   Põhimõte

Proov ekstraheeritakse metanooli vesilahuses. Pärast liikuva faasiga lahjendamist ja membraanfiltreerimist määratakse amprooliumisisaldus kõrgefektiivse katioonvahetus-vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades UV-detektorit.

3.   Reaktiivid

1 000 ml mõõtekolvis lahustatakse vees (3.3) 13,80 g naatriumdivesinikfosfaadi monohüdraati, täidetakse kolb veega (3.3) kuni märgini ja segatakse.

1 000 ml mõõtekolvis lahustatakse vees (3.3) 224,74 g naatriumperkloraadi monohüdraati, täidetakse kolb veega (3.3) kuni märgini ja segatakse.

Atsetonitriili (3.2), naatriumdivesinikfosfaadi lahuse (3.4) ja naatriumperkloraadi lahuse (3.5) segu, 450 + 450 + 100 (v+v+v). Enne kasutamist filtreeritakse lahus läbi 0,22 μm membraanfiltri (4.3) ja degaseeritakse (nt ultrahelivannis (4.4) vähemalt 15 minutit).

50 mg amprooliumi (3.7) kaalutakse täpsusega 0,1 mg, pannakse see 100 ml mõõtekolbi, lahustatakse 80 ml metanoolis (3.1) ja asetatakse kolb 10 minutiks ultrahelivanni (4.4). Pärast ultraheliga mõjutamist viiakse lahuse temperatuur toatemperatuurini, täidetakse kolb veega kuni märgini ja segatakse. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

5,0 ml põhistandardlahust (3.7.1) pipetitakse 50 ml mõõtekolbi, täidetakse see ekstrahendiga (3.8) kuni märgini ja segatakse. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

0,5 , 1,0 ja 2,0 ml vahestandardlahust (3.7.2) pannakse 50 ml mõõtekolbidesse. Kolvid täidetakse liikuva faasiga (3.6) märgini ja segatakse. Nende lahuste amprooliumisisaldus on 0,5 , 1,0 ja 2 μg/ml. Lahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

Metanooli (3.1) ja vee segu 2+1 (v+v)

4.   Seadmed

5.   Töö käik

5.1.   Üldsätted

5.1.1.    Võrdlussööt

Selleks, et teha saagisekatset (5.1.2), tuleb eelnevalt teha võrdlussööda analüüs, veendumaks, et selles ei ole ei amprooliumi ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ja selles ei tohi leiduda amprooliumi või segavaid aineid.

5.1.2.    Saagisekatse

Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta, millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus amprooliumi. Et saada kontsentratsiooni 100 mg/kg, viiakse 10,0 ml põhistandardlahust (3.7.1) 250 ml koonilisse kolbi ja aurustatakse lahus ligikaudu 0,5 milliliitrini. Lisatakse 50 g võrdlussööta, segatakse hoolikalt ja jäetakse 10 minutiks seisma, segades enne ekstraheerima (5.2) asumist veel mitu korda.

Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse analüüsitavale proovile ligikaudu sama suur amprooliumikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.

5.2.   Ekstraheerimine

5.2.1.    Eelsegud (amprooliumisisaldus < 1 %) ja söödad

Olenevalt amprooliumisisaldusest kaalutakse 5–40 g proovi täpsusega 0,01 g, kantakse see 500 ml koonilisse kolbi ja lisatakse 200 ml ekstrahenti (3.8). Kolb asetatakse ultrahelivanni (4.4) ja jäetakse 15 minutiks seisma. Kolb võetakse ultrahelivannist välja ja loksutatakse loksutil või segatakse magnetseguril (4.5) üks tund. Ekstrakti alikvoot lahjendatakse liikuva faasiga (3.6) amprooliumisisalduseni 0,5 –2 μg/ml ja segatakse (vt tähelepanek 9.3). 5–10 ml lahjendatud lahust filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.2). Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).

5.2.2.    Eelsegud (amprooliumisisaldus ≥ 1 %)

Olenevalt amprooliumisisaldusest kaalutakse 1–4 g proovi täpsusega 0,001 g, kantakse see 500 ml koonilisse kolbi ja lisatakse 200 ml ekstrahenti (3.8). Kolb asetatakse ultrahelivanni (4.4) ja jäetakse 15 minutiks seisma. Kolb võetakse ultrahelivannist välja ja loksutatakse loksutil või segatakse magnetseguril (4.5) üks tund. Ekstrakti alikvoot lahjendatakse liikuva faasiga (3.6) amprooliumisisalduseni 0,5 –2 μg/ml ja segatakse. 5–10 ml lahjendatud lahust filtreeritakse läbi membraanfiltri (4.2). Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.3).

5.3.   HPLC määramine

5.3.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need tagavad samaväärsed tulemused):

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides kolonni mitu korda kalibreerimislahust (3.5.3) kontsentratsiooniga 1,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused ja retentsiooniajad.

5.3.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.7.3) süstitakse mitu korda ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad keskmised piigikõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.3.3.    Proovilahus

Prooviekstrakti (5.2) süstitakse mitu korda, kasutades sama mahtu, mis kalibreerimislahuste puhul, ja määratakse amprooliumipiikide keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse amprooliumipiikide keskmise kõrguse (pindala) alusel leitakse kalibreerimisgraafiku (5.3.2) abil proovilahuse kontsentratsioon (μg/ml).

Proovi amprooliumisisaldus w (mg/kg) arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

V

=

punkti 5.2 kohane ekstrahendi (3.8) maht milliliitrites (s.o 200 ml);

c

=

amprooliumi kontsentratsioon (μg/ml) prooviekstraktis (5.2);

f

=

punkti 5.2 kohane lahjendusfaktor;

m

=

kaalutise mass grammides.

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti (5.2) ja 2,0 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.7.3) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile (5.2) lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.7.3). Lisatud amprooliumikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist leitud amprooliumikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes amprooliumipiigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti amprooliumipiigi laiusest.

7.1.2.    Kontrollimine dioodireadetektori abil

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi ületada:

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)proovi puhul peab saagis olema vähemalt 90 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühisuuring, mille käigus analüüsiti kolme kodulindude sööta (proovid 1–3), ühte mineraalsööta (proov 4) ja ühte eelsegu (proov 5). Tulemused on esitatud järgmises tabelis:

L

=

laboratooriumide arv

n

=

üksikmääramiste arv

sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja

sR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja

9.   Tähelepanekud

D.   KARBADOKSI MÄÄRAMINE

Metüül-3-(2-kinoksalinüülmetüleen)karbasaat-N 1 ,N 4 -dioksiid

1.   Eesmärk ja rakendusala

Selle meetodiga on võimalik määrata karbadoksi kogust söödas, eelsegudes ja preparaatides. Avastamiskünnis on 1 mg/kg. Määramispiir on 5 mg/kg.

2.   Põhimõte

Proovil lastakse vees seista ja ekstraheeritakse metanooli ja atsetonitriili seguga. Sööda puhul lastakse filtreeritud ekstrakti alikvoodil selgida alumiiniumoksiidkolonnil. Eelsegude ja preparaatide puhul lahjendatakse filtreeritud ekstrakti alikvoot vee, metanooli ja atsetonitriiliga sobiva kontsentratsioonini. Karbadoksisisaldus määratakse pöördfaasilise kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, kasutades ultraviolettdetektorit.

3.   Reaktiivid

500 ml metanooli (3.1) segatakse 500 ml atsetonitriiliga (3.2).

10 ml äädikhapet (3.3) lahjendatakse veega 100 milliliitrini.

0,82 g naatriumatsetaati (3.7) lahustatakse 700 ml vees (3.8) ja pH korrigeeritakse äädikhappega (3.6) 6,0 -ni. Lahus kallatakse 1 000 ml mõõtekolbi, kolb täidetakse veega (3.8) kuni märgini ja segatakse.

825 ml atsetaatpuhverlahust (3.9) segatakse 175 ml atsetonitriiliga (3.2).

Filtreeritakse läbi 0,22 μm filtri (4,5 ) ja lahus degaseeritakse (nt töödeldes ultraheliga 10 minutit).

Puhas karbadoks: metüül-3-(2-kinoksalinüülmetüleen)karbasaat-N1,N4-dioksiid, E 850

25 mg karbadoksi standardainet (3.11) kaalutakse täpsusega 0,1 mg ja asetatakse see 250 ml mõõtekolbi. Lahustatakse ultraheliga mõjutades (4.7) metanooli ja atsetonitriili segus (3.5). Pärast ultraheliga mõjutamist viiakse lahuse temperatuur toatemperatuurini, täidetakse kolb metanooli ja atsetonitriili seguga (3.5) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi või kasutatakse tumedat anumat ja säilitatakse külmikus. Temperatuuril ≤ 4 oC säilib lahus muutumatuna ühe kuu.

2,0 , 5,0 10,0 ja 20,0 ml põhistandardlahust (3.11.1) pannakse 100 ml mõõtekolbidesse. Lisatakse 30 ml vett, täidetakse kolvid metanooli ja atsetonitriili seguga (3.5) kuni märgini ja segatakse. Kolb mähitakse alumiiniumfooliumi. Need lahused sisaldavad karbadoksi vastavalt 2,0 , 5,0 , 10,0 ja 20,0 μg/ml.

Kalibreerimislahused tuleb valmistada vahetult enne kasutamist.

Märkus:

karbadoksi määramiseks söödas, mille karbadoksisisaldus on alla 10 mg/kg, tuleb valmistada kalibreerimislahused, mille kontsentratsioon on alla 2,0 μg/ml.

300 ml vett segatakse 700 ml metanooli ja atsetonitriili seguga (3.5).

4.   Seadmed

Märkus:

kasutada võib ka sulgemiskraaniga või koonuseks töödeldud otsaga klaaskolonni; sel juhul pannakse kolonni alumisse otsa väike klaasvillatropp, mis tambitakse klaaspulgaga tihedaks.

5.   Töö käik

Märkus:

karbadoks on valgustundlik. Kõik protseduurid tehakse nõrgas valguses või kasutatakse tumedat või alumiiniumfooliumi mähitud anumat.

5.1.   Üldsätted

5.1.1.    Võrdlussööt

Selleks, et teha saagisekatset (5.1.2), tuleb eelnevalt teha võrdlussööda analüüs, veendumaks, et selles ei ole ei karbadoksi ega segavaid aineid. Võrdlussööt peab olema prooviga samalaadne ja selles tohi leiduda karbadoksi ega segavaid aineid.

5.1.2.    Saagisekatse

Saagisekatses analüüsitakse võrdlussööta (5.1.1), millele on lisatud proovis oleva kogusega ligilähedane kogus karbadoksi. Et saada kontsentratsiooni 50 mg/kg, kantakse 5,0 ml põhistandardlahust (3.11.1) 200 ml koonilisse kolbi. Lahus aurustatakse lämmastikuvoolus ligikaudu 0,5 milliliitrini. Lisatakse 10 g võrdlussööta, segatakse ja jäetakse enne ekstraheerima (5.2) asumist 10 minutiks seisma.

Juhul kui prooviga samalaadne võrdlussööt puudub (vt 5.1.1), võib saagisekatse teha standardsel lisamismeetodil. Sel juhul lisatakse proovile ligikaudu sama suur karbadoksikogus, mis on proovis juba olemas. Seda proovi analüüsitakse koos kontsentreerimata prooviga ja saagis leitakse lahutamise teel.

5.2.   Ekstraheerimine

5.2.1.    Sööt

10 g proovi kaalutakse täpsusega 0,01 g ja pannakse 200 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 15,0 ml vett, segatakse ja lastakse seista 5 minutit. Lisatakse 35,0 ml metanooli ja atsetonitriili segu (3.5), korgitakse kinni ja loksutatakse 30 minutit loksutil või segatakse magnetseguril (4.1). Lahus filtreeritakse läbi klaaskiust filterpaberi (4.2). See lahus säilitatakse puhastamiseks (5.3).

5.2.2.    Eelsegud (0,1 –2,0 %)

1 g jahvatamata proovi kaalutakse täpsusega 0,001 g ja pannakse 200 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 15,0 ml vett, segatakse ja lastakse seista 5 minutit. Lisatakse 35,0 ml metanooli ja atsetonitriili segu (3.5), korgitakse kinni ja loksutatakse 30 minutit loksutil või segatakse magnetseguril (4.1). Lahus filtreeritakse läbi klaaskiust filterpaberi (4.2).

Filtraadi alikvoot pipetitakse 50 ml mõõtekolbi. Lisatakse 15,0 ml vett, täidetakse kolvid metanooli ja atsetonitriili seguga (3.5) kuni märgini ja segatakse. Lõpplahuse karbadoksikontsentratsioon on ligikaudu 10 μg/ml. Alikvoot filtreeritakse läbi 0,45 μm filtri (4.6).

Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.4).

5.2.3.    Preparaadid (> 2 %)

0,2 g jahvatamata proovi kaalutakse täpsusega 0,001 g ja pannakse 250 ml koonilisse kolbi. Lisatakse 45,0 ml vett, segatakse ja lastakse seista 5 minutit. Lisatakse 105,0 ml metanooli ja atsetonitriili segu (3.5), korgitakse kinni ja homogeenitakse. Proovi mõjutatakse ultraheliga (4.7) 15 minutit, seejärel loksutatakse või segatakse 15 minuti jooksul (4.1). Lahus filtreeritakse läbi klaaskiust filterpaberi (4.2).

Filtraadi alikvoot lahjendatakse vee ning metanooli ja atsetonitriili seguga (3.12), kuni karbadoksi lõppkontsentratsioon on 10–15 μg/ml (10 % preparaadi puhul on lahjendusaste 10). Alikvoot filtreeritakse läbi 0,45 μm filtri (4.6).

Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.4).

5.3.   Puhastamine

5.3.1.    Alumiiniumoksiidikolonni ettevalmistamine

Kaalutakse 4 g alumiiniumoksiidi (3.4) ja pannakse klaaskolonni (4.3).

5.3.2.    Proovi puhastamine

Alumiiniumoksiidikolonni lisatakse 15 ml filtreeritud ekstrakti (5.2.1) ja visatakse eluaadi esimesed 2 ml ära. Järgmised 5 ml kogutakse ning filtreeritakse alikvoot läbi 0,45 μm filtri (4.6).

Seejärel alustatakse HPLC määramist (5.4).

5.4.   HPLC määramine

5.4.1.    Parameetrid

Soovitatakse juhinduda järgmistest tingimustest (muid tingimusi võib kasutada juhul, kui need annavad samaväärsed tulemused):

Kromatograafiaseadme tasakaalustatust kontrollitakse, süstides kolonni mitu korda kalibreerimislahust (3.11.2) kontsentratsiooniga 5,0 μg/ml, kuni saavutatakse konstantsed piigikõrgused ja retentsiooniajad.

5.4.2.    Kalibreerimisgraafik

Iga kalibreerimislahust (3.11.2) süstitakse mitu korda ja mõõdetakse igale kontsentratsioonile vastavad piigikõrgused (pindalad). Koostatakse kalibreerimisgraafik, kandes ordinaatteljele kalibreerimislahuste keskmised piigi kõrgused (pindalad) ja abstsissteljele vastavad kontsentratsioonid (μg/ml).

5.4.3.    Proovilahus

Prooviekstrakti [(5.3.2) söötade, (5.2.2) eelsegude ja (5.2.3) preparaatide puhul] süstitakse mitu korda ja määratakse karbadoksipiikide keskmine kõrgus (pindala).

6.   Tulemuste arvutamine

Proovilahuse karbadoksi piikide keskmise kõrguse (pindala) järgi määratakse proovilahuse karbadoksikontsentratsioon μg/ml, kasutades kalibreerimisgraafikut (5.4.2).

6.1.   Sööt

Karbadoksisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

c

=

karbadoksi kontsentratsioon (μg/ml) prooviekstraktis (5.3.2);

V1

=

ekstrahendi maht, ml (s.o 50);

m

=

kaalutise mass grammides.

6.2.   Eelsegud ja preparaadid

Karbadoksisisaldus w (mg/kg) proovis arvutatakse järgmise valemi järgi:

[mg/kg]

kus:

c

=

karbadoksi kontsentratsioon (g/ml) prooviekstraktis (5.2.2 või 5.2.3);

V2

=

ekstrahendi maht, ml (s.o 50 eelsegude, 150 preparaatide puhul);

f

=

punkti 5.2.2 (eelsegud) või 5.2.3 (preparaadid) kohane lahjendusfaktor;

m

=

kaalutise mass grammides.

7.   Tulemuste kehtivuse kontroll

7.1.   Identsus

Uuritava aine identsust saab kinnitada täiendava kromatograafiakatse abil või kasutades dioodireadetektorit, mille puhul võrreldakse prooviekstrakti ja 10,0 μg/ml sisaldusega kalibreerimislahuse (3.11.2) spektreid.

7.1.1.    Täiendav kromatograafia

Prooviekstraktile lisatakse vajalik kogus kalibreerimislahust (3.11.2). Lisatud karbadoksikogus peab olema ligikaudu sama suur nagu prooviekstraktist hinnanguline karbadoksikogus.

Võttes arvesse nii lisatud kogust kui ka ekstrakti lahjendust, peab tõusma üksnes karbadoksipiigi kõrgus. Piigi laius selle poolel kõrgusel ei tohi erineda rohkem kui 10 % kontsentreerimata prooviekstrakti karbadoksipiigi laiusest.

7.1.2.    Dioodireadetektori kasutamine

Tulemusi hinnatakse järgmiste kriteeriumide kohaselt:

Kui mõni nendest nõuetest ei ole täidetud, ei peeta otsitava aine olemasolu tõestatuks.

7.2.   Korratavus

Sama prooviga tehtud kahe paralleelse määramise tulemuste erinevus ei tohi 10 mg/kg ja suuremate sisalduste puhul ületada 15 % suuremast tulemusest.

7.3.   Saagis

Suurendatud kontsentratsiooniga (fooni)proovi puhul peab saagis olema vähemalt 90 %.

8.   Ühisuuringu tulemused

Korraldati ühisuuring, mille käigus analüüsiti 8 laboratooriumis kuut sööta, nelja eelsegu ja kolme preparaati. Iga proovi puhul tehti kaks analüüsi. (Üksikasjalikumat teavet selle ühisuuringu kohta võib leida ajakirjas Journal of AOAC, köide 71, 1988, lk 484–490.) Tulemused (välja arvatud kõrvalekalded) on esitatud järgmises tabelis:

L

=

laboratooriumide arv

n

=

üksikmääramiste arv

Sr

=

korratavust iseloomustav standardhälve

CVr

=

korratavuse variatsioonikordaja

SR

=

reprodutseeritavust iseloomustav standardhälve

CVR

=

reprodutseeritavuse variatsioonikordaja

---

IX LISA

ARTIKLIS 6 OSUTATUD VASTAVUSTABELID

1.   Direktiiv 71/250/EMÜ

2.   Direktiiv 71/393/EMÜ

3.   Direktiiv 72/199/EMÜ

4.   Direktiiv 73/46/EMÜ

5.   Direktiiv 76/371/EMÜ

6.   Direktiiv 76/372/EMÜ

7.   Direktiiv 78/633/EMÜ

8.   Direktiiv 81/715/EMÜ

9.   Direktiiv 84/425/EMÜ

10.   Direktiiv 86/174/EMÜ

11.   Direktiiv 93/70/EMÜ

12.   Direktiiv 93/117/EÜ

13.   Direktiiv 98/64/EÜ

14.   Direktiiv 1999/27/EÜ

15.   Direktiiv 1999/76/EÜ

16.   Direktiiv 2000/45/EÜ

17.   Direktiiv 2002/70/EÜ

18.   Direktiiv 2003/126/EÜ

---

( 1 ) ELT L 268, 18.10.2003, lk 29.

( 2 ) EÜT L 140, 30.5.2002, lk 10.

( 3 ) EÜT L 70, 16.03.2005, lk 1.

( 4 ) Kõik tükid purustatakse (vajaduse korral võetakse need proovist välja ja pannakse pärast purustamist tagasi).

( 5 ) Välja arvatud kerge kuiv- ja koresööt.

( 6 ) Välja arvatud kerge kuiv- ja koresööt.

( 7 ) ELT L 229, 1.9.2009, lk 1.

( 7 ) Teravilja, jahu, tangude ja manna kuivatamisel peab kuivatuskapi soojusmahutavus olema selline, et seatuna temperatuurile 131 oC saavutab kuivatuskapp pärast maksimaalse arvu uuritavate proovide üheaegselt kuivatuskappi kuivama panemist selle temperatuuri uuesti vähem kui 45 minuti jooksul. Ventilatsioon peab olema selline, et kui kuivatuskapis on kahe tunni jooksul kuivatatud nii suurel arvul pehme nisu proove, kui kapp neid mahutab, erinevad saadud tulemused neljatunnise kuivatamise tulemustest vähem kui 0,15 %.

( 7 ) Kui hiljem tuleb kontrollida õli või rasva kvaliteeti, asendatakse pimsskivitükid klaashelmestega.

( 7 ) EÜT L 125, 23.5.1996, lk 35.

( 7 ) Määramised viis läbi ühenduse Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) söötade uurimisgrupp.

( 7 ) Määramised viis läbi ühenduse Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) söötade uurimisgrupp.

( 7 ) Kasutada võib ka teisi lagundamismeetodeid, kui on kindlaks tehtud, et nendega saadakse samaväärsed tulemused (näiteks rõhu all mikrolainelagundamine).

( 7 ) Haljassööt (värske või kuivatatud) võib sisaldada suurel hulgal taimset räni, mis võib hoida kinni mikroelemente ning tuleb eemaldada. Kõnealuse sööda proovide korral tuleb seega järgida järgmist muudetud menetlust. Sooritada punktis 5.1.1.1 osutatud toiming kuni filtreerimiseni. Lahustumatut jääki sisaldav filterpaber pestakse kaks korda keeva veega ning asetatakse kvarts- või plaatinatiiglisse. Põletatakse muhvelahjus (4.1) temperatuuril alla 550 oC, kuni kõik söeosakesed on täielikult kadunud. Lastakse jahtuda, lisatakse mõned tilgad vett ning 10–15 ml vesinikfluoriidhapet (3.4) ning aurustatakse kuivaks ligikaudu 150 oC juures. Kui jääkides on siiski räni, lahustatakse see uuesti paaris milliliitris vesinikfluoriidhappes (3.4) ning aurustatakse kuivaks. Lisatakse viis tilka väävelhapet (3.5) ning kuumutatakse, kuni enam ei eraldu valget auru. Pärast 5 ml 6 mol/l soolhappe (3.2) ja ligikaudu 30 ml vee lisamist kuumutatakse, lahus filtreeritakse 250 ml mõõtekolbi ning täidetakse kuni märgini veega (HCl kontsentratsioon ligikaudu 0,5 mol/l). Mikroelementide määramist jätkatakse punktist 5.1.2.

( 7 ) The Analyst 108, 1983, lk 1252–1256.

( *1 ) Analyst, 1995, 120, 2175-2180

( 8 ) PCDDde, PCDFide ja dioksiinitaoliste PCBde toksilisusfaktorite (TEF) tabel. Inimestele avalduva riski hindamisel kasutatavad WHO-TEFid põhinevad 2005. aasta juunis Genfis peetud Maailma Terviseorganisatsiooni rahvusvahelise kemikaaliohutuse programmi (IPCS) ekspertkohtumise järeldustel (Martin van den Berg et al., „The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds”, Toxicological Sciences 93(2), 223–241 (2006)).

Kasutatud lühendid: T = tetra; Pe = penta; Hx = heksa; Hp = hepta; O = okta; CDD = klorodibensodioksiin; CDF = klorodibensofuraan; CB = klorobifenüül.

( 9 ) Komisjoni 14. augusti 2002. aasta otsus 2002/657/EÜ, millega rakendatakse nõukogu direktiivi 96/23/EÜ analüüsimeetodite tulemuslikkuse ja tulemuste tõlgendamise osas (EÜT L 221, 17.8.2002, lk 8).

( 10 ) Vajaduse korral järgitakse dokumendis „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (Juhend mõõtemääramatuse kohta laboritele, kus tehakse PCDDde/PCDFide ja PCBde analüüse isotooplahjendusega massispektromeetria abil) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en) kirjeldatud põhimõtteid.

( 11 ) Ülemise tõkke põhimõtte kohaselt vastab iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus määramispiiri väärtusele. Alumise tõkke põhimõtte kohaselt vastab iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus nullile. Vaheväärtuse põhimõtte kohaselt vastab iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus poolele määramispiiri väärtusest.

( 12 ) Kordusanalüüs – huvipakkuvate analüütide eraldi analüüs sama homogeniseeritud proovi teise alikvoodi põhjal. Üldiselt kohaldatakse kordusanalüüsi suhtes II lisa C peatüki punktis 3 sätestatud nõudeid. Meetodite puhul, milles kasutatakse asjaomaste analüütide jaoks 13C-märgistatud sisestandardit, on kordusanalüüs vajalik ainult siis, kui esimese määramise tulemus ei vasta nõuetele. Kordusanalüüs on vajalik, et välistada sisemise ristsaastumise või proovide juhusliku segiajamise võimalus. Kui analüüs tehakse seoses saastamisjuhtumiga, võib kinnitava kordusanalüüsi jätta tegemata, kui analüüsiks valitud proovid on jälgitavuse alusel seostatavad asjaomase saastamisjuhtumiga ning tuvastatud saasteainete sisaldus ületab oluliselt piirnormi.

( 13 ) Ülemise tõkke põhimõtte kohaselt vastab toksilisusekvivalendi (TEQ) arvutamisel iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus määramispiiri väärtusele. Alumise tõkke põhimõtte kohaselt vastab TEQ arvutamisel iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus nullile. Vaheväärtuse põhimõtte kohaselt vastab TEQ arvutamisel iga kvantitatiivselt määramata analoogi panus poolele määramispiiri väärtusest.

( 14 ) Üldiselt kohaldatakse kordusanalüüsi suhtes II lisa C peatüki punktis 2 sätestatud nõudeid. Kinnitavate meetodite puhul, milles kasutatakse asjaomaste analüütide jaoks 13C-märgistatud sisestandardit, on kordusanalüüs vajalik ainult siis, kui esimese määramise tulemus ei vasta nõuetele. Kordusanalüüs on vajalik, et välistada sisemise ristsaastumise või proovide juhusliku segiajamise võimalus. Kui analüüs tehakse seoses saastamisjuhtumiga, võib kinnitava kordusanalüüsi jätta tegemata, kui analüüsiks valitud proovid on jälgitavuse alusel seostatavad asjaomase saastamisjuhtumiga ning tuvastatud saasteainete sisaldus ületab oluliselt piirnormi.

( 15 ) Häiretaseme kontrollimise kordusanalüüsi suhtes kehtivad samad selgitused ja nõuded, mis on esitatud eespool joonealuses märkuses 2 piirnormide kohta.

( 16 ) Euroopa Parlamendi ja nõukogu 12. jaanuari 2005. aasta määrus (EÜ) nr 183/2005, millega kehtestatakse söödahügieeni nõuded (ELT L 35, 8.2.2005, lk 1).

( 17 ) Bioanalüütilised meetodid ei ole spetsiifilised toksilisusfaktori (TEF) süsteemi analoogide suhtes. Prooviekstrakt võib sisaldada muid sarnase struktuuriga AhR-aktiivseid ühendeid, mis mõjutavad üldist tulemust. Seega ei saa bioanalüütilist tulemust pidada TEQ taseme hinnanguks, pigem viitab see proovi TEQ võimalikule tasemele.

( 18 ) „Guidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDD/F and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometry” (Juhend mõõtemääramatuse kohta laboritele, kus tehakse PCDDde/PCDFide ja PCBde analüüse isotooplahjendusega massispektromeetria abil) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en), „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (Juhend avastamispiiri ja määramispiiri hinnangulise väärtuse määramiseks söödas ja toidus esinevate saasteainete mõõtmisel) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en).

( 19 ) Kehtivad nõuded põhinevad TEFidel, mis on avaldatud artiklis: M. van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 20 ) Sageli koos elueeruvad analoogid on nt PCB 28/31, PCB 52/69 ja PCB 138/163/164. GC-MSi puhul tuleb arvestada ka suuremal määral klooritud analoogide fragmentide võimalikku segavat mõju.

( 21 ) Vajaduse korral järgitakse dokumendis „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food” (Juhend avastamispiiri ja määramispiiri hinnangulise väärtuse määramiseks söödas ja toidus esinevate saasteainete mõõtmisel) (http://ec.europa.eu/food/safety/animal-feed_en) kirjeldatud põhimõtteid.

( 22 ) On väga soovitatav, et reaktiiviga tühiproovi tulemus oleks väike võrreldes proovis leiduva saasteaine sisaldusega. Labor on kohustatud kontrollima tühiproovi tulemuste varieeruvust, eriti siis, kui tühiproovi tulemus tuleb lahutada.

( 23 ) Kehtivad nõuded põhinevad TEFidel, mis on avaldatud artiklis: M. van den Berg et al., Toxicol Sci 93 (2), 223–241 (2006).

( 24 ) http://eurl.craw.eu/

( 25 ) http://eurl.craw.eu/

( 26 ) Iga uuritava loomaliigi jaoks olemasolevate praimerite ja sondide loeteluga saab tutvuda EURL-AP veebisaidil.

( 27 ) Vajalike Master Mix’i lahuste näited on esitatud EURL-AP veebisaidil.