02021R0808 — ES — 10.06.2021 — 001.002

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REGLAMENTO DE EJECUCIÓN (UE) 2021/808 DE LA COMISIÓN de 22 de marzo de 2021 relativo al funcionamiento de los métodos analíticos para los residuos de sustancias farmacológicamente activas utilizadas en animales productores de alimentos y a la interpretación de resultados, así como a los métodos que deben utilizarse para el muestreo, y por el que se derogan las Decisiones 2002/657/CE y 98/179/CE (Texto pertinente a efectos del EEE) (DO L 180 de 21.5.2021, p. 84)

Modificado por:

		Diario Oficial
		n°	página	fecha
►M1	REGLAMENTO DE EJECUCIÓN (UE) 2021/810 DE LA COMISIÓN de 20 de mayo de 2021	L 180	112	21.5.2021

Rectificado por:

C1	Rectificación,, DO L 186, 27.5.2021, p.  32 (2021/810)

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REGLAMENTO DE EJECUCIÓN (UE) 2021/808 DE LA COMISIÓN

de 22 de marzo de 2021

relativo al funcionamiento de los métodos analíticos para los residuos de sustancias farmacológicamente activas utilizadas en animales productores de alimentos y a la interpretación de resultados, así como a los métodos que deben utilizarse para el muestreo, y por el que se derogan las Decisiones 2002/657/CE y 98/179/CE

(Texto pertinente a efectos del EEE)

Artículo 1

Objeto y ámbito de aplicación

El presente Reglamento establece las normas sobre los métodos analíticos utilizados para el muestreo y los análisis de laboratorio relativos a residuos de sustancias farmacológicamente activas en animales vivos productores de alimentos, partes y fluidos de su cuerpo, excrementos, tejidos, productos de origen animal, subproductos animales, piensos y agua. Establece asimismo las normas para la interpretación de los resultados de dichos análisis de laboratorio.

El presente Reglamento se aplica a los controles oficiales destinados a verificar el cumplimiento de los requisitos relativos a la presencia de residuos de sustancias farmacológicamente activas.

Artículo 2

Definiciones

A efectos del presente Reglamento, se aplicarán las definiciones del artículo 2 del Reglamento Delegado (UE) 2019/2090 de la Comisión ( 1 ), del Reglamento (UE) 2019/1871 de la Comisión ( 2 ), del artículo 2 del Reglamento (CE) n.o 470/2009 del Parlamento Europeo y del Consejo ( 3 ) y del Reglamento (CEE) n.o 315/93 del Consejo ( 4 ).

También se aplicarán las siguientes definiciones:

Artículo 3

Métodos de análisis

Los Estados miembros garantizarán que las muestras tomadas de conformidad con el artículo 34 del Reglamento (UE) 2017/625 se analicen utilizando métodos que cumplan los siguientes requisitos:

Artículo 4

Control de calidad

Los Estados miembros garantizarán la calidad de los resultados de los análisis efectuados de conformidad con el Reglamento (UE) 2017/625, en particular controlando los resultados de los ensayos o de la calibración con arreglo a la norma ISO/IEC 17025:2017 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración, y de conformidad con los requisitos de control de calidad durante análisis de rutina establecidos en el capítulo 3 del anexo I del presente Reglamento.

Artículo 5

Interpretación de los resultados

Artículo 6

Métodos de muestreo

Los Estados miembros garantizarán que las muestras se tomen, manipulen y etiqueten de conformidad con los métodos detallados de muestreo establecidos en el anexo II del presente Reglamento.

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Artículo 7

Derogaciones y medidas transitorias

Quedan derogadas las Decisiones 2002/657/CE y 98/179/CE a partir de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento.

No obstante, hasta el 10 de junio de 2026, los requisitos establecidos en los puntos 2 y 3 del anexo I de la Decisión 2002/657/CE seguirán aplicándose a los métodos que hayan sido validados antes de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento.

A efectos de lo dispuesto en el artículo 8, párrafo segundo, del Reglamento (UE) 2019/1871, el anexo II de la Decisión 2002/657/CE seguirá siendo aplicable hasta el 27 de noviembre de 2022.

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Artículo 8

Entrada en vigor

El presente Reglamento entrará en vigor a los veinte días de su publicación en el Diario Oficial de la Unión Europea.

El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro.

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ANEXO I

CAPÍTULO 1

CRITERIOS DE FUNCIONAMIENTO Y OTROS REQUISITOS DE LOS MÉTODOS ANALÍTICOS

1.1.    Requisitos aplicables a los métodos de cribado

1.1.1.    Categorías de métodos adecuados de cribado

Como métodos adecuados de cribado se utilizarán métodos cualitativos, semicuantitativos o cuantitativos.

1.1.2.   Requisitos aplicables a los métodos de cribado biológicos, bioquímicos o físicoquímicos

La CCβ de las sustancias prohibidas o no autorizadas será la más baja posible de alcanzar razonablemente y, en cualquier caso, inferior al valor de referencia a efectos de intervención (VRI) de las sustancias para las que se haya establecido dicho valor en virtud del Reglamento (UE) 2019/1871.

En el caso de las sustancias farmacológicamente activas autorizadas, la CCβ será inferior al límite máximo de residuos (LMR) o al contenido máximo (CM).

Solo se utilizarán para el cribado aquellos métodos analíticos de los que se pueda demostrar de manera documentada que están validados y que tienen un porcentaje de falsos conformes (error β) igual o inferior al 5 %. Si se sospecha que un resultado es no conforme, dicho resultado se confirmará mediante un método de confirmación.

Los métodos cuantitativos de cribado utilizados tanto para el cribado como para la confirmación cumplirán los mismos requisitos de exactitud, rango y precisión que los descritos en los puntos 1.2.2.1 y 1.2.2.2.

1.2.    Requisitos aplicables a los métodos de confirmación

1.2.1.    Requisitos generales para métodos de confirmación

El CCα de las sustancias prohibidas o no autorizadas será el más bajo posible de alcanzar razonablemente. El CCα de las sustancias prohibidas o no autorizadas para las que se haya establecido un VRI en virtud del Reglamento (UE) 2019/1871 será igual o inferior al VRI.

El CCα de las sustancias autorizadas será superior, pero lo más cercano posible, al LMR o al CM.

Para la confirmación, solo se utilizarán aquellos métodos analíticos de los que se pueda demostrar de manera documentada que están validados y que tienen un porcentaje de falsos no conformes (error α) igual o inferior al 1 % para las sustancias prohibidas o no autorizadas, o igual o inferior al 5 % para las sustancias autorizadas.

Los métodos de confirmación proporcionarán información sobre la composición química estructural del analito. En consecuencia, los métodos de confirmación basados exclusivamente en análisis cromatográficos sin recurrir a la detección por espectrometría de masas no son adecuados por sí solos como métodos de confirmación para sustancias farmacológicamente activas prohibidas o no autorizadas. En caso de que la espectrometría de masas no sea adecuada para sustancias autorizadas, pueden utilizarse otros métodos, como la HPLC-DAD y la HPLC-FLD o una combinación de ambas.

Cuando el método de confirmación así lo requiera, al comenzar el procedimiento de extracción se añadirá un patrón interno adecuado a la porción de ensayo. Se emplearán, según su disponibilidad, formas marcadas por isótopos estables del analito, especialmente adecuadas para la detección por espectrometría de masas, o compuestos análogos cuya estructura esté estrechamente relacionada con el analito. Cuando no pueda utilizarse un patrón interno adecuado, la identificación del analito se confirmará, de preferencia, mediante cocromatografía ( 16 ). En este caso, solo se obtendrá un pico, en el cual la altura (o superficie) máxima será equivalente a la cantidad de analito añadida. Si esto no es posible, se utilizarán patrones similares a la matriz o de matriz enriquecida.

1.2.2.    Criterios generales de funcionamiento para métodos de confirmación

1.2.2.1.   Veracidad por recuperación

En el caso de análisis repetidos de un material de referencia certificado, la desviación entre la fracción de masa media determinada experimentalmente, con corrección de recuperación, y el valor certificado cumplirá los rangos de veracidad mínima recogidos en el cuadro 1.

Cuando no se disponga de materiales de referencia certificados, es aceptable que la veracidad de las mediciones se evalúe de otras maneras como, por ejemplo, utilizando materiales con valores asignados a partir de estudios interlaboratorios o añadiendo cantidades conocidas del analito o analitos a una matriz en blanco.

1.2.2.2.   Precisión

El coeficiente de variación (CV) para el análisis repetido de un material de referencia o enriquecido, en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio, no superará el nivel calculado mediante la ecuación de Horwitz. La ecuación es la siguiente:

CV = 2(1 – 0.5 log C)

donde C es la fracción de masa expresada como potencia (exponente) de 10 (por ejemplo, 1 mg/g = 10-3). Para las fracciones de masa inferiores a 120 μg/kg, la aplicación de la ecuación de Horwitz arroja valores inaceptablemente altos. Por consiguiente, el coeficiente de variación máximo autorizado no deberá ser superior a los valores presentados en el cuadro 2.

En el caso de los análisis efectuados en condiciones de repetibilidad, el coeficiente de variación en condiciones de repetibilidad será igual o inferior a dos tercios de los valores enumerados en el cuadro 2.

1.2.3.    Requisitos aplicables a la separación cromatográfica

Para la cromatografía líquida (LC) o de gases GC), el tiempo de retención mínimo aceptable para los analitos examinados será el doble del tiempo de retención correspondiente al volumen vacío de la columna. El tiempo de retención del analito en el extracto corresponderá al del patrón de calibración, al de un patrón similar a la matriz o al de un patrón de matriz enriquecida, con una tolerancia de ± 0,1 minuto. Para la cromatografía rápida, en la que el tiempo de retención es inferior a 2 minutos, se aceptará una desviación inferior al 5 % del tiempo de retención. En caso de que se utilice un patrón interno, la relación entre el tiempo de retención cromatográfica del analito y el del patrón interno, es decir, el tiempo relativo de retención del analito, se corresponderá con el del patrón de calibración, el patrón similar a la matriz o el patrón de matriz enriquecida, con una desviación máxima del 0,5 % para la cromatografía de gases y del 1 % para la cromatografía líquida, en el caso de métodos validados a partir de la fecha de entrada en vigor del presente Reglamento.

1.2.4.    Criterios específicos de funcionamiento para la espectrometría de masas

1.2.4.1.   Detección por espectrometría de masas

La detección por espectrometría de masas se llevará a cabo mediante alguna de las opciones siguientes:

Son adecuadas la espectrometría de masas de baja resolución (LRMS, a resolución de masa unitaria) y la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), incluidos, por ejemplo, los instrumentos de doble focalización, de tiempo de vuelo (TOF) y orbitrap.

Para confirmar la identidad de un analito en HRMS, la desviación de la masa de todos los iones de diagnóstico será inferior a 5 ppm (o en el caso de m/z < 200, inferior a 1 mDa). Sobre esta base, debe seleccionarse la resolución efectiva idónea para el fin previsto. La resolución será normalmente superior a 10 000 para todo el rango de masas a un valle del 10 %, o superior a 20 000 en anchura a media altura (FWHM).

Cuando la determinación mediante espectrometría de masas se lleve a cabo registrando espectros de barrido completo (tanto LRMS como HRMS), solo son adecuados los iones de diagnóstico con una intensidad relativa superior al 10 % en el espectro de referencia del patrón de calibración, patrón similar a la matriz o patrones de matriz enriquecida. Los iones de diagnóstico incluirán el ion molecular (si se encuentra presente en una intensidad de ≥ 10 % del pico base) y los iones fragmento o iones producto característicos.

Selección del ion precursor: cuando la determinación mediante espectrometría de masas se realiza por fragmentación tras la selección del ion precursor, la selección del ion precursor se realiza con una resolución de masa unitaria o mejor. El ion precursor seleccionado será el ion molecular, los aductos característicos del ion molecular, los iones producto característicos o uno de sus iones isotópicos. Si la selección del precursor tiene una ventana de selección de la masa de más de un dalton (por ejemplo, en caso de adquisición independiente de datos), la técnica se considerará un análisis confirmatorio de barrido completo.

Iones fragmento e iones producto: los iones producto o fragmento seleccionados serán iones de diagnóstico para el analito o producto medido. Siempre que sea posible, se omitirán las transiciones no selectivas (por ejemplo, el catión de tropilio o la pérdida de agua). La abundancia de iones de diagnóstico se determinará a partir del área o la altura del pico de los cromatogramas integrados de ion extraído. Esto también se aplica cuando se utilizan mediciones de barrido completo para la identificación. La relación señal-ruido de todos los iones de diagnóstico será igual o superior a tres a uno (3:1).

Intensidades relativas: las intensidades relativas de los iones de diagnóstico (relación de iones) se expresan como porcentaje de la intensidad del ion o de la transición más abundante. La relación de iones debe determinarse comparando espectros o integrando las señales de las trazas de masa de iones extraídos. La relación de iones del analito que debe confirmarse corresponderá a las de los patrones similares a la matriz, los patrones de matriz enriquecida o las disoluciones patrón en concentraciones comparables, medidas en las mismas condiciones, con una desviación relativa de ± 40 %.

Para todos los análisis mediante espectrometría de masas, se determinará al menos una relación de iones. Se trata preferentemente de iones obtenidos en un único barrido, pero los iones también pueden proceder de distintos barridos en la misma inyección (es decir, barrido completo y barrido de fragmentación).

1.2.4.2.   Identificación

Se utilizará un sistema de puntos de identificación para seleccionar los modos de adquisición y los criterios de evaluación adecuados. Para confirmar la identidad de sustancias para las que se ha establecido un LMR (uso autorizado) presentes en una matriz, se requiere un mínimo de 4 puntos de identificación. En el caso de las sustancias no autorizadas o prohibidas, se requieren 5 puntos de identificación. Un punto puede proceder de la separación cromatográfica. El cuadro 3 muestra el número de puntos de identificación que aporta cada una de las técnicas. Para alcanzar el número de puntos de identificación necesario para la confirmación, pueden añadirse puntos de identificación obtenidos a partir de diferentes técnicas.

1.2.5.    Criterios de funcionamiento específicos para la determinación de un analito mediante cromatografía líquida con técnicas de detección distintas de la espectrometría de masas

Solo en el caso de sustancias autorizadas, podrán utilizarse las técnicas siguientes como alternativa a los métodos basados en la espectrometría de masas, siempre que se cumplan los criterios pertinentes para estas técnicas:

Por sí sola, la cromatografía líquida con detección de UV/VIS (longitud de onda única) no es apropiada como método de confirmación.

1.2.5.1.   Criterios de funcionamiento de la espectrofotometría con detección por diodos en serie mediante barrido completo

Deberán cumplirse los criterios de funcionamiento de la separación cromatográfica incluidos en el capítulo 1.2.3.

Los máximos de absorción en el espectro UV del analito presentarán las mismas longitudes de onda que las del patrón de calibración en matriz, dentro de un margen máximo determinado por la resolución del sistema de detección. Para la detección por diodos en serie, este margen máximo suele ser de ± 2 nm. El espectro del analito por encima de los 220 nm, para aquellas partes de ambos espectros con una absorbancia relativa superior o igual al 10 %, no deberán diferir visualmente del espectro del patrón de calibración. Este criterio se satisface, en primer lugar, cuando se presentan máximos iguales y, en segundo lugar, cuando en ninguno de los puntos la diferencia entre ambos espectros es superior al 10 % de la absorbancia del patrón de calibración. Si se recurre a la búsqueda bibliográfica asistida por ordenador y a la concordancia, la comparación de los datos del espectro en las muestras oficiales con los de la disolución de calibración debe superar un factor crítico de correspondencia. Este factor se determinará durante el proceso de validación para cada analito, sobre la base de espectros para los que se cumplen los criterios descritos anteriormente. Se controlará la variabilidad debida a la matriz de la muestra y el funcionamiento del detector.

1.2.5.2.   Criterios de funcionamiento para la espectrofotometría de detección por fluorescencia

Deberán cumplirse los criterios de funcionamiento de la separación cromatográfica incluidos en el capítulo 1.2.3.

La selección de las longitudes de onda de excitación y de emisión en combinación con las condiciones cromatográficas se harán de tal manera que se minimicen los efectos de componentes de interferencia en extractos de muestras en blanco. Debe haber un mínimo de 50 nanómetros entre la longitud de onda de excitación y la de emisión.

El máximo del pico más próximo en el cromatograma estará separado del pico del analito designado por al menos una anchura del pico, medida al 10 % de la altura máxima del pico del analito.

Ello se aplica a las moléculas que presentan fluorescencia natural y a las que la presentan después de transformación o derivatización.

CAPÍTULO 2

VALIDACIÓN

2.1.    Características de funcionamiento que deben determinarse para los métodos analíticos

Mediante la validación del método, se demostrará que el método analítico cumple los criterios relativos a las características de funcionamiento aplicables. Controles con objetivos diferentes requieren distintas categorías de métodos. El cuadro 5 determina qué característica de funcionamiento debe verificarse para qué tipo de método. En el presente capítulo se ofrece una explicación más detallada de cada parámetro.

2.2.    Veracidad, repetibilidad y reproducibilidad intralaboratorio

En este capítulo se ofrecen ejemplos y referencias de procedimientos de validación. Pueden utilizarse otros enfoques para demostrar que el método cumple los criterios de funcionamiento, a condición de que alcancen la misma cantidad y calidad de información.

2.2.1.    Validación convencional

El cálculo de los parámetros por métodos convencionales exige la realización de diversos experimentos aislados. Debe determinarse cada característica de funcionamiento para cada cambio importante (véase la sección 2.4). Con los métodos multianalito pueden analizarse varios analitos simultáneamente, siempre que se hayan descartado posibles interferencias de importancia. De modo similar pueden determinarse varias características de funcionamiento. Así pues, para minimizar la carga de trabajo es conveniente combinar los experimentos cuando sea posible (por ejemplo, la repetibilidad y la reproducibilidad intralaboratorio con la especificidad, el análisis de muestras en blanco para determinar el límite decisión para confirmación y las pruebas de especificidad).

2.2.1.1.   Veracidad mediante material de referencia certificado

Es preferible determinar la veracidad de un método analítico mediante material de referencia certificado (MRC). El procedimiento para ello se describe en la norma ISO 5725-4:1994 ( 17 ).

Presentamos un ejemplo a continuación:

Veracidad (%) = (concentración media detectada tras introducción del factor corrector de recuperación) × 100/valor certificado.

2.2.1.2.   Veracidad mediante muestras enriquecidas

Si no se dispone de material de referencia certificado, la veracidad del método se determinará mediante experimentos con una matriz en blanco enriquecida, como mínimo de acuerdo con el sistema siguiente:

Veracidad (%) = (concentración media detectada tras introducción del factor corrector de recuperación) × 100/nivel de enriquecimiento

En el caso de los métodos para sustancias autorizadas validados antes de la fecha de aplicación del presente Reglamento, será suficiente una determinación de la veracidad del método utilizando seis alícuotas enriquecidas a 0,5, 1,0 y 1,5 veces el LMR o el CM.

2.2.1.3.   Repetibilidad

En el caso de los métodos para sustancias autorizadas validados antes de la fecha de aplicación del presente Reglamento, será suficiente una determinación de la repetibilidad con matrices enriquecidas en concentraciones a 0,5, 1,0 y 1,5 veces el LMR o el CM.

Otra posibilidad es calcular la repetibilidad con arreglo a la norma ISO 5725-2: 2019 ( 22 ).

2.2.1.4.   Reproducibilidad intralaboratorio

En el caso de los métodos para sustancias autorizadas validados antes de la fecha de aplicación del presente Reglamento, será suficiente una determinación de la reproducibilidad intralaboratorio con matrices enriquecidas en concentraciones a 0,5, 1,0 y 1,5 veces el LMR o el CM.

Otra posibilidad es calcular la reproducibilidad intralaboratorio/precisión intermedia de acuerdo con las normas ISO 5725-2: 2019, ISO 11843-1: 1997 ( 23 ) o Codex CAC/GL 59-2006 ( 24 ).

2.2.2.    Validación mediante modelos alternativos

El cálculo de los parámetros mediante modelos alternativos exige la realización de un plan experimental, que deberá elaborarse en función del número de especies y de factores diferentes que se pretenda estudiar. Por ello, en el primer paso de todo el proceso de validación se estudiarán las poblaciones de muestras que se analizarán en el futuro en el laboratorio para determinar las especies más importantes y los factores que pueden influir en los resultados de las mediciones. El enfoque factorial permite evaluar la incertidumbre de medida de los resultados de ensayos obtenidos en un laboratorio determinado en diversas condiciones de ensayo, como diferentes analistas, instrumentos, lotes de reactivos, matrices, duraciones de ensayo y temperaturas de ensayo. Posteriormente, se debe elegir el rango de concentraciones adaptado a la finalidad en función del LMR o del CM de sustancias autorizadas, o del VRI o del NMC de sustancias prohibidas o no autorizadas.

El enfoque factorial tiene por objeto establecer datos de precisión y de medición fiables mediante una variación controlada simultánea de los factores seleccionados. Permite evaluar el impacto combinado de los efectos factoriales y los efectos aleatorios. El diseño experimental también permite la investigación de la robustez ( 25 ) del método analítico y la determinación de la desviación estándar de la reproducibilidad interna con las distintas matrices.

Se presenta a continuación un ejemplo de planteamiento alternativo mediante un plan de diseño experimental ortogonal.

Pueden examinarse hasta siete factores (factores de ruido). El estudio está diseñado de tal manera que la precisión, la veracidad (basada en muestras enriquecidas), la sensibilidad, la incertidumbre de medida y las concentraciones críticas puedan determinarse simultáneamente mediante la aplicación del plan experimental.

El cálculo de las características del método se efectuará según lo descrito por Jülicher et al ( 26 ).

2.2.3.    Otros enfoques de validación

Pueden utilizarse otros enfoques para demostrar que el método cumple los criterios de funcionamiento para las características de funcionamiento, a condición de que alcancen la misma cantidad y calidad de información. La validación también puede realizarse a través de estudios interlaboratorios, como se establece en el Codex Alimentarius, las normas ISO o la IUPAC ( 27 ), o de acuerdo con métodos alternativos tales como estudios en un solo laboratorio o la validación interna ( 28 ). Si se aplican procedimientos alternativos de validación, se indicará en el protocolo de validación el modelo y la estrategia, con sus respectivos requisitos previos, hipótesis y fórmulas, o, cuando menos, sus referencias.

2.3.    Selectividad/especificidad

La capacidad de discriminación entre el analito y las sustancias estrechamente relacionadas se determinará al máximo posible. Se determinará la interferencia de homólogos, isómeros, productos de degradación, sustancias endógenas, análogos, productos metabólicos del residuo de interés, de compuestos de la matriz o de cualquier otra sustancia que pueda interferir y, en caso necesario, se modificará el método para evitar las interferencias detectadas. Para determinar la especificidad del método, se utilizará el siguiente planteamiento:

2.4.    Robustez

El método analítico se someterá a ensayo para comprobar su funcionamiento continuado en diferentes condiciones experimentales, que incluyen, por ejemplo, condiciones de muestreo diferentes y cambios menores que pueden producirse en los ensayos rutinarios. Para comprobar la robustez del método, los cambios introducidos en las condiciones experimentales deben ser menores. Se evaluará la importancia de estos cambios. Se determinará cada característica de funcionamiento para todos los cambios menores que hayan tenido un efecto demostrado significativo en el funcionamiento del análisis.

2.5.    Estabilidad

Se determinará la estabilidad del patrón de calibración, el patrón similar a la raíz y los patrones de matriz enriquecida, así como la estabilidad de los componentes del analito o la matriz en la muestra, durante el almacenamiento o el análisis, ya que las inestabilidades pueden influir en el resultado del ensayo.

Normalmente, la estabilidad del analito está debidamente caracterizada para diversas condiciones de almacenamiento. Los experimentos realizados para supervisar las condiciones de almacenamiento de los patrones y las muestras, que se llevan a cabo como parte del sistema normal de acreditación de laboratorio y control de calidad, pueden proporcionar la información requerida. Si los datos de estabilidad de los analitos en la matriz están disponibles (por ejemplo, a partir de información de los laboratorios de referencia de la UE, datos publicados, etc.), no es necesario que cada laboratorio determine dichos datos. Sin embargo, referirse a los datos disponibles sobre la estabilidad de los analitos en la disolución y en la matriz solo es aceptable si se aplican condiciones idénticas.

En caso de que no se disponga de los datos de estabilidad requeridos, deberán utilizarse los métodos descritos a continuación.

2.5.1.    Determinación de la estabilidad del analito en la solución

analito restante (%) = Ci × 100/Crecién preparada

Ci = concentración en el momento i

Crecién preparada = concentración de la solución recién preparada

El valor medio de cinco soluciones idénticas que se hayan almacenado no diferirá en más de un 15 % del valor medio de cinco soluciones idénticas recién preparadas. El valor medio de las cinco soluciones recién preparadas se utilizará como base para calcular la diferencia porcentual.

2.5.2.    Determinación de la estabilidad del analito (o los analitos) en la matriz

El valor medio de cinco soluciones idénticas que se hayan almacenado no diferirá en más de la reproducibilidad intralaboratorio del método con respecto al valor medio de cinco soluciones idénticas recién preparadas. El valor medio de las cinco soluciones recién preparadas se utilizará como base para calcular la diferencia porcentual.

2.6.    Límite de decisión para confirmación (CCα)

El CCα se determinará para los métodos de confirmación. El CCα se establecerá en condiciones que cumplan los requisitos de identificación o identificación más cuantificación definidos en los «Criterios de funcionamiento y otros requisitos de los métodos analíticos» establecidos en el capítulo 1.

Para el control de conformidad de las muestras, la incertidumbre estándar combinada de medida ya ha sido tenida en cuenta en el valor del CCα (límite de decisión para confirmación).

2.7.    Capacidad de detección del cribado (CCβ)

Se determinará la CCβ para los métodos de cribado. La CCβ se establecerá tal como se define en los «Criterios de funcionamiento y otros requisitos de los métodos analíticos» establecidos en el capítulo 1 del presente anexo, y de conformidad con los requisitos establecidos en el cuadro 5. Sin embargo, no es necesario aplicar a los métodos de cribado todos los requisitos de identificación (véanse los puntos 1.2.3, 1.2.4 y 1.2.5).

2.8.    Curvas de calibración

Cuando se utilizan curvas de calibración para la cuantificación es preciso:

Para las curvas de calibración basadas en una disolución patrón, en patrones similares a la matriz o en patrones de matriz enriquecida, se indicarán los márgenes aceptables para los parámetros de la curva de calibración, que pueden variar de una serie a otra.

2.9.    Recuperación absoluta

La recuperación absoluta del método se determinará cuando no se utilice ningún patrón interno o ninguna calibración de matriz enriquecida.

Cuando se cumplan los requisitos de veracidad establecidos en el cuadro 1, podrá utilizarse un factor de corrección fijo. En caso contrario, se aplicará el factor de recuperación obtenido para ese lote específico. Como alternativa, se utilizará el procedimiento de adición de patrón ( 31 ) o un patrón interno, en lugar de utilizar un factor de corrección de recuperación.

La recuperación absoluta se calculará para al menos seis lotes representativos de matriz.

Una alícuota de matriz en blanco se enriquecerá con el analito antes de la extracción, y una segunda alícuota de matriz en blanco se enriquecerá tras la preparación de la muestra a un nivel de concentración adecuado, y se determinará la concentración del analito.

La recuperación se calculará de la manera siguiente:

Rec (analito) = (patrón de matriz enriquecida)/(patrón similar a la matriz) × 100

2.10.    Efecto matriz relativo

El efecto matriz relativo se determinará en todos los casos. Esto puede hacerse como parte de la validación o en experimentos separados. Se efectuará el cálculo del efecto matriz relativo para al menos 20 lotes en blanco diferentes (matrices/especies), según el ámbito de aplicación del método, como, por ejemplo, diferentes especies que deben cubrirse.

Tras la extracción, la matriz en blanco debe enriquecerse con el analito al VRI, el LMR o el CM, y debe analizarse junto con una disolución pura del analito.

El efecto matriz relativo o factor matriz (FM) se calcula como sigue:

PI : patrón interno

PSM : patrón similar a la matriz

El coeficiente de variación no superará el 20 % para el FM (patrón normalizado para PI).

CAPÍTULO 3

CONTROL DE CALIDAD DURANTE ANÁLISIS DE RUTINA. VERIFICACIÓN CONTINUA DEL FUNCIONAMIENTO DEL MÉTODO

Deberán cumplirse los requisitos para garantizar la calidad de los resultados analíticos del capítulo 7.7 de la norma ISO/IEC 17025:2017 ( 32 ).

Durante los análisis de rutina, el análisis de los materiales de referencia certificados (MRC) es la opción preferible para aportar pruebas del funcionamiento del método. Dado que rara vez se dispone de MRC que contengan los analitos pertinentes en los niveles de concentración requeridos, también pueden utilizarse como alternativa materiales de referencia suministrados y caracterizados por los laboratorios de referencia de la Unión Europea o por laboratorios que posean una acreditación ISO/IEC 17043: 2010 ( 33 ). Otra posibilidad es utilizar materiales de referencia internos que se controlen periódicamente.

La verificación continua del funcionamiento del método durante análisis de rutina debe llevarse a cabo en la fase de cribado y en la fase de confirmación.

Se recomienda el siguiente orden para las muestras de control de calidad: muestra de control de la adecuación del instrumento al sistema, muestra de control conforme, muestras pendientes de confirmación, muestra de control conforme de nuevo y muestra de control de calidad enriquecida (muestras de control no conformes).

En el caso de los métodos cuantitativos, con cada tanda de muestras oficiales se analizará y medirá una curva de calibración antes o después de las muestras enumeradas en el párrafo anterior.

Cuando sea posible, se evaluará la veracidad (a partir de muestras enriquecidas) de todos los analitos de las muestras de control no conformes, mediante gráficos de control de calidad de conformidad con el capítulo 7.7 de la norma ISO/IEC 17025: 2017. Si ello requiere un número desproporcionado de determinaciones de veracidad, el número de analitos podrá reducirse a varios analitos representativos.

CAPÍTULO 4

AMPLIACIÓN DEL ÁMBITO DE APLICACIÓN VALIDADO DE UN MÉTODO VALIDADO CON ANTERIORIDAD

A veces es necesario ampliar el ámbito de aplicación de un método validado globalmente con anterioridad. En estos casos, la ampliación del ámbito de aplicación debe llevarse a cabo de manera eficiente y sólida desde el punto de vista analítico. Esto puede lograrse realizando una validación en un número reducido de muestras (por ejemplo, la mitad de muestras), en comparación con una validación completa.

No obstante, el tipo y el número de modificaciones que deben validarse en un único sistema de validación reducido siempre se basará en conocimientos especializados y experiencias anteriores. Por ejemplo, un cambio en la técnica de detección requeriría una validación completa en cualquier caso.

En general, para garantizar que el método siga siendo válido, su funcionamiento será objeto de un seguimiento continuo y se comparará con los parámetros de validación obtenidos inicialmente. Idealmente, este control continuo del funcionamiento del método está diseñado de manera que los datos que faltan para una validación completa puedan recogerse con el tiempo (por ejemplo, con algunos puntos de datos procedentes de muestras de control de calidad en cada serie analítica).

4.1.    Ampliaciones de los métodos relativas al rango de concentraciones

Debido a cambios en los LMR, los CM y los VRI, puede resultar necesario ajustar el rango de concentraciones para el que está validado un método. En tal caso, es aceptable la aplicación de un sistema de validación reducido.

Las curvas de calibración del intervalo modificado deben prepararse según el procedimiento validado. Deben analizarse diferentes lotes enriquecidos a diferentes niveles de concentración (véanse los puntos 2.2.1 y 2.2.2). La veracidad, la repetibilidad y la reproducibilidad intralaboratorio/precisión intermedia deben situarse dentro de un intervalo aceptable en comparación con los del método validado originalmente. Cuando proceda, debe volver a calcularse la CCβ (métodos de cribado) y el CCα (métodos de confirmación).

4.2.    Ampliaciones de los métodos relativas a sustancias adicionales

En general, ampliar el método a otros compuestos solo es posible si se trata de analitos con estructura y características similares a las de los analitos que ya están incluidos en el método analítico. En tal caso, es aceptable la aplicación de un sistema de validación reducido. De la misma manera, no se permiten divergencias con respecto a la descripción del método.

Las curvas de calibración de las nuevas sustancias deben prepararse según el procedimiento validado. Deben analizarse diferentes tandas de materiales matriz enriquecidos a diferentes niveles de concentración (véanse los puntos 2.2.1 y 2.2.2). La veracidad, la repetibilidad y la reproducibilidad intralaboratorio/precisión intermedia deben situarse dentro de un intervalo comparable a los de los demás analitos del método validado originalmente, y deben ajustarse a los requisitos establecidos en el punto 1.2.2. Deben calcularse la CCβ (métodos de cribado) y el CCα (métodos de confirmación) para los nuevos analitos.

4.3.    Ampliaciones de los métodos relativas a matrices o especies

La decisión de incluir nuevas matrices o especies en un método analítico ya validado se tomará siempre caso por caso, basándose en el conocimiento y la experiencia adquiridos hasta el momento con el método y en experimentos preliminares que evalúen posibles efectos matriz e interferencias. En general, esto solo será posible en el caso de matrices que presenten propiedades similares y de analitos no críticos (estabilidad, detectabilidad).

Las curvas de calibración (patrón o matriz) deben prepararse según el procedimiento validado. Deben analizarse diferentes tandas de material matriz enriquecido a diferentes niveles de concentración (véanse los puntos 2.2.1 y 2.2.2). La veracidad, la repetibilidad y la reproducibilidad intralaboratorio/precisión intermedia deben situarse dentro de un intervalo aceptable en comparación con las del método validado originalmente, y deben ajustarse a los requisitos establecidos en el punto 1.2.2. En función del método de validación, puede ser necesario volver a calcular la CCβ (métodos de cribado) o el CCα (métodos de confirmación).

Si los resultados no se encuentran dentro de un intervalo aceptable en comparación con los valores de la matriz original, será necesaria una nueva validación completa para determinar los parámetros específicos de funcionamiento de la matriz o especie.

En aquellos casos en los que el LMR de una sustancia específica difiera en determinadas matrices, probablemente resultará muy difícil adaptar el ámbito de aplicación a la nueva matriz o especie y a la nueva concentración, ya que, en este caso, deben tenerse en cuenta dos modificaciones. En estos casos se recomienda realizar una validación completa.

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ANEXO II

PROCEDIMIENTOS DE MUESTREO Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS OFICIALES

1.    Cantidad de muestras

Las cantidades mínimas de muestras se definirán en el programa nacional de control de residuos. Dichas cantidades serán suficientes para que los laboratorios autorizados puedan efectuar los procedimientos analíticos necesarios para completar el cribado y los análisis de confirmación. Concretamente en el caso de las aves de corral, la acuicultura, los conejos, la caza de cría, los reptiles y los insectos, las muestras se compondrán de uno o varios animales, dependiendo de los requisitos de los métodos analíticos. En el caso de los huevos, el tamaño de la muestra será de al menos 12 huevos, según los métodos analíticos utilizados. Si deben analizarse varias categorías de sustancias en una única muestra con diferentes métodos analíticos, el tamaño de la muestra se incrementará en consecuencia.

2.    División en submuestras

Cada muestra se dividirá al menos en dos submuestras equivalentes, de forma que sea posible realizar el procedimiento analítico completo de cada una, excepto si es técnicamente imposible o no lo exige la normativa nacional. La subdivisión podrá efectuarse en el lugar donde se recojan las muestras o en el laboratorio.

3.    Trazabilidad

Cada muestra se tomará de forma que sea siempre posible obtener su trazabilidad hasta la explotación de origen y el animal o lote de animales, cuando proceda. En particular, las muestras de leche pueden tomarse, según decidan los Estados miembros, en cualquiera de los lugares siguientes:

4.    Recipientes para muestras

Las muestras se recogerán en recipientes adecuados para mantener la integridad y la trazabilidad de las muestras. En particular, los recipientes deberán evitar la sustitución, la contaminación cruzada y la degradación, y deberán estar provistos de un precinto oficial.

5.    Informe de muestreo

Después de cada muestreo se elaborará un informe.

El inspector incluirá en el informe de muestreo al menos los datos siguientes:

En función del procedimiento de muestreo, se facilitarán copias impresas o electrónicas del informe. El informe de muestreo y sus copias se cumplimentarán de forma que se garantice su autenticidad y validez jurídica, lo que puede requerir que estos documentos estén firmados por el inspector. Cuando el muestreo se realice en la explotación, podrá invitarse al ganadero o a su suplente a firmar el informe de muestreo original.

El original del informe de muestreo quedará en poder de la autoridad competente, que impedirá que puedan acceder a él personas no autorizadas.

En caso necesario, el ganadero o propietario de la explotación podrá ser informado de la toma de muestras.

6.    Informe de muestreo para el laboratorio

El informe de muestreo para el laboratorio establecido por las autoridades competentes cumplirá los requisitos establecidos en el capítulo 7 de la norma ISO/IEC 17025:2017 ( 34 ) y contendrá al menos la información siguiente:

El informe de muestreo para el laboratorio acompañará a la muestra cuando se envíe al laboratorio.

7.    Transporte y almacenamiento

Los programas de control de residuos especificarán las condiciones adecuadas de almacenamiento y transporte de cada combinación de analito/matriz para garantizar la estabilidad del analito y la integridad de la muestra. El transporte durará lo menos posible y la temperatura durante el transporte deberá ser la adecuada para garantizar la estabilidad del analito.

Se prestará una atención especial a las cajas de transporte, la temperatura y el plazo de entrega al laboratorio responsable.

En caso de que se incumpla cualquier requisito del programa de control, el laboratorio informará de ello inmediatamente a la autoridad competente.

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( 1 ) Reglamento Delegado (UE) 2019/2090 de la Comisión, de 19 de junio de 2019, que complementa al Reglamento (UE) 2017/625 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo que respecta a los casos de sospecha o constatación de incumplimiento de las normas de la Unión aplicables al uso de sustancias farmacológicamente activas autorizadas o sus residuos en medicamentos veterinarios o como aditivos de piensos o de las normas de la Unión aplicables al uso de sustancias farmacológicamente activas no autorizadas o prohibidas o sus residuos (DO L 317 de 9.12.2019, p. 28).

( 2 ) Reglamento (UE) 2019/1871 de la Comisión, de 7 de noviembre de 2019, relativo a los valores de referencia para las sustancias farmacológicamente activas no autorizadas presentes en los alimentos de origen animal y por el que se deroga la Decisión 2005/34/CE (DO L 289 de 8.11.2019, p. 41).

( 3 ) Reglamento (CE) n.o 470/2009 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 6 de mayo de 2009, por el que se establecen procedimientos comunitarios para la fijación de los límites de residuos de las sustancias farmacológicamente activas en los alimentos de origen animal, se deroga el Reglamento (CEE) n.o 2377/90 del Consejo y se modifican la Directiva 2001/82/CE del Parlamento Europeo y del Consejo y el Reglamento (CE) n.o 726/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo (DO L 152 de 16.6.2009, p. 11).

( 4 ) Reglamento (CEE) n.o 315/93 del Consejo, de 8 de febrero de 1993, por el que se establecen procedimientos comunitarios en relación con los contaminantes presentes en los productos alimenticios (DO L 037 de 13.2.1993, p. 1).

( 5 ) ISO 3534-1: 2006. Estadística. Vocabulario y símbolos. Parte 1: Términos estadísticos generales y términos empleados en el cálculo de probabilidades (capítulo 1).

( 6 ) Directiva 2001/82/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 6 de noviembre de 2001, por la que se establece un código comunitario sobre medicamentos veterinarios (DO L 311 de 28.11.2001, p. 1).

( 7 ) JCGM 200:2008, Vocabulario Internacional de Metrología. Conceptos fundamentales y generales y términos asociados (VIM) (capítulo 5. Patrones de medida). Tercera edición (2008): https://www.iso.org/sites/JCGM/VIM-JCGM200.htm.

( 8 ) Reglamento (CE) n.o 124/2009 de la Comisión, de 10 de febrero de 2009, que establece los contenidos máximos de coccidiostáticos e histomonóstatos presentes en los alimentos como resultado de la transferencia inevitable de estas sustancias en los piensos a los que no están destinadas (DO L 040 de 11.2.2009, p. 7).

( 9 ) Reglamento (UE) n.o 37/2010 de la Comisión, de 22 de diciembre de 2009, relativo a las sustancias farmacológicamente activas y su clasificación por lo que se refiere a los límites máximos de residuos en los productos alimenticios de origen animal (DO L 015 de 20.1.2010, p. 1).

( 10 ) «Directrices sobre la terminología analítica» (CAC/GL 72-2009) de la Comisión del Codex Alimentarius (Organización de las naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura/Organización Mundial de la Salud).

( 11 ) ISO 5725-1:1994. Exactitud (veracidad y precisión) de resultados y métodos de medición. Parte 1: Principios generales y definiciones (capítulo 3).

( 12 ) ISO 80000-1:2009. Magnitudes y unidades. Parte 1: Generalidades.

( 13 ) Directiva 80/181/CEE del Consejo, de 20 de diciembre de 1979, relativa a la aproximación de las legislaciones de los Estados miembros sobre las unidades de medida y por la que se deroga la Directiva 71/354/CEE (DO L 39 de 15.2.1980, p. 40).

( 14 ) ISO/IEC 17025:2017. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración (capítulo 3).

( 15 ) ISO 78-2: 1999 Química. Diseños para normas. Parte 2: Métodos de análisis químico (anexos).

( 16 ) La cocromatografía es un procedimiento en el que se divide el extracto muestra en dos partes antes de las etapas cromatográficas. Una parte se cromatografía tal cual. La otra parte se mezcla con el analito patrón que debe medirse y se cromatografía también esta mezcla. La cantidad de analito patrón añadido debe ser similar a la cantidad de analito estimada en el extracto. La cocromatografía se usa para mejorar la identificación de un analito por métodos cromatográficos, especialmente cuando no puede utilizarse un patrón interno adecuado.

( 17 ) ISO 5725-4:2020 Exactitud (veracidad y precisión) de resultados y métodos de medición. Parte 4: Métodos básicos para la determinación de la veracidad de un método de medición normalizado (artículo 3).

( 18 ) Cuando, para una sustancia farmacológicamente activa no autorizada, la validación de una concentración de 0,5 veces el VRI no sea razonablemente posible, la concentración de 0,5 veces el VRI puede sustituirse por la concentración más baja que pueda alcanzarse razonablemente entre 0,5 veces y 1,0 veces el VRI.

( 19 ) Cuando, para una determinada sustancia farmacológicamente activa, la validación de una concentración de 0,1 veces el LMR no sea razonablemente posible, la concentración de 0,1 veces el LRM puede sustituirse por la concentración más baja que pueda alcanzarse razonablemente entre 0,1 veces y 0,5 veces el LMR.

( 20 ) Cuando, para una sustancia farmacológicamente activa no autorizada, la validación de una concentración de 0,5 veces el VRI no sea razonablemente posible, la concentración de 0,5 veces el VRI puede sustituirse por la concentración más baja que pueda alcanzarse razonablemente entre 0,5 veces y 1,0 veces el VRI.

( 21 ) Cuando, para una determinada sustancia farmacológicamente activa, la validación de una concentración de 0,1 veces el LMR no sea razonablemente posible, la concentración de 0,1 veces el LRM puede sustituirse por la concentración más baja que pueda alcanzarse razonablemente entre 0,1 veces y 0,5 veces el LMR.

( 22 ) ISO 5725-2:2019 Exactitud (veracidad y precisión) de resultados y métodos de medición. Parte 2: Método básico para la determinación de la repetibilidad y la reproducibilidad de un método de medición normal (artículo 3).

( 23 ) ISO 11843-1:1997 Capacidad de detección. Parte 1: Términos y definiciones

( 24 ) «Directrices sobre la estimación de la incertidumbre de los resultados» (CAC/GL 59-2006) de la Comisión del Codex Alimentarius (Organización de las naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura/Organización Mundial de la Salud).

( 25 ) Los cambios de las condiciones experimentales a que se hace referencia pueden consistir en cambios en los materiales de la muestra, los analitos, las condiciones de almacenamiento o las condiciones ambientales o de preparación de la muestra. Deberá indicarse cualquier variación de las condiciones experimentales susceptibles de fluctuación en la práctica (por ejemplo, estabilidad de los reactivos, composición de la muestra, pH o temperatura) que puedan afectar a los resultados analíticos.

( 26 ) Jülicher, B., Gowik, P., Uhlig, S. (1998). Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 123, 173-179.

( 27 ) IUPAC (1995). Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies. Pure & Applied Chem, 67(2), 331-343.

( 28 ) Gowik, P., Jülicher, B., Uhlig, S. (1998). Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716(1-2), 221-232.

( 29 ) ISO 11843-1:1997 Capacidad de detección. Parte 1: Términos y definiciones

( 30 ) Reglamento de Ejecución (UE) 2018/470 de la Comisión, de 21 de marzo de 2018, que establece normas detalladas sobre el límite máximo de residuos a tener en cuenta a efectos de control de alimentos derivados de animales tratados en la UE según lo dispuesto en el artículo 11 de la Directiva 2001/82/CE (DO L 79 de 22.3.2018, p. 16).

( 31 ) La cantidad de analito patrón añadida puede ser, por ejemplo, entre dos y cinco veces superior al contenido estimado de analito en la muestra. Este procedimiento está diseñado para determinar el contenido de un analito en una muestra, teniendo en cuenta la recuperación del procedimiento analítico.

( 32 ) Norma ISO/IEC 17025: 2017 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración (capítulo 7.7).

( 33 ) ISO/IEC 17043:2010 Evaluación de la conformidad. Requisitos generales para los ensayos de aptitud.

( 34 ) Norma ISO/IEC 17025: 2017 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración (capítulo 7.7).