1998L0057 — ES — 30.07.2006 — 001.001

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►B	DIRECTIVA 98/57/CE DEL CONSEJO de 20 de julio de 1998 sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. (DO L 235, 21.8.1998, p.1)

Modificado por:

		Diario Oficial
		No	page	date
►M1	DIRECTIVA 2006/63/CE DE LA COMISIÓN de 14 de julio de 2006	L 206	36	27.7.2006

Rectificado por:

C1	Rectificación,, DO L 218, 18.8.1999, p. 30  (98/57)

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DIRECTIVA 98/57/CE DEL CONSEJO

de 20 de julio de 1998

sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Artículo 1

La presente Directiva regula las medidas que habrán de tomarse en los Estados miembros contra el organismo Ralstonia solanacearum (Smith) Yabucchi et al., anteriormente denominado Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (denominado en lo sucesivo «el organismo») con el fin de, en lo que respecta a las plantas huésped del organismo indicadas en la sección I del anexo I (denominadas en lo sucesivo «el material vegetal indicado»):

Artículo 2

1.  Los Estados miembros llevarán a cabo anualmente exámenes oficiales sistemáticos para detectar la posible presencia del organismo en el material vegetal indicado originario de su territorio. Con objeto de determinar otras posibles fuentes de contaminación existentes para el cultivo del material vegetal indicado, los Estados miembros llevarán a cabo una evaluación de riesgo y, salvo que no se haya detectado riesgo alguno de propagación durante dicha evaluación, efectuarán en las zonas productoras de dicho material exámenes oficiales orientados específicamente a la detección del organismo en plantas distintas de ese material, incluidas las solanáceas silvestres huésped, así como en las aguas de superficie que se utilicen para regar o rociar tal material y en los residuos líquidos vertidos por las instalaciones industriales de transformación o de embalaje en las que se manipule el material indicado y que se utilicen para regar o rociar el material vegetal indicado. La extensión de estos exámenes orientados se determinará en función del riesgo observado. Los Estados miembros podrán realizar también exámenes oficiales destinados a la detección del organismo en otros materiales, como el medio de cultivo, el suelo y los residuos sólidos procedentes de las instalaciones industriales de transformación o de embalaje.

2.  Los exámenes oficiales previstos en el apartado 1 se efectuarán:

Para la realización de esos exámenes, los pormenores de los procedimientos de inspección así como el número, origen y clasificación de las muestras y el calendario de su recogida serán decididos por los organismos oficiales responsables contemplados en la Directiva 77/93/CEE basándose en principios científicos y estadísticos sólidos y en la biología del organismo y teniendo en cuenta, según el Estado miembro de que se trate, los sistemas concretos que se utilicen para la producción del material vegetal indicado y, en su caso, de otras plantas huésped del organismo.

3.  Los detalles y resultados de los exámenes oficiales previstos en el apartado 1 serán notificados a los demás Estados miembros y a la Comisión cada año, siguiendo a tal efecto las disposiciones del punto 2 de la sección II del anexo I. Estas notificaciones se presentarán a más tardar el 1 de junio salvo en el caso de las patatas utilizadas para siembra en la propia explotación, que se presentarán a más tardar el 1 de septiembre. Los detalles y resultados relativos a los cultivos se referirán a la producción del año anterior. El contenido de estas notificaciones podrá presentarse al Comité.

4.  Deberá aplicarse el procedimiento establecido en el artículo 16 bis de la Directiva 77/93/CEE en la adopción de:

5.  El mismo procedimiento podrá aplicarse en la adopción de:

Artículo 3

Los Estados miembros velarán por que los casos en que se sospeche o se confirme la presencia del organismo en su territorio sean comunicados a sus propios organismos oficiales responsables.

Artículo 4

1.  En todos los casos de sospecha de brote, los organismos oficiales responsables del Estado o Estados miembros afectados velarán por la realización de análisis de laboratorio oficiales o bajo supervisión oficial en los que se aplique, para el material vegetal indicado, el método pertinente establecido en el anexo II y en las condiciones determinadas en el punto 1 del anexo III o, en todos los demás casos, cualquier otro método aprobado oficialmente que permita confirmar o despejar la sospecha en cuestión. En caso de confirmación, serán de aplicación los requisitos dispuestos en el punto 2 del anexo III.

2.  En espera de la confirmación o disipación de la sospecha a la que se refiere el apartado 1, en todos los casos en que:

los organismos oficiales responsables de los Estados miembros, en lo que respecta a la producción propia:

3.  En los casos de sospecha de brote en que exista un riesgo de contaminación del material vegetal indicado o de las aguas de superficie que procedan o se dirijan a otro u otros Estados miembros, el Estado miembro en el que se haya observado el presunto brote informará inmediatamente a ese o esos Estados miembros de los detalles de dicho brote y del nivel de riesgo identificado, y dichos Estados miembros cooperarán en consecuencia. Los Estados miembros a los que así se informe aplicarán medidas preventivas acordes con lo dispuesto en la letra c) del apartado 2 y tomarán cualquier otra medida que resulte adecuada de conformidad con lo dispuesto en los apartados 1 y 2.

4.  Se aplicará el procedimiento establecido en el artículo 16 bis de la Directiva 77/93/CEE en la adopción de:

Artículo 5

1.  Si la presencia del organismo en una muestra tomada en cumplimiento de la presente Directiva fuere confirmada por análisis de laboratorio oficiales o bajo supervisión oficial en los que se utilice, para el material vegetal indicado, el método establecido en el anexo II o, para todos los demás casos, cualquier otro método oficialmente aprobado, los organismos oficiales responsables del Estado miembro interesado, basándose a tal efecto en principios científicos sólidos, en la biología del organismo y en los sistemas concretos de producción, comercialización y transformación que se utilicen en dicho Estado para las plantas huésped del organismo, adoptarán las siguientes medidas:

2.  De conformidad con las disposiciones del punto 3 del anexo V, los Estados miembros notificarán inmediatamente a los otros Estados miembros y a la Comisión cualquier caso de contaminación declarada en virtud del inciso ii) de la letra a) y del inciso ii) de la letra c) del apartado 1, así como los datos relativos a la zona que se haya delimitado con arreglo al inciso iv) de la letra a) del apartado 1 y, en su caso, al inciso iii) de la letra c) de ese mismo apartado. Los detalles de la notificación con arreglo al presente párrafo podrán ser presentados al Comité.

Los Estados miembros presentarán al mismo tiempo a la Comisión la notificación complementaria prevista en el apartado 4 del anexo V. Los detalles de la notificación con arreglo al presente párrafo podrán ser presentados al Comité.

3.  Como resultado de la notificación dispuesta en el apartado 2 y de los datos en ella contenidos, los Estados miembros afectados emprenderán una investigación de acuerdo con el inciso i) de la letra a) del apartado 1 y, en su caso, con el inciso i) de la letra c) del mismo apartado, y tomarán las medidas complementarias que sean adecuadas de conformidad con los apartados 1 y 2.

Artículo 6

1.  Los Estados miembros prohibirán la plantación del material vegetal indicado que se haya declarado contaminado en virtud del inciso ii) de la letra a) del apartado 1 del artículo 5 y ordenarán que, bajo el control y aprobación de sus organismos oficiales responsables, dicho material sea sometido a una de las disposiciones del punto 1 del anexo VI con el fin de que pueda establecerse que no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo.

2.  Los Estados miembros prohibirán la plantación del material vegetal indicado que, en virtud del inciso iii) de la letra a) y del inciso iii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 5, se haya considerado probablemente contaminado, incluido el material vegetal indicado respecto del que se haya detectado la existencia de algún riesgo, producido en lugares de producción que con arreglo al inciso iii) de la letra a) del apartado 1 del artículo 5 se hayan considerado probablemente contaminados, y ordenarán que, bajo el control de sus organismos oficiales responsables, dicho material se destine a un uso adecuado o se elimine de acuerdo con el punto 2 del anexo VI a fin de que pueda establecerse que no existe ningún riesgo identificable de propagación del organismo.

3.  Los Estados miembros ordenarán que toda maquinaria, vehículo, nave, almacén o unidades de éstos y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que se hayan declarado contaminados en virtud del inciso ii) de la letra a) y del inciso iii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 5 o que se hayan considerado probablemente contaminados en virtud del inciso iii) de la letra a) del apartado 1 del mismo artículo se destruyan o se descontaminen aplicando métodos apropiados de conformidad con el punto 3 del anexo VI. Tras su descontaminación, todos estos objetos dejarán de considerarse contaminados.

4.  Sin perjuicio de las medidas que se ejecuten en virtud de los apartados 1, 2 y 3, los Estados miembros ordenarán que en la zona delimitada con arreglo a los incisos iv) de la letra a) y iii) de la letra c) del apartado 1 del artículo 5 se apliquen una serie de medidas acordes con lo dispuesto en los puntos 4.1 y 4.2 del anexo VI. Cada año se notificarán detalles de estas medidas a los demás Estados miembros y a la Comisión. Los detalles de esta notificación podrán ser presentados al Comité.

Artículo 7

1.  Los Estados miembros dispondrán que las patatas de siembra deberán cumplir los requisitos de la Directiva 77/93/CEE y proceder en línea directa de patatas que, habiéndose obtenido en el marco de un programa oficialmente aprobado, hayan dado resultados negativos en cuanto a la presencia del organismo en análisis oficiales u oficialmente supervisados en los que se haya utilizado el método pertinente establecido en el anexo II.

Dichos análisis serán efectuados por un Estado miembro:

2.  De conformidad con el procedimiento establecido en el artículo 16 bis de la Directiva 77/93/CEE podrán adoptarse las siguientes disposiciones:

Artículo 8

Los Estados miembros prohibirán la conservación y manipulación del organismo.

Artículo 9

Sin perjuicio de las disposiciones de la Directiva 77/93/CEE, los Estados miembros podrán autorizar excepciones a lo dispuesto en los artículos 6 y 8 de la presente Directiva de conformidad con las normas establecidas en la Directiva 95/44/CE para la realización de pruebas e investigaciones científicas o de estudios en materia de selecciones varietales ( 5 ).

Artículo 10

Los Estados miembros podrán adoptar, respecto a su producción propia, las medidas complementarias o más estrictas que sean necesarias para combatir el organismo o impedir su propagación, siempre que tales medidas se ajusten a las disposiciones de la Directiva 77/93/CEE.

Los datos de estas medidas deberán ser notificados a los demás Estados miembros y a la Comisión. El contenido de esta notificación podrá ser presentado al Comité.

Artículo 11

Las modificaciones que a la vista de la evolución de los conocimientos científicos o técnicos sea preciso introducir en los anexos de la presente Directiva se adoptarán de conformidad con el procedimiento establecido en el artículo 16 bis de la Directiva 77/93/CEE. En el caso de los métodos establecidos en el anexo II y de las medidas dispuestas en los puntos 4.1 y 4.2 del anexo VI, la Comisión elaborará un informe en el que se analizarán tales métodos y medidas sobre la base de la experiencia adquirida, y este informe se presentará al Comité antes del 1 de enero de 2002.

Artículo 12

1.  Los Estados miembros pondrán en vigor las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas necesarias para dar cumplimiento a lo establecido en la presente Directiva con efectos al 21 de agosto de 1999. Informarán de ello inmediatamente a la Comisión.

Cuando los Estados miembros adopten dichas medidas, éstas harán referencia a la presente Directiva o irán acompañadas de dicha referencia en su publicación oficial. Los Estados miembros establecerán las modalidades de la mencionada referencia.

2.  Los Estados miembros comunicarán de inmediato a la Comisión las principales disposiciones de Derecho interno que adopten en el ámbito regulado por la presente Directiva. La Comisión informará de ello a los demás Estados miembros.

Artículo 13

La presente Directiva entrará en vigor el día de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas.

Artículo 14

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros.

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ANEXO I

SECCIÓN I

Lista de plantas que pueden ser huésped de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. a las que se refiere el artículo 1

SECCIÓN II

Exámenes

1.

Los exámenes oficiales contemplados en la letra a) del apartado 2 del artículo 2 se basarán en la biología del organismo, así como en los sistemas de producción concretos que se utilicen en el Estado miembro de que se trate, e incluirán lo siguiente: i) en el caso de las patatas: — en los momentos oportunos, una inspección visual del cultivo en crecimiento, y/o muestras de patatas de siembra y de otras patatas durante la fase de crecimiento o almacenadas; estas muestras se someterán a una inspección visual oficial o bajo supervisión oficial, para lo cual se procederá a seccionar los tubérculos, — y — en el caso de las patatas de siembra y, si procede, de otras patatas, análisis de laboratorio oficiales o bajo supervisión oficial en los que se utilice el método establecido en el anexo II; ii) en el caso de los tomates: — en los momentos oportunos, una inspección visual de, al menos, el cultivo en crecimiento de plantas destinadas a la replantación para utilización profesional.

2.

La notificación de los exámenes oficiales dispuesta en el apartado 3 del artículo 2 incluirá los datos siguientes: i) en el caso de los exámenes de patatas: — la superficie total estimada, en hectáreas, de los cultivos de patatas de siembra y de otras patatas, — la clasificación por categorías (de siembra y de consumo) y, en su caso, por regiones, — la cantidad de muestras tomadas para los análisis y el momento de su recogida, — el número de inspecciones visuales efectuadas en el campo, — el número de inspecciones visuales realizadas en tubérculos (y la cantidad de muestras); ii) en el caso de los exámenes de, al menos, el cultivo en crecimiento de plantas de tomate destinadas a la replantación para utilización profesional: — la cantidad total estimada de plantas, — el número de inspecciones visuales; iii) en el caso de los exámenes de plantas huésped del organismo distintas de la patata y el tomate, incluidas las solanáceas silvestres huésped: — la especie, — la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida, — la zona o río objeto del muestreo, según proceda, — el método de análisis; iv) en el caso de los exámenes de aguas y de los vertidos de residuos líquidos procedentes de las instalaciones industriales de transformación o de embalaje: — la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida, — la zona, río o ubicación de la instalación objeto del muestreo, según corresponda, — el método de análisis.

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ANEXO II

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO, DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ÁMBITO DE APLICACIÓN DEL MÉTODO

El presente método describe los diversos procedimientos relacionados con:

ÍNDICE

PRINCIPIOS GENERALES

En los apéndices se presentan protocolos optimizados para los diferentes métodos y reactivos validados, así como información detallada para la preparación de materiales de prueba y control. En el apéndice 1 se presenta una lista de los laboratorios que se incluyeron en la optimización y validación de los protocolos.

Habida cuenta de que los protocolos implican la detección de un organismo de cuarentena y de que incluirán la utilización de cultivos viables de R. solanacearum como materiales de control, será preciso llevar a cabo los procedimientos bajo condiciones de cuarentena apropiadas, con instalaciones adecuadas de eliminación de residuos y en aplicación de las condiciones de obtención de los permisos apropiados emitidos por las autoridades oficiales de cuarentena de las plantas.

Los parámetros de las pruebas deben garantizar una detección coherente y reproducible de niveles de R. solanacearum en los límites establecidos en los métodos seleccionados.

Es imprescindible una preparación precisa de los controles positivos.

Asimismo, la realización de pruebas con arreglo a los niveles requeridos implica la utilización de los parámetros correctos, el mantenimiento y el calibrado del equipo, una preservación y manipulación cuidadosa de los reactivos y todas las medidas para evitar la contaminación entre las muestras, como por ejemplo la separación de los controles positivos de las muestras de ensayo. Deben aplicarse normas de control de la calidad para evitar errores administrativos y de otro tipo, especialmente de etiquetado y documentación.

Una sospecha de brote, tal como se menciona en el artículo 4, apartado 2, de la Directiva 98/57/CE, implica la obtención de un resultado positivo de las pruebas de diagnóstico o selección efectuadas a una muestra tal como se especifica en los siguientes diagramas de flujo. Un resultado positivo en la primera prueba de selección (prueba IF, PCR/FISH, aislamiento selectivo) debe confirmarse con una segunda prueba de selección basada en un principio biológico diferente.

Si la primera prueba de selección arroja un resultado positivo, se sospecha entonces la contaminación con R. solanacearum y debe efectuarse una segunda prueba de selección. Si la segunda prueba de selección arroja un resultado positivo, se confirma entonces la sospecha (sospecha de presencia) y debe continuar la prueba con arreglo al método. Si la segunda prueba de selección arroja un resultado negativo, se considera entonces que la muestra no está contaminada con R. solanacearum.

Una presencia confirmada, tal como se menciona en el artículo 5, apartado 1, de la Directiva 98/57/CE, implica el aislamiento y la identificación de un cultivo puro de R. solanacearum con confirmación de patogenicidad.

SECCIÓN I

APLICACIÓN DEL MÉTODO

1.   Método de detección para el diagnóstico de la podredumbre parda y la marchitez bacteriana (R. solanacearum) en tubérculos de patata y plantas de patata, tomate u otras plantas huésped con síntomas de la podredumbre parda o la marchitez bacteriana

El procedimiento de análisis está destinado a los tubérculos de patata y a las plantas que presentan síntomas típicos de la podredumbre parda o la marchitez vascular o que permiten la sospecha de su presencia. Incluye una prueba de selección rápida, el aislamiento del patógeno del tejido vascular infectado en un medio (selectivo) y, en caso de resultado positivo, la identificación del cultivo como R. solanacearum.

2.   Método de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de tubérculos de patata

Fundamento

El procedimiento de análisis tiene por objeto la detección de infecciones latentes en tubérculos de patata. Un resultado positivo de un mínimo de dos pruebas de selección3, basadas en diferentes principios biológicos, debe complementarse con el aislamiento del patógeno, seguido, en caso de aislamiento de colonias típicas, por la confirmación de un cultivo puro como R. solanacearum. Un resultado positivo de solamente una de las pruebas de selección no es suficiente para considerar sospechosa la muestra.

Las pruebas de selección y las pruebas de aislamiento deben permitir la detección de 103 a 104 células/ml de precipitado resuspendido, incluidas como controles positivos en cada serie de pruebas.

3.   Método de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de patatas, tomates y otras plantas huésped

SECCIÓN II

MÉTODOS DETALLADOS DE DETECCIÓN DE R. SOLANACEARUM EN TUBÉRCULOS DE PATATA Y PLANTAS DE PATATA, TOMATE U OTRAS PLANTAS HUÉSPED CON SÍNTOMAS DE LA PODREDUMBRE PARDA O LA MARCHITEZ BACTERIANA

1.   Síntomas (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Síntomas en las patatas

La planta de la patata. La fase inicial de la infección en el campo se reconoce por un marchitamiento de las hojas en progresión ascendente hacia el extremo superior de la planta, bajo el efecto de las temperaturas diurnas altas, con una recuperación durante la noche. En las primeras fases del marchitamiento, las hojas siguen estando verdes, pero posteriormente se desarrolla necrosis parda y amarilleo. También se produce epinastia. El marchitamiento de un brote o de plantas enteras se hace rápidamente irreversible y ocasiona el colapso y la muerte de la planta. El tejido vascular de los tallos de las plantas marchitadas cortados transversalmente suele ser pardo, y de la superficie del corte brota un exudado mucoso bacteriano o este puede extraerse apretando el tallo. Si se coloca verticalmente un tallo cortado en agua, de los haces vasculares salen hilos viscosos.

El tubérculo de la patata. Los tubérculos de patata deben cortarse transversalmente cerca de la parte basal (estolón) o bien longitudinalmente sobre el estolón. La fase inicial de la infección en el campo se reconoce por un marchitamiento de las hojas en progresión ascendente hacia el extremo superior de la planta, bajo el efecto de las temperaturas diurnas altas, con una recuperación durante la noche. Posteriormente, la decoloración vascular adquiere un tono pardo más marcado y la necrosis puede extenderse al tejido parenquimático. En las fases avanzadas, la infección progresa desde la parte basal y los ojos, por las que pueden fluir hilos de flujo bacteriano, lo que hace que se adhieran partículas del suelo. Pueden aparecer en la piel lesiones ligeramente hundidas de color pardo rojizo debido al colapso interno de los tejidos vasculares. En las fases avanzadas de la enfermedad es habitual el desarrollo secundario de podredumbre blanda causada por hongos y bacterias.

1.2.   Síntomas en los tomates

La planta del tomate. El primer síntoma visible es el aspecto fláccido de las hojas más jóvenes. Si se producen condiciones medioambientales favorables para el patógeno (temperaturas del suelo de 25 °C; humedad saturada), en un plazo de pocos días se produce epinastia y marchitamiento de un lado de la planta o de toda ella, lo que desemboca en un colapso total de la planta. En condiciones menos favorables (temperatura del suelo por debajo de 21 °C), se produce un menor marchitamiento, pero pueden surgir numerosas raíces adventicias del tallo. En ocasiones se observan estrías empapadas de agua desde la base del tallo, lo que demuestra la existencia de necrosis en el sistema vascular. Al cortar transversalmente el tallo, los tejidos vasculares que presentan una decoloración parda exudan gotas de líquido bacteriano blanco o amarillento.

1.3.   Síntomas en otros huéspedes

Plantas de Solanum dulcamara y S. nigrum. En condiciones naturales, en pocos casos se observan síntomas de marchitamiento en estos huéspedes herbáceos a no ser que las temperaturas del suelo superen los 25 °C o los niveles de inóculo sean extremadamente elevados (por ejemplo, para S. nigrum que crezca junto a plantas enfermas de patatas o tomates). Cuando se produce el marchitamiento, los síntomas son como los descritos para el tomate. Las plantas de S. dulcamara, que no se marchitan y que crecen con tallos y raíces en el agua, pueden mostrar una decoloración interna pardo claro de los tejidos vasculares en una sección transversal de la base del tallo o las partes del tallo que se encuentran bajo el agua. Pueden fluir bacterias de los tejidos vasculares cortados, o formar hilos viscosos, si el tallo cortado se coloca verticalmente en el agua, incluido en caso de inexistencia de síntomas de marchitamiento.

2.   Pruebas de selección rápida

Las pruebas de selección rápida facilitan el diagnóstico de presunción, pero no son esenciales. Realícese una o más de las siguientes pruebas validadas:

2.1.   Prueba de la exudación del tallo

(Véase la sección VI.A.1.)

2.2.   Prueba de la detección de gránulos de poli-β-hidroxibutirato (PHB)

Los gránulos de PHB característicos en las células de R. solanacearum se visualizan tiñendo frotis de exudado bacteriano fijado con calor procedente de tejido infectado en un portaobjetos con azul Nilo A o negro Sudán B (véase la sección VI.A.2).

2.3.   Pruebas de aglutinación serológica

(Véase la sección VI.A.3.)

2.4.   Otras pruebas

Otras pruebas de selección rápida apropiadas incluyen la prueba IF (véase la sección VI.A.5), la prueba FISH (véase la sección VI.A.7), las pruebas ELISA (véase la sección VI.A.8) y las pruebas PCR (véase la sección VI.A.6).

3.   Proceso de aislamiento

4.   Pruebas de identificación de R. solanacearum

Las pruebas para confirmar la identidad de presuntos aislados de R. solanacearum se muestran en la sección VI.B.

SECCIÓN III

1.   Métodos detallados de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de tubérculos de patata

1.1.   Preparación de la muestra

Nota:

Pretratamiento opcional previo a la preparación de la muestra:

1.1.1.

Quitar la epidermis de la parte basal (estolón) del tubérculo con un bisturí o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que los tejidos vasculares queden a la vista. Extraer con cuidado una cuña cónica pequeña de tejido vascular de la parte basal y extraer el mínimo volumen posible de tejido no vascular (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Nota: Retirar los tubérculos (podridos) que presenten síntomas sospechosos de «podredumbre parda» y analizarlos por separado. Si durante la extracción de la cuña de la parte basal se observan síntomas sospechosos de la podredumbre parda, deberá efectuarse una inspección visual del tubérculo, y cortarse este cerca de la parte basal. Todo tubérculo cortado con síntomas sospechosos deberá guardarse durante un mínimo de dos días a temperatura ambiente a fin de permitir la suberización y almacenar refrigerado (a 4-10 °C) en condiciones de cuarentena apropiadas. Todos los tubérculos, incluidos los que presenten síntomas sospechosos, deberán mantenerse con arreglo a lo establecido en el anexo III.

1.1.2.

Colocar las cuñas de la parte basal en recipientes desechables no utilizados que puedan cerrarse y/o sellarse (en caso de reutilización de los recipientes, deberán limpiarse y desinfectarse por completo utilizando compuestos de cloro). Es conveniente procesar las cuñas inmediatamente. Si esto no es posible, almacenarlas en el recipiente, sin añadir ningún tampón, refrigeradas durante un período máximo de 72 horas o de 24 horas a temperatura ambiente. Procesar las cuñas por uno de los métodos siguientes: a) bien cubrir las cuñas con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tampón de extracción (apéndice 4) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante cuatro horas por debajo de 24 °C o refrigeradas entre 16 y 24 horas, o bien b) homogeneizar las cuñas con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tampón de extracción (apéndice 4) en una trituradora (por ejemplo, Waring o Ultra Thurax) o machacándolas en una bolsa de maceración desechable sellada (por ejemplo, Stomacher o Bioreba de politeno de gran calibre, 150 mm × 250 mm; esterilizada por radiación) utilizando un mazo de goma o un aparato de trituración adecuado (por ejemplo, Homex). Nota: Existe un elevado riesgo de contaminación cruzada de muestras cuando se homogeneizan las muestras utilizando una trituradora. Tomar precauciones a fin de evitar la generación de aerosoles o el vertido durante el proceso de extracción. Debe asegurarse que se utilizan para cada muestra recipientes y cuchillas de trituradora esterilizados. Si se utiliza la prueba PCR, evitar la transferencia de ADN en los recipientes o el aparato de trituración. Al utilizar PCR, se recomienda machacar el material en bolsas desechables y utilizar tubos desechables.

1.1.3.

Se desecha el sobrenadante. Si es demasiado turbio, clarificarlo con una centrifugación a baja velocidad (no más de 180 g durante diez minutos a una temperatura entre 4-10 °C) o mediante filtración al vacío (40-100 µm), lavando el filtro con tampón de extracción adicional (10 ml).

1.1.4.

Concentrar la fracción bacteriana por centrifugación a 7 000 g durante 15 minutos (o 10 000 g durante diez minutos) a una temperatura entre 4-10 °C y descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.

1.1.5.

Resuspender el precipitado en 1,5 ml de tampón de precipitado (apéndice 4). Utilizar 500 µl para pruebas de R. solanacearum, 500 µl para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus y 500 µl para referencia. Añadir glicerol estéril a la concentración final de 10-25 % (v/v) a los 500 µl de la alícuota de referencia y a la restante alícuota de prueba, mezclar y almacenar a una temperatura comprendida entre 16 a 24 °C (semanas) o entre 68 a 86 °C (meses). Mantener las alícuotas de prueba a entre 4-10 °C durante la prueba. No se aconseja congelar y descongelar repetidamente. Si debe transportarse el extracto, entréguese en un recipiente frío en un plazo de 24 a 48 horas.

1.1.6.

Es de capital importancia tratar por separado todos los controles y muestras positivos de R. solanacearum para evitar la contaminación. Esto se aplica a los portaobjetos IF y a todas las pruebas.

1.2.   Análisis

Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas y los protocolos optimizados en los apéndices pertinentes:

2.   Métodos detallados de detección e identificación de R. solanacearum en muestras asintomáticas de patatas, tomates y otras plantas huésped

2.1.   Preparación de la muestra

Nota: Para la detección de poblaciones latentes de R. solanacearum se aconseja someter a prueba muestras mixtas. El procedimiento puede aplicarse convenientemente a muestras mixtas de hasta 200 partes del tallo. Cuando se efectúen exámenes, deberán basarse en una muestra estadísticamente representativa de la población de plantas investigada.

2.1.1.

Colocar segmentos de tallo de 1-2 cm en un recipiente estéril cerrado con arreglo a los siguientes procedimientos de muestreo: Plántulas de tomate de vivero: con un cuchillo limpio y desinfectado, cortar un segmento de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo. Plantas de tomate cultivadas en el campo o en un invernadero: con un cuchillo limpio y desinfectado, arrancar el brote lateral más inferior de cada planta cortando justo por encima de la unión con el tallo principal. Cortar un segmento de 1 cm del extremo inferior de cada brote lateral. Otros huéspedes: con un cuchillo limpio y desinfectado o con tijeras de podar, cortar un segmento de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo. En el caso de S. dulcamara o de otras plantas huésped que crecen en el agua, cortar secciones de 1-2 cm de los tallos bajo el agua o estolones con raíces acuáticas. Cuando se muestree un lugar específico, se recomienda analizar una muestra estadísticamente representativa de un mínimo de diez plantas por punto de muestreo de cada huésped herbáceo potencial. La detección del patógeno será más fiable a finales de primavera, en verano y en otoño, aunque las infecciones naturales pueden detectarse durante todo el año en Solanum dulcamara perenne que crece en cursos de agua. Los huéspedes conocidos incluyen plantas de patata espontáneas (groundkeepers), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium y otros miembros de la familia Solanaceae. Otros huéspedes son Pelargonium spp. y Portulaca oleracea. Entre las especies herbáceas europeas que pueden albergar potencialmente poblaciones de R. solanacearum biovar 2/raza 3 en raíces y/o rizosferas, en condiciones medioambientales específicas, se incluyen: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp, Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra y Urtica dioica. Nota: Puede efectuarse en este momento el examen visual para detectar síntomas internos (coloración vascular o líquido bacteriano). Retirar todos los segmentos del tallo con síntomas y analizarlos por separado (véase la sección II).

2.1.2.

Desinfectar brevemente los segmentos del tallo con etanol al 70 % y secar inmediatamente con un pañuelo de papel. A continuación, procesar los segmentos del tallo mediante uno de los procedimientos siguientes: a) cubrir los segmentos con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tampón de extracción (apéndice 4) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante cuatro horas por debajo de 24 °C o refrigerados entre 16 y 24 horas, o bien b) procesar inmediatamente machacando los segmentos en una bolsa de maceración resistente (por ejemplo, Stomacher o Bioreba) con un volumen apropiado de tampón de extracción (apéndice 4) utilizando un mazo de goma o un aparato de trituración adecuado (por ejemplo, Homex). De no ser posible, almacenar los segmentos del tallo refrigerados durante un máximo de 72 horas o un máximo de 24 horas a temperatura ambiente.

2.1.3.

Desechar el sobrenadante tras 15 minutos de sedimentación.

2.1.4.

No suele ser necesaria otra clarificación del extracto o la concentración de la fracción bacteriana, pero puede conseguirse por filtración y/o centrifugación tal como se describe en la sección III.1.1.3 a 1.1.5.

2.1.5.

Dividir el extracto de la muestra pura o concentrada en dos partes iguales. Mantener una mitad entre 4 y 10 °C durante el análisis y almacenar la otra mitad con glicerol estéril al 10-25 % (v/v) entre 16 y 24 °C (semanas) o entre 68 y 86 °C (mes) en caso de que deban efectuarse nuevas pruebas.

2.2.   Análisis

Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas y los protocolos optimizados en los apéndices pertinentes:

SECCIÓN IV

1.   Esquema del método de detección e identificación de R. solanacearum en el agua

2.   Métodos de detección e identificación de R. solanacearum en el agua

Principio

El método validado de detección que se describe en la presente sección es aplicable a la detección del patógeno en muestras de aguas superficiales y puede aplicarse asimismo a las muestras para análisis del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales. No obstante, es importante señalar que la sensibilidad previsible de la detección variará en función del sustrato. La sensibilidad de la prueba de aislamiento se ve afectada por las poblaciones de bacterias saprofitas competidoras, que son generalmente muy superiores en el proceso de transformación de la patata y las aguas residuales que en las aguas superficiales. Si bien se espera que el método que se describe a continuación solamente detecte 103 células por litro de aguas superficiales, la sensibilidad de la detección en el proceso de transformación de la patata o las aguas residuales será con toda probabilidad mucho menor. Por este motivo, se recomienda analizar las aguas residuales después de todo tratamiento de purificación (por ejemplo, sedimentación o filtración), durante el cual las poblaciones de bacterias saprofitas se reducen. Deberán tenerse en cuenta las limitaciones de sensibilidad del método de prueba a la hora de evaluar la fiabilidad de cualquier resultado negativo obtenido. Si bien se ha utilizado con éxito este método en trabajos de investigación para determinar la presencia o ausencia del patógeno en las aguas superficiales, deberán tenerse en cuenta sus limitaciones cuando se utilice en investigaciones similares del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales.

2.1.   Preparación de la muestra

Nota:

2.1.1.

Recoger muestras de agua en puntos de muestreo seleccionados llenando botellas o tubos estériles desechables, a una profundidad, si es posible, por debajo de 30 cm y a 2 m de la orilla. Para los efluentes resultantes de la transformación de la patata y las aguas residuales, recoger muestras en el punto de vertido de las aguas residuales. Se recomiendan las muestras de hasta 500 ml por punto de muestreo. Si se prefieren muestras más pequeñas, se aconseja tomar muestras como mínimo en tres ocasiones por punto de muestreo, cada una de las cuales consistirá en dos submuestras duplicadas de un mínimo de 30 ml. Para un trabajo de investigación intensivo, seleccione como mínimo tres puntos de muestreo por 3 km de curso de agua y asegúrese de que también se toman muestras en los afluentes que desembocan en el curso de agua.

2.1.2.

Transportar las muestras en un entorno fresco y oscuro (4-10 °C) y analizarlas en un plazo de 24 horas.

2.1.3.

Si es preciso, podrá concentrarse la fracción bacteriana utilizando uno de los métodos siguientes: a) centrifugar 30-50 ml de submuestras de 10 000 g durante diez minutos (o 7 000 g durante 15 minutos), preferiblemente a 4-10 °C, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de tampón de precipitado (apéndice 4); b) filtración por membrana (tamaño mínimo de los poros de 0,45 µm) y a continuación lavado del filtro en 5-10 ml de tampón de precipitado y retención de los lavados. Este método es adecuado para grandes volúmenes de agua que contengan bajos niveles de saprofitas. No suele aconsejarse la concentración para muestras del proceso de transformación de la patata o de aguas residuales, ya que unas poblaciones mayores de bacterias saprofitas competidoras inhibirán la detección de R. solanacearum.

2.2.   Análisis

Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas en los apéndices pertinentes.

SECCIÓN V

1.   Esquema del método de detección e identificación de R. solanacearum en el suelo

2.   Métodos de detección e identificación de R. solanacearum en el suelo

Principios

El método validado de detección que se describe en la presente sección es aplicable a la detección del patógeno en muestras del suelo, pero también puede utilizarse para analizar muestras de residuos sólidos de la transformación de la patata o de lodos de depuradora. No obstante, debe señalarse que estos métodos no son lo suficientemente sensibles para asegurar la detección de poblaciones pequeñas y/o irregularmente distribuidas de R. solanacearum que pueden encontrarse en muestras naturalmente infectadas de estos sustratos.

Deberán tenerse en cuenta las limitaciones de sensibilidad de este método de prueba a la hora de evaluar la fiabilidad de cualquier resultado negativo obtenido, así como cuando se utilice en investigaciones para determinar la presencia o ausencia del patógeno en el suelo o los lodos. El método más fiable para determinar la presencia del patógeno en el suelo del campo es plantar un posible huésped del mismo y supervisar si se produce infección, pero incluso con este método no se detectarán niveles bajos de contaminación.

2.1.   Preparación de la muestra

2.1.1.

El muestreo del suelo del campo deberá seguir los principios habituales utilizados para el muestreo de nematodos. Recoger entre 0,5 y 1 kg de suelo por muestra de 60 lugares de 0,3 ha de una profundidad de 10 a 20 cm (o de una cuadrícula de 7 × 7 metros). Si se sospecha la presencia del patógeno, incrementar el número de puntos de recogida a 120 por 0,3 ha. Mantener las muestras a una temperatura comprendida entre 12 y 15 °C antes del análisis. Tomar muestras de la transformación de la patata y de lodos de depuradora, recogiendo un total de 1 kg de sitios que representen el volumen total de lodos que se analizará. Mezclar adecuadamente cada muestra antes del análisis.

2.1.2.

Dispersar submuestras de 10 a 25 g de suelo o lodos mediante agitación rotatoria (250 rpm) en 60-150 ml de tampón de extracción (apéndice 4) durante un máximo de dos horas. En caso necesario, el añadido de 0,02 % de Tween-20 estéril y de 10 a 20 g de grava estéril puede contribuir a la dispersión.

2.1.3.

Mantener la suspensión a 4 °C durante el análisis.

2.2.   Análisis

Véase el diagrama de flujo y la descripción de las pruebas en los apéndices pertinentes.

SECCIÓN VI

PROTOCOLOS OPTIMIZADOS PARA LA DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE R. SOLANACEARUM

A.   PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO Y DETECCIÓN

1.   Prueba de la exudación del tallo

La presencia de R. solanacearum en tallos de patata, tomate u otras plantas huésped marchitas puede observarse mediante la sencilla prueba de presunción que se indica a continuación: cortar el tallo justo por encima del nivel del suelo. Suspender la superficie del corte en un tubo de agua limpia. Observar si se produce la característica exudación espontánea de hilos de flujo bacteriano de los haces vasculares cortados unos minutos después.

2.   Prueba de la detección de gránulos de poli-β-hidroxibutirato

Prueba del azul Nilo

Prueba del negro Sudán

3.   Pruebas de aglutinación serológica

La mejor manera de observar la aglutinación de células de R. solanacearum en líquido bacteriano o extractos de tejido sintomático es utilizando anticuerpos validados (véase el apéndice 3) etiquetados con marcadores coloreados apropiados tales como células rojas de Staphylococcus aureus o partículas coloreadas de látex. Si se utiliza un equipo comercializado (véase el apéndice 3), siga las instrucciones del fabricante. En caso contrario, aplique el procedimiento siguiente:

4.   Aislamiento selectivo

4.1.   Siembra en medio selectivo

Nota: Antes de utilizar este método por primera vez, efectúe pruebas preliminares a fin de garantizar una detección reproducible de 103 a 104 unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml añadido a extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos.

Utilizar un medio selectivo validado adecuado tal como SMSA (modificado por Elphinstone et al., 1996; véase el apéndice 2).

Es preciso diferenciar R. solanacearum de otras bacterias que pueden desarrollar colonias en el medio. Además, las colonias de R. solanacearum pueden mostrar morfologías atípicas si las placas están superpobladas o si también contienen bacterias antagonistas. Cuando se sospeche la existencia de efectos de la competencia o el antagonismo, deberá volver a analizarse la muestra con otro método.

Para lograr la máxima sensibilidad con este método, utilizar extractos de muestras recién preparados. Sin embargo, este método también puede aplicarse a extractos que se hayan almacenado con glicerol entre 68 y 86 °C.

Como controles positivos, preparar diluciones decimales de una suspensión de 106 cfu por ml de una cepa virulenta biovar 2 de R. solanacearum (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar toda posibilidad de contaminación, preparar controles positivos totalmente separados de las muestras que van a analizarse.

Deberá examinarse la adecuación para el crecimiento del patógeno de cada lote recién preparado de un medio selectivo antes de utilizarlo para analizar muestras rutinarias.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

4.1.1.

Aplicar una técnica de dilución en placas apropiada a fin de garantizar la dilución de cualquier población saprofita formadora de colonias que pudiera existir. Extender 50-100 µl por placa de extracto de muestra y de cada dilución.

4.1.2.

Incubar las placas a 28 °C. Leer las placas 48 horas después, y posteriormente a diario hasta un máximo de seis días. Las colonias típicas de R. solanacearum en el medio SMSA son de color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas y, tras tres días de incubación, se vuelven de color rosa a rojo sangre en el centro con rayas o espirales internas (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Nota: En algunos casos se forman colonias atípicas de R. solanacearum en este medio. Estas pueden ser pequeñas, redondas, completamente rojas y no fluidas, o solo parcialmente fluidas y, por tanto, difíciles de distinguir de las bacterias saprofitas formadoras de colonias.

4.1.3.

Purificar las presuntas colonias de R. solanacearum tras el estriado o la dilución en placas en un medio nutritivo general a fin de obtener colonias aisladas (véase el apéndice 2).

4.1.4.

Almacenar los cultivos a corto plazo en agua estéril (pH 6-8, sin cloro) a temperatura ambiente en la oscuridad, o a largo plazo en un medio crioprotector adecuado entre 68 y 86 °C o liofilizado.

4.1.5.

Identificar los presuntos cultivos (véase la sección VI. B) y efectuar una prueba de patogenicidad (véase la sección VI. C).

La siembra en medio selectivo es negativa si no se observan colonias bacterianas al cabo de seis días ni se encuentran presuntas colonias típicas de R. solanacearum, siempre que no haya sospechas de inhibición producida por la competencia o el antagonismo de otras bacterias y que en los controles positivos se encuentren colonias típicas de R. solanacearum. La siembra en medio selectivo es positiva si se aíslan presuntas colonias de R. solanacearum.

4.2.   Procedimiento de enriquecimiento

Utilizar un medio de enriquecimiento validado como el caldo Wilbrink modificado (véase el apéndice 2).

Este procedimiento puede utilizarse para incrementar selectivamente las poblaciones de R. solanacearum en extractos de muestras e incrementar la sensibilidad de la detección. Asimismo, este procedimiento diluye efectivamente los inhibidores de la reacción PCR (1:100). Sin embargo, debe señalarse que el enriquecimiento de R. solanacearum puede fallar debido a la competencia o el antagonismo de organismos saprofitas, que en muchos casos se enriquecen simultáneamente. Por este motivo, el aislamiento de R. solanacearum a partir de cultivos de caldos enriquecidos puede resultar difícil. Además, debido a que pueden incrementarse las poblaciones de saprofitos serológicamente afines, se recomienda la utilización de anticuerpos monoclonales específicos en lugar de anticuerpos policlonales cuando se aplique la prueba ELISA.

4.2.1.

Para el enriquecimiento PCR, transferir 100 µl de extracto de muestras a 10 ml de caldo de enriquecimiento (apéndice 2) previamente alicuotados en tubos o matraces sin ADN. Para el enriquecimiento ELISA, pueden utilizarse proporciones más elevadas de extracto de muestras en el caldo (por ejemplo, 100 µl en 1,0 ml de caldo de enriquecimiento).

4.2.2.

Incubar durante 72 horas entre 27 y 30 °C en un cultivo agitado o un cultivo estático manteniendo el tapón del tubo sin apretar para que haya aireación.

4.2.3.

Mezclar adecuadamente antes de utilizar en las pruebas ELISA o PCR.

4.2.4.

Tratar el caldo enriquecido de manera idéntica a la muestra o las muestras de las pruebas anteriormente mencionadas. Nota: Si se prevé una inhibición o un enriquecimiento de R. solanacearum debido a las elevadas poblaciones de determinadas bacterias saprofitas competidoras, pueden conseguirse mejores resultados con el enriquecimiento de extractos de muestras antes de cualquier centrifugación o con otras medidas de concentración.

5.   Prueba de inmunofluorescencia (prueba IF)

Principio

Se recomienda utilizar la prueba IF como principal prueba de selección debido a su capacidad demostrada para alcanzar los límites requeridos.

Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de selección y su lectura sea positiva, deberá efectuarse la prueba de aislamiento, PCR o FISH como segunda prueba de selección. Cuando se utilice la prueba IF como segunda prueba de selección y su lectura sea positiva, deberá efectuarse una nueva prueba con arreglo al diagrama de flujo para completar el análisis.

Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. solanacearum (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución más elevada en la que se produce una reacción óptima cuando se analiza una suspensión que contenga de 105 a 106 células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum, utilizando un conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) apropiado, según las recomendaciones del fabricante. Todo el antisuero policlonal validado debe presentar un título IF de al menos 1:2 000. Durante el análisis, deberán utilizarse los anticuerpos en diluciones de trabajo cercanas o equivalentes al título.

La prueba debería efectuarse en extractos de muestras recién preparados. En caso necesario, puede realizarse con éxito en extractos almacenados entre 68 y 86 °C en glicerol. El glicerol puede eliminarse de la muestra si se añade 1 ml de tampón de precipitado (véase el apéndice 4), se recentrifuga durante 15 minutos a 7 000 g y se resuspende en un volumen equivalente de tampón de precipitado. En muchos casos no es necesario efectuar este procedimiento, especialmente si las muestras se han fijado en los portaobjetos mediante flameado.

Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homóloga o de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 3, punto B, y opcionalmente en tampón.

Cuando sea posible, deberá utilizarse tejido naturalmente infectado (mantenido por liofilización o congelación entre 16 y 24 °C) como control similar en el mismo portaobjetos.

Pueden utilizarse como controles negativos alícuotas de extracto de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos de R. solanacearum.

En el apéndice 3 se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.

Utilizar portaobjetos de pocillos múltiples, de preferencia con diez pocillos de 6 mm de diámetro como mínimo.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

5.1.   Preparar los portaobjetos según uno de los procedimientos siguientes

5.2.

Secar las gotitas a temperatura ambiente o calentándolas entre 40 y 45 °C. Fijar las células bacterianas al portaobjetos calentándolo (15 minutos a 60 °C), flameándolo con etanol del 95 % o con arreglo a las instrucciones específicas de los suministradores de los anticuerpos. En caso necesario, pueden almacenarse a continuación portaobjetos fijos en un recipiente desecado durante el menor tiempo que resulte necesario (hasta un máximo de 3 meses) antes de efectuar nuevas pruebas.

5.3.

Procedimiento IF i) Si el portaobjetos se ha preparado según el punto 5.1.i): Preparar un conjunto de diluciones a 1/2. El primer pocillo deberá contener 1/2 del título (T/2), los otros 1/4 del título (T/4), 1/2 del título (T/2), el título (T) y el doble del título (2T). ii) Si el portaobjetos se ha preparado según el punto 5.1.ii): Preparar la dilución de trabajo (DT) del anticuerpo en el tampón IF. La dilución de trabajo afecta a la especificidad. Figura 1.  Preparación del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.i) y 5.3.i).   Diluciones de precipitado resuspendido 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Dilución de precipitado resuspendido (T = título) T/2 T/4 T/2 T 2T  Diluciones a 1/2 de antisuero/anticuerpo Muestra 1   1 2 3 4 5 Duplicado de muestra 1 o muestra 2 6 7 8 9 10 Figura 2.  Preparación del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.ii) y 5.3.ii).   Dilución de trabajo de antisuero/anticuerpo 1/1 1/10 1/100 vacío vacío  Dilución decimal de precipitado resuspendido Muestra 1     1 2 3 4 5 Duplicado de muestra 1 o muestra 2 6 7 8 9 10 5.3.1. Colocar los portaobjetos en un pañuelo de papel humedecido. Cubrir cada pocillo completamente con la dilución o diluciones de anticuerpos. El volumen de anticuerpos aplicado en cada pocillo debe ser como mínimo equivalente al volumen de extracto aplicado. En caso de que no existan instrucciones específicas de los suministradores de los anticuerpos deberá aplicarse el siguiente procedimiento: 5.3.2. Dejar en incubación los portaobjetos en papel húmedo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C). 5.3.3. Sacudir las gotitas de cada portaobjetos y enjuagar cuidadosamente con tampón IF. Lavar por inmersión durante cinco minutos en tampón IF-Tween (apéndice 4) y posteriormente en tampón IF. Evitar la transferencia de aerosoles o gotitas que pudiera provocar contaminaciones cruzadas. Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad secándolo suavemente. 5.3.4. Colocar los portaobjetos en papel húmedo. Cubrir los pocillos con la dilución del conjugado FITC utilizado para determinar el título. El volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser idéntico al volumen de anticuerpos aplicado. 5.3.5. Dejar en incubación los portaobjetos en papel húmedo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C). 5.3.6. Sacudir las gotitas de conjugado del portaobjetos. Enjuagar y lavar como antes (5.3.3). Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad. 5.3.7. Echar con una pipeta 5 a 10 µl de tampón fosfato glicerol de 0,1 M (apéndice 4) o un volumen de solución comercial que proteja la fluorescencia (antifading) en cada pocillo y colocar un cubreobjetos.

5.4.

Lectura de la prueba IF 5.4.1. Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitación del FITC, con aceite o agua de inmersión y a 500-1 000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que presenten un bajo número de células o ninguna, deben observarse como mínimo 40 campos microscópicos. En primer lugar, comprobar el control positivo. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas en el título de anticuerpos o la dilución de trabajo determinados. La prueba IF (sección VI.A.5) debe repetirse si la tinción es aberrante. 5.4.2. Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con morfología característica de R. solanacearum en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo en la misma dilución de anticuerpos. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa. Deberá repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contaminación. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren células positivas debido a la contaminación del tampón o si se encuentran células positivas (fuera de los pocillos de los portaobjetos) en la superficie. 5.4.3. Existen varios problemas inherentes a las características específicas de la prueba de inmunofluorescencia. En los precipitados de cuñas basales de patata y los precipitados de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de R. solanacearum. 5.4.4. Tener solamente en cuenta las células fluorescentes con tamaño y morfología típicos en el título o la dilución de trabajo de los anticuerpos, tal como se describe en 5.3. 5.4.5. Interpretación de la lectura de la prueba IF: i) si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, estimar el número medio de células típicas por campo microscópico y calcular el número de células típicas por ml de precipitado resuspendido (apéndice 5). La lectura IF es positiva en las muestras con un mínimo de 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido. Se considera entonces que la muestra puede estar contaminada y deben efectuarse otras pruebas, ii) la lectura IF es negativa en las muestras con menos de 5 × 103 células por ml de precipitado resuspendido, y se considera negativa la muestra. No es preciso efectuar más pruebas.

6.   Prueba de reacción en cadena de la polimerasa (prueba PCR)

Principios

Cuando se utilice la prueba PCR como principal prueba de selección y dé resultados positivos, deberá efectuarse la prueba de aislamiento o la IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la PCR como segunda prueba de selección y dé resultados positivos, deberán efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico.

La plena explotación de este método como principal método de selección solo se recomienda en el caso de que se hayan adquirido conocimientos especializados del mismo.

Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de 103 a 104 células de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente arrojaron resultados negativos. Puede ser necesario llevar a cabo experimentos de optimización para lograr niveles máximos de sensibilidad y especificidad en todos los laboratorios.

Utilizar reactivos y protocolos PCR validados (véase el apéndice 6). Seleccionar preferiblemente un método con control interno.

Tomar las precauciones adecuadas para evitar la contaminación de la muestra con el ADN buscado. La prueba PCR debe ser efectuada por técnicos experimentados, en laboratorios especializados en biología molecular, con el fin de reducir al máximo la posibilidad de contaminación con el ADN buscado.

Como muestras finales del procedimiento siempre deben efectuarse controles negativos (para la extracción de ADN y los procedimientos PCR) que dejen constancia de si se ha producido arrastre de ADN.

En la prueba PCR deben incluirse los siguientes controles negativos:

Deben incluirse los siguientes controles positivos:

Para evitar toda posible contaminación, preparar los controles positivos en un entorno distinto al de las muestras que vayan a analizarse.

Los extractos de muestras deben contener la cantidad mínima de tierra posible. En determinados casos puede ser recomendable preparar los extractos a partir de patatas lavadas cuando vayan a utilizarse protocolos PCR.

En el apéndice 3 se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.

6.1.   Métodos de purificación del ADN

Utilizar muestras de control positivas y negativas como se indica más arriba (véase el apéndice 3).

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

Existen diferentes métodos para purificar el ADN buscado a partir de sustratos de muestras complejas, separando de esta manera los inhibidores de PCR y otras reacciones enzimáticas y concentrando el ADN buscado en el extracto de la muestra. Se ha optimizado el método siguiente para su utilización con los métodos PCR validados mostrados en el apéndice 6.

a)   Método de Pastrik (2000)

b)   Otros métodos

Pueden aplicarse otros métodos de extracción del ADN, como por ejemplo Qiagen DNeasy Plant Kit, siempre que se haya demostrado que son igual de eficaces en la purificación del ADN a partir de muestras de control que contengan de 103 a 104 células patógenas por ml.

6.2.   PCR

6.2.1.

Preparar plantillas de ensayo y de control para la prueba PCR con arreglo a los protocolos validados (sección VI.A.6). Preparar una dilución decimal de extracto de ADN de la muestra (1:10 en agua ultrapura).

6.2.2.

Preparar la mezcla de reacción PCR apropiada en un entorno sin contaminación de acuerdo con los protocolos publicados (apéndice 6). Cuando sea posible, se recomienda utilizar un protocolo PCR multiplex que incorpore asimismo un control interno de la prueba PCR.

6.2.3.

Añadir de 2 a 5 µl de extracto de ADN por 25 µl de reacción PCR en tubos PCR estériles con arreglo a los protocolos PCR (véase el apéndice 6).

6.2.4.

Incorporar una muestra de control negativo que contenga solo mezcla de reacción PCR y añadir la misma fuente de agua ultrapura utilizada en la mezcla PCR en lugar de la muestra.

6.2.5.

Colocar los tubos en el mismo termociclador utilizado en las pruebas preliminares y aplicar el programa PCR optimizado adecuado (apéndice 6).

6.3.   Análisis del producto de la PCR

6.3.1.

Resolver los amplicones PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Aplicar como mínimo 12 µl de mezcla de reacción de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 µl de tampón de carga (apéndice 6) en 2,0 % (w/v) de geles de agarosa en un tampón de tris-acetato-EDTA (TAE) (apéndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar un marcador de ADN adecuado, por ejemplo, 100 bp ladder.

6.3.2.

Revelar las bandas de ADN tiñéndolas con bromuro de etidio (0,5 mg/l) durante 30 a 60 minutos, tomando las precauciones adecuadas para el manejo de este mutágeno.

6.3.3.

Observar el gel teñido mediante transiluminación en UV de onda corta (λ = 302 nm) para productos de la PCR amplificados del tamaño esperado (apéndice 6) y anotar los resultados.

6.3.4.

En relación con todos los nuevos descubrimientos o casos, para verificar la autenticidad del amplicón PCR efectuar un análisis de la enzima de restricción en una muestra del ADN restante amplificado incubando a la temperatura óptima y durante el tiempo necesario con una enzima y un tampón apropiados (véase el apéndice 6). Resolver los fragmentos digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa, al igual que antes, y observar el patrón característico del fragmento de restricción con transiluminación UV una vez teñido con bromuro de etidio y comparar con el control positivo no digerido y digerido.

Interpretación de los resultados de la prueba PCR

La prueba PCR es negativa si el amplicón PCR específico de R. solanacearum del tamaño esperado no se detecta en la muestra en cuestión pero sí se detecta en todas las muestras de controles positivos (en caso de PCR multiplex con cebadores de control interno específicos de la planta, se debe amplificar con la muestra en cuestión un segundo producto PCR del tamaño esperado).

La prueba PCR es positiva si se detecta el amplicón PCR específico de R. solanacearum del tamaño y patrón de restricción esperado (cuando se exija), siempre que no se amplifique a partir de ninguna de las muestras de control negativo. La confirmación fiable de un resultado positivo puede obtenerse también repitiendo la prueba con un segundo conjunto de cebadores de la PCR (apéndice 6).

Nota: Puede sospecharse la inhibición de la PCR si el amplicón esperado se obtiene a partir de la muestra de control positivo que contiene R. solanacearum en agua, pero se obtienen resultados negativos de los controles positivos con R. solanacearum en extracto de patata. En protocolos PCR multiplex con controles PCR internos, la inhibición de la reacción se indica cuando no se obtiene ninguno de los dos amplicones.

Puede sospecharse la existencia de contaminación si el amplicón esperado se obtiene a partir de uno o varios de los controles negativos.

7.   Prueba de hibridación fluorescente in situ (prueba FISH)

Principio

Cuando se utilice la prueba FISH como primera prueba de selección y esta arroje resultados positivos, deberá efectuarse la prueba de aislamiento o la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selección. Cuando se utilice la prueba FISH como segunda prueba de selección y dé resultados positivos, deberán efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagnóstico.

Nota: Utilizar oligosondas específicas para R. solanacearum validadas (véase el apéndice 7). Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de al menos 103 a 104 células de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos.

El procedimiento siguiente debería efectuarse, a ser posible, con extracto de muestra recién preparado, pero también puede realizarse con éxito con extracto de muestra que se haya almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre 16 y 24 °C o entre 68 y 86 °C.

Utilizar como controles negativos alícuotas de extracto de muestras que hayan dado previamente resultados negativos para R. solanacearum.

Como controles positivos, preparar suspensiones que contengan de 105 a 106 células por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo la cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3) en tampón de fosfato de 0,01 M de un cultivo de tres a cinco días. Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa homóloga o de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el apéndice 3, punto B.

El uso de una oligosonda eubacteriana con etiqueta FITC ofrece un control para el proceso de hibridación, ya que teñirá todas las eubacterias presentes en la muestra.

En el apéndice 3, punto A, se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

7.1.   Fijación del extracto de patata

El protocolo siguiente se basa en Wullings et al. (1998).

7.1.1.

Preparar la solución de fijación (véase el apéndice 7).

7.1.2.

Verter 100 µl de cada extracto de muestra en un tubo Eppendorf y centrifugar durante siete minutos a 7 000 g.

7.1.3.

Separar el sobrenadante y disolver el precipitado en 200 µl de solución fijadora preparada con menos de 24 horas de antelación. Agitar e incubar durante una hora en el refrigerador.

7.1.4.

Centrifugar durante siete minutos a 7 000 g, separar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 µl de tampón de fosfato de concentración 0,01 M (véase el apéndice 7).

7.1.5.

Colocar 16 µl de las suspensiones fijadas en un portaobjetos múltiple limpio, tal como muestra la figura 7.1. Aplicar dos muestras diferentes por portaobjetos sin diluir y utilizar 10 µl para realizar una dilución a 1:100 (en tampón de fosfato de concentración 0,01 M). La solución de la muestra restante (49 µl) puede almacenarse a 20 °C tras la adición de 1 volumen de etanol al 96 %. En caso de que sea necesario repetir la prueba FISH, separar el etanol mediante centrifugación y añadir un volumen equivalente de tampón de fosfato de concentración 0,01 (mezclar mediante agitación). Figura 7.1.  Distribución del portaobjetos para la prueba FISH. Muestra 1 Nada Nada Nada Muestra 2 pocillo 1 pocillo 2 pocillo 3 pocillo 4 pocillo 5 Muestra 1 Nada Nada Nada Muestra 2 pocillo 6 pocillo 7 pocillo 8 pocillo 9 pocillo 10 Cubreobjetos 1   Cubreobjetos 2

7.1.6.

Secar los portaobjetos al aire (o con secador de portaobjetos a 37 °C) y fijarlos flameándolos. El procedimiento puede interrumpirse en esta fase, pudiéndose proseguir con la hibridación al día siguiente. Los portaobjetos deben almacenarse secos y sin polvo a temperatura ambiente.

7.2.   Hibridación

7.2.1.

Deshidratar las células en series de etanol escalonadas al 50 %, 80 % y 96 % durante un minuto cada una. Secar las preparaciones en un portaobjetos.

7.2.2.

Preparar una cámara de incubación húmeda recubriendo el fondo de una caja hermética con papel de seda o de filtro empapado en 1x hybmix (apéndice 7). Preincubar la caja en el horno de hibridación a 45 °C durante un mínimo de diez minutos.

7.2.3.

Aplicar 10 μl de solución de hibridación (apéndice 7) a ocho pocillos (pocillos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 y 10; véase la figura 7.1) de cada portaobjetos dejando vacíos los dos pocillos centrales (3 y 8).

7.2.4.

Aplicar cubreobjetos (24 × 24 mm) al primer y a los cuatro últimos pocillos evitando la entrada de aire. Colocar los portaobjetos en la cámara húmeda precalentada y dejar que se produzca la hibridación durante cinco horas a 45 °C en la oscuridad.

7.2.5.

Preparar tres vasos de precipitado que contengan 1 l de agua Milli Q (grado molecular), 1 l de 1x hybmix (334 ml 3x hybmix y 666 ml agua Milli Q) y 1 l de 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix y 958 ml agua Milli Q). Preincubarlos al baño maría a 45 °C.

7.2.6.

Quitar los cubreobjetos de las preparaciones y colocar estas en un portaobjetos.

7.2.7.

Lavar el exceso de sonda mediante incubación durante 15 minutos en el vaso de precipitado con 1x hybmix a 45 °C.

7.2.8.

Transferir el portaobjetos a una solución de lavado de hybmix a 1/8 e incubar durante otros 15 minutos.

7.2.9.

Sumergir las preparaciones brevemente en agua Milli Q y colocarlas en papel de filtro. Eliminar el exceso de humedad cubriendo la superficie con cuidado con papel de filtro. Verter de 5 a 10 μl de solución de montaje protectora de la fluorescencia (por ejemplo Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, o equivalente) en cada pocillo y aplicar un cubreobjetos grande (24 × 60 mm) sobre la totalidad de la preparación.

7.3.   Lectura de la prueba FISH

7.3.1.

Los portaobjetos deben examinarse inmediatamente utilizando un microscopio epifluorescente a 630 o 1 000 aumentos con aceite de inmersión. Con un filtro adecuado para isotiocianato de fluoresceína (FITC), las células eubacterianas (incluida la mayoría de las células gramnegativas) de la muestra aparecen teñidas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina-5-isotiocianato, las células de R. solanacearum marcadas con Cy3 aparecen teñidas de rojo fluorescente. Comparar la morfología de las células con la de los controles positivos. Las células deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente teñidas. La prueba FISH (sección VI.A.7) debe repetirse si la tinción es aberrante. Recorrer los pocillos a lo largo de dos diámetros perpendiculares entre sí y alrededor del perímetro. En el caso de muestras que presenten un bajo número de células o ninguna, deben observarse como mínimo 40 campos microscópicos.

7.3.2.

Comprobar si hay células fluorescentes brillantes con la morfología característica de R. solanacearum en los pocillos de los portaobjetos (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente o mejor que la de la cepa de control positivo. Deberán descartarse las células que presenten una tinción incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.

7.3.3.

Deberá repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contaminación. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren células positivas debido a la contaminación del tampón o si se encuentran células positivas (fuera de los pocillos de los portaobjetos) en la superficie.

7.3.4.

Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba FISH. En los precipitados de cuñas basales de patata y de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de células fluorescentes de morfología atípica y bacterias saprofitas con reacción cruzada cuyo tamaño y morfología sean similares a los de R. solanacearum, aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF.

7.3.5.

Ténganse en cuenta únicamente las células fluorescentes de tamaño y morfología típicos.

7.3.6.

Interpretación de los resultados de la prueba FISH i) Se obtendrán resultados válidos en la prueba FISH siempre que en todos los controles positivos y en ninguno de los controles negativos se observen células teñidas de verde fluroescente brillante, cuyo tamaño y morfología sean los típicos de las de R. solanacearum, cuando se utilice el filtro FITC, y células teñidas de rojo fluorescente brillante cuando se utilice el filtro de rodamina. Si se encuentran células fluorescentes brillantes con morfología característica, estimar el número medio de células típicas por campo microscópico y calcular el número de células típicas por ml de precipitado resuspendido (apéndice 4). Las muestras que presenten al menos 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido se consideran potencialmente contaminadas. Es preciso efectuar nuevas pruebas. Las muestras que presenten menos de 5 × 103 células típicas por ml de precipitado resuspendido se consideran negativas. ii) Los resultados de la prueba FISH serán negativos cuando no se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante con un tamaño y morfología típicos de R. solanacearum utilizando el filtro de rodamina, siempre que se observen células teñidas de rojo fluorescente brillante típicas en las preparaciones de control positivo cuando se utilice el filtro de rodamina.

8.   Pruebas de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)

Principio

Las pruebas ELISA solamente pueden utilizarse como prueba opcional además de las pruebas IF, PCR o FISH, debido a la sensibilidad relativamente baja de esta prueba. Cuando se utilice DAS ELISA, es obligatorio efectuar un enriquecimiento y utilizar anticuerpos monoclonales (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Puede resultar de utilidad efectuar un enriquecimiento de las muestras antes de utilizar la prueba ELISA a fin de incrementar la sensibilidad de la prueba, pero puede fracasar debido a la competencia de otros organismos en la muestra.

Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. solanacearum (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Se recomienda determinar el título para cada nuevo lote de anticuerpos. El título se define como la dilución más elevada en la que se produce una reacción óptima cuando se analiza una suspensión que contenga de 105 a 106 células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum, utilizando conjugados de anticuerpos secundarios apropiados, según las recomendaciones del fabricante. Durante el análisis, deben utilizarse los anticuerpos en diluciones de trabajo cercanas o equivalentes a la formulación comercial.

Determinar el título de los anticuerpos en una suspensión de 105 a 106 células por ml de la cepa homóloga de R. solanacearum.

Incluir una muestra de extracto que haya dado previamente resultados negativos para R. solanacearum y una suspensión de una bacteria que no tenga reacción cruzada en tampón fosfato salino (PBS) como controles negativos.

Como control positivo utilizar alícuotas de extracto de muestra que haya dado previamente resultados negativos, mezcladas con 103 a 104 células por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; véase el apéndice 3, puntos A y B). Para la comparación de los resultados de cada placa utilizar una suspensión normalizada de 105 a 106 células por ml en PBS de R. solanacearum. Debe asegurarse que los controles positivos estén bien separados en la placa de microtitulación de la muestra o las muestras analizadas.

En el apéndice 3, punto A, se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.

Procesar el material de control de la misma manera que la muestra o muestras.

Se han validado dos protocolos ELISA:

a)   ELISA indirecta (Robinson Smith et al., 1995):

b)   DASI (doble sandwich de anticuerpos indirecto) ELISA:

Interpretación de los resultados de la prueba ELISA

La prueba ELISA es negativa si la lectura media de la densidad óptica (DO) de pocillos de muestras duplicadas es < 2 veces la DO del pocillo de control del extracto de muestra negativa, siempre y cuando todas las DO de los controles positivos sean superiores a 1,0 (tras 90 minutos de incubación con el substrato) y sean más de dos veces superiores a la DO obtenida a partir de extractos de muestra negativa.

La prueba ELISA es positiva si las lecturas medias de la DO de los pocillos de muestra duplicados es > 2 veces la DO en el pocillo del extracto de muestra negativa, siempre y cuando las lecturas de DO en todos los pocillos de control negativo sean < 2 veces las de los pocillos de control positivo.

Las lecturas ELISA negativas en pocillos de control positivo indican que no se ha efectuado correctamente la prueba o que ha estado inhibida. Las lecturas ELISA positivas en pocillos de control negativo indican que se ha producido contaminación cruzada o unión de anticuerpos no específicos.

9.   Prueba de bioensayo

Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este método deberían permitir la detección reproducible de 103 a 104 unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml añadidas a los extractos de muestras que previamente arrojaron resultados negativos (para la preparación véase el apéndice 3).

Se puede alcanzar la máxima sensibilidad de detección cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cultivo sean las óptimas. No obstante, este método puede aplicarse también con éxito a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre 68 y 86 °C.

El protocolo siguiente se basa en Janse (1988):

9.1.

Utilizar diez plantas de prueba de un cultivar de tomate sensible (por ejemplo, Moneymaker o cultivar con sensibilidad equivalente determinado por el laboratorio de análisis) en la fase de la tercera hoja verdadera para cada muestra. Para más detalles de cultivo, véase el apéndice 8. Otra alternativa es utilizar berenjenas (por ejemplo, cultivar Black Beauty o cultivares con sensibilidad equivalente), únicamente plantas en fase de hoja 2-3 hasta la plena expansión de la tercera hoja verdadera. Se ha observado que los síntomas son menos graves y que se desarrollan más lentamente en la berenjena. Por tanto, cuando sea posible se recomienda utilizar plántulas de tomate.

9.2.

Distribuir 100 µl de extracto de muestra entre las plantas analizadas. 9.2.1.   Inoculación con jeringa Inocular los tallos de las patatas justo por encima de los cotiledones con una jeringa provista de una aguja hipodérmica (no menos de 23G). Distribuir la muestra entre las plantas analizadas. 9.2.2.   Inoculación en estrías Sosteniendo la planta entre dos dedos, aplíquese con una pipeta una gota (de unos 5-10 µl) del precipitado en suspensión en el tallo situado entre los cotiledones y la primera hoja. Con un bisturí estéril practicar una incisión diagonal de aproximadamente 1,0 cm de largo y una profundidad de aproximadamente 2/3 del grosor del tallo, comenzando el corte a partir de la gota del precipitado. Sellar el corte con vaselina estéril utilizando una jeringa.

9.3.

Inocular con la misma técnica cinco plantones con una suspensión acuosa de 105 a 106 células por ml preparada a partir de un cultivo de 48 horas de una cepa biovar 2 virulenta de R. solanacearum como control positivo y con tampón de precipitado (apéndice 4) como control negativo. Separar las plantas de control positivo y negativo de las otras para evitar la contaminación cruzada.

9.4.

Cultivar las plantas de prueba en instalaciones de cuarentena hasta un máximo de cuatro semanas entre 25 y 30 °C con elevada humedad relativa, regándolas adecuadamente para evitar que se aneguen o se marchiten por deficiencia hídrica. Para evitar la contaminación se deben incubar las plantas de control positivo y negativo en bancos claramente separados en un invernadero o cámara de cultivo; en el caso de que se disponga de un espacio reducido, garantizar la estricta separación entre tratamientos. En el caso de que deban incubarse juntas plantas para distintas muestras, deben separarse con las pantallas adecuadas. Durante la fertilización, el riego, la inspección y cualquier otra manipulación deben extremarse las precauciones para evitar la contaminación cruzada. Es esencial mantener los invernaderos y las cámaras libres de toda plaga de insectos, ya que estos pueden transmitir la bacteria de una muestra a otra. Comprobar si se aprecian síntomas de marchitamiento, epinastia, clorosis y/o crecimiento reducido.

9.5.	Aislarlas de las plantas infectadas (sección II.3) e identificar cultivos purificados de presunta R. solanacearum (sección VI. B).

9.6.	Si no se observan síntomas después de tres semanas, efectuar una prueba IF/PCR/Aislamiento en una muestra mixta de secciones de 1 cm del tallo de cada planta analizada, tomadas por encima del punto de inoculación. Si la prueba es positiva, efectuar una dilución en placas (sección 4.1).

9.7.	Identificar cualquier cultivo purificado de presunta R. solanacearum (sección VI. B).

Se obtienen resultados válidos de la prueba del bioensayo cuando las plantas del control positivo muestran síntomas típicos, pueden reaislarse las bacterias de estas plantas y no se encuentran síntomas en los controles negativos. La prueba del bioensayo es negativa si las plantas analizadas no están infectadas por R. solanacearum, siempre que se detecte R. solanacearum en los controles positivos. La prueba del bioensayo es positiva si las plantas analizadas están infectadas por R. solanacearum.

B.   PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

Identificar cultivos puros de aislados de presunta R. solanacearum utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios biológicos diferentes.

Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada (véase el apéndice 3).

1.   Pruebas de identificación nutricional y enzimática

Determinar las propiedades fenotípicas siguientes que estén universalmente presentes o ausentes en R. solanacearum, de acuerdo con los métodos de Lelliott y Stead (1987), Klement et al. (1990) y Schaad (2001).

2.   Prueba IF

2.1.	Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en tampón IF (apéndice 4).

2.2.	Preparar una serie de diluciones a 1/2 de un antisuero adecuado (véase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.	Aplicar el procedimiento IF (sección VI.A.5).

2.4.	La prueba IF será positiva si el título IF del cultivo es equivalente al del control positivo.

3.   Prueba ELISA

Nota: Si solamente se efectúan dos pruebas de identificación, no debe utilizarse ninguna otra prueba serológica además de este método.

3.1.	Preparar una suspensión de aproximadamente 108 células por ml en 1X PBS (apéndice 4).

3.2.	Llevar a cabo un procedimiento ELISA adecuado con un anticuerpo monoclonal específico de R. solanacearum.

3.3.	La prueba ELISA será positiva si la lectura ELISA obtenida del cultivo es como mínimo la mitad de la obtenida para el control positivo.

4.   Prueba PCR

4.1.	Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en agua estéril de grado molecular.

4.2.	Calentar 100 µl de la suspensión celular en tubos cerrados en un calentador o al baño maría a 100 °C durante cuatro minutos. Las muestras pueden almacenarse entonces a una temperatura de 16 a 24 °C hasta que sea necesario.

4.3.	Aplicar los procedimientos PCR adecuados para amplificar los amplicones específicos de R. solanacearum [por ejemplo, Seal et al. (1993); Pastrik y Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997); Weller et al. (1999)].

4.4.	Se logrará la identificación positiva de R. solanacearum si los amplicones de la PCR son del mismo tamaño y tienen los mismos polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción que los de la cepa de control positivo.

5.   Prueba FISH

5.1.	Preparar una suspensión de aproximadamente 106 células por ml en agua ultrapura.

5.2.	Aplicar el procedimiento FISH (sección VI.A.7) con al menos dos oligosondas específicas para R. solanacearum (apéndice 7).

5.3.	La prueba FISH será positiva si se obtienen las mismas reacciones del cultivo y el control positivo.

6.   Perfiles de ácidos grasos (Fatty acid profiling o FAP)

6.1.	Mantener el cultivo en agar de tripticasa de soja (Oxoide) durante 48 horas a 28 °C.

6.2.	Aplicar un procedimiento FAP adecuado (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.	La prueba FAP será positiva si el perfil del presunto cultivo es idéntico al del control positivo. Los ácidos grasos cuya presencia es característica son 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH y 18:1 2OH, y la ausencia de 16:0 3OH es altamente indicativa de Ralstonia sp.

7.   Métodos de caracterización de las cepas

Se recomienda efectuar la caracterización de las cepas con uno de los métodos siguientes para cada nuevo caso de aislamiento de R. solanacearum.

Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada (véase el apéndice 3).

7.1.   Determinación de los biovares

R. solanacearum se separa en biovares en función de la capacidad para utilizar y/o oxidar tres disacáridos y tres hexosas alcohólicas (Hayward, 1964 y Hayward et al., 1990). Los medios nutritivos para la prueba del biovar se describen en el apéndice 2. Esta prueba puede efectuarse con éxito inoculando los medios por perforación con cultivos puros de aislados de R. solanacearum e incubando a 28 °C. Si los medios se distribuyen en placas estériles de cultivo de células de 96 pocillos (200 µl por pocillo) puede observarse en un plazo de 72 horas un cambio de color, del verde oliva al amarillo, lo que indica un resultado positivo de la prueba.

El biovar 2 se diferencia en subfenotipos mediante pruebas adicionales

7.2.   Obtención de la huella dactilar genómica

La diferenciación molecular de las cepas en el complejo de R. solanacearum puede conseguirse mediante diferentes técnicas, entre las que se incluyen:

7.2.1.

Análisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2.

PCR de secuencia repetitiva utilizando cebadores REP, BOX y ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3.

Análisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento amplificado (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3.   Métodos PCR

Pueden utilizarse cebadores específicos de PCR (Pastrik et al, 2002; véase el apéndice 6) para diferenciar cepas que pertenezcan a la división 1 (biovares 3, 4 y 5) y la división 2 (biovares 1, 2A y 2T) de R. solanacearum, tal como se define originalmente con el análisis RFLP (Cook et al., 1989) y la secuenciación de 16S rADN (Taghavi et al., 1996).

C.   PRUEBA DE CONFIRMACIÓN

Como confirmación final del diagnóstico de R. solanacearum y para la evaluación de la virulencia de cultivos identificados como R. solanacearum debe realizarse la prueba de patogenicidad:

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Apéndice 1

Laboratorios que han participado en la optimización y la validación de los protocolos

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Apéndice 2

Medios para el aislamiento y el cultivo de R. solanacearum

a)   Medios de cultivo en general

Agar nutritivo (NA)

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Agar de levadura, glucosa, peptona (YPGA)

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Agar de sacarosa y peptona (SPA)

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Medio de tetrazolio de Kelman

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Enfriar a 50 °C y añadir una solución de cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (Sigma), esterilizada por filtración, para conseguir una concentración final de 50 mg/l.

b)   Medios de cultivo selectivo validados

Medio SMSA (Englebrecht, 1994, modificado por Elphinstone et al., 1996)

Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Enfriar a 50 °C y añadir soluciones estándar acuosas, esterilizadas por filtración, de los siguientes ingredientes, a fin de obtener las concentraciones finales especificadas:

Nota:

Almacenar los medios y las soluciones estándar de antibióticos a 4 °C en la oscuridad y utilizar en el plazo de un mes.

Las placas deberán carecer de condensación de superficie antes de su utilización.

Evitar un secado excesivo de las placas.

Deberá efectuarse un control de calidad tras la preparación de cada nuevo lote de medio mediante siembra de una suspensión de un cultivo de referencia de R. solanacearum (véase el apéndice 3) y observación de la formación de colonias típicas después de incubación a 28 °C de dos a cinco días.

c)   Medios de enriquecimiento validados

Caldo SMSA (Elphinstone et al., 1996)

Preparar como para medio de agar selectivo SMSA pero omitir Bacto-agar y cloruro de 2,3,5-tetrazolio.

Caldo Wilbrink modificado (Caruso et al., 2002)

Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos y enfriar a 50 °C.

Añadir soluciones estándar de antibióticos como para el caldo SMSA.

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Apéndice 3

A.   Material de control normalizado comercialmente disponible

a)   Aislados bacterianos

Se recomiendan los siguientes aislados bacterianos para su utilización como material normalizado de referencia, bien como controles positivos (cuadro 1) o durante la optimización de las pruebas para evitar reacciones cruzadas (cuadro 2). Todas las cepas están comercializadas por:

Nota: La autenticidad de las cepas mencionadas solamente puede garantizarse si se ha recogido de un auténtico cultivo.

b)   Material de control normalizado comercialmente disponible

El siguiente material de control normalizado puede obtenerse a partir de un cultivo NCPPB:

Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tubérculos de patata sanos como control negativo para todas las pruebas.

Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tubérculos de patata sanos que contengan de 103 a 104 y 104 a 106 células de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como controles positivos para pruebas serológicas y PCR. Teniendo en cuenta que la viabilidad de las células se ve afectada durante la criodesecación, no son adecuados como controles normalizados para pruebas de aislamiento o de bioensayo.

Utilizar suspensiones fijadas con formalina de R. solanacearum biovar 2 (cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de 106 células por ml como controles positivos para pruebas serológicas.

B.   Preparación de controles positivos y negativos

Preparar un cultivo de 48 horas de una cepa virulenta de R. solanacearum raza 3/biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) en medio base SMSA y suspender en tampón fosfato 10 mM para obtener una densidad celular de aproximadamente 2 × 108 cfu por ml. Esto se obtiene normalmente mediante una suspensión ligeramente turbia equivalente a una densidad óptica de 0,15 a 600 nm.

Separar las cuñas basales de 200 tubérculos de una variedad de piel blanca conocida por estar exenta de R. solanacearum.

Procesar las cuñas basales como es habitual y resuspender el precipitado en 10 ml.

Preparar diez microviales estériles de 1,5 ml con 900 µl del precipitado resuspendido.

Transferir 100 µl de la suspensión de R. solanacearum al primer microvial. Homogeneizar por agitación.

Establecer niveles decimales de contaminación realizando nuevas diluciones en los cinco microviales siguientes.

Los seis microviales contaminados se utilizarán como controles positivos. Los cuatro microviales no contaminados se utilizarán como controles negativos. Etiquetar los microviales como corresponda.

Preparar alícuotas de 100 µl en microviales estériles de 1,5 ml para obtener de este modo nueve réplicas de cada muestra de control. Almacenar a una temperatura de 16 a 24 °C hasta que se vayan a utilizar.

La presencia y la cuantificación de R. solanacearum en las muestras de control deberá confirmarse en primer lugar mediante una prueba IF.

Para la prueba PCR, extraer ADN de las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensayo.

Para las pruebas IF y FISH, realizar ensayos con las muestras de control positivas y negativas para cada serie de muestras de ensayo.

En las pruebas IF, FISH y PCR, debe detectarse R. solanacearum en al menos 106 y 104 células/ml de los controles positivos y en ninguno de los controles negativos.

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Apéndice 4

Tampones para procedimientos de ensayo

GENERAL: Los tampones esterilizados que no se hayan abierto pueden almacenarse hasta un año.

1.   Tampones para el procedimiento de extracción

1.1.   Tampón de extracción (tampón fosfato 50 mM, pH 7,0)

Este tampón se utiliza para la extracción de la bacteria del tejido de las plantas mediante la homogeneización o la agitación.

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Los siguientes componentes adicionales pueden resultar útiles:

1.2.   Tampón de precipitado (tampón fosfato 10 mM, pH 7,2)

Este tampón se utiliza para la resuspensión y la dilución de extractos de cuñas basales de tubérculos de patata tras la concentración en un precipitado mediante centrifugación.

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

2.   Tampones para la prueba IF

2.1.   Tampón IF [tampón fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2]

Este tampón se utiliza para la dilución de anticuerpos.

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

2.2.   Tampón IF-Tween

Este tampón se utiliza para lavar los portaobjetos.

Añadir 0,1 % de Tween 20 al tampón IF.

2.3.   Solución de glicerol con tampón de fosfato, pH 7,6

Este tampón se utiliza como fluido de montaje en los pocillos de los portaobjetos de IF para aumentar la fluorescencia.

En el mercado pueden encontrarse soluciones de montaje que protegen la fluorescencia, como, por ejemplo, Vectashield® (Vector Laboratories) o Citifluor® (Leica).

3.   Tampones para la prueba ELISA indirecta

3.1.   Tampón fuerza doble para tapizado, pH 9,6

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

Puede añadirse como antioxidante sulfito de sodio (0,2 %) si es necesario para evitar la acumulación de compuestos aromáticos oxidados.

3.2.   10X Tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4

3.3.   PBS-Tween

3.4.   Tampón de bloqueo (anticuerpos) (debe prepararse en el momento de su utilización)

3.5.   Solución de sustrato fosfatasa alcalina, pH 9,8

Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.

Completar hasta 1 litro con agua destilada.

Añadir 0,2 g de MgCl2.

Disolver dos pastillas de 5 mg de sustrato fosfatasa (Sigma) por cada 15 ml de solución.

4.   Tampones para la prueba DASI ELISA

4.1.   Tampón de tapizado, pH 9,6

Disolver los ingredientes y comprobar el pH.

4.2.   10X Tampón fosfato salino (PBS), pH 7,2-7,4

4.3.   PBS-Tween

4.4.   Tampón de sustrato, pH 9,8

Mezclar y ajustar el pH a 9,8 con HCl concentrado.

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Apéndice 5

Determinación del nivel de contaminación en las pruebas IF y FISH

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Apéndice 6

Protocolos y reactivos PCR validados

Nota: Las pruebas preliminares deberán permitir la detección reproducible de al menos 103 a 104 células de R. solanacearum por ml de extracto de muestra.

Por otra parte, las pruebas preliminares no deben arrojar resultados positivos falsos con respecto a un conjunto de cepas bacterianas seleccionadas (véase el apéndice 3).

1.   Protocolo PCR de Seal et al. (1993)

1.1.   Cebadores del oligonucleótido

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 288 bp.

1.2.   Mezcla para la reacción PCR

1.3.   Condiciones de reacción PCR

Aplicar el siguiente programa:

Nota: Este programa se optimizó para utilizarlo con un termociclador Perkin Elmer 9600. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.

1.4.   Análisis de la enzima de restricción del amplicón

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Ava II tras la incubación a 37 °C.

2.   Protocolo PCR de Pastrik y Maiss (2000)

2.1.   Cebadores del oligonucleótido

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 553 bp.

2.2.   Mezcla para la reacción PCR

2.3.   Condiciones de reacción PCR

Aplicar el siguiente programa:

Nota: Este programa está optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.

2.4.   Análisis de la enzima de restricción del amplicón

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Taq I tras la incubación a 65 °C durante 30 minutos. Los fragmentos de restricción obtenidos a partir del fragmento específico de R. solanacearum tienen un tamaño de 457 bp y 96 bp.

3.   Protocolo PCR multiplex con control PCR interno (Pastrik et al., 2002)

3.1.   Cebadores del oligonucleótido

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum = 718 bp (conjunto de cebadores RS).

Tamaño esperado del amplicón de control PCR interno 18S rARN = 310 bp (conjunto de cebadores NS).

3.2.   Mezcla para la reacción PCR

3.3.   Condiciones de reacción PCR

Aplicar el siguiente programa:

Nota: Este programa está optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.

3.4.   Análisis de la enzima de restricción del amplicón

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Bsm I o un Isoschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubación a 65 °C durante 30 minutos.

4.   Protocolo PCR específico del biovar de R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)

4.1.   Cebadores del oligonucleótido

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de R. solanacearum:

con Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

con Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2.   Mezcla para la reacción PCR

4.3.   Condiciones de reacción PCR

Aplicar el siguiente programa a las reacciones específicas de biovar 1/2 y biovar 3/4/5:

Nota: Este programa se optimizó para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duración de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilización con otros modelos.

4.4.   Análisis de la enzima de restricción del amplicón

Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando cebadores Rs-1-F y Rs-1-R producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Bsm I o un Isoschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubación a 65 °C durante 30 minutos. Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando los cebadores Rs-1-F y Rs-3-R no poseen sitios de restricción.

5.   Preparación del tampón de carga

5.1.   Azul de bromofenol (solución estándar al 10 %)

5.2.   Tampón de carga

6.   10X tampón de tris acetato EDTA (TAE), pH 8,0

Diluir a 1X antes de utilizarlo.

Se encuentra también disponible en el mercado (por ejemplo, Invitrogen o equivalente).

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Apéndice 7

Reactivos validados para la prueba FISH

1.   Oligosondas

Sonda específica para R. solanacearum OLI-1-CY3: 5′- GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3′

Sonda eubacteriana no específica EUB-338-FITC: 5′- GCT GCC TCC CGT AGG AGT -3′

2.   Solución fijadora

¡ADVERTENCIA! LA SOLUCIÓN FIJADORA CONTIENE PARAFORMALDEHÍDO QUE ES TÓXICO. UTILIZAR GUANTES Y NO INHALAR. SE RECOMIENDA TRABAJAR EN UNA CAMPANA EXTRACTORA DE GASES.

3.   3X Hybmix

Diluir a 1X como se precisa.

4.   Solución de hibridación

Preparar las cantidades de solución de hibridación de acuerdo con los cálculos del cuadro. Para cada portaobjetos (que contenga dos muestras distintas por duplicado) se precisan 90 μl de solución de hibridación. IMPORTANTE: DEBE TENERSE EN CUENTA QUE LA FORMAMIDA ES MUY TÓXICA, POR LO QUE DEBEN UTILIZARSE GUANTES Y TOMARSE LAS PRECAUCIONES DE SEGURIDAD NECESARIAS.

5.   Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0

Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.

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Apéndice 8

Condiciones de cultivo para el tomate y la berenjena

Sembrar semillas de tomate (Lycopersicon esculentum) o berenjena (Solanum melongena) en compost pasteurizado de semillas. Trasplantar las plántulas con los cotiledones completamente abiertos (10 a 14 días) en compost pasteurizado de tiesto.

Las berenjenas o los tomates deben cultivarse en un invernadero que cumpla las siguientes condiciones medioambientales antes de la inoculación:

REFERENCIAS

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ANEXO III

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ANEXO IV

Los elementos de la investigación que dispone el artículo 5, apartado 1, letra a), inciso i), serán, cuando proceda, los siguientes:

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ANEXO V

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ANEXO VI

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ANEXO VII

Los métodos de eliminación de residuos autorizados oficialmente mencionados en el anexo VI, punto 1, deberán cumplir las disposiciones que se indican a continuación con el fin de evitar todo riesgo identificable de propagación del organismo:

Las opciones descritas en el presente anexo se aplican asimismo a los residuos asociados a la manipulación, la eliminación y el tratamiento de lotes contaminados.

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( 1 ) DO C 124 de 21.4.1997, p. 12, y DO C 108 de 7.4.1998, p. 85.

( 2 ) DO C 14 de 19.1.1998, p. 34.

( 3 ) DO C 206 de 7.7.1997, p. 57.

( 4 ) DO L 26 de 31.1.1977, p. 20; Directiva cuya última modificación la constituye la Directiva 98/2/CE de la Comisión (DO L 15 de 21.1.1998, p. 34).

( 5 ) DO L 184 de 3.8.1995, p. 34. Directiva cuya última modificación la constituye la Directiva de la Comisión (DO L 204 de 31.7.1997, p. 43).