1991R2568 — CS — 01.11.2003 — 020.001

---

Tento dokument je třeba brát jako dokumentační nástroj a instituce nenesou jakoukoli odpovědnost za jeho obsah

►B	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91 ze dne 11. července 1991 o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy (Úř. věst. L 248, 5.9.1991, p.1)

Ve znění:

		Úřední věstník
		No	page	date
►M1	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 3682/91 ze dne 17. prosince 1991,	L 349	36	18.12.1991
►M2	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 1429/92 ze dne 26. května 1992,	L 150	17	2.6.1992
M3	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1683/92 of 29 June 1992 (*)	L 176	27	30.6.1992
M4	COMMISSION REGULATION (EEC) No 1996/92 of 15 July 1992 (*)	L 199	18	18.7.1992
►M5	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 3288/92 ze dne 12. listopadu 1992,	L 327	28	13.11.1992
►M6	NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 183/93 ze dne 29. ledna 1993,	L 22	58	30.1.1993
M8	COMMISSION REGULATION (EEC) No 620/93 of 17 March 1993 (*)	L 66	29	18.3.1993
►M9	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 177/94 ze dne 28. ledna 1994,	L 24	33	29.1.1994
M10	COMMISSION REGULATION (EC) No 2632/94 of 28 October 1994 (*)	L 280	43	29.10.1994
►M11	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 656/95 ze dne 28. března 1995,	L 69	1	29.3.1995
M12	COMMISSION REGULATION (EC) No 2527/95 of 27 October 1995 (*)	L 258	49	28.10.1995
►M13	COMMISSION REGULATION (EC) No 2472/97 of 11 December 1997 (*)	L 341	25	12.12.1997
►M14	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 282/98 ze dne 3. února 1998,	L 28	5	4.2.1998
M15	COMMISSION REGULATION (EC) No 2248/98 of 19 October 1998 (*)	L 282	55	20.10.1998
M16	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 379/1999 ze dne 19. února 1999,	L 46	15	20.2.1999
►M17	COMMISSION REGULATION (EC) No 455/2001 of 6 March 2001 (*)	L 65	9	7.3.2001
M18	COMMISSION REGULATION (EC) No 2042/2001 of 18 October 2001 (*)	L 276	8	19.10.2001
►M19	COMMISSION REGULATION (EC) No 796/2002 of 6 May 2002 (*)	L 128	8	15.5.2002
►M20	NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 1989/2003 ze dne 6. listopadu 2003,	L 295	57	13.11.2003

(*)	Tento akt nebyl nikdy publikován v češtině.

---

▼B

NAŘÍZENÍ KOMISE (EHS) č. 2568/91

ze dne 11. července 1991

o charakteristikách olivového oleje a olivového oleje z pokrutin a o příslušných metodách analýzy

▼M20

Článek 1

1.  Oleje s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodech 1 a 2 přílohy I tohoto nařízení, jsou považovány za panenské olivové oleje ve smyslu bodu 1 písm. a) a b) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

2.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 3 přílohy I tohoto nařízení, je považován za lampantový olivový olej ve smyslu bodu 1 písm. c) přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

3.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 4 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej ve smyslu bodu 2 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

4.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 5 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej obsahující směs rafinovaného olivového oleje a panenského olivového oleje ve smyslu bodu 3 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

5.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 6 přílohy I tohoto nařízení, je považován za surový olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 4 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

6.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 7 přílohy I tohoto nařízení, je považován za rafinovaný olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 5 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

7.  Olej s charakteristikami, které odpovídají charakteristikám stanoveným v bodu 8 přílohy I tohoto nařízení, je považován za olivový olej z pokrutin ve smyslu bodu 6 přílohy nařízení č. 136/66/EHS.

▼B

Článek 2

1.  Charakteristiky olivových olejů uvedených v příloze I se stanoví v souladu s těmito metodami analýzy:

▼M19

▼B

▼M20 —————

▼B

▼M20 —————

▼M11

▼M13

▼M19

▼M19

2.  Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3.  When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

▼M17

4.   ►M20  Pro účely ověření podle odstavce 3 se analýzy uvedené v přílohách II, III, IX, X a XII, jakož i případné kontrolní analýzy stanovené vnitrostátními právními předpisy, provádějí před datem minimální trvanlivosti. Pokud se odběr vzorků provede více než čtyři měsíce před datem minimální trvanlivosti, analýzy se provedou nejpozději ve čtvrtém měsíci po odebrání vzorku. Pro ostatní analýzy tohoto nařízení neplatí žádné lhůty. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5.  For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Článek 2a

Vnitrostátní orgány nebo jejich zástupci mohou ověřit, zda je vzorek v souladu s deklarovanou kategorií:

▼M19 —————

▼M5

►M19  Článek 3 ◄

Pokud se zjistí rozdíly mezi zjištěnými organoleptickými vlastnostmi a těmi, které vyplývají z označení výrobku, uloží daný členský stát, aniž jsou dotčeny jakékoli další sankce, administrativní finanční sankce, jejich výše se stanoví podle závažnosti zjištěné nesrovnalosti.

Při posuzování nesrovnalostí se berou v úvahu přirozené změny vlastností olejů uchovávaných v běžných podmínkách.

Na začátku každého pololetí členské státy informují Komisi o počtu a druhu zjištěných nesrovnalostí a sankcí uložených v průběhu předešlého pololetí.

▼M5

Článek 4

▼M19

1.  The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2.  Pokud členský stát narazí na potíže při sestavování zkušebních komisí na svém území, může povolat zkušební komisi schválenou v jiném členském státě.

3.  Každý členský stát vypracuje seznam zkušebních komisí sestavených profesionálními nebo mezioborovými organizacemi za podmínek stanovených v odstavci 1 a zajistí dodržování těchto podmínek.

▼M19 —————

▼B

Článek 6

1.  Obsah oleje u pokrutin z oliv a jiných zbytků po extrakci olivového oleje (podpoložky 2306 90 11 a 2306 90 19) se stanoví metodou uvedenou v příloze XV.

2.  Obsah oleje, na který odkazuje odstavec 1, se vyjadřuje v procentech hmotnosti oleje v sušině.

▼M20

Článek 7

Pokud jde o přítomnost kontaminujících látek, použijí se příslušné předpisy Společenství.

Pokud jde o halogenovaná rozpouštědla, zavádějí se pro všechny kategorie olivového oleje tyto limity:

▼B

Článek 8

1.  Členské státy sdělí Komisi opatření přijatá k provádění tohoto nařízení.

2.  Členské státy předají Komisi na začátku každého pololetí souhrn analytických údajů, které se vztahují ke zkouškám provedeným během předchozího pololetí.

Výsledky budou přezkoumány Řídícím výborem pro oleje a tuky postupem podle článku 39 nařízení č. 136/66/EHS.

Článek 9

Nařízení (EHS) č. 1058/77 se zrušuje.

Článek 10

1.  Toto nařízení vstupuje v platnost třetím dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství.

Metoda uvedená v příloze XII se však použije ode dne ►M1  1. listopadu 1992 ◄ , s výjimkou případů, kdy se jedná o intervenční opatření.

▼M5

Tato metoda se nepoužije u panenského olivového oleje stočeného před 1. listopadem 1992.

▼B

2.  Toto nařízení se nepoužije na olivový olej a olivový olej z pokrutin stočený do obalů před vstupem tohoto nařízení v platnost a uvedený na trh do 31. října 1992.

Toto nařízení je závazné v celém rozsahu a přímo použitelné ve všech členských státech.

---

PŘÍLOHA

Obsah

▼M20

---

PŘÍLOHA I

CHARAKTERISTIKY OLIVOVÉHO OLEJE

---

PŘÍLOHA I A

ODBĚR VZORKŮ ZE ŠARŽÍ OLIVOVÉHO OLEJE NEBO OLIVOVÉHO OLEJE Z POKRUTIN VE SPOTŘEBITELSKÝCH OBALECH O OBJEMU NEJVÝŠE 100 LITRŮ

Tato metoda odběru vzorků se týká dodávek olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin nepřesahujících 125 000 litrů, stočených do spotřebitelských obalů o objemu nejvýše 100 litrů.

Pokud daná dodávka obsahuje více než 125 000 litrů, rozdělí se na přibližně stejně velké šarže o objemu nejvýše 125 000 litrů. Pokud dodávka obsahuje méně než 125 000 litrů, pak představuje jednu šarži. Metoda se pak použije u každé šarže.

Minimální počet odebraných dílčích vzorků závisí na velikosti šarže podle tabulky uvedené v bodu 1.

Velikost dílčího vzorku se určuje na základě objemu spotřebitelského obalu podle tabulky uvedené v bodu 2.1.

Dodávkou, dílčím vzorkem a laboratorním vzorkem se rozumějí definice uvedené v normě EN ISO 5555.

„Šarže“ se skládá z více prodejních jednotek, které jsou produkovány, vyrobeny a baleny za takových okolností, že olej obsažený v každé prodejní jednotce se považuje za homogenní vzhledem ke všem svým analytickým charakteristikám.

1.   POČET DÍLČÍCH VZORKŮ, KTERÉ JE NUTNO ODEBRAT

Minimální počet odebraných dílčích vzorků závisí na velikosti šarže a odpovídá dále uvedené tabulce:

Spotřebitelské obaly daného dílčího vzorku musí pocházet s navzájem sousedících míst šarže.

V případě pochybností členské státy zvýší počet odebraných dílčích vzorků.

2.   OBSAH DÍLČÍCH VZORKŮ

2.1

Každý dílčí vzorek se skládá: V případě spotřebitelských obalů o objemu: Dílčí vzorek musí obsahovat olej: a)  nejméně 5 litrů a)  ze 3 spotřebitelských obalů b)  nejméně 3 litrů, ale méně než 5 litrů b)  ze 3 spotřebitelských obalů c)  nejméně 2 litrů, ale méně než 3 litry c)  ze 3 spotřebitelských obalů d)  nejméně 1 litru, ale méně než 2 litrů d)  z 6 spotřebitelských obalů e)  nejméně 0,75 litru, ale méně než 1 litr e)  z 6 spotřebitelských obalů f)  méně než 0,75 litru f)  z trojnásobného množství oleje z minimálního počtu obalů, jejichž celkový objem je větší než 1,5 litru

2.2	Dílčí vzorky musí být uchovány ve spotřebitelských obalech až do doby provedení analýzy. Olej z dílčích vzorků se pak rozdělí do tří laboratorních vzorků pro provedení: a) analýz uvedených v přílohách II, III, IX a X; b) analýz uvedených v příloze XII; c) ostatních analýz.

2.3	Obaly tvořící dílčí vzorek musí být rozděleny v souladu s kontrolními postupy, stanovenými vnitrostátními právními předpisy.

3.   ANALÝZY A VÝSLEDKY

▼M20

---

PŘÍLOHA I B

ROZHODOVACÍ SCHÉMA PRO OVĚŘENÍ SOULADU VZORKU OLIVOVÉHO OLEJE S DEKLAROVANOU KATEGORIÍ

Soulad olivového oleje nebo olivového oleje z pokrutin je možné přezkoušet takto:

Nezávisle na tom se provádějí analýzy nutné pro ověření souladu s normami Společenství, pokud jde o případné kontaminující látky.

Rozhodovací schéma platí pro všechny kategorie olivového oleje a olivového oleje z pokrutin. Skládá se z tabulek, očíslovaných 1 až 11, které se použijí na základě deklarované kategorie daného oleje v pořadí, stanoveném ve všeobecné tabulce.

Klíč k všeobecné tabulce a k tabulkám 1 až 11:

---

DODATEK 1

Srovnávací tabulka mezi prílohami tohoto narízení a analýzami uvedenými v rozhodovacím schématu

---

DODATEK 2

Tabulka 1

Tabulka 2

Tabulka 3

Tabulka 4

Tabulka 7

Tabulka 8

Tabulka 11

▼B

---

PŘÍLOHA II

STANOVENÍ VOLNÝCH MASTNÝCH KYSELIN

1.   STANOVENÍ KYSELOSTI

Stanovení volných mastných kyselin v olivových olejích. Obsah volných mastných kyselin je vyjádřen jako kyselost vypočtená obvyklým způsobem.

1.1.   Podstata metody

Vzorek se rozpustí ve směsi rozpouštědel. Přítomné volné mastné kyseliny se potom titrují ethanolickým roztokem hydroxidu draselného.

1.2.   Chemikálie

Všechna činidla musí mít čistotu p. a., voda destilovaná nebo odpovídající čistoty.

1.2.1

Směs diethyletheru a 95 % ethanolu 1:1 (V/V). Poznámka: diethylether je vysoce hořlavý a může vytvářet výbušné peroxidy. Při jeho používání je třeba dbát zvýšené opatrnosti. Neutralizuje se těsně před použitím pomocí roztoku hydroxidu draselného (1.2.2) a přidá se 0,3 ml fenolftaleinového roztoku (1.2.3) na 100 ml směsi. Poznámka: není-li možné použít diethylether, může se použít směsné rozpouštědlo obsahující ethanol a toluen. V případě potřeby může být ethanol nahrazen 2-propanolem.

1.2.2

Hydroxid draselný, titrační ethanolický roztok o koncentraci c(KOH) přibližně 0,1 mol/l, nebo v případě potřeby přibližně 0,5 mol/l. Přesná koncentrace ethanolického roztoku hydroxidu draselného musí být známa a zkontrolována těsně před použitím. Použije se roztok připravený nejméně pět dnů před použitím a dekantovaný v láhvi z hnědého skla s gumovou zátkou. Roztok musí být bezbarvý nebo pouze slabě zbarvený. Poznámka: stabilní bezbarvý roztok hydroxidu draselného je možné připravit takto: do varu se uvede 1 000 ml ethanolu s 8 g hydroxidu draselného a 0,5 g hliníkových hoblin a nechá se jednu hodinu vařit pod zpětným chladičem. Okamžitě se destiluje. V destilátu se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného. Několik dnů se nechá stát a oddělí se čistá kapalina od usazeniny uhličitanu draselného. Tento roztok je též možné připravit bez destilace takto: do 1 000 ml ethanolu se přidá 4 ml aluminium-butylátu a směs se nechá několik dní stát. Odsazená kapalina se slije a v ní se rozpustí požadované množství hydroxidu draselného. Roztok je připraven k použití.

1.2.3

Fenolftalein, roztok o koncentraci 10 g/l, v 95 % - 96 % ethanolu (V/V), nebo alkalická modř (v případě silně zbarvených tuků), roztok o koncentraci 20 g/l, v 95 % - 96 % ethanolu (V/V).

1.3   Přístroje a pomůcky

Obvyklé laboratorní přístroje a pomůcky, mj.:

1.3.1

analytické váhy,

1.3.2

Erlenmeyerova baňka na 250 ml,

1.3.3

byreta na 10 ml s hodnotou dílku 0,05 ml.

1.4   Postup

1.4.1

Příprava vzorku na testování (Testování se provádí s filtrovaným vzorkem. Pokud celkový obsah vody a nečistot činí méně než 1 %, provede se testování s nefiltrovaným vzorkem.)

1.4.2

Odběr vzorku Hmotnost vzorku se řídí podle očekávaného obsahu volných mastných kyselin (podle údajů v dále uvedené tabulce). Očekávaný obsah volných mastných kyselin Hmotnost vzorku (g) Přesnost vážení na (g) < 1 20 0,05 1 až 4 10 0,02 4 až 15 2,5 0,01 15 až 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Vzorek se naváží v Erlenmeyerově baňce (1.3.2).

1.4.3

Stanovení Vzorek (1.4.2) se rozpustí v 50 až 150 ml předem neutralizované směsi diethyletheru a ethanolu (1.2.1). Titruje se za současného míchání roztokem hydroxidu draselného o koncentraci přibližně 0,1 mol/l (1.2.2) (viz poznámka 2), dokud nedojde k barevné změně indikátoru (růžová zbarvení fenolftaleinu musí trvat nejméně 10 sekund). Poznámky: 1. Pokud přidané množství vody nevyvolá rozložení fází, lze titrační ethanolický roztok hydroxidu draselného (1.2.2) nahradit vodným roztokem hydroxidu draselného nebo sodného. Poznámky: 2. Pokud je k titraci potřeba více než 10 ml roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,1 mol/l, je nutno použít roztok o koncentraci 0,5 mol/l. Poznámky: 3. Pokud se během titrace roztok zakalí, je nutno přidat dostačující množství rozpouštědel (1.2.1), aby roztok byl opět čirý.

1.5   Výpočet obsahu volných mastných kyselin vyjádřených jako procento kyseliny olejové

Obsah volných mastných kyselin v % hmotnostních se vypočítá podle vzorce:

kde

V

=

spotřeba titračního roztoku hydroxidu draselného v ml;

c

=

přesná koncentrace roztoku hydroxidu draselného v mol/l;

M

=

molární hmotnost v g na mol kyseliny použité pro výpočet (= 282);

m

=

hmotnost vzorku v g.

Za výsledek se považuje aritmetický průměr ►M6  ze dvou stanovení ◄ .

---

PŘÍLOHA III

STANOVENÍ PEROXIDOVÉHO ČÍSLA

1.   PŘEDMĚT

tato metoda popisuje postup stanovení peroxidového čísla v olejích a tucích.

2.   OBLAST POUŽITÍ

tato metoda platí pro živočišné a rostlinné oleje a tuky.

3.   DEFINICE

Peroxidové číslo je množství těchto látek ve vzorku, vyjádřené v milimolech aktivního kyslíku na kg, které oxidují jodid draselný za popsaných pracovních podmínek.

4.   PODSTATA

Reakce vzorku s jodidem draselným v roztoku kyseliny octové a chloroformu. Titrace uvolněného jodu standardizovaným roztokem thiosíranu sodného.

5.   PŘÍSTROJE

Všechna zařízení musí být zbavena redukčních a oxidačních látek.

Poznámka:zábrusy nesmí být mazány tukem.

5.1	Skleněná váženka na 3 ml.

5.2	Baňky na 250 ml se zábrusy, předem vysušené a naplněné čistým, suchým inertním plynem (dusík, nebo lépe oxid uhličitý).

5.3	Byreta na 25 nebo 50 ml, s hodnotou dílku 0,1 ml.

6.   CHEMIKÁLIE

6.1	Chloroform čistoty p. a., zbavený kyslíku probubláváním proudem suchého inertního plynu.

6.2	Ledová kyselina octová čistoty p. a., zbavená kyslíku probubláváním proudem suchého inertního plynu.

6.3	Jodid draselný, nasycený vodný roztok, čerstvě připravený, zbavený jodu a jodičnanů.

6.4	Thiosíran sodný, vodný roztok o koncentraci přesně 0,01 nebo 0,002 mol/l, připravený těsně před použitím.

6.5	Škrobový roztok, vodní disperze 10 g/l, čerstvě připravený z přírodního rozpustného škrobu.

7.   VZOREK

Vzorek je nutno odebrat a skladovat v temnu a chladu ve zcela naplněném skleněném obalu, hermeticky uzavřeném zabroušenou skleněnou, nebo korkovou zátkou.

8.   POSTUP

Stanovení musí být prováděno v rozptýleném denním světle, nebo při umělém osvětlení. Vzorek se naváží ve skleněné vážence (5.1) nebo v baňce (5.2) s přesností na 0,001 g s ohledem na očekávaná peroxidové čísla podle dále uvedené tabulky:

Z baňky (5.2) se vyjme zátka a vloží se do ní váženka obsahující vzorek. Přidá se 10 ml chloroformu (6.1). Vzorek se rychle rozpustí zamícháním. Přidá se 15 ml kyseliny octové (6.2) a potom 1 ml roztoku jodidu draselného (6.3). Baňka se ihned uzavře, 1 minutu protřepává a nechá se stát přesně 5 minut v temnu při teplotě 15 °C a 25 °C.

Přidá se přibližně 75 ml destilované vody. Uvolněný jod se po přídavku škrobového roztoku (6.5) jako indikátoru za silného protřepávání titruje roztokem thiosíranu sodného (6.4) při použití koncentrace 0,002 mol/l roztoku pro předpokládané peroxidové číslo do 12, nebo roztokem o koncentraci 0,01 mol/l pro předpokládané peroxidové číslo větší než 12.

Z jednoho analytického vzorku se provedou dvě stanovení.

Spolu s vlastním stanovením se provádí slepý pokus. Jestliže výsledky slepého pokusu přesáhnou 0,05 ml roztoku thiosíranu sodného o koncentraci 0,01 mol/l (6.4), je nutno vyměnit znečištěná činidla.

9.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Peroxidové číslo (PV) vyjádřené v miliekvivalentech aktivního kyslíku na kg se vypočítá podle vzorce:

V

=

objem roztoku thiosíranu sodného (6.4), použitého pro stanovení, korigovaný s ohledem na slepý pokus;

T

=

přesná molarita použitého roztoku thiosíranu sodného (6.4);

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v g.

Za výsledek se považuje aritmetický průměr dvou stanovení.

▼M6

---

PŘÍLOHA IV

STANOVENÍ OBSAHU VOSKU KAPILÁRNÍ PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu a složení vosku v různých olejích a tucích při testovacích podmínkách.

Tento postup lze použít zejména k rozlišení mezi olivovým olejem získaným lisováním a extrakcí (olivový olej z pokrutin).

2.   PODSTATA METODY

K tuku nebo oleji se přimísí vhodný vnitřní standard a poté se provádí chromatografická frakční destilace na hydratované silikagelové koloně. Získaná frakce eluovaná nejprve při testovacích podmínkách (jejíž polarita je menší než polarita triglyceridů) se přímo analyzuje pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1.	Kónická 25ml baňka.

3.2.	Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 15 mm a délce 30 až 40 cm.

3.3.

Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a vybavený přímým vstřikováním, obsahující následující části: 3.3.1 Termostaticky ovládatelná kolonová komora, nastavitelná na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C. 3.3.2. Studené nástřikové zařízení pro přímé zavádění do kolony. 3.3.3. Plameno-ionizační detektor a konverzní zesilovač. 3.3.4. Integrátor se zapisovačem, vhodný pro provoz s konverzním zesilovačem (3.3.3.), s rychlostí odezvy nižší než 1 sekundu a s nastavitelnou rychlostí posunu papíru. 3.3.5. Kapilární kolona, ze skla nebo taveného křemene, dlouhá 10 až 15 mm s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi SE-52 nebo SE-54 nebo ekvivalentní, o jednotné tloušťce 0,10 až 0,30 μm.

3.4.	Mikrostříkačka na 10 μl pro přímý vstřik do kolony opatřená tvrzenou jehlou.

4.   CHEMIKÁLIE

4.1.	Silikagel, 70/230 mesh, článek 7754 Merck. Silikagel se umístí na čtyři hodiny do pouzdrové (muflové) pece o teplotě 500 °C, nechá se ochladit a přidají se 2 % vody. Řádným protřepáním se směs homogenizuje. Před použitím se ponechá nejméně 12 hodin v temnotě.

4.2.	n-hexan pro chromatografii.

4.3.	Diethylether pro chromatografii.

4.4.	n-heptan pro chromatografii.

4.5.	Standardní roztok 0,1 % (m/V) laurylarachidátu v hexanu (vnitřní standard).

4.6.	Nosný plyn: vodík, čistý pro plynovou chromatografii.

4.7.	Pomocné plyny: — vodík, čistý pro plynovou chromatografii, — vzduch, čistý pro plynovou chromatografii.

5.   POSTUP

5.1.   Oddělení voskové frakce.

5.1.1

Příprava chromatografické kolony. 15 g silikagelu se doplní 2 % vody, suspenduje v bezvodém n-hexanu a zavede do kolony. Po spontánní sedimentaci se tato dokončí pomocí elektrického vibrátoru, aby byla chromatografická vrstva co nejhomogennější, a provede se perkolace 30 ml n-hexanu za účelem odstranění případných nečistot.

5.1.2.

Kolonová chromatografie Do 25ml baňky se naváží přesně 500 mg vzorku a přidá se vhodné množství vnitřního standardu v závislosti na předpokládaném obsahu vosku, např. 0,1 mg laurylu arachidátu v případě olivového oleje a 0,25 až 0,5 mg v případě olivového oleje z pokrutin. Získaný vzorek se za pomoci dvou dávek 2 ml n-hexanu převede do chromatografické kolony připravené podle 5.1.1. Umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 mm nad horní úrovní absorbentu. Poté se zahájí chromatografické eluování; odejme se 140 ml směsi n-hexanu/éteru (99: 1) při průtoku přibližně 15 kapek za 10 sekund (2,1 ml/min). Získaná frakce se usuší v rotačním odpařovači, až je téměř všechno rozpouštědlo odstraněno. Poslední 2 nebo 3 ml rozpouštědla se odstraní za pomoci slabého proudu dusíku, poté se přidá 10 ml n-heptanu.

5.2.   Plynová chromatografická analýza

5.2.1.

Přípravné práce, kondicionace kolony. 5.2.1.1. Kolona se spojí s plynovým chromatografem, vstupní port se připojí ke kolonovému systému (on-column system) a výstupní port k detektoru. Poté se plynový chromatograf překontroluje (těsnost plynových vedení, funkce detektoru a záznamníku atd.). 5.2.1.2. Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20°C vyšší, než je provozní teplota (viz poznámka). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do předepsaných podmínek (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače, nastavení teploty kolonové komory, detektoru, injektoru atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony. Poznámka: Teplota kondicionace musí být nejméně o 20°C nižší než maximální teplota specifikovaná pro použité eluční činidlo.

5.2.2.

Výběr pracovních podmínek. 5.2.2.1. Všeobecné pracovní podmínky jsou tyto: — teplota kolony: počáteční teplota 80 °C, nárůst po 30 °C/min do teploty 120 °C a pak se naprogramuje růst o 5 °C/min do teploty 340 °C, — teplota detektoru: 350 °C, — lineární rychlost nosného plynu: vodík, 20 až 35 cm/s, — citlivost přístroje: 4 až 16násobek minimálního útlumu, — citlivost detektoru: 1 až 2 mV z plného rozsahu, — rychlost posunu papíru: 30 cm/hod, — množství nastříknuté látky: 0,5 až 1 μl roztoku. Výše uvedené podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto podmínky: retenční čas vnitřního standardu C32 musí být 25 ± 2 minuty a nejreprezentativnější pík vosku musí dosáhnout 60 až 100 % z plného rozsahu. 5.2.2.2. Parametry pro integraci píků se nastaví tak, aby došlo ke správnému vyhodnocení ploch uvažovaných píků.

5.2.3.

Provedení analýzy 5.2.3.1. Do 10μl mikrostříkačky se natáhne 1 μl roztoku; píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle nastříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. 5.2.3.2. Zaznamenávání je prováděno, dokud vosky nejsou zcela eluovány. Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům odstavce (5.2.1.2).

5.2.4.

Identifikace píků Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se směsmi vosků, jejichž retenční časy jsou známé a které byly analyzované za stejných podmínek. Chromatogram vosků panenského olivového oleje je znázorněn na obrázku 1.

5.2.5.

Kvantitativní vyhodnocení 5.2.5.1. Pomocí integrátoru se vypočítají plochy píků odpovídajících vnitřnímu standardu a alifatickým esterům C40 až C46. 5.2.5.2. Obsah vosku jednotlivých esterů vyjádřený v mg/kg tukové látky se vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku příslušného esteru, As = plocha píku laurylu arachidátu, ms = hmotnost přidaného laurylu arachidátu v mg, m = hmotnost vzorku použitého pro stanovení v g.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Uvádí se obsahy jednotlivých vosků a souhrn těchto obsahů v mg/kg tukové látky.

---

DODATEK

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se nastříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu a pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku vzniku píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas v sekundách, změřený stopkami.

▼B

---

PŘÍLOHA V

STANOVENÍ SLOŽENÍ A OBSAHU STEROLŮ POMOCÍ KAPILÁRNÍ PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení obsahu a složení sterolů v tukové látce.

2.   PODSTATA METODY

Zmýdelnění tukové látky, k níž je přidán β-cholestanol jako vnitřní standard, pomocí ethanolického roztoku hydroxidu draselného a extrakce nezmýdelnitelných látek pomocí diethyletheru.

Pomocí chromatografie na bazické silikagelové desce se z nezmýdelnitelného extraktu oddělí sterolová frakce. Steroly oddělené ze silikagelu se převedou na trimethylsilylether a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1	Baňka na 250 ml vybavená zpětným chladičem se zábrusem.

3.2	Dělicí nálevky na 500 ml.

3.3	Baňky na 250 ml.

3.4	Kompletní zařízení pro tenkovrstvou chromatografii se skleněnými deskami o rozměrech 20 × 20 cm.

3.5	Ultrafialová lampa s vlnovou délkou 366 nebo 254 nm.

3.6	Mikrostříkačky na 100 μl a 500 μl.

3.7	Filtrační nálevka ze sintrovaného skla pórovitou fritou G3 (pórovitost 15 až 40 μm) o průměru přibližně 2 cm a výšce přibližně 5 cm, vybavená uzávěrem pro vakuovou filtraci a s vnějším zábrusem 12/21.

3.8	Odsávací baňka na 50 ml s vnitřním zábrusem 12/21 pro použití s filtrační nálevkou (3.7).

3.9	Zkumavka na 10 ml s kónickým dnem a zátkou.

3.10

Plynový chromatograf vhodný pro použití s kapilární kolonou a opatřený dělicím systémem složeným: 3.10.1 z termostatické kolonové komory, nastavitelné na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C; 3.10.2 z odpařovací jednotky s termostatem (vstřikové komory) s povlakem ze silanizovaného skla, 3.10.3 z plameno-ionizačního detektoru se zesilovačem, 3.10.4 z integrátoru se zapisovačem vhodného pro provoz se zesilovačem (3.10.3), s dobou odezvy nejvýše jednu sekundu a s proměnnou rychlostí papíru.

3.11	Kapilární kolona ze skla nebo taveného křemene dlouhá 20 až 30 m, s vnitřním průměrem 0,25 až 0,32 mm, obsahující kapalnou fázi SE-52 nebo SE-54 nebo ekvivalentní, o tloušťce filmu 0,10 až 0,30 μm.

3.12	Mikrostříkačka pro plynovou chromatografii na 10 μl s tvrzenou jehlou.

4.   CHEMIKÁLIE

4.1

Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci přibližně 2 mol/l: 130 g přibližně 85 % hydroxidu draselného se za současného chlazení rozpustí ve 200 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem. Tento roztok je nutno uchovávat v dobře uzavřené skleněné láhvi z tmavého skla.

4.2	Diethylether čistoty p. a.

4.3	Bezvodý síran sodný čistoty p. a.

4.4	Silikagelem potažené skleněné desky bez fluorescenčního indikátoru o tloušťce 0,25 mm (obchodně dostupné).

4.5	Hydroxid draselný ve formě ethanolického roztoku o koncentraci 0,2 mol/l: 13 g hydroxidu draselného se rozpustí ve 20 ml destilované vody a doplní se do jednoho litru ethanolem.

4.6	Benzen pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.7	Aceton pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.8	Hexan pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.9	Diethylether pro chromatografii (viz 5.2.2).

4.10	Chloroform čistoty p. a.

4.11	Referenční roztok pro tenkovrstvou chromatografii: ►M6  2 % ◄ roztok cholesterolu nebo fytosterolu v chloroformu.

4.12	0,2 % ethanolický roztok 2,7-dichlor-fluoresceinu, mírně zásaditý přidáním několika kapek alkoholového roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l.

4.13	Bezvodý pyridin pro chromatografii.

4.14	Hexamethyl-disilazan.

4.15	Trimethyl-chlorsilan.

4.16	Referenční roztoky sterol(trimethylsilyl)etherů. Připraví se z čistých sterolů nebo ze směsí sterolů získaných z olejů, které je obsahují, těsně před použitím.

4.17	0,2 % roztok α-cholestanolu v chloroformu (m/V) (vnitřní standard).

4.18	Nosné plyny: vodík nebo helium, čisté pro plynovou chromatografii.

4.19	Pomocné plyny: vodík a vzduch, čisté pro plynovou chromatografii.

5.   POSTUP

5.1

Příprava nezmýdelnitelných látek 5.1.1 Pomocí mikrostříkačky na 500 μl se do baňky na 250 ml dá pro účely analýzy 0,2 % roztok α-cholestanolu v chloroformu (4.17), obsahující množství cholestanolu rovnající se přibližně 10 % obsahu sterolu v části vzorku, která má být odebrána za účelem analýzy. Například při analýze oleje se na 5 g vzorku přidá 500 μl 0,2 % roztoku α-cholestanolu, a 1 500 μl při analýze ►M6  ————— ◄ olivového oleje z pokrutin. V dusíku se vzorek odpaří do sucha a do stejné baňky se naváží přesně 5 g vysušeného přefiltrovaného vzorku. ►M6  Oleje ◄ obsahující větší množství cholesterolu mohou vykazovat pík s retenčním časem shodným s cholestanolem. Pokud k tomu dojde, musí být sterolová frakce analyzována jednou s vnitřním standardem, a jednou bez něj. ►M6  Namísto cholestanolu je možné použít také betulinol. ◄ 5.1.2 Přidá se 50 ml ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l, připojí se zpětný chladič a zahřeje se do mírného varu na parní lázni za nepřetržitého míchání během zahřívání, dokud nedojde ke zmýdelnění (roztok se vyčeří). V zahřívání se pokračuje dalších 20 minut a poté se přes chladič přidá 50 ml destilované vody. Chladič se pak odpojí a baňka se vychladí na teplotu přibližně 30 °C. 5.1.3 Obsah baňky se kvantitativně převede do dělicí nálevky na 500ml a propláchne 2 x 25 ml destilované vody. Přidá se přibližně 80 ml diethyletheru, vše se protřepe po dobu 30 sekund a nechá se odstát (poznámka 1). Spodní vodná fáze se převede do druhé nálevky. Stejným způsobem se provedou další dvě extrakce vodné fáze vždy s použitím 60 až 70 ml diethyletheru. Poznámka 1 Emulze je možné odstranit přidáním malých množství ethanolu nebo methanolu formou postřiku. 5.1.4 Diethyletherové extrakty se smíchají v dělicí nálevce a promyjí destilovanou vodou (50 ml v jedné dávce), dokud promývací voda nevykáže neutrální reakci. Odstraní se vodná fáze, etherová fáze se vysuší bezvodým síranem sodným a přefiltruje se do předem zvážené baňky na 250 ml, přičemž nálevka a filtr se promyjí malými množstvími diethyletheru, které se přidá k celkovému množství. 5.1.5 Ether se pozvolným zahříváním odpařuje, až jej zbude jen několik ml, a zbytek se vysuší v mírném vakuu nebo pod proudem dusíku. Vysušení se dokončí v sušárně při teplotě 100 °C po dobu přibližně 15 minut a zbytek po se zváží po vychlazení v exsikátoru.

5.2

Separace sterolové frakce 5.2.1 Příprava bazických desek. Silikagelové desky (4.4) se na 10 sekund zcela ponoří do ethanolického roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 2 mol/l (4.5), poté se nechají dvě hodiny sušit v digestoři a nakonec na jednu hodinu umístí do sušárny vyhřáté na 100 °C. Desky se vyjmou ze sušárny a až do okamžiku použití uloží do exsikátoru s chloridem vápenatým. Takto upravené desky musí být použity během 15 dnů. Poznámka 2 Jsou-li pro separaci alkoholové frakce použity bazické silikagelové desky, není nutné upravovat nezmýdelnitelné látky pomocí AlO (oxidu hlinitého). Dojde tak k zadržení všech kyselých sloučenin (mastných kyselin apod.) na počátku, a tím se zřetelně oddělí pásmo sterolů od pásma alifatických a triterpenických alkoholů. 5.2.2 Vyvíjecí komora se naplní roztokem benzenu a acetonu v poměru 95: 5 (V/V) do výšky přibližně 1 cm. Jinak je možné použít směs hexanu a diethyletheru 65:35 (V/V). Vyvíjecí komora se uzavře a nejméně půl hodiny ponechá v klidu, aby se mohla vytvořit rovnováha mezi parami a kapalinou. Na vnitřní povrch vyvíjecí komory je možné připojit proužky filtračního papíru namočené v eluční směsi za účelem zkrácení doby vyvolávání přibližně o jednu třetinu a dosílení stejnoměrnější, pravidelní eluce složek. Poznámka 3 Vyvíjecí roztok musí být pro každou analýzu vyměněn, aby bylo dosaženo reprodukovatelných podmínek vyvíjení. 5.2.3 Připraví se 5 % roztok nezmýdelnitelných látek (5.1.5) v chloroformu a 300 μl tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 100 μl nastříkne jako co nejrovnoměrnější a co nejtenčí pruh na tenkovrstvou desku přibližně 2 cm od dolního okraje desky. Ve stejné úrovni se nanese 2 až 3 μl referenčního roztoku sterolů (4.11) za účelem stanovení sterolového pásma po dokončení vyvíjení. 5.2.4 Deska se umístí do vyvíjecí komory uvedené v odstavci 5.2.2. Teplota se udržuje mezi 15 a 20 °C. Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu nebo se deska na chvíli nechá v digestoři. 5.2.5 Deska se lehce a rovnoměrně postříká roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu a pozoruje se pod ultrafialovým zářením. Sterolové pásmo se stanoví porovnáním skvrn vytvořených referenčním roztokem. Obrysy pásma podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem. 5.2.6 Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové špachtle. Odebraná hmota se rozmělní na malé části a převede do filtrační nálevky (3.7). Přidá se 10 ml horkého chloroformu. Obsah se důkladně promíchá kovovou stěrkou a vakuově přefiltruje. Filtrát se shromáždí v baňce, připojené na filtrační nálevku. Zbytek v nálevce se propláchne 3 × 10 ml diethyletheru. Filtrát se přitom sbírá do stejné baňky připojené k nálevce. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do předem zvážené zkumavky na 10 ml (3.9). Zkumavka se vysuší lampou pod mírným proudem dusíku. Zbytek se znovu rozpustí několika kapkami acetonu, opět vysuší a na deset minut vloží do sušárny vyhřáté na 105 °C, vyjme, vychladí v exsikátoru a zváží. Zbytek ve zkumavce je tvořen sterolovou frakcí.

5.3

Příprava trimethylsilyletherů 5.3.1 Do zkumavky obsahující sterolovou frakci se přidá činidlo pro silylaci tvořené směsí pyridinu, hexamethyl-disilazanu a trimethyl-chlorsilanu v poměru 9:3:1 (V/V/V) (poznámka 4) v množství 50 μl na každý mg sterolů. Přitom je nutné zabránit jakékoli absorpci vlhkosti (poznámka 5). Poznámka 4 Roztoky připravené k použití jsou obchodně dostupné: silanizační činidla, jako například N, O-bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid + 1 % trimethyl-chlor-silan pro smíchání se stejným objemem bezvodého pyridinu. 5.3.2 Zkumavka se uzavře a pečlivě protřepe bez převracení, dokud se steroly nerozpustí. Poté se nechá v klidu nejméně 15 minut při laboratorní teplotě a potom několik minut odstřeďuje. Čirý roztok je připraven pro plynovou chromatografickou analýzu. Poznámka 5 Vznik slabé opalescence je normální a není nijak rušivý. Tvorba bílých vloček nebo existence růžového zabarvení jsou známkami přítomné vlhkosti nebo degradace činidla. V tomto případě je třeba zkoušku opakovat.

5.4

Analýza plynovou chromatografií 5.4.1 Přípravné operace a kondicionace kapilární kolony 5.4.1.1 Kapilární kolona se připojí k plynovému chromatografu tak, že začátek kolony se připojí k odpařovací jednotce, která je spojena s oddělovacím systémem. Konec kolony se připojí k detektoru. Provede se kompletní kontrola plynového chromatografu (těsnost plynových spojovacích prvků, účinnost detektoru, účinnost oddělovacího a zapisovacího systému atd.). 5.4.1.2 Kapilární kolony, které mají být použity poprvé, je nutno nejprve kondicionovat. Kapilární kolonou se nechá protékat malé množství nosného plynu, poté se zapne plynový chromatograf a nechá se postupně zahřívat, dokud není dosaženo teploty nejméně o 20 °C vyšší, než je laboratorní teplota (viz poznámka 6). Tato teplota se udržuje nejméně dvě hodiny a poté se systém převede do pracovních podmínek (regulace průtoku plynu, oddělování, zapálení plamene, připojení elektronického zapisovače, nastavení teploty kolonové komory, detektoru, injektoru atd.) a signál se nastaví na citlivost, která činí nejméně dvojnásobek nejvyšší úrovně uvažované pro provedení analýzy. Základní linie záznamu musí být rovná, bez jakýchkoli píků nebo driftů. Záporné drifty jsou známkou nedokonalé těsnosti spojů kolony, zatímco kladné svědčí o nedostatečné kondicionaci kolony. Poznámka 6 Teplota kondicionace musí být nejméně o 20 °C nižší než maximální teplota použitelná pro uvažovanou stacionární fázi. 5.4.2 Výběr pracovních podmínek 5.4.2.1 Všeobecné pracovní podmínky jsou tyto: — teplota kolony: 260 ± 5 °C, — teplota odpařovací jednotky: 280 °C, — teplota detektoru: 290 °C, — lineární rychlost nosného plynu: helium 20 až 35 cm/s, vodík 30 až 50 cm/s, — oddělovací poměr: 1:50 až 1:100, — citlivost přístroje: 4 až 16násobek minimálního útlumu, — citlivost záznamu: 1 až 2 mV f.s., — rychlost posunu papíru, nastavitelná na hodnoty mezi 30 až 60 cm/hod, — množství nastříknuté látky: 0,5 až 1 μl trimethylsilyletherového roztoku. Výše uvedené podmínky mohou být upraveny podle charakteristik kolony a plynového chromatografu s cílem zajistit, aby chromatogramy splňovaly tyto podmínky: — retenční čas betasitosterolu musí být 20 ± 5 minut, — pík kampesterolu musí být u olivového oleje (střední obsah 3 %) 0 ± 20 % plného rozsahu a u sojového oleje (střední obsah 20 %) 40 ± 20 % plného rozsahu; — všechny přítomné steroly musí být odděleny. Kromě separace musí být píky též zcela rozlišeny, tj. dráha záznamu píku se musí vrátit na základní linii dříve, než se zvedne do dalšího píku. Neúplné rozlišení je však tolerováno za předpokladu, že pík s relativním retenčním časem 1,02 je možné kvantifikovat pomocí kolmé úsečky. 5.4.3 Provedení analýzy 5.4.3.1 Do mikrostříkačky na 10 μl se natáhne 1 μl hexanu, poté 0,5 μl vzduchu a nakonec 0,5 až 1 μl zkušebního roztoku. Píst mikrostříkačky se povytáhne tak, aby se vyprázdnila jehla. Jehla se zavede přes septum vstřikové komory a přibližně po jedné nebo dvou sekundách se rychle vstříkne roztok. Přibližně po pěti sekundách se jehla pomalu vytáhne. 5.4.3.2 Zaznamenávání je prováděno, dokud přítomná trimethylsilyletherová směs sterolů není zcela eluována. Základní linie záznamu musí vždy odpovídat požadavkům odstavce 5.4.1.2. 5.4.4 Identifikace píků Identifikace jednotlivých píků se provádí podle retenčních časů a porovnáním se standardní směsí trimethylsilyletherů analyzovanou za stejných podmínek. Steroly jsou eluovány v tomto pořadí: cholesterol, brassikasterol, 24-methyl-en-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, delta-7-kampesterol, delta-5, 23-stigmastadienol, chlerosterol, betasitosterol, sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5, 24-stigmastadienol, delta-7-stigmastenol a delta-7-avenasterol. Retenční časy sitosterolu v případě kolon SE-52 a SE-54 jsou uvedeny v tabulce 1. Chromatogram typický pro některé oleje je vidět na obrázku 1 a 2. 5.4.5 Kvantitativní vyhodnocení 5.4.5.1 Pomocí integrátoru se vypočítá plocha píků α-cholestanolu a sterolů. Píky jakýchkoli sloučenin, které nejsou mezi sloučeninami uvedenými v tabulce 1. Koeficient odezvy β-cholestanolu musí být roven 1. 5.4.5.2 Obsah jednotlivých sterolů vyjádřený v mg/100 g tuku se vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku sterolu x ►M6  ————— ◄ , As = plocha β-cholestanolu ►M6  ————— ◄ , ms = množství přidaného β-cholestanolu v mg,, m = množství vzorku použitého pro stanovení v g.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1	Uvádí se obsah jednotlivých sterolů v mg/100 g tuku a souhrn „obsah sterolů celkem“.

6.2	Procentní podíl jednotlivých sterolů z poměru plochy příslušného píku k celkové ploše píků sterolůse vypočítá podle vzorce: kde Ax = plocha píku sterolu x, ΣA = celková plocha píků sterolů.

---

DODATEK

Stanovení lineární rychlosti plynu

Do plynového chromatografu nastaveného na normální pracovní podmínky se vstříkne 1 až 3 μl methanu nebo propanu a pomocí stopek se změří doba průchodu plynu kolonou od počátku vstřiku do okamžiku eluce píků (tM).

Lineární rychlost proudění v cm/s je dána poměrem L/tM, kde L je délka kolony v cm a (tM) je čas v sekundách, změřený stopkami.

Obrázek 1

Plynový chromatogram sterolové frakce surového olivového oleje

Obrázek 2

Plynový chromatogram sterolové frakce rafinovaného olivového oleje

---

PŘÍLOHA VI

STANOVENÍ ERYTHRODIOLU A UVAOLU

ÚVOD

Erythrodiol (obvykle chápaní jako úhrn glykolů erythrodiol a uvaolu) je složkou nezmýdelnitelného podílu, charakteristického pro některé typy tukových látek. V olivovém oleji extrahovaném pomocí rozpouštědel se nachází ve významně vyšších koncentracích než v ostatních olejích, jako například lisovaném olivovém oleji a v hroznovém oleji, které erythrodiol také obsahují, a tak jeho přítomnost může prokázat existenci olivového oleje extrahovaného pomocí rozpouštědel.

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení přítomnosti erythrodiolu v tukové látce.

2.   PODSTATA METODY

Zmýdelnění tukové látky pomocí ethanolického roztoku hydroxidu draselného. Extrakce nezmýdelnitelných látek pomocí diethyletheru. Vyčištění průchodem kolonou s oxidem hlinitým.

Nezmýdelnitelné látky se podrobují tenkovrstvé chromatografii na silikagelové desce, dokud nejsou oddělena pásma odpovídající sterolové a erythrodiolové frakce. Steroly a erythrodiol oddělené ze silikagelu se převedou na trimethylsilylether a analyzují pomocí kapilární plynové chromatografie.

Výsledek je vyjádřen jako procentní podíl erythrodiolu ve směsi erythrodiolu a sterolů.

3.   PŘÍSTROJE APOMŮCKY

3.1	Přístroje a pomůcky uvedené v příloze V (Stanovení obsahu a složení sterolů).

4.   CHEMIKÁLIE

4.1	Chemikálie uvedené v příloze V (Stanovení obsahu a složení sterolů).

4.2	Referenční 0,5 % roztok erythrodiolu v chloroformu.

5.   POSTUP

5.1   Příprava nezmýdelnitelných látek

Viz přílohu V odst. 5.1.2.

5.2   Separace erythrodiolu a sterolů

5.2.1

Viz přílohu V odst. 5.2.1.

5.2.2

Viz přílohu V odst. 5.2.2.

5.2.3

Připravte 5 % roztok nezmýdelnitelných látek v chloroformu. 300 μl tohoto roztoku se pomocí mikrostříkačky na 0,1 ml nastříkne jako co nejrovnoměrnější a co nejtenčí pruh na tenkovrstvou desku přibližně 1,5 cm od dolního okraje desky Na jeden konec desky se nanese několik mikrolitrů roztoků cholesterolu a erythrodiolu, které budou sloužit jako referenční látka.

5.2.4

Deska se umístí do vyvíjecí komory uvedené v odstavci 5.2.1. Teplota se udržuje kolem 20 °C. Vyvíjecí komora se okamžitě uzavře a vzorek se nechá eluovat, dokud čelo rozpouštědla nedosáhne přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se poté vyjme z vyvíjecí komory a rozpouštědlo se nechá odpařit pod proudem horkého vzduchu.

5.2.5

Deska se lehce a rovnoměrně postříká alkoholovým roztokem 2,7-dichlor-fluoresceinu a pozoruje se pod ultrafialovým zářením. Erythrodiolová pásma je možno stanovit porovnáním s referenčním roztokem. Obrysy pásma podél okrajů fluorescence se vyznačí černým značkovačem.

5.2.6

Silikagel se z označené oblasti seškrábe pomocí kovové špachtle. Odebraná hmota se převede do baňky na 50 ml. Přidá se 15 ml horkého chloroformu, dobře protřepe a přefiltruje přes nálevku s diskem ze sintrovaného skla tak, aby se silikagel převedl do filtru. Třikrát se propere horkým chloroformem (vždy 10 ml) a filtrát se shromáždí v baňce na 100 ml. Filtrát se odpaří na objem přibližně 4 až 5 ml a zbytkový roztok se převede do kalibrované kónické vakuové baňky na 10 ml, vysuší pod mírným proudem dusíku a zváží.

5.3   Příprava trimethylsilyletherů

Viz odst. 5.3 přílohy V.

5.4   Analýza plynovou chromatografií

Viz popis v odstavci 5.4 předchozí metody. Pracovní podmínky plynového chromatografu při analýze musí být takové, aby umožnily provedení analýzy sterolů a separace trimethylsilyletheru od erythrodiolu a uvaolu.

Po nastříknutí vzorku je prováděno zaznamenávání, dokud přítomná směs sterolů, erythrodiolu a uvaolu není zcela eluována. Pak určete píky (relativní retenční časy vzhledem k betasitosterolu jsou u erythrodiolu přibližně 1,45 a u uvaolu 1,55) a vypočtěte obsahy ploch jako v případě sterolů.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

kde

A1

=

plocha píku erythrodiolu ►M6  ————— ◄

A2

=

plocha píku uvaolu ►M6  ————— ◄

∑ Asterolů

=

celková plocha píků sterolů ►M6  ————— ◄ .

Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo.

---

PŘÍLOHA VII

STANOVENÍ NASYCENÝCH MASTNÝCH KYSELIN V TRIGLYCERIDECH VÁZANÝCH V POLOZE 2

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup stanovení složení frakce mastných kyselin v oleji nebo tuku, které jsou esterifikovány v poloze 2 (nebo ve vnitřní poloze) glyceridu.

2.   OBLAST POUZITÍ

Tato norma platí pro oleje a tuky s bodem tání nižším než 45 °C a využívá specifického účinku pankreatické lipázy.

Není bezvýhradně použitelná pro oleje a tuky obsahující větší množství mastných kyselin s 12 nebo méně atomy uhlíku (kokosového a palmojádrového oleje, máselný tuk), nebo vysoce nenasycených mastných kyselin (s více než čtyřmi dvojnými vazbami) s 20 nebo více atomy uhlíku (rybí tuky a oleje z mořských živočichů), nebo mastných kyselin s kyslíkatými skupinami jinými než kyselinovými.

3.   PODSTATA

Případná neutralizace kyselých olejů a tuků v rozpouštědle. Čištění průchodem kolonou s oxidem hlinitým. Parciální hydrolýza pomocí pankreatické lipázy během stanovené doby. Separace vzniklých monoglyceridů pomocí tenkovrstvé chromatografie a methanolýza těchto monoglyceridů. Analýza získaných methylesterů plynovou chromatografií.

4.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1	Baňka na 100 ml.

4.2	Baňka na 25 ml a se zábrusem.

4.3	1 m dlouhý vzduchový chladič, vhodný k připojení k baňce 4.2.

4.4	Baňka na 250 ml.

4.5	Kádinka na 50 ml.

4.6	Dělicí nálevka na 500 ml.

4.7	Skleněná chromatografická kolona o vnitřním průměru 13 mm a délce 400 mm s vložkou ze sintrovaného skla a kohoutem.

4.8	Odstředivková zkumavka na 10 ml se zabroušenou skleněnou zátkou.

4.9	Byreta na 5 ml, s hodnotou dílku 0,05 ml.

4.10	Stříkačka na 1 ml s tenkou jehlou.

4.11	Mikrostříkačka pro dávkování po 3 až 4μl kapkách.

4.12	Nástroj na rozprostírání vrstev pro tenkovrstvou chromatografii.

4.13	Skleněné desky pro tenkovrstvou chromatografii, 20 × 20 cm.

4.14	Skleněná vyvíjecí komora pro tenkovrstvou chromatografii s víkem ze zabroušeného skla, pro desky 20 × 20.

4.15	Rozprašovač pro tenkovrstvou chromatografii.

4.16.

Sušárna nastavitelná na teplotu 103 ± 2 °C.

4.17	Termostat nastavitelný na 30 až 45 °C s přesností na 0,5 °C.

4.18	Rotační odpařovač.

4.19	Vibrační elektrická třepací zařízení pro silné promíchávání odstředivkových zkumavek.

4.20	Ultrafialová lampa ke zkoumání desek pro tenkovrstvou chromatografii.

4.21 pH metr. 4.22 Spirálovité míchadlo. 4.23 Byreta na 5 ml. 4.24 Stopky.

4.25 Laboratorní míchadlo vhodné pro disperze a směsi heterogenních materiálů.

5.   CHEMIKÁLIE

5.1	n — hexan nebo, není-li k dispozici, petrolether (bod varu 30 až 50 °C), pro chromatografii.

5.2	2-propanol nebo 95 % ethanol (V/V), čistoty p. a.

5.3	2-propanol nebo ethanol, vodný roztok 1:1.

5.4	Diethylether, bez peroxidů.

5.5

Aceton.

5.6	Nejméně 98 % kyselina mravenčí (m/m).

5.7	Vyvíjecí roztok: směs n — hexanu (5.1), diethyletheru (5.4) a kyseliny mravenčí (5.6) v poměru 70:30:1 (V/V/V).

5.8	Aktivovaný oxid hlinitý pro chromatografii, neutrální, stupeň jakosti Brockmann I.

5.9	Křemenný prach s pojivem, odpovídající jakosti pro tenkovrstvou chromatografii.

5.10	Pankreatická lipáza vhodné kvality (poznámky 1 a 2).

5.11	Hydroxid sodný, vodný roztok o koncentraci 120 g/l.

5.12	Kyselina chlorovodíková, vodný roztok o koncentraci 6 mol/l.

5.13	Chlorid vápenatý (CaCl2), vodný roztok o koncentraci 220 g/l.

5.14	Cholát sodný (enzymatické kvality), vodný roztok o koncentraci 1 g/l.

5.15	Tlumivý roztok: 1M vodný roztok trihydroxy-methyl-aminomethanu upravený na pH 8 přidáním kyseliny chlorovodíkové (5.12) (zkontrolujte potenciometrem).

5.16	Fenolftalein, roztok 10 g/l v 95 % ethanolu (V/V).

5.17	2′, 7′-dichlor-fluorescein, roztok 2 g/l v 95 % ethanolu (V/V), upravený na mírně zásaditou reakci přidáním jedné kapky 1N roztoku hydroxidu sodného na 100 ml.

5.18 Neutralizovaný olej. 5.19 Hydroxid sodný, vodný roztok o koncentraci 0,1 mol/l. 5.20 Cholát sodný (enzymatické jakosti), vodný roztok o koncentraci 200 g/l. 5.21 Arabská guma, vodný roztok o koncentraci 100 g/l.

6.   PŘÍPRAVA VZORKU

Pokud je hodnota kyselosti vzorku, stanovená podle přílohy II, nižší než 3 %, vyčistí se přímo průchodem přes oxid hlinitý podle odstavce 6.2.

Pokud je hodnota kyselosti vzorku, stanovená podle přílohy II, vyšší než 3 %, neutralizuje se zásadou za přítomnosti rozpouštědla podle odstavce 6.1 a poté se nechá projít oxidem hlinitým podle odstavce 6.2.

6.1

Neutralizace zásadou za přítomnosti rozpouštědla Do dělicí nálevky (4.6) se převede přibližně 10 g surového olivového oleje a přidá se 100 ml hexanu (5.1), 50 ml 2-propanolu (5.2), několik kapek roztoku fenolftaleinu (5.16) a množství roztoku hydroxidu sodného (5.11) odpovídající hodnotě volné kyselosti oleje, plus 0,3 % navíc. Jednu minutu se důkladně protřepá, přidá se 50 ml destilované vody, znovu protřepá a nechá se usadit. Po separaci se odstraní spodní mýdlová vrstva. Odstraní se také jakékoli mezilehlé vrstvy (sliz, nerozpustnou hmotu). Hexanový roztok neutralizovaného oleje se promyje následnými dávkami 25 až 30ml roztoku 2-propanolu (5.3), dokud růžové zabarvení fenolftaleinu nezmizí. Odstraní se většina hexanu destilací ve vakuu v rotačním odpařovači (4.18), olivový olej se vysuší ve vakuu při teplotě 30 až 40 °C pomocí proudu čistého dusíku, dokud nebude hexan zcela odstraněn.

6.2

Čištění průchodem oxidem hlinitým Připraví se suspenze 15 g aktivovaného oxidu hlinitého (5.8) v 50 ml hexanu (5.1) a za současného míchání se nalije do chromatografické kolony (4.7). Oxid hlinitý se nechá rovnoměrně usadit a umožní se, aby hladina rozpouštědla poklesla tak, aby byla 1 až 2 mm nad absorbentem. Do kolony se opatrně nalije roztok 5 g oleje ve 25 ml hexanu (5.1) a celý výtok z kolony se shromáždí v baňce (4.1).

7.

PŘÍPRAVA CHROMATOGRAFICKÝCH DESEK Skleněné desky (4.13) se důkladně vyčistí ethanolem, petroletherem a acetonem, aby se odstranila jakákoli stopa tuku. Do Erlenmeyerovy baňky (4.4) se nasype 30 g křemenného prachu (5.9). Přidá se 60 ml destilované vody. Uzavře se a jednu minutu důkladně protřepe. Kaše se okamžitě přenese do nanášecího zařízení (4.12) a desky se pokryjí vrstvou silnou 0,25 mm. Desky se suší 15 minut na vzduchu a poté jednu hodinu v sušárně (4.16) při teplotě 103 ± 2 °C. Desky se před použitím vychladí v exsikátoru na laboratorní teplotu. Hotové desky jsou obchodně dostupné.

8.

POSTUP 8.1 Hydrolýza za přítomnosti pankreatické lipázy Do odstředivkové zkumavky (4.8) se naváží přibližně 0,1 g připraveného vzorku; pokud je vzorkem kapalný olej, postupujte přímo níže uvedeným způsobem. Přidá se 20 mg lipázy (5.10) a 2 ml tlumivého roztoku (5.15). Dobře, ale opatrně se protřepe a pak se přidá 0,5 ml roztoku cholátu sodného (5.14) a 0,2 ml roztoku chloridu vápenatého (5.13). Zkumavka se uzavře zátkou se zábrusem, opatrně se protřepe (nelze dopustit zvlhčení zátky), okamžitě se vloží do termostatu (4.17) udržovaného na teplotě 40 ± 0, 5 °C a ručně se přesně jednu minutu protřepá. Zkumavka se vyjme z termostatu a důkladně se přesně dvě minuty protřepe pomocí elektrického třepacího zařízení (4.19). Okamžitě se vychladí pod tekoucí vodou, přidá se do ní 1 ml kyseliny chlorovodíkové (5.12) a 1 ml diethyletheru (5.4). Uzavře se a důkladně promíchá na elektrickém třepacím zařízení. Nechá se ustát, v případě potřeby odstředí, a pomocí stříkačky (4,10) se odebere organická vrstva. 8.2 Separace monoglyceridů pomocí tenkovrstvé chromatografie Extrakt se pomocí mikrostříkačky (4.11) nastříkne jako co nejrovnoměrnější a co nejtenčí pruh na tenkovrstvou desku přibližně 1,5 cm od dolního okraje chromatografické desky. Deska se vloží do dobře nasycené vývojové komory (4.14) a nechá se vyvíjet ve vyvíjecím roztoku (5.7) přibližně při 20 °C, dokud čelo roztoku nebude přibližně 1 cm od horního okraje desky. Deska se usuší na vzduchu při stejné teplotě, jakou má vyvíjecí komora a postříká se roztokem 2′, 7′-dichlor-fluoresceinu (5.17). Pod ultrafialovým světlem (4.20) se označí pásmo monoglyceridů (Rf přibližně 0,035). 8.3 Analýza monoglyceridů plynovou chromatografií Pomocí špachtle se odstraní pásmo získané v odstavci 8.2 (je nutno se vyvarovat odstranění složek, které zůstaly na základní linii) a převeďte je do methylační baňky (4.2). Získaný oxid křemičitý se upraví přímo metodami uvedenými v příloze XB, s cílem převedení monoglyceridů na methylestery; potom se estery analyzují pomocí plynové chromatografie, jak je popsáno v příloze XA.

9.	VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ Složení mastných kyselin vázaných v poloze 2 se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo (poznámka 3).

10.

POZNÁMKY Poznámka 1 Kontrola aktivity lipázy Připraví se olejová emulze promícháním směsi 165 ml roztoku arabské gumy (5.21), 15 g drceného ledu a 20 ml neutralizovaného oleje (5.18) vhodným třepacím zařízením. Do kádinky (4.5) se převede 10 ml olejové emulze, poté se postupně přidá 0,3 ml roztoku cholátu sodného (5.20) a 20 ml destilované vody. Kádinka se vloží do termostatu udržovaného na teplotě 37 ± 0, 5 °C (poznámka 4); vloží se elektrody pH metru (4.21) a spirálovité míchadlo (4.22). Pomocí byrety (4.23) se po kapkách přidává roztok hydroxidu sodného (5.19), dokud hodnota pH nedosáhne 8,5. Přidá se dostatečné množství vodní suspenze lipázy (viz níže). Jakmile pH metr začne ukazovat pH 8,3, zapnou se stopky (4.24) a přikapává se roztok hydroxidu sodného (5.19) takovou rychlostí, aby se udržovala hodnota pH 8,3. Zaznamená se objem spotřebovaného zásaditého roztoku za minutu. Pozorování se zaznamená ve formě grafu, jehož nezávisle proměnnou je čas a závisle proměnnou objem zásaditého roztoku v ml potřebný pro udržení konstantní hodnoty pH. Výsledný graf musí být lineární. Výše zmíněná suspenze lipázy je vodní suspenzí 1:1000 (m/m). Při každé zkoušce se použije takové množství této suspenze, aby se během čtyř až pěti minut spotřeboval přibližně 1 ml zásaditého roztoku. Obvykle je zapotřebí přibližně 1 až 5 mg prášku. Lipázovou jednotkou se rozumí množství enzymu, které uvolní 10 mikroekvivalentů kyseliny za minutu. Aktivita A použitého prášku vyjádřená v lipázových jednotkách na 1 mg je pak dána vzorcem: kde V je objem v ml roztoku hydroxidu sodného (5.19) spotřebovaného za minutu, vypočítaný z grafu, a m je hmotnost použitého zkušebního vzorku prášku v mg. Poznámka 2 Příprava lipázy Lipázy s dostatečnou aktivitou jsou obchodně dostupné. Je ale rovněž možné je připravit v laboratoři takto: 5 kg čerstvé vepřové slinivky břišní se vychladí na 0 °C; okolní sádlo a vazivová tkáň se oddělí a v míchadle se rozmělní, dokud nevznikne tekutá mazlavá pasta. Tato pasta se v míchadle (4.25) smíchá s 2,5 l bezvodého acetonu a poté odstředí. Zbytek se extrahuje třikrát pomocí stejného množství acetonu, potom dvakrát pomocí směsi acetonu a diethyletheru 1:1 (V/V) a dvakrát pomocí diethyletheru. Zbytek se po 48 hodin suší ve vakuu za účelem získání stabilního prášku, který je možné skladovat v ledničce. Poznámka 3 V každém případě se doporučuje stanovit složení veškerých mastných kyselin ve stejném vzorku, neboť porovnání se složením kyselin vázaných v poloze 2 pomůže při vyhodnocení získaných čísel. Poznámka 4 Teplota hydrolýzy je 37 °C, je-li použit kapalný olej. V případě zkušebního vzorku se však nastaví na 40 °C, aby se umožnila analýza tuků s bodem tání až do 45 °C.

▼M20 —————

▼B

---

PŘÍLOHA IX

SPEKTROFOTOMETRICKÁ ANALÝZA V ULTRAFIALOVÉ OBLASTI SPEKTRA

PŘEDMLUVA

Spektrofotometrická analýza v ultrafialové oblasti spektra může poskytnout informace o jakosti tuku, stavu jeho zachovalosti a změnách způsobených technologickými procesy.

Absorpce na vlnových délkách specifikovaných v metodě je způsobena přítomností konjugovaných dienových a trienových systémů. Tyto absorpce jsou vyjádřeny jako specifické extinkce E1 % 1 cm (extinkce vyvolaná 1 % roztokem tuku v předepsaném rozpouštědle při tloušťce vrstvy 1 cm) obvykle označované písmenem K (též zmiňované jako „extinkční koeficienty“).

1.   PŘEDMĚT

Tato metoda popisuje postup při spektrofotometrické analýze olivového oleje v ultrafialové oblasti spektra.

2.   PODSTATA METODY

Zkoumaný tuk se rozpustí v požadovaném rozpouštědle a poté se určí extinkce roztoku při určitých vlnových délkách proti čistému rozpouštědlu. Z výsledků spektrofotometrických měření se vypočtou specifické extinkce.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

3.1	Spektrofotometr pro měření extinkce v ultrafialové oblasti spektra mezi 220 a 360 nm s možností odečítání jednotlivých nanometrických jednotek.

3.2	Pravoúhlé křemenné kyvety s víčky a optickou délkou 1 cm. Jsou-li naplněny vodou nebo jiným vhodným rozpouštědlem, nesmí vykazovat rozdíly větší než 0,01 jednotky extinkce.

3.3	Odměrné baňky na 25 ml.

▼M6

3.4	Chromatografická kolona s horní částí o délce 270 mm a průměru 35 mm a dolní částí o délce 270 mm a průměru 10 mm.

▼B

4.   CHEMIKÁLIE

4.1

Spektrofotometricky čistý isooktan (2,2,4-trimethyl-pentan). Proti destilované vodě musí mít transmitanci nejméně 60 % při 220 nm a nejméně 95 % při 250 nm, nebo — spektrofotometricky čistý cyklohexan: proti destilované vodě musí mít transmitanci nejméně 40 % při 220 nm a nejméně 95 % při 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2	Bazický oxid hlinitý pro kolonovou chromatografii připravený a zkontrolovaný v souladu s postupem uvedeným v příloze I.

4.3	n — hexan pro chromatografii.

5.   POSTUP

5.1	Zkoumaný vzorek musí být dokonale homogenní a bez podezřelých nečistot. Oleje, které jsou při normální teplotě kapalné, mají být přefiltrovány přes papír při teplotě přibližně 30 °C, pevné tuky je třeba homogenizovat a přefiltrovat při teplotě nejvýše 10 °C nad jejich bodem tání.

5.2	Naváží se přibližně 0,25 g takto připraveného vzorku do odměrné baňky na 25 ml, doplní se až ke značce předepsaným rozpouštědlem a homogenizuje. Výsledný roztok musí být dokonale čirý. Je-li roztok zakalený nebo obsahuje nečistoty, je nutno jej rychle přefiltrovat přes papír.

5.3

Kyveta se naplní získaným roztokem a změří se extinkce v oblasti vlnových délek 232 až 276 nm, jako referenční roztok slouží použité rozpouštědlo. Zaznamenané hodnoty extinkce musí ležet v rozsahu 0,1 až 0,8. Pokud tomu tak není, musí být měření zopakována s použitím roztoků o vhodně upravené koncentraci.

5.4

Je-li nutné stanovit specifické extinkce po průchodu oxidem hlinitým, postupuje se takto: Do chromatografické kolony se nalije suspenze 30 g bazického oxidu hlinitého v hexanu. Po usazení adsorbentu se odstraní přebytečný hexan tak, aby převyšoval horní okraj oxidu hlinitého přibližně o 1 cm. Rozpustí se 10 g tuku, homogenizovaného a filtrovaného podle popisu v odstavci 5.1, ve 100 ml hexanu a roztok se nalije do kolony. Shromáždí se eluát a odpaří se veškeré rozpouštědlo ve vakuu při teplotě nižší než 25 °C. Takto získaný vzorek tuku se neprodleně zpracuje podle popisu v odstavci 5.2.

6.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

6.1

Zaznamenávají se specifické extinkce (extinkční koeficienty) při různých vlnových délkách vypočtené takto kde Kλ = specifická extinkce při vlnové délce λ, Eλ = extinkce při vlnové délce λ, c = koncentrace analytického roztoku v g/100 ml zkušebního roztoku, s = tloušťka kyvety v cm. Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo.

6.2

Spektrofotometrická analýza olivového oleje v souladu s úřední metodou definovanou v nařízeních EHS předepisuje stanovení charakteristických extinkcí v roztoku isooktanu při vlnových délkách 232 a 270 nm a stanovení hodnoty ΔK, která je definována takto kde Km je charakteristická extinkce při vlnové délce m, vlnová délka v blízkosti 270 nm, při níž dochází k maximální absorpci.

---

DODATEK I

Příprava oxidu hlinitého a zkouška jeho aktivity

A.1.1   Příprava oxidu hlinitého

Oxid hlinitý, který byl nejprve tři hodiny sušen v laboratorní pícce při teplotě 380 až 400 °C, se vloží do hermeticky uzavřené nádoby, přidá se destilovaná voda v poměru 5 ml na 100 g oxidu hlinitého, nádoba se ihned uzavře, opakovaně protřepe a poté před použitím nechá nejméně 12 hodin v klidu.

A.1.2   Kontrolaaktivity oxiduhlinitého

Připraví se chromatografická kolona s 30 g oxidu hlinitého. Postupem podle odstavce 5.4. se kolonou nechá projít směs tvořená:

Jestliže po průchodu kolonou má směs charakteristickou extinkci při 268 nm větší než 0,11, je oxid hlinitý přijatelný, pokud ne, úroveň dehydratace musí být zvýšena.

---

DODATEK II

Kalibrace spektrofotometru

A.2	Zařízení musí být v pravidelných intervalech (nejméně jednou za šest měsíců) kontrolováno, pokud jde o vlnovou délku a přesnost odezvy.

A.2.1

Vlnovou délku je možné kontrolovat pomocí rtuťové výbojky nebo pomocí vhodných filtrů.

A.2.2

Při kontrole odezvy fotočlánku a fotonásobiče se postupuje takto: naváží se 0,2000 g čistého chromanu draselného pro spektrofotometrii a rozpustí se v roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 0,05 mol/l v 1 000 ml odměrné baňce a doplní po značku. Odebere se přesně 25 ml získaného roztoku, převede do odměrné baňky na 500 ml a doplní po značku stejným roztokem hydroxidu draselného. Extinkce takto získaného roztoku se změří při vlnové délce 275 nm proti roztoku hydroxidu draselného. Extinkce naměřená pomocí jednocentimetrové kyvety musí být 0,200 ± 0,005.

---

PŘÍLOHA X A

ANALÝZA METHYLESTERŮ MASTNÝCH KYSELIN PLYNOVOU CHROMATOGRAFIÍ

1.   PODSTATA

Tato metoda popisuje použití plynové chromatografie s náplňovými nebo kapilárními kolonami pro stanovení kvalitativního a kvantitativního složení směsi methylesterů mastných kyselin, získaných podle metody uvedené v příloze X B.

Metoda není použitelná pro polymerní mastné kyseliny.

2.   CHEMIKÁLIE

2.1   Nosný plyn

Inertní plyn (dusík, helium, argon, vodík atd.), dokonale vysušený a s obsahem kyslíku menším než 10 mg/kg.

Poznámka 1

Vodík, který je používán pouze na kapilárních kolonách, umožňuje dvakrát zvýšit rychlost analýzy, ale je nebezpečný. Bezpečnostní zařízení jsou dostupná.

2.2   Pomocné plyny

2.2.1

Vodík (čistoty vyšší než 99,9 %), neobsahující organické nečistoty.

2.2.2

Vzduch nebo kyslík, neobsahující organické nečistoty.

2.3   Referenční standard

Směs methylesterů čistých mastných kyselin, nebo methylestery z oleje známého složení; výhodné je složení podobné analyzovanému vzorku.

Pozornost je nutno věnovat ochraně polynenasycených mastných kyselin před oxidací.

3.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Uvedené pokyny se vztahují na obvyklá zařízení používaná pro plynovou chromatografii, používající náplňové, nebo kapilární kolony a plameno-ionizační detektor. Vhodné jsou přístroje dosahující účinnosti a rozlišení uvedené v odstavci 4.1.2.

3.1   Plynový chromatograf

Plynový chromatograf, obsahující následující části:

3.1.1   Injektor

Používá se injektor buď

Poznámka 2

Pokud nejsou přítomny mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku, může být použit injektor s pohyblivou jehlou.

3.1.2   Termostat

Termostat má mít schopnost vyhřát kolonu na teplotu nejméně 260 °C a udržovat žádanou teplotu s přesností na 1 °C v případě náplňové kolony a na 0,1 °C v případě kapilární kolony. Poslední požadavek je důležitý při použití křemenných kolon.

Použití ohřevu s programovanou teplotou je doporučeno ve všech případech, zejména pro mastné kyseliny s méně než 16 atomy uhlíku.

3.1.3   Náplňové kolony

3.1.3.1

Kolona má být vyrobena z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (např. sklo nebo korozivzdorná ocel), a má mít následující rozměry: a) délka: 1 m až 3 m. Relativně kratší kolony by mohly být použity za přítomnosti mastných kyselin s dlouhým řetězcem (nad C20). Při analýzách kyselin se 4 nebo 6 uhlíkovými atomy se doporučuje použít kolonu o délce 2 m; b) vnitřní průměr: 2 až 4 mm. Poznámka 3 Jestliže jsou analyzovány polyenové kyseliny s více než třemi dvojnými vazbami, může na koloně z korozivzdorné oceli docházet k jejich rozložení. Poznámka 4 Může být použit systém s dvěma náplňovými kolonami.

3.1.3.2

Náplň zahrnuje tyto části: a)  nosič: kyselinou praná a silanizovaná křemelina, nebo jiný vhodný inertní nosič s úzkým rozsahem velikosti částic (25 μm v rozmezí mezi 125 μm až 200 μm), přičemž průměrná velikost částic má vztah k vnitřními průměru a délce kolony; b)  stacionární fáze: polární fáze polyesterového typu (např. diethylenglykoljantarát polyester, butandioljantarát polyester, ethylenglykoladipat polyester atd.), kyanosilikony nebo jiné kapaliny splňující požadavky na chromatografickou separaci (viz bod 4). Stacionární fáze by měla tvořit 5 % až 20 % (m/m) z náplně. Pro určitá dělení může být použita nepolární stacionární fáze.

3.1.3.3

Kondicionace kolony Připravená kolona odpojená od detektoru, je-li to možné, se postupně ohřeje v termostatu na teplotu 185 °C za průtoku inertního plynu rychlostí 20 ml/min až 60 ml/min, nechá se nejméně 16 hodin při této teplotě a další dvě hodiny při 195 °C.

3.1.4   Kapilární kolona

3.1.4.1

Trubice má být vyrobena z materiálu, který je inertní k analyzovaným látkám (např. sklo nebo tavený křemen). Vnitřní průměr by se měl pohybovat mezi 0,2 mm až 0,8 mm. Vnitřní povrch by měl být přiměřeným způsobem upraven (např. příprava povrchu, inaktivace). Délka 25 m je ve většině případů dostatečná.

3.1.4.2

Stacionární fáze, obvykle polyethylenglykolového typu (polyethylenglykol 20 000), polyestery (butandioljantarát polyester) nebo polární polysiloxany (kyanosilikony). Vhodné jsou vázané stacionární fáze (zesíťované). Poznámka 5 Při použití polárních polysiloxanů je nebezpečí obtížné identifikace a separace kyseliny linolenové a kyselin C20. Pokrytí by mělo být tenké, např. 0,1 μm až 0,2 μm.

3.1.4.3

Montáž a kondicionace kolony Je nutno zachovat běžnou opatrnost při montáži kapilární kolony, např. úprava kolony v termostatu (nosič), výběr a provedení spojů (netěsné spoje), poloha konce kolony v injektoru a detektoru (zmenšení mrtvých prostorů). Kolono se nechá protékat nosný plyn (např. 0 kPa pro kolonu délky 25 mm a vnitřním průměru 0,3 mm). Kolona se ohřívá v termostatu za programované teploty rychlostí 3 °C/min od teploty okolí do teploty 10 °C pod limitní hodnotu, při které dochází k rozložení stacionární fáze. Termostat se udržuje při této teplotě po dobu jedné hodiny, dokud nedojde k ustálení základní linie. Potom se termostat ochladí na 180 °C a pracuje se za isotermních podmínek. Poznámka 6 Vhodné kondiciované kolony jsou obchodně dostupné.

3.1.5

Detektor; vhodnější je detektor vyhřívaný na teplotu vyšší, než je teplota kolony.

3.2   Stříkačka

Stříkačka o maximálním objemu 10 μl, dělená po 0,1 μl.

3.3   Zapisovač

Jestliže je pro výpočet složení analyzované směsi použit záznam zapisovače, je nutno použit elektronický zapisovač s vysokou přesností, slučitelný s přístrojem. Zapisovač by měl mít následující charakteristiky:

3.4   Integrátor nebo kalkulátor (volitelný)

Rychlý a přesný výpočet může být proveden pomocí elektronického integrátoru nebo kalkulátoru. Ten má poskytovat lineární odezvu s odpovídající citlivostí a uspokojivou korekcí na opravu základní linie.

4.   POSTUP

Postup popsaný v odstavcích 4.1 až 4.3 se týká použití plameno-ionizačního detektoru.

Může být použít plynový chromatograf vybavený detektorem pracujícím na principu tepelné vodivosti (katarometrem), který pracuje na principu změn tepelné vodivosti. Pracovní podmínky je třeba v tomto případě upravit tak, jak je uvedeno v bodu 6.

4.1   Zkušební podmínky

4.1.1

Výběr optimálních pracovních podmínek 4.1.1.1 Náplňové kolony Při výběru pracovních podmínek je nutno přihlížet k následujícím proměnným: a) délka a průměr kolony; b) povaha a množství stacionární fáze; c) teplota kolony; d) průtok nosného plynu; e) požadované rozlišení; f) velikost nástřiku zvolená tak, aby sestava detektoru a elektrometru dávala lineární odezvu; g) trvání analýzy. Obecně hodnoty uvedené v tabulkách 1 a 2 povedou k požadovaným výsledkům, tj. nejméně 2 000 teoretických pater na metr délky kolony pro methylstearát a jeho eluci v průběhu přibližně 15 minut. Jestliže to přístrojové vybavení dovolí, měla by být teplota injektoru přibližně 200 °C a detektoru stejná nebo vyšší než je teplota kolony. Platí pravidlo, že poměr průtoku vodíku přiváděného do plameno-ionizačního detektoru k průtoku nosného plynu by se měl pohybovat v rozmezí 1:2 až 1:1 v závislosti na průměru kolony. Průtok kyslíku by měl být 5krát až 10krát vyšší než průtok vodíku. Tabulka 1 Vnitřní průměr kolony mm Průtok nosného plynu ml/min 2 15 až 25 3 20 až 40 4 40 až 60 Tabulka 2 Koncentrace stacionární fáze % (m/m) Teplota kolony °C 5 175 10 180 15 185 20 185 4.1.1.2 Kapilární kolona Účinnost a permeabilita kapilární kolony způsobují, že dělení složek a doba trvání analýzy jsou značně závislé na průtoku nosného plynu kolonou. Je proto nezbytné optimalizovat pracovní podmínky působením na tyto parametry (nebo jednodušeji na tlakovou ztrátu na koloně) podle toho, zda je cílem zlepšit dělení, nebo zrychlit analýzu.

4.1.2

Stanovení počtu teoretických pater (účinnosti) a rozlišení (viz obrázek 1) Provede se analýza směsi přibližně stejného množství methylstearátu a methyloleátu (např. methylestery z kakaového másla). Teplota kolony a průtok nosného plynu se nastaví tak, aby maximum píku methylstearátu bylo zaznamenáno přibližně 15 minut po píku rozpouštědla. Použijte dostatečné množství směsi methylesterů, aby výška píku methylstearátu dosahovala přibližně tří čtvrtin rozsahu stupnice. Počet teoretických pater n (účinnost) se vypočítá podle vzorce: a rozlišení R podle vzorce: kde dr1 je vzdálenost v mm od počátku chromatogramu do maxima píku methylstearátu; ω1 a ω2 jsou šířky v mm píků methylstearátu a methyloleátu změřené mezi průsečíky tangent vedenými inflexními body na píku a základní linií; Δ je vzdálenost mezi maximy píků methylstearátu a methyloleátu v mm; ▼M2 a rozlišovací index Ir pomocí vzorce kde a = výška nejnižšího píku měřená od základní linie a b = výška nejnižšího bodu sedla mezi dvěma sousedními píky měřená od základní linie. ▼B Obrázek 1 Chromatogram pro stanovení počtu teoretických pater (účinnosti) a rozlišení Při stanovení by měly být nastaveny pracovní podmínky poskytující nejméně 2 000 teoretických pater na jeden metr délky kolony pro methylstearát a rozlišení nejméně 1,25.

4.2   Nástřik vzorku

Za použití stříkačky (3.2) se na kolonu chromatografu nastříkne 0,1 μl až 2 μl roztoku methylesterů připravených podle přílohy X B.

Pokud methylestery nejsou v roztoku, připraví se roztok přibližně 100 mg v 1 ml heptanu pro chromatografii a nastřikuje se 0,1 μl až 1 μl tohoto roztoku.

Jestliže jsou analyzovány složky přítomné pouze ve stopových množstvích, velikost nástřiku může být zvýšena (až desetinásobně).

4.3   Analýza

Pracovní podmínky by měly být nastaveny podle odstavce 4.1.1.

Pokud jsou analyzovány mastné kyseliny s méně než 12 atomy uhlíku, lze pracovat při nižší teplotě. Při analýzách mastných kyselin s více než 20 atomy uhlíku lze pracovat naopak při teplotě vyšší. Je také možno použít v obou těchto případech programové teploty. Např. při analýze vzorku, který obsahuje methylestery mastných kyselin s méně než 12 atomy uhlíku nastřikujeme vzorek při teplotě 100 °C (nebo 50 °C až 60 °C, je-li přítomna kyselina máselná) a okamžitě se zvyšuje teplota rychlostí 4 Co/min až 8 °C/min až na optimální hodnotu. V některých případech mohou být oba postupy kombinovány.

Po ukončení programovaném ohřevu pokračuje eluce při konstantní teplotě, dokud nejsou eluovány všechny složky. Jestliže přístroj není vybaven programováním teploty, je možno použít dvě teploty mezi 100 °C a 195 °C.

Jestliže je to nutné, je doporučeno provést analýzu na dvou zakotvených fázích o různé polaritě, aby byla ověřena nepřítomnost maskovaných píků, například v případě současného výskytu C18:3 a C20:0, nebo C18:3 a konjugovaných C18:2.

4.4   Příprava referenčního chromatogramu a referenčních grafů

Provádí se analýza referenční standardní směsi (2.3) za stejných pracovních podmínek, které byly použity při analýze vzorku, měřením retenčních časů nebo retenčních vzdáleností pro základní mastné kyseliny. Do semilografického grafu se vynesou logaritmy retenčních časů nebo vzdáleností pro jednotlivé stupně nasycenosti proti počtu atomů uhlíku. Za isotermních podmínek by měla být závislost pro kyseliny s rovným řetězcem stejného stupně nasycenosti lineární. Tyto přímky by měly být přibližně rovnoběžné.

Je nutné stanovit podmínky k vyvarování se přítomnosti „maskovaných píků“ v případě, že rozlišení je nedostatečné k rozdělení dvou složek.

5.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

5.1   Kvalitativní analýza

Provede se identifikace píků methylesterů pro vzorek z grafu podle 4.4; podle potřeby se interpoluje.

5.2   Kvantitativní analýza

5.2.1   Určení složení

Až na výjimečné případy lze použít metody vnitřní normalizace, tj. za předpokladu, že všechny složky vzorku jsou zaznamenány na chromatogramu, představuje celková plocha píků 100 % (celková eluce).

Jestliže je přístroj vybaven integrátorem, použijí se výsledky získané tímto způsobem. Není-li integrátor k dispozici, vypočte se plocha každého píku vynásobením výšky píku šířkou píku v poloviční výšce a podle potřeby se použije ve výpočtu změna zeslabení použitá při záznamu chromatogramu.

5.2.2   Výpočet

5.2.2.1

Obecný případ Obsah složky i vyjádřený v hmotnostních procentech methylesterů se vypočítá určením plochy odpovídajícího píku vzhledem k součtu ploch všech píků podle vzorce: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, ΣA je součet ploch všech píků. Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo. Poznámka 7 V tomto obecném případě je výsledek založen na předpokladu, že plocha píku představuje hmotnostní procenta. V případech, že tento předpoklad neplatí, viz 5.2.2.2.

5.2.2.2

Použití korekčních faktorů V některých případech, zvláště za přítomnosti mastných kyselin s méně než 8 atomy uhlíku, nebo kyselin se sekundární skupinou v případě použití detektoru pracujícího na principu tepelné vodivosti, nebo je-li požadována zvláště vysoká přesnost, by měly být použity korekční faktory k převedení plochy píku vyjádřené v procentech na hmotnostní procenta složek. Určení korekčních faktorů za pomoci chromatogramu referenční směsi methylesterů známého složení se provádí za stejných pracovních podmínek, jaké byly použity při analýze vzorku. Pro tyto referenční směsi se obsah v hmotnostních procentech vypočte podle vzorce: kde mi je hmotnost složky i v referenční směsi, Σm je celková hmotnost všech složek v referenční směsi. Z chromatogramu referenční směsi (4.4) se vypočítá procentní podíl ploch (plocha/plocha) pro složku i takto: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, ΣA součet ploch všech píků. Korekční faktor se vypočítá podle vzorce Obecně se korekční faktory vyjádří ve vztahu ke KC16 jako relativní faktor: Pro vzorek se vyjádří obsah každé složky i v hmotnostních procentech methylesteru jako: Výsledky se vypočítají s přesností na jedno desetinné místo.

5.2.2.3

Použití vnitřního standardu V některých případech (např. když nejsou kvantifikovány všechny mastné kyseliny, k čemuž dochází, jsou-li přítomny kyseliny se čtyřmi a šesti atomy uhlíku současně s kyselinami s 16 a 18 atomy uhlíku, nebo když je třeba určit absolutní množství mastných kyselin ve vzorku) by měl být použit vnitřní standard. Jako vnitřní standard se používají nejčastěji methylestery mastných kyselin s 5, 15 nebo 17 atomy uhlíku. Pro vnitřní standard by měl být stanoven korekční faktor (pokud se použije). Hmotnostní procenta složky i vyjádřená jako methylester lze vypočítat podle vzorce: kde Ai je plocha píku odpovídající složce i, As plocha píku odpovídající vnitřnímu standardu, K′i korekční faktor pro složku i (vztažený na KC16), K′s korekční faktor pro vnitřní standard (vztažený na KC16), m hmotnost zkušebního vzorku v mg, ms hmotnost vnitřního standardu v mg. Výsledek se vypočítá s přesností na jedno desetinné místo.

▼M2

6.   ZVLÁŠTNÍ PŘÍPAD – STANOVENÍ TRANS-ISOMERŮ

Obsah trans-isomerů mastných kyselin s počtem atomů uhlíku mezi 10 až 24 je možné stanovit separací methylesterů pomocí kapilární plynové chromatografie s kolonami se specifickou polaritou.

6.1	Kapilární kolona z křemene o vnitřním průměru 0,25 až 0,32 mm a délce 50 m, potažená vrstvou kyanopropisilikonu o tloušťce 0,1 až 0,3 μm (typ SP 2380, C. P. sil 88, silor 10 a podobné typy).

6.2	Methylestery se připravují postupem popsaném v příloze X B. Tukové látky s obsahem volných kyselin vyšším než 3 % musí být předem neutralizovány v souladu s bodem 6.1 přílohy VII.

6.3

Laboratorní podmínky pro plynovou chromatografii jsou tyto: — teplota kolony nastavitelná na teplotu od 150 do 230 °C (například 165 °C po dobu 15 minut a poté narůstající o 5 °C za minutu na 200 °C), — teplota vstřikovací jednotky: 250 °C při nástřiku pomocí děliče (split type), nebo počáteční teplota kolony při použití systému nástřiku bez dělení přímo na kolonu (on column), — teplota detektoru: 260 °C, — rychlost průtoku nosného plynu (helium a vodík): 1,2 ml za minutu. Vstříknuté množství musí být takové, aby za daných podmínek citlivosti byla výška píku odpovídajícího methylesteru kyseliny arachidové nejméně 20 % spodní části škály.

6.4

Stanovení jednotlivých methylesterů se provádí na základě retenčních časů, které jsou porovnány s retenčními časy referenčních směsí (viz bod 2.3.). Estery trans-mastných kyselin se eluují před odpovídajícími cis-isomery. Příklad chromatogramu je uveden na obrázku 2. Obrázek 2 Chromatogram pro stanovení trans-isomerů mastných kyselin pomocí kapilární plynové chromatografie

6.5	Účinnost kolony podle bodu 4.1.2. musí umožňovat separaci určitých kritických párů, například páru tvořeného masívem píků kyseliny trans-olejové a píkem kyseliny cis-olejové, trans- C18:1/cis- C18:1, s rozlišovacím indexem vyšším než 2.

6.6

Procentní podíl jednotlivých trans-mastných kyselin se vypočítá na základě vztahu mezi danými plochami píků a součtem ploch všech přítomných píků. Pro jednotlivé kyseliny se berou v úvahu tyto procentní podíly: — trans-oktadecenové kyseliny (T 18: 1) podle přílohy I k tomuto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny olejové, — cis-trans- a trans-cis-oktadekadienové kyseliny [(CT/TC) 18: 2] podle přílohy I tohoto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny linolové, — trans-cis-trans-, cis-cis-trans-, cis-trans-cis- a trans-cis-cis-oktadekatrienové kyseliny [(TCT + CCT + CTC + TCC)18: 3] podle přílohy I tohoto nařízení jako úhrn trans-isomerů kyseliny linolenové. Poznámka 8: S přihlédnutím ke zvláštním charakteristikám této metody je výsledky nutno uvádět na dvě desetinná místa.

▼B

►M2  7. ◄    SPECIÁLNÍ PŘÍPAD: POUŽITÍ KATAROMETRU (DETEKTORU PRACUJÍCÍHO NA PRINCIPU ZMĚN TEPELNÉ VODIVOSTI)

Plynový chromatograf vybavený detektorem pracujícím na principu změn tepelné vodivosti (katarometr) může být rovněž použit pro kvalitativní a kvantitativní stanovení složení směsi methylesterů mastných kyselin. Při jeho použití by podmínky uvedené v odstavcích 3 a 4 měly být upraveny podle tabulky 3.

Pro kvantitativní analýzu je definováno použití korekčních faktorů v 5.2.2.2.

►M2  8. ◄    PROTOKOL O ZKOUŠCE

Protokol musí obsahovat odkaz na použitou metodu pro přípravu methylesterů a jejich stanovení plynovou chromatografií a získané výsledky. Dále zahrnuje všechny pracovní podrobnosti nespecifikované v této mezinárodní normě nebo považované za volitelné, jakož i další okolnosti, které mohou ovlivnit výsledek.

Protokol musí obsahovat všechny informace nutné pro kompletní identifikaci vzorku.

▼M19

---

ANNEX X B

PREPARATION OF THE FATTY ACID METHYL ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

The following two methods are recommended for preparing the fatty acid methyl esters from olive oils and olive-pomace oils:

Method A

:

Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

Method B

:

Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium.

Each method will be applied according to the analytical parameter to be determined and the oil category as indicated below:

PURIFICATION OF OIL SAMPLES

When necessary, the samples will be purified by passing the oil through a silica gel column, eluting with hexane/diethyl ether (87:13, v/v) as described in IUPAC method 2.507.

Alternatively, solid-phase extraction on silica gel phase cartridges can be used. A silica gel cartridge (1 g, 6 ml) is placed in a vacuum elution apparatus and washed with 6 ml of hexane. The vacuum is released to prevent the column from becoming dry and then a solution of the oil (0,12 g approximately) in 0,5 ml of hexane is loaded into the column and vacuum is applied. The solution is pulled down and then eluted with 10 ml of hexane/diethyl ether (87:13 v/v) under vacuum. The combined eluates are homogenised and divided in two similar volumes. An aliquot is evaporated to dryness in a rotary evaporator under reduced pressure at room temperature. The pomace is dissolved in 1 ml of heptane and the solution is ready for fatty acid analysis by GC. The second aliquot is evaporated and the pomace is dissolved in 1 ml of acetone for triglyceride analysis by HPLC, if necessary.

METHODS FOR PREPARING THE FATTY ACID METHYL ESTERS

1.   Method A: Trans-esterification with cold methanolic solution of potassium hydroxide

1.1.   Purpose

This rapid method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of less than 3,3 %. Free fatty acids are not esterified by potassium hydroxide. Fatty acid ethyl esters are trans-esterified at a lower rate than glyceridic esters and may be only partially methylated.

1.2.   Principle

Methyl esters are formed by trans-esterification with methanolic potassium hydroxide as an intermediate stage before saponification takes place (title 5 in ISO-5509:2000, title 5 in IUPAC method 2.301).

1.3.   Reagents

Methanol containing not more than 0,5 % (m/m) water.

Heptane, chromatographic quality.

Potassium hydroxide, approximately 2 N methanolic solution: dissolve 11,2 g of potassium hydroxide in 100 ml of methanol.

1.4.   Apparatus

Screw-top test tubes (5 ml volume) with cap fitted with a PTFE joint.

Graduated or automatic pipettes, 2 ml and 0,2 ml

1.5.   Procedure

In a 5 ml screw-top test tube weigh approximately 0,1 g of the oil sample. Add 2 ml of heptane, and shake. Add 0,2 ml of 2 N methanolic potassium hydroxide solution, put on the cap fitted with a PTFE joint, tighten the cap, and shake vigorously for 30 seconds. Leave to stratify until the upper solution becomes clear. Decant the upper layer containing the methyl esters. The heptane solution is suitable for injection into the gas chromatograph. It is advisable to keep the solution in the refrigerator until gas chromatographic analysis. Storage of the solution for more than 12 hours is not recommended.

2.   Method B: Methylation by heating with sodium methylate in methanol followed by esterification in acid medium

2.1.   Purpose

This method is applicable to olive oils and olive-pomace oils with a free fatty acid content of more than 3,3 %.

2.2.   Principle

Neutralisation of the free fatty acids and alkaline methanolysis of the glycerides, followed by esterification of the fatty acids in acid medium (title 4.2. in IUPAC method 2.301).

2.3.   Reagents

2.4.   Apparatus

2.5.   Procedure

Transfer about 0,25 g of the oil sample into a 50 ml ground-necked volumetric flask. With the aid of a funnel, add 10 ml of 0,2 N sodium methylate in methanol and the boiling chips. Fit a reflux condenser, shake, and bring to the boil. The solution should become clear, which usually occurs in about 10 minutes. The reaction is complete after 15 minutes. Remove the flask from the source of heat, wait until the reflux stops, remove the condenser, and add two drops of phenolphthalein solution. Add a few ml of 1 N sulphuric acid in methanol solution until the solution becomes colourless and then add 1 ml in excess. Fit the condenser and boil again for 20 minutes. Withdraw from the source of heat and cool the flask under running water. Remove the condenser, add 20 ml of saturated sodium chloride solution, and shake. Add 5 ml of heptane, plug the flask, and shake vigorously for 15 seconds.

Leave to settle until the two phases have separated. Add saturated sodium chloride solution again until the aqueous layer reaches the lower end of the flask neck. The upper layer containing the methyl esters fills the flask neck. This solution is ready to be injected in the GC.

Caution: Methylation by method B must be done under a hood.

2.6.   Alternatives to methylation Method B

2.6.1.   Method C

2.6.1.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is treated with methanol-hydrochloric acid, in a sealed vial, at 100 °C.

2.6.1.2.   Apparatus

2.6.1.3.   Reagents

Solution of hydrochloric acid in 2 % methanol. This is prepared from gaseous hydrochloric acid and anhydrous methanol (Note 1).

Hexane, chromatographic quality.

Commercial solutions of hydrogen chloride in methanol can be used. Small amounts of gaseous hydrochloric acid can easily be prepared in the laboratory by simple displacement from the commercial solution (p = 1,18) by dripping concentrated sulphuric acid. Since hydrochloric acid is very rapidly absorbed by methanol, it is advisable to take the usual precautions when dissolving it, e.g. introduce the gas through a small inverted funnel with the rim just touching the surface of the liquid. Large quantities of methanolic hydrochloric acid solution can be prepared in advance, as it keeps perfectly in glass-stoppered bottles stored in the dark. Alternatively, this reagent can be prepared by dissolution of acetyl chloride in anhydrous methanol.

2.6.1.4.   Procedure

2.6.2.   Method D

2.6.2.1.   Principle

The fatty matter undergoing analysis is heated under reflux with methanol-hexane-sulphuric acid. The methyl esters obtained are extracted with petroleum ether.

2.6.2.2.   Apparatus

2.6.2.3.   Reagents

2.6.2.4.   Procedure

Place 0,1 g of oil in the 20 ml test tube and add 5 ml of methylation reagent.

Fit the reflux condenser and heat for 30 minutes in a boiling water bath (Note 2).

Transfer quantitatively the mixture into a 50 ml separating funnel, with the aid of 10 ml distilled water and 10 ml petroleum ether. Shake vigorously, and allow the phases to separate, remove the aqueous phase and wash the ether layer twice with 20 ml distilled water. Add to the separating funnel a small quantity of anhydrous sodium sulphate, shake, allow to settle for a few minutes and filter, collecting the filtrate in a 15 ml test tube with a conical base.

Evaporate the solvent over a water bath in a current of nitrogen.

Note 2: To control boiling, insert a glass rod into the test tube and limit the temperature of the water bath to 90 °C.

3.   Precision parameters

The statistical evaluation of the precision of methods A and B was published by the International Olive Oil Council in its method COI/T.20/CO. No 24.

RECOMMENDATIONS FOR GAS CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF THE FATTY ACID ESTERS FROM OLIVE OIL AND OLIVE-POMACE OIL

1.   Procedure

The gas chromatographic analysis of solutions of fatty esters in heptane is to be carried out according to standard ISO-5508 using a capillary column (50 m length x 0,25 or 0,32 mm i.d.) impregnated with cyanopropylsilicone phase as indicated for the determination of fatty acid trans-isomers (COI/T.20/Doc. no. 17).

Figure 1 gives the typical gas chromatographic profile of an olive-pomace oil containing methyl and ethyl esters of fatty acids, and trans-isomers of methyl esters.

2.   Calculations

2.1.

For the calculation of the fatty acid composition and ΔECN42, all the following fatty acids will be taken into account: Myristic (C14:0). Palmitic (C16:0). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters. Palmitoleic (C16:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester. Margaric (C17:0). Margaroleic (C17:1). Stearic (C18:0). Oleic (C18:1). Sum of the areas of the peaks corresponding to the ω9 and ω7 isomers of the methyl ester, ethyl ester, and trans-isomers of the methyl ester. Linoleic (C18:2). Sum of the areas of the peaks corresponding to the methyl and ethyl esters, and the trans-isomers of the methyl ester. Arachidic (C20:0). Linolenic (C18:3). Sum of the areas of the methyl ester and the trans-isomers of the methyl ester. Eicosenoic (C20:1). Behenic (C22:0). Lignoceric (C24:0). Squalene will not be taken into account for the calculation of the total area.

2.2.

For the calculation of the percentage of trans-C18:1 the peak corresponding to the methyl esters of this fatty acid is to be used. For the sum [trans-C18:2 + trans-C18:3], all the peaks corresponding to the trans-isomers of these two fatty acids are to be added together. For the calculation of the total area, all the peaks mentioned in 2.1. are to be taken into account (see COI/T.20/Doc. No. 17). The calculation of the percentage of each fatty acid will be carried out according to the formula: Figure 1: Gas chromatographic profile obtained by the cold methylation method from olive-pomace oil. The chromatographic peaks correspond to the methyl and ethyl esters except where otherwise indicated.

▼B

---

PŘÍLOHA XI

STANOVENÍ OBSAHU TĚKAVÝCH HALOGENOVANÝCH ROZPOUŠTĚDEL V OLIVOVÉM OLEJI

1.   PODSTATA

Tato metoda popisuje analýzu plynovou chromatografií s použitím techniky parního prostoru (head space).

2.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

2.1	Plynový chromatograf vybavený detektorem elektronového záchytu (ECD).

2.2	Zařízení pro přípravu vzorku v parním prostoru (head space).

2.3	Skleněná kolona pro plynovou chromatografii o délce 2 m a průměru 2 mm se stacionární fází tvořenou 10 % OV101 nebo ekvivalentem, zachycenou v kyselinou prané a silanizované křemelině s velikostí částic 80-100 mesh.

2.4	Nosný a pomocný plyn: dusík pro plynovou chromatografii, vhodný pro detektor elektronového záchytu.

2.5	Skleněné baňky na 10 až 15 ml s teflonovým povlakem a hliníkovým uzávěrem s vybavením pro vpich stříkačky.

2.6	Hermeticky těsnící svorky.

2.7	Plynová stříkačka na 0,5 až 2 ml.

3.   CHEMIKÁLIE

Standard: halogenovaná rozpouštědla se stupněm čistoty vhodným pro plynovou chromatografii.

4.   POSTUP

4.1

Do skleněné baňky se přesně naváží přibližně 3 g oleje (nesmí být použita opakovaně); baňka se hermeticky uzavře. Baňka se vloží na jednu hodinu do termostatu nastaveného na 70 °C. Pomocí stříkačky se opatrně odebere 0,2 až 0,5 ml z parního prostoru. Obsah stříkačky se nastříkne na kolonu chromatografu nastaveného takto: — teplota vstřiku: 150 °C, — teplota kolony: 70 až 80 °C, — teplota detektoru: 200 až 250 °C. Mohou být použity i jiné teploty, pokud se dosáhne ekvivalentních výsledků.

4.2	Referenční roztoky: s použitím rafinovaného olivového oleje beze stop rozpouštědel se připraví standardní roztoky s různými koncentracemi těkavých halogenovaných rozpouštědel o hodnotách 0,05 mg/kg až 1 mg/kg. V případě potřeby se halogenovaná rozpouštědla rozředí pentanem.

4.3

Kvantitativní vyhodnocení: porovnejte plochy nebo výšky píků vzorku a standardního roztoku, jehož koncentrace se nejvíce blíži předpokládané koncentraci. Je-li odchylka větší než 10 %, analýza musí být opakována, tj. musí být provedeno porovnání s dalším standardním roztokem, dokud nebude odchylka menší než 10 %. Obsah se stanoví na základě průměru jednotlivých vstřiků.

4.4	Vyjádření výsledků: v mg/kg (ppm). Detekční limit činí u této metody 0,01 mg/kg.

▼M19

---

ANNEX XII

ORGANOLEPTIC ASSESSMENT OF VIRGIN OLIVE OILS

1.   PURPOSE AND SCOPE

This Annex sets the criteria required for organoleptic assessment of the virgin oils defined at 1 in the Annex to Regulation No 136/66/EEC and describes the method of grading them with reference to characteristics.

This method can be used only for grading virgin oils on the basis of fruitiness and intensity of defects by a group of selected trained tasters operating as a panel in line with section 4.

2.   GENERAL

For the general basic vocabulary, the tasting room, the general methodology and the tasting glass compliance with the stipulations of the International Olive Oil Council is recommended.

3.   SPECIFIC VOCABULARY

3.1.   Positive attributes

Fruity: range of smells (dependent on variety) characteristic of oil from healthy fresh fruit, green or white, perceived directly or retronasally.

Bitter: characteristic taste of oil from green olives or olives turning colour.

Pungent: tingling sensation characteristic of oil made at the beginning of the season mainly from olives that are still green.

3.2.   Negative attributes

Atrojado (fusty): characteristic flavour of oil from piled olives in advanced anaerobic fermentation.

Mustiness/humidity: characteristic flavour of oil from olives in which large numbers of fungi and yeasts had developed as a result of storage for several days in humid conditions.

Muddy sediment: characteristic flavour of oil that has remained in contact with sediment in vats and tanks.

Winey/vinegary: characteristic flavour of certain oils reminiscent of wine or vinegar, due basically to formation of acetic acid, ethyl acetate and ethanol by fermentation of the olives.

Metallic: flavour reminiscent of metal, characteristic of oil that has been in prolonged contact with metal surfaces during crushing, mixing, pressing or storage.

Rancid: flavour of oil that has become oxidised.

Heated or burnt: characteristic flavour caused by excessive and/or prolonged heating during production, particularly by thermo-mixing of the paste in unsuitable conditions.

Hay/wood: characteristic flavour of certain oils from dry olives.

Rough: thick and pasty mouthfeel produced by some oils.

Greasy: flavour reminiscent of diesel, grease or mineral oil.

Vegetable water: flavour acquired by oil through prolonged contact with the vegetable water.

Brine: flavour of oil from olives preserved in salt solution.

Esparto: characteristic flavour of oil from olives pressed in new esparto mats. It can vary according to whether the mats are of green or dried esparto.

Earthy: flavour of oil from olives collected with earth or mud on them and not washed.

Grubby: flavour of oil from olives heavily attacked by grubs of the olive fly (Bactrocera oleae).

Cucumber: characteristic flavour of oil kept too long in hermetically sealed containers, notably in tins, attributed to formation of 2,6-nonadienal.

4.   PANEL

The panel is appointed by the Member State and consists of a panel head and from eight to twelve tasters. However, for the 2001/02 marketing year, the panel may consist of fewer than eight tasters.

The panel head must be a soundly trained expert in the various types of oil. He or she is responsible for the panel and its organisation and operation, including preparation, coding and presentation of the samples to the tasters and collection and processing of the data.

He or she selects the testers, sees to their training and checks that their performance remains of adequate standard.

The testers must be selected and trained on account of their skill in distinguishing between similar samples. The International Olive Oil Council's manual on the selection, training and monitoring of qualified virgin oil tasters must be followed.

Panels must undertake to participate in national, Community and international organoleptic assessments organised for the purposes of periodic monitoring and harmonisation of perception criteria. They must also provide the Member State concerned with full information each year on the composition of the panel and the number of assessments made in their capacity as an approved panel.

5.   PROCEDURE FOR ORGANOLEPTIC ASSESSMENT AND GRADING

5.1.   Use of profile sheet by taster

The profile sheet to be used by the taster is reproduced as Appendix A.

Tasters must each smell and then taste ( 5 ) the oil submitted for examination contained in the tasting glass, analysing their olfactory, gustatory, tactile and kinaesthetic perceptions and mark on the sheet the intensity of their perception of each negative and positive attribute.

If negative attributes not listed on the profile sheet are perceived these must be noted under “Other” using those of the terms defined in 3.2 above that best describe them.

5.2.   Processing of data by panel head

The panel head collects the profile sheets completed by the tasters and scrutinises the intensities assigned. In the event of an anomaly he or she will ask tasters to re-examine their sheet and if necessary repeat the test.

The panel head may feed each tester's data into a computer programme for calculating the median (Appendix B). Input of each sample shall be made with the help of a grid of 10 vertical columns for the 10 sensory attributes and one line for each panel member.

If a negative attribute is mentioned under “Other” by 50 % of the panel the head must calculate the median for this attribute and grade accordingly.

In cases of assessment in connection with monitoring of conformity to standards and of counter-assessment the panel head shall arrange for the assessment to be repeated twice at intervals of at least one day. The attribute medians shall be calculated using the data from the profile sheets of the three assessments.

5.3.   Grading of oils

The oil is graded as follows in line with the median of the defects and the median for “fruity”. By this is understood the median of the negative attribute perceived with greatest intensity. The value of the robust variation coefficient for this negative attribute must be no greater than 20 %.

From 1 November 2003 categories c) and d) are replaced by:

5.4.   Special case

If the median of a positive attribute other than “fruity” is above 5,0 the panel head must note this on the analysis certificate.

---

APPENDIX A

---

APPENDIX B

METHOD OF CALCULATING MEDIAN AND CONFIDENCE INTERVALS

Median

The median is the real number Xm characterised by the fact that the probability (P) that the values of the distribution (X) are below that number (Xm) is not more than 0,5 and that simultaneously the probability (P) that the values of the distribution (X) are not above Xm is not less than 0,5. Another definition considers the median to be the 50th percentile of a distribution of numbers ranked in order of increase. In other terms the median represents the central value of an ordered series of uneven numbers or the average of the two central values of an ordered series of even numbers.

Robust standard deviation

To obtain a reliable estimate of the variability that arises around the median recourse is required to the Stuart and Kendall method of estimating the robust standard deviation. The formula for the asymptotic standard deviation S involves N and IQR. N is the number of observations and IQR the interquartile range, i.e. the robust estimate of the variability of the data under consideration (the interquartile range covers exactly 50 % of the cases of any probability distribution). The interquartile range is given by calculating the size of the deviation between the 75th and the 25th percentiles.

The percentile is the value Xpc characterised by the fact that the probability (P) that the valves of the distribution are below Xpc is not more than a determined hundredth and that simultaneously the probability (P) that the valves of the distribution are not above Xpc is not less than the said hundredth. The hundredth indicates the distribution fraction used. In the case of the median this is 50/100.

In other words the percentile is the distribution value corresponding to a determined area plotted from the distribution or density curve. For example, the 25th percentile represents the distribution value corresponding to an area equal to 0,25 or 25/100.

Robust variation coefficient %

The RVC represents a pure number, i.e. without dimension, that indicates the percentage of variability of the series of numbers analysed against the Av value of the median. For that reason it is very useful for verifying the reliability of the panel members.

Confidence intervals at 95 % on the median

The confidence intervals (C.I.) at 95 % (value of the error of first kind equal to 0,05 or 5 %) represent the range in which the value of the median would be able to vary should it be possible to repeat the experiment an infinite number of times. In practice this interval indicates the range of variability of the test under the operating conditions selected should it be possible to repeat the test several times. The interval helps evaluate, as in the case of the RVC, the reliability of the test.

where c in the case of a confidence interval of 0,95 is equal to 1,96.

Grading is effected by comparing the median values with the reference ranges set in section 5.3. The software package permits a visualised grading on a table of the statistics or on a graph.’

▼M20 —————

▼M19 —————

▼B

---

PŘÍLOHA XV

1.   STANOVENÍ OBSAHU OLEJE V OLIVOVÝCH POKRUTINÁCH

1.1   Přístroje a pomŭcky

1.2   Chemikálie

Technický hexan, jehož odparek nesmí být větší než 2 mg na 100 ml rozpouštědla.

2.   POSTUP

2.1   Příprava zkušebního vzorku

V případě potřeby se k rozemletí laboratorního vzorku použije předem dobře vyčištěný mechanický mlýnek, aby částice zcela prošly sítem.

Asi jedna dvacetina vzorku se použije pro vyčištění mlýnku; tento rozemletý materiál se vyhodí. Zbytek se rozemele a shromáždí, důkladně promíchá a neprodleně analyzuje.

2.2   Velikost zkušebního vzorku

Po dokončení mletí se naváží asi 10 g vzorku s přesností na 0,01 g.

2.3   Příprava extrakční patrony

Zkušební vzorek se převede do extrakční patrony a utěsní se vatovým tamponem. Je-li použit filtrační papír, zkušební vzorek se do něj zabalí.

2.4   Vysušení předem

Jsou-li olivové pokrutiny velmi vlhké (tj. vlhkost a obsah těkavých látek je vyšší než 10 %), provede se vysušení předem umístěním naplněné extrakční patrony (nebo filtračního papíru) na vhodnou dobu do sušárny vyhřáté na teplotu nejvýše 80 °C, aby došlo ke snížení vlhkosti a obsahu těkavých látek na hodnotu menší než 10 %.

2.5   Příprava extrakční baňky

Extrakční baňka s několika kousky pemzy, která byla předem vysušena v sušárně při teplotě 103 ± 2 °C a zchlazena po dobu nejméně 1 hodiny v exsikátoru, se zváží s přesností na 1 mg.

2.6   První extrakce

Extrakční patrona (nebo filtrační papír) se zkušebním vzorkem se vloží do extrakčního přístroje. Do baňky se nalije potřebné množství hexanu. Extrakční baňka se nasadí na extrakční přístroj a to celé se umístí na elektricky vyhřívanou lázeň. Extrakční baňka se zahřívá tak, aby kondenzace extrakčního rozpouštědla byla nejméně 3 kapky za sekundu (tzn. mírný, ne prudký var). Extrahuje se 4 hodiny. Potom se extrakční přístroj nechá vychladnout. Extrakční patrona se vyjme z extrakčního přístroje a postaví se do proudu vzduchu, aby se odpařila většina rozpouštědla.

2.7   Druhá extrakce

Obsah extrakční patrony se vysype do mikromlýnku a co nejjemněji se rozemele. Rozemletá směs se převede zpět do extrakční patrony, která se vloží zpět do extrakčního přístroje.

Znovu se extrahuje další dvě hodiny do téže extrakční baňky, obsahující již prvou část extraktu.

Roztok obsažený v extrakční baňce musí být čirý. Není-li tomu tak, je nutno jej přefiltrovat přes filtrační papír, přičemž původní baňka a filtrační papír se několikrát propláchnou hexanem. Filtrát a proplachovací rozpouštědlo se převede do druhé předem vysušené baňky zvážené s přesností na 1 mg.

2.8   Odstranění rozpouštědla a vážení extraktu

Větší část rozpouštědla se z extrakční baňky odstraní oddestilováním na elektricky vyhřívané lázni. Poslední stopy rozpouštědla se odstraní zahříváním extrakční baňky po dobu 20 minut v sušárně při 103 ± 2 °C. Zbytku rozpouštědla se mohou odstranit proudem vzduchu, anebo výhodněji inertním plynem zaváděným do baňky po krátkou dobu, nebo pod vakuem.

Baňky s vyextrahovaným olejem se nechají vychladnout na okolní teplotu po dobu nejméně jedné hodiny a zváží se s přesností na 1 mg.

Zvážené baňky se za stejných podmínek znovu zahřívají po dobu 10 minut, opět se nechají vychladnout v exsikátoru a znovu se zváží.

Rozdíl mezi dvěma váženími nesmí být vyšší než 10 mg. Pokud je rozdíl vyšší, opakuje se zahřívání, vychlazení a vážení tak dlouho, dokud rozdíl mezi dvěma po sobě následujícími váženími je nejvýše 10 mg. Potom se zaznamená konečná hmotnost baňky.

Na stejném zkušebním vzorku se vždy provedou dvě zkoušky;.

3.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

3.1   Metoda výpočtu a vzorec

3.2   Opakovatelnost

Absolutní rozdíl mezi dvěma jednotlivými na sobě nezávislými výsledky zkoušky, získanými stejným pracovníkem v rozmezí krátkého časového intervalu nebo souběžně může činit nejvýše 0,2 g hexanového extraktu na 100 g zkušebního vzorku.

Pokud je rozdíl větší, analýza se opakuje na dalších dvou zkušebních vzorcích. Pokud je rozdíl opět vyšší než 0,2 g, za výsledek se považuje aritmetický průměr všech čtyřech stanovení.

---

PŘÍLOHA XVI

STANOVENÍ JODOVÉHO ČÍSLA

1.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato mezinárodní norma specifikuje metodu stanovení jodového čísla v živočišných a rostlinných tucích a olejích, dále jen „tuky“.

2.   DEFINICE

Pro účely této mezinárodní normy platí tato definice:

2.1	Jodové číslo: vyjadřuje hmotnost jodu vázaného na vzorek za pracovních podmínek specifikovaných touto mezinárodní normou. Jodové číslo je vyjádřeno v g jodu na 100 g vzorku.

3.   PODSTATA ZKOUŠKY

Zkušební vzorek se rozpustí v rozpouštědle a přidá se Wijsovo činidlo. Po stanoveném čase se přidá roztok jodidu draselného a voda a uvolněný jod se titruje roztokem thiosíranu sodného.

4.   CHEMIKÁLIE

Všechna činidla musí mít čistotu p. a.

4.2	Jodid draselný, 100 g/l roztoku; nesmí obsahovat volný jod nebo jodičnany.

4.3	Škrobový roztok. 5 g rozpustného škrobu se smísí se 30 ml vody a ke směsi se přidá 1 000 ml vroucí vody, vaří se tři minuty a roztok se nechá vychladnout.

4.4	Thiosíran sodný, standardní odměrný roztok c(Na2S2O3.5H2O) = 0,1 mol/l, standardizovaný ne déle než 7 dnů před použitím.

4.5	Rozpouštědlo připravené smícháním stejných objemů cyklohexanu a kyseliny octové.

4.6	Wijsovo činidlo, obsahující jodmonochlorid v kyselině octové. Doporučuje se použít Wijsovo činidlo obchodně dostupné. Poznámka: Činidlo obsahuje 9 g ICl3 + 9 g I v kyselině octové.

5.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

Běžné laboratorní vybavení, a zejména:

5.1	Skleněná váženka, odpovídající hmotnosti zkušebního vzorku a hodící se do baňky (5.2).

5.2	Erlenmeyerovy baňky na 500 ml se skleněnou zabroušenou zátkou, dokonale vysušené.

6.   PŘÍPRAVA ZKUŠEBNÍHO VZORKU

Homogenizovaný vzorek se vysuší síranem sodným a přefiltruje.

7.   POSTUP ZKOUŠKY

7.1

Zkušební vzorek Hmotnost zkušebního vzorku se liší podle očekávaného jodového čísla, viz tabulka 1. Tabulka 1 Očekávané jodové číslo Hmotnost zkušebního vzorku v g Méně než 5 3,00 5 až 20 1,00 21 až 50 0,40 51 až 100 0,20 101 až 150 0,13 151 až 200 0,10 Zkušební vzorek se navažuje s přesností 0,1 mg do skleněné váženky (5.1).

7.2

Stanovení Váženka se zkušebním vzorkem se vloží do 500ml baňky (6.2). Přidá se 20 ml rozpouštědla (4.5), a tuk se rozpustí. Přidá se přesně 25 ml Wijsova činidla (4.6), baňka se uzavře zátkou, obsah se promíchá a baňka se umístí na tmavé místo. Pipetování Wijsova činidla se neprovádí ústy. Stejným způsobem se připraví slepý pokus s přídavkem rozpouštědla a Wijsova činidla, ale vynechá se zkušební vzorek. Pro vzorky s jodovým číslem nižším než 150 se baňka ponechá 1 hodinu v temnotě, pro vzorky s jodovým číslem nad 150, pro polymerované výrobky a výrobky ve značné míře oxidované je nutno dobu prodloužit na 2 hodiny. Po této době se do každé baňky přidá 20 ml roztoku jodidu draselného (4.2) a 150 ml vody (4.1). Obsah baňky se titruje standardním odměrným roztokem thiosíranu sodného (4.4), dokud téměř nezmizí žluté zbarvení jodu. Potom se přidá několik kapek škrobového roztoku (4.3) a pokračuje se v titraci, dokud po intenzivním protřepání nezmizí modré zabarvení. Poznámka: Připouští se stanovení bodu ekvivalence potenciometrickou indikací.

7.3	Počet stanovení Z jednoho zkušebního vzorku se provádějí dvě stanovení.

8.   VYJÁDŘENÍ VÝSLEDKŮ

Jodové číslo se vypočítá podle vzorce:

kde

c

=

přesná koncentrace standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) v mol/l,

V1

=

objem použitého standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) na slepý pokus v ml,

V2

=

objem použitého standardního odměrného roztoku thiosíranu sodného (4.4) pro vlastní stanovení v ml,

m

=

hmotnost zkušebního vzorku v g (7.1).

Jako výsledek se uvádí aritmetický průměr dvou stanovení za předpokladu, že je splněna podmínka opakovatelnosti.

▼M11

---

PŘÍLOHA XVII

METODA PRO STANOVENÍ STIGMASTADIENOLŮ V ROSTLINNÝCH OLEJÍCH

1.   ÚČEL

Stanovení stigmastadienolů v rostlinných olejích obsahujících nízké koncentrace těchto uhlovodíků, zejména v panenském olivovém oleji a surovém olivovém oleji z pokrutin.

2.   OBLAST PŮSOBNOSTI

Tato norma může být použita pro všechny rostlinné oleje, ačkoliv měření jsou spolehlivá jedině tehdy, leží-li obsah těchto uhlovodíků mezi 0,01 a 4,0 mg/kg. Metoda je obzvlášť vhodná pro zjišťování přítomnosti rafinovaných rostlinných olejů (olivového oleje, olivového oleje z pokrutin, slunečnicového oleje, palmového oleje atd.) v panenském olivovém oleji, protože na rozdíl od panenských olejů rafinované oleje obsahují stigmastadienoly.

3.   PODSTATA METODY

Izolace nezmýdelnitelného extraktu. Separace steroidové uhlovodíkové frakce kolonovou chromatografií na silikagelu a analýza pomocí kapilární plynové chromatografie.

4.   PŘÍSTROJE A POMŮCKY

4.1	250 ml baňky pro použití se zpětným chladičem.

4.2	Dělicí nálevky na 500 ml.

4.3	100 ml baňky s kulatým dnem.

4.4	Rotační odpařovač.

4.5

Skleněná chromatografická kolona (vnitřní průměr 1,5 až 2,0 cm, délka 50 cm) s teflonovým kohoutem a se dnem se zátkou ze skelné vaty nebo s kotoučem ze sintrovaného skla. Za účelem připravení silikagelové kolony se do chromatografické kolony nalije hexan do výšky přibližně 5 cm a poté se kolonu naplní suspenzí tvořenou 15 g silikagelu a ve 40 ml hexanu pomocí dávek hexanu. Nechá se úplně usadit pomocí mírných vibrací. Přidá se bezvodý síran sodný do výšky přibližně 0,5 cm a nadbytečný hexan se nakonec eluuje.

4.6	Plynový chromatograf s plameno-ionizačním detektorem, vstřikovacím systémem pro nástřik pomocí děliče nebo studeným vstřikovacím systémem typu on-column a termostatickou komorou, nastavitelnou na požadovanou teplotu s přesností ± 1 °C.

4.7	Kapilární kolona z taveného křemene pro plynovou chromatografii (vnitřní průměr 0,25 nebo 0,32 mm, délka 25 m) potažená 5 % fenylmethylsilikonem o tloušťce filmu 0,25 mm. Poznámka 1: Mohou být použity jiné kolony s podobnou nebo nižší polaritou.

4.8	Zapisovač s integrátorem s možností integrace mezi dvěma minimálními hodnotami.

4.9	Mikrostříkačka na 5 až 10 ml pro plynovou chromatografii opatřená tvrzenou jehlou.

4.10	Elektrický ohřívací plášť nebo topná deska.

5.   ČINIDLA

Všechna činidla musí být čistoty p. a., není-li uvedeno jinak. Používá se destilovaná voda nebo voda přinejmenším ekvivalentní čistoty.

5.1	Hexan nebo směs alkanů s bodem varu v rozmezí od 65 do 70 °C, destilované v rektifikační koloně. Poznámka 2: Rozpouštědlo musí být destilováno za účelem odstranění nečistot.

5.2	96 % ethanol (V/V).

5.3	Bezvodý síran sodný.

5.4	10 % alkoholový roztok hydroxidu draselného. 10 ml vody se přidá k 50 g hydroxidu draselného, zamíchá se a doplní se ethanolem na objem 500 ml. Poznámka 3: Stáním alkoholový uhličitan draselný hnědne. Měl by být připraven každý den čerstvý a uchováván v dobře uzavřených lahvích z tmavého skla.

5.5

Silikagel 60 pro kolonovou chromatografii, s velikostí částic 70-230 mesh (Merck, č. zboží 7734 apod.). Poznámka 4: Obvykle může být silikagel použit přímo z balení bez jakéhokoli úpravy. Některé šarže silikagelu však mohou vykazovat nízkou aktivitu, která vede k neuspokojivým chromatografickým separacím. V takových případech je nutno postupovat takto: silikagel se aktivuje nejméně 4hodinovým zahříváním na teplotu 550 °C. Po zahřátí se silikagel vloží do exsikátoru a po vychladnutí se převede do uzavíratelné baňky. Přidá se 2 % vody a protřepává se, dokud nezmizí hrudky a dokud se prášek volně nepřesýpá. Šarže silikagelů, jejichž výsledkem jsou chromatogramy se vzájemně se překrývajícími píky, je nutno upravit výše uvedeným způsobem. Jinou alternativou může být použití extra čistého silikagelu 60 (Merck, č. zboží 7754).

5.6	Zásobní roztok (200 ppm) cholesta-3, 5-dienu (Sigma, 99 % čistoty) v hexanu (10 mg v 50 ml).

5.7	Standardní roztok cholesta-3, 5-dienu v hexanu o koncentraci 20 ppm získaný naředěním výše uvedeného roztoku. Poznámka 5: Roztoky 5.6 a 5.7 uchovávané při teplotě do 4 °C jsou stabilní po dobu nejméně čtyř měsíců.

5.8	Roztok n-nonakosanu v hexanu o koncentraci přibližně 100 ppm.

5.9	Nosný plyn pro chromatografii: helium nebo vodík o 99,9990 % čistotě.

5.10	Pomocné plyny pro plameno-ionizační detektor: vodík o 99,9990 % čistotě a čistý vzduch.

6.   POSTUP

6.1   Příprava nezmýdelnitelných látek

6.1.1

Do 250ml baňky (4.1) se naváží 20 ± 0, 1 g oleje, přidá se 1 ml standardního roztoku cholesta-3, 5-dienu (20 μg) a 75 ml 10 % alkoholového roztoku hydroxidu draselného, připojí se zpětný chladič a zahřívá se na mírný var po dobu 30 minut. Baňka obsahující vzorek se odstraní ze zdroje tepla a roztok se nechá mírně vychladnout (nenechá se vychladnout úplně, protože vzorek by se usadil). Přidá se 100 ml vody a roztok se převede do dělící nálevky (4.2) pomocí 100 ml hexanu. Směs se po 30 sekund energicky protřepe a nechá se stát až do separace fází. Poznámka 6: Pokud vznikne emulze, která hned znovu nezmizí, přidávají se malá množství ethanolu.

6.1.2

Spodní vodná fáze se převede do druhé dělící nálevky a znovu se extrahuje 100 ml hexanu. Spodní fáze se nechá znovu vypustit a hexanové extrakty (smíchané v jiné dělící nálevce) se třikrát properou pokaždé 100 ml směsi ethanolu a vodu (1:1), dokud se nedocílí neutrální hodnoty pH.

6.1.3

Hexanový roztok se nechá projít bezvodým síranem sodným (50 g), propere se 20 ml hexanu a odpaří se v rotačním odpařovači do sucha při 30 °C a za sníženého tlaku.

6.2   Separace steroidové uhlovodíkové frakce

6.2.1

Zbytek se převede do rektifikační kolony pomocí dvou 1ml množství hexanu, vzorek se zavede do kolony tak, že se hladina roztoku nechá poklesnout na úroveň síranu sodného, a zahájí se chromatografická eluce s hexanem s rychlostí průtoku přibližně 1 ml/min. Prvních 25 až 30 ml eluátu se vyhodí a použije se dalších 40 ml frakce. Tato frakce se převede do 100ml baňky s kulatým dnem (4.3). Poznámka 7: První frakce obsahuje nasycené uhlovodíky (obrázek 1a) a druhá frakce steroidové uhlovodíky. Další eluce poskytuje squalen a příbuzné sloučeniny. Pro dosažení dobré separace nasycených a steroidových uhlovodíků je nutná optimalizace objemů frakcí. Za tímto účelem je nutno objem první frakce upravit tak, aby při analýze druhé frakce byly píky reprezentující nasycené uhlovodíky nízké (viz obrázek 1c). Pokud se žádné takové píky neobjeví, avšak standardní píky mají zároveň pouze omezenou velikost, je třeba objem první frakce snížit. Úplná separace složek první a druhé frakce navíc není nutná, poněvadž během analýzy plynovou chromatografií za podmínek popsaných v bodě 6.3.1 nedochází k žádnému překrývání píků. Optimalizace objemu druhé frakce není zpravidla nutná, protože další složky se dobře separují. Nicméně přítomnost většího píku s retenčním časem přibližně o 1,5 minuty nižším než u standardu je způsobena squalenem a svědčí o špatné separaci.

6.2.2

Druhá frakce se zcela odpaří v rotačním odpařovači při 30 °C v mírném vakuu a zbytek se rozpustí neprodleně v 0,2 ml hexanu. Roztok se až do analýzy uchovává v ledničce. Poznámka 8: Zbytky 6.1.3 a 6.2.2 by neměly být přechovávány v suchém stavu a při pokojové teplotě. Jakmile jsou zbytky získány, je nutno k nim přidat neprodleně rozpouštědla a roztoky uchovávat v ledničce.

6.3   Plynová chromatografie

6.3.1

Pracovní podmínky pro nástřik pomocí děliče: — teplota vstřikovací komůrky: 300 °C, — teplota detektoru: 320 °C, — integrátor se zapisovačem: parametry pro integraci by měly být zvoleny tak, aby se správně určily plochy píků. Doporučuje se integrace mezi dvěma minimy, — citlivost: zhruba 16násobek nejmenšího útlumu, — množství nastříknutého roztoku: 1 μl roztoku, — programu termostatu: 6minutová izoterma o hodnotě 235 °C, potom nárůst na teplotu 285 °C rychlostí 2 °C/min, — vstřikovací komůrka s rozdělovačem toku (dělicí poměr 1:15), — nosný plyn: helium nebo vodík o tlaku asi 120 kPa. Tyto podmínky mohou být upraveny podle specifikací chromatografu a kolony tak, aby poskytly chromatogramy splňující následující podmínky: pík vnitřního standardu se musí objevit během pěti minut před, nebo po čase uvedeném v bodu 6.3.2 a musí dosáhnout nejméně 80 % plného rozsahu stupnice. Systém plynové chromatografie je nutno přezkoušet nástřikem směsi zásobního roztoku cholestadienu (5.6) a roztoku n-nonakosanu (5.8). Pík cholesta-3, 5-dienu se musí objevit dříve, než pík n-nonakosanu (obrázek 1c). Pokud se neobjeví, je možno snížit teplotu termostatu a/nebo nahradit kolonu pro plynovou chromatografii kolonou s nižší polaritou.

6.3.2

Identifikace píků Pík vnitřního standardu se objeví přibližně za 19 minut a píky stigmastadienolů s relativním retenčním časem přibližně 1,29 (viz obrázek 1b). Stigmasta-3, 5-dien se objevuje s malými množstvími izomeru a obvykle se obě tyto látky eluují současně jako jediný pík. Je-li však kolona příliš polární nebo vykazuje-li vysokou rozlišovací schopnost, může se izomer objevit jako malý pík těsně před píkem stigmasta-3, 5-dienu (obrázek 2). Aby byla zajištěna eluce stigmastadienolů jako jednoho píku, doporučuje se nahradit kolonu kolonou s nižší polaritou, nebo kolonou s větším vnitřním průměrem. Poznámka 9: Referenční chromatogram pro stigmastadienoly je možné získat analýzou rafinovaných rostlinných olejů s použitím menšího vzorku (1 až 2 g). Stigmastadienoly vytvářejí nápadný a snadno identifikovatelný pík.

6.3.3

Kvantitativní analýza Obsah stigmastadienolů se stanoví podle vzorce: mg/kg stigmastadienolů= kde: As = plochy píků stigmastadienolů (jestliže je pík rozdělen, součet ploch obou izomerů), Ac = plochy píků vnitřního standardu (cholestadienu), Mc = hmotnost přidaného standardu v mikrogramech, Mo = hmotnost navážených olejů v gramech. Detekční limit: asi 0,01 mg/kg.

Obrázek č. 1

Plynové chromatogramy vzorků olivového oleje analyzovaných v kapilární koloně z taveného křemene (vnitřní průměr 0,25 mm, délka 25 m) potažené 5 % fenylmethylsilikonem o tloušťce filmu 0,25 μm.

Obrázek č. 2

Plynový chromatogram získaný ze vzorku rafinovaného olivového oleje analyzovaného na koloně DB-5, vykazující izomer stigmasta-3, 5-dienu.

▼M13

---

ANNEX XVIII

DETERMINATION OF TRIACYLGLYCEROLS WITH ECN 42 (DIFFERENCE BETWEEN HPLC DATA AND THEORETICAL CONTENT)

1.   Scope

Determination of the composition of triacylglycerols (TAGs) in olive oils, in terms of their equivalent carbon number by differences between the analytical results obtained by high performance liquid chromatography (HPLC) and the theoretical content, calculated starting from the fatty acid composition.

2.   Field application

The standard is applicable to olive oils. The method is applicable to the detection of the presence of small amounts of seed oils (rich in linoleic acid) in every class of olive oils.

3.   Principle

The content of triacylglycerols with ECN42 determined by HPLC analysis and the theoretical content of triacylglycerols with ECN42 (calculated on the basis of GLC determination of fatty acid composition) correspond within a certain limit for pure oils. A difference larger than the values stated in the Regulation for each type of oil points out that the oil contains seed oils.

4.   Method

The method for calculation of theoretical content of triacylglycerols with ECN42 and of the difference between the HPLC data and this one essentially is made by the coordination of analytical data obtained by means of other methods: it is possible to distinguish three phases: determination of fatty acid composition by capillary gas chromatography, calculation of theoretical composition of triacylglycerols with ECN42, HPLC determination of ECN42 triacylglycerols

4.1.   Apparatus

4.1.1.

Round bottom flasks, 250 and 500 ml.

4.1.2.

Beakers 100 ml.

4.1.3.

Glass chromatographic column, 21 mm internal diameter, 450 mm length, with cock and normalized cone (female) at the top.

4.1.4.

Separator funnels, 250 ml, with normalized cone (male) at the bottom, suitable to be connected with the top of the column.

4.1.5.

Glass rod, 600 mm length.

4.1.6.

Glass funnel, 80 mm diameter.

4.1.7.

Volumetric flasks, 50 ml.

4.1.8.

Volumetic flasks, 20 ml.

4.1.9.

Rotative evaporator.

4.1.10.

High performance liquid chromatography, allowing thermostatic control of column temperature.

4.1.11.

Injection units for 10 μl delivery.

4.1.12.

Detector: differential refractometer. The full scale sensitivity should be at least 10−4 units of refractive index.

4.1.13.

Column: stainless steel tube 250 mm length and 4,5 mm internal diameter packed with 5 μm diameter particles of slica with 22 to 23 % carbon in the form of octadecylsilane (note 2).

4.1.14.

Recorder and/or integrator.

4.2.   Reagents

The reagents should be of analytical purity. Elution solvents should be de-gassed, and may be recycled several times without effect on the separations.

4.2.1.

Petroleum ether 40 to 60 °C chromatographic grade.

4.2.2.

Ethil ether, peroxides free, freshly distilled.

4.2.3.

Glass chromatographic elution solvent: mixture petroleum ether/ethil ether 87/13 (v/v).

4.2.4.

Silicagel, 70-230 mesh, type Merck 7734, with water content standardized at 5 % (w/w).

4.2.5.

Glass wool.

4.2.6.

Acetone.

4.2.7.

Acetonitrile.

4.2.8.

HPLC elution solvent: acetonitrile + acetone (proportions to be adjusted to obtain the desired separation; begin with 50:50 mixture).

4.2.9.

Solubilization solvent: acetone.

4.2.10.

Reference triglycerides commercial triglycerides tripalmitin, triolein, etc.) may be used and the retention times thence plotted in accordance with the equivalent carbon number, or alternatively reference chromatograms obtained from soya oil, mixture 30:70 soya oil/olive oil and pure olive oil (see notes 3 and 4 and figure 1, 2, 3, 4).

4.3.   Sample preparation

As a number of interfering substances can rise false positive results, the sample must always be purified according to IUPAC method 2.507, used for determination of polar substances in oxidised oils.

4.3.1.   Chromatographic column preparation

Fill the column (4.1.3) with about 30 ml of elution solvent (4.2.3), then introduce inside the column some glass wool (4.2.5) pushing it to the bottom of the column by means of the glass rod (4.1.5).

In a 100 ml beaker, suspend 25 g of silicagel (4.2.4) in 80 ml of elution mixture (4.2.3), then transfer it inside the column, by means of a glass funnel (4.1.6).

To ensure the complete transfer of silicagel inside the column, wash the beaker with the elution mixture and transfer the washing portions inside the column, too.

Open the cock and let solvent elute from the column until its level is about 1 cm over the silicagel.

4.3.2.   Column chromatography

Weigh with the accuracy of 0,001 g, 2,5 ± 0,1 g of oil, previously filtered, homogenized and anhydrified, if necessary, in a 50 ml volumetric flask (4.1.7). Solve it in about 20 ml of elution solvent (4.2.3), if necessary, slightly heat it to make the dissolution easily. Cool at room temperature and adjust the volume with elution solvent.

By means of a volumetric pipette, introduce 20 ml of solution inside the column prepared according to 4.3.1, open the cock and let solvent elute to the silicagel layer level.

Then elute with 150 ml of elution solvent (4.2.3), adjusting the solvent rate at about 2 ml/min (150 ml will take about 60 to 70 minutes to pass through the column).

The eluated is recovered in a 250 ml round bottom flask (4.1.1) previously tared in an oven and exactly weighted. Eliminate solvent at reduce pressure (Rotavapor) and weigh the residue that will be used to prepare the solution for HPLC analysis and for methyl ester preparation.

The sample recovery from the column must be 90 % at least for extra virgin, virgin, ordinary refined and olive oil categories, and a minimum of 80 % for lampante and residue olive oils.

4.4.   HPLC analysis

4.4.1.   Preparation of the samples for chromatographic analysis

A 5 % solution of the sample to be analysed is prepared by weighing 0,5 ± 0,001 g of the sample into a 10 ml graduated flask and making up to 10 ml with the solubilization solvent (4.2.9).

4.4.2.   Procedure

Set up the chromatographic system. Pump elution solvent (4.2.8) at a rate of 1,5 ml/min to purge the entire system. Wait until a stable base line is obtained. Inject 10 μl of the sample prepared as in 4.3.

4.4.3.   Calculation and expression of results

Use the area normalization method, i.e. assume that the sum of the areas of the peaks corresponding to TAGs from ECN42 up to ECN52 is equal to 100 %. Calculate the relative percentage of each triglyceride using the formula:

% triglyceride = area of peak × 100/ sum of peak areas.

The results are to be given to within at least two decimal places.

Note 1: The elution order can be determined by calculating the equivalent carbon numbers, often defined by the relation ECN = CN-2n, where CN is the carbon number and n is the number of double bounds, it can be calculated more precisely by taking into account the origin of the double bond. If no, nl and nln are the numbers of double bonds attributed to oleic, linoleic and linolenic acids respectively, the equivalent carbon number can be calculated by means of the relation of the formula:

where the coefficient do, dl and dln can be calculated by means of the reference triglycerides. Under the conditions specified in this method, the relation obtained will be close in:

Note 2:

Note 3: With several reference triglycerides, it is also possible to calculate the resolution with respect to triolein:

by use of the reduced retention time RT' = RT − RT solvent.

The graph of log α against f (number of double bonds) enables the retention values to be determined for all the triglycerides of fatty acids contained in the reference triglycerides — see figure 2.

Note 4: The efficiency of the column should permit clear separation of the peak of trilinoein from the peaks of the triglycerides with an adjacent RT. The elution is carried out up to ECN52 peak.

Note 5: A correct measure of the areas of all peaks of interest for the present determination is ensured if the second peak corresponding to ECN50 is 50 % of full scale of the recorder.

4.5.   Calculation of triacylglycerols composition

4.5.1.   Determination of fatty acid composition

Fatty acid composition is carried out by means of the EEC gas chromatographic method reported in Annex X A of Regulation (EEC) No 2568/91, by means of a capillary column. The methyl esters preparation is carried out according to Annex X B (sodium methylate alcohol solution).

4.5.2.   Fatty acids for calculation

Glycerides are grouped by their equivalent carbon number (ECN), taking into account the following equivalencies between ECN and fatty acids. Only fatty acids with 16 and 18 carbon atoms were taken in consideration, because only these are important for olive oil.

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

The result gives the percentage of each fatty acid in moles % in the overall (1,2,3-) position of the TAGs.

Then the sum of the saturated fatty acids P and S (SFA) and the unsaturated fatty acids Po, O, L and Ln (UFA) are calculated:

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of TAGs

The fatty acids are distributed to three pools as follows: two identical for 1- and 3- positions and one for 2- position, with different coefficients for the saturated (P and S) and unsaturated acids (Po, O, L and Ln).

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = moles % P (1,2,3) * 0,06 (4) moles % S(2) = moles % S (1,2,3) * 0,06

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 2- position [Po(2), O(2), L(2) and Ln(2)]: (5)

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)]: (6)

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols

4.5.6.1.

TAGs with one fatty acid (AAA, here LLL, PoPoPo) (7)

4.5.6.2.

TAGs with two fatty acids (AAB, here PoPoL, PoLL) (8)

4.5.6.3.

TAGs with three different fatty acids (ABC, here OLLn, PLLn, PoOLn, PPoLn) (9)

4.5.6.4.

Triacylglycerides with ECN42 The following triglycerides with ECN42 are calculated according equation 7, 8 and 9 in order of expected elution in HPLC (normally only three peaks). LLL PoLL and the positional isomer LPoL OLLn and the positional isomers OLnL and LnOL PoPoL and the positional isomer PoLPo PoOLn and the positional isomers OPoLn and OLnPo PLLn and the positional isomers LLnP and LnPL PoPoPo SLnLn and the positional isomer LnSLn PPoLn and the positional isomers PLnPo and PoPLn The triacylglycerides with ECN42 are given by the sum of the nine triacylglycerols including their positional isomers. The results to be given with at least two decimal places.

5.   Evaluation of the results

The calculated theoretical content and the content determined by the HPLC analysis are compared. If the difference between HLPC data minus theoretical data is greater than the values states for the appropriate oil category in the Regulation, the sample contains seed oil.

Note: Results are given to within one decimal figure.

6.   Example (The numbers refer to the sections in the text of the method)

4.5.1.   Calculation of moles % fatty acids from GLC data (area %)

The following data are obtained for the fatty acid composition by GLC:

4.5.3.   Conversion of area % into moles for all fatty acids

4.5.4.   Normalization of fatty acids to 100 %

Sum of the saturated and unsaturated fatty acids in the 1,2,3- position of TAGs

4.5.5.   Calculation of the fatty acid composition in 2- and 1,3- positions of the TAGs

4.5.5.1.

Saturated fatty acids in 2- position [P(2) and S(2)] moles % P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 moles % See formula (4) moles % S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 moles % See formula (4)

4.5.5.2.

Unsaturated fatty acids in 1,3-position [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)] See formula (5) See formula (5) See formula (5) See formula (5)

4.5.5.3.

Fatty acids in 1,3-positions [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) and Ln(1,3)] See formula (6) See formula (6) See formula (6) See formula (6) See formula (6) See formula (6)

4.5.6.   Calculation of triacylglycerols

From the calculated fatty acid composition in sn-2- and sn-1,3- positions (see above):

the following triacylglycerols are calculated:

4.5.6.1.

TAGs with one fatty acid (LLL, PoPoPo) See formula (7) = 0,09708 mol LLL = 0,00013 mol PoPoPo

4.5.6.2.

TAGs with two fatty acids (PoLL, SLnLn, PoPoL) See formula (8) = 0,02141 = 0,01070   0,03211 mol PoLL = 0,00093 = 0,00002   0,00095 mol SLnLn = 0,00236 = 0,00118   0,00354 mol PoPoL

4.5.6.3.

TAGs with three different fatty acids (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn) See formula (9) = 0,00375 = 0,00012 = 0,00375   0,00762 mol PPoLn = 0,14577 = 0,14577 = 0,14577   0,43671 mol OLLn = 0,03400 = 0,00111 = 0,03400   0,06911 mol PLLn = 0,01605 = 0,01605 = 0,01605   0,04815 mol PoOLn ECN42 = 0,69540 mol TAGs

▼M14

Obrázek 1: Graf log α jako funkce f (počet dvojných vazeb)

Poznámka:

La = kyselina laurová, L = kyselina linolová, My = kyselina myristová, Ln = kyselina linolenová, P = kyselina palmitová, St = kyselina stearová, O = kyselina olejová.

Obrázek 2: Sójový olej

Obrázek 3: Sójový olej/olivový olej 30/70

Obrázek 4: Olivový olej

▼M19

---

ANNEX XIX

DETERMINATION OF ALIPHATIC ALCOHOLS CONTENT BY CAPILLARY GAS CHROMATOGRAPHY

1.   OBJECT

The procedure describes a method for the determination of aliphatic alcohols content in oils and fats.

2.   PRINCIPLE OF THE METHOD

The fatty substance, with 1-eicosanol added as internal standard, is saponified with ethanolic potassium hydroxide and then the unsaponifiable matter extracted with ethyl ether. The alcoholic fraction is separated from the unsaponifiable matter by chromatography on a basic silica gel plate; the alcohols recovered from the silica gel are transformed into trimethylsilyl ethers and analysed by capillary gas chromatography.

3.   EQUIPMENT

4.   REAGENTS

5.   PROCEDURE

5.1.   Preparation of the unsaponifiables

5.1.1.

Using a 500 μl microsyringe place, into a 250 ml round-bottom flask, a volume of 0,1 % 1-eicosanol solution in chloroform (4.17) containing a quantity of 1-eicosanol approximately equal to 10 % of the aliphatic alcohols content in that portion of sample to be taken for analysis. For example, to 5 g of sample add 250 μl of the 0,1 % 1-eicosanol solution if olive oil and 1 500 μl if olive pomace oil. Evaporate to dryness in current of nitrogen and then weigh accurately 5 g of the dry filtered sample into the same flask.

5.1.2.

Add 50 ml of 2 N potassium hydroxide ethanolic solution, fit the reflux condenser and heat the apparatus to slight boiling on a steam bath, stirring continuously throughout the heating process until saponification has taken place (the solution becomes clear). Continue heating for a further 20 minutes and then add 50 ml of distilled water through the condenser. The condenser is then disconnected and the flask cooled to approximately 30 °C.

5.1.3.

The contents of the flask are quantitatively transferred to a separating funnel of 500 ml capacity by adding distilled water several times, using a total of around 50 ml distilled water. Add approximately 80 ml of ethyl ether, shake vigorously for approximately 30 seconds and allow to settle (Note 1). Separate off the lower aqueous phase collecting it in a second separating funnel. Two further extractions are effected on the aqueous phase, in the same manner, using each time 60 to 70 ml ethyl ether. Note 1: Emulsions may be eliminated by adding, using as a spray, small quantities of ethyl alcohol or methyl alcohol.

5.1.4.

The ethyl ether extracts are combined in a separating funnel and washed with distilled water (50 ml at a time) until the washing water gives a neutral reaction. Discard the washing water, dry with anhydrous sodium sulphate and filter, into a flask of 250 ml capacity which has been weighed beforehand, the funnel and filter being washed with small quantities of ethyl ether which are added to the total.

5.1.5.

Distil the ether down to a few ml, then bring to dryness under a slight vacuum or in a current of nitrogen, completing drying in an oven at 100 °C for approximately a quarter of an hour, and then weigh after cooling in a desiccator.

5.2.   Separation of alcoholic fractions

5.2.1.

Preparation of basic TLC plates: the silica gel plates (4.4) are immersed completely, in 0,2 N potassium hydroxide solution (4.5) for 10 seconds, and then left to dry for two hours under an extractor hood and finally placed in an oven at 100 °C for one hour. Remove from the oven and keep in a calcium chloride desiccator until required for use (plates treated in this way must be used within 15 days). Note 2: When basic silica gel plates are used to separate the alcoholic fraction there is no need to treat the unsaponifiables with alumina. It follows that all acid compounds (fatty acids and others) are retained at the origin thereby obtaining both aliphatic alcohol and terpenic alcohol bands which are both separated distinctly from the sterol band.

5.2.2.

Place a 65/35 by volume hexane/ethyl ether mixture in the plate-developing chamber to a depth of approximately 1 cm ( 6 ). Close the chamber using an appropriate cover and leave for half an hour to allow equilibration between vapour and liquid. Strips of filter paper dipping into the eluent may be affixed to the inside surfaces of the tank to reduce the development time by approximately one third and obtain more uniform, regular elution of the components. Note 3: The developing solution must be replaced for each analysis in order to obtain reproducible developing conditions.

5.2.3.

An approximately 5 % solution of unsaponifiable matter (5.1.5) in chloroform is prepared and 0,3 ml of the solution is streaked as a uniform strip of minimum thickness, using the 100 μl microsyringe, on a TLC plate at approximately 2 cm from the bottom of the TLC plate. Aligned with the origin, 2 to 3 μl of the aliphatic alcohols reference solution (4.11) are spotted for the identification of the aliphatic alcohols band after development has been completed.

5.2.4.

Place the plate inside the development tank as stated in 5.2.2. The ambient temperature should be maintained between 15 and 20 °C. Immediately close the chamber with the cover and allow to elute until the solvent front reaches approximately 1 cm from the upper edge of the plate. The plate is then removed from the development chamber and the solvent evaporated under a hot air current or the plate is left for a while under the extractor hood.

5.2.5.

The plate is sprayed lightly and evenly with the solution of 2', 7'-dichlorofluorescein when the plate is observed under ultra violet light. The aliphatic alcohols band can be identified through being aligned with the stain obtained from the reference solution: mark the limits of the band with a black pencil; outlining the band of aliphatic alcohols and the band immediately above that, which is the terpenic alcohols band, together. Note 4: The aliphatic alcohols band and the terpenic alcohols band are to be grouped together in view of the possible migration of some aliphatic alcohols into the triterpenic alcohols band.

5.2.6.

Using a metal spatula scrape off the silica gel in the marked area. Place the finely comminuted material removed into the filter funnel (3.7). Add 10 ml of hot chloroform, mix carefully with the metal spatula and filter under vacuum, collecting the filtrate in the conical flask (3.8) attached to the filter funnel. Wash the pomace in the flask three times with ethyl ether (approximately 10 ml each time) collecting the filtrate in the same flask attached to the funnel. Evaporate the filtrate to a volume of 4 to 5 ml, transfer the residual solution to the previously weighed 10 ml test tube (3.9), evaporate to dryness by mild heating in a gentle flow of nitrogen, make up again using a few drops of acetone, evaporate again to dryness, place in an oven at 105 °C for approximately 10 minutes and then allow to cool in a desiccator and weigh. The pomace inside the test tube is composed of the alcoholic fraction.

5.3.   Preparation of the trimethylsilyl ethers

5.3.1.

The reagent for silylation, consisting of a mixture of 9:3:1 by volume (Note 5) of pyridine-hexamethyldisilazane-trimethylchlorosilane in the proportion of 50 μl for each milligram of aliphatic alcohols, is added to the test tube containing the alcoholic fraction, avoiding all absorption of moisture (Note 6). Note 5: Solutions which are ready for use are available commercially. Other silanising reagents such as, for example, bis-trimethylsilyl, trifluor acetamide + 1 % trimethyl chlorosilane, which has to be diluted with an equal volume of anhydrous pyridine, are also available. Note 6: The slight opalescence which may form is normal and does not cause any interference. The formation of a white floc or the appearance of a pink colour are indicative of the presence of moisture or deterioration of the reagent. If these occur the test must be repeated.

5.3.2.

Stopper the test tube, shake carefully (without overturning) until the aliphatic alcohols are completely dissolved. Stand for at least 15 minutes at ambient temperature and then centrifuge for a few minutes. The clear solution is ready for gas chromatographic analysis.

5.4.   Gas chromatography analysis

5.4.1.   Preliminary operations, column packing

5.4.1.1.

Fit the column in the gas chromatograph, attaching the inlet end to the injector connected to the splitting system and the outlet end to the detector. Carry out a general check of the gas chromatography assembly (tightness of gas fittings, efficiency of the detector, efficiency of the splitting system and of the recording system, etc.).

5.4.1.2.

If the column is being used for the first time it is recommended that it should be subjected to conditioning. A little carrier gas is passed through the capillary column and then the gas chromatography assembly is switched on and gradually heated until a temperature not less than 20 °C above the operating temperature (see Note 7) is attained. That temperature is held for not less than two hours and then the assembly is brought to the operating conditions (regulation of gas flow, split flame ignition, connection to the electronic recorder, adjustment of the temperature of the capillary column oven, the detector and the injector, etc.) and the signal is adjusted to a sensitivity not less than twice the highest level contemplated for the execution of the analysis. The course of the base line must be linear, without peaks of any kind, and must not drift. A negative straight-line drift indicates leakage from the column connections; a positive drift indicates inadequate conditioning of the column. Note 7: The conditioning temperature shall be at least 20 °C less than the maximum temperature contemplated for the liquid phase employed.

5.4.2.   Choice of operating conditions

5.4.3.   Analytical procedure

5.4.4.   Peak identification

The identification of individual peaks is effected according to the retention times and by comparison with the standard TMSE mixture, analysed under the same conditions.

A chromatogram of the alcoholic fraction of a virgin olive oil is shown in Figure 1.

5.4.5.   Quantitative evaluation

6.   EXPRESSION OF THE RESULTS

The contents of the individual aliphatic alcohols in mg/1 000 g of fatty substance and the sum of the “total aliphatic alcohols” are reported.

---

APPENDIX

Determination of the linear velocity of the gas

1 to 3 μl of methane or propane are injected into the gas chromatograph set at normal operating conditions and the time taken for the methane or propane to flow through the column from the instant of injection to the instant the peak elutes (tM) is measured using a stop clock.

The linear velocity in cm/s is given by L/tM, where L is the length of the column in centimetres and tM is the measured time in seconds.

Figure 1 — Chromatogram of the alcoholic fraction of virgin oil

1

=

Eicosanol

2

=

Decosanol

3

=

Tricosanol

4

=

Tetracosanol

5

=

Pentacosanol

6

=

Hexacosanol

7

=

Heptacosanol

8

=

Octacosanol

---

( 1 ) Úř. věst. 172, 30.9.1966, s. 3025/66.

( 2 ) Úř. věst. L 353, 17.12.1990, s. 23.

( 3 ) Úř. věst. L 128, 24.5.1977, s. 6.

( 4 ) Úř. věst. L 166, 1.7.1988, s. 10.

( 5 ) But may refrain from tasting if they note some extremely intense negative attributes; they will note this exceptional circumstance on the profile sheet.

( 6 ) In these cases in particular, a 95/5 by volume benzene/acetone eluent mixture must be used to obtain distinct band separation.