31996D0240

ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 5ης Φεβρουαρίου 1996 για την τροποποίηση της απόφασης 92/532/ΕΟΚ για τον καθορισμό των τεχνικών δειγματοληψίας και των διαγνωστικών μεθόδων για την ανίχνευση και τη διαπίστωση ορισμένων ασθενειών ιχθύων (Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ) (96/240/ΕΚ)

Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ,

Έχοντας υπόψη:

τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας,

την οδηγία 91/67/ΕΟΚ του Συμβουλίου, της 28ης Ιανουαρίου 1991, σχετικά με τους όρους υγειονομικού ελέγχου που διέπουν τη διάθεση στην αγορά ζώων και προϊόντων υδατοκαλλιέργειας (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 95/22/ΕΚ (2), και ιδίως το άρθρο 15,

Εκτιμώντας:

ότι οι τεχνικές δειγματοληψίας και οι διαγνωστικές μέθοδοι για την ανίχνευση και τη διαπίστωση ορισμένων ασθενειών ιχθύων καθορίζονται από την απόφαση 92/532/ΕΚ της Επιτροπής (3) 7

ότι, μετά από τη θέσπιση αυτής της οδηγίας, με βάση την πρακτική και επιστημονική εξέλιξη, πρέπει να ενημερωθούν οι τεχνικές δειγματοληψίας και οι διαγνωστικές μέθοδοι 7

ότι η ενημέρωση αυτή αφορά το μέγεθος του δείγματος, τα δείγματα που πρέπει να ληφθούν, τη μεταφορά των δειγμάτων και τη μέθοδο απομόνωσης των ιών που ενδεχομένως υπάρχουν στα δείγματα 7

ότι έχει ζητηθεί η γνώμη της επιστημονικής κτηνιατρικής επιτροπής, η οποία συστάθηκε με την απόφαση 81/651/ΕΟΚ της Επιτροπής (4) 7

ότι τα μέτρα που προβλέπονται στην παρούσα απόφαση είναι σύμφωνα με τη γνώμη της μόνιμης κτηνιατρικής επιτροπής,

ΕΞΕΔΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΑΠΟΦΑΣΗ:

Άρθρο 1

Το παράρτημα της απόφασης 92/532/ΕΟΚ αντικαθίσταται από το παράρτημα της παρούσας απόφασης.

Άρθρο 2

Η παρούσα απόφαση απευθύνεται στα κράτη μέλη.

Βρυξέλλες, 5 Φεβρουαρίου 1996.

Για την Επιτροπή

Franz FISCHLER

Μέλος της Επιτροπής

(1) ΕΕ αριθ. L 46 της 19. 2. 1991, σ. 1.

(2) ΕΕ αριθ. L 243 της 11. 10. 1995, σ. 1.

(3) ΕΕ αριθ. L 337 της 21. 11. 1992, σ. 18.

(4) ΕΕ αριθ. L 233 της 19. 8. 1981, σ. 32.

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

ΜΕΡΟΣ 1

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ ΚΑΙ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΗΣ VHS ΚΑΙ ΤΗΣ ΙΗΝ

Ι. Δειγματοληψία

1. Χρόνος δειγματοληψίας

Οι εκμεταλλεύσεις επιθεωρούνται κλινικά τουλάχιστον δύο φορές το χρόνο κατά την περίοδο από Οκτώβριο έως Ιούνιο ή όποτε η θερμοκρασία του νερού είναι κατώτερη από 14° C. Τα μεταξύ των ελέγχων χρονικά διαστήματα πρέπει να είναι τουλάχιστον τέσσερις μήνες. Επιθεωρούνται όλες οι μονάδες παραγωγής (λίμνες, δεξαμενές, ενυδρεία, δικτυοκλωβοί κ.λπ.), προκειμένου να διαπιστωθεί η ύπαρξη ιχθύων νεκρών, αδύναμων με ασυνήθη συμπεριφορά. Πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στο σημείο απορροής του νερού (εάν είναι εφικτό), όπου τείνουν να συγκεντρώνονται οι αδύναμοι ιχθύες, εξαιτίας του υδατικού ρεύματος.

2. Επιλογή και συλλογή δειγμάτων

Συλλέγονται από 30 μέχρι 150 ιχθύες ή/και υγρά δείγματα από ωοθήκες σε σχέση με τους ελέγχους που προβλέπονται στον πίνακα 1 Α. Εάν υπάρχουν ιριδοειδείς πέστροφες, θα πρέπει οπωσδήποτε στο δείγμα να περιλαμβάνονται ιχθύες αυτού του είδους. Εάν δεν υπάρχουν, στο δείγμα θα πρέπει να περιλαμβάνονται ιχθύες όλων των άλλων υφιστάμενων ειδών, στο μέτρο που τα είδη αυτά είναι ευαίσθητα την VHS ή/και την IHN (όπως καθορίζονται στο παράρτημα Α της οδηγίας 91/67/ΕΟΚ σχετικά με τις συνθήκες υγιεινής των ζώων που διέπουν τη διάθεση στην αγορά των ζώων και των προϊόντων της υδατοκαλλιέργειας). Τα είδη θα πρέπει να αντιπροσωπεύονται αναλογικά στο δείγμα. Κατά τη διάρκεια των δύο πρώτων ετών της αρχικής τετραετούς περιόδου ελέγχου που προηγείται της έγκρισης, το δείγμα θα πρέπει να αποτελείται από 150 μονάδες, κατά τρόπο ώστε να εξασφαλίζεται ανίχνευση με ποσοστό εμπιστοσύνης 95 % φορέων ιού, σε επικράτηση φορέα 2 %, εξαιρουμένων των εκμεταλλεύσεων εκτροφής σαλμονιδών που δεν περιλαμβάνουν γόνους στις παράκτιες ζώνες και όπου το μέγεθος του δείγματος θα πρέπει να είναι 30 μονάδες.

Κατά τη διάρκεια των δύο τελευταίων ετών της περιόδου ελέγχου, το δείγμα μπορεί να μειωθεί σε 30 μονάδες, προκειμένου να εξασφαλίζεται ανίχνευση με ποσοστό εμπιστοσύνης 95 % φορέων ιού, σε επικράτηση φορέα 10 %. Κατά τη διάρκεια των προσεχών ετών (διατήρηση εγκεκριμένης κατάστασης), το δείγμα μπορεί επίσης να μειωθεί σε 30 μονάδες.

Σε εκμεταλλεύσεις με επίσημο ιστορικό απαλλαγής από VHS και IHN για τουλάχιστον τέσσερα έτη (βάσει προγράμματος τακτικού επίσημου υγειονομικού ελέγχου) μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί το μειωμένο μέγεθος μείγματος, κατά τη διάρκεια του αρχικού τετραετούς ελέγχου.

Εάν χρησιμοποιούνται για ιχθυοπαραγωγή περισσότερες της μιας πηγές ύδατος, θα πρέπει να συμπεριληφθούν ιχθύες που αντιπροσωπεύουν όλες τις πηγές ύδατος σε δείγματα 150 ή 30 ιχθύων. Εάν υπάρχουν αδύναμοι, με ασυνήθη συμπεριφορά ή πρόσφατα αποθανόντες (αλλά όχι αποσυντεθειμένοι) ιχθύες, θα πρέπει καταρχήν να συμπεριληφθούν στο δείγμα. Εάν δεν υπάρχουν τέτοιου είδους ιχθύες, το δείγμα θα πρέπει να αποτελείται από κανονικά συμπεριφερόμενους υγιείς ιχθύες που έχουν συλλεχθεί κατά τρόπο ώστε όλα τα τμήματα της εκμετάλλευσης, καθώς και όλες οι τάξεις ηλικίας να αντιπροσωπεύονται αναλογικά στο δείγμα.

3. Προετοιμασία και αποστολή των δειγμάτων ιχθύων

Πριν την αποστολή ή μεταφορά στο εργαστήριο, αφαιρούνται προς εξέταση τμήματα οργάνων των ιχθύων με ψαλίδι ή άλλα εργαλεία αποστειρωμένα και τοποθετούνται σε πλαστικούς σωλήνες που περιέχουν υπόστρωμα μεταφοράς, δηλαδή υπόστρωμα κυτταροκαλλιέργειας με 10 % ορό μόσχου και αντιβιοτικά. Συνιστάται, για παράδειγμα, ο συνδυασμός 200 UI πενικιλίνης, 200 μg στρεπτομυκίνης και 200 μg καναμυκίνης ανά ml, αλλά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και άλλα αντιβιοτικά αποδεδειγμένης αποτελεσματικότητας. Το ιστολογικό υλικό προς εξέταση είναι σπλήνα, πρόσθιο νεφρό και ακόμη εγκέφαλος ή καρδιά. Σε μερικές περιπτώσεις, θα πρέπει να εξεταστεί υγρό ωοθήκης (βλ. πίνακα 1).

Υγρό ωοθήκης ή τμήματα οργάνων από 10 ιχθύες (βλ. πίνακα 1) μπορούν να συγκεντρωθούν σ' ένα πλαστικό σωλήνα 10 ml, ο οποίος να περιέχει 4 ml υποστρώματος μεταφοράς, και να αντιπροσωπεύουν ένα συνολικό δείγμα. Ο ιστός κάθε δείγματος θα πρέπει να ζυγίζει τουλάχιστον 0,5 g.

Οι σωλήνες τοποθετούνται σε μεμονωμένα δοχεία (για παράδειγμα κουτιά με παχύ στρώμα πολυστυρενίου) μαζί με αρκετό πάγο ή «παγοκολώνες», για να εξασφαλίζεται, κατά τη διάρκεια της μεταφοράς στο εργαστήριο, θερμοκρασία των δειγμάτων μεταξύ 0 και 5° C. Θα πρέπει να αποφεύγεται η κατάψυξη των δειγμάτων. Η θερμοκρασία ενός δείγματος, κατά τη διάρκεια της μεταφοράς του, δεν θα πρέπει σε καμία περίπτωση να υπερβαίνει τους 10° C και τα δοχεία της μεταφοράς θα πρέπει ακόμη να περιέχουν πάγο τη στιγμή παραλαβής τους.

Η ιολογική εξέταση θα πρέπει να ξεκινήσει το δυνατόν συντομότερα και το αργότερο σε 48 ώρες από τη συλλογή των δειγμάτων ή, σε εξαιρετικές περιπτώσεις, το αργότερο σε 72 ώρες από τη στιγμή που το υλικό, το οποίο συλλέχθηκε προς εξέταση, προστατεύθηκε από υπόστρωμα μεταφοράς και εφόσον τηρήθηκαν οι προϋποθέσεις σχετικά με τη θερμοκρασία κατά τη διάρκεια της μεταφοράς. (1.1.3, παράγραφος 3).

Μπορούν να αποστέλλονται στο εργαστήριο ολόκληροι ιχθύες, εφόσον μπορούν να τηρηθούν οι προϋποθέσεις σχετικά με τη θερμοκρασία κατά τη διάρκεια της μεταφοράς. Οι ολόκληροι ιχθύες μπορούν να τυλίγονται σε απορροφητικό χαρτί και θα πρέπει τελικά να αποστέλλονται σε πλαστική σακούλα και στις συνθήκες ψύξης που ορίζονται ανωτέρω. Μπορούν επίσης να αποστέλλονται και ζωντανοί ιχθύες.

4. Συλλογή συμπληρωματικού διαγνωστικού υλικού

Ανάλογα με τη συμφωνία που έχει συναφθεί με το σχετικό διαγνωστικό εργαστήριο, μπορούν να συλλέγονται και άλλοι ιστοί ιχθύων και να προετοιμάζονται για συμπληρωματικές εξετάσεις.

ΙΙ. Προετοιμασία των δειγμάτων για ιολογική εξέταση

1. Ομογενοποίηση των οργάνων

Στο εργαστήριο θα πρέπει να ομογενοποιούνται πλήρως (με χωνευτήρα, αναμείκτη ή ιγδίο) οι ιστοί που βρίσκονται στους σωλήνες και στη συνέχεια να τοποθετούνται σε μορφή εναιωρήματος στο αρχικό υπόστρωμα μεταφοράς. Εάν το δείγμα αποτελείται από ολόκληρους ιχθύες μικρότερους από 6 cm, αυτοί τεμαχίζονται με αποστειρωμένο ψαλίδι, μετά από την αφαίρεση του σώματος που βρίσκεται όπισθεν του ανοίγματος των εντοσθίων, ομογενοποιούνται ως ανωτέρω και τοποθετούνται σε μορφή εναιωρήματος στο υπόστρωμα μεταφοράς. Η τελική αναλογία του ιστολογικού υλικού και του υποστρώματος μεταφοράς θα πρέπει να είναι >NUM>1 >DEN>10.

2. Φυγοκέντρηση του πολτού

Ο πολτός φυγοκεντρείται σε καταψυχόμενο φυγόκεντρο στους 2 ° - 5° C στα 2000 - 4000 Χ g επί 15 λεπτά και στη συνέχεια συλλέγεται το υπερκείμενο υγρό και εκτίθεται σε αντιβιοτικά, είτε επί 4 ώρες σε 15° C είτε ολονυχτίς σε 4° C, δηλαδή σ' αυτό το στάδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί γενταμικίνη σε ποσοστό 1mg/ml.

Εάν η αποστολή του δείγματος έγινε μέσα σε υπόστρωμα μεταφοράς (δηλαδή με έκθεση σε αντιβιοτικά), το υπερκείμενο υγρό δεν χρειάζεται περαιτέρω μεταχείριση με αντιβιοτικά.

Η αντιβιοτική μεταχείριση αποσκοπεί στον έλεγχο της βακτηριακής μόλυνσης των δειγμάτων και καθιστά περιττή τη διήθηση μέσω μεμβρανικών φίλτρων.

Εάν το υπερκείμενο υγρό που συλλέχθηκε διατηρήθηκε σε -80° C επί 48 ώρες μετά τη δειγματοληψία, μπορεί να αποψυχθεί και να ξαναχρησιμοποιηθεί μία μόνο φορά για ιολογική εξέταση.

Εάν εμφανιστούν πρακτικές δυσχέρειες (βλάβη του επωαστή, προβλήματα στις κυτταροκαλλιέργειες, κ.λπ.), οι οποίες εμποδίζουν τον εμβολιασμό των κυττάρων κατά τις 48 ώρες μετά τη συλλογή των δειγμάτων ιστών, επιτρέπεται η κατάψυξη του υπερκείμενου υγρού σε -80° C, αλλά θα πρέπει να πραγματοποιηθεί μια ιολογική εξέταση εντός 14 ημερών.

Πριν τον εμβολιασμό των κυττάρων, θα πρέπει να αναμειγνύεται το υπερκείμενο υγρό με ίσα μέρη μιας ομάδας κατάλληλα αραιωμένων αντιορών σε ιθαγενείς ορότυπους του ιού ΙΡΝ, και να επωάζεται κατ' αυτόν τον τρόπο επί τουλάχιστον μία ώρα σε 15° C ή το πολύ επί 18 ώρες σε 4° C. Ο τίτλος του αντιορού θα πρέπει να είναι τουλάχιστον >NUM>1 >DEN>2 000 σε δοκιμή εξουδετέρωσης 50 % της επιφανειακής πλάκας.

Η επεξεργασία όλων των εμβολίων με αντιορό στον ιό ΙΡΝ (ιός, ο οποίος σε ορισμένες περιοχές της Ευρώπης εκδηλώνεται στο 50 % των δειγμάτων ιχθύων) αποσκοπεί στην αποτροπή ανάπτυξης ΚΠΦ, οφειλόμενου στον ιό ΙΡΝ, σε εμβολιασμένες κυτταροκαλλιέργειες. Αυτό θα μειώσει τη διάρκεια των βιολογικών εξετάσεων, καθώς και τον αριθμό των περιπτώσεων στις οποίες η εμφάνιση του ΚΠΦ θα θεωρείται δυνάμει ενδεικτική για VHS ή IHN.

Όλα τα δείγματα προέρχονται από μονάδες παραγωγής που θεωρούνται απαλλαγμένες από ΙΡΝ, μπορεί να παραλειφθεί η επεξεργασία των εμβολίων με αντιορό στον ιό ΙΡΝ.

ΙΙΙ. Ιολογική εξέταση

1. Κυτταροκαλλιέργειες και υποστρώματα

Θα πρέπει να αναπτύσσονται κύτταρα BF-2 ή RTG-2 και είτε EPC ή FHM, σε 20° C με 30° C σε κατάλληλο υπόστρωμα, δηλαδή σε Eagle's MEM (ή τροποποιήσεις αυτού), με συμπλήρωμα 10 % βοείου εμβρυακού ορού και αντιβιοτικών σε τυποποιημένες συγκεντρώσεις.

Όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται σε κλειστά φιαλίδια, συνιστάται να ρυθμίζεται το υπόστρωμα με διττανθρακικό. Το υπόστρωμα που χρησιμοποιείται για καλλιέργεια κυττάρων σε ανοιχτές μονάδες πρέπει να ρυθμίζεται με Tris-HCl (23 mM) και διττανθρακικό νάτριο (6 mM). Το pH θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πλησιέστερο του 7,6.

Οι κυτταροκαλλιέργειες που θα χρησιμοποιηθούν για εμβολιασμό με ιστολογικό υλικό πρέπει να είναι πρόσφατες (4 με 48 ωρών) και ενεργά αναπτυσσόμενες (όχι συρρέουσες) κατά τον εμβολιασμό.

2. Εμβολιασμός των κυτταροκαλλιεργειών

Θα πρέπει να εμβολιάζεται εναιώρημα οργάνων επεξεργασμένο με αντιβιοτικά μέσα σε κυτταροκαλλιέργεια σε δύο διαλύματα: το πρώτο και, επιπρόσθετα, μια αραίωση >NUM>1 >DEN>10 αυτού, το οποίο να δίνει αντίστοιχα τελικά διαλύματα του ιστολογικού υλικού σε υπόστρωμα κυτταροκαλλιέργειας σε >NUM>1 >DEN>100 και >NUM>1 >DEN>1 000 (κατά τρόπο ώστε να αποφεύγονται ομόλογες αλληλεπιδράσεις). Πρέπει να εμβολιάζονται τουλάχιστον δύο σειρές κυττάρων (βλ. ΙΙΙ.1). Η αναλογία μεγέθους εμβολίου και όγκου υποστρώματος κυτταροκαλλιέργειας θα πρέπει να είναι περίπου >NUM>1 >DEN>10.

Για κάθε διάλυμα και για κάθε σειρά κυττάρων, θα πρέπει να χρησιμοποιείται ελάχιστη κυτταρική επιφάνεια περίπου 2 cm², η οποία αντιστοιχεί σε μια κοιλότητα δίσκου κυτταροκαλλιέργειας των 24 κοιλοτήτων. Συνιστάται η χρησιμοποίηση δίσκου κυτταροκαλλιέργειας, αλλά είναι εξίσου αποδεκτές και άλλες μονάδες με παρόμοια ή μεγαλύτερη επιφάνεια ανάπτυξης.

3. Επώαση των κυτταροκαλλιεργειών

Οι εμβολιασμένες κυτταροκαλλιέργειες θα πρέπει να επωάζονται στους 15° C επί 7 μέχρι 10 ημέρες. Εάν το χρώμα του υποστρώματος της κυτταροκαλλιέργειας αλλάξει από κόκκινο σε κίτρινο, υποδηλώνοντας οξίνιση του υποστρώματος, θα πρέπει να πραγματοποιηθεί προσαρμογή του pH με αποστειρωμένο διάλύμα διττανθρακικού ή ισοδύναμες ουσίες, προκειμένου να εξασφαλιστεί η επιδεκτικότητα των κυττάρων στη μόλυνση από τον ιό.

Θα πρέπει κάθε έξι μήνες να πραγματοποιείται τιτλοδότηση των κατεψυγμένων αποθεμάτων των ιών VHS και IHN για να πιστοποιείται η επιδεκτικότητα των κυτταροκαλλιεργειών στη μόλυνση.

4. Μικροσκόπηση

Οι εμβολιασμένες κυτταροκαλλιέργειες, θα πρέπει να επιθεωρούνται καθημερινά ως προς την εμφάνιση ΚΦΠ σε μεγένθυση περίπου 40. Εάν παρατηρηθεί εμφανές ΚΠΦ, θα πρέπει να αρχίσουν αμέσως οι διαδικασίες ταυτοποίησης του ιού με το τμήμα IV.

5. Επιμέρους καλλιέργεια

Εάν δεν έχει αναπτυχθεί ΚΠΦ μετά από την αρχική επώαση επί επτά μέχρι δέκα ημέρες, θα πρέπει να πραγματοποιηθεί μια επιμέρους καλλιέργεια σε πρόσφατες κυτταροκαλλιέργειες με τη χρησιμοποίηση κυτταρικής επιφάνειας, παρόμοιας με αυτή της αρχικής καλλιέργειας.

Επί επτά μέχρι δέκα ημέρες από την επώαση θα πρέπει να συγκεντρώνονται, σύμφωνα με τη σειρά των κυττάρων, υποπολλαπλάσια του υποστρώματος (υπερκείμενο υγρό) από όλες τις καλλιέργειες/κοιλότητες που συνιστούν την αρχική καλλιέργεια. Στη συνέχεια, οι ομάδες εμβολιάζονται σε ομόλογες κυτταροκαλλιέργειες μη διαλυμένες και διαλυμένες σε >NUM>1 >DEN>10 (δίνοντας αντίστοιχα τελικά διαλύματα του υπερκείμενου υγρού σε >NUM>1 >DEN>10 και >NUM>1 >DEN>100), όπως περιγράφεται στο τμήμα Ι.ΙΙΙ.2. Του εμβολιασμού μπορεί να προηγηθεί προεπώαση των διαλυμάτων με αντιορό στον ιό ΙΡΝ σε κατάλληλη αραίωση, όπως περιγράφεται στο τμήμα Ι.ΙΙ.2.

Στη συνέχεια, οι εμβολιασμένες καλλιέργειες θα πρέπει να επωάζονται επί επτά μέχρι δέκα ημέρες σε 15° C, λαμβανομένων υπόψη των διατάξεων του τμήματος ΙΙΙ.4.

Εάν παρατηρηθεί τοξική ΚΠΦ κατά τις τρεις πρώτες ημέρες μετά την επώαση, μπορεί να πραγματοποιηθεί σ' αυτό το στάδιο μια επιμέρους καλλιέργεια αλλά σ' αυτή την περίπτωση τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν επωασθεί επί επτά ημέρες και να έχουν υποβληθεί σε νέα επιμέρους καλλιέργεια, ακολουθούμενη από άλλες επτά ημέρες επώασης. Εάν παρατηρηθεί ΚΠΦ μετά από τρεις ημέρες, τα κύτταρα μπορούν να γίνουν δεκτά και να επωαστούν, προκειμένου να συμπληρώσουν συνολικά 14 ημέρες από τον αρχικό εμβολιασμό. Δεν θα πρέπει να παρατηρηθούν σ' αυτά σημεία τοξικότητας κατά τη διάρκεια των επτά τελευταίων ημερών επώασης.

IV. Προσδιορισμός της ταυτότητας του ιού

1. Δοκιμές για τον προσδιορισμό της ταυτότητας του ιού

Εάν παρατηρηθεί ΚΠΦ σε μια κυτταροκαλλιέργεια, το υπόστρωμα (υπερκείμενο υγρό) συλλέγεται και εξετάζεται σύμφωνα με μία ή περισσότερες από τις ακόλουθες τεχνικές: εξουδετέρωση, ανοσοφθορισμό (IF), ανοσοαπορρόφηση μέσω σύνδεσης με ένζυμο (ELISA).

Εάν οι δοκιμές δεν επιτρέπουν τον βέβαιο προσδιορισμό της ταυτότητας του ιού εντός μίας εβδομάδας, τότε αυτός θα πρέπει να μεταφερθεί σε ένα εθνικό εργαστήριο αναφοράς για ασθένειες ιχθύων ή στο εργαστήριο αναφοράς της ΕΕ για ασθένειες ιχθύων, προκειμένου να προσδιοριστεί αμέσως η ταυτότητά του.

Τα ανοσοαντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της ταυτότητας του ιού θα πρέπει να είναι ποιότητας αναφοράς και εγκεκριμένα, όσον αφορά τον τίτλο και την εξειδίκευση, από το εθνικό εργαστήριο αναφοράς για ασθένειες ιχθύων.

2. Εξουδετέρωση

Θα πρέπει να απομακρυνθύν τα κύτταρα από το υπόστρωμα με φυγοκέντρηση (2000 - 4000 Χ g) ή με διήθηση μέσω μεμβράνης (0,45 μm), και στη συνέχεια να αραιωθεί το υπόστρωμα σε >NUM>1 >DEN>100 και >NUM>1 DEN>10 000

μέσα σε ένα υπόστρωμα κυτταροκαλλιέργειας.

Στη συνέχεια θα πρέπει να αναμειχθούν τα υποπολλαπλάσια των διαλυμάτων και να επωασθούν ξεχωριστά επί 60 λεπτά σε 15° C μαζί με ίσα μέρη των ακόλουθων αντιδραστηρίων:

>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>

Τουλάχιστον δύο κυτταροκαλλιέργειες θα πρέπει να εμβολιάζονται με 50 μl καθεμία από κάθε μείγμα ιού-ορού και μετά να επωάζονται σε 15° C. Θα πρέπει να ελέγχεται η ανάπτυξη του ΚΠΦ, όπως περιγράφεται στο τμήμα ΙΙΙ.4.

Μπορούν να εφαρμόζονται και άλλες δοκιμές εξουδετέρωσης, αποδεδειγμένης αποτελεσματικότητας.

2. Ανοσοφθορισμός (IF)

Για κάθε απομόνωση ιού που θα πρέπει να εντοπιστεί η ταυτότητά του, θα πρέπει να επικαλύπτονται τουλάχιστον οκτώ γυάλινα τριβλία ή ισοδύναμά τους με κύτταρα EPC σε πυκνότητα που αποβαίνει σε συρροή περίπου 60 μέχρι 90 % μετά από 24 ώρες καλλιέργειας. Για το σκοπό αυτό, θα πρέπει να επιλέγονται τα κύτταρα EPC, λόγω της ισχυρής προσκόλλησής τους σε γυάλινες επιφάνειες.

Όταν τα κύτταρα έχουν κατακαθίσει επάνω στη γυάλινη επιφάνεια (περίπου μία ώρα μετά την επικάλυψη), ή όταν οι καλλιέργειες έχουν επωασθεί επί 24 ώρες το μέγιστο, θα πρέπει να εμβολιάζεται ο ιός του οποίου πρέπει να εντοπιστεί η ταυτότητά του. Θα πρέπει να εμβολιάζονται τέσσερις καλλιέργειες σε αναλογία >NUM>1 >DEN>10 κατ' όγκο, καθώς και τέσσερις καλλιέργειες σε αναλογία >NUM>1 >DEN>100.

Μετά την πάροδο 20 και 30 ωρών από τον εμβολιασμό, οι καλλιέργειες θα πρέπει να εκπλύνονται δύο φορές εντός Eagle's MEM χωρίς ορό, να σταθεροποιούνται με ακετόνη και στη συνέχεια να χρωνύονται με IF διπλής στοιβάδας. Η πρώτη στοιβάδα αντιδραστήρων αποτελείται από πολύ- ή μονόκλωνα αντισώματα ποιότητας αναφοράς. Η δεύτερη είναι αντιορός, συζευγμένος με FITC, κατά της ανοσογλοβουλίνης που χρησιμοποιείται στην πρώτη στοιβάδα. Θα πρέπει να χρωνύονται τουλάχιστον μία εμβολιασμένη καλλιέργεια υψηλής δόσης και μία χαμηλής δόσης, για καθέναν από τους δοκιμαζόμενους αντιορούς. Στη δοκιμή θα πρέπει να συμπεριλαμβάνονται κατάλληλοι αρνητικοί και θετικοί έλεγχοι.

Οι χρωσμένες καλλιέργειες στερεώνονται με τη χρησιμοποίηση διαλύματος αλατούχου γλυκερίνης. Θα πρέπει επίσης να εξετάζονται υπό προσπίπτον υπεριώδες φως. Χρησιμοποιούνται σ' αυτή την περίπτωση προσοφθάλμιοι των 10 Χ ή 12 Χ και αντικειμενικοί φακοί των Χ 25 ή Χ 40, με αριθμητικό άνοιγμα > 0,7 και > 1,3 αντίστοιχα.

Ορισμένα στελέχη του ιού Egtved αντιδρούν έντονα με αντιορό κατά του στελέχους αναφοράς F1 σε IF, αν και δεν αντιδρούν στις δοκιμές εξουδετέρωσης.

Η τεχνική IF που περιγράφεται ανωτέρω ενδείκνυται ως παράδειγμα. Μπορούν να εφαρμόζονται και άλλες τεχνικές IF (όσον αφορά τις κυτταροκαλλιέργειες, η σταθεροποίηση και τα αντισώματα ποιότητας αναφοράς), αποδεδειγμένης αποτελεσματικότητας.

3. Δοκιμή ELISA

Θα πρέπει να επικαλύποννται κοιλότητες σε τριβλία μικροτιτλοδότησης (για παράδειγμα, Nunc-ανοσοτριβλία, Maxisorp, Nunc, Denmark) κατά τη διάρκεια μιας νύχτας με συνιστώμενες αραιώσεις κλασμάτων ανοσογλοβουλίνης των αντιορών ποιότητας αναφοράς, καθαρισμένης με πρωτεΐνη Α.

Αφού εκπλυθούν οι κοιλότητες με ρυθμιστικό διάλυμα PBS-Tween-20, ο προς ταυτοποίηση ιός προστίθεται στις κοιλότητες σε διαδοχικές διπλές ή τετραπλές αραιώσεις και αφήνεται να αντιδράσει με το επικαλύπτον αντίσωμα επί 60 λεπτά σε 37° C. Μετά την έκπλυση με ρυθμιστικό διάλυμα PBS-Tween-20, προστίθενται βιοτινυλιωμένα αντισώματα εξειδίκευσης αντιστοίχευσης σ' αυτή των επικαλυπτόντων αντισωμάτων και αφήνονται να αντιδράσουν επί 60 λεπτά σε 20° C. Ακολουθεί και νέα έκπλυση ως ανωτέρω, προστίθεται στρεπτοβιδίνη συζευγμένη με HRP και αφήνεται να αντιδράσει επί μία ώρα σε 20° C. Μετά από μια τελευταία έκπλυση, το συνδεδεμένο ένζυμο γίνεται ορατό με τη χρησιμοποίηση κατάλληλων υποστρωμάτων ELISA (OPD και λοιπών).

Η ανωτέρω, βασιζόμενη σε βιοτίνη-οβιδίνη, εκδοχή ELISA δίνεται ως παράδειγμα. Μπορούν να χρησιμοποιούνται και άλλες εκδοχές ELISA αποδεδειγμένης αποτελεσματικότητας.

>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>

>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>

>ΘΕΣΗ ΠΗΝΑΚΑ>

ΜΕΡΟΣ ΙΙ

ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ IHN ΚΑΙ VHS ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ ΥΠΟΨΙΑΣ ΕΠΙΔΗΜΙΑΣ

Η διάγνωση της IHN και της VHS μπορεί να επιτευχθεί με μία από τις ακόλουθες τεχνικές:

- Α. Συμβατική απομόνωση του ιού, ακολουθούμενη από ορολογική ταυτοποίηση του ιού.

- Β. Απομόνωση του ιού με ταυτόχρονη ορολογική ταυτοποίηση του ιού.

- Γ. Λοιπές τεχνικές διάγνωσης (IF, ELISA).

Η πρώτη διάγνωση της IHN και της VHS σε εκμεταλλεύσεις που βρίσκονται σε εγκεκριμένες ζώνες δεν θα πρέπει να βασίζεται στη μέθοδο Γ. Πρέπει να εφαρμόζεται είτε η μέθοδος Α είτε η μέθοδος Β.

Το ιστολογικό υλικό που προορίζεταιι για ιολογική εξέταση μπορεί σε ορισμένες περιπτώσεις να πρέπει να συνοδεύεται από συμπληρωματικό υλικό, ενόψει βακτηριολογικής, παρασιτολογικής, ιστολογικής ή άλλης εξέτασης, προκειμένου να δοθεί η δυνατότητα για μια διαφοροποιημένη διάγνωση. Τέτοιου είδους υλικό πρέπει να συγκεντρώνεται σύμφωνα με τις διαδικασίες που καθορίζονται από το διεθνές γραφείο επιζωοτιών (OIE).

ΙΙ.Α. Συμβατική απομόνωση του ιού, ακολουθούμενη από ορολογική ταυτοποίηση του ιού

II.A.I.1. Επιλογή των δειγμάτων

Πρέπει να επιλέγονται προς εξέταση τουλάχιστον 10 ιχθύες που εμφανίζουν τυπικά συμπτώματα IHN ή VHS.

II.A.I.2. Προετοιμασία και αποστολή των δειγμάτων των ιχθύων

Βλέπε I.I.3

II.A.I.3. Συλλογή συμπληρωματικού διαγνωστικού υλικού

Βλέπε I.I.4

II.A.II Προετοιμασία των δειγμάτων για ιολογική εξέταση

Βλέπε I.II

II.A.III Ιολογική εξέταση

Βλέπε I.III, εάν πρόκειται μόνο για κύτταρα BF-2, RTG-2 EPC ή FHM, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για εμβολιασμό με το ιστολογικό υλικό.

II.A.IV Προσδιορισμός της ταυτότητας του ιού

Βλέπε I.IV.

II.B. Απομόνωση του ιού με συνοδεύουσα ορολογική απομόνωση του ιού

II.B.I.1. Επιλογή των δειγμάτων

Βλέπε II.A.I.1.

II.B.I.2. Προετοιμασία και αποστολή των δειγμάτων των ιχθύων

Βλέπε I.I.3.

II.B.I.3. Συλλογή συμπληρωματικού διαγνωστικού υλικού

Βλέπε I.I.4.

II.B.II.1. Ομογενοποίηση των οργάνων

Βλέπε I.II.1.

II.B.II.2. Φυγοκέντρηση του πολτού

Βλέπε I.II.2.

II.B.II.3. Επεξεργασία του υπερκείμενου υγρού με διαγνωστικούς αντιορούς

Το επεξεργασμένο με αντιβιοτικά και αντι-IPN εναιώρημα οργάνου αραιούται σε >NUM>1 >DEN>10 και >NUM>1 >DEN>10 000

σε υπόστρωμα κυτταροκαλλιέργειας και υποπολλαπλάσια αναμειγνύονται και επωάζονται επί 60 λεπτά σε 15° C με ίσα μέρη των αντιδραστηρίων που καταγράφονται στο τμήμα I.IV.2.

II.B.III.1. Κυτταροκαλλιέργειες και υποστρώματα

Καλλιεργούνται κύτταρα BF-2 ή RTG-2 και είτε EPC ή FHM σε 20 με 30° C σε κατάλληλο υπόστρωμα, δηλαδή Eagle's MEM (ή τροποποιήσεις του), με την πρόσθεση 10 % βοείου εμβριακού ορού και αντιβιοτικών σε τυποποιημένες συγκεντρώσεις.

Σε περίπτωση που τα κύτταρα καλλιεργούνται σε κλειστά φιαλίδια συνιστάται η ρύθμιση του υποστρώματος με διττανθρακικό. Το υπόστρωμα που χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια των κυττάρων σε ανοιχτές μονάδες μπορεί να ρυθμίζεται με Tris-HCl (23 mM) και διττανθρακικό νάτριο (6 mM). Το pH θα πρέπει επίσης να είναι το δυνατό πλησιέστερο στο 7,6.

Οι κυτταροκαλλιέργειες που θα χρησιμοποιηθούν για εμβολιασμό με ιστολογικό υλικό, θα πρέπει να είναι πρόσφατες (4 μέχρι 48 ωρών) και ενεργά αναπτυσσόμενες (όχι συρρέουσες) κατά τον εμβολιασμό.

II.B.III.2. Εμβολιασμός των κυτταροκαλλιεργειών

Εμβολιάζονται τουλάχιστον δύο κυτταροκαλλιέργειες ανά κυτταρική σειρά με 50 μl η καθεμία από κάθε μείγμα ορού-ιού (παρασκευασμένο σύμφωνα με το II.B.II.3).

II.B.III.3. Επώαση κυτταροκαλλιεργειών

Βλέπε I.III.3

II.B.III.4. Μικροσκόπηση

Θα πρέπει να επιθεωρούνται καθημερινά οι εμβολιασμένες κυτταροκαλλιέργειες ως προς την εμφάνιση ΚΠΦ σε μεγέθυνση περίπου 40. Εάν η εμφάνιση ΚΠΦ αποτρέπεται με έναν από τους χρησιμοποιούμενους αντιορούς, μπορεί να θεωρηθεί κατά συνέπεια ότι ο ιός έχει ταυτοποιηθεί.

Σε περίπτωση που η εμφάνιση ΚΠΦ δεν αποτρέπεται από κάποιον από τους αντιορούς, θα πρέπει να πραγματοποιηθούν οι διαδικασίες ταυτοποίησης του ιού, σύμφωνα με το I.IV.

II.B.III.5. Επιμέρους καλλιέργεια

Εάν το ΚΠΦ δεν έχει εμφανιστεί καθόλου μετά από επτά ημέρες, θα πρέπει να πραγματοποιηθεί επιμέρους καλλιέργεια από καλλιέργειες εμβολιασμένες με υπερκείμενο υγρό συν το υπόστρωμα (II.B.II.3.), σύμφωνα με το I.III.5.

ΙΙ.Γ. Λοιπές διαγνωστικές τεχνικές

Υπερκείμενο υγρό, παρασκευασμένο όπως περιγράφεται στο II.A.II.2, μπορεί να υποβληθεί σε IF ή ELISA, σύμφωνα με το II.A.IV.3 ή II.A.IV.4 αντίστοιχα. Οι ταχείες αυτές τεχνικές θα πρέπει να συμπληρώνονται με μία ιολογική εξέταση, σύμφωνα με το Α ή Β εντός 48 ωρών μετά τη δειγματοληψία, εάν:

α) το αποτέλεσμα είναι αρνητικό

ή

β) προκύψει θετικό αποτέλεσμα με δείγματα που αντιπροσωπεύουν την πρώτη περίπτωση IHN ή VHS σε μια εγκεκριμένη ζώνη.

Το ιστολογικό υλικό μπορεί να υποβληθεί και σε άλλες διαγνωστικές τεχνικές, όπως στην IF επί κατεψυγμένων στοιχείων ή την ανοσοϊστοχημεία επί ιστολογικού υλικού, σταθεροποιημένου με φορμαλίνη. Οι τεχνικές αυτές θα πρέπει πάντα να συνοδεύονται από ένα εμβολιασμό μη σταθεροποιημένο σε κυτταροκαλλιέργειες ιστολογικού υλικού.

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ

BF-2 ινοβλάστης του bluegill (σειρά κυττάρων)

ECP κυτταροπαθογενές φαινόμενο

ELISA ανοσοενζυματική μέθοδος

EPC Epithelioma papulosum cyprinii (σειρά κυττάρων)

FHM tκte de boule (σειρά κυττάρων)

FITC ισοθειοκυανάτη φθοριεσκίνης

HRP υπεροξειδάση από ραφανίδα

IF ανοσοφθορισμός

IFAT ανοσοφθορισμός των τίτλων αντισωμάτων

IHN(V) λοιμώδης αιματοποιητική νέκρωση (ιός)

PIN(V) λοιμώδης παγκρεατική νέκρωση (ιός)

MEM ελάχιστο βασικό υπόστρωμα

OPD ορθοφενολίνη διαμίνη

PBS διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφάτο

RTG-2 γεννητικός αδένας της ιριδιειδούς πέστροφας (σειρά κυττάρων)

Tris-HCl tris(hydroxymιthyl) aminomιthane - HCl

VHS(V) λοιμώδης αιμορραγική νέκρωση (ιός)

(1*) Κλινικές επιθεωρήσεις.