►B

ROZHODNUTÍ KOMISE

ze dne 1. února 2002,

kterým se schvaluje diagnostická příručka s diagnostickými postupy, metodami odběru vzorků a kritérii pro hodnocení laboratorních testů na potvrzení klasického moru prasat

(oznámeno pod číslem K(2002) 381)

(Text s významem pro EHP)

(2002/106/ES)

(Úř. věst. L 039, 9.2.2002, p.71)

Úřední věstník

  No

page

date

►M1

ROZHODNUTÍ KOMISE ze dne 5. prosince 2003,

  L 324

55

11.12.2003

1.

Odstávčata a prasata na výkrm nejčastěji vykazují akutní formu klasického moru prasat. Počátečními známkami jsou anorexie, letargie, horečka, zánět očních spojivek, oteklé lymfatické uzliny, respirační příznaky a zácpa následovaná průjmem.

Typické hemoragie kůže se obvykle vyskytují na uchu, ocase, břiše a vnitřní straně končetin od druhého a třetího týdne od infekce až do uhynutí. Často lze pozorovat neurologické příznaky, například vrávorání zadních končetin, nekoordinované pohyby a křeče.

Stálým nálezem je horečka. Je obvykle vyšší než 40 °C, ale u dospělých prasat nemusí přesáhnout 39,5 °C.

2.

Vir klasického moru prasat způsobuje těžkou leukopenii a utlumení imunitní reakce organismu, což často vede k sekundárním střevním nebo dýchacím infekcím. Známky těchto sekundárních infekcí mohou zakrýt nebo překrýt nejtypičtější znaky klasického moru prasat, a tak mohou být pro chovatele nebo veterináře zavádějící.

K úhynu většinou dojde do jednoho měsíce. Dochází i k uzdravení a produkci protilátek, nejčastěji u dospělých plemenných zvířat, která nevykazují závažné klinické příznaky. Protilátky proti viru klasického moru prasat lze zjistit od druhého nebo třetího týdnu po infikování.

3.

Patologické změny viditelné při postmortálním vyšetření lze nejčastěji pozorovat v lymfatických uzlinách a v ledvinách. Lymfatické uzliny jsou oteklé a hemoragické. Hemoragie ledvin mohou mít různou velikost, od téměř neviditelných petechií po ekchymozní hemoragie. Podobné hemoragie lze pozorovat také v močovém měchýři, hrtanu, hrtanové příklopce a srdci a někdy na serózní bláně pobřišnice a pohrudnice. Často je zjištěn také nehnisavý zánět mozku. Lze pozorovat také změny způsobené sekundárními infekcemi, které mohou být pro veterináře zavádějící. Infarkty ve slezině se pokládají za patognomonické příznaky, ale vyskytují se zřídka.

4.

Akutní forma afrického moru prasat má většinou velice podobný klinický a patologický obraz jako klasický mor prasat. Hemoragie kůže a uší, pokud k nim dojde, lze snadno rozpoznat a nabýt podezření na akutní africký nebo klasický mor prasat. Málokteré jiné choroby způsobují podobné léze.

Akutní klasický mor prasat je nutno brát v úvahu také v případě podezření na eryspel, rozmnožovací a dýchací syndrom prasat, otravu kumarinem, tečkovité krvácení, multisystémový kachektický syndrom po odstavu, dermatitidu prasat a syndrom choroby ledvin, infekce Salmonellou nebo Pasteurellou nebo jakékoli střevní nebo dýchací syndromy s horečkou, které nereagují na léčbu antibiotiky.

5.

Virus klasického moru prasat se přenáší slinami, močí a výkaly od chvíle, kdy se objeví klinické příznaky až po úhyn. Vir klasického moru prasat může být také přenesen spermatem.

1.

K chronickému průběhu infekce dochází, pokud prasata nejsou schopna vyvolat účinnou imunitní reakci na virus klasického moru prasat. Počáteční příznaky chronické infekce se podobají příznakům akutní infekce. Později převládají nespecifické příznaky, tj. přerušovaná horečka, chronická enteritida a kachexie. Nedochází k typickým kožním hemoragiím.

Taková prasata mohou vykazovat klinické příznaky choroby 2 až 3 měsíce před úhynem. Od prvního výskytu klinických příznaků až po úhyn neustále šíří vir klasického moru prasat. Ve vzorcích séra lze dočasně zjistit protilátky.

2.

Patologické změny jsou méně typické, mohou být zjištěny zejména hemoragie v orgánech a serózní bláně. U zvířat s chronickým průjmem jsou běžné nekrotické změny v ileu, ileocekální chlopni a v konečníku.

3.

Vzhledem k tomu, že klinické příznaky klasického moru prasat jsou značně nespecifické, musí se u mnoha jiných chorob uvažovat o diferenciální diagnóze. U všech zvířat nedochází nutně ke zvýšení tělesné teploty, ale v zamořeném hospodářství bude horečka zjištěna přinejmenším u části prasat.

1.

Vir klasického moru prasat je schopen infikovat plod přes placentu prasnic, ale u prasnic samotných choroba často zůstane v subklinické formě.

Výsledek infekce plodů přes placentu závisí z velké části na stádiu gravidity a na virulenci viru. Infekce na počátku gravidity může vést k potratům, narození mrtvého selete, mumifikaci nebo malformacím. To vše vede ke snížení indexu plodnosti v hospodářství.

Infekce prasnic před devadesátým dnem gravidity může vést k narození trvale viremických selat, která mohou být při narození klinicky normální a mohou přežít několik měsíců. Po narození se u nich může projevit špatný růst, kachexie, občas i vrozený třes. Tento průběh infekce se označuje jako „pozdní propuknutí klasického moru prasat“. Tato selata mohou hrát hlavní roli při šíření choroby a udržování perzistence viru v populaci, protože až do svého úhynu neustále šíří vir.

2.

Zjištění klasického moru prasat může být obzvláště obtížné v chovech plemenných prasat, protože průběh infekce může být velmi mírný a lze ho zaměnit za mnoho jiných patologických stavů. Příčinou snížené plodnosti a potratů může být vir klasického moru prasat stejně tak jako infekce parvovirem, rozmnožovací a dýchací syndrom prasat, leptospiróza a Aujeszkyho choroba. Těla nedonošených prasat potracených kvůli infekci virem klasického moru prasat nelze po patologické stránce rozlišit od potratů způsobených jinými patogenními činiteli.

V případě podezření na infekční chorobu rozmnožovacího ústrojí musí být okamžitě provedeno vyšetření na klasický mor prasat, pokud může být dané hospodářství považováno za rizikové (např. z důvodů umístění hospodářství v oblasti, ve které se klasický mor prasat vyskytuje u volně žijících prasat) a kdykoli, jakmile byly vyloučeny běžnější infekční choroby rozmnožovacího ústrojí.

1.

Členské státy zajistí, aby v podezřelých hospodářstvích byla provedena příslušná klinická vyšetření, odběr vzorků a laboratorní vyšetření, která potvrdí nebo vyloučí klasický mor prasat podle obecných zásad a postupů stanovených v bodech 2 až 7.

Bez ohledu na přijetí opatření uvedených v čl. 4 odst. 2 směrnice 2001/89/ES v daném hospodářství, platí tyto obecné zásady a postupy také pro choroby, u nichž diferenciální diagnóza zvažuje klasický mor prasat. Týkají se i případů, v nichž klinické příznaky a epizootologický obraz choroby pozorované u prasat naznačují velice nízkou pravděpodobnost výskytu klasického moru prasat.

Ve všech ostatních případech, v nichž existuje podezření, že jedno nebo několik prasat je infikováno virem klasického moru prasat, se v daném podezřelém hospodářství přijmou opatření uvedená v čl. 4 odst. 2 směrnice 2001/89/ES.

V případě podezření na klasický mor prasat u prasat na jatkách nebo v dopravním prostředku obdobně platí postupy stanovené v bodech 2 až 7.

2.

Když úřední veterinární lékař navštíví podezřelé hospodářství, aby potvrdil nebo vyvrátil výskyt klasického moru prasat:

Klinické vyšetření musí zahrnovat změření tělesné teploty a musí se týkat zejména těchto prasat nebo skupin prasat:

Pokud inspekce v podezřelém hospodářství nezjistí přítomnost prasat nebo skupin prasat uvedených v předcházejícím bodu, zajistí příslušný orgán, aniž jsou dotčena jiná opatření, která se mohou na dané hospodářství vztahovat podle směrnice 2001/89/ES, a s ohledem na epizootologickou situaci, aby:

3.

Pokud se odkazuje na tento bod, je nutné, aby bylo klinické vyšetření v daném hospodářství provedeno na náhodně vybraných prasatech v podjednotkách, u nichž bylo zjištěno riziko zavlečení viru klasického moru prasat nebo u nichž existuje podezření na takové riziko.

V těchto podjednotkách musí minimální počet vyšetřených prasat umožnit zjištění moru, pokud se vyskytuje, s jistotou 95 % při prevalenci 10 %.

Avšak v případě:

4.

Pokud se v podezřelém hospodářství naleznou uhynulá nebo umírající prasata, musí být provedena postmortální vyšetření, pokud je to možné přinejmenším u pěti z těchto prasat, a to zejména u prasat:

Pokud tato vyšetření nezjistila změny poukazující na klasický mor prasat, ale pokud je kvůli epizootologické situaci považováno za nutné provést další šetření:

Bez ohledu na přítomnost nebo nepřítomnost změn poukazujících na klasický mor prasat musí být prasatům, u kterých se provádí postmortální vyšetření, odebrány vzorky orgánů nebo tkání k virologickým testům podle kapitoly V části B bodu 1. Tyto vzorky by měly být odebrány z nedávno uhynulých prasat.

Při provádění postmortálního vyšetření musí příslušný orgán zajistit, aby:

5.

Pokud jsou v podezřelém hospodářství zjištěny další klinické příznaky nebo změny, které mohou poukazovat na klasický mor prasat, ale příslušný orgán usoudí, že tyto nálezy nestačí k potvrzení ohniska klasického moru prasat a že jsou proto nutné laboratorní testy, musí být podezřelým prasatům a dalším prasatům v každé podjednotce, ve které jsou chována podezřelá prasata, odebrány v souladu s níže uvedenými postupy vzorky krve k laboratornímu vyšetření.

Minimální počet vzorků odebraných pro sérologické testy musí v dané podjednotce umožnit zjištění 10 % séroprevalence s jistotou 95 %.

Avšak v případě:

Počet vzorků odebraných k virologickým testům odpovídá pokynům příslušného orgánu, který vezme v úvahu škálu testů, jež mohou být provedeny, citlivost laboratorních testů, které budou použity, a epizootologickou situaci.

6.

Pokud se v daném hospodářství vztahuje podezření z klasického moru prasat k výsledkům předchozích sérologických testů, uplatní se kromě odběru vzorků krve prasatům uvedeným v bodu 2 druhém pododstavci páté odrážce i tyto postupy:

7.

Pokud po vyšetření provedeném v podezřelém hospodářství nejsou zjištěny klinické příznaky nebo změny typické pro klasický mor prasat, ale pokud příslušný orgán usoudí, že k vyloučení klasického moru prasat jsou nezbytné další laboratorní testy, použijí se pro orientační účely postupy odběru vzorků uvedené v bodu 5.

1.

Aby mohl být zjištěn způsob zavlečení viru klasického moru prasat do zamořeného hospodářství a doba, která uplynula od zavlečení, musí být v hospodářství, v němž po potvrzení ohniska podle čl. 5 odst. 1 písm. a) směrnice 2001/89/ES probíhá utrácení prasat, těmto prasatům při utracení namátkově odebrány vzorky krve k sérologickým testům.

2.

Minimální počet prasat, kterým jsou odebrány vzorky, musí umožnit zjištění 10 % séroprevalence s jistotou 95 % u prasat v každé podjednotce hospodářství ( 9 ).

Podle pokynů příslušného orgánu, který vezme v úvahu škálu testů, které je možno provést, citlivost laboratorních testů, které budou použity, a epizootologickou situaci, mohou být také odebrány vzorky pro virologické testy.

3.

V případě sekundárních ohnisek však příslušný orgán může rozhodnout o odchylce od bodů 1 a 2 a zavést postupy odběru vzorků ad hoc se zřetelem k dostupným epizootologickým informacím o zdroji a způsobu zavlečení viru do hospodářství a o možném šíření choroby z hospodářství.

1.

Pro potvrzení nebo vyloučení klasického moru prasat a pro získání dodatečných epizootologických informací se v podezřelém hospodářství, v němž probíhá usmrcování prasat jako preventivní opatření podle ustanovení čl. 4 odst. 3 písm. a) nebo čl. 7 odst. 2 směrnice 2001/89/ES, odebírají podle postupu stanoveného v bodu 2 vzorky krve k sérologickým testům a vzorky krve nebo mandlí k virologickým testům.

2.

Odběr vzorků se týká zejména:

Těmto prasatům se musí odebrat vzorky podle pokynů příslušného orgánu, který vezme v úvahu epizootologickou situaci. V takovém případě se pro orientační účely použijí postupy odběru vzorků uvedené níže ve druhém, třetím a čtvrtém bodě.

Kromě toho musí být namátkově odebrány vzorky prasatům pocházejícím z každé podjednotky hospodářství ( 10 ). V tomto případě musí minimální počet vzorků odebraných pro sérologické testy umožnit zjištění 10 % séroprevalence s jistotou 95 % v každé dotčené podjednotce.

Avšak v případě:

Typ vzorků odebraných pro virologické testy i další testy, které budou použity, jsou v souladu s pokyny příslušného orgánu, který vezme v úvahu škálu testů, které lze provést, citlivost těchto testů a epizootologickou situaci.

1.

Aniž jsou dotčena ustanovení čl. 11 odst. 1 písm. f) druhého pododstavce směrnice 2001/89/ES, je pro udělení povolení přemístit prasata z hospodářství umístěných v ochranném pásmu nebo v pásmu dozoru podle čl. 10 odst. 3 uvedené směrnice nezbytné, aby klinické vyšetření provedené úředním veterinárním lékařem:

2.

Pokud budou prasata přemístěna do jiného hospodářství, musí být kromě vyšetření prováděných podle bodu 1 provedeno také klinické vyšetření prasat v každé podjednotce hospodářství, ve které se chovají prasata, která budou přemístěna. V případě prasat starších než tři nebo čtyři měsíce musí toto vyšetření zahrnovat změření tělesné teploty části prasat.

Minimální počet zkontrolovaných prasat musí v těchto podjednotkách umožnit zjištění horečky, pokud se vyskytuje, s jistotou 95 % při prevalenci 20 %.

Avšak v případě:

3.

Pokud budou prasata přemístěna na jatka nebo do zpracovatelského závodu nebo na jakékoli jiné místo, kde budou poražena nebo utracena, musí být kromě vyšetření prováděných podle bodu 1 provedeno také klinické vyšetření prasat v každé podjednotce, v níž se chovají prasata, která budou přemístěna. V případě prasat starších než tři až čtyři měsíce musí toto vyšetření zahrnovat změření tělesné teploty části prasat.

Minimální počet zkontrolovaných prasat musí v těchto podjednotkách umožnit zjištění horečky, pokud se vyskytuje, s jistotou 95 % při prevalenci 20 %.

U plemenných prasnic nebo kanců však musí minimální počet vyšetřených prasat umožnit zjištění horečky, pokud se vyskytuje, s jistotou 95 % při prevalenci 5 % v podjednotce, ve které se chovají prasata, která budou přemístěna.

4.

V případě porážky nebo utracení prasat uvedených v bodu 3 musí být prasatům z každé podjednotky, ze které byly přemístěny, odebrány vzorky krve na sérologické testy a vzorky krve nebo mandlí na virologické testy.

Minimální počet odebraných vzorků musí umožnit zjištění 10 % séroprevalence nebo prevalence viru s jistotou 95 % v každé podjednotce.

U plemenných prasnic nebo kanců však musí minimální počet prasat, kterým budou odebrány vzorky, umožnit zjištění 5 % séroprevalence nebo prevalence viru s jistotou 95 % v podjednotkách, v nichž byla prasata chována.

Typ odebraných vzorků a použité testy odpovídají pokynům příslušného orgánu, který vezme v úvahu škálu testů, které lze provést, citlivost těchto testů a epizootologickou situaci.

5.

Pokud jsou však po porážce nebo utracení prasat zjištěny postmortální změny poukazující na klasický mor prasat, platí odchylně od bodu 4 ustanovení o odběru vzorků uvedená v části C.

1.

Pokud se do hospodářství znovu umísťují prasata v souladu s čl. 13 odst. 2 písm. a) nebo čl. 19 odst. 8 písm. b) druhým pododstavcem směrnice 2001/89/ES, musí být použity tyto postupy odběru vzorků:

V případě plemenných prasnic nebo kanců však musí být počet odebraných vzorků takový, aby umožnil zjištění 10 % séroprevalence s jistotou 95 %.

2.

Po umístění nových prasat příslušný orgán zajistí, aby v případě jakékoli choroby nebo úhynu prasat v hospodářství z neznámých příčin byla dotčená prasata okamžitě vyšetřena na klasický mor prasat. Tato ustanovení platí až do zrušení omezení uvedených v čl. 13 odst. 2 písm. a) druhém pododstavci a v čl. 19 odst. 8 písm. b) druhém pododstavci druhé větě směrnice 2001/89/ES pro dané hospodářství.

1.

Aby mohla být v ochranném pásmu zrušena opatření uvedená v článku 10 směrnice 2001/89/ES, musí být ve všech hospodářstvích v pásmu:

2.

Minimální počet odebraných vzorků krve musí umožnit zjištění 10 % séroprevalence s jistotou 95 % u prasat v každé podjednotce hospodářství.

Avšak v případě:

1.

Aby mohla být v pásmu dozoru zrušena omezení uvedená v článku 11 směrnice 2001/89/ES, musí být ve všech hospodářstvích v pásmu provedeno klinické vyšetření podle postupů stanovených v části A bodu 2.

Kromě toho musí být odebrány vzorky krve prasat:

2.

V každém případě odběru vzorků krve k sérologickým testům v hospodářství, které se nacházejí v pásmu dozoru, musí být počet odebraných vzorků krve v souladu s částí F bodem 2. Pokud se však příslušný orgán domnívá, že se klasický mor prasat mohl nepozorovaně rozšířit mezi plemennými prasnicemi, je možné provést odběr vzorků pouze v podjednotkách, v nichž jsou tato zvířata chována.

1.

V případě sérologického sledování volně žijících prasat v oblastech, v nichž byl potvrzen klasický mor prasat nebo v nichž existuje podezření na jeho výskyt, by nejprve měla být definována velikost populace, které budou odebrány vzorky, a zeměpisná oblast, ve které žije, aby mohl být určen počet vzorků k odebrání. Počet vzorků je nutno stanovit podle odhadovaného počtu živých zvířat a nikoli podle zastřelených zvířat.

2.

Pokud nejsou dostupné údaje o hustotě a velikosti populace, je nutné určit zeměpisnou oblast, v níž budou odebrány vzorky, a brát při tom v úvahu stálou přítomnost volně žijících prasat a existenci přirozených nebo umělých překážek, které účinně brání rozsáhlému a stálému pohybu zvířat. Pokud takové překážky neexistují nebo pokud se jedná o rozlehlé oblasti, doporučuje se určit oblast odběru vzorků, jejíž rozloha nepřesahuje 200 km2, kde obvykle žije populace asi 400 až 1 000 volně žijících prasat.

3.

Aniž jsou dotčena ustanovení čl. 15 odst. 2 písm. c) směrnice 2001/89/ES, musí minimální počet prasat, kterým budou v určené oblasti odběru odebrány vzorky, umožnit zjištění 5 % séroprevalence s jistotou 95 %. Pro tyto účely je v každé určené oblasti nutné odebrat vzorky nejméně 59 zvířatům.

Doporučuje se také, aby:

4.

Shromažďování vzorků pro virologické testy z volně žijících prasat, která byla zastřelena nebo nalezena uhynutá, musí být provedeno podle kapitoly V části B bodu 1.

Pokud se usoudí, že je nezbytné virologické sledování zastřelených volně žijících prasat, musí se provádět zejména na zvířatech starých tři měsíce až jeden rok.

5.

Ke všem vzorkům odeslaným do laboratoře musí být přiložen dotazník uvedený v čl. 16 odst. 3 písm. 1 směrnice 2001/89/ES.

1.

Před provedením odběru vzorků v podezřelém hospodářství musí být vypracována mapa hospodářství a musí být určeny epizootologické podjednotky hospodářství.

2.

Kdykoli se předpokládá, že by mohlo být nutné opakovat odběr vzorků, musí být každé prase, kterému byly odebrány vzorky, označeno vlastní značkou, což zjednoduší opakování odběru vzorků.

3.

Aniž je dotčena kapitola IV část A bod 5 písm. b), nesmí se vzorky pro sérologické testy odebírat selatům, která ještě nedosáhla stáří osmi měsíců.

4.

Všechny vzorky musí být zaslány do laboratoře spolu s příslušnými formuláři podle požadavků stanovených příslušným orgánem. Tyto formuláře obsahují podrobné údaje o anamnéze prasat, jimž byly odebrány vzorky, a o zjištěných klinických známkách nebo postmortálních změnách.

V případě prasat chovaných v hospodářství musí být u prasat, kterým byly odebrány vzorky, uvedeny jasné informace o stáří, kategorii a hospodářství původu. Doporučuje se, aby se u každého prasete, kterému byl odebrán vzorek, zaznamenalo kromě jeho vlastní identifikační značky i jeho umístění v hospodářství.

1.

Ke zjištění viru, antigenu nebo genomu klasického moru prasat u uhynulých nebo utracených prasat jsou nejvhodnější vzorky tkání mandlí, sleziny a ledvin. Kromě toho se doporučuje získat dva vzorky dalších lymfatických tkání, například retrofaryngických, příušních, čelistních nebo mezenterických lymfatických uzlin nebo vzorek ilea. V případě těl, u nichž proběhla autolýza, je nejvhodnější vybrat si vzorek dlouhé nebo hrudní kosti.

2.

U prasat s horečkou nebo jinými příznaky choroby musí být podle pokynů příslušného orgánu získány vzorky antikoagulované nebo koagulované krve.

3.

V případě nemocných zvířat se doporučují virologické testy. Pokud se tyto testy použijí s cílem sledovat zvířata, na nichž se neprojevují klinické příznaky, mají obvykle jen omezenou hodnotu. Pokud je však cílem rozsáhlého odběru vzorků zjištění viru klasického moru prasat v inkubačním období, jsou nejvhodnějšími vzorky mandlí.

1.

Doporučuje se, aby všechny vzorky:

2.

Balík musí být na vnější straně označen adresou přijímací laboratoře a musí na něm být výrazně uvedena tato sdělení: Živočišný patologický materiál; Podléhající zkáze; Křehké; Neotevírejte mimo laboratoř klasického moru prasat.

3.

Laboratoř, pro kterou jsou vzorky určeny, musí být předem informována o době a způsobu dodání vzorků.

4.

V případě letecké přepravy vzorků ze třetích zemí a z členských států vyjma Německa do referenční laboratoře Společenství pro klasický mor prasat ( 12 ) musí být balíček označen podle předpisů IATA.

1.

Izolace viru je založena na inkubaci materiálu ze vzorku na citlivých buněčných kulturách pocházejících z prasat. Pokud se ve vzorku vyskytne virus klasického moru prasat, rozmnoží se v buňkách až na množství, které lze rozpoznat díky imunozbarvení buněk infikovaných konjugovanými protilátkami. Aby bylo možné přistoupit k diferenční diagnóze vůči k jiným pestivirům, je nutné mít k dispozici specifické protilátky klasického moru prasat.

2.

Upřednostňovanými vzorky pro izolaci viru klasického moru prasat jsou leukocyty, plazma nebo čistá krev získaná z nekoagulovaných vzorků krve nebo orgánů uvedených v části A bodě 1.

3.

Izolace viru je nejvýhodnější pro zkoumání vzorků malého počtu zvířat spíše než pro hromadný dozor. Postup izolace viru je náročný na práci a výsledky jsou k dispozici nejdříve za tři dny. Pro zjištění malého množství viru ve vzorků může být nutné využít další dvě buněčné kultury. To znamená, že konečný výsledek se získá až po deseti dnech zkoumání. Autolyzované vzorky mohou být cytotoxické vůči buněčné kultuře a tak omezit její použití.

4.

Izolace viru se doporučuje také v případě předchozího potvrzení klasického moru prasat jinými metodami. Je nutné ji použít jako referenční test na potvrzení pozitivních výsledků předchozích antigenů ELISA, PCR nebo testem FAT založeném na nepřímém zbarvení peroxydázou.

Takto získané izoláty klasického moru prasat jsou užitečné pro charakterizaci viru včetně genetické klasifikace a molekulární epizootologie.

5.

Všechny izoláty viru klasického moru prasat z primárních ohnisek, z primárních případů u volně žijících prasat nebo z případů na jatkách nebo v dopravních prostředcích musí být geneticky zařazeny národní referenční laboratoří v členských státech nebo jakoukoli schválenou laboratoří v daném členském státě nebo referenční laboratoří Společenství v souladu s částí E.

V každém případě musí být izoláty viru neprodleně zaslány do referenční laboratoře Společenství, která je shromažďuje.

1.

Ke zjištění genomu viru ve vzorcích krve, tkání nebo orgánů se používá řetězová reakce polymerázy (PCR). Malé fragmenty RNA viru jsou přepsány do fragmentů DNA, které PCR zvětší na zjistitelné množství. Vzhledem k tomu, že tento test zjistí pouze sekvenci genomu viru, může být PCR pozitivní, i když není přítomen žádný infekční vir (např. v autolyzovaných tkáních nebo ve vzorcích z uzdravujících se prasat).

2.

PCR lze použít na malém počtu pozorně vybraných vzorků od podezřelých zvířat nebo na materiále z potracených plodů. U těl volně žijících prasat je možné tuto metodu vybrat, pokud je materiál autolyzovaný a kvůli cytotoxicitě není možné provést izolaci viru.

3.

Vhodným materiálem pro diagnózu pomocí PCR jsou orgány popsané u izolace viru a nekoagulovaná krev.

4.

PCR lze provést v průběhu 48 hodin. Vyžaduje příslušné laboratorní vybavení, oddělená zařízení a kvalifikovaný personál. Výhodou je, že se částice infekčního viru nemusí v laboratoři množit. Metoda je velice citlivá, ale často může dojít ke kontaminaci, což vede k falešně pozitivním výsledkům. Proto jsou zásadní přísné postupy kontroly jakosti. Některé metody jsou specifické spíše pro pestiviry než pro klasický mor prasat, což vyžaduje další potvrzující testy, například zjišťováni sekvence produktu PCR.

1.

Virologické testy jsou pro potvrzení klasického moru prasat nezbytné.

Izolaci viru je nutné pokládat za referenční virologický test a musí být v případě potřeby použita jako potvrzující test. Její provedení se doporučuje zejména tehdy, když pozitivní výsledky FAT, ELISA nebo PCR nejsou doprovázeny zjištěním klinických příznaků nebo lézí typických pro chorobu a v jakýchkoli jiných sporných případech.

Primární ohnisko klasického moru prasat však může být potvrzeno, pokud byly u daných prasat zjištěny klinické příznaky nebo známky typické pro chorobu a pokud alespoň dva testy na zjištění antigenu nebo genomu měly pozitivní výsledky.

Sekundární ohnisko klasického moru prasat může být potvrzeno, pokud kromě epizootologického spojení s potvrzeným ohniskem nebo případem byly u dotčených prasat zjištěny klinické příznaky nebo léze typické pro chorobu a pokud měl jeden test na zjištění antigenu nebo genomu pozitivní výsledek.

Primární případ klasického moru prasat u volně žijících prasat může být potvrzen po izolaci viru nebo poté, co měly alespoň dva testy na zjištění antigenu nebo genomu pozitivní výsledky. Další případy klasického moru prasat u volně žijících prasat, u nichž bylo zjištěno epizootologické spojení s dříve potvrzenými případy, mohou být potvrzeny, pokud měl jeden test na zjištění antigenu nebo genomu pozitivní výsledek.

2.

Aby test na zjištění genomu nebo antigenu klasického moru prasat měl pozitivní výsledek, musí být proveden za pomoci specifických protilátek nebo zárodků klasického moru prasat. Pokud není provedený test specifický pro vir klasického moru prasat, ale je specifický pouze pro pestiviry, je nutno ho zopakovat s použitím činidel specifických pro klasický mor prasat.

1.

Genetická charakterizace izolátů viru klasického moru prasat se provádí určením sekvencí nukleotidů částí genomu viru, zejména specifických částí nekódujícího segmentu 5 a/nebo glykoproteinu E2. Podobnost mezi těmito sekvencemi a sekvencemi získanými z předchozích izolátů viru naznačuje, zda jsou ohniska choroby způsobena novými nebo již určenými kmeny. Takový údaj může potvrdit nebo vyvrátit hypotézy o trasách přenosu založené na epizootologickém šetření.

Genetická charakterizace izolátů viru klasického moru prasat je velice významná pro určení zdroje choroby. Blízká příbuznost mezi viry získanými z různých ohnisek však není absolutním důkazem přímé epizootologické vazby.

2.

Pokud v národní laboratoři nebo v jakékoli jiné laboratoři oprávněné k diagnostice klasického moru prasat nemůže být v krátké lhůtě provedena charakterizace viru, musí být původní vzorek izolátu viru zaslán co nejrychleji do referenční laboratoře Společenství.

Údaje, které mají laboratoře oprávněné k diagnostice klasického moru prasat k dispozici o charakteru a sekvencích izolátů viru klasického moru prasat, musí být postoupeny referenční laboratoři Společenství, která tyto informace zanese do své databáze.

Informace uložené v této databázi jsou dostupné všem národním referenčním laboratořím v členských státech. Pro účely publikace v odborném tisku však na žádost dotčené laboratoře zaručí referenční laboratoř Společenství důvěrnost těchto údajů až do jejich zveřejnění.

1.

U prasat infikovaných virem klasického moru prasat lze obvykle zjistit protilátky ve vzorcích séra od dvou až tří týdnů po infikování. U uzdravených prasat lze nacházet ochranné neutralizační protilátky několik let nebo v průběhu celého jejich života. Protilátky lze také občas zjistit u smrtelně nemocných zvířat v konečném stadiu. U některých prasat s chronickou formou klasického moru prasat lze nalézt protilátky během několika dní na konci prvního měsíce po infekci.

Prasata infikovaná in utero mohou být imunotolerantní vůči homologickému viru klasického moru prasat a nevytvářet žádné specifické protilátky. V prvních dnech života však mohou být zjištěny mateřské protilátky. Poločas mateřských protilátek je u neviremických zdravých selat asi dva týdny. Pokud jsou u selat starších než tři měsíce zjištěny protilátky klasického moru prasat, je velice nepravděpodobné, že jsou mateřského původu.

2.

Zjištění protilátek viru klasického moru prasat ve vzorcích séra nebo plazmatu se provádí jako podpora při diagnóze klasického moru prasat v podezřelém hospodářství, při zjišťování doby infekce v případě potvrzeného ohniska a pro účely sledování a dozoru. Sérologické testy však mají omezenou hodnotu pro zjišťování klasického moru prasat v případě nedávné infekce v hospodářství.

Několik séropozitivních prasat s nízkým titrem neutralizace může být znamením nedávné infekce (dva až čtyři týdny). Větší množství prasat s vysokým titrem neutralizace může být znamením, že vir byl vnesen do hospodářství déle než před měsícem. Umístění séropozitivních prasat v hospodářství může poskytnout cenné informace o způsobu zavlečení viru klasického moru prasat do hospodářství.

Pro přesné vyhodnocení výsledků sérologických testů je však nutné brát v úvahu celkové klinické, virologické a epizootologické nálezy z vyšetření provedeného v případě podezření nebo potvrzení klasického moru prasat v souladu s článkem 8 směrnice 2001/89/ES.

1.

Test neutralizace viru (VNT) a ELISA jsou nejvhodnější testy pro sérologickou diagnózu klasického moru prasat.

Kvalita a účinnost sérologické diagnózy provedené národními laboratořemi musí být pravidelně kontrolována mezilaboratorními srovnávacími testy pravidelně organizovanými referenční laboratoří Společenství.

2.

VNT se zakládá na určení neutralizační činnosti protilátek vzorku séra vůči viru, vyjádřené jako neutralizační 50 % titr.

Konstantní množství viru klasického moru prasat se inkubuje při teplotě 37 °C se zředěným sérem. Pro účely sledování je sérum nejprve zředěno v poměru 1:10. Pokud je nutná úplná titrace, lze připravit dvojnásobné ředění séra od poměru 1:2 do 1:5. Každý roztok je smíchán se stejným objemem suspenze viru obsahující 100 infekčních dávek (TCID 50).

Po inkubaci je směs naočkována buněčným kulturám, které se inkubovaly tři až pět dní. Po tomto inkubačním období se kultury fixují a systém imunoznačení odhalí jakoukoli replikaci viru v infikovaných buňkách. Lze použít buď neutralizaci imunoperoxydázou (NPLA), nebo neutralizaci imunofluorescencí (NIF).

Výsledky VNT se vyjadřují jako převrácená hodnota původního ředění séra, v němž u poloviny naočkovaných buněčných kultur (konečný titr 50 %) nedojde k jakékoli replikaci viru (neobjeví se žádné specifické značení). Odhadne se titr mezi dvěma roztoky. Konečný systém roztoku se zakládá na skutečném roztoku séra v průběhu neutralizační reakce, tj. po přidání viru, ale před přidáním buněčné suspenze.

3.

VNT je nejcitlivější a nejspolehlivější test na zjištění protilátek proti klasickému moru prasat. Doporučuje se proto pro sérologické vyšetření jednoho zvířete stejně tak jako pro vyšetření stáda. Tento test však může zjistit protilátky specifické pro infekci prasat pestiviry přežvýkavců, které způsobují křížovou neutralizační reakci.

Test VNT používaný ke zjištění protilátek virů BVD a BD se také řídí výše uvedenými zásadami a provádí se pro stanovení diferenciální diagnózy klasického moru prasat.

4.

Kmeny pestivirů použitých v neutralizačních testech musí odpovídat doporučením referenční laboratoře Společenství.

5.

Byly vyvinuty některé techniky ELISA, které využívají monoklonální protilátky; mají dvě podoby: konkurenční a blokující ELISA nebo nekonkurenční ELISA.

Konkurenční nebo blokující ELISA je obvykle založena na monoklonálních protilátkách. Pokud vzorek séra obsahuje protilátky klasického viru, bude zabráněno vázání vybrané monoklonální protilátky konjugované peroxydázou na antigen viru, což vede ke snížení signálu.

V nekonkurenčních testech ELISA se vázání protilátek séra na antigen měří přímo za použití protiprasečích protilátek konjugovaných peroxydázou.

6.

Národní laboratoře musí pravidelně provádět kontrolu jakosti citlivosti a specifičnosti každé šarže ELISA a používat při tom řadu referenčních sér poskytnutých referenční laboratoří Společenství. Tato řada zahrnuje:

Testy ELISA použité pro sérologickou diagnózu klasického moru prasat musí rozpoznat všechna referenční séra z uzdravujících se prasat. Všechny výsledky získané z referenčních sér musí být možno opakovat. Dále se doporučuje, aby testy byly schopné zjistit všechna pozitivní séra z raného stadia a aby vykazovaly minimální křížové reakce se séry prasat infikovaných pestiviry přežvýkavců.

Výsledky získané z referenčních sér pocházejících z prasat v raném stadiu infekce ukazují citlivost testu ELISA.

7.

Soudí se, že citlivost testu ELISA je nižší než citlivost VNT, a proto je doporučeno ji používat pro účely vyšetření stád. Může však být provedena v méně specializovaných zařízeních a díky automatizovanému systému rychleji než VNT.

Testy ELISA musí umožnit identifikaci všech infekcí klasickým morem prasat ve stádiu rekonvalescence a musí být co nejvíce prosty jakékoli interference křížově reagujících protilátek pestivirů přežvýkavců.

1.

Aniž jsou dotčena ustanovení čl. 4 odst. 3 písm. a) směrnice 2001/89/ES, v případě zjištění titru neutralizace klasického moru prasat rovného nebo vyššího než 10 ND50 ve vzorcích séra odebraných jednomu nebo více prasatům nebo zjištění pozitivního výsledku testu ELISA ve vzorcích séra od skupiny prasat se neprodleně použijí nebo se budou nadále používat opatření uvedená v čl. 4 odst. 2 směrnice 2001/89/ES.

Vzorky, které již v tomto hospodářství byly odebrány, musí být podrobeny testu VNT konečnou srovnávací titrací neutralizačních protilátek viru klasického moru prasat a pestivirů přežvýkavců.

2.

Pokud srovnávací testy prokáží protilátky pestivirů přežvýkavců a žádné nebo výrazně nižší (přinejmenším třikrát) titry protilátek viru klasického moru prasat, bude vyloučeno podezření z přítomnosti klasického moru prasat, pokud neexistují jiné důvody, které opravňují další používání opatření uvedených v čl. 4 odst. 2 směrnice 2001/89/ES v daném hospodářství.

3.

Pokud srovnávací testy prokážou u více než jednoho prasete titr neutralizace viru rovný nebo vyšší než 10 ND50 a tento titr bude rovný nebo vyšší než titry ostatních pestivirů, zajistí příslušný orgán potvrzení klasického moru prasat, pokud se v daném hospodářství našel epizootologický důkaz choroby.

4.

Aniž jsou dotčena ustanovení čl. 4 odst. 3 směrnice 2001/89/ES v případě, že nebyl nalezen epizootologický důkaz choroby nebo pokud nejsou výsledky předchozích testů přesvědčivé, zajistí příslušný orgán, aby v daném hospodářství:

5.

Pokud však další kontroly a testy uvedené v bodu 4 neumožní vyloučení klasického moru prasat, musí být v hospodářství nejdříve dva týdny po provedení předchozích kontrol proveden další odběr vzorků krve pro sérologické testy.

V rámci tohoto dalšího odběru vzorků se prasatům, kterým již byly odebrány vzorky, znovu odeberou vzorky a provedou se srovnávací testy nových vzorků s dříve odebranými vzorky za účelem zjištění sérokonverze viru klasického moru prasat nebo pestivirů přežvýkavců, pokud jsou přítomny.

Pokud tyto další kontroly a testy neumožní potvrzení klasického moru prasat, mohou být opatření uvedená v článku 4 směrnice 2001/89/ES zrušena.

1.

Diskriminační sérologický test ELISA (diskriminační test) umožňuje úspěšně rozlišit prasata očkovaná markerovými očkovacími látkami, které způsobují vznik protilátek výhradně proti glykoproteinu E2 viru klasického moru prasat, od prasat, která byla infikována volně se vyskytujícím kmenem viru klasického moru prasat. Tento test je určen ke zjištění protilátek na glykoprotein Ems viru klasického moru prasat. Je založen na principu, že zdravá zvířata očkoovaná markerovými očkovacími látkami vylučují protilátky pouze proti glykoproteinu E2 viru klasického moru prasat, zatímco zvířata infikovaná volně se vyskytujícím virem reagují též proti jiným antigenům viru a vytvářejí proti nim protilátky.

Tento diskriminační test je citlivý a specifický ( 14 ). Prasata, která však byla infikována pestiviry jinými, než je virus klasického moru prasat, např. viry BVD a BD, budou též vykazovat pozitivní reakci na Ems. Navíc není citlivost testu ideální, jelikož některá zvířata očkovaná markerovými očkovacími látkami a později infikovaná nemusejí vykazovat pozitivní reakci na Ems.

Současně dostupné údaje ukazují, že diskriminační test nemůže být spolehlivě použit pro testování vzorků séra odebraných z volně žijících prasat.

2.

Diskriminační test je kapalná fáze blokujícího enzymatického imunopokusu. Vzorky k testování se inkubují na mikrotitrových destičkách předem povlečených monoklonálními protilátkami anti-Ems společně s definovaným množstvím antigenu Ems. Jakákoliv protilátka specifická pro Ems váže určité množství antigenu Ems v roztoku a vytvoří se komplex antigen/protilátka, který nereaguje na protilátky anti-Ems umístěné na mikrotitrové destičce. Po omytí destiček, jímž se odstraní nevázaný materiál, se přidá peroxidáza označená anti-Ems konjugátem, která se váže na antigen Ems komplexovaný protilátkou umístěnou na mikrotitrové destičce. Nevázaný konjugát se odstraní omytím a přidá se chromogenový substrát. Stupeň zbarvení, který se objeví, je v obráceném poměru k množství specifických protilátek Ems přítomných ve vzorku. Pokud vzorek neobsahuje protilátky (negativní vzorek), většina definovaného množství antigenu Ems, která byla přidána, se může vázat na protilátky anti-Ems na destičce, přičemž je pozorována silná barevná reakce.

Výsledku se dosáhne porovnáním optické hustoty (OD) v jamkách obsahujících testované vzorky s hustotou jamek obsahujících negativní a pozitivní kontroly.