„ПРИЛОЖЕНИЕ IX

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНО ИЗСЛЕДВАНЕ В УЛТРАВИОЛЕТОВИЯ СПЕКТЪР

ПРЕДИСЛОВИЕ

Спектрофотометричното изследване в ултравиолетовия спектър може да осигури информация за качеството на дадена мазнина, състоянието ѝ на запазеност и промените, настъпили в нея при технологичните процеси. Абсорбцията при дължините на вълните, упоменати в метода, е вследствие на системи от конюгирани диени и триени, проявяващи се в резултат на процеси на окисляване и/или практики на рафиниране. Тези абсорбции са изразени като специфични екстинкции (екстинкцията на 1 % разтвор (w/v) на мазнината в упоменатия разтворител, в кювета 10 mm), обикновено обозначавани като К (наричан още „коефициент на екстинкция“).

1.   ОБХВАТ

Настоящото приложение описва процедурата за извършване на спектрофотометрично изследване на маслиново масло в ултравиолетовия спектър.

2.   ПРИНЦИП НА МЕТОДА

Проба се разтваря в нужния разтворител и абсорбцията на разтвора се определя при определени дължини на вълната срещу чистия разтворител.

Изчисляват се специфичните екстинкции при 232 nm и 268 nm в изооктан или при 232 nm и 270 nm в циклохексан за концентрация от 1 % w/v в кювета 10 mm.

3.   ОБОРУДВАНЕ

3.1.   Спектрофотометър, подходящ за извършване на измервания при ултравиолетови дължини на вълната (от 220 nm до 360 nm), с възможност за отчитане на отделните нанометрични единици. Препоръчва се редовна проверка на точността и възпроизводимостта на абсорбцията и скалите за дължина на вълната, както и за разсеяна светлина.

3.1.1.   Скала за дължина на вълната: Тя може да се провери с помощта на референтен материал, състоящ се от филтър от оптично стъкло, съдържащ холмиев оксид или разтвор на холмиев оксид (запечатан или не), който има ясно разграничени абсорбционни ивици. Референтните материали са предназначени за проверка и калибриране на скалите за дължина на вълната на спектрофотометри във видимата и ултравиолетовата област с номинални ширини на спектралната ивица 5 nm или по-малко. Измерванията се извършват спрямо празна проба въздух в диапазона от дължини на вълната от 640 до 240 nm, според указанията, приложени към референтните материали. Извършва се корекция на базисната линия с празна траектория на лъча при всяка промяна на ширината на процепа. Дължините на вълната на стандарта са изброени в сертификата на референтния материал.

3.1.2.   Скала за абсорбция: Тя може да се провери, като се използват налични в търговската мрежа запечатани референтни материали, състоящи се от подкислени разтвори на калиев дихромат, при някои концентрации и сертифицирани стойности на абсорбция при неговото λmax (от 4 разтвора на калиев дихромат в перхлорна киселина, запечатани в четири ултравиолетови кварцови кювети за измерване на линейността и референтната фотометрична точност в ултравиолетовата област). Разтворите на калиев дихромат се измерват спрямо празна проба на използваната киселина, след корекция на базисната линия, съгласно указанията, приложени към референтния материал. Стойностите на абсорбция са изброени в сертификата на референтния материал.

С оглед на проверката на отклика на фотоклетката и фотоумножителя може да се постъпи и по следния начин: претеглят се 0,2000 g чист калиев хромат за спектрофотометрия и се разтварят в 0,05 N разтвор на калиев хидроксид в 1 000 ml градуирана колба като се долива до резката. Вземат се точно 25 ml от получения разтвор, пренасят се в 500 ml градуирана колба и се разреждат до резката като се използва същият разтвор на калиев хидроксид.

Измерва се екстинкцията на така получения разтвор при 275 nm, като се използва разтворът на калиев хидроксид като референтен. Измерената екстинкция при използването на 1 cm кювета трябва да е 0,200 ± 0,005.

3.2.   Кварцови кювети с правоъгълно сечение, с капачки, подходящи за измервания на дължини на вълната в ултравиолетовия спектър (220 до 360 nm), с оптичен път от 10 mm. Когато се напълнят с вода или друг подходящ разтворител, кюветите не трябва да показват помежду си разлики по-големи от 0,01 екстинкционни единици.

3.3.   Мерителни колби с резка с обем 25 ml, клас А.

3.4.   Аналитична везна, която позволява отчитане с точност до 0,0001 g.

4.   РЕАКТИВИ

По време на анализа, освен ако е посочено друго, се използват само реактиви, признати като „чисти за анализ“, и дестилирана или деминерализирана вода, или вода с еквивалентна степен на чистота.

Разтворител: изооктан (2,2,4-триметилпентан) за измерването при 232 nm и 268 nm и циклохексан за измерването при 232 nm и 270 nm, с абсорбция по-малка от 0,12 при 232 nm и по-малка от 0,05 при 270 nm спрямо дестилирана вода, измерена в кювета 10 mm.

5.   ПРОЦЕДУРА

5.1.   Пробата трябва да е напълно хомогенна и без суспендирани онечиствания. В противен случай тя трябва да се филтрува през хартия при температура приблизително 30 °С.

5.2.   Измерват се прецизно приблизително 0,25 g (с точност до 1 mg) от така подготвената проба в 25-милилитрова градуирана колба, долива се от определения разтворител до резката и се хомогенизира. Полученият разтвор трябва да е напълно бистър. Ако има наличност на опалесценция или мътност, бързо се филтрува през хартия.

БЕЛЕЖКА: По принцип маса от 0,25—0,30 g е достатъчна за измерване на абсорбция на необработено маслиново масло и необработено маслиново масло екстра качество при 268 nm и 270 nm. За измерване при 232 nm, обикновено се изисква проба от 0,05 g, поради което обикновено се приготвят два отделни разтвора. За измервания на абсорбция на маслинови масла от остатъчен материал, рафинирани маслинови масла и маслинови масла с примеси обикновено е необходима по-малка проба, напр. 0,1 g, поради тяхната по-висока абсорбция.

5.3.   Ако е необходимо, се коригира базисната линия (220—290 nm) с разтворител в двете кварцови кювети (с проба и референтна), след това кварцовата кювета с пробата се напълва с изпитвания разтвор и се измерва екстинкцията при 232, 268 или 270 nm спрямо референтния разтворител.

Записаните стойности на екстинкцията трябва да са в рамките от 0,1 до 0,8 или в рамките на интервала на линейност на спектрофотометъра, който следва да бъде проверен. В противен случай измерванията трябва да се повторят, като според нуждата се използват по-концентрирани или по-разредени разтвори.

5.4.   След измерване на абсорбцията при 268 или 270 nm се измерва абсорбцията при λmax, λmax + 4 и λmax – 4. Тези стойности на абсорбцията се използват за определяне на вариацията на специфичната екстинкция (ΔΚ).

БЕЛЕЖКА: λmax се приема за 268 nm за изооктан, използван като разтворител, и 270 nm за циклохексан.

6.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

6.1.   Записват се специфичните екстинкции (коефициенти на екстинкция) при различните дължини на вълната, изчислени по следния начин:

където:

Kλ	=	специфичната екстинкция при дължина на вълната λ;
Eλ	=	екстинкцията, измерена при дължина на вълната λ;
c	=	концентрация на разтвора в g/100 ml;
s	=	дължина на пътя на кварцовата кювета, в cm;

с точност до два знака след десетичната запетая.

6.2.   Вариация на специфичната екстинкция (ΔΚ)

Вариацията на абсолютната стойност на екстинкцията (ΔΚ) се изчислява по следния начин:

където Km е специфичната екстинкция при дължина на вълната за максимална абсорбция при 270 nm и 268 nm в зависимост от използвания разтворител.

Резултатите се изразяват с точност до два знака след десетичната запетая.“

ПРИЛОЖЕНИЕ Х

ОПРЕДЕЛЯНЕ НА МЕТИЛОВИ ЕСТЕРИ НА МАСТНИ КИСЕЛИНИ ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ОБХВАТ

В настоящото приложение са дадени указания за определяне чрез газова хроматография на свободни и свързани мастни киселини в растителни мазнини и масла след тяхното превръщане в метилови естери на мастни киселини (МЕМК).

Свързаните мастни киселини на триацилглицеролите (TAG) и, в зависимост от метода на естерификация, свободните мастни киселини (FFA) се превръщат в метилови естери на мастни киселини (МЕМК)), които се определят чрез капилярна газова хроматография.

Методът, описан в настоящото приложение, позволява определянето на метиловите естери на мастни киселини от C12 до C24, включително метилови естери на наситени, цис- и транс-мононенаситени и цис- и транс-полиненаситени мастни киселини.

2.   ПРИНЦИП

Газовата хроматография се използва за количествен анализ на метилови естери на мастни киселини. Метиловите естери на мастни киселини се подготвят в съответствие с част A. След това те се инжектират в инжектора и се изпаряват в него. Разделянето на метиловите естери на мастни киселини се извършва в аналитични колони със специфична полярност и дължина. Пламъчно-йонизационен детектор (FID) се използва за откриване на метилови естери на мастни киселини. Условията на анализ са представени в част Б.

Може да се използва водород или хелий като газ носител (подвижна фаза) в газовата хроматография на метиловите естери на мастни киселини с пламъчно-йонизационен детектор. Водородът ускорява разделянето и дава по-резки пикове. Неподвижната фаза е микроскопичен слой на тънко течно покритие върху инертна твърда повърхност от кварц.

При преминаването си през капилярната колонка анализираните изпарени съединения взаимодействат с неподвижната фаза, която покрива вътрешната повърхност на колоната. Поради това различно взаимодействие на различни съединения, те елуират по различно време, което се нарича време на задържане на съединението за даден набор от параметри на анализа. Сравнението на времената на задържане се използва за идентификация на отделните съединения.

ЧАСТ A

ПРИГОТВЯНЕ НА МЕТИЛОВИТЕ ЕСТЕРИ НА МАСТНИТЕ КИСЕЛИНИ ОТ МАСЛИНОВО МАСЛО И МАСЛИНОВО МАСЛО ОТ ОСТАТЪЧЕН МАТЕРИАЛ

1.   ОБХВАТ

В настоящата част се определя приготвянето на метиловите естери на мастните киселини. Тя включва методи за приготвянето на метилови естери на мастните киселини от маслиново масло и маслиново масло от остатъчен материал.

2.   ПРИЛОЖНО ПОЛЕ

Приготвянето на метилови естери на мастни киселини от маслинови масла и маслинови масла от остатъчен материал се извършва чрез транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид при стайна температура. Необходимостта от пречистване на пробата преди транс-естерификацията зависи от съдържанието на свободни мастни киселини в пробата и аналитичния параметър, който следва да бъде определен, той може да се избира в съответствие със следната таблица:

Категория масло	Метод
Необработено маслиново масло с киселинност ≤ 2,0 %	1. Мастни киселини 2. Транс-мастни киселини 3. ΔECN 42 (след пречистване със силикагел чрез ТФЕ)
Рафинирано маслиново масло
Маслиново масло, съставено от рафинирано масло и необработени маслинови масла
Рафинирано маслиново масло от остатъчен материал
Маслиново масло от остатъчен материал
Необработено маслиново масло с киселинност > 2,0 % Сурово маслиново масло от остатъчен материал	1. Мастни киселини (след пречистване със силикагел чрез ТФЕ) 2. Транс-мастни киселини (след пречистване със силикагел чрез ТФЕ) 3. ΔECN42 (след пречистване със силикагел чрез ТФЕ)

3.   МЕТОДОЛОГИЯ

3.1.    Транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид при стайна температура

3.1.1.   Принцип

Метиловите естери се образуват чрез транс-естерификация с метанолов разтвор на калиев хидроксид като междинен етап преди да се извърши осапуняването.

3.1.2.   Реактиви

3.1.2.1.   Метанол със съдържание на не повече от 0,5 % (m/m) вода.

3.1.2.2.   Хексан с качество за хроматография.

3.1.2.3.   Хептан с качество за хроматография.

3.1.2.4.   Диетилов етер, стабилизиран за анализ.

3.1.2.5.   Ацетон с качество за хроматография.

3.1.2.6.   Разтворител за елуиране, за пречистване на маслото чрез колонна хроматография/ТФЕ, смес от хексан/диетилов етер в съотношение 87/13 (v/v).

3.1.2.7.   Калиев хидроксид, приблизително 2М метанолов разтвор: разтварят се 11,2 g калиев хидроксид в 100 ml метанол.

3.1.2.8.   Патрони силикагел — 1 g (6 ml) за твърдофазна екстракция.

3.1.3.   Апаратура

3.1.3.1.   Епруветки с отвор на винт (с вместимост 5 ml ) с капачка със снадка от политетрафлуороетилен.

3.1.3.2.   Градуирани или автоматични пипети, 2 ml и 0,2 ml.

3.1.4.   Пречистване на пробите масло

При необходимост пробите се пречистват чрез преминаване на маслото през патрон силикагел за твърдофазна екстракция. Патрон силикагел (3.1.2.8) се поставя в апарат за вакуумно елуиране и се промива с 6 ml хексан (3.1.2.2); промиването се извършва без вакуум. След това разтвор на маслото (приблизително 0,12 g) в 0,5 ml хексан (3.1.2.2) се зарежда в колоната. Разтворът се прекарва през колоната и след това се елуира с 10 ml хексан/диетилов етер (87:13 v/v) (3.1.2.6). Комбинираните елуати се хомогенизират и се разделят на две еднакви по обем части. Една аликвотна част се изпарява до изсъхване в ротационен изпарител при понижено налягане при стайна температура. Остатъкът се разтваря в 1 ml хептан и разтворът е готов за анализ на мастни киселини чрез газова хроматография. Втората аликвотна част се изпарява и остатъкът се разтваря в 1 ml ацетон за анализ на триглицеридите чрез ВЕТХ при необходимост.

3.1.5.   Процедура

В епруветка с отвор на винт с вместимост 5 ml (3.1.3.1) се претегля приблизително 0,1 g от пробата от маслото. Добавят се 2 ml (3.1.2.2) хептан и се разклаща. Добавят се 0,2 ml метанолов разтвор на калиев хидроксид (3.1.2.7), поставя се капачката със снадка от политетрафлуороетилен, затяга се и се разклаща енергично в продължение на 30 секунди. Оставя се да се разслои до избистряне на горния слой от разтвора. Декантира се горният слой, който съдържа метиловите естери. Хептановият разтвор е готов за инжектиране в газовия хроматограф. Препоръчва се разтворът да се запази в хладилника до анализа чрез газова хроматография. Не се препоръчва съхраняване на разтвора в продължение на повече от 12 часа.

ЧАСТ Б

АНАЛИЗ НА МЕТИЛОВИ ЕСТЕРИ НА МАСТНИ КИСЕЛИНИ ЧРЕЗ ГАЗОВА ХРОМАТОГРАФИЯ

1.   ОБХВАТ

В настоящата част се дават общи насоки за прилагането на капилярна газова хроматография за определяне на качествения и количествен състав на сместа от метилови естери на мастните киселини, получени в съответствие с метода, указан в част А.

Частта не е приложима за полимеризирани мастни киселини.

2.   РЕАКТИВИ

2.1.   Газ носител

Инертен газ (хелий или водород), щателно подсушен и с кислородно съдържание по-малко от 10 mg/kg.

Бележка 1:

Водородът може да удвои скоростта на анализа, но е опасен. Достъпни са средства за безопасност.

2.2.   Спомагателни газове

2.2.1.   Водород (чистота ≥ 99,9 %), свободен от органични онечиствания.

2.2.2.   Въздух или кислород, свободен от органични онечиствания.

2.2.3.   Азот (чистота > 99 %).

2.3.   Референтен еталон

Смес от метилови естери на чисти мастни киселини или метиловите естери на мазнина с известен състав, за предпочитане сходен с този на мастното вещество, което ще се анализира. Цис- и транс- изомерите на метилови естери на октадеценова, октадекадиенова и октадекатриенова киселина са полезни за идентифициране на транс-изомери на ненаситени киселини.

Трябва да се вземат мерки за предотвратяване на окисляването на полиненаситените мастни киселини.

3.   АПАРАТУРА

Дадените инструкции се отнасят до обикновеното оборудване, използвано за газова хроматография, включващо капилярни колонки и пламъчно-йонизационен детектор.

3.1.   Газов хроматограф

Газовият хроматограф се състои от следните елементи.

3.1.1.   Система за инжектиране

Използва се инжекционна система с капилярни колонки, като в този случай системата за инжектиране следва да е специално проектирана за използване с такива колонки. Тя може да е с колонен инжектор от тип със или без разделяне на пробата.

3.1.2.   Пещ

Пещта трябва да е в състояние да нагрява капилярната колонка до температура от поне 260 °С и да поддържа желаната температура с точност до 0,1°С. Последното изискване е особено важно, когато се използва епруветка от кварц.

Използването на програмирано температурно нагряване се препоръчва във всички случаи и в частност за мастни киселини с по-малко от 16 въглеродни атома.

3.1.3.   Капилярна колона

3.1.3.1.   Тръба, изготвена от материал, инертен към веществата, които ще се анализират (обикновено от стъкло или кварц). Вътрешният диаметър трябва да е между 0,20 и 0,32 mm. Вътрешната повърхност следва да се обработи по подходящ начин (напр. подготовка на повърхността, инактивация), преди да се запълни с покритието от неподвижната фаза. Дължина 60 m е достатъчна за мастни киселини и цис- и транс- изомери на мастните киселини.

3.1.3.2.   Подходящи са колонки с неподвижна фаза полярен полисилоксан (цианопропилсиликон) омрежен (напречно свързан).

Бележка 2:

Съществува риск полярните полисилоксани да създадат трудности при разпознаването и разделянето на линоленовата киселина и киселините с С20.

Покритието трябва да е тънко, т.е. 0,1 до 0,2 μm.

3.1.3.3.   Сглобяване и кондициониране на колонката

Спазват се нормалните мерки за безопасност при сглобяване на капилярните колонки, т.е. подреждането на колонката в пещта (носител), избор и сглобяване на свръзките (плътност за недопускане на изтичане), поставяне на краищата на колонката в инжектора и детектора (намаляване на мъртвите обеми). Поставя се колонката под поток от газ носител (напр. 0,3 bar (30 kPa) за колонка с дължина 25 m и вътрешен диаметър 0,3 mm).

Колонката се кондиционира чрез програмиране на пещта за повишаване на температурата в сравнение с околната с 3 °С/min до температура с 10 °С по-ниска от границата за разграждане на неподвижната фаза. Поддържа се температурата на пещта в продължение на един час до стабилизиране на базисната линия. Понижава се до 180 °C за работа при изотермални условия.

Бележка 3:

Предварително кондиционирани по подходящ начин колонки се предлагат в търговската мрежа.

3.1.4.   Пламъчно-йонизационен детектор и усилвателен преобразувател.

3.2.   Спринцовка

Спринцовката трябва да има максимална вместимост 10 μl и да е градуирана на деления от 0,1 μl.

3.3.   Система за събиране на данни

Система за събиране на данни, свързана онлайн с детекторите и използвана със софтуерна програма, подходяща за интегриране на пиковете и нормализиране.

4.   ПРОЦЕДУРА

Дейностите, описани в точки 4.1.—4.3, се отнасят до използването на пламъчно-йонизационен детектор.

4.1.   Условия на изпитване

4.1.1.   Избор на оптимални условия на работа за капилярни колони

Предвид ефикасността и пропускливостта на капилярните колонки разделянето на различните съставки и времетраенето на анализа в голяма степен зависят от скоростта на потока на газа носител в колонката. Следователно ще е необходимо да се оптимизират условията на работа чрез коригиране на този параметър (или просто — към намаляване на налягането на колонката) в зависимост от това дали се цели подобряването на разделянето или извършването на по-бърз анализ.

Следните условия се оказаха подходящи за разделяне на метилови естери на мастни киселини (C4—C26). Примери на хроматограми са показани в допълнение Б:

температура на инжектора:	250 °C
температура на детектора:	250 °C
температура на пещта:	165 °C (8 min) до 210 °C при 2 °C/min
газ носител водород:	входно налягане на колоната, 179 kPa
общ поток:	154,0 ml/min;
съотношение на разделяне:	1:100
обем на впръскване:	1 μl

4.1.2.   Определяне на разделителната способност (вж. допълнение А)

Изчисляване на разделителната способност R, на два съседни пика I и II, използвайки формулата:

R = 2 × ((dr(II) – dr(I) )/(ω(I) ω(II))) или R = 2 × ((tr(II) – tr(I) )/(ω(I) ω(II))) (USP) (Фармакопея на САЩ),

или

R = 1,18 × ((tr(II) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Фармакопея на Япония), EP (Европейска фармакопея), (BP (Фармакопея на Великобритания)

където:

d r(I) е разстоянието на задържане на пик I;

d r(II) е разстоянието на задържане на пик II;

t r(I) е времето на задържане на пик I;

t r(II) е времето на задържане на пик II;

ω(I) е широчината на основата на пик I;

ω(II) е широчината на основата на пик II;

ω0,5 е широчината на пика на посоченото съединение, при средата на височината на пика;

Ако ω(I) ≈ ω(II), да се изчисли R, като се използват следните формули:

R = (dr(II) – d r(I))/ω = (dr(II) – d r(I))/4σ

където:

σ е стандартното отклонение (вж. допълнение А, фигура 1).

Ако разстоянието dr между двата пика d r(II) – d r(I) е равно на 4σ, разделителната способност R = 1.

Ако два пика не са напълно разделени, допирателните към инфлексните точки на двата пика се пресичат в точка C. За да бъдат напълно разделени двата пика, разстоянието между тях трябва да бъде равно на:

d r(II) – d r(I) = 6 σ откъдето R = 1,5 (вж. допълнение A, фигура 3).

5.   ИЗРАЗЯВАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕ

5.1.   Качествен анализ

Разпознават се пиковете на метиловите естери за пробата от хроматограмата в допълнение Б, фигура 1, ако е необходимо чрез интерполация или чрез сравнение с тези на референтните смеси на метиловите естери (както е посочено в точка 2.3).

5.2.   Количествен анализ

5.2.1.   Определяне на състава

Изчислява се масовата част w i на отделните метилови естери на мастни киселини, изразена в проценти от масата на метиловите естери, както следва:

5.2.2.   Метод на изчисляване

5.2.2.1.   Общ случай

Изчислява се съдържанието на даден компонент i, изразено в проценти от масата на метиловите естери, чрез определянето на процента, представляващ площта на съответния пик, отнесена към сбора от площите на всички пикове, при използване на следната формула:

wi = (Ai/ΣA) × 100

където:

Ai е площта под пика на отделния метилов естер на мастна киселина i;

ΣА е сборът от площите под всички пикове на всички отделни метилови естери на мастни киселини.

Резултатите се изразяват с точност до две цифри след десетичната запетая.

Бележка 4:

За мазнини и масла масовата част на метиловите естери на мастни киселини е равна на масовата част на триацилглицеролите в грамове на 100 g. За случаите, в които това допускане не се позволява, вж. 5.2.2.2.

5.2.2.2.   Използване на корекционни коефициенти

В определени случаи, например при наличието на мастни киселини с по-малко от осем въглеродни атома или на киселини с вторични групи, площите се коригират със специфични корекционни коефициенти (Fci). Тези коефициенти се определят за всеки един инструмент. За тази цел трябва да се използват подходящи референтни материали със сертифициран състав на мастни киселини в съответния обхват.

Бележка 5:

Тези корекционни коефициенти не са идентични с теоретичните корекционни коефициенти за FID, които се посочват в допълнение А, тъй като те включват и параметрите на инжекционната система и др. Въпреки това, в случаите на по-големи разлики следва да бъдат проверени параметрите на цялата система.

За тази референтна смес, процентното съотношение на метилов естер на мастни киселини i е представено от формулата:

wi = (mi /Σm) × 100

където:

m i е масата на метиловия естер на мастни киселини i в референтната смес;

Σm е общият сбор на масите на различните компоненти като метилови естери на мастни киселини в референтната смес.

От хроматограмата на референтната смес се изчислява процентът на площта за метилов естер на мастни киселини i както следва:

wi = (Ai/ΣA) × 100

където:

Ai е площта на метилов естер на мастни киселини i в референтната смес;

ΣА е сумата от всички площи на всички метилови естери на референтната смес.

Съответно корекционният коефициент Fc е

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

За извадката, процентът от масата на всеки метилов естер на мастни киселини i е:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Резултатите се изразяват до две цифри след десетичната запетая.

Бележка 6:

Изчислената стойност съответства на процента от масата на отделните мастни киселини, изчислени като триацилглицероли на 100 g мазнини.

5.2.2.3.   Използване на вътрешен стандарт

При определени анализи (например, когато не са определени количествено всички мастни киселини, например когато има наличие на киселини с четири и шест въглеродни атома, наред с киселини с 16 и 18 въглеродни атома, или когато е необходимо да се определи абсолютното количество на някоя мастна киселина в дадена проба) е необходимо да се използва вътрешен стандарт. Често се използват мастни киселини с 5, 15 или 17 въглеродни атома. Трябва да се определи корекционният коефициент (ако има такъв) за вътрешния стандарт.

Процентното съотношение по маса на компонента i, изразено като метилови естери, тогава се дава чрез формулата:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

където:

A i е площта на метилов естер на мастни киселини i;

A IS е площта на вътрешния стандарт;

F i е корекционният коефициент на мастната киселина i, изразена като метилов естер на мастни киселини;

F IS е корекционният коефициент на вътрешния стандарт;

m е масата, в милиграми, на изпитваната проба

m IS е масата, в милиграми, на вътрешния стандарт

Резултатите се изразяват с точност до две цифри след десетичната запетая.

6.   ПРОТОКОЛ ОТ ИЗПИТВАНЕТО

Протоколът от изпитването следва да описва методите, използвани за приготвянето на метиловите естери и за анализа чрез газова хроматография. Също така той трябва да включва всички подробности около извършването, които не са упоменати в настоящия стандартен метод, или разгледани като незадължителни, както и подробности относно всички инциденти, които може да са повлияли на резултатите.

Протоколът от изпитването трябва да съдържа всички необходими данни за пълната идентификация на пробата.

7.   ТОЧНОСТ

7.1.   Резултати от междулабораторно изпитване

Подробности за междулабораторно изпитване относно прецизността на метода са дадени в приложение В към стандарт IOC/T.20/Doc. № 33. Стойностите, получени от това междулабораторно изпитване може да не са приложими към концентрационни обхвати и матрици, различни от посочените.

7.2.   Повторяемост

Абсолютната разлика между два независими единични резултата от изпитване, получени чрез използването на един и същ метод върху идентичен изпитван материал, в една и съща лаборатория, от един и същ оператор, чрез използването на едно и също оборудване, в кратък интервал от време, не трябва да надвишава в повече от 5 % от случаите r от таблиците 1—14 в приложение В към стандарт IOC/T.20/Doc. № 33.

7.3.   Възпроизводимост

Абсолютната разлика между два независими единични резултата от изпитване, получени чрез използването на един и същ метод върху идентичен изпитван материал, в различни лаборатории, от различни оператори, чрез използването на различно оборудване, не трябва да надвишава в повече от 5 % от случаите R от таблиците 1—14 в приложение В към стандарт IOC/T.20/Doc. № 33.