1998L0057 — BG — 30.07.2006 — 001.001

---

Този документ е средство за документиране и не обвързва институциите

►B	ДИРЕКТИВА 98/57/ЕО НА СЪВЕТА от 20 юли 1998 година за контрол на Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et.al. (ОВ L 235, 21.8.1998, p.1)

Изменен с

		Официален вестник
		No	page	date
►M1	ДИРЕКТИВА 2006/63/ЕО НА КОМИСИЯТА от 14 юли 2006 година	L 206	36	27.7.2006

---

▼B

ДИРЕКТИВА 98/57/ЕО НА СЪВЕТА

от 20 юли 1998 година

за контрол на Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et.al.

Член 1

Настоящата директива се отнася до мерките, които ще се вземат в рамките на държавите-членки срещу Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., преди известен като Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (наричан по-нататък „организмът“), с цел, по отношение на растенията-гостоприемници за организма, изброени в приложение I, раздел 1, (наричани по-нататък „изброеният растителен материал“) да:

Член 2

1.  Държавите-членки провеждат ежегодни систематични официални обследвания за организма върху изброения растителен материал, произхождащ от тяхната територия. С цел да се открият други възможни източници на замърсяване, представляващи заплаха за производството на изброения растителен материал, държавите-членки извършват оценка на риска и, освен ако при оценката не е установен риск от разпространение на организма, провеждат в районите на производство на изброения растителен материал, контролни официални обследвания за организма върху растения, различни от изброения растителен материал, включително диви картофени растения-гостоприемници, както и на повърхностните води, които се използват за напояване или пръскане на изброения растителен материал и на отпадъчните води, отделяни от предприятията за промишлена преработка или пакетиране, в които се обработва изброеният растителен материал, и които се използват за напояване или пръскане на изброения растителен материал. Обхватът на тези контролни обследвания се определя съгласно установения риск. Държавите-членки могат също така да извършват официални обследвания за организма върху материали, като среди за отглеждане, почва и твърди отпадъци от предприятията за промишлената преработка или пакетиране.

2.  Официалните обследвания, предвидени в параграф 1, се извършват:

Допълнителните подробности за тези обследвания по отношение на процедурите на инспектиране и броя, произхода, напластяването и времето за вземане на проби се решават от отговорните официални органи, по смисъла на Директива 77/93/ЕИО на базата на обосновани научни и статистически принципи и биологията на организма, като се вземат под внимание специфичните системи за производство на изброения растителен материал в заинтересованата държава-членка и, при необходимост, на други растения-гостоприемници за организма.

3.  Останалите държави-членки и Комисията се уведомяват за подробностите и резултатите от официалните обследвания, предвидени в параграф 1, всяка година, в съответствие с разпоредбите на точка 2 от раздел II, приложение I. Тези уведомявания се предоставят до 1 юни, освен относно използването на картофите, запазени във фермата за семе, за които уведомяването се предоставя до 1 септември. Подробностите и резултатите за културите се отнасят за продукцията от предходната година. Подробностите от тези уведомявания може да се предоставят на Комитета.

4.  Приема се следната разпоредба в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

5.  Могат да бъдат приети следните разпоредби в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

Член 3

Държавите-членки вземат мерки, така че техните собствени отговорни официални органи да получават информация за предполагаема поява или потвърдено наличие на организма на тяхната територия.

Член 4

1.  Във всеки случай на предполагаема поява, отговорните официални органи на засегнатите държави-членки осигуряват извършване на официално или под официален надзор лабораторно изследване, като за изброения растителен материал използват съответния метод, определен в приложение II и в съответствие с условията, посочени в точка 1 от приложение III, или, във всички останали случаи, който и да е друг официално одобрен метод, с цел да се потвърди или отхвърли предполагаемото наличие. В случай на потвърждаване се прилагат изискванията, посочени в точка 2 от приложение III.

2.  До потвърждаване или отхвърляне на предполагаема поява, съгласно параграф 1, във всеки случай на предполагаема поява, в който:

отговорните официални органи на държавите-членки, във връзка със собственото си производство:

3.  В тези случаи на предполагаема поява, при която има риск от замърсяване на изброения растителен материал или надземните води от или към друга/и държава/и-членка/и, държавата-членка, в която е докладвано за предполагаемата поява, незабавно уведомява другите засегнати държави-членки, съобразно установения риск, за подробностите относно посочената предполагаема поява и се осъществява подходящо сътрудничество между посочените държави-членки. Уведомените държави-членки въвеждат предохранителни мерки в съответствие с параграф 2, буква в) и, при необходимост, предприемат по-нататъшни действия, съгласно параграфи 1 и 2.

4.  Могат да бъдат приети следните разпоредби в съответствие с процедурата, предвидена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

Член 5

1.  Ако в резултат на официално или извършено под официален надзор лабораторно изследване, използващо за изброения растителен материал определения в приложение II метод, или, във всички останали случаи, който и да е друг официално одобрен метод, се потвърди наличие на организма в проба, взета съгласно настоящата директива, тогава отговорните официални органи на държавата-членка, като вземат предвид обоснованите научни принципи, биологията на организма и специфичните системи на производство, пускане на пазара и обработка на растенията-гостоприемници за организма в тази държава-членка:

2.  Държавите-членки незабавно уведомяват останалите държави-членки и Комисията, в съответствие с разпоредбите на точка 3 от приложение V, за всяко замърсяване, обявено съгласно параграфи 1, буква а), ii) и 1 буква в), ii) и за подробностите относно разграничаването на зоната, съгласно параграф 1, буква в), iv) и, при необходимост, съгласно параграф 1, буква в), iii). Подробностите от тези уведомявания могат да се предоставят на Комитета.

Държавите-членки в същото време предоставят на Комисията допълнителното известие, посочено в точка 4 от приложение V. Подробностите от известието по тази алинея незабавно се предоставят на членовете на Комитета.

3.  В резултат на известието по параграф 2 и посочените там елементи, други държави-членки, които са изброени в известието, започват разследване съгласно параграф 1, буква а), i) и, при необходимост, по параграф 1, буква в), i) и предприемат по целесъобразност по-нататъшни действия в съответствие с параграфи 1 и 2.

Член 6

1.  Държавите-членки постановяват, че този изброен растителен материал, обявен като замърсен по член 5, параграф 1, буква а), i), не може да се засажда и, под контрола и одобрението на техните отговорни официални органи, е предмет на една от разпоредбите в точка 1 от приложение VI, така че да се гарантира липсата на риск от разпространение на организма.

2.  Държавите-членки постановяват, че този изброен растителен материал, определен като вероятно замърсен съгласно член 5, параграф 1, буква а), iii) и в), iii), включително изброения растителен материал, за който е установен риск и който е произведен на места, определени като вероятно замърсени по член 5, параграф 1, буква а), iii), не може да се засажда и, под контрола на техните отговорни официални органи, е подходящо оползотворен или ликвидиран, в съответствие с предвиденото в точка 2 от приложение VI, така че да не се установява съществуването на риск от разпространение на организма.

3.  Държавите-членки постановяват, че всички машини, превозни средства, съдове, складове или участъци от тях и всички други предмети, включително опаковъчен материал, обозначени като замърсени по член 5, параграф 1, буква а), ii) или определени като вероятно замърсени по член 5, параграф 1, буква а), iii) и в), iii), трябва да бъдат или унищожени или обеззаразени чрез използване на подходящи методи, в съответствие с предвиденото в точка 3 от приложение VI. След обеззаразяване всички тези предмети не се считат вече за замърсени.

4.  Без да се засягат мерките, предприети съгласно параграфи 1, 2 и 3, държавите-членки постановяват, че в зоната, разграничена съгласно член 5, параграф 1, буква а), iv) и в), iii), трябва да бъде изпълнена серия от мерки, в съответствие с предвиденото в точки 4.1 и 4.2 от приложение VI. Останалите държави-членки и Комисията се уведомяват ежегодно за подробностите във връзка с тези мерки. Подробностите от това известие могат да бъдат предоставени на Комитета.

Член 7

1.  Държавите-членки постановяват, че картофите за семе трябва да отговарят на изискванията от Директива 77/93/ЕИО и да са добити по пряка линия от картофен материал, получен съгласно официално одобрена програма, за който е констатирано, че няма наличие на организма чрез официално изследване или чрез такова, извършено под официален надзор с използване на съответния метод, определен в приложение II.

Посоченото изследване се извършва от държава-членка:

2.  Следните разпоредби могат да бъдат приети в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО:

Член 8

Държавите-членки забраняват притежаването и извършването на манипулации с организма.

Член 9

Без да се засягат разпоредбите на Директива 77/93/ЕИО, държавите-членки могат да разрешат дерогации от мерките, посочени в членове 6 и 8 от настоящата директива, в съответствие с разпоредбите, определени в Директива 95/44/ЕО ( 5 ) за експериментални или научни цели и за работа върху селекция на нови сортове.

Член 10

Държавите-членки могат да приемат, във връзка със собственото си производство, такива допълнителни или по-строги мерки, каквито може да са необходими за борба срещу организма или за да се предотврати неговото разпространение, доколкото те са в съответствие с разпоредбите на Директива 77/93/ЕИО.

Подробностите за прилагане на тези мерки се нотифицират на другите държави-членки и на Комисията. Комитетът може да бъде сезиран за условията и реда на това нотифициране.

Член 11

Изменения на приложенията към настоящата директива, изготвени съобразно развитието в научното и техническото познание, се приемат в съответствие с процедурата, определена в член 16а от Директива 77/93/ЕИО. По отношение на методите, определени в приложение II и по отношение на мерките в параграфи 4.1 и 4.2 от приложение VI към настоящата директива, Комисията изготвя доклад за преразглеждане на тези методи и мерки на базата на натрупания опит, като докладът се предоставя на Комитета преди 1 януари 2002 г.

Член 12

1.  Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими за да се съобразят с настоящата директива, преди 21 август 1999 г. Те незабавно информират Комисията за това.

Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позоваване се определят от държавите-членки.

2.  Държавите-членки съобщават незабавно на Комисията текста на основните разпоредби от националното законодателство, които те приемат в областта, уредена с настоящата директива. Комисията информира останалите държави-членки за тези разпоредби.

Член 13

Настоящата директива влиза в сила в деня на публикуването ѝ в Официален вестник на Европейските общности.

Член 14

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.

---

ПРИЛОЖЕНИЕ I

РАЗДЕЛ I

Списък на растения-гостоприемници за Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., посочен в член 1

РАЗДЕЛ II

Обследвания

1.

Официалните обследвания, посочени в член 2, параграф 2, буква а) се основават върху биологията на организма и специфичните системи на производство в засегнатата държава-членка и включват: i) при картофи; — през подходящи интервали от време, визуален преглед на растящата култура, и/или вземане на проби, както от картофите за семе, така и от останалите картофи по време на вегетация или в склада. Тези проби се подлагат на официален или извършен под официален надзор визуален преглед, чрез разрязване на клубените, и — при картофите за семе, а при необходимост и при други картофи, официално или извършено под официален надзор лабораторно изследване по метод, определен в приложение II; ii) при домати; — визуален преглед през подходящи интервали от време поне на растящите култури от растенията, предназначени за пресаждане с професионална цел.

2.

Известяването на официалните обследвания, посочени в член 2, параграф 3 включва: i) в случай на обследвания върху картофи; — предполагаема обща площ, в хектари, засадена с картофи за семе и други картофи, — класифициране по категории за семе и продукция и, при необходимост, по район, — брой и обозначаване времето на взетите за изследване проби, — брой визуални прегледи на полето, — брой (и размер на пробата) визуални прегледи върху клубени; ii) в случай на обследвания поне върху растящите култури от доматени растения, предназначени за пресаждане с професионална цел: — предполагаем общ брой растения, — брой визуални прегледи; iii) в случай на обследвания върху растения-гостоприемници, различни от картофи и домати, включително диви картофени растения-гостоприемници: — вид, — брой и обозначаване времето на взетите проби, — по целесъобразност, район/река, откъдето е взета пробата, — метод на изследване; iv) в случай на обследвания на вода и течни отпадъци, отделяни от помещения за промишлена преработка или пакетиране; — брой и обозначаване времето на взетите проби, — по целесъобразност, район/река/местоположение на помещенията, откъдето е взета пробата, — метод на изследване.

▼M1

---

ПРИЛОЖЕНИЕ II

ТЕСТОВА СХЕМА ЗА ДИАГНОСТИКА, ОТКРИВАНЕ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ОБХВАТ НА ТЕСТОВАТА СХЕМА

Настоящата схема описва различните процедури, включени в:

СЪДЪРЖАНИЕ

	Общи принципи
РАЗДЕЛ I:	Прилагане на тестовата схема
	1. Схема за диагностициране за наличие на бактериално кафяво гниене по картофените клубени и бактериално увяхване при картофени, доматени и други растения гостоприемници със симптоми на бактериално кафяво гниене или бактериално увяхване
	2. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени клубени
	3. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични, картофени, доматени или други растения гостоприемници
РАЗДЕЛ II:	Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в картофени клубени и картофени, доматени или други растения гостоприемници със симптоми на бактериално кафяво гниене или бактериално увяхване
	1. Симптоми
	2. Бързи скринингови тестове
	3. Процедура за изолиране
	4. Тестове за определяне на R. Solanacearum
РАЗДЕЛ III:	1. Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени клубени
	1.1. Изготвяне на проби
	1.2. Тестване
	2. Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени, доматени или други растения
	2.1. Изготвяне на проби
	2.2. Тестване
РАЗДЕЛ IV:	1. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum във вода
	2. Методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва
	2.1. Изготвяне на проби
	2.2. Тестване
РАЗДЕЛ V:	1. Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва
	2. Методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва
	2.1. Изготвяне на проби
	2.2. Тестване
РАЗДЕЛ VI:	Оптимизирани протоколи за откриване и определяне на R. Solanacearum
	А Тестове за диагностициране и откриване
	1. Стриминг тест на стеблото
	2. Откриване на поли-β-хидроксибутиратни гранули
	3. Серологични аглутинационни тестове
	4. Селективна изолация
	4.1. Селективно посяване
	4.2. Процедура на обогатяване
	5. Имунофлуоресцентен тест (IF тест)
	6. Тестване на полимеразна верижна реакция (PCR тест)
	6.1. Методи за очистване на ДНК
	а) Метод на Пастрик (2000)
	б) Други методи
	6.2. PCR
	6.3. Анализ на PCR продукт
	7. Флуоресцентен in-situ хибридизационен тест (FISH тест)
	8. Тествания на ензимно свързани имуносорбентни изследвания (Елайза тестове)
	а) Индиректен Елайза
	б) DASI Елайза
	9. Тест на биологична проба
	Б. Идентификационни тестове
	1. Хранителни и ензимни идентификационни тестове
	2. IF тест
	3. Елайза тест
	4. PCR тест
	5. FISH тест
	6. Профилиране на мастни киселини (FAP)
	7. Методи за характеризиране на щамове
	7.1. Определяне на биовар
	7.2. Геномен финтърпринтинг
	7.3. PCR методи
	В. Тест за потвърждаване
	Допълнение 1 Лаборатории, които участват в оптимизирането и валидирането на протоколите
	Допълнение 2 Среда за изолиране и култивиране на R. solanacearum
	Допълнение 3 А) Стандартизиран контролен материал с търговско предназначение
	Б) Изготвяне на контроли
	Допълнение 4 Буфери за тестателни процедури
	Допълнение 5 Определяне на нивото на заразяване в IF и FISH тестове
	Допълнение 6 Валидирани PCR протоколи и реагенти
	Допълнение 7 Валидирани рагенти за FISH тест
	Допълнение 8 Кондициониране на култури от син домат и домат
	Източници

ОБЩИ ПРИНЦИПИ

В допълненията са дадени оптимизирани протоколи за различните методи, валидирани реагенти и подробна информация за подготвяне на тестовите и контролни материали. Списъкът на лабораториите, които са участвали в оптимизирането и валидирането на протоколите, е даден в допълнение 1.

Тъй като протоколите включват откриване на карантинен вредител и обикновено включват използването на жизнеспособни култури на R. Solanacearum като контролен материал, се налага процедурите да се извършват при подходящи карантинни условия със съответстващи възможности за депониране на отпадъците и в рамките на условията на съответстващи лицензи, издадени от официалните органи за растителна карантина.

Тестовите параметри трябва да осигуряват съвместимо и възпроизводимо откриване на нивата на R. Solanacearum при определените прагове на избраните методи.

Прецизната подготовка на положителни контроли е задължителна.

Тестването в съответствие със задължителните прагове означава също правилно разполагане, поддържане и калибриране на оборудването, внимателна транспортиране и съхраняване на реагентите и осигуряване на всички мерки за предотвратяване на заразяване между пробите, например отделяне на положителните контроли от тестовите пробите за тестване. За избягване на административни и други грешки, особено по отношение на етикетирането и документацията, трябва да се прилагат стандартите за управление на качеството.

Предполагано наличие, посочено в член 4, параграф 2 от Директива 98/57/ЕО, означава положителен резултат при диагностични или скринингови тестове, извършени върху проба, както е описано в диаграмите по-долу. Положителен първи скринингов тест (IF тест, PCR/FISH, селективна изолация) трябва да се потвърди от втори скринингов тест на базата на различен биологичен принцип.

Ако първият скринингов тест е положителен, тогава се предполага заразяване с R. Solanacearum и трябва да се направи втори скринингов тест. Ако вторият скринингов тест е положителен потвърждението се потвърждава (предполагано наличие) и тестването трябва да продължи по схемата. Ако вторият скринингов тест е отрицателен, се счита, че пробата не е заразена с R. Solanacearum.

Потвърдено наличие, посочено в член 5, параграф 1 от Директива 98/57/ЕО, означава изолирането и определянето на чиста култура на R. Solanacearum с потвърждение за патогенност.

РАЗДЕЛ I

ПРИЛАГАНЕ НА ТЕСТОВАТА СХЕМА

1.   Схема за диагностициране за наличие на бактериално кафяво гниене по картофените клубени и бактериално увяхване при картофени, доматени и други растения гостоприемници със симптоми на бактериално кафяво гниене или бактериално увяхване.

Тестовата процедура е предназначена за картофени клубени и растения с типични симптоми или симптоми за съмнение за наличие на кафяво гниене или везикуларно увяхване. Тя включва бърз скринингов тест, изолиране на патогенни от инфектираната везикуларна тъкан върху (селектирана) среда и, ако резултатът е положителен, определяне на културата като Ralstonia solanacearum.

2.   Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени клубени

Принцип

Тестовата процедура е предназначена за откриване на латентни инфекции в картофени клубени. Положителен резултат от поне два скринингови теста, на базата на различни биологични принципи, трябва да се допълни от изолирането на патогена; последвано, при изолирането на типични колонии, от потвърждаването на чиста култура като R. Solanacearum. Положителен резултат само от един от скрининговите тестове не е достатъчен, за да се счете пробата за съмнителна.

Скрининговите тестовете и изолационните тестове трябва да позволяват откриване на 103 и 104 клетки/ml от повторно суспендирана пелета, включени като положителни контроли във всяка серия тестове.

3.   Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични, картофени, доматени или други растения гостоприемници

РАЗДЕЛ II

ПОДРОБНИ МЕТОДИ ЗА ОТКРИВАНЕ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА R. SOLANACEARUM В КАРТОФЕНИ КЛУБЕНИ И КАРТОФЕНИ, ДОМАТЕНИ ИЛИ ДРУГИ РАСТЕНИЯ ГОСТОПРИЕМНИЦИ СЪС СИМПТОМИ НА БАКТЕРИАЛНО КАФЯВО ГНИЕНЕ ИЛИ БАКТЕРИАЛНО УВЯХВАНЕ

1.   Симптоми (Виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1.   Симптоми по картофите

Картофеното растение. Ранният стадий на инфекцията в полето се разпознава по увяхването на листата към върха на растението при високите температури през деня и възстановяване през нощта. При ранните стадии на повяхване листата се запазват зелени, но по-късно настъпва пожълтяване и кафява некроза. Появява се и епинастия. Повяхването на един стрък или на цели растения бързо става необратимо и води до падане и смърт на растението. Съдовата тъкан на напречно разрязани стебла на увехнали растения обикновено изглежда кафява и от разрязаната повърхност се отделя млечен бактериален филтрат или може да се отдели при стискане. Когато отрязаното стебло се постави вертикално във вода, от съдовите снопчета изтичат слизести нишки.

Картофеният клубен. Картофените клубени трябва да се разрежат напречно близо до надебеления край (при ластуна) или надлъжно по надебеления край с ластуна. Ранният стадий на инфекцията се разпознава по стъклено жълтото до светло кафяво обезцветяване на съдовия пръстен, от който след няколко минути спонтанно се появява бледокремав бактериален филтрат. По-късно съдовото обезцветяване става по-забележимо кафяво и некрозата може да обхване и паренхимната тъкан. При напредналите стадии инфекцията се разпространява навън от надебеления край и очите, от които може да се отделя слизест бактериален филтрат, който предизвиква полепване на частици от почвата. Върху кората могат да се появят червеникаво-кафяви леко хлътнали увредени участъци поради вътрешно разпадане на съдова тъкан. Вторично развитие на гъбни и бактериални меки загнили участъци се среща често при напредналите стадии на болестта.

1.2.   Симптоми по доматите

Доматеното растение. Първият видим симптом е омекване на най-младите листа. При благоприятни за патогена условия на околната среда (почвени температури около 25 °С; наситена влажност) настъпва епинастия и увяхване на едната страна или на цялото растение в рамките на няколко дни, което води до пълно падане на растението. При по-неблагоприятни условия на околната среда (почвени температури под 21 °С) увяхването е по-малко, но могат да се развият голям брой външни корени върху стеблото. Възможно е да се наблюдават набраздявания, пълни с вода, от основата на стеблото, което свидетелства за некроза на съдовата тъкан. При напречно разрязване на стеблото от обезцветената кафява съдова тъкан се отделя бял или жълтеникав бактериален филтрат.

1.3.   Симптоми по други гостоприемници

Растения на Solanum dulcamara и S. nigrum. При естествени условия рядко се наблюдават симптоми на увяхване при тези плевелни растения гостоприемници, освен ако температурите на почвата не надвишават 25 °С или нивата на инокулация са изключително високи (например когато S. nigrum расте в близост до заразени доматени или картофени растения). При настъпване на увяхване симптомите са същите, както при доматите. При неувяхващите растения на Solanum dulcamara, чиито стебла и корени растат във вода, може да се забележи вътрешно светлокафяво обезцветяване на съдовите тъкани при напречен разрез в основата на стеблото или частите на стеблото, които са под водата. От разрязаните съдови тъкани или от слизестите нишки, ако отрязаното стебло се постави вертикално във водата, може да изтече филтрат с бактерии дори при отсъствие на симптоми за увяхване.

2.   Бързи скринингови тестове

Бързите скринингови тестове могат да улеснят диагностицирането на вероятна зараза, но не са съществени. Използват се един или няколко валидирани тестове от дадените по-долу:

2.1.   Стриминг тест на стеблото

(виж раздел VI, точка А, точка 1)

2.2.   Откриване на поли-β-хидроксибутиратни (РНВ) гранули

Характерни РНВ гранули в клетките на R. Solanacearum се визуализират чрез оцветяване на топлинно фиксирано мазилно вещество от бактериален филтрат от заразена тъкан върху предметно стъкло с Nile Blue A или Sudan Black (виж раздел VI, точка А, точка 2).

2.3.   Серологични аглутинационни тестове

(виж раздел VI, точка А, точка 3).

2.4.   Други тестове

Други подходящи бързи скринингови тестове са IF тест (виж раздел VI, точка А, точка 5), FISH тест (виж раздел VI, точка А, точка 7), Елайза тестове (виж раздел VI, точка А, точка 8) и PCR тестове (виж раздел VI, точка А, точка 6).

3.   Процедура за изолиране

4.   Тестове за определяне на R. Solanacearum

Тестове за потвърждаване идентичността на вероятни изолати на R. Solanacearum са дадени в раздел VI, точка Б.

РАЗДЕЛ III

1.   Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени клубени

1.1.   Изготвяне на проба

Забележка:

Незадължително предварително третиране преди изготвяне на пробата:

1.1.1.

Отстранява се с чист и дезинфекциран скалпел или нож за зеленчуци кората при надебеления край (с ластун) на всеки клубен, така че да се вижда съдовата тъкан. Внимателно се изрязва малка сърцевина от съдовата тъкан при надебеления край с минимално количество несъдова тъкан. (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Забележка: Отделят се всички (загнили) клубени с вероятни симптоми на кафяво гниене и се тестват отделно. Ако при отстраняването на надебеления край се наблюдават симптоми на кафяво гниене в сърцевината, се прави визуална проверка на клубена и той се разрязва близо до надебеления край. Всеки разрязан клубен с вероятни симптоми трябва да се запази най-малко два дена при стайна температура, за да се създаде възможност за суберизация, и да се пази в хладилник (при температури от 4 до 10 °С) при подходящи карантинни условия. Всички клубени, включително тези с вероятни симптоми, се съхраняват в съответствие с изискванията на приложение III.

1.1.2.

Събират се сърцевините от надебеления край в неизползвани контейнери за еднократна употреба, които могат да се затварят и/или запечатват (ако се използват повторно контейнерите, трябва да се почистят основно и да се дезинфекцират с хлорни съединения). Предпочита се сърцевините от надебеления край да се обработят незабавно. Когато това не е възможно, те се съхраняват в контейнер, без да се прибавя буфер, в хладилник за не повече от 72 часа или за 24 час при стайна температура. Надебеленият край и сърцевините се обработват с една от следните процедури: а) Сърцевините се покриват с достатъчно количество (около 40 ml) екстракционен буфер (допълнение 4) и се разбъркват с ротационен шейкър (50—100 rpm) в продължение на 4 часа при температура под 24 °С или в продължение на 16 до 24 часа охладени, или б) Сърцевините се хомогенизират с достатъчно количество (около 40 ml) екстракционен буфер (допълнение 4) или в блендер (например Waring или Ultra Thurax) или чрез трошене в запечатана торбичка за мацерация (например от усилен полиетилен Stomacher или Bioreba, 150 mm × 250 mm; стерилизирана чрез облъчване), като се използва гумен чук или подходящ апарат за мелене (например Homex). Забележка: При използване на блендер за хомогенизиране има голяма опасност от кръстосано заразяване на пробите. Необходимо е да се вземат предпазни мерки, за да се избегне създаването на аерозоли или разливане по време на процеса на екстракция. За всяка проба се осигуряват прясно стерилизирани ножове на блендера и съдове. Ако ще се използва PCR тест, избягвайте пренасянето на ДНК върху контейнерите и апаратите за мелене. Препоръчва се трошене в торбички за еднократна употреба и използването на еднократни тръби, когато ще се използва PCR.

1.1.3.

Декантира се изплувалата на повърхността част. Ако мътността е голяма, се налага избистряне чрез центрофугиране при ниска скорост (при не повече от 180 g за 10 минути при температура между 4 и 10 °С) или чрез вакуумна филтрация (40 до 100 μm), като филтърът се измива с допълнителен (около 10 ml) екстракционен буфер.

1.1.4.

Сгъстява се бактериалната фракция чрез центрофугиране при 7 000 g за 15 минути (или 10 000 g за 10 минути) при температура между 4 и 10 °С и се отстранява изплувалата на повърхността част, без да се нарушава пелетата.

1.1.5.

Повторно се суспендира пелетата в 1,5 ml пелетен буфер (допълнение 4). Използват се 500 μl за тестване за R. solanacearum, 500 μl за Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus и 500 μl за сравняване. Добавя се стерилен глицерин към окончателната концентрация —10 до 25 % (v/v) към 500 μl от референтната аликвотна част и към останалата аликвотна част за тестване, разбърква се и се оставя при температура от –16 до –24 °С (седмици) или от –68 до –86 °С (месеци). Аликвотните части за тестване се съхраняват при температура от 4 до 10 °С по време на тестването. Не се препоръчва многократно замразяване и размразяване на пробите. Ако се налага транспортиране на екстракта доставката се осигурява в охладена кутия в рамките на 24 до 48 часа.

1.1.6.

Задължително е отделното третиране на всички R. solanacearum положителни контроли и проби, за да се избегне заразяване. Това се отнася за предметните стъкла за IF тест и за всички други тестове.

1.2.   Тестване

Виж схемата и описанието на тестовете и оптимизираните протоколи в съответните допълнения:

2.   Подробни методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в проби от асимптоматични картофени, доматени или други растения

2.1.   Изготвяне на проба

Забележка: За откриване на наличие на латентни популации на R. Solanacearum се препоръчва използването на съставни проби. Процедурата е удобна за използване при съставни проби от не повече от 200 стеблени части. Когато се правят изследвания, те трябва да се базират на статистическа представителна извадка на изследваната растителна популация.

2.1.1.

Събират се сегменти от стеблото с дължина от 1 до 2 cm в затворен стерилен контейнер в съответствие със следната процедура за пробонабиране: Ранен доматен разсад: С чист дезинфекциран нож се отстранява сегмент с дължина 1 cm от основата на всяко стебло точно над нивото на почвата. Полски или парникови доматени растения: С чист дезинфекциран нож се отстранява най-ниското странично клонче на всяко растение, като се реже точно над връзката с главното стебло. Отстранява се сегмент с дължина 1 cm от най-долната част на всяко странично клонче. Други гостоприемници: С чист дезинфекциран нож или градинарски ножици се отстранява сегмент с дължина 1 cm от основата на всяко стебло точно над нивото на почвата. При S. dulcamara или други растения гостоприемници, които виреят във вода, се отстраняват участъци с дължина 1—2 cm от частта на стеблото под водата или от ластуните, пуснали корени във водата. Когато се прави пробонабиране от определено място, се препоръчва да се тества статистическа представителна извадка, съставена от най-малко 10 растения от всяко място на пробовземане за всеки потенциален плевелен гостоприемник. Откриването на наличие на патоген е най-надеждно през пролетта, лятото и есента, въпреки че естествените инфекции могат да се откриват през цялата година в многогодишното Solanum dulcamara, което расте в реките. Познатите гостоприемници включват саморасли картофени растения (задържащи почвата), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium и други представители на семейство Solanaceае. Други гостоприемници са Pelargonium spp. и Portulaca oleracea. Някои европейски плевелни spp., които потенциално могат да дават подслон на популации биовар 2/род 3 на R. Solanacearum в корени и/или ризосфери при специфични условия на околната среда, включват Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra и Urtica dioica. Забележка: Визуалната проверка за откриване на вътрешни симптоми (съдово оцветяване или бактериален филтрат) може да се направи на този етап. Всички сегменти от стеблото със симптоми се отделят и се тестват отделно (виж раздел II).

2.1.2.

Сегментите от стеблото за кратко време се дезинфекцират със 70 % етанол и веднага се подсушават върху салфетка. След това сегментите от стеблото се обработват с помощта на една от следните процедури: а) Сегментите се покриват с достатъчно количество (около 40 ml) екстракционен буфер (допълнение 4) и се разбъркват с ротационен шейкър (50—100 rpm) в продължение на четири часа при температура под 24 °С или в продължение на 16 до 24 часа охладени, или б) Сегментите се обработват незабавно чрез трошене в здрава торбичка за мацерация (например Stomacher или Bioreba) с достатъчно количество екстракционен буфер (допълнение 4), като се използва гумен чук или подходящ апарат за мелене (например Homex). Ако това е невъзможно, сегментите от стеблото се съхраняват охладени не повече от 72 часа или не повече от 24 часа при стайна температура.

2.1.3.

След 15 минути утаяване се декантира изплувалата на повърхността част.

2.1.4.

Обикновено не се налага допълнително избистряне на екстракта или концентриране на бактериалната фракция, но може да се получат чрез филтриране и/или центрофугиране, описани в раздел III, точки 1.1.3—1.1.5.

2.1.5.

Неразреденият или концентриран екстракт се разделя на две равни части. Едната част се поддържа при температура от 4 до 10 °С по време на тестването, а другата се съхранява с 10 до 25 % (v/v) стерилен глицерин — при температура от –16 до –24 °С (седмици) или от –68 до –86 °С (месеци) в случай, че се наложи допълнително тестване.

2.2.   Тестване

Виж схемата и описанието на тестовете и оптимизираните протоколи в съответните допълнения:

РАЗДЕЛ IV

1.   Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum във вода

2.   Методи за откриване и определяне на R. Solanacearum във вода

Принцип

Валидираната схема за откриване наличието на бактерията, описана в настоящия раздел, се прилага за откриване на патоген в проби от повърхностна вода и може също да се прилага за тестване на проби от води от преработка на картофи или отпадъчни води. Важно е, обаче, да се отбележи, че очакваната чувствителност на откриването на наличие се променя в зависимост от субстрата. Чувствителността на теста за изолация се влияе от популациите конкурентни сапрофитни бактерии, които по принцип са много повече във водите от преработка на картофи и в отпадъчните води, отколкото в повърхностните води. Въпреки че от схемата, дадена по-долу, се очаква да установи не по-малко от 103 клетки на литър в повърхностни води, чувствителността на откриването на наличие във водите от преработка на картофи и в отпадъчните води е значително по-ниска. Поради тази причина се препоръчва тестването на отпадъчни води да става след всяко третиране за пречистване, при което се редуцират популациите на сапрофитни бактерии. Ограниченията в чувствителността на тестовата схема трябва да се имат предвид, когато се оценява надеждността на получени отрицателни резултати. Въпреки че схемата се използва успешно при изследвания за определяне на наличие или отсъствие на патогена в повърхностни води, нейните ограничения трябва да се имат предвид, когато схемата се използва в подобни изследвания на води от преработка на картофи или отпадъчни води.

2.1.   Изготвяне на проба

Забележка:

2.1.1.

На избраните за пробовземане места се събират проби чрез напълване на стерилни епруветки или бутилки на дълбочина по възможност под 30 cm и до 2 m от брега. За водите от преработка и отпадъчните води пробите се събират на мястото на заустване. Препоръчва се размерът на пробите за едно място на пробовземане да не надвишава 500 ml. Ако се предпочитат по-малки проби, се препоръчва пробовземането да стане поне на три пъти за всяко място на пробовземане, като всяка проба е съставена от две еднакви подпроби по 30 ml най-малко. При интензивни изследвания се избират поне три места на пробовземане през 3 km по речното течение, като се осигурява пробонабиране и от притоците, които се вливат в реката.

2.1.2.

Пробите се транспортират на хладно и тъмно (4 до 10 °С) и се тестват в рамките на 24 часа.

2.1.3.

При необходимост бактериалната фракция може да бъде концентрирана, като се използва един от следните методи: а) 30 до 50 ml подпроби се центрофугират при 10 000 g за 10 минути (или 7 000 g за 15 минути) за предпочитане при температури от 4 до 10 °С, отстранява се изплувалата на повърхността част и повторно се суспендира пелетата в 1 ml пелетен буфер (допълнение 4). б) Мембранна филтрация (минимален размер на порите 0,45 μm) последвана от измиване на филтъра в 5 до 10 ml пелетен буфер и запазване на отмитото. Този метод е подходящ за големи количества вода, съдържащи малък брой сапрофити. Обикновено концентрацията не се препоръчва за проби от води от преработката на картофи или отпадъчни води откакто увеличената популация от конкурентни сапрофитни бактерии ще инхибира откриването на Ralstonia solanacearum.

2.2.   Тестване

Виж схемата и описанието на тестовете в съответните допълнения.

РАЗДЕЛ V

1.   Схема за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва

2.   Методи за откриване и определяне на R. Solanacearum в почва

Принципи

Схемата за потвърждаване на откриване на наличието на бактерията, описана в настоящия раздел, се прилага за откриване на патоген в проби от почва, но може също да се прилага за тестване на проби от твърди отпадъци от преработката на картофи или утайки от отпадъчни води. Но е необходимо да се отбележи, че тези методи не са достатъчно чувствителни, за да се гарантира откриване на малък брой и/или разпръснати популации на R. Solanacearum, които могат да се появят в естествено заразени проби на такива субстрати.

Ограниченията в чувствителността на тази тестова схема трябва да се имат предвид, когато се оценява надеждността на получени отрицателни резултати, а също и когато се използва в изследвания за определяне на наличие или отсъствие на патогена в почви или утайки. Най-надеждният тест за наличието на патогена в полски почви е да се засади възприемчив гостоприемник и да се наблюдава за поява на инфекция, но дори и при този метод може да убегне откриването на ниски нива на заразяване.

2.1.   Изготвяне на проба

2.1.1.

Пробонабирането от полска почва трябва да следва стандартните принципи, използвани за пробонабиране на нематоди. Събира се 0,5 до 1 kg почва за една проба от 60 места на 0,3 ha на дълбочина от 10 до 20 cm (или в мрежа 7 × 7 метра). Ако е налице съмнение за наличие на патогена броят на местата на пробовземане се увеличава до 120 на 0,3 ha. Пробите се държат на температура от 12 до 15 °С преди тестването. Пробонабирането за води от преработката на картофи и за отпадъчни води става чрез събиране на общо 1 kg от местата, което представлява общото количество утайка за тестване. Всяка проба се разбърква добре преди тестване.

2.1.2.

Пробите от 10 до 25 g почва или утайка се диспергират чрез въртене и разклащане (250 rpm) в 60 до 150 ml буфер за екстракция (допълнение 4) в продължение на не повече от два часа. При необходимост диспергирането може да се улесни като се добави 0, 02 % стерилен Tween-20 и 10 до 20 g стерилна баластра.

2.1.3.

По време на тестване се поддържа температура на суспензията от 4 °С.

2.2.   Тестване

Виж схемата и описанието на тестовете в съответните допълнения.

РАЗДЕЛ VI

ОПТИМИЗИРАНИ ПРОТОКОЛИ ЗА ОТКРИВАНЕ И ОПРЕДЕЛЯНЕ НА R. SOLANACEARUM

А.   ТЕСТОВЕ ЗА ДИАГНОСТИЦИРАНЕ И ОТКРИВАНЕ

1.   Стриминг тест на стеблото

Наличието на R. Solanacearum в стеблата на увехнали картофени, доматени и други растения гостоприемници може да се установи с помощта на следното просто вероятностно тестване: Стеблото се отрязва точно над нивото на почвата. Отрязаната повърхност се потапя в епруветка с чиста вода. Наблюдава се дали след няколко минути от отрязаните съдови възелчета ще се появи характерно спонтанно изтичане на бактериални слизести нишки.

2.   Откриване на поли-β-хидроксибутиратни гранули

Тестване с Nile Blue A

Тестване със Sudan Black

3.   Серологични аглутинационни тестове

Аглутинацията на клетки на R. Solanacearum в бактериален филтрат или симптоматични тъканни екстракти се наблюдава най-добре като се използват валидирани антитела (виж допълнение 3), етикетирани с маркери с подходящ цвят, например червено за клетки на Staphylococcus aureus или цветни латексови частици. Когато се използва комплект, закупен в търговската мрежа (виж допълнение 3), се спазват указанията на производителя. В противен случай се извършва следната процедура:

4.   Селективна изолация

4.1.   Селективно посяване в петра

Забележка: Преди да се използва този метод за пръв пет се извършват предварителни тестове, за да се гарантира възпроизводимо откриване на 103 до 104 единици, образуващи колонии, на R. Solanacearum на ml, добавени към екстракти от проби, които са дали отрицателен резултат при предишно тестване.

Използва се съответстващо валидирана селективна среда като например SMSA (модифицирана от Elphinstone et al., 1996 г.; виж допълнение 2).

Изисква се внимание, за да се разграничи R. Solanacearum от други бактерии, които могат да развият колонии върху средата. Освен това колониите от R. Solanacearum могат да покажат атипична морфология, ако петрите са пренаселени или присъстват и антагонистични бактерии. Когато има съмнение за последствия от конкуриране или антагонизъм, пробата следва да се теста повторно, като се използва друг вид тест.

Най-висока чувствителност на откриване чрез този метод може да се очаква, когато се използват прясно приготвени екстракти от проби. Но методът е приложим и към използването на екстракти, които са били съхранявани в глицерин при температура от –68 до –86 °С.

За положителни контроли се изготвят десетични разреждания от суспензия на 106 cfu на ml от вирулентен биовар 2 щам на R. solanacearum (например NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). За да се избегне всяка възможност за заразяване, положителните контроли се изготвят напълно отделно от пробите за тестване.

За всяка новоизготвена партида селективна среда задължително се тества нейната пригодност за растеж на патогена, преди да се използва за тестване на рутинни проби.

Контролният материал се тества по същия начин както пробата/пробите.

4.1.1.

Изпълнява се подходяща техника за селективно посяване в петра, чиято цел е да се гарантира отстраняването чрез разреждане на фоновите сапрофитни популации, образуващи колонии. Разпределят се 50—100 μl от екстракта от пробата на петра и на всяко разреждане.

4.1.2.

Петрите се инкубират при 28 °С. Отчитането на петрите става след 48 часа, а след това ежедневно до 6 дни. Типичните R. solanacearum колонии върху SMSA среда са млечнобели, плоски, с неправилна форма и флуидни и след тридневна инкубация развиват розово до кървавочервено оцветяване в центъра с вътрешно набраздяване или венче. (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Забележка: Върху тази среда понякога се образуват атипични колонии. Те може да са малки, кръгли, само червени на цвят и нефлуидни или само отчасти флуидни и затова трудно се различават от сапрофитните бактерии, образуващи колонии.

4.1.3.

Вероятните колонии на R. solanacearum след щрихово посяване или разреждане в петра се пречистват върху обща хранителна среда, за да се получат изолирани колонии (виж допълнение 2).

4.1.4.

Културите се съхраняват краткосрочно в стерилна вода (Ph от 6 до 8, без съдържание на хлор) при стайна температура на тъмно или дългосрочно в подходяща криозащитна среда при –68 до –86 °С или лиофилизирани.

4.1.5.

Определят се вероятните култури (виж раздел VI, точка Б) и се извършва тест за патогенност (виж раздел VI, точка В).

Тестването на селективно посяване в петра е отрицателно, ако не се наблюдават никакви бактериални колонии след шест дни или ако не са открити никакви вероятни колонии, типични за R. solanacearum, при условие че не се очаква вероятно инхибиране поради конкуриране или антагонизъм на други бактерии и са намерени типични R. solanacearum колонии в положителните контроли. Тестването на селективно посяване е възможно, ако са изолирани вероятни R. solanacearum колонии.

4.2.   Процедура на обогатяване

Използва се валидирана среда за обогатяване като например хранителна среда на Уйлбринк (виж допълнение 2).

Тази процедура може да се използва за селективно увеличаване на R. solanacearum популациите в екстрактите от проби и за увеличаване на чувствителността на откриването. Процедурата също така ефективно разрежда инхибиторите на PCR реакцията (1:100). Но следва да се обърне внимание, че обогатяването на R. solanacearum може да се провали поради конкурирането или антагонизма на сапрофитни организми, които често се обогатяват едновременно. Поради тази причина изолирането на R. solanacearum от обогатени хранителни култури може да се затрудни. Освен това, тъй като популациите на серологично свързани сапрофити могат да се увеличат, се препоръчва използването на специфични моноклонални антитела пред поликлоналните антитела, когато ще се използва Елайза тест.

4.2.1.

За обогатяване чрез PCR 100 μl от екстракта от пробата се прехвърлят в 10 ml хранителна среда за обогатяване (виж допълнение 2), предварително разпределена в епруветки и колби без наличие на ДНК. За обогатяване чрез Елайза могат да се използват по-високи съотношения на екстракта към хранителната среда (например 100 μl в 1,0 ml хранителна среда за обогатяване).

4.2.2.

Инкубира се за 72 часа при температура от 27 до 30 °С във вибрираща или в статична култура, като капачките не са плътно затворени, за да има възможност за аерация.

4.2.3.

Разбърква се добре, преди да се използва в Елайза или PCR тестове.

4.2.4.

Обогатената хранителна среда се третира по същия начин както пробата/пробите в тестовете по-горе. Забележка: Ако се очаква инхибиране на обогатяването на R. solanacearum поради високи популации на някои конкурентни сапрофитни бактерии, обогатяването на екстрактите от пробите преди центрофугиране или други форми на концентрация може да даде по-добри резултати.

5.   IF тест

Принцип

Използването на IF теста като основен скринингов тест е препоръчително поради доказаната му сила при постигане на задължителните прагове.

Когато IF тестът е използван като основен скринингов тест и отчитането по него е положително, като втори скринингов тест трябва да се направи изолационен тест, PCR тест или FISH тест. Когато IF тестът е използван като втори скринингов тест и отчитането по него е положително, за завършване на анализа е необходимо допълнително тестване в зависимост от схемата.

Забележка: Използва се валидиран източник на антитела на R. solanacearum (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Препоръчва се за всяка нова партида антитела да се определи титърът. Титър е най-високото разреждане, при което се осъществява оптимална реакция при тестването на суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки на ml от хомоложния щам на R. solanacearum, като се използва подходящо конюгатно съединение на флуоресцеин изотиоцианат (FITC) в съответствие с указанията на производителя. Всичките валидирани антисеруми са имали IF титър 1:2 000. По време на тестването антителата трябва да се използват при работно разреждане/работни разреждания, близки до или равни на титъра.

Тестването трябва да се извърши с прясно приготвени екстракти от проби. При необходимост то може успешно да се извърши с проби, съхранявани при температура от –68 до –86 °С в глицерин. Глицеринът може да се отстрани от пробата чрез добавяне на 1 ml пелетен буфер (допълнение 4), повторно центрофугиране за 15 минути при 7 000 g и повторно суспендиране в равно количество пелетен буфер. Това не се налага често, особено ако пробите са фиксирани към предметните стъкла на пламък.

Подготвят се отделни предметни стъкла с положителни контроли на хомоложния щам или друг референтен щам на R. solanacearum и се потапят в картофен екстракт, определен в допълнение 3, точка Б, а по избор — в буфер.

При възможност трябва да се използва естествено заразена тъкан (запазена чрез лиофилизация или замразяване при температура от –16 до –24 °С) като подобна контрола върху предметните стъкла.

Като отрицателни контроли могат да се използват аликвоти от екстрактите от проби, които при предходно тестване са дали отрицателни резултати.

Стандартизираните положителни и отрицателни контролни материали, които могат да се използват с този тест, са изброени в допълнение 3.

Използват се многогнездови предметни стъкла на микроскоп, като се предпочитат тези с 10 прозореца с диаметър 6 mm всеки.

Контролният материал се тества по същия начин като пробата/пробите.

5.1.   Тестателните предметни стъкла се изготвят, като се използва една от следните процедури:

5.2.

Капчиците се изсушават при стайна температура или чрез затопляне до температури от 40 до 45 °С. Бактериалните клетки се фиксират върху предметното стъкло чрез загряване (15 минути при 60 °С), с помощта на пламък, с 95 % етанол или в съответствие с конкретните указания на доставчиците на антителата. При необходимост фиксираните предметни стъкла могат да се съхраняват в замразено състояние в сушилна камера за необходимото време (не повече от три месеца), преди да бъдат подложени на тестване отново.

5.3.

IF процедура i) В съответствие с изготвянето на тестово предметно стъкло в точка 5.1, i): Изготвя се набор от двойни разреждания. В първото гнездо се поставя ½ от титъра (Т/2), а в другите — ¼ от титъра (Т/4), ½ от титъра (Т/2), титъра (Т) и два пъти титъра (2Т). ii) В съответствие с изготвянето на тестово предметно стъкло в точка 5.1, ii): Изготвя се работното разреждане (WD) на антитялото в IF буфер. Работното разреждане оказва въздействие върху спецификата. 5.3.1. Предметните стъкла се подреждат върху влажна салфетка. Всеки тестов прозорец се покрива изцяло с разреденото антитяло/антитела. Във всеки прозорец количеството на антитялото трябва да е най-малко равно на количеството на екстракта. Когато не са дадени конкретни указания от доставчиците на антителата, се извършва следната процедура: 5.3.2. Предметните стъкла се инкубират покрити върху влажна хартия в продължение на 30 минути при стайна температура (от 18 до 25 °С). 5.3.3. От всяко предметно стъкло се изтръскват капчиците и внимателно се изплаква с IF буфер. Измива се чрез потапяне за пет минути в IF буфер-Tween (допълнение 4), а след това в IF буфер. Трябва да се внимава да не се образуват аерозоли или да се разпръснат капчици, което би довело до кръстосано заразяване. Излишната влага се отстранява чрез внимателно попиване. 5.3.4. Предметните стъкла се подреждат върху влажна салфетка. Тестовите прозорци се покриват с разредено FITC конюгатно съединение, използвано за определянето на титъра. Във всеки прозорец количеството на съединението трябва да е най-малко равно на количеството на антитялото. 5.3.5. Предметните стъкла се инкубират покрити върху влажна хартия в продължение на 30 минути при стайна температура (от 18 до 25 °С). 5.3.6. От всяко предметно стъкло се изтръскват капчиците. Изплаква се и се измива, както по-горе (5.3.3). Излишната влага се отстранява внимателно. 5.3.7. С пипета се отмерват 5—10 μm от 0,1М фосфатен буферен глицерин (допълнение 4) или предпазващо от обезцветяване вещество, продавано в търговската мрежа, върху всеки прозорец и се покрива с хартия.

5.4.

Отчитане на IF тест: 5.4.1. Тестовите предметни стъкла се изследват с епифлуоресцентен микроскоп с филтри, подходящи за възбуждане на FITC, потопени в масло или вода при увеличение 500—1 000. Прозорците се сканират по дължината на двата диаметъра под прав ъгъл и по периметъра. За пробите, които не показват никакви клетки или малък брой клетки, се наблюдават поне 40 микроскопски полета. Най-напред се проверява предметното стъкло с положителна контрола. Клетките трябва да се светли, флуоресцентни и напълно оцветени при определения титър за антитяло или работно разреждане. Ако оцветяването е нетипично, IF тестът (раздел VI, точка А, точка 5) трябва да се повтори. 5.4.2. Тестателните прозорци на тестовите предметни стъкла се наблюдават за светли флуоресциращи клетки с характерната морфология на R. solanacearum (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интензитетът на флуоресценцията трябва да е равен на положителното контролно оцветяване при същото разреждане на антителата. Клетките с непълно оцветяване или със слаба флуоресценция не се зачитат. При съмнение за заразяване тестът трябва да се повтори. Това става, когато всички предметни стъкла в партидата показват положителни клетки поради заразяване на буфера или ако се открият положителни клетки (извън прозорците на предметните стъкла) върху покритието на предметните стъкла. 5.4.3. Няколко проблема са присъщи за спецификата на имунофлуоресцентния тест. В пелетите от картофена сърцевина откъм надебеления край и сегменти от стеблото могат да се появят фонови популации от флуоресциращи клетки с атипична морфология и сапрофитни бактерии с кръстосано действие, чиито размер и морфология са сходни до тези на R. solanacearum. 5.4.4. Разглеждат се само флуоресциращите клетки с типичен размер и морфология при титъра или работното разреждане на антителата в 5.3. 5.4.5. Интерпретиране на отчетените резултати от IF тест i) При откриване на светли флуоресциращите клетки с характерна морфология се определя средният брой на типични клетки за микроскопско поле и се изчислява броят на типичните клетки за ml повторно суспендирана пелета (допълнение 5). Отчетените резултати от IF тест са положителни за пробите с поне 5 × 103 типични клетки за ml повторно суспендирана пелета. ii) Отчетените резултати от IF тест са отрицателни за пробите с по-малко от 5 × 103 типични клетки за ml повторно суспендирана пелета и пробата се счита за отрицателно. Не се налага допълнително тестване.

6.   PCR тестове

Принципи

Когато PCR тест се използва като основен скринингов тест и резултатите от него са положителни, трябва да се направи изолационен или IF тест като втори задължителен скринингов тест. Когато PCR тест се използва като втори скринингов тест и резултатите от него са положителни, трябва да се направи допълнително тестване в съответствие със схемата, за да завърши диагностицирането.

Пълното използване на този метод като основен скринингов тест се препоръчва само когато са натрупани необходимите експертни знания и умения.

Забележка: Предварителното тестване с помощта на този метод трябва да позволява възпроизводимо откриване на 103 до 104 клетки на R. solanacearum на ml, добавени към екстракти от проби, които са дали отрицателни резултати при предишно тестване. За да се постигнат максимални нива на чувствителност и конкретност във всички лаборатории, може да се наложи експериментиране с цел оптимизиране на тестването.

Използват се валидирани PCR реагенти и протоколи (виж допълнение 6). По-добре е да се избере метод с вътрешна контрола.

Използват се подходящи предпазни мерки, за да се избегне заразяване на пробите с целева ДНК. За да се минимизира възможността за заразяване с целева ДНК, PCR тестът трябва да се провежда от опитни технически лица в специализирани лаборатории по молекулярна биология.

Отрицателните контроли (за екстракция на ДНК и за PCR процедури) винаги трябва да се обработват като окончателни проби в процедурата, за да стане ясно дали е настъпило пренасяне на ДНК.

В PCR теста трябва да се включат следните контроли:

Включват се задължително следните положителни контроли:

За да се избегне потенциално заразяване, положителните контроли се изготвят отделно от пробите за тестване.

Екстрактите от проби трябва по възможност да нямат замърсяване с почва. Затова в някои случаи се препоръчва да се изготвят екстракти от измити картофи, когато ще се използват PCR протоколи.

Стандартизираните положителни и отрицателни контролни материали, които могат да се използват с този тест, са изброени в допълнение 3.

6.1.   Методи за очистване на ДНК

Използват се описаните по-горе положителни и отрицателни контролни проби (виж допълнение 3).

Контролният материал се тества по същия начин като пробата/пробите.

Съществуват голям брой методи за очистване на целева ДНК от сложни пробни субстрати, като се отстраняват инхибиторите на PCR и други ензимни реакции и се концентрира целева ДНК в екстракта от пробата. За използване с валидираните PCR методи, дадени в допълнение 6, е оптимизиран следният метод.

а)   Метод на Пастрик (2000)

б)   Други методи

Могат да се използват и други методи за екстракция на ДНК например Qiagen DNeasy Plant Kit, при условие че са доказали, че са еднакво ефективни при очистване на ДНК от контролни проби, съдържащи от 103 до 104 патогенни клетки на μl.

6.2.   PCR

6.2.1.

Изготвят се тестателни и контролни темплети за PCR в съответствие с валидираните протоколи (раздел VI, точкаА, точка 6). Изготвя се едно десетично разреждане на пробен ДНК екстракт (1:10 в UPW).

6.2.2.

Изготвя се подходящ микс за PCR реакция в среда без заразяване в съответствие с публикуваните протоколи (допълнение 6). При възможност се препоръчва де се използва съставен PCR протокол, който включва и вътрешна PCR контрола.

6.2.3.

Добавят се 2—5 μl ДНК екстракт на 25 μl PCR реакция в стерилни PCR епруветки в съответствие с PCR протоколите (виж допълнение 6).

6.2.4.

Включете отрицателна контролна проба, съдържаща само микс за PCR реакция, и добавете същият източник на UPW, който е използван в PCR сместа вместо пробата.

6.2.5.

Епруветките се поставят в същото термоциклично устройство, което е използвано при предварителното тестване и се изпълнява подходящо оптимизирана PCR програма (допълнение 6).

6.3.   Анализ на PCR продукт

6.3.1.

PCR ампликоните се разделят чрез агарозна гел електрофореза. Пуска се поне 12 μl амплифициран микс за ДНК реакция от всяка проба, смесена с 3 μl пълнителен буфер (допълнение 6) в 2,0 % (w/v) агарозни гелове в трис-ацетат-EDTA (TAE) буфер (допълнение 6) при 5—8 V за cm. Използва се подходящ ДНК маркер например 100 bp ladder (набор от ДНК фрагменти с фиксирана дължина).

6.3.2.

Разкриват се ДНК веригите чрез оцветяване в етидиев бромид (0,5 mg на l) за 30 до 60 минути като се вземат необходимите предпазни мерки за работа с този мутаген.

6.3.3.

Наблюдава се оцветеният гел при късовълнова UV трансилюминация (λ = 302 nm) за амплифицирани PCR продукти с очаквания размер (допълнение 6) и се документира.

6.3.4.

За всички нови констатации/случаи се прави проверка на автентичността на PCR ампликона чрез извършване на ограничителен ензимен анализ върху проба от останалата амплифицирана ДНК, като се инкубира при оптимална температура и време с подходящ ензим и буфер (виж допълнение 6). Стабилизираните фрагменти се отделят чрез агарозна гел електрофореза, както е описано по-горе, и се следи за поява на характерно рестрикционно фрагментиране при UV трансилюминация след оцветяване с етидиев бромид и се сравнява с нестабилизираната и стабилизираната положителна контрола.

Интерпретиране на резултатите от PCR тест:

PCR тестът е отрицателен, ако за въпросната проба не е установен R. Solanacearum специфичен ампликон с очакван размер, но е установен за всички положителни контролни проби (в случай на съставна PCR със специфични за растението вътрешни контролни праймери: втори PCR продукт с очакван размер трябва да се амплифицира с въпросната проба).

PCR тестът е положителен, ако е установен R. Solanacearum специфичен PCR ампликон с очакван размер и е установен ограничителен модел (при необходимост), при условие че той не е амплифициран от никоя отрицателна контролна проба. Надеждно потвърждаване на положителен резултат може също да се получи, като се повтори теста с втори набор от PCR праймери (допълнение 6).

Забележка: Може да има съмнение за инхибиране на PCR, ако очакваният ампликон е получен от положителната контролна проба, съдържаща R. Solanacearum във вода, но отрицателните резултати се получават от положителни контроли с R. Solanacearum в картофен екстракт. В съставните PCR протоколи с вътрешни PCR контроли инхибиране на реакцията се отбелязва, когато не е получен нито един от двата ампликона.

Може да има съмнение за заразяване, ако очакваният ампликон е получен от една или няколко отрицателни контроли.

7.   FISH тест

Принцип

Когато FISH тест се използва като първи скринингов тест и резултатите от него са положителни, трябва да се направи изолационен или IF тест като втори задължителен скринингов тест. Когато FISH тест се използва като втори скринингов тест и резултатите от него са положителни, трябва да се направи допълнително тестване в съответствие със схемата, за да завърши диагностицирането.

Забележка: Използват се валидирани специфични за R. solanacearum олигопроби. Предварителното тестване с помощта на този метод трябва да позволява възпроизводимо откриване на 103 до 104 клетки на R. solanacearum на ml, добавени към екстракти от проби, които са дали отрицателни резултати при предишно тестване.

Следната процедура се препоръчва да се извърши с прясно приготвен екстракт от проби, но може успешно да се извърши с екстракт от проби, съхраняван в глицерин при температура от –16 до –24 °С и от –68 до –86 °С.

За отрицателни контроли се използват аликвоти на екстракт от проби, които са дали отрицателни резултати за R. solanacearum при предишни изследвания.

За положителни контроли се използват суспензии, съдържащи от 105 до 106 клетки на ml R. Solanacearum биовар 2 (например щам NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, виж допълнение 3) в 0,01М фосфатен буфер (РВ) от 3- до 5-дневна култура). Отделно се изготвят предметни стъкла с положителни контроли от хомоложния щам или друг референтен щам на R. Solanacearum, потопени в картофен екстракт, определени в допълнение 3, точка Б.

Използването на FITC-етикетирана еубактериална олигопроба предлага контрола за процеса на хибридизация, тъй като тя ще оцвети всички еубактерии, които се намират в пробата.

Стандартизираните положителни и отрицателни контролни материали, които могат да се използват с този тест, са изброени в допълнение 3, точка А.

Контролният материал се тества по същия начин като пробата/пробите.

7.1.   Фиксиране на картофен екстракт

Следващият протокол е на базата на Wullings et al. (1998):

7.1.1.

Изготвя се фиксиращ разтвор (виж допълнение 7).

7.1.2.

Отмерват се с пипета 100 μl от всеки екстракт в епруветка на Епендорф и се центрофугира за 7 минути при 7 000 g.

7.1.3.

Отстранява се изплувалата на повърхността част и пелетата се разтваря в 200 μl от фиксиращия разтвор, изготвен < 24 часа предварително. Разбърква се и се инкубира за един час в хладилник.

7.1.4.

Центрофугира се за 7 минути при 7 000 g, отстранява се изплувалата на повърхността част и пелетата се разтваря в 75 μl 0,01М РВ (виж допълнение 7).

7.1.5.

Капват се 16 μl от фиксиращата суспензия върху чисто предметно стъкло, предназначено за множество тестове, както е показано на фиг. 7.1. На всяко стъкло се слагат две различни проби, неразредени, и се използват 10 μl за разреждане 1:100 (в 0,01М РВ). Останалият разтвор от пробата (49 μl) може да се съхрани при –20 °С след добавяне на 1 обем 96 % етанол. Ако е необходимо да се повтори FISH тестът, етанолът се отстранява чрез центрофугиране и се добавя равен обем 0,01 РВ (размесен чрез разбъркване).

7.1.6.

Предметните стъкла се изсушават на въздух (или в сушилня за предметните стъкла при 37 °С) и се фиксират на пламък. На този етап процедурата може да се прекъсне и да се продължи с хибридизацията на другия ден. Предметните стъкла се съхраняват обезпрашени и сухи на стайна температура.

7.2.   Хибридизация

7.2.1.

Клетките се дехидрират, като всяко предметно стъкло се поставя за 1 минута в етанолова серия с нарастващ процент —50 %, 80 % и 96 %. Предметните стъкла се изсушават на въздух, поставени в държател.

7.2.2.

Приготвя се влажна инкубационна камера, като дъното на херметизирана кутия се покрива със салфетка или филтърна хартия, напоена с 1x hybmix (допълнение 7). Кутията се инкубира предварително в хибридизационна пещ.

7.2.3.

Разпределят се 10 μl от хибридизационния разтвор (допълнение 7) в 8 прозореца (прозорци 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 и 10; виж фиг. 7.1) върху всяко предметно стъкло, като двата централни прозореца (3 и 8) се оставят празни.

7.2.4.

Върху първите и последните четири прозореца се поставят покривни стъкла (24 × 24 mm) без изпускане на въздуха. Предметните стъкла се поставят в предварително затоплената влажна камера и се хибридизират за пет часа в пещта при 45 °С на тъмно.

7.2.5.

Изготвят се три химични чаши, съдържащи 1 l Milli Q (молекулярна степен), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix и 666 ml Milli Q вода) и 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix и 958 ml Milli Q вода). Всяка чаша предварително се инкубира във водна баня при 45 °С.

7.2.6.

Отстраняват се покривните стъкла от предметните стъкла и последните се поставят в държател.

7.2.7.

Отмива се излишната проба чрез инкубиране за 15 минути в химичната чаша с 1x hybmix при 45 °С.

7.2.8.

Държателят се поставя в 1/8 hybmix миещ разтвор и се инкубира за още 15 минути.

7.2.9.

Предметните стъкла се потапят за кратко време в Milli Q вода и се поставят върху филтърна хартия. Отстранява се излишната вода чрез внимателно покриване на повърхността с филтърна хартия. Отмерват се с пипета 5—10 ml предпазващ от обезцветяване клей (например Vectashield, Vecta Laboratories, Калифорния, САЩ или равностоен) и върху цялото предметно стъкло се поставя голямо покривно стъкло (24 × 60 mm).

7.3.   Отчитане на резултатите от FISH тест

7.3.1.

Предметните стъкла незабавно се подлагат на наблюдение с микроскоп, пригоден за епифлуоресцентна микроскопия с увеличение от 630 или 1 000 с маслено потапяне. С филтър, подходящ за флуоресцентен изоцианат (FITC), еубактериалните клетки (включително и повечето грам отрицателни клетки) в пробата се оцветяват в флуоресцентно зелено. При използването на филтър за тетраметилродамин-5-изотиоцианат Су3-оцветените клетки на R. Solanacearum изглеждат оцветени в флуоресциращо червено. Сравнява се морфологията на клетките с тази на положителните контроли. Клетките трябва да са светли, флуоресциращи и напълно оцветени. Ако оцветяването е нетипично, FISH тестът (раздел VI, точка А, точка 7) трябва да се повтори. Прозорците се сканират по дължината на двата диаметъра под прав ъгъл и по периметъра. За пробите, които не показват никакви клетки или малък брой клетки, се наблюдават поне 40 микроскопски полета.

7.3.2.

Тестовите прозорци на тестовите предметни стъкла се наблюдават за светли флуоресциращи клетки с характерната морфология на R. solanacearum (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Интензитетът на флуоресценцията трябва да е равен или по-силен. Клетките с непълно оцветяване или със слаба флуоресценция не се зачитат.

7.3.3.

При съмнение за заразяване тестът трябва да се повтори. Това става, когато всички предметни стъкла в партидата показват положителни клетки поради заразяване на буфера или ако се открият положителни клетки (извън прозорците на предметните стъкла) върху покритието на предметните стъкла.

7.3.4.

Няколко проблема са присъщи за спецификата на FISH теста. В пелетите от картофена сърцевина откъм надебеления край и сегменти от стеблото могат да се появят фонови популации от флуоресциращи клетки с атипична морфология и сапрофитни бактерии с кръстосано действие, чиито размер и морфология са сходни до тези на R. solanacearum.

7.3.5.

Разглеждат се само флуоресциращите клетки с типичен размер и морфология.

7.3.6.

Интерпретиране на резултата от FISH тест: i) Валидни резултати от FISH тест се получават, когато се наблюдават яркозелени флуоресциращите клетки с размер и морфология, типични за R. Solanacearum, когато се използва FITC филтър, и яркочервени флуоресциращите клетки, когато се използва родаминов филтър, във всички положителни контроли и нито в една отрицателна контрола. При откриване на светли флуоресциращи клетки с характерна морфология се определя средният брой на типични клетки за микроскопско поле и се изчислява броят на типичните клетки за ml повторно суспендирана пелета (допълнение 4). Пробите с поне 5 × 103 типични клетки за ml повторно суспендирана пелета се считат за потенциално заразени. Налага се допълнително тестване. Пробите с по-малко от 5 × 103 типични клетки за ml повторно суспендирана пелета се считат за отрицателни. ii) FISH тестът е отрицателен, не се наблюдават яркочервени флуоресциращи клетки с размер и морфология, типични за R. Solanacearum, когато се използва родаминов филтър, при условие че се наблюдават типични яркочервени флуоресциращите клетки в положителните контролни препарати, когато се използва родаминов филтър.

8.   Елайза тестове

Принцип

Поради сравнително ниската чувствителност на Елайза този тест може да се използва само като незадължителен допълнителен тест към IF, PCR и FISH. Когато се използва DAS Елайза, задължително се прави обогатяване и се използват моноклонални антитела (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Обогатяването на пробите преди да се използва Елайза може да е полезно като начин за увеличаване на чувствителността на теста, но може да се провали поради конкуриране от страна на други организми в пробата.

Забележка: Използва се валидиран източник на антитела на R. solanacearum (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Препоръчва се за всяка нова партида антитела да се определи титърът. Титър е най-високото разреждане, при което се осъществява оптимална реакция при тестването на суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки на ml от хомоложния щам на R. solanacearum, като се използват подходящи конюгатни съединение на вторични антитела в съответствие с указанията на производителя. По време на тестването антителата трябва да се използват при работно разреждане, близко до или равно на титъра на търговската рецептура.

Определя се титърът на антителата върху суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки на ml от хомоложния щам на R. solanacearum.

Включва се екстракт от проби, които са дали отрицателен резултат за R. solanacearum при предишно тестване, и суспензия на бактерия без кръстосано действие във фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS) като отрицателни контроли.

Като положителни контроли се използват аликвоти от екстракт от проби, които при предходно тестване са дали отрицателни резултати, смесени с 103 до 104 клетки на ml R. Solanacearum биовар 2 (например щам NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, виж допълнение 2, точки А и Б). За сравняване на резултатите във всяка петра се използва стандартна суспензия, съдържаща 105 до 106 клетки на ml в PBS на R. Solanacearum. Осигурява се отделяне на положителните контроли върху микротитърната петра от пробата/пробите за тестване.

Стандартизираните положителни и отрицателни контролни материали, които могат да се използват с този тест, са изброени в допълнение 3, точка А.

Контролният материал се тества по същия начин както пробата/пробите.

Потвърдени са два Елайза протокола.

а)   Индиректен Елайза (Robinson Smith et al., 1995)

б)   DASI Елайза

Интерпретиране на резултатите от Елайза тест:

Елайза тест е отрицателен, ако отчитането на средната оптична плътност (OD) от дубликатни пробни гнезда е < 2x OD от това в контролното гнездо с екстракт от отрицателна проба, при условие че всички оптичните плътности за положителните контроли са над 1,0 (след 90 минути инкубация със субстрата) и са по-големи от два пъти OD, получено за екстрактите от отрицателните проби.

Елайза тест е положителен, ако отчитанията на средната оптична плътност (OD) от дубликатни пробни гнезда е >2x OD в екстракта от отрицателната проба при категоричното условие, че отчитанията на средната оптична плътност във всички отрицателни контролни гнезда са < 2х отчитанията в положителните контролни гнезда.

Отрицателни отчитания от Елайза в положителните контролни гнезда означава, че тестът не е проведен правилно или е бил инхибиран. Положителни отчитания от Елайза в отрицателни контролни гнезда означава, че е настъпило кръстосано заразяване или неспецифично свързване на антитела.

9.   Тестване на биологична проба

Забележка: Предварителното тестване с този метод трябва да дава възможност за възпроизводимо откриване на 103 до 104 единици, образуващи колонии, на R. Solanacearum на ml, добавени към екстракти от проби, които са дали отрицателен резултат при предишно тестване (за приготвянето виж допълнение 3).

Най-висока чувствителност на откриване чрез този метод може да се очаква, когато се използват прясно приготвени екстракти от проби и оптимални условия за растеж. Но методът може да се прилага успешно и към екстракти, които са били съхранявани в глицерин при температура от –68 до –86 °С.

Протоколът по-долу е на базата на Janse (1988)

9.1.

Използват се 10 тестови растения от възприемчив доматен култивар (например Moneymaker или култивар със сходна възприемчивост, определена от тестващата лаборатория) във фаза трети същински лист за всяка проба. За подробна информация по отношение на културите виж допълнение 8. Могат също да се използват сини домати (например култивар Black Beauty или култивари със сходна възприемчивост), като се използват само растения във втора или трета фаза до пълно разгръщане на трети същински лист. Симптомите се проявяват по-слабо и се развиват по-бавно при синия домат. Затова се препоръчва при възможност да се използва доматен разсад.

9.2.

Разпределят се 100 μl екстракт от проби между тестовите растения. 9.2.1.   Инокулация със спринцовка Инокулират се стеблата на растенията точно над котиледоните, като се използва спринцовка с хиподермична игла (най-малко 23G). Пробата се разпределя между тестателните растения. 9.2.2.   Инокулация чрез разрез Растението се държи с два пръста и с пипета се отмерва капка (приблизително 5—10 μl) от суспендираната пелета върху стеблото между котиледоните и първи същински лист. С помощта на стерилен скалпел се прави диагонален разрез с дължина около 1,0 cm на дълбочина приблизително 2/3 от дебелината на стеблото, като се започва от капката. Разрезът се запечатва със стерилен вазелин от спринцовка.

9.3.

С помощта на същата техника се инокулират пет растения с водна суспензия, съдържаща от 105 до 106 клетки на ml, изготвена от 48-часова култура на вирулентен биовар 2 щам на R. Solanacearum, като положителна контрола, и с пелетен буфер (допълнение 4), като отрицателна контрола. Положителните и отрицателните контролни растения се отделят от другите растения, за да се избегне кръстосано заразяване.

9.4.

Тестовите растения се отглеждат се при карантинни условия за период до четири седмици при 25—30 °С и висока относителна влажност с подходящо напояване, за да се избегне прекомерното поливане или увяхване поради недостиг на вода. За да се избегне заразяването на растенията, инкубирането им за положителна и отрицателна контрола става на отделни стендове в оранжерия или камера за нарастване или, ако пространството е ограничено, се осигурява стриктно разделяне при третирането им. Ако растения, предназначени за различни проби, трябва да се инкубират близо едни до други те се отделят с подходящи екрани. При торене, напояване, инспектиране и други манипулации се полагат специални грижи, за да не се допусне кръстосано заразяване. От съществено значение е в оранжериите и камерите за нарастване да не се допуснат никакви насекоми вредители, тъй като те могат да пренесат бактерията от проба на проба. Наблюдава се за симптоми на увяхване, епинастия, хлороза и/или закърняване.

9.5.	Изолират се от инфектираните растения (раздел II, точка 3) и се идентифицират културите без предполагаемо заразяване с R. Solanacearum (раздел VI, точка Б).

9.6.	Ако след три седмици не се наблюдават никакви симптоми, се извършва IF тест, PCR тест или изолационен тест на съставна проба от части от стеблото с дължина 1 cm от всички тестателни растения, взети над мястото на инокулация. Ако тестът е положителен, се прави разреждане в петра (точка 4.1).

9.7.

Идентифицират се всички растения без предполагаемо заразяване с R. Solanacearum (раздел VI, точка Б). Валидни резултати от тестването на биологична проба се получават, когато растенията от положителната контрола показват типични симптоми, от тези растения може повторно да се изолира бактерията и по отрицателните контроли не са установени никакви симптоми. Тестването на биологична проба е отрицателно, ако тестовите растения не са заразени с R. Solanacearum и при условие че R. Solanacearum е открита в положителните контроли. Тестването на биологична проба е положително, ако тестателните растения са заразени с R. Solanacearum.

Б.   ТЕСТОВЕ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ

Определят се чисти култури на предполагаеми изолати на R. Solanacearum, като се използват най-малко два от дадените по-долу тестове на основата на различни биологични принципи.

За всеки извършен тест се включват познати референтни щамове в зависимост от случая (виж допълнение 3).

1.   Хранителни и ензимни тестове за определяне

Определят се следните фенотипни свойства, които универсално присъстват или отсъстват в R. Solanacearum, в съответствие с методите на Lelliott и Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001).

2.   IF тест

2.1.	Приготвя се суспензия с приблизително 106 клетки на ml в IF буфер (допълнение 4).

2.2.	Приготвя се серия с двойно разреждане на подходящ антисерум (виж интернет страница http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3.	Прилага се IF процедура (раздел VI, точка А, точка5).

2.4.	Постигнат е положителен IF тест, ако IF титърът на културата е еквивалентен на IF титъра на положителната контрола.

3.   Елайза тест

Забележка: Ако се изпълняват само 2 теста за определяне, не се използва друг серологичен тест в допълнение на този метод.

3.1.	Приготвя се суспензия с приблизително 108 клетки на ml в IX PBS (допълнение 4).

3.2.	Прилага се подходяща Елайза процедура със специфично моноклонално антитяло към R. Solanacearum.

3.3.	Постигнат е положителен Елайза тест, ако Елайза отчитането, получено от културата, е не по-малко от половината от това, получено от положителната контрола.

4.   PCR тестове

4.1.	Приготвя се суспензия с приблизително 106 клетки на ml в молекулна стерилна вода.

4.2.	Загряват се 100 μl от клетъчната суспензия в затворени епруветки в подгряващ блок или вряща водна баня при 100 °С за четири минути. След това пробите може да се съхраняват при –16 до –24 °С, докато станат необходими.

4.3.	Прилагат се подходящи PCR процедури за амплификация на специфичните за R. Solanacearum ампликони (например Seal et al. (1993); Pastrik и Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).

4.4.	Постигнато е положително определяне на R. Solanacearum, ако PCR ампликоните имат същия размер и имат същите полиморфизми по дължината на рестрикционните фрагменти като за положителния контролен щам.

5.   FISH тест

5.1.	Изготвя се суспензия с приблизително 106 клетки на ml в UPW.

5.2.	Прилага се FISH процедура (раздел VI, точка А, точка 7) с най-малко две специфични за R. Solanacearum олигопроби (допълнение 7).

5.3.	Постигнат е положителен FISH тест, ако са получени едни и същи резултати от културата и от положителната контрола.

6.   Профилиране на мастни киселини (FAP)

6.1.	Културата се отглежда върху типичен соев агар (Oxoid) за 48 часа при 28 °С.

6.2.	Прилага се подходяща FAP процедура (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3.	Постигнат е положителен FAP тест, ако профилът на предполагаемата култура е идентичен с този на положителната контрола. 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH и 18:1 2OH означава наличие на характерни мастни киселини, а отсъствие на 16:0 3OH в голяма степен е показателно за Ralstonia sp.

7.   Методи за характеризиране на щамове

Препоръчва се един от следните методи за характеризиране на щамове за всеки нов случай на изолиране на R. Solanacearum.

За всеки направен тест се включват познати референтни щамове (виж допълнение 3).

7.1.   Определяне на биовар

R. Solanacearum е разделена на биовари въз основа на способността за утилизиране и/или окисляване на три дизахариди и три хексоза алкохоли (Hayward, 1964 и Hayward et al., 1990). В допълнение 2 е дадено описание на растежна среда за тест на биовари. Тестът може да се извърши успешно като средите се инокулират чрез пробождане с чисти култури на изолати на R. Solanacearum и се инкубират при 28 °С. Ако средите се разпределят в стерилни петри за клетъчни култури с 96 гнезда (200 μ на гнездо) може да се наблюдава промяна в цвета от маслиновозелено в жълто в рамките на 72 часа, което означава положителен резултат от теста.

Допълнителните тестове разграничават биовар 2 подфенотипове

7.2.   Геномен фингърпринтинг

Молекулната диференциация на щамовете в R. Solanacearum комплекс може да се постигне, като се използват няколко техники, както следва:

7.2.1.

Анализ на полиморфизмите по дължината на рестрикционните фрагменти (RELP анализ) (Cook et al., 1989).

7.2.2.

PCR с повтаряща се последователност, използваща REP, BOX и ERIC праймери (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995).

7.2.3.

Анализ на полиморфизмите по дължината на амплифицираните фрагменти (AFLP анализ) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3.   PCR методи

Специфичните PCR праймери могат да се използват за диференциация на щамове от дивизия 1 (биовари 3, 4 и 5) и дивизия 2 (биовари 1, 2A и 2T) на R. solanacearum, първоначално определени чрез RFLP анализ (Cook et al., 1989) и 16S rDNA sequencing (Taghavi et al., 1996).

В.   ТЕСТ ЗА ПОТВЪРЖДАВАНЕ

Тестът за патогенност трябва да се направи като окончателно потвърждаване на диагностициране на R. solanacearum и за оценка на вирулентността на култури, идентифицирани като R. solanacearum.

---

Допълнение 1

Лаборатории, които участват в оптимизирането и валидирането на протоколите

---

Допълнение 2

Среда за изолиране и култивиране на R. solanacearum

а)   Обща растежна среда

Хранителен агар (NA)

Разтварят се съставките и се стерилизират чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

Дрождов пептонов глюконен агар (YPGA)

Разтварят се съставките и се стерилизират чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

Захарозов пептонов агар (SPA)

Разтварят се съставките и се стерилизират чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

Тетразолиева среда на Келман

Разтварят се съставките и се стерилизират чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

Охлаждат се до 50 °С и се добавя капково-стерилизиран разтвор на 2,3,5-трифенил тетразолиев хлорид (Sigma) за получаване на окончателната концентрация от 50 mg на l.

б)   Потвърдена селективна растежна среда

SMSA среда (Englebrecht, 1994 с измененията в Elphinstone et al., 1996)

Разтварят се съставките и се стерилизират чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

Охлаждат се до 50 °С и се добавят капково-стерилизирани водни основни разтвори на следните съставки за получаване на определените крайни концентрации:

Забележка:

Средите и основните разтвори на антибиотиците се съхраняват при 4 °С на тъмно и се използват в срок от един месец.

Преди използване по повърхността на петрите не трябва да има кондензация.

Избягва се прекомерно изсушаване на петрите.

Контрол върху качеството трябва да се осъществява след изготвянето на всяка нова партида от среда, като се прави посяване в петра на суспензия от референтна култура на R. Solanacearum (виж допълнение 3) и се наблюдава формирането на типични колонии след инкубиране при 28 °С за два до пет дни.

в)   Потвърдена обогатителна среда

SMSA Broth (Elphinstone et al., 1996)

Изготвя се като за SMSA селективна агарна среда, но се изключват бакто-агар и 2,3,5-трифенил тетразолиев хлорид.

Модифицирана хранителна среда на Вилбринк (Caruso et al., 2002)

Стерилизират чрез автоклав при 121 °С за 15 минути и се охлажда до 50 °С.

Добавят се основните антибиотични разтвори като при SMSA хранителна среда.

---

Допълнение 3

А.   Стандартизиран контролен материал с търговско предназначение

а)   Бактериални изолати

Препоръчва се използването на следните бактериални изолати като стандартен референтен материал или като положителни контроли (таблица 1), или по време на оптимизация на тестовете за избягване на кръстосани реакции (таблица 2). Всички щамове могат да се закупят от:

Забележка: Автентичността на щамовете, дадени по-горе, е гарантирана само ако са получени от автентична култивирана колекция.

б)   Стандартизиран контролен материал с търговско предназначение

Следният стандартен контролен материал може да се достави от колекцията от култури на NCPPB.

Замразена изсушена пелета от картофен екстракт от 200 здрави картофени клубена като отрицателна контрола за всички тестове.

Замразена изсушена пелета от картофен екстракт от 200 здрави картофени клубена, съдържащи от 103 до 104 и от 104 до 106 клетки на R. solanacearum биовар 2 (щам NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) като положителни контроли за серологични и PCR тестове. Тъй като замразяването и изсушаването се отразяват на жизнеспособността, те не са подходящи за стандартни контроли за изолационни тестове и тествания на биологична проба.

Фиксирани с формалин суспензии на R. solanacearum биовар 2 (щам NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) с 106 клетки на ml като положителни контроли за серологични тестове.

Б.   Изготвяне на положителни и отрицателни контроли за основните скринингови тестове PCR/IF и FISH

Произвежда се 48-часова култура на вирулентен щам на R. Solanacearum род 3/биовар 2 (например щам NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) върху основна SMSA среда и се суспендира в 10 mM фосфатен буфер за получаването на гъстота на клетките приблизително 2 × 108 cfu на ml. Това обикновено се получава с леко замътнена суспензия, еквивалентна на оптична плътност от 0,15 при 600 nm.

Отстраняват се сърцевините при надебеления край на 200 клубени от произведен сорт с бяла кора, за който се знае, че не е заразен с R. Solanacearum.

Надебелените краища на клубените се обработват по обичайния начин и пелетата се суспендира повторно в 10 ml.

Изготвят се 10 стерилни 1,5 ml микровиали с 900 μl от повторно суспендираната пелета.

Прехвърлят се 100 μl от суспензията на R. Solanacearum в първия микровиал. Разбърква се.

Определят се десетичните нива на заразяване чрез продължаване на разреждането в следващите пет микровиала.

Шестте заразени микровиала се използват като положителни контроли. Четирите незаразени микровиала се използват като отрицателни контроли. Микровиалите се етикетират съответстващо.

Изготвят се аликвоти от 100 μl в стерилни 1,5 ml микровиали и така се получават девет точни копия на всяка контролна проба. Съхраняват се при –16 до –24 °С до използването им.

Наличието и количественото определяне на R. Solanacearum в контролните проби трябва да се потвърди най-напред с IF тест.

За PCR теста се прави екстракция на ДНК от положителни и отрицателни контролни проби при всяка серия проби за тестване.

За IF и FISH тестовете се правят изследвания върху положителни и отрицателни контролни проби при всяка серия проби за тестване.

За IF, FISH и PCR изследванията трябва да се установи наличие на R. Solanacearum в най-малко 106 и 104 клетки) ml на положителните контроли и в нито една от отрицателните контроли.

---

Допълнение 4

Буфери за тестови процедури

Обща разпоредба: Неотворените стерилизирани буфери могат да се съхраняват до една година.

1.   Буфери за екстракционна процедура

1.1.   Екстракционен буфер (50 mM фосфатен буфер, pH 7,0)

Този буфер се използва за екстракция на бактерията от растителни тъкани чрез хомогенизиране или разклащане.

Разтварят се съставките, проверява се pH и се стерилизира чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

Могат да бъдат полезни и следните допълнителни компоненти:

1.2.   Пелетен буфер (50 mM фосфатен буфер, pH 7,2)

Този буфер се използва за повторно суспендиране и разреждане на екстракти от сърцевина при надебелената част на картофени клубени след концентрацията им в пелети чрез центрофугиране.

Разтварят се съставките, проверява се pH и се стерилизира чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

2.   Буфери за IF тест

2.1.   IF-буфер (10 mM фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS), pH 7,2)

Този буфер се използва за разреждане на антитела.

Разтварят се съставките, проверява се pH и се стерилизира чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

2.2.   IF-буфер-Tween

Този буфер се използва за измиване на предметни стъкла.

Добавя се 0,1 % Tween 20 към IF буфера.

2.3.   Фосфатен буферен глицерин, pH 7,6

Буферът е флуидно вещество върху прозорците на предметни стъкла за IF тест.

Предпазващи от обезцветяване разтвори могат да се закупят например от Vectashield® (Vector Laboratories) или Citifluor® (Leica).

3.   Буфери за индиректен Елайза тест

3.1.   Покривен буфер с двойна сила, pH 9,6

Разтварят се съставките, проверява се pH и се стерилизира чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

Може да се добави натриев сулфит (0,2 %) като антиоксидант, ако е необходимо да се предотврати изграждането на окислени ароматни съединения.

3.2.   10Х Фосфатен буферен физиологичен разтвор, pH 7,4

3.3.   PBS-Tween

3.4.   Блокиращ (антитела) буфер (трябва да е прясно приготвен)

3.5.   Алкален фосфатен субстратен разтвор, pH 9,8

Размесва се и се регулира до pH 9,8 с концентрирана HCl.

Допълва се до 1 l с дестилирана вода.

Добавя се 0,2 g MgCl2.

Разтварят се 2 фосфатазни субстратни 5 mg таблети (Sigma) на 15 ml разтвор.

4.   Буфери за DASI Елайза тест

4.1.   Покривен буфер, pH 9,6

Разтварят се съставките и се проверява pH 9,6.

4.2.   10Х Фосфатен физиологичен буфер (PBS) pH от 7,2 до 7,4

4.3.   PBS-Tween

4.4.   Субстратен буфер, pH 9,8

Размесва се и се регулира до pH 9,8 с концентрирана HCl.

---

Допълнение 5

Определяне на нивото на заразяване в IF и FISH тестове

---

Допълнение 6

Потвърдени PCR протоколи и реагенти

NB: Предварителното тестване трябва да позволява възпроизводимо откриване на 103 до 104 клетки на R. Solanacearum на ml екстракт от проба.

Предварителното тестване не трябва да показва никакви фалшиви положителни резултати за панел от избрани бактериални щамове (виж допълнение 3).

1.   PCR протокол на Seal et al. (1993)

1.1.   Олигонуклеотидни праймери

Очакван размер на апликон от R. Solanacearum матрична ДНК = 288 bp

1.2.   Микс за PCR реакция

1.3.   Условия за PCR реакция

Провеждат се следните програми:

NB: Тази програма е оптимизирана за използване с термоциклично устройство Perkin Elmer 9600. При използване с други модели може да е необходима модификация на продължителността на стъпки ii), iii) и iv).

1.4.   Анализ на ампликоните по отношение на рестрикционните ензими

PCR продуктите, амплифицирани от ДНК на R. Solanacearum, произвеждат ясно изразен полиморфизъм по дължината на рестрикционните фрагменти с ензим Ava II след инкубиране при 37 °С.

2.   PCR протокол на Pastrik и Maiss (2000)

2.1.   Олигонуклеотидни праймери

Очакван размер на апликон от R. Solanacearum матрична ДНК = 553 bp

2.2.   Микс за PCR реакция

2.3.   Условия за PCR реакция

Провеждат се следните програми:

NB: Тази програма е оптимизирана за използване с термоциклично устройство MJ Research PTC 200. При използване с други модели може да е необходима модификация на продължителността на стъпки ii), iii) и iv).

2.4.   Анализ на ампликоните по отношение на рестрикционните ензими

PCR продуктите, амплифицирани от ДНК на R. Solanacearum, произвеждат ясно изразен полиморфизъм по дължината на рестрикционните фрагменти с ензим Taq I след инкубиране при 65 °С за 30 минути. Рестрикционните фрагменти, получени от специфичен за R. Solanacearum фрагмент, са с размер 457 bp и 96 bp.

3.   Съставен PCR протокол с вътрешен PCR контрол (Pastrik et al., 2002)

3.1.   Олигонуклеотидни праймери

Очакван размер на апликон от R. Solanacearum матрична ДНК = 718 bp (набор RS-праймери)

Очакван размер на апликон от 18S rRNA вътрешен PCR контрол = 310 bp (набор NS-праймери)

3.2.   Микс за PCR реакция

3.3.   Условия за PCR реакция

Провеждат се следните програми:

NB: Тази програма е оптимизирана за използване с термоциклично устройство MJ Research PTC 200. При използване с други модели може да е необходима модификация на продължителността на стъпки ii), iii) и iv).

3.4.   Анализ на ампликоните по отношение на рестрикционните ензими.

PCR продуктите, амплифицирани от ДНК на R. Solanacearum, произвеждат ясно изразен полиморфизъм по дължината на рестрикционните фрагменти с ензим Bsm I или с изосхизомер (например Mva 12691) след инкубиране при 65 °С за 30 минути.

4.   PCR протокол, специфичен за R. Solanacearum биовар (Pastrik et al., 2001)

4.1.   Олигонуклеотидни праймери

Очакван размер на апликон от R. Solanacearum матрична ДНК:

.

4.2.   Микс за PCR реакция

4.3.   Условия за PCR реакция

Провеждат се следните програми за специфичните реакции за биовар 1/2 и биовар 3/4/5

NB: Тази програма е оптимизирана за използване с термоциклично устройство MJ Research PTC 200. При използване с други модели може да е необходима модификация на продължителността на стъпки ii), iii) и iv).

4.4.   Анализ на ампликоните по отношение на рестрикционните ензими

PCR продуктите, амплифицирани от ДНК на R. Solanacearum, като се използват праймерите Rs-1-F и Rs-1-R, произвеждат ясно изразен полиморфизъм по дължината на рестрикционните фрагменти с ензим Bsm I или с изосхизомер (например Mva 1269 I) след инкубиране при 65 °С за 30 минути. PCR продуктите, амплифицирани от ДНК на R. Solanacearum, като се използват праймерите Rs-1-F и Rs-3-R, нямат рестрикционни местоположения.

5.   Приготвяне на зареждащия буфер

5.1.   Бромфенолово синьо (10 %-основен разтвор)

5.2.   Зареждащ буфер

6.   10Х Трис ацетатен EDTA (TAE) буфер, pH 8.0

Разрежда се до 1Х преди употреба.

Разпространява се в търговската мрежа (например инвитроген или негов еквивалент).

---

Допълнение 7

Потвърдени реагенти за FISH тест

1.   Олигопроби

Специфична за R. solanacearum проба OLI-1-CY3: 5′-ggc agg tag caa gct acc ccc-3′

Неспецифична еубактерна проба EUB-338-FITC: 5′-gct gcc tcc cgt agg agt-3′

2.   Фиксиращ разтвор

(ВНИМАНИЕ! ФИКСАТОРЪТ СЪДЪРЖА ПАРАФОРМАЛДЕХИД, КОЙТО Е ТОКСИЧЕН. ТРЯБВА ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ РЪКАВИЦИ, ДА НЕ СЕ ВДИШВА И ДА СЕ РАБОТИ В СМУКАТЕЛЕН ШКАФ ЗА ГАЗОВЕ.)

3.   3Х Хибмикс

Разрежда се до 1Х съгласно изискванията.

4.   Хибридизиращ разтвор

Приготвя се хибридизиращ разтвор в количества, които се определят съгласно таблица 1. За всяко предметно стъкло (съдържащо по два броя от 2 различни проби) е необходим 90 μl хибридизиращ разтвор. ВАЖНО: ФОРМАМИДЪТ Е МНОГО ТОКСИЧЕН И Е НЕОБХОДИМО ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ РЪКАВИЦИ И ДА СЕ ВЗЕМАТ НЕОБХОДИМИТЕ ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ!

5.   0,1 М фосфатен буфер, pH 7,0

Разтварят се съставките, проверява се pH и се стерилизира чрез автоклав при 121 °С за 15 минути.

---

Допълнение 8

Кондициониране на култури от син домат и домат

Посяват се семена на домат (Lycopersicon esculentum) или син домат (Solanum melongena) в пастьоризиран семенен компост. Разсадът с напълно развити котиледони (от 10 до 14 дни) се пресажда в пастьоризиран компост в съд.

Сините домати и доматите трябва да се отглеждат във оранжерия при следните условия на околната среда преди инокулация:

ИЗТОЧНИЦИ

---

ПРИЛОЖЕНИЕ III

---

ПРИЛОЖЕНИЕ IV

Елементите на разследването, посочено в член 5, параграф 1, буква а), i), в зависимост от случая, са както следва:

---

ПРИЛОЖЕНИЕ V

---

ПРИЛОЖЕНИЕ VI

---

ПРИЛОЖЕНИЕ VII

Официално одобрените методи за депониране на отпадъци, посочени в приложение IV, точка 1, съответстват на следните изисквания, които за всеки установен риск от предаване на вредителя премахват този риск:

Възможните варианти, описани в настоящото приложение, се прилагат и за отпадъците, свързани с обработката, депонирането и преработката на заразени партиди.

---

( 1 ) ОВ С 124, 21.4.1997 г., стр. 12, и

ОВ С 108, 7.4.1998 г., стр. 85.

( 2 ) ОВ С 14, 19.1.1998 г., стр. 34.

( 3 ) ОВ С 206, 7.7.1997 г., стр. 57.

( 4 ) ОВ L 26, 31.1.1977 г., стр. 20. Директива, последно изменена с Директива 98/2/ЕО на Комисията (ОВ L 15, 21.1.1998 г., стр. 34).

( 5 ) ОВ L 184, 3.8.1995 г., стр. 34. Директива, последно изменена с Директива 97/46/ЕО на Комисията (ОВ L 204, 31.7.1997 г., стр. 43).