1.

Указанията за изпитването на химикали на Организацията за икономическо сътрудничество и развитие (ОИСР) и основаните на тях методи на ЕС за изпитване периодично се преразглеждат във връзка с научния прогрес, промяната на регулаторните нужди и съображенията, свързани с хуманното отношение към животните. Първоначалният метод за изпитване (МИ) за определянето на кожна сенсибилизация при мишки — Изследването на локалните лимфни възли (LLNA; Указание за изпитване 429 на ОИСР; глава Б.42 от настоящото приложение) — беше приет по-рано (1). Публикувана е подробна информация за валидирането на LLNA и е направен преглед на съответните научни трудове (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Актуализираното LLNA се основава на оценката на опита и научните данни (12). Това е вторият МИ, предназначен за оценка на потенциала на химикалите (вещества и смеси) да предизвикват кожна сенсибилизация при животни. При другия МИ (т.е. Указание за изпитване 406 на ОИСР; глава Б.6 от настоящото приложение) се използват тестове върху морски свинчета, по-специално максимизиращ тест върху морски свинчета и тест на Buehler (13). LLNA има предимства в сравнение с Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР (13) по отношение на хуманното отношение към животните. Настоящият актуализиран метод за изпитване LLNA включва набор от стандарти за ефективност (СЕ) (допълнение 1), които могат да се използват за оценка на статуса на валидиране на нови и/или модифицирани методи за изпитване, които са функционално и по своя механизъм сходни с LLNA, в съответствие с принципите на Ръководство № 34 на ОИСР (14).

2.

При LLNA се проучва индукционната фаза на кожна сенсибилизация и се получават количествени данни, подходящи за оценяване на зависимостта доза—отговор. Следва да се отбележи, че слабите — умерени сенсибилизатори, които се препоръчват като подходящи положителни контролни химикали (ПК) при методите за изследване върху морски свинчета (т.е. Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13), са подходящи за използване и при LLNA (6) (8) (15). Подходът на ограничено изследване на локалните лимфни възли (rLLNA), при който биха могли да се използват до 40 % по-малко животни, също е описан като възможност в настоящия МИ (16) (17) (18). Изследването rLLNA може да се използва, когато е налице регулаторна необходимост да се потвърди отрицателна прогноза за кожно-сенсибилизиращ потенциал, при условие че се спазват всички други протоколни спецификации за LLNA, описани в настоящия МИ. Прогнозата за отрицателен резултат следва да бъде направена въз основа на цялата налична информация, както е описано в точка 4. Преди прилагането на подхода rLLNA следва да се посочат ясни основания и научна обосновка за неговото използване. Ако въпреки очакванията при rLLNA се получи положителен или неясен резултат, може да е необходимо допълнително изпитване за тълкуване или изясняване на резултата. Изследването rLLNA не трябва да се използва за определянето на опасността от изпитвани вещества, предизвикващи кожна сенсибилизация, когато е необходима информация за зависимостта доза—отговор, като например при подкатегоризация за Регламент (ЕО) № 1272/2008 относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси и Глобалната хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) на Организацията на обединените нации (ООН).

3.

Определенията са дадени в допълнение 2.

4.

LLNA осигурява алтернативен метод за определяне на химикали, които са потенциални кожни сенсибилизатори. Това не означава непременно, че при всички случаи следва да се използва LLNA вместо тестове върху морски свинчета, (т.е. глава Б.6, Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13), а по-скоро че изпитването е равностойно и може да бъде използвано като алтернатива, при която обикновено положителните и отрицателните резултати не се нуждаят от допълнително потвърждаване. Лабораторията, провеждаща теста, следва да вземе предвид цялата налична информация за изпитваното вещество преди провеждането на теста. Тази информация следва да включва идентичността и химичната структура на изпитваното вещество; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vitro или in vivo токсикологични тестове на изпитваното вещество; и токсикологични данни за структурно подобни вещества. Тази информация следва да се вземе предвид, за да се определи дали LLNA е подходящо за веществото (с оглед на неприложимостта на LLNA по отношение на ограничен брой видове химикали — вж. точка 5) и като помощно средство при избора на доза.

5.

LLNA е in vivo метод и вследствие на това няма да доведе до преустановяване на използването на животни при оценяването на алергичната контактна сенсибилизираща активност. При все това този метод дава възможност да се намали броят на животните, изисквани за тази цел. Освен това LLNA предлага съществено подобрение (изразяващо се в намаление на болката и страданието) на начина, по който животните се използват за изпитване на алергичната контактна сенсибилизация. LLNA се основава на отчитането на имунологичните ефекти, стимулирани от химикалите по време на индукционната фаза на сенсибилизирането. За разлика от изследванията върху морски свинчета (т.е. глава Б.6, Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13), LLNA не изисква да се разкрие кожна свръхчувствителност след предизвикване. Освен това LLNA не изисква употребата на адювант, както в случаите на максимизиращото изследване върху морски свинчета (13). По такъв начин при използване на LLNA се намаляват болката и страданието на животните. Въпреки предимствата на LLNA пред Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР, следва да се признае, че съществуват определени ограничения, които могат да доведат до необходимост от използване на Б.6 или на Указание за изпитване 406 на ОИСР (13) (напр. фалшиво отрицателни резултати при LLNA по отношение на някои метали, фалшиво положителни резултати при определени кожни дразнители) [например някои видове повърхностноактивни химикали] (19) (20) или разтворимост на изпитваното вещество). Освен това химичните класове или вещества, съдържащи функционални групи, за които е доказано че водят до възможно объркване (21), могат да породят необходимост от използване на изследванията върху морски свинчета (т.е. Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР) (13). Също така, въз основа на ограничената валидационна база данни, която се състои предимно от пестицидни препарати, LLNA е по-вероятно да даде положителен резултат за тези видове изпитвани вещества в сравнение с изследването върху морски свинчета (22). При изпитването на препарати, обаче, следва да се обмисли включването на подобни вещества с известни резултати като еталонни вещества, за да се докаже правилното функциониране на LLNA (вж. точка 16). С изключение на тези установени ограничения, LLNA би следвало да е приложимо за изпитване на всички вещества, освен ако съществуват свързани с тези вещества свойства, които могат да повлияят на точността на LLNA.

6.

Основният принцип, залегнал в LLNA, е, че сенсибилизаторите предизвикват пролиферация на лимфоцитите в лимфните възли, дрениращи мястото на прилагане на изпитваното вещество. Тази пролиферация е пропорционална на дозата и на потенциала на приложения алерген и осигурява лесен начин за получаване на количествено измерване на сенсибилизацията. Пролиферацията се измерва чрез сравняване на средната пролиферация във всяка изпитвана група със средната пролиферация в третираната само с носителя контролна група (КН). Определя се съотношението на средната пролиферация във всяка третирана група спрямо тази в паралелната третирана само с носителя контролна група, наречено стимулационен индекс (SI), който следва да е ≥ 3, за да може изпитваното вещество да бъде класифицирано като потенциален кожен сенсибилизатор. Описаните тук процедури се основават на използването на радиоактивно маркиране in vivo за измерване на увеличения брой на пролифериращите клетки в дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли. От друга страна обаче, за оценка на броя на пролифериращите клетки могат да бъдат използвани други подходи, при условие че са спазени напълно изискванията за стандартите за ефективност (допълнение 1).

7.

Биологичният вид, избран за това изследване, е мишката. Използват се млади възрастни мишки от женски пол от порода СВА/Са или CBA/J, които не са раждали и не са бременни. В началото на изследването животните следва да бъдат на възраст 8—12 седмици и отклоненията в теглото им следва да бъдат минимални и да не превишават 20 % от средното тегло. Алтернативно могат да бъдат използвани животни от други породи и от мъжки пол, когато има достатъчно събрани данни, които доказват, че не съществуват съществени различия при реакцията при LLNA, обусловени от пола и/или породата.

8.

Мишките следва да бъдат групово отглеждани (23), освен ако е дадена подходяща научна обосновка за индивидуално отглеждане на мишките. Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 ± 3 °C. При все че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението следва да бъде изкуствено, с последователност 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни диети с неограничен достъп до вода за пиене.

9.

Животните се избират произволно, маркират се, за да е възможно индивидуалното им идентифициране (но не и чрез маркиране на ушите им) и се оставят в клетките им поне пет дни преди започване на дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия. Всички животни се изследват преди да започне третирането, за да се потвърди отсъствието на видими кожни лезии.

10.

Твърдите химикали следва да се разтворят или суспендират в разтворители/носители и ако е необходимо, да се разредят преди прилагането им върху ушите на мишките. Течните химикали могат да се прилагат в чист или разреден вид преди дозирането. Неразтворимите химикали като тези, които обикновено се наблюдават в медицинските изделия, следва да се подложат на засилена екстракция в подходящ разтворител, за да се проявят всички екстрахируеми съставки за изпитване преди прилагането им върху ушите на мишките. Изпитваните вещества следва да се приготвят ежедневно, освен ако данните за устойчивостта им показват, че те могат да се съхраняват.

11.

Използват се положителни контролни химикали (ПК) за доказване на подходящо провеждане на изследването чрез реагиране с достатъчна и възпроизводима чувствителност като сенсибилизиращо изпитвано вещество, за което степента на реакция е добре характеризирана. Препоръчва се включването на паралелна положителна контрола (ПК), защото тя доказва компетентността на лабораторията успешно да провежда всяко изследване и позволява оценка на вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост и сравнимост. Освен това някои регулаторни органи изискват положителна контрола за всяко изпитване и поради това е препоръчително ползвателите на метода да се консултират със съответните органи преди провеждането на LLNA. В съответствие с това се насърчава рутинното използване на паралелна положителна контрола, за да се избегне необходимостта от допълнително изследване върху животни за спазване на изисквания, които биха могли да възникнат при използването на периодична положителна контрола (вж. точка 12). Положителната контрола следва да предизвиква положителна реакция при LLNA при ниво на експозиция, при което се очаква нарастване на стимулационния индекс SI > 3 спрямо отрицателната контролна група (ОК). Дозата за ПК следва да бъде избрана така, че да не причинява прекомерно кожно дразнене или системна токсичност и индукцията да е възпроизводима, но не прекомерна (напр. SI > 20 би било прекомерно). Предпочитаните положителни контроли са 25 % хексилканелен алдехид (№ 101-86-0 съгласно химичния регистър на Службата за химични индекси — Chemical Abstracts Service [CAS]) в ацетон: зехтин (4:1, об./об.) и 5 % меркаптобензотиазол (CAS № 149-30-4) в N,N-диметилформамид (вж. допълнение 1, таблица 1). Може да има обстоятелства, при които след подходяща обосновка могат да бъдат използвани и други положителни контроли, отговарящи на горепосочените критерии.

12.

При все че е препоръчително постоянното включване на паралелна положителна контролна (ПК) група, могат да съществуват ситуации, при които прилагането на периодично изпитване (т.е. на интервали ≤ 6 месеца) на ПК може да е подходящо за лаборатории, които редовно провеждат LLNA (т.е. провеждат LLNA не по-малко от веднъж месечно) и имат създадена база данни от предишни изпитвания с ПК, доказваща способността на лабораторията да получава възпроизводими и точни резултати с положителните контроли. Подходящата компетентност за провеждане на LLNA може да бъде успешно доказана чрез получаването на последователни положителни резултати с ПК при най-малко 10 независими изпитвания, проведени в рамките на разумно продължителен период от време (т.е. по-малко от една година).

13.

Винаги следва да се включва паралелна ПК група, когато има процедурна промяна в LLNA (например промяна на обучения персонал, промяна на материалите и/или реагентите, с които се провежда методът за изпитване, промяна на оборудването, с което се провежда методът за изпитване, промяна в произхода на опитните животни), като тези промени следва да бъдат документирани в лабораторните доклади. Следва да се обърне внимание на въздействието на тези промени върху годността на предварително създадената база данни от предишни изпитвания с оглед да се определи необходимостта от създаване на нова база данни от предишни изпитвания за документиране на последователността на резултатите с ПК.

14.

Изследователите следва да са наясно, че решението за периодично провеждане на изпитване с положителна контрола вместо паралелното му провеждане има последици върху адекватността и приемливостта на отрицателните резултати от изпитването, получени без паралелна положителна контрола по време на интервала между всяко периодично изпитване с положителна контрола. Например, ако се получи погрешен отрицателен резултат при периодичното изпитване с положителна контрола, отрицателните резултати за изпитваното вещество, получени по време на интервала между последното приемливо периодично изпитване с положителна контрола и неприемливото периодично изпитване с положителна контрола, могат да бъдат поставени под съмнение. Изводите относно тези резултати следва внимателно да се проучат, когато се взема решение дали да се включват паралелни ПК или само да се провеждат периодични ПК. Следва да се проучи и възможността за използване на по-малко животни в паралелната ПК група, когато това е научно обосновано и ако лабораторията докаже, въз основа на конкретните за лабораторията данни от предишни изпитвания, че могат да бъдат използвани по-малко мишки (12).

15.

Въпреки че положителната контрола следва да бъде изпитвана с носителя, за който е известно, че при прилагането му се получава постоянна реакция (напр. ацетон: зехтин; 4:1, об./об.), може да има определени регулаторни ситуации, при които да е необходимо също провеждането на изпитване с нестандартен носител (клинично/химично отговаряща формулация) (24). Ако паралелната положителна контрола се изпитва с различен носител от изпитваното вещество, тогава следва да се включи отделна третирана само с носителя контролна група за паралелната положителна контрола.

16.

В случаи, при които се оценяват изпитвани вещества от определен химичен клас или спектър от реакции, от полза могат да бъдат и еталонните вещества, за да се докаже, че методът за изпитване функционира правилно по отношение на откриването на потенциала за кожна сенсибилизация на тези видове изпитвани вещества. Подходящите еталонни вещества следва да притежават следните свойства:

17.

Използват се минимум четири животни за подложена на дадена доза група, при минимум три концентрации на изпитваното вещество, плюс паралелна отрицателна контролна група (ОК), третирана само с носителя на изпитваното вещество, както и положителна контрола (паралелна или неотдавнашна въз основа на лабораторната политика като се вземат предвид точки 11—15). Следва да се разгледа възможността за изпитване на множество дози на положителната контрола, особено когато не се провеждат редовни изпитвания на ПК. Животните от контролните групи следва да бъдат отглеждани и третирани по начин, идентичен с този на животните от третираните групи, с изключение на това, че липсва третиране с изпитваното вещество.

18.

Изборът на доза и носител следва да се базира на препоръките, посочени в литературните източници (3) и (5). Последователните дози обикновено се избират от подходяща поредица от концентрации като например 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % и т.н. Изборът на използваната поредица от концентрации следва да бъде придружен от подходяща научна обосновка. В случаите когато има съответна информация, при избора на трите последователни концентрации следва да бъде взета предвид цялата съществуваща токсикологична информация (напр. остра токсичност и кожно дразнене) и информацията за структурните и физикохимичните свойства на представляващото интерес изпитвано вещество (и/или структурно свързаните вещества), така че най-високата концентрация да увеличава в максимална степен експозицията, като същевременно се избягва систематична токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене (3) (25). При липсата на такава информация може да е необходимо първоначално предварително скринингово изпитване (вж. точки 21—24).

19.

Носителят не следва да пречи или да оказва влияние на резултата от изпитването и следва да бъде избран въз основа на способността си максимално да повишава разтворимостта, за да се получи най-високата постижима концентрация, като същевременно се приготвя подходящ разтвор/суспензия за прилагане на изпитваното вещество. Препоръчителните носители са ацетон: зехтин (4:1, об./об.), N,N-диметилформамид, метилетилкетон, пропилен гликол и диметилсулфоксид (19), но могат да бъдат използвани и други, при условие че се предостави достатъчна научна обосновка. При определени ситуации може да бъде необходимо да се използват в качеството на допълнителна контрола клинично използван разтворител или търговски препарат, в състава на който изпитваното вещество се предлага на пазара. Следва да се положи специална грижа за да се осигури, че хидрофилните изпитвани вещества се влагат в среда от носители, която навлажнява кожата и не се стича веднага, чрез инкорпорирането на подходящи солюбилизатори (напр. 1 % плуроник — Pluronic® L92). Поради тази причина трябва да се избягват носителите на изцяло водна основа.

20.

Обработката на лимфни възли на отделни мишки дава възможност за оценка на вариабилността между животните и за статистическо сравнение на разликата между изпитваното вещество и измерванията в третираната с носителя контролна група (вж. точка 35). В допълнение към това е възможно оценяването на възможността за намаляване на броя на мишките в ПК група, когато са събрани индивидуални данни за отделните животни (12). Освен това някои регулаторни органи изискват събирането на индивидуални данни за отделните животни. Въпреки това сборните данни за животните могат да бъдат счетени за приемливи от някои регулаторни органи и в такива случаи ползвателите имат възможността да събират или индивидуални, или сборни данни за животните.

21.

При липса на информация за определянето на най-високата доза за изпитване (вж. точка 18) следва да се извърши предварително скринингово изпитване, за да се определи подходящото ниво на дозата за изпитване при LLNA. Целта на предварителното скринингово изпитване е да осигури данни за избор на максималното ниво на дозата, което да бъде използвано в основното изпитване LLNA в случаите, когато не е налична информация за концентрацията, причиняваща системна токсичност (вж. точка 24) и/или прекомерно локално кожно дразнене (вж. точка 23). Изпитваното максимално ниво на дозата следва да се състои от 100 % чисто изпитвано вещество (за течностите), или да е с максималната възможна концентрация (за твърдите вещества или суспензиите).

22.

Предварителното скринингово изпитване следва да се провежда при условия, идентични на тези в основното изпитване LLNA, с изключение на това, че не се оценява пролиферацията на лимфните възли и могат да се използват по-малко животни за подложена на определена доза група. Предлага се използването на едно или две животни за подложена на определена доза група. Всички мишки се наблюдават ежедневно за всякакви клинични признаци за системна токсичност или локално дразнене на мястото на прилагане. Телесните тегла се записват преди изпитването и преди завършването му (ден 6). И двете уши на всяка мишка се наблюдават за еритема и резултатите се отчитат, като се използва таблица 1 (25). Измерванията на дебелината на ушите се правят, като се използва измервателен уред за дебелина (напр. цифров микрометър или измервателен уред за дебелина Peacock Dial) в ден 1 (преди дозирането), ден 3 (приблизително 48 часа след първата доза) и ден 6. Освен това дебелината на ушите в ден 6 може да се определи чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части, което следва да се извърши след като животните бъдат умъртвени по хуманен начин. Показател за прекомерното локално кожно дразнене е балова оценка на еритемата ≥ 3 и/или увеличаване на дебелината на ушите в размер на ≥ 25 % в който и да било от дните с измервания (26) (27). Най-високата доза, избрана за основното изпитване LLNA, ще бъде следващата по-ниска доза от поредицата от концентрации в предварителното скринингово изпитване (вж. точка 18), която не причинява системна токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене.

Таблица 1

Оценки на еритемата

23.

В допълнение към увеличаването на дебелината на ушите с 25 % (26) (27), за идентифициране на дразнители при LLNA също така се използва статистически значимо увеличаване на дебелината на ушите при третираните мишки в сравнение с контролните мишки (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Въпреки това, макар че могат да възникнат статистически значими увеличения, когато дебелината на ушите е по-малка от 25 %, те не са конкретно свързани с прекомерното дразнене (30) (32) (33) (34).

24.

Следните клинични наблюдения могат да покажат наличие на системна токсичност (35) (36), когато се използват като част от интегрална оценка, и поради това могат да посочат какво следва да е максималното ниво на дозата, което да се използва в основното LLNA изпитване: промени във функционирането на нервната система (напр. пилоерекция, атаксия, тремори и конвулсии); промени в поведението (напр. агресивност, промяна в хигиената на тялото, изразена промяна в нивото на активност); промени в начина на дишане (т.е. промени в честотата и интензивността на дишането като диспнея, задъханост и хрипове) и промени в консумацията на храна и вода. Освен това в оценката следва да бъдат взети предвид признаци на летаргия и/или липса на реакция и всякакви клинични признаци на нещо повече от лека или момента болка и страдание или намаляване на телесното тегло > 5 % от ден 1 до ден 6, както и смъртността. Умиращите животни, както и животните, които очевидно изпитват болка или показват признаци на тежко и продължително страдание, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин (37).

25.

Експерименталният график на изпитването е, както следва:

—   Ден 1: Индивидуално се идентифицира и записва теглото на всяко животно и всяко клинично наблюдение. Прилага се 25 μL подходящо разреден разтвор на изпитваното вещество, както и самостоятелно носителят или положителната контрола (паралелна или неотдавнашна въз основа на лабораторната политика, като се вземат предвид точки 11—15), в горната част на всяко ухо.

—   Дни 2 и 3: Повтаря се процедурата по прилагане, извършена в ден 1.

—   Дни 4 и 5: Няма третиране.

—   Ден 6: Записва се теглото на всяко животно. Инжектира се 250 μL стерилен буферен физиологичен разтвор с фосфат (PBS), съдържащ 20 μСi (7,4 × 105 Bq) тритиев (3H)-метил тимидин на всички изследвани и контролни мишки през опашната вена. Алтернативно се инжектира 250 μL стерилен PBS, съдържащ 2 μСi (7,4 × 104 Bq) 125I-йододеоксиуридин и 10–5Μ флуородеоксиуридин на всички мишки през опашната вена. Пет часа (5 h) по-късно животните се умъртвяват по хуманен начин. Дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли от всяко ухо на мишката се отрязват и се обработват заедно в PBS за всяко животно (индивидуален подход към животните); алтернативно лимфните възли от всяко ухо се отрязват и събират в PBS за всяка третирана група (общ подход за третиране на групата). Подробности и диаграми за идентифицирането и дисекцията на лимфните възлите могат да бъдат намерени в позоваване (12). За допълнително наблюдение на локалната кожна реакция при основното изпитване в протокола от изпитването могат да бъдат включени допълнителни параметри като оценяване на ушната еритема или измервания на дебелината на ушите (получени или чрез използването на измервателен уред за дебелината, или чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части при аутопсията).

26.

Клетъчна суспензия от единични клетки се приготвя от клетки от лимфните възли (КЛВ), отрязани двустранно, като се използва индивидуалният подход към животните или алтернативно общият подход за третиране на групата, чрез леко механично раздробяване през 200-микронови отвори на мрежа от неръждаема стомана или чрез друга приемлива техника за получаване на клетъчна суспензия от единични клетки. Клетките от лимфните възли се измиват двукратно с голямо количество PBS и ДНК-то се преципитира с 5 % трихлороцетна киселина (ТСА) при 4 °C в продължение на 18 часа (3). Малките сферични топчета или повторно се суспендират в 1 ml ТСА и се прехвърлят в сцинтилационни стъкленици, съдържащи 10 mL сцинтилационна течност за 3H-преброяване, или се прехвърлят директно в гама броителни епруветки за 125I-преброяване.

27.

Инкорпорирането на 3H-метил тимидин се измерва чрез β-сцинтилационен брояч като разпадане (дезинтегриране) за минута (DPM). Инкорпорирането на 125I-йододеоксиуридин се измерва чрез 125I-брояч и също се изразява като DPM. В зависимост от използвания подход инкорпорирането се изразява като DPM/мишка (индивидуален подход към животните) или DPM/третирана група (общ подход за третиране на групата).

28.

В определени случаи, когато е налице регулаторна необходимост да се потвърди отрицателна прогноза за потенциален кожен сенсибилизатор, може да се използва незадължителен протокол за rLLNA (16) (17) (18), при който се използват по-малко животни, при условие че се спазват всички други протоколни спецификации за LLNA, описани в настоящия МИ. Преди прилагането на подхода rLLNA следва да се предоставят ясни основания и научна обосновка за неговото използване. Ако се получи положителен или неясен резултат, може да е необходимо допълнително изпитване за тълкуване или изясняване на резултата.

29.

Намаляването на броя подложени на различни дози групи е единствената разлика между протоколите за методите на изпитване LLNA и rLLNA и поради тази причина rLLNA не предоставя информация за зависимостта доза—реакция. Следователно rLLNA не трябва да се използва, когато е необходима информация за зависимостта доза—реакция. Както при използващото множество дози LLNA, концентрацията на изпитваното вещество, оценявана при rLLNA, следва да бъде максималната концентрация, която не причинява явна систематична токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене на мишката (вж. точка 18).

30.

Всяка мишка следва да бъде внимателно наблюдавана поне веднъж дневно за всякакви клинични признаци за локално дразнене на мястото на прилагане или за систематична токсичност. Всички наблюдения следва систематично да се записват, като се водят дневници за всяка мишка. Плановете за наблюдение следва да включват критерии за бързото идентифициране на мишките, които показват признаци на систематична токсичност, прекомерно локално кожно дразнене или корозивност на кожата, за да бъдат подложени на евтаназия (37).

31.

Както е посочено в точка 25, индивидуалните телесни тегла на животните следва да бъдат измерени в началото на изпитването и при планираното умъртвяване на животните по хуманен начин.

32.

Резултатите за всяка третирана група се изразяват чрез стимулационния индекс (SI). Когато се използва индивидуалният подход към животните, SI се получава чрез разделяне на средната стойност на DPM/мишка във всяка група, изследвана с изпитваното вещество, както и в положителната контролна група, на средната стойност на DPM/мишка за контролната група, третирана само с разтворителя/носителя. Средната стойност на SI за контролите, третирани само с носителя, е единица. Когато се използва общият подход за третиране на групата, SI се получава чрез разделяне на общото радиоактивно инкорпориране за всяка третирана група на инкорпорирането на общата третирана само с носителя контролна група; така се получава средният SI.

33.

При процеса на вземане на решение, даден резултат се счита за положителен, когато SI ≥ 3. При гранични резултати, обаче, могат да бъдат взети предвид и силата на зависимостта доза—отговор, статистическата значимост и съответствието на реакциите при третиране с разтворител/носител и ПК реакциите (4) (5) (6).

34.

Ако е необходимо изясняване на получените резултати, следва да се обърне внимание на различните свойства на изпитваното вещество, включително дали то има структурна връзка с познати кожни сенсибилизатори, дали причинява прекомерно кожно дразнене при мишките, както и на естеството на наблюдаваната зависимост доза—отговор. Тези и други съображения подробно се обсъждат на друго място (7).

35.

Събирането на данни за радиоактивността на нивото на отделните мишки дава възможност за статистически анализ на наличието и степента на зависимостта доза—отговор в данните. Всяка статистическа оценка би могла да включва оценка на зависимостта доза—отговор, както и подходящо направени сравнения между изпитваните групи (напр. сравнения по двойки на третираните с определени дози групи съответно с паралелната третирана с носител контролна група). Статистическите анализи могат например да включват линейна регресия или изпитването на William за оценка на тенденциите в зависимостта доза—отговор и изпитването на Dunnett за сравнения по двойки. При избора на подходящ метод за статистически анализ изследователят следва да обърне внимание на възможни различия в дисперсиите и други свързани с тях проблеми, които могат да наложат трансформация на данните или провеждане на статистически анализ без параметри. Във всеки случай на изследователя може да му се наложи да извърши изчисления за SI и статистически анализи със и без определени точки с данни (понякога наричани „отклоняващи се стойности“).

36.

Данните следва да бъдат обобщени в табличен вид. Когато се използва индивидуалният подход към животните, се посочват индивидуалните DPM стойности за отделните животни, средната за групата стойност DPM/животно, съответните граници на отклонения (напр. SD, SEM) и средният SI за всяка подложена на дадена доза група в сравнение с паралелната третирана с носителя контролна група. Когато се използва общият подход за третиране на групата, се посочва средната/междинната DPM стойност и средният SI за всяка подложена на дадена доза група в сравнение с паралелната третирана с носителя контролна група.

37.

Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:

(1)

OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 429, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(2)

Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169.

(3)

Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 13-31.

(4)

Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79.

(5)

Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.

(6)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.

(7)

Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.

(8)

Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59.

(9)

Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273.

(10)

Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286.

(11)

Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257.

(12)

ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]

(13)

OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals № 406, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(14)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment № 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(15)

Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284.

(16)

Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185.

(17)

ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, April 2007. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]

(18)

ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

(19)

ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication № 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]

(20)

Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.

(21)

Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.

(22)

ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, на разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]

(23)

ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.

(24)

McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.

(25)

OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals № 404, Paris, France. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(26)

Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.

(27)

ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. На разположение на адрес: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]

(28)

Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.

(29)

Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.

(30)

Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256.

(31)

Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.

(32)

Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.

(33)

Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.

(34)

Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.

(35)

OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals № 402, Paris, France. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(36)

ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, на разположение на адрес: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]

(37)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment № 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

1.

Кожно дразнене означава предизвикване на обратимо увреждане на кожата вследствие на прилагането на изпитвано вещество за период от време до 4 часа [както е определено в Глобалната хармонизирана система за класифициране и етикетиране на химикали (GHS) на Организацията на обединените нации (ООН) и Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси (Регламент CLP) (1) (3)]. Настоящият метод за изпитване (МИ) съдържа in vitro процедура, която може да се използва за определянето на опасността от дразнещи химикали (вещества и смеси) в съответствие с категория 2 по GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС (1) (2) (3). В ЕС и други региони, които не са приели незадължителната категория 3 по GHS на ООН (слаби дразнители), настоящият МИ може също така да се използва за определяне на некласифицирани химикали, т.е. без категория по GHS на ООН и Регламент CLP на ЕС (1) (3). Настоящият МИ може да се използва за определяне на дразнещия ефект на химикали върху кожата като напълно самостоятелно заместващо изпитване на in vivo изпитването за кожно дразнене в рамките на стратегия за поетапно изпитване (4) и глава Б.4 от настоящото приложение).

2.

Оценката на кожното дразнене обикновено включва използването на опитни животни [Указание за изпитване 404 на ОИСР; глава Б.4 от настоящото приложение] (4). Метод Б.4 бе преработен през 2004 г. във връзка със съображенията за хуманно отношение към животните, което позволи определянето на корозивността/дразненето на кожата с прилагането на стратегия за поетапно изпитване, като се използват валидирани in vitro и ex vivo методи и по този начин се избягват болката и страданието на животните. Три валидирани метода за in vitro изпитване бяха приети като указания за изпитване 430, 431 и 435 на ОИСР (5) (6) (7) и два от тях като глави Б.40 и Б.40 bis от настоящото приложение, които следва да се използват за свързаната с корозивността част на стратегията за поетапно изпитване от метод Б.4 или Указание за изпитване 404 на ОИСР (4).

3.

Предмет на настоящия МИ е кожното дразнене като опасност за човешкото здраве. Той се основава на реконструиран човешки епидермис (RhE), който поради цялостното си устройство (използването на човешки нетрансформирани епидермални кератиноцити като източник на клетки, както и на използването на представителна тъканна и клетъчна структура) силно наподобява биохимичните и физиологичните свойства на горните слоеве на човешката кожа, т.е. на епидермиса. Настоящият МИ също така включва набор от стандарти за ефективност (СЕ) (допълнение 2) за оценката на сходни и модифицирани методи за изпитване, основани на RhE и разработени от EC-ECVAM (8), в съответствие с принципите на Ръководство № 34 на ОИСР (9).

4.

Съществуват три валидирани метода, които съответстват на разглеждания тук МИ. Бяха проведени изследвания преди валидирането, както и изследвания за оптимизирането и за валидирането на метод за in vitro изпитване (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), предлаган на пазара като EpiSkinTM и използващ модел на реконструиран човешки епидермис (RhE) (определен като валидирания референтен метод — ВРМ). Други два предлагани на пазара методи RhE за in vitro изпитване за кожно дразнене са показали подобни резултати като ВРМ съгласно валидиране, основано на стандартите за ефективност (21), и това са методите EpiDermTM SIT (EPI-200) и SkinEthicTM RHE (22).

5.

Преди предлаган сходен или модифициран метод RhE за in vitro изпитване, различен от ВРМ и методите EpiDermTM SIT (EPI-200) или SkinEthicTM RHE, да може да бъде използван за регулаторни цели, следва да се определят неговата надеждност, приложимост (точност) и ограничения за предложеното му използване, за да се гарантира, че той може да се счита за сходен с ВРМ, в съответствие със стандартите за ефективност, определени в настоящия МИ (допълнение 2). Освен това е препоръчително да се направи справка в Обяснителния справочен документ на ОИСР относно in vitro изпитването за кожно дразнене, преди разработването и валидирането на сходен или модифициран метод RhE за in vitro изпитване и представянето му за регулаторно приемане (23).

6.

Използваните определения са дадени в допълнение 1.

7.

Едно ограничение на МИ, както бе демонстрирано чрез изследването за валидиране (16), се състои в това, че той не позволява класифицирането на химикали в незадължителната категория 3 по GHS на ООН (леки дразнители) (1). Когато се използва като частично заместващо изпитване, може да се изиска последващо in vivo изпитване, за да се характеризира напълно потенциалът за кожно дразнене (4 и глава Б.4 от настоящото приложение). Признава се, че използването на човешка кожа е предмет на национални и международни етични съображения и условия.

8.

Предмет на настоящия МИ е in vitro изпитването за кожно дразнене като елемент от стратегията за поетапно изпитване на Б.4 (Указание за изпитване 404 на ОИСР) относно корозивност/дразнене на кожата (4). Докато настоящият МИ не предоставя адекватна информация за корозивността на кожата, следва да се отбележи, че методът за изпитване Б.40 bis (Указание за изпитване 431 на ОИСР) относно корозивността на кожата се основа на една и съща система за изпитване RhE, макар че се използва друг протокол (глава Б.40 bis). Настоящият метод се основава на моделите RhE, използващи човешки кератиноцити, като по този начин представя in vitro целевия орган на вида, представляващ интерес. Освен това той обхваща пряко първоначалния етап от каскадата на възпалението/механизмът на действие на възпалението (увреждане на клетки и тъкани, водещо до локализирана травма), която/който се появява по време на in vivo дразнене. По време на валидирането, което е залегнало в основата на настоящия МИ, беше изпитан широк кръг от химикали, като емпиричната база данни на изследването за валидиране наброяваше общо 58 химикала (16) (18) (23). Методът е приложим за твърди вещества, течности, полутвърди вещества и восъци. Течностите може да са на водна или друга основа; твърдите вещества може да са разтворими или неразтворими във вода. Където е възможно, твърдите вещества преди използването им следва да бъдат стрити на фин прах, като не се изисква никаква друга предварителна обработка на пробата. Газовете и аерозолите все още не са оценени с валидационно проучване (24). Въпреки че е възможно те да бъдат изпитвани чрез използване на технология RhE, настоящият МИ не дава възможност за изпитване на газове и аерозоли. Освен това следва да се отбележи, че силно оцветените химикали могат да окажат влияние на измерванията за жизнеспособността на клетките и е необходимо използването на адаптирани контроли за корекции (вж. точки 24—26).

9.

Едно изпитване, включващо три тъканни репликата, би следвало да е достатъчно за изпитването на даден химикал, когато класификацията е недвусмислена. При все това при наличие на гранични резултати, каквито са несъответстващите измервания на репликати и/или средната жизнеспособност, изразена процентно като 50 ± 5 %, следва да се разгледа възможността за провеждане на второ изпитване, както и на трето изпитване в случай на наличие на несъответстващи резултати между първите две изпитвания.

10.

Изпитваният химикал се прилага локално на триизмерен модел на реконструиран човешки епидермис (RhE), състоящ се от нетрансформирани човешки епидермални кератиноцити, които са култивирани да образуват многослоен, силно диференциран модел на човешкия епидермис. Той се състои от организиран базален, спинозен и грануларен слой, и от многослоенстратум корнеум, съдържащ междуклетъчни ламелни липидни слоеве, представляващи основните липидни класове, аналогични на тези, които се наблюдават in vivo.

11.

Кожното дразнене, предизвикано от химикали, което се проявява с еритема и оток, е резултат от поредица от събития, започваща с проникване в роговия слой и увреждане на по-долните слоеве кератиноцити. Умиращите кератиноцити освобождават медиатори, които дават начало на каскадата на възпалението, действаща върху клетките в дермиса, по-специално върху стромалните и ендотелиалните клетки. Разширяването и повишената пропускливост на ендотелиалните клетки водят до получаването на наблюдаваните еритема и оток (24). Основаните на RhE методи измерват началните събития, настъпващи в рамките в каскадата.

12.

Клетъчната жизнеспособност в моделите RhE се измерва чрез ензимно превръщане на виталния оцветител MTT [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиев бромид, тиазолил синьо; CAS номер 298-93-1] в синя формазанова сол, която се измерва количествено след екстракция от тъканите (25). Дразнещите химикали се определят по способността им да намаляват клетъчната жизнеспособност под определени прагови нива (т.е. ≤ 50 % за дразнители от категория 2 по GHS на ООН/Регламент CLP на ЕС). В зависимост от регулаторната рамка, в която се използват резултатите от настоящия МИ, химикалите, при които клетъчната жизнеспособност е над определеното прагово ниво, могат да се считат за химикали, които не са дразнители (т.е. > 50 %, „Без категория“).

13.

Преди рутинното използване на който и да било от трите валидирани метода, които се придържат към настоящия МИ, лабораториите следва да докажат техническа компетентност, като използват десетте референтни химикала, посочени в таблица 1. По отношение на сходни методи, разработени съгласно настоящия МИ, или изменения на някой от трите валидирани метода, следва да бъдат спазени изискванията на стандартите за ефективност, описани в допълнение 2 от настоящия МИ, преди методът да бъде използван за регулаторно изпитване.

14.

Като част от процедурата за доказване на компетентност, е препоръчително след получаването на тъканите ползвателят да провери бариерните им свойства, както е посочено от производителя на модела на RhE. Това е особено важно, ако тъканите са били превозвани на дълго разстояние или в продължение на дълги периоди от време. След като един метод е успешно установен и е доказана компетентност по отношение на неговото използване, такава проверка няма да бъде рутинно необходима. Когато обаче методът се използва рутинно, се препоръчва да се продължи оценяването на бариерните свойства на редовни интервали.

Таблица 1

Референтни химикали  (8)

15.

По-долу са описани елементите и процедурите на метод RhE за оценка на кожно дразнене. Следва да бъде реконструиран модел на RhE, като той може да бъде изготвен на място или закупен от търговски източник. Налични са стандартни работни процедури (СРП) за методите EpiSkinTM, EpiDermTM SIT (EPI-200) и SkinEthicTM RHE (26) (27) (28). Изпитването следва да се провежда съгласно следните изисквания:

16.

За реконструирането на епитела следва да се използват нетрансформирани човешки кератиноцити. Под функционалния рогов слой следва да има множество слоеве от жизнеспособни епителни клетки (базален, спинозен и грануларен слой). Роговият слой следва да бъде многослоен и да съдържа основния липиден профил, за да създаде функционална бариера, която е достатъчно здрава, за да устои на бързото проникване на цитотоксични химични маркери, например натриев додецил сулфат (SDS) или Triton X-100. Бариерната функция следва да бъде доказана и може да бъде оценена или чрез определяне на концентрацията, при която химичен маркер намалява жизнеспособността на тъканите с 50 % (IC50) след определено време на експозиция, или чрез определяне на времето на експозиция, необходимо за намаляване на жизнеспособността с 50 % (ET50) при прилагане на химичния маркер с определена фиксирана концентрация. Задържащите свойства на модела на RhE следва да предотвратяват преминаването на материал около роговия слой към жизнеспособната тъкан, което би довело до неадекватно моделиране на експозицията на кожата. Моделът на RhE следва да не е заразен с бактерии, вируси, микоплазма или гъбички.

17.

Използваното изпитване за определяне на величината на жизнеспособността е изпитването с MTT (25). Ползвателите на модела на RhE следва да гарантират, че всяка използвана партида от модела на RhE отговаря на определените критерии за отрицателната контрола (ОК). Оптичната плътност (ОП) на разтворителя, който се използва за екстракцията, сама по себе си следва да бъде достатъчно малка, т.е. ОП < 0.1. Разработчикът/доставчикът на модела на RhE определя интервал на приемливост (горна и долна граница) за стойностите на ОП на отрицателната контрола (при условията на метода за изпитване за кожно дразнене), като интервалите на приемливост за трите валидирани метода са дадени в таблица 2. Следва да се документира, че тъканите, третирани с ОК, са стабилни като култура (дават сходни измервания на жизнеспособността) за периода на продължителност на експозицията при изпитването.

Таблица 2

Интервали на приемливост за стойностите на ОП на отрицателната контрола

18.

Роговият слой и липидният му състав следва да бъдат достатъчни, за да устоят на бързото проникване на цитотоксични химични маркери, например SDS или Triton X-100, оценено с IC50 или ET50 (таблица 3).

19.

Следва да бъде проведено хистологично изследване на модела на RhE, за да се докаже структура, подобна на човешки епидермис (включително на многослойния рогов слой).

20.

Резултатите от положителните контролни химикали (ПК) и отрицателните контроли (ОК) на метода за изпитване следва да доказват възпроизводимост с течение на времето.

21.

Разработчикът/доставчикът на модела на RhE следва да гарантира и докаже, че всяка използвана партида от модела на RhE отговаря на определени критерии за пускане в обращение на продукцията, сред които най-значими са тези за жизнеспособността (точка 17), бариерната функция (точка 18) и морфологията (точка 19). Тези данни следва да бъдат предоставени на ползвателите на метода, така че те да могат да включат тази информация в протокола от изпитването. Разработчикът/доставчикът на модела на RhE (или изследователят, ако се използва собствен модел) следва да определи интервал на приемливост (горна и долна граница) за IC50 или ET50. За надеждно прогнозиране на класификацията на дразненето могат да се приемат само резултати, получени с отговарящи на изискванията тъкани. Интервалите на приемливост за трите валидирани метода са дадени като пример в таблица 3.

Таблица 3

Примери за критерии на контрол на качеството на партида за пускане в обращение

22.

За всеки изпитван химикал и за контролите във всяко изпитване следва да се използват най-малко три репликата. За течни, както и за твърди вещества следва да се прилага достатъчно количество от изпитвания химикал за равномерното покриване на повърхността на епидермиса, като същевременно се избягва прилагането на изобилна доза, т.е. следва да се използват най-малко 25 μL/cm2 или 25 mg/cm2. Преди прилагането на твърдите вещества повърхността на епидермиса следва да се овлажни с дейонизирана или дестилирана вода, за да се подобри контакта между изпитвания химикал и повърхността на епидермиса. Когато е възможно, твърдите вещества следва да се изпитват под формата на фин прах. В края на периода на експозиция изпитваният химикал следва внимателно да се измие от повърхността на епидермиса с буферен воден разтвор или 0,9 % NaCl. В зависимост от това кой от трите валидирани метода на RhE се използва, периодът на експозиция варира между 15 и 60 минути, а температурата на инкубация — между 20 и 37 °C. Тези периоди на експозиция и температури са оптимизирани за всеки метод на RhE и представляват различните присъщи свойства на методите, за подробности вж. стандартните работни процедури (СРП) за методите (26) (27) (28).

23.

За да се докаже, че жизнеспособността (с ОК), бариерната функция и получената в резултат тъканна чувствителност (с ПК) на тъканите са в границите на определен от предишни изследвания интервал на приемливост, при всяко изпитване следва да се използват паралелни отрицателни (ОК) и положителни контроли (ПК). За положителна контрола е предложен 5 % воден разтвор на SDS. Като химикали за отрицателни контроли са предложени вода или буферен физиологичен разтвор с фосфат (PBS).

24.

Най-важният елемент на процедурата за изпитване е измерванията на жизнеспособността да не се провеждат веднага след експозицията на изпитваните химикали, а в чиста среда след достатъчно дълъг инкубационен период след третирането на промитите тъкани. Този период позволява както възстановяването от леките цитотоксични ефекти, така и появата на ясно изразени цитотоксични ефекти. По време на фазата на оптимизиране на изпитването (11) (12) (13) (14) (15) беше доказано, че оптималният период на инкубация след третирането е 42 часа.

25.

Изпитването с MTT е валидиран количествен метод, който следва да се използва за измерване на клетъчната жизнеспособност съгласно настоящия МИ. Той е съвместим с използване в триизмерни тъканни модели. Кожната проба се поставя в разтвор на MTT с подходяща концентрация (например 0,3—1 mg/mL) за 3 часа. След това утаеният син формазанов продукт се извлича от тъканта с помощта на разтворител (например изопропанол, киселинен изопропанол), а концентрацията на формазан се измерва, като се определи ОП при 570 nm, използвайки ширина на филтърната дължина на вълната най-много ± 30 nm.

26.

Оптичните свойства на изпитвания химикал или химичното му въздействие върху MTT могат да повлияят на изпитването, като доведат до погрешна оценка на жизнеспособността (защото изпитваният химикал може да предотврати, да предизвика или да промени оцветяването). Това може да се случи, ако определен изпитван химикал не бъде напълно отстранен от тъканта чрез промиване или когато проникне през епидермиса. Ако изпитваният химикал действа пряко върху MTT (редуктор на МТТ), ако е естествено оцветен или се оцветява по време на третиране на тъканта, следва да се използват допълнителни контроли, за да се открие и коригира въздействието на изпитвания химикал върху техниката за измерване на жизнеспособността. Подробно описание на това как да се коригира пряката редукция на MTT и въздействията на оцветителите е налично в СРП за трите валидирани метода (26) (27) (28).

27.

За всеки модел, използващ валидни партиди на модели на RhE (вж. точка 21), тъканите, третирани с отрицателната контрола, следва да показват оптична плътност, отразяваща състоянието на тъканите, които са преминали през етапите по транспортиране и приемане, както и през всички процедури по протокола. Стойностите на оптичната плътност на контролите не трябва да са по-ниски от установените граници от предишни изпитвания. По подобен начин тъканите, третирани с положителната контрола, т.е. 5 % воден разтвор на SDS, следва да отразяват способността им да реагират на дразнещ химикал при условията на МИ (26) (27) (28). Следва да се определят съответни и подходящи критерии за оценка на вариабилността между тъканните репликати (например ако се използват стандартните отклонения (СО), те следва да бъдат в рамките на 1-странен интервал на толерантност от 95 %, изчислен на базата на данни от предишни изследвания; за СО на ВРМ < 18 %).

28.

Получените стойности за оптична плътност за всеки изпитван химикал могат да се използват за изчисляването на процентната жизнеспособност, нормализирана спрямо ОК, която е определена на 100 %. Граничната стойност за процента на клетъчната жизнеспособност, която разграничава дразнещите от некласифицираните изпитвани химикали, и статистическата(ите) процедура(и), използвана(и) за оценка на резултатите и определяне на дразнещите химикали, следва да бъдат ясно определени и документирани, както и доказано целесъобразни. Граничните стойности за прогнозиране на дразненето са дадени по-долу:

29.

За всяко изпитване следва да се докладват в табличен вид данни от отделните тъканни репликати (например данни за стойностите на оптична плътност и изчисления процент на клетъчната жизнеспособност за всеки изпитван химикал, включително класифициране), включително данни от повторните опити, ако е целесъобразно. В допълнение следва да се докладват средните стойности ± стандартното отклонение за всяко изпитване. Наблюдаваните взаимодействия с реагента MTT и оцветените изпитвани химикали следва да се докладват за всеки изпитван химикал.

30.

Протоколът от изпитването следва да включва следната информация:

(1)

UN (2009), United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Third revised edition, UN New York and Geneva. На разположение на адрес: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]

(2)

EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of three in vitro assays for skin irritation testing and the adaptation of the Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards“, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 април 2009 г. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(3)

Регламент (ЕО) № 1272/2008 на Европейския парламент и на Съвета от 16 декември 2008 г. относно класифицирането, етикетирането и опаковането на вещества и смеси, за изменение и за отмяна на директиви 67/548/ЕИО и 1999/45/ЕО и за изменение на Регламент (ЕО) № 1907/2006. ОВ L 353, 31.12.2008 г., стр. 1.

(4)

OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 404, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(5)

OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 430, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(6)

OECD (2004), In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 431, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(7)

OECD (2006), In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, OECD Guideline for the Testing of Chemicals № 435, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(8)

EC-ECVAM (2009), Performance Standards for in vitro skin irritation test methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(9)

OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment № 34, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]

(10)

Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, Results and evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57-93.

(11)

Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in Vitro 16, 765–770.

(12)

Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests, ALTEX 21, 107–114.

(13)

Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests – An assessment of the performance of the optimised test, ATLA 33, 351-367.

(14)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. (2005), The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process, ATLA 33, 329-349.

(15)

Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation, The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irritation Task Force report 2, ATLA 30, 109-129.

(16)

Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559-601.

(17)

Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(18)

Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 603-619.

(19)

Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007), In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 351-358.

(20)

EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of in vitro tests for skin irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 април 2007 г. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(21)

EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation testing. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(22)

EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of in vitro tests for skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC29), 5 ноември 2008 г. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(23)

OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test Guideline on in vitro skin irritation testing. OECD Series on Testing and Assessment, № 137, OECD, Paris. На разположение на адрес: [http://www.oecd.org/document/24/0,3746,en_2649_34377_47858904_1_1_1_1,00.html]

(24)

Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004), In vitro skin irritation: fact and future. State of the art review of mechanisms and models, Toxicol. in Vitro 18, 231-243.

(25)

Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Methods 65, 55-63.

(26)

EpiSkinTM SOP, Version 1.8 (February 2009), ECVAM Skin Irritation Validation Study: Validation of the EpiSkinTM test method 15 min - 42 hours for the prediction of acute skin irritation of chemicals. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(27)

EpiDermTM SOP, Version 7.0 (Revised March 2009), Protocol for: In vitro EpiDermTM skin irritation test (EPI-200-SIT), For use with MatTek Corporation’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(28)

SkinEthicTM RHE SOP, Version 2.0 (February 2009), SkinEthic skin irritation test-42а test method for the prediction of acute skin irritation of chemicals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]

(29)

Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, стр. 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc Graw-Hill, New York.

(30)

Директива 2001/59/ЕО на Комисията от 6 август 2001 г. относно двадесет и осмо адаптиране към техническия прогрес на Директива 67/548/ЕИО на Съвета за сближаването на законовите, подзаконовите и административните разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества, ОВ L 225, 21.8.2001 г., стр. 1.

(31)

Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. Contact Dermatitis 51, 1-4.

(32)

Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irritation and photo-irritation patch test data with cellular in vitro assays and animal in vivo data, ALTEX, 14, 359-365.

(33)

Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with in vitro skin irritation assays and animal data, Contact Dermatitis, 62, 109-116.

1.

Изпитването in vitro за микроядра (MNvit) представлява изпитване за генотоксичност за откриване на микроядра (МЯ) в цитоплазмата на интерфазни клетки. Микроядрата могат да произлизат от ацентрични хромозомни фрагменти (т.е. с липсващ центромер) или от цели хромозоми, които не са в състояние да се придвижат към полюсите по време на анафазния стадий на клетъчно делене. Изпитването открива активността на кластогенните и анеугенните химикали (вещества и смеси) (1) (2) в клетки, които са преминали през клетъчно делене по време на и след експозиция на изпитваното вещество. Настоящият метод за изпитване (МИ) позволява използването на протоколи със и без инхибитор на полимеризацията на актина — цитохалазин Б (цитоБ). Добавянето на цитоБ преди целевата митоза дава възможност за идентификация и селективен анализ на честотата на микроядра в клетките, които са преминали през една митоза, тъй като тези клетки са двуядрени (3) (4). Настоящият МИ позволява използването на протоколи без блокиране на цитокинезата, при условие че са налице доказателства за това, че анализираната популация на клетки е преминала през митоза.

2.

В допълнение към използването на изпитването MNvit за идентифициране на химикали (вещества и смеси), които индуцират микроядра, използването на блокиране на цитокинезата, имунохимично маркиране на кинетохорите или хибридизация с центромерни/теломерни проби (флуоресцентна in situ хибридизация (FISH) също може да предостави информация относно механизмите на увреждане на хромозомите и образуване на микроядра (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Процедурите на маркиране и хибридизация могат да бъдат използвани, когато е налице увеличено образуване на микроядра и изследователят пожелае да определи дали увеличението е резултат от кластогенни и/или анеугенни ефекти.

3.

Микроядрата представляват увреждане, което е било предадено на дъщерните клетки, докато хромозомните аберации, отчетени в метафазните клетки, могат да не бъдат предадени. Тъй като микроядрата в интерфазните клетки могат да бъдат оценени относително обективно, лабораторният персонал трябва единствено да определи дали клетките са преминали през делене и колко клетки съдържат микроядро. В резултат на това препаратите могат да бъдат оценени относително бързо, а анализът може да бъде автоматизиран. Поради това е практично да се оценят хиляди вместо стотици клетки в рамките на едно третиране, с което се увеличава статистическата достоверност на изпитването. Накрая, тъй като микроядрата могат да се породят от изоставащи хромозоми, налице е потенциал за откриване на агенти, индуциращи анеуплоидия, които се изследват трудно в рамките на конвенционални изпитвания за хромозомни аберации, напр. Указание за изпитване 473 на ОИСР (глава Б.10 от настоящото приложение) (17). При все това изпитването MNvit не дава възможност за разграничаване на химикалите, индуциращи полиплоидия, от химикалите, индуциращи кластогенност, без специални техники, каквато е техниката FISH, описана в точка 2.

4.

Изпитването MNvit представлява метод in vitro, при който обичайно се използват култивирани човешки клетки или клетки на гризачи. Той осигурява изчерпателна основа за изследване на възможността за увреждане на хромозомите in vitro, тъй като могат да бъдат открити както анеугени, така и кластогени.

5.

Изпитването MNvit е устойчиво и ефективно при разнообразни типове клетки и при наличието или липсата на цитоБ. Налице са изчерпателни данни в подкрепа на валидността на изпитването MNvit, за което се използват клетъчни линии на гризачи (CHO, V79, CHL/IU и L5178Y) и човешки лимфоцити (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Те включват по-конкретно данни от международните изпитвания за валидиране, координирани от Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) и от докладите от Международния семинар относно изпитването за генотоксичност (4) (16). Наличните данни също така бяха повторно оценени в рамките на ретроспективно изследване за валидиране, основано на тежестта на доказателствата и извършено от Европейския център за валидиране на алтернативните методи (ECVAM) към Европейската комисия, и методът за изпитване беше одобрен като научно валиден от Научния консултативен комитет (НКК) на ECVAM (32) (33) (34). Беше описано използването на човешката лимфобластоидна клетъчна линия TK6 (35), клетките HepG2 (36) (37) и първичната култура на клетки от ембрион на сирийски хамстер (38), въпреки че те не са били използвани в изследвания за валидиране.

6.

Използваните определения са дадени в допълнение 1.

7.

Изпитванията, провеждани in vitro, по принцип изискват използването на екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато клетките са с адекватен метаболизиращ капацитет по отношение на изпитваните вещества. Екзогенната система на метаболитно активиране не възпроизвежда изцяло in vivo условия. Също така следва внимателно да се избягват условия, които биха довели до изкуствено предизвикани положителни резултати, които не отразяват присъща мутагенност и които биха могли да се породят от фактори като подчертани промени на рН или осмотичното налягане или от високи нива на цитотоксичност (39) (40) (41). Ако изпитваният химикал причини промяна в pH на средата към момента на добавянето, pH следва да бъде коригирано, за предпочитане чрез буфериране на изходния разтвор по такъв начин, че общият обем във всички изпитвани концентрации и за всички контроли да остане същият.

8.

За целите на анализиране на индуцирането на микроядра от съществено значение е митозата да е настъпила както при третирани, така и при нетретирани култури. Най-информативният стадий за отчитане на наличието на микроядра е в клетки, които са завършили една митоза по време на или след третиране с изпитваното вещество.

9.

Клетъчните култури с произход от хора или бозайници се подлагат на въздействието на изпитваното вещество със и без екзогенен източник на метаболитно активиране, освен когато се използват клетки с адекватен метаболизиращ капацитет. Във всички изпитвания се включват паралелни контроли с разтворителя/носителя (КН) и положителни контролни химикали (ПК).

10.

По време на и след експозицията на изпитваното вещество клетките се отглеждат за период, който е достатъчен, за да позволи увреждането на хромозомите или делителното вретено да доведе до образуването на микроядра в интерфазните клетки. За индуциране на анеуплоидия изпитваното вещество обикновено следва да бъде налично по време на митозата. Събраните и оцветените интерфазни клетки се анализират за наличието на микроядра. В идеалния случай микроядрата следва да бъдат отчетени само в онези клетки, които са преминали през митоза по време на експозиция на изпитваното вещество или по време на периода след експозиция, ако се използва такъв. При култури, които са били третирани с блокер на цитокинезата, това се постига с отчитане само на двуядрените клетки. При липсата на блокер на цитокинезата е важно да се докаже, че е вероятно анализираните клетки да са преминали през клетъчно делене по време на или след експозиция на изпитваното вещество. За всички протоколи е важно да се докаже, че пролиферацията на клетки е настъпила както в контролните, така и в третираните култури, и степента на цитотоксичност или цитостаза, индуцирана от изпитваното вещество, следва да бъде оценена в културите (или в паралелните култури), които се оценяват за наличието на микроядра.

11.

Могат да бъдат използвани култивирани първични човешки лимфоцити от периферна кръв (5) (19) (42) (43) и редица клетъчни линии на гризачи, например клетките CHO, V79, CHL/IU и L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Използването на други клетъчни линии и типове следва да бъде обосновано въз основа на тяхната доказана ефективност в рамките на изпитването, както е описано в раздела „Критерии за приемливост“. Тъй като фоновата честота на микроядрата ще окаже влияние върху чувствителността на изпитването, препоръчва се използването на типове клетки с ниска, стабилна фонова честота на образуване на микроядра.

12.

Човешките лимфоцити от периферна кръв следва да бъдат получени от млади (на приблизителна възраст 18—35 години), здрави индивиди, които не са пушачи и за които не е известно скорошно излагане на генотоксични химикали или радиация. Броят на донорите следва да бъде посочен, ако се обединят клетките от повече от един донор в обща група за използване. Честотата на микроядрата нараства с възрастта и тази тенденция е по-изразена при индивидите от женски пол, отколкото при индивидите от мъжки пол (44), като това следва да бъде взето предвид при подбора на донорни клетки за обединяване в обща група.

13.

При отглеждането на културата следва да се използват подходяща хранителна среда и инкубационни условия (съдове за културата, концентрация на СО2, температура и влажност). Установените клетъчни линии и щамове следва да се проверяват рутинно за стабилност на модалния брой на хромозомите и отсъствие на микоплазмено замърсяване и не следва да се използват, ако са замърсени или има промени в модалния брой на хромозомите. Следва да се знае нормалното време на клетъчен цикъл при използваните условия за отглеждане на културата в лабораторията, провеждаща изпитването. Ако се използва методът на блокиране на цитокинезата, тогава концентрацията на инхибитора на цитокинезата следва да бъде оптимизирана за конкретния тип клетки и следва да се докаже, че тя произвежда добра реколта от двуядрени клетки за отчитане.

14.

Установени клетъчни линии и щамове: размножават се клетки от изходни култури, посяват се в хранителна среда с такава гъстота, че културите да не достигат точката на сливане в монослоеве и суспензионните култури да не достигнат прекомерна гъстота преди времето на събиране, и се инкубират при 37 °C.

15.

Лимфоцити: цялостна кръв, третирана с антикоагулант (напр. хепарин), или изолирани лимфоцити се култивират в присъствието на митоген, напр. фитохемаглутинин (ФХА), преди експозиция на изпитваното вещество и на цитоБ.

16.

Следва да се използват екзогенни метаболизиращи системи при използването на клетки с недостатъчен ендогенен метаболичен капацитет. Най-често използваната система е постмитохондрична фракция (S9) с добавка на ко-фактор, приготвена от черните дробове на гризачи, третирани с ензимно индуциращи агенти като Ароклор 1254 (45) (46) или смес от фенобарбитон и β-нафтофлавон (46) (47) (48) (49). Последната комбинация не противоречи на Стокхолмската конвенция за устойчивите органични замърсители (50) и Регламент (ЕО) № 850/2004 относно устойчивите органични замърсители (66) и е доказано, че е също толкова ефективна, колкото Ароклор 1254 за индуцирането на оксидазите със смесени функции (46) (47) (48) (49). Фракцията S9 обикновено се използва в концентрации, вариращи от 1 до 10 % (об./об.) в последната среда на изпитване. Състоянието на системата за метаболитно активиране може да зависи от класа на изпитвания химикал и в някои случаи може да е подходящо да се използва повече от една концентрация на S9.

17.

Създадените чрез генно инженерство клетъчни линии, експресиращи специфични човешки активиращи ензими или активиращи ензими на гризачи, могат да премахнат необходимостта от екзогенна система за метаболитно активиране и могат да се използват като тестклетки. В такива случаи изборът на използваните клетъчни линии следва да е научно обоснован, например чрез приложимостта на оксидази със смесени функции за метаболизма на изпитваното вещество (51) и реагирането им на известни кластогени и анеугени (вж. отделния раздел „Критерии за приемливост“). Следва да се отбележи, че изпитваното вещество може да не бъде метаболизирано от оксидазата(ите) с изразени смесени функции; в такъв случай отрицателните резултати няма да покажат, че изпитваното вещество не може да индуцира микроядра.

18.

Твърдите химикали следва да се разтворят в подходящи разтворители или носители и ако е необходимо, да се разредят преди третиране на клетките. Течните химикали могат да се добавят директно в системите за изпитване и/или да се разредят преди третирането. Газовете или летливите химикали следва да бъдат изпитвани чрез подходящи изменения на стандартните протоколи, като например обработване в запечатани съдове (52) (53). Следва да се използват пресни препарати на изпитваното вещество, освен ако данните за устойчивостта му показват, че то може да се съхранява.

19.

Разтворителят/носителят не следва да реагира с изпитваното вещество или да е несъвместим с оцеляването на клетките или с поддържането на активността на S9 при използваната концентрация. Ако се използват различни от добре утвърдените разтворители/носители, (напр. вода, среда за клетъчни култури, диметил сулфоксид), използването им следва да бъде подкрепено от данни за съвместимостта им с изпитваното вещество и липсата им на генетична токсичност. Препоръчва се винаги когато е възможно първо да се обмисля възможността за използването на воден разтворител/носител.

20.

Едно от най-важните съображения при извършването на изпитването MNvit е да се осигури, че оценяваните клетки са преминали през митоза по време на третирането или инкубационния период след третирането, ако се използва такъв. ЦитоБ е агентът, който е бил най-широко използван за блокиране на цитокинезата, тъй като той инхибира събирането на актин и по този начин предотвратява отделянето на дъщерни клетки след митоза, което води до образуването на двуядрени клетки (5) (54) (55). Поради това отчитането на микроядра може да се ограничи до клетки, които са преминали през митоза по време на или след третиране. Въздействието, което изпитваното вещество оказва върху кинетиката на клетъчната пролиферация, може да бъде измерено едновременно. ЦитоБ следва да бъде използван като блокер на цитокинезата, когато се използват човешки лимфоцити, тъй като периодите на клетъчен цикъл ще варират при различните култури и донори и тъй като не всички лимфоцити ще реагират на ФХА (фитохемаглутинин). При изпитване на клетъчните линии са били използвани други методи, за да се прецени дали оценяваните клетки са претърпели делене; тези методи са разгледани по-долу (вж. точка 26).

21.

Лабораторията следва да определи подходящата концентрация на цитоБ за всеки тип клетки за постигане на оптималната честота на двуядрени клетки в контролните култури, третирани с разтворителя/носителя. Подходящата концентрация на цитоБ обикновено е между 3 и 6 μg/ml.

22.

При определяне на най-високата концентрация на изпитваното вещество, която да бъде изпитана, следва да се избягват концентрациите, които могат да доведат до изкуствено предизвикани положителни реакции, например които предизвикват прекомерна цитотоксичност, преципитиране в хранителната среда и явни промени в pH или осмотичното налягане (39) (40) (41).

23.

Извършват се измервания на пролиферацията на клетките, за да се гарантира, че третираните клетки са преминали през митоза по време на изпитването, както и че третиранията са извършени при подходящи нива на цитотоксичност (вж. точка 29). Цитотоксичността следва да се определи със и без метаболитно активиране в клетки, които изискват метаболитно активиране, като се използва относителният ръст в количеството клетки (RICC) или относителното удвояване на популации (RPD) (вж. допълнение 2 за формули), освен когато се употребява цитоБ. Когато се употребява цитоБ, цитотоксичността може да бъде определена, като се използва индексът на репликация (RI) (вж. допълнение 2 за формула).

24.

Третирането на култури с цитоБ и измерването на относителните честоти на едноядрени, двуядрени и многоядрени клетки в културата осигурява точен метод за количествено определяне на ефекта върху пролиферацията на клетките и цитотоксичната или цитостатичната активност на дадено третиране (5) и гарантира, че се отчитат само клетки, които са преминали през делене по време на или след третирането.

25.

При изследвания с цитоБ, цитостазата/цитотоксичността може да бъде определена количествено чрез индекса на пролиферация при блокиране на цитокинезата (CBPI) (5) (26) (56) или да бъде получена чрез RI от поне 500 клетки на култура (вж. допълнение 2 за формули). Когато се използва цитоБ за оценка на пролиферацията на клетки, CBPI или RI следва да бъдат определени от поне 500 клетки на култура. Тези измервания, наред с другите измервания, могат да бъдат използвани за оценяване на цитотоксичността чрез сравняване на стойностите в третираните и контролните култури. Оценката на другите маркери за цитотоксичност (напр. сливане, клетъчен брой, апоптоза, некроза, преброяване на метафази) може да предостави полезна информация.

26.

При изследвания без цитоБ е необходимо да се докаже, че клетките, отчетени в културата, са преминали през делене по време на или след третирането с изпитваното вещество, в противен случай могат да се получат погрешно отрицателни реакции. Методите, които са използвани, за да се гарантира, че преминалите през делене клетки, които се отчитат, включват инкорпориране и последващо откриване на бромодеоксиуридин (BrdU) за идентифициране на клетки, които са се репликирали (57), образуването на клонинги, когато клетките от постоянни клетъчни линии се третират и отчитат in situ върху микроскопско предметно стъкло (индекс на пролиферация (PI)) (25) (26) (27) (28), или измерването на относително удвояване на популации (RPD), относителен ръст в количеството клетки (RICC) или други доказани методи (16) (56) (58) (59) (вж. допълнение 2 за формули). Оценката на другите маркери за цитотоксичност или цитостаза (напр. сливане, клетъчен брой, апоптоза, некроза, преброяване на метафази) може да предостави полезна информация.

27.

Следва да се оценят най-малко три концентрации, които могат да бъдат подложени на анализ. За да се постигне това, може да бъде необходимо да се извърши опит, като се използва голям брой близки по стойност концентрации и да се анализира образуването на микроядра в тези концентрации, като се предостави подходящият диапазон от цитотоксичности. Алтернативна стратегия е да се извърши предварителен тест за цитотоксичност с цел стесняване на диапазона за окончателното изпитване.

28.

Най-високата концентрация следва да има за цел постигане на цитотоксичност в размер на 55 ± 5 %. По-високите равнища могат да индуцират увреждане на хромозомите като вторичен ефект от цитотоксичността (60). Когато се прояви цитотоксичност, избраните изпитвани концентрации следва да обхващат диапазон от цитотоксичност в размер на 55 ± 5 % до малка или нулева токсичност.

29.

Ако не се наблюдава никаква цитотоксичност или преципитат, най-високата изпитвана концентрация следва да съответства на 0,01 M, 5 mg/mL или 5 μl/mL, в зависимост коя от стойностите е най-ниска. В общия случай концентрациите, избрани за анализ, следва да бъдат разграничени една от друга със стойност, непревишаваща 10. За изпитвани вещества, които показват стръмна крива „концентрация — отговор“, може да бъде необходимо сближаване на концентрациите на изпитваните вещества по стойност, така че културите в диапазоните на средна и ниска токсичност също да бъдат оценени.

30.

Когато разтворимостта е ограничаващ фактор, максималната концентрация, ако не е ограничена от цитотоксичност, следва да бъде най-ниската концентрация, при която минималният преципитат е видим при култури, при условие че липсва каквото и да било въздействие върху оценяването. Оценяването на преципитацията следва да бъде извършвано чрез методи като оптическа микроскопия, като се отбелязва преципитатът, който се задържа или се появява по време на култивирането (към края на третирането).

31.

Във всеки опит следва да бъдат включени паралелни положителни контроли и контроли с разтворителя/носителя, както със, така и без метаболитно активиране.

32.

ПК са необходими за показване на способността на използваните клетки и протокола от изпитването с цел идентифициране на кластогените и анеугените, както и за потвърждаване на метаболитния капацитет на препарата S9. За извършване на ПК следва да се използват известни индуктори на образуване на микроядра при концентрации, които се очаква да породят малки, но възпроизводими увеличения над фоновите равнища, както и да се демонстрира чувствителността на системата за изпитване. Концентрациите на положителната контрола следва да са избрани така, че ефектите да са ясни, но да не разкриват непосредствено на четящото устройство идентичността на кодираните предметни стъкла.

33.

Следва да бъде използван кластоген, който изисква метаболитно активиране (напр. циклофосфамид; бензо[а]пирен), за да се демонстрира както метаболитното активиране, така и способността на системата за изпитване за откриване на кластогени. Ако са обосновани, могат да се използват и други ПК. Тъй като някои ПК, които имат нужда от метаболитно активиране, могат да бъдат активни без екзогенно метаболитно активиране при определени условия на третиране или в определени клетъчни линии, необходимостта от метаболитно активиране, както и активността на препарата S9 следва да бъдат изпитани в избраната клетъчна линия и при избраните концентрации.

34.

Понастоящем не са известни анеугени, които изискват метаболитно активиране на тяхната генотоксична активност (16). Възприетите към настоящия момент ПК за анеугенна активност са например колхицин и винбластин. Могат да бъдат използвани и други химикали, ако те индуцират микроядра единствено или основно чрез анеугенна активност. С цел избягване на необходимостта от две ПК (за кластогенност и анеугенност) без метаболитно активиране, контролата на анеугенността може да служи за ПК без S9, а контролата на кластогенността може да бъде използвана за изпитване на адекватността на използваната система за метаболитно активиране. За клетките, които не изискват S9, следва да се използват ПК както за кластогенността, така и за анеугенността. Предложените ПК са включени в допълнение 3.

35.

Може да се обмисли използването на положителни контролни химикали, принадлежащи към даден химичен клас, когато са налични подходящи химикали. Всички използвани ПК следва да бъдат подходящи за клетъчния тип и условията на активиране.

36.

Контролите, третирани с разтворителя/носителя, следва да бъдат включвани за всеки период на събиране. В допълнение към това следва също да се използват нетретирани ОК (които не се третират с разтворителя/носителя), освен когато са налице публикувани или лабораторни контролни данни от предишни изследвания, показващи, че от избрания разтворител при използваната концентрация не се предизвикват генотоксични или други делеционни ефекти.

37.

За да се увеличи в максимална степен вероятността за откриване на анеуген или кластоген, действащ на конкретен стадий от клетъчния цикъл, е важно достатъчен брой клетки да бъдат третирани с изпитваното вещество по време на всички стадии на техните клетъчни цикли. Поради това графикът на третиране за клетъчните линии и първичните клетъчни култури може да се различава в известна степен от графика за лимфоцитите, които изискват митогенна стимулация, за да започнат своя клетъчен цикъл, и тези въпроси са разгледани в точки 41—43 (16).

38.

Теоретичните съображения, заедно с публикуваните данни (18), показват, че повечето анеугени и кластогени ще бъдат открити в рамките на кратък период на третиране от не повече от 3 до 6 часа при наличието и липсата на S9, последван от премахване на изпитваното вещество и период на растеж от 1,5—2,0 клетъчни цикъла (6). Събират се проби от клетките в период, равняващ се на около 1,5—2,0 пъти обичайната (т.е. при липса на третиране) продължителност на клетъчния цикъл или след началото, или в края на третирането (вж. таблица 1). Периодите на вземане на проби или възстановяване могат да бъдат удължени, ако е известно или се допуска, че изпитваното вещество засяга продължителността на клетъчния цикъл (напр. при изпитване на нуклеозидни аналози).

39.

Поради потенциалната цитотоксичност на препаратите S9 за култивирани клетки от бозайници, третиране с удължен период на експозиция с продължителност 1,5—2,0 обичайни клетъчни цикъла се прилага само при липсата на S9. При удължения период на третиране се предлагат варианти, които позволяват третиране на клетките с изпитвания химикал при наличието или липсата на цитоБ. Тези варианти са насочени към ситуации, при които е възможно да има опасения, свързани с възможните взаимодействия между изпитваното вещество и цитоБ.

40.

Предложените графици на третиране на клетките са представени в таблица 1. Тези общи графици на третиране могат да бъдат изменяни в зависимост от стабилността или реактивността на изпитваното вещество или конкретните характеристики, свързани с растежа на използваните клетки. Всички третирания следва да започват и приключват, докато клетките растат експоненциално. Тези графици са представени по-подробно в точки 41—47 по-долу.

Таблица 1

Третиране на клетки и време за събиране за изпитването MNvit

41.

За лимфоцитите най-ефикасният подход е започване на експозицията на изпитваното вещество 44—48 часа след стимулация с ФХА, когато синхронизацията на циклите ще е изчезнала (5). При първоначалното изпитване клетките се третират за период от 3 до 6 часа с изпитваното вещество при липсата и наличието на S9. Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се заменя с чиста среда, която съдържа цитоБ, а клетките се събират след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.

42.

Ако и двете първоначални изпитвания на краткосрочното (3—6 часа) третиране са отрицателни или неясни, се използва последващо третиране с удължен период на експозиция без S9. Налични са два варианта на третиране, като и двата са приемливи в еднаква степен. При все това може да е по-уместно да се използва вариант А за стимулирани лимфоцити, когато е вероятно продължителността на експоненциалния растеж да намалее до 96 часа след стимулацията. Освен това клетъчните култури следва да не са достигнали до сливане към момента на окончателното взимане на проби, както е описано във вариант Б.

43.

Първичните клетки и клетъчните линии следва да бъдат третирани по начин, подобен на начина на третиране на лимфоцитите, с изключение на това, че не е необходимо да бъдат стимулирани с ФХА за период от 44—48 часа. Клетките, различни от лимфоцити, следва да бъдат изложени на въздействие по такъв начин, че към момента на прекратяване на изследването те все още да се намират в логаритмична фаза на растеж.

44.

Клетките следва да бъдат третирани за 3—6 часа при наличие и при липса на S9. Средата, в която се извършва третирането, се премахва и се заменя с чиста среда, а клетките се събират след период с продължителността на 1,5—2,0 нормални клетъчни цикъла.

45.

Ако и двете първоначални изпитвания на краткосрочното (3—6 часа) третиране са отрицателни или неясни, се използва последващо третиране с удължен период на експозиция (без S9). Налични са два варианта на третиране, като и двата са приемливи в еднаква степен:

46.

При еднослойните култури е възможно към края на третирането с продължителност 3—6 часа да присъстват митотични клетки (които се идентифицират като кръгли и отделящи се от повърхността). Тъй като тези митотични клетки се отделят лесно, те могат да се загубят при премахване на средата, съдържаща изпитваното вещество. Следва да се положат грижи те да бъдат събрани при измиване на културите и да бъдат върнати в културите, за да се избегне загубата на клетки, намиращи се в стадий на митоза, и на такива, за които е налице риск от образуване на микроядра, към момента на събиране на клетъчната реколта.

47.

Следва да се използват дубликатни култури за всяка концентрация на изпитвано вещество и за културите, третирани с носителя/разтворителя и отрицателните контролни култури. Когато чрез лабораторната база данни от предишни изследвания може да се докаже минимално вариране между дубликатните култури, използването на единични култури може да бъде приемлив вариант. Ако се използват единични култури, се препоръчва анализирането на увеличен брой концентрации.

48.

Всяка култура се събира и обработва отделно. Подготовката на клетките може да включва хипотонично третиране, но тази мярка не е необходима, ако по друг начин е постигнато адекватно разстилане на клетките. В подготовката на предметното стъкло могат да бъдат използвани различни техники, при условие че е постигната висококачествена подготовка на клетките за оценяване. Цитоплазмата на клетките следва да бъде запазена, за да се даде възможност за откриването на микроядра и (в метода на блокиране на цитокинезата) надеждното идентифициране на двуядрени клетки.

49.

Предметните стъкла могат да бъдат оцветявани чрез използване на различни методи, като Giemsa или флуоресцентни специфични оцветители за ДНК (59). Използването на специфичен оцветител за ДНК (напр. акридин оранжево (61) или Хьохст 33258 плюс пиронин-Y (62) може да елиминира някои от артефактите, свързани с използването на оцветител, който не е специфичен за ДНК. Антикинетохорните антитела, FISH с панцентромерни ДНК проби или праймирано маркиране in situ с праймери, специфични за панцентромера, заедно с подходящо контрастно оцветяване на ДНК, могат да бъдат използвани за идентифициране на съдържанието (хромозоми/хромозомни фрагменти) на микроядрата, ако механистичната информация за тяхното образуване представлява интерес (15) (16). Могат да бъдат използвани и други методи за разграничаване на кластогените от анеугените, ако те са се доказали като ефективни.

50.

Всички предметни стъкла, включително тези на разтворителя/носителя и на контролите, следва да се кодират независимо едно от друго преди микроскопския анализ. Алтернативно, кодираните проби могат да бъдат анализирани чрез използване на валидирана, автоматизирана система за поточна цитометрия или анализ на изображения.

51.

При култури, третирани с цитоБ, честотата на микроядрата следва да бъде анализирана при поне 2 000 двуядрени клетки на концентрация (поне 1 000 двуядрени клетки на култура; две култури на концентрация). Ако се използват единични култури, от тази култура следва да бъдат отчетени поне 2 000 двуядрени клетки на концентрация. Ако за оценяване при всяка концентрация са налични значително по-малко от 1 000 двуядрени клетки на култура или по-малко от 2 000 при единична култура и ако не е открито значително увеличение на микроядрата, изпитването следва да бъде повторено с използване на повече клетки или при по-малко токсични концентрации, което от двете е уместно. Следва да се внимава да не се отчитат двуядрени клетки с неправилни форми или, когато двете ядра се различават в голяма степен по размер, двуядрените клетки не следва да се бъркат със слаборазстлани многоядрени клетки. Клетките, които съдържат повече от две основни ядра, не следва да бъдат анализирани за наличието на микроядра, тъй като базовата честота на микроядрата може да бъде по-висока при тези клетки (63) (64). Отчитането на едноядрените клетки е приемливо, ако е доказано, че изпитваното вещество оказва влияние върху активността на цитоБ.

52.

При клетъчни линии, изпитвани без третиране с цитоБ, микроядрата следва да бъдат отчетени при поне 2 000 клетки на концентрация (поне 1 000 клетки на култура; две култури на концентрация). Когато се използва само една култура на концентрация, от тази култура следва да бъдат отчетени поне 2 000 клетки.

53.

Когато се употребява цитоБ, CBPI или RI следва да бъдат определени за оценка на пролиферацията на клетките (вж. допълнение 2), като се използват поне 500 клетки на култура. Когато третиранията се извършват при липсата на цитоБ, от съществено значение е да бъдат предоставени доказателства, че оценяваните клетки са пролиферирали, както е обсъдено в точки 24—27.

54.

Лаборатория, която предлага да използва изпитването MNvit, описано в този МИ, следва да докаже своята способност надеждно и точно да открива химикали с известна анеугенна и кластогенна активност, със и без метаболитно активиране, както и известни отрицателни химикали чрез използване на референтните химикали, изброени в допълнение 3. Като доказателство за своята способност да извърши този МИ правилно, лабораторията следва да предостави доказателства, че клетките, които се оценяват за образуване на микроядра, са преминали през едно клетъчно делене, ако изпитването е проведено без използване на цитоБ.

55.

Химикалите, изброени в допълнение 3, се препоръчват за използване като референтни химикали. Могат да бъдат включени химикали заместители или допълнителни химикали, ако тяхната активност е известна, ако те индуцират микроядра посредством същите механизми за действие и ако за тях е доказано, че са приложими към химикалите чрез използване на процедурата MNvit. Обосновката може да включва изследване за валидиране, използващо голямо разнообразие от вещества или фокусирано върху по-тесен спектър въз основа на химичния клас на изпитваното вещество или изследвания механизъм на увреждане.

56.

Контролните култури, третирани с разтворителя/носителя, и нетретираните култури следва да имат възпроизводимо ниски и съгласувани честоти на микроядра (обикновено 5—25 микроядра/1 000 клетки за клетъчните типове, идентифицирани в точка 11). Другите типове клетки могат да имат различни спектри от реакции, които следва да бъдат определени, когато те се валидират за използване в изпитването MNvit. Данните от отрицателните контроли, контролите на разтворителя и ПК следва да се използват за установяване на диапазоните от контроли от предишни изследвания. Тези стойности следва да се използват при определяне на адекватността на едновременните НК/ПК за даден експеримент.

57.

Ако за изпитването са предложени незначителни промени на протокола (напр. използване на автоматизирани вместо ръчни техники на оценяване; използване на нов тип клетки), ефективността на промяната следва да бъде показана преди измененият протокол да може да бъде счетен за приемлив за използване. Показването на ефективност включва демонстриране, че могат да се открият основните механизми на разкъсване и придобиване или загуба на хромозоми, както и че могат да бъдат постигнати подходящи положителни и отрицателни резултати за класа на отделните вещества или широкия спектър от вещества, които ще бъдат изпитвани.

58.

Ако се използва техниката на блокиране на цитокинезата, в оценката на индуцирането на микроядра се използват само честотите на двуядрените клетки с микроядра (независимо от броя на микроядрата в една клетка). Отчитането на броя на клетките с едно, две или повече ядра може да предостави полезна информация, но не е задължително.

59.

Следва да се определят съпътстващите измервания на цитотоксичността и/или цитостазата за всички третирани и контролни култури, третирани с разтворителя/носителя (58). Следва да бъдат изчислени CBPI или RI за всички третирани и контролни култури като измервания на забавяне на клетъчния цикъл, когато се използва методът на блокиране на цитокинезата. При липса на цитоБ следва да бъдат използвани RPD, RICC или PI (вж. допълнение 2).

60.

Следва да се предоставят данни за отделните култури. В допълнение към това всички данни следва да бъдат обобщени в табличен вид.

61.

Химикалите, които индуцират микроядра в изпитването Mnvit, постигат това, като индуцират разкъсване на хромозоми, загуба на хромозоми или комбинация от двете. Последващият анализ, при който се използват антикинетохорни антитела, специфични за центромера проби in situ или други методи, може да бъде използван за определяне дали механизмът за индуциране на микроядра се дължи на кластогенна и/или анеугенна активност.

62.

Няма изискване за потвърждаване на ясна положителна или отрицателна реакция чрез допълнително изпитване. Двузначните резултати могат да бъдат изяснени чрез анализ на още 1 000 клетки от всички култури с цел избягване на маскиране. Ако резултатът не бъде изяснен при този подход, следва да бъде извършено допълнително изпитване. Изменението на параметрите на изследването с цел разширяване или стесняване на обхвата на условията, ако е целесъобразно, следва да се вземе предвид при последващите експерименти. Параметрите на изследването, които могат да се изменят, включват границите на изпитваната концентрация, подбиране на подходящия момент на третиране и събирането на клетки и/или условията на метаболитно активиране.

63.

Има няколко критерия за определяне на положителен резултат, като например свързано с концентрацията увеличение, или статистически значимо увеличение в броя на клетките, съдържащи микроядра. Първо следва да се разгледа биологичната значимост на резултатите. Проучването дали наблюдаваните стойности са в рамките на или извън границите на историческата контрола може да осигури насоки при оценката на биологичната значимост на реакцията. Може да бъдат използвани подходящи статистически методи като помощно средство за оценка на резултатите от изпитването (65). Резултатите от статистическото изпитване обаче следва да се оценяват във връзка със зависимостта доза—отговор. Възпроизводимостта и данните от предишни изпитвания също следва да бъдат взети предвид.

64.

Въпреки че повечето опити дават ясни положителни или отрицателни резултати, в някои случаи наборът от данни изключва категоричната преценка за активността на изпитваното вещество. Тези неясни или съмнителни реакции могат да продължат да се получават, независимо колко пъти е повторен опитът.

65.

Положителните резултати от изпитването MNvit показват, че изпитваното вещество индуцира разкъсване на хромозоми или загуба на хромозоми в култивирани клетки от бозайници. Отрицателните резултати показват, че при използваните условия на изпитване изпитваното вещество не индуцира разкъсване на хромозоми и/или придобиване или загуба на хромозоми в култивирани клетки от бозайници.

66.

Протоколът от изпитването следва да включва поне следната информация, когато тя има отношение към провеждането на изпитването:

(1)

Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4.

(2)

Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15.

(3)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246.

(4)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172.

(5)

Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104.

(6)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198.

(7)

Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43.

(8)

Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20.

(9)

Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302.

(10)

Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334.

(11)

Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213.

(12)

Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525.

(13)

Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20.

(14)

Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245.

(15)

Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219.

(16)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163.

(17)

OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline № 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. На разположение на адрес: [[www.oecd.org/env/testguidelines]

(18)

Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36.

(19)

Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60.

(20)

Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87.

(21)

Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124.

(22)

Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152.

(23)

Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208.

(24)

Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59.

(25)

Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116.

(26)

Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190.

(27)

Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71.

(28)

von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163.

(29)

Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134.

(30)

Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580.

(31)

Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152.

(32)

ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 ноември 2006 г., На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(33)

ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, На разположение на адрес: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(34)

Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283.

(35)

Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115.

(36)

Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260.

(37)

Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328.

(38)

Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70.

(39)

Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205.

(40)

Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305.

(41)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(42)

Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36.

(43)

Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18.

(44)

Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31-45.

(45)

Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215.

(46)

Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(47)

Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177.

(48)

Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, стр. 85-88.

(49)

Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(50)

UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). На разположение на адрес: [http://www.pops.int/]

(51)

Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274.

(52)

Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, стр. 91-103.

(53)

Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801.

(54)

Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44.

(55)

Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112.

(56)

Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the in vitro micronucleus assay working group“, Mutation Res., 564, 97-100.

(57)

Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65.

(58)

Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3.

(59)

Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184.

(60)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201.

(61)

Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247.

(62)

MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275.

(63)

Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247.

(64)

Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75.

(65)

Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, стр. 463-467.

(66)

Регламент (ЕО) № 850/2004 на Европейския парламент и на Съвета от 29 април 2004 г. относно устойчивите органични замърсители и за изменение на Директива 79/117/ЕИО, ОВ L 229, 30.4.2004 г., стр. 5.

1.

Указанията за изпитването на химикали на ОИСР и методите за изпитване на ЕС периодично се преразглеждат с оглед на научния прогрес, промяната на регулаторните нужди и съображенията, свързани с хуманното отношение към животните. Първият метод за изпитване (МИ) (Б.42) за определянето на кожна сенсибилизация при мишки — изследването на локалните лимфни възли (LLNA, Указание за изпитване 429 на ОИСР) — бе преработен (1). Публикувана е подробна информация за валидирането на LLNA и е направен преглед на съответните научни трудове (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). При LLNA се използва радиоизотопен тимидин или йод за измерване на пролиферацията на лимфоцитите и поради това изследването има ограничена употреба, когато придобиването, използването или обезвреждането на радиоактивни вещества е проблематично. LLNA: DA (разработено от Daicel Chemical Industries, Ltd.) е нерадиоактивно изменение на LLNA, което определя количествено съдържанието на аденозин трифосфат (АТР) чрез биолуминесценция като индикатор за пролиферацията на лимфоцитите. Методът за изпитване LLNA: DA е валидиран, преработен и препоръчван от международна група за партньорска оценка, тъй като се счита за полезен за идентифициране на химикалите, които са кожни сенсибилизатори, както и на химикалите, които не предизвикват кожна сенсибилизация (10) (11) (12) (13). Този МИ е предназначен за оценка на потенциала на химикалите (вещества и смеси) да предизвикват кожна сенсибилизация при животни. В глава Б.6 от настоящото приложение и в Указание за изпитване 406 на ОИСР се използват изследвания върху морски свинчета, по-специално максимизиращ тест върху морски свинчета и тест на Buehler (14). LLNA (глава Б.42 от настоящото приложение; Указание за изпитване 429 на ОИСР) и двете му нерадиоактивни изменения: LLNA: DA (глава Б.50 от настоящото приложение; Указание за изпитване 442 А на ОИСР) и LLNA: BrdU-ELISA (глава Б.51 от настоящото приложение; Указание за изпитване 442 Б на ОИСР) — всички те предоставят предимство спрямо изследванията върху морски свинчета в Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР (14), що се отнася до намаляването на и усъвършенстването при използването на животни.

2.

Подобно на LLNA, LLNA: DA проучва индукционната фаза при кожна сенсибилизация и осигурява количествени данни, подходящи за оценяване на зависимостта доза—отговор. Освен това способността за откриване на кожни сенсибилизатори без да е необходимо използването на радиомаркер за ДНК елиминира потенциалната възможност за професионална експозиция на радиоактивност, както и проблемите, свързани с обезвреждането на отпадъци. Това от своя страна може да даде възможност за повишаване на използването на мишки за откриване на кожни сенсибилизатори, което още повече би могло да намали използването на морски свинчета за изпитване на потенциала за кожна сенсибилизация (т.е. Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР) (14).

3.

Използваните определения са дадени в допълнение 1.

4.

LLNA: DA е модифициран метод LLNA за определяне на химикалите, които са потенциални кожни сенсибилизатори, с известни ограничения. Това не означава непременно, че при всички случаи следва да се използва LLNA: DA вместо LLNA или изследванията върху морски свинчета (т.е. Б.6, Указание за изпитване 406 на ОИСР) (14), а по-скоро че изпитването е равностойно и може да бъде използвано като алтернатива, при която обикновено положителните и отрицателните резултати вече не изискват допълнително потвърждаване (10) (11). Лабораторията, провеждаща изпитването, следва да вземе предвид цялата налична информация за изпитваното вещество преди провеждането на изпитването. Тази информация ще включва идентичността и химичната структура на изпитваното вещество; неговите физикохимични свойства; резултатите от всякакви други in vitro или in vivo токсикологични изпитвания на изпитваното вещество; и токсикологични данни за структурно свързани вещества. Тази информация следва да се вземе предвид, за да се определи дали LLNA: DA е подходящо за изпитваното веществото (с оглед на несъвместимостта на ограничен брой видове химикали с LLNA: DA [вж. точка 5] и като помощно средство при избора на доза.

5.

LLNA: DA е in vivo метод и вследствие на това няма да доведе до преустановяване на използването на животни при оценяването на алергичната контактна сенсибилизираща активност. Той обаче има потенциала да намали използването на животни за тази цел в сравнение с изследванията върху морски свинчета (Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР) (14). Освен това LLNA: DA предлага съществено усъвършенстване (по-малко болка и страдание) на начина, по който животните се използват за изпитване на алергичната контактна сенсибилизация, тъй като за разлика от Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР LLNA: DA не изисква да се разкрие кожна свръхчувствителност след предизвикване. Въпреки предимствата на LLNA: DA пред Б.6 и Указание за изпитване 406 на ОИСР (14), съществуват определени ограничения, които могат да доведат до необходимост от използване на Б.6 или на Указание за изпитване 406 на ОИСР (напр. изпитването на определени метали, фалшиво положителни резултати при определени кожни дразнители) [например някои видове повърхностноактивни вещества] (6) (1 и глава Б.42 от настоящото приложение) или разтворимостта на изпитваното вещество). Освен това химичните класове или вещества, съдържащи функционални групи, за които е доказано, че водят до възможно объркване (16), могат да доведат до необходимост от използване на изследванията върху морски свинчета (т.е. Б.6; Указание за изпитване 406 на ОИСР (14)). В допълнение се препоръчва установените за LLNA ограничения (1 и глава Б.42 от настоящото приложение) да бъдат прилагани и по отношение на LLNA: DA (10). Освен това използването на LLNA: DA може да не е подходящо за изпитвани вещества, които влияят на нивата на аденозин трифосфат (АТР) (напр. вещества, които действат като инхибитори на АТР), или такива, които влияят на точното измерване на вътреклетъчния ATP (напр. наличието на ATP-разграждащи ензими, наличието на извънклетъчен ATP в лимфния възел). С изключение на тези установени ограничения LLNA: DA следва да се прилага за изпитване на всички вещества, освен ако съществуват свързани с тези вещества свойства, които могат да повлияят на точността на LLNA: DA. Освен това следва да бъде обърнато внимание на възможността за гранични положителни резултати, когато са получени стойности на стимулационния индекс (SI) между 1,8 и 2,5 (вж. точка 31—32). Това се основава на базата данни от валидирането, състояща се от 44 вещества, които използват SI ≥ 1,8 (вж. точка 6), за които изследването LLNA: DA: правилно е определило всички 32 сенсибилизатора при LLNA, но неправилно е определило три от 12-те вещества, които не са сенсибилизатори при LLNA със стойности на SI между 1,8 и 2,5 (т.е гранични положителни) (10). При все това, тъй като същият набор от данни беше използван за определяне на стойностите на SI и изчисляване на прогнозните способности на изпитването, посочените резултати могат да представляват надценяване на реалните прогнозни способности.

6.

Основният принцип, залегнал в LLNA: DA, е, че сенсибилизаторите предизвикват пролиферация на лимфоцитите в лимфните възли, дрениращи мястото на прилагане на изпитваното вещество. Тази пролиферация е пропорционална на дозата и на действието на приложения алерген и осигурява лесен начин за получаване на количествено измерване на сенсибилизацията. Пролиферацията се измерва чрез сравняване на средната пролиферация във всяка изпитвана група със средната пролиферация в третираната с носителя контролна група (КН). Съотношението на средната пролиферация във всяка третирана група спрямо тази в паралелната третирана с носителя контролна група, наречено SI, е предварително определено и следва да бъде ≥ 1,8, за да може изпитваното вещество да бъде оценено по-нататък като потенциален кожен сенсибилизатор. Описаните тук процедури се основават на измерването на съдържанието на ATP чрез използването на биолуминесценция (за която е известно, че корелира с броя на живите клетки) (17) за показване на увеличения брой на пролифериращите клетки в дрениращите аурикуларни (ушни) лимфни възли (18) (19). Биолуминесцентният метод използва ензима луцифераза за катализиране на образуването на светлина от ATP и луциферин съгласно следната реакция:

ATP + Луциферин + O 2 Оксилуцифеpuн + AMP + PPi + CO 2 + светлина

Интензитетът на излъчваната светлина е в линейна зависимост от концентрацията на ATP и се измерва чрез използването на луминометър. Изпитването луциферин—луцифераза е чувствителен метод за количествено определяне на ATP и се използва в широк кръг от приложения (20).

7.

Видът животно, избран за това изследване, е мишката. Изследванията за валидиране на LLNA: DA бяха проведени изключително с мишки от порода CBA/J, която поради това се счита за предпочитаната порода (12) (13). Използват се млади възрастни мишки от женски пол, които не са раждали и не са бременни. В началото на изследването животните следва да бъдат на възраст между 8—12 седмици и отклоненията в теглото им следва да бъдат минимални и да не превишават 20 % от средното тегло. Алтернативно могат да бъдат използвани животни от други породи и от мъжки пол, когато има достатъчно събрани данни, които доказват, че не съществува реакция при LLNA: DA, която да показва съществени различия, обусловени от пола и/или породата.

8.

Мишките следва да бъдат групово отглеждани (21), освен ако е направена подходяща научна обосновка за индивидуално отглеждане на мишките. Температурата в стаята на опитните животни следва да бъде 22 ± 3 °C. Въпреки че относителната влажност следва да бъде поне 30 % и е препоръчително тя да не надвишава 70 % освен по време на почистване на стаята, целта е относителната влажност да се поддържа в интервала 50—60 %. Осветлението следва да бъде изкуствено, като последователността е 12 часа светлина, 12 часа тъмнина. За храненето могат да се използват обичайните лабораторни диети с неограничен достъп до вода за пиене.

9.

Животните се избират произволно, маркират се, за да е възможно индивидуалното им идентифициране (но не и чрез маркиране на ушите им) и се оставят в клетките си поне пет дни преди започване на дозирането, за да се аклиматизират към лабораторните условия. Преди да започне третирането, всички животни се изследват, за да се потвърди отсъствието на видими кожни лезии.

10.

Твърдите химикали следва да се разтворят или суспендират в разтворители/носители и ако е необходимо, да се разредят преди прилагането им върху ушите на мишките. Течните химикали могат да се прилагат в чист или разреден вид преди дозирането. Неразтворимите химикали като тези, които обикновено се наблюдават в медицинските изделия, следва да се подложат на засилена екстракция в подходящ разтворител, за да се проявят всички екстрахируеми съставки за изпитване преди прилагането им върху ушите на мишките. Изпитваните вещества следва да се приготвят ежедневно, освен ако данните за устойчивостта им показват, че те могат да се съхраняват.

11.

Положителните контролни химикали (ПК) се използват за доказване на подходящо провеждане на изпитването чрез реагиране с достатъчна и възпроизводима чувствителност на сенсибилизиращо изпитвано вещество, за което степента на реакция е добре характеризирана. Препоръчва се включването на паралелна положителна контрола (ПК), защото така се доказва компетентността на лабораторията успешно да провежда всяко изследване и позволява оценка на вътрешно- и междулабораторната възпроизводимост и сравнимост. Някои регулаторни органи също изискват ПК за всяко изпитване и поради това е препоръчително потребителите да се консултират със съответните органи преди провеждането на LLNA: DA. Следователно се насърчава рутинното използване на паралелна ПК, за да се избегне необходимостта от изследване на допълнителни животни за изпълняването на тези изисквания, които биха могли да възникнат в резултат на използването на периодична ПК (вж. точка 12). ПК следва да предизвика положителна LLNA: DA реакция при ниво на експозиция, при което се очаква нарастване на стимулационния индекс SI ≥ 1,8 спрямо отрицателната контролна група (ОК). Дозата за ПК следва да бъде избрана така, че да не причинява прекомерно кожно дразнене или системна токсичност и индукцията да е възпроизводима, но не прекомерна (например SI > 10 би се считало за прекомерно). Предпочитаните ПК са 25 % хексилканелен алдехид (№ 101-86-0 съгласно химичния регистър на Службата за химични индекси [CAS]) и 25 % евгенол (CAS номер 97-53-0) в ацетон: зехтин (4:1, об./об.). Може да има обстоятелства, при които след направено подходящо обосноваване могат да бъдат използвани други положителни контроли, отговарящи на горепосочените критерии.

12.

При все че е препоръчително постоянното включване на паралелна положителна контролна (ПК) група, могат да съществуват ситуации, при които периодичното изпитване (т.е. на интервали ≤ 6 месеца) на ПК може да бъде подходящо за лаборатории, които редовно провеждат LLNA: DA (т.е. провеждат LLNA: DA с честота не по-малко от веднъж месечно) и имат създадена база данни от предишни изпитвания с ПК, доказваща способността на лабораторията да получава възпроизводими и точни резултати с положителните контроли. Подходяща компетентност за провеждане на LLNA: DA може да бъде успешно доказана чрез получаването на последователни положителни резултати с ПК при най-малко 10 независими изпитвания, проведени в рамките на разумен период от време (т.е. по-малко от една година).

13.

Паралелна ПК група следва да се включва винаги, когато има процедурна промяна в LLNA: DA (например промяна на обучения персонал, промяна на материалите и/или реагентите, с които се провежда методът за изпитване, промяна на оборудването, с което се провежда методът за изпитване, промяна в произхода на опитните животни), като тези промени следва да бъдат документирани в лабораторни доклади. Следва да бъде обърнато внимание на въздействието на тези промени върху годността на предварително създадената база данни от предишни изпитвания с оглед да се определи необходимостта от създаване на нова база данни от предишни изпитвания за документиране на последователността на резултатите с ПК.

14.

Изследователите следва да са наясно, че решението за периодично провеждане на изпитване с ПК вместо паралелното му провеждане има последици върху годността и приемливостта на отрицателните резултати от изпитването, получени без паралелна ПК по време на интервала между всяко периодично изпитване с ПК. Например, ако се получи фалшиво отрицателен резултат при периодичното изпитване с ПК, отрицателните резултати за изпитваното вещество, получени по време на интервала между последното приемливо периодично изпитване с ПК и неприемливото периодично изпитване с ПК, могат да бъдат поставени под съмнение. Изводите относно тези резултати следва внимателно да бъдат взети предвид при определяне дали да се включват паралелни ПК или само да се провеждат периодични ПК. Следва да се обърне внимание и на използването на по-малко животни в паралелната ПК група, когато това е научно обосновано и ако лабораторията докаже, въз основа на конкретните за лабораторията данни от предишни изпитвания, че могат да бъдат използвани по-малко мишки (22).

15.

Въпреки че ПК следва да бъде изпитвана в носител, за който е известно, че при прилагането му се получава постоянна реакция (напр. ацетон: зехтин; 4:1, об./об.), може да има определени регулаторни ситуации, при които ще бъде необходимо провеждането на изпитване и в нестандартен носител (клинично/химично отговаряща формулация) (23). Ако паралелната ПК се изпитва в различен носител от изпитваното вещество, тогава следва да бъде включена отделна третирана с носителя контролна група за паралелната ПК.

16.

В случаи, при които се оценяват вещества от определен химичен клас или спектър от реакции, еталонните вещества също могат да бъдат от полза, за да се докаже, че методът за изпитване функционира правилно по отношение на откриването на потенциала за кожна сенсибилизация на тези видове вещества. Подходящите еталонни вещества следва да притежават следните свойства:

17.

Използват се минимум четири животни за подложена на дадена доза група, при минимум три концентрации на изпитваното вещество, плюс паралелна отрицателна контролна група (ОК), третирана само с носителя на изпитваното вещество, както и ПК (паралелна или скорошна въз основа на лабораторната политика, като се вземат предвид точки 11—15). Следва да се обмисли изпитването на множество дози на ПК, особено когато не се провеждат редовни изпитвания на ПК. Животните от контролните групи следва да бъдат отглеждани и третирани по начин, идентичен с този, на животните от третираните групи, с изключение на това, че липсва третиране с изпитваното вещество.

18.

Изборът на доза и носител следва да бъде основан на препоръките, посочени в библиографски бележки 2 и 24. Последователните дози обикновено се избират от подходяща поредица от концентрации като например 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % и т.н. Изборът на използваната поредица от концентрации следва да бъде придружен от подходяща научна обосновка. Цялата съществуваща токсикологична информация (напр. остра токсичност и кожно дразнене) и информацията за структурните и физикохимичните свойства на представляващото интерес изпитвано вещество (и/или структурно свързаните вещества) следва да бъде взета предвид в случай на наличност при избора на трите последователни концентрации, така че най-високата концентрация да увеличава в максимална степен експозицията, като същевременно се избягва системната токсичност и/или прекомерното локално кожно дразнене (24) (25). При липсата на такава информация може да е необходимо първоначално предварително скринингово изпитване (вж. точки 21—24).

19.

Носителят не следва да пречи или да оказва влияние на резултата от изпитването и следва да бъде избран въз основа на способността си максимално да повишава разтворимостта, за да се получи най-високата постижима концентрация, като същевременно се приготвя подходящ разтвор/суспензия за прилагане на изпитваното вещество. Препоръчителните носители са ацетон: зехтин (4:1, об./об.), N,N-диметилформамид, метилетилкетон, пропилен гликол и диметилсулфоксид (6), но могат да бъдат използвани и други, при условие че се предостави достатъчна научна обосновка. При определени ситуации може да бъде необходимо да се използват клинично обусловени разтворители или търговска формулация, в която изпитваното вещество се маркира като допълнителна контрола. Особено внимание следва да бъде обърнато, за да се гарантира, че хидрофилните изпитвани вещества се инкорпорират в среда от носители, която навлажнява кожата и не се изпарява веднага чрез инкорпорирането на подходящи солюбилизатори (напр. 1 % плуроник — Pluronic® L92). Поради тази причина носителите на изцяло водна основа трябва да бъдат избягвани.

20.

Обработката на лимфни възли от отделни мишки дава възможност за оценка на вариабилността между животните и за статистическо сравнение на разликата между изпитваното вещество и измерванията в третираната с носителя контролна група (вж. точка 33). В допълнение на това е възможно оценяване на възможността за намаляване на броя на мишките в ПК група, когато са събрани индивидуални данни за отделните животни (22). Освен това някои регулаторни органи изискват събирането на индивидуални данни за отделните животни. Редовното събиране на индивидуални данни за отделните животни предоставя предимство по отношение на хуманното отношение към животните, като се избягва дублирането на изпитвания, което би било необходимо, ако резултатите за изпитваното вещество, които първоначално са събрани по един начин (напр. чрез сборни данни за животните), по-късно бъдат разглеждани от регулаторни органи с други изисквания (напр. за събиране на индивидуални данни за отделните животни).

21.

При липсата на информация за определянето на най-високата доза за изпитване (вж. точка 18) следва да се извърши предварително скринингово изпитване, за да се определи подходящото ниво на дозата за изпитване при LLNA: DA. Целта на предварителното скринингово изпитване е да предостави насоки за избора на максималното ниво на дозата, което да бъде използвано в основното изпитване LLNA: DA, в случаите, когато не е налична информация за концентрацията, която причинява системна токсичност (вж. точка 24) и/или прекомерно локално кожно дразнене (вж. точка 23). Изпитваното максимално ниво на дозата следва да бъде 100 % от изпитваното вещество за течности или максималната възможна концентрация за твърди вещества или суспензии.

22.

Предварителното скринингово изпитване се провежда при условия, идентични на тези в основното изпитване LLNA: DA, с изключение на това, че не се оценява пролиферацията на лимфните възли и могат да бъдат използвани по-малко животни за подложена на дадена доза група. Предлага се използването на едно или две животни за подложена на дадена доза група. Всички мишки се наблюдават ежедневно за всякакви клинични признаци за системна токсичност или локално дразнене на мястото на прилагане. Телесните тегла се записват преди изпитването и преди завършването му (ден 8). И двете уши на всяка мишка се наблюдават за еритема и резултатите се отчитат, като се използва таблица 1 (25). Измерванията на дебелината на ушите се правят, като се използва измервателен уред за дебелината (напр. цифров микрометър или измервателен уред за дебелина Peacock Dial) в ден 1 (преди дозирането), ден 3 (приблизително 48 часа след първата доза), ден 7 (24 часа преди приключването) и ден 8. Освен това дебелината на ушите в ден 8 би могла да бъде определена чрез продупчване на ушите и определяне на теглото на взетите продупчени части, което следва да се извърши след като животните бъдат умъртвени по хуманен начин. Показател за прекомерно локално дразнене е балова оценка на еритемата ≥ 3 и/или дебелина на ушите в размер на ≥ 25 % в който и било от дните с измервания (26) (27). Най-високата доза, избрана за основното изпитване LLNA: DA, ще бъде следващата по-ниска доза от поредицата от концентрации в предварителното скринингово изпитване (вж. точка 18), която не причинява системна токсичност и/или прекомерно локално кожно дразнене.

Таблица 1

Оценки на еритемата

23.

В допълнение към увеличаване на дебелината на ушите с 25 % (26) (27), за идентифициране на дразнители при LLNA също така се използва статистически значимо увеличаване на дебелината на ушите при третираните мишки в сравнение с контролните мишки (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Въпреки това, макар че могат да възникнат статистически значими увеличения, когато дебелината на ушите е по-малка от 25 %, те не са конкретно свързани с прекомерното дразнене (30) (31) (32) (33) (34).

24.

Следните клинични наблюдения могат да показват системна токсичност (35), когато се използват като част от интегрална оценка, и поради това могат да показват максималното ниво на дозата, което да се използва в основното LLNA: DA: промени във функционирането на нервната система (напр. пилоерекция, атаксия, тремори и конвулсии); промени в поведението (напр. агресивност, промяна в хигиената на тялото, изразена промяна в нивото на активност); промени в начина на дишане (т.е. промени в честотата и интензивността на дишането като диспнея, задъханост и хрипове) и промени в консумацията на храна и вода. Освен това в оценката следва да бъдат взети предвид признаци на летаргия и/или липса на реакция и всякакви клинични признаци на нещо повече от лека или моментна болка и страдание или намаляване на телесното тегло > 5 % от ден 1 до ден 8, както и смъртността. Умиращите животни, както и животните, които показват признаци на силна болка или страдание, следва да бъдат умъртвени по хуманен начин (36).