a)

la concentrazione di un analita nell'estratto di un campione che produce una risposta strumentale a due diversi ioni da monitorare con un rapporto S/R (segnale/rumore) di 3:1 per il segnale meno intenso dei dati grezzi;

oppure, se per motivi tecnici il calcolo del rapporto segnale/rumore non fornisce risultati affidabili,

b)

il punto di concentrazione più basso su una curva di calibrazione che produce una deviazione accettabile (≤30 %) e coerente (misurata almeno all'inizio e alla fine della serie analitica di campioni) rispetto al fattore di risposta relativo medio calcolato per tutti i punti sulla curva di calibrazione per ciascuna serie di campioni (3).

BEQ

Equivalenti bioanalitici

GC

Gascromatografia

HRMS

Spettrometria di massa ad alta risoluzione

LRMS

Spettrometria di massa a bassa risoluzione

MS/MS

Spettrometria di massa tandem

PCB

Policlorobifenili

PCDD

Policlorodibenzo-p-diossine

PCDF

Policlorodibenzofurani

QC

Controllo di qualità

REP

Potenziale relativo

TEF

Fattore di equivalenza tossica

TEQ

Equivalenti tossici

TCDD

Tetraclorodibenzodiossina

U

Incertezza di misura estesa

—

Se la partita da cui è prelevato il campione è costituita da pesci di piccole dimensioni (di peso inferiore a 1 kg circa), il pesce intero è prelevato come campione elementare per formare il campione globale. Se il campione globale che ne risulta pesa più di 3 kg, i campioni elementari possono essere costituiti dalla parte centrale, del peso di almeno 100 grammi, dei pesci che formano il campione globale. La parte intera cui si applica il livello massimo è utilizzata per l'omogeneizzazione del campione.

La parte centrale del pesce è quella in cui si trova il centro di gravità, che nella maggior parte dei casi si situa in corrispondenza della pinna dorsale (se il pesce ne è provvisto) o a uguale distanza dall'apertura branchiale e dall'ano.

—

Se la partita da cui è prelevato il campione è costituita da pesci di maggiori dimensioni (di peso superiore a 1 kg circa), il campione elementare è costituito dalla parte centrale del pesce. Il peso di un campione elementare è di almeno 100 grammi.

Nel caso di pesci di dimensioni intermedie (da 1 a 6 kg circa) il campione elementare è costituito da una trancia prelevata nella parte centrale del pesce dalla colonna vertebrale al ventre.

Nel caso di pesci di dimensioni molto grandi (di peso superiore a 6 kg circa), il campione elementare è prelevato dal muscolo dorsolaterale destro (vista frontale) nella parte centrale del pesce. Qualora il prelievo di questa porzione dalla parte centrale del pesce comporti un considerevole danno economico, può essere considerato sufficiente il prelievo di tre campioni elementari di almeno 350 grammi ciascuno, indipendentemente dalle dimensioni della partita; in alternativa, per formare il campione elementare rappresentativo del livello di diossine nell'intero pesce possono essere prelevate parti uguali dal muscolo vicino alla coda e dal muscolo vicino alla testa.

—

Si applicano le disposizioni del punto III.3 per quanto riguarda la costituzione del campione.

—

Nel caso in cui predomini una classe/categoria di dimensione o peso (80 % circa o più della partita) il campione è prelevato dai pesci appartenenti alla classe/categoria predominante. Tale campione è considerato rappresentativo dell'intera partita.

—

Nel caso in cui non predomini una particolare classe/categoria di dimensione o peso, occorre assicurarsi che i pesci selezionati per costituire il campione siano rappresentativi della partita. Il «Guidance document on sampling of whole fishes of different size and/or weight» (1) fornisce orientamenti specifici per questo tipo di situazioni.

—

calcolando l'incertezza estesa, utilizzando un fattore di copertura pari a 2 corrispondente a un livello di affidabilità del 95 % circa. Una partita o sottopartita non è conforme se il valore misurato meno U supera il livello consentito stabilito;

—

stabilendo il limite di decisione (CCα) secondo le disposizioni della decisione 2002/657/CE della Commissione (punto 3.1.2.5 dell'allegato I di tale decisione; caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito). Una partita o sottopartita non è conforme se il valore misurato è pari o superiore al CCα.

—

eseguita con un metodo di screening con un tasso di falsi conformi inferiore al 5 % indica che il livello non supera i livelli massimi fissati dal regolamento (CE) n. 1881/2006 rispettivamente per PCDD/F e per la somma di PCDD/F e PCB diossina-simili;

—

eseguita con un metodo di conferma non supera i livelli massimi fissati dal regolamento (CE) n. 1881/2006 rispettivamente per PCDD/F e per la somma di PCDD/F e PCB diossina-simili tenendo conto dell'incertezza di misura.

—

calcolando l'incertezza estesa, utilizzando un fattore di copertura pari a 2 corrispondente a un livello di affidabilità del 95 % circa. Una partita o sottopartita non è conforme se il valore misurato meno U supera il livello consentito stabilito. Nel caso di una determinazione separata di PCDD/F e PCB diossina-simili, la somma dell'incertezza estesa stimata dei risultati analitici separati di PCDD/F e PCB diossina-simili deve essere utilizzata per la somma di PCDD/F e PCB diossina-simili;

—

stabilendo il limite di decisione (CCα) secondo le disposizioni della decisione 2002/657/CE (punto 3.1.2.5 dell'allegato I di tale decisione; caso di sostanze per le quali è stato stabilito un limite consentito). Una partita o sottopartita non è conforme se il valore misurato è pari o superiore al CCα.

a)

Metodi di screening

L'obiettivo dei metodi di screening è selezionare i campioni con livelli di PCDD/F e PCB diossina-simili superiori ai livelli massimi o di azione. I metodi di screening dovrebbero consentire un alto throughput di campioni a costi commisurati all'efficacia, in modo da accrescere la possibilità di scoprire nuovi incidenti con alta esposizione e rischi per la salute dei consumatori. La loro applicazione ha lo scopo di evitare i risultati falsi conformi. Essi possono comprendere metodi bioanalitici e metodi GC/MS.

I metodi di screening confrontano il risultato analitico con un valore di cut-off e danno una decisione sì/no indicativa del possibile superamento del livello massimo o di azione. La concentrazione di PCDD/F e la somma di PCDD/F e PCB diossina-simili nei campioni che si sospetta non siano conformi al livello massimo deve essere determinata/confermata mediante un metodo di conferma.

I metodi di screening possono inoltre fornire un'indicazione dei livelli di PCDD/F e dei PCB diossina-simili presenti nel campione. In caso di applicazione di metodi di screening bioanalitici il risultato è espresso in equivalenti bioanalitici (BEQ), mentre in caso di applicazione di metodi fisico-chimici GC-MS tale risultato è espresso in equivalenti tossici (TEQ). I risultati numerici dei metodi di screening sono atti a dimostrare la conformità o la sospetta non conformità dei livelli di azione nonché il loro superamento; forniscono inoltre un'indicazione del range dei livelli in caso di follow-up con metodi di conferma. Non sono idonei per attività quali la valutazione dei livelli di background, la stima dell'assunzione, il monitoraggio delle tendenze nel tempo dei livelli o la ri-valutazione dei livelli massimi e di azione.

b)

Metodi di conferma

I metodi di conferma consentono di identificare e di quantificare in modo inequivoco i PCDD/F e i PCB diossina-simili presenti nel campione e forniscono informazioni complete in base ai congeneri. Questi metodi permettono pertanto di controllare i livelli massimi e di azione, compresa la conferma dei risultati ottenuti con i metodi di screening. I risultati possono inoltre essere utilizzati per altri scopi quali la determinazione dei livelli di background bassi nel controllo degli alimenti, il monitoraggio delle tendenze nel tempo, la valutazione dell'esposizione della popolazione e la creazione di una base di dati per l'eventuale ri-valutazione dei livelli di azione e massimi. Essi sono importanti anche per stabilire pattern di congeneri al fine di identificare la fonte di una eventuale contaminazione. Tali metodi impiegano la GC-HRMS. Al fine di confermare la conformità o la non conformità con il livello massimo può essere impiegata anche la GC-MS/MS.

—

Devono essere adottate misure per evitare contaminazioni incrociate durante ogni fase del campionamento e dell'analisi.

—

I campioni devono essere conservati e trasportati in contenitori di vetro, alluminio, polipropilene o polietilene, che ne permettano la conservazione senza influenzare i livelli di PCDD/F e di PCB diossina-simili. Le tracce di polvere di carta devono essere rimosse dal contenitore.

—

La conservazione e il trasporto devono avvenire in modo da preservare l'integrità del campione di prodotto alimentare.

—

Se necessario, macinare finemente e mescolare bene ogni campione di laboratorio ricorrendo a un metodo che garantisca una completa omogeneizzazione (ad esempio, macinazione che consenta al materiale di passare attraverso un setaccio a maglie di 1 mm); prima della macinazione, i campioni devono essere asciugati, qualora il tenore di umidità sia troppo elevato.

—

È di importanza generale il controllo dei reagenti, della vetreria e delle apparecchiature per evitare che influenzino i risultati espressi in TEQ o BEQ.

—

È effettuata un'analisi in bianco, eseguendo l'intera procedura analitica senza il campione.

—

Per i metodi bioanalitici è di grande importanza verificare che la vetreria e i solventi utilizzati nell'analisi siano esenti da composti che interferiscono con la rilevazione dei composti bersaglio nel working range (campo di applicazione). La vetreria deve essere risciacquata con solventi e/o riscaldata a temperature che consentano di eliminare dalla superficie le tracce di PCDD/F, composti diossina-simili e composti interferenti.

—

La quantità del campione utilizzato per l'estrazione deve essere sufficiente a permettere la conformità ai requisiti in relazione a un working range sufficientemente basso comprendente le concentrazioni di livelli massimi o di azione.

—

Le procedure specifiche di preparazione dei campioni utilizzate per i prodotti considerati sono conformi a linee guida internazionalmente accettate.

—

Nel caso dei pesci, è necessario eliminare la pelle, dato che il livello massimo si applica al muscolo privo di pelle. Occorre però rimuovere accuratamente e completamente tutti i resti di muscolo e di grasso che aderiscono alla parte interna della pelle e aggiungerli al campione da analizzare.

—

Come prescritto dal regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio (1), i laboratori devono essere accreditati da un organismo riconosciuto operante in conformità alla Guida ISO 58, per garantire che alle loro analisi sia applicata l'assicurazione qualità. I laboratori devono essere accreditati in base alla norma EN ISO/IEC 17025.

—

La competenza del laboratorio è dimostrata dalla partecipazione regolare ed efficace a studi condotti in collaborazione con altri laboratori per la determinazione di PCDD/F e di PCB diossina-simili nelle matrici di alimenti e nei range di concentrazioni corrispondenti.

—

I laboratori che applicano metodi di screening per il controllo di routine dei campioni instaurano una stretta cooperazione con i laboratori che applicano il metodo di conferma per il controllo di qualità e per la conferma del risultato analitico dei campioni sospetti.

—

Per i PCDD/F le quantità rilevabili devono situarsi nel range superiore del femtogrammo (10– 15g), data l'estrema tossicità di alcuni di questi composti. Per la maggior parte dei congeneri dei PCB è già sufficiente il limite di quantificazione dell'ordine del nanogrammo (10– 9g). Tuttavia, per la misura dei congeneri più tossici dei PCB diossina-simili (in particolare i congeneri non orto-sostituiti) il limite inferiore del working range deve raggiungere i livelli bassi del picogrammo (10– 12g).

—

Occorre distinguere tra PCDD/F e PCB diossina-simili e una moltitudine di altri composti coestratti che possono generare un'interferenza, presenti anche in concentrazioni superiori di vari ordini di grandezza a quelle degli analiti di interesse. Per i metodi di gascromatografia/spettrometria di massa (GC-MS), è necessaria una differenziazione tra i vari congeneri, in particolare tra quelli tossici (ad esempio, i diciassette PCDD/F 2,3,7,8-sostituiti e i dodici PCB diossina-simili) e gli altri congeneri.

—

I metodi bioanalitici permettono di rilevare i composti bersaglio come somma di PCDD/F e/o PCB diossina-simili. Il clean-up del campione ha lo scopo di eliminare i composti che causano risultati falsi non conformi o che possono diminuire la risposta, causando risultati falsi conformi.

—

Per i metodi GC-MS la determinazione fornisce una stima valida della vera concentrazione in un campione. È necessaria un'alta accuratezza (accuratezza della misura: grado di concordanza tra il risultato di una misura e il valore vero o assegnato del misurando) per evitare che il risultato dell'analisi di un campione sia respinto a causa della scarsa affidabilità del livello di TEQ determinato. L'accuratezza è espressa come esattezza (differenza tra il valore medio misurato per un analita in un materiale certificato e il suo valore certificato, espressa in percentuale di tale valore) e precisione (deviazione standard relativa RSDR calcolata in base a risultati ottenuti in condizioni di riproducibilità).

—

Per i metodi bioanalitici è determinato il recupero apparente del biodosaggio.

—

I laboratori dimostrano la performance di un metodo nel range del livello massimo, ad esempio 0,5 ×, 1 × e 2 × il livello massimo con un coefficiente di variazione accettabile per le analisi ripetute, durante la procedura di validazione e/o durante le analisi di routine.

—

Controlli regolari in bianco ed esperimenti spiking o analisi di campioni di controllo (di preferenza, se disponibile, materiale di riferimento certificato) sono effettuati come misure interne di controllo della qualità. Per i controlli in bianco, gli esperimenti spiking o le analisi dei campioni di controllo sono registrate e verificate carte di controllo qualità (QC) per assicurare che la performance analitica sia conforme alle prescrizioni.

—

Per un metodo di screening bioanalitico non è indispensabile fissare il limite di quantificazione, ma il metodo deve dimostrare di poter differenziare tra il valore bianco e il valore di cut-off. Quando è fornito un livello BEQ, è fissato un livello di reporting per trattare i campioni che presentano una risposta al di sotto di tale livello. Il livello di reporting è dimostrato diverso dai campioni bianchi di procedura di almeno di un fattore tre, con una risposta al di sotto del working range. È quindi calcolato a partire da campioni contenenti i composti bersaglio attorno al livello minimo richiesto, e non da un rapporto S/R o un dosaggio bianco.

—

Il limite di quantificazione per un metodo di conferma è dell'ordine di circa un quinto del livello massimo.

—

Affinché i metodi di conferma o di screening diano risultati affidabili, devono essere soddisfatti i seguenti criteri nel range del livello massimo o del livello di azione, rispettivamente per il valore TEQ e il valore BEQ, determinati come TEQ totale (somma di PCDD/F e PCB diossina-simili) o separatamente per PCDD/F e PCB diossina-simili.

—

Per lo screening possono essere utilizzati metodi GC-MS e metodi bioanalitici. Per i metodi GC-MS valgono le prescrizioni indicate al punto 6 del presente allegato. Per i metodi bioanalitici cellulari valgono le prescrizioni specifiche indicate al punto 7 del presente allegato.

—

I laboratori che applicano metodi di screening per il controllo di routine dei campioni instaurano una stretta cooperazione con i laboratori che applicano il metodo di conferma.

—

Durante l'analisi di routine la performance del metodo di screening deve essere verificata mediante un controllo della qualità analitica e una validazione del metodo on-going. È necessario un programma continuo per il controllo dei risultati conformi.

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Controllo dell'eventuale soppressione della risposta cellulare e della citotossicità

Il 20 % degli estratti del campione è misurato in screening di routine senza e con aggiunta di 2,3,7,8-TCDD corrispondente al livello massimo o di azione, per verificare se la risposta è soppressa da sostanze interferenti presenti nell'estratto del campione. La concentrazione misurata del campione spiked è comparata con la somma della concentrazione dell'estratto unspiked e della concentrazione dello spiking. Se la concentrazione misurata è inferiore di più del 25 % alla concentrazione (somma) calcolata, si ha un'indicazione di una potenziale soppressione del segnale e il rispettivo campione deve essere sottoposto ad analisi di conferma. I risultati sono monitorati in carte di controllo qualità.

—

Controllo di qualità sui campioni conformi

Sono confermati dal 2 al 10 % circa dei campioni conformi, secondo la matrice del campione e l'esperienza del laboratorio.

—

Determinazione dei tassi di falsi conformi a partire dai dati QC.

È determinato il tasso dei risultati falsi conformi dello screening di campioni al di sotto e al di sopra del livello massimo o del livello di azione. I tassi reali di falsi conformi sono inferiori al 5 %.

Se si dispone di un minimo di 20 risultati confermati per matrice/gruppo di matrici dal controllo di qualità dei campioni conformi, da questa base di dati sono tratte conclusioni sul tasso di falsi conformi. I risultati dei campioni analizzati in ring trial o durante incidenti di contaminazione che coprono un range di concentrazione fino a per esempio 2 volte il livello massimo (LM) possono essere inclusi nel minimo di 20 risultati per la valutazione del tasso di falsi conformi. I campioni coprono i pattern di congeneri più frequenti, rappresentanti varie fonti.

Anche se i dosaggi di screening sono diretti principalmente a individuare campioni che superano il livello di azione, il criterio per la determinazione dei tassi di falsi conformi è il livello massimo, tenendo conto dell'incertezza di misura del metodo di conferma.

—

I risultati potenzialmente non conformi dello screening sono sempre verificati con una nuova analisi completa mediante un metodo analitico di conferma. Questi campioni possono anche essere utilizzati per valutare il tasso di risultati falsi non conformi. Per i metodi di screening, il tasso di «risultati falsi non conformi» è la frazione dei risultati confermati conformi dall'analisi di conferma, quando nello screening precedente il campione era stato dichiarato sospetto non conforme. Tuttavia, la valutazione della vantaggiosità del metodo di screening si basa sul confronto dei campioni falsi non conformi con il numero totale di campioni controllati. Tale tasso deve essere sufficientemente basso da rendere vantaggioso l'uso di uno strumento di screening.

—

Almeno in condizioni di validazione, i metodi bioanalitici forniscono una valida indicazione del livello di TEQ, calcolato ed espresso in BEQ.

—

Anche per i metodi bioanalitici applicati in condizioni di ripetibilità, la RSDr intralaboratorio è di norma inferiore alla riproducibilità RSDr.

—

La differenza tra il livello upperbound e il livello lowerbound non deve essere superiore al 20 % per la conferma del superamento dei livelli massimi o, ove opportuno, di azione.

—

Per convalidare la procedura di analisi, occorre aggiungere all'inizio dell'analisi, ad esempio prima dell'estrazione, standard interni di PCDD/F clorosostituiti alle posizioni 2,3,7,8 e marcati con 13C e standard interni di PCB diossina-simile marcati con 13C. Deve essere aggiunto almeno un congenere per ciascuno dei gruppi omologhi da tetra a octaclorati di PCDD/F e almeno un congenere per ciascuno dei gruppi omologhi di PCB diossina-simile (in alternativa, almeno un congenere per ciascuna funzione di registrazione di ioni selezionati tramite spettrometria di massa utilizzata per il monitoraggio di PCDD/F e PCB diossina-simili). Nel caso dei metodi di conferma, sono utilizzati tutti i 17 standard interni di PCDD/F 2,3,7,8-sostituiti marcati con 13C e tutti i 12 standard interni di PCB diossina-simile marcati con 13C.

—

Sono inoltre determinati i fattori di risposta relativa per i congeneri ai quali non è aggiunto alcun analogo marcato con 13C, utilizzando appropriate soluzioni di calibrazione.

—

Per i prodotti alimentari di origine vegetale e per i prodotti alimentari di origine animale con un contenuto di grassi inferiore al 10 %, l'aggiunta di standard interni prima dell'estrazione è obbligatoria. Per i prodotti alimentari di origine animale con tenore di grassi superiore al 10 %, gli standard interni possono essere aggiunti prima o dopo l'estrazione dei grassi. È effettuata un'appropriata validazione dell'efficienza dell'estrazione, a seconda della fase in cui sono introdotti gli standard interni e del modo in cui i risultati sono espressi (sulla base del prodotto o dei grassi).

—

Prima dell'analisi GC-MS, occorre aggiungere 1 o 2 standard di recupero (surrogato).

—

È necessario il controllo del recupero. Per i metodi di conferma, i recuperi dei singoli standard interni sono compresi tra il 60 % e il 120 %. Recuperi inferiori o superiori per singoli congeneri, in particolare per alcune dibenzo-p-diossine e alcuni dibenzofurani epta e octaclorati, sono accettabili, purché il loro contributo al valore TEQ non superi il 10 % del valore totale TEQ (in base alla somma di PCDD/F e PCB diossina-simili). Per quanto concerne i metodi di screening GC-MS, i recuperi devono essere compresi tra il 30 % e il 140 %.

—

La separazione delle PCDD e dei PCDF dai composti clorurati interferenti, quali i PCB non diossina-simili e gli eteri clorurati di difenile è effettuata mediante appropriate tecniche cromatografiche (di preferenza con una colonna di florisil, di allumina e/o di carbone).

—

È sufficiente la separazione gascromatografica degli isomeri (< 25 % da picco a picco tra 1,2,3,4,7,8-HxCDF e 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Il range della curva di calibrazione copre il corrispondente range dei livelli massimi o di azione.

—

Per la GC-HRMS:

—

Per la GC-MS/MS:

—

Nel calcolo delle concentrazioni a partire da una curva di calibrazione della TCDD, i valori agli estremi inferiore e superiore della curva presenteranno una forte variazione [coefficiente di variazione (CV) elevato]. Il working range è costituito dalla zona in cui il CV è inferiore al 15 %. L'estremo inferiore del working range (limite di reporting) deve inoltre essere fissato in misura significativamente superiore (almeno di un fattore tre) ai bianchi di procedura. L'estremo superiore del working range è di norma rappresentato dal valore EC70 (70 % della concentrazione effettiva massima), ma è più basso se il CV è superiore al 15 % in questo range. Il working range è stabilito durante la validazione. I valori di cut-off (7.3) devono situarsi entro il working range.

—

Le soluzioni standard e gli estratti dei campioni sono testati almeno in doppio. Nel caso di uso di doppi, una soluzione standard o un estratto di controllo testati in 4-6 pozzetti distribuiti sulla piastra producono una risposta o una concentrazione (possibile solo nel working range) in base a un CV<15 %.

—

I livelli nei campioni possono essere stimati comparando la risposta al test a una curva di calibrazione della TCDD (o del PCB 126 o di una miscela standard PCDD/F/PCB diossina-simili) per calcolare il livello BEQ nell'estratto e poi nel campione.

—

Le curve di calibrazione contengono da 8 a 12 concentrazioni (almeno in doppio) con concentrazioni sufficienti nella parte inferiore della curva (working range). Particolare attenzione è prestata alla qualità del fit della curva nel working range. Il valore R2, come tale, è di scarsa o nessuna utilità nella stima della bontà del fit in regressione non lineare. Un migliore fit è ottenuto minimizzando la differenza tra i livelli calcolati e osservati nel working range (ad esempio minimizzando la somma dei quadrati residui).

—

Il livello stimato nell'estratto del campione è quindi corretto del livello BEQ calcolato per un campione bianco di matrice/solvente (per tener conto delle impurità provenienti dai solventi e dalle sostanze chimiche utilizzate) e del recupero apparente (calcolato a partire dal livello BEQ di idonei campioni di riferimento con pattern di congeneri rappresentativi attorno al livello massimo o di azione). Quando si effettua una correzione del recupero, il recupero apparente deve essere sempre entro il range richiesto (cfr. punto 7.1.4.). I campioni di riferimento utilizzati per la correzione del recupero devono rispondere alle prescrizioni di cui al punto 7.2.

—

I campioni di riferimento rappresentano la matrice campione, i pattern di congeneri e i range di concentrazione per PCDD/F e PCB diossina-simili attorno al livello massimo o di azione.

—

Una bianco di procedura o di preferenza un bianco matrice e un campione di riferimento al livello massimo o di azione devono essere inclusi in ciascuna serie di test. Questi campioni devono essere estratti e testati nello stesso momento in condizioni identiche. Il campione di riferimento deve presentare una risposta notevolmente più elevata del campione bianco, in modo da garantire l'idoneità del test. Questi campioni possono essere utilizzati per le correzioni del bianco e del recupero.

—

I campioni di riferimento scelti per effettuare una correzione del recupero sono rappresentativi dei campioni del test, il che significa che i pattern di congeneri non portano a una sottostima dei livelli.

—

Campioni di riferimento supplementari, per esempio a 0,5 × e 2 × il livello di massimo o di azione possono essere inclusi per dimostrare la performance adeguata del test nel range di interesse per il controllo del livello massimo o di azione. Combinati, questi campioni possono essere utilizzati per calcolare i livelli BEQ nei campioni del test (7.1.2.2).

BEQDL

BEQ corrispondente al limite di decisione del metodo di conferma, ossia al livello massimo compresa l'incertezza di misura

sy,x

deviazione standard residua

t α,f = m – 2

fattore di Student (α = 5 %, f = gradi di libertà, un lato)

m

numero totale dei punti di calibrazione (indice j)

n

numero di ripetizioni ad ogni livello

xi

concentrazione del campione (in TEQ) del punto di calibrazione i determinato con un metodo di conferma

media delle concentrazioni (in TEQ) di tutti i campioni di calibrazione

Qxx

=

i

=

indice per il punto di calibrazione i

SDR

deviazione standard dei risultati del biodosaggio a BEQDL, misurata in condizioni di riproducibilità in laboratorio

1.

dalla banda inferiore dell'intervallo di predizione del 95 % al limite di decisione del metodo di conferma;

2.

da analisi multiple di campioni (n≥6) contaminati al limite di decisione del metodo di conferma, come endpoint inferiore della distribuzione dei dati (rappresentata nella figura da una curva a campana) al corrispondente valore BEQ medio.

—

Poiché nei metodi bioanalitici non possono essere utilizzati standard interni, sono eseguiti test di ripetibilità per ottenere informazioni sulla deviazione standard nelle e tra le serie di test. La ripetibilità è inferiore al 20 %, la riproducibilità in laboratorio inferiore al 25 % in base ai livelli calcolati in BEQ dopo correzione del bianco e del recupero.

—

Nel processo di validazione il test deve permettere di distinguere tra un campione bianco e un livello al valore di cut-off, consentendo l'identificazione dei campioni al di sopra del corrispondente valore di cut-off (cfr. 7.1.2).

—

Sono definiti i composti bersaglio, le possibili interferenze e i livelli massimi tollerabili di bianco.

—

La deviazione standard percentuale nella risposta o nella concentrazione calcolata a partire dalla risposta (possibile solo nel working range) di una determinazione triplice di un estratto del campione non è superiore al 15 %.

—

I risultati non corretti dei campioni di riferimento espressi in BEQ (bianco e livello massimo o di azione) sono utilizzati per valutare la performance del metodo bioanalitico su un periodo di tempo costante.

—

Le carte di controllo qualità (QC) per i bianchi di procedura e ciascun tipo di campione di riferimento sono registrate e controllate per assicurare che la performance analitica sia conforme ai requisiti, in particolare per i bianchi di procedura per quanto riguarda la differenza minima richiesta rispetto all'estremo inferiore del working range e per i campioni di riferimento per quanto riguarda la riproducibilità in laboratorio. I bianchi di procedura devono essere ben controllati per evitare risultati falsi conformi quando sono sottratti.

—

I risultati dei metodi di conferma dei campioni sospetti e del 2-10 % dei campioni conformi (minimo di 20 campioni per matrice) sono raccolti e utilizzati per valutare la performance del metodo di screening e il rapporto tra BEQ e TEQ. Questa base di dati può essere utilizzata per la ri-valutazione dei valori di cut-off applicabili ai campioni di routine per le matrici validate.

—

La buona performance del metodo può essere dimostrata anche con la partecipazione a ring trial. Anche i risultati dei campioni analizzati in ring trial, che coprano un range di concentrazione fino a per esempio due volte il limite massimo, possono essere inclusi nella valutazione del tasso di falsi conformi, se il laboratorio è in grado di dimostrare la sua buona performance. I campioni coprono i pattern di congeneri più frequenti, rappresentanti varie fonti.

—

Durante gli incidenti, i valori di cut-off possono essere ri-valutati, tenendo conto della matrice e dei pattern di congeneri specifici del singolo incidente.

—

Se la procedura analitica impiegata lo consente, i risultati dell'analisi contengono i livelli dei singoli congeneri di PCDD/F e di PCB diossina-simili che sono espressi come lowerbound, upperbound e mediumbound, per includere un massimo di informazione nel reporting dei risultati e permettere così l'interpretazione dei risultati secondo prescrizioni specifiche.

—

Il rapporto indica anche il metodo utilizzato per l'estrazione di PCDD/F, PCB diossina-simili e lipidi. Il tenore lipidico del campione è determinato e indicato per i campioni di alimenti con livelli massimi espressi su base grassa e una concentrazione di materia grassa attesa compresa tra lo 0 e il 2 % (in corrispondenza alla legislazione vigente); per gli altri campioni la determinazione del tenore lipidico è facoltativa.

—

I recuperi dei singoli standard interni devono essere indicati se si situano al di fuori del range menzionato al punto 6.2, se il livello massimo è superato (nel qual caso occorre indicare i recuperi per una delle due analisi in doppio) e in altri casi su richiesta.

—

Poiché nel decidere della conformità di un campione occorre tener conto dell'incertezza di misura, deve essere indicato anche questo parametro. I risultati analitici sono pertanto espressi come x +/- U, dove x è il risultato analitico e U l'incertezza di misura estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 che dà un livello di fiducia del 95 % circa. Nel caso di una determinazione separata di PCDD/F e PCB diossina-simili, la somma dell'incertezza estesa stimata dei risultati analitici separati di PCDD/F e PCB diossina-simili deve essere utilizzata per la somma di PCDD/F e PCB diossina-simili.

—

Se si tiene conto dell'incertezza di misura applicando il CCα (come descritto nell'allegato II, punto IV. 2), questo parametro è indicato.

—

I risultati devono essere espressi nelle stesse unità e con almeno lo stesso numero di cifre significative dei tenori massimi stabiliti dal regolamento (CE) n. 1881/2006.

—

Il risultato dello screening è espresso come conforme o sospetto non conforme («sospetto»).

—

Inoltre, per PCDD/F e/o PCB diossina-simili può essere dato un risultato espresso in equivalenti bioanalitici (BEQ) (non TEQ) (cfr. allegato III, punto 1). I campioni con una risposta al di sotto del limite di reporting sono espressi come inferiori al limite di reporting.

—

Per ciascun tipo di matrice del campione il rapporto menziona il livello massimo o di azione su cui si basa la valutazione.

—

Il rapporto menziona il tipo di test applicato, il principio base del test e il tipo di calibrazione.

—

Il rapporto indica anche il metodo utilizzato per l'estrazione di PCDD/F, PCB diossina-simili e lipidi. Il tenore lipidico del campione è determinato e indicato per i campioni di alimenti con livelli massimi o di azione espressi su base grassa e una concentrazione di materia grassa attesa compresa tra 0 e 2 % (in corrispondenza alla legislazione vigente); per gli altri campioni la determinazione del tenore lipidico è facoltativa.

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In caso di campioni sospetti non conformi il rapporto deve includere una nota sulle azioni da intraprendere. La concentrazione di PCDD/F e la somma di PCDD/F e PCB diossina-simili nei campioni con livelli elevati deve essere determinata/confermata mediante un metodo di conferma.

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Tempo di ritenzione relativo rispetto agli standard interni o agli standard di riferimento (deviazione accettabile di +/– 0,25 %).

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Separazione gascromatografica dei sei PCB indicatori (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 e PCB 180) dalle sostanze interferenti, specie PCB coeluenti, in particolare se i livelli dei campioni si situano entro i limiti legali e la non conformità deve essere confermata.

[I congeneri che spesso coeluiscono sono per esempio PCB 28/31, PCB 52/69 e PCB 138/163/164. Per la GC-MS devono essere considerate anche le possibili interferenze di frammenti di congeneri più altamente clorurati.]

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Per le tecniche GC-MS:

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Per GC-ECD:

Conferma dei risultati che oltrepassano la tolleranza con due colonne GC con fasi stazionarie di diversa polarità.

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Uso di idonei standard interni con proprietà fisico-chimiche comparabili agli analiti di interesse.

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Aggiunta di standard interni:

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Prescrizioni per i metodi che utilizzano tutti i sei congeneri di PCB indicatori marcati con isotopi:

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Prescrizioni per i metodi che non utilizzano tutti i sei standard interni marcati con isotopi o utilizzano altri standard interni:

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I recuperi dei congeneri non marcati sono controllati per mezzo di campioni spiked o campioni di controllo qualità con concentrazioni nel range del livello massimo. I recuperi accettabili per questi congeneri sono compresi tra 70 e 120 %.

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Se la procedura analitica impiegata lo consente, i risultati dell'analisi contengono i livelli dei singoli congeneri di PCB e sono espressi come lowerbound, upperbound e mediumbound, per includere un massimo di informazione nel reporting dei risultati e permettere così l'interpretazione dei risultati secondo prescrizioni specifiche.

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Il rapporto indica anche il metodo utilizzato per l'estrazione di PCB e lipidi. Il tenore lipidico del campione è determinato e indicato per i campioni di alimenti con livelli massimi espressi su base grassa e una concentrazione di materia grassa attesa compresa tra lo 0 e il 2 % (in corrispondenza alla legislazione vigente); per gli altri campioni la determinazione del tenore lipidico è facoltativa.

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I recuperi dei singoli standard interni devono essere indicati se si situano al di fuori del range menzionato al punto 6, se il livello massimo è superato e in altri casi su richiesta.

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Poiché nel decidere della conformità di un campione occorre tener conto dell'incertezza di misura, deve essere indicato anche questo parametro. I risultati analitici sono pertanto espressi come x +/– U, dove x è il risultato analitico e U l'incertezza di misura estesa, calcolata per mezzo di un fattore di copertura 2 che dà un livello di fiducia del 95 % circa.

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Se si tiene conto dell'incertezza di misura applicando il CCα (come descritto nell'allegato II, punto IV.1), questo parametro è indicato.

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I risultati devono essere espressi nelle stesse unità e con almeno lo stesso numero di cifre significative dei tenori massimi stabiliti dal regolamento (CE) n. 1881/2006.