1)

I indholdsfortegnelsen foretages følgende ændringer:

2)

I kapitel III indsættes følgende:

»III.3.   BESTEMMELSE AF FLYGTIGE SYRER I SPIRITUS

1.   Anvendelsesområde

Metoden er blevet valideret i interkalibrering for rom, brandy, druemarc og frugtbrændevin i intervaller fra 30 mg/l til 641 mg/l.

2.   Normative referencer

ISO 3696: 1987 Vand til analytisk laboratoriebrug. Specifikation og prøvningsmetoder.

3.   Definitioner

3.1.   Indholdet af flygtige syrer beregnes ved at fratrække indholdet af ikke-flygtige syrer fra det totale syreindhold.

3.2.   Totalt syreindhold er det totale titreringssyreindhold.

3.3.   Indholdet af ikke-flygtige syrer er syreindholdet i inddampningsresten efter tørring af spiritussen.

4.   Princip

Det totale syreindhold og indholdet af ikke-flygtige syrer bestemmes ved titrering eller potentiometri.

5.   Reagenser og materialer

Under analysen må der kun benyttes reagenser af anerkendt analysekvalitet og vand af mindst klasse 3 if. ISO 3696:1987, medmindre andet er anført.

5.1.   0,01 M natriumhydroxidopløsning (NaOH)

5.2.   Indikatorblanding:

6.   Apparatur og udstyr

Indirekte laboratorieudstyr, A-glasudstyr og følgende:

7.   Prøveudtagning og prøver

Prøver opbevares ved rumtemperatur inden analysen.

8.   Fremgangsmåde

8.1.   Totalt syreindhold

8.1.1.   Fremstilling af prøve

Spiritussen bestråles med ultralyd (sonikering) eller omrøres i to minutter under vakuum for at fjerne kuldioxid, hvis det er nødvendigt.

8.1.2.   Titrering

Der afpipetteres 25 ml spiritus i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe.

Der tilsættes ca. 200 ml afkølet kogt destilleret vand (fra samme dag) og 2-6 dråber af indikatorblandingen (5.2).

Der titreres med 0,01 M natriumhydroxidopløsning (5.1), indtil den gulgrønne farve ændres til violet i forbindelse med farveløs spiritus, og den gulbrune farve ændres til rødbrun i forbindelse med brunfarvet spiritus.

Titreringen kan også foretages ved potentiometri til pH 7,5.

Antallet af ml tilsat 0,01 M natriumhydroxidopløsning betegnes n1.

8.1.3.   Beregning

Det totale syreindhold (TA) i milliækvivalenter pr. l spiritus er lig med 0,4 × n1.

Det totale syreindhold (TA′) i mg eddikesyre pr. l spiritus er lig med 24 × n1.

8.2.   Ikke-flygtige syrer

8.2.1.   Fremstilling af prøve

Der inddampes 25 ml spiritus til tørhed:

8.2.2.   Titrering

Inddampningsresten efter inddampningen med afkølet kogt destilleret vand (fra samme dag) opløses, og der fyldes op til ca. 100 ml og tilsættes 2-6 dråber af indikatorblandingen (5.2).

Der titreres med 0,01 M natriumhydroxidopløsning (5.1).

Titreringen kan også foretages ved potentiometri til pH 7,5.

Antallet af ml tilsat 0,01 M natriumhydroxidopløsning betegnes n2.

8.2.3.   Beregning

Indholdet af ikke-flygtige syrer (FA) i milliækvivalenter pr. l spiritus er lig med 0,4 × n2.

Indholdet af ikke-flygtige syrer (FA) i mg eddikesyre pr. l spiritus er lig med 24 × n2.

9.   Beregning af indholdet af flygtige syrer

9.1.   Udtrykt i milliækvivalenter pr. l:

Idet:

Indholdet af flygtige syrer (VA) i milliækvivalenter pr. l er lig med:

TA – FA

9.2.   Udtrykt i mg eddikesyre pr. l:

Idet:

Indholdet af flygtige syrer (VA) i mg eddikesyre pr. l er lig med:

TA′ – FA′

9.3.   Udtrykt i g eddikesyre pr. hl ren alkohol (100 % vol.) er lig med:

hvor A er volumenkoncentration af alkohol i spiritus.

10.   Metodens kvalitetsparametre (præcision)

10.1.   Statistiske resultater af interkalibrering

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer [1], [2].

Prøvetyper:

3)

Der indsættes følgende som kapitel VIII:

»VIII.   TOTALT SUKKERINDHOLD

1.   Anvendelsesområde

HPLC-RI finder anvendelse på bestemmelsen af totalt sukkerindhold (udtrykt i invertsukker) i spiritus, bortset fra likører med æg- og mælkeprodukter.

Metoden er blevet valideret i interkalibrering for pastis, destilleret anis, kirsebærlikør, crème de (efterfulgt af navnet på frugten eller den anvendte råvare) og crème de cassis, i intervaller fra 10,86 til 509,7 g/l. Lineariteten af instrumenternes respons blev imidlertid påvist for koncentrationsintervallet fra 2,5 til 20 g/l.

Denne metode er ikke egnet til bestemmelse af lavt sukkerindhold.

2.   Normative referencer

ISO 3696: 1987 Vand til analytisk laboratoriebrug. Specifikation og prøvningsmetoder.

3.   Princip

Højtryksvæskekromatografisk analyse af sukkeropløsninger til bestemmelse af deres koncentrationer af glucose, fructose, saccharose, maltose og lactose.

Denne metode omfatter en stationær fase af alkylaminer og detektering ved differentialrefraktometri og er givet som eksempel. Det er ligeledes muligt at anvende ionbytterharpikser som stationær fase.

4.   Reagenser og materialer

4.1.   Glucose (CAS 50-99-7) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.2.   Fructose (CAS 57-48-7) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.3.   Saccharose (CAS 57-50-1) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.4.   Lactose (CAS 5965-66-2) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.5.   Maltose monohydrat (CAS 6363-53-7) med en renhedsgrad på mindst 99 %.

4.6.   Ren acetonitril (CAS 75-05-8) for HPLC-analyse.

4.7.   Destilleret eller demineraliseret vand, helst mikrofiltreret.

4.8.   Opløsningsmidler (eksempel)

Elueringsvæsken består af:

Helium passeres langsomt gennem i 5-10 minutter inden anvendelse med henblik på afgasning.

Er det anvendte vand ikke mikrofiltreret, tilrådes det at filtrere væsken gennem et filter til organiske opløsningsmidler med porestørrelse på ikke over 0,45 μm.

4.9.   Ethanol, absolut (CAS 64-17-5).

4.10.   Ethanolopløsning (5 %, v/v).

4.11.   Fremstilling af standardstamopløsning (20 g/l)

2 g af de enkelte sukkerarter, der skal analyseres (4.1-4.5), afvejes og hældes uden spild i en 100 ml målekolbe. (Bemærk: 2,11 g maltose monohydrat svarer til 2 g maltose).

Der fyldes op til 100 ml med en alkoholopløsning på 5 % vol. (4.10), der omrøres og opbevares ved ca. + 4 °C. Der fremstilles en ny stamopløsning en gang om ugen.

4.12.   Fremstilling af arbejdsstandardopløsninger (2,5, 5,0, 7,5, 10 og 20 g/l)

Stamopløsningen på 20 g/l fortyndes (4.11) behørigt med en alkoholopløsning på 5 % vol. (4.10) til fremstilling af fem arbejdsstandardopløsninger på 2,5, 5,0, 7,5, 10 og 20 g/l. Opløsningen filtreres gennem et filter med porestørrelse på ikke over 0,45 μm (5.3).

5.   Apparatur og udstyr

5.1.   HPLC-system til fremstilling af en grundopløsning af alle sukkerarterne.

5.1.1.   Højtryksvæskekromatograf med en seksvejsinjektor med 10 μL loop eller anden automatisk eller manuel anordning til pålidelig injektion af mikromængder.

5.1.2.   Pumpesystem, som giver mulighed for at opnå og opretholde en konstant eller programmeret gennemstrømningshastighed med stor nøjagtighed.

5.1.3.   Differentialrefraktometer.

5.1.4.   Dataintegrator eller -registrator med en ydeevne, som er forenelig med det øvrige system.

5.1.5.   Forkolonne:

Det anbefales at knytte en passende forkolonne til den analytiske kolonne.

5.1.6.   Kolonne (eksempel):

5.1.7.   Betingelser for kromatografi (eksempel):

For at sikre, at detektoren er helt stabil, bør den tændes et par timer inden brug. Blindprøven skal opfyldes med elueringsvæsken.

5.2.   Analysevægt med nøjagtighed 0,1 mg.

5.3.   Filtreringsopstilling til små mængder ved brug af mikromembran på 0,45 μm.

6.   Opbevaring af prøver

Prøver opbevares ved modtagelsen ved rumtemperatur inden analysen.

7.   Fremgangsmåde

7.1.   DEL A: Forberedelse af prøve

7.1.1.   Prøven rystes.

7.1.2.   Prøven filtreres gennem et filter med porestørrelse på ikke over 0,45 μm (5.3).

7.2.   DEL B: HPLC

7.2.1.   Bestemmelse

10 μL af standardopløsningerne (4.12) og prøverne (7.1.2). Analysen foretages under passende betingelser for kromatografi, f.eks. de oven for beskrevne betingelser.

7.2.2.   Hvis arealet (eller højden) af en top i en prøve er større end den tilsvarende top i den mest koncentrerede standard, bør prøven fortyndes med destilleret vand og analyseres på ny.

8.   Beregning

De to opnåede kromatogrammer for standardopløsningen og spiritussen sammenlignes. Toppene identificeres ud fra retentionstiden. Højden (eller arealet) af hver top måles for at beregne koncentrationerne ved anvendelse af ekstern standard. Der tages højde for eventuelle fortyndinger af prøven.

Det endelige resultat er summen af saccharose, maltose, lactose, glucose og fructose i g/l invertsukker.

Indholdet af invertsukker beregnes som summen af alle monosaccharider og ved at reducere indholdet af disaccharider plus den støkiometriske mængde af glucose og fructose beregnet på grundlag af indholdet af saccharose.

9.   Metodens kvalitetsparametre (præcision)

9.1.   Statistiske resultater af interkalibrering

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse, der er foretaget efter internationalt anerkendte procedurer [1], [2].

Tabel 1

Fruktose, glukose, maltose

Tabel 2

Saccharose

Tabel 3

Totalt sukkerindhold

(Bemærk: Disse data er beregnet for totalt sukkerindhold og ikke for invertsukker som defineret i punkt 8 ovenfor.)

4)

Følgende indsættes som kapitel X:

»X.   BESTEMMELSE AF FØLGENDE FORBINDELSER FRA TRÆ I SPIRITUS VED HØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI (HPLC): FURFURAL, 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL, 5-METHYLFURFURAL, VANILLIN, SYRINGALDEHYD, CONIFERALDEHYD, SINAPALDEHYD, GALLUSSYRE, ELLAGINSYRE, VANILLINSYRE, SYRINGASYRE OG SCOPOLETIN

1.   Anvendelsesområde

Metoden vedrører bestemmelse af furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanillin, syringaldehyd, coniferaldehyd, sinapaldehyd, gallussyre, ellaginsyre, vanillinsyre, syringasyre og scopoletin ved højtryksvæskekromatografi.

2.   Normativ reference

Analysemetode, der er godkendt af Den Internationale Vinorganisations (OIV) generalforsamling og offentliggjort af OIV under reference OIV-MA-BS-16: R2009.

3.   Princip

Bestemmelse ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) med detektering ved ultraviolet spektrofotometri ved flere bølgelængder og ved spektrofluorimetri.

4.   Reagenser

Reagenserne skal være af analysekvalitet. Der anvendes destilleret vand eller vand af mindst tilsvarende renhed. Det er bedst at anvende mikrofiltreret vand med en resistivitet på 18,2 M Ω.cm.

4.1.   Alkoholindhold på 96 %.

4.2.   Methanol af HPLC-kvalitet (væske B).

4.3.   0,5 % eddikesyre (væske A).

4.4.   Mobile faser: (er kun givet som eksempel).

Væske A (0,5 % eddikesyre) og væske B (ren methanol). Filtreres gennem et membranfilter (porestørrelse 0,45 μm). Der afgasses om nødvendigt i ultralydsbad.

4.5.   Referencestandarder for en renhed på mindst 99 %: furfural, 5-hydroxymethylfurfural, 5-methylfurfural, vanillin, syringaldehyd, coniferaldehyd, sinapaldehyd, gallussyre, ellaginsyre, vanillinsyre, syringasyre og scopoletin.

4.6.   Referenceopløsning: Standardstofferne opløses i en vandig-alkoholholdig opløsning på 50 % vol. De endelige koncentrationer i referenceopløsningen bør være i størrelsesordenen:

furfural: 5 mg/l; 5-hydroxymethyl furfural: 10 mg/l; 5-methylfurfural 2 mg/l; vanillin: 5 mg/l; syringaldehyd: 10 mg/l; coniferaldehyd: 5 mg/l; sinapaldehyd: 5 mg/l; gallussyre: 10 mg/l; ellaginsyre: 10 mg/l; vanillinsyre: 5 mg/l; syringasyre: 5 mg/l; scopoletin: 0,5 mg/l.

5.   Apparatur

Sædvanligt laboratorieudstyr

5.1.   Højtryksvæskekromatograf, der kan fungere i binær gradient mode, udstyret med:

5.2.   Sprøjter til HPLC.

5.3.   Anordning til membranfiltrering af små mængder.

5.4.   Computer/integrator eller optager/integrator, der er kompatibel med hele apparaturet. Den skal navnlig have flere indsamlingskanaler.

6.   Fremgangsmåde

6.1.   Fremstilling af injektionsopløsningen.

Referenceopløsningen og spiritussen filtreres om nødvendigt gennem et membranfilter med porestørrelse på ikke over 0,45 μm.

6.2.   Kromatografiske driftsbetingelser: Analysen foretages ved stuetemperatur ved hjælp af det udstyr, der er beskrevet i punkt 5.1, og ved brug af de mobile faser (punkt 4.4) og en gennemstrømningshastighed på ca. 0,6 ml pr. minut i overensstemmelse med nedenstående gradient (er kun givet som et eksempel)

Tidspunkt: 0 min, 50 min, 70 min, 90 min

Væske A (vand-syre): 100 %, 60 %, 100 %, 100 %

Væske B (methanol): 0 %, 40 %, 0 %, 0 %

Bemærk, at denne gradient bør ændres i nogle tilfælde for at undgå co-eluering.

6.3.   Bestemmelse

6.3.1.   Referencestandarderne sprøjtes ind særskilt og blandes.

Tilpas driftsbetingelserne, således at opløsningsfaktorerne for alle forbindelsernes toppe mindst svarer til 1.

6.3.2.   Prøven fremstillet i overensstemmelse med punkt 6.1 indsprøjtes.

6.3.3.   Arealet af toppene i referenceopløsningen og spiritussen måles, og koncentrationerne beregnes.

7.   Angivelse af resultater

Koncentrationen af hver bestanddel udtrykkes i mg/l.

8.   Metodens kvalitetsparametre (præcision)

Følgende data kommer fra en international metodekvalitetsundersøgelse af forskellige spirituskategorier foretaget i 2009 efter internationalt anerkendte procedurer [1], [2].

8.1.   Furfural

8.2.   5-hydroxymethylfurfural

8.3.   5-methylfurfural

8.4.   Vanillin

8.5.   Syringaldehyd

8.6.   Coniferaldehyd

8.7.   Sinapaldehyd

8.8.   Gallussyre

8.9.   Ellaginsyre

8.10.   Vanillinsyre

8.11.   Syringasyre

8.12.   Scopoletin