2002D0657 — NL — 10.01.2004 — 002.001

---

Dit document vormt slechts een documentatiehulpmiddel en verschijnt buiten de verantwoordelijkheid van de instellingen

►B

BESCHIKKING VAN DE COMMISSIE van ►C1  14 augustus 2002 ◄ ter uitvoering van Richtlijn 96/23/EG van de Raad wat de prestaties van analysemethoden en de interpretatie van resultaten betreft (kennisgeving geschied onder nummer C(2002) 3044) (Voor de EER relevante tekst) (2002/657/EG) (PB L 221, 17.8.2002, p.8)

Gewijzigd bij:

		Publicatieblad
		No	page	date
►M1	Beschikking van de Commissie van 13 maart 2003	L 71	17	15.3.2003
►M2	Beschikking van de Commissie van 22 december 2003	L 6	38	10.1.2004

Gerectificeerd bij:

►C1	Rectificatie, PB L 239, 6.9.2002, blz. 66  (657/02)

---

▼B

BESCHIKKING VAN DE COMMISSIE

van ►C1  14 augustus 2002 ◄

ter uitvoering van Richtlijn 96/23/EG van de Raad wat de prestaties van analysemethoden en de interpretatie van resultaten betreft

(kennisgeving geschied onder nummer C(2002) 3044)

(Voor de EER relevante tekst)

(2002/657/EG)

Artikel 1

Doel en toepassingsgebied

In deze beschikking worden voorschriften vastgesteld voor de analysemethoden die moeten worden gebruikt bij het onderzoeken van officiële monsters die zijn genomen krachtens artikel 15, lid 1, tweede zin, van Richtlijn 96/23/EG en worden gemeenschappelijke criteria gegeven voor de interpretatie van analyseresultaten van laboratoria voor officiële controles betreffende die monsters.

Deze beschikking is niet van toepassing op stoffen waarvoor in andere communautaire wetgeving specifieke voorschriften zijn vastgesteld.

Artikel 2

Definities

Voor de toepassing van deze beschikking gelden de definities van Richtlijn 96/23/EG en van ►M1  bijlage I ◄ bij deze beschikking.

Artikel 3

Analysemethoden

De lidstaten zorgen ervoor dat officiële monsters die krachtens Richtlijn 96/23/EG zijn genomen, worden geanalyseerd met behulp van methoden die:

▼M2

Artikel 4

De lidstaten zorgen ervoor dat de analysemethoden die worden gebruikt voor het opsporen van de volgende stoffen voldoen aan de in bijlage II aangegeven minimaal vereiste prestatielimieten (MRPL's) in de in die bijlage genoemde matrices:

▼B

Artikel 5

Kwaliteitsbewaking

De lidstaten waarborgen de kwaliteit van de resultaten van de analyses op monsters die krachtens Richtlijn 96/23/EG zijn genomen, met name door de test- en/of kalibratieresultaten te controleren overeenkomstig ISO 17025 (1), hoofdstuk 5.9.

Artikel 6

Interpretatie van de resultaten

1.  Het resultaat van een analyse wordt als niet-conform beschouwd als de beslissingsgrens van de bevestigingsmethode voor de analyt wordt overschreden.

2.  Wanneer voor een stof een toelaatbaar gehalte is vastgesteld, is de beslissingsgrens de concentratie waarboven met een statistische zekerheid van 1 – α kan worden besloten dat het toelaatbare gehalte werkelijk is overschreden.

3.  Wanneer voor een stof geen toelaatbaar gehalte is vastgesteld, is de beslissingsgrens de laagste concentratie waarbij een methode met een statistische zekerheid van 1 – α uit kan maken of de analyt in kwestie al dan niet aanwezig is.

4.  Voor de in groep A van bijlage I bij Richtlijn 96/23/EG bedoelde stoffen mag de α-fout maximaal 1 % bedragen. Voor alle overige stoffen mag de α-fout maximaal 5 % bedragen.

Artikel 7

Intrekking

De Beschikkingen 90/515/EEG, 93/256/EEG en 93/257/EEG worden ingetrokken.

Artikel 8

Overgangsbepalingen

De methoden voor de analyse van officiële monsters van stoffen in groep A van bijlage I bij Richtlijn 96/23/EG, die voldoen aan de criteria van de Beschikkingen 90/515/EEG, 93/256/EEG en 93/257/EEG, mogen nog gedurende twee jaar na de inwerkingtreding van deze beschikking worden gebruikt. De methoden die momenteel gebruikt worden voor stoffen in groep B van bijlage I bij Richtlijn 96/23/EG moeten uiterlijk vijf jaar na de inwerkingtreding van deze beschikking aan deze beschikking voldoen.

Artikel 9

Datum van toepassing

Deze beschikking is van toepassing met ingang van 1 september 2002.

Artikel 10

Adressaten

Deze beschikking is gericht tot de lidstaten.

---

BIJLAGEI

PRESTATIECRITERIA, ANDERE VOORSCHRIFTEN EN PROCEDURES VOOR ANALYSEMETHODEN

1.   DEFINITIES

2.   PRESTATIECRITERIA EN ANDERE VOORSCHRIFTEN VOOR ANALYSEMETHODEN

Andere analysemethoden of combinaties van methoden dan degene die hierna worden beschreven, mogen alleen voor screening of bevestiging worden gebruikt als kan worden bewezen dat zij aan de desbetreffende voorschriften van deze beschikking voldoen.

2.1.   ALGEMENE VOORSCHRIFTEN

2.1.1.   Behandeling van monsters

De monsters worden zo verkregen, behandeld en bewerkt dat de kans op detectie van de analyt maximaal is. Bij de monsterbehandelingsprocedures wordt ervoor gezorgd dat accidentele verontreiniging en verlies van analyten wordt voorkomen.

2.1.2.   Testprestaties

2.1.2.1.   Terugvinding

Indien een vaste terugvindingscorrectiefactor wordt gebruikt, wordt tijdens de analyse van de monsters bij elke batch monsters de terugvinding bepaald. Indien de terugvinding binnen de grenzen ligt, mag de vaste correctiefactor worden gebruikt. Anders wordt de voor de specifieke batch verkregen terugvindingsfactor gebruikt, tenzij de specifieke terugvinding van de analyt in het monster wordt gebruikt; dan wordt de standaardadditiemethode (zie punt 3.5) of een interne standaard gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van een analyt in een monster.

2.1.2.2.   Specificiteit

Met de gebruikte methode moet onder de gegeven proefomstandigheden een onderscheid kunnen worden gemaakt tussen de analyt en de andere stoffen. Er moet een schatting worden gemaakt in hoeverre dit mogelijk is. Er moeten strategieën worden gevolgd voor het verhelpen van te verwachten storingen met andere stoffen, bijvoorbeeld homologen, analogen, metabolieten van het betrokken residu, bij gebruik van de beschreven meettechniek. Het is van het grootste belang dat eventuele aan matrixcomponenten toe te schrijven storingen worden bestudeerd.

2.2.   SCREENINGSMETHODEN

Alleen analysetechnieken waarvoor aan de hand van documentatie kan worden aangetoond dat zij gevalideerd zijn en bij het betrokken concentratieniveau een percentage fout-conforme uitslagen < 5 % (β-fout) hebben, mogen worden toegepast voor screeningsdoeleinden overeenkomstig Richtlijn 96/23/EG. Wordt een vermoedelijk niet-conforme uitslag verkregen, dan moet die uitslag worden bevestigd door middel van een bevestigingsmethode.

2.3.   BEVESTIGINGSMETHODEN VOOR ORGANISCHE RESIDUEN EN VERONTREINIGINGEN

Bevestigingsmethoden voor organische residuen of verontreinigingen moeten informatie opleveren over de chemische structuur van de analyt. Methoden die alleen gebaseerd zijn op chromatografische analyse, zonder gebruikmaking van spectrometrische detectie, zijn daarom op zichzelf niet geschikt als bevestigingsmethode. Indien echter een bepaalde techniek als zodanig onvoldoende specifiek is, moet de gewenste specificiteit worden bereikt door toepassing van analysemethoden die bestaan uit geschikte combinaties van opzuivering, chromatografische scheiding(en) en spectrometrische detectie.

De volgende methoden of combinaties daarvan worden geschikt geacht voor de identificatie van organische residuen of verontreinigingen van de aangegeven groepen stoffen.

Tabel 1

Geschikte bevestigingsmethoden voor organische residuen en verontreinigingen

Meettechniek	Stoffen in bijlage I 96/23/EG	Beperkingen
LC of GC met massaspektrometrische detectie	Groepen A en B	Alleen in combinatie (on line of off line) met een chromatische scheiding Alleen als full-scantechnieken worden gebruikt of, ingeval van technieken die niet het hele massaspectrum opnemen, als er minimaal 3 (groep B) of 4 (groep A) identificatiepunten zijn
LC of GC met IR-spectrometrische detectie	Groepen A en B	Er moet worden voldaan aan de specifieke voorschriften voor absorptie in UV-spectrometrie
LC-full-scan DAD	Groep B	Er moet worden voldaan aan de specifieke voorschriften voor absorptie in UV-spectrometrie
LC-fluorescentie	Groep B	Alleen voor moleculen die zelf fluoresceren en voor moleculen die na omzetting of derivatisering fluorescentie vertonen
2-D DLC-full-scan-UV/VIS	Groep B	Tweedimensionale HPTLC en co-chromatografie zijn verplicht
GC-elektronvangstdetectie	Groep B	Alleen als twee kolommen van verschillende polariteit worden gebruikt
LC-immunogram	Groep B	Alleen bij gebruik van ten minste twee verschillende chromatografiesystemen of een tweede, onafhankelijke detectiemethode
LC-UV/VIS (vaste golflengte)	Groep B	Alleen bij gebruik van ten minste twee verschillende chromatografiesystemen of een tweede, onafhankelijke detectiemethode

2.3.1.   Gemeenschappelijke prestatiecriteria en voorschriften

Bevestigingsmethoden moeten informatie verschaffen over de chemische structuur van de analyt. Indien meer dan een stof dezelfde respons geeft, kan de methode geen onderscheid maken tussen deze stoffen. Methoden die alleen gebaseerd zijn op chromatografische analyse, zonder gebruikmaking van spectrometrische detectie, zijn op zichzelf niet geschikt als bevestigingsmethode.

Indien gebruikt, wordt een geschikte interne standaard aan het begin van het extractieprocédé aan de analyseportie toegevoegd. Al naar gelang van de beschikbaarheid worden hiervoor met een stabiele isotoop gemerkte vormen van de analyt gebruikt, die bijzonder geschikt zijn voor massaspectrometrische detectie, dan wel verbindingen die structureel met de analyt verwant zijn.

Indien geen geschikte interne standaard kan worden gebruikt, wordt de identificatie van de analyt bevestigd met behulp van co-chromatografie. In dat geval mag slechts één piek worden verkregen, waarvan de hoogte (of het oppervlak) evenredig aan de hoeveelheid toegevoegde analyt is toegenomen. Bij gaschromatografie (GC) of vloeistofchromatografie (LC) dient de piekbreedte op halve hoogte binnen een bereik van 90-110 % van de oorspronkelijke breedte te blijven en moeten de retentietijden binnen een marge van 5 % identiek zijn. Bij dunnelaagmethoden (DLC) mag alleen de vlek die aan de analyt wordt toegeschreven in intensiteit toenemen; er mag geen nieuwe vlek worden gevormd en de vlek mag visueel niet van uiterlijk veranderen.

Referentiemateriaal of materiaal waaraan bekende hoeveelheden analyt om en nabij het toelaatbare gehalte of de beslissingsgrens zijn toegevoegd (niet-conform controlemonster), alsmede conforme controlematerialen en reagensblanco's, dienen bij voorkeur de gehele procedure te doorlopen, samen met iedere batch analysemonsters. De volgorde voor het injecteren van de extracten in het toestel is als volgt: reagensblanco, conform controlemonster, te bevestigen monster(s), nogmaals conform controlemonster en ten slotte niet-conform controlemonster. Afwijkingen van deze volgorde moeten gemotiveerd worden.

2.3.2.   Aanvullende prestatiecriteria en andere voorschriften voor kwantitatieve analysemethoden

2.3.2.1.   Juistheid van kwantitatieve methoden

Bij herhaalde analyse van een gecertificeerd referentiemateriaal gelden ten aanzien van de afwijking tussen de experimenteel bepaalde, voor terugvinding gecorrigeerde gemiddelde massafractie en de gecertificeerde waarde de volgende richtwaarden.

Tabel 2

Minimale juistheid van kwantitatieve methoden

Massafractie	Interval
≤ 1 μg/kg	tussen – 50 % en + 20 %
> 1 μg/kg tot 10 μg/kg	tussen – 30 % en + 10 %
≥ 10 μg/kg	tussen – 20 % en + 10 %

Zijn geen gecertificeerde referentiematerialen beschikbaar, dan mag de juistheid van de metingen worden beoordeeld aan de hand van de terugvinding van toevoegingen van bekende hoeveelheden van de analyt(en) aan een blanco matrix. Met de gemiddelde terugvinding gecorrigeerde gegevens zijn alleen aanvaardbaar als zij binnen de in tabel 2 aangegeven intervallen liggen.

2.3.2.2.   Precisie van kwantitatieve methoden

De interlaboratoriumvariatiecoëfficiënt (VC) voor de herhaalde analyse van een referentiemateriaal of materiaal met toegevoegde analyt onder reproduceerbaarheidsomstandigheden mag niet groter zijn dan de waarde die volgt uit de vergelijking van Horwitz. Deze vergelijking luidt:

waarbij C de massafractie is, uitgedrukt als een macht (exponent) van 10 (bijvoorbeeld 1 mg/g = 10-3). Voorbeelden zijn in tabel 3 gegeven.

Tabel 3

Voorbeelden van VC's voor de reproduceerbaarheid van kwantitatieve methoden bij een aantal massafracties van de analyt

Massafractie	VC reproduceerbaarheid (%)
1 μg/kg	(1)
10 μg/kg	(1)
100 μg/kg	23
1 000 μg/kg (1 mg/kg)	16
(*)   Voor massafracties kleiner dan 100 μg/kg geeft de vergelijking van Horwitz onaanvaardbaar hoge waarden. Daarom moeten de VC's voor concentraties van minder dan 100 μg/kg zo klein mogelijk zijn.

Voor analyses die onder herhaalbaarheidsomstandigheden worden verricht, ligt de intralaboratoriumvariatiecoëfficiënt normaliter tussen de helft en tweederde van de hierboven aangegeven waarden. Voor analyses die worden uitgevoerd onder intralaboratoriumreproduceerbaarheidsomstandigheden mag de intralaboratoriumvariatiecoëfficiënt niet groter zijn dan de variatiecoëfficiënt van de reproduceerbaarheid.

Voor stoffen waarvoor een toelaatbaar gehalte is vastgesteld, mag de intralaboratoriumreproduceerbaarheid niet groter zijn dan de overeenkomstige variatiecoëfficiënt van de reproduceerbaarheid bij een concentratie van 0,5 × het toelaatbare gehalte.

2.3.3.   Prestatiecriteria en andere voorschriften voor massaspectrometrische detectie

Massaspectrometrische methoden zijn alleen in combinatie (on line of off line) met een chromatische scheiding geschikt als bevestigingsmethode.

2.3.3.1.   Chromatografische scheiding

Bij GC-MS-methoden wordt de gaschromatografische scheiding met behulp van capillaire kolommen verricht. Bij LC-MS-methoden wordt de gaschromatografische scheiding met behulp van geschikte LC-kolommen verricht. In ieder geval bedraagt de minimaal aanvaardbare retentietijd voor de te bepalen analyt tweemaal de retentietijd die overeenkomt met het dode volume van de kolom. De retentietijd (of relatieve retentietijd) van de analyt in de analyseportie moet binnen een bepaald interval overeenkomen met die van de ijkstandaard. Dit retentietijdinterval moet afgestemd zijn op het scheidend vermogen van het chromatografiesysteem. De verhouding tussen de retentietijd van de analyt en de retentietijd van de interne standaard, d.w.z. de relatieve retentietijd van de analyt, moet overeenkomen met die van de ijkoplossing binnen een marge van ± 0,5 % voor GC en ± 2,5 % voor LC.

2.3.3.2.   Massaspectrometrische detectie

Massaspectrometrische detectie wordt uitgevoerd met behulp van MS-technieken als het opnemen van volledige massaspectra (full scans) of selected ion monitoring (SIM), en ook met MS-MSn-technieken als selected reaction monitoring (SRM) of andere geschikte MS- of MS-MSn-technieken in combinatie met de juiste ionisatiemethoden. Bij hogeresolutiemassaspectrometrie (HRMS) moet de resolutie normaliter groter dan 10 000 zijn voor het hele massabereik bij een dalwaarde van 10 %.

Full scan: ingeval de massaspectrometrische bepaling wordt verricht door het opnemen van full-scanspectra moeten alle in het referentiespectrum van de ijkstandaard gemeten diagnostische ionen (molecuulion, karakteristieke adducten van het molecuulion, karakteristieke fragmentionen en isotoopionen) die een relatieve intensiteit van meer dan 10 % hebben aanwezig zijn.

SIM: ingeval de massaspectrometrische bepaling wordt verricht door middel van fragmentografie, is het molecuulion bij voorkeur een van de geselecteerde diagnostische ionen (molecuulion, karakteristieke adducten van het molecuulion, karakteristieke fragmentionen en al hun isotoopionen). De geselecteerde diagnostische ionen mogen niet allemaal van hetzelfde deel van het molecuul afkomstig zijn. De signaal-ruisverhouding voor elk diagnostische ion moet ≥ 3:1 zijn.

Full scan en SIM: de relatieve intensiteiten van de gedetecteerde ionen, uitgedrukt als percentage van de intensiteit van het ion of de overgang met de hoogste intensiteit, moeten overeenkomen met de bij vergelijkbare concentraties onder dezelfde omstandigheden gemeten intensiteiten van de ijkstandaard, hetzij afkomstig van ijkoplossingen, hetzij van verrijkte monsters, en wel binnen de onderstaande marges.

Tabel 4

Maximaal toelaatbare marges voor de relatieve ionenintensiteiten voor diverse massaspectrometrische technieken

Relatieve intensiteit (% van hoofdpiek)	EI-GC-MS (relatief)	CI-GC-MS, GC-MSn LC-MS, LC-MSn (relatief)
> 50 %	± 10 %	± 20 %
> 20 % tot 50 %	± 15 %	± 25 %
> 10 % tot 20 %	± 20 %	± 30 %
≤ 10 %	± 50 %	± 50 %

Interpretatie van massaspectrumgegevens: de relatieve intensiteiten van de diagnostische ionen en/of de precursor/productionenparen moeten worden bepaald door vergelijking van spectra of door de signalen van de afzonderlijke massasporen te integreren. Wanneer achtergrondcorrectie wordt toegepast, wordt die voor de hele batch (zie punt 2.3.1, vierde alinea) op dezelfde wijze uitgevoerd en wordt dit duidelijk vermeld.

Full scan: indien full-scanspectra met enkelvoudige massaspectrometrie worden opgenomen, moeten er ten minste vier ionen aanwezig zijn met een relatieve intensiteit van ≥ 10 % van de hoofdpiek. Het molecuulion moet worden meegenomen als het in het referentiespectrum een relatieve intensiteit van ≥ 10 % heeft. Er moeten ten minste vier ionen binnen de maximaal toegestane marges voor relatieve ionenintensiteiten (tabel 5) liggen. Er mag gebruik worden gemaakt van computerondersteunde library searching. In dat geval moet de vergelijking tussen de massaspectrometrische gegevens van de analysemonsters en die van de ijkoplossing boven een bepaalde kritieke matchfactor liggen. Deze factor wordt tijdens de validatie voor elke analyt vastgesteld aan de hand van spectra die aan de hieronder beschreven criteria voldoen. Nagegaan moet worden of er variaties in de spectra optreden als gevolg van de monstermatrix en de detectorprestaties.

SIM: indien massafragmenten worden gemeten met behulp van andere dan full-scantechnieken moet een puntensysteem gebruikt worden om de gegevens te interpreteren. Ter bevestiging van stoffen van groep A van bijlage I bij Richtlijn 96/23/EG is een minimumscore van 4 identificatiepunten vereist. Ter bevestiging van stoffen van groep B van bijlage I bij Richtlijn 96/23/EG is de minimumscore 3 identificatiepunten. De onderstaande tabel geeft het aantal identificatiepunten voor de verschillende elementaire massaspectrometrische technieken. Deze identificatiepunten mogen echter alleen toegekend en bij elkaar opgeteld worden als aan de volgende drie voorwaarden is voldaan:

Tabel 5

Verband tussen typen massafragmenten en toegekende identificatiepunten

MS-techniek	Identificatiepunten per ion
Lageresolutiemassaspectrometrie (LR)	1,0
LR-MSn precursorion	1,0
LR-MSn overgangsproducten	1,5
HRMS	2,0
HR- MSn precursorion	2,0
HR-MSn overgangsproducten	2,5
Opmerkingen: 1.  Elk ion mag maar eenmaal geteld worden. 2.  GC-MS met elektronimpactionisatie wordt beschouwd als een andere techniek dan GC-MS met chemische ionisatie. 3.  Verschillende analyten mogen alleen worden gebruikt om een hogere identificatiescore te verkrijgen als de hierbij betrokken chemische reacties van verschillende aard zijn. 4.  Indien voor stoffen in groep A van bijlage I bij Richtlijn 96/23/EG een van de volgende technieken in de analysemethode wordt gebruikt: HPLC gekoppeld aan full-scan diode-array-spectrofotometrie (DAD), HPLC met fluorescentiedetectie, of HPLC gekoppeld aan een immunogram, of tweedimensionale DLC gekoppeld aan spectrometrische detectie, mogen zij maximaal één identificatiepunt bijdragen, mits aan de relevante criteria voor deze technieken is voldaan. 5.  Overgangsproducten omvatten zowel dochter- als kleindochterproducten.

2.3.4.   Prestatiecriteria en andere voorschriften voor chromatografie met infrarooddetectie

Adequate pieken: absorptiemaxima in het infraroodspectrum van een ijkstandaard, die aan de onderstaande voorschriften voldoen.

2.3.4.1.   Infrarooddetectie

Absorptiemaximum: ligt in het golfgetalgebied van 4 000-500 cm-1.

Intensiteit van de absorptie: niet minder dan

beide gemeten ten opzichte van de nullijn, en 5 % van de grootste piek in het gebied 4 000-500 cm-1 wanneer beide ten opzichte van de basislijn van de piek worden gemeten.

Opmerking:

Hoewel adequate pieken volgens a) vanuit theoretisch oogpunt de voorkeur verdienen, zijn adequate pieken volgens b) in de praktijk gemakkelijker te bepalen.

Het aantal pieken in het infraroodspectrum van de analyt waarvan de frequentie binnen een marge van ± 1 cm-1 overeenkomt met een adequate piek in het spectrum van de ijkstandaard, wordt bepaald.

2.3.4.2.   Interpretatie van infraroodspectrumgegevens

Er moet absorptie aanwezig zijn in alle gebieden van het spectrum van de analyt die overeenkomen met een adequate piek in het referentiespectrum van de ijkstandaard. In het infraroodspectrum van de ijkstandaard moeten minimaal zes adequate pieken aanwezig zijn. Indien er minder dan zes adequate pieken zijn (7), kan het desbetreffende spectrum niet als referentiespectrum worden gebruikt. De „score”, dat is het percentage adequate pieken dat in het infraroodspectrum van de analyt wordt gevonden, moet ten minste 50 bedragen. Wanneer een gebied niet exact overeenkomt met een adequate piek, mag het desbetreffende gebied van het spectrum van de analyt de aanwezigheid van een overeenkomstige piek niet uitsluiten. De procedure is alleen van toepassing op absorptiepieken in het spectrum van het monster met een intensiteit van ten minste driemaal de piek-tot-piekruis.

2.3.5.   Prestatiecriteria en andere voorschriften voor de bepaling van een analyt via LC met andere detectietechnieken

2.3.5.1.   Chromatografische scheiding

Er moet gebruik worden gemaakt van een interne standaard indien een daarvoor geschikt materiaal beschikbaar is. Bij voorkeur wordt hiervoor een verwante standaard met een retentietijd vlakbij die van de analyt gebruikt. De analyt moet elueren bij de retentietijd die karakteristiek is voor de overeenkomstige ijkstandaard onder dezelfde proefomstandigheden. De minimaal aanvaardbare retentietijd voor een analyt bedraagt tweemaal de retentietijd die overeenkomt met het dode volume van de kolom. De verhouding tussen de retentietijd van de analyt en de retentietijd van de interne standaard, d.w.z. de relatieve retentietijd van de analyt, moet dezelfde zijn als die van de ijkstandaard in een hiermee overeenkomende matrix, binnen een marge van ± 2,5 %.

2.3.5.2.   Full-scan UV/VIS-detectie

Aan de prestatiecriteria voor LC-methoden moet worden voldaan.

De absorptiemaxima in het spectrum van de analyt moeten bij dezelfde golflengten liggen als die van de ijkstandaard, binnen een marge die afhankelijk is van de resolutie van het detectiesysteem. Voor diode-array-detectie is de karakteristieke marge ± 2 nm. Het spectrum van de analyt boven 220 nm mag voor de delen van de twee spectra met een relatieve extinctie ≥ 10 % niet zichtbaar verschillen van het spectrum van de ijkstandaard. Aan dit criterium wordt voldaan wanneer ten eerste dezelfde maxima aanwezig zijn en ten tweede het verschil tussen de twee spectra op geen enkel waarnemingspunt groter is dan 10 % van de extinctie van de ijkstandaard. Wanneer gebruik wordt gemaakt van computerondersteunde library searching en matching moet de vergelijking tussen de spectrumgegevens van de analysemonsters en die van de ijkoplossing boven een bepaalde kritieke matchfactor liggen. Deze factor wordt tijdens de validatie voor elke analyt vastgesteld aan de hand van spectra die aan de hierboven beschreven criteria voldoen. Nagegaan moet worden of er variaties in de spectra optreden als gevolg van de monstermatrix en de detectorprestaties.

2.3.5.3.   Prestatiecriteria voor fluorimetrische detectie

Aan de prestatiecriteria voor LC-methoden moet worden voldaan.

Dit geldt voor moleculen die zelf fluoresceren en voor moleculen die na omzetting of derivatisering fluorescentie vertonen. De excitatie- en emissiegolflengte worden in combinatie met de chromatografiecondities zodanig gekozen dat er in blancomonsterextracten zo weinig mogelijk storende componenten voorkomen.

De afstand tussen de karakteristieke piek van de analyt en de top van de dichtstbijzijnde piek in het chromatogram moet ten minste eenmaal de volle piekbreedte zijn op 10 % van de maximumhoogte van de piek van de analyt.

2.3.5.4.   Prestatiecriteria voor de bepaling van een analyt via een LC-immunogram

Een LC-immunogram is als zodanig niet geschikt als bevestigingsmethode.

Aan de desbetreffende criteria voor LC-methoden moet worden voldaan.

De van tevoren vastgestelde kwaliteitsbewakingsparameters, bijvoorbeeld niet-specifieke binding, de relatieve binding van de controlemonsters, extinctie van de blanco, moeten binnen de bij de validatie van de bepaling verkregen grenzen liggen.

Het immunogram moet uit minimaal vijf fracties worden opgebouwd.

Elke fractie moet kleiner dan de helft van de piekbreedte zijn.

De fractie met het grootste gehalte aan analyt moet dezelfde zijn voor het verdachte monster, het niet-conforme controlemonster en de standaard.

2.3.5.5.   Bepaling van een analyt via LC met UV/VIS-detectie (vaste golflengte)

LC met UV-VIS-detectie (vaste golflengte) is als zodanig niet geschikt als bevestigingsmethode.

De afstand tussen de karakteristieke piek van de analyt en de top van de dichtstbijzijnde piek in het chromatogram moet ten minste eenmaal de volle piekbreedte zijn op 10 % van de maximumhoogte van de piek van de analyt.

2.3.6.   Prestatiecriteria en andere voorschriften voor de bepaling van een analyt via 2-D DLC gekoppeld aan full-scan UV/VIS-spectrometrische detectie

Hierbij zijn tweedimensionale HPTLC en co-chromatografie verplicht.

De Rf-waarden van de analyt moeten binnen ± 5 % overeenstemmen met de Rf-waarden van de standaarden.

De vlekken van de analyt mogen visueel niet te onderscheiden zijn van de vlekken van de standaard.

Voor vlekken van dezelfde kleur moet de afstand tussen het middelpunt van de dichtstbijzijnde vlek en het middelpunt van de vlek van de analyt minimaal gelijk zijn aan de helft van de som van de vlekdiameters.

Het spectrum van de analyt mag visueel niet verschillen van het spectrum van de standaard, zoals beschreven voor full-scan UV/VIS-detectie.

Wanneer gebruik wordt gemaakt van computerondersteunde library searching en matching moet de vergelijking tussen de spectrumgegevens van de analysemonsters en die van de ijkoplossing boven een bepaalde kritieke matchfactor liggen. Deze factor wordt tijdens de validatie voor elke analyt vastgesteld aan de hand van spectra die aan de hierboven beschreven criteria voldoen. Nagegaan moet worden of er variaties in de spectra optreden als gevolg van de monstermatrix en de detectorprestaties.

2.3.7.   Prestatiecriteria en andere voorschriften voor de bepaling van een analyt via GC met elektronvangstdetectie (ECD)

Er moet gebruik worden gemaakt van een interne standaard indien een daarvoor geschikt materiaal beschikbaar is. Bij voorkeur wordt hiervoor een verwante stof met een retentietijd vlakbij die van de analyt gebruikt. De analyt moet elueren bij de retentietijd die karakteristiek is voor de overeenkomstige ijkstandaard onder dezelfde proefomstandigheden. De minimaal aanvaardbare retentietijd voor een analyt bedraagt tweemaal de retentietijd die overeenkomt met het dode volume van de kolom. De verhouding tussen de retentietijd van de analyt en de retentietijd van de interne standaard, d.w.z. de relatieve retentietijd van de analyt, moet dezelfde zijn als die van de ijkstandaard in een hiermee overeenkomende matrix, binnen een marge van ± 0,5 %. De afstand tussen de karakteristieke piek van de analyt en de top van de dichtstbijzijnde piek in het chromatogram moet ten minste eenmaal de volle piekbreedte zijn op 10 % van de maximumhoogte van de piek van de analyt. Co-chromatografie kan worden gebruikt om nadere informatie te verkrijgen.

2.4.   BEVESTIGINGSMETHODEN VOOR ELEMENTEN

Bevestigingsanalyses voor chemische elementen moeten berusten op ondubbelzinnige identificatie en nauwkeurige en precieze kwantificering aan de hand van fysisch-chemische eigenschappen die uniek zijn voor het element in kwestie (bijvoorbeeld voor het element karakteristieke golflengte van de geëmitteerde of geabsorbeerde straling, atoommassa) op het betrokken concentratieniveau.

De volgende methoden of combinaties daarvan worden geschikt geacht voor de identificatie van chemische elementen.

Tabel 7

Geschikte bevestigingsmethoden voor chemische elementen

Techniek	Gemeten parameter
Differential pulse anodic stripping voltammetrie	Elektrisch signaal
Atomaire-absorptiespectrometrie
vlam	Absorptiegolflengte
hydridevorming	Absorptiegolflengte
koude damp	Absorptiegolflengte
elektrothermische atomisatie (grafietoven)	Absorptiegolflente
Atomaire-emissiespectrometrie
inductief gekoppeld plasma	Emissiegolflengte
Massaspectrometrie
inductief gekoppeld plasma	Massa-ladingverhouding

2.4.1.   Gemeenschappelijke prestatiecriteria en andere voorschriften voor bevestigingsmethoden

Referentiemateriaal of materiaal waaraan bekende hoeveelheden analyt om en nabij het maximaal toelaatbare gehalte of de beslissingsgrens zijn toegevoegd (niet-conform controlemonster), alsmede conforme controlematerialen en reagensblanco's, dienen bij voorkeur de gehele procedure te doorlopen, samen met iedere batch analysemonsters. De aanbevolen volgorde voor het injecteren van de extracten in het toestel is als volgt: reagensblanco, conform controlemonster, te bevestigen monster, conform controlemonster en ten slotte niet-conform controlemonster. Afwijkingen van deze volgorde moeten gemotiveerd worden.

Voor de meeste analysetechnieken moet de organische matrix doorgaans volledig ontsloten worden om een oplossing te verkrijgen voordat de analyt kan worden bepaald. Dit kan worden gedaan met behulp van microgolfmineralisatie, waarbij het risico op verlies van analyten en/of verontreiniging minimaal is. Er moeten gedecontamineerde Teflonvaatjes van goede kwaliteit gebruikt worden. Worden andere natte of droge ontsluitingsmethoden gebruikt, dan moet er documentatie beschikbaar zijn waaruit blijkt dat hierbij geen verlies of verontreiniging kan optreden. Als alternatief voor ontsluiting kunnen onder bepaalde omstandigheden scheidingsmethoden (bijvoorbeeld extractie) worden gebruikt om analyten van matrixcomponenten te scheiden en/of analyten te concentreren met het oog op invoering in de analyseapparatuur.

Bij de ijking, ongeacht of dit extern of via standaardadditie gebeurt, wordt ervoor gezorgd dat het voor de analyse vastgestelde werkgebied niet te buiten gegaan wordt. Bij externe ijking moeten de ijkstandaarden bereid worden in een oplossing die de samenstelling van de monsteroplossing zo dicht mogelijk benadert. Ook moet achtergrondcorrectie worden toegepast voorzover de specifieke analyseomstandigheden dat vereisen.

2.4.2.   Aanvullende prestatiecriteria en andere voorschriften voor kwantitatieve analysemethoden

2.4.2.1.   Juistheid van kwantitatieve methoden

Bij herhaalde analyses van een gecertificeerd referentiemateriaal voor elementen mag het experimenteel bepaalde gemiddelde gehalte niet meer dan ± 10 % van de gecertificeerde waarde afwijken. Zijn geen gecertificeerde referentiematerialen beschikbaar, dan mag de juistheid van de metingen worden beoordeeld aan de hand van de terugvinding van toevoegingen van bekende hoeveelheden van het element aan de onbekende monsters. Er wordt op gewezen dat het toegevoegde element niet chemisch in de echte matrix gebonden is, wat met de analyt wel het geval is; daarom zijn de op deze manier verkregen resultaten minder valide dan met behulp van gecertificeerde referentiematerialen verkregen resultaten. Terugvindingsgegevens zijn alleen aanvaardbaar als zij binnen ± 10 % van de doelwaarde liggen.

2.4.2.2.   Precisie van kwantitatieve methoden

Bij herhaalde analyse van een monster onder intralaboratoriumreproduceerbaarheidsomstandigheden mag de intralaboratorium variatiecoëfficiënt (VC) van het gemiddelde niet hoger zijn dan de volgende waarden:

Tabel 8

VC's voor kwantitatieve methoden bij een aantal massafracties van het element

Massafractie	VC (%)
≥ 10 μg/kg tot en met 100 μg/kg	20
> 100 μg/kg tot 1 000 μg/kg	15
≥ 1 000 μg/kg	10

2.4.3.   Specifieke voorschriften voor differential pulse anodic stripping voltammetrie (DPASV)

Volledige destructie van het organische materiaal in de monsters voorafgaande aan DPASV-bepalingen is van het grootste belang. In de voltammogrammen mogen geen brede signalen als gevolg van de aanwezigheid van organische materialen te zien zijn. Anorganische matrixbestanddelen kunnen bij DPASV van invloed zijn op de piekhoogte. Daarom moet het kwantificeren plaatsvinden volgens de methode van standaardaddities. Bij de methode dienen voorbeelden van karakteristieke voltammogrammen van een monsteroplossing te worden verstrekt.

2.4.4.   Specifieke voorschriften voor atomaire-absorptiespectrometrie (AAS)

Bij deze techniek wordt in principe steeds één element tegelijk gemeten, wat betekent dat de experimentele instellingen afhankelijk van het te bepalen element moeten worden geoptimaliseerd. Waar mogelijk worden de resultaten kwalitatief en kwantitatief gecontroleerd aan de hand van alternatieve absorptielijnen (in het ideale geval worden twee verschillende lijnen genomen). De ijkstandaarden worden bereid in een oplossing die zoveel mogelijk overeenkomt met de monsteroplossing (bijvoorbeeld wat betreft zuurconcentratie of modificatorsamenstelling). Om de blancowaarden zo klein mogelijk te maken, moeten alle gebruikte reagentia van de hoogst mogelijke zuiverheid zijn. Afhankelijk van de wijze van verstuiving en/of atomisatie van het monster kunnen verschillende types AAS worden onderscheiden.

2.4.4.1.   Specifieke voorschriften voor vlam-AAS

De instrumentele instellingen moeten voor elk element geoptimaliseerd worden. Met name moeten de gassamenstelling en de gasstromen nagegaan worden. Om storingen door achtergrondabsorptie te vermijden, moet achtergrondcorrectie met een continue bron worden toegepast. Bij onbekende matrices moet worden nagegaan of achtergrondcorrectie al dan niet nodig is.

2.4.4.2.   Specifieke voorschriften voor grafietoven-AAS

Bij het werken met uiterst lage concentraties in de grafietoven is verontreiniging in het laboratorium vaak van invloed op de nauwkeurigheid. Daarom moeten reagentia van hoge zuiverheid, gedeïoniseerd water en inert kunststofmateriaal voor de monsters en standaarden worden gebruikt. De instrumentele instellingen voor elk element moeten geoptimaliseerd worden. Met name de voorbehandeling en atomisatiecondities (temperatuur, tijd) en de matrixmodificatie moeten worden nagegaan.

Wanneer onder isotherme atomisatiecondities wordt gewerkt (bijvoorbeeld transversaal verwarmde grafietbuis met geïntegreerd L'vov-platform) (8) zal de invloed van de matrix op de atomisatie van de analyt geringer zijn. In combinatie met matrixmodificatie en Zeeman-achtergrondcorrectie (9) is kwantificering met behulp van een ijkcurve die is opgesteld op basis van metingen van waterige standaardoplossingen toegestaan.

2.4.5.   Specifieke voorschriften voor atomaire-absorptiespectrometrie met hydridevorming

Organische verbindingen die elementen als arseen, bismut, germanium, lood, antimoon, seleen, tin en telluur bevatten, kunnen erg stabiel zijn en moeten oxidatief worden ontleed wil men correcte resultaten voor het totale elementgehalte krijgen. Daarom wordt hiervoor microgolfontsluiting of verassing onder hoge druk in sterk oxiderend milieu aanbevolen. Er dient in het bijzonder op te worden gelet dat de elementen volledig en reproduceerbaar in hun hydriden worden omgezet.

De vorming van arseenhydride in zoutzuur met NaBH4 is afhankelijk van het oxidatiegetal van arseen (As(III): snelle hydridevorming, As(V): langere periode nodig). Om bij de bepaling van As(V) met de flowinjectietechniek een daling van de gevoeligheid als gevolg van de korte reactietijd van dit systeem te vermijden moet As(V) na de oxidatieve ontleding tot As(III) gereduceerd worden. Kaliumjodide/ascorbinezuur of cysteïne zijn hiervoor geschikt. Blanco's, ijkoplossingen en monsteroplossingen moeten op dezelfde manier behandeld worden. Met een batchsysteem kan zowel As(III) als As(V) bepaald worden zonder dat dit ten koste gaat van de nauwkeurigheid. Als gevolg van de vertraagde vorming van arseen(V)hydride moeten voor de ijking de piekoppervlakten geïntegreerd worden. De instrumentele instellingen moeten geoptimaliseerd worden. Met name de gasstroom waarmee het hydride naar de atomisator gevoerd wordt, is belangrijk en moet nagegaan worden.

2.4.6.   Specifieke voorschriften voor koude-damp-atomaire-absorptiespectrometrie

De koude-damptechniek wordt alleen voor kwik gebruikt. Als gevolg van vervluchtigings- en adsorptieverliezen van elementair kwik moet de hele analyse met bijzondere zorgvuldigheid uitgevoerd worden. Verontreiniging door reagentia of de omgeving moet zorgvuldig vermeden worden.

Kwik bevattende organische verbindingen moeten oxidatief ontleed worden wil men correcte resultaten voor het totale kwikgehalte verkrijgen. Voor de ontleding moeten afgesloten systemen met microgolfontsluiting of hogedrukverassing worden gebruikt. De apparatuur die met kwik in aanraking gekomen is, moet zorgvuldig gereinigd worden.

Het gebruik van de flowinjectietechniek biedt voordelen. Bij lagere beslissingsgrenzen wordt adsorptie van elementair kwik aan een goud/platina-absorber gevolgd door thermische desorptie aanbevolen. De meting wordt gestoord wanneer de adsorber of de cel met vocht in aanraking komt, dus dit dient te worden vermeden.

2.4.7.   Specifieke voorschriften voor atomaire-emissiespectrometrie met inductief gekoppeld plasma (ICP-AES)

Atomaire-emissiespectrometrie met inductief gekoppeld plasma (10) is een multi-elementmethode, waarmee dus een aantal elementen gelijktijdig gemeten kunnen worden. Voor ICP-AES moeten de monsters eerst ontsloten worden om de organische matrices te ontleden. Hiervoor moeten afgesloten systemen met microgolfontsluiting of hogedrukverassing worden gebruikt. Om zinvolle resultaten te krijgen bij een ICP-AES-analyse zijn de ijking van het instrument en de keuze van het element of de golflengte essentieel. Voor de ijking van het instrument kan men zich als de ijkcurves lineair zijn gewoonlijk beperken tot het meten van ijkoplossingen met vier concentraties; de ijkcurves zijn bij ICP-AES in de regel namelijk lineair over vier tot zes orden van grootte van de concentratie. Het ICP-AES-systeem moet in de regel geijkt worden met een multi-elementstandaard, die moet worden bereid in een oplossing met dezelfde zuurconcentratie als de meetoplossing. Voor de lineaire curve moeten de elementconcentraties worden nagegaan.

De golflengten waarop de emissie van de analyten wordt gemeten, moeten al naar gelang van de concentraties van de te bepalen elementen worden gekozen. Als de analytconcentratie buiten het werkbereik van een emissielijn valt, moet een andere emissielijn worden genomen. In eerste instantie wordt de gevoeligste (storingsvrije) emissielijn gekozen en vervolgens een minder gevoelige. Wanneer op of vlakbij de aantoonbaarheidsgrens wordt gewerkt, is de gevoeligste lijn voor de betrokken analyt doorgaans de beste keuze. Spectrale en achtergrondstoringen leveren bij ICP-AES de grootste problemen op. Mogelijke storingen zijn bijvoorbeeld een eenvoudige achtergrondverschuiving, een hellende achtergrondverschuiving, directe spectrale overlap en een complexe achtergrondverschuiving. Elk van deze storingen heeft zijn eigen oorzaken en oplossingen. Afhankelijk van de matrix moeten storingscorrecties worden toegepast en de operationele parameters worden geoptimaliseerd. Sommige storingen kunnen worden vermeden door verdunning of door aanpassing van de matrices. Bij elke onderzochte batch analysemonsters moet referentiemateriaal en materiaal waaraan bekende hoeveelheden van de analyt(en) zijn toegevoegd, alsmede blancomateriaal, op dezelfde wijze worden behandeld als de analysemonsters. Voor het nagaan van eventuele drift moet de standaard na bijvoorbeeld tien monsters nogmaals worden gemeten. Alle gebruikte reagentia moeten van de hoogst mogelijke zuiverheid zijn.

2.4.8.   Specifieke voorschriften voor inductief gekoppelde massaspectrometrie (ICP-MS)(11)

De bepaling van sporenelementen met een gemiddelde atoommassa, zoals chroom, koper en nikkel, kan sterk gestoord worden door andere isobare en polyatomaire ionen. Dit kan alleen worden verholpen met een oplossend vermogen van minimaal 7 000-8 000. Bij de MS-technieken voorkomende problemen zijn onder meer instrumentele drift, matrixeffecten en storing van het molecuulion (m/z < 80). Het gebruik van multipele interne standaarden die hetzelfde massabereik bestrijken als de te bepalen elementen is noodzakelijk om te corrigeren voor instrumentele drift en matrixeffecten.

Volledige ontleding van het organische materiaal in de monsters voorafgaande aan ICP-MS-metingen is van het grootste belang. Evenals bij AAS moeten vluchtige elementen, zoals jood, na ontsluiting in gesloten vaten in een stabiele oxidatietoestand gebracht worden. De ernstigste storingen zijn afkomstig van molecuulioncombinaties van argon (plasmagas), waterstof, koolstof, stikstof en zuurstof (voor het oplossen gebruikte zuren, onzuiverheden in het plasmagas en meegesleepte gassen uit de lucht) en de monstermatrix. Volledige ontsluiting, achtergrondmetingen, een juiste keuze van de analysemassa's, soms met een lagere abundantie (slechtere aantoonbaarheidsgrens), en van de voor het oplossen gebruikte zuren (bijvoorbeeld salpeterzuur) zijn nodig om storingen te vermijden.

Voor de te bepalen elementen moeten storingen worden uitgesloten door een juiste keuze van de specifieke analysemassa's, inclusief bevestiging van isotoopverhoudingen. Voor elke meting moet de respons van het instrument door middel van interne standaarden met behulp van Fano-factoren worden nagegaan.

3.   VALIDATIE

Door validatie moet worden aangetoond dat de analysemethode voldoet aan de criteria voor de desbetreffende prestatiekenmerken.

Verschillende controledoeleinden vereisen verschillende categorieën methoden. In de onderstaande tabel is aangegeven welk prestatiekenmerk met welk soort methode moet worden gecontroleerd.

Tabel 9

Indeling van analysemethoden naar de te bepalen prestatiekenmerken

		Aantoonbaarheidsgrens CCβ	Beslissingsgrens CCα	Juistheid/Terugvinding	Precisie	Gevoeligheid/Specificiteit	Toepasbaarheid/Robuustheid/Stabiliteit
Kwalitatieve methoden	S	+	–	–	–	+	+
	C	+	+	–	–	+	+
Kwantitatieve methoden	S	+	–	–	+	+	+
	C	+	+	+	+	+	+

3.1.   VALIDATIEPROCEDURES

Dit hoofdstuk bevat voorbeelden en/of referenties voor validatieprocedures voor analysemethoden. Er mogen ook andere methoden worden gebruikt om aan te tonen dat de analysemethode voldoet aan de prestatiecriteria voor het desbetreffende prestatiekenmerk, mits zij dezelfde hoeveelheid informatie van dezelfde kwaliteit opleveren.

De validatie kan ook plaatsvinden door middel van een interlaboratoriumonderzoek zoals vastgesteld door de Codex Alimentarius, ISO of IUPAC (12) of volgens alternatieve methoden zoals intralaboratoriumonderzoek of interne validatie (13)(14). Dit deel richt zich op intralaboratoriumonderzoek (interne validatie) aan de hand van een modulaire aanpak. Deze aanpak omvat:

Tabel 10

Modelonafhankelijke en modelafhankelijke prestatieparameters

Validatie
Modelonafhankelijke prestatieparameters	Modelafhankelijke prestatieparameters
Gemeenschappelijke prestatiekenmerken (punt 3.1.1)	Conventionele validatiemethode (punt 3.1.2)	Interne validatiemethode (punt 3.1.3)
Specificiteit	Terugvinding	Terugvinding
Juistheid	Herhaalbaarheid	Herhaalbaarheid
Robuustheid: kleine veranderingen	Intralabarotoriumreproduceerbaarheid	Intralaboratoriumreproduceerbaarheid
Stabiliteit	Reproduceerbaarheid	Reproduceerbaarheid
	Beslissingsgrens (CCα)	Beslissingsgrens (CCα)
	Detectievermogen (CCβ)	Detectievermogen (CCβ)
	IJkcurves	IJkcurve
	Robuustheid: grotere veranderingen	Robuustheid

3.1.1.   Modelonafhankelijke prestatieparameters

Ongeacht de gekozen validatiemethode moeten de volgende prestatiekenmerken worden bepaald. Om werk te besparen kan een zorgvuldig opgezette, statistisch deugdelijke benadering worden gevolgd om de voor het bepalen van de verschillende parameters te verrichten experimenten te combineren.

3.1.1.1.   Specificiteit

Voor analysemethoden is het vermogen om de analyt te onderscheiden van nauw verwante stoffen (isomeren, metabolieten, afbraakproducten, endogene stoffen, matrixbestanddelen, enz.) van belang. Er zijn twee benaderingen nodig om na te gaan of zich storingen voordoen.

Er moeten potentieel storende stoffen worden gekozen en relevante blancomonsters worden geanalyseerd om eventuele storingen op te sporen en het effect daarvan te schatten:

3.1.1.2.   Juistheid

De bepaling van de juistheid (een van de onderdelen van de nauwkeurigheid) wordt hierna beschreven. De juistheid kan alleen worden bepaald met behulp van gecertificeerd referentiemateriaal (CRM). Als een CRM beschikbaar is, moet dat worden gebruikt. De procedure wordt uitvoerig beschreven in ISO-norm 5725-4 (5). Hier volgt een voorbeeld:

Juistheid (in %) = gemiddelde voor de terugvinding gecorrigeerde gemeten concentratie × 100/gecertificeerde waarde.

Indien er geen CRM beschikbaar is, kan in plaats van de juistheid de terugvinding bepaald worden zoals in punt 4.1.2.1 is beschreven.

3.1.1.3.   Toepasbaarheid/robuustheid (kleine veranderingen)

Bij deze studies worden door het laboratorium opzettelijk kleine, in redelijkheid te verwachten veranderingen aangebracht en wordt gekeken wat hiervan de gevolgen zijn.

De aan het eigenlijke onderzoek voorafgaande studies moeten uitgevoerd worden door factoren met betrekking tot de voorbewerking, de opzuivering en de analyse te selecteren die van invloed kunnen zijn op de meetresultaten. Dit kunnen zijn de analist, de herkomst en de ouderdom van de reagentia, oplosmiddelen, standaarden en monsterextracten, de snelheid van verwarmen, de temperatuur, de pH en tal van andere factoren die in het laboratorium een rol kunnen spelen. De orde van grootte waarover deze factoren worden gevarieerd moet overeenkomen met de afwijkingen die gewoonlijk tussen laboratoria voorkomen.

Het principe is dat er niet telkens één verandering wordt bestudeerd, maar tegelijkertijd verschillende factoren worden gevarieerd. Stel bijvoorbeeld dat A, B, C, D, E, F, G de nominale waarden zijn voor zeven verschillende factoren die de resultaten kunnen beïnvloeden als deze nominale waarden in geringe mate veranderd worden. De alternatieve waarden geven we aan met de overeenkomstige kleine letters a, b, c, d, e, f en g. Dan zijn er 27 oftewel 128 verschillende combinaties mogelijk.

Hieruit kan een deelverzameling van acht combinaties worden gevormd waarbij de hoofd- en kleine letters in totaal even vaak voorkomen (tabel 11). Er moeten dan acht bepalingen uitgevoerd worden met bepaalde combinaties van de gekozen factoren (A-G). De resultaten van deze bepalingen zijn in tabel 11 als S-Z aangegeven.

Tabel 11

Proefopzet voor robuustheidsstudies (kleine veranderingen)

Factorwaarde F	Combinatie van bepalingen nr.
	1	2	3	4	5	6	7	8
A/a	A	A	A	A	a	a	a	a
B/b	B	B	b	b	B	B	b	b
C/c	C	c	C	c	C	c	C	c
D/d	D	D	d	d	d	d	D	D
E/e	E	e	E	e	e	E	e	E
F/f	F	f	f	F	F	f	f	F
G/g	G	g	g	G	g	G	G	g
Waargenomen resultaat R	S	T	U	V	W	X	Y	Z
Voor berekeningen zie de voorbeelden voor de bepaling van de robuustheid in punt 3.3.

3.1.1.4.   Stabiliteit

Geconstateerd is dat wanneer de analyt of de matrixbestanddelen in het monster tijdens de opslag of analyse onvoldoende stabiel zijn, er aanzienlijke afwijkingen in het analyseresultaat kunnen optreden. Ook de stabiliteit van de ijkstandaard in oplossing moet worden nagegaan. Doorgaans is de stabiliteit van de analyt onder verschillende opslagcondities goed gekarakteriseerd. Het controleren van de opslagcondities maakt deel uit van het normale laboratoriumaccreditatiesysteem. Is dit niet bekend, dan kan uit de onderstaande voorbeelden worden afgeleid hoe de stabiliteit kan worden bepaald.

3.1.1.5.   IJkcurves

Indien voor de kwantificering ijkcurves worden gebruikt:

Indien seriële ijking op basis van een standaardoplossing nodig is, moeten de aanvaardbaarheidsintervallen voor de parameters van de curve worden aangegeven, aangezien die van reeks tot reeks anders kunnen zijn.

3.1.2.   Conventionele validatieprocedures

Om de parameters volgens conventionele methoden te berekenen moeten verscheidene afzonderlijke proeven gedaan worden. Elk prestatiekenmerk moet voor elke grotere verandering worden bepaald (zie hierboven onder toepasbaarheid/robuustheid). Bij multianalytmethoden kunnen verschillende analyten tegelijkertijd geanalyseerd worden, mits eventueel relevante storingen van tevoren uitgesloten zijn. Verscheidene prestatiekenmerken kunnen op een soortgelijke wijze bepaald worden. Om werk te besparen wordt het daarom aangeraden om proeven zoveel mogelijk te combineren (bijvoorbeeld herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid met specificiteit, analyse van blancomonsters ter bepaling van de beslissingsgrens en testen op specificiteit).

3.1.2.1.   Terugvinding

Indien er geen CRM beschikbaar is, moet de terugvinding worden bepaald aan de hand van proeven met een blancomatrix waaraan analyt is toegevoegd, bijvoorbeeld volgens het volgende schema:

Deze conventionele methode ter bepaling van de terugvinding is een variant op de in punt 3.5 beschreven standaardadditiemethode, wanneer:

Indien aan een van de bovenstaande voorwaarden niet is voldaan, of vermoed wordt dat dat niet het geval is, moet de volledige procedure voor het bepalen van de terugvinding met behulp van de in punt 3.5 beschreven standaardadditiemethode worden gevolgd.

3.1.2.2.   Herhaalbaarheid

3.1.2.3.   Intralaboratoriumreproduceerbaarheid

3.1.2.4.   Reproduceerbaarheid

Indien de reproduceerbaarheid bepaald moet worden, moeten de laboratoria deelnemen aan ringonderzoeken overeenkomstig ISO 5725-2 (5).

3.1.2.5.   Beslissingsgrens (CCα)

De beslissingsgrens moet worden bepaald volgens de in deel 2, „Prestatiecriteria en andere voorschriften voor analysemethoden” vastgelegde voorschriften voor identificatie dan wel identificatie plus kwantificering.

Bij stoffen waarvoor geen toelaatbaar gehalte is vastgesteld, kan de CCα worden bepaald:

Bij stoffen waarvoor wel een toelaatbaar gehalte is vastgesteld, kan de CCα worden bepaald:

Zie ook artikel 5 en punt 3.2.

3.1.2.6.   Detectievermogen (CCβ)

Het detectievermogen moet worden bepaald volgens de in deel 2 gegeven voorschriften voor screening, identificatie dan wel identificatie plus kwantificering.

Bij stoffen waarvoor geen toelaatbaar gehalte is vastgesteld, kan de CCβ worden bepaald:

Bij stoffen waarvoor geen toelaatbaar gehalte is vastgesteld, kan de CCβ worden bepaald:

Zie ook punt 3.2.

3.1.2.7.   Robuustheid (grotere veranderingen)

De analysemethode moet onder verschillende proefomstandigheden worden getest, bijvoorbeeld met verschillende diersoorten, verschillende matrices of verschillende bemonsteringscondities. De aangebrachte veranderingen dienen groot te zijn. De invloed van deze veranderingen kan bijvoorbeeld worden nagegaan met behulp van de methode van Youden (15)(16). Elk prestatiekenmerk moet worden bepaald voor alle grotere veranderingen die een significant effect op de prestaties van de bepaling blijken te hebben.

3.1.3.   Validatie volgens andere modellen

Indien andere validatieprocedures worden gevolgd, moeten het model en de strategie waarop deze berusten met de verschillende eisen, aannamen en formules in het validatieprotocol worden vastgelegd of moet hier in elk geval naar worden verwezen. Hier volgt een voorbeeld voor een alternatieve benadering. Wanneer bijvoorbeeld het interne validatiemodel wordt toegepast, worden de prestatiekenmerken bepaald op een zodanige manier dat de methode binnen een en dezelfde validatieprocedure voor grotere veranderingen kan worden gevalideerd. Hiertoe moet een proefopzet worden uitgewerkt.

3.1.3.1.   Proefopzet

Er moet een proefopzet worden uitgewerkt afhankelijk van het aantal verschillende diersoorten en factoren dat wordt onderzocht. De validatieprocedure moet dus beginnen met te kijken naar de monsterpopulaties die in de toekomst in het laboratorium zullen worden onderzocht en daaruit de belangrijkste diersoorten en de factoren die van invloed kunnen zijn op de meetresultaten te selecteren. Vervolgens moet het concentratiebereik al naar gelang van het doel van de bepalingen en het betrokken concentratieniveau worden gekozen.

Tabel 13

Voorbeelden van factoren die voor de validatieprocedure van belang geacht worden

Geslacht van het dier	(factor 1)
Ras	(factor 2)
Omstandigheden bij het vervoer	(factor 3)
Opslagcondities	(factor 4)
Versheid van het monster	(factor 5)
Mesterijomstandigheden	(factor 6)
Verschillende analisten met uiteenlopende ervaring	(factor 7)

Tabel 14

Mogelijke proefopzet voor het bovenstaande voorbeeld

Diersoort	Factor 1	Factor 2	Factor 3	Factor 4	Factor 5	Factor 6	Factor 7	Factor 8
A	+	+	+	+	–	+	–	1
A	+	+	–	–	+	–	–	2
A	+	–	+	–	–	–	+	3
A	+	–	–	+	+	+	+	4
A	–	+	+	–	+	+	+	5
A	–	+	–	+	–	–	+	6
A	–	–	+	+	+	–	–	7
A	–	–	–	–	–	+	–	8
B	+	+	+	+	+	–	+	9
B	+	+	–	–	–	+	+	10
B	+	–	+	–	+	+	–	11
B	+	–	–	+	–	–	–	12
B	–	+	+	–	–	–	–	13
B	–	+	–	+	+	+	–	14
B	–	–	+	+	–	+	+	15
B	–	–	–	–	+	–	+	16

Aangezien elk monster (elke combinatie van factorniveaus) met vier verschillende concentraties rond het betrokken concentratieniveau moet worden verrijkt en voor elk niveau een blancomonster moet worden geanalyseerd, moeten er 5 × 16 = 80 analyses worden verricht om de hele validatieproef uit te voeren.

Uit deze 80 metingen kan het volgende worden berekend (13)(14):

Terugvinding

Met deze prestatiekenmerken kunnen de prestaties van de methode volledig worden geëvalueerd, aangezien niet alleen de invloed van de afzonderlijke factoren wordt nagegaan, maar ook de relevante combinaties van deze factoren. Met behulp van deze proefopzet kan worden uitgemaakt of een van de gekozen factoren van de globale ijkcurve moet worden uitgesloten omdat hij significant afwijkt van de standaardafwijkingen van de andere factoren.

3.1.3.2.   Powercurve

De powercurve verstrekt informatie over het detectievermogen van de methode in het gekozen concentratiebereik. Hij geeft de β-foutkans bij het toepassen van de bestudeerde methode aan. Met behulp van de powercurve kunnen de detectievermogens voor de verschillende categorieën (screening, bevestiging) of typen (kwalitatief of kwantitatief) methoden voor een bepaalde β-fout (bijvoorbeeld 5 %) worden berekend.

Figuur 1

Powercurve

Figuur 1 geeft een voorbeeld van de grafische bepaling van het detectievermogen (CCβ) van een analysemethode. Bij de beschouwde methode bedraagt het resterende risico om bij een concentratie van 0,50 μg/kg een foute beslissing te nemen 5 %. Bij een concentratie van 0,55 μg/kg is het risico van een fout-conforme beslissing tot 1 % gedaald.

3.1.3.3.   Reproduceerbaarheid

Ter bepaling van de reproduceerbaarheid van een methode via intralaboratoriumonderzoek (interne validatie) moet herhaaldelijk worden deelgenomen aan een proficiency-test overeenkomstig ISO-handleiding 43-1 (3) en 43-2 (4). De laboratoria mogen hun eigen methoden kiezen, mits die onder routineomstandigheden worden gebruikt. De standaardafwijking van het laboratorium kan worden gebruikt om de reproduceerbaarheid van de methode te bepalen.

3.2.   GRAFISCHE VOORSTELLING VAN DE VERSCHILLENDE ANALYSEGRENZEN

Figuur 2

Stoffen waarvoor geen toelaatbaar gehalte is vastgesteld

Figuur 3

Stoffen waarvoor een toelaatbaar gehalte is vastgesteld

3.3.   REKENVOORBEELD VOOR HET BEPALEN VAN DE ROBUUSTHEID VOOR KLEINE VERANDERINGEN VOLGENS DE METHODE VAN YOUDEN (16)

Vergelijking van gemiddelden (A)

AA = Σ(Ai)/4 AB = Σ(Bi)/4 AC = Σ(Ci)/4 AD = Σ(Di)/4 AE = Σ(Ei)/4 AF = Σ(Ei)/4 AG = Σ(Gi)/4 Aa = Σ(ai)/4 Ab = Σ(bi)/4 Ac = Σ(ci)/4 Ad = Σ(di)/4 Ae = Σ(ei)/4 Af = Σ(fi)/4 Ag = Σ(gi)/4

Vergelijk de gemiddelden van de hoofdletters (AA tot en met AG) met de gemiddelden van de corresponderende kleine letters (Aa tot en met Ag). Als een factor een effect heeft, zal het verschil significant groter zijn dan de verschillen van de overige factoren. Een robuuste methode mag niet worden beïnvloed door veranderingen die vrijwel zeker tussen laboratoria optreden. Zijn er geen opvallende verschillen, dan wordt de meest realistische maat van de toevallige fout gegeven door de zeven verschillen.

Verschillen (Di)	Kwadraten van de verschillen (Di 2)
Da = A – a = Σ(Ai) – Σ(ai) Db = B – b = Σ(Bi) – Σ(bi) Dc = C – c = Σ(Ci) – Σ(ci) Dd = D – d = Σ(Di) – Σ(di) De = E – e = Σ(Ei) – Σ(ei) Df = F – f = Σ(Fi) – Σ(fi) Dg = G – g = Σ(Gi) – Σ(gi)	Da 2 = waarde a Db 2 = waarde b Dc 2 = waarde c Dd 2 = waarde d De 2 = waarde e Df 2 = waarde f Dg 2 = waarde g

Standaardafwijking van de verschillen Di (sDi):

Indien sDi significant groter is dan de standaardafwijking van de methode wanneer die is uitgevoerd onder intralaboratoriumreproduceerbaarheidsomstandigheden (zie boven), staat vast dat alle factoren tezamen het resultaat beïnvloeden, ook al vertoont elke factor afzonderlijk geen significante invloed, en dat de methode onvoldoende robuust is voor de gekozen veranderingen.

3.4.   REKENVOORBEELDEN VOOR DE INTERNE VALIDATIEPROCEDURE

Voorbeelden en berekeningen voor het interne validatieprotocol zoals beschreven onder „Validatie volgens andere modellen” (punt 3.1.3) (13) (14).

3.5.   VOORBEELDEN VOOR DE STANDAARDADDITIEMETHODE

Een analysemonster met een analytgehalte T wordt verdeeld in twee analyseporties 1 en 2, met massa's m1 en m2. Analyseportie 2 wordt verrijkt met een volume VA van een oplossing van de analyt met concentratie ρA. Na extractie en zuivering volgens de methode worden twee extracten van de analyseporties verkregen met volumes V1 en V2. De terugvinding van de analyt wordt gesteld op rc. Beide extracten worden bepaald met een meetmethode met gevoeligheid b en geven een analytische respons van x1, respectievelijk x2.

Onder de aanname dat rc en b voor de analyt in het oorspronkelijke monster en in het verrijkte monster hetzelfde zijn, kan het gehalte T worden berekend als:

Aldus kan de terugvinding rc worden bepaald. Vervolgens wordt naast de bovenbeschreven bepaling een gedeelte van het extract van analyseportie 1 (met volume V3) verrijkt met een bekende hoeveelheid ρB.VB van de analyt en bepaald. De analytische respons is x3 en de terugvinding is:

Verder kan de gevoeligheid b berekend worden als:

Alle toepassingsvoorwaarden en bijzonderheden zijn beschreven (18).

4.   GEBRUIKTE AFKORTINGEN

AAS	Atomaire-absorptiespectrometrie

AES	Atomaire-emissiespectrometrie

AOAC-I

Association of Official Analytical Chemists International

B	Gebonden fractie (immunoassays)

CI	Chemische ionisatie

CRM	Gecertificeerd referentiemateriaal

2-D	Tweedimensionaal

DAD	Diode-array-detectie

DLC	Dunnelaagchromatografie

DPASV

Differential pulse anodic stripping voltammetrie

ECD	Elektronvangstdetectie

EI	Elektronimpactionisatie

GC	Gaschromatografie

HPLC	Hogeprestatievloeistofchromatografie

HPTLC

Hogeprestatiedunnelaagchromatografie

HRMS	Hoge resolutie (massaspectrometrie)

ICP-AES

Atomaire-emissiespectrometrie met inductief gekoppeld plasma

ICP-MS

Massaspectrometrie met inductief gekoppeld plasma

IR

Infrarood

ISO	International Standard Organisation (Internationale Organisatie voor Normalisatie)

LC	Vloeistofchromatografie

LR(MS)

Lage resolutie (massaspectrometrie)

MRPL	Minimaal vereiste prestatielimiet

MS	Massaspectrometrie

m/z	Massa-ladingverhouding

Rf	Relatieve migratie ten opzichte van het vloeistoffront (DLC)

RSDL	Relatieve standaardafwijkingen van het laboratorium

SIM	Selected ion monitoring

UV	Ultraviolet licht

VC	Variatiecoëfficiënt

VIS	Zichtbaar licht

5.   REFERENTIES

▼M1

---

BIJLAGE II

Minimaal vereiste prestatielimieten

Stof en/of metaboliet	Matrix	MRPL
Chlooramfenicol	Vlees
	Eieren	0,3 μg/kg
	Melk
	Urine
	Aquacultuurproducten
	Honing
Medroxyprogesteronacetaat	Niervet van varkens	1 μg/kg
Nitrofuranmetabolieten:
—  Furazolidon	Pluimveevlees	1 μg/kg voor alle stoffen
—  Furaltadon	Aquacultuurproducten
—  Nitrofurantoïne
—  Nitrofurazon
Som van malachietgroen en leucomalachietgroen	Vlees van aquacultuurproducten	2 μg/kg

---

( 1 ) PB L 125 van 23.5.1996, blz. 10.

( 2 ) PB L 65 van 5.3.1998, blz. 31.

( 3 ) PB L 290 van 24.11.1993, blz. 14.

( 4 ) PB L 286 van 18.10.1990, blz. 33.

( 5 ) PB L 118 van 14.5.1993, blz. 64.

( 6 ) PB L 118 van 14.5.1993, blz. 75.

( 7 ) PB L 251 van 11.9.1998, blz. 39.

( 8 ) Opbrengst: de massafractie van de in het monster aanwezige analyt die zich in het uiteindelijke extract bevindt.

( 9 ) Terugvinding (hier): de massafractie van de aan het monster toegevoegde analyt die zich in het uiteindelijke extract bevindt. In dit document wordt verder aangenomen dat de opbrengst en de terugvinding aan elkaar gelijk zijn en wordt alleen de term „terugvinding” gebruikt.