31984L0319

Komisijos Direktyva

1984 m. birželio 7 d.

iš dalies keičianti Tarybos direktyvos 77/96/EEB dėl trichinelių (trichinella spiralis) tyrimo naminių kiaulių šviežioje mėsoje, importuojamoje iš trečiųjų šalių, priedus

(84/319/EEB)

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,

atsižvelgdama į Europos ekonominės bendrijos steigimo sutartį,

atsižvelgdama į 1976 m. gruodžio 21 d. Tarybos direktyvą 77/96/EEB dėl trichinelių (trichinella spiralis) tyrimo naminių kiaulių šviežioje mėsoje, importuojamoje iš trečiųjų šalių [1], su paskutiniais pakeitimais, padarytais Direktyva 83/91/EEB [2], ypač į jos 8 straipsnį,

kadangi naujieji tyrimai įgalino atrasti tam tikrus trichinelių aptikimo kiaulienoje metodus; kadangi sveikatos apsaugos atžvilgiu šie metodai yra tokie pat patikimi, kaip ir esami metodai; kadangi reikia atitinkamai papildyti Direktyvos 77/96/EEB I priedą;

kadangi siekiant palengvinti trichinelių ištyrimą, valstybėms, kurios nėra narės ir valstybėms narėms turėtų būti leista rinktis iš siūlomų metodų;

kadangi šiuo metu taikomi trichinelių ištyrimo metodai turi būti tam tikru būdu techniškai pritaikyti, taip pat ir reikalavimai, kurių turi laikytis trichineles tiriančios laboratorijos;

kadangi šia direktyva nustatytos priemonės atitinka Veterinarijos nuolatinio komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ:

1 straipsnis

Direktyva 77/96/EEB iš dalies keičiama taip, kaip pateikta priede.

2 straipsnis

Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie, įsigalioję ne vėliau kaip iki 1985 m. sausio 1 d., įgyvendina šią direktyvą. Jos nedelsdamos apie tai praneša Komisijai.

3 straipsnis

Ši direktyva skirta valstybėms narėms.

Priimta Briuselyje, 1984 m. birželio 7 d.

Komisijos vardu

Poul Dalsager

Komisijos narys

[1] OL L 26, 1977 1 31, p. 67.

[2] OL L 59, 1983 3 5, p. 34.

--------------------------------------------------

PRIEDAS

A. I priedas iš dalies keičiamas taip:

1. II poskyrio a punkte:

- 10 įtrauka pakeičiama taip:

"stereomikroskopas (didinamoji galia nuo 15 iki 40 kartų) su atitinkamu apšvietimu",

- paskutinė įtrauka pakeičiama taip:

"virškinimo skystis, susidedantis iš:

10 g pepsino (80 u/g FIP: Fédération internationale de pharmacie), 5 ml HCl (bent 37 %), sumaišyti su vienu litru vandentiekio vandens."

2. III poskyris pakeičiamas taip:

"III. DIRBTINIO VIRŠKINIMO METODAS, KAI TIRIAMI BENDRI MĖGINIAI

a) Įranga ir reagentai

- peilis ir žnyplės mėginių paėmimui,

- mėsos malimo įrankis, kurio skylučių diametras — 2–3 mm,

- 3 l talpos Erlenmejerio kolba su guminiu arba vatos kamščiu,

- 2000 ml talpos kūgio formos piltuvėlis,

- paprastas A formos stovas, kurio ilgis – apie 28 cm, o vertikalė – 80 cm,

- žiedas, kurio apytikslis diametras – 10–11 cm ir kurį galima tvirtinti prie stovo,

- užvarža su plokščiomis žnyplėmis (23 × 40 mm), kuri gali būti pritvirtinta prie stovo dvigubu sukabinimu,

- sietas (skylutės dydis - 177 mikronai), kurio išorinis diametras – 11 cm, pagamintas iš žalvario ar nerūdijančio plieno,

- piltuvėlis, kurio vidinis diametras – ne mažesnis kaip 12 cm,

- 100 ml talpos stikliniai matavimo cilindrai,

- stereomikroskopas (didinamoji galia – 15–40 kartų) su atitinkamu apšvietimu arba trichinoskopas su horizontaliu stalu kompresoriui ir atitinkamu apšvietimu,

- naudojant trichinoskopą – indą, kuriame skaičiuojamos lervos, galima apibūdinti taip:

lervų skaičiavimo indą sudaro 3 mm storio akrilo plokštelės:

i) 180 × 40 mm indo dugnas, padalytas į kvadratus;

ii) 230 × 20 mm šoninės sienelės;

iii) 40 × 20 mm galinės sienelės. Dugnas ir galinės sienelės įstatomos tarp šoninių sienelių ir taip gaunamas indas su dviem mažomis rankenėlėm abiejuose galuose. Išorinis dugno paviršius turėtų būti 7–9 mm pakilęs nuo karkaso, suformuoto iš šoninių ir galinių sienelių, pagrindo. Dalys klijuojamos specialiais klijais,

- keletas 9 cm skersmens Petri lėkštelių (jos naudojamos, atliekant tyrimą stereomikroskopu), kurių dugno paviršius aštriu įrankiu padalytas į 10 × 10 mm tyrimo plotelius,

- keletas 10 l talpos šiukšlių dėžių, kurios teigiamų rezultatų atveju naudojamos įrankių dezinfekavimo tirpalams (pvz., formalinui) ir likusiam virškinimo tirpalui surinkti,

- koncentruota (37 %) druskos rūgštis,

- pepsinas, kurio koncentracija – 1:10000 NF (US National Formulary)

atitinkanti 1:12500 BP (British Pharmacopoea)

atitinkanti 2000 FIP (Fédération internationale de pharmacie),

- keletas padėklų, ant kurių galima laikyti 50 mėginių po 2 g,

- svarstyklės, sveriančios 0,1 g tikslumu.

b) Mėginių ėmimas

1. Kai tiriama visa skerdena, imamas apie 2 g mėginys iš abiejų diafragmos kojelių prie perėjimo į raumeningąją dalį. Kai diafragmos kojelių nėra, reikia paimti tokio paties dydžio mėginį iš diafragmos šonkaulinės arba krūtinkaulio dalies arba iš liežuvio, žandikaulio ar pilvo raumenų.

2. Kai turimi mėsos gabalai, imamas maždaug 2 g mėginys iš skeleto raumenų, kurie turi nedaug riebalų, o jei įmanoma – arčiau kaulų ar sausgyslių.

c) Metodas

1. i) Jungtinis 100 mėginių tyrimas

Iš 100 atskirų kiaulienos mėginių turi būti paimta maždaug 1 g. Šis jungtinis mėginys kartą perleidžiamas per mėsmalę.

Malta mėsa turi būti patalpinta 3 litrų talpos Erlenmejerio kolboje, pridedant į ją 7 g pepsino, apie 2 litrus vandentiekio vandens, pašildyto maždaug iki 40–41 oC, ir 25 ml koncentruotos druskos rūgšties. Mišinį reikia suplakti, kad ištirptų pepsinas.

Tirpalo pH bus lygus 1,5–2.

- Virškinimui Erlenmejerio kolba turi būti inkubuojama 40-41 oC temperatūroje maždaug keturias valandas. Inkubacinio periodo metu ją reikia laikas nuo laiko bent du kartus per valandą pakratyti.

- Suvirškintas tirpalas turi būti perfiltruojamas per sietą į kūgio formos 2 l atskiriantį piltuvėlį ir bent valandai paliekamas ant stovo.

- Iš viso apie 45 ml skysčio turi būti išleista į matavimo cilindrą ir išpilstyta į tris Petri lėkšteles, kurių dugnai turėtų būti padalyti į kvadratus po 15 ml kiekviename inde.

- Kiekvienas Petri lėkštelės turinys turi būti kruopščiai ištirtas, ieškant pro stereomikroskopą trichinelių lervų.

- Kai naudojami lervas skaičiuojantys indai, 45 ml skysčio turi būti paskirstyti į du lervų skaičiavimo indus, ir ištirti per trichinoskopą.

Nuosėdose lervas galima atpažinti, ir dažnai drungname vandenyje pastebimos susisukančios bei išsisukančios "spiralės".

- Nuosėdos turi būti ištirtos iš karto, kai tik baigtas virškinimas. Jokiu būdu tyrimo negalima atidėti kitai dienai.

Jei susidariusios nuosėdos nėra pakankamai skaidrios ar nebuvo ištirtos per 30 min. nuo paruošimo, jas būtina praskalauti: galutinis 45 ml mėginys pilamas į matavimo cilindrą ir paliekamas 10 minučių nusistovėti. Po to 30 ml paviršinio skysčio nusiurbiama, o likę 15 ml skysčio atskiedžiami vandentiekio vandeniu iki 45 ml. Skystis paliekamas nusistovėti 10 min., po to nusiurbiama 30 ml paviršinio skysčio, o likę 15 ml skysčio supilama į Petri lėkštelę arba trichinelių lervų skaičiavimo indą ištirti. Matavimo cilindras išplaunamas 10 ml vandentiekio vandens, kuris supilamas į mėginį Petri lėkštelėje arba lervų skaičiavimo inde ištirti.

ii) Jungtinio mėginio, kurį sudaro mažiau kaip 100 individualių mėginių, tyrimas

Prie jungtinio mėginio, kurį sudaro 100 mėginių, galima pridėti iki 15 pavienių mėginių, kuriuos galima tirti kartu su šitais mėginiais. Jei tiriama daugiau kaip 15 mėginių ir mažiau kaip 100 mėginių, turi būti naudojama atitinkamai mažiau virškinimo tirpalo.

2. Kai jungtinio mėginio analizės rezultatas teigiamas arba keliantis abejones, iš kiekvienos kiaulės, laikantis b punkto reikalavimų, turėtų būti paimtas kitas 20 g mėginys. 20 g mėginiai, paimti iš penkių kiaulių, turėtų būti sudėti kartu ir ištirti taikant pirmiau aprašytą metodą. Tokiu būdu bus ištirti mėginiai iš 20 grupių, kurių kiekviena sudaryta iš penkių kiaulių. Jei 5 skerdenų jungtinio mėginio tyrimo rezultatas teigiamas, iš tos grupės kiekvienos skerdenos imamas papildomas 20 g mėginys ir, taikant pirmiau aprašytą metodą, ištiriamas kiekvienas atskirai."

3. Pridedami IV, V ir VI poskyriai:

"IV. JUNGTINIŲ MĖGINIŲ TYRIMAS VIRŠKINIMO APARATU (LERVŲ IŠSKYRIMAS SEDIMENTACIJOS METODU)

a) Įranga ir reagentai

- peilis ar žirklutės mėginiams paimti,

- padėklai, padalyti į 50 kvadratų, kurių kiekviename kvadrate galima laikyti maždaug po 2 g mėsos mėginių,

- virškinimo aparatas "Lab-blender 3500 Thermo",

- virškinimo aparatui "Lab-blender" tinkami polietileniniai maišeliai,

- 2 litrų talpos kūgio formos piltuvėlis, pageidautina su tefloniniais saugos kaiščiais,

- stovas, žiedai ir užvaržos,

- sietas (skylutės dydis – 177 mikronai), kurio išorinis diametras – 11 cm, pagamintas iš nerūdijančio plieno,

- piltuvėliai sietams įdėti, kurių vidinis diametras – ne mažesnis kaip 12 cm,

- 100 ml stikliniai matavimo cilindrai,

- 25 ml talpos dozatorius,

- 3 l talpos menzūros,

- šaukštas arba stiklinė lazdelė virškinimo tirpalui menzūroje išmaišyti,

- plastikinis švirkštas ir žarnelė siurbti,

- 6 g matavimo šaukštas,

- 1–100 oC termometras (± 0,5 oC tikslumo),

- vibratorius, pvz., elektrinis skustuvas be galvutės,

- laiko relė, įsijungianti kas minutę,

- trichinoskopas su horizontaliu stalu arba stereomikroskopas su atitinkamu apšvietimu,

- atliekant tyrimą trichinoskopu naudojamas trichinelių lervų skaičiavimo indas, kurį sudaro 3 mm storio akrilo plokštelės:

i) 180 × 40 mm indo dugnas, padalytas į kvadratus;

ii) 230 × 20 mm šoninės sienelės;

iii) 40 × 20 mm galinės sienelės. Dugnas ir galinės sienelės įstatomos tarp šoninių sienelių ir taip gaunamas indas su dviem mažomis rankenėlėmis abiejuose galuose. Išorinis dugno paviršius turėtų būti 7-9 mm pakilęs nuo karkaso, suformuoto iš šoninių ir galinių sienelių, pagrindo. Dalys klijuojamos specialiais klijais,

- keletas 9 cm skersmens Petri lėkštelių (jos naudojamos atliekant tyrimą stereomikroskopu), kurių išorinis dugno paviršius aštriu įrankiu padalintas į 10 × 10 mm tyrimo plotelius,

- 17,5 % druskos rūgšties tirpalas,

- pepsinas, kurio koncentracija 1:10000 NF (US National Formulary),

atitinkanti 1:12500 BP (British Pharmacopoea)

atitinkanti 2000 FIP (Fédération internationale de pharmacie),

- keletas 10 l talpos šiukšlių dėžių, kurios teigiamų rezultatų atveju naudojamos įrankių dezinfekavimo tirpalams (pvz., formalinui) ir likusiam virškinimo tirpalui surinkti,

- svarstyklės, sveriančios 0,1 g tikslumu.

b) Mėginių ėmimas

1. Kai tiriama visa skerdena, imamas apie 2 g mėginys iš abiejų diafragmos kojelių prie perėjimo į raumeningąją dalį. Kai diafragmos kojelių nėra, reikia paimti tokio paties dydžio mėginį iš diafragmos šonkaulinės arba krūtinkaulio dalies arba žandikaulio ar pilvo raumenų.

2. Kai turimi mėsos gabalai, imamas maždaug 2 g mėginys iš skeleto raumenų, kurie turi nedaug riebalų, o jei įmanoma – arčiau kaulų ar sausgyslių.

c) Metodas

1. Virškinimo eiga

i) Jungtinis 100 mėginių tyrimas

- Virškinimo aparate "Lab-blender 3500" nustatoma 40–41 oC temperatūra, ir į jį įdedami vienas į kitą įdėti du polietileniniai maišeliai.

- Į vidinį maišelį įpilama 1,5 litro 32–35 oC temperatūros vandens ir pašildoma iki 40–41 oC.

- Į vandenį virškinimo aparate įpilami 25 ml 17,5 % druskos rūgšties.

- Įdedama 100 maždaug 1 g sveriančių mėginių (25–30 oC temperatūros), paimtų iš pavienių mėginių pagal b punkto reikalavimus.

- Galiausiai įdedami 6 g pepsino. Siekiant išvengti pepsino suirimo privaloma griežtai laikytis šios komponentų dėjimo tvarkos.

- Įjungiamas virškinimo aparatas, maišelio turinys virškinamas 25 min.

- Polietileninis maišelis ištraukiamas iš virškinimo aparato, ir virškinimo tirpalas per sietą filtruojamas į 3 litrų talpos menzūrą.

- Polietileninis maišelis išplaunamas maždaug 100 ml kiekiu vandens, kuris tada panaudojamas sietui išskalauti ir galiausiai įpilamas į menzūroje esantį filtratą.

Prie jungtinio 100 mėginių mėginio galima pridėti iki 15 papildomų pavienių mėginių, kuriuos galima tirti kartu su šiais mėginiais.

ii) Jungtiniai mėginiai, kuriuos sudaro mažiau kaip 100 pavienių mėginių

- Virškinimo aparate "Lab-blender 3500" nustatoma 40–41 oC temperatūra, ir į jį įdedami vienas į kitą įdėti du polietileniniai maišeliai.

- Virškinimo tirpalas paruošiamas taip: į maždaug 1,5 litro vandens įpilami 25 ml 17,5 % druskos rūgšties. Įdedami 6 g pepsino, viskas sumaišoma ir pašildoma iki 40–41 oC. Siekiant išvengti pepsino suirimo privaloma griežtai laikytis šios komponentų dėjimo tvarkos.

- Į vidinį maišelį pilamas virškinimo tirpalas ir dedami maždaug 1 g svorio pavieniai mėsos mėginiai (25–30 oC temperatūra), paimti pagal b punkto reikalavimus santykiu 15 ml virškinimo tirpalo su vienu gramu mėginio (pvz., 30 mėginių reikalingas tūris yra 30 × 15 ml, arba 450 ml).

- Į išorinį maišelį pripilama apie 41 oC temperatūros vandens, kad bendras vandens ir virškinimo tirpalo kiekis abiejuose maišeliuose sudarytų 1,5 litro.

- Įjungiamas virškinimo aparatas, maišelio turinys virškinamas 25 min.

- Iš virškinimo aparato ištraukiamas polietileninis maišelis, ir virškinimo tirpalas per sietą filtruojamas į 3 litrų talpos menzūrą.

- Polietileninis maišelis išplaunamas maždaug 100 ml kiekiu vandens, kuris tada panaudojamas sietui išskalauti ir galiausiai įpilamas į menzūroje esantį filtratą.

2. Lervų sedimentacijos tyrimo eiga

- Į virškinimo tirpalą įdedama 300–400 g ledo gabalėlių arba susmulkinto ledo, kad bendras tirpalo kiekis būtų apie 2 litrus. Tirpalą reikia maišyti, kol ledas ištirps.

Jei virškinama mažiau nei 100 mėginių (žr. 1 dalies ii papunktį), ledo kiekis atitinkamai sumažinamas.

- Atšaldytas virškinimo tirpalas perpilamas į 2 l atskiriantį piltuvėlį, prie kurio papildomo gnybto pritvirtintas vibratorius.

- Sedimentacija trunka 30 min., jos metu sedimentatuojamas piltuvėlis vibruojamas 1 minutę su 1 minutės pertrauka.

- Po 30 min. į 100 ml matavimo cilindrą greitai nuleidžiama 60 ml nuosėdų mėginio, (panaudotas piltuvėlis išplaunamas detergento tirpalu).

- 60 ml mėginys paliekamas mažiausiai 10 min. nusistovėti, paskui paviršinis skystis nusiurbiamas ir paliekama 15 ml skysčio ištirti, ar yra lervų.

- Nusiurbti galima vienkartiniu švirkštu su plastikine žarnele.

Žarnelės ilgis turi būti toks, kad matavimo cilindre liktų 15 ml skysčio, kai švirkšto stūmoklis ištrauktas ir atremtas į cilindro briauną.

- Likę 15 ml skysčio supilama į trichinelių lervų skaičiavimo indą arba į dvi Petri lėkšteles ir tiriama atitinkamai trichinoskopu arba stereomikroskopu.

- Nuosėdos turi būti ištirtos iš karto, kai tik baigiamas virškinimas. Jokiu būdu tyrimo negalima atidėti kitai dienai.

Jei susidariusios nuosėdos nėra pakankamai skaidrios ar nebuvo ištirtos per 30 min. nuo paruošimo, jas būtina praskalauti: galutinis 60 ml mėginys supilamas į matavimo cilindrą ir paliekamas 10 min. nusistovėti. Po to 45 ml paviršinio skysčio nusiurbiama, o likę 15 ml skysčio atskiedžiama vandentiekio vandeniu iki 45 ml. Skystis paliekamas nusistovėti 10 min., paskui nusiurbiama 30 ml paviršinio skysčio, o likę 15 ml skysčio supilama į Petri lėkštelę arba trichinelių lervų skaičiavimo indą ištirti. Matavimo cilindras išplaunamas 10 ml vandentiekio vandens, kuris taip pat supilamas į mėginį Petri lėkštelėje arba trichinelių lervų skaičiavimo inde ištirti.

3. Kai jungtinio mėginio analizės rezultatas teigiamas arba keliantis abejones, iš kiekvienos kiaulės skerdenos imami papildomi 20 g mėginiai, laikantis pirmiau nurodyto b punkto reikalavimų. Paruošiamas bendras 5 skerdenų 100 g mėginys ir tiriamas pirmiau aprašytu metodu. Taip ištiriama 20 skerdenų grupių po 5 kiekvienoje. Jei 5 skerdenų jungtinio mėginio tyrimo rezultatas teigiamas, iš tos grupės kiekvienos skerdenos imamas papildomas 20 g mėginys ir ištiriamas kiekvienas atskirai taikant pirmiau aprašytą metodą.

V. JUNGTINIŲ MĖGINIŲ TYRIMAS VIRŠKINIMO APARATU (LERVŲ IŠSKYRIMAS FILTRO IZOLIACIJOS METODU)

a) Įranga ir reagentai

Nurodyti IV poskyrio a punkte.

Be jau minėtosios, naudojama papildoma įranga:

- 1 litro talpos Gelmano piltuvėlis su filtro laikikliu (diametras – 45 mm),

- filtro diskai, kuriuos sudaro:

apskritas nerūdijančio plieno tinklelis, kurio skylučių dydis – 35 mikronai (disko skersmuo – 45 mm),

du 1 mm storio guminiai žiedai (išorinis diametras – 45 mm, vidinis diametras – 38 mm),

apskritas tinklelis, įdedamas tarp dviejų guminių žiedų ir priklijuojamas specialiais dviejų komponentų klijais,

- 3 l talpos Erlenmejerio kolba su žarnele siurbti šone,

- filtro pompa,

- mažiausiai 80 ml talpos polietileniniai maišeliai,

- įranga polietileniniams maišeliams sandarinti,

- renilazė, kurios koncentracija – 1:150000 soksleto vienetų/g.

b) Mėginių ėmimas

Žr. IV poskyrio b punktą.

c) Metodas

1. Virškinimo eiga

i) Jungtinis 100 mėginių tyrimas

Žr. IV poskyrio c punkto 1 dalies i papunktį.

ii) Jungtinio mėginio, kurį sudaro mažiau nei 100 pavienių mėginių, tyrimas

Žr. IV poskyrio c punkto 1 dalies ii papunktį.

2. Lervų filtracijos tyrimo eiga

- Į virškinimo tirpalą įdedama 300–400 g ledo gabalėlių arba susmulkinto ledo, kad bendras tirpalo kiekis būtų apie 2 litrus.

Jei virškinama mažiau nei 100 mėginių, ledo kiekis atitinkamai sumažinamas.

- Tirpalą reikia maišyti, kol ledas ištirps. Atvėsęs virškinimo tirpalas paliekamas mažiausiai 3 min., kad lervos galėtų rangytis.

- Gelmano piltuvėlis su filtro laikikliu ir filtro disku įtaisomas ant Erlenmejerio kolbos, prijungtos prie filtro pompos.

- Virškinimo tirpalas pilamas į Gelmano piltuvėlį ir filtruojamas. Baigiantis filtracijai tam, kad virškinimo tirpalas lengviau pratekėtų pro filtrą, galima siurbti su filtro pompa. Siurbimas turi būti baigtas prieš filtrui išdžiūvant, t. y. piltuvėlyje likus 2–5 ml tirpalo.

- Prafiltravus visą virškinimo tirpalą, filtro diskas nuimamas ir įdedamas į 80 ml talpos polietileninį maišelį kartu su 15–20 ml renilazės tirpalo. Renilazės tirpalas paruošiamas įdėjus 2 g renilazės į 100 ml vandentiekio vandens.

- Polietileninis maišelis dukart hermetiškai uždaromas ir įdedamas į virškinimo aparatą tarp vidinio ir išorinio maišelio.

- Įjungiamas virškinimo aparatas, virškinama 3 min., t. y. kol jis tiria jungtinį ar kitą mėginį.

- Praėjus 3 min. polietileninis maišelis su filtro disku ir renilazės tirpalu ištraukiamas iš virškinimo aparato ir prakerpamas žirklėmis. Skystis išpilamas į lervų skaičiavimo indą arba Petri lėkštelę. Maišelis išplaunamas 5-10 ml vandens, kuris po to supilamas į lervų skaičiavimo indą ištirti trichinoskopu arba į Petri lėkštelę – ištirti stereomikroskopu.

- Nuosėdos turi būti ištirtos iš karto, kai tik baigiamas virškinimas. Jokiu būdu tyrimo negalima atidėti kitai dienai.

Pastaba

Filtro diskai turi būti naudojami tik tada, jei jie yra visiškai švarūs. Negalima leisti, kad nešvarūs diskai išdžiūtų.

Filtro diskai gali būti plaunami palikus juos nakčiai renilazės tirpale. Prieš pradedant naudoti diskai turi būti išplauti šviežiame renilazės tirpale naudojant virškinimo aparatą.

3. Kai jungtinio mėginio analizės rezultatas teigiamas arba keliantis abejones, iš kiekvienos kiaulės skerdenos turėtų būti paimamas papildomas 20 g mėginys, laikantis b punkto reikalavimų. 20 g mėginiai, paimti iš penkių kiaulių, turėtų būti sudėti kartu ir ištirti, taikant pirmiau minėtą metodą. Tokiu būdu bus ištirti mėginiai iš 20 grupių, kurių kiekviena sudaryta iš penkių kiaulių. Jei 5 skerdenų jungtinio mėginio tyrimo rezultatas teigiamas, iš tos grupės kiekvienos skerdenos imamas papildomas 20 g mėginys ir ištiriamas kiekvienas atskirai taikant pirmiau aprašytą metodą.

VI. JUNGTINIŲ MĖGINIŲ TYRIMAS VIRŠKINIMO METODU NAUDOJANT MAGNETINĘ MAIŠYKLĘ

a) Įranga ir reagentai

- peilis ir žnyplės mėginių paėmimui,

- padėklai, padalyti į 50 kvadratų, kurių kiekviename kvadrate galima laikyti maždaug 2 g mėsos mėginių,

- mikseris mėginiams susmulkinti,

- magnetinė maišyklė su termostatiškai kontroliuojama šildymo plokšte ir apie 5 cm ilgio teflonu padengtais magnetiniais strypukais,

- 2 litrų talpos kūgio formos piltuvėlis,

- stovas, žiedai ir užvaržos,

- sietas (skylutės dydis – 177 mikronai), kurio išorinis diametras – 11 cm, pagamintas iš nerūdijančio plieno,

- piltuvėliai sietams įdėti, kurių vidinis diametras – ne mažesnis kaip 12 cm,

- 3 litrų talpos menzūros,

- apie 50 ml talpos matavimo cilindrai ar centrifuginiai mėgintuvėliai,

- trichinoskopas su horizontaliu stalu arba stereomikroskopas su atitinkamu apšvietimu,

- lervų skaičiavimo indas (naudojant trichinoskopą): lervų skaičiavimo indas, pagamintas iš 3 mm storio akrilo plokštelių, kurį galima apibūdinti taip:

i) 180 × 40 mm indo dugnas, padalytas į kvadratus;

ii) dvi 230 × 20 mm šoninės sienelės;

iii) dvi 40 × 20 mm galinės sienelės. Dugnas ir galinės sienelės įstatomos tarp šoninių sienelių ir taip gaunamas indas su dviem mažomis rankenėlėmis abiejuose galuose. Išorinis dugno paviršius turėtų būti 7-9 mm pakilęs nuo karkaso, suformuoto iš šoninių ir galinių sienelių, pagrindo. Dalys klijuojamos specialiais klijais,

- keletas 9 cm skersmens Petri lėkštelių (jos naudojamos atliekant tyrimą stereomikroskopu), kurių išorinis dugno paviršius aštriu įrankiu padalytas į 10 × 10 mm tyrimo plotelius,

- aliuminio folija,

- 25 % druskos rūgštis,

- pepsinas, kurio koncentracija – 1:10000 NF (US National Formulary)

atitinkanti 1:12500 BP (British Pharmacopoea)

atitinkanti 2000 FIP (Fédération internationale de pharmacie),

- 46–48 oC temperatūros vandentiekio vanduo,

- keletas 10 l šiukšlių dėžių, kurios teigiamų rezultatų atveju naudojamos įrankių dezinfekavimo tirpalams (pvz., formalinui) ir likusiam virškinimo tirpalui surinkti,

- svarstyklės, sveriančios 0,1 g tikslumu.

b) Mėginių ėmimas

1. Kai tiriama visa skerdena, imamas apie 2 g mėginys iš abiejų diafragmos kojelių prie ties perėjimo į raumeningąją dalį. Kai diafragmos kojelių nėra, reikia paimti tokio paties dydžio mėginį iš diafragmos šonkaulinės arba krūtinkaulio dalies arba žandikaulio ar pilvo raumenų.

2. Kai turimi mėsos gabalai, imamas maždaug 2 g mėginys iš skeleto raumenų, kurie turi nedaug riebalų, o jei įmanoma – arčiau kaulų ar sausgyslių.

c) Metodas

1. i) Jungtinis 100 mėginių tyrimas

- 100 maždaug 1 g svorio pavienių mėginių, paimtų, kaip nurodyta b punkte, susmulkinama mikseriu. Smulkinama 3 ar 4 kartus maždaug po 1 sekundę.

- Susmulkinti mėginiai dedami į 3 litrų talpos menzūrą ir apšlakstomi 10 g pepsino. 2 l pašildyto iki 46–48 oC temperatūros vandentiekio vandens įpilama į menzūrą kartu su 16 ml druskos rūgšties tirpalo.

- Mikserio peilis kelis kartus įmerkiamas į virškinimo tirpalą, kad atliptų prie peilio prilipę mėsos likučiai.

- Į menzūrą su virškinimo tirpalu ir mėginiais dedamas magnetinis strypukas, ir menzūra uždengiama aliuminio folija.

- Menzūra dedama ant pašildytos magnetinės maišyklės, pradedamas maišymas. Prieš pradedant maišyti magnetinė maišyklė sureguliuojama taip, kad viso proceso metu palaikytų pastovią 44–46 oC temperatūrą. Maišymo metu tirpalas turi nesitaškydamas suktis tokiu greičiu, kad susidarytų pakankamai gilus sūkurys.

- Virškinimo tirpalas maišomas 30 min., paskui maišyklė išjungiama, o virškinimo tirpalas per sietą supilamas į nuosėdų piltuvėlį.

- Virškinimo tirpalas paliekamas nusistovėti piltuvėlyje 30 min.

- Praėjus 30 min. 40 ml virškinimo tirpalo mėginio greit nuleidžiama į matavimo cilindrą ar centrifuginį mėgintuvėlį.

- 40 ml mėginys paliekamas 10 min. nusistovėti, paskui 30 ml paviršinio sluoksnio nusiurbiama, paliekama 10 ml.

- Likę 10 ml nuosėdų mėginio supilama į trichinelių lervų skaičiavimo indą arba Petri lėkštelę.

- Tada matavimo cilindras arba centrifuginis mėgintuvėlis išplaunamas apie 10 ml kiekiu vandentiekio vandens, kuris supilamas į trichinelių lervų skaičiavimo indą arba į Petri lėkštelę atitinkamai trichinoskopu arba stereomikroskopu ištirti.

- Nuosėdos turi būti ištirtos iš karto, kai tik baigiamas virškinimas. Jokiu būdu tyrimo negalima atidėti kitai dienai.

Jei susidariusios nuosėdos nėra pakankamai skaidrios ar nebuvo ištirtos per 30 min. nuo paruošimo, jas būtina praskalauti: galutinis maždaug 40 ml mėginys supilamas į matavimo cilindrą ir paliekamas 10 min. nusistovėti. Po to 30 ml paviršinio skysčio nusiurbiama ir paliekama 10 ml skysčio, kuris vandentiekio vandeniu atskiedžiamas iki 40 ml. Skystis paliekamas 10 min. nusistovėti, paskui nusiurbiama 30 ml paviršinio skysčio, o likę 10 ml skysčio supilama į Petri lėkštelę arba trichinelių lervų skaičiavimo indą ištirti. Matavimo cilindras išplaunamas 10 ml vandentiekio vandens, kuris taip pat supilamas į mėginį Petri lėkštelėje arba trichinelių lervų skaičiavimo inde ištirti.

Jeigu yra per daug nuosėdų, kurios trukdo atlikti tyrimą, mėginys supilamas atgal į matavimo cilindrą, papildomas vandentiekio vandeniu iki 40 ml, paskui kartojama pirmiau aprašyta procedūra.

ii) Jungtinio mėginio, kurį sudaro mažiau nei 100 individualių mėginių, tyrimas

Esant reikalui, prie viso jungtinio mėginio, kurį sudaro 100 individualių mėginių, galima pridėti iki 15 papildomų pavienių 1 g mėginių ir kartu ištirti, kaip nurodyta c punkto 1 dalies i papunktyje. Pridėjus daugiau kaip 15 mėginių, reikia tirti kaip atskirą jungtinį mėginį. Virškinant jungtinius mėginius, kuriuos sudaro ne daugiau kaip 50 individualių mėginių, virškinimo tirpalo kiekį galima sumažinti iki vieno litro.

2. Kai jungtinio mėginio analizės rezultatas teigiamas arba keliantis abejones, iš kiekvienos skerdenos papildomai imami 20 g mėginiai pagal pirmiau nurodytus b punkto reikalavimus. Padaromas 5 skerdenų po 20 g bendras mėginys ir tiriamas pirmiau aprašytu metodu. Taip ištiriami mėginiai iš 20 grupių po 5 skerdenas kiekvienoje. Jei 5 skerdenų jungtinio mėginio tyrimo rezultatas teigiamas, iš tos grupės kiekvienos skerdenos imamas papildomas 20 g mėginys ir ištiriamas kiekvienas atskirai taikant pirmiau aprašytą metodą."

B. II priedo I poskyrio 1 dalis iš dalies keičiama taip:

1. b punkto tekstas pakeičiamas taip:

"b) tinkamai įrengta užrakinama patalpa, kuri gali būti užtemdyta, tyrimą atliekant trichinoskopu;"

.

2. Punktas f panaikinamas, punktai g, h, i, j, k, l, m ir n tampa atitinkamai punktais f, g, h, i, j, k, l ir m.

3. Naujojo punkto g tekstas pakeičiamas taip:

"g) prausykla, kurioje valoma ir dezinfekuojama tyrimų įranga (pvz., talpyklos, kuriose laikomi mėginiai, kompresoriai, peiliai ir žirklės), su

- vandeniui atsparia grindų danga, netrūdijančia ir lengvai valoma ir dezinfekuojama,

- lygiomis sienomis, kurios bent iki 2 m aukščio padengtos plaunama šviesios spalvos danga arba dažais.

Ši nuostata netaikoma naudojant I priedo II, III, IV, V ir VI poskyriuose nurodytus metodus, kai laboratorijose yra įrengta didelė darbui tinkama kriauklė."

--------------------------------------------------