1.1.1.1.

Ricoprire le piastre ELISA con la proteina VP7 ricombinante dell'AHSV-4 diluita in un tampone di carbonato/bicarbonato a pH 9,6. Incubare le piastre per una notte a una temperatura di 4 °C.

1.1.1.2.

Lavare le piastre cinque volte con acqua distillata contenente 0,01 % (v/v) di Tween 20 (soluzione di lavaggio). Tamponare leggermente le piastre su un materiale assorbente per rimuovere i residui della soluzione di lavaggio.

1.1.1.3.

Bloccare le piastre con un tampone fosfato salino (phosphate buffered saline- PBS) a pH 7,2 + 5 % (p/v) di latte scremato (latte scremato in polvere NestléTM), 200 μl per pozzetto, per 1 ora a 37 °C.

1.1.1.4.

Rimuovere la soluzione bloccante e tamponare leggermente le piastre su un materiale assorbente.

1.1.2.1.

I campioni di siero da esaminare e i sieri di controllo positivo e negativo sono diluiti 1:25 in PBS + 5 % (p/v) di latte scremato + 0,05 % (v/v) di Tween 20, 100 μl per pozzetto. Incubare per 1 ora a una temperatura di 37 °C.

Per la titolazione, eseguire diluizioni seriali duplici da 1:25 (100 μl per pozzetto) con un unico siero per ogni striscia della piastra e ripetere l'operazione con i controlli positivi e negativi. Incubare per 1 ora a una temperatura di 37 °C.

1.1.2.2.

Lavare le piastre cinque volte con acqua distillata contenente 0,01 % (v/v) di Tween 20 (soluzione di lavaggio). Tamponare leggermente le piastre su un materiale assorbente per rimuovere i residui del lavaggio.

1.1.3.1.

Distribuire in ogni pozzetto 100 μl di gammaglobulina anti-cavallo coniugata con perossidasi di rafano (horseradish-peroxidase — HRP), diluita in PBS + 5 % di latte + 0,05 % di Tween 20, a pH 7,2. Incubare per 1 ora a una temperatura di 37 °C.

1.1.3.2.

Lavare le piastre cinque volte con acqua distillata contenente 0,01 % (v/v) di Tween 20 (soluzione di lavaggio). Tamponare leggermente le piastre su un materiale assorbente per rimuovere i residui del lavaggio.

1.1.4.1.

Aggiungere in ogni pozzetto 200 μl di soluzione di cromogeno/substrato [10 ml di 80,6 mM DMAB (dimetilamminobenzaldeide) + 10 ml di 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzotiazolina idrazone idrocloruro) + 5 μl di H2O2].

La colorazione viene arrestata aggiungendo 50 μl di 3N H2SO4 dopo circa 5-10 minuti (prima che il controllo negativo inizi a colorarsi).

Possono essere utilizzati anche altri cromogeni, ad esempio ABTS [2,2′-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-acido sulfonico)], TMB (tetrametilbenzidina) oppure OPD (ortofenildiammina).

1.1.4.2.

Leggere le piastre a 600 nm (o 620 nm).

1.2.1.

Calcolare il valore soglia (cut-off) aggiungendo 0,06 al valore del controllo negativo (0,06 è la deviazione standard ottenuta con un gruppo di 30 sieri negativi).

1.2.2.

I campioni di prova che presentano valori di assorbanza inferiori al cut-off sono considerati negativi.

1.2.3.

I campioni di prova che presentano valori di assorbanza superiori al cut-off + 0,15 sono considerati positivi.

1.2.4.

I campioni di prova che presentano valori di assorbanza intermedi sono considerati non conclusivi e per confermare il risultato deve essere utilizzata un'altra tecnica.

2.1.1.1.

Ricoprire le piastre ELISA con 50-100 ng di proteina VP7 ricombinante dell'AHSV-4 diluita in un tampone di carbonato/bicarbonato a pH 9,6. Incubare le piastre per una notte a una temperatura di 4 °C.

2.1.1.2.

Lavare le piastre tre volte con un tampone fosfato salino (PBS) 0,1× contenente 0,135 M di NaCl e lo 0,05 % (v/v) di Tween 20 (PBST). Tamponare leggermente le piastre su un materiale assorbente per rimuovere i residui del lavaggio.

2.1.2.1.

I campioni di siero da esaminare e i sieri di controllo positivo e negativo sono diluiti 1:25 in un diluente contenente 0,35 M di NaCl, 0,05 % (v/v) di Tween 20 e 0,1 % di Kathon, 100 μl per pozzetto. Incubare per 1 ora a una temperatura di 37 °C.

Per la titolazione, eseguire diluizioni seriali duplici dei sieri del test da 1:10 a 1:280 in 8 pozzetti (100 μl per pozzetto) con un unico siero per ogni striscia della piastra e ripetere l'operazione con i controlli positivo e negativo. Incubare per 1 ora a una temperatura di 37 °C.

2.1.2.2.

Lavare le piastre cinque volte con un tampone fosfato salino (PBS) 0,1× contenente 0,135 M di NaCl e 0,05 % (v/v) di Tween 20 (PBST). Tamponare leggermente le piastre su un materiale assorbente per rimuovere i residui del lavaggio.

2.1.3.1.

Distribuire in ciascun pozzetto 100 μl di anticorpo monoclonale anti-VP7 coniugato con perossidasi di rafano. Questo anticorpo monoclonale è stato precedentemente diluito da 1/5 000 a 1/15 000 in una soluzione di StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics, riferimento: SZ03) in acqua distillata. Incubare per 30 minuti a una temperatura di 37 °C.

2.1.3.2.

Lavare le piastre cinque volte con un tampone fosfato salino (PBS) 0,1× contenente 0,135 M di NaCl e 0,05 % (v/v) di Tween 20 (PBST). Tamponare leggermente le piastre su un materiale assorbente per rimuovere i residui del lavaggio.

2.2.1.

Determinare la percentuale di blocco (BP) di ciascun campione applicando la seguente formula, in cui «Abs» sta per anticorpi:

2.2.2.

I campioni che presentano un valore BP superiore al 50 % dovranno essere considerati positivi per quanto riguarda gli anticorpi contro l'AHSV.

2.2.3.

I campioni che presentano un valore BP inferiore al 45 % dovranno essere considerati negativi per quanto riguarda gli anticorpi contro l'AHSV.

2.2.4.

I campioni che presentano un valore BP compreso tra 45 % e 50 % dovranno essere considerati non conclusivi e vanno sottoposti a un'altra prova. Se il risultato è nuovamente inconclusivo, gli animali dovranno essere sottoposti a un'altra prova su campioni prelevati almeno due settimane dopo il prelievo del campione considerato non conclusivo.

—

l'estrazione del fenolo-cloroformio degli acidi nucleici,

—

l'adsorbimento degli acidi nucleici con il sistema di filtro,

—

l'adsorbimento degli acidi nucleici con il sistema delle biglie magnetiche.

1.1.

1 g di un campione di tessuto è omogeneizzato in 1 ml di soluzione denaturante (4 M guanidina tiocianato, 25 mM citrato di sodio, 0,1 M 2-2-mercaptoetanolo, 0,5 % sarcosyl).

1.2.

Dopo la centrifugazione si aggiungono al supernatante 1 μg di RNA di lievito, 0,1 ml di 2 M acetato di sodio a pH 4, una miscela di 1 ml di fenolo e 0,2 ml di cloroformio/alcool isoamilico (49:1).

1.3.

Si scuote vigorosamente la sospensione, raffreddandola sul ghiaccio per 15 minuti.

1.4.

Dopo centrifugazione l'RNA presente nella fase acquosa è fenolo estratto, etanolo precipitato e risospeso in acqua sterile.

—

primer forward

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

primer reverse

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

sonda MGB-TaqMan

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

La concentrazione dello stock del primer è diluita fino una una concentrazione d'uso di 8 μM («stock d'uso del primer di 8 μM») mentre la sonda è diluita fino a una concentrazione d'uso di 50 μM («stock d'uso della sonda di 50 μM»). Si dovrebbe preparare uno schema della piastra sperimentale e caricarlo nella software sul dispositivo di PCR in tempo reale. Utilizzando lo schema come guida, si aggiungono 2,5 μl di ciascuno stock d'uso del primer di 8 μM a ciascun pozzetto che conterrà campioni di RNA, un controllo positivo e/o un controllo negativo (la concentrazione finale del primer sarà di 1 μM nella miscela RT-PCR di 20 μl). La piastra viene raffreddata sul ghiaccio.

2.1.2.

2 μl di RNA isolato (campioni di prova e controllo positivo) o 2 μl di acqua senza RNA nei controlli con reazione negativa sono mescolati con i primer forward e reverse. Questa miscela viene denaturata mediante riscaldamento a 95 °C per 5 minuti, seguito da un rapido raffreddamento su ghiaccio per almeno 5 minuti.

2.1.3.

Si prepara un appropriato volume di miscela master RT-PCR a fase unica in tempo reale per il numero di campioni da esaminare seguendo le istruzioni del fabbricante. Aggiungere 0,1μl dello stock d'uso della sonda di 50 μM a ciascun pozzetto contenente campioni di RNA (la concentrazione finale della sonda sarà di 0,25 μM in ogni pozzetto contenente campioni di RNA). Distribuire 13 μl della miscela master RT-PCR a fase unica in tempo reale in ciascun pozzetto sulla piastra di PCR contenente l'RNA e i primer denaturati.

2.1.4.

La piastra è collocata in un termociclatore a tempo reale programmato per la retro-trascrizione e per l'amplificazione del cDNA/l'individuazione della fluorescenza. Le condizioni di amplificazione consistono in una prima fase di retro-trascrizione a 48 °C per 25 minuti, seguita da 10 minuti a 95 °C («hot start») e 40 cicli di 15 secondi a 95 °C, 35 secondi a 55 °C e 30 secondi a 72 °C (oppure 40 cicli a 97 °C per 2 secondi e 55 °C per 30 secondi, se si utilizzano reagenti e un termociclatore che consentono reazioni rapide). I dati sulla fluorescenza sono rilevati alla fine della fase a 55 °C.

2.1.5.

Se si ottengono curve di amplificazione atipiche, il saggio non è considerato valido e deve essere ripetuto.

I campioni sono considerati positivi se il valore Ct (numero del ciclo in cui la fluorescenza emessa in una reazione attraversa la soglia di fluorescenza) è inferiore o uguale alla soglia Ct definita (35) nei 40 cicli della PCR (Ct ≤ 35).

I campioni sono considerati non conclusivi se il valore Ct è superiore alla soglia Ct definita (35) nei 40 cicli della PCR (Ct ≤ 35).

I campioni sono considerati negativi se si ottiene una curva di amplificazione orizzontale che non taglia la linea soglia nei 40 cicli della PCR.

—

primer forward:

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

primer reverse

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

sonda MGB-TaqMan

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

Le soluzioni stock della miscela di primer e sonda sono preparate in una concentrazione 25× di 5 μΜ per i primer forward e reverse e 3 μΜ per la sonda. Si dovrà preparare uno schema della piastra sperimentale e caricarlo nella software sul dispositivo della PCR in tempo reale. Utilizzando lo schema come guida, aggiungere 5 μl di campioni di RNA, comprendenti campioni di prova e controlli positivi e negativi, ai pozzetti appropriati della piastra seguendo lo schema.

2.2.2.

L'RNA viene denaturato mediante riscaldamento a 95 °C per 5 minuti, seguito da un rapido raffreddamento sul ghiaccio per almeno 3 minuti.

2.2.3.

Si prepara un volume appropriato di miscela master RT-PCR a fase unica in tempo reale per il numero di campioni da esaminare, seguendo le istruzioni del fabbricante. Includere 1 μl della soluzione stock 25 × della miscela di primer e sonda (di cui al punto 2.2.1) nella miscela master per ottenere una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 200 nM per ogni primer e 120 nM della sonda. Distribuire 20 μl della miscela master in ciascun pozzetto sulla piastra PCR contenente l'RNA denaturato.

2.2.4.

La piastra è collocata in un termociclatore a tempo reale programmato per la retro-trascrizione e l'amplificazione del cDNA/l'individuazione della fluorescenza, come indicato dai fabbricanti. Le condizioni di amplificazione consistono, ad esempio, in una prima fase di retro-trascrizione a 48 °C per 10 minuti, seguita da 10 minuti a 95 °C («hot start») e 40 cicli di 15 secondi a 95 °C e di 45 secondi a 60 °C.

2.2.5.

I campioni sono considerati positivi se la fluorescenza normalizzata per il saggio RT-PCR dell'AHSV supera una soglia di 0,1 nei 36 cicli della PCR in tutte le repliche di un campione.

I campioni sono considerati non conclusivi se la fluorescenza normalizzata per il saggio RT-PCR dell'AHSV supera una soglia di 0,1 tra i cicli 36 e 40 della PCR in tutte le repliche di un campione.

I campioni sono considerati negativi se la fluorescenza normalizzata per il saggio di RT-PCR dell'AHSV non ha superato una soglia di 0,1 nei 40 cicli della PCR in tutte le repliche di un campione e se la fluorescenza normalizzata per il saggio di controllo esterno sintetico brevettato ha superato una soglia di 0,1 in 33 cicli della PCR.»