(1)

U dijelu A dodaje se sljedeće poglavlje:

„A.25.   KONSTANTE DISOCIJACIJE U VODI (TITRACIJSKA METODA – SPEKTROFOTOMETRIJSKA METODA – KONDUKTOMETRIJSKA METODA)

UVOD

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 112 (1981.).

Preduvjeti

Opće informacije

Posebni uvjeti

Referentni dokumenti

Ova se ispitna metoda temelji na metodama koje su navedene u literaturi čiji se popis nalazi u odjeljku ‚Literatura’ te na EPA-inom ‚Preliminarnom nacrtu smjernica za obavješćivanje prije proizvodnje’ (engl. Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification, EPA) od 18. kolovoza 1978.

METODA – UVOD, SVRHA, PODRUČJE PRIMJENE, RELEVANTNOST, PRIMJENA I GRANICE ISPITIVANJA

Disocijacija određene tvari u vodi važna je za procjenu utjecaja te tvari na okoliš. Njome se određuje oblik tvari, o kojemu zatim ovisi njezino ponašanje i prijenos. Može utjecati na adsorpciju kemikalije na tla i sedimente te na apsorpciju u biološke stanice.

Definicije i jedinice

Disocijacija je reverzibilno razdvajanje na dvije ili više kemijskih vrsta koje mogu biti ionske. Proces se uobičajeno prikazuje jednadžbom

RX ⇌ R ++ X –

a koncentracijska konstanta ravnoteže za tu je reakciju

Na primjer, u konkretnom slučaju u kojemu je R vodik (tvar je kiselina), konstanta je

ili

Referentne tvari

Kod ispitivanja novih tvari nije uvijek potrebno upotrijebiti sljedeće referentne tvari. One se prije svega navode radi povremene kalibracije metode te kako bi se omogućila usporedba rezultata kod primjene neke druge metode.

Bilo bi korisno imati dostupnu tvar koja ima više vrijednosti pK, kako je navedeno u nastavku u odjeljku ‚Načelo metode’. Takva bi tvar mogla biti:

Načelo ispitne metode

Opisani kemijski proces općenito tek u maloj mjeri ovisi o temperaturi u rasponu temperatura koji nalazimo u okolišu. Za određivanje konstante disocijacije potrebno je znati koncentraciju disociranih i nedisociranih oblika kemijske tvari. Na temelju spoznaja o stehiometriji reakcije disocijacije navedene u odjeljku ‚Definicije i jedinice’ može se odrediti odgovarajuća konstanta. U konkretnom slučaju opisanom u ispitnoj metodi tvar se ponaša kao kiselina ili baza pa je određivanje najprikladnije provesti mjerenjem relativnih koncentracija ioniziranog i neioniziranog oblika tvari te pH-vrijednosti otopine. Odnos između tih članova prikazan je jednadžbom za pKa, koja je navedena u odjeljku ‚Definicije i jedinice’. Neke tvari imaju više od jedne konstante disocijacije te se mogu izvesti slične jednadžbe. Neke od ovdje opisanih metoda prikladne su i za ne-acidobaznu disocijaciju.

Kriteriji kvalitete

Ponovljivost

Određivanje konstante disocijacije potrebno je ponoviti (najmanje tri određivanja), a dobivene se vrijednosti moraju kretati unutar područja od ± 0,1 log jedinica.

OPIS ISPITNIH POSTUPAKA

Vrijednost pKa. može se odrediti na dva osnovna načina. Jedan uključuje titraciju poznate količine tvari standardnom kiselinom ili bazom, ovisno o slučaju; drugi uključuje određivanje relativne koncentracije ioniziranih i neioniziranih oblika te njihove ovisnosti o pH-vrijednosti.

Preparati

Metode koje se temelje na navedenim načelima mogu se svrstati u titracijske, spektrofotometrijske i konduktometrijske metode.

Ispitne otopine

Za titracijsku i konduktometrijsku metodu kemijsku tvar potrebno je otopiti u destiliranoj vodi. Za spektrofotometrijsku i ostale metode upotrebljavaju se puferske otopine. Koncentracija ispitivane tvari ne smije premašiti 0,01 M ili polovinu koncentracije zasićenja, ovisno o tome koja je od tih vrijednosti manja. Za pripremu otopine potrebno je upotrijebiti najčišći raspoloživi oblik tvari. Ako je tvar slabo topljiva, može se otopiti u maloj količini otapala mješljivog s vodom prije nego što se razrijedi do prethodno navedenih koncentracija.

Potrebno je provjeriti jesu li u otopinama prisutne emulzije, i to tako da se provjeri javlja li se Tyndallov efekt, posebno ako je za poboljšanje topljivosti upotrijebljeno suotapalo. Ako se upotrebljavaju puferske otopine, koncentracija pufera ne smije premašiti 0,05 M.

Ispitni uvjeti

Temperatura

Temperaturu treba održavati tako da odstupanje iznosi najviše± 1 °C. Određivanje je poželjno provoditi na temperaturi od 20 °C.

Ako se smatra da će rezultati znatno varirati ovisno o temperaturi, određivanje je potrebno provesti na još barem dvije druge temperature. U tom slučaju temperaturni intervali trebaju iznositi 10 °C, a temperaturu treba održavati tako da odstupanje iznosi najviše ± 0,1 °C.

Analize

Izbor metode ovisi o vrsti tvari koja se ispituje. Metoda mora biti dovoljno osjetljiva da se njome omogući određivanje različitih vrsta pri svakoj koncentraciji ispitne otopine.

Provođenje ispitivanja

Titracijska metoda

Ispitna otopina određuje se titracijom standardnom otopinom baze ili kiseline, ovisno o slučaju, pri čemu se nakon svakog dodavanja titranta mjeri pH. Potrebno je izvršiti najmanje deset dodavanja prije točke ekvivalencije. Ako se ravnoteža postigne dovoljno brzo, može se upotrijebiti potenciometar za bilježenje mjerenja. Za ovu je metodu potrebno točno znati količinu tvari i njezinu koncentraciju. Moraju se poduzeti mjere opreza kako bi se isključio ugljikov dioksid. Detaljne pojedinosti o postupku, mjerama opreza i izračunu navedene su u standardnim ispitivanjima, npr. u literaturi 1., 2., 3., 4.

Spektrofotometrijska metoda

Valna duljina pronalazi se tamo gdje ionizirani i neionizirani oblici tvari imaju znatno drukčije koeficijente ekstinkcije. Spektar apsorpcije UV/vidljivog zračenja bilježi se kod otopina stalne koncentracije u onim uvjetima pH-vrijednosti u kojima je tvar uglavnom neionizirana i u cijelosti ionizirana te pri nekoliko srednjih pH-vrijednosti. To se može postići dodavanjem koncentrirane kiseline (baze) u relativno velik volumen otopine tvari u višekomponentnom puferu, počevši pri visokoj (niskoj) pH-vrijednosti (literatura 5.), ili dodavanjem jednakih količina matične otopine tvari, npr. u vodi ili metanolu, u stalne volumene različitih puferskih otopina kojima je obuhvaćen željeni raspon pH-vrijednosti. Iz pH-vrijednosti i vrijednosti apsorbancije na izabranoj valnoj duljini izračunava se dovoljan broj vrijednosti za pKa, pri čemu se upotrebljavaju podaci dobiveni za najmanje pet pH-vrijednosti pri kojima stupanj ionizacije tvari iznosi najmanje 10 %, a manje od 90 %. Dodatni eksperimentalni podaci i metoda izračuna navedeni su u literaturi 1.

Konduktometrijska metoda

S pomoću ćelije čija je konstanta mala i poznata mjeri se vodljivost oko 0,1 M otopine tvari u elektrovodljivoj vodi. Mjeri se i vodljivost određenog broja otopina dobivenih preciznim razrjeđivanjem navedene otopine. Koncentracija se svaki put smanjuje za polovinu, a nizom treba obuhvatiti barem red veličine koncentracije. Granična vrijednost vodljivosti pri beskonačnom razrjeđenju utvrđuje se sličnim pokusom sa solju Na te ekstrapolacijom. Potom se iz podataka za vodljivost svake otopine može izračunati stupanj disocijacije s pomoću Onsagerove jednadžbe te se iz toga, primjenom Ostwaldovog zakona razrjeđenja, može izračunati konstanta disocijacije s pomoću formule K = α2C/(1 – α) pri čemu je C koncentracija u molovima po litri, a α je disocirana frakcija. Moraju se poduzeti mjere opreza kako bi se isključio CO2. Dodatni eksperimentalni podaci i metoda izračuna navedeni su u referentnim tekstovima i literaturi pod brojevima 1., 6. i 7.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Obrada rezultata

Titracijska metoda

Vrijednost pKa izračunava se za deset izmjerenih točaka na titracijskoj krivulji. Za te se vrijednosti pKa izračunavaju srednja vrijednost i standardna devijacija. Grafičkom prikazu potrebno je priložiti i grafički prikaz pH-vrijednosti u ovisnosti o volumenu standardne baze ili kiseline.

Spektrofotometrijska metoda

Za svaki se spektar tablično prikazuju podaci o apsorbanciji i pH-vrijednosti. Iz točaka podataka za prijelazne spektre izračunava se najmanje pet vrijednosti za pKa te srednja vrijednost i standardna devijacija tih rezultata.

Konduktometrijska metoda

Ekvivalentna vodljivost Λ izračunava se za svaku koncentraciju kiseline i za svaku koncentraciju smjese sastavljene od jednog ekvivalenta kiseline plus 0,98 ekvivalenta natrijeva hidroksida bez karbonata. Kiseline je više kako bi se spriječio višak OH– koji nastaje zbog hidrolize. Grafički se prikazuje 1/Λ u ovisnosti o √C, a Λo soli može se utvrditi ekstrapolacijom na nultu koncentraciju.

Vrijednost Λo kiseline može se izračunati upotrebom vrijednosti koje su za H+ i Na+ navedene u literaturi. Za svaku se koncentraciju vrijednost pKa može izračunati s pomoću formula α = Λi /Λo i Ka = α2C/(1 – α). Bolje vrijednosti za Ka mogu se dobiti tako da se izvrše korekcije s obzirom na pokretljivost i aktivnost. Potrebno je izračunati srednje vrijednosti i standardne devijacije vrijednosti pKa.

Izvješće o ispitivanju

Potrebno je dostaviti sve sirove podatke i izračunane vrijednosti pKa te metodu izračuna (po mogućnosti u obliku tablice kako se predlaže u literaturi 1.), kao i prethodno opisane statističke parametre. Za titracijske metode potrebno je navesti podatke o standardizaciji titranta.

Za spektrofotometrijsku metodu potrebno je dostaviti sve spektre. Za konduktometrijsku metodu potrebno je navesti podatke o određivanju konstante ćelije. Potrebno je navesti informacije o upotrijebljenim tehnikama, analitičkim metodama i vrsti svih upotrijebljenih pufera.

Potrebno je izvijestiti o ispitnoj temperaturi (ispitnim temperaturama).

LITERATURA

(2)

U dijelu B poglavlje B.5. zamjenjuje se sljedećim:

„B.5.   AKUTNO NADRAŽIVANJE/NAGRIZANJE OKA

UVOD

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 405 (2012.). Smjernice OECD-a za ispitivanje kemijskih tvari periodički se preispituju kako bi se osiguralo da odražavaju najbolje dostupne znanstvene spoznaje. U prethodnim preispitivanjima ovih smjernica za ispitivanje posebna je pozornost posvećena mogućim poboljšanjima u smislu procjenjivanja svih postojećih informacija o ispitivanoj kemikaliji kako bi se izbjeglo nepotrebno ispitivanje na laboratorijskim životinjama i time pridonijelo njihovoj dobrobiti. Smjernica za ispitivanje 405 (donesena 1981. te ažurirana 1987., 2002. i 2012.) sadržava preporuku da se prije provođenja opisanog in vivo ispitivanja akutnog nagrizajućeg/nadražujućeg djelovanja tvari na oko provede analiza snage dokaza (1.) na temelju postojećih relevantnih podataka. Ako nema dovoljno raspoloživih podataka, preporučuje se njihovo prikupljanje primjenom sekvencijskog ispitivanja (2., 3.). Strategija ispitivanja uključuje provođenje validiranih i prihvaćenih ispitivanja in vitro, a opisana je u Dodatku ovoj ispitnoj metodi. Za potrebe Uredbe (EZ) br. 1907/2006 o registraciji, evaluaciji, autorizaciji i ograničavanju kemikalija (REACH) (2), integrirana strategija ispitivanja navedena je i u odgovarajućoj smjernici ECHA-e (21.). Ispitivanje na životinjama trebalo bi provoditi samo ako se utvrdi da je ono potrebno nakon razmatranja dostupnih alternativnih metoda i primjene onih za koje se utvrdi da su primjerene. U vrijeme izrade ove ažurirane ispitne metode još uvijek postoje slučajevi u kojima je primjena ove ispitne metode potrebna ili je propisana određenim regulatornim okvirima.

Zadnje se ažuriranje uglavnom odnosilo na upotrebu analgetika i anestetika te se njime nije mijenjala osnovna zamisao i struktura smjernice za ispitivanje. ICCVAM (3) i međunarodni nezavisni odbor za stručnu reviziju preispitali su korisnost i ograničenja rutinske primjene lokalnih anestetika, sustavnih analgetika te humanih krajnjih točaka tijekom in vivo ispitivanja nadražujućeg djelovanja tvari na oko (12.). Zaključili su da bi se primjenom lokalnih anestetika i sustavnih analgetika moglo većim dijelom ili u cijelosti izbjeći bol i patnju bez utjecaja na ishod ispitivanja te su preporučili da bi te tvari trebalo uvijek primjenjivati. U ovoj se ispitnoj metodi uzimaju u obzir zaključci tog preispitivanja. Lokalne anestetike, sustavne analgetike i humane krajnje točke trebalo bi rutinski primjenjivati tijekom in vivo ispitivanja akutnog nagrizanja/nadraživanja oka. Iznimke u pogledu njihove primjene trebaju biti opravdane. Poboljšanjima opisanima u ovoj metodi značajno će se smanjiti ili izbjeći bol i patnja životinja u većini ispitnih okolnosti u kojima je još uvijek potrebno in vivo ispitivanje sigurnosti za oči.

U uravnoteženu preventivnu kontrolu boli trebalo bi uključiti: i. rutinsko davanje lokalnog anestetika (npr. proparakaina ili tetrakaina) i sustavnog analgetika (npr. buprenorfina) prije tretiranja, ii. rutinski program tretiranja sustavnim analgetikom (npr. buprenorfinom i meloksikamom) nakon tretiranja, iii. program promatranja, praćenja i bilježenja kliničkih znakova boli i/ili patnje kod životinja te iv. program promatranja, praćenja i bilježenja vrste, težine i napredovanja svih ozljeda očiju. Dodatne su pojedinosti navedene u ažuriranim postupcima opisanima u nastavku. Nakon primjene ispitivane kemikalije ne bi se smjeli davati nikakvi dodatni lokalni anestetici ili analgetici kako ne bi utjecali na ispitivanje. Analgetike s protuupalnim djelovanjem (npr. meloksikam) ne bi trebalo primjenjivati lokalno, a doze koje se primjenjuju sustavno ne bi smjele utjecati na učinke na oči.

Definicije su navedene u Dodatku ovoj ispitnoj metodi.

POČETNA RAZMATRANJA

Kako bi se osigurala pouzdanost znanstvenih rezultata i dobrobit životinja, in vivo ispitivanja ne bi smjela doći u obzir sve dok se analizom snage dokaza ne ocijene svi raspoloživi podaci koji su relevantni za moguće nagrizajuće/nadražujuće djelovanje predmetne kemikalije na oko. Takvi podaci obuhvaćaju dokaze koji proizlaze iz postojećih studija provedenih na ljudima i/ili laboratorijskim životinjama, dokaze o nagrizajućim/nadražujućim svojstvima jedne ili više strukturno srodnih tvari ili smjesa tih tvari, podatke koji ukazuju na jaku kiselost ili lužnatost kemikalije (4., 5.) i rezultate validiranih i prihvaćenih in vitro ili ex vivo ispitivanja nagrizanja kože i nagrizanja/nadraživanja oka (6., 13., 14., 15., 16., 17.). Te su studije mogle biti provedene prije analize snage dokaza ili na temelju te analize.

Kod nekih kemikalija takva analiza može upućivati na potrebu za in vivo ispitivanjem potencijala kemikalije za nagrizanje/nadraživanje oka. U svim je takvim slučajevima poželjno da se prije razmatranja primjene in vivo ispitivanja na oku ispita nagrizajuće djelovanje kemikalije na kožu in vitro i/ili in vivo te da se dobiveni rezultati ocijene u skladu sa strategijom sekvencijskog ispitivanja iz ispitne metode B.4. (7.) ili integriranom strategijom ispitivanja koja je opisana u smjernici ECHA-e (21.).

Strategija sekvencijskog ispitivanja, koja uključuje provođenje validiranih in vitro ili ex vivo ispitivanja nagrizanja/nadraživanja oka, navedena je u Dodatku ovoj ispitnoj metodi te, za potrebe Uredbe REACH, u smjernicama ECHA-e (21). Preporučuje se slijediti tu strategiju ispitivanja prije provođenja ispitivanja in vivo. Ako je riječ o novim kemikalijama, preporučuje se stupnjevito ispitivanje kako bi se dobili znanstveno pouzdani podaci o nagrizajućim/nadražujućim svojstvima kemikalije. Ako je riječ o postojećim kemikalijama o čijem nagrizanju/nadraživanju kože i oka nema dovoljno podataka, strategija se može primijeniti kako bi se popunile praznine u podacima. Primjenu drukčije strategije ili postupka ispitivanja ili odluku da se ne primijeni metoda stupnjevitog ispitivanja potrebno je opravdati.

NAČELO IN VIVO ISPITIVANJA

Nakon davanja sustavnog analgetika te odgovarajuće lokalne anestezije jedna doza ispitivane kemikalije nanese se na jedno oko pokusne životinje; netretirano oko služi za kontrolu. Stupanj nadraživanja/nagrizanja oka ocjenjuje se na temelju zabilježenih lezija očne spojnice (sluznice), rožnice i šarenice u određenim intervalima. Opisuju se i ostale promjene na oku, kao i neželjene sustavne promjene, kako bi se osigurala kompletna procjena djelovanja tvari. Ispitivanje treba trajati dovoljno dugo da se ocijeni reverzibilnost ili ireverzibilnost učinaka.

Životinje koje pokazuju znakove jake patnje i/ili boli u bilo kojoj fazi ispitivanja ili lezije koje odgovaraju humanim krajnjim točkama opisanima u ovoj ispitnoj metodi (vidjeti stavak 26.) treba humano usmrtiti, a ispitivanu tvar ocijeniti u skladu s tim. Kriteriji za donošenje odluke o humanom usmrćivanju životinja koje su na umoru i koje jako pate navedeni su u smjernici OECD-a (8.).

PRIPREME ZA IN VIVO ISPITIVANJE

Odabir vrste

Kao pokusne životinje preporučuje se upotrijebiti albino kuniće, i to zdrave mlade odrasle primjerke. Ako se upotrebljavaju neke druge subpopulacije ili vrste životinja, potrebno je navesti razloge za to.

Priprema životinja

Oba oka svake pokusne životinje odabrane za ispitivanje treba pregledati unutar 24 sata prije početka ispitivanja. Životinje kod kojih se utvrdi nadraženost oka, očni defekti ili već postojeća ozljeda rožnice ne smiju se upotrijebiti.

Uvjeti smještaja i hranjenja

Životinje treba smjestiti pojedinačno. Ako je riječ o kunićima, temperatura prostorije u kojoj se drže pokusne životinje treba biti 20 °C (± 3 °C). Iako relativna vlažnost zraka treba iznositi najmanje 30 % i po mogućnosti ne više od 70 %, osim za vrijeme čišćenja prostorije, treba je nastojati održavati na 50 – 60 %. Rasvjeta bi trebala biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Potrebno je izbjegavati prejako osvjetljenje. Što se tiče hranjenja, može se primjenjivati standardna hrana za laboratorijske životinje uz neograničene količine pitke vode.

ISPITNI POSTUPAK

Upotreba lokalnih anestetika i sustavnih analgetika

Preporučuju se sljedeći postupci za sprječavanje ili smanjenje boli i patnje pri ispitivanju sigurnosti za oči. Mogu se primijeniti i zamjenski postupci za koje je dokazano da su isto toliko djelotvorni ili djelotvorniji u sprječavanju ili smanjenju boli i patnje životinja.

Primjena ispitivane kemikalije

Ispitivanu kemikaliju treba staviti u konjunktivalnu vrećicu jednog oka svake životinje, pri čemu donji kapak treba lagano odmaknuti od očne jabučice. Kapke zatim treba lagano držati spojenima oko jedne sekunde da bi se spriječilo istjecanje materijala. Drugo oko koje se ne tretira služi za kontrolu.

Ispiranje

Oči pokusnih životinja ne smiju se ispirati najmanje 24 sata od primjene ispitivane kemikalije, osim ako je riječ o krutim tvarima (vidjeti stavak 18.) te u slučaju da odmah dođe do nagrizajućeg ili nadražujućeg djelovanja. Nakon 24 sata oči se mogu isprati, ako se to smatra potrebnim.

Upotreba satelitske skupine životinja za istraživanje utjecaja ispiranja ne preporučuje se ako za to ne postoji znanstveno opravdanje. Ako je satelitska skupina potrebna, treba upotrijebiti dva kunića. Uvjete ispiranja treba detaljno dokumentirati, npr. vrijeme ispiranja; sastav i temperatura otopine za ispiranje; trajanje, volumen i brzina primjene otopine.

Visina doze

1.   Ispitivanje tekućina

Za ispitivanje tekućina primjenjuje se doza od 0,1 ml. Sprejevi na pumpicu ne smiju se upotrebljavati za primjenu kemikalija izravno na oko. Ako je tekućina u spreju, najprije je treba istisnuti u posudu, iz nje uzeti 0,1 ml i nakapati u oko.

2.   Ispitivanje krutih tvari

Kad se ispituju krute tvari, paste i kemikalije u obliku čestica, volumen upotrijebljene doze treba iznositi 0,1 ml, odnosno njezina masa ne smije biti veća od 100 mg. Ispitivanu kemikaliju potrebno je usitniti u fini prah. Volumen krutog materijala treba izmjeriti nakon što se lagano natisne, npr. lupkanjem po mjernoj posudi. Ako se pri prvom opažanju jedan sat nakon tretiranja utvrdi da kruta ispitna kemikalija nije uklonjena iz oka pokusne životinje djelovanjem fizioloških mehanizama, oko se može isprati fiziološkom otopinom ili destiliranom vodom.

3.   Ispitivanje aerosola

U slučaju sprejeva na pumpicu i aerosola, prije kapanja u oko preporučuje se tekućinu staviti u posudu. Jedini izuzetak čine kemikalije u obliku aerosola pod tlakom koje se u posudu ne mogu staviti zbog hlapljenja. U takvim slučajevima oko treba držati otvorenim i ispitivanu kemikaliju nanijeti na oko jednostavnim prskanjem u trajanju od oko jedne sekunde, s udaljenosti od 10 cm ravno ispred oka. Ova razdaljina može varirati ovisno o tlaku i sadržaju spreja. Mora se paziti da ne dođe do oštećenja oka koje može izazvati tlak spreja. U nekim slučajevima može biti potrebno procijeniti mogućnost ‚mehaničkih’ ozljeda oka koje bi mogao izazvati jaki mlaz iz spreja.

Procjena doze iz aerosola može se napraviti simuliranjem testa na sljedeći način: kemikalija se naspreja na papir za vaganje kroz otvor veličine oka kunića postavljen ravno ispred papira. Povećanje težine papira približno odgovara količini tekućine koja se naspreja u oko. Kod hlapljivih kemikalija doza se može procijeniti vaganjem posude u koju se naspreja ispitivana kemikalija prije i nakon pražnjenja posude.

Inicijalni test (ispitivanje nadraživanja/nagrizanja oka in vivo na jednoj životinji)

Čvrsto se preporučuje da se in vivo ispitivanje prvo provede samo na jednoj životinji (vidjeti dodatak ovoj ispitnoj metodi: Strategija sekvencijskog ispitivanja nadraživanja i nagrizanja oka). Zapažanja iz tog ispitivanja trebala bi omogućiti određivanje težine i reverzibilnosti lezija prije provođenja potvrdnog testa na dodatnoj životinji.

Ako rezultati tog testa pokažu da uz primjenu opisanog postupka kemikalija djeluje na oko nagrizajuće ili jako nadražujuće, daljnja ispitivanja nadraživanja oka ne smiju se provoditi.

Potvrdni test (ispitivanje nadraživanja/nagrizanja oka in vivo na dodatnim životinjama)

Ako se tijekom inicijalnog testa ne opazi nagrizajuće ili jako nadražujuće djelovanje, nadražujuću ili negativnu reakciju potrebno je potvrditi upotrebljavajući do dvije dodatne životinje. Ako se tijekom inicijalnog testa opazi nadražujući učinak, preporučuje se da se potvrdni test izvede sekvencijski na jednoj po jednoj životinji, a ne da se istodobno izlože dvije dodatne životinje. Ako se na drugoj životinji otkrije nagrizajuće ili jako nadražujuće djelovanje, ispitivanje se ne nastavlja. Ako su rezultati testa na dodatnoj životinji dovoljni da omoguće svrstavanje tvari u kategoriju opasnosti, ne provode se daljnja ispitivanja.

Razdoblje promatranja

Promatranje treba trajati dovoljno dugo da se u potpunosti može utvrditi jačina i reverzibilnost opaženih učinaka. Međutim, pokus treba prekinuti čim životinja počne pokazivati znakove jake boli ili patnje (8.). Da bi se utvrdila reverzibilnost učinaka, životinje obično treba promatrati 21 dan od primjene ispitivane kemikalije. Ako se reverzibilnost uoči prije isteka 21 dana, pokus odmah treba prekinuti.

Klinička opažanja i stupnjevanje reakcija oka

Sat vremena nakon primjene ispitivane kemikalije oči treba sveobuhvatno pregledati kako bi se utvrdila moguća prisutnost očnih lezija, a potom preglede treba ponavljati najmanje jednom dnevno. Tijekom prva tri dana životinje treba pregledavati nekoliko puta dnevno kako bi se osiguralo pravovremeno donošenje odluke o prekidu pokusa. Tijekom cjelokupnog trajanja ispitivanja pokusne životinje treba rutinski pregledavati kako bi se provjerilo pokazuju li kliničke znakove boli i/ili patnje (npr. ponavljajuće grebanje šapom ili trljanje oka, pretjerano treptanje, pretjerano suzenje) (9., 10., 11.), i to najmanje dva puta dnevno u razmacima od najmanje šest sati ili češće ako je potrebno. Ta su pregledavanja potrebna kako bi se i. pravilno procijenilo pokazuju li životinje znakove boli i patnje te na temelju činjeničnog stanja donijela odluka o tome treba li povećati doziranje analgetika te ii. ocijenilo jesu li kod životinja dosegnute humane krajnje točke te na temelju činjeničnog stanja donijela odluka je li primjereno humano eutanazirati životinje, osiguravajući pritom da ta odluka bude donesena pravodobno. Kako bi se oštećenja očiju mogla lakše otkriti i izmjeriti te kako bi se ocijenilo jesu li dosegnute utvrđene krajnje točke za humanu eutanaziju, potrebno je rutinski primjenjivati bojenje fluoresceinom te upotrebljavati biomikroskop s procjepnom svjetiljkom kada se to smatra potrebnim (npr. za procjenu dubine lezije u slučaju ulceracije rožnice). Mogu se prikupiti digitalne fotografije uočenih lezija koje će služiti u referentne svrhe te biti trajan zapis o opsegu oštećenja očiju. Životinje ne treba držati u uvjetima ispitivanja duže nego što je potrebno za dobivanje konačnih rezultata. Životinje koje pokazuju znakove jake boli ili patnje treba bez odlaganja humano usmrtiti, a kemikaliju ocijeniti u skladu s tim.

Životinje kod kojih se nakon primjene tvari uoče sljedeće lezije oka treba humano usmrtiti (u tablici 1. nalazi se opis stupnjeva lezija): perforacija ili znatna ulceracija rožnice, uključujući stafilom; krv u prednjoj očnoj komori; zamućenje rožnice 4. stupnja; nedostatak svjetlosnog refleksa (reakcija šarenice 2. stupnja) u trajanju od 72 sata; ulceracija konjunktivalne membrane; nekroza očne spojnice (konjunktive) ili trećeg kapka (membrana nictitans); ili ljuštenje. To se poduzima zato jer takve lezije uglavnom nisu reverzibilne. Nadalje se preporučuje da se sljedeće lezije očiju upotrebljavaju kao humane krajnje točke za prekid ispitivanja prije isteka planiranog razdoblja promatranja od 21 dana. Te se lezije smatra pretkazateljima teških oštećenja nastalih zbog nadražujućeg ili nagrizajućeg učinka tvari te oštećenja za koje se ne očekuje da će se u cijelosti povući do kraja razdoblja promatranja od 21 dana: vrlo duboke lezije (npr. ulceracija rožnice koja prodire dublje od površinskih slojeva strome), oštećenje limbusa > 50 % (koje dokazuje bljedilo konjunktivalnog tkiva) te teška infekcija oka (gnojni iscjedak). Istodobna pojava vaskularizacije površine rožnice (tj. panusa) te površine obojene fluoresceinom za koju je dnevnim pregledima utvrđeno da se ne smanjuje tijekom vremena i/ili izostanka ponovne epitelizacije pet dana nakon primjene ispitivane kemikalije mogu isto tako, u kombinaciji, biti korisni kriteriji za donošenje kliničke odluke o prijevremenom prekidu ispitivanja. Međutim, navedeni nalazi promatrani zasebno nisu dovoljni da opravdaju prijevremeni prekid ispitivanja. Nakon što se utvrde teški učinci na oči, potrebno je obratiti se veterinaru koji vodi brigu o pokusnim životinjama ili je specijalist za pokusne životinje ili osoblju koje je osposobljeno za prepoznavanje kliničkih lezija kako bi izvršili klinički pregled i utvrdili zahtijeva li kombinacija tih učinaka prijevremeni prekid ispitivanja. Nakon jednog, 24, 48 i 72 sata od primjene ispitivane kemikalije potrebno je odrediti i zabilježiti stupnjeve reakcija oka (očne spojnice, rožnice i šarenice) (tablica 1.). Životinje kod kojih se ne pojave očne lezije mogu se usmrtiti najranije tri dana nakon primjene ispitivane kemikalije. Životinje kod kojih očne lezije nisu teške treba promatrati dok lezije ne nestanu ili 21 dan, nakon čega se ispitivanje prekida. Promatranja treba izvršiti i zabilježiti najmanje nakon jednog, 24, 48 i 72 sata te sedmog, 14. i 21. dana kako bi se utvrdilo stanje lezija i njihova reverzibilnost ili ireverzibilnost. Ako je potrebno, promatranja treba provoditi češće kako bi se utvrdilo treba li pokusne životinje eutanazirati iz humanih razloga ili ih ukloniti iz ispitivanja zbog negativnih rezultata.

Stupnjeve reakcija oka (tablica 1.) treba zabilježiti pri svakom pregledu. Isto tako treba zabilježiti sve druge lezije oka (npr. panus, obojenje, promjene prednje komore), kao i sustavne štetne učinke.

Pregled reakcija može se olakšati upotrebom binokularne lupe, ručne procjepne svjetiljke, biomikroskopa i drugih prikladnih pomagala. Nakon bilježenja opažanja nakon 24 sata, oči se mogu dodatno pregledati s pomoću fluoroesceina.

Stupnjevanje očnih reakcija po svojoj je prirodi subjektivno. Da bi se poboljšala usklađenost u stupnjevanju očnih reakcija te da bi se u tom smislu pomoglo ispitnim laboratorijima i svima koji sudjeluju u promatranjima i tumačenju rezultata, osoblje koje provodi promatranja treba proći odgovarajuću obuku o sustavu ocjenjivanja koji se primjenjuje.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Ocjena rezultata

Vrijednosti za nadraženost očiju treba ocijeniti ovisno o vrsti i stupnju lezija te o njihovoj reverzibilnosti ili ireverzibilnosti. Pojedinačne vrijednosti ne predstavljaju apsolutni standard za nadražujuća svojstva kemikalije jer se ocjenjuju i drugi učinci ispitivane kemikalije. Umjesto toga, na pojedinačne vrijednosti treba gledati kao na referentne vrijednosti koje imaju značenje samo ako su potkrijepljene potpunim opisom i ocjenom svih opažanja.

Izvješće o ispitivanju

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:

Tumačenje rezultata

Ekstrapolacija rezultata ispitivanja nadraživanja oka kod laboratorijskih životinja na ljude valjana je samo do određene granice. U mnogim su slučajevima albino kunići osjetljiviji od ljudi na tvari koje nadražuju ili nagrizaju oči.

Pri tumačenju podataka treba paziti da se isključi nadraženost uzrokovana sekundarnom infekcijom.

LITERATURA

Tablica 1.

Stupnjevanje očnih lezija

DODATAK ISPITNOJ METODI B.5.  (4)

STRATEGIJA SEKVENCIJSKOG ISPITIVANJA NADRAŽIVANJA I NAGRIZANJA OKA

Opća razmatranja

Kako bi se osigurala pouzdanost znanstvenih rezultata i dobrobit životinja, važno je izbjegavati nepotrebnu upotrebu životinja te svesti na najmanju mjeru ispitivanja koja bi mogla uzrokovati teške reakcije kod životinja. Prije donošenja odluke o in vivo ispitivanju potrebno je procijeniti sve informacije o kemikaliji koje se odnose na njezino moguće nadraživanje/nagrizanje oka. Možda već postoji dovoljno dokaza na temelju kojih se ispitivana kemikalija može razvrstati s obzirom na njezin potencijal nagrizanja ili nadraživanja oka, bez potrebe za provođenjem ispitivanja na laboratorijskim životinjama. Prema tome, primjenom analize snage dokaza i strategije sekvencijskog ispitivanja potreba za in vivo ispitivanjima svodi se na minimum, posebno ako postoji vjerojatnost da će kemikalija izazvati teške reakcije.

Preporučuje se primijeniti analizu snage dokaza kako bi se ocijenile postojeće informacije o nadražujućem i nagrizajućem djelovanju kemikalija na oko te utvrdilo je li potrebno provesti dodatna istraživanja koja ne uključuju in vivo ispitivanja na oku, a koja bi pomogla u karakterizaciji takvog potencijala. Ako su potrebna dodatna istraživanja, preporučuje se primijeniti strategiju sekvencijskog ispitivanja za dobivanje relevantnih eksperimentalnih podataka. Ako je riječ o tvarima koje nikada nisu bile podvrgnute ispitivanjima, strategiju sekvencijskog ispitivanja trebalo bi primijeniti za dobivanje podataka potrebnih za ocjenjivanje njihova nagrizanja/nadraživanja oka. Prva verzija strategije ispitivanja opisane u ovom Dodatku razvijena je u okviru OECD-ove radionice (1.). Kasnije je potvrđena i proširena u sklopu Usklađenog integriranog sustava za klasifikaciju opasnosti od štetnog djelovanja kemijskih tvari na ljudsko zdravlje i okoliš, koji je odobren na 28. zajedničkom sastanku Odbora za kemikalije i radne skupine za kemikalije, održanom u studenome 1998. (2.), a u 2011. ažurirala ju je radna skupina OECD-a.

Iako ova strategija ispitivanja nije sastavni dio ispitne metode B.5., ona odražava preporučeni pristup utvrđivanju nadražujućeg/nagrizajućeg djelovanja tvari na oči. Taj pristup predstavlja najbolju praksu i etičko mjerilo za in vivo ispitivanja nadraživanja/nagrizanja oka. Ova ispitna metoda sadržava smjernice za izvođenje in vivo ispitivanja te sažeti prikaz čimbenika koje je potrebno razmotriti prije započinjanja takvog ispitivanja. Kod strategije sekvencijskog ispitivanja postojeći podaci o nadražujućem/nagrizajućem djelovanju kemikalija na oko ocjenjuju se na temelju analize snage dokaza, a za dobivanje relevantnih podataka o kemikalijama za koje su potrebna dodatna istraživanja ili za koje istraživanja još nisu provedena primjenjuje se višerazinski pristup. Prema toj strategiji prvo se provode validirana i prihvaćena in vitro ili ex vivo ispitivanja, a potom istraživanja prema ispitnoj metodi B.4. u posebnim okolnostima (3., 4.).

Opis strategije stupnjevitog ispitivanja

Prije provođenja ispitivanja u okviru strategije sekvencijskog ispitivanja (Slika) potrebno je ocijeniti sve raspoložive informacije kako bi se utvrdilo je li in vivo ispitivanje na oku uopće potrebno. Iako se ocjenjivanjem pojedinačnih parametara mogu dobiti važne informacije (npr. ekstremni pH), postojeće je informacije potrebno procijeniti u cijelosti. Kod donošenja odluke na temelju ocjenjivanja snage dokaza treba ocijeniti sve relevantne podatke o djelovanju predmetne kemikalije i njezinih strukturnih analoga te navesti na čemu se odluka temelji. Naglasak prije svega treba staviti na postojeće podatke o djelovanju kemikalije na ljude i životinje, a potom na rezultate in vitro ili ex vivo ispitivanja. Kad god je to moguće, treba izbjegavati in vivo istraživanja nagrizajućih kemikalija. U strategiji ispitivanja razmatraju se sljedeći čimbenici:

STRATEGIJA ISPITIVANJA I OCJENJIVANJA NADRAŽUJUĆEG/NAGRIZAJUĆEG DJELOVANJA NA OČI

LITERATURA

(3)

U dijelu B poglavlje B.10. zamjenjuje se sljedećim:

„B.10.    In vitro ispitivanje kromosomskih aberacija kod sisavaca

UVOD

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 473 (2016.). Dio je serije metoda za ispitivanje genetske toksikologije. Razvijen je i dokument OECD-a u kojemu se daju sažete informacije o ispitivanju u području genetske toksikologije te pregled novijih promjena tih smjernica za ispitivanje (1).

Svrha in vitro ispitivanja kromosomskih aberacija jest utvrđivanje kemikalija koje uzrokuju strukturne kromosomske aberacije u uzgojenim stanicama sisavaca (2., 3. i 4.). Razlikujemo dva tipa strukturnih kromosomskih aberacija, kromosomski i kromatidni. Tijekom in vitro analiza kromosomskih aberacija može doći do pojave poliploidije (uključujući endoreduplikaciju). Iako aneugeni mogu izazvati poliploidiju, sama poliploidija nije pokazatelj aneugenog potencijala, već može jednostavno biti pokazatelj poremećaja staničnog ciklusa ili citotoksičnosti (5.). Ovo ispitivanje nije namijenjeno mjerenju aneuploidije. In vitro mikronukleus-test (6.) preporučuje se za otkrivanje aneuploidije.

U in vitro ispitivanju kromosomskih aberacija mogu se upotrebljavati kulture uspostavljenih staničnih linija ili primarne stanične kulture ljudskog podrijetla ili dobivene od glodavaca. Stanice za uporabu trebalo bi odabrati na temelju sposobnosti rasta u kulturi, stabilnosti kariotipa (uključujući broj kromosoma) i spontane učestalosti kromosomskih aberacija (7.). Podacima koji su dostupni u ovom trenutku ne omogućuje se davanje čvrstih preporuka, ali oni upućuju na to da je pri ocjenjivanju kemijskih opasnosti važno uzeti u obzir status proteina p53, genetsku (kariotipsku) stabilnost, sposobnost popravka DNK i podrijetlo stanica odabranih za ispitivanje (potječu li od sisavaca ili od ljudi). Stoga se korisnike ove ispitne metode potiče na to da u obzir uzmu utjecaj tih i drugih svojstava stanica na rezultate stanične linije u otkrivanju nastanka kromosomskih aberacija s razvojem znanja u tom području.

Upotrijebljene definicije navedene su u Dodatku 1.

POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA

Ispitivanja koja se obavljaju in vitro općenito zahtijevaju uporabu egzogenih izvora metaboličke aktivacije osim ako stanice imaju metaboličko djelovanje u odnosu na ispitivane kemikalije. Egzogenim sustavom metaboličke aktivacije ne oponašaju se u cijelosti in vivo uvjeti. Trebalo bi voditi računa o tome da se izbjegnu uvjeti koji bi mogli dovesti do lažnih pozitivnih rezultata, odnosno do oštećenja kromosoma koje nije uzrokovano izravnom interakcijom između ispitivanih kemikalija i kromosoma; takvi uvjeti uključuju promjene pH vrijednosti ili osmolalnosti (8., 9. i 10.), interakciju s komponentama podloge (11. i 12.) ili prekomjerne razine citotoksičnosti (13., 14., 15. i 16.).

Ovo ispitivanje primjenjuje se za otkrivanje kromosomskih aberacija koje mogu nastati kao posljedica klastogenih događaja. Analizu nastanka kromosomskih aberacija trebalo bi provesti koristeći se stanicama u metafazi. Stoga je bitno da stanice dosegnu mitozu u tretiranim i netretiranim kulturama. U slučaju proizvedenih nanomaterijala mogu biti potrebne posebne prilagodbe ove ispitne metode, ali one nisu opisane u ovoj ispitnoj metodi.

Prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se njome dobiti primjereni rezultati za tu svrhu te ako mogu, zašto. Takva razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese.

NAČELO ISPITIVANJA

Stanične kulture ljudskog podrijetla ili dobivene od drugih sisavaca izlažu se ispitivanoj kemikaliji s egzogenim izvorom metaboličke aktivacije i bez njega, osim ako se upotrebljavaju stanice s odgovarajućim metaboličkim djelovanjem (vidjeti stavak 13.). U prikladnim, unaprijed određenim intervalima nakon početka izlaganja staničnih kultura ispitivanoj kemikaliji stanične kulture tretiraju se kemikalijom za zaustavljanje metafaze (npr. kolcemidom ili kolhicinom), izdvajaju se stanice, boje se te se mikroskopskom analizom metafaznih stanica utvrđuje prisutnost aberacija kromatidnog i kromosomskog tipa.

OPIS METODE

Preparati

Stanice

Mogu se primjenjivati različite stanične linije (npr. jajnik kineskog hrčka(CHO), pluća kineskog hrčka V79, pluća kineskog hrčka (CHL)/IU, TK6) ili primarne stanične kulture, uključujući limfocite periferne krvi čovjeka ili drugih sisavaca (7.). Odabir upotrijebljenih staničnih linija trebalo bi znanstveno opravdati. Kada se primjenjuju primarne stanice, radi dobrobiti životinja trebalo bi, ako je to izvedivo, razmotriti uporabu primarnih stanica ljudskog podrijetla, a uzorke bi trebalo uzeti u skladu s ljudskim etičkim načelima i propisima. Ljudske limfocite periferne krvi trebalo bi uzeti od mladih (približna dob od 18 do 35 godina) nepušača koji prema raspoloživim informacijama ne boluju ni od kakvih bolesti i nisu nedavno bili izloženi genotoksičnim agensima (npr. kemikalijama, ionizirajućem zračenju) pri razinama koje uzrokuju povećanje osnovne pojavnosti kromosomskih aberacija. Time bi se osigurala niska i dosljedna osnovna pojavnost kromosomskih aberacija. Osnovna pojavnost kromosomskih aberacija povećava se s dobi, pri čemu je taj trend izraženiji kod ženki nego kod mužjaka (17. i 18.). Ako su za uporabu objedinjene stanice više od jednog donora, trebalo bi navesti broj donora. Potrebno je dokazati da je u razdoblju od početka tretiranja ispitivanom kemikalijom do uzorkovanja stanica došlo do diobe stanica. Stanične kulture održavaju se u fazi eksponencijalnog rasta stanica (stanične linije) ili se stimuliraju na diobu (primarne kulture limfocita) kako bi se osigurala izloženost stanica u različitim stadijima staničnog ciklusa jer možda nije poznata osjetljivost stadija stanice na ispitivanu kemikaliju. Primarne stanice koje je potrebno mitogenima potaknuti na diobu obično nisu više sinkronizirane tijekom izloženosti ispitivanoj kemikaliji (npr. ljudski limfociti nakon mitogenske stimulacije u trajanju od 48 sati). Uporaba sinkroniziranih stanica tijekom tretiranja nije preporučljiva, ali može biti prihvatljiva, ako je opravdana.

Uvjeti koje moraju zadovoljavati podloge i kulture

Za održavanje kultura trebalo bi primjenjivati prikladne uvjete za hranjive podloge za uzgoj kultura i uvjete inkubacije (posude za kulture, prema potrebi vlažne atmosferske uvjete od 5 % CO2, temperaturu inkubacije od 37 °C). Rutinski bi trebalo provjeravati stabilnost modalnog broj kromosoma staničnih linija te odsutnost mikoplazmatske kontaminacije (7. i 19.), a stanice ne bi trebalo upotrebljavati ako su kontaminirane ili ako je promijenjen modalni broj kromosoma. Trebalo bi utvrditi uobičajeno trajanje staničnog ciklusa staničnih linija ili primarnih kultura upotrijebljenih u ispitnom laboratoriju i ono bi trebalo biti usklađeno s objavljenim svojstvima stanica (20).

Priprema kultura

Stanične linije: stanice se razmnožavaju iz matičnih kultura te se nasađuju na hranjivu podlogu za uzgoj kulture takvom gustoćom da stanice u suspenziji ili jednoslojnoj kulturi nastave eksponencijalno rasti do trenutka izdvajanja (npr. treba izbjegavati konfluenciju kod stanica koje rastu kao jednoslojna kultura).

Limfociti: cjelokupna krv tretirana antikoagulansom (npr. heparinom) ili izdvojeni limfociti uzgajaju se (npr. 48 sati za ljudske limfocite) u prisutnosti mitogena (npr. fitohemaglutinina (PHA) za ljudske limfocite) kako bi se izazvala dioba stanica prije izlaganja ispitivanoj kemikaliji.

Metabolička aktivacija

Kod uporabe stanica s neodgovarajućom endogenom sposobnošću metabolizma trebalo bi upotrebljavati egzogene sustave metaboličkog djelovanja. Sustav koji se najčešće upotrebljava i automatski preporučuje, osim ako je drukčije opravdano, jest postmitohondrijska frakcija s dodanim kofaktorom (S9), pripravljena iz jetra glodavaca (općenito štakora), koja je bila tretirana sredstvima za enzimsku indukciju, kao što je Aroclor 1254 (21., 22. i 23.), ili mješavinom fenobarbitona i β-naftoflavona (24., 25., 26., 27., 28. i 29.). Potonja smjesa nije u suprotnosti sa Stockholmskom konvencijom o postojanim organskim onečišćujućim tvarima (30.) i dokazano je da je za nastanak oksidaza s miješanom funkcijom jednako učinkovita kao Aroclor 1254 (24., 25., 26. i 28.). Frakcija S9 obično se upotrebljava u koncentracijama u rasponu od 1 do 2 % (v/v), ali može se povećati na 10 % (v/v) u konačnom ispitnom mediju. Tijekom tretiranja trebalo bi izbjegavati uporabu proizvoda kojima se smanjuje mitotski indeks, posebno proizvoda s kompleksom kalcija (31.). Na odabir vrste i koncentracije upotrijebljenog egzogenog sustava metaboličke aktivacije ili metaboličkog pokretača može utjecati kategorija kemikalija koje se ispituju.

Priprema ispitivane kemikalije

Prije tretiranja stanica krute ispitivane kemikalije trebalo bi pripremiti u prikladnim otapalima i prema potrebi razrijediti (vidjeti stavak 23.). Tekuće ispitivane kemikalije mogu se dodati izravno u ispitni sustav i/ili razrijediti prije tretiranja ispitnog sustava. Plinovite ili hlapive ispitivane kemikalije trebalo bi ispitivati nakon što se prikladno izmijene standardni protokoli, kao što je tretiranje u hermetički zatvorenim posudama za kulture (32., 33. i 34.). Ispitivanu kemikaliju potrebno je pripremiti neposredno prije tretiranja, osim ako je prema podacima o stabilnosti prihvatljivo skladištenje.

Ispitni uvjeti

Otapala

Otapalo bi trebalo odabrati tako da se optimizira topljivost ispitivanih kemikalija bez negativnih učinaka na provedbu testa, kao što su npr. promjena rasta stanica, učinak na integritet ispitivane kemikalije, reagiranje s posudama za kulture ili oštećenje sustava metaboličke aktivacije. Preporučuje se da se, kada god je to moguće, prvo uzme u obzir upotreba vodenog otapala (ili hranjive podloge za uzgoj kulture). Dobro provjerena su otapala, na primjer, voda ili dimetil sulfoksid. Općenito, organska otapala ne bi trebala prelaziti 1 % (v/v), dok vodena otapala (fiziološka otopina ili voda) ne bi trebala prelaziti 10 % (v/v) u konačnom mediju za tretiranje. Ako se upotrebljavaju otapala koja nisu dobro provjerena (npr. etanol ili aceton), njihovu uporabu trebalo bi poduprijeti podacima u kojima su navedeni njihova kompatibilnost s ispitivanim kemikalijama, sustav ispitivanja i izostanak genetske toksičnosti u koncentraciji koja se upotrebljava. Ako ne postoje takvi popratni podaci, važno je uključiti netretirane kulture (vidjeti Dodatak 1.) kako bi se dokazalo da odabrano otapalo nema štetne ili klastogene učinke.

Mjerenje proliferacije stanica i citotoksičnosti te odabir ispitnih koncentracija

Pri utvrđivanju najviše koncentracije ispitivane kemikalije trebalo bi izbjegavati koncentracije koje imaju sposobnost izazivanja lažnih pozitivnih odgovora, kao što su koncentracije koje izazivaju prekomjernu citotoksičnost (vidjeti stavak 22.), taloženje u hranjivoj podlozi za uzgoj kulture (vidjeti stavak 23.) i značajne promjene pH vrijednosti ili osmolalnosti (vidjeti stavak 5.). Ako ispitivana kemikalija u trenutku dodavanja uzrokuje značajnu promjenu pH-vrijednosti hranjive podloge, pH-vrijednost može se prilagoditi puferiranjem konačnog medija za tretiranje kako bi se izbjegli lažno pozitivni rezultati te održali primjereni uvjeti uzgoja kulture.

Proliferacija stanica mjeri se kako bi se osiguralo da je u dovoljnom broju tretiranih stanica tijekom ispitivanja došlo do mitoze i da se stanice tretiraju pri prikladnim razinama citotoksičnosti (vidjeti stavke 18. i 22.). Citotoksičnost bi trebalo utvrditi s metaboličkom aktivacijom i bez nje u glavnom pokusu uz uporabu prikladnih pokazatelja smrti i rasta stanica. Iako ocjena citotoksičnosti u početnom ispitivanju može biti korisna za bolje određivanje koncentracija koje će se upotrebljavati u glavnom pokusu, početno ispitivanje nije obvezno. Ako se provede, njime se ne bi trebalo zamijeniti mjerenje citotoksičnosti u glavnom pokusu.

Relativno udvostručenje populacije (RPD) ili relativno povećanje broja stanica (RICC) prikladne su metode za ocjenu citotoksičnosti u citogenetskim ispitivanjima (13., 15., 35., 36. i 55.) (formule vidjeti u Dodatku 2.). U slučaju dugotrajnih tretiranja i vremena uzorkovanja koja od početka tretiranja traju dulje od 1,5 uobičajenog staničnog ciklusa (npr. dulje od tri stanična ciklusa ukupno), u okviru RPD-a citotoksičnost može biti podcijenjena (37.). U tim okolnostima RICC može biti bolja mjera ili bi ocjena citotoksičnosti nakon 1,5 uobičajenog staničnog ciklusa bila korisna procjena uz primjenu RPD-a.

Iako je za limfocite u primarnim kulturama mitotski indeks mjerilo citotoksičnih/citostatskih učinaka, na njega utječu vrijeme u koje je izmjeren nakon tretiranja, upotrijebljeni mitogen i mogući poremećaj staničnog ciklusa. Međutim, mitotski je indeks prihvatljiv jer druga mjerenja citotoksičnosti mogu biti komplicirana i nepraktična i ne mogu se primjenjivati na ciljanu populaciju limfocita koji rastu kao odgovor na stimulaciju fitohemaglutininom (PHA).

Iako su RICC i RPD za stanične linije i mitotski indeks za primarne kulture limfocita preporučeni parametri citotoksičnosti, drugim pokazateljima (kao što su npr. integritet stanica, apoptoza, nekroza, stanični ciklus) mogu se pružiti korisne dodatne informacije.

Potrebno je ocijeniti najmanje tri ispitne koncentracije (ne uključujući kontrolu s otapalom i pozitivnu kontrolu) koje ispunjuju kriterije prihvatljivosti (odgovarajuća citotoksičnost, broj stanica itd.). Neovisno o vrsti stanica (stanične linije ili primarne kulture limfocita), za svaku se ispitivanu koncentraciju može upotrijebiti samo jedna tretirana kultura ili više njezinih ponovljenih uzoraka. Iako se preporučuje upotreba dviju identičnih kultura, prihvatljiva je i upotreba jedne kulture pod uvjetom da se pregleda jednak ukupni broj stanica neovisno o tome je li riječ o jednoj kulturi ili dvjema identičnim kulturama. Uporaba jedne kulture posebno je relevantna ako se ocjenjuje više od tri koncentracije (vidjeti stavak 31.). Rezultati dobiveni iz više neovisnih ponovljenih kultura pri određenoj koncentraciji mogu se objediniti radi analize podataka (38.). Za ispitivane kemikalije za koje je dokazana mala citotoksičnost ili nepostojanje citotoksičnosti uobičajeno će biti prikladne koncentracije u dva do tri intervala. U slučaju pojave citotoksičnosti, odabranim ispitnim koncentracijama trebao bi biti obuhvaćen raspon od koncentracije pri kojoj se pojavljuje citotoksičnost kako je opisano u stavku 22. do koncentracija pri kojima je citotoksičnost umjerena, niska ili nepostojeća. Mnoge ispitivane kemikalije imaju oštre krivulje odgovora na koncentraciju te će za dobivanje podataka pri niskoj ili umjerenoj citotoksičnosti ili za detaljno istraživanje odnosa između doze i odgovora biti potrebno upotrijebiti bliže raspoređene koncentracije i/ili više od tri koncentracije (za jednu ili ponovljene kulture), posebno u situacijama u kojima je potrebno ponavljanje pokusa (vidjeti stavak 47.).

Ako se maksimalna koncentracija temelji na citotoksičnosti, najvišom koncentracijom trebalo bi nastojati ostvariti citotoksičnost od 55 ± 5 % uz primjenu preporučenih parametara citotoksičnosti (odnosno smanjenja RICC-a i RPD-a za stanične linije i smanjenja mitotskog indeksa za primarne kulture limfocita na 45 ± 5 % istodobne negativne kontrole). Trebalo bi voditi računa o tumačenju pozitivnih rezultata koji se mogu utvrditi samo u gornjem dijelu tog raspona citotoksičnosti od 55 ± 5 % (13.).

Za slabo topljive ispitivane kemikalije koje nisu citotoksične pri koncentracijama nižima od najniže koncentracije pri kojoj kemikalija nije topljiva, najviša bi analizirana koncentracija trebala dovesti do zamućenja ili taloga vidljivog golim okom ili inverznim mikroskopom na kraju tretiranja ispitivanom kemikalijom. Čak i ako se citotoksičnost pojavi iznad najniže netopljive koncentracije, preporučuje se ispitivanje pri samo jednoj koncentraciji koja dovodi do zamućenja ili s vidljivim talogom jer lažni učinci mogu biti posljedica taloga. Pri koncentraciji zbog koje nastaje talog potrebno je osigurati da taj talog ne utječe na izvođenje testa (npr. bojenje ili brojenje). Može biti korisno odrediti topljivost u hranjivoj podlozi za uzgoj kulture prije izvođenja pokusa.

Ako nisu zapaženi talog ili ograničavajuća citotoksičnost, najviša ispitna koncentracija trebala bi odgovarati najnižoj od sljedećih vrijednosti: 10 mM, 2 mg/ml ili 2 μl/ml (39., 40. i 41.). Ako nije utvrđen sastav ispitivane kemikalije, npr. ako je ona tvar nepoznatog ili promjenjivog sastava, složeni reakcijski proizvod ili biološki materijal (UVCB) (42.), uzorak iz okoliša itd., najviša koncentracija možda će morati biti viša (npr. 5 mg/ml) u slučaju izostanka dostatne citotoksičnosti kako bi se povećala koncentracija svake komponente. Međutim, trebalo bi napomenuti da ti zahtjevi mogu biti drukčiji za farmaceutske proizvode namijenjene ljudima (43.).

Kontrole

Kod svakog izdvajanja stanica trebalo bi uključiti istodobne negativne kontrole (vidjeti stavak 15.) koje se sastoje samo od otapala u hranjivoj podlozi i koje su tretirane jednako kao i kulture.

Istodobne pozitivne kontrole potrebne su za dokazivanje sposobnosti laboratorija za određivanje klastogena u uvjetima upotrijebljenog protokola ispitivanja i učinkovitosti egzogenog sustava metaboličke aktivacije ako je to primjenjivo. Primjeri pozitivnih kontrola navedeni su u tablici 1. u nastavku. Ako je to opravdano, mogu se upotrebljavati alternativne kemikalije pozitivne kontrole. Budući da su in vitro ispitivanja stanica sisavaca na genetsku toksičnost u dovoljnoj mjeri standardizirana, uporaba pozitivnih kontrola može biti ograničena na klastogen koji zahtijeva metaboličku aktivaciju. Pod uvjetom da se provodi paralelno s neaktiviranim ispitivanjem uz primjenu jednakog trajanja tretiranja, jednim odgovorom pozitivne kontrole dokazat će se aktivnost sustava metaboličke aktivacije i osjetljivost sustava ispitivanja. Međutim, dugotrajno tretiranje (bez S9) trebalo bi imati svoju pozitivnu kontrolu jer će se trajanje tretiranja razlikovati od ispitivanja u kojem se primjenjuje metabolička aktivacija. Svaku pozitivnu kontrolu trebalo bi primijeniti pri jednoj ili više koncentracija za koje se očekuje da će dovesti do ponovljivih i zamjetnih povećanja u odnosu na pozadinu kako bi se dokazala osjetljivost ispitnog sustava (tj. učinci su jasni, ali identitet kodiranih predmetnih stakalaca nije odmah očit osobi koja očitava rezultate), a odgovor ne bi trebalo dovesti u pitanje citotoksičnošću koja prelazi granične vrijednosti utvrđene u ispitnoj metodi.

Tablica 1.

Referentne kemikalije preporučene za ocjenu osposobljenosti laboratorija i za odabir pozitivnih kontrola.

POSTUPAK

Tretiranje ispitivanom kemikalijom

Stanice koje se razmnožavaju tretiraju se ispitivanom kemikalijom uz prisutnost i odsutnost sustava metaboličke aktivacije.

Vrijeme izdvajanja stanica iz kulture

Za temeljito ocjenjivanje, koje će biti potrebno za donošenje zaključka o negativnom ishodu, trebalo bi provesti sva tri sljedeća pokusna uvjeta uz primjenu kratkotrajnog tretiranja s metaboličkom aktivacijom i bez nje i dugotrajnog tretiranja bez metaboličke aktivacije (vidjeti stavke 43., 44. i 45.).

Ako bilo koji od gore navedenih pokusnih uvjeta dovede to pozitivnog odgovora, možda neće biti potrebno istražiti ni jedan drugi postupak tretiranja.

Priprema kromosoma

Stanične kulture tretiraju se kolcemidom ili kolhicinom obično jedan sat do tri sata prije izdvajanja stanica. Stanice za pripremu kromosoma izdvajaju se i obrađuju iz svake stanične kulture zasebno. Priprema kromosoma uključuje hipotoničko tretiranje stanica, fiksiranje i bojenje. U slučaju jednog sloja, na kraju tretiranja u trajanju od tri sata do šest sati mogu biti prisutne mitotske stanice (prepoznatljive kao okrugle stanice koje se odvajaju od površine). Budući da se te mitotske stanice lako odvajaju, mogu se izgubiti pri odstranjivanju podloge s ispitivanom kemikalijom. Ako postoji dokaz o znatnom povećanju broja mitotskih stanica u odnosu na kontrole, čime se ukazuje na vjerojatno zaustavljanje mitoze, te stanice trebalo bi prikupiti centrifugiranjem i ponovno dodati kulturama kako bi se u trenutku izdvajanja stanica izbjegao gubitak stanica koje se nalaze u fazi mitoze i koje su u opasnosti od kromosomskih aberacija.

Analiza

Sva predmetna stakalca, uključujući i stakalca pozitivnih i negativnih kontrola, trebalo bi prije mikroskopske analize radi utvrđivanja kromosomskih aberacija nezavisno kodirati. Budući da postupak fiksiranja često za posljedicu ima određeni udio metafaznih stanica koje su izgubile kromosome, stanice koje se pregledavaju trebale bi stoga sadržavati broj centromera jednak modalnom broju +/– 2.

Za svaku koncentraciju i kontrolu trebalo bi pregledati najmanje 300 dobro vidljivih metafaza kako bi se zaključilo da je ispitivana kemikalija jasno negativna (vidjeti stavak 45.). Ako se upotrebljavaju ponovljene kulture, 300 stanica trebalo bi jednakomjerno raspodijeliti među ponovljenim kulturama. Ako se upotrebljava jedna kultura po koncentraciji (vidjeti stavak 21.), trebalo bi pregledati najmanje 300 dobro vidljivih metafaza u toj jednoj kulturi. Prednost vrednovanja 300 stanica jest povećanje statističke snage ispitivanja; osim toga, rijetko se zapažaju nulte vrijednosti (očekuje se da će iznositi samo 5 %) (44.). Broj metafaza koje se pregledavaju može se smanjiti ako se opazi veliki broj stanica s kromosomskim aberacijama i ako se ispitivana kemikalija smatra jasno pozitivnom.

Trebalo bi pregledati stanice sa strukturnim kromosomskim aberacijama uključujući i isključujući kromosomske prekide. Lomovi i prekidi definirani su u Dodatku 1. u skladu s (45. i 46.). Aberacije kromatidnog i kromosomskog tipa trebalo bi bilježiti odvojeno i klasificirati prema podtipovima (lomovi, zamjene). U postupcima koji se primjenjuju u laboratoriju trebalo bi osigurati da analizu kromosomskih aberacija provode dobro osposobljeni analitičari te da je, prema potrebi, pregledaju stručnjaci.

Iako je svrha ovog ispitivanja otkrivanje strukturnih kromosomskih aberacija, važno je zabilježiti učestalost poliploidije i endoreduplikacije u slučaju da se opaze te pojave. (Vidjeti stavak 2.)

Osposobljenost laboratorija

Kako bi se utvrdilo dostatno iskustvo u ispitivanju prije njegove uporabe za rutinsko ispitivanje, laboratorij bi trebao provesti niz pokusa s referentnim pozitivnim kemikalijama uz primjenu različitih mehanizama i različitih negativnih kontrola (uključujući uporabu različitih otapala/nosača). Odgovori pozitivnih i negativnih kontrola trebali bi biti u skladu s literaturom. To se ne odnosi na laboratorije s iskustvom, odnosno laboratorije s bazom prijašnjih podataka koja je stavljena na raspolaganje u skladu s definicijom iz stavka 37.

Odabir kemikalija pozitivnih kontrola (vidjeti tablicu 1. iz stavka 26.) trebalo bi istražiti primjenom kratkotrajnih i dugotrajnih tretiranja bez metaboličke aktivacije, kao i primjenom kratkotrajnog tretiranja s metaboličkom aktivacijom kako bi se dokazala osposobljenost za otkrivanje klastogenih kemikalija i utvrdila učinkovitost sustava metaboličke aktivacije. Potrebno je izabrati raspon koncentracija odabranih kemikalija pri kojima će doći do ponovljivih povećanja u odnosu na pozadinske vrijednosti, koja su povezana s koncentracijom, kako bi se dokazala osjetljivost i dinamički raspon ispitnog sustava.

Podaci o prijašnjim kontrolama

Laboratorij bi trebao utvrditi:

Pri prvom prikupljanju podataka za distribuciju prijašnjih negativnih kontrola istodobne negativne kontrole trebale bi biti u skladu s objavljenim podacima o kontrolama, ako oni postoje. Nakon što se distribuciji kontrola doda još podataka o pokusima, istodobne negativne kontrole trebale bi u idealnim okolnostima biti unutar kontrolnih granica od 95 % te distribucije (44. i 47.). Baza podataka o prijašnjim negativnim kontrolama laboratorija trebala bi u početku obuhvaćati najmanje deset pokusa, međutim bilo bi poželjno da se sastoji od najmanje 20 pokusa provedenih u usporedivim pokusnim uvjetima. Laboratoriji bi trebali primjenjivati metode za kontrolu kvalitete, kao što su kontrolni dijagrami (npr. C-dijagrami ili X-stupčasti dijagrami 48.), kako bi utvrdili koliko su promjenjivi njihovi podaci o pozitivnim i negativnim kontrolama i dokazali da je u njihovom laboratoriju metodologija ‚pod kontrolom’ (44.). Daljnje preporuke o tome kako uspostaviti i upotrebljavati ranije podatke (npr. kriterije za uključivanje podataka u ranije podatke i za isključivanje iz njih i kriterije prihvatljivosti za određeni pokus) nalaze se u literaturi (47.).

Svaku izmjenu pokusnog protokola trebalo bi razmotriti s obzirom na to je li u skladu s postojećim bazama podataka laboratorija o prijašnjim kontrolama. Svaka veća nesukladnost trebala bi dovesti do uspostave nove baze podataka o prijašnjim kontrolama.

Podaci o negativnim kontrolama trebali bi se sastojati od podataka o pojavnosti stanica s kromosomskim aberacijama iz jedne kulture ili zbroja ponovljenih kultura kako je opisano u stavku 21. Istodobne negativne kontrole trebale bi u idealnim okolnostima biti unutar kontrolnih granica od 95 % za distribuciju baze podataka laboratorija o prijašnjim negativnim kontrolama (44. i 47.). Ako su podaci o istodobnim negativnim kontrolama izvan kontrolnih granica od 95 %, njihovo je uključivanje u distribuciju prijašnjih kontrola prihvatljivo sve dok ti podaci nisu ekstremne netipične vrijednosti i ako postoje dokazi o tome da je sustav ispitivanja ‚pod kontrolom’ (vidjeti stavak 37.) i dokazi o nepostojanju tehničke ili ljudske pogreške.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Predstavljanje rezultata

Trebalo bi ocijeniti postotak stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama. Aberacije kromatidnog i kromosomskog tipa, klasificirane prema podtipovima (lomovi, zamjene), trebalo bi navesti odvojeno s njihovim brojem i učestalošću za pokusne i kontrolne kulture. Kromosomski prekidi bilježe se i navode u izvješću odvojeno, ali se ne uključuju u ukupnu učestalost aberacija. Postotak poliploidnih i/ili endoredupliciranih stanica bilježi se ako su zapažene takve stanice.

Trebalo bi zabilježiti i rezultate istodobnog mjerenja citotoksičnosti za sve tretirane, negativne i pozitivne kontrolne kulture u glavnim pokusima za dokazivanje aberacija.

Potrebno je navesti podatke o pojedinačnim kulturama. Osim toga, sve je podatke potrebno sažeto prikazati u obliku tablice.

Kriteriji prihvatljivosti

Prihvatljivost ispitivanja temelji se na sljedećim kriterijima:

Ocjenjivanje i tumačenje rezultata

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno pozitivnom ako je u bilo kojem od ispitanih pokusnih uvjeta (vidjeti stavak 28.):

Kada su ispunjeni svi ti uvjeti, smatra se da ispitivana kemikalija može izazvati kromosomske aberacije u uzgojenim stanicama sisavaca u tom sustavu ispitivanja. Preporuke za najprikladnije statističke metode nalaze se u literaturi (49., 50. i 51.).

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno negativnom ako u svim ispitanim pokusnim uvjetima (vidjeti stavak 28.):

Tada se smatra da ispitivana kemikalija ne može izazvati kromosomske aberacije u uzgojenim stanicama sisavaca u tom sustavu ispitivanja.

Jasan pozitivan ili negativan odgovor nije potrebno provjeravati.

Ako odgovor nije ni jasno pozitivan ni jasno negativan kako je opisano gore ili kako bi se pridonijelo utvrđivanju biološke relevantnosti rezultata, podatke bi trebalo ocjenjivati na temelju stručne prosudbe i/ili daljnjih istraživanja. Vrednovanje dodatnih stanica (ako je to prikladno) ili ponavljanje pokusa uz moguću primjenu izmijenjenih pokusnih uvjeta (npr. rasporeda koncentracija, ostalih uvjeta metaboličke aktivacije (npr. S9 koncentracije ili S9 podrijetla)) mogu biti korisni.

U rijetkim slučajevima, čak i nakon daljnjih istraživanja, neće biti moguće na temelju dobivenih podataka donijeti zaključak o pozitivnim ili negativnim rezultatima, te će se stoga zaključiti da je odgovor na ispitivanu kemikaliju dvosmislen.

Povećanje broja poliploidnih stanica može značiti da ispitivana kemikalija može inhibirati mitotske procese i izazvati numeričke kromosomske aberacije (52.). Povećanje broja stanica s endoredupliciranim kromosomima može značiti da ispitivana kemikalije može inhibirati progresiju staničnog ciklusa (53. i 54.) (vidjeti stavak 2.). Stoga bi pojavnost poliploidnih stanica i stanica s endoredupliciranim kromosomima trebalo bilježiti odvojeno.

Izvješće o ispitivanju

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:

LITERATURA

(4)

U dijelu B poglavlje B.11. zamjenjuje se sljedećim:

„B.11.   Ispitivanje kromosomskih aberacija u koštanoj srži sisavaca

UVOD

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 475 (2016.). Dio je serije metoda za ispitivanje genetske toksikologije. Razvijen je i dokument OECD-a u kojemu se daju sažete informacije o ispitivanju u području genetske toksikologije te pregled novijih promjena tih ispitnih smjernica (1).

In vivo ispitivanje kromosomskih aberacija u koštanoj srži sisavaca posebno je relevantno za ocjenu genotoksičnosti jer, iako se mogu razlikovati među vrstama, faktori metabolizma, farmakokinetike i procesa popravka DNK in vivoaktivni su i pridonose odgovorima. In vivo test koristan je i za daljnje istraživanje genotoksičnosti otkrivene nekim in vitro sustavom.

In vivo ispitivanje kromosomskih aberacija sisavaca primjenjuje se za otkrivanje strukturnih kromosomskih aberacija u stanicama koštane srži životinja, obično glodavaca, uzrokovanih ispitivanim kemikalijama (2., 3., 4. i 5.). Razlikujemo dva tipa strukturnih kromosomskih aberacija: kromosomski i kromatidni. Iako je većina aberacija izazvanih genotoksičnim kemikalijama kromatidnog tipa, pojavljuju se i aberacije kromosomskog tipa. Oštećenja kromosoma i srodne pojave uzrok su mnogih genetskih oboljenja ljudi i postoje dostatni dokazi da su te lezije i srodne pojave koje uzrokuju promjene u onkogenima i genima supresorima tumora povezane s pojavom raka kod ljudi i u pokusnim sustavima. Tijekom in vivo testova kromosomskih aberacija može doći do pojave poliploidije (uključujući endoreduplikaciju). Međutim, povećanje poliploidije samo po sebi nije pokazatelj aneugenog potencijala, već može jednostavno biti pokazatelj poremećaja staničnog ciklusa ili citotoksičnosti. Ovo ispitivanje nije namijenjeno mjerenju aneuploidije. In vivo mikronukleus-test na eritrocitima sisavaca (poglavlje B.12. ovog Priloga) ili in vitro mikronukleus-test na stanicama sisavaca (poglavlje B.49. ovog Priloga) bila bi in vivo i in vitro ispitivanja preporučena za otkrivanje aneuploidije.

Upotrijebljene definicije terminologije navedene su u Dodatku 1.

POČETNA RAZMATRANJA

U tom ispitivanju uobičajeno se upotrebljavaju glodavci, ali i druge vrste mogu biti prikladne u određenim slučajevima, ako je to znanstveno opravdano. Ciljno tkivo u tom ispitivanju jest koštana srž jer je jako prokrvljena i sadržava populaciju stanica čiji se ciklus odvija brzo i koje se mogu lako izolirati i obrađivati. U izvješću bi trebalo navesti znanstveno opravdanje za uporabu drugih vrsta osim štakora i miševa. Ako se upotrebljavaju druge vrste osim glodavaca, preporučuje se uvrštavanje mjerenja kromosomske aberacije u koštanoj srži u drugo prikladno ispitivanje toksičnosti.

Ako postoje dokazi da ispitivana kemikalija ili njezin metabolit neće dospjeti do ciljnog tkiva, ovaj oblik ispitivanja možda nije prikladan.

Prije nego što se ta ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se njome dobiti primjereni rezultati za tu svrhu te ako mogu, zašto. Takva razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese.

NAČELO ISPITNE METODE

Životinje se izlažu ispitivanoj kemikaliji prikladnim načinom izlaganja i humano eutanaziraju u prikladnom trenutku nakon tretiranja. Prije eutanazije životinje se tretiraju agensom za zaustavljanje metafaze (npr. kolhicinom ili kolcemidom). Nakon toga se pripremaju i boje kromosomski preparati stanica koštane srži te se analizom utvrđuju kromosomske aberacije metafaznih stanica.

PROVJERA OSPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

Istraživanja osposobljenosti

Kako bi se utvrdilo dostatno iskustvo u provedbi testa prije njegove uporabe za rutinsko ispitivanje, laboratorij bi trebao dokazati sposobnost dobivanja očekivanih rezultata na temelju objavljenih podataka (npr. 6.) za učestalost kromosomskih aberacija s najmanje dvije kemikalije pozitivnih kontrola (uključujući slabe odgovore izazvane niskom dozom pozitivnih kontrola), kao što su one navedene u tablici 1., i s kompatibilnim kontrolama s nosačem/otapalom (vidjeti stavak 22.). U tim pokusima trebalo bi upotrebljavati doze na temelju kojih se dobivaju ponovljiva povećanja koja se odnose na dozu i dokazuju osjetljivost i dinamički raspon ispitnog sustava u pogledu ciljnog tkiva (koštane srži) uz uporabu metode vrednovanja koja će se upotrebljavati u laboratoriju. Taj se zahtjev ne odnosi na laboratorije s iskustvom, odnosno laboratorije s bazom ranijih podataka koja je stavljena na raspolaganje u skladu s definicijom iz stavaka od 10. do 14.

Podaci o prijašnjim kontrolama

Tijekom istraživanja osposobljenosti laboratorij bi treba utvrditi:

Pri prvom prikupljanju podataka za distribuciju prijašnjih negativnih kontrola istodobne negativne kontrole trebale bi biti u skladu s objavljenim podacima o kontrolama, ako oni postoje. Nakon što se distribuciji prijašnjih kontrola doda još podataka o pokusima, istodobne negativne kontrole trebale bi u idealnim okolnostima biti unutar kontrolnih granica te distribucije od 95 %. Baza podataka laboratorija o prijašnjim negativnim kontrolama trebala bi biti statistički čvrsta kako bi se osigurala sposobnost laboratorija za ocjenjivanje distribucije podataka o negativnim kontrolama. U literaturi je navedeno da može biti potrebno najmanje deset pokusa, ali bilo bi poželjno da podaci obuhvaćaju najmanje 20 pokusa provedenih u usporedivim pokusnim uvjetima. Laboratoriji bi trebali primjenjivati metode za kontrolu kvalitete, kao što su kontrolni dijagrami (npr. C-dijagrami ili X-stupčasti dijagrami (7.)), kako bi utvrdili koliko su promjenjivi njihovi podaci i dokazali da je u njihovom laboratoriju metodologija ‚pod kontrolom’. Daljnje preporuke o tome kako uspostaviti i upotrebljavati ranije podatke (npr. kriterije za uključivanje podataka u ranije podatke i za isključivanje iz njih i kriterije prihvatljivosti za određeni pokus) nalaze se u literaturi (8.).

Ako laboratorij ne provede dovoljan broj pokusa za utvrđivanje statistički čvrste distribucije negativnih kontrola (vidjeti stavak 11.) tijekom istraživanja osposobljenosti (kako je opisano u stavku 9.), prihvatljiva je uspostava distribucije tijekom prvih rutinskih ispitivanja. Taj pristup trebao bi biti u skladu s preporukama iz literature (8.), a rezultati dobiveni negativnim kontrolama u tim pokusima trebali bi biti u skladu s objavljenim podacima o negativnim kontrolama.

Sve izmjene protokola pokusa trebalo bi razmotriti s obzirom na to je li njihov učinak na dobivene podatke ostao u skladu s postojećom bazom podataka laboratorija o prijašnjim kontrolama. Samo veće neusklađenosti trebale bi za posljedicu imati uspostavljanje nove baze podataka o prijašnjim kontrolama, pri čemu se na temelju stručne prosudbe utvrđuje da je riječ o razlici u odnosu na prijašnju distribuciju (vidjeti stavak 11.). Tijekom ponovnog uspostavljanja možda neće biti potrebna potpuna baza podataka o negativnim kontrolama za provedbu stvarnog ispitivanja pod uvjetom da laboratorij može dokazati da su vrijednosti istodobnih negativnih kontrola ostale u skladu s prijašnjom bazom podataka ili s odgovarajućim objavljenim podacima.

Podaci o negativnim kontrolama trebali bi uključivati pojavnost strukturnih kromosomskih aberacija (isključujući prekide) kod svake životinje. Istodobne negativne kontrole trebale bi u idealnim okolnostima biti unutar kontrolnih granica od 95 % za distribuciju baze podataka laboratorija o prijašnjim negativnim kontrolama. Ako su podaci o istodobnim negativnim kontrolama izvan kontrolnih granica od 95 %, njihovo je uključivanje u distribuciju prijašnjih kontrola prihvatljivo sve dok ti podaci nisu ekstremne netipične vrijednosti i ako postoje dokazi o tome da je ispitni sustav ‚pod kontrolom’ (vidjeti stavak 11.) i ako nema dokaza o tehničkoj ili ljudskoj pogrešci.

OPIS METODE

Preparati

Odabir životinjske vrste

Trebalo bi upotrebljavati zdrave mlade odrasle životinje sojeva koji se obično upotrebljavaju u laboratorijskim istraživanjima. Uobičajeno se upotrebljavaju štakori, iako i miševi mogu biti prikladan odabir. Moguća je uporaba bilo koje druge prikladne vrste sisavaca ako je to znanstveno opravdano u izvješću.

Uvjeti smještaja i hranjenja životinja

U slučaju glodavaca, temperatura prostorije u kojoj se drže životinje trebala bi biti 22 °C (±3 °C). Iako bi u idealnim okolnostima relativna vlažnost trebala biti 50 – 60 %, ona bi trebala biti najmanje 40 %, a poželjno je da ne prelazi 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Rasvjeta bi trebala biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana uz neograničenu količinu vode za piće. Kad se ispitivana tvar primjenjuje ovom metodom, na izbor prehrane može utjecati potreba da se osigura odgovarajuća primjesa ispitivane kemikalije. Glodavci bi trebali biti smješteni u malim skupinama (ne više od pet po kavezu) istog spola i skupine za tretiranje ako se ne očekuje agresivno ponašanje, po mogućnosti u kavezima s čvrstim podom i uz prikladno obogaćivanje okoliša. Životinje se mogu držati u zasebnim nastambama samo ako je to znanstveno opravdano.

Priprema životinja

Uobičajeno se upotrebljavaju zdrave mlade odrasle životinje (u slučaju glodavaca, u idealnim okolnostima životinje u dobi od šest do deset tjedana na početku tretiranja, iako su prihvatljive i nešto starije životinje) koje se nasumično određuju za kontrolne skupine i skupine za tretiranje. Pojedinačne životinje identificiraju se jedinstvenom humanom, najmanje invazivnom metodom (npr. prstenovanjem, stavljanjem oznaka, mikročipiranjem ili biometrijskom identifikacijom, ali ne rezanjem uha ili prsta) i prilagođavaju laboratorijskim uvjetima najmanje pet dana. Kaveze bi trebalo rasporediti tako da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Trebalo bi izbjegavati unakrsnu kontaminaciju pozitivnom kontrolom i ispitivanom kemikalijom. Na početku studije variranje tjelesne mase životinja trebalo bi biti što manje i ne bi trebalo prelaziti ±20 % odgovarajuće srednje vrijednosti mase svakog spola.

Priprema doza

Prije no što se doza da životinjama, krute ispitivane kemikalije trebalo bi otopiti ili suspendirati u prikladnim otapalima ili nosačima ili dodati hrani ili vodi za piće. Tekuće ispitivane kemikalije mogu se dozirati izravno ili razrijediti prije doziranja. Ako se unose inhaliranjem, ispitivane kemikalije mogu se primijeniti u obliku plina, pare ili krutog/tekućeg aerosola, ovisno o njihovim fizikalno-kemijskim svojstvima. Ako prema podacima o stabilnosti skladištenje nije prihvatljivo i ako nisu utvrđeni prikladni uvjeti skladištenja, preparate ispitivane kemikalije trebalo bi upotrebljavati svježe.

Otapalo/nosač

Pri visinama doza koje se primjenjuju otapalo/nosač ne bi trebali imati toksične učinke i ne bi trebala postojati sumnja da bi mogli kemijski reagirati s ispitivanim kemikalijama. Ako se upotrebljavaju otapala/nosači koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje trebalo bi potkrijepiti referentnim podacima kojima se dokazuje njihova usklađenost. Kad god je to moguće preporučuje se najprije razmotriti mogućnost primjene vodenog otapala/nosača. Primjeri uobičajeno korištenih usklađenih otapala/nosača uključuju vodu, fiziološku otopinu, otopinu metil-celuloze, otopinu soli natrijeve karboksimetilne celuloze, maslinovo ulje i kukuruzno ulje. Ako ne postoje raniji ili objavljeni podaci o kontrolama kojima se dokazuje da odabranim atipičnim otapalom/nosačem nisu izazvane strukturne aberacije ili drugi štetni učinci, trebalo bi provesti početno istraživanje kako bi se utvrdila prihvatljivost kontrole s otapalom/nosačem.

Kontrole

Pozitivne kontrole

U svako ispitivanje trebalo bi uobičajeno uključiti skupinu životinja tretiranih kemikalijom pozitivne kontrole. Od toga se može odstupiti ako je ispitni laboratorij dokazao osposobljenost za provedbu ispitivanja i uspostavio raspon prijašnjih pozitivnih kontrola. Ako nije uključena istodobna pozitivna kontrolna skupina, u svaki pokus trebalo bi uključiti kontrole vrednovanja (fiksirana i nebojena predmetna stakalca). Njih se može dobiti uključivanjem prikladnih referentnih uzoraka u vrednovanje istraživanja koji su dobiveni i pohranjeni iz zasebnog pokusa s pozitivnom kontrolom koji se provodi periodično (npr. svakih šest do 18 mjeseci) u laboratoriju u kojem se provodi ispitivanje, na primjer, tijekom ispitivanja osposobljenosti laboratorija i redovito nakon toga, ako je to potrebno.

Kemikalije pozitivnih kontrola trebale bi pouzdano izazvati zamjetno povećanje učestalosti stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama iznad spontane razine. Doze pozitivnih kontrola trebalo bi odabrati tako da učinci budu jasni, ali da analitičar ne može odmah vidjeti identitet kodiranih uzoraka. Prihvatljiva je drukčija primjena pozitivnih kontrola u odnosu na primjenu ispitivane kemikalije, uz uporabu drukčijeg rasporeda tretiranja, te provedba uzorkovanja u samo jednom trenutku. Osim toga, može se razmotriti uporaba kemikalija pozitivne kontrole koje pripadaju istoj kategoriji opasnosti kao i ispitivana kemikalija ako je to prikladno. Primjeri kemikalija pozitivne kontrole navedeni su u tablici 1.

Tablica 1.

Primjeri kemikalija pozitivne kontrole

Negativne kontrole

Životinje iz negativnih kontrolnih skupina trebalo bi uključiti kod svakog uzorkovanja te bi s njima trebalo postupati jednako kao i sa skupinama za tretiranje, uz izostanak tretiranja ispitivanom kemikalijom. Ako se pri primjeni ispitivane kemikalije upotrebljava nosač/otapalo, kontrolna skupina trebala bi dobiti taj nosač / to otapalo. Međutim, ako se podacima o prijašnjim negativnim kontrolama dokažu dosljedna varijabilnost među životinjama i učestalost stanica sa strukturnim aberacijama za svako vrijeme uzorkovanja za ispitni laboratorij, za negativnu kontrolu može biti potrebno samo jedno uzorkovanje. Ako se za negativne kontrole upotrebljava samo jedno uzorkovanje, to bi trebalo biti vrijeme prvog uzorkovanja u istraživanju.

POSTUPAK

Broj i spol životinja

Općenito, odgovor mikronukleusa sličan je kod mužjaka i ženki (9.) te se očekuje da će to vrijediti i za strukturne kromosomske aberacije; stoga se većina istraživanja može provesti na bilo kojem spolu. Podacima kojima se dokazuju relevantne razlike između mužjaka i ženki (npr. razlike u sustavnoj toksičnosti, metabolizmu, bioraspoloživosti, toksičnosti za koštanu srž itd., uključujući npr. istraživanje o utvrđivanju raspona) potaknula bi se uporaba obaju spolova. U tom slučaju može biti prikladno provesti istraživanje na oba spola, npr. kao dio istraživanja toksičnosti nakon ponovljene doze. Ako se upotrebljavaju oba spola, bilo bi primjereno primijeniti faktorski model. U Dodatku 2. navedeni su detalji o načinu analize podataka primjenom tog plana.

Na početku istraživanja trebalo bi utvrditi veličine skupina kako bi se po skupini osiguralo minimalno pet životinja istog spola, ili svakog spola ako se upotrebljavaju oba spola, prikladnih za analizu. U slučajevima kad izloženost ljudi nekoj kemikaliji može biti vezana uz spol, kao što je slučaj s nekim farmaceutskim sredstvima, test bi trebalo obaviti na životinjama odgovarajućeg spola. Kao smjernica za maksimalne uobičajene zahtjeve u pogledu životinja, za istraživanje koštane srži s dva vremena uzorkovanja, tri skupine koje primaju dozu i istodobnom negativnom kontrolnom skupinom plus pozitivnom kontrolnom skupinom (pri čemu se svaka skupina sastoji od pet životinja istog spola) bilo bi potrebno 45 životinja.

Visine doza

Ako se provodi preliminarno istraživanje o utvrđivanju raspona jer nisu već na raspolaganju prikladni podaci kao pomoć u odabiru doza, ono bi se trebalo provesti u istom laboratoriju uz uporabu iste vrste, soja, spola i postupaka tretiranja kao i u glavnom istraživanju (10.). Cilj istraživanja trebalo bi biti utvrđivanje maksimalne doze tolerancije (MTD), koja je definirana kao najviša doza koja će se tolerirati bez dokaza o toksičnosti, povezane s ograničavanjem trajanja istraživanja (na primjer izazivanjem smanjenja tjelesne mase ili hematopoetske sustavne citotoksičnosti), isključujući smrt ili dokaze o boli, patnji ili stresu zbog kojih se zahtijeva humana eutanazija (11.).

Najviša doza može biti definirana i kao doza koja izaziva određenu toksičnost za koštanu srž.

Kemikalije koje pokazuju zasićenost toksikokinetičkih svojstava ili koje izazivaju postupke detoksifikacije koji mogu dovesti do smanjene izloženosti nakon dugotrajnog tretiranja mogu se izuzeti iz kriterija u pogledu određivanja doza i trebalo bi ih ocijeniti od slučaja do slučaja.

Kako bi se dobile informacije o odgovoru na dozu, potpuno istraživanje trebalo bi uključivati negativnu kontrolnu skupinu i minimalno tri visine doze pri čemu je svaka uglavnom dvostruko veća od prethodne, ali najviše četverostruko. Ako ispitivana kemikalija u istraživanju o utvrđivanju raspona ili na temelju postojećih podataka ne izaziva toksičnost, najviša doza za jednu primjenu trebala bi biti 2 000 mg/kg tjelesne mase. Međutim, ako ispitivana kemikalija uzrokuje toksičnost, MTD bi trebao biti najviša primijenjena doza i poželjno je da se primijenjenim visinama doze obuhvati raspon od maksimalne doze do doze koja izaziva malu toksičnost ili ne izaziva toksičnost. Ako je toksičnost ciljnog tkiva (koštane srži) zapažena pri svim ispitanim razinama doza, preporučuje se daljnje istraživanje pri netoksičnim dozama. Za istraživanja čiji je cilj potpunije opisati kvantitativne informacije o odgovoru na dozu mogu biti potrebne dodatne skupine koje primaju dozu. Za određene vrste ispitivanih kemikalija (npr. za farmaceutske proizvode namijenjene ljudima) obuhvaćene posebnim zahtjevima ta se ograničenja mogu razlikovati.

Granično ispitivanje

Ako se pokusima o utvrđivanju raspona doze ili postojećim podacima o srodnim sojevima životinja dokaže da se načinom tretiranja koji uključuje najmanje graničnu dozu (opisanu u nastavku) ne uzrokuju vidljivi toksični učinci (uključujući izostanak smanjenja proliferacije koštane srži ili druge dokaze o citotoksičnosti za ciljno tkivo) i ako se genotoksičnost ne očekuje na temelju in vitro istraživanja genotoksičnosti ili podataka o strukturno srodnim kemikalijama, potpuno istraživanje uz primjenu tri razine doza ne smatra se potrebnim, pod uvjetom da je dokazano da su ispitivane kemikalije dospjele do ciljnog tkiva (koštane srži). U takvim slučajevima može biti dovoljna jedna razina doze pri graničnoj dozi. Za razdoblje primjene > 14 dana granična je doza 1 000 mg/kg tjelesne mase dnevno. Za razdoblje primjene od 14 dana ili manje granična je doza 2 000 mg/kg tjelesne mase dnevno.

Primjena doza

Pri planiranju testa u obzir bi trebalo uzeti očekivani način ljudske izloženosti. Stoga se, ako su opravdani, mogu izabrati putovi primjene poput unosa hranom, vodom za piće, lokalnom primjenom, potkožno, intravenozno, oralno (intubacijom), udisanjem, intratrahealno ili implantacijom. U svakom slučaju, način izlaganja trebalo bi odabrati tako da se osigura prikladno izlaganje ciljnog tkiva. Intraperitonealna injekcija općenito se ne preporučuje jer nije način izlaganja namijenjen ljudima i trebalo bi je upotrebljavati samo uz posebno znanstveno opravdanje. Ako se ispitivana kemikalija dodaje hrani ili vodi za piće, posebno u slučaju primjene jedne doze, trebalo bi voditi računa o tome da se osigura dostatno vrijeme od unosa hrane i vode do uzorkovanja kako bi se omogućilo otkrivanje učinaka (vidjeti stavke 33. i 34.). Maksimalni volumen tekućine koji se odjednom može primijeniti sondom ili injekcijom ovisi o veličini ispitne životinje. Taj volumen uobičajeno ne bi trebao biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim u slučaju vodenih otopina gdje je dopušteno upotrijebiti maksimalno 2 ml/100 g tjelesne mase. Opravdanost primjene većih volumena od navedenog trebalo bi dokazati. Osim kod nadražujućih ili nagrizajućih ispitivanih kemikalija, za koje je uobičajeno da u većim koncentracijama izazivaju intenzivnije učinke, variranje ispitnih volumena trebalo bi podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako bi se kod primjene svih visina doze osigurao stalni volumen u odnosu na tjelesnu masu.

Plan tretiranja

Ispitivane kemikalije uobičajeno se primjenjuju jednokratno, ali se mogu primjenjivati i u podijeljenoj dozi (odnosno kao dva ili više doziranja u istom danu u razmaku od najviše dva do tri sata) kako bi se olakšalo davanje velikog volumena. U tim okolnostima ili pri primjeni ispitivane kemikalije inhalacijom, vrijeme uzorkovanja trebalo bi planirati na temelju vremena posljednje doze ili završetka izlaganja.

Malo je podataka dostupno o prikladnosti protokola o primjeni ponovljenih doza za ovo ispitivanje. Međutim, u okolnostima u kojima je poželjno ovo ispitivanje uključiti u ispitivanje toksičnosti s ponovljenim dozama trebalo bi voditi računa o tome da se izbjegne gubitak mitotskih stanica s oštećenim kromosomima koje mogu nastati pri toksičnim dozama. Takvo je uključivanje prihvatljivo ako je najviša doza veća od granične doze ili jednaka graničnoj dozi (vidjeti stavak 29.) i ako se na skupinu koja prima dozu primijeni granična doza tijekom razdoblja tretiranja. Mikronukleus-test (ispitnu metodu B.12.) trebalo bi smatrati preferiranim in vivo ispitivanjem kromosomskih aberacija ako je poželjna integracija s drugim istraživanjima.

Uzorci koštane srži trebali bi se uzimati odvojeno u dva navrata nakon pojedinačnih tretiranja. Ako je riječ o glodavcima, prvi interval uzorkovanja trebalo bi biti vrijeme potrebno za završetak 1,5 uobičajenog staničnog ciklusa (pri čemu potonji uobičajeno traje 12 – 18 sati nakon razdoblja tretiranja). Budući da vrijeme potrebno za unos i metabolizam ispitivane kemikalije i za njezino djelovanje na kinetiku staničnog ciklusa može utjecati na optimalno vrijeme za otkrivanje kromosomskih aberacija, preporuča se još jedno uzimanje uzorka 24 sata nakon vremena prvog uzorkovanja. U vrijeme prvog uzorkovanja trebalo bi tretirati sve skupine koje primaju dozu i prikupiti uzorke za analizu; međutim, u vrijeme kasnijeg uzorkovanja potrebno je primijeniti samo najvišu dozu. Ako se primjenjuju postupci primjene doze u trajanju duljem od jednog dana gdje je to znanstveno opravdano, općenito bi trebalo primijeniti samo jedno vrijeme uzorkovanja po isteku vremena od približno 1,5 uobičajenog staničnog ciklusa nakon posljednjeg tretiranja.

Nakon tretiranja i prije uzimanja uzoraka životinjama se intraperitonealnom injekcijom daje prikladna doza agensa za zaustavljanje metafaze (npr. kolcemida ili kolhicina) te se nakon toga u prikladnom intervalu uzimaju uzorci. Za miševe je taj interval približno tri sata do pet sati prije uzimanja uzorka, a za štakore dva sata do pet sati. Stanice se izdvajaju iz koštane srži, bubre, fiksiraju i boje te zatim analiziraju kako bi se utvrdile kromosomske aberacije (12.).

Zapažanja

Opća klinička zapažanja o pokusnim životinjama i kliničke znakove trebalo bi bilježiti najmanje jednom dnevno, po mogućnosti svaki dan u isto vrijeme, vodeći računa o razdoblju najvećeg intenziteta očekivanih učinaka nakon primjene doze. Najmanje dva puta dnevno tijekom razdoblja primjene doze trebalo bi provjeriti ima li slučajeva morbiditeta ili mortaliteta životinja. Sve životinje trebalo bi izvagati na početku istraživanja, najmanje jednom tjedno tijekom istraživanja s ponovljenim dozama i pri eutanaziji. U istraživanjima koja traju najmanje tjedan dana trebalo bi najmanje jednom tjedno mjeriti unos hrane. Ako se ispitivana kemikalija daje s vodom za piće, trebalo bi mjeriti i unos vode pri svakoj promjeni vode i najmanje jednom tjedno. Životinje u kojih su vidljivi nesmrtonosni pokazatelji prekomjerne toksičnosti trebalo bi humano eutanazirati prije završetka ispitnog razdoblja (11.).

Izlaganje ciljnog tkiva

Uzorak krvi trebalo bi uzeti u prikladnom trenutku / prikladnim trenucima kako bi se omogućilo istraživanje razina plazme ispitivane kemikalije u cilju dokazivanja da je došlo do izlaganja koštane srži, ako je to opravdano i ako ne postoje drugi podaci o izlaganju (vidjeti stavak 44.).

Preparati koštane srži i kromosomski preparati

Stanice koštane srži uzimaju se iz femura ili tibije životinja odmah nakon humane eutanazije, izlažu hipotoničkoj otopini i fiksiraju. Metafazne stanice zatim se nanose na predmetna stakalca i boje primjenom utvrđenih metoda (vidjeti 3. i 12.).

Analiza

Sva predmetna stakalca, uključujući i ona za pozitivne i negativne kontrole, trebalo bi prije analize neovisno kodirati i pregledati nasumično tako da analitičar ne zna za uvjete tretiranja.

Kao mjerilo toksičnosti trebalo bi odrediti mitotski indeks u najmanje 1 000 stanica po životinji za sve tretirane životinje (uključujući pozitivne kontrole), netretirane životinje iz negativnih kontrola ili životinje iz negativnih kontrola s nosačem/otapalom.

Za svaku životinju trebalo bi analizirati najmanje 200 metafaza radi utvrđivanja strukturnih kromosomskih aberacija, uključujući i isključujući kromosomske prekide (6.). Međutim, ako je u bazi podataka o prijašnjim negativnim kontrolama navedeno da je prosječna učestalost osnovne pojavnosti strukturnih kromosomskih aberacija < 1 % u ispitnom laboratoriju, trebalo bi razmotriti vrednovanje dodatnih stanica. Aberacije kromatidnog i kromosomskog tipa trebalo bi bilježiti odvojeno i klasificirani prema podtipovima (lomovi, zamjene). U postupcima koji se primjenjuju u laboratoriju trebalo bi osigurati da analizu kromosomskih aberacija provode dobro osposobljeni analitičari te da je, prema potrebi, pregledaju stručnjaci. Uzimajući u obzir da postupci pripreme predmetnih stakalaca često za posljedicu imaju lom jednog dijela metafaza uz posljedični gubitak kromosoma, stanice koje se pregledavaju trebale bi stoga sadržavati broj centromera koji nije manji od 2n ± 2, pri čemu je n haploidan broj kromosoma za tu vrstu.

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Obrada rezultata

Podatke o pojedinačnim životinjama trebalo bi prikazati u tabličnom obliku. Za svaku životinju trebalo bi ocijeniti mitotski indeks, broj pregledanih metafaznih stanica, broj aberacija po metafaznoj stanici i postotak stanica sa strukturnim kromosomskim aberacijama. Trebalo bi navesti različite tipove strukturnih kromosomskih aberacija zajedno s njihovim brojem i učestalošću za tretirane i kontrolne skupine. Kromosomski prekidi, poliploidne stanice i stanice s endoredupliciranim kromosomima bilježe se odvojeno. Iako se bilježi učestalost kromosomskih prekida, ona se općenito ne uključuje u analizu ukupne učestalosti strukturnih aberacija. Ako nema dokaza o razlikama u odgovoru između spolova, za statističku analizu mogu se kombinirati podaci. Trebalo bi bilježiti i podatke o toksičnosti za životinje i o kliničkim znakovima.

Kriteriji prihvatljivosti

Na temelju sljedećih kriterija utvrđuje se prihvatljivost ispitivanja:

Ocjenjivanje i tumačenje rezultata

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno pozitivnom:

Ako se u određeno vrijeme uzorkovanja ispituje samo najviša doza, ispitivana kemikalija smatra se jasno pozitivnom ako postoji statistički značajno povećanje u odnosu na istodobnu negativnu kontrolu i ako rezultati nisu uključeni u distribuciju povijesnih podataka o negativnim kontrolama (npr. kontrolne granice od 95 % prema Poissonovoj distribuciji). Preporuke za prikladne statističke metode nalaze se u literaturi (13.). Pri analizi odgovora na dozu trebalo bi analizirati najmanje tri skupine tretirane dozom. U statističkim testovima trebalo bi upotrebljavati životinju kao pokusnu jedinicu. Pozitivnim rezultatima ispitivanja kromosomskih aberacija dokazuje se da ispitivana kemikalija izaziva strukturne kromosomske aberacije u koštanoj srži ispitne vrste.

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno negativnom ako u svim ispitanim pokusnim uvjetima:

Preporuke za najprikladnije statističke metode nalaze se u literaturi (13.). Dokaz o izlaganju koštane srži ispitivanoj kemikaliji može uključivati smanjenje mitotskog indeksa ili mjerenje razina plazme ili krvi ispitivane kemikalije. U slučaju intravenozne primjene nije potreban dokaz o izlaganju. Kao druga mogućnosti, podaci o apsorpciji, distribuciji, metabolizmu i eliminaciji (ADME), dobiveni u okviru neovisnog istraživanja u kojem su se upotrebljavali jednaki način izlaganja i jednaka vrsta, mogu se upotrijebiti za dokazivanje izlaganja koštane srži. Negativnim rezultatima dokazuju se da u ispitnim uvjetima ispitivana kemikalija ne izaziva strukturne kromosomske aberacije koštane srži ispitnih vrsta.

Jasan pozitivan ili negativan odgovor nije potrebno provjeriti.

Ako odgovor nije jasno negativan ili pozitivan i kako bi se pridonijelo utvrđivanju biološke relevantnosti rezultata (npr. blago ili granično povećanje), podatke bi trebalo ocjenjivati na temelju stručne prosudbe i/ili daljnjih istraživanja postojećih završenih pokusa. U nekim slučajevima može biti korisno analizirati više stanica ili provesti ponovljeni pokus uz primjenu izmijenjenih pokusnih uvjeta.

U rijetkim slučajevima, čak i nakon daljnjih istraživanja, na temelju dobivenih podataka neće biti moguće donijeti zaključak da ispitivana kemikalija uzrokuje pozitivne ili negativne rezultate, te će se stoga zaključiti da je istraživanje dvosmisleno.

Učestalost poliploidnih i endoredupliciranih metafaza među ukupnim metafazama trebalo bi zabilježiti odvojeno. Povećanje broja poliploidnih/endoredupliciranih stanica može značiti da ispitivana kemikalija može inhibirati mitotske procese ili progresiju staničnog ciklusa (vidjeti stavak 3.).

Izvješće o ispitivanju

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:

Sažetak

LITERATURA

(5)

U dijelu B poglavlje B.12. zamjenjuje se sljedećim:

„B.12.   Mikronukleus-test na eritrocitima sisavaca

UVOD

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 474 (2016.). Dio je serije metoda za ispitivanje genetske toksikologije. Razvijen je i dokument OECD-a u kojemu se daju sažete informacije o ispitivanju u području genetske toksikologije te pregled novijih promjena tih ispitnih smjernica (1).

In vivo mikronukleus-test na sisavcima posebno je relevantan za ocjenu genotoksičnosti jer, iako se mogu razlikovati među vrstama, faktori metabolizma, farmakokinetika i procesi popravka DNK in vivo aktivni su i pridonose odgovorima. In vivo test koristan je i za daljnje istraživanje genotoksičnosti otkrivene nekim in vitro sustavom.

In vivo mikronukleus-test na sisavcima primjenjuje se za otkrivanje oštećenja kromosoma ili oštećenja mitotskog aparata eritroblasta izazvanih ispitivanom kemikalijom. Ispitivanjem se ocjenjuje nastajanje mikronukleusa u eritrocitima uzorkovanih iz stanica koštane srži ili periferne krvi životinja, uobičajeno glodavaca.

Svrha mikronukleus-testa jest utvrđivanje kemikalija koje izazivaju citogenetska oštećenja zbog kojih dolazi do nastajanja mikronukleusa koji sadržavaju zaostale fragmente kromosoma ili čitave kromosome.

Kada se eritroblast koštane srži razvije u nezreli eritrocit (koji se ponekad naziva i polikromatski eritrocit ili retikulocit), dolazi do istiskivanja glavnog nukleusa; bilo koji nastali mikronukleus može zaostati u citoplazmi. Vidljivost ili otkrivanje mikronukleusa u tim je stanicama olakšano jer im nedostaje glavni nukleus. Povećanje učestalosti nezrelih eritrocita s mikronukleusima kod tretiranih životinja pokazatelj je izazvanih strukturnih ili numeričkih kromosomskih aberacija.

Novonastali eritrociti s mikronukleusima utvrđuju se i kvantificiraju bojenjem, nakon čega slijedi vizualno očitavanje mikroskopom ili automatska analiza. Prebrojavanje dovoljnog broja nezrelih eritrocita u perifernoj krvi ili koštanoj srži odraslih životinja u velikoj je mjeri olakšano uporabom platforme za automatsko očitavanje. Takve su platforme prihvatljiva alternativa ručnom prebrojavanju (2.). Usporednim istraživanjima dokazano je da se takvim metodama, u kojima se primjenjuju prikladni standardi kalibracije, mogu osigurati bolja međulaboratorijska i unutarlaboratorijska obnovljivost i osjetljivost nego ručnim mikroskopskim očitavanjem (3. i 4.). Automatski sustavi kojima se može mjeriti učestalost eritrocita s mikronukleusima uključuju, među ostalim, protočne citometre (5.), platforme za analizu slike (6. i 7.) i citometre s laserskim skeniranjem (8.).

Iako se to uobičajeno ne radi u okviru ispitivanja, fragmenti kromosoma mogu se razlikovati od čitavih kromosoma na temelju niza kriterija. Oni uključuju utvrđivanje prisutnosti ili odsutnosti kinetohore ili centromernog DNK, koji su oboje svojstveni netaknutim kromosomima. Odsutnost kinetohore ili centromernog DNK znači da mikronukleus sadržava samo fragmente kromosoma, dok njihova prisutnost znači gubitak kromosoma.

Upotrijebljene definicije terminologije navedene su u Dodatku 1.

POČETNA RAZMATRANJA

Ciljno je tkivo za genetska oštećenja u ovom ispitivanju koštana srž mladih odraslih glodavaca jer u tom tkivu nastaju eritrociti. Mjerenje mikronukleusa u nezrelim eritrocitima u perifernoj krvi prihvatljivo je kod drugih vrsta sisavaca za koje je dokazana odgovarajuća osjetljivost na otkrivanje kemikalija koje uzrokuju strukturne ili numeričke kromosomske aberacije u tim stanicama (nastankom mikronukleusa u nezrelim eritrocitima) i za koje je navedeno znanstveno opravdanje. Učestalost nezrelih eritrocita s mikronukleusima glavna je krajnja točka. Učestalost zrelih eritrocita s mikronukleusima u perifernoj krvi jednako se tako može primijeniti kao krajnja točka kod vrsta bez snažne selekcije stanica s mikronukleusima u slezeni i u slučajevima kada se životinje neprekidno tretiraju tijekom razdoblja duljeg od životnog vijeka eritrocita kod upotrijebljene vrste (npr. četiri tjedna ili dulje kod miševa).

Ako postoje dokazi da ispitivana kemikalija ili njezin metabolit neće dospjeti do ciljnog tkiva, ovaj oblik ispitivanja možda nije prikladan.

Prije nego što se ova ispitna metoda primijeni na smjesi radi dobivanja podataka za predviđenu regulatornu svrhu, potrebno je razmotriti mogu li se njome dobiti primjereni rezultati za tu svrhu te ako mogu, zašto. Takva razmatranja nisu potrebna ako postoji regulatorni zahtjev za ispitivanje smjese.

NAČELO ISPITNE METODE

Životinje se na odgovarajući način izlažu ispitivanoj kemikaliji. Ako se upotrebljava koštana srž, životinje se humano eutanaziraju u prikladnom trenutku nakon tretiranja, uzima se koštana srž te se pripremaju mikroskopski preparati koji se zatim boje (9., 10., 11., 12., 13., 14. i 15.). Kada se upotrebljava periferna krv, u prikladnom trenutku nakon tretiranja uzima se krv te se pripremaju mikroskopski preparati koji se zatim boje (12., 16., 17. i 18.). Ako se tretiranje provodi akutno, važno je odabrati vrijeme uzimanja koštane srži i krvi u koje se može otkriti nastanak nezrelih eritrocita s mikronukleusima koji je povezan s tretiranjem. U slučaju uzorkovanja periferne krvi, mora proći dovoljno vremena kako bi došlo do pojave tih događaja u cirkulirajućoj krvi. Prisutnost mikronukleusa u preparatima analizira se vizualizacijom uz uporabu mikroskopa, analizom slike, protočnom citometrijom ili citometrijom s laserskim skeniranjem.

PROVJERA OSPOSOBLJENOSTI LABORATORIJA

Istraživanja osposobljenosti

Kako bi se utvrdilo dostatno iskustvo u provedbi testa prije njegove uporabe za rutinsko ispitivanje, laboratorij bi trebao dokazati sposobnost stvaranja očekivanih rezultata na temelju objavljenih podataka (17., 19., 20., 21. i 22.) za učestalosti mikronukleusa s najmanje dvije kemikalije pozitivnih kontrola (uključujući slabe odgovore izazvane niskom dozom pozitivnih kontrola), kao što su one navedene u tablici 1., i s kompatibilnim kontrolama s nosačem/otapalom (vidjeti stavak 26.). U tim bi se pokusima trebale upotrebljavati doze na temelju kojih se dobivaju ponovljiva povećanja povezana s dozom i dokazuju osjetljivost i dinamički raspon ispitnog sustava u pogledu ciljnog tkiva (koštane srži ili periferne krvi) uz uporabu metode vrednovanja koja će se upotrebljavati u laboratoriju. Taj se zahtjev ne odnosi na laboratorije s iskustvom, odnosno laboratorije s bazom ranijih podataka koja je stavljena na raspolaganje u skladu s definicijom iz stavaka od 14. do 18.

Podaci o prijašnjim kontrolama

Tijekom istraživanja osposobljenosti laboratorij bi trebao utvrditi:

Pri prvom prikupljanju podataka za distribuciju prijašnjih negativnih kontrola istodobne negativne kontrole trebale bi biti u skladu s objavljenim podacima o kontrolama, ako oni postoje. Nakon što se distribuciji prijašnjih kontrola doda još podataka o pokusima, paralelne negativne kontrole trebale bi u idealnim okolnostima biti unutar kontrolnih granica od 95 % te distribucije. Baza podataka o prijašnjim negativnim kontrolama laboratorija trebala bi biti statistički čvrsta kako bi se osigurala sposobnost laboratorija za ocjenjivanje distribucije podataka o negativnim kontrolama. U literaturi je navedeno da može biti potrebno najmanje deset pokusa, ali bilo bi poželjno da podaci obuhvaćaju najmanje 20 pokusa provedenih u usporedivim pokusnim uvjetima. Laboratoriji bi trebali primjenjivati metode za kontrolu kvalitete, kao što su kontrolni dijagrami (npr. C-dijagrami ili X-stupčasti dijagrami (23.)), kako bi utvrdili koliko su promjenjivi njihovi podaci i dokazali da je u njihovom laboratoriju metodologija ‚pod kontrolom’. Daljnje preporuke o tome kako uspostaviti i upotrebljavati ranije podatke (npr. kriterije za uključivanje podataka u ranije podatke i za isključivanje iz njih i kriterije prihvatljivosti za određeni pokus) mogu se pronaći se u literaturi (24.).

Ako laboratorij ne provede dovoljan broj pokusa za utvrđivanje statistički čvrste distribucije negativnih kontrola (vidjeti stavak 15.) tijekom istraživanja osposobljenosti (kako je opisano u stavku 13.), prihvatljiva je uspostava distribucije tijekom prvih rutinskih ispitivanja. Taj bi pristup trebao biti u skladu s preporukama iz literature (24.), a rezultati dobiveni negativnim kontrolama u tim pokusima trebali bi biti u skladu s objavljenim podacima o negativnim kontrolama.

Sve izmjene protokola pokusa trebalo bi razmotriti s obzirom na to je li njihov učinak na dobivene podatke ostao u skladu s postojećom bazom podataka laboratorija o prijašnjim kontrolama. Samo veće neusklađenosti trebale bi za posljedicu imati uspostavljanje nove baze podataka o prijašnjim kontrolama, pri čemu se na temelju stručne prosudbe utvrđuje da je riječ o razlici u odnosu na prijašnju distribuciju (vidjeti stavak 15.). Tijekom ponovnog uspostavljanja možda neće biti potrebna potpuna baza podataka o negativnim kontrolama za provedbu stvarnog ispitivanja pod uvjetom da laboratorij može dokazati da su vrijednosti paralelnih negativnih kontrola ostale u skladu s prijašnjom bazom podataka ili s odgovarajućim objavljenim podacima.

Podaci o negativnim kontrolama trebali bi uključivati pojavnost nezrelih eritrocita s mikronukleusima kod svake životinje. Istodobne negativne kontrole trebale bi u idealnim okolnostima biti unutar kontrolnih granica od 95 % za distribuciju baze podataka laboratorija o prijašnjim negativnim kontrolama. Ako su podaci o paralelnim negativnim kontrolama izvan kontrolnih granica od 95 %, njihovo je uključivanje u distribuciju prijašnjih kontrola prihvatljivo sve dok ti podaci nisu ekstremne netipične vrijednosti i ako postoje dokazi o tome da je ispitni sustav ‚pod kontrolom’ (vidjeti stavak 15.) i ako nema dokaza o tehničkoj ili ljudskoj pogrešci.

OPIS METODE

Preparati

Odabir životinjske vrste

Trebalo bi upotrebljavati zdrave mlade odrasle životinje sojeva koji se uobičajeno upotrebljavaju u laboratorijskim istraživanjima. Mogu se upotrebljavati miševi, štakori ili bilo koja druga prikladna vrsta sisavaca. Ako se upotrebljava periferna krv, mora se utvrditi da se uklanjanjem stanica s mikronukleusima iz krvotoka u slezeni ne ugrožava otkrivanje nastalih mikronukleusa kod odabranih vrsta. To je jasno dokazano za perifernu krv miševa i štakora (2.). U izvješću bi trebalo navesti znanstveno opravdanje za uporabu drugih vrsta osim štakora i miševa. Ako se upotrebljavaju druge vrste osim glodavaca, preporučuje se uvrštavanje mjerenja nastalih mikronukleusa u drugo prikladno ispitivanje toksičnosti.

Uvjeti smještaja i hranjenja životinja

U slučaju glodavaca, temperatura prostorije u kojoj se drže životinje trebala bi biti 22 °C (±3 °C). Iako bi u idealnim okolnostima relativna vlažnost trebala biti 50 – 60 %, ona bi trebala biti najmanje 40 %, a poželjno je da ne prelazi 70 %, osim tijekom čišćenja prostorije. Rasvjeta bi trebala biti umjetna uz izmjenu 12 sati svjetla i 12 sati mraka. Za hranjenje se može upotrebljavati konvencionalna laboratorijska hrana uz neograničenu količinu vode za piće. Na izbor prehrane može utjecati potreba da se na odgovarajući način umiješa ispitivana kemikalija, ako se ona daje u hrani. Glodavci bi trebali biti smješteni u malim skupinama (ne više od pet po kavezu) istog spola i skupine za tretiranje ako se ne očekuje agresivno ponašanje, po mogućnosti u kavezima s čvrstim podom i uz prikladno obogaćivanje okoliša. Životinje se mogu držati u zasebnim nastambama samo ako je to znanstveno opravdano.

Priprema životinja

Uobičajeno se upotrebljavaju zdrave mlade odrasle životinje (u slučaju glodavaca, u idealnim okolnostima životinje u dobi od šest do deset tjedana na početku tretiranja, iako su prihvatljive i nešto starije životinje) koje se nasumično određuju za kontrolne i skupine i skupine za tretiranje. Pojedinačne životinje identificiraju se jedinstvenom humanom, najmanje invazivnom metodom (npr. prstenovanjem, stavljanjem oznaka, mikročipiranjem ili biometrijskom identifikacijom, ali ne rezanjem uha ili prsta) i prilagođavaju laboratorijskim uvjetima najmanje pet dana. Kaveze bi trebalo rasporediti tako da se učinci do kojih bi moglo doći zbog položaja kaveza svedu na minimum. Trebalo bi izbjegavati unakrsnu kontaminaciju pozitivnom kontrolom i ispitivanom kemikalijom. Na početku studije variranje tjelesne mase životinja trebalo bi biti što manje i ne bi trebalo prelaziti ±20 % odgovarajuće srednje vrijednosti mase svakog spola.

Priprema doza

Prije no što se doza da životinjama, krute ispitivane kemikalije trebalo bi otopiti ili suspendirati u prikladnim otapalima ili nosačima ili dodati hrani ili vodi za piće. Tekuće ispitivane kemikalije mogu se dozirati izravno ili razrijediti prije doziranja. Ako se unose inhaliranjem, ispitivane kemikalije mogu se primijeniti u obliku plina, pare ili krutog/tekućeg aerosola, ovisno o njihovim fizikalno-kemijskim svojstvima. Ako prema podacima o stabilnosti skladištenje nije prihvatljivo i ako nisu utvrđeni prikladni uvjeti skladištenja, preparate ispitivane kemikalije trebalo bi upotrebljavati svježe.

Ispitni uvjeti

Otapalo/nosač

Pri visinama doza koje se primjenjuju otapalo/nosač ne bi trebali imati toksične učinke i ne bi trebala postojati sumnja da bi mogli kemijski reagirati s ispitivanim kemikalijama. Ako se upotrebljavaju otapala/nosači koji nisu dobro poznati, njihovo uključivanje u ispitivanje trebalo bi potkrijepiti referentnim podacima kojima se dokazuje njihova usklađenost. Kad god je to moguće preporučuje se najprije razmotriti mogućnost primjene vodenog otapala/nosača. Primjeri uobičajeno korištenih usklađenih otapala/nosača uključuju vodu, fiziološku otopinu, otopinu metil-celuloze, otopinu soli natrijeve karboksimetilne celuloze, maslinovo ulje i kukuruzno ulje. Ako ne postoje raniji ili objavljeni podaci o kontrolama kojima se dokazuje da odabranim atipičnim otapalom/nosačem nije izazvana pojava mikronukleusa ili drugi štetni učinci, trebalo bi provesti početno istraživanje kako bi se utvrdila prihvatljivost kontrole s otapalom/nosačem.

Kontrole

Pozitivne kontrole

U svako ispitivanje trebalo bi uobičajeno uključiti skupinu životinja tretiranih kemikalijom pozitivne kontrole. Od toga se može odstupiti ako je ispitni laboratorij dokazao osposobljenost za provedbu ispitivanja i uspostavio raspon prijašnjih pozitivnih kontrola. Ako nije uključena istodobna pozitivna kontrolna skupina, u svaki bi pokus trebalo uključiti kontrole vrednovanja (fiksirana i nebojena predmetna stakalca ili uzorke suspenzije stanica, ovisno o tome što je prikladno za metodu vrednovanja). Njih se može dobiti uključivanjem u vrednovanje istraživanja prikladnih referentnih uzoraka koji su dobiveni i pohranjeni iz zasebnog pozitivnog kontrolnog pokusa koji se provodi periodično (npr. svakih šest do 18 mjeseci); na primjer, tijekom ispitivanja osposobljenosti laboratorija i redovito nakon toga, ako je to potrebno.

Kemikalije pozitivne kontrole trebale bi pouzdano izazvati zamjetno povećanje učestalosti mikronukleusa iznad spontane razine. Kada se primjenjuje ručna analiza mikroskopom, doze pozitivnih kontrola trebalo bi odabrati tako da učinci budu jasni, ali da analitičar ne može odmah vidjeti identitet kodiranih uzoraka. Prihvatljiva je drukčija primjena pozitivnih kontrola u odnosu na primjenu ispitivane kemikalije, uz uporabu drukčijeg rasporeda tretiranja, te provedba uzorkovanja u samo jednom trenutku. Osim toga, može se razmotriti uporaba kemikalija pozitivne kontrole koje pripadaju istoj kategoriji opasnosti kao i ispitivana kemikalija, ako je to prikladno. Primjeri kemikalija pozitivne kontrole navedeni su u tablici 1.

Tablica 1.

Primjeri kemikalija pozitivne kontrole.

Kemikalije i CAS br.

Etil metansulfonat [CAS br. 62-50-0]

Metil metansulfonat [CAS br. 66-27-3]

Etil-nitrozourea [CAS br. 759-73-9]

Mitomicin C [CAS br. 50-07-7]

Ciklofosfamid (monohidrat) [CAS br. 50-18-0 (CAS br. 6055-19-2)]

Trietilenmelamin [CAS br. 51-18-3]

Kolhicin [CAS br. 64-86-8] ili vinblastin [CAS br. 865-21-4] – kao aneugeni

Negativne kontrole

Životinje iz negativnih kontrolnih skupina trebalo bi uključiti kod svakog uzorkovanja te bi s njima trebalo postupati jednako kao i sa skupinama za tretiranje, uz izostanak tretiranja ispitivanom kemikalijom. Ako se pri primjeni ispitivane kemikalije upotrebljava nosač/otapalo, kontrolna skupina trebala bi dobiti taj nosač / to otapalo. Međutim, ako se podacima o prijašnjim negativnim kontrolama dokažu dosljedna varijabilnost među životinjama i učestalost stanica s mikronukleusima za svako vrijeme uzorkovanja za ispitni laboratorij, za negativnu kontrolu može biti potrebno samo jedno uzorkovanje. Ako se za negativne kontrole upotrebljava samo jedno uzorkovanje, to bi trebalo biti vrijeme prvog uzorkovanje u istraživanju.

Ako se upotrebljava periferna krv, za kratkotrajna istraživanja prihvatljiv je uzorak uzet prije tretiranja umjesto istodobne negativne kontrole ako su dobiveni podaci u skladu s bazom podataka o prijašnjim kontrolama za ispitni laboratorij. Za štakore je dokazano da uzorkovanje malih volumena prije tretiranja (npr. manje od 100 μl/dan) ima minimalan učinak na osnovnu učestalost mikronukleusa (25.).

POSTUPAK

Broj i spol životinja

Općenito, odgovor mikronukleusa sličan je kod mužjaka i ženki i stoga se većina istraživanja može provesti na bilo kojem spolu (26.). Podacima kojima se dokazuju relevantne razlike između mužjaka i ženki (npr. razlike u sustavnoj toksičnosti, metabolizmu, bioraspoloživosti, toksičnosti za koštanu srž itd., uključujući npr. istraživanje o utvrđivanju raspona) potaknula bi se uporaba obaju spolova. U tom slučaju može biti prikladno provesti istraživanje na oba spola, npr. kao dio istraživanja toksičnosti nakon ponovljene doze. Ako se upotrebljavaju oba spola, bilo bi primjereno primijeniti faktorski model. U Dodatku 2. navedeni su detalji o načinu analize podataka primjenom tog modela.

Na početku istraživanja trebalo bi utvrditi veličine skupina kako bi se po skupini osiguralo minimalno pet životinja istog spola, ili svakog spola ako se upotrebljavaju oba spola, prikladnih za analizu. U slučajevima kad izloženost ljudi nekoj kemikaliji može biti povezana sa spolom, kao što je slučaj s nekim farmaceutskim sredstvima, ispitivanje bi trebalo obaviti na životinjama odgovarajućeg spola. Kao smjernica za maksimalne uobičajene zahtjeve u pogledu životinja, za istraživanje koštane srži koje se provodi u skladu s parametrima utvrđenima u stavku 37. s tri skupine koje primaju dozu i paralelnim negativnim i pozitivnim kontrolnim skupinama (pri čemu se svaka skupina sastoji od pet životinja istog spola) bilo bi potrebno od 25 do 35 životinja.

Visine doza

Ako se provodi preliminarno istraživanje o utvrđivanju raspona jer nisu već na raspolaganju prikladni podaci kao pomoć u odabiru doza, ono bi se trebalo provesti u istom laboratoriju uz uporabu iste vrste, soja, spola i postupaka tretiranja kao i u glavnom istraživanju (27.). Cilj istraživanja trebao bi biti utvrđivanje maksimalne doze tolerancije (MTD), koja je definirana kao najviša doza koja će se tolerirati bez dokaza o toksičnosti, povezane s ograničavanjem istraživanja (na primjer izazivanjem smanjenja tjelesne mase ili hematopoetske sustavne citotoksičnosti, isključujući smrt ili dokaze o boli, patnji ili stresu zbog kojih se zahtijeva humana eutanazija (28.).

Najviša doza može biti definirana i kao doza koja izaziva toksičnost za koštanu srž (npr. smanjenje udjela nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita u koštanoj srži ili perifernoj krvi za više od 50 %, ali ne manje od 20 % kontrolne vrijednosti). Međutim, pri analizi stanica pozitivnih na CD71 u perifernoj krvi (npr. u protočnoj citometriji), taj vrlo mladi dio nezrelih eritrocita odgovara na toksične izazove brže od veće kohorte nezrelih eritrocita pozitivnih na RNK. Stoga viša prividna toksičnost može biti vidljiva kod modela akutnog izlaganja u okviru kojih se ispituje dio nezrelih eritrocita pozitivnih na CD71 u usporedbi s modelima u kojima se utvrđuju nezreli eritrociti na temelju sadržaja RNK. Zbog toga se u slučaju pokusa u kojima tretiranje traje pet ili manje dana najviša doza za ispitivane kemikalije koje uzrokuju toksičnost može definirati kao doza koja uzrokuje statistički značajno smanjenje udjela nezrelih eritrocita pozitivnih na CD71 u ukupnom broju eritrocita, ali koja nije manja od 5 % kontrolne vrijednosti (29.).

Kemikalije koje pokazuju zasićenost toksikokinetičkih svojstava ili koje izazivaju postupke detoksifikacije koji mogu dovesti do smanjene izloženosti nakon dugotrajne primjene mogu se izuzeti iz kriterija u pogledu određivanja doza i trebalo bi ih ocijeniti od slučaja do slučaja.

Kako bi se dobile informacije o odgovoru na dozu, potpuno istraživanje trebalo bi uključivati negativnu kontrolnu skupinu i minimalno tri visine doze pri čemu je svaka uglavnom dvostruko veća od prethodne, ali najviše četverostruko. Ako ispitivana kemikalija ne izaziva toksičnost u okviru istraživanja o utvrđivanju raspona ili na temelju postojećih podataka, najviša doza u razdoblju primjene od 14 dana ili više trebala bi biti 1 000 mg/kg tjelesne mase dnevno, a ako je razdoblje primjene kraće od 14 dana, 2 000 mg/kg/ tjelesne mase dnevno. Međutim, ako ispitivana kemikalija uzrokuje toksičnost, MTD bi trebao biti najviša primijenjena doza i poželjno je da se visinama doze obuhvati raspon od maksimalne doze do doze koja izaziva malu toksičnost ili ne izaziva toksičnost. Ako je toksičnost ciljnog tkiva (koštane srži) zapažena pri svim ispitanim razinama doza, preporučuje se daljnje istraživanje pri netoksičnim dozama. Za istraživanja čiji je cilj potpunije opisati kvantitativne informacije o odgovoru na dozu mogu biti potrebne dodatne skupine koje primaju dozu. Za određene vrste ispitivanih kemikalija (npr. za farmaceutske proizvode namijenjene ljudima) obuhvaćene posebnim zahtjevima ta se ograničenja mogu razlikovati.

Granično ispitivanje

Ako se pokusima o utvrđivanju raspona ili postojećim podacima o srodnim sojevima životinja dokaže da se postupkom tretiranja koji uključuje najmanje graničnu dozu (opisanu u nastavku) ne uzrokuju vidljivi toksični učinci (uključujući izostanak smanjenja proliferacije koštane srži ili druge dokaze o citotoksičnosti za ciljno tkivo) i ako se genotoksičnost ne očekuje na temelju in vitro istraživanja genotoksičnosti ili podataka o strukturno srodnim kemikalijama, potpuno istraživanje uz primjenu tri razine doza ne smatra se potrebnim, pod uvjetom da je dokazano da su ispitivane kemikalije dospjele do ciljnog tkiva (koštane srži). U takvim slučajevima može biti dovoljna jedna razina doze pri graničnoj dozi. Za razdoblje primjene od 14 dana ili više granična je doza 1 000 mg/kg tjelesne mase dnevno. Za razdoblje primjene od 14 dana ili manje granična je doza 2 000 mg/kg tjelesne mase dnevno.

Primjena doza

Pri planiranju testa u obzir bi trebalo uzeti očekivani način ljudske izloženosti. Stoga se, ako je to opravdano, mogu odabrati načini izlaganja kao što su unos hrane, unos vode za piće, lokalno potkožno, intravenozno, oralno (sondom), inhalacija, primjena u dušnik ili implantacija. U svakom slučaju, način izlaganja trebalo bi odabrati tako da se osigura prikladno izlaganje ciljnog tkiva. Intraperitonealna injekcija općenito se ne preporučuje jer nije način izlaganja namijenjen ljudima i trebalo bi je upotrebljavati samo uz posebno znanstveno opravdanje. Ako se ispitivana kemikalija dodaje hrani ili vodi za piće, posebno u slučaju primjene jedne doze, trebalo bi voditi računa o tome da se osigura dostatno vrijeme od unosa hrane i vode do uzorkovanja kako bi se omogućilo otkrivanje učinaka (vidjeti stavak 37.). Maksimalni volumen tekućine koji se odjednom može primijeniti sondom ili injekcijom ovisi o veličini ispitne životinje. Taj volumen uobičajeno ne bi trebao biti veći od 1 ml/100 g tjelesne mase, osim u slučaju vodenih otopina gdje je dopušteno upotrijebiti maksimalno 2 ml/100 g tjelesne mase. Opravdanost primjene većih volumena od navedenog trebalo bi dokazati. Osim kod nadražujućih ili nagrizajućih ispitivanih kemikalija, za koje je uobičajeno da u većim koncentracijama izazivaju intenzivnije učinke, variranje ispitnih volumena trebalo bi podešavanjem koncentracije svesti na minimum kako bi se kod primjene svih visina doze osigurao stalni volumen u odnosu na tjelesnu masu.

Plan tretiranja

Poželjna je primjena dvaju ili više tretmana u intervalima od 24 sata, posebno ako je ovo ispitivanje sastavni dio drugih ispitivanja toksičnosti. Druga je mogućnost primjena jednog tretmana ako je to znanstveno opravdano (npr. ako je poznato da ispitivane kemikalije blokiraju stanični ciklus). Ispitivane kemikalije mogu se primjenjivati i u podijeljenoj dozi, odnosno kao dva ili više tretmana u istom danu u razmaku od najviše dva do tri sata, kako bi se olakšalo davanje velikog volumena. U tim okolnostima ili pri primjeni ispitivane kemikalije inhalacijom, vrijeme uzorkovanja trebalo bi planirati na temelju vremena posljednje doze ili završetka izlaganja.

Ispitivanje se može provoditi na miševima ili štakorima na jedan od sljedeća tri načina.

Ako je to relevantno i znanstveno opravdano te u cilju lakšeg uključivanja u druga ispitivanja toksičnosti, mogu se upotrebljavati drugi postupci primjene doza ili uzimanja uzoraka.

Zapažanja

Opća klinička zapažanja o ispitnim životinjama i kliničke znakove trebalo bi bilježiti najmanje jednom dnevno, po mogućnosti svaki dan u isto vrijeme, vodeći računa o razdoblju najvećeg intenziteta očekivanih učinaka nakon primjene doze. Najmanje dva puta dnevno tijekom razdoblja primjene doze trebalo bi provjeriti ima li slučajeva morbiditeta ili mortaliteta životinja. Sve bi životinje trebalo izvagati na početku istraživanja, najmanje jednom tjedno tijekom istraživanja s ponovljenim dozama i pri eutanaziji. U istraživanjima koja traju najmanje tjedan dana trebalo bi najmanje jednom tjedno mjeriti unos hrane. Ako se ispitivana kemikalija daje s vodom za piće, pri svakoj promjeni vode i najmanje jednom tjedno trebalo bi mjeriti i unos vode. Životinje u kojih su vidljivi nesmrtonosni pokazatelji prekomjerne toksičnosti trebalo bi humano eutanazirati prije završetka ispitnog razdoblja (28.). U određenim okolnostima mogla bi se pratiti tjelesna temperatura životinja jer se navodi da su hipertermija i hipotermija izazvane tretiranjem dovele do netočnih rezultata (32., 33. i 34.).

Izlaganje ciljnog tkiva

Uzorak krvi trebalo bi uzeti u prikladnom trenutku / prikladnim trenucima kako bi se omogućilo istraživanje razina plazme ispitivane kemikalije u cilju dokazivanja da je došlo do izlaganja koštane srži, ako je to opravdano i ako ne postoje drugi podaci o izlaganju (vidjeti stavak 48.).

Preparati koštane srži / krvi

Stanice koštane srži uobičajeno se uzimaju iz femura ili tibije životinja odmah nakon humane eutanazije. Stance se uobičajeno uklanjaju, pripremaju i boje primjenom utvrđenih metoda. Male količine periferne krvi mogu se uzeti, u skladu s odgovarajućim standardima dobrobiti životinja, primjenom metode kojom se omogućuje preživljavanje ispitne životinje, kao što je krvarenje iz repne vene ili druge prikladne krvne žile, ili punkcijom srca ili uzorkovanjem iz velike žile pri eutanaziji životinje. Ovisno o metodi analize, za eritrocite dobivene iz koštane srži ili periferne krvi, stanice se mogu odmah supravitalno obojiti (16., 17. i 18.), nakon čega se preparati razmaza pripremaju i boje za mikroskopiju ili se fiksiraju i boje na prikladan način za analizu protočnom citometrijom. Uporabom boja specifičnih za DNK [kao što su npr. akridin oranž (35.) ili Hoechst 33258 i pironin-Y (36.)] mogu se ukloniti neki od artefakta povezanih s uporabom boja koje nisu specifične za DNK. Ta prednost ne isključuje uporabu konvencionalnih boja (kao što je npr. Giemsa za mikroskopsku analizu). Mogu se upotrebljavati i dodatni sustavi [npr. celulozne kolone za uklanjanje stanica s nukleusom (37. i 38.)], pod uvjetom da je dokazano da su ti sustavi usklađeni s pripremom uzoraka u laboratoriju.

Ako su te metode primjenjive, za utvrđivanje naravi mikronukleusa (kromosoma / fragmenata kromosoma) mogu se upotrebljavati antikinetohorna antitijela (39.), fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) pancentromernim sondama DNK (40.) ili primarno in situ označavanje početnicama specifičnima za pancentromere, zajedno s prikladnim protubojenjem DNK (41.), kako bi se utvrdilo je li mehanizam nastajanja mikronukleusa posljedica klastogenog i/ili aneugenog djelovanja. Za razlikovanje između klastogena i aneugena mogu se primjenjivati i druge metode ako su dokazano učinkovite.

Analiza (ručna i automatska)

Sva predmetna stakalca ili uzorke za analizu, uključujući i one za pozitivne i negativne kontrole, trebalo bi prije bilo kakve vrste analize neovisno kodirati i pregledati nasumično tako da analitičar ne zna za uvjete tretiranja; kodiranje nije nužno ako se primjenjuju sustavi za automatsko očitavanje koji se ne temelje na vizualnom pregledu i na koje ne može utjecati pristranost ispitivača. Za svaku se životinju utvrđuje udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju (nezrelih + zrelih) eritrocita tako da se ukupno prebroji najmanje 500 eritrocita kada je u pitanju koštana srž i 2 000 eritrocita kada je u pitanju periferna krv (42.). Za utvrđivanje pojavnosti nezrelih eritrocita s mikronukleusima za svaku bi životinju trebalo pregledati najmanje 4 000 nezrelih eritrocita (43.). Ako je u bazi podataka o prijašnjim negativnim kontrolama navedeno da je prosječna učestalost osnovne pojavnosti nezrelih eritrocita s mikronukleusima < 0,1 % u ispitnom laboratoriju, trebalo bi razmotriti vrednovanje dodatnih stanica. Prilikom analize uzoraka, udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita tretiranih životinja ne bi trebao biti manji od 20 % udjela u kontroli s nosačem/otapalom pri očitavanju mikroskopijom i ne bi trebao biti manji od približno 5 % udjela u kontroli s nosačem/otapalom pri očitavanju nezrelih eritrocita pozitivnih na CD71 citometrijskim metodama (vidjeti stavak 31.) (29.). Na primjer, kod testa koštane srži u kojem se za analizu primjenjuje mikroskop, ako je kontrolni udio nezrelih eritrocita u koštanoj srži 50 %, gornja granična vrijednost toksičnosti bila bi 10 % nezrelih eritrocita.

Budući da se kod štakora eritrociti s mikronukleusima odvajaju i uništavaju u slezeni, za održavanje visoke razine osjetljivosti pri testu periferne krvi štakora poželjno je ograničiti analizu nezrelih eritrocita s mikronukleusima na najmlađi dio. Kada se primjenjuju metode automatske analize, najnezreliji eritrociti mogu se utvrditi na temelju njihova visokog sadržaja RNK ili visoke razine transferinskih receptora (CD71+) izraženih na njihovoj površini (31.). Međutim, izravnom usporedbom različitih metoda bojenja pokazalo se da se zadovoljavajući rezultati mogu dobiti različitim metodama, uključujući konvencionalno bojenje akridin oranžom (3. i 4.).

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Obrada rezultata

Podatke o pojedinačnim životinjama trebalo bi prikazati u tabličnom obliku. Za svaku bi analiziranu životinju trebalo posebno navesti broj pregledanih nezrelih eritrocita, broj nezrelih eritrocita s mikronukleusima i udio nezrelih eritrocita u ukupnom broju eritrocita. Ako se miševi neprekidno tretiraju četiri tjedna ili dulje, trebalo bi navesti i podatke o broju i udjelu zrelih eritrocita s mikronukleusima ako su prikupljeni. Trebalo bi bilježiti i podatke o toksičnosti za životinje i o kliničkim znakovima.

Kriteriji prihvatljivosti

Na temelju sljedećih kriterija utvrđuje se prihvatljivost ispitivanja:

Ocjenjivanje i tumačenje rezultata

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno pozitivnom:

Ako se u određeno vrijeme uzorkovanja ispituje samo najviša doza, ispitivana kemikalija smatra se jasno pozitivnom ako postoji statistički značajno povećanje u odnosu na istodobnu negativnu kontrolu i ako rezultati nisu uključeni u distribuciju povijesnih podataka o negativnim kontrolama (npr. kontrolne granice od 95 % prema Poissonovoj distribuciji). Preporuke za najprikladnije statističke metode nalaze se u literaturi (44., 45., 46. i 47.). Pri analizi odgovora na dozu trebalo bi analizirati najmanje tri skupine tretirane dozom. U statističkim ispitivanjima trebalo bi upotrebljavati životinju kao pokusnu jedinicu. Pozitivni rezultati u mikronukleus-testu znače da ispitivana kemikalija uzrokuje nastanak mikronukleusa, koji su posljedica oštećenja kromosoma ili oštećenja mitotskog aparata eritroblasta ispitne vrste. Ako je ispitivanje provedeno radi otkrivanja centromera unutar mikronukleusa, ispitivana kemikalija koja uzrokuje nastanak mikronukleusa s centromerima (centromernim DNK ili kinetohorom koji ukazuju na gubitak čitavog kromosoma) dokaz je da je ispitivana kemikalija aneugen.

Pod uvjetom da su ispunjeni svi kriteriji prihvatljivosti, ispitivana kemikalija smatra se jasno negativnom ako u svim ispitanim pokusnim uvjetima:

Preporuke za najprikladnije statističke metode nalaze se u literaturi (44., 45., 46. i 47.). Dokaz o izlaganju koštane srži ispitivanoj kemikaliji može uključivati smanjenje omjera nezrelih i zrelih eritrocita ili mjerenje razina plazme ili krvi ispitivane kemikalije. U slučaju intravenozne primjene, nije potreban dokaz o izlaganju. Kao druga mogućnosti, podaci o apsorpciji, distribuciji, metabolizmu i eliminaciji (ADME), dobiveni u okviru neovisnog istraživanja u kojem su se upotrebljavali jednaki način izlaganja i jednaka vrsta, mogu se upotrijebiti za dokazivanje izlaganja koštane srži. Negativni rezultati znače da ispitivana kemikalija u ispitnim uvjetima ne uzrokuje nastanak mikronukleusa u nezrelim eritrocitima ispitne vrste.

Jasan pozitivan ili negativan odgovor nije potrebno provjeriti.

Ako odgovor nije jasno negativan ili pozitivan i kako bi se pridonijelo utvrđivanju biološke relevantnosti rezultata (npr. blago ili granično povećanje), podatke bi trebalo ocjenjivati na temelju stručne prosudbe i/ili daljnjih istraživanja postojećih završenih pokusa. U nekim slučajevima može biti korisno analizirati više stanica ili provesti ponovljeni pokus uz primjenu izmijenjenih pokusnih uvjeta.

U rijetkim slučajevima, čak i nakon daljnjih istraživanja, neće biti moguće na temelju dobivenih podataka donijeti zaključak da ispitivana kemikalija uzrokuje pozitivne ili negativne rezultate, te će se stoga zaključiti da je istraživanje dvosmisleno.

Izvješće o ispitivanju

Izvješće o ispitivanju trebalo bi sadržavati sljedeće informacije:

LITERATURA

(6)

U dijelu B briše se poglavlje B.15.

(7)

U dijelu B briše se poglavlje B.16.

(8)

U dijelu B briše se poglavlje B.18.

(9)

U dijelu B briše se poglavlje B.19.

(10)

U dijelu B briše se poglavlje B.20.

(11)

U dijelu B briše se poglavlje B.24.

(12)

U dijelu B poglavlje B.47. zamjenjuje se sljedećim:

„B.47.   Metoda ispitivanja zamućenja i propusnosti goveđe rožnice za utvrđivanje i. kemikalija koje izazivaju tešku ozljedu oka i ii. kemikalija koje nije potrebno razvrstati s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka

UVOD

Ova ispitna metoda odgovara Smjernici OECD-a za ispitivanje 437 (2013.). Metodu ispitivanja zamućenja i propusnosti goveđe rožnice (BCOP) ocijenio je Međuagencijski koordinacijski odbor za validaciju alternativnih metoda (ICCVAM) u suradnji s Europskim centrom za validaciju alternativnih metoda (ECVAM) i Japanskim centrom za validaciju alternativnih metoda (JaCVAM) 2006. i 2010. (1. i 2.). Tijekom prvog ocjenjivanja BCOP ispitne metode ocjenjivala se njezina korisnost pri utvrđivanju kemikalija (tvari i smjesa) koje izazivaju tešku ozljedu oka (1.). Tijekom drugog ocjenjivanja BCOP ispitne metode ocjenjivala se njezina korisnost pri utvrđivanju kemikalija (tvari i smjesa) koje su nerazvrstane s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka (2.) Validacijska baza podataka za validaciju sadržavala je ukupno 113 tvari i 100 smjesa (2. i 3.). Na temelju tih ocjenjivanja i njihova stručnog preispitivanja zaključeno je da se ispitnom metodom mogu točno utvrditi kemikalije (tvari i smjese) koje izazivaju tešku ozljedu oka (kategorija 1.) i one koje nije potrebno razvrstati s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka, kako je utvrđeno Globalno usklađenim sustavom razvrstavanja i označivanja kemikalija (GHS) Ujedinjenih naroda (UN) (4.) i Uredbom (EZ) br. 1272/2008 o razvrstavanju, označivanju i pakiranju tvari i smjesa (CLP) (7), te je ona stoga odobrena kao znanstveno valjana u obje svrhe. Teška ozljeda oka znači oštećenje očnog tkiva ili ozbiljno fizičko pogoršanje vida nakon primjene ispitivane kemikalije na prednju površinu oka koji nisu potpuno reverzibilni u roku od 21 dana nakon primjene. Ispitivane kemikalije koje izazivaju tešku ozljedu oka razvrstane su u kategoriju 1. sustava UN GHS. Kemikalije koje su nerazvrstane s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka definirane su kao one koje ne ispunjavaju zahtjeve za razvrstavanje u kategoriju 1. ili 2. (2.A ili 2.B) sustava UN GHS, odnosno one se navode kao kemikalije bez kategorije prema sustavu UN GHS. Ova ispitna metoda uključuje preporučenu uporabu i ograničenja BCOP ispitne metode na temelju njezinih ocjenjivanja. Glavne razlike između izvorne verzije Smjernice OECD-a za ispitivanje iz 2009. i ažurirane verzije iz 2013. odnose se, među ostalim, na: uporabu BCOP ispitne metode za utvrđivanje kemikalija koje nije potrebno razvrstati u skladu sa sustavom UN GHS (stavci 2. i 7.), pojašnjenja primjene BCOP ispitne metode na ispitivanje alkohola, ketona i krutih tvari (stavci 6. i 7.) te tvari i smjesa (stavak 8.), pojašnjenja kako bi trebalo ispitivati površinski aktivne tvari i smjese koje sadržavaju površinski aktivne tvari (stavak 28.), ažuriranja i pojašnjenja povezana s pozitivnim kontrolama (stavci 39. i 40), ažuriranje kriterija za donošenje odluke o BCOP ispitnoj metodi (stavak 47.), ažuriranje kriterija prihvatljivosti istraživanja (stavak 48.), ažuriranje elemenata izvješća o ispitivanju (stavak 49.), ažuriranje Dodatka 1. o definicijama, dodavanje Dodatka 2. o prediktivnoj sposobnosti BCOP ispitne metode u okviru različitih sustava razvrstavanja, ažuriranje Dodatka 3. o popisu kemikalija za ispitivanje osposobljenosti i ažuriranje Dodatka 4. o držaču rožnice za ispitivanje BCOP-a (stavak 1.) i o opacimetru (stavci 2. i 3.).

Trenutačno je opće prihvaćena činjenica da se u doglednoj budućnosti in vivo Draizeovo ispitivanje na oku neće moći zamijeniti nijednim pojedinačnim in vitro ispitivanjem nadraživanja oka za predviđanje punog raspona nadraživanja za različite kemijske razrede. Međutim, kao zamjena za Draizeovo ispitivanje na oku mogu se primjenjivati strateške kombinacije nekoliko alternativnih ispitnih metoda u okviru strategije (višerazinskog) ispitivanja (5.). Pristup odozgo prema dolje (5.) trebalo bi primijeniti kada se na temelju postojećih informacija očekuje da će kemikalija imati veliki potencijal za nadražujuće djelovanje, dok bi se pristup odozdo prema gore (5.) trebao primijeniti kada se na temelju postojećih informacija očekuje da će nadraživanje oka koje prouzroči kemikalija biti takvo da će kemikaliju biti potrebno razvrstati. BCOP ispitna metoda je in vitro ispitna metoda koja se u određenim okolnostima i uz posebna ograničenja može primjenjivati za razvrstavanje i označivanje kemikalija prema opasnosti. Iako se ne smatra valjanom kao samostalna zamjena za in vivo ispitivanje na oku kunića, BCOP ispitna metoda preporučuje se kao početni korak u okviru ispitne strategije kao što je pristup odozgo prema dolje koji predlažu Scott et al. (5.) za utvrđivanje kemikalija koje izazivaju tešku ozljedu oka, odnosno kemikalija koje treba razvrstati u kategoriju 1. sustava UN GHS bez daljnjeg ispitivanja (4.). BCOP ispitna metoda preporučuje se i za utvrđivanje kemikalija koje nije potrebno razvrstati s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka, kako je utvrđeno sustavom UN GHS (bez kategorije prema sustavu UN GHS (4.) u okviru ispitne strategije kao što je pristup odozdo prema gore (5.) Međutim, za kemikaliju za koju nije predviđeno da će uzrokovati tešku ozljedu oka ili da će biti nerazvrstana s obzirom na nadraživanje oka / tešku ozljedu oka na temelju BCOP ispitne metode bit će potrebno dodatno ispitivanje (in vitro i/ili in vivo) za utvrđivanje konačnog razvrstavanja.

Svrha je ove ispitne metode opisati postupke koji se primjenjuju za ocjenjivanje potencijala opasnosti ispitivane kemikalije za oko mjerenog njezinom sposobnošću izazivanja zamućenja i povećane propusnosti izolirane goveđe rožnice. Toksični učinci na rožnicu mjere se: i. smanjenim prijenosom svjetlosti (zamućenjem) i ii. povećanim prolazom boje natrijevog fluoresceina (propusnošću). Ocjene zamućenja i propusnosti rožnice nakon izlaganja ispitivanoj kemikaliji kombiniraju se kako bi se dobila in vitro vrijednost nadražujućeg djelovanja (IVIS), koja se upotrebljava za razvrstavanje ispitivane kemikalije prema razini nadražujućeg djelovanja.

Definicije su navedene u Dodatku 1.

POČETNA RAZMATRANJA I OGRANIČENJA

Ova se ispitna metoda temelji na protokolu ICCVAM-a za BCOP ispitnu metodu (6. i 7.), koji je izvorno razvijen na temelju informacija dobivenih iz protokola Instituta za in vitro znanosti (IIVS) i protokola INVITTOX 124. (8.). Potonji protokol primjenjivao se u predvalidacijskom istraživanju koje je naručila Europska zajednica i koje je provedeno 1997. i 1998. Oba su se protokola temeljila na BCOP ispitnoj metodi o kojoj su prvi izvijestili Gautheron et al. (9.).

BCOP ispitna metoda može se primjenjivati za utvrđivanje kemikalija koje izazivaju tešku ozljedu oka kako je utvrđeno sustavom UN GHS, odnosno kemikalija koje treba razvrstati u kategoriju 1. sustava UN GHS (4.). Kada se primjenjuje u tu svrhu, BCOP ispitna metoda ima sveukupnu točnost od 79 % (150/191), stopu lažno pozitivnih rezultata od 25 % (32/126) i stopu lažno negativnih rezultata od 14 % (9/65) u odnosu na podatke dobivene metodom in vivo ispitivanja na oku kunića razvrstane u skladu sa sustavom razvrstavanja UN GHS (3.) (vidjeti tablicu 1. u Dodatku 2.). Ako se iz baze podataka isključe ispitivane kemikalije iz određenih kemijskih (tj. alkoholi, ketoni) ili fizikalnih (tj. krute tvari) kategorija, BCOP ispitna metoda ima sveukupnu točnost od 85 % (111/131), stopu lažno pozitivnih rezultata od 20 % (16/81) i stopu lažno negativnih rezultata od 8 % (4/50) u sustavu razvrstavanja UN GHS (3.). Mogući nedostaci BCOP ispitne metode kada se primjenjuje za utvrđivanje kemikalija koje izazivaju tešku ozljedu oka (kategorija 1. sustava UN GHS) temelje se na visokim stopama lažno pozitivnih rezultata za alkohole i ketone i visokoj stopi lažno negativnih rezultata za krute tvari zapaženih u validacijskoj bazi podataka (1., 2. i 3.). Međutim, budući da BCOP ispitnom metodom nisu precijenjeni rezultati za sve alkohole i ketone i budući da je za određene alkohole i ketone točno predviđena kategorija 1. sustava UN GHS, ne smatra se da su te dvije organske funkcionalne skupine izvan područja primjene ispitne metode. Na korisniku je ove ispitne metode da odluči o tome mogu li se prihvatiti mogući precijenjeni rezultati u pogledu određenog alkohola ili ketona ili bi trebalo provesti dodatno ispitivanje uz primjenu pristupa koji se temelji na ocjenjivanju snage dokaza. U pogledu stopa lažno negativnih rezultata za krute tvari, trebalo bi napomenuti da krute tvari mogu dovesti do promjenjivih i ekstremnih uvjeta izlaganja u in vivo Draizeovom ispitivanju nadraživanja oka, što za posljedicu može imati nevažna predviđanja u pogledu njihova stvarnog potencijala za nadražujuće djelovanje (10.). Jednako bi tako trebalo napomenuti da, u kontekstu utvrđivanja kemikalija koje izazivaju tešku ozljedu oka (kategorija 1. sustava UN GHS), nijedan lažno negativan rezultat utvrđen u validacijskoj bazi podataka ICCVAM-a (2. i 3.) nije za posljedicu imao IVIS ≤ 3, što je kriterij koji se primjenjuje kako bi se utvrdilo da je ispitivana kemikalija bez kategorije prema sustavu UN GHS. Nadalje, lažno negativni rezultati prema BCOP-u u tom kontekstu nisu kritični jer će se sve ispitivane kemikalije s rezultatom 3 < IVIS ≤ 55 naknadno ispitati drugim in vitro ispitivanjima potvrđenima na odgovarajući način ili, kao krajnja opcija, na kunićima, ovisno o regulatornim zahtjevima, uz primjenu strategije naknadnog ispitivanja i pristupa koji se temelji na ocjenjivanju snage dokaza. S obzirom na činjenicu da je BCOP ispitnom metodom točno predviđeno da određene krute kemikalije pripadaju kategoriji 1. sustava UN GHS, jednako se tako ne smatra da je to agregatno stanje izvan područja primjene ispitne metode. Istraživači bi mogli razmotriti primjenu ove ispitne metode za sve vrste kemikalija, pri čemu bi IVIS > 55 trebalo prihvatiti kao pokazatelj odgovora da kemikalija izaziva tešku ozljedu oka i da bi je bez daljnjeg ispitivanja trebalo razvrstati u kategoriju 1. sustava UN GHS. Međutim, kako je već navedeno, pozitivne rezultate dobivene s alkoholima ili ketonima trebalo bi oprezno tumačiti zbog potencijalno precijenjenih rezultata.

BCOP ispitna metoda može se primjenjivati i za utvrđivanje kemikalija za koje nije potrebno razvrstavanje s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka u skladu sa sustavom razvrstavanja UN GHS (4.). Kada se primjenjuje u tu svrhu, BCOP ispitna metoda ima sveukupnu točnost od 69 % (135/196), stopu lažno pozitivnih rezultata od 69 % (61/89) i stopu lažno negativnih rezultata od 0 % (0/107) u odnosu na podatke dobivene metodom in vivo ispitivanja na oku kunića razvrstane u skladu sa sustavom razvrstavanja UN GHS (3.) (vidjeti tablicu 2. u Dodatku 2.). Dobivena stopa lažno pozitivnih rezultata (in vivo kemikalije bez kategorije prema sustavu UN GHS koje imaju IVIS > 3, vidjeti stavak 47.) prilično je visoka, ali nije kritična u tom kontekstu jer će se sve ispitivane kemikalije s rezultatom 3 < IVIS ≤ 55 naknadno ispitati drugim in vitro ispitivanjima potvrđenima na odgovarajući način ili, kao krajnja opcija, na kunićima, ovisno o regulatornim zahtjevima, uz primjenu strategije sekvencijskog ispitivanja u okviru pristupa koji se temelji na ocjenjivanju snage dokaza. U BCOP ispitnoj metodi nisu zapaženi posebni nedostaci u pogledu ispitivanja alkohola, ketona i krutih tvari kada je cilj utvrđivanje kemikalija za koje nije potrebno razvrstavanje s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka (bez kategorije prema sustavu UN GHS) (3.). Istraživači bi mogli razmotriti primjenu ove ispitne metode za sve vrste kemikalija, pri čemu bi negativan rezultat (IVIS ≤ 3) trebalo prihvatiti kao pokazatelj da nije potrebno razvrstavanje (bez kategorije prema sustavu UN GHS). Budući da se BCOP ispitnom metodom može točno utvrditi samo 31 % kemikalija za koje nije potrebno razvrstavanje s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka, ova ispitna metoda ne bi trebala biti prvi izbor za pokretanje pristupa odozdo prema gore (5.) ako su na raspolaganju druge potvrđene i prihvaćene in vitro metode sa sličnom osjetljivošću, ali većom specifičnošću.

Validacijska baza podataka za validaciju sadržavala je ukupno 113 tvari i 100 smjesa (2. i 3.). Stoga se smatra da je BCOP ispitna metoda primjenjiva za ispitivanje i tvari i smjesa.

BCOP ispitna metoda ne preporučuje se za utvrđivanje ispitivanih kemikalija koje bi trebalo razvrstati kao kemikalije koje nadražuju oči (kategorija 2. ili kategorija 2.A sustava UN GHS) ili ispitivanih kemikalija koje bi trebalo razvrstati kao kemikalije koje blago nadražuju oči (kategorija 2.B sustava UN GHS) zbog znatnog broja kemikalija iz kategorije 1. sustava UN GHS koje su razvrstane u nedovoljno visoke kategorije 2., 2.A ili 2.B sustava UN GHS te zbog kemikalija bez kategorije prema sustavu UN GHS koje su razvrstane u previsoke kategorije 2., 2.A ili 2.B sustava UN GHS (2. i 3.). U tu svrhu može biti potrebno daljnje ispitivanje drugom prikladnom metodom.

Svi postupci s goveđim očima i goveđim rožnicama trebali bi biti u skladu s primjenjivim propisima ustanove koja provodi ispitivanje i postupcima za rukovanje materijalom dobivenim od životinja, koji među ostalim uključuje tkiva i tkivne tekućine. Preporučuju se općenite mjere opreza za laboratorije (11.).

Iako se u okviru BCOP ispitne metode ne razmatraju ozljede konjunktive i šarenice, razmatraju se učinci na rožnicu, koji su glavni pokretač in vivo razvrstavanja kad je riječ o razvrstavanju u skladu sa sustavom UN GHS. Reverzibilnost lezija rožnice ne može se sama po sebi ocijeniti BCOP ispitnom metodom. Na temelju istraživanja na oku kunića predloženo je da se za utvrđivanje određenih vrsta ireverzibilnih učinaka može primjenjivati ocjena početne dubine ozljede rožnice (12.). Međutim, potrebne su daljnje znanstvene spoznaje kako bi se razumjelo kako nastaju ireverzibilni učinci koji nisu povezani s početnom ozljedom visoke razine. Naposljetku, BCOP ispitnom metodom ne omogućuje se ocjena potencijala za sustavnu toksičnost povezanu s izlaganjem oka.

Ovu će se ispitnu metodu povremeno ažurirati uzimajući u obzir nove informacije i podatke. Na primjer, histopatologija može biti korisna ako je potreban potpuniji opis oštećenja rožnice. Kako je istaknuto u Smjernici OECD-a br. 160 (13.), korisnike se potiče da konzerviraju rožnice i pripreme histopatološke uzorke koji se mogu upotrijebiti za izradu baze podataka i kriterija za donošenje odluka kojima se može dodatno poboljšati točnost ove ispitne metode.

Svaki laboratorij koji je započeo s uspostavljanjem ove ispitne metode trebao bi upotrebljavati kemikalije za ispitivanje osposobljenosti navedene u Dodatku 3. Laboratorij može upotrebljavati te kemikalije kako bi dokazao svoju tehničku osposobljenost za provedbu BCOP ispitne metode prije dostave podataka o BCOP ispitnoj metodi u svrhu regulatornog razvrstavanja prema opasnosti.

NAČELO ISPITIVANJA

BCOP ispitna metoda organotipski je model kojim se osigurava kratkotrajno održavanje normalne fiziološke i biokemijske funkcije goveđe rožnice in vitro. U ovoj ispitnoj metodi oštećenje uzrokovano ispitivanom kemikalijom ocjenjuje se kvantitativnim mjerenjima promjena zamućenja i propusnosti rožnice opacimetrom odnosno spektrofotometrom vidljive svjetlosti. Oba mjerenja primjenjuju se za izračun IVIS-a, koji se upotrebljava kako bi se in vitro utvrđena kategorija razvrstavanja prema opasnosti nadraživanja mogla iskoristiti za in vivo procjenu potencijala neke ispitivane kemikalije da nadraži oko (vidjeti kriterije za donošenje odluke u stavku 48.).

U BCOP ispitnoj metodi upotrebljavaju se izolirane rožnice iz očiju svježe zaklane stoke. Zamućenje rožnice mjeri se kvantitativno kao količina prijenosa svjetlosti kroz rožnicu. Propusnost se mjeri kvantitativno kao količina boje natrijeva fluoresceina koja prolazi punom debljinom rožnice, kako je detektirana u mediju u stražnjoj komori. Ispitivane kemikalije nanose se na epitelnu površinu rožnice dodavanjem u prednju komoru držača rožnice. Dodatak 4. sadržava opis i dijagram držača rožnice koji se upotrebljava u BCOP ispitnoj metodi. Držači rožnice mogu se komercijalno nabaviti iz različitih izvora ili se mogu izraditi.

Izvor i starost goveđih očiju i odabir životinjskih vrsta

Stoka koja se šalje u klaonicu obično se kolje za ljudsku potrošnju ili za druge komercijalne namjene. Samo zdrave životinje koje se smatraju prikladnima za uvrštavanje u lanac ljudske prehrane upotrebljavaju se kao izvor rožnica za uporabu u BCOP ispitnoj metodi. Budući da tjelesna masa stoke u velikoj mjeri varira ovisno o pasmini, dobi i spolu, ne postoji preporučena tjelesna masa životinje u vrijeme klanja.

Kada se upotrebljavaju oči životinja različite dobi, može doći do varijacija u dimenzijama rožnica. Rožnice horizontalnog promjera > 30,5 mm i vrijednosti debljine srednjeg dijela rožnice (CCT) ≥ 1 100 μm obično se dobivaju od stoke starije od osam godina, dok se rožnice horizontalnog promjera < 28,5 mm i CCT-a < 900 μm obično dobivaju od stoke mlađe od pet godina (14.). Zbog toga se obično ne upotrebljavaju oči stoke starije od 60 mjeseci. Oči stoke mlađe od 12 mjeseci uglavnom se ne upotrebljavaju jer su one još u razvoju pa su debljina i promjer rožnice znatno manji nego kod očiju odrasle stoke. Međutim, uporaba rožnice mladih životinja (tj. životinja u dobi do šest do 12 mjeseci) dopuštena je jer ima određenih prednosti, kao što su veća dostupnost, uži dobni raspon i smanjena opasnost povezana s potencijalnim izlaganjem radnika goveđoj spongiformnoj encefalopatiji (15.). Budući da bi dodatno ocjenjivanje učinka veličine i debljine rožnice na osjetljivost na nagrizajuće i nadražujuće kemikalije bilo korisno, korisnike se potiče da za životinje od kojih se uzima rožnica koja se upotrebljava u istraživanju zabilježe procijenjenu dob i/ili tjelesnu masu.

Prikupljanje i prijevoz očiju u laboratorij

Oči prikupljaju radnici u klaonici. Kako bi se mehanička i druga oštećenja očiju svela na najmanju moguću mjeru, oči bi trebalo enukleirati što je to moguće prije nakon smrti životinje i odmah staviti na hlađenje nakon enukleacije i tijekom prijevoza. Kako bi se izbjeglo izlaganje očiju potencijalno nadražujućim kemikalijama, pri ispiranju glave životinje radnici u klaonici ne bi se trebali služiti deterdžentima.

Oči bi trebalo potpuno uroniti u Hankovu izbalansiranu slanu otopinu (HBSS) u spremniku prikladne veličine i prevesti do laboratorija tako da se propadanje i/ili bakteriološka kontaminacija svedu na najmanju moguću mjeru. Budući da se prikupljaju tijekom postupka klanja, oči mogu biti izložene krvi i drugim biološkim materijalima, uključujući bakterije i druge mikroorganizme. Stoga je važno osigurati da se rizik kontaminacije svede na najmanju moguću mjeru (npr. spremnik s očima treba držati na mokrom ledu tijekom prikupljanja i prijevoza, a HBSS-u u kojem su oči pohranjene tijekom prijevoza treba dodati antibiotike [npr. 100 IU/ml penicilina i 100 μg/ml streptomicina]).

Vremenski interval između prikupljanja očiju i uporabe rožnica u BCOP ispitnoj metodi trebao bi biti što kraći (oči se uobičajeno prikupljaju i upotrebljavaju istog dana) i trebalo bi dokazati da se njime ne dovode u pitanje rezultati analize. Ti se rezultati temelje na kriterijima za odabir očiju, kao i odgovorima pozitivnih i negativnih kontrola. Sve oči koje se upotrebljavaju u analizi trebale bi biti iz iste skupine očiju prikupljenih određenog dana.

Kriteriji za odabir očiju koje se upotrebljavaju u BCOP ispitnoj metodi

Kada stignu u laboratorij, oči se pažljivo pregledavaju kako bi se utvrdila oštećenja, uključujući povećano zamućenje, ogrebotine i neovaskularizaciju. Treba upotrebljavati samo rožnice očiju koja nemaju takvih oštećenja.

Kvaliteta svake rožnice ocjenjuje se i u kasnijim fazama analize. Rožnice koje imaju zamućenje veće od sedam jedinica zamućenja ili istovjetnu vrijednost za upotrijebljeni opacimetar ili držače rožnice nakon početnog jednosatnog ujednačavanja treba odbaciti (NAPOMENA: opacimetar bi trebalo kalibrirati u skladu sa standardima zamućenja koji se primjenjuju za utvrđivanje jedinica zamućenja, vidjeti Dodatak 4.).

Svaka skupina za tretiranje (ispitivana kemikalija, istodobne negativne i pozitivne kontrole) sadržava najmanje tri oka. Za negativnu kontrolu u BCOP ispitnoj metodi trebalo bi upotrijebiti tri rožnice. Budući da su sve rožnice odvojene od čitavih očnih jabučica i zatim stavljene u komore držača rožnice, postoji mogućnost pojave artefakata kao posljedice rukovanja pri pojedinim vrijednostima zamućenja i propusnosti rožnice (uključujući negativne kontrole). Nadalje, vrijednosti zamućenja i propusnosti rožnica iz negativnih kontrola primjenjuju se za korekciju vrijednosti zamućenja i propusnosti rožnica tretiranih ispitivanom kemikalijom i tretiranih u pozitivnim kontrolama u izračunima IVIS-a.

POSTUPAK

Priprema očiju

Pri disekciji neoštećenih rožnica ostavlja se rub od 2 do 3 mm sklere kako bi se olakšalo naknadno rukovanje, pri čemu treba paziti da se ne oštete epitel i endotel rožnice. Izolirane rožnice postavljaju se na posebno konstruirane držače rožnice tako da je prednji odjeljak u kontaktu s epitelnom stranom rožnice, a stražnji s endotelnom stranom rožnice. Obje se komore do ruba pune prethodno zagrijanim Eagleovim minimalnim esencijalnim medijem (EMEM) bez fenolne crvene (prvo stražnja komora), vodeći računa o tome da se ne stvaraju mjehurići zraka. Uređaj se tada uravnotežuje na 32 ± 1 °C najmanje jedan sat kako bi se omogućilo uravnoteženje rožnica s medijem i, u mjeri u kojoj je to moguće, postigla normalna metabolička aktivnost (približna temperatura površine rožnice in vivo iznosi 32 °C).

Nakon razdoblja uravnoteženja u obje komore dodaje se svježi, prethodno zagrijani EMEM bez fenolne crvene i za svaku rožnicu očitava se polazna vrijednost zamućenja. Odbacuju se sve rožnice kod kojih je zapaženo makroskopsko oštećenje tkiva (npr. ogrebotine, pigmentacija, neovaskularizacija) ili zamućenje veće od sedam jedinica zamućenja odnosno zamućenje istovjetne vrijednosti za upotrijebljeni opacimetar ili držače rožnice. Kao rožnice za negativnu kontrolu (ili kontrolu s otapalom) odabiru se minimalno tri rožnice. Preostale rožnice zatim se razdjeljuju u skupine za tretiranje i pozitivne kontrolne skupine.

Budući da je toplinski kapacitet vode veći od toplinskog kapaciteta zraka, vodom se osiguravaju stabilniji temperaturni uvjeti za inkubaciju. Stoga se za održavanje držača rožnice i njegova sadržaja pri temperaturi od 32 ± 1 °C preporučuje uporaba vodene kupelji. Međutim, mogu se upotrebljavati i zračni inkubatori uz mjere opreza kako bi se održala stabilnost temperature (npr. prethodnim zagrijavanjem držača i medija).

Primjena ispitivane kemikalije

Za tretiranje se primjenjuju dva različita protokola, jedan za tekućine i površinski aktivne tvari (krute tvari ili tekućine) i jedan za površinski neaktivne krute tvari.

Tekućine se ispituju nerazrijeđene. Polukrute tvari, paste i voskovi obično se ispituju kao tekućine. Čiste površinski aktivne tvari ispituju se pri koncentraciji od 10 % w/v u otopini natrijevog klorida od 0,9 %, destiliranoj vodi ili drugom otapalu za koje je dokazano da nema negativnih učinaka na ispitni sustav. Za alternativne koncentracije razrjeđivanja trebalo bi navesti prikladno opravdanje. Smjese koje sadržavaju površinski aktivne tvari mogu se ispitivati nerazrijeđene ili razrijeđene na prikladnu koncentraciju ovisno o relevantnom scenariju izlaganja in vivo. Za ispitane koncentracije trebalo bi navesti prikladno opravdanje. Rožnice se izlažu tekućinama i površinski aktivnim tvarima deset minuta. Uporaba drugih vremena izlaganja trebala bi biti popraćena prikladnim znanstvenim opravdanjem. Definicije površinski aktivne tvari i smjese koja sadržava površinski aktivne tvari navedene su u Dodatku 1.

Površinski neaktivne krute tvari obično se ispituju kao otopine ili suspenzije pri koncentraciji od 20 % w/v u otopini natrijeva klorida od 0,9 %, destiliranoj vodi ili drugom otapalu za koje je dokazano da nema negativnih učinaka na ispitni sustav. U određenim okolnostima i uz primjereno znanstveno opravdanje krute tvari mogu se ispitivati i čiste izravnim nanošenjem na površinu rožnice metodom otvorene komore (vidjeti stavak 32.). Rožnice se izlažu krutim tvarima tijekom četiri sata, ali, kao i kod tekućina i površinski aktivnih tvari, moguća su alternativna vremena izlaganja uz prikladno znanstveno opravdanje.

Mogu se primjenjivati različite metode tretiranja ovisno o fizikalnoj naravi i kemijskim svojstvima ispitivane kemikalije (npr. krute tvari, tekućine, viskozne ili neviskozne tekućine). Ključno je osigurati da je epitelna površina prikladno pokrivena ispitivanom kemikalijom i da se u fazama ispiranja ispitivana kemikalija pravilno ukloni. Za neviskozne do slabo viskozne tekuće ispitivane kemikalije uobičajeno se primjenjuje metoda zatvorene komore, dok se metoda otvorene komore obično primjenjuje za poluviskozne i viskozne tekuće ispitivane kemikalije i čiste krute tvari.

Kod metode zatvorene komore, količina ispitivane kemikalije (750 μl) dovoljna za prekrivanje epitelne strane rožnice uvodi se u prednju komoru kroz otvore za doziranje na gornjoj površini komore, koji se nakon toga hermetički zatvaraju čepovima i ostaju zatvoreni tijekom izlaganja. Važno je osigurati da svaka rožnica bude izložena ispitivanoj kemikaliji u odgovarajućem vremenu.

Kod metode otvorene komore, prije tretiranja s prednje se komore uklanja stakleni prozorčić i njegov prstenasti osigurač. Kontrolna ili ispitivana kemikalija (750 μl ili količina ispitivane kemikalije dovoljna za potpuno prekrivanje rožnice) mikropipetom se izravno nanosi na epitelnu površinu rožnice. Ako je ispitivanu kemikaliju teško pipetirati, radi lakšeg doziranja, ispitivana kemikalija može se pod tlakom napuniti u volumetrijsku pipetu. Vrh volumetrijske pipete umeće se u vrh šprice za doziranje tako da se materijal može pod tlakom napuniti u vrh volumetrijske pipete. Klip šprice potiskuje se istodobno s povlačenjem klipa pipete prema gore. Ako se u vrhu pipete pojave mjehurići zraka, ispitivana se kemikalija uklanja (izbacuje) i postupak se ponavlja dok vrh nije napunjen bez mjehurića zraka. Prema potrebi se može upotrijebiti obična šprica (bez igle) jer se njome omogućuje točno mjerenje volumena ispitivane kemikalije i lakše nanošenje na epitelnu površinu rožnice. Nakon doziranja stakleni prozorčić vraća se na prednju komoru čime se ponovno uspostavlja zatvoreni sustav.

Inkubacija nakon izlaganja

Nakon razdoblja izlaganja ispitivana kemikalija, kemikalija negativne kontrole ili kemikalija pozitivne kontrole uklanjaju se iz prednje komore i epitel se ispire najmanje tri puta (ili sve dok se više ne mogu zapaziti vidljivi dokazi ispitivane kemikalije) EMEM-om (koji sadržava fenolnu crvenu). Za ispiranje se upotrebljava medij koji sadržava fenolnu crvenu jer se u fenolnoj crvenoj može pratiti promjena boje kako bi se utvrdila učinkovitost ispiranja kiselih ili lužnatih ispitivanih kemikalija. Rožnice se ispiru više od tri puta ako fenolna crvena još nije obojena (ako je žuta ili ljubičasta) ili ako je još uvijek vidljiva ispitivana kemikalija. Nakon uklanjanja ispitivane kemikalije iz medija rožnice se završno ispiru EMEM-om (bez fenolne crvene). EMEM (bez fenolne crvene) se primjenjuje kao sredstvo za konačno ispiranje kako bi se osiguralo uklanjanje fenolne crvene iz prednje komore prije mjerenja zamućenja. Prednja komora zatim se ponovno puni svježim EMEM-om bez fenolne crvene.

Za tekućine i površinski aktivne tvari, rožnice se nakon ispiranja inkubiraju dodatna dva sata pri temperaturi od 32 ± 1 °C. U određenim okolnostima može biti korisno produljiti vrijeme nakon izlaganja, što se može razmotriti u svakom pojedinačnom slučaju. Rožnice tretirane krutim tvarima temeljito se ispiru po isteku četverosatnog razdoblja izlaganja, ali daljnja inkubacija nije potrebna.

Na kraju razdoblja inkubacije nakon izlaganja za tekućine i površinski aktivne tvari i na kraju četverosatnog razdoblja izlaganja za površinski neaktivne krute tvari bilježe se zamućenje i propusnost svake rožnice. Jednako tako, svaku se rožnicu vizualno promatra i bilježe se relevantna zapažanja (npr. ljuštenje tkiva, rezidualna ispitivana kemikalija, nejednolični obrasci zamućenja). Ta bi zapažanja mogla biti važna jer se mogu odraziti kao varijacije u očitavanjima opacimetra.

Kontrolne kemikalije

Svaki pokus uključuje istodobne negativne kontrole ili kontrole s otapalom/nosačem i pozitivne kontrole.

Kada se ispituje nerazrijeđena tekuća tvar, u BCOP ispitnu metodu uvodi se istodobna negativna kontrola (npr. otopina natrijeva klorida od 0,9 % ili destilirana voda) kako bi se mogle otkriti nespecifične promjene u ispitnom sustavu i kako bi se dobila polazna vrijednost za krajnje točke testa. Njome se osigurava i da se uvjetima provedbe testa ne izazove neprikladan odgovor na nadražujuću tvar.

Kada se ispituje razrijeđena tekućina, površinski aktivna tvar ili kruta tvar, u BCOP ispitnu metodu uvodi se istodobna kontrolna skupina s otapalom/nosačem kako bi se mogle otkriti nespecifične promjene u sustavu ispitivanja i kako bi se dobila polazna vrijednost za krajnje točke testa. Mogu se upotrebljavati samo otapala/nosači za koje je dokazano da nemaju negativne učinke na ispitni sustav.

Kemikalija za koju se zna da izaziva pozitivan odgovor uvodi se u svaki pokus kao istodobna pozitivna kontrola kako bi se provjerili integritet ispitnog sustava i pravilna provedba pokusa. Međutim, kako bi se osigurala mogućnost procjene varijabilnosti odgovora u pozitivnoj kontroli tijekom vremena, jačina odgovora na nadražujuću tvar ne bi trebala biti prekomjerna.

Primjeri pozitivnih kontrola za tekuće ispitivane kemikalije su 100 %-tni etanol ili 100 %-tni dimetilformamid. Primjer pozitivne kontrole za krute ispitivane kemikalije je 20 % w/v imidazola u otopini natrijeva klorida od 0,9 %.

Referentne kemikalije korisne su za ocjenjivanje potencijala za nadražujuće djelovanje na oči nepoznatih kemikalija iz specifičnog kemijskog razreda ili razreda proizvoda ili za ocjenjivanje relativnog potencijala za nadražujuće djelovanje tvari koja nadražuje oči unutar specifičnog raspona odgovora na nadražujuću tvar.

Mjerenje krajnjih točaka

Zamućenje se utvrđuje na temelju količine prijenosa svjetlosti kroz rožnicu. Zamućenje rožnice mjeri se kvantitativno opacimetrom te se tako dobivaju vrijednosti zamućenja mjerene na kontinuiranoj ljestvici.

Propusnost se utvrđuje na temelju količine boje natrijeva fluoresceina koja prodire u sve slojeve stanice rožnice (tj. od epitela na vanjskoj površini rožnice do endotela na unutarnjoj površini rožnice). Dodaje se 1 ml otopine natrijeva fluoresceina (4 ili 5 mg/ml kada se ispituju tekućine i površinski aktivne tvari odnosno površinski neaktivne krute tvari) u prednju komoru držača rožnice, koji je u kontaktu s epitelnom stranom rožnice, dok se stražnja komora, koja je u kontaktu s endotelnom stranom rožnice, puni svježim EMEM-om. Držač se zatim inkubira u horizontalnom položaju 90 ± 5 min pri temperaturi od 32 ± 1 °C. Količina natrijeva fluoresceina koja prijeđe u stražnju komoru kvantitativno se mjeri UV/VIS spektrofotometrijom. Spektrofotometrijska mjerenja koja se ocjenjuju pri 490 nm bilježe se kao vrijednosti optičke gustoće (OD490) ili vrijednosti apsorbancije, koje se mjere na kontinuiranoj ljestvici. Vrijednosti propusnosti fluoresceina utvrđuju se primjenom vrijednosti OD490 na temelju spektrofotometra vidljive svjetlosti standardne duljine puta od 1 cm.

Kao druga mogućnost, može se upotrijebiti čitač pločica za mikrotitraciju s 96 bunarića pod uvjetom: i. da se za određivanje vrijednosti OD490 fluoresceina može utvrditi linearni raspon čitača pločica i ii. da se na pločici s 96 bunarića upotrebljavaju uzorci fluoresceina točnog volumena kako bi se dobile vrijednosti OD490 istovjetne standardnoj duljini puta od 1 cm (za što bi moglo biti potrebno potpuno napuniti bunarić [obično 360 μl]).

PODACI I IZVJEŠĆIVANJE

Procjena podataka

Nakon korekcije vrijednosti (OD490) zamućenja i srednje izmjerene vrijednosti propusnosti s obzirom na osnovno zamućenje i na vrijednosti OD490 propusnosti negativne kontrole, srednje izmjerene vrijednosti OD490 zamućenja i propusnosti za svaku ispitnu skupinu trebalo bi kombinirati u empirijski izvedenoj formuli za izračun in vitro vrijednosti nadražujućeg djelovanja (IVIS) za svaku tretiranu skupinu kako slijedi:

IVIS = srednja izmjerena vrijednost zamućenja + (15 × srednja izmjerena vrijednost OD490 propusnosti).

Sina et al. (16.) izvijestili su da je ta formula izvedena tijekom unutarlaboratorijskih i međulaboratorijskih istraživanja. Podaci prikupljeni za niz od 36 spojeva u multilaboratorijskom istraživanju podvrgnuti su multivarijacijskoj analizi radi utvrđivanja najprikladnije jednadžbe između in vivo i in vitro podataka. Znanstvenici u dvama odvojenim poduzećima proveli su tu analizu i izveli gotovo identične jednadžbe.

Vrijednosti zamućenja i propusnosti trebalo bi neovisno ocjenjivati i kako bi se na temelju samo jedne od dviju krajnjih točaka utvrdilo je li ispitivana kemikalija izazvala nagrizanje ili jako nadraživanje (vidjeti Kriterije za donošenje odluke).

Kriteriji za donošenje odluke

Granične vrijednosti IVIS-a za utvrđivanje ispitivanih kemikalija koje izazivaju tešku ozljedu oka (kategorija 1. sustava UN GHS) i ispitivanih kemikalija koje nije potrebno razvrstati s obzirom na nadraživanje oka ili tešku ozljedu oka (bez kategorije prema sustavu UN GHS) navedene su nastavku.

Kriteriji prihvatljivosti istraživanja

Ispitivanje se smatra prihvatljivim ako se u pozitivnoj kontroli dobije IVIS između dvaju standardnih odstupanja postojeće povijesne srednje izmjerene vrijednosti, koja se ažurira najmanje svaka tri mjeseca ili svaki put kada se u laboratorijima u kojima se ispitivanja ne provode često (tj. manje nego jednom mjesečno) provede prihvatljivo ispitivanje. Odgovorima u negativnoj kontroli ili kontroli s nosačem/otapalom trebale bi se dobiti vrijednosti zamućenja i propusnosti koje su manje od utvrđenih gornjih granica za osnovne vrijednosti zamućenja i propusnosti za goveđe rožnice tretirane odgovarajućom negativnom kontrolom ili kontrolom s otapalom/nosačem. Jedan ciklus ispitivanja koji obuhvaća najmanje tri rožnice trebao bi biti dovoljan za ispitivanu kemikaliju ako je dobiveno razvrstavanje nedvosmisleno. Međutim, u slučajevima graničnih rezultata u prvom ciklusu ispitivanja, trebalo bi razmotriti mogućnost provođenja drugog ciklusa (koji, međutim, nije nužno potreban), a potom i trećeg u slučaju neusklađenih rezultata srednjeg izmjerenog IVIS-a između prvog i drugog ciklusa ispitivanja. U tom se kontekstu rezultat iz prvog ciklusa ispitivanja smatra graničnim ako predviđanja na temelju tri rožnice nisu bila usklađena tako da:

Izvješće o ispitivanju

U izvješće o ispitivanju trebalo bi uključivati sljedeće informacije ako su one relevantne za provedbu istraživanja:

LITERATURA