1)

En la parte A se añade el capítulo siguiente:

«A.25.   CONSTANTES DE DISOCIACIÓN EN AGUA (MÉTODO DE VALORACIÓN VOLUMÉTRICA — MÉTODO DE ESPECTROFOTOMETRÍA — MÉTODO DE CONDUCTIMETRÍA)

INTRODUCCIÓN

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 112 (1981).

Condiciones previas

Información orientativa

Indicación general sobre el método de ensayo

Documentos de referencia

El presente método de ensayo se basa en métodos que figuran en las referencias de la sección de «Bibliografía» y en el documento Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification de la EPA, de 18 de agosto de 1978.

MÉTODO — INTRODUCCIÓN, OBJETIVO, ÁMBITO DE APLICACIÓN, PERTINENCIA, APLICACIÓN Y LÍMITES DEL ENSAYO

La disociación de una sustancia en el agua es importante para evaluar su impacto sobre el medio ambiente. De ella depende la forma de la sustancia, que a su vez determina su comportamiento y transporte. Puede afectar a la adsorción del producto en el suelo y los sedimentos y a su absorción en células biológicas.

Definiciones y unidades

La disociación es la descomposición reversible en dos o más especies químicas que pueden ser iónicas. El proceso se representa generalmente mediante la ecuación:

RX ⇌ R ++ X –

y la constante de equilibrio de concentraciones que gobierna la reacción es

Por ejemplo, en el caso particular en que R es el hidrógeno (la sustancia es un ácido), la constante es

o bien

Sustancias de referencia

No es preciso emplear las sustancias de referencia siguientes cada vez que se estudia una nueva sustancia. Se facilitan principalmente para poder efectuar de vez en cuando el calibrado del método y ofrecer la posibilidad de comparar los resultados cuando se aplique un método distinto.

Sería útil disponer de una sustancia con varios pK como se indica en la sección Principio del método, más abajo. Esta sustancia podría ser la siguiente:

Principio del método

El proceso químico descrito suele depender solo ligeramente de la temperatura, en el intervalo de temperaturas pertinentes para el medio ambiente. La determinación de la constante de disociación requiere una medición de las concentraciones de las formas disociadas y sin disociar de la sustancia. La constante adecuada puede determinarse a partir de la estequiometría de la reacción de disociación indicada en la sección Definiciones y unidades, más arriba. En el caso concreto descrito en el presente método de ensayo, la sustancia se comporta como ácido o base, y la determinación más conveniente se hace midiendo las concentraciones relativas de las formas ionizadas y sin ionizar de la sustancia y el pH de la solución. La relación entre estos términos se da en la ecuación del pKa en la sección Definiciones y unidades, más arriba. Algunas sustancias presentan más de una constante de disociación y pueden obtenerse ecuaciones similares. Algunos de los métodos descritos aquí son también adecuados para disociaciones distintas del tipo ácido/base.

Criterios de calidad

Repetibilidad

La constante de disociación debe repetirse (un mínimo de tres determinaciones) con una variación no superior a ± 0,1 unidades logarítmicas.

DESCRIPCIÓN DE LOS PROCEDIMIENTOS DE ENSAYO

Hay dos planteamientos básicos para la determinación del pKa. Uno supone la valoración volumétrica de una cantidad conocida de sustancia con ácido o base patrón, según proceda; el otro consiste en determinar la concentración relativa de las formas ionizadas y sin ionizar y su dependencia del pH.

Preparación

Los métodos basados en estos principios pueden clasificarse como procedimientos de valoración volumétrica, de espectrofotometría y de conductimetría.

Soluciones de ensayo

Para los métodos de valoración volumétrica y de conductimetría, el producto debe disolverse en agua destilada. Para los métodos de espectrofotometría y otros tipos se utilizan soluciones amortiguadoras. La concentración de la sustancia problema no debe ser superior a 0,01 M o a la mitad de la concentración de saturación (si este valor es menor), y para preparar las soluciones debe emplearse la forma más pura posible de la sustancia. Si la sustancia es poco soluble, podrá disolverse en una pequeña cantidad de un solvente miscible con agua, antes de añadirla hasta conseguir las concentraciones indicadas anteriormente.

Las soluciones deben verificarse utilizando el efecto Tyndall con objeto de detectar la presencia de emulsiones, especialmente si se ha utilizado un cosolvente para aumentar la solubilidad. Si se utilizan soluciones amortiguadoras, la concentración de esta no debe ser superior a 0,05 M.

Condiciones del ensayo

Temperatura

La temperatura debe controlarse con una precisión mínima de ± 1 °C. La determinación debe efectuarse preferentemente a 20 °C.

Si se sospecha que el resultado depende significativamente de la temperatura, la determinación debe realizarse al menos a otras dos temperaturas. Los intervalos de temperatura deben ser en este caso de 10 °C y el control de la temperatura de ± 0,1 °C.

Análisis

El método se determinará en función de la naturaleza de la sustancia problema. Debe ser lo suficientemente sensible para permitir la determinación de las distintas especies a la concentración de cada solución de ensayo.

Realización del ensayo

Método de valoración volumétrica

La solución de ensayo se determina por valoración volumétrica con la solución patrón de ácido o de base, según proceda, y midiendo el pH después de cada adición de valorante. Deben efectuarse al menos diez adiciones graduales antes de llegar al punto de equivalencia. Si se alcanza el equilibrio con suficiente rapidez, puede utilizarse un potenciómetro gráfico. A efectos del presente método, es preciso conocer con exactitud tanto la cantidad total de sustancia como su concentración. Deben tomarse las precauciones necesarias para excluir la presencia de dióxido de carbono. En los ensayos normalizados se encuentran pormenores del procedimiento, precauciones y cálculos, por ejemplo en las referencias (1), (2), (3), (4).

Método de espectrofotometría

Se encuentra una longitud de onda a la que las formas ionizada y sin ionizar de la sustancia tienen coeficientes de extinción sensiblemente diferentes. Se obtiene el espectro de absorción UV/VIS de soluciones de concentración constante a un pH al que la sustancia está esencialmente sin ionizar, a un pH al que está totalmente ionizada, y a varios pH intermedios. Esto puede llevarse a cabo bien añadiendo incrementos de ácido concentrado (o base) a un volumen relativamente grande de una solución de la sustancia de carácter amortiguador y de varios componentes, al principio a pH elevado (o bajo) (ref. 5), o bien añadiendo volúmenes iguales de una solución madre de la sustancia en, por ejemplo, agua o metanol, a volúmenes constantes de diversas soluciones amortiguadoras que abarquen el intervalo deseado de pH. Los valores del pH y de absorbancia a la longitud de onda elegida permiten calcular un número suficiente de valores de pKa, utilizando datos de al menos 5 valores de pH a los que la sustancia esté ionizada como mínimo en un 10 % y sin llegar al 90 %. En la referencia (1) se dan más detalles experimentales y el método de cálculo.

Método de conductimetría

En una celda de constante pequeña y conocida, se mide la conductividad de una solución aproximadamente 0,1 M de la sustancia en agua de conductividad. Se mide también la conductividad de una serie de diluciones de esta solución efectuadas con exactitud. La concentración se reduce a la mitad cada vez, y la serie debe abarcar al menos un orden de magnitud de concentración. La conductividad limitante a dilución infinita se encuentra realizando un experimento similar con la sal sódica y extrapolando. El grado de disociación puede calcularse entonces a partir de la conductividad de cada solución mediante la ecuación de Onsager, y a continuación, haciendo uso de la ley de dilución de Ostwald, puede calcularse la constante de disociación como K = α2C/(1 – α), donde C es la concentración en moles por litro y α es la fracción disociada. Deben tomarse las precauciones necesarias para excluir la presencia de CO2. En los textos de las normas y en las referencias (1), (6) y (7) se dan más detalles experimentales y el método de cálculo.

DATOS E INFORME

Tratamiento de los resultados

Método de valoración volumétrica

Se calcula el valor del pKa en 10 puntos de medición de la curva de valoración. Se calculan la media y la desviación típica de estos valores de pKa. Debe incluirse una representación gráfica del pH frente al volumen de base o ácido patrón, junto con una presentación en forma de cuadro.

Método de espectrofotometría

Se presentan en forma de cuadro la absorbancia y el pH de cada espectro. Se calculan al menos cinco valores de pKa a partir de los puntos de datos de espectros intermedios, y también se calculan la media y la desviación típica de estos resultados.

Método de conductimetría

Se calcula la conductividad equivalente Λ para cada concentración de ácido y para cada concentración de una mezcla de un equivalente de ácido más 0,98 equivalentes de hidróxido de sodio exento de carbonato. El ácido se encuentra en exceso para evitar un exceso de OH– debido a la hidrólisis. Se representa 1/Λ frente a Ö_C y puede determinarse la Λo de la sal por extrapolación a concentración cero.

La Λo del ácido puede calcularse utilizando los valores de la bibliografía para H+ y Na+. El pKa puede calcularse de α = Λi /Λo y Ka = α2C/(1 – α) para cada concentración. Es posible obtener mejores valores de Ka aplicando correcciones para tener en cuenta la movilidad y la actividad. Deben calcularse la media y la desviación típica de los valores de pKa.

Informe del ensayo

Deben presentarse todos los datos en bruto y los valores calculados de pKa, junto con el método de cálculo (de preferencia en forma de cuadro, tal como se sugiere en la referencia 1), así como los parámetros estadísticos descritos anteriormente. En el caso de los métodos de valoración volumétrica, deben darse datos de la normalización de los valorantes.

En el caso del método de espectrofotometría, deben presentarse todos los espectros. En el caso del método de conductimetría, deben darse datos de la determinación de la constante de celda. Debe aportarse información sobre la técnica utilizada, los métodos analíticos y la naturaleza de los eventuales amortiguadores utilizados.

Debe indicarse la temperatura o temperaturas de ensayo.

BIBLIOGRAFÍA

2)

En la parte B, el capítulo B.5 se sustituye por el texto siguiente:

«B.5.   IRRITACIÓN/CORROSIÓN OCULAR AGUDA

INTRODUCCIÓN

El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo (TG) 405 de la OCDE (2012). Las directrices de ensayo de la OCDE para los ensayos de productos se revisan periódicamente a fin de garantizar que reflejan los mejores conocimientos científicos disponibles. En anteriores revisiones de estas directrices de ensayo se prestaba atención especial a las posibles mejoras mediante la evaluación de toda la información existente sobre el producto problema, para no someter a los animales de laboratorio a pruebas innecesarias y responder así a la preocupación por el bienestar de los animales. Las TG 405 (adoptadas en 1981 y actualizadas en 1987, 2002, y 2012) incluyen la recomendación de que, antes de llevar a cabo el ensayo in vivo que se describe para la irritación/corrosión ocular aguda, hay que efectuar una ponderación de las pruebas (1) con los datos relevantes existentes. Si los datos disponibles son insuficientes, se recomienda obtenerlos mediante la aplicación de secuencias de ensayos (2) (3). La estrategia de evaluación recomendada incluye la realización de ensayos in vitro validados y aceptados, y se recoge como suplemento del presente método de ensayo. A efectos del Reglamento (CE) n.o 1907/2006, relativo al registro, la evaluación, la autorización y la restricción de las sustancias y mezclas químicas (REACH) (2), en el correspondiente documento de orientación de la ECHA (21) se incluye también una estrategia de ensayos integrada. Los ensayos con animales solo deben llevarse a cabo si se estima que resultan necesarios tras el examen de los métodos alternativos disponibles, y si se considera que su uso es adecuado. En el momento de la redacción del presente método de ensayo actualizado, hay casos en que la utilización de este método de ensayo sigue siendo necesaria u obligatoria en virtud de algunos marcos normativos.

La última actualización se centró principalmente en el uso de analgésicos y anestésicos, sin afectar al concepto de base ni a la estructura de las directrices de ensayo. El ICCVAM (3) y un grupo internacional e independiente de revisión científica por pares revisó la utilidad y las limitaciones de la utilización sistemática de anestésicos tópicos, de analgésicos sistémicos y de parámetros compasivos en los ensayos de irritación ocular in vivo (12). La revisión concluyó que el uso de anestésicos tópicos y de analgésicos sistémicos puede evitar la mayoría o la totalidad del dolor y del sufrimiento, sin afectar a los resultados del ensayo, y recomendó que estas sustancias se utilizaran siempre. El presente método de ensayo tiene en cuenta esta revisión. En los ensayos in vivo de irritación y corrosión ocular aguda deben utilizarse sistemáticamente anestésicos tópicos, analgésicos sistémicos y parámetros compasivos. Las eventuales excepciones habrán de justificarse. Los refinamientos que se describen en el presente método reducirán sustancialmente o evitarán el dolor y el sufrimiento de los animales en la mayoría de las situaciones en las que siga siendo necesario efectuar ensayos de seguridad ocular in vivo.

Un tratamiento preventivo y equilibrado del dolor debe incluir: i) un tratamiento previo sistemático con un anestésico tópico (por ejemplo, proparacaína o tetracaína) y un analgésico sistémico (por ejemplo, buprenorfina), ii) un tratamiento posterior sistemático con analgésicos sistémicos (por ejemplo, buprenorfina y meloxicam), iii) un programa de observación, seguimiento y registro de los animales en cuanto a los signos clínicos de dolor o sufrimiento, y iv) un programa de observación, seguimiento y registro de la naturaleza, gravedad y evolución de todas las lesiones oculares. Se encuentran más detalles en los procedimientos actualizados que se describen a continuación. Tras la administración del producto problema, no deben aplicarse más anestésicos ni analgésicos tópicos a fin de evitar interferencias con el estudio. No deben aplicarse de forma tópica analgésicos con actividad antiinflamatoria (p. ej., meloxicam), y las dosis utilizadas sistémicamente no deben interferir con los efectos oculares.

Las definiciones se recogen en el apéndice del presente método de ensayo.

CONSIDERACIONES INICIALES

En aras de una ciencia válida y del bienestar de los animales no debe considerarse la realización de ensayos in vivo hasta que se hayan evaluado todos los datos disponibles relativos al potencial de corrosión/irritación ocular del producto mediante la ponderación de las pruebas. Dichos datos incluyen las pruebas obtenidas en estudios previos realizados con seres humanos o con animales de laboratorio, las pruebas de corrosión/irritación ocular por una o más de sustancias relacionadas estructuralmente o por una mezcla de las mismas, los datos que demuestren una elevada acidez o alcalinidad del producto (4) (5), y los resultados obtenidos en ensayos aceptados y validados de corrosión cutánea y de corrosión/irritación ocular in vitro o ex vivo (6) (13) (14) (15) (16) (17). Los estudios pueden haber sido realizados antes de la ponderación de las pruebas, o a consecuencia de la misma.

Para ciertos productos, dicho análisis puede indicar la necesidad de realizar estudios in vivo del potencial de corrosión/irritación ocular del producto. En todos esos casos, antes de considerar el uso de un ensayo ocular in vivo, resulta preferible llevar a cabo en primer lugar un estudio in vitro o in vivo de los efectos de corrosión cutánea del producto, y evaluar este estudio de acuerdo con la estrategia de evaluación secuencial del método de ensayo B.4 (7) o la estrategia de ensayos integrada descrita en el documento de orientación de la ECHA (21).

Se adjunta como suplemento del presente método de ensayo, y, a efectos de REACH, en el documento de orientación de la ECHA (21), una estrategia de evaluación secuencial, que incluye la ejecución de ensayos validados de irritación/corrosión ocular in vitro o ex vivo. Se recomienda seguir dicha estrategia de evaluación antes de llevar a cabo ensayos in vivo. Con los productos nuevos se recomienda un enfoque de evaluación por fases para obtener datos científicamente válidos sobre la corrosión/irritación provocada por el producto. Con los productos existentes que cuentan con datos insuficientes sobre su corrosión/irritación cutánea y ocular, puede utilizarse también esta estrategia para obtener los datos que falten. Deben justificarse los casos en que se emplee una estrategia o procedimiento de evaluación diferente, o en que se decida no utilizar un enfoque de evaluación por fases.

PRINCIPIO DEL ENSAYO IN VIVO

Después de un tratamiento previo con analgésicos sistémicos y la inducción de una anestesia tópica adecuada, el producto problema se aplica en una sola dosis a uno de los ojos del animal de experimentación; el ojo sin tratar sirve de testigo. Se evalúa el grado de irritación/corrosión ocular a intervalos determinados, asignando una puntuación a las lesiones de la conjuntiva, la córnea y el iris. También se describen otros efectos en el ojo y los efectos sistémicos adversos, para proporcionar una evaluación completa de los efectos. La duración del estudio ha de ser suficiente para evaluar la reversibilidad o irreversibilidad de los efectos observados.

Los animales que presenten signos de sufrimiento o dolor graves en cualquier fase del ensayo o lesiones compatibles con los parámetros compasivos descritos en el presente método de ensayo (véase el punto 26) deben ser sacrificados de forma compasiva, y el producto evaluado en consecuencia. Los criterios para tomar la decisión de sacrificar de forma compasiva los animales moribundos y que sufren intensamente son objeto de un documento de orientación de la OCDE (8).

PREPARACIÓN DEL ENSAYO IN VIVO

Selección de las especies

El conejo albino es el animal de laboratorio preferido; se emplean individuos adultos jóvenes y sanos. Si se utilizan otras especies será necesario justificarlo.

Preparación de los animales

En las 24 horas previas al inicio del ensayo se examinarán los dos ojos de los animales de experimentación provisionalmente seleccionados para el ensayo. No se utilizarán animales que muestren irritación ocular, defectos oculares o lesión corneal preexistente.

Alojamiento y alimentación

Los animales deben ser alojados de manera individual. La temperatura de los animalarios debe ser de 20 °C (± 3 °C) en el caso de los conejos. Aunque la humedad relativa debe ser del 30 % como mínimo y preferiblemente no superar el 70 %, excepto durante la limpieza del animalario, el objetivo debe ser el 50-60 %. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Debe evitarse una excesiva intensidad de la luz. Para la alimentación se podrán utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber.

PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

Uso de anestésicos tópicos y analgésicos sistémicos

Se recomiendan los siguientes procedimientos para evitar o reducir al mínimo el dolor y el sufrimiento en los ensayos de seguridad ocular. Pueden utilizarse otros procedimientos de los que se haya establecido que evitan o alivian de forma igual o mejor el dolor y el sufrimiento.

Aplicación del producto problema

El producto problema debe aplicarse a la conjuntiva de un ojo de cada animal, tras separar suavemente el párpado inferior del globo ocular. A continuación se juntan con suavidad los párpados durante un segundo aproximadamente, para que no se pierda el material. El otro ojo no se trata y sirve de testigo.

Lavado

No se lavarán los ojos de los animales tratados hasta al menos 24 horas después de la instilación del producto problema, excepto en el caso de sólidos (véase el punto 18) y si se producen efectos corrosivos o irritantes inmediatos. Transcurridas 24 horas se podrán lavar los ojos si se considera necesario.

No se recomienda utilizar un grupo satélite de animales para investigar la influencia del lavado, a menos que esté justificado desde el punto de vista científico. Si se necesita un grupo satélite, estará formado por dos conejos. Las condiciones del lavado deben quedar minuciosamente documentadas como, por ejemplo, hora del lavado, composición y temperatura de la solución de lavado, duración, volumen y velocidad de la aplicación.

Posología

1)   Ensayo de líquidos

Para el ensayo de líquidos se emplea una dosis de 0,1 ml. No se deben utilizar bombas de aerosol para instilar el producto directamente en el ojo. El aerosol líquido se expulsa de la bomba y se recoge en un recipiente, antes de instilar 0,1 ml en el ojo.

2)   Ensayo de sólidos

Para el ensayo de sólidos, pastas y productos con partículas, la cantidad utilizada debe tener un volumen de 0,1 ml o no pesar más de 100 mg. El material problema debe estar reducido a polvo fino. El volumen de material sólido se medirá tras compactarlo con suavidad, por ejemplo golpeando suavemente con los dedos el envase medidor. Si en el primer punto temporal de observación (1 hora después de la aplicación) el producto problema sólido no ha sido eliminado del ojo del animal de ensayo por mecanismos fisiológicos, se puede lavar el ojo con suero salino o con agua destilada.

3)   Evaluación de aerosoles

Se recomienda recoger en un recipiente el contenido de todas las bombas de aerosol antes de instilarlo en el ojo. La única excepción son los productos que van en envases de aerosol presurizados y que no se pueden recoger debido a la vaporización. En esos casos hay que sujetar el ojo bien abierto, administrando el producto problema en el ojo con una sola pulverización de alrededor de un segundo, a una distancia de 10 cm directamente delante del ojo. Esta distancia puede variar dependiendo de la presión del aerosol y de su contenido. Hay que tener cuidado para no lesionar el ojo con la presión del aerosol. En determinados casos puede ser necesario evaluar el potencial de causar una lesión «mecánica» del ojo por la fuerza del aerosol.

Es posible calcular la dosis de un aerosol, simulando el ensayo como se indica a continuación: se pulveriza el producto sobre papel de pesar, a través de una abertura del tamaño del ojo de un conejo, colocada directamente delante del papel. El aumento de peso del papel sirve para calcular aproximadamente la cantidad administrada al ojo. En el caso de los productos volátiles se puede calcular la dosis pesando un envase receptor antes y después de retirar el producto problema.

Ensayo inicial (ensayo de irritación/corrosión ocular in vivo con un solo animal)

Se recomienda encarecidamente realizar el ensayo in vivo inicialmente con un solo animal (véase el suplemento del presente método de ensayo: Estrategia de evaluación secuencial de la irritación y la corrosión oculares). Las observaciones deben permitir determinar la gravedad y la reversibilidad antes de proceder a un ensayo de confirmación con un segundo animal.

Si los resultados de este ensayo indican que el producto es irritante intenso o corrosivo en el ojo siguiendo el procedimiento descrito, no se harán más ensayos de irritación ocular.

Ensayo de confirmación (ensayo de irritación ocular in vivo con animales adicionales)

Si en el ensayo inicial no se observa efecto corrosivo o irritante intenso, la respuesta irritante o negativa debe confirmarse con un máximo de dos animales más. Si se observa efecto irritante en el ensayo inicial, se recomienda efectuar el ensayo de confirmación de forma secuencial exponiendo a los animales de uno en uno, en lugar de exponer a los dos animales adicionales a la vez. Si el segundo animal presenta efectos corrosivos o irritantes intensos se suspenderá el ensayo. Si los resultados del segundo animal son suficientes para permitir una clasificación de peligro, no deben hacerse más ensayos.

Período de observación

La duración del período de observación debe ser suficiente para evaluar por completo la magnitud y reversibilidad de los efectos observados. No obstante, se dará por finalizado el experimento si en cualquier momento el animal presenta signos de dolor o sufrimiento intensos (8). Para determinar la reversibilidad de los efectos, lo normal es someter a los animales a 21 días de observación a partir de la administración del producto problema. Si se observa la irreversibilidad antes de 21 días, el experimento debe finalizar en ese momento.

Observaciones clínicas y graduación de las reacciones oculares

Los ojos deben ser objeto de una evaluación exhaustiva en cuanto a la presencia o ausencia de lesiones oculares cuando haya pasado una hora de la APP, seguida de evaluaciones al menos diarias. Los animales deben ser evaluados varias veces al día durante los primeros 3 días para asegurarse de que las decisiones de finalización se adoptan en el momento oportuno. Los animales de ensayo deben ser objeto de evaluación sistemática a lo largo de toda la duración del estudio en cuanto a la presencia de signos clínicos de dolor o sufrimiento (por ejemplo, frotamiento repetido del ojo, parpadeo o lagrimeo excesivo) (9) (10) (11), al menos dos veces al día, con un mínimo de 6 horas entre las observaciones, o con mayor frecuencia si es necesario. Esto es necesario para: i) evaluar adecuadamente los animales en cuanto a la presencia de signos de dolor y sufrimiento a fin de tomar decisiones con conocimiento de causa sobre la necesidad de aumentar la dosis de analgésicos, y ii) evaluar los animales en cuanto a la presencia de parámetros compasivos establecidos a fin de tomar decisiones con conocimiento de causa sobre si procede realizar el sacrificio de los animales de forma compasiva, y garantizar que tales decisiones se tomen de manera oportuna. Se debe utilizar la tinción de fluoresceína sistemáticamente y un biomicroscopio de lámpara de hendidura cuando se considere oportuno (por ejemplo, para evaluar la profundidad de la lesión en caso de úlcera de la córnea) como ayuda en la detección y medición de daños oculares, y para evaluar si se han cumplido los criterios de parámetros establecidos para el sacrificio compasivo. Pueden tomarse fotografías digitales de las lesiones observadas para que sirvan de referencia y proporcionen un registro permanente de la importancia de los daños oculares. Los animales no permanecerán en el ensayo más tiempo del necesario, una vez obtenida la información definitiva. Los animales que muestren dolor o sufrimiento intenso deben ser sacrificados inmediatamente de forma compasiva, y el producto evaluado en consecuencia.

Los animales que presenten las siguientes lesiones oculares después de la instilación deben ser sacrificados de forma compasiva (véase en el cuadro 1 una descripción de los grados de las lesiones): perforación de la córnea o ulceración importante de la córnea, incluido el estafiloma; presencia de sangre en la cámara anterior del ojo; opacidad corneal de grado 4; ausencia de reflejo fotomotor (respuesta del iris de grado 2) que persista durante 72 horas; ulceración de la conjuntiva; necrosis de la conjuntiva o de la membrana nictitante, o pérdida de epitelio. Esto se debe a que tales lesiones no suelen ser reversibles. Además, se recomienda que las siguientes lesiones oculares se utilicen como parámetros compasivos para finalizar los estudios antes de que termine el período de observación de 21 días. Se considera que estas lesiones predicen la aparición de lesiones irritantes intensas o corrosivas y de lesiones de las que no se espera que reviertan plenamente al final del período de observación de 21 días: lesión de profundidad importante (por ejemplo, úlcera de la córnea que se extiende más allá de las capas superficiales del estroma), destrucción del limbo > 50 % (puesta de manifiesto por la palidez conjuntival), e infección ocular grave (supuración). Una combinación de vascularización de la superficie de la córnea (es decir, queratitis vascular), mantenimiento de la superficie teñida con fluoresceína a lo largo del tiempo según una evaluación diaria y/o ausencia de nueva epitelización 5 días después de la aplicación del producto problema también podría considerarse como un criterio potencialmente útil para influir en la decisión clínica sobre la finalización precoz del estudio. No obstante, estas observaciones aisladas son insuficientes para justificar la finalización precoz del estudio. Una vez que se han detectado efectos oculares graves, debe pedirse a un veterinario especialista o experto en animales de laboratorio o a una persona con una formación adecuada para identificar lesiones clínicas que realice un examen clínico para determinar si la combinación de tales efectos justifica la finalización precoz del estudio. Deben obtenerse y registrarse los grados de reacción ocular (conjuntiva, córnea e iris) cuando han pasado 1, 24, 48 y 72 horas desde la aplicación del producto problema (cuadro 1). Los animales que no presenten lesiones oculares deben permanecer en observación al menos 3 días después de la instilación. Los animales con lesiones que no sean graves deben permanecer en observación hasta que desaparezcan las lesiones o hasta que transcurran 21 días, momento en que finaliza el estudio. Deben efectuarse y registrarse observaciones al menos cuando hayan pasado 1 hora, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 7 días, 14 días y 21 días, para determinar el estado de las lesiones y si son o no reversibles. Deben efectuarse observaciones más frecuentes cuando sea necesario para determinar si el animal de experimentación ha de sacrificarse por motivos compasivos o eliminarse del estudio debido a los resultados negativos.

Deben registrarse en cada examen los grados de las lesiones oculares (cuadro 1). También deben consignarse las demás lesiones oculares (por ejemplo, queratitis vascular, manchas, cambios en la cámara anterior) o efectos sistémicos adversos eventuales.

Se puede facilitar el examen de las reacciones mediante el uso de una lupa binocular, de una lámpara de hendidura manual, de un biomicroscopio o de otro dispositivo adecuado. Tras registrar las observaciones a las 24 horas, las ulteriores exploraciones del ojo pueden hacerse con la ayuda de fluoresceína.

La graduación de las respuestas oculares es subjetiva necesariamente. Para armonizar tal graduación y ayudar a los laboratorios y a quienes efectúan e interpretan las observaciones, el personal encargado recibirá formación adecuada sobre el sistema de puntuación utilizado.

DATOS E INFORME

Evaluación de los resultados

Deben evaluarse las puntuaciones de la irritación ocular, junto con la naturaleza y la gravedad de las lesiones, así como su reversibilidad o irreversibilidad. Las puntuaciones individuales no dan el nivel absoluto de las propiedades irritantes de un producto, ya que también se evalúan otros efectos del producto problema; más bien deben considerarse como valores de referencia, que solo serán significativos cuando sean respaldados por una descripción completa y la evaluación de todas las demás observaciones.

Informe del ensayo

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

Interpretación de los resultados

La extrapolación a seres humanos de los resultados de los estudios de irritación ocular realizados con animales de laboratorio solo es válida en cierto grado. En muchos casos, los conejos albinos son más sensibles a los irritantes o corrosivos oculares que los seres humanos.

Hay que interpretar con cuidado los datos para excluir la irritación resultante de una infección secundaria.

BIBLIOGRAFÍA

Cuadro 1:

Graduación de las lesiones oculares

SUPLEMENTO DEL MÉTODO DE ENSAYO B.5  (4)

ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN SECUENCIAL DE LA IRRITACIÓN Y LA CORROSIÓN OCULARES

Consideraciones generales

Es importante evitar el uso innecesario de animales y reducir al mínimo los ensayos que con toda probabilidad producen respuestas graves en los animales, por su bienestar y por motivos científicos. Antes de considerar la realización de ensayos in vivo hay que evaluar toda la información sobre un producto en lo que respeta a su posible poder corrosivo/irritante ocular. Puede que existan pruebas suficientes para clasificar el potencial corrosivo o irritante ocular de un producto problema, sin necesidad de realizar ensayos con animales de laboratorio. Por eso el uso de la ponderación de las pruebas y de una estrategia de evaluación secuencial reducirá al mínimo la necesidad de realizar ensayos in vivo, especialmente si es probable que el producto produzca reacciones graves.

Se recomienda utilizar la ponderación de las pruebas para evaluar la información existente sobre el potencial de irritación y corrosión oculares de los productos, para determinar si la realización de estudios adicionales, aparte de los oculares in vivo, ayudaría a caracterizar dicho potencial. Cuando sean necesarios otros estudios, se recomienda utilizar la estrategia de evaluación secuencial para obtener los datos experimentales relevantes. Para sustancias no evaluadas anteriormente, se utilizará la estrategia de evaluación secuencial para obtener los datos necesarios a fin de evaluar su potencial corrosivo/irritante ocular. La estrategia de evaluación inicial que se describe en el prresente suplemento fue redactada en un taller de la OCDE (1). Posteriormente fue confirmada y ampliada por el sistema armonizado integrado de clasificación de peligros para la salud humana y efectos ambientales de los productos químicas (Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances), y fue aprobada en la XXVIII reunión del Comité Conjunto para productos químicos (Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals) en noviembre de 1998 (2) y actualizada por un grupo de expertos de la OCDE en 2011.

Aunque la presente estrategia de evaluación no forma parte integrante del método de evaluación B.5, sí expresa el enfoque recomendado para la determinación de las características de irritación/corrosión oculares. Este enfoque representa la práctica óptima y una referencia desde el punto de vista ético para el análisis in vivo de la irritación/corrosión oculares. El método de ensayo proporciona instrucciones para la realización del ensayo in vivo, y resume los factores que se han de abordar antes de ponerlo en marcha. La estrategia proporciona un enfoque basado en la ponderación de las pruebas para la evaluación de los datos existentes sobre las propiedades de irritación/corrosión oculares de los productos problema, y un enfoque escalonado para generar datos relevantes sobre productos que necesitan estudios adicionales o que no han sido estudiadas. La estrategia incluye la realización en primer lugar de ensayos in vitro o ex vivo validados y aceptados, y luego de estudios según el método de ensayo B.4 en condiciones concretas (3) (4).

Descripción de la estrategia de evaluación por fases

Antes de llevar a cabo los ensayos que forman parte de la estrategia de evaluación secuencial (véase la figura), se evaluará toda la información disponible, para determinar la necesidad de practicar estudios oculares in vivo. Aunque se puede obtener información significativa a partir de la evaluación de parámetros aislados (por ejemplo, un pH extremo), hay que considerar la totalidad de la información existente. Se evaluarán todos los datos relevantes sobre los efectos del producto en cuestión y de sus análogos estructurales, para tomar una decisión basada en la ponderación de las pruebas, y se presentará la justificación de dicha decisión. Se hará especial hincapié en los datos existentes sobre el producto obtenidos con seres humanos y animales, seguido por el resultado de los ensayos in vitro o ex vivo. Siempre que sea posible se evitará realizar estudios in vivo con productos corrosivos. Los factores que se tienen en cuenta en la estrategia de evaluación son:

ESTRATEGIA DE EVALUACIÓN DE LA IRRITACIÓN/CORROSIÓN OCULAR

BIBLIOGRAFÍA

3)

En la parte B, el capítulo B.10 se sustituye por el texto siguiente:

«B.10.   Ensayo de aberraciones cromosómicas en mamíferos in vitro

INTRODUCCIÓN

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 473 (2016). Forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. Se ha elaborado un documento de la OCDE que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a dichas directrices de ensayo (1).

El ensayo de aberraciones cromosómicas in vitro tiene por objeto detectar productos que provocan aberraciones cromosómicas estructurales en células de mamífero en cultivo (2) (3) (4). Las aberraciones estructurales pueden ser cromosómicas o cromatídicas. Puede surgir poliploidía (incluida la endorreduplicación) en los ensayos de aberraciones cromosómicas in vitro. Si bien los anéugenos pueden inducir la aparición de poliploidía, esta por sí sola no indica potencial aneugénico y puede indicar simplemente perturbación del ciclo celular o citotoxicidad (5). Este ensayo no está diseñado para medir la aneuploidía. Para la detección de la aneuploidía se recomendaría un ensayo de micronúcleos in vitro (6).

El ensayo de aberraciones cromosómicas in vitro puede emplear cultivos de líneas celulares establecidas o cultivos de células primarias humanas o de roedores. Las células deben seleccionarse sobre la base de su capacidad de crecimiento en cultivo, su estabilidad cariotípica (incluido el número de cromosomas) y su frecuencia de aberraciones cromosómicas espontáneas (7). Por el momento, los datos de que se dispone no permiten formular recomendaciones firmes pero sugieren que es importante, a la hora de evaluar los peligros químicos, examinar la situación de la proteína p53, la estabilidad genética (cariotipo), la capacidad de reparación del ADN y el origen (roedores frente a hombre) de las células elegidas para el ensayo. Se recomienda, pues, a los usuarios de este método de ensayo que consideren la influencia de estas y otras características de las células sobre el comportamiento de una línea celular en la detección de la inducción de aberraciones cromosómicas, ya que la situación de los conocimientos en este ámbito está evolucionando.

En el apéndice 1 se dan las definiciones utilizadas.

CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

Los ensayos realizados in vitro suelen exigir la utilización de una fuente exógena de activación metabólica, salvo que las células sean competentes metabólicamente respecto a los productos problema. El sistema exógeno de activación metabólica no reproduce completamente las condiciones in vivo. Deben evitarse las condiciones que puedan conducir a resultados positivos falsos, es decir, lesiones cromosómicas no causadas por la interacción directa entre los productos problema y los cromosomas; tales condiciones incluyen cambios en el pH o en la osmolalidad (8) (9) (10), la interacción con los componentes del medio (11) (12) o unos niveles excesivos de citotoxicidad (13) (14) (15) (16).

Este ensayo se emplea para detectar aberraciones cromosómicas que puedan producirse como consecuencia de sucesos clastogénicos. El análisis de la inducción de aberraciones cromosómicas debe efectuarse utilizando células en metafase. Por tanto, es esencial que las células estén en mitosis en los cultivos tanto tratados como sin tratar. En caso de nanomateriales fabricados, puede ser necesario recurrir a adaptaciones específicas del presente método de ensayo, pero estas no se describen aquí.

Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

Los cultivos celulares de origen humano o de otros mamíferos se exponen al producto problema tanto con fuente exógena de activación metabólica como sin ella, salvo que se utilicen células con una capacidad adecuada de metabolización (véase el punto 13). A intervalos predeterminados apropiados tras el inicio de la exposición de los cultivos celulares al producto problema, se tratan estos con un producto que detenga la división celular en la metafase (p. ej., colcemid o colchicina), se recolectan, se tiñen y se analizan al microscopio las células en metafase para evaluar la presencia de aberraciones cromatídicas y cromosómicas.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Preparación

Células

Pueden utilizarse cultivos de diversas líneas celulares (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células de pulmón de hámster chino V79, células de pulmón de hámster chino (CHL)/IU, TK6) o de células primarias, incluidos los linfocitos de sangre periférica de hombre o de otros mamíferos (7). La elección de las líneas celulares debe justificarse científicamente. Cuando se utilizan células primarias, por razones de bienestar animal, debe considerarse la utilización de células primarias de origen humano, cuando sea viable y se hayan tomado de conformidad con los principios éticos humanos y la reglamentación. Los linfocitos de sangre periférica humana deben obtenerse de individuos jóvenes (aproximadamente de 18 a 35 años de edad), no fumadores, sin enfermedades conocidas ni exposiciones recientes a agentes genotóxicos (por ejemplo, productos, radiaciones ionizantes) a niveles que puedan aumentar la incidencia de fondo de las aberraciones cromosómicas. Esto garantizaría una incidencia de fondo de las aberraciones cromosómicas baja y constante. La incidencia de base de las aberraciones cromosómicas aumenta con la edad y esta tendencia es más pronunciada en las mujeres que en los varones (17) (18). Si se combinan células procedentes de más de un donante, debe especificarse el número de donantes. Es necesario demostrar que las células se han dividido entre el inicio de la administración del producto problema y la recolección de las células. Los cultivos celulares se mantienen en fase exponencial de crecimiento celular (líneas celulares) o se estimulan para que se dividan (cultivos primarios de linfocitos), a fin de exponer las células en diferentes fases del ciclo celular, ya que es posible que no se conozca la sensibilidad de las distintas fases celulares a los productos problema. Las células primarias que es preciso estimular con agentes mitogénicos para que se dividan dejan generalmente de estar sincronizadas durante la exposición al producto problema (por ejemplo, los linfocitos humanos tras una estimulación mitogénica de 48 horas). La utilización de células sincronizada durante el tratamiento no es recomendable, pero puede aceptarse si está justificada.

Medios y condiciones de cultivo

Para el mantenimiento de los cultivos deben utilizarse medios de cultivo y condiciones de incubación adecuados (recipientes de cultivo, atmósfera humidificada con 5 % de CO2 en su caso, temperatura de incubación de 37 °C). Las líneas celulares deben examinarse sistemáticamente para comprobar la estabilidad del número modal de cromosomas y la ausencia de contaminación por Mycoplasma (7) (19), y no deben utilizarse las células que se contaminen o que presenten un cambio en el número modal de cromosomas. Debe determinarse la duración del ciclo celular normal de las líneas celulares o cultivos primarios utilizados en el laboratorio de ensayo, y ser coherente con las características celulares publicadas (20).

Preparación de los cultivos

Líneas celulares: las células se propagan a partir de cultivos madre, se siembran en el medio de cultivo a una densidad tal que las células en suspensión o en monocapas sigan creciendo exponencialmente hasta el momento de la recolección (por ejemplo, debe evitarse la confluencia de las células cultivadas en monocapas).

Linfocitos: se cultiva sangre completa tratada con anticoagulante (p. ej., heparina) o bien linfocitos separados (p.ej., durante 48 horas en el caso de los linfocitos humanos) en presencia de un mitógeno [p. ej., fitohemaglutinina (PHA) en el caso de los linfocitos humanos] a fin de inducir la división celular antes de la exposición al producto problema.

Activación metabólica

Se debe recurrir a sistemas exógenos de metabolización cuando se utilicen células con una capacidad metabólica endógena inadecuada. El sistema utilizado con más frecuencia que se recomienda por defecto, salvo en casos justificados, es una fracción postmitocondrial (S9) a la que se añaden cofactores y que se obtiene a partir del hígado de roedores (generalmente ratas) tratados con inductores enzimáticos como el aroclor 1254 (21) (22) (23) o una combinación de fenobarbital y β-naftoflavona (24) (25) (26) (27) (28) (29). Esta última combinación no infringe el Convenio de Estocolmo sobre contaminantes orgánicos persistentes (30), y se ha visto que es tan efectiva como el aroclor 1254 para inducir oxidasas de función mixta (24) (25) (26) (28). La fracción S9 se utiliza normalmente a concentraciones que varían entre el 1 y el 2 % (v/v), pero pueden aumentarse hasta el 10 % (v/v) en el medio de ensayo final. Debe evitarse durante el tratamiento el uso de productos que reduzcan el índice mitótico, especialmente productos que acomplejen el calcio (31). La elección del tipo y de la concentración del sistema exógeno de activación metabólica o del inductor metabólico utilizado puede estar influida por la clase de los productos que se someten a ensayo.

Preparación del producto problema

Los productos problema sólidos deben prepararse en disolventes adecuados y, si es conveniente, diluirse antes de tratar las células (véase el punto 23). Los productos problema líquidos pueden añadirse directamente al sistema de ensayo o diluirse antes del tratamiento del sistema de ensayo. Los productos problema gaseosos o volátiles deben someterse a ensayo aplicando modificaciones adecuadas a los protocolos normales, tales como el tratamiento en recipientes de cultivo sellados (32) (33) (34). La preparación del producto problema debe hacerse justo antes del tratamiento, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación.

Condiciones del ensayo

Disolventes

El disolvente debe elegirse para optimizar la solubilidad de los productos problema sin tener un impacto negativo en la realización del ensayo, por ejemplo por cambiar el crecimiento celular, afectar a la integridad del producto problema, reaccionar con los recipientes de cultivo, o interferir con el sistema de activación metabólica. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente (o medio de cultivo) acuoso. Son ejemplos de disolventes bien establecidos el agua o el dimetilsulfóxido. En general, los disolventes orgánicos no deben exceder del 1 % (v/v) y los disolventes acuosos (solución salina o agua) no deben superar el 10 % (v/v) en el medio de tratamiento final. Si se utilizan disolventes que no están bien establecidos (por ejemplo, etanol o acetona), debe disponerse de datos justificativos que indiquen su compatibilidad con el sistema de ensayo y los productos problema, y su ausencia de toxicidad genética a la concentración utilizada. En ausencia de estos datos justificativos, es importante incluir testigos sin tratar (véase el apéndice 1) para demostrar que el disolvente elegido no es nocivo ni tiene efectos clastogénicos.

Medición de la proliferación celular y de la citotoxicidad, y selección de las concentraciones de tratamiento

Al determinar la concentración máxima de producto problema, debe evitarse llegar a concentraciones que puedan producir respuestas positivas falsas, tales como las que provocan una citotoxicidad excesiva (véase el punto 22), precipitación en el medio de cultivo (véase el punto 23), o cambios marcados del pH o de la osmolalidad (véase el punto 5). Si el producto problema provoca un cambio marcado en el pH del medio en el momento de su adición, el pH puede ajustarse amortiguando el medio de tratamiento final para evitar resultados positivos falsos y mantener unas condiciones de cultivo adecuadas.

Se mide la proliferación celular para asegurarse de que las células tratadas han alcanzado la mitosis durante el ensayo en número suficiente y de que los tratamientos se efectúan a los niveles adecuados de citotoxicidad (véanse los puntos 18 y 22). La citotoxicidad se debe determinar con y sin activación metabólica en el experimento principal mediante un indicador adecuado de la muerte y el crecimiento de las células. Si bien la evaluación de la citotoxicidad en un ensayo inicial puede ser útil para definir mejor las concentraciones que deben utilizarse en el experimento principal, no es obligatorio efectuar un ensayo inicial. Si se lleva a cabo, no debe sustituir a la medición de la citotoxicidad en el experimento principal.

Para evaluar la citotoxicidad en los ensayos citogenéticos, puede recurrirse a la medición de la duplicación relativa de la población (DRP) o del aumento relativo del recuento celular (ARRC) (13) (15) (35) (36) (55) (véanse las fórmulas en el apéndice 2). En caso de tratamiento a largo plazo y de tiempos de recolección tras el inicio del tratamiento superiores a 1,5 veces la duración del ciclo celular normal (es decir, más de 3 ciclos celulares en total), la DRP puede subestimar la citotoxicidad (37). En tales circunstancias, puede ser preferible medir el ARRC, o puede ser útil evaluar la citotoxicidad tras un tiempo igual a 1,5 veces la duración del ciclo celular normal utilizando la DRP.

En el caso de los linfocitos en cultivos primarios, si bien el índice mitótico (IM) es una medida de los efectos citotóxicos o citostáticos, se ve influido por el tiempo al que se mide después del tratamiento, por el mitógeno empleado y por la posible alteración del ciclo celular. No obstante, el IM es aceptable porque es posible que otras mediciones de la citotoxicidad resulten engorrosas y poco prácticas y no puedan aplicarse a la población objetivo de linfocitos que crecen en respuesta a la estimulación con PHA.

Si bien el ARRC y la DRP en el caso de las líneas celulares y el IM en el de los cultivos primarios de linfocitos son los parámetros de citotoxicidad recomendados, el uso de otros indicadores (por ejemplo, integridad de las células, apoptosis, necrosis, ciclo celular) podría proporcionar información adicional útil.

Deben evaluarse al menos tres concentraciones de ensayo (sin incluir los testigos positivos y de disolvente) que cumplan los criterios de aceptabilidad (citotoxicidad apropiada, número de células, etc.). Cualquiera que sea el tipo de células (líneas celulares o cultivos primarios de linfocitos), pueden utilizarse a cada concentración de ensayo cultivos tratados replicados o sin replicar. Si bien se recomienda el uso de cultivos duplicados, también son aceptables los cultivos sin replicar, siempre que se examine el mismo número total de células, sea en cultivos duplicados o sin replicar. La utilización de cultivos sin replicar es especialmente pertinente cuando se evalúan más de 3 concentraciones (véase el punto 31). Los resultados obtenidos en los cultivos replicados independientes a una concentración determinada se pueden poner en común para el análisis de los datos (38). En el caso de productos problema que muestren escasa o nula citotoxicidad, normalmente serán adecuados los intervalos de concentración de aproximadamente el doble o el triple. Cuando se produce citotoxicidad, las concentraciones de ensayo seleccionadas deben cubrir una gama a partir de la que provoca citotoxicidad según se describe en el punto 22, con inclusión en particular de las concentraciones a las que existe citotoxicidad moderada y débil o nula. Muchos productos problema presentan curvas de respuesta a la concentración de elevada pendiente y, con el fin de obtener datos a niveles bajos y moderados de citotoxicidad o de estudiar en detalle la relación entre dosis y respuesta, entonces es necesario recurrir a concentraciones más próximas entre sí o a más de tres concentraciones (cultivos replicados o sin replicar), en particular en situaciones en que se requiere una repetición del experimento (véase el punto 47).

Si la concentración máxima se basa en la citotoxicidad, la concentración más elevada debe aspirar a provocar un 55 ± 5 % de citotoxicidad utilizando los parámetros recomendados de citotoxicidad (es decir, reducción del ARRC y de la DRP con líneas celulares y reducción del IM con cultivos primarios de linfocitos al 45 ± 5 % del testigo negativo en paralelo). Ha de tenerse cuidado al interpretar resultados positivos que solo se encuentren en el extremo superior de este intervalo de citotoxicidad del 55 ± 5 % (13).

Para los productos problema poco solubles que no son citotóxicos a concentraciones inferiores a la concentración mínima insoluble, la mayor concentración analizada debe producir turbidez o precipitado visibles a simple vista o con ayuda de un microscopio invertido al final del tratamiento con el producto problema. Incluso si se produce citotoxicidad por encima del límite de solubilidad, es aconsejable hacer el ensayo a una única concentración que produzca turbidez o precipitado visible porque este puede provocar efectos falsos. A la concentración que produce precipitado, se debe evitar que este interfiera con la realización del ensayo (por ejemplo, con la tinción o el examen celular). Puede ser útil determinar la solubilidad en el medio de cultivo antes de que efectuar el experimento.

Si no se observa precipitado ni citotoxicidad limitante, la concentración de ensayo más elevada debe corresponder a la más baja de las siguientes: 10 mM, 2 mg/ml o 2 μl/ml (39) (40) (41). Si el producto problema no tiene una composición definida y se trata, por ejemplo, de sustancias de composición desconocida o variable, productos complejos de reacción o materiales biológicos (UVCB) (42), extractos medioambientales, etc., es posible que la concentración superior tenga que ser mayor (por ejemplo, 5 mg/ml), en ausencia de citotoxicidad suficiente, para aumentar la concentración de cada uno de los componentes. Conviene señalar, no obstante, que estos requisitos pueden variar en caso de medicamentos de uso humano (43).

Testigos

Se incluirán, para cada período de recolección, testigos negativos en paralelo (véase el punto 15), consistentes en el disolvente solo en el medio de tratamiento y sometidos al mismo proceso que los cultivos del ensayo.

Es necesario disponer testigos positivos en paralelo a fin de demostrar la capacidad del laboratorio para detectar clastógenos en las condiciones establecidas en el protocolo de ensayo utilizado y la efectividad del sistema exógeno de activación metabólica, si procede. En el cuadro 1 a continuación se encuentran ejemplos de testigos positivos. Es posible utilizar como testigos positivos otros productos, si se justifica. Dado que los ensayos de toxicidad genética con células de mamífero in vitro están suficientemente normalizados, el uso de testigos positivos puede limitarse a un clastógeno que requiera activación metabólica. Siempre que se utilice de forma paralela al ensayo sin activación con la misma duración del tratamiento, la respuesta de este único testigo positivo demostrará tanto la actividad del sistema de activación metabólica como la capacidad de respuesta del sistema de ensayo. No obstante, los tratamiento a largo plazo (sin fracción S9) deben tener su propio testigo positivo, ya que la duración del tratamiento será diferente de la del ensayo con activación metabólica. Cada testigo positivo debe utilizarse a una o varias concentraciones de las que quepa esperar que produzcan incrementos reproducibles y detectables respecto a los valores de fondo para demostrar la sensibilidad del sistema de ensayo (es decir, que los efectos sean claros, pero sin revelar inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados), y la respuesta no debe verse comprometida por una citotoxicidad que exceda de los límites especificados en el método de ensayo.

Cuadro 1.

Productos de referencia recomendados para evaluar la competencia del laboratorio, y para la selección de los testigos positivos.

PROCEDIMIENTO

Tratamiento con el producto problema

Se tratan células en crecimiento con el producto problema en presencia y en ausencia de un sistema de activación metabólica.

Momento de recolección del cultivo

Para una evaluación a fondo, que sería necesaria para deducir un resultado negativo, deben aplicarse las tres condiciones experimentales siguientes, utilizando un tratamiento a corto plazo con y sin activación metabólica y un tratamiento a largo plazo sin activación metabólica (véanse los puntos 43, 44 y 45):

En caso de que alguna de las anteriores condiciones experimentales conduzca a una respuesta positiva, puede no ser necesario investigar los otros regímenes de tratamiento.

Preparación de los cromosomas

Se tratan los cultivos celulares con colcemid o colchicina, por lo general durante un período de 1 a 3 horas antes de la recolección. Los cultivos celulares se recolectan y procesan por separado para preparar los cromosomas. Esta preparación incluye el tratamiento hipotónico de las células, y su fijación y tinción. En las monocapas, es posible que haya células mitóticas (identificables por su forma redondeada y por despegarse de la superficie) al final del tratamiento de 3-6 horas. Como estas células mitóticas se despegan con facilidad, pueden perderse cuando se retira el medio que contiene el producto problema. Si hay pruebas de un aumento sustancial del número de células mitóticas en comparación con los testigos, lo que indica una probable detención mitótica, las células deben recogerse por centrifugación y volver a añadirse a los cultivos, para evitar la pérdida de células que estén en mitosis, y que podrían presentar aberraciones cromosómicas, en el momento de la recolección.

Análisis

Todos los portaobjetos, incluidos los de los testigos positivos y negativos, deben codificarse de forma independiente antes de su análisis microscópico para detectar aberraciones cromosómicas. Dado que los métodos de fijación provocan con frecuencia que una parte de las células en metafase pierdan cromosomas, las células examinadas deben contener un número de centrómeros igual al número modal ± 2.

Deben examinarse al menos 300 metafases bien extendidas de cada concentración y testigo para concluir que un producto problema es claramente negativo (véase el punto 45). Las 300 células deben repartirse a partes iguales entre las réplicas, cuando se utilizan cultivos replicados. Cuando se utiliza un solo cultivo sin replicar por concentración (véase el punto 21), deben examinarse al menos 300 metafases bien extendidas en este cultivo único. El examen de 300 células tiene la ventaja de aumentar la potencia estadística del ensayo y, además, será poco probable que se observen valores nulos (se espera que sean solo el 5 %) (44). El número de metafases examinadas puede reducirse cuando se observe un elevado número de células con aberraciones cromosómicas y el producto problema se considere claramente positivo.

Deben examinarse células con aberraciones cromosómicas estructurales, contando tanto con las separaciones (gaps) como sin ellas. Las roturas y separaciones se definen en el apéndice 1 de conformidad con (45) (46). Las aberraciones cromosómicas y las cromatídicas deben registrarse por separado y clasificarse en subtipos (roturas, intercambios). Los procedimientos seguidos en el laboratorio deben garantizar que el análisis de las aberraciones cromosómicas es realizado por examinadores bien formados y es objeto de una revisión por pares, si procede.

Pese a que el objeto del ensayo consiste en detectar aberraciones cromosómicas estructurales, es importante registrar las frecuencias de la poliploidía y de la endorreduplicación cuando se dan estos fenómenos (véase el punto 2).

Competencia del laboratorio

Con el fin de conseguir la suficiente experiencia con el ensayo antes de utilizarlo en ensayos sistemáticos, el laboratorio debe haber efectuado una serie de experimentos con productos positivos de referencia que actúen a través de diferentes mecanismos y con diversos testigos negativos (con diversos disolventes o vehículos). Las respuestas obtenidas con estos testigos positivos y negativos deben ser coherentes con la bibliografía. Esto no es aplicable a los laboratorios que tienen experiencia, esto es, que disponen de una base de datos históricos, según se define en el punto 37.

Debe investigarse una selección de productos testigo positivos (véase el cuadro 1 en el punto 26) con tratamientos cortos y largos en ausencia de activación metabólica, y también con tratamientos cortos en presencia de activación metabólica, para demostrar su capacidad de detectar productos clastogénicos y determinar la efectividad del sistema de activación metabólica. Debe elegirse una gama de concentraciones de los productos seleccionados de forma que produzcan aumentos sobre el nivel de fondo relacionados con la concentración y reproducibles para demostrar la sensibilidad y el intervalo dinámico del sistema de ensayo.

Datos sobre testigos históricos

El laboratorio debe determinar:

Cuando se obtengan datos por primera vez en relación con la distribución de testigos negativos históricos, los testigos negativos en paralelo deben ser coherentes con los datos publicados de los testigos, si existen. Según se añadan más datos experimentales sobre la distribución de los testigos, los testigos negativos en paralelo deben situarse idealmente dentro de los límites de control del 95 % de dicha distribución (44) (47). La base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio debe constituirse en un principio con un mínimo de 10 experimentos, pero preferiblemente con al menos 20 experimentos realizados en condiciones experimentales comparables. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control [por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (48)], con el fin de determinar la variabilidad de sus datos sobre los testigos positivos y negativos, y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio (44). En la bibliografía pueden encontrarse más recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (47).

Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de su coherencia con las bases de datos de testigos históricos existentes del laboratorio. Cualquier incoherencia importante debería dar lugar a la creación de una nueva base de datos de testigos históricos.

Los datos sobre los testigos negativos deben consistir en la incidencia de células con aberraciones cromosómicas procedentes de un solo cultivo o de la suma de cultivos replicados como se describe en el punto 21. Lo ideal sería que los testigos negativos en paralelo estuvieran dentro de los límites de control del 95 % de la distribución de la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio (44) (47). Cuando hay datos de los testigos negativos en paralelo que quedan fuera de los límites de control del 95 %, su inclusión en la distribución de testigos históricos puede ser aceptable en la medida en que dichos datos no sean valores extremos y haya pruebas de que el sistema de ensayo está «controlado» (véase el punto 37) y pruebas de la ausencia de fallos técnicos o humanos.

DATOS E INFORME

Presentación de los resultados

Debe evaluarse el porcentaje de células que presentan aberraciones cromosómicas estructurales. Las aberraciones cromosómicas y cromatídicas, clasificadas por subtipos (roturas, intercambios), deben enumerarse por separado con su número y frecuencia en relación con los cultivos experimentales y testigos. Las separaciones se registran y se recogen en el informe aparte, pero por lo general no se incluyen en la frecuencia total de aberraciones. Se recoge en el informe el porcentaje de poliploidía o de células endorreduplicadas, cuando se observan.

Asimismo, deben registrarse las determinaciones de citotoxicidad realizadas en paralelo en todos los cultivos tratados y en los testigos positivos y negativos de los experimentos principales sobre aberraciones.

Deben proporcionarse datos de cada cultivo. Además, se resumirán todos los datos en forma de cuadro.

Criterios de aceptabilidad

La aceptabilidad de un ensayo se basa en los criterios siguientes:

Evaluación e interpretación de los resultados

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si, en alguna de las condiciones experimentales examinadas (véase el punto 28):

Cuando se cumplen todos estos criterios, el producto problema se considera capaz de inducir aberraciones cromosómicas en las células de mamífero cultivadas en este sistema de ensayo. En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (49) (50) (51).

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si, en todas las condiciones experimentales examinadas (véase el punto 28):

el producto problema se considera entonces incapaz de inducir aberraciones cromosómicas en las células de mamífero cultivadas en este sistema de ensayo.

No se requiere ninguna verificación de una respuesta claramente positiva o negativa.

En caso de que la respuesta no sea ni claramente positiva ni claramente negativa como se describe más arriba, o a fin de ayudar a determinar la relevancia biológica de un resultado, los datos deben ser evaluados por expertos o mediante más investigaciones. Puede ser útil examinar células adicionales (en su caso) o realizar una repetición del experimento modificando las condiciones experimentales, como, por ejemplo, la separación entre concentraciones u otras condiciones de activación metabólica (es decir, concentración u origen de la fracción S9).

En casos raros, incluso después de hacer más investigaciones, el conjunto de datos puede no permitir que se extraiga una conclusión de resultado positivo o negativo, por lo que la respuesta del producto problema se considerará dudosa.

El aumento del número de células poliploides puede indicar que los productos problema son capaces de inhibir procesos mitóticos y de producir aberraciones cromosómicas numéricas (52). El aumento del número de células con cromosomas endorreduplicados puede indicar que los productos problema tienen la capacidad de inhibir el progreso del ciclo celular (53) (54) (véase el punto 2). Por consiguiente, deben consignarse por separado la incidencia de células poliploides y la de células con cromosomas endorreduplicados.

Informe del ensayo

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

BIBLIOGRAFÍA

4)

En la parte B, el capítulo B.11 se sustituye por el texto siguiente:

«B.11.   Ensayo de aberraciones cromosómicas en médula ósea de mamífero

INTRODUCCIÓN

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 475 (2016). Forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. Se ha elaborado un documento de la OCDE que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a dichas directrices de ensayo (1).

El ensayo de aberraciones cromosómicas en médula ósea de mamíferos in vivo es especialmente relevante para la genotoxicidad porque, aunque pueden variar según la especie, los factores de los procesos del metabolismo in vivo, de la farmacocinética y de la reparación del ADN están activos y contribuyen a las respuestas. Los ensayos in vivo también resultan útiles para ahondar en el estudio de la genotoxicidad detectada en un sistema in vitro.

El ensayo de aberraciones cromosómicas en mamíferos in vivo se realiza para detectar aberraciones cromosómicas estructurales inducidas por los productos problema en células de médula ósea de animales, por lo general roedores (2) (3) (4) (5). Las aberraciones cromosómicas estructurales pueden ser de tipo cromosoma o de tipo cromátida. Si bien la mayoría de las aberraciones provocadas por productos genotóxicos son de tipo cromátida, también pueden producirse aberraciones de tipo cromosoma. Las lesiones cromosómicas y los efectos relacionados ocasionan numerosas enfermedades genéticas humanas y hay pruebas de peso de que, cuando estas lesiones y efectos relacionados provocan alteraciones en los oncogenes y en los genes supresores de tumores, tienen relación con el cáncer en los seres humanos y en sistemas experimentales. Puede surgir poliploidía (incluida la endorreduplicación) en los ensayos de aberraciones cromosómicas in vivo. No obstante, un aumento en la poliploidía no indica por sí solo que haya potencial aneugénico y puede indicar simplemente perturbación del ciclo celular o citotoxicidad. Este ensayo no está diseñado para medir la aneuploidía. Para la detección de la aneuploidía se recomiendan como ensayos in vivo e in vitro, respectivamente, el ensayo de micronúcleos en eritrocitos de mamífero in vivo (capítulo B.12 del presente anexo) o el ensayo de micronúcleos en células de mamífero in vitro (método B.49 del presente anexo).

En el apéndice 1 se dan las definiciones de la terminología utilizada.

CONSIDERACIONES INICIALES

En este ensayo se utilizan habitualmente roedores, pero en algunos casos pueden ser adecuadas otras especies, si está justificado científicamente. El tejido diana es la médula ósea por estar muy vascularizada y por contener una población de células de ciclo corto que pueden aislarse y tratarse con facilidad. La justificación científica para la utilización de especies distintas de las ratas y los ratones debe facilitarse en el informe. Si se utilizan especies que no sean de roedores, se recomienda que la medición de aberraciones cromosómicas en la médula ósea se integre en otro ensayo adecuado de toxicidad.

Si hay pruebas de que el producto o productos problema, o alguno o algunos de sus metabolitos, no llegan al tejido diana, puede no proceder la realización del presente ensayo.

Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla.

PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO

Se exponen los animales al producto problema por una vía adecuada y se sacrifican de forma compasiva, en un momento adecuado después del tratamiento. Antes de sacrificarlos, se tratan con un agente que detenga la división celular en la metafase (por ejemplo, colchicina o colcemid). A continuación, se realizan preparaciones de cromosomas de células de la médula ósea y se tiñen, tras lo cual se analizan las células en metafase para detectar aberraciones cromosómicas.

VERIFICACIÓN DE LA COMPETENCIA DEL LABORATORIO

Investigaciones de competencia

A fin de establecer que posee la suficiente experiencia con la realización del ensayo antes de utilizarlo para hacer ensayos sistemáticos, el laboratorio debe haber demostrado su capacidad de reproducir los resultados previstos a partir de los datos publicados (por ejemplo, (6)) en cuanto a frecuencias de las aberraciones cromosómicas con un mínimo de dos productos como testigo positivo (incluidas las respuestas débiles inducidas por dosis bajas de los testigos positivos), como las que figuran en el cuadro 1 y con testigos de disolvente/vehículo compatibles (véase el punto 22). Estos experimentos deben utilizar dosis que den aumentos relacionados con la dosis y reproducibles, y demostrar la sensibilidad y el intervalo dinámico del sistema de ensayo en el tejido de interés (médula ósea), empleando el método de examen utilizado en el laboratorio. Este requisito no es aplicable a los laboratorios que tienen experiencia, esto es, que disponen de una base de datos históricos, según se define en los puntos 10-14.

Datos sobre testigos históricos

En el transcurso de las investigaciones de competencia, el laboratorio debe demostrar:

Cuando se obtengan datos por primera vez en relación con la distribución de testigos negativos históricos, los testigos negativos en paralelo deben ser coherentes con los datos publicados de los testigos, si existen. Según se añadan más datos experimentales sobre la distribución de los testigos históricos, los testigos negativos en paralelo deben situarse idealmente dentro de los límites de control del 95 % de dicha distribución. La base de datos históricos del laboratorio de testigos negativos debe ser estadísticamente sólida para garantizar la capacidad del laboratorio de evaluar la distribución de sus datos sobre los testigos negativos. La bibliografía sugiere que puede ser necesario un mínimo de 10 experimentos, pero que sería preferible contar con al menos 20 experimentos realizados en condiciones experimentales comparables. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control (por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (7)), con el fin de determinar la variabilidad de sus datos y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio. En la bibliografía pueden encontrarse más recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (8).

Si el laboratorio no completa un número suficiente de experimentos para establecer una distribución de los testigos negativos estadísticamente sólida (véase el punto 11) durante las investigaciones de competencia (descritas en el punto 9), es admisible que la distribución se establezca durante los primeros exámenes sistemáticos. Este enfoque debe seguir las recomendaciones recogidas en la bibliografía (8) y los resultados de los testigos negativos obtenidos en estos experimentos deben seguir siendo coherentes con los datos publicados de los testigos negativos.

Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de su impacto en el mantenimiento de la coherencia entre los datos resultantes y la base de datos históricos de testigos existente del laboratorio. Solo si hubiera incoherencias importantes se justificaría el establecimiento de una nueva base de datos históricos de testigos, en caso de que la evaluación por expertos determine que es diferente de la distribución anterior (véase el punto 11). Durante el nuevo establecimiento, puede que no sea necesaria una base de datos completa sobre testigos negativos para poder realizar una prueba real, siempre que el laboratorio pueda demostrar que sus valores de los testigos negativos en paralelo siguen estando en consonancia con su anterior base de datos o con los correspondientes datos publicados.

Los datos sobre testigos negativos deben consistir en la incidencia de aberraciones cromosómicas estructurales, excluidas las separaciones (gaps), en cada animal. Lo ideal sería que los testigos negativos en paralelo estuvieran dentro de los límites de control del 95 % de la distribución de la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio. Cuando haya datos de los testigos negativos en paralelo que queden fuera de los límites de control del 95 %, su inclusión en la distribución de testigos históricos puede ser aceptable en la medida en que dichos datos no sean valores discrepantes extremos y haya pruebas de que el sistema de ensayo está «controlado» (véase el punto 11) y no haya pruebas de fallos técnicos o humanos.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Preparación

Selección de la especie animal

Deben usarse animales adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. Si bien suelen emplearse ratas, también puede ser adecuado el uso de ratones. Puede utilizarse cualquier otra especie apropiada de mamíferos, si se facilita la justificación científica en el informe.

Condiciones de alojamiento y alimentación de los animales

Con roedores, la temperatura en el animalario debe ser de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser idealmente del 50 al 60 %, debe ser como mínimo del 40 % y preferentemente no superar el 70 %, salvo durante la limpieza del local. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se pueden utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La elección de la dieta puede verse influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente del producto problema si se administra por esta vía. Los roedores deben alojarse en grupos pequeños (no más de cinco animales por jaula) del mismo sexo y grupo de tratamiento si no se espera conducta agresiva, preferentemente en jaulas de suelo continuo con un enriquecimiento ambiental adecuado. Los animales podrán alojarse por separado solo si está justificado científicamente.

Preparación de los animales

Se utilizan normalmente animales adultos jóvenes y sanos (en el caso de los roedores, idealmente de 6-10 semanas de edad al inicio del tratamiento, aunque también pueden aceptarse animales ligeramente más viejos), y se reparten al azar entre los lotes tratados y los testigos. Los animales se identifican individualmente utilizando un método compasivo y mínimamente invasivo (por ejemplo, mediante anillamiento, marcado, implantación de un microchip o identificación biométrica, pero no grapado a las orejas o los dedos), y se deja que se acostumbren a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días. Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Debe evitarse la contaminación cruzada por el testigo positivo y el producto problema. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder del ± 20 % del peso medio de cada sexo.

Preparación de las dosis

Los productos problema sólidos deben disolverse o suspenderse en disolventes o vehículos adecuados, o mezclarse con los alimentos o con el agua de bebida, antes de su administración a los animales. Los productos problema líquidos pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administración. En lo que respecta a la exposición por inhalación, los productos problema pueden administrarse en forma de gas, de vapor o de aerosol sólido o líquido, dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas. Deben utilizarse preparaciones recientes del producto problema, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación y definan las condiciones adecuadas de esta.

Disolvente o vehículo

El disolvente o vehículo no debe producir efectos tóxicos a las dosis empleadas, y no debe sospecharse que pueda reaccionar químicamente con el producto problema. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información de referencia que avale su compatibilidad. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso. Pueden citarse como ejemplos de disolventes o vehículos compatibles comúnmente utilizados el agua, el suero fisiológico, la solución de metilcelulosa, la solución de sal sódica de carboximetilcelulosa, el aceite de oliva y el aceite de maíz. A falta de información histórica o publicada sobre testigos que demuestre que un disolvente o vehículo elegido atípico no induce ninguna aberración estructural ni otro tipo de efectos nocivos, debe realizarse un estudio inicial a fin de establecer la aceptabilidad del testigo de disolvente/vehículo.

Testigos

Testigos positivos

En principio debe incluirse en cada ensayo un grupo de animales tratados con un producto testigo positivo. Esto puede no aplicarse cuando el laboratorio de ensayo ha demostrado su competencia en la realización del ensayo y ha establecido un intervalo histórico de testigos positivos. Si no se incluye un grupo testigo positivo en paralelo, debe contarse en cada experimento con testigos de examen (portaobjetos fijados y sin teñir). Esto puede conseguirse incluyendo en el examen del estudio muestras de referencias adecuadas que se hayan obtenido y conservado a partir de un experimento con testigo positivo aparte realizado periódicamente (por ejemplo, cada 6 o 18 meses) en el laboratorio donde se realiza el ensayo; por ejemplo, durante las pruebas de competencia y, a continuación, con carácter periódico, en caso necesario.

Los productos utilizados como testigo positivo deben provocar con fiabilidad un aumento detectable en la frecuencia de células con aberraciones cromosómicas estructurales respecto al nivel espontáneo. Las dosis del testigo positivo deben elegirse de tal forma que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al examinador la identidad de las muestras codificadas. El producto empleado como testigo positivo podrá administrarse por una vía distinta de la del producto problema, con otro programa de tratamiento, y el muestreo podrá efectuarse solo en un único momento. Además, podrá considerarse la utilización como testigo positivo de productos de clases químicas afines, cuando sea posible. En el cuadro 1 se incluyen ejemplos de productos válidos como testigo positivo.

Cuadro 1.

Ejemplos de productos válidos como testigo positivo

Testigos negativos

Deben incluirse animales de un grupo testigo negativo en cada tiempo de muestreo y someterse al mismo proceso que los grupos de tratamiento, salvo que no reciben el tratamiento con el producto problema. Si se utiliza un disolvente o vehículo para la administración del producto problema, el grupo testigo recibirá este disolvente o vehículo. No obstante, si mediante los datos históricos de testigos negativos se demuestra que la variabilidad entre animales y la frecuencia de las células con aberraciones estructurales son coherentes en cada momento de muestreo para el laboratorio de ensayo, puede que solo sea necesario un único muestreo del testigo negativo. En los casos en que se realice un único muestreo de los testigos negativos, debe corresponder al primer momento de muestreo utilizado en el estudio.

PROCEDIMIENTO

Número y sexo de los animales

En general, la respuesta de micronúcleos es similar entre animales machos y hembras (9) y se espera que esto sea así también respecto a las aberraciones cromosómicas estructurales; por lo tanto, la mayor parte de los estudios podría realizarse con cualquier sexo. Unos datos que demuestren la existencia de diferencias pertinentes entre machos y hembras (como diferencias de toxicidad sistémica, metabolismo, biodisponibilidad, toxicidad para la médula ósea, etc., con inclusión por ejemplo de un estudio de determinación del intervalo) favorecerían la utilización de ambos sexos. En este caso puede ser conveniente realizar un estudio con ambos sexos, por ejemplo como parte de un estudio de toxicidad por administración continuada. Podría ser adecuado utilizar el diseño factorial en caso de que se utilizaran animales de ambos sexos. En el apéndice 2 se recogen detalles sobre cómo analizar los datos utilizando dicho diseño.

El tamaño de los grupos al principio del estudio debe establecerse de manera que comprendan un mínimo de 5 animales analizables de un mismo sexo, o de cada sexo si se utilizan ambos, por grupo. En caso de que la exposición humana a los productos pueda ser específica de un sexo, como sucede con algunos productos farmacéuticos, el ensayo debe realizarse con animales del sexo correspondiente. Como orientación sobre las necesidades máximas típicas de animales, un estudio de la médula ósea con dos momentos de muestreo con tres grupos tratados y un grupo testigo negativo en paralelo, más un grupo testigo positivo (cada grupo compuesto por cinco animales de un solo sexo), requeriría 45 animales.

Dosis

Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación del intervalo porque no se dispone aún de datos adecuados para ayudar en la selección de las dosis, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y protocolo de tratamiento que se vayan a utilizar en el estudio principal (10). El estudio debe tratar de determinar la dosis máxima tolerada (DMT), es decir, la dosis más alta que se tolera sin signos de toxicidad que limite el estudio, en relación con la duración del período de estudio (por ejemplo, reducción del peso corporal o citotoxicidad para el sistema hematopoyético) pero sin llegar a la muerte ni presentar signos de dolor, sufrimiento o angustia que requieran el sacrificio compasivo (11).

La dosis más alta también puede definirse como la dosis que produce algún signo de toxicidad para la médula ósea.

Los productos que presentan saturación de las propiedades toxicocinéticas, o inducen procesos de destoxificación que puedan dar lugar a una disminución de la exposición después de un tratamiento a largo plazo pueden constituir excepciones en cuanto a los criterios de establecimiento de la dosis y han de evaluarse caso por caso.

A fin de obtener información sobre la relación dosis-respuesta, los estudios completos deben incluir un grupo testigo negativo y un mínimo de tres dosis separadas por un factor que será en general de 2 y nunca superior a 4. Si el producto problema no produce toxicidad en un estudio de determinación del intervalo o según los datos disponibles, la dosis más alta para una administración única debe ser de 2 000 mg/kg de peso corporal. No obstante, si el producto problema provoca toxicidad, la DMT debe ser la mayor dosis administrada y las dosis deben abarcar preferentemente el intervalo desde la dosis máxima hasta una dosis que provoque toxicidad escasa o nula. Si se observa toxicidad para el tejido diana (médula ósea) a todas las dosis utilizadas en el ensayo, se recomienda hacer otro estudio a dosis no tóxicas. Unos estudios destinados a caracterizar de forma más completa la relación cuantitativa dosis-respuesta pueden necesitar más grupos de dosis. Estos límites pueden variar con determinados tipos de productos problema (por ejemplo, productos farmacéuticos de uso humano) a los que se apliquen requisitos específicos.

Ensayo límite

Si los experimentos de determinación del intervalo, o los datos disponibles sobre cepas animales afines, indican que un régimen de tratamiento de, como mínimo, la dosis límite (véase más adelante) no produce efectos tóxicos observables (entre los que se incluirían la depresión de la proliferación de la médula ósea u otros signos de citotoxicidad para el tejido diana) y si, basándose en estudios de genotoxicidad in vitro o en datos de productos estructuralmente afines, no cabe esperar genotoxicidad, entonces puede no considerarse necesario realizar un estudio completo con tres dosis, siempre que se haya demostrado que el producto o productos problema alcanzan el tejido diana (médula ósea). En tales casos, podrá ser suficiente una sola dosis, al nivel de la dosis límite. Para un período de administración superior a 14 días, la dosis límite será de 1 000 mg/kg de peso corporal/día. Para un período de administración inferior o igual a 14 días, la dosis límite será de 2 000 mg/kg de peso corporal/día.

Administración de las dosis

A la hora de diseñar el ensayo, debe tenerse en cuenta la vía prevista de exposición humana. Por lo tanto, cuando esté justificado, podrán elegirse vías de exposición como los alimentos, el agua de bebida, la tópica, la subcutánea, la intravenosa, la oral forzada (por sonda), la inhalación, la intratraqueal o la implantación. En cualquier caso, la vía debe elegirse de forma que se garantice una exposición adecuada del tejido o tejidos diana. En general no se recomienda la inyección intraperitoneal, ya que no es una vía de exposición humana prevista, y debe utilizarse solo en casos que tengan justificación científica específica. Si el producto problema se mezcla con los alimentos o el agua de bebida, en particular en caso de administración única, debe procurarse que el plazo entre el consumo de los alimentos o el agua y el muestreo sea suficiente para permitir la detección de los efectos (véanse los puntos 33-34). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez por sonda o por inyección depende del tamaño del animal utilizado. Dicho volumen no debe en principio superar 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a un máximo de 2 ml/100 g. El uso de volúmenes superiores deberá justificarse. Excepto en el caso de productos problema irritantes o corrosivos, que por lo general producen efectos exacerbados a concentraciones superiores, la variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para conseguir la administración de un volumen constante en relación con el peso corporal a todas las dosis.

Pauta de tratamiento

Los productos problema se administran normalmente de una vez, pero también puede dividirse la dosis (es decir, realizar dos o más tratamientos el mismo día separados por no más de 2 o 3 horas) con el fin de facilitar la administración de grandes volúmenes. En estas circunstancias, o cuando se administra el producto problema por inhalación, el tiempo de muestreo debe programarse basándose en el momento de la última administración o el final de la exposición.

Se dispone de pocos datos sobre la idoneidad de un protocolo de administración continuada para este ensayo. Sin embargo, en circunstancias en las que sea deseable integrar este ensayo con un ensayo de toxicidad por administración continuada, deberá tenerse cuidado para evitar la pérdida de células mitóticas con lesiones cromosómicas, lo que puede suceder a dosis tóxicas. Esta integración es aceptable siempre y cuando la dosis más alta sea superior o igual a la dosis límite (véase el punto 29) y se le administre a un grupo la dosis límite mientras dure el período de tratamiento. El ensayo de micronúcleos (método B.12) debe considerarse el ensayo in vivo de elección para detectar las aberraciones cromosómicas cuando se desee la integración con otros estudios.

Deben tomarse muestras de médula ósea en dos momentos distintos tras el tratamiento único. En el caso de los roedores, el primer intervalo de muestreo debe ser el tiempo equivalente a 1,5 veces la duración del ciclo celular normal (suele ser de 12 a 18 horas después del período de tratamiento). Dado que el tiempo necesario para que el producto o productos problema se absorban y se metabolicen, así como su efecto sobre la cinética del ciclo celular, pueden modificar el momento óptimo para detectar aberraciones cromosómicas, se recomienda tomar otra muestra 24 horas después de la primera. En el primer momento de muestreo, se tratan todos los grupos de dosis y se toman muestras de todos ellos para su análisis; no obstante, en los momentos de muestreo posteriores, solo es necesario administrar la dosis más alta. Si se siguen pautas de tratamiento de más de un día con justificación científica, debe hacerse un solo muestreo en general a un máximo de aproximadamente 1,5 veces la duración del ciclo celular normal desde el último tratamiento.

Tras el tratamiento y antes de la recogida de la muestra, se les inyecta a los animales por vía intraperitoneal una dosis adecuada de un agente que detenga la división celular en la metafase (por ejemplo, colcemid o colchicina), y las muestras se toman a un intervalo adecuado a partir de ese momento. En el caso de los ratones, este intervalo hasta el muestreo es aproximadamente de 3-5 horas y en el de las ratas es de 2-5 horas. Se toman las células de la médula ósea, se hinchan, fijan y tiñen, y se analizan en busca de aberraciones cromosómicas (12).

Observaciones

Deben hacerse observaciones clínicas generales de los animales de ensayo y registrarse los signos clínicos al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora u horas cada día y teniendo en cuenta el período de mayor intensidad de los efectos previstos tras la administración. Al menos dos veces al día durante el periodo de administración, se debe observar la posible morbilidad y mortalidad de todos los animales. Deben pesarse todos los animales al principio del estudio, al menos una vez por semana durante los estudios de administración continuada, y en el momento del sacrificio. En los estudios de al menos una semana de duración, el consumo de alimentos debe medirse al menos semanalmente. Si el producto problema se administra con el agua de bebida, debe medirse el consumo de agua cada vez que se cambie el agua y al menos una vez por semana. Los animales que presenten signos de toxicidad excesiva pero no letal deben sacrificarse de forma compasiva antes de que termine el período del ensayo (11).

Exposición del tejido diana

Debe tomarse una muestra de sangre en el momento o momentos adecuados para permitir la investigación de los niveles plasmáticos de los productos problema, a fin de demostrar que ha habido exposición de la médula ósea, cuando esté justificado y cuando no se disponga de otros datos de exposición (véase el punto 44).

Preparación de la médula ósea y de los cromosomas

Inmediatamente después del sacrificio compasivo, se extraen células de la médula ósea del fémur o la tibia de los animales, se exponen a una solución hipotónica y se fijan. A continuación, las células en metafase se extienden en portaobjetos y se tiñen según métodos establecidos ((3) (12)).

Análisis

Todos los portaobjetos, incluidos los de los testigos positivos y negativos, deben codificarse independientemente antes del análisis y deben aleatorizarse de forma que el examinador no tenga conocimiento de cómo se han tratado.

Se evalúa la citotoxicidad determinando el índice mitótico en un mínimo de 1 000 células por animal, en todos los animales tratados (incluidos los testigos positivos) y en los animales usados como testigos negativos sin tratar o solo con disolvente/vehículo.

Deben analizarse al menos 200 metafases en cada animal para detectar aberraciones cromosómicas estructurales, contando tanto con las separaciones (gaps) como sin ellas. No obstante, en caso de que la base de datos históricos de testigos negativos indique que la frecuencia media de aberraciones cromosómicas estructurales de fondo es < 1 % en el laboratorio de ensayo, debe considerarse el examen de células adicionales. Las aberraciones de tipo cromosoma y las de tipo cromátida deben registrarse por separado y clasificarse en subtipos (roturas, intercambios). Los procedimientos seguidos en el laboratorio deben garantizar que el análisis de las aberraciones cromosómicas es realizado por examinadores bien formados y es objeto de una revisión por pares, si procede. Reconociendo que los métodos de preparación de los portaobjetos provocan con frecuencia la rotura de células en metafase y la consiguiente pérdida de cromosomas, las células examinadas deben, por tanto, contener un número de centrómeros no inferior a 2n ± 2, donde n es el número de cromosomas haploides de la especie.

DATOS E INFORME

Tratamiento de los resultados

Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de cuadro. Deben evaluarse respecto a cada animal el índice mitótico, el número de células en metafase examinadas, el número de aberraciones por célula en metafase y el porcentaje de células con aberraciones cromosómicas estructurales. Se debe hacer una relación de los distintos tipos de dichas aberraciones, con su número y frecuencia, respecto a los grupos tratados y los testigos. Las separaciones, así como las células poliploides y las células con cromosomas endorreduplicados, se registran por separado. La frecuencia de las separaciones se recoge en el informe, pero por lo general no se incluye en el análisis de la frecuencia total de aberraciones estructurales. Si no se observan diferencias en la respuesta de un sexo y otro, los datos pueden combinarse para el análisis estadístico. Deben también consignarse los datos sobre toxicidad y signos clínicos de los animales.

Criterios de aceptabilidad

Los siguientes criterios determinan la aceptabilidad del ensayo:

Evaluación e interpretación de los resultados

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si:

Si se examina únicamente la dosis más alta en un momento particular de muestreo, el producto problema se considera claramente positivo si se ve un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo y los resultados están fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson). En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (13). Al realizar un análisis de la relación dosis-respuesta, deben someterse al mismo por lo menos tres grupos tratados con el producto problema. Las pruebas estadísticas deben utilizar como unidad experimental el animal. Un resultado positivo en el ensayo de aberraciones cromosómicas indica que el producto problema provoca aberraciones cromosómicas estructurales en la médula ósea de la especie estudiada.

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si, en todas las condiciones experimentales examinadas:

En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (13). Como pruebas de exposición de la médula ósea a un producto problema pueden citarse la reducción del índice mitótico o la medición de los niveles hemáticos o plasmáticos del producto o productos problema. En caso de administración por vía intravenosa, no hacen falta pruebas de la exposición. Alternativamente, para demostrar la exposición de la médula ósea es posible utilizar los datos de ADME obtenidos en un estudio independiente utilizando la misma vía y la misma especie. Un resultado negativo indica que, en las condiciones del ensayo, el producto problema no provoca aberraciones cromosómicas estructurales en la médula ósea de la especie estudiada.

No se requiere ninguna verificación de una respuesta positiva clara o negativa clara.

En los casos en que la respuesta no sea claramente negativa ni positiva y con el fin de ayudar a determinar la importancia biológica de un resultado (por ejemplo, un incremento límite o débil), los datos deben ser evaluados por expertos o hay que completar otras investigaciones de los experimentos existentes. En algunos casos, puede ser de utilidad el análisis de más células o la repetición de un experimento en condiciones experimentales modificadas.

En casos excepcionales, incluso después de otras investigaciones, los datos no permiten concluir si el producto problema produce resultados positivos o negativos, y el estudio deberá considerarse, por tanto, como de resultado dudoso.

Deben consignarse por separado las frecuencias de las metafases poliploides y endorreduplicadas entre las metafases totales. El aumento del número de células poliploides o endorreduplicadas puede indicar que el producto problema es capaz de inhibir procesos mitóticos o la progresión del ciclo celular (véase el punto 3).

Informe del ensayo

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

Resumen

BIBLIOGRAFÍA

5)

En la parte B, el capítulo B.12 se sustituye por el texto siguiente:

«B.12.   Ensayo de micronúcleos en eritrocitos de mamífero

INTRODUCCIÓN

El presente método de ensayo es equivalente a las directrices de ensayo de la OCDE 474 (2016). Forma parte de una serie de métodos de ensayo sobre toxicología genética. Se ha elaborado un documento de la OCDE que aporta información sucinta sobre los ensayos de toxicología genética y una síntesis de los recientes cambios aportados a dichas directrices de ensayo (1).

El ensayo de micronúcleos de mamífero in vivo es especialmente relevante para evaluar la genotoxicidad porque, aunque pueden variar según la especie, los factores de los procesos del metabolismo in vivo, de la farmacocinética y de la reparación del ADN están activos y contribuyen a las respuestas. Los ensayos in vivo también resultan útiles para ahondar en el estudio de la genotoxicidad detectada en un sistema in vitro.

El ensayo de micronúcleos de mamífero in vivo se emplea para detectar lesiones provocadas por el producto problema en los cromosomas o el aparato mitótico de los eritroblastos. El ensayo sirve para evaluar la formación de micronúcleos en los eritrocitos tomados bien de la médula ósea o bien de la sangre periférica de los animales (por lo general, roedores).

El ensayo de micronúcleos tiene por objeto determinar los productos que ocasionan lesiones citogenéticas que dan lugar a la formación de micronúcleos con fragmentos de cromosomas o cromosomas enteros retardados.

Cuando los eritroblastos de la médula ósea se transforman en eritrocitos inmaduros (a veces denominados también reticulocitos o eritrocitos policromáticos), el núcleo principal es eliminado, pero los micronúcleos que se hayan formado pueden permanecer en el citoplasma. Resulta más fácil visualizar o detectar los micronúcleos en estas células, pues carecen de núcleo principal. El aumento de la frecuencia de micronúcleos en los eritrocitos inmaduros de animales tratados es indicativo de la inducción de aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales.

Los eritrocitos micronucleados recién formados se identifican y se cuantifican bien mediante tinción seguida de examen visual con microscópico, o bien mediante análisis automatizado. El recuento de suficientes eritrocitos inmaduros en la médula ósea o la sangre periférica de animales adultos se facilita en gran medida mediante la utilización de un programa automatizado de examen. Estos programas son alternativas aceptables a la evaluación manual (2). En estudios comparativos se ha puesto de manifiesto que tales métodos, utilizando los pertinentes patrones de calibración, pueden proporcionar una mayor sensibilidad y reproducibilidad intralaboratorios e interlaboratorios que el examen microscópico manual (3) (4). Entre los sistemas automatizados que permiten medir la frecuencia de eritrocitos micronucleados se incluyen, por ejemplo, los citómetros de flujo (5), los programas de análisis de imágenes (6) (7), y los citómetros de barrido por láser (8).

Aunque no forme parte normalmente del ensayo, es posible distinguir los fragmentos de cromosomas de los cromosomas enteros aplicando diversos criterios. Entre estos se encuentra la presencia o la ausencia de cinetocoro o de ADN centromérico, que son tanto el uno como el otro característicos de los cromosomas intactos. La ausencia de cinetocoro o de ADN centromérico indica que el micronúcleo solo contiene fragmentos de cromosomas, mientras que su presencia es indicativa de la pérdida de cromosomas.

En el apéndice 1 se dan las definiciones de la terminología utilizada.

CONSIDERACIONES INICIALES

La médula ósea de roedores adultos jóvenes es el tejido diana de las lesiones genéticas en este ensayo, ya que los eritrocitos se producen en este tejido. La medición de los micronúcleos en eritrocitos inmaduros en la sangre periférica es aceptable en otras especies de mamíferos respecto a las cuales se haya demostrado que poseen la sensibilidad adecuada para detectar productos que provocan aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales (por inducción de la formación de micronúcleos en eritrocitos inmaduros) y se aporte una justificación científica. La frecuencia de la presencia de eritrocitos inmaduros micronucleados es el principal parámetro. La frecuencia de la presencia de eritrocitos maduros que contienen micronúcleos en la sangre periférica también puede utilizarse como parámetro en especies sin una fuerte selección esplénica contra las células micronucleadas y si los animales han sido tratados de forma continua durante un período superior a la vida de los eritrocitos en la especie utilizada (por ejemplo, 4 semanas o más en el caso del ratón).

Si hay pruebas de que el producto o productos problema, o sus metabolitos, no llegan al tejido diana, puede no proceder la realización del presente ensayo.

Antes de la utilización del método de ensayo con una mezcla para obtener datos con fines reglamentarios, debe considerarse si podría proporcionar resultados adecuados a tal fin y, en caso afirmativo, por qué. Tales consideraciones no son necesarias si la reglamentación impone el ensayo de la mezcla.

PRINCIPIO DEL MÉTODO DE ENSAYO

Se exponen los animales al producto problema por una vía adecuada. Si se utiliza la médula ósea, los animales se sacrifican de forma compasiva, en uno o varios momentos adecuados tras el tratamiento, se extrae la médula ósea, se hacen los frotis y se tiñen (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Si se emplea sangre periférica, esta se extrae en uno o varios momentos adecuados tras el tratamiento, se hacen los frotis y se tiñen (12) (16) (17) (18). Cuando el tratamiento se administra de forma aguda, es importante seleccionar los momentos en que se toman las muestras de médula ósea o de sangre para que en ellos se pueda detectar la inducción de la formación de eritrocitos inmaduros micronucleados relacionada con el tratamiento. En el caso de la toma de sangre periférica, también deberá haber transcurrido tiempo suficiente para que estos eritrocitos aparezcan en la sangre circulante. Se analizan los frotis para detectar la presencia de micronúcleos, por visualización utilizando un microscopio, análisis de imágenes, citometría de flujo, o citometría de barrido por láser.

VERIFICACIÓN DE LA COMPETENCIA DEL LABORATORIO

Investigaciones de competencia

A fin de establecer que posee la suficiente experiencia con la realización del ensayo antes de utilizarlo para hacer ensayos sistemáticos, el laboratorio debe haber demostrado su capacidad de reproducir los resultados previstos a partir de los datos publicados (17) (19) (20) (21) (22) en cuanto a frecuencias de los micronúcleos con un mínimo de dos productos como testigo positivo (incluidas las respuestas débiles inducidas por dosis bajas de los testigos positivos), como las que figuran en el cuadro 1, y con testigos de disolvente/vehículo compatibles (véase el punto 26). Estos experimentos deben utilizar dosis que den aumentos relacionados con la dosis y reproducibles, y demostrar la sensibilidad y el intervalo dinámico del sistema de ensayo en el tejido de interés (médula ósea o sangre periférica), empleando el método de examen utilizado en el laboratorio. Este requisito no es aplicable a los laboratorios que tienen experiencia, esto es, que disponen de una base de datos históricos, según se define en los puntos 14-18.

Datos sobre testigos históricos

En el transcurso de las investigaciones de competencia, el laboratorio debe demostrar:

Cuando se obtengan datos por primera vez en relación con la distribución de testigos negativos históricos, los testigos negativos en paralelo deben ser coherentes con los datos publicados de los testigos, si existen. Según se añadan más datos experimentales sobre la distribución de los testigos históricos, los testigos negativos en paralelo deben situarse idealmente dentro de los límites de control del 95 % de dicha distribución. La base de datos históricos del laboratorio de testigos negativos debe ser estadísticamente sólida para garantizar la capacidad del laboratorio de evaluar la distribución de sus datos sobre los testigos negativos. La bibliografía sugiere que puede ser necesario un mínimo de 10 experimentos, pero que sería preferible contar con al menos 20 experimentos realizados en condiciones experimentales comparables. Los laboratorios deben utilizar métodos de control de calidad, como gráficos de control (por ejemplo, gráficos C o gráficos de medias (23)), con el fin de determinar la variabilidad de sus datos y de demostrar que la metodología está «controlada» en su laboratorio. En la bibliografía pueden encontrarse más recomendaciones sobre cómo conseguir y utilizar los datos históricos (es decir, criterios de inclusión y exclusión de datos en los datos históricos y criterios de aceptabilidad para un determinado experimento) (24).

Si el laboratorio no completa un número suficiente de experimentos para establecer una distribución de los testigos negativos estadísticamente sólida (véase el punto 15) durante las investigaciones de competencia (descritas en el punto 13), es admisible que la distribución se establezca durante los primeros exámenes sistemáticos. Este enfoque debe seguir las recomendaciones recogidas en la bibliografía (24) y los resultados de los testigos negativos obtenidos en estos experimentos deben seguir siendo coherentes con los datos publicados de los testigos negativos.

Cualquier cambio en el protocolo experimental debe considerarse en función de su impacto en el mantenimiento de la coherencia entre los datos resultantes y la base de datos históricos de testigos existente del laboratorio. Solo si hubiera incoherencias importantes se justificaría el establecimiento de una nueva base de datos históricos de testigos, en caso de que la evaluación por expertos determine que es diferente de la distribución anterior (véase el punto 15). Durante el nuevo establecimiento, puede que no sea necesaria una base de datos completa sobre testigos negativos para poder realizar una prueba real, siempre que el laboratorio pueda demostrar que sus valores de los testigos negativos en paralelo siguen estando en consonancia con su anterior base de datos o con los correspondientes datos publicados.

Los datos sobre testigos negativos deben consistir en la incidencia de eritrocitos inmaduros con micronúcleos en cada animal. Lo ideal sería que los testigos negativos en paralelo estuvieran dentro de los límites de control del 95 % de la distribución de la base de datos de testigos negativos históricos del laboratorio. Cuando haya datos de los testigos negativos en paralelo que queden fuera de los límites de control del 95 %, su inclusión en la distribución de testigos históricos puede ser aceptable en la medida en que dichos datos no sean valores discrepantes extremos y haya pruebas de que el sistema de ensayo está «controlado» (véase el punto 15) y no haya pruebas de fallos técnicos o humanos.

DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

Preparación

Selección de la especie animal

Deben usarse animales adultos jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en laboratorio. Pueden utilizarse ratones, ratas, u otras especies adecuadas de mamíferos. Si se emplea sangre periférica, se debe comprobar que la eliminación esplénica de células con micronúcleos de la circulación no compromete la detección de la formación de micronúcleos inducida en la especie seleccionada. Esto se ha comprobado claramente en el caso de la sangre periférica de ratón y rata (2). La justificación científica para la utilización de especies distintas de las ratas y los ratones debe facilitarse en el informe. Si se utilizan especies que no sean de roedores, se recomienda que la medición de los micronúcleos inducidos se integre en otro ensayo adecuado de toxicidad.

Condiciones de alojamiento y alimentación de los animales

Con roedores, la temperatura en el animalario debe ser de 22 °C (± 3 °C). Aunque la humedad relativa debe ser idealmente del 50 al 60 %, debe ser como mínimo del 40 % y preferentemente no superar el 70 %, salvo durante la limpieza del local. La iluminación debe ser artificial, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentación se pueden utilizar dietas de laboratorio convencionales, con suministro ilimitado de agua para beber. La elección de la dieta puede verse influida por la necesidad de garantizar una mezcla conveniente del producto problema si se administra por esta vía. Los roedores deben alojarse en grupos pequeños (no más de cinco animales por jaula) del mismo sexo y grupo de tratamiento si no se espera conducta agresiva, preferentemente en jaulas de suelo continuo con un enriquecimiento ambiental adecuado. Los animales podrán alojarse por separado solo si está justificado científicamente.

Preparación de los animales

Se utilizan normalmente animales adultos jóvenes y sanos (en el caso de los roedores, idealmente de 6-10 semanas de edad al inicio del tratamiento, aunque también pueden aceptarse animales ligeramente más viejos), y se reparten al azar entre los lotes tratados y los testigos. Los animales se identifican individualmente utilizando un método compasivo y mínimamente invasivo (por ejemplo, mediante anillamiento, marcado, implantación de un microchip o identificación biométrica, pero no grapado a las orejas o los dedos), y se deja que se acostumbren a las condiciones del laboratorio durante al menos cinco días. Las jaulas se disponen de forma que se reduzcan al mínimo los posibles efectos debidos al enjaulamiento. Debe evitarse la contaminación cruzada por el testigo positivo y el producto problema. La variación del peso de los animales al empezar el estudio ha de ser mínima y no debe exceder del ± 20 % del peso medio de cada sexo.

Preparación de las dosis

Los productos problema sólidos deben disolverse o suspenderse en disolventes o vehículos adecuados, o mezclarse con los alimentos o con el agua de bebida, antes de su administración a los animales. Los productos problema líquidos pueden administrarse directamente o diluirse antes de la administración. En lo que respecta a la exposición por inhalación, los productos problema pueden administrarse en forma de gas, de vapor o de aerosol sólido o líquido, dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas. Deben utilizarse preparaciones recientes del producto problema, salvo que se cuente con datos de estabilidad que avalen la posibilidad de su conservación y definan las condiciones adecuadas de esta.

Condiciones del ensayo

Disolvente o vehículo

El disolvente o vehículo no debe producir efectos tóxicos a las dosis empleadas, y no debe tener la posibilidad de reaccionar químicamente con los productos problema. Si se emplean disolventes o vehículos poco conocidos, debe disponerse de información de referencia que avale su compatibilidad. Siempre que sea posible, se recomienda considerar en primer lugar la utilización de un disolvente o vehículo acuoso. Pueden citarse como ejemplos de disolventes o vehículos compatibles comúnmente utilizados el agua, el suero fisiológico, la solución de metilcelulosa, la solución de sal sódica de carboximetilcelulosa, el aceite de oliva y el aceite de maíz. A falta de información histórica o publicada sobre testigos que demuestre que un disolvente o vehículo elegido atípico no induce la formación de micronúcleos ni ningún otro tipo de efectos nocivos, debe realizarse un estudio inicial a fin de establecer la aceptabilidad del testigo de disolvente o vehículo.

Testigos

Testigos positivos

En principio debe incluirse en cada ensayo un grupo de animales tratados con un producto testigo positivo. Esto puede no aplicarse cuando el laboratorio de ensayo ha demostrado su competencia en la realización del ensayo y ha establecido un intervalo histórico de testigos positivos. Si no se incluye un grupo testigo positivo en paralelo, debe contarse en cada experimento con testigos de examen (portaobjetos fijados y sin teñir o muestras de suspensiones celulares, según el método de examen). Esto puede conseguirse incluyendo en el examen del estudio muestras de referencias adecuadas que se hayan obtenido y conservado a partir de un experimento con testigo positivo aparte realizado periódicamente (por ejemplo, cada 6 o 18 meses); por ejemplo, durante las pruebas de competencia y, a continuación, con carácter periódico, en caso necesario.

Los productos utilizados como testigo positivo deben provocar con fiabilidad un aumento detectable en la frecuencia de los micronúcleos respecto al nivel espontáneo. Cuando se emplee un examen manual por microscopia, las dosis del testigo positivo deben elegirse de tal forma que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al examinador la identidad de las muestras codificadas. El producto empleado como testigo positivo podrá administrarse por una vía distinta de la del producto problema, con otro programa de tratamiento, y el muestreo podrá efectuarse solo en un único momento. Además, podrá considerarse la utilización como testigo positivo de productos de clases químicas afines, cuando sea posible. En el cuadro 1 se incluyen ejemplos de productos válidos como testigo positivo.

Cuadro 1.

Ejemplos de productos válidos como testigo positivo

Productos y CASRN

Metanosulfonato de etilo [CASRN 62-50-0]

Metanosulfonato de metilo [CASRN 66-27-3]

Etil-nitrosourea [CASRN 759-73-9]

Mitomicina C [CASRN 50-07-7]

Ciclofosfamida (monohidrato) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Trietilenomelamina [CASRN 51-18-3]

Colchicina [CASRN 64-86-8] o vimblastina [CASRN 865-21-4] — como anéugenos

Testigos negativos

Deben incluirse animales de un grupo testigo negativo en cada tiempo de muestreo y someterse al mismo proceso que los grupos de tratamiento, salvo que no reciben el tratamiento con el producto problema. Si se utiliza un disolvente o vehículo para la administración del producto problema, el grupo testigo recibirá este disolvente o vehículo. No obstante, si mediante los datos históricos de testigos negativos se demuestra que la variabilidad entre animales y la frecuencia de las células con micronúcleos son coherentes en cada momento de muestreo en el laboratorio de ensayo, puede que solo sea necesario un único muestreo del testigo negativo. En los casos en que se realice un único muestreo de los testigos negativos, debe corresponder al primer momento de muestreo utilizado en el estudio.

Si se emplea sangre periférica, puede aceptarse una muestra previa al tratamiento en lugar de un testigo negativo en paralelo en los estudios a corto plazo si los resultados son coherentes con la base de datos históricos de testigos del laboratorio de ensayo. Se ha demostrado que en las ratas la toma de pequeñas muestras previas al tratamiento (por ejemplo, de menos de 100 μl/día) tiene un impacto mínimo sobre la frecuencia espontánea de micronúcleos (25).

PROCEDIMIENTO

Número y sexo de los animales

En general, la respuesta de micronúcleos es similar entre machos y hembras y, por lo tanto, la mayor parte de los estudios podría realizarse con cualquier sexo (26). Unos datos que demostraran la existencia de diferencias pertinentes entre machos y hembras (como diferencias de toxicidad sistémica, metabolismo, biodisponibilidad, toxicidad para la médula ósea, etc., por ejemplo en un estudio de determinación del intervalo) favorecerían la utilización de ambos sexos. En este caso puede ser conveniente realizar un estudio con ambos sexos, por ejemplo como parte de un estudio de toxicidad por administración continuada. Podría ser adecuado utilizar el diseño factorial en caso de que se utilizaran animales de ambos sexos. En el apéndice 2 se recogen detalles sobre cómo analizar los datos utilizando dicho diseño.

El tamaño de los grupos al principio del estudio debe establecerse de manera que comprendan un mínimo de 5 animales analizables de un mismo sexo, o de cada sexo si se utilizan ambos, por grupo. En caso de que la exposición humana a los productos pueda ser específica de un sexo, como sucede con algunos productos farmacéuticos, el ensayo debe realizarse con animales del sexo correspondiente. Como orientación sobre las necesidades máximas típicas de animales, un estudio de la médula ósea realizado de acuerdo con los parámetros establecidos en el punto 37 con tres grupos tratados y testigos negativo y positivo en paralelo (cada grupo compuesto por cinco animales de un solo sexo), requeriría entre 25 y 35 animales.

Dosis

Si se lleva a cabo un estudio previo de determinación del intervalo porque no se dispone aún de datos adecuados para ayudar en la selección de las dosis, ha de hacerse en el mismo laboratorio, con la misma especie, cepa, sexo y protocolo de tratamiento que se vayan a utilizar en el estudio principal (27). El estudio debe tratar de determinar la dosis máxima tolerada (DMT), es decir, la dosis más alta que se tolera sin signos de toxicidad que limite el estudio, en relación con la duración del período de estudio (por ejemplo, reducción del peso corporal o citotoxicidad para el sistema hematopoyético pero sin llegar a la muerte ni presentar signos de dolor, sufrimiento o angustia que requieran el sacrificio compasivo (28)).

La dosis más alta también puede definirse como la dosis que produce toxicidad en la médula ósea (por ejemplo, una reducción de la proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos en la médula ósea o en la sangre periférica superior al 50 %, pero hasta no menos del 20 % del valor del testigo). No obstante, al analizar las células positivas para el CD71 en la circulación sanguínea periférica (es decir, mediante citometría de flujo), esta fracción muy joven de eritrocitos inmaduros responde a los estímulos tóxicos más rápidamente que la cohorte positiva para el ARN de eritrocitos inmaduros, que es más grande. Por lo tanto, puede ponerse de manifiesto una mayor toxicidad aparente con diseños de exposición aguda que examinen la fracción de eritrocitos inmaduros positivos para el CD71 respecto a los que identifican eritrocitos inmaduros sobre la base del contenido de ARN. Por esta razón, cuando en los experimentos se utilizan cinco o menos días de tratamiento, la dosis más alta de los productos problema que causa toxicidad puede definirse como la dosis que produce una reducción estadísticamente significativa de la fracción de eritrocitos inmaduros positivos para el CD71 respecto al total de eritrocitos, pero hasta no menos del 5 % del valor del testigo (29).

Los productos que presentan saturación de las propiedades toxicocinéticas, o inducen procesos de destoxificación que puedan dar lugar a una disminución de la exposición después de una administración a largo plazo pueden constituir excepciones en cuanto a los criterios de establecimiento de la dosis y han de evaluarse caso por caso.

A fin de obtener información sobre la relación dosis-respuesta, los estudios completos deben incluir un grupo testigo negativo y un mínimo de tres dosis separadas por un factor que será en general de 2 y nunca superior a 4. Si el producto problema no produce toxicidad en el estudio de determinación del intervalo o según los datos existentes, la dosis más alta con un período de administración de 14 días o más debe ser de 1 000 mg/kg de peso corporal/día o, en caso de administración durante un período inferior a 14 días, de 2 000 mg/kg de peso corporal/día. No obstante, si el producto problema provoca toxicidad, la DMT debe ser la mayor dosis administrada y las dosis deben abarcar preferentemente el intervalo desde la dosis máxima hasta una dosis que provoque toxicidad escasa o nula. Si se observa toxicidad para el tejido diana (médula ósea) a todas las dosis utilizadas en el ensayo, se recomienda hacer otro estudio a dosis no tóxicas. Unos estudios destinados a caracterizar de forma más completa la relación cuantitativa dosis-respuesta pueden necesitar más grupos de dosis. Estos límites pueden variar con determinados tipos de productos problema (por ejemplo, productos farmacéuticos de uso humano) a los que se apliquen requisitos específicos.

Ensayo límite

Si los experimentos de determinación del intervalo, o los datos disponibles sobre cepas animales afines, indican que un régimen de tratamiento de, como mínimo, la dosis límite (véase más adelante) no produce efectos tóxicos observables (entre los que se incluirían la depresión de la proliferación de la médula ósea u otros signos de citotoxicidad para el tejido diana) y si, basándose en estudios de genotoxicidad in vitro o en datos de productos estructuralmente afines, no cabe esperar genotoxicidad, entonces puede no considerarse necesario realizar un estudio completo con tres dosis, siempre que se haya demostrado que el producto o productos problema alcanzan el tejido diana (médula ósea). En tales casos, podrá ser suficiente una sola dosis, al nivel de la dosis límite. Cuando la administración tiene lugar durante un período de 14 días o más, la dosis límite será de 1 000 mg/kg de peso corporal/día. Si el período de administración es inferior a 14 días, la dosis límite será de 2 000 mg/kg de peso corporal/día.

Administración de las dosis

A la hora de diseñar el ensayo, debe tenerse en cuenta la vía prevista de exposición humana. Por lo tanto, en casos justificados podrán elegirse vías de exposición como los alimentos, el agua de bebida, la tópica, la subcutánea, la intravenosa, la oral forzada (por sonda), la inhalación, la intratraqueal o la implantación. En cualquier caso, la vía debe elegirse de forma que se garantice una exposición adecuada del tejido o tejidos diana. En general no se recomienda la inyección intraperitoneal, ya que no es una vía de exposición humana prevista, y debe utilizarse solo en casos que tengan justificación científica específica. Si el producto problema se mezcla con los alimentos o el agua de bebida, en particular en caso de administración única, debe procurarse que el plazo entre el consumo de los alimentos o el agua y el muestreo sea suficiente para permitir la detección de los efectos (véase el punto 37). El volumen máximo de líquido que puede administrarse de una sola vez por sonda o por inyección depende del tamaño del animal utilizado. Dicho volumen no debe en principio superar 1 ml/100 g de peso corporal, salvo en el caso de las soluciones acuosas, en que puede llegarse a un máximo de 2 ml/100 g. El uso de volúmenes superiores deberá justificarse. Excepto en el caso de productos problema irritantes o corrosivos, que por lo general producen efectos exacerbados a concentraciones superiores, la variabilidad del volumen de ensayo debe reducirse al mínimo ajustando la concentración para conseguir la administración de un volumen constante en relación con el peso corporal a todas las dosis.

Pauta de tratamiento

De preferencia, se efectúan 2 o más tratamientos a intervalos de 24 horas, especialmente cuando se integra este ensayo en otros estudios de toxicidad. También es posible administrar tratamientos únicos cuando esté científicamente justificado (por ejemplo, productos problema conocidos por bloquear el ciclo celular). Los productos problema también pueden administrarse en dosis divididas (es decir, en dos o más tratamientos el mismo día separados por no más de 2 o 3 horas) con el fin de facilitar la administración de grandes volúmenes. En estas circunstancias, o cuando se administra el producto problema por inhalación, el tiempo de muestreo debe programarse basándose en el momento de la última administración o el final de la exposición.

El ensayo puede realizarse con ratas o ratones de tres maneras:

Pueden aplicarse otros regímenes de muestreo o de tratamiento cuando sea pertinente y esté científicamente justificado, y para facilitar la integración con otros ensayos de toxicidad.

Observaciones

Deben hacerse observaciones clínicas generales de los animales de ensayo y registrarse los signos clínicos al menos una vez al día, preferentemente a la misma hora u horas cada día y teniendo en cuenta el período de mayor intensidad de los efectos previstos tras la administración. Al menos dos veces al día durante el periodo de administración, se debe observar la posible morbilidad y mortalidad de todos los animales. Deben pesarse todos los animales al principio del estudio, al menos una vez por semana durante los estudios de administración continuada, y en el momento del sacrificio. En los estudios de al menos una semana de duración, el consumo de alimentos debe medirse al menos semanalmente. Si el producto problema se administra con el agua de bebida, debe medirse el consumo de agua cada vez que se cambie el agua y al menos una vez por semana. Los animales que presenten signos de toxicidad excesiva pero no letal deben sacrificarse de forma compasiva antes de que termine el período del ensayo (28). En determinadas circunstancias, podría comprobarse la temperatura corporal de los animales, dado que la hipotermia y la hipertermia inducidas por el tratamiento se han relacionado con la producción de falsos resultados (32) (33) (34).

Exposición del tejido diana

Debe tomarse una muestra de sangre en el momento o momentos adecuados para permitir la investigación de los niveles plasmáticos de los productos problema, a fin de demostrar que ha habido exposición de la médula ósea, cuando esté justificado y cuando no se disponga de otros datos de exposición (véase el punto 48).

Preparación de la médula ósea o de la sangre periférica

Por lo general, las células de la médula ósea se extraen del fémur o de la tibia de los animales inmediatamente después de su sacrificio compasivo. Las células suelen tomarse, prepararse y teñirse según métodos establecidos. Pueden obtenerse pequeñas cantidades de sangre periférica, conforme a las normas de bienestar animal adecuadas, bien mediante un método que permita la supervivencia del animal, como el sangrado de la vena caudal o de otro vaso sanguíneo adecuado, o bien por punción cardiaca o extracción de un gran vaso en la eutanasia del animal. Tanto en el caso de eritrocitos tomados de la médula ósea como en el de los procedentes de la sangre periférica, dependiendo del método de análisis, las células pueden someterse inmediatamente a una tinción supravital (16) (17) (18), a la preparación de frotis y luego a tinción para microscopia, o a la fijación y tinción de manera adecuada para análisis por citometría de flujo. Si se emplea un colorante específico del ADN [p. ej., naranja de acridina (35) o Hoechst 33258 más pironina-Y (36)] pueden evitarse algunos de los artefactos que aparecen cuando se utiliza un colorante que no es específico del ADN. Esta ventaja no excluye el uso de tinciones convencionales (por ejemplo, Giemsa para el análisis microscópico). También pueden utilizarse otros sistemas [por ejemplo, columnas de celulosa para eliminar las células nucleadas (37) (38)], siempre que se tenga constancia de que son compatibles con la preparación de las muestras en el laboratorio.

Si estos métodos son aplicables, pueden utilizarse anticuerpos anti-cinetocoros (39), la técnica FISH con sondas pancentroméricas de ADN (40), o el etiquetado in situ cebado con cebadores pancentroméricos específicos, junto con una tinción de contraste adecuada del ADN (41), para determinar la naturaleza de los micronúcleos (cromosoma/fragmento cromosómico) a fin de determinar si el mecanismo de inducción de la formación de micronúcleos se debe a actividad clastogénica o aneugénica. Pueden utilizarse otros métodos para diferenciar entre clastógenos y anéugenos, siempre que se haya comprobado que son efectivos.

Análisis (manual y automatizado)

Todos los portaobjetos o muestras para el análisis, incluidos los de los testigos positivos y negativos, deben codificarse independientemente antes de cualquier tipo de análisis y aleatorizarse de forma que el examinador manual no tenga conocimiento de cómo se han tratado; esta codificación no es necesaria cuando se utilizan sistemas de examen automatizados que no dependen de la inspección visual y no pueden verse afectados por el sesgo del operador. Para cada animal, se determina la relación entre los eritrocitos inmaduros y el total de eritrocitos (inmaduros + maduros) en un recuento de al menos 500 eritrocitos si se trata de médula ósea y de 2 000 si se trata de sangre periférica (42). Se debe determinar la incidencia de eritrocitos inmaduros micronucleados en un mínimo de 4 000 eritrocitos inmaduros por animal (43). En caso de que la base de datos históricos de testigos negativos indique que la frecuencia media de eritrocitos inmaduros con micronúcleos de fondo es < 0,1 % en el laboratorio de ensayo, debe considerarse el examen de células adicionales. A la hora de analizar las muestras, la proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos en los animales tratados no debe ser inferior al 20 % de la proporción del testigo del vehículo/disolvente cuando se examinan por microscopia, ni al 5 % aproximadamente de la proporción del testigo del vehículo/disolvente cuando se examinan eritrocitos inmaduros positivos para el CD71 por métodos de citometría (véase el punto 31) (29). Por ejemplo, para un ensayo de médula ósea con examen por microscopia, si la proporción de eritrocitos inmaduros en la médula ósea respecto al testigo es del 50 %, el límite superior de toxicidad sería un 10 % de eritrocitos inmaduros.

Debido a que el bazo de la rata secuestra y destruye los eritrocitos micronucleados, para mantener una elevada sensibilidad del ensayo cuando se analiza sangre periférica de rata, es preferible limitar el análisis de eritrocitos inmaduros micronucleados a la fracción más joven. Cuando se utilicen métodos de análisis automatizados, estos eritrocitos más inmaduros podrán identificarse sobre la base de su alto contenido de ARN, o del alto nivel de receptores de transferrina (positivos para el CD71) expresados en su superficie (31). No obstante, la comparación directa de diferentes métodos de tinción ha demostrado que se pueden obtener resultados satisfactorios con diversos métodos, incluyendo la tinción convencional con naranja de acridina (3) (4).

DATOS E INFORME

Tratamiento de los resultados

Los datos relativos a cada animal se presentarán en forma de cuadro. Con cada animal analizado por separado se relacionará el número de eritrocitos inmaduros examinados, el de eritrocitos inmaduros micronucleados y la proporción de eritrocitos inmaduros respecto al total de eritrocitos. Cuando se tratan ratones de forma continua durante 4 semanas o más, también deben darse los datos sobre el número y la proporción de eritrocitos maduros micronucleados, si se han tomado. Deben también consignarse los datos sobre toxicidad y signos clínicos de los animales.

Criterios de aceptabilidad

Los siguientes criterios determinan la aceptabilidad del ensayo:

Evaluación e interpretación de los resultados

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente positivo si también se cumple lo siguiente:

Si se examina únicamente la dosis más alta en un momento particular de muestreo, el producto problema se considera claramente positivo si se ve un aumento estadísticamente significativo en comparación con el testigo negativo en paralelo y los resultados están fuera de la distribución de los datos históricos de los testigos negativos (por ejemplo, límites de control del 95 % según la distribución de Poisson). En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (44) (45) (46) (47). Al realizar un análisis de la relación dosis-respuesta, deben someterse al mismo por lo menos tres grupos tratados con dosis diferentes del producto problema. Las pruebas estadísticas deben utilizar como unidad experimental el animal. Un resultado positivo en el ensayo de micronúcleos indica que el producto problema induce la formación de micronúcleos, que son consecuencia de una lesión de los cromosomas o del aparato mitótico de los eritroblastos de la especie estudiada. En caso de que se haya realizado un ensayo para detectar la presencia de centrómeros en los micronúcleos, si el producto produce micronúcleos con centrómeros (ADN centromérico o cinetocoro, que indica la pérdida de cromosomas enteros), queda demostrado que este producto problema es un anéugeno.

Siempre que se cumplan todos los criterios de aceptabilidad, se considera que el producto problema es claramente negativo si, en todas las condiciones experimentales examinadas, también se cumple lo siguiente:

En la bibliografía se encuentran recomendaciones sobre los métodos estadísticos más adecuados (44) (45) (46) (47). Como pruebas de la exposición de la médula ósea a un producto problema pueden citarse la reducción de la proporción de eritrocitos inmaduros y maduros o la medición de los niveles hemáticos o plasmáticos del producto problema. En caso de administración por vía intravenosa, no hacen falta pruebas de la exposición. Alternativamente, para demostrar la exposición de la médula ósea es posible utilizar los datos de ADME obtenidos en un estudio independiente utilizando la misma vía y la misma especie. Un resultado negativo indica que, en las condiciones del ensayo, el producto problema no induce la formación de micronúdeos en los eritrocitos inmaduros de la especie estudiada.

No se requiere ninguna verificación de una respuesta positiva clara o negativa clara.

En los casos en que la respuesta no sea claramente negativa ni positiva y con el fin de ayudar a determinar la importancia biológica de un resultado (por ejemplo, un incremento límite o débil), los datos deben ser evaluados por expertos o hay que completar otras investigaciones de los experimentos existentes. En algunos casos, puede ser de utilidad el análisis de más células o la repetición de un experimento en condiciones experimentales modificadas.

En casos excepcionales, incluso después de otras investigaciones, los datos no permiten concluir si el producto problema produce resultados positivos o negativos, y el estudio deberá considerarse, por tanto, como de resultado dudoso.

Informe del ensayo

El informe del ensayo debe incluir la información siguiente:

BIBLIOGRAFÍA

6)

En la parte B, se suprime el capítulo B.15.

7)

En la parte B, se suprime el capítulo B.16.

8)

En la parte B, se suprime el capítulo B.18.

9)

En la parte B, se suprime el capítulo B.19.

10)

En la parte B, se suprime el capítulo B.20.

11)

En la parte B, se suprime el capítulo B.24.

12)

En la parte B, el capítulo B.47 se sustituye por el texto siguiente:

«B.47.   Método de ensayo de la opacidad y permeabilidad de la córnea de bovino para identificar: i) productos que provocan lesiones oculares graves y ii) productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves

INTRODUCCIÓN

El presente método de ensayo reproduce las directrices de ensayo (TG) 437 de la OCDE (2013). El método de ensayo de la opacidad y permeabilidad de la córnea de bovino (conocido por la siglas de su nombre en inglés, BCOP), fue evaluado por el Comité de Coordinación Interagencias sobre la Validación de Métodos Alternativos estadounidense (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM), junto con el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) y el Centro Japonés para la Validación de Métodos Alternativos (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM), en 2006 y 2010 (1)(2). En la primera evaluación, el método de ensayo BCOP se evaluó en cuanto a su utilidad para identificar productos (sustancias y mezclas) que provocan lesiones oculares graves (1). En la segunda evaluación, el método de ensayo BCOP se evaluó en cuanto a su utilidad para identificar productos (sustancias y mezclas) que no están clasificados por irritación ocular ni por lesiones oculares graves (2). La base de datos de validación del método BCOP incluía 113 sustancias y 100 mezclas en total (2)(3). De estas evaluaciones y de su revisión por pares se dedujo que el método de ensayo permite identificar correctamente los productos (tanto sustancias como mezclas) que provocan lesiones oculares graves (categoría 1), así como los que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves, según se definen en el Sistema Globalmente Armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos (SGA) de las Naciones Unidas (4) y en el Reglamento (CE) n.o 1272/2008 del Parlamento Europeo y del Consejo, sobre clasificación, etiquetado y envasado de sustancias y mezclas (CLP) (7), por lo que el método se considera científicamente válido para ambos objetivos. Una lesión ocular grave es un daño tisular en el ojo o un deterioro físico importante de la visión, como consecuencia de la aplicación de un producto problema en la superficie anterior del ojo, que no es completamente reversible en los 21 días siguientes a la aplicación. Los productos problema que provocan lesiones oculares graves se clasifican en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas. Los productos no clasificados por irritación ocular o lesiones oculares graves se definen como aquellos que no cumplen los requisitos para la clasificación en las categorías 1 o 2 (2A o 2B), es decir, se mencionan como «sin categoría» del SGA de las Naciones Unidas. El presente método de ensayo incluye el uso recomendado y las limitaciones del método de ensayo BCOP a partir de sus evaluaciones. Las principales diferencias entre la versión inicial de 2009 y la versión actualizada de 2013 de las líneas directrices de la OCDE se refieren, entre otros, a los siguientes elementos: el uso del método de ensayo BCOP para identificar productos que no requieren clasificación según el SGA de las Naciones Unidas (puntos 2 y 7); aclaraciones sobre la aplicabilidad del método de ensayo BCOP a los ensayos de alcoholes, cetonas y sólidos (puntos 6 y 7) y de sustancias y mezclas (punto 8); aclaraciones sobre cómo deben someterse a ensayo las sustancias tensioactivas y las mezclas que contienen tensioactivos (punto 28); actualizaciones y aclaraciones sobre los testigos positivos (puntos 39 y 40); una actualización de los criterios de decisión del método de ensayo BCOP (punto 48); una actualización de los criterios de aceptación del estudio (punto 49); una actualización de los elementos del informe del ensayo (punto 50); una actualización del apéndice 1, sobre las definiciones; la adición del apéndice 2 sobre la capacidad de predicción del método de ensayo BCOP en diferentes sistemas de clasificación; una actualización del apéndice 3 sobre la lista de productos utilizados para demostrar la aptitud; y una actualización del apéndice 4 sobre el soporte de córnea para el método BCOP (punto 1) y sobre el opacímetro (puntos 2 y 3).

Actualmente se reconoce en general que, en un futuro próximo, ningún ensayo de irritación ocular in vitro podrá sustituir por sí solo al ensayo ocular de Draize in vivo para predecir toda la gama de irritación causada por las distintas categorías de productos. Sin embargo, unas combinaciones estratégicas de varios métodos de ensayo alternativos dentro de una estrategia de ensayos (escalonados) sí podrán sustituir al ensayo ocular de Draize (5). El enfoque descendente (5) está diseñado para utilizarse cuando, sobre la base de la información existente, se espera de un producto que tenga una alta capacidad de irritación, mientras que el enfoque ascendente (5) está diseñado para utilizarse cuando, sobre la base de la información existente, se espera de un producto que no cause irritación ocular suficiente para exigir una clasificación. El método de ensayo BCOP es un procedimiento in vitro que puede utilizarse, en determinadas circunstancias y con limitaciones específicas con fines de clasificación de peligros para los ojos y de etiquetado de productos. Si bien no se considera válido para sustituir por sí solo al ensayo in vivo con ojo de conejo, el método de ensayo BCOP se recomienda como fase inicial en una estrategia de ensayo tal como el enfoque descendente sugerido por Scott et al. (5) para identificar los productos que provocan lesiones oculares graves, es decir, los productos que han de clasificarse en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas, sin necesidad de hacer más pruebas (4). El método de ensayo BCOP se recomienda también para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves, según se definen en el SGA de las Naciones Unidas (sin categoría del SGA de las Naciones Unidas) (4) dentro de una estrategia de ensayos como el enfoque ascendente (5). No obstante, un producto del que no se espere que cause lesiones oculares graves o que no esté clasificado por irritación ocular o lesiones oculares graves según el método de ensayo BCOP tendría que someterse a ensayos adicionales (in vitro o in vivo) para establecer una clasificación definitiva.

El objetivo del presente método de ensayo es describir los procedimientos utilizados para evaluar el posible peligro para los ojos de un producto problema en función de su capacidad para inducir opacidad y aumento de la permeabilidad en una córnea aislada de bovino. Los efectos tóxicos para la córnea se miden mediante: i) el descenso de la transmisión luminosa (opacidad), y ii) el aumento del paso del pigmento fluoresceína sódica (permeabilidad). Los resultados de la evaluación de la opacidad y de la permeabilidad de la córnea tras su exposición al producto problema se combinan para obtener una puntuación de la capacidad de irritación in vitro (conocida por sus siglas en inglés, IVIS), que se utiliza para clasificar el nivel de capacidad de irritación del producto problema.

En el apéndice 1 se dan las definiciones pertinentes.

CONSIDERACIONES INICIALES Y LIMITACIONES

El presente método de ensayo se basa en el protocolo del método de ensayo BCOP del ICCVAM (6)(7), que fue elaborado originariamente a partir del protocolo del Institute for in vitro Sciences (IIVS) y del protocolo 124 de INVITTOX (8). Este último representa el protocolo utilizado en el estudio de prevalidación patrocinado por la Comunidad Europea y realizado en 1997-1998. Estos dos protocolos se basaban en el método de ensayo BCOP comunicado por primera vez por Gautheron et al. (9).

El método de ensayo BCOP puede utilizarse para identificar los productos que provocan lesiones oculares graves, tal como se definen en el SGA de las Naciones Unidas, es decir, que deben clasificarse como productos de la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas (4). Cuando se utiliza para este fin, el método de ensayo BCOP tiene una exactitud general del 79 % (150/191), una tasa de falsos positivos del 25 % (32/126), y una tasa de falsos negativos del 14 % (9/65), cuando se compara con los datos del método de ensayo in vivo con ojo de conejo, clasificados según el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (3) (véase el apéndice 2, cuadro 1). Cuando los productos problema de ciertas clases químicas (en concreto, alcoholes y cetonas) o físicas (en concreto, sólidos), se excluyen de la base de datos, el método de ensayo BCOP tiene una exactitud general del 85 % (111/131), una tasa de falsos positivos del 20 % (16/81), y una tasa de falsos negativos del 8 % (4/50) para el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (3). Las posibles deficiencias del método de ensayo BCOP para identificar los productos que provocan lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas) están relacionadas con la elevada tasa de falsos positivos de alcoholes y cetonas y la elevada tasa de falsos negativos de sólidos, observadas en la base de datos de validación (1)(2)(3). Sin embargo, dado que no todos los alcoholes y cetonas dan resultados positivos excesivos (sobrepredicción) por el método de ensayo BCOP y algunos de ellos se asignan correctamente a la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas, estos dos grupos funcionales orgánicos no se consideran fuera del ámbito de aplicación del método de ensayo. Corresponde al usuario del método de ensayo decidir si puede aceptarse una posible sobrepredicción de un alcohol o cetona, o si deben efectuarse más ensayos con un planteamiento basado en la ponderación de las pruebas. En relación con las tasas de falsos negativos de sólidos, cabe señalar que los sólidos pueden dar lugar a condiciones de exposición variables y extremas en el ensayo in vivo de irritación de Draize, lo cual puede derivar en resultados poco pertinentes sobre el verdadero potencial de irritación (10). También debe señalarse que ninguno de los falsos negativos detectados en la base de datos de validación del ICCVAM (2)(3), en el contexto de la identificación de los productos que inducen lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas), dio lugar a una IVIS ≤ 3, que es el criterio utilizado para identificar un producto problema como sin categoría del SGA de las Naciones Unidas. Además, los falsos negativos del BCOP no son fundamentales en este contexto, ya que todos los productos problema que den 3 < IVIS ≤ 55 se someterían posteriormente a otros ensayos in vitro validados adecuadamente, o como última opción con conejos, en función de las exigencias normativas, utilizando una estrategia de ensayo secuencial en un enfoque de ponderación de las pruebas. Teniendo en cuenta que algunos productos sólidos son clasificados adecuadamente por el método de ensayo BCOP como de la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas, tampoco se considera que este estado físico quede fuera del ámbito de aplicación del método de ensayo. Los investigadores pueden considerar la posibilidad de utilizar este método de ensayo con todos los tipos de productos, aceptándose una IVIS > 55 como indicativa de una respuesta que provoca lesiones oculares graves, con lo que el producto se clasificaría en la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas sin ensayos adicionales. Sin embargo, como se ha mencionado antes, los resultados positivos obtenidos con alcoholes o cetonas deben interpretarse con precaución, debido al riesgo de sobrepredicción.

El método de ensayo BCOP puede utilizarse también para identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves con arreglo al sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (4). Cuando se utiliza para este fin, el método de ensayo BCOP tiene una exactitud general del 69 % (135/196), una tasa de falsos positivos del 69 % (61/89), y una tasa de falsos negativos del 0 % (0/107), cuando se compara con los datos del método de ensayo in vivo con ojo de conejo, clasificados según el sistema de clasificación del SGA de las Naciones Unidas (3) (véase el apéndice 2, cuadro 2). La tasa de falsos positivos obtenida (productos sin categoría del SGA de las Naciones Unidas in vivo que presentan una IVIS > 3, véase el punto 48) es considerablemente elevada, pero no es crítica en este contexto, ya que todos los productos problema que den 3 < IVIS ≤ 55 se someterían posteriormente a otros ensayos in vitro validados adecuadamente, o como última opción con conejos, en función de las exigencias normativas, utilizando una estrategia de ensayo secuencial en un enfoque de ponderación de las pruebas. El método de ensayo BCOP no presenta deficiencias específicas para el ensayo de alcoholes, cetonas y sólidos cuando el objetivo es identificar productos que no requieren clasificación por irritación ocular ni lesiones oculares graves (sin categoría del SGA de las Naciones Unidas) (3). Los investigadores pueden considerar la posibilidad de utilizar este método de ensayo con todos los tipos de productos, aceptándose un resultado negativo (IVIS ≤ 3) como indicativo de que no se requiere clasificación (sin categoría del SGA de las Naciones Unidas). Dado que el método de ensayo BCOP solo puede identificar correctamente el 31 % de los productos que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves, este método de ensayo no debe ser la primera opción para iniciar un enfoque ascendente (5), si se dispone de otros métodos in vitro validados y aceptados, con gran sensibilidad similar pero mayor especificidad.

La base de datos de validación del método BCOP incluía 113 sustancias y 100 mezclas en total (2)(3). El método de ensayo BCOP se considera, por tanto, aplicable a los ensayos de sustancias y de mezclas.

El método de ensayo BCOP no se recomienda para la identificación de productos problema que deben clasificarse como irritantes oculares (categoría 2 o categoría 2A del SGA de las Naciones Unidas) o de productos problema que deben clasificarse como moderadamente irritantes para los ojos (categoría 2B del SGA de las Naciones Unidas) debido al considerable número de productos de la categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas clasificados de forma insuficiente en las categorías 2, 2A o 2B del SGA de las Naciones Unidas y productos sin categoría del SGA de las Naciones Unidas clasificados de forma excesiva en las categorías 2, 2A o 2B del SGA de las Naciones Unidas (2) (3). A tal fin, pueden resultar necesarias pruebas adicionales con otro método adecuado.

Todos los procedimientos con ojos de bovino y córneas de bovino deben ajustarse a las normas y procedimientos aplicables de la instalación de ensayo en relación con la manipulación de materiales derivados de animales, entre los que figuran los tejidos o los líquidos tisulares. Se recomienda observar las precauciones universales de laboratorio (11).

Si bien el método de ensayo BCOP no tiene en cuenta las lesiones de la conjuntiva y del iris, sí atiende a los efectos en la córnea, que son un factor de primer orden de la clasificación in vivo cuando se considera la clasificación del SGA de las Naciones Unidas. La reversibilidad de las lesiones de la córnea no puede evaluarse per se en el método de ensayo BCOP. Se ha propuesto, según estudios realizados con ojo de conejo, que se utilice una evaluación de la profundidad inicial de la lesión de la córnea para identificar algunos tipos de efectos irreversibles (12). Sin embargo, se necesitan más conocimientos científicos para comprender cómo se dan efectos irreversibles no relacionados con lesiones iniciales de alto nivel. Finalmente, el método de ensayo BCOP no permite la evaluación del potencial de toxicidad sistémica asociado con la exposición ocular.

El presente método de ensayo se actualizará periódicamente a la luz de la nueva información y los datos que se vayan considerando. Por ejemplo, la histopatología puede ser útil si se necesita una caracterización más completa de las lesiones de la córnea. Como se indica en el documento de orientación de la OCDE n.o 160 (13), se insta a los usuarios a conservar las córneas y a preparar muestras de histopatología que puedan utilizarse para compilar una base de datos y criterios de decisión con los que se pueda mejorar más tarde la exactitud de este método.

Cuando algún laboratorio establezca inicialmente este método de ensayo, deben utilizarse los productos para demostrar la aptitud que se indican en el apéndice 3. Los laboratorios pueden utilizar estos productos para demostrar su competencia técnica en la realización del método de ensayo BCOP antes de presentar, con fines de clasificación normativa de peligro, los datos obtenidos con este ensayo.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

El método de ensayo BCOP es un modelo organotípico con mantenimiento a corto plazo del funcionamiento fisiológico y bioquímico normal de la córnea de bovino in vitro. En este método de ensayo, la lesión provocada por el producto problema se evalúa mediante la medición cuantitativa de los cambios producidos en la opacidad y en la permeabilidad de la córnea, utilizando un opacímetro y un espectrofotómetro de luz visible, respectivamente. Las dos mediciones se combinan para calcular la IVIS, que se utiliza para asignar una categoría de clasificación de peligro por irritación in vitro a fin de predecir el potencial de irritación ocular in vivo de un producto problema (véanse los criterios de decisión en el punto 48).

El método de ensayo BCOP utiliza córneas aisladas de ojos de ganado bovino recién sacrificado. La opacidad de la córnea se mide cuantitativamente como cantidad de luz transmitida a través de la córnea. La permeabilidad se mide cuantitativamente como cantidad del pigmento fluoresceína sódica que atraviesa todo el espesor de la córnea y se detecta así en el medio que se encuentra en la cámara posterior. Los productos problema se aplican a la superficie epitelial de la córnea poniéndolos en la cámara anterior del soporte de córnea. En el apéndice 4 se ofrece una descripción y un diagrama de un soporte de córnea utilizado en el método de ensayo BCOP. Los soportes de córnea pueden obtenerse de diferentes fuentes comerciales o bien construirse en el propio laboratorio.

Fuente y edad de los ojos de bovino y selección de la especie animal

El ganado bovino enviado a los mataderos se sacrifica normalmente para el consumo humano o con otros fines comerciales. Como fuente de córneas para el método de ensayo BCOP se utilizan solo animales sanos que se consideren adecuados para entrar en la cadena alimentaria humana. Debido a que el ganado bovino presenta una amplia variedad de peso, en función de la raza, edad y sexo, no se recomienda ningún peso concreto del animal en el momento del sacrificio.

Puede variar el tamaño de la córnea cuando se utilizan ojos de animales de distintas edades. Las córneas con un diámetro horizontal > 30,5 mm y un espesor central de la córnea (ECC) ≥ 1 100 μm suelen obtenerse de animales de más de ocho años, mientras que las córneas con un diámetro horizontal < 28,5 mm y un ECC < 900 μm suelen proceder de animales de menos de cinco años (14). Por este motivo, no suelen utilizarse ojos de animales de más de sesenta meses de edad. Tradicionalmente no se utilizan tampoco ojos de animales de menos de doce meses, ya que estos ojos están aún en fase de desarrollo y el espesor y el diámetro de su córnea son considerablemente más pequeños que los observados en ojos de bovinos adultos. Sin embargo, es admisible el uso de córneas de animales jóvenes (es decir, de entre seis y doce meses de edad) porque presentan ciertas ventajas, como una mayor disponibilidad, una variabilidad pequeña en cuanto a la edad, y un peligro reducido en cuanto a la posible exposición de los trabajadores a la encefalopatía espongiforme bovina (15). Como puede ser útil una evaluación más completa del efecto del tamaño o del espesor de la córnea sobre la sensibilidad ante productos corrosivos e irritantes, se anima a los usuarios a informar sobre la edad o el peso estimados de los animales de los que proceden las córneas utilizadas en un estudio.

Recogida y transporte de los ojos al laboratorio

Los ojos son recogidos por los empleados del matadero. Para minimizar las lesiones de los ojos, de tipo mecánico u otro, hay que enuclear los ojos tan pronto como sea posible tras la muerte y enfriarlos inmediatamente después de la enucleación y durante el transporte. A fin de evitar la exposición de los ojos a productos potencialmente irritantes, los empleados del matadero no deben utilizar detergentes cuando laven la cabeza del animal.

Los ojos deben sumergirse completamente en solución salina equilibrada de Hank (conocida por sus siglas en inglés, HBSS) refrigerada en un recipiente de tamaño adecuado, y transportarse al laboratorio de manera que se reduzcan al mínimo su deterioro y su contaminación bacteriana. Como los ojos se recogen durante el proceso de sacrificio, pueden estar expuestos a la sangre y a otros materiales biológicos, además de bacterias y otros microorganismos. Por tanto, es importante velar por que se reduzca al mínimo el riesgo de contaminación (por ejemplo, manteniendo en hielo el recipiente con los ojos durante las operaciones de recogida y transporte, y añadiendo antibióticos a la HBSS utilizada para conservar los ojos durante el transporte [por ejemplo, 100 UI/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina]).

Debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la recogida de los ojos y la utilización de las córneas en el método de ensayo BCOP (lo normal es efectuar todo el proceso en un solo día), y hay que demostrar que ese tiempo no altera los resultados del ensayo. Estos resultados se basan en los criterios de selección de los ojos, así como en las respuestas obtenidas con testigos positivos y negativos. Todos los ojos utilizados en el ensayo deben proceder del mismo grupo de ojos recogidos un día concreto.

Criterios de selección de los ojos utilizados en el método de ensayo BCOP

Tras su llegada al laboratorio, los ojos se someten a un atento examen para detectar posibles defectos, como un aumento de la opacidad, arañazos o neovascularización. Solo deben utilizarse las córneas de ojos que no presenten estos defectos.

La calidad de cada córnea se evalúa también en otras fases posteriores del ensayo. Deben desecharse las córneas que tengan una opacidad mayor de siete unidades de opacidad o equivalente según el opacímetro y los soportes de córneas que se hayan usado con ellas después del período inicial de equilibrado de una hora (NOTA: El opacímetro debe calibrarse con los patrones de opacidad utilizados para establecer las unidades de opacidad, véase el apéndice 4).

Cada grupo de tratamiento (producto problema, testigos negativos y positivos en paralelo) consiste en un mínimo de tres ojos. Para el testigo negativo en el método de ensayo BCPO deben utilizarse tres córneas. Puesto que todas las córneas se extraen del globo entero y se montan en las cámaras de córnea, existe la posibilidad de que haya artefactos procedentes de la manipulación que influyan en los distintos valores de opacidad y permeabilidad de la córnea (incluido el testigo negativo). Por otra parte, los valores de opacidad y permeabilidad de las córneas del testigo negativo se utilizan para corregir los valores de opacidad y permeabilidad de las córneas tratadas con la muestra problema y con los testigos positivos a efectos del cálculo de la IVIS.

PROCEDIMIENTO

Preparación de los ojos

Se disecan córneas libres de defectos, dejándoles un borde de 2 o 3 mm de esclerótica para facilitar la manipulación posterior, y atendiendo a no lesionar el epitelio ni el endotelio de la córnea. Las córneas aisladas se montan en soportes de córnea, diseñados especialmente, que consisten en un compartimento anterior y otro posterior, en contacto respectivamente con el lado epitelial y el lado endotelial de la córnea. Ambas cámaras se llenan hasta rebosar con medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) sin rojo de fenol y precalentado, empezando por la cámara posterior y evitando la formación de burbujas. El dispositivo se estabiliza después a 32 ± 1 °C durante al menos una hora para que las córneas alcancen un estado de equilibrio con el medio y consigan una actividad metabólica normal, dentro de lo posible (la temperatura aproximada de la superficie de la córnea in vivo es de 32 °C).

Tras el periodo de equilibrado, se añade a ambas cámaras nuevo EMEM sin rojo de fenol y precalentado, y se toman lecturas de la opacidad de base de cada córnea. Deben desecharse las córneas que muestren lesiones tisulares macroscópicas (p. ej., arañazos, pigmentación, neovascularización) o una opacidad mayor de siete unidades de opacidad o equivalente según el opacímetro y los soportes de córneas que se hayan usado. Se selecciona para el testigo negativo (o de disolvente) un mínimo de tres córneas. El resto de las córneas se distribuye después en grupos de tratamiento y de testigo positivo.

Como la capacidad térmica del agua es superior a la del aire, el agua ofrece condiciones de temperatura más estables para la incubación. Por tanto, se recomienda utilizar un baño de agua para mantener los soportes de córnea y su contenido a 32 ± 1 °C. Sin embargo, también pueden utilizarse incubadoras de aire, si se toman precauciones para mantener la estabilidad de la temperatura (por ejemplo, precalentando los soportes y los medios).

Aplicación del producto problema

Se utilizan dos protocolos de tratamiento diferentes, uno para líquidos y agentes tensioactivos (sólidos o líquidos) y otro para sólidos que no son agentes tensioactivos.

Los líquidos se someten al ensayo sin diluir. Los semisólidos, cremas y ceras se someten a ensayo en principio como líquidos. Las sustancias tensioactivas sin diluir se someten a ensayo a una concentración del 10 % (p/v) en solución de cloruro sódico al 0,9 %, agua destilada u otro disolvente del que se haya demostrado que no tiene efectos negativos sobre el sistema de ensayo. Debe justificarse adecuadamente si se utilizan otras concentraciones de dilución. Las mezclas que contengan tensioactivos pueden someterse a ensayo sin diluir o diluidas a una concentración adecuada en función del escenario de exposición in vivo pertinente. Debe justificarse adecuadamente la concentración utilizada en el ensayo. Las córneas se exponen a los líquidos y agentes tensioactivos durante 10 minutos. La utilización de otros tiempos de exposición exige una explicación científica adecuada. Véase en el apéndice 1 una definición de tensioactivo y de mezcla que contiene tensioactivos.

Los sólidos que no son agentes tensioactivos se someten a ensayo en principio como soluciones o suspensiones a una concentración del 20 % (p/v) en solución de cloruro sódico al 0,9 %, agua destilada u otro disolvente del que se haya demostrado que no tiene efectos negativos sobre el sistema de ensayo. En ciertas circunstancias y con una justificación científica adecuada, es posible someter a ensayo los sólidos sin diluir mediante aplicación directa sobre la superficie de la córnea, utilizando el método de cámara abierta (véase el punto 32). Las córneas se exponen a los sólidos durante cuatro horas, pero, como sucede con los líquidos y agentes tensioactivos, es posible utilizar otros tiempos de exposición si se cuenta con una explicación científica adecuada.

Pueden utilizarse distintos métodos de tratamiento, en función de la naturaleza física y de las características químicas del producto problema (por ejemplo, sólidos, líquidos, líquidos viscosos frente a líquidos no viscosos). El factor crítico consiste en velar por que el producto problema cubra adecuadamente la superficie epitelial y se elimine adecuadamente durante las fases de lavado. Suele utilizarse un método de cámara cerrada cuando se estudian productos problema líquidos desde no viscosos hasta ligeramente viscosos, mientras que se usa en principio un método de cámara abierta con productos problema líquidos viscosos y semiviscosos, así como con sólidos sin diluir.

En el método de cámara cerrada, se introduce en la cámara anterior (a través de los orificios de administración que se encuentran en la superficie superior de la cámara) una cantidad suficiente de producto problema (750 μl) para cubrir la cara epitelial de la córnea, y los agujeros se tapan a continuación con los tapones de la cámara durante la exposición. Es importante que cada córnea quede expuesta al producto problema durante el periodo adecuado.

En el método de cámara abierta, antes del tratamiento se retiran el anillo de cierre de la ventana y la ventana de cristal de la cámara anterior. El producto problema o testigo (750 μl, o una cantidad suficiente de producto problema para cubrir completamente la córnea) se aplica directamente sobre la superficie epitelial de la córnea utilizando una micropipeta. Si es difícil pipetear el producto problema, este puede cargarse a presión en una pipeta de desplazamiento positivo para facilitar la dosificación. La punta de pipeta de la pipeta de desplazamiento positivo se inserta en la punta de dispensación de la jeringa, de forma que el producto problema pueda cargarse en la punta de desplazamiento bajo presión. Simultáneamente, se oprime el émbolo de la jeringa mientras se arrastra hacia arriba el pistón de la pipeta. Si aparece alguna burbuja de aire en la punta de la pipeta, se retira (se expulsa) el producto problema y se repite el proceso hasta que la punta se quede llena sin ninguna burbuja de aire. En caso necesario, puede utilizarse una jeringa normal (sin aguja), ya que permite medir un volumen exacto de producto problema y facilita su aplicación sobre la superficie epitelial de la córnea. Tras la aplicación del producto, se vuelve a colocar la ventana de cristal de la cámara anterior para crear de nuevo un sistema cerrado.

Incubación tras la exposición

Tras el periodo de exposición, el producto problema, el testigo negativo o el producto de testigo positivo se retiran de la cámara anterior y se lava el epitelio al menos tres veces (o hasta que no quede ningún rastro visible del producto problema) utilizando EMEM con rojo de fenol. Se utiliza para el lavado el medio con rojo de fenol porque la observación del cambio de color de esta sustancia permite determinar la efectividad del lavado de productos problema ácidos o alcalinos. Las córneas se lavan más de tres veces si el rojo de fenol sigue sin colorearse (amarillo o púrpura) o sigue viéndose el producto problema. Una vez el medio ha quedado libre de producto problema, se lavan las córneas una última vez con EMEM sin rojo de fenol. Se utiliza EMEM sin rojo de fenol en el lavado final para eliminar el rojo de fenol de la cámara anterior antes de medir la opacidad. La cámara anterior vuelve a llenarse a continuación con EMEM nuevo sin rojo de fenol.

En el caso de líquidos o agentes tensioactivos, las córneas, una vez lavadas, se incuban otras dos horas a 32 ± 1 °C. En ciertas circunstancias puede ser útil prolongar este tiempo tras la exposición, extremo que debe estudiarse en cada caso. Las córneas tratadas con sólidos se lavan a fondo al final del periodo de exposición de cuatro horas, pero no es necesario prolongar su incubación.

Al final del periodo de incubación tras la exposición en el caso de líquidos y agentes tensioactivos y al final del periodo de exposición de cuatro horas en el caso de sólidos que no son agentes tensioactivos, se registran la opacidad y la permeabilidad de cada córnea. Asimismo, se observa visualmente cada córnea y se registran las observaciones pertinentes (por ejemplo, abrasión tisular, producto problema residual, opacidad no uniforme). Estas observaciones pueden ser importantes ya que pueden reflejarse en variaciones de las lecturas del opacímetro.

Productos testigo

En cada experimento se incluyen testigos simultáneos negativos (o del disolvente/vehículo) y positivos.

Cuando se somete a ensayo una sustancia líquida al 100 %, se incluye en el método de ensayo BCOP un testigo negativo en paralelo (por ejemplo, solución de cloruro sódico al 0,9 % o agua destilada), de forma que puedan detectarse los eventuales cambios inespecíficos del sistema de ensayo y se disponga de una base de referencia para los parámetros del ensayo. También permite asegurarse de que las condiciones del ensayo no provocan de forma inadecuada una respuesta de irritación.

Cuando se somete a ensayo una sustancia líquida diluida, un agente tensioactivo o un sólido, se incluye en el método de ensayo BCOP un grupo de testigo en paralelo del disolvente/vehículo, de forma que puedan detectarse los eventuales cambios inespecíficos del sistema de ensayo y se disponga de una base de referencia para los parámetros del ensayo. Solo pueden utilizarse disolventes/vehículos de los que se haya demostrado que carecen de efectos adversos sobre el sistema de ensayo.

Un producto del que se sabe que induce una respuesta positiva se incluye como testigo positivo en paralelo en cada experimento para verificar la integridad del sistema de ensayo y su correcta realización. Sin embargo, para asegurar la posibilidad de evaluar la variabilidad de las respuestas del testigo positivo a lo largo del tiempo, no debe ser excesiva la magnitud de la respuesta de irritación.

Como ejemplos de testigos positivos para productos problema líquidos se pueden citar el etanol al 100 % y la dimetilformamida al 100 %. Un ejemplo de testigo positivo para productos problema sólidos es el imidazol al 20 % (p/v) en solución de cloruro sódico al 0,9 %.

Es útil disponer de productos de referencia para evaluar el potencial de irritación ocular de productos desconocidos dentro de una clase específica de productos, o para evaluar la capacidad de irritación relativa de un irritante ocular dentro de una gama específica de respuestas de irritación.

Parámetros medidos

La opacidad se determina mediante la cantidad de luz transmitida a través de la córnea. La opacidad de la córnea se mide cuantitativamente con ayuda de un opacímetro, que permite medir los valores de opacidad en una escala continua.

La permeabilidad se determina por la cantidad del pigmento fluoresceína sódica que penetra en todas las capas de células de la córnea (es decir, desde el epitelio de la superficie exterior de la córnea hasta el endotelio de su superficie interior). Se añade a la cámara anterior del soporte de córnea 1 ml de solución de fluoresceína sódica (4 o 5 mg/ml cuando se estudian líquidos y agentes tensioactivos o sólidos no tensioactivos, respectivamente), en contacto con el lado epitelial de la córnea, mientras que la cámara posterior, en contacto con el lado endotelial de la córnea, se llena con EMEM nuevo. El soporte se incuba a continuación en posición horizontal durante 90 ± 5 min a 32 ± 1 °C. La cantidad de fluoresceína sódica que atraviesa la córnea hasta la cámara posterior se mide cuantitativamente mediante espectrofotometría UV/VIS. Las mediciones espectrofotométricas evaluadas a 490 nm se registran como valores de absorbancia o densidad óptica (DO490), medidos en una escala continua. Los valores de permeabilidad a la fluoresceína se determinan utilizando los valores de DO490 conseguidos mediante un espectrofotómetro de luz visible con un camino óptico normal de 1 cm.

También puede utilizarse un lector de placa de microvaloración de 96 pocillos siempre que: i) pueda establecerse la banda de linealidad del lector de placas para determinar los valores de DO490 de fluoresceína; y ii) se utilice el volumen correcto de muestras de fluoresceína en la placa de 96 pocillos para obtener unos valores de DO490 equivalentes a los conseguidos con un camino óptico normal de 1 cm [esto puede exigir que los pocillos estén completamente llenos (generalmente, 360 l)].

DATOS E INFORME

Evaluación de los datos

Una vez corregidos los valores de opacidad y de permeabilidad media (DO490) para tener en cuenta los valores de opacidad de fondo y de permeabilidad (DO490) del testigo negativo, los valores medios de opacidad y permeabilidad (DO490) se combinan en una fórmula empírica para calcular la puntuación de la capacidad de irritación in vitro (IVIS) de cada grupo de tratamiento, de la manera siguiente:

IVIS = valor medio de opacidad + [15 × valor medio de permeabilidad (DO490)]

Sina et al. (16) comunican que esta fórmula se ha obtenido mediante estudios internos e interlaboratorios. Los datos obtenidos con una serie de 36 compuestos en un estudio interlaboratorios se sometieron a análisis con múltiples variables para determinar la ecuación que se ajustara mejor a los datos in vivo e in vitro. Los científicos de dos empresas distintas realizaron este análisis y llegaron a ecuaciones casi idénticas.

Los valores de opacidad y permeabilidad deben evaluarse también independientemente para determinar si un producto problema ha inducido corrosividad o irritación intensa mediante solo uno de los dos parámetros (véase la parte siguiente, sobre criterios de decisión).

Criterios de decisión

Los valores de corte de la IVIS para la identificación de productos problema que provocan lesiones oculares graves (categoría 1 del SGA de las Naciones Unidas) y productos problema que no requieren clasificación por irritación ocular o lesiones oculares graves (sin categoría del SGA de las Naciones Unidas) figuran a continuación:

Criterios de aceptación del estudio

Se considera que un ensayo es aceptable si el testigo positivo da una IVIS comprendida en el intervalo de dos desviaciones típicas respecto a la media histórica del momento, que debe actualizarse al menos cada tres meses, o cada vez que se efectúe un ensayo aceptable en caso de laboratorios en los que no sea frecuente efectuar estos ensayos (es decir, con una frecuencia que no llegue a mensual). Las respuestas de los testigos negativos o del disolvente/vehículo deben llevar a unos valores de opacidad y permeabilidad inferiores a los límites superiores establecidos para los valores de opacidad y permeabilidad de fondo de las córneas de bovino tratadas con el respectivo testigo negativo o del disolvente/vehículo. Una sola tanda de ensayos, formada al menos por tres córneas, debería ser suficiente para un producto problema, si la clasificación resultante es inequívoca. Sin embargo, en casos de resultados dudosos en la primera tanda de ensayos, debe considerarse la realización de una segunda tanda de ensayos (aunque no sea necesariamente obligatoria), así como la de una tercera en caso de resultados medios de IVIS discordantes entre las dos primeras series de pruebas. En este contexto, un resultado de la primera tanda de ensayos se considera dudoso si las predicciones obtenidas de las tres córneas no concuerdan, de forma que:

Informe del ensayo

El informe del ensayo debe incluir la siguiente información, en caso de que corresponda a la realización del estudio:

BIBLIOGRAFÍA