32000L0045

Komisijas Direktīva 2000/45/EK

(2000. gada 6. jūlijs),

ar ko nosaka Kopienas analīžu metodes A vitamīna, E vitamīna un triptofāna noteikšanai barībā

(dokuments attiecas uz EEZ)

EIROPAS KOPIENU KOMISIJA,

ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu,

ņemot vērā Padomes 1970. gada 20. jūlija Direktīvu 70/373/EEK par paraugu ņemšanas un analīžu Kopienas metožu ieviešanu barības oficiālajai kontrolei [1], kurā jaunākie grozījumi veikti ar Austrijas, Somijas un Zviedrijas Pievienošanās aktu [2], un jo īpaši tā 2. pantu,

tā kā:

(1) Direktīva70/373/EEK paredz, ka, lai pārbaudītu, vai barība atbilst prasībām, kas izriet no normatīviem un administratīviem aktiem, kuri regulē tās kvalitāti un sastāvu, tās oficiālās kontroles jāveic, izmantojot Kopienas paraugu ņemšanas un analīžu metodes.

(2) Padomes 1970. gada 23. novembra Direktīva 70/524/EEK par barības piedevām [3], kurā jaunākie grozījumi veikti ar Komisijas 1999. gada 17. novembra Regulu (EK) Nr. 2439/1999 [4] paredz, ka A vitamīna un E vitamīna saturs ir jānorāda uz premiksu un barības etiķetēm, kam pievienotas šīs vielas.

(3) Padomes 1979. gada 2. aprīļa Direktīva 79/373/EEK par barības maisījumu tirdzniecību [5], kurā jaunākie grozījumi veikti ar Komisijas Direktīvu 2000/16/EK [6], un Padomes 1993. gada 13. septembra Direktīva 94/74/EEK par īpašām uztura vajadzībām domātas barības tirdzniecību [7], kurā jaunākie grozījumi veikti ar Direktīvu 96/25/EK [8], paredz, ka uz barības etiķetēm ir jānorāda aminoskābes.

(4) Jānosaka Kopienas metodes šo vielu noteikšanai.

(5) Šajā direktīvā paredzētie pasākumi saskan ar Barības pastāvīgās komitejas atzinumu,

IR PIEŅĒMUSI ŠO DIREKTĪVU:

1. pants

Dalībvalstis nodrošina, ka analīzes nolūkā oficiāli kontrolēt A vitamīna, E vitamīna un triptofāna saturu barībā un premiksos veic ar metodēm, kas izklāstītas šīs direktīvas pielikumā.

2. pants

Dalībvalstīs, vēlākais, līdz 2000. gada 31. augustam stājas spēkā normatīvi un administratīvi akti, kas vajadzīgi, lai izpildītu šīs direktīvas prasības. Par to tās tūlīt informē Komisiju.

Dalībvalstis piemēro šos noteikumus no 2000. gada 1. septembra.

Kad dalībvalstis pieņem šos tiesību aktus, tajos ietver atsauci uz šo direktīvu vai arī šādu atsauci pievieno šo tiesību aktu oficiālai publikācijai. Dalībvalstis nosaka šādas atsauces pievienošanas kārtību.

3. pants

Šī direktīva stājas spēkā divdesmitajā dienā pēc tās publicēšanas Eiropas Kopienu Oficiālajā Vēstnesī.

4. pants

Šī direktīva ir adresēta dalībvalstīm.

Briselē, 2000. gada 6. jūlijā

Komisijas vārdā —

Komisijas loceklis

David Byrne

[1] OV L 170, 3.8.1970., 2. lpp.

[2] OV C 241, 29.8.1994., 1. lpp.

[3] OV L 270, 14.12.1970., 1. lpp.

[4] OV L 297, 18.11.1999., 8. lpp.

[5] OV L 86, 6.4.1979., 30. lpp.

[6] OV L 105, 3.5.2000., 36. lpp.

[7] OV L 237, 22.9.1993., 23. lpp.

[8] OV L 125, 23.5.1996., 35. lpp.

--------------------------------------------------

PIELIKUMS

A DAĻA A VITAMĪNA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un piemērošanas joma

Šo metodi izmanto, lai premiksos un barībā noteiktu A vitamīnu (retinolu). Ar A vitamīnu saprot all-trans-retinil spirtu un tā cis izomērus, ko nosaka ar šo metodi. A vitamīna saturu izsaka starptautiskajās vienībās (s. v.) uz kg. Viena s. v. atbilst 0,300 μg all-trans- A vitamīna spirta vai, 344 μg all-trans- A vitamīna acetāta vai 0,550 μg all-trans- A vitamīna palmitāta aktivitātei.

Mazākais nosakāmais daudzums ir 2000 s. v. A vitamīna/kg.

2. Princips

Paraugu hidrolizē kālija hidroksīda šķīdumā etanolā, un A vitamīnu ekstrahē petrolēterī. Šķīdinātāju iztvaicē un nogulsnes šķīdina metanolā, un vajadzības gadījumā atšķaida līdz nepieciešamajai koncentrācijai. A vitamīna saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augsta snieguma šķidruma hromatogrāfiju (RP-HPLC), izmantojot UV vai fluorescences detektoru. Hromatogrāfiskos parametrus izvēlas tā, lai all-trans- A vitamīna spirts neatdalās no tā cis izomēriem.

3. Reaģenti

3.1. Etanols, σ = 96 %

3.2. Petrolēteris, vārīšanās punkta intervāls no 40 ° līdz 60 °C

3.3. Metanols

3.4. Kālija hidroksīda šķīdums, β = 50 g/100 ml

3.5. Nātrija askorbāta šķīdums, β = 10 g/100 ml (skat. novērojumu 7.7)

3.6. Nātrija sulfīds, Na2S · x H2O (x = 7–9)

3.6.1. Nātrija sulfīda šķīdums, c = 0,5 mol/l glicerolā, β = 120 g/l (x = 9) (skat. novērojumu 7.8)

3.7. Fenolftaleīna šķīdums etanolā, β = 2 g/100 ml (3.1)

3.8. 2-Propanols

3.9. HPLC kustīgā fāze: metanola (3.3) un ūdens maisījums, piemēram, 980 + 20 (v + v). Precīza attiecība ir atkarīga no izmantotās kolonnas īpašībām.

3.10. Slāpeklis, bez skābekļa

3.11. All-trans- A vitamīna acetāts, īpaši tīrs ar sertificētu aktivitāti, piem., 2,80 x 106 s. v./g

3.11.1. All-trans- A vitamīna acetāta izejas šķīdums: Ar precizitāti līdz 0,1 mg 100 ml mērkolbā nosver 50 mg A vitamīna acetāta (3.11). Izšķīdina 2-propanolā (3.8) un uzpilda līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 1400 s. v. A vitamīna/ml. Precīzais saturs jānosaka saskaņā ar 5.6.3.1.

3.12. All-trans- A vitamīna palmitāts, īpaši tīrs ar sertificētu aktivitāti, piemēram, 1,80 x 106 s. v./g

3.12.1. All-trans- A vitamīna palmitāta izejas šķīdums: Ar precizitāti līdz 0,1 mg 100 ml mērkolbā nosver 80 mg A vitamīna palmitāta (3.12). Izšķīdina 2-propanolā (3.8) un uzpilda līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 1400 s. v. A vitamīna uz ml. Precīzais saturs jānosaka saskaņā ar 5.6.3.2.

3.13. 2,6 Di-terc-butil-4 metilfenols (BHT) (skat. novērojumu 7.5)

4. Iekārta

4.1. Rotācijas vakuumietvaicētājs

4.2. Brūnā stikla trauki

4.2.1. Plakandibena vai koniskās kolbas, 500 ml, ar pieslīpēta stikla uzmavu

4.2.2. Mērkolbas ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem, šaurkakla, 10, 25, 100 un 500 ml

4.2.3. Dalāmās piltuves, koniskas, 1000 ml ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem

4.2.4. Bumbierveida kolbas, 250 ml, ar pieslīpēta stikla uzmavām

4.3. Alīna dzesētājs, seguma garums 300 mm, ar pieslīpēta stikla savienojumu un adapteri gāzu padeves caurulei.

4.4. Kroku filtrs fāžu atdalīšanai, diametrs 185 mm (piemēram, Schleicher & Schuell 597 HY ½)

4.5. HPLC iekārta, ar iesmidzināšanas sistēmu

4.5.1. Šķidruma hromatogrāfijas kolonna, 250 mm x 4 mm, C18, 5 vai 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs (snieguma kritērijs: viens pīķis visiem retinola izomēriem HPLC)

4.5.2. UV vai fluorescences detektors, ar regulējamu viļņu garumu

4.6. Spektrofotometrs ar 10 mm kvarca šūnām

4.7. Ūdens vanna ar magnētisko maisītāju

4.8. Ekstrakcijas iekārta (skat. 1. attēlu), kas sastāv no:

4.8.1. Stikla cilindra ar 1 l kapacitāti, ar pieslīpēta stikla kaklu un aizbāzni;

4.8.2. Pieslīpēta stikla ieliktņa ar ņņņnņ sānu nozarojumu un regulējamu cauruli, kas iet caur centru. Lai virsējo šķidruma slāni cilindrā varētu novadīt uz dalāmo piltuvi, regulējamajai caurulei ir jābūt U veida apakšējam galam un sprauslai pretējā galā.

5. Procedūra

Piezīme:

Vitamīns A ir jutīgs pret (UV) gaismas un skābekļa iedarbību. Visas darbības būtu jāveic, izvairoties no gaismas klātbūtnes (izmantojot brūna stikla traukus vai stikla traukus, kas ir aizsargāti ar alumīnija foliju), kā arī no skābekļa klātbūtnes (noskalo ar slāpekli). Ekstrakcijas laikā gaiss virs šķidruma būtu jāaizstāj ar slāpekli (periodiski atbrīvojot aizbāzni, lai izvairītos no pārmērīga spiediena.)

5.1. Paraugu sagatavošana

Paraugu samaļ tā, lai tas izietu caur sietu ar 1 mm lielām acīm, un malšanas laikā nerastos siltums. Paraugs jāsamaļ tieši pirms svēršanas un pārziepjošanas, lai izvairītos no A vitamīna zudumiem.

5.2. Pārziepjošana

Atkarībā no A vitamīna satura 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1) ar precizitāti līdz 0,01 g nosver 2 g līdz 25 g parauga. Svārstot pakāpeniski pievieno 130 ml etanola (3.1), apmēram 100 mg BHT (3.13) un 2 ml nātrija askorbāta šķīduma (3.5), un 2 ml nātrija sulfīda šķīduma (3.6). Kolbai pievieno dzesētāju (4.3) un iegremdē kolbu ūdens vannā ar magnētisko maisītāju (4.7). Uzvāra un ļauj vārīties piecas minūtes. Tad caur dzesētāju (4.3) pievieno 25 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.4) un maisot lēnā slāpekļa plūsmā vāra vēl 25 minūtes. Tad noskalo dzesētāju ar apmēram 20 ml ūdens un kolbas saturu atdzesē līdz istabas temperatūrai.

5.3. Ekstrakcija

Pārziepjoto šķīdumu dekantējot kvantitatīvi, pārnes uz 1000 ml dalāmo (4.2.3) piltuvi vai ekstrakcijas iekārtu, noskalojot ar 250 ml ūdens (4.8). Pārziepjošanas kolbu pēc kārtas noskalo ar 25 ml etanola (3.1) un 100 ml petrolētera (3.2), un noskalojumus pārnes uz dalāmo piltuvi vai ekstrakcijas iekārtu. Ūdens un etanola attiecībai kombinētajos šķīdumos būtu jābūt 2:1. Enerģiski krata divas minūtes un divas minūtes ļauj nostādināties.

5.3.1. Ekstrakcija, izmantojot dalāmo piltuvi (4.2.3)

Kad slāņi ir atdalījušies (skat. novērojumu 7.3) petrolētera slāni pārnes uz citu dalāmo piltuvi (4.2.3). Ekstrakciju atkārto divas reizes ar 100 ml petrolētera (3.2) un divas reizes ar 50 ml petrolētera (3.2).

Kombinētos ekstraktus viegli svārstot, lai neveidotos emulsija, ar 100 ml ūdens porcijām divas reizes mazgā dalāmajā piltuvē, tad, atkārto kratot, ar jaunām 100 ml ūdens porcijām, līdz ūdens, pievienojot fenolftaleīna šķīdumu (3.7) paliek bezkrāsains (parasti pietiek ar četrām mazgāšanas reizēm). Lai atdalītu suspendēto ūdeni, mazgāto ekstraktu caur sausu kroku filtru fāžu atdalīšanai (4.4) filtrē 500 ml mērkolbā (4.2.2). Dalāmo piltuvi un filtru noskalo ar 50 ml petrolētera (3.2), uzpilda līdz zīmei ar petrolēteri (3.2) un rūpīgi samaisa.

5.3.2. Ekstrakcija, izmantojot ekstrakcijas iekārtu (4.8)

Kad slāņi ir atdalījušies (skat. novērojumu 7.3), stikla cilindra aizbāzni (4.8.1) nomaina ar pieslīpēta stikla ieliktni (4.8.2) un regulējamās caurules U veida galu novieto tā, lai tas atrastos tieši virs slāņu saskares līmeņa. Caur sānu nozarojumu ievadot slāpekli, augšējo petrolētera slāni pārnes uz 1000 ml dalāmo piltuvi (4.2.3). Stikla cilindrā ievieno 100 ml petrolētera (3.2), aizbāž un kārtīgi sakrata. Ļauj slāņiem atdalīties un pārnes augšējo slāni uz to pašu dalāmo piltuvi. Atkārto ekstrakciju ar papildus 100 ml petrolētera (3.2), tad divas reizes ar 50 ml petrolētera (3.2) porcijām, un petrolētera slāņus pārnes uz dalāmo piltuvi.

Kombinētos petrolētera ekstraktus mazgā, kā aprakstīts 5.3.1., un turpina rīkoties saskaņā ar šo punktu.

5.4. Parauga šķīduma sagatavošana HPLC

Alikvotu porciju petrolētera šķīduma ar pipeti pārnes (5.3.1. vai 5.3.2.) 250 ml bumbierveida kolbā (4.2.4). Rotācijas ietvaicētājā samazinātā spiedienā ūdens vannas temperatūrā, kas nepārsniedz 40 °C, iztvaicē šķīdinātāju, līdz gandrīz sauss. Atjauno atmosfēras spiedienu, pievienojot slāpekli (3.10) un izņem kolbu no rotācijas ietvaicētāja. Atlikušo šķīdinātāju aizvāc ar slāpekļa (3.10) plūsmu un nekavējoties izšķīdina nogulsnes zināmā tilpumā (10–100 ml) metanola (3.3) (A vitamīna koncentrācijai būtu jābūt no 5 s. v./ml līdz 30 s. v./ml).

5.5. Noteikšana ar HPLC

A vitamīnu atdala C18 apgrieztās fāzes kolonnā (4.5.1), un koncentrāciju izmēra ar UV detektoru (325 nm) vai fluorescences detektoru (ierosināšana: 325 nm, emisija: 475 nm) (4.5.2).

Alikvotu porciju (, piem., 20 μl) iesmidzina metanola šķīdumā, kas iegūts 5.4 un eluē ar kustīgo fāzi (3.9). Aprēķina vairāku viena parauga šķīduma injekciju vidējos pīķus (platību) un vairāku kalibrēšanas šķīdumu (5.6.2) injekciju vidējos pīķus (platību).

HPLC parametri

Paraugam piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie sniedz līdzvērtīgus rezultātus:

Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.5.1) | 250 mm x 4 mm, C18, 5 vai 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs |

Kustīgā fāze (3.9) | Metanola (3.3) un ūdens maisījums, piemēram, 980 + 20 (v + v) |

Plūsmas ātrums | 1–2 ml/min. |

Detektors (4.5.2) | UV detektors (325 nm) vai fluorescences detektors (ierosināšana: 325 nm/emisija 475 nm) |

5.6. Kalibrēšana

5.6.1. Standarta darba šķīdumu sagatavošana

20 ml A vitamīna acetāta izejas šķīduma (3.11.1) vai 20 ml A vitamīna palmitāta izejas šķīduma (3.12.1) ar pipeti pārnes 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1) un hidrolizē, kā norādīts 5.2, taču nepievienojot BHT. Tad ar petrolēteri (3.2) ekstrahē saskaņā ar 5.3 un uzpilda līdz zīmei ar petrolēteri (3.2). Rotācijas ietvaicētājā iztvaicē 100 ml šī ekstrakta (skat. 5.4), līdz gandrīz sauss, ar slāpekļa plūsmu (3.10) aizvāc atlikušo šķīdinātāju un atkārtoti šķīdina nogulsnes 10,0 ml metanola (3.3). Šī šķīduma nominālā koncentrācija ir 560 s. v. A vitamīna uz mililitru. Precīzu saturu nosaka saskaņā ar 5.6.3.3. Standarta darba šķīdums jāsagatavo tieši pirms lietošanas.

2,0 ml šā standarta darba šķīduma ar pipeti pārnes 20 ml mērkolbā, uzpilda līdz zīmei ar metanolu (3.3) un sajauc. Šā atšķaidītā darba šķīduma nominālā koncentrācija ir 56 s. v. A vitamīna uz mililitru.

5.6.2. Kalibrēšanas šķīduma un kalibrēšanas grafika sagatavošana.

1,0, 2,0, 5,0 un 10,0 ml atšķaidīta standarta darba šķīduma pārnes uz 20 ml mērkolbu rindu, uzpilda līdz zīmei ar metanolu (3.3) un sajauc. Šo šķīdumu nominālās koncentrācijas ir 2,8, 5,6, 14,0, un 28,0 s. v. A vitamīna uz mililitru.

20 μl katra kalibrēšanas šķīduma iesmidzina vairākas reizes un nosaka vidējos pīķus (platības). Izmantojot vidējos pīķus (platības), izveido kalibrēšanas grafiku, kas satur UV kontroles (5.6.3.3) rezultātus.

5.6.3. Standartšķīdumu UV standartizācija

5.6.3.1. A vitamīna acetāta izejas šķīdums

2,0 ml A vitamīna acetāta izejas šķīduma (3.11.1) ar pipeti pārnes 50 ml mērkolbā (4.2.2) un uzpilda līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 56 s. v. A vitamīna uz mililitru. 3,0 ml šā atšķaidītā A vitamīna šķīduma ar pipeti pārnes 25 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8). Šī šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 s. v. A vitamīna uz mililitru. Šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā salīdzina ar 2-propanola (3.8) spektru intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Ekstinkcijas maksimumam ir jābūt starp 325 nm un 327 nm.

A vitamīna satura aprēķināšana:

+++++ TIFF +++++

5.6.3.2. A vitamīna palmitāta izejas šķīdums

2,0 ml A vitamīna acetāta izejas šķīduma (3.12.1) 5 ar pipeti pārnes 50 ml mērkolbā (4.2.2) un uzpilda līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 56 s. v. A vitamīna uz mililitru. 3,0 ml šī atšķaidītā A vitamīna šķīduma ar pipeti pārnes 25 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8). Šī šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 s. v. A vitamīna uz mililitru. Šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā salīdzina ar 2-propanola (3.8) spektru intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Ekstinkcijas maksimumam ir jābūt starp 325 nm un 327 nm.

A vitamīna satura aprēķināšana:

+++++ TIFF +++++

5.6.3.3. A vitamīna standarta darba šķīdums

3,0 ml neatšķaidīta A vitamīna standarta darba šķīduma, kas sagatavots saskaņā ar 5.6.1, ar pipeti pārnes 50 ml mērkolbā (4.2.2) un uzpilda līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8). 5,0 ml šī šķīduma ar pipeti pārnes 25 ml mērkolbā un uzpilda līdz zīmei ar 2-propanolu (3.8). Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 6,72 s. v. A vitamīna uz mililitru. Šī šķīduma UV spektru spektrofotometrā salīdzina ar 2-propanola (3.8) spektru intervālā no 300 nm līdz 400 nm. Ekstinkcijas maksimumam ir jābūt starp 325 nm un 327 nm.

A vitamīna satura aprēķināšana:

+++++ TIFF +++++

6. Rezultātu aprēķināšana

Izmantojot A vitamīna vidējos pīķus (platības) parauga šķīdumā, atsaucoties uz kalibrēšanas grafiku (5.6.2), nosaka parauga šķīduma koncentrāciju s. v./ml.

A vitamīna saturu w paraugā s. v./kg aprēķina, izmantojot šādu formulu:

w =

500 . β . V

. 1000

V

. m

kur:

β = A vitamīna koncentrācija s. v./ml parauga šķīdumā (5.4),

V1 = parauga šķīduma (5.4) tilpums ml,

V2 = 5.4 ņemtā alikvota tilpums,

m = testa porcijas masa g.

7. Novērojumi

7.1. Paraugiem ar zemu A vitamīna koncentrāciju būtu derīgi kombinēt petrolētera ekstraktus no divām pārziepjošanas reizēm (svērtais daudzums: 25 g vienam HPLC parauga šķīdumam.

7.2. Analīzei ņemtais paraugs nedrīkst saturēt vairāk kā 2 g tauku.

7.3. Ja fāzes neatdalās, lai izjauktu emulsiju, pievieno apmēram 10 ml etanola (3.1).

7.4. Mencu aknu eļļai un citiem tīriem taukiem pārziepjošanas laiks ir jāpagarina līdz 45–60 minūtēm.

7.5. BHT vietā var izmantot hidrohinonu.

7.6. Izmantojot normālās fāzes kolonnu, var atdalīt retinola izomērus.

7.7. Askorbāta šķīduma vietā var izmantot apmēram 150 ml askorbīnskābes.

7.8. Nātrija sulfīda šķīduma vietā var izmantot apmēram 50 mg EDTA.

8. Atkārtojamība

Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 15 % no lielākā rezultāta.

9. Salīdzinošā pētījuma rezultāti [1]

L : laboratoriju skaits

n : atsevišķu vērtību skaits

sr : atkārtojamības standarta novirze

sR : reproducējamības standarta novirze

r : atkārtojamība

R : reproducējamība

CVr : atkārtojamības variāciju koeficients

CVR : reproducējamības variāciju koeficients

| Premikss | Barības premikss | Minerālvielu koncentrāts | Olbaltumvielu barība | Sivēniem |

L: | 13 | 12 | 13 | 12 | 13 |

n | 48 | 45 | 47 | 46 | 49 |

vidējais [s. v./kg] | 17,02 x 106 | 1,21 x 106 | 537100 | 151800 | 18070 |

sr [s. v./kg] | 0,51 x 106 | 0,039 x 106 | 22080 | 12280 | 682 |

r [s. v./kg] | 1,43 x 106 | 0,109 x 106 | 61824 | 34384 | 1910 |

CVr [%] | 3,0 | 3,5 | 4,1 | 8,1 | 3,8 |

sR [s. v./kg] | 1,36 x 106 | 0,069 x 106 | 46300 | 23060 | 3614 |

R [s. v./kg] | 3,81 x 106 | 0,193 x 106 | 129640 | 64568 | 10119 |

CVR [%] | 8,0 | 6,2 | 8,6 | 15 | 20 |

+++++ TIFF +++++

B DAĻA E VITAMĪNA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un piemērojuma joma

Šo metodi izmanto E vitamīna noteikšanai barībā un premiksos. E vitamīna saturu izsaka kā DL- α -tokoferola acetātu mg uz kg. 1 mg DL-α-tokoferola acetāta atbilst 0,91 mg DL-α-tokoferola (vitamīna E).

Mazākais nosakāmais daudzums ir 2 mg E vitamīna/kg.

2. Princips

Paraugu hidrolizē ar kālija hidroksīda šķīdumu etanolā, un E vitamīnu ekstrahē petrolēterī. Šķīdinātāju aizvāc iztvaicējot, nogulsnes šķīdina metanolā un, ja vajadzīgs, atšķaida līdz nepieciešamajai koncentrācijai. E vitamīna saturu nosaka ar apgrieztās fāzes augstas izšķiršanas šķidruma hromatogrāfiju (RF-HPLC), izmantojot fluorescences vai UV detektoru.

3. Reaģenti

3.1. Etanols, σ = 96 %

3.2. Petrolēteris, vārīšanās diapazons 40 °C – 60 °C

3.3. Metanols

3.4. Nātrija hidroksīda šķīdums, β = 50 g/100 ml

3.5. Nātrija askorbāta šķīdums, β = 10 g/100 ml (skat. novērojumu 7.7)

3.6. Nātrija sulfīds, Na2S · x H2O (x = 7 – 9)

3.6.1. Nātrija sulfīda šķīdums, c = 0,5 mol/l glicerīnā, β = 120 g/l (ja x = 9) (skat. novērojumu 7.8)

3.7. Fenolftaleīna šķīdums, β = 2 g/100 ml etanolā (3.1)

3.8. Kustīgā fāze HPCL: metanola (3.3) un ūdens maisījums, piemēram, 980 + 20 (v + v). Precīzu attiecību nosaka izmantotās kolonnas īpašības.

3.9. Slāpeklis, bez skābekļa

3.10. DL-α-tokoferola acetāts, īpaši tīrs, ar sertificētu aktivitāti

3.10.1. DL-α-tokoferola acetāta izejas šķīdums: Ar precizitāti līdz 0,1 mg 100 ml mērkolbā nosver 100 mg DL-α-tokoferola acetāta (3.10). Izšķīdina etanolā (3.1) un uzpilda līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju. 1 ml šī šķīduma satur 1 mg DL-α-tokoferola acetāta. (UV kontrole, skat. 5.6.1.3. stabilizācija skat. novērojumu 7.4).

3.11. DL-α-tokoferola acetāts, īpaši tīrs, ar sertificētu aktivitāti

3.11.1. Ar precizitāti līdz 0,1 mg 100 ml mērkolbā nosver 100 ml DL-α-tokoferola (3.10). Šķīdina etanolā (3.1) un uzpilda līdz zīmei ar to pašu šķīdinātāju. 1 ml šā šķīduma satur 1 mg DL-α-tokoferola. (UV kontrole, skat. 5.6.2.3; stabilizācija – skat. novērojumu 7.4).

3.12. 2,6-Di-terc-butil-4-metilfenols (BHT) (skat. novērojumu 7.5)

4. Iekārta

4.1. Rotācijas vakuumietvaicētājs

4.2. Brūnā stikla trauki

4.2.1. Plakandibena vai koniskās kolbas, 500 ml, ar pieslīpēta stikla uzmavu

4.2.2. Mērkolbas ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem, šaurkakla, 10, 25, 100 un 500 ml

4.2.3. Dalāmās piltuves, koniskas, 1000 ml, ar pieslīpēta stikla aizbāžņiem

4.2.4. Bumbierveida kolbas, 250 ml, ar pieslīpēta stikla uzmavām

4.3. Alīna dzesētājs, seguma garums 300 mm, ar pieslīpēta stikla savienojumu un adapteri gāzu padeves caurulei.

4.4. Kroku filtrs fāžu atdalīšanai, diametrs 185 mm (piemēram, Schleicher & Schuell 597 HY ½)

4.5. HPLC iekārta ar iesmidzināšanas sistēmu

4.5.1. Šķidruma hromatogrāfijas kolonna, 250 mm x 4 mm, C18, 5 vai 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs (darbības kritērijs: viens pīķis visiem retinola izomēriem HPLC)

4.5.2. UV vai fluorescences detektors ar regulējamu viļņu garumu

4.6. Spektrofotometrs ar 10 mm kvarca šūnām

4.7. Ūdens vanna ar magnētisko maisītāju

4.8. Ekstrakcijas iekārta (skat. 1. attēlu), kas sastāv no:

4.8.1. Stikla cilindra ar 1 l kapacitāti, ar pieslīpēta stikla kaklu un aizbāzni

4.8.2. Pieslīpēta stikla ieliktnis ar sānu nozarojumu un regulējamu cauruli, kas iet caur centru. Regulējamajai caurulei ir jābūt U veida apakšējam galam un sprauslai pretējā galā, lai virsējo šķidruma slāni cilindrā varētu novadīt uz dalāmo piltuvi

5. Procedūra

Piezīme:

Vitamīns E ir jūtīgs pret (UV) gaismu un skābekļa iedarbību Visas darbības būtu jāveic, izvairoties no gaismas klātbūtnes (izmantojot brūna stikla traukus vai stikla traukus, kas ir aizsargāti ar alumīnija foliju), kā arī no skābekļa klātbūtnes (noskalo ar slāpekli). Ekstrakcijas laikā gaiss virs šķidruma būtu jāaizstāj ar slāpekli (periodiski atbrīvojot aizbāzni, lai izvairītos no pārmērīga spiediena).

5.1. Paraugu sagatavošana

Paraugu samaļ tā, lai tas izietu caur sietu ar 1 mm lielām acīm un malšanas laikā nerastos siltums. Lai izvairītos no E vitamīna zudumiem, paraugs jāsamaļ tieši pirms svēršanas un pārziepjošanas.

5.2. Pārziepjošana

Atkarībā no E vitamīna satura 500 ml plakandibena vai koniskā kolbā (4.2.1) ar precizitāti līdz 0,01 g nosver 2 g līdz 25 g parauga. Kratot pakāpeniski pievieno 130 ml etanola (3.1), apmēram 100 mg BHT (3.12) un 2 ml nātrija askorbāta šķīduma (3.5), un 2 ml nātrija sulfīda šķīduma (3.6). Kolbai pievieno dzesētāju (4.3) un iegremdē kolbu ūdens vannā ar magnētisko maisītāju (4.7). Uzvāra un ļauj vārīties ar atteces dzesinātāju piecas minūtes. Tad caur dzesētāju (4.3) pievieno 25 ml kālija hidroksīda šķīduma (3.4) un lēnā slāpekļa plūsmā maisot vāra vēl 25 minūtes. Tad noskalo dzesētāju ar apmēram 20 ml ūdens un atdzesē kolbas saturu līdz istabas temperatūrai.

5.3. Ekstrakcija

Pārziepjoto šķīdumu dekantējot kvantitatīvi pārnes uz 1000 ml dalāmo (4.2.3) piltuvi vai ekstrakcijas iekārtu, noskalojot ar 250 ml ūdens (4.8). Pārziepjošanas kolbu pēc kārtas noskalo ar 25 ml etanola (3.1) un 100 ml petrolētera (3.2), un noskalojumus pārnes uz dalāmo piltuvi vai ekstrakcijas iekārtu. Ūdens un etanola attiecībai kombinētajos šķīdumos būtu jābūt 2:1. Enerģiski krata divas minūtes, un divas minūtes ļauj nostāties.

5.3.1. Ekstrakcija ar dalāmo piltuvi (4.2.3)

Kad slāņi ir atdalījušies (skat. novērojumu 7.3), petrolētera slāni pārnes uz citu dalāmo piltuvi (4.2.3). Ekstrakciju divas reizes atkārto ar 100 ml petrolētera (3.2) un divas reizes – ar 50 mililitrus petrolētera (3.2).

Kombinētos ekstraktus divas reizes mazgā dalāmajā piltuvē ar 100 ml ūdens porcijām, viegli kratot, lai neveidotos emulsija, tad, atkārtoti kratot, ar jaunām 100 ml ūdens porcijām, līdz ūdens, pievienojot fenolftaleīna šķīdumu, (3.7) paliek bezkrāsains (parasti pietiek ar četrām mazgāšanas reizēm). Lai atdalītu suspendētu ūdeni, mazgāto ekstraktu caur sausu kroku filtru fāžu atdalīšanai (4.4.) filtrē 500 ml mērkolbā (4.2.2). Dalāmo piltuvi un filtru noskalo ar 50 ml petrolētera (3.2), uzpilda līdz zīmei ar petrolēteri (3.2) un rūpīgi samaisa.

5.3.2. Ekstrakcija ar ekstrakcijas iekārtu (4.8)

Kad slāņi ir atdalījušies (skat. novērojumu 7.3), stikla cilindra aizbāzni (4.8.1) nomaina ar pieslīpēta stikla ieliktni (4.8.2) un regulējamās caurules U veida galu novieto tā, lai tas atrastos tieši virs slāņu saskares līmeņa. Ievadot slāpekli caur sānu nozarojumu, pārnes augšējo petrolētera slāni uz 1000 ml dalāmo piltuvi (4.2.3). Stikla cilindrā ievieno 100 ml petrolētera (3.2), aizdara ar aizbāzni un kārtīgi sakrata. Ļauj slāņiem atdalīties un pārnes augšējo slāni uz to pašu dalāmo piltuvi, ko iepriekš. Atkārto ekstrakciju ar papildus 100 ml petrolētera (3.2), tad divas reizes ar 50 ml petrolētera (3.2) porcijām, un pārnes petrolētera slāņus uz dalāmo piltuvi.

Mazgā kombinētos petrolētera ekstraktus kā 5.3.1. un turpina rīkoties saskaņā ar šo punktu.

5.4. Parauga šķīduma sagatavošana HPLC

Alikvotu porciju petrolētera šķīduma (5.3.1. vai 5.3.2.) ar pipeti pārnes 250 ml bumbierveida kolbā (4.2.4). Rotācijas ietvaicētājā samazinātā spiedienā ūdens vannas temperatūrā, kas nepārsniedz 40 °C, iztvaicē šķīdinātāju, līdz gandrīz sauss. Pievadot slāpekli (3.9), atjauno atmosfēras spiedienu un izņem kolbu no rotācijas ietvaicētāja. Atlikušo šķīdinātāju aizvāc ar slāpekļa (3.9) plūsmu un nekavējoties izšķīdina nogulsnes zināmā tilpumā (10–100 ml) metanola (3.3) (DL-α-tokoferola koncentrācijai būtu jābūt no 5 μg/ml līdz 30 g/ml).

5.5. Noteikšana ar HPLC

E vitamīnu atdala C18 apgrieztās fāzes kolonnā (4.5.1) un koncentrāciju izmēra ar UV detektoru (325 nm) vai fluorescences detektoru (ierosināšana: 295 nm, emisija: 330 nm) vai UV detektoru (295 nm) (4.5.2).

Alikvotu porciju (piemēram, 20 μl) iesmidzina metanola šķīdumā, kas iegūts 5.4 un eluē ar kustīgo fāzi (3.8). Aprēķina vairāku viena parauga šķīduma injekciju vidējos pīķus (platību) un vairāku kalibrēšanas šķīdumu (5.6.2) injekciju vidējos pīķus (platību).

HPLC parametri

Paraugam piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie nodrošina līdzvērtīgus rezultātus.

Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.5.1): | 250 mm x 4 mm, C18, 5 vai 10 μm pakojums vai līdzvērtīgs |

Kustīgā fāze (3.8): | Metanola (3.3) un ūdens maisījums, piemēram, 980 + 20 (v + v) |

Plūsmas ātrums: | 1 – 2 ml/min |

Detektors (4.5.2): | Fluorescences detektors (ierosināšana: 295 nm/emisija: 330 nm) vai UV detektors (292 nm) |

5.6. Kalibrēšana (DL-α-tokoferola acetāts vai. DL-α-tokoferols)

5.6.1. DL-α-tokoferola acetāts, standarta

5.6.1.1. Standarta darba šķīduma sagatavošana

25 ml DL-α-tokoferola acetāta izejas šķīduma (3.10.1) ar pipeti pārnes uz 500 ml plakandibena vai konisko kolbu (4.2.1) un hidrolizē saskaņā ar 5.2. Tad ekstrahē ar petrolēteri (3.2) saskaņā ar 5.3 un ar petrolēteri uzpilda līdz 500 ml tilpumam. Rotācijas ietvaicētājā iztvaicē 25 ml šā ekstrakta (skat. 5.4), līdz gandrīz sauss, aizvāc atlikušo šķīdinātāju ar slāpekļa plūsmu (3.9) un atkārtoti šķīdina nogulsnes 25,0 ml metanola (3.3) Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 45,5 μg DL-α-tokoferola uz ml, kas atbilst 50 μg DL-α-tokoferola acetāta uz ml. Standarta darba šķīdums jāsagatavo tieši pirms lietošanas.

5.6.1.2. Kalibrēšanas šķīduma un kalibrēšanas grafika sagatavošana

1,0, 2,0, 4,0 un 10,0 ml atšķaidīta standarta darba šķīduma pārnes uz 20 ml mērkolbu rindu, ar metanolu (3.3) uzpilda līdz zīmei un sajauc. Šo šķīdumu nominālās koncentrācijas ir 2,5, 5,0, 10,0 un 25,0 μg/ml DL-α-tokoferola acetāta, tas ir 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml un 22,8 μg/ml DL-α-tokoferola.

Katru kalibrēšanas šķīdumu iesmidzina vairākas reizes un nosaka vidējos pīķus (platības). Izmantojot vidējos pīķus (platības), izveido kalibrēšanas grafiku.

5.6.1.3 5.6.1.3. DL-α-tokoferola acetāta izejas šķīduma (3.10.1) UV standartizācija

5,0 ml DL-α-tokoferola acetāta izejas šķīduma (3.10.1) atšķaida ar etanolu līdz 25,0 ml un šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā (4.6) salīdzina ar etanola (3.1) spektru starp 250 nm un 320 nm.

Absorbcijas maksimumam ir jābūt ap 284 nm:

+++++ TIFF +++++

Šādā atšķaidījumā jāiegūst ekstinkcijas vērtība no 0,84 līdz 0,88.

5.6.2. DL-α-tokoferola standarts

5.6.2.1. Standarta darba šķīduma sagatavošana

2,0 ml DL-α-tokoferola izejas šķīduma (3.11.1) ar pipeti pārnes 50 ml mērkolbā, izšķīdina metanolā (3.3) un uzpilda līdz zīmei ar metanolu. Šā šķīduma nominālā koncentrācija ir 40 μg DL-α-tokoferola uz ml, līdzvērtīga 44,0 μg DL-α-tokoferola acetāta uz ml. Standarta darba šķīdums ir jāsagatavo tieši pirms lietošanas.

5.6.2.2. Kalibrēšanas šķīdumu un kalibrēšanas grafiku sagatavošana

1,0, 2,0, 4,0 un 10,0 ml standarta darba šķīduma pārnes uz 20 ml mērkolbu rindu, uzpilda līdz zīmei ar metanolu (3.3) un sajauc. Šo šķīdumu nominālās koncentrācijas ir 2,0, 4,0, 8,0 un 20,0 μg/ml DL-α-tokoferola, tas ir, 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml un 22,0 μg/ml DL-α-tokoferola acetāta.

20 μl katra kalibrācijas šķīduma iesmidzina vairākas reizes un nosaka vidējos pīķus (platības). Izmantojot vidējos pīķus (platības), izveido kalibrēšanas grafiku.

5.6.2.3. DL-α-tokoferola izejas šķīduma (3.11.1) UV standartizācija

2,0 ml DL-α-tokoferola izejas šķīduma (3.11.1) atšķaida ar etanolu līdz 25,0 ml un šā šķīduma UV spektru spektrofotometrā (4.6) salīdzina ar etanola (3.1) spektru starp 250 nm un 320 nm. Absorbcijas maksimumam būtu jābūt ap 292 nm:

+++++ TIFF +++++

Šajā atšķaidījumā ekstinkcijas līmenim jābūt 0,6.

6. Rezultātu aprēķināšana

Izmantojot parauga šķīduma vidējo pīķi (platību), nosaka parauga šķīduma koncentrāciju μg/ml (izsakot kā α -tokoferola acetātu), atsaucoties uz kalibrēšanas grafiku (5.6.1.2 vai 5.6.2.2)

E vitamīna saturu paraugā aprēķina, izmantojot šādu formulu:

+++++ TIFF +++++

kurā:

β = E vitamīna koncentrācija parauga šķīdumā (5.4) μg/ml,

V1 = parauga šķīduma tilpums (5.4) ml,

V2 = 5.4 ņemtā alikvota tilpums ml,

m = testa porcijas masa, kas izteikta g.

7. Novērojumi

7.1. Paraugiem ar zemu E vitamīna koncentrāciju var būt lietderīgi kombinēt divu pārziepjošanas reižu petrolētera ekstraktus (svērtais apjoms: 25 g) vienam parauga šķīduma HPLC noteikšanai)

7.2. Analīzei ņemtais paraugs nedrīkst saturēt vairāk kā 2 g tauku.

7.3. Ja fāzes neatdalās, pievieno apmēram 10 ml etanola, lai izjauktu emulsiju (3.1).

7.4. Pēc DL- α - tokoferola acetāta vai DL- α - tokoferola šķīduma saskaņā ar 5.6.1.3. vai 5.6.2.3. spektrofotometriskajiem mērījumiem šķīdumam (3.10.1 vai 3.10.2) pievieno apmēram 10 mg BHT (3.12) un tur šķīdumu ledusskapī (ne ilgāk par četrām nedēļām).

7.5. BHT vietā var izmantot hidrohinonu.

7.6. Izmantojot normālās fāzes kolonnu, var atdalīt α -, β-, χ-, δ- tokoferolu.

7.7. Nātrija askorbāta šķīduma vietā var izmantot apmēram 150 mg askorbīnskābes.

7.8. Nātrija sulfīda šķīduma vietā var izmantot apmēram 50 mg EDTA.

8. Atkārtojamība

Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 15 % no lielākā rezultāta.

9. Salīdzinošā pētījuma rezultāti [2]

L : laboratoriju skaits

n : atsevišķu vērtību skaits

sr : atkārtojamības standarta novirzes

sR : reproducējamības standarta novirzes

r : atkārtojamība

R : reproducējamība

CVr : atkārtojamības variāciju koeficients

CVR : reproducējamības variāciju koeficients

| Premikss | Premiksa barība | Minerālvielu koncentrāts | Olbaltumvielu barība | Sivēniem |

L: | 12 | 12 | 12 | 12 | 12 |

n | 48 | 48 | 48 | 48 | 48 |

vidējais [mg/kg] | 17380 | 1187 | 926 | 315 | 61,3 |

sr [mg/kg] | 384 | 45,3 | 25,2 | 13,0 | 2,3 |

r [mg/kg] | 1075 | 126,8 | 70,6 | 36,4 | 6,4 |

CVr [%] | 2,2 | 3,8 | 2,7 | 4,1 | 3,8 |

vidējais [mg/kg] | 830 | 65,0 | 55,5 | 18,9 | 7,8 |

sR [mg/kg] | 2324 | 182,0 | 155,4 | 52,9 | 21,8 |

CVR [%] | 4,8 | 5,5 | 6,0 | 6,0 | 12,7 |

+++++ TIFF +++++

C DAĻA TRIPTOFĀNA NOTEIKŠANA

1. Mērķis un darbības joma

Šo metodi izmanto kopējā un brīvā triptofāna noteikšanai barībā. Tā neizšķir D un L formas.

2. Princips

Lai noteiktu kopējo triptofāna saturu, paraugu sārmainā vidē hidrolizē ar piesātinātu bārija hidroksīda šķīdumu un 20 stundas karsē 110 °C temperatūrā. Pēc hidrolīzes pievieno iekšējo standartu.

Lai noteiktu brīvo triptofānu, paraugu iekšējā standarta klātbūtnē ekstrahē viegli skābā vidē.

Triptofānu un iekšējo standartu hidrolizātā vai ekstraktā nosaka, izmantojot HPLC ar fluorescences detektoru.

3. Reaģenti

3.1. Divreiz destilēts ūdens vai līdzvērtīgas kvalitātes ūdens (vadītspēja < 10 μS/cm)

3.2. Standarta substance: triptofāns (tīrība/saturu ≥ 99 %) žāvēts vakuumā virs fosfora pentoksīda

3.3. Iekšējā standarta substance: α-metil-triptofāns (tīrība/saturs ≥ 99 %), žāvēts vakuumā virs fosfora pentoksīda

3.4. Bārija hidroksīda oktahidrāts (jārūpējas, lai Ba(OH)2 •8 H2O ilgstoši nepakļautu gaisa iedarbībai, lai izvairītos no BaCO3 veidošanās, kas varētu traucēt noteikšanu) (skat. novērojumu 9.3)

3.5. Nātrija hidroksīds

3.6. Ortofosforskābe, w = 85 %

3.7. Sālsskābe, ρ 20 = 1,19 g/ml

3.8. Metanols, HPLC kvalitāte

3.9. Petrolēteris, vārīšanās intervāls 40 – 60 °C

3.10. Nātrija hidroksīda šķīdums, c = 1 mol/l:

40,0 g NaOH (3.5) izšķīdina ūdenī un uzpilda līdz 1 l ar ūdeni (3.1).

3.11. Sālsskābe, c = 6 mol/l:

ņem 492 ml HCl (3.7) un uzpilda līdz 1 l ar ūdeni.

3.12. Sālsskābe, c = 1 mol/l:

ņem 82 ml HCl (3.7) un uzpilda līdz 1 l ar ūdeni.

3.13. Sālsskābe, c = 0,1 mol/l:

ņem 8,2 ml HCl (3.7) un uzpilda līdz 1 l ar ūdeni

3.14. Ortofosforskābe, c = 0,5 mol/l:

Ņem 34 ml ortofosforskābes (3.6) un uzpilda līdz 1 l ar ūdeni (3.1)

3.15. Koncentrēts triptofāna (3.2) šķīdums, c = 2,50 μmol/ml:

500 ml mērkolbā sālsskābē (3.12) izšķīdina 0,2553 g triptofāna (3.2) un uzpilda līdz zīmei ar sālsskābi (3.13). Glabā –18.°C ne ilgāk kā četras nedēļas.

3.16. Koncentrēts iekšējā standarta šķīdums, c = 2,50 μmol/ml:

500 ml mērkolbā sālsskābē (3.13) šķīdina 0,2728 g α -metiltriptofāna (3.3) un uzpilda līdz zīmei ar sālsskābi (3.13). Glabā –18.°C ne ilgāk kā četras nedēļas.

3.17. Triptofāna un iekšējā standarta kalibrēšanas šķīdums:

ņem 2,00 ml koncentrēta triptofāna (3.15) šķīduma un 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (α-metil-triptofāna) šķīduma (3.16) Atšķaida ar ūdeni (3.1) un metanolu (3.8) līdz aptuveni tam pašam tilpumam un metanola koncentrācijai (10–30 %), kā iegūtajā hidrolizātā.

Šis šķīdums jāsagatavo tieši pirms lietošanas.

Sagatavošanas laikā aizsargāt no tiešas saules gaismas

3.18. Etiķskābe

3.19. 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanols

3.20. Etanolamīns > 98 %

3.21. 1 g 1,1,1-trihlor-2-metil-2-propanola (3.19) šķīdums 100 ml metanola (3.8)

3.22. Kustīgā fāze HPLC: 3,00 g etiķskābes (3.18) + 900 ml ūdens (3.1) + 50,0 ml 1,1,1-trihlor-2-metil-2- propanola (3.19) šķīduma (3.21) metanolā (3.8) (1g/100 ml). Izmantojot etanolamīnu (3.20), koriģē pH līdz 5,00. Uzpilda ar ūdeni (3.1) līdz 1000 ml.

4. Iekārta

4.1. HPLC iekārta ar spektrofluorometrijas noteicēju

4.2. Šķidruma hromatogrāfijas kolonna, 125 mm x 4mm, C18, 3 μm pakojums vai līdzvērtīgs

4.3. pH-metrs

4.4. Polipropilēna kolba ar 125 ml tilpumu, ar platu kaklu un skrūvējamu vāciņu.

4.5. Membrānas filtrs, 0,45 μm

4.6. Autoklāvs, 110 (± 2) °C, 1,4 (± 0,1) bāri

4.7. Mehāniskais kratītājs vai magnētiskais maisītājs

4.8. Virpuļmaisītājs

5. Procedūra

5.1. Parauga sagatavošana

Paraugu samaļ, lai tas izietu cauri 0,5 mm sietu. Paraugus ar augstu mitruma saturu pirms malšanas žāvē gaisā, temperatūrā, kas nepārsniedz 50.°C, vai žāvē pirms malšanas. Paraugus ar augstu tauku saturu pirms malšanas ekstrahē ar petrolēteri.

5.2. Brīvā triptofāna (ekstrakta) noteikšana

Piemērotu sagatavotā parauga (5.1) apjomu (1 – 5 g) nosver koniskā kolbā ar precizitāti līdz 1 mg. Pievieno 100,0 ml sālsskābes, c = 0,1 mol/l (3.13) un 5,00 ml koncentrēta iekšējā standarta šķīduma (3.16). 60 minūtes krata vai maisa, izmantojot mehānisko kratītāju vai magnētisko maisītāju (4.7). Ļauj izgulsnēties nogulsnēm un 10,0 ml centrifugāta ar pipeti pārnes vārglāzē. Pievieno 5 ml ortofosforskābes, c = 0,5 mol/l (3.14). Izmantojot nātrija hidroksīdu c = 1,0 mol/l (3.10), koriģē pH līmeni līdz 3,0 Pievieno pietiekami daudz metanola (3.8), lai metanola koncentrācija galīgajā tilpumā būtu starp 10 un 30 %. Piemērotu tilpumu pārnes uz mērkolbu un atšķaida ar ūdeni līdz hromatogrāfijai nepieciešamajam tilpumam (apmēram tas pats tilpums kā kalibrēšanas standartšķīdumam (3.17)).

Pirms iesmidzināšanas HPLC dažus ml šķīduma filtrē caur 0,45 μm membrānas filtru (4.5). Turpina hromatogrāfiju saskaņā ar 5.4.

Standartšķīdumu un ekstraktus aizsargā no tiešas saules gaismas. Ja ekstraktus nav iespējams analizēt tajā pašā dienā, tos var glabāt 5 °C temperatūrā ne ilgāk kā trīs dienas.

5.3. Kopējā triptofāna (hidrolizāta) satura noteikšana

Polipropilēna kolbā (4.4) ar precizitāti līdz 0,2 mg nosver 0,1 līdz 1 g sagatavotā parauga. Nosvērtajā parauga porcijā būtu jābūt apmēram 10 mg slāpekļa. Pievieno 8,4 g bārija hidroksīda oktahidrāta (3.4) un 10 ml ūdens. Maisa virpuļmaisītājā (4.8) vai magnētiskajā maisītājā (4.7). Maisījumā atstāj magnētu, kas pārklāts ar teflonu. Trauka sieniņas noskalo ar 4 ml ūdens. Kolbai uzliek skrūvējamo vāciņu un vaļīgi aiztaisa. Ieliek autoklāvā (4.6) ar verdošu ūdeni un tvaicē 30–60 minūtes). Aizver autoklāvu un 20 stundas karsē 110 (± 2 °C) temperatūrā.

Pirms autoklāva atvēršanas temperatūru samazina tieši zem 100 °C. Lai novērstu Ba(OH)2 ·8 H2O kristalizēšanos, siltajam maisījumam pievieno 30 ml ūdens istabas temperatūrā. Viegli krata vai maisa. Pievieno 2,00 ml koncentrēta iekšējā standarta (α -metil-triptofāna) šķīduma (3.16). Trauku 15 minūtes atdzesē ūdens/ledus vannā.

Tad pievieno 5 ml ortofosforskābes, c = 0,5 mol/l (3.14). Tur trauku dzesēšanas vannā un maisot neitralizē ar HCl, c = 6 mol/l (3.11) un koriģē pH līmeni, pievienojot HCl, c = 1 mol/l (3.12). Pievieno pietiekami daudz metanola, lai galīgajā tilpumā metanola koncentrācija būtu starp 10 % un 30 %. Pārnes uz piemērota tilpuma mērkolbu un atšķaida ar ūdeni līdz definētajam tilpumam, kas nepieciešamas hromatogrāfijai (piemēram, 100 ml). Metanola pievienošana nedrīkstētu izraisīt izgulsnēšanos.

Dažus ml šķīduma pirms iesmidzināšanas HPLC filtrē caur 0,45 μm membrānas filtru (4.5). Turpina hromatogrāfiju saskaņā ar 5.4.

Standarta šķīdumu un hidrolizātus sargā no tiešas saules gaismas iedarbības. Ja hidrolizātus nav iespējams analizēt tajā pašā dienā, tos var uzglabāt 5 °C temperatūrā ne vairāk kā trīs dienas.

5.4. HPLC noteikšana

Izokrātiskai eluēšanai piedāvā šādus parametrus; var izmantot citus parametrus, ja tie dod līdzvērtīgus rezultātus (skat. arī novērojumus 9.1 un 9.2):

Šķidruma hromatogrāfijas kolonna (4.2): | 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm pakojuma, vai līdzvērtīgs |

Kolonnas temperatūra: | Telpu temperatūra |

Kustīgā fāze: | 3,00 g etiķskābes (3.18) + 900 ml ūdens (3.1)+ 50,0 ml 1,1,1,-trihlor-2-metil-2-propanola šķīduma (3.21) metanolā (3.8) (1 g/mol) Izmantojot etanolamīnu (3.20), koriģē pH līdz 5,00. Uzpilda ar ūdeni (3.1) līdz 1000 ml. |

Plūsmas ātrums: | 1 ml/min. |

Kopējais norises laiks: | apmēram 34 min. |

Viļņu garums noteikšanai: | ierosināšana: 280 nm, emisija: 356 nm |

Iesmidzināmais tilpums: | 20 μl |

6. Rezultātu aprēķināšana

+++++ TIFF +++++

A = iekšējā standarta pīķis, kalibrēšanas standartšķīdums (3.17)

B = triptofāna, ekstrakta (5.2) vai hidrolizāta (5.3) pīķis

C = koncentrāta triptofāna šķīduma (3.15) tilpums ml (2 ml), ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17)

D = koncentrēta triptofāna šķīduma (3.15) koncentrācija μmo/ml (= 2,50), ko pievieno kalibrēšanas šķīdumam (3.17)

E = koncentrēta iekšējā standarta šķīduma (3.16) tilpums, kas pievienots ekstrakcijā (5.2) vai hidrolizātam (5.3) (= 2,00 ml)

F = iekšējā standarta, ekstrakta (5.2) vai hidrolizāta (5.3) pīķis

G = triptofāna, kalibrēšanas standartšķīduma (3.17) pīķis

H = koncentrēta iekšējā standarta šķīduma (3.16) tilpums ml, ko pievieno kalibrēšanas standartšķīdumam (3.17)

W = parauga masa g (koriģēta atbilstoši sākotnējai masai, ja paraugs ir žāvēts un/vai attaukots)

MW = triptofāna molekulmasa (= 204,23)

7. Atkārtojamība

Atšķirība starp divu paralēli veiktu noteikšanu rezultātiem nedrīkst pārsniegt 10 % no lielākā rezultāta.

8. Salīdzinošā pētījuma rezultāti

Kopienas salīdzinošajā pētījumā (ceturtais salīdzinājums), lai sertificētu hidrolīzes metodi, trīs paraugus analizēja līdz pat 12 laboratorijās. Katru paraugu analizēja vairākas (5) reizes. Rezultāti ir sniegti šajā tabulā:

L : To laboratoriju skaits, kas iesniedz rezultātus

n : atsevišķu rezultātu skaits, izņemot galējos rezultātus (identificē ar Koksrana, Diksona galējo rezultātu testu)

sr : atkārtojamības standarta novirze

sR : reproducējamības standarta novirze

r : atkārtojamība

R : reproducējamība

CVr : atkārtojamības variāciju koeficients, %

CVR : reproducējamības variāciju koeficients, %

| 1. paraugs Cūku barība | 2. paraugs Ar L-triptofānu papildināta cūku barība | 3. paraugs Barības koncentrāts cūkām |

L: | 12 | 12 | 12 |

n | 50 | 55 | 50 |

vidējais [mg/kg] | 2,42 | 3,40 | 4,22 |

sr [g/kg] | 0,05 | 0,05 | 0,08 |

r [g/kg] | 0,14 | 0,14 | 0,22 |

CVr [%] | 1,9 | 1,6 | 1,9 |

sR [g/kg] | 0,15 | 0,20 | 0,09 |

R [g/kg] | 0,42 | 0,56 | 0,25 |

CVR [%] | 6,3 | 6,0 | 2,2 |

Vēl vienā Kopienas salīdzinošajā pētījumā (trešais salīdzinājums), lai sertificētu brīvā triptofāna ekstrakcijas metodi, divus paraugus analizēja līdz pat 13 laboratorijām. Katru paraugu analizēja vairākas (5) reizes. Rezultāti ir sniegti šajā tabulā:

L : To laboratoriju skaits, kuras iesniedz rezultātus

n : atsevišķu rezultātu skaits, izņemot galējos rezultātus (identificē ar Koksrana, Diksona galējo rezultātu testu)

sr : atkārtojamības standarta novirze

sR : reproducējamības standarta novirze

r : atkārtojamība

R : reproducējamība

CVr : atkārtojamības variāciju koeficients, %

CVR : reproducējamības variāciju koeficients, %

| 4. paraugs Kviešu un sojas maisījums | 5. paraugs Ar triptofānu (0,457 g/kg) papildināts kviešu un sojas maisījums (4. paraugs) |

L | 12 | 12 |

n | 55 | 60 |

vidējais [mg/kg] | 0,391 | 0,931 |

sr [g/kg] | 0,005 | 0,012 |

r [g/kg] | 0,014 | 0,034 |

CVr [%] | 1,34 | 1,34 |

sR [g/kg] | 0,018 | 0,048 |

R [g/kg] | 0,050 | 0,134 |

CVR [%] | 4,71 | 5,11 |

Tika organizēts cits Kopienas salīdzinošais pētījums, kurā septiņās laboratorijās analizēja četrus paraugus ar mērķi sertificēt triptofānu hidrolīzei. Piecās katra parauga analīzēs iegūti šādi rezultāti.

L : To laboratoriju skaits, kuras iesniedz rezultātus

n : atsevišķu rezultātu skaits, izņemot galējos rezultātus (identificē ar Koksrana, Diksona galējo rezultātu testu)

sr : atkārtojamības standarta novirze

sR : reproducējamības standarta novirze

r : atkārtojamība

R : reproducējamība

CVr : atkārtojamībai variāciju koeficients, %

CVR : reproducējamības variāciju koeficients, %

| 1. paraugs Jaukta cūku barība (CRM 117) | 2. paraugs Zivju milti ar zemu tauku saturu (CRM 118) | 3. paraugs Sojas pupu milti (CRM 117) | 3. paraugs Sausais vājpiens (CRM 117) |

L | 7 | 7 | 7 | 7 |

n | 25 | 30 | 30 | 30 |

vidējais [g/kg] | 2,064 | 8,801 | 6,882 | 5,236 |

sr [g/kg] | 0,021 | 0,101 | 0,089 | 0,040 |

r [g/kg] | 0,059 | 0,283 | 0 249 | 0,112 |

CVr [%] | 1,04 | 1,15 | 1,30 | 0,76 |

sR [g/kg] | 0,031 | 0,413 | 0,283 | 0,221 |

R [g/kg] | 0,087 | 1,156 | 0,792 | 0,619 |

CVR [%] | 1,48 | 4,69 | 4,11 | 4,22 |

9. Novērojumi

9.1. Šādi īpašie hromatogrāfiskie parametri var nodrošināt labāku triptofāna atdalīšanos no α -metil-triptofāna.

Izokrātiskā eluēšana, kam seko gradienta kolonnas tīrīšana:

Šķidruma hromatogrāfijas kolonna: | 125 mm x 4 mm, C18, 5 μm pakojums vai līdzvērtīgs |

Kolonnas temperatūra: | 32 °C |

kustīgā fāze (3.8): | A: 0,01 mol/l KH2PO4/Metanols, 95 + 5 (V + V) B Metanols |

Gradienta programma: | 0 min | 100 % A | 0 % B |

15 min | 100 % A | 0 % B |

17 min | 60 % A | 40 % B |

19 min | 60 % A | 40 % B |

21 min | 100 % A | 0 % B |

33 min | 100 % A | 0 % B |

Plūsmas ātrums | 1,2 ml/min |

Kopējais norises ilgums: | apmēram 33 min. |

9.2. Hromatogrāfijas rezultāti atšķiras atkarībā no HPLC tipa un izmantotā kolonnas pakojuma materiāla. Izvēlētajai sistēmai jānodrošina triptofāna un iekšējā standarta bāzes līnijas atdalīšanās. Turklāt ir ļoti svarīgi degradācijas produktus atdalīt no triptofāna un iekšējā standarta. Lai pārbaudītu, vai iekšējais standarts nesatur piemaisījumus, jāizmanto hidrolizāti bez iekšējā standarta. Norises ilgumam ir jābūt pietiekamam, lai eluētu visus degradēšanas produktus, citādi eluēšanas vēlie pīķi var traucēt turpmākās hromatogrāfijas.

Darbību laikā hromatogrāfiskajai sistēmai būtu jāuzrāda lineāra reakcija. Lineārā reakcija būtu jāmēra nemainīgā (normālā) iekšējā standarta koncentrācijā un mainīgās triptofāna koncentrācijās. Gan triptofāna, gan iekšējā standarta pīķiem ir jābūt HPLC/fluorescences sistēmas lineārajā intervālā. Ja triptofāna un/vai iekšējā standarta pīķis(pīķi) ir pārāk mazs(i) vai liels(i), analīze būtu jāatkārto ar citu parauga apjomu un/vai citu galīgo tilpumu.

9.3. Bārija hidroksīds

Laika gaitā bārija hidroksīda šķīdība samazinās. Tādēļ HPLC šķīdums ir neskaidrs un var uzrādīt zemu triptofāna saturu.

[1] Veikusi Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) darba grupa.

[2] Veikusi Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA) darba grupa.

--------------------------------------------------