32001R0213

Rozporządzenie Komisji (WE) nr 213/2001

z dnia 9 stycznia 2001 r.

ustanawiające szczegółowe zasady stosowania rozporządzenia Rady (WE) nr 1255/1999 w odniesieniu do metod analizy oraz oceny jakości mleka i przetworów mlecznych oraz zmieniające rozporządzenia (WE) nr 2771/1999 i (WE) nr 2799/1999

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając rozporządzenie Rady (WE) nr 1255/1999 z dnia 17 maja 1999 r. w sprawie wspólnej organizacji rynku mleka i przetworów mlecznych [1], w szczególności jego art. 10 i 15 oraz art. 26 ust. 3, art. 29 ust. 1 i art. 31 ust. 14,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) Rozporządzenia Komisji (EWG) nr 1216/68 i (EWG) nr 3942/92 i (WE) nr 86/94, (WE) nr 2721/95, (WE) nr 1080/96, (WE) nr 1081/96, (WE) nr 1082/96, (WE) nr 1854/96, (WE) nr 880/98 i (WE) nr 1459/98, do których pełne odniesienia znajdują się w załączniku XXVI do niniejszego rozporządzenia, określają referencyjne i rutynowe metody analizy i oceny jakości mleka i przetworów mlecznych oraz określają zakres i zasady stosowania tych metod. W celu uzyskania przejrzystości oraz w celu dostarczenia przedsiębiorcom działającym w branży jednego aktu zawierającego obowiązujące ich metody i zasady, wyżej wymienione rozporządzenia muszą zostać zmienione i zgromadzone w jednym tekście. Z tego samego powodu rozporządzenie Komisji (WE) nr 2771/1999 z dnia 16 grudnia 1999 r. ustanawiające szczegółowe zasady stosowania przepisów rozporządzenia Rady (WE) nr 1255/1999 w odniesieniu do interwencji na rynku masła i śmietany [2] oraz (WE) nr 2799/1999 z dnia 17 grudnia 1999 r. ustanawiające szczegółowe zasady stosowania rozporządzenia (WE) nr 1255/1999 w zakresie przyznawania pomocy w odniesieniu do mleka odtłuszczonego i mleka odtłuszczonego w proszku przeznaczonych na paszę oraz sprzedaży mleka odtłuszczonego w proszku o takim przeznaczeniu [3] powinny zostać zmienione tak, aby załączniki do tych rozporządzeń dotyczące metod analizy mogły zostać włączone do niniejszego rozporządzenia.

(2) Skład oraz wymogi jakości w odniesieniu do mleka i przetworów mlecznych ustanowione w ramach uzgodnień przewidzianych w rozporządzeniu (WE) nr 1255/1999 muszą zostać zweryfikowane w celu zapewnienia ich bezwzględnego przestrzegania.

(3) Metody referencyjne mające zastosowanie do takich weryfikacji są często metodami publikowanymi przez międzynarodowe organizacje, takie jak CEN, IDF, ISO oraz AOAC International, i często przez nie uaktualnianymi. W niektórych przypadkach ustanowiona jest wspólnotowa metoda referencyjna, podczas gdy w innych przypadkach taka metoda referencyjna nie jest wymieniona w zasadach wspólnotowych. W celu zapewnienia jednolitego stosowania metod referencyjnych każdego roku powinien być sporządzany wykaz metod referencyjnych i tylko metody zawarte w tym wykazie, mogą być stosowane.

(4) Używanie metod rutynowych nie powinno być wykluczone. Dlatego powinny zostać określone warunki ich stosowania.

(5) Powinny również zostać ustanowione wspólne metody w celu zapewnienia jednolitej praktyki oceny wyników analiz, w ocenie sensorycznej danych produktów oraz w ponownym badaniu wyników spornych.

(6) W odniesieniu do niektórych analiz nie istnieją aktualnie zaakceptowane na szczeblu międzynarodowym zatwierdzone metody referencyjne, tak więc nie są dostępne informacje o różnicach wyników analitycznych między laboratoriami. Dlatego powinny zostać ustanowione metody wspólnotowe, potwierdzone zgodnie z międzynarodowymi regułami i stosowane jako metody referencyjne.

(7) Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2571/97 z dnia 15 grudnia 1997 r. w sprawie sprzedaży masła po obniżonych cenach oraz przyznawania pomocy w odniesieniu do śmietany, masła i koncentratu masła, przeznaczonych do wykorzystania w produkcji ciast, lodów i innych środków spożywczych [4], ostatnio zmienione rozporządzeniem (WE) nr 635/2000 [5], przewiduje w niektórych okolicznościach, znaczenie śmietany, masła i koncentratu masła, w celu zapewnienia poprawnego końcowego wykorzystywania tych produktów. Ze względu na to, że znaczenie jest ważne, dla poprawnego działania systemu oraz w celu zapewnienia, że podmioty gospodarcze biorące w nim udział są jednakowo traktowane, powinny zostać określone wspólne metody określania niektórych z tych znaczników.

(8) Na mocy rozporządzenia Komisji (EWG) nr 3143/85 z dnia 11 listopada 1985 r. w sprawie sprzedaży po obniżonych cenach masła pochodzącego ze skupu interwencyjnego przeznaczonego do bezpośredniego spożycia w postaci koncentratu masła [6], ostatnio zmienionego rozporządzeniem (WE) nr 101/1999 [7], rozporządzenia Komisji (EWG) nr 429/90 z dnia 20 lutego 1990 r. w sprawie przyznawania w formie przetargu pomocy na koncentrat masła przeznaczony do bezpośredniego spożycia we Wspólnocie [8], ostatnio zmienionego rozporządzeniem (WE) nr 124/1999 [9], oraz rozporządzenia (WE) nr 251/97, dodawanie znaczników do koncentratu masła musi odbywać się pod nadzorem. Zgodność z wymogami dotyczącymi dodawania znaczników do koncentratu masła musi być ściśle egzekwowana tak, aby zapewnić, że produkty nie są fałszowane. Dlatego powinna zostać ustanowiona wspólna metoda wykrywania tych znaczników.

(9) Na mocy art. 9 rozporządzenia (WE) nr 1255/1999 może zostać przyznana pomoc w odniesieniu do prywatnego składowania serów z mleka owczego. W odniesieniu do tych samych produktów może być przyznawana specjalna refundacja na mocy art. 31 tego rozporządzenia. Sery z mleka owczego, mleka koziego, mleka bawolego oraz z mieszanin mleka owczego, koziego i bawolego mogą być przywożone z niektórych państw trzecich do Wspólnoty w ramach porozumień preferencyjnych. W świetle powyższych przepisów istnieje potrzeba określenia właściwych kontroli w celu zapewnienia, iż powyższe produkty nie zawierają mleka krowiego. Dlatego powinna zostać określona wspólnotowa metoda referencyjna w celu wykrywania mleka krowiego, bez uszczerbku dla stosowania metod rutynowych, pod warunkiem że są one zgodne z niektórymi kryteriami.

(10) Na mocy rozporządzenia Komisji (EWG) nr 2921/90 z dnia 10 października 1990 r. w sprawie pomocy w odniesieniu do produkcji kazeiny i kazeinianów z mleka odtłuszczonego [10], ostatnio zmienionego rozporządzeniem (WE) nr 2654/1999 [11], musi zostać wykryty brak form bakterii coli. Uznaną międzynarodowo metodą wykrywania form bakterii coli w mleku i przetworach mlecznych jest norma międzynarodowa IDF 73A: 1985. Jednakże norma ta ma zastosowanie tylko w zmodyfikowanej formie, do wykrywania form bakterii coli w przypadku pewnej ilości produktu. Dlatego musi zostać ustanowiona wspólnotowa metoda referencyjna wykrywania form bakterii coli, oparta na wyżej wymienionej normie.

(11) Rozporządzenie Rady (EWG) nr 2658/87 z dnia 23 lipca 1987 r. w sprawie nomenklatury taryfowej i statystycznej oraz w sprawie Wspólnej Taryfy Celnej [12], ostatnio zmienione rozporządzeniem (WE) nr 254/2000 [13], przewiduje różne stawki celne w odniesieniu do mieszanek paszowych, objętych pozycją taryfową nr 2309, w zależności od ilości zawartych w nich przetworów mlecznych. W celu zapewnienia jednolitego stosowania omawianych zasad powinna zostać ustanowiona ogólnie obowiązująca metoda analizy zawartości laktozy, do obowiązkowego stosowania we wszystkich Państwach Członkowskich.

(12) Na mocy rozporządzenia (WE) nr 1255/1999 masło i mleko odtłuszczone w proszku przeznaczone do skupu interwencyjnego lub w przypadku mleka odtłuszczonego w proszku, na paszę dla zwierząt, muszą spełniać niektóre wymogi jakości. Powinny zostać ustanowione metody referencyjne w celu sprawdzania, czy wymienione wymogi są spełnione.

(13) Wdrożenie niektórych metod wprowadzonych po raz pierwszy w niniejszym rozporządzeniu wymagać będzie okresu dostosowawczego. Dlatego stosowanie wymienionych metod powinno być odroczone.

(14) Komitet Zarządzający ds. Mleka i Przetworów Mlecznych nie wydał opinii w terminie wyznaczonym przez jego przewodniczącego,

PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:

ROZDZIAŁ I

PRZEPISY OGÓLNE

Artykuł 1

Zakres i dziedzina zastosowania

Niniejsze rozporządzenie ustanawia zasady stosowania metod analizy chemicznej, fizycznej i mikrobiologicznej, jak również sensorycznej oceny mleka i przetworów mlecznych, mających zastosowanie w ramach uzgodnień przewidzianych we wspólnej organizacji rynku mleka i przetworów mlecznych, określonej w rozporządzeniu (WE) nr 1255/1999. Niniejsze rozporządzenie określa również niektóre z tych metod.

Artykuł 2

Wykaz metod

1. Załącznik I do niniejszego rozporządzenia zawiera wykaz metod referencyjnych stosowanych w analizach, określonych w art. 1.

2. Komisja aktualizuje wykaz, przynajmniej raz w roku, zgodnie z procedurą ustanowioną w art. 42 rozporządzenia (WE) nr 1255/1999.

Artykuł 3

Metody rutynowe

Metody rutynowe mogą być wykorzystywane w celu wykonywania analiz wymaganych przez zasady wspólnotowe pod warunkiem, że metody te są odpowiednio kalibrowane i regularnie sprawdzane w porównaniu z metodami referencyjnymi.

Procedura określona w załączniku II może być stosowana w celu sprawdzenia wyników otrzymanych na podstawie metod rutynowych, które są zbliżone do wartości granicznych określonych w stosownych rozporządzeniach.

W przypadku sporu ostateczne są wyniki uzyskane w zastosowaniu metody referencyjnej.

Artykuł 4

Potwierdzenie metod referencyjnych

1. Metody referencyjne są potwierdzane, jeżeli spełniają wcześniej ustalone kryteria dokładności, dotyczące wartości granicznych powtarzalności i odtwarzalności.

2. Jeżeli metoda referencyjna ustanowiona w stosownych rozporządzeniach nie została potwierdzona, Państwa Członkowskie określają tymczasową wartość graniczną odtwarzalności.

Ta wartość graniczna jest uzyskiwana zgodnie z procedurą określoną w załączniku III lit. b). Jednakże przez pierwszych 18 miesięcy od daty wejścia w życie niniejszego rozporządzenia Państwa Członkowskie mogą stosować procedurę równorzędną.

Zgodność z wartością graniczną jest sprawdzana przynajmniej raz w roku.

3. W przypadku gdy wyniki stosowania potwierdzonych metod referencyjnych lub metod o tymczasowych wielkościach precyzji wskazują, że wartość graniczna została przekroczona, wyniki analityczne mogą być oceniane z zastosowaniem metody określonej w załączniku IV w celu ustalenia różnicy krytycznej w stosunku do danej wartości granicznej.

Artykuł 5

Dopuszczalność wyników analizy

1. Analizy są przeprowadzane w laboratoriach stosujących procedurę wewnętrznej kontroli jakości, zgodnie z procedurą określoną w załączniku V lit. a) lub procedurę równorzędną.

Szczegółowy opis stosowanych procedur musi być dostępny w laboratorium w celach konsultacji.

2. Laboratoria ustanawiają własną wewnątrzlaboratoryjną precyzję w zastosowaniu wszystkich metod, na podstawie:

a) procedury określonej w załączniku V lit. b); lub

b) opublikowanej, potwierdzonej procedury o ustalonej powtarzalności.

Zgodność z wartością graniczną powtarzalności musi być sprawdzana przynajmniej raz w roku, z zastosowaniem procedury określonej w załączniku III lit. a).

Akapitu drugiego nie stosuje się w odniesieniu do laboratoriów, które w ciągu roku brały udział w programie kontroli biegłości.

3. Laboratoryjne protokoły wyników analiz muszą zawierać informacje wystarczające dla oceny wyników przeprowadzanej zgodnie z załącznikiem IV i załącznikiem VIII.

4. Za dopuszczalne uważa się wyniki uzyskane zgodnie z kryteriami dopuszczalności opisanymi w procedurze wewnętrznej kontroli jakości, określonej w ust. 1 oraz w wewnątrzlaboratoryjnej precyzji określonej w ust. 2.

Artykuł 6

Ocena sensoryczna

1. W odniesieniu do masła procedury opisane w załączniku VI są stosowane w celu sprawdzenia sprawności osób oceniających oraz wiarygodności wyników. Procedura określona w załączniku VII ma zastosowanie jako metoda referencyjna dla oceny sensorycznej.

2. W odniesieniu do mleka i przetworów mlecznych innych niż masło metodą referencyjną, która ma być stosowana przez Państwa Członkowskie do oceny sensorycznej, jest albo norma IDF 99C/1997 albo inne porównywalne metody, które są notyfikowane Komisji.

Procedury opisane w załączniku VI mogą być stosowane w celu sprawdzenia sprawności osób oceniających oraz wiarygodności wyników.

Artykuł 7

Pobieranie próbek oraz spory dotyczące wyników analiz

1. W celu wykonania wymaganych analiz zgodnie z zasadami wspólnotowymi muszą być pobierane duplikaty próbek.

2. W przypadku gdy wyniki analiz nie zostaną zaakceptowane przez podmiot gospodarczy, stosuje się procedurę określoną w załączniku VIII.

ROZDZIAŁ II

METODY ANALIZY

Artykuł 8

Zawartość wody/suchej masy beztłuszczowej/tłuszczu w maśle

1. Metoda analizy opisana w załączniku IX jest stosowana jako metoda referencyjna w celu oznaczenia zawartości wody w maśle.

2. Metoda analizy opisana w załączniku X jest stosowana jako metoda referencyjna w celu oznaczenia zawartości suchej masy beztłuszczowej w maśle.

3. Metoda analizy opisana w załączniku XI jest stosowana jako metoda referencyjna w celu oznaczenia zawartości tłuszczu w maśle.

Artykuł 9

Znaczniki

1. Metoda analizy opisana w załączniku XII jest stosowana jako metoda referencyjna w celu oznaczenia zawartości waniliny w koncentracie masła, w maśle i w śmietanie.

2. Metoda analizy opisana w załączniku XIII jest stosowana jako metoda referencyjna w celu oznaczenia zawartości estru etylowego kwasu beta-apo-8-karotenowego w koncentracie masła i w maśle.

3. Metoda analizy opisana w załączniku XIV jest stosowana jako metoda referencyjna w celu oznaczenia zawartości beta-sitosterolu lub stigmasterolu w maśle i koncentracie masła.

4. Uważa się, że znaczniki zostały dodane do koncentratu masła, masła i śmietany zgodnie z odpowiednimi przepisami Wspólnoty w przypadku, gdy uzyskane wyniki odpowiadają specyfikacjom ust. 8 załączników określonych w ust. 1, 2 i 3.

Artykuł 10

Wykrywanie kazeiny mleka krowiego

1. Metoda referencyjna analizy opisana w załączniku XV jest stosowana w celu zapewnienia, że ser, który musi być wyprodukowany wyłącznie z mleka owczego, mleka koziego lub mleka bawolego albo z mieszanin mleka owczego, koziego i bawolego, nie zawiera kazeiny mleka krowiego.

Uznaje się obecność kazeiny mleka krowiego w produkcie, jeżeli jej zawartość w próbce pobranej do analizy jest równa lub większa niż zawartość w próbce referencyjnej zawierającej 1 % mleka krowiego, jak określono w załączniku XV.

2. Rutynowe metody wykrywania kazeiny mleka krowiego w serze określone w ust. 1 mogą być stosowane pod warunkiem, że:

a) wartość graniczna wykrywania wynosi 0,5 % lub mniej;

b) nie występują fałszywie pozytywne wyniki;

c) kazeina mleka krowiego jest wykrywalna, z wymaganą czułością, również po upływie długich okresów dojrzewania, które mogą wystąpić w zwykłych warunkach handlowych.

Jeżeli wymagania przewidziane w lit. b) nie są spełnione, każda próbka dająca pozytywny wynik musi zostać poddana analizie z zastosowaniem metody referencyjnej.

Jeżeli wymagania przewidziane w lit. c) nie są spełnione w odniesieniu do jednego z rodzajów sera określonego w ust. 1, ser ten musi być poddany analizie z zastosowaniem metody referencyjnej.

Artykuł 11

Wykrywanie form bakterii coli

1. Metoda referencyjna analizy opisana w załączniku XVI jest stosowana w celu wykrywania obecności form bakterii coli w maśle, odtłuszczonym mleku w proszku, kazeinie i kazeinianach.

2. Metody rutynowe można wykorzystywać do wykrywania form bakterii coli, pod warunkiem że uzyskane wyniki są porównywalne z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu metody referencyjnej, opisanej w tym Załączniku. Metody rutynowe muszą mieć w szczególności stosowną wartość graniczną wykrywalności. Nie mogą występować wyniki fałszywie negatywne. Jeżeli nie jest możliwe wykluczenie występowania wyników fałszywie pozytywnych, każdy wynik pozytywny musi być potwierdzony z zastosowaniem metody referencyjnej.

Artykuł 12

Zawartość laktozy

Metoda oznaczania zawartości laktozy w produktach objętych kodem CN 2309 opisana jest w załączniku XVII.

Artykuł 13

Wykrywanie serwatki podpuszczkowej

1. Metoda wykrywania serwatki podpuszczkowej w odtłuszczonym mleku w proszku przeznaczonym do składowania w magazynach państwowych opisana jest w załączniku XVIII.

2. Metoda wykrywania serwatki podpuszczkowej w mleku odtłuszczonym w proszku i mieszankach, przeznaczonych na pasze dla zwierząt, opisana jest w załączniku XIX.

Artykuł 14

Wykrywanie maślanki

Metoda wykrywania maślanki w mleku odtłuszczonym w proszku opisana jest w załączniku XX.

Artykuł 15

Pozostałości antymikrobiotyków

Metoda wykrywania pozostałości antybiotyków i sulfonamidów/dapsonu w mleku odtłuszczonym w proszku opisana jest w załączniku XXI.

Artykuł 16

Zawartość mleka odtłuszczonego w proszku

Metoda oznaczania zawartości mleka odtłuszczonego w proszku w mieszankach paszowych opisana jest w załączniku XXII.

Artykuł 17

Wykrywanie skrobi

Metoda wykrywania skrobi w mleku odtłuszczonym w proszku, zdenaturowanym mleku w proszku oraz w mieszankach paszowych opisana jest w załączniku XXIII.

Artykuł 18

Zawartość wilgoci w kwasowej maślance w proszku

Metoda oznaczania zawartości wilgoci w kwasowej maślance w proszku przeznaczonej do stosowania w paszach opisana jest w załączniku XXIV.

Artykuł 19

Wykrywanie tłuszczów obcych

Metoda wykrywania tłuszczów obcych w tłuszczach mleka opisana jest w załączniku XXV.

ROZDZIAŁ III

PRZEPISY KOŃCOWE

Artykuł 20

Zmiany w rozporządzeniu (WE) nr 2771/1999

W rozporządzeniu (WE) nr 2771/1999 wprowadza się następujące zmiany:

1) W art. 4 ust. 1 zdanie pierwsze otrzymuje brzmienie: "Właściwe władze kontrolują jakość masła przy zastosowaniu metod opisanych w załączniku I oraz w oparciu o próbki pobierane zgodnie z zasadami określonymi w załączniku IV.".

2) W załączniku I przypis 2 otrzymuje brzmienie: "Patrz załącznik I do rozporządzenia (WE) nr 213/2001.".

3) Załączniki II i III skreśla się.

4) W załączniku IV.2 zdanie przedostatnie wyrazy "z załącznikiem III" zastępuje się wyrazami: "z załącznikiem VII do rozporządzenia (WE) nr 213/2001.".

Artykuł 21

Zmiany w rozporządzeniu (WE) nr 2799/1999

W rozporządzeniu (WE) nr 2799/1999 wprowadza się następujące zmiany:

1) W art. 20 ust. 1, 2, 3 i 4 otrzymują brzmienie:

"1. Zawartość mleka odtłuszczonego w proszku oraz w mieszankach i mieszankach paszowych ustala się poprzez zbadanie każdej próbki, co najmniej w dwóch egzemplarzach, z zastosowaniem metody analizy opisanej w załączniku XXII do rozporządzenia (WE) nr 213/2001, uzupełnionej o kontrole przewidziane w art. 17 ust. 3 niniejszego rozporządzenia. W razie wystąpienia rozbieżności między wynikami wymienionych kontroli wynik inspekcji na miejscu jest ostateczny.

2. Brak serwatki podpuszczkowej jest dowodzony z zastosowaniem metody opisanej w załączniku XIX do rozporządzenia (WE) nr 213/2001.

3. Zawartość skrobi w mieszankach paszowych jest oznaczana na podstawie kontroli przewidzianych w art. 17 ust. 3 niniejszego rozporządzenia, które muszą być uzupełnione zastosowaniem metody opisanej w załączniku XXIII do rozporządzenia (WE) nr 213/2001.

4. Zawartość wilgoci w kwasowej maślance w proszku jest oznaczana z zastosowaniem metody analizy opisanej w załączniku XXIV do rozporządzenia (WE) nr 213/2001."

2) Załączniki III, IV, V i VI skreśla się.

Artykuł 22

Uchylenia

Niniejszym rozporządzenia (EWG) nr 1216/68, (EWG) nr 3942/92, (WE) nr 86/94, (WE) nr 2721/95, (WE) nr 1854/96, (WE) nr 1080/96, (WE) nr 1081/96, (WE) nr 1082/96, (WE) nr 880/98 i (WE) nr 1459/98 tracą moc.

Odniesienia do uchylonych rozporządzeń należy traktować jako odniesienia do niniejszego rozporządzenia.

Artykuł 23

Wejście w życie

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie siódmego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich.

Jednakże metody opisane w załącznikach III, IV.4, V, VI i VIII stosuje się 18 miesięcy po wejściu w życie niniejszego rozporządzenia.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest stosowane bezpośrednio we wszystkich Państwach Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 9 stycznia 2001 r.

W imieniu Komisji

Franz Fischler

Członek Komisji

[1] Dz.U. L 160 z 26.6.1999, str. 48.

[2] Dz.U. L 333 z 24.12.1999, str. 11.

[3] Dz.U. L 340 z 31.12.1999, str. 3.

[4] Dz.U. L 350 z 20.12.1997, str. 3.

[5] Dz.U. L 76 z 25.3.2000, str. 9.

[6] Dz.U. L 298 z 12.11.1985, str. 9.

[7] Dz.U. L 11 z 16.1.1999, str. 14.

[8] Dz.U. L 45 z 21.2.1990, str. 8.

[9] Dz.U. L 16 z 21.1.1999, str. 19.

[10] Dz.U. L 279 z 11.10.1990, str. 22.

[11] Dz.U. L 325 z 17.12.1999, str. 10.

[12] Dz.U. L 256 z 7.9.1987, str. 1.

[13] Dz.U. L 28 z 3.2.2000, str. 16.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK I

(Art. 2)

WYKAZ METOD REFERENCYJNYCH

Spis treści

Min. = minimum,

Maks. = maksimum,

Załącznik = Załącznik do cytowanego rozporządzenia,

SNF = sucha masa beztłuszczowa,

FFA = wolne kwasy tłuszczowe,

PV = liczba nadtlenkowa,

A = wygląd,

F = aromat,

C = konsystencja,

TBC = ogólna liczba bakterii,

Therm = liczba bakterii ciepłolubnych,

MS = Państwo Członkowskie,

IDF = Międzynarodowa Federacja Mleczarska,

ISO = Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna,

IUPAC = Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej,

ADPI = Amerykański Instytut Produktów Mleczarskich,

SCM = mleko zagęszczone słodzone,

EMC = zagęszczone mleko lub śmietana,

MSNF = sucha masa beztłuszczowa mleka

Uwaga 1 : Oddzielenie tłuszczu mleka według normy IDF 6B:1989 (ochrona przed światłem).

Uwaga 2 : Nie ustalono żadnej metody referencyjnej.

Uwaga 3 : Próbka ma być przygotowana zgodnie z normą IDF 122C:1996 normą IDF 73A:1985.

Uwaga 4 : Inkubacja w ciągu 48 godzin w temperaturze 55 °C, należy podjąć działanie zapobiegające wysuszeniu pożywki dla bakterii.

Uwaga 5 : % SNF = % substancji stałej – % tłuszczu.

Uwaga 6 : Masło musi odpowiadać krajowym klasom jakości produkującego Państwa Członkowskiego, określonym w załączniku V do rozporządzenia Komisji (WE) nr 2771/1999.

Uwaga 7 : Dyrektywa Komisji 84/8/EWG.

Uwaga 8 : Rozporządzenie Komisji (WE) nr 1758/94 (Dz.U. L 183 z 19.7.1994, str. 14).

Uwaga 9 : Dyrektywa Komisji 78/633/EWG.

CZĘŚĆ A

Rozporządzenie Komisji | Produkt | Parametry | Wartości graniczne | Metoda referencyjna | Uwagi |

Rozporządzenie (WE) nr 2771/1999 składowanie w magazynach państwowych (Dz.U. L 333 z 24.12.1999, str. 11) | Masło niesolone | Tłuszcze mleka | Min. 82 % | Załącznik XI | |

Woda | Do 16 % | Załącznik IX | |

SNF | Do 2 % | Załącznik X | |

FFA (maks.) | 1.2 mmole/100 g tłuszczu | Norma IDF 6B:1989 | |

PV (maks.) | 0,3 meq. tlenu/1000 g tłuszczu | Norma IDF 74A:1991 (wersja angielska) | Uwaga 1 |

Formy bakterii coli | Niewykrywalne w 1 g | Załącznik XVII | Uwaga 3 |

Tłuszcz niepochodzący z mleka | Niewykrywalny poprzez analizę triglicerydów | Załącznik XXVI | |

Znaczniki sterolu | Niewykrywalne | Załącznik XIV | |

Pozostałe znaczniki: | | | |

—wanilina | Niewykrywalna | Załącznik XII | |

—ester etylowy kwasu karotenowego | Niewykrywalny | Załącznik XIII | |

—triglicerydy kwasu enantowego | Niewykrywalne | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Charakterystyka sensoryczna | Co najmniej 4 na 5 punktów dla A, G i C | Załącznik VII | |

Dyspersja w wodzie | Co najmniej 4 punkty | Norma IDF 112A:1989 | |

Rozporządzenie (WE) nr 2771/1999 Prywatne składowanie | Masło niesolone | Tłuszcze mleka | Min. 82 % | Załącznik XI | Uwaga 6 |

Woda | Do 16 % | Załącznik IX | |

Rozporządzenie (WE) nr 2771/1999 Prywatne składowanie | Masło solone | Tłuszcze mleka | Min. 80 % | Załącznik XI | Uwaga 6 |

Woda | Do 16 % | Załącznik IX | |

Sól | Do 2 % | Norma IDF 12B: 1988 | |

Rozporządzenie (WE) nr 2571/97 (Dz.U. L 350 z 20.12.1997, str. 3) | Masło niesolone | Tłuszcze mleka | Min. 82 % | Załącznik XI | |

Woda | Do 16 % | Załącznik IX | |

Znaczniki: | | | |

—sterole | | Załącznik XIV | |

—wanilina | | Załącznik XII | |

—ester etylowy kwasu karotenowego | | Załącznik XIII | |

—triglicerydy kwasu enantowego | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Rozporządzenie (WE) nr 2571/97 | Masło solone | Tłuszcze mleka | Min. 80 % | Załącznik XI | |

Woda | Do 16 % | Załącznik IX | |

Sól | Do 2 % | Norma IDF 12B: 1988 | |

Znaczniki: | | | |

sterole | | Załącznik XIV | |

wanilina | | Załącznik XII | |

ester etylowy kwasu karotenowego | | Załącznik XIII | |

triglicerydy kwasu enantowego | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Rozporządzenie (WE) nr 2571/97 | Koncentrat masła | Tłuszcze mleka | Min. 99,8 % | Norma IDF 24: 1964 | |

Wilgotność i MSNF | Do 0,2 % | Norma IDF 23A: 1988 (wilgotność) | |

FFA | Do 0,35 % (oleinowy) | Norma IDF 24: 1964 (MSNF) | |

PV (maks.) | 0,5 meq. tlen/1000 g tłuszczu | Norma IDF 6B: 1989 | Uwaga 1 |

Tłuszcz niepochodzący z mleka | Brak | Norma IDF 74A: 1991 (wersja angielska) | |

Aromat | Czysty | | |

Zapach | Brak obcych zapachów | | |

Inne | Brak środków zobojętniających, przeciwutleniaczy i środków konserwujących | | |

Znaczniki: | | | |

—sterole | | Załącznik XIV | |

—wanilina | | Załącznik XII | |

—ester etylowy kwasu karotenowego | | Załącznik XIII | |

—triglicerydy kwasu enantowego | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Rozporządzenie (WE) nr 2571/97 | Śmietana | Tłuszcze mleka | 35 % | Norma IDF 16C: 1987 | |

Znaczniki: | | | |

—sterole | | Metody zatwierdzone przez właściwe władze | Uwaga 2 |

—wanilina | | Załącznik XII | |

—ester etylowy kwasu karotenowego | | Metody zatwierdzone przez właściwe władze | Uwaga 2 |

—triglicerydy kwasu enantowego | | IUPAC 2.301 sub 5 | |

Rozporządzenie (EWG) nr 429/90 (Dz.U. L 45 z 21.2.1990, str. 8) | Koncentrat masła | Tłuszcze mleka | Min. 96 % | Metody zatwierdzone poprzez właściwe władze | Uwaga 2 |

SNF | Do 2 % | Metody zatwierdzone poprzez właściwe władze | Uwaga 2 |

Znaczniki: | | | |

—stigmasterol (95 %) | 15 g/100 kg koncentratu masła | Załącznik XIV | |

—stigmasterol (85 %) | 17 g/100 kg koncentratu masła | Załącznik XIV | |

—triglicerydy kwasu enantowego | 1,1 kg/100 kg koncentratu masła | IUPAC 2.301 sub 5 | |

—ester etylowy kwasu masłowego i stigmasterol | Patrz Załącznik, pkt 1 lit. c) | Załącznik XIV | Uwaga 2 |

—lecytyna (E 322) | Do 0,5 % | Metody zatwierdzone przez właściwe władze | Uwaga 2 |

NaCl | Do 0,75 % | Norma IDF 12B: 1988 | |

FFA | Do 0,35 % (oleinowy) | Norma IDF 6B: 1989 | |

PV (maks.) | Do 0,5 meq. tlen/1000 g tłuszczu | Norma IDF 74A: 1991 (wersja angielska) | Uwaga 1 |

Aromat | Czysty | | |

Zapach | Brak obcych zapachów | | |

Inne | Brak środków zobojętniających, przeciwutleniaczy i środków konserwujących | | |

Rozporządzenie (EWG) nr 2191/81 (Dz.U. L 213 z 1.8.1981, str. 20) | Masło niesolone | Tłuszcze mleka | Min. 82 % | Załącznik XI | |

Woda | Do 16 % | Załącznik IX | |

Rozporządzenie (EWG) nr 2191/81 | Masło solone | Tłuszcze mleka | Min. 80 % | Załącznik XI | |

Woda | Do 16 % | Załącznik IX | |

Sól | Do 2 % | Norma IDF 12B: 1988 | |

Art. 9 i tytuł II rozporządzenia (WE) nr 1255/1999 | Sery wytworzone z mleka owczego i/lub koziego | Mleko krowie | < 1 % | Załącznik XV | |

Rozporządzenie (EWG) nr 2921/90 | Załącznik – Kazeina kwasowa | Woda | Do 12,00 % | Norma IDF 78C: 1991 | |

Tłuszcz | Do 1,75 % | Norma IDF 127A: 1988 | |

Kwas wolny | Do 0,30 % (mleczny) | Norma IDF 91: 1979 | |

Rozporządzenie (EWG) nr 2921/90 | Załącznik I – Kazeina podpuszczkowa | Woda | Do 12,00 % | Norma IDF 78C: 1991 | |

Tłuszcz | Do 1,00 % | Norma IDF 127A: 1988 | |

Popiół | Min. 7,50 % | Norma IDF 90: 1979 | |

Rozporządzenie (EWG) nr 2921/90 | Załącznik I –Kazeiniany | Woda | Do 6,00 % | Norma IDF 78C: 1991 | |

Białko mleka | Min. 88,00 % | Norma IDF 92: 1979 | |

Tłuszcz i popiół | Do 6,00 % | Norma IDF 127A: 1988, Norma IDF 98: 1979 albo | |

Rozporządzenie (EWG) nr 2921/90 | Załącznik II – Kazeina kwasowa | Woda | Do 10,00 % | Norma IDF 78C: 1991 | |

Tłuszcz | Do 1,50 % | Norma IDF 127A: 1988 | |

Kwas wolny | Do 0,20 % (mleczny) | Norma IDF 91: 1979 | |

TBC (maks.) | 30000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwaga 3 |

Bakterie coli | Brak w 0,1 g | Załącznik XVI | Uwaga 3 |

Therm.(maks.) | 5000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwaga 3 i 4 |

Rozporządzenie (EWG) nr 2921/90 | Załącznik II – Kazeina podpuszczkowa | Woda | Do 8,00 % | Norma IDF 78C: 1991 | |

Tłuszcz | Do 1,00 % | Norma IDF 127A: 1988 | |

Popiół | Min. 7,50 % | Norma IDF 90: 1979 | |

TBC (maks.) | 30000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwaga 3 |

Formy bakterii coli | Brak w 0,1 g | Załącznik XVI | Uwaga 3 |

Therm. (maks.) | 5000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwaga 3 i 4 |

Rozporządzenie (EWG) nr 2921/90 | Załącznik II – Kazeiniany | Woda | Do 6,00 % | Norma IDF 78C: 1991 | |

Białko mleka | Min. 88,00 % | Norma IDF 92: 1979 | |

Tłuszcz i popiół | Do 6,00 % | Norma IDF 127A: 1988 Norma IDF 89: 1979 albo 90: 1979 | |

TBC (maks.) | 30000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwaga 3 |

Formy bakterii coli | Brak w 0,1 g | Załącznik XVI | Uwaga 3 |

Therm. (maks.) | 5000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwagi 3 i 4 |

Rozporządzenie (EWG) nr 2921/90 | Załącznik III Kazeiniany | Woda | Do 6,00 % | Norma IDF 78C: 1991 | |

Białko mleka | Min. 85,00 % | Norma IDF 92: 1979 | |

Tłuszcz | Do 1,50 % | Norma IDF 127A: 1988 | |

Laktoza | Do 1,00 % | Norma IDF 106: 1982 | |

Popiół | Do 6,50 % | Norma IDF 89: 1979 albo 90:1979 | |

TBC (maks.) | 30000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwaga 3 |

Formy bakterii coli | Brak w 0,1 g | Załącznik XVI | Uwaga 3 |

Therm. (maks.) | 5000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwagi 3 i 4 |

Rozporządzenie (WE) nr 2799/1999 (Dz.U. L 340 z 31.12.1999, str. 3) | Mieszanki paszowe i odtłuszczone mleko w proszku (SMP) (do stosowania w żywieniu zwierząt) | Woda (kwasowa maślanka w proszku) | Do 5 % | | |

Białko | 31,4 % (min.) suchej substancji beztłuszczowej | Norma IDF 20B: 1993 | |

Woda (SMP) | Do 5 % | Norma IDF 26A: 1993 | |

Tłuszcz (SMP) | Do 11 % | Norma IDF 9C: 1987 | |

Serwatka podpuszczkowa (SMP) | Brak | Załącznik XIX | Uwaga 7 |

Skrobia (SMP) | Brak | Załącznik XXIII | |

Woda (mieszanina) | Do 5 % suchej substancji beztłuszczowej | Norma IDF 26A: 1993 | |

Tłuszcze (mieszaniny) | — | Dyrektywa Komisji 84/4/EWG (Dz.U. L 15 z 18.1.1984, str. 28) | |

Serwatka - podpuszczkowa (mieszaniny) | Brak | Załącznik XIX | |

Zawartość SMP (w produkcie końcowym) | Min. 50 % | Załącznik XXII | Uwaga 7 |

Tłuszcze (w produkcie końcowym) | Min. 2,5 % albo 5 % | Dyrektywa Komisji 84/4/EWG | Uwaga 8 |

Skrobia (w produkcie końcowym) | Min. 2 % | Załącznik XXIII | Uwaga 9 |

Miedź (w produkcie końcowym) | 25 ppm | Dyrektywa Komisji 78/633/EWG (Dz.U. L 206 z 26.7.1987, str. 43) | |

Rozporządzenie (WE) nr 322/96 (Dz.U. L 45 z 23.2.96, str. 5) | SMP (aerozol) | Tłuszcz | Do 1,0 % | Norma IDF 9C: 1987 | |

Białko | 31,4% (min.) suchej substancji beztłuszczowej | Norma IDF 20B: 1993 | |

Woda | Do 3,5 % | Norma IDF 26A: 1993 | |

Kwasowość (N/10 NaOH) | Do 19,5 ml | Norma IDF 86: 1981 | |

Mleczany | Do 150 mg/100 g | Norma IDF 69B: 1987 | |

Fosforan | Negatywny | Norma ISO 3356: 1975 | |

Rozpuszczalność | Do 0,5 ml w 24 °C | Norma IDF 129A: 1988 | |

Przypalone cząstki | Dysk B min. (15,0 mg) | ADPI: 1990 | |

TBC | 40000 l/g | Norma IDF 100B: 1991 | Uwaga 3 |

Formy bakterii coli | Negatywny/0,1 g | Załącznik XVI | Uwaga 3 |

Maślanka | Negatywny | Załącznik XX | |

Serwatka podpuszczkowa | Negatywny | Załącznik XVIII | |

Serwatka kwasowa | Negatywny | Metody zatwierdzone przez właściwe władze | Uwaga 2 |

Środki przeciwdrobnoustrojowe | | Załącznik XXI | |

CZĘŚĆ B

Metody referencyjne wymienione w części B mogą być stosowane w celu analizowania produktów objętych którymkolwiek z rozporządzeń wymienionych w kolumnie 1.

Rozporządzenie Komisji | Produkt | Kod CN | Parametry | Wartości graniczne | Metoda referencyjna | Uwagi |

Rozporządzenie (EWG) nr 2658/87 (Dz.U. L 256 z 7.9.1987, str. 1) Rozporządzenie (WE) nr 2414/98 (Dz.U. L 299 z 10.11.1998, str. 7) Rozporządzenie (WE) nr 1374/98 (Dz.U. L 185 z 30.6.1998, str. 21) Rozporządzenie (WE) nr 2508/97 (Dz.U. L 345 z 16.12.1997, str. 31) Rozporządzenie (WE) nr 174/1999 (Dz.U. L 20 z 27.1.1999, str. 8) | Mleko i śmietana niezagęszczane i niezawierające dodatku cukru ani innego środka słodzącego | 0401 | Tłuszcz ( ≤ 6 %) | Obowiązują wartości graniczne określone w opisie do kodu CN dla każdego produktu, dodatkowo wymienionego, gdzie stosowne, w rozporządzeniu Komisji (EWG) nr 3846/87 (Dz.U. L 366 z 24.12.1987, str. 1) część 9 nomenklatury wywozowej lub w rozporządzeniu (WE) nr 1374/98 (Dz.U. L 185 z 30.6.1998, str. 21) | Norma IDF 1D: 1996 | |

Tłuszcz ( > 6 %) | Norma IDF 16C: 1987 | |

Mleko i śmietana zagęszczone lub zawierające dodatek cukru lub innego środka słodzącego | 0402 | Tłuszcze (w postaci płynnej) | Norma IDF 13C: 1987 | |

Tłuszcze (w postaci stałej) | Norma IDF 9C: 1987 | |

Białko | Norma IDF 20B: 1993 | |

Sacharoza (zawartość normalna) | Norma IDF 35A: 1992 | |

Sacharoza (zawartość niska). | Metody zatwierdzone przez właściwe władze | Uwaga 2 |

Substancje stałe (SCM) | Norma IDF 15B: 1991 | |

Substancje stałe (EMC) | Norma IDF 21B: 1987 | |

Woda (mleko i śmietana w proszku) | Norma IDF 26A: 1993 | |

Maślanka, sfermentowane lub zakwaszone mleko i śmietana, zagęszczone lub nie, zawierające dodatek cukru lub innego środka słodzącego | 0403 | Tłuszcz | Norma IDF 1D: 1996, 9C: 1987, 16C: 1987, 22B: 1987, 126A: 1988 | |

Białko | Norma IDF 20B: 1993 | |

Sacharoza (normalna zawartość) | Norma IDF 35A: 1992 | |

Sacharoza (zawartość niska). | Metody zatwierdzone przez właściwe władze | Uwaga 2 |

Woda (kwasowa maślanka w proszku) | Załącznik XXIV | |

Woda (słodka maślanka w proszku) | Norma IDF 26A: 1993 | |

Substancje stałe (Inne produkty) | Metody zatwierdzone przez właściwe władze | |

Serwatka, zagęszczona lub nie lub zawierająca dodatek cukru lub innego środka słodzącego; produkty składające się z naturalnych składników mleka | 0404 | Tłuszcz | Norma IDF 9C: 1987, 16C: 1987, 22B: 1987 | |

Białko | Norma IDF 20B: 1993 | |

Sacharoza (normalna zawartość) | Norma IDF 35A: 1992 | |

Sacharoza (zawartość niska) | Metody zatwierdzone przez właściwe władze | Uwaga 2 |

040490 | Białko | Norma IDF 20B: 1993 | |

Woda | Norma IDF 26A: 1993 | |

Substancje stałe | Norma IDF 15B: 1991 | |

(Produkty zagęszczone) | Norma IDF 21B: 1987 | |

Masło i inne tłuszcze otrzymane z mleka; produkty mleczarskie do smarowania | 0405 | Tłuszcz (jeżeli ( 85 %) | Załącznik XI | |

Woda | Załącznik IX | |

Masło | SNF | Załącznik X | |

NaCl | Norma IDF 12B: 1998 | |

Bezwodny tłuszcz mleczny | Tłuszcz (jeżeli > 99 %) | Norma IDF 24: 1964 | |

Woda (jeżeli tłuszcz < 99 %) | Norma IDF 23A: 1988 | |

Ser i twaróg | 0406 | Tłuszcz | Norma IDF 5B: 1986 | |

Substancje stałe | Norma IDF 4A: 1982 | |

Substancje stałe (Ricotta) | Norma IDF 58: 1970 | |

NaCl | Norma IDF 88A: 1988 | |

Laktoza | Norma IDF 79B: 1991 | |

Rozporządzenie (EWG) nr 2658/87 | Mieszanki paszowe | 2309 | Laktoza | | Załącznik XVII | |

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK II

(Art. 3)

SPRAWDZANIE OTRZYMANYCH WYNIKÓW Z ZASTOSOWANIEM METOD RUTYNOWYCH, ZBLIŻONYCH DO WARTOŚCI GRANICZNYCH WYMIENIONYCH W ROZPORZĄDZENIACH DOTYCZĄCYCH SKŁADU I WYMOGÓW JAKOŚCI

Jeżeli mo jest wartością graniczną dla składu i wymogów jakości wymienionych w rozporządzeniu, ostateczną wartością graniczną L jest

L = m

o

jeżeli RRout/RRef≤ 1

RRout : Wartość graniczna odtwarzalności w przypadku metody rutynowej

RRef : Wartość graniczna odtwarzalności w przypadku metody referencyjnej

Jeżeli mo jest górną wartością graniczną, a RRout/Rref > 1, ostateczna wartość graniczna jest otrzymywana z zastosowaniem wzoru:

L=m

-

R

/R

.CrD

95

Jeżeli w takich samych warunkach mo jest dolną wartością graniczną, ostateczna wartość graniczna jest otrzymywana z zastosowaniem wzoru:

L=m

+

R

/R

.CrD

95

gdzie CrD95 jest różnicą krytyczną metody referencyjnej (patrz załącznik IV).

Jeżeli mo jest górną wartością graniczną, wynik końcowy otrzymany z zastosowaniem metody rutynowej, wyższy od ostatecznej wartości granicznej, musi zostać zastąpiony końcowym wynikiem otrzymanym z zastosowaniem metody referencyjnej. Ten wynik końcowy musi być oparty co najmniej na takiej samej ilości analiz/próbek jak końcowy wynik z zastosowaniem metody rutynowej.

Jeżeli mo jest dolną wartością graniczną, taka sama procedura musi być stosowana dla końcowego wyniku, niższego od ostatecznej wartości granicznej uzyskanej z zastosowaniem metody rutynowej.

Uwaga

Przedstawioną wyżej procedurę można stosować, o ile nie występują wykrywalne efekty matrycy.

Efekty matrycy można wykryć w następujący sposób: dla każdej próbki wykorzystanej do kalibracji jest ustalana różnica (w1) między wynikami otrzymanymi z zastosowaniem metody referencyjnej i z zastosowaniem metody rutynowej.

Obliczenie odchylenia standardowego z zastosowaniem wzoru

s=

∑w

i2/2m

m : Ilość próbek użytych do kalibracji jest porównywana ze średnią arytmetyczną odchylenia standardowego powtarzalności metody referencyjnej i rutynowej

s

=

s

+s

rrout2/2

Nie można wykluczyć efektu matrycy, jeżeli

+++++ TIFF +++++

gdzie:

f = m (f: liczba stopni swobody)

α = prawdopodobieństwo błędu; α = 0,05.

W takim przypadku konieczne są dodatkowe badania przed ustaleniem ostatecznej wartości granicznej.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK III

(Art. 4 i 5)

a) Procedura określenia zgodności z ustalonymi wartościami granicznymi odtwarzalności (Analiza chemiczna)

Zgodność z wartościami granicznymi odtwarzalnościjest sprawdzana przez porównanie wyników laboratoryjnych z wynikami doświadczonego laboratorium [1], otrzymanymi z wykorzystaniem identycznych próbek. Określanie jest przeprowadzane w obu laboratoriach, a wyniki są oceniane z zastosowaniem wzoru:

CrD

Iy

y

=

r

2

gdzie:

CrD

95 : różnica krytyczna (P = 0,95)

y

-1 : średnia arytmetyczna dwóch wyników otrzymanych w laboratorium 1,

y

-2 : średnia arytmetyczna dwóch wyników otrzymanych w laboratorium 2,

R : wartość graniczna odtwarzalności: ma być ustalona metodą interpolacji,

r : wartość graniczna powtarzalności: jeżeli precyzja zmienia się w zależności od poziomu.

Jeżeli jest przekroczona różnica krytyczna, w ciągu kolejnych dwóch miesięcy musi zostać przeprowadzone inne doświadczenie. Jeżeli wyniki drugiego doświadczenia nie są zgodne z wartością graniczną odtwarzalności, właściwe władze muszą podjąć konieczne kroki.

b) Procedura otrzymywania tymczasowej wartości granicznej odtwarzalności (analiza chemiczna)

Tymczasowa granica odtwarzalności(Rprov) jest otrzymywana na podstawie równania:

R

=

y

+

r22

gdzie:

y

-1 : średnia dwóch wyników otrzymanych w laboratorium 1

y

-2 : średnia dwóch wyników otrzymanych w laboratorium 2 (patrz załącznik IIIa)

r : wartość graniczna powtarzalności lub tymczasowa wartość graniczna powtarzalności.

Uwagi:

1. Rprov może być wykorzystywane w celu obliczenia różnic krytycznych (patrz załącznik VI)

2. Rprov jest ustalone na 2r, jeżeli obliczona wartość dla Rprov jest niższa niż 2r.

3. RSDR c [2], wówczas Rprov jest niedopuszczalnie wysokie i nie może być wykorzystane w celu obliczenia różnicy krytycznej.

4. Rprov powinno być oznaczone, co najmniej raz w roku, w oparciu o wyniki otrzymane w dwóch laboratoriach (patrz załącznik IV).

5. Średnia wartość Rprov musi być wykorzystana do wyliczania różnic krytycznych. Zasady określone w pkt 2 i 3 są stosowane w odniesieniu do średniej wartości Rprov.

Wartość graniczna odtwarzalności (wartość R) jest otrzymywana w następujący sposób z obliczonej wartości RSDR:

R=0,0283

RDS

R

x

- : średnia arytmetyczna otrzymanych wyników

Niektóre obliczone wartości RSDR (przykłady)

Stężenie | RSDR (%) |

1 g/100 g | 4 |

0,01 g/100 g | 8 |

1 mg/1 000 g | 16 |

Stężenie analitu 1 g/100 g wyniesie:

R = 0,0283 * 1 * 4 = 0,11 g/100 g.

[1] Doświadczone laboratorium powinno być jednym z laboratoriów uczestniczących z powodzeniem bądź w potwierdzaniu metod badań, bądź w programie kontroli biegłości.

[2] stężenie wyrażone jako ułamek dziesiętny (przykład: 10 g/100 g = 0,10)Odniesienie:Peeler, J.T. Horwitz, W. and Albert, R.J.Ass. Off. Anal. Chem.72(5), 784-806 (1989).

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK IV

(Art. 4)

OCENA WYNIKÓW ANALITYCZNYCH OTRZYMANYCH Z ZASTOSOWANIEM POTWIERDZONYCH METOD

Jeżeli wynik analityczny wskazuje, że wartość graniczna została przekroczona, obliczana jest średnia arytmetyczna z dwóch lub więcej wyników. Stosowana jest następująca procedura:

1) W przypadkach gdy wynik analityczny stanowi wynik pojedynczy, musi być przeprowadzona w warunkach powtarzalności druga analiza. Jeżeli dwie analizy nie mogą być przeprowadzone w warunkach powtarzalności, musi być przeprowadzona dodatkowa podwójna analiza w warunkach powtarzalności, a wyniki wykorzystane w celu oceny zgodności z różnicą krytyczną.

2) Oznaczana jest wartość bezwzględna różnicy między średnią arytmetyczną wyników otrzymanych w warunkach powtarzalności oraz wartością graniczną. Wartość bezwzględna różnicy wyższa od różnicy krytycznej oznacza, że próbka poddana analizie nie spełnia wymogów.

Różnica krytyczna jest ustalana za pomocą wzoru:

CrD

y

-m

=

2

n

gdzie:

y

- : średnia arytmetyczna otrzymanych wyników

mo : wartość graniczna

n : liczba analiz/próbek

Jeżeli precyzja zmienia się w zależności od poziomu, konieczne może być oznaczenie r i R przez interpolację.

Normalnie końcowy wynik odniesiony do próbki musi wykazywać zgodność z wartością graniczną.

Wynik końcowy

- w zakresie m

i m

+CrD

jeżeli wartość graniczna stanowi wielkość maksymalną;

- w zakresie m

i m

+ CrD

jeżeli wartość graniczna stanowi wielkość minimalną

powinien dlatego wystąpić jedynie w drodze wyjątku.

Wyniki końcowe we wspomnianych zakresach są dopuszczalne jedynie w przypadku, gdy wystąpią nie częściej niż jeden raz na każde pięć próbek analizowanych na przesyłkę. Jeżeli mniej niż pięć próbek jest analizowanych na przesyłkę, dopuszczalny jest jeden wynik we wspomnianych zakresach. Jednakże zasada, iż tylko jeden wynik we wspomnianych zakresach jest otrzymywany na pięć analizowanych próbek, musi być przestrzegana, jeżeli przesyłki od producenta występują systematycznie.

3) Jeżeli końcowy wynik x jest obliczany z zastosowaniem wzoru w postaci x = y1 ± y2 (przykład: woda + zawartość suchej masy beztłuszczowej w maśle w celu obliczenia zawartości tłuszczu), gdzie y1 i y2 są końcowymi wynikami jednego rodzaju analizy, wówczas całkowite wartości graniczne powtarzalności i odtwarzalności rx i Rx końcowych wyników x są obliczane jako:

r

=

2r12+r22

R

=

2R12+R22

gdzie r1 i r2 są wartościami granicznymi powtarzalności, a R1 i R2 są wartościami granicznymi odtwarzalności dotyczącymi odpowiednio y1 i y2.

x jest porównywany z wartością graniczną m0 zgodnie z zasadami wymienionymi w pkt 1 i 2. Różnica krytyczna jest oznaczana z zastosowaniem wzoru:

CrD

x-m

=

2

n

gdzie x jest średnią arytmetyczną otrzymanych wyników x1

4) Jeżeli wynik końcowy jest obliczany z zastosowaniem wzoru w postaci

x=

y

y

2

(przykład: tłuszcz w suchej masie sera)

gdzie y1 i y2 są końcowymi wynikami jednego rodzaju analizy, wówczas całkowite wartości graniczne powtarzalności i odtwarzalności rx i Rx mogą być obliczane jako:

r

=μ

x2r*12+r*22

R

=μ

x2r*12+R*22

μ

=μ

| μ

2

μ1 : wartość graniczna lub docelowa dla y1 (przykład: tłuszcz)

μ2 : μwartość graniczna lub docelowa dla y2 (przykład: sucha masa)

r

=

r

μ

≤0,15

r

=

r

μ

≤0,15

gdzie:

r1 : wartość graniczna powtarzalności, y1

r2 : wartość graniczna powtarzalności, y2

R

=

R

μ

≤0,15

R

=

R

μ

≤0,15

gdzie:

R1 : wartość graniczna odtwarzalności, y1

R2 : wartość graniczna odtwarzalności, y2

Procedury obliczania rx i Rx mają zastosowanie jedynie w przypadku, gdy względne wartości graniczne powtarzalności i odtwarzalności (r*1, r*2; R*1; R*2) są niższe lub równe 0,15.

x jest porównywany z wartością graniczną zgodnie z zasadami wymienionymi w pkt 1 i 2. Różnica krytyczna jest oznaczana z zastosowaniem wzoru:

CrD

x

-μ

=

2

n

gdzie

x

jest średnią arytmetyczną wyników x otrzymanych w porządku chronologicznym [1].

[1] Uwaga:Na przykład, jeżeli są otrzymywane wyniki y11, y12, y21 i y22, musi być obliczona średnia arytmetyczna z y11/y21 i y12/y22.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK V

KONTROLA WEWNĘTRZNA

(Art. 5)

a) Procedura wewnętrznej kontroli jakości (IQC) (analiza chemiczna)

Definicja materiału kontrolnego

Materiał wykorzystywany do celów IQC jest poddany tej samej procedurze lub części tej samej procedury co materiały badane.

Materiałem kontrolnym może być:

- certyfikowany materiał wzorcowy,

- wewnętrzny materiał wzorcowy

- materiał potwierdzony przez badania międzylaboratoryjne,

- materiał wzbogacony.

Procedura ustanawiająca IQC

Laboratorium powinno wprowadzić IQC zgodnie z procedurą określoną w dokumencie IUPAC "Zharmonizowane wytyczne dla wewnętrznej kontroli jakości w laboratoriach analitycznych" [1].

IQC obejmuje włączenie materiałów kontrolnych do kolejnych faz analizy lub analizy replikacji badanych próbek. Materiały kontrolne muszą posiadać skład chemiczny podobny do składu badanych próbek i być odpowiednio stabilne w wymaganym czasie. Należy wykazać, że mogą one być odpowiednio podzielone do celów analizy na identyczne części i mają stężenie analitu właściwe dla zakresu zainteresowania.

Materiał kontrolny musi być dodany przynajmniej raz do każdej serii analitycznej, a otrzymana wartość wykreślona na karcie kontrolnej w celu pomiaru błędów w długim okresie czasu. Dodatkowo laboratorium powinno okresowo wykazywać zgodność z warunkami powtarzalności w ramach serii. Można to osiągnąć poprzez podwójne analizy kontrolnych i/lub badanych materiałów. Wyniki tych analiz powinny być porównywane z publikowanymi wartościami granicznymi powtarzalności i istniejącymi danymi na temat precyzji wewnętrznej.

W przypadku gdy wykorzystywane są materiały kontrolne, wartości otrzymane dla analiz międzyseryjnych materiału kontrolnego muszą zostać wykreślone na karcie Shewharta (ISO 8258 (1991)) wraz z właściwymi kontrolnymi wartościami granicznymi. Wartości graniczne działania muszą być wyznaczone dla:

x ± 3s

,

gdzie st jest całkowitym odchyleniem standardowym,

ostrzegawcze wartości graniczne dla:

x ± 2s

t

Całkowite odchylenie standardowe:

s

=

2sb2+ sw2/n

gdzie:

sb : międzyseryjne odchylenie standardowe

sw : wewnątrzseryjne odchylenie standardowe

n : liczba określeń

W przypadkach, w których nie są wykorzystywane materiały kontrolne (np.: z powodu braku stabilności), co najmniej jeden z badanych materiałów musi być podwójnie analizowany w każdej serii.

Różnica bezwzględna otrzymana z podwójnej analizy wewnątrz serii (patrz załącznik III) musi zostać wykreślona. Linia środkowa wynosi 1,128 sw, dolna wartość graniczna wynosi 0, górna wartość graniczna (wartość graniczna działania) wynosi 3,686 sw, gdzie sw jest wewnątrzseryjnym odchyleniem standardowym.

Procedura kontrolna powinna obejmować materiały dolnych i górnych poziomów, gdy zakres stężenia jest znaczny.

Jeżeli badane materiały obejmują szeroki zakres stężeń analitów, laboratorium powinno ustalić związek między precyzją i poziomem. Jeżeli precyzja jest proporcjonalna do poziomu, kolejna kontrola powinna być oparta na precyzji relatywnej (różnica bezwzględna jest wartością procentową wartości średniej).

Wystąpienie którejkolwiek z poniższych okoliczności wskazuje na stan systemu analitycznego odbiegający od normy:

A. aktualna wartość wykresu znajduje się poza wartościami granicznymi działania,

B. wartość aktualna i wartość poprzednia znajdują się poza wartościami granicznymi ostrzeżenia, ale w ramach wartości granicznych działania,

C. w przypadku wykorzystywania materiałów kontrolnych dziewięć kolejnych wartości znajduje się po tej samej stronie linii wyrażającej średnią.

Laboratorium powinno w następujący sposób zareagować na stan odbiegający od normy:

A. wstrzymać analizy w oczekiwaniu na wyniki badań diagnostycznych i działań naprawczych, oraz

B. odrzucić serię wyników i przystąpić do ponownej analizy badanych materiałów.

b) Procedura selekcji wewnętrznego materiału kontrolnego i określania wewnętrznych wartości granicznych precyzji (analiza chemiczna)

Dane na temat wewnątrzlaboratoryjnej precyzji mogą być określone przez analizy replikacji materiałów kontrolnych i/lub przez analizy replikacji badanych próbek.

Laboratoria powinny wykorzystywać poniższą procedurę w celu ustanowienia parametrów precyzji dla wewnątrzseryjnych i międzyseryjnych różnic w odniesieniu do kolejnego zastosowania w tworzeniu wykresów kontrolnych. Laboratoria mogą przyjąć procedury alternatywne pod warunkiem, że mogą należycie wykazać, iż zostały uzyskane wiarygodne dane dotyczące precyzji.

1. Wybór materiałów kontrolnych

W przypadku gdy laboratorium wykorzystuje materiał kontrolny, muszą zostać najpierw zebrane dane w celu określenia wartości granicznych. W miarę możliwości powinny być stosowane certyfikowane materiały wzorcowe (CMW). Potencjalne materiały kontrolne powinny być analizowane w warunkach powtarzalności w tej samej serii zawierającej właściwe CMW oraz podlegać replikacji i randomizacji. W przypadku gdy podejście takie nie jest możliwe, laboratoria powinny zabiegać o udział w kontroli biegłości i ustanowić w drodze porozumienia średnie (wartości przypisane), które mogą zostać uznane za prawdziwą średnią konwencjonalną połączoną z dużą dozą niepewności. Inne procedury obejmują przypisanie prawdziwej wartości poprzez sformułowanie lub wykorzystanie aktywowanego materiału kontrolnego.

Dodatkowo w przypadku, gdy laboratoria przeprowadzają regularnie analizy tego rodzaju i wprowadziły już kontrolę statystyczną, każde nowe materiały kontrolne (np.: wymagane z powodu wyczerpania zapasów) muszą być otrzymane z odniesieniem do analiz, które są pod kontrolą i w których wykorzystywane są materiały istniejące.

2. Ustalanie wartości granicznych

Po wybraniu materiału kontrolnego laboratorium powinno go zastosować w celu ustanowienia wewnątrzseryjnych i międzyseryjnych wielkości odnoszących się do precyzji.

Jako wymóg minimalny dla ustanowienia wewnątrzseryjnej precyzji materiał kontrolny powinien być podwójnie analizowany w 12 zdarzeniach. Podwójna analiza powinna być przeprowadzona w warunkach powtarzalności, tj. przez ten sam podmiot, z tymi samymi odczynnikami itd. Podwójna analiza materiału kontrolnego powinna być randomizowana w ramach serii analitycznej. Każda podwójna analiza powinna być podjęta innego dnia w określonym czasie, tak by odzwierciedlać uzasadnione odchylenia między seriami, z uwzględnieniem normalnych odchyleń np. odczynników, ponownej kalibracji przyrządów i jeżeli właściwe, różnych analityków.

Uwaga:

Wykorzystywanie danych, które nie odzwierciedlają w pełni różnic międzyseryjnych, może spowodować zbędną replikację analiz z powodu przyjęcia zbyt wąskich wartości granicznych. Odwrotnie, laboratorium, które przedstawia niezbyt dokładne dane dotyczące precyzji, prawdopodobnie niespełniające wyznaczonych wymogów metod referencyjnych, może wykazywać niezadowalające działanie w porównaniu z podobnymi laboratoriami i może nie prezentować danych odpowiednich do zamierzonego celu.

2.1. Określenie precyzji wewnątrzseryjnej

2.1.1. Precyzja wewnątrzseryjna w przypadku, gdy materiał kontrolny jest dostępny

Podwójne dane (minimum 12 duplikatów) powinny najpierw zostać poddane testowi Cochrana dla ekstremalnej wartości wariancji. Wymaga to porównania kwadratu maksymalnych zakresów duplikatu z sumą kwadratów zakresów.

C =

d

max

∑

d

i2

gdzie:

di = różnica między duplikatami.

Wartość parametru Cochrana, C, jest porównywana z wartościami tabel (ISO 5725 (1994)). Jeżeli wartość może być zakwalifikowana jako wątpliwa lub odstająca, wynik powinien być zbadany w celu znalezienia wyjaśnienia, np. błędu technicznego, błędu obliczeniowego, pomyłki w wykonaniu badania, analizie nieodpowiednich próbek. W przypadku gdy z wyjaśnienia błędu technicznego wynika brak możliwości zastąpienia wątpliwego wyniku, powinien być on wyeliminowany jako przypadek rzeczywistej wartości odstającej. Jeżeli wartości wątpliwe lub odstające, które nie mogą być wyjaśnione, utrzymują się, wartości wątpliwe są przyjmowane jako poprawne, a statystyczne wartości odstające są odrzucane. Laboratorium powinno starać się o określenie wartości zastępczych.

Po uzyskaniu przez laboratoriom pewności, że dane nie zawierają już wartości odstających, odchylenie standardowe wewnątrz serii sw jest otrzymywane w następujący sposób: Dla każdej pary p duplikatów danych suma duplikatów,

s

= x

+ x

i2

oraz różnica duplikatów,

d

= x

- x

i1

są obliczone i dodawane, aby uzyskać

A = ∑

s

i

B = ∑

d

i2

C = ∑

s

i2

Prognoza wewnątrzseryjnego odchylenia standardowego wynosi:

s

=

2B2p

Wewnętrzna precyzja wartości granicznej wynosi 2,8 sw.

W przypadku gdy stosowana jest metoda referencyjna, wewnętrzna precyzja wartości granicznej powinna być porównana z opublikowanymi wartościami granicznymi powtarzalności. Laboratorium powinno przestrzegać zgodności z wymogiem metody referencyjnej. Musi zostać wykryta przyczyna niespełniania tego wymogu.

Ustalone wartości graniczne powinny być uznane za tymczasowe i podlegać rewizji.

2.1.2. Precyzja wewnątrzseryjna, w przypadku gdy materiał kontrolny nie jest dostępny

Laboratorium może wybrać ustanowienie wewnątrzseryjnej precyzji przez podwójne analizy reprezentatywnych próbek badanych (minimum 12 podwójnych analiz). W przypadkach gdy nie jest możliwe stosowanie materiałów kontrolnych, np.: z powodu niestabilności, podwójne dane muszą być zebrane tą metodą.

Uwaga:

Zakłada się, że analizy pokrywają relatywnie wąski zakres wartości i dlatego pojedyncza wartość może być stosowana do wszystkich próbek. W przypadkach, w którym zakres wyników jest szerszy, np.: ponad rząd wielkości i precyzja jest zależna od poziomu, laboratoria powinny zbadać wykorzystywanie względnych odchyleń standardowych.

Dane powinny być poddane badaniu Cochrana, tak jak w ppkt 2.1.1. W przypadku gdy laboratorium ma pewność, że dane nie zawierają wartości odstających, odchylenie standardowe wewnątrz serii i wewnętrzna precyzja wartości granicznej mogą być ustalane jak w ppkt 2.1.1.

Odchylenie standardowe wewnątrz serii sw może być wykorzystywane do sporządzania wykresów kontrolnych (patrz załącznik II). Wyznaczone wartości graniczne powinny być uznane za tymczasowe i podlegać rewizji.

2.2. Określenie precyzji międzyseryjnej

Wyliczenie średnich wartości (s1/2) dla każdej pary i poddanie ich testowi Grubbsa (ISO 5725 (1994)). Kryteria odrzucenia/dopuszczenia dla wartości odstających lub wątpliwych są takie, jak opisane w ppkt 2.1.1. Laboratorium powinno zabiegać o określenie wartości zastępczej dla wszystkich odrzuconych wyników. Gdy laboratorium nabierze pewności, że dane nie zawierają wartości odstających, obliczane jest odchylenie standardowe między seriami sb.

s

=

1

C -

B -

A

2p

lub 0, jeżeli wyrażenie pod pierwiastkiem kwadratowym jest ujemne.

Całkowite odchylenie standardowe st jest wykorzystywane do sporządzenia kart kontrolnych dla średniej n oznaczeń (patrz załącznik II). Wyznaczone wartości graniczne powinny zostać uznane za tymczasowe i podlegać rewizji.

3. Rewizja początkowych wartości granicznych.

Kontrolne wartości graniczne ustanowione zgodnie z powyższym opisem muszą być uznane za szacunki wstępne.

W celu uaktualnienia wartości granicznych wyznaczonych w oparciu o dopuszczalną precyzję wewnątrzseryjną (ppkt 2.1.2.) należy zebrać dodatkowe duplikaty danych dotyczących badanych próbek. Przerwa poprzedzająca rewizję będzie zależała od częstotliwości analiz. Tytułem wskazówki należy stwierdzić, że dane powinny być poddane rewizji po otrzymaniu kolejnych 10 duplikatów. Wszystkie dane powinny być poddane badaniu Cochrana, a wartości graniczne wyznaczone na nowo w oparciu o nowe wartości odchylenia standardowego. Późniejsze decyzje w sprawie ważności kontrolnych wartości granicznych muszą być podejmowane w świetle dodatkowych danych.

Rewizja wstępnych danych otrzymanych dla precyzji międzyseryjnej zależy również od częstotliwości analiz. Tytułem wskazówki należy stwierdzić, że po otrzymaniu dalszych dziesięciu danych na podstawie analiz materiału kontrolnego, przy częstotliwości jednej analizy na partię, założenia wyjściowe dotyczące odchylenia standardowego i średniej powinny zostać poddane rewizji.

Wszystkie dane powinny podlegać badaniu Grubbsa, dla wartości odstających. Średnia i odchylenie standardowe powinny zostać ponownie obliczone w oparciu o nowe dane.

Ponadto na tym etapie laboratorium powinno stosować kartę Cusum (BS S700: (1984) z poprawką 5480 (1987)) w celu zbadania wszystkich problemów, które mogą być związane np. ze starzeniem się odczynników. Każdy pojedynczy wynik wykraczający poza wartości graniczne Cusum "V-mask" musi być przedmiotem badania.

Nowe wartości graniczne (średnia i odchylenie standardowe) muszą podlegać regularnej inspekcji z zastosowaniem techniki Cusum. Wszelkie wskazania, zgodnie z którymi ważność materiału kontrolnego może być kwestionowana, muszą być starannie zbadane.

4. Informowanie o danych dotyczących precyzji

Laboratoria muszą przesyłać poniższe informacje właściwym organom krajowym:

- stosowane metody,

- wewnątrzseryjne odchylenie standardowe sw i wewnętrzna precyzja wartości granicznej,

- międzyseryjne odchylenie standardowe sb,

- całkowite odchylenie standardowe s1,

- liczba analiz wykonanych w celu otrzymania danych dotyczących precyzji.

[1] M. Thompson i R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK VI

(Art. 6)

OCENA OSÓB OCENIAJĄCYCH I WIARYGODNOŚĆ WYNIKÓW ANALIZ SENSORYCZNYCH

Jeżeli wykorzystywane są metody punktów (norma IDF 99C/1997), stosowana jest poniższa procedura.

a) Określenie "indeksu powtarzalności"

Co najmniej dziesięć próbek zostanie poddanych analizie jako ślepe duplikaty przez jedną osobę oceniającą w okresie 12 miesięcy. Zazwyczaj będzie to odbywać się w czasie kilku sesji. Wyniki dla określonych cech produktu są oceniane z zastosowaniem poniższego wzoru:

w

=

∑

n

gdzie:

w

1 : indeks powtarzalności

x

i1 : wynik pierwszej oceny próbki x1

x

i2 : wynik drugiej oceny próbki x1

n : liczba próbek

Oceniane próbki powinny odzwierciedlać szeroki zakres jakości. Wartość w1 nie powinna przekroczyć 1,5 (skala pięciopunktowa).

b) Określenie "indeksu odchyleń"

Indeks ten powinien być wykorzystywany w celu sprawdzenia, czy osoba oceniająca wykorzystuje dla oceny jakości tę samą skalę co doświadczona grupa osób oceniających. Punkty otrzymane przez osobę oceniającą są porównywane ze średnią punktów otrzymanych przez grupę osób oceniających.

Do oceny wyników ma zastosowanie poniższe równanie:

D

=1+

∑

x

-x

x

-x

-i222n

gdzie:

xi1; xi2 : patrz lit. a)

;x

-i2 : średni wynik grupy osób oceniających odpowiednio w pierwszej i drugiej ocenie próbki xi

n : liczba próbek (co najmniej dziesięć na 12 miesięcy).

Oceniane próbki powinny odzwierciedlać szeroki zakres jakości. Wartość D1 nie powinna przekroczyć 1,5 (skala pięciopunktowa).

Państwa Członkowskie muszą zawiadamiać Komisję o wszelkich trudnościach napotkanych podczas stosowania niniejszej procedury.

c) Porównanie wyników otrzymanych w różnych regionach Państwa Członkowskiego i w różnych Państwach Członkowskich

Gdzie stosowne, badanie musi być zorganizowane co najmniej raz w roku w celu porównania wyników otrzymanych przez osoby oceniające w różnych regionach. Jeżeli występują znaczne różnice, powinny zostać podjęte konieczne kroki w celu zidentyfikowania przyczyn oraz uzyskania porównywalnych wyników.

Państwa Członkowskie mogą organizować badania w celu porównania wyników otrzymanych przez ich własne osoby oceniające i osoby oceniające z sąsiednich Państw Członkowskich. Znaczne różnice powinny prowadzić do pogłębionego badania w celu uzyskania wyników porównywalnych.

Państwa Członkowskie powinny zawiadomić Komisję o rezultatach tych porównań.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK VII

(Art. 6)

SENSORYCZNA OCENA MASŁA

1. Zakres

Celem niniejszej procedury dla sensorycznej oceny masła jest ustalenie jednolitej metody stosowanej we wszystkich Państwach Członkowskich.

2. Definicje

"Ocena sensoryczna" oznacza badanie właściwości produktu za pomocą narządów zmysłu.

"Zespół oceniający"oznacza grupę wybranych praktykujących osób oceniających, które podczas przeprowadzania oceny nie mają możliwości komunikowania się między sobą oraz nie mają możliwości wpływu jedna na drugą.

"Ocena punktowa"oznacza sensoryczną ocenę przeprowadzaną przez zespół oceniający, przy użyciu skali numerycznej. Musi być wykorzystywana nomenklatura dotycząca wad.

"Stopniowanie" oznacza klasyfikację jakościową, przeprowadzaną w oparciu o ocenę punktową.

"Dokumenty kontroli": dokumenty służące do rejestrowania indywidualnych ocen punktowych dla każdej cechy oraz ostatecznego stopnia dla danego produktu. (Dokument ten może zostać również wykorzystany do rejestrowania składu chemicznego).

3. Pomieszczenie do przeprowadzania badań

3.1. Należy podjąć środki ostrożności, aby znajdujące się w pomieszczeniu do przeprowadzania badań osoby oceniające nie były poddawane oddziaływaniu czynników zewnętrznych.

3.2. Pomieszczenie do przeprowadzania badań musi być wolne od obcych zapachów i łatwe do utrzymania w czystości. Ściany muszą być w jasnym kolorze.

3.3. Pomieszczenie do przeprowadzania badań oraz jego oświetlenie muszą być takie, aby nie miały wpływu na cechy ocenianych produktów. Pomieszczenie musi być wyposażone we właściwy czujnik temperatury.

4. Wybór osób oceniających

Osoba oceniająca musi znać produkty z masła oraz posiadać kwalifikacje w przeprowadzaniu stopniowania sensorycznego. Jej kompetencje powinny być regularnie oceniane (co najmniej raz w roku) przez właściwe władze.

5. Wymogi dotyczące zespołu oceniającego

Liczba osób oceniających w zespole powinna być nieparzysta, w liczbie co najmniej trzech osób. Większość z nich muszą stanowić pracownicy zatrudnieni przez właściwe władze bądź upoważnione osoby niezatrudnione w branży mleczarskiej.

W celu zapewnienia najlepszego wykonania zadania przez uczestników oceny przed podjęciem tej oceny musi zostać uwzględniony szereg czynników:

- uczestnicy nie mogą cierpieć na żadną chorobę, która mogłaby wpłynąć na ich sprawność. W razie wystąpienia takiego przypadku ta osoba oceniająca powinna zostać zastąpiona w zespole przez inną osobę,

- uczestnicy muszą punktualnie przystąpić do oceny i upewnić się, że mają wystarczająco dużo czasu na jej wykonanie,

- uczestnicy nie mogą używać substancji o silnym zapachu, takich jak perfumy, płyny po goleniu, dezodoranty itd., oraz powinni unikać spożywania aromatycznych pokarmów (np. mocno przyprawionych) itd.

- uczestnicy nie mogą palić, jeść ani pić niczego poza wodą na pół godziny przed ocenianiem.

6. Ocena wartości dla każdej cechy

6.1. Przy ocenie sensorycznej należy uwzględnić trzy czynniki: wygląd, konsystencję oraz aromat.

"Wygląd"wiąże się z następującymi cechami: kolor, widoczna czystość, porost pleśni oraz dyspersja wody. Dyspersję wody bada się zgodnie z normą IDF 112A/1989.

"Konsystencja"wiąże się z następującymi cechami: twardość oraz smarowność.

Do oceny konsystencji masła mogą być stosowane metody fizyczne. Komisja przewiduje dalszą harmonizację tych metod.

"Aromat" wiąże z następującymi cechami: smak i zapach.

Znaczne odchylenie od zalecanej temperatury uniemożliwia przeprowadzenie wiarygodnej oceny konsystencji oraz aromatu. Temperatura jest parametrem najwyższej wagi.

6.2. Sensoryczna ocena każdej cechy musi być przeprowadzana oddzielnie. Ocena punktowa musi być dokonywana zgodnie z tabelą 1.

6.3. W celu osiągnięcia jednolitości w ocenie punktowej może być wskazane, aby osoby oceniające, przed rozpoczęciem przeprowadzania oceny, przyznały punkty wspólnie dla jednej lub więcej próbek referencyjnych za ich wygląd, konsystencję i aromat.

6.4. Ocena punktowa dopuszczalności przedstawia się, jak następuje:

| Maksymalna | Wymagana |

Wygląd | 5 | 4 |

Konsystencja | 5 | 4 |

Aromat | 5 | 4 |

W przypadku gdy nie zostaje uzyskana wymagana liczba punktów, należy koniecznie podać opis wady. Liczba punktów przyznanych przez każdą z osób oceniających dla każdej cechy musi zostać zarejestrowana w dokumencie kontroli. Produkt zostaje dopuszczony bądź odrzucony (zdyskwalifikowany) w oparciu o decyzję większości. Przypadki, w których różnice między indywidualną oceną punktową dla każdej cechy są większe niż przyległa punktacja, nie powinny występować często (nie częściej niż raz na 20 próbek). W przeciwnym przypadku kierownik zespołu oceniającego powinien sprawdzić kompetencje tego zespołu.

7. Nadzór

Kierownik zespołu oceniającego, który musi być pracownikiem właściwych władz i może być członkiem zespołu, musi być generalnie odpowiedzialny za całą procedurę. Musi on rejestrować indywidualnie przyznane liczby punktów dla każdej cechy w dokumencie kontrolnym oraz uwierzytelniać dopuszczenie bądź odrzucenie produktu.

8. Pobieranie próbek oraz przygotowanie próbki

8.1. - Pożądane jest, aby tożsamość próbek była ukryta podczas przeprowadzania oceny, tak aby uniknąć wszelkiego możliwego wpływu na wyniki badania.

- Powinno to zostać zorganizowane przez kierującego zespołem oceniającym, przed przeprowadzeniem oceny, podczas nieobecności innych członków zespołu.

8.2. W przypadku gdy sensoryczna ocena przeprowadzana jest w chłodni składowej, próbkę pobiera się za pomocą sondy do pobierania masła. W przypadku gdy sensoryczna ocena jest przeprowadzana w innym miejscu niż chłodnia składowa, musi zostać próbka o masie co najmniej 500 g.

8.3. Podczas przeprowadzania oceny masło powinno mieć temperaturę 10–12 °C. Za wszelką cenę należy unikać dużych odchyleń od tych wartości temperatury.

9. Nomenklatura

Patrz załączona tabela 2.

Tabela 1: Punktowa ocena masła

Wygląd | Konsystencja | Aromat + woń |

Punkty | Nr [1] | Uwagi | Punkty (klasa jakości) | Nr [1] | Uwagi | Punkty (klasa jakości) | Nr [1] | Uwagi |

5 | | Bardzo dobry idealny rodzaj najwyższa jakość (gładka sucha powierzchnia) | 5 | | Bardzo dobra idealny rodzaj najwyższa jakość (dobrze smarowne) | 5 | | Bardzo dobry idealny rodzaj najwyższa jakość (idealnie czysta woń) |

4 | | Dobry [2] | 4 | | Dobra [2] | 4 | | Dobry [2] |

| Bez wyraźnych wad | 17 | twarda | | Bez wyraźnych wad |

| | 18 | miękka | | |

3 | | Odpowiedni (niewielkie wady) | 3 | | Odpowiednia (niewielkie wady) | 3 | | Odpowiedni (niewielkie wady) |

1 | luźny, wilgotny | 14 | krucha, łamliwa, lasująca się | 21 | nieklarowny |

2 | niejednolity, dwukolorowy | 15 | pastowata, ciastowata, mazista | 22 | obcy aromat |

3 | smugowaty | 16 | lepka | 25 | kwaśny |

4 | marmurkowy, nakrapiany | 17 | twarda | 27 | aromat gotowania, aromat spalenizny |

5 | plamisty | 18 | miękka | 33 | aromat paszowy |

6 | oddzielony olej | | | 34 | cierpki, gorzki |

7 | przebarwienia | | | 35 | przesolony |

8 | słaba, luźna struktura | | | | |

2 | | Zły (wyraźne wady) | 2 | | Zła (wyraźne wady) | 2 | | Zły (wyraźne wady) |

1 | luźny, wilgotny | 14 | Krucha, łamliwa, lasująca się | 21 | nieklarowny |

3 | smugowaty | 15 | pastowata, ciastowata, mazista | 22 | obcy aromat |

4 | marmurkowy, nakrapiany | 16 | lepka | 23 | czerstwy |

5 | plamisty | 17 | twarda | 25 | kwaśny |

6 | oddzielony olej | 18 | miękka | 32 | aromat utlenienia, aromat metaliczny |

10 | obce substancje | | | 33 | aromat paszowy |

11 | zapleśnienia | | | 34 | cierpki, gorzki |

12 | nierozpuszczona sól | | | 35 | przesolony |

| | | | 36 | stęchły, zgniły |

| | | | 38 | aromat chemikaliów |

1 | | Bardzo zły (mocne wady) | 1 | | Bardzo zła (mocne wady) | 1 | | Bardzo zły (mocne wady) |

1 | luźny, wilgotny | 14 | krucha, łamliwa, lasująca się | 22 | obcy aromat |

3 | smugowaty | 15 | pastowata, ciastowata, mazista | 24 | aromat serowy, twarogowy |

4 | marmurkowy, nakrapiany | 16 | lepka | 25 | kwaśny |

5 | plamisty | 17 | twarda | 26 | drożdżowy |

6 | oddzielony olej | 18 | miękka | 28 | spleśniały aromat |

7 | przebarwiony | | | 29 | zjełczały |

9 | granulowaty | | | 30 | oleisty, rybi |

10 | obce substancje | | | 31 | łojowaty |

11 | spleśniały | | | 32 | aromat utlenienia, aromat metaliczny |

12 | nierozpuszczona sól | | | 34 | cierpki, gorzki |

| | | | 36 | stęchły, zgniły |

| | | | 37 | słodowy |

| | | | 38 | aromat chemikaliów |

Tabela 2: Wykaz wad masła

I. Wygląd

1. luźny, wilgotny

2. niejednolity, dwukolorowy

3. smugowaty

4. marmurkowy, nakrapiany

5. plamisty

6. oddzielony olej

7. przebarwiony

8. słaby (luźna struktura)

9. granulowany

10. substancje obce

11. zapleśniały

12. nierozpuszczona sól

II. Konsystencja

14. krucha, łamliwa, lasująca się

15. pastowata, ciastowata, mazista

16. lepka

17. twarda

18. miękka

III. Aromat i woń

20. bez aromatu

21. nieklarowny [3]

22. obcy aromat

23. czerstwy

24. serowy, twarogowy

25. kwaśny

26. drożdżowy

27. a) aromat gotowania

b) aromat spalenizny

28. spleśniały aromat

29. zjełczały

30. oleisty, rybi

31. łojowaty

32. a) aromat utlenienia

b) aromat metaliczny

33. aromat paszowy

34. cierpki, gorzki

35. przesolony

36. stęchły, zgniły

37. słodowy

38. aromat chemikaliów

[1] Tabela 2

[2] Wady wymienione pod oceną "dobra" stanowią jedynie bardzo małe odchylenia od rodzaju idealnego

[3] To oznaczenie powinno być używane możliwie najrzadziej i wyłacznie wtedy, gdy wada nie może być opisana bardziej dokładnie.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK VIII

(art. 7)

PROCEDURA STOSOWANA W PRZYPADKACH SPORÓW DOTYCZĄCYCH WYNIKÓW ANALIZ (analizy chemiczne)

1. Dodatkowa analiza może być przeprowadzana na wniosek podmiotu w ciągu siedmiu dni roboczych od ogłoszenia wyników pierwszej analizy, pod warunkiem że zapieczętowane duplikaty próbek produktu są dostępne i zostały odpowiednio składowane przez właściwe władze.

2. Właściwe władze wyślą te próbki do drugiego laboratorium, na wniosek i koszt podmiotu. Laboratorium to musi być uprawnione do przeprowadzania analiz urzędowych i musi posiadać potwierdzone kompetencje do wykonywania wnioskowanych analiz. Kompetencje te powinny być udokumentowane udanym udziałem w badaniach międzylaboratoryjnych, testach biegłości lub w porównaniach między laboratoriami. Drugie laboratorium musi wykorzystywać metodę referencyjną. Wyniki otrzymane przez dwa laboratoria muszą zostać ocenione, jak następuje:

a) Jeżeli obydwa laboratoria spełniają wymóg powtarzalności i odtwarzalności

Średnią arytmetyczną wyników badań, otrzymanych przez obydwa laboratoria, podaje się jako wynik końcowy. Ten wynik końcowy jest oceniany z uwzględnieniem różnicy krytycznej, z zastosowaniem poniższego wzoru:

CrD

Y

- m

=

2

1 -

2n

-

2n

2

gdzie:

Y

- : średnia arytmetyczna wszystkich wyników otrzymanych przez obydwa laboratoria

mo : wartość graniczna

R : odtwarzalność

r : powtarzalność

n1 : liczba wyników otrzymanych przez laboratorium 1

n2 : liczba wyników otrzymanych przez laboratorium 2

Uwaga

Jeżeli wynik końcowy jest obliczany za pomocą wzorów:

x = y

± y

lub

x = y

/y

(patrz ust. 3 i 4 załącznika IV odpowiednio) i powinny być podstawione do wzorów zamiast i.

b) Jeżeli laboratoria spełniają wymóg powtarzalności, ale nie spełniają wymogu odtwarzalności

Jeżeli druga analiza potwierdza pierwszą, ilość poddana analizie powinna zostać odrzucona jako niezgodna. W przeciwnym razie ilość powinna zostać dopuszczona.

c) Jeżeli tylko jedno laboratorium spełnia wymóg powtarzalności

Wynik końcowy laboratorium spełniającego wymóg powtarzalności należy wykorzystać do podjęcia decyzji o dopuszczeniu ilości poddawanych analizie.

d) Jeżeli żadne z laboratoriów nie spełnia wymogu powtarzalności, ale spełniony jest wymóg odtwarzalności

Stosuje się lit. a).

e) Jeżeli żadne z laboratoriów nie spełnia wymogu powtarzalności ani wymogu odtwarzalności

Ilość poddawana analizie powinna być dopuszczona, jeżeli wyniki otrzymane przez jedno z laboratoriów prowadzą do takiego wniosku.

f) Jeżeli wyniki zostały otrzymane z zastosowaniem metod niepotwierdzonych

Ilość poddawana analizie powinna być dopuszczona, jeżeli wyniki otrzymane przez jedno z laboratoriów prowadzą do takiego wniosku

3. Wyniki drugiej analizy muszą być notyfikowane podmiotowi przez właściwe władze możliwie najszybciej. Koszt drugiej analizy jest ponoszony przez dany podmiot, jeżeli ilość poddawana analizie jest odrzucona.

4. Jeżeli podmiot może udowodnić, w ciągu pięciu dni roboczych od momentu pobrania próbek, że procedura pobierania próbek nie została przeprowadzona prawidłowo, pobranie próbek musi zostać w miarę możliwości powtórzone. Jeżeli pobranie próbek nie może zostać powtórzone, ilość poddana analizie musi zostać dopuszczona.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK IX

(art. 8)

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WODY W MAŚLE

1. Zakres i dziedzina stosowania

Niniejsza metoda referencyjna precyzuje metodę oznaczania zawartości wody w maśle.

2. Odniesienie

Norma IDF 50 C: 1995 – Mleko i przetwory mleczne – Metody pobierania próbek

3. Definicja

Zawartość wody w maśle: utrata masy po zakończeniu procesu ogrzewania określonego w niniejszej normie. Zawartość wody w maśle wyrażona jest w gramach na 100 g.

4. Zasada

Odparowywanie wody, z próbki analitycznej w obecności pumeksu, w temperaturze 102 °C w piecu suszarniczym.

5. Aparatura i materiały

Typowa aparatura laboratoryjna, w szczególności:

5.1. Waga analityczna o czułości 1 mg.

5.2. Eksykator zaopatrzony w wydajny środek osuszający (na przykład świeżo wyschnięty żel krzemionkowy ze znacznikiem higroskopijnym).

5.3. Piec suszarniczy, wentylowany, regulowany termostatycznie, działający w temperaturze 102 ± 2 °C na całej powierzchni roboczej.

5.4. Szklane, porcelanowe lub niekorodujące naczynia metalowe, o wysokości około 20 mm, o średnicy 60–80 mm.

5.5. Kamień pumeksowy, granulowany, myty, o średnicy 0,8–10 mm.

6. Pobieranie próbek

Patrz IDF 50 C: 1995

7. Procedura

7.1. Przygotowanie próbki badanej

Podgrzać próbkę laboratoryjną w zamkniętym szklanym lub odpowiednim plastykowym pojemniku, który powinien być napełniony w połowie do dwóch trzecich, do temperatury, w której próbka będzie wystarczająco miękka, aby ułatwić staranne mieszanie do uzyskania stanu jednorodnego (mieszadłem mechanicznym lub ręcznie). Temperatura mieszania nie powinna normalnie przekraczać 35 °C. Schłodzić próbkę do temperatury otoczenia. Natychmiast po schłodzeniu otworzyć pojemnik z próbką i mieszać krótko (nie dłużej niż przez 10 sekund) odpowiednim przyrządem, na przykład łyżką lub łopatką, przed zważeniem.

7.2. Określenie zawartości wody

7.2.1. Umieścić w przybliżeniu 10 g pumeksu w naczyniu (ppkt 5.4).

7.2.2. Suszyć naczynie z pumeksem w piecu (ppkt 5.3) w temperaturze 102 ± 2 °C przynajmniej przez jedną godzinę.

Uwaga:

Okresy suszenia wspomniane w ppkt 7.2.2, 7.2.5 i 7.2.7 rozpoczynają się, kiedy temperatura pieca osiąga 102 ± 2 °C.

7.2.3. Schłodzić naczynie w eksykatorze (ppkt 5.2) do temperatury pokoju wagowego i ważyć z dokładnością do 1 mg.

7.2.4. Odmierzyć wagowo do naczynia, z dokładnością do 1 mg, porcję badaną o wielkości w przybliżeniu 5 g badanej próbki.

7.2.5. Umieścić naczynie w piecu w temperaturze 102 ± 2 °C i pozostawić je na trzy godziny.

7.2.6. Schłodzić naczynie w eksykatorze do temperatury pokoju wagowego i zważyć z dokładnością do 1 mg.

7.2.7. Powtarzać proces suszenia przez dodatkowe jednogodzinne okresy, chłodząc i ważąc za każdym razem w sposób określony w ppkt 7.2.6 aż do uzyskania stałej masy (zmiany masy nie przekraczają 1 mg).

W przypadku zwiększenia się masy przyjąć do obliczenia najniższą zarejestrowaną masę.

8. Sposób prezentowania wyników

8.1. Metoda obliczeń i wzór

Obliczyć zawartość wody, W, jako wartość procentową masy z zastosowaniem poniższego wzoru:

W =

m

- m

m

- m

x 100

gdzie

m0 mjest masą w gramach naczynia z pumeksem (ppkt 7.2.3.)

m1 mjest masą w gramach, porcji badanej, naczynia i pumeksu przed suszeniem (ppkt 7.2.4)

m2 mjest masą w gramach, porcji badanej, naczynia i pumeksu po suszeniu (ppkt 7.2.7)

Przedstawić wynik z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

8.2. Powtarzalność

Różnica bezwzględna między wynikami dwóch pojedynczych oznaczeń, przeprowadzonych równocześnie lub w bezpośrednim następstwie przez ten sam podmiot w tych samych warunkach na identycznym materiale badanym, nie przekracza 0,2 %.

8.3. Odtwarzalność

Różnica bezwzględna między dwoma pojedynczymi i niezależnymi wynikami, otrzymanymi przez dwa podmioty pracujące w różnych laboratoriach na identycznym materiale badanym, nie przekracza 0,3 %.

9. Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań powinno precyzować wykorzystane metody oraz podawać otrzymane wyniki. Powinno także ujmować wszystkie szczegóły operacyjne niesprecyzowane w niniejszej normie międzynarodowej lub uznane za fakultatywne, łącznie ze szczegółami dotyczącymi jakichkolwiek zdarzeń, które mogły wpłynąć na wyniki. Sprawozdanie z badań powinno podawać wszystkie informacje konieczne do pełnej identyfikacji próbki.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK X

(art. 8)

MASŁO: OZNACZANIE ZAWARTOŚCI SUCHEJ MASY BEZTŁUSZCZOWEJ

1. Zakres i dziedzina stosowania

Niniejsza norma precyzuje metodę oznaczania zawartości suchej masy beztłuszczowej w maśle.

2. Odniesienie

Norma IDF 50 C: 1995 – Mleko i przetwory mleczne – Metody pobierania próbek

3. Definicja

Zawartość suchej masy beztłuszczowej w maśle: Wartość procentowa udziału w masie substancji, oznaczona przez wymienioną procedurę. Zawartość ta wyrażona jest w gramach na 100 g.

4. Zasada

Odparowywanie wody ze znanej masy masła, ekstrakcja z zastosowaniem lekkiej ropy naftowej i ważenie pozostałości.

5. Odczynnik

Lekka ropa naftowa o zakresie wrzenia między 30 i 60 °C. Odczynnik nie powinien pozostawiać więcej niż 1 mg pozostałości po odparowaniu 100 ml.

6. Aparatura i materiały

6.1. 6.1. Waga analityczna, o czułości 1 mg.

6.2. Eksykator zaopatrzony w wydajny środek wysuszający (na przykład świeżo wyschnięty żel krzemionkowy ze znacznikiem higroskopijnym).

6.3. Piec suszarniczy, wentylowany, regulowany termostatycznie, działający w temperaturze 102 ± 2 °C na całej powierzchni roboczej.

6.4. Szklane, porcelanowe lub niekorodujące naczynia metalowe, o wysokości odpływu około 20 mm, o średnicy 60–80 mm, zaopatrzone w szklany pręt do mieszania.

6.5. Tygiel filtracyjny, szkło spiekane, średnica pora 16–40 μm, z kolbą ssącą.

7. Pobieranie próbek

Patrz norma IDF 50 C: 1995

8. Procedura

8.1. Przygotowanie badanej próbki

Podgrzać próbkę laboratoryjną w zamkniętym szklanym lub odpowiednim plastykowym pojemniku, który powinien być napełniony w połowie do dwóch trzecich, do temperatury, w której próbka będzie wystarczająco miękka, aby ułatwić staranne mieszanie do uzyskania stanu jednorodnego (mieszadłem mechanicznym lub ręcznie). Temperatura mieszania nie powinna normalnie przekraczać 35 °C. Schłodzić próbkę do temperatury otoczenia. Możliwie najszybciej po schłodzeniu otworzyć pojemnik z próbką i mieszać krótko (nie dłużej niż przez 10 sekund) odpowiednim przyrządem, na przykład łyżką lub łopatką, przed zważeniem.

8.2. Oznaczanie

8.2.1. Suszyć naczynie z prętem (ppkt 6.4) i tyglem (ppkt 6.5) w piecu (ppkt 6.3) przez jedną godzinę. Pozostawić te przedmioty do schłodzenia w eksykatorze i zważyć je razem (to znaczy naczynie, pręt i tygiel) z dokładnością do 1 mg (m0).

Uwagi:

- Z zasady wystarczającym czasem chłodzenia jest 45 minut.

- Ważne jest, aby dla każdej porcji badanej używać tego samego zestawu naczynia, pręta i tygla, jeżeli w partii analizuje się więcej niż jedną porcję badaną.

8.2.2. Usunąć tygiel, zarejestrować łączną wagę naczynia i pręta, z dokładnością do 1 mg (m1).

8.2.3. Odmierzyć wagowo do naczynia, z dokładnością do 1 mg, porcję badaną o wielkości około 5 g z badanej próbki (ppkt 8.1) (m2).

8.2.4. Umieścić naczynie (zawierające pręt i masło) w piecu w temperaturze 102 ± 2°C i pozostawić na noc.

8.2.5. Pozostawić naczynie (ppkt 8.2.3) do schłodzenia do temperatury pokojowej.

8.2.6. Dodać 15 ml ciepłej (w przybliżeniu 25 °C) lekkiej ropy naftowej do naczynia i oddzielić możliwie najwięcej osadu przylegającego do naczynia, używając pręta szklanego. Przenieść rozpuszczalnik do tygla i pozostawić go, aż się przefiltruje do kolby ssącej.

8.2.7. Przeprowadzić czynności ppkt 8.2.6 jeszcze cztery razy. Jeżeli nie ma żadnych śladów tłuszczu na powierzchni naczynia, przenieść ilościowo podczas czwartego płukania możliwie najwięcej osadu do tygla. W przeciwnym razie powtarzać czynności ppkt 8.2.6 do czasu całkowitego wyeliminowania wszystkich śladów tłuszczu.

8.2.8. Spłukać osad w tyglu za pomocą 25 ml ciepłej ropy naftowej.

8.2.9. Suszyć naczynie, pręt szklany i tygiel razem w piecu w temperaturze 120 ± 2°C przez 30 minut.

8.2.10. Pozostawić w eksykatorze do schłodzenia do temperatury pokojowej i zważyć z dokładnością do 1 mg.

8.2.11. Powtarzać czynności ppkt 8.2.9 i 8.2.10 do czasu otrzymania stałej masy (zmiana masy nieprzekraczająca 1 mg) naczynia, pręta i tygla łącznie (m3).

9. Sposób prezentowania wyników

9.1. Wyliczenie zawartości suchej masy beztłuszczowej

Obliczyć zawartość suchej masy beztłuszczowej, SNF, jako wartość procentową masy z zastosowaniem poniższego wzoru:

SNF =

m

- m

m

- m

x 100

gdzie

m0 mjest masą w gramach, pustego naczynia z prętem szklanym i tyglem (ppkt 8.2.1)

m1 mjest masą w gramach, pustego naczynia z prętem szklanym (ppkt 8.2.2)

m2 mjest masą w gramach, porcji badanej i naczynia z prętem szklanym (ppkt 8.2.3)

m3 jest końcową masą w gramach, w naczyniu z prętem i tyglem zawierającym osad (ppkt 8.2.11)

Przedstawić wynik z dokładnością jednego miejsca po przecinku.

9.2. Powtarzalność

Różnica bezwzględna między wynikami dwóch pojedynczych oznaczeń, przeprowadzonych równocześnie lub w bezpośrednim następstwie przez ten sam podmiot w tych samych warunkach na identycznym materiale badanym, nie przekracza 0,1 %.

9.3. Odtwarzalność

Różnica bezwzględna między dwoma pojedynczymi i niezależnymi wynikami, otrzymanymi przez dwa podmioty pracujące w różnych laboratoriach na identycznym materiale badanym, nie przekracza 0,2 %.

10. Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań powinno precyzować wykorzystaną metodę oraz podawać otrzymane wyniki. Powinno także ujmować wszystkie szczegóły operacyjne niesprecyzowane w tej normie międzynarodowej lub uznane za fakultatywne, łącznie ze szczegółami dotyczącymi jakichkolwiek zdarzeń, które mogły wpłynąć na wyniki. Sprawozdanie z badań powinno podawać wszystkie informacje konieczne do pełnej identyfikacji próbki.

Uwaga:

Jeżeli analizie poddawane jest masło solone, dodana sól jest określona jako sucha masa beztłuszczowa. Dla oznaczenia zawartości suchej masy beztłuszczowej mleka należy odjąć od zawartości suchej masy beztłuszczowej zawartość dodanej soli.

Obliczone wielkości precyzji dla oznaczania zawartości suchej masy beztluszczowej mleka wynoszą:

Powtarzalność: | r = 0,104 % |

Odtwarzalność: | R = 0,206 %. |

Może zostać przyjęte, że wielkości precyzji otrzymane dla oznaczenia suchej masy beztłuszczowej są ważne dla oznaczania zawartości suchej masy beztłuszczowej mleka.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XI

(art. 8)

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI TŁUSZCZU W MAŚLE

Zawartość tłuszczu jest otrzymywana pośrednio przez oznaczenie zawartości wody i zawartości suchej masy beztłuszczowej zgodnie z załącznikiem IX i załącznikiem X odpowiednio. Wartość procentowa udziału tłuszczu w masie jest równa:

100 -

W + SNF

gdzie:

W : jest wartością procentową udziału wody w masie

SNF : jest wartością procentową udziału suchej masy beztłuszczoej w wodzie

Obliczone wielkości precyzji dla oznaczania zawartości tłuszczu to:

Powtarzalność: | r = 0,22 % |

Odtwarzalność: | R = 0,36 % |

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XII

(art. 9)

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WANILINY W KONCENTRACIE MASŁA, W MAŚLE LUB ŚMIETANIE ZA POMOCĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ HPLC

1. Zakres i dziedzina stosowania

Niniejsza metoda opisuje procedurę ilościowego oznaczania waniliny w koncentracie masła, w maśle lub śmietanie.

2. Zasada

Ekstrakcja znanej ilości próbki za pomocą mieszaniny izopropanolu/etanolu/acetonitrylu (1:1:2). Strącenie większości tłuszczu przez schłodzenie do temperatury w granicach między -15 °C a -20 °C, a następnie odwirowanie.

Po rozcieńczeniu w wodzie oznaczenie zawartości waniliny za pomocą chromatografii (HPLC).

3. Aparatura

Typowa aparatura laboratoryjna, w szczególności:

3.1. zamrażarka, działająca w amplitudzie temperatur od -15 °C do -20 °C;

3.2. strzykawki, o pojemności 2 ml;

3.3. mikrofiltry membranowe, o wielkości porów 0,45 μm, odporne na działanie roztworu zawierającego 5 % roztwór ekstrakcyjny (ppkt 4.4);

3.4. zestaw do wykonywania chromatografii składający się z pompy (przepływ 1,0 ml/min), iniektora (iniekcja 20 μl automatyczna lub ręczna), detektora UV (długość fali 306 nm, pełna skala 0,01 AU), rejestratora lub integratora oraz termostatu kolumny działającego przy temperaturze 25 °C;

3.5. kolumna analityczna (250 mm × 4,6 mm ID) z wypełnieniem materiałem LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) lub równorzędnym;

3.6. kolumna osłonowa (ok. 20 mm × 3 mm ID) z suchym wypełnieniem materiałem Perisorb RP 18 (30–40 μm) lub równorzędnym.

4. Odczynniki

Wszystkie wykorzystane odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej.

4.1. Izopropanol

4.2. Etanol 96 % (obj.)

4.3. Acetonitryl

4.4. Roztwór ekstrakcyjny

Wymieszać izopropanol (ppkt 4.1), etanol (ppkt 4.2. ) i acetonitryl (ppkt 4.3) w stosunku 1:1:2 (objętościowo).

4.5. Wanilina (4-hydroksy-3-metoksybenzaldehyd);

4.5.1. Roztwór podstawowy waniliny (= 500 μg/ml)

Odmierzyć wagowo z dokładnością do 0,1 mg około 50 mg (CM mg) waniliny (ppkt 4.5) w kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml, dodać 25 ml roztworu ekstrakcyjnego (ppkt 4.4) i uzupełnić wodą.

4.5.2. Roztwór wzorcowy waniliny (= 10 μg/ml)

Odmierzyć pipetą 5 ml roztworu podstawowego waniliny (ppkt 4.5.1) do kolby pomiarowej o pojemności 250 ml i uzupełnić wodą.

4.6. Metanol, jakość HPLC

4.7. Kwas octowy lodowaty

4.8. Woda, jakość HPLC

4.9. Faza ruchoma HPLC

Zmieszać 300 ml etanolu (ppkt 4.6) z około 500 ml wody (ppkt 4.8) i 20 ml kwasu octowego (ppkt 4.7) w kolbie pomiarowej o pojemności 1000 ml, a następnie uzupełnić wodą (ppkt 4.8). Przefiltrować przez filtr 0,45 μm.

5. Procedura

5.1. Przygotowanie badanej próbki.

5.1.1. Masło

Ogrzewać próbkę, aż zacznie się topić. Unikać lokalnego przegrzania powyżej 40 °C. Gdy próbka stanie się dostatecznie plastyczna, homogenizować ją przez wstrząsanie. Przed pobraniem próbki mieszać masło przez 15 sekund. Odmierzyć wagowo z dokładnością do 1 mg około 5 g (SM g) masła do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml.

5.1.2. Koncentrat masła

Bezpośrednio przed pobraniem próbki umieścić pojemnik z koncentratem masła w piecu o temperaturze 40–50 °C, dopóki nie ulegnie całkowitemu stopieniu. Rozrobić próbkę przez odwirowanie lub mieszanie, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza na skutek zbyt energicznego mieszania. Odmierzyć wagowo ok. 4 g (SM g) koncentratu masła, z dokładnością do 1 mg, do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml.

5.1.3. Śmietana

Ogrzać próbkę w łaźni wodnej lub w inkubatorze w temperaturze 35–40 °C. Rozprowadzić tłuszcz równomiernie przez wirowanie lub w razie potrzeby przez mieszanie. Schłodzić szybko próbkę do temperatury 20 ± 2 °C. Próbka powinna mieć jednorodny wygląd; jeżeli tak nie jest, powtórzyć procedurę. Odmierzyć wagowo 10 g (SM g) śmietany, z dokładnością do 1 g, do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml.

5.2. Przygotowanie badanego roztworu

Dodać około 75 ml roztworu ekstrakcyjnego (ppkt 4.4) do porcji badanej (ppkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3), energicznie mieszać lub wstrząsać przez 15 minut i uzupełnić roztworem ekstrakcyjnym (ppkt 4.4). Przenieść około 10 ml tego ekstraktu do rurki z korkiem. Umieścić rurkę w zamrażarce (ppkt 3.1) i pozostawić na około 30 minut. Odwirowywać zimny ekstrakt przez 5 minut z prędkością około 2000 obr./min, a następnie niezwłocznie zdekantować. Pozostawić zdekantowany roztwór, dopóki nie osiągnie temperatury pokojowej. Pobrać pipetą 5 ml zdekantowanego roztworu do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml i uzupełnić wodą. Przefiltrować podwielokrotność przez mikrofiltr membranowy (ppkt 3.3). Filtrat jest gotowy do oznaczania za pomocą HPLC.

5.3. Kalibracja

Pobrać pipetą 5 ml wzorcowego roztworu waniliny (ppkt 4.5.2) do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Dodać 5 ml roztworu ekstrakcyjnego (ppkt 4.4) i uzupełnić wodą do znaku. Roztwór ten zawiera 0,5 μg/ml waniliny.

5.4. Oznaczanie za pomocą HPLC

Pozostawić układ chromatograficzny na 30 minut w celu ustabilizowania. Dokonać iniekcji roztworu wzorcowego (ppkt 5.3). Powtarzać tę czynność, dopóki różnice między powierzchniami pików lub wysokościami pików między dwoma kolejnymi iniekcjami są mniejsze niż 2 %. W opisanych warunkach czas retencji waniliny wynosi około 9 minut. Poddać analizie roztwór wzorcowy (ppkt 5.3) w dwóch egzemplarzach przez iniekcję 20 μl. Dokonać iniekcji 20 μl roztworów badanych (ppkt 5.2). Określić powierzchnię lub wysokość otrzymanego piku waniliny. Powtórzyć podwójną iniekcję roztworu wzorcowego (ppkt 5.3) po 10 iniekcjach badanych próbek (ppkt 5.2).

6. Obliczanie wyników

Obliczyć średnią wielkość powierzchni (lub wysokość) (AC) pików waniliny powiązanych z granicznymi duplikatami iniekcji dla każdej partii roztworów badanych (łącznie cztery obszary lub wysokości).

Obliczyć współczynnik odpowiedzi (R):

R = AC/CM

gdzie CM jest masą waniliny w mg (ppkt 4.5.1).

Zawartość (w mg/kg) waniliny (C) w próbce badanej określa wzór:

C =

AS x 20 x 0,96SM x R

gdzie:

AS = powierzchnia piku waniliny w badanej próbce

SM =

masa badanej próbki w g (ppkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3).

Jeżeli śmietana jest badana na obecność waniliny, stężenie znacznika musi być wyrażone w mg znacznika/kg tłuszczu mlekowego. Jest to obliczane przez mnożenie C przez 100/f. Wartość f jest procentową zawartością tłuszczu w śmietanie (m/m).

20 = współczynnik uwzględniający rozcieńczenie próbki wzorcowej i badanej

0,96 = współczynnik korygujący dla zawartości tłuszczu w pierwszym rozcieńczeniu badanej próbki

Uwaga

Zamiast powierzchni piku można wykorzystać wysokości pików (patrz ppkt 8.3).

7. Dokładność metody

7.1. Powtarzalność (r)

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych w możliwie najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot z zastosowaniem tej samej aparatury na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 16 mg/kg.

7.2. Odtwarzalność (R)

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych przez podmioty gospodarcze w różnych laboratoriach z wykorzystaniem różnej aparatury na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 27 mg/kg.

8. Granice tolerancji

8.1. Z produktu zawierającego znacznik muszą być pobrane trzy próbki w celu sprawdzenia jednorodności.

8.2. Znacznik otrzymany z wanilii albo z waniliny syntetycznej:

8.2.1. Wielkość inkorporacji 4-hydroksy-3-metoksybenzaldehydu wynosi 250 g na tonę koncentratu masła lub masła. Jeżeli znaczona jest śmietana, wielkość inkorporacji wynosi 250 g na tonę tłuszczu mleka.

8.2.2. Wyniki dla trzech próbek, otrzymane w trakcie analizy produktu, są wykorzystywane do sprawdzenia proporcji i równomierności inkorporacji znacznika, a najniższy z wyników jest porównywany z poniższymi wartościami granicznymi (biorąc pod uwagę różnicę krytyczną dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % (DCr95)):

- 221,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji),

- 159,0 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji).

Stężenie znacznika w próbce, która daje najniższy wynik, jest wykorzystywane w powiązaniu z interpolacją między 221,0 mg/kg i 159,0 mg/kg.

8.3. Znacznik otrzymany wyłącznie z ziaren wanilii lub jej integralnych ekstraktów:

8.3.1. Wielkość inkorporacji 4-hydroksy-3-metoksybenzaldehydu wynosi 100 gramów na tonę koncentratu masła lub masła. Jeżeli znaczona jest śmietana, wielkość inkorporacji wynosi 100 g na tonę tłuszczu mleka.

8.3.2. Wyniki dla trzech próbek, otrzymane w trakcie analizy produktu, są wykorzystywane do sprawdzenia proporcji i równomierności wprowadzenia znacznika, a najniższy z wyników jest porównywany z poniższymi wartościami granicznymi (biorąc pod uwagę różnicę krytyczną dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % (DCr95)):

- 79,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji),

- 54,0 mg/kg (70c % minimalnej wielkości inkorporacji).

Stężenie znacznika w próbce, która daje najniższy wynik, jest wykorzystywane w powiązaniu z interpolacją między 79,0 mg/kg a 54,0 mg/kg.

9. Uwagi

9.1. Powtarzalność r jest to wartość, poniżej której można się spodziewać, że różnica bezwzględna między dwoma pojedynczymi wynikami badań otrzymanymi za pomocą tej samej metody na identycznym materiale badanym w takich samych warunkach (ta sama aparatura, to samo laboratorium i krótki odstęp czasu) będzie zawierała się w granicach określonego prawdopodobieństwa; z braku innych wskazań prawdopodobieństwo wynosi 95 %.

9.2. Odtwarzalność R jest to wartość, poniżej której można się spodziewać, że różnica bezwzględna między pojedynczymi wynikami badań otrzymanymi za pomocą tej samej metody na identycznym materiale badanym w różnych warunkach (różne podmioty, różna aparatura, różne laboratoria i/lub różne terminy) może zawierać się w granicach określonego prawdopodobieństwa; w braku innych wskazań prawdopodobieństwo wynosi 95 %

9.3. Odzysk dodanej waniliny przy 250 mg/kg bezwodnego tłuszczu mlecznego waha się w granicach 97,0–103,8. Stwierdzona średnia zawartość waniliny wynosiła 99,9 % przy odchyleniu standardowym 2,7 %.

9.4. Wzorcowy roztwór zawiera 5 % roztwór ekstrakcyjny mający wyrównać poszerzenie piku spowodowane obecnością 5 % roztworu ekstrakcyjnego w badanych próbkach. Umożliwia to kwantyfikację według wysokości pików.

9.5. Analiza oparta jest na linii kalibracji liniowej z początkiem układu współrzędnych.

Przez zastosowanie odpowiednich rozcieńczeń roztworu wzorcowego (ppkt 4.5.2) liniowość powinna być sprawdzona po raz pierwszy podczas dokonywania analizy, a następnie w regularnych odstępach czasu i po zmianach lub naprawach sprzętu HPLC.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XIII

(art. 9)

OZNACZANIE DROGĄ SPEKTROMETRII ZAWARTOŚCI ESTRU ETYLU KWASU BETA-APO-8'-KAROTENOWEGO W KONCENTRACIE MASŁA ORAZ W MAŚLE

1. Zakres i dziedzina stosowania

Metoda przedstawia procedurę stosowaną do ilościowego oznaczania zawartości estru etylowego kwasu beta-apo-8’-karotenowego (ester apokarotenowy) w koncentracie masła i w maśle. Ester apokarotenowy jest sumą wszystkich substancji obecnych w ekstrakcie próbek otrzymanych zgodnie z warunkami określonymi w metodzie, która polega na absorbowaniu światła przy 440 nm.

2. Zasada

Tłuszcz z masła jest rozpuszczany w lekkiej ropie naftowej, a absorbancja jest mierzona przy 440 nm. Zawartość estru apokarotenowego jest ustalona poprzez odniesienie do normy zewnętrznej.

3. Aparatura

3.1. Pipety – miarowe, o pojemności 0,25, 0,50, 0,75 i 1,0 ml.

3.2. Spektrofotometr – odpowiedni do użycia przy 440 nm (oraz 447–449 nm) i wyposażony w naczyńka o długości drogi optycznej 1 cm.

3.3. Kolby pomiarowe: 20 ml i 100 ml.

3.4. Waga analityczna, czułość 0,1 mg.

4. Odczynniki

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej.

4.1. Zawiesina estru apokarotenowego (w przybliżeniu 20 %).

4.1.1. Ustalić zawartość zawiesiny w następujący sposób:

Odmierzyć wagowo 400 mg do kolby pomiarowej (100 ml); rozpuścić w 20 ml chloroformu (ppkt 4.4) i uzupełnić cykloheksanem (ppkt 4.5). Rozcieńczyć, przy użyciu cykloheksanu, 5 ml tego roztworu do całkowitej objętości 100 ml (roztwór A). Rozcieńczyć, przy użyciu cykloheksanu, 5,0 ml roztworu A do całkowitej objętości 100 ml. Zmierzyć absorbancję przy 447–449 nm (zmierzyć maksimum w stosunku do cykloheksanu, używając jako ślepej próby naczynek o długości drogi optycznej 1 cm).

Zawartość estru apokarotenowego

=

Amax. 40000A. 2550

Amax = absorbancja roztworu pomiarowego

A = masa próbki (g)

2555 = wartość odniesienia A (1 %, 1 cm)

Czystość zawiesiny wynosi P ( %).

Uwaga

Zawiesina estru apokarotenowego jest wrażliwa na powietrze, ciepło i światło. Przechowywana może być przez okres około 12 miesięcy w zamkniętym oryginalnym pojemniku (uszczelnionym azotem) przechowywanym w chłodnym miejscu. Po otwarciu zawartość powinna być w krótkim okresie zużyta.

4.1.2. Wzorcowy roztwór estru apokarotenowego, w przybliżeniu 0,2 mg/ml.

Odmierzyć wagowo z dokładnością do 0,1 mg około 0,100 g zawiesinę estru apokarotenowego (ppkt 4.1.1) (Wg), rozpuścić w benzynie lakowej (ppkt 4.2), przenieść ilościowo do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml i uzupełnić benzyną lakową do znaku.

Roztwór ten zawiera (W.P)/10 mg/ml estru apokarotenowego.

Uwaga

Roztwór musi być przechowywany w chłodnym miejscu w ciemności. Wyrzucić niewykorzystany roztwór po upływie jednego miesiąca.

4.2. Benzyna lakowa (40–60 °C).

4.3. Siarczan sodu, bezwodny, granulowany, wcześniej suszony przez dwie godziny w temperaturze 102 °C.

4.4. Chloroform.

4.5. Cykloheksan.

5. Procedura

5.1. Przygotowanie badanej próbki

5.1.1. Koncentrat masła

Roztopić próbkę w piecu w temperaturze około 45 °C.

5.1.2. Masło

Roztopić próbkę w piecu w temperaturze około 45 °C oraz przefiltrować reprezentatywną porcję przez filtr zawierający około 10 g bezwodnego siarczanu sodu (ppkt 4.3) w środowisku zasłoniętym od silnego naturalnego lub sztucznego światła i utrzymywanym w stałej temperaturze 45 °C. Zebrać odpowiednią ilość tłuszczu masła.

5.2. Oznaczanie

Odmierzyć wagowo przybliżoną ilość 1 g koncentratu masła, z dokładnością do 1 mg (lub ekstrahowanego tłuszczu masła (ppkt 5.1.2)), (Mg). Przenieść ilościowo do kolby pomiarowej o pojemności 20 ml (Vml), wykorzystując benzynę lakową (ppkt 4.2), uzupełnić do znaku i dokładnie wymieszać.

Przenieść podwielokrotność do 1 cm naczynka i zmierzyć absorbancję przy 440 nm w stosunku do ślepej próby benzyny lakowej. Uzyskać stężenie estru apokarotenowego w roztworze poprzez odniesienie do wykresu kalibracji (C μ/ml).

5.3. Wykres kalibracji

Za pomocą pipety wkroplić 0, 0,25, 0,5, 0,75 i 1,0 ml wzorcowego roztworu estru apokarotenowego (ppkt 4.1.2) do pięciu kolb pomiarowych o pojemności 100 ml. Rozcieńczyć benzyną lakową (ppkt 4.2) do pełnej objętości i wymieszać.

Zakresy przybliżonych stężeń roztworów wynoszą 0–2 μg/ml i są dokładnie obliczone przez odniesienie do stężenia roztworu wzorcowego (ppkt 4.1.2) (W.P)/10 mg/ml. Zmierzyć absorbancję przy 440 nm w stosunku do ślepej próby benzyny lakowej (ppkt 4.2).

Wykreślić wartości absorbancji na oś y, a stężenia apokarotenowego estru na oś x.

6. Obliczanie wyników

6.1. Zawartość estru apokarotenowego, wyrażona w mg/kg produktu, jest podawana jako:

(C.V)/M

0,82 (C.V)M

gdzie:

C = zawartość estru apokarotenowego, μg/ml, odczytać z wykresu kalibracji (ppkt 5.3)

V = objętość (ml) roztworu badanego (ppkt 5.2)

M = masa (g) porcji badanej (ppkt 5.2)

0,82 = współczynnik korygujący zawartość tłuszczu masła w maśle.

7. Dokładność metody

7.1. Powtarzalność

7.1.1. Analiza masła

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych w możliwie najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot wykorzystujący tę samą aparaturę na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 1,4 mg/kg.

7.1.2. Analiza koncentratu masła

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych w możliwie najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot wykorzystujący tę samą aparaturę na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 1,6 mg/kg.

7.2. Powtarzalność

7.2.1. Analiza masła

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzanych przez podmioty w różnych laboratoriach, wykorzystujące różną aparaturę, na identycznym materiale badanym, nie może przekraczać 4,7 mg/kg.

7.2.2. Analiza koncentratu masła

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych przez podmioty w różnych laboratoriach, wykorzystujące różna aparaturę na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 5,3 mg/kg.

7.3. Źródło danych na temat precyzji

Dane na temat precyzji zostały określone na podstawie doświadczenia przeprowadzonego w 1995 r., które obejmowało 11 laboratoriów i 12 znaczonych próbek (sześć ślepych duplikatów) dla masła oraz 12 takich znaczonych próbek (sześć ślepych duplikatów) dla koncentratu masła.

8. Granice tolerancji

8.1. Trzy próbki muszą zostać pobrane z produktu znaczonego, w celu sprawdzenia prawidłowości znaczenia produktu.

8.2. Masło

8.2.1. Proporcja wprowadzana w przypadku masła, przy uwzględnieniu absorbancji drugoplanowej, wynosi 22 mg/kg.

8.2.2. Wyniki dla trzech próbek, otrzymane w trakcie analizy produktu, są wykorzystywane do sprawdzenia proporcji i równomierności inkorporacji znacznika, a najniższy z wyników jest porównywany z poniższymi wartościami granicznymi (biorąc pod uwagę różnicę krytyczną dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % (DCr95)):

- 18,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji),

- 13,0 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji).

Stężenie znacznika w próbce, która daje najniższy wynik, jest wykorzystywane w powiązaniu z interpolacją między 18,0 mg/kg i 13,0 mg/kg.

8.3. Koncentrat masła

8.3.1. Wielkość inkorporacji w przypadku koncentratu masła, przy uwzględnieniu absorbancji drugoplanowej, wynosi 24 mg/kg.

8.3.2. Wyniki dla trzech próbek, otrzymane w trakcie analizy produktu, są wykorzystywane do sprawdzenia proporcji i równomierności inkorporacji znacznika, a najniższy z wyników jest porównywany z poniższymi wartościami granicznymi (biorąc pod uwagę różnicę krytyczną dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % (DCr95)):

- 20,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji),

- 14,0 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji).

Stężenie znacznika w próbce, która daje najniższy wynik, jest wykorzystywane w powiązaniu z interpolacją między 20,0 mg/kg i 14,0 mg/kg.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XIV

(art. 9)

OZNACZANIE SITOSTEROLU LUB STIGMASTEROLU W MAŚLE LUB W KONCENTRACIE MASŁA METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ NA KOLUMNACH KAPILARNYCH.

1. ZAKRES I DZIEDZINA STOSOWANIA

Metoda określa procedurę ilościowego oznaczania sitosterolu lub stigmasterolu w maśle i w koncentracie masła. Przyjmuje się, ze sitosterol stanowi sumę beta-sitosterolu i 22-dihydro-beta-sitosterolu, przy czym zakłada się, że pozostałe sitosterole są śladowe.

2. ZASADA

Masło lub koncentrat masła ulega zmydlaniu za pomocą wodorotlenku potasu w roztworze etanolu, a części nieulegające zmydleniu ekstrahuje się eterem dietylowym.

Sterole są przekształcane w etery trimetylosylilu i poddawane analizie metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych w odniesieniu do wewnętrznego wzorca/betulina.

3. APARATURA

3.1. Kolba do zmydlania o pojemności 150 ml połączona z chłodnicą zwrotną (połączenia szlifowe).

3.2. Rozdzielacze 500 ml.

3.3. Kolby 250 ml.

3.4. Lejki wyrównujące ciśnienie, 250 ml lub podobne, do zbierania odpadów eteru dietylu.

3.5. Kolumna szklana, 350 × 20 mm, wyposażona w zatyczkę ze szkła spiekanego.

3.6. Łaźnia wodna lub płaszcz izolujący.

3.7. Fiolki reakcyjne 2 ml.

3.8. Chromatograf gazowy dostosowany do wykorzystania z kolumną kapilarną i wyposażony w system rozdzielający składający się z:

3.8.1. komory termostatycznej dla kolumn, w której można utrzymać żądaną temperaturę z dokładnością do ± 1 °C;

3.8.2. wyparki z regulowaną temperaturą;

3.8.3. detektora jonizacji płomieniowej oraz wzmacniacza-konwertora;

3.8.4. integratora-rejestratora odpowiedniego do wykorzystania ze wzmacniaczem-konwertorem (ppkt 3.8.3).

3.9. Kolumna kapilarna ze stopionej krzemionki całkowicie pokryta powłoką z BP1 lub równorzędna, o jednolitej grubości 0,25 mm; kolumna musi umożliwiać rozdzielenie trimetylosylilowych pochodnych lanosterolu i sitosterolu. Odpowiednie jest BP1, o długości 12 m, średnicy wewnętrznej 0,2 mm.

3.10. Mikrostrzykawka do chromatografii gazowej o pojemności 1 ìl z utwardzoną igłą.

4. ODCZYNNIKI

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej. Używana woda musi być wodą destylowaną lub wodą o porównywalnym stopniu czystości.

4.1. Etanol, o czystości co najmniej 95 %.

4.2. Wodorotlenek potasu, roztwór 60 %, rozpuścić 600 g wodorotlenku potasu (co najmniej 85 %) w wodzie i uzupełnić wodą do objętości 1 litra.

4.3. Betulina, o czystości co najmniej 99 %.

4.3.1. Roztwory betuliny w eterze dietylowym (ppkt 4.4).

4.3.1.1. Stężenie roztworu betuliny używane do oznaczania sitosterolu powinno wynosić 1,0 mg/ml.

4.3.1.2. Stężenie roztworu betuliny używane do oznaczania stigmasterolu powinno wynosić 0,4 mg/ml.

4.4. Eter dietylowy, o czystości analitycznej (bez nadtlenków lub pozostałości).

4.5. Siarczan sodu, bezwodny, w postaci granulatu, wcześniej suszony w temperaturze 102 °C przez dwie godziny.

4.6. Odczynnik sylilujący, np. TRI-SIL (produkowany przez Pierce Chemical Co., nr kat. 49001) lub równorzędny. (Ważne: TRI-SIL jest łatwopalny, toksyczny, korozyjny i prawdopodobnie rakotwórczy. Pracownicy laboratorium muszą być zaznajomieni z parametrami bezpieczeństwa TRI-SIL i stosować właściwe środki ostrożności).

4.7. Lanosterol

4.8. Sitosterol o znanej czystości nie mniejszej niż 90 % (P).

Uwaga 1:

Czystość wzorcowych materiałów wykorzystywanych do kalibracji musi być ustalona metodą normalizacji. Przy założeniu, że wszystkie sterole występujące w próbce zostają wykazane na chromatogramie, całkowita powierzchnia pików stanowi 100 % składników sterolowych i że sterole wywołują taką samą reakcję detektora, liniowość systemu musi być potwierdzona przy zakresach stężeń będących przedmiotem zainteresowania.

4.8.1. Wzorcowy roztwór sitosterolu – przygotować roztwór zawierający, z dokładnością do 0,001 mg/ml, w przybliżeniu 0,5 mg/ml (W1) sitosterolu (ppkt 4.8) w eterze dietylowym (ppkt 4.4).

4.9. Stigmasterol o znanej czystości nie mniejszej niż 90 % (P).

4.9.1. Wzorcowy roztwór stigmasterolu – przygotować roztwór zawierający z dokładnością do 0,001 mg/m, w przybliżeniu 0,2 mg/ml (W1) stigmasterolu (ppkt 4.9) w eterze dietylowym (ppkt 4.4).

4.10. Mieszanina do badania rozdzielczości. Przygotować roztwór zawierający 0,05 mg/ml lanosterolu (ppkt 4.7) i 0,5 mg/ml sitosterolu (ppkt 4.8) w eterze dietylowym (ppkt 4.4).

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie wzorcowych roztworów do celów chromatografii. Wewnętrzny roztwór wzorcowy (ppkt 4.3.1) musi być dodany do odpowiedniego wzorcowego roztworu sterolu jednocześnie z dodaniem go do zmydlonej próbki (patrz ppkt 5.2.2).

5.1.1. Chromatograficzny wzorcowy roztwór sitosterolu: przenieść 1 ml wzorcowego roztworu sitosterolu (ppkt 4.8.1) do każdej z dwóch fiolek reakcyjnych (ppkt 3.7) i usunąć eter dietylowy strumieniem azotu. Dodać 1 ml wewnętrznego roztworu wzorcowego (ppkt 4.3.1.1) i usunąć eter dietylowy za pomocą strumienia azotu.

5.1.2. Chromatograficzny wzorcowy roztwór stigmasterolu: przenieść 1 ml wzorcowego roztworu stigmasterolu (ppkt 4.9.1) do każdej z dwóch fiolek reakcyjnych (ppkt 3.7) i usunąć eter dietylowy strumieniem azotu. Dodać 1 ml wewnętrznego roztworu wzorcowego (ppkt 4.3.1.2) i usunąć eter dietylowy za pomocą strumienia azotu.

5.2. Przygotowanie substancji niezmydlających się

5.2.1. Roztopić próbkę masła w temperaturze nieprzekraczającej 35 °C, rozrobić, starannie mieszając.

Odmierzyć wagowo, z dokładnością do 1 mg, w przybliżeniu 1 g masła (W1) lub koncentratu masła (W2) do kolby 150 ml (ppkt 3.1). Dodać 50 ml etanolu (ppkt 4.1) i 10 ml roztworu wodorotlenku potasu (ppkt 4.2). Zainstalować chłodnicę zwrotną i podgrzewać przez około 30 minut w temperaturze 75 °C. Odłączyć chłodnicę i schłodzić kolbę do temperatury zbliżonej do temperatury otoczenia.

5.2.2. Dodać do kolby 1 ml wewnętrznego roztworu wzorcowego (ppkt 4.3.1.1) w przypadku określania sitosterolu lub (ppkt 4.3.1.2) w przypadku określania stigmasterolu. Starannie wymieszać. Przenieść ilościowo zawartość kolby do rozdzielacza 500 ml (ppkt 3.2), przemywając kolbę kolejno 50 ml wody i 250 ml eteru dietylowego (ppkt 4.4). Wstrząsać energicznie rozdzielaczem przez dwie minuty i pozostawić do rozdzielenia się faz. Usunąć niższą warstwę wodną i przemyć warstwę eteru, wstrząsając z czterema kolejnymi podwielokrotnościami 100 ml wody.

Uwaga 2:

Aby uniknąć powstania emulsji, istotne jest, aby pierwsze dwa mycia wodą przeprowadzać ostrożnie (10 odwróceń). Trzecie mycie można prowadzić, wstrząsając energicznie przez 30 sekund. W przypadku powstania emulsji można ją rozbić, dodając w tym celu 5–10 ml etanolu. W przypadku dodania etanolu konieczne jest przeprowadzenie dwóch dodatkowych energicznych przemywań wodą.

5.2.3. Przepuścić klarowną oddzieloną od mydła warstwę eteru przez szklaną kolumnę (ppkt 3.5) zawierającą 30 g bezwodnego siarczanu sodu (ppkt 4.5). Zebrać eter do kolby 250 ml (ppkt 3.3). Dodać jedną granulkę zapobiegającą wrzeniu burzliwemu i odparować prawie do sucha w łaźni wodnej lub w płaszczu izolującym, zwracając uwagę na zebranie odpadów rozpuszczalników.

Uwaga 3:

Jeżeli ekstrakty próbki zostaną całkowicie wysuszone w zbyt wysokiej temperaturze, mogą wystąpić straty sterolu.

5.3. Przygotowanie eterów trimetylo-sylilowych

5.3.1. Przenieść pozostały w kolbie roztwór eteru do fiolki reakcyjnej 2 ml (ppkt 3.7) z 2 ml eteru dietylowego i usunąć eter za pomocą strumienia azotu. Przemyć kolbę dwoma dodatkowymi podwielokrotnościami 2 ml eteru dietylowego, przenosząc je do próbówki i usuwając za każdym razem eter za pomocą azotu.

5.3.2. Poddać próbkę sylilowaniu, dodając 1 ml TRI-SIL-u (ppkt 4.6). Zamknąć fiolkę i potrząsać energicznie w celu rozpuszczenia. Jeżeli całkowite rozpuszczenie nie nastąpi, podgrzać do temperatury 65–70 °C. Pozostawić na co najmniej pięć minut, przed wprowadzeniem do chromatografu gazowego. Poddać wzorce sylilowaniu w taki sam sposób jak próbki. Poddać sylilowaniu mieszaninę do badania rozdzielczości (ppkt 4.10) w taki sam sposób jak próbki.

Uwaga 4:

Proces sylilowania musi być prowadzony w środowisku bezwodnym. Niepełne sylilowanie betuliny uwidacznia się przez pojawienie się drugiego piku usytuowanego w pobliżu piku odpowiadającego betulinie.

Obecność etanolu na etapie sylilowania będzie kolidować z procesem sylilowania. Może to być wynikiem niedostatecznego mycia na etapie ekstrakcji. Jeżeli problem utrzymuje się, na etapie ekstrakcji można wprowadzić piąte energiczne 30-sekundowe mycie.

5.4. Analiza metodą chromatografii gazowej.

5.4.1. Dobór warunków roboczych.

Ustawić chromatograf gazowy zgodnie z instrukcjami producenta.

Wskazówki dla warunków roboczych są następujące:

- temperatura kolumny: 265 °C

- temperatura iniektora: 265 °C

- temperatura detektora: 300 °C

- prędkość przepływu gazu nośnego: 0,6 ml/min

- ciśnienie wodoru: 84 kPa

- ciśnienie powietrza: 155 kPa

- rozdział próbki od 10:1 do 50:1, stosunek rozdziału musi być dobrany optymalnie zgodnie z instrukcją producenta i liniowością odpowiedzi detektora, a następnie potwierdzony przy zakresie stężenia będącym przedmiotem zainteresowania.

Uwaga 5:

Szczególnie ważne jest regularne czyszczenie wkładki iniekcyjnej.

- ilość substancji wprowadzonej: 1 ìl roztworu TMSE.

Poczekać na osiągnięcie przez system stanu równowagi i uzyskanie jego dostatecznie stabilnej reakcji, przed rozpoczęciem jakiejkolwiek analizy.

Powyższe warunki muszą być zróżnicowane w zależności od parametrów technicznych kolumny i chromatografu gazowego, tak aby otrzymać chromatogramy spełniające poniższe wymagania:

- pik sitosterolu musi odpowiednio oddzielać się od lanosterolu. Rysunek 1 przedstawia typowy chromatogram, jaki powinna dawać sylilowana mieszanina do testu rozdzielczości (ppkt 4.10),

- czasy retencji względnej poniższych steroli powinny wynosić w przybliżeniu:

cholesterol: 1,0

stigmasterol: 1,3

sitosterol: 1,5

betulina: 2,5

- czas retencji betuliny powinien wynosić w przybliżeniu 24 minuty.

5.4.2. Procedura analityczna

Wprowadzić 1 ìl sylilowanego roztworu wzorcowego (stigmasterolu lub sitosterolu) i dostosować parametry kalibracyjne integratora.

Wprowadzić następny 1 ìl sylilowanego wzorcowego roztworu w celu oznaczenia współczynników odpowiedzi w odniesieniu do betuliny.

Wprowadzić 1 ìl sylilowanej próbki wzorcowego roztworu i zmierzyć powierzchnie pików. Każda seria chromatograficzna musi być oddzielona przez iniekcję wzorców.

Wskazówka: sześć iniekcji próbki musi być zawartych w każdej oddzielonej serii.

Uwaga 6:

Całkowanie piku stigmasterolu powinno obejmować każde ogonowanie zgodnie z pkt 1, 2 i 3 na rysunku 2b.

Całkowanie piku sitosterolu powinno obejmować powierzchnię piku 22 dihydro-beta-sitosterolu (stigmastanol), który ulega elucji bezpośrednio po sitosterolu (patrz rysunek 3b), przy ocenie sitosterolu całkowitego.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

6.1. Oznaczyć obszar pików sterolu i betuliny w obydwóch wzorcach oddzielających każdą partię i obliczyć R1:

R

=

średnia powierzchnia piku dla sterolu we wzorcuśrednia powierzchnia piku dla betuliny we wzorcu

Oznaczyć powierzchnię piku sterolu (stigmasterolu i sitosterolu) i piku betuliny w próbce i wyliczyć R2:

R

=

powierzchnia piku sterolu w próbcepowierzchnia piku betuliny w próbce

W1 = zawartość sterolu we wzorcu (mg) znajdującego się w 1 ml roztworu wzorcowego (ppkt 4.8.1 lub 4.9.1)

W2 = masa próbki (g) (ppkt 5.2.1)

P = czystość sterolu wzorcowego (ppkt 4.8 lub 4.9)

Zawartość sterolu w próbce

=

R

R

x

W

W

x P x 10

7. DOKŁADNOŚĆ METODY

7.1 Masło

7.1.1. Powtarzalność

7.1.1.1. Stigmasterol

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych w jak najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot wykorzystujący tę samą aparaturę na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 19,3 mg/kg.

7.1.1.2. Sitosterol

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych w jak najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot wykorzystujący tę samą aparaturę na identycznym materiale badanym, nie może przekraczać 23,0 mg/kg.

7.1.2. Odtwarzalność

7.1.2.1. Stigmasterol

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzanych przez podmioty w różnych laboratoriach wykorzystujące różne aparatury na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 31,9 mg/kg.

7.1.2.2. Sitosterol

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzanych przez podmioty w różnych laboratoriach wykorzystujące różne aparatury na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 8,7 % odpowiednio do wartości średniej oznaczeń.

7.1.3. Źródło danych dotyczących precyzji

Dokładne dane zostały określone w oparciu o doświadczenie przeprowadzone w 1992 r., które obejmowało dziewięć laboratoriów i sześć próbek (trzy ślepe duplikaty) dla stigmasterolu oraz sześć próbek (trzy ślepe duplikaty) dla sitosterolu.

7.2. Koncentrat masła

7.2.1. Powtarzalność

7.2.1.1. Stigmasterol

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych w możliwie najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot wykorzystujący tę samą aparaturę na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 10,2 mg/kg.

7.2.1.2. Sitosterol

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych w możliwie najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot wykorzystujący tę samą aparaturę na identycznym materiale badanym nie może przekraczać 3,6 %, odpowiednio do wartości średniej oznaczeń.

7.2.2. Odtwarzalność

7.2.2.1. Stigmasterol

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzanych przez podmioty w różnych laboratoriach wykorzystujące różne aparatury na identycznym materiale badanym, nie może przekraczać 25,3 mg/kg

7.2.2.2. Sitosterol

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzanych przez podmioty w różnych laboratoriach wykorzystujące różne aparatury na identycznym materiale badanym, nie może przekraczać 8,9 % odpowiednio do wartości średniej oznaczeń.

7.2.3. Źródło danych dotyczących precyzji

Dane dotyczące precyzji zostały określone w oparciu o doświadczenie przeprowadzone w 1991 r., które obejmowało dziewięć laboratoriów i sześć próbek (trzy ślepe duplikaty) dla stigmasterolu oraz sześć próbek (trzy ślepe duplikaty) dla sitosterolu.

8. GRANICE TOLERANCJI

8.1. Trzy próbki muszą zostać pobrane z produktu znaczonego, w celu sprawdzenia prawidłowości znaczenia produktu.

8.2. Masło

8.2.1. Stigmasterol

8.2.1.1. Wielkość inkorporacji dla stigmasterolu wynosi 150 g stigmasterolu o czystości co najmniej 95 %, na tonę masła, tzn. 142,5 mg/kg, lub 170 g stigmasterolu o czystości co najmniej 85 % na tonę masła, tzn. 144,5 mg/kg.

8.2.1.2. Wyniki dla trzech próbek, otrzymane w trakcie analizy produktu, są wykorzystywane do sprawdzenia proporcji i równomierności inkorporacji znacznika, a najniższy z wyników jest porównywany z poniższymi wartościami granicznymi (biorąc pod uwagę różnicę krytyczną dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % (DCr95)):

- 116,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku stigmasterolu o czystości 95 %,

- 118,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku stigmasterolu o czystości 85 %,

- 81,0 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku stigmasterolu o czystości 95 %,),

- 82,0 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku stigmasterolu o czystości 85 %).

Stężenie znacznika w próbce, która daje najniższy wynik, jest wykorzystywane w powiązaniu z interpolacją odpowiednio między 116,0 mg/kg i 81,0 mg/kg lub 118,0 mg/kg i 82,0 mg/kg.

8.2.2. Sitosterol

8.2.2.1. Wielkość inkorporacji dla sitosterolu wynosi 600 g sitosterolu o czystości co najmniej 90 %, na tonę masła, tzn. 540 mg/kg.

8.2.2.2. Wyniki dla trzech próbek, otrzymane w trakcie analizy produktu, są wykorzystywane do sprawdzenia proporcji i równomierności inkorporacji znacznika, a najniższy z wyników jest porównywany z poniższymi wartościami granicznymi (biorąc pod uwagę różnicę krytyczną dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % (DCr95)):

- 486,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku sitosterolu o czystości 90 %),

- 358 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku sitosterolu o czystości 90 %).

Stężenie znacznika w próbce, która daje najniższy wynik, jest wykorzystywane w powiązaniu z interpolacją między 486,0 mg/kg i 358,0 mg/kg.

8.3. Koncentrat masła

8.3.1. Stigmasterol

8.3.1.1. Wielkość inkorporacji dla stigmasterolu wynosi 150 g stigmasterolu o czystości co najmniej 95 %, na tonę koncentratu masła, tzn. 142,5 mg/kg, lub 170 g stigmasterolu o czystości co najmniej 85 %, na tonę masła, tzn. 144,5 mg/kg.

8.3.1.2. Wyniki dla trzech próbek, otrzymane w trakcie analizy produktu, są wykorzystywane do sprawdzenia proporcji i równomierności inkorporacji znacznika, a najniższy z wyników jest porównywany z poniższymi wartościami granicznymi (biorąc pod uwagę różnicę krytyczną dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % (DCr95)):

- 120,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku stigmasterolu o czystości 95 %,

- 122,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku stigmasterolu o czystości 85 %,

- 84,0 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku stigmasterolu o czystości 95 %),

- 86,0 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku stigmasterolu o czystości 85 %).

Stężenie znacznika w próbce, która daje najniższy wynik, jest wykorzystywane w powiązaniu z interpolacją odpowiednio między 120,0 mg/kg i 84,0 mg/kg lub 122,0 mg/kg i 86,0 mg/kg.

8.3.2 Sitosterol

8.3.2.1. Wielkość inkorporacji dla sitosterolu wynosi 600 g sitosterolu o czystości co najmniej 90 %, na tonę koncentratu masła, tzn. 540 mg/kg.

8.3.2.2. Wyniki dla trzech próbek, otrzymane w trakcie analizy produktu, są wykorzystywane do sprawdzenia proporcji i równomierności inkorporacji znacznika, a najniższy z wyników jest porównywany z poniższymi wartościami granicznymi (biorąc pod uwagę różnicę krytyczną dla poziomu prawdopodobieństwa 95 % (DCr95)):

- 486,0 mg/kg (95 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku sitosterolu o czystości 90 %),

- 358 mg/kg (70 % minimalnej wielkości inkorporacji w przypadku sitosterolu o czystości 90 %).

Stężenie znacznika w próbce, która daje najniższy wynik, jest wykorzystywane w powiązaniu z interpolacją między 486,0 mg/kg i 358,0 mg/kg.

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XV

(art. 10)

REFERENCYJNA METODA WYKRYWANIA OBECNOŚCI MLEKA KROWIEGO I KAZEINIANÓW W SERACH WYPRODUKOWANYCH Z MLEKA OWCZEGO, MLEKA KOZIEGO, MLEKA BAWOLEGO LUB MIESZANIN MLEKA OWCZEGO, KOZIEGO I BAWOLEGO

1. Zakres

Wykrywanie obecności mleka krowiego i kazeinianów w serach wyprodukowanych z mleka owczego, mleka koziego, mleka bawolego lub mieszanin mleka owczego, koziego i bawolego przez wyznaczanie punktu izoelektrycznego gamma-kazein po plazminolizie.

2. Dziedzina stosowania

Metoda ta jest odpowiednia dla czułego i szczególnego wykrywania obecności naturalnego oraz poddanego obróbce cieplnej mleka krowiego i kazeinianu w świeżych i dojrzałych serach wyprodukowanych z mleka owczego, mleka koziego, mleka bawolego lub też mieszanin mleka owczego, koziego i bawolego. Metoda ta nie jest odpowiednia do wykrywania mleka i fałszowania sera przez poddanie obróbce cieplnej koncentratów białkowych serwatki pochodzącej od krów.

3. Zasada metody

3.1. Oddzielenie kazein z sera i standardowych wzorców.

3.2. Rozpuszczenie oddzielonych z sera kazein i poddanie rozszczepieniu plazminy (WE.3.4.21.7).

3.3. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazein skażonych plazminą w obecności mocznika oraz barwienie białka.

3.4. Ocena zabarwionych modeli gamma3 i gamma2 – kazeiny (dowód występowania mleka krowiego) poprzez porównanie modelu otrzymanego z próbki z modelami otrzymanymi w tym samym żelu ze standardowych wzorców zawierających 0 % i 1 % mleka krowiego.

4. Odczynniki

Jeżeli nie zostało to inaczej wskazane, zastosowane muszą być środki chemiczne klasy analitycznej. Woda musi być dwukrotnie destylowana lub o równorzędnej czystości.

Uwaga:

Poniższe dane szczegółowe odnoszą się do przygotowanych w laboratorium arkuszy poliakryloamidowych żeli, zawierających mocznik o wymiarach 265 × 125 × 0,25 mm. W przypadku gdy stosuje się inne rodzaje i rozmiary żelu, warunki rozdzielania najprawdopodobniej muszą być odpowiednio dostosowane.

Wyznaczenie punktu izoelektrycznego

4.1. Odczynniki do produkcji żeli poliakryloamidowych zawierających mocznik.

4.1.1. Roztwór podstawowy żelu

Rozpuścić:

4,85 g akryloamidu

0,15 g N, N'-metyleno-bis-akryloamidu (BIS)

48,05 g mocznika

15,00 g gliceryny (87 % w/w),

w wodzie oraz uzupełnić do 100 ml i przechowywać w chłodziarce w butelce z brązowego szkła.

Uwaga:

Można stosować dostępny w handlu roztwór wstępnie zestawiony akryloamid/BIS zamiast przytoczonych stałych miar akryloamidów neurotoksycznych. W przypadku gdy taki roztwór zawiera 30 % w/v akryloamidu i 0,8 % w/v BIS, to zamiast stałych miar do preparatu użyta musi być objętość 16,2 ml. Okres przechowywania roztworu podstawowego wynosi najwyżej 10 dni; jeżeli jego przewodnictwo jest wyższe niż 5 μS, dejonizować poprzez mieszanie przez 30 minut z 2 g Amberlitu MB-3, a następnie filtrować przez membranę 0,45 μm.

4.1.2. Roztwór żelu

Przygotować roztwór żelu przez wymieszanie dodatków i amfolitów amfoterycznych z podstawowym roztworem żelu (patrz ppkt 4.1.1).

9,0 ml roztworu podstawowego

24,0 mg beta-alaniny

500 μl amfolitów pH 3,5–9,5 [1]

250 μl amfolitów pH 5 –7 [2]

250 μl amfolitów pH 6–8. [3]

Wymieszać roztwór żelu i odgazowywać przez od dwóch do trzech minut za pomocą ultradźwięków lub w próżni.

Uwaga:

Przygotować roztwór żelu bezpośrednio przed wlaniem (patrz ppkt 6.2).

4.1.3. Roztwory katalityczne

4.1.3.1. N, N, N', N' – tetrametyloetylenodiamina (Temed).

4.1.3.2. 40 % w/v nadsiarczanu amonu (PER).

Rozpuścić 800 mg PER w wodzie i uzupełnić do 2 ml.

Uwaga:

Zawsze stosować świeżo przygotowany roztwór PER.

4.2. Płyn kontaktowy

Nafta lub parafina ciekła

4.3. Roztwór anodowy

Rozpuścić 5,77 g kwasu ortofosforowego (85 % w/w) w wodzie i rozcieńczyć do 100 ml.

4.4. Roztwór katodowy

Rozpuścić 2,00 g wodorotlenku sodu w wodzie i rozcieńczyć z wodą do 100 ml.

Przygotowanie próbki

4.5. Odczynniki do oddzielenia białka

4.5.1. Rozpuścić kwas octowy (25,0 ml kwasu octowego lodowatego uzupełnionego do 100 ml wodą)

4.5.2. Dichlorometan

4.5.3. Aceton

4.6. Bufor rozpuszczający białka

Rozpuścić:

5,75 g gliceryny (87 % w/w)

24,03 g mocznika

250 mg ditiotreotolu,w wodzie i uzupełnić do 50 ml

Uwaga:

Przechowywać w chłodziarce, maksymalny okres przechowywania jeden tydzień.

4.7. Odczynniki dla rozszczepiania kazein plazminą

4.7.1. Bufor węglanu amonu

Miareczkować 0,2 mol/l roztworu wodorowęglanu amonu (1,58 g/100 ml wody) zawierającego 0,05 mol/l kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 1,46 g/100 ml) z 0,2 mol/l roztworu węglanu amonu (1,92 g/100 ml wody) zawierającego 0,05 mol/l EDTA do pH 8.

4.7.2. Plazmina bydlęca (WE. 3.4.21.7), aktywność co najmniej 5 U/ml.

4.7.3. Roztwór kwasu e-aminokapronowego dla inhibitowania enzymów

Rozpuścić 2,624 g e-aminokapronowego (kwas 6-amino-n-heksanowy) w 100 ml 40 % (v/v) etanolu.

4.8. Wzorce

4.8.1. Certyfikowane standardowe wzorce mieszaniny odtłuszczonego mleka owczego i koziego, z dodatkiem podpuszczki, zawierającego 0 % i 1 % mleka krowiego dostępne są w Instytucie Materiałów Referencyjnych i Pomiarów przy Komisji B-2440 Geel, Belgia.

4.8.2. Przygotowanie laboratoryjnych pośrednich wzorców mleka bawolego, z dodatkiem podpuszczki, zawierającego 0 % i 1 % mleka krowiego.

Mleko odtłuszczone jest przygotowywane przez odwirowywanie surowego mleka bawolego lub krowiego w temperaturze 37 °C przy 2500 g przez 20 minut. Po szybkim schłodzeniu rurki i zawartości do 6–8 °C górna warstwa tłuszczu jest usuwana w całości. W celu przygotowania 1 % wzorca dodać 5,00 ml odtłuszczonego mleka krowiego do 495 ml odtłuszczonego mleka bawolego w jednolitrowej zlewce, dostosować pH do 6,4 poprzez dodanie rozcieńczonego kwasu mlekowego (10 % w/v). Dostosować temperaturę do 35 °C i dodać 100 μl podpuszczki cielęcej (aktywność podpuszczki 1: 10000, c. 3000 U/ml), mieszać przez 1 minutę, po czym pozostawić zlewkę przykrytą folią aluminiową w temperaturze 35 °C przez jedną godzinę, w celu uformowania twarogu. Po uformowaniu twarogu całe mleko z podpuszczką jest wymrażane bez uprzedniej homogenizacji lub odprowadzania serwatki. Po wymrażaniu mleko jest rozdrabniane do uzyskania jednorodnego proszku. W celu przygotowania 0 % wzorca przeprowadzić taką samą procedurę przy użyciu prawdziwego odtłuszczonego mleka bawolego. Wzorce muszą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

Uwaga:

Przed przygotowaniem wzorca zalecane jest zbadanie mleka bawolego pod względem jego czystości poprzez wyznaczenie punktu izoelektrycznego kazein skażonych plazminą.

Odczynniki do barwienia białka

4.9. Utrwalacz

Rozpuścić 150 g kwasu trichlorooctowego w wodzie destylowanej i uzupełnić do 1000 ml.

4.10. Roztwór odbarwiający

Rozpuścić 500 ml metanolu i 200 ml kwasu octowego lodowatego w wodzie destylowanej.

Uwaga:

Przygotowywać świeży środek odbarwiający każdego dnia; może być on przygotowany poprzez zmieszanie jednakowych objętości roztworów podstawowych 50 % (v/v) alkoholu metylowego i 20 % (v/v) kwasu octowego lodowatego.

4.11. Roztwory barwiące

4.11.1. Roztwór barwiący (roztwór podstawowy 1)

Rozpuścić 3,0 g Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) w 1000 ml 90 % (v/v) metanolu, za pomocą mieszadła magnetycznego (w przybliżeniu 45 minut), przefiltrować przez dwa filtry złożone, o średniej prędkości filtrowania.

4.11.2. Roztwór barwiący (roztwór podstawowy 2)

Rozpuścić 5,0 g siarczanu miedzi pięciowodnego w 1000 ml 20 % (v/v) kwasu octowego.

4.11.3. Roztwór barwiący (roztwór roboczy)

Zmieszać razem 125 ml każdego z roztworów podstawowych (ppkt 4.11.1, 4.11.2) bezpośrednio przed barwieniem.

Uwaga:

Roztwór barwiący powinien być przygotowany w dniu, w którym ma być użyty.

5. Wyposażenie

5.1. Szklane płytki (265 × 125 × 4 mm); gumowe walce (szerokość 15 cm); stół wypoziomowany.

5.2. Pojemnik transportowy arkusza żelu (265 × 125 mm).

5.3. Arkusz pokrywający (280 × 125 mm). Przymocować pasek taśmy klejącej (280 × 6 × 0,25 mm) do każdej długiej krawędzi (patrz rysunek 1).

5.4. Komora elektroogniskowania z płytą chłodzącą (na przykład 265 × 125 mm) oraz odpowiedni układ zasilania (≥ 2,5 kV) lub urządzenie do automatycznej elektroforezy.

5.5. Kriostat cyrkulacyjny, regulowany termostatycznie przy 12 ± 0,5 °C.

5.6. Wirówka nastawna do 3000 g.

5.7. Paski elektrody (długości ≥ 265 mm).

5.8. Plastykowe butelki z wkraplaczem dla roztworu anodowego i katodowego.

5.9. Aplikator próbek (10 × 5 mm, bibuła filtracyjna wiskozowa lub o niskiej adsorpcji białka).

5.10. Nożyczki, skalpele i szczypce ze stali nierdzewnej.

5.11. Naczynia ze stali nierdzewnej lub ze szkła barwionego lub nie lub (na przykład tace do instrumentów, o wymiarach 280 × 150 mm).

5.12. Nastawny homogenizator drążkowy (średnica wałka – 10 mm), liczba obrotów na minutę 8000-20000.

5.13. Mieszadło magnetyczne.

5.14. Wanna ultradźwiękowa.

5.15. Zgrzewarka warstwy.

5.16. Mikropipety 25 μl.

5.17. Wyparka próżniowa lub wymrażarka.

5.18. Termostatycznie regulowana wanna wodna nastawna do 35 i 40 ± 1°C z wytrząsarką.

5.19. Sprzęt densytometryczny z czytnikiem przy λ = 634 nm.

6. Procedura

6.1. Przygotowanie próbki

6.1.1. Oddzielenie kazein

Odmierzyć wagowo równowartość 5,0 g suchej masy sera lub standardowych wzorców do rurki wirówkowej, 100 ml dodać 60 destylowanej wody i homogenizować za pomocą homogenizatora drążkowego (8000-10000 obrotów na minutę). Dostosować do pH 4,6 za pomocą rozcieńczonego kwasu octowego (ppkt 4.5.1), odwirować (5 minut, 3000 g). Zlać tłuszcz i serwatkę, homogenizować pozostałość przy 20000 obrotach na minutę w 40 ml destylowanej wody dostosowanej do pH 4,5 za pomocą rozcieńczonego kwasu octowego (ppkt 4.5.1), dodać 20 ml dichlorometanu (ppkt 4.5.2), znowu homogenizować i odwirowywać (5 minut, 3000 g). Usunąć warstwę kazeiny znajdującą się między fazami wodną i organiczną (patrz rysunek 2) za pomocą łopatki i zlać obydwie fazy. Ponownie homogenizować kazeinę w 40 ml destylowanej wody (patrz wyżej) oraz 20 ml dichlorometanu (ppkt 4.5.2) i odwirować. Powtarzać tę procedurę, dopóki obie fazy ekstrakcyjne nie staną się bezbarwne (od dwóch do trzech razy). Homogenizować pozostałości białka przy użyciu 50 ml acetonu (ppkt 4.5.3) i przefiltrować przez złożoną bibułę filtracyjną o średniej prędkości filtrowania. Przemyć pozostałości znajdujące się na filtrze, każdorazowo dwoma oddzielnymi 25-ml porcjami acetonu i pozostawić do wysuszenia na powietrzu lub suszyć strumieniem azotu, na koniec sproszkować w moździerzu.

Uwaga:

Oddzielona sucha kazeina powinna być przechowywana w temperaturze -20 °C.

6.1.2. Rozszczepienie plazminą beta-kazein celem wzmocnienia gamma-kazein

Rozproszyć 25 mg oddzielonej kazeiny (ppkt 6.1.1) w 0,5 ml buforu węglanu amonu (ppkt 4.7.1) i homogenizować przez 20 minut przez zastosowanie, na przykład, obróbki ultradźwiękowej. Podgrzać do 40 °C i dodać 10 μl plazminy (ppkt 4.7.2), wymieszać i poddać procesowi inkubacji przez jedną godzinę w temperaturze 40 °C, stale wstrząsając. Aby zahamować enzym, dodać 20 μl roztworu kwasu ε-aminoheksanowego (ppkt 4.7.3), następnie dodać 200 mg mocznika w postaci stałej i 2 mg ditiotreotolu.

Uwaga:

Aby otrzymać lepszą symetrię w skupionych pasmach kazeiny, zaleca się wymrażanie roztworu po dodaniu kwasu ε-aminoheksanowego, a następnie rozpuszczenie pozostałości w 0,5 ml buforu rozpuszczającego białka (ppkt 4.6).

6.2. Przygotowanie żeli poliakryloamidowych zawierających mocznik

Używając kilku kropli wody, walcować pojemnik transportowy arkusza żelu (ppkt 5.2) na szklanej płytce (ppkt 5.1), usuwając resztki wody ręcznikiem papierowym lub bibułką. W ten sam sposób walcować arkusz pokrywający (ppkt 5.3) za pomocą przekładki (0,25 mm) na drugiej płytce szklanej. Położyć płytkę poziomo na stole wpoziomowanym.

Dodać 10 μl Temedu (ppkt 4.1.3.1) do przygotowanego i odpowietrzonego roztworu żelu (ppkt 4.1.2), wymieszać i dodać 10 μl roztworu PER (ppkt 4.1.3.2), starannie wymieszać i natychmiast wylać równomiernie na środek arkusza pokrywającego. Umieścić jedną krawędź pojemnika transportowego arkusza żelu (stroną arkusza do dołu) na arkuszu pokrywającym i opuszczać ją powoli, tak aby umożliwić powstanie cienkiej powłoki żelu między arkuszami i rozprowadzenie jej równo i bez pęcherzyków (rysunek 3). Ostrożnie opuścić całkowicie pojemnik transportowy arkusza żelu przy użyciu cienkiej łopatki i umieścić trzy dodatkowe płytki szklane na górze, aby spełniały funkcję ciężarków. Kiedy polimeryzacja jest zakończona (około 60 minut), przemieścić polimeryzowany żel na pojemniku transportowym arkusza żelu razem z arkuszem pokrywającym, poprzez lekkie uderzanie płytek szklanych. Ostrożnie wyczyścić drugą stronę pojemnika transportowego arkusza celem usunięcia pozostałości żelu i mocznika. Zgrzać żel wielowarstwowy w rurze foliowej i przechowywać w chłodziarce (maksymalnie przez sześć tygodni).

Uwaga:

Arkusz pokrywający z przekładkami może zostać użyty ponownie. Żel poliakryloamidowy może być pocięty na mniejsze części, co jest zalecane w przypadku, kiedy jest kilka próbek lub kiedy użyte jest urządzenie do automatycznej elektroforezy (dwa żele, rozmiar 4,5 × 5 cm).

6.3. Wyznaczenie punktu izoelektrycznego

Nastawić termostat chłodzący na 12 °C. Wytrzeć drugą stronę pojemnika transportowego arkusza żelu naftą, następnie nakapać kilka kropli nafty (ppkt 4.2) na środek bloku chłodzącego. Następnie walcować żel wielowarstwowy, stroną pojemnika transportowego do dołu, unikając przy tym powstawania pęcherzyków. Wytrzeć nadmiar nafty oraz usunąć arkusz pokrywający. Nasączyć paski elektrod roztworem elektrodowym (ppkt 4.3, 4.4), przyciąć do długości żelu i umieścić w określonym położeniu (odległość między elektrodami 9,5 cm).

Warunki wyznaczenia punktu izoelektrycznego:

6.3.1. Rozmiar żelu 265 × 125 × 0,25 mm

Krok | Czas (minuty) | Napięcie elektryczne (V) | Natężenie elektryczne (mA) | Moc (W) | Wolto-godziny (Vh) |

1.Ogniskowanie wstępne | 30 | maksymalne 2500 | maksymalny 15 | stała 4 | c. 300 |

2.Ogniskowanie próbki [4] | 60 | maksymalne 2500 | maksymalny 15 | stała 4 | c. 1000 |

3.Ogniskowa niekońcowe | 60 | maksymalne 2500 | maksymalny 5 | maksymalna 20 | c. 3000 |

40 | maksymalne 2500 | maksymalny 6 | maksymalna 20 | c. 3000 |

30 | maksymalne 2500 | maksymalny 7 | maksymalna 25 | c. 3000 |

Uwaga:

Jeżeli grubość lub szerokość żelów są zmienione, wielkości w odniesieniu do natężenia elektrycznego i mocy muszą być odpowiednio dostosowane (np. podwoić wielkości dla natężenia elektrycznego i mocy, jeżeli stosuje się żel o rozmiarach 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Przykład programu napięcia elektrycznego dla urządzenia do automatycznej elektroforezy (dwa żele 5,0 × 4,5 cm), elektrody bez pasków stosowane bezpośrednio na żelu.

Krok | Napięcie elektryczne | Natężenie elektryczne | Moc | Temperatura | Wolto-godziny |

1.Ogniskowanie wstępne | 1000 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 85 Vh |

2.Ogniskowanie próbki | 250 V | 5,0 mA | 2,5 W | 8 °C | 30 Vh |

3.Ogniskowanie | 1200 V | 10,0 mA | 3,5 W | 8 °C | 80 Vh |

4.Ogniskowanie | 1500 V | 5,0 mA | 7,0 W | 8 °C | 570 Vh |

Umieścić aplikator próbki w ramach kroku 2 przy 0 Vh.

Usunąć aplikator próbki w ramach kroku 2 przy 30 Vh.

6.4. Barwienie białka

6.4.1. Utrwalanie białka

Usunąć paski elektrody niezwłocznie po wyłączeniu mocy i włożyć żel bezpośrednio do naczynia do barwienia/odbarwiania, wypełnionego 200 ml utrwalacza (ppkt 4.9); pozostawić na 15 minut, stale wstrząsając.

6.4.2. Mycie i barwienie płytki żelu.

Starannie odprowadzić utrwalacz i przemyć płytkę żelu dwa razy po 30 sekund w 100 ml roztworu odbarwiającego (ppkt 4.10). Wylać roztwór odbarwiający i napełnić naczynie 250 ml roztworu barwiącego (ppkt 4.11.3); pozostawić do zabarwienia na 45 minut, lekko wstrząsając.

6.4.3. Odbarwianie płytki żelu

Wylać roztwór barwiący, przemyć płytkę żelu dwa razy, używając 100 ml roztworu odbarwiającego (ppkt 4.10) za każdym razem, następnie wstrząsać z 200 ml roztworu odbarwiającego przez 15 minut i powtórzyć czynności odbarwiania co najmniej dwa lub trzy razy do czasu uzyskania klarownego i bezbarwnego tła. Następnie płukać płytkę żelu wodą destylowaną (dwa razy po 2 minuty) i suszyć na powietrzu (2–3 godziny) lub za pomocą suszarki do włosów (10–15 minut).

Uwaga 1:

Czynności wiązania, mycia, barwienia i odbarwiania wykonywać w temperaturze 20 °C. Nie stosować podwyższonych temperatur.

Uwaga 2:

Jeżeli preferowane jest bardziej czułe barwienie srebrem zabarwienie (na przykład Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, kod nr 17-1150-01), to próbki kazeiny skażonej plazminą muszą być rozcieńczone do 5 mg/ml.

7. Ocena

Ocena jest przeprowadzana przez porównywanie modeli białek nieznanej próbki ze standardowymi wzorcami na tym samym żelu. Wykrywanie mleka krowiego w serach produkowanych z mleka owczego, mleka koziego i mleka bawolego lub mieszanin mleka owczego, koziego i bawolego jest za pomocą gamma2 i gamma3 kazein, których punkty izoelektryczne mają zakres od pH 6,5 do pH 7,5 (wykres 4 a, b, wykres 5). Wartość graniczna wykrywalności jest niższa od 0,5 %.

7.1. Ocena wizualna

Przy ocenie wizualnej ilości mleka krowiego zalecane jest dostosowanie stężeń próbek i wzorców celem uzyskania tego samego poziomu nasilenia owczych, kozich i/lub bawolich gamma2 i gamma3 kazein (patrz "gamma2 E, G, B" i "gamma3 E,G,B" na wykresach 4a, b i wykresie 5). Po takim dostosowaniu ilość mleka krowiego (mniejsza, równa lub większa od 1 %) w nieznanej próbce może być oceniona bezpośrednio poprzez porównanie wzmocnienia gamma2 i gamma3 kazein krowich (patrz "gamma3 C" i "gamma2 C" na wykresach 4a, b i wykresie 5) z tymi standardowymi wzorcami 0 % i 1 % (owca, koza) lub tymczasowymi wzorcami laboratoryjnymi (bawół).

7.2. Ocena densytometryczna

Jeżeli jest dostępna, stosować densytometrię (ppkt 5.19) celem oznaczenia stosunku powierzchni pików gamma2 i gamma3 kazein krów do owiec, kóz lub/i bawołów (patrz wykres 5). Porównać te wartości do stosunku powierzchni pików gamma2 i gamma3 kazeiny – 1 % standardowego wzorca (owca, koza) lub tymczasowego wzorca laboratoryjnego (bawół), poddanych analizie na tym samym żelu.

Uwaga:

Metoda sprawdza się należycie w przypadkach, gdy występuje jasny dodatni sygnał w odniesieniu do obydwu krowich gamma2 i gamma3 kazein w 1-procentowym standardowym wzorcu, ale nie w przypadku 0-procentowego standardowego wzorca. Jeżeli nie, optymalizować procedurę przez dokładne postępowanie według wskazówek.

Próbka jest oceniana jako pozytywna, jeżeli obie krowie kazeiny gamma2 i gamma3 – lub odpowiedni stosunek powierzchni pików – są równe lub wyższe od poziomu 1 % standardowego wzorca.

8. Odniesienia

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of gamma-2caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte – and carier ampholyte/immobilized pH gradient – isoelectric focusing of gamma-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause L. Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. - käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

[1] Produkt Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) i Resolyte® pH 5–7 i pH 6–8 (BDH, Merck) okazały się szczególnie odpowiednie do uzyskania wymaganego rozdzielenia γ-kazein.

[2] Produkt Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) i Resolyte® pH 5–7 i pH 6–8 (BDH, Merck) okazały się szczególnie odpowiednie do uzyskania wymaganego rozdzielenia γ-kazein.

[3] Produkt Ampholine® pH 3,5–9,5 (Pharmacia) i Resolyte® pH 5–7 i pH 6–8 (BDH, Merck) okazały się szczególnie odpowiednie do uzyskania wymaganego rozdzielenia γ-kazein.

[4] Zastosowanie próbki: Po ogniskowaniu wstępnym (krok 1) odmierzyć przy użyciu pipety 18 μl próbki i podstawowych roztworów na aplikatory próbek (10 × 5 mm), rozmieścić je w odległości 1 mm od siebie na żelu i w odległości 5 mm wzdłużnie od anody oraz lekko ucisnąć. Kontynuować ogniskowanie w powyżej wymienionych warunkach, ostrożnie usuwając aplikatory próbek po 60 minutach ogniskowania próbek.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XVI

(art. 11)

METODA REFERENCYJNA WYKRYWANIA BAKTERII Z GRUPY COLI W MAŚLE, ODTŁUSZCZONYM MLEKU W PROSZKU, KAZEINIE I KAZEINIANACH

Próbki odpowiadające 1 g masła umieszcza się na podłożu kultury bakterii, jeżeli badane jest masło na obecność form bakterii coli.

W przypadku gdy badane jest odtłuszczone mleko w proszku lub kazeina/kazeiniany na obecność form bakterii coli, na podłożu kultury bakterii umieszcza się próbki o wadze 0,1 g.

Norma IDF 73A/1985, metoda B jest stosowana z uwzględnieniem następujących zmian:

1) Przygotowanie próbki wykonuje się zgodnie z normą IDF 122B: 1992. Dla kazeiny kwasowej procedura przygotowania próbki opisana w normie IDF 73A:1985 może być wykorzystywana alternatywnie.

2) Inkubacji oraz ocenie poddaje się jedynie rurki zawierające próbki masła o wadze 1 g lub odpowiednio 0,1 g odtłuszczonego mleka w proszku, kazeiny/kazeinianów. Nie sporządza się rozcieńczeń dziesiętnych.

Ocena wyników

Trzy wyniki negatywne | spełnia wymogi |

Dwa lub trzy wyniki pozytywne | nie spełnia wymogów |

Dwa wyniki negatywne | należy poddać analizie dwie dodatkowe próbki o wadze 1 g (masło) lub odpowiednio 0,1 g (odtłuszczone mleko w proszku, kazeina/kazeiniany). Spełnia wymogi, jeżeli dwa ostatnie wyniki są negatywne. W innym przypadku wymogi nie są spełnione. |

UWAGA

Zawartość form bakterii coli: przeciętnie 1/10 g w odniesieniu do masła, 1/g w odniesieniu do odtłuszczonego mleka w proszku, kazeiny/kazeinianów.

Wyniki wskazujące, że wymogi są spełnione, są uzyskiwane z prawdopodobieństwem wynoszącym 93 %.

Zawartość form bakterii coli; przeciętnie 1/g w odniesieniu do masła, 1/0,1 g w odniesieniu do odtłuszczonego mleka w proszku, kazeiny/kazeinianów.

Wyniki wskazujące, że wymogi nie są spełnione, są uzyskiwane z prawdopodobieństwem wynoszącym 91 %.

(Założenie: rozkład Poisssona).

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XVII

(Art. 12)

METODA OZNACZANIA ZAWARTOŚCI LAKTOZY W PRODUKTACH OBJĘTYCH KODEM CN 2309 [1]

CZĘŚĆ I

1. Zakres stosowania

Metodę stosuje się w przypadkach, w których zawartość laktozy przekracza 0,5 %.

2. Zasada

Rozpuścić cukry w wodzie. Pozwolić na działanie drożdży (Saccharomyces cerevisiae): pozostawi to laktozę w stanie nienaruszonym. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu określić zawartość laktozy w tym roztworze, za pomocą metody Luffa-Schoorla.

3. Odczynniki

Tiosiarczan sodu 0,1 N

Znacznik: roztwór skrobi. Dodać mieszaninę 5 g rozpuszczalnej skrobi (można dodać 10 mg jodku rtęci jako środka konserwującego) i 30 ml wody do 1 litra wrzącej wody; utrzymywać mieszaninę w stanie wrzenia przez trzy minuty; pozostawić do wystudzenia.

Roztwór jodku potasu AR do 30 % (w/v).

Roztwór kwasu siarkowego 6 N

Odczynnik Luffa-Schoorla:

a) Rozpuścić 25 g pięciowodnego siarczanu miedzi II AF wolnego od żelaza (CuSO4 5H20) w 100 ml wody.

b) Rozpuścić 50 g kwasu cytrynowego monowodnego AR (C6H8O7 H2O) w 50 ml wody.

c) Rozpuścić 143,8 g bezwodnego węglanu sodu AR (Na2CO3) w około 300 ml gorącej wody i pozostawić do wystudzenia.

Nalać lit. b) do lit. c), ostrożnie wstrząsać, a następnie dodać lit. a). Uzupełnić do 1 litra, pozostawić na jedną noc i następnie przefiltrować. Skontrolować normalność otrzymanego w ten sposób odczynnika (Cu 0,1 N, Na2CO3 2 N). pH musi wynosić w przybliżeniu 9,4.

roztwór Carreza I: rozpuścić 23,8 g Zn (C2H3O2)2.2H2O i 3 g kwasu octowego lodowatego w wodzie i uzupełnić do 100 ml.

roztwór Carreza II: rozpuścić 10,6 g K4F2(CN)6. 3 H2 O w wodzie i uzupełnić do 100 ml.

Ziarenka pumeksu, poddane działaniu kwasu chlorowodorowego w czasie wrzenia, umyte w wodzie i wysuszone. Zawiesina Saccharomyces cerevisae: 25 g świeżych drożdży w 100 ml wody (przechowywać w chłodziarce nie dłużej niż przez jeden tydzień).

4. Procedura

Odmierzyć wagowo, z dokładnością do 1 mg, 1-gramową próbkę do analizy; umieścić tę próbkę w kolbie kalibrowanej 100 ml. Dodać od 25 do 30 ml wody. Umieścić kolbę we wrzącej łaźni wodnej na trzydzieści minut, następnie schłodzić do temperatury w przybliżeniu 35 °C.

Dodać 5 ml zawiesiny drożdży [2] i wstrząsnąć. Pozostawić kalibrowaną kolbę i jej zawartość w łaźni wodnej o temperaturze 38–40 °C na dwie godziny.

Po sfermentowaniu schłodzić do temperatury około 20 °C. Dodać 2,5 ml roztworu Carreza I i wstrząsać przez trzydzieści sekund, następnie dodać 2,5 ml roztworu Carreza II i ponownie wstrząsać przez 30 sekund. Uzupełnić do 100 ml wodą, wymieszać i przefiltrować. Odmierzyć pipetą ilość filtratu nie większą niż 25 ml, najlepiej zawierającego od 40 do 80 mg laktozy; w razie konieczności uzupełnić do 25 ml wodą i określić zawartość bezwodnej laktozy metodą Luffa-Schoorla.

Przeprowadzić pełną ślepą próbę z samymi drożdżami.

CZĘŚĆ II

1. Oznaczanie zawartości laktozy metodą Luffa-Schoorla.

Odmierzyć pipetą 25 ml odczynnika Luffa-Schoorla i umieścić go w 300-ml kolbie Erlenmeyera; dodać dokładnie odmierzone 25 ml sklarowanego roztworu.

Po dodaniu dwóch ziarenek pumeksu podgrzać, potrząsając ręcznie nad nieosłoniętym płomieniem średniej wysokości i doprowadzić ciecz do wrzenia przez około dwie minuty. Natychmiast umieścić kolbę Erlenmeyera na siatce drucianej z azbestowym ekranem, pod którym wcześniej zapalono płomień. Ustawić go tak, aby ogrzewał jedynie dno kolby Erlenmeyera; następnie dołączyć chłodnicę zwrotną. Od tej chwili utrzymywać w stanie wrzenia dokładnie przez dziesięć minut. Schłodzić niezwłocznie w zimnej wodzie i po około pięciu minutach badać w następujący sposób:

Dodać do cieczy 10 ml jodku potasu i bezpośrednio potem, lecz ostrożnie (ponieważ może wystąpić silne wytwarzanie piany), 25 ml kwasu siarkowego 6 N.

Następnie badać, używając tiosiarczanu sodu aż do pojawienia się żółtego, matowego koloru i pod koniec badania dodać znacznik skrobi.

Przeprowadzić to samo badanie z mieszaniną dokładnie odmierzonych 25 ml odczynnika Luffa-Schoorla i 25 ml wody, po dodaniu 10 ml jodku potasu i 25 ml kwasu siarkowego 6 N, tym razem bez doprowadzania do wrzenia.

Wykorzystując poniższą tabelę, ustalić ilość laktozy w mg odpowiadającą różnicy między wynikami dwóch badań (wyrażoną w ml tiosiarczanu sodu 0,1 N).

TABELA

Tabela dla 25 ml odczynnika Luffa-Schoorla

(patrz warunki przedstawione w tekście)

1. Tiosiarczan sodu 0,1 N

2. Laktoza C12H22O11

1 | 2 |

ml | mg | różnica |

1 | 3,6 | |

| | 3,7 |

2 | 7,3 | |

| | 3,7 |

3 | 11,0 | |

| | 3,7 |

4 | 14,7 | |

| | 3,7 |

5 | 18,4 | |

| | 3,7 |

6 | 22,1 | |

| | 3,7 |

7 | 25,8 | |

| | 3,7 |

8 | 29,5 | |

| | 3,7 |

9 | 33,2 | |

| | 3,8 |

10 | 37,0 | |

| | 3,8 |

11 | 40,8 | |

| | 3,8 |

12 | 44,6 | |

| | 3,8 |

13 | 48,4 | |

| | 3,8 |

14 | 52,2 | |

| | 3,9 |

15 | 56,0 | |

| | 3,9 |

16 | 59,9 | |

| | 3,9 |

17 | 63,8 | |

| | 4,0 |

18 | 67,7 | |

| | 4,0 |

19 | 71,7 | |

| | 4,1 |

20 | 75,7 | |

| | 4,1 |

21 | 79,8 | |

| | 4,1 |

22 | 83,9 | |

| | 4,1 |

23 | 88,0 | |

[1] Rozporządzenie (EWG) nr 222/88.

[2] Dla produktów zawierających więcej niż 40 % cukru fermentacyjnego należy zwiększyć ilość zawiesiny drożdży.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XVIII

(Art. 13)

WYKRYWANIE OBECNOŚCI SERWATKI PODPUSZCZKOWEJ W ODTŁUSZCZONYM MLEKU W PROSZKU PRZEZNACZONYM DO SKŁADOWANIA W MAGAZYNACH PAŃSTWOWYCH, ZA POMOCĄ OZNACZANIA GLIKOMAKROPEPTYDÓW METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)

1. Zakres i dziedzina stosowania

Omawiana metoda umożliwia wykrywanie obecności serwatki podpuszczkowej w odtłuszczonym mleku w proszku przeznaczonym do składowania w magazynach państwowych, metodą oznaczania glikomakropeptydów.

2. Odniesienie

Międzynarodowa norma ISO 707 – Mleko i przetwory mleczne – metody pobierania próbek, zgodnie z wytycznymi zawartymi w: załączniku I pkt 2 lit. c) akapit ostatni.

3. Definicja

Zawartość glikomakropeptydów w odtłuszczonym mleku w proszku: zawartość substancji oznaczanych za pomocą określonej poniżej metody, wyrażana jako wartość procentowa masy.

4. Zasada

- Odtworzenie odtłuszczonego mleka w proszku, usunięcie tłuszczu i białka za pomocą kwasu trichlorooctowego, a następnie odwirowanie;

- Oznaczenie ilości glikomakropeptydów (GMP) w supernatantu metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC);

- Ocena wyniku, otrzymanego w przypadku próbek, poprzez odniesienie do próbek wzorcowych składających się z odtłuszczonego mleka w proszku z dodatkiem lub bez dodatku znanej wartości procentowej ilości serwatki w proszku.

5. Odczynniki

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej. Woda wykorzystywana musi być wodą destylowaną lub wodą o co najmniej równorzędnej czystości.

5.1. Roztwór kwasu trichlorooctowego

Rozpuścić w wodzie 240 g kwasu trichlorooctowego (C13CCOOH) i uzupełnić do 1000 ml.

5.2. Roztwór eluentu, pH 6,0

Rozpuścić w około 700 ml wody 1,74 g ortofosforanu dipotasu (K2HPO4), 12,37 g ortofosforanu potasu (KH2PO4) oraz 21,41 g siarczanu sodu (Na2SO4). Jeżeli potrzeba, dostosować pH do 6,0, używając roztworu kwasu fosforowego lub wodorotlenku potasu.

Uzupełnić wodą do 1000 ml i homogenizować.

Przed użyciem przefiltrować roztwór eluentu za pomocą filtru membranowego o średnicy porów 0,45 μm.

5.3. Rozpuszczalnik wymywający

Zmieszać jedną objętość acetonitrylu (CH3CN) z dziewięcioma objętościami wody. Przed użyciem przefiltrować mieszaninę przez filtr membranowy o średnicy porów 0,45 μm.

Uwaga:

Można zastosować każdy inny rozpuszczalnik spłukujący o działaniu bakteriobójczym, który nie wpływa na skuteczność rozdzielczą kolumn.

5.4. Próbki wzorcowe

5.4.1. Odtłuszczone mleko w proszku spełniające wymogi niniejszego rozporządzenia (tzn. [0]).

5.4.2. To samo odtłuszczone mleko w proszku zafałszowane 5 % (m/m) serwatką typu podpuszczkowego w proszku, o składzie standardowym (tzn. [5]).

6. Aparatura

6.1. Waga analityczna

6.2. Wirówka, mogąca osiągać siłę odśrodkową 2200 g, wyposażona w rurki wirówkowe z zatyczkami, o pojemności około 25 ml.

6.3. Wytrząsarka mechaniczna.

6.4. Mieszadło magnetyczne.

6.5. Lejki szklane, średnica około 7 cm.

6.6. Bibuły filtracyjne, średni stopień filtrowania, średnica około 12,5 cm.

6.7. Sprzęt szklany do filtracji z filtrem membranowym o średnicy porów 0,45 μm.

6.8. Kalibrowane pipety umożliwiające podawanie 10 ml (ISO 648, klasa A lub ISO/R 835).

6.9. Łaźnia wodna termostatowana, ustawiona na 25 ± 0,5 °C.

6.10. Zestaw do HPLC, składający się z:

6.10.1. Pompy.

6.10.2. Iniektora ręcznego lub automatycznego, o pojemności od 15 do 30 μl.

6.10.3. Dwóch kolumn TSK 2000-SW połączonych szeregowo (długość 30 cm, średnica wewnętrzna 0,75 cm) lub kolumn równorzędnych, wraz z kolumną wstępną (3 cm × 0,3 cm), wypełnionych I 125 lub materiałem o równorzędnej skuteczności.

6.10.4. Suszarki termostatowanej kolumny, ustawionej na 35 ± 1 °C.

6.10.5. Detektora zmiennej długości fali UV, umożliwiającego pomiary przy 205 nm, przy czułości 0,008 A.

6.10.6. Integratora umożliwiającego całkowanie powierzchni pików (dolina-dolina).

Uwaga:

Praca z kolumnami utrzymywanymi w temperaturze pokojowej jest możliwa, ale ich zdolność rozdzielcza jest nieco niższa. W takim przypadku temperatura powinna różnić się o mniej niż ± 5 °C w każdym zakresie analiz.

7. Pobieranie próbki

7.1. Międzynarodowa norma ISO 707 – "Mleko i przetwory mleczne – metody pobierania próbek", zgodnie z wytycznymi zawartymi w załączniku I pkt 2 lit. c) akapit ostatni.

7.2. Przechowywać próbki w warunkach wykluczających jakiekolwiek ich zniszczenie lub zmianę składu.

8. Procedura

8.1. Przygotowanie próbki badanej

Przenieść mleko w proszku do pojemnika o objętości w przybliżeniu dwukrotnie większej niż objętość proszku, wyposażonego w hermetyczną pokrywę. Natychmiast zamknąć pojemnik. Wymieszać dobrze mleko w proszku poprzez wielokrotne odwracanie pojemnika.

8.2. Porcja badana

Odmierzyć wagowo 2,000 + 0,001 g próbki do badań i umieścić w rurce wirówkowej (ppkt 6.2).

8.3. Usuwanie tłuszczu i białek

8.3.1. Do porcji badanej dodać 20 g ciepłej wody (50 °C). Rozpuścić proszek przez 5-minutowe potrząsanie za pomocą wytrząsarki mechanicznej (ppkt 6.3). Schłodzić rurkę do temperatury 25 °C.

8.3.2. Przez dwie minuty dodawać stopniowo 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (ppkt 5.1), mieszając jednocześnie mieszadłem magnetycznym (ppkt 6.4). Umieścić rurkę w łaźni wodnej (ppkt 6.9) i pozostawić tam na 60 minut.

8.3.3. Odwirowywać (ppkt 6.2) przez 10 minut przy 2200 g bądź filtrować przez bibułę (ppkt 6.6), odrzucając pierwsze 5 ml filtratu.

8.4. Oznaczanie chromatograficzne

8.4.1. Dokonać iniekcji 15–30 μl dokładnie odmierzonego supernatantu lub filtratu (ppkt 8.3.3) do aparatury HPLC (ppkt 6.10), ustawiając na działanie przy prędkości przepływu wynoszącej 1,0 ml roztworu eluentu (ppkt 5.2) na minutę.

Uwagi:

1. Utrzymywać roztwór eluentu (ppkt 5.2) w temperaturze 85 °C przez cały czas trwania analizy chromatograficznej po to, aby utrzymać go w stanie odgazowanym i aby zapobiec rozwojowi bakterii. Można stosować wszelkie inne środki ostrożności o podobnym działaniu.

2. Podczas każdej przerwy płukać kolumny wodą. Nie pozostawiać nigdy roztworu eluentu (ppkt 5.2) w kolumnach.

Przed każdą przerwą dłuższą niż 24 godziny przepłukać kolumny wodą, a następnie myć je roztworem (ppkt 5.3) co najmniej przez trzy godziny z prędkością przepływu równą 0,2 ml na minutę.

8.4.2. Wyniki analizy chromatograficznej próbki [E] są otrzymywane w postaci chromatogramu, na którym poszczególne piki określa się za pomocą ich czasu retencji RT, jak następuje:

Pik II: | Drugi pik chromatogramu, z RT równym około 12,5 min. |

Pik III: | Trzeci pik chromatogramu, odpowiadający GMP, z RT równym 15,5 ± 1,0 min. |

Pik IV | Czwarty pik chromatogramu, z RT równym około 17,5 min. |

Jakość kolumn może mieć wpływ na czasy retencji poszczególnych pików.

Integrator (ppkt 6.10.6) automatycznie oblicza powierzchnię A dla każdego piku:

AII: | powierzchnia piku II, |

AIII: | powierzchnia piku III, |

AIV: | powierzchnia piku IV. |

Istotne jest zbadanie wyglądu każdego chromatogramu przed dokonaniem interpretacji ilościowej, w celu wykrycia ewentualnych nieprawidłowości będących skutkiem wadliwego działania aparatury lub kolumn bądź wynikających z pochodzenia i rodzaju analizowanej próbki.

W razie wątpliwości analizę powtórzyć.

8.5. Kalibracja

8.5.1. Do próbek wzorcowych (ppkt 5.4) zastosować dokładnie procedurę opisaną od ppkt 8.2 do ppkt 8.4.2.

Używać świeżo przygotowanych roztworów, z powodu degradacji GMP w 8-procentowym środowisku kwasu trichlorooctowego. Straty szacuje się na 0,2 % na godzinę w temperaturze 30 °C.

8.5.2. Przed chromatograficznym oznaczaniem próbek należy przygotować kolumny za pomocą wielokrotnych iniekcji próbki wzorcowej (ppkt 5.4.2) do roztworu (ppkt 8.5.1) aż do momentu, gdy powierzchnia i czas retencji piku odpowiadającego GMP są stałe.

8.5.3. Oznaczyć współczynniki odpowiedzi R przez iniekcję takiej samej objętości filtratów (ppkt 8.5.1) jak wykorzystywana do próbek.

9. Sposób prezentowania wyników

9.1. Metoda obliczenia i wzory

9.1.1. Wyliczanie współczynników odpowiedzi R:

Pik II: | RII=100AII0 |

Pik IV: | RIV=100AIV0 |

gdzie:

RII i RIV = współczynniki odpowiedzi odpowiednio piku II i IV;

AII[0] i AIV[0] = powierzchnie odpowiednio pików II i IV próbki wzorcowej [0] otrzymane w ppkt 8.5.3.

Pik III: | RIII=WAIII5- AIII0 |

gdzie:

RIII = współczynnik odpowiedzi piku III,

AIII [0] i AIII [5] = powierzchnie piku III w próbkach wzorcowych [0] i [5] odpowiednio otrzymane w ppkt 8.5.3,

W = ilość serwatki w próbce wzorcowej [5], tzn. 5.

9.1.2. Obliczanie względnej powierzchni pików w próbce [E]

S

= R

x A

IIE

S

III

III

E

S

= R

x A

IVE

gdzie:

SII [E], SIII [E], SIV[E] = względne powierzchnie pików II, III i IV odpowiednio w próbce [E],

AII [E], AIII[E], AIV[E] = powierzchnie pików II, III i IV odpowiednio w próbce [E] otrzymane w ppkt 8.4.2,

RII, RIII, RIV = współczynniki odpowiedzi obliczone w ppkt 9.1.1.

9.1.3. Obliczanie względnego czasu retencji piku III w próbce [E]:

RRT

=

RT

RT

III5

gdzie:

RRTIII [E] = względny czas retencji piku III w próbce [E],

RTIII [E] = czas retencji piku III w próbce [E] otrzymany w ppkt 8.4.2,

RTIII [5] = czas retencji piku III w próbce kontrolnej [5] otrzymany w ppkt 8.5.3.

9.1.4. Doświadczenia wykazały, że istnieje liniowa zależność między względnym czasem retencji piku III, tzn. RRTIII[E], i wartością procentową serwatki uzupełnionej do 10 %.

- RRTIII [E] jest < 1,000, gdy wartość procentowa serwatki wynosi > 5 %,

- RRTIII [E] jest ≥ 1,000, gdy wartość procentowa serwatki wynosi ≤ 5 %.

Dopuszczalna niepewność w odniesieniu do wartości RRTIII wynosi ± 0,002.

Zazwyczaj wartość RRTIII [0] odchyla się nieco od 1,034. W zależności od stanu kolumn wartość ta może zbliżać się do 1,000, ale zawsze musi ją przewyższać.

9.2. Wyliczanie wartości procentowej serwatki podpuszczkowej w proszku w próbce:

W = S

-

S

- 0,9

gdzie:

W = wartość procentowa m/m serwatki podpuszczkowej w próbce [E];

SIII [E] = względna powierzchnia piku III próbki badanej [E] otrzymana jak w ppkt 9.1.2;

1,3 = stanowi średnią powierzchnię względną piku III wyrażoną w gramach serwatki podpuszczkowej, na 100 g, oznaczoną w niezafałszowanym odtłuszczonym mleku w proszku różnego pochodzenia. Wielkość ta została uzyskana doświadczalnie;

SIII [0] = stanowi względną powierzchnię piku III, która jest równa RIII x AIII[0]. Wartości te uzyskano w ppkt 9.1.1 i 8.5.3 odpowiednio;

(SIII [0] –– 0,9) = stanowi poprawkę do wykonania w odniesieniu do średniej powierzchni względnej 1,3, gdy SIII [0] nie jest równe 0,9. Doświadczalnie średnia powierzchnia względna piku III próbki kontrolnej [0] wynosi 0,9.

9.3. Dokładność procedury

9.3.1. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń wykonanych równocześnie lub w bezpośrednim następstwie przez tego samego analityka za pomocą tej samej aparatury na identycznym materiale badanym nie przekracza 0,2 % m/m.

9.3.2. Odtwarzalność

Różnica między dwoma pojedynczymi i niezależnymi wynikami, otrzymanymi na identycznym materiale badanym, nie przekracza 0,4 % m/m.

9.4. Interpretacja

9.4.1. Przyjąć nieobecność serwatki, jeżeli względna powierzchnia piku III, SIII [E] wyrażona w gramach serwatki podpuszczkowej na 100 g produktu, wynosi

≤ 2,0 +

gdzie:

2,0 = jest maksymalną wartośscią dopuszczalną dla względnej powierzchni piku III przy uwzględnieniu względnej powierzchni piku III, tzn. 1,3 niepewności wynikającej ze zmian składu odtłuszczonego mleka w proszku oraz odtwarzalności metody (ppkt 9.3.2),

(SIII [0] –– 0,9) = stanowi poprawkę do wykonania, jeżeli powierzchnia SIII [0] jest różna od 0,9 (patrz ppkt 9.2)

9.4.2. Jeżeli względna powierzchnia piku III,

S

jest > 2,0 +

, a względna powierzchnia piku II, SII [E] ≤ 160, oznaczyć zawartość serwatki podpuszczkowej w sposób wskazany w pkt 9.2.

9.4.3. Jeżeli względna powierzchnia piku III,

S

jest > 2,0 +

, a względna powierzchnia piku II, SII [E] ≤ 160, oznaczyć całkowitą zawartość białka (P %), następnie zbadać wykresy 1 i 2.

9.4.3.1. Dane otrzymane po analizie próbek niezafałszowanego odtłuszczonego mleka w proszku, o wysokiej całkowitej zawartości białka, zostały zgromadzone na wykresach 1 i 2.

Linia ciągła ilustruje regresję liniową, której współczynniki obliczane są metodą najmniejszych kwadratów.

Linia prosta przerywana wyznacza górną granicę względnej powierzchni piku III, z prawdopodobieństwem nieprzekroczenia jej w 90 % przypadków.

Równania w odniesieniu do prostych linii przerywanych na wykresach 1 i 2 są następujące:

SIII= 0,376 P % - 0,7 | (wykres 1), |

SIII= 0,0123 SIIE+ 0,93 | (wykres 2), |

gdzie:

SIII jest wzglęedną powierzchnią piku III wyliczoną albo według całkowitej zawartości białka albo według względnej powierzchni piku SII [E],

P % jest to całkowita zawartość białka wyrażona jako wartość procentowa w masie,

(SII[E] jest to względna powierzchnia próbki obliczona w ppkt 9.1.2.

Równania te odpowiadają liczbie 1,3 wymienionej w ppkt 9.2.

Rozbieżność (T1 i T2) między stwierdzoną względną powierzchnią SIII[E] a względną powierzchnią SIII jest podawana w sposób następujący:

T

= S

-

S

-0,9

T

= S

-

0,0123 S

+ 0,93

S

- 0,91

9.4.3.2. Jeżeli T1 i/lub T2 są równe lub mniejsze od zera, nie można ustalić obecności serwatki podpuszczkowej.

Jeżzeli T1 i/lub T2 są większe od zera, występuje obecność serwatki podpuszczkowej.

Zawartość serwatki podpuszczkowej jest obliczana zgodnie ze wzorem:

W = T

+ 0,91

gdzie:

0,91 jest to odległość na pionowej osi między ciągłymi i przerywanymi liniami prostymi.

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XIX

(Art. 13)

OZNACZANIE SUCHEJ MASY SERWATKI PODPUSZCZKOWEJ W ODTŁUSZCZONYM MLEKU W PROSZKU ORAZ W MIESZANKACH ZGODNIE Z ROZPORZĄDZENIEM (WE) NR 2799/1999

1. Cel: Wykrycie dodania suchej masy serwatki podpuszczkowej do:

a) odtłuszczonego mleka w proszku określonego w art. 2 rozporządzenia (WE) nr 2799/1999; oraz

b) mieszanek określonych w art. 4 rozporządzenia (EW) nr 2799/1999.

2. Odniesienia: Międzynarodowa norma ISO 707

3. Definicja

Zawartość suchej masy serwatki podpuszczkowej jest oznaczana jako wartość procentowa w masie, ustalona w ramach opisanej procedury.

4. Zasada

Zawartość glikomakropeptydu A jest oznaczana zgodnie z załącznikiem XVIII. Próbki dające pozytywne wyniki poddaje się badaniu na glikomakropeptyd A w drodze zastosowania procedury wysokosprawnej chromatografii cieczowej (procedura HPLC) z odwróconymi fazami. Ocena wyników jest otrzymywana przez odniesienie do próbek wzorcowych składających się z mleka odtłuszczonego w proszku zawierającego lub nie znaną wartość procentową serwatki w proszku. Wyniki wyższe niż 1 % (m/m) wskazują na obecność suchej masy serwatki podpuszczkowej.

5. Odczynniki

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej. Woda wykorzystywana musi być wodą destylowaną lub wodą o co najmniej równorzędnej czystości. Acetonitryl powinien mieć jakość spektroskopową lub jakość wymaganą dla HPLC.

Odczynniki konieczne do przeprowadzenia procedury są opisane w załączniku XVIII do niniejszego rozporządzenia.

Odczynniki do HPLC z odwróconymi fazami.

5.1. Roztwór kwasu trichlorooctowego

Rozpuścić 240 g kwasu trichlorooctowego (CCl3CCOOH) w wodzie i uzupełnić do 1000 ml.

5.2. Eluenty A oraz B

Eluent A: 150 ml acetonitrylu (CH3CN), 20 ml izopropanolu (CH3CHOHCH3) oraz 1,00 ml kwasu trifluorooctowego (TFA, CF3COOH) umieszcza się w 1000-ml kolbie pomiarowej. Uzupełnić do 1000 ml wodą. Eluent B: 550 ml acetonitrylu, 20 ml izopropanolu oraz 1,00 ml TFA umieszcza się kolbie pomiarowej. Uzupełnić do 1000 ml wodą. Przed zastosowaniem przefiltrować roztwór eluentu przez filtr membranowy, o średnicy porów wynoszącej 0,45 μm.

5.3. Konserwacja kolumny

Po przeprowadzeniu analizy kolumnę płucze się eluentem B (poprzez gradient), a następnie spłukuje acetonitrylem (poprzez gradient przez 30 minut). Kolumnę przechowuje się w acetonitrylu.

5.4. Próbki wzorcowe

5.4.1. Mleko odtłuszczone w proszku spełniające wymogi składowania w magazynach państwowych (tzn. (0)).

5.4.2. To samo mleko odtłuszczone w proszku zafałszowane za pomocą 5 % (m/m) podpuszczkowego rodzaju serwatki w proszku o wzorcowym składzie (tzn. (5)).

5.4.3. To samo mleko odtłuszczone w proszku zafałszowane za pomocą 50 % (m/m) podpuszczkowego rodzaju serwatki w proszku o wzorcowym składzie (to jest (50)) [1].

6. Aparatura

Aparatura konieczna do opisanej procedury omówiona jest w załączniku XVIII do niniejszego rozporządzenia.

6.1. Waga analityczna.

6.2. Wirówka, mogąca osiągać siłę odśrodkową 2200 g, wyposażona w rurki wirówkowe z zatyczkami, o pojemności około 50 ml.

6.3. Wstrząsarka mechaniczna, umożliwiająca wstrząsanie w temperaturze 50 °C.

6.4. Mieszadło magnetyczne.

6.5. Lejki szklane, średnica około 7 cm.

6.6. Bibuły filtracyjne, średni stopień filtrowania, średnicy wynoszącej około 12,5 cm.

6.7. Szklany sprzęt do filtrowania, z filtrem membranowym o średnicy porów 0,45 μm.

6.8. Kalibrowane pipety, umożliwiające podawanie 10 ml (ISO 648, Klasa A lub ISO/R 835), bądź system umożliwiający podawanie 10,0 ml w ciągu dwóch minut.

6.9. Łaźnia wodna termostatowana ustawiona na temperaturę 25 ± 0,5 °C.

6.10. Zestaw do HPLC, składający się z:

6.10.1. Systemu pompującego o podwójnym gradiencie.

6.10.2. Iniektora, ręcznego bądź automatycznego, o pojemności 100 μl.

6.10.3. Kolumny Dupont Protein Plus (długości 25 cm, średnica wewnętrzna 0,46 cm) bądź równoważnej jej kolumny odwróconej fazy opartej o krzemionkę o szerokiej porowatości.

6.10.4. Termostatycznego pieca kolumnowego, ustawionego na temperaturę 35 ± 1 °C.

6.10.5. Detektora dla zmiennej długości fal UV, umożliwiającego pomiary przy 210 nm (w razie konieczności można stosować długość fal do 220 nm), o czułości wynoszącej 0,02.

6.10.6. Integratora umożliwiającego całkowanie powierzchni pików (dolina-dolina).

Uwaga

Działanie kolumny w temperaturze pokojowej jest możliwe, pod warunkiem że temperatura pokojowa nie podlega wahaniom większym niż 1 °C, w przeciwnym razie ma miejsce zbyt duże wahanie w retencji czasu GMP.

7. Pobieranie próbek

7.1. Próbki muszą być pobierane zgodnie z procedurą określoną w międzynarodowej normie ISO 707. Jednakże Państwa Członkowskie mogą wykorzystywać inną metodę pobierania próbek pod warunkiem, że jest ona zgodna z zasadami powyższej normy.

7.2. Próbkę składować w warunkach wykluczających pogorszenie lub zmianę składu.

8. Procedura

8.1. Przygotowanie próbki badanej

Przenieść mleko w proszku do pojemnika o pojemności około dwukrotnie większej niż objętość proszku, wyposażonego w szczelną pokrywkę. Natychmiast zamknąć pojemnik. Wymieszać dobrze mleko w proszku poprzez wielokrotne odwracanie pojemnika.

8.2. Porcja badana

Odmierzyć wagowo 2,000 ± 0,001 g próbki badanej i umieścić w rurce wirówkowej (ppkt 6.2) lub w odpowiedniej kolbie z zatyczką (50 ml).

8.3. Usuwanie tłuszczu i białek

8.3.1. Do porcji badanej dodać 20 g ciepłej wody (50 °C). Rozpuścić proszek, potrząsając przez pięć minut lub 30 minut w przypadku maślanki kwasowej, za pomocą wstrząsarki mechanicznej (ppkt 6.3). Umieścić rurkę w łaźni wodnej i pozostawić do wyrównania się temperatury do 25 °C.

8.3.2. Przez dwie minuty dodawać stopniowo 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (ppkt 5.1), mieszając jednocześnie energicznie mieszadłem magnetycznym (ppkt 6.4). Umieścić probówkę w łaźni wodnej (ppkt 6.9) i pozostawić na 60 minut.

8.3.3. Odwirowywać (ppkt 6.2) 2,200 g przez 10 minut lub filtrować przez bibułę (ppkt 6.6), odrzucając pierwsze 5 ml filtratu.

8.4. Oznaczanie chromatograficzne

8.4.1. Wykonać analizę HPLC w sposób opisany w załączniku XVIII. W przypadku otrzymania wyniku negatywnego analizowana próbka nie zawiera suchej masy serwatki podpuszczkowej w ilościach wykrywalnych. Jeżeli wynik jest pozytywny, musi zostać zastosowana określona poniżej procedura HPLC z odwróconymi fazami. Obecność maślanki kwasowej w proszku może stanowić podstawę fałszywie pozytywnych wyników. Metoda HPLC z odwróconymi fazami wyklucza taką możliwość.

8.4.2. Przed przeprowadzeniem analizy HPLC z odwróconymi fazami zoptymalizowane powinny zostać warunki gradientów. Czas retencji wynoszący 26 ± 2 minuty dla GMPA jest optymalny dla systemów gradientowych o objętości martwej wynoszącej około 6 ml (objętość od punktu, w którym rozpuszczalniki schodzą się razem do objętości iniektora włącznie). Systemy gradientowe o mniejszej objętości martwej (np. 2 ml) powinny osiągać optymalny czas retencji 22 minuty.

Wziąć roztwory próbek wzorcowych (ppkt 5.4) z dodatkiem oraz bez dodatku 50 % serwatki podpuszczkowej.

Dokonać iniekcji 100 μl supernatantu lub filtratu (ppkt 8.3.3) do aparatury HPLC działającej w warunkach gradientu próbnego podanych w tabeli 1.

Tabela 1

Warunki gradientu próbnego dla optymalizacji chromatografii

Czas (minuty) | Przepływ (ml/minuty) | % A | % B | Krzywa |

Pocz. | 1,0 | 90 | 10 | * |

27 | 1,0 | 60 | 40 | lin |

32 | 1,0 | 10 | 90 | lin |

37 | 1,0 | 10 | 90 | lin |

42 | 1,0 | 90 | 10 | lin |

Porównanie dwóch chromatogramów powinno ujawnić położenie (piku GMPA).

Wykorzystując podany poniżej wzór, można obliczyć skład początkowego rozpuszczalnika, który ma zostać użyty do normalnego gradientu (patrz ppkt 8.4.3)

% B = 10 - 2,5 +

*30/27

% B = 7,5 +

*1,11

Gdzie:

RTgmpA : czas retencji GMPA w gradiencie próbnym

10 : wstępny % B gradientu próbnego

2,5 : % B w punkcie środkowym minus % B w punkcie początkowym w gradiencie normalnym

13,5 : czas w punkcie środkowym gradientu próbnego

26 : wymagany czas retencji GMPA

6 : stosunek nachyleń gradientu próbnego i normalnego

30 : % B na wstępie minus % B w 27. minucie gradientu próbnego

27 : czas działania gradientu próbnego.

8.4.3. Wziąć roztwory próbek do badań

Dokonać iniekcji dokładnie odmierzonch 100 μl supernatantu lub filtratu (ppkt 8.3.3) do aparatury HPLC działającej przy przepływie wynoszącym 1,0 roztworu eluentu (ppkt 5.2) na minutę.

Skład eluentu w chwili rozpoczęcia analizy otrzymuje się z ppkt 8.4.2. Normalnie jest on zbliżony do A:B = 76:24 (ppkt 5.2). Natychmiast po dokonaniu iniekcji rozpoczyna się gradient liniowy, który prowadzi do 5 % zwiększenia wartości procentowej B po 27 minutach. Następnie rozpoczęty zostaje gradient liniowy, który doprowadza skład eluentu do 90 % B w ciągu pięciu minut. Skład ten jest utrzymywany przez pięć minut, po czym zostaje zmieniony, poprzez gradient liniowy w ciągu pięciu minut do składu wstępnego. W zależności od wewnętrznej pojemności systemu pompującego następna iniekcja może zostać wykonana 15 minut po osiągnięciu warunków początkowych.

Uwagi

1. Czas retencji glikomakropeptydu powinien wynosić 26 ± dwie minuty. Może to zostać osiągnięte w drodze różnicowania wstępnych oraz końcowych warunków pierwszego gradientu. Jednakże różnica w % B dla wstępnych oraz końcowych warunków pierwszego gradientu musi pozostawać na poziomie 5 % B.

2. Eluenty powinny być odgazowane w sposób wystarczający i pozostawać odgazowane. Jest to istotne dla sprawnego funkcjonowania gradientowego systemu pompowania. Odchylenie standardowe dla czasu retencji piku GMP powinno wynosić mniej niż 0,1 minuty (n = 10).

3. Co pięć próbek powinna być sporządzona przez iniekcję próbka wzorcowa (5) w celu obliczenia nowego współczynnika odpowiedzi R. (ppkt 9.1.1).

8.4.4. Wyniki chromatograficznej analizy próbki do badań (E) są otrzymywane w postaci chromatogramu, w którym pik GMP identyfikowany jest za pomocą swojego czasu retencji wynoszącego około 26 minut.

Integrator (ppkt 6.40.6) automatycznie oblicza szczytową wysokość H piku GMP. W każdym chromatogramie powinno zostać sprawdzone położenie linii podstawowej. Analiza lub całkowanie powinny zostać powtórzone w przypadku nieprawidłowego położenia linii podstawowej.

Istotne jest zbadanie wyglądu każdego chromatogramu przed dokonaniem interpretacji ilościowej, w celu wykrycia jakichkolwiek nieprawidłowości będących skutkiem wadliwego działania aparatury lub kolumny bądź wynikających z pochodzenia i rodzaju analizowanej próbki. W razie wątpliwości analizę powtórzyć.

8.5. Kalibracja

8.5.1. Do próbek wzorcowych (ppkt 5.4.1-5.4.2) stosować dokładnie procedurę opisaną od ppkt 8.2 do ppkt 8.4.4. Używać świeżo przygotowanych roztworów, z powodu degradacji GMP w środowisku 8-procentowego kwasu trichlorooctowego w temperaturze pokojowej. W temperaturze 4 °C roztwór pozostaje stabilny przez 24 godziny. W przypadku długich serii analiz pożądane jest korzystanie ze schłodzonej tacki na próbki w iniektorze automatycznym.

Uwaga

Podpunkt 8.4.2 można opuścić w przypadku, gdy % B w warunkach początkowych znany jest z poprzednich analiz.

Chromatogram próbki wzorcowej (5) powinien być analogiczny do pokazanego na rysunku 1. Na tym rysunku pik GMPA poprzedzony jest przez dwa małe piki. Istotne jest uzyskanie podobnej separacji.

8.5.2. Przed oznaczeniem chromatograficznym próbek dokonać iniekcji 100 μl próbki wzorcowej bez serwatki podpuszczkowej (0) (ppkt 5.4.1).

Chromatogram nie powinien wykazywać piku w czasie retencji piku GMPA.

8.5.3. Oznaczyć współczynniki odpowiedzi R przez iniekcję takiej samej objętości filtratów (ppkt 8.5.1) jak wykorzystana do próbek.

9. Sposób prezentowania wyników

9.1. Metoda obliczania oraz wzory

9.1.1. Wyliczanie współczynnika odpowiedzi R:

Pik GMP: R = W/H

Gdzie:

R = współczynnik odpowiedzi piku GMP

H = wysokość piku GMP

W = ilość serwatki w próbce wzorcowej (5).

9.2. Obliczanie wartości procentowej serwatki podpuszczkowej w proszku, w próbce

R × H(E)

gdzie:

W(E) = wartość procentowa (m/m) serwatki podpuszczkowej w próbce (E).

R = współczynnik odpowiedzi piku GMP (ppkt 9.1.1)

H(E) = wysokość piku GMP dla próbki (E).

W przypadku gdy wartość W(E) jest większa niż 1 %, a różnica między czasem retencji a czasem retencji próbki wzorcowej (5) jest mniejsza niż 0,2 minuty, stwierdzona jest obecność suchej masy serwatki podpuszczkowej.

9.3. Dokładność procedury

9.3.1. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzanych równocześnie bądź w bezpośrednim następstwie przez tego samego analityka za pomocą tej samej aparatury na identycznym materiale badanym nie przekracza 0,2 % m/m.

9.3.2. Odtwarzalność

Dotychczas nieustalona.

9.3.3. Liniowość

Przy 0–16 % serwatki podpuszczkowej powinna zostać uzyskana zależność liniowa, ze współczynnikiem korelacji > 0,99.

9.4. Interpretacja

9.4.1. Uważa się, że serwatka występuje, w przypadku gdy wynik otrzymany w ppkt 9.2. jest wyższy niż 1 % m/m, a czas retencji piku GMP różni się o mniej niż 0,2 minuty od czasu dla próbki wzorcowej (5).Wartość graniczna wynosząca 1 % jest ustalana zgodnie z przepisami ppkt 9.2 i 9.4.1 załącznika V do rozporządzenia (EWG) nr 625/78.

+++++ TIFF +++++

[1] Podpuszczkowy rodzaj serwatki w proszku o składzie wzorcowym, jak również zafałszowane odtłuszczone mleko w proszku są dostępne w NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20 – NL-6710 BA Ede. Jednakże stosowane mogą być również proszki dające wyniki równoważne wynikom uzyskiwanym za pomocą proszków NIZO.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XX

(Art. 14)

ODTŁUSZCZONE MLEKO W PROSZKU: ILOŚCIOWE OZNACZANIE ZAWARTOŚCI FOSFATYDYLOSERYNY I FOSFATYDYLOETANOLAMINY

Metoda HPLC z odwróconymi fazami

1. Zakres i dziedzina stosowania

Metoda opisuje procedurę ilościowego oznaczania fosfatydyloseryny (PS) oraz fosfatydyloetanolaminy (PE) w odtłuszczonym mleku w proszku (SMP) i nadaje się do wykrywania suchej masy maślanki w odtłuszczonym mleku w proszku.

2. Definicja

Zawartość PS + PE: ułamek masowy substancji oznaczony z wykorzystaniem procedury określonej niniejszym. Wynik wyrażony jest w miligramach dipalmitoilu fosfatydyloetanoloaminy (PEDP) na 100 g proszku.

3. Zasada

Ekstrakcja aminofosfolipidów z odtworzonego odtłuszczonego mleka w proszku za pomocą metanolu. Oznaczanie PS i PE jako pochodnych o-ftalodialdehydu (OPA) metodą HPLC z odwróconymi fazami (RP) oraz wykrywanie fluoroscencyjne. Kwantyfikacja zawartości PS i PE w badanej próbce przez odniesienie do próbki wzorcowej zawierającej znaną ilość PEDP.

4. Odczynniki

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej. Woda musi być destylowana lub co najmniej o równorzędnej czystości, chyba że ustalono inaczej.

4.1. Materiał wzorcowy:PEDP, czystość co najmniej 99 %

Uwaga:

Materiał wzorcowy musi być przechowywany w temperaturze –18 °C.

4.2. Odczynniki do przygotowania próbki wzorcowej i próbki do badań

4.2.1. Metanol czystości HPLC

4.2.2. Chloroform czystości HPLC

4.2.3. Chlorowodorek tryptaminy

4.3. Odczynniki do derywatyzacji o-ftalodialdehydu

4.3.1. Wodorotlenek sodu, roztwór wodny 12 M

4.3.2. Kwas borny, roztwór wodny 0,4 M dostosowany do 10,0 pH za pomocą wodorotlenku sodu (ppkt 4.3.1)

4.3.3. 2-markaptoetanol

4.3.4. o-ftalodialdehyd (OPA)

4.4. Rozpuszczalniki elucyjne do HPLC

Rozpuszczalniki elucyjne muszą być przygotowane przy użyciu odczynników czystości HPLC.

4.4.1. Woda czystości HPLC

4.4.2. Metanol o czystości sprawdzonej fluorymetrycznie.

4.4.3. Tetrahydrofuran

4.4.4. Diwodorofosforan sodu

4.4.5. Octan sodu

4.4.6. Kwas octowy

5. Aparatura

5.1. Waga analityczna

5.2. Zlewki o pojemności 25 i 100 ml

5.3. Pipety, dozujące 1 i l0 ml

5.4. Mieszadło magnetyczne

5.5. Kalibrowane pipety, dozujące 0,2, 0,5 i 5 ml

5.6. Kolby pomiarowe o pojemności 10, 50 i l00 ml

5.7. Strzykawki o pojemności 20 i 100 μl

5.8. Łaźnia ultradźwiękowa

5.9. Wirówka działająca przy 27000 × g

5.10. Fiolki szklane o pojemności około 5 ml

5.11. Cylinder pomiarowy o pojemności 25 ml

5.12. Pehametr

5.13. Sprzęt do HPLC

5.13.1. System pompujący o podwójnym gradiencie o możliwości działania 1,0 ml/min przy 200 barach

5.13.2. Automatyczny próbnik do pobierania próbek o zdolności różniczkującej.

5.13.3. Ogrzewacz kolumnowy ustawiony na 30 °C

5.13.4. Detektor fluorescencji ustawiony na długość fal wzbudzenia 330 nm i długość fal emisji 440 nm

5.13.5. Integrator lub oprogramowanie do przetwarzania danych zdolne do pomiaru powierzchni pików

5.13.6. Kolumna Lichrosphere – 100 (250 × 4,6 mm) lub równorzędna kolumna wypełniona oktadecylosilanem (C18) o wielkości cząsteczek 5 μm

6. Pobieranie próbek

Pobieranie próbek musi być przeprowadzane zgodnie z normą IDF 50B: 1985.

7. Procedura

7.1. Przygotowanie wewnętrznego roztworu wzorcowego

Odmierzyć wagowo 30,0 ± 0,1 mg chlorowodorku tryptaminy (ppkt 4.2.3) do 100 ml kolby pomiarowej (ppkt 5.6), uzupełnić do znaku metanolem (ppkt 4.2.1). Odmierzyć pipetą (ppkt 5.3) 1 ml tego roztworu do kolby pomiarowej 10 ml (ppkt 5.6) i uzupełnić do znaku metanolem (ppkt 4.2.1), w celu uzyskania stężenia 0,15 mM tryptaminy.

7.2. Przygotowanie roztworu próbki badanej

Odmierzyć wagowo 1,000 ± 0,001 g próbki odtłuszczonego mleka w proszku do 25 ml zlewki (ppkt 5.2). Dodać pipetą (ppkt 5.3) 10 ml wody destylowanej o temperaturze 40 °C i mieszać mieszadłem magnetycznym (ppkt 5.4) przez 30 min do całkowitego rozpuszczenia grudek. Odmierzyć pipetą (ppkt 5.5) 0,2 ml odtworzonego mleka do 10 ml kolby pomiarowej (ppkt 5.6), za pomocą strzykawki (ppkt 5.7) dodać 100 μl roztworu 0,15 mM tryptaminy (ppkt 7.1) i uzupełnić objętość metanolem (ppkt 4.2.1). Wymieszać dokładnie, odwracając kolbę i poddając działaniu ultradźwięków (ppkt 5.8) przez 15 minut. Odwirowywać (ppkt 5.9) przy 27000 × g przez 10 minut i zebrać supernatant do szklanej probówki (ppkt 5.10).

Uwaga:

Do chwili przeprowadzania analizy HPLC roztwór próbki do badań powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C.

7.3. Przygotowanie zewnętrznego roztworu wzorcowego

Odmierzyć wagowo 55,4 mg PEDP (ppkt 4.1) do 50 ml kolby pomiarowej (ppkt 5.6) i dodać około 25 ml chloroformu (ppkt 4.2.2), używając kalibrowanego cylindra (ppkt 5.11). Ogrzać zakorkowaną kolbę do 50 °C i wymieszać dokładnie, aż do rozpuszczenia PEDP. Schłodzić kolbę do 20 °C, uzupełnić objętość metanolem (ppkt 4.2.1) i wymieszać odwracając. Odmierzyć pipetą 1 ml (ppkt 5.3) tego roztworu do 100 ml kolby pomiarowej (ppkt 5.6), uzupełnić objętość metanolem (ppkt 4.2.1). Odmierzyć pipetą 1 ml (ppkt 5.3) tego roztworu do l0 ml kolby pomiarowej (ppkt 5.6), dodać 100 μl (ppkt 5.7) roztworu 0,15 mM tryptaminy (ppkt 7.1) i uzupełnić objętość metanolem (ppkt 4.2.1). Wymieszać, odwracając.

Uwaga:

Do chwili przeprowadzania analizy HPLC roztwór próbki wzorcowej powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C.

7.4. Przygotowanie odczynnika derywatyzacyjnego

Odmierzyć wagowo 25,0 ± 0,1 mg OPA (ppkt 4.3.4) do 10 ml kolby pomiarowej (ppkt 5.6), dodać 0,5 ml (ppkt 5.5) metanolu (ppkt 4.2.1) i wymieszać dokładnie w celu rozpuszczenia OPA. Uzupełnić do znaku roztworem kwasu bornego (ppkt 4.3.2) i dodać 20 μl 2-markaptoetanolu (ppkt 4.3.3), używając strzykawki (ppkt 5.7).

Uwaga:

Odczynnik derywatyzacyjny powinien być przechowywany w temperaturze 4 °C w ciemnej probówce, kiedy to zachowuje stabilność przez okres jednego tygodnia.

7.5. Oznaczanie za pomocą HPLC

7.5.1. Rozpuszczalniki elucyjne (ppkt 4.4)

Rozpuszczalnik A:

Roztwór 0,3 mM diwodorofosforanu sodu i roztwór 3 mM octanu sodu (dostosowane do pH 6,5 za pomocą kwasu octowego): metanol: tetrahydrofuran = 558:440:2 (v/v/v)

Rozpuszczalnik B:

metanol

7.5.2. Zalecany gradient elucji

Czas (min) | Rozpuszczalnik A (%) | Rozpuszczalnik B (%) | Prędkość przepływu (ml/min) |

Początkowy | 40 | 60 | 0 |

0,1 | 40 | 60 | 0,1 |

5,0 | 40 | 60 | 0,1 |

6,0 | 40 | 60 | 1,0 |

6,5 | 40 | 60 | 1,0 |

9,0 | 36 | 64 | 1,0 |

10,0 | 20 | 80 | 1,0 |

11,5 | 16 | 84 | 1,0 |

12,0 | 16 | 84 | 1,0 |

16,0 | 10 | 90 | 1,0 |

19,0 | 0 | 100 | 1,0 |

20,0 | 0 | 100 | 1,0 |

21,0 | 40 | 60 | 1,0 |

29,0 | 40 | 60 | 1,0 |

30,0 | 40 | 60 | 0 |

Uwaga:

W celu uzyskania rozdzielenia pokazanego na rysunku 1 może okazać się konieczna lekka modyfikacja gradientu elucji.

Temperatura kolumny: 30 °C.

7.5.3. Objętość iniekcji: 50 μl odczynnika derywatyzacyjnego i 50 μl roztworu próbki.

7.5.4. Równoważenie kolumny

Uruchamiając układ codziennie, spłukiwać kolumny rozpuszczalnikiem B o 100-procentowym stężeniu przez 15 minut, następnie ustalić rozpuszczalniki A i B w proporcji 40: 60 i wyrównać do poziomu 1 ml/min dla 15 minut. Przeprowadzić ślepą próbę poprzez iniekcję metanolu (ppkt 4.2.1).

Uwaga:

Przed długotrwałym przechowywaniem płukać kolumnę roztworem metanolu i chloroformu w proporcji 80: 20 (v/v) przez 30 minut.

7.5.5. Oznaczenie zawartości PS + PE w badanej próbce.

7.5.6. Przeprowadzić serię analiz chromatograficznych, utrzymując stały czas między seriami w celu uzyskania stałych okresów retencji. Wprowadzać zewnętrzny roztwór wzorcowy (ppkt 7.3) co 5–10 roztworów badanych próbek w celu ustalenia współczynnika odpowiedzi.

Uwaga:

Kolumna musi być czyszczona przez płukanie 100-procentowym rozpuszczalnikiem B (ppkt 7.5.1) co najmniej przez 30 minut, co 20–25 serii.

7.6. Sposób całkowania

7.6.1. Pik PEDP

PEDP jest eluowany jak pojedynczy pik. Oznaczyć powierzchnię piku przez całkowanie powierzchni pików (dolina-dolina).

7.6.2. Pik tryptaminy

Tryptamina jest eluowana jak pojedynczy pik (rysunek 1). Oznaczyć powierzchnię piku poprzez całkowanie powierzchni pików (dolina-dolina).

7.6.3. Grupy pików PS i PE

Na niżej opisanych warunkach (rysunek 1) PS jest eluowany w formie dwóch częściowo nierozdzielonych pików poprzedzonych mniejszym pikiem. PE jest wypłukiwany/eluowany w formie trzech częściowo nierozdzielonych pików. Oznaczyć całkowitą powierzchnię każdej grupy pików przez utworzenie linii podstawowej zgodnie z rysunkiem 1.

8. Obliczanie i prezentacja wyników

Zawartość PS i PE w próbce badanej oblicza się, jak następuje:

C=55,36 x

x

T1T2

gdzie:

C = zawartość PS lub PE (mg/100 g proszku) w próbce badanej

A

1 = powierzchnia piku PEDP roztworu próbki wzorcowej (ppkt 7.3)

A

2 = powierzchnia piku PS lub PE roztworu próbki badanej (ppkt 7.2)

T

1 = powierzchnia piku tryptaminy w roztworze próbki wzorcowej (ppkt 7.3)

T

2 = powierzchnia piku tryptaminy w roztworze próbki badanej (ppkt 7.2)

9. Dokładność

Uwaga:

Wartości dotyczące powtarzalności zostały obliczone zgodnie z międzynarodową normą IDF [1]. Tymczasową wartość graniczną odtwarzalności obliczono zgodnie z procedurą określoną w załączniku III lit. b) do niniejszego rozporządzenia.

9.1. Powtarzalność

Względne odchylenie standardowe powtarzalności, wyrażające zmienność niezależnych wyników analitycznych otrzymanych przez ten sam podmiot, wykorzystujący tę samą aparaturę, w takich samych warunkach, na takiej samej próbce badanej oraz w krótkim odstępie czasu, nie powinno przekraczać 2 % względne. Jeżeli dwa oznaczenia są otrzymane w tych warunkach, względna różnica między dwoma wynikami nie powinna być większa niż 6 % średniej arytmetycznej wyników.

9.2. Odtwarzalność

Jeżeli dwa oznaczenia otrzymane są przez podmioty w różnych laboratoriach wykorzystujące różną aparaturę w różnych warunkach, podczas analizy tej samej próbki względna różnica między dwoma wynikami nie powinna być większa niż 11 % średniej arytmetycznej wyników.

10. Odniesienia:

10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Ramilli M.: "Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids". Sci. Tecn. Latt.-Cas. 39,395 (1988).

+++++ TIFF +++++

[1] Międzynarodowa norma IDF 135B/1991. Mleko i przetwory mleczne. Charakterystyka precyzji metod analitycznych. Zarys procedury współpracy badawczej.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XXI

(Art. 15)

WYKRYWANIE POZOSTAŁOŚCI ANTYBIOTYKÓW I SULFONAMIDÓW/DAPSONU W ODTŁUSZCZONYM MLEKU W PROSZKU

Stosuje się badanie przesiewowe na inhibicję mikrobiologiczną, przy użyciu Bacillus stearothermophilus var. calidolactis C953jako mikroorganizmu badanego, o czułości odpowiedniej do wykrycia w mleku 4 μg benzylopenicyliny oraz 100 μg sulfadymidyny. W handlu są dostępne zestawy do badań i można ich używać, o ile mają one wymaganą czułość w odniesieniu do benzylopenicyliny i sulfadymidyny [1].

Do badania używa się odtworzonego odtłuszczonego mleka w proszku (l g proszku + 9 ml wody destylowanej). Badanie przeprowadza się w sposób opisany w biuletynie IDF – nr 258/1991, sekcja 1, rozdział 2, bądź zgodnie z instrukcją producenta zestawu do badań.

Wyniki pozytywne należy interpretować w sposób następujący:

1) Powtórzyć badanie, dodając do systemu badawczego penicylinazę.

Wynik pozytywny: Za pomocą tej procedury nie można zidentyfikować substancji hamującej.

Wynik negatywny: Substancją hamujacą jest antybiotyk beta-laktam.

2) Powtórzyć badanie, dodając do systemu badawczego kwas p-aminobenzoesowy:

Wynik pozytywny: Za pomocą tej procedury nie można zidentyfikować substancji hamującej.

Wynik negatywny: Substancją hamującą jest sulfonamid/dapson.

3) Powtórzyć badanie, dodając do systemu badawczego penicylinazę + kwas p-aminobenzoesowy:

Wynik pozytywny: Za pomocą tej procedury nie można zidentyfikować substancji hamujacej.

Wynik negatywny: Substancjami hamującymi są antybiotyk beta-laktam oraz sulfonamid/dapson.

[1] Ważne spostrzeżenie:Przy analizie odtłuszczonego mleka w proszku można uzyskać wyniki fałszywie pozytywne. Dlatego ważne jest sprawdzenie, czy wykorzystywany system badawczy nie daje wyników fałszywie pozytywnych.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XXII

(Art. 16)

ILOŚCIOWE OZNACZANIE ZAWARTOŚCI MLEKA ODTŁUSZCZONEGO W PROSZKU W MIESZANKACH PASZOWYCH, METODĄ ENZYMATYCZNEJ KOAGULACJI PARAKAZEINY

1. Cel

Ilościowe oznaczenie zawartości mleka odtłuszczonego w proszku w mieszankach paszowych metodą enzymatycznej koagulacji parakazeiny.

2. Zakres

Metoda ma zastosowanie w odniesieniu do mieszanek paszowych zawierających co najmniej 10 % odtłuszczonego mleka w proszku; duże ilości maślanki i/lub niektórych białek niepochodzących z mleka mogą prowadzić do powstania zakłóceń.

3. Zasada metody

3.1. Rozpuszczenie kazeiny zawartej w mieszance paszowej poprzez ekstrahowanie za pomocą roztworu cytrynianu sodu.

3.2. Dostosowanie stężenia jonów wapnia do wymaganego poziomu w celu oddzielenia parakazeiny; parakazeina uzyskiwana jest z kazeiny poprzez dodanie podpuszczki.

3.3. Zawartość azotu w osadzie parakazeiny określana jest metodą Kjeldahla, zgodnie z opisem w normie 20A 1986; ilość odtłuszczonego mleka w proszku jest obliczana na podstawie minimalnej zawartości kazeiny wynoszącej 27,5 % (patrz ppkt 9.1).

4. Odczynniki

Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej klasie analitycznej. Woda wykorzystywana musi być wodą destylowaną lub wodą co najmniej o równorzędnej czystości. Z wyjątkiem podpuszczki (ppkt 4.5) wszystkie odczynniki i roztwory muszą być wolne od substancji azotowych.

4.1. Cytrynian (tri) sodu, dihydrat (1 % roztwór).

4.2. Chlorek wapnia (roztwór 2M). Odmierzyć wagowo 20,018 g CaCO3 (jakość analityczna) w naczyniu porcelanowym o odpowiedniej wielkości (od 150 do 200 ml) lub w zlewce. Zalać wodą destylowaną i przenieść do łaźni o wrzącej wodzie. Dodawać powoli 50–60 ml roztworu HCl (koncentrat HCl: woda = 1:1) w celu całkowitego rozpuszczenia węglanu. Utrzymywać w łaźni o wrzącej wodzie do chwili uzyskania suchego CaCl2, w celu wyeliminowania HCl, który nie wszedł w reakcję. Przenieść za pomocą wody destylowanej do 100 ml kolby pomiarowej i rozcieńczyć do znaku. Zmierzyć wartość pH, która nie może być mniejsza niż 4,0. Przechowywać roztwór w chłodziarce.

4.3. Wodorotlenek sodu 0,1 N.

4.4. Kwas chlorowodorowy 0,1 N.

4.5. Płynna podpuszczka cielęca (wzorcowe stężenie 1:10000). Przechowywać w chłodziarce w temperaturze od 4 do 6 °C.

4.6. Odczynniki do ilościowego oznaczania azotu według metody Kjeldahla, zgodnie z opisem w normie IDF 20A 1986.

5. Aparatura

Typowa aparatura laboratoryjna, składająca się z:

5.1. Moździerza lub homogenizatora

5.2. Wagi analitycznej

5.3. Wirówki przenośnej (2000–3000 obr./min) z rurkami o pojemności 50 ml

5.4. Mieszadła magnetycznego z adherentami (10–15 mm)

5.5. Zlewek 150–200 ml

5.6. Kolby 250 oraz 500 ml

5.7. Lejków szklanych o średnicy 60–80 mm

5.8. Szybko filtrującej bezpopiołowej bibuły, o średnicy 150 mm (S.S. 589, S.S. 595 1/2)

5.9. Pipet o różnych pojemnościach nominalnych

5.10. Łaźni wodnej termostatowanej w temperaturze 37 °C

5.11. Pehametru

5.12. Zestawu do wytrawiania i destylacji metodą Kjeldahla wraz z osprzętem

5.13. 25 ml kalibrowanych biuretów

5.14. Plastykowej tryskawki do wody destylowanej

5.15. Łopatki ze stali nierdzewnej

5.16. Termometrów

5.17. Pieca suszarniczego, regulowanego termostatycznie.

6. Procedura

6.1. Przygotowanie próbki.

Zetrzeć w moździerzu lub zhomogenizować w młynku 10–20 g próbki w celu uzyskania jednorodnej mieszanki.

6.2. Rozpuszczenie mleka w proszku oraz oddzielenie nierozpuszczalnych pozostałości.

6.2.1. Odmierzyć wagowo 1,000 +/- 0,002 g dobrze zhomogenizowanej mieszanki paszowej (ppkt 6.1) bezpośrednio do rurki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 30 ml roztworu cytrynianu (tri) sodu (ppkt 4.1) podgrzanego uprzednio do temperatury 45 °C. Mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego co najmniej przez pięć minut.

6.2.2. Wirować przy 500 g (2000–3000 obr./min) przez 10 minut, a następnie dekantować czysty wodny supernatant do zlewki o pojemności od 150 do 200 ml, dbając o to, aby nie przelać żadnej części luźnego materiału pozostającego na dnie.

6.2.3. Przeprowadzić dwie kolejne ekstrakcje pozostałości, według tej samej procedury, dodając uzyskane ekstrakty do pierwszego.

6.2.4. Jeżeli na powierzchni utworzy się warstwa oleju, schłodzić ekstrakt w chłodziarce do chwili zestalenia się tłuszczu i usunąć zestaloną warstwę za pomocą łopatki.

6.3. Koagulacja kazeiny za pomocą enzymów podpuszczki.

6.3.1. Nie przerywając mieszania, dodawać po kropli 3,4 ml nasyconego roztworu chlorku wapnia (ppkt 4.2) do całości ekstraktu wodnego (około 100 ml). Dostosować pH do 6,4–6,5 przy użyciu roztworów NaOH (ppkt 4.3) lub HCl (ppkt 4.4). Umieścić w regulowanej termostatycznie łaźni wodnej w temperaturze 37 °C na 15–20 minut w celu uzyskania równowagi solnej. Stanie się to bardzo wyraźne poprzez uformowanie się lekkiego zmętnienia.

6.3.2. Przenieść płyn do jednej (lub dwóch) rurek wirówkowych i odwirowywać przy 2000 g przez 10 minut w celu usunięcia wytrąconego materiału. Przenieść supernatant, nie spłukując osadu, do jednej (lub dwóch) rurek wirówkowych.

6.3.3. Doprowadzić temperaturę supernatantu z powrotem do 37 °C. Mieszając ekstrakt, dodawać po kropli, 0,5 ml płynnej podpuszczki (ppkt 4.5). Koagulacja zachodzi w ciągu jednej lub dwóch minut.

6.3.4. Włożyć z powrotem próbkę do łaźni wodnej i pozostawić w temperaturze 37 °C na 15 minut. Wyjąć próbkę z łaźni i rozbić koagulat poprzez mieszanie. Wirować przy 2000 g przez 10 minut. Filtrować supernatant przez odpowiednią bibułę filtracyjną [1] (Whatman nr 541 lub równorzędną) i zachować bibułę filtracyjną. Przemyć osad,mieszając go w rurce wirówkowej z 50 ml wody o przybliżonej temperaturze 35 °C.

Wirować ponownie przy 2000 g przez 10 minut. Przefiltrować supernatant przez zachowaną poprzednio bibułę filtracyjną.

6.4. Oznaczanie zawartości azotu w kazeinie

6.4.1. Po przemyciu przenieść ilościowo osad na zachowaną poprzednio bibułę filtracyjną (ppkt 6.3.4), używając wody destylowanej. Przenieść bibułę filtracyjną do kolby Kjeldahla. Oznaczyć zawartość azotu metodą Kjeldahla, zgodnie z jej opisem w IDF normie 20A 1986.

7. Ślepa próba

7.1. Ślepa próba jestprzeprowadzana regularnie z wykorzystaniem bezpopiołowej bibuły filtracyjnej (ppkt 5.8) zwilżonej mieszaniną składającą się z 90 ml roztworu cytrynianu sodu (ppkt 4.1), 1 ml nasyconego roztworu chlorku wapnia (ppkt 4.2), 0,5 ml podpuszczki płynnej (ppkt 4.5) i przemytej z użyciem 3 × 15 ml wody destylowanej przed mineralizacją za pomocą metody Kjeldahla, zgodnie z jej opisem w IDF normie 20A 1986.

7.2. Objętość kwasu użytego do przeprowadzenia ślepej próby musi zostać odjęta od objętości kwasu (ppkt 4.4) użytego do miareczkowania próbki.

8. Próba kontrolna

8.1. W celu zbadania wspomnianej powyżej procedury oraz odczynników wykonać oznaczenie na wzorcowej mieszance paszowej o znanej zawartości odtłuszczonego mleka w proszku ustalonej w trakcie badań międzylaboratoryjnych. Przeciętny wynik podwójnego oznaczenia nie powinien różnić się więcej niż 1 % od wyniku badania międzylaboratoryjnego.

9. Sposób prezentowania wyników

9.1. Wartość procentowa mleka odtłuszczonego w proszku w mieszankach paszowych jest obliczana za pomocą poniższego wzoru:

% MMP =

27,5

- 2,81

0,908

gdzie N jest wartością procentową azotu parakazeiny; 27,5 stanowi współczynnik służący konwersji oznaczonej kazeiny na wartość procentową mleka odtłuszczonego w proszku; 2,81 oraz 0,908 są współczynnikami korygującymi otrzymanymi z analizy regresji.

10. Dokładność metody

10.1. Powtarzalność

Co najmniej w 95 % przebadanych przypadków podwójna analiza tej samej próbki przez ten sam podmiot w tym samym laboratorium musi dawać różnice wyników równoważne wielkości nie większej niż 2,3 g odtłuszczonego mleka w proszku, w 100 g mieszanki paszowej.

10.2. Odtwarzalność

Co najmniej w 95 % przebadanych przypadków ta sama próbka analizowana przez dwa laboratoria musi dawać różnice wyników nie większe niż 6,5 g odtłuszczonego mleka w proszku, w 100 g mieszanki paszowej.

11. Granica tolerancji

Wartość CrD95 (różnica krytyczna; 95 % poziom ufności) jest obliczana z wykorzystaniem wzoru (ISO 5725):

CrD

=

n

Odtwarzalność; r: powtarzalność)

Podwójne oznaczenie: CrD95 = 4,5 g

W przypadku gdy wynik analizy chemicznej różni się od deklarowanej zawartości mleka odtłuszczonego w proszku o nie więcej niż 4,5 g (podwójne oznaczenie), przesyłkę mieszanki paszowej uważa się za zgodną z niniejszym przepisem rozporządzenia.

12. Uwagi

12.1. Dodanie dużych wartości procentowych niektórych białek niepochodzących z mleka, w szczególności białek soi, podczas podgrzewania z mlekiem odtłuszczonym w proszku, może prowadzić do uzyskania zbyt wysokich wyników z powodu współwydzielania z parakazeiną mleka.

12.2. Dodanie maślanki może prowadzić do uzyskania nieco zaniżonych wartości liczbowych, z tego powodu, że oznaczona jest wyłącznie część beztłuszczowa. Dodanie niektórych maślanek kwasowych może dawać znacznie niższe wartości liczbowe, z powodu niepełnej rozpuszczalności w roztworze cytrynianu.

12.3. Dodatki lecytyny wielkości 0,5 % lub większe mogą również prowadzić do niskich wyników.

12.4. Dodanie mocno podgrzanego mleka odtłuszczonego w proszku może prowadzić do uzyskania zbyt wysokich wartości liczbowych z powodu współ-wydzielania niektórych białek serwatki z parakazeiną mleka.

[1] Ponieważ powinna być zastosowana bezpopiołowa bibuła do szybkiego filtrowania.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XXIII

(Art. 17)

JAKOŚCIOWE OZNACZANIE SKROBI W MLEKU ODTŁUSZCZONYM W PROSZKU, W ZDENATUROWANYM MLEKU W PROSZKU ORAZ W MIESZANKACH PASZOWYCH

1. Zakres

Metoda służy do wykrywania skrobi, która jest wydzielana w ilościach śladowych w zdenaturowanych mlekach w proszku.

Wartość graniczna wykrywalności metody wynosi w przybliżeniu 0,05 g skrobi na 100 g próbki.

2. Zasada

Reakcja oparta jest na reakcji wykorzystywanej w jodometrii:

- wiązanie za pomocą koloidów wolnego jodu w roztworze wodnym,

- absorpcja za pomocą miceli skrobi oraz za pomocą zabarwienia.

3. Odczynniki

3.1. Roztwór jodu

- jod 1 g,

- jodek potasu 2 g,

- woda destylowana 100 ml.

4. Aparatura

4.1. Waga analityczna

4.2. Łaźnia wodna

4.3. Rurki do badań, 25 mm × 200 mm.

5. Procedura

Odmierzyć wagowo 1 g próbki i umieścić tę ilość w rurce do badań (ppkt 4.3).

Dodać 20 ml wody destylowanej i wstrząsnąć w celu rozprowadzenia próbki.

Umieścić w łaźni wrzącej wody (ppkt 4.2) i pozostawić na pięć minut.

Wyjąć z łaźni i schłodzić do temperatury pokojowej.

Dodać 0,5 ml roztworu jodu (ppkt 3.1), wstrząsnąć i zaobserwować pojawiający się kolor.

6. Sposób prezentowania wyników

Zabarwienie niebieskie wskazuje na obecność naturalnej skrobi w próbce.

W przypadku gdy próbka zawiera skrobię modyfikowaną, zabarwienie może nie być niebieskie.

7. Uwagi

Zabarwienie, intensywność zabarwienia oraz obecność skrobi widzianej pod mikroskopem będą się różnić w zależności od pochodzenia skrobi naturalnej (np. kukurydza lub ziemniak) oraz od rodzaju skrobi modyfikowanej obecnej w próbce.

W obecności skrobi zmodyfikowanych wytworzone zabarwienie zmieni się na fioletowe, czerwone lub brązowe, zgodnie ze stopniem modyfikacji struktury krystalicznej skrobi naturalnej.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XXIV

(Art. 18)

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WILGOCI W KWASOWEJ MAŚLANCE W PROSZKU

1. Zakres

Oznaczyć zawartość wilgoci w kwasowej maślance w proszku przeznaczonej na pasze dla zwierząt.

2. Zasada

Próbka jest suszona w warunkach próżni. Ubytek masy oznaczany jest przez ważenie.

3. Aparatura

3.1. Waga analityczna

3.2. Suche pojemniki z niekorodującego metalu lub ze szkła, zaopatrzone w pokrywki zapewniające szczelne zamknięcie; powierzchnia robocza umożliwiająca rozprowadzenie badanej próbki do wartości około 0,3 g/cm2.

3.3. Regulowany, ogrzewany elektrycznie piec próżniowy, wyposażony w pompę olejową oraz albo w mechanizm służący do wprowadzania gorącego suchego powietrza, albo w środek suszący (np. tlenek wapnia).

3.4. Eksykator zawierający skuteczny środek suszący.

3.5. Piec suszarniczy, wentylowany, regulowany termostatycznie, w temperaturze 102 ± 2 °C.

4. Procedura

Podgrzewać pojemnik (ppkt 3.2) wraz z pokrywką w piecu (ppkt 3.5) co najmniej przez jedną godzinę. Umieścić pokrywkę na pojemniku, natychmiast przenieść go do eksykatora (ppkt 3.4) i schłodzić do temperatury pokojowej oraz zważyć z dokładnością do 0,5 mg.

Zważyć pojemnik (ppkt 3.2) wraz z jego pokrywką, z dokładnością do 0,5 mg. W zważonym pojemniku odmierzyć wagowo, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i rozprowadzić ją równomiernie. Umieścić pojemnik bez pokrywki, w piecu próżniowym (ppkt 3.3) podgrzanym wcześniej do temperatury 83 °C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, możliwie jak najszybciej umieścić pojemnik w piecu.

Doprowadzić ciśnienie do 100 Torr (13,3 kPa) i pozostawić do wyschnięcia na cztery godziny w takim ciśnieniu, albo w strumieniu suchego, gorącego powietrza, albo wysuszyć za pomocą środka suszącego (około 300 g na 20 próbek). Następnie wyłączyć pompę próżniową, gdy osiągnięte zostanie zalecane ciśnienie. Odliczać czas suszenia od chwili, kiedy temperatura pieca powróci do wartości 83 °C. Ostrożnie doprowadzić piec do ciśnienia atmosferycznego. Otworzyć piec i natychmiast umieścić pokrywkę na pojemniku, wyjąć pojemnik z pieca, pozostawić do schłodzenia na 30–45 minut w eksykatorze (ppkt 3.4) oraz zważyć z dokładnością do 1 mg. Suszyć przez dodatkowe 30 minut w piecu próżniowym (ppkt 3.3) w temperaturze 83 °C oraz ponownie zważyć. Różnica między wynikami dwóch ważeń nie powinna przekraczać 0,1 % wilgoci.

5. Obliczenie

·

100E

gdzie:

E = masa początkowa badanej próbki w gramach,

m = masa suchej próbki badanej w gramach.

6. Dokładność

6.1. Wartość graniczna powtarzalności

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzanych w możliwie najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot za pomocą tej samej aparatury na identycznym materiale badanym nie przekracza 0,4 g wody/100 g kwasowej maślanki w proszku.

6.2. Wartość graniczna odtwarzalności

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzanych przez podmioty w różnych laboratoriach za pomocą różnej aparatury na identycznym materiale badanym nie przekracza 0,6 g wody/100 g kwasowej maślanki w proszku.

6.3. Źródło danych dotyczących dokładności

Dane dotyczące dokładności zostały określone w czasie doświadczeń przeprowadzanych w 1995 r., które obejmowały osiem laboratoriów i 12 próbek (sześć ślepych duplikatów).

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XXV

(Art. 19)

METODA REFERENCYJNA SŁUŻĄCA DO WYKRYWANIA OBCYCH TŁUSZCZÓW W TŁUSZCZU MLEKA W DRODZE GAZOWO-CHROMATOGRAFICZNEJ ANALIZY TRIGLICERYDÓW – REWIZJA 1

1. Zakres i dziedzina stosowania

Niniejsza norma ustanawia metodę służącą do wykrywania obcych tłuszczów, zarówno tłuszczów roślinnych, jak i tłuszczów zwierzęcych, takich jak łój wołowy oraz smalec, w tłuszczu mleka lub przetworów mlecznych, za pomocą gazowo-chromatograficznej analizy triglicerydów.

Przy użyciu określonych wzorów triglicerydowych tłuszcze roślinne i zwierzęce są jakościowo i ilościowo wykrywalne w czystym tłuszczu mlekowym bez względu na warunki żywienia oraz laktacji.

Uwaga1:

Jakkolwiek kwas masłowy (C4) występujący wyłącznie w tłuszczach mleka umożliwia przeprowadzenie szacunków ilościowych od niskich do średnich ilości tłuszczu mleka w tłuszczach roślinnych, bardzo trudno jest uzyskać informację o charakterze jakościowym oraz ilościowym w zakresie dodania, do co najmniej 20 % ( % wagowo) obcego tłuszczu do czystego tłuszczu mleka z powodu dużego zróżnicowania C4 wahającego się przeciętnie między 3,5 a 4,5 % ( % wagowy).

Uwaga 2:

Wyniki ilościowe można praktycznie uzyskać wyłącznie w drodze analiz triglicerydów, ponieważ zawartość sterolu w tłuszczach roślinnych różni się, będąc funkcją warunków produkcji i obróbki.

2. Definicja

Tłuszcze obce w tłuszczu mleka: zgodnie z definicją podaną w niniejszej normie tłuszczami obcymi są wszystkie tłuszcze roślinne oraz zwierzęce z wyjątkiem tłuszczu mleka.

3. Zasada metody

Po dokonaniu ekstrakcji tłuszczu mleka jest przygotowywany roztwór podstawowy. W tym roztworze oznaczane są triglicerydy (całkowite liczby węglowe) w drodze gazowo-chromatograficznej w kolumnach z wypełnieniem. Poprzez wprowadzanie procentu wagowego różnej wielkości molekuł tłuszczowych (C24 – C54 – wyłącznie liczby parzyste) do formuły triglicerydowej tłuszcze obce są albo wykrywane jakościowo, albo oznaczane ilościowo.

Uwaga:

Przestrzeganie oceny zgodnie z niniejszym opisem umożliwia zastosowanie kapilarnej chromatografii gazowej, jeżeli gwarantowane jest osiągnięcie porównywalnych wyników [1].

4. Odczynniki

Muszą zostać użyte chemikalia klasy analitycznej.

4.1. Gaz nośny: azot, stopień czystości ≥ 99,996 %.

4.2. Triglicerydy wzorcowe [2], nasycone, jak również cholesterol do standaryzacji wzorcowego tłuszczu mleka zgodnie z ppkt 6.5.4.

4.3. Metanol, bezwodny.

4.4. n-heksan

4.5. n-heptan

4.6. Toluen

4.7. Roztwór dimetylochlorosilanu: 50 ml dimetylochlorosilanu zostaje rozpuszczone w 283 ml toluenu.

4.8. Gaz palny: wodór i powietrze syntetyczne

4.9. Faza stacjonarna, 3- % OV-1 na 125/150 μm (siatka 100/120) Gas ChromQ [3].

4.10. 10-procentowy roztwór masła kakaowego

5. Aparatura

Typowa aparatura laboratoryjna, w szczególności:

5.1. Wysokotemperaturowy chromatograf gazowy przystosowany do temperatur wynoszących co najmniej 400–450 °C, wyposażony w detektor jonizacji płomieniowej (FID) oraz regulator przepływu masy stałej dla gazu nośnego. Gaz palny: 30 ml/min H2, 270 ml/min powietrza syntetycznego.

Przy danym wysokim przepływie gazu nośnego płomień powinien być szczególnie duży.

Uwaga:

Z powodu wysokich temperatur występujących przy analizach triglicerydów szklane wkładki w FID oraz w systemie iniektora muszą być często czyszczone.

Chromatograf gazowy musi być wyposażony w membrany, odporne na działanie wysokich temperatur, które mogą być często używane, oraz musi wykazywać ogólnie bardzo mały stopień "ociekania".

Uwaga:

Odpowiednie są membrany Chromblue (tm) (Chrompack).

Membrany muszą być wymieniane w regularnych odstępach czasu, np. średnio po 100 iniekcjach lub natychmiast, gdy pogarsza się rozdzielczość (patrz rysunek 4).

5.2. Kolumna chromatograficzna

Szklana kolumna w kształcie litery U (o wewnętrznej średnicy 2 mm i długości 500 mm), która jest najpierw silanizowana zgodnie z ppkt 6.1 za pomocą dimetylochlorosilanu w celu dezaktywowania powierzchni szklanej.

Uwaga:

Odpowiednie są również nieco dłuższe (80–200 mm długości) kolumny z wypełnieniem. Za ich pomocą może zostać osiągnięta nieco lepsza odtwarzalność wyników. Z drugiej strony faza stacjonarna wykazuje okazjonalne pęknięcia po eksploatacji, które mogą z kolei doprowadzić do uzyskania gorszych wyników ilościowych. Ponadto płomień FID jest łatwy do zgaszenia w wyniku wymaganego wyjątkowo dużego przepływu gazu nośnego, wynoszącego od 75 do 85 ml/min.

5.3. Instalacja do wypełniania kolumny (patrz rysunek 1)

+++++ TIFF +++++

5.3.1. Plastikowa kolumna z nakrętkami, wraz z oznaczeniem, do jakiej wysokości można wypełniać wymaganą ilością fazy stacjonarnej.

5.3.2. Drobne sito (o wielkości oczek wynoszącej w przybliżeniu 100 μm) z nakrętką, odpowiednie do zamykania kolumny szklanej zgodnie z rysunkiem 1.

5.3.3. Zdezaktywowana, silanizowana wata szklana.

5.3.4. Wibrator służący do jednolitego rozprowadzenia fazy stacjonarnej podczas wypełniania

5.4. 1–3-ml kolumna Extrelut [4] z żelem krzemionkowym. Kolumna ta może być alternatywnie wykorzystana do ekstrakcji mającej na celu uzyskanie tłuszczu mleka.

5.5. Plomba grafitowa o średnicy 6,4 mm (1/4) z przewodem o średnicy 6 mm.

5.6. Urządzenia do silanizacji szklanej powierzchni kolumny, zgodnie z ppkt 6.1.

5.6.1. Butelka Woulffa

5.6.2. Wodna pompa ssąca

5.7. Łaźnia wodna, regulowana do (50 ± 2) °C

5.8. Suszarka szafkowa, regulowana do (50 ± 2) °C oraz (100 ± 2) °C

5.9. Pipeta mikrolitrowa

5.10. 5 ml kalibrowana pipeta, do odmierzania 1,5 ml metanolu

5.11. 50-ml kolba okrągłodenna

5.12. Kolba Erlenmeyera, o nominalnej objętości 50 ml

5.13. Lejek

5.14. Filtr o drobnych porach

5.15. Wyparka obrotowa

5.16. Ampułki, o nominalnej objętości 1 ml, zamykane korkiem aluminiowym, z wewnętrzną membraną.

5.17. Strzykawka do iniekcji, tłok używanej strzykawki nie może dochodzić do końcówki igły.

Uwaga

Takie strzykawki umożliwiają lepszą odtwarzalność osiąganych wyników.

W celu uniknięcia uszkodzenia membrany stan końcówki igły powinien być sprawdzany w regularnych odstępach czasu (np. za pomocą stereomikroskopu).

6. Procedura

6.1. Przygotowanie kolumny (silanizacja)

Po podłączeniu butelki Woulffa do wodnej pompy ssącej, tak jak przedstawiono to na rysunku 2, zanurzyć rurkę 2 w roztworze zgodnie z ppkt 4.7. Kolumna wypełniana jest poprzez zamknięcie zaworu odcinającego; następnie należy usunąć obydwie rurki.

+++++ TIFF +++++

Kolumna jest umocowana na statywie i jest całkowicie napełniona roztworem dimetylodichlorosilanu za pomocą pipety.

Po 20–30 min butelka Woulffa zostaje zastąpiona kolbą filtracyjną, natomiast kolumna zostaje opróżniona poprzez połączenie z wodną pompą ssącą (patrz rysunek 3).

6.2. Wypełnianie kolumny

Po czynności tej następuje czynność płukania przy użyciu 75 ml toluenu oraz 50 ml metanolu; następnie opróżniona kolumna jest suszona w suszarce szafkowej w temperaturze 100 °C przez około 30 minut.

+++++ TIFF +++++

Do napełniania kolumny służy instalacja przedstawiona na rysunku 1. Zgodnie z ppkt 4.9 fazę stacjonarną wprowadza się do kolumny plastikowej do wysokości znaku. Niższy koniec kolumny szklanej, który ma zostać wypełniony, jest zamykany za pomocą korka z waty szklanej o długości około 1 cm, uprzednio silanizowanego, który wciskany jest za pomocą stalowego pręta. Następnie koniec kolumny jest zamykany za pomocą sita zgodnie z ppkt 5.3.2.

Kolumna zostaje wypełniona pod ciśnieniem (N2, 3 bar) fazą stacjonarną. W celu uzyskania jednorodnego, nieprzerwanego oraz zwartego upakowania podczas wypełniania przesuwa się wibrator w górę oraz w dół kolumny szklanej.

Po wypełnieniu drugi koniec kolumny z wypełnieniem jest zakorkowany twardym korkiem z silanizowanej wełny szklanej, wystające końcówki są odcinane, a korek dociskany w kolumnie na głębokość kilku milimetrów, za pomocą łopatki.

6.3. Przygotowanie próbek

Do przygotowania próbek wykorzystywana jest jedna z trzech poniższych metod:

6.3.1. Wyodrębnienie tłuszczu mleka z masła

5–10 g masła jest stapiane w odpowiednim naczyniu w łaźni wodnej zgodnie z ppkt 5.7, w temperaturze 50 °C.

Kolba Erlenmeyera o pojemności 50 ml oraz lejek z filtrem zgodnie z ppkt 5.14 są podgrzewane w suszarce szafkowej do temperatury 50 °C. Warstwa tłuszczu roztopionej próbki masła jest filtrowana z zastosowaniem podgrzanego wcześniej urządzenia.

Taki tłuszcz mleka jest prawie całkowicie wolny od fosfolipidów.

6.3.2. Ekstrakcja frakcji tłuszczu według metody Röse-Gottlieba.

Ekstrakcja jest przeprowadzana albo zgodnie z normą IDF 1 C: 1987, 16C: 1987, 116A: 1987 lub 22B: 1987.

Przy takim tłuszczu mleka fosfolipidy umożliwiają uzyskanie piku cholesterolowego, który jest powiększony w przybliżeniu o 0,1 %.

Widmo triglicerydów, znormalizowane do 100 za pomocą cholesterolu, ulega więc wpływom tylko w nieznacznym zakresie.

6.3.3. Ekstrakcja z mleka przy użyciu kolumn z żelem krzemionkowym

Próbka mleka o temperaturze 20 °C i objętości 0,7 ml jest wprowadzona, za pomocą pipety mikrolitrowej, do kolumny Extrelut o pojemności 1–3 ml zgodnie z ppkt 5.4 i pozostawiona na około pięć minut w celu równomiernego rozprowadzenia na żelu krzemionkowym.

W celu denaturowania zespołów białkowo-lipidowych za pomocą pipety zostaje dodane 1,5 ml metanolu. Następnie próbka jest ekstrahowana za pomocą 20 ml n-heksanu. N-heksan jest dodawany powoli w niewielkich ilościach, natomiast odprowadzony rozpuszczalnik jest zbierany do 50 ml kolby okrągłodennej, wysuszonej do stałej, znanej wagi.

Po dokonaniu ekstrahowania kolumna jest całkowicie opróżniana.

Rozpuszczalniki zostają wydestylowane z eluatu na wyparce obrotowej w łaźni wodnej o temperaturze 40–50 °C.

Kolba jest osuszana, a uzysk tłuszczu oznaczony poprzez ważenie.

Uwaga:

Ekstrakcja tłuszczu według Gerbera, Weibulla-Berntropa, Schmida-Bondzynskiego-Ratzlaffa oraz metoda oddzielania tłuszczu mleka przy użyciu detergentów (metoda BDI) nie są odpowiednie dla analizy triglicerydów, ponieważ przy stosowaniu tych metod mniejsze lub większe ilości cząstkowych gliceryny lub fosfolipidów mogą przeniknąć do fazy tłuszczowej.

6.4. Przygotowanie roztworu próbki

Do celów chromatografii gazowej wykorzystywany jest 5-procentowy roztwór tłuszczu w n-heptanie otrzymany zgodnie z ppkt 6.3. W celu przygotowania takiego roztworu próbki odpowiednie ilości materiału próbki otrzymane zgodnie z ppkt 6.3.1 oraz 6.3.2 są odmierzane wagowo i rozpuszczane w odpowiednich ilościach n-heptanu.

Przy przygotowywaniu próbki zgodnie z ppkt 6.3.3 ilość n-heptanu, która ma być dodana do materiału próbki w kolbie, jest obliczana na podstawie wagi, a pozostałość w niej rozpuszczona.

1 ml roztworu próbki w przybliżeniu jest wprowadzany do ampułki zgodnie z ppkt 5.1.6.

6.5. Chromatograficzne oznaczanie triglicerydów

W wysokich temperaturach do 350 °C stosowanych przy elucji triglicerydów o długim łańcuchu C52-C56 łatwo dochodzi do wznoszenia się linii podstawowej, szczególnie w przypadku, gdy kolumny nie były należycie wstępnie kondycjonowane. Można całkowicie uniknąć wymienionego wznoszenia się linii podstawowej w wysokich temperaturach przez albo łączenie dwóch kolumn, albo odejmowanie linii podstawowej.

Przy stosowaniu sposobu kompensacyjnego bądź działaniu za pomocą pojedynczych kolumn użyte muszą być szczelne plomby grafitowe, wymienione w ppkt 5.5, zarówno do wkładów szklanych w iniektorze, jak i w detektorze.

6.5.1. Korekta linii podstawowej

Aby uniknąć wznoszenia się linii podstawowej stosuje się jedną z poniższych czterech metod:

6.5.1.1. Połączenie kolumn

W sposobie kompensacyjnym stosowane są dwie kolumny z wypełnieniem.

6.5.1.2. Korekta linii podstawowej za pomocą chromatografu gazowego

Wznoszenia się linii podstawowej można uniknąć poprzez zastosowanie przebiegu chromatografu gazowego bez iniekcji roztworu tłuszczu oraz następującego po tym odjęcia zapisanej linii podstawowej.

6.5.1.3. Korekta linii podstawowej za pomocą oprogramowania wykonującego całkowanie.

Wznoszenia się linii podstawowej można uniknąć poprzez zastosowanie przebiegu układu integratora bez iniekcji roztworu tłuszczu oraz następującego po tym odjęcia zapisanej linii podstawowej.

6.5.1.4. Korekta linii podstawowej za pomocą odpowiedniego kondycjonowania

Po odpowiednim wstępnym kondycjonowaniu oraz średnio 20 dokonanych iniekcjach roztworów tłuszczu mleka wznoszenie się linii podstawowej w wysokich temperaturach jest często tak niewielkie, że korekcje linii podstawowej nie są konieczne.

6.5.2. Technika iniekcji

Technika "gorących iniekcji" jest stosowana w celu uniknięcia efektów wykluczających oraz w celu uzyskania lepszych wyników ilościowych za pomocą mających wysoką temperaturę wrzenia składników triglicerydów. W tej technice roztwór tłuszczu wciąga się do strzykawki, a przed dokonaniem iniekcji zimna igła strzykawki jest ogrzewana przez około trzy sekundy w głowicy iniektora. Następnie jest dokonywana szybka iniekcja zawartości strzykawki.

Uwaga:

W tej technice iniekcji zmniejszone jest niebezpieczeństwo powstania zjawiska frakcjonowania wewnątrz strzykawki oraz powstania blokady iniekcyjnej. Nie są stosowane bezpośrednie iniekcje "na kolumnę", w jej górnej bardziej ogrzanej części, ponieważ gromadzące się w tym miejscu fragmenty membrany, jak również zanieczyszczenia mogą zostać łatwo usunięte w stosowanej technice przez regularne wymienianie wkładu iniektora bez rozmontowywania kolumny.

Należy bezwzględnie unikać zginania końcówki igły w wyniku dotykania dna zlewki (nawet gdy jest ono trudno widzialne), aby nie doprowadzić do uszkodzenia membrany.

+++++ TIFF +++++

6.5.3. Kondycjonowanie kolumny z wypełnieniem.

Podczas wykonywania czynności lit. a)–c) góry kolumny nie podłącza się do detektora w celu uniknięcia zanieczyszczenia.

Kolumny wypełnione zgodnie z ppkt 6.2 są kondycjonowane w poniższy sposób:

a) 15 minut 40 ml/min N2 – przepływ w temperaturze 50 °C;

b) podgrzewanie przy 1 K/min do temperatury 355 °C przy 10 ml N2/min;

c) przetrzymywanie przez 12–15 godzin w temperaturze 355 °C;

d) dokonanie dwóch iniekcji objętości 1 μl roztworu masła kakaowego zgodnie z ppkt 4.10 oraz właściwym programem temperatury;

e) dokonanie 20 iniekcji objętości 0,5 μm roztworu tłuszczu mlekowego w czasie od dwóch do trzech dni, zgodnie z ppkt 6.4.

Uwaga:

Masło kakaowe składa się niemal wyłącznie z triglicerydów od C50 do C56 o wysokiej temperaturze wrzenia. Iniekcja masła kakaowego służy do celu specjalnego kondycjonowania w tym zakresie o długim łańcuchu. Przy triglicerydach C50–C54 o wysokiej temperaturze wrzenia mogą wystąpić współczynniki odpowiedzi średnio do około 1,20. Normalnie przy powtarzanej iniekcji roztworu tłuszczu mleka należy oczekiwać zmniejszenia początkowo wysoko współczynników odpowiedzi dla C50–C54. W przypadku triglicerydów o niskiej liczbie acyl-c współczynniki są zbliżone do 1. Przygotowane zostają, odpowiednio, trzy pary kolumn wypełnione zgodnie z ppkt 6.2. Kondycjonowane pary są sprawdzane odpowiednio za pomocą analizy tłuszczu mleka w ramach badań rutynowych.

Para o najlepszych wynikach ilościowych (współczynniki odpowiedzi bliskie 1) wykorzystywana jest w dalszej części. Nie jest wykorzystywana kolumna o współczynniku odpowiedzi > 1,20.

6.5.4. Kalibracja

W celu kalibracji oznaczone powinny zostać współczynniki odpowiedzi odpowiednich triglicerydów, jak również cholesterolu w tłuszczu mleka (tłuszcz znormalizowany), przy użyciu znormalizowanych triglicerydów (przynajmniej nasyconych triglicerydów C24, C30, C36, C42, C48 oraz C54, jak również cholesterolu; a najlepiej dodatkowo C50 oraz C52). Pośrednie współczynniki odpowiedzi mogą zostać stwierdzone metodą interpolacji matematycznej.

Przy użyciu tłuszczu znormalizowanego muszą zostać przeprowadzone codziennie od dwóch do trzech kalibracji. W przypadku gdy uzyskiwane są prawie identyczne wyniki, osiąga się dobrze odtwarzalne wyniki ilościowe przy analizie triglicerydowej próbek.

Znormalizowany tłuszcz mleka może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze wynoszącej maksymalnie minus 18 oC i może być on tym samym wykorzystywany jako wzór.

Uwaga:

Współczynnik odpowiedzi każdego składnika może być oznaczony z wykorzystaniem tłuszczu znormalizowanego o certyfikowanym składzie triglicerydów, takiego jak CRM 519 (bezwodny tłuszcz mleczny), który można otrzymać w Instytucie Materiałów Referencyjnych i Pomiarów, Geel, Belgia.

6.5.5. Program temperatury, gaz nośny oraz inne warunki dla analizy triglicerydów.

Program temperatury: wstępną temperaturę kolumny 210 °C utrzymywać przez jedną minutę, następnie zaprogramować na 6 °C/min do 350 °C oraz utrzymywać w końcowej temperaturze przez pięć minut.

Temperatura detektora oraz iniektora: odpowiednio 370 °C.

Uwaga:

Temperatury (temperatura wstępna) detektora, iniektora oraz pieca powinny być utrzymywane na stałym poziomie (również w nocy, podczas weekendów oraz świąt).

Gaz nośny: azot, prędkość przepływu 40 ml/min.

Uwaga:

W przypadku wykorzystywania kolumn 80 cm przepływ musi wynosić co najmniej 75 ml/min N2. Przepływ gazu nośnego musi być stale utrzymywany (również w nocy, podczas weekendów oraz świąt). Dokładna wielkość przepływu gazu nośnego powinna być dostosowana w taki sposób, aby niezależnie od długości kolumny C54 był eluowany w temperaturze 341 °C.

Czas trwania analizy: 29,3 minuty.

Objętość iniekcji: 0,5 μl.

Uwaga:

Strzykawka musi być kilkakrotnie płukana czystym heptanem po każdej iniekcji.

Warunki FID: zgodnie z ppkt 5.1.

Uwaga:

Detektor jonizacji płomieniowej jest zapalany, odpowiednio, na początku każdego dnia roboczego.

7. Całkowanie, ocena oraz kontrola warunków pomiarowych

Triglicerydy o nieparzystej liczbie acyl-c (2n + 1) są łączone z poprzednimi triglicerydami o liczbie parzystej (2n). Mniej odtwarzalne, o niskich zawartościach C56 nie są uwzględniane. Pozostałe triglicerydy (powierzchnia pików) na chromatogramie włącznie z cholesterolem (pik bliski C24) są mnożone przez odpowiednie współczynniki odpowiedzi wzorcowego tłuszczu (ostatnia kalibracja) oraz wspólnie znormalizowane do 100. Obok wolnego cholesterolu, tym samym, oceniane są triglicerydy C24, C26, C28, C30, C32, C34, C36, C38, C40, C42, C44, C46, C48, C50, C52 oraz C54. Wyniki podawane są w % wagowych (g/100 g).

Ocena pików chromatogramu powinna zostać sporządzona przy użyciu integratora, za pomocą którego wykreślona może zostać linia podstawowa. Powinno być możliwe ponowne całkowanie przy zoptymalizowanych parametrach całkowania

Rysunki 5 i 6 przedstawiają dwa przykłady chromatogramów triglicerydów. Rysunek 5 przedstawia chromatogram, który może zostać dobrze oceniony, podczas gdy rysunek 6 przedstawia błąd przypadkowy w zakresie od C50 do C54 oraz linię podstawową przebiegającą w sposób niepoprawny w porównaniu z linią podstawową przedstawioną na rysunku 5. Takie typowe błędy mogą być z dużym stopniem pewności wykryte i można ich uniknąć jedynie poprzez użycie integratora, za pomocą którego wykreślona jest linia podstawowa.

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

Do celów kontrolowania warunków pomiarowych można stosować względne odchylenia standardowe (RSD) (RSD: współczynnik zmienności × 100) podane w tabeli 1 dla różnych triglicerydów. Zostały one obliczone na podstawie 19 kolejnych analiz tego samego tłuszczu mleka:

Tabela 1

Względne odchylenia standardowe (RSD) zawartości triglicerydów (n=19)

Trigliceryd | RSD (%) |

C24 | 10,00 |

C26 | 2,69 |

C28 | 3,03 |

C30 | 1,76 |

C32 | 1,03 |

C34 | 0,79 |

C36 | 0,25 |

C38 | 0,42 |

C40 | 0,20 |

C42 | 0,26 |

C44 | 0,34 |

C46 | 0,37 |

C48 | 0,53 |

C50 | 0,38 |

C52 | 0,54 |

C54 | 0,60 |

Przy RSD znacznie wyższych niż wartości podane w tabeli 1 chromatogramy są niewłaściwe i muszą zostać sprawdzone membrany oraz prędkość przepływu gazu. Ponadto niewielkie cząsteczki membrany mogły utworzyć osady na wacie szklanej przy wejściu do kolumny lub kolumna nie nadaje się już do użytku w wyniku zestarzenia się, oddziaływania temperatury itd. (patrz rysunek 3).

Uwaga

Wartości podane w tabeli 1 nie są obowiązkowe, lecz jedynie orientacyjne do celów kontroli jakości. Jednakże w przypadku, gdy wyższe wartości RSD są dopuszczalne, wartości graniczne powtarzalności i odtwarzalności wskazane w pkt 11 muszą być mimo wszystko przestrzegane.

8. Jakościowe wykrywanie tłuszczu obcego

Do celów wykrywania tłuszczów obcych opracowane zostały wzory triglicerydowe (tabela 2) z wartościami granicznymi S (tabela 3), gdzie wartości S czystych tłuszczów mleka mogą ulegać wahaniom. W przypadku gdy te wartości graniczne zostają przekroczone, można przyjąć obecność tłuszczu obcego.

Najbardziej czułym wzorem służącym do wykrywania dodatku smalcu jest np.:

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S

Uwaga

Przy wykorzystaniu 755 różnych próbek tłuszczu mleka uzyskano 99-procentowy przedział ufności S = 97,96 - 102,04 w odniesieniu do próbek czystego tłuszczu mleka przy odchyleniu standardowym wszystkich wartości S wynoszącym SD = 0,39897.

Rozpoczynając od oznaczania składu triglicerydów próbki nieznanego tłuszczu, zastosowanie takiego wzoru umożliwia, bez konieczności użycia komputera, przeprowadzenie w prosty sposób weryfikacji, czy suma zawartości triglicerydów przedstawiona tutaj wraz z odpowiadającymi współczynnikami mieści się poza zakresem 97,96-102,04 i czy mamy najprawdopodobniej do czynienia z dodatkiem tłuszczu obcego.

Do celów wykrywania różnych tłuszczów obcych w tabeli 2 przedstawione są różne wzory triglicerydowe. Wspólny wzór może zostać odpowiednio wykorzystywany do celów wykrywania tłuszczów obcych, takich jak olej sojowy, olej słonecznikowy, oliwa z oliwek, olej z nasion rzepaku, olej z siemienia lnianego, olej z kiełków pszenicy, olej z kiełków kukurydzy, olej z nasion bawełny oraz uwodorniony olej z ryb, dla tłuszczów roślinnych, tłuszczu kokosowego oraz tłuszczu z ziaren palmowych, jak również dla oleju palmowego oraz łoju wołowego.

Z uwagi na to, że skład triglicerydów tłuszczów obcych również podlega wahaniom, wykorzystano dane tego samego typu, zmierzone doświadczalnie, odnoszące się do czterech różnych triglicerydów tłuszczu obcego (Przy tych samych rodzajach tłuszczu obcego uwzględniono odpowiednio najmniej korzystną wartość graniczną (patrz tabela 4)).

Za pomocą następującego "wzoru całkowitego" podobnie dobre wyniki mogą zostać uzyskane dla wszystkich tłuszczów obcych:

- 2,7575 · C26 + 6,4077 · C28 + 5,5437 · C30 - 15,3247 · C32 + 6,2600 · C34 + 8,0108 · C40 - 5,0336 · C42 + 0,6356 · C44 + 6,0171 · C46 = S

Obliczenia przeprowadzone w celu wykrycia jakiejkolwiek kombinacji tłuszczów obcych w tłuszczu mleka wykazały, że np. w odniesieniu do jakiegokolwiek wzoru dla smalcu, podanego w tabeli 2, wartość graniczna dla tego tłuszczu obcego jest niska, a mianowicie 2,7 %, to inne tłuszcze, takie jak tłuszcz kokosowy, olej palmowy bądź tłuszcz z ziaren palmowych, o wartościach granicznych wykrywalności wynoszących odpowiednio 26,8 %, 12,5 % oraz 19,3 %, mogą, za pomocą tego wzoru, zostać wykryte wyłącznie w przypadku, gdy do tłuszczu mlekowego została dodana ich wyjątkowo duża ilość. Stosuje się to również do pozostałych wzorów podanych w tabeli 2.

Tabela 2

Wzory triglicerydowe służące do wykrywania różnych tłuszczów obcych w tłuszczu mleka, wskazujących odchylenia standardowe SD dla S

Wzór dla oleju sojowego, słonecznikowego, z oliwek, z nasion rzepaku, siemienia lnianego, z kiełków pszenicy, z kiełków kukurydzy, z nasion bawełny oraz oleju rybiego

2,0983 · C30 + 0,7288 · C34 + 0,6927 · C36 + 0,6353 · C38 + 3,7452 · C40 - 1,2929 · C42 + 1,3544 · C44 + 1,7013 · C46 + 2,5283 · C50 = S; SD = 0,38157

Wzór dla tłuszczu kokosowego oraz tłuszczu z ziaren palmowych

3,7453 · C32 + 1,1134 · C36 + 1,3648 · C38 + 2,1544 · C42 + 0,4273 · C44 + 0,5809 · C46 + 1,1226 · C48 + 1,0306 · C50 + 0,9953 · C52 + 1,2396 · C54 = S; SD = 0,11323

Wzór dla oleju palmowego oraz dla łoju wołowego

3,6644 · C28 + 5,2297 · C30 - 12,5073 · C32 + 4,4285 · C34 - 0,2010 · C36 + 1,2791 · C38 + 6,7433 · C40 - 4,2714 · C42 + 6,3739 · C46 = S; SD = 0,81094

Wzór dla smalcu

6,5125 · C26 + 1,2052 · C32 + 1,7336 · C34 + 1,7557 · C36 + 2,2325 · C42 + 2,8006 · C46 + 2,5432 · C52 + 0,9892 · C54 = S; SD = 0,39897

Dlatego dla sprawdzenia nieznanej próbki tłuszczu użyte muszą zostać wszystkie wzory podane w tabeli 2 oraz wzór ogólny (2), w przypadku gdy prawdopodobne jest to, że próbka stanowi mieszankę tłuszczu mleka oraz jednego z 14 różnych tłuszczów obcych lub połączenie takich tłuszczów obcych. W przypadku gdy poprzez wprowadzanie triglicerydu próbki tłuszczu, która ma zostać poddana analizie, otrzymuje się taką wartość S, która nie mieści się w zakresach podanych w tabeli 3 wyłącznie dla jednej z pięciu wzorów, wówczas próbka stanowi najprawdopodobniej zmodyfikowany tłuszcz mleka. Wykrycie obcego tłuszczu w tłuszczu mleka za pomocą jednego z czterech wzorów podanych w tabeli 2 nie pozwala na wyciągnięcie wniosków co do rodzaju domieszki tłuszczu obcego.

Tabela 3

Wartości graniczne S dla tłuszczów mleka

Wzór służący do wykrywania: | Zakres S |

Oleju sojowego, słonecznikowego, z oliwek, z nasion rzepaku, z siemienia lnianego, z kiełków pszenicy, z kiełków kukurydzy, bawełnianego, z ryb | 98,05-101,95 |

Tłuszczu kokosowego oraz tłuszczu z ziaren palmowych | 99,42-100, 58 |

Oleju palmowego oraz łoju wołowego | 95,90-104,10 |

Smalcu | 97,96-102,04 |

Wzór ogólny | 95,68-104, 32 |

W tabeli 4 podane są wartości graniczne wykrywalności różnych tłuszczów obcych przy ufności 99 %. W kolumnie pierwszej przedstawione są minimalne wartości graniczne wykrywalności dla najlepszego wzoru tłuszczu mleka w tabeli 2. W kolumnie drugiej przedstawione są wartości graniczne wykrywalności dla wzoru ogólnego. Jakkolwiek te wartości graniczne są nieco wyższe, wyłącznie ten wzór konieczny jest do wykrycia nieco większych ilości tłuszczów obcych. Za pomocą wszystkich wzorów również połączenia różnych tłuszczów obcych mogą zostać wykryte. Zakresy wahań triglicerydów różnych tłuszczów obcych jednego rodzaju nie mają znaczącego wpływu na wartości graniczne wykrywalności.

Tabela 4

99 % wartości graniczne wykrywalności poprzez dodanie tłuszczu obcego do tłuszczu mleka w %

| Wzór indywidualny | Wzór ogólny |

Olej sojowy | 2,1 | 4,4 |

Olej słonecznikowy | 2,3 | 4,8 |

Oliwa z oliwek | 2,4 | 4,7 |

Tłuszcz kokosowy | 3,5 | 4,3 |

Olej palmowy | 4,4 | 4,7 |

Olej z ziaren palmowych | 4,6 | 5,9 |

Olej z nasion rzepaku | 2,0 | 4,4 |

Olej z siemienia lnianego | 2,0 | 4,0 |

Olej z kiełków pszenicy | 2,7 | 6,4 |

Olej z kiełków kukurydzy | 2,2 | 4,5 |

Olej z nasion bawełny | 3,3 | 4,4 |

Smalec | 2,7 | 4,7 |

Łój wołowy | 5,2 | 5,4 |

Uwodorniony olej rybi | 5,4 | 6,1 |

Uwaga

Zakresy S oblicza się w taki sposób, że przyjmuje się jedynie występowanie tłuszczu obcego, jeżeli wartości graniczne wzoru indywidualnego są przekroczone (patrz tabela 4).

9. Ilościowe oznaczanie tłuszczów obcych

W celu uzyskania informacji ilościowej na temat stężenia tłuszczu obcego w próbce tłuszczu mleka stosuje się poniższy wzór:

X

=

100 - S

,

gdzie X stanowi ilość nieznanego tłuszczu obcego bądź mieszanki tłuszczów obcych w nieznanym tłuszczu mleka. S wynika z dodania nieznanego tłuszczu obcego poprzez wprowadzenie triglicerydów tłuszczu obcego/mieszanki tłuszczu mleka do powyższego ogólnego wzoru triglicerydowego. W przypadku gdy nieznany tłuszcz obcy jest dodany do tłuszczu mleka wartość S dotycząca różnych tłuszczów obcych dla wzoru ogólnego jest wybierana dla SF; ta średnia wartość S jest uzyskiwana przez wprowadzenie danych dotyczących triglicerydów czystych tłuszczów obcych do tego wzoru oraz przez obliczenie wartości średniej (SF = 7,46). Dobre wyniki ilościowe dotyczące wszelkich dodatków tłuszczów obcych są uzyskiwane również przy wykorzystaniu wzoru dla oleju palmowego/łoju wołowego (tabela 2) oraz średniej wartości SF wynoszącej 10,57.

W przypadku znanych rodzajów tłuszczów obcych do powyższego wzoru wprowadzone muszą zostać następujące wartości SF oraz wybrany musi zostać odpowiedniwzór tłuszczu obcego z tabeli 2:

Tabela 5

Wartości SF różnych tłuszczów obcych

Tłuszcz obcy | SF |

Olej sojowy | 8,18 |

Olej słonecznikowy | 9,43 |

Oliwa z oliwek | 12,75 |

Tłuszcz kokosowy | 118,13 |

Olej palmowy | 7,55 |

Olej z ziaren palmowych | 112,32 |

Olej z nasion rzepaku | 3,30 |

Olej z siemienia lnianego | 4,44 |

Olej z kiełków pszenicy | 27,45 |

Olej z kiełków kukurydzy | 9,29 |

Olej z nasion bawełny | 41,18 |

Smalec | 177,55 |

Łój wołowy | 17,56 |

Olej rybi | 64,12 |

10. Zakres stosowania metody wykrywania

Omawiana metoda ma zastosowanie do mleka ze zbiornika i oparta jest na reprezentatywności próbek tłuszczu mleka.

Wysoce precyzyjne wykrywanie byłoby możliwe, gdyby z uwagi na reprezentatywną liczbę tłuszczów mleka omówione powyżej wzory zostały wyprowadzone w odniesieniu do różnych państw.

Szczególnie dobrze dostosowane możliwości wykrywania mogłyby zostać uzyskane, gdyby w różnych państwach wzory, zgodne z przedstawionym opisem, zostały utworzone z reprezentatywnej liczby tłuszczów mlekowych. W tym przypadku wykorzystywanie złożonych programów komputerowych nie jest wymagane, jeżeli zastosowane są połączenia triglicerydów użyte w tabeli 2, a współczynniki zostają ponownie oznaczone metodą najmniejszych kwadratów.

Poprzez stosowanie zakresów S przedstawionych w tabeli 3 wzory stają się ogólnie stosowalne, w ramach szczególnych warunków żywienia, jak na przykład, niedożywienia krów bądź żywienia krów drożdżami paszowymi lub kostkami wapiennymi. Wyłącznie w przypadku ekstremalnych warunków żywienia (wysokiego wychwytu czystych olejów paszowych, intensywne podawanie kostek wapiennych w połączeniu z tłuszczem paszowym etc.) wzory wskazują częściowo zmodyfikowany tłuszcz mleka.

Uwaga:

Frakcjonowane tłuszcze mleka są generalnie uznawane za niezmodyfikowane tłuszcze mleka, jeżeli modyfikacja jest zakładana jedynie w przypadku, gdy wartości graniczne są przekroczone. Wyłącznie w przypadku frakcjonowanych tłuszczów mleka o niezwyczajnym składzie tłuszczu mleka, jak to ma miejsce w przypadku na przykład frakcji twardej, uzyskiwanych przez frakcjonowanie za pomocą metod fizycznych w wysokich temperaturach wynoszących w przybliżeniu 30 °C, przy niskich wielkościach wynoszących kilka procent lub przez frakcjonowanie o ponad krytyczną wielkość CO2, wzory wskazują na modyfikację.

Frakcjonowanie tłuszczu mlekowego może być jednakże wykryte przy wykorzystaniu innych procedur, np. kalorymetrii skaningowej różnicowej.

11. Dokładność metody

Oznaczona przy wykorzystaniu tłuszczu mleka w oparciu o wzory przedstawione w tabeli 2 oraz zakresy S przedstawione w tabeli 3.

11.1. Powtarzalność

Różnica między wartościami S uzyskanymi w dwóch oznaczeniach przeprowadzonych w możliwie najkrótszym odstępie czasu przez ten sam podmiot zgodnie z tą samą procedurą, na identycznym materiale próbki, w takich samych warunkach (ta sama osoba, te same narzędzia/to samo urządzenie, to samo laboratorium):

Tabela 6

Wartości graniczne powtarzalności (r) dla różnych wzorów

Wzór służący do wykrywania: | r |

Oleju sojowego, słonecznikowego, z oliwek, z ziaren rzepaku, z siemienia lnianego, z kiełków pszenicy, z kiełków kukurydzy, z nasion bawełny, z ryb. | 0,67 |

Tłuszczu kokosowego oraz z ziaren palmowych | 0,12 |

Oleju palmowego oraz łoju wołowego | 1,20 |

Smalcu | 0,58 |

Wzór ogólny | 1,49 |

11.2. Odtwarzalność

Różnica między wartościami S uzyskanymi w dwóch oznaczeniach przeprowadzonych przez podmioty w różnych laboratoriach, zgodnie z tą samą procedurą z wykorzystaniem identycznego materiału próbki, w różnych warunkach (inna osoba, inne przyrządy) w różnym czasie.

Tabela 7

Wartości graniczne odtwarzalności (R) dla różnych wzorów

Wzór służący do wykrywania: | R |

Oleju sojowego, słonecznikowego, z oliwek, z ziaren rzepaku, z siemienia lnianego, z kiełków pszenicy, z kiełków kukurydzy, z nasion bawełny, z ryb | 1,08 |

Tłuszczu kokosowego oraz tłuszczu z ziaren palmowych | 0,40 |

Oleju palmowego oraz łoju wołowego | 1,81 |

Smalcu | 0,60 |

Wzór ogólny | 2,07 |

11.3. Różnica krytyczna

Przy znanych wartościach granicznych powtarzalności (r) oraz odtwarzalności (R) różnice krytyczne dla wszystkich zakresów S z tabeli 3 mogą zostać obliczone (podwójne analizy). Odpowiednie wartości są przedstawione w tabeli 8.

Tabela 8

Różnice krytyczne dla wszystkich wzorów triglicerydowych

Wzór służący do wykrywania | Zakres |

Oleju sojowego, słonecznikowego, z oliwek, z ziaren rzepaku, z siemienia lnianego, z kiełków pszenicy, z kiełków kukurydzy, z nasion bawełny, z ryb | 97,43-102,57 |

Tłuszczu kokosowego oraz z ziaren palmowych | 99,14-100,86 |

Oleju palmowego oraz łoju wołowego | 94,91-105,09 |

Smalcu | 97,65-102,35 |

Wzór ogólny | 94,58-105,42 |

11.4. Dopuszczalność wyników

Wszystkie skalibrowane, o wartości wyliczonej w zaokrągleniu do dwóch miejsc po przecinku, zawartości triglicerydów C24, C26, C28 do C54, jak również cholesterolu, muszą być dokładnie znormalizowane do 100.

Wyniki podwójnej analizy są wykorzystywane jako sprawdzenie powtarzalności. W przypadku gdy różnica bezwzględna między dwoma wynikami S dla wszystkich pięciu wzorów triglicerydowych nie przekracza wartości granicznych powtarzalności r przedstawionych w tabeli 6, wymóg powtarzalności jest spełniony.

Do celów kontroli optymalnych warunków chromatografii gazowej oraz, szczególnie, jakości kolumny zagwarantowane powinno zostać to, że przy 10 powtarzających się seriach różnica między maksymalnymi a minimalnymi wartościami S we wszystkich pięciu wzorach triglicerydowych nie przekracza zakresu x · r, przy x = 1,58 (dla 10 serii, patrz bibliografia (16)), oraz wartości granicznych powtarzalności r dla różnych wzorów przedstawionych w tabeli 6.

12. Powołane normy

DIN 10 336: 1994 | Nachweis oraz Bestimmung von Fremdfetten in Milchfett anhand einer gaschromatographischen Triglyceridanalyse |

Norma IDF 1 C: 1987 | Milk. Determination of Fat Content — Rose Gottlieb Gravimetric Method |

Norma IDF 16C: 1987 | Cream. Determination of Fat Content — Rose Gottlieb Gravimetric Method |

Norma IDF 116A: 1987 | Milk – Based Edible Ices and Ice Mixes. Determination of Fat Content — Rose Gottlieb Gravimetric Method |

Norma IDF 22B: 1987 | Skimmed Milk, Whey & Buttermilk. Determination of Fat Content — Rose Gottlieb Gravimetric Method. |

13. Bibliografia

1. Komisja Wspólnot Europejskich: Detection of foreign fats in milk fat by means of gas chromatographic triglyceride analysis, Doc. No VI/5202/90-EN, VI/2645/91.

2. Komisja Wspólnot Europejskich: Control of butter fat purity of 100 different samples of different feeding periods from 11 EEC countries; Doc. No VI/4577/93.

3. Komisja Wspólnot Europejskich: Consideration of results from the first, second, third, fourth, fifth and sixth EWG collaborative trial: Determination of triglycerides in milk fat; Doc. No VI/2644/91, VI/8.11.91, VI/1919/92, VI/3842/92, VI/5317/92, VI/4604/93.

4. Timms, R. E.: Detection and quantification of non-milk fat in mixtures of milk and non-milk fats. Dairy Research 47 295-303 (1980).

5. Precht, D., Heine, K.: Nachweis von modifiziertem Milchfett mit der Triglyceridanalyse. 2. Fremdfettnachweis im Milchfett mit Hilfe von Triglyceridkombinationen, 41 406-410 (1986).

6. Luf, W., Stock, A., Brandl, E.: Zum Nachweis von Fremdfett in Milchfett über die Trigylceridanalyse. Österr. Milchwirtsch. Wissensch. Beilage 5, 42 29-35 (1987).

7. Precht, D.: Bestimmung von pflanzlichen Fetten oder tierischen Depotfetten in Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 143-157 (1989).

8. Precht, D.: Schnelle Extraktion von Milchfett, Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 119-128 (1990).

9. Precht, D.: Schnelle gaschromatographische Triglyceridanalyse von Milchfett. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 42 139-154 (1990).

10. Precht, D.: Control of milk fat purity by gas chromatographic triglyceride analysis. Kieler Milchwirtsch. Forschungsber. 43 (3) 219-242 (1991).

11. Precht, D.: Detection of adulterated milk fat by fatty acid and triglyceride analysis. Fat Sci. Technol. 93 538-544 (1991).

12. Precht, D.: Detection for foreign fat in milk fat. I. Qualitative detection by triacylglycerol formulae. II. Quantitative evaluation of foreign fat mixtures. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 194 1-8, 107-114 (1992).

13. Precht, D.: Gas chromatography of triacylglycerols and other lipids on packed columns in CRC Handbook of Chromatography: Analysis of lipids, p. 123-138, Ed. K.D. Mukherjee, N. Weber, J. Sherma, CRC Press, Boca Raton (1993).

14. Precht, D., Molkentin, J.: Quantitative triglyceride analysis using short capillary columns, Chrompack News 4 16-17 (1993).

15. Molkentin, J., Precht, D.: Comparison of packed and capillary columns for quantitative gas chromatography of triglycerides in milk fat. Chromatographia 39 (5/6) 265-270 (1994).

16. Stange, K.: Angewandte Statistik, Erster Teil, Eindimensionale Probleme, Springer - Verlag, Berlin, P. 378 (1970).

[1] Opisano już stosowne metody, patrz D. Precht and J. Molkentin: Quantative triglyceride analysis using short capillary columns (Ilościowa analiza triglicerydów przy zastosowaniu krótkich kolumn kapilarnych), Chrompack News 4 z 16–17 (1993).

[2] Odpowiednie produkty są dostępne w handlu.

[3] Nazwy handlowe, takie jak np. Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack, stanowią przykłady odpowiednich produktów dostępnych w wyspecjalizowanym handlu. Informacja ta przedstawiona jest w celu umożliwienia łatwego posługiwania się wzorcem przez użytkownika, a nie stanowi żądania nabycia produktu. Wskazanie grubości ziarna zostało zamienione na μm będący jednostką SI, zgodnie z BS 410:1988 ("Wykaz brytyjskich norm dla Standardu dla sit testowych").

[4] Nazwy handlowe, takie jak np. Extrelut, Gas ChromQ, Chrompack, stanowią przykłady odpowiednich produktów dostępnych w wyspecjalizowanym handlu. Informacja ta przedstawiona jest w celu umożliwienia łatwego posługiwania się wzorcem przez użytkownika, a nie stanowi żądania nabycia produktu. Wskazanie grubości ziarna zostało zamienione na μm będący jednostką SI, zgodnie z BS 410:1988 ("Wykaz brytyjskich norm w odniesieniu do standardu dla sit testowych").

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK XXVI

WYKAZ ROZPORZĄDZEŃ, DO KTÓRYCH NASTĘPUJE ODNIESIENIE W PIERWSZYM USTĘPIE PREAMBUŁY

- rozporządzenie Komisji (EWG) nr 1216/68 z dnia 9 sierpnia 1968 r. ustanawiające metodę oznaczania zawartości laktozy w zwierzęcych mieszankach paszowych przywożonych z państw trzecich [1], zmienione rozporządzeniem Komisji (EWG) nr 222/88 z dnia 22 grudnia 1987 r. zmieniające niektóre środki w sprawie stosowania wspólnej organizacji rynku w sektorze mleka i przetworów mlecznych w następstwie wprowadzenia Nomenklatury Scalonej [2];

- rozporządzenie Komisji (WE) nr 3942/92 z dnia 22 grudnia 1992 r. ustanawiające metodę referencyjną oznaczania sitosterolu i stigmasterolu w bezwodnym tłuszczu mleka [3], ostatnio zmienione rozporządzeniem Komisji (WE) nr 175/1999 zmieniającym rozporządzenia (EWG) nr 3942/92, (WE) nr 86/94, (WE) 1082/96 i (WE) nr 1459/98 ustanawiające metodę referencyjną oznaczania niektórych znaczników w maśle, bezwodnym tłuszczu mlecznym i śmietanie [4];

- rozporządzenie Komisji (WE) nr 86/94 z dnia 19 stycznia 1994 r. ustanawiające metodę referencyjną oznaczania sitisterolu i stigmasterolu w maśle [5], zmienione rozporządzeniem (WE) nr 175/1999;

- rozporządzenie Komisji (WE) nr 2721/95 z dnia 24 listopada 1995 r. ustanawiające zasady stosowania metod referencyjnych i rutynowych analizy i oceny jakości mleka oraz przetworów mlecznych w ramach wspólnej organizacji rynku [6];

- rozporządzenie Komisji (WE) nr 1080/96 z dnia 14 czerwca 1996 r. ustanawiające metodę referencyjną wykrywania form bakterii coli w maśle, odtłuszczonym mleku w proszku i kazeinie/kazeinianach [7];

- rozporządzenie Komisji (WE) nr 1081/96 z dnia 14 czerwca 1996 r. ustanawiające metodę referencyjną wykrywania mleka krowiego i kazeiny w serach wyprodukowanych z mleka owczego, mleka koziego lub mleka bawolego lub mieszanki mleka owczego, koziego i bawolego i uchylające rozporządzenie (EWG) nr 690/92 [8];

- rozporządzenie Rady (WE) nr 1082/96 z dnia 14 czerwca 1996 r. ustanawiające referencyjną metodę oznaczania zawartości estru etylowego kwasu beta-apo-8' karotenowego w koncentracie masła oraz w maśle [9], zmienione rozporządzeniem (WE) nr 175/1999;

- rozporządzenie Komisji (WE) nr 1854/96 z dnia 26 września 1996 r. ustanawiające wykaz metod referencyjnych stosowanych do celów analizy i oceny jakości mleka i przetworów mlecznych w ramach organizacji wspólnego rynku [10], zmienione rozporządzeniem (WE) nr 881/1999 [11];

- rozporządzenie Komisji (WE) nr 880/98 z dnia 24 kwietnia 1998 r. ustanawiające referencyjne metody oznaczania zawartości wody, suchej masy beztłuszczowej i tłuszczu w maśle [12];

- rozporządzenie Komisji (WE) nr 1459/98 z dnia 8 lipca 1998 r. ustanawiające referencyjną metodę oznaczania waniliny w koncentracie masła, maśle lub śmietanie [13] zmienione rozporządzeniem (WE) nr 175/1999.

[1] Dz.U. L 160 z 26.6.1999, str. 48.

[2] Dz.U. L 333 z 24.12.1999, str. 11.

[3] Dz.U. L 340 z 31.12.1999, str. 3.

[4] Dz.U. L 350 z 20.12.1997, str. 3.

[5] Dz.U. L 76 z 25.3.2000, str. 9.

[6] Dz.U. L 298 z 12.11.1985, str. 9.

[7] Dz.U. L 11 z 16.1.1999, str. 14.

[8] Dz.U. L 45 z 21.2.1990, str. 8.

[9] Dz.U. L 16 z 21.1.1999, str. 19.

[10] Dz.U. L 279 z 11.10.1990, str. 22.

[11] Dz.U. L 325 z 17.12.1999, str. 10.

[12] Dz.U. L 256 z 7.9.1987, str. 1.

[13] Dz.U. L 28 z 3.2.2000, str. 16.

--------------------------------------------------