EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32019R1390

Kommissionens förordning (EU) 2019/1390 av den 31 juli 2019 om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (Text av betydelse för EES)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

SV

Europeiska unionens officiella tidning

L 247/1


KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EU) 2019/1390

av den 31 juli 2019

om ändring, för anpassning till den tekniska utvecklingen, av bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach)

(Text av betydelse för EES)

EUROPEISKA KOMMISSIONEN HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING

med beaktande av fördraget om Europeiska unionens funktionssätt,

med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 av den 18 december 2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach), inrättande av en europeisk kemikaliemyndighet, ändring av direktiv 1999/45/EG och upphävande av rådets förordning (EEG) nr 793/93 och kommissionens förordning (EG) nr 1488/94 samt rådets direktiv 76/769/EEG och kommissionens direktiv 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG och 2000/21/EG (1), särskilt artikel 13.2, och

av följande skäl:

(1)

I kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 (2) fastställs testmetoder som ska användas för tillämpning av förordning (EG) nr 1907/2006 när det gäller bestämning av kemikaliers fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet.

(2)

Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) utvecklar harmoniserade och internationellt överenskomna testriktlinjer för testning av kemikalier för tillsynsändamål. OECD utfärdar regelbundet nya och reviderade testriktlinjer som tar hänsyn till den vetenskapliga utvecklingen inom området.

(3)

För att ta hänsyn till den tekniska utvecklingen och, när så är möjligt, minska antalet djur som används för djurförsök i enlighet med artikel 13.2 i förordning (EG) nr 1907/2006 bör, efter det att relevanta testriktlinjer från OECD har antagits, två nya testmetoder för bedömning av ekotoxicitet och nio nya testmetoder för bestämning av toxicitet för människors hälsa fastställas och sju testmetoder uppdateras. Elva av dessa testmetoder gäller in vitro-tester avseende irritation/korrosion av hud och ögon, hudsensibilisering, genotoxicitet och endokrina verkningar. Berörda parter har rådfrågats angående den föreslagna ändringen.

(4)

Förordning (EG) nr 440/2008 bör därför ändras i enlighet med detta.

(5)

De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från den kommitté som inrättats enligt artikel 133 i förordning (EG) nr 1907/2006.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras i enlighet med bilagan till den här förordningen.

Artikel 2

Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning.

Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater.

Utfärdad i Bryssel den 31 juli 2019.

På kommissionens vägnar

Jean-Claude JUNCKER

Ordförande


(1)  EUT L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Kommissionens förordning (EG) nr 440/2008 av den 30 maj 2008 om testmetoder enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1907/2006 om registrering, utvärdering, godkännande och begränsning av kemikalier (Reach) (EUT L 142, 31.5.2008, s. 1).


BILAGA

Bilagan till förordning (EG) nr 440/2008 ska ändras på följande sätt:

1)

I del B ska kapitel B.4 ersättas med följande:

”B.4   AKUT HUDIRRITATION/HUDKORROSION

INLEDNING

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 404 (2015). OECD:s riktlinjer för kemikalietestning ses över med jämna mellanrum för att säkerställa att de återspeglar bästa tillgängliga vetenskap. Under omarbetningen av OECD TG 404 lades särskild vikt vid möjliga förbättringar avseende djurskydd och vid utvärderingen av all tillgänglig information om testkemikalier för att undvika onödiga djurförsök. Den uppdaterade versionen av OECD TG 404 (antagen för första gången 1981 och omarbetad 1992, 2002 och 2015) innehåller referenser till vägledningsdokumentet om ett integrerat synsätt på testning och bedömning (IATA) av hudirritation/hudkorrosion (1) och ett förslag på moduler för testning av hudirritation och hudkorrosion. I vägledningsdokumentet om IATA beskrivs flera moduler som grupperar olika informationskällor och analysverktyg, och där ges också i) vägledning om hur tillgängliga testdata och icke testdata kan integreras och användas i bedömningen av kemikaliers potential för hudirritation och hudkorrosion, och ii) förslag på hur man ska gå till väga när det krävs ytterligare testning (1). I riktlinjen rekommenderas också att de tre testkompresserna, när så krävs, appliceras på djuret i följd, i stället för samtidigt, vid det inledande in vivo-testet.

2.

Definitioner av hudirritation och hudkorrosion finns i tillägget till den här testmetoden.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

3.

För en sund vetenskap och för djurs välbefinnande bör in vivo-testning inte utföras förrän alla relevanta data för den potentiella hudkorrosionen/hudirritationen orsakad av testkemikalien har utvärderats i en sammanvägd bedömning (weight of evidence) i enlighet med vägledningsdokumentet om ett integrerat synsätt på testning och bedömning (IATA) av hudkorrosion och hudirritation, dvs. i enlighet med dokumentets tre delar och deras respektive moduler (1). I del 1 ges en presentation av tillgängliga data i sju moduler som omfattar humandata, in vivo-data, in vitro-data, data om fysikalisk-kemiska egenskaper (t.ex. pH, särskilt starkt surt eller alkaliskt) samt metoder som inte innebär testning. I del 2 utförs en WoE-analys. Om WoE-analysen inte ger något entydigt resultat ska del 3 genomföras med kompletterande testning, först med in vitro-metoder och sedan med in vivo-testning som en sista utväg. Genom analysen bör man kunna minska behovet av in vivo-testning med avseende på hudkorrosion/hudirritation av sådana testkemikalier för vilka det redan finns tillräckliga belägg från andra undersökningar för dessa två endpoints.

PRINCIP FÖR IN VIVO-TESTET

4.

Testkemikalien appliceras som en engångsdos på försöksdjurets hud. Djurets obehandlade hudområden används som kontroll. Graden av irritation/korrosion granskas och poängsätts med specificerade intervall, och beskrivs närmare så att en fullständig utvärdering av effekterna erhålls. Testet bör pågå tillräckligt länge för att ge möjlighet att utvärdera om de observerade verkningarna är reversibla eller irreversibla.

5.

Djur som uppvisar ihållande tecken på allvarligt lidande och/eller smärta i något skede av testet bör avlivas på ett skonsamt sätt, och detta bör beaktas vid utvärderingen av testkemikalien. Kriterier för att fatta beslut om skonsam avlivning av döende eller allvarligt lidande djur finns i ett separat vägledningsdokument (2).

FÖRBEREDELSER FÖR IN VIVO-TESTET

Val av djurart

6.

Rekommenderat försöksdjur är albinokanin. Friska yngre adulta exemplar bör användas. Om andra arter används bör detta motiveras.

Förberedelse av djuren

7.

Cirka 24 timmar före testet bör djurens päls avlägsnas genom kortklippning av flankens ryggsida. Varsamhet bör iakttas för att inte repa huden, och endast djur med frisk och intakt hud bör användas.

8.

Kaniner av vissa stammar har områden med särskilt tät päls som är mer framträdande under vissa tider på året. Sådana områden bör inte användas för testning.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

9.

Djuren ska inhysas individuellt. Temperaturen i försöksdjurens utrymmen bör vara 20 °C (± 3 °C) för kaniner. Den relativa fuktigheten bör vara minst 30 % och helst inte överstiga 70 %, utom när rummet rengörs då målet bör vara 50–60 %. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. Konventionellt laboratoriefoder kan användas för utfodringen, och djuren bör ha obegränsad tillgång till dricksvatten.

TESTNINGSFÖRFARANDE

Applicering av testkemikalien

10.

Testkemikalien appliceras på en liten yta (cirka 6 cm2) av huden och täcks med en kompress som hålls på plats med ett icke-irriterande häftförband. Om det inte är möjligt att applicera testkemikalien direkt (exempelvis vätskor eller vissa pastor) bör den först appliceras på kompressen, som därefter placeras på huden. Kompressen ska under exponeringsperioden hållas i lös kontakt med huden med hjälp av ett lämpligt halvocklusivt förband. Om testkemikalien appliceras på kompressen bör denna fästas på huden på ett sätt som säkerställer god kontakt och en jämn fördelning av kemikalien på huden. Man bör se till att djuret inte når kompressen eller kan äta eller andas in testkemikalien.

11.

Flytande testkemikalier används vanligen outspädda. Vid testning av fasta ämnen (som vid behov kan pulveriseras) ska testkemikalien vätas med minsta möjliga mängd vatten (eller vid behov någon annan lämplig vehikel) som behövs för att säkerställa god hudkontakt. Om annan vehikel än vatten används bör vehikelns potentiella inverkan på den hudirritation som testkemikalien framkallar vara minimal eller noll.

12.

I slutet av exponeringsperioden (som i regel varar fyra timmar) ska rester av testkemikalien om möjligt avlägsnas med vatten eller ett lämpligt lösningsmedel, utan att störa befintlig respons eller skada huden.

Doseringsnivå

13.

En dos på 0,5 ml vätska eller 0,5 g fast ämne eller pasta appliceras på huden.

Inledande test (test avseende hudirritation/hudkorrosion in vivo på ett enskilt djur)

14.

Om en testkemikalie bedömts vara frätande eller irriterande eller inte går att klassificera efter en sammanvägd bedömning eller en tidigare in vitro-testning är ytterligare in vivo-testning i regel inte nödvändig. I fall där man bedömer att det krävs ytterligare data ska in vivo-testet utföras först, med användning av ett djur och i enlighet med följande förfarande. Upp till tre testkompresser appliceras sekventiellt på djuret. Den första kompressen tas bort efter tre minuter. Om ingen allvarlig hudreaktion kan observeras appliceras en andra kompress, som i sin tur tas bort efter en timme. Om observationerna i detta skede tyder på att exponeringen kan förlängas till fyra timmar utan lidande för testdjuret, appliceras en tredje kompress, som tas bort efter fyra timmar. Därefter kan responsen graderas.

15.

Om korrosion kan observeras efter någon av de tre sekventiella exponeringarna avslutas testet omedelbart. Om ingen korrosion observeras efter att den sista kompressen har tagits bort, hålls djuret under observation i 14 dagar, utom om korrosion framkallas tidigare.

16.

I fall där testkemikalien inte förväntas framkalla korrosion men där den kan vara irriterande, appliceras en enstaka kompress på ett djur i fyra timmar.

Bekräftande test (in vivo-test avseende hudirritation med ytterligare djur)

17.

Om ingen korrosion observeras vid det inledande testet bör irritationsrespons eller negativ respons bekräftas med hjälp av ytterligare två djur. En kompress appliceras på vardera djuret för en exponeringsperiod på fyra timmar. Om irritation har observerats vid det inledande testet kan det bekräftande testet göras sekventiellt eller genom samtidig exponering av ytterligare två djur. Om inledande test i undantagsfall inte utförs, kan två eller tre djur behandlas med en enskild kompress som tas bort efter fyra timmar. Om två djur används, och samma respons observeras hos båda, behövs ingen ytterligare testning. I annat fall testas även det tredje djuret. Tvetydiga responser kan behöva bedömas med användning av ytterligare djur.

Observationsperiod

18.

Observationsperioden bör vara tillräckligt lång för att man till fullo ska kunna utvärdera om de observerade effekterna är reversibla eller inte. Försöket bör dock avslutas omedelbart om ett djur uppvisar ihållande tecken på svår smärta eller lidande. För utvärderingen av om verkningarna är reversibla bör djuren observeras i upp till 14 dagar efter att kompresserna har tagits bort. Om reversibilitet kan observeras innan 14 dagar har gått kan försöket omedelbart avslutas.

Kliniska observationer och gradering av hudreaktionerna

19.

Alla djur bör undersökas för tecken på hudrodnad och ödem, och den respons som erhållits vid 60 minuter och därefter vid 24, 48 och 72 timmar efter borttagning av kompresserna registreras. Vid inledande test på ett enskilt djur undersöks applikationsstället omedelbart efter att kompressen har tagits bort. Hudreaktionerna graderas och registreras enligt klassificeringsskalan i tabellen nedan. Om det uppkommit en hudskada som efter 72 timmar inte kan identifieras som irritation eller korrosion kan det krävas observationer fram till dag 14 för att avgöra om effekerna är reversibla. Utöver observationerna av irritation bör alla lokala toxiska effekter, t.ex. avfettning av huden, och alla skadliga systemiska effekter (t.ex. kliniska tecken på toxicitet eller effekter på kroppsvikten) till fullo beskrivas och registreras. I fall av tvetydig respons bör en histopatologisk undersökning övervägas i klargörande syfte.

20.

Graderingen av hudresponser är alltid subjektiv. För att underlätta harmonisering i fråga om graderingen av hudresponser och som stöd för testningslaboratorier och för de personer som utför och tolkar observationer, måste den personal som utför observationerna få adekvat utbildning i det poängsättningssystem som används (se tabellen nedan). En illustrerad vägledning för gradering av hudirritation och andra skador kan vara till hjälp (3).

DATA OCH RAPPORTERING

21.

Resultaten bör summeras i tabellform i den slutliga testrapporten, och de bör omfatta alla aspekter som anges i punkt 24.

Utvärdering av resultaten

22.

Graderna av hudirritation bör bedömas med hänsyn till skadornas natur och allvarlighetsgrad samt till om skadorna är reversibla eller irreversibla. Individuella klassificeringsresultat utgör ingen absolut standard för ett materials förmåga att framkalla irritation, eftersom även andra effekter av testmaterialet utvärderas. De enskilda bedömningarna bör däremot ses som referensvärden, som bör utvärderas i kombination med alla andra observationer från undersökningen.

23.

Reversibiliteten hos hudskador bör beaktas när man utvärderar respons med avseende på irriterande egenskaper. Om verkningar av typen alopeci (begränsat område), hyperkeratos, hyperplasi och flagning håller i sig i slutet av den 14 dagar långa observationsperioden, bör testkemikalien betraktas som irriterande.

Testrapport

24.

Testrapporten ska innehålla följande uppgifter:

 

Motivering för in vivo-testning:

Sammanvägd bedömning av redan tillgängliga testdata, inbegripet resultat från strategin med stegvis testning.

Beskrivning av relevanta data som erhållits före testningen.

Data som erhållits från de enskilda stegen i teststrategin.

Beskrivning av utförda in vitro-tester, inklusive uppgifter om förfaranden samt resultat som erhållits med test- och referensämnen.

Sammanvägd bedömning för utförande av in vivo-försök.

 

Testkemikalie:

Monokomponentämne: kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel, renhet samt motsvarande identifiering av föroreningar i förekommande fall och om det är praktiskt möjligt.

Multikomponentämnen, ämnen och blandningar med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter och biologiskt material (UVCB): karakteriseras så långt som möjligt genom beståndsdelarnas kemiska identitet (se ovan), kvantitativa förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

Fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

Ursprung, satsnummer om sådant finns.

Eventuell behandling av testkemikalien/kontrollämnet före testning (t.ex. uppvärmning, malning).

Testkemikaliens stabilitet, sista förbrukningsdatum eller sista datum för upprepad analys, om känt.

Lagringsförhållanden.

 

Vehikel:

Identifieringsdata, koncentration (om tillämpligt), volym som har använts.

Motivering för val av vehikel.

 

Försöksdjur:

Art och stam som har använts, motivering om albinokanin inte har använts.

Antalet djur per kön.

De enskilda djurens vikt vid testets start och slut.

Djurens ålder vid testets start.

Ursprung, förvaringsförhållanden, foder och dylikt.

 

Testbetingelser:

Metod för förberedelse av kompressområde.

Uppgifter om använt kompressmaterial och kompressmetod.

Uppgifter om testkemikaliens beredning, applicering och borttagning.

 

Resultat:

En tabell med graderad irritations-/korrosionsrespons för varje djur vid samtliga observationspunkter.

Beskrivningar av alla observerade skador.

Beskrivande redogörelse av typen och graden av den irritation eller korrosion som observerats samt eventuella histopatologiska fynd.

Beskrivning av andra skadliga lokala (till exempel avfettning av huden) och systemiska verkningar utöver hudirritation eller hudkorrosion.

 

Diskussion av resultaten

 

Slutsatser

LITTERATUR

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 203, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

(2)

OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, undertecknat vid det 28:e mötet mellan kemikaliekommittén och kemikaliearbetsgruppen i november 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 19, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

TABELL

GRADERING AV HUDREAKTIONER

Ingen rodnad…

0

Svag rodnad (knappt skönjbart)…

1

Väldefinierad rodnad…

2

Måttlig till svår rodnad…

3

Svår rodnad (köttrodnad) till sårskorpebildning som förhindrar gradering av rodnaden…

4

Högsta möjliga poäng: 4

Inget ödem…

0

Svagt ödem (knappt skönjbart)…

1

Milt ödem (området är väl avgränsat genom klar svullnad)…

2

Måttligt ödem (svullnadens höjd cirka 1 mm)…

3

Svårt ödem (höjd över 1 mm och svullnaden sträcker sig utöver exponeringsområdet)…

4

Högsta möjliga poäng: 4

I fall av tvetydig respons kan en histopatologisk undersökning utföras i klargörande syfte.

Tillägg

DEFINITIONER

Kemikalie: ett ämne eller en blandning.

Hudirritation: en reversibel hudskada som finns kvar i upp till fyra timmar efter applicering av en testkemikalie.

Hudkorrosion: en irreversibel skada på huden i form av synlig nekros genom epidermis och in i dermis, efter applicering av en testkemikalie i upp till fyra timmar. Typiska korrosiva reaktioner är sår, blödningar och blodiga sårskorpor samt, i slutet av observationsperioden på 14 dagar, missfärgning av huden på grund av blekning, partier med totalt håravfall och ärr. Histopatologi bör övervägas för att bedöma tveksamma skador.

Testkemikalie: varje ämne eller blandning som testas med denna testmetod.

2)

I del B ska kapitel B.17 ersättas med följande:

”B.17   TESTER AV GENMUTATIONER HOS DÄGGDJURSCELLER IN VITRO MED ANVÄNDNING AV HPRT- OCH XPRT-GENER

INLEDNING

1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 476 (2016). Testmetoder ses regelbundet över med avseende på den vetenskapliga utvecklingen, nya bestämmelser samt djurens välbefinnande. Denna nya omarbetade version av TM B.17 speglar nästan trettio års erfarenhet av detta test och är också resultatet av utvecklingen av en ny och separat metod för in vitro-tester avseende genmutation hos däggdjursceller med användning av thymidinkinasgenen. TM B.17 ingår i en serie av testmetoder för genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

2.

Syftet med genmutationstestet för däggdjursceller in vitro är att upptäcka genmutationer som inducerats av kemikalier. De cellinjer som används i dessa tester mäter framåtmutationer i rapportgener, i detta fall genen för endogent hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferas (Hprt i gnagarceller, HPRT i mänskliga celler, vilka i den här testmetoden går under den samlade benämningen Hprt-genen och HPRT-testet) samt xantin-guanin-fosforibosyltransferas-transgenen (gpt) (här kallat XPRT-testet). Mutationstesterna HPRT och XPRT används för att påvisa olika spektra av genetiska händelser. Utöver de mutationshändelser som påvisas genom HPRT-testet (t.ex. punktmutationer, läsramsmutationer, små deletioner och insertioner) kan gpt-transgenens autosomala läge göra det möjligt att påvisa mutationer som uppstår på grund av stora deletioner och möjligen mitotisk rekombination som inte påvisas genom HPRT-testet eftersom Hprt-genen är belägen på X-kromosomen (2) (3) (4) (5) (6) (7). XPRT-testet används för närvarande i mindre omfattning än HPRT-testet för lagstadgade ändamål.

3.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN OCH BEGRÄNSNINGAR

4.

Tester som utförs in vitro kräver i allmänhet att en exogen källa för metabolisk aktivering används. Det exogena metaboliska aktiveringssystemet efterliknar inte helt förhållandena in vivo.

5.

Åtgärder bör vidtas för att undvika förhållanden som leder till artefaktiska positiva resultat (dvs. möjlig interaktion med testsystemet) som inte orsakas av direkt interaktion mellan testkemikalierna och cellens genetiska material. Sådana förhållanden kan vara ändringar av pH eller osmolalitet (8) (9) (10), interaktion med mediets komponenter (11) (12) eller alltför hög cytotoxicitet (13). En cytotoxicitet som överskrider de rekommenderade maxnivåerna för cytotoxicitet enligt definitionen i avsnitt 19 anses vara för hög för HPRT-test.

6.

Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag.

TESTPRINCIP

7.

Muterade celler som saknar Hprt-enzymaktivitet i HPRT-testet eller xprt-enzymaktivitet i XPRT-testet är resistenta mot de cytostatiska effekterna av purinanalogen 6-tioguanin (TG). Celler som klarar av Hprt (i HPRT-testet) eller gpt (i XPRT-testet) är känsliga för TG eftersom TG ger upphov till inhibering av cellmetabolismen och stoppar fortsatt celldelning. Muterade celler kan därför proliferera i närvaro av TG, till skillnad från normala celler som innehåller Hprt-enzym (i HPRT-testet) eller gpt-enzym (i XPRT-testet).

8.

Celler i odlingar i form av suspensioner eller monolager exponeras för testkemikalien, både med och utan en exogen källa för metabolisk aktivering (se punkt 14), under en lämplig tidsperiod (3–6 timmar) och subkultiveras sedan för att bestämma cytotoxiciteten och möjliggöra fenotypisk expression innan mutanturvalet sker (14) (15) (16) (17). Cytotoxiciteten bestäms utifrån överlevandekvoten (RS), dvs. kloningseffektiviteten som mäts omedelbart efter behandling och anpassas efter eventuell cellförlust under behandlingen till skillnad från vid en negativ kontroll (punkt 18 och tillägg 2). De behandlade odlingarna bibehålls i ett tillväxtmedium under en tillräckligt lång tid, karakteristisk för varje celltyp, för att tillåta i det närmaste optimal fenotypisk expression av inducerade mutationer (i regel under minst 7–9 dagar). Efter fenotypisk expression bestäms mutantfrekvensen genom inokulering av ett känt antal celler i ett medium som innehåller det selektiva ämnet för detektion av mutantkolonier, och i ett medium utan selektivt ämne för bestämning av kloningseffektiviteten (viabiliteten). Efter en lämplig inkubationstid räknas kolonierna. Mutantfrekvensen räknas fram utifrån antalet mutantkolonier korrigerat för kloningseffektiviteten vid tidpunkten för mutanturvalet.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Beredningar

Celler

9.

De celltyper som används för HPRT- och XPRT-testerna bör ha påvisad känslighet för kemiska mutagener, hög kloningseffektivitet, stabil karyotyp och stabil spontan mutantfrekvens. Bland de vanligast förekommande cellerna för HPRT-test innefattas CHO-, CHL- och V79-linjerna från kinesiska hamsterceller, L5178Y lymfomceller från mus och TK6-linjerna från lymfoblastoidceller från människa (18) (19). AS52-celler som tagits från CHO-linjer och som innehåller gpt-transgenen (och vars Hprt-gen har eliminerats) används till XPRT-testet (20) (21). HPRT-testet kan inte utföras på AS52-celler eftersom hprt-genen har eliminerats. Om andra cellinjer används ska detta motiveras och godkännas.

10.

Cellinjer bör rutinmässigt kontrolleras med avseende på det modala kromosomantalets stabilitet och frånvaro av mykoplasmakontamination (22) (23), och celler får inte användas om de är kontaminerade eller om det modala kromosomantalet har ändrats. Cellernas normala cellcykeltid som används i testlaboratoriet bör fastställas och bör överensstämma med kända cellegenskaper. Den spontana mutantfrekvensen i stamodlingen bör också kontrolleras, och odlingen bör inte användas om mutantfrekvensen inte är acceptabel.

11.

Innan odlingarna används i detta test kan de behöva rensas på befintliga muterade celler, t.ex. genom att odlas i HAT-medium för HPRT-testet och MPA-medium för XPRT-testet (5) (24) (se tillägg 1). De rensade odlingarna kan frysas ner och sedan tinas upp och användas som arbetslösningar med celler. De nyupptinade arbetslösningarna med celler kan användas för testet efter att normal dubbleringstid har uppnåtts. Vid genomförande av ett XPRT-test med rutinodling av AS52-celler bör detta göras under förhållanden som garanterar att gpt-transgenen bevaras (20).

Medier och odlingsbetingelser

12.

Lämpliga odlingsmedier och inkubationsförhållanden (odlingskärl, fuktad atmosfär med 5 % CO2 och inkubationstemperatur på 37 °C) bör väljas för odlingarna. Celler bör alltid odlas under förhållanden som garanterar en logfastillväxt. Det är särskilt viktigt att odlingsmedier och -förhållanden väljs så att man säkrar optimal celltillväxt under expressionsperioden och optimal kloningseffektivitet för både muterade celler och icke-muterade celler.

Beredning av odlingarna

13.

Cellinjer dras upp från stamodlingar och inokuleras i odlingsmedium med en sådan densitet att cellerna i suspension eller i monolager fortsätter att växa exponentiellt under behandlings- och expressionsperioderna (konfluens bör undvikas för celler som växer i monolager).

Metabolisk aktivering

14.

Exogena metaboliserande system bör användas när cellerna inte har tillräcklig endogen metabolisk kapacitet. Det mest använda systemet, som rekommenderas som standard om inte annat kan motiveras, är en kofaktorstödd postmitokondriell fraktion (S9) som beretts av lever från gnagare (vanligen råttor) som behandlats med enzyminducerande ämnen, t.ex. aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) eller en kombination av fenobarbital och β-naftoflavon (29) (30) (31) (32). Den senare kombinationen bryter inte mot Stockholmskonventionen om långlivade organiska föroreningar (33) och har visat sig vara lika effektiv som aroclor 1254 när det gäller att inducera multifunktionsoxidaser (”mixed-function oxidases”) (29) (31). S9-fraktionen används vanligen i koncentrationer mellan 1–2 volymprocent men kan ökas till 10 volymprocent i det slutliga testmediet. Valet av typ och koncentration av använt exogent metaboliskt aktiveringssystem eller metabolisk induktion kan påverkas av den klass av ämnen som testas (34) (35) (36).

Beredning av testkemikalien

15.

Fasta testkemikalier bör lösas upp i eller blandas med lämpliga lösningsmedel eller vehiklar och vid behov spädas ut innan cellerna behandlas (se punkt 16). Flytande testkemikalier kan tillsättas direkt till testsystemet och/eller spädas ut före behandling av testsystemet. Gaser eller flyktiga testkemikalier bör testas genom lämpliga modifikationer av standardprotokollen, såsom behandling i slutna odlingskärl (37) (38). Testkemikalien bör beredas strax före behandling om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel.

TESTBETINGELSER

Lösningsmedel

16.

Man bör välja ett lösningsmedel som optimerar testkemikaliens löslighet utan att testet påverkas negativt, t.ex. genom förändringar i celltillväxten, påverkan på testkemikaliens integritet, reaktion med odlingskärlen eller försämrad metabolisk aktivering. När det är möjligt rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel (eller odlingsmedier). Vedertagna lösningsmedel är till exempel vatten och dimetylsulfoxid. Generellt bör organiska lösningsmedel inte överstiga 1 volymprocent, och vattenbaserade lösningsmedel (saltlösningar eller vatten) inte överstiga 10 volymprocent i det slutliga behandlingsmediet. Om man använder lösningsmedel som inte är vedertagna (t.ex. etanol eller aceton) bör detta stödjas av uppgifter om att de är kompatibla med testkemikalierna och testsystemet och att de inte är genotoxiska vid den koncentration som används. Om ett sådant underlag saknas är det viktigt att inkludera obehandlade kontroller (se tillägg 1) för att visa att inga skadliga eller mutagena effekter induceras av det valda lösningsmedlet.

Mätning av cellproliferation och cytotoxicitet och val av exponeringskoncentrationer

17.

Vid bestämning av maximal testkemikaliekoncentration bör man undvika koncentrationer som kan ge artefaktiska positiva resultat, t.ex. sådana som medför alltför kraftig cytotoxicitet (se punkt 20), fällning i odlingsmediet (se punkt 21) eller betydande ändringar av pH eller osmolalitet (se punkt 5). Om testkemikalien orsakar en betydande ändring av mediets pH vid tillsättningen kan pH justeras genom buffring av det slutliga behandlingsmediet för att undvika artefaktiska positiva resultat och upprätthålla lämpliga odlingsförhållanden.

18.

Valet av koncentrationer baseras på cytotoxicitet och andra överväganden (se punkterna 20–22). Även om det kan vara användbart att utvärdera cytotoxicitet i ett inledande test för att bättre definiera de koncentrationer som ska användas i huvudförsöket är ett inledande test inte obligatoriskt. Även om en inledande cytotoxicitetsbedömning görs måste cytotoxiciteten för varje odling mätas i huvudexperimentet. Cytotoxicitet bör bedömas genom användning av RS, dvs. kloningseffektivitet (CE) hos celler som överförts till plattor omedelbart efter behandling, och justeras för eventuell cellförlust under behandlingen, utifrån en cellräkning, i förhållande till den justerade kloningseffektiviteten i negativa kontroller (där överlevandekvoten sätts till 100 %) (se tillägg 2 för formeln).

19.

Minst fyra testkoncentrationer (exklusive lösningsmedel och positiva kontroller) som uppfyller acceptanskriterierna (lämplig cytotoxicitet, antal celler osv.) bör utvärderas. Även om användning av duplikat är att föredra kan både replikat och enskilt behandlade odlingar användas för varje koncentration som testas. De resultat som erhölls i de oberoende replikatodlingarna vid en given koncentration kan slås ihop för dataanalysen (17). För testkemikalier med låg eller ingen cytotoxicitet är två- till trefaldiga koncentrationsintervall vanligen lämpliga. Om testkemikalien är cytotoxisk bör de valda testkoncentrationerna täcka ett relevant intervall av cytotoxicitet och omfatta koncentrationer med måttlig, låg eller ingen cytotoxicitet. Många testkemikalier uppvisar koncentrationsreponskurvor. För att täcka in alla grader av cytotoxicitet eller undersöka dos-responsförhållandet i detalj kan det vara nödvändigt att använda mer nära varandra liggande koncentrationer och fler än fyra koncentrationer, i synnerhet i situationer där försöket måste upprepas (se punkt 43). Användning av mer än fyra koncentrationer kan vara särskilt viktigt vid användande av enstaka odlingar.

20.

Om maxkoncentrationen ska baseras på cytotoxicitet bör den högsta koncentrationen ha ett RS-värde på mellan 20 och 10 %. Vid tolkning av positiva resultat som endast uppvisar ett RS-värde på 10 % eller lägre uppmanas till försiktighet (punkt 43).

21.

För svårlösliga testkemikalier som inte är cytotoxiska vid koncentrationer under den lägsta olösliga koncentrationen bör den högsta analyserade koncentrationen framkalla grumlighet eller en fällning som är synlig med blotta ögat eller med hjälp av ett inverterat mikroskop vid slutet av behandlingen med testkemikalien. Även om cytotoxicitet uppträder över den lägsta olösliga koncentrationen är det lämpligt att testa endast en koncentration som orsakar grumlighet eller synlig fällning, eftersom fällningen kan ge artefaktiska effekter. När det gäller koncentrationer som ger fällningar bör man se till att fällningarna inte påverkar utförandet av testet negativt. Bestämning av löslighet i odlingsmediet före försöket kan vara användbart.

22.

Om ingen fällning eller begränsande cytotoxicitet observeras ska de maximala testkoncentrationerna motsvara det lägsta av följande värden: 10 mM, 2 mg/ml eller 2 μl/ml (39) (40). Om testkemikalien inte har en definierad sammansättning, t.ex. ett ämne med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter eller biologiskt material (dvs. UVCB) (41), miljöextrakt osv., kan man behöva använda en högre toppkoncentration (t.ex. 5 mg/ml) om cytotoxiciteten inte är tillräckligt hög, så att koncentrationen av varje komponent ökas. Det bör dock noteras att dessa krav kan skilja sig för humanläkemedel (42).

Kontroller

23.

Parallella negativa kontroller (se punkt 16), bestående av enbart lösningsmedel i behandlingsmediet, och hanterade på samma sätt som behandlingsodlingarna, bör inkluderas för varje testbetingelse.

24.

Parallella positiva kontroller behövs för att visa laboratoriets förmåga att identifiera mutagener enligt villkoren i det använda testprotokollet och, i förekommande fall, effektiviteten hos det exogena systemet för metabolisk aktivering. Exempel på positiva kontroller ges i tabell 1 nedan. Alternativa positiva kontrollämnen kan användas om det är motiverat. Eftersom in vitro-tester för genotoxicitet på däggdjursceller är tillräckligt standardiserade kan tester som använder sig av behandling med eller utan exogen metabolisk aktivering utföras med endast en positiv kontroll som kräver metabolisk aktivering. I detta fall visar en enda klastogenisk positiv kontrollrespons både aktiviteten hos det metaboliska aktiveringssystemet och testsystemets känslighet. Varje positiv kontroll bör användas för en eller flera koncentrationer som förväntas ge ökningar över bakgrunden som går att reproducera och detektera. Syftet med detta är att visa testsystemets sensitivitet, och responsen får inte äventyras av cytotoxicitet som överskrider de gränser som anges i testmetoden (se punkt 20).

Tabell 1

Rekommenderade referensämnen för utvärdering av laboratoriets kompetens och för urval av positiva kontroller

Betingelser för metabolisk aktivering

Lokus

Ämne och CAS-nr

Frånvaro av exogen metabolisk aktivering

Hprt

Etylmetansulfonat [CAS-nr 62-50-0] Etylnitrokarbamid [CAS-nr 759-73-9] 4-Nitroquinolin 1-oxid [CAS-nr 56-57-5]

 

xprt

Streptonigrin [CAS-nr 3930-19-6] Mitomycin C [CAS-nr 50-07-7]

Närvaro av exogen metabolisk aktivering

Hprt

3-Metylkolantren [CAS-nr 56-49-5] 7,12-dimetylbenzanthracen [CAS-nr 57-97-6] Benso[a]pyren [CAS-nr 50-32-8]

 

xprt

Benso[a]pyren [CAS-nr 50-32-8]

FÖRFARANDE

Behandling med testkemikalien

25.

Prolifererande celler behandlas med testkemikalien i såväl närvaro som frånvaro av ett system för metabolisk aktivering. Exponering bör ske under en lämplig tidsperiod (normalt är 3–6 timmar lagom).

26.

Minimiantalet celler som används för varje testodling (kontrollodlingar och behandlade odlingar) i varje etapp i testet bör baseras på den spontana mutantfrekvensen. Enligt de allmänna anvisningarna ska ett tillräckligt stort antal celler behandlas och passera så att tio spontana mutanter kan bevaras i varje odling i testet (17). Den spontana mutantfrekvensen brukar ligga på mellan 5 och 20 × 10–6. För att få fram en spontan mutantfrekvens på 5 × 10–6 och för att bevara ett tillräckligt stort antal spontana mutanter (10 eller fler) även i de odlingar som behandlats med koncentrationer som orsakar 90 % cytotoxicitet under behandlingen (10 % RS) är det nödvändigt att behandla minst 20 × 106 celler. Dessutom måste ett tillräckligt antal celler (aldrig färre än två miljoner) odlas fram under expressionsperioden och överföras till plattor för mutanturvalet (17).

Fenotypisk expressionstid och mätning av mutantfrekvens

27.

Efter behandlingsperioden odlas cellerna på ett sätt som tillåter mutant fenotypisk expression. Det räcker i allmänhet med sju till nio dagar tills de nya inducerade Hprt- och xprt-mutanterna uppvisar en närmast optimal fenotypisk expression (43) (44). Under den här perioden subkultiveras cellerna regelbundet så att de fortsätter att tilläxa exponentiellt. Efter fenotypisk expression överförs cellerna till plattor igen i medier med respektive utan selektivt ämne (6-tioguanin) för bestämning av antal mutanter respektive kloningseffektivitet vid tidpunkten för urvalet. Denna överföring kan genomföras med användning av antingen plattor för odling i monolager eller mikrotiterplattor för celler i suspension. För mutanturvalet bör cellerna överföras till plattor vid en densitet som garanterar en optimal mutant återhämtning (dvs. så att metabolisk samverkan undviks) (17). Plattorna inkuberas under en lämplig tidsperiod som ger optimal kolonitillväxt (t.ex. 7–12 dagar) varefter kolonierna räknas. Mutantfrekvensen beräknas utifrån antalet mutantkolonier korrigerat för kloningseffektiviteten vid tidpunkten för mutanturvalet (se tillägg 2 för formler).

Laboratoriets kompetens

28.

För att visa att det finns tillräcklig erfarenhet av testet innan det börjar användas för rutintestning bör laboratoriet ha utfört en serie försök med positiva referensämnen som utövar sin verkan via olika mekanismer (minst ett aktivt ämne med och ett aktivt ämne utan metabolisk aktivering som valts ut bland ämnena i tabell 1) och olika negativa kontroller (med olika lösningsmedel/vehiklar). Dessa positiva och negativa kontrollresponser bör överensstämma med vad som anges i litteraturen. Detta gäller inte laboratorier som redan har erfarenhet, dvs. har en historisk databas enligt punkterna 30–33.

29.

Ett urval av de positiva kontrollämnena (se tabell 1 i punkt 25) bör undersökas både vid avsaknad och förekomst av metabolisk aktivering, i syfte att visa deras förmåga att detektera mutagena kemikalier, för att avgöra det metaboliska aktiveringssystemets effektivitet och för visa att celltillväxtförhållandena har varit lämpliga under behandling, fenotypisk expression och mutanturval samt att lämplig metod för gradering använts. En serie koncentrationer av de valda ämnena bör användas för att ge reproducerbara och koncentrationsrelaterade ökningar över bakgrunden i syfte att visa testsystemets sensitivitet och dynamiska omfång.

Historiska kontrolldata

30.

Laboratoriet bör fastställa följande:

Historiskt positivt kontrollintervall samt fördelning.

Historiskt negativt (obehandlad, lösningsmedel) kontrollintervall samt fördelning.

31.

Om data för en historiskt negativ kontrollfördelning samlas in först bör de parallella negativa kontrollerna överensstämma med publicerade kontrolldata (22). Allteftersom kontrollfördelningen kompletteras med fler försöksdata bör de parallella negativa kontrollerna helst ligga inom fördelningens kontrollgräns på 95 % (17) (45) (46).

32.

Laboratoriets historiska databas för negativa kontroller bör inledningsvis baseras på minst 10 försök, men bör helst bygga på minst 20 försök som utförts under jämförbara testbetingelser. Laboratorierna bör använda kvalitetskontrollmetoder såsom kontrolldiagram (t.ex. C-diagram eller X-stapeldiagram (47)), för att fastställa hur variabla deras positiva och negativa kontrolldata är och för att visa att metoden är ”under kontroll” (46). Fler rekommendationer om hur man bygger upp och använder historiska data (t.ex. kriterier för att ta med eller inte ta med data samt acceptanskriterier för ett givet försök) finns i litteraturen (45).

33.

Negativa kontrolldata bör bestå av mutantfrekvenser från enskilda odlingar eller, ännu hellre, replikatodlingar enligt beskrivningen i punkt 23. Parallella negativa kontroller bör helst ligga inom kontrollgränsen på 95 % för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldatabas (17) (45) (46). Om parallella negativa kontrolldata faller utanför kontrollgränserna på 95 % kan de ändå ingå i den historiska kontrollfördelningen så länge de inte är extremt avvikande och det finns bevis för att testsystemet är ”under kontroll” (se ovan) och att inga tekniska eller mänskliga fel begåtts.

34.

Eventuella ändringar av försöksprotokollen bör övervägas när det gäller deras överensstämmelse med laboratoriets befintliga historiska kontrolldatabaser. Alla större inkonsekvenser bör leda till att en ny historisk kontrolldatabas upprättas.

DATA OCH RAPPORTERING

Presentation av resultaten

35.

Presentationen av resultaten bör omfatta all den data som behövs för att beräkna cytotoxiciteten (uttryckt som ett RS-värde). Data för både behandlade odlingar och kontrollodlingar bör inkludera antalet celler vid behandlingens slut, antalet celler som överförts till plattor direkt efter behandling samt antal kolonier (eller antal brunnar utan kolonier för mikrotitermetoden). RS-värdet för varje odling ska uttryckas som en procentandel av den parallella lösningsmedelskontrollen (se tillägg 1 för definitioner).

36.

Redovisningen av resultat bör även omfatta alla data som behövs för att beräkna mutantfrekvensen. Data för både behandlade odlingar och kontrollodlingar bör omfatta: 1) antalet celler som överförts till plattor med respektive utan selektivt ämne (i samband med att cellerna överförts till plattor för mutanturvalet), och 2) antalet räknade kolonier (eller, för mikrotitermetoden, antalet brunnar utan kolonier) från plattorna med respektive utan selektivt ämne. Mutantfrekvensen beräknas utifrån antalet mutantkolonier (i plattor med selektivt ämne) korrigerat för kloningseffektiviteten (från plattorna utan selektivt ämne). Mutantfrekvensen uttrycks som antalet muterade celler per miljon viabla celler (se tillägg 1 för definitioner).

37.

Data bör anges per enskild odling. Dessutom bör alla data sammanfattas i tabellform.

Acceptanskriterier

38.

Testet måste uppfylla följande kriterier för att godkännas:

Den parallella negativa kontrollen måste anses godtagbar för registrering i laboratoriets historiska databas över negativa kontroller enligt punkt 33.

Parallella positiva kontroller (se punkt 24) bör framkalla reaktioner som överensstämmer med de kontroller som genereras i en historiska databasen över positiva kontroller och ge en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Två olika testbetingelser (med respektive utan metabolisk aktivering) testades, utom då en av dem gav positiva resultat (se punkt 25).

Tillräckligt många celler och koncentrationer finns tillgängliga för analys (punkterna 25, 26 och 19).

Urvalskriterierna för toppkoncentrationen överensstämmer med de kriterier som beskrivs i punkterna 20, 21 och 22.

Utvärdering och tolkning av resultaten

39.

Förutsatt att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses en testkemikalie vara klart positiv om följande gäller för någon av de undersökta testbetingelserna:

Åtminstone en av testkoncentrationerna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med samtidig negativ kontroll.

Ökningen är dosrelaterad när den utvärderas med ett lämpligt trendtest.

Något av resultaten ligger utanför fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserad 95 %-kontrollgräns, se punkt 33).

Om alla dessa kriterier är uppfyllda anses testkemikalien kunna inducera genmutationer hos odlade däggdjursceller i detta testsystem. Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns i litteraturen (46) (48).

40.

Förutsatt att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses en testkemikalie vara klart negativ om följande gäller för samtliga undersökta testbetingelser:

Ingen av testkoncentrationerna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Det finns ingen koncentrationsrelaterad ökning vid utvärdering med ett lämpligt trendtest.

Alla resultat ligger inom fördelningen av historiska negativa kontrolldata (t.ex. Poisson-baserade 95 %-kontrollgränser, se punkt 33).

Testkemikalien anses då inte kunna inducera genmutationer hos odlade däggdjursceller i detta testsystem.

41.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller negativt svar.

42.

Om responsen varken är klart negativ eller klart positiv enligt beskrivningen ovan eller för att göra det lättare att fastställa resultatets biologiska relevans bör uppgifterna fackgranskas och/eller undersökas ytterligare. Det kan även vara användbart att upprepa försöket med ändrade testbetingelser (t.ex. koncentrationsavstånd eller andra metaboliska aktiveringsvillkor, dvs. S9-koncentration eller S9-ursprung).

43.

I sällsynta fall är det, trots ytterligare undersökningar, inte möjligt att dra en slutsats om huruvida testkemikalien ger positiva eller negativa resultat. Responsen på testkemikalien ska i sådana fall anses vara tvetydig (vilket innebär att den lika gärna kan vara positiv som negativ).

Testrapport

44.

Testrapporten ska innehålla följande information:

 

Testkemikalie:

källa, satsnummer, sista förbrukningsdag om detta anges,

testkemikaliens stabilitet i sig, om den är känd,

löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet, om detta är känt,

Mätning av pH, osmolalitet och fällningar i det odlingsmedium till vilket testkemikalien tillsattes, i förekommande fall.

 

Monokomponentämne:

fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel, renhet samt motsvarande identifiering av föroreningar i förekommande fall och om det är praktiskt möjligt.

 

Multikomponentämne, UVCB-ämnen och blandningar:

karakteriseras så långt som möjligt genom beståndsdelarnas kemiska identitet (se ovan), kvantitativa förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

 

Lösningsmedel:

motivering av valet av lösningsmedel,

procentandelen lösningsmedel i den slutliga odlingsmediet.

 

Celler:

 

För stamodlingar i laboratorium:

Typ, cellinjernas källa.

Antal passager, om känt, och laboratoriets historia.

Kromosomernas karyotypiska egenskaper och/eller modala antal.

Metoder för underhåll av cellodlingar.

frånvaro av mykoplasma,

fördubblingstid.

 

Testbetingelser:

Grund för val av koncentrationer och antal odlingar inklusive t.ex. cytotoxicitetsdata och löslighetsbegränsningar.

Mediets sammansättning, CO2-koncentration och luftfuktighet.

Testkemikaliens koncentration, uttryckt som slutlig koncentration i odlingsmediet (t.ex. μg eller mg/ml eller mM av odlingsmediet).

Koncentration (och/eller volym) av det lösningsmedel och den testkemikalie som tillsätts odlingsmediet.

inkubationstemperatur,

inkubationstid,

behandlingens varaktighet,

celldensitet under behandlingen,

typ och sammansättning hos det system som används för metabolisk aktivering (S9-källa, beredningsmetod för S9-blandningen, koncentration eller volym för S9-blandningen, S9 i det slutliga odlingsmediet, kvalitetskontroller av S9), Positiva och negativa kontrollämnen, slutkoncentrationer för varje behandlingsförhållande.

Expressionsperiodens längd (inklusive antal celler som inokulerats samt subkulturer och scheman för näringstillförsel, om detta är tillämpligt).

Det selektiva ämnets identitet och koncentration.

Acceptanskriterier för testerna.

Metoder som används för att räkna antalet viabla och muterade celler.

Metoder för mätning av cytotoxicitet.

All tilläggsinformation som är relevant rörande cytotoxicitet samt använd metod.

Inkubationstidens varaktighet efter överföring till plattor.

Kriterier för att bedöma om testresultaten är positiva, negativa eller tvetydiga.

Metoder som använts för att bestämma pH, osmolalitet och fällningar.

 

Resultat:

antal behandlade celler och antal subkultiverade celler i varje odling,

Mätning av cytotoxicitet och övriga observationer, i förekommande fall.

Tecken på fällning och tid för bestämningen.

Antal celler som överförts till plattor i selektiva och icke-selektiva medier.

Antal kolonier i icke-selektiva medier och antal resistenta kolonier i selektiva medier, samt relaterade mutantfrekvenser.

Koncentration-responsförhållande, där det är möjligt.

data om parallella negativa (lösningsmedel) och positiva kontroller (koncentrationer och lösningsmedel),

Historiska negativa (lösningsmedel) och positiva kontrolldata med intervall, medelvärden, standardavvikelser och konfidensintervall (t.ex. 95 %) samt antal data.

Statistik (för individuella odlingar och sammanslagna replikat, i förekommande fall) samt p-värden om sådana finns.

 

Diskussion av resultaten.

 

Slutsats

LITTERATUR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr 234, OECD, Paris.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

(3)

Chu E.H.Y. och Malling H.V. (1968). Däggdjurscellers genetik. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro , Proc. Natl. Akad. Sci., USA, s. 61, 1306–1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. och Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5)

Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res., 223, 121–128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., s. 312, 235–239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. och Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17-36.

(8)

Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. och Myhr, B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. En rapport från ICPEMC:s arbetsgrupp nr 9. Mutation Res., s. 257, 147–204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Miljö. Mutagen., s. 8, 789–886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. och Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., s. 49, 439–452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. och Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., s. 634, 177–183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L., och Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 584, 1–256.

(14)

Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W.N, Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)

Stankowski, L. F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. I: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), Cambridge University Press, s. 66–101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., och Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): s. 9616-9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manus under bearbetning.)

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, s. 33, 261–287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. och Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. s. 8, 299–305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. och de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. och Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)

Ames B.N., McCann J. och Yamasaki E. (1975). Ames, B. N., McCann,). and Yamasaki E. (1975), Metods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenitic Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)

Maron D.M. och Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., s. 113, 173–215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). Matsushima, T., Sawamura, M, Hara, K. och Sugimura, T. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. I: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. och Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32)

Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. och Galloway, S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., s. 28, 51–59.

(33)

Unep (2001). Stockholmskonventionen om långlivade organiska föroreningar, FN:s miljöprogram (Unep). Tillgänglig på: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Mammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, s. 4, 7–18.

(37)

Krahn, D.F., Barsky, F.C. och McCooey, K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. I: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91–103.

(38)

Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. och Brooks, A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Utgiven av Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD).

(40)

Brookmire L., Chen J.J. och Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, s. 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011). (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances.

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Tillgänglig på: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. och Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation Res., 1335:2, s. 121–28.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

(46)

OECD (2014). Statistik som stöd för revisionen av riktlinjerna för genotoxicitetsförsök. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 199, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., och Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. I: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Mutagener som orsakar punktmutationer: kemikalier som orsakar utbyte av baspar i DNA.

Kemikalie: Ett ämne eller en blandning.

Kloningseffektivitet: Procentandel celler som överförts till plattor vid låg densitet och som kan tillväxa till en koloni som kan räknas.

Koncentrationer: slutliga koncentrationer av testkemikalien i odlingsmediet.

Cytotoxicitet: För de analyser som omfattas av denna testmetod definieras cytotoxicitet som en minskning av den relativa överlevnaden hos behandlade celler jämfört med den negativa kontrollen (se särskild punkt).

Framåtmutation: en genmutation från den parentala typen till mutantformen, vilket ger upphov till en förändring eller förlust av den enzymatiska aktiviteten eller funktionen hos det protein som bildas.

Läsramsmutagener: kemikalier som orsakar addition eller deletion av ett eller flera baspar i DNA-molekylen.

Genotoxisk: en allmän term som omfattar alla typer av DNA- och kromosomskador, inklusive brott, addukter, omlagringar, mutationer, kromosomavvikelser och aneuploidi. Inte alla typer av genotoxiska effekter leder till mutationer eller stabila kromosomskador.

HAT-medium: ett medium som innehåller hypoxantin, aminopterin och tymidin och som används för att rensa Hprt-mutanter.

Mitotisk rekombination: rekombination mellan homologa kromatider under mitosen, vilket kan resultera i dubbla trådbrott i DNA eller förlust av heterozygositet.

MPA-medium: ett medium som innehåller xantin, adenin, tymidin, aminopterin och mykofenolsyra och som används för att rensa Xprt-mutanter.

Mutagent ämne: ämne som producerar en ärftlig ändring av DNA-basparssekvensen/-erna i gener eller i kromosomstrukturen (kromosomavvikelser).

Mutantfrekvens: antal mutantkolonier som observeras delat med antal celler som överförts till plattor i selektivt medium, korrigerat för kloningseffektivitet (eller viabilitet) vid tidpunkten för urvalet.

Fenotypisk expressionstid: den tid efter behandlingen under vilken den genetiska förändringen fixeras i genomet och de ursprungliga genprodukterna försvinner i så hög grad att den fenotypiska egenskapen förändras.

Relativ överlevnad (RS): RS används som ett mått på behandlingsrelaterad cytotoxicitet. RS är kloningseffektiviteten (CE) hos celler som överförts till plattor omedelbart efter behandling justerat för eventuell cellförlust under behandlingen, jämfört med kloningseffektiviteten i negativa kontroller (där överlevanden sätts till 100 %).

S9-leverfraktion: supernatant av leverhomogenat efter 9 000 g centrifugering, dvs. råleverextrakt.

S9-blandning: blandning av S9-leverfraktion och kofaktorer som krävs för metabolisk enzymaktivitet.

Lösningsmedelskontroll: Allmän term för att definiera kontrollodlingar som endast tillsatts det lösningsmedel som används för att lösa upp testkemikalien.

Testkemikalie: Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Obehandlad kontroll: odlingar som inte behandlas (dvs. varken testkemikalie eller lösningsmedel tillsätts), men som behandlas parallellt på samma sätt som de odlingar där testkemikalien tillsätts.

UVCB-ämne: kemiskt ämne med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter och biologiskt material.

Tillägg 2

FORMLER FÖR BEDÖMNING AV CYTOTOXICITET OCH MUTANTFREKVENS

Cytotoxicitet bedöms genom den relativa överlevnaden, dvs. kloningseffektiviteten hos celler som överförts till plattor omedelbart efter behandling justerat för eventuell cellförlust under behandlingen, jämfört med den justerade kloningseffektiviteten i negativa kontroller (där överlevanden sätts till 100 %) (se RS-formeln nedan).

Anpassad CE för en odling som behandlats med testkemikalie beräknas på följande sätt:

Formula

RS för en odling som behandlats med testkemikalie beräknas på följande sätt:

Formula

Mutantfrekvensen är kloningseffektiviteten hos mutantkolonier i ett selektivt medium delat med kloningseffektiviteten i ett icke-selektivt medium för samma odling vid tidpunkten för urvalet.

Formula

När plattor används för kloningseffektivitet:

CE = antal kolonier/antal celler som överförts till plattor.

När mikrotiterplattor används för kloningseffektivitet:

Antalet kolonier per brunn i mikrotiterplattor följer en Poisson-fördelning.

Kloningseffektivitet = -LnP(0)/antal celler som överförts per brunn.

LnP(0) är det troliga antalet tomma brunnar av de inokulerade brunnarna och beskrivs av följande formel:

LnP(0) = -Ln (antal tomma brunnar/antal fyllda brunnar)

3)

I del B ska kapitel B.22 ersättas med följande:

”B.22   DOMINANT LETALT TEST PÅ GNAGARE

INLEDNING

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 478 (2016). Testmetoder ses regelbundet över mot bakgrund av den vetenskapliga utvecklingen, nya bestämmelser samt djurens välbefinnande. Den modifierade versionen av den här testmetoden återspeglar över trettio års erfarenhet av testet och möjligheten att integrera eller kombinera testet med andra toxicitetstester, t.ex. studier som avser utveckling, reproduktionstoxicitet eller genotoxicitet. På grund av sina begränsningar och det stora antalet djur som används är testet dock inte avsett att användas som en primärmetod utan snarare som en kompletterande testmetod som endast ska användas när de befintliga kraven inte går att uppfylla på annat sätt. Genom att kombinera olika toxicitetstester kan antalet försöksdjur som behövs för toxicitetstesterna minskas kraftigt. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

2.

Syftet med det dominanta letala testet (DL-försöket) är att undersöka om kemikalier producerar mutationer i form av kromosomavvikelser i könsceller. Det dominanta letala testet är även relevant för att bedöma genotoxicitet, eftersom faktorer som in vivo-metabolism, farmakokinetik och DNA-reparationsprocesser är aktiva och bidrar till responsen, även om de kan variera mellan arter. Induktion av DL-mutation efter kontakt med en testkemikalie tyder på att kemikalien har påverkat könsvävnaden hos försöksdjuret.

3.

DL-mutationer dödar embryon och foster. Induktion av DL-mutation efter exponering för en testkemikalie tyder på att kemikalien har påverkat försöksdjurets könsceller.

4.

Ett DL-test är användbart för att bekräfta positiva resultat från tester med somatiska in vivo-endpoints, och det är en relevant endpoint för att förutsäga faror för människor samt risk för genetiska sjukdomar som överförs via könscellerna. Detta test kräver dock ett stort antal försöksdjur och mycket arbete och är därför väldigt kostsamt och tidskrävande. Eftersom den spontana frekvensen för dominant letala mutationer är relativt hög har testet i regel begränsad känslighet för att påvisa små ökningar av mutationsfrekvensen.

5.

Definitioner av centrala begrepp anges i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

6.

Testet utförs oftast på möss (2) (3) (4), men andra arter, t.ex. råtta (5) (6) (7) (8), kan vara lämpliga i vissa fall om det kan motiveras vetenskapligt. DL orsakas i regel av stora kromosomavvikelser (strukturella och numeriska avvikelser) (9) (10) (11), men genmutation kan inte uteslutas. En DL-mutation är en mutation som sker i själva könscellen eller som fixeras efter befruktning i det tidiga embryot och som inte skadar könscellens funktion, men som är dödlig för det befruktade ägget eller för embryot som håller på att utvecklas.

7.

Individuella hanar paras ihop sekventiellt med icke tidigare befruktade honor under lämpliga intervall. Antalet parningar efter behandling beror på det slutliga syftet med DL-försöket (punkt 23), och samtliga faser i hanens könscellsmognad ska utvärderas inför försöket (12).

8.

Om det finns bevis för att testkemikalien eller dess metabolit(er) inte kommer att nå testiklarna är det inte lämpligt att använda testet.

TESTPRINCIP

9.

Hanar exponeras i regel för testkemikalien på ett lämpligt sätt och paras därefter med obehandlade honor som inte har befruktats tidigare. Könscellernas olika stadier kan undersökas separat genom att använda på varandra följande parningsperioder. Efter parning avlivas honorna efter en lämplig tidsperiod, och deras livmödrar undersöks för att bestämma antal implantat samt levande och döda embryon. Testkemikaliens dominanta letalitet bestäms genom att antalet levande implantat per hona i den behandlade gruppen jämförs med antalet levande implantat per hona i gruppen med vehikel-/lösningsmedelskontroll. Ökningen av antalet döda implantat per hona i den behandlade gruppen i förhållande till antalet döda implantat per hona i kontrollgruppen återspeglar den postimplantationsförlust som testkemikalien inducerat. Postimplantationsförlusten beräknas genom dödskvoten för det totala antalet implantat i den behandlade gruppen i förhållande till dödskvoten för det totala antalet implantat i kontrollgruppen. Preimplantationsförlusten kan uppskattas genom att beräkna skillnaden mellan antalet gulkroppar och det totala antalet implantat eller det totala antalet implantat per hona i behandlade grupper och kontrollgrupper.

KVALIFIKATIONSPRÖVNING AV LABORATORIET

10.

För det här försöket bör laboratoriets kompetens fastställas genom förmågan att reproducera dominanta letala frekvenser utifrån tidigare publicerade data (t.ex. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) med positiva kontrollämnen (inklusive svaga responser), t.ex. de som listas i tabell 1, och vehikelkontroller samt erhålla negativa kontrollfrekvenser som överensstämmer med de acceptabla gränserna (se referenser ovan) eller med laboratoriets historiska kontrollfördelning, om sådan finns.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Beredningar

Val av djurart

11.

Friska vuxna djur som härrör från normala laboratoriestammar bör användas. Oftast används möss, men även råttor kan vara lämpliga. Andra lämpliga däggdjursarter kan användas om en vetenskaplig motivering anges i rapporten.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

12.

För gnagare bör temperaturen i djurutrymmena vara 22 °C (± 3 °C). Den relativa fuktigheten bör helst vara 50–60 %, men minst 40 %, och bör helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus följt av 12 timmar mörker. För utfodring kan konventionellt laboratoriefoder användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna väg. Gnagare bör före behandling eller parning inhysas i små grupper (högst fem individer) med individer av samma kön, förutsatt att inget aggressivt beteende observeras eller förväntas, och företrädesvis i fasta burar med lämplig miljöberikning. Djuren får hållas individuellt om det är vetenskapligt motiverat.

Förberedelse av djuren

13.

Friska könsmogna hanar och honor väljs ut slumpvis till kontroll- och behandlingsgrupperna. Djuren ska ha en unik identifiering som appliceras med en human och minimalt invasiv metod (t.ex. ringmärkning, taggar, mikrochipp eller biometrisk identifiering, men inte öron- eller tassclips). De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar. Burarna placeras på sådant sätt att eventuella verkningar på grund av placeringen minimeras. Korskontaminering av den positiva kontrollen och testkemikalien bör undvikas. När undersökningen ska påbörjas är det lämpligt att viktskillnaden mellan djuren är så liten som möjligt, och den bör inte överstiga ± 20 % av medelvikten för varje kön.

Beredning av doser

14.

Fasta testkemikalier bör lösas upp eller suspenderas i lämpliga lösningsmedel eller vehiklar eller blandas i foder eller dricksvatten innan dosen administreras till djuren. Testkemikalier i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före doseringen. Vid inhalationexponering kan testkemikalier administreras såsom gas, ånga eller en fast/flytande aerosol, beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper. Nygjorda beredningar av testkemikalien bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel och lämpliga lagringsförhållanden bör fastställas.

Testbetingelser

Lösningsmedel/vehikel

15.

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna misstänkas för att reagera kemiskt med testkemikalien. Om andra lösningsmedel/vehiklar än de gängse används bör det finnas referensdata som visar att de är kompatibla. När det är möjligt, rekommenderas att man i första hand överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar. Exempel på vanliga kompatibla lösningsmedel/vehiklar är vatten, fysiologisk saltlösning, metylcellulosalösning, karboximetylcellulosa natriumsaltlösning, olivolja och majsolja.

Positiva kontroller

16.

Parallella positiva kontrolldjur bör alltid användas såvida inte laboratoriet har påvisat sin duglighet för testet i fråga och utfört testet rutinmässigt under de senaste åren (t.ex. under de senaste 5 åren). Det är dock inte nödvändigt att behandla de positiva kontrolldjuren på samma sätt som de djur som behandlas med testkemikalien, eller att ta prover på samtliga parningsintervall. De positiva kontrollämnena ska ha en känd dominant letal verkan under de förhållanden som gäller för testet. Utom vid behandling bör försöksdjuren i kontrollgrupperna hanteras på ett sätt som är identiskt med det sätt som försöksdjuren i de behandlade grupperna hanteras på.

17.

Doserna av de positiva kontrollämnena bör väljas så att de ger svaga eller måttliga effekter som kritiskt bedömer resultaten och analysens känslighet, men som konsekvent ger positiva dominanta letala effekter. Exempel på positiva kontrollämnen och lämpliga doser ges i tabell 1.

Tabell 1

Exempel på positiva kontrollämnen

Ämne [CAS-nr]

(Referensnummer)

Effektiv dosering) (mg/kg)

(arter av gnagare)

Administreringstid (dagar)

Trietylenmelamin [51-18-3] (15)

0,25 (möss)

1

Cyklofosfamid [50-18-0] (19)

50–150 (möss)

5

Cyklofosfamid [50-18-0] (5)

25–100 (råttor)

1

Etylmetansulfonat [62-50-0] (13)

100-300 (möss)

5

Monomerisk akrylamid [79-06-1] (17)

50 (möss)

5

klorambucil [305-03-3] (14)

25 (möss)

1

Negativa kontroller

18.

Negativa kontroller, behandlade med lösningsmedel eller endast vehikel, och i övrigt behandlade på samma sätt som djuren i behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle (20). I avsaknad av historiska eller publicerade kontrolldata som visar att ingen dominant letalitet eller andra deletära effekter induceras av det valda lösningsmedlet/vehiklen, bör obehandlade kontroller också inkluderas för varje provtagningstillfälle, för att fastställa acceptansen för vehikelkontrollen.

FÖRFARANDE

Antal försöksdjur

19.

Enskilda hanar paras sekventiellt med lämpliga förbestämda intervall (t.ex. veckovis, se punkterna 21 och 23), företrädesvis med en icke tidigare befruktad hona. Antalet hanar per grupp bör bestämmas i förväg så att det är tillräckligt stort (i kombination med antalet parade honor vid varje parningsintervall) för att man ska uppnå den statistiska styrka som krävs för att upptäcka åtminstone en fördubbling i DL-frekvensen (punkt 44).

20.

Antalet honor per parningsintervall bör också bestämmas i förväg utifrån beräkningar av statistisk styrka så att åtminstone en fördubbling i DL-frekvensen kan upptäckas (dvs. tillräckligt många befruktade honor så att minst 400 implantat erhålls) (20) (21) (22) (23) och så att minst en död implantat per analysenhet (dvs. parningsgrupp per dos) kan förväntas (24).

Administreringsperiod och parningsintervall

21.

Antalet parningar efter behandling styrs av behandlingsschemat, och det måste garanteras att samtliga faser i hanens könscellsmognad utvärderas inför DL-försöket 12) (25). För en enskild behandling ska minst fem doser administreras dagligen, och 8 (möss) eller 10 (råttor) parningar ska genomföras veckovis efter den sista behandlingen. Vid administrering av flera doser kan antalet parningar reduceras i proportion till den ökade tidsperioden för administreringen, men målet att utvärdera samtliga faser av spermatogenes (efter 28 dagars exponering räcker det t.ex. med fyra parningar i veckan för att utvärdera samtliga faser av spermatogenes hos möss). Alla behandlings- och parningsscheman ska motiveras vetenskapligt.

22.

Honorna ska stanna kvar hos hanarna minst så länge ägglossningscykeln varar (en vecka täcker ägglossningscykeln hos både möss och råttor). Honor som inte parat sig under ett veckointervall kan användas för nästkommande parningsintervall, eller tills parning har skett, vilket påvisas genom förekomst av sperma i vaginan eller av en vaginalpropp.

23.

Exponeringen och parningsregimen styrs av syftet med DL-försöket. Om syftet är att avgöra om en given kemikalie i sig inducerar DL-mutation bör en hel spermatogenes exponeras (t.ex. för möss 7 veckors exponering med 5–7 behandlingar per vecka), och parning bör genomföras en gång i slutet. Om syftet i stället är att identifiera vilken könscellstyp som är känslig för DL-induktion är en enstaka exponering eller en 5-dagars exponering att föredra.

Dosnivåer

24.

Om det inte redan finns lämpliga data som kan ge vägledning om dosval och ett förberedande test därför utförs för att fastställa koncentrationsintervallet, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium, och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvudundersökningen (26). Syftet med undersökningen bör vara att identifiera högsta tolererbara dos (MTD), som definieras som den dos som tolereras utan bevis för toxicitet som begränsar undersökningen i förhållande till dess varaktighet (t.ex. genom att inducera minskad kroppsvikt eller hematopoietisk systemcytotoxicitet, men inte dödlighet eller tecken på smärta, lidande eller ångest som kräver human avlivning (27).

25.

MTD får inte heller påverka parningsframgången negativt (21).

26.

Testkemikalier med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska doser (t.ex. hormoner och mitogena ämnen) och kemikalier som uppvisar mättnad för toxikokinetiska egenskaper kan vara undantag från kriterierna för dosbestämning och bör utvärderas från fall till fall.

27.

För att inhämta data om dosrespons bör en fullständig undersökning omfatta en negativ kontrollgrupp och minst tre dosnivåer som vanligen skiljer sig med en faktor 2, men inte högre än 4. Om testkemikalien inte visar toxicitet i en dosfinnande studie eller baserat på befintliga uppgifter bör den högsta dosen för engångsdosering vara 2 000 mg/kg kroppsvikt. Om testkemikalien orsakar toxicitet bör MTD vara den högsta dosen, och de dosnivåer som används bör helst omfatta ett intervall från maxdos till en dos som producerar liten eller ingen toxicitet. För icke-toxiska kemikalier med en administreringsperiod på 14 dagar eller mer är den högsta dosen (gränsdosen) 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag. För administreringsperioder på mindre än 14 dagar är den högsta dosen 2 000 mg/kg kroppsvikt/dag.

Administrering av doser

28.

Den förväntade exponeringsvägen för människor bör beaktas vid utformningen av en analys. Därför kan exponeringsvägar (t.ex. via kosten eller dricksvattnet, lokalt subkutant, intravenöst, topikalt, genom inhalation, oralt (via sond) eller genom implantation) väljas som former för motiverad exponering. Exponeringsvägen bör i alla händelser väljas för att säkerställa lämplig exponering av målvävnaden. Intraperitoneal injektion rekommenderas generellt inte eftersom den inte är en avsedd exponeringsväg för människor, och bör endast användas med specifik vetenskaplig motivering. Om testkemikalien blandas i födan eller dricksvattnet bör man, särskilt i fråga om engångsdosering, se till att fördröjningen mellan födo- och vattenintag och provtagning är tillräcklig för att upptäcka effekterna (punkt 31). Den maximala vätskevolymen som kan administreras via sond eller injektion vid ett tillfälle är beroende av försöksdjurets storlek. Volymen bör normalt inte överstiga 1 ml per 100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där högst 2 ml/100 g får användas. Användning av större volymer än så (om det är tillåtet enligt djurskyddslagstiftningen) ska motiveras. Variationer i testvolym bör minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym i relation till kroppsvikten vid alla dosnivåer.

Observationer

29.

Allmänna kliniska observationer av försöksdjuren bör utföras och kliniska tecken registreras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Alla djur bör observeras minst två gånger dagligen under doseringsperioden beträffande morbiditet och mortalitet. Alla djur bör vägas när undersökningen inleds och åtminstone en gång i veckan under undersökningar med upprepad dosering samt vid avlivning. Mätning av foderkonsumtion bör göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas vid varje byte av vatten och minst en gång i veckan. Djur som uppvisar icke-dödliga indikatorer på överskottstoxicitet bör avlivas innan slutförandet av testperioden (27).

Vävnadsinsamling och hantering

30.

Honor ska avlivas under den andra halvan av dräktigheten, nämligen på dräktighetsdag (GD) 13 för möss och GD 14–15 för råttor. Livmödrarna undersöks för att fastställa dominanta letala effekter och bestämma antalet implantat, levande och döda embryon samt gulkroppar.

31.

Livmoderhornen och äggstockarna blottläggs så att gulkropparna kan räknas och foster tas bort, räknas och vägas. Livmodern bör undersökas noggrant så att resorptioner som döljs av levande foster upptäcks och samtliga resorptioner kan räknas. Fosterdödlighet ska registreras. Även antalet framgångsrikt befruktade honor och det totala antalet implantat, preimplantationsförluster samt mortalitet efter implantation (inklusive tidiga och sena resorptioner) ska registreras. Synliga foster kan bevaras i Bouins lösning i minst två veckor och därefter undersökas för större yttre missbildningar (28), i syfte att ge ytterligare information om testämnets effekter på reproduktion och utveckling.

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

32.

Data ska ställas upp i tabellform och ange antal parade hanar samt antal dräktiga och icke dräktiga honor. Resultaten av varje enskild parning, inbegripet identifiering av varje hane och hona, ska anges separat. Parningsintervallet, dosnivån för behandlade hanar samt antalet levande respektive döda implantat per hona ska registreras.

33.

Postimplantationsförlusten beräknas genom dödskvoten för det totala antalet implantat i den behandlade gruppen i förhållande till dödskvoten för det totala antalet implantat i gruppen med vehikel-/lösningsmedelskontroll.

34.

Preimplantationsförlusten beräknas som skillnaden mellan antalet gulkroppar och antalet implantat eller som en minskning av det genomsnittliga antalet implantat per hona i jämförelse med kontrollparningarna. Om preimplantationsförlusten uppskattas ska värdet rapporteras.

35.

Den dominanta letala faktorn (DL-faktorn) beräknas enligt följande: (dödsfall efter implantation/totalt antal implantationer per hona) × 100.

36.

Uppgifter om toxicitet och kliniska tecken (enligt punkt 29) ska redovisas.

Acceptanskriterier

37.

Följande kriterier avgör om testet är godtagbart.

Parallella negativa kontroller stämmer överens med publicerade normer för historiskt negativa data, och laboratoriets historiska kontrolldata finns tillgängliga (se punkterna 10 och 18).

Parallella positiva kontroller framkallar reaktioner som överensstämmer med publicerade normer för historiskt positiv kontrolldata, eller med laboratoriets historiska positiva kontrolldatabas om en sådan finns, och genererar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den negativa kontrollen (se punkterna 17 och 18).

Ett tillräckligt antal implantat och doser ska ha analyserats (punkt 20).

Urvalskriterierna för högsta dos överensstämmer med de kriterier som beskrivs i punkterna 24 och 27.

Utvärdering och tolkning av resultaten

38.

Minst tre behandlade dosgrupper bör analyseras för att ge tillräckligt med uppgifter för dos-responsanalysen.

39.

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses en testkemikalie vara klart positiv om något av följande inträffar:

Åtminstone en av testdoserna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Ökningen är dosrelaterad under åtminstone en testbetingelse (t.ex. ett veckovis parningsintervall) vid utvärdering med ett lämpligt test. och

Några av resultaten faller utanför de godtagbara värdena för negativa kontrolldata, eller fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldata (t.ex. en Poisson-baserad kontrollgräns på 95 %) om sådan finns.

Testkemikalien ska då anses kunna orsaka dominanta letala mutationer i försöksdjurens könsceller. Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna beskrivs i punkt 44. För övriga rekommenderade statistiska metoder, se litteraturen (20) (21) (22) (24) (29). Statistiska tester som används bör betrakta djuret som den experimentella enheten.

40.

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses en testkemikalie vara klart negativ om något av följande inträffar:

Ingen av testdoserna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Det finns ingen dosrelaterad ökning under någon testbetingelse. och

Samtliga resultat ligger inom de godtagbara värdena för negativ kontrolldata, eller för distributionen av laboratoriets historiska negativa kontrolldata (t.ex. en Poisson-baserad kontrollgräns på 95 %) om sådan finns.

Testkemikalien ska då anses inte kunna orsaka dominanta letala mutationer i försöksdjurens könsceller.

41.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller ett tydligt negativt svar.

42.

Om responsen varken är tydligt negativ eller positiv bör uppgifterna utvärderas av en expert och/eller ytterligare undersökningar genomföras med tillgängliga försöksdata, i syfte att etablera resultatets biologiska relevans (t.ex. vid en svag ökning eller en ökning som är på gränsen) och för att avgöra om det positiva resultatet faller utom de acceptabla värdena för negativa kontrolldata, eller utanför laboratoriets historiska negativa kontrolldata (30).

43.

I sällsynta fall är det, trots ytterligare undersökningar, inte möjligt att dra en slutsats om huruvida testkemikalien ger positiva eller negativa resultat och i dessa fall anses undersökningen vara tvetydig.

44.

Statistiska tester som används bör betrakta hanen som den experimentella enheten. Även om data som avser antal (t.ex. antal implantat per hona) kan distribueras enligt Poisson-metoden och även om proportionerna (t.ex. proportionen döda implantat) kan distribueras binomialt brukar sådana data ofta vara överdispergerade (31). Den statistiska analysen bör därför inledas med ett test av över- respektive underdispergering med hjälp av ett varianstest i form av t.ex. Cochrans binomiala varianstest (32) eller Tarones C(α)-test för binomial överdispergering (31) (33). Om inga avvikelser från den binomiala dispergeringen detekteras kan proportionstrender över dosnivå testas med hjälp av Cochran-Armitage trendtest (34), och parvis jämförelser kan göras med kontrollgruppen med hjälp av Fishers signifikanstest (35). Även om inga avvikelser från Poissons dispergering detekteras kan beräkningen testas för trender genom användning av Poissons regression (36), och parvis jämförelser kan göras med kontrollgruppen enligt Possion-modellen genom att parvisa kontraster används (36). Om en betydande över- eller underdispergering upptäcks rekommenderas icke-parametriska metoder (23) (31). Dessa omfattar rankbaserade tester, t.ex. Jonckheere-Terpstra-testet för trender (37) och Mann-Whitney-testet (38) för parvisa jämförelser med gruppen med vehikel-/lösningsmedelskontroll, liksom permutation, ny provtagning eller bootstraptester för trender och parvisa jämförelser med kontrollgruppen (31) (39).

45.

Ett positivt DL-försök tyder på att testkemikalien har genotoxisk verkan på könscellerna hos den behandlade hanen av den testade arten.

46.

Prövning av om de observerade värdena ligger inom eller utanför det historiska kontrollområdet kan ge vägledning för att utvärdera responsens biologiska betydelse (40).

Testrapport

47.

Testrapporten ska innehålla följande information:

Sammanfattning.

 

Testkemikalie:

källa, satsnummer, sista förbrukningsdag om detta anges,

testkemikaliens stabilitet i sig, om den är känd,

löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet, om detta är känt,

Mätning av pH, osmolalitet och fällningar i det odlingsmedium till vilket testkemikalien tillsattes, i förekommande fall.

 

Monokomponentämne:

fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel, renhet samt motsvarande identifiering av föroreningar i förekommande fall och om det är praktiskt möjligt.

 

Multikomponentämne, UVCB-ämnen och blandningar:

karakteriseras så långt som möjligt genom beståndsdelarnas kemiska identitet (se ovan), kvantitativa förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

 

Beredning av testkemikalien:

motivering för val av vehikel.

Löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet/vehikeln, om detta är känt.

Beredning av foder, dricksvatten eller inandningsberedningar.

Analytiska bestämningar av beredningar (t.ex. stabilitet, homogenitet, nominella koncentrationer) om sådana görs.

 

Försöksdjur:

Art/stam som används och motivering av valet.

Djurens antal, ålder och kön.

Ursprung, inhysning, foder osv.

Metod för unik identifiering av djuren.

För korttidsstudier: Individuell vikt hos försöksdjuren vid försökets början och vid slutet av testet. För undersökningar som varar längre än en vecka: Individuella kroppsvikter under studien och foderförbrukning. Kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp bör inkluderas.

 

Testbetingelser:

Positiva och negativa kontrolldata (vehikel/lösningsmedel).

Data från den dosfinnande studien.

Grund för valet av dosnivå.

Uppgifter om beredning av testkemikalien.

Uppgifter om administreringen av testkemikalien.

Grund för administreringsväg.

Metoder för mätning av djurtoxicitet, inklusive, i förekommande fall, histopatologiska eller hematologiska analyser och frekvensen av djurobservationer och mätningar av djurens kroppsvikt.

Metoder för att verifiera att testkemikalien nått målvävnaden eller den allmänna cirkulationen om negativa resultat erhålls.

Faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag) som beräknats genom dietens/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (ppm) och konsumtion, i tillämpliga fall.

Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.

Uppgifter om miljöberikning i burarna.

Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman samt motivering av valen.

Smärtlindringsmetod.

Metod för avlivning.

Förfaranden för att isolera och bevara vävnader.

Ursprungs- och partinummer för alla satser och reagenser (i förekommande fall).

Metoder för räkning av DL-mutanter.

Parningsschema.

Metod för bestämning av om parning skett.

Avlivningstid.

Kriterier för gradering av DL-effekter, inklusive gulkroppar, implantat, resorptioner, preimplantationsförluster samt levande och döda implantat.

 

Resultat:

Djurens kondition före och under hela testperioden, inklusive tecken på toxicitet.

Hanarnas kroppsvikt under behandlings- och parningsperioderna.

Antal parade honor.

Dos/respons-förhållandet, där detta är möjligt.

Data från jämsides behandlad och tidigare negativ kontroll med omfång, medelvärden och standardavvikelser.

Parallella positiva kontrolldata.

Tabelldata för varje moderdjur inklusive: Antal gulkroppar per moderdjur. Antal implantat per moderdjur. Antal resorptioner och preimplantationsförluster per moderdjur. Antal levande implantat per moderdjur. Antal döda implantat per moderdjur. Fostervikter.

En summering av ovanstående data för varje parningsperiod och dos, med DL-frekvenser.

De statistiska analyser och metoder som använts.

 

Diskussion av resultaten.

 

Slutsatser

LITTERATURHÄNVISNINGAR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr 234, OECD, Paris.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al. (Eds.) s. 235–334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., och Wiemann, H. (1978). Standardprotokoll för DL-försök på hanmöss. Sammanställt av arbetsgruppen ”Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., s. 39, 173–185.

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res, 352:159–167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. och Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267–270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. och Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. och Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. och Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80–85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., och Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., s. 33, 239–249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. och Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616–624.

(11)

Marchetti F. och Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., 75:112–129.

(12)

Adler, I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)

Favor J., och Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: s. 21-27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. och Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. och Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371–378.

(16)

James D.A. och Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303–314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. och Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: s. 143-156.

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. och Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, s. 129–156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. och Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)

Generoso W.M. och Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124–141.

(23)

Haseman J.K. och Soares E.R. (1976). The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: s. 277-288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen.,1:353–360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., och Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417–429.

(26)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Rapport från det brittiska toxikologisällskapet/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313–319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J. och Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, s. 127, 291–306.

(29)

Kirkland D.J., (Ed.) (1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. och Thybaud V. (2011). ”Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87–90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res.., 272:35–58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: s. 417-451.

(33)

Tarone, R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: s. 585-590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. I: Encyclopedia of Statistical Sciences, volym 9, Kotz S. och Johnson N. L. (Eds.), s. 334–336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London.

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133–145.

(38)

Conover W.J. (1971). Praktisk icke-parametrisk statistik. John Wiley and Sons, New York

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistiska metoder för gradering och proportioner. John Wiley and Sons, New York.

Tillägg 1

DEFINITIONER

Kemikalie: ett ämne eller en blandning.

Gulkroppar: Den hormonella sekretstruktur som formas kring äggstocken på sidan av den äggledare varifrån ägget har lossnat. Antalet gulkroppar i äggstockarna motsvarar antalet ägg som har avgivits.

Dominant letal mutation: en mutation som sker i en könscell eller som fixeras efter befruktning och som dödar embryon eller foster.

Fertilitetsgrad: antal befruktade honor i förhållande till antal parade honor.

Parningsintervall: tiden mellan exponeringens slut och parningen av behandlade hanar. Genom att kontrollera detta intervall kan de olika kemiska effekterna på olika sorters könsceller bedömas. Vid musparning under första, andra, tredje, fjärde, femte, sjätte, sjunde och åttonde veckan efter exponering mäts effekterna på spermier, kondenserade spermatider, runda spermatider, pakytena spermatider, tidiga spermatocyter, differentierade spermatogonier, differentierande spermatogonier och stamcellsspermatogonier.

Preimplantationsförlust: skillnaden mellan antalet implantat och antalet gulkroppar. Missfall före implantation kan även uppskattas genom att jämföra det totala antalet implantat per hona i behandlade grupper respektive kontrollgrupper.

Postimplantationsförlust: kvoten döda implantat i den behandlade gruppen jämfört med dödskvoten bland samtliga implantat i kontrollgruppen.

Testkemikalie: Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

UVCB-ämne: kemiskt ämne med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter och biologiskt material.

Tillägg 2

TIDSFÖRLOPP FÖR SPERMATOGENESEN HOS DÄGGDJUR

Image 1

Fig. 1: En jämförelse av tiden (antal dagar) det tar för hanliga könsceller att utvecklas i möss, råttor och människor. Ingen DNA-reparation sker under de skuggade perioderna.

Ett schema över spermatogenesen hos möss, råttor och människor visas ovan (hämtat från Adler, 1996). Odifferentierade spermatogonier omfattar A-enkel, A-dubbel och A-justerade spermatogonier (Hess och de Franca, 2008). A-enkel anses vara den sanna stamcellen, och för att bedöma effekterna på stamceller måste det därför gå minst 49 dagar (för möss) mellan den sista injektionen av testkemikalien och parningen.

Litteraturhänvisningar

Adler, I.D (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutat Res, 352:169–172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. I: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

4)

I del B ska kapitel B.23 ersättas med följande:

”B.23   SPERMATOGONIALT TEST AV KROMOSOMAVVIKELSER HOS DÄGGDJUR

INLEDNING

1.

Den här testmetoden motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 483 (2016). Testmetoder ses regelbundet över med avseende på vetenskaplig utveckling, nya bestämmelser samt djurens välbefinnande. Den modifierade versionen av den här testmetoden återspeglar många års erfarenhet av att använda det här testet och visar testets potential för att integreras och kombineras med andra toxicitets- eller genotoxicitetstest. Genom att kombinera olika toxicitetstest kan antalet försöksdjur som behövs för toxicitetstestet potentiellt minskas kraftigt. Denna testmetod är en del av en serie av testmetoder för genetisk toxikologi. Ett OECD-dokument som ger kortfattad information om tester inom genetisk toxikologi och en översikt över de senaste ändringarna av dessa testriktlinjer har utarbetats (1).

2.

Syftet med testet av spermatogoniala kromosomavvikelser in vivo hos däggdjur är att identifiera kemikalier som orsakar strukturella kromosomavvikelser i spermatogoniala celler hos däggdjur (2) (3) (4). Detta test är dessutom relevant för bedömning av genotoxicitet eftersom faktorer rörande in vivo-metabolism, farmakokinetik och DNA-reparationsprocesser är aktiva och bidrar till responsen, även om de kan variera mellan olika arter. Denna testmetod är inte avsedd att mäta numeriska avvikelser, och testet används i regel inte i detta syfte.

3.

Det här testet mäter strukturella kromosomavvikelser (av både kromosom- och kromatidtyp) i spermatogoniala könsceller som är under delning och förväntas därför kunna förutsäga induktion av ärftliga mutationer i dessa könsceller.

4.

Definitioner av centrala begrepp anges i tillägget.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

5.

Gnagare används rutinmässigt i detta test, men även andra arter kan i vissa fall vara lämpliga om det är vetenskapligt motiverat. Standardcytogenetiska beredningar av testiklar från gnagare genererar mitotiska (spermatogonier) och meiotiska (spermatocyter) metafaser. Mitotiska och meiotiska metafaser identifieras utifrån kromosomernas morfologi (4). Detta cytogenetiska in vivo-test används för att påvisa strukturella kromosomavvikelser i spermatogoniala mitoser. Andra målceller omfattas inte av denna metod.

6.

För att upptäcka avvikelser beträffande kromatidtyp i spermatogoniala celler bör den första mitotiska celldelningen efter behandlingen undersökas innan dessa avvikelser omvandlas till avvikelser av kromosomtyp i de efterföljande celldelningarna. En meiotisk kromosomanalys avseende strukturella kromosomavvikelser i diakines–metafas I och metafas II kan ge ytterligare information om behandlade spermatocyter.

7.

Det finns flera generationer av spermatogonier i testiklarna (5), och dessa olika könscellstyper kan uppvisa olika känslighet för kemisk behandling. De avvikelser som upptäcks utgör därför en samlad respons på behandlade spermatogoniala cellpopulationer. Majoriteten av de mitotiska cellerna i testikelberedningarna utgörs av B-spermatogonier, som har en cellcykel på ungefär 26 h (3).

8.

Om det finns bevis för att testkemikalien eller dess metabolit(er) inte kommer att nå testiklarna är det olämpligt att använda detta test.

PRINCIP FÖR TESTMETODEN

9.

Försöksdjuren exponeras för testkemikalien genom en lämplig exponeringsväg och avlivas sedan humant vid en lämplig tid efter behandlingen. Innan de avlivas behandlas djuren med ett ämne som gör att celler stannar upp i metafas (t.ex. kolkicin eller kolkemid®). Kromosomberedningar görs sedan från könsceller och färgas in, varpå de celler som är i metafas analyseras med avseende på kromosomavvikelser.

KVALIFIKATIONSPRÖVNING AV LABORATORIET

10.

Kompetens för detta test ska fastställas genom uppvisad förmåga att reproducera förväntade resultat för strukturella kromosomavvikelsefrekvenser i spermatogonier med positiva kontrollämnen (inklusive svaga responser), t.ex. de som listas i tabell 1, och erhålla negativa kontrollfrekvenser som stämmer överens med acceptabla värden för kontrolldata i litteraturen (t.ex. (2) (3) (6) (7) (8) (9) (10)) eller med laboratoriets historiska kontrollfördelning, om sådan finns.

BESKRIVNING AV TESTMETODEN

Beredningar

Val av djurart

11.

Friska yngre adulta exemplar från normala laboratoriestammar bör användas. I regel används hanmöss, men hanar av andra lämpliga däggdjursarter kan användas om detta kan motiveras vetenskapligt och om det är en förutsättning för att samköra detta test med en annan testmetod. Om andra arter än gnagare används bör en vetenskaplig motivering lämnas i rapporten.

Inhysnings- och utfodringsförhållanden

12.

För gnagare bör temperaturen i djurutrymmena vara 22 °C (± 3 o). Den relativa fuktigheten bör helst vara 50–60 %, men minst 40 %, och bör helst inte överstiga 70 % utom när rummet rengörs. Artificiell belysning bör användas, med en dygnsrytm på 12 timmar ljus och 12 timmar mörker. För utfodring kan konventionellt laboratoriefoder användas med obegränsad tillgång till dricksvatten. Valet av foder kan påverkas av behovet av att säkerställa en lämplig blandning av en testkemikalie när den administreras genom denna väg. Gnagare bör inhysas i små grupper (högst fem per bur), förutsatt att inget aggressivt beteende kan förväntas, och företrädesvis i fasta golvburar med lämplig miljöberikning. Djuren får hållas individuellt om det är vetenskapligt motiverat.

Förberedelse av djuren

13.

Friska yngre adulta hanar (8–12 veckor gamla vid behandlingsstarten) används vanligen, och dessa väljs slumpvis ut till kontroll- och behandlingsgrupperna. Djuren ska ha en unik identifiering som appliceras med en human och minimalt invasiv metod (t.ex. ringmärkning, taggar, mikrochipp eller biometrisk identifiering, men inte öron- eller tassclips). De bör vänjas vid förhållandena i laboratoriet under minst fem dagar. Burarna placeras på sådant sätt att eventuella verkningar på grund av placeringen minimeras. Korskontaminering av den positiva kontrollen och testkemikalien bör undvikas. Vid testets början bör variationen i vikt mellan individuella djur vara minimal, och den får inte överstiga ± 20 %.

Beredning av doser

14.

Fasta testkemikalier bör lösas upp eller suspenderas i lämpliga lösningsmedel eller vehiklar eller blandas i foder eller dricksvatten innan dosen administreras till djuren. Testkemikalier i flytande form kan doseras direkt eller spädas ut före doseringen. Vid inhalationexponering kan testkemikalier administreras såsom gas, ånga eller en fast/flytande aerosol, beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper. Nygjorda beredningar av testkemikalien bör användas om inte stabilitetsdata visar att lagringen är acceptabel och lämpliga lagringsförhållanden bör fastställas.

Testbetingelser – Lösningsmedel/vehikel

15.

Lösningsmedlet/vehikeln bör inte ge upphov till toxiska effekter vid de dosnivåer som används och bör inte kunna reagera kemiskt med testkemikalierna. Om andra lösningsmedel/vehiklar än de gängse används bör det finnas referensdata som visar att de är kompatibla. Det rekommenderas att man alltid när det är möjligt överväger vattenbaserade lösningsmedel/vehiklar som första alternativ. Exempel på vanliga kompatibla lösningsmedel/vehiklar är vatten, fysiologisk saltlösning, metylcellulosalösning, karboximetylcellulosa natriumsaltlösning, olivolja och majsolja. I avsaknad av historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga strukturella kromosomavvikelser eller andra skadliga effekter induceras av de valda atypiska lösningsmedlen/vehiklarna bör en preliminär undersökning utföras för att fastställa acceptansen för lösningsmedels-/vehikelkontrollen.

Positiva kontroller

16.

Parallella positiva kontrolldjur bör alltid användas såvida inte laboratoriet har påvisat sin duglighet för testet i fråga och utfört testet rutinmässigt under de senaste åren (t.ex. under de senaste 5 åren). Om en parallell positiv kontrollgrupp inte ingår bör klassificeringskontroller (fasta och ofläckade utstryksglas) inkluderas i varje försök. Detta kan åstadkommas genom att inbegripa lämpliga referensprover i klassificeringen av undersökningen som har erhållits och lagrats från ett separat positivt kontrollförsök som utförs med jämna mellanrum (t.ex. var 6:e till 18:e månad) på det laboratorium där testet utförs, t.ex. under kvalifikationsprövning och vid behov med jämna mellanrum därefter.

17.

Positiva kontrollämnen bör på ett tillförlitligt sätt ge en detekterbar ökning i frekvensen av celler med strukturella kromosomavvikelser över den spontana nivån. Positiva kontrolldoser bör väljas på ett sådant sätt att effekterna är tydliga men inte omedelbart avslöjar identiteten hos de kodade proverna för bedömaren. Exempel på positiva kontrollämnen ges i tabell 1.

Tabell 1

I tabellen nedan ges några exempel på positiva kontrollämnen

Ämnen [CAS-nr] (referensnummer)

Cyklofosfamid (monohydrat) [CAS-nr 50-18-0 (CAS-nr 6055-19-2)] (9)

Cyklohexylamin [CAS-nr 108-91-8] (7)

Mitomycin C [CAS-nr 50-07-7] (6)

Monomerisk akrylamid [CAS-nr 79-06-1] (10)

Trietylenmelamin [CAS-nr 51-18-3] (8)

Negativa kontroller

18.

Negativa kontroller, behandlade med lösningsmedel eller endast vehikel, och i övrigt behandlade på samma sätt som behandlingsgrupperna, bör inkluderas för varje provtagningstillfälle. I avsaknad av historiska eller publicerade kontrolldata som visar att inga kromosomavvikelser eller andra skadliga effekter induceras av de valda lösningsmedlen/vehiklarna bör obehandlade kontrolldjur också inkluderas för varje provtagningstillfälle för att fastställa acceptansen för vehikelkontrollen.

FÖRFARANDE

Antal försöksdjur

19.

Gruppernas storlek bör fastställas vid inledning av studien, och målet bör vara minst fem hanar per grupp. Detta antal djur per grupp anses vara tillräckligt för att ge lämplig statistisk styrka (dvs. i regel kan minst en fördubbling i kromosomavvikelsefrekvensen detekteras vid en negativ kontrollnivå på 1,0 % eller mer med 80 % sannolikhet vid en signifikansnivå på 0,05) (3) (11). Som en vägledning för ett vanligt krav på maximalt antal djur skulle det krävas 45 djur för en benmärgsundersökning med två provtagningstillfällen, tre dosgrupper och en parallell negativ kontrollgrupp plus en positiv kontrollgrupp (fem djur i varje grupp).

Behandlingsschema

20.

Testkemikalierna administreras i regel vid ett tillfälle (dvs. enstaka behandling), men andra doseringsmetoder kan användas under förutsättning att de är vetenskapligt motiverade.

21.

I den högsta dosgruppen används två provtagningstider efter behandlingen. Eftersom den tid som krävs för upptag och metabolism av testkemikalien såväl som dess effekt på cellcykelns kinetik kan påverka den optimala tiden för detektion av kromosomavvikelser rekommenderas en tidig och en sen provtagning, ca 24 respektive 48 timmar efter behandling. För övriga doser än maxdosen ska en tidig provtagning göras 24 timmar efter behandlingen (kortare eller lika lång som cellcykeltiden för B-spermatogonier och därför optimal för att detektera de första metafaserna efter behandlingen), om ingen annan provtagningstid anses mer lämplig och därför är motiverad.

22.

Andra provtagningstider kan användas. När det t.ex. gäller fall där kemikalier kan ge upphov till S-oberoende effekter, kan tidigare provtagningstider (dvs. kortare än 24 h) vara lämpliga.

23.

En behandling med upprepade doser kan användas, t.ex. i kombination med ett test avseende en annan endpoint för vilket en 28 dagars administreringsperiod används (t.ex. TM B.58), men i så fall behövs ytterligare djurgrupper för att förena olika provtagningstider. Det måste fastställas att ett sådant schema är vetenskapligt lämpligt och motiveras från fall till fall.

24.

Innan djuren avlivas bör de injiceras intraperitonealt med en lämplig dos av ett ämne som stoppar celldelningen i metafas (t.ex. kolkemid® eller kolchicin). Provtagning på försöksdjur sker därefter med lämpliga intervall. För möss och råttor är detta intervall ca 3–5 timmar.

Dosnivåer

25.

Om det inte finns lämpliga data från andra relevanta undersökningar som kan ge vägledning om dosval och en preliminär undersökning därför utförs för att fastställa omfattningen, bör denna undersökning utföras i samma laboratorium och med samma arter, stammar, kön och behandlingsschema som senare ska användas i huvudundersökningen enligt gällande rekommendationer för dosfinnande studier (12). Syftet med undersökningen bör vara att identifiera högsta tolererbara dos (MTD), som definieras som den dos som inducerar små toxiska effekter i förhållande till undersökningsperiodens varaktighet (t.ex. onormalt beteende eller onormala reaktioner, mindre viktminskningar eller hemapatopoietisk cytotoxicitet) men inte dödlighet eller tecken på smärta, lidande eller ångest, vilket kräver avlivning av försöksdjuren i fråga (13).

26.

Den högsta dosen kan även definieras som en dos vilken ger upphov till någon indikation på toxicitet i de spermatogoniala cellerna (t.ex. en reduktion i kvoten av spermatogoniala mitoser hos den första och den andra meiotiska metafasen). Denna reduktion bör inte överskrida 50 %.

27.

Testkemikalier med specifika biologiska verkningar vid låga icke-toxiska doser (t.ex. hormoner och mitogena ämnen) och kemikalier som uppvisar mättnad för toxikokinetiska egenskaper kan vara undantag från kriterierna för dosbestämning och bör utvärderas från fall till fall.

28.

För att inhämta data om dosrespons bör en fullständig undersökning omfatta en negativ kontrollgrupp (punkt 18) och minst tre dosnivåer som vanligen separeras av en faktor på minst 2 men max 4. Om testkemikalien inte visar toxicitet i en dosfinnande studie eller baserat på befintliga uppgifter bör den högsta dosen för engångsdosering vara 2 000 mg/kg kroppsvikt. Men om testkemikalien orsakar toxicitet bör MTD vara den högsta administrerade dosen, och de dosnivåer som används bör helst omfatta ett intervall från maxdos till en dos som producerar liten eller ingen toxicitet. När toxicitet observeras i målvävnaden (dvs. testiklarna) vid alla testade dosnivåer rekommenderas fortsatta undersökningar med icke-toxiska doser. Undersökningar som syftar till att mer grundligt karakterisera kvantitativ information om dosrespons kan kräva ytterligare dosgrupper. Dessa gränser kan variera för vissa typer av testkemikalier (t.ex. humanläkemedel) som omfattas av särskilda krav. Om testkemikalien orsakar toxicitet ska gränsdosen plus två lägre doser (enligt beskrivningen ovan) väljas ut. För administreringsperioder på 14 dagar eller mer är gränsdosen 1 000 mg/kg kroppsvikt/dag, och för administreringsperioder på mindre än 14 dagar är gränsdosen 2 000 mg/kg/kroppsvikt/dag.

Administrering av doser

29.

Den förväntade exponeringsvägen för människor bör beaktas vid utformningen av en analys. Därför kan exponeringsvägar (t.ex. via kosten, via dricksvattnet, lokalt subkutant, intravenöst, oralt (via sond), via inhalation eller genom implantation) väljas som motiverad exponeringsväg. Exponeringsvägen bör i alla händelser väljas för att säkerställa lämplig exponering av målvävnaden. Intraperitoneal injektion rekommenderas inte, såvida den inte kan motiveras vetenskapligt, eftersom den inte är en fysiologiskt relevant exponeringsväg för människor. Om testkemikalien blandas i födan eller dricksvattnet bör man, särskilt i fråga om engångsdosering, se till att fördröjningen mellan födo- och vattenintag och provtagning är tillräcklig för att upptäcka effekterna (se punkt 33). Den maximala vätskevolymen som kan administreras via sond eller injektion vid ett tillfälle är beroende av försöksdjurets storlek. Volymen bör normalt inte överstiga 1 ml/100 g kroppsvikt, utom för vattenlösningar där högst 2 ml/100 mg kroppsvikt får användas. Användning av större volymer än så (om det är tillåtet enligt djurskyddslagstiftningen) ska motiveras. Variationer i testvolym bör minimeras genom justering av koncentrationen för att säkerställa en konstant volym i relation till kroppsvikten vid alla dosnivåer.

Observationer

30.

Allmänna kliniska observationer av försöksdjuren bör utföras och kliniska tecken registreras minst en gång per dag, helst vid samma tidpunkt med hänsyn till maximalt förväntade effekter efter doseringen. Minst två gånger dagligen bör djuren observeras beträffande morbiditet och mortalitet. Alla djur bör vägas när undersökningen inleds, åtminstone en gång i veckan under undersökningar med upprepad dosering och vid avlivning. För undersökningar som varar minst en vecka bör mätning av foderkonsumtion göras minst en gång i veckan. Om testkemikalien tillförs via dricksvattnet bör även vattenkonsumtionen mätas vid varje byte av vatten och minst en gång i veckan. Djur som uppvisar icke-dödliga indikatorer på överskottstoxicitet bör avlivas innan slutförandet av testperioden (13).

Kromosompreparation

31.

Omedelbart efter avlivning tas cellsuspensioner ut från en eller båda testiklarna, exponeras för en hypoton lösning och fixeras i enlighet med standardprotokoll, t.ex. (2) (14) (15). Cellerna stryks sedan ut på utstryksglas och färgas in (16) (17). Alla utstryksglas bör kodas så att deras identitet är okänd för den som utför graderingen.

Analys

32.

Minst 200 väl spridda metafaser bör graderas för varje djur (3) (11). Om den historiska negativa kontrollfrekvensen är < 1 %, bör mer än 200 celler graderas per djur för att öka den statistiska styrkan (3). Infärgningsmetoder som tillåter identifiering av centromeren ska användas.

33.

Avvikelser av kromatid- och kromosomtyp bör registreras separat och klassificeras enligt subtyper (brott, utbyten). Luckor ska registreras men inte tas med i bedömningen av huruvida en kemikalie orsakar en betydande ökning i antal celler med kromosomavvikelser. Laboratoriets förfaranden ska säkerställa att analysen av kromosomavvikelser utförs av välutbildade bedömare. Eftersom beredningen av utstryksglas ofta resulterar i brott på en del av de celler som är i metafas med förlust av kromosomer som följd, bör de celler som påträffas därför innehålla ett centromererantal på minst 2n± 2, där n är antalet haploider för kromosomerna hos den arten.

34.

Även om syftet med testet är att detektera strukturella kromosomavvikelser, är det viktigt att notera frekvenserna för polyploidi och endoreduplikation när dessa händelser observeras (se punkt 44).

DATA OCH RAPPORTERING

Behandling av resultaten

35.

Individuella djurdata bör presenteras i tabellform. För varje individuellt försöksdjur bör antalet celler med strukturella kromosomavvikelser och antalet kromosomavvikelser per cell utvärderas. Avvikelser av kromatid- och kromosomtyp som klassificeras enligt subtyper (brott, utbyten) bör anges separat, med antal och intervall för försöks- och kontrollodlingarna. Luckor ska anges separat. Frekvensen av luckor rapporteras men tas i regel inte med i analysen av den totala strukturella avvikelsefrekvensen. Andelen polyploida celler och celler med endoreduplicerade kromosomer ska rapporteras om dessa företeelser observeras.

36.

Data om toxicitet och kliniska tecken (enligt punkt 30) ska redovisas.

Acceptanskriterier

37.

Följande kriterier avgör om testet är godtagbart.

Parallella negativa kontroller stämmer överens med publicerade normer för historiskt negativa data, vilka i regel förväntas ligga på > 0 % och ≤ 1,5 % celler med kromosomavvikelser, samt med laboratoriets historiska kontrolldata, om sådana finns (se punkterna 10 och 18).

Parallella positiva kontroller framkallar responser som överensstämmer med publicerade normer för historiskt positiva kontrolldata, eller med laboratoriets historiska positiva kontrolldatabas om en sådan finns, och genererar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den negativa kontrollen (se punkterna 17 och 18).

Ett tillräckligt antal celler och doser ska ha analyserats (se punkterna 28 och 32).

Urvalskriterierna för högsta dos överensstämmer med de kriterier som beskrivs i punkterna 25 och 26.

38.

Om såväl mitos som meios observeras bör förhållandet mellan spermatogoniala mitoser och de första och andra meiotiska metafaserna fastställas som ett mått på cytotoxicitet för alla behandlade och negativa kontrollförsöksdjur i ett totalt prov på 100 delande celler per djur. Om endast mitos observeras bör mitosindexet bestämmas i minst 1 000 celler för varje försöksdjur.

Utvärdering och tolkning av resultaten

39.

Minst tre behandlade dosgrupper bör analyseras för att ge tillräckligt med uppgifter för dos-responsanalysen.

40.

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses en testkemikalie vara klart positiv om något av följande inträffar:

Åtminstone en av testdoserna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Ökningen är dosrelaterad vid minst ett provtagningstillfälle.

Några av resultaten faller utanför de godtagbara värdena för negativa kontrolldata, eller för fördelningen av laboratoriets historiska negativa kontrolldata (t.ex. en Poisson-baserad kontrollgräns på 95 %) om sådan finns.

Testkemikalien ska då anses kunna orsaka kromosomavvikelser i försöksdjurens spermatogoniala celler. Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns även i litteraturen (11) (18). Statistiska tester som används bör betrakta djuret som den experimentella enheten.

41.

Under förutsättning att samtliga acceptanskriterier är uppfyllda anses en testkemikalie vara klart negativ om något av följande inträffar:

Ingen av testdoserna uppvisar en statistiskt signifikant ökning jämfört med den parallella negativa kontrollen.

Det finns ingen dosrelaterad ökning under någon testbetingelse. och

Samtliga resultat ligger inom de godtagbara värdena för negativ kontrolldata, eller för distributionen av laboratoriets historiska negativa kontrolldata (t.ex. en Poisson-baserad kontrollgräns på 95 %) om sådan finns.

Testkemikalien ska då anses oförmögen att orsaka kromosomavvikelser i försöksdjurens spermatogoniala celler. Rekommendationer om de lämpligaste statistiska metoderna finns även i litteraturen (11) (18). Ett negativt resultat utesluter inte möjligheten att kemikalien kan orsaka kromosomavvikelser under senare icke-undersökta utvecklingsfaser, eller genmutationer.

42.

Det finns inget krav på verifiering av ett tydligt positivt eller ett tydligt negativt svar.

43.

Om responsen varken är tydligt negativ eller positiv bör uppgifterna utvärderas av en expert och/eller ytterligare undersökningar genomföras med tillgängliga försöksdata, i syfte att etablera resultatets biologiska relevans (t.ex. vid en svag ökning eller en ökning som är på gränsen) och för att avgöra om det positiva resultatet faller utom de acceptabla värdena för negativa kontrolldata, eller utanför laboratoriets historiska negativa kontrolldata (19).

44.

I sällsynta fall är det, trots ytterligare undersökningar, inte möjligt att dra en slutsats om huruvida testkemikalien ger positiva eller negativa resultat och i dessa fall anses undersökningen vara tvetydig.

45.

En ökning av antalet polyploida celler kan tyda på att testkemikalien har potential att inhibera mitotiska processer och att inducera numeriska kromosomavvikelser (20). En ökning av antalet celler med endoreduplicerade kromosomer kan tyda på att testkemikalien har potential att inhibera cellcykelns fortskridande (21) (22), vilket är en annan slags mekanism för induktion av numeriska kromosomförändringar än inhibition av mitotiska processer (se punkt 2). Därför bör förekomsten av polyploida celler och celler med endoreduplicerade kromosomer registreras separat.

Testrapport

46.

Testrapporten ska innehålla följande information:

 

Sammanfattning.

 

Testkemikalie:

källa, satsnummer, sista förbrukningsdag om detta anges,

testkemikaliens stabilitet i sig, om den är känd,

löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet, om detta är känt,

Mätning av pH, osmolalitet och fällningar i det odlingsmedium till vilket testkemikalien tillsattes, i förekommande fall.

 

Monokomponentämne:

fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper,

kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel, renhet samt motsvarande identifiering av föroreningar i förekommande fall och om det är praktiskt möjligt.

 

Multikomponentämne, UVCB-ämnen och blandningar:

karakteriseras så långt som möjligt genom beståndsdelarnas kemiska identitet (se ovan), kvantitativa förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

 

Beredning av testkemikalien:

Motivering för val av vehikel.

Löslighet och stabilitet av testkemikalien i lösningsmedlet/vehikeln.

Beredning av foder, dricksvatten eller inandningsberedningar.

Analytiska bestämningar av beredningar (t.ex. stabilitet, homogenitet, nominella koncentrationer) om sådana görs.

 

Försöksdjur:

art/stam som används och motivering av valet.

Antal djur och deras ålder.

Ursprung, inhysning, foder osv.

Metod för unik identifiering av djuren.

För korttidsstudier: Individuell vikt hos försöksdjuren vid testets början och slut. För undersökningar som varar längre än en vecka: Individuella kroppsvikter under studien och foderförbrukning. Kroppsviktsintervallet, medelvärde och standardavvikelse för varje grupp bör inkluderas.

 

Testbetingelser:

Positiva och negativa kontrolldata (vehikel/lösningsmedel).

Data från en preliminär undersökning, om en sådan har utförts.

Grund för valet av dosnivå.

Grund för administreringsväg.

Uppgifter om beredning av testkemikalien.

Uppgifter om administreringen av testkemikalien.

Grund för avlivningstider.

Metoder för mätning av djurtoxicitet, inklusive, i förekommande fall, histopatologiska eller hematologiska analyser och frekvensen av djurobservationer och mätningar av djurens kroppsvikt.

Metoder för att verifiera att testkemikalien nått målvävnaden eller den allmänna cirkulationen om negativa resultat erhålls.

Faktisk dos (mg/kg kroppsvikt/dag) som beräknats genom dietens/dricksvattnets testkemikaliekoncentration (ppm) och konsumtion, i tillämpliga fall.

Uppgifter om foder- och vattenkvalitet.

Detaljerad beskrivning av behandlings- och provtagningsscheman samt motivering av valen.

Avlivningsmetod.

Smärtlindringsmetod (i förekommande fall).

Förfaranden för att isolera vävnader.

Identitet hos kemikalie som stoppar cellcykeln i metafas, dess koncentration och behandlingens varaktighet.

Metoder för preparation av utstryksglas.

Kriterier för hur avvikelser påvisas.

Antalet analyserade celler per försöksdjur.

Kriterier för bedömning av om undersökningarna är positiva, negativa eller tvetydiga.

 

Resultat:

Djurens kondition före och under hela testperioden, inklusive tecken på toxicitet.

Kropps- och organvikt vid avlivning (om flera behandlingar används ska även kroppsvikter under behandlingarna kontrolleras).

Tecken på toxicitet.

Mitosindex:

Omfattning av spermatogoniala celler vid första och andra meiotiska metafasen, eller annat bevis på att målvävnaden har exponerats.

Typ av och antal avvikelser, angivna separat för varje försöksdjur.

Totalt antal avvikelser per grupp med medelvärden och standardavvikelser.

Antal celler med avvikelser per grupp med medelvärden och standardavvikelser.

Dos/respons-förhållandet, där detta är möjligt.

De statistiska analyser och metoder som använts.

Samtidiga negativa kontrolldata.

Historiska negativa kontrolldata med intervall, medelvärden, standardavvikelser, samt ett 95 % konfidensintervall (i förekommande fall) eller publicerad historiska negativa kontrolldata som använts för att godkänna testresultaten.

Parallella positiva kontrolldata.

Förändringar i ploiditet om sådana påvisas, inklusive frekvenser för polyploida och/eller endoreduplicerade celler.

 

Diskussion av resultaten

 

Slutsats

LITTERATUR

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris

(2)

Adler, I.-D. (1984). Adler, I. D. (1984), Cytogenetic tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Venitt och J. M. Parry (eds). IRL Press, Oxford, Washington DC, s. 275–306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)

Russo, A (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. I: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477-484.

(7)

Cattanach, B.M., och Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)

Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): s. 313–324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. och Hayashi, M. (1998). Recommendations for statistical designs of In Vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Res.,417, s. 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. och Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, s. 313–319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

(14)

Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, s. 207–209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. och Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Miljö. Mutagen., 1, s. 291–294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G., och Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, s. 289–294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. och Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetic Assays, i: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141.

(18)

Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. och Savage, J. R. K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays, i: D. J. Kirkland (ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Dala. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. och Thybaud, V. (2011). Compilation and use of genetic toxicity historical control Data. Mutation Res., 723, s. 87–90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. och Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)

Huang, Y., Change, C. och Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, s. 1362–1364.

(22)

Locke-Huhle, C (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., vol. 119, s. 403–413.

Tillägg

DEFINITIONER

Aneuploidi: alla avvikelser från det normala antalet diploida (eller haploida) kromosomer med en eller flera kromosomer, men inte med hela uppsättningar kromosomer (polyploidi).

Centromer: region(er) på en kromosom där kärnspolefibrer är fästa under celldelning, vilket möjliggör en ordnad rörelse av dotterkromosomerna mot dottercellernas poler.

Kemikalie: ett ämne eller en blandning.

Kromosomdiversitet: Variation i kromosomform (t.ex. metacentrisk, akricentisk etc.) och kromosomstorlek.

Avvikelse av kromatidtyp: strukturell kromosomskada uttryckt som brott på enstaka kromatider eller brott och återförening mellan kromatider.

Avvikelse av kromosomtyp: strukturell kromosomskada uttryckt som brott, eller som brott och återförening, på båda kromatiderna på samma ställe.

Klastogen: alla kemikalier som orsakar strukturella kromosomavvikelser i populationer av celler eller organismer.

Lucka: en akromatisk skada som är mindre än bredden på en kromatid, och med ett minimum av missanpassning hos kromatiderna.

Genotoxisk: allmän term som omfattar alla typer av DNA- och kromosomskador, inklusive brott, deletioner, addukter, modifieringar av och kopplingar mellan nukleotider, omlagringar, mutationer, kromosomavvikelser och aneuploidi. Inte alla typer av genotoxiska effekter leder till mutationer eller stabila kromosomskador.

Mitosindex (MI): den andel celler som är i metafas delat med det totala antalet celler som kan observeras i en cellpopulation, en indikation på graden av tillväxt hos populationen ifråga.

Mitos: delning av cellkärnan, i regel bestående av profas, prometafas, metafas, anafas och telofas.

Mutagent ämne: ämne som producerar en ärftlig ändring av DNA-basparssekvensen(-erna) i gener eller i kromosomstrukturen (kromosomavvikelser).

Numerisk anomali: en förändring av antalet kromosomer från det normala antalet karakteristiskt för det försöksdjur som används.

Polyploidi: en multipel av det haploida kromosomantalet (n) som skiljer sig från det diploida (dvs. 3n, 4n osv.).

Strukturell avvikelse: en förändring i kromosomstrukturen som kan påvisas genom mikroskopisk undersökning av celler i metafas och som uppträder i form av deletioner och fragment samt translokationer.

Testkemikalie: Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

UVCB-ämne: kemiskt ämne med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter och biologiskt material.

(5)

I del B ska kapitel B.40 ersättas med följande:

”B.40   HUDKORROSION IN VITRO: BESTÄMNING AV TRANSKUTANT ELEKTRISKT MOTSTÅND (TER)

INLEDNING

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 430 (2015). Hudkorrosion innebär att det uppstår en irreversibel skada på huden i form av synlig nekros genom epidermis och in i dermis, efter applicering av en testkemikalie (enligt definitionen i Förenta nationernas globalt harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1) och Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) (1)). Den uppdaterade testmetoden B.40 är en in vitro-metod för att identifiera frätande och icke frätande ämnen och blandningar i enlighet med GHS (1) och CLP.

2.

Bedömningen av hudkorrosivitet har i regel inneburit användning av försöksdjur (TM B.4, likvärdig med OECD TG 404 som antogs 1981 och reviderades 1992, 2002 och 2015) (2). Utöver den föreliggande metoden TM B.40 har andra in vitro-metoder för testning av kemikaliers potential att orsaka hudkorrosion validerats och antagits, t.ex. TM B.40a (likvärdig med OECD TG 431) (3) och TM B.65 (likvärdig med OECD TG 435) (4), vilka också kan identifiera underkategorier av frätande kemikalier om så krävs. Flera validerade in vitro-testmetoder har antagits, t.ex. TM B.46 (likvärdig med OECD TG 439 (5)), för att användas i tester avseende hudirritation. I OECD:s vägledningsdokument om ett integrerat synsätt på testning och bedömning (IATA) av hudkorrosion och hudirritation beskrivs flera moduler som grupperar olika informationskällor och analysverktyg, och där ges också i) vägledning om hur tillgängliga testdata och icke testdata kan integreras och användas i bedömningen av kemikaliers potential för hudirritation och hudkorrosion, och ii) förslag på hur man ska gå till väga när det krävs ytterligare testning (6).

3.

Denna testmetod gäller endpointen hudkorrosion hos människa. Den baseras på testmetoden TER, som testar transkutant elektriskt motstånd i råtthud och där hudbitar används för att identifiera frätande ämnen utifrån deras förmåga att skada den normala integriteten hos hudens hornlager och försämra dess barriärfunktion. OECD:s motsvarande testriktlinje antogs första gången 2004 och uppdaterades 2015 för att överensstämma med vägledningsdokumentet om IATA.

4.

För att utvärdera in vitro-testning av hudkorrosion för lagstadgade ändamål utfördes förvalideringsstudier (7) följt av en formell valideringsstudie av TER-testmetoden för bedömning av hudkorrosion på råtthud (8) (9) (10) (11). Resultaten av dessa studier ledde till rekommendationen att TER-testmetoden (som betecknas validerad referensmetod – VRM) kunde användas för lagstadgade ändamål i syfte att bedöma hudkorrosivitet in vivo (12) (13) (14).

5.

Innan en annan, liknande eller modifierad, in vitro-TER-testmetod för hudkorrosion än VRM kan användas för lagstadgade ändamål måste metodens tillförlitlighet, relevans (noggrannhet), och begränsningar för det föreslagna syftet bestämmas för att garantera dess likhet med VRM i enlighet med kraven i prestandastandarderna (PS) (15). OECD:s ömsesidiga dataacceptans kan endast garanteras efter att eventuella föreslagna testmetoder, nya eller uppdaterade, som följer PS har granskats och inkluderats i motsvarande OECD-testriktlinjer.

DEFINITIONER

6.

Definitioner av begreppen finns i tillägget.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

7.

En valideringsstudie (10) och andra publicerade studier (16) (17) har visat att TER-testmetoden för råtthud kan skilja mellan ämnen som man vet är frätande respektive icke frätande för huden med en generell känslighet på 94 % (51/54) och en specificitet på 71 % (48/68) från en databas med 122 ämnen.

8.

Denna testmetod gäller hudkorrosion in vitro. Den möjliggör identifiering av frätande och icke frätande testkemikalier i enlighet med GHS/CLP. En begränsning med testmetoden som påvisats i valideringsstudierna (8) (9) (10) (11) är att den inte tillåter underkategorisering av frätande ämnen och blandningar i enlighet med GHS/CLP. Gällande regelverk inom området avgör hur testmetoden kommer att användas. Denna testmetod ger visserligen inte adekvat information om hudirritation, men det bör nämnas att TM B.46 är särskilt avsedd för hälsoeffekten hudirritation in vitro (5). För en fullständig bedömning av lokala effekter på huden efter en enstaka dermal exponering, se OECD:s vägledningsdokument om IATA (6).

9.

Ett stort spektrum av kemikalier som framför allt motsvarar ämnen har testats vid den validering som ligger till grund för denna testmetod, och valideringsstudiens empiriska databas uppgick till totalt 60 ämnen och omfattade en mängd olika kemiska klasser (8) (9). Utifrån de samlade data som finns tillgängliga är testmetoden tillämplig på en mängd olika kemiska klasser och fysikaliska tillstånd, inklusive vätskor, halvfasta ämnen, fasta ämnen och vaxer. Det bör nämnas att ett jämförelsevis litet antal vaxer och frätande fasta ämnen bedömdes under valideringen. Detta beror på att det är svårt att få fram testobjekt med lämpliga referensdata för vissa fysikaliska tillstånd. Vätskorna kan vara vattenbaserade eller inte. fasta ämnen kan vara lösliga eller olösliga i vatten. Om det finns bevis för att testmetoden inte är tillämplig på en specifik ämneskategori bör den inte användas för denna kategori. Eftersom denna testmetod är applicerbar på ämnen anses den även kunna användas för blandningar. Med tanke på att blandningar omfattar ett brett spektrum av kategorier och sammansättningar och det i nuläget endast finns begränsad information om testning av blandningar bör dock testmetoden inte användas på blandningskategorier för vilka den har visat sig vara icke-applicerbar (t.ex. i enlighet med den strategi som föreslås av Eskes m.fl., 2012) (18). Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag. Gaser och aerosoler har ännu inte bedömts genom valideringsstudier (8) (9). Även om det är tänkbart att de kan testas med TER-testmetoden så tillåter den aktuella testmetoden inte testning av gaser och aerosoler.

TESTPRINCIP

10.

Testkemikalien appliceras och får verka i upp till 24 timmar på den epidermala ytan av hudbitar i ett testsystem med två kammare där hudbitarna fungerar som skiljemembran mellan kamrarna. Hudbitarna tas från humant avlivade, 28–30 dagar gamla råttor. Frätande kemikalier identifieras genom sin förmåga att försämra hornlagrets normala integritet och barriärfunktion, vilket kan mätas som en minskning av det transkutana elektriska motståndet (TER) under ett visst tröskelvärde (16) (se punkt 32). För TER för råtthud har man valt ett brytvärde på 5kΩ, baserat på omfattande data för ett brett urval av ämnen där den absoluta majoriteten av värdena antingen låg klart över (ofta > 10kΩ) eller klart under (ofta < 3kΩ) detta värde (16). I allmänhet sänker testkemikalier som inte har någon frätande verkan på djur inte TER under detta brytvärde, oavsett om de orsakar hudirritation eller inte. Vidare kan användning av andra hudberedningar eller annan utrustning ändra brytvärdet, vilket kräver ytterligare validering.

11.

Ett färgämnesbindningssteg ingår i testförfarandet för verifiering av positiva resultat vid TER-värden runt 5 kΩ. Färgämnesbindningssteget visar om ökningen av jonpermeabiliteten beror på fysisk nedbrytning av hornlagret. TER-metoden med råtthud har visat sig kunna förutsäga in vivo-korrosivitet på kanin, fastställd enligt testmetod B.4 (2).

DEMONSTRATION AV KOMPETENS

12.

Före rutinanvändning av den TER-testmetod för råtthud som är kopplad till den här testmetoden bör laboratorierna visa sin tekniska kompetens genom att korrekt klassificera de tolv kvalifikationsämnen som rekommenderas i tabell 1. När ett listat ämne inte finns tillgängligt eller när det är motiverat kan ett annat ämne som det finns adekvat in vivo- och in vitro- referensdata för (t.ex. från listan över referenskemikalier (16)) användas, förutsatt att samma urvalskriterier tillämpas som de som beskrivs i tabell 1.

Tabell 1

Lista på kvalifikationsämnen  (2)

Ämne

CAS-nr

Kemisk klass (3)

GHS/CLP Kat. baserade på in vivo-resultat (4)

VRM Kat. baserade på in vitro-resultat

Fysikaliskt tillstånd

pH (5)

Frätande ämnen in vivo

N,N’-dimetyl dipropylentriamin

10563-29-8

Organisk bas

1A

6 × C

L

8,3

1,2-diaminopropan

78-90-0

Organisk bas

1A

6 × C

L

8,3

Svavelsyra (10 %)

7664-93-9

Oorganisk syra

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × × NC

L

1,2

kaliumhydroxid (10 % vattenlösning)

1310-58-3

Oorganisk bas

(1A/)1B/1C

6 × C

L

13,2

Oktansyra (kaprylsyra)

124-07-2

Organisk syra

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,6

2-tert-butylfenol

88-18-6

fenol

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,9

Icke frätande ämnen in vivo

Isostearinsyra

2724-58-5

Organisk syra

NC

6 × NC

L

3,6

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Organisk bas

NC

6 × NC

S

5,5

Fenetylbromid

103-63-9

Elektrofil

NC

6 × NC

L

3,6

4-(metyltio)-bensaldehyd

3446-89-7

Elektrofil

NC

6 × NC

L

6,8

1,9-dekadien

1647-16-1

Neutral organisk

NC

6 × NC

L

3,9

Tetrakloretylen

127-18-4

Neutral organisk

NC

6 × NC

L

4,5

Förkortningar: aq = vattenbaserad, CAS-nr = Chemical Abstracts Service Registry Number, VRM = validerad referensmetod, C = frätande, NC = icke frätande

FÖRFARANDE

13.

Det finns standardiserade tillvägagångssätt (SOP) för TER-testmetoden för hudkorrosion på råtthud (19). TER-testmetoderna för råtthud som omfattas av den här testmetoden ska uppfylla följande villkor:

Djur

14.

Råttor ska användas eftersom deras hud har en påvisad känslighet mot ämnena i den här testmetoden (12) och eftersom deras hud är den enda hudkälla som har validerats formellt (8) (9). Åldern (då huden tas till vara) och råttstammen är av särskild betydelse för att säkerställa att hårsäckarna är i vilofas innan den vuxna hårtillväxten börjar.

15.

Rygg- och flankhår från unga, ungefär 22 dagar gamla han- eller honråttor (erhållna från Wistar eller en jämförbar stam) avlägsnas noggrant med en liten sax. Därefter tvättas djuren noga och torkas sedan omsorgsfullt medan det klippta området hålls ner i antibiotikalösning (som innehåller t.ex. streptomycin, penicillin, kloramfenikol och amfotericin, i koncentrationer som hämmar bakterietillväxt). Djuren tvättas på nytt med antibiotika på tredje eller fjärde dagen efter den första tvätten och används inom tre dagar från den andra tvätten, då hornlagret har återhämtat sig från hårborttagningen.

Beredning av hudbitar

16.

Djuren avlivas med en human metod när de är 28–30 dagar gamla. Åldern är av stor betydelse. Huden från rygg och flank från varje djur avlägsnas sedan, och överflödet av underhudsfett skrapas försiktigt bort från huden. Hudbitar med en diameter på ungefär 20 mm tas ut. Hudbitarna kan lagras innan de används om det kan visas att positiva och negativa kontrolldata är likvärdiga med dem som erhålls för färsk hud.

17.

Varje hudbit placeras över änden av ett PTFE-rör (polytetrafluoreten) så att överhuden är i kontakt med röret. En o-ring i gummi presspassas över rörets ände för att hålla huden på plats och överflödig vävnad putsas bort. O-ringen i gummi förseglas sedan till PTFE-rörets ände med vaselin. Röret fästs med en fjäderklämma i en kammare som innehåller MgSO4-lösning (154 mM) (figur 1). Hudbiten ska vara helt nedsänkt i MgSO4-lösningen. Upp till 10–15 hudbitar kan erhållas från en enda råtthud. Rörets och o-ringens mått visas i figur 2.

18.

Innan testningen börjar mäts de båda hudbitarnas elektriska motstånd som ett kvalitetskontrollförfarande för varje djurhud. Båda bitarna ska ge värden för motståndet som är större än 10 kΩ för att återstoden av hudbitarna ska kunna användas för testet. Om motståndet är mindre än 10 kΩ ska återstående hudbitar från den aktuella huden kastas.

Applicering av testkemikalie och kontrollämnen

19.

Parallella positiva och negativa kontroller ska användas i varje studie (experiment) för att säkerställa att försöksmodellen fungerar adekvat. Hudbitar från ett enda djur ska användas i varje studie (experiment). Förslag på testkemikalier för positiv och negativ kontroll är 10 M saltsyra respektive destillerat vatten.

20.

Testkemikalier i vätskeform (150 μl) appliceras jämnt på hudytan inuti röret. Vid testning av ämnen i fast form appliceras en tillräcklig mängd för att säkerställa att hela hudytan täcks av ett jämntjockt skikt. Därefter tillförs avjoniserat vatten (150 μl) på det fasta ämnet, och röret omskakas varsamt. För vissa fasta ämnen kan detta uppnås genom uppvärmning till 30 °C så att testkemikalien smälter eller mjuknar. Alternativt kan ämnet finfördelas till granulat eller pulver.

21.

Tre hudbitar ska användas för varje test, och kontrollämnen ska användas i varje studie (experiment). Testkemikalien ska appliceras under 24 timmar vid en temperatur på 20–23 °C. Den tvättas sedan bort med rumstempererat kranvatten tills allt material är avlägsnat.

TER-mätningar

22.

Hudens elektriska impedans uttryckt som transkutant elektriskt motstånd (TER) mäts med hjälp av växelström med låg spänning med en Wheatstonebrygga (18). Allmänna tekniska data för bryggan är 1–3 V driftspänning, en sinusformad eller rektangulär växelström på 50–1 000 Hz och ett mätområde på minst 0,1–30 kΩ. Den brygga som användes i valideringsstudien mätte induktans, kapacitans och motstånd upp till värden på 2 000 H, 2 000 μF respektive 2 MΩ vid frekvenser på 100 Hz eller 1 kHz med användning av seriella eller parallella värden. För mätningen av hudkorrosivitet genom TER-bestämning registrerades motståndet vid frekvensen 100 Hz, och seriella värden användes. Före mätning av det elektriska motståndet sänks hudens ytspänning genom tillförsel av etanol (70 %) i tillräcklig mängd för att täcka hudytan. Etanolen får verka några sekunder och hälls sedan ur röret. Därefter hydreras vävnaden genom tillsats av 3 ml MgSO4-lösning (154 mM). För motståndsmätningen (kΩ/hudbit) placeras mätutrustningens elektroder på hudbitens motstående båda ytor (figur 1). Elektrodernas mått och elektrodlängden under krokodilklämman framgår av figur 2. Den inre elektrodklämman hålls uppe på PTFE-röret under motståndsmätningen för att säkerställa att elektrodlängden i magnesiumsulfatlösningen (MgSO4) hålls konstant. Den yttre elektroden placeras innanför receptorkammaren så att elektroden ligger mot kammarens botten. Avståndet mellan fjäderklämman och PTFE-rörets botten ska hållas konstant (figur 2) eftersom avståndet påverkar det erhållna motståndsvärdet. Följaktligen ska avståndet mellan den inre elektroden och hudbiten vara konstant och minimalt (1–2 mm).

23.

Om det uppmätta motståndsvärdet överstiger 20 kΩ kan detta bero på att epidermis på hudbiten är täckt av rester av testkemikalien. Man kan försöka att avlägsna denna beläggning genom att täppa till PTFE-röret med tummen (använd handskar) och skaka det i ca 10 sekunder. MgSO4-lösningen kasseras varpå motståndsmätningen upprepas med färsk MgSO4-lösning.

24.

Såväl testanordningens egenskaper och mått som försöksförfarandet kan påverka de TER-värden som erhålls. Tröskelvärdet på 5 kΩ för hudkorrosion togs fram utifrån data som erhållits med den specifika anordning och det specifika förfarande som beskrivs för denna metod. Andra tröskelvärden och kontrollvärden kan gälla om testbetingelserna ändras eller om en annan testanordning används. Därför måste metoden och tröskelvärdena för motstånd kalibreras genom tester av ett antal kvalifikationsämnen som väljs bland de ämnen som användes i valideringsstudien (8) (9) eller från liknande kemiska klasser som de kemikalier som undersöks. Ett antal lämpliga kvalifikationsämnen anges i tabell 1.

Metoder som bygger på färgämnesbindning

25.

Exponering för vissa icke frätande material kan sänka motståndet under tröskelvärdet 5 kΩ så att joner kan flöda genom hornlagret då det elektriska motståndet minskar (9). Exempelvis kan neutrala organiska ämnen och ämnen med ytaktiva egenskaper (t.ex. detergenter, emulgeringsmedel och andra ytaktiva ämnen) avlägsna lipider från huden och därmed göra barriären mer permeabel för joner. Om de TER-värden som kemikalierna ger upphov till är lägre än eller omkring 5 kΩ och det inte finns några synliga skador på hudbitarna bör en bedömning av färgämnespenetrationen göras i kontrollvävnad och behandlad vävnad för att fastställa om de erhållna TER-värdena är en följd av ökad hudpermeabilitet eller av hudkorrosion (7) (9). Om hudkorrosion föreligger och hornlagret är skadat kommer färgämnet sulforhodiamin B snabbt att tränga igenom hudytan och färga underliggande vävnad då det appliceras. Detta färgämne är stabilt mot ett brett urval av kemikalier och påverkas inte av det extraktionsförfarande som beskrivs nedan.

Applicering och avlägsnande av färgämnet sulforhodamin B

26.

Efter TER-testet hälls magnesiumsulfatet bort från röret, och huden granskas noga med avseende på synlig skada. Vid avsaknad av tydlig större skada (dvs. perforering) ska 150 μl av en 10 % (w/v) lösning av färgämnet sulforhodiamin B i destillerat vatten (röd syra 52, C.I. 45100, CAS-nummer 3520-42-1) appliceras på varje hudbit i två timmar. Därefter avlägsnas överskott (obundet färgämne) genom tvättning av hudbitarna med kranvattenstråle (upp till rumstemperatur) i ungefär 10 sekunder. Varje hudbit tas försiktigt ut ur PTFE-röret och placeras i en burk (t.ex. en 20-ml scintillationsburk av glas) som innehåller avjoniserat vatten (8 ml). Burkarna skakas varsamt i fem minuter för att avlägsna eventuella obundna färgrester. Därefter upprepas sköljningen. Hudbitarna tas bort, placeras i burkar som innehåller 5 ml 30-procentigt (vikt i volym) natriumdodecylsulfat (SDS) i destillerat vatten och inkuberas över natten vid 60 °C.

27.

Efter inkubationen avlägsnas hudbitarna och slängs, och den kvarvarande lösningen centrifugeras under 8 minuter vid 21 °C (relativ centrifugalkraft ~ 175 × g). Ett 1 ml prov av supernatanten späds ut i volymförhållandet 1:5 (dvs. 1 ml + 4 ml) med 30-procentig (vikt i volym) SDS i destillerat vatten. Lösningens optiska densitet (OD) mäts vid 565 nm.

Beräkning av färgämneshalten

28.

Halten av sulforhodamin B per hudbit beräknas utifrån OD-värdena (9) (färgämnets molära extinktionskoefficient vid 565 nm = 8,7 × l04molekylvikt = 580). Färgämneshalten bestäms för varje hudbit med hjälp av en lämplig kalibreringskurva, och därefter beräknas replikatens medelhalt.

Acceptanskriterier

29.

TER-medelvärdena godtas om parallella positiva och negativa kontrollvärden faller inom de godtagbara intervallen för den metod som används på testlaboratoriet. De godtagbara motståndsintervallen för metoden och anordningen som beskrivs ovan anges i följande tabell:

Kontroll

Ämne

Motståndsintervall (kΩ)

Positivt

10M saltsyra

0,5–1,0

Negativt

Destillerat vatten

10–25

30.

Medelhalterna för färgämnesbindning godtas på villkor att värdena för de parallella kontrollerna ligger inom de godtagbara intervallen för metoden. Föreslagna intervall för färgämneshalt för kontrollämnena för den metod och den apparatur som beskrivs ovan anges i följande tabell:

Kontroll

Ämne

Intervall för färgämneshalt (μg/hudbit)

Positivt

10M saltsyra

40–100

Negativt

Destillerat vatten

15–35

Tolkning av resultaten

31.

Det erhållna TER-värdet som skiljer frätande testkemikalier från icke frätande fastställdes vid optimeringen av testmetoden, testades under en förvalideringsfas och bekräftades i en formell valideringsstudie.

32.

Prediktionsmodellen för TER-metoden för korrosion på råtthud (9) (19) i GHS/CLP-klassificeringssystemet anges nedan:

Testkemikalien anses vara icke frätande för huden

i)

om dess genomsnittliga TER-värde överstiger (>) 5 kΩ, eller

ii)

om dess genomsnittliga TER-värde är högst (≤) 5 kΩ, och

hudbitarna inte uppvisar några tydliga skador (dvs. perforering), och

det genomsnittliga färginnehållet på hudbitarna är mindre än (<) medelhalten av färgämne i den parallella positiva kontroll som behandlats med 10 M HCl (se punkt 30 för positiva värden).

Testkemikalien anses vara korrosiv för huden

i)

om dess genomsnittliga TER-värde är högst (≤) 5 kΩ och hudbitarna uppvisar tydliga skador (t.ex. är perforerade), eller

ii)

om dess genomsnittliga TER-värde är högst (≤) 5 kΩ, och

hudbitarna inte uppvisar några tydliga skador (t.ex. perforering), men

medelhalten av färgämne är större än eller lika hög som (≥) medelhalten av färgämne i den parallella positiva kontroll som behandlats med 10 M HCl (se punkt 30 för positiva kontrollvärden).

33.

En enda testomgång med minst tre hudbitsreplikat bör vara tillräcklig för en testkemikalie förutsatt att den resulterande klassificeringen är otvetydig. Om man får resultat som ligger på gränsen, t.ex. icke-konkordanta mätningar av replikaten och/eller genomsnittliga TER-värden motsvarande 5 ± 0,5 kΩ, bör man dock överväga en andra oberoende testomgång (experiment), och även en tredje omgång om resultaten mellan de två första omgångarna (experimenten) är diskordanta.

DATA OCH RAPPORTERING

Data

34.

Motståndsvärden (kΩ) och medelhalter av färgämne (μg/hudbit) ska där det lämpar sig för testkemikalien, liksom för positiva och negativa kontroller, rapporteras i tabellform, inbegripet data för varje enskilt replikat i varje testomgång (experiment) och genomsnittliga värden ± SD. Alla upprepade experiment ska rapporteras. Förekomsten av skador på hudbitarna ska rapporteras för varje testkemikalie.

Testrapport

35.

Testrapporten ska innehålla följande information:

 

Testkemikalie och kontrollämnen:

Monokomponentämne: kemisk identifiering, t.ex. med IUPAC- eller CAS-namn, CAS-nummer, Smiles- eller InChI-kod, strukturformel, renhet samt motsvarande identifiering av föroreningar i förekommande fall och om det är praktiskt möjligt.

Multikomponentämne, UVCB-ämne och blandning: karakteriseras så långt som möjligt genom beståndsdelarnas kemiska identitet (se ovan), kvantitativa förekomst och relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

Fysikaliskt tillstånd, vattenlöslighet och ytterligare relevanta fysikalisk-kemiska egenskaper.

Ursprung, satsnummer om sådant finns.

Eventuell behandling av testkemikalien/kontrollämnet före testning (t.ex. uppvärmning, malning).

Testkemikaliens stabilitet, sista förbrukningsdatum eller sista datum för upprepad analys, om känt.

Lagringsförhållanden.

 

Försöksdjur:

Stam och kön för använda djur.

Djurens ålder då de användes som donatordjur.

Ursprung, uppfödningsförhållanden, diet etc.

Uppgifter om hudberedningen.

 

Testbetingelser:

Kalibreringskurvor för testanordningen.

Kalibreringskurvor för utförande av färgämnesbindning, bandpassen som använts för mätning av OD-värden samt det linjära OD-intervallet för mätningsinstrumenten (dvs. spektrofotometer), i förekommande fall.

Uppgifter om testförfarandet för TER-mätningar.

Uppgifter om testförfarandet för bestämning av färgämnesbindning, om detta är tillämpligt.

De testdoser som använts, exponeringstid och exponeringstemperatur(er).

Detaljer för tvättningsförfarandet efter exponering.

Antal hudbitsreplikat som använts per testkemikalie och kontroll (positiva och negativa).

Beskrivning av eventuella modifieringar av försöksförfarandet.

Hänvisning till historiska uppgifter om modellen. Dessa ska omfatta, men inte vara begränsade till, följande:

i)

Uppgifter om huruvida de positiva och negativa TER-kontrollvärdena är godtagbara med avseende på positiva och negativa intervall för kontrollernas motstånd.

ii)

Uppgifter om huruvida de positiva och negativa kontrollvärdena för färginnehåll (mätt i μg/hudbit) är godtagbara med avseende på positiva och negativa intervall för kontrollernas färgämneshalt.

iii)

Uppgifter om huruvida testresultaten är godtagbara med avseende på historisk variabilitet mellan hudbitsreplikat.

Beskrivning av beslutskriterierna/den prediktionsmodell som använts.

 

Resultat:

Redovisning i tabellform av uppgifterna från TER- och färgbindningstesten (i förekommande fall) för varje enskild testkemikalie och kontroll, för varje testomgång (experiment) och för varje hudbitsreplikat (enskilda prover av djur- och människohud), medelvärden, SD-värden och CV-värden.

Beskrivning av observerade effekter.

Härledda klassificeringar med hänvisning till förekommande prediktionsmodell/beslutskriterier.

 

Diskussion av resultaten

 

Slutsatser

LITTERATUR

(1)

United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), andra reviderade utgåvan, FN New York och Genève, 2013. Tillgänglig på: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Kapitel B.4 i denna bilaga, Akut hudirritation/hudkorrosion.

(3)

Kapitel B.40a i denna bilaga, Hudkorrosion in vitro.

(4)

Kapitel B.65 i denna bilaga, In vitro-membranbarriärtest för hudkorrosion.

(5)

Kapitel B.46 i denna bilaga, Hudirritation in vitro: Testmetod med rekonstruerad human epidermis.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 203, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

(7)

Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P. och Balls, M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23, s. 219–255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, s. 471–482.

(9)

Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. och Liebsch, M (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro 12, s. 483–524.

(10)

Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., och Zucco, F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, s. 129–147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication nr 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, s. 275–280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication nr 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 218. Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., och Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test – Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol.24, s. 507–512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., och Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. och Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, s. 393–403.

(19)

TER SOP (december 2008). INVITTOX Protocol (nr 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 34, Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling, Paris.

Figur 1

Anordning för ter-analys av Råtthud

Image 2

Figur 2

Mått på Polytetrafluoretenrör (PTFE-RÖR), MOttagarrör och Elektroder

Image 3

Kritiska faktorer för den anordning som visas ovan:

PTFE-rörets innerdiameter.

Elektrodernas längd jämfört med PTFE-rörets och mottagarrörets. Hudbiten ska inte vara i kontakt med elektroderna, och en standardlängd av elektroden ska vara i kontakt med MgSO4-lösningen.

Mängden MgSO4-lösning i mottagarröret ska ge ett visst djup i vätskan jämfört med nivån i PTFE-röret, såsom visas i figur 1.

Hudbiten ska vara ordentligt fäst vid PTFE-röret, så att det elektriska motståndet är ett verkligt mått på hudens egenskaper.

Tillägg

DEFINITIONER

Noggrannhet : Ett mått på hur väl testmetodresultaten och de godtagna referensvärdena överensstämmer med varandra. Exakthet är ett mått på testmetodens prestanda och en relevansaspekt. Detta begrepp används ofta omväxlande med ”konkordans” för att beskriva andelen korrekta resultat med en testmetod (20).

C : korrosiv.

Kemikalie : Ett ämne eller en blandning.

Konkordans : ett mått på testmetodens prestanda för sådana testmetoder som ger kategoriska resultat, och relevansaspekt. Termen används ibland omväxlande med noggrannhet och definieras som andelen av alla testade kemikalier som klassificeras korrekt som positiva eller negativa. Konkordansen är direkt beroende av förekomsten av positiva värden i den testkemikalie som undersöks (20).

GHS (globalt harmoniserat system för klassificering och märkning av kemikalier) : ett system för att klassificera kemikalier (ämnen och blandningar) enligt standardiserade typer och nivåer av fysiska risker, hälsorisker och miljörisker, och informera om resultaten genom t.ex. piktogram, signalord, faroangivelser, skyddsangivelser och säkerhetsdatablad i syfte att informera om kemikaliernas skadliga effekter för att skydda personer (inklusive arbetsgivare, arbetstagare, transportörer, konsumenter och personal inom räddningstjänsten) samt miljön (1).

IATA : integrerat synsätt på testning och bedömning (Integrated Approach to Testing and Assessment).

Blandning : blandning eller lösning som består av två eller flera ämnen.

Monokomponentämne : Ett ämne, definierat av sin kvantitativa sammansättning, där en huvudsaklig beståndsdel utgör minst 80 viktprocent.

Multikomponentämne : Ett ämne, definierat av sin kvantitativa sammansättning, där fler än en huvudsaklig beståndsdel förekommer i en koncentration på ≥ 10 viktprocent och < 80 viktprocent. Ett multikomponentämne är resultatet av en tillverkningsprocess. Skillnaden mellan blandningar och multikomponentämnen är att en blandning erhålls genom att två eller flera ämnen blandas utan någon kemisk reaktion. Ett multikomponentämne är resultatet av en kemisk reaktion.

NC : Icke frätande.

OD : Optisk densitet

PC : positiv kontroll, ett replikat som innehåller ett testsystems alla komponenter och som behandlats med ett ämne som man vet ger positiv respons. För att säkerställa att den positiva kontrollresponsens variationer kan bedömas över tid, bör den kraftiga irritation som framkallas inte vara överdriven.

Prestandastandarder (PS) : standarder som baseras på en validerad testmetod och som utgör grunden för utvärdering av jämförbarheten för en föreslagen testmetod som är mekaniskt och funktionellt likartad. Följande ingår: i) testmetodens grundläggande komponenter, ii) en minimiförteckning med referenskemikalier som valts ut från de kemikalier som använts för att påvisa att den validerade testmetoden fungerar tillfredsställande och iii) de jämförbara nivåer av tillförlitlighet och noggrannhet, på grundval av vad som erhållits för den validerade testmetoden, som man bör kunna påvisa för den föreslagna testmetoden när den utvärderas med användning av minimiförteckningen med referenskemikalier.

Relevans : beskrivning av förhållandet mellan testet och den berörda effekten och huruvida detta förhållande är meningsfullt och användbart för ett visst ändamål. Relevansen är ett mått på hur väl man genom testet korrekt kan mäta och förutse den biologiska effekt det gäller. Relevans omfattar också överväganden om en testmetods noggrannhet (konkordans) (20).

Tillförlitlighet : Mått på i vilken utsträckning en testmetod kan reproduceras inom och mellan laboratorier över tid, när den utförs med användning av samma protokoll. Den bedöms genom att man beräknar reproducerbarheten inom och mellan laboratorier (20).

Sensitivitet : den andel av alla positiva/aktiva testkemikalier som klassificeras korrekt i testet. Det är ett mått på noggrannhet för en testmetod som ger kategoriska resultat och är en viktig faktor vid bedömningen av relevansen för en testmetod (20).

Hudkorrosion in vivo : en irreversibel skada på huden i form av synlig nekros genom epidermis och in i dermis, efter applicering av en testkemikalie i upp till fyra timmar. Korrosiva reaktioner karakteriseras av sår, blödning, blodiga sårskorpor och, vid slutet av observationsperioden på 14 dagar, avfärgning genom blekning av huden, hela områden med alopeci (håravfall) och ärr. Histopatologi bör övervägas för att bedöma tveksamma skador.

Specificitet : den andel av alla negativa/inaktiva testkemikalier som klassificeras korrekt i testet. Det är ett mått på noggrannhet för en testmetod som ger kategoriska resultat och är en viktig faktor vid bedömningen av relevansen för en testmetod (20).

Ämne : Ett kemiskt grundämne och föreningar av detta grundämne i naturlig eller tillverkad form, inklusive eventuella tillsatser som är nödvändiga för att bevara ämnets stabilitet och sådana föroreningar som härrör från tillverkningsprocessen, men exklusive eventuella lösningsmedel som kan avskiljas utan att det påverkar ämnets stabilitet eller ändrar dess sammansättning.

(Test)omgång : parallell testning av en enskild testkemikalie på minst tre hudbitsreplikat.

Testkemikalie : Alla ämnen eller blandningar som testas med denna testmetod.

Transkutant elektriskt motstånd (TER) : ett mått på hudens elektriska impedans, uttryckt som ett motståndsvärde i kΩ. Det är en enkel och robust metod för att bedöma hudens barriärfunktion genom att registrera jonflödet genom huden med en Wheatstonebrygga.

UVCB-ämne : ämne med okänd eller varierande sammansättning, komplexa reaktionsprodukter och biologiskt material.

6)

I del B ska kapitel B.40a ersättas med följande:

”B.40a   HUDKORROSION IN VITRO: TESTMETOD MED REKONSTRUERAD HUMAN EPIDERMIS (RhE)

INLEDNING

1.

Denna testmetod motsvarar OECD:s testriktlinje (TG) 431 (2016). Hudkorrosion innebär att det uppstår en irreversibel skada på huden i form av synlig nekros genom epidermis och in i dermis, efter applicering av en testkemikalie (enligt definitionen i Förenta nationernas globalt harmoniserade system för klassificering och märkning av kemikalier (GHS) (1) och Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 1272/2008 om klassificering, märkning och förpackning av ämnen och blandningar (CLP-förordningen) (6)). Denna uppdaterade testmetod B.40a är en in vitro-metod för att identifiera icke frätande och frätande ämnen och blandningar i enlighet med GHS och CLP. Den möjliggör också en partiell underkategorisering av frätande ämnen.

2.

Bedömningen av kemikaliers potential för hudkorrosion har i regel inneburit användning av försöksdjur (TM B.4, likvärdig med OECD TG 404, ursprungligen antagen 1981, reviderad 1992, 2002 och 2015) (2). Utöver den nuvarande testmetoden TM B.40a har två andra in vitro-testmetoder för bedömning av kemikaliers potential att orsaka hudkorrosion validerats och antagits: TM B.40 (likvärdig med OECD TG 430) (3) och TM B.65 (likvärdig med OECD TG 435) (4). Dessutom har in vitro-metoden TM B.46 (likvärdig med OECD TG 439) (5) antagits för att testa hudirriterande potential. I OECD:s vägledningsdokument om ett integrerat synsätt på testning och bedömning (IATA) av hudkorrosion och hudirritation beskrivs flera moduler som grupperar olika informationskällor och analysverktyg, och där ges också i) vägledning om hur tillgängliga testdata och icke testdata kan integreras och användas i bedömningen av kemikaliers potential för hudirritation och hudkorrosion och ii) förslag på hur man ska gå till väga när det krävs ytterligare testning (6).

3.

Denna testmetod gäller endpointen hudkorrosion hos människa. Den använder sig av rekonstruerad human epidermis (RhE) (framtagen från icke-transformerade epidermala keratinocyter från människa) som histologiskt, morfologiskt, biokemiskt och fysiologiskt nära efterliknar den mänskliga hudens översta del (epidermis). Den motsvarande OECD-testriktlinjen antogs ursprungligen 2004 och uppdaterades dels 2013, för att inkludera ytterligare testmetoder som använder sig av RhE-modeller och möjliggöra användning av metoder som stöder underkategorisering av frätande kemikalier, dels 2015, för att ta med hänvisningar till vägledningsdokumentet om IATA och introducera ett alternativt förfarande för mätning av viabilitet.

4.

Denna testmetod omfattar fyra validerade RhE-modeller som finns tillgängliga på marknaden. Förvalideringsstudier (7) följda av en formell valideringsstudie för bedömning av hudkorrosion (8) (9) (10) har genomförts (11) (12) för två av dessa testmodeller som finns tillgängliga på marknaden, nämligen EpiSkin™ Standard Model (SM) och EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (nedan kallade validerade referensmetoder (VRM)). Utifrån resultaten av dessa studier rekommenderas användning av de två ovannämnda VRM för lagstadgade ändamål när frätande ämnen (C) ska skiljas från icke frätande ämnen (NC), och EpiSkin™ rekommenderas dessutom som ett stöd vid underkategorisering av frätande ämnen (13) (14) (15). Enligt PS-baserad validering (16) (17) (18) har de två andra in vitro-RhE-testmodellerna för hudkorrosion som finns tillgängliga på marknaden uppvisat liknande resultat som den validerade referensmetoden EpiDerm™. Dessa är SkinEthic™ RHE (7) och epiCS® (tidigare kallad EST-1000), och de kan också användas för lagstadgade ändamål i syfte att skilja frätande ämnen från icke frätande (19) (20). Under perioden 2012–2014 har tillverkarna av RhE-modeller genomfört uppföljande valideringsstudier med ett förbättrat protokoll och därmed kunnat korrigera interferens från icke-specifik MTT-reduktion av testkemikalier samt förbättra prestandan både vad gäller särskiljande av C/NC och underkategorisering av frätande ämnen (21) (22). Ytterligare statistiska analyser av data från de uppföljande valideringsstudierna av EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE och epiCS® har genomförts i syfte att identifiera alternativa prediktionsmodeller som förbättrar prediktionskapaciteten för underkategorisering (23).

5.

Innan en föreslagen liknande eller modifierad in vitro-RhE-testmetod för hudkorrosion som inte är en VRM kan användas för lagstadgade ändamål bör dess tillförlitlighet, relevans (noggrannhet) och begränsningar för det valda syftet bedömas i syfte att garantera att metoden motsvarar VRM, i enlighet med kraven i prestandastandarderna (PS) (24) som fastställts i enlighet med principerna i OECD:s vägledningsdokument nr 34 (25). Ömsesidig dataacceptans kan endast garanteras efter att eventuella föreslagna testmetoder, nya eller uppdaterade, som följer PS har granskats och inkluderats i motsvarande testriktlinjer. De testmodeller som inkluderas i testriktlinjerna kan användas i enskilda länder för att möta ländernas krav på testresultat gällande in vitro-testmetoder för hudkorrosion, tack vare den ömsesidiga dataacceptansen.

DEFINITIONER

6.

Definitioner av begreppen finns i tillägg 1.

INLEDANDE ÖVERVÄGANDEN

7.

Den här testmetoden möjliggör identifiering av frätande och icke frätande ämnen och blandningar i enlighet med GHS och CLP. Den stöder dessutom indelning av frätande ämnen och blandningar i en valfri underkategori 1A, i enlighet med GHS (1), liksom i en kombination av underkategorierna 1B och 1C (21) (22) (23). En begränsning med den här testmetoden är att den inte särskiljer mellan underkategori 1B respektive 1C för hudkorrosion enligt GHS och CLP på grund av sin begränsade uppsättning av välkända kemikalier för in vivo-underkategori 1C för korrosiva ämnen. Testmodellerna EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE och epiCS® kan användas för underkategorisering (dvs. mellan 1A och 1B respektive 1C och NC).

8.

En stor mängd kemikalier, främst enskilda ämnen, har testats för att validera de testmodeller som ingår i den här testmetoden gällande identifiering av icke- korrosiva och korrosiva ämnen. I den empiriska databasen från valideringsstudien ingår 60 kemikalier från flera olika kemiska klasser (8) (9) (10). Utvecklarna av testmetoden har genomfört test för att visa underkategoriseringens sensitivitet, specificitet, noggrannhet och reproducerbarhet inom laboratoriet, och resultaten från dessa test har granskats av OECD (21) (22) (23). Utifrån de samlade data som finns tillgängliga är testmetoden tillämplig på en mängd olika kemiska klasser och fysikaliska tillstånd, inklusive vätskor, halvfasta ämnen, fasta ämnen och vaxer. Vätskorna kan vara vattenbaserade eller inte. fasta ämnen kan vara lösliga eller olösliga i vatten. När det är möjligt bör ämnen i fast form pulveriseras före applicering, och ingen annan beredning behövs. Om det finns bevis för att en testmodell som ingår i den här testmetoden inte är tillämplig på en specifik kategori av testkemikalier bör den inte användas för denna kategori. Eftersom denna testmetod är tillämplig på ämnen anses den även kunna användas för blandningar. Med tanke på att blandningar omfattar en stor mängd kategorier och sammansättningar och det i nuläget endast finns begränsad information om testning av blandningar bör dock testmetoden inte användas på blandningskategorier för vilka den har visat sig vara icke-applicerbar (dvs. enligt den strategi som föreslås i (26)) ska testmetoden då inte användas för denna specifika kategori av blandningar. Innan testmetoden används på en blandning i syfte att samla in data för ett lagstadgat ändamål bör man överväga om, och i så fall varför, den kommer att ge godtagbara resultat för det syftet. Sådana överväganden är inte nödvändiga om blandningen måste provas enligt lag. Gaser och aerosoler har ännu inte bedömts genom valideringsstudier (8) (9) (10). Det är tänkbart att de kan testas med RhE-teknik, men den aktuella testmetoden ger inte möjlighet att testa gaser och aerosoler.

9.

Testkemikalier som absorberar ljus i samma våglängdsområde som MTT-formazan och testkemikalier som direkt kan reducera vitalfärgämnet MTT (till MTT-formazan) kan störa mätningarna av vävnadens viabilitet och göra det nödvändigt att använda anpassade kontroller för korrigeringar. Vilken typ av anpassade kontroller som krävs beror på vilken typ av interferens som skapas av testkemikalien samt vilken procedur som används för att mäta MTT-formazan (se punkterna 25–31).

10.

Denna testmetod ger visserligen inte adekvat information om hudirritation, men det bör nämnas att TM B.46 är särskilt avsedd att testa hälsoeffekten hudirritation in vitro och att den är baserad på samma RhE-testsystem även om den använder ett annat protokoll (5). För en fullständig bedömning av lokala effekter på huden efter en enstaka dermal exponering, se OECD:s vägledningsdokument om IATA (6). Denna IATA-strategi inbegriper utförande av in vitro-tester av hudkorrosion (enligt beskrivningen i den här testmetoden) och hudirritation innan tester på levande djur övervägs. Användningen av human hud är föremål för nationella och internationella etiska överväganden och begränsningar.

TESTPRINCIP

11.

Testkemikalien appliceras lokalt på en tredimensionell RhE-modell bestående av icke-transformerade epidermala keratinocyter från människa, vilka har odlats till att bilda en flerskiktad och starkt differentierad modell av human epidermis. Den består av ordnade skikt i form av basallager, taggcellslager och granulärt lager samt ett flerskiktat hornlager innehållande intercellulära lamellära lipidlager av de huvudsakliga lipidklasser som motsvarar dem som förekommer in vivo.

12.

Principen för bestämningen följer hypotesen om att kemikalier är korrosiva om de kan penetrera hornlagret genom diffusion eller erosion och är tillräckligt cytotoxiska för att orsaka celldöd i underliggande cellskikt. Cellviabiliteten mäts genom enzymatisk omvandling av vitalfärgämnet MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid, tiazolylblått-tetrazoliumbromid, CAS-nummer 298-93-1], till ett blått formazansalt som mäts kvantitativt efter att det har extraherats från vävnaderna (27). Irriterande kemikalier identifieras genom deras förmåga att minska cellviabiliteten under definierade gränsvärden (se punkterna 35 och 36). Den RhE-baserade testmetoden för hudkorrosion har visat sig vara prediktiv för in vivo-effekter på kaninhud, enligt TM B.4 (2).

DEMONSTRATION AV KOMPETENS

13.

Före rutinanvändning av någon av de validerade RhE-testmodellerna i denna testmetod bör laboratoriet visa sin tekniska förmåga genom att korrekt klassificera de tolv kvalifikationsämnen som listas i tabell 1. Om en metod för underkategorisering ska användas bör det även visa en korrekt underkategorisering. När ett listat ämne inte finns tillgängligt eller när det är motiverat kan ett annat ämne som det finns adekvat in vivo- och in vitro- referensdata för (t.ex. från listan över referenskemikalier (24)) användas, förutsatt att samma urvalskriterier tillämpas som de som beskrivs i tabell 1.

Tabell 1

Lista på kvalifikationsämnen  (8)

Ämne

CAS-nr

Kemisk klass (9)

GHS/CLP-kategori baserat på in vivo-resultat (10)

VRM Kat. baserat på In vitro-resultat (11)

MTT Reducerare (12)

Fysiskt tillstånd

Underkategori 1A frätande ämnen in vivo

Bromättiksyra

79-08-3

Organisk syra

1A

(3) 1A

S

Bortrifluoriddihydrat

13319-75-0

Oorganisk syra

1A

(3) 1A

L

Fenol

108-95-2

Fenol

1A

(3) 1A

S

Dikloroacetylklorid

79-36-7

Elektrofil

1A

(3) 1A

L

Kombination av underkategorierna 1B och 1C för frätande ämnen in vivo

Monohydratisk glyoxylsyra

563-96-2

Organisk syra

1B och 1C

(3) 1B och 1C

S

Mjölksyra

598-82-3

Organisk syra

1B och 1C

(3) 1B och 1C

L

Etanolamin

141-43-5

Organisk bas

1B

(3) 1B och 1C

Y

Trögflytande ämnen

Saltsyra (14,4 %)

7647-01-0

Oorganisk syra

1B och 1C

(3) 1B och 1C

L

Icke frätande ämnen in vivo

Fenetylbromid

103-63-9

Elektrofil

NC

(3) NC

Y

L

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Organisk bas

NC

(3) NC

S

4-(metyltio)-bensaldehyd

3446-89-7

Elektrofil

NC

(3) NC

Y

L

Laurinsyra

143-07-7

Organisk syra

NC

(3) NC

S

Förkortningar: CAS-nr = Chemical Abstracts Service Registry Number VRM = validerad referensmetod NC = icke frätande, Y = ja, S = fast form, L = flytande form

14.

Som en del av kvalitetsförfarandet rekommenderas att användarna efter mottagande av vävnaden verifierar dess barriäregenskaper enligt specifikationerna från RhE-modelltillverkaren. Detta är särskilt viktigt om vävnader transporteras över långa sträckor eller om transporten tar lång tid. När en metod har etablerats på ett framgångsrikt sätt och kvaliteten hos metodanvändningen har påvisats, behöver sådana verifikationer inte göras rutinmässigt. När en metod används rutinmässigt rekommenderas dock att bedömningen av barriäregenskaperna görs med jämna mellanrum.

FÖRFARANDE

15.

Nedan följer en generisk beskrivning av komponenterna och procedurerna i de RhE-testmodeller för bedömning av hudkorrosion som ingår i denna testmetod. De RhE-modeller som anses vetenskapligt giltiga för att användas inom denna testmetod, dvs. EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE och epiCS® modellerna (16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33), finns tillgängliga i handeln. Det finns standardiserade tillvägagångssätt (SOP) för dessa fyra RhE-modeller (34) (35) (36) (37), och deras huvudsakliga testemetodkomponenter sammanfattas i tillägg 2. Vid implementering och användning av en av dessa modeller i laboratoriet bör de SOP som är relevanta i sammanhanget konsulteras. Testning med de fyra RhE-modeller som omfattas av den här testmetoden ska uppfylla följande villkor:

RHE-TESTMETOD, KOMPONENTER

Allmänna betingelser

16.

Icke-transformerade humana keratinocyter ska användas för rekonstruktion av epitelvävnaden. Flera lager av viabla epitelceller (basallager, taggcellslager och granulärt lager) ska finnas under ett funktionellt hornlager. Hornlagret ska bestå av flera skikt och innehålla den lipidprofil som krävs för att ge en funktionell barriär som är tillräckligt robust för att stå emot snabb penetrering av cytotoxiska markörer (t.ex. natriumdodecylsulfat eller Triton X-100). Barriärfunktionen bör påvisas och kan bedömas antingen genom bestämning av den koncentration vid vilken markören minskar vävnadernas viabilitet med 50 % (IC50) efter en fast exponeringstid eller genom att bestämma den exponeringstid som krävs för att minska cellviabiliteten med 50 % (ET50) vid applicering av en viss fastställd koncentration av markören (se punkt 18). RhE-modellens inneslutningsegenskaper ska förhindra att material kan passera runt hornlagret till den viabla vävnaden, vilket kan leda till en bristande modellering av hudexponeringen. RhE-modellen får inte vara kontaminerad med bakterier, virus, mykoplasma eller svamp.

Funktionella betingelser

Viabilitet

17.

För kvantifiering av vävnadens viabilitet används MTT-testet (27). De viabla cellerna i den konstruerade RhE-vävnaden reducerar vitalfärgämnet MTT till en fällning av blått MTT-formazan, som därefter extraheras från vävnaden med hjälp av isopropanol (eller ett liknande lösningsmedel). Extraktionsmedlets optiska densitet (OD) bör vara tillräcklig låg, dvs. < 0,1. Det extraherade MTT-formazanet kan kvantifieras antingen med hjälp av en mätning av standardabsorbans (OD) eller med HPLC/UPLC-spektrofotometri (38). Användare av RhE-modellen bör se till att varje sats som används uppfyller de definierade kriterierna för den negativa kontrollen. Utvecklaren/leverantören av RhE-modellen bör fastställa acceptabla gränsvärden (övre och nedre gräns) för den negativa kontrollens OD-värden. I tabell 2 anges de acceptabla gränsvärdena för de negativa OD-kontrollvärdena som gäller för de fyra validerade RhE-testmodeller som ingår i denna testmetod. Vid användning av en HPLC/UPLC-spektrofotometer ska de negativa OD-kontrollvärden som anges i tabell 2 användas som acceptanskriterier för den negativa kontrollen. Det bör finnas dokumenterat att de vävnader som behandlas med den negativa kontrollen är stabila i odlingar (ger motsvarande resultat vid viabilitetsmätning) under testets hela exponeringsperiod.

Tabell 2

Godkända OD-värden för den negativa kontrollen av satsens kvalitet

 

Nedre gräns för godkännande

Acceptansintervallets övre gräns

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Barriärfunktion

18.

Hornlagret och dess lipidsammansättning ska räcka till för att stå emot snabb penetrering av cytotoxiska markörkemikalier (t.ex. SDS eller Triton X-100, enligt uppskattningar genom IC50 eller ET50 (tabell 3). I samband med leverans av vävnaderna till slutanvändaren bör RhE-modellens utvecklare/återförsäljare demonstrera barriärfunktionen för varje sats av modellen (se punkt 21).

Morfologi

19.

Före påvisande av människoliknande hud i flera lager som innehåller basallager, taggcellslager, granulärt lager och hornlager och som uppvisar en lipidprofil som påminner om den mänskliga hudens lipidprofil bör en histologisk undersökning av RhE-modellen genomföras. I samband med leverans av vävnaderna till slutanvändaren bör RhE-modellens utvecklare/återförsäljare utföra en histologisk undersökning av varje sats av modellen för att visa att vävnaderna har lämpliga morfologiska egenskaper (se punkt 21).

Reproducerbarhet

20.

Metodanvändarna ska kunna säkerställa och påvisa testmetodens reproducerbarhet över tid, genom positiva och negativa kontroller. Testmetoden bör endast användas om utvecklaren/leverantören av RhE-modellen tillhandahåller data som visar att modellen kan reproduceras över tid med frätande och icke frätande kemikalier från t.ex. listan med kvalifikationsämnen (tabell 1). Vid användning av en testmetod för underkategorisering bör även reproducerbarheten för underkategoriseringen demonstreras.

Kvalitetskontroll

21.

Utvecklaren/leverantören av RhE-modellen bör säkerställa och påvisa att varje sats av den RhE-modell som används uppfyller de fastställda produktkriterierna, där kriterierna för viabilitet (punkt 17), barriärfunktion (punkt 18) och morfologi (punkt 19) är de viktigaste. Dessa data ges till metodanvändarna så att de kan införliva informationen i testrapporten. Endast resultat som har producerats med vävnader som klarat kvalitetskontrollen kan ge en tillförlitlig prediktion av korrosionsklassificering. Utvecklaren/leverantören av RhE-modellen ska fastställa acceptabla gränsvärden (övre och nedre gräns) för IC50 eller ET50. I tabell 3 anges de acceptabla gränsvärdena för de fyra validerade testmodellerna.

Tabell 3

Kvalitetskriterier för godkännande

 

Nedre gräns för godkännande

Acceptansintervallets övre gräns

EpiSkin™ (SM) (18 timmars behandling med SDS) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 timmar

ET50 = 8,7 timmar

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)

ET50 = 4,0 timmar

ET50 = 10,0 timmar

epiCS® (1 % Triton X-100) (36)

ET50 = 2,0 timmar

ET50 = 7,0 timmar

Applicering av testkemikalien och kontrollämnen

22.

Minst två vävnadsreplikat ska användas per testkemikalie och för kontrollerna i varje omgång. För vätskor och fasta ämnen appliceras en tillräcklig mängd av testkemikalien så att hudens yta täcks med ett jämnt lager så att en infinit dos undviks. Dosen ska vara minst 70 μl/cm2 eller 30 mg/cm2. För fasta ämnen fuktas hudens yta med avjoniserat eller destillerat vatten före appliceringen för att förbättra kontakten mellan testkemikalien och hudens yta (34) (35) (36) (37). När det är möjligt ska fasta ämnen testas i form av ett fint pulver. Appliceringsmetoden måste vara lämplig för testkemikalien (se hänvisningarna 34–37). Vid slutet av exponeringsperioden tvättas testkemikalien omsorgsfullt bort från hudens yta med buffrad vattenlösning eller 0,9-procentig NaCl. Beroende på vilken av de fyra validerade RhE-modellerna som används ska två eller tre exponeringsperioder användas per testkemikalie (för alla godkända RhE-modeller): 3 min och 1 timme, men för EpiSkin™ en ytterligare exponeringstid på 4 timmar). Inkubationstiden under exponeringen kan variera mellan rumstemperatur och 37 °C beroende på typ av RhE-testmodell och exponeringsperiod.

23.

Negativa kontroller (NC) och positiva kontroller (PC) ska användas parallellt vid varje testomgång för att visa att viabiliteten (med NC), barriärfunktionen och den resulterande känsligheten (med PC) hos vävnaderna ligger inom fastställda godkända historiska värden. Föreslagna ämnen för positiv kontroll är isättika eller 8N KOH, beroende på vilken RhE-modell som används. Det bör noteras att 8N KOH reducerar MTT direkt och eventuellt kräver anpassade kontroller som de som beskrivs i punkterna 25 och 26. Föreslagna ämnen för negativ kontroll är 0,9-procentig NaCl eller vatten.

Mätning av cellernas viabilitet

24.

MTT-metoden är en validerad kvantitativ metod som ska användas i denna testmetod för att mäta cellviabiliteten (27). Vävnadsprovet placeras i en MTT-lösning av lämplig koncentration (0,3 eller 1 mg/ml) i 3 timmar. Fällningen i form av blått formazan extraheras sedan från vävnaden med ett lösningsmedel (t.ex. isopropanol, sur isopropanol), och koncentrationen av formazan mäts genom bestämning av OD vid 570 nm med ett filterbandpass på högst ± 30 nm, eller med hjälp av en HPLC/UPLC-spektrofotometer (se punkterna 30 och 31) (38).

25.

Testkemikalierna kan störa MTT-testet, antingen genom direkt reduktion av MTT till blått formazan och/eller genom färginterferens om testkemikalien absorberar ljus, i sitt ursprungliga tillstånd eller till följd av behandlingar, i samma OD-intervall som formazan (570 ± 30 nm, främst blå och lila kemikalier). I syfte att upptäcka och korrigera potentiell interferens från dessa testkemikalier bör ytterligare kontroller, som en icke-specifik MTT-reduktionskontroll (NSMTT) och en icke-specifik färgkontroll (NSC) användas (se punkterna 26–30). Detta är särskilt viktigt när en specifik testkemikalie inte kan tvättas bort helt och hållet från vävnaden eller när den har penetrerat huden och därför påvisas i vävnaden vid genomförande av MTT-viabilitetstestet. En detaljerad beskrivning av hur direkt MTT-reduktion och färgämnesinterferens kan korrigeras finns i SOP för de tre validerade testmodellerna (34) (35) (36) (37).

26.

För att identifiera vilka av testkemikalierna som reducerar MTT bör de tillsättas en och en till ett nypreparerat MTT-medium (34) (35) (36) (37). Om MTT-blandningen som innehåller testkemikalien färgas blå/lila kan testkemikalien antas reducera MTT direkt, och då bör en ytterligare funktionskontroll utföras på icke-viabel epidermis, oberoende av om en mätning av standardabsorbans (OD) eller en HPLC/UPLC-spektrofotometerprocedur har använts. I nämnda funktionskontroll ska död vävnad användas som endast har residual metabolisk aktivitet men som kan absorbera testkemikalien i samma mängd som viabel vävnad kan. Varje testkemikalie som kan reducera MTT ska appliceras på minst två döda vävnadsreplikat per exponeringstid, och dessa ska genomgå hela hudkorrosionstestet. Därefter beräknas vävnadens faktiska viabilitet utifrån procentandelen viabel vävnad som har exponerats för en MTT-reducerare minus procentandelen icke-specifik MTT-reduktion som erhålls från den döda vävnad som har exponerats för samma MTT-reducerare, och detta beräknas genom en jämförelse med den negativa kontroll som gjorts parallellt för det test som korrigeras (%NSMTT).

27.

För att identifiera potentiell interferens av färgade testkemikalier eller av testkemikalier som färgas vid kontakt med vatten eller isopropanol och för att kunna avgöra om ytterligare kontroller behövs bör en spektral analys av testkemikalien utföras i vatten (miljö under exponering) och/eller i isopropanol (extraherande lösningsmedel). Om testkemikalien i vatten och/eller isopropanol absorberar ljus inom ett intervall på 570 ± 30 nm bör ytterligare färgningskontroller utföras, och om sådana kontroller inte behövs bör en HPLC/UPLC-spektrofotometerprocedur användas (se punkterna 30 och 31). Vid mätning av standardabsorbans (OD) ska varje färgad interfererande testkemikalie appliceras på minst två viabla vävnadsreplikat per exponering, och dessa ska genomgå hela hudkorrosionstestet men inkuberas med medium i stället för MTT-lösning under MTT-inkuberingsfasen för att generera en icke-specifik färgkontroll (NSCliving). NSCliving måste utföras samtidigt för varje färgad testkemikalie per exponering (i varje omgång) på grund av den levande vävnadens inneboende biologiska mångfald. Därefter beräknas vävnadens faktiska viabilitet efter procentandelen levande vävnad som erhålls efter det att den levande vävnaden har exponerats för en interfererande testkemikalie och inkuberats med en MTT-lösning minus procentandelen icke-specifik färg som erhålls från levande vävnad som har exponerats för den interfererande testkemikalien och inkuberats i ett medium utan MTT, parallellt med det test som korrigeras (%NSCliving).

28.

Testkemikalier som konstaterats orsaka både direkt MTT-reduktion (se punkt 26) och färginterferens (se punkt 27) kräver en tredje typ av kontroller utöver de NSMTT- och NSCliving-kontroller som beskrivs ovan, vid mätningen av standardabsorbans (OD). Detta är vanligtvis fallet med mörkt färgade testkemikalier som interfererar med MTT-testet (t.ex. blå, lila, svart) eftersom deras naturliga färg gör det omöjligt att bedöma om de reducerar MTT direkt så som beskrivs i punkt 26. Dessa testkemikalier kan bindas till både levande och död vävnad, och en NSMTT-kontroll kan då utöver att korrigera den potentiella direkta MTT-reduktionen även korrigera den färginterferens som uppstår när testkemikalien binds till död vävnad. Detta kan leda till en dubbel korrigering av färginterferens eftersom NSCliving redan korrigerar färginterferens som uppstår när testkemikalien binds till levande vävnad. För att undvika dubbel korrigering av färginterferens krävs en tredje kontroll anpassad för icke-specifik färg i död vävnad (NSCkilled). Vid nämnda kontroll appliceras testkemikalien på minst två döda vävnadsreplikat vilka sedan genomgår hela testproceduren men inkuberas i ett medium i stället för i en MTT-lösning under MTT-inkubationsfasen. Det räcker med en enda NSCkilled-kontroll per testkemikalie oavsett antalet oberoende tester/omgångar som har utförts, men kontrollen bör genomföras parallellt med NSMTT-kontrollen och, om det är möjligt, med samma sats av vävnadsprover. Därefter beräknas vävnadens faktiska viabilitet efter procentandelen levande vävnad som erhålls efter det att den levande vävnaden har exponerats för en interfererande testkemikalie och inkuberats med en MTT-lösning minus %NSMTT minus %NSCliving plus procentandelen icke-specifik färg som erhålls från levande vävnad som har exponerats för den interfererande testkemikalien och inkuberats i ett medium utan MTT, beräknat efter den negativa kontroll som utförts parallellt med det test som korrigeras (%NSCkilled).

29.

Observera att icke-specifik MTT-reduktion och icke-specifik färginterferens kan öka avläsningen av vävnadsprovet så att det överskrider spektrofotometerns linjeintervall. Laboratoriet ska därför fastställa spektrofotometerns linjära område med MTT-formazan (CAS-nr 57360-69-7) från en kommersiell källa innan försök med testkemikalier för lagstadgade ändamål inleds. Mätningen av standardabsorbans (OD) med hjälp av spektrofotometer är lämplig för bedömning av vilka kemikalier som direkt reducerar eller orsakar färginterferens i de fall testkemikalien, utan att ha korrigerats för direkt MTT-reduktion och/eller färginterferens, ger OD-värden som ligger inom spektrofotometerns linjeintervall eller då redan den icke-korrigerade procentuella viabilitet som erhålls med testkemikalien räcker för att definiera denna som frätande (se punkterna 35 och 36). Dock ska resultat utifrån negativa kontroller där testkemikalierna har producerat %NSMTT och/eller %NSCliving som är högre än 50 % beaktas med försiktighet.

30.

För färgade testkemikalier som inte är kompatibla med mätningen av standardabsorbans (OD) på grund av alltför stark interferens vid MTT-testet kan en alternativ HPLC/UPLC-spektrofotometerprocedur användas för att mäta MTT-formazan (se punkt 31) (37). HPLC/UPLC-spektrofotometersystemet gör det möjligt att separera MTT-formazanet från testkemikalien före kvantifiering (38). Därför behövs aldrig NSCliving- eller NSCkilled-kontroller vid användning av HPLC/UPLC-spektrofotometerteknik oavsett vilken kemikalie som testas. NSMTT-kontroller ska dock användas när det finns misstankar om att testkemikalien reducerar MTT direkt eller när den har en färg som gör det omöjligt att bedöma huruvida den kan reducera MTT direkt (enligt beskrivningen i punkt 26). Vid användning av HPLC/UPLC-spektrofotometri för att mäta MTT-formazan beräknas vävnadens viabilitet som förhållandet (i procent) mellan å ena sidan den topparea för MTT-formazan som erhållits med levande vävnad exponerad för testkemikalien och, å andra sidan, den topparea för MTT-formazan som erhållits med den parallellt utförda negativa kontrollen. För testkemikalier som kan reducera MTT direkt beräknas vävnadens viabilitet genom den levande vävnadens viabilitet i procent minus %NSMTT. Slutligen bör nämnas att kemikalier som direkt reducerar MTT även kan orsaka färginterferens, vilken stannar kvar i vävnaden efter behandling och reducerar MTT så starkt att de orsakar OD-värden (påvisbart genom OD-standardmätning) eller toppareor (påvisbart genom användning av en UPLC/HPLC- spektrofotometer) på de testade vävnadsextrakt som faller utom spektrofotometerns linjeintervall och därför inte kan bedömas. Detta är dock väldigt ovanligt.

31.

HPLC/UPLC-spektrofotometersystem kan användas för att mäta MTT-formazan för alla typer av testkemikalier (färgade, icke-färgade, de som reducerar MTT och de som inte gör det) (38). På grund av mångfalden av HPLC/UPLC-spektrofotometersystem ska HPLC/UPLC-spektrofotometersystemets godtagbarhet demonstreras innan det används för att kvantifiera MTT-formazan från vävnadsextrakt, genom att systemet uppfyller acceptanskriterierna för en uppsättning standardkvalifikationsparametrar som baseras på dem som beskrivs i FDA:s vägledning för industrin om bioanalytisk metodvalidering (38) (39). Dessa nyckelparametrar och deras acceptanskriterier anges i tillägg 4. När de acceptanskriterier som anges i tillägg 4 är uppfyllda ska HPLC/UPLC-spektrofotometersystemet anses vara godkänt och färdigt att användas för mätning av MTT-formazan under de testbetingelser som beskrivs i denna testmetod.

Acceptanskriterier

32.

För varje testmetod där godkända RhE-modeller används ska vävnader som behandlats med negativ kontroll uppvisa OD-värden som återspeglar vävnadernas kvalitet enligt beskrivningen i tabell 2, och dessa bör inte ligga under de historiskt fastställda gränsvärdena. Vävnader som har behandlats med PC, dvs. isättika eller 8N KOH, ska återspegla vävnadernas responsförmåga på en frätande kemikalie under de förhållanden som gäller för testmodellen ifråga (se tillägg 2). Variabiliteten mellan de vävnadsreplikat som behandlats med testkemikalien och/eller kontrollkemikalier måste ligga inom de acceptabla gränsvärdena för varje godkänd RhE-modell (se tillägg 2) (t.ex. skillnaden i viabilitet mellan de två vävnadsreplikaten får inte överskrida 30 %). Om den negativa kontrollen eller en PC som ingår i en omgång ger resultat som faller utom de acceptabla gränsvärdena ska omgången anses vara icke-godkänd och måste göras om. Om en testkemikalie uppvisar en variabilitet som faller utanför de definierade gränsvärdena ska den testas på nytt.

Tolkning av resultaten och prediktionsmodell

33.

De OD-värden som erhålls för varje testkemikalie används för att beräkna procentuell viabilitet i förhållande till den negativa kontrollen, som sätts till 100 %. Vid användning av HPLC/UPLC-spektrofotometri beräknas vävnadens viabilitet som förhållandet (i procent) mellan å ena sidan den topparea för MTT-formazan som erhållits med levande vävnad exponerad för testkemikalien och, å andra sidan, den topparea för MTT-formazan som erhållits med den parallellt utförda negativa kontrollen. De avreglerade procentvärdena för cellviabilitet som skiljer korrosiva testkemikalier från icke-korrosiva (eller som skiljer olika korrosiva underkategorier från varandra) definieras nedan i punkterna 35 och 36, separat för varje testmodell som ingår i denna testmetod, och ska användas vid tolkning av resultaten.

34.