EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32019R1390

Nariadenie Komisie (EÚ) 2019/1390 z 31. júla 2019, ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) (Text s významom pre EHP)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

SK

Úradný vestník Európskej únie

L 247/1


NARIADENIE KOMISIE (EÚ) 2019/1390

z 31. júla 2019,

ktorým sa na účely prispôsobenia technickému pokroku mení príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH)

(Text s významom pre EHP)

EURÓPSKA KOMISIA,

so zreteľom na Zmluvu o fungovaní Európskej únie,

so zreteľom na nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES (1), a najmä na jeho článok 13 ods. 2,

keďže:

(1)

Nariadenie Komisie (ES) č. 440/2008 (2) obsahuje testovacie metódy na stanovenie fyzikálno-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity chemických látok, ktoré sa majú uplatňovať na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006.

(2)

Organizácia pre hospodársku spoluprácu a rozvoj (OECD) vypracúva harmonizované a medzinárodne schválené usmernenia na testovanie chemických látok na regulačné účely. OECD pravidelne vydáva nové a revidované usmernenia na testovanie chemických látok, pričom zohľadňuje vedecký pokrok v tejto oblasti.

(3)

V nadväznosti na prijatie príslušných usmernení OECD na testovanie by sa mali stanoviť dve nové testovacie metódy na posúdenie ekotoxicity a deväť nových testovacích metód na stanovenie toxicity pre zdravie ľudí, pričom by sa malo aktualizovať sedem testovacích metód s cieľom zohľadniť technický pokrok a podľa možnosti vždy znížiť počet zvierat používaných na pokusné účely v súlade s článkom 13 ods. 2 nariadenia (ES) č. 1907/2006. Jedenásť z uvedených testovacích metód súvisí s testami in vitro na stanovenie podráždenia/poleptania kože a oka, kožnej citlivosti, genotoxicity a endokrinných účinkov. Navrhovaná zmena bola prekonzultovaná so zainteresovanými stranami.

(4)

Nariadenie (ES) č. 440/2008 by sa preto malo zodpovedajúcim spôsobom zmeniť.

(5)

Opatrenia stanovené v tomto nariadení sú v súlade so stanoviskom výboru zriadeného na základe článku 133 nariadenia (ES) č. 1907/2006,

PRIJALA TOTO NARIADENIE:

Článok 1

Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení v súlade s prílohou k tomuto nariadeniu.

Článok 2

Toto nariadenie nadobúda účinnosť dvadsiatym dňom po jeho uverejnení v Úradnom vestníku Európskej únie.

Toto nariadenie je záväzné v celom rozsahu a priamo uplatniteľné vo všetkých členských štátoch.

V Bruseli 31. júla 2019

Za Komisiu

predseda

Jean-Claude JUNCKER


(1)  Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Nariadenie Komisie (ES) č. 440/2008 z 30. mája 2008, ktorým sa ustanovujú testovacie metódy podľa nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemických látok (REACH) (Ú. v. EÚ L 142, 31.5.2008, s. 1).


PRÍLOHA

Príloha k nariadeniu (ES) č. 440/2008 sa mení takto:

1.

V časti B sa kapitola B.4 nahrádza takto:

„B.4   AKÚTNE PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE KOŽE

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 404 (2015). Usmernenia OECD na testovanie chemikálií sa pravidelne preskúmavajú, aby sa zabezpečilo, že odzrkadľujú najaktuálnejšie vedecké poznatky. Pri preskúmaní usmernenia OECD TG 404 sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam v súvislosti s dobrými životnými podmienkami zvierat a posúdeniu všetkých existujúcich informácií o testovanej chemikálii, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na laboratórnych zvieratách. Súčasťou aktualizovanej verzie usmernenia OECD TG 404 (ktoré bolo pôvodne prijaté v roku 1981 a revidované v rokoch 1992, 2002 a 2015) sú odkazy na usmerňovací dokument o integrovaných prístupoch k testovaniu a hodnoteniu (IATA) v prípade podráždenia/poleptania kože (1), v ktorom sa navrhuje modulárny prístup k testovaniu podráždenia a poleptania kože. V rámci prístupu IATA sa opisuje viacero modulov, v ktorých sú zoskupené zdroje informácií a analytické nástroje, a i) poskytuje sa usmernenie o tom, ako integrovať a používať existujúce údaje z testovania, ako aj údaje nepochádzajúce z testovania na posúdenie potenciálu chemikálií na spôsobenie podráždenia a poleptania kože a ii) navrhuje sa prístup v prípade potreby ďalšieho testovania (1). V uvedenom usmernení sa okrem toho podľa potreby odporúča v počiatočnom teste in vivo použiť postupne, a nie súčasne, tri testovacie náplasti na zviera.

2.

Vymedzenia podráždenia a poleptania kože sú uvedené v dodatku k tejto testovacej metóde.

POČIATOČNÉ ÚVAHY

3.

V záujme vedeckej spoľahlivosti a dobrých životných podmienok zvierat sa testovanie in vivo nemá vykonávať, pokiaľ neboli všetky dostupné údaje súvisiace s potenciálnym poleptaním/podráždením kože testovanou chemikáliou vyhodnotené v analýze váhy dôkazov, ako sa uvádza v usmerňovacom dokumente o integrovaných prístupoch k testovaniu a hodnoteniu v prípade podráždenia/poleptania kože, t. j. v rámci troch častí tohto usmernenia a príslušných modulov (1). Stručne možno uviesť, že časť 1 sa venuje existujúcim údajom v rámci siedmich modulov týkajúcich sa údajov o ľuďoch, údajov in vivo, údajov in vitro, údajov o fyzikálno-chemických vlastnostiach (napr. pH, obzvlášť silná kyslosť alebo zásaditosť) a údajom získaným z netestovacích metód. V časti 2 sa uskutočňuje analýza váhy dôkazov. Ak analýza váhy dôkazov nevedie k presvedčivým záverom, má sa uskutočniť časť 3 s dodatočným testovaním, pričom sa začína metódami in vitro a testovanie in vivo sa používa len ako posledná možnosť. Táto analýza tak zníži potrebu testovania in vivo na poleptanie/podráždenie kože testovanými chemikáliami, pre ktoré už existujú dostatočné dôkazy z iných štúdií k uvedeným dvom sledovaným parametrom.

PRINCÍP TESTU IN VIVO

4.

Chemikália, ktorá sa má testovať, sa aplikuje v jednorazovej dávke na kožu pokusného zvieraťa; neošetrené časti kože testovaného zvieraťa slúžia ako kontrola. V stanovených intervaloch sa zistí a vyhodnotí stupeň podráždenia/poleptania a následne sa opíše, aby sa zabezpečilo kompletné posúdenie účinkov. Trvanie štúdie má byť dostatočné na posúdenie vratnosti alebo nevratnosti pozorovaných účinkov.

5.

Zvieratá vykazujúce pretrvávajúce príznaky silného utrpenia a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu sa humánnym spôsobom usmrtia a testovaná chemikália sa na základe toho zatriedi. Kritériá pre rozhodnutie o humánnom usmrtení moribundných a silne trpiacich zvierat sú predmetom samostatného usmerňovacieho dokumentu (2).

PRÍPRAVA NA TEST IN VIVO

Výber druhov zvierat

6.

Ako laboratórne zviera sa prednostne používa králik – albín a použijú sa zdravé mladé dospelé králiky. Použitie iných druhov je potrebné zdôvodniť.

Príprava zvierat

7.

Približne 24 hodín pred testom sa dôkladným ostrihaním na chrbtovej časti trupu týchto zvierat odstráni srsť. Je potrebné venovať pozornosť tomu, aby sa koža neodrala, a použijú sa iba zvieratá so zdravou, neporušenou kožou.

8.

Niektoré druhy králikov majú miesta s hustou srsťou, ktoré sa objavujú v určitých obdobiach roka. Takéto miesta, zarastené hustou srsťou, by sa nemali používať ako miesta na testovanie.

Podmienky umiestnenia a kŕmenia

9.

Zvieratá by sa mali umiestniť jednotlivo. Teplota miestnosti pre pokusné zvieratá má byť 20 °C (±3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 % a pokiaľ možno, okrem obdobia počas čistenia miestnosti, by nemala prevyšovať 70 %, cieľová relatívna vlhkosť by mala byť 50 – 60 %. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie možno používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.

TESTOVACÍ POSTUP

Aplikácia testovanej chemikálie

10.

Testovaná chemikália sa aplikuje na malú plochu (približne 6 cm2) kože a zakryje náplasťou z gázy, ktorá sa prichytí leukoplastom, ktorý nespôsobuje podráždenie. V prípadoch, keď nie je možná priama aplikácia (napr. kvapaliny alebo niektoré pasty), sa testovaná chemikália nanesie najskôr na náplasť z gázy, ktorá sa potom aplikuje na kožu. Náplasť sa voľne prichytí, aby bola v kontakte s kožou, pomocou vhodného semiokluzívneho obväzu počas trvania expozície. Ak sa testovaná chemikália aplikuje na náplasť, pripevní sa tak, aby mala dobrý kontakt s kožou a aby testovaná chemikália bola na koži rovnomerne rozložená. Je potrebné zabrániť tomu, aby zviera dosiahlo na náplasť a aby požilo alebo vdýchlo testovanú chemikáliu.

11.

Kvapalné testované chemikálie sa spravidla aplikujú neriedené. Pri testovaní tuhých látok (ktoré sa môžu v prípade potreby rozotrieť na prach) sa testovaná chemikália navlhčí malým množstvom vody (alebo v prípade potreby iným vhodným nosičom), ktoré bude dostatočné na to, aby sa zabezpečil dobrý kontakt s kožou. Ak sa použijú iné nosiče ako voda, prípadný vplyv nosiča na podráždenie kože testovanou chemikáliou má byť minimálny.

12.

Po skončení expozície, ktorá trvá zvyčajne štyri hodiny, sa zvyšná testovaná chemikália odstráni podľa potreby s použitím vody alebo vhodného rozpúšťadla bez toho, aby sa pozmenila existujúca reakcia alebo integrita epidermy.

Úroveň dávky

13.

Na testované miesto sa aplikuje dávka 0,5 ml kvapaliny alebo 0,5 g tuhej látky alebo pasty.

Počiatočný test (test in vivo podráždenia/poleptania kože na jednom zvierati)

14.

Keď sa na základe analýzy váhy dôkazov alebo predchádzajúceho testovania in vitro určí, že testovaná chemikália je žieravá, dráždivá alebo neklasifikovaná, zvyčajne nie je potrebné ďalšie testovanie in vivo. Avšak v prípadoch, keď sa považuje za odôvodnené získanie ďalších údajov, sa vykoná test in vivo, a to najskôr na jednom zvierati s využitím tohto prístupu. Postupne sa na zviera aplikujú najviac tri testovacie náplasti. Prvá náplasť sa odstráni po troch minútach. Ak sa nezistí závažná reakcia kože, na iné miesto sa aplikuje druhá náplasť, ktorá sa odstráni po jednej hodine. Ak zo zistení v tomto štádiu vyplýva, že je humánne, aby sa expozícia mohla predĺžiť na štyri hodiny, aplikuje sa tretia náplasť, ktorá sa odstráni po štyroch hodinách, a reakcia sa vyhodnotí.

15.

Ak sa zistí žieravý účinok po ktorejkoľvek z troch postupných expozícií, test sa ihneď ukončí. Ak sa po odstránení poslednej náplasti nezistí žieravý účinok, zviera sa pozoruje 14 dní, pokiaľ sa poleptanie neprejaví skôr.

16.

V tých prípadoch, keď sa neočakáva, že testovaná chemikália spôsobí poleptanie, ale môže byť dráždivá, aplikuje sa jediná náplasť jednému zvieraťu na štyri hodiny.

Potvrdzujúci test (test in vivo podráždenia kože na ďalších zvieratách)

17.

Ak sa nezistí žieravý účinok v počiatočnom teste, dráždivá alebo negatívna reakcia sa potvrdí na maximálne dvoch ďalších zvieratách, každé s jednou náplasťou s časom expozície štyri hodiny. Ak sa v počiatočnom teste zistí dráždivý účinok, môže sa vykonať potvrdzujúci test postupným spôsobom alebo expozíciou dvoch ďalších zvierat súčasne. Vo výnimočnom prípade, keď sa neuskutoční počiatočný test, dvom alebo trom zvieratám sa môže aplikovať jediná náplasť, ktorá sa odstráni po štyroch hodinách. V prípade, keď sa použijú dve zvieratá, ak obidve vykazujú rovnakú reakciu, nie je potrebné ďalšie testovanie. V opačnom prípade sa testuje aj tretie zviera. Môže byť potrebné, aby sa nejednoznačné reakcie vyhodnotili na ďalších zvieratách.

Obdobie pozorovania

18.

Dĺžka obdobia pozorovania má byť dostatočná na celkové posúdenie vratnosti zistených účinkov. Pokus je však potrebné ukončiť vždy, keď zviera vykazuje pretrvávajúce príznaky silnej bolesti alebo utrpenia. Na určenie vratnosti účinkov sa zvieratá pozorujú do 14 dní po odstránení náplastí. Ak sa vratnosť pozoruje pred uplynutím 14 dní, pokus by sa mal v tej chvíli ukončiť.

Klinické pozorovania a vyhodnotenie kožných reakcií

19.

Všetky zvieratá sa vyšetria, či nemajú príznaky erytému (sčervenania kože) a edému (opuchu), a reakcie sa vyhodnotia po 60 minútach a potom po 24, 48 a 72 hodinách po odstránení náplasti. V prípade počiatočného testu na jednom zvierati sa testované miesto vyšetrí aj bezprostredne po odstránení náplasti. Kožné reakcie sa vyhodnotia a zaznamenajú podľa stupňov v tabuľke uvedenej ďalej. Ak sa po 72 hodinách vyskytne poškodenie kože, ktoré nie je možné označiť ako podráždenie alebo poleptanie, budú potrebné pozorovania až do 14. dňa, aby sa určila vratnosť účinkov. Okrem pozorovania podráždenia sa celkove opíšu a zaznamenajú všetky lokálne toxické účinky, ako je napríklad odmastenie pokožky, a všetky systémové nežiaduce účinky (napr. účinky na klinické toxické príznaky a telesnú hmotnosť). Na objasnenie nejednoznačných reakcií je potrebné uvažovať o vykonaní histopatologického vyšetrenia.

20.

Vyhodnotenie kožných reakcií je nevyhnutne subjektívne. Na podporu zosúladenia pri vyhodnocovaní kožnej reakcie a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní výsledkov, zamestnanci uskutočňujúci vyšetrenia musia byť primerane vyškolení na používanie systému hodnotenia (pozri tabuľku uvedenú ďalej). Užitočnou by mohla byť ilustrovaná príručka na vyhodnotenie podráždenia kože a iných lézií (3).

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

21.

Výsledky štúdie sa zhrnú v podobe tabuliek v záverečnej správe o teste a zahŕňajú všetky body uvedené v odseku 24.

Vyhodnotenie výsledkov

22.

Stupne podráždenia kože sa posudzujú v súvislosti s charakterom a závažnosťou lézií a ich vratnosťou alebo nevratnosťou. Jednotlivé stupne nepredstavujú absolútne kritérium pre dráždivé vlastnosti materiálu, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovaného materiálu. Skôr je potrebné na jednotlivé stupne nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré sa majú posudzovať v súvislosti s inými pozorovaniami zo štúdie.

23.

Pri hodnotení dráždivých reakcií je potrebné posúdiť vratnosť poškodení kože. Keď reakcie ako alopécia (obmedzená), hyperkeratóza, hyperplázia a šupinatosť pretrvávajú do konca 14-dňového obdobia pozorovania, testovaná chemikália sa pokladá za dráždivú.

Správa o teste

24.

Správa o teste musí obsahovať tieto informácie:

 

Zdôvodnenie testovania in vivo:

analýza váhy dôkazov na základe údajov z predchádzajúcich testov vrátane výsledkov stratégie postupného testovania,

opis relevantných údajov dostupných z predchádzajúceho testovania,

údaje získané v každom štádiu stratégie testovania,

opis uskutočnených testov in vitro vrátane podrobných údajov o postupoch, získaných výsledkov s testovanými/referenčnými látkami,

analýza váhy dôkazov pre uskutočnenie štúdie in vivo.

 

Testovaná chemikália:

jednozložková látka: identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď.,

viaczložková látka, zmes a látky neznámeho alebo variabilného zloženia, komplexné reakčné produkty alebo biologické materiály (UVCB): charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek,

fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,

zdroj, číslo šarže, ak je k dispozícii,

prípadná úprava testovanej chemikálie/kontrolnej látky pred testovaním (napr. zahrievanie, drvenie),

stabilita testovanej chemikálie, konečný dátum použitia alebo dátum opätovnej analýzy, ak sú známe,

podmienky skladovania.

 

Nosič:

identifikácia, koncentrácia (ak je to vhodné), použitý objem,

zdôvodnenie výberu nosiča.

 

Pokusné zvieratá:

použitý druh/kmeň, zdôvodnenie použitia iných zvierat ako králika – albína,

počet zvierat každého pohlavia,

hmotnosť jednotlivých zvierat na začiatku a na konci testu,

vek na začiatku štúdie,

zdroj zvierat, podmienky umiestnenia, krmivo atď.

 

Podmienky testovania:

technika prípravy miesta aplikácie náplasti,

podrobnosti o materiáloch náplastí a postupe vykonania náplasťového testu,

podrobnosti o príprave testovanej chemikálie, jej aplikácii a odstránení.

 

Výsledky:

tabuľkové spracovanie stupňov reakcie podráždenia/poleptania pre každé zviera vo všetkých meraných časoch,

opisy všetkých pozorovaných lézií,

podrobný opis charakteru a stupňa zisteného podráždenia alebo poleptania a všetky histopatologické pozorovania,

opis iných nepriaznivých lokálnych (napr. odmastenie kože) a systémových účinkov okrem podráždenia kože alebo poleptania.

 

Diskusia k výsledkom

 

Záver

LITERATÚRA

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organistion for Economic Cooperation and Development, Paris.

Tabuľka

Vyhodnotenie Reakcií Kože

Žiadny erytém…

0

Veľmi slabý erytém (sotva pozorovateľný…

1

Jasne ohraničený erytém…

2

Mierny až silný erytém…

3

Výrazný erytém (tmavočervený) až vytvorenie chrasty zabraňujúcej vyhodnoteniu erytému…

4

Maximálny možný stupeň: 4

Žiadny edém…

0

Veľmi slabý edém (sotva pozorovateľný)…

1

Slabý edém (okraje oblasti jasne ohraničené zreteľným opuchom)…

2

Mierny edém (opuch približne 1 mm)…

3

Výrazný edém (opuch viac ako 1 mm a presahujúci za oblasť expozície)…

4

Maximálny možný stupeň: 4

Na objasnenie nejednoznačných reakcií sa môže vykonať histopatologické vyšetrenie.

Dodatok

VYMEDZENIE POJMOV

Chemikália je látka alebo zmes.

Podráždenie kože je vznik vratného poškodenia kože po aplikácii testovanej chemikálie, a to až do štyroch hodín.

Poleptanie kože je vznik nevratného poškodenia kože; konkrétne ide o viditeľnú nekrózu cez epidermu až do dermy po aplikácii testovanej chemikálie, a to až do štyroch hodín. Pre reakcie v dôsledku poleptania sú typické vredy, krvácanie, krvavé chrasty a na konci pozorovania po 14 dňoch strata farby v dôsledku vyblednutia kože, celé plochy postihnuté alopéciou a jazvy. Na vyhodnotenie problematických lézií by sa malo uvažovať o histopatológii.

Testovaná chemikália je akákoľvek látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.

2.

V časti B sa kapitola B.17 nahrádza takto:

„B.17    IN VITRO TESTY NA GÉNOVÉ MUTÁCIE CICAVČÍCH BUNIEK S VYUŽITÍM GÉNOV HPRT A XPRT

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda (TM) je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 476 (2016). Testovacie metódy sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok, zmeny regulačných potrieb a dobré životné podmienky zvierat. Táto súčasná revidovaná verzia TM B.17 zohľadňuje takmer tridsaťročné skúsenosti s týmto testom, ako aj výsledky z vývoja samostatnej novej metódy zameranej na in vitro testy na génové mutácie cicavčích buniek s využitím génu tymidínkinázy. TM B.17 je súčasťou série testovacích metód v oblasti genetickej toxikológie. Bol vypracovaný dokument OECD, ktorý obsahuje stručné informácie o testovaní v oblasti genetickej toxikológie a prehľad posledných zmien, ktoré sa vykonali v usmerneniach OECD na vykonávanie testov v oblasti genetickej toxicity (1).

2.

In vitro test na génové mutácie cicavčích buniek sa používa na zistenie génových mutácií vyvolaných chemikáliami. V bunkových líniách, ktoré sa používajú v týchto testoch, sa merajú priame mutácie v reportérových génoch, konkrétne v endogénnom géne hypoxantín-guanín-fosforibozyltransferázy (Hprt v bunkách hlodavcov, HPRT v ľudských bunkách; v tejto testovacej metóde spoločne označované ako gén Hprt a test HPRT) a prenesenom géne xantín-guanín-fosforibozyltransferázy (gpt) (označovaný ako test XPRT). Testmi mutácií HPRT a XPRT sa zisťuje rôzne spektrum genetických udalostí. Okrem mutačných udalostí zisťovaných testom HPRT (napr. bázové zámeny, posuny čítacieho rámca, malé delécie a včlenenia) možno pomocou autozomálnej lokalizácie preneseného génu gpt zistiť mutácie v dôsledku veľkých delécií a prípadne mitotickej rekombinácie, ktorá sa nezistila prostredníctvom testu HPRT, pretože gén Hprt sa nachádza v X-chromozóme (2) (3) (4) (5) (6) (7). Pokiaľ ide o regulačné účely, test XPRT sa v súčasnosti využíva menej často než test HPRT.

3.

Vymedzenie použitých pojmov sa uvádza v dodatku 1.

POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA

4.

Testy vykonávané in vitro si vo všeobecnosti vyžadujú použitie exogénneho zdroja metabolickej aktivácie. Exogénny systém metabolickej aktivácie nenapodobňuje v plnej miere podmienky in vivo.

5.

Je potrebné dbať na to, aby sa predišlo podmienkam, ktoré by viedli k falošným pozitívnym výsledkom (t. j. možnej interakcii so systémom testovania), ktoré by neboli spôsobené priamou interakciou medzi testovanými chemikáliami a genetickým materiálom bunky, pričom medzi takéto podmienky patria zmeny pH alebo osmolality (8) (9) (10), interakcia so zložkami média (11) (12) alebo nadmerné úrovne cytotoxicity (13). Cytotoxicita, ktorá prekračuje odporúčané horné hranice cytotoxicity uvedené v odseku 19, sa na účely testu HPRT považuje za nadmernú.

6.

Pred použitím tejto testovacej metódy na zmesi s cieľom generovať údaje plánované na regulačné účely by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť adekvátne výsledky na tento účel, a ak áno, tak prečo. Takéto úvahy nie sú nutné, pokiaľ existuje regulatórna požiadavka na testovanie danej zmesi.

PRINCÍP TESTU

7.

Mutantné bunky s nedostatočnou enzymatickou aktivitou Hprt v teste HPRT alebo enzymatickou aktivitou xprt v teste XPRT sú rezistentné voči cytostatickým účinkom purínového analógu 6-tioguanínu (TG). Bunky s dostatkom Hprt (v teste HPRT) alebo gpt (v teste XPRT) sú citlivé na TG, čo spôsobuje inhibíciu bunkového metabolizmu a zastavuje ďalšie delenie buniek. Mutantné bunky sú tak schopné rozširovať sa za prítomnosti TG, zatiaľ čo normálne bunky, ktoré obsahujú Hprt (v teste HPRT) alebo gpt (v teste XPRT), toho schopné nie sú.

8.

Bunky v suspenzii alebo jednovrstvových kultúrach sa vystavia testovanej chemikálii s exogénnym zdrojom metabolickej aktivácie i bez takéhoto zdroja (pozri odsek 14) na primeraný čas (3 – 6 hodín) a následne sa subkultivujú na stanovenie cytotoxicity a na umožnenie fenotypového prejavu pred mutantnou selekciou (14) (15) (16) (17). Cytotoxicita sa určuje na základe relatívneho prežitia (RS), t. j. klonovacej účinnosti meranej bezprostredne po ošetrení pri zohľadnení všetkých strát buniek počas ošetrenia v porovnaní s negatívnou kontrolou (odsek 18 a dodatok 2). Ošetrené kultúry sa dostatočné obdobie, charakteristické pre každý typ buniek, udržiavajú v médiu, čo umožní takmer optimálny fenotypový prejav indukovaných mutácií (zvyčajne minimálne 7 – 9 dní). Po fenotypovom prejave sa frekvencia mutácií stanovuje zasadením známeho počtu buniek do média obsahujúceho selektívne činidlo na zistenie mutantných kolónií a do média bez selektívneho činidla na stanovenie klonovacej účinnosti (životaschopnosti). Po vhodnom inkubačnom čase sa kolónie zrátajú. Frekvencia mutácií sa vypočíta na základe počtu mutantných kolónií s korekciou podľa klonovacej účinnosti v čase mutantnej selekcie.

OPIS METÓDY

Príprava

Bunky

9.

Typy buniek použité na testy HPRT a XPRT majú mať preukázanú citlivosť na chemické mutagény, vysokú klonovaciu účinnosť, stabilný karyotyp a stabilnú frekvenciu spontánnych mutácií. Medzi najčastejšie používané bunky v teste HPRT patria línie CHO, CHL a V79 buniek škrečkov čínskych, lymfómové bunky myší L5178Y a TK6 ľudské lymfoblastoidné bunky (18) (19). Bunky AS52 odvodené od CHO, ktoré obsahujú prenesený gén gpt (a majú deletovaný gén Hprt), sa používajú pre test XPRT (20) (21); test HPRT nemožno uskutočniť na bunkách AS52 v dôsledku delécie génu hprt. Použitie iných bunkových línií má byť opodstatnené a validované.

10.

Bunkové línie by sa mali pravidelne kontrolovať, pokiaľ ide o stabilitu modálneho počtu chromozómov a o vylúčenie kontaminácie mykoplazmou (22) (23), a v prípade kontaminácie alebo zmeny modálneho počtu chromozómov by sa nemali použiť. Mala by sa stanoviť dĺžka bežného bunkového cyklu pri použití v skúšobnom laboratóriu, ktorá by mala byť v súlade s bunkovými charakteristikami uvedenými v literatúre. Je potrebné skontrolovať aj frekvenciu spontánnych mutácií v zásobe materských buniek a nepoužívať zásobu v prípade neprijateľnej frekvencie mutácií.

11.

Pred použitím v tomto teste sa kultúry podľa potreby prečistia od existujúcich mutantných buniek, napr. kultiváciou v médiu HAT pre test HPRT a v médiu MPA pre test XPRT (5) (24) (pozri dodatok 1). Prečistené bunky možno kryogénne zakonzervovať a následne rozmraziť, aby ich bolo možné používať ako pracovné zásoby. Nanovo rozmrazenú pracovnú zásobu možno používať na účely testu, keď sa dosiahnu normálne časy zdvojenia. Pri vykonávaní testu XPRT sa pre rutinnú kultúru buniek AS52 používajú podmienky, ktoré zabezpečujú udržiavanie preneseného génu gpt (20).

Médiá a podmienky kultivácie

12.

Na udržiavanie kultúr by sa malo použiť vhodné kultivačné médium a inkubačné podmienky (kultivačné nádoby, atmosféra s vyššou relatívnou vlhkosťou a 5 % CO2, inkubačná teplota 37 °C). Bunkové kultúry sa majú vždy udržiavať v podmienkach, v ktorých je zabezpečené, že ich rast prebieha v logaritmickej fáze. Osobitne dôležité je zvoliť médium a podmienky kultivácie tak, aby bol zabezpečený optimálny rast buniek počas doby expresie a optimálna klonovacia účinnosť mutantných aj nemutantných buniek.

Príprava kultúr

13.

Bunkové línie sa rozmnožujú zo zásobných kultúr, nasadia sa do kultivačného média v takej hustote, aby pri bunkách v suspenziách alebo v jednovrstvových bunkových kultúrach pokračoval exponenciálny rast počas času ošetrenia a doby expresie (napr. malo by sa zabrániť zhlukovaniu v prípade buniek rastúcich v jednovrstvových bunkových kultúrach).

Metabolická aktivácia

14.

Ak sa použijú bunky s nedostatočnou endogénnou metabolickou kapacitou, mali by sa použiť exogénne systémy metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom, ktorý sa štandardne odporúča, pokiaľ to nie je odôvodnené inak, je kofaktormi obohatená postmitochondriálna frakcia (S9) pripravená z pečene hlodavcov (väčšinou potkanov) ošetrená činidlami na indukciu enzýmov, ako je napríklad Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) alebo kombinácia fenobarbitalu a β-naftoflavónu (29) (30) (31) (32). Použitie uvedenej kombinácie nie je v rozpore so Štokholmským dohovorom o perzistentných organických látkach (33) a preukázalo sa, že táto kombinácia je rovnako účinná pri indukcii oxidáz so zmiešanou funkciou ako Aroclor 1254 (29) (31). Frakcia S9 sa v konečnom testovacom médiu zvyčajne používa v koncentráciách od 1 obj. % do 2 obj. %, môže sa však zvýšiť až na 10 obj. %. Výber typu a koncentrácie použitého exogénneho systému metabolickej aktivácie alebo metabolického induktora môže ovplyvniť trieda testovaných látok (34) (35) (36).

Príprava testovanej chemikálie

15.

Testované chemikálie v tuhom skupenstve by sa podľa potreby mali rozpustiť vo vhodnom rozpúšťadle pred ich aplikáciou na bunky (pozri odsek 16). Kvapalné testované chemikálie možno pridať priamo do testovacieho systému a/alebo pred aplikáciou na testovací systém rozriediť. Plynné alebo prchavé testované chemikálie by sa mali testovať tak, že sa štandardné protokoly vhodne upravia, napríklad sa v nich uskutoční aplikácia v uzavretých kultivačných nádobách (37) (38). Prípravky testovanej chemikálie by sa mali pripraviť bezprostredne pred aplikáciou, pokiaľ údaje o stabilite nepoukazujú na prijateľnosť uskladnenia.

PODMIENKY TESTOVANIA

Rozpúšťadlá

16.

Rozpúšťadlo by sa malo zvoliť tak, aby sa optimalizovala rozpustnosť testovaných chemikálií bez toho, aby rozpúšťadlo malo negatívny vplyv na vykonávanie testu (napr. zmenou rastu buniek), ovplyvňovalo integritu testovanej chemikálie, reagovalo s kultivačnými nádobami a narušovalo systém metabolickej aktivácie. Odporúča sa, pokiaľ je to možné, najskôr zvážiť použitie vodného rozpúšťadla (alebo kultivačného média). Medzi osvedčené rozpúšťadlá patrí napr. voda a dimetylsulfoxid. Organické rozpúšťadlá by vo všeobecnosti nemali presiahnuť 1 obj. % a vodné rozpúšťadlá (fyziologický roztok alebo voda) by nemali presiahnuť 10 obj. % v konečnom médiu s testovanou chemikáliou. Ak sa použijú iné ako osvedčené rozpúšťadlá (napr. etanol alebo acetón), ich použitie by malo byť podložené údajmi o ich kompatibilite s testovanou chemikáliou a testovacím systémom a o tom, že v použitej koncentrácii nie sú genotoxické. V prípade, že tieto podkladové údaje nie sú k dispozícii, je dôležité do testu doplniť neošetrené kontroly (pozri dodatok 1) s cieľom preukázať, že zvolené rozpúšťadlo nevyvoláva žiadne nepriaznivé ani mutagénne účinky.

Meranie cytotoxicity a výber expozičných koncentrácií

17.

Pri stanovovaní najvyššej koncentrácie testovanej chemikálie by sa malo zabrániť použitiu koncentrácií, ktoré majú schopnosť vyvolať falošné pozitívne reakcie, napr. koncentrácií vyvolávajúcich nadmernú cytotoxicitu (pozri odsek 20), zrážanie kultivačného média (pozri odsek 21) alebo výrazné zmeny pH alebo osmolality (pozri odsek 5). Ak testovaná chemikália v čase, keď sa pridáva, spôsobuje výraznú zmenu pH média, mohlo by sa pH upraviť aplikovaním tlmivého roztoku do konečného média s testovanou chemikáliou tak, aby nedošlo k falošným pozitívnym výsledkom a aby sa zachovali vhodné kultivačné podmienky.

18.

Koncentrácia sa určuje na základe cytotoxicity a iných faktorov (pozri odseky 20 – 22). Aj keď z hľadiska lepšieho definovania koncentrácií, ktoré sa majú použiť v hlavnom experimente, môže byť užitočné hodnotenie cytotoxicity v počiatočnom teste, počiatočný test nie je povinný. Aj keď sa vykoná počiatočné hodnotenie cytotoxicity, vyžaduje sa aj meranie cytotoxicity jednotlivých kultúr v hlavnom experimente. Cytotoxicita sa hodnotí na základe relatívneho prežitia (RS), t. j. klonovacej účinnosti (CE) buniek naočkovaných bezprostredne po ošetrení pri zohľadnení všetkých strát buniek počas ošetrenia, a to na základe počtu buniek v porovnaní s upravenou klonovacou účinnosťou negatívnych kontrol (ktorým je priradená miera prežitia 100 %) (pozri vzorec v dodatku 2).

19.

Mali by sa vyhodnotiť aspoň štyri testovacie koncentrácie (bez rozpúšťadla a pozitívnych kontrol), ktoré spĺňajú kritériá prijateľnosti (vhodná cytotoxicita, počet buniek atď.). Hoci sa odporúča použitie duplicitných kultúr, pri každej testovanej koncentrácii sa môžu použiť buď paralelné kultúry, alebo jednotlivé ošetrené kultúry. Výsledky získané z nezávislých paralelných kultúr pri danej koncentrácii sa majú uvádzať samostatne, možno ich však zlúčiť na účely analýzy údajov (17). V prípade testovaných chemikálií, ktoré vykazujú malú alebo nevykazujú žiadnu cytotoxicitu, budú za bežných okolností vhodné približne dvojnásobné až trojnásobné intervaly koncentrácií. Pri výskyte cytotoxicity by vybrané testované koncentrácie mali pokrývať rozsah od koncentrácie, ktorá vyvoláva cytotoxicitu, po koncentrácie, pri ktorých je cytotoxicita mierna a slabá alebo žiadna. Mnohé testované chemikálie vykazujú strmé krivky závislosti reakcie od koncentrácie a s cieľom pokryť celý rozsah cytotoxicity alebo podrobne preskúmať vzťah medzi koncentráciou a reakciou môže byť nevyhnutné použiť viac koncentrácií s tesným odstupom a viac ako štyri koncentrácie, najmä v situáciách, keď sa vyžaduje opakovať experiment (pozri odsek 43). Použitie viac ako štyroch koncentrácií môže byť obzvlášť dôležité pri použití jednotlivých kultúr.

20.

Ak maximálna koncentrácia vychádza z cytotoxicity, cieľová najvyššia koncentrácia by mala mať hodnotu relatívneho prežitia v rozsahu 20 až 10 %. Pri interpretácii pozitívnych výsledkov, ktoré sa zistili len pri hodnote relatívneho prežitia 10 % alebo nižšej, je potrebné postupovať obozretne (odsek 43).

21.

V prípade slabo rozpustných testovaných chemikálií, ktoré nie sú cytotoxické pri koncentráciách nižších, než je najnižšia nerozpustná koncentrácia, by najvyššia analyzovaná koncentrácia mala na konci ošetrenia testovanou chemikáliou vyvolať zakalenie alebo zrazeninu viditeľnú voľným okom alebo pomocou inverzného mikroskopu. Aj keď sa cytotoxicita vyskytne pri koncentrácii vyššej, ako je najnižšia nerozpustná koncentrácia, testovať sa odporúča len pri jednej koncentrácii vyvolávajúcej zakalenie alebo viditeľnú zrazeninu, pretože falošné účinky môžu byť spôsobené zrazeninou. Pri koncentrácii vyvolávajúcej zrazeninu je potrebné zabezpečiť, aby táto zrazenina nenarušovala vykonávanie testu. Môže byť užitočné pred experimentom stanoviť rozpustnosť v kultivačnom médiu.

22.

Ak sa nezistí žiadna zrazenina ani obmedzujúca cytotoxicita, najvyššia testovaná koncentrácia by mala zodpovedať 10 mM, 2 mg/ml alebo 2 μl/ml, podľa toho, ktorá je najnižšia (39) (40). Keď testovaná chemikália nemá určené zloženie, napr. látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály [t. j. chemické látky neznámeho alebo variabilného zloženia (UVCB)] (41), extrakty z prostredia atď., môže byť potrebná vyššia maximálna koncentrácia (napr. 5 mg/mL) v prípade absencie dostatočnej cytotoxicity, aby sa zvýšila koncentrácia jednotlivých zložiek. Je však potrebné poznamenať, že tieto požiadavky sa môžu v prípade humánnych liekov líšiť (42).

Kontroly

23.

Pre všetky experimentálne podmienky by sa mali zahrnúť súbežné negatívne kontroly (pozri odsek 16), ktoré pozostávajú zo samotného rozpúšťadla v médiu s testovanou chemikáliou a s ktorými sa manipuluje rovnakým spôsobom ako s ošetrenými kultúrami.

24.

Súbežné pozitívne kontroly sú potrebné na preukázanie schopnosti laboratória identifikovať mutagény v podmienkach použitého testovacieho protokolu a v prípade potreby aj na preukázanie účinnosti exogénneho systému metabolickej aktivácie. Príklady pozitívnych kontrol sú uvedené v tabuľke 1 ďalej. V odôvodnených prípadoch sa môžu na pozitívnu kontrolu použiť alternatívne látky. Keďže testy na cicavčích bunkách in vitro na zistenie genetickej toxicity sú dostatočne štandardizované, možno testy využívajúce ošetrenia s exogenóznou metabolickou aktiváciou a bez takejto aktivácie uskutočniť len pomocou pozitívnej kontroly vyžadujúcej metabolickú aktiváciu. V tomto prípade reakcia na túto jednu pozitívnu kontrolu preukáže činnosť systému metabolickej aktivácie, ako aj vnímavosť testovacieho systému. Každá pozitívna kontrola sa má použiť pri jednej alebo viacerých koncentráciách, pri ktorých sa očakáva reprodukovateľný a zistiteľný nárast voči pozadiu s cieľom preukázať citlivosť testovacieho systému, pričom reakciu by nemalo narušiť prekročenie limitov cytotoxicity, ktoré sú stanovené pre túto testovaciu metódu (pozri odsek 20).

Tabuľka 1

Referenčné látky odporúčané na posúdenie spôsobilosti laboratória a na výber pozitívnych kontrol

Stav metabolickej aktivácie

Lokus

Látka a číslo CAS

neprítomnosťexogénnej metabolickej aktivácie

Hprt

etyl-metánsulfonát [č. CAS 62-50-0] N-etyl-N-nitrózomočovina [č. CAS 759-73-9] 4-nitrochinolín-1-oxid [č. CAS 56-57-5]

 

xprt

streptonigrín [č. CAS 3930-19-6] mitomycín C [č. CAS 50-07-7]

prítomnosť exogénnej metabolickej aktivácie

Hprt

3-metylcholantrén [č. CAS 56-49-5] 7,12-dimetylbenzantracén [č. CAS 57-97-6] benzo[a]pyrén (č. CAS 50-32-8)

 

xprt

benzo[a]pyrén (č. CAS 50-32-8)

POSTUP

Ošetrenie testovanou chemikáliou

25.

Proliferujúce bunky sa ošetria testovanou chemikáliou za prítomnosti aj za neprítomnosti systému metabolickej aktivácie. Expozícia trvá primeraný čas (primeraný čas je zvyčajne 3 až 6 hodín).

26.

Minimálny počet buniek použitých v každej z testovacích kultúr (kontrolnej aj ošetrenej) v každom štádiu testu je založený na frekvencii spontánnych mutácií. Všeobecným usmernením je ošetriť a subkultivovať dostatočný počet buniek na to, aby sa vo všetkých štádiách testu vo všetkých kultúrach zachovalo 10 spontánnych mutantov (17). Frekvencia spontánnych mutácií je vo všeobecnosti v rozsahu 5 až 20 × 10-6. Na dosiahnutie frekvencie spontánnych mutácií 5 × 10-6 a zachovanie dostatočného počtu spontánnych mutantov (najmenej 10) aj pri kultúrach ošetrených pomocou koncentrácií, ktoré počas ošetrenia spôsobujú 90 % cytotoxicitu (10 % relatívne prežitie), by bolo potrebné ošetriť aspoň 20 × 106 buniek. Okrem toho sa počas doby expresie musí kultivovať a naočkovať na účely mutantnej selekcie dostatočný počet buniek (nikdy nie menej ako 2 milióny) (17).

Čas do prejavenia fenotypu a meranie frekvencie mutácií

27.

Po období ošetrenia sa vykoná kultivácia buniek, aby sa mohol prejaviť mutantný fenotyp. Najmenej 7 až 9 dní je vo všeobecnosti dostatočných, aby bol možný takmer optimálny fenotypový prejav novoindukovaných mutantov Hprt a xprt (43) (44). Počas tohto času sa bunky pravidelne subkultivujú, aby sa zachoval ich exponenciálny rast. Po fenotypovom prejave sa bunky opätovne naočkujú do média so selektívnym činiteľom aj bez selektívneho činiteľa (6-tioguanín) na stanovenie počtu mutantov, resp. klonovacej účinnosti v čase selekcie. Na toto očkovanie možno použiť Petriho misky na jednovrstvové bunkové kultúry alebo mikrotitračné platničky pre bunky v suspenzii. Na účely mutantnej selekcie sa bunky naočkujú s takou hustotou, aby sa zabezpečila optimálna výťažnosť mutantov (t. j. aby sa predišlo metabolickému spolupôsobeniu) (17). Misky sa inkubujú primeraný čas na zabezpečenie optimálneho rastu kolónie (napr. 7 – 12 dní) a kolónie sa spočítajú. Frekvencia mutácií sa vypočíta na základe počtu mutantných kolónií s korekciou podľa klonovacej účinnosti v čase mutantnej selekcie (pozri vzorce v dodatku 2).

Spôsobilosť laboratória

28.

Na to, aby sa pred vykonaním rutinného testu zistilo, či má laboratórium s danou skúškou dostatočné skúsenosti, malo by mať vykonanú sériu pokusov s referenčnými pozitívnymi látkami pôsobiacimi prostredníctvom rôznych mechanizmov (aspoň jedna látka aktívna s metabolickou aktiváciou a jedna látka aktívna bez metabolickej aktivácie, vybraté z látok uvedených v tabuľke 1) a s rôznymi negatívnymi kontrolami (pri použití rôznych rozpúšťadiel/nosičov). Reakcie týchto pozitívnych a negatívnych kontrol by mali byť v súlade s príslušnou literatúrou. Tento postup sa nepoužije v prípade laboratórií, ktoré majú skúsenosti, t. j. ktoré majú k dispozícii databázu historických údajov, ako sa definuje v odsekoch 30 až 33.

29.

Mal by sa preskúmať výber látok na pozitívnu kontrolu (pozri tabuľku 1 v odseku 25) za neprítomnosti aj za prítomnosti metabolickej aktivácie, aby sa preukázala spôsobilosť zistiť mutagénne chemikálie, stanoviť účinnosť systému metabolickej aktivácie a preukázať vhodnosť podmienok pre rast buniek počas ošetrovania, fenotypového prejavu a mutatnej selekcie, ako aj vhodnosť postupov hodnotenia. Rozsah koncentrácií vybraných látok by sa mal zvoliť tak, aby poskytol opakovateľné zvýšenia súvisiace s jednotlivými koncentráciami v porovnaní s úrovňou pozadia, aby sa tak preukázala citlivosť a dynamické rozpätie testovacieho systému.

Údaje o historických kontrolách

30.

Laboratórium by malo určiť:

rozsah a distribúciu historických pozitívnych kontrol,

rozsah a distribúciu historických negatívnych kontrol (neošetrených, s rozpúšťadlom).

31.

Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s distribúciou historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými údajmi o kontrolách (22). S pridávaním ďalších experimentálnych údajov k distribúcii kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tejto distribúcie (17) (45) (46).

32.

Databázu historických negatívnych kontrol laboratória by na začiatku malo tvoriť minimálne 10 experimentov, ale podľa možnosti by mala pozostávať aspoň z 20 experimentov vykonaných za porovnateľných experimentálnych podmienok. Laboratóriá by mali použiť metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (47)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov týkajúcich sa pozitívnych a negatívnych kontrol a preukázať, že metodika v danom laboratóriu je „pod kontrolou“ (46). Ďalšie odporúčania k vytváraniu a využívaniu historických údajov (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného experimentu) možno nájsť v literatúre (45).

33.

Údaje o negatívnych kontrolách majú obsahovať frekvencie mutácií z jednej alebo prednostne z paralelných kultúr podľa opisu v odseku 23. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí distribúcie databázy historických negatívnych kontrol laboratória (17) (45) (46). V prípade, že údaje o súbežných negatívnych kontrolách nepatria do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do distribúcie historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne mimo uvedených medzí a pokiaľ existujú dôkazy o tom, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri vyššie), a dôkazy o tom, že nedošlo k technickému alebo ľudskému zlyhaniu.

34.

Všetky zmeny v skúšobnom protokole by sa mali zvážiť z hľadiska ich súladu s existujúcimi databázami historických kontrol laboratória. Každý výrazný nesúlad by mal viesť k vytvoreniu novej databázy historických kontrol.

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Prezentovanie výsledkov

35.

Súčasťou prezentovania výsledkov majú byť všetky údaje potrebné na výpočet cytotoxicity (vyjadrenej ako relatívne prežitie). Tieto údaje, ktoré sa uvádzajú pre ošetrené aj kontrolné kultúry, obsahujú počet buniek na konci ošetrenia, počet buniek naočkovaných bezprostredne po ošetrení a počty kolónií (alebo počet jamiek bez kolónií v prípade mikrotitračnej metódy). Relatívne prežitie jednotlivých kultúr sa vyjadruje ako percentuálna hodnota vzhľadom na súbežnú kontrolu s aplikáciou rozpúšťadla (pozri vymedzenie pojmov v dodatku 1).

36.

Súčasťou prezentovania výsledkov majú byť aj všetky údaje potrebné na výpočet frekvencie mutácií. Údaje, ktoré sa uvádzajú pre ošetrené aj kontrolné kultúry, obsahujú: 1. počet buniek naočkovaných so selektívnym činiteľom a bez selektívneho činiteľa (v čase naočkovania buniek na účely mutantnej selekcie) a 2. počet spočítaných kolónií (alebo počet jamiek bez kolónií v prípade mikrotitračnej metódy) z misiek so selektívnym činiteľom a bez selektívneho činiteľa. Frekvencia mutácií sa vypočíta na základe počtu mutantných kolónií (v miskách so selektívnym činiteľom) s korekciou podľa klonovacej účinnosti (z misiek bez selektívneho činiteľa). Frekvencia mutácií sa vyjadruje ako počet mutantných buniek na milión životaschopných buniek (pozri vymedzenie pojmov v dodatku 1).

37.

Mali by sa uvádzať údaje o jednotlivých kultúrach. Všetky údaje sa dodatočne sumarizujú v tabuľkovej forme.

Kritériá prijateľnosti

38.

Prijateľnosť testu je založená na týchto kritériách:

Súbežná negatívna kontrola sa považuje za prijateľnú na doplnenie do databázy historických negatívnych kontrol laboratória, ako je opísané v odseku 33.

Súbežné pozitívne kontroly (pozri odsek 24) by mali vyvolať reakcie, ktoré sú zlučiteľné s reakciami generovanými v databáze historických pozitívnych kontrol, a viesť k štatisticky významnému nárastu v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou.

Testovali sa dve experimentálne podmienky (t. j. s metabolickou aktiváciou a bez metabolickej aktivácie), pokiaľ jedna z nich neviedla k pozitívnym výsledkom (pozri odsek 25).

Analyzovateľný je adekvátny počet buniek a koncentrácií (odseky 25, 26 a 19).

Kritériá výberu najvyššej koncentrácie sú v súlade s kritériami opísanými v odsekoch 20, 21 a 22.

Hodnotenie a interpretácia výsledkov

39.

Za predpokladu, že všetky kritériá prijateľnosti sú splnené, sa testovaná chemikália pokladá za jednoznačne pozitívnu, ak pre ktorúkoľvek z preskúmaných experimentálnych podmienok platí, že:

aspoň jedna z testovaných koncentrácií vykazuje štatisticky významné zvýšenie v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,

ide o nárast, pri ktorom sa pri hodnotení vhodným testovaním trendov potvrdí súvislosť s koncentráciou,

niektorý z týchto výsledkov je mimo distribúcie údajov historických negatívnych kontrol (napr. mimo 95 % regulačných medzí Poissonovho rozdelenia, pozri odsek 33).

Ak sú splnené všetky tieto kritériá, testovaná chemikália sa považuje za schopnú vyvolať génové mutácie v kultivovaných bunkách cicavcov v tomto testovacom systéme. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (46) (48).

40.

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jednoznačne negatívnu, ak pre všetky preskúmané experimentálne podmienky platí, že:

ani jedna z testovaných koncentrácií nevykazuje štatisticky významný nárast v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,

hodnotenie pomocou vhodného testovania trendov ukáže, že nedochádza k nárastu v závislosti od koncentrácie,

všetky výsledky sa vyskytujú v rámci distribúcie historických údajov negatívnych kontrol (napr. v 95 % regulačných medziach Poissonovho rozdelenia, pozri odsek 33).

Testovaná chemikália sa vtedy považuje za neschopnú vyvolať génové mutácie v kultivovaných bunkách cicavcov v tomto testovacom systéme.

41.

Neexistuje požiadavka na potvrdenie jednoznačne pozitívnej alebo negatívnej reakcie.

42.

V prípade, že reakcia nie je jednoznačne negatívna ani jednoznačne pozitívna podľa uvedeného opisu, alebo v prípade, že ide o pomoc pri stanovovaní biologickej relevantnosti výsledku, by sa údaje mali odborne posúdiť a/alebo podrobiť ďalšiemu skúmaniu. Prípadne by mohlo byť užitočné uskutočnenie opakovaného experimentu pomocou zmenených experimentálnych podmienok [napr. odstup medzi koncentráciami, iné podmienky metabolickej aktivácie (t. j. koncentrácia S9 alebo pôvod S9)].

43.

V zriedkavých prípadoch neumožní súbor údajov ani po ďalšom skúmaní vyvodiť záver o pozitívnom alebo negatívnom výsledku. Reakcia na testovanú chemikáliu sa preto uzavrie ako nejednoznačná (interpretovaná ako s rovnakou pravdepodobnosťou pozitívna alebo negatívna).

Správa o teste

44.

Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:

 

Testovaná chemikália:

zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii,

stabilita testovanej chemikálie, ak je známa,

rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle, ak je známa,

prípadné meranie pH, osmolality a zrazeniny v kultivačnom médiu, do ktorého bola pridaná testovaná chemikália.

 

Jednozložkové látky:

fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,

identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď.

 

Viaczložkové látky, UVCB a zmesi:

charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek.

 

Rozpúšťadlo:

zdôvodnenie výberu rozpúšťadla,

percentuálny podiel rozpúšťadla v konečnom kultivačnom médiu.

 

Bunky:

 

Pre hlavné laboratórne kultúry:

typ, zdroj bunkových línií,

počet pasáží, ak je dostupný, a história laboratória,

vlastnosti karyotypu a/alebo modálny počet chromozómov,

metódy udržiavania bunkových kultúr,

neprítomnosť mykoplazmy,

časy zdvojenia buniek.

 

Podmienky testovania:

zdôvodnenie výberu koncentrácií a počtu kultúr vrátane napríklad údajov o cytotoxicite a obmedzení rozpustnosti,

skladba média, koncentrácia CO2, úroveň vlhkosti,

koncentrácia testovanej chemikálie vyjadrená ako konečná koncentrácia v kultivačnom médiu (napr. μg alebo mg/ml alebo mM kultivačného média),

koncentrácia (a/alebo objem) rozpúšťadla a testovanej chemikálie pridaných do kultivačného média,

inkubačná teplota,

inkubačný čas,

trvanie ošetrenia,

hustota buniek počas ošetrenia,

typ a zloženie systému metabolickej aktivácie (zdroj S9, metóda prípravy zmesi S9, koncentrácia alebo objem zmesi S9 a S9 v konečnom kultivačnom médiu, kontroly kvality S9),

látky na pozitívnu a negatívnu kontrolu, konečné koncentrácie pre každú z podmienok ošetrenia;

dĺžka doby expresie (vrátane počtu vysadených buniek, subkultúr a harmonogramov kŕmenia, ak je to vhodné),

identita selektívneho činiteľa a jeho koncentrácia,

kritériá prijateľnosti testov,

metódy použité na stanovenie počtu životaschopných a mutantných buniek,

metódy použité na meranie cytotoxicity,

akékoľvek doplňujúce informácie týkajúce sa cytotoxicity a použitej metódy,

dĺžka inkubačného času po očkovaní,

kritériá na považovanie štúdií za pozitívne, negatívne alebo nejednoznačné,

metódy použité na určenie pH, osmolality a zrážania.

 

Výsledky:

počet ošetrených buniek a počet subkultivovaných buniek pre jednotlivé kultúry,

merania cytotoxicity a prípadné iné pozorovania,

známky zrážania a čas ich stanovenia,

počet buniek naočkovaných v selektívnom a neselektívnom médiu,

počet kolónií v neselektívnom médiu a počet rezistentných kolónií v selektívnom médiu a súvisiace frekvencie mutácií,

ak je to možné, závislosť medzi koncentráciou a reakciou,

údaje o súbežných negatívnych (rozpúšťadlo) a pozitívnych kontrolách (koncentrácie a rozpúšťadlá),

historické údaje o negatívnych (rozpúšťadlo) a pozitívnych kontrolách obsahujúce rozsahy, stredné hodnoty, štandardné odchýlky a interval spoľahlivosti (napr. 95 %), ako aj počet údajov,

štatistické analýzy (pre jednotlivé kultúry a spojené paralelné kultúry v odôvodnených prípadoch) a hodnoty p, ak existujú.

 

Diskusia o výsledkoch.

 

Záver

LITERATÚRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)

Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306–1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394–403.

(5)

Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121–128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235–239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutation Res., 196, 17–36.

(8)

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147–204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297–305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789–886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439–452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177–183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 584, 1–256.

(14)

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O’Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135–141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9–17.

(16)

Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133–147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, s. 66–101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193–214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165–175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411–1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation).

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261–287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299–305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83–90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365–373.

(27)

Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347–364.

(28)

Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175–177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, s. 85–88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55–65.

(32)

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33)

UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). K dispozícii na adrese: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)

Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, s. 91-103.

(38)

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Available upon request from the Organisation for Economic Cooperation and Development.

(40)

Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. K dispozícii na adrese: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., and Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

(46)

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141-154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

Dodatok 1

VYMEDZENIE POJMOV

Substitučné mutagény bázového páru: chemikálie, ktoré spôsobujú substitúciu bázových párov v DNA.

Chemikália: látka alebo zmes.

Klonovacia účinnosť: percentuálny podiel buniek naočkovaných s nízkou hustotou, ktoré sú rastom schopné vytvoriť kolóniu, ktorú možno spočítať.

Koncentrácie: sú konečné koncentrácie testovanej chemikálie v kultivačnom médiu.

Cytotoxicita: v prípade skúšok v rámci tejto testovacej metódy znamená cytotoxicita pokles relatívneho prežitia ošetrených buniek v porovnaní s negatívnou kontrolou (pozri príslušný odsek).

Priama mutácia: génová mutácia z rodičovského typu na mutantnú formu, ktorá spôsobuje zmenu alebo stratu enzymatickej aktivity alebo funkcie kódovaného proteínu.

Konštrukčné mutagény: chemikálie, ktoré v molekule DNA spôsobujú pridanie alebo deléciu jedného alebo viacerých bázových párov.

Genotoxický: všeobecný výraz, ktorý zahŕňa všetky typy poškodenia DNA alebo chromozómov vrátane zlomov DNA, aduktov, zmien usporiadania, mutácií, chromozómových aberácií a aneuploidie. Nie všetky typy genotoxických účinkov majú za následok mutácie alebo trvalé poškodenie chromozómov.

Médium HAT: médium, ktoré obsahuje hypoxantín, aminopterín a tymidín a slúži na odstránenie mutantov HPRT.

Mitotická rekombinácia: rekombinácia medzi homológnymi chromatidmi počas mitózy, ktorá môže potenciálne indukovať zlom dvojvláknového reťazca DNA alebo stratu heterozygozity.

Médium MPA: médium, ktoré obsahuje xantín, adenín, tymidín, aminopterín a kyselinu mykofenolovú a slúži na odstránenie mutantov XPRT.

Mutagénny: produkujúci dedičnú zmenu sekvencie(-í) párov báz DNA v génoch alebo štruktúry chromozómov (chromozómové aberácie).

Frekvencia mutácií (MF): podiel počtu zistených mutantných kolónií a počtu buniek naočkovaných v selektívnom médiu, ktorý sa upraví na základe klonovacej účinnosti (alebo životaschopnosti) v čase selekcie.

Čas do prejavenia fenotypu: Čas po ošetrení, počas ktorého prebieha genetická zmena v rámci genómu a už existujúce génové produkty sa vyčerpajú až do bodu, keď dôjde k zmene fenotypovej charakteristiky.

Relatívne prežitie (RS): na základe relatívneho prežitia sa meria cytotoxicita súvisiaca s ošetrením. Relatívne prežitie predstavuje klonovaciu účinnosť (CE) buniek naočkovaných bezprostredne po ošetrení pri zohľadnení všetkých strát buniek počas ošetrenia v porovnaní s klonovacou účinnosťou negatívnych kontrol (ktorým je priradená miera prežitia 100 %).

Frakcie pečene S9: supernatant pečeňového homogenátu po odstredení pri 9 000 g, t. j. surový pečeňový extrakt.

Zmes S9: zmes frakcie pečene S9 a kofaktorov potrebných pre aktivitu metabolických enzýmov.

Kontrola s aplikáciou rozpúšťadla: všeobecný termín na vymedzenie kontrolných kultúr, ku ktorým sa pridáva len rozpúšťadlo používané na rozpúšťanie testovanej chemikálie.

Testovaná chemikália: každá látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.

Neošetrená kontrola: kultúry, ktoré sa neošetrujú (t. j. testovanou chemikáliou ani rozpúšťadlom), ale sa spracovávajú súbežne a rovnakým spôsobom ako kultúry, ku ktorým sa pridáva testovaná chemikália.

UVCB: chemické látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.

Dodatok 2

VZORCE NA POSÚDENIE CYTOTOXICITY A FREKVENCIE MUTÁCIÍ

Cytotoxicita sa hodnotí na základe relatívneho prežitia, t. j. klonovacej účinnosti (CE) buniek naočkovaných bezprostredne po ošetrení pri zohľadnení všetkých strát buniek počas ošetrenia v porovnaní s upravenou klonovacou účinnosťou negatívnych kontrol (ktorým je priradená miera prežitia 100 %) (pozri vzorec relatívneho prežitia ďalej).

Upravená klonovacia účinnosť pre kultúru ošetrenú pomocou testovanej chemikálie sa vypočíta ako:

Formula

Relatívne prežitie (RS) pre kultúru ošetrenú pomocou testovanej chemikálie sa vypočíta ako:

Formula

Frekvencia mutácií predstavuje podiel klonovacej účinnosti mutantných kolónií v selektívnom médiu a klonovacej účinnosti v neselektívnom médiu, ktorá sa meria pre tú istú kultúru v čase selekcie.

Formula

Keď sa na účely klonovacej účinnosti používajú Petriho misky:

Klonovacia účinnosť = počet kolónií/počet naočkovaných buniek.

Keď sa na účely klonovacej účinnosti používajú mikrotitračné platničky:

Počet kolónií na jamku mikrotitračnej platničky zodpovedá Poissonovmu rozdeleniu.

Klonovacia účinnosť = –LnP(0)/počet naočkovaných buniek na jednu jamku

Keď –LnP(0) je pravdepodobný počet prázdnych jamiek spomedzi nasadených jamiek a opisuje ho tento vzorec:

LnP(0) = –Ln (počet prázdnych jamiek/počet naočkovaných jamiek).

3.

V časti B sa kapitola B.22 nahrádza takto:

„B.22   TEST DOMINANTNÝCH LETÁLNYCH MUTÁCIÍ PRI HLODAVCOCH

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda (TM) je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 478 (2016). Testovacie metódy sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok, zmeny regulačných potrieb a faktory dobrých životných podmienok zvierat. Táto upravená verzia testovacej metódy zohľadňuje viac než tridsaťročné skúsenosti s týmto testom a potenciál na integrovanie alebo kombinovanie tohto testu s inými testmi toxicity, napríklad v rámci štúdií vývojovej, reprodukčnej toxicity alebo genotoxicity. Vzhľadom na obmedzenia tohto testu a používanie veľkého počtu zvierat však táto skúška nie je určená na to, aby sa používala ako primárna metóda, ale skôr ako doplnková testovacia metóda, ktorú možno použiť, len ak neexistuje žiadna alternatíva z hľadiska regulačných požiadaviek. Kombinovanie testov toxicity potenciálne umožňuje ušetriť veľké počty zvierat, ktoré by sa inak využívali v rámci testov toxicity. Bol vypracovaný dokument OECD, ktorý obsahuje stručné informácie o testovaní v oblasti genetickej toxikológie a prehľad posledných zmien, ktoré sa vykonali v usmerneniach OECD na vykonávanie testov v oblasti genetickej toxicity (1).

2.

Účelom testu dominantných letálnych mutácií (DL) je skúmať, či chemikálie vyvolávajú mutácie v dôsledku chromozómových aberácií v zárodočných bunkách. Okrem toho je test dominantných letálnych mutácií relevantný pre hodnotenie genotoxicity, pretože faktory in vivo metabolizmu, farmakokinetiky a opravných procesov DNA sú aktívne a prispievajú k reakciám, hoci sú v prípade rôznych druhov odlišné. Vyvolanie dominantných letálnych mutácií po vystavení testovanej chemikálii naznačuje, že chemikália ovplyvnila zárodočné tkanivá pokusného zvieraťa.

3.

Dominantné letálne mutácie spôsobujú smrť embrya alebo plodu. Vyvolanie dominantných letálnych mutácií po vystavení testovanej chemikálii naznačuje, že chemikália ovplyvnila zárodočné bunky pokusného zvieraťa.

4.

Skúška dominantných letálnych mutácií je užitočná na potvrdenie pozitívnych výsledkov testov pomocou somatických sledovaných parametrov in vivo a je relevantným sledovaným parametrom na predikciu nebezpečnosti pre ľudí a rizika genetických chorôb prenášaných prostredníctvom zárodočnej línie. Táto skúška je však prácna a vyžaduje si vysoký počet zvierat, v dôsledku čoho je jej uskutočnenie veľmi drahé a časovo náročné. Keďže spontánna frekvencia dominantných letálnych mutácií je pomerne vysoká, má táto skúška všeobecne obmedzenú citlivosť pri detekcii malých zvýšení frekvencie mutácií.

5.

Vymedzenie kľúčových pojmov je uvedené v dodatku 1.

POČIATOČNÉ ÚVAHY

6.

Tento test sa najčastejšie uskutočňuje na myšiach (2) (3) (4), ale ak je to vedecky opodstatnené, v niektorých prípadoch môžu byť vhodné aj iné druhy, napríklad potkany (5) (6) (7) (8). Dominantné letálne mutácie sú vo všeobecnosti dôsledkom veľkých chromozómových aberácií (štrukturálnych a numerických abnormalít) (9) (10) (11), nemožno však vylúčiť ani génové mutácie. Dominantná letálna mutácia je mutácia, ku ktorej dochádza v zárodočnej bunke ako takej alebo ktorá vznikne po oplodnení v skorých fázach embrya, pričom nespôsobuje dysfunkciu gaméty, ale je letálna pre oplodnené vajíčko alebo vyvíjajúce sa embryo.

7.

Jednotlivé samce sa postupne pária s panenskými samicami vo vhodných intervaloch. Počet párení po ošetrení závisí od konečného účelu štúdie dominantných letálnych mutácií (odsek 23) a má zabezpečiť, aby sa z hľadiska dominantných letálnych mutácií posúdili všetky fázy dozrievania samčej zárodočnej bunky (12).

8.

Ak existujú dôkazy, že testovaná chemikália alebo jej metabolity nedosiahnu semenníky, nie je vhodné tento test použiť.

PRINCÍP TESTU

9.

Vo všeobecnosti sa samčí jedinci vystavia testovanej chemikálii prostredníctvom vhodného spôsobu expozície a pária sa s neovplyvnenými panenskými samičkami. Rôzne typy zárodočných buniek možno testovať s využitím postupných intervalov párenia. Po uplynutí primeraného času po párení sa samice usmrtia a vyšetrením ich materníc sa určí počet implantátov a živých a mŕtvych embryí. Dominantná letalita testovanej chemikálie sa určí porovnaním počtu živých implantátov na samicu v ošetrenej skupine s počtom živých implantátov na samicu v kontrolnej skupine s nosičom/v kontrolnej skupine s aplikáciou rozpúšťadla. Zvýšenie počtu mŕtvych implantátov na samicu v ošetrenej skupine v porovnaní s počtom mŕtvych implantátov na samicu v kontrolnej skupine odráža postimplantačné straty vyvolané testovanou chemikáliou. Postimplantačné straty sa vypočítajú stanovením pomeru mŕtvych implantátov k celkovému počtu implantátov v ošetrenej skupine v porovnaní s pomerom mŕtvych implantátov k celkovému počtu implantátov v kontrolnej skupine. Predimplantačné straty sa môžu odhadnúť na základe porovnania rozdielu počtu žltých teliesok a celkového počtu implantátov alebo porovnaním všetkých implantátov na samicu v ošetrenej a v kontrolnej skupine.

OVEROVANIE SPÔSOBILOSTI LABORATÓRIA

10.

Kompetencia na vykonávanie tejto skúšky sa určí preukázaním schopnosti reprodukovať frekvencie dominantných letálnych mutácií z publikovaných údajov [napr. (13) (14) (15) (16) (17) (18)] s látkami, ktoré slúžia ako pozitívna kontrola (vrátane slabých reakcií), napríklad s látkami uvedenými v tabuľke 1, a s kontrolnými skupinami s nosičom, a získaním frekvencií z negatívnych kontrol, ktoré sú v súlade s prijateľným rozsahom údajov (pozri referencie uvedené vyššie) alebo s distribúciou historických kontrol laboratória, ak je k dispozícii.

OPIS METÓDY

Príprava

Výber druhov zvierat

11.

Mali by sa vyberať bežne používané laboratórne kmene zdravých pohlavne dospelých zvierat. Bežne sa používajú myši, vhodné však môžu byť aj potkany. Použiť možno akékoľvek iné vhodné druhy cicavcov, ak je to vedecky zdôvodnené v správe.

Podmienky umiestnenia a kŕmenia zvierat

12.

V prípade hlodavcov by mala byť teplota v miestnosti pre zvieratá 22 °C (±3 °C). Hoci relatívna vlhkosť by mala byť ideálne 50 – 60 %, mala by dosahovať minimálne 40 % a pokiaľ možno, okrem obdobia počas čistenia miestnosti, by nemala presiahnuť 70 %. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva touto cestou. Pred ošetrením alebo párením sa hlodavce umiestnia do malých skupín (najviac päťčlenných) rovnakého pohlavia, pokiaľ sa neočakáva ani nepozoruje agresívne správanie, a to prednostne v pevných klietkach s vhodným obohatením prostredia. Ak to je vedecky opodstatnené, zvieratá môžu byť umiestnené samostatne.

Príprava zvierat

13.

Zdravé, pohlavne zrelé a dospelé samčie a samičie zvieratá sa náhodne rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Každé zviera sa jednotlivo označí humánnou, minimálne invazívnou metódou (napr. krúžkovanie, označenie štítkom, aplikácia mikročipu alebo biometrická identifikácia, nie však skracovanie prstov ani uší) a aklimatizuje sa na laboratórne podmienky v priebehu minimálne piatich dní. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy spôsobené ich umiestnením. Malo by sa zabrániť krížovej kontaminácii pozitívnou kontrolou a testovanou chemikáliou. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variabilita zvierat minimálna a nemala by presiahnuť ±20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia.

Príprava dávok

14.

Tuhé testované chemikálie by sa pred podávaním dávok zvieratám mali rozpustiť alebo suspendovať vo vhodných rozpúšťadlách alebo nosičoch alebo primiešať do krmiva alebo pitnej vody. Kvapalné testované chemikálie sa môžu podávať priamo alebo rozriedené pred podávaním. V prípade inhalačných expozícií sa testované chemikálie môžu v závislosti od svojich fyzikálnochemických vlastností podávať ako plyn, výpary alebo tuhé/kvapalné aerosóly. Ak údaje o stabilite nepreukazujú prijateľnosť uskladnenia a nestanovujú vhodné podmienky skladovania, mali by sa používať čerstvo pripravené testované chemikálie.

Podmienky testovania

Rozpúšťadlo/nosič

15.

Rozpúšťadlo/nosič by nemal vyvolávať toxické účinky v používaných objemoch dávok a nemalo by pri nich existovať podozrenie na možnosť chemickej reakcie s testovanou chemikáliou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by mali podporiť referenčné údaje uvádzajúce ich kompatibilitu. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Príklady bežne používaných kompatibilných rozpúšťadiel/nosičov zahŕňajú vodu, fyziologický roztok, roztok metylcelulózy, roztok sodnej soli karboxymetylcelulózy, olivový olej a kukuričný olej.

Pozitívne kontroly

16.

Pokiaľ laboratórium nepreukázalo spôsobilosť pri vykonávaní testu a bežne nepoužívalo test v nedávnej minulosti (napr. počas posledných 5 rokov), vždy sa majú používať zvieratá na súbežné pozitívne kontroly. Nie je však potrebné ošetriť zvieratá v rámci pozitívnej kontroly rovnakým spôsobom ako zvieratá, ktorým sa podáva testovaná chemikália, ani odoberať vzorky pri všetkých intervaloch párenia. O látkach na pozitívnu kontrolu má byť známe, že vyvolávajú dominantné letálne mutácie pri podmienkach použitých v teste. S výnimkou ošetrenia sa so zvieratami v kontrolných skupinách zaobchádza rovnakým spôsobom ako so zvieratami v ošetrenej skupine.

17.

Dávky látok na pozitívnu kontrolu sa zvolia tak, aby vyvolávali slabé až mierne účinky, na základe ktorých možno kriticky posúdiť funkčnosť a citlivosť skúšky, pričom majú konzistentne vyvolávať pozitívne dominantné letálne mutácie. Príklady látok na pozitívnu kontrolu a vhodných dávok sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Príklady látok na pozitívnu kontrolu

Látka [č. CAS]

(referenčné č.)

Rozsah efektívnej dávky (mg/kg)

(druhy hlodavcov)

Obdobie podávania (v dňoch)

trietylénmelamín [51-18-3] (15)

0,25 (myši)

1.

cyklofosfamid [50-18-0] (19)

50 – 150 (myši)

5.

cyklofosfamid [50-18-0] (5)

25 – 100 (potkany)

1.

etyl-metánsulfonát [62-50-0] (13)

100 – 300 (myši)

5.

monomerický akrylamid [79-06-1] (17)

50 (myši)

5.

chlorambucil [305-03-3] (14)

25 (myši)

1.

Negatívne kontroly

18.

Súčasťou každého času odberu vzoriek by mali byť zvieratá z negatívnych kontrol ošetrované len s rozpúšťadlom alebo nosičom, s ktorými sa inak zaobchádza rovnako ako s pokusnými skupinami (20). Ak neexistujú historické alebo zverejnené kontrolné údaje, ktoré by preukazovali, že zvolené rozpúšťadlo/nosič nespôsobujú žiadne dominantné letálne mutácie ani iné nepriaznivé vplyvy, zvieratá z neošetrenej kontroly by mali byť súčasťou aj každého času odberu vzoriek na stanovenie prijateľnosti kontroly s nosičom.

POSTUP

Počet zvierat

19.

Jednotlivé samce sa postupne pária vo vhodne zvolených intervaloch (napr. v týždenných intervaloch, odseky 21 a 23) prednostne s jednou panenskou samičkou. Počet samcov v jednej skupine sa vopred určí tak, aby mal (v kombinácii s počtom spárených samíc v jednotlivých intervaloch párenia) dostatočnú štatistickú váhu potrebnú na zistenie minimálne zdvojnásobenia frekvencie dominantných letálnych mutácií (odsek 44).

20.

Počet samíc na jeden interval párenia je takisto potrebné vopred určiť na základe výpočtov štatistickej váhy tak, aby umožňoval detekciu minimálne zdvojnásobenia frekvencie dominantných letálnych mutácií (t. j. dostatočný počet gravidných samíc, aby celkovo poskytli aspoň 400 implantátov) (20) (21) (22) (23), pričom sa očakáva aspoň jeden mŕtvy implantát na jednotku analýzy (t. j. skupina párenia na dávku) (24).

Obdobie podávania a intervaly párenia

21.

Počet intervalov párenia nasledujúcich po ošetrení sa riadi harmonogramom ošetrovania a má zabezpečiť, že sa všetky štádiá dozrievania samčích zárodočných buniek posúdia z hľadiska vyvolania dominantných letálnych mutácií (12) (25). V prípade jedného ošetrenia do piatich podaní denných dávok sa má uskutočniť 8 (myš) alebo 10 (potkan) párení v týždenných intervaloch po poslednom ošetrení. V prípade viacnásobného podania dávky sa počet intervalov párenia môže znížiť úmerne k predĺženému času obdobia podávania, pričom sa však musí zachovať cieľ posúdenia všetkých štádií spermatogenézy (napr. po 28-dňovej expozícii sú na posúdenie všetkých štádií spermatogenézy pri myšiach dostatočné len 4 párenia v týždenných intervaloch). Všetky harmonogramy ošetrovania a párenia musia byť vedecky odôvodnené.

22.

Samice sa majú ponechať so samcami počas aspoň jedného estrálneho cyklu (napr. jeden týždeň pokrýva jeden estrálny cyklus pri myšiach a potkanoch). Samice, ktoré sa nepárili počas týždňového intervalu, možno použiť pre nasledujúci interval párenia. Prípadne sa majú ponechať dovtedy, kým nedôjde k páreniu, čo sa stanoví na základe prítomnosti spermií vo vagíne alebo prítomnosti vaginálnej zátky.

23.

Použitý režim expozície a párenia závisí od konečného účelu štúdie dominantných letálnych mutácií. Ak je cieľom určiť, či daná chemikália vyvoláva dominantné letálne mutácie ako také, prijateľnou metódou by bola expozícia počas celého cyklu spermatogenézy (napr. 7 týždňov pri myši, 5 – 7 ošetrení za týždeň) a uskutočnenie jedného párenia na záver. Ak je však cieľom identifikovať typ zárodočnej bunky, ktorý je citlivý z hľadiska vyvolania dominantných letálnych mutácií, uprednostňuje sa jednorazová alebo 5-dňová expozícia, po ktorej nasleduje párenie v týždňových intervaloch.

Úrovne dávok

24.

Ak sa z dôvodu, že ešte nie sú dostupné vhodné údaje na pomoc pri výbere dávky, vykoná predbežná štúdia na zistenie rozsahu, mala by sa vykonať v tom istom laboratóriu s použitím toho istého druhu, kmeňa, pohlavia a dávkovacieho režimu, aké majú byť použité v hlavnej štúdii (26). Štúdia by sa mala zamerať na zistenie maximálnej tolerovanej dávky (MTD) definovanej ako najvyššia dávka, ktorá sa bude tolerovať bez dôkazu toxicity obmedzujúcej štúdiu, a to vzhľadom na trvanie štúdie (napr. abnormálne správanie alebo reakcie, menšie zníženie telesnej hmotnosti alebo hematopoetická systémová cytotoxicita), ale nie smrti ani znakov bolesti, utrpenia či stavu, ktorý si vyžaduje humánne usmrtenie (27).

25.

Maximálna tolerovaná dávka nesmie zároveň nepriaznivo ovplyvňovať úspešnosť párenia (21).

26.

Testované chemikálie s osobitnými biologickými aktivitami pri nízkych netoxických dávkach (ako napríklad hormóny a mitogény) a chemikálie, ktoré vykazujú saturáciu toxikokinetických vlastností, môžu predstavovať výnimku z kritérií na stanovenie dávok a mali by sa hodnotiť prípad od prípadu.

27.

Na získanie informácií o vzťahu dávky a účinku by kompletná štúdia mala zahŕňať negatívnu kontrolnú skupinu a minimálne tri úrovne dávok, pričom vo všeobecnosti je každá úroveň dávky dvojnásobkom, no nie viac než štvornásobkom predchádzajúcej. Ak testovaná chemikália nevyvoláva toxicitu v štúdii na zistenie rozsahu alebo na základe existujúcich údajov, najvyššia dávka pri jednorazovom podaní by mala byť 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti. Ak však testovaná chemikália spôsobuje toxicitu, maximálna tolerovaná dávka by mala byť najvyššia podávaná dávka a použité úrovne dávky by mali podľa možnosti pokrývať rozsah od maximálnej dávky po dávku, ktorá spôsobuje slabú alebo nespôsobuje žiadnu toxicitu. V prípade netoxických chemikálií je limitná dávka pre obdobie podávania v trvaní najmenej 14 dní 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti na deň a pre obdobia podávania kratšie ako 14 dní je limitná dávka 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti na deň.

Podávanie dávok

28.

Pri plánovaní skúšky by sa mal zvážiť predpokladaný spôsob expozície ľudí. Preto možno ako opodstatnené zvoliť spôsoby expozície napríklad prostredníctvom stravy, pitnej vody, podkožne, intravenózne, topickou cestou, inhalačne, perorálne (pomocou sondy) alebo implantačne. V každom prípade by sa mal zvoliť taký spôsob, ktorým sa zaručí adekvátna expozícia cieľového tkaniva, resp. tkanív. Vo všeobecnosti sa neodporúča použitie intraperitoneálnej injekcie, keďže to nie je zamýšľaný spôsob expozície ľudí, a mal by sa použiť iba v prípade, že je k dispozícii osobitné vedecké zdôvodnenie. Ak je testovaná chemikália primiešaná do krmiva alebo pitnej vody, najmä v prípade jednej dávky, treba dbať na to, aby sa medzi konzumáciou potravy a vody a párením ponechal dostatočný čas, aby sa umožnilo zistenie účinkov (odsek 31). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať sondou alebo injekciou, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem nemá byť zvyčajne vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, okrem vodných roztokov, keď sa môže použiť objem najviac 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Použitie väčších objemov ako uvedený objem (pokiaľ to dovoľujú predpisy o dobrých životných podmienkach zvierat) by sa malo zdôvodniť. Zmeny v testovanom objeme sa minimalizujú tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vzhľadom na telesnú hmotnosť pri všetkých úrovniach dávky.

Pozorovania

29.

Najmenej raz denne by sa mali vykonať všeobecné klinické pozorovania testovaných zvierat a zaznamenať klinické príznaky, najlepšie každý deň v rovnakom čase a so zreteľom na časový interval najintenzívnejších predpokladaných účinkov po podaní dávky. Počas obdobia podávania dávok je potrebné aspoň dvakrát denne sledovať chorobnosť a úmrtnosť všetkých zvierat. Všetky zvieratá by sa mali odvážiť na začiatku štúdie, aspoň raz za týždeň počas štúdií s opakovanou dávkou a potom pri usmrtení. Spotreba potravy by sa mala merať aspoň raz týždenne. Ak sa testovaná chemikália podáva v pitnej vode, mala by sa pri každej výmene vody a aspoň raz za týždeň odmerať spotreba vody. Zvieratá, ktoré vykazujú neletálne ukazovatele nadmernej toxicity, by mali byť usmrtené pred dokončením testovacieho obdobia (27).

Odber a spracovanie tkaniva

30.

Samice sa usmrtia v druhej polovici gravidity na 13. deň gravidity v prípade myší a 14. – 15. deň gravidity v prípade potkanov. Vyšetrením materníc sa určia dominantné letálne mutácie a stanoví sa počet implantátov, živých a mŕtvych embryí a žltých teliesok.

31.

Rohy maternice a vaječníky sa odhalia, aby bolo možné spočítať žlté telieska, a plody sa vyberú, spočítajú a odvážia. Maternice treba starostlivo vyšetriť a zistiť prípadné resorpcie zakryté živými plodmi, pričom všetky resorpcie je potrebné zaznamenať. Zaznamená sa úmrtnosť plodov. Zaznamená sa aj počet úspešne oplodnených samíc a celkový počet implantácií, predimplantačné straty a postimplantačná úmrtnosť (vrátane skorých a neskorých resorpcií). Okrem toho sa viditeľné plody môžu najmenej dva týždne uchovávať v Bouinovom fixačnom prostriedku a následne sa vyšetrením zistí prítomnosť významných vonkajších malformácií (28) s cieľom získať doplňujúce informácie o reprodukčných a vývojových účinkoch testovanej látky.

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Spracovanie výsledkov

32.

Údaje sa prezentujú vo forme tabuliek, ktoré ukazujú počet spárených samcov, počet gravidných samíc a počet negravidných samíc. Výsledky každého párenia vrátane identity každého samca a každej samice sa uvádzajú samostatne. Pre každú samicu sa uvedie interval párenia, úroveň dávky ošetrených samcov a počet živých a mŕtvych implantátov.

33.

Postimplantačné straty sa vypočítajú stanovením pomeru mŕtvych implantátov k celkovému počtu implantátov z ošetrenej skupiny v porovnaní s pomerom mŕtvych implantátov k celkovému počtu implantátov v kontrolnej skupine s nosičom/v kontrolnej skupine s aplikáciou rozpúšťadla.

34.

Predimplantačné straty sa vypočítajú ako rozdiel medzi počtom žltých teliesok a počtom implantátov alebo ako zníženie priemerného počtu implantátov na samicu v porovnaní s kontrolnými páreniami. Je potrebné uviesť, ak sa predimplantačné straty určia odhadom.

35.

Faktor dominantnej letálnej mutácie sa odhaduje ako: (postimplantačné úmrtia/celkový počet implantácií na samicu) × 100.

36.

Treba vykazovať údaje o toxicite a o klinických príznakoch (podľa odseku 29).

Kritériá prijateľnosti

37.

Prijateľnosť testu určujú tieto kritériá:

Súbežná negatívna kontrola je v súlade so zverejnenými normami pre údaje historických negatívnych kontrol a s údajmi laboratória o historických kontrolách, ak sú k dispozícii (pozri odseky 10 a 18).

Súbežné pozitívne kontroly vyvolávajú reakcie, ktoré sú v súlade so zverejnenými normami pre údaje historických pozitívnych kontrol alebo s údajmi laboratória o historických pozitívnych kontrolách, ak sú k dispozícii, a vedú k štatisticky významnému nárastu v porovnaní s negatívnou kontrolou (pozri odseky 17 a 18).

Analyzoval sa primeraný celkový počet implantátov a dávok (odsek 20).

Kritériá výberu najvyššej dávky sú v súlade s kritériami opísanými v odsekoch 24 a 27.

Hodnotenie a interpretácia výsledkov

38.

Na zabezpečenie dostatočných údajov na analýzu vzťahu medzi dávkou a reakciou treba analyzovať najmenej tri skupiny ošetrené podaním dávky.

39.

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jednoznačne pozitívnu, ak:

najmenej jedna z testovaných dávok vykazuje štatisticky významný nárast v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,

ide o nárast, ktorý pri hodnotení vhodným testom potvrdí súvislosť s dávkou najmenej pri jednej experimentálnej podmienke (napr. týždenný interval párenia), a

niektorý z týchto výsledkov je mimo prijateľného rozsahu údajov negatívnych kontrol alebo distribúcie historických údajov negatívnych kontrol laboratória (napr. 95 % regulačných medzí Poissonovho rozdelenia), ak sú k dispozícii.

Testovaná chemikália sa vtedy považuje za schopnú vyvolať dominantné letálne mutácie v zárodočných bunkách pokusných zvierat. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód sú opísané v odseku 44. Iné odporúčané štatistické prístupy možno nájsť aj v literatúre (20) (21) (22) (24) (29). V použitých štatistických testoch by sa malo zviera posudzovať ako pokusná jednotka.

40.

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jednoznačne negatívnu, ak:

ani jedna z testovaných dávok nevykazuje štatisticky významný nárast v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,

neexistuje nárast súvisiaci s dávkou pri žiadnej experimentálnej podmienke a

všetky výsledky sú v rámci prijateľného rozsahu údajov negatívnych kontrol alebo historických údajov negatívnych kontrol laboratória (napr. 95 % regulačných medzí Poissonovho rozdelenia), ak sú k dispozícii.

Testovaná chemikália sa vtedy považuje za neschopnú vyvolať dominantné letálne mutácie v zárodočných bunkách pokusných zvierat.

41.

Neexistuje požiadavka na overenie jednoznačne pozitívnej alebo jednoznačne negatívnej reakcie.

42.

Ak reakcia nie je jednoznačne negatívna ani pozitívna a má sa pomôcť pri stanovení biologickej relevantnosti výsledku (napr. slabé alebo hraničné zvýšenie), údaje by sa mali vyhodnotiť na základe odborného posúdenia a/alebo ďalšieho skúmania pomocou existujúcich experimentálnych údajov, napríklad posúdením, či je pozitívny výsledok mimo prijateľného rozsahu údajov negatívnych kontrol alebo historických údajov negatívnych kontrol laboratória (30).

43.

V zriedkavých prípadoch, dokonca aj po ďalších skúmaniach, nemusí byť na základe daného súboru údajov možné dospieť k záveru o pozitívnych alebo negatívnych výsledkoch, a preto sa takéto údaje budú považovať za nejednoznačné.

44.

V použitých štatistických testoch by sa malo samčie zviera posudzovať ako pokusná jednotka. Hoci je možné, že údaje o počtoch (napr. počet implantátov na samicu) môžu zodpovedať Poissonovmu rozdeleniu a/alebo pomery (napr. pomer mŕtvych implantátov) môžu mať binomické rozdelenie, často sa stáva, že takéto údaje majú nadmerný rozptyl (31). V rámci štatistickej analýzy by sa malo tak najskôr uskutočniť testovanie nadmerného alebo nedostatočného rozptylu pomocou testov rozptylu, ako je napr. Cochranov binomický test rozptylu (32) alebo Taroneho test C(α) na určenie binomického nadmerného rozptylu (31) (33). Ak sa nezistí odchýlka od binomického rozdelenia, trendy v pomeroch v rámci úrovní dávok možno testovať pomocou testovania trendov podľa Cochranovho a Armitageovho testu (34) a párové porovnania s kontrolnou skupinou možno testovať pomocou Fisherovho exaktného testu (35). Podobne, ak sa nezistí odchýlka od Poissonovho rozdelenia, trendy v počtoch možno testovať pomocou Poissonovej regresie (36) a párové porovnania s kontrolnou skupinou možno testovať v kontexte Poissonovho modelu pomocou párových kontrastov (36). Ak sa zistí značný nadmerný alebo nedostatočný rozptyl, odporúčajú sa neparametrické metódy (23) (31). Patria sem testy založené na poradí, napríklad Jonckheereho-Terpstrov test trendu (37) Mannove-Whitneyho testy (38) párových porovnaní s kontrolnou skupinou s nosičom/s kontrolnou skupinou s aplikáciou rozpúšťadla, ako aj testy na základe permutácie, prevzorkovania alebo testy typu „bootstrap“ pre trendové a párové porovnania s kontrolnou skupinou (31) (39).

45.

Pozitívna skúška dominantných letálnych mutácií poskytuje dôkaz o genotoxicite testovanej chemikálie v zárodočných bunkách ošetreného samca testovaného druhu.

46.

Zváženie toho, či sú pozorované hodnoty v rozsahu historickej kontroly alebo mimo nej, môže poskytnúť usmernenie pri hodnotení biologického významu reakcie (40).

Správa o teste

47.

Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:

Zhrnutie.

 

Testovaná chemikália:

zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii,

stabilita testovanej chemikálie, ak je známa,

rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle, ak je známa,

prípadné meranie pH, osmolality a zrazeniny v kultivačnom médiu, do ktorého bola pridaná testovaná chemikália.

 

Jednozložkové látky:

fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,

identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, číslo CAS, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď.

 

Viaczložkové látky, UVCB a zmesi:

charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek.

 

Príprava testovanej chemikálie:

zdôvodnenie voľby nosiča,

rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle/nosiči, ak je známa,

príprava potravy, pitnej vody alebo inhalačných prípravkov,

analytické stanovenie prípravkov (napr. stabilita, homogenita, nominálne koncentrácie) v prípade, že sa vykonávajú.

 

Testované zvieratá:

použitý druh/kmeň a odôvodnenie voľby,

počet, vek a pohlavie zvierat,

zdroj, podmienky umiestnenia, potrava atď.,

metóda na jedinečnú identifikáciu zvierat,

pre krátkodobé štúdie: telesná hmotnosť jednotlivých samčích zvierat na začiatku a na konci testu, v prípade štúdií dlhších ako jeden týždeň: telesná hmotnosť jednotlivých zvierat počas štúdie a spotreba potravy. Mali by sa uviesť aj rozsah telesnej hmotnosti, stredná hodnota a štandardná odchýlka pre každú skupinu.

 

Podmienky testovania:

údaje z pozitívnych a negatívnych (rozpúšťadlo/nosič) kontrol,

údaje zo štúdie na zistenie rozsahu,

odôvodnenie výberu úrovne dávky,

podrobné údaje o príprave testovanej chemikálie,

podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie,

odôvodnenie cesty podania,

metódy merania toxicity pre zvieratá vrátane, keď to je možné, histopatologických alebo hematologických analýz a frekvencia pozorovaní a vážení zvierat,

metódy overovania, či sa testovaná chemikália dostala do cieľového tkaniva alebo hlavného obehu v prípade negatívnych výsledkov,

skutočná dávka (mg/kg telesnej hmotnosti/deň) vypočítaná z koncentrácie testovanej chemikálie (ppm) v potrave/pitnej vode a zo spotreby potravy/pitnej vody, ak sa uplatňuje,

podrobné informácie o kvalite potravy a vody,

podrobné informácie o obohatení prostredia klietky,

podrobný opis harmonogramu ošetrovania a harmonogramu odberu vzoriek a zdôvodnenie ich voľby,

metóda analgézie,

metóda usmrtenia,

postupy izolácie a uchovávania tkanív,

zdroj a čísla šarží všetkých súprav a reakčných činidiel (v náležitých prípadoch),

metódy vyčísľovania dominantných letálnych mutácií,

harmonogram párenia,

metódy použité na stanovenie toho, že sa uskutočnilo párenie,

čas usmrtenia,

kritériá hodnotenia účinkov dominantných letálnych mutácií vrátane údajov o žltých telieskach, implantáciách, resorpciách a predimplantačných stratách, živých implantátoch, mŕtvych implantátoch.

 

Výsledky:

stav zvieraťa pred testovaním a počas obdobia testovania vrátane toxických príznakov,

telesná hmotnosť samcov počas období ošetrovania a párenia,

počet spárených samíc,

vzťah medzi dávkou a reakciou, ak je možné ho určiť,

súbežné a historické údaje o negatívnych kontrolách s rozsahmi, strednými hodnotami a štandardnými odchýlkami,

súbežné údaje o pozitívnych kontrolách,

údaje v tabuľkovej forme o jednotlivých matkách vrátane počtu žltých teliesok na matku, počtu implantácií na matku, počtu resorpcií a predimplantačných strát na matku, počtu živých implantátov na matku, počtu mŕtvych implantátov na matku, hmotnosti plodu,

vyššie uvedené údaje zhrnuté za jednotlivé obdobia párenia a dávky s uvedením frekvencie dominantných letálnych mutácií,

použité štatistické analýzy a metódy.

 

Diskusia o výsledkoch.

 

Záver.

LITERATÚRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) s. 235-334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group „Dominant“ lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352: 159-167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48: 267-270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397: 77-74.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20: 325-329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3: 80-85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70: 616-624.

(11)

Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75: 112-129.

(12)

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352: 169-172.

(13)

Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21-27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345: 167-180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40: 371-378.

(16)

James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99: 303-314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173: 35-40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, s. 129-156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417: 19-30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312: 313-318.

(22)

Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A: 124-141.

(23)

Haseman J.K. and Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1: 353-360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85: 417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7: 313-319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291-306.

(29)

Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). „Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data“, Mutation. Res., 723: 87-90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272: 35-58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), s. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41: 133-145.

(38)

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Dodatok 1

VYMEDZENIE POJMOV

Chemikália: látka alebo zmes.

Žlté teliesko (Corpus luteum): štruktúra vylučujúca hormóny, ktorá vzniká na vaječníku v mieste folikulu, ktorý uvoľnil vajíčko. Počet žltých teliesok vo vaječníkoch zodpovedá počtu ovulovaných vajíčok.

Dominantná letálna mutácia: mutácia, ku ktorej dochádza v zárodočnej bunke alebo ktorá vznikne po oplodnení, spôsobujúca smrť embrya alebo plodu.

Miera plodnosti: počet spárených gravidných samíc na počet spárených samíc.

Interval párenia: čas medzi skončením expozície a párením ošetrených samcov. Kontrolou tohto intervalu je možné posúdiť chemické účinky na rôznych typoch zárodočných buniek. V rámci párenia myší počas 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. a 8. týždňa sa po skončení expozície merajú účinky na spermie, kondenzované spermatidy, okrúhle spermatidy, pachyténne spermatocyty, rané spermatocyty, diferencované spermatogóniá, diferencované spermatogóniá a spermatogóniá kmeňových buniek.

Preimplantačné straty: rozdiel medzi počtom implantátov a počtom žltých teliesok. Môžu sa odhadnúť aj na základe porovnania celkového počtu implantátov na samicu v ošetrenej a v kontrolnej skupine.

Postimplantačné straty: pomer počtu mŕtvych implantátov v ošetrenej skupine v porovnaní s pomerom počtu implantátov v kontrolnej skupine.

Testovaná chemikália: každá látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.

UVCB: chemická látka neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií a biologické materiály.

Dodatok 2

ČASOVÝ PRIEBEH SPERMATOGENÉZY U CICAVCOV

Image 1

Obr. 1: Porovnanie obdobia vývoja (v dňoch) samčej zárodočnej bunky u myší, potkanov a ľudí. V časových úsekoch, ktoré sú vytieňované, nedochádza k oprave DNA.

Na obr. 1 je zobrazená schéma spermatogenézy u myší, potkanov a ľudí (prevzaté z publikácie Adler, 1996). Nediferencované spermatogóniá zahŕňajú typy: A – jednoduché (single); A – spárované (paired); a A – usporiadané (aligned) spermatogóniá (Hess a de Franca, 2008). A – jednoduché sa považujú za pravé kmeňové bunky, preto na posúdenie vplyvov na kmeňové bunky musí medzi poslednou injekciou testovanej chemikálie a párením uplynúť aspoň 49 dní (u myší).

Odkazy

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169 – 172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

4.

V časti B sa kapitola B.23 nahrádza takto:

„B.23   TEST SPERMATOGONIÁLNEJ CHROMOZÓMOVEJ ABERÁCIE U CICAVCOV

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda (TM) je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 483 (2016). Testovacie metódy sa pravidelne revidujú vzhľadom na vedecký pokrok, zmeny regulačných potrieb a faktory dobrých životných podmienok zvierat. Táto upravená verzia testovacej metódy zohľadňuje veľa rokov skúseností s touto skúškou a potenciál na integrovanie tohto testu do iných štúdií toxicity alebo genotoxicity alebo na kombinovanie s takýmito štúdiami. Kombinovanie štúdií toxicity potenciálne umožňuje znížiť počty zvierat používaných v rámci testov toxicity. Táto testovacia metóda je súčasťou série testovacích metód týkajúcich sa genetickej toxikológie. Bol vypracovaný dokument OECD, ktorý obsahuje stručné informácie o testovaní v oblasti genetickej toxikológie a prehľad posledných zmien, ktoré sa vykonali v usmerneniach OECD na vykonávanie testov v oblasti genetickej toxicity (1).

2.

Účelom testu spermatogoniálnej chromozómovej aberácie in vivo u cicavcov je identifikovať tie chemikálie, ktoré spôsobujú štrukturálne chromozómové aberácie spermatogoniálnych buniek cicavcov (2) (3) (4). Okrem toho je test relevantný pre hodnotenie genotoxicity, pretože faktory metabolizmu, farmakokinetiky a opravných procesov DNA in vivo sú aktívne a prispievajú k odozvám, aj keď môžu byť v prípade rôznych druhov odlišné. Táto testovacia metóda nie je navrhnutá na meranie numerických abnormalít, skúška sa na tento účel nepoužíva rutinne.

3.

Týmto testom sa merajú štrukturálne chromozómové aberácie (chromozómového aj chromatidového typu) pri delení spermatogoniálnych zárodočných buniek, a preto sa očakáva, že na jeho základe sa bude dať predpovedať indukcia dedičnej mutácie v týchto zárodočných bunkách.

4.

Vymedzenie základných pojmov sa uvádza v dodatku.

POČIATOČNÉ ÚVAHY

5.

V tomto teste sa rutinne používajú hlodavce, ale ak je to vedecky opodstatnené, v niektorých prípadoch môžu byť vhodné aj iné druhy. Štandardnými cytogenetickými prípravami semenníkov hlodavcov sa generujú mitotické (spermatogóniá) a meiotické (spermatocyty) metafázy. Mitotické a meiotické metafázy sa určia na základe morfológie chromozómov (4). Týmto cytogenetickým testom in vivo sa zisťujú štrukturálne chromozómové aberácie v spermatogoniálnych mitózach. Iné cieľové bunky nie sú predmetom tejto testovacej metódy.

6.

Na zistenie aberácie chromatidového typu v spermatogoniálnych bunkách by sa malo skúmať prvé mitotické delenie buniek po ošetrení, predtým ako tieto aberácie v nasledujúcom delení konvertujú na chromozómové aberácie. Ďalšie informácie z ošetrených spermatocytov sa dajú získať analýzou meiotických chromozómov na zistenie štrukturálnych chromozómových aberácií počas diakinézy – metafázy I a metafázy II.

7.

V semenníkoch sa nachádza viacero generácií spermatogónií (5) a tieto rôzne typy zárodočných buniek môžu vykazovať rôznu škálu citlivosti na chemické ošetrenie. Zistené aberácie predstavujú teda celkovú odozvu populácie ošetrených spermatogoniálnych buniek. Väčšina mitotických buniek v prípravkoch semenníkov sú spermatogóniá B, ktorých bunkový cyklus trvá približne 26 hodín (3).

8.

Ak existujú dôkazy, že testovaná chemikália alebo jej metabolity nezasiahnu semenníky, nie je vhodné tento test použiť.

PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

9.

Zvieratá sú vo všeobecnosti exponované príslušným spôsobom vystavené pôsobeniu testovanej chemikálie a vo vhodnom čase po aplikácii testovanej chemikálie sa usmrtia. Pred usmrtením sa zvieratám aplikuje prostriedok zastavujúci metafázu (napr. kolchicín alebo Colcemid®). Následne sa zo zárodočných buniek urobia chromozómové prípravky, zafarbia sa a metafázové bunky sa analyzujú na chromozómové aberácie.

OVEROVANIE SPÔSOBILOSTI LABORATÓRIA

10.

Kompetencia na vykonávanie tejto skúšky by sa mala určiť preukázaním schopnosti reprodukovať očakávané výsledky frekvencie štrukturálnych chromozómových aberácií v prípade spermatogónií s látkami, ktoré slúžia ako pozitívna kontrola (vrátane slabých odoziev), napríklad s látkami uvedenými v tabuľke 1, a získaním frekvencií z negatívnych kontrol, ktoré sú v súlade s prijateľným rozsahom kontrolných údajov z publikovanej literatúry [napr. (2) (3) (6) (7) (8) (9) (10)] alebo s rozložením historických kontrol laboratória, ak sú k dispozícii.

OPIS METÓDY

Príprava

Výber druhov zvierat

11.

Mali by sa vyberať bežne používané laboratórne kmene zdravých mladých dospelých zvierat. Bežne sa používajú samce myší, ak je to však vedecky opodstatnené a s cieľom umožniť priebeh testu v spojení s inou testovacou metódou, môžu sa použiť samce iných vhodných druhov cicavcov. V správe by malo byť poskytnuté vedecké zdôvodnenie použitia iných druhov než hlodavcov.

Podmienky umiestnenia a kŕmenia zvierat

12.

V prípade hlodavcov by mala byť teplota v miestnosti pre zvieratá 22 °C (±3 °C). Hoci relatívna vlhkosť by mala byť ideálne 50 – 60 %, mala by dosahovať minimálne 40 % a pokiaľ možno by nemala presiahnuť 70 % okrem obdobia počas čistenia miestnosti. Osvetlenie by malo byť umelé a malo by sa striedať 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. Hlodavce by sa mali umiestniť do malých skupín (najviac päť na klietku), pokiaľ sa neočakáva agresívne správanie, a to prednostne v klietkach s pevným dnom s vhodným obohatením prostredia. Ak to je vedecky opodstatnené, zvieratá môžu byť umiestnené samostatne.

Príprava zvierat

13.

Vo všeobecnosti sa používajú zdravé mladé dospelé samčie zvieratá (staré 8 až 12 týždňov na začiatku pokusu) a náhodne sa rozdelia do kontrolných a pokusných skupín. Každé zviera sa jednotlivo označí humánnou, minimálne invazívnou metódou (napr. krúžkovanie, označenie štítkom, aplikácia mikročipu alebo biometrická identifikácia, nie však skracovanie uší ani prstov) a aklimatizuje sa na laboratórne podmienky v priebehu minimálne piatich dní. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy spôsobené ich umiestnením. Malo by sa zabrániť krížovej kontaminácii pozitívnou kontrolou a testovanou chemikáliou. Na začiatku štúdie by mali byť rozdiely v hmotnosti zvierat minimálne a nemali by presiahnuť ±20 %.

Príprava dávok

14.

Pevné testované chemikálie by sa pred podaním dávky zvieratám mali rozpustiť alebo suspendovať vo vhodných rozpúšťadlách alebo nosičoch alebo primiešať do krmiva alebo pitnej vody. Kvapalné testované chemikálie sa môžu podávať priamo alebo rozriedené pred podaním. V prípade inhalačných expozícií sa testované chemikálie môžu v závislosti od svojich fyzikálno-chemických vlastností podávať ako plyn, výpary alebo tuhé/kvapalné aerosóly. Ak údaje o stabilite nepreukazujú prijateľnosť uskladnenia a nestanovujú vhodné podmienky skladovania, mali by sa používať čerstvo pripravené testované chemikálie.

Podmienky testovania – rozpúšťadlo/nosič

15.

Rozpúšťadlo/nosič by nemali vyvolávať toxické účinky pri používaných dávkach a nemali by mať schopnosť chemicky reagovať s testovanou chemikáliou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by sa malo podporiť referenčnými údajmi uvádzajúcimi ich kompatibilitu. Odporúča sa, aby sa vždy, keď je to možné, najskôr zvážilo použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Príklady bežne používaných kompatibilných rozpúšťadiel/nosičov zahŕňajú vodu, fyziologický roztok, roztok metylcelulózy, roztok sodnej soli karboxymetylcelulózy, olivový olej a kukuričný olej. Ak neexistujú historické alebo zverejnené údaje o kontrolách, z ktorých vyplýva, že zvolené atypické rozpúšťadlo/nosič neindukuje tvorbu štrukturálnych chromozómových aberácií ani iné škodlivé účinky, mala by sa vykonať východisková štúdia s cieľom stanoviť prijateľnosť kontroly s aplikáciou rozpúšťadla/kontroly s nosičom.

Pozitívne kontroly

16.

Pokiaľ laboratórium nepreukázalo spôsobilosť pri vykonávaní testu a bežne nepoužívalo test v nedávnej minulosti (napr. počas posledných 5 rokov), vždy sa majú používať zvieratá na súbežné pozitívne kontroly. Ak nie je zahrnutá súbežná pozitívna kontrolná skupina, do každého experimentu by sa mali zahrnúť kontroly hodnotenia (fixované a nezafarbené sklíčka). Možno ich získať tak, že sa do hodnotenia štúdie zahrnú vhodné referenčné vzorky získané a uchované zo samostatného experimentu s pozitívnou kontrolou, ktorý sa vykonáva periodicky (napr. každých 6 až 18 mesiacov) v laboratóriu, kde sa test vykonáva; napríklad počas testovania spôsobilosti a potom pravidelne, podľa potreby.

17.

Látky na pozitívnu kontrolu by mali spoľahlivo vyvolať zistiteľný nárast frekvencií buniek so štrukturálnymi chromozómovými aberáciami nad spontánne úrovne. Dávky na pozitívnu kontrolu by sa mali voliť tak, aby boli účinky zjavné, ale aby hodnotiteľovi priamo neodhaľovali identitu kódovaných vzoriek. Príklady látok na pozitívnu kontrolu sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Príklady látok na pozitívnu kontrolu

Látky [CAS č.] (referenčné č.)

cyklofosfamid (monohydrát) [č. CAS 50-18-0 (č. CAS 6055-19-2)] (9)

cyklohexylamín [č. CAS 108-91-8] (7)

mitomycín C [č. CAS 50-07-7] (6)

monomerický akrylamid [č. CAS 79-06-1] (10)

trietylénmelamín [č. CAS 51-18-3] (8).

Negatívne kontroly

18.

Súčasťou každého odberu vzoriek by mali byť zvieratá z negatívnych kontrol ošetrované len s rozpúšťadlom alebo nosičom, s ktorými sa inak zaobchádza rovnako ako s pokusnými skupinami. Ak neexistujú historické alebo zverejnené kontrolné údaje, ktoré by preukazovali, že zvolené rozpúšťadlo/nosič nespôsobuje žiadne chromozómové aberácie ani iné nepriaznivé účinky, zvieratá z neošetrenej kontroly by mali byť súčasťou aj každého času odberu vzoriek na stanovenie prijateľnosti kontroly s nosičom.

POSTUP

Počet zvierat

19.

Veľkosti skupín na začiatku štúdie by sa mali stanoviť s cieľom zabezpečiť minimálne 5 samčích zvierat na skupinu. Tento počet zvierat na skupinu sa považuje za dostatočný na zabezpečenie primeranej štatistickej váhy (t. j. na jeho základe sa dá vo všeobecnosti zistiť minimálne zdvojnásobenie frekvencie chromozómových aberácií, ak je úroveň negatívnej kontroly 1,0 % alebo vyššia, s 80 % pravdepodobnosťou na úrovni významnosti 0,05) (3) (11). Ako pomôcku pri bežných požiadavkách na maximálny počet zvierat možno uviesť, že štúdia s dvomi odbermi vzoriek, tromi dávkovými skupinami a so súbežnou negatívnou a pozitívnou kontrolnou skupinou (každá skupina zložená z piatich zvierat) by si vyžadovala 45 zvierat.

Harmonogram aplikácie

20.

Testované chemikálie sa obvykle podávajú raz (t. j. ako jednorazové ošetrenie). Môžu sa použiť aj iné dávkovacie schémy, ak sú vedecky opodstatnené.

21.

V skupine s najvyššou dávkou sa uskutočnia dva odbery vzoriek po ošetrení. Keďže čas potrebný na príjem a metabolizmus testovaných chemikálií a ich účinky na kinetiku bunkového cyklu môžu ovplyvniť optimálny čas na zistenie chromozómovej aberácie, uskutočňuje sa jeden skorý a jeden neskorý odber vzorky približne 24 a 48 hodín po ošetrení. V prípade iných dávok, ako je najvyššia dávka, by sa skorý odber vzoriek mal vykonať po 24 hodinách od ošetrenia (maximálne v dĺžke bunkového cyklu spermatogónií B, čím sa optimalizuje pravdepodobnosť hodnotenia prvých metafáz po ošetrení), ak neexistuje vedomosť o inom čase odberu vzoriek, ktorý by bol vhodnejší a opodstatnenejší.

22.

Môžu sa použiť aj iné časy odberu vzoriek. Napríklad v prípade chemikálií, ktoré vyvolávajú účinky nezávislé od S, môže byť vhodnejší skorší čas odberu vzoriek (t. j. menej ako 24 hodín).

23.

Môže sa použiť dávkovacia schéma ošetrenia s opakovanou dávkou, napr. v spojení s testom iného sledovaného parametra, pri ktorom sa používa obdobie podávania 28 dní (napr. TM B.58); v prípade ďalších skupín zvierat by sa však vyžadovalo použiť iné časy odberu vzoriek. Vhodnosť takéhoto harmonogramu sa musí vedecky odôvodniť prípad od prípadu.

24.

Pred usmrtením sa zvieratám injekčne intraperitoneálne podáva vhodná dávka chemikálie zastavujúcej metafázu (napr. Colcemid® alebo kolchicín). Po vhodnom čase sa následne zo zvierat odoberú vzorky. U myší a potkanov ide o čas približne 3 – 5 hodín.

Úrovne dávok

25.

Ak sa vykonáva predbežná štúdia na zistenie rozsahu dávky z dôvodu nedostatku vhodných údajov, ktoré by pomohli pri výbere dávky, mala by sa vykonať v tom istom laboratóriu použitím toho istého druhu, rodu a tej istej schémy ošetrenia ako v hlavnej štúdii a podľa odporúčaní na vykonávanie štúdií na zistenie rozsahu dávky (12). Takáto štúdia by sa mala zamerať na zistenie maximálnej tolerovanej dávky (MTD) definovanej ako dávka, ktorá v porovnaní s časom trvania štúdie vyvolá mierne toxické účinky (napr. nezvyčajné správanie alebo reakcie, mierny úbytok telesnej hmotnosti alebo cytotoxicitu hematopoietického systému), nie však smrť alebo známky bolesti, utrpenia, príp. ťažkostí, ktoré si vyžadujú usmrtenie zvierat (13).

26.

Najvyššia dávka sa tiež definuje ako dávka, ktorá spôsobí určité príznaky toxicity v spermatogoniálnych bunkách (napríklad: zníženie pomeru spermatogoniálnej mitózy k prvej a druhej meiotickej metafáze). Toto zníženie by nemalo presiahnuť 50 %.

27.

Testované chemikálie s osobitnými biologickými aktivitami pri nízkych netoxických dávkach (ako napríklad hormóny a mitogény) a chemikálie, ktoré vykazujú saturáciu toxikokinetických vlastností, môžu predstavovať výnimku z kritérií na stanovenie dávok a mali by sa hodnotiť prípad od prípadu.

28.

Na získanie informácií o odozve na dávku by kompletná štúdia mala zahŕňať negatívnu kontrolnú skupinu (odsek 18) a minimálne tri úrovne dávok vo všeobecnosti oddelené faktorom 2, ale nie vyšším ako 4. Ak testovaná chemikália nevyvoláva toxicitu v štúdii na zistenie rozsahu dávky alebo na základe existujúcich údajov, najvyššia dávka pri jednorazovom podaní by mala byť 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti. Ak však testovaná chemikália spôsobuje toxicitu, maximálna tolerovaná dávka by mala byť najvyššia podávaná dávka a použité úrovne dávky by mali podľa možnosti pokrývať rozsah od maximálnej dávky po dávku, ktorá spôsobuje slabú alebo nespôsobuje žiadnu toxicitu. Ak sa zistí toxicita v cieľovom tkanive (t. j. semenníky) pri všetkých testovaných úrovniach dávok, odporúča sa vykonanie ďalšej štúdie s netoxickými dávkami. Štúdie, ktorých cieľom je podrobnejšie charakterizovať kvantitatívne informácie o odozve na dávku, môžu vyžadovať dodatočné skupiny, ktorým sa budú podávať dávky. V prípade určitých druhov testovaných chemikálií (napr. humánne lieky), na ktoré sa vzťahujú osobitné požiadavky, sa tieto limity môžu líšiť. Ak testovaná chemikália vyvoláva toxicitu, mala by sa zvoliť limitná dávka plus dve nižšie dávky (podľa uvedeného opisu). Limitná dávka pre obdobie podávania v trvaní najmenej 14 dní je 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti na deň a pre obdobie podávania kratšie ako 14 dní je limitná dávka 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti na deň.

Podávanie dávok

29.

Pri plánovaní skúšky by sa mal zvážiť predpokladaný spôsob expozície ľudí. Preto sa za opodstatnené považuje zvoliť spôsoby expozície napríklad potravou, pitnou vodou, lokálne podkožne, intravenózne, orálne (sondou), inhaláciou alebo implantáciou. V každom prípade by sa mal zvoliť taký spôsob, ktorým sa zaručí adekvátna expozícia cieľového tkaniva. Okrem vedecky odôvodnených prípadov sa vo všeobecnosti neodporúča použitie intraperitoneálnej injekcie, keďže zvyčajne nepredstavuje fyziologicky relevantný spôsob expozície ľudí. Ak je testovaná chemikália primiešaná do potravy alebo pitnej vody, najmä v prípade jednej dávky, treba venovať pozornosť tomu, aby sa medzi spotrebou potravy a vody a odberom vzorky ponechal dostatočný čas, aby sa umožnilo zistenie účinkov (pozri odsek 33). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať sondou alebo injekciou, závisí od veľkosti pokusného zvieraťa. Objem zvyčajne nemá byť vyšší ako 1 ml/100 g telesnej hmotnosti, okrem vodných roztokov, keď sa môže použiť objem najviac 2 ml/100 g telesnej hmotnosti. Použitie väčších objemov ako uvedený objem (pokiaľ to dovoľujú právne predpisy o dobrých životných podmienkach zvierat) by sa malo odôvodniť. Zmeny v testovanom objeme by sa mali minimalizovať tým, že sa koncentrácie upravia tak, aby sa zabezpečil stály objem vzhľadom na telesnú hmotnosť pri všetkých úrovniach dávky.

Pozorovania

30.

Najmenej raz denne by sa mali vykonať všeobecné klinické pozorovania testovaných zvierat a zaznamenať klinické príznaky, najlepšie každý deň v rovnakom čase a so zreteľom na časový interval najintenzívnejších predpokladaných účinkov po podaní dávky. Najmenej dvakrát denne je u všetkých zvierat potrebné sledovať chorobnosť a úmrtnosť. Všetky zvieratá by sa mali odvážiť na začiatku štúdie, aspoň raz za týždeň počas štúdií s opakovanou dávkou, a pri usmrtení. V prípade štúdií, ktoré trvajú aspoň jeden týždeň, by sa malo aspoň raz za týždeň vykonať meranie spotreby potravy. Ak sa testovaná chemikália podáva v pitnej vode, mala by sa spotreba vody odmerať pri každej výmene vody a aspoň raz za týždeň. Zvieratá, ktoré vykazujú neletálne ukazovatele nadmernej toxicity, by mali byť usmrtené pred ukončením testovacieho obdobia (13).

Príprava chromozómov

31.

Okamžite po usmrtení sa z jedného alebo oboch semenníkov získavajú suspenzie zárodočných buniek, ktoré sa vystavia hypotonickému roztoku a fixujú sa podľa zavedených protokolov [napr. (2) (14) (15)]. Následne sa bunky nanesú na sklíčka a zafarbia (16) (17). Všetky sklíčka by sa mali okódovať, aby hodnotiteľ nepoznal ich identitu.

Analýza

32.

V prípade každého zvieraťa by sa malo ohodnotiť minimálne 200 dobre nanesených metafáz (3) (11). Ak je frekvencia historickej negatívnej kontroly nižšia ako 1 %, malo by sa ohodnotiť viac ako 200 buniek/zviera, aby sa zvýšila štatistická váha (3). Mali by sa používať také metódy farbenia, ktoré umožňujú identifikáciu centroméry.

33.

Aberácie chromozómového a chromatidového typu by sa mali zaznamenávať oddelene a klasifikovať podľa poddruhu (zlomy, výmeny). Gapy by sa mali zaznamenávať, ale neberú sa do úvahy pri určovaní, či chemikália vyvoláva významný nárast v rámci incidencie buniek s chromozómovou aberáciou. Postupmi používanými v laboratóriu by sa malo zabezpečiť, aby analýzu chromozómových aberácií vykonávali primerane vyškolení hodnotitelia. Vzhľadom na to, že pri príprave sklíčok často dochádza k zlomom časti buniek v metafáze s následnou stratou chromozómov, vyhodnocované bunky by mali obsahovať najmenej 2n ±2 centromér, kde n je haploidný počet chromozómov pre daný druh.

34.

Napriek tomu, že účelom testu je zistiť štrukturálne chromozómové aberácie, je dôležité zaznamenať frekvencie polyploidných buniek a buniek s endoreduplikovanými chromozómami, ak sa tieto udalosti spozorujú (pozri odsek 44).

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Spracovanie výsledkov

35.

Údaje o jednotlivých zvieratách by sa mali uvádzať v tabuľkovej forme. Pre každé zviera by sa mal hodnotiť počet buniek so štrukturálnymi chromozómovými aberáciami a počet chromozómových aberácií na bunku. Aberácie chromatidového a chromozómového typu klasifikované podľa poddruhov (zlomy, výmeny) by mali byť uvedené oddelene spolu s ich počtom a frekvenciami výskytu v prípade experimentálnych a kontrolných skupín. Gapy sa zaznamenávajú oddelene. Frekvencia gapov sa zaznamenáva, ale vo všeobecnosti sa nezahŕňa do analýzy celkovej frekvencie štrukturálnych chromozómových aberácií. Uvádza sa percentuálny podiel polyploidie a buniek s endoreduplikovanými chromozómami, ak boli pozorované.

36.

Treba vykazovať údaje o toxicite a o klinických príznakoch (podľa odseku 30).

Kritériá prijateľnosti

37.

Prijateľnosť testu určujú tieto kritériá:

súbežná negatívna kontrola je v súlade so zverejnenými normami pre historické údaje negatívnych kontrol, pri ktorých sa vo všeobecnosti očakáva, že budú predstavovať > 0 % a ≤ 1,5 % buniek s chromozómovými aberáciami, a s historickými údajmi laboratória o kontrolách, ak sú k dispozícii (pozri odseky 10 a 18),

súbežné pozitívne kontroly vyvolávajú odozvy, ktoré sú v súlade so zverejnenými normami pre historické údaje z pozitívnych kontrol alebo s historickými údajmi laboratória z pozitívnych kontrol, ak sú k dispozícii, a v porovnaní s negatívnou kontrolou vedú k štatisticky významnému nárastu (pozri odseky 17, 18),

analyzoval sa adekvátny počet buniek a dávok (pozri odsek 28 a 32),

kritériá výberu najvyššej dávky sú v súlade s kritériami opísanými v odsekoch 25 a 26.

38.

Ak sa pozoruje mitóza aj meióza, pomer spermatogoniálnych mitóz k prvej a druhej meiotickej metafáze by sa mal stanoviť ako indikátor cytotoxicity v prípade všetkých ošetrených zvierat a zvierat z negatívnych kontrol pri celkovej vzorke 100 deliacich sa buniek na zviera. Ak sa pozoruje len mitóza, mitotický index sa stanovuje pre najmenej 1 000 buniek na jedno zviera.

Hodnotenie a interpretácia výsledkov

39.

Na zabezpečenie dostatočných údajov na analýzu vzťahu medzi dávkou a odozvou treba analyzovať najmenej tri skupiny ošetrené podaním dávky.

40.

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jednoznačne pozitívnu, ak:

najmenej jedna z testovaných dávok vykazuje štatisticky významný nárast v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,

nárast aspoň pri jednom čase odberu vzoriek súvisí s dávkou a

niektorý z týchto výsledkov je mimo prijateľného rozsahu údajov z negatívnych kontrol alebo distribúcie historických údajov z negatívnych kontrol laboratória (napr. 95 % regulačné medze Poissonovho rozdelenia), ak sú k dispozícii.

Testovaná chemikália sa vtedy považuje za schopnú vyvolať chromozómové aberácie v spermatogoniálnych bunkách testovaných zvierat. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno takisto nájsť aj v literatúre (11) (18). V použitých štatistických testoch by sa malo zviera posudzovať ako pokusná jednotka.

41.

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jednoznačne negatívnu, ak:

ani jedna z testovaných dávok nevykazuje štatisticky významný nárast v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou,

neexistuje nárast súvisiaci s dávkou pri žiadnej experimentálnej podmienke a

všetky výsledky sú v rámci prijateľného rozsahu údajov negatívnych kontrol alebo historických údajov negatívnych kontrol laboratória (napr. 95 % regulačnej medze Poissonovho rozdelenia), ak sú k dispozícii.

Testovaná chemikália sa vtedy považuje za neschopnú vyvolať chromozómové aberácie v spermatogoniálnych bunkách pokusných zvierat. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno takisto nájsť aj v literatúre (11) (18). Negatívnym výsledkom sa nevylučuje možnosť, že chemikálie môžu v neskorších vývojových fázach, ktoré nie sú predmetom štúdie, vyvolávať chromozómové aberácie alebo génové mutácie.

42.

Neexistuje požiadavka na overenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej odozvy.

43.

Ak odozva nie je jednoznačne negatívna ani pozitívna a má sa pomôcť pri stanovení biologickej relevantnosti výsledku (napr. slabé alebo hraničné zvýšenie), údaje by sa mali vyhodnotiť na základe odborného posúdenia a/alebo ďalšieho skúmania pomocou existujúcich experimentálnych údajov, napríklad posúdením, či je pozitívny výsledok mimo prijateľného rozsahu údajov negatívnych kontrol alebo historických údajov negatívnych kontrol laboratória (19).

44.

V zriedkavých prípadoch, dokonca aj po ďalších skúmaniach, nemusí byť na základe daného súboru údajov možné dospieť k záveru o pozitívnych alebo negatívnych výsledkoch, a preto sa takéto údaje budú považovať za nejednoznačné.

45.

Nárast počtu polyploidných buniek môže naznačovať, že testovaná chemikália má potenciál brzdiť mitotické procesy a indukovať numerické chromozómové aberácie (20). Nárast počtu buniek s endoreduplikovanými chromozómami môže naznačovať, že testovaná chemikália má potenciál brzdiť progres bunkového cyklu (21) (22), ktorý predstavuje iný mechanizmus indukcie numerických zmien chromozómov ako brzdenie mitotických procesov (pozri odsek 2). Preto by sa incidencia polyploidných buniek a buniek s endoreduplikovanými chromozómami mala zaznamenávať oddelene.

Správa o teste

46.

Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:

 

Zhrnutie.

 

Testovaná chemikália:

zdroj, číslo šarže, konečný dátum použitia, ak sú tieto informácie k dispozícii,

stabilita testovanej chemikálie, ak je známa,

rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle, ak je známa,

meranie pH, osmolality a zrazeniny v kultivačnom médiu, do ktorého bola pridaná testovaná chemikália.

 

Jednozložková látka:

fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,

identifikácia chemikálie, napríklad názov podľa IUPAC alebo CAS, CAS číslo, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt atď., ak to je vhodné a prakticky uskutočniteľné.

 

Viaczložkové látky, UVCB a zmesi:

charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívneho výskytu a príslušných fyzikálno-chemických vlastností zložiek.

 

Príprava testovanej chemikálie:

zdôvodnenie voľby nosiča,

rozpustnosť a stabilita testovanej chemikálie v rozpúšťadle/nosiči,

príprava potravy, pitnej vody alebo inhalačných prípravkov,

analytické stanovenie prípravkov (napr. stabilita, homogenita, nominálne koncentrácie) v prípade, že sa vykonávajú.

 

Testované zvieratá:

použitý druh/kmeň a zdôvodnenie jeho použitia,

počet a vek zvierat,

zdroj, podmienky umiestnenia, potrava atď.,

metóda na jedinečnú identifikáciu zvierat,

v prípade krátkodobých štúdií: hmotnosť jednotlivých zvierat na začiatku a na konci testu; v prípade štúdií trvajúcich viac ako jeden týždeň: hmotnosť jednotlivých zvierat počas štúdie a konzumácia potravy. Mal by sa zahrnúť rozsah telesnej hmotnosti, stredná hodnota a štandardná odchýlka pre každú skupinu.

 

Podmienky testovania:

údaje z pozitívnych a negatívnych (rozpúšťadlo/nosič) kontrol,

údaje zo štúdie na zistenie rozsahu, ak sa vykonala,

odôvodnenie výberu úrovne dávky,

odôvodnenie cesty podania,

podrobné údaje o príprave testovanej chemikálie,

podrobné údaje o podávaní testovanej chemikálie,

zdôvodnenie času utratenia,

metódy merania toxicity pre zvieratá vrátane, ak sú k dispozícii, histopatologických alebo hematologických analýz, ako aj frekvencia pozorovaní zvierat a váženia ich telesnej hmotnosti,

metódy overovania, či sa testovaná chemikália dostala do cieľového tkaniva alebo hlavného obehu v prípade negatívnych výsledkov,

skutočná dávka (mg/kg telesnej hmotnosti/deň) vypočítaná z koncentrácie testovanej chemikálie (ppm) v potrave/pitnej vode a zo spotreby potravy/pitnej vody, ak sa uplatňuje,

podrobné informácie o kvalite potravy a vody,

podrobný opis harmonogramu ošetrovania a harmonogramu odberu vzoriek a zdôvodnenie ich voľby,

metóda usmrtenia,

metóda analgézie (v prípade použitia),

postupy izolácie tkanív,

identita chemikálie zastavujúcej metafázu, jej koncentrácia a trvanie ošetrenia,

metódy prípravy sklíčok,

kritériá na hodnotenie aberácií,

počet analyzovaných buniek na jedno zviera,

kritériá na hodnotenie štúdií ako pozitívne, negatívne alebo nejednoznačné.

 

Výsledky:

stav zvieraťa pred testovaním a počas obdobia testovania vrátane toxických príznakov,

hmotnosť tela a orgánov pri utratení (ak boli vykonané viaceré ošetrenia, telesné hmotnosti počas schémy ošetrenia),

príznaky toxicity,

mitotický index,

pomer spermatogoniálnej mitózy k prvej a druhej meiotickej metafáze alebo iný dôkaz expozície cieľového tkaniva,

typ a počet odchýlok uvádzaný samostatne na každé zviera,

celkový počet aberácií na skupinu s priemerom a štandardnou odchýlkou,

počet buniek s aberáciami na skupinu s priemerom a štandardnou odchýlkou,

vzťah medzi dávkou a odozvou, ak je možné ho určiť,

použité štatistické analýzy a metódy,

súbežné údaje z negatívnych kontrol,

historické údaje z negatívnych kontrol, priemery, štandardné odchýlky a interval spoľahlivosti 95 % (ak je dostupný) alebo publikované historické údaje z negatívnych kontrol používané pri prijateľnosti výsledkov testu,

súbežné údaje o pozitívnych kontrolách,

zmeny v ploídii, ak sa pozorovali, vrátane frekvencie polyploidie a/alebo endoreduplikovaných buniek.

 

Rozbor výsledkov

 

Záver

LITERATÚRA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014–2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Adler, ID (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt a J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, s. 275-306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. a Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312: 313-318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, s. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368–379. Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, s. 477-484.

(7)

Cattanach, B.M., a Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)

Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313-324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19-30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organizácia pre hospodársku spoluprácu a rozvoj, Paríž.

(14)

Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G., a Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. správa Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115-141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184-232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)

Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Dodatok

VYMEDZENIE POJMOV

Aneuploidia: akákoľvek odchýlka od bežného diploidného (alebo haploidného) počtu chromozómov vo forme jedného alebo viacerých chromozómov, nie však vo forme celého(-ých) súboru(-ov) chromozómov (polyploidia).

Centroméra: oblasť(-ti) chromozómu, v ktorej(-ých) sa vlákna deliaceho vretienka pripájajú k chromozómu počas delenia bunky a ktorá(-é) umožňuje(-ú) riadny pohyb dcérskych chromozómov k pólom dcérskych buniek.

Chemikália: látka alebo zmes.

Chromozómová diverzita: diverzita tvaru (napr. metacentrický, akrocentrický) a veľkosti chromozómov.

Aberácia chromatidového typu: štrukturálne chromozómové poškodenie prejavujúce sa ako zlom jednej z chromatíd alebo zlom a opätovné spojenie medzi chromatídami.

Aberácia chromozómového typu: štrukturálne poškodenie chromozómu prejavujúce sa ako zlom alebo zlom a opätovné spojenie oboch chromatíd na rovnakej strane.

Klastogén: každá chemikália, ktorá spôsobuje štrukturálne chromozómové aberácie v populáciách buniek alebo organizmov.

Gap: achromatická lézia menšia ako šírka jednej chromatídy s minimálnym posunutím chromatíd.

Genotoxický: všeobecný výraz, ktorý zahŕňa všetky typy poškodenia DNA alebo chromozómov vrátane zlomov, delécií, aduktov, modifikácií a prepojení nukleotidov, prestavieb, mutácií, chromozómových aberácií a aneuploidie. Nie všetky typy genotoxických účinkov majú za následok mutácie alebo trvalé poškodenie chromozómov.

Mitotický index (MI): pomer buniek v metafáze vydelený celkovým počtom buniek pozorovaných v populácii buniek; náznak stupňa šírenia tejto populácie.

Mitóza: delenie bunkového jadra, ktoré sa zvyčajne delí na profázu, prometafázu, metafázu, anafázu a telofázu.

Mutagénny: produkujúci dedičnú zmenu sekvencie(-í) párov báz DNA v génoch alebo štruktúry chromozómov (chromozómové aberácie).

Numerické abnormality: zmena v počte chromozómov v porovnaní s bežným počtom charakteristickým pre použité zvieratá.

Polyploidia: násobok haploidného chromozómového čísla (n) odlišného od diploidného čísla (t. j. 3n, 4n atď.).

Štrukturálna aberácia: zmena chromozómovej štruktúry rozpoznateľná mikroskopickým skúmaním metafázového štádia delenia buniek, pozorovaná ako delécie a fragmenty, výmeny.

Testovaná chemikália: každá látka alebo zmes testovaná pomocou tejto testovacej metódy.

UVCB: látka neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.

5.

V časti B sa kapitola B.40 nahrádza takto:

„B.40   POLEPTANIE KOŽE IN VITRO: TESTOVACIA METÓDA POMOCOU TRANSKUTÁNNEHO ELEKTRICKÉHO ODPORU (TER)

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda (ďalej len „TM“) je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (ďalej len „TG“) 430 (2015). Poleptanie kože je vznik nevratného poškodenia kože, ktoré sa prejavuje ako viditeľná nekróza cez epidermu až do dermy po aplikácii testovanej chemikálie [v znení definície podľa Globálneho harmonizovaného systému klasifikácie a označovania chemických látok (GHS) Organizácie Spojených národov (OSN) (1) a nariadenia Európskej únie (EÚ) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (CLP) (1)]. Touto aktualizovanou testovacou metódou B.40 sa stanovuje postup in vitro, ktorý umožňuje identifikáciu nežieravých a žieravých látok a zmesí v súlade s GHS OSN (1) a CLP.

2.

Posudzovanie poleptania kože zvyčajne zahŕňalo použitie laboratórnych zvierat (TM B.4, ekvivalent OECD TG 404 pôvodne prijatého v roku 1981 a revidovaného v rokoch 1992, 2002 a 2015) (2). Dodatočne k súčasnej testovacej metóde B.40 sa validovali a prijali dve ďalšie testovacie metódy in vitro na testovanie žieravých vlastností chemikálií pre kožu – TM B.40a (ekvivalent usmernenia OECD TG 431) (3) a TM B.65 (ekvivalent usmernenia OECD TG 435) (4), ktorými je tiež v prípade potreby možné určiť podkategórie žieravých chemikálií. Na testovanie poleptania kože sa prijalo niekoľko validovaných testovacích metód in vitro ako TM B.46 (ekvivalent usmernenia OECD TG 439) (5). V usmerňovacom dokumente OECD o integrovaných prístupoch k testovaniu a hodnoteniu (IATA) v prípade poleptania a podráždenia kože sa opisuje viacero modulov, v ktorých sú zoskupené rôzne zdroje informácií a analytické nástroje, a poskytuje sa usmernenie o tom, i) ako integrovať a používať existujúce údaje z testovania, ako aj údaje nepochádzajúce z testovania na posúdenie dráždivých a žieravých vlastností chemikálií pre kožu, a ii) navrhuje sa prístup v prípade potreby ďalšieho testovania (6).

3.

Táto testovacia metóda sa týka koncového sledovaného parametra poleptania kože pre ľudské zdravie. Je založená na testovacej metóde pomocou transkutánneho elektrického odporu (TER) na potkanej koži, pri ktorej sa žieraviny na kožných terčíkoch identifikujú ich schopnosťou spôsobiť stratu normálnej integrity a ochrannej funkcie stratum corneum. Príslušné usmernenie OECD na vykonávanie testov sa pôvodne prijalo v roku 2004, pričom v roku 2015 sa aktualizovalo s cieľom odkázať na usmerňovací dokument IATA.

4.

Na posúdenie testovania poleptania kože in vitro sa na regulačné účely vykonali prevalidačné štúdie (7), po ktorých nasledovala riadna validačná štúdia testovacej metódy TER na potkanej koži na posúdenie poleptania kože (8) (9) (10) (11). Výsledky týchto štúdií viedli k odporúčaniu, že testovacia metóda TER (označená ako validovaná referenčná metóda alebo VRM) by sa na regulačné účely mohla používať pri posudzovaní poleptania kože in vivo (12) (13) (14).

5.

Pred tým, ako sa na regulačné účely môže použiť navrhovaná podobná alebo upravená testovacia metóda TER in vitro na poleptanie kože, ktorá je iná ako validovaná referenčná metóda, mala by sa stanoviť jej spoľahlivosť, relevantnosť (presnosť) a obmedzenia jej navrhovaného používania, aby sa zabezpečila podobnosť s validovanými referenčnými metódami podľa výkonnostných noriem (PS) (15). Vzájomné uznávanie údajov OECD je možné zaručiť len po tom, ako sa každá navrhovaná nová alebo aktualizovaná testovacia metóda na základe noriem výkonnosti preskúma a zaradí do príslušného usmernenia OECD na vykonávanie testov.

VYMEDZENIE POJMOV

6.

Vymedzenie použitých pojmov sa uvádza v dodatku.

POČIATOČNÉ ÚVAHY

7.

Z validačnej štúdie (10) a ďalších publikovaných štúdií (16) (17) vyplýva, že testovacou metódou TER na potkanej koži je možné rozlíšiť medzi známymi látkami so žieravými účinkami na kožu a látkami, ktoré nemajú žieravé účinky, s celkovou citlivosťou 94 % (51/54) a špecifickosťou 71 % (48/68) v prípade databázy so 122 látkami.

8.

Predmetom tejto testovacej metódy sú poleptania kože in vitro. Umožňuje sa ňou identifikácia nežieravých a žieravých testovaných chemikálií v súlade s GHS OSN/CLP. Obmedzením tejto testovacej metódy, ako sa preukázalo vo validačných štúdiách (8) (9) (10) (11), je, že neumožňuje podkategorizáciu žieravých látok a zmesí v súlade s GHS OSN/CLP. Spôsob použitia tejto testovacej metódy sa určí uplatniteľným regulačným rámcom. Keďže táto testovacia metóda neposkytuje dostatočné informácie o podráždení kože, treba poznamenať, že TM B.46 sa špecificky zameriava na zdravotný účinok podráždenia kože in vitro (5). Na úplné vyhodnotenie lokálnych účinkov na kožu po jednorazovej expozícii kože by sa mal použiť usmerňovací dokument OECD o IATA (6).

9.

V rámci validácie, ktorá je základom tejto testovacej metódy, bol otestovaný celý rad chemikálií, ktoré predstavovali najmä látky, a empirická databáza validačnej štúdie obsahovala celkovo 60 látok, ktoré pokrývali širokú škálu chemických tried (8) (9). Na základe celkových dostupných údajov je daná metóda testovania uplatniteľná na širokú škálu chemických tried a fyzikálnych stavov vrátane kvapalín, polotuhých látok, tuhých látok a voskov. Treba poznamenať, že počas validácie sa posudzoval porovnateľne malý počet voskov a tuhých žieravých látok, keďže pre špecifické fyzikálne stavy nie sú v súčasnosti k dispozícii testovacie predmety s vhodnými referenčnými údajmi. Kvapaliny môžu byť vodné alebo nevodné; tuhé látky môžu byť rozpustné alebo nerozpustné vo vode. V prípade, že existujú dôkazy o nepoužiteľnosti tejto testovacej metódy na špecifickú kategóriu látok, nemala by sa táto testovacia metóda pri tejto špecifickej kategórii použiť. Táto testovacia metóda sa považuje za aplikovateľnú nielen na látky, ale aj v prípade zmesí. Vzhľadom na skutočnosť, že zmesi zahŕňajú široké spektrum kategórií a zloženia, a v súčasnosti sú dostupné iba obmedzené informácie o testovaní zmesí, v prípadoch, kde možno preukázať dôkazy o nepoužiteľnosti testovacej metódy pre špecifickú kategóriu zmesí (napr. na základe stratégie navrhovanej Eskesom et al., 2012) (18), testovacia metóda by sa nemala používať pri danej špecifickej kategórii zmesí. Pred použitím tejto testovacej metódy na zmesi s cieľom generovať údaje plánované na regulačné účely by sa malo zvážiť, či môže na tento účel poskytnúť adekvátne výsledky, a ak áno, tak prečo. Takéto úvahy nie sú nutné, pokiaľ existuje regulatórna požiadavka na testovanie danej zmesi. Plyny a aerosóly ešte neboli posúdené vo validačných štúdiách (8) (9). Aj keď je možné, že tieto látky sa môžu testovať testovacou metódou TER, súčasná testovacia metóda neumožňuje testovanie plynov a aerosólov.

PRINCÍP TESTU

10.

Testovaná chemikália sa aplikuje v trvaní do 24 hodín na epidermálny povrch kožných terčíkov v dvojkomorovom testovacom systéme, v ktorom tieto kožné terčíky majú funkciu deliacej steny medzi komorami. Kožné terčíky sa odoberú z potkanov vo veku 28 až 30 dní, ktoré boli usmrtené humánnym spôsobom. Žieravé chemikálie sa identifikujú ich schopnosťou spôsobiť stratu normálnej integrity a bariérnej funkcie rohovitej vrstvy (stratum corneum), čo sa pri meraní prejavuje ako zníženie TER pod prahovú úroveň (16) (pozri odsek 32). Na základe rozsiahlych údajov širokej škály látok, v prípade ktorých veľká väčšina hodnôt bola jednoznačne výrazne nad (často > 10 kΩ) alebo výrazne pod (často < 3 kΩ) touto hodnotou, sa pre TER na potkanej koži zvolila medzná hodnota 5 kΩ (16). Vo všeobecnosti chemikálie, ktoré nie sú u zvierat žieravé, ale sú dráždivé alebo nedráždivé, neznižujú TER pod túto medznú hodnotu. Použitie iných kožných prípravkov alebo iného vybavenia môže zmeniť medznú hodnotu, čo si vyžaduje ďalšiu validáciu.

11.

Do testovacieho postupu je na potvrdenie pozitívnych výsledkov testovania TER vrátane hodnôt okolo 5 kΩ zaradený krok na stanovenie viazania farbiva. Krokom viazania farbiva sa stanovuje, či zvýšenie permeability iónov nastáva v dôsledku fyzického porušenia rohovitej vrstvy (stratum corneum). Ukázalo sa, že metóda TER používajúca potkaniu kožu umožňuje predvídať výsledky zisťovania žieravosti in vivo s králikmi podľa testovacej metódy B.4 (2).

PREUKAZOVANIE SPÔSOBILOSTI

12.

Pred rutinným použitím testovacej metódy TER na potkanej koži, ktoré zodpovedá požiadavkám tejto testovacej metódy, by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť správnou klasifikáciou dvanástich chemikálií na preukázanie spôsobilosti odporúčaných v tabuľke 1. V prípadoch, keď uvedená látka nie je k dispozícii alebo keď je to odôvodniteľné, možno použiť inú látku, pri ktorej sú k dispozícii primerané referenčné údaje in vivo a in vitro [napríklad zo zoznamu referenčných chemikálií (16)], za predpokladu, že sa uplatnia rovnaké kritériá výberu, ktoré sú opísané v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Zoznam chemikálií na preukázanie spôsobilosti  (2)

Látka

CASRN

Chemická trieda (3)

GHS OSN/CLP Kat. založená na výsledkoch in vivo  (4)

VRM Kat. založená na výsledkoch in vitro

Fyzikálny stav

pH (5)

Žieravé látky in vivo

N,N’-dimetyl dipropyléntriamín

10563-29-8

organická báza

1A

6 × C

L

8,3

propán-l,2-diamín

78-90-0

organická báza

1A

6 × C

L

8,3

kyselina sírová (10 %)

7664-93-9

anorganická kyselina

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NC

L

1,2

hydroxid draselný (10 % vodný roztok)

1310-58-3

organická báza

(1A/)1B/1C

6 × C

L

13,2

kyselina oktánová (kaprylová)

124-07-2

organická kyselina

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,6

2-terc-butylfenol

88-18-6

fenol

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,9

Nežieravé látky in vivo

kyselina izostearová

2724-58-5

organická kyselina

NC

6 × NC

L

3,6

4H-1,2,4-triazoM-ylamín

584-13-4

organická báza

NC

6 × NC

S

5,5

fenetylbromid

103-63-9

elektrofil

NC

6 × NC

L

3,6

4-(metylsulfanyl)benzaldehyd

3446-89-7

elektrofil

NC

6 × NC

L

6,8

deka-1,9-dién

1647-16-1

neutrálna organická látka

NC

6 × NC

L

3,9

tetrachlóretylén

127-18-4

neutrálna organická látka

NC

6 × NC

L

4,5

Skratky: aq = vodné; CASRN = registračné číslo CAS (CAS číslo, Chemical Abstracts Service Registry Number); VRM = validovaná referenčná metóda; C = žieravá látka; NC = nežieravá látka.

POSTUP

13.

K dispozícii sú štandardné operačné postupy (SOP) pre testovaciu metódu poleptania kože TER na potkanej koži (19). Testovacia metóda TER na potkanej koži, na ktorú sa vzťahuje táto testovacia metóda, by mala byť v súlade s týmto podmienkami:

Zvieratá

14.

Mali by sa používať potkany, pretože citlivosť ich kože na látky tejto testovacej metódy už bola preukázaná (12) a sú jediným zdrojom kože, ktorý bol formálne validovaný (8) (9). Vek (v čase odberu kože) a kmeň potkanov sú osobitne dôležité na zabezpečenie toho, aby folikuly chlpov boli v latentnej fáze, predtým než sa začne rast zrelej srsti.

15.

Chrbtová a bočná srsť mladých, približne 22-denných samcov alebo samíc potkanov (z kmeňa príbuzného Wistaru alebo porovnateľného kmeňa) sa opatrne odstráni malými nožnicami. Zvieratá sa následne umyjú opatrným utieraním, pričom sa ostrihaná oblasť ponorí do antibiotického roztoku (obsahujúceho napríklad streptomycín, penicilín, chloramfenikol a amfotericín v koncentráciách účinne inhibujúcich rast baktérií). Zvieratá sa na tretí alebo štvrtý deň po prvom omytí znova omyjú antibiotikami a použijú sa do troch dní od druhého omytia, keď sa rohovitá vrstva (stratum corneum) po odstránení srsti zregeneruje.

Príprava kožných terčíkov

16.

Zvieratá sa humánne usmrcujú vo veku 28 až 30 dní, presný vek má rozhodujúci význam. Z každého zvieraťa sa potom odstráni dorzolaterálna koža, ktorá sa opatrne zbaví nadbytočného podkožného tuku. Odoberú sa kožné terčíky, z ktorých každý má priemer približne 20 mm. Koža sa pred použitím terčíkov môže uchovávať, ak sa preukáže, že údaje z pozitívnych a negatívnych kontrol sú rovnocenné s tými, ktoré sa získali s čerstvou kožou.

17.

Každý kožný terčík sa preloží cez jeden z koncov trubice z PTFE (polytetrafluóretylén) tak, aby epidermálny povrch bol v kontakte trubicou. Cez koniec trubice sa natesno prevlečie gumený tesniaci krúžok, aby sa koža nepohybovala, a nadbytočné tkanivo sa oreže. Gumený tesniaci krúžok sa potom opatrne utesní na koniec trubice z PTFE vazelínou. Trubica sa v receptorovej komore obsahujúcej roztok MgSO4 (154 mM) pridržiava pružinovou svorkou (obrázok 1). Kožný terčík by sa mal úplne ponoriť do roztoku MgSO4. Z jednej kože potkana možno získať 10 až 15 kožných terčíkov. Rozmery trubice a tesniaceho krúžku sú uvedené na obrázku 2.

18.

Pred začatím testovania sa na účely postupu kontroly kvality odmeria TER dvoch kožných terčíkov na každú kožu zvieraťa. Ak sa pri tejto testovacej metóde majú použiť zostávajúce terčíky, v prípade obidvoch terčíkov by mala byť nameraná hodnota elektrického odporu väčšia ako 10 kΩ. Ak je hodnota odporu nižšia ako 10 kΩ, zvyšné terčíky z danej kože by sa mali z testov vyradiť.

Aplikácia testovanej chemikálie a kontrolných látok

19.

Pre každý testovací cyklus (pre každý pokus) by sa mali súbežne použiť pozitívne a negatívne kontroly, aby sa zaručila primeraná účinnosť daného experimentálneho modelu. V každom testovacom cykle (pri každom pokuse) by sa mali použiť kožné terčíky z jedného zvieraťa. Navrhovanými chemikáliami pre pozitívnu kontrolu je 10 M kyselina chlorovodíková a pre negatívnu kontrolu destilovaná voda.

20.

Na epidermálny povrch vo vnútri trubice sa rovnomerne aplikujú tekuté testované chemikálie (150 μl). Pri testovaní tuhých materiálov sa na terčík rovnomerne aplikuje dostatočné množstvo tuhej látky, aby bol pokrytý celý povrch epidermy. Na tuhú látku sa pridá deionizovaná voda (150 μl) a trubica sa jemne pretrepe. S cieľom dosiahnuť maximálny styk s kožou môže byť potrebné zohriať tuhé látky na 30 °C, aby sa testovaná chemikália roztavila alebo zmäkla, alebo ju treba pomlieť na granulát alebo prášok.

21.

Pre každú testovanú a kontrolnú chemikáliu sa v každom testovacom cykle (pri každom pokuse) použijú tri kožné terčíky. Testované chemikálie sa aplikujú 24 hodín pri teplote 20 – 23 °C. Testovaná chemikália sa odstráni omytím prúdom vody z vodovodu izbovej teploty, kým sa nedá odstrániť žiaden ďalší materiál.

Merania TER

22.

Impedancia kože sa meria ako TER s použitím Wheatstonovho mostíka so striedavým prúdom nízkeho napätia (18). Všeobecné špecifikácie mostíka sú: 1 – 3 volty prevádzkového napätia, sínusový alebo pravouhlý tvar kmitov striedavého prúdu s frekvenciou 50 – 1 000 Hz a rozsah merania minimálne 0,1 – 30 kΩ. Merací mostík použitý vo validačnej štúdii meria induktanciu, kapacitanciu a odpor až do hodnôt 2 000 H, 2 000 μF a 2 MΩ pri frekvenciách 100 Hz alebo 1 kHz, s použitím sériových alebo paralelných hodnôt. Na účely merania TER v rámci skúšky žieravosti sa zaznamenávajú hodnoty odporu pri frekvencii 100 Hz a s použitím sériových hodnôt. Pred meraním elektrického odporu sa povrchové napätie kože zníži pridaním dostatočného množstva 70 % etanolu tak, aby sa epiderma zakryla. Po niekoľkých sekundách sa etanol z trubice odstráni a tkanivo sa potom zvlhčí pridaním 3 ml roztoku MgSO4 (154 mM). Elektródy meracieho mostíka sa umiestnia na obe strany kožného terčíka a zmeria sa odpor v kΩ/kožný terčík (obrázok 1). Rozmery elektródy a dĺžka exponovanej elektródy pod krokosvorkami sú uvedené na obrázku 2. Svorka vnútornej elektródy je počas merania odporu položená na vrchu trubice z PTFE, aby sa zabezpečilo, že dĺžka elektródy ponorenej v roztoku MgSO4 sa nemení. Vonkajšia elektróda je umiestnená vo vnútri receptorovej komory tak, aby spočívala na dne komory. Udržiava sa konštantná vzdialenosť medzi pružinovou svorkou a dolnou časťou trubice z PTFE (obrázok 2), pretože táto vzdialenosť má vplyv na nameranú hodnotu odporu. Vzdialenosť medzi vnútornou elektródou a kožným terčíkom by preto mala byť konštantná a minimálna (1 – 2 mm).

23.

Ak je hodnota nameraného odporu väčšia ako 20 kΩ, môže to byť spôsobené tým, že na povrchu epidermy kožného terčíka sa nachádzajú zvyšky testovanej chemikálie. Táto vrstva sa môže odstrániť napríklad tak, že sa trubica z PTFE utesní palcom chráneným rukavicou a pretrepáva sa asi 10 sekúnd; odstráni sa roztok MgSO4 a zopakuje sa meranie odporu s novým roztokom MgSO4.

24.

Vlastnosti a rozmery testovacej aparatúry a použitý experimentálny postup môžu mať vplyv na namerané hodnoty TER. Prahová hodnota 5 kΩ v prípade žieravín bola stanovená na základe údajov získaných špecifickou aparatúrou a špecifickým postupom, ktoré sú popísané v tejto testovacej metóde. Ak sa zmenia podmienky testovania alebo sa použije iná aparatúra, môžu sa použiť iné prahové a kontrolné hodnoty. Metodiku a prahové hodnoty odporu je preto potrebné kalibrovať testovaním série látok na preukázanie spôsobilosti, ktoré sa zvolia z látok použitých vo validačnej štúdii (8) (9), alebo z chemických tried podobných skúmaným látkam. V tabuľke 1 je uvedený zoznam vhodných látok na preukázanie spôsobilosti.

Metódy viazania farbiva

25.

Expozícia kože určitým nežieravým materiálom môže mať za následok zníženie odporu pod prahovú hodnotu 5 kΩ, v dôsledku čoho sa umožní prienik iónov cez rohovitú vrstvu (stratum corneum) a zníži sa elektrický odpor (9). Napríklad neutrálne organické látky a látky, ktoré majú povrchovo aktívne vlastnosti (vrátane detergentov, emulzifikátorov a ostatných povrchovo aktívnych látok), môžu odstrániť kožné lipidy, čím sa bariéra stane pre ióny priepustnejšia. Preto, ak sú hodnoty TER takýchto chemikálií nižšie ako 5 kΩ, alebo sa pohybujú okolo tejto hodnoty, a kožný terčík nie je viditeľne poškodený, malo by sa vykonať posúdenie prieniku farbiva na kontrolných a ošetrených tkanivách, aby sa zistilo, či sú namerané hodnoty TER výsledkom zvýšenej priepustnosti kože alebo poleptania kože (7) (9). V prípade poleptania kože, keď sa rohovitá vrstva stratum corneum poruší, farbivo sulforodamín B pri aplikácii na povrch kože ňou rýchlo preniká a sfarbuje podkladové tkanivo. Toto konkrétne farbivo je stabilné v prostredí širokého rozsahu chemikálií a nemá naň vplyv extrakčný postup opísaný ďalej.

Aplikácia a odstránenie farbiva sulforodamínu B

26.

Po posúdení TER sa síran horečnatý odstráni z trubice a koža sa pozorne preskúma, či nie je viditeľne poškodená. Ak sa nepozoruje žiadne väčšie viditeľné poškodenie (napr. perforácia), aplikuje sa 150 μl 10 hm./obj. % zriedenia sulforodamínu B (Acid Red 52; č. C.I. 45100; CAS číslo 3520-42-1) v destilovanej vode na každý kožný terčík počas 2 hodín. Tieto kožné terčíky sa potom asi 10 sekúnd omývajú vodou z vodovodu maximálne izbovej teploty, aby sa odstránilo všetko nadbytočné/neviazané farbivo. Všetky kožné terčíky sa opatrne odoberú z trubice z PTFE a umiestnia sa do nádoby (napr. 20 ml sklenená scintilačná nádoba) obsahujúcej deionizovanú vodu (8 ml). Nádoby sa 5 minút ľahko pretrepávajú, aby sa odstránilo nadbytočné neviazané farbivo. Tento postup oplachovania sa potom zopakuje a kožné terčíky sa následne vyberú a vložia do nádob obsahujúcich 5 ml 30 hm./obj. % nátrium-dodecyl-sulfátu (SDS) v destilovanej vode a cez noc sa inkubujú pri teplote 60 °C.

27.

Po inkubácii sa všetky kožné terčíky odstránia a zlikvidujú a zostávajúci roztok sa odstreďuje 8 minút pri teplote 21 °C (pri relatívnej odstredivej sile ~ 175 × g). Vzorka supernatantu s objemom 1 ml sa zriedi v pomere 1:5 obj. % [t. j. 1 ml + 4 ml] s 30 hm./obj. % SDS v destilovanej vode. Optická hustota (OD) roztoku sa meria pri 565 nm.

Výpočet obsahu farbiva

28.

Obsah farbiva sulforodamín B v kožnom terčíku sa vypočíta z hodnôt OD (9) (molárny koeficient extinkcie farbiva sulforodamín B pri 565 nm = 8,7 × l04, molekulová hmotnosť = 580). Obsah farbiva sa určí pre každý kožný terčík s využitím vhodnej kalibračnej krivky a potom sa vypočíta stredná hodnota obsahu farbiva pre replikáty.

Kritériá prijateľnosti

29.

Stredné hodnoty výsledkov TER sú prijateľné, ak súbežne namerané hodnoty pozitívnej aj negatívnej kontroly spadajú do prijateľných rozsahov danej metódy v danom skúšobnom laboratóriu. Pre opísanú metodiku a aparatúru sú prijateľné hodnoty rozsahov odporu uvedené v tejto tabuľke:

Kontrola

Látka

Rozsah odporu (kΩ)

pozitívna

10 M kyselina chlorovodíková

0,5 – 1,0

negatívna

destilovaná voda

10 – 25

30.

Výsledné stredné hodnoty viazania farbiva sú prijateľné, ak hodnoty pre súbežné kontroly spadajú do prijateľných rozsahov danej metódy. Pre opísanú metodiku a aparatúru sa navrhujú prijateľné rozsahy obsahu farbiva pre kontrolné látky uvedené v tejto tabuľke:

Kontrola

Látka

Rozsah obsahu farbiva (μg/terčík)

pozitívna

10 M kyselina chlorovodíková

40 – 100

negatívna

destilovaná voda

15 – 35

Interpretácia výsledkov

31.

Medzná hodnota TER na rozlíšenie medzi žieravou a nežieravou testovanou chemikáliou sa stanovila v rámci optimalizácie testovacej metódy, skúšala sa v predvalidačnej fáze a bola potvrdená formálnou validačnou štúdiou.

32.

Prognostický model na testovaciu metódu poleptania kože TER na potkanej koži (9) (19) spojený s klasifikačným systémom GHS OSN/CLP:

Testovaná chemikália sa pokladá za látku nežieravú pre kožu:

i)

ak je stredná hodnota TER získaná pre testovanú chemikáliu väčšia ako (>) 5 kΩ, alebo

ii)

ak sa stredná hodnota TER získaná pre testovanú chemikáliu rovná 5 kΩ alebo je menšia (≤) a

nepozoruje sa žiadne viditeľné poškodenie kožných terčíkov (napr. perforácia) a

stredná hodnota obsahu farbiva kožného terčíka je menšia ako (<) stredná hodnota obsahu farbiva kožného terčíka získaná v rámci súbežne vykonávanej pozitívnej kontroly s 10 M HCl (pre hodnoty pozitívnej kontroly pozri odsek 30).

Testovaná chemikália sa pokladá za žieravú pre kožu:

i)

ak sa stredná hodnota TER získaná pre testovanú chemikáliu rovná 5Ω alebo je menšia (≤) a kožné terčíky sú viditeľne poškodené (napr. perforované) alebo

ii)

ak sa stredná hodnota TER získaná pre testovanú chemikáliu rovná 5 kΩ alebo je menšia (≤) a

nepozoruje sa žiadne viditeľné poškodenie kožných terčíkov (napr. perforácia), ale

stredná hodnota obsahu farbiva kožného terčíka sa rovná strednej hodnote obsahu farbiva kožného terčíka získaný v rámci súbežne vykonávanej pozitívnej kontroly s 10 M HCl (pre hodnoty pozitívnej kontroly pozri odsek 30) alebo je väčší (≥).

33.

Jeden testovací cyklus (pokus), ktorý sa skladá najmenej z troch replík kožných terčíkov, by mal pre testovanú chemikáliu postačovať, ak je jeho klasifikácia jednoznačná. V prípadoch s hraničnými výsledkami, napríklad ak sa nezhodujú merania replík a/alebo ak sa stredná hodnota TER rovná 5 ±0,5 kΩ, je potrebné zvážiť vykonanie druhého nezávislého testovacieho cyklu (pokusu), ako aj tretieho testovacieho cyklu, ak sa výsledky z prvých dvoch testovacích cyklov (pokusov) nezhodujú.

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Údaje

34.

Správy o hodnotách odporu (kΩ) a prípadne hodnotách obsahu farbiva (μg/terčík) pre testovanú chemikáliu, ako aj pre pozitívne a negatívne kontroly, by sa mali podávať vo forme tabuliek vrátane údajov pre každý jednotlivý replikát terčíka v každom testovacom cykle (pokuse) a stredné hodnoty ± SD. O všetkých opakovaných pokusoch by sa mali podať správy. Pozorované poškodenie kožných terčíkov by sa malo nahlasovať pre každú testovanú chemikáliu.

Správa o teste

35.

Správa o teste by mala obsahovať tieto informácie:

 

Testované chemikálie a kontrolné látky:

jednozložková látka: identifikácia chemikálie, napr. názov podľa IUPAC alebo CAS, CAS číslo, kód SMILES alebo InChI, štruktúrny vzorec, čistota, chemická identita nečistôt, ak je to vhodné a prakticky uskutočniteľné, atď.,

mnohozložková látka, UVCB a zmes: charakterizácia v najväčšej možnej miere na základe chemickej identity (pozri vyššie), kvantitatívny výskyt a príslušné fyzikálno-chemické vlastnosti zložiek,

fyzický vzhľad, rozpustnosť vo vode a ďalšie relevantné fyzikálno-chemické vlastnosti,

zdroj, číslo šarže, ak je k dispozícii,

prípadná úprava testovanej chemikálie/kontrolnej látky pred testovaním (napr. zahrievanie, drvenie),

stabilita testovanej chemikálie, konečný dátum použitia alebo dátum opätovnej analýzy, ak sú známe,

podmienky skladovania.

 

Pokusné zvieratá:

kmeň a pohlavie,

vek zvierat, ak sú použité ako darcovské zvieratá,

zdroj, podmienky umiestnenia, krmivo atď.,

podrobnosti o príprave kože.

 

Podmienky testovania:

kalibračné krivky testovacej aparatúry,

kalibračné krivky na vykonanie testu viazania farbiva, pásmový filter použitý na meranie hodnôt optickej hustoty a rozsah linearity optickej hustoty meracieho zariadenia (napr. spektrofotometer), ak je to relevantné,

podrobnosti o použitom testovacom postupe na meranie TER,

podrobnosti o testovacom postupe použitom na posúdenie viazania farbiva, ak je to relevantné,

použité testovacie dávky, trvanie expozičného(-ých) času(-ov) a teplota(-y) expozície,

podrobnosti o použitých postupoch umývania po expozičnom čase,

počet replikátov kožných terčíkov použitých pri každej testovanej chemikálii a kontrole (pozitívna aj negatívna kontrola),

opis každej zmeny testovacieho postupu,

odkaz na historické údaje o modeli. K nim by mali okrem iného patriť:

i)

prijateľnosť hodnôt TER pozitívnej a negatívnej kontroly (v kΩ) s odkazom na rozsahy odporu pozitívnych a negatívnych kontrol;

ii)

prijateľnosť hodnôt obsahu farbiva pozitívnej a negatívnej kontroly (v μg/terčík) s odkazom na rozsahy obsahu farbiva pozitívnych a negatívnych kontrol;

iii)

prijateľnosť výsledkov testu s odkazom na historickú variabilitu medzi replikátmi kožných terčíkov;

opis uplatnených rozhodovacích kritérií/prognostických modelov.

 

Výsledky:

uvedenie (v podobe tabuliek) údajov zo skúšok TER a skúšok viazania farbiva (v prípade potreby) pre jednotlivé testované chemikálie a kontroly, každý testovací cyklus (pokus) a každý replikát kožného terčíka (jednotlivé zvieratá a jednotlivé vzorky kože), stredné hodnoty, štandardné odchýlky (SD) a variačné koeficienty (CV),

opis všetkých pozorovaných účinkov,

odvodená klasifikácia v súvislosti s prognostickým modelom/rozhodovacími kritériami, ktoré sa používajú.

 

Rozbor výsledkov

 

Závery

LITERATÚRA

(1)

United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. K dispozícii na adrese: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Kapitola B.4 tejto prílohy, Akútne podráždenie, poleptanie kože.

(3)

Kapitola B.40a tejto prílohy, Model kože in vitro.

(4)

Kapitola B.65 tejto prílohy, Metóda na testovanie s využitím membránovej bariéry in vitro.

(5)

Kapitola B.46 tejto prílohy, Podráždenie kože in vitro: Test na modeli rekonštruovanej ľudskej pokožky.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organizácia pre hospodársku spoluprácu a rozvoj, Paríž.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, s. 219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro, 12, s. 471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. In Vitro 12, s. 483-524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops. ATLA 23, s. 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 apríl 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organizácia pre hospodársku spoluprácu a rozvoj, Paríž.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., a Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6, 191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. a Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 34), Organizácia pre hospodársku spoluprácu a rozvoj, Paríž.

Obrázok 1

Aparatúra na Meranie ter Potkanej Kože

Image 2

Obrázok 2

Rozmery Polytetrafluóretylénovej Trubice (PTFE) a Trubice Receptora a Použitých Elektród

Image 3

Rozhodujúce faktory zobrazenej aparatúry:

vnútorný priemer trubice z PTFE,

dĺžka elektród v pomere k trubici z PTFE a trubici receptora by mala byť taká, že elektródy nedosahujú ku kožnému terčíku a elektróda so štandardnou dĺžkou je v kontakte s roztokom MgSO4,

množstvom roztoku MgSO4 v trubici receptora by sa mala vzhľadom na úroveň hladiny v trubici z PFTE zabezpečiť taká hĺbka tekutiny, ako je znázornené na obrázku 1,

kožný terčík by mal byť k trubici z PFTE pripevnený tak, aby elektrický odpor predstavoval skutočnú mieru vlastností kože.

Dodatok

VYMEDZENIE POJMOV

Presnosť : Miera zhody výsledkov testovacej metódy a akceptovaných referenčných hodnôt. Ide o mieru výkonnosti testovacej metódy a jedno z rozhodujúcich hľadísk. Tento pojem sa často používa zameniteľne s pojmom „zhoda“ a označuje podiel správnych výsledkov testovacej metódy (20).

C : Žieravina.

Chemikália : látka alebo zmes.

Zhoda : miera výkonnosti testovacej metódy v rámci skúšobných metód, ktoré poskytujú jednoznačný výsledok, a tiež jedno z rozhodujúcich hľadísk. Tento pojem sa niekedy používa zameniteľne s pojmom presnosť a vymedzuje sa ako podiel všetkých testovaných chemikálií, ktoré sú správne klasifikované ako pozitívne alebo negatívne. Zhoda je vo vysokej miere závislá od prevalencie pozitívnych výsledkov v typoch testovaných chemikálií, ktoré sa skúmajú (20).

GHS [Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií (OSN)] : systém, ktorým sa navrhuje klasifikácia chemikálií (látok a zmesí) podľa štandardizovaných typov a úrovní fyzikálnej, zdravotnej a environmentálnej nebezpečnosti a ich označovanie zodpovedajúcimi komunikačnými prvkami, ako sú piktogramy, výstražné slová, výstražné upozornenia, bezpečnostné upozornenia a karty bezpečnostných údajov, s cieľom poskytnúť informácie o nepriaznivých účinkoch daných chemikálií v záujme ochrany osôb (vrátane zamestnávateľov, pracovníkov, prepravcov, spotrebiteľov a subjektov reakcie na núdzové situácie) a životného prostredia (1).

IATA : integrovaný prístup k testovaniu a hodnoteniu.

Zmes : zmes alebo roztok, ktoré sú zložené z dvoch alebo viacerých látok.

Jednozložková látka : látka definovaná svojím kvantitatívnym zložením, v ktorej je jedna hlavná zložka zastúpená v koncentrácii najmenej 80 hm. %.

Viaczložková látka : látka definovaná svojím kvantitatívnym zložením, v ktorej je viac ako jedna hlavná zložka zastúpená v koncentrácii ≥ 10 hm. % a < 80 hm. %. Viaczložková látka je výsledkom výrobného procesu. Rozdiel medzi zmesou a viaczložkovou látkou spočíva v tom, že zmes sa získava zmiešaním dvoch alebo viacerých látok bez toho, aby došlo ku chemickej reakcii. Viaczložková látka je výsledkom chemickej reakcie.

NC : nežieravá látka.

OD : optická hustota.

PC : pozitívna kontrola, replikát obsahujúci všetky zložky testovacieho systému, ošetrený látkou, o ktorej sa vie, že vyvoláva pozitívnu odozvu. Aby sa zabezpečila možnosť hodnotenia variability odozvy pozitívnej kontroly v priebehu času, rozsah pozitívnej odozvy by nemal byť nadmerný.

Výkonnostné normy (Performance standards – PS) : normy založené na validovanej testovacej metóde, ktoré slúžia ako základ na hodnotenie porovnateľnosti navrhovanej testovacej metódy, ktorá je mechanicky a funkčne podobná. Patria sem: i) nevyhnutné zložky testovacej metódy; ii) minimálny zoznam referenčných chemikálií vybraných spomedzi chemikálií používaných na preukázanie prijateľnej výkonnosti validovanej testovacej metódy; a iii) podobné úrovne presnosti a spoľahlivosti založené na tom, čo sa získalo pri validovanej testovacej metóde a čo by navrhovaná testovacia metóda mala preukázať pri hodnotení pomocou minimálneho zoznamu referenčných chemikálií.

Relevantnosť : opis vzťahu testovacej metódy k účinku, ktorý je predmetom záujmu, a toho, či je tento účinok zmysluplný a užitočný na konkrétny účel. Ide o mieru, do akej testovacia metóda správne meria alebo predpovedá biologický účinok, ktorý je predmetom záujmu. Relevantnosť zohľadňuje presnosť (zhodu) testovacej metódy (20).

Spoľahlivosť : vyjadruje rozsah, v rámci ktorého sa môže testovacia metóda v priebehu času reprodukovateľne vykonávať v rámci laboratórií a medzi nimi navzájom, ak sa pri nej používa ten istý protokol. Posudzuje sa vypočítaním vnútrolaboratórnej a medzilaboratórnej reprodukovateľnosti (20).

Citlivosť : podiel všetkých pozitívnych/aktívnych chemikálií správne klasifikovaných testovacou metódou. Je to miera presnosti testovacej metódy, ktorá poskytuje jednoznačné výsledky, pričom ide o dôležité hľadisko pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (20).

Poleptanie kože in vivo : vznik nevratného poškodenia kože; konkrétne ide o viditeľnú nekrózu cez pokožku až do kože po aplikácii testovanej chemikálie, a to až do štyroch hodín. Pre reakcie v dôsledku poleptania sú typické vredy, krvácanie, krvavé chrasty a na konci pozorovania po 14 dňoch zmena farby v dôsledku vyblednutia kože, celé plochy postihnuté alopéciou a jazvy. Na vyhodnotenie problematických lézií by sa malo uvažovať o histopatológii.

Špecifickosť : podiel všetkých negatívnych/neaktívnych chemikálií správne klasifikovaných testovacou metódou. Je to miera presnosti testovacej metódy, ktorá poskytuje jednoznačné výsledky, a ide o dôležité hľadisko pri hodnotení relevantnosti testovacej metódy (20).

Látka : chemický prvok a jeho zlúčeniny v prírodnom stave alebo získané akýmkoľvek výrobným postupom vrátane všetkých prísad potrebných na udržanie stability látky a všetkých nečistôt pochádzajúcich z použitého postupu, ale s vylúčením všetkých rozpúšťadiel, ktoré možno oddeliť bez ovplyvnenia stability látky alebo bez zmeny jej zloženia.

(Testovací) cyklus : jedna testovaná chemikália, ktorá sa testuje súbežne minimálne v troch paralelných kožných terčíkoch.

Testovaná chemikália : akákoľvek látka alebo zmes, ktorá sa testuje touto testovacou metódou.

Transkutánny elektrický odpor (TER) : je miera elektrickej impedancie kože vyjadrená ako hodnota odporu v kiloohmoch. Jednoduchá a spoľahlivá metóda posúdenia bariérovej funkcie spočíva v zaznamenávaní prechodu iónov cez kožu s použitím aparatúry s Wheatstonovým mostíkom.

UVCB : látky neznámeho alebo variabilného zloženia, produkty komplexných reakcií alebo biologické materiály.

6.

V časti B sa kapitola B.40a nahrádza takto:

„B.40a   POLEPTANIE KOŽE IN VITRO: TESTOVACIA METÓDA S POUŽITÍM REKONŠTRUOVANEJ ĽUDSKEJ POKOŽKY (RhE)

ÚVOD

1.

Táto testovacia metóda (TM) je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 431 (2016). Poleptanie kože je vznik nevratného poškodenia kože, ktoré sa prejavuje ako viditeľná nekróza cez epidermu až do dermy po aplikácii testovanej chemikálie [v znení definície podľa Globálneho harmonizovaného systému klasifikácie a označovania chemických látok (GHS) Organizácie Spojených národov (OSN) (1) a nariadenia Európskej únie (EÚ) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (CLP) (6)]. Touto aktualizovanou testovacou metódou B.40a sa zabezpečuje postup in vitro, ktorý umožňuje identifikáciu nežieravých a žieravých látok a zmesí v súlade s GHS OSN a CLP. Umožňuje sa ňou aj čiastočné zaradenie žieravých látok do podkategórií.

2.

Posudzovanie žieravých vlastností chemikálií pre kožu sa zvyčajne vykonávalo na laboratórnych zvieratách (TM B.4, rovnocenná s usmernením OECD TG 404, ktoré bolo pôvodne prijaté v roku 1981 a revidované v rokoch 1992, 2002 a 2015) (2). Okrem súčasnej testovacej metódy B.40a sa validovali a prijali dve ďalšie testovacie metódy in vitro na testovanie žieravých vlastností chemikálií – TM B.40 (rovnocenná s usmernením OECD TG 430) (3) a TM B.65 (rovnocenná s usmernením OECD TG 435) (4). Okrem toho sa na testovanie vlastností dráždivosti pre kožu prijala metódain vitro TM B.46 (rovnocenná s usmernením OECD TG 439) (5). V usmerňovacom dokumente OECD o integrovaných prístupoch k testovaniu a hodnoteniu (IATA) v prípade poleptania a podráždenia kože sa opisuje viacero modulov, v ktorých sú zoskupené zdroje informácií a analytické nástroje, pričom sa v ňom uvádza usmernenie o tom, i) ako integrovať a používať existujúce údaje z testovania, ako aj údaje nepochádzajúce z testovania na posúdenie dráždivých a žieravých vlastností chemikálií pre kožu a ii) navrhuje sa prístup v prípade potreby ďalšieho testovania (6).

3.

Táto testovacia metóda sa týka podráždenia kože ako sledovaného parametra ľudského zdravia. Využíva sa pri nej rekonštruovaná ľudská pokožka (RhE) (získaná z netransformovaných keratinocytov získaných z ľudskej pokožky), ktorá dôkladne napodobňuje histologické, morfologické, biochemické a fyziologické vlastnosti vrchných častí ľudskej kože, t. j. pokožky. Príslušné usmernenie OECD na vykonávanie testov sa pôvodne prijalo v roku 2004, pričom v roku 2013 sa aktualizovalo s cieľom začleniť doň dodatočné testovacie metódy, pri ktorých sa používa model RhE, ako aj možnosť používať metódy umožňujúce zaradenie žieravých chemikálí do podkategórií, a v roku 2015 sa aktualizovalo s cieľom odkázať na usmerňovací dokument IATA a zaviesť používanie alternatívneho postupu na meranie životaschopnosti.

4.

V tejto testovacej metóde sú začlenené štyri validované komerčne dostupné modely RhE. V prípade dvoch z týchto komerčne dostupných modelov testovania – EpiSkin™ Standard Model (SM) a EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (na ktoré sa ďalej v texte odkazuje ako na validované referenčné metódy alebo VRM) sa vykonali predvalidačné štúdie (7), po ktorých nasledovala riadna validačná štúdia na posúdenie poleptania kože (8)(9)(10)(11) (12). Výsledky týchto štúdií viedli k odporúčaniu, že dve uvedené validované referenčné metódy by sa mohli používať na regulačné účely na odlíšenie žieravých (C) a nežieravých (NC) látok a že model EpiSkin™ by sa navyše mohol používať na podporu zaradenia žieravých látok do podkategórií (13)(14)(15). Dvoma ďalšími komerčne dostupnými modelmi RhE testovania poleptania kože in vitro sa dospelo k podobným výsledkom ako v prípade EpiDerm™ VRM podľa validácie na základe výkonnostných noriem (16)(17)(18). Ide o modely SkinEthic™ RHE (7) a epiCS® (predtým nazvaný EST-1000), ktoré sa takisto môžu používať na regulačné účely na odlíšenie žieravých a nežieravých látok (19)(20). Postvalidačnými štúdiami, ktoré vykonali výrobcovia modelu RhE v rokoch 2012 až 2014 s prepracovaným protokolom s korekciou na interferencie nešpecifickej redukcie MTT prostredníctvom testovaných chemikálií, sa zlepšila výkonnosť odlišovania žieravých a nežieravých látok, ako aj podpora zaraďovania žieravých látok do podkategórií (21)(22). Ďalšie štatistické analýzy postvalidačných údajov, ktoré boli získané pomocou EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE a EpiCS® sa vykonali s cieľom identifikovať alternatívne prediktívne modely, ktorými sa zlepšila prediktívna schopnosť na účely podkategorizácie (23).

5.

Pred tým, ako sa môže na regulačné účely použiť navrhovaná podobná alebo upravená metóda RhE in vitro na testovanie poleptania kože, ktorá je iná ako validované referenčné metódy, by sa mala stanoviť jej spoľahlivosť, relevantnosť (presnosť) a obmedzenia jej navrhovaného používania, aby sa zabezpečila podobnosť s validovanými referenčnými metódami v súlade s požiadavkami výkonnostných noriem (PS) (24) stanovenými v súlade so zásadami usmerňovacieho dokumentu OECD č. 34 (25). Vzájomné uznávanie údajov je možné zaručiť len po tom, ako sa každá navrhovaná nová alebo aktualizovaná testovacia metóda na základe výkonnostných noriem preskúma a zaradí do príslušného usmernenia na vykonávanie testov. Modely testovania zaradené do uvedeného usmernenia na vykonávanie testov možno využívať na riešenie požiadaviek krajín, ktoré sa týkajú výsledkov testov v súvislosti s metódou testovania poleptania kože in vitro, a to pri súčasnom využívaní prínosov plynúcich zo vzájomného uznávania údajov.

VYMEDZENIE POJMOV

6.

Vymedzenie použitých pojmov sa uvádza v dodatku 1.

POČIATOČNÉ ÚVAHY

7.

Touto testovacou metódou sa umožňuje identifikácia nežieravých a žieravých látok a zmesí v súlade s GHS OSN a CLP. Touto testovacou metódou sa okrem toho podporuje podkategorizácia žieravých látok a zmesí do nepovinnej podkategórie 1A v súlade s GHS OSN (1), ako aj kombinácia podkategórií 1B a 1C (21)(22)(23). Obmedzením tejto metódy je skutočnosť, že neumožňuje rozlišovanie medzi podkategóriami poleptania kože 1B a 1C v súlade s GHS OSN a CLP v dôsledku obmedzeného súboru známych žieravých chemikálií in vivo podkategórie 1C. Na základe modelov testovania EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE a epiCS® je možné zaraďovanie do podkategórií (t. j. 1A verzus 1B a 1C verzus NC).

8.

Pri validácii podporujúcej modely testovania zahrnuté do tejto testovacej metódy, ak sa používajú na identifikáciu nežieravých a žieravých látok, sa testovala široká škála chemikálií predstavujúcich predovšetkým individuálne látky. empirická databáza validačnej štúdie obsahovala celkovo 60 chemikálií, ktoré sa vzťahujú na širokú škálu tried chemikálií (8)(9)(10). Autori testovacej metódy vykonali testovanie na preukázanie citlivosti, špecifickosti, presnosti a vnútrolaboratórnej reprodukovateľnosti skúšky na účely podkategorizácie a výsledky preskúmala organizácia OECD (21) (22) (23). Na základe celkových dostupných údajov je daná testovacia metóda uplatniteľná na širokú škálu tried chemikálií a fyzikálnych stavov vrátane kvapalín, polotuhých látok, tuhých látok a voskov. Kvapaliny môžu byť vodné alebo nevodné; tuhé látky môžu byť rozpustné alebo nerozpustné vo vode. Tuhé materiály by sa mali podľa možnosti pred aplikáciou zomlieť na jemný prášok; žiadne iné predchádzajúce ošetrenie vzorky sa nevyžaduje. V prípadoch, keď je možné preukázať dôkazy o nepoužiteľnosti testovacích modelov zahrnutých do tejto testovacej metódy v prípade iných špecifických kategórií testovaných chemikálií, by sa tieto modely nemali použiť pri uvedenej špecifickej kategórii testovaných chemikálií. Táto testovacia metóda sa okrem toho považuje za použiteľnú v prípade zmesí ako rozšírenie jej použiteľnosti pri látkach. Vzhľadom na skutočnosť, že zmesi zahŕňajú široké spektrum kategórií a zloženia, a na skutočnosť, že v súčasnosti sú dostupné iba obmedzené informácie o testovaní zmesí, v prípadoch, keď možno preukázať dôkazy o nepoužiteľnosti testovacej metódy pri špecifickej kategórii zmesí (napr. na základe stratégie navrhovanej v odseku 26), by sa však daná testovacia metóda nemala používať pri uvedenej špecifickej kategórii zmesí. Pred použitím danej testovacej metódy na zmesi s cieľom generovať údaje plánované na regulačné účely by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť adekvátne výsledky na daný účel, a ak áno, prečo. Takéto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie danej zmesi. Plyny a aerosóly ešte neboli posúdené vo validačných štúdiách (8)(9)(10). Aj keď je možné, že tieto látky sa môžu testovať použitím technológie RhE, aktuálna testovacia metóda neumožňuje testovanie plynov a aerosólov.

9.

Testované chemikálie absorbujúce svetlo v rovnakom rozsahu ako formazán MTT a testované chemikálie so schopnosťou priamo redukovať vitálne farbivo MTT (na formazán MTT) môžu interferovať s výsledkami merania životaschopnosti tkaniva a môžu si vyžadovať použitie upravených kontrol na korekcie. Typ prispôsobených kontrol, ktoré môžu byť potrebné, sa bude rôzniť v závislosti od typu interferencie produkovanej testovanou chemikáliou a postupu použitého na meranie formazánu MTT (pozri odseky 25–31).

10.

Keďže táto testovacia metóda neposkytuje dostatočné informácie o podráždení kože, treba poznamenať, že TM B.46 sa špecificky zameriava na zdravotný účinok podráždenia kože in vitro a je založená na tom istom systéme testovania na modeli RhE, hoci sa pri nej používa iný protokol (5). Na úplné vyhodnotenie lokálnych účinkov na kožu po jednorazovej expozícii kože by sa mal použiť usmerňovací dokument OECD o integrovaných prístupoch k testovaniu a hodnoteniu (6). Tento prístup IATA zahŕňa vykonanie in vitro testov poleptania kože (opísaných v tejto testovacej metóde) a podráždenia kože pred zvážením testovania na živých zvieratách. Je známe, že použitie ľudskej kože podlieha vnútroštátnym a medzinárodným etickým zásadám a podmienkam.

PRINCÍP TESTU

11.

Testovaná chemikália sa lokálne aplikuje na trojrozmerný model RhE pozostávajúci z netransformovaných keratinocytov získaných z ľudskej pokožky, ktoré sa vykultivovali tak, aby vytvorili viacvrstvový, vysoko diferencovaný model ľudskej pokožky. Pozostáva z organizovanej bazálnej vrstvy, vrstvy ostnitých buniek a vrstvy zrnitých buniek a viacvrstvovej rohovitej vrstvy (stratum corneum) obsahujúcej medzibunkové lipidové lamelové vrstvy predstavujúce hlavné triedy lipidov, ktoré sú analogické s vrstvami nachádzajúcimi sa in vivo.

12.

Testovacia metóda RhE sa zakladá na predpoklade, že žieravé chemikálie sú schopné preniknúť rohovitou vrstvou (stratum corneum) difúziou alebo eróziou a sú cytotoxické pre bunky v hlbších vrstvách. Životaschopnosť buniek sa meria enzymatickou premenou vitálneho farbiva MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazólium-bromid, tiazolylová modrá; CAS číslo 298-93-1] na modrú formazánovú soľ, ktorá sa kvantitatívne meria po extrakcii z tkanív (27). Žieravé chemikálie sa identifikujú na základe ich schopnosti spôsobiť pokles životaschopnosti buniek pod vymedzené prahové úrovne (pozri odseky 35 a 36). Ukázalo sa, že testovacia metóda poleptania kože s použitím RhE umožňuje predvídať výsledky zisťovania poleptania kože in vivo pri králikoch podľa TM B.4 (2).

PREUKAZOVANIE SPÔSOBILOSTI

13.

Pred bežným použitím ktoréhokoľvek zo štyroch validovaných testovacích modelov RhE, ktoré zodpovedajú požiadavkám tejto testovacej metódy, by mali laboratóriá preukázať technickú spôsobilosť správnou klasifikáciou dvanástich chemikálií na preukázanie spôsobilosti uvedených v tabuľke 1. V prípade použitia metódy podklasifikácie by sa zároveň mala preukázať správnosť daného zaradenia do podkategórie. V prípadoch, keď uvedená látka nie je k dispozícii alebo keď je to odôvodniteľné, možno použiť inú látku, pri ktorej sú k dispozícii primerané referenčné údaje in vivo a in vitro [napríklad zo zoznamu referenčných chemikálií (24)], za predpokladu, že sa uplatnia rovnaké kritériá výberu, ktoré sú opísané v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Zoznam chemikálií na preukázanie spôsobilosti  (8)

Látka

CAS č.

Chemická trieda (9)

Kat. GHS OSN/CLP založená na výsledkoch In Vivo (testov) (10)

VRM kat. založená na výsledkoch In Vitro  (11)

MTT redukcia (12)

Fyzikálny stav

Žieraviny in vivo, podkategória 1A

kyselina brómoctová

79-08-3

organická kyselina

1A

(3) 1A

tuhá látka

dihydrát fluoridu boritého

13319-75-0

anorganická kyselina

1A

(3) 1A

kvapalina

fenol

108-95-2

fenol

1A

(3) 1A

tuhá látka

dichlóracetyl chlorid

79-36-7

elektrofil

1A

(3) 1A

kvapalina

Žieraviny in vivo, kombinácia podkategórií 1B a 1C

monohydrát kyseliny glyoxylovej

563-96-2

organická kyselina

1B a 1C

(3) 1B a 1C

tuhá látka

kyselina mliečna

598-82-3

organická kyselina

1B a 1C

(3) 1B a 1C

kvapalina

etanolamín

141-43-5

organická báza

1B

(3) 1B a 1C

áno

viskózna látka

kyselina chlorovodíková (14,4 %)

7647-01-0

anorganická kyselina

1B a 1C

(3) 1B a 1C

kvapalina

Nežieravé látky In Vivo

fenetylbromid

103-63-9

elektrofil

nežier. (NC)

(3) nežier. (NC)

áno

kvapalina

4H-1,2,4-triazolylamín

584-13-4

organická báza

nežier. (NC)

(3) nežier. (NC)

tuhá látka

4-(metylsulfanyl) benzaldehyd

3446-89-7

elektrofil

nežier. (NC)

(3) nežier. (NC)

áno

kvapalina

kyselina laurová

143-07-7

organická kyselina

nežier. (NC)

(3) nežier. (NC)

tuhá látka

Skratky: CASRN = registračné číslo CAS (CAS číslo, Chemical Abstracts Service Registry Number) VRM = validovaná referenčná metóda; NC = nežieravá chemikália.

14.

Ako súčasť postupu overovania spôsobilosti sa odporúča, aby používateľ overil bariérové vlastnosti tkanív po ich prijatí, ako to stanovuje výrobca modelu RhE. To je osobitne dôležité najmä vtedy, ak sa tkanivá zasielajú na veľkú vzdialenosť alebo počas dlhých časových období. Po úspešnom stanovení testovacej metódy a preukázaní spôsobilosti na jej použitie už takéto overovanie nebude bežne potrebné. Pri bežnom používaní testovacej metódy sa však odporúča naďalej v pravidelných intervaloch posudzovať bariérové vlastnosti.

POSTUP

15.

Nasleduje všeobecný opis zložiek a postupov testovacích modelov RhE určených na posúdenie poleptania kože, na ktoré sa táto metóda vzťahuje. Modely RhE schválené ako vedecky platné na použitie v rámci tejto testovacej metódy, t. j. modely EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE a epiCS® (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33), možno získať z komerčných zdrojov. Pre tieto štyri modely RhE sú k dispozícii štandardné operačné postupy (SOP) (34) (35) (36) (37) a hlavné zložky testovacej metódy sú zhrnuté v dodatku 2. Pri uplatňovaní a používaní jedného z týchto modelov v laboratóriu sa odporúča použitie príslušných štandardných operačných postupov. Testovanie so štyrmi testovacími modelmi RhE, na ktoré sa vzťahuje táto testovacia metóda, by malo byť v súlade s týmto:

ZLOŽKY TESTOVACEJ METÓDY S POUŽITÍM RHE

Všeobecné podmienky

16.

Na rekonštrukciu epitelu by sa mali použiť netransformované ľudské keratinocyty. Pod funkčnou vrstvou stratum corneum by sa malo nachádzať viacero vrstiev životaschopných epitelových buniek (bazálna vrstva, stratum spinosum, stratum granulosum). Rohovitá vrstva stratum corneum by mala byť viacvrstvová a obsahovať základný lipidový profil, aby sa vytvorila silná funkčná bariéra, ktorá odolá rýchlemu prenikaniu cytotoxických referenčných chemikálií, ku ktorým patrí napríklad dodecylsulfát sodný (SDS) alebo Triton X-100. Mala by sa preukázať bariérová funkcia, ktorá sa môže posudzovať buď stanovením koncentrácie, pri ktorej referenčná chemikália znižuje životaschopnosť tkanív o 50 % (IC50) po pevne stanovenom expozičnom čase, alebo stanovením expozičného času, ktorý je potrebný na zníženie životaschopnosti buniek o 50 % (ET50) po aplikácii referenčnej chemikálie v určenej pevne stanovenej koncentrácii (pozri odsek 18). Izolačné vlastnosti modelu RhE by mali zabrániť prieniku materiálu okolo stratum corneum do životaschopného tkaniva, čo by viedlo k chybnému modelovaniu expozície kože. Model RhE by nemal byť kontaminovaný baktériami, vírusmi, mykoplazmami ani hubami.

Funkčné podmienky

Životaschopnosť

17.

Skúška použitá na kvantifikovanie životaschopnosti tkaniva je skúška MTT (27). Životaschopné bunky RhE modelu tkaniva redukujú vitálne farbivo MTT na vyzrážaný modrý formazánový produkt MTT, ktorý sa potom z tkaniva extrahuje pomocou izopropanolu (alebo podobného rozpúšťadla). Optická hustota (OD) samotného extrakčného rozpúšťadla by mala byť dostatočne nízka, t. j. OD < 0,1. Extrahovaný formazán MTT môže byť kvantifikovaný buď meraním absorbancie štandardu (OD) alebo spektrofotometriou HPLC/UPLC (38). Používatelia modelu RhE by sa mali ubezpečiť, že každá šarža použitého modelu RhE spĺňa kritériá stanovené pre negatívnu kontrolu. Rozsah prijateľnosti (hornú a dolnú hranicu) pre hodnoty optickej hustoty negatívnej kontroly by mal stanoviť autor/dodávateľ modelu RhE. V tabuľke 2 sú uvedené rozsahy prijateľnosti pre hodnoty optickej hustoty pri negatívnej kontrole v prípade štyroch validovaných testovacích modelov RhE zahrnutých v tejto testovacej metóde. Používateľ spektrofotometrie HPLC/UPLC by mal pri negatívnej kontrole ako akceptačné kritérium použiť rozsahy optickej hustoty pri negatívnej kontrole stanovené v tabuľke 2. Malo by sa zaznamenať, že tkanivá ošetrené negatívnou kontrolou sú počas času expozície stabilné v kultúre (zabezpečujú podobné výsledky merania optickej hustoty).

Tabuľka 2

Rozsahy prijateľnosti hodnôt optickej hustoty pri negatívnej kontrole na kontrolu kvality šarže

 

Dolná hranica prijateľnosti

Horná hranica prijateľnosti

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Bariérová funkcia

18.

Rohovitá vrstva stratum corneum a jej lipidové zloženie by mali byť dostačujúce na zabránenie rýchlemu prieniku určitých cytotoxických referenčných chemikálií (napr. SDS alebo Triton X-100), a to podľa odhadu pomocou IC50 alebo ET50 (tabuľka 3). Autor/predajca modelu RhE by mal pri dodaní tkanív konečnému používateľovi predviesť bariérovú funkciu každej šarže použitého modelu RhE (pozri odsek 21).

Morfológia

19.

Model RhE by sa mal histologicky preskúmať, pričom by sa mala preukázať viacvrstvová štruktúra podobná ľudskej pokožke, ktorá obsahuje stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum a stratum corneum a ktorá vykazuje lipidový profil podobný lipidovému profilu ľudskej pokožky. Autor/predajca modelu RhE by mal pri dodaní tkanív konečnému používateľovi zabezpečiť histologické preskúmanie každej šarže použitého modelu RhE, pričom by sa mala preukázať vhodná morfológia tkanív (pozri odsek 21).

Reprodukovateľnosť

20.

Používatelia testovacej metódy by mali preukázať reprodukovateľnosť testovacích metód v priebehu času s pozitívnymi a negatívnymi kontrolami. Daná testovacia metóda by sa navyše mala používať len v prípade, ak autor/dodávateľ modelu RhE poskytne údaje preukazujúce reprodukovateľnosť v priebehu času so žieravými a nežieravými chemikáliami, napríklad chemikáliami zo zoznamu chemikálií na preukázanie spôsobilosti (tabuľka 1). V prípade použitia testovacej metódy na účely zaraďovania do podkategórií by sa mala preukázať aj reprodukovateľnosť s ohľadom na zaraďovanie do podkategórií.

Kontrola kvality (QC)

21.

Model RhE by sa mal používať len v prípade, ak autor/dodávateľ preukáže, že každá šarža použitého modelu RhE spĺňa stanovené kritériá na uvoľnenie do obehu, v rámci ktorých sú najvýznamnejšie kritériá životaschopnosti (odsek 17), bariérovej funkcie (odsek 18) a morfológie (odsek 19). Tieto údaje sa poskytujú používateľom testovacej metódy, aby mohli túto informáciu zahrnúť do správy o teste. V záujme spoľahlivej prognózy klasifikácie žieravín sú akceptovateľné len výsledky, ktoré sa získali zo šarží tkaniva prijateľných v rámci kontroly kvality. Rozsah prijateľnosti (hornú a dolnú hranicu) pre IC50 alebo ET50 stanovuje autor/dodávateľ modelu RhE. Rozsahy prijateľnosti pre dané štyri validované testovacie modely sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3

Kritériá kontroly kvality na uvoľnenie šarží do obehu

 

Dolná hranica prijateľnosti

Horná hranica prijateľnosti

EpiSkin™ (SM) (18-hodinové ošetrenie SDS) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 hodiny

ET50 = 8,7 hodiny

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)

ET50 = 4,0 hodiny

ET50 = 10,0 hodiny

epiCS® (1 % Triton X-100) (36)

ET50 = 2,0 hodiny

ET50 = 7,0 hodiny

Aplikácia testovaných chemikálií a kontrolných chemikálií

22.

Pri každej testovanej chemikálii a kontrolách by sa mali použiť aspoň dve replikáty tkaniva na každý expozičný čas. V prípade kvapalných aj tuhých chemikálií je potrebné na povrch pokožky rovnomerne naniesť dostatočné množstvo testovanej chemikálie, pričom je nutné vyhýbať sa nekonečnej dávke, t. j. malo by sa použiť minimálne 70 μL/cm2 alebo 30 mg/cm2. V závislosti od modelov by sa mal pred aplikáciou tuhých chemikálií povrch pokožky zvlhčiť deionizovanou alebo destilovanou vodou, aby sa tak zlepšil kontakt testovanej chemikálie s povrchom pokožky (34)(35)(36)(37). Tuhé látky by sa mali podľa možnosti testovať vo forme jemného prášku. Metóda aplikácie by mala byť vhodná pre testovanú chemikáliu (pozri napr. odkazy 34 – 37). Na konci expozičného obdobia by sa testovaná chemikália mala z pokožky dôkladne zmyť tlmivým roztokom alebo 0,9 % roztokom NaCl. V závislosti od toho, ktorý zo štyroch validovaných testovacích modelov RhE sa použije, sa pri každej testovanej chemikálii použijú dva alebo tri expozičné časy (v prípade všetkých štyroch validovaných modelov RhE: 3 minúty a 1 hodina; v prípade EpiSkin™ dodatočný expozičný čas v trvaní 4 hodín). V závislosti od použitého testovacieho modelu RhE a posudzovaného expozičného času sa môže inkubačná teplota počas expozície pohybovať v rozmedzí izbovej teploty a 37 °C.