|
(2)
|
În partea B, capitolul B.17 se înlocuiește cu următorul text:
„B.17 TESTE IN VITRO DE MUTAȚIE GENICĂ PE CELULE DE MAMIFERE FOLOSIND GENELE HPRT ȘI XPRT
INTRODUCERE
|
1.
|
Această metodă de testare (MT) este echivalentă cu Orientarea OCDE nr. 476 privind testarea (2016). Metodele de testare sunt revizuite periodic în contextul progreselor științifice, al necesităților fluctuante de reglementare și al bunăstării animalelor. Actuala versiune revizuită a MT B.17 reflectă aproape treizeci de ani de experiență în ceea ce privește acest test și, de asemenea, constituie rezultatul dezvoltării unei noi metode separate dedicate testelor in vitro de mutație genică pe celule de mamifere folosind gena timidin-kinază. MT B.17 face parte dintr-o serie de metode de testare privind toxicologia genetică. OCDE a elaborat un document care oferă informații succinte privind testarea pentru toxicologia genetică și o prezentare a modificărilor efectuate recent asupra orientărilor OCDE privind testarea pentru toxicologia genetică (1).
|
|
2.
|
Scopul testului in vitro de mutație genică pe celule de mamifere este detectarea mutațiilor genice induse de substanțe chimice. Liniile celulare utilizate în aceste teste măsoară mutațiile directe la genele reporter, în special la gena endogenă hipoxantin-guanină fosforibozil transferază (Hprt la celulele de rozătoare, HPRT la celulele umane; denumite colectiv gena Hprt și testul HPRT în cadrul prezentei metode de testare), precum și la transgena de xantin-guanină fosforibozil transferază (gpt) (denumit testul XPRT). Testele de mutație HPRT și XPRT permit detectarea diferitelor spectre de fenomene genetice. În plus față de mutațiile detectate prin testul HPRT (de exemplu, substituții ale perechilor de bază, decalări ale cadrului de citire, mici deleții și inserții), localizarea autozomică a transgenei gpt ar putea permite detectarea mutațiilor produse ca urmare a unor deleții semnificative și, eventual, a recombinării mitotice care nu este detectată prin testul HPRT, deoarece gena Hprt se află pe cromozomul X (2) (3) (4) (5) (6) (7). În prezent, XPRT este mai puțin utilizat decât testul HPRT în scopuri de reglementare.
|
|
3.
|
Definițiile utilizate sunt furnizate în apendicele 1.
|
CONSIDERAȚII PRELIMINARE ȘI LIMITĂRI
|
4.
|
Testele realizate in vitro necesită, în general, utilizarea unei surse exogene de activare metabolică. Sistemul exogen de activare metabolică nu reproduce integral condițiile in vivo.
|
|
5.
|
Ar trebui să se acorde atenție evitării condițiilor care ar conduce la rezultate pozitive artificiale (și anume, o posibilă interacțiune cu sistemul de testare), care nu sunt cauzate de interacțiunea directă dintre substanțele chimice de testat și materialul genetic al celulei; astfel de condiții includ modificări ale pH-ului sau ale osmolalității (8) (9) (10), interacțiunea cu componentele de mediu (11) (12) sau niveluri excesive ale citotoxicității (13). Citotoxicitatea care depășește nivelurile recomandate de citotoxicitate de vârf, astfel cum sunt definite la punctul 19, este considerată excesivă pentru testul HPRT.
|
|
6.
|
Înainte de utilizarea metodei de testare pe un amestec pentru a genera date pentru un obiectiv de reglementare prevăzut, se ia în considerare dacă și, în caz afirmativ, din ce cauză aceasta poate oferi rezultate adecvate pentru respectivul scop. Astfel de considerații nu sunt necesare atunci când există o cerință de reglementare pentru testarea amestecului.
|
PRINCIPIUL TESTULUI
|
7.
|
Celulele mutante deficiente în activitatea enzimei Hprt în cadrul testului HPRT sau în activitatea enzimei xprt în cadrul testului XPRT sunt rezistente la efectele citostatice ale substanței 6-tioguanină purină analogă (TG). Celulele care conțin enzima Hprt (în cadrul testului HPRT) sau gpt (în cadrul testului XPRT) sunt sensibile la TG, ceea ce produce inhibarea metabolismului celular și oprirea diviziunii celulare. Astfel, celulele mutante pot prolifera în prezența TG, în timp ce celulele normale, care conțin enzima Hprt (în cadrul testului HPRT) sau gpt (în cadrul testului XPRT), nu pot prolifera.
|
|
8.
|
Celulele în suspensie sau culturile monostrat sunt expuse la substanța chimică de testat atât în prezența, cât și în absența unei surse exogene de activare metabolică (a se vedea punctul 14), pentru o perioadă adecvată de timp (3-6 ore) și apoi subcultivate pentru determinarea citotoxicității și pentru a permite expresia fenotipică înaintea selecției mutantului (14) (15) (16) (17). Citotoxicitatea este determinată prin supraviețuire relativă (RS), și anume, eficacitatea clonării măsurată imediat după tratament și ajustată pentru orice pierdere de celule în timpul tratamentului comparativ cu martorul negativ (punctul 18 și apendicele 2). Culturile tratate sunt menținute în mediul de cultură un timp suficient, caracteristic pentru fiecare tip de celulă, pentru a permite o expresie fenotipică aproape optimă a mutațiilor induse (de regulă, minim 7-9 zile). În urma manifestării fenotipice, frecvența mutanților se determină prin însămânțarea unui număr cunoscut de celule într-un mediu ce conține agentul selectiv pentru a detecta coloniile mutante și într-un mediu fără agent selectiv pentru a determina eficacitatea clonării (viabilitatea). După un timp corespunzător de incubare, se numără coloniile. Frecvența mutanților se calculează pe baza numărului de colonii de mutanți, corectat prin eficacitatea clonării la momentul selecției mutantului.
|
DESCRIEREA METODEI
Pregătiri
Celule
|
9.
|
Tipurile de celule utilizate pentru testele HPRT și XPRT ar trebui să aibă o sensibilitate demonstrată la mutageni chimici, o eficacitate de clonare mare, un cariotip stabil și o frecvență stabilă a celulelor mutante spontane. Cele mai frecvent utilizate celule pentru testul HPRT includ liniile CHO, CHL și V79 de celule de hamster chinezesc, celule de limfom de șoarece L5178Y și celule limfoblastoide umane TK6 (18) (19). Celulele AS52 derivate din CHO, care conțin transgena gpt (dar nu și gena Hprt) sunt utilizate pentru testul XPRT (20) (21); testul HPRT nu poate fi efectuat pe celule AS52, deoarece gena hprt a fost eliminată. Utilizarea altor linii celulare ar trebui să fie justificată și validată.
|
|
10.
|
Liniile celulare ar trebui să fie controlate în mod regulat pentru verificarea stabilității numărului modal de cromozomi și a absenței contaminării cu micoplasmă (22) (23), iar, în cazul în care se constată contaminarea sau în cazul în care numărul modal de cromozomi s-a modificat, celulele nu se mai utilizează. Ar trebui să se stabilească durata normală a ciclului celular utilizată în laboratorul de testare, iar aceasta ar trebui să fie conformă cu caracteristicile celulare publicate. Frecvența celulei mutante spontane în stocul de celule mamă ar trebui să fie, de asemenea, verificată, iar stocul nu ar trebui utilizat în cazul în care frecvența mutanților nu este acceptabilă.
|
|
11.
|
Înainte de utilizare în cadrul acestui test, este posibil să fie necesară curățarea culturilor de celule mutante preexistente, de exemplu, prin cultivare în mediul HAT pentru testul HPRT și în MPA pentru testul XPRT (5) (24) (a se vedea apendicele 1). Celulele curățate pot fi păstrate în mediu criogenic și apoi decongelate pentru a fi utilizate ca stocuri de lucru. Stocul de lucru proaspăt decongelat poate fi utilizat pentru testare după încheierea perioadelor normale de dublare. Atunci când este efectuat testul XPRT, cultura de rutină a celulelor AS52 ar trebui să utilizeze condiții care asigură menținerea transgenei gpt (20).
|
Condiții pentru medii și cultură
|
12.
|
Ar trebui să fie asigurate condiții adecvate pentru mediul de cultură și incubare (vase de cultură, umiditate atmosferică de 5 % CO2 și temperatura de incubare de 37 °C) pentru menținerea culturilor. Culturile de celule ar trebui să fie menținute întotdeauna în condiții care să asigure creșterea acestora în faza de dezvoltare logaritmică. Este deosebit de important să se aleagă condiții de medii și de cultură astfel încât să se asigure creșterea optimă a celulelor în perioada de manifestare și eficacitatea optimă a clonării atât pentru celulele mutante, cât și pentru cele nemutante.
|
Pregătirea culturilor
|
13.
|
Liniile celulare se propagă din culturi stoc, se însămânțează în mediul de cultură la o anumită densitate astfel încât celulele în suspensie ori în culturile monostrat să continue să crească exponențial în perioadele de tratament și manifestare (de exemplu, ar trebui să se evite confluența celulelor care cresc în monostrat).
|
Activare metabolică
|
14.
|
Recurgerea la un sistem endogen de activare metabolică este necesară în cazul utilizării de celule dotate cu o capacitate endogenă metabolică inadecvată. Sistemul utilizat cel mai frecvent și care este recomandat implicit, cu excepția cazului în care se justifică altfel, constă într-o fracție postmitocondrială îmbogățită cu un cofactor (S9) preparată din ficat provenit de la rozătoare (în general, șobolani) tratat cu agenți de inducție enzimatică, de exemplu Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) sau un amestec de fenobarbital și β-naftoflavonă (29) (30) (31) (32). Utilizarea celui din urmă amestec nu este contrară prevederilor Convenției de la Stockholm privind poluanții organici persistenți (33) și s-a dovedit a fi la fel de eficientă ca și Aroclor 1254 pentru inducția de oxidaze cu funcție mixtă (29) (31). Fracția S9 este utilizată în general cu o concentrație cuprinsă între 1-2 % (v/v), dar poate fi majorată la 10 % (v/v) în mediul de testare final. Alegerea tipului și concentrației sistemului exogen de activare metabolică sau inductorului metabolic utilizat poate fi influențată de clasa de substanțe chimice testate (34) (35) (36).
|
Prepararea substanței chimice de testat
|
15.
|
Substanțele chimice de testat în stare solidă ar trebui să fie preparate în solvenți adecvați și diluate, dacă este cazul, înainte de tratamentul aplicat celulelor (a se vedea punctul 16). Substanțele chimice de testat în stare lichidă pot fi adăugate direct în sistemul de testare și/sau diluate anterior tratamentului sistemului de testare. Gazele sau substanțele chimice de testat volatile necesită o modificare adecvată a protocoalelor standard, de exemplu utilizarea de vase de cultură închise ermetic (37) (38). Preparatele cu substanța chimică de testat ar trebui să fie realizate anterior tratamentului, cu excepția cazului în care există date care să demonstreze stabilitatea acestora în ceea ce privește acceptabilitatea condițiilor de stocare.
|
CONDIȚII DE TESTARE
Solvenți
|
16.
|
Solventul ar trebui ales pentru a optimiza solubilitatea substanțelor chimice de testat fără a afecta negativ desfășurarea testului, de exemplu, modificarea creșterii celulare, afectarea integrității substanței chimice de testat, reacția cu vasele de cultură, afectarea sistemului de activare metabolică. Se recomandă ca, în măsura în care este posibil, să se ia în considerare în primă instanță utilizarea unui solvent apos (sau a unui mediu de cultură). Solvenții bine stabiliți sunt, de exemplu, apa și dimetilsulfoxidul. În general, solvenții organici nu ar trebui să depășească 1 % (v/v) și solvenții apoși (soluție salină sau apă) nu ar trebui să depășească 10 % (v/v) în mediul final de tratament. În cazul în care solvenții utilizați nu sunt bine stabiliți (de exemplu, etanol sau acetonă), utilizarea acestora ar trebui să fie justificată prin date care să indice compatibilitatea acestora cu substanța chimică de testat și cu sistemul de testare, precum și absența genotoxicității la concentrația utilizată. În lipsa unor astfel de date justificative, este important să se includă martori netratați (a se vedea apendicele 1) pentru a demonstra că solventul ales nu induce efecte vătămătoare sau mutagene.
|
Măsurarea citotoxicității și alegerea concentrațiilor de expunere
|
17.
|
În momentul determinării celei mai mari concentrații a substanței chimice de testat, ar trebui să se evite concentrațiile susceptibile de a produce răspunsuri pozitive date de artefacte, cum ar fi cele care produc citotoxicitate excesivă (a se vedea punctul 20), precipitate în mediul de cultură (a se vedea punctul 21) sau modificări importante de pH sau osmolalitate (a se vedea punctul 5). În cazul în care substanța chimică de testat provoacă o modificare importantă a pH-ului mediului la momentul adăugării acesteia, pH-ul ar putea fi ajustat prin tamponarea mediului final de tratament astfel încât să se evite rezultate pozitive date de artefacte și să se mențină condiții de cultură corespunzătoare.
|
|
18.
|
Selecția concentrației este efectuată în funcție de citotoxicitate și pe baza altor considerente (a se vedea punctele 20-22). Chiar dacă evaluarea citotoxicității în cadrul unui test inițial poate fi utilă pentru o mai bună definire a concentrațiilor care urmează să fie utilizate în experimentul principal, efectuarea unui test inițial nu este obligatorie. Chiar dacă se realizează o evaluare inițială a citotoxicității, măsurarea citotoxicității pentru fiecare cultură este totuși necesară în cadrul experimentului principal. Citotoxicitatea ar trebui să fie evaluată cu ajutorul RS, și anume, eficacitatea clonării (EC) celulelor placate imediat după tratament, ajustată prin orice pierdere de celule în timpul tratamentului, pe baza numărului de celule, în comparație cu ajustarea eficacității clonării la martorii negativi (cărora li se atribuie o rată de supraviețuire de 100 %) (a se vedea apendicele 2 pentru formulă).
|
|
19.
|
Ar trebui să se evalueze cel puțin patru concentrații de testat (fără a include martorii cu solvent și cei pozitivi) care îndeplinesc criteriile de acceptabilitate (citotoxicitate adecvată, număr de celule etc.). Chiar dacă se recomandă utilizarea culturilor duplicat, se poate utiliza fie cultura duplicat, fie cultura tratată ca fiind unică în cadrul fiecărei concentrații testate. Rezultatele obținute în ceea ce privește culturile duplicate independente la o concentrație dată ar trebui să fie consemnate separat, însă pot fi grupate pentru analiza datelor (17). În cazul substanțelor chimice de testat cu citotoxicitate ușoară sau fără citotoxicitate, sunt adecvate, de regulă, intervale de concentrație de aproximativ 2 până la 3 ori mai mari. În prezența citotoxicității, concentrațiile de testat selectate ar trebui să acopere un interval de la concentrația care produce citotoxicitate până la concentrații la care există citotoxicitate moderată și ușoară sau la care nu există citotoxicitate. Multe substanțe chimice de testat prezintă curbe concentrație-răspuns cu pante abrupte, iar pentru a acoperi întregul interval de valori de citotoxicitate sau pentru a studia în detaliu relația concentrație-răspuns, ar putea fi necesară utilizarea concentrațiilor cu spațiu de separare redus și mai mult de patru concentrații, în special în situațiile în care este necesară repetarea experimentului (a se vedea punctul 43). Utilizarea a peste patru concentrații poate fi deosebit de importantă atunci când se utilizează culturi unice.
|
|
20.
|
În cazul în care concentrația maximă se bazează pe citotoxicitate, cea mai mare concentrație ar trebui să vizeze obținerea unei valori cuprinse între 20 și 10 % RS. Ar trebui să se acorde atenție atunci când se interpretează rezultate pozitive identificate doar la valori de până la 10 % RS (punctul 43).
|
|
21.
|
În cazul substanțelor chimice de testat cu solubilitate redusă care nu sunt citotoxice la concentrații mai mici decât concentrația minimă de insolubilitate, cea mai mare concentrație analizată produce o turbiditate sau un precipitat vizibil cu ochiul liber sau cu ajutorul unui microscop inversat la sfârșitul tratamentului cu substanța chimică de testat. Chiar dacă apare citototoxicitatea la un nivel peste concentrația minimă de insolubilitate, se recomandă testarea la o singură concentrație care produce turbiditate sau cu un precipitat vizibil deoarece pot rezulta efecte date de artefacte din precipitat. La concentrația care produce un precipitat, ar trebui să se acorde atenție pentru a se asigura faptul că precipitatul nu interferează cu desfășurarea testului. Ar putea fi utilă determinarea solubilității în mediul de cultură înainte de experiment.
|
|
22.
|
În cazul în care se constată inexistența precipitatului sau o citotoxicitate limitată, concentrația maximă de testare ar trebui să corespundă cu 10 mM, 2 mg/ml sau 2 μl/ml, fiind reținută cea mai mică valoare (39) (40). În cazul în care substanța chimică de testat nu are o compoziție definită, de exemplu, o substanță cu o compoziție necunoscută sau variabilă, produse cu reacție complexă sau materiale biologice [și anume, substanțele chimice cu o compoziție necunoscută sau variabilă (UVCB)] (41), extracte din mediu etc., este posibil să fie necesară o concentrație de vârf mai mare (de exemplu, 5 mg/ml), în absența citotoxicității suficiente, pentru a crește concentrația fiecăreia dintre componente. Cu toate acestea, ar trebui remarcat faptul că aceste cerințe pot fi diferite de cele pentru produsele farmaceutice umane (42).
|
Martori
|
23.
|
Pentru fiecare condiție experimentală ar trebui să se includă martori negativi testați concomitent (a se vedea punctul 16) constituiți doar dintr-un solvent în mediul de tratare și tratați în aceleași condiții precum culturile de tratare.
|
|
24.
|
Martorii pozitivi testați în paralel sunt necesari pentru a demonstra abilitatea laboratorului de a identifica substanțe mutagene în condițiile prevăzute în protocolul de testare utilizat și eficacitatea sistemului exogen de activare metabolică, după caz. Tabelul 1 de mai jos prezintă exemple de martori pozitivi. Pot fi utilizate substanțe martor pozitive alternative, dacă acest lucru este justificat. Întrucât testele in vitro pe celule de mamifere pentru toxicitate genetică sunt suficient de standardizate, pot fi efectuate teste folosind tratamente cu și fără activare metabolică exogenă, cu utilizarea unui singur martor pozitiv care necesită activare metabolică. În acest caz, acest răspuns al unicului martor pozitiv va demonstra atât activitatea sistemului de activare metabolică, cât și capacitatea de răspuns a sistemului de testare. Fiecare martor pozitiv ar trebui să fie utilizat la una sau mai multe concentrații prevăzute a genera creșteri reproductibile și detectabile față de cele de fond pentru a demonstra sensibilitatea sistemului de testare, iar răspunsul nu ar trebui să fie compromis de citotoxicitate care depășește limitele specificate în prezenta metodă de testare (a se vedea punctul 20).
|
Tabelul 1
Substanțe de referință recomandate pentru evaluarea competenței de laborator și pentru selectarea de martori pozitivi
|
Condiția activării metabolice
|
Locus
|
Substanța și nr. CAS
|
|
Absența activării metabolice exogene
|
Hprt
|
Metan-sulfonat de etil [CAS nr. 62-50-0] Etil nitrozouree [CAS nr. 759-73-9] 4-nitrochinolină 1-oxid [CAS nr. 56-57-5]
|
|
|
xprt
|
Streptonigrină [CAS nr. 3930-19-6] Mitomicină C [CAS nr. 50-07-7]
|
|
Prezența activării metabolice exogene
|
Hprt
|
3-metilcolantren [CAS nr. 56-49-5] 7,12-dimetilbenzantracen [CAS nr. 57-97-6] Benzopiren [CAS nr. 50-32-8]
|
|
|
xprt
|
Benzopiren [CAS nr. 50-32-8]
|
PROCEDURA
Tratamentul cu substanța chimică de testat
|
25.
|
Celulele în stadiu de proliferare se tratează cu substanța chimică de testat atât în prezența, cât și în absența unui sistem de activare metabolică. Timpul de expunere ar trebui să fie corespunzător (de obicei, un timp de 3 până la 6 ore este suficient).
|
|
26.
|
Numărul minim de celule utilizate pentru fiecare cultură de testare (martor și tratată) în fiecare etapă a testului ar trebui să depindă de frecvența celulelor mutante spontane. Orientarea generală este să se trateze și să se treacă suficiente celule pentru a menține 10 celule mutante spontane în fiecare cultură în toate etapele testului (17). Frecvența celulelor mutante spontane se situează, în general, între 5 și 20 × 10-6. Pentru o frecvență spontană a celulelor mutante de 5 × 10-6 și pentru a menține un număr suficient de celule mutante spontane (10 sau mai multe) chiar și pentru culturile tratate la concentrații care provoacă 90 % citotoxicitate în timpul tratamentului (10 % RS), ar fi necesar să se trateze cel puțin 20 × 106 celule. În plus, în perioada de manifestare, trebuie cultivate un număr suficient de celule (dar niciodată sub 2 milioane) care să fie placate pentru selecția celulelor mutante (17).
|
Timpul de expresie fenotipică și măsurarea frecvenței celulelor mutante
|
27.
|
După perioada de tratament, celulele sunt cultivate pentru a permite manifestarea fenotipului mutant. În general, minim 7-9 zile sunt suficiente pentru a permite manifestarea fenotipică aproape optimă a celulelor mutante nou induse Hprt și xprt (43) (44). În această perioadă, celulele sunt subcultivate în mod regulat pentru a le menține într-o creștere exponențială. După manifestarea fenotipică, celulele sunt replacate în mediu cu și fără agent selectiv (6-tioguanină) pentru determinarea numărului de celule mutante și, respectiv, a eficacității clonării la momentul selecției. Această placare se poate realiza prin utilizarea de plăcuțe pentru culturi monostrat sau de plăci cu micro-godeuri pentru celule în suspensie. Pentru selectarea celulelor mutante, celulele ar trebui să fie placate la o densitate pentru a asigura recuperarea optimă a respectivelor celule mutante (și anume, pentru a se evita cooperarea metabolică) (17). Plăcile sunt incubate pentru o perioadă adecvată de timp pentru creșterea optimă a coloniilor (de exemplu, 7-12 zile) și coloniile sunt numărate. Frecvența celulelor mutante se calculează pe baza numărului de colonii de mutanți, corectat prin eficacitatea clonării la momentul selecției celulelor mutante (a se vedea apendicele 2 pentru formule).
|
Competența de laborator
|
28.
|
Pentru a stabili o experiență suficientă în materie de testare înainte de utilizarea acestuia pentru efectuarea testelor de rutină, laboratorul ar trebui să fi efectuat o serie de experiențe cu substanțe pozitive de referință care acționează prin diferite mecanisme (cel puțin una cu și una fără activare metabolică, alese dintre substanțele enumerate în tabelul 1) și diferiți martori negativi (utilizând diferiți solvenți/diferite vehicule). Aceste răspunsuri ale martorilor pozitivi și negativi ar trebui să fie în concordanță cu referințele bibliografice. Acest lucru nu se aplică laboratoarelor care au experiență, și anume, celor care au o bază de date anterioară disponibilă, astfel cum este definit la punctele 30-33.
|
|
29.
|
În absența și în prezența activării metabolice ar trebui să se examineze o selecție de substanțe martor pozitive (a se vedea tabelul 1 de la punctul 25), pentru a demonstra capacitatea de a detecta substanțele chimice mutagene, pentru a determina eficacitatea sistemului de activare metabolică și pentru a demonstra caracterul adecvat al condițiilor de creștere a celulelor în timpul tratamentului, al manifestării fenotipice și al selecției celulelor mutante, precum și al procedurilor de punctare. Ar trebui să se aleagă o plajă de valori ale concentrațiilor substanțelor chimice selectate astfel încât să se obțină creșteri reproductibile și legate de concentrație peste nivelul de fond pentru a demonstra sensibilitatea și gama dinamică a sistemului de testare.
|
Date anterioare privind martorii testați
|
30.
|
Laboratorul ar trebui să stabilească:
|
—
|
o plajă de valori și o distribuție a martorilor pozitivi testați anterior,
|
|
—
|
o plajă de valori și o distribuție a martorilor negativi (netratați, solvenți) testați anterior.
|
|
|
31.
|
La obținerea primelor date pentru o distribuție a martorilor negativi testați anterior, martorii negativi testați în paralel ar trebui să fie în concordanță cu datele publicate referitoare la martori (22). Pe măsură ce se adaugă tot mai multe date experimentale la distribuția martorilor, martorii negativi testați în paralel ar trebui să fie, în mod ideal, în limitele de control de 95 % ale respectivei distribuții (17) (45) (46).
|
|
32.
|
Baza de date privind martori negativi testați anterior a laboratorului ar trebui să fie construită inițial cu cel puțin 10 experimente, dar ar fi de preferat să conțină cel puțin 20 de experimente efectuate în conformitate cu condiții experimentale comparabile. Laboratoarele ar trebui să utilizeze metode de control al calității precum grafice de control [de exemplu, diagrame C sau X (47)] pentru a identifica gradul de variabilitate al datelor privind martorii negativi și pozitivi ale acestora și pentru a dovedi faptul că metodologia se află „sub control” în cadrul respectivului laborator (46). Referințele bibliografice prezintă recomandări suplimentare privind modalitatea în care se pot construi și utiliza datele istorice (și anume, criteriile de includere și excludere a datelor în datele istorice și criteriile de acceptabilitate pentru un anumit experiment) (45).
|
|
33.
|
Datele privind martorii negativi ar trebui să constea în frecvențe ale celulelor mutante dintr-o cultură unică sau, de preferință, din culturi duplicate, astfel cum este descris la punctul 23. Martorii negativi testați în paralel trebuie să fie, în mod ideal, în limitele de control de 95 % ale distribuției bazelor de date privind martorii negativi testați anterior ale laboratorului (17) (45) (46). În cazul în care datele privind martorii negativi testați în paralel se situează în afara limitei de 95 % a martorilor, acestea pot fi acceptabile pentru a fi incluse în distribuția martorilor testați anterior, în măsura în care datele respective nu reprezintă valori aberante extreme și există dovezi că sistemul de testare se află „sub control” (a se vedea mai sus) și nu există nicio dovadă a unor erori tehnice sau umane.
|
|
34.
|
Orice modificare a protocolului experimental ar trebui să fie luată în considerare în ceea ce privește consecvența acesteia cu bazele de date privind martorii testați anterior existente ale laboratorului. Orice inconsecvență majoră ar trebui să conducă la stabilirea unei noi baze de date privind martorii testați anterior.
|
DATE ȘI RAPORTARE
Prezentarea rezultatelor
|
35.
|
Prezentarea rezultatelor ar trebui să includă toate datele necesare pentru calcularea citotoxicității (exprimată ca RS). Datele, atât pentru culturile tratate, cât și pentru cele martor, ar trebui să includă numărul de celule la sfârșitul tratamentului, numărul de celule placate imediat după tratament și numărul de colonii (sau numărul de godeuri fără colonii, în cazul metodei cu micro-godeuri). Valoarea RS pentru fiecare cultură ar trebui exprimată ca procent raportat la martorul tratat cu solvent testat în paralel (a se vedea apendicele 1 pentru definiții).
|
|
36.
|
Prezentarea rezultatelor ar trebui să includă, de asemenea, toate datele necesare pentru calcularea frecvenței celulelor mutante. Datele pentru culturile tratate și cele martor ar trebui să includă: (1) numărul de celule placate cu și fără agent selectiv (în momentul în care celulele sunt placate pentru selecția celulelor mutante) și (2) numărul coloniilor numărate (sau numărul de godeuri fără colonii, în cazul metodei cu micro-godeuri) din plăcile cu și fără agent selectiv. Frecvența celulelor mutante se calculează pe baza numărului de colonii de mutanți (pe plăci cu agent selectiv), corectat prin eficacitatea clonării (pe plăcile fără agent selectiv). Frecvența celulelor mutante ar trebui să fie exprimată ca fiind numărul de celule mutante pe milion de celule viabile (a se vedea apendicele 1 pentru definiții).
|
|
37.
|
Ar trebui să fie prezentate date pentru fiecare cultură în parte. În plus, toate datele ar trebui să fie sintetizate sub formă de tabel.
|
Criterii de acceptabilitate
|
38.
|
Acceptarea unui test se bazează pe următoarele criterii:
|
—
|
Martorul negativ testat în paralel este considerat acceptabil pentru a fi adăugat în baza de date privind martorii negativi testați anterior a laboratorului, astfel cum este descris la punctul 33.
|
|
—
|
Martorii pozitivi testați în paralel (a se vedea punctul 24) ar trebui să inducă răspunsuri compatibile cu cele provenite din baza de date privind martorii pozitivi testați anterior și să producă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel.
|
|
—
|
Două condiții experimentale (și anume, cu și fără activare metabolică) au fost testate, cu excepția cazului în care una a condus la rezultate pozitive (a se vedea punctul 25).
|
|
—
|
Se pot analiza un număr adecvat de celule și concentrații (punctele 25, 26 și 19).
|
|
—
|
Criteriile de selecție ale concentrației maxime sunt conforme cu cele descrise la punctele 20, 21 și 22.
|
|
Evaluarea și interpretarea rezultatelor
|
39.
|
Cu condiția ca toate criteriile de acceptabilitate să fie îndeplinite, o substanță chimică de testat este considerată a fi în mod clar pozitivă în cazul în care, în oricare dintre condițiile experimentale examinate:
|
—
|
cel puțin una dintre concentrațiile de testare prezintă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel,
|
|
—
|
atunci când este evaluată prin intermediul unui test de stabilire a tendinței corespunzător, creșterea depinde de concentrație,
|
|
—
|
Oricare dintre aceste rezultate se situează în afara distribuției de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limita de control de 95 % pe baza distribuției Poisson; a se vedea punctul 33).
|
La îndeplinirea tuturor acestor criterii, se consideră că substanța chimică de testat poate produce mutații ale genelor la celulele de mamifere în cultură în cadrul acestui sistem de testare. Referințele bibliografice prezintă recomandări pentru cele mai adecvate metode statistice (46) (48).
|
|
40.
|
Cu condiția ca toate criteriile de acceptabilitate să fie îndeplinite, o substanță chimică de testat este considerată în mod clar negativă dacă, în toate condițiile experimentale examinate:
|
—
|
niciuna dintre concentrațiile de testare nu prezintă o creștere semnificativă din punct de vedere statistic în comparație cu martorul negativ testat în paralel,
|
|
—
|
atunci când este evaluată prin intermediul unui test de stabilire a tendinței, nu se înregistrează nicio creștere legată de concentrație,
|
|
—
|
toate rezultatele se situează în interiorul distribuției de date cu privire la martorii negativi testați anterior (de exemplu, limita de control de 95 % pe baza distribuției Poisson; a se vedea punctul 33).
|
Atunci substanța chimică de testat este considerată a fi incapabilă de a provoca mutații ale genelor la celulele de mamifere în cultură în cadrul acestui sistem de testare.
|
|
41.
|
Nu există nicio cerință referitoare la verificarea unui răspuns clar pozitiv sau negativ.
|
|
42.
|
În cazul în care răspunsul nu este nici în mod clar negativ, nici în mod clar pozitiv, astfel cum este descris mai sus sau pentru a ajuta la stabilirea relevanței biologice a unui rezultat, datele ar trebui să fie evaluate de către experți și/sau prin intermediul unor investigații suplimentare. Ar putea fi util să se desfășoare un experiment repetat, eventual folosind condiții experimentale modificate [de exemplu, stabilirea unei distanțe între concentrații, alte condiții de activare metabolică (și anume, concentrația S9 sau originea S9)].
|
|
43.
|
În cazuri rare, chiar și după efectuarea de investigații suplimentare, setul de date va exclude posibilitatea stabilirii unei concluzii pentru rezultate pozitive sau negative. Prin urmare, răspunsul substanței chimice de testat ar trebui să fie concluzionat ca fiind echivoc (interpretat cu aceeași probabilitate de a fi pozitiv sau negativ).
|
Raportul testului
|
44.
|
Raportul testului ar trebui să includă următoarele informații:
|
|
Substanța chimică de testat:
|
—
|
sursa, numărul lotului, data limită de utilizare, dacă sunt disponibile;
|
|
—
|
stabilitatea substanței chimice de testat, dacă se cunoaște;
|
|
—
|
solubilitatea și stabilitatea substanței chimice de testat în solvent, dacă se cunosc;
|
|
—
|
măsurarea pH-ului, a osmolalității și a precipitatului în mediul de cultură în care s-a adăugat substanța chimică de testat, după caz.
|
|
|
|
Substanță mono-constituent:
|
—
|
aspectul fizic, solubilitatea în apă și alte proprietăți fizico-chimice relevante;
|
|
—
|
identificarea chimică, precum denumirea IUPAC sau CAS, numărul CAS sau codul său InChI, formula structurală, puritatea, identitatea chimică a impurităților după cum este necesar și fezabil din punct de vedere practic etc.
|
|
|
|
Substanță multicomponentă, UVCB și amestecuri:
|
—
|
în măsura în care este posibil, caracterizată prin identitatea chimică (a se vedea mai sus), apariția cantitativă și proprietățile fizico-chimice relevante ale componentelor.
|
|
|
|
Solvent:
|
—
|
justificarea alegerii solventului;
|
|
—
|
procentul de solvent în mediul final de cultură.
|
|
|
|
Pentru culturile principale din laborator:
|
—
|
tipul, sursa liniilor celulare;
|
|
—
|
numărul de treceri, dacă există, precum și istoricul în laborator;
|
|
—
|
caracteristicile cariotipului și/sau numărul modal de cromozomi;
|
|
—
|
metode de întreținere a culturilor de celule;
|
|
—
|
perioade de dublare a celulelor.
|
|
|
|
Condiții de testare:
|
—
|
justificarea selectării concentrațiilor și a numărului de culturi, inclusiv, de exemplu, datele de citotoxicitate și limitele de solubilitate;
|
|
—
|
compoziția mediilor de cultură, concentrația de CO2, nivelul de umiditate;
|
|
—
|
concentrația substanței chimice de testat, exprimată în concentrație finală în mediu de cultură (de exemplu, μg sau mg/ml sau mM din mediul de cultură);
|
|
—
|
concentrația (și/sau volumul) de solvent și substanță chimică de testat adăugate în mediul de cultură;
|
|
—
|
temperatura de incubare;
|
|
—
|
densitatea celulară în timpul tratamentului;
|
|
—
|
tipul și compoziția sistemului de activare metabolică (sursa fracției S9, metoda de preparare a amestecului S9, concentrația și volumul amestecului S9 și fracția S9 în mediul final de cultură, controalele de calitate ale fracției S9); substanțe martor pozitive și negative, concentrații finale pentru fiecare condiție de tratament;
|
|
—
|
timpul de manifestare (inclusiv numărul de celule însămânțate, subculturile și programele de alimentare, dacă este cazul);
|
|
—
|
identitatea agentului selectiv și a concentrației acestuia;
|
|
—
|
criteriile pentru acceptarea testelor;
|
|
—
|
metodele utilizate pentru numărarea celulelor viabile și mutante;
|
|
—
|
metodele utilizate pentru măsurarea citotoxicității;
|
|
—
|
orice alte informații suplimentare cu privire la citotoxicitate și metoda utilizată;
|
|
—
|
durata perioadelor de incubare după placare;
|
|
—
|
criteriile conform cărora un studiu poate fi considerat ca fiind pozitiv, negativ sau echivoc;
|
|
—
|
metode utilizate pentru a determina pH-ul, osmolalitatea și precipitarea.
|
|
|
|
Rezultate:
|
—
|
numărul de celule tratate și numărul de celule subcultivate pentru fiecare cultură;
|
|
—
|
măsurători ale citotoxicității și alte observații, dacă este cazul;
|
|
—
|
semne de precipitare și ora determinării;
|
|
—
|
numărul de celule placată în mediu selectiv și neselectiv;
|
|
—
|
numărul de colonii în mediul neselectiv și numărul de colonii rezistente în mediu selectiv și frecvențele celulelor mutante aferente;
|
|
—
|
relația concentrație-răspuns, dacă este posibil;
|
|
—
|
date (concentrație și solvenți) privind martorii negativi (solvent) și pozitivi testați în paralel;
|
|
—
|
datele anterioare privind martorii negativi (cu solvent) și cei pozitivi, cu intervale, valori medii și abateri standard, precum și intervale de încredere (de exemplu, 95 %) și numărul de date;
|
|
—
|
analize statistice (pentru culturi individuale și duplicate grupate, dacă este cazul) și valori p, dacă există.
|
|
|
REFERINȚE BIBLIOGRAFICE
|
(1)
|
OCDE (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, nr. 234, OCDE, Paris.
|
|
(2)
|
Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. și Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.
|
|
(3)
|
Chu E.H.Y. și Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.
|
|
(4)
|
Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. și Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.
|
|
(5)
|
Aaron C.S. și Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121-128.
|
|
(6)
|
Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. și Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239.
|
|
(7)
|
Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. și Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. Mutation Res., 196, 17-36.
|
|
(8)
|
Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. și Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.
|
|
(9)
|
Morita T., Nagaki T., Fukuda I. și Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.
|
|
(10)
|
Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.
|
|
(11)
|
Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. și Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.
|
|
(12)
|
Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. și Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.
|
|
(13)
|
Kirkland D., Aardema M., Henderson L. și Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.
|
|
(14)
|
Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O’Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. și Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.
|
|
(15)
|
Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.
|
|
(16)
|
Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. și Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.
|
|
(17)
|
Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. și Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 66-101.
|
|
(18)
|
Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P. și Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.
|
|
(19)
|
Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.
|
|
(20)
|
Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R. și Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.
|
|
(21)
|
Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M. și Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.
|
|
(22)
|
Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscript in preparation).
|
|
(23)
|
Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. și Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.
|
|
(24)
|
Rosen M.P., San R.H.C. și Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.
|
|
(25)
|
Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. și de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.
|
|
(26)
|
Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. și Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.
|
|
(27)
|
Ames B.N., McCann J. și Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
|
|
(28)
|
Maron D.M. și Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.
|
|
(29)
|
Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. și Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.
|
|
(30)
|
Matsushima T., Sawamura M., Hara K. și Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. și Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
|
|
(31)
|
Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. și Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.
|
|
(32)
|
Johnson T.E., Umbenhauer D.R. și Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.
|
|
(33)
|
UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, Programul Organizației Națiunilor Unite pentru Mediu (UNEP). Publicație disponibilă la adresa: [http://www.pops.int.html].
|
|
(34)
|
Tan E.-L. și Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.
|
|
(35)
|
O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.
|
|
(36)
|
Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.
|
|
(37)
|
Krahn D.F., Barsky F.C. și McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.
|
|
(38)
|
Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. și Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.
|
|
(39)
|
OCDE (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Orientările nr. 473, 476 și 487 privind testarea). Disponibil, la cerere, la Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică.
|
|
(40)
|
Brookmire L., Chen J.J. și Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.
|
|
(41)
|
EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,
|
|
(42)
|
USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Publicație disponibilă la adresa: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].
|
|
(43)
|
O’Neill J.P. și Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.
|
|
(44)
|
Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L. și Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.
|
|
(45)
|
Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J. și Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.
|
|
(46)
|
OCDE (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental Health and Safety, Series on Testing and Assessment, (nr. 199), Organizația pentru Cooperare și Dezvoltare Economică, Paris.
|
|
(47)
|
Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O.și Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
|
|
(48)
|
Fleiss J. L., Levin B. și Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, a treia ediție, New York: John Wiley & Sons.
|
Apendicele 1
DEFINIȚII
Mutageni care provoacă substituția perechilor de bază: Substanțe chimice care cauzează substituția perechilor de bază în ADN.
Substanță chimică: O substanță sau un amestec.
Eficacitatea clonării: Procentul de celule placate la o densitate scăzută, care pot crește într-o colonie care poate fi numărată.
Concentrații: se referă la concentrații finale ale substanței chimice de testat în mediul de cultură.
Citotoxicitate: Pentru testele incluse în prezenta metodă de testare, citotoxicitatea este identificată ca fiind o reducere a supraviețuirii relative a celulelor tratate în comparație cu martorul negativ (a se vedea punctul specific).
Mutație directă: o mutație a genelor de la forma parentală la forma mutantă care generează o modificare sau o pierdere a activității enzimatice sau a funcției proteinei codificate.
Mutageni de decalare a cadrului de citire: substanțe chimice care provoacă adăugarea sau ștergerea uneia sau a mai multor perechi de bază din molecula de ADN.
Genotoxic: termen general cuprinzând toate tipurile de leziuni ale ADN-ului sau ale cromozomilor, inclusiv ruperi ale ADN-ului, aducții, rearanjări, mutații, aberații cromozomiale și aneuploidie. Nu toate tipurile de efecte genotoxice au drept rezultat mutații sau leziuni cromozomiale stabile.
Mediul HAT: Mediu care conține hipoxantină, aminopterină și timidină, utilizate pentru curățarea celulelor mutante Hprt.
Recombinare mitotică: În timpul mitozei, recombinarea între cromatide omoloage, ceea ce ar putea conduce la inducerea unor rupturi duble ale șirului ADN sau la pierderea heterozigozității.
Mediul MPA: Mediu care conține xantină, adenină, timidină, aminopterină și acid micofenolic utilizat pentru curățarea genelor mutante Xprt.
Mutagen: produce o modificare ereditară a uneia sau mai multor secvențe de perechi de bază de ADN la gene sau a structurii cromozomilor (aberații cromozomiale).
Frecvența mutanților (FM): numărul de colonii de celule mutante observate împărțit la numărul de celule placate într-un mediu selectiv, corectat pentru eficacitatea (sau viabilitatea) clonării la momentul selecției.
Timpul de expresie fenotipică: Timpul după tratament, în care modificarea genetică se fixează în interiorul genomului și orice produse genetice preexistente sunt epuizate până la modificarea trăsăturii fenotipice.
Supraviețuire relativă (RS): RS este utilizat ca indicator al citotoxicității legate de tratament. RS constituie eficacitatea clonării (EC) celulelor placate imediat după tratament, ajustată prin orice pierdere de celule în timpul tratamentului, în comparație cu eficacitatea clonării la martorii negativi (se atribuie o rată de supraviețuire de 100 %).
Fracția S9 a ficatului: supernatant din ficat omogenizat după centrifugare la 9 000 g, și anume extract din ficat crud.
Amestec S9: amestecul dintre fracția S9 a ficatului și cofactorii necesari pentru activitatea metalică a enzimelor.
Martor tratat cu solvent: Termen general pentru a defini culturile martor care primesc doar solventul, care este utilizat pentru a dizolva substanța chimică de testat.
Substanța chimică de testat: orice substanță sau amestec testat utilizând prezenta metodă de testare.
Martor netratat: culturi care nu beneficiază de niciun tratament (și anume, nici substanță chimică de testat, nici solvent), dar care sunt prelucrate în mod simultan și în același mod precum culturile care primesc substanța chimică de testat.
UVCB: substanțe chimice cu o compoziție necunoscută sau variabilă, produși de reacție complexă și materiale biologice
Apendicele 2
FORMULE PENTRU EVALUAREA CITOTOXICITĂȚII ȘI A FRECVENȚEI GENELOR MUTANTE
Citotoxicitatea este evaluată prin supraviețuirea relativă, și anume, eficacitatea clonării (EC) celulelor placate imediat după tratament, ajustată prin orice pierdere de celule în timpul tratamentului, în comparație cu eficacitatea ajustată a clonării la martorii negativi (se atribuie o rată de supraviețuire de 100 %) (a se vedea formula RS de mai jos).
EC ajustată pentru o cultură tratată printr-o substanță chimică de testat se calculează ca:
RS ajustată pentru o cultură tratată cu o substanță chimică de testat se calculează după cum urmează:
Frecvența genelor mutante reprezintă eficacitatea clonării coloniilor de gene mutante în mediu selectiv împărțită la eficacitatea clonării în mediu neselectiv, măsurată pentru aceeași cultură la momentul selecției.
În cazul în care se utilizează plăci pentru eficacitatea clonării:
|
EC = Număr de colonii/Număr de celule placate.
|
Atunci când se utilizează plăci cu micro-godeuri pentru eficacitatea clonării:
|
Numărul de colonii per godeu pe plăcile cu micro-godeuri respectă o distribuție Poisson.
|
|
Eficacitatea clonării = -LnP (0)/Numărul celulelor placate per godeu
|
|
Unde -LnP(0) este numărul probabil de godeuri goale dintre godeurile însămânțate și este descris prin următoarea formulă
|
|
LnP(0) = -Ln (număr de godeuri goale/numărul de godeuri placate)
|
” |
In force
