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Document 32019R1390

Regulamento (UE) 2019/1390 da Comissão, de 31 de julho de 2019, que altera, tendo em vista a adaptação ao progresso técnico, o anexo do Regulamento (CE) n.o 440/2008 que estabelece métodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH) (Texto relevante para efeitos do EEE)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

PT

Jornal Oficial da União Europeia

L 247/1


REGULAMENTO (UE) 2019/1390 DA COMISSÃO

de 31 de julho de 2019

que altera, tendo em vista a adaptação ao progresso técnico, o anexo do Regulamento (CE) n.o 440/2008 que estabelece métodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH)

(Texto relevante para efeitos do EEE)

A COMISSÃO EUROPEIA,

Tendo em conta o Tratado sobre o Funcionamento da União Europeia,

Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 18 de dezembro de 2006, relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH), que cria a Agência Europeia dos Produtos Químicos, que altera a Diretiva 1999/45/CE e revoga o Regulamento (CEE) n.o 793/93 do Conselho e o Regulamento (CE) n.o 1488/94 da Comissão, bem como a Diretiva 76/769/CEE do Conselho e as Diretivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comissão (1), nomeadamente o artigo 13.o, n.o 2,

Considerando o seguinte:

(1)

O Regulamento (CE) n.o 440/2008 da Comissão (2) estabelece os métodos de ensaio a aplicar para os fins do Regulamento (CE) n.o 1907/2006 com vista à determinação das propriedades físico-químicas, da toxicidade e da ecotoxicidade dos produtos químicos.

(2)

A Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Económicos (OCDE) elabora orientações harmonizadas e acordadas a nível internacional para o ensaio de produtos químicos para fins regulamentares. A OCDE adota regularmente orientações de ensaio novas e revistas, atendendo aos progressos científicos no domínio em causa.

(3)

A fim de ter em conta o progresso técnico e, sempre que possível, reduzir o número de animais utilizados para fins experimentais, em conformidade com o artigo 13.o, n.o 2, do Regulamento (CE) n.o 1907/2006, importa, após a adoção das respetivas diretrizes de ensaio da OCDE, estabelecer dois novos métodos de ensaio para avaliação da ecotoxicidade e nove novos métodos de ensaio para determinação da toxicidade para a saúde humana, bem como atualizar sete métodos de ensaio. Onze desses métodos dizem respeito a ensaios in vitro de irritação ou corrosão cutânea e ocular, sensibilização cutânea, genotoxicidade e efeitos endocrinológicos. As partes interessadas foram consultadas sobre a proposta de alteração.

(4)

O Regulamento (CE) n.o 440/2008 deve, portanto, ser alterado em conformidade.

(5)

As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do comité instituído pelo artigo 133.o do Regulamento (CE) n.o 1907/2006,

ADOTOU O PRESENTE REGULAMENTO:

Artigo 1.o

O anexo do Regulamento (CE) n.o 440/2008 é alterado em conformidade com o anexo do presente regulamento.

Artigo 2.o

O presente regulamento entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e diretamente aplicável em todos os Estados-Membros.

Feito em Bruxelas, em 31 de julho de 2019.

Pela Comissão

O Presidente

Jean-Claude JUNCKER


(1)  JO L 396 de 30.12.2006, p. 1.

(2)  Regulamento (CE) n.o 440/2008 da Comissão, de 30 de maio de 2008, que estabelece métodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) n.o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH) (JO L 142 de 31.5.2008, p. 1).


ANEXO

O anexo do Regulamento (CE) n.o 440/2008 é alterado do seguinte modo:

(1)

na parte B, o capítulo B.4 passa a ter a seguinte redação:

«B.4   TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICA

INTRODUÇÃO

1.

O presente método de ensaio é equivalente à Test Guideline 404 (2015) da OCDE. As diretrizes da OCDE para o ensaio de produtos químicos são revistas periodicamente, de modo a assegurar que refletem os melhores dados científicos disponíveis. Na revisão da Test Guideline 404 da OCDE, foi prestada particular atenção a possíveis melhorias no que respeita ao bem-estar dos animais e à avaliação de todas as informações existentes sobre o produto químico em estudo, a fim de evitar ensaios desnecessários em animais de laboratório. A versão atualizada da Test Guideline 404 da OCDE (originalmente adotada em 1981 e revista em 1992, 2002 e 2015) inclui uma referência ao documento de orientação sobre as abordagens integradas de ensaio e avaliação para irritação/corrosão dérmicas (1), propondo uma abordagem modular aplicável à irritação cutânea e à corrosão cutânea. A IATA descreve vários módulos que agrupam fontes de informação e ferramentas de análise; além disso: i) fornece orientações sobre como integrar e utilizar os ensaios existentes e os dados não provenientes de ensaios para a avaliação dos potenciais de irritação cutânea e de corrosão cutânea dos produtos químicos e ii) propõe uma abordagem quando há necessidade de ensaios complementares (1). Quando for apropriado, recomenda-se a aplicação sucessiva (não simultânea) dos três pensos de ensaio ao animal no ensaio in vivo inicial.

2.

As definições de irritação e corrosão dérmica são estabelecidas no apêndice do presente método de ensaio.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

3.

Tendo em conta o interesse científico e o bem-estar dos animais, não devem ser efetuados ensaios in vivo até se proceder a uma avaliação de todos os dados disponíveis relevantes para a potencial corrosibilidade/irritabilidade dérmica do produto químico numa análise de ponderação da suficiência da prova, conforme apresentado no Documento de Orientação sobre Abordagens Integradas de Ensaio e Avaliação da Corrosão e Irritação Dérmicas, ou seja, as três partes desta orientação e os módulos correspondentes (1). Sucintamente, na parte 1, os dados existentes são tratados em sete módulos que abrangem dados humanos, dados in vivo, dados in vitro, dados sobre as propriedades físico-químicas (por exemplo, pH, nomeadamente uma forte acidez ou alcalinidade) e métodos sem ensaios. Na parte 2, é efetuada a análise de ponderação da suficiência da prova. Se esta análise de ponderação da suficiência da prova ainda for inconclusiva, deve passar-se à parte 3, com ensaios adicionais, começando com métodos in vitro, sendo os ensaios in vivo o último recurso. Esta análise deve, pois, reduzir a necessidade de ensaios in vivo para a corrosão/irritação dérmica dos produtos químicos em estudo para os quais já existam dados suficientes provenientes de outros estudos em relação a estes dois fatores.

PRINCÍPIO DO ENSAIO IN VIVO

4.

O produto químico em estudo é aplicado em dose única na pele de um animal de experiência; as áreas de pele não tratadas do animal de experiência são utilizadas como controlo. O grau de irritação/corrosão é observado e registado em intervalos determinados e detalhadamente descrito de modo a permitir uma avaliação completa dos efeitos. A duração do estudo deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos observados.

5.

Os animais que apresentem sinais de sofrimento e/ou dor intensos durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e o produto químico em estudo deve ser classificado de acordo com estas observações. Os critérios para a decisão de abater animais moribundos e animais em grave sofrimento são objeto de um documento de orientação específico (2).

PREPARAÇÃO DO ENSAIO IN VIVO

Seleção de espécies animais

6.

O coelho albino é o animal de laboratório mais adequado, devendo ser usados coelhos jovens adultos saudáveis. A utilização de outras espécies deve ser justificada.

Preparação dos animais

7.

Aproximadamente 24 horas antes do ensaio, o pelo deve ser removido por corte curto na área dorsal do tronco dos animais. Deve ter-se o cuidado de não ferir a pele do animal e só devem ser usados animais com pele saudável e intacta.

8.

Algumas estirpes de coelhos têm tufos densos de pelo, que são mais proeminentes em certas épocas do ano. Estas áreas de crescimento denso de pelo não devem ser utilizadas como local de ensaio.

Condições de alojamento e de alimentação

9.

Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotério para os coelhos deve ser de 20 °C (±3 °C). Embora a humidade relativa deva ser de pelo menos 30 % e de preferência não exceder os 70 %, exceto durante o período de limpezas, o valor pretendido deve ser de 50 %-60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de obscuridade. Na alimentação, podem ser utilizadas dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem restrições.

PROCEDIMENTO DE ENSAIO

Aplicação do produto químico em estudo

10.

O produto químico em estudo deve ser aplicado numa pequena área de pele (aproximadamente 6 cm2) e coberta com um penso de gaze, colado com fita adesiva não irritante. Nos casos em que não é possível aplicação direta (por exemplo, líquidos e algumas pastas), o produto químico em estudo deve ser aplicada num penso de gaze, que é, por sua vez, aplicado a pele. Durante o período de exposição, o penso deve estar em contacto com a pele de uma forma ligeiramente solta através de uma ligadura semioclusiva adequada. Se o produto químico em estudo for aplicado num penso, este deve ser mantido sobre a pele de modo a assegurar um bom contacto e uma distribuição uniforme da substância na pele. Deve ser evitado o acesso do animal ao penso e a ingestão ou inalação do produto químico em estudo.

11.

Os produtos químicos em estudo líquidos são geralmente utilizados sem diluição. Quando se ensaiam sólidos (que podem ser pulverizados, caso tal seja considerado necessário), o produto químico em estudo deve ser humedecido com a menor quantidade de água (ou, se necessário, com outro excipiente adequado) suficiente para assegurar um bom contacto com a pele. No caso de serem utilizados excipientes que não água, a influência potencial do excipiente na irritação da pele pela substância de ensaio deve ser mínima ou nula.

12.

No final do período de exposição, que é normalmente de quatro horas, o produto químico em estudo residual deve ser removido, caso tal seja praticável, utilizando água ou um solvente apropriado, que não altere a resposta ou a integridade da epiderme.

Nível de dosagem

13.

Aplica-se ao local de ensaio uma dose de 0,5 ml de líquido ou de 0,5 g de sólido ou pasta.

Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritação/corrosão dérmica utilizando um animal)

14.

No caso de um produto químico em estudo ter sido considerado corrosivo, irritante ou não classificado com base numa análise de ponderação da suficiência da prova ou em ensaios in vitro anteriores, não são, em princípio, necessários ensaios in vivo adicionais. No entanto, nos casos em que se considere necessária a obtenção de dados adicionais, o ensaio in vivo é realizado inicialmente utilizando a seguinte metodologia: aplicação sequencial de, no máximo, três pensos de ensaio ao animal. O primeiro penso é removido após três minutos. Caso não se observe qualquer reação grave na pele, aplica-se um segundo penso num local diferente, que é removido ao fim de uma hora. Se nesta etapa as observações indicarem que se pode aumentar o tempo de exposição para quatro horas em condições não agressivas para o animal, aplica-se um terceiro penso, que é removido após quatro horas, sendo a resposta devidamente graduada.

15.

Caso seja observado um efeito corrosivo após qualquer das três exposições sequenciais, o ensaio é imediatamente finalizado. Caso não se observe qualquer efeito corrosivo após a remoção do último penso, o animal é observado durante 14 dias, exceto se se observar corrosão antes do final desse período.

16.

Nos casos em que o produto químico em estudo não seja suscetível de provocar corrosão, mas possa ser irritante, deve ser aplicado um único penso a um animal durante quatro horas.

Ensaio de confirmação (ensaio in vivo de irritação dérmica com animais adicionais)

17.

Se não for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a resposta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando até dois animais adicionais, cada um com um penso e por um período de exposição de quatro horas. Se for observado um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmação pode ser efetuado de uma forma sequencial ou através da exposição simultânea de dois animais adicionais. No caso excecional de não ser efetuado um ensaio inicial, podem tratar-se dois ou três animais com um penso único, que é removido quatro horas após a aplicação. No caso serem utilizados dois animais e ambos apresentarem a mesma resposta, não é necessário efetuar mais ensaios. Caso contrário, o terceiro animal é igualmente sujeito a ensaio. Pode ser necessária a utilização de animais adicionais para confirmar respostas equívocas.

Período de observação

18.

O período de observação deve ser suficiente para uma avaliação completa da reversibilidade dos efeitos observados. No entanto, a experiência deve ser interrompida em qualquer altura caso o animal apresente sinais continuados de dor ou sofrimento intensos. Para a determinação da reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser observados durante 14 dias após a remoção dos pensos. No caso de se observar reversibilidade antes do final do período de 14 dias, deve interromper-se a experiência.

Observações clínicas e graduação das reações da pele

19.

Todos os animais devem ser examinados para sinais de eritema e edema, sendo as respostas avaliadas 60 minutos e 24, 48 e 72 horas após a remoção do penso. No ensaio inicial com um animal, o local de ensaio é igualmente examinado imediatamente após a remoção do penso. As reações dérmicas são graduadas e registadas de acordo com a graduação da tabela infra. Caso ocorram danos na pele que não possam ser identificados como irritação ou corrosão após 72 horas, pode ser necessário efetuar observações até ao dia 14 para determinar a reversibilidade dos efeitos. Além da observação de irritação, todos os efeitos tóxicos locais, tais como perda de gordura cutânea e quaisquer efeitos sistémicos nocivos (por exemplo, efeitos em sintomas de toxicidade e efeitos no peso corporal), devem ser descritos e registados pormenorizadamente. Poderá ser efetuado um exame histopatológico para clarificar respostas equívocas.

20.

A graduação das respostas dérmicas é necessariamente subjetiva. Para se promover a harmonização da graduação da resposta dérmica e auxiliar os laboratórios de ensaio e as pessoas envolvidas na obtenção e interpretação das observações, o pessoal que executa as observações deve receber formação adequada sobre o sistema de graduação utilizado (ver tabela infra). Poderá ser útil a consulta de um guia ilustrado para graduação da irritação dérmica e de outras lesões (3).

DADOS E RELATÓRIOS

21.

Os resultados do estudo devem ser resumidos sob a forma de tabela no relatório final de ensaio e devem abranger todos os aspetos descritos no ponto 24.

Avaliação dos resultados

22.

Os resultados de irritação dérmica devem ser avaliados conjuntamente com a natureza e a gravidade das lesões e a sua reversibilidade ou ausência de reversibilidade. As respostas individuais não representam um padrão absoluto das propriedades irritantes de um material, já que são também avaliados outros efeitos do material de ensaio. Pelo contrário, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referência, que necessitam de ser avaliados conjuntamente com todas as outras observações efetuadas durante o estudo.

23.

Deve-se ter em conta a reversibilidade das lesões dérmicas na avaliação da resposta irritante. Nos casos em que ocorram respostas como alopecia (área limitada), hiperqueratose, hiperplasia e descamação persistentes no final do período de 14 dias de observação, o produto químico em estudo deve ser considerada irritante.

Relatório de ensaio

24.

O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:

 

Fundamentação lógica do ensaio in vivo

análise de ponderação da suficiência da prova relativa aos dados de ensaio preexistentes, incluindo os resultados da estratégia de ensaio sequencial;

descrição dos dados relevantes disponíveis de ensaios anteriores;

dados obtidos em cada etapa da estratégia de ensaio;

descrição dos ensaios in vitro efetuados, incluindo informações sobre o protocolo, resultados obtidos com substâncias de ensaio/referência;

análise de ponderação da suficiência da prova para a realização do estudo in vivo.

 

Produto químico em estudo

substância monocomponente: dados de identificação química, como as denominações IUPAC ou CAS, número CAS, código SMILES ou InChI, fórmula estrutural, pureza, identidade química das impurezas, caso se justifique e seja exequível, etc.;

substância multicomponentes, mistura e substâncias de composição desconhecida ou variável, produtos de reação complexos ou materiais biológicos (UVCB): caracterização, tanto quanto possível, por identidade química (ver supra), ocorrência quantitativa e principais propriedades físico-químicas dos componentes;

aspeto físico, solubilidade em água e ouras propriedades físico-químicas pertinentes;

proveniência, número do lote, se disponíveis;

tratamento do produto químico em estudo/substância de controlo antes do ensaio, se for o caso;

estabilidade do produto químico em estudo, data-limite de utilização ou data de reanálise, se conhecidas;

condições de armazenagem.

 

Veículo

identificação, concentração (se pertinente), volume utilizado;

justificação do excipiente escolhido.

 

Animais de ensaio

espécie/estirpe utilizada, justificação da eventual utilização de outros animais que não coelhos albinos;

número de animais de cada sexo;

peso de cada animal no início e no final do ensaio;

idade no início do estudo;

origem dos animais, condições de alojamento, dieta, etc.

 

Condições de realização do ensaio

pormenores relativos à preparação da zona de ensaio;

pormenores relativos aos materiais e técnicas de apósito utilizadas;

descrição pormenorizada da preparação, aplicação e remoção do produto químico em estudo.

 

Resultados

tabelas com a classificação das respostas de irritação/corrosão para cada animal em cada observação;

descrição de todas as lesões observadas;

descrição pormenorizada da natureza e grau da irritação ou corrosão observada e de quaisquer observações histopatológicas;

descrição de quaisquer outros efeitos nocivos locais (por exemplo, perda de gordura cutânea) e efeitos sistémicos, além da irritação ou corrosão dérmica.

 

Discussão dos resultados

 

Conclusões

BIBLIOGRAFIA

(1)

OCDE (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (N.o 203), Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Económicos, Paris.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organistion for Economic Cooperation and Development, Paris.

Quadro

Graduação de Reações dérmicas

Ausência de eritema…

0

Eritema muito ligeiro (fracamente discernível)…

1

Eritema bem definido…

2

Eritema moderado a grave…

3

Eritema grave (vermelhidão cor de carne) e formação de escara que impede a graduação do eritema…

4

Máximo possível: 4

Número de edemas…

0

Edema muito ligeiro (fracamente discernível)…

1

Edema ligeiro (bordos da área bem definida por elevação delineada)…

2

Edema moderado (com uma elevação de aproximadamente 1 mm…

3

Edema grave (com uma elevação superior a 1 mm e excedendo a área de exposição)…

4

Máximo possível: 4

Poderá ser efetuado um exame histopatológico para clarificar respostas equívocas.

Apêndice

DEFINIÇÕES

Produto químico: uma substância ou mistura.

Irritação dérmica: consiste na produção de danos reversíveis na pele após a aplicação do produto químico em estudo, por um período não superior a quatro horas.

Corrosão dérmica: consiste na produção de danos irreversíveis na pele, nomeadamente necrose visível através da epiderme e que atinge a derme, após a aplicação do produto químico em estudo por um período não superior a quatro horas. São exemplos típicos de reações corrosivas as úlceras, hemorragias e escaras sanguinolentas e, perto do final do período de observação de 14 dias, a descoloração, devido à perda de pigmentação da pele, a formação de zonas de alopecia total e a ocorrência de cicatrizes. As lesões duvidosas poderão ser esclarecidas por métodos histopatológicos.

Produto químico em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.

»

(2)

na parte B, o capítulo B.17 passa a ter a seguinte redação:

«B.17   ENSAIO IN VITRO DE MUTAÇÃO GÉNICA EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS UTILIZANDO OS GENES HPRT E XPRT

INTRODUÇÃO

1.

O presente método de ensaio é equivalente à Test Guideline 476 (2016) da OCDE. Os métodos de ensaio são revistos periodicamente à luz do progresso científico, das necessidades normativas em evolução e de considerações de bem-estar animal. A presente versão revista do método de ensaio B.17 reflete quase trinta anos de experiência com este ensaio e resulta também do desenvolvimento de um novo método distinto consagrado a ensaios de mutação génica em células de mamíferos in vitro utilizando o gene da timidina-cinase. O método B.17 faz parte de uma série de métodos de ensaio no domínio da toxicologia genética. Está disponível um documento da OCDE que fornece informações sucintas sobre ensaios de toxicologia genética e resume as alterações recentemente introduzidas nas orientações da OCDE neste domínio (1).

2.

O objetivo do ensaio de mutação génica em células de mamíferos in vitro consiste em detetar mutações génicas induzidas por produtos químicos. As linhas celulares utilizadas nestes ensaios apresentam mutações em genes repórteres, nomeadamente o gene endógeno da hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (Hprt em células de roedores, HPRT em células humanas; coletivamente designados como «gene Hprt» e «ensaio HPRT» no presente método de ensaio) e o transgene da xantina-guanina-fosforribosil-transferase (xprt ou gpt) (referido como «ensaio de XPRT»). Os ensaios de mutação HPRT e XPRT detetam diferentes gamas de ocorrências genéticas. Além dos eventos de mutação detetados pelo ensaio HPRT (por exemplo, substituição de um par de bases, deslocação do quadro de leitura, pequenas supressões e inserções), a localização autossómica do transgene gpt pode permitir a deteção de mutações decorrentes de grandes supressões e possivelmente a recombinação mitótica não detetada pelo ensaio HPRT porque o gene Hprt está localizado no cromossoma X (2) (3) (4) (5) (6) (7). Atualmente, o ensaio XPRT é menos utilizado do que o ensaio HPRT para fins normativos.

3.

As definições utilizadas constam do apêndice 1.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES

4.

Os ensaios realizados in vitro exigem geralmente a utilização de uma fonte exógena de ativação metabólica. O sistema exógeno de ativação metabólica não reproduz inteiramente as condições in vivo.

5.

Deve ter-se o cuidado de evitar condições que conduzam a resultados falsos positivos (ou seja, a possível interação com o sistema de ensaio) não causados pela interação direta entre o produto químico em estudo e o material genético da célula; tais condições incluem variações do pH ou da pressão osmótica (8) (9) (10), interação com os componentes médios (11) (12) ou níveis excessivos de citotoxicidade (13). No ensaio HPRT, é considerada excessiva a citotoxicidade que exceda os níveis de citotoxicidade máxima recomendados, estabelecidos no ponto 19.

6.

Antes da aplicação do método de ensaio a uma mistura para obter dados com fins normativos, importa ponderar se – e, em caso afirmativo, por que motivo – o método pode proporcionar resultados adequados para o efeito. Tais considerações não são necessárias se houver um requisito normativo para o ensaio da mistura.

PRINCÍPIO DO ENSAIO

7.

As células mutantes com deficiências na atividade enzimática de Hprt no ensaio HPRT ou na atividade enzimática xprt no ensaio XPRT são resistentes aos efeitos citostáticos da 6-tioguanina (TG), análoga da purina. As células que dispõem de Hprt (no ensaio HPRT) ou de Gpt (no ensaio VPRT) são sensíveis à TG, que causa inibição do metabolismo celular e impede a divisão da célula. Logo, as células mutantes podem proliferar na presença de TG, o que não acontece com as células normais, que contêm a enzima Hprt (no ensaio HPRT) ou Gpt (no ensaio XPRT).

8.

As células em suspensão ou em cultura em monocamada são expostas ao produto químico em estudo, tanto na presença como na ausência de uma fonte exógena de ativação metabólica, (ver ponto 14) por um período apropriado (3-6 horas), sendo depois cultivadas para determinar a citotoxidade e para permitir a expressão fenotípica antes da seleção do mutante (14) (15) (16) (17). A citotoxicidade é determinada pela sobrevivência relativa (SR), ou seja, a eficiência de clonagem medida imediatamente após o tratamento e ajustada por qualquer perda de células durante o tratamento, em comparação com o controlo negativo (ponto 18 e apêndice 2). As culturas tratadas são mantidas no meio de cultura durante um período suficiente, que varia em função do tipo de célula, a fim de permitir a expressão fenotípica tão boa quanto possível das mutações induzidas (normalmente um mínimo de 7-9 dias). Após a expressão fenotípica, a frequência de mutação é determinada mediante a inoculação de um número conhecido de células num meio que contenha o agente seletivo, para a deteção de colónias mutantes, e num meio sem agente seletivo, para determinar as respetivas eficiências de clonagem (viabilidade). Após um período de incubação apropriado, as colónias são contadas. A frequência de mutação é calculada com base no número de colónias mutantes corrigido pela eficiência de clonagem no momento da seleção de mutantes.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Preparações

Células

9.

Os tipos de células utilizados nos ensaios HPRT e XPRT devem ter uma sensibilidade demonstrada aos mutagéneos químicos, uma elevada eficiência de clonagem, um cariótipo estável e uma frequência de mutação espontânea estável. As células mais frequentemente utilizadas para o ensaio HPRT incluem as linhas CHO, CHL e V79 de células de hámsteres chineses, as células L5178Y do linfoma do rato e as células linfoblastóides humanas TK6 (18) (19). As células AS52 derivadas de CHO contendo o transgene gpt (e com o gene Hprt suprimido) são utilizadas para o ensaio XPRT (20) (21); o ensaio HPRT não pode ser realizado em células AS52 porque o gene Hprt foi suprimido. A utilização de outras linhas celulares deve ser justificada e validada.

10.

As linhas celulares devem ser periodicamente verificadas quanto à estabilidade do número modal de cromossomas e à ausência de contaminação por micoplasmas (22) (23), não devendo ser utilizadas se se verificar que foram contaminadas ou que o número modal de cromossomas se alterou. A duração normal do ciclo celular das células utilizadas no laboratório de ensaio deve ser conhecida e compatível com as características celulares publicadas. Deve também ser verificada a frequência de mutação espontânea no banco de células principal, que não deve ser utilizado se a frequência de mutação não for aceitável.

11.

Antes da realização no presente ensaio, as culturas poderão ter de ser limpas de células mutantes eventualmente presentes, por exemplo, através de culturas em meio HAT, para o ensaio HPRT, e MPA, para o ensaio de XPRT (5) (24) (ver apêndice 1). As células limpas podem ser criopreservadas e descongeladas para utilização em trabalhos ulteriores. O material recém-descongelado pode ser utilizado para o ensaio, após o tempo de duplicação normal. Ao realizar o ensaio XPRT, a cultura de rotina de células AS52 deve ser feita em condições que garantam a manutenção do transgene gpt (20).

Meios e condições de cultura

12.

Devem manter-se as culturas em meios de cultura e condições de incubação adequados (tipo de recipiente, atmosfera humidificada com uma concentração de CO2 de 5 % e temperatura de incubação de 37 °C). As culturas de células devem ser sempre mantidas em condições que assegurem o seu crescimento exponencial. É particularmente importante que sejam escolhidos meios e condições de cultura que garantam um crescimento ótimo das células durante o período de expressão e uma elevada eficiência de clonagem tanto para células mutantes como não mutantes.

Preparação das culturas

13.

As linhas celulares são propagadas a partir de culturas de arranque, inoculadas no meio de cultura a uma densidade tal que as células em suspensão ou em monocamadas continuem a crescer exponencialmente durante o período de tratamento e de expressão (deve evitar-se, p. ex., a confluência no caso do crescimento de células em monocamadas).

Ativação metabólica

14.

Se forem utilizadas células com capacidade metabólica endógena inadequada, será necessário utilizar sistemas metabolizantes exógenos. O sistema mais geralmente utilizado e que se recomenda por defeito, salvo motivo em contrário, é uma fração pós-mitocondrial reforçada com co-fator (S9) preparada a partir de fígados de roedores (em geral, ratazanas) tratados com agentes de indução enzimática, como, por exemplo, Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) ou uma mistura de fenobarbital e β-naftoflavona (29) (30) (31) (32). Esta última combinação não é contrária à Convenção de Estocolmo sobre Poluentes Orgânicos Persistentes (33) e relevou-se tão eficaz na indução de oxidases de função mista como o Aroclor 1254 (29) (31). A fração S9 é habitualmente utilizada em concentrações na gama de 1 % a 2 % (v/v), mas pode ser aumentada para 10 % (v/v) no meio de ensaio final. A classe de substâncias em estudo pode influenciar a escolha do tipo e da concentração do sistema de ativação metabólica exógeno ou do indutor metabólico utilizado (34)(35)(36).

Preparação do produto químico em estudo

15.

Os produtos químicos sólidos em estudo devem ser adicionados a solventes adequados e, se necessário, ser diluídos antes do tratamento das células (ver ponto 16). Os produtos químicos líquidos em estudo podem ser adicionados diretamente ao sistema de ensaio e/ou ser diluídos antes de serem utilizados no tratamento do sistema de ensaio. Para o ensaio de produtos químicos gasosos ou voláteis, devem efetuar-se alterações adequadas aos protocolos normalizados, como o tratamento em recipientes de cultura fechados (37) (38). A preparação do produto químico em estudo deve ocorrer imediatamente antes do tratamento, a menos que dados de estabilidade demonstrem que o produto pode ser armazenado.

CONDIÇÕES DE ENSAIO

Solventes

16.

O solvente deve ser escolhido de modo a otimizar a solubilidade dos produtos químicos em estudo sem afetar negativamente a realização do ensaio, por exemplo, alterando o crescimento celular, afetando a integridade do produto químico em estudo, reagindo com os recipientes de cultura ou alterando o sistema de ativação metabólica. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de um solvente (ou meio de cultura) aquoso. A água e o dimetilsulfóxido, por exemplo, são solventes cujo desempenho é bem conhecido. Em geral, os solventes orgânicos não devem exceder 1 % (v/v) e os solventes aquosos (soluções salinas ou água) não devem exceder 10 % (v/v) no meio de tratamento final. Se forem utilizados solventes cujo desempenho não é bem conhecido (p. ex., etanol ou acetona), devem fornecer-se dados que comprovem a respetiva compatibilidade com os produtos químicos em estudo e com o sistema de ensaio e a inexistência de genotoxicidade à concentração utilizada. Na ausência de dados comprovativos, é importante incluir amostras de controlo não tratadas (ver apêndice 1) para demonstrar que o solvente escolhido não tem efeitos deletérios ou clastogénicos.

Medição da citotoxicidade e escolha das concentrações de tratamento

17.

Ao determinar a concentração máxima a ensaiar do produto químico em estudo, devem evitar-se concentrações capazes de gerar respostas positivas falsas, como as que produzam citotoxicidade excessiva (ver ponto 20), precipitações no meio de cultura (ver ponto 21) ou alterações pronunciadas do pH ou da pressão osmótica (ver ponto 5). Se, ao ser adicionado, o produto químico em estudo causar uma alteração pronunciada do pH do meio, o pH pode ser ajustado por tamponamento do meio de tratamento final, de modo a evitar falsos resultados positivos e manter condições de cultura adequadas.

18.

A seleção da concentração baseia-se na citotoxicidade e noutras considerações (ver pontos 20-22). Embora a avaliação da citotoxicidade num ensaio inicial possa ser útil para definir melhor as concentrações a utilizar no ensaio principal, não é necessária. Mesmo no caso de se realizar uma avaliação inicial da citotoxicidade, a determinação da citotoxicidade em cada cultura continua a ser necessária no ensaio principal. A citotoxidade deve ser avaliada com recurso à RS, ou seja, à eficiência de clonagem (CE) das células, imediatamente após o tratamento, ajustada por qualquer perda de células durante o tratamento, com base na contagem celular, em comparação com a eficiência ajustada de clonagem em controlos negativos (taxa de sobrevivência de 100 %) (ver a fórmula no apêndice 2).

19.

Devem ser avaliadas, pelo menos, quatro concentrações de ensaio (não incluindo as amostras de controlo positivo nem as amostras de controlo do solvente) que cumpram os critérios de aceitabilidade (citotoxicidade adequada, número de células, etc.). Embora seja aconselhável a utilização de culturas replicadas, as culturas únicas são igualmente aceitáveis em todas as concentrações a ensaiar. Os resultados obtidos com as culturas replicadas independentes, a uma dada concentração, devem ser registados separadamente, mas podem ser agrupados para fins de análise de dados (17). No caso dos produtos químicos que demonstrem pouca ou nenhuma citotoxicidade, são normalmente adequadas concentrações espaçadas por um fator de 2 a 3. Quando se observa citotoxicidade, as concentrações escolhidas devem abranger uma gama com início na concentração que produz citotoxicidade e inclua as concentrações às quais se observa pouca ou nenhuma citotoxicidade. Muitos produtos químicos em estudo apresentam curvas concentração-resposta com declive acentuado, pelo que, para obter dados sobre toda a gama de citotoxicidade ou para analisar em pormenor a relação concentração-resposta, pode ser necessário recorrer a concentrações menos espaçadas e a mais de quatro concentrações, em especial nas situações em que for necessário repetir o ensaio (ver ponto 43). A utilização de mais de quatro concentrações pode ser particularmente importante quando se utilizam culturas únicas.

20.

Se a concentração máxima se basear na citotoxicidade, a concentração mais elevada deverá atingir um valor entre 20 % e 10 % RS. Deve ser-se cauteloso na interpretação de resultados positivos que se obtêm apenas a 10 % ou menos (ver ponto 43).

21.

No caso de produtos químicos pouco solúveis não-citotóxicos a concentrações inferiores à concentração insolúvel mínima, a maior concentração analisada deve gerar, no final do tratamento com o produto químico em estudo, turbidez ou um precipitado visível a olho nu ou com auxílio de um microscópio invertido. Mesmo no caso de se observar citotoxicidade acima da menor concentração insolúvel, é conveniente ensaiar uma única concentração que produza turbidez ou um precipitado visível, devido aos efeitos falsos que possam ser induzidos pelo precipitado. À concentração que produz um precipitado, deve assegurar-se que este não interfere com a realização do ensaio. Neste contexto, pode ser útil determinar a solubilidade no meio de cultura antes do ensaio.

22.

Se não se observar precipitação nem citotoxicidade condicionante, a maior concentração ensaiada deve corresponder à menor das seguintes concentrações: 10 mM, 2 mg/ml ou 2 μl/ml (39) (40). Se o produto químico em estudo não for de composição definida – caso, p. ex., de uma substância de composição desconhecida ou variável, de produtos de reação complexos ou de materiais biológicos (UVCB) (41), de extratos ambientais, etc. –, a concentração de topo poderá ter de ser mais elevada (p. ex., 5 mg/ml) na ausência de citotoxicidade suficiente, para aumentar a concentração de cada um dos componentes. Importa, contudo, notar que estes requisitos podem diferir no caso de medicamentos para uso humano (42).

Controlos

23.

Para cada uma das condições experimentais, devem também realizar-se controlos negativos paralelos (ver ponto 16), em que as células são expostas apenas ao solvente e ao meio de tratamento, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal.

24.

São necessários controlos positivos para demonstrar a capacidade do laboratório para identificar mutagénios nas condições do protocolo de ensaio, bem como a eficácia do sistema exógeno de ativação metabólica, se pertinente. O quadro 1 apresenta exemplos de produtos químicos de controlo positivo. Se tal se justificar, podem utilizar-se outras substâncias de controlo positivo. Dado que os ensaios de toxicidade genética in vitro em células de mamíferos estão suficientemente normalizados, podem realizar-se ensaios que utilizem tratamentos com ou sem ativação metabólica exógena utilizando apenas um controlo positivo que necessite de ativação metabólica. Neste caso, a resposta de controlo positivo única demonstrará a atividade do sistema de ativação metabólica e a capacidade de resposta do sistema de ensaio. Cada controlo positivo deve ser utilizado numa ou mais das concentrações a que se prevê um aumento detetável e reprodutível relativamente à base, a fim de demonstrar a sensibilidade do sistema de ensaio e a resposta não deve ser comprometida por uma concentração de citotoxicidade superior aos limites especificados no presente método de ensaio (ver ponto 20).

Quadro 1

Substâncias de referência recomendadas para a avaliação da competência do laboratório e para a seleção dos controlos positivos

Condição de ativação metabólica

Locus

Substância e n.o CAS

Ausência de ativação metabólica exógena

Hprt

Metanossulfonato de etilo [n.o CAS 62-50-0] Etilnitrosureia [n.o CAS 759-73-9] 1-Óxido de 4-nitroquinolina [número CAS 56-57-5]

 

xprt

Estreptonigrina (n.o CAS 3930-19-6) Mitomicina C [n.o CAS 50-07-7]

Presença de ativação metabólica exógena

Hprt

3-Metilcolantreno [n.o CAS 56-49-5] 7,12-Dimetilbenzantraceno [n.oCAS 57-97-6] Benzo[a]pireno [n.o CAS 50-32-8]

 

xprt

Benzo[a]pireno [n.o CAS 50-32-8]

PROCEDIMENTO

Tratamento com o produto químico em estudo

25.

As células em proliferação são expostas ao produto químico em estudo na presença e na ausência de um sistema de ativação metabólica. A exposição deve ter uma duração adequada (normalmente, é adequada uma duração de 3 a 6 horas).

26.

O número mínimo de células utilizado para cada cultura de ensaio (controlada e tratada), em cada fase do ensaio, deve basear-se na frequência de mutação espontânea. Uma orientação geral consiste em tratar e transferir células suficientes para manter 10 mutantes espontâneas em todas as culturas em todas as fases do ensaio (17). A frequência de mutação espontânea é, em geral, entre 5 e 20 × 10-6. Para uma frequência de mutação espontânea de 5 × 10-6 e para manter um número suficiente de mutantes espontâneos (10 ou mais), mesmo para culturas expostas a concentrações que provoquem 90 % de citotoxicidade durante o tratamento (10 % RS), será necessário tratar, pelo menos, 20 × 106 células. Além disso, deve ser cultivado um número suficiente de células (nunca inferior a 2 milhões) durante o período de expressão e incubadas em placas para seleção de mutantes (17).

Período de expressão fenotípica e medição da frequência de mutação

27.

Após o período de exposição, as células são cultivadas para permitir a expressão fenotípica das mutações. Regra geral, um mínimo de 7 a 9 dias é suficiente para permitir a expressão fenotípica quase ótima dos mutantes Hprt e xprt recentemente induzidos (43) (44). Durante este período, as células são regularmente subcultivadas, a fim de serem mantidas em crescimento exponencial. Após a expressão fenotípica, as células são incubadas em placas em meio com e sem agente seletivo (6-tioguanina) para determinação do número de mutações e da eficiência de clonagem no momento da seleção, respetivamente. Esta incubação em placas pode ser realizada usando pratos para monocamada ou placas de microcamada para células em suspensão. Para a seleção de mutantes, as células devem ser incubadas em placas a uma densidade que garanta uma taxa de mutação ótima (ou seja, que evite a cooperação metabólica) (17). As placas são incubadas durante um período adequado para potenciar o crescimento das colónias (por exemplo, 7-12 dias) e são contadas. A frequência de mutação é calculada com base no número de colónias mutantes corrigido pela eficiência de clonagem no momento da seleção de mutantes (ver fórmulas no apêndice 2).

Competência técnica do laboratório

28.

A fim de comprovar que possui experiência suficiente na realização do ensaio antes de passar a utilizar este método em ensaios de rotina, o laboratório deve ter efetuado uma série de experiências com substâncias de referência positivas que ajam por diferentes mecanismos (pelo menos uma ativa com e outra ativa sem ativação metabólica, sendo as substâncias correspondentes selecionadas da lista constante do quadro 1), bem como várias amostras de controlo negativas (utilizando vários solventes/excipientes). As respostas observadas às amostras de controlo positivas e negativas devem ser corroboradas por referências bibliográficas. Este requisito não é aplicável a laboratórios com experiência, isto é, que disponham de uma base de dados históricos como se refere nos pontos 30 a 33.

29.

Deve ser investigada uma seleção de substâncias de controlo positivo (ver quadro 1 do ponto 25), com e sem ativação metabólica, a fim de demonstrar a sua competência na deteção de produtos químicos mutagénicos, para determinar a eficácia do sistema de ativação metabólica e demonstrar a adequação das condições de crescimento das células durante o tratamento, da expressão fenotípica, da seleção de mutantes e dos métodos de contagem. A gama de concentrações das substâncias selecionadas deve ser escolhida de forma a proporcionar aumentos reprodutíveis e dependentes da concentração, relativamente ao nível de fundo, que permitam demonstrar a sensibilidade e a gama dinâmica do sistema de ensaio.

Dados históricos de controlo

30.

O laboratório deve elaborar:

um historial da gama e da distribuição dos controlos positivos;

um historial da gama e da distribuição dos controlos negativos (amostras não tratadas, solvente).

31.

Ao obter os primeiros dados para um historial de distribuição dos controlos negativos, os controlos negativos em paralelo devem ser coerentes com os dados de controlo publicados, caso existam (22). À medida que forem sendo adicionados mais dados experimentais à distribuição dos controlos, os controlos negativos em paralelo devem, de preferência, situar-se dentro dos limites de controlo de 95 % daquela distribuição (17) (45) (46).

32.

A base de dados históricos de controlo negativo deve ser inicialmente constituída por um mínimo de 10 experiências, embora de preferência, seja constituída por, pelo menos, 20 experiências efetuadas em condições experimentais comparáveis. Os laboratórios devem utilizar métodos de controlo de qualidade, como gráficos de controlo – por exemplo, gráficos C ou gráficos de barras (47) –, para identificar a variabilidade dos seus dados de controlo positivo e de controlo negativo e demonstrar que o laboratório domina a metodologia (46). Encontram-se na bibliografia (45) outras recomendações sobre a forma de obter e utilizar os dados históricos (critérios de inclusão e exclusão de dados em séries históricas e critérios de aceitação para um determinado ensaio).

33.

Os dados de controlo negativo devem consistir em frequências mutantes em culturas únicas ou, de preferência, replicadas, conforme descrito no ponto 23. Os controlos negativos realizados em paralelo devem, idealmente, situar-se dentro dos limites de 95 % dos controlos da distribuição da base de dados históricos de controlo negativo do laboratório (17) (45) (46). Os dados do controlo negativo realizado em paralelo que se situem fora dos limites de controlo de 95 % são aceitáveis para inclusão no historial de distribuição de controlo se não forem valores extremos e ainda se houver indícios de que o sistema de ensaio está «sob controlo» (ver supra) e não houver indícios da existência de erros humanos ou técnicos.

34.

Quaisquer alterações do protocolo experimental devem ser ponderadas em função da sua coerência com as bases de dados históricos de controlo do laboratório. As incoerências de monta devem conduzir à constituição de uma nova base de dados históricos de controlo.

DADOS E RELATÓRIOS

Apresentação dos resultados

35.

A apresentação dos resultados deve incluir todos os dados necessários para calcular a citotoxicidade (expressa em RS). Os dados, tanto para as culturas tratadas como para as de controlo, devem incluir o número de células no final da exposição, o número de células incubadas em placas imediatamente após o tratamento e o número de contagens de colónias (ou número de poços sem colónias, para o método micropoços). A RS para cada cultura deve ser expressa em percentagem em relação à amostra de controlo do solvente ensaiada em paralelo (ver definições no apêndice 1).

36.

A apresentação dos resultados deve incluir também todos os dados necessários para calcular a frequência de mutação. Os dados das culturas tratadas e das culturas de controlo devem incluir: (1) o número de células incubadas em placas com e sem agente seletivo (no momento em que as células são colocadas em placas para seleção mutante) e (2) o número de colónias contadas (ou o número de poços sem colónias sem colónias no método de micropoços) nas placas, com e sem agente seletivo. A frequência de mutação é calculada com base no número de colónias mutantes (em placas com agente seletivo) corrigido pela eficiência de clonagem (a partir das placas sem agente seletivo). A frequência de mutação deve ser expressa em número de células mutantes por milhão de células viáveis (ver definições no apêndice 1).

37.

Devem ser fornecidos dados individuais das culturas. Os dados devem ser fornecidos por cultura e resumidos em quadros.

Critérios de aceitabilidade

38.

A aceitação do ensaio baseia-se nos seguintes critérios:

Um controlo negativo realizado em paralelo é considerado aceitável para inclusão na base de dados históricos de controlo negativo do laboratório, nos termos descritos no ponto 33.

As amostras de controlo positivo (ver ponto 24) devem induzir respostas compatíveis com as incluídas na base de dados históricos de controlo positivo e produzir um aumento estatisticamente significativo relativamente ao controlo negativo em paralelo.

Foram ensaiadas duas condições experimentais (com e sem ativação metabólica), a menos que tenha sido possível obter resultados positivos numa (ver ponto 25).

É analisável um número adequado de células e concentrações (pontos 25, 26 e 19).

Os critérios para a seleção da concentração de topo são coerentes com os descritos nos pontos 20, 21 e 22.

Avaliação e interpretação dos resultados

39.

Se forem cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente positivo se, em qualquer das condições experimentais examinadas:

pelo menos uma das concentrações de ensaio apresentar um aumento estatisticamente significativo em relação ao controlo negativo,

o aumento, avaliado com base numa análise de tendências adequada, for dependente da concentração,

nenhum dos resultados estiver fora da distribuição dos dados históricos de controlo negativo (p. ex., limites de controlo de 95 % com base numa distribuição de Poisson; ver ponto 33).

Se todos estes critérios estiverem preenchidos, o produto químico em estudo é considerado passível de induzir mutações génicas em células de mamífero cultivadas no presente sistema de ensaio. As referências bibliográficas (46) (48) contêm recomendações sobre os métodos estatísticos mais adequados.

40.

Se forem cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente negativo se, em todas as condições experimentais examinadas:

nenhuma das concentrações de ensaio apresentar um aumento estatisticamente significativo em relação ao controlo negativo paralelo,

não se observar qualquer aumento dependente da concentração, numa avaliação feita com base numa análise de tendências adequada;

todos os resultados se situarem dentro da distribuição dos dados históricos de controlo negativo (p. ex., limites de controlo de 95 % com base numa distribuição de Poisson; ver ponto 33).

Nesse caso, o produto químico em estudo não é considerado passível de induzir mutações génicas em culturas de células de mamíferos neste sistema de ensaio.

41.

Não há qualquer exigência concreta para a verificação de uma resposta inequivocamente positiva ou negativa.

42.

No caso de a resposta não ser inequivocamente positiva ou negativa como atrás descrito, ou para estabelecer a importância biológica do resultado, os dados devem ser avaliados por peritos e/ou numa investigação complementar. Pode ser útil um ensaio de repetição, eventualmente com alteração das condições experimentais (intervalo diferente entre as concentrações ou outras condições de ativação metabólica — p. ex., concentração ou origem do S9).

43.

Em casos raros, mesmo após estudos complementares, os dados obtidos não permitirão concluir por um resultado positivo ou negativo. Assim, deve concluir-se que a resposta do produto químico em estudo é ambígua (interpretada como igualmente suscetível de ser positiva ou negativa).

Relatório de ensaio

44.

O relatório de ensaio deve conter as seguintes informações:

 

Produto químico em estudo

origem, número de lote e data-limite de utilização, se conhecidos;

estabilidade, se conhecida;

solubilidade e estabilidade no solvente, se conhecidas;

medição do pH, da pressão osmótica e da quantidade de precipitado no meio de cultura ao qual foi adicionado o produto químico em estudo, consoante o que for adequado.

 

Substância monocomponente

aspeto físico, hidrossolubilidade e outras propriedades físico-químicas pertinentes;

dados de identificação química, como as denominações IUPAC ou CAS, número CAS, código SMILES ou InChI, fórmula estrutural, pureza, identidade química de impurezas, caso se justifique e seja exequível, etc.

 

Substância multicomponentes, UVCB e misturas

 

caracterizada, na medida do possível, pela identidade química (ver acima), pela ocorrência quantitativa e pelas propriedades físico-químicas dos componentes.

 

Solvente

justificação da escolha;

percentagem no meio de cultura final.

 

Células

 

Para as culturas principais de laboratório:

tipo e fonte das linhas celulares;

número de passagens, se disponível, e histórico no laboratório;

características do cariótipo e/ou número modal de cromossomas.

métodos de manutenção das culturas celulares;

ausência de micoplasma;

tempo de duplicação celular.

 

Condições de realização do ensaio

justificação para a seleção das concentrações e do número de culturas, incluindo, por exemplo, dados sobre a citotoxicidade e sobre as limitações de solubilidade;

composição dos meios, concentração de CO2, nível de humidade;

concentração do produto químico em estudo, expressa em concentração final no meio de cultura (p. ex., μg ou mg/ml ou mM do meio de cultura);

concentração (e/ou volume) de solvente e de produto químico em estudo adicionado ao meio de cultura;

temperatura de incubação;

tempo de incubação;

duração do tratamento;

densidade celular durante a exposição;

tipo e composição do sistema de ativação metabólica (fonte de S9, método de preparação da mistura de S9, concentração ou volume da mistura de S9 e de S9 no meio de cultura final, controlos de qualidade do S9); substâncias de controlo positivo e negativo, concentrações finais para cada condição de tratamento;

duração do período de expressão (incluindo o número de células inoculadas e os calendários de subcultura e de alimentação, quando aplicável),

identidade do agente seletivo e respetiva concentração;

critérios de aceitabilidade dos ensaios;

métodos utilizados para a enumeração dos números de células mutantes e viáveis,

métodos de medição da citotoxicidade;

outros dados pertinentes relativos à citotoxicidade e ao método utilizado;

duração dos períodos de incubação após a colocação em placas;

critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou não conclusivo;

métodos utilizados para determinar o pH, a pressão osmótica e a precipitação.

 

Resultados

número de células expostas e número de células subcultivadas para cada cultura;

medições de citotoxicidade e outras observações, se for caso disso;

sinais de precipitação e instante da determinação;

número de células colocadas em placas em meio seletivo e não seletivo;

número de colónias em meio não seletivo, número de colónias resistentes em meio seletivo e frequências de mutação conexas;

relação concentração-resposta, quando for possível determiná-la;

dados (concentrações e solventes) relativos às amostras de controlo negativo (solvente) e de controlo positivo, ensaiadas em paralelo;

dados históricos relativos aos controlos positivos e negativos (solvente), com as respetivas gamas, valor médio e desvio-padrão e intervalo de confiança (por exemplo, 95 %), bem como o número de dados;

análises estatísticas (para culturas individuais e replicados agrupados, se for caso disso) e valores p, caso existam.

 

Discussão dos resultados.

 

Conclusão

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

(1)

OCDE (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. and Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)

Chu E.H.Y. and Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 61, 1306-1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. and Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5)

Aaron C.S. and Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. Mutation Res.,223, 121-128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. and Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res.,312, 235-239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. and Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17-36.

(8)

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. and Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. and Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. and Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. and Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L., and Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. and Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. and Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)

Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. and Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. and Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., and Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., and Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., and Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Manuscrito em preparação).

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. and Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. and Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. and de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. and Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)

Ames B.N., McCann J. and Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)

Maron D.M. and Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. and Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. and Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. and Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. and Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32)

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. and Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33)

UNEP. (2001). Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Disponível em: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. and Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)

O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)

Krahn D.F., Barsky F.C. and McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103.

(38)

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. and Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.

(39)

OCDE (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Disponível a pedido da Organização de Cooperação e de Desenvolvimento Económicos.

(40)

Brookmire L., Chen J.J. and Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Disponível em:[https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. and Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., e Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., and Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

(46)

OCDE (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., and Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B., and Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

Apêndice 1

DEFINIÇÕES

Amostra de controlo do solvente: termo geral que define as culturas de controlo tratadas apenas com o solvente utilizado para dissolver o produto químico em estudo.

Amostra de controlo não tratada: cultura não sujeita a qualquer tratamento (com o produto químico em estudo ou solvente), mas processada simultaneamente e do mesmo modo que as culturas tratadas com o produto químico em estudo.

Citotoxicidade: para efeitos dos ensaios abrangidos pelo presente método de ensaio, a citotoxicidade é definida como uma redução da sobrevivência relativa das células expostas comparativamente com o controlo negativo (ver ponto específico).

Concentrações: refere-se às concentrações finais do produto químico em estudo no meio de cultura.

Eficiência de clonagem: a percentagem de células incubadas em placas em baixa densidade que consegue originar uma colónia que pode ser contada.

Fração S9 de fígado: sobrenadante após centrifugação do homogeneizado hepático a 9 000 g (extrato hepático em bruto).

Frequência de mutação (MF): número de colónias mutantes observadas dividido pelo número de células incubadas em placas em meio seletivo, corrigido pela eficiência de clonagem (ou viabilidade) no momento da seleção.

Genotóxico: termo geral que abrange todos os tipos de danos ao ADN ou aos cromossomas, incluindo quebra do ADN, aduções, rearranjos, mutações, aberrações cromossomáticas e aneuploidia. Nem todos os tipos de efeitos genotóxicos originam mutações ou danos cromossómicos estáveis.

Meio HAT: meio que contém hipoxantina, aminopterina e timidina, utilizado para limpeza de mutantes Hprt.

Meio MPA: meio que contém xantina, adenina, timidina, aminopterina e ácido microfenólico, utilizado para limpeza de mutantes xprt.

Mistura S9: mistura de fração S9 de fígado e dos cofatores necessários à atividade enzimática metabólica.

Mutação para diante: mutação genética do tipo parental para a forma mutante que causa uma alteração ou perda de atividade enzimática da função da proteína codificada.

Mutagéneos por deslocação do quadro de leitura: produtos químicos que causam a adição ou supressão de um par de bases ou de uma sequência de pares de bases do ADN.

Mutagéneos por substituição de um par de bases: produtos químicos que causam a substituição de pares de bases do ADN.

Mutagénico: que produz uma alteração hereditária de sequências de pares de bases do ADN em genes ou da estrutura dos cromossomas (aberrações cromossómicas).

Período de expressão fenotípica: o período após o tratamento durante o qual a modificação genética é fixada no genoma e os produtos dos genes inalterados se esgotam ao ponto de alterar o caráter fenotípico.

Produto químicouma substância ou mistura.Sobrevivência relativa (SR): a SR é utilizada para medir a citotoxicidade relacionada com a exposição. a SR é a eficiência de clonagem (CE) de células incubada em placas imediatamente após a exposição, ajustada por qualquer perda de células durante a exposição, em comparação com a eficiência de clonagem em controlos negativos (com uma taxa de sobrevivência de 100 %).

Produto químico em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.

Recombinação mitótica: durante a mitose, a recombinação entre cromatídeos homólogos, eventualmente resultante na indução de quebras em cadeias duplas do ADN ou numa perda de heterozigotia.

UVCB: substâncias químicas de composição desconhecida ou variável, produtos de reação complexos e materiais biológicos.

Apêndice 2

FÓRMULAS PARA A AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE E DA FREQUÊNCIA DE MUTAÇÃO

A citotoxicidade é avaliada pela sobrevivência relativa, ou seja pela eficiência de clonagem (CE) de células incubada em placas imediatamente após a exposição, ajustada por qualquer perda de células durante a exposição, em comparação com a eficiência de clonagem ajustada em controlos negativos (com uma taxa de sobrevivência de 100 %) (ver fórmula RS infra).

A CE ajustada para uma cultura tratada pelo produto químico em estudo é calculada do seguinte modo:

Formula

Para uma cultura tratada pelo produto químico em estudo, a RS é calculada do seguinte modo:

Formula

A frequência de mutação é a eficiência de clonagem de colónias mutantes num meio seletivo dividida pela eficiência de clonagem num meio não seletivo medido para a mesma cultura no momento da seleção.

Formula

Se forem utilizadas placas para a eficiência de clonagem:

CE = número de colónias/número de células incubadas em placas.

Quando forem utilizadas placas de micropoços para a eficiência de clonagem:

O número de colónias por poço nas placas de micropoços segue uma distribuição de Poisson.

Eficiência de clonagem = -LnP(0) / número de células incubadas por poço

Em que -LnP(0) é o número provável de poços vazios de entre os poços inoculados e é descrito pela seguinte fórmula:

LNP (0) = -Ln (número de poços vazios/número de poços inoculados).

»

(3)

Na parte B, o capítulo B.22 passa a ter a seguinte redação:

«B.22   ENSAIO DE LETALIDADE DOMINANTE NO ROEDOR

INTRODUÇÃO

1.

O presente método de ensaio é equivalente à Test Guideline (TG) 478 (2016) da OCDE. Os métodos de ensaio são revistos periodicamente à luz do progresso científico, das necessidades normativas em evolução e de considerações de bem-estar animal. A presente versão alterada do método de ensaio reflete mais de trinta anos de experiência com este ensaio e o potencial de integração ou de combinação deste ensaio com outros ensaios de toxicidade, como estudos de desenvolvimento, toxicidade reprodutiva ou genotoxicidade; no entanto, devido às suas limitações e à utilização de um grande número de animais, este ensaio não deve ser utilizado como método principal, mas sim como um método de ensaio suplementar, que apenas pode ser utilizado quando não houver alternativa para as exigências normativas. A combinação de ensaios de toxicidade pode poupar um grande número de animais de serem utilizados em ensaios de toxicidade. Está disponível um documento da OCDE que fornece informações sucintas sobre ensaios de toxicologia genética e resume as alterações recentemente introduzidas nas orientações da OCDE neste domínio (1).

2.

O objetivo do ensaio de letalidade dominante (DL) consiste em verificar se os produtos químicos produzem mutações resultantes de aberrações cromossómicas nas células germinais. Além disso, o ensaio de letalidade dominante tem importância para a avaliação da genotoxicidade, porquanto, embora possam variar consoante as espécies, os fatores do metabolismo in vivo, da farmacocinética e dos processos de reparação do ADN estão ativos e contribuem para a resposta. A indução de uma mutação de DL após exposição ao produto químico em estudo indica que o produto químico afetou o tecido germinal do animal de ensaio.

3.

As mutações de DL provocam a morte do embrião ou do feto. A indução da mutação do DL após exposição ao produto químico em estudo indica que o produto químico afetou as células germinais do animal de ensaio.

4.

Um ensaio de DL é útil para confirmar os resultados positivos de ensaios com parâmetros somáticos in vivo e constitui um parâmetro relevante para a previsão do perigo/risco para o ser humano de doenças genéticas transmitidas através da linha germinal. Contudo, este ensaio requer um grande número de animais e muita mão de obra; por isso, é muito oneroso e demorado. Dado que a frequência espontânea das mutações letais dominantes é bastante elevada, a sensibilidade do ensaio para deteção de ligeiros aumentos da frequência das mutações é geralmente limitada.

5.

Os termos-chave são definidos no apêndice 1.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

6.

O presente ensaio utiliza, normalmente, ratos (2) (3) (4), mas, em alguns casos, podem ser adequadas outras espécies, como as ratazanas (5) (6) (7) (8), mediante justificação científica. De modo geral, as DL são resultado de aberrações cromossómicas graves (anomalias estruturais e numéricas) (9) (10) (11), mas não podem ser excluídas as mutações génicas. Uma mutação de DL é uma mutação que ocorre numa célula germinal per se ou, após a fertilização, nas primeiras fases do desenvolvimento embrionário, não causa lesões no gâmeta, mas é letal para o ovo fecundado ou para o embrião em desenvolvimento.

7.

Cada macho é acasalado sequencialmente com fêmeas virgens a intervalos adequados. O número de acasalamentos após tratamento depende do objetivo final do estudo de DL (ponto 23) e deve assegurar que todas as fases da maturação de células germinais masculinas sejam avaliadas para DL (12).

8.

Caso existam provas de que o produto químico em estudo ou o(s) seu(s) metabolito(s) não atingem o testículo, o presente ensaio não é apropriado.

PRINCÍPIO DO ENSAIO

9.

Em geral, os animais machos são expostos ao produto químico em estudo por uma via de exposição adequada e acasalados com fêmeas virgens não tratadas. Podem ser testados diferentes tipos de células germinais com recurso a intervalos de acasalamento sequenciais. Decorrido um período adequado após o acasalamento, as fêmeas são eutanasiadas e os seus úteros examinados para determinar o número de implantes e de embriões vivos e mortos. A letalidade dominante de um produto químico em estudo é determinada por comparação dos implantes vivos por fêmea do grupo tratado com os implantes vivos por fêmea do grupo de controlo do excipiente/solvente. O aumento do número de implantes mortos por fêmea do grupo tratado em relação ao número de implantes mortos por fêmea do grupo de controlo reflete as perdas após a implantação induzidas pelo produto químico em estudo. Estas perdas são calculadas determinando a proporção de implantes mortos no total de implantes do grupo tratado, comparativamente com a proporção de implantes mortos no total de implantes no grupo de controlo. As perdas antes da implantação podem ser estimadas por comparação dos corpos lúteos menos os implantes totais ou o total de implantes por fêmea do grupo tratado e do grupo de controlo.

VERIFICAÇÃO DA COMPETÊNCIA DO LABORATÓRIO

10.

A competência para ensaio deve ser estabelecida mediante a demonstração da capacidade de reproduzir as frequências de letalidade dominante a partir de dados publicados – por exemplo, (13) (14) (15) (16) (17) (18) – com substâncias de controlo positivo (incluindo respostas fracas), como as constantes do quadro 1, e controlos do veículo e a obtenção de frequências de controlo negativas coerentes (ver referências supra) ou com o histórico de distribuição do controlo do laboratório, se disponível.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Preparações

Seleção de espécies animais

11.

Devem ser utilizados animais saudáveis, das espécies de laboratório mais comuns, que tenham atingido a maturidade sexual. Geralmente são utilizados ratos, embora também possam ser adequadas ratazanas. Pode utilizar-se qualquer outra espécie adequada de mamífero, se o relatório fornecer uma justificação científica.

Condições de alojamento e de alimentação dos animais

12.

No caso dos roedores, a temperatura do biotério deve ser de 22 °C (±3 °C). Idealmente, a humidade relativa deve estar compreendida entre 50 % e 60 %, embora sejam aceitáveis valores compreendidos entre 40 %, no mínimo, e um valor máximo que, de preferência, não deve exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de obscuridade. Para a alimentação, podem ser usadas dietas convencionais de laboratório, com acesso ilimitado a água potável. Se o produto químico em estudo for administrado pela alimentação, a escolha da dieta poderá ser condicionada pela necessidade de assegurar a dosagem adequada. Antes do tratamento ou do acasalamento, os roedores devem ser alojados em pequenos grupos (não mais de cinco) do mesmo sexo – caso não se prevejam ou observem comportamentos agressivos –, de preferência em gaiolas sólidas com um enriquecimento ambiental adequado. Os animais podem ser alojados individualmente se tal se justificar do ponto de vista científico.

Preparação dos animais

13.

Distribuem-se aleatoriamente animais saudáveis e sexualmente maduros, machos e fêmeas, pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. Os animais são identificados de forma inequívoca, utilizando um método humano minimamente invasivo (p. ex., anilhagem, marcação, microchip ou identificação biométrica, mas não entalhe de orelhas nem amputação de falanges), e são aclimatados às condições de laboratório durante, pelo menos, cinco dias. As gaiolas devem estar dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Devem ser evitadas contaminações cruzadas pelo produto químico de controlo positivo e pelo produto químico em estudo. No início do estudo, a diferença de peso entre os animais deve ser mínima e não deve exceder ±20 % do peso médio de cada sexo.

Preparação das doses

14.

Os produtos químicos em estudo na forma sólida devem ser dissolvidos ou suspensos em solventes ou veículos adequados, ou misturados na dieta ou na água potável antes da administração aos animais. Os produtos químicos em estudo no estado líquido podem ser adicionados diretamente aos sistemas em estudo e/ou diluídos antes da administração. No caso das exposições por inalação, os produtos químicos em estudo podem ser administrados sob a forma de gás, vapor ou aerossol sólido/líquido, consoante as respetivas propriedades físico-químicas. Devem utilizar-se preparações frescas do produto químico em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o mesmo pode ser armazenado e determinem as condições de armazenagem adequadas.

Condições de ensaio

Solvente/veículo

15.

O solvente/veículo não deve produzir efeitos tóxicos nos volumes utilizados e não devem existir indícios de reação química com o produto químico em estudo. A eventual utilização de solventes/veículos menos habituais deve ser fundamentada por dados de referência que indiquem serem compatíveis. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de um solvente/veículo aquoso. A água, o soro fisiológico, uma solução de metilcelulose, uma solução de sal de sódio de carboximetilcelulose, o azeite e o óleo de milho constituem exemplos de solventes/veículos compatíveis de utilização comum.

Amostras de controlo positivo

16.

Devem ser sempre utilizados animais de controlo positivo em paralelo, a menos que o laboratório tenha demonstrado competência na realização do ensaio e o tenha utilizado regularmente no passado recente (nos últimos 5 anos, por exemplo). Não é, contudo, necessário tratar os animais de controlo positivo pela mesma via que os animais que recebem o produto químico em estudo, nem colher amostras em todos os intervalos de acasalamento. As substâncias de controlo positivo devem ser comprovadamente produtoras de DL nas condições utilizadas para o ensaio. Salvo para o tratamento, os animais dos grupos de controlo devem ser alvo dos mesmos procedimentos que os animais dos grupos tratados.

17.

As doses das substâncias de controlo positivo devem ser determinadas de modo a produzirem efeitos fracos ou moderados que avaliem criticamente o desempenho e a sensibilidade do ensaio, mas a produzirem, de forma consistente, efeitos letais dominantes positivos. O quadro 1 apresenta exemplos de substâncias de controlo positivo e de dosagens adequadas.

Quadro 1

Exemplos de substâncias de controlo positivo

Substância [n.o CAS]

(número de referência)

Gama de doses eficazes (mg/kg)

(espécies de roedores)

Período de administração (dias)

Trietilenomelamina [51-18-3] (15)

0,25 (ratos)

1

Ciclofosfamida [50-18-0] (19)

50-150 (ratos)

5

Ciclofosfamida [50-18-0] (5)

25-100 (ratazanas)

1

Metanossulfonato de etilo [62-50-0] (13)

100-300 (ratos)

5

Acrilamida monómera [79-06-1] (17)

50 (ratos)

5

Clorambucil [305-03-3] (14)

25 (ratos)

1

Controlos negativos

18.

Cada amostragem deve incluir animais de controlo negativo, tratados apenas com solvente ou veículo e, em todos os outros aspetos, sujeitos ao mesmo procedimento que os grupos de tratamento (20). Na ausência de dados de controlo históricos ou publicados que demonstrem que o solvente/veículo escolhido não induz DL nem qualquer outro efeito prejudicial, todas as amostragens devem incluir igualmente animais de controlo sem tratamento, de modo a estabelecer a aceitabilidade do controlo do veículo.

PROCEDIMENTO

Número de animais

19.

Cada macho é acasalado sequencialmente, a intervalos adequados previamente determinados (por exemplo, semanais, pontos 21 e 23), de preferência com uma fêmea virgem. O número de machos por grupo deve ser predeterminado de forma a ser suficiente (em combinação com o número de fêmeas acasaladas a cada intervalo de acasalamento) para assegurar a representatividade estatística necessária para detetar pelo menos uma duplicação na frequência de DL (ponto 44).

20.

O número de fêmeas por intervalo de acasalamento deve também ser predeterminado pelos cálculos de representatividade estatística de modo de permitir a deteção de, pelo menos, uma duplicação na frequência de DL (ou seja, fêmeas prenhes em número suficiente para a obtenção de, pelo menos, 400 implantes totais) (20) (21) (22) (23) e a probabilidade de, pelo menos, um implante morto por unidade de análise (ou seja, o grupo de acasalamento por dose) (24).

Período de administração e intervalo de acasalamento

21.

O número de intervalos de acasalamento após o tratamento é determinado pelo calendário deste e deve assegurar que todas as fases da maturação de células germinais masculinas são avaliadas para indução de DL (12) (25). No caso de um tratamento único com, no máximo, cinco administrações de doses diárias, devem realizar-se, após a última destas, acasalamentos de 8 ratos ou 10 ratazanas com intervalos semanais. Em caso de administração de doses múltiplas, o número de intervalos de acasalamento pode ser reduzido proporcionalmente ao aumento do período de administração, mas deve manter-se o objetivo de avaliar todas as fases da espermatogénese (por exemplo, após uma exposição de 28 dias, quatro acasalamentos semanais são suficientes para avaliar todas as fases da espermatogénese no rato). Todos os calendários de tratamento e acasalamento devem ser cientificamente justificados.

22.

As fêmeas devem permanecer com os machos durante, pelo menos, um ciclo éstrico (por exemplo, uma semana abrange um ciclo éstrico em ratos e em ratazanas). As fêmeas que não tenham acasalado durante um intervalo de uma semana podem ser utilizadas para um intervalo de acasalamento subsequente. Em alternativa, até à ocorrência do acasalamento, comprovado pela presença de esperma na vagina ou pela presença de um rolhão vaginal.

23.

A exposição e o regime de acasalamento utilizados são função do objetivo último do estudo de DL. Se o objetivo for determinar se um determinado produto químico induz mutações de DL per se, o método deve consistir em expor todo um ciclo de espermatogénese (p. ex., 7 semanas no rato, 5-7 tratamentos por semana) e acasalar no final. Contudo, se o objetivo for identificar o tipo de células germinais sensíveis para indução de DL, é preferível uma exposição única ou uma exposição de 5 dias, seguida de acasalamento semanal.

Doses

24.

Se for realizado um estudo preliminar para avaliação da gama de doses a administrar por não estarem disponíveis dados apropriados de apoio à seleção de doses, esse estudo deve ser efetuado no mesmo laboratório, utilizando a mesma espécie, a mesma linha celular, o mesmo sexo e o mesmo regime de exposição do estudo principal (26). O estudo deve procurar identificar a dose máxima tolerável (DMT), definida como a dose mais elevada tolerada, durante o período de ensaio, sem sinais de toxicidade limitativa do estudo (p. ex., comportamentos ou reações anormais, ligeira redução do peso corporal ou citotoxicidade no sistema hematopoiético) e sem causar a morte nem sinais de dor, sofrimento ou tensão que levem à eutanásia por meios humanos (27).

25.

A DMT também não deve afetar negativamente o êxito do acasalamento (21).

26.

Os produtos químicos em estudo com atividade biológica específica em doses baixas não tóxicas (como hormonas e agentes mitogénicos) e os produtos químicos que apresentem saturação de propriedades toxicocinéticas podem ser exceções aos critérios de definição da dosagem e devem ser avaliados caso a caso.

27.

Para obter informações sobre a resposta às doses, o estudo completo deve incluir um grupo de controlo negativo e, no mínimo, três níveis de dosagem, separadas por um fator que, em geral, é 2 e não pode ser superior a 4. Se o produto químico em estudo não produzir efeitos tóxicos num estudo de avaliação da gama de doses ou com base em dados existentes, a dose mais elevada administrada de uma só vez deve ser de 2 000 mg/kg de peso corporal. Se o produto químico em estudo gerar toxicidade, a dose máxima administrada deve ser a DMT e as doses utilizadas devem, de preferência, abranger uma gama compreendida entre a dose máxima e uma dose de toxicidade baixa ou nula. No caso de produtos químicos não tóxicos, a dose máxima para um período de administração igual ou superior a 14 dias é de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia e, para um período de administração inferior a 14 dias, a dose máxima é de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia.

Administração das doses

28.

Na conceção de um ensaio, deve ter-se em mente a via prevista de exposição humana. Por conseguinte, desde que devidamente justificadas, podem escolher-se, por exemplo, vias de exposição como a alimentação, água de beber, subcutânea, intravenosa, tópica, inalação, oral (por gavagem) ou implantação. Seja qualquer for, a via escolhida deve garantir a exposição adequada do(s) tecido(s)-alvo. A injeção intraperitoneal não é, em geral, recomendada, uma vez que não se trata de uma via previsível de exposição humana, só devendo utilizar-se com justificação científica específica. Se o produto químico em estudo for misturado nos alimentos ou na água de beber, especialmente no caso de uma dose única, deve prever-se, entre o consumo dos alimentos e da água e o acasalamento, um intervalo suficiente para permitir a deteção dos efeitos (ponto 31). O volume máximo de líquido que pode ser administrado de uma só vez por gavagem ou injeção depende do tamanho do animal de ensaio, não devendo exceder 1 ml/100 g de peso corporal, exceto no que respeita a soluções aquosas, em que pode ser administrado um máximo de 2 ml/100 g de peso corporal. A utilização de volumes maiores (caso seja permitida pela legislação no domínio do bem-estar dos animais) deve ser justificada. As variações no volume de ensaio devem ser minimizadas mediante o ajustamento da concentração, de modo a assegurar um volume constante em relação ao peso corporal em todas as dosagens.

Observações

29.

Os animais de ensaio devem ser sujeitos a exames clínicos gerais, registando-se os sinais clínicos observados pelo menos uma vez por dia, de preferência à(s) mesma(s) hora(s) todos os dias e tendo em conta o período de pico dos efeitos previstos após a exposição. Durante o período de exposição, devem observar-se todos os animais pelo menos duas vezes por dia, para a deteção de sinais de morbilidade e mortalidade. Todos os animais devem ser pesados no início do estudo e, pelo menos, uma vez por semana nos estudos com repetição de dose, bem como aquando da eutanásia. Pelo menos uma vez por semana, devem realizar-se medições do consumo de alimentos. Se o produto químico em estudo for administrado através da água de beber, o consumo desta deve ser medido em cada mudança de água e, pelo menos, uma vez por semana. Os animais que exibam indicadores não letais de toxicidade excessiva devem ser eutanasiados antes da conclusão do período de ensaio (27).

Colheita e tratamento de tecidos

30.

As fêmeas são eutanasiadas na segunda metade da gravidez, no dia da gestação (GD) 13 no caso dos ratos e no GD 14-15 no caso das ratazanas. Os úteros são examinados para deteção de efeitos letais dominantes, a fim de determinar o número de implantes, de embriões vivos e mortos e de corpos lúteos.

31.

Os cornos uterinos e os ovários são expostos para contagem dos corpos lúteos e os fetos são removidos, contados e pesados. Os úteros devem ser examinados para detetar reabsorções ocultas por fetos vivos e para garantir que todas as reabsorções são enumeradas. É registada a mortalidade fetal. É igualmente registado o número de fêmeas prenhes e o número total de implantações, as perdas antes da implantação e a mortalidade após a implantação (incluindo as reabsorções precoces e tardias). Além disso, os fetos visíveis podem ser conservados no fixador de Bouin durante, pelo menos, 2 semanas, após o que são examinados para deteção de malformações externas graves (28), a fim de se obterem informações adicionais sobre os efeitos sobre a reprodução e o desenvolvimento do agente em estudo.

DADOS E RELATÓRIOS

Tratamento dos resultados

32.

Os resultados devem ser apresentados em quadros que indiquem o número de machos acasalados, o número de fêmeas prenhes e o número de fêmeas não prenhes. Os resultados de cada acasalamento, incluindo a identidade de cada macho e de cada fêmea, são apresentados individualmente. Deve especificar-se, para cada fêmea, o intervalo de acasalamento, a dose dos machos tratados e o número de implantes vivos e implantes mortos.

33.

As perdas após a implantação são calculadas determinando a proporção de implantes mortos no total de implantes do grupo tratado, comparativamente com a proporção de implantes mortos no total de implantes no grupo de controlo de veículos/solventes.

34.

As perdas antes da implantação são calculadas como a diferença entre o número de corpos lúteos e o número de implantes ou como a diminuição do número médio de implantes por fêmea em relação ao dos acasalamentos de controlo. Se forem avaliadas as perdas antes da implantação, devem apresentar-se os resultados.

35.

O fator de letalidade dominante é estimado do seguinte modo: (mortes após a implantação/total de implantações por fêmea) × 100.

36.

Devem ser comunicados os dados relativos à toxicidade e aos sinais clínicos, em conformidade com o ponto 29.

Critérios de aceitabilidade

37.

A aceitabilidade de um ensaio é determinada pelos critérios a seguir enunciados.

O controlo negativo em paralelo está de acordo com as normas publicadas para os dados históricos de controlo negativo, bem como com os dados históricos de controlo do laboratório, se disponíveis (ver pontos 10 e 18).

Os controlos positivos realizados em paralelo induzem respostas coerentes com as normas publicadas relativas a dados históricos de controlo positivo ou com a base de dados históricos de controlo positivo do laboratório, se disponíveis, e produzem um aumento estatisticamente significativo em relação ao controlo negativo (ver pontos 17 e 18).

Foi analisado um número total adequado de implantes e de doses (ponto 20).

Os critérios de seleção da dose máxima são coerentes com os descritos nos pontos 24 e 27.

Avaliação e interpretação dos resultados

38.

Devem ser analisados pelo menos três grupos tratados, de modo a proporcionar dados suficientes para uma análise da resposta à dosagem.

39.

Se forem cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente positivo se:

pelo menos uma das doses de ensaio apresentar um aumento estatisticamente significativo em relação ao controlo negativo;

o aumento, avaliado com um ensaio adequado, estiver relacionado com a dose em, pelo menos, uma condição experimental (por exemplo, um intervalo de acasalamento semanal);

nenhum dos resultados estiver fora da gama aceitável de dados de controlo negativo ou da distribuição dos dados históricos de controlo negativo do laboratório (por exemplo, limites de controlo de 95 % com base numa distribuição de Poisson), se disponível.

Nesse caso, o produto químico em estudo é considerado passível de induzir mutações letais dominantes em células germinais dos animais de ensaio. O ponto 44 contém recomendações sobre os métodos estatísticos mais adequados; as referências bibliográficas (20) (21) (22) (24) (29) contêm outras recomendações sobre abordagens estatísticas. Nos testes estatísticos utilizados, um animal deve considerar-se a unidade experimental.

40.

Se forem cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente negativo se:

nenhuma das doses de ensaio apresentar um aumento estatisticamente significativo em relação ao controlo negativo;

não se observar qualquer aumento relacionado com a doses em nenhuma condição experimental;

todos os resultados estiverem dentro da gama aceitável de dados de controlo negativo ou dos dados históricos de controlo negativo do laboratório (por exemplo, limites de controlo de 95 % com base numa distribuição de Poisson), se disponíveis.

Nesse caso, o produto químico em estudo não é considerado passível de induzir mutações letais dominantes em células germinais dos animais de ensaio.

41.

As respostas inequivocamente positivas ou inequivocamente negativas não carecem de confirmação.

42.

Se a resposta não for inequivocamente negativa nem positiva, e a fim de contribuir para o estabelecimento da relevância biológica de um resultado (por exemplo, um aumento ténue ou no limite), os dados devem ser avaliados por peritos e/ou através de estudos complementares que utilizem os dados experimentais existentes, para determinar, nomeadamente, se o resultado positivo está fora da gama aceitável de dados de controlo negativo ou dos dados históricos de controlo negativo do laboratório (30).

43.

Em casos raros, mesmo após estudos complementares, os dados obtidos não permitem concluir um resultado positivo ou negativo, pelo que se considera que o resultado é ambíguo.

44.

Os testes estatísticos utilizados devem considerar o animal macho como a unidade experimental. Embora seja possível que os dados relativos à contagem (por exemplo, o número de implantes por fêmea) possam ser objeto de uma distribuição de Poisson e/ou certas proporções (p. ex., proporção de implantes mortos) possam ser distribuídas de forma binomial, é muito frequente os dados encontrarem-se dispersos (31). Por conseguinte, a análise estatística deve começar por efetuar um teste de sobredispersão/subdispersão com recurso a testes de variância, como o teste de variância binomial de Cochran (32) ou o teste C(α) de Tarone para a sobredispersão binomial (31) (33). Se não for detetada qualquer desvio em relação à dispersão binomial, as tendências das proporções das dosagens podem ser testadas utilizando o teste de tendência de Cochran-Armitage (34) e a comparação entre pares com o grupo de controlo pode ser testada com o teste exato de Fisher (35). Do mesmo modo, se se detetar qualquer desvio em relação à dispersão de Poisson, as tendências das contagens podem ser testadas utilizando o teste de regressão de Poisson (36) e as comparações par a par com o grupo de controlo podem ser testadas no contexto do modelo de Poisson, utilizando contrastes par a par (36). Se for detetada sobredispersão ou subdispersão significativa, recomenda-se a utilização de métodos não paramétricos (23) (31). Estes métodos incluem testes de base, como o teste de tendências de Jonckheere-Terpstra (37) e o teste de Mann-Whitney (38) para comparações par a par com o grupo de controlo de veículos/solventes, bem como testes de permutação, reamostragem ou bootstrap para tendências e comparações par a par com o grupo de controlo (31) (39).

45.

Um ensaio de DL positivo fornece provas da genotoxicidade do produto químico em estudo nas células germinais do macho tratado da espécie de ensaio.

46.

A averiguação do facto de os valores observados estarem dentro ou fora da faixa de controlo histórico pode fornecer orientações para a avaliação da significância biológica da resposta (40).

Relatório de ensaio

47.

O relatório de ensaio deve incluir as seguintes informações:

Síntese.

 

Produto químico em estudo:

origem, número de lote e data-limite de utilização, se conhecidos;

estabilidade, se conhecida;

solubilidade e estabilidade no solvente, se conhecidas;

medição do pH, da pressão osmótica e da quantidade de precipitado no meio de cultura ao qual foi adicionado o produto químico em estudo, consoante o caso.

 

Substância monocomponente:

aspeto físico, hidrossolubilidade e outras propriedades físico-químicas pertinentes;

dados de identificação química, como as denominações IUPAC ou CAS, número CAS, código SMILES ou InChI, fórmula estrutural, pureza, identidade química de impurezas, caso se justifique e seja exequível, etc.

 

Substância multicomponentes, UVCB e misturas:

caracterizada, na medida do possível, pela identidade química (ver acima), pela ocorrência quantitativa e pelas principais propriedades físico-químicas dos componentes.

 

Preparação do produto químico em estudo:

justificação da escolha do veículo;

solubilidade e estabilidade do produto químico em estudo no solvente/veículo, se conhecidas;

preparação de fórmulas alimentares, na água de beber ou inaláveis;

determinações analíticas (eventualmente) realizadas a essas fórmulas (por exemplo: estabilidade, homogeneidade, concentrações nominais).

 

Animais utilizados no ensaio:

espécie/estirpe utilizada e justificação da escolha;

número, idade e sexo dos animais;

proveniência, condições de alojamento, alimentação, etc.;

método de identificação unívoca dos animais;

para estudos de curta duração: peso individual dos animais machos no início e no final do teste; para estudos de duração superior a uma semana: os pesos durante o estudo e o consumo alimentar. Deve incluir-se, relativamente a cada grupo, a gama de pesos corporais, com a respetiva média e o desvio-padrão.

 

Condições de realização do ensaio:

controlos positivos e negativos (veículo/solvente);

dados do estudo de determinação da gama de dosagem;

fundamentação da escolha das doses;

detalhes da preparação do produto químico em estudo;

elementos relativos à administração do produto químico em estudo;

justificação da via de administração escolhida;

métodos de medição da toxicidade para os animais, incluindo, sempre que disponíveis, análises histopatológicas ou hematológicas e a frequência com que foram realizadas observações dos animais e dos respetivos pesos corporais;

métodos para verificar se o produto químico em estudo atingiu o tecido-alvo ou a circulação geral, caso se obtenham resultados negativos;

dose real (mg/kg de peso corporal/dia), calculada a partir da concentração do produto químico em estudo nos alimentos ou na água de beber (ppm) e do consumo, se aplicável;

elementos relativos à qualidade dos alimentos e da água;

elementos relativos ao enriquecimento ambiental da gaiola;

descrição detalhada da exposição e do programa de colheita de amostras e justificação das escolhas feitas;

método de analgesia;

método de eutanásia;

procedimentos para o isolamento e a preservação de tecidos;

proveniência e números de lote de todos os kits e reagentes (quando aplicável);

métodos de enumeração de DL;

calendário de acasalamento;

métodos utilizados para comprovar o acasalamento;

momento da eutanásia;

critérios para a contagem dos efeitos de DL incluindo os corpos lúteos, as implantações, as reabsorções as perdas antes da implantação, os implantes vivos e os implantes mortos.

 

Resultados:

estado dos animais antes e durante o período de ensaio, incluindo sinais de toxicidade;

peso corporal dos machos durante o tratamento e os períodos de acasalamento;

número de fêmeas acasaladas;

relação dose-resposta, se possível;

dados históricos e simultâneos sobre o controlo negativo, com as respectivas gama, valor médio e desvio-padrão;

dados sobre o controlo positivo simultâneo;

dados apresentados em quadro para cada mãe, incluindo: número de corpos lúteos por mãe, número de implantações por mãe, número de reabsorções e de perdas antes da implantação, número de implantes vivos por mãe, número de implantes mortos por mãe, peso dos fetos;

os dados supramencionados relativamente a cada período de acasalamento e a cada dose, com frequências de DL;

métodos estatísticos utilizados e análises estatísticas efetuadas.

 

Discussão dos resultados.

 

Conclusão.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

(1)

OCDE (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, in Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., and Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group «Dominant» lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. and Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. and Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. and Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. and Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., and Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. and Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

(11)

Marchetti F. and Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

(12)

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)

Favor J., and Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21-27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. and Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. and Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.

(16)

James D.A. and Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. and Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. and Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. and Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. and Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 129-156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)

Generoso W.M. and Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

(23)

Haseman J.K. and Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., and Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

(27)

OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J and Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)

Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. and Thybaud V. (2011). «Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data», Mutation. Res., 723:87-90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. and Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. In Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. and Johnson N. L. (Eds.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35)

Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, London (1970).

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. and Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, Chapters 14 and 17. McGraw-Hill, Boston

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

(38)

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Apêndice 1

DEFINIÇÕES

Corpo lúteo: estrutura secretora de hormonas que se forma no ovário, num folículo que libertou um óvulo. O número de corpos lúteos nos ovários corresponde ao número de óvulos libertados.

Intervalo de acasalamento: período transcorrido entre o final da exposição e o acasalamento dos machos tratados. Através do controlo deste intervalo é possível avaliar os efeitos químicos nos diferentes tipos de células germinais. Nos ratos que acasalam durante a 1.a, 2.a, 3.a, 4.a, 5.a, 6.a, 7.a e 8.a semanas após o final da exposição, mede os efeitos nos espermatozoides, espermatídios condensados, espermatídios redondos, espermatócitos paquítenos, espermatócitos precoces, espermatogónias diferenciadas, espermatogónias diferenciadoras, e células espermatogónias estaminais.

Mutação letal dominante: mutação que ocorre numa célula germinal ou se fixa após a fertilização e que provoca a morte do embrião ou do feto.

Perdas antes da implantação: diferença entre o número de implantes e o número de corpos lúteos. As perdas antes da implantação podem ser estimadas comparando o número total de implantes por fêmea no grupo tratado e no grupo de controlo.

Perdas após a implantação: proporção de implantes mortos no grupo tratado comparativamente com a proporção de implantes mortos no total dos implantes no grupo de controlo.

Produto químico: uma substância ou mistura

Produto químico em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.

Taxa de fecundidade: relação entre o número de fêmeas que acasalaram e engravidaram e o número de fêmeas que acasalaram.

UVCB: substâncias químicas de composição desconhecida ou variável, produtos de reação complexos e materiais biológicos.

Apêndice 2

OPORTUNIDADE DA ESPERMATOGÉNESE NOS MAMÍFEROS

Image 1

Fig.1: Comparação da duração (dias) do desenvolvimento de células germinais masculinas em ratos, ratazanas e seres humanos. A reparação do ADN não ocorre durante os períodos indicados pelo sombreado.

É apresentado um esquema de espermatogénese nos ratos, ratazanas e seres humanos (extraído de Adler, 1996). As espermatogónias indiferenciadas incluem: espermatogónia A-simples, A-emparelhada e A-alinhada (Hess e de Franca, 2008). As A-simples são consideradas as verdadeiras células estaminais; portanto, para avaliar os efeitos nas células estaminais, devem transcorrer pelo menos 49 dias (no rato) entre a última injeção do produto químico em estudo e o acasalamento.

Referências

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

»

(4)

Na parte B, o capítulo B.23 passa a ter a seguinte redação:

«B.23   ENSAIO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÓMICAS EM ESPERMATOGÓNIAS DE MAMÍFERO

INTRODUÇÃO

1.

O presente método de ensaio é equivalente à Test Guideline 483 (2016) da OCDE. Os métodos de ensaio são revistos periodicamente à luz do progresso científico, das necessidades normativas em evolução e de considerações de bem-estar animal. A presente versão alterada do método de ensaio reflete muitos anos de experiência com este ensaio e o potencial de integração ou de combinação deste ensaio com outros estudos de toxicidade ou genotoxicidade. A combinação de estudos de toxicidade tem potencial para reduzir o número de animais utilizados em ensaios de toxicidade. O presente método faz parte de uma série de métodos de ensaio no domínio da toxicologia genética. Está disponível um documento da OCDE que fornece informações sucintas sobre ensaios de toxicologia genética e resume as alterações recentemente introduzidas nas orientações da OCDE neste domínio (1).

2.

O objetivo do ensaio in vivo de aberrações cromossómicas em espermatogónias de mamífero consiste em identificar os produtos químicos que causam aberrações cromossómicas estruturais nas células espermatogónias de mamíferos (2) (3) (4). Além disso, o presente ensaio é relevante para a avaliação da genotoxicidade, porquanto, embora possam variar consoante as espécies, os fatores do metabolismo in vivo, da farmacocinética e dos processos de reparação do ADN estão ativos e contribuem para a resposta. O método do presente ensaio não foi concebido para medir aberrações numéricas e não é normalmente utilizado para esse efeito.

3.

O presente ensaio mede aberrações cromossómicas estruturais (tanto cromossómicas como cromatídicas) na divisão das células germinais espermatogónias e, por conseguinte, pressupõe-se que tenha um caráter de previsão da indução de mutações hereditárias nas células germinais.

4.

Os termos-chave encontram-se definidos no apêndice.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

5.

O presente ensaio utiliza normalmente roedores mas, em alguns casos, podem ser adequadas outras espécies, mediante justificação científica. As preparações citogenéticas normais dos ensaios com roedores geram metáfases mitóticas (espermatogónias) e meióticas (espermatócitos). As metáfases mitóticas e meióticas são identificadas com base na morfologia dos cromossomas (4). O ensaio citogenético in vivo deteta aberrações cromossómicas estruturais nas mitoses espermatogónias. O presente método de ensaio visa outros tipos de células.

6.

Para detetar aberrações cromatídicas em células espermatogónias deve examinar-se a primeira divisão mitótica da célula após a exposição, antes de estas aberrações se converterem em aberrações cromossómicas nas divisões celulares subsequentes. Podem obter-se informações adicionais sobre os espermatócitos expostos através da análise cromossómica dos cromossomas meióticos para deteção de aberrações cromossómicas estruturais nas metáfases I e II da diacinese.

7.

Nos testículos estão presentes várias gerações de espermatogónias (5), e estes diferentes tipos de células germinais podem ter diferentes sensibilidades ao tratamento químico. Logo, as aberrações detetadas representam uma resposta agregada das várias populações de células espermatogónias expostas. A maioria das células mitóticas nos preparativos do testículo são espermatogónias de tipo B, que têm um ciclo celular de aproximadamente 26 horas (3).

8.

O presente ensaio não é apropriado caso existam provas de que o produto químico em estudo ou o(s) seu(s) metabolito(s) não atingem o testículo.

PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

9.

Por norma, os animais são expostos ao produto químico em estudo através de um modo de exposição apropriado. Ao cabo de um período pós-exposição adequado, são eutanasiados. Antes da eutanásia, os animais são tratados com um agente fixador da metáfase (por exemplo, colquicina ou Colcemid®). Seguidamente, são feitas preparações de cromossomas a partir das células germinais e, após serem coradas, as células em metáfase são analisadas para deteção de aberrações cromossómicas.

VERIFICAÇÃO DA COMPETÊNCIA DO LABORATÓRIO

10.

A competência para este ensaio deve ser estabelecida mediante a demonstração da capacidade de reproduzir os resultados esperados em termos de frequências estruturais de aberrações cromossómicas em espermatogónias com substâncias de controlo positivo (incluindo respostas fracas), como as enumeradas no quadro 1, e a obtenção de frequências de controlo negativo coerentes com a gama aceitável de dados de controlo constantes da literatura publicada – p. ex.: (2) (3) (6) (7) (8) (9) (10) – ou com a distribuição do controlo histórico do laboratório, se disponível.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Preparações

Seleção de espécies animais

11.

Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis das espécies de laboratório mais comuns. São normalmente utilizados ratos machos; no entanto, os machos de outras espécies de mamíferos adequadas podem ser utilizados quando cientificamente justificado e para permitir que o ensaio seja realizado em conjunção com outro método de ensaio. A justificação científica para a utilização de outras espécies que não roedores deve constar do relatório.

Condições de alojamento e de alimentação dos animais

12.

No caso dos roedores, a temperatura do biotério deve ser de 22 °C (±3 °C). Embora a humidade relativa ideal seja de 50-60 %, na prática pode descer a 40 %, não devendo exceder 70 %, exceto durante a lavagem do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de obscuridade. Para a alimentação, podem ser usadas dietas convencionais de laboratório, com acesso ilimitado a água potável. Se o produto químico em estudo for administrado pela alimentação, a escolha da dieta poderá ser condicionada pela necessidade de assegurar a dosagem adequada. Os roedores devem ser alojados em pequenos grupos (não mais de cinco por gaiola), caso não se prevejam comportamentos agressivos, de preferência em gaiolas sólidas com um enriquecimento ambiental adequado. Os animais podem ser alojados individualmente se tal se justificar do ponto de vista científico.

Preparação dos animais

13.

Utilizam-se geralmente animais machos jovens adultos (8-12 semanas de idade no início do tratamento), distribuídos aleatoriamente pelos grupos de controlo e de tratamento. Os animais são identificados de forma unívoca, utilizando um método que não cause sofrimento e seja o menos invasivo possível (por exemplo: (p. ex., anilhagem, marcação, microchip ou identificação biométrica, mas não entalhe de orelhas nem amputação de falanges), e são aclimatados às condições de laboratório durante, pelo menos, cinco dias. As gaiolas devem estar dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Deve evitar-se a contaminação cruzada pelo controlo positivo e pelo produto químico em estudo. No início do estudo, a variação entre os pesos individuais dos animais deve ser mínima, não devendo exceder±20 %.

Preparação das doses

14.

Os produtos químicos em estudo na forma sólida devem ser dissolvidos ou suspensos em solventes ou veículos adequados, ou misturados na dieta ou na água potável antes da administração aos animais. Os produtos químicos em estudo no estado líquido podem ser adicionados diretamente aos sistemas em estudo e/ou diluídos antes da administração. No caso das exposições por inalação, os produtos químicos em estudo podem ser administrados sob a forma de gás, vapor ou aerossol sólido/líquido, consoante as respetivas propriedades físico-químicas. Devem utilizar-se preparações frescas do produto químico em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o mesmo pode ser armazenado e determinem as condições de armazenagem adequadas.

Condições de ensaio — solvente/veículo

15.

O solvente/veículo não deve produzir efeitos tóxicos nas doses utilizadas nem reagir quimicamente com o produto químico em estudo. A eventual utilização de solventes/veículos menos habituais deve ser fundamentada por dados de referência que indiquem a sua compatibilidade. Recomenda-se, sempre que possível, a utilização prioritária de solventes/veículos aquosos. A água, o soro fisiológico, uma solução de metilcelulose, uma solução de sal de sódio de carboximetilcelulose, o azeite e o óleo de milho constituem exemplos de solventes/veículos compatíveis de utilização comum. Na ausência de dados de controlo históricos ou publicados que demonstrem que o solvente/veículo atípico escolhido não induz nenhuma aberração estrutural cromossómica ou outros efeitos deletérios, deve realizar-se um ensaio preliminar destinado a estabelecer a aceitabilidade do controlo do solvente ou veículo.

Amostras de controlo positivo

16.

Devem utilizar-se sempre animais de controlo positivo em paralelo, a menos que o laboratório tenha demonstrado competência na realização do ensaio e o tenha utilizado com regularidade no passado recente (nos últimos 5 anos, por exemplo). Se não for incluído um grupo de controlo positivo paralelo, cada experiência deve compreender controlos de contagem (lâminas fixas e não coradas). Estes podem ser realizados mediante a inclusão, no estudo, de amostras de referência adequadas obtidas e armazenadas a partir de um controlo positivo separado, efetuado a intervalos regulares (p. ex., a cada 6-18 meses), no laboratório em que o ensaio é realizado: por exemplo, em testes de competência e, subsequentemente, de uma forma regular, se necessário.

17.

As substâncias de controlo positivo devem produzir, com fiabilidade, um aumento detetável na frequência de células com aberrações cromossómicas estruturais em relação ao nível de ocorrência espontânea. A dose de controlo positiva a administrar deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros, mas também a que as amostras codificadas não sejam imediatamente identificadas pelo operador que procede às leituras. O quadro 1 apresenta exemplos de substâncias de controlo positivas.

Quadro 1

Exemplos de substâncias de controlo positivas

Substâncias [N.o CAS] (referência n.o)

Ciclofosfamida mono-hidratada [n.o CAS 50-18-0 (n.o CAS 6055-19-2)] (9)

Ciclo-hexilamina [n.o CAS 108-91-8] (7)

Mitomicina C [n.o CAS 50-07-7] (6)

Acrilamida monómera [n.o CAS 79-06-1] (10)

Trietilenomelamina [n.o CAS 51-18-3] (8)

Controlos negativos

18.

Cada amostragem deve incluir animais de controlo negativo, tratados apenas com solvente ou veículo e, em todos os outros aspetos, da mesma forma que os grupos de tratamento. Na ausência de dados de controlo históricos ou publicados que demonstrem que o solvente/veículo escolhido não induz aberrações cromossómicas ou outros efeitos deletérios, todas as amostragens devem incluir igualmente animais de controlo sem tratamento, de modo a estabelecer a aceitabilidade do controlo do veículo.

PROCEDIMENTO

Número de animais

19.

No início do estudo, as dimensões dos grupos devem ser estabelecidas de forma a assegurar um mínimo de 5 machos por grupo. Este número de animais por grupo é considerado suficiente para assegurar uma representatividade estatística adequada (isto é, permite, em geral, detetar pelo menos uma duplicação da frequência das aberrações cromossómicas com um nível de controlo negativo de 1,0 % ou superior, com uma probabilidade de 80 % a um nível de significância de 0,05) (3) (11). A título de orientação, um estudo realizado com dois tempos de amostragem, três grupos de doses e um grupo de controlo negativo em paralelo, além de um grupo de controlo positivo (cada um com cinco animais), requer 45 animais.

Programa de exposição

20.

Os produtos químicos em estudo são geralmente administrados uma vez (ou seja, num único tratamento); podem ser utilizados outros regimes de dosagem, desde que cientificamente justificados.

21.

No grupo exposto à dose mais elevada são realizadas duas amostragens após a exposição. Dado que o tempo necessário para a absorção e metabolização do(s) produto(s) químico(s) em estudo, bem como o efeito deste(s) na cinética do ciclo celular, pode afetar o momento ótimo para a deteção de uma eventual aberração cromossómica, recomenda-se a colheita de uma segunda amostra 24 horas após a primeira. Para as doses que não a dose mais elevada, deve prever-se uma amostragem precoce de 24 horas (inferior ou igual à duração do ciclo celular das espermatogónias B, de modo a otimizar a probabilidade de contagem das primeiras metáfases pós-tratamento) após o tratamento, a menos que se saiba que outro intervalo de amostragem é mais adequado e justificado.

22.

Podem ser utilizados outros tempos de amostragem. Por exemplo, no caso de produtos químicos que induzam efeitos independentes do fator S, pode ser adequado efetuar amostragens mais precoces (ou seja, menos de 24 horas).

23.

O tratamento pode repetir as doses, nomeadamente em conjunção com um ensaio relativo a outros parâmetros que preveja um período de administração de 28 dias (por exemplo, método de ensaio B.58); no entanto, serão necessários outros grupos de animais para ter em conta os diferentes tempos de amostragem. A adequação de tal calendário tem de ser justificada cientificamente, numa base casuística.

24.

Antes da eutanásia, os animais são injetados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um produto químico de fixação da metáfase (por exemplo, colquicina ou Colcemid®). As amostras são colhidas a intervalos regulares a partir desse momento. No caso dos ratos e ratazanas, este intervalo é de, aproximadamente, 3 a 5 horas.

Níveis de dosagem

25.

Se, por não existirem dados adequados disponíveis que possam servir de orientação na escolha das doses, for realizado um estudo exploratório da gama de dosagens a administrar, este deve ser realizado no mesmo laboratório, utilizando a mesma espécie, a mesma estirpe e o mesmo regime de exposição a utilizar no estudo principal, de acordo com recomendações para a realização de estudos exploratórios de determinação da gama de dosagens (12). O estudo deve ter por objetivo identificar a dose máxima tolerável (DMT), definida como a dose que, durante o período de ensaio, produz efeitos ligeiramente tóxicos (por exemplo, comportamentos ou reações anormais, ligeira redução do peso corporal ou citotoxicidade do sistema hematopoiético), mas não a morte ou sinais de dor, sofrimento ou tensão que obriguem à eutanásia dos animais (13).

26.

A dose mais elevada pode igualmente ser definida como uma dose que produz algumas indicações de toxicidade nas espermatogónias (por exemplo, redução da taxa de mitose das espermatogónias na primeira e segunda metáfases meióticas; essa redução não deve ser superior a 50 %.

27.

Os produtos químicos em estudo com atividade biológica específica em doses baixas não tóxicas (como hormonas e agentes mitogénicos) e os produtos químicos que apresentem saturação de propriedades toxicocinéticas podem ser exceções aos critérios de definição da dosagem e devem ser avaliados caso a caso.

28.

Um estudo completo que vise obter informação sobre a resposta às doses deve incluir um grupo de controlo negativo (ponto 18) e, no mínimo, três níveis de dosagem, separados por um fator que, em geral, é 2 e não pode ser superior a 4. Se o produto químico em estudo não produzir efeitos tóxicos num estudo de avaliação da gama de dosagens ou com base em dados existentes, a dose mais elevada administrada de uma só vez deve ser de 2 000 mg/kg de peso corporal. Contudo, se o produto químico em estudo gerar toxicidade, a dose máxima administrada deve ser a DMT e as dosagens utilizadas devem, de preferência, abranger uma gama compreendida entre a dose máxima e uma dose de toxicidade baixa ou nula. Caso se observe toxicidade no tecido-alvo (testículos) em todas as dosagens ensaiadas, recomenda-se a realização de um estudo complementar com doses não tóxicas. Os estudos destinados a obter informações quantitativas dose-resposta mais precisas podem necessitar de mais grupos de dosagem. Os limites indicados podem variar no caso do estudo de certos tipos de produtos químicos (por exemplo medicamentos para uso humano) abrangidos por exigências específicas. Se o produto químico em estudo produzir toxicidade, deve selecionar-se a dose-limite e duas doses inferiores (conforme descrito supra). A dose-limite para um período de administração igual ou superior a 14 dias é de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia e, para um período de administração inferior a 14 dias, a dose-limite é de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia.

Administração das doses

29.

Na conceção de um ensaio, deve ter-se em mente a via prevista de exposição humana. Por conseguinte, desde que devidamente justificadas, podem escolher-se vias de exposição como a alimentação, a água de beber, as vias tópica, subcutânea ou intravenosa, a via oral (por gavagem), a via inalatória ou o recurso a implantes. A via escolhida deve garantir a exposição adequada do tecido-alvo. Em geral, a injeção intraperitoneal não é recomendada – a menos que se justifique cientificamente –, uma vez que não é uma via fisiologicamente relevante de exposição humana. Se o produto químico em estudo for misturado na alimentação ou na água de beber, especialmente no caso de dose única, deve prever-se um intervalo suficiente entre a ingestão dos alimentos ou da água e a amostragem, de modo a que os efeitos possam ser detetados (ver ponto 33). O volume máximo de líquido que pode ser administrado de uma só vez por gavagem ou injeção depende do tamanho do animal de ensaio, não devendo exceder 1 ml/100 g de peso corporal, exceto no que respeita a soluções aquosas, em que pode ser administrado um máximo de 2 ml/100 g de peso corporal. Deve justificar-se a utilização de volumes maiores (se permitida pela legislação no domínio do bem-estar dos animais). As variações no volume de ensaio devem ser minimizadas mediante o ajustamento da concentração, de modo a assegurar um volume constante em relação ao peso corporal em todas as dosagens.

Observações

30.

Os animais de ensaio devem ser sujeitos a exames clínicos gerais, registando-se, pelo menos, uma vez por dia, de preferência à(s) mesma(s) hora(s), os sinais clínicos observados, tendo em conta o período de pico dos efeitos previstos após a exposição. Pelo menos duas vezes por dia, todos os animais devem ser observados para a deteção de sinais de morbilidade e mortalidade. Todos os animais devem ser pesados no início do estudo, bem como, pelo menos, uma vez por semana (em estudos com doses repetidas) e no momento da eutanásia. Nos estudos que se prolonguem por uma semana ou mais, o consumo de alimentos deve ser medido, pelo menos, uma vez por semana. Se o produto químico em estudo for administrado através da água de beber, o consumo desta deve ser medido em cada mudança de água e, pelo menos, uma vez por semana. Os animais que exibam indicadores não letais de toxicidade excessiva devem ser eutanasiados antes da conclusão do período de ensaio (13).

Preparação dos cromossomas

31.

Imediatamente após a eutanásia, devem ser preparadas suspensões de células germinais, de um ou de ambos os testículos, que serão seguidamente expostas a uma solução hipotónica e fixadas, de acordo com protocolos estabelecidos – por exemplo, (2) (14) (15). As células são depois espalhadas em lâminas e coradas (16) (17). Todas as lâminas devem ser codificadas, para que o operador que procede às leituras não tenha acesso à sua identidade.

Análise

32.

Devem ser contabilizadas pelo menos 200 metáfases com uma boa repartição para cada animal (3) (11). Se a frequência de controlo negativo histórico for < 1 %, devem ser contabilizadas mais de 200 células/animal para aumentar a representatividade estatística (3). Devem ser utilizados métodos de coloração que permitam identificar o centrómero.

33.

As aberrações cromossómicas e cromatídicas devem ser registadas separadamente e classificadas em subtipos (quebras, intercâmbios). Importa registar as lacunas, que não devem ser tidas em conta, para determinar se um produto químico induz um aumento significativo da incidência de células com aberrações cromossómicas. Os procedimentos em laboratório devem garantir que a análise das aberrações cromossómicas é efetuada por operadores com formação adequada. Dado que os procedimentos de preparação de lâminas resultam frequentemente na rotura de uma determinada proporção de células em metáfase, com perda de cromossomas, as células contabilizadas devem, portanto, conter um número de centrómeros não inferior a 2 n ±2, em que n é o número de cromossomas haploides na espécie em causa.

34.

Embora o objetivo do ensaio seja a deteção de aberrações cromossómicas estruturais, é importante registar as frequências de células poliploides e células com cromossomas endorreduplicados, caso ocorram (ver o ponto 44).

DADOS E RELATÓRIOS

Tratamento dos resultados

35.

Os dados relativos a cada animal devem ser apresentados num quadro. Também para cada animal, devem verificar-se o número de células com aberrações cromossómicas estruturais e o número de aberrações cromossómicas por célula. As aberrações cromatídicas e cromossómicas, classificadas em subtipos (quebras, intercâmbios), devem ser enumeradas separadamente, com os respetivos números e frequências, para os grupos experimentais e os grupos de controlo. As lacunas são registadas separadamente. A frequência das lacunas é incluída no relatório, mas, em geral, não é tida em conta na análise da frequência total das aberrações cromossómicas estruturais. Devem registar-se as percentagens de poliploidia e de células com cromossomas endorreduplicadas, sempre que ocorram.

36.

Devem comunicar-se os dados relativos à toxicidade e aos sinais clínicos, em conformidade com o ponto 30.

Critérios de aceitabilidade

37.

A aceitabilidade de um ensaio é determinada pelos seguintes critérios:

O controlo negativo em paralelo está em sintonia com as normas publicadas relativas a dados históricos de controlo negativo – segundo as quais a percentagem prevista de células com aberrações cromossómicas deverá ser, em geral, > 0 % e ≤ 1,5 % –, bem como com dados históricos de controlo do laboratório, se disponíveis (ver pontos 10 e 18).

Os controlos positivos realizados em paralelo induzem respostas coerentes com as normas publicadas relativas a dados históricos de controlo positivo ou com base de dados históricos de controlo positivo do laboratório, se disponíveis, e produzem um aumento estatisticamente significativo em relação ao controlo negativo (ver pontos 17 e 18).

Analisaram-se números adequados de células e doses (ver pontos 28 e 32).

Os critérios de seleção da dose máxima são coerentes com os descritos nos pontos 25 e 26.

38.

Se, para além das mitoses, também se observarem meioses, a relação entre o número de mitoses e de metáfases I ou II das espermatogónias deve ser determinada num total de 100 células em divisão por animal, para medição da citotoxicidade em todos os animais tratados e do controlo negativo. Se apenas se observarem mitoses, o índice mitótico deve ser calculado utilizando pelo menos 1 000 células de cada animal.

Avaliação e interpretação dos resultados

39.

Devem analisar-se, pelo menos, três grupos tratados, de modo a proporcionar dados suficientes para uma análise da resposta à dosagem.

40.

Caso sejam cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente positivo se:

pelo menos, uma das doses de ensaio apresentar um aumento estatisticamente significativo em relação ao controlo negativo;

o aumento estiver relacionado com a dose em, pelo menos, um momento de amostragem;

nenhum dos resultados estiver fora da gama aceitável de dados de controlo negativo ou da distribuição dos dados históricos de controlo negativo do laboratório (por exemplo, limites de controlo de 95 % com base numa distribuição de Poisson), caso existam.

Nesse caso, o produto químico em estudo é considerado passível de induzir aberrações cromossómicas em células espermatogónias dos animais de ensaio. As referências bibliográficas (11) e (18) contêm recomendações sobre os métodos estatísticos mais adequados. Os testes estatísticos utilizados devem considerar o animal a unidade experimental.

41.

Caso sejam cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente negativo se:

nenhuma das doses de ensaio apresentar um aumento estatisticamente significativo em relação ao controlo negativo;

não se observar qualquer aumento relacionado com a dose em nenhuma condição experimental;

todos os resultados estiverem dentro da gama aceitável de dados de controlo negativo ou dos dados históricos de controlo negativo do laboratório (por exemplo, limites de controlo de 95 % com base numa distribuição de Poisson), caso existam.

Nesse caso, o produto químico em estudo não é considerado passível de induzir aberrações cromossómicas nas células espermatogónias dos animais sujeitos ao ensaio. As referências bibliográficas (11) e (18) contêm recomendações sobre os métodos estatísticos mais adequados. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de o produto químico induzir aberrações cromossómicas em fases de desenvolvimento posteriores não estudadas, ou mutações genéticas.

42.

As respostas inequivocamente positivas ou inequivocamente negativas não carecem de confirmação.

43.

Se a resposta não for inequivocamente negativa ou positiva, e a fim de contribuir para o estabelecimento da adequação biológica de um resultado (por exemplo, um aumento ténue ou no limite), os dados devem ser avaliados por pareceres de peritos e/ou estudos complementares que utilizem os dados experimentais existentes, nomeadamente para determinar se o resultado positivo está fora da gama aceitável de dados de controlo negativo ou dos dados históricos de controlo negativo do laboratório (19).

44.

Em casos raros, mesmo após estudos complementares, os dados obtidos não permitem concluir se um resultado é positivo ou negativo, pelo que se considera inconclusivo.

45.

Um aumento do número de células poliploides pode indicar que o produto químico em estudo apresenta potencial de inibição da mitose e de indução de aberrações cromossómicas numéricas (20). Um aumento do número de células com cromossomas endorreduplicados pode indicar que o produto químico em estudo apresenta potencial de inibição dos progressos do ciclo celular (21) (22), o que constitui um mecanismo de indução de mudanças cromossómicas numéricas diferente da inibição dos processos mitóticos (ver ponto 2). Por conseguinte, deve registar-se separadamente a incidência de células poliploides e de células com cromossomas endorreduplicados.

Relatório de ensaio

46.

O relatório de ensaio deve conter as seguintes informações:

 

Síntese.

 

Produto químico em estudo:

origem, número de lote e data-limite de utilização, se conhecidos;

estabilidade, se conhecida;

solubilidade e estabilidade no solvente, se conhecidas;

medição do pH, da pressão osmótica e da quantidade de precipitado no meio de cultura ao qual foi adicionado o produto químico em estudo, consoante o caso.

 

Substância monocomponente:

aspeto físico, hidrossolubilidade e outras propriedades físico-químicas pertinentes;

dados de identificação química, como: denominações IUPAC ou CAS, número CAS, código SMILES ou InChI, fórmula estrutural, pureza, identidade química de impurezas, caso se justifique e seja exequível, etc.

 

Substância multicomponentes, UVCB e misturas:

caracterizada, na medida do possível, pela identidade química (ver acima), pela ocorrência quantitativa e pelas principais propriedades físico-químicas dos componentes.

 

Preparação do produto químico em estudo:

justificação da escolha do veículo;

solubilidade e estabilidade do produto químico em estudo no solvente/veículo.

preparação de fórmulas alimentares, na água de beber ou inaláveis;

determinações analíticas com essas fórmulas (p. ex., estabilidade, homogeneidade, concentrações nominais). quando realizadas.

 

Animais utilizados no ensaio:

espécie/estirpe utilizada e justificação da utilização;

número e idade dos animais,

proveniência, condições de alojamento, alimentação, etc.;

método de identificação unívoca dos animais

para estudos de curta duração: peso individual dos animais machos no início e no final do teste; para estudos de duração superior a uma semana: pesos durante o estudo e consumo alimentar. Deve incluir-se, relativamente a cada grupo, a gama de pesos corporais, com a respetiva média e o desvio-padrão.

 

Condições de realização do ensaio:

controlos positivos e negativos (veículo/solvente);

resultados do eventual estudo exploratório da gama de dosagem;

fundamentação da escolha das doses;

justificação da via de administração escolhida;

detalhes da preparação do produto químico em estudo;

elementos relativos à administração do produto químico em estudo;

justificação do momento da eutanásia;

métodos de medição da toxicidade para os animais, incluindo, sempre que disponíveis, análises histopatológicas ou hematológicas e a frequência com que foram realizadas observações dos animais e dos respetivos pesos corporais;

métodos para verificar se o produto químico em estudo atingiu o tecido-alvo ou a circulação geral, caso se obtenham resultados negativos;

dose real (mg/kg de peso corporal/dia), calculada a partir da concentração do produto químico em estudo nos alimentos ou na água de beber (ppm) e do consumo, se aplicável;

elementos relativos à qualidade dos alimentos e da água;

descrição detalhada da exposição e do programa de colheita de amostras e justificação das escolhas feitas;

método de eutanásia;

eventual método de analgesia;

procedimentos para o isolamento de tecidos;

identidade do agente de fixação da metáfase e respetiva concentração e duração do tratamento;

métodos de preparação das lâminas;

critérios de contabilização das aberrações;

número de células analisadas por animal;

critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, negativo ou inconclusivo.

 

Resultados:

estado dos animais antes e durante o período de ensaio, incluindo sinais de toxicidade;

peso corporal e dos órgãos no momento da eutanásia (se forem utilizados múltiplos tratamentos, peso corporal durante o período de tratamento);

sinais de toxicidade;

índice mitótico;

proporção de células espermatogónias em mitose em relação às células em metáfase meiótica I ou II ou outras provas da exposição ao tecido-alvo;

tipo e número de aberrações, discriminados por animal;

número total de aberrações em cada grupo, com as respetivas médias e desvios-padrão;

número de células aberrantes em cada grupo, com as respetivas médias e desvios-padrão;

relação dose-resposta, se possível;

métodos estatísticos utilizados e análises estatísticas efetuadas;

dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o ensaio;

dados históricos de controlo negativo, com indicação de intervalos, médias, desvios-padrão e intervalos de confiança de 95 % (se disponíveis), ou dados históricos de controlo negativo publicados, utilizados para efeitos de aceitação dos resultados do ensaio;

dados sobre o controlo positivo simultâneo;

alterações da ploidia, quando observadas, incluindo as frequências de poliploidia e/ou de células endorreduplicadas;

 

Discussão dos resultados

 

Conclusão

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

(1)

OCDE (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Paris

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)

Hess, R.A. and de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. and Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.

(7)

Cattanach, B.M., and Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)

Cattanach, B.M., and Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313-324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. and Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

(13)

OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(14)

Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. and Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G., and Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.and Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. and Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. and Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)

Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Apêndice

DEFINIÇÕES

Aberração cromatídica: lesão estrutural de um cromossoma expressa na quebra, ou na quebra seguida de união, de cromatídeos simples.

Aberração cromossómica: lesão estrutural de um cromossoma expressa na quebra, ou na quebra seguida de união, de ambos os cromatídeos no mesmo local.

Aberração estrutural: alteração da estrutura dos cromossomas detetável por exame microscópico das células em metáfase, na forma de supressão de segmentos, de alterações de partes da sequência ou da troca de segmentos num cromatídeo ou entre cromatídeos.

Aberração numérica: alteração do número de cromossomas relativamente ao número de cromossomas característico dos animais utilizados.

Aneuploidia: desvio, num único ou em mais cromossomas, mas não por séries completas de cromossomas (poliploidia), do número diploide (ou haploide) normal de cromossomas.

Centrómero: região ou regiões de um cromossoma às quais se ligam as fibras fusiformes durante a divisão celular, permitindo o movimento organizado dos cromossomas-filhos para os polos das células-filhas.

Clastogénio: produto químico que provoca aberrações cromossomáticas estruturais em populações de células ou organismos.

Diversidade cromossómica: diversidade de formas (por exemplo, metacêntrica, acrocêntrica, etc.) e tamanhos dos cromossomas.

Genotóxico: termo genérico que abrange todos os tipos de danos no ADN ou nos cromossomas, incluindo fraturas, supressão de segmentos, aduções, ligações e alterações nucleotídicas, rearranjos, mutações, aberrações cromossómicas e aneuploidia. Nem todos os tipos de efeitos genotóxicos originam mutações ou danos cromossómicos estáveis.

Índice mitótico (MI): relação entre o número de células em metáfase e o número total de células observadas numa população de células, que fornece uma indicação do grau de proliferação da população em causa.

Lacuna: lesão acromática de extensão inferior à largura de um cromatídeo e que determina um ligeiro desalinhamento do mesmo.

Mitose: divisão do núcleo celular, habitualmente subdividida em prófase, prometáfase, metáfase, anáfase e telófase.

Mutagénico: que produz uma alteração hereditária de sequências de pares de bases do ADN em genes ou da estrutura dos cromossomas (aberrações cromossómicas).

Poliploidia: número de cromossomas múltiplo do número haploide (n), mas diferente do número diploide (ou seja, 3n, 4n e assim por diante).

Produto químico: uma substância ou mistura.

Produto químico em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.

UVCB: substâncias químicas de composição desconhecida ou variável, produtos de reação complexos e materiais biológicos.

»

(5)

Na parte B, o capítulo B.40 passa a ter a seguinte redação:

«B.40   CORROSÃO DA PELE IN VITRO: MÉTODO DE ENSAIO DA RESISTÊNCIA ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA (RET)

INTRODUÇÃO

1.

O presente método de ensaio é equivalente à Test Guideline (TG) 430 (2015) da OCDE. Entende-se por corrosão da pele a produção de danos irreversíveis nos tecidos cutâneos, que se manifestam como necrose visível em toda a epiderme e atingindo a derme, por aplicação de um produto químico em estudo [definido pelo Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos da ONU (GHS) (1) e pelo Regulamento (UE) n.o 1272/2008 da União Europeia relativo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas (CRE) (1)]. O presente método de ensaio B.40 atualizado prevê um procedimento in vitro que permite a identificação de substâncias e misturas corrosivas e não corrosivas em conformidade com o sistema GHS da ONU (1) e com o CRE.

2.

A determinação da corrosividade cutânea tem normalmente recorrido a animais de laboratório (método B.4, equivalente ao TG 404 da OCDE originalmente adotado em 1981 e revisto em 1992, 2002 e 2015) (2). Para além do presente método de ensaio B.40, foram validados e adotados outros métodos de ensaio in vitro para o ensaio do potencial de corrosão da pele dos produtos químicos, como o método de ensaio B.40bis (equivalente ao método TG 431 da OCDE) (3) e o método de ensaio B.65 (equivalente ao TG 435 da OCDE) (4), que também permitem identificar subcategorias de produtos químicos corrosivos, quando necessário. Foram adotados vários métodos de ensaio in vitro validados, como o método de ensaio B.46 [equivalente ao TG 439 da OCDE (5)], que devem ser utilizados para o ensaio de irritação cutânea. Um documento de orientação da OCDE sobre abordagens integradas de ensaio e avaliação (IATA) para a corrosão e irritação da pele descreve vários módulos que agrupam várias fontes de informação e instrumentos de análise e fornece orientações sobre (i) como integrar e utilizar os ensaios existentes e os dados não provenientes de ensaios para a avaliação dos potenciais de irritação e de corrosão cutâneas dos produtos químicos e (ii) propõe uma abordagem quando há necessidade de ensaios complementares (6).

3.

O presente método de ensaio incide na corrosão cutânea no ser humano. É baseado no método de ensaio da resistência elétrica transcudana (RET) da pele da ratazana, que utiliza discos de pele para identificar substâncias corrosivas pela sua capacidade de produzir uma perda da integridade normal do status corneum e da função de barreira. A diretriz de ensaio correspondente da OCDE foi adotada em 2004 e atualizada em 2015 para ter em conta o documento de orientação IATA.

4.

A fim de avaliar testes de corrosão da pele in vitro para fins normativos, foram realizados estudos de pré-validação (7), seguidos de um estudo de validação formal do método de ensaio RET para avaliar a corrosão cutânea na pele de ratazanas (8) (9) (10) (11). O resultado destes estudos levou à recomendação de que o método de teste RET (designado método de referência validado – MRV) poderia ser utilizado para fins normativos para a avaliação da corrosividade de pele in vivo (12) (13) (14).

5.

Antes de se poder utilizar um método de ensaio proposto de RET in vitro para a corrosão da pele diferente do MRV para efeitos normativos, é necessário determinar a sua fiabilidade e adequação (precisão), bem como as limitações para a utilização proposta, de modo a garantir a sua similaridade com o MRV, de acordo com os requisitos das normas de desempenho (15). A aceitação mútua de dados nos termos do acordo da OCDE só poderá ser garantida no caso de métodos de ensaio novos ou atualizados de acordo com as normas de desempenho, se esses métodos tiverem sido revistos e incluídos na correspondente diretriz de ensaio da OCDE.

DEFINIÇÕES

6.

As definições utilizadas constam do apêndice.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

7.

Um estudo de validação (10) e outros estudos publicados (16) (17) indicaram que o método de ensaio de RET em pele de ratazana permite distinguir substâncias reconhecidamente corrosivas da pele e não corrosivas, com uma sensibilidade global de 94 % (51/54) e uma especificidade de 71 % (48/68) para uma base de dados de 122 substâncias.

8.

O presente método de ensaio incide na corrosão da pele in vitro. Permite a identificação de produtos químicos não corrosivos e corrosivos, em conformidade com o GHS da ONU/CRE. Uma limitação do método, comprovada pelos estudos de validação (8) (9) (10) (11), reside no facto de não permitir a subcategorização de substâncias e misturas corrosivas em conformidade com o GHS da ONU/CRE. O quadro regulamentar em causa determinará a forma como o método será aplicado. Embora não forneça informações adequadas sobre a irritação da pele, deve notar-se que o método B.46 incide especificamente no efeito de irritação cutânea da pele in vitro (5). Para uma avaliação completa dos efeitos locais na pele após uma exposição única por via dérmica, consultar o documento de orientações da OCDE sobre IATA (6).

9.

Uma vasta gama de produtos químicos, constituída essencialmente por substâncias, foi testada na validação subjacente ao presente método de ensaio; a base de dados empíricos do estudo de validação foi de 60 substâncias que cobrem um vasto leque de classes químicas (8) (9). Com base nos dados globais disponíveis, o método de ensaio é aplicável a um vasto leque de classes químicas e de estados físicos, incluindo líquidos, semissólidos, sólidos e ceras. No entanto, dado que, para determinados estados físicos específicos, não se encontram imediatamente disponíveis elementos de ensaio com dados de referência adequados, é de notar que, durante a validação, foi avaliado um número comparativamente pequeno de ceras e de sólidos corrosivos. Os líquidos podem ser aquosos ou não, e os sólidos podem ser solúveis ou insolúveis na água. Nos casos em que seja possível demonstrar a inaplicabilidade do método de ensaio a uma determinada categoria de substâncias, o mesmo não deve ser utilizado para essa categoria específica de substâncias. Presume-se, além disso, que o método é aplicável às misturas como extensão da sua aplicabilidade a substâncias. No entanto, uma vez que as misturas abrangem uma vasta gama de categorias e composições e que os dados atualmente disponíveis sobre a análise de misturas são limitados, o método não deve ser utilizado para uma categoria específica de misturas nos casos em que puder ser demonstrada a sua inaplicabilidade a essa categoria específica (por exemplo, na sequência de uma estratégia como a proposta por Eskes et al., 2012) (18). Antes da aplicação do método a uma mistura para obter dados com fins normativos, importa ponderar se – e, em caso afirmativo, por que motivo – pode proporcionar resultados adequados para o efeito. Essas considerações não são necessárias se existir um requisito normativo para o ensaio da mistura. Os estudos de validação ainda não incidiram em gases e aerossóis (8) (9). Embora se admita que uns e outros possam ser testados com recurso ao método de ensaio de RET, a versão atual do método não permite o ensaio de gases nem de aerossóis.

PRINCÍPIO DO ENSAIO

10.

O produto químico em estudo é aplicado durante 24 horas, no máximo, sobre a superfície epidérmica de discos cutâneos num sistema de ensaio com dois compartimentos, no qual o disco estabelece a separação entre os compartimentos. Os discos cutâneos são retirados de ratazanas com 28 a 30 dias de idade, eutanasiadas. Os produtos químicos corrosivos são identificados pela sua capacidade de causarem uma perda da integridade normal do stratum corneum e da função de barreira, perda essa que é medida pela descida da RET abaixo de um determinado limiar (16) (ver ponto 32). Para determinação da RET na pele da ratazana, foi selecionado um valor-limite de 5 kΩ, com base numa multiplicidade de dados obtidos com uma vasta gama de substâncias, situando-se a grande maioria dos valores claramente muito acima (frequentemente > 10 kΩ) ou muito abaixo (frequentemente < 3 kΩ) desse valor (16). Em geral, os produtos químicos em estudo não são corrosivos para os animais, mas simplesmente irritantes (ou não irritantes), não reduzem a RET abaixo daquele valor-limite. A utilização de outras preparações cutâneas ou de outros equipamentos pode alterar o valor-limite, necessitando da correspondente validação.

11.

O método inclui uma etapa de ligação de um corante, para a confirmação dos resultados positivos na determinação da RET (incluindo próximos de 5 kΩ). A etapa de ligação do corante esclarece se o aumento de permeabilidade iónica se deve à destruição física do stratum corneum. O método de determinação da RET em pele de ratazana revelou-se capaz de prever a corrosividade in vivo no coelho, determinada pelo TM B.4 (2).

DEMONSTRAÇÃO DE COMPETÊNCIA

12.

Antes de utilizarem de forma rotineira o método de ensaio de RET em pele de ratazana conforme ao presente método de ensaio, os laboratórios devem demonstrar a sua competência técnica, classificando corretamente as doze substâncias de referência recomendadas no quadro 1. No caso de uma substância incluída na lista estar indisponível ou sempre que se justifique, pode ser utilizada outra substância para a qual estejam disponíveis dados adequados de referência in vivo e in vitro [por exemplo, da lista de produtos químicos de referência (16)], desde que sejam aplicados os critérios de seleção descritos no quadro 1.

Quadro 1

Lista de substâncias de referência  (2)

Substância

N.o CAS

Classe química (3)

SISTEMA GHS DA ONU/CRE Cat. com base em resultados em vivo  (4)

MRV Cat. com base em resultados in vitro

Estado físico

pH (5)

Corrosivos in vivo

N,N’-Dimetil dipropilenotriamina

10563-29-8

Base orgânica

1A

6 × C

L

8,3

1,2-Diaminopropano

78-90-0

Base orgânica

1A

6 × C

L

8,3

Ácido sulfúrico (10 %)

7664-93-9

Ácido inorgânico

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × × NC

L

1,2

Hidróxido de potássio (solução aquosa a 10 %)

1310-58-3

Base orgânica

(1A/)1B/1C

6 × C

L

13,2

Ácido octanoico (caprílico)

124-07-2

Ácido orgânico

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,6

2-terc-butilfenol

88-18-6

Fenol

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,9

Não corrosivos in vivo

Ácido isoesteárico

2724-58-5

Ácido orgânico

NC

6 × NC

L

3,6

4-Amino-1,2,4-triazolo

584-13-4

Base orgânica

NC

6 × NC

S

5,5

Brometo de fenetilo

103-63-9

Eletrófilo

NC

6 × NC

L

3,6

4-(Metiltio)-benzaldeído

3446-89-7

Eletrófilo

NC

6 × NC

L

6,8

1,9-Decadieno

1647-16-1

Orgânico neutro

NC

6 × NC

L

3,9

Tetracloroetileno

127-18-4

Orgânico neutro

NC

6 × NC

L

4,5

Abreviaturas: aq = aquoso; N.o CAS = número de registo do Chemical Abstracts Service; MRV = método de referência validado; C = corrosivo; NC = não corrosivo.

PROCEDIMENTO

13.

Existem procedimentos operacionais normalizados (PON) para o método de ensaio de corrosão da pele de ratazana (19). Os protocolos de ensaio de RET em pele de ratazana abrangidos pelo presente método devem cumprir as condições que se seguem.

Animais

14.

Devem utilizar-se ratazanas, uma vez que a sensibilidade da sua pele às substâncias deste método de ensaio foi previamente demonstrada (12) e é a única fonte de pele que foi formalmente validada (8) (9). A estirpe e a idade da ratazana (no momento da colheita da pele) assumem particular importância, devendo os folículos pilosos encontrar-se na fase de dormência, antes do crescimento da pilosidade adulta.

15.

Com uma pequena tosquiadora, cortam-se cuidadosamente os pelos dorsais e dos flancos de ratazanas, fêmeas ou machos, jovens (estirpe Wistar ou comparável), com aproximadamente 22 dias de idade. Os animais são depois cuidadosamente lavados e esfregados, devendo a zona da pele que irá ser utilizada ser mergulhada numa solução antibiótica (contendo, por exemplo, estreptomicina, penicilina, cloranfenicol e anfotericina em concentrações suficientes para inibir o crescimento bacteriano). Os animais voltam a ser lavados com solução antibiótica no terceiro ou quarto dia após a primeira lavagem e são utilizados nos três dias seguintes à segunda lavagem, quando o stratum corneum tiver recuperado da tosquia.

Preparação dos discos cutâneos

16.

Os animais são eutanasiados entre a idade de 28 e 30 dias (este fator é muito importante). Em seguida, retira-se a pele dorsal lateral e remove-se a gordura subcutânea em excesso, raspando cuidadosamente. Cortam-se discos cutâneos de aproximadamente 20 mm de diâmetro. A pele pode ser guardada antes da utilização dos discos, desde que se demonstre que os dados de controlo (positivos e negativos) são equivalentes aos obtidos com pele fresca.

17.

Cada disco cutâneo é colocado numa das extremidades de um tubo de politetrafluoroetileno (PTFE), com a superfície epidérmica em contacto com o tubo. A pele é fixada na extremidade do tubo com uma junta tónica em borracha e elimina-se o tecido em excesso. A junta tórica é então envolvida em vaselina, de forma a garantir a estanquidade da sua união com o tubo de PTFE. Este é depois suspenso com uma tampa-suporte de molas dentro de uma câmara recetora com uma solução de MgSO4 (154 mM) (figura 1). O disco cutâneo deve ficar totalmente imerso na solução de MgSO4. Cada pele de ratazana pode fornecer de 10 a 15 discos cutâneos. As dimensões do tubo e da junta tónica são as apresentadas na figura 2.

18.

Antes do início do ensaio, a RET de dois discos cutâneos é medida a título de procedimento de controlo de qualidade para cada pele. Ambos os discos devem apresentar valores de resistência elétrica superiores a 10 kΩ para o resto dos discos a utilizar no método de ensaio. Se o valor da resistência for inferior a 10 kΩ, os discos restantes da pele em causa serão rejeitados.

Aplicação do produto químico em estudo e das substâncias de controlo

19.

Para garantir a adequabilidade do modelo experimental, devem utilizar-se em paralelo, em cada estudo (experiência), uma amostra de controlo positiva e uma amostra de controlo negativa. Em cada estudo (ensaio) devem utilizar-se discos de pele de um único animal. Como substâncias de controlo positivo e negativo sugerem-se o ácido clorídrico 10 M e a água destilada, respetivamente.

20.

Os produtos químicos em estudo líquidos são aplicados uniformemente (150 μl) na superfície epidérmica no interior do tubo. Se a matéria ensaiada for sólida, aplicar-se-á uniformemente no disco uma quantidade suficiente da mesma, de modo a cobrir toda a superfície epidérmica. Em seguida, deita-se água desionizada (150 μl) por cima do sólido e agita-se suavemente o tubo. Para garantir um contacto máximo com a pele, pode ser necessário aquecer as matérias sólidas a 30 °C, para fundir ou amolecer o produto químico em estudo, ou moê-las, para produzir um pó ou granulado.

21.

São utilizados três discos de pele para cada ensaio e cada produto químico de controlo em cada série de ensaios. Os produtos químicos de ensaio são aplicados por 24 horas, a 20-23 °C. O produto químico é removido por lavagem com um jato de água da torneira até que seja atingida a temperatura ambiente e não haja mais material a remover.

Medições de RET

22.

A impedância da pele é medida como RET por meio de uma ponte de Wheatstone de baixa tensão e corrente alternada (18). As especificações gerais da ponte de Wheatstone são as seguintes: tensão operacional de 1 V a 3 V, corrente alternada sinusoidal ou retangular de 50 Hz a 1 000 Hz e gama de medição de pelo menos 0,1 kΩ a –30 kΩ. A ponte utilizada no estudo de validação media valores de indutância, capacitância e resistência até 2 000 H, 2 000 μF e 2 MΩ, respetivamente, a frequências de 100 Hz ou 1 kHz, utilizando valores em série ou em paralelo. Para o ensaio RET de corrosividade, as medições são registadas em resistência, à frequência de 100 Hz, utilizando valores em série. Antes da medição da resistência elétrica, reduz-se a tensão superficial da pele adicionando um volume de etanol a 70 % suficiente para cobrir toda a epiderme. Após alguns segundos, remove-se o etanol do tubo e hidrata-se o tecido adicionando 3 ml de solução de sulfato de magnésio (154 mM). Para medir a resistência do disco cutâneo em kΩ, colocam-se os elétrodos da ponte de Wheatstone de cada um dos lados do disco (figura 1). As dimensões dos elétrodos e o comprimento de cada elétrodo abaixo da pinça crocodilo são indicados na figura 2. A pinça aplicada ao elétrodo interno deve ficar apoiada no rebordo do tubo de PTFE durante a medição da resistência, de forma a garantir que o comprimento de elétrodo mergulhado na solução de sulfato de magnésio seja constante. O elétrodo externo deve ser colocado dentro da câmara recetora de forma a tocar no fundo da mesma. A distância entre a tampa-suporte de molas (spring clip) e o fundo do tubo de PTFE deve ser mantida constante (figura 2), porque afeta o valor de resistência medido. A distância entre o elétrodo interno e o disco cutâneo deve ser mínima (1 mm a 2 mm) e constante.

23.

Se o valor de resistência medido exceder 20 kΩ, tal pode dever-se à presença de restos do produto químico em estudo na superfície epidérmica do disco cutâneo. Para eliminar essas matérias, poderá, por exemplo, tapar-se o tubo de PTFE com o polegar, usando luvas de borracha, e agitar-se durante cerca de 10 segundos. Rejeita-se a solução de sulfato de magnésio e repete-se a medição da resistência com solução fresca de MgSO4.

24.

As propriedades e dimensões da montagem de ensaio e o procedimento experimental aplicado podem influenciar os valores de RET obtidos. O limite de corrosão de 5 kΩ foi estabelecido a partir de dados obtidos com a montagem e segundo os procedimentos especificamente descritos no presente método. Se as condições de ensaio forem alteradas ou for utilizada uma montagem diferente, poderão ser aplicáveis outros valores-limite e de controlo. É, portanto, necessário calibrar a metodologia e os valores-limite de resistência ensaiando uma série de substâncias de referência selecionadas a partir das substâncias utilizadas no estudo de validação (8) (9), ou de classes químicas similares às das substâncias em estudo. O quadro 1 apresenta uma série de substâncias de referência adequadas.

Métodos da ligação de corante

25.

A exposição a determinadas matérias não corrosivas pode originar uma redução da resistência para valores inferiores ao limite de 5 kΩ, ao permitir a passagem de iões através do stratum corneum, que se traduz numa redução da resistência elétrica (9). Determinados compostos orgânicos neutros e substâncias, por exemplo, tensioativas (detergentes, emulsionantes e outras substâncias), podem remover os lípidos cutâneos, daí resultando uma maior permeabilidade iónica da barreira. Assim, se os valores de RET produzidos por esses produtos químicos forem inferiores ou iguais a cerca de 5 kΩ, na ausência de lesões visualmente percetíveis dos discos cutâneos, deve proceder-se a uma avaliação da penetração de corantes nos tecidos de controlo e nos tecidos tratados, a fim de determinar se os valores de RET obtidos se deveram a uma maior permeabilidade cutânea ou à corrosão da pele (7) (9). Neste último caso, se o stratum corneum estiver danificado, o corante sulforrodamina B, uma vez aplicado na superfície da pele, penetrará rapidamente e colorará o tecido subjacente. Este corante específico é estável perante uma grande variedade de substâncias, e não é afetado pelo processo de extração acima referido.

Aplicação e eliminação do corante sulforrodamina B

26.

Depois da determinação da RET, a solução de sulfato de magnésio é removida do tubo e verifica-se cuidadosamente se a pele apresenta danos evidentes. Se não houver danos graves óbvios (por exemplo, perfuração), são aplicados à superfície epidérmica de cada disco de pele, durante 2 horas, 150 μl de uma solução a 10 % (m/v) em água destilada do corante sulforrodamina B (Acid Red 52; C.I. 45100; número CAS 3520-42-1). Lavam-se de seguida os discos em água corrente, à temperatura ambiente, durante cerca de 10 segundos, a fim de remover o corante em excesso ou não fixado. Os discos de pele devem então ser cuidadosamente retirados do tubo de PTFE e colocados num recipiente (por exemplo: um frasco de 20 ml) com água desmineralizada (8 ml). Agitam-se cuidadosamente os frascos durante 5 minutos, para remover os restos de corante que eventualmente não se tenham fixado. Repete-se este procedimento de lavagem e transferem-se os discos cutâneos para frascos que contenham 5 ml de uma solução a 30 % (m/v) de dodecilsulfato de sódio (SDS) em água destilada, incubando-se a 60 °C de um dia para o outro.

27.

Depois da incubação, os discos cutâneos são retirados e rejeitados e a solução remanescente em cada frasco é centrifugada durante 8 minutos a 21 °C (força relativa de centrifugação: ~175 × g). Dilui-se então a 1:5 (v/v, ou seja, 1 ml + 4 ml) uma amostra de 1 ml do líquido sobrenadante com uma solução a 30 % (m/v) de SDS em água destilada. Mede-se a densidade ótica da solução resultante, a 565 nm.

Cálculo da concentração de corante

28.

A concentração do corante sulforrodamina B por disco é calculada a partir dos valores de densidade ótica (9) (coeficiente de extinção molar do corante sulforrodamina B a 565 nm = 8,7 × 104; massa molecular = 580). Utilizando uma curva de calibração apropriada, determina-se a concentração de corante correspondente a cada disco cutâneo, calculando-se em seguida uma concentração média de corante para os replicados.

Critérios de aceitabilidade

29.

Os valores médios de RET obtidos serão aceites se os valores das amostras de controlo positiva e negativa correspondentes se encontrarem dentro dos intervalos aceitáveis para o método no laboratório de ensaio. Os intervalos de resistência aceitáveis para o método e a montagem acima descritos são indicados no quadro seguinte:

Controlo

Substância

Intervalo de resistência (kΩ)

Positivo

Ácido clorídrico 10 M

0,5 – 1,0

Negativo

Água destilada

10 – 25

30.

Os valores médios obtidos para a ligação do corante serão aceites se os valores das amostras de controlo correspondentes se encontrarem dentro dos intervalos aceitáveis para o método. Os intervalos aceitáveis de concentração de corante que se sugerem para as substâncias de controlo, para o método e a montagem acima descritos, são indicados no quadro seguinte:

Controlo

Substância

Intervalo de concentração de corante (μg/disco)

Positivo

Ácido clorídrico 10 M

40 – 100

Negativo

Água destilada

15 – 35

Interpretação dos resultados

31.

O valor-limite de TER que permite distinguir os produtos químicos corrosivos dos não corrosivos foi estabelecido durante a fase de otimização do método, testado numa fase de pré-validação e confirmado num estudo de validação formal.

32.

O modelo de previsão do método de ensaio de corrosão cutânea em ratazanas (9) (19), associado ao sistema de classificação GHS da ONU/CRE, é apresentado a seguir:

O produto químico em estudo é considerado não corrosivo para a pele se:

i)

o valor médio de RET obtido para a substância em estudo exceder 5 kΩ, ou

ii)

o valor médio de RET obtido para o produto químico em estudo for inferior ou igual a 5 kΩ e

os discos de pele não apresentarem danos evidentes (por exemplo, perfuração) e

o teor médio de corante dos discos for inferior ao teor médio de corante de 10M de HCl para o controlo positivo obtido simultaneamente (ver ponto 30 para valores de controlo positivo).

Considera-se que o produto químico em estudo é corrosivo para a pele se:

i)

o valor médio de RET obtido para o produto químico em estudo for inferior ou igual a 5 kΩ e os discos de pele estiverem claramente danificados (por exemplo, perfurados), ou

ii)

o valor médio de RET obtido para o produto químico em estudo for inferior ou igual a 5 kΩ e

os discos de pele não apresentarem danos evidentes (por exemplo, perfuração), mas

a concentração média de corante do disco for superior ou igual à concentração média de corante de 10M de HCl para o controlo positivo obtido simultaneamente (ver ponto 30 para valores de controlo positivo).

33.

Se a classificação do produto químico em estudo for inequívoca, basta normalmente uma série de ensaios (experiência) constituída por, pelo menos, três discos replicados de pele. Contudo, em caso de resultados inconclusivos (por exemplo, medições discordantes dos replicados e/ou RET médio igual a 5 ±0,5 kΩ, deve ser considerada uma segunda série de testes independentes (experiência), bem como uma terceira em caso de resultados discordantes entre os dois primeiros ensaios (experiências).

DADOS E RELATÓRIOS

Dados

34.

Os valores da resistência (kΩ) e os valores do teor de corante (μg/disco), se for caso disso, para o produto químico em estudo, bem como para os controlos positivos e negativos devem ser apresentados sob a forma de uma tabela, incluindo os dados para cada disco individual replicado (experiência) e os valores médios ±do DP. Todas as repetições de experiências devem ser comunicadas. Devem comunicar-se os danos observados nos discos cutâneos relativamente a cada produto químico em estudo.

Relatório de ensaio

35.

O relatório de ensaio deve conter as seguintes informações:

 

Produto químico em estudo e substâncias de controlo

Substância monocomponente: dados de identificação química, como as denominações IUPAC ou CAS, número CAS, código SMILES ou InChI, fórmula estrutural, pureza, identidade química das impurezas, caso se justifique e seja exequível, etc.;

Substância multicomponentes, UVCB e mistura: caracterizada, na medida do possível, pela identidade química (ver acima), ocorrência quantitativa e pelas propriedades físico-químicas dos componentes;

Aspeto físico, solubilidade em água e outras propriedades físico-químicas pertinentes;

Proveniência e número do lote, se disponíveis;

Tratamento do produto químico em estudo/substância de controlo antes do ensaio, se for o caso;

Estabilidade do produto químico em estudo, data-limite de utilização ou data de reanálise, se conhecidas;

Condições de armazenagem.

 

Animais de ensaio

Estipe e sexo;

Idade dos animais no momento em que foram dadores;

Proveniência, condições de alojamento, alimentação, etc.;

Pormenores sobre a preparação da pele.

 

Condições de realização do ensaio

Curvas de calibração da montagem de ensaio;

Curvas de calibração para o ensaio de desempenho de ligação do corante, filtro de banda passante utilizado para a medição da densidade ótica (DO) e linearidade do dispositivo de medição da DO (espetrofotómetro), se for caso disso;

Pormenores sobre o método de ensaio utilizado na medição das RET;

Pormenores sobre o método de ensaio utilizado na medição da ligação do corante, se tiver sido o caso;

Doses de ensaio utilizadas, duração do(s) período(s) de exposição e temperatura(s) de exposição;

Informações pormenorizadas sobre o procedimento de lavagem utilizado após o período de exposição;

Número de replicados cutâneos utilizados para cada produto químico em estudo (controlos positivos e negativos);

Descrição de eventuais modificações na execução do ensaio;

Referência a dados anteriormente publicados sobre o modelo; tal deve incluir, nomeadamente, o seguinte:

i)

Aceitabilidade dos valores do controlo positivo e negativo de RET (em kΩ), por referência aos intervalos de resistência do controlo positivo e negativo,

ii)

Aceitabilidade dos valores do controlo positivo e negativo do teor de corante (em μg/disco) por referência a concentrações de corante de controlo positivo e negativo,

iii)

Aceitabilidade dos resultados do ensaio por referência à variabilidade histórica entre os replicados do disco cutâneo,

Descrição do modelo de critérios de decisão/previsão aplicado.

 

Resultados

Quadro dos dados correspondentes aos ensaios específicos de determinação da RET e de ligação dos corantes (se for caso disso) para cada produto químico em estudo e controlos, para cada série de ensaios (experiências) e cada replicado de disco cutâneo (animais individuais e amostras individuais de pele), médias, DS e CV;

Descrição dos efeitos eventualmente observados;

Classificação atribuída, mencionando o modelo de previsão ou os critérios de decisão utilizados.

 

Discussão dos resultados

 

Conclusões

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

(1)

Nações Unidas (ONU) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Disponível em: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Capítulo B.4 deste anexo, «Toxicidade aguda: irritação/corrosão dérmica»

(3)

Capítulo B.40-A deste anexo, «Corrosão da pele in vitro

(4)

Capítulo B.65 deste anexo: «Método de ensaio da membrana de estanquidade in vitro»

(5)

Capítulo B.46 deste anexo, «Irritação cutânea in vitro: método de ensaio em epiderme humana reconstruída»

(6)

OCDE (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., and Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., and Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OCDE (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., and Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OCDE (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Devlopment, Paris.

Figura 1

Montagem Para o Ensaio da ret em Pele de Ratazana

Image 2

Figura 2

Dimensões do tubo de Politetrafluoroetileno (PTFE) e do Tubo Recetor, bem como dos Elétrodos Utilizados

Image 3

Fatores críticos da montagem ilustrada:

Diâmetro interno do tubo de PTFE;

Comprimento dos elétrodos em relação ao tubo de PTFE e ao tubo recetor, para que os elétrodos não toquem no disco cutâneo e de modo que um comprimento fixo de elétrodo esteja em contacto com a solução de MgSO4;

A quantidade de solução de MgSO4 no tubo recetor deve produzir, em relação ao nível no tubo de PTFE, um nível de líquido conforme o ilustrado na figura 1;

O disco cutâneo deve ser convenientemente fixado ao tubo de PTFE, para que a resistência elétrica seja uma medida fiável das propriedades da pele.

Apêndice

DEFINIÇÕES

Adequação : Relação do método de ensaio com o efeito em causa; pertinência e utilidade do ensaio para o fim em vista. Traduz a medida em que o método de ensaio mede ou prevê corretamente o efeito biológico em causa. A adequação compreende a exatidão (concordância) do método de ensaio (20).

C : Corrosivo

Concordância : Uma medida do desempenho do método de ensaio no caso dos métodos cujos resultados sejam estabelecidos em função de categorias e constitui um dos aspetos da adequação. Este termo e o termo «exatidão» são muitas vezes utilizados indistintamente para indicar a proporção de produtos químicos testados que são corretamente classificados como positivos ou negativos. A concordância é altamente dependente da prevalência do produto químico em estudo positivos no tipo de produto químico em estudo (20).

Corrosão da pele in vivo : Produção de danos irreversíveis à pele, nomeadamente a necrose visível da epiderme, prolongando-se para a derme, após a aplicação de um produto químico em estudo durante um máximo de quatro horas. São exemplos típicos de reações corrosivas as úlceras, hemorragias e escaras sanguinolentas e, para o final do período de observação de 14 dias, a descoloração, devido à perda de pigmentação da pele, a formação de zonas de alopécia total e a ocorrência de cicatrizes. As lesões duvidosas poderão ser esclarecidas por métodos histopatológicos.

CP : Amostra de controlo positiva, um replicado que contém todos os componentes do sistema de ensaio e foi tratado com uma substância que comprovadamente induz reação positiva. Para que possa determinar-se a variabilidade no tempo da reação a esta amostra de controlo, essa reação não deve ser excessivamente positiva.

DO : Densidade ótica.

Especificidade : Proporção dos produtos químicos negativos/inativos que são corretamente classificados pelo método de ensaio. Constitui uma medida da exatidão de um método de ensaio cujos resultados sejam estabelecidos em função de categorias e é um aspeto importante a ter em conta na avaliação da adequação do método de ensaio (20).

Exatidão : Grau de acordo entre os resultados do método de ensaio e os valores de referência aceites. Constitui uma medida do desempenho do método e um dos aspetos da adequação. Este termo e o termo «concordância» são muitas vezes utilizados indistintamente para indicar a proporção de resultados corretos de um método de ensaio (20).

Fiabilidade : Medida em que, utilizando o mesmo protocolo, um método de ensaio pode ser continuadamente reproduzido no mesmo laboratório e em laboratórios diferentes. A fiabilidade é avaliada com base nos valores calculados das reprodutibilidades intralaboratorial e interlaboratorial (20).

GHS (Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (ONU)) : Sistema que propõe a classificação dos produtos químicos (substâncias e misturas) em função de tipos e níveis normalizados de perigos físicos, sanitários e ambientais e trata ainda dos correspondentes elementos de comunicação, como pictogramas, palavras-sinal, advertências de perigo, recomendações de prudência e fichas de dados de segurança, de modo a transmitir informações sobre os efeitos indesejáveis do produto em causa, com vista à proteção das pessoas (empregadores, trabalhadores, transportadores, consumidores, pessoal dos serviços de emergência, etc.) e do ambiente (1).

IATA : Abordagem integrada de ensaio e avaliação.

Mistura : Uma mistura ou solução composta por duas ou mais substâncias.

Substância monocomponente : Substância, definida pela sua composição quantitativa, da qual um dos principais componentes está presente num teor de, pelo menos, 80 % (m/m).

Substância multicomponentes : Substância, definida pela sua composição quantitativa, da qual mais de um dos principais componentes está presente numa concentração ≥ 10 % (m/m) e < 80 % (m/m). As substâncias multicomponentes resultam de processos de fabrico. A diferença entre uma mistura e uma substância multicomponentes reside em que a primeira se obtém misturando duas ou mais substâncias, sem reação química. As substâncias multicomponentes resultam de reações químicas.

NC : Não corrosivo.

Normas de desempenho : Normas associadas a um método de ensaio validado com base nas quais pode ser avaliada a comparabilidade de um método de ensaio proposto que lhe seja funcional e mecanisticamente similar. Incluem: (i) componentes essenciais do método de ensaio; (ii) uma lista mínima de produtos químicos de referência, escolhidos de entre os produtos químicos utilizados para demonstrar o desempenho aceitável do método de ensaio validado; e (iii) níveis de fiabilidade e exatidão semelhantes, baseados no que foi obtido para o método de ensaio validado, que o método de ensaio proposto deve demonstrar quando avaliado pela utilização da lista mínima de produtos químicos de referência.

Produto químico : Uma substância ou mistura.

Produto químico em estudo : Qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.

Resistência elétrica transcutânea (RET) : Valor da resistência em kΩ medido para a impedância elétrica da pele. Trata-se de um método simples e robusto de avaliação da função de barreira por meio do registo do fluxo iónico através da pele com uma ponte de Wheatstone.

Sensibilidade : Proporção dos produtos químicos positivos/ativos que são corretamente classificados pelo método de ensaio. Constitui uma medida da exatidão de um método de ensaio cujos resultados sejam estabelecidos em função de categorias e é um aspeto importante a ter em conta na avaliação da adequação do método de ensaio (20).

Série (de ensaio) : Um único produto químico em estudo testado simultaneamente num mínimo de três discos de pele.

Substância : um elemento químico e os seus compostos no estado natural ou obtido por qualquer processo de produção, incluindo qualquer aditivo necessário para preservar a sua estabilidade e qualquer impureza derivada do processo utilizado, mas excluindo qualquer solvente que possa ser separado sem afetar a estabilidade da substância nem modificar a sua composição.

UVCB : Substâncias de composição desconhecida ou variável, produtos de reação complexos ou materiais biológicos.

»

(6)

Na parte B, o capítulo B.40.A passa a ter a seguinte redação:

«B.40.A.   CORROSÃO DA PELE IN VITRO: MÉTODO DE ENSAIO COM EPIDERME HUMANA RECONSTRUÍDA (RHE)

INTRODUÇÃO

1.

O presente método de ensaio é equivalente à Test Guideline (TG) 431 (2016) da OCDE. Entende-se por corrosão da pele a produção de danos irreversíveis nos tecidos cutâneos, que se manifestam como necrose visível em toda a epiderme e atingindo a derme, por aplicação de um produto químico em estudo [definido pelo Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos da ONU (GHS) (1) e pelo Regulamento (UE) n.o 1272/2008 da União Europeia relativo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas (CRE) (6)]. O presente método de ensaio B.40bis atualizado prevê um procedimento in vitro que permite a identificação de substâncias e misturas corrosivas e não corrosivas em conformidade com o sistema GHS da ONU e com o CRE. Permite igualmente uma subcategorização parcial de substâncias corrosivas.

2.

A determinação do potencial de corrosão cutânea de produtos químicos tem normalmente recorrido a animais de laboratório (método B.4 ao TG 404 da OCDE originalmente adotado em 1981 e revisto em 1992, 2002 e 2015) (2). Para além do presente método de ensaio B.40bis, foram validados e adotados dois outros métodos para o ensaio in vitro do potencial de corrosão da pele dos produtos químicos, como o método B.40 (equivalente ao método TG 430 da OCDE) (3) e o método B.65 (equivalente ao método TG 435 da OCDE) (4). Além disso, foi adotado o método B.46 (equivalente à Test Guideline TG 439 da OCDE) (5) para o ensaio in vitro do potencial de irritação cutânea. Um documento de orientação da OCDE sobre abordagens integradas de ensaio e avaliação (IATA) para a corrosão e corrosão da pele descreve vários módulos que agrupam as fontes de informação e os instrumentos de análise e fornece orientações sobre: i) como integrar e utilizar os ensaios existentes e os dados não obtidos no ensaio de avaliação de potenciais de produtos químicos em termos de irritação cutânea e de corrosão cutânea e ii) propor uma abordagem na necessidade de ensaios complementares (6).

3.

O presente método de ensaio incide na corrosão cutânea no ser humano. Utiliza a epiderme humana reconstruída (obtida a partir de queratinócitos de epiderme humana não transformados) que reproduz com rigor as propriedades histológicas, morfológicas, bioquímicas e fisiológicas das partes superiores da pele humana, isto é, da epiderme. A diretriz de ensaio da OCDE foi adotada inicialmente em 2004 e atualizada em 2013, a fim de incluir métodos de ensaio adicionais utilizando modelos de epiderme humana reconstruída e a possibilidade de utilizar os métodos de apoio à subcategorização de produtos químicos corrosivos e de novo atualizada em 2015 para ter em conta o documento de orientação da IATA e para introduzir a utilização de um procedimento alternativo para a medição da viabilidade.

4.

O presente método inclui quatro modelos validados comercialmente disponíveis de epiderme humana reconstruída. Foram realizados estudos de pré-validação (7), seguidos de um estudo de validação formal para avaliar a corrosão da pele (8) (9) (10) (12) relativamente a dois desses modelos de ensaio comercialmente disponíveis, o método Modelo Normalizado de EpiSkin™ e o método Ensaio de corrosividade cutânea EpiDerm™ (EPI-200), referidos no texto como métodos de referência validados – MRV. O resultado destes estudos levou à recomendação de que os dois MRV supramencionados podem ser utilizados para fins normativos para distinguir as substâncias corrosivas (C) das substâncias não corrosivas (NC) e de que o método EpiSkin™ pode, além disso, ser utilizado para apoiar a subcategorização das substâncias corrosivas (13) (14) (15). Dois outros modelos de ensaio de corrosão cutânea in vitro em epiderme humana reconstruída disponíveis comercialmente em corrosão cutânea in vitro têm mostrado resultados similares ao do MRVEpiDerm™ de acordo com a validação baseada em PS (16)(17)(18). Trata-se de SkinEthic™ RHE (7) and epiCS® (anteriormente designado EST-1000), que também podem ser utilizados para fins normativos, para distinguir substâncias corrosivas e não corrosivas (19) (20). Estudos de pós-validação realizados pelos produtores do modelo de epiderme humana reconstruída nos anos de 2012 a 2014 com um protocolo aperfeiçoado que corrige interferências de redução MTT inespecífica pelo produto químico em estudo permitiram melhorar o desempenho da discriminação de C/NC, bem como da subcategorização de corrosivos (21) (22). Foram realizadas outras análises estatísticas dos dados pós-validação gerados com EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE and EpiCS® para identificar modelos previsionais alternativos que tenham melhorado a capacidade de prever a subcategorização (23).

5.

Antes de se poder utilizar um método de ensaio proposto de RhE in vitro para a corrosão da pele similar ou alterado diferente dos MRV para efeitos normativos, é necessário determinar a sua fiabilidade e adequação (exatidão), bem como as limitações para a utilização proposta, de modo a garantir a sua similaridade com os MRV, de acordo com os requisitos das normas de desempenho (15) estabelecidas em conformidade com os princípios do documento de orientação n.o 34 da OCDE (25). A aceitação mútua de dados nos termos do acordo da OCDE só poderá ser garantida no caso de métodos de ensaio novos ou atualizados de acordo com as normas de desempenho, se estes métodos tiverem sido revistos e incluídos na correspondente diretriz de ensaio da OCDE. Os modelos de ensaio incluídos nessa diretriz de ensaio podem ser utilizados para satisfazer as exigências dos países em matéria de resultados dos ensaios sobre o método de ensaio in vitro da corrosão cutânea, beneficiando simultaneamente da aceitação mútua de dados.

DEFINIÇÕES

6.

As definições utilizadas constam do apêndice 1.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

7.

O presente método de ensaio permite a identificação de substâncias e misturas corrosivas e não corrosivas em conformidade com o GHS da ONU e com o CRE. Corrobora a subcategorização de substâncias e misturas corrosivas na subcategoria facultativa 1A, em conformidade com o sistema GHS da ONU (1), bem como numa combinação das subcategorias 1B e 1C (21) (22) (23). Uma limitação deste método é que não permite discriminar entre a subcategoria 1B e a subcategoria 1C, de acordo com o GHS da ONU e com o CRE, devido ao conjunto limitado de produtos químicos corrosivos in vivo conhecidos da subcategoria 1C. Os modelos de ensaio EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE and epiCS® permitem classificar em subcategorias (ou seja, 1A versus 1B e 1C versus NC)

8.

Uma vasta gama de produtos químicos – principalmente substâncias individuais – foi testada, na validação, para apoio dos modelos de ensaio incluídos neste método, utilizados para a identificação de substâncias corrosivas e não corrosivas; a base de dados empíricos do estudo de validação foi constituída por 60 produtos químicos que cobrem um vasto leque de classes químicas (8) (9) (10). Os ensaios para demonstrar a sensibilidade, a especificidade, a exatidão e a reprodutibilidade intralaboratorial do ensaio para a subcategorização foram realizados pelos concetores do método; os resultados foram revistos pela OCDE (21) (22) (23). Com base nos dados globais disponíveis, o método de ensaio é aplicável a um vasto leque de classes químicas e de estados físicos, incluindo líquidos, semissólidos, sólidos e ceras. Os líquidos podem ser aquosos ou não, e os sólidos podem ser solúveis ou insolúveis na água. Sempre que possível, os sólidos devem ser moídos em pó fino antes da aplicação; nenhum outro tratamento prévio da amostra é necessário. Nos casos em que se possa demonstrar a inaplicabilidade de modelos de ensaio incluídos neste método a uma categoria específica de produtos químicos em estudo, estes não devem ser utilizados para essa categoria específica de produtos químicos. Presume-se, além disso, que o método de ensaio é aplicável às misturas como extensão da sua aplicabilidade a substâncias. No entanto, uma vez que as misturas abrangem uma vasta gama de categorias e composições e que só se dispõe atualmente de informações limitadas sobre a análise de misturas, nos casos em que se possa demonstrar a inaplicabilidade do método de ensaio a uma categoria específica de misturas – por exemplo, na sequência de uma estratégia como a proposta no ponto (26) –, o método de ensaio não deve ser utilizado para essa categoria específica de misturas. Antes da aplicação do método a uma mistura para obter dados com fins normativos, importa ponderar se – e, em caso afirmativo, por que motivo – o mesmo pode proporcionar resultados adequados para o efeito. Essas considerações não são necessárias se existir um requisito normativo para o ensaio da mistura. Os gases e aerossóis ainda não foram avaliados em estudos de validação (8) (9) (10). Embora se possa considerar que podem ser ensaiados utilizando a tecnologia da epiderme humana reconstruída, o método de ensaio atual não permite o ensaio de gases e aerossóis.

9.

Os produtos químicos que absorvem luz na mesma gama que o MTT formazano e os produtos químicos em estudo capazes de reduzir diretamente o corante vital MTT (MTT formazano) podem interferir nas medições da viabilidade dos tecidos e requerer a aplicação de controlos adaptados para correções. O tipo de controlos adaptados que podem ser necessários varia em função do tipo de interferência resultante do produto químico em estudo e do procedimento utilizado para medir o formazano MTT (ver pontos 25 a 31).

10.

Embora o presente método de ensaio não forneça informações adequadas sobre a irritação da pele, deve notar-se que o método B.46 aborda especificamente a irritação cutânea in vitro e se baseia no mesmo sistema de ensaio de RhE, embora com outro protocolo (5). Para uma avaliação completa dos efeitos locais na pele após uma exposição única por via dérmica, deve consultar-se o documento de orientações da OCDE relativo a abordagens integradas de ensaio e avaliação da OCDE (6). Esta abordagem IATA inclui a realização de ensaios de corrosão cutânea in vitro (tal como descrito no presente método) e de irritação cutânea, antes de ponderar a realização de ensaios em animais vivos. Sabe-se que a utilização de pele humana está sujeita a condições e argumentos nacionais e internacionais de natureza ética.

PRINCÍPIO DO ENSAIO

11.

O produto químico em estudo é aplicado localmente num modelo tridimensional de epiderme humana reconstruída, constituído por queratinócitos de epiderme humana não transformados, cultivados de modo a formarem um modelo com várias camadas e altamente diferenciado. Este é constituído por uma camada basal, uma camada espinhosa e uma camada granulosa organizadas e por um stratum corneum em várias camadas, com uma estrutura lipídica lamelar intercelular representativa das principais classes de lípidos, semelhante ao observado in vivo.

12.

O método de ensaio RhE baseia-se na premissa de que os produtos químicos corrosivos podem penetrar no stratum corneum por difusão ou erosão e são citotóxicos para as células das camadas subjacentes. A viabilidade celular é medida por conversão enzimática do corante vital MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, azul de tiazolilo, n.o CAS 298-93-1] num sal azul de formazano, que é determinado quantitativamente depois de extraído dos tecidos (20). Os produtos químicos corrosivos são identificados pela sua capacidade de reduzir a viabilidade celular abaixo dos limiares definidos (ver pontos 35 e 36). O método de ensaio de corrosão cutânea baseado na epiderme humana reconstruída revelou-se capaz de prever efeitos de corrosão da pele in vivo avaliados em coelhos, de acordo com o método de ensaio B.4 (2).

DEMONSTRAÇÃO DE COMPETÊNCIA

13.

Antes de utilizarem de forma rotineira qualquer um dos quatro modelos de ensaio de epiderme humana reconstruída validados conformes com o presente método de ensaio, os laboratórios devem demonstrar a sua competência técnica, classificando corretamente as doze substâncias de referência enumeradas no quadro 1. Caso seja utilizado um método para subclassificação, deve também demonstrar-se a correta subcategorização. Caso uma substância constante da lista esteja indisponível ou sempre que se justifique, pode utilizar-se outra substância para a qual existam dados adequados de referência in vivo e in vitro – por exemplo, da lista de produtos químicos de referência (24) –, desde que sejam aplicados os critérios de seleção descritos no quadro 1.

Quadro 1

Lista de substâncias de referência  (8)

Substância

N.o CAS

Classe química (9)

Categoria GHS da ONU/CRE Com base em resultados in vivo  (10)

MRV Cat. Com base em resultados in vitro  (11)

MTT redutor (12)

Estado físico

Subcategoria 1A Corrosivos in vivo

Ácido bromoacético

79-08-3

Ácido orgânico

1A

(3) 1A

S

Trifluoreto de boro di-hidratado

13319-75-0

Ácido inorgânico

1A

(3) 1A

L

Fenol

108-95-2

Fenol

1A

(3) 1A

S

Cloreto de dicloroacetilo

79-36-7

Eletrófilo

1A

(3) 1A

L

Combinação das subcategorias 1B e 1C de corrosivos in vivo

Ácido glioxílico mono-hidratado

563-96-2

Ácido orgânico

1B e 1C

(3) 1B e 1C

S

Ácido lático

598-82-3

Ácido orgânico

1B e 1C

(3) 1B e 1C

L

Etanolamina

141-43-5

Base orgânica

1B

(3) 1B e 1C

Sim

Viscoso

Ácido clorídrico (14,4 %)

7647-01-0

Ácido inorgânico

1B e 1C

(3) 1B e 1C

L

Não corrosivos in vivo

Brometo de fenetilo

103-63-9

Eletrófilo

NC

(3) NC

Sim

L

4-Amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Base orgânica

NC

(3) NC

S

4-(Metiltio)-benzaldeído

3446-89-7

Eletrófilo

NC

(3) NC

Sim

L

Ácido láurico

143-07-7

Ácido orgânico

NC

(3) NC

S

Abreviaturas: N.o CAS = número de registo do Chemical Abstracts Service; MRV = método de referência validado; NC = Não Corrosivo; S = sólido; L = líquido

14.

No âmbito da confirmação de competência, recomenda-se que o utilizador verifique, após a receção dos tecidos, as propriedades de barreira dos mesmos, especificadas pelo produtor do modelo de epiderme humana reconstruída. Este aspeto é especialmente importante se os tecidos forem expedidos a longas distâncias ou demorarem muito tempo a chegar. A partir do momento em que um método de ensaio esteja implantado e tenha sido demonstrada competência para utilizá-lo, não é necessário efetuar por rotina a referida verificação. Recomenda-se, contudo, que, ao utilizar um método de ensaio, se continue a avaliar periodicamente as propriedades de barreira.

PROCEDIMENTO

15.

Apresenta-se em seguida uma descrição genérica dos componentes e procedimentos dos modelos de ensaio de epiderme humana reconstruída para avaliação da corrosão cutânea abrangidos pelo presente método de ensaio. Os modelos de epiderme humana reconstruída aprovados como cientificamente válidos para utilização neste método de ensaio, ou seja, os modelos EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic RHE™ e epiCS® (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33), podem ser obtidos nos circuitos comerciais. Os procedimentos operacionais normalizados (PON) para estes quatro modelos de epiderme humana reconstruída estão disponíveis (34) (35) (36) (37); os principais componentes de método de ensaio são resumidos no apêndice 2. Recomenda-se que o respetivo PON seja consultado aquando da implementação e utilização de um desses modelos no laboratório. Os ensaios com os quatro modelos de ensaio de epiderme humana reconstruída abrangidos por este método devem respeitar o seguinte:

COMPONENTES DO MÉTODO DE ENSAIO DE EPIDERME HUMANA RECONSTRUÍDA

Condições gerais

16.

Na reconstrução do epitélio, utilizam-se queratinócitos humanos não transformados. Devem estar presentes várias camadas de células epiteliais viáveis (camada basal, camada espinhosa, camada granulosa), sob um stratum corneum funcional. Este último deve ter várias camadas e possuir um perfil lipídico que permita estabelecer uma barreira funcional suficientemente robusta para resistir a uma penetração rápida de produtos químicos marcadores citotóxicos, por exemplo, SDS ou o Triton X-100. Deve demonstrar-se a função de barreira, que pode ser avaliada determinando a concentração à qual o produto químico de referência reduz a viabilidade dos tecidos em 50 % (IC50) após um tempo de exposição fixo, ou determinando o tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade celular em 50 % (EF50), mediante a aplicação do produto químico de referência a uma concentração especificada e fixa (ver ponto 18). As propriedades de contenção do modelo de epiderme humana reconstruída devem impedir a passagem de matéria para o tecido viável por contorno do stratum corneum, que redundaria numa modelação deficiente da exposição cutânea. O modelo de epiderme humana reconstruída não deve estar contaminado por bactérias, vírus, micoplasmas ou fungos.

Condições funcionais

Viabilidade

17.

O ensaio MTS (27) é utilizado para quantificar a viabilidade dos tecidos. As células viáveis do tecido de epiderme humana reconstruída reduzem o corante vital MTT a um precipitado azul de formazano que é depois extraído do tecido com isopropanol ou um solvente semelhante. A densidade ótica do solvente de extração deve ser suficientemente reduzida (DO < 0,1). O formazano extraído pode ser quantificado utilizando um método de medição da absorvância normalizado ou espetrofotometria HPLC/UPLC (38). Os utilizadores do modelo de epiderme humana reconstruída devem garantir que cada lote de epiderme humana reconstruída utilizado preenche os critérios de controlo negativo. O concetor/fornecedor de epiderme humana reconstruída deve estabelecer um intervalo de aceitabilidade (limite superior e inferior) para os valores de controlo negativo da densidade ótica. Apresentam-se no quadro 2 os intervalos de aceitabilidade dos valores de controlo negativo da densidade ótica para os quatro modelos de ensaio validados incluídos no presente método de ensaio. Um utilizador de espetrofotometria HPLC/UPLC deve utilizar as gamas de controlo negativo da densidade ótica indicadas no quadro 2 como critério de aceitação para o controlo negativo. Deve documentar-se a estabilidade em cultura dos tecidos tratados com controlo negativo durante o período de exposição (fornecer medições de densidade ótica pertinentes).

Quadro 2

Intervalos de aceitabilidade dos valores de controlo negativo da densidade ótica para controlo da qualidade dos lotes

 

Limite inferior de aceitabilidade

Limite superior de aceitabilidade

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200).

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Função de barreira

18.

O stratum corneum e a sua composição lipídica devem ser suficientes para resistir a uma penetração rápida de certos produtos químicos marcadores citotóxicos (por exemplo, SDS ou Triton X-100), estimada com base na IC50 ou no ET50 (quadro 3). A função de barreira de cada lote do modelo de epiderme humana reconstruída deve ser demonstrada pelo concetor/vendedor do modelo de epiderme humana reconstruída aquando da entrega dos tecidos ao utilizador final (ver ponto 21).

Morfologia

19.

No contexto do exame histológico do modelo RhE, a estrutura multicamadas análoga da epiderme humana deve conter camada basal, camada espinhosa, camada granulosa e stratum corneum, e exibir um perfil lipídico similar ao perfil lipídico da epiderme humana. O perfil histológico de cada lote do modelo de epiderme humana reconstruída deve ser fornecido pelo concetor/vendedor do modelo de epiderme humana reconstruída aquando da entrega dos tecidos ao utilizador final (ver ponto 21).

Reprodutibilidade

20.

Os utilizadores do método de ensaio devem demonstrar a reprodutibilidade do mesmo ao longo do tempo, com os controlos positivos e negativos. Além disso, o método de teste deve ser usado somente se o criador/fornecedor modelo RhE fornecer dados que demonstrem a reprodutibilidade ao longo do tempo com produtos químicos corrosivos e não corrosivos, por exemplo, constantes da lista de substâncias de referência (quadro 1). Caso seja utilizado um método de ensaio para a subcategorização, deve igualmente demonstrar-se a reprodutibilidade no que respeita a esta última.

Controlo de qualidade

21.

O modelo de epiderme humana reconstruída só deve ser utilizado se o concetor/fornecedor demonstrar que cada lote do modelo de epiderme humana reconstruída satisfaz determinados critérios de aptidão, dos quais os de viabilidade (ponto 17), função de barreira (ponto 18) e morfologia (ponto 19) são os mais importantes. Estes dados são fornecidos aos utilizadores do método para que estes possam incluir tais informações no relatório de ensaio. Só os resultados obtidos com lotes de tecidos QC aceites podem ser utilizados para a previsão fiável da classificação corrosiva. O criador/fornecedor de epiderme humana reconstruída estabelece um intervalo de aceitabilidade (limite superior e inferior) para IC50 ou TE50. Indicam-se no quadro 3 os intervalos de aceitabilidade para os quatro modelos de ensaio validados.

Quadro 3

Critérios de controlo da qualidade para liberação dos lotes

 

Limite inferior de aceitabilidade

Limite superior de aceitabilidade

EpiSkin™ (SM) (18 horas de tratamento com (SDS) (33)

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200). (1 % Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 horas

ET50 = 8,7 horas

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)

ET50 = 4,0 horas

ET50 = 10,0 horas

epiCS® (1 % Triton X-100) (36)

ET50 = 2,0 horas

ET50 = 7,0 horas

Aplicação dos produtos químicos em estudo e de controlo