EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32019R1390

Rozporządzenie Komisji (UE) 2019/1390 z dnia 31 lipca 2019 r. zmieniające, w celu dostosowania do postępu technicznego, załącznik do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 ustalającego metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) (Tekst mający znaczenie dla EOG)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

L 247/1


ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) 2019/1390

z dnia 31 lipca 2019 r.

zmieniające, w celu dostosowania do postępu technicznego, załącznik do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 ustalającego metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH)

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA EUROPEJSKA,

uwzględniając Traktat o funkcjonowaniu Unii Europejskiej,

uwzględniając rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH), utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz uchylające rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE (1), w szczególności jego art. 13 ust. 2,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1)

Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 (2) zawiera metody badawcze służące do określania właściwości fizykochemicznych, toksyczności oraz ekotoksyczności substancji chemicznych, które to metody należy stosować do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006.

(2)

Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) opracowuje zharmonizowane i uzgodnione na szczeblu międzynarodowym wytyczne dotyczące badania substancji chemicznych do celów regulacyjnych. OECD regularnie wydaje nowe i zmienione wytyczne dotyczące badań, biorąc pod uwagę postęp naukowy w tej dziedzinie.

(3)

W celu uwzględnienia postępu technicznego oraz, w miarę możliwości, w celu zmniejszenia liczby zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych zgodnie z art. 13 ust. 2 rozporządzenia (WE) nr 1907/2006 i w następstwie przyjęcia odpowiednich wytycznych OECD dotyczących badań należy ustanowić dwie nowe metody badawcze do celów oceny ekotoksyczności i dziewięć nowych metod badawczych do określania toksyczności dla zdrowia ludzi, a siedem metod badawczych należy zaktualizować. Jedenaście spośród tych metod badawczych dotyczy badań in vitro działania drażniącego/żrącego na skórę i oczy, działania uczulającego na skórę, genotoksyczności i oddziaływania na układ hormonalny. W sprawie proponowanej zmiany przeprowadzono konsultacje z zainteresowanymi stronami.

(4)

Należy zatem odpowiednio zmienić rozporządzenie (WE) nr 440/2008.

(5)

Środki przewidziane w niniejszym rozporządzeniu są zgodne z opinią komitetu ustanowionego na mocy art. 133 rozporządzenia (WE) nr 1907/2006,

PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:

Artykuł 1

W załączniku do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem do niniejszego rozporządzenia.

Artykuł 2

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie dwudziestego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich.

Sporządzono w Brukseli dnia 31 lipca 2019 r.

W imieniu Komisji

Jean-Claude JUNCKER

Przewodniczący


(1)  Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 1.

(2)  Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 z dnia 30 maja 2008 r. ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) (Dz.U. L 142 z 31.5.2008, s. 1).


ZAŁĄCZNIK

W załączniku do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 wprowadza się następujące zmiany:

1)

w części B rozdział B.4 otrzymuje brzmienie:

„B.4   OSTRE DZIAŁANIE DRAŻNIĄCE/ŻRĄCE NA SKÓRĘ

WPROWADZENIE

1.

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 404 (2015). Okresowo dokonuje się przeglądu wytycznych OECD dotyczących badania substancji chemicznych, aby odzwierciedlały one najlepszą dostępną wiedzę naukową. W przeglądzie dotyczącej badań wytycznej (TG) OECD nr 404 szczególną uwagę poświęcono ewentualnym ulepszeniom w zakresie dobrostanu zwierząt i oceny wszystkich dostępnych informacji na temat badanej substancji chemicznej w celu uniknięcia niepotrzebnych badań na zwierzętach laboratoryjnych. Zaktualizowana wersja dotyczącej badań wytycznej OECD nr 404 (pierwotnie przyjętej w 1981 r., poprawianej w latach 1992, 2002 i 2015) zawiera odniesienia do wytycznych dotyczących zintegrowanych podejść do badań i oceny (IATA) podrażnienia skóry / działania żrącego na skórę (1) sugerujących podejście modułowe do badań nad podrażnieniem i działaniem żrącym na skórę. W ramach IATA opisano kilka modułów grupujących źródła informacji i narzędzia do analizy danych oraz (i) przedstawiono wytyczne dotyczące sposobu włączania i wykorzystywania istniejących danych, które uzyskano w ramach badań i metodami niebadawczymi, do celów oceny potencjałów substancji chemicznych pod względem działania drażniącego i żrącego na skórę, a także (ii) zaproponowano podejście w sytuacji gdy potrzebne są dalsze badania (1). Ponadto w razie potrzeby, zamiast jednoczesnego zastosowania u zwierzęcia trzech płatków gazy we wstępnym badaniu in vivo, w powyższej wytycznej zalecane jest sekwencyjne zastosowanie płatków.

2.

Definicje działania drażniącego i żrącego na skórę podano w dodatku do niniejszej metody badawczej.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE

3.

Z uwagi na dobrze pojęty interes nauki i dobrostan zwierząt nie należy przeprowadzać badań in vivo, dopóki wszystkie dostępne dane na temat potencjalnego żrącego/drażniącego działania badanej substancji chemicznej na skórę nie zostaną ocenione w ramach analizy wagi dowodów tak, jak to przedstawiono w wytycznej dotyczącej zintegrowanych podejść do badań i oceny działania żrącego i drażniącego na skórę, tj. w trzech częściach tej wytycznej i ich odpowiednich modułach (1). W części 1 omówiono pokrótce istniejące danych w siedmiu modułach obejmujących dane dotyczące ludzi, dane in vivo, dane in vitro, dane dotyczące właściwości fizykochemicznych (np. pH, w szczególności silnej kwasowości lub zasadowości) i metody niebadawcze. W części 2 przeprowadzono analizę wagi dowodów. Jeżeli powyższa analiza wagi dowodów okaże się niejednoznaczna, należy przeprowadzić dodatkowe badania, o których mowa w części 3, zaczynając od metod in vitro, przy czym badania in vivo stosuje się w ostateczności. Wspomniana analiza powinna zatem przyczynić się do ograniczenia potrzeby prowadzenia badań in vivo pod kątem działania żrącego/drażniącego na skórę wywołanego przez badane substancje chemiczne, w odniesieniu do których już istnieje wystarczający, pochodzący z innych badań materiał dowodowy dotyczący tych dwóch odnośnych punktów końcowych.

ZASADA BADANIA IN VIVO

4.

Substancja chemiczna, która ma być zbadana, jest nakładana na skórę zwierzęcia doświadczalnego w pojedynczej dawce; część skóry niepoddana zabiegowi służy jako część kontrolna. Stopień działania żrącego/drażniącego jest określany i oceniany przy pomocy punktacji w określonych odstępach, a następnie dodatkowo opisywany w celu całkowitego oszacowania skutków działania. Czas trwania badania powinien być wystarczający do oceny odwracalności lub nieodwracalności zaobserwowanych skutków.

5.

Zwierzęta wykazujące ciągłe objawy silnego stresu lub bólu na jakimkolwiek etapie badania powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny, a badana substancja chemiczna oceniona stosownie do zaobserwowanych skutków. Kryteria podejmowania decyzji o uśmiercaniu zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących silny ból określono w osobnych wytycznych (2).

PRZYGOTOWANIA DO BADANIA IN VIVO

Wybór gatunku zwierząt

6.

Preferowanym gatunkiem zwierzęcia laboratoryjnego jest królik albinos; wykorzystywane są zdrowe młode dorosłe króliki. W przypadku wykorzystania innych gatunków należy podać uzasadnienie.

Przygotowanie zwierząt

7.

Na około 24 godziny przed przeprowadzeniem badania należy krótko przyciąć sierść z powierzchni grzbietowej tułowia zwierząt. Należy unikać otarć skóry; należy wykorzystywać wyłącznie zwierzęta ze zdrową nienaruszoną skórą.

8.

Niektóre szczepy królików mają kępy futra, których gęstość jest większa w określonych porach roku. Takie obszary gęstego futra nie powinny być używane jako miejsca badań.

Warunki utrzymywania i karmienia

9.

Zwierzęta należy trzymać oddzielnie. W przypadku królików temperatura w pomieszczeniach dla zwierząt doświadczalnych powinna wynosić 20 °C (± 3 °C). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne w cyklu 12 godzin z dostępem światła i 12 godzin bez dostępu światła. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.

PROCEDURA BADANIA

Podawanie badanej substancji chemicznej

10.

Badana substancja chemiczna powinna zostać zaaplikowana na małym obszarze skóry (około 6 cm2) i przykryta płatkiem gazy przytrzymywanym na miejscu przy pomocy taśmy niedrażniącej. W przypadku gdy bezpośrednie zaaplikowanie badanej substancji chemicznej nie jest niemożliwe (np. w przypadku cieczy lub niektórych past), badana substancja chemiczna powinna zostać najpierw nałożona na gazę, a następnie na skórę. Gaza powinna luźno przylegać do skóry i powinna być przyczepiona do skóry na czas trwania narażenia przy pomocy odpowiedniego opatrunku półokluzyjnego. Jeżeli badana substancja chemiczna została nałożona na płatek gazy, powinna zostać przyczepiona do skóry w sposób zapewniający dobry kontakt i równomierne rozprowadzenie badanej substancji chemicznej na skórze. Należy zapobiec dostępowi zwierzęcia do gazy oraz spożyciu lub inhalacji badanej substancji chemicznej przez zwierzę.

11.

Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym są na ogół stosowane w stanie nierozcieńczonym. W przypadku badania substancji stałych (które w razie potrzeby można sproszkować) badana substancja chemiczna powinna zostać rozcieńczona przy użyciu minimalnej ilości wody (lub, o ile to konieczne, innego odpowiedniego nośnika), wystarczającej do zapewnienia dobrego kontaktu ze skórą. Jeżeli stosowany jest inny nośnik niż woda, potencjalny wpływ nośnika na podrażnienia skóry przez badaną substancję chemiczną powinien być minimalny lub żaden.

12.

O ile to możliwe, na zakończenie okresu narażenia, który na ogół trwa 4 godziny, pozostałości badanej substancji chemicznej powinny zostać usunięte przy użyciu wody lub innego odpowiedniego rozcieńczalnika w sposób pozwalający na uniknięcie zmian w zaistniałej reakcji oraz nienaruszenie naskórka.

Poziom dawki

13.

Na badany obszar skóry aplikowana jest dawka 0,5 ml cieczy lub 0,5 g ciała stałego lub pasty.

Badanie wstępne (Badanie in vivo działania drażniącego/żrącego na skórę przy użyciu jednego zwierzęcia)

14.

Jeżeli na podstawie analizy wagi dowodów lub wcześniejszych badań in vivo oceniono, że badana substancja chemiczna może mieć działanie żrące, drażniące lub niesklasyfikowane, nie są wymagane dalsze badania in vivo. Jednakże w przypadkach gdzie istnieje potrzeba dostarczenia dodatkowych danych, przeprowadza się badanie in vivo przy użyciu jednego zwierzęcia z zastosowaniem procedury opisanej poniżej. Na skórę zwierzęcia nakłada się maksymalnie do trzech płatków gazy z badaną substancją. Pierwszy płatek gazy jest usuwany po trzech minutach. Jeżeli nie zaobserwowano żadnych poważnych reakcji skórnych, drugi płatek gazy jest nakładany w innym miejscu i usuwany po godzinie. Jeżeli obserwacje na tym etapie wskazują na to, że narażenie można wydłużyć w sposób humanitarny do czterech godzin, trzeci płatek gazy jest nakładany i zdejmowany po czterech godzinach, a reakcja klasyfikowana punktowo.

15.

Jeżeli działanie żrące zostaje stwierdzone po jednym z trzech sekwencyjnych narażeń, badanie zostaje natychmiast przerywane. W przypadku niestwierdzenia działania żrącego po usunięciu ostatniego płatka gazy, zwierzę jest poddawane obserwacji przez okres 14 dni, o ile wcześniej nie rozwinie się uszkodzenie skóry.

16.

W przypadku gdy nie przewiduje się, że badana substancja chemiczna może powodować działanie żrące, lecz może wywoływać podrażnienia, należy zaaplikować jednemu zwierzęciu jeden płatek gazy na czas czterech godzin.

Badanie potwierdzające (Badanie in vivo działania drażniącego na skórę przy wykorzystaniu dodatkowych zwierząt)

17.

W przypadku niestwierdzenia działania żrącego w badaniach wstępnych działanie drażniące lub brak działania należy potwierdzić, wykorzystując maksymalnie dwa dodatkowe zwierzęta i stosując u każdego z nich jedną gazę przez cztery godziny narażenia. W przypadku stwierdzenia działania drażniącego w badaniu wstępnym, badanie potwierdzające może zostać przeprowadzone w sposób sekwencyjny lub poprzez narażenie dwóch dodatkowych zwierząt jednocześnie. W wyjątkowym przypadku nieprzeprowadzania badania wstępnego, można zbadać dwa lub trzy zwierzęta, z których każde zostanie poddane działaniu badanej substancji na jednym płatku gazy, usuniętym następnie po czterech godzinach. Jeżeli w przypadku wykorzystywania dwóch zwierząt, obydwa wykazują te same reakcje, nie wymaga się przeprowadzania dalszych badań. W innym wypadku zbadane zostaje również trzecie zwierzę. Niejednoznaczna reakcja może wymagać oceny z wykorzystaniem dodatkowych zwierząt.

Okres obserwacji

18.

Długość trwania obserwacji powinna być wystarczająca do pełnej oceny odwracalności zaobserwowanych efektów. Jednakże eksperyment powinien zostać przerwany, skoro tylko zwierzę zacznie wykazywać trwałe objawy silnego bólu lub stresu. W celu określenia odwracalności skutków zwierzę powinno być obserwowane przez okres maksymalnie 14 dni od usunięcia płatków gazy. W przypadku zaobserwowania odwracalności przed upływem 14 dni, eksperyment powinien zostać przerwany.

Obserwacja kliniczna i ocena punktowa reakcji skóry

19.

Zwierzęta powinny zostać zbadane pod kątem wystąpienia objawów rumienia i obrzęku oraz reakcji odnotowanych po 60 minutach, a następnie po 24, 48 oraz 72 godzinach od usunięcia płatka gazy. W badaniu wstępnym przeprowadzanym na jednym zwierzęciu miejsce zaaplikowania badanej substancji chemicznej jest również badane natychmiast po usunięciu płatka gazy. Reakcje skórne są oceniane przy pomocy wartości punktowych i zapisywane zgodnie z punktacją podaną w tabeli poniżej. W przypadku uszkodzenia naskórka, którego nie można zidentyfikować jako działania drażniącego ani żrącego po 72 godzinach, w celu określenia odwracalności efektów konieczne może okazać się prowadzenie obserwacji do 14. dnia. Oprócz spostrzeżeń na temat działania drażniącego należy w pełni opisać i zarejestrować wszelkie miejscowe efekty toksyczne, takie jak odtłuszczenie skóry oraz wszelkie niepożądane skutki ogólnoustrojowe (np. skutki klinicznych objawów toksyczności i utrata masy ciała). Celem wyjaśnienia niejednoznacznych reakcji można posłużyć się badaniem histopatologicznym.

20.

Ocena punktowa reakcji skóry jest z konieczności subiektywna. Celem propagowania harmonizacji punktowej oceny reakcji skóry oraz zapewnienia pomocy laboratoriom badawczym oraz osobom zaangażowanym w prowadzenie oraz interpretację obserwacji, personel prowadzący obserwacje powinien być odpowiednio przeszkolony w zakresie stosowanego systemu oceny (zob. tabela poniżej). Pomocne mogą okazać się ilustrowane instrukcje dotyczące klasyfikacji podrażnień i innych uszkodzeń skóry (3).

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

21.

Streszczenie wyników badań powinno zostać przedstawione w sprawozdaniu końcowym z badań w formie tabeli, która powinna zawierać wszystkie pozycje wymienione w sekcji 24.

Ocena wyników

22.

Wynik badania działania drażniącego na skórę powinien być oceniany stosownie do charakteru oraz natężenia uszkodzeń, oraz z uwzględnieniem ich odwracalności lub jej braku. Poszczególne wyniki nie stanowią normy bezwzględnej działania drażniącego na skórę danego materiału, ponieważ ocenie poddawane są również pozostałe skutki narażenia na badany materiał. Poszczególne wyniki powinny natomiast być traktowane jako wartości odniesienia, które muszą być oceniane w świetle wszystkich pozostałych spostrzeżeń z badań.

23.

W ocenie uszkodzeń skóry pod uwagę powinna być brana odwracalność zmian skóry. Jeżeli reakcje takie jak alopecja (na ograniczonej powierzchni), hiperkeratoza, hiperplazja i łuszczenie są nadal obecne wraz z upływem 14-dniowego okresu obserwacji, badana substancja chemiczna powinna zostać uznana za drażniącą.

Sprawozdanie z badania

24.

Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:

 

Uzasadnienie badań in vivo:

analiza wagi dowodów pochodzących z danych z dotychczasowych badań, w tym wyniki strategii badań sekwencyjnych;

opis odpowiednich danych dostępnych z uprzednio przeprowadzonych badań;

dane uzyskane w wyniku realizacji każdego etapu strategii badawczej;

opis przeprowadzonych badań in vitro, w tym szczegółowe dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem substancji testowych/odniesienia;

analiza wagi dowodów dla celów przeprowadzenia badania in vivo.

 

Badana substancja chemiczna:

substancja jednoskładnikowa: dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, stosownie do przypadku i jeśli jest to praktycznie wykonalne itp.;

substancja wieloskładnikowa, mieszanina i substancje o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji lub materiały biologiczne (UVCB): opisane w miarę możliwości przez podanie nazwy chemicznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników;

wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne;

źródło, numer partii (jeżeli dostępny);

w stosownych przypadkach obróbka badanej substancji chemicznej/substancji kontrolnej przed badaniem (np. ogrzanie, rozdrobnienie);

stabilność badanej substancji chemicznej, termin przydatności lub data ponownej analizy, jeżeli są znane;

warunki przechowywania.

 

Nośnik:

identyfikacja, stężenie (jeżeli dotyczy) użyta objętość;

uzasadnienie wyboru nośnika.

 

Badane zwierzę (zwierzęta):

wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania zwierząt innych niż królik albinos;

liczba zwierząt każdej płci;

indywidualna masa ciała na początku i na końcu badania,

wiek na początku badania;

źródło pochodzenia zwierząt, warunki utrzymywania, pasza itp.

 

Warunki badania:

technika przygotowywania miejsc nałożenia płatków gazy;

szczegółowy opis materiału, z którego wykonane są płatki gazy i sposób ich nakładania;

szczegóły dotyczące przygotowania, zaaplikowania i usunięcia badanej substancji chemicznej.

 

Wyniki:

tabele wyników działania drażniącego/żrącego dla każdego zwierzęcia w każdym punkcie czasowym pomiaru;

opis wszelkich zaobserwowanych uszkodzeń;

słowny opis charakteru i stopnia zaobserwowanego działania drażniącego lub żrącego oraz wszystkie wyniki badania histopatologicznego;

opis innych niekorzystnych zmian miejscowych i ogólnoustrojowych (np. odtłuszczenia skóry) towarzyszących działaniu drażniącemu lub żrącemu.

 

Omówienie wyników

 

Wnioski

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion, [w:] Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr 203), Paryż: Organisation for Economic Cooperation and Development.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, zatwierdzony na 28. wspólnym posiedzeniu komitetu ds. substancji chemicznych i grupy roboczej ds. substancji chemicznych w listopadzie 1998 r.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, [w:] Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 19), Paryż: Organistion for Economic Cooperation and Development.

Tabela

Punktowa ocena Reakcji skóry

Brak rumienia…

0

Bardzo lekki rumień (prawie niewidoczny)…

1

Dobrze zdefiniowany rumień…

2

Rumień umiarkowany do mocnego…

3

Mocny rumień (czerwień przypominająca barwę mięsa czerwonego) do form obrzęku wykluczających klasyfikację zmiany jako rumienia…

4

Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4

Brak obrzęku…

0

Bardzo słaby obrzęk (prawie niewidoczny)…

1

Lekki obrzęk (dobrze wyodrębniony)…

2

Umiarkowany obrzęk (wzniesienie na około 1 mm)…

3

Mocny obrzęk (wniesienie ponad 1 mm, sięgający poza obszar narażenia)…

4

Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4

Celem wyjaśnienia reakcji niejednoznacznych można przeprowadzić badanie histopatologiczne.

Dodatek

DEFINICJE

Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.

Działanie drażniące na skórę jest wynikiem odwracalnych uszkodzeń skóry wynikających z zastosowania substancji badanej przez okres do czterech godzin.

Działanie żrące na skórę jest wynikiem nieodwracalnego uszkodzenia skóry; tj. widocznej martwicy przebiegającej przez naskórek w głąb skóry, spowodowanej naniesieniem badanej substancji chemicznej na okres nieprzekraczający czterech godzin. Reakcjami na działanie żrące są wrzody, krwotoki, krwawiące strupy oraz – po zakończeniu 14-dniowej obserwacji – odbarwienia wynikłe ze zblednięcia skóry, obszary jednolitej alopecji, a także blizny. Celem oceny wątpliwych uszkodzeń można przeprowadzić badanie histopatologiczne.

Badana substancja chemiczna oznacza każdą substancję lub mieszaninę badaną za pomocą niniejszej metody badawczej

2)

w części B rozdział B.17 otrzymuje brzmienie:

„B.17   TESTY MUTACJI GENOWYCH NA KOMÓRKACH SSAKÓW IN VITRO Z WYKORZYSTANIEM GENÓW HPRT I XPRT

WPROWADZENIE

1.

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 476 (2016). Metody badawcze są poddawane okresowemu przeglądowi w związku z postępem naukowym, zmieniającymi się potrzebami regulacyjnymi oraz troską o dobrostan zwierząt. Niniejsza zaktualizowana wersja metody badawczej B.17 odzwierciedla prawie trzydzieści lat doświadczenia w stosowaniu metody badawczej, a także stanowi efekt opracowania oddzielnej nowej metody przeznaczonej do testów mutacji genowych na komórkach ssaków in vitro z wykorzystaniem genu kinazy tymidynowej. Metoda badawcza B.17 stanowi część serii metod dotyczących toksykologii genetycznej. OECD opracowała dokument, który zawiera zwięzłe informacje na temat badań w zakresie toksykologii genetycznej oraz przegląd najnowszych zmian, jakie wprowadzono do wytycznych OECD dotyczących badań w zakresie toksykologii genetycznej (1).

2.

Celem testu mutacji genowych na komórkach ssaków in vitro jest wykrycie mutacji genowych wywołanych przez substancje chemiczne. Linie komórkowe stosowane w tych badaniach mierzą mutacje pierwotne w genach reporterowych, w szczególności w endogennym genie fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (Hprt w komórkach gryzoni, HPRT w komórkach ludzkich; w niniejszej metodzie badawczej zbiorczo zwane genem Hprt i badaniem HPRT) i transgenu fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej (GPT) (zwanego badaniem XPRT). Badania mutacji HPRT oraz XPRT wykrywają różne widma zdarzeń genetycznych. Poza zdarzeniami mutacji wykrywanymi przy pomocy badania HPRT (np. mutacjami punktowymi, zmianami fazy odczytu, niewielkimi delecjami i insercjami) lokalizacja w autosomie transgenu GPT może pozwolić na wykrycie mutacji powodowanych dużymi delecjami i możliwe, że również rekombinacji mitotycznej niewykrytej w badaniu HPRT z powodu umiejscowienia genu Hprt na chromosomie X (2)(3)(4)(5)(6)(7). Metoda badania XPRT jest obecnie stosowana do celów regulacyjnych w mniejszym zakresie niż badanie HPRT.

3.

Zastosowane definicje znajdują się w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA

4.

Badania przeprowadzane in vitro wymagają zazwyczaj wykorzystania egzogennego źródła aktywacji metabolicznej. Egzogenny układ metabolizujący nie jest w stanie całkowicie naśladować warunków in vivo.

5.

Należy zachować ostrożność, aby uniknąć wystąpienia warunków, które mogłyby prowadzić do zniekształconych wyników dodatnich (tj. do potencjalnej interakcji z układem badawczym) niespowodowanych bezpośrednią interakcją między badanymi substancjami chemicznymi a materiałem genetycznym komórki; do takich warunków zalicza się zmiany pH lub osmolalności (8)(9)(10), interakcje z elementami podłoża (11)(12) bądź zbyt wysokie poziomy cytotoksyczności (13). Cytotoksyczność przekraczającą zalecane najwyższe poziomy cytotoksyczności ustanowione w pkt 19 uznaje się za zbyt wysoką w przypadku badania HPRT.

6.

Przed zastosowaniem przedmiotowej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się, czy zastosowanie tej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak, to dlaczego. Przeprowadzenie takiej analizy nie jest konieczne, jeżeli istnieje wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny.

ZASADA BADANIA

7.

Zmutowane komórki charakteryzujące się niedoborem aktywności enzymów HPRT w badaniu HPRT lub niedoborem aktywności enzymów XPRT w badaniu XPRT są odporne na działanie cytostatyczne 6-tioguaniny (TG) będącej analogiem puryny. Komórki, w przypadku których odnotowuje się prawidłowy poziom enzymów HPRT (w ramach badania HPRT) lub enzymów GPT (w ramach badania XPRT), są wrażliwe na TG, która powoduje wstrzymanie komórkowej przemiany materii oraz zatrzymuje dalsze dzielenie się komórek. W ten sposób zmutowane komórki są w stanie rozmnażać się w obecności TG, natomiast normalne komórki, które zawierają enzymy HPRT (w przypadku badania HPRT) lub GPT (w przypadku badania XPRT), nie mogą.

8.

Komórki w zawiesinie lub w jednowarstwowych hodowlach są poddawane działaniu badanej substancji chemicznej, zarówno z udziałem jak i bez udziału egzogennego źródła aktywacji metabolicznej (zob. pkt 14), przez odpowiedni okres (3–6 godzin), a następnie hodowane wtórnie w celu oznaczenia cytotoksyczności oraz dopuszczenia do ekspresji fenotypowej przed wybraniem mutanta (14)(15)(16)(17). Cytotoksyczność jest oznaczana na podstawie względnego wskaźnika przeżyć, tj. skuteczności klonowania mierzonej natychmiast po zakończeniu poddawania działaniu substancji i skorygowanej o wszelkie komórki utracone w trakcie działania substancji badanej w stosunku do kontroli ujemnej (pkt 18 dodatku 2). Kultury poddane działaniu substancji są utrzymywane na podłożu przez okres odpowiedni dla każdego wybranego rodzaju komórki, aby umożliwić zbliżoną do optymalnej ekspresję fenotypową wywołanych mutacji (zazwyczaj co najmniej 7–9 dni). Po uzyskaniu ekspresji fenotypowej oznacza się częstość występowania mutacji, dokonując posiewu określonej liczby komórek na podłożu zawierającym czynnik selektywny w celu wykrycia kolonii zmutowanych komórek oraz na podłożu pozbawionym takiego czynnika selektywnego, aby oznaczyć skuteczność klonowania (żywotność). Kolonie liczy się po upływie odpowiedniego okresu inkubacji. Częstość występowania mutacji oblicza się na podstawie liczby kolonii zmutowanych komórek skorygowanej o wartość wskaźnika skuteczności klonowania w momencie wyboru zmutowanych komórek.

OPIS METODY

Czynności przygotowawcze

Komórki

9.

Rodzaje komórek wykorzystywane w badaniach HPRT i XPRT powinny charakteryzować się wykazaną wrażliwością na oddziaływanie mutagenów, wysoką skutecznością klonowania, stabilnym kariotypem oraz stabilną spontaniczną częstością występowania mutacji. Wśród rodzajów komórek powszechnie wykorzystywanych w badaniach HPRT należy wymienić linie komórkowe CHO, CHL i V79 chomika chińskiego, mysie komórki chłoniaków L5178Y oraz ludzkie komórki limfoblastyczne TK6 (18)(19). W badaniu XPRT wykorzystuje się komórki AS52 pochodzące z linii CHO i zawierające transgen GPT, z których usunięto gen HPRT (20)(21); komórki AS52 nie mogą zostać poddane badaniu HPRT, ponieważ usunięty został gen HPRT. Korzystanie z innych linii komórkowych powinno zostać uzasadnione i zatwierdzone.

10.

Linie komórkowe powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem stabilności zmiennej liczby chromosomów oraz braku zanieczyszczenia mykoplazmą (22)(23), a komórki nie powinny być wykorzystywane, jeżeli są zanieczyszczone lub doszło do zmiany zmiennej liczby chromosomów. Należy ustalić normalny czas trwania cyklu komórkowego wykorzystywanego w laboratorium badawczym, który powinien być zgodny z opublikowanymi właściwościami komórek. Należy również sprawdzić spontaniczną częstość występowania mutacji w banku komórek macierzystych – w przypadku stwierdzenia, że wskaźnik częstości występowania mutacji w danej kulturze jest niedopuszczalny, taka kultura nie powinna być wykorzystywana.

11.

Przed wykorzystaniem kultur do celów tego badania konieczne może okazać się ich oczyszczenie z powstałych wcześniej zmutowanych komórek, np. poprzez hodowanie komórek na podłożu HAT w przypadku badania HPRT oraz na podłożu MPA w przypadku badania XPRT (5)(24) (zob. dodatek 1). Oczyszczone komórki mogą zostać poddane krioprezerwacji, a następnie rozmrożone w celu ich wykorzystania w charakterze kultur roboczych. Nowo rozmrożona kultura robocza może zostać wykorzystana do celów badania po osiągnięciu standardowych czasów podwojenia. Przy przeprowadzaniu badania XPRT rutynowa kultura komórek AS52 powinna być utrzymywana w warunkach gwarantujących zachowanie transgenu GPT (20).

Podłoża i warunki hodowli kultur

12.

W celu utrzymania kultur należy zastosować odpowiednie podłoże oraz warunki inkubacji (naczynia do hodowli komórkowych, wilgotne środowisko o zawartości CO2 wynoszącej 5 %, oraz temperatura inkubacji 37 °C). Kultury komórkowe powinny być zawsze utrzymywane w warunkach zapewniających fazę logarytmicznego wzrostu. W tym kontekście szczególne znaczenie ma dobór podłoża i warunków hodowli kultur w taki sposób, aby zapewnić optymalny wzrost komórek w okresie ekspresji oraz optymalną skuteczność klonowania zarówno w przypadku komórek zmutowanych, jak i komórek niezmutowanych.

Przygotowanie kultur

13.

Linie komórkowe są rozmnażane z kultur wyjściowych i wysiewane na podłoże z taką gęstością, by komórki w zawiesinach lub jednowarstwowych hodowlach mogły nadal rosnąć wykładniczo przez okres poddawania działaniu substancji i okres ekspresji (np. należy unikać konfluencji w przypadku komórek rosnących w jednowarstwowych hodowlach).

Aktywacja metaboliczna

14.

Egzogenne układy metabolizujące powinny być stosowane w przypadku wykorzystania komórek o nieodpowiedniej endogennej wydolności metabolicznej. Najpowszechniej stosowanym układem, który jest domyślnie zalecany, jeżeli w danym przypadku nie występują czynniki uzasadniające zastosowanie innego układu, jest frakcja postmitochondrialna suplementowanego kofaktora (S9) przygotowywana z wątrób gryzoni (najczęściej szczurów) poddawanych działaniu substancji indukujących enzymy takich jak Aroclor 1254 (25)(26)(27)(28) lub połączenie fenobarbitalu i β-naftoflawonu (29)(30)(31)(32). Stosowanie tego ostatniego połączenia substancji nie narusza postanowień Konwencji sztokholmskiej w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych (33), przy czym połączenie to okazało się równie skuteczne jak Aroclor 1254 w indukowaniu oksydaz wieloczynnościowych (29)(31). Frakcja S9 jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach mieszczących się w przedziale 1–2 % (objętościowo), ale stężenie to może zostać zwiększone do 10 % (objętościowo) w końcowym podłożu badawczym. Klasa badanych substancji może wywierać wpływ na rodzaj i stężenie stosowanego egzogennego układu metabolizującego lub czynnika pobudzającego metabolizm (34)(35)(36).

Przygotowanie badanej substancji chemicznej

15.

Badane substancje chemiczne w stanie stałym należy rozpuścić w odpowiednich rozpuszczalnikach oraz – w stosownych przypadkach – rozcieńczyć przed poddaniem komórek ich działaniu (zob. pkt 16). Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym można dodać do układu badawczego bezpośrednio lub rozcieńczyć je przed poddaniem układu badawczego ich działaniu. Badane substancje chemiczne w stanie gazowym lub lotnym należy badać, wprowadzając stosowne modyfikacje w standardowych protokołach, np. poddając układ działaniu substancji w szczelnie zamkniętych naczyniach do hodowli komórkowych (37)(38). Preparaty badanej substancji chemicznej należy przygotowywać tuż przed poddaniem komórek jej działaniu, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, że dopuszczalne jest składowanie substancji.

WARUNKI BADANIA

Rozpuszczalniki

16.

Rozpuszczalnik należy wybrać tak, aby zoptymalizować rozpuszczalność badanych substancji chemicznych, unikając niepożądanego wpływu na przebieg badania, np. zmiany wzrostu komórek, wpływu na integralność badanej substancji chemicznej, reakcji z naczyniami do hodowli komórkowych czy zakłócenia układu metabolizującego. Zaleca się, aby w miarę możliwości w pierwszej kolejności rozważyć możliwość zastosowania wodnego rozpuszczalnika (lub podłoża). Sprawdzonymi rozpuszczalnikami są na przykład woda i sulfotlenek dimetylu. Zasadniczo zawartość rozpuszczalników organicznych nie powinna przekraczać 1 % (obj.) a zawartość rozpuszczalników wodnych (soli fizjologicznej lub wody) w końcowym podłożu użytym do badania nie powinna przekroczyć 10 % (obj.). Jeżeli używane są niesprawdzone rozpuszczalniki (np. etanol czy aceton), ich użycie powinno być uzasadnione danymi, które potwierdzają ich zgodność z badanymi substancjami chemicznymi oraz z układem badawczym, a także brak właściwości świadczących o toksyczności genetycznej w zastosowanym stężeniu. W przypadku braku takich danych potwierdzających, należy uwzględnić dodatkowe kontrole niepoddane działaniu substancji (zob. dodatek 1), aby wykazać, że wybrany rozpuszczalnik nie wywołuje szkodliwych ani mutagennych skutków.

Pomiar cytotoksyczności i wybór stężeń ekspozycyjnych

17.

Przy ustalaniu najwyższego stężenia badanej substancji chemicznej należy unikać stężeń, które mogą doprowadzić do zniekształconych wyników dodatnich, np. stężeń wywołujących nadmierną cytotoksyczność (zob. pkt 20), wytrącania substancji w podłożu (zob. pkt 21) lub znacznej zmiany w pH lub osmolalności (zob. pkt 5). Jeżeli badana substancja chemiczna wywołuje znaczną zmianę pH podłoża w momencie jej dodania, poziom pH można skorygować, buforując końcowe podłoże użyte do badania, aby uniknąć zniekształconych wyników dodatnich i utrzymać odpowiednie warunki hodowli kultur.

18.

Wyboru stężenia dokonuje się na podstawie poziomu cytotoksyczności oraz innych parametrów (zob. pkt 20–22). Choć dokonanie oceny cytotoksyczności na etapie badania wstępnego może przyczynić się do precyzyjniejszego określenia stężeń, które mają zostać zastosowane w ramach głównego doświadczenia, wykonanie takiego badania wstępnego nie jest wymagane. Nawet w przypadku dokonania wstępnej oceny cytotoksyczności, w ramach głównego doświadczenia należy wykonać ponownie pomiar cytotoksyczności w odniesieniu do każdej kultury. Ocenę cytotoksyczności należy przeprowadzić w oparciu o względny wskaźnik przeżyć, tj. wskaźnik skuteczności klonowania komórek posianych natychmiast po poddaniu działaniu substancji skorygowany o wszelkie komórki utracone w trakcie działania substancji na podstawie liczby komórek w stosunku do skorygowanego wskaźnika skuteczności klonowania w kontrolach ujemnych (którym przypisano wskaźnik przeżycia wynoszący 100 %) (odpowiedni wzór zawarto w dodatku 2).

19.

Należy ocenić co najmniej cztery badane stężenia (poza kontrolami z rozpuszczalnikiem i kontrolami dodatnimi), które spełniają kryteria dopuszczalności (odpowiednia cytotoksyczność, liczba komórek itp.). Choć zaleca się korzystanie ze zduplikowanych kultur, w odniesieniu do każdego badanego stężenia dopuszcza się możliwość stosowania kontrprób albo pojedynczych kultur poddawanych działaniu substancji. Wyniki uzyskane na podstawie niezależnych zduplikowanych kultur przy danym stężeniu należy zgłaszać odrębnie, ale dopuszcza się możliwość ich łączenia na potrzeby analizy danych (17). W przypadku badanych substancji chemicznych wykazujących niewielką cytotoksyczność lub niewykazujących cytotoksyczności na ogół odpowiednie będzie zastosowanie 2–3-krotnych przedziałów stężenia. W przypadku wystąpienia cytotoksyczności wybrane badane stężenia powinny obejmować zakres rozpoczynający się od stężenia, które wykazuje cytotoksyczność, oraz uwzględniający stężenia, w których wystąpiła umiarkowana i niewielka cytotoksyczność lub nie wystąpiła cytotoksyczność. W przypadku wielu badanych substancji chemicznych można zaobserwować strome krzywe ilustrujące zależność stężenie-odpowiedź, dlatego też aby uwzględnić cały zakres cytotoksyczności lub szczegółowo zbadać zależność stężenie-odpowiedź, konieczne może okazać się zastosowanie więcej niż czterech stężeń o bardziej zbliżonych wartościach – dotyczy to zwłaszcza przypadków, w których zachodzi konieczność powtórzenia doświadczenia (zob. pkt 43). Stosowanie więcej niż 4 stężeń może mieć szczególnie istotne znaczenie w przypadku korzystania z pojedynczych kultur.

20.

Jeżeli maksymalne stężenie określono na podstawie cytotoksyczności, należy dążyć do tego, by poziom takiego maksymalnego stężenia doprowadził do uzyskania względnego wskaźnika przeżyć na poziomie od 20 do 10 %. Należy przy tym zachować ostrożność przy interpretowaniu wyników dodatnich uzyskiwanych wyłącznie przy względnym wskaźniku przeżyć na poziomie 10 % lub niższym (pkt 43).

21.

W przypadku słabo rozpuszczalnych badanych substancji chemicznych, które nie wykazują cytotoksyczności w stężeniach niższych od najniższego stężenia nierozpuszczalnego, najwyższy poziom stężenia wykorzystanego w badaniu powinien wywołać zmętnienie lub doprowadzić do wytrącenia się osadu widocznego gołym okiem lub przez mikroskop odwrócony pod koniec poddawania działaniu badanej substancji. Nawet jeżeli cytotoksyczność wystąpi powyżej najniższego stężenia nierozpuszczalnego, zaleca się przeprowadzenie badania przy zastosowaniu wyłącznie jednego stężenia wywołującego zmętnienie lub skutkującego wytrącaniem się widocznego osadu, ponieważ osad może prowadzić do uzyskania zniekształconych wyników. W przypadku stężenia powodującego powstanie osadu należy zadbać, aby pojawienie się osadu nie zakłóciło przebiegu badania. Pomocne może okazać się oznaczenie rozpuszczalności w podłożu przed przeprowadzeniem doświadczenia.

22.

Jeżeli nie zaobserwowano żadnego osadu ani ograniczenia cytotoksyczności, najwyższe badane stężenie powinno odpowiadać 10 mM, 2 mg/ml lub 2 μl/ml, w zależności od tego, która z tych wartości jest najniższa (39)(40). Jeżeli badana substancja chemiczna nie ma określonego składu, np. substancje o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji lub materiały biologiczne (tj. substancje chemiczne o nieznanym lub zmiennym składzie (UVCB)) (41), wyciągi pochodzące ze środowiska itp., może być konieczne podwyższenie najwyższego stężenia (np. do 5 mg/ml) w przypadku braku dostatecznej cytotoksyczności, aby zwiększyć stężenie każdego ze składników. Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że wymagania te mogą być inne w przypadku produktów leczniczych przeznaczonych dla ludzi (42).

Kontrole

23.

Dla każdego warunku doświadczalnego należy włączyć jednoczesne kontrole ujemne (zob. pkt 16) obejmujące sam rozpuszczalnik w podłożu użytym do badania, w odniesieniu do których podjęto takie same czynności jak w odniesieniu do kultur poddanych działaniu substancji.

24.

Jednoczesne kontrole dodatnie są niezbędne do wykazania zdolności danego laboratorium do zidentyfikowania mutagenów w warunkach określonych w zastosowanym protokole badania oraz, w stosownych przypadkach, skuteczności egzogennego układu metabolizującego. W tabeli 1 poniżej przedstawiono przykłady kontroli dodatnich. W uzasadnionych przypadkach dopuszcza się możliwość stosowania alternatywnych substancji służących do kontroli dodatniej. Ponieważ badania na komórkach ssaków in vitro pod kątem toksyczności genetycznej są w dostatecznym stopniu znormalizowane, badania, w których komórki poddaje się działaniu substancji z udziałem i bez udziału egzogennej aktywacji metabolicznej, można przeprowadzić wyłącznie przy wykorzystaniu kontroli dodatniej wymagającej aktywacji metabolicznej. W takim przypadku wspomniana pojedyncza reakcja kontroli dodatniej potwierdzi zarówno aktywność układu metabolizującego, jak i reaktywność układu badawczego. Każdą kontrolę dodatnią należy zastosować z co najmniej jednym stężeniem, w odniesieniu do którego oczekuje się uzyskania odtwarzalnych oraz wykrywalnych wzrostów powyżej tła, w celu wykazania czułości układu badawczego, przy czym reakcja nie powinna być zakłócona cytotoksycznością wykraczającą poza limity określone w niniejszej metodzie badawczej (zob. pkt 20).

Tabela 1

Substancje odniesienia, z których zaleca się korzystać przy przeprowadzaniu oceny biegłości laboratorium i przy dokonywaniu wyboru kontroli dodatnich

Warunek aktywacji metabolicznej

Locus

Substancja i nr CAS

Brak egzogennej aktywacji metabolicznej

HPRT

Metanosulfonat etylu [nr CAS 62-50-0] Nitrozomocznik etylu [nr CAS 759-73-9] 1-tlenek-4-nitrochinoliny [nr CAS 56-57-5]

 

XPRT

Streptonigryna [nr CAS 3930-19-6] Mitomycyna C [nr CAS 50-07-7]

Obecność egzogennej aktywacji metabolicznej

HPRT

3-metylocholantren [nr CAS 56-49-5] 7,12-antracen dimetylobenzenu [nr CAS 57-97-6] Benzo[a]piren [nr CAS 50-32-8]

 

XPRT

Benzo[a]piren [nr CAS 50-32-8]

PROCEDURA

Poddanie działaniu badanej substancji chemicznej

25.

Rozmnażające się komórki są poddawane działaniu badanej substancji chemicznej z udziałem i bez udziału układu metabolizującego. Narażenie na działanie badanej substancji powinno trwać dostatecznie długo (z reguły przyjmuje się, że odpowiedni okres narażenia na działanie substancji wynosi od 3 do 6 godzin).

26.

Minimalną liczbę komórek wykorzystywanych w odniesieniu do każdej kultury (kontrolnej i poddawanej działaniu substancji) na poszczególnych etapach badania należy ustalić na podstawie wskaźnika spontanicznej częstości występowania mutacji. Ogólnie zaleca się poddawanie działaniu substancji i pasażowanie takiej liczby komórek, która będzie wystarczająca, aby utrzymać poziom 10 spontanicznie powstałych zmutowanych komórek w każdej kulturze na wszystkich etapach badania (17). Częstość spontanicznej mutacji waha się zazwyczaj w przedziale od 5 do 20 × 10-6. W przypadku gdy częstość występowania spontanicznej mutacji wynosi 5 × 10-6, utrzymanie wystarczającej liczby spontanicznie zmutowanych komórek (przynajmniej 10) również w kulturach poddanych działaniu substancji w stężeniach powodujących cytotoksyczność na poziomie 90 % (względny wskaźnik przeżyć wynoszący 10 %) wiązałoby się z koniecznością poddania działaniu substancji co najmniej 20 × 106 komórek. Ponadto w okresie ekspresji należy wyhodować wystarczającą liczbę komórek (co najmniej 2 mln), a następnie posiać te komórki w celu dokonania wyboru zmutowanych komórek (17).

Czas ekspresji fenotypowej i pomiar częstości występowania mutacji

27.

Po zakończeniu okresu poddawania działaniu substancji komórki hoduje się, aby umożliwić ekspresję fenotypu mutanta. Na ogół okres wynoszący co najmniej 7–9 dni wystarczy do zapewnienia niemal optymalnej ekspresji fenotypowej nowo wywołanych mutacji HPRT i XPRT (43)(44). W tym okresie z komórek regularnie wydziela się kultury pochodne, aby podtrzymać ich wzrost wykładniczy. Po zakończeniu okresu ekspresji fenotypowej komórki ponownie posiewa się na podłożu z udziałem lub bez udziału czynnika selektywnego (6-tioguaniny), aby odpowiednio ustalić liczbę mutantów i określić skuteczność klonowania w momencie dokonywania wyboru. Takiego posiewu można dokonać przy wykorzystaniu płytek do jednowarstwowej hodowli kultur lub mikropłytek do komórek w zawiesinie. Na potrzeby wyboru mutantów komórki powinny zostać posiane z gęstością zapewniającą optymalny poziom pozyskiwania mutantów (tj. aby nie doszło do sprzężenia metabolicznego) (17). Posiane komórki inkubuje się przez odpowiedni czas, aby zapewnić optymalne tempo wzrostu kolonii (np. 7–12 dni), po czym liczy się kolonie. Częstość występowania mutacji oblicza się na podstawie liczby kolonii zmutowanych komórek skorygowanej o wartość wskaźnika skuteczności klonowania w momencie wyboru zmutowanych komórek (stosowne wzory przedstawiono w dodatku 2).

Biegłość laboratorium

28.

Aby ustalić, czy dane laboratorium ma dostateczne doświadczenie w zakresie przedmiotowego badania przed zastosowaniem go w rutynowych badaniach, powinno ono przeprowadzić szereg doświadczeń z wykorzystaniem referencyjnych substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej, działających za pomocą różnych mechanizmów (co najmniej jedna substancja aktywna z udziałem aktywacji metabolicznej i jedna substancja aktywna bez udziału aktywacji metabolicznej, wybrane spośród substancji wymienionych w tabeli 1) oraz różnych kontroli ujemnych (różnych rozpuszczalników/nośników). Reakcje otrzymane w wyniku takiej kontroli dodatniej i ujemnej powinny odpowiadać reakcjom opisanym w literaturze. Nie dotyczy to laboratoriów, które mają odpowiednie doświadczenie, tj. laboratoriów prowadzących bazę danych historycznych, o której mowa w pkt 30–33.

29.

Aby wykazać biegłość w zakresie wykrywania mutagennych substancji chemicznych, oznaczania skuteczności układu metabolizującego i wykazywania adekwatności warunków wzrostu komórek poddawanych działaniu substancji, ekspresji fenotypowej i wyboru mutantów oraz procedur oceny punktowej, należy zbadać szereg substancji chemicznych z udziałem i bez udziału aktywacji metabolicznej (zob. tabela 1 pkt 25). Należy dobrać zakres stężeń wybranych substancji tak, aby uzyskać powtarzalne i powiązane ze stężeniem wzrosty powyżej tła w celu wykazania czułości i zakresu oznaczania układu badawczego.

Dane historyczne dotyczące kontroli

30.

Laboratorium powinno ustalić:

zakres i rozkład historycznych wyników kontroli dodatniej,

zakres i rozkład historycznych wyników kontroli ujemnej (bez poddania działaniu substancji chemicznej, z rozpuszczalnikiem).

31.

Przy pierwszym gromadzeniu danych dotyczących rozkładu historycznych wyników kontroli ujemnych wyniki jednoczesnych kontroli ujemnych powinny być zgodne z opublikowanymi danymi dotyczącymi kontroli (22). W miarę dodawania kolejnych danych doświadczalnych do rozkładu kontroli najlepiej byłoby, gdyby jednoczesne kontrole ujemne mieściły się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % tego rozkładu (17)(45)(46).

32.

Prowadzona przez dane laboratorium baza danych historycznych dotyczących kontroli ujemnych powinna początkowo zawierać dane z co najmniej 10 doświadczeń, a najlepiej z co najmniej 20 doświadczeń przeprowadzonych w porównywalnych warunkach doświadczalnych. Laboratoria powinny stosować metody kontroli jakości, takie jak karty kontrolne (np. karty C lub karty X-średnie (47)) w celu określania stopnia zmienności gromadzonych przez nie danych dotyczących kontroli dodatniej i ujemnej oraz w celu wykazania, że stosowana przez nie metodologia jest „pod kontrolą” (46). Dalsze zalecenia dotyczące sposobu gromadzenia i wykorzystywania danych historycznych (tj. kryteria włączania danych do zbioru danych historycznych i wykluczania danych z tego zbioru oraz kryteria dopuszczalności dla danego doświadczenia) można znaleźć w literaturze (45).

33.

Dane dotyczące kontroli ujemnej powinny obejmować częstość występowania mutacji w pojedynczej kulturze lub, najlepiej, w zduplikowanych kulturach, jak opisano w pkt 23. Najlepiej byłoby, gdyby jednoczesne kontrole ujemne mieściły się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % rozkładu danych zawartych w prowadzonej przez laboratorium bazie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnych) (17)(45)(46). Jeżeli dane dotyczące jednoczesnych kontroli ujemnych nie mieszczą się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 %, włączenie ich do rozkładu kontroli historycznej może być dopuszczalne, pod warunkiem że dane te nie stanowią skrajnych obserwacji nietypowych oraz że istnieją dowody świadczące o tym, iż dany układ badawczy znajduje się „pod kontrolą” (zob. powyżej), a także dowody wykluczające błąd techniczny czy ludzki.

34.

Wszelkie zmiany w protokole doświadczalnym należy rozpatrywać pod kątem ich spójności z dotychczas prowadzonymi przez laboratorium bazami danych historycznych dotyczących kontroli. Wszelkie poważne niespójności powinny skutkować utworzeniem nowej bazy danych historycznych dotyczących kontroli.

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Przedstawienie wyników

35.

Przedstawienie wyników powinno obejmować wszystkie dane niezbędne do obliczenia poziomu cytotoksyczności (wyrażonej jako względny wskaźnik przeżyć). Wspomniane dane, które dotyczą zarówno kultur poddanych działaniu substancji, jak i kultur kontrolnych, powinny uwzględniać liczbę komórek pod koniec poddawania działaniu substancji, liczbę komórek posianych bezpośrednio po zakończeniu poddawania działaniu substancji oraz liczbę kolonii (lub liczbę dołków bez kolonii w przypadku metody mikropłytkowej). Względny wskaźnik przeżyć dla każdej kultury powinien zostać wyrażony jako odsetek w stosunku do równoczesnej kontroli z rozpuszczalnikiem (zob. dodatek 1, aby zapoznać się ze stosownymi definicjami).

36.

Przedstawienie wyników powinno również obejmować wszystkie dane niezbędne do obliczenia częstości występowania mutacji. Dane dotyczące zarówno kultur poddanych działaniu substancji, jak i kultur kontrolnych, powinny obejmować: 1) liczbę komórek posianych z udziałem lub bez udziału czynnika selektywnego (w momencie posiewu komórek w celu wybrania komórek zmutowanych) oraz 2) liczbę kolonii (lub liczbę dołków bez kolonii w przypadku metody mikropłytkowej) na płytkach z czynnikiem selektywnym lub bez tego czynnika. Częstość występowania mutacji oblicza się na podstawie liczby kolonii zmutowanych komórek (na płytkach z czynnikiem selektywnym) skorygowanej o wartość wskaźnika skuteczności klonowania w momencie wyboru zmutowanych komórek (z płytek bez czynnika selektywnego). Częstość występowania mutacji powinna być wyrażona jako liczba zmutowanych komórek na milion komórek żywotnych (zob. dodatek 1, aby zapoznać się ze stosownymi definicjami).

37.

Należy dostarczyć dane dotyczące poszczególnych kultur. Dodatkowo wszystkie dane należy przedstawić w postaci tabeli.

Kryteria dopuszczalności

38.

Dopuszczalność testu ocenia się na podstawie następujących kryteriów:

uznaje się, że dopuszczalne jest włączenie danych dotyczących równoczesnych kontroli ujemnych do prowadzonej przez laboratorium bazy danych historycznych dotyczących kontroli ujemnych, jak opisano w pkt 33;

równoczesne kontrole dodatnie (zob. pkt 24) powinny wywoływać reakcje zgodne z reakcjami odnotowanymi w bazie danych historycznych dotyczących kontroli dodatniej i wykazywać statystycznie istotny wzrost w porównaniu z równoczesną kontrolą ujemną;

zbadano dwa warunki doświadczalne (z udziałem i bez udziału aktywacji metabolicznej) do momentu uzyskania w jednym z nich wyników dodatnich (zob. pkt 25);

można poddać analizie wystarczającą liczbę komórek i stężeń (pkt 25, 26 i 19);

kryteria wyboru najwyższego stężenia są spójne z kryteriami opisanymi w pkt 20, 21 i 22.

Ocena i interpretacja wyników

39.

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik jednoznacznie dodatni, jeżeli w dowolnych ze zbadanych warunków doświadczalnych:

co najmniej jedno z badanych stężeń wykazuje statystycznie istotny wzrost w porównaniu z równoczesną kontrolą ujemną,

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu tendencji pokazuje, że wzrost jest powiązany ze stężeniem,

którykolwiek z wyników znajduje się poza rozkładem danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. poza granicą kontrolną wyznaczającą przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona; zob. pkt 33).

W przypadku gdy wszystkie wspomniane kryteria zostały spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna jest w stanie wywołać mutacje genowe w hodowanych komórkach ssaków w danym układzie badawczym. Zalecenia dotyczące najodpowiedniejszych metod statystycznych można znaleźć w literaturze (46)(48).

40.

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności zostały spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik jednoznacznie ujemny, jeżeli we wszystkich zbadanych warunkach doświadczalnych:

żadne z badanych stężeń nie wykazuje statystycznie istotnego wzrostu w porównaniu z równoczesną kontrolą ujemną,

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu tendencji pokazuje, że wzrost nie jest powiązany ze stężeniem,

wszystkie wyniki mieszczą się w rozkładzie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona; zob. pkt 33).

Badaną substancję chemiczną uznaje się następnie za niezdolną do wywołania mutacji genowych w hodowanych komórkach ssaków w danym układzie badawczym.

41.

Weryfikacja jednoznacznie dodatniej lub ujemnej reakcji nie jest wymagana.

42.

Jeżeli reakcja nie jest ani jednoznacznie ujemna, ani jednoznacznie dodatnia, jak opisano powyżej, oraz aby ułatwić ustalenie biologicznego znaczenia wyniku, dane powinny zostać ocenione w oparciu o opinię eksperta lub dalsze badania. Przydatne może być powtórne przeprowadzenie doświadczenia, potencjalnie z zastosowaniem zmienionych warunków doświadczalnych (np. odstępów czasu między stężeniami, innych warunków aktywacji metabolicznej (tj. stężenie S9 lub pochodzenie S9)).

43.

W rzadkich przypadkach nawet po przeprowadzeniu dalszych badań uzyskany zbiór danych uniemożliwi uznanie wyników za dodatnie lub ujemne. W takiej sytuacji należy uznać, że reakcja badanej substancji chemicznej jest niejednoznaczna (tj. może zostać zinterpretowana zarówno jako dodatnia, jak i jako ujemna).

Sprawozdanie z badania

44.

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

 

Badana substancja chemiczna:

źródło, numer partii, termin przydatności, jeżeli jest dostępny;

stabilność badanej substancji chemicznej, jeżeli jest znana;

rozpuszczalność i stabilność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku, jeżeli są znane;

pomiar pH, osmolalności i osadu w podłożu, do którego dodano badaną substancję chemiczną, stosownie do przypadku.

 

Substancja jednoskładnikowa:

wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne;

dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, w stosownych przypadkach i jeśli jest to praktycznie wykonalne, itp.

 

Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny:

opisane w miarę możliwości przez podanie nazwy chemicznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników.

 

Rozpuszczalnik:

uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika;

zawartość procentowa rozpuszczalnika w końcowym podłożu.

 

Komórki:

 

W przypadku głównych kultur laboratoryjnych:

rodzaj i źródło komórek oraz linie komórkowe;

liczba pasaży – o ile informacje na ten temat są dostępne – i dane historyczne dostępne w laboratorium;

cechy kariotypu lub zmienna liczba chromosomów;

metody utrzymywania kultur komórkowych;

brak mykoplazmy;

czasy podwojenia komórek.

 

Warunki badania:

uzasadnienie wyboru stężeń oraz liczby kultur, z uwzględnieniem np. danych dotyczących cytotoksyczności oraz granic rozpuszczalności;

skład podłoża, stężenie CO2, poziom wilgotności;

stężenie badanej substancji chemicznej wyrażone jako stężenie końcowe w podłożu (np. μg lub mg/ml lub mM podłoża);

stężenie (lub objętość) rozpuszczalnika i badanej substancji chemicznej dodanych do podłoża;

temperatura inkubacji;

okres inkubacji;

czas poddawania działaniu substancji chemicznej;

zagęszczenie komórek w trakcie poddawania działaniu substancji;

typ oraz skład układu metabolizującego (źródło frakcji S9, metoda przygotowania preparatu frakcji S9, stężenie lub objętość preparatu frakcji S9 i frakcji S9 w końcowym podłożu, kontrole jakości frakcji S9);

substancje służące do kontroli dodatniej i ujemnej, stężenia końcowe w poszczególnych warunkach poddawania działaniu substancji chemicznej;

długość okresu ekspresji (w tym liczba posianych komórek i podkultur oraz – w stosownych przypadkach – schematy żywienia);

nazwa czynnika selektywnego i jego stężenie;

kryteria dopuszczalności badań;

metody wykorzystywane do wyliczenia liczby żywotnych i zmutowanych komórek;

metody wykorzystywane do pomiaru cytotoksyczności;

wszelkie informacje uzupełniające istotne w kontekście cytotoksyczności i stosowanej metody;

czas trwania okresów inkubacji po posiewie;

kryteria uznawania wyników badań za dodatnie, ujemne lub niejednoznaczne;

metody stosowane w celu ustalenia poziomu pH, osmolalności i strącania.

 

Wyniki:

liczba komórek poddanych działaniu substancji chemicznej i liczba komórek w hodowli pochodnej z każdej kultury;

wyniki pomiaru cytotoksyczności oraz ewentualne inne obserwacje;

oznaki strącania i czas oznaczenia;

liczba komórek posianych na podłożu selektywnym i nieselektywnym;

liczba kolonii na podłożu nieselektywnym i liczba odpornych kolonii na podłożu selektywnym oraz powiązane częstości występowania mutacji;

w stosownych przypadkach zależność stężenie-odpowiedź;

dane dotyczące jednoczesnych kontroli ujemnych (z rozpuszczalnikiem) i dodatnich (stężenia i rozpuszczalniki);

dane historyczne dotyczące kontroli ujemnych (z rozpuszczalnikiem) i dodatnich wraz z zakresami, średnimi i odchyleniami standardowymi oraz przedziałem ufności (np. 95 %), przy uwzględnieniu również ilości danych;

analizy statystyczne (dla poszczególnych kultur oraz, w stosownych przypadkach, połączonych kontrprób) oraz p-wartości, jeżeli występują.

 

Omówienie wyników.

 

Wniosek

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. [W:] Publikacje na temat środowiska, seria dotycząca badań i oceny nr 234. Paryż: OECD.

(2)

Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. i Tindall, K.R. (red.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis. Cold Spring Harbor Laboratory, Nowy Jork, 1987.

(3)

E. H. Y. Chu i H. V. Malling (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro. „Proc. Natl. Acad. Sci., USA”. nr 61, s. 1306–1312.

(4)

Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. i Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. „Mutagen.” Res.„nr 4” s. 394–403.

(5)

Aaron C.S. i Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates. „Mutation Res.” nr 223, s. 121–128.

(6)

Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. i Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. „Mutation Res.” nr 312, s. 235–239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. i Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program. „Mutation Res.” nr 196, s. 17–36.

(8)

Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. i Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. „Mutation Res.” nr 257, s. 147–204.

(9)

Morita T., Nagaki T., Fukuda I. i Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. „Mutation Res.” nr 268, s. 297–305.

(10)

Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations. „Environ. Mutagen.” nr 8, s. 789–886.

(11)

Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. i Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. „Environ. Mol. Mutation Res.” nr 49, s. 439–452.

(12)

Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. i Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium. „Mutation Res.” nr 634, s. 177–183.

(13)

Kirkland D., Aardema M., Henderson L. i Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. „Mutation Res.” nr 584, s. 1–256.

(14)

Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O'Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. i Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. „Mutation Res.” nr 189, s. 135–141.

(15)

Liber H.L., Yandell D.W. i Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. „Mutation Res.” nr 216, s. 9–17.

(16)

L. F. Jr. Stanowski, K. R. Tindall i A. W. Hsie (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. „Mutation Res.” nr 160, s. 133–147.

(17)

Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. i Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation, [W:] Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (red.), Cambridge University Press, s. 66–101.

(18)

Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P. i Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program. „Mutation Res.” nr 86, s. 193–214.

(19)

Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures. „Mutation Res.” nr 85, s. 165–175.

(20)

Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R. i Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells. „Mol. Cell. Biol.” nr 4, s. 1411–1415.

(21)

Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M. i Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells.„Proc Natl Acad Sci.” nr 83(24), s. 9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Tekst w przygotowaniu).

(23)

Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. i Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice. „ATLA” nr 33, s. 261–287.

(24)

Rosen M.P., San R.H.C. i Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures. „Can. Lett.” nr 8, s. 299–305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. i de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. „Mutation Res.” nr 37, s. 83-90.

(26)

Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. i Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. „Mutation Res.” nr 46, s. 365–373.

(27)

Ames B.N., McCann J. i Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. „Mutation Res.” nr 31, s. 347–364.

(28)

Maron D.M. i Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. „Mutation Res.” nr 113, s. 173–215.

(29)

Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. i Wolf R.C. (1992). Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. „Mutagen.” nr 7, s. 175–177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. i Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, [W:] In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. i Philpot R.M. (red.). Elsevier, North-Holland, s. 85–88.

(31)

Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. i Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver.„J. Environ. Pathol. Toxicol.” nr 4, s. 55–65.

(32)

Johnson T.E., Umbenhauer D.R. i Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9. „Environ. Mol. Mutagen.” nr 28, s. 51–59.

(33)

UNEP (2001). Konwencja sztokholmska w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych, Program Narodów Zjednoczonych ds. Ochrony Środowiska (UNEP). Dostępne na stronie internetowej: [http://www.pops.int.html].

(34)

Tan E.-L. i Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. „Mutation Res.” nr 84, s. 147–156.

(35)

J. P. O’Neill, R. Machanoff, J. R. San Sebastian i A. W. Hsie (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. „Environ. Mol. Mutation.” nr 4, s. 7–18.

(36)

Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. „Environ. Mol. Mutation.”, nr 4, s. 7–18.

(37)

Krahn D.F., Barsky F.C. i McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. [W:] Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (red.), Genotoxic Effects of Airborne Agents, Nowy Jork, Plenum, s. 91–103.

(38)

Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. i Brooks A.L. (1983). for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay.„Environ. Mutagenesis”., nr 5, s. 795–801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487). Dostępny na żądanie od Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju.

(40)

Brookmire L., Chen J.J. i Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the in vitro Chromosome Aberrations Assay.„Environ. Mol. Mutation.”, nr 54, s. 36–43.

(41)

EPA, Urząd ds. Bezpieczeństwa Substancji Chemicznych i Zapobiegania Zanieczyszczeniom. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)

USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Dostępne na stronie internetowej: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)

O’Neill J.P. i Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)

Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L. i Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells.„Mutation Research” nr 1335(2), s. 121–128.

(45)

Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., i Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, [w:] „Mutation Research” nr 723, s. 87–90.

(46)

OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines [w:] Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (nr 199), Paryż: Organisation for Economic Cooperation and Development.

(47)

Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., i Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. [W:] Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland (red.) Cambridge: Cambridge University Press, s. 141–154.

(48)

Fleiss J. L., Levin B., i Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, wydanie trzecie, Nowy Jork: John Wiley & Sons.

Dodatek 1

DEFINICJE

Mutageny powodujące substytucję: substancje chemiczne, które powodują podstawienie par zasad w DNA.

Substancja chemiczna: substancja lub mieszanina.

Skuteczność klonowania: odsetek komórek posiewanych z niską gęstością, będących w stanie przekształcić się w zdatną do zliczenia kolonię.

Stężenia: odnoszą się do stężeń końcowych badanej substancji chemicznej w podłożu.

Cytotoksyczność: W odniesieniu do testów objętych niniejszą metodą badawczą cytotoksyczność określa się jako obniżenie względnego wskaźnika przeżyć komórek poddanych działaniu substancji w porównaniu z kontrolą ujemną (zob. odpowiedni pkt).

Mutacja pierwotna: mutacja genu z rodzaju macierzystego do mutanta, który powoduje zmianę lub stratę aktywności enzymatycznej funkcji zakodowanego białka.

Mutageny typu zmiany fazy odczytu: substancje chemiczne, które powodują dodanie lub delecję pojedynczej pary zasad lub wielu par zasad w cząstce DNA.

Genotoksyczny: termin ogólny, obejmujący wszystkie rodzaje uszkodzeń DNA lub chromosomu, w tym pęknięcia, przegrupowania adduktów, mutacje, aberracje chromosomowe i aneuploidię. Nie wszystkie rodzaje skutków genotoksycznych powodują mutacje lub stałe uszkodzenia chromosomu.

Podłoże HAT: podłoże wykorzystywane do czyszczenia mutantów fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej, zawierające hipoksantynę, aminopterynę oraz tymidynę.

Rekombinacja mitotyczna: zachodząca podczas mitozy rekombinacja między chromatydami homologicznymi, której możliwe skutki to indukowanie pęknięć łańcucha DNA lub utrata heterozygotyczności.

Podłoże MPA: podłoże wykorzystywane do czyszczenia mutantów fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej zawierające ksantynę, adeninę, tymidynę, aminopterynę oraz kwas mykofenolowy.

Mutagenny: powoduje dziedziczne zmiany w sekwencji lub sekwencjach par zasad DNA w genach lub w strukturze chromosomów (aberracje chromosomowe).

Częstość występowania mutacji (MF): liczba zaobserwowanych kolonii zmutowanych komórek podzielona przez liczbę komórek posianych w podłożu selektywnym, skorygowana podczas wyboru względem skuteczności klonowania (lub żywotności).

Czas ekspresji fenotypowej: czas po poddaniu działaniu substancji chemicznej, w trakcie którego zmiana genetyczna utrwalana jest w genomie, a wszelkie istniejące wcześniej produkty genu zostają oddzielone w takim stopniu, że zmianie ulega cecha fenotypowa.

Względny wskaźnik przeżyć (RS): względny wskaźnik przeżyć wykorzystuje się do mierzenia cytotoksyczności związanej z działaniem substancji chemicznej. Względny wskaźnik przeżyć to wskaźnik skuteczności klonowania komórek posianych natychmiast po poddaniu działaniu substancji chemicznej, skorygowany o wszelkie komórki utracone w trakcie działania substancji w stosunku do wskaźnika skuteczności klonowania w kontrolach ujemnych (którym przypisano wskaźnik przeżycia wynoszący 100 %).

Frakcje S9 uzyskane z wątroby: supernatant z homogenatu wątroby po odwirowaniu przy 9 000 g, tj. surowy ekstrakt z wątroby.

Preparat frakcji S9: preparat złożony z frakcji S9 uzyskanej z wątroby i kofaktorów niezbędnych do aktywności metabolicznej enzymów.

Kontrola z rozpuszczalnikiem: ogólny termin opisujący kultury kontrolne otrzymujące wyłącznie rozpuszczalnik stosowany do rozpuszczenia badanej substancji chemicznej.

Badana substancja chemiczna: dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

Kontrola niepoddawana działaniu substancji: hodowle, które nie są poddawane działaniu żadnej substancji (tj. ani badanej substancji chemicznej, ani rozpuszczalnika), lecz które są poddawane zabiegom równolegle i w taki sam sposób jak hodowle otrzymujące badaną substancję chemiczną.

UVCB: substancje o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji lub materiały biologiczne.

Dodatek 2

WZORY DO CELÓW OCENY CYTOKSYCZNOŚCI ORAZ CZĘSTOŚCI WYSTĘPOWANIA MUTACJI

Ocenę cytotoksyczności przeprowadza się w oparciu o względny wskaźnik przeżyć, tj. wskaźnik skuteczności klonowania komórek posianych natychmiast po poddaniu działaniu substancji, skorygowany o wszelkie komórki utracone w trakcie działania substancji w stosunku do skorygowanej skuteczności klonowania w kontrolach ujemnych (którym przypisano wskaźnik przeżycia wynoszący 100 %) (zob. poniżej wzór dotyczący względnego wskaźnika przeżyć).

Skorygowaną skuteczność klonowania kultury poddanej działaniu badanej substancji chemicznej oblicza się w następujący sposób:

Formula

Względny wskaźnik przeżyć kultury poddanej działaniu badanej substancji chemicznej oblicza się w następujący sposób:

Formula

Częstość występowania mutacji jest to skuteczność klonowania kolonii zmutowanych komórek w podłożu selektywnym podzielona przez skuteczność klonowania w podłożu nieselektywnym, mierzona podczas dokonywania wyboru w odniesieniu do tej samej kultury.

Formula

Gdy stosuje się płytki w odniesieniu do skuteczności klonowania:

Skuteczność klonowania = liczba kolonii / liczba posianych komórek

Gdy stosuje się mikropłytki w odniesieniu do skuteczności klonowania:

Liczba kolonii na dołek w mikropłytkach jest zgodna z rozkładem Poissona.

Skuteczność klonowania = -LnP(0) / liczba posianych komórek na dołek

Gdzie -LnP(0) jest to prawdopodobna liczba pustych dołków pośród dołków posianych, określana według następującego wzoru:

LnP(0)= -Ln (liczba pustych dołków / liczba posianych dołków)

3)

w części B rozdział B.22 otrzymuje brzmienie:

„B.22   BADANIE DOMINUJĄCEGO GENU LETALNEGO GRYZONIA

WPROWADZENIE

1.

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w wytycznej dotyczącej badań OECD (TG) 478 (2016). Metody badawcze są okresowo poddawane przeglądowi w związku z postępem naukowym, zmieniającymi się potrzebami regulacyjnymi oraz troską o dobrostan zwierząt. Niniejsza zmodyfikowana wersja metody badawczej jest efektem ponad trzydziestoletniego doświadczenia w przeprowadzaniu tego badania i odzwierciedla potencjał integracji lub łączenia tego badania z innymi badaniami dotyczącymi toksyczności, takimi jak badania rozwojowe, badania toksyczności reprodukcyjnej lub genotoksyczności; jednak z powodu tych ograniczeń oraz wykorzystania dużej liczby zwierząt nie zaleca się stosować tego testu jako podstawowej metody, a raczej traktować jako metodę dodatkową, którą można stosować jedynie w przypadku gdy w odniesieniu do wymogów regulacyjnych nie istnieje metoda alternatywna. Połączenie badań toksyczności może uchronić dużą liczbę zwierząt przed wykorzystaniem ich w takich badaniach. OECD opracowała dokument, który zawiera zwięzłe informacje na temat badań w zakresie toksykologii genetycznej oraz przegląd najnowszych zmian, jakie wprowadzono do wytycznych OECD dotyczących badań w zakresie toksykologii genetycznej (1).

2.

Celem badania dominującej mutacji letalnej jest ustalenie, czy substancje chemiczne wytwarzają w komórkach germinalnych mutacje wynikające z aberracji chromosomowych. Ponadto badanie dominującego genu letalnego ma istotne znaczenie dla oceny genotoksyczności, ponieważ czynniki związane z metabolizmem in vivo, farmakokinetyką oraz procesami naprawy DNA – choć mogą różnić się w zależności od gatunku – są aktywne i wywierają wpływ na reakcję. Indukcja dominującej mutacji letalnej po narażeniu na działanie badanej substancji chemicznej wskazuje, że substancja chemiczna wpłynęła na tkankę rozrodczą zwierzęcia laboratoryjnego.

3.

Mutacje dominującego genu letalnego powodują śmierć embrionu lub stratę płodu. Indukcja dominującej mutacji letalnej po narażeniu na działanie badanej substancji chemicznej wskazuje, że substancja chemiczna wpływa na komórki germinalne zwierzęcia laboratoryjnego.

4.

Test dominującej mutacji letalnej jest użytecznym testem, który umożliwia potwierdzenie wyników dodatnich badań wykorzystujących somatyczne punkty końcowe in vivo oraz jest istotnym punktem końcowym pozwalającym przewidzieć zagrożenie wobec ludzi i ryzyko chorób genetycznych przekazywanych w linii germinalnej. Test ten jest jednak pracochłonny i wymaga wykorzystania dużej liczby zwierząt; w rezultacie jego przeprowadzenie jest bardzo kosztowne i czasochłonne. Z uwagi na fakt, że spontaniczna częstotliwość dominujących mutacji letalnych jest dość wysoka, czułość testu pod kątem wykrywania niewielkich wzrostów częstotliwości mutacji jest zasadniczo ograniczona.

5.

Definicje kluczowych terminów zamieszczono w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE

6.

Badanie najczęściej przeprowadza się na myszach (2)(3)(4), jednak jeżeli jest to naukowo uzasadnione – w niektórych przypadkach dopuszcza się wykorzystanie innych gatunków, takich jak szczury (5)(6)(7)(8). Dominujące mutacje letalne są zazwyczaj skutkiem rażących aberracji chromosomowych (aberracji strukturalnych i liczbowych) (9)(10)(11), jednak niewykluczone są także mutacje genowe. Dominująca mutacja letalna to mutacja, która zachodzi per se w komórce germinalnej lub utrwala się po zapłodnieniu we wczesnym stadium embrionalnym; nie powoduje ona jednak dysfunkcji gamety, ale jest śmiertelna dla zapłodnionego jaja lub rozwijającego się embrionu.

7.

Poszczególne samce wykorzystywane są do krycia dziewiczych samic sekwencyjnie w odpowiednich odstępach czasu. Liczba kryć następujących po zakończeniu badania jest zależna od ostatecznego celu badania dotyczącego dominującej mutacji letalnej (pkt 23) oraz powinna zapewnić możliwość przeprowadzenia oceny dojrzewania męskich komórek germinalnych pod kątem dominujących mutacji letalnych (12).

8.

Jeżeli istnieją dowody świadczące o tym, że badana substancja chemiczna lub jej metabolit lub metabolity nie dotrą do jądra, nie należy przeprowadzać tego badania.

ZASADA BADANIA

9.

Zasadniczo samce poddaje się działaniu badanej substancji chemicznej z zastosowaniem odpowiedniej drogi narażenia i kryje nimi dziewicze samice, których nie poddano takiemu działaniu. Wykorzystując kolejne następujące po sobie okresy krycia można badać różne rodzaje komórek germinalnych. Po okresie krycia i upływie odpowiedniego czasu samice poddaje się eutanazji i bada ich macice, aby ustalić liczbę implantów oraz żywych i martwych embrionów. Letalność dominującą badanej substancji chemicznej określa się, porównując liczbę żywych zagnieżdżonych zarodków na samicę w grupie badanej do liczby żywych zagnieżdżonych zarodków na samicę w grupie kontrolnej z nośnikiem/rozpuszczalnikiem. Wzrost liczby martwych zagnieżdżonych zarodków na samicę w grupie badanej powyżej liczby martwych zagnieżdżonych zarodków na samicę w grupie kontrolnej odzwierciedla straty poimplantacyjne wywołane przez badaną substancję chemiczną. Straty poimplantacyjne oblicza się, określając stosunek martwych zagnieżdżonych zarodków do całkowitej liczby zagnieżdżonych zarodków w grupie badanej i porównując stosunek martwych zagnieżdżonych zarodków do ich całkowitej liczby w grupie kontrolnej. Straty przedimplantacyjne można oszacować, porównując liczby ciałek żółtych po odjęciu całkowitej liczby zagnieżdżonych zarodków lub całkowitej liczby zagnieżdżonych zarodków na samicę w grupie badanej i grupach kontrolnych.

WERYFIKACJA BIEGŁOŚCI LABORATORIUM

10.

Kompetencje w zakresie przedmiotowego testu ustala się, wykazując zdolność do odtwarzania częstotliwości dominujących mutacji letalnych z opublikowanych danych (np. (13)(14)(15)(16)(17)(18)) z zastosowaniem substancji służących do kontroli dodatniej (w tym reakcji słabych), takich jak te wymienione w tabeli 1, oraz do grup kontrolnych nośnika, i uzyskując częstotliwości kontroli ujemnej posiadające akceptowalny pod względem spójności zakres danych (zob. powyższe odniesienia), lub z wykorzystaniem historycznego rozkładu kontroli laboratorium, gdy taki rozkład jest dostępny.

OPIS METODY

Czynności przygotowawcze

Wybór gatunku zwierząt

11.

Badania należy prowadzać na zdrowych, dojrzałych płciowo laboratoryjnych szczepach zwierząt powszechnie wykorzystywanych w badaniach laboratoryjnych. Badania przeprowadza się zazwyczaj na myszach, choć właściwe może być również wykorzystywanie szczurów. Dopuszcza się również możliwość wykorzystania wszelkich innych odpowiednich gatunków ssaków, o ile zostanie to w sprawozdaniu uzasadnione naukowo.

Warunki utrzymywania i karmienia zwierząt

12.

W przypadku gryzoni temperatura w pomieszczeniu dla zwierząt powinna wynosić 22 °C (±3 °C). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 40 % i pożądane jest, by nie przekraczała 70 % poza okresami czyszczenia pomieszczenia, najlepiej byłoby, gdyby utrzymywała się na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne z zachowaniem cyklu 12 godzin bez dostępu światła, które poprzedza 12 godzin z dostępem światła. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Wybór paszy może zależeć od potrzeby zapewnienia odpowiedniej domieszki badanej substancji chemicznej, jeżeli jest ona podawana tą drogą. Przed poddaniem działaniu substancji lub przed kryciem gryzonie należy trzymać w małych grupach (nie więcej niż pięć sztuk) składających się ze zwierząt tej samej płci, jeżeli nie przewiduje się lub nie obserwuje agresywnego zachowania, a najlepiej trzymać je w klatkach z pełną podłogą oraz zapewnić im odpowiednie urozmaicenie warunków bytowania. Jeżeli ma to naukowe uzasadnienie, zwierzęta mogą być trzymane oddzielnie.

Przygotowanie zwierząt

13.

Zdrowe i dojrzałe płciowo dorosłe samce i samice należy przydzielić losowo do grup kontrolnych i grup poddawanych działaniu badanej substancji. Zwierzęta znakuje się indywidualnie przy użyciu humanitarnej, mało inwazyjnej metody (np. poprzez obrączkowanie, kolczykowanie, wszczepianie mikroukładów i identyfikację biometryczną, a nie przycinanie uszu i palców) i aklimatyzuje do warunków laboratoryjnych przez co najmniej pięć dni. Klatki należy rozmieścić w taki sposób, aby zminimalizować potencjalny wpływ ich układu. Należy unikać zanieczyszczenia krzyżowego kontrolą dodatnią i badaną substancją chemiczną. W momencie rozpoczęcia badania różnice w masie ciała zwierząt powinny być minimalne i nie powinny przekraczać ±20 % średniej masy dla każdej płci.

Przygotowanie dawek

14.

Badane substancje chemiczne w stanie stałym należy rozpuszczać lub przygotowywać w postaci zawiesiny w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach lub dodawać do paszy lub do wody do picia przed podaniem dawki zwierzętom. Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym mogą być dawkowane bezpośrednio lub można je rozcieńczać przed dawkowaniem. W przypadku narażenia w drodze inhalacji badane substancje chemiczne można podawać w postaci gazu, pary lub stałych/ciekłych aerozoli, w zależności od ich właściwości fizykochemicznych. Należy stosować świeże preparaty badanej substancji chemicznej, chyba że z danych dotyczących stabilności wynika, iż przechowywanie tych preparatów jest dopuszczalne i że w danych tych określono warunki prawidłowego przechowywania takich preparatów.

Warunki badania

Rozpuszczalnik/nośnik

15.

Rozpuszczalnik/nośnik w stosowanych objętościach dawek nie powinien wywoływać efektów toksycznych oraz nie powinno istnieć ryzyko, że wejdzie on w reakcję chemiczną z badaną substancją chemiczną. Jeśli stosowane są inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki, ich włączenie do doświadczenia powinno być poparte danymi referencyjnymi wskazującymi na ich zgodność. Zaleca się, aby, o ile to możliwe, w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników. Wśród przykładów powszechnie wykorzystywanych zgodnych rozpuszczalników/nośników można wymienić wodę, sól fizjologiczną, roztwór metylocelulozy, roztwór soli sodowej karboksymetylocelulozy, oliwę z oliwek i olej kukurydziany.

Kontrole dodatnie

16.

Zawsze należy prowadzić równoległą grupę zwierząt na potrzeby kontroli dodatniej, chyba że laboratorium wykazało biegłość w przeprowadzaniu badania oraz w niedawnej przeszłości regularnie przeprowadzało takie badania (np. w ciągu ostatnich 5 lat). Nie ma jednak konieczności postępowania ze zwierzętami przeznaczonymi na potrzeby kontroli dodatniej w ten sam sposób jak ze zwierzętami otrzymującymi badaną substancję chemiczną, czy konieczności pobierania próbek we wszystkich odstępach czasu między okresami krycia. Substancjami stosowanymi do celów kontroli dodatniej powinny być substancje znane z wytwarzania dominującej mutacji letalnej w warunkach prowadzenia badania. Z wyjątkiem poddawania działaniu substancji badanej, ze zwierzętami w grupach kontrolnych należy obchodzić się w identyczny sposób jak ze zwierzętami w grupach poddanych działaniu substancji.

17.

Dawki substancji stosowane do celów kontroli dodatniej należy dobrać w taki sposób, aby wywoływały słabe lub umiarkowane efekty, pozwalające na krytyczną ocenę efektywności i czułości badania, jednak wywołujące w sposób systematyczny efekty dodatnie dominującej mutacji letalnej. W tabeli 1 przedstawiono przykładowe substancje chemiczne stosowane do celów kontroli dodatniej oraz ich właściwe dawkowanie.

Tabela 1

Przykładowe substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej

Substancja [Nr CAS]

(numer referencyjny)

Zakres dawki efektywnej

(gatunek gryzonia)

Czas podawania (wyrażony w dniach)

Trietylenomelamina [51-18-3] (15)

0,25 (myszy)

1

Cyklofosfamid [50-18-0] (19)

50–150 (myszy)

5

Cyklofosfamid [50-18-0] (5)

25–100 (szczury)

1

Metanosulfonian etylu [62-50-0] (13)

100–300 (myszy)

5

Akrylamid monomeryczny [79-06-1] (17)

50 (myszy)

5

Chlorambucyl [305-03-3] (14)

25 (myszy)

1

Kontrole ujemne

18.

W każdym okresie pobierania próbek należy uwzględnić zwierzęta przeznaczone do celów kontroli ujemnej, poddane działaniu samego rozpuszczalnika lub nośnika, a poza tym badane w ten sam sposób, jak grupy poddawane działaniu substancji (20). Jeżeli nie istnieją historyczne lub opublikowane dane wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik/nośnik nie wywołuje żadnych dominujących mutacji letalnych ani innych szkodliwych skutków, zwierzęta w grupie kontrolnej powinny zostać również uwzględnione w każdym okresie pobierania próbek, aby ustalić dopuszczalność grupy kontrolnej nośnika.

PROCEDURA

Liczba zwierząt

19.

Zaleca się krycie jednej dziewiczej samicy w sposób sekwencyjny w odpowiednio ustalonych z góry odstępach czasu (np. w tygodniowych odstępach czasu, pkt 21 i 23) przez pojedyncze samce. Liczbę samców w grupach należy ustalić z góry tak, aby zapewnić wystarczającą (w połączeniu z liczbą pokrytych samic w każdym okresie krycia) moc testów statystycznych niezbędną do wykrycia co najmniej dwukrotnego zwiększenia częstotliwości dominującej mutacji letalnej (pkt 44).

20.

Należy również określić z góry liczbę samic w danym okresie krycia na podstawie obliczeń mocy testów statystycznych, aby zapewnić możliwość wykrycia co najmniej podwojenia częstości występowania dominującej mutacji letalnej (tj. liczba ciężarnych samic powinna być wystarczająca, aby uzyskać łącznie co najmniej 400 zagnieżdżonych zarodków) (20)(21)(22)(23), przy czym oczekuje się co najmniej jednego martwego zagnieżdżonego zarodka na jednostkę poddawaną analizie (tj. na grupę wykorzystywaną do krycia przy danej dawce) (24).

Okres podawania i okresy krycia

21.

Liczbę okresów krycia po poddaniu działaniu substancji ustala się na podstawie harmonogramu podawania substancji chemicznej, przy czym powinna ona zagwarantować, aby wszystkie etapy dojrzewania męskich komórek germinalnych zostały ocenione pod kątem indukcji dominującej mutacji letalnej (12)(25). W przypadku pojedynczego poddania działaniu substancji obejmującego podanie do pięciu dawek substancji w odstępach tygodniowych od ostatniego poddania działaniu substancji powinno odbyć się 8 kryć (w przypadku myszy) lub 10 kryć (w przypadku szczurów). W przypadku podania wielu dawek liczba okresów krycia może zostać zmniejszona proporcjonalnie do wydłużenia okresu podawania z zachowaniem celu polegającego na przeprowadzeniu oceny wszystkich etapów spermatogenezy (np. po 28-dniowym okresie narażenia ocena wszystkich etapów spermatogenezy u myszy wymaga zaledwie 4 kryć w tygodniu). Wszystkie harmonogramy podawania substancji chemicznej i harmonogramy krycia powinny być naukowo uzasadnione.

22.

Samice powinny przebywać z samcami przez co najmniej jeden pełny cykl estrogenowy (np. jeden tydzień obejmuje jeden pełny cykl estrogenowy zarówno u myszy, jak i u szczurów). Samice, które nie zostały pokryte w tym jednotygodniowym okresie, mogą zostać wykorzystane w kolejnym okresie krycia. Ewentualnie samice mogą przebywać z samcami do momentu pokrycia, co ustala się poprzez sprawdzenie obecności plemników w pochwie lub obecności czopa pochwowego.

23.

Okres narażenia i harmonogram krycia ustala się w zależności od nadrzędnego celu badania dominującej mutacji letalnej. Jeżeli celem jest ustalenie, czy dana substancja chemiczna sama w sobie wywołuje dominującą mutację letalną, uznawaną metodą byłoby poddanie całego cyklu spermatogenezy działaniu substancji (np. 7 tygodni u myszy, 5–7 przypadków poddania działaniu substancji w tygodniu) i przeprowadzenie jednorazowego krycia na zakończenie cyklu. Jeżeli jednak celem jest zidentyfikowanie wrażliwego rodzaju komórek germinalnych w kontekście indukcji dominującej mutacji letalnej, wówczas lepiej jest przeprowadzić jeden cykl narażenia lub poddawać działaniu substancji przez okres 5 dni, po którym zaleca się tygodniowy okres krycia.

Poziomy dawek

24.

W przypadku przeprowadzania wstępnego badania ustalającego zakres dawkowania ze względu na brak dostępnych odpowiednich danych umożliwiających dobranie dawki, badanie takie należy wykonać w tym samym laboratorium z wykorzystaniem tego samego gatunku, szczepu, płci i schematu podawania substancji chemicznej, jakie mają być stosowane w badaniu głównym (26). Celem badania powinno być określenie maksymalnej tolerowanej dawki (MTD) zdefiniowanej jako najwyższa dawka tolerowana bez wywoływania objawów toksyczności ograniczającej badanie w stosunku do czasu trwania badania (na przykład dawka wywołująca nietypowe zachowanie lub reakcje, niewielki spadek masy ciała lub cytotoksyczność układu krwiotwórczego), ale niepowodująca śmierci lub objawów bólu, cierpienia lub stresu, które wiązałyby się z koniecznością uśmiercenia zwierzęcia w humanitarny sposób (27)).

25.

Maksymalna tolerowana dawka nie może również wywierać niekorzystnego wpływu na skuteczność krycia (21).

26.

W przypadku badanych substancji chemicznych charakteryzujących się szczególną aktywnością biologiczną przy niskich dawkach nietoksycznych (takich jak hormony i mitogeny) oraz substancji chemicznych wykazujących intensywne parametry toksykokinetyczne dopuszcza się możliwość zastosowania odstępstwa od kryteriów ustalania dawek – każdą taką substancję należy oceniać indywidualnie.

27.

Aby uzyskać informacje na temat zależności dawka-odpowiedź, w kompletnym badaniu należy uwzględnić grupę kontrolną ujemną oraz co najmniej trzy poziomy dawek, przy czym każda kolejna dawka jest większa od poprzedniej na ogół dwukrotnie, ale nie więcej niż czterokrotnie. Jeżeli wyniki badania ustalającego zakres dawkowania lub istniejące dane będą wskazywały, że badana substancja chemiczna nie wywołuje toksyczności, najwyższa dawka w przypadku podania jednorazowego powinna wynosić 2 000 mg/kg masy ciała. Jeżeli jednak badana substancja chemiczna będzie miała działanie toksyczne, maksymalną tolerowaną dawkę należy ustalić na poziomie odpowiadającym najwyższej podanej dawce, przy czym najlepiej byłoby, gdyby zastosowane poziomy dawek obejmowały zakres od dawki maksymalnej do dawki o niskiej toksyczności lub niewywołującej żadnej toksyczności. Jeżeli chodzi o nietoksyczne substancje chemiczne, dawka graniczna w przypadku okresu podawania trwającego 14 dni lub dłuższego wynosi 1 000 mg/kg masy ciała dziennie, a w przypadku okresu podawania trwającego krócej niż 14 dni – 2 000 mg/kg masy ciała dziennie.

Podawanie dawek

28.

Planując test, należy wziąć pod uwagę przewidywaną drogę narażenia ludzi. W związku z tym można wybrać jako uzasadnione takie drogi narażenia, jak podanie substancji z paszą, z wodą do picia, podskórne, dożylne, przez wdychanie, ustne (przez sondę) lub przez implantację. W każdym razie drogę narażenia należy dobrać w taki sposób, aby zapewnić odpowiednie narażenie tkanek docelowych. Zasadniczo nie zaleca się dokonywania wstrzyknięć dootrzewnowych, ponieważ nie jest to typowa droga narażenia ludzi – taką drogę należy stosować wyłącznie w przypadku wystąpienia konkretnego uzasadnienia naukowego. Jeżeli badaną substancję chemiczną dodaje się do paszy lub wody do picia, w szczególności w przypadku pojedynczej dawki substancji, należy upewnić się, że okres między spożyciem paszy i wody a kryciem jest wystarczający, aby zapewnić możliwość wykrycia skutków podania substancji (pkt 31). Maksymalna objętość płynu, jaką można podać przez sondę lub wstrzyknąć jednorazowo, zależy od wielkości zwierzęcia doświadczalnego. Objętość ta nie powinna co do zasady przekraczać 1 ml/100 g masy ciała oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można zastosować maksymalnie 2 ml/100 g masy ciała. Zastosowanie objętości wyższych niż podane (jeżeli są dopuszczone przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt) powinno być uzasadnione. Zmienność objętości badanej substancji należy zminimalizować, dostosowując stężenie, aby zapewnić stałą objętość w stosunku do masy ciała przy wszystkich poziomach dawek.

Obserwacje

29.

Ogólne obserwacje kliniczne zwierząt doświadczalnych wraz z rejestrowaniem objawów klinicznych powinny odbywać się co najmniej raz dziennie, najlepiej każdego dnia o tej samej porze i z uwzględnieniem szczytowego okresu przewidywanych skutków po dawkowaniu. Co najmniej dwa razy dziennie w trakcie okresu dawkowania wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane pod kątem zachorowalności i upadkowości. Wszystkie zwierzęta powinny być ważone na początku badania i co najmniej raz w tygodniu w trakcie badań dawki powtórzonej, a także w momencie ich uśmiercenia. Pomiary ilości spożytego pokarmu powinny być dokonywane co najmniej co tydzień. Jeżeli badana substancja chemiczna jest podawana w wodzie do picia, należy mierzyć spożycie wody przy każdej zmianie wody i co najmniej raz w tygodniu. Zwierzęta, u których stwierdzono oznaki podwyższonej toksyczności nieprowadzące do śmierci, należy uśmiercić przed zakończeniem okresu badania (27).

Pobieranie i przetwarzanie tkanek

30.

Samice uśmierca się w drugiej połowie okresu ciąży, tj. w 13. dniu ciąży w przypadku myszy i w 14.–15. dniu ciąży w przypadku szczurów. Macice bada się pod kątem cech świadczących o dominującej mutacji letalnej, aby ustalić liczbę zagnieżdżonych zarodków, żywych i martwych embrionów oraz ciałek żółtych.

31.

Rogi macicy i jajniki odsłania się w celu policzenia ciałek żółtych; płody są następnie usuwane, zliczane i ważone. Należy pamiętać o zbadaniu macic pod kątem resorbowanych jaj płodowych przesłoniętych żywymi płodami oraz o wyliczeniu wszystkich przypadków resorpcji. Należy odnotować upadkowość płodów. Odnotowuje się również liczbę skutecznie zapłodnionych samic oraz łączną liczbę implantacji, strat przedimplantacyjnych i upadkowości po implantacji (uwzględniając przypadki resorpcji na wczesnym i późnym etapie). Ponadto widoczne płody mogą zostać utrwalone w utrwalaczu Bouina na co najmniej 2 tygodnie; następnie bada się je pod kątem poważnych zewnętrznych wad rozwojowych (28), aby uzyskać dodatkowe informacje na temat wpływu badanego czynnika na rozrodczość i rozwój.

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Opracowanie wyników

32.

Dane należy przedstawić w formie tabeli, wskazując liczbę samców, które pokryły samice, liczbę ciężarnych samic, oraz liczbę samic niebędących w ciąży. Wyniki krycia, w tym dane identyfikacyjne każdego samca i samicy, należy odnotować indywidualnie. W odniesieniu do każdej samicy należy wskazać okres krycia, poziom dawek, jakie podano samcom poddawanym działaniu substancji, oraz liczbę żywych i martwych zagnieżdżonych zarodków.

33.

Straty poimplantacyjne oblicza się, ustalając stosunek martwych zagnieżdżonych zarodków do całkowitej liczby zagnieżdżonych zarodków w grupie poddawanej działaniu substancji i zestawiając ten stosunek ze stosunkiem martwych zagnieżdżonych zarodków do łącznej liczby zagnieżdżonych zarodków w danej grupie kontrolnej z nośnikiem/rozpuszczalnikiem.

34.

Straty przedimplantacyjne oblicza się jako różnicę między liczbą ciałek żółtych a liczbą zagnieżdżonych zarodków lub jako spadek średniej liczby zagnieżdżonych zarodków na daną samicę w porównaniu z kryciami kontrolnymi. Jeżeli oszacowano straty przedimplantacyjne, należy zgłosić ten fakt.

35.

Wartość wskaźnika dominującej mutacji letalnej szacuje się w następujący sposób: (upadki po implantacji / łączna liczba implantacji na samicę) × 100.

36.

Należy zgłosić dane dotyczące toksyczności i objawów klinicznych (zgodnie z pkt 29).

Kryteria dopuszczalności

37.

Dopuszczalność badania ocenia się na podstawie następujących kryteriów:

równoczesna kontrola ujemna jest zgodna z opublikowanymi normami dotyczącymi danych historycznych w zakresie kontroli ujemnych, a także – w stosownych przypadkach – z danymi historycznymi w zakresie kontroli zgromadzonymi przez dane laboratorium (zob. pkt 10 i 18);

równoczesne kontrole dodatnie powinny wywoływać reakcje zgodne z reakcjami odnotowanymi w opublikowanych normach dotyczących historycznych prób kontrolnych dodatnich lub reakcje zgodne z reakcjami odnotowanymi w prowadzonej przez laboratorium bazie danych historycznych dotyczących kontroli dodatniej, jeżeli taka baza jest dostępna, i doprowadzić do statystycznie istotnego wzrostu w porównaniu z kontrolą ujemną (zob. pkt 17 i 18);

poddano analizie wystarczającą liczbę zagnieżdżonych zarodków i dawek (pkt 20);

kryteria wyboru najwyższej dawki są spójne z kryteriami opisanymi w pkt 24 i 27.

Ocena i interpretacja wyników

38.

Aby uzyskać wystarczające dane do analizy zależności dawka-odpowiedź, należy przeanalizować co najmniej trzy poddane działaniu substancji grupy dawkowania.

39.

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik jednoznacznie dodatni, jeżeli:

co najmniej jedna badana dawka wykazuje statystycznie istotny wzrost w porównaniu z równoczesną kontrolą ujemną,

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu pokazuje, że wzrost jest powiązany z dawką w co najmniej jednym z warunków doświadczalnych (np. tygodniowy odstęp między okresami krycia), oraz

którykolwiek wynik znajduje się poza dopuszczalnym zakresem danych dotyczących kontroli ujemnej lub poza rozkładem danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej gromadzonych przez dane laboratorium (np. poza granicami kontrolnymi wyznaczającymi przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona), jeżeli takie dane są dostępne.

Od tego momentu badaną substancję chemiczną uznaje się za zdolną do wywołania dominujących mutacji letalnych w komórkach germinalnych zwierząt doświadczalnych. W pkt 44 opisano zalecenia dotyczące najodpowiedniejszych metod statystycznych; informacje na temat innych zalecanych podejść statystycznych można znaleźć również w literaturze (20)(21)(22)(24)(29). Jednostką doświadczalną w zastosowanych badaniach statystycznych powinno być zwierzę.

40.

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik jednoznacznie ujemny, jeżeli:

żadna dawka testowa nie wykazuje statystycznie istotnego wzrostu w porównaniu z równoczesną kontrolą ujemną,

w ramach żadnego warunku doświadczalnego nie dochodzi do wzrostu powiązanego z dawką, oraz

wszystkie wyniki mieszczą się w dopuszczalnym zakresie danych dotyczących kontroli ujemnych lub danych historycznych dotyczących kontroli ujemnych gromadzonych przez dane laboratorium (np. w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona), jeżeli takie dane są dostępne.

Od tego momentu badaną substancję chemiczną uznaje się za niezdolną do wywołania dominujących mutacji letalnych w komórkach germinalnych zwierząt doświadczalnych.

41.

Weryfikacja jednoznacznie dodatniej lub jednoznacznie ujemnej reakcji nie jest wymagana.

42.

Jeżeli reakcja nie jest ani jednoznacznie ujemna, ani jednoznacznie dodatnia oraz aby ułatwić ustalenie biologicznego znaczenia wyniku (np. niewielki lub graniczny wzrost), dane powinny zostać ocenione w oparciu o opinię eksperta lub wyniki dalszych badań przy wykorzystaniu istniejących danych doświadczalnych, takich jak dane wskazujące, czy wynik dodatni wykracza poza zakres danych dotyczących kontroli ujemnej lub poza zakres danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej gromadzonych przez dane laboratorium (30).

43.

W rzadkich przypadkach, nawet po przeprowadzeniu dalszych badań, uzyskany zbiór danych uniemożliwi uznanie wyników za dodatnie lub ujemne i w takiej sytuacji wynik zostanie uznany za niejednoznaczny.

44.

W badaniach statystycznych należy przyjąć, że jednostką doświadczalną jest zwierzę płci męskiej. Choć dane o liczbie (np. liczba zagnieżdżonych zarodków na samicę) mogą być rozłożone zgodnie z rozkładem Poissona lub odpowiednie dane dotyczące proporcji (np. odsetek martwych zagnieżdżonych zarodków) mogą być rozłożone zgodnie z rozkładem dwumianowym, takie dane są niejednokrotnie nadmiernie rozproszone (31). Dlatego też w ramach analizy statystycznej należy w pierwszej kolejności przeprowadzić badanie służące ustaleniu, czy w danym przypadku dochodzi do nadmiernego lub zbyt małego rozproszenia, takie jak test wariancji dwumianowej Cochrana (32) lub test Tarone’a C(α) w przypadku nadmiernego rozproszenia dwumianowego (31)(33). Jeżeli nie zostanie stwierdzone odstępstwo od rozproszenia dwumianowego, tendencje w zakresie proporcji przy poszczególnych poziomach dawek można zbadać, przeprowadzając test tendencji Cochrana-Armitage’a (34), przy czym przeprowadzane parami porównania z grupą kontrolną mogą zostać zbadane w ramach testu dokładnego Fishera (35). Podobnie w przypadku niestwierdzenia odstępstwa od rozproszenia dwumianowego tendencje w zakresie danych liczbowych można zbadać za pomocą regresji Poissona (36), przy czym przeprowadzane sparowane porównania z grupą kontrolną mogą zostać zbadane w kontekście modelu Poissona przy wykorzystaniu sparowanych kontrastów (36). W przypadku stwierdzenia znacznego nadmiernego lub zbyt małego rozproszenia zaleca się skorzystanie z metod nieparametrycznych (23)(31). Metody te obejmują bezparametrowe badanie statystyczne, takie jak test Jonckheere’a-Terpstry dla tendencji (37) i testy Manna-Whitneya (38) dla sparowanych porównań z grupą kontrolną z nośnikiem/rozpuszczalnikiem, a także testów permutacyjnych, testów, w ramach których dochodzi do ponownego wyboru próby, testów bootstrapowych dla tendencji oraz przeprowadzanych parami porównań z grupą kontrolną (31)(39).

45.

Dodatni wynik testu dominującej mutacji letalnej dostarcza dowodów potwierdzających genotoksyczność badanej substancji chemicznej w odniesieniu do komórek germinalnych samca poddawanego działaniu substancji chemicznej, należącego do gatunku doświadczalnego.

46.

Ustalenie, czy odnotowane wartości mieszczą się w zakresie danych historycznych dotyczących kontroli, czy też wykraczają poza ten zakres, może okazać się pomocne w kontekście oceny biologicznego znaczenia reakcji (40).

Sprawozdanie z badania

47.

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

Streszczenie.

 

Badana substancja chemiczna:

źródło, numer partii, termin przydatności, jeżeli jest dostępny;

stabilność badanej substancji chemicznej, jeżeli jest znana;

rozpuszczalność i stabilność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku, jeżeli są znane;

pomiar pH, osmolalności i osadu w podłożu, do którego dodano badaną substancję chemiczną, stosownie do przypadku.

 

Substancja jednoskładnikowa:

wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne;

dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, stosownie do przypadku i jeśli jest to praktycznie wykonalne, itp.

 

Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny:

opisane w miarę możliwości przez podanie nazwy chemicznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników.

 

Przygotowanie badanej substancji chemicznej:

uzasadnienie wyboru nośnika;

rozpuszczalność oraz stabilność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli są znane;

przygotowanie postaci użytkowych przeznaczonych do spożycia w paszy i z wodą do picia lub w formie wziewnej;

oznaczenie analityczne postaci użytkowych (np. stabilność, jednorodność, stężenia nominalne), jeżeli jest przeprowadzane.

 

Zwierzęta doświadczalne:

gatunek/szczep wykorzystywane w badaniu wraz z uzasadnieniem jego wyboru;

liczba, wiek i płeć zwierząt;

źródło pochodzenia, warunki utrzymywania, pasza itp.;

metoda niepowtarzalnej identyfikacji zwierząt;

w przypadku badań krótkoterminowych: masa ciała poszczególnych samców na początku i na końcu badania; w przypadku badań trwających dłużej niż jeden tydzień: masa ciała poszczególnych zwierząt w trakcie badania oraz informacje o spożyciu pokarmu. W odniesieniu do każdej grupy należy uwzględnić informacje o zakresie masy ciała oraz o średniej i odchyleniu standardowym.

 

Warunki badania:

dane dotyczące kontroli dodatnich i ujemnych (z rozpuszczalnikiem/nośnikiem);

dane uzyskane w ramach badania ustalającego zakres dawkowania;

uzasadnienie wyboru poziomu dawkowania;

szczegółowe informacje dotyczące przygotowania badanej substancji chemicznej;

szczegółowe informacje dotyczące podawania badanej substancji chemicznej;

uzasadnienie drogi podawania;

metody pomiaru toksyczności u zwierząt, w tym dostępne analizy histopatologiczne lub hematologiczne oraz częstotliwość przeprowadzania obserwacji zwierząt i pomiaru masy ciała;

metody sprawdzania, czy badana substancja chemiczna dotarła do tkanki docelowej lub do krwiobiegu w przypadku otrzymania wyników ujemnych;

dawka faktyczna (mg/kg masy ciała na dobę) obliczona w oparciu o stężenie badanej substancji chemicznej w paszy/wodzie do picia (ppm) i spożycie, w stosownych przypadkach;

szczegółowe informacje dotyczące jakości pokarmu i wody;

szczegółowe informacje dotyczące urozmaicenia warunków bytowania w klatce;

szczegółowy opis harmonogramów podawania substancji chemicznej i pobierania próbek oraz ich uzasadnienie;

metoda analgezji;

metoda uśmiercenia;

procedury izolowania i konserwacji tkanek;

źródło i numery partii wszystkich zestawów i odczynników (w stosownych przypadkach);

metody oznaczania liczby dominujących mutacji letalnych;

harmonogram krycia;

metody stosowane w celu ustalenia, czy nastąpiło krycie;

czas uśmiercenia;

kryteria oceny punktowej skutków dominującej mutacji letalnej, z uwzględnieniem ciałek żółtych, implantacji, resorpcji i strat przedimplantacyjnych, żywych zagnieżdżonych zarodków, martwych zagnieżdżonych zarodków.

 

Wyniki:

stan zwierząt przed badaniem i podczas całego okresu badania, w tym oznaki toksyczności;

masa ciała samca w okresie poddawania działaniu substancji i w okresie krycia;

liczba pokrytych samic;

w stosownych przypadkach zależność dawka-odpowiedź;

dane dotyczące równoczesnych i historycznych kontroli ujemnych z uwzględnieniem zakresów, średnich i odchyleń standardowych;

dane dotyczące równoczesnych kontroli dodatnich;

dane zestawione w formie tabeli dla każdej z matek, w tym: liczba ciałek żółtych u danej matki; liczba implantacji u danej matki; liczba resorpcji i strat przedimplantacyjnych u danej matki; liczba żywych zagnieżdżonych zarodków u danej matki; liczba martwych zagnieżdżonych zarodków u danej matki; masy płodów;

powyższe dane zestawione dla poszczególnych okresów krycia i dawek z uwzględnieniem częstości występowania dominujących mutacji letalnych;

zastosowane analizy i metody statystyczne.

 

Omówienie wyników.

 

Wniosek.

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. [W:] Publikacje na temat środowiska, seria dotycząca badań i oceny nr 234. Paryż: OECD.

(2)

Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, [w:] B. J. Kilbey et al. (red.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures s. 235–334, Elsevier, Amsterdam.

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M. i Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Dokument sporządzony przez grupę roboczą utworzoną w ramach powołanej ad hoc komisji ds. genetyki chemicznej zajmującej się dominującymi mutacjami letalnymi. „Toxicol.”nr 39, s. 173–185.

(4)

Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. „Mutation Res.” nr 352, s. 159–167.

(5)

Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. i Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. „Mutation Research” nr 48, s. 267–270.

(6)

Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. i Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene.„Mutation Research” nr 397, s. 74–77.

(7)

Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. i Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats.Toxicology Lett.” nr 20, s. 325–329.

(8)

Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. i Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats.„Fundamental and Applied Toxicology” nr 3, s. 80–85.

(9)

Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., i Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells.„Mutation Research” nr 33, s. 239–249.

(10)

Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. i Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. „Biology of Reproduction” nr 70, s. 616–624.

(11)

Marchetti F. i Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations.„Birth Defects Research”, nr C 75: 112–129

(12)

Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans.„Mutation Research” nr 352, s. 169–172.

(13)

Favor J. i Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, „Mutation Research” nr 53, s. 21–27.

(14)

Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. i Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. „Mutation Research” nr 345, s. 167–180.

(15)

Hastings S.E., Huffman K.W. i Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine.„Mutation Research” nr 40, s. 371–378.

(16)

James D.A. i Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, „Mutation Research” nr 99 s. 303–314.

(17)

Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. i Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice.„Mutation Research” nr 173, s. 35–40.

(18)

Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. i Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice.„Mutation Research” nr 296, s. 143–156.

(19)

Holstrom L.M., Palmer A.K. i Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. i Fox M. (red.), Cambridge: Cambridge University Press, s. 129–156.

(20)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. i Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis.„Mutation Research” nr 417 s. 19–30.

(21)

Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. i Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests.„Mutation Research” nr 312, s. 313-318.

(22)

Generoso W.M. i Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice.„Methods in Toxicology”, część 3A, s. 124–141.

(23)

Haseman J.K. i Soares E.R. The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects.„Mutation Research” nr 41, s. 277–288.

(24)

Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality. Teratogen. Carcinogen. „Mutagenesis” nr 1, s. 353–360.

(25)

Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S. i Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies.„Mutation Research” nr 85, s. 417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. i Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays.„Mutagenesis” nr 7 s. 313–319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, [w:] Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 19), Paryż: Organisation for Economic Cooperation and Development.

(28)

Barrow M.V., Taylor W.J i Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, nr. 127, s. 291–306.

(29)

Kirkland D.J., (red.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Cambridge University Press.

(30)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. i Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data.„Mutation Research” nr 723, s. 87–90.

(31)

Lockhart A.C., Piegorsch W.W. i Bishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay.„Mutation Research” nr 272, s. 35–58.

(32)

Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests.„Biometrics” nr 10, 417–451.

(33)

Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution.„Biometrika” nr 66, 585–590.

(34)

Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. [W:] Kotz S. and Johnson N. L. (red.) Encyclopedia of Statistical Sciences. t. 9, s. 334–336. John Wiley and Sons, Nowy Jork.

(35)

D.R. Cox, Analysis of Binary Data. Chapman and Hall, Londyn (1970).

(36)

Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. i Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models. wydanie czwarte, rozdziały 14 i 17, McGraw-Hill, Boston.

(37)

Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives.„Biometrika” nr 41, s. 133–145.

(38)

Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, Nowy Jork.

(39)

Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Filadelfia.

(40)

Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, Nowy Jork.

Dodatek 1

DEFINICJE

Substancja chemiczna: substancja lub mieszanina.

Ciałko żółte (ciałka żółte): hormonalna struktura wydzielnicza utworzona na jajniku w obszarze pęcherzyka, który uwolnił jajo. Liczba ciałek żółtych w jajnikach odpowiada liczbie jaj, u których nastąpił proces owulacji.

Dominująca mutacja letalna: mutacja, która zachodzi w komórce germinalnej lub utrwala się po zapłodnieniu, powodując śmierć embrionu lub stratę płodu.

Współczynnik płodności: liczba pokrytych ciężarnych samic w stosunku do liczby pokrytych samic.

Okres krycia: czas między zakończeniem fazy narażenia a kryciem przez samców poddanych działaniu substancji. Kontrolowanie tego okresu pozwala na ocenę wpływu efektów chemicznych na różne rodzaje komórek germinalnych. W przypadku krycia myszy w 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7. i 8. tygodniu po zakończeniu narażenia mierzy się skutki, jakie zaszły w plemnikach, skondensowanych spermatydach, okrągłych spermatydach, spermatocytach na etapie pachytenu, wczesnych spermatocytach, zróżnicowanych spermatogoniach, spermatogoniach różnicujących oraz w spermatogoniach macierzystych.

Strata przedimplantacyjna: różnica między liczbą zagnieżdżonych zarodków a liczbą ciałek żółtych. Można ocenić przez porównanie całkowitej ilości zagnieżdżonych zarodków u danej samicy w grupie poddanej działaniu substancji i grupach kontrolnych.

Strata poimplantacyjna: odsetek martwych zagnieżdżonych zarodków w grupie poddanej działaniu substancji porównany ze stosunkiem liczby martwych zagnieżdżonych zarodków do ich całkowitej liczby w grupie kontrolnej.

Badana substancja chemiczna: dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

UVCB: substancje o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji lub materiały biologiczne.

Dodatek 2

HARMONOGRAM SPERMATOGENEZY U SSAKÓW

Image 1

Rysunek. 1. Porównanie czasu trwania (w dniach) rozwoju męskiej komórki germinalnej u myszy i człowieka. Naprawa DNA nie następuje w okresach wskazanych przez zacienienie.

Powyższy schemat przedstawia przebieg spermatogenezy u myszy, szczurów i człowieka (źródło: „Alder” 1996). Do spermatogoniów niezróżnicowanych zalicza się: spermatogonia A single (As); spermatogonia A paired (Ap); oraz spermatogonia A aligned (Aal) (źródło: Hess and de Franca, 2008). Spermatogonia A single uznaje się za rzeczywiste komórki macierzyste; w związku z tym, aby móc przeprowadzić ocenę wpływu na komórki macierzyste, między ostatnim wstrzyknięciem badanej substancji chemicznej a kryciem musi upłynąć co najmniej 49 dni (w przypadku myszy).

Źródła

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans.„Mutation Research” nr 352, s. 169–172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium [W:] C. Yan Cheng (red.), Molecular Mechanisms in Spermatogenesis. Landes Biosciences and Springer Science & Business Media, s. 1–15.

4)

w części B rozdział B.23 otrzymuje brzmienie:

„B.23   BADANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ SPERMATOGONIÓW U SSAKÓW

WPROWADZENIE

1.

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 483 (2016). Metody badawcze są okresowo poddawane przeglądowi w związku z postępem naukowym, zmieniającymi się potrzebami regulacyjnymi oraz troską o dobrostan zwierząt. Niniejsza zmodyfikowana wersja metody badawczej odzwierciedla wieloletnie doświadczenie w przeprowadzaniu tego badania oraz potencjał integracji lub łączenia tego badania z innymi badaniami dotyczącymi toksyczności lub genotoksyczności. Łączenie badań toksyczności stwarza możliwość ograniczenia liczby zwierząt wykorzystywanych w badaniach toksyczności. Niniejsza metoda badawcza stanowi część cyklu metod badawczych dotyczących toksykologii genetycznej. OECD opracowała dokument, który zawiera zwięzłe informacje na temat badań w zakresie toksykologii genetycznej oraz przegląd najnowszych zmian, jakie wprowadzono do wytycznych OECD dotyczących badań w zakresie toksykologii genetycznej (1).

2.

Celem badania aberracji chromosomowej spermatogoniów u ssaków in vivo jest zidentyfikowanie substancji chemicznych, które powodują strukturalne aberracje chromosomowe w spermatogoniach ssaków (2)(3)(4). Ponadto niniejsze badanie jest istotne dla oceny genotoksyczności, ponieważ czynniki związane z metabolizmem, farmakokinetyką oraz procesami naprawy DNA in vivo – choć mogą różnić się w zależności od gatunku – są aktywne i wywierają wpływ na reakcję. Niniejsza metoda badawcza nie służy do pomiaru aberracji liczbowych; testu tego nie stosuje się rutynowo w tym celu.

3.

Za pomocą niniejszego badania mierzy się strukturalne aberracje chromosomowe (zarówno w typie chromosomowym, jak i chromatydowym) w dzieleniu komórek germinalnych i w związku z tym oczekuje się, że pozwoli ono prognozować wprowadzanie dziedzicznych mutacji w komórkach germinalnych.

4.

Definicje kluczowych terminów podano w dodatku.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE

5.

Chociaż niniejsze badanie przeprowadza się zazwyczaj na gryzoniach, w niektórych przypadkach dopuszcza się również możliwość wykorzystania innych gatunków, jeżeli zostanie to naukowo uzasadnione. Standardowe preparaty cytogenetyczne jąder gryzoni umożliwiają wygenerowanie metafaz mitotycznych (spermatogoniów) oraz mejotycznych (spermatocytów). Metafazy mitotyczne oraz mejotyczne można zidentyfikować, opierając się na morfologii chromosomów (4). Niniejsze badanie cytogenetyczne in vivo umożliwia wykrywanie strukturalnych aberracji chromosomowych podczas podziału mitotycznego spermatogonii. Inne komórki docelowe nie są przedmiotem niniejszej metody badawczej.

6.

Aby wykryć aberracje typu chromatydowego w spermatogoniach przed przekształceniem tych aberracji w aberracje typu chromosomowego w kolejnych podziałach komórek, należy zbadać pierwszy podział komórki mitotycznej następujący po poddaniu działaniu substancji. Dodatkowe informacje ze spermatocytów poddanych działaniu substancji można uzyskać w drodze analizy chromosomu mejotycznego pod kątem strukturalnych aberracji chromosomowych w diakinezie metafazy I i metafazie II.

7.

W jądrze występuje pewna liczba generacji spermatogoniów (5) i te różne rodzaje komórek germialnych mogą charakteryzować się pewnym zakresem wrażliwości na działanie substancji chemicznej. Zatem wykryte aberracje przedstawiają zagregowaną reakcję poddanych działaniu substancji populacji spermatogoniów. Spermatogonia B stanową większość komórek mitotycznych w preparatach z jądrem, a ich cykl komórkowy wynosi około 26 godzin (3).

8.

Jeżeli istnieją dowody świadczące o tym, że badana substancja chemiczna lub jej metabolit lub metabolity nie dotrą do jądra, nie należy przeprowadzać tego badania.

ZASADA METODY BADAWCZEJ

9.

Zasadniczo zwierzęta poddaje się działaniu badanej substancji chemicznej z zastosowaniem odpowiedniej drogi narażenia i uśmierca się je po upływie odpowiedniego czasu od podania substancji chemicznej. Przed uśmierceniem zwierzętom podaje się substancję chemiczną zawierającą środek zatrzymujący metafazę (np. kolchicynę lub Colcemid®). Następnie z komórek germinalnych sporządza się preparaty chromosomowe i je barwi, po czym analizuje się komórki metafazy pod kątem aberracji chromosomowych.

WERYFIKACJA BIEGŁOŚCI LABORATORIUM

10.

Kompetencje w zakresie przedmiotowego testu ustala się, wykazując zdolność do odtwarzania częstotliwości oczekiwanych wyników strukturalnej aberracji chromosomowej w spermatogoniach z substancjami służącymi do kontroli dodatniej (łącznie z reakcjami słabymi), takimi jak te wymienione w tabeli 1, oraz uzyskując częstotliwości kontroli ujemnej spójne z zakresem danych dotyczących kontroli dopuszczalnym w dostępnej literaturze (np. (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) lub z historycznym rozkładem kontroli laboratorium, jeżeli jest dostępny.

OPIS METODY

Czynności przygotowawcze

Wybór gatunku zwierząt

11.

Badania należy prowadzać na zdrowych młodych dorosłych zwierzętach należących do szczepów powszechnie wykorzystywanych w badaniach laboratoryjnych. Zazwyczaj wykorzystuje się samce myszy; jeżeli zostanie to naukowo uzasadnione, dopuszcza się jednak możliwość wykorzystania innych odpowiednich gatunków ssaków, dopuszcza się także przeprowadzenie niniejszego badania w połączeniu z inną metodą badawczą. W sprawozdaniu należy przedstawić naukowe uzasadnienie wykorzystania gatunków innych niż gryzonie.

Warunki utrzymywania i karmienia zwierząt

12.

W przypadku gryzoni temperatura w pomieszczeniu dla zwierząt powinna wynosić 22 °C (±3 °C). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 40 % i pożądane jest, by nie przekraczała 70 % poza okresami czyszczenia pomieszczenia, najlepiej byłoby, gdyby utrzymywała się na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne w cyklu 12 godzin z dostępem światła i 12 godzin bez dostępu światła. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Wybór paszy może zależeć od potrzeby zapewnienia odpowiedniej domieszki badanej substancji chemicznej, jeżeli jest ona podawana tą drogą. Gryzonie należy trzymać w małych grupach (nie więcej niż pięć zwierząt w klatce), jeżeli nie przewiduje się ich agresywnego zachowania, najlepiej w klatkach z pełną podłogą, oraz zapewnić im odpowiednie urozmaicenie warunków bytowania. Jeżeli ma to naukowe uzasadnienie, zwierzęta mogą być trzymane oddzielnie.

Przygotowanie zwierząt

13.

Zazwyczaj wykorzystuje się zdrowe młode dorosłe samce (w wieku 8–12 tygodni na początku badania) i losowo przydziela do grup kontrolnych i grup poddawanych działaniu substancji. Zwierzęta znakuje się indywidualnie przy użyciu humanitarnej, mało inwazyjnej metody (np. poprzez obrączkowanie, kolczykowanie, wszczepianie mikroukładów i identyfikację biometryczną, a nie przycinanie uszu lub palców) i aklimatyzuje do warunków laboratoryjnych przez co najmniej pięć dni. Klatki należy rozmieścić w taki sposób, aby zminimalizować potencjalny wpływ ich układu. Należy unikać zanieczyszczenia krzyżowego kontrolą dodatnią i badaną substancją chemiczną. W momencie rozpoczęcia badania różnice w masie ciała poszczególnych zwierząt powinny być minimalne i nie powinny przekraczać ±20 %.

Przygotowanie dawek

14.

Badane substancje chemiczne w stanie stałym należy rozpuszczać lub przygotowywać w postaci zawiesiny w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach lub dodawać do paszy lub do wody do picia przed podaniem dawki zwierzętom. Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym mogą być dawkowane bezpośrednio lub można je rozcieńczać przed dawkowaniem. W przypadku narażenia w drodze inhalacji badane substancje chemiczne można podawać w postaci gazu, pary lub stałych/ciekłych aerozoli, w zależności od ich właściwości fizykochemicznych. Należy stosować świeże preparaty badanej substancji chemicznej, chyba że z danych dotyczących stabilności wynika, iż przechowywanie tych preparatów jest dopuszczalne i że w danych tych określono warunki prawidłowego przechowywania takich preparatów.

Warunki badania – rozpuszczalnik/nośnik

15.

Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien wywoływać efektów toksycznych przy stosowanych poziomach dawek oraz nie powinien być w stanie wchodzić w reakcję chemiczną z badanymi substancjami chemicznymi. Jeśli stosowane są inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki, ich włączenie do doświadczenia powinno być poparte danymi referencyjnymi wskazującymi na ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników. Wśród przykładów powszechnie wykorzystywanych zgodnych rozpuszczalników/nośników można wymienić wodę, sól fizjologiczną, roztwór metylocelulozy, roztwór soli sodowej karboksymetylocelulozy, oliwę z oliwek i olej kukurydziany. Jeżeli nie istnieją historyczne lub opublikowane dane wykazujące, że wybrany nietypowy rozpuszczalnik/nośnik nie wywołuje żadnych strukturalnych aberracji chromosomowych ani innych szkodliwych skutków, należy wykonać badanie wstępne w celu ustalenia dopuszczalności stosowania kontroli z rozpuszczalnikiem/nośnikiem.

Kontrole dodatnie

16.

Zawsze należy prowadzić równoległą grupę zwierząt na potrzeby kontroli dodatniej, chyba że laboratorium wykazało biegłość w przeprowadzaniu badania oraz w niedawnej przeszłości regularnie przeprowadzało takie badania (np. w ciągu ostatnich 5 lat). W przypadku nieuwzględnienia równoczesnej kontroli dodatniej, do każdego doświadczenia należy włączyć kontrolę na potrzeby oceny ilościowej (utrwalone i niebarwione preparaty). Tego rodzaju kontrole można uzyskać, włączając do oceny ilościowej wyników badania odpowiednie próbki referencyjne, które pozyskano w trakcie odrębnego doświadczenia przeprowadzanego okresowo (np. co 6–18 miesięcy) z wykorzystaniem kontroli dodatniej, i które są przechowywane w laboratorium przeprowadzającym test; na przykład w trakcie badania biegłości i – w stosownych przypadkach – w regularnych odstępach czasu w późniejszym okresie.

17.

Substancje służące do kontroli dodatniej powinny w przewidywalny sposób generować zauważalny wzrost częstości występowania komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi w porównaniu z częstością występowania samorzutnego. Dawki stosowane do celów kontroli dodatniej należy dobierać w taki sposób, aby efekty były jasne, lecz aby osoba zliczająca nie była w stanie natychmiast zidentyfikować zakodowanych próbek. W tabeli 1 przedstawiono przykładowe substancje służące do kontroli dodatniej.

Tabela 1

Przykładowe substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej

Substancje [nr CAS] (numer referencyjny)

Cyklofosfamid (monohydrat) [nr CAS 50-18-0 (nr CAS 6055-19-2)] (9)

Cykloheksyloamina [nr CAS 108-91-8] (7)

Mitomycyna C [nr CAS 50-07-7] (6)

Akrylamid monomeryczny [CAS 79-06-1] (10)

Trietylenomelamina [CAS 51-18-3] (8)

Kontrole ujemne

18.

W każdym okresie pobierania próbek należy uwzględnić zwierzęta przeznaczone do celów kontroli ujemnej, poddane działaniu samego rozpuszczalnika lub nośnika, a poza tym badane w ten sam sposób, jak grupy poddawane działaniu substancji. Jeżeli nie istnieją historyczne lub opublikowane dane wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik/nośnik nie wywołuje żadnych aberracji chromosomowych lub innych szkodliwych skutków, zwierzęta w grupie kontrolnej powinny zostać również uwzględnione w każdym okresie pobierania próbek w celu ustalenia dopuszczalności grupy kontrolnej nośnika.

PROCEDURA

Liczba zwierząt

19.

Na początku badania należy ustalić liczebność grup w celu zapewnienia w każdej grupie co najmniej 5 samców. Uważa się, że ta liczba zwierząt w grupie jest wystarczająca, aby zapewnić odpowiednią moc testów statystycznych (tj. ogólnie umożliwiającą wykrycie co najmniej podwojenia częstości występowania aberracji chromosomowych, kiedy poziom kontroli ujemnej wynosi co najmniej 1,0 %, a prawdopodobieństwo poziomu istotności wynoszącego 0,05 jest równe 80 %) (3)(11). Zgodnie z maksymalnymi typowymi wymaganiami w zakresie liczby zwierząt – w przypadku badania, w ramach którego dwukrotnie pobiera się próbki, z trzema grupami dawkowania i równolegle prowadzoną kontrolą ujemną oraz dodatnią (każda grupa złożona z pięciu zwierząt), wymagane byłoby użycie 45 zwierząt.

Harmonogram podawania substancji chemicznej

20.

Badane substancje chemiczne zazwyczaj podaje się jednorazowo (tj. jako pojedynczą dawkę); można również zastosować inne schematy dawkowania, pod warunkiem że są one naukowo uzasadnione.

21.

W grupie otrzymującej najwyższą dawkę wykorzystywane są dwa okresy pobierania próbek po poddaniu działaniu substancji badanej. Ponieważ czas wymagany na wchłonięcie i metabolizm badanych substancji chemicznych oraz jego oddziaływanie na kinetykę cyklu komórkowego mogą wywierać wpływ na optymalny czas na wykrycie aberracji chromosomowej, wykorzystuje się wcześniejszy i późniejszy okres pobierania próbek – po upływie 24 godzin oraz po upływie 48 godzin po poddaniu działaniu substancji badanej. W przypadku dawek innych niż najwyższa należy wykorzystać wczesny okres pobierania próbek – po 24 godzinach (czas równy czasowi trwania cyklu komórkowego spermatogoniów B lub krótszy i tym samym optymalizujący prawdopodobieństwo oceny pierwszych metafaz po poddaniu działaniu substancji), chyba że znany jest inny, bardziej odpowiedni i uzasadniony okres pobierania próbek.

22.

Można stosować inne okresy pobierania próbek. Na przykład w przypadku substancji chemicznych, które mogą wywierać skutki niezależne od fazy S, odpowiednie mogą być wcześniejsze okresy pobierania próbek (tj. krótsze niż 24 godziny).

23.

Można wykorzystać schemat powtórzonej dawki substancji chemicznej, np. w połączeniu z badaniem w innym punkcie końcowym, w którym stosuje się okres podawania wynoszący 28 dni (np. metoda badawcza B.58); aby uwzględnić różne okresy pobierania próbek, będą jednak wymagane dodatkowe grupy zwierząt. W związku z powyższym odpowiedniość takiego schematu należy uzasadnić naukowo w poszczególnych przypadkach.

24.

Przed uśmierceniem zwierzętom wstrzykuje się dootrzewnowo odpowiednią dawkę substancji chemicznej zatrzymującej metafazę (np. Colcemid® lub kolchicyna). Następnie pobiera się próbkę ze zwierząt w odpowiednim odstępie czasu. W przypadku myszy i szczurów ten odstęp czasu wynosi około 3–5 godzin.

Poziomy dawek

25.

W przypadku przeprowadzenia wstępnego badania ustalającego zakres dawkowania ze względu na brak dostępnych odpowiednich danych umożliwiających dobranie dawki, badanie takie należy wykonać w tym samym laboratorium z wykorzystaniem tego samego gatunku, szczepu i schematu podawania substancji chemicznej, jakie mają być stosowane w badaniu głównym według zaleceń dotyczących prowadzenia badań ustalających zakres dawkowania (12). Celem badania powinno być określenie maksymalnej tolerowanej dawki (MTD) zdefiniowanej jako dawka powodująca niewielkie efekty toksyczne w stosunku do czasu trwania badania (na przykład nietypowe zachowanie lub reakcje, niewielki spadek masy ciała lub cytotoksyczność układu krwiotwórczego), ale niepowodująca śmierci lub objawów bólu, cierpienia albo stresu, które wiązałyby się z koniecznością uśmiercenia zwierząt (13).

26.

Najwyższa dawka może być również określona jako dawka wywołująca niektóre objawy toksyczności w spermatogoniach (np. zmniejszenie wskaźnika podziału mitotycznego spermatogonii w odniesieniu do pierwszej oraz drugiej metafazy podziału mejotycznego). Redukcja ta nie powinna przekroczyć 50 %.

27.

W przypadku badanych substancji chemicznych charakteryzujących się szczególną aktywnością biologiczną przy niskich dawkach nietoksycznych (takich jak hormony i mitogeny) oraz substancji chemicznych wykazujących intensywne parametry toksykokinetyczne dopuszcza się możliwość zastosowania odstępstwa od kryteriów ustalania dawek – każdą taką substancję należy oceniać indywidualnie.

28.

Aby uzyskać informacje na temat zależności dawka-odpowiedź, w kompletnym badaniu należy uwzględnić grupę kontrolną ujemną (pkt 18) oraz co najmniej trzy poziomy dawek, przy czym każda kolejna dawka jest większa od poprzedniej na ogół dwukrotnie, ale nie więcej niż czterokrotnie. Jeżeli wyniki badania ustalającego zakres dawkowania lub istniejące dane będą wskazywały, że badana substancja chemiczna nie wywołuje toksyczności, najwyższa dawka w przypadku podania jednorazowego powinna wynosić 2 000 mg/kg masy ciała. Jeżeli jednak badana substancja chemiczna będzie miała działanie toksyczne, maksymalną tolerowaną dawkę należy ustalić na poziomie odpowiadającym najwyższej podanej dawce, przy czym najlepiej byłoby, gdyby zastosowane poziomy dawek obejmowały zakres od dawki maksymalnej do dawki o niskiej toksyczności lub niewywołującej żadnej toksyczności. W przypadku zaobserwowania toksyczności w tkance docelowej (tj. w jądrze) przy wszystkich badanych poziomach dawek zaleca się dalsze badania z wykorzystaniem dawek nietoksycznych. W przypadku badań przeprowadzanych w celu uzyskania bardziej szczegółowych ilościowych informacji na temat zależności dawka-odpowiedź konieczne może okazać się utworzenie dodatkowych grup dawkowania. Wspomniane wartości graniczne mogą różnić się w przypadku niektórych rodzajów badanych substancji chemicznych (np. produktów leczniczych przeznaczonych dla ludzi), które podlegają szczególnym wymogom. Jeżeli badana substancja chemiczna wywołuje toksyczność, należy wybrać dawkę graniczną i dwie niższe dawki (jak opisano powyżej). Dawka graniczna w przypadku okresu podawania trwającego 14 dni lub dłuższego wynosi 1 000 mg/kg masy ciała dziennie, a w przypadku okresu podawania trwającego krócej niż 14 dni – 2 000 mg/kg masy ciała dziennie.

Podawanie dawek

29.

Planując test, należy wziąć pod uwagę przewidywaną drogę narażenia ludzi. W związku z tym można wybrać jako uzasadnione takie drogi narażenia, jak podanie substancji z paszą, z wodą do picia, miejscowe, podskórne, dożylne, ustne (przez sondę), przez wdychanie lub przez implantację. Drogę narażenia należy w każdym razie dobrać w taki sposób, aby zapewnić odpowiednie narażenie tkanki docelowej. Zasadniczo nie zaleca się dokonywania wstrzyknięć dootrzewnowych, o ile nie jest to naukowo uzasadnione, ponieważ nie jest to zazwyczaj droga narażenia ludzi pod względem fizjologicznym. Jeżeli badaną substancję chemiczną dodaje się do paszy lub wody do picia, w szczególności w przypadku pojedynczej dawki substancji, należy upewnić się, że okres między spożyciem paszy i wody a pobraniem próbki jest wystarczający, aby zapewnić możliwość wykrycia skutków podania substancji (zob. pkt 33). Maksymalna objętość płynu, jaką można podać przez sondę lub wstrzyknąć jednorazowo, zależy od wielkości zwierzęcia doświadczalnego. Objętość ta nie powinna co do zasady przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można zastosować maksymalnie 2 ml/100 g masy ciała. Zastosowanie objętości wyższych niż podane (jeżeli są dopuszczone przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt) powinno być uzasadnione. Zmienność objętości badanej substancji należy zminimalizować, dostosowując stężenie, aby zapewnić stałą objętość w stosunku do masy ciała przy wszystkich poziomach dawek.

Obserwacje

30.

Ogólne obserwacje kliniczne zwierząt doświadczalnych wraz z rejestrowaniem objawów klinicznych powinny odbywać się co najmniej raz dziennie, najlepiej każdego dnia o tej samej porze i z uwzględnieniem szczytowego okresu przewidywanych skutków po dawkowaniu. Co najmniej dwa razy dziennie wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane pod kątem zachorowalności i upadkowości. Wszystkie zwierzęta powinny być ważone na początku badania, co najmniej raz w tygodniu w trakcie badań z dawką powtórzoną oraz po uśmierceniu. W przypadku badań trwających co najmniej tydzień co najmniej raz w tygodniu należy dokonywać pomiaru ilości spożytego pokarmu. Jeżeli badana substancja chemiczna jest podawana w wodzie do picia, należy mierzyć spożycie wody przy każdej zmianie wody i co najmniej raz w tygodniu. Zwierzęta, u których stwierdzono oznaki podwyższonej toksyczności nieprowadzące do śmierci, należy uśmiercić przed zakończeniem okresu badania (13).

Przygotowanie chromosomów

31.

Natychmiast po uśmierceniu pozyskuje się zawiesiny komórek germinalnych z jednego jądra lub z obu jąder, poddaje działaniu roztworu hipotonicznego i utrwala zgodnie z ustalonymi protokołami (np. (2)(14)(15)). Komórki umieszcza się następnie na szkiełkach mikroskopowych i barwi (16)(17). Wszystkie szkiełka mikroskopowe należy zakodować, aby osoba zliczająca nie mogła ich zidentyfikować.

Analiza

32.

W przypadku każdego zwierzęcia należy ocenić co najmniej 200 prawidłowo rozmieszczonych metafaz (3)(11). Jeżeli historyczna częstość kontroli ujemnych jest < 1 %, w przypadku każdego zwierzęcia należy ocenić ponad 200 komórek, aby zwiększyć moc testów statystycznych (3). Należy zastosować metody barwienia, które umożliwiają identyfikację centromeru.

33.

Aberracje typu chromosomowego i chromatydowego należy odnotowywać oddzielnie i klasyfikować według podtypów (pęknięcia, wymiany). Przy ustalaniu, czy substancja chemiczna powoduje znaczący wzrost występowania komórek z aberracjami chromosomowymi, należy odnotować przerwy bez ich uwzględniania. Procedury stosowane w laboratorium powinny zapewniać przeprowadzanie analizy aberracji chromosomowych przez odpowiednio przeszkolonych pracowników dokonujących oceny punktowej. Z uwagi na fakt, iż w wyniku przygotowywania preparatów często dochodzi do złamań w części komórek w metafazie, co prowadzi do utraty chromosomów, komórki poddawane ocenie punktowej powinny zawierać liczbę centromerów wynoszącą co najmniej 2n±2, gdzie n stanowi haploidalną liczbę chromosomów dla danego gatunku.

34.

Mimo że celem badania jest wykrycie strukturalnych aberracji chromosomowych, należy pamiętać o konieczności odnotowywania częstości występowania komórek poliploidalnych i komórek z endoreduplikowanymi chromosomami, jeżeli zaobserwowano wystąpienie tych zjawisk (zob. pkt 44).

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Opracowanie wyników

35.

Dane dotyczące poszczególnych zwierząt należy przedstawić w postaci tabeli. W przypadku każdego zwierzęcia należy ocenić liczbę komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi oraz liczbę aberracji chromosomowych na komórkę. Aberracje typu chromosomowego i chromatydowego sklasyfikowane według podtypów (pęknięcia, wymiany) należy wyszczególnić oddzielnie, podając ich liczbę i częstość występowania w grupach doświadczalnych i kontrolnych. Przerwy odnotowuje się osobno. Częstość występowania przerw zgłasza się, lecz zazwyczaj nie uwzględnia się ich w analizie ogólnej częstości występowania strukturalnych aberracji chromosomowych. Odsetek poliploidalności oraz komórek z endoreduplikowanymi chromosomami zgłasza się, jeżeli zostaną one zaobserwowane.

36.

Należy zgłosić dane dotyczące toksyczności i objawów klinicznych (zgodnie z pkt 30).

Kryteria dopuszczalności

37.

Dopuszczalność badania ocenia się na podstawie następujących kryteriów:

równoczesna kontrola ujemna jest zgodna opublikowanymi normami dotyczącymi danych historycznych dotyczących kontroli ujemnych, co do których oczkuje się, że odsetek komórek z aberracjami chromosomowymi będzie > 0 % i ≤ 1,5 %, a także – w stosownych przypadkach – zgodnie z danymi historycznymi dotyczącymi kontroli zgromadzonymi przez dane laboratorium (zob. pkt 10 i 18);

równoczesne kontrole dodatnie powinny wywoływać reakcje zgodne z reakcjami odnotowanymi w opublikowanych normach dotyczących historycznych prób kontrolnych dodatnich lub reakcje zgodne z reakcjami odnotowanymi w prowadzonej przez laboratorium bazie danych historycznych dotyczących kontroli dodatniej, jeżeli taka baza jest dostępna, i doprowadzić do statystycznie istotnego wzrostu w porównaniu z kontrolą ujemną (zob. pkt 17, 18);

poddano analizie wystarczające liczby komórek i dawek (zob. pkt 28 i 32);

kryteria wyboru najwyższej dawki są spójne z kryteriami opisanymi w pkt 25 i 26.

38.

Jeżeli obserwuje się zarówno mitozę, jak i mejozę, powinien zostać oznaczony wskaźnik podziału mitotycznego spermatogonii w odniesieniu do pierwszej i drugiej metafazy podziału mejotycznego, jako miara cytotoksyczności dla wszystkich zwierząt poddanych działaniu substancji oraz poddanych kontroli ujemnej w całkowitej próbie 100 dzielących się komórek na zwierzę. Jeżeli obserwuje się jedynie mitozę, indeks mitotyczny powinien zostać oznaczony w co najmniej 1 000 komórek w odniesieniu do każdego zwierzęcia.

Ocena i interpretacja wyników

39.

Aby uzyskać wystarczające dane do analizy zależności dawka-odpowiedź, należy przeanalizować co najmniej trzy poddane działaniu substancji grupy dawkowania.

40.

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik jednoznacznie dodatni, jeżeli:

co najmniej jedna badana dawka wykazuje statystycznie istotny wzrost w porównaniu z równoczesną kontrolą ujemną,

wzrost jest powiązany z dawką w co najmniej jednym okresie pobierania próbek; oraz

którykolwiek wynik znajduje się poza dopuszczalnym zakresem danych dotyczących kontroli ujemnej lub poza rozkładem danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej gromadzonych przez dane laboratorium (np. poza granicami kontrolnymi wyznaczającymi przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona), jeżeli takie dane są dostępne.

Od tego momentu badaną substancję chemiczną uznaje się za zdolną do wywołania aberracji chromosomowych w spermatogoniach zwierząt doświadczalnych. Zalecenia dotyczące najodpowiedniejszych metod statystycznych można również znaleźć w literaturze (11)(18). Jednostką doświadczalną w zastosowanych badaniach statystycznych powinno być zwierzę.

41.

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik jednoznacznie ujemny, jeżeli:

żadna dawka testowa nie wykazuje statystycznie istotnego wzrostu w porównaniu z równoczesną kontrolą ujemną,

w ramach żadnego warunku doświadczalnego nie dochodzi do wzrostu powiązanego z dawką, oraz

wszystkie wyniki mieszczą się w dopuszczalnym zakresie danych dotyczących kontroli ujemnych lub danych historycznych dotyczących kontroli ujemnych gromadzonych przez dane laboratorium (np. w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona), jeżeli takie dane są dostępne.

Od tego momentu badaną substancję chemiczną uznaje się za niezdolną do wywołania aberracji chromosomowych w spermatogoniach zwierząt doświadczalnych. Zalecenia dotyczące najodpowiedniejszych metod statystycznych można również znaleźć w literaturze (11)(18). Wynik ujemny nie wyklucza możliwości, że dana substancja chemiczna może wywoływać aberracje chromosomowe lub mutacje genowe w późniejszych fazach rozwojowych, których nie zbadano.

42.

Weryfikacja wyraźnie dodatniej lub ujemnej reakcji nie jest wymagana.

43.

Jeżeli reakcja nie jest ani jednoznacznie ujemna, ani jednoznacznie dodatnia oraz aby ułatwić ustalenie biologicznego znaczenia wyniku (np. niewielki lub graniczny wzrost), dane powinny zostać ocenione w oparciu o opinię eksperta lub wyniki dalszych badań przy wykorzystaniu istniejących danych doświadczalnych, takich jak dane wskazujące, czy wynik dodatni wykracza poza zakres danych dotyczących kontroli ujemnej lub poza zakres danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej gromadzonych przez dane laboratorium (19).

44.

W rzadkich przypadkach, nawet po przeprowadzeniu dalszych badań, uzyskany zbiór danych uniemożliwi uznanie wyników za dodatnie lub ujemne i w takiej sytuacji wynik zostanie uznany za niejednoznaczny.

45.

Wzrost liczby komórek poliploidalnych może świadczyć o tym, że badana substancja chemiczna może potencjalnie hamować procesy mitotyczne oraz powodować aberracje liczby chromosomów (20). Wzrost liczby komórek z endoreduplikowanymi chromosomami może świadczyć o tym, że badana substancja chemiczna może potencjalnie hamować przebieg cyklu komórkowego (21)(22), który jest innym mechanizmem wywoływania ilościowych zmian chromosomowych niż hamowanie procesów mitotycznych (zob. pkt 2). W związku z tym częstość występowania komórek poliploidalnych i komórek z endoreduplikowanymi chromosomami należy odnotować oddzielnie.

Sprawozdanie z badania

46.

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

 

Streszczenie.

 

Badana substancja chemiczna:

źródło, numer partii, termin przydatności, jeżeli jest dostępny;

stabilność badanej substancji chemicznej, jeżeli jest znana;

rozpuszczalność i stabilność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku, jeżeli są znane;

pomiar pH, osmolalności i osadu w podłożu, do którego dodano badaną substancję chemiczną, stosownie do przypadku.

 

Substancja jednoskładnikowa:

wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne;

dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, stosownie do przypadku i jeśli jest to praktycznie wykonalne, itp.

 

Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny:

opisane w miarę możliwości przez podanie nazwy chemicznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników.

 

Przygotowanie badanej substancji chemicznej:

uzasadnienie wyboru nośnika;

rozpuszczalność i stabilność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku/nośniku.

przygotowanie postaci użytkowych przeznaczonych do spożycia w paszy i z wodą do picia lub w formie wziewnej;

oznaczenia analityczne postaci użytkowych (np. stabilność, jednorodność, stężenia nominalne), jeżeli są przeprowadzane.

 

Zwierzęta doświadczalne:

gatunek/szczep wykorzystywane w badaniu wraz z uzasadnieniem jego zastosowania;

liczba oraz wiek zwierząt;

źródło pochodzenia, warunki utrzymywania, pasza itp.;

metoda niepowtarzalnej identyfikacji zwierząt;

w przypadku badań krótkoterminowych: masa ciała poszczególnych zwierząt na początku i na końcu badania; w przypadku badań trwających dłużej niż jeden tydzień: masa ciała poszczególnych zwierząt w trakcie badania oraz informacje o spożyciu pokarmu. W odniesieniu do każdej grupy należy uwzględnić informacje o zakresie masy ciała oraz o średniej i odchyleniu standardowym.

 

Warunki badania:

dane dotyczące kontroli dodatnich i ujemnych (z rozpuszczalnikiem/nośnikiem);

dane dotyczące studium określającego zakres badania, jeżeli zostało przeprowadzone;

uzasadnienie wyboru poziomu dawkowania;

uzasadnienie drogi podawania;

szczegółowe informacje dotyczące przygotowania badanej substancji chemicznej;

szczegółowe informacje dotyczące podawania badanej substancji chemicznej;

uzasadnienie czasu uśmiercenia;

metody pomiaru toksyczności u zwierząt, w tym dostępne analizy histopatologiczne lub hematologiczne oraz częstotliwość przeprowadzania obserwacji zwierząt i pomiaru masy ciała;

metody sprawdzania, czy badana substancja chemiczna dotarła do tkanki docelowej lub do krwiobiegu w przypadku otrzymania wyników ujemnych;

dawka faktyczna (mg/kg masy ciała na dobę) obliczona w oparciu o stężenie badanej substancji chemicznej w paszy/wodzie do picia (ppm) i spożycie, w stosownych przypadkach;

szczegółowe informacje dotyczące jakości pokarmu i wody;

szczegółowy opis harmonogramów podawania substancji chemicznej i pobierania próbek oraz ich uzasadnienie;

metoda uśmiercenia;

metoda analgezji (jeżeli jest stosowana);

procedury izolowania tkanek;

nazwa substancji chemicznej zatrzymującej metafazę, jej stężenie oraz czas poddania działaniu substancji;

metody przygotowywania preparatów;

kryteria oceny aberracji;

liczba poddanych analizie komórek przypadających na zwierzę;

kryteria uznawania badań za pozytywne, ujemne lub niejednoznaczne.

 

Wyniki:

stan zwierząt przed badaniem i podczas całego okresu badania, w tym oznaki toksyczności;

masa ciała i organów po uśmierceniu (jeżeli zastosowano wielokrotne poddanie działaniu substancji chemicznej, pomiar masy ciała przeprowadza się w trakcie danego schematu dawkowania);

oznaki toksyczności;

indeks mitotyczny;

wskaźnik podziału mitotycznego spermatogonii w odniesieniu do pierwszej i drugiej metafazy podziału mejotycznego lub inne dowody świadczące o narażeniu na tkankę docelową;

rodzaj i liczba aberracji podawane osobno dla każdego zwierzęcia;

łączna liczba aberracji na grupę wraz ze średnimi i odchyleniami standardowymi;

liczba komórek z aberracjami na grupę wraz ze średnimi i odchyleniami standardowymi;

w stosownych przypadkach zależność dawka-odpowiedź;

zastosowane analizy i metody statystyczne;

dane dotyczące równoczesnych kontroli ujemnych;

dane historyczne dotyczące kontroli ujemnej wraz z zakresami, średnimi, odchyleniami standardowymi i przedziałem ufności o wartości 95 % (w stosownych przypadkach) lub opublikowane dane historyczne dotyczące kontroli ujemnej wykorzystywane do akceptacji wyników badania;

dane dotyczące równoczesnych kontroli dodatnich;

zmiany ploidalności, jeżeli zostały zaobserwowane, w tym informacje na temat częstości występowania poliploidalności lub komórek endoreduplikowanych.

 

Omówienie wyników

 

Wniosek

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. [W:] Publikacje na temat środowiska, Seria dotycząca badań i oceny, nr 234, OECD, Paryż.

(2)

Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals, [W:] Mutagenicity Testing: a Practical Approach, red. S. Venitt i J.M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, s. 275–306.

(3)

Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. i Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests.„Mutation Research” nr 312, s. 313–318.

(4)

Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. „Mutation Research” nr 455, s. 167–189.

(5)

Hess, R.A. i de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium [W:] Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, (red.) Cheng C.Y, Landes Biosciences and Springer Science+Business Media, s. 1–15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C. „Mutation Research” nr 23(3): s. 368–379. Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, [W:] Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, (red.) Ramel C., Lambert B. i Magnusson J., Liss, New York, s. 477–484.

(7)

Cattanach, B.M., i Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse. „Mutation Research”, nr 12, 472–474.

(8)

Cattanach, B.M. i Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens. „Mutation Research”, nr 13, 371–375.

(9)

Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia. „Humangenetik”, nr 29, 135–140.

(10)

Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice. „Mutation Research”, nr 57(3), s. 313–324.

(11)

Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. i Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis.„Mutation Research” nr 417 s. 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. i Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays.„Mutagenesis”, nr 7, s. 313–319.

(13)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. „Series on Testing and Assessment”, nr 19, Organisation for Economic Cooperation and Development, Paryż.

(14)

Yamamoto, K. i Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. „Mutation Research”, nr 52, 207–209.

(15)

Hsu, T.C., Elder, F. i Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. „Environ. Mutagen.”, nr 1, s. 291–294.

(16)

Evans, E.P., Breckon, G., i Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. „Cytogenetics and Cell Genetics” nr 3, 289–294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. i Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, [w:] (red.) D.J. Kirkland, Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 115–141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.i Savage, J.R.K. (1989). „Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays”, [w:] (red.) D.J. Kirkland, Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, s. 184–232.

(19)

Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. i Thybaud, V. (2011). Compilation and use of genetic toxicity historical control Data. „Mutation Research” nr 723, s. 87–90.

(20)

Warr T.J., Parry E.M. i Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens. „Mutation Research” nr 287, s. 29–46.

(21)

Huang, Y., Change, C. i Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. „Cancer Res.” nr 43, s. 1362–1364.

(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest.„Mutation Research” nr 119, s. 403–413.

Dodatek

DEFINICJE

Aneuploidia: wszelkie odchylenia od zwykłej diploidalnej (lub haploidalnej) liczby chromosomów w pojedynczym chromosomie lub w większej ich liczbie, ale nie w całym zestawie lub w całych zestawach chromosomów (poliploidalność).

Centromer: region(y) chromosomu, w którym(-ch) mikrotubule wrzeciona podziałowego są asocjowane w trakcie podziału komórki, co umożliwia przemieszczenie się chromosomów potomnych do biegunów komórek potomnych.

Substancja chemiczna: substancja lub mieszanina.

Różnorodność chromosomów: różnorodność kształtów chromosomów (np. metacentryczne, akrocentryczne itd.) i ich rozmiarów.

Aberracja typu chromatydowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu wyrażone jako złamanie pojedynczych chromatyd lub złamanie i ponowne połączenie się chromatyd.

Aberracja typu chromosomowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu wyrażone jako złamanie chromatyd lub złamanie i ponowne połączenie się obu chromatyd w tym samym miejscu.

Klastogen: każda substancja chemiczna, która powoduje strukturalne aberracje chromosomowe w populacjach komórek lub organizmów.

Przerwa: achromatyczne uszkodzenie mniejsze niż szerokość jednej chromatydy prowadzące do minimalnego wypaczenia chromatyd.

Genotoksyczny: ogólny termin obejmujący wszelkiego rodzaju uszkodzenia DNA lub chromosomu, w tym pęknięcia, delecje, addukty, modyfikacje i sprzężenia nukleotydów, rearanżacje, mutacje, aberracje chromosomowe oraz aneuploidie. Nie wszystkie rodzaje skutków genotoksycznych powodują mutacje lub stałe uszkodzenia chromosomu.

Indeks mitotyczny: stosunek komórek w metafazie do całkowitej liczby komórek zaobserwowanych w populacji komórek; wskazanie stopnia proliferacji tej populacji.

Mitoza: podział jądra komórkowego zazwyczaj podzielony na profazę, prometafazę, metafazę, anafazę i telofazę.

Mutagenny: powoduje dziedziczne zmiany w sekwencji lub sekwencjach par zasad DNA w genach lub w strukturze chromosomów (aberracje chromosomowe).

Aberracja liczbowa: zmiana liczby chromosomów względem standardowej liczby chromosomów typowej dla wykorzystywanych zwierząt.

Poliploidalność: wielokrotność haploidalnej liczby chromosomów (n) inna niż liczba diploidalna (tj. 3n, 4n itd.).

Strukturalna aberracja chromosomowa: zmiana w strukturze chromosomu wykrywalna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy w cyklu podziału komórki, zaobserwowana jako delecje, fragmenty i wymiany.

Badana substancja chemiczna: dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

UVCB: substancje chemiczne o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji i materiały biologiczne;

5)

w części B rozdział B.40 otrzymuje brzmienie:

„B.40   BADANIE DZIAŁANIA ŻRĄCEGO NA SKÓRĘ METODĄ IN VITRO: TEST PRZEZSKÓRNEJ OPORNOŚCI ELEKTRYCZNEJ

WPROWADZENIE

1.

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 430 (2015). Działanie żrące na skórę oznacza powstawanie nieodwracalnych uszkodzeń skóry, które przejawiają się jako widoczna martwica naskórka i skóry, w wyniku naniesienia na skórę substancji badanej [zgodnie z definicją Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS) Organizacji Narodów Zjednoczonych (ONZ) (1) i z rozporządzeniem Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin (CLP) (1)]. Niniejsza zaktualizowana metoda badawcza B.40 obejmuje procedurę in vitro umożliwiającą identyfikację substancji i mieszanin mających działanie żrące i nie mających takiego działania zgodnie z GHS ONZ (1) oraz rozporządzeniem CLP.

2.

Ocena działania żrącego na skórę wiązała się zwykle z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych (metoda badawcza B.4 równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 404 pierwotnie przyjętej w 1981 r. i zmienionej w latach 1992, 2002 i 2015) (2). Poza obecną metodą badawczą B.40 zweryfikowano i przyjęto inne metody badawcze in vitro służące badaniu potencjalnego działania żrącego na skórę substancji chemicznych jako metodę badawczą B.40bis (równoważną metodzie opisanej w wytycznej dotyczącej badań OECD (TG) 431) (3) oraz B.65 (równoważną metodzie opisanej w wytycznej dotyczącej badań OECD (TG) 435) (4), dzięki którym, jeżeli jest to wymagane, można również zidentyfikować podkategorie żrących substancji chemicznych. Jako metodę badawczą B.46 (równoważną metodzie opisanej w wytycznej dotyczącej badań OECD (TG) 439) (5) przyjęto szereg zweryfikowanych metod badawczych in vitro w celu wykorzystywania ich do badania podrażnienia skóry. W wytycznych OECD dotyczących zintegrowanych podejść do badań i oceny (IATA) działania żrącego na skórę i podrażnienia skóry opisano kilka modułów grupujących różne źródła informacji i narzędzia do analizy oraz (i) przedstawiono wytyczne dotyczące sposobu włączania i wykorzystywania istniejących danych, które uzyskano w ramach badań i metodami niebadawczymi, do celów oceny potencjałów substancji chemicznych pod względem działania drażniącego i żrącego na skórę, a także (ii) zaproponowano podejście w sytuacji gdy potrzebne są dalsze badania (6).

3.

Niniejsza metoda badawcza odnosi się do punktu końcowego, jakim jest działanie żrące na skórę ludzką. Metoda ta opiera się na teście pomiaru przezskórnej oporności elektrycznej z użyciem skóry szczura, w którym wykorzystuje się krążki skóry, aby określić substancje żrące według ich zdolności do powodowania utraty normalnej integralności warstwy rogowej i funkcji ochronnej naskórka. Odpowiadającą wytyczną dotyczącą badań OECD przyjęto pierwotnie w 2004 r. i zaktualizowano w 2015 r., aby odnieść się do wytycznych IATA.

4.

Aby ocenić badania działania żrącego na skórę in vitro do celów regulacyjnych, przeprowadzono badania poprzedzające walidację (7), po których przeprowadzono badanie walidacyjne testu pomiaru przezskórnej oporności elektrycznej z użyciem skóry szczura do pomiaru działania żrącego (8)(9)(10)(11). Wyniki tych badań doprowadziły do opracowania zalecenia, że metodę badawczą testu przezskórnej oporności elektrycznej (oznaczoną jako zwalidowana metoda referencyjna – VRM) można wykorzystywać do celów regulacyjnych oceny działania żrącego na skórę in vivo (12)(13)(14).

5.

Zanim będzie można wykorzystać do celów regulacyjnych zaproponowaną podobną lub zmienioną metodę badawczą testu przezskórnej oporności elektrycznej in vitro inną niż VRM powinny zostać określone jej wiarygodność, istotność (dokładność) oraz ograniczenia dotyczące jej proponowanego wykorzystania, aby zapewnić jej podobieństwo do VRM zgodnie z wymogami standardów wykonywania badań (15). Wzajemne uznawanie danych OECD będzie zagwarantowane wyłącznie po poddaniu przeglądowi każdej nowej lub zaktualizowanej metody badawczej zgodnej ze standardem wykonywania badań i włączeniu jej do odpowiednich wytycznych OECD dotyczących badań.

DEFINICJE

6.

Stosowane definicje znajdują się w dodatku.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE

7.

Na podstawie badania walidacyjnego (10) i innych opublikowanych badań (16) (17) stwierdzono, że dzięki metodzie badawczej testu przezskórnej oporności elektrycznej z użyciem skóry szczura możliwe jest rozróżnienie znanych substancji mających działanie żrące na skórę i substancji niemających takiego działania przy ogólnej wrażliwości na poziomie 94 % (51/54) i swoistości na poziomie 71 % (48/68) w przypadku bazy danych obejmującej 122 substancje.

8.

Niniejsza metoda badawcza dotyczy działania żrącego na skórę in vitro. Umożliwia ona określenie badanych substancji chemicznych mających działanie żrące i niemających takiego działania zgodnie z GHS ONZ/rozporządzeniem CLP. Ograniczenie niniejszej metody badawczej, jak pokazano na podstawie badań walidacyjnych (8)(9)(10)(11), polega na tym, że metoda ta nie umożliwia podziału żrących substancji i mieszanin na podkategorie zgodnie z GHS ONZ/rozporządzeniem CLP. To, jak będzie stosowana niniejsza metoda badawcza zostanie określone w obowiązujących ramach regulacyjnych. Chociaż niniejsza metoda badawcza nie pozwala uzyskać odpowiednich informacji na temat podrażnienia skóry, należy zauważyć, że metoda badawcza B.46 dotyczy w szczególności badania in vitro (5) skutku dla zdrowia jakim jest podrażnienie skóry. Aby dokonać pełnej oceny miejscowego działania na skórę po pojedynczym narażeniu przez skórę, należy zapoznać się z wytycznymi OECD dotyczącymi IATA (6).

9.

W ramach walidacji leżącej u podstaw niniejszej metody badawczej zbadano szeroką gamę produktów chemicznych, z których większość stanowiły substancje chemiczne, a w empirycznej bazie danych z badania walidacyjnego znalazło się 60 substancji obejmujących szeroki zakres klas chemicznych (8)(9). Z dostępnych ogólnych danych wynika, że metoda badawcza ma zastosowanie do wielu klas chemicznych i stanów skupienia, w tym do płynów, substancji półstałych, stałych i wosków. Jednak ponieważ dla konkretnych stanów skupienia elementy badane z odpowiednimi danymi porównawczymi nie są łatwo dostępne, należy zauważyć, że podczas zatwierdzania dokonano oceny stosunkowo niewielkiej liczby wosków i substancji stałych o działaniu żrącym. Ciecze mogą być wodne lub niewodne; substancje stałe mogą być rozpuszczalne lub nierozpuszczalne w wodzie. W przypadkach, w których można przedstawić dowody na brak możliwości zastosowania omawianej metody badawczej do konkretnej kategorii substancji, metody tej nie należy stosować w odniesieniu do tej konkretnej kategorii substancji. Ponadto przyjmuje się, że niniejsza metoda badawcza ma zastosowanie nie tylko do substancji, ale także do mieszanin. Jednak ze względu na fakt, iż mieszaniny obejmują szeroki zakres kategorii oraz składów, oraz że obecnie dostępna jest niewielka ilość informacji na temat badania mieszanin, w przypadkach, w których można przedstawić dowody na brak możliwości zastosowania omawianej metody badawczej w odniesieniu do danej kategorii mieszanin (np. kierując się strategią zaproponowaną przez Eskesa i in., 2012) (18), metody tej nie należy stosować w odniesieniu do tej konkretnej kategorii mieszanin. Przed zastosowaniem przedmiotowej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się, czy zastosowanie tej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak, to dlaczego. Przeprowadzenie takiej analizy nie jest konieczne, jeżeli ustanowiono wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny. Gazów i aerozoli nie oceniano jeszcze w badaniach walidacyjnych (8)(9). Chociaż nie można wykluczyć, że da się je badać z wykorzystaniem metody badawczej jaką jest test przezskórnej oporności elektrycznej, niniejsza metoda badawcza nie pozwala na badanie gazów i aerozoli.

ZASADA BADANIA

10.

Badaną substancję chemiczną nakłada się na okres do 24 godzin na powierzchnię naskórka krążków skóry w dwuczęściowym układzie badawczym, w którym krążki skóry pełnią funkcję przegrody między dwoma częściami. Krążki skóry pobiera się od szczurów uśmiercanych w humanitarny sposób w wieku 28–30 dni. Substancje chemiczne mające działanie żrące identyfikuje się na podstawie ich zdolności do powodowania utraty integralności warstwy rogowej naskórka i do zaburzania funkcji ochronnej, co mierzy się spadkiem TER poniżej poziomu progowego (16) (zob. pkt 32). W przypadku testu przezskórnej oporności elektrycznej z użyciem skóry szczurów przyjęto wartość graniczną 5 kΩ; wartość tę ustalono na podstawie obszernych danych dla szerokiego zakresu substancji, w przypadku których znaczna większość wartości była albo wyraźnie wyższa (często > 10 kΩ) albo znacznie niższa (często < 3 kΩ) od tej wartości (16). Ogólnie badane substancje chemiczne, które w przypadku zwierząt nie mają działania żrącego, tylko drażniące lub nie mają działania drażniącego, nie powodują spadku przezskórnej oporności elektrycznej poniżej tej wartości granicznej. Co więcej, zastosowanie innych preparatów skóry lub innego sprzętu może zmienić wartość graniczną, powodując konieczność dalszej walidacji.

11.

Etap wiązania barwnika jest włączony do procedury testowej mającej potwierdzić dodatnie wyniki testu przezskórnej oporności elektrycznej, w tym wartości około 5 kΩ. Etap wiązania barwnika pozwala na stwierdzenie, czy wzrost przepuszczalności jonów jest spowodowany fizycznym zniszczeniem warstwy rogowej naskórka. Wykazano, że metoda polegająca na teście przezskórnej oporności elektrycznej z wykorzystaniem skóry szczurów świadczy o działaniu żrącym in vivo, badanym u królików metodą badawczą B.4 (2).

WYKAZANIE BIEGŁOŚCI

12.

Przed przystąpieniem do rutynowego stosowania metody badawczej, jaką jest test przezskórnej oporności elektrycznej z użyciem skóry szczura, która to metoda jest zgodna z niniejszą metodą badawczą, laboratoria powinny wykazać swoją biegłość techniczną, prawidłowo ustalając klasyfikację 12 substancji chemicznych zalecanych w tabeli 1. W sytuacji gdy substancja znajdująca się w wykazie jest niedostępna lub w uzasadnionych przypadkach można zastosować inną substancję, dla której dostępne są odpowiednie dane porównawcze z badań in vivo i in vitro (np. z wykazu referencyjnych substancji chemicznych (16)), pod warunkiem zastosowania tych samych kryteriów wyboru, które opisano w tabeli 1.

Tabela 1

Wykaz substancji służących do wykazania biegłości  (2)

Substancja

Numer CAS

Klasa chemiczna (3)

Kategoria wg GHS ONZ / rozporządzenia CLP na podstawie wyników badań in vivo  (4)

Kategoria VRM na podstawie wyników badań in vitro

Stan skupienia

pH (5)

Substancje żrące in vivo

N,N-Dimetylo-dipropylenotriamina

10563-29-8

zasada organiczna

1A

6 × Ż

L

8,3

1,2-Diaminopropan

78-90-0

zasada organiczna

1A

6 × Ż

L

8,3

Kwas siarkowy (10 %)

7664-93-9

kwas nieorganiczny

(1A/)1B/1C

5 × Ż 1 × x NŻ

L

1,2

Wodorotlenek potasu (10 % r.w.)

1310-58-3

zasada nieorganiczna

(1A/)1B/1C

6 × Ż

L

13,2

Kwas oktanowy (kaprylowy)

124-07-2

kwas organiczny

1B/1C

4 × Ż 2 × NŻ

L

3,6

Di-tert-butylofenol

88-18-6

fenol

1B/1C

4 × Ż 2 × NŻ

L

3,9

Substancje niedziałające żrąco in vivo

Kwas izostearynowy

2724-58-5

kwas organiczny

6 × NŻ

L

3,6

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

zasada organiczna

6 × NŻ

S

5,5

Bromek fenetylu

103-63-9

elektrofil

NC

6 × NŻ

L

3,6

4-(metyltio)-benzaldehyd

3446-89-7

elektrofil

6 × NŻ

L

6,8

1,9-dekadien

1647-16-1

obojętna organiczna

6 × NŻ

L

3,9

tetrachloroetylen

127-18-4

obojętna organiczna

6 × NŻ

L

4,5

Skróty: r.w. = roztwór wodny Numer CAS = numer w rejestrze Chemical Abstracts Service; VRM = zwalidowana metoda referencyjna; Ż = żrące; NŻ = nieżrące.

PROCEDURA

13.

Dostępne są standardowe procedury operacyjne z wykorzystaniem skóry szczura w odniesieniu do metody badawczej jaką jest test przezskórnej oporności elektrycznej na działanie żrące na skórę (19). Metody badawcze polegające na teście przezskórnej oporności elektrycznej z wykorzystaniem skóry szczura powinny spełniać następujące warunki:

Zwierzęta

14.

Należy wykorzystać szczury, ponieważ wcześniej wykazano wrażliwość ich skóry na substancje stosowane w niniejszej metodzie badawczej (12) oraz jest to jedyny formalnie zatwierdzony rodzaj skóry (8)(9). Wiek (w momencie pobierania skóry) i szczep szczurów mają zasadnicze znaczenie, bowiem od tego zależy, czy mieszki włosowe są w stanie uśpienia poprzedzającym fazę wzrostu włosa u dorosłych osobników.

15.

Owłosienie z grzbietu i boku ciała młodych, około 22-dniowych samców lub samic szczurów (pochodzących od szczepu Wistar lub podobnych) zostaje starannie usunięte małą maszynką do strzyżenia. Następnie zwierzęta są dokładnie przemywane i wycierane, natomiast miejsca, z których usuwano owłosienie, są pokrywane roztworem antybiotyku (zawierającym na przykład streptomycynę, penicylinę, chloramfenikol i amfoterycynę w stężeniach zapewniających zahamowanie rozwoju bakterii). Zwierzęta są przemywane antybiotykiem powtórnie trzeciego lub czwartego dnia po pierwszym przemyciu i są poddawane eksperymentowi w ciągu 3 dni od drugiego przemycia, kiedy warstwa rogowa naskórka ulegnie regeneracji po usunięciu owłosienia.

Przygotowanie krążków skóry

16.

Zwierzęta są humanitarnie uśmiercane, gdy osiągną 28–30 dzień życia; ten wiek ma kluczowe znaczenie. Z grzbietu i boków ciała każdego zwierzęcia pobierana jest skóra, z której następnie starannie usuwa się nadmiar tłuszczu podskórnego. Pobierane są krążki skóry, każdy o średnicy około 20 mm. Przed użyciem krążków skóra może być przechowywana, jeśli wykazano, że dane dla kontroli dodatniej i ujemnej są równoważne z danymi uzyskanymi przy użyciu świeżej skóry.

17.

Każdy krążek skóry jest umieszczany nad jednym z końców rurki PTFE (politetrafluoroetylenowej), przy czym należy dopilnować, aby powierzchnia naskórka przylegała do rurki. Na koniec rurki wciskany jest gumowy pierścień, który utrzymuje skórę w odpowiednim położeniu, a nadmiar tkanki jest odcinany. Połączenie między rurką PTFE a gumowym pierścieniem jest następnie starannie uszczelniane wazeliną. Rurka jest następnie mocowana zaciskiem sprężynowym wewnątrz komory receptorowej zawierającej roztwór MgSO4 (154 mM) (rysunek 1). Krążek skóry powinien być całkowicie zanurzony w roztworze MgSO4. Ze skóry jednego szczura można otrzymać aż 10–15 krążków. Wymiary rurki i pierścienia pokazano na rysunku 2.

18.

Przed rozpoczęciem badania, w ramach procedury kontroli jakości, przezskórną oporność elektryczną na dwóch krążkach skóry mierzy się w odniesieniu do skóry każdego ze zwierząt. Aby reszta krążków mogła zostać wykorzystana w metodzie badawczej, wartości oporu elektrycznego dla obu krążków powinny być wyższe niż 10 kΩ. Jeśli wartość oporu jest mniejsza niż 10 kΩ, resztę krążków tej skóry należy wyrzucić.

Podawanie badanej i kontrolnej substancji chemicznej

19.

Aby zapewnić odpowiednie działanie modelu, w każdej analizie (doświadczeniu) należy równocześnie stosować kontrole dodatnie i ujemne. W każdej analizie (doświadczeniu) należy wykorzystać krążki skóry pozyskane z pojedynczego zwierzęcia. Jako badanych substancji chemicznych kontroli dodatniej i ujemnej zaleca się używać odpowiednio 10M kwasu solnego i wody destylowanej.

20.

Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym nanosi się równomiernie na powierzchnię naskórka wewnątrz rurki (150 μl). Aby podczas badania materiałów stałych mieć pewność, że pokryta jest cała powierzchnia, na krążek nakłada się równomiernie odpowiednią ilość materiału stałego. Do substancji stałej dodaje się wodę dejonizowaną (150 μl) i delikatnie potrząsa się rurką. W celu zapewnienia maksymalnego kontaktu substancji stałych ze skórą może być konieczne podgrzanie ich do 300 °C w celu stopienia lub zmiękczenia badanej substancji chemicznej, lub jej zmielenie, by otrzymać granulat lub proszek.

21.

W każdej serii badawczej (każdym doświadczeniu) wykorzystuje się trzy krążki skóry w odniesieniu do każdej serii badawczej i kontrolnej substancji chemicznej. Badane substancje chemiczne nakłada się na 24 godziny w temperaturze 20–23 °C. Usuwa się je, zmywając strumieniem wody wodociągowej o temperaturze pokojowej do momentu, gdy nie będzie można usunąć żadnego dalszego materiału.

Pomiary przezskórnej oporności elektrycznej

22.

Impedancję skóry mierzy się jako przezskórną oporność elektryczną za pomocą mostka Wheatstone’a zasilanego prądem przemiennym o niskim napięciu (18). Ogólne dane techniczne mostka: napięcie robocze 1–3 V, prąd przemienny 50–1 000 Hz sinusoidalny lub prostokątny i zakres pomiaru co najmniej 0,1–30 kΩ. Mostek Wheatstone’a w badaniach walidacyjnych mierzy indukcyjność, opór bierny pojemnościowy i opór do wartości odpowiednio 2 000 H, 2 000 μF oraz 2 MΩ, przy częstotliwości odpowiednio 100 Hz lub 1 kHz w połączeniach szeregowych lub równoległych. Do celów oceny testu działania żrącego TER dokonuje się pomiarów oporności przy częstotliwości 100 Hz i przy zastosowaniu połączeń szeregowych. Przed pomiarem oporu elektrycznego zmniejsza się napięcie skóry, dodając dostateczną ilość 70 % etanolu, aby pokryła naskórek. Po kilku sekundach usuwa się etanol z rurki, a następnie nawadnia się tkankę przez dodanie 3 ml roztworu MgSO4 (154 mM). W celu zmierzenia oporu krążka skóry w kΩ, po obu jego stronach są umieszczane elektrody mostka (rysunek 1). Na rysunku 2 pokazano wymiary elektrod i długość obnażonej części elektrod poniżej zacisku szczękowego. W czasie pomiaru oporu zacisk przymocowany do wewnętrznej elektrody opiera się na górnym końcu rurki PTFE, aby w roztworze MgSO4 zanurzony był ciągły odcinek elektrody. Elektroda zewnętrzna umieszczona jest wewnątrz komory receptorowej na jej dnie. Należy utrzymywać stałą odległość między zaciskiem sprężynowym a dnem rurki PTFE (rysunek 2), ponieważ odległość ma wpływ na otrzymywane wartości oporu. W związku z tym odległość między wewnętrzną elektrodą a krążkiem skóry powinna być stała i minimalna (1–2 mm).

23.

Jeśli zmierzona wartość oporu jest większa niż 20 kΩ, może to być spowodowane pozostałościami badanej substancji chemicznej pokrywającej naskórkową powierzchnię krążka skóry. Można próbować usunąć tę warstwę, zatykając na przykład rurkę palcem w rękawiczce i potrząsając nią przez około 10 sekund; usuwa się roztwór MgSO4 i powtarza pomiar oporu ze świeżą porcją MgSO4.

24.

Na otrzymane wartości testu przezskórnej oporności elektrycznej mogą mieć wpływ charakterystyka i wymiary aparatu testowego oraz zastosowana procedura eksperymentalna. Na podstawie danych uzyskanych przy użyciu określonej aparatury i procedury, przedstawionych w opisie tej metody badawczej, ustalono próg działania żrącego na skórę na poziomie 5 kΩ. Jeśli warunki testu zostaną zmienione lub jeśli stosuje się inną aparaturę, zastosowanie mogą znajdować inne progi i wartości kontrolne. Tak więc konieczne jest dokonanie kalibracji metodyki i wartości progów oporu przez zbadanie szeregu substancji służących do wykazania biegłości wybranych spośród substancji chemicznych użytych w badaniu walidacyjnym (8)(9) lub spośród substancji chemicznych podobnych do badanych substancji. W tabeli 1 znajduje się zestaw odpowiednich substancji służących do wykazania biegłości.

Metody wiązania barwników

25.

Narażenie na niektóre materiały niedziałające żrąco na skórę może prowadzić do zmniejszenia oporu poniżej wartości granicznej 5 kΩ, umożliwiając przechodzenie jonów przez warstwę rogową naskórka i w ten sposób redukując opór elektryczny (9). Na przykład obojętne związki organiczne oraz substancje powierzchniowo czynne (w tym detergenty, emulgatory i inne surfaktanty) mogą usuwać ze skóry tłuszcz, powodując, że bariera skórna staje się bardziej przepuszczalna dla jonów. Tak więc, jeśli wartości TER wytworzone przez takie substancje chemiczne są niższe niż lub zbliżone do 5 kΩ przy braku wizualnie dostrzegalnego uszkodzenia krążków skóry, należy dla tkanek kontrolnych i badanych przeprowadzić test przenikania barwnika, aby stwierdzić, czy uzyskane wartości TER są wynikiem zwiększonej przepuszczalności skóry czy jej uszkodzenia (7)(9). W tym drugim przypadku, jeśli uszkodzona jest warstwa rogowa naskórka, barwnik sulforodamina B szybko przenika w głąb skóry i zabarwia leżącą głębiej tkankę. Ten szczególny barwnik nie wchodzi w reakcję z wieloma różnymi substancjami chemicznymi i nie ma na niego wpływu procedura ekstrakcji opisana poniżej.

Stosowanie barwnika sulforodaminy B i jego usuwanie

26.

Po dokonaniu oceny testu przezskórnej oporności elektrycznej siarczan magnezu jest usuwany z rurki i skóra jest poddawana dokładnym oględzinom, aby sprawdzić, czy są na niej widoczne uszkodzenia. Jeżeli nie ma oczywistych dużych uszkodzeń (np. perforacji), na naskórkową powierzchnię każdego krążka skóry nakłada się na dwie godziny 150 μl 10 proc. (masa/obj.) roztworu barwnika sulforodaminy B w wodzie destylowanej (Acid Red 52; C.I. 45100; nr CAS 3520-42-1). Krążki skóry są następnie przemywane wodą wodociągową o temperaturze nie wyższej od pokojowej przez około 10 sekund, aby usunąć wszelki zbędny/niezwiązany barwnik. Każdy krążek skóry jest starannie usuwany z rurki PTFE i umieszczany w fiolce (np. w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml) zawierającej wodę dejonizowaną (8 ml). Fiolki są delikatnie wstrząsane przez 5 minut, aby usunąć cały nadmiar niezwiązanego barwnika. Procedurę płukania powtarza się, po czym krążki skóry wyjmuje się i umieszcza w fiolkach zawierających 5 ml 30 % (masa/obj.) roztworu sodowego siarczanu dodecylu (SDS) w wodzie destylowanej i inkubuje przez noc w 60 °C.

27.

Po inkubacji krążki należy wyjąć i wyrzucić, a pozostały roztwór odwirować przez 8 minut w 21 °C (względna siła odśrodkowa ~175 × g). Próbka o objętości 1 ml supernatantu jest rozpuszczana w stosunku 1 do 5 (obj./obj.) [tj. 1 ml + 4 ml] z 30 % (masa/obj) SDS w wodzie destylowanej. Gęstość optyczną (OD) mierzy się przy 565 nm.

Obliczanie zawartości barwnika

28.

Zawartość barwnika sulforodaminy B na krążek obliczana jest na podstawie wartości OD (9) (współczynnik molowy ekstynkcji sulforodaminy B przy 565 nm = 8,7 × l04; masa cząsteczkowa = 580). Zawartość barwnika jest określana dla wszystkich krążków skóry przy zastosowaniu odpowiedniej krzywej kalibracyjnej, a następnie dla wszystkich kontrprób liczona jest średnia.

Kryteria dopuszczalności

29.

Średnie wyniki TER są uznawane, jeśli w testującym laboratorium wartości otrzymane w równoczesnych próbach kontroli dodatniej i ujemnej mieszczą się w zakresie dopuszczalnym dla metody. Dopuszczalne zakresy oporu dla metodyki i aparatury opisanych powyżej podano w poniższej tabeli:

Kontrola

Substancja

Zakres oporu (kΩ)

Dodatnia

Kwas chlorowodorowy 10 M

0,5 – 1,0

Ujemna

Woda destylowana

10 – 25

30.

Średnie wyniki wiązania barwnika są akceptowane, pod warunkiem że wartości otrzymane w równoczesnych testach kontrolnych mieszczą się w przedziałach akceptowanych dla metody. Sugerowane dopuszczalne zakresy zawartości barwnika substancji kontrolnych dla metodyki i aparatury opisanych powyżej zamieszczono w poniższej tabeli:

Kontrola

Substancja

Zakres zawartości barwnika (μg/krążek)

Dodatnia

Kwas chlorowodorowy 10 M

40 – 100

Ujemna

Woda destylowana

15 – 35

Interpretacja wyników

31.

Wartość graniczną testu przezskórnej oporności elektrycznej, odróżniającą żrące substancje chemiczne od substancji chemicznych niemających działania żrącego, ustanowiono podczas optymalizacji metody badawczej, testowano w fazie prewalidacyjnej oraz zatwierdzono w formalnym badaniu walidacyjnym.

32.

Poniżej przedstawiono związany z systemem klasyfikacji Globalnego Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów / rozporządzenia CLP model prognozowania z wykorzystaniem skóry szczura w odniesieniu do metody badawczej, jaką jest test przezskórnej oporności elektrycznej na działanie żrące na skórę (9)(19):

Uznaje się, że badana substancja chemiczna nie działa żrąco na skórę:

i)

jeśli średnia wartość uzyskana w teście przezskórnej oporności elektrycznej dla badanej substancji chemicznej jest większa (>) niż 5 kΩ; lub

ii)

jeśli średnia wartość uzyskana w teście przezskórnej oporności elektrycznej dla badanej substancji chemicznej jest mniejsza bądź równa (≤) 5 kΩ; oraz

krążki skóry nie wykazują oczywistych uszkodzeń (np. perforacji); oraz

średnia zawartość barwnika krążka jest niższa (<) niż średnia zawartość barwnika krążka otrzymanej jednocześnie kontroli dodatniej 10M HCl (zob. pkt 30 w odniesieniu do wartości kontroli dodatnich).

Uznaje się, że badana substancja chemiczna działa żrąco na skórę:

i)

jeśli średnia wartość uzyskana w teście przezskórnej oporności elektrycznej dla badanej substancji chemicznej jest mniejsza bądź równa (≤) 5 kΩ oraz krążki skóry posiadają oczywiste uszkodzenia (np. są perforowane); lub

ii)

jeśli średnia wartość uzyskana w teście przezskórnej oporności elektrycznej dla badanej substancji chemicznej jest mniejsza bądź równa (≤) 5 kΩ; oraz

krążki skóry nie wykazują oczywistych uszkodzeń (np. perforacji); ale

średnia zawartość barwnika krążka jest większa bądź równa (≥) średniej zawartości barwnika krążka otrzymanej jednocześnie kontroli dodatniej 10M HCl (zob. pkt 30 w odniesieniu do wartości kontroli dodatnich).

33.

Jeśli klasyfikacja jest jednoznaczna, seria badawcza (doświadczenie), w skład której wchodzą co najmniej trzy kontrpróby, powinna wystarczyć dla badanej substancji chemicznej. W przypadku wyników granicznych, np. niezgodności powtarzalnych pomiarów lub średniej TER równej 5 ± 0,5 kΩ, należy jednak rozważyć przeprowadzenie drugiej niezależnej serii badawczej (doświadczenia), jak również trzeciej w przypadku niezgodności między wynikami dwóch pierwszych serii badawczych (doświadczeń).

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Dane

34.

Wartości oporu (kΩ) oraz, w stosownych przypadkach, wartości zawartości barwnika (μg/krążek) w odniesieniu do badanej substancji chemicznej oraz kontroli dodatnich i ujemnych należy zgłaszać w postaci tabeli, która będzie zawierać dane dotyczące każdego krążka kontrpróby w każdej serii badawczej (każdym doświadczeniu) oraz średnie wartości ± SD. Należy zgłaszać wszystkie powtarzane doświadczenia. Zaobserwowane uszkodzenia krążków skóry należy zgłaszać w odniesieniu do każdej badanej substancji chemicznej.

Sprawozdanie z badania

35.

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

 

Badana substancja chemiczna oraz substancje kontrolne:

Substancja jednoskładnikowa: dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, stosownie do przypadku i jeśli jest to praktycznie wykonalne itp.;

substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszanina: opisane w miarę możliwości przez podanie nazwy chemicznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników;

wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne;

źródło, numer partii (jeżeli dostępny);

w stosownych przypadkach obróbka badanej substancji chemicznej/substancji kontrolnej przed badaniem (np. ogrzanie, rozdrobnienie);

stabilność badanej substancji chemicznej, termin przydatności lub data ponownej analizy, jeżeli są znane;

warunki przechowywania.

 

Zwierzęta doświadczalne:

szczep i płeć;

wiek zwierząt w momencie pobierania skóry;

źródło, warunki utrzymywania, pasza itp.;

szczegóły dotyczące przygotowania skóry.

 

Warunki badania:

krzywe wzorcowe dla aparatury testowej;

krzywe wzorcowe dla parametrów testu wiązania barwnika, wykorzystanego filtru środkowoprzepustowego stosowanego do pomiaru wartości OD oraz, w stosownych przypadkach, zakres liniowości OD urządzenia wykorzystywanego do przeprowadzania pomiaru (np spektrofotometr);

szczegółowe informacje na temat procedury badawczej stosowanej do pomiarów przezskórnej oporności elektrycznej;

szczegółowe informacje na temat procedury badawczej stosowanej do oceny wiązania barwnika, w stosownych przypadkach;

zastosowane dawki badanej substancji chemicznej, czas trwania okresu lub okresów narażenia oraz temperatura lub temperatury narażenia;

szczegółowe informacje na temat stosowanej procedury mycia po okresie narażenia;

Liczba wykorzystywanych kontrprób krążków skóry na każdą badaną substancję chemiczną oraz kontrolę (kontrola dodatnia i ujemna);

opis wszelkich modyfikacji procedur testowych;

odniesienie do danych historycznych modelu. Powinno to między innymi obejmować:

i)

dopuszczalność wartości przezskórnej oporności elektrycznej kontroli dodatniej oraz ujemnej (w k Ω) w odniesieniu do zakresów oporu kontroli dodatniej oraz ujemnej;

ii)

dopuszczalność wartości zawartości barwnika kontroli dodatniej oraz ujemnej (w μg/krążek) w odniesieniu do zakresów oporu kontroli dodatniej oraz ujemnej;

iii)

dopuszczalność wyników badania w odniesieniu do historycznej zmienności między kontrpróbami krążków skóry.

Opis zastosowanych kryteriów podejmowania decyzji/modelu prognozowania.

 

Wyniki:

Tabele zawierające dane z badań TER i testu wiązania barwnika (w stosownych przypadkach) dla poszczególnych badanych substancji chemicznych oraz kontroli, dla każdej serii badawczej (każdego doświadczenia) oraz każdej kontrpróby krążka skóry (poszczególne zwierzęta i poszczególne próbki skóry), średnie, wartości SD oraz CV;

opis wszelkich zaobserwowanych skutków;

ustalona na tej podstawie klasyfikacja w odniesieniu do modelu prognozowania lub zastosowanych kryteriów podejmowania decyzji.

 

Omówienie wyników

 

Wnioski

BIBLIOGRAFIA

(1)

Organizacja Narodów Zjednoczonych (ONZ), Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), wydanie drugie zmienione, ONZ Nowy Jork i Genewa 2013. Dostępne na stronie internetowej: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html]

(2)

Rozdział B.4 niniejszego załącznika, Ostre działanie drażniące na skórę.

(3)

Rozdział B.40bis niniejszego załącznika, Model skóry in vitro.

(4)

Rozdział B.65 niniejszego załącznika, Metoda badawcza bariery membranowej in vitro.

(5)

Rozdział B.46 niniejszego załącznika, Badanie podrażnień skóry in vitro: Metoda badania z użyciem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka.

(6)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion, [w:] Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 203), Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., i Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.„ALTA” nr 23, s. 219–255.

(8)

Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., i Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals.„Toxicology In Vitro” nr 12, s. 471–482.

(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G. i Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team.„Toxicology In Vitro” nr 12, s. 483–524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., i Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.„ALTA” nr 23, s. 129–147.

(11)

ICCVAM (Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych) (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. Publikacja NIH nr 97-3981, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, Karolina Północna, Stany Zjednoczone.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity). ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 kwietnia 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA nr 26, 275–280.

(14)

ICCVAM (Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych) (2002), ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals.„NIH Publication” nr 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, Karolina Północna, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. [w:] Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 218), Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A. i Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation.„Food and Chemical Toxicology” nr 24, s. 507–512.

(17)

Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., i Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial.„Toxicology in Vitro” nr 6, s. 191–194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. i Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations.„Regulatory Toxicology and Pharmacology” nr 62, s. 393–403.

(19)

TER SOP (grudzień 2008), Protokół 115 INVITTOX, Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. [w:] Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 34), Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju.

Rysunek 1

Aparatura do wykonywania testu przezskórnej oporności elektrycznej skóry szczura

Image 2

Rysunek 2

Wymiary Rurek Politetrafluoroetylenowej (Pfte) I Receptorowej Oraz Stosowane Elektrody

Image 3

Najważniejsze elementy urządzenia przedstawionego powyżej:

wewnętrzna średnica rurki PTFE,

długość elektrod w stosunku do rurek PTFE i receptorowej dobrana tak, aby elektrody nie dotykały do krążka skóry oraz by standardowy odcinek elektrody stykał się z roztworem MgSO4,

ilość roztworu MgSO4 w rurce receptorowej powinna zapewniać wysokość słupa cieczy względem poziomu w rurce PTFE, jak pokazano na rysunku 1,

krążek skóry powinien być wystarczająco mocno przymocowany do rurki PFTE, aby opór elektryczny był rzeczywistą miarą właściwości skóry.

Dodatek

DEFINICJE

Dokładność : stopień zgodności wyników zastosowanej metody badawczej z przyjętymi wartościami odniesienia. Jest to miara efektywności metody badawczej i jeden z aspektów jej istotności. Pojęcia tego często używa się zamiennie z pojęciem „zgodność” na określenie odsetka prawidłowych wyników uzyskiwanych przy użyciu metody badawczej (20).

C : żrący.

Substancja chemiczna : substancja lub mieszanina.

Zgodność : miara efektywności metody badawczej w odniesieniu do metod badawczych, które dają wyniki kategoryczne; jest jednym z aspektów istotności. To określenie jest czasami stosowane wymiennie z określeniem „dokładność”; definiuje się jako odsetek wszystkich badanych substancji chemicznych, które są prawidłowo sklasyfikowane jako dodatnie lub ujemne. Zgodność jest w dużym stopniu uzależniona od przewagi dodatnich wyników w rodzajach badanej substancji chemicznej (20).

GHS (Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (ONZ)) : system obejmujący klasyfikację substancji chemicznych (substancji i mieszanin) według znormalizowanych rodzajów i poziomów zagrożeń fizycznych, zdrowotnych i środowiskowych oraz odpowiednie elementy komunikacyjne, takie jak: piktogramy, hasła ostrzegawcze, zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia, zwroty wskazujące środki ostrożności i karty charakterystyki, mające informować na temat szkodliwego działania tych substancji chemicznych w celu zapewnienia ochrony ludzi (w tym pracowników, robotników, przewoźników, konsumentów i ratowników) oraz środowiska (1).

IATA : zintegrowane podejście do badań i oceny.

Mieszanina : mieszanina lub roztwór składający się z co najmniej dwóch substancji.

Substancja jednoskładnikowa : substancja zdefiniowana za pomocą jej składu ilościowego, w której jeden główny składnik występuje w stężeniu co najmniej 80 % (w/w).

Substancja wieloskładnikowa : substancja zdefiniowana za pomocą jej składu ilościowego, w której więcej niż jeden główny składnik występuje w stężeniu ≥ 10 % (w/w) i < 80 % (w/w). Substancja wieloskładnikowa powstaje w wyniku procesu wytwarzania. Różnica między mieszaniną a substancją wieloskładnikową polega na tym, że mieszaninę uzyskuje się w wyniku zmieszania co najmniej dwóch substancji, między którymi nie zachodzi reakcja chemiczna. Substancja wieloskładnikowa powstaje w wyniku reakcji chemicznej.

: substancja niemająca działania żrącego.

OD : gęstość optyczna.

PC : Kontrola dodatnia; kontrpróba zawierająca wszystkie składniki układu badawczego, poddana działaniu substancji chemicznej, o której wiadomo, że wywołuje reakcję dodatnią. Aby zapewnić możliwość oceny zmienności reakcji w kontroli dodatniej w czasie, siła reakcji w postaci silnego działania drażniącego nie może być zbyt duża.

Standardy wykonywania badań : normy oparte na zwalidowanej metodzie badania, zapewniające podstawę do oceny porównywalności proponowanej metody badawczej, która jest podobna do metody referencyjnej pod względem mechanistycznym i funkcjonalnym. Uwzględnia się: (i) zasadnicze elementy metody badawczej; (ii) podstawowy wykaz chemicznych substancji odniesienia wybranych spośród substancji chemicznych wykorzystywanych w celu wykazania dopuszczalnej efektywności zwalidowanej metody badania; oraz (iii) podobny poziom dokładności i wiarygodności, na podstawie wyników uzyskanych dla zwalidowanej metody badawczej, który proponowana metoda badawcza powinna osiągnąć przy ocenie z wykorzystaniem podstawowego wykazu chemicznych substancji odniesienia.

Istotność : opis powiązania badania z oczekiwanym skutkiem oraz czy jest ono istotne i użyteczne dla konkretnego celu. Jest to zakres, w jakim metoda badawcza prawidłowo mierzy lub przewiduje biologiczny oczekiwany skutek. Istotność obejmuje uwzględnienie dokładności (zgodności) metody badawczej (20).

Wiarygodność : miary zakresu, w jakim metoda badawcza może być przeprowadzana w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomiędzy laboratoriami na przestrzeni czasu w przypadku jej przeprowadzania przy użyciu tego samego protokołu. Ocenia się ją, obliczając odtwarzalność wewnątrz- i międzylaboratoryjną (20).

Czułość : odsetek wszystkich substancji chemicznych dających wynik dodatni / aktywnych substancji chemicznych prawidłowo sklasyfikowanych za pomocą danej metody badawczej. Jest to miara dokładności metody badawczej, która daje wyniki definitywne i stanowi istotny parametr w ocenie istotności metody badawczej (20).

Działanie żrące na skóręin vivo : powstanie nieodwracalnego uszkodzenia skóry; tj. widocznej martwicy przebiegającej przez naskórek w głąb skóry, spowodowanej naniesieniem badanej substancji chemicznej na okres nieprzekraczający czterech godzin. Reakcjami na działanie żrące są wrzody, krwotoki, krwawiące strupy oraz – po zakończeniu 14-dniowej obserwacji – odbarwienia wynikłe ze zblednięcia skóry, obszary jednolitej alopecji, a także blizny. Celem oceny wątpliwych uszkodzeń można przeprowadzić badanie histopatologiczne.

Swoistość : odsetek wszystkich substancji chemicznych dających wynik ujemny / nieaktywnych substancji chemicznych prawidłowo sklasyfikowanych za pomocą danej metody badawczej. Jest to miara dokładności metody badawczej, która daje wyniki definitywne i stanowi istotny parametr w ocenie istotności metody badawczej (20).

Substancja : pierwiastek chemiczny i jego związki w stanie naturalnym lub uzyskane w wyniku dowolnego procesu produkcyjnego, w tym wszelkie dodatki konieczne do zachowania trwałości produktu i wszelkie zanieczyszczenia powstałe w wyniku zastosowanego procesu, z wyłączeniem wszelkich rozpuszczalników, które można oddzielić bez wpływu na stabilność substancji i bez zmiany jej składu.

Seria (badawcza) : Pojedyncza substancja chemiczna badana jednocześnie na co najmniej trzech kontrpróbach krążków skóry.

Badana substancja chemiczna : dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

Test przezskórnej oporności elektrycznej (TER) : miara elektrycznej impedancji skóry jako wartość oporu w kiloomach. Jest to prosta i pewna metoda oceny funkcji ochronnej skóry polegająca na rejestrowaniu przechodzenia przez skórę jonów za pomocą mostka Wheatstone'a.

UVCB : substancje o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji lub materiały biologiczne.

6)

w części B rozdział B.40bis otrzymuje brzmienie:

„B.40bis   BADANIE DZIAŁANIA ŻRĄCEGO NA SKÓRĘ IN VITRO: METODA BADAWCZA Z UŻYCIEM ZREKONSTRUOWANEGO LUDZKIEGO NASKÓRKA

WPROWADZENIE

1.

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 431 (2016). Działanie żrące na skórę oznacza powstawanie nieodwracalnych uszkodzeń skóry, które przejawiają się jako widoczna martwica naskórka i skóry, w wyniku naniesienia na skórę substancji badanej [zgodnie z definicją Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS) Organizacji Narodów Zjednoczonych (ONZ) (1) i z rozporządzeniem Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin (CLP) (6)]. Niniejsza zaktualizowana metoda badawcza B.40bis obejmuje procedurę in vitro umożliwiającą identyfikację substancji i mieszanin mających działanie żrące i niemających takiego działania zgodnie z GHS ONZ oraz rozporządzeniem CLP. Umożliwia ona również częściowy podział substancji działających żrąco na podkategorie.

2.

Ocena potencjalnego działania żrącego na skórę substancji chemicznych wiązała się zwykle z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych (metoda badawcza B.4 równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 404, pierwotnie przyjętej w 1981 r. i zmienionej w latach 1992, 2002 i 2015) (2). Poza niniejszą metodą badawczą B.40bis zweryfikowano i przyjęto dwie inne metody badawcze in vitro służące badaniu potencjalnego działania żrącego substancji chemicznych jako metodę badawczą B.40 (równoważną metodzie opisanej w wytycznej dotyczącej badań OECD (TG) 430) (3) oraz B.65 (równoważną metodzie opisanej w wytycznej dotyczącej badań OECD (TG) 435) (4). Ponadto w celu badania potencjalnego działania drażniącego na skórę przyjęto metodę badawczą B.46 in vitro (równoważną metodzie opisanej w wytycznej dotyczącej badań OECD (TG) 439) (5). W wytycznych OECD dotyczących zintegrowanych podejść do badań i oceny (IATA) działania żrącego na skórę i podrażnienia skóry opisano kilka modułów grupujących źródła informacji i narzędzia do analizy oraz (i) przedstawiono wytyczne dotyczące sposobu włączania i wykorzystywania istniejących danych, które uzyskano w ramach badań i metodami niebadawczymi, do celów oceny potencjałów substancji chemicznych pod względem działania drażniącego i żrącego na skórę, a także (ii) zaproponowano podejście w sytuacji gdy potrzebne są dalsze badania (6).

3.

Niniejsza metoda badawcza odnosi się do punktu końcowego, jakim jest działanie żrące na skórę ludzką. Wykorzystuje się w niej zrekonstruowany ludzki naskórek (RhE) (otrzymany z niezmienionych keratynocytów naskórka pochodzenia ludzkiego), który dokładnie imituje historyczne, morfologiczne, biochemiczne i fizjologiczne właściwości górnych warstw ludzkiej skóry, tj. naskórka. Odpowiadającą wytyczną dotyczącą badań OECD przyjęto pierwotnie w 2004 r. i zaktualizowano w 2013 r., aby zawrzeć w niej dodatkowe metody badawcze z wykorzystaniem modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka oraz możliwość wykorzystania tych metod w celu uzasadnienia podziału substancji chemicznych mających działanie żrące na kategorie; w 2015 r. zaktualizowano wytyczną, by odnieść się do wytycznych IATA oraz wprowadzić wykorzystanie alternatywnej procedury pomiaru żywotności.

4.

W niniejszej metodzie badawczej zawarto cztery zatwierdzone i dostępne na rynku modele RhE. W odniesieniu do dwóch z tych dostępnych na rynku modeli – model standardowy EpiSkin™ (SM) oraz badanie działania żrącego na skórę EpiDerm™ (SCT) (EPI-200) (nazywane w dalszej części tekstu zwalidowanymi metodami referencyjnymi – VRM) – przeprowadzono (11)(12) badania prewalidacyjne (7) po których nastąpiło badanie walidacyjne w celu oceny działania żrącego na skórę (8)(9)(10). W wyniku tych badań opracowano zalecenie, że dwie wspomniane VRM można stosować do celów regulacyjnych, by odróżnić żrące substancje (Ż) od substancji niemających działania żrącego (NŻ), oraz że model EpiSkin™ można ponadto stosować, by uzasadnić podział substancji żrących na podkategorie (13)(14)(15). W wyniku zastosowania dwóch pozostałych dostępnych na rynku modeli badania działania żrącego na skórę in vitro z wykorzystaniem RhE uzyskano podobne wyniki do VRM EpiDerm™ zgodnie z walidacją opartą na standardach wykonywania badań (16)(17)(18). Są to metody SkinEthic™ RHE (7) oraz epiCS® (wcześniej znane pod nazwą EST-1000), które również można stosować do celów regulacyjnych, by odróżnić substancje żrące od tych, które nie mają działania żrącego (19)(20). Dzięki badaniom powalidacyjnym wykonanym przez producentów modelu RhE w latach 2012–2014 z udoskonalonym protokołem korygującym interferencje nieswoistej redukcji MTT przez badaną substancję chemiczną poprawiono efektywność zarówno jeżeli chodzi o rozróżnianie, czy substancja jest żrąca, czy nie, jak i jeżeli chodzi o uzasadnienie podziału substancji żrących na podkategorie (21)(22). Dalsze analizy statystyczne powalidacyjnych danych wygenerowanych dzięki EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE i EpiCS® wykonano w celu określenia alternatywnych modeli predykcyjnych, dzięki którym poprawiono zdolność predykcyjną podziału na podkategorie (23).

5.

Zanim będzie można wykorzystać do celów regulacyjnych zaproponowaną podobną lub zmienioną metodę badawczą in vitro działania żrącego na skórę z wykorzystaniem RhE inną niż VRM należy określić jej wiarygodność, istotność (dokładność) oraz ograniczenia dotyczące jej proponowanego wykorzystania, aby zapewnić jej podobieństwo do VRM zgodnie z wymogami standardów wykonywania badań (24) określonymi zgodnie z zasadami przedstawionymi w wytycznej dotyczącej badań OECD nr 34 (25). Wzajemne uznawanie danych będzie zagwarantowane dopiero po dokonaniu przeglądu i włączeniu do odpowiadającej wytycznej dotyczącej badań jakiejkolwiek zaproponowanej nowej lub zaktualizowanej metody badawczej zgodnej ze standardem wykonywania badań. Modele badań objęte wytyczną dotyczącą badań można wykorzystywać, by spełnić wymagania państw dotyczące wyników badań metody badawczej działania żrącego na skórę in vitro, korzystając jednocześnie z wzajemnego uznawania danych.

DEFINICJE

6.

Zastosowane definicje znajdują się w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE

7.

Niniejsza metoda badawcza umożliwia identyfikację substancji i mieszanin mających działanie żrące i niemających takiego działania zgodnie z GHS ONZ oraz rozporządzeniem CLP. Niniejsza metoda badawcza umożliwia podział na podkategorie substancji i mieszanin mających działanie żrące; kategorie te to fakultatywna podkategoria 1A zgodnie z GHS ONZ (1) oraz połączenie podkategorii 1B i 1C (21)(22)(23). Ograniczenie niniejszej metody badawczej polega na tym, że nie pozwala ona na rozróżnienie między podkategorią 1B (działanie żrące na skórę) a podkategorią 1C zgodnie z GHS ONZ i rozporządzeniem CLP ze względu na ograniczony zestaw dobrze znanych substancji chemicznych mających działanie żrące na skórę in vivo należących do podkategorii 1C. Podział na podkategorie jest możliwy dzięki modelom badań EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE i epiCS® (tj. 1A a 1B oraz 1C a substancje niemające działania żrącego na skórę).

8.

W ramach walidacji wspierającej modele badań objęte niniejszą metodą badawczą przebadano szeroki zakres substancji chemicznych reprezentujących głównie poszczególne substancje, kiedy są one wykorzystywane do określania, które substancje mają działanie żrące, a które nie; w empirycznej bazie danych z badania walidacyjnego znalazło się 60 substancji chemicznych obejmujących szeroki zakres klas chemicznych (8)(9)(10). Badanie mające na celu wykazanie wrażliwości testu podziału na podkategorie, jego swoistości, dokładności i odtwarzalności w warunkach laboratoryjnych wykonali twórcy metody badawczej, a przegląd wyników wykonała OECD (21)(22)(23). Z dostępnych ogólnych danych wynika, że metoda badawcza ma zastosowanie do wielu klas chemicznych i stanów skupienia, w tym do płynów, substancji półstałych, stałych i wosków. Ciecze mogą być wodne lub niewodne; substancje stałe mogą być rozpuszczalne lub nierozpuszczalne w wodzie. W miarę możliwości substancje stałe należy przed zastosowaniem zmielić na drobnoziarnisty proszek; nie jest wymagana żadna wcześniejsza obróbka próbki. W przypadkach, w których można przedstawić dowody na brak możliwości zastosowania modeli badań objętych omawianą metodą badawczą do konkretnej kategorii badanych substancji chemicznych, modeli tych nie należy stosować w odniesieniu do tej konkretnej kategorii badanych substancji chemicznych. Ponadto przyjmuje się, że niniejsza metoda badawcza ma zastosowanie nie tylko do substancji, ale także do mieszanin. Jednak ze względu na fakt, iż mieszaniny obejmują szeroki zakres kategorii oraz składów, oraz że obecnie dostępna jest niewielka ilość informacji na temat badania mieszanin, w przypadkach, w których można przedstawić dowody na brak możliwości zastosowania omawianej metody badawczej w odniesieniu do konkretnej kategorii mieszanin (np. kierując się strategią zaproponowaną w (26)), metody tej nie należy stosować w odniesieniu do tej konkretnej kategorii mieszanin. Przed zastosowaniem przedmiotowej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się, czy zastosowanie tej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak, to dlaczego. Przeprowadzenie takiej analizy nie jest konieczne, jeżeli ustanowiono wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny. Gazów i aerozoli nie oceniano jeszcze w badaniach walidacyjnych (8)(9)(10). Chociaż nie można wykluczyć, że da się je badać z wykorzystaniem technologii RhE, niniejsza metoda badawcza nie pozwala na badanie gazów i aerozoli.

9.

Badane substancje chemiczne pochłaniające światło w takim samym zakresie, jak formazan MTT oraz badane substancje chemiczne, które są w stanie bezpośrednio obniżyć zawartość barwnika przyżyciowego MTT (do formazanu MTT), mogą zakłócać pomiary żywotności tkanki i wymagać zastosowania przystosowanych kontroli w celu korekty. Rodzaj przystosowanych kontroli, który może być wymagany, będzie się różnił w zależności od rodzaju interferencji wywołanych przez badaną substancję chemiczną oraz procedurę zastosowaną w celu pomiaru formazanu MTT (zob. pkt 25–31).

10.

Chociaż niniejsza metoda badawcza nie dostarcza wystarczających informacji na temat podrażnienia skóry, należy zauważyć, że metoda badawcza B.46 dotyczy konkretnie badania in vitro, powodującego skutki dla zdrowia w postaci podrażnienia skóry, i opiera się na tym samym układzie badawczym RhE, choć z wykorzystaniem innego protokołu (5). Aby dokonać pełnej oceny miejscowego działania na skórę po pojedynczym narażeniu przez skórę, należy zapoznać się z wytycznymi OECD dotyczącymi zintegrowanych podejść do badań i oceny (6). Podejście IATA obejmuje przeprowadzanie badań in vitro w kierunku działania żrącego na skórę (takich jak opisano w niniejszej metodzie badawczej) i podrażnienia skóry przed rozważeniem badań na żywych zwierzętach. Uznaje się, że zastosowanie ludzkiej skóry podlega krajowym i międzynarodowym zastrzeżeniom i warunkom etycznym.

ZASADA BADANIA

11.

Badana substancja chemiczna jest nanoszona miejscowo na trójwymiarowy model RhE składający się z niezmienionych keratynocytów naskórka pochodzących od człowieka, które poddano hodowli w celu uzyskania wielowarstwowego, wysoce zróżnicowanego modelu ludzkiego naskórka. Model ten składa się z zorganizowanych warstw: podstawnej, kolczystej i ziarnistej oraz z wielopoziomowej warstwy rogowej naskórka zawierającej struktury blaszkowate utworzone z lipidów wypychanych do przestrzeni międzykomórkowej, analogiczne do struktur stwierdzanych in vivo.

12.

Metoda badawcza RhE opiera się na założeniu, że substancje chemiczne są w stanie przeniknąć przez warstwę rogową naskórka na drodze dyfuzji lub w wyniku jej niszczenia i są cytotoksyczne dla leżących głębiej warstw komórek. Żywotność komórek jest mierzona metodą enzymatycznej konwersji barwnika przyżyciowego MTT [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, błękit tiazolilowy; numer CAS 298-93-1], w niebieską sól formazanu, którą oznacza się ilościowo po ekstrakcji z tkanek (27). Substancje żrące identyfikuje się na podstawie ich zdolności do zmniejszenia żywotności komórek poniżej określonych wartości progowych (zob. pkt 35 i 36). Okazało się, że oparta na RhE metoda badania działania żrącego na skórę pozwala na prognozowanie skutków takiego działania na skórę in vivo, ocenianych u królików zgodnie z metodą badawczą B.4 (2).

WYKAZANIE BIEGŁOŚCI

13.

Przed przystąpieniem do rutynowego stosowania dowolnego z czterech zweryfikowanych modeli badań RhE zgodnych z niniejszą metodą badawczą laboratoria powinny wykazać swoją biegłość techniczną, prawidłowo klasyfikując 12 substancji służących do wykazania biegłości wykazanych w tabeli 1. W przypadku wykorzystania metody do utworzenia niższych jednostek klasyfikacji, należy również wykazać prawidłowy podział na podkategorie. W sytuacji gdy substancja znajdująca się w wykazie jest niedostępna lub w uzasadnionych przypadkach można zastosować inną substancję, dla której dostępne są odpowiednie dane porównawcze z badań in vivo i in vitro (np. z wykazu referencyjnych substancji chemicznych (24)), pod warunkiem zastosowania tych samych kryteriów wyboru, które opisano w tabeli 1.

Tabela 1

Wykaz substancji służących do wykazania biegłości  (8)

Substancja

Numer CAS

Klasa chemiczna (9)

Kategoria wg GHS ONZ/rozporządzenia CLP na podstawie wyników badań in vivo  (10)

Kategoria VRM VRM na podstawie wyników badań in vitro  (11)

Reduktor MTT (12)

Stan skupienia

Podkategoria 1A substancji żrących in vivo

Kwas bromooctowy

79-08-3

Kwas organiczny

1A

(3) 1A

S

Trójfluorek boru – dwuwodny

13319-75-0

Kwas nieorganiczny

1A

(3) 1A

C

Fenol

108-95-2

Fenol

1A

(3) 1A

S

Chlorek dichloroacetylu

79-36-7

Elektrofil

1A

(3) 1A

C

Kombinacja podkategorii 1B i 1C substancji żrących in vivo

Kwas glioksalowy – jednowodny

563-96-2

Kwas organiczny

1B i 1C

(3) 1B i 1C

S

Kwas mlekowy

598-82-3

Kwas organiczny

1B i 1C

(3) 1B i 1C

C

Etanoloamina

141-43-5

Zasada organiczna

1B

(3) 1B i 1C

T

Lepka konsystencja

Kwas chlorowodorowy (14,4 %)

7647-01-0

Kwas nieorganiczny

1B i 1C

(3) 1B i 1C

C

Substancje niedziałające żrąco in vivo

Bromek fenetylu

103-63-9

Elektrofil

(3) NŻ

T

C

4-amino-1,2,4-triazol

584-13-4

Zasada organiczna

(3) NŻ

S

4-(metylotio)-benzaldehyd

3446-89-7

Elektrofil

(3) NŻ

T

C

Kwas laurynowy

143-07-7

Kwas organiczny

(3) NŻ

S

Skróty: Numer CAS = numer w rejestrze Chemical Abstracts Service; VRM = zwalidowana metoda referencyjna; NŻ = nieżrące; T = tak S = stały; C = ciekły

14.

W ramach wykazywania efektywności zaleca się, aby użytkownik sprawdził właściwości bariery cechujące tkanki po ich otrzymaniu zgodnie ze wskazaniami producenta modelu RhE. Jest to szczególnie istotne, jeżeli tkanki są wysyłane na duże odległości lub wysyłka trwa długo. Gdy metoda badawcza została z powodzeniem wprowadzona oraz wykazano jej efektywność, weryfikacja taka nie będzie konieczna w ramach rutynowej procedury. W przypadku rutynowego zastosowania metody zaleca się jednak, aby w dalszym ciągu oceniać właściwości bariery w regularnych odstępach czasu.

PROCEDURA

15.

Poniższe stanowi ogólny opis składowych i procedur modeli badań RhE służących ocenie działania żrącego na skórę objętej niniejszą metodą badawczą. Modele RhE, które potwierdzono naukowo jako zdatne do wykorzystania w niniejszej metodzie badawczej, tj. modele EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE i epiCS® (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33), można uzyskać ze źródeł komercyjnych. Standardowe proced