32019R1390

Document 32019R1390

Title and reference

Regolament tal-Kummissjoni (UE) 2019/1390 tal-31 ta’ Lulju 2019 li jemenda, għall-finijiet tal-adattament tiegħu għall-progress tekniku, l-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 li jistabbilixxi metodi ta’ ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta’ sustanzi kimiċi (REACH) (Test b’rilevanza għaż-ŻEE)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

Languages, formats and link to OJ

HTML

PDF

Official Journal

To see if this document has been published in an e-OJ with legal value, click on the icon above (For OJs published before 1st July 2013, only the paper version has legal value).

Multilingual display

Text

26.9.2019

Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea

L 247/1

REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) 2019/1390

tal-31 ta’ Lulju 2019

li jemenda, għall-finijiet tal-adattament tiegħu għall-progress tekniku, l-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 li jistabbilixxi metodi ta’ ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta’ sustanzi kimiċi (REACH)

(Test b’rilevanza għaż-ŻEE)

IL-KUMMISSJONI EWROPEA,

Wara li kkunsidrat it-Trattat dwar il-Funzjonament tal-Unjoni Ewropea,

Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta’ Diċembru 2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta’ sustanzi kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE tal-Kunsill u d-Direttivi 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE tal-Kummissjoni (1), u b’mod partikolari l-Artikolu 13(2) tiegħu,

Billi:

(1)	Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 440/2008 (2) fih il-metodi ta’ ttestjar li jintużaw biex jiġu determinati l-proprjetajiet fiżikokimiċi, it-tossiċità u l-ekotossiċità ta’ sustanzi kimiċi li għandhom jiġu applikati għall-finijiet tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006.

(2)

L-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi (OECD) tiżviluppa linji gwida armonizzati u miftiehma f’livell internazzjonali għall-ittestjar ta’ sustanzi kimiċi għal skopijiet regolatorji. L-OECD b’mod regolari toħroġ linji gwida ġodda u riveduti dwar l-ittestjar, filwaqt li tqis il-progress xjentifiku f’dan il-qasam.

(3)

Biex jittieħed kont tal-progress tekniku u, kull fejn possibbli, biex jitnaqqas in-numru ta’ annimali użati għall-finijiet sperimentali f’konformità mal-Artikolu 13(2) tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006, wara l-adozzjoni tal-linji gwida rilevanti tal-OECD dwar l-ittestjar, jenħtieġ li jiġu stabbiliti żewġ metodi ta’ ttestjar ġodda għall-valutazzjoni tal-ekotossiċità u disa’ metodi ta’ ttestjar ġodda għad-determinazzjoni tat-tossiċità għas-saħħa tal-bniedem u jenħtieġ li jiġu aġġornati seba’ metodi ta’ ttestjar. Ħdax minn dawk il-metodi ta’ ttestjar huma relatati ma’ testijiet in vitro għall-irritazzjoni/korrużjoni dermali u tal-għajnejn, għas-sensitizzazzjoni tal-ġilda, għall-ġenotossiċità u għall-effetti endokrinali. Il-partijiet ikkonċernati ġew ikkonsultati dwar l-emenda proposta.

(4)	Għalhekk, ir-Regolament (KE) Nru 440/2008 jenħtieġ li jiġi emendat skont dan.

(5)	Il-miżuri previsti f’dan ir-Regolament huma konformi mal-opinjoni tal-Kumitat imwaqqaf permezz tal-Artikolu 133 tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006,

ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:

Artikolu 1

L-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 hu emendat f’konformità mal-Anness ta’ dan ir-Regolament.

Artikolu 2

Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum wara dak tal-pubblikazzjoni tiegħu f’Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.

Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u japplika direttament fl-Istati Membri kollha.

Magħmul fi Brussell, il-31 ta’ Lulju 2019.

Għall-Kummissjoni

Il-President

Jean-Claude JUNCKER

(1) ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1.

(2) Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 440/2008 tat-30 ta’ Mejju 2008 li jistabbilixxi metodi ta’ ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta’ sustanzi kimiċi (REACH) (ĠU L 142, 31.5.2008, p. 1).

ANNESS

L-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 hu emendat kif ġej:

(1)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.4 hu sostitwit b’dan li ġej:

“B.4 IRRITAZZJONI DERMALI AKUTA/KORRUŻJONI

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta’ ttestjar hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 404 tal-OECD (2015). Il-linji gwida tal-OECD għall-ittestjar tas-Sustanzi Kimiċi jiġu rieżaminati kull ċertu żmien biex jiġi żgurat li dawn jirriflettu l-aħjar xjenza disponibbli. Fir-rieżami tat-TG 404 tal-OECD, ingħatat attenzjoni speċjali għat-titjib possibbli b’rabta ma’ dak li jikkonċerna l-benessri tal-annimali u għall-evalwazzjoni tal-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza kimika tat-test biex ikunu evitati testijiet mingħajr ħtieġa fuq l-annimali tal-laboratorju. Il-verżjoni aġġornata tat-TG 404 tal-OECD (oriġinarjament adottata fl-1981, riveduta fl-1992, fl-2002 u fl-2015) tinkludi referenza għad-Dokument ta’ Gwida dwar l-Approċċi Integrati għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni (IATA) għall-Irritazzjoni/Korrużjoni tal-Ġilda (1), filwaqt li tipproponi approċċ modulari għall-ittestjar tal-irritazzjoni tal-ġilda u għall-korrużjoni tal-ġilda. L-IATA jiddeskrivi diversi moduli li jiġbru fihom sorsi ta’ informazzjoni u għodod ta’ valutazzjoni, u (i) jipprovdi gwida dwar kif tintegra u tuża d-data eżistenti dwar l-ittestjar u mhux tal-ittestjar għall-valutazzjoni tal-potenzjali ta’ irritazzjoni tal-ġilda u ta’ korrużjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi u (ii) jipproponi approċċ fejn ikun meħtieġ ittestjar ulterjuri (1). Barra minn dan, il-Linja Gwida tirrakkomanda, meta tkun meħtieġa, l-applikazzjoni suċċessiva, minflok simultanja, tat-tliet kumpressi tat-test għall-annimal fit-test inizjali in vivo.

Id-definizzjonijiet ta’ irritazzjoni u ta’ korrużjoni dermali huma stabbiliti fl-Appendiċi ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

Fl-interess kemm tax-xjenza solida kif ukoll tat-trattament xieraq tal-annimali, l-ittestjar in vivo ma għandux isir qabel ma d-data disponibbli kollha rilevanti għall-korrużività/irritazzjoni dermali potenzjali tas-sustanza kimika tat-test tkun ġiet evalwata f’analiżi tal-piż tal-evidenza (WoE) kif ippreżentata fid-Dokument ta’ Gwida dwar l-Approċċi Integrati għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni għall-Korrużjoni u għall-Irritazzjoni tal-Ġilda, jiġifieri fuq it-tliet Partijiet ta’ din il-gwida u l-moduli korrispondenti tagħhom (1). Fil-qosor, fil-Parti 1 id-data eżistenti tiġi indirizzata fuq seba’ moduli li jkopru d-data umana, id-data in vivo, id-data in vitro, id-data dwar il-proprjetajiet fiżikokimiċi (eż. pH, b’mod partikolari aċidità jew alkalinità b’saħħitha) u metodi mhux ta’ ttestjar. Fil-Parti 2 issir l-analiżi tad-WoE. Jekk din l-analiżi tad-WoE tibqa’ inkonklużiva, il-Parti 3 għandha ssir permezz ta’ ttestjar addizzjonali, l-ewwel b’metodi in vitro, u bl-ittestjar in vivo li jintuża bħala l-aħħar istanza. Għaldaqstant, din l-analiżi għandha tnaqqas il-ħtieġa għall-ittestjar in vivo għall-korrussività/irritazzjoni dermali ta’ sustanza kimika tat-test li għalihom diġà jkun hemm biżżejjed evidenza minn studji oħra rigward dawk iż-żewġ punti ta’ tmiem.

PRINĊIPJU TAT-TEST IN VIVO

Is-sustanza kimika tat-test li għandha tkun ittestjata tiġi applikata f’doża singola għall-ġilda ta’ annimal sperimentali; iż-żoni tal-ġilda mhux trattati tal-annimal tat-test iservu għall-kontroll. Il-grad tal-korrużjoni/irritazzjoni ikun moqri u rreġistrat matul intervalli speċifiċi u jkun deskritt aktar biex jipprovdi evalwazzjoni sħiħa tal-effetti. Id-durata tal-istudju għandha tkun suffiċjenti biex ikunu evalwati r-riversibbbiltà jew in-nuqqas ta’ riversibbbiltà tal-effetti osservati.

L-annimali li juru sinjali kontinwi ta’ tbatija u/jew uġigħ severi fi kwalunkwe stadju tat-test għandhom jinqatlu bl-ewtanażja, u s-sustanza kimika tat-test għandha tkun ivvalutata kif xieraq. Il-kriterji għat-teħid tad-deċiżjoni biex jinqatlu bl-ewtanażja l-annimali fi stat ta’ agunija jew ta’ tbatija severa huma spjegati f’Dokument ta’ Gwida separat (2).

PREPARAMENTI GĦAT-TEST IN VIVO

Għażla tal-ispeċi tal-annimali

Il-fenek albino hu l-annimal preferut tal-laboratorju, u jintużaw fniek adulti żgħar f’saħħithom. Ir-raġuni għall-użu ta’ speċi oħra għandha tiġi pprovduta.

Preparazzjoni tal-annimali

Madwar 24 siegħa qabel it-test, is-suf għandu jitneħħa bi tqaxxir taż-żona dorsali minn fuq id-dahar l-annimali. Għandha tingħata attenzjoni biex jiġi evitat li tinbarax il-ġilda, u għandhom jintużaw biss dawk l-annimli li jkunu b’saħħithom u li jkollhom ġilda intatta.

Uħud mir-razez tal-fniek ikollhom irqajja’ folti ta’ suf li jkunu aktar prominenti f’ċerti żminijiet tas-sena. Tali żoni ta’ tkabbir ta’ suf folt ma għandhomx jintużaw bħala siti tat-testijiet.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u tal-għalf

L-annimali għandhom jinżammu f’gaġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra tal-annimali esperimentali għandha tkun ta’ 20 °C (± 3 °C) għall-fniek. Filwaqt li l-umdità relattiva għandha tkun tal-anqas ta’ 30 % u idealment ma taqbiżx is-70 %, minbarra matul it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun ta’ 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 12-il siegħa dawl/12-il siegħa dlam. Għall-għalf, jistgħu jintużaw id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista mingħajr limitu ta’ ilma tax-xorb

PROĊEDURA TAT-TEST

Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

10.

Is-sustanza kimika tat-test għandha tkun applikata fuq żona żgħira (madwar 6 cm2) tal-ġilda u tinkesa b’kumpressa b’garża, li tinżamm fil-post bi stikk mhux irritanti. Fil-każi li fihom l-applikazzjoni diretta ma tkunx possibbli (eż. likwidi u ċerti pejsts), is-sustanza kimika tat-test l-ewwel għandha tkun applikata fuq kumpressa b’garża, li mbagħad tkun applikata fuq il-ġilda. Il-kumpressa għandha tinżamm f’kuntatt laxk mal-ġilda permezz ta’ faxxa semiokklużiva adattata għad-durata tal-esponiment. Jekk is-sustanza kimika tat-test tkun applikata fuq il-kumpressa, din għandha titwaħħal mal-ġilda b’tali mod li jkun hemm kuntatt tajjeb u distribuzzjoni uniformi tas-sustanza kimika tat-test mal-ġilda. L-aċċess mill-annimal għall-kumpressa u l-inġestjoni jew it-teħid man-nifs tas-sustanza kimika tat-test għandhom jiġu evitati.

11.

Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test ġeneralment jintużaw fi stat mhux dilwit. Meta jsiru t-testijiet ta’ solidi (li jistgħu jitfarrku, jekk dan jitqies li jkun meħtieġ), is-sustanza kimika tat-test għandha tkun niedja b’ammont żgħir ilma (jew, meta meħtieġ, b’xi veikolu adattat ieħor) li jkun suffiċjenti biex jiżgura kuntatt tajjeb mal-ġilda. Meta jintużaw veikoli oħra apparti l-ilma, l-influwenza potenzali tal-veikolu fuq l-irritazzjoni tal-ġilda mis-sustanza kimika tat-test għandha tkun minima, jekk tkun preżenti affattu.

12.

Fit-tmiem tal-perjodu tal-esponiment, li normalment ikun ta’ erba’ sigħat, is-sustanza kimika tat-test residwa għandha titneħħa, fejn prattikabbli, bl-użu tal-ilma jew ta’ xi solvent xieraq mingħajr ma jitbiddlu r-rispons eżistenti jew l-integrità tal-epidermis.

Livell tad-doża

13.

Doża ta’ 0,5 ml likwidu jew 0,5 g solidu jew pejst tiġi applikata fiż-żona tat-test.

Test inizjali (Test in vivo għall-irritazzjoni/korrużjoni dermali bl-użu ta’ annimal wieħed)

14.

Meta sustanza kimika tat-test tiġi ġudikata bħala korrużiva, irritanti jew mhux klassifikata fuq il-bażi ta’ analiżijiet tal-piż tal-evidenza jew ta’ ttestjar in vitro preċedenti, normalment ma jkunx hemm bżonn ta’ ttestjar in vivo ulterjuri. Madankollu, fil-każijiet li fihom id-data addizzjonali titqies ġustifikata, it-test in vivo għall-ewwel isir bl-użu ta’ annimal wieħed u billi jiġi applikat l-approċċ segwenti. Sa tliet kumpressi tat-test jiġu applikati b’mod sekwenzjali fuq l-annimal. L-ewwel kumpressa titneħħa wara tliet minuti. Jekk ma tiġi osservata ebda reazzjoni serja tal-ġilda, tiġi applikata t-tieni kumpressa f’sit differenti u din titneħħa wara siegħa. Jekk l-osservazzjonijiet f’dan l-istadju jindikaw li l-esponiment jista’ jitħalla b’mod uman għal erba’ sigħat, tiġi applikata t-tielet kumpressa u din titneħħa wara erba’ sigħat, u jiġi gradat ir-rispons.

15.

Jekk effett korrossiv ikun osservat wara kwalunkwe wieħed mit-tliet esponimenti sekwenzali, it-test jiġi terminat minnufih. Jekk effett korrossiv ma jkunx osservat wara li titneħħa l-aħħar kumpressa, l-annimal ikun osservat għal 14-il jum, sakemm il-korrużjoni ma tkunx żviluppat f’xi punt aktar kmieni.

16.

F’dawk il-każijiet li fihom is-sustanza kimika tat-test ma tkunx mistennija tipproduċi korrużjoni imma tista’ tkun irritanti, għandha tiġi applikata kumpressa waħda fuq annimal wieħed għal erba’ sigħat.

Test konfermatorju (Test in vivo għal irritazzjoni dermali b’annimali addizzjonali)

17.

Jekk effett korrużiv ma jkunx osservat fit-test inizjali, l-irritant jew ir-rispons negattiv għandu jiġi kkonfermat bl-użu ta’ massimu ta’ żewġ annimali oħra, kull wieħed b’kumpressa waħda, għal perjodu ta’ esponiment ta’ erba’ sigħat. Jekk effett irritanti jkun osservat fit-test inizjali, it-test konfermatorju jista’ jitwettaq b’mod sekwenzali, jew bl-esponiment ta’ żewġ annimali addizzjonali fl-istess ħin. Fil-każ eċċezzjonali li fih ma jsirx it-test inizjali, żewġ annimali jew tlieta jistgħu jiġu ttrattati b’kumpressa waħda, li titneħħa wara erba’ sigħat. Meta jintużaw żewġ annimali, jekk it-tnejn li huma juru l-istess rispons, ma jkun meħtieġ isir ebda ttestjar ulterjuri. Inkella, jiġi ttestjat it-tielet annimal ukoll. Risponsi ekwivoċi ikunu jeħtieġu evalwazzjoni bl-użu ta’ annimali addizzjonali.

Perjodu ta’ osservazzjoni

18.

Id-durata tal-perjodu ta’ osservazzjoni għandha tkun suffiċjenti biex tkun evalwata bis-sħiħ ir-riversabbiltà tal-effetti osservati. Minkejja dan, l-esperiment għandu jiġi terminat fi kwalunkwe waqt jekk l-annimal juri sinjali kontinwi ta’ uġigħ jew ta’ tbatija serji. Biex ikunu determinati l-effetti tar-riversibbbiltà, l-annimali għandhom ikunu osservati sa 14-il jum wara t-tneħħija tal-kumpressi. Jekk ir-riversibbiltà tkun osservata qabel l-14-il jum, l-esperiment għandu jiġi terminat f’dak il-waqt.

Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet tal-ġilda

19.

L-annimali kollha għandhom ikunu eżaminati għal sinjali ta’ eritema u ta’ edema, u r-risponsi reġistrati wara 60 minuta, u mbagħad 24, 48 u 72 siegħa wara t-tneħħija tal-kumpressa. Għat-test inizjali fuq annimal wieħed, is-sit tat-test ikun ukoll eżaminat immedjatament wara li titneħħa l-kumpressa. Ir-reazzjonijiet dermali huma ggradati u rreġistrati skont il-gradi fit-Tabella ta’ hawn taħt. Jekk ikun hemm ħsara fil-ġilda li ma tistax tiġi identifikata bħala irritazzjoni jew korrużjoni wara 72 siegħa, l-osservazzjonijiet jistgħu jkunu meħtieġa sal-jum 14 biex tkun determinata r-riversibbiltà tal-effetti. B’żieda mal-osservazzjonijiet tal-irritazzjoni, l-effetti tossiċi lokali kollha, bħal ma huma n-nuqqas ta’ xaħam min taħt il-ġilda, u kwalunkwe effett sistematiku avvers (eż. l-effetti fuq sinjali kliniċi ta’ tossiċità u l-piż tal-ġisem), għandhom ikunu deskritti bis-sħiħ u rreġistrati. L-eżami istopatoloġiku għandu jiġi kkunsidrat biex jiċċara risponsi ekwivoċi.

20.

L-iggradar tar-reazzjonijiet tal-ġilda bilfors li jkun soġġettiv. Biex tkun imħġeġġa l-armonizzazzjoni fl-iggradar tar-rispons tal-ġilda u biex ikunu megħjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fit-twettiq u fl-interpretazzjoni tal-osservazzjonijiet, il-persunal li jagħmel l-osservazzjonijiet irid ikun imħarreġ b’mod adegwat fis-sistema tal-iggradar użata (ara t-Tabella ta’ hawn taħt). Gwida illustrata għall-iggradar tal-irritazzjoni tal-ġilda u ta’ leżjonijiet oħra tista’ tkun ta’ għajnuna (3).

DATA U RAPPORTAR

21.

Ir-riżultati tal-istudju għandhom ikunu miġbura f’forma tabulari fir-rapport tat-test finali u għandhom ikopru l-punti kollha elenkati fil-paragrafu 24.

Evalwazzjoni tar-riżultati

22.

Il-punteġġi tal-irritazzjoni dermali għandhom ikunu evalwati flimkien man-natura u mas-severità tal-leżjonijiet, u mar-riversibbbiltà jew man-nuqqas ta’ riversibbbiltà tagħhom. Il-punteġġi individwali ma jirrappreżentawx norma assoluta għall-propjetajiet irritanti ta’ xi materjal, minħabba li jiġu evalwati wkoll effetti oħra tal-materjal tat-test. Minflok, il-punteġġi individwali għandhom jitqiesu bħala valuri referenzjarji, li jridu jkunu evalwati flimkien mal-osservazzjonijiet l-oħra kollha li jirriżultaw mill-istudju.

23.

Ir-riversibbbiltà tal-leżjonijiet dermali wkoll għandha tkun ikkunsidrata fl-evalwazzjoni tar-risponsi irritanti. Meta r-risponsi bħalma huma l-alopeċja (żona limitata), l-iperkeratożi, l-iperplażja u l-esfoljazzjoni, jippersistu sa tmiem il-perjodu ta’ 14-il jum osservazzjoni, is-sustanza kimika tat-test għandha titqies bħala irritant.

Rapport tat-test

24.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Il-ħsieb wara l-ittestjar in vivo:

—	Analiżi tal-piż tal-evidenza tad-data preeżistenti tat-test, inklużi r-riżultati minn strateġija ta’ ttestjar sekwenzjali;

—	Deskrizzjoni tad-data rilevanti disponibbli mill-ittestjar preċedenti;

—	Data miksuba f’kull stadju tal-istrateġija ta’ ttestjar;

—	Deskrizzjoni tat-testijiet in vitro mwettqa, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati miksuba bis-sustanzi tat-test/referenza;

—	Analiżi tal-piż tal-evidenza għat-twettieq tal-istudju in vivo.

Sustanza kimika tat-test:

—	Sustanza monokostitwenti: l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;

—

Sustanza multikostitwenti, taħlita u sustanzi b’kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti b’reazzjoni kumplessa jew materjali bijoloġiċi (UVCB): ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti;

—	Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;

—	Is-sors, in-numru tal-lott jekk disponibbli;

—	It-trattament tas-sustanza kimika tat-test/tas-sustanza tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (eż., it-tisħin, it-tħin);

—	L-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, id-data ta’ limitu għall-użu, jew id-data għall-analiżi mill-ġdid, jekk magħrufa;

—	Il-kundizzjonijiet tal-ħżin.

Il-veikolu:

—	L-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (fejn xieraq), il-volum użat;

—	Il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.

L-annimal(i) tat-test:

—	L-ispeċi/ir-razza użata, ir-raġuni wara l-użu ta’ annimal(i) li mhuwiex fenek albino;

—	In-numru tal-annimal(i) għal kull sess;

—	Il-piż(ijiet) tal-annimali individwali, kemm fil-bidu kif ukoll fil-konklużjoni tat-test;

—	L-età fil-bidu tal-istudju;

—	Is-sors tal-annimal(i), il-kundizzjonijiet tal-abitazzjoni, id-dieta, eċċ.

Il-kundizzjonijiet tat-test:

—	It-teknika tal-preparazzjoni tas-sit tal-kumpressa;

—	Id-dettalji dwar il-materjali tal-kumpressa użati u t-teknika tal-kumpressa;

—	Id-dettalji dwar il-preparazzjoni, l-applikazzjoni u t-tneħħija tas-sustanza kimika tat-test.

Ir-riżultati:

—	Tabulazzjoni tal-punteġġi tar-rispons/korrużjoni għal kull annimal fil-punti kollha tal-ħin imkejla;

—	Id-deskrizzjonijiet tal-leżjonijiet kollha, kif osservati;

—	Id-deskrizzjoni narrattiva tan-natura u l-grad tal-irritazzjoni jew tal-korrużjoni osservati, u kwalunkwe sejba istopatoloġika;

—	Id-deskrizzjoni ta’ effetti avversi lokali (eż. tneħħija tax-xaħam minn taħt il-ġilda) u sistematiċi oħra minbarra l-irritazzjoni jew il-korrużjoni dermali.

Diskussjoni dwar ir-riżultati

Konklużjonijiet

DOKUMENTAZZJONI

(1)	OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.

(2)	OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, kif approvata mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat tas-Sustanzi Kimiċi u tal-Grupp ta’ Ħidma dwar is-Sustanzi Kimiċi, Novembru 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.

Tabela

Iggradar tar-reazzjonijiet tal-?ilda


Ebda eritema…	0
Eritema ħafifa ħafna (kemm kemm tidher)…	1
Eritema definita sew…	2
Eritema moderata sa severa…	3
Eritema severa (ħmura tal-laħam) sa formazzjoni ta’ eskara li tipprevjeni l-iggradar tal-eritema…	4
Il-massimu possibbli: 4

Ebda edema…	0
Edema ħafifa ħafna (kemm kemm tidher)…	1
Edema ħafifa (il-ġnub taż-żona huma definiti sew b’nefħiet definiti)…	2
Edema moderata (nefħa ta’ madwar 1 mm)…	3
Edema severa (nefħa akbar minn 1 mm u tifrix lil hinn miż-żona tal-esponiment)…	4
Il-massimu possibbli: 4
L-eżami istopatoloġiku għandu jitwettaq biex jiċċara risponsi ekwivoċi.

Appendiċi

DEFINIZZJONIJIET

Sustanza kimika hi sustanza jew taħlita.

Irritazzjoni dermali hi l-produzzjoni ta’ ħsara riversibbli fil-ġilda wara li tiġi applikata sustanza kimika tat-test għal mhux aktar minn erba’ sigħat.

Korrużjoni dermali hi l-produzzjoni ta’ ħsara irriversibbli fil-ġilda; jiġifieri nekrożi viżibbli mill-epidermis u ġewwa d-dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test għal mhux aktar minn erba’ sigħat. Ir-reazzjonijiet korrossivi huma kkaratterizzati minn ulċeri, fsad, qxur bid-demm, u, fit-tmiem tal-osservazzjoni fl-14-il jum, minn skulurazzjoni minħabba t-tibjid tal-ġilda, żoni sħaħ b’alopeċja, u ċikatriċi. L-istopatoloġija għandha titqies biex jiġu evalwati leżjonijiet li dwarhom ikun hemm dubju.

Sustanza kimika tat-test hi kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata bl-użu ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar

”

(2)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.17 hu ssostitwit b’dan li ġej:

“B.17 TESTIJIET IN VITRO TAL-MUTAZZJONI ĠENETIKA FUQ ĊELLOLI TAL-MAMMIFERI BL-UŻU TAL-ĠENI HPRT U XPRT

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linji gwida tat-test 476 tal-OECD (2016). Il-metodi ta’ ttestjar jiġu rieżaminati kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku, tal-ħtiġijiet regolatorji li jinbidlu u tat-trattament xieraq tal-annimali. Din il-verżjoni riveduta kurrenti tat-TM B.17 tirrifletti kważi tletin sena esperjenza b’dan it-test u tirriżulta wkoll mill-iżvilupp ta’ metodu ġdid separat dedikat għal testijiet in vitro tal-mutazzjoni ġenetika fuq ċelloli tal-mammiferi bl-użu tal-ġene tat-timidina kinażi. TM B.17 hu parti minn sensiela ta’ metodi ta’ ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. L-OECD żviluppat dokument li jipprovdi informazzjoni sintetika fuq l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali lejn it-tibdiliet riċenti li seħħew fil-linji gwida tat-test tal-OECD dwar it-tossiċità ġenetika (1).

L-iskop tat-test in vitro tal-mutazzjoni ġenetika fuq ċelloli tal-mammiferi hu li jindividwa l-mutazzjonijiet ġenetiċi indotti mis-sustanzi kimiċi. Il-linji ta’ ċelloli użati f’dawn it-testijiet ikejlu l-mutazzjonijiet ’il quddiem fil-ġeni indikaturi, speċifikament il-ġene endoġenu ipoksantina-gwanina fosforibożil trasferażi (Hprt f’ċelloli ta’ rodituri, HPRT f’ċelloli umani; kollettivament imsejħa l-ġene Hprt u t-test HPRT f’dan il-metodu ta’ ttestjar), u t-transġene ksantina-gwanina fosforibożil trasferażi (gpt) (imsejjaħ it-test XPRT). It-testijiet ta’ mutazzjoni HPRT u XPRT jiżvelaw dehriet differenti ta’ avvenimenti ġenetiċi. Minbarra l-avvenimenti mutazzjonali individwati mit-test HPRT (eż. sostituzzjonijiet tal-pari bażi, tibdil fil-qari ġenetiku, tħassiriet żgħar u inserzjonijiet) il-lokazzjoni awtosomali tat-transġene gpt tista’ tippermetti l-iżvelar ta’ mutazzjonijiet li jirriżultaw minn tħassiriet kbar u possibilment rikombinazzjoni mitotika mhux żvelata mit-test HPRT għaliex il-ġene Hprt jinsab fil-kromożoma X (2) (3) (4) (5) (6) (7). L-XPRT bħalissa jintuża anqas mit-test HPRT għal skopijiet regolatorji.

Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET INIZJALI U LIMITAZZJONIJIET

Ġeneralment it-testijiet imwettqa in vitro jeħtieġu l-użu ta’ sors esoġenu ta’ attivazzjoni metabolika. Is-sistema esoġena ta’ attivazzjoni metabolika ma timitax għalkollox il-kundizzjonijiet in vivo.

Għandha tingħata attenzjoni biex jiġu evitati kundizzjonijiet li jkunu jwasslu għal riżultati pożittivi artefattwali, (jiġifieri interazzjonijiet possibbli mas-sistema tat-test), mhux ikkawżati minn interazzjoni diretta bejn is-sustanzi kimiċi tat-test u l-materjal ġenetiku taċ-ċellola; tali kundizzjonijiet jinkludu tibdiliet fil-pH jew fl-ożmolalità (8) (9) (10), interazzjoni mal-komponenti tal-medium (11) (12) jew livelli eċċessivi ta’ ċitotossiċità (13). Ċitotossiċità li taqbeż il-livelli massimi rakkomandati ta’ ċitotossiċità kif definiti fil-paragrafu 19 titqies eċċessiva għat-test HPRT.

Qabel ma jintuża l-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.

PRINĊIPJU TAT-TEST

Iċ-ċelloli mutanti nieqsa mill-attività tal-enzima Hprt fit-test HPRT jew mill-attività tal-enzima prt fit-test XPRT huma reżistenti għall-effetti ċitostatiċi tal-analogu tal-purina 6-tjogwanina (TG). Iċ-ċelloli profiċjenti fl-Hprt (fit-test HPRT) jew fil-gpt (fit-test XPRT) huma sensittivi għat-TG, li joħloq l-inibizzjoni tal-metaboliżmu ċellolari u jwaqqaf aktar diviżjoni fiċ-ċelloli. B’hekk, iċ-ċelloli mutanti jkunu jistgħu jipproliferaw fil-preżenza tat-TG, filwaqt li ċelloli normali, li fihom l-enzima Hprt (fit-test HPRT) jew gpt (fit-test XPRT) ma jkunux.

Ċelloli f’sospensjoni jew f’kolturi monosaff jiġu esposti għas-sustanza kimika tat-test, kemm b’sors esoġenu ta’ attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajr (ara l-paragrafu 14), għal perjodu xieraq ta’ żmien (3-6 sigħat), u mbagħad jiġu subkolturati biex tiġi determinata ċ-ċitotossiċità u titħalla l-espressjoni fenotipika qabel l-għażla tal-mutant (14) (15) (16) (17). Iċ-ċitotossiċità tiġi determinata mis-sopravivenza relattiva (RS), jiġifieri l-effiċjenza tal-klonazzjoni mkejla eżatt wara t-trattament u aġġustata għal kwalunkwe telf ta’ ċelloli matul it-trattament meta mqabbla mal-kontroll negattiv (paragrafu 18 u Appendiċi 2). Il-kolturi ttrattati jinżammu f’medium tat-tkabbir għal perjodu ta’ żmien suffiċjenti, karatteristiku ta’ kull tip ta’ ċellola, biex jippermetti l-espressjoni fenotipika kważi ottimali tal-mutazzjonijiet indotti (tipikament minimu ta’ 7-9 ijiem). Wara l-espressjoni fenotipika, il-frekwenza mutanti tiġi stabbilita biż-żrigħ ta’ għadd magħruf ta’ ċelloli f’medium li jkun fih l-aġent selettiv biex jiġu żvelati l-kolonji mutanti, u f’medium mingħajr aġent selettiv biex tiġi żvelata l-effiċjenza tal-klonazzjoni (vijabbiltà). Wara perjodu xieraq ta’ inkubazzjoni, jingħaddu l-kolonji. Il-frekwenza tal-mutanti tiġi kkalkolata fuq il-bażi tan-numru ta’ kolonji mutanti kkoreġut bl-effiċjenza tal-klonazzjoni fil-mument tal-għażla tal-mutanti.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Ċelloli

It-tipi ta’ ċelloli użati għat-testijiet HPRT u XPRT għandu jkollhom sensittività murija għal mutaġeni kimiċi, effiċjenza għolja tal-klonazzjoni, karjotip stabbli, u frekwenza mutanti spontanja stabbli. L-aktar ċelloli użati ta’ spiss għat-test HPRT jinkludu l-linji CHO, CHL u V79 taċ-ċelloli tal-hamster Ċiniż, ċelloli tal-linfoma tal-ġrieden L5178Y, u ċelloli linfoblastojdi umani TK6 (18) (19). Għat-test XPRT jintużaw iċ-ċelloli AS52 derivati mis-CHO li fihom it-transġene gpt (u li jitħassrilhom il-ġene Hprt) (20) (21); it-test HPRT ma jistax isir f’ċelloli AS52 għaliex il-ġene hprt ikun tħassar. L-użu ta’ linji ta’ ċelloli oħra għandu jkun ġustifikat u validat.

10.

Il-linji ta’ ċelloli għandhom jiġu verifikati b’mod regolari għall-istabbiltà tal-għadd ta’ kromożomi modali u l-assenza ta’ kontaminazzjoni tal-Mikoplażma (22) (23), u ċ-ċelloli ma għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati jew jekk jinbidel l-għadd ta’ kromożomi modali. It-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli użat fil-laboratorju tal-ittestjar għandu jkun stabbilit u konsistenti mal-karatteristiċi taċ-ċelloli ppubblikati. Il-frekwenza mutanti spontanja fiċ-ċelloli omm prinċipali għandha tiġi verifikat wkoll, u ċ-ċelloli omm ma għandhomx jintużaw jekk il-frekwenza mutanti ma tkunx aċċettabbli.

11.

Qabel l-użu f’dan it-test, il-kolturi jaf ikollhom bżonn jitnaddfu miċ-ċelloli mutanti preeżistenti, eż. bil-kolturazzjoni f’medium HAT għat-test HPRT u MPA għat-test XPRT (5) (24) (Ara l-Appendiċi 1). Iċ-ċelloli mnaddfa jistgħu jiġu krijopreservati u mbagħad jinħallu biex jintużaw bħala ċelloli omm għall-użu. Iċ-ċelloli omm għall-użu li jkunu għadhom kif inħallew jistgħu jintużaw għat-test wara li jinkisbu ħinijiet normali tal-irdoppjar. Meta jsir it-test XPRT, il-koltura ta’ rutina taċ-ċelloli AS52 għandha tuża kundizzjonijiet li jiżguraw iż-żamma tat-transġene gpt (20).

Kundizzjonijiet tal-media tal-koltura

12.

Għandhom jintużaw kundizzjonijiet xierqa tal-media tat-tkabbir u tal-inkubazzjoni (reċipjenti tal-koltura, atmosfera umidifikata ta’ 5 % CO2, u temperatura ta’ inkubazzjoni ta’ 37 °C) għaż-żamma tal-kolturi. Il-kolturi taċ-ċelloli dejjem għandhom jinżammu f’kundizzjonijiet li jiżguraw li jkunu qed jikbru fil-fażi log. Hu partikolarment importanti li l-kundizzjonijiet tal-media u tal-kolturi jingħażlu hekk li jiżguraw l-iżvilupp ottimali taċ-ċelloli matul il-perjodu ta’ espressjoni u l-effiċjenza ottimali tal-klonazzjoni kemm għaċ-ċelluli mutanti kif ukoll għal dawk mhux mutanti.

Preparazzjoni tal-kolturi

13.

Il-linji taċ-ċelloli huma propagati minn kolturi omm, miżrugħa fil-medium tat-tkabbir b’densità tali li ċ-ċelloli f’sospensjonijiet jew f’monosaffi jibqgħu jikbru b’mod esponenzjali matul it-trattament u l-perjodi ta’ espressjoni kollha kemm huma (eż. għandha tiġi evitata konfluwenza għal ċelloli li jikbru f’monosaffi).

Attivazzjoni metabolika

14.

Għandhom jintużaw sistemi metabolizzanti esoġeni meta jintużaw ċelloli b’kapaċità metabolika endoġena inadegwata. L-aktar sistema użata spiss, li hi l-ewwel rakkomandata, sakemm ma jkunx ġustifikat mod ieħor, hi frazzjoni postmitokondrijali ssupplimentata minn kofatturi (S9) imħejjija mill-fwied ta’ rodituri (ġeneralment firien) ittrattati b’indutturi enzimatiċi bħal Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) jew taħlita ta’ fenobarbital u β-naftoflavon (29) (30) (31) (32). Din it-taħlita msemmija l-aħħar ma tmurx kontra l-Konvenzjoni ta’ Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes (33) u ntwera li hi effettiva daqs Aroclor 1254 għall-induzzjoni ta’ ossidażijiet b’funzjoni mħallta (29) (59) (31). Il-frazzjoni S9 normalment tintuża f’konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 1 sa 2 % (v/v) iżda tista’tiżdied sa 10 % (v/v) fil-medium tat-test finali. L-għażla tat-tip u tal-konċentrazzjoni ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika esoġena jew tal-induttur metaboliku użati tista’ tkun influwenzata mill-klassi tas-sustanzi li jiġu ttestjati (34) (35) (36).

Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

15.

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jiġu ppreparati f’solventi xierqa u jiġu dilwiti, jekk dan ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 16). Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistema tat-test u/jew jiġu dilwiti qabel it-trattament tas-sistema tat-test. Is-sustanzi kimiċi gassużi jew volatili tat-test għandhom jiġu ttestjati b’modifiki xierqa fil-protokolli standard, bħat-trattament f’reċipjenti tal-koltura ssiġillati (37) (38). Il-preparati tas-sustanza kimika tat-test għandhom isiru eżatt qabel it-trattament, sakemm id-data dwar l-istabbiltà ma turix l-aċċettabbiltà tal-ħżin.

KUNDIZZJONIJIET TAT-TEST

Solventi

16.

Is-solvent għandu jingħażel biex tiġi ottimizzata s-solubbiltà tas-sustanzi kimiċi tat-test mingħajr ma jitħalla impatt avvers fuq it-twettiq tal-assaġġ, eż. tibdil fit-tkabbir taċ-ċelloli, effett fuq l-integrità tas-sustanza kimika tat-test, reazzjoni ma’ reċipjenti tal-koltura, indeboliment tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika. Hu rakkomandat li, kull meta dan ikun possibbli, l-ewwel għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta’ solvent milwiem (jew medium tat-tkabbir). Pereżempju, fost is-solventi ferm stabbiliti hemm l-ilma u s-sulfossidu tad-dimetil. Ġeneralment, is-solventi organiċi ma għandhomx jaqbżu l-1 % (v/v) u s-solventi milwiema (salina jew ilma) ma għandhomx jaqbżu l-10 % (v/v) fil-medium tat-trattament finali. Jekk is-solventi użati ma jkunux ferm stabbiliti (eż. etanol jew aċeton), l-użu tagħhom għandu jkun sostnut minn data li tindika l-kompatibbiltà tagħhom mas-sustanzi kimiċi tat-test u mas-sistema tat-test, u n-nuqqas tagħhom ta’ tossiċità ġenetika bil-konċentrazzjoni użata. Fin-nuqqas ta’ dik id-data ta’ sostenn, importanti li jiġu inklużi kontrolli mhux trattati (ara l-Appendiċi 1) biex jintwera li s-solvent magħżul ma jinduċi ebda effett dannuż jew mutaġeniku.

Kejl taċ-ċitotossiċità u għażla tal-konċentrazzjonijiet tal-esponiment

17.

Meta wieħed jistabbilixxi l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, għandhom jiġu evitati konċentrazzjonijiet li għandhom il-kapaċità li jipproduċu rispons pożittiv artefattwali, bħal dawk li jipproduċu ċitotossiċità eċċessiva (ara l-paragrafu 20), il-preċipitazzjoni fil-medium tat-tkabbir (ara l-paragrafu 21), jew tibdiliet ċari fil-pH jew fl-ożmolalità (ara l-paragrafu 5). Jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tibdil ċar fil-pH tal-medium fi żmien iż-żieda, il-pH tista’ tiġi aġġustata bl-ibbaferjar tal-medium tat-trattament finali biex jiġu evitati riżultati pożittivi artefattwali u biex jinżammu l-kundizzjonijiet xierqa tal-koltura.

18.

L-għażla tal-konċentrazzjoni hi bbażata fuq iċ-ċitotossiċità u fuq kunsiderazzjonijiet oħra (ara l-paragrafi 20-22). Filwaqt li l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità f’test inizjali tista’ tkun siewja biex jiġu definiti aħjar il-konċentrazzjonijiet li jkunu se jintużaw fl-esperiment ewlieni, test inizjali mhuwiex meħtieġ. Anki jekk issir evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità inizjali, il-kejl taċ-ċitotossiċità għal kull koltura xorta waħda jkun meħtieġ fl-esperiment ewlieni. Iċ-ċitotossiċità għandha tiġi evalwata bl-użu tal-RS, jiġifieri l-effiċjenza tal-klonazzjoni (CE) taċ-ċelloli pjastrati eżatt wara t-trattament, aġġustata skont kwalunkwe telf ta’ ċelloli matul it-trattament, fuq il-bażi tal-għadd taċ-ċelloli, meta mqabbla mal-aġġustament tal-effiċjenza tal-klonazzjoni f’kontrolli negattivi (assenjati sopravivenza ta’ 100 %) (ara l-Appendiċi 2 għall-formula).

19.

Għandhom jiġu evalwati tal-anqas erba’ konċentrazzjonijiet tat-test (mhux inklużi l-kontrolli tas-solvent u pożittivi) li jissodisfaw il-kriterji ta’ aċċettabbiltà (iċ-ċitotossiċità xierqa, in-numru ta’ ċelloli, eċċ.). Filwaqt li l-użu ta’ kolturi duplikati hu rakkomandat, jistgħu jintużaw kolturi repliki jew trattati individwalment f’kull konċentrazzjoni ttestjata. Ir-riżultati miksuba fil-kolturi rreplikati indipendenti f’konċentrazzjoni partikolari għandhom jiġu rrapportati b’mod separat iżda jistgħu jiġu aggregati għall-analiżi tad-data (17). Għal sustanzi kimiċi tat-test li juru tossiċità baxxa jew ebda tossiċità, intervalli tal-konċentrazzjoni ta’ madwar id-doppju jew it-triplu normalment ikunu xierqa. Meta sseħħ ċitotossiċità, il-konċentrazzjonijiet tat-test magħżulin għandhom ikopru firxa minn dik iċ-ċitotossiċità produttiva sa konċentrazzjonijiet li fihom ikun hemm ċitotossiċità moderata u baxxa jew ebda ċitotossiċità. Ħafna sustanzi kimiċi tat-test juru kurvi konċentrazzjoni rispons weqfin u, biex tkun koperta l-medda sħiħa taċ-ċitotossiċità jew biex tiġi studjata r-relazzjoni bejn il-konċentrazzjoni u r-rispons fid-dettall, jaf ikun hemm bżonn li jintużaw konċentrazzjonijiet spazjati aktar qrib xulxin u aktar minn erba’ konċentrazzjonijiet, speċjalment f’sitwazzjonijiet li fihom ikun hemm bżonn li jsir esperiment ripetut (ara l-paragrafu 43). L-użu ta’ aktar minn erba’ konċentrazzjonijiet jista’ jkun partikolarment importanti meta jintużaw kolturi individwali.

20.

Jekk il-konċentrazzjoni massima tkun ibbażata fuq iċ-ċitotossiċità, l-ogħla konċentrazzjoni għandu jkollha l-għan li tilħaq bejn 20 u 10 % RS. Għandha tingħata attenzjoni meta jiġu interpretati riżultati pożittivi li jinsabu biss f’10 % RS jew anqas (il-paragrafu 43).

21.

Għal sustanzi kimiċi tat-test ftit li xejn solubbli li mhumiex ċitotossiċi f’konċentrazzjonijiet anqas mill-anqas konċentrazzjoni insolubbli, l-ogħla konċentrazzjoni analizzata għandha tipproduċi turbidità jew preċipitat viżibbli bl-għajnejn jew bl-għajnuna ta’ mikroskopju invertit fi tmiem it-test bis-sustanza kimika tat-test. Anki jekk iċ-ċitotossiċità sseħħ f’livelli inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, huwa rakkomandat li l-ittestjar isir f’konċentrazzjoni waħda biss li tipproduċi turbidità jew bi preċipitat viżibbli għaliex jistgħu jirriżultaw effetti artefattwali mill-preċipitat. Fil-konċentrazzjoni li tipproduċi preċipitat, għandha tingħata attenzjoni biex jiġi żgurat li l-preċipitat ma jxekkilx it-twettiq tat-test. Id-determinazzjoni tas-solubbiltà fil-medium tat-tkabbir qabel l-esperiment tista’ tkun utli.

22.

Jekk ma jiġu osservati ebda preċipitat jew ċitotossiċità li tillimita, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun tikkorrispondi għal 10 mM, 2 mg/ml jew 2 μl/ml, liema minnhom tkun l-anqas (39) (40). Meta s-sustanza kimika tat-test ma jkollhiex kompożizzjoni definita, eż. sustanza b’kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa (jiġifieri Sustanzi Kimiċi b’Kompożizzjoni Mhux Magħrufa jew Varjabbli (UVCBs)) (41), estratti ambjentali, eċċ., il-konċentrazzjoni massima jaf ikollha bżonn tkun ogħla (eż. 5 mg/mL), fin-nuqqas ta’ biżżejjed ċitotossiċità, biex tiżdied il-konċentrazzjoni ta’ kull wieħed mill-komponenti. Madankollu, ta’ min jinnota li dawn ir-rekwiżiti jistgħu jvarjaw għall-prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem (42).

Kontrolli

23.

Għal kull kundizzjoni sperimentali għandhom ikunu inklużi kontrolli negattivi konkorrenti (ara l-paragrafu 16) li jikkonsistu f’solvent waħdu fil-medium tat-trattament u mmaniġġjati bl-istess mod bħall-kolturi tat-trattament.

24.

Kontrolli pożittivi konkorrenti huma meħtieġa biex juru l-ħila tal-laboratorju fl-identifikazzjoni ta’ mutaġeni fil-kundizzjonijiet tal-protokoll tat-test użat u l-effikaċja tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika esoġena, meta applikabbli. Fit-tabella 1 ta’ hawn taħt jingħataw xi eżempji ta’ kontrolli pożittivi. Jistgħu jintużaw sustanzi ta’ kontroll pożittiv oħra, jekk ikunu ġustifikati. Peress li t-testijiet in vitro fuq ċelloli tal-mammiferi għat-tossiċità ġenetika huma standardizzati biżżejjed, it-testijiet li jużaw trattament b’attivazzjoni metabolika esoġena u mingħajr jistgħu jitwettqu biss bl-użu ta’ kontroll pożittiv li jeħtieġ attivazzjoni metabolika. F’dan il-każ, dan ir-rispons tal-kontroll pożittiv individwali se juri kemm l-attività tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika kif ukoll ir-risponsività tas-sistema tat-test. Kull kontroll pożittiv għandu jintuża f’konċentrazzjoni waħda jew aktar li tkun mistennija tagħti żidiet riproduċibbli u individwabbli li jispikkaw biex tintwera s-sensittività tas-sistema tat-test, u r-rispons ma għandux ikun imxekkel miċ-ċitotossiċità li taqbeż il-limiti speċifikati f’dan il-metodu ta’ ttestjar (ara l-paragrafu 20).

Tabella 1

Sustanzi ta’ riferiment rakkomandati għall-valutazzjoni tal-profiċjenza tal-laboratorju u għall-għażla tal-kontrolli pożittivi

Kundizzjoni tal-Attivazzjoni Metabolika	Lokus	Sustanza u Nru CAS
Assenza ta’ attivazzjoni metabolika esoġena	Hprt	Etilmetansulfonat [Nru CAS 62-50-0] Etilnitrosourea [Nru CAS 759-73-9] 4-Nitrokinolina 1-ossidu [Nru CAS 56-57-5]
	xprt	Streptonigrina [Nru CAS 3930-19-6] Mitomiċina C [Nru CAS 50-07-7]
Preżenza ta’ attivazzjoni metabolika esoġena	Hprt	3-Metilkolantren [Nru CAS 56-49-5] 7,12-Dimetilbenżantraċen [Nru CAS 57-97-6] Benżo[a]piren [Nru CAS 50-32-8]
	xprt	Benżo[a]piren [Nru CAS 50-32-8]

PROĊEDURA

Trattament bis-sustanza kimika tat-test

25.

Iċ-ċelloli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ sistema ta’ attivazzjoni metabolika. L-esponiment għandu jkun għal perjodu xieraq ta’ żmien (normalment perjodu ta’ bejn tlieta u sitt sigħat ikun adegwat).

26.

In-numru minimu ta’ ċelloli użati għal kull koltura tat-test (tal-kontroll u trattata) f’kull stadju fit-test għandu jkun ibbażat fuq il-frekwenza mutanti spontanja. Gwida ġenerali hi li jiġu ttrattati u passaġġati biżżejjed ċelloli biex jinżammu 10 mutanti spontanji f’kull koltura fil-fażijiet kollha tat-test (17). Il-frekwenza mutanti spontanja ġeneralment tkun ta’ bejn 5 u 20 × 10-6. Għal frekwenza mutanti spontanja ta’ 5 × 10-6 u biex jinżamm numru suffiċjenti ta’ mutanti spontanji (10 jew aktar) anki għall-kolturi ttrattati b’konċentrazzjonijiet li jikkawżaw ċitotossiċità ta’ 90 % matul it-trattament (10 % RS), ikun hemm bżonn li tal-anqas jiġu ttrattati 20 × 106 ċelloli. Barra minn hekk, numru suffiċjenti ta’ ċelloli (iżda qatt anqas minn żewġ miljuni) iridu jiġu kolturati matul il-perjodu ta’ espressjoni u pjastrati għall-għażla tal-mutanti (17).

Il-ħin tal-espressjoni fenotipika u l-kejl tal-frekwenza tal-mutanti

27.

Wara l-perjodu tat-trattament, iċ-ċelloli jiġu kkolturati biex tkun tista’ ssir l-espressjoni tal-fenotip tal-mutanti. Ġeneralment ikun biżżejjed minimu ta’ bejn sebgħa u disat ijiem biex tkun tista’ ssir espressjoni fenotipika kważi ottimali ta’ mutanti Hprt u xprt indotti ġodda (43) (44). Matul dan il-perjodu, iċ-ċelloli jiġu subkolturati regolarment biex jinżammu fi stat ta’ tkabbir esponenzjali. Wara l-espressjoni fenotipika, iċ-ċelloli jerġgħu jiġu pjastrati f’medium b’aġent selettiv (6-tiogwanina) u mingħajr għad-determinazzjoni tan-numru ta’ mutanti u tal-effiċjenza tal-klonazzjoni fil-mument tal-għażla, rispettivament. Dan il-pjastrament jista’ jitwettaq bl-użu ta’ platti għall-kolturi monosaffi jew ta’ mikropjastri għaċ-ċelloli f’sospensjoni. Għall-għażla tal-mutanti, iċ-ċelloli għandhom jiġu pjastrati f’densità tali li tiżgura rkupru ottimali tal-mutanti (jiġifieri tiġi evitata kooperazzjoni metabolika) (17). Il-pjastri jiġu inkubati għal tul xieraq ta’ żmien għat-tkabbir ottimali tal-kolonja (eż. 7-12-il jum) u jingħaddu l-kolonji. Il-frekwenza tal-mutanti tiġi kkalkolata fuq il-bażi tan-numru ta’ kolonji mutanti kkoreġut bl-effiċjenza tal-klonazzjoni fil-mument tal-għażla tal-mutanti (ara l-Appendiċi 2 għall-formuli).

Profiċjenza tal-laboratorju

28.

Biex tiġi stabbilita biżżejjed esperjenza bit-test qabel ma jintuża għall-ittestjar ta’ rutina, il-laboratorju għandu jkun għamel sensiela ta’ esperimenti b’sustanzi pożittivi ta’ riferiment li jaġixxu permezz ta’ mekkaniżmi differenti (tal-anqas waħda b’attivazzjoni metabolika u waħda mingħajr magħżula mis-sustanzi elenkati fit-Tabella 1) u diversi kontrolli negattivi (bl-użu ta’ diversi solventi/veikoli). Dawn ir-risponsi tal-kontroll pożittiv u negattiv għandhom ikunu konsistenti mad-dokumentazzjoni. Dan mhuwiex applikabbli għal laboratorji li jkollhom esperjenza, jiġifieri li jkollhom bażi ta’ data storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 30 sa 33.

29.

Għażla ta’ sustanzi tal-kontroll pożittiv (ara t-Tabella 1 fil-paragrafu 25) għandha tiġi investigata fin-nuqqas u fil-preżenza ta’ attivazzjoni metabolika, biex tintwera l-profiċjenza fl-iżvelar ta’ sustanzi kimiċi mutaġeniċi, biex tiġi ddeterminata l-effikaċja tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika u biex tintwera l-adegwatezza tal-kundizzjonijiet tat-tkabbir taċ-ċelloli matul it-trattament, l-espressjoni fenotipika u l-għażla tal-mutanti u tal-proċeduri tal-għoti ta’ punteġġ. Għandha tingħażel medda ta’ konċentrazzjonijiet tas-sustanzi magħżulin biex jingħataw żidiet riproduċibbli u marbutin mal-konċentrazzjoni li jispikkaw biex jintwerew is-sensittività u l-medda dinamika tas-sistema tat-test.

Data storika tal-kontroll

30.

Il-laboratorju għandu jistabbilixxi:

—	Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv,

—	Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv (mhux trattat, solvent).

31.

Meta għall-ewwel tinkiseb id-data għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi konkorrenti għandhom ikunu konsistenti mad-data tal-kontroll ippubblikata (22). Peress li tiżdied aktar data sperimentali mad-distribuzzjoni tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi konkorrenti għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta’ kontroll ta’ 95 % ta’ dik id-distribuzzjoni (17) (45) (46).

32.

Il-bażi ta’ data storika tal-kontrolli negattivi tal-laboratorju għall-ewwel għandha tinbena b’minimu ta’ 10 esperimenti iżda idealment tkun tikkonsisti f’tal-anqas 20 esperiment imwettqin f’kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta’ kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (47)), biex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-data tal-kontroll pożittiv u negattiv tagħhom, u biex juru li l-metodoloġija hi “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom (46). Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-data storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta’ data fid-data storika u l-kriterji ta’ aċċettabbiltà għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mid-dokumentazzjoni (45).

33.

Id-data ta’ kontroll negattiv għandha tikkonsisti fi frekwenzi mutanti minn kolturi individwali jew idealment irreplikati kif deskritt fil-paragrafu 23. Idealment, il-kontrolli negattivi konkorrenti għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta’ kontroll ta’ 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (17) (45) (46). Meta d-data tal-kontroll negattiv konkorrenti toħroġ mil-limitu ta’ kontroll ta’ 95 %, din tista’ titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll dment li din id-data ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara aktar ’il fuq) u jkun hemm evidenza ta’ ebda żball tekniku jew uman.

34.

Kwalunkwe tibdil fil-protokoll tal-esperimenti għandu jiġi kkunsidrat fid-dawl tal-konsistenza tiegħu mal-bażijiet ta’ data tal-kontroll storiċi eżistenti tal-laboratorju. Kwalunkwe inkonsistenza kbira għandha tirriżulta fl-istabbiliment ta’ bażi ta’ data storika ġdida tal-kontroll.

DATA U RAPPORTAR

Preżentazzjoni tar-riżultati

35.

Il-preżentazzjoni tar-riżultati għandha tinkludi d-data kollha meħtieġa biex tiġi kkalkolata ċ-ċitotossiċità (espressa bħala RS). Id-data, kemm għal kolturi ttrattati kif ukoll għal dawk tal-kontroll, għandha tinkludi n-numru ta’ ċelloli fi tmiem it-trattament, in-numru ta’ ċelloli pjastrati eżatt wara t-trattament, u l-għadd tal-kolonji (jew in-numru ta’ bwejriet mingħajr kolonji għall-metodu tal-mikropjastri). L-RS għal kull koltura għandha tkun espressa bħala perċentwal relattiv għall-kontroll tas-solvent konkorrenti (irreferi għall-Appendiċi 1 għad-definizzjonijiet).

36.

Il-preżentazzjoni tar-riżultati għandha tinkludi wkoll id-data kollha meħtieġa biex tiġi kkalkolata l-frekwenza mutanti. Id-data għall-kolturi ttrattati kif ukoll tal-kontroll għandha tinkludi: (1) in-numru ta’ ċelloli pjastrati b’aġent selettiv u mingħajr (fil-mument li fih iċ-ċelloli jiġu pjastrati għall-għażla tal-mutanti), u (2) in-numru ta’ kolonji magħduda (jew in-numru ta’ bwejriet mingħajr kolonji għall-metodu tal-mikropjastri) mill-pjastri b’aġent selettiv u mingħajr. Il-frekwenza mutanti tiġi kkalkolata fuq il-bażi tan-numru ta’ kolonji mutanti (fil-pjastri b’aġent selettiv) ikkoreġut bl-effiċjenza tal-klonazzjoni (mill-pjastri mingħajr aġent selettiv). Il-frekwenza mutanti għandha tiġi espressa bħala n-numru ta’ ċelloli mutanti għal kull miljun ċellola vijabbli (irreferi għall-Appendiċi 1 għad-definizzjonijiet).

37.

Għandha tiġi pprovduta data dwar il-koltura individwali. Barra minn hekk, id-data kollha għandha tinġabar taħt forma ta’ tabella.

Kriterji ta’ Aċċettabbiltà

38.

L-aċċettazzjoni ta’ test hi bbażata fuq il-kriterji li ġejjin:

—	Il-kontroll negattiv konkorrenti jitqies aċċettabbli għaż-żieda fil-bażi ta’ data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju kif deskritt fil-paragrafu 33.

—	Il-kontrolli negattivi konkorrenti (ara l-paragrafu 24) għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma’ dawk iġġenerati fil-bażi ta’ data storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv konkorrenti.

—	Ġew ittestjati żewġ kundizzjonijiet sperimentali (jiġifieri b’attivazzjoni metabolika u mingħajr) sakemm wieħed ma jirriżultax f’riżultati pożittivi (ara l-paragrafu 25).

—	Hemm numru adegwat ta’ ċelloli u konċentrazzjonijiet li huma analizzabbli (paragrafi 25, 26 u 19).

—	Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla konċentrazzjoni huma konsistenti ma’ dawk deskritti fil-paragrafi 20, 21 u 22.

Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati

39.

Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li tkun pożittiva biċ-ċar jekk, fi kwalunkwe waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali analizzati:

—	tal-anqas waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti,

—	iż-żieda hi relatata mal-konċentrazzjoni meta tiġi evalwata b’test xieraq tat-tendenzi,

—	kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa’ barra mid-distribuzzjoni tad-data storika tal-kontroll negattiv (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson; ara l-paragrafu 33).

Meta jiġu ssodisfati dawn il-kriterji kollha, is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata kapaċi tinduċi mutazzjonijiet ġenetiċi f’ċelloli kolturati tal-mammiferi f’din is-sistema tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-aktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mid-dokumentazzjoni (46) (48).

40.

Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali kollha eżaminati:

—	l-ebda waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test ma turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti,

—	ma hemm l-ebda żieda marbuta mal-konċentrazzjoni meta tiġi evalwata b’test xieraq tat-tendenzi,

—	ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-data storika tal-kontroll negattiv (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson; ara l-paragrafu 33).

Imbagħad, is-sustanza kimika tat-test tiġi kkunsidrata li mhijiex kapaċi tinduċi mutazzjonijiet ġentiċi f’ċelloli kolturati tal-mammiferi f’din is-sistema tat-test.

41.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta’ rispons posittiv jew negattiv ċar.

42.

F’każijiet li fihom ir-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar kif spjegat hawn fuq jew biex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta’ riżultat, id-data għandha tiġi evalwata b’ġudizzju espert u/jew b’investigazzjonijiet ulterjuri. It-twettiq ta’ speriment ripetut, possibilment bl-użu ta’ kundizzjonijiet sperimentali modifikati (eż. spazjar tal-konċentrazzjonijiet, kundizzjonijiet oħra tal-attivazzjoni metabolika [jiġifieri konċentrazzjoni S9 jew oriġini S9]) jista’ jkun siewi.

43.

F’każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta’ data jipprekludi milli tinħareġ konklużjoni ta’ riżultati pożittivi jew negattivi. Għaldaqstant, ir-rispons tas-sustanza kimika tat-test għandu jiġi konkluż bħala ekwivoku (interpretat bħala bl-istess probabbiltà li jkun pożittiv jew negattiv).

Rapport tat-test

44.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Is-sustanza kimika tat-test:

—	is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli;

—	l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;

—	is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;

—	il-kejl tal-pH, tal-ożmolalità u tal-preċipitat fil-medium tat-tkabbir li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.

Sustanza monokostitwenti:

—	id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;

—	l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.

Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:

—	ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.

Is-solvent:

—	ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent;

—	il-perċentwal ta’ solvent fil-medium tat-tkabbir finali.

Iċ-ċelloli:

Għal kolturi prinċipali tal-Laboratorju:

—	it-tip, is-sors tal-linji ta’ ċelloli;

—	in-numru ta’ passaġġi, jekk disponibbli, u l-istorja fil-laboratorju;

—	il-karatteristiċi tal-karjotip u/jew in-numru modali tal-kromożomi;

—	il-metodi għaż-żamma tal-kolturi taċ-ċelloli;

—	l-assenza tal-mikoplażma;

—	il-ħinijiet għall-irdoppjar taċ-ċelloli.

Il-kundizzjonijiet tat-test:

—	ir-raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u l-għadd ta’ kolturi inklużi, eż. data dwar iċ-ċitotossiċità u limitazzjonijiet tas-solubbiltà;

—	il-kompożizzjoni tal-media, il-konċentrazzjoni ta’ CO2, il-livell ta’ umdità;

—	il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test espressa bħala konċentrazzjoni finali fil-medium tat-tkabbir (eż. μg jew mg/ml jew mM tal-medium tat-tkabbir);

—	il-konċentrazzjoni (u/jew il-volum) ta’ solvent u s-sustanza kimika tat-test miżjuda fil-medium tat-tkabbir;

—	it-temperatura ta’ inkubazzjoni;

—	il-ħin ta’ inkubazzjoni;

—	id-durata tat-trattament;

—	id-densità taċ-ċellula waqt it-trattament;

—	it-tip u l-kompożizzjoni tas-sistema ta’ attivazzjoni metabolika (is-sors ta’ S9, il-metodu ta’ preparazzjoni tat-taħlita ta’ S9, il-konċentrazzjoni jew il-volum ta’ taħlita ta’ S9 u l-S9 fil-medium tat-tkabbir finali, il-kontrolli tal-kwalità tal-S9);

—	is-sustanzi tal-kontroll pożittiv u negattiv, il-konċentrazzjonijiet finali għal kull kundizzjoni tat-trattament;

—	it-tul tal-perjodu ta’ espressjoni (inkluż in-numru ta’ ċelluli miżrugħa, u skedi ta’ subkolturi u ta’ tagħlif, jekk ikun xieraq);

—	l-identità tal-aġent selettiv u l-konċentrazzjoni tiegħu;

—	il-kriterji għall-aċċettabbiltà tat-testijiet;

—	il-metodi użati biex jingħadd in-numru ta’ ċelloli vijabbli u mutanti;

—	il-metodi użati għall-kejl taċ-ċitotossiċità;

—	kwalunkwe informazzjoni supplimentari rilevanti għaċ-ċitotossiċità u l-metodu użat;

—	id-durata tal-ħinijiet ta’ inkubazzjoni wara l-pjastrament;

—	il-kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi;

—	il-metodi użati biex jiġu stabbiliti l-pH, l-ożmolalità u l-preċipitazzjoni.

Ir-riżultati:

—	in-numru ta’ ċelloli ttrattati u n-numru ta’ ċelloli subkolturati għal kull koltura;

—	il-kejlijiet taċ-ċitotossiċità u osservazzjonijiet oħra, jekk ikun hemm;

—	is-sinjali ta’ preċipitazzjoni u l-ħin tad-determinazzjoni;

—	in-numru ta’ ċelloli pjastrati f’medium selettiv u mhux selettiv;

—	in-numru ta’ kolonji f’medium mhux selettiv u n-numru ta’ kolonji reżistenti f’medium selettiv, u l-frekwenzi mutanti relatati;

—	ir-relazzjoni konċentrazzjoni rispons, fejn possibbli,

—	id-data tal-kontroll negattiv (solvent) u pożittiv (konċentrazzjonijiet u solventi) konkorrenti;

—	id-data storika tal-kontroll pożittiv u negattiv (solvent), bil-meded, bil-medji u bid-dejvazzjonijiet standard u bl-intervall ta’ kunfidenza (eż. 95 %) kif ukoll bin-numru tad-data;

—	analiżijiet statistiċi (għal kolturi individwali u għal repliki raggruppati jekk xieraq), u l-valuri p jekk ikun hemm.

Diskussjoni tar-riżultati.

Konklużjoni

DOKUMENTAZZJONI

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Pariġi.

(2)	Moore M.M., DeMarini D.M., DeSerres F.J. u Tindall, K.R. (Eds.) (1987). Banbury Report 28: Mammalian Cell Mutagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, New York.

(3)	Chu E.H.Y. u Malling H.V. (1968). Mammalian Cell Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci. Sci., L-Istati Uniti, 61, 1306-1312.

(4)	Moore M.M., Harrington-Brock K., Doerr C.L. u Dearfield K.L. (1989). Differential Mutant Quantitation at the Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagen. Res., 4, 394-403.

(5)	Aaron C.S. u Stankowski Jr. L.F. (1989). Comparison of the AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six Drug Candidates, Mutation Res. Mutation Res.,223, 121-128.

(6)	Aaron C.S., Bolcsfoldi G., Glatt H.R., Moore M., Nishi Y., Stankowski L., Theiss J. u Thompson E. (1994). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Report. Report of the International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res. Mutation Res.,312, 235-239.

(7)

Li A.P., Gupta R.S., Heflich R.H. u Wasson J. S. (1988). A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-tox Program.Mutation Res., 196, 17-36.

(8)	Scott D., Galloway S.M., Marshall R.R., Ishidate M., Brusick D., Ashby J. u Myhr B.C. (1991). Genotoxicity Under Extreme Culture Conditions. A Report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, 147-204.

(9)	Morita T., Nagaki T., Fukuda I. u Okumura K. (1992). Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells. Mutation Res., 268, 297-305.

(10)	Brusick D. (1986). Genotoxic Effects in Cultured Mammalian Cells Produced by Low pH Treatment Conditions and Increased Ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.

(11)	Nesslany F., Simar-Meintieres S., Watzinger M., Talahari I. u Marzin D. (2008). Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid. Environ. Mol. Mutation Res., 49, 439-452.

(12)	Long L.H., Kirkland D., Whitwell J. u Halliwell B. (2007). Different Cytotoxic and Clastogenic Effects of Epigallocatechin Gallate in Various Cell-Culture Media Due to Variable Rates of its Oxidation in the Culture Medium, Mutation Res., 634, 177-183.

(13)	Kirkland D., Aardema M., Henderson L., u Müller L. (2005). Evaluation of the Ability of a Battery of Three In Vitro Genotoxicity Tests to Discriminate Rodent Carcinogens and Non-Carcinogens. I: Sensitivity, Specificity and Relative Predictivity. Mutation Res., 5841-256.

(14)	Li A.P., Carver J.H., Choy W.N., Hsie A.W., Gupta R.S., Loveday K.S., O’Neill J.P., Riddle J.C., Stankowski L.F. Jr. u Yang L.L. (1987). A Guide for the Performance of the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, 135-141.

(15)	Liber H.L., Yandell D.W. u Little J.B. (1989). A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in Human Lymphoblastoid Cells; Quantitative Differences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, 9-17.

(16)	Stankowski L.F. Jr., Tindall K.R. u Hsie A.W. (1986). Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanesulfonate- and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, 133-147.

(17)	Arlett C.F., Smith D.M., Clarke G.M., Green M.H.L., Cole J., McGregor D.B. u Asquith J.C. (1989). Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. Fi: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (Eds.), CambridgeUniversity Press, pp. 66-101.

(18)	Hsie A.W., Casciano D.A., Couch D.B., Krahn D.F., O’Neill J.P., u Whitfield B.L. (1981). The Use of Chinese Hamster Ovary Cells to Quantify Specific Locus Mutation and to Determine Mutagenicity of Chemicals; a Report of the Gene-Tox Program, Mutation Res., 86, 193-214.

(19)	Li A.P. (1981). Simplification of the CHO/HGPRT Mutation Assay Through the Growth of Chinese Hamster Ovary Cells as Unattached Cultures, Mutation Res., 85, 165-175.

(20)	Tindall K.R., Stankowski Jr., L.F., Machanoff R., u Hsie A.W. (1984). Detection of Deletion Mutations in pSV2gpt-Transformed Cells, Mol. Cell. Biol., 4, 1411-1415.

(21)	Hsie A. W., Recio L., Katz D. S., Lee C. Q., Wagner M., u Schenley R. L. (1986). Evidence for Reactive Oxygen Species Inducing Mutations in Mammalian Cells. Proc Natl Acad Sci., 83(24): 9616–9620.

(22)

Lorge E., Moore M., Clements J., Donovan M. O., Honma M., Kohara A., Van Benthem J., Galloway S., Armstrong M.J., Thybaud V., Gollapudi B., Aardema M., Kim J., Sutter A., Kirkland D.J. (2015). Standardized Cell Sources and Recommendations for Good Cell Culture Practices in Genotoxicity Testing. (Il-manuskritt għadu qed jitħejja).

(23)	Coecke S., Balls M., Bowe G., Davis J., Gstraunthaler G., Hartung T., Hay R., Merten O.W., Price A., Schechtman L., Stacey G. u Stokes W. (2005). Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, 33, 261-287.

(24)	Rosen M.P., San R.H.C. u Stich H.F. (1980). Mutagenic Activity of Ascorbate in Mammalian Cell Cultures, Can. Lett. 8, 299-305.

(25)

Natarajan A.T., Tates A.D, Van Buul P.P.W., Meijers M. u de Vogel N. (1976). Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes. Mutation Res., 37, 83-90.

(26)	Abbondandolo A., Bonatti S., Corti G., Fiorio R., Loprieno N. u Mazzaccaro A. (1977). Induction of 6-Thioguanine-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, 365-373.

(27)	Ames B.N., McCann J. u Yamasaki E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.

(28)	Maron D.M. u Ames B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, 173, 215.

(29)	Elliott B.M., Combes R.D., Elcombe C.R., Gatehouse D.G., Gibson G.G., Mackay J.M. u Wolf R.C. (1992) Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in In Vitro Genotoxicity Assays. Mutagen. 7, 175-177.

(30)

Matsushima T., Sawamura M., Hara K. u Sugimura T. (1976). A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. Fi: In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres F.J., Fouts J.R., Bend J.R. u Philpot R.M. (Eds), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(31)	Ong T.-m., Mukhtar M., Wolf C.R. u Zeiger E. (1980). Differential Effects of Cytochrome P450-Inducers on Promutagen Activation Capabilities and Enzymatic Activities of S-9 from Rat Liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.

(32)	Johnson T.E., Umbenhauer D.R. u Galloway S.M. (1996). Human Liver S-9 Metabolic Activation: Proficiency in Cytogenetic Assays and Comparison with Phenobarbital/beta-Naphthoflavone or Aroclor 1254 Induced Rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.

(33)	UNEP. (2001). Il-Konvenzjoni ta’ Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes, Programm tan-Nazzjonijiet Uniti għall-Ambjent (UNEP). Disponibbli fuq: [http://www.pops.int.html].

(34)	Tan E.-L. u Hsie A.W. (1981). Effect of Calcium Phosphate and Alumina Cγ Gels on the Mutagenicity and Cytotoxicity of Dimethylnitrosamine as Studied in the CHO/HGPRT System. Mutation Res., 84, 147-156.

(35)	O’Neill J.P., Machanoff R., San Sebastian J.R., Hsie A.W. (1982). Cytotoxicity and Mutagenicity of Dimethylnitrosamine in Cammalian Cells (CHO/HGPRT system): Enhancement by Calcium Phosphate. Environ. Mol. Mutation., 4, 7-18.

(36)	Li, A.P. (1984). Use of Aroclor 1254-Induced Rat Liver Homogenate in the Assaying of Promutagens in Chinese Hamster Ovary Cells. Environ. Mol. Mutation, 4, 7-18.

(37)	Krahn D.F., Barsky F.C. u McCooey K.T. (1982). CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. Fi: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds.) Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91–103.

(38)	Zamora P.O., Benson J.M., Li A.P. u Brooks A.L. (1983). Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environ. Mutagen.,5, 795-801.

(39)

OECD (2014). Document Supporting the WNT Decision to Implement Revised Criteria for the Selection of the Top Concentration in the In Vitro Mammalian Cell Assays on Genotoxicity (Linji Gwida tat-Test 473, 476 u 487). Disponibbli fuq talba mingħand l-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi.

(40)	Brookmire L., Chen J.J. u Levy D.D. (2013). Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environ. Mol. Mutation, 54, 36-43.

(41)	EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention. (2011). Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances,

(42)	USFDA (2012). International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use. Disponibbli fuq: [https://federalregister.gov/a/2012-13774].

(43)	O’Neill J.P. u Hsie A.W. (1979). Phenotypic Expression Time of Mutagen-Induced 6-thioguranine resistance in Chinese hamster ovary cells (CHO/HGPRT system), Mutation, Res., 59, 109-118.

(44)	Chiewchanwit T., Ma H., El Zein R., Hallberg L., u Au W.W. (1995). Induction of Deletion Mutations by Methoxyacetaldehyde in Chinese Hamster Ovary (CHO)-AS52 cells. Mutation, Res., 1335(2):121-8.

(45)	Hayashi M., Dearfield K., Kasper P., Lovell D., Martus H.J., u Thybaud V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data, Mutation,Res., 723, 87-90.

(46)	OECD (2014). Statistical Analysis Supporting the Revision of the Genotoxicity Test Guidelines. Environmental, Health and Safety, Series on testing and assessment (No 199), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.

(47)	Richardson C., Williams D.A., Allen J.A., Amphlett G., Chanter D.O., u Phillips B. (1989). Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. Fi: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (Ed) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(48)	Fleiss J. L., Levin B., u Paik M. C. (2003). Statistical Methods for Rates and Proportions, Third Edition, New York: John Wiley & Sons.

Appendiċi 1

DEFINIZZJONIJIET

Mutaġeni li jissostitwixxu l-koppji tal-bażijiet: sustanzi kimiċi li jikkawżaw sostituzzjoni tal-koppji tal-bażijiet fid-DNA.

Sustanza kimika: Sustanza jew taħlita.

Effiċjenza tal-klonazzjoni: Il-perċentwal ta’ ċelloli pjastrati f’densità baxxa li kapaċi jikbru f’kolonja li tista’ tingħadd.

Konċentrazzjonijiet: irreferi għall-konċentrazzjonijiet finali tas-sustanza kimika tat-test fil-medium tat-tkabbir

Ċitotossiċità: Għall-assaġġi koperti f’dan il-metodu ta’ ttestjar, iċ-ċitotossiċità hi identifikata bħala tnaqqis fis-sopravivenza relattiva taċ-ċelloli ttrattati meta mqabbla mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu speċifiku).

Mutazzjoni ’l quddiem: mutazzjoni ta’ ġene mit-tip parentali għall-forma mutanti li tkun toħloq alterazzjoni jew telf tal-attività enzimatika jew tal-funzjoni tal-proteina kodifikata.

Mutaġeni li jibdlu l-qari tal-kodiċi ġenetiku: sustanzi kimiċi li jikkawżaw iż-żieda jew it-tħassir ta’ koppji tal-bażijiet individwali jew multipli fil-molekula tad-DNA.

Ġenotossiċi: terminu ġenerali li jinkludi kull tip ta’ ħsara fid-DNA jew kromożomika, inkluż ksur tad-DNA, addotti, riarranġamenti, mutazzjonijiet, aberrazzjonijiet kromożomiċi, u anewplojdija. Mhux it-tipi kollha ta’ effetti ġenotossiċi jirriżultaw f’mutazzjonijiet jew fi ħsara kromożomika stabbli.

Medium tal-HAT: medium li fih l-Ipoksantina, l-Aminopterina u t-Timidina, użat għat-tindif tal-mutanti Hprt.

Rikombinament mitotiku: matul il-mitożi, ir-rikombinament bejn kromatidi omologi li possibilment jirriżulta fl-induzzjoni ta’ ksur tal-ħajta doppja tad-DNA jew f’telf ta’ eterożigożità.

Medium tal-MPA:: medium li fih il-Ksantina, l-Adenina, it-Timidina, l-Aminopterina u l-aċidu Mikofenoliku, użat għat-tindif tal-mutanti Xprt.

Mutaġeniċi: jipproduċu tibdil ereditarju ta’ sekwenza/i tal-koppja ta’ bażijiet tad-DNA fil-ġeni jew tal-istruttura tal-kromożomi (aberrazzjonijiet kromożomiċi).

Frekwenza mutanti (MF): in-numru ta’ kolonji mutanti osservati diviż bin-numru ta’ ċelloli pjastrati f’medium selettiv, ikkoreġut għall-effiċjenza tal-klonazzjoni (jew il-vijabbiltà) fil-mument tal-għażla.

Ħin tal-espressjoni fenotipika: Il-ħin wara t-trattament li matulu l-alterazzjoni ġenetika tkun fissa fi ħdan il-ġenom u kwalunkwe prodott tal-ġeni preeżistenti jitbattal sal-punt li l-karatteristika fenotipika tinbidel.

Sopravivenza relattiva (RS): RS tintuża bħala l-kejl taċ-ċitotossiċità relatata mat-trattament. RS hi l-effiċjenza tal-klonazzjoni (CE) taċ-ċelloli pjastrati eżatt wara t-trattament aġġustata skont kwalunkwe telf ta’ ċelloli matul it-trattament meta mqabbla mal-effiċjenza tal-klonazzjoni f’kontrolli negattivi (assenjati sopravivenza ta’ 100 %).

Frazzjoni tal-fwied S9: supernatant ta’ omoġenat tal-fwied wara ċentrifugazzjoni ta’ 9 000g, jiġifieri estratt minn fwied mhux proċessat

Taħlita ta’ S9: taħlita tal-frazzjoni tal-fwied S9 u tal-kofatturi neċessarji għall-attività tal-enzimi metaboliċi.

Kontrolli tas-solvent: Terminu ġenerali li jiddefinixxi l-kolturi tal-kontroll li jirċievu s-solvent waħdu użat biex jiddisolvi s-sustanza kimika tat-test.

Sustanza kimika tat-test: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.

Kontroll mhux trattat: kolturi li ma jirċievu ebda trattament (jiġifieri la sustanza kimika tat-test u lanqas solvent) iżda jiġu pproċessati fl-istess ħin u bl-istess mod bħall-kolturi li jirċievu s-sustanza kimika tat-test.

UVCB: Sustanzi Kimiċi b’Kompożizzjoni Mhux Magħrufa jew Varjabbli, Prodotti jew Materjali Bijoloġiċi b’Reazzjoni Kumplessa

Appendiċi 2

FORMULI GĦALL-VALUTAZZJONI TAĊ-ĊITOTOSSIĊITÀ U TAL-FREKWENZA MUTANTI

Iċ-ċitotossiċità tiġi evalwata bis-sopravivenza relattiva, jiġifieri l-effiċjenza tal-klonazzjoni (CE) taċ-ċelloli pjastrati eżatt wara t-trattament aġġustata skont kwalunkwe telf ta’ ċelloli matul it-trattament meta mqabbla mal-effiċjenza tal-klonazzjoni aġġustata f’kontrolli negattivi (assenjati sopravivenza ta’ 100 %) (ara l-formula tal-RS aktar ’il quddiem).

Is-CE aġġustata għal koltura ttrattata b’sustanza kimika tat-test tiġi kkalkolata bħala:

Formula

RS aġġustata għal koltura ttrattata b’sustanza kimika tat-test tiġi kkalkolata bħala:

Formula

Il-frekwenza mutanti hi l-effiċjenza tal-klonazzjoni tal-kolonji mutanti f’medium selettiv diviża bl-effiċjenza tal-klonazzjoni f’medium mhux selettiv imkejla għall-istess koltura fil-ħin tal-għażla.

Formula

Meta l-pjastri jintużaw għall-effiċjenza tal-klonazzjoni:

CE = Numru ta’ kolonji / Numbru ta’ ċelloli pjastrati.

Meta l-mikropjastri jintużaw għall-effiċjenza tal-klonazzjoni:

In-numru ta’ kolonji għal kull bwejra fil-mikropjastri jsegwi distribuzzjoni ta’ Poisson.

Effiċjenza tal-Klonazzjoni = -LnP(0) / Numru ta’ ċelloli pjastrati għal kull bwejra

Fejn -LnP(0) hu n-numru probabbli ta’ bwejriet vojta mill-bwejriet miżrugħa u hu deskritt bil-formula li ġejja

LnP(0)= -Ln (numru ta’ bwejriet vojta / numru ta’ bwejriet pjastrati)

”

(3)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.22 hu ssostitwit b’dan li ġej:

“B.22 TEST LETALI DOMINANTI TAR-RODITURI

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linji gwida tat-test 478 tal-OECD (2016). Il-metodi ta’ ttestjar jiġu rieżaminati kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku, tal-ħtiġijiet regolatorji li jinbidlu u tal-kunsiderazzjonijiet relatati mat-trattament xieraq tal-annimali. Din il-verżjoni modifikata tal-metodu ta’ ttestjar tirrifletti aktar minn tletin sena esperjenza b’dan it-test u l-potenzjal għall-integrazzjoni jew għall-kombinament ta’ dan it-test ma’ testijiet oħra tat-tossiċità bħal studji dwar it-tossiċità fl-iżvilupp jew riproduttiva, jew dwar il-ġenotossiċità; madankollu, minħabba l-limitazzjonijiet tiegħu u l-użu ta’ numru kbir ta’ annimali, dan l-assaġġ mhuwiex maħsub biex jintuża bħala metodu primarju, iżda aktar bħala metodu ta’ ttestjar supplimentari li jista’ jintuża biss meta ma jkun hemm ebda alternattiva għar-rekwiżiti regolatorji. Il-kombinament tal-ittestjar tat-tossiċità għandu l-potenzjal li jiffranka numri kbar ta’ annimali mill-użu fit-testijiet tat-tossiċità. L-OECD żviluppa dokument li jipprovdi informazzjoni sintetika fuq l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali lejn it-tibdiliet riċenti li seħħew fil-linji gwida tat-test tal-OECD dwar it-tossiċità ġenetika (1).

L-iskop tat-test Letali Dominanti (DL) hu li jinvestiga jekk is-sustanzi kimiċi jipproduċux mutazzjonijiet li jirriżultaw minn aberrazzjonijiet kromożomiċi f’ċelloli ġerminali. Barra minn hekk, it-test letali dominanti hu rilevanti għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għalkemm jistgu jvarjaw bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetika u l-proċessi ta’ tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-rispons. L-induzzjoni ta’ mutazzjoni DL wara l-esponiment għal sustanza kimika tat-test tindika li s-sustanza kimika affettwat it-tessut ġerminali tal-annimal tat-test.

Il-mutazzjonijiet tad-DL jikkawżaw mewt embrijoniku jew tal-fetu. L-induzzjoni ta’ mutazzjoni DL wara l-esponiment għal sustanza kimika tat-test tindika li s-sustanza kimika affettwat iċ-ċelloli ġerminali tal-annimal tat-test.

Assaġġ tad-DL hu siewi għall-konferma ta’ riżultati pożittivi ta’ testijiet bl-użu ta’ punti ta’ tmiem somatiċi in vivo, u hu punt ta’ tmiem rilevanti għat-tbassir tal-periklu għall-bniedem u tar-riskju ta’ mardiet ġenetiċi trażmessi permezz tal-linja ġerminali. Madankollu, dan l-assaġġ jeħtieġ numru kbir ta’ annimali u jinvolvi xogħol intensiv; għaldaqstant, hu għali ħafna u jieħu ż-żmien biex isir. Minħabba li l-frekwenza spontanja tal-mutazzjonijiet letali dominanti hi kemxejn għolja, is-sensittività tal-assaġġ għad-detezzjoni ta’ żidiet żgħar fil-frekwenza tal-mutazzjonijiet ġeneralment tkun limitata.

Id-definizzjonijiet tat-termini ewlenin huma stabbiliti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

It-test isir l-aktar bil-ġrieden (2) (3) (4) iżda f’ċerti każijiet jistgħu jkunu xierqa speċijiet oħra, bħall-firien (5) (6) (7) (8), jekk ikunu xjentifikament ġustifikati. Id-DLs ġeneralment ikunu r-riżultat ta’ aberrazzjonijiet kromożomiċi kbar (anormalitajiet strutturali u numeriċi) (9) (10) (11), iżda mutazzjonijiet tal-ġeni ma jistgħux ikunu esklużi. Mutazzjoni tad-DL hi mutazzjoni li sseħħ f’ċellola ġerminali minnha nfisha, jew tiġi ffissata wara l-fertilizzazzjoni fl-embrijun bikri, li ma tikkawżax disfunzjoni tal-gamet, iżda hi letali għall-bajda fertilizzata jew għall-embrijun li jkun qed jiżviluppa.

L-irġiel individwali jitgħammru b’mod sekwenzjali ma’ nisa verġni f’intervalli xierqa. In-numru ta’ drabi li jitgħammru wara t-trattament jiddependi mill-iskop finali tal-istudju tad-DL (Paragrafu 23) u għandu jiżgura li l-fażijiet kollha tal-maturazzjoni taċ-ċelloli ġerminali tal-irġiel jiġu evalwati għad-DLs (12).

Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, ma jkunux se jilħqu t-testikoli, ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.

PRINĊIPJU TAT-TEST

Ġeneralment, l-annimali rġiel jiġu esposti għal sustanza kimika tat-test b’rotta ta’ esponiment xierqa u jitgħammru ma’ nisa verġni mhux trattati. Tipi differenti ta’ ċelloli ġerminali jistgħu jiġu ttestjati bl-użu ta’ intervalli ta’ tgħammir sekwenzjali. Wara t-tgħammir, in-nisa jiġu ewtanizzati wara perjodu ta’ żmien xieraq, u l-utri tagħhom jiġu eżaminati biex jiġu determinati n-numri ta’ impjanti u ta’ embrijuni ħajjin u mejtin. Il-letalità dominanti ta’ sustanza kimika tat-test hi determinata bit-tqabbil tal-impjanti ħajjin għal kull mara fil-grupp trattat mal-impjanti ħajjin għal kull mara fil-grupp tal-kontroll bil-veikolu/bis-solvent. Iż-żieda fl-impjanti mejtin f’kull waħda tas-sess femminil fil-grupp trattat diviż bin-numru ta’ impjanti mejtin f’kull waħda tas-sess femminil fil-grupp tal-kontroll turi t-telf ta’ wara l-impjantazzjoni indott mis-sustanza kimika tat-test. It-telf ta’ wara l-impjantazzjoni jiġi kkalkolat bid-determinazzjoni tal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjanti totali fil-grupp trattat meta mqabbel mal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjanti totali fil-grupp tal-kontroll. It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni tista’ tkun stimata billi jitqabbel l-għadd ta’ corpora lutea nieqes l-impjanti totali jew l-impjanti totali għal kull mara fil-gruppi trattati u tal-kontroll.

VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU

10.

Il-kompetenza f’dan l-assaġġ għandha tiġi stabbilita billi tintwera l-ħila li jiġu rirpodotti frekwenzi letali dominanti minn data ppubblikata (eż. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) b’sustanzi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfa) bħal dawk elenkati fit-Tabella 1, u b’kontrolli bil-veikoli u billi jinkisbu frekwenzi tal-kontroll negattiv li jkunu medda aċċettabbli konssitenti ta’ data (ara r-referenzi aktar ’il fuq) jew bid-distribuzzjoni storika tal-kontroll tal-laboratorju, jekk disponibbli.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Għażla tal-ispeċi tal-annimali

11.

Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta’ annimali sesswalment maturi f’saħħithom. Il-ġrieden jintużaw spiss iżda l-firien jistgħu jkunu adattati wkoll. Tista’ tintuża kwalunkwe speċi ta’ mammiferi xierqa oħra, jekk tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika fir-rapport.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali

12.

Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta’ 22 °C (±3 °C). Għalkemm idealment l-umdità relattiva għandha tkun ta’ 50-60 %, għandha tkun ta’ tal-anqas 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b’sekwenza ta’ 12-il siegħa dawl, segwita minn 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta’ sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Qabel it-trattament jew it-tgħammir, ir-rodituri għandhom jinżammu fi gruppi żgħar (mhux aktar minn ħamsa) tal-istess sess jekk ma tkun mistennija jew osservata ebda mġiba aggressiva, idealment f’gaġeġ solidi b’arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat.

Preparazzjoni tal-annimali

13.

L-annimali adulti rġiel u nisa f’saħħithom u sesswalment maturi jkunu assenjati b’mod każwali lill-gruppi ta’ kontroll u trattament. L-annimali individwali jiġu identifikati b’mod uniku bl-użu ta’ metodu uman u l-inqas invasiv possibbli (eż. b’ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b’titqib fis-swaba’ u fil-widnejn) u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-anqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u mis-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± l-20 % tal-piż medju ta’ kull sess.

Preparazzjoni tad-dożi

14.

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f’solventi jew f’veikoli xierqa jew jitħalltu f’dieta jew f’ilma tax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għall-esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-data dwar l-istabbiltà ma turix l-aċċettabbiltà tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.

Kundizzjonijiet tat-test

Solvent/veikolu

15.

Is-solvent/il-veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-volumi tad-doża użati, u ma għandux ikun suspettat li joħloq reazzjoni kimika mas-sustanza kimika tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħra li ma jkunux magħrufa sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta’ data ta’ riferiment li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Hu rakkomandat li, fejn jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta’ solvent/veikolu milwiem. Eżempji ta’ solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu l-ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetil, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum.

Kontrolli pożittivi

16.

Dejjem għandhom jintużaw annimali tal-kontroll pożittiv konkorrenti sakemm il-laboratorju ma jkunx wera profiċjenza fit-twettiq tat-test u jkun uża t-test bħala rutina fl-imgħoddi riċenti (eż. matul l-aħħar ħames snin). Madankollu, ma hemmx bżonn li l-annimali tal-kontroll pożittiv jiġu ttrattati bl-istess rotta bħall-annimali li jirċievu s-sustanza kimika tat-test, jew li jiġu kampjunati l-intervalli tat-tgħammir kollha. Is-sustanzi tal-kontroll pożittiv għandhom ikunu magħrufa li jipproduċu DLs bil-kundizzjonijiet użati għat-test. Ħlief għat-trattament, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom ikunu maniġġati b’mod identiku bħall-annimali fil-gruppi trattati.

17.

Id-dożi tas-sustanzi tal-kontroll pożittiv għandhom jintgħażlu biex jipproduċu effetti dgħajfa jew moderati li jivvalutaw b’mod kritiku l-prestazzjoni u s-sensittività tal-assaġġ, iżda li konsistentement jipproduċu effetti letali dominanti pożittivi. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta’ sustanzi tal-kontroll pożittiv u tad-dożi xierqa.

Tabella 1

Eżempji ta’ Sustanzi tal-Kontroll Pożittiv

Sustanza [Nru CAS] (nru ta’ riferiment)	Medda tad-Doża Effettiva (mg/kg) (speċi tar-rodituri)	Żmien tal-Amministrazzjoni (jiem)
Trietilenmelamina [51-18-3] (15)	0,25 (ġrieden)	1
Ċiklofosfammid [50-18-0] (19)	50-150 (ġrieden)	5
Ċiklofosfammid [50-18-0] (5)	25-100 (firien)	1
Metansulfonat tal-etil [62-50-0] (13)	100-300 (ġrieden)	5
Akrilammid Monomeriku [79-06-1] (17)	50 (ġrieden)	5
Klorambusil [305-03-3] (14)	25 (ġrieden)	1

Kontrolli negattivi

18.

L-annimali tal-kontrolli negattivi, trattati b’solvent jew b’veikolu waħdu, u mill-bqija trattati bl-istess mod bħall-gruppi tal-kura, għandhom ikunu inklużi għal kull ħin tal-kampjunar (20). Fin-nuqqas ta’ data tal-kontroll storika jew ippubblikata li turi li ma kien indott ebda DL jew effett ta’ tħassir ieħor mis-solvent/mill-veikolu magħżul, l-annimali tal-kontroll mhux trattati għandhom ikunu inklużi wkoll għal kull ħin tal-kampjunar biex tiġi stabbilita aċċettabbiltà tal-kontroll tal-veikolu.

PROĊEDURA

Għadd ta’ Annimali

19.

L-irġiel individwali jitgħammru b’mod sekwenzjali f’intervalli predeterminati xierqa (eż. intervalli ta’ kull ġimgħa, Paragrafi 21 u 23), idealment ma’ mara verġni waħda. L-għadd ta’ rġiel għal kull grupp għandu jkun predeterminat biex ikun biżżejjed (flimkien man-numru ta’ nisa mgħammra f’kull intervall ta’ tgħammir) biex tiġi pprovduta s-saħħa statistika neċessarja biex tal-anqas jiġi individwat irdoppjar tal-frekwenza tad-DL (Paragrafu 44).

20.

L-għadd ta’ nisa għal kull intervall ta’ tgħammir ukoll għandu jkun predeterminat mill-kalkoli tas-saħħa statistika biex tal-anqas ikun jista’ jiġi individwat irdoppjar fil-frekwenza tad-DL (jiġifieri biżżejjed nisa tqal biex jipprovdu tal-anqas 400 impjant totali) (20) (21) (22) (23) u li tal-anqas ikun mistenni impjant mejjet wieħed għal kull unità ta’ analiżi (jiġifieri grupp ta’ tgħammir għal kull doża) (24).

Perjodu ta’ Amministrazzjoni u l-Intervalli ta’ Tgħammir

21.

L-għadd ta’ intervalli ta’ tgħammir wara t-trattament hu regolat bl-iskeda tat-trattament u għandu jiżgura li l-fażijiet kollha ta’ maturazzjoni taċ-ċelloli ġerminali tal-irġiel jiġu evalwati għall-induzzjoni tad-DL (12) (25). Għal trattament wieħed sa ħames amministrazzjonijiet tad-dożi kuljum, għandu jkun hemm tmien istanzi ta’ tgħammir (ġrieden) jew 10 (firien) imwettqa f’intervalli ta’ kull ġimgħa wara l-aħħar trattament. Għal amministrazzjoni b’doża multipla, l-għadd ta’ intervalli ta’ tgħammir jista’ jitnaqqas b’mod proporzjonat għaż-żmien miżjud tal-perjodu ta’ amministrazzjoni, iżda jinżamm l-għan ta’ evalwazzjoni tal-fażijiet kollha ta’ spermatoġenesi (eż. wara esponiment għal 28 jum, erba’ istanzi ta’ tgħammir fil-ġimgħa biss ikunu biżżejjed biex jiġu evalwati l-fażijiet kollha tal-ispermatoġenesi fil-ġurdien). L-iskedi kollha ta’ trattament u ta’ tgħammir għandhom ikunu xjentifikament ġustifikati.

22.

In-nisa għandhom jibqgħu mal-irġiel tal-anqas għad-durata ta’ ċiklu estruż wieħed (eż. ġimgħa tkopri ċiklu estruż wieħed fil-ġrieden kif ukoll fil-firien). In-nisa li ma jitgħammrux matul intervall ta’ ġimgħa jistgħu jintużaw għal intervall sussegwenti ta’ tgħammir. Inkella, sakemm iseħħ it-tgħammir, kif determinat mill-preżenza ta’ sperma fil-vaġina jew mill-preżenza ta’ tapp vaġinali.

23.

Ir-reġimen ta’ esponiment u ta’ tgħammir użat jiddependi mill-iskop finali tal-istudju tad-DL. Jekk l-għan hu li jiġi determinat jekk sustanza kimika partikolari tinduċix mutazzjonijiet tad-DL per se, il-metodu aċċettat ikun li tiġi esposta serje sħiħa ta’ spermatoġenesi (eż. seba’ ġimgħat fil-ġurdien, minn ħamsa sa sebgħa trattamenti fil-ġimgħa) u tgħammir ta’ darba fl-aħħar. Madankollu, jekk l-għan hu li jiġi identifikat it-tip ta’ ċellola ġerminali sensittiva għall-induzzjoni tad-DL, ikun preferut esponiment ta’ darba jew fuq ħames jiem segwit minn tgħammir darba fil-ġimgħa.

Livelli tad-doża

24.

Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda data xierqa diġà disponibbli biex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jridu jintużaw fl-istudju ewlieni (26). L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala l-ogħla doża li tiġi tollerata mingħajr evidenza ta’ tossiċità li tillimita l-istudju, b’rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, imġiba jew reazzjonijiet anormali, dipressjoni minuri tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika), iżda mhux mewt jew evidenza ta’ uġigħ, ta’ tbatija jew ta’ diffikultà li jeħtieġu ewtanażja umanitarja (27).

25.

L-MTD lanqas ma tista’ taffettwa b’mod avvers is-suċċess tat-tgħammir (21).

26.

Is-sustanzi kimiċi tat-test b’attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f’dożi mhux tossiċi baxxi (bħal ormoni u mitoġeni), u sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni ta’ proprjetajiet tossikokinetiċi jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta’ tfassil tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta’ każ b’każ.

27.

Biex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv u tal-anqas tliet livelli ta’ dożi ġeneralment separati b’fattur ta’ 2, iżda mhux akbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-data eżistenti, l-ogħla doża għal amministrazzjoni waħda għandha tkun ta’ 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom idealment ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Għal sustanzi kimiċi mhux tossiċi, id-doża limitu għal perjodu ta’ amministrazzjoni ta’ 14-il jum jew aktar hi ta’ 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum, u għal perjodi ta’ amministrazzjoni ta’ anqas minn 14-il jum id-doża limitu hi ta’ 2 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum.

Amministrazzjoni tad-Dożi

28.

Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja, fil-vini, bit-teħid man-nifs, orali (b’gavage), jew b’impjantazzjoni, kif ġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel biex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Normalment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li ma tkunx rotta intiża ta’ esponiment tal-bniedem, u għandha tintuża biss b’ġustifikazzjoni xjentifika speċifika. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew l-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta’ dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u t-tgħammir ikun biżżejjed biex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (paragrafu 31). Il-volum massimu ta’ likwidu li jista’ jingħata b’gavage jew b’injezzjoni f’darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun ta’ aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet milwiema fejn jista’ jintuża massimu ta’ 2 ml/100 g. L-użu ta’ volumi akbar minn dan (jekk ikunu permessi mil-leġiżlazzjoni dwar it-trattament xieraq tal-annimali) għandu jkun iġġustifikat. Il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tiġi minimizzata billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti b’rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.

Osservazzjonijiet

29.

Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-anqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta’ wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-aktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum matul il-perjodu ta’ dożaġġ, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għall-morbidità u għall-mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju u tal-anqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b’doża ripetuta, u fil-ħin tal-ewtanażja. Il-kejlijiet tal-konsum tal-ikel għandu jsir tal-anqas darba kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f’kull bidla tal-ilma u tal-anqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta’ tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanizzati qabel jintemm il-perjodu ta’ ttestjar (27).

Ġbir u Proċessar tat-Tessuti

30.

In-nisa jiġu ewtanizzati fit-tieni nofs tat-tqala fil-jum tal-ġestazzjoni (GD), 13 għall-ġrieden u GD 14-15 għall-firien. L-utri jiġu eżaminati għal effetti letali dominanti biex jiġi determinat in-numru ta’ impjanti, ta’ embrijuni ħajjin u mejtin, u ta’ corpora lutea.

31.

Il-qrejjen tal-utru u l-ovarji jiġu esposti għall-għadd tal-corpora lutea, u l-feti jitneħħew, jingħaddu u jintiżnu. Għandha tingħata attenzjoni biex l-utri jiġu eżaminati għal riassorbimenti oskurati minn feti ħajjin u biex jiġi żgurat li r-riassorbimenti kollha jiġu enumerati. Tiġi reġistrata l-mortalità tal-feti. In-numru ta’ nisa mtaqqla b’suċċess u n-numru ta’ impjantazzjonijiet totali, it-telf qabel l-impjantazzjoni, u l-mortalità ta’ wara l-impjantazzjoni (inklużi r-riassorbimenti bikrin u tardivi) jiġu reġistrati wkoll. Barra minn hekk, il-feti viżibbli jistgħu jiġu preservati fil-fissattiv ta’ Bouin għal tal-anqas ġimagħtejn (2) u mbagħad jiġu eżaminati għal malformazzjonijiet esterni maġġuri (28) biex tiġi pprovduta informazzjoni addizzjonali dwar l-effetti riproduttivi u fuq l-iżvilupp tal-aġent tat-test.

DATA U RAPPORTAR

Trattament tar-riżultati

32.

Id-data għandha tkun fil-forma ta’ tabelli biex turi n-numru ta’ annimali rġiel mgħammra, in-numru ta’ nisa tqal, u n-numru ta’ nisa li mhumiex tqal. Ir-riżultati ta’ kull tgħammir, inkluża l-identità ta’ kull raġel u mara għandhom ikunu rrapportati b’mod individwali. L-intervall tat-tgħammir, il-livell tad-doża għall-irġiel ittrattati, u n-numri ta’ impjanti ħajjin u ta’ impjanti mejtin għandhom jiġu enumerati għal kull mara.

33.

It-telf ta’ wara l-impjantazzjoni jiġi kkalkolat bid-determinazzjoni tal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjanti totali mill-grupp trattat meta mqabbel mal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjantazzjonijiet totali mill-grupp tal-kontroll bil-veikolu/bis-solvent.

34.

It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni hu kkalkolat bħala d-differenza bejn in-numru ta’ corpora lutea u n-numru ta’ impjanti jew bħala tnaqqis fin-numru medju ta’ impjanti għal kull mara meta mqabbel mat-tgħammir tal-kontroll. Meta jkun stimat it-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni, għandu jkun irrapportat.

35.

Il-fattur Letali Dominanti jiġi stmat bħala: (l-imwiet ta’ wara l-impjantazzjoni/l-impjantazzjonijiet totali għal kull mara) × 100.

36.

Għandha tiġi rrapportata d-data dwar it-tossiċità u s-sinjali kliniċi (skont il-Paragrafu 29).

Kriterji ta’ Aċċettabbiltà

37.

Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabbiltà ta’ test.

—	Il-kontroll negattiv konkorrenti hu konsistenti man-normi ppubblikati għad-data storika tal-kontroll negattiv, u mad-data storika tal-kontroll tal-laboratorju jekk tkun disponibbli (ara l-Paragrafi 10 u 18).

—

Il-kontrolli pożittivi konkorrenti jinduċu risponsi li jkunu konsistenti man-normi ppubblikati għad-data storika tal-kontroll pożittiv, jew mal-bażi tad-data storika tal-kontroll pożittiv tal-laboratorju, jekk disponibbli, u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv (ara l-Paragrafi 17 u 18).

—	Ġew analizzati numru adegwat ta’ impjanti totali u dożi (Paragrafu 20).

—	Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla doża huma konsistenti ma’ dawk deskritti fil-Paragrafi 24 u 27.

Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati

38.

Tal-anqas tliet gruppi tad-doża kkurati għandhom jiġu analizzati biex tiġi pprovduta biżżejjed data għal analiżi tar-rispons għad-doża.

39.

Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hi pożittiva biċ-ċar jekk:

—	tal-anqas waħda mid-dożi tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti;

—	iż-żieda tkun relatata mad-doża f’tal-anqas kundizzjoni sperimentali waħda (eż. intervall tat-tgħammir ta’ kull ġimgħa) meta evalwata b’test xieraq; u,

—	kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa’ barra mill-medda aċċettabbli tad-data tal-kontroll negattiv, jew mid-distribuzzjoni tad-data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson) jekk disponibbli.

Imbagħad is-sustanza kimika tat-test titqies li kapaċi tinduċi mutazzjonijiet letali dominanti fiċ-ċelloli ġerminali tal-annimali tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-aktar metodi statistiċi xierqa huma deskritti fil-Paragrafu 44; approċċi statistiċi rakkomandati oħra jistgħu jinstabu fid-dokumentazzjoni (20) (21) (22) (24) (29). It-testijiet statistiċi użati għandhom jikkunsidraw l-annimal bħala l-unità sperimentali.

40.

Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hi negattiva biċ-ċar jekk:

—	l-ebda waħda mid-dożi tat-test ma turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti;

—	ma jkun hemm ebda żieda relatata mad-doża f’xi kundizzjoni sperimentali; u

—	ir-riżultati kollha jaqgħu fi ħdan il-medda aċċettabbli tad-data tal-kontroll negattiv, jew tad-data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson), jekk disponibbli.

Imbagħad is-sustanza kimika tat-test titqies li ma tkunx kapaċi tinduċi mutazzjonijiet letali dominanti fiċ-ċelloli ġerminali tal-annimali tat-test.

41.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta’ rispons posittiv jew negattiv ċar.

42.

Jekk ir-rispons ma jkunx negattiv jew pożittiv b’mod ċar, u bħala għajnuna għall-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta’ riżultat (eż. żieda dgħajfa jew ambigwa), id-data għandha tiġi evalwata b’ġudizzju espert u/jew b’investigazzjonijiet ulterjuri li jużaw id-data sperimentali eżistenti, bħal kunsiderazzjoni ta’ jekk ir-riżultat pożittiv jaqax barra mill-medda aċċettabbli ta’ data tal-kontroll negattiv, jew ta’ data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (30).

43.

F’każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta’ data jipprekludi milli tinħareġ konklużjoni ta’ riżultati pożittivi jew negattivi u għaldaqstant jiġi konkluż bħala ekwivoku.

44.

It-testijiet statistiċi użati għandhom jikkunsidraw l-annimal raġel bħala l-unità sperimentali. Filwaqt li hu possibbli li d-data dwar l-għadd (eż. in-numru ta’ impjanti għal kull mara) tista’ tkun distribwita skont Poisson u/jew il-proporzjonijiet (eż. il-proporzjon ta’ impjanti mejtin) jistgħu jkunu distribwiti b’mod binomjali, spiss ikun il-każ li t-tali data tkun mifruxa wisq (31). Għaldaqstant, l-ewwel l-analiżi statistika għandha tuża test għal dispersjoni eċċessiva jew subottimali billi tuża testijiet tal-varjanza bħat-test tal-varjanza binomjali ta’ Cochran (32) jew it-test C(α) ta’ Tarone għad-dispersjoni binomjali eċċessiva (31) (33). Jekk ma jiġi individwat ebda tbegħid mid-dispersjoni binomjali, it-tendenzi fil-proporzjonijiet bejn il-livelli tad-doża jistgħu jiġu ttestjati bl-użu tat-test tat-tendenzi ta’ Cochran-Armitage (34) u l-paraguni fil-livell tal-pari mal-grupp tal-kontroll jistgħu jiġu ttestjati bl-użu tat-test eżatt ta’ Fisher (35). Bl-istess mod, jekk ma jiġi individwat ebda tbegħid mid-dispersjoni ta’ Poisson, it-tendenzi fl-għadd jistgħu jiġu ttestjati bl-użu tar-rigressjoni ta’ Poisson (36) u l-paraguni fil-livell tal-pari mal-grupp tal-kontroll jistgħu jiġu ttestjati fi ħdan il-kuntest tal-mudell Poisson, bl-użu tal-kuntrasti bejn il-pari (36). Jekk tiġi individwata dispersjoni eċċessiva jew subottimali, huma rakkomandati metodi mhux parametriċi (23) (31). Dawn jinkludu testijiet ibbażati fuq il-klassifikazzjonijiet, bħat-test Jonckheere-Terpstra għat-tendenza (37) u t-testijiet Mann-Whitney (38) għall-paraguni bejn il-pari mal-grupp tal-kontroll bil-veikolu/bis-solvent, kif ukoll it-testijiet tal-permutazzjoni, tal-kampjunar mill-ġdid, jew bootstrap għall-paraguni tat-tendenzi u bejn il-pari mal-grupp tal-kontroll (31) (39).

45.

Assaġġ tad-DL pożittiv jipprovdi evidenza għall-ġenotossiċità tas-sustanza kimika tat-test fiċ-ċelloli ġerminali tar-raġel trattati tal-ispeċi tat-test.

46.

Kunsiderazzjoni ta’ jekk il-valuri osservati humiex fi ħdan jew barra l-medda ta’ kontroll storiku tista’ tipprovdi gwida meta tiġi evalwata s-sinifikanza bijoloġika tar-rispons (40).

Rapport tat-Test

47.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja.

Sommarju.

Sustanza kimika tat-test:

—	is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli;

—	l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;

—	is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;

—	il-kejl tal-pH, tal-ożmolalità u tal-preċipitat fil-medium tat-tkabbir li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.

Sustanza monokostitwenti:

—	id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;

—	l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.

Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:

—	ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.

Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test:

—	il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.

—	is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin;

—	il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djetetiċi, tal-ilma tajjeb għax-xorb jew tat-teħid man-nifs;

—	id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż. l-istabbiltà, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali), meta jsiru.

L-annimali tat-test:

—	l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjoni għall-għażla,

—	l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;

—	is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;

—	il-metodu tal-identifikazzjoni unika tal-annimali;

—

għal studji fuq terminu qasir: il-piż tal-ġisem individwali tal-annimali rġiel fil-bidu u fi tmiem it-test; għal studji itwal minn ġimgħa: il-piżijiet tal-ġisem individwali matul l-istudju u l-konsum ta’ ikel. Il-medda tal-piż individwali, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp għandhom ikunu inklużi.

Il-kundizzjonijiet tat-test:

—	data tal-kontrolli pożittivi u negattivi (veikolu/solvent);

—	data mill-istudju ta’ sejbien tal-medda,

—	ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;

—	dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;

—	dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;

—	ir-raġuni għar-rotta tal-amministrazzjoni;

—	metodi għall-kejl tat-tossiċità tal-annimali, inklużi, fejn disponibbli, l-analiżijiet istopatoloġiċi jew ematoloġiċi u l-frekwenza li biha saru l-osservazzjonijiet u ttieħdu l-piżijiet tal-ġisem tal-annimali;

—	il-metodi għall-verifika li s-sustanza kimika tat-test laħqet it-tessut fil-mira, jew iċ-ċirkolazzjoni ġenerali, jekk jinkisbu riżultati negattivi;

—	id-doża proprja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni (ppm) u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tax-xorb, jekk applikabbli;

—	dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;

—	dettalji dwar l-arrikkiment tal-ambjent tal-gaġeġ;

—	deskrizzjoni dettaljata tat-trattament u l-iskedi tal-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall-għażliet;

—	il-metodu tal-analġeżija;

—	il-metodu tal-ewtanażja;

—	il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti;

—	is-sors u n-numri tal-lott tal-kitts u tar-reaġenti kollha (fejn applikabbli);

—	il-metodi għall-enumerazzjoni tad-DLs;

—	l-iskeda tat-tgħammir;

—	il-metodi użati biex ikun determinat li seħħ it-tgħammir;

—	il-ħin tal-ewtanażja;

—	il-kriterji għall-għoti ta’ punteġġ lill-effetti tad-DL, inklużi l-corpora lutea, l-impjantazzjonijiet, ir-riassorbimenti u t-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni, l-impjanti ħajjin, l-impjanti mejta.

Ir-riżultati:

—	il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklużi sinjali tat-tossiċità;

—	il-piż tal-ġisem tal-irġiel matul il-perjodi tat-trattament u tat-tgħammir;

—	in-numru ta’ nisa mgħammra;

—	ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn possibbli;

—	id-data konkorrenti u storika tal-kontroll negattiv bil-meded, bil-medji u bid-devjazzjonijiet standard;

—	id-data konkorrenti tal-kontroll pożittiv;

—

id-data f’tabelli għal kull omm inklużi: in-numru ta’ corpora lutea għal kull omm; in-numru ta’ impjantazzjonijiet għal kull omm; in-numru ta’ riassorbimenti u ta’ telf ta’ qabel l-impjantazzjoni għal kull omm; in-numru ta’ impjanti ħajjin għal kull omm; in-numru ta’ impjanti mejtin għal kull omm; il-piżijiet tal-feti;

—	id-data ta’ hawn fuq miġbura għal kull perjodu ta’ tgħammir u doża, bil-frekwenzi Letali Dominanti;

—	l-analiżijiet u l-metodi statistiċi applikati.

Diskussjoni tar-riżultati.

Konklużjoni.

DOKUMENTAZZJONI

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Pariġi.

(2)	Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, f’Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam

(3)

Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., u Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group “Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185

(4)	Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167.

(5)	Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. u Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.

(6)	Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. u Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.

(7)	Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. u Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.

(8)	Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. u Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.

(9)	Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., u Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.

(10)	Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. u Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.

(11)	Marchetti F. u Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.

(12)	Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.

(13)	Favor J., u Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27.

(14)	Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. u Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.

(15)	Hastings S.E., Huffman K.W. u Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.

(16)	James D.A. u Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.

(17)	Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. u Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.

(18)	Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. u Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.

(19)	Holstrom L.M., Palmer A.K. u Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. u Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 129-156.

(20)	Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. u Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.

(21)	Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. u Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.

(22)	Generoso W.M. u Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.

(23)	Haseman J.K. u Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.

(24)	Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.

(25)	Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., u Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.

(26)

Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. u Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.

(27)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.

(28)	Barrow M.V., Taylor W.J u Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.

(29)	Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.

(30)	Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. u Thybaud V. (2011). “Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87-90.

(31)	Lockhart A.C., Piegorsch W.W. u ishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.

(32)	Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.

(33)	Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.

(34)	Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. F’Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. u Johnson N. L. (Eds.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York.

(35)	Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman u Hall, Londra (1970).

(36)	Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. u Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, il-Kapitli 14 u 17. McGraw-Hill, Boston

(37)	Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.

(38)	Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York

(39)	Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.

(40)	Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.

Appendiċi 1

DEFINIZZJONIJIET

Sustanza kimika: Sustanza jew taħlita

Corpora lutea (lutea): l-istruttura tas-sekrezzjoni ormonali fformata fuq l-ovarju fis-sit ta’ follikolu li jkun ħeles il-bajda. In-numru ta’ corpora lutea fl-ovarji jikkorrispondi għan-numru ta’ bajd li ġew ovulati.

Mutazzjoni Letali Dominanti: mutazzjoni li sseħħ f’ċellola ġerminali, jew li tiġi fissa wara l-fertilizzazzjoni, li tikkawża mewta embrijonika jew fetali.

Rata ta’ fertilità: in-numru ta’ nisa tqal mgħammra fuq in-numru ta’ nisa mgħammra.

Intervall tat-tgħammir: il-ħin bejn tmiem l-esponiment u t-tgħammir tal-irġiel trattati. Bil-kontroll ta’ dan l-intervall, ikunu jistgħu jiġu vvalutati l-effetti kimiċi fuq it-tipi differenti ta’ ċelloli ġerminali. Fit-tgħammir tal-ġrieden matul il-ġimgħat numru 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 wara tmiem l-esponiment ikejjel l-effetti fl-isperma, fl-ispermatidi kondensi, fl-ispermatidi tondi, fl-ispermatoċiti pakiten, fl-ispermatoċiti bikrin, fl-ispermatogonji differenzjati, fl-ispermatogonji tad-differenzazzjoni u fl-ispermatogonji taċ-ċelloli staminali.

Telf ta’ qabel l-impjantazzjoni: id-differenza bejn in-numru ta’ impjanti u n-numru ta’ corpora lutea. Dan jista’ jiġi stmat ukoll billi jitqabblu l-impjanti totali għal kull mara fil-grupp trattat u fil-grupp tal-kontroll.

Telf ta’ wara l-impjantazzjoni: il-proporzjon tal-impjanti mejtin fil-grupp trattat meta mqabbel mal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjanti totali fil-grupp tal-kontroll.

Sustanza kimika tat-test: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.

UVCB: Sustanza Kimika b’Kompożizzjoni Mhux Magħrufa jew Varjabbli, Prodotti u Materjali Bijoloġiċi b’Reazzjoni Kumplessa

Appendiċi 2

TWAQQIT TAL-ISPERMATOĠENESI FIL-MAMMIFERI

Fig.1: Tqabbil tad-durata (jiem) tal-iżvilupp taċ-ċelloli ġerminali tal-irġiel fil-ġrieden, fil-firien u fil-bnedmin. It-tiswija tad-DNA ma sseħħx matul il-perjodi indikati mit-tidwil.

Skematika tal-ispermatoġenesi fil-ġrieden, fil-firien u fil-bniedem hi murija hawn fuq (meħuda minn Adler, 1996). L-ispermatogonji mhux differenzjati jinkludu: A-singla; A-pari; u spermatogonji A-allinjati (Hess u de Franca, 2008). A-singla titqies bħala ċ-ċelloli staminali veri; għalhekk, biex jiġu vvalutati l-effetti fuq iċ-ċelloli staminali jridu jgħaddu tal-anqas 49 jum (fil-ġrieden) bejn l-aħħar injezzjoni tas-sustanza kimika tat-test u t-tgħammir.

Referenzi

Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.

Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Fi: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences u Springer Science&Business Media:1-15.

”

(4)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.23 hu ssostitwit b’dan li ġej:

“B.23 TEST TAL-ABERRAZZJONI FIL-KROMOŻOMI SPERMATOGONI TAL-MAMMIFERI

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linji gwida tat-test 483 tal-OECD (2016). Il-metodi ta’ ttestjar jiġu rieżaminati kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku, tal-ħtiġijiet regolatorji li jinbidlu u tal-kunsiderazzjonijiet relatati mat-trattament xieraq tal-annimali. Din il-verżjoni modifikata tal-metodu ta’ ttestjar tirrifletti ħafna snin ta’ esperjenza b’dan l-assaġġ u l-potenzjal għall-integrazzjoni jew għall-kombinament ta’ dan it-test ma’ studji oħra dwar it-tossiċità jew il-ġenotossiċità. Il-kombinament tal-istudji tat-tossiċità għandu l-potenzjal li jnaqqas in-numri ta’ annimali użati fl-ittestjar tat-tossiċità. Dan il-metodu ta’ ttestjar hu parti minn sensiela ta’ metodi ta’ ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. L-OECD żviluppa dokument li jipprovdi informazzjoni sintetika fuq l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali lejn it-tibdiliet riċenti li seħħew fil-linji gwida tat-test tal-OECD dwar it-tossiċità ġenetika (1).

L-għan tat-test in vivo tal-aberazzjoni fil-kromożomai spermatogoni tal-mammiferi hu li jidentifika dawk is-sustanzi kimiċi li jikkawżaw aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fiċ-ċelloli spermatogoni tal-mammiferi (2) (3) (4). Barra minn hekk, dan it-test hu rilevanti għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għalkemm ivarjaw bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetika u l-proċessi ta’ tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-rispons. Dan il-metodu ta’ ttestjar mhuwiex imfassal biex ikejjel l-anormalitajiet numeriċi; l-assaġġ ma jintużax bħala rutina għal dan l-għan.

Dan it-test ikejjel l-aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali (kemm tat-tip kromożomiku u kromatidiku) fid-diviżjoni taċ-ċelloli ġerminali spermatogoni u, għalhekk, hu mistenni jkun ibassar mutazzjonijiet li jintirtu f’dawn iċ-ċelloli ġerminali.

Id-definizzjonijiet tat-termini ewlenin huma stabbiliti fl-Appendiċi.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

F’dan it-test spiss jintużaw rodituri, iżda f’ċerti każijiet jista’ jkun hemm speċijiet oħrajn li jkunu xierqa, jekk ikunu xjentifikament ġustifikati. Il-preparati ċitoġenetiċi standard tat-testikoli tar-rodituri jiġġeneraw metafażijiet mitotiċi (spermatogonji) u mejotiċi (spermatoċiti). Il-metafażijiet mitotiċi u mejotiċi huma identifikati fuq il-bażi tal-morfoloġija tal-kromożomi (4). Dan it-test ċitoġenetiku in vivo jindividwa aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fil-mitożijiet spermatogoni. Ċelloli oħra mmirati mhumiex l-oġġett ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.

Biex jiġu individwati aberrazzjonijiet tat-tip kromatidiku f’ċelloli spermatogoni, l-ewwel diviżjoni taċ-ċelloli mitotiċi wara t-trattament għandha tiġi eżaminata qabel ma dawn l-aberrazzjonijiet jiġu konvertiti f’aberrazzjonijiet tat-tip kromożomatiku f’diviżjonijiet sussegwenti taċ-ċelloli. Informazzjoni addizzjonali mill-ispermatoċiti trattati tista’ tinkiseb b’analiżi tal-kromożomi mejotiċi għal aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fil-metafażi I u fil-metafażi II tad-dijakineżi.

Numru ta’ ġenerazzjonijiet ta’ spermatogonji huma preżenti fit-testikoli (5), u dawn it-tipi differenti ta’ ċelloli ġerminali jista’ jkollhom spettru ta’ sensittività għat-trattament bis-sustanza kimika. B’hekk, l-aberrazzjonijiet individwati jirrappreżentaw rispons aggregat ta’ popolazzjonijiet ta’ ċelloli spermatogoni trattati. Il-maġġoranza taċ-ċelloli mitotiċi fil-preparati tat-testikoli huma spermatogonji B, li għandhom ċiklu taċ-ċelloli ta’ madwar 26 siegħa (3).

Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, ma jkunux se jilħqu t-testikoli, ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.

PRINĊIPJU TAL-METODU TA’ TTESTJAR

Ġeneralment, l-annimali jiġu esposti għas-sustanza kimika tat-test b’rotta ta’ esponiment xierqa u jiġu ewtanizzati fi żminijiet xierqa wara t-trattament. Qabel l-ewtanażja, l-annimali jiġu ttrattati b’inibitur tal-metafażi (eż. kolkiċina jew Colcemid®). Imbagħad isiru preparati ta’ kromożomi miċ-ċelloli ġerminali u jiġu mtebbgħin, u ċ-ċelloli metafażiċi jiġu analizzati għal aberrazzjonijiet kromożomiċi.

VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU

10.

Il-kompetenza f’dan l-assaġġ għandha tiġi stabbilita billi tintwera l-ħila li jiġu riprodotti r-riżultati mistennija għall-frekwenzi ta’ aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fl-ispermatogonji b’sustanzi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfa) bħal dawk elenkati fit-Tabella 1 u jinkisbu frekwenzi tal-kontroll negattiv li jkunu konsistenti mal-medda aċċettabbli ta’ data tal-kontroll fid-dokumentazzjoni ippubblikata (eż. (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) jew mad-distribuzzjoni storika tal-kontroll tal-laboratorju, jekk disponibbli.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Għażla tal-ispeċi tal-annimali

11.

Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta’ annimali adulti żgħar b’saħħithom. Spiss jintużaw ġrieden irġiel; madankollu, l-irġiel ta’ speċijiet ta’ mammiferi xierqa oħra jistgħu jintużaw meta dan ikun xjentifikament ġustifikat u biex dan it-test ikun jista’ jsir flimkien ma’ metodu ta’ ttestjar ieħor. Fir-rapport għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika meta jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex rodituri.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u tal-għalf tal-annimali

12.

Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta’ 22 °C (±3 °C). Għalkemm idealment l-umdità relattiva għandha tkun ta’ 50-60 %, għandha tkun tal-anqas ta’ 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, bis-sekwenza tkun ta’ 12-il siegħa dawl/12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta’ sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Ir-rodituri għandhom jinżammu fi gruppi żgħar (mhux aktar minn ħamsa f’kull gaġġa) jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva, idealment f’gaġeġ solidi (ta’ mal-art) b’arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat.

Preparazzjoni tal-annimali

13.

Normalment jintużaw annimali rġiel adulti żgħar f’saħħithom (8-12-il ġimgħa fil-bidu tal-kura) u dawn jiġu assenjati b’mod aleatorju fil-gruppi ta’ kontroll u tal-kura. L-annimali individwali jiġu identifikati b’mod uniku bl-użu ta’ metodu uman u l-inqas invasiv possibbli (eż. b’ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b’titqib fil-widnejn jew fis-swaba’) u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-anqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u mis-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni bejn il-piżijiet tal-annimali individwali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± l-20 %.

Preparazzjoni tad-dożi

14.

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f’solventi jew f’veikoli xierqa jew jitħalltu f’dieta jew f’ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-data dwar l-istabbiltà ma turix l-aċċettabbiltà tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.

Kundizzjonijiet tat-test - Solvent/veikolu

15.

Is-solvent/veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli tad-doża użati, u ma għandux ikun kapaċi li joħloq reazzjoni kimika mas-sustanzi kimiċi tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħra li ma jkunux magħrufa sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta’ data ta’ riferiment li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Hu rrakkomandat li, kull fejn ikun possibbli, l-ewwel għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta’ solvent/mezz likwidu. Eżempji ta’ solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu l-ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetil, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum. Fin-nuqqas ta’ data storika jew ippubblikata tal-kontroll li turi li ma huma indotti ebda aberrazzjoni kromożomika strutturali u effett dannuż ieħor minn solvent/veikolu atipiku magħżul, għandu jsir studju inizjali biex tiġi stabbilita l-aċċettabbiltà tal-kontroll bis-solvent/bil-veikolu.

Kontrolli pożittivi

16.

Dejjem għandhom jintuażw annimali tal-kontroll pożittiv konkorrenti sakemm il-laboratorju ma jkunx wera profiċjenza fit-twettiq tat-test u jkun uża t-test bħala rutina fl-imgħoddi riċenti (eż. matul l-aħħar 5 snin). Meta ma jkunx hemm grupp tal-kontroll pożittiv konkorrenti inkluż, il-kontrolli tal-punteġġ (lametti fissi u mhux imlewnin) għandhom ikunu inklużi f’kull esperiment. Dawn jistgħu jinkisbu billi fl-ikklassifikar tal-istudju jiddaħħlu kampjuni ta’ riferiment xierqa li nkisbu u nħażnu minn esperiment tal-kontroll pożittiv separat imwettaq b’mod perjodiku (eż. kull 6-18-il xahar) fil-laboratorju fejn isir it-test; pereżempju, matul l-ittestjar tal-profiċjenza u fuq bażi regolari wara, fejn ikun hemm bżonn.

17.

Is-sustanzi tal-kontroll pożittiv għandhom jipproduċu b’mod affidabbli żieda identifikabbli fil-frekwenzi taċ-ċelloli b’aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fuq il-livelli spontanji. Id-dożi tal-kontroll pożittiv għandhom jingħażlu biex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tal-kampjuni kodifikati lil min jaqrahom. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta’ sustanzi tal-kontroll pożittiv.

Tabella 1

Eżempji ta’ sustanzi tal-kontroll pożittiv

Sustanzi [Nru CAS] (nru ta’ riferiment)

Ċiklofosfamid (monoidrat) [Nru CAS 50-18-0 (Nru CAS 6055-19-2)] (9)

Ċikloessilamina [Nru CAS 108-91-8]

Mitomiċina C [Nru CAS 50-07-7] (6)

Akrilammid monomeriku [CAS 79-06-1] (10)

Trietilenmelamina [CAS 51-18-3] (8)

Kontrolli negattivi

18.

L-annimali tal-kontrolli negattivi, trattati b’solvent jew b’veikolu waħdu, u mill-bqija trattati bl-istess mod bħall-gruppi tal-kura, għandhom ikunu inklużi għal kull ħin tal-kampjunar. Fin-nuqqas ta’ data tal-kontroll storika jew ippubblikata li turi li ma kien indott ebda aberrazzjoni kromożomika jew effett ta’ tħassir ieħor mis-solvent/mill-veikolu magħżul, l-annimali tal-kontroll mhux trattati għandhom ikunu inklużi wkoll għal kull ħin tal-kampjunar biex tiġi stabbilita aċċettabbiltà tal-kontroll tal-veikolu.

PROĊEDURA

Numru ta’ annimali

19.

Id-daqsijiet tal-grupp fil-bidu tal-istudju għandhom jiġu stabbiliti bl-għan li tal-anqas jiġu pprovduti ħames annimali rġiel għal kull grupp. Dan in-numru ta’ annimali għal kull grupp jitqies li hu biżżejjed biex tiġi pprovduta saħħa statistika adegwata (jiġifieri ġeneralment ikun jista’ jiġi individwat tal-anqas irdoppjar fil-frekwenza tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi meta l-livell tal-kontroll negattiv ikun 1,0 % jew akbar bi probabbiltà ta’ 80 % f’livell ta’ sinifikat ta’ 0,05) (3) (11). Bħala gwida għar-rekwiżiti tipiċi massimi tal-annimali, studju f’żewġ waqtiet tal-kampjunar bi tliet gruppi tad-doża u grupp tal-kontroll negattiv konkorrenti, flimkien ma’ grupp tal-kontroll pożittiv (kull wieħed imsawwar minn ħames annimali għal kull grupp), ikun jeħtieġ 45 annimal.

Skeda tat-trattament

20.

Normalment is-sustanzi kimiċi tat-test jingħataw darba (jiġifieri bħala trattament wieħed); jistgħu jintużaw reġimi tad-dożi oħra, dment li ma jkunux xjentifikament ġustifikati.

21.

Fil-grupp tal-ogħla doża jittieħdu żewġ kampjuni wara t-trattament. Ladarba l-ħin meħtieġ għall-bidu u l-metaboliżmu tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test kif ukoll l-effetti tagħha fuq il-kinetika taċ-ċikli taċ-ċelloli jistgħu jaffettwaw il-ħin ottimali għall-individwar tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi, jintużaw ħin tal-kampjunar wieħed bikri u ħin ieħor tard madwar 24 u 48 siegħa wara t-trattament. Għal dożi li mhumiex l-ogħla doża, għandu jittieħed ħin tal-kampjunar bikri ta’ 24 siegħa (anqas jew daqs il-ħin taċ-ċiklu taċ-ċelloli ta’ spermatogonji B u b’hekk tiġi ottimizzata l-probabbiltà ta’ għoti ta’ punteġġ għall-ewwel metafażijiet ta’ wara t-trattament) wara t-trattament, sakemm ma jkunx magħruf li hemm ħin ieħor tal-kampjunar aktar xieraq u ġustifikat.

22.

Jistgħu jintużaw ħinijiet oħra tal-kampjunar. Pereżempju, fil-każ ta’ sustanzi kimiċi li jeħilsu effetti indipendenti mis-S, ħinijiet tal-kampjunar aktar bikrin (jiġifieri anqas minn 24 siegħa) jistgħu jkunu xierqa.

23.

Jista’ jintuża reġim ta’ trattament ta’ doża ripetuta, bħal flimkien ma’ test fuq punt ta’ tmiem ieħor li juża perjodu ta’ amministrazzjoni ta’ 28 jum (eż., TM B.58); madankollu, gruppi ta’ annimali addizzjonali jkunu meħtieġa jakkomodaw ħinijiet tal-kampjunar differenti. Għalhekk, l-idoneità ta’ skeda bħal din trid tiġi aġġustata xjentifikament skont kull każ individwali.

24.

Qabel l-ewtanażja, l-annimali jiġu injettati intraperitonalment b’doża xierqa ta’ sustanza kimika li twaqqaf l-metafażi (eż. Colcemid® jew kolkiċina). Wara dan, jittieħed kampjun mill-annimali f’intervalli xierqa. Għall-ġrieden u għall-firien, dan l-intervall hu ta’ madwar 3 - 5 sigħat.

Livelli tad-doża

25.

Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda data xierqa diġà disponibbli biex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jridu jintużaw fl-istudju ewlieni, skont ir-rakkomandazzjonijiet għat-twettiq ta’ studji ta’ individwazzjoni tad-doża (26). Dan l-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala d-doża li tinduċi effetti tossiċi ħfief b’rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, imġiba jew reazzjonijiet anormali, dipressjoni minuri tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika) iżda mhux mewt jew evidenza ta’ uġigħ, ta’ tbatija jew ta’ diffikultà li jeħtieġu ewtanażja tal-annimali (27).

26.

L-ogħla doża tista’ ukoll tfisser id-doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta’ tossiċità fiċ-ċelloli spermatogoni (eż. tnaqqis fil-proporzjon bejn mitożijiet spermatogoni sal-ewwel u t-tieni metafażijiet mejotiċi). Dan it-tnaqqis ma għandux jaqbeż il-50 %).

27.

28.

Biex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv (paragrafu 18) u tal-anqas tliet livelli ta’ dożi ġeneralment separati b’fattur ta’ 2, iżda b’mhux akbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-data eżistenti, l-ogħla doża għal amministrazzjoni waħda għandha tkun ta’ 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom idealment ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Meta tiġi osservata tossiċità tat-tessut fil-mira (jiġifieri testikoli) fil-livelli tad-doża kollha ttestjati, hu rakkomandat li jsir studju ulterjuri f’dożi mhux tossiċi. Studji li jkollhom l-għan li jikkaratterizzaw iktar bis-sħiħ l-informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża jistgħu jeħtieġu gruppi tad-doża addizzjonali. Għal ċerti tipi ta’ sustanzi kimiċi tat-test (eż. prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem) koperti minn rekwiżiti speċifiċi, dawn il-limiti jistgħu jvarjaw. Jekk is-sustanza kimika tat-test tipproduċi tossiċità, għandhom jintgħażlu d-doża limitu flimkien ma’ żewġ dożi inferjuri (kif deskritti aktar ’il fuq). Id-doża limitu għal perjodu ta’ amministrazzjoni ta’ 14-il jum jew aktar hi ta’ 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum, u għal perjodi ta’ amministrazzjoni ta’ anqas minn 14-il jum id-doża limitu hi ta’ 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum.

Amministrazzjoni tad-dożi

29.

Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja topika, fil-vini, orali (gavage), mat-teħid man-nifs, jew b’impjant, kif iġġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel biex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut fil-mira. L-injezzjoni intraperitoneali normalment ma tkunx rakkomandata sakemm ma tkunx xjentifikament ġustifikata peress li normalment ma tkunx rotta fiżjoloġikament rilevanti ta’ esponiment tal-bniedem. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew fl-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta’ dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u l-kampjunar ikun biżżejjed biex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (ara l-paragrafi 33). Il-volum massimu ta’ likwidu li jista’ jingħata b’gavage jew b’injezzjoni f’darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun ta’ aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet milwiema fejn jista’ jintuża massimu ta’ 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. L-użu ta’ volumi akbar minn dan (jekk ikunu permessi mil-leġiżlazzjoni dwar it-trattament xieraq tal-annimali) għandu jkun iġġustifikat. Il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tiġi minimizzata billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti b’rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.

Osservazzjonijiet

30.

Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-anqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta’ wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-aktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju, tal-anqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b’doża ripetuta, u fil-fażi tal-ewtanażja. Fi studji twal tal-anqas ġimgħa, il-kejlijiet tal-konsum tal-ikel għandhom isiru tal-anqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f’kull bidla tal-ilma u tal-anqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta’ tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanizzati qabel jintemm il-perjodu ta’ ttestjar (13).

Preparazzjoni tal-kromożomi

31.

Eżatt wara l-ewtanażja, is-sospensjonijiet taċ-ċelloli ġerminali jinkisbu minn testikola waħda, jew mit-tnejn, esposti għal soluzzjoni ipotonika u ffissati skont il-protokolli stabbiliti (eż. (2) (14) (15). Imbagħad iċ-ċelloli jitferrxu fuq il-lametti u jitlewnu (16) (17). Il-lametti kollha għandhom ikunu kodifikati biex l-identità tagħhom ma tkunx disponibbli għal min jiggradahom.

Analiżi

32.

Tal-anqas 200 metafażi mifruxa sew għandhom jiġu ggradati għal kull annimal (3) (11). Jekk il-frekwenza tal-kontroll negattiv storiku tkun < 1 %, aktar minn 200 ċellola/annimal għandhom jiġu gradati biex tiżdied is-saħħa statistika (3). Għandhom jintużaw metodi ta’ tilwin li jippermettu l-identifikazzjoni taċ-ċentromeru.

33.

Aberrazzjonijiet tat-tip kromożomiku u kromatidiku għandhom jiġu reġistrati għalihom u jiġu klassifikati skont is-sottotipi (ksur, skambji). Id-diskrepanzi għandhom jiġu reġistrati, iżda mhux kunsidrati, meta jiġi determinat jekk sustanza kimika tinduċix żidiet sinifikanti fl-inċidenza ta’ ċelloli b’aberrazzjonijiet kromożomiċi. Il-proċeduri użati fil-laboratorji għandhom jiżguraw li l-analiżi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi ssir minn persuni mħarrġa kif suppost fl-għoti ta’ punteġġ. Fid-dawl tal-fatt li l-proċeduri ta’ preparazzjoni tal-lametti spiss jirriżultaw fil-ksur ta’ sehem mill-metafażijiet li jirriżulta fit-telf ta’ kromożomi, iċ-ċelloli li jingħataw punteġġ għandu jkun fihom għadd ta’ ċentromeri ta’ mhux inqas minn 2n±2, fejn n hi n-numru aplojdi ta’ kromożomi għal dik l-ispeċi.

34.

Għalkemm l-iskop tat-test hu li jindividwa aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali, importanti li jiġu reġistrati l-frekwenzi ta’ ċelloli poliplojdi u ta’ ċelloli bi kromożomi endoreduplikati meta jiġu osservati dawn l-avvenimenti (ara l-Paragrafu 44).

DATA U RAPPORTAR

Trattament tar-riżultati

35.

Data dwar l-annimali individwali għandha tiġi ppreżentata f’forma ta’ tabelli. Għal kull annimal għandhom jiġu evalwati n-numru ta’ ċelloli b’aberrazzjoni(jiet) kromożomika/ċi strutturali u n-numru ta’ aberrazzjonijiet kromożomiċi għal kull ċellola. L-aberrazzjonijiet tat-tip kromatidiku u kromożomiku klassifikat skont is-sottotipi (ksur, skambji) għandhom jiġu elenkati b’mod separat bin-numri u bil-frekwenzi tagħhom għall-gruppi sperimentali u tal-kontroll. Id-diskrepanzi jiġu reġistrati b’mod separat. Il-frekwenza tad-diskrepanzi tiġi rapportata iżda, ġeneralment, ma tkunx inkluża fl-analiżi tal-frekwenza totali ta’ aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali. Il-perċentwal ta’ poliplojdija u ta’ ċelloli bi kromożomi endoreduplikati jiġi rapportat meta jiġi osservat.

36.

Għandha tiġi rrapportata d-data dwar it-tossiċità u s-sinjali kliniċi (skont il-Paragrafu 30).

Kriterji ta’ Aċċettabbiltà

37.

Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabbiltà ta’ test.

—

Il-kontroll negattiv konkorrenti hu konsistenti man-normi ppubblikati għad-data storika tal-kontroll negattiv, li ġeneralment ikunu mistennija jkunu > 0 % u ≤ 1,5 % taċ-ċelloli b’aberrazzjonijiet kromożomiċi, u u mad-data storika tal-kontroll tal-laboratorju jekk tkun disponibbli (ara l-Paragrafi 10 u 18).

—

—	Ġew analizzati numri adegwati ta’ ċelloli u ta’ dożi (ara l-Paragrafi 28 u 32).

—	Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla doża huma konsistenti ma’ dawk deskritti fil-Paragrafi 25 u 26.

38.

Jekk jiġu osservati mitożi u mejożi, il-proporzjon ta’ mitożijiet spermatogoni għall-ewwel u t-tieni metafażijiet mejotiċi għandu jkun determinat bħala kejl taċ-ċitotossiċità għall-annimali trattati u tal-kontroll negattiv kollha f’kampjun totali ta’ 100 ċellola diviżorja għal kull annimal. Jekk tiġi osservata mitożi biss, l-indiċi mitotiku għandu jiġi determinat f’tal-anqas 1 000 ċellola għal kull annimal.

Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati

39.

Tal-inqas tliet gruppi tad-doża kkurati għandhom jiġu analizzati biex tiġi pprovduta biżżejjed data għal analiżi tar-rispons għad-doża.

40.

Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hi pożittiva biċ-ċar jekk:

—	tal-anqas waħda mid-dożi tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti;

—	iż-żieda hi relatata mad-doża tal-anqas f’ħin tal-kampjunar wieħed; u,

—	kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa’ barra mill-medda aċċettabbli tad-data tal-kontroll negattiv, jew mid-distribuzzjoni tad-data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson) jekk disponibbli.

Imbagħad is-sustanza kimika tat-test titqies li kapaċi tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi fiċ-ċelloli spermatogoni tal-annimali tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-aktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu wkoll mid-dokumentazzjoni (11) (18). It-testijiet statistiċi użati għandhom jikkunsidraw l-annimal bħala l-unità sperimentali.

41.

Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hi negattiva biċ-ċar jekk:

—	l-ebda waħda mid-dożi tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti;

—	ma jkun hemm ebda żieda relatata mad-doża f’xi kundizzjoni sperimentali; u,

—	ir-riżultati kollha jaqgħu fi ħdan il-medda aċċettabbli tad-data tal-kontroll negattiv, jew tad-data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson), jekk disponibbli.

Imbagħad is-sustanza kimika tat-test titqies li mhix kapaċi tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi f’ċelloli spermatogoni tal-annimali tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-aktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu wkoll mid-dokumentazzjoni (11) (18). Riżultat negattiv ma jeskludix il-possibbiltà li s-sustanza kimika tista’ tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi f’fażijiet tal-iżvilupp aktar tard mhux studjati, jew mutazzjonijiet tal-ġeni.

42.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta’ rispons posittiv jew negattiv ċar.

43.

44.

45.

Żieda fin-numru ta’ ċelloli poliplojdi tista’ tindika li s-sustanza kimika tat-test għandha l-potenzjal li tinibixxi l-proċessi mitotiċi u tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi numeriċi (20). Żieda fin-numru ta’ ċelloli bi kromożomi endoreduplikati tista’ tindika li s-sustanza kimika tat-test għandha l-potenzjal li tinibixi progress fiċ-ċiklu taċ-ċelloli (21) (22), li hu mekkaniżmu differenti ta’ induzzjoni ta’ tibdiliet kromożomiċi numeriċi mill-inibizzjoni tal-proċessi mitotiċi (ara l-Paragrafu 2). Għaldaqstant, l-inċidenza ta’ ċelloli poliplojdi u ċelloli bi kromożomi endoreduplikati għandha tiġi reġistrata b’mod separat.

Rapport tat-test

46.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Sommarju.

Sustanza kimika tat-test:

—	is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli;

—	l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;

—	is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;

—	il-kejl tal-pH, tal-ożmolalità u tal-preċipitat fil-medium tat-tkabbir li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.

Sustanza monokostitwenti:

—	id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;

—	l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.

Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:

—	ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.

Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test:

—	il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.

—	is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/fil-mezz.

—	il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djetetiċi, tal-ilma tajjeb għax-xorb jew tat-teħid man-nifs;

—	id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż. l-istabbiltà, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali), meta jsiru.

L-annimali tat-test:

—	l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjoni għall-għażla;

—	l-għadd u l-età tal-annimali,

—	is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;

—	il-metodu għall-identifikazzjoni unika tal-annimali

—	għal studji fuq terminu qasir: il-piż individwali tal-annimali fil-bidu u fi tmiem it-test; għal studji itwal minn ġimgħa: il-piżijiet tal-ġisem individwali matul l-istudju u l-konsum ta’ ikel. Il-medda tal-piż individwali, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp għandhom ikunu inklużi.

Il-kundizzjonijiet tat-test:

—	data tal-kontrolli pożittivi u negattivi (veikolu/solvent);

—	data minn studju għat-tiftix tal-medda, jekk ikun sar;

—	ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;

—	ir-raġuni għar-rotta tal-amministrazzjoni;

—	dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;

—	dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;

—	raġuni prinċipali għall-ħinijiet tas-sagrifiċċju;

—	metodi għall-kejl tat-tossiċità tal-annimali, inklużi, fejn disponibbli, l-analiżijiet istopatoloġiċi jew ematoloġiċi u l-frekwenza li biha saru l-osservazzjonijiet u ttieħdu l-piżijiet tal-ġisem tal-annimali;

—	il-metodi għall-verifika li s-sustanza kimika tat-test laħqet it-tessut fil-mira, jew iċ-ċirkolazzjoni ġenerali, jekk jinkisbu riżultati negattivi;

—	id-doża proprja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni (ppm) u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tax-xorb, jekk applikabbli;

—	dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;

—	deskrizzjoni dettaljata tat-trattament u l-iskedi tal-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall-għażliet;

—	il-metodu tal-ewtanażja;

—	il-metodu tal-analġeżija (meta tintuża)

—	il-proċeduri għall-iżolament tat-tessuti;

—	l-identità tas-sustanza kimika li twaqqaf il-metafażi, il-konċentrazzjoni tagħha u d-durata tat-trattament;

—	il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti;

—	il-kriterji għall-ikklassifikar tal-aberrazzjonijiet;

—	in-numru ta’ ċelloli analizzati għal kull annimal;

—	kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi.

Ir-riżultati:

—	il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklużi sinjali tat-tossiċità;

—	il-piżijiet tal-ġisem u tal-organi matul is-sagrifiċċju (jekk jintużaw diversi trattamenti, il-piżijiet tal-ġisem meħuda matul ir-reġim tat-trattament);

—	sinjali ta’ tossiċità;

—	indiċi mitotiku;

—	il-proporzjon ta’ ċelloli tal-mitożi spermatogoni għall-ewwel u t-tieni metafażijiet mejotiċi, jew evidenza oħra ta’ esponiment għat-tessut fil-mira;

—	it-tip u n-numru ta’ aberrazzjonijiet, mogħtija separatament għal kull annimal;

—	in-numru totali ta’ aberrazzjonijiet għal kull grupp bil-medji u bid-devjazzjonijiet standard;

—	in-numru ta’ ċelloli b’aberrazzjonijiet għal kull grupp bil-medji u bid-devjazzjonijiet standard;

—	ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn possibbli;

—	l-analiżijiet statistiċi u l-metodi applikati;

—	data konkorrenti tal-kontroll negattiv;

—	data storika tal-kontroll negattiv b’meded, b’medji, b’devjazzjonijiet standard, u b’intervall ta’ kunfidenza ta’ 95 % (fejn disponibbli), jew data storika ppubblikata tal-kontroll negattiv użata għall-aċċettabbiltà tar-riżultati tat-test;

—	data konkorrenti tal-kontroll pożittiv;

—	tibdiliet fil-plojdija, inklużi l-frekwenzi ta’ ċelloli poliplojdi u/jew endoreduplikati.

Diskussjoni tar-riżultati

Konklużjoni

DOKUMENTAZZJONI

(1)	OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Pariġi

(2)	Adler, I.-D. (1984). Cytogenetic Tests in Mammals. Fi: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt u J. M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.

(3)	Adler I.-D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. u Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, 313-318.

(4)	Russo, A. (2000). In Vivo Cytogenetics: Mammalian Germ Cells. Mutation Res., 455, 167-189.

(5)	Hess, R.A. u de Franca L.R. (2008). Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous Epithelium. Fi: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, Cheng C.Y. (Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, pp. 1-15.

(6)

Adler, I.-D. (1974). Comparative Cytogenetic Study after Treatment of Mouse Spermatogonia with Mitomycin C, Mutation. Res., 23(3): 368-379.Adler, I.D. (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications. Fi: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel C., Lambert B. u Magnusson J. (Eds.) Liss, New York, pp. 477-484.

(7)	Cattanach, B.M., u Pollard C.E. (1971). Mutagenicity Tests with Cyclohexylamine in the Mouse, Mutation Res., 12, 472-474.

(8)	Cattanach, B.M., u Williams, C.E. (1971). A search for Chromosome Aberrations Induced in Mouse Spermatogonia by Chemical Mutagens, Mutation Res., 13, 371-375.

(9)	Rathenburg, R. (1975). Cytogenetic Effects of Cyclophosphamide on Mouse Spermatogonia, Humangenetik 29, 135-140.

(10)	Shiraishi, Y. (1978). Chromosome Aberrations Induced by Monomeric Acrylamide in Bone Marrow and Germ Cells of Mice, Mutation Res., 57(3): 313-324.

(11)	Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. u Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417, 19–30.

(12)

Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. u Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagenesis, 7, 313-319.

(13)	OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, (No 19.), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.

(14)	Yamamoto, K. u Kikuchi, Y. (1978). A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mutation Res., 52, 207-209.

(15)	Hsu, T.C., Elder, F. u Pathak, S. (1979). Method for Improving the Yield of Spermatogonial and Meiotic Metaphases in Mammalian Testicular Preparations. Environ. Mutagen., 1, 291-294.

(16)	Evans, E.P., Breckon, G., u Ford, C.E. (1964). An Air-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.

(17)

Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. u Henderson, L. (1990). In Vivo Cytogenetics Assays, Fi: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Report. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.

(18)

Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G.u Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of In Vivo Cytogenetic Assays fi: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.

(19)	Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper, P., Lovell, D., Martus, H.-J. u Thybaud, V. (2011). Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data. Mutation Res., 723, 87-90.

(20)	Warr T.J., Parry E.M. u Parry J.M. (1993). A Comparison of Two In Vitro Mammalian Cell Cytogenetic Assays for the Detection of Mitotic Aneuploidy Using 10 Known or Suspected Aneugens, Mutation Res., 287, 29-46.

(21)	Huang, Y., Change, C. u Trosko, J.E. (1983). Aphidicolin-Induced Endoreduplication in Chinese Hamster Cells. Cancer Res., 43, 1362-1364.

(22)	Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Appendiċi

DEFINIZZJONIJIET

Anewplojdija: kwalunkwe devjazzjoni mill-għadd ta’ diplojdi (jew aplojdi) normali ta’ kromożomi minn kromożomu wieħed jew aktar, iżda mhux mis-sett(ijiet) kollu/kollha ta’ kromożomi (poliplojdija).

Ċentromeru: Reġjun(i) ta’ kromożomu li miegħu huma assoċjati fibri rqaq waqt id-diviżjoni taċ-ċellola, li jippermettu l-moviment b’ċertu ordni ta’ kromożomi sekondarji għall-poli ta’ ċelloli sekondarji.

Sustanza kimika: Sustanza jew taħlita

Diversità tal-kromożomi: diversità tal-forom tal-kromożomi (eż. metaċentriċi, akroċentriċi, eċċ) u d-daqsijiet.

Aberrazzjoni tat-tip kromatidiku: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta’ kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.

Aberrazzjoni tat-tip kromożomiku: ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f’sit identiku.

Klastoġenu: kwalunkwe sustanza kimika li tikkawża aberrazzjonijiet kromożomiċi f’popolazzjonijiet ta’ ċelloli jew ta’ organiżmi.

Vojt: leżjoni akromatika iżgħar mill-wisa’ ta’ kromatid wieħed, u b’misallinjament minimu tal-kromatidi.

Ġenotossiċi: terminu ġenerali li jkopri t-tipi kollha ħsara lid-DNA jew lill-kromożomi, inklużi ksur, tħassiriet, addotti, modifiki u konnessjonijiet tan-nukleotidi, riarranġamenti, mutazzjonijiet, aberrazzjonijiet kromożomiċi, u anewplojdija. Mhux it-tipi kollha ta’ effetti ġenotossiċi jirriżultaw f’mutazzjonijiet jew ħsara fil-kromożomi stabbli.

Indiċi mitotiku (MI): il-proporzjon ta’ ċelloli fil-metafażi diviż bin-numru totali ta’ ċelloli osservati f’popolazzjoni ta’ ċelloli; indikazzjoni tal-livell ta’ profilerazzjoni ta’ dik il-popolazzjoni.

Mitożi: diviżjoni tan-nukleu taċ-ċelloli li normalment jinqasam fi profażi, prometafażi, metafażi, anafażi u telofażi.

Mutaġeniku: jipproduċi tibdil ereditarju ta’ sekwenza/i tal-koppja ta’ bażijiet tad-DNA f’ġeni jew tal-istruttura tal-kromożomi (aberrazzjonijiet kromożomiċi).

Anormalità numerika: tibdil fin-numru ta’ kromożomi min-numru karatteristku normali tal-annimali użati.

Poliplojdija: multiplu tan-numru aplojdu ta’ kromożomi (n) minbarra n-numru diplojdu (jiġifieri 3n, 4n u l-bqija).

Aberrazzjoni strutturali: tibdil fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku tal-istadju metafażiku tad-diviżjoni taċ-ċelloli, osservati bħala tħassir u biċċiet, skambji.

Sustanza kimika tat-test: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.

UVCB: Sustanzi Kimiċi b’Kompożizzjoni Mhux Magħrufa jew Varjabbli, Prodotti u Materjali Bijoloġiċi b’Reazzjoni Kumplessa

”

(5)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.40 hu ssostitwit b’dan li ġej:

“B.40 KORRUŻJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: IL-METODU TA’ TTESTJAR TAR-REŻISTENZA ELETTRIKA TRANSKUTANJA (TER))

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 430 tal-OECD (2015). Il-korrużjoni tal-ġilda tirreferi għall-produzzjoni ta’ ħsara irreversibbli għall-ġilda li tidher bħala nekrożi viżibbli permezz tal-epidermis u fid-dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test [kif definita mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) u mir-Regolament tal-Unjoni Ewropea (UE) 1272/2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet (CLP) (1)]. Dan il-metodu ta’ ttestjar aġġornat B.40 jipprovdi proċedura in vitro li tippermetti li jiġu identifikati sustanzi u taħlitiet mhux korrużivi u korrużivi skont il-GHS tan-NU (1) u s-CLP.

Il-valutazzjoni tal-korrużività tal-ġilda tipikament involviet l-użu ta’ annimali tal-laboratorju (TM B.4, ekwivalenti għat-TG 404 tal-OECD oriġinarjament adottata fl-1981, u riveduta fl-1992, fl-2002 u fl-2015) (2). Minbarra t-TM B.40 preżenti, metodi ta’ ttestjar in vitro oħra għall-ittestjar tal-potenzjal ta’ korrużjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi ġew validati u adottati bħala TM B.40bis (ekwivalenti għat-TG 431 tal-OECD) (3) u TM B.65 (ekwivalenti għat-TG 435 tal-OECD) (4), li wkoll huma kapaċi jidentifikaw subkategoriji ta’ sustanzi kimiċi korrużivi meta jkun hemm bżonn. Ġew adottati diversi metodi ta’ ttestjar in vitro validati bħala TM B.46 (ekwivalenti għat-TG 439 tal-OECD (5), biex jintużaw għall-ittestjar tal-irritazzjoni tal-ġilda. Dokument ta’ gwida tal-OECD dwar Approċċi Integrati għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni (IATA) għall-Korrużjoni u għall-Irritazzjoni tal-Ġilda jiddeskrivi diversi moduli li jiġbru fihom diversi sorsi ta’ informazzjoni u għodod ta’ valutazzjoni, u jipprovdi gwida dwar (i) kif tintegra u tuża d-data eżistenti dwar l-ittestjar u mhux tal-ittestjar għall-valutazzjoni tal-potenzjali ta’ irritazzjoni tal-ġilda u ta’ korrużjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi u (ii) jipproponi approċċ fejn ikun meħtieġ ittestjar ulterjuri (6).

Dan il-metodu ta’ ttestjar jindirizza l-korrużjoni tal-ġilda tal-punt tat-tmiem tas-saħħa umana. Hu bbażat fuq il-metodu ta’ ttestjar tar-reżistenza elettrika transkutanja (TER) tal-ġilda tal-firien, li juża diski tal-ġilda biex jidentifika l-korrużivi mill-ħila tagħhom li jipproduċu telf ta’ integrità ormali stratum corneum u funzjoni barriera. Il-linja gwida tat-test korrispondenti tal-OECD oriġinarjament ġiet adottata fl-2004 u aġġornata fl-2015 biex tirreferi għad-dokument ta’ gwida tal-IATA.

Biex jiġi evalwat l-ittestjar tal-korrużjoni tal-ġilda in vitro għall-finijiet regolatorji, saru studji ta’ qabel il-validazzjoni (7) segwiti minn studju tal-validazzjoni formali tal-metodu ta’ ttestjar TER tal-ġilda tal-firien għall-valutazzjoni tal-korrużjoni tal-ġilda (8) (9) (10) (11). L-eżitu ta’ dawn l-istudji wassal għar-rakkomandazzjoni li l-metodu ta’ ttestjar TER (imsejjaħ il-Metodu ta’ Referenza Validat – VRM) jista’ jintuża għall-finijiet regolatorji għall-valutazzjoni tal-korrużjoni tal-ġilda in vivo (12) (13) (14).

Qabel ma metodu ta’ ttestjar TER in vitro simili jew modifikat propost għall-korrużjoni tal-ġilda li mhuwiex il-VRM ikun jista’ jintuża għall-finijiet regolatorji, l-ewwel għandhom jiġu determinati l-affidabbiltà, ir-rilevanza (preċiżjoni), u l-limitazzjonijiet tiegħu biex tiġi żgurata s-similarità tiegħu għall-VRM, skont ir-rekwiżiti tal-Istandards tal-Prestazzjoni (PS) (15). L-Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data tal-OECD tiġi garantita biss wara li kwalunkwe metodu ta’ ttestjar propost ġdid jew aġġornat wara l-PS ikun ġie rieżaminat u inkluż fil-linja gwida tat-test korrispondenti tal-OECD.

DEFINIZZJONIJIET

Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

Studju tal-validazzjoni (10) u studji ppubblikati oħra (16) (17) irrapportaw li l-metodu ta’ ttestjar TER tal-ġilda tal-firien kapaċi jiddiskrimina bejn korrużivi tal-ġilda magħrufa u mhux korrużivi b’sensittività ġenerali ta’ 94 % (51/54) u bi speċifiċità ta’ 71 % (48/68) għal bażi ta’ data ta’ 122 sustanza.

Dan il-metodu ta’ ttestjar jindirizza l-korrużjoni tal-ġilda in vitro. Jippermetti l-identifikazzjoni ta’ sustanzi kimiċi tat-test mhux korrużivi u korrużivi skont il-GHS tan-NU/is-CLP. Limitazzjoni ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar, kif murija mill-istudji ta’ validazzjoni (8) (9) (10) (11), hi li dan ma jippermettix is-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi u ta’ taħlitiet korrużivi skont il-GHS tan-NU/is-CLP. Il-qafas regolatorju applikabbli jiddetermina kif se jintuża dan il-metodu ta’ ttestjar. Filwaqt li dan il-metodu ta’ ttestjar ma jipprovdix informazzjoni adegwata dwar l-irritazzjoni tal-ġilda, ta’ min jinnota li t-TM B.46 jindirizza b’mod speċifiku l-irritazzjoni tal-ġilda in vitro b’effett fuq is-saħħa (5). Għal evalwazzjoni sħiħa tal-effetti lokali fuq il-ġilda wara esponiment dermali wieħed, għandu jiġi kkonsultat id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar il-IATA (6).

Firxa wiesgħa ta’ sustanzi kimiċi li jirrappreżentaw primarjament sustanzi ġiet ittestjata fil-validazzjoni li hi l-bażi ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar u l-bażi ta’ data empirika tal-istudju ta’ validazzjoni kienet tammonta għal total ta’ 60 sustanza kimika li tkopri firxa wiesgħa ta’ klassijiet kimiċi (8) (9). Fuq il-bażi tad-data ġenerali disponibbli, dan il-metodu ta’ ttestjar hu applikabbli għal firxa wiesgħa ta’ klassijiet kimiċi u ta’ stati fiżiċi li jinkludu likwidi, semisolidi, solidi u xama’. Madankollu, peress li għal ma hemmx disponibbli għalkollox oġġetti tat-test b’data ta’ riferiment xierqa għal stati fiżiċi speċifiċi, ta’ min jinnota li matul il-validazzjoni ġie vvalutat numru komparabbilment żgħir ta’ xama’ u ta’ solidi korrużivi. Il-likwidi jistgħu jkunu jew ma jkunux milwiema; is-solidi jistgħu jkunu jew ma jkunux solubbli fl-ilma. F’każijiet li fihom tista’ tiġi pprovduta evidenza fuq in-nuqqas ta’ applikabbiltà tal-metodu ta’ ttestjar għal kategorija speċifika ta’ sustanzi, il-metodu ta’ ttestjar ma għandux jintuża għal dik il-kategorija speċifika ta’ sustanzi. Barra minn hekk, dan il-metodu ta’ ttestjar hu preżunt bħala applikabbli għal taħlitiet bħala estensjoni tal-applikabbiltà tiegħu għas-sustanzi. Madankollu, minħabba l-fatt li t-taħlitiet ikopru spettru mifrux ta’ kategoriji u ta’ kompożizzjoni, u li bħalissa hemm disponibbli biss informazzjoni limitata dwar l-ittestjar tat-taħlitiet, f’każijiet li fihom tkun tista’ tintwera evidenza fuq in-nuqqas ta’ applikabbiltà tal-metodu ta’ ttestjar għal kategorija speċifika ta’ taħlitiet (eż. skont strateġika kif proposta minn Eskes et al., 2012) (18), il-metodu ta’ ttestjar ma għandux jintuża għal dik il-kategorija speċifika ta’ taħlitiet. Qabel ma jintuża l-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju maħsub, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita. Il-gassijiet u l-aerosols għadhom ma ġewx ivvalutati fi studji ta’ validazzjoni (8) (9). Filwaqt li hu konċepibbli li dawn jistgħu jiġu ttestjati billi jintuża l-metodu ta’ ttestjar TER, il-metodu ta’ ttestjar attwali ma jippermettix l-ittestjar ta’ gassijiet u ta’ aerosols.

PRINĊIPJU TAT-TEST

10.

Is-sustanza kimika tat-test hi applikata għal mhux aktar minn 24 siegħa fuq l-uċuħ epidermiċi ta’ diski ta’ ġilda f sistema tat-test b’żewġ kompartimenti fejn id-diski tal-ġilda jaħdmu bħala s-separazzjoni bejn il-kompartimenti. Id-diski tal-ġilda jittieħdu minn firien maqtula b’mod uman ta’ età ta’ 28-30 jum. Is-sustanzi kimiċi korriżivi huma identifikati mill-abbiltà tagħhom li jipproduċu telf ta’ integrita normali ta’ stratum corneum u tal-funzjoni ta’ barrjera, li jitkejjel bħala tnaqqis fit-TER ’l isfel minn livell ta’ limitu (16) (ara l-paragrafu 32). Għat-TER tal-ġilda tal-firien, intgħażel valur ta’ limitu ta’ 5kΩ ibbażat fuq data estensiva għal varjetà kbira ta’ sustanzi fejn il-maġġoranza l-kbira ta’ valuri kienu jew sew aktar ’il fuq (spiss > 10 kΩ), jew sew aktar ’l isfel (spiss < 3 kΩ) minn dan il-valur (16). B’mod ġenerali, is-sustanzi kimiċi tat-test li mhumiex korrużivi fl-annimali iżda li huma irritanti jew mhux irritanti ma jnaqqsux it-TER inqas minn dan il-valur ta’ limitu. Barra minn hekk, l-użu ta’ preparati ta’ ġilda oħrajn jew tagħmir ieħor jista’ jibdel il-valur ta’ limitu, li jeħtieġ aktar validazzjoni.

11.

Hu inkorporat fil-proċedura tat-test pass li jorbot iż-żebgħa sabiex isir it-test ta’ konferma tar-riżultati pożittivi fit-TER inklużi valuri madwar 5 kΩ. Il-pass li jorbot iż-żebgħa jiddetermina jekk iż-żjieda fil permeabbiltà ionika hijiex minħabba qerda fiżika tal-istratum corneum. Il-metodu TER tal-ġilda tal-firien wera li jista’ jbassar il-korrużività in vivo fil-fenek ivvalutat taħt it-TM B.4 (2).

WIRI TAL-PROFIĊJENZA

12.

Qabel l-użu ta’ rutina tal-metodu ta’ ttestjar TER tal-ġilda tal-firien li jaderixxi ma’ dan il-metodu ta’ ttestjar, il-laboratorji għandhom juru profiċjenza teknika billi jikklassifikaw kif suppost tnax-il Sustanza ta’ Profiċjenza rakkomandati fit-Tabella 1. F’sitwazzjonijiet li fihom sustanza elenkata ma tkunx disponibbli jew, fejn ġustifikabbli, tista’ tintuża sustanza oħra li għaliha jkun hemm data ta’ riferiment adegwata in vivo u in vitro (eż. mil-lista ta’ sustanzi kimiċi ta’ riferiment (16)) dment li ma jiġux applikati l-istess kriterji tal-għażla bħal dawk deskritti fit-Tabella 1.

Tabella 1

Lista ta’ Sustanzi ta’ Profiċjenza (2)

Sustanza	CASRN	Klassi Kimika (3)	GHS tan-NU/CLP Kat. Ibbażata fuq Riżultati In Vivo (4)	VRM Kat. Ibbażata fuq Riżultati In Vitro	Stat Fiżiku	pH (5)
Korrużivi In Vivo
N,N’-Dimetil dipropilentriammina	10563-29-8	bażi organika	1A	6 × C	L	8,3
1,2-Diamminopropan	78-90-0	bażi organika	1A	6 × C	L	8,3
Aċidu sulfuriku (10 %)	7664-93-9	aċidu inorganiku	(1A/)1B/1C	5 × C 1 × NC	L	1,2
Idrossidu tal-potassju (10 % soluzzjoni milwiema)	1310-58-3	bażi inorganika	(1A/)1B/1C	6 × C	L	13,2
Aċidu ottanojku (Kapriliku)	124-07-2	aċidu organiku	1B/1C	4 × C 2 × NC	L	3,6
2-terz-Butilfenol	88-18-6	fenol	1B/1C	4 × C 2 × NC	L	3,9
Non korrużivi in vivo
Aċidu isosteariku	2724-58-5	aċidu organiku	NC	6 × NC	L	3,6
4-Ammino-1,2,4-triażol	584-13-4	bażi organika	NC	6 × NC	S	5,5
Fenetil bromur	103-63-9	elettrofil	NC	6 × NC	L	3,6
4-(Metiltjo)-benżaldeid	3446-89-7	elettrofil	NC	6 × NC	L	6,8
1,9-Dekadjen	1647-16-1	organiku newtrali	NC	6 × NC	L	3,9
Tetrakloroetilen	127-18-4	organiku newtrali	NC	6 × NC	L	4,5
Abbrevjazzjonijiet: aq = soluzzjoni milwiema; CASRN = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi; VRM = Metodu ta’ Referenza Validat; C = korrużiva; NC = mhux korrużiva.

PROĊEDURA

13.

Il-Proċeduri Operatorji Standard (SOP) għall-metodu ta’ ttestjar tal-korrużjoni tal-ġilda TER tal-ġilda tal-firien huma disponibbli (19). Il-metodu ta’ ttestjar TER tal-ġilda tal-firien koperti minn dan il-metodu ta’ ttestjar għandhom jikkonformaw mal-kundizzjonijiet li ġejjin:

Annimali

14.

Il-firien għandhom jintużaw għaliex is-sensittività tal-ġilda tagħhom għal sustanzi f’dan il-metodu ta’ ttestjar intweriet fl-imgħoddi (12) u huma l-uniku sors ta’ ġilda li ġie validat b’mod formali (8) (9). L-età (meta tinġabar il-ġilda) u l-ispeċi tal-far huma partikolarment importanti biex jiġi żgurat li l-follikoli tax-xahar fil-fażi dormanti qabel ma jibda t-tkabbir tax-xahar adult.

15.

Ix-xahar dorsali u tal-ġenb minn firien żgħar, ta’ età ta’ madwar 22 jum (derivati minn Wistar jew fergħa komparabbli), jitneħħa bir-reqqa b’qattiegħ ix-xahar żgħir. Imbagħad l-annimali jiġu maħsula billi jintmesħu bl-attenzjoni, filwaqt li l-parti bix-xagħar maqtugħ tiġi mgħarrqa f’taħlita antibijotika (li pereżempju, li jkun fiha streptomiċina, peniċillina, kloramfenikol, u amfoteriċina, f konċentrazzjonijiet li huma effettivi biex jinibixxu t-tkabbir tal-batterji). L-annimali jerġgħu jiġu maħsula bl-anitibjotiċi fit-tielet jew ir-raba’ jum wara l-ewwel ħasla u jintużaw fi żmien tlitt ijiem wara t-tieni ħasla, meta l-istratum corneum ikun irkupra mit-tneħħija tax-xahar.

Il-preparazzjoni tad-diski tal-ġilda

16.

L-annimali jinqatlu umanament meta jagħlqu 28-30 jum; din l-età hi kritika. Il-ġilda dorso-laterali ta’ kull annimal imbagħad titneħħa u jinqatgħalha x-xaħam subkutanju eċċess billi titqaxxar bil-galbu mill-ġilda. Id-diski tal-ġilda, b’djametru ta’ madwar 20 mm kull wieħed, jitneħħew. Il-ġilda tista’ tiġi maħżuna qabel ma jintużaw id-diski fejn jidher li d-data tal-kontroll pożittiv u negattiv tkun ekwivalenti għal dik miksuba b’ġilda friska.

17.

Kull disk tal-ġilda jitqiegħed fuq wieħed mit-truf ta’ tubu PTFE (politetrafluworoetilen), li jiżgura li l-wiċċ epidermiku hu f kuntatt mat-tubu. Ċirku “O” tal-gomma jitwaħħal billi jingħafas mat-tarf tat-tubu biex il-ġilda tinżamm f postha u t-tessut żejjed jiġi maqtugħ. Iċ-ċirku “O” tal-ġilda imbagħad jiġi ssiġġillat bir-reqqa mat-tarf tat-tubu PTFE bl-ingwent. It-tubu hu appoġġjat minn molla ġewwa parti reċettorja li fiha taħlita ta’ MgSO4 (154 mM) (Figura 1). Id-disk tal-ġilda għandha tiġi għal kollhox meqruda fit-taħlita ta’ MgSO4. Minn ġilda ta’ far wieħed jistgħu jinkisbu daqs 10 – 15-il disk tal-ġilda. Id-dimensjonijiet tat-tubu u taċ-ċirku “O” jintwerew fil-Figura 2.

18.

Qabel ma jibda l-ittestjar, it-TER taż-żewġ diski tal-ġilda jitkejlu bħala proċedura ta’ kontroll tal-kwalità għal kull ġilda tal-annimal. Iż-żewġ diski għandhom jagħtu valuri ta’ reżistenza elettrika akbar minn 10 kΩ biex jintużaw il-bqija tad-diski għall-metodu ta’ ttestjar. Jekk il-valur tar-reżistenza huwa inqas minn 10 kΩ, il-bqija tad-diski minn dik il-ġilda għandha tintrema.

Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test u tas-sustanzi tal-kontroll

19.

Għandhom jintużaw kontrolli konkorrenti pożittivi u negattivi għal kull sessjoni (esperiment) biex tiġi żgurata l-ħidma xierqa tal-mudell esperimentali. Id-diski tal-ġilda minn annimal wieħed għandhom jintużaw f’kull sessjoni (esperiment). Is-sustanzi kimiċi tat-test tal-kontroll pożittiv jew negattiv suġġeriti huma 10M aċidu idrokloriku u ilma ddistillat, rispettivament.

20.

Is-sustanzi kimiċi tat-test likwidi (150 μL) huma applikati b’mod uniformi mal-wiċċ epidermiku ġewwa t-tubu. Meta jiġu ttestjati materjali solidi, hu applikat ammont biżżejjed ta’ solidu b’mod livell fuq id-disk biex jiġi żgurat li l-wiċċ kollu tal-epidermis hu kopert. Jiżdied l-ilma deioniżżat (150 μL) fuq is-solidu u t-tubu jiġi aġitat bil-mod. Biex jinkiseb il-kuntatt massimu mal-ġilda, is-solidi jistgħu jkunu jridu jissaħħnu sa 30 ° C biex tinħall jew tiġi mrattba s-sustanza kimika tat-test, jew mitħuna biex jipproduċu materjal granurali jew terra.

21.

Jintużaw tliet diski tal-ġilda għal kull sustanza kimika tat-test u tal-kontroll f’kull sessjoni ta’ ttestjar (esperiment). Is-sustanzi kimiċi tat-test jiġu applikati għal 24 siegħa f’20-23 ° C. Is-sustanza kimika tat-test titneħħa bil-ħasil b’ġett ta’ ilma tal-vit f’temperatura li tasal sa dik ambjentali sakemm ma jifdal ebda materjal ieħor li jista’ jitneħħa.

Il-kejl tat-TER

22.

L-impedenza tal-ġilda titkejjel bħala TER bl-użu ta’ Wheatstone bridge b’vultaġġ baxx u kurrent alternanti (18). L-ispeċifikazzjonijiet ġenerali tal-bridge huma vultaġġ operattiv ta’ 1-3 Volt, kurrent sinus jew rettangolari alternat ta’ 50 - 1 000 Hz, u firxa tal-kejl ta’ mhux anqas minn 0,1 – -30 kΩ. Id-databridge użat fl-istudju tal-validazzjoni kejjel l-induttanza, il-kapaċitanza u r-reżistenza sa valuri ta’ 2 000 H, 2 000 μF, u 2 MΩ, rispettivament bi frekwenzi ta’ 100 Hz jew 1 kHz, bl-użu ta’ valuri serje jew paralleli. Għal-għanijiet tal-korrożività tat-TER il-kejl tal-figura hu rrekordjat f reżistenza, bi frekwenzi ta’ 100 Hz u bl-użu ta’ valuri serje. Qabel ma titkejjel ir-reżistenza elettrika, it-tensjoni tal-wiċċ tal-ġilda titnaqqas billi jiżdied volum suffiċjenti ta’ etanol 70 % biex ikopri l-epidermis. Wara ftit sekondi, l-ethanol jitneħħa mit-tubu u mbagħad t-tessut jiġi idratat billi tiżdied soluzzjoni ta’ 3 ml MgSO4 (154 mM). L-elettrodi tad-databridge jitqiegħdu fuq kull naħa tad-disk tal-ġilda biex titkejjel ir-reżistenza f kΩ/disk tal-ġilda (Figura 1). Id-dimensjonijiet tal-elettrodi u t-tul tal-elettrodu espost taħt il-klipep tal-kukkudrill jintwerew fil-Figura 2. Il-klipp imqabbda mal-elettrodu intern titqiegħed fuq il-wiċċ tat-tubu PTFE matul il-kejl tar-resistenza, biex ikun żgurat li jiddaħħal tul konsistenti tal-elettrodu fis-soluzzjoni ta’ MgSO4. L-elettrodu ta’ barra jitqiegħed ġewwa l-kamra riċeventi biex isserraħ fuq il-qiegħ tal-kompartiment. Id-distanza bejn il-molla u l-qiegħ tat-tubu PTFE tinżamm kostanti (Figura 2), għaliex din id-distanza taffettwa l-valur ta’ reżistenza miksub. Għalhekk, id-distanza bejn l-elettrodu ta’ ġewwa u d-disk tal-ġilda għandha tkun kostanti u minimali (1-2 mm).

23.

Jekk il-valur tar-reżistenza mkejjel ikun akbar minn 20 kΩ, dan jista’ jkun dovut għall-fdalijiet tas-sustanza kimika tat-test li jiksu l-wiċċ epidermiku tad-disk tal-ġilda. Tista’ tiġi ppruvata t-tneħħija ulterjuri ta’ din il-kisja, pereżempju, billi t-tubu PTFE jiġi ssiġillat bis-saba’ kbir b’ingwanta u jitħawwad għal madwar 10 sekondi; is-soluzzjoni ta’ MgSO4 tintrema u jerġa’ jsir il-kejl tar-reżistenza b’ MgSO4 ġdid.

24.

Il-karatteristiċi u d-dimensjonijiet tal-apparat tat-test u l-proċedura tal-esperiment użati jistgħu jinfluwenzaw il-valuri tat-TER miksuba. Il-limitu korrożiv ta’ 5 kΩ ġie żviluppat mid-data miksuba fl-apparat u fil-proċdura speċifiċi użati f dan il-metodu ta’ ttestjar. Jistgħu jgħoddu valuri differenti tal-limitu u tal-kontroll jekk jinbidlu l-kundizzjonijiet tat-test jew jintuża apparat differenti. Għalhekk, hu meħtieġ li jiġu kkalibrati l-metodoloġija u l-valuri tal-limiti tar-reżistenza bl-ittestjar ta’ serje ta’ Sustanzi ta’ Profiċjenza magħżula mis-sustanzi fl-istudju tal-validazzjoni (8) (9), jew minn klassijiet tas-sustanzi kimiċi li jkunu simili għas-sustanzi li jkunu qed jiġu investigati. Sett ta’ Sustanzi ta’ Profiċjenza xierqa hu identifikat fit-Tabella 1.

Metodi ta’ Fissazzjoni tal-Kulurant

25.

L-esponiment ta’ xi materjali mhux korrużivi jista’ jirriżulta fi tnaqqis tar-reżistenza ’l isfel mil-limitu ta’ 5 kΩ li jippermetti l-mogħdija ta’ joni mill-istratum corneum, u b’hekk titnaqqas ir-reżistenza elettrika (9). Pereżempju, l-organiċi newtri u s-sustanzi li għandhom karatteristiċi tensjoattivi (inklużi deterġenti, emulsifikanti u tensjoattivi oħrajn) jistgħu jneħħu l-lipidi tal-ġilda b’tali mod li jagħmlu l-barriera aktar permeabbli għall-joni. Għalhekk, jekk il-valuri TER prodotti mit-tali sustanzi kimiċi jkunu anqas minn jew madwar 5 kΩ fin-nuqqas ta’ dannu viżwalment perċettibbli tad-diski tal-ġilda, tista’ ssir valutazzjoni tal-penetrazzjoni tal-kulurant fuq it-tessuti tal-kontroll u dawk trattati biex jiġi determinat jekk il-valuri tat-TER miksuba kinux ir-riżultat tal-permeabbiltà akbar tal-ġilda, jew tal-korrużjoni tal-ġilda (7) (9). Fil-każ tal-aħħar fejn jinqasam l-istratum corneum, il-kulurant sulforodammina B, meta applikat mas-superfiċje tal-ġilda, jippenetra malajr u jtebba’ t-tessut ta’ taħt. Dan il-kulurant partikolari hu stabbli għal varjetà kbira ta’ sustanzi u mhuwiex affettwat mill-proċedura tal-estrazzjoni deskritta hawn taħt.

Applikazzjoni u Tneħħija tal-kulurant Sulforodammina B

26.

Wara l-valutazzjoni tat-TER, is-sulfat tal-manjeżju jintrema mit-tubu u l-ġilda tiġi eżaminata bir-reqqa għal dannu ovvju. Jekk ma jkun hemm ebda dannu maġġuri ovvju (eż. perforazzjoni), 150 μl ta’ dilwizzjoni ta’ 10 % (w/v) fl-ilma distillat tal-kulurant sulforodammina B (Aħmar Aċidu 52; C.I. 45100; Numru CAS 3520-42-1), tiġi applikata għall-wiċċ epidermiku ta’ kull disk tal-ġilda għal sagħtejn. Dawn id-diski tal-ġilda mbagħad jinħaslu bl-ilma tal-vit sa temperatura ambjentali għal madwar 10 sekondi biex jitneħħa l-kulurant eċċessiv/mhux użat. Kull disk tal-ġilda mbagħad jitneħħa bl-attenzjoni mit-tubu PTFE u jitqiegħed f’kunjett (eż. flixkun tal-ħġieġ tax-xintillazzjoni ta’ 20 ml) li jkun fih ilma dejonizzat (8 ml). Il-fliexken jiġu aġitati bil-mod għal ħames minuti biex jitneħħa kulurant żejjed mhux użat. Din il-proċedura ta’ tlaħliħ imbagħad tiġi ripetuta, u wara dan jitneħħew id-diski tal-ġilda u jitqiegħdu fi fliexken li fihom 5 ml ta’ 30 % (w/v) dodeċilsulfat tas-sodju (SDS) fl-ilma distillat u jiġu inkubati mal-lejl f’temperatura ta’ 60 ° C.

27.

Wara l-inkubazzjoni, kull disk tal-ġilda jitneħħa u jintrema u l-bqija tas-soluzzjoni tiġi ċċentrifugata għal tmien minuti f’temperatura ta’ 21 ° C (forza relattiva ċentrifugali ~175 × g). Kampjun ta’ 1 ml tas-supernatant jiġi dilwit 1 f’5 (v/v) [jiġifieri 1 ml + 4 ml] ma’ 30 % (w/v) SDS fl-ilma ddistillat. Id-densità ottika (OD) tas-soluzzjoni titkejjel f’565 nm.

Il-kalkolu tal-kontenut tal-kulurant

28.

Il-kontenut tal-kulurant sulforodammina B għal kull disk jiġi kkalkolat mill-valuri OD (9) (koeffiċjent ta’ estinzjoni molari tal-kulurant sulforodammina B ta’ 565 mm = 8,7 × l04; piż molekolari = 580). Il-kontenut tal-kulurant jiġi determinat għal kull disk tal-ġilda bl-użu ta’ kurva xierqa tal-kalibrazzjoni u l-kontenut medju tal-kulurant imbagħad jiġi kkalkolat għar-repliki.

Kriterji ta’ Aċċettabbiltà

29.

Ir-riżultati medji tat-TER huma aċċettati jekk il-valuri tal-kontroll pożittiv u negattiv konkorrenti jaqgħu fl-iskali aċċettabbli għall-metodi fil-laboratorju tat-test. L-iskali aċċettabli tar-reżistenza għall-metodoloġija u l-apparat deskritti hawn fuq jingħataw f’din it-tabella li ġejja:

Kontroll	Sustanza	Medda ta’ reżistenza (kΩ)
Pożittiv	10M Aċidu idrokloriku	0,5 - 1,0
Negattiv	Ilma distillat	10 - 25

30.

Ir-riżultati medji tal-fissazzjoni tal-kulurant jiġu aċċettati b’kundizzjoni li l-valuri konkorrenti tal-kontroll jaqgħu fil-meded aċċettabbli għall-metodu. Meded aċċettabbli suġġeriti tal-kontenut tal-kulurant għas-sustanzi tal-kontroll għall-metodoloġija u għall-apparat deskritti hawn fuq jingħataw fit-tabella li ġejja:

Kontroll	Sustanza	Medda ta’ kontenut tal-kulurant (μg/disk)
Pożittiv	10M Aċidu idrokloriku	40 - 100
Negattiv	Ilma distillat	15 - 35

Interpretazzjoni tar-riżultati

31.

Il-valur ta’ limitu TER li jiddistingwi sustanzi kimiċi tat-test korrużivi minn dawk mhux korrużivi ġie stabbilit matul l-ottimizzazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar, ittestjat matul fażi ta’ prevalidazzjoni, u kkonfermat fi studju ta’ validazzjoni formali.

32.

Il-mudell ta’ tbassir għall-metodu ta’ ttestjar tal-korrużjoni tal-ġilda TER tal-ġilda tal-firien (9) (19), assoċjat mas-sistema ta’ klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU/tas-CLP, hu pprovdut hawn taħt:

Is-sustanza kimika tat-test titqies li mhix korrużiva għall-ġilda:

i)	jekk il-valur TER medju miksub għas-sustanza kimika tat-test ikun akbar minn (>) 5kΩ, jew

ii)

il-valur TER medju miksub għas-sustanza kimika tat-test ikun anqas jew daqs (≤) 5kΩ, u

—	id-diski tal-ġilda ma juru ebda dannu ovvju (eż. perforazzjoni), u

—	il-kontenut medju ta’ kulurant tad-disk jkun anqas (<) mill-kontenut medju ta’ kulurant tad-disk tal-kontroll pożittiv 10M Hcl miksub b’mod konkorrenti (ara l-paragrafu 30 għall-valuri tal-kontroll pożittiv).

Is-sustanza kimika tat-test titqies li hi korrużiva għall-ġilda:

i)	jekk il-valur TER medju miksub għas-sustanza kimika tat-test ikun anqas minn jew daqs (≤) 5 kΩ u d-diski tal-ġilda jkollhom dannu ovvju (eż. perforati), jew

ii)

il-valur TER medju miksub għas-sustanza kimika tat-test ikun anqas jew daqs (≤) 5kΩ, u

—	id-diski tal-ġilda ma juru ebda dannu ovvju (eż. perforazzjoni), iżda

—	il-kontenut medju ta’ kulurant tad-disk jkun akbar (>) mill-kontenut medju ta’ kulurant tad-disk tal-kontroll pożittiv 10M Hcl miksub b’mod konkorrenti (ara l-paragrafu 30 għall-valuri tal-kontroll pożittiv).

33.

Sessjoni ta’ ttestjar (esperiment) magħmula minn tal-anqas tliet diski tal-ġilda rreplikati għandha tkun biżżejjed għal sustanza kimika tat-test meta l-klassifikazzjoni tkun inekwivokabbli. Madankollu, f’każijiet ta’ riżultati li joqorbu ħafna lejn il-limitu, bħal pereżempju kejl irreplikat mhux konkordanti u/jew TER medja daqs 5 ± 0,5 kΩ, għandha tiġi kkunsidrata t-tieni sessjoni ta’ ttestjar indipendenti (esperiment), kif ukoll it-tielet waħda f’każ ta’ riżultati mhux konkordanti bejn l-ewwel żewġ sessjonijiet ta’ ttestjar (esperimenti).

DATA U RAPPORTAR

Data

34.

Il-valuri tar-reżistenza (kΩ) u l-valuri tal-kontenut tal-kulurant (μg/disk), fejn xieraq, għas-sustanza kimika tat-test, kif ukoll għall-kontrolli pożittivi u negattivi għandhom jiġu rrapportati f’forma tabulari, inkluża d-data għal kull disk rreplikat individwali f’kull sessjoni ta’ ttestjar (esperiment) u l-valuri medji ± SD. L-esperimenti ripetuti kollha għandhom jiġu rrapportati. Id-dannu osservat fid-diski tal-ġilda għandu jiġi rrapportat għal kull sustanza kimika tat-test.

Rapport tat-test

35.

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Sustanza Kimika tat-Test u Sustanzi tal-Kontroll:

—	Sustanza monokostitwenti: l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ;

—	Sustanza multikostitwenti, UVCB u taħlita: ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti;

—	Id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;

—	Is-sors, in-numru tal-lott jekk disponibbli;

—	It-trattament tas-sustanza kimika tat-test/tas-sustanza tal-kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (eż., it-tisħin, it-tħin);

—	L-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test, id-data ta’ limitu għall-użu, jew id-data għall-analiżi mill-ġdid, jekk magħrufa;

—	Il-kundizzjonijiet tal-ħżin.

Annimali tat-Test:

—	Razza u sess użati;

—	L-età tal-annimali meta użati bħala annimali donaturi;

—	Is-sors, il-kundizzjoni tal-abitazzjoni, id-dieta, eċċ.;

—	Id-dettalji tal-preparazzjoni tal-ġilda.

Kundizzjonijiet tat-Test:

—	Il-kurvi tal-kalibrazzjoni għall-apparat tat-test;

—	Il-kurvi tal-kalibrazzjoni għat-twettiq tat-test tal-fissazzjoni tal-kulurant, il-band pass użat għall-kejl tal-valuri tal-OD, u l-medda tal-linearità tal-OD tal-apparat tal-kejl (eż. spettrofotometru), jekk xieraq;

—	Id-dettalji tal-proċedura tat-test użata biex titkejjel it-TER;

—	Dettalji tal-proċedura tat-test użata għall-valutazzjoni tal-fissazzjoni tal-kulurant, jekk xieraq;

—	Id-dożi tat-test użati, id-durata tal-perjodu/i tal-esponiment u t-temperatura/i tal-esponiment;

—	Dettalji dwar il-proċedura tal-ħasil użata wara l-perjodu tal-esponiment;

—	In-numru ta’ diski tal-ġilda rreplikati użati għal kull sustanza kimika tat-test u kontroll (kontroll pożittiv u negattiv);

—	Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test;

—

Referenza għad-data storika tal-mudell. Din għandha tinkludi, iżda ma għandhiex tkun limitata għal:

i)	Aċċettabbiltà tal-valuri TER tal-kontrolli pożittivi u negattivi (f’kΩ) b’referenza għall-meded tar-reżistenza tal-kontrolli pożittivi u negattivi

ii)	Aċċettabbiltà tal-valuri tal-kontenut tal-kulurant tal-kontrolli pożittivi u negattivi (f’μg/disk) b’referenza għall-meded tal-kontenut tal-kulurant tal-kontrolli pożittivi u negattivi

iii)	Aċċetabbiltà tar-riżultati tat-test b’referenza għall-varjabbiltà storika bejn ir-repliki tad-diski tal-ġilda

—	Deskrizzjoni tal-kriterji ta’ deċiżjoni/tal-mudell ta’ tbassir applikati.

Ir-riżultati:

—

Tabulazzjoni tad-data mill-assaġġi tat-TER u tal-fissazzjoni tal-kulurant (jekk xieraq) għal sustanzi kimiċi tat-test u għal kontrolli individwali, għal kull sessjoni ta’ ttestjar (esperiment) u għal kull replika tad-diski tal-ġilda (annimali individwali u kampjuni tal-ġilda individwali), medji, SDs u CVs;

—	Deskrizzjoni ta’ kwalunkwe effett osservat;

—	Il-klassifikazzjoni derivata b’referenza għall-mudell ta’ tbassir/għall-kriterji tad-deċiżjoni użati.

Diskussjoni tar-riżultati

Konklużjonijiet

DOKUMENTAZZJONI

(1)	In-Nazzjonijiet Uniti (NU) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York u Ġinevra, 2013. Disponibbli fuq: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)	Il-Kapitolu B.4 ta’ dan l-Anness, Irritazzjoni, Korrużjoni Akuta tal-Ġilda.

(3)	Il-Kapitolu B.40bis ta’ dan l-Anness, Mudell tal-Ġilda In Vitro.

(4)	Il-Kapitolu B.65 ta’ dan l-Anness, Metodu ta’ Ttestjar tal-Barriera tal-Membrana In Vitro.

(5)	Il-Kapitolu B.46 ta’ dan l-Anness, Irritazzjoni tal-Ġilda In Vitro: Metodu ta’ Ttestjar tal-Epidermis Uman Rikostitwit.

(6)	OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.

(7)

Botham P.A., Chamberlain M., Barratt M.D., Curren R.D., Esdaile D.J., Gardner J.R., Gordon V.C., Hildebrand B., Lewis R.W., Liebsch M., Logemann P., Osborne R., Ponec M., Regnier J.F., Steiling W., Walker A.P., u Balls M. (1995). A Prevalidation Study on In Vitro Skin Corrosivity Testing. The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 6.ATLA 23, 219-255.

(8)	Barratt M.D., Brantom P.G., Fentem J.H., Gerner I., Walker A.P., u Worth A.P. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Skin Corrosivity. 1. Selection and Distribution of the Test Chemicals. Toxic.In Vitro 12, 471-482.

(9)	Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., u Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., u Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

(11)	ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)	EC-ECVAM (1998). Dikjarazzjoni dwar il-Validità Xjentifika tat-Test ta’ Reżistenza Elettrika Transkuntanja tal-Ġilda tal-Firien (TER) (Test In Vitro għall-Korrużività tal-Ġilda), Maħruġa mill-Kumitat Konsultattiv Xjentifiku tal-ECVAM (ESAC10), 3 ta’ April 1998.

(13)	ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OECD (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.

(16)	Oliver G.J.A., Pemberton M.A., u Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)	Botham P.A., Hall T.J., Dennett R., McCall J.C., Basketter D.A., Whittle E., Cheeseman M., Esdaile D.J., u Gardner J. (1992). The Skin Corrosivity Test In Vitro: Results of an Interlaboratory Trial. Toxicol. In Vitro 6,191-194.

(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. u Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)	TER SOP (Diċembru 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)	OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.

Figura 1

Apparat Għall-Assaġġ Tat-Ter Tal-Ġilda Tal-Firien

Figura 2

Dimensjonijiet Tat-Tubu Tal-Politetrafluworoetilen (Ptfe) U T-Tubi Reċettorji U L-Elettrodi Użati

Il-fatturi kritiċi tal-apparat muri fuq:

—	Id-djametru ġewwieni tat-tubu tal-PTFE,

—	It-tul tal-elettrodi relattivi għat-tubu tal-PTFE u t-tubu reċettorju, b’tali mod li d-disk tal-ġilda ma għandux jintmess mill-elettrodi u li tul standard tal-elettrodu hu f’kuntatt mas-soluzzjoni MgSO4;

—	L-ammont tas-soluzzjoni MgSO4 fit-tubu reċettorju għandu jagħti fond ta’ likwidu, relattiv għal-livell fit-tubu tal-PTFE, kif muri fil-Figura 1,

—	Id-disk tal-ġilda għandu jitwaħħal tajjeb biżżejjed mat-tubu tal-PTFE, b’tali mod li r-reżistenza elettrika tkun kejl veru tal-karatteristiċi tal-ġilda.

Appendiċi

DEFINIZZJONIJIET

Akkuratezza : Il-qrubija fil-livell ta’ qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta’ ttestjar u l-valuri referenzjarji aċċettati. Hi kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar u wieħed mill-aspetti ta’ rilevanza. Spiss it-terminu jintuża b’mod alternanti ma’ “konkordanza” biex ifisser il-proporzjon ta’ riżultati korretti ta’ metodu ta’ ttestjar (20).

C : Korrużiv.

Sustanza kimika : Sustanza jew taħlita.

Konkordanza : Kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar għal metodi ta’ ttestjar li jagħtu riżultat kategoriku, u hu aspett wieħed tar-rilevanza. It-terminu kultant jintuża b’mod interkambjabbli mal-akkuratezza, u hu definit bħala l-proporzjon tas-sustanzi kimiċi kollha ttestjati li jiġu klassifikati kif suppost bħala pożittivi jew negattivi. Il-konkordanza hi ferm dipendenti fuq il-prevalenza tal-pożittivi fit-tipi ta’ sustanzi kimiċi tat-test li jkunu qed jiġu eżaminati (20).

GHS (Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi (NU)) : Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta’ perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta’ komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta’ twissija, dikjarazzjonijiet ta’ periklu, dikjarazzjonijiet ta’ prekawzjoni u skedi ta’ data dwar is-sikurezza, biex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u min jintervjeni f’emerġenza) u l-ambjent (1).

IATA : Approċċ Integrat għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni

Taħlita : Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew aktar.

Sustanza monokostitwenti : Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha kostitwent ewlieni wieħed ikun preżenti għal tal-anqas 80 % (w/w).

Sustanza multikostitwenti : Sustanza, definita mill-kompożizzjoni kwantitattiva tagħha, li fiha aktar minn kostitwent ewlieni wieħed ikunu preżenti f’konċentrazzjoni ≥ 10 % (w/w) u < 80 % (w/w). Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ proċess tal-manifattura. Id-differenza bejn taħlita u sustanza multikostitwenti hi li taħlita tinkiseb bit-tħallit ta’ żewġ sustanzi jew aktar mingħajr reazzjoni kimika. Sustanza multikostitwenti hi r-riżultat ta’ reazzjoni kimika.

NC : Mhux korrużiva.

OD : Densità Ottika.

PC : Kontroll Pożittiv, replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta’ sistema tat-test u trattat b’sustanza li jkun magħruf li tikkawża reazzjoni pożittiva. Biex jiġi żgurat li l-varjabbiltà fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista’ tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.

Standards tal-prestazzjoni (PS) : Standards, ibbażati fuq metodu ta’ ttestjar validat, li jipprovdu bażi għall-evalwazzjoni tal-komparabbiltà ta’ metodu ta’ ttestjar propost li hu simili b’mod funzjonali u mekkanistiku. Hemm inklużi; (i) il-komponenti essenzjali tal-metodi ta’ ttestjar; (ii) lista minima ta’ Sustanzi Kimiċi ta’ Referenza magħżula minn fost is-sustanzi kimiċi użati biex tintwera l-prestazzjoni aċċettabbli tal-metodu ta’ ttestjar validat; u (iii) il-livelli simili ta’ affidabbiltà u ta’ akkuratezza, fuq il-bażi ta’ dak li nkiseb għall-metodu ta’ ttestjar validat, li l-metodu ta’ ttestjar propost għandu juri meta evalwat bl-użu tal-lista minima ta’ Sustanzi Kimiċi ta’ Referenza.

Rilevanza : Deskrizzjoni tar-relazzjoni tal-metodu ta’ ttestjar mal-effett ta’ interess u jekk huwiex sinifikanti u utli għal skop partikolari. Din tiddetermina kemm il-metodu ta’ ttestjar għandu l-ħila jkejjel jew ibassar b’mod korrett l-effett bijoloġiku ta’ interess. Ir-rilevanza tinkorpora l-kunsiderazzoni tal-akkuratezza (konkordanza) ta’ metodu ta’ ttestjar (20).

Affidabbiltà : Kejlijiet ta’ kemm metodu ta’ ttestjar jista’ jitwettaq b’mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Din hi vvalutata billi tiġi kkalkolata r-riproduċibbiltà fi ħdan laboratorju u bejn laboratorju u ieħor (20).

Sensittività : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi/attivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-metodu ta’ ttestjar. Hi kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta’ ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ metodu ta’ ttestjar (20).

Korrużjoni tal-ġilda in vivo : Il-produzzjoni ta’ dannu irriversibbli fil-ġilda; jiġifieri nekrożi viżibbli mill-epidermis u ġewwa d-dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test għal mhux aktar minn erba’ sigħat. Ir-reazzjonijiet korrossivi huma kkaratterizzati minn ulċeri, fsad, qxur bid-demm, u, fit-tmiem tal-osservazzjoni fl-14-il jum, minn skulurazzjoni minħabba t-tibjid tal-ġilda, żoni sħaħ b’alopeċja, u ċikatriċi L-istopatoloġija għandha titqies biex jiġu evalwati leżjonijiet li dwarhom hemm dubju.

Speċifiċità : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi/inattivi kollha li huma klassifikati kif suppost mill-metodu ta’ ttestjar. Hi kejl tal-preċiżjoni għal metodu ta’ ttestjar li jipproduċi riżultati kategoriċi, u hi kunsiderazzjoni importanti fil-valutazzjoni tar-relevanza ta’ metodu ta’ ttestjar (20).

Sustanza : Element kimiku u l-komposti tiegħu fl-istat naturali jew mislut minn kwalunkwe proċess ta’ produzzjoni, li jinkludi kull addittiv neċessarju għall-preżervazzjoni tal-istabbiltà tiegħu u kwalunkwe impurità li tirriżulta mill-proċess użat, iżda bl-esklużjoni ta’ kull solvent li jista’ jkun separat mingħajr ma tkun effettwata l-istabbiltà tas-sustanza jew mibdula l-kompożizzjoni tagħha.

Sessjoni (ta’ ttestjar) : Sustanza kimika tat-test waħda testjata b’mod konkorrenti f’minimu ta’ tliet diski tal-ġilda rreplikati.

Sustanza kimika tat-test : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.

Reżistenza Elettrika Transkutanja (TER) : hi kejl tal-impendenza elettrika tal-ġilda, bħala valur ta’ reżistenza f’kilo Ohms. Metodu sempliċi u robust biex tiġi stmata l-funzjoni ta’ barrjera bir-rekordjar tal-passaġġ tal-joni mill-ġilda bl-użu ta’ apparat Wheatstone bridge.

UVCB : Sustanzi kimiċi b’kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, prodotti jew materjali bijoloġiċi b’reazzjoni kumplessa.

”

(6)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.40bis hu ssostitwit b’dan li ġej:

“B.40bis KORRUŻJONI TAL-ĠILDA IN VITRO: METODU TA’ TTESTJAR TAL-EPIDERMIS UMAN RIKOSTITWIT (RhE)

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 431 tal-OECD (2016). Il-korrużjoni tal-ġilda tirreferi għall-produzzjoni ta’ ħsara irreversibbli għall-ġilda li tidher bħala nekrożi viżibbli permezz tal-epidermis u fid-dermis, wara l-applikazzjoni ta’ sustanza kimika tat-test [kif definita mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta’ Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) u mir-Regolament tal-Unjoni Ewropea (UE) 1272/2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet (CLP) (6)]. Dan il-metodu ta’ ttestjar aġġornat B.40bis jipprovdi proċedura in vitro li tippermetti li jiġu identifikati sustanzi u taħlitiet mhux korrużivi u korrużivi skont il-GHS tan-NU u s-CLP. Jippermetti wkoll subkategorizzazzjoni parzjali tal-korrużivi.

Il-valutazzjoni tal-potenzjal ta’ korrużjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi tipikament kienet tinvolvi l-użu ta’ annimali tal-laboratorju (TM B.4 ekwivalenti għat-TG 404 tal-OECD; oriġinarjament adottata fl-1981 u riveduta fl-1992, fl-2002 u fl-2015) (2). Minbarra l-metodu ta’ ttestjar B.40bis preżenti, żewġ metodi ta’ ttestjar in vitro oħra għall-ittestjar tal-potenzjal ta’ korrużjoni tas-sustanzi kimiċi ġew validati u adottati bħala TM B.40 (ekwivalenti għat-TG 430 tal-OECD) (3) u TM B.65 (ekwivalenti għat-TG 435 tal-OECD) (4). Barra minn hekk, it-TM B.46 in vitro (ekwivalenti għat-TG 439 tal-OECD) (5) ġie adottat għall-ittestjar tal-potenzjal ta’ irritazzjoni tal-ġilda. Dokument ta’ gwida tal-OECD dwar Approċċi Integrati għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni (IATA) għall-Korrużjoni u għall-Irritazzjoni tal-Ġilda jiddeskrivi diversi moduli li jiġbru fihom sorsi ta’ informazzjoni u għodod ta’ valutazzjoni, u jipprovdi gwida dwar (i) kif tintegra u tuża d-data eżistenti dwar l-ittestjar u mhux tal-ittestjar għall-valutazzjoni tal-potenzjali ta’ irritazzjoni tal-ġilda u ta’ korrużjoni tal-ġilda tas-sustanzi kimiċi u (ii) jipproponi approċċ fejn ikun meħtieġ ittestjar ulterjuri (6).

Dan il-metodu ta’ ttestjar jindirizza l-korrużjoni tal-ġilda tal-punt tat-tmiem tas-saħħa umana. Jagħmel użu minn epidermis uman rikostitwit (RhE) (miksub minn keratinoċiti epidermali mhux trasformati derivati mill-bniedem) li jimita mill-qrib il-proprjetajiet istoloġiċi, morfoloġiċi, bijokimiċi u fiżjoloġiċi tal-partijiet ta’ fuq tal-ġilda tal-bniedem, jiġifieri l-epidermis. Il-linja gwida korrispondenti tal-OECD oriġinarjament ġiet adottata fl-2004 u aġġornata fl-2013 biex tinkludi metodi ta’ ttestjar addizzjonali bl-użu tal-mudelli RhE u l-possibbiltà li jintużaw il-metodi għas-sostenn tas-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi kimiċi korrużivi, u aġġornata fl-2015 biex tirreferi għad-dokument ta’ gwida tal-IATA u tintroduċi l-użu ta’ proċedura alternattiva għall-kejl tal-vijabbiltà.

F’dan il-metodu ta’ ttestjar huma inklużi erba’ mudelli RhE kummerċjalment disponibbli. Saru (11) (12) studji ta’ prevalidazzjoni (7), segwiti minn studju formali ta’ validazzjoni għall-valutazzjoni tal-korrużjoni tal-ġilda (8)(9)(10) għal tnejn minn dawn il-mudelli tat-test kummerċjalment disponibbli, EpiSkin™ Standard Model (SM) u EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200) (imsejħa fit-test segwenti bħala l-Metodi ta’ Referenza Validat - VRMs). L-eżitu ta’ dawn l-istudji wassal għar-rakkomandazzjoni li ż-żewġ VRMs imsemmija hawn fuq jistgħu jintużaw għall-finijiet regolatorji ta’ distinzjoni ta’ sustanzi korrużivi (C) minn sustanzi mhux korrużivi (NC), u li barra minn hekk EpiSkin™ jista’ jintuża biex isostni s-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi korrużivi (13)(14)(15). Żewġ mudelli oħra tat-test RhE tal-korrużjoni tal-ġilda in vitro disponibbli kummerċjalment urew riżultati simili għall-VRM EpiDerm™ skont il-validazzjoni bbażata fuq il-PS (16)(17)(18). Dawn huma SkinEthic™ RHE (7) u epiCS® (qabel imsejħa EST-1000) li jistgħu jintużaw ukoll għall-finijiet regolatorji ta’ distinzjoni tas-sustanzi korrużivi minn dawk mhux korrużivi (19)(20). L-istudji ta’ wara l-validazzjoni mwettqa mill-produtturi tal-mudell tal-RhE fis-snin 2012 sal-2014 bi protokoll irfinut li jikkoreġi interferenzi ta’ tnaqqis mhux speċifiku ta’ MTT mis-sustanzi kimiċi tat-test tejbu l-prestazzjoni kemm fid-diskriminazzjoni tas-C/NC kif ukoll fis-sostenn tas-subkategorizzazzjoni tal-korrużivi (21)(22). Analiżijiet statistiċi ulterjuri tad-data ta’ wara l-validazzjoni ġġenerata b’EpiDerm™ SCT, bi SkinEthic™ RHE u b’EpiCS® saru bl-għan li jidentifikaw mudelli ta’ tbassir alternattivi li tejbu l-kapaċità ta’ tbassir għas-subkategorizzazzjoni (23).

Qabel ma metodu ta’ ttestjar tal-RhE in vitro simili jew modifikat propost għall-korrużjoni tal-ġilda li mhuwiex il-VRMs ikun jista’ jintuża għall-finijiet regolatorji, l-ewwel għandhom jiġu determinati l-affidabbiltà, ir-rilevanza (preċiżjoni), u l-limitazzjonijiet tiegħu biex tiġi żgurata s-similarità tiegħu għall-VRMs, skont ir-rekwiżiti tal-Istandards tal-Prestazzjoni (PS) (24) stabbiliti skont il-prinċipji tad-dokument ta’ gwida Nru 34 tal-OECD (25). L-Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data tiġi garantita biss wara li kwalunkwe metodu ta’ ttestjar propost ġdid jew aġġornat wara l-PS ikun ġie rieżaminat u inkluż fil-linja gwida tat-test korrispondenti. Il-mudelli tat-test inklużi fil-linja gwida tat-test jistgħu jintużaw biex jindirizzaw ir-rekwiżiti tal-pajjiżi għar-riżultati tat-testijiet fuq il-metodu ta’ ttestjar in vitro għall-korrużjoni tal-ġilda, filwaqt li jibbenefikaw mill-Aċċettazzjoni Reċiproka tad-Data.

DEFINIZZJONIJIET

Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

Dan il-metodu ta’ ttestjar jippermetti li jiġu identifikati sustanzi u taħlitiet mhux korrużivi u korrużivi skont il-GHS tan-NU u s-CLP. Dan il-metodu ta’ ttestjar ikompli jsostni s-subkategorizzazzjoni ta’ sustanzi u ta’ taħlitiet korrużivi fis-subkategorija fakultattiva 1A, skont il-GHS tan-NU (1), kif ukoll taħlita tas-subkategoriji 1B u 1C (21)(22)(23). Limitazzjoni ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar hi li ma jippermettix id-diskriminazzjoni bejn is-subkategorija 1B u s-subkategorija 1C tal-korrużivi tal-ġilda skont il-GHS tan-NU u s-CLP minħabba s-sett limitat ta’ sustanzi kimiċi korrużivi in vivo ferm magħrufa tas-subkategorija 1C. Il-mudelli tat-test EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE u epiCS® jistgħu jiġu subkategorizzati (jiġifieri 1A kontra 1B-u-1C kontra NC)

Firxa wiesgħa ta’ sustanzi kimiċi li primarjament tirrappreżenta sustanzi individwali ġiet ittestjata fil-validazzjoni li ssostni l-mudelli tat-test inklużi f’dan il-metodu ta’ ttestjar meta jintużaw għall-identifikazzjoni ta’ sustanzi mhux korrużivi u korrużivi; il-bażi ta’ data empirika tal-istudju ta’ validazzjoni kien fiha 60 sustanza kimika li jkopru firxa wiesgħa ta’ klassijiet kimiċi (8)(9)(10). L-ittestjar biex jintwerew is-sensittività, l-ispeċifiċità, l-akkuratezza u ir-riproduċibbiltà fi ħdan il-laboratorju tal-assaġġ għas-subkategorizzazzjoni sar mill-iżviluppaturi tal-metodu ta’ ttestjar u r-riżultati ġew rieżaminati mill-OECD (21) (22) (23). Fuq il-bażi tad-data ġenerali disponibbli, dan il-metodu ta’ ttestjar hu applikabbli għal firxa wiesgħa ta’ klassijiet kimiċi u ta’ stati fiżiċi li jinkludu likwidi, semisolidi, solidi u xama’. Il-likwidi jistgħu jkunu jew ma jkunux milwiema; is-solidi jistgħu jkunu jew ma jkunux solubbli fl-ilma. Kull meta dan ikun possibbli, is-solidi għandhom jiġu mitħuna fi trab fin qabel ma jiġu applikati; mhu meħtieġ ebda trattament preċedenti ieħor tal-kampjun. F’każijiet li fihom tista’ tiġi pprovduta evidenza fuq in-nuqqas ta’ applikabbiltà tal-mudelli tat-test inklużi f’dan il-metodu ta’ ttestjar għal kategorija speċifika ta’ sustanzi kimiċi tat-test, dawn ma għandhomx jintużaw għal dik il-kategorija speċifika ta’ sustanzi kimiċi tat-test. Barra minn hekk, dan il-metodu ta’ ttestjar hu preżunt bħala applikabbli għal taħlitiet bħala estensjoni tal-applikabbiltà tiegħu għas-sustanzi. Madankollu, minħabba l-fatt li t-taħlitiet ikopru spettru mifrux ta’ kategoriji u ta’ kompożizzjoni, u li bħalissa hemm disponibbli biss informazzjoni limitata dwar l-ittestjar tat-taħlitiet, f’każijiet li fihom tkun tista’ tintwera evidenza fuq in-nuqqas ta’ applikabbiltà tal-metodu ta’ ttestjar għal kategorija speċifika ta’ taħlitiet (eż. skont strateġika kif proposta f’(26)), il-metodu ta’ ttestjar ma għandux jintuża għal dik il-kategorija speċifika ta’ taħlitiet. Qabel ma jintuża l-metodu ta’ ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta’ data għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet mhumiex meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita. Il-gassijiet u l-aerosols għadhom ma ġewx ivvalutati fi studji ta’ validazzjoni (8)(9)(10). Filwaqt li huwa mifhum li dawn jistgħu jiġu ttestjati billi tintuża t-teknoloġija tal-RhE, il-metodu ta’ ttestjar attwali ma jippermettix l-ittestjar ta’ gassijiet u ta’ aerosols.

Is-sustanzi kimiċi tat-test li jassorbu d-dawl fl-istess medda bħal MTT formażan u s-sustanzi kimiċi tat-test li kapaċi jnaqqsu direttament l-MTT tal-kulurant vitali (għal MTT formażan) jistgħu jinterferixxu mal-kejlijiet tal-vijabbiltà tat-tessut u jkollhom bżonn l-użu ta’ kontrolli adattati għall-korrezzjonijiet. It-tip ta’ kontrolli adattati li jistgħu jkunu meħtieġa se jvarja skont it-tip ta’ interferenza prodotta mis-sustanza kimika tat-test u l-proċedura użata biex jitkejjel MTT formażan (ara l-paragrafi 25-31).

10.

Filwaqt li dan il-metodu ta’ ttestjar ma jipprovdix informazzjoni adegwata dwar l-irritazzjoni tal-ġilda, ta’ min jinnota li t-TM B.46 jindirizza b’mod speċifiku l-irritazzjoni tal-ġilda in vitro b’effett fuq is-saħħa u hu bbażat fuq l-istess sistema tat-test tal-RhE, bl-użu ta’ protokoll ieħor (5). Għal evalwazzjoni sħiħa tal-effetti lokali fuq il-ġilda wara esponiment dermali wieħed, għandu jiġi kkonsultat id-Dokument ta’ Gwida tal-OECD dwar l-Approċċi Integrati għall-Ittestjar u għall-Valutazzjoni (6). Dan l-approċċ tal-IATA jinkludi t-twettiq ta’ testijiet in vitro għall-korrożjoni tal-ġilda (bħal kif deskritt f’dan il-metodu ta’ ttestjar) u l-irritazzjoni tal-ġilda qabel ma jitqies l-ittestjar fl-annimali ħajjin. Hu rikonoxxut li l-użu ta’ ġilda umana hu soġġett għal konsiderazzjonijiet u kundizzjonijiet etiċi nazzjonali u internazzjonali.

PRINĊIPJU TAT-TEST

11.

Is-sustanza kimika tat-test hi applikata b’mod topiku għal mudell tal-RhE tridimensjonali, ifformata minn keratinoċiti mhux trasformati mnissla mill-epidermis uman, li ffurmaw ruħhom f’mudell b’diversi saffi, ferm differenzjat ta’ epidermis uman. Din tikkonsisti f’saff tal-qiegħ, f’saff spinuż u f’saff granulari organizzati, u fi stratum corneum b’diversi saffi li jkun fih saffi lipidi lamellari interċellolari li jirrappreżentaw il-klassijiet lipidi ewlenin b’mod analogu għal dawk li jinstabu in vivo.

12.

Il-metodu ta’ ttestjar tal-RhE hu bbażat fuq il-premessa li s-sustanzi kimiċi korrużivi jistgħu jinfdu l-istratum corneum permezz tad-diffużjoni jew tal-erożjoni, u huma ċitotossiċi għaċ-ċelloli li jinsabu fis-saffi ta’ taħt. Il-vijabbiltà taċ-ċelloli titkejjel b’konverżjoni enzimatika tal-kulurant vitali MTT [bromur tat-3-(4,5-Dimetiltjażol-2-il)-2,5- difeniltetrażolju, bromur tat-tetrażolju tal-blu tjażolil; Numru CAS 298-93-1], f’melħ tal-formażan blu li jitkejjel b’mod kwantitattiv wara l-estrazzjoni mit-tessuti (27). Is-sustanzi kimiċi korrużivi huma identifikati mill-abbiltà tagħhom li jnaqqsu l-vijabbiltà taċ-ċelloli taħt il-livelli limitu definiti (ara l-paragrafi 35 u 36). Il-metodu ta’ ttestjar tal-korrużjoni tal-ġilda bbażat fuq l-RhE wera li jbassar effetti tal-korrużjoni tal-ġilda in vivo vvalutati fil-fniek skont it-TM B.4 (2).

WIRI TAL-PROFIĊJENZA

13.

Qabel l-użu ta’ rutina ta’ kwalunkwe wieħed mill-erba’ metodi ta’ ttestjar validati tal-RhE li jaderixxu ma’ dan il-metodu ta’ ttestjar, il-laboratorji għandhom juru profiċjenza teknika billi jikklassifikaw kif suppost tnax-il Sustanza ta’ Profiċjenza elenkati fit-Tabella 1. Fil-każ ta’ użu ta’ metodu għas-subklassifikazzjoni, għandha tintwera s-subkategorizzazzjoni korretta wkoll. F’sitwazzjonijiet li fihom sustanza elenkata ma tkunx disponibbli jew, fejn ġustifikabbli, tista’ tintuża sustanza oħra li għaliha jkun hemm data ta’ riferiment adegwata in vivo u in vitro (eż. mil-lista ta’ sustanzi kimiċi ta’ riferiment (24)) dment li ma jiġux applikati l-istess kriterji tal-għażla bħal dawk deskritti fit-Tabella 1.

Tabella 1

Lista ta’ Sustanzi ta’ Profiċjenza (8)

Sustanza	CASRN	Klassi Kimika (9)	Kat. tal-GHS tan-NU/tas-CLP fuq il-bażi tar-riżultati In Vivo (10)	VRM Kat. Ibbażata fuq riżultati (11) In Vitro	Riduċent tal-MTT (12)	Stat Fiżiku
Korrużivi In Vivo tas-Subkategorija 1A
Aċidu bromoaċetiku	79-08-3	Aċidu organiku	1A	(3) 1A	—	S
Diidrat tat-trifluworur tal-Boron	13319-75-0	Aċidi inorganiċi	1A	(3) 1A	—	L
Fenol	108-95-2	Fenol	1A	(3) 1A	—	S
Klorur tad-Dikloroaċetil	79-36-7	Elettrofil	1A	(3) 1A	—	L
Taħlita ta’ Korrużivi In Vivo tas-subkategoriji 1B u 1C
Monoidrat tal-aċidu gliossiliku	563-96-2	Aċidu organiku	1B-u-1C	(3) 1B-u-1C	—	S
Aċidu lattiku	598-82-3	Aċidu organiku	1B-u-1C	(3) 1B-u-1C	—	L
Etanolammina	141-43-5	Bażi organika	1B)	(3) 1B-u-1C	Y	Viskuż
Aċidu idrokloriku (14,4 %)	7647-01-0	Aċidi inorganiċi	1B-u-1C	(3) 1B-u-1C	—	L
Mhux korrużivi In Vivo
Bromur tal-fenetil	103-63-9	Elettrofil	NC	(3) NC	Y	L
4-Amino-1,2,4-triażol	584-13-4	Bażi organika	NC	(3) NC	—	S
4-(metiltjo)-benżaldeid	3446-89-7	Elettrofil	NC	(3) NC	Y	L
Aċidu lawriku	143-07-7	Aċidu organiku	NC	(3) NC	—	S
Abbrevjazzjonijiet: CASRN = Numru tar-Reġistru tas-Servizz tat-Taqsiriet tas-Sustanzi Kimiċi; VRM = Metodu ta’ Referenza Validat; NC = mhux korrużiva; I = iva; S = solidu; L= likwidu

14.

Bħala parti mill-eżerċizzju tal-profiċjenza, hu rrakkomandat li l-utent jivverifika l-karatteristiċi ta’ protezzjoni tat-tessuti wara li dawn jiġu riċevuti kif speċifikat mill-manifattur tal-mudell tal-RhE. Dan hu ta’ importanza partikolari jekk it-tessuti jintbagħtu minn distanzi twal jew jekk idumu biex jaslu. Ladarba metodu ta’ ttestjar ikun ġie stabbilit b’suċċess u tkun intweriet profiċjenza fl-użu tiegħu, verifika bħal din ma għandhiex tkun meħtieġa fuq bażi ta’ rutina. Madankollu, meta jintuża metodu ta’ ttestjar b’rutina, hu rrakkomandat li jibqgħu jiġu vvalutati l-karatteristiċi ta’ protezzjoni f’intervalli regolari.

PROĊEDURA

15.

Din li ġejja hi deskrizzjoni ġenerika tal-komponenti u tal-proċeduri tal-mudelli tat-test tal-RhE għall-valutazzjoni tal-korrużjoni tal-ġilda koperti minn dan il-metodu ta’ ttestjar. Il-mudelli tal-RhE approvati bħala xjentifikament validi għall-użu fi ħdan dan il-metodu ta’ ttestjar, jiġifieri l-mudelli EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE u epiCS® (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33), jistgħu jinkisbu minn sorsi kummerċjali. Il-Proċeduri Operatorji Standard (SOPs) għal dawn l-erba’ mudelli tal-RhE huma disponibbli (34)(35)(36)(37), u l-komponenti ewlenin tal-metodu ta’ ttestjar tagħhom huma miġbura fil-qosor fl-Appendiċi 2. Hu rakkomandat li l-SOP rilevanti tiġi kkonsultata matul l-implimentazzjoni u l-użu ta’ wieħed minn dawn il-mudelli fil-laboratorju. L-ittestjar bl-erba’ mudelli tat-test tal-RhE b’dan il-metodu ta’ ttestjar għandu jikkonforma mal-kundizzjonijiet li ġejjin:

KOMPONENTI TAL-METODU TA’ TTESTJAR TAL-RHE

Kundizzjonijiet Ġenerali

16.

Keratinoċiti umani mhux trasformati għandhom jintużaw biex jerġgħu jibnu l-epitelju. Is-saffi multipli ta’ ċelloli epitelji vijabbli (saff tal-qiegħ, stratum spinosum, stratum granulosum) għandhom ikunu preżenti taħt stratum corneum funzjonali. L-istratum corneum għandu jkollu saffi multipli li jkun fihom il-profil lipidu essenzjali biex jipproduċu protezzjoni funzjonali robusta biex tirreżisti l-penetrazzjoni rapida ta’ sustanzi kimiċi referenzjarji ċitotossiċi, pereżempju d-dodeċilsulfat tas-sodju (SDS) jew Triton X-100. Il-funzjoni ta’ protezzjoni għandha tintwera u tista’ tiġi eżaminata jew permezz ta’ determinazzjoni tal-konċentrazzjoni li fiha s-sustanza kimika referenzjarja tnaqqas il-vijabbiltà tat-tessuti b’50 % (IC50) wara ħin ta’ esponiment fiss, jew permezz ta’ determinazzjoni tal-ħin ta’ esponiment meħtieġ sabiex il-vijabbiltà taċ-ċellola titnaqqas b’50 % (ET50) wara l-applikazzjoni tas-sustanza kimika referenzjarja b’konċentrazzjoni speċifika u fissa (ara l-paragrafu 18). Il-karatteristiċi ta’ trażżin tal-mudell tal-RhE għandhom iwaqqfu l-passaġġ ta’ materjal madwar l-istratum corneum għat-tessut vijabbli, li nkella jwassal għal immudellar ta’ livell baxx tal-esponiment tal-ġilda. Il-mudell tal-RhE għandu jkun ħieles minn kontaminazzjoni minn batterji, vajrusijiet, majkoplasma, jew fungi.

Kundizzjonijiet Funzjonali

Vijabbiltà

17.

L-assaġġ użat għall-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà tat-tessut hu l-assaġġ MTT (27). Iċ-ċelloli vijabbli tal-mudell ta’ tessut tal-RhE jnaqqsu l-MTT tal-kulurant vitali fi preċipitat tal-blu MTT formażan, li mbagħad jiġi estratt mit-tessut bl-użu tal-isopropanol (jew solvent simili). L-OD tas-solvent ta’ estrazzjoni waħedha għandha tkun żgħira biżżejjed, jiġifieri OD < 0,1. L-MTT formażan estratt jista’ jiġi kwantifikat bl-użu ta’ kejl tal-assorbanza standard (OD) jew bi proċedura ta’ spettrofotometrija tal-HPLC/UPLC (38). L-utenti tal-mudell tal-RhE għandhom jiżguraw li kull lott mill-mudell tal-RhE użat jissodisfa l-kriterji definiti għall-kontroll negattiv. Medda tal-aċċettabbiltà (limitu superjuri u inferjuri) għall-valuri tal-OD tal-kontroll negattiv għandha tiġi stabbilita mill-iżviluppatur/fornitur tal-mudell tal-RhE. Meded tal-aċċettabbiltà għall-valuri tal-OD tal-kontroll negattiv għall-erba’ mudelli tat-test tal-RhE validati inklużi f’dan il-metodu ta’ ttestjar huma mogħtija fit-Tabella 2. Utent tal-Ispettrofotometrija tal-HPLC/UPLC għandu juża l-meded tal-OD tal-kontroll negattiv ipprovduti fit-Tabella 2 bħala l-kriterju ta’ aċċettazzjoni għall-kontroll negattiv. Għandu jiġi dokumentat li t-tessuti ttrattati bil-kontroll negattiv huma stabbli fil-koltura (jipprovdu kejl tal-OD simili) sakemm idum il-perjodu ta’ esponiment.

Tabella 2

Il-meded ta’ aċċettabbiltà għall-valuri tal-OD tal-kontroll negattiv għall-kontroll tal-kwalità tal-lott

	Limitu inferjuri ta’ aċċettabbiltà	Limitu superjuri ta’ aċċettabbiltà
EpiSkin™ (SM)	> 0,6	< 1,5
EpiDerm™ SCT (EPI-200)	> 0,8