(3)
|
Fil-Parti B, il-Kapitolu B.22 hu ssostitwit b’dan li ġej:
“B.22 TEST LETALI DOMINANTI TAR-RODITURI
INTRODUZZJONI
|
1.
|
Dan il-metodu ta’ ttestjar (TM) hu ekwivalenti għal-linji gwida tat-test 478 tal-OECD (2016). Il-metodi ta’ ttestjar jiġu rieżaminati kull ċertu żmien fid-dawl tal-progress xjentifiku, tal-ħtiġijiet regolatorji li jinbidlu u tal-kunsiderazzjonijiet relatati mat-trattament xieraq tal-annimali. Din il-verżjoni modifikata tal-metodu ta’ ttestjar tirrifletti aktar minn tletin sena esperjenza b’dan it-test u l-potenzjal għall-integrazzjoni jew għall-kombinament ta’ dan it-test ma’ testijiet oħra tat-tossiċità bħal studji dwar it-tossiċità fl-iżvilupp jew riproduttiva, jew dwar il-ġenotossiċità; madankollu, minħabba l-limitazzjonijiet tiegħu u l-użu ta’ numru kbir ta’ annimali, dan l-assaġġ mhuwiex maħsub biex jintuża bħala metodu primarju, iżda aktar bħala metodu ta’ ttestjar supplimentari li jista’ jintuża biss meta ma jkun hemm ebda alternattiva għar-rekwiżiti regolatorji. Il-kombinament tal-ittestjar tat-tossiċità għandu l-potenzjal li jiffranka numri kbar ta’ annimali mill-użu fit-testijiet tat-tossiċità. L-OECD żviluppa dokument li jipprovdi informazzjoni sintetika fuq l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali lejn it-tibdiliet riċenti li seħħew fil-linji gwida tat-test tal-OECD dwar it-tossiċità ġenetika (1).
|
|
2.
|
L-iskop tat-test Letali Dominanti (DL) hu li jinvestiga jekk is-sustanzi kimiċi jipproduċux mutazzjonijiet li jirriżultaw minn aberrazzjonijiet kromożomiċi f’ċelloli ġerminali. Barra minn hekk, it-test letali dominanti hu rilevanti għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għalkemm jistgu jvarjaw bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetika u l-proċessi ta’ tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-rispons. L-induzzjoni ta’ mutazzjoni DL wara l-esponiment għal sustanza kimika tat-test tindika li s-sustanza kimika affettwat it-tessut ġerminali tal-annimal tat-test.
|
|
3.
|
Il-mutazzjonijiet tad-DL jikkawżaw mewt embrijoniku jew tal-fetu. L-induzzjoni ta’ mutazzjoni DL wara l-esponiment għal sustanza kimika tat-test tindika li s-sustanza kimika affettwat iċ-ċelloli ġerminali tal-annimal tat-test.
|
|
4.
|
Assaġġ tad-DL hu siewi għall-konferma ta’ riżultati pożittivi ta’ testijiet bl-użu ta’ punti ta’ tmiem somatiċi in vivo, u hu punt ta’ tmiem rilevanti għat-tbassir tal-periklu għall-bniedem u tar-riskju ta’ mardiet ġenetiċi trażmessi permezz tal-linja ġerminali. Madankollu, dan l-assaġġ jeħtieġ numru kbir ta’ annimali u jinvolvi xogħol intensiv; għaldaqstant, hu għali ħafna u jieħu ż-żmien biex isir. Minħabba li l-frekwenza spontanja tal-mutazzjonijiet letali dominanti hi kemxejn għolja, is-sensittività tal-assaġġ għad-detezzjoni ta’ żidiet żgħar fil-frekwenza tal-mutazzjonijiet ġeneralment tkun limitata.
|
|
5.
|
Id-definizzjonijiet tat-termini ewlenin huma stabbiliti fl-Appendiċi 1.
|
KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU
|
6.
|
It-test isir l-aktar bil-ġrieden (2) (3) (4) iżda f’ċerti każijiet jistgħu jkunu xierqa speċijiet oħra, bħall-firien (5) (6) (7) (8), jekk ikunu xjentifikament ġustifikati. Id-DLs ġeneralment ikunu r-riżultat ta’ aberrazzjonijiet kromożomiċi kbar (anormalitajiet strutturali u numeriċi) (9) (10) (11), iżda mutazzjonijiet tal-ġeni ma jistgħux ikunu esklużi. Mutazzjoni tad-DL hi mutazzjoni li sseħħ f’ċellola ġerminali minnha nfisha, jew tiġi ffissata wara l-fertilizzazzjoni fl-embrijun bikri, li ma tikkawżax disfunzjoni tal-gamet, iżda hi letali għall-bajda fertilizzata jew għall-embrijun li jkun qed jiżviluppa.
|
|
7.
|
L-irġiel individwali jitgħammru b’mod sekwenzjali ma’ nisa verġni f’intervalli xierqa. In-numru ta’ drabi li jitgħammru wara t-trattament jiddependi mill-iskop finali tal-istudju tad-DL (Paragrafu 23) u għandu jiżgura li l-fażijiet kollha tal-maturazzjoni taċ-ċelloli ġerminali tal-irġiel jiġu evalwati għad-DLs (12).
|
|
8.
|
Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, ma jkunux se jilħqu t-testikoli, ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.
|
PRINĊIPJU TAT-TEST
|
9.
|
Ġeneralment, l-annimali rġiel jiġu esposti għal sustanza kimika tat-test b’rotta ta’ esponiment xierqa u jitgħammru ma’ nisa verġni mhux trattati. Tipi differenti ta’ ċelloli ġerminali jistgħu jiġu ttestjati bl-użu ta’ intervalli ta’ tgħammir sekwenzjali. Wara t-tgħammir, in-nisa jiġu ewtanizzati wara perjodu ta’ żmien xieraq, u l-utri tagħhom jiġu eżaminati biex jiġu determinati n-numri ta’ impjanti u ta’ embrijuni ħajjin u mejtin. Il-letalità dominanti ta’ sustanza kimika tat-test hi determinata bit-tqabbil tal-impjanti ħajjin għal kull mara fil-grupp trattat mal-impjanti ħajjin għal kull mara fil-grupp tal-kontroll bil-veikolu/bis-solvent. Iż-żieda fl-impjanti mejtin f’kull waħda tas-sess femminil fil-grupp trattat diviż bin-numru ta’ impjanti mejtin f’kull waħda tas-sess femminil fil-grupp tal-kontroll turi t-telf ta’ wara l-impjantazzjoni indott mis-sustanza kimika tat-test. It-telf ta’ wara l-impjantazzjoni jiġi kkalkolat bid-determinazzjoni tal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjanti totali fil-grupp trattat meta mqabbel mal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjanti totali fil-grupp tal-kontroll. It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni tista’ tkun stimata billi jitqabbel l-għadd ta’ corpora lutea nieqes l-impjanti totali jew l-impjanti totali għal kull mara fil-gruppi trattati u tal-kontroll.
|
VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU
|
10.
|
Il-kompetenza f’dan l-assaġġ għandha tiġi stabbilita billi tintwera l-ħila li jiġu rirpodotti frekwenzi letali dominanti minn data ppubblikata (eż. (13) (14) (15) (16) (17) (18)) b’sustanzi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfa) bħal dawk elenkati fit-Tabella 1, u b’kontrolli bil-veikoli u billi jinkisbu frekwenzi tal-kontroll negattiv li jkunu medda aċċettabbli konssitenti ta’ data (ara r-referenzi aktar ’il fuq) jew bid-distribuzzjoni storika tal-kontroll tal-laboratorju, jekk disponibbli.
|
DESKRIZZJONI TAL-METODU
Preparamenti
Għażla tal-ispeċi tal-annimali
|
11.
|
Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta’ annimali sesswalment maturi f’saħħithom. Il-ġrieden jintużaw spiss iżda l-firien jistgħu jkunu adattati wkoll. Tista’ tintuża kwalunkwe speċi ta’ mammiferi xierqa oħra, jekk tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika fir-rapport.
|
Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali
|
12.
|
Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta’ 22 °C (±3 °C). Għalkemm idealment l-umdità relattiva għandha tkun ta’ 50-60 %, għandha tkun ta’ tal-anqas 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b’sekwenza ta’ 12-il siegħa dawl, segwita minn 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta’ ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista’ tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta’ sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Qabel it-trattament jew it-tgħammir, ir-rodituri għandhom jinżammu fi gruppi żgħar (mhux aktar minn ħamsa) tal-istess sess jekk ma tkun mistennija jew osservata ebda mġiba aggressiva, idealment f’gaġeġ solidi b’arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom jekk dan ikun xjentifikament ġustifikat.
|
Preparazzjoni tal-annimali
|
13.
|
L-annimali adulti rġiel u nisa f’saħħithom u sesswalment maturi jkunu assenjati b’mod każwali lill-gruppi ta’ kontroll u trattament. L-annimali individwali jiġu identifikati b’mod uniku bl-użu ta’ metodu uman u l-inqas invasiv possibbli (eż. b’ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b’titqib fis-swaba’ u fil-widnejn) u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-anqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b’mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u mis-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± l-20 % tal-piż medju ta’ kull sess.
|
Preparazzjoni tad-dożi
|
14.
|
Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f’solventi jew f’veikoli xierqa jew jitħalltu f’dieta jew f’ilma tax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għall-esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-data dwar l-istabbiltà ma turix l-aċċettabbiltà tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.
|
Kundizzjonijiet tat-test
Solvent/veikolu
|
15.
|
Is-solvent/il-veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-volumi tad-doża użati, u ma għandux ikun suspettat li joħloq reazzjoni kimika mas-sustanza kimika tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħra li ma jkunux magħrufa sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta’ data ta’ riferiment li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Hu rakkomandat li, fejn jista’ jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta’ solvent/veikolu milwiem. Eżempji ta’ solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu l-ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetil, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum.
|
Kontrolli pożittivi
|
16.
|
Dejjem għandhom jintużaw annimali tal-kontroll pożittiv konkorrenti sakemm il-laboratorju ma jkunx wera profiċjenza fit-twettiq tat-test u jkun uża t-test bħala rutina fl-imgħoddi riċenti (eż. matul l-aħħar ħames snin). Madankollu, ma hemmx bżonn li l-annimali tal-kontroll pożittiv jiġu ttrattati bl-istess rotta bħall-annimali li jirċievu s-sustanza kimika tat-test, jew li jiġu kampjunati l-intervalli tat-tgħammir kollha. Is-sustanzi tal-kontroll pożittiv għandhom ikunu magħrufa li jipproduċu DLs bil-kundizzjonijiet użati għat-test. Ħlief għat-trattament, l-annimali fil-gruppi tal-kontroll għandhom ikunu maniġġati b’mod identiku bħall-annimali fil-gruppi trattati.
|
|
17.
|
Id-dożi tas-sustanzi tal-kontroll pożittiv għandhom jintgħażlu biex jipproduċu effetti dgħajfa jew moderati li jivvalutaw b’mod kritiku l-prestazzjoni u s-sensittività tal-assaġġ, iżda li konsistentement jipproduċu effetti letali dominanti pożittivi. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta’ sustanzi tal-kontroll pożittiv u tad-dożi xierqa.
|
Tabella 1
Eżempji ta’ Sustanzi tal-Kontroll Pożittiv
Sustanza [Nru CAS]
(nru ta’ riferiment)
|
Medda tad-Doża Effettiva (mg/kg)
(speċi tar-rodituri)
|
Żmien tal-Amministrazzjoni (jiem)
|
Trietilenmelamina [51-18-3] (15)
|
0,25 (ġrieden)
|
1
|
Ċiklofosfammid [50-18-0] (19)
|
50-150 (ġrieden)
|
5
|
Ċiklofosfammid [50-18-0] (5)
|
25-100 (firien)
|
1
|
Metansulfonat tal-etil [62-50-0] (13)
|
100-300 (ġrieden)
|
5
|
Akrilammid Monomeriku [79-06-1] (17)
|
50 (ġrieden)
|
5
|
Klorambusil [305-03-3] (14)
|
25 (ġrieden)
|
1
|
Kontrolli negattivi
|
18.
|
L-annimali tal-kontrolli negattivi, trattati b’solvent jew b’veikolu waħdu, u mill-bqija trattati bl-istess mod bħall-gruppi tal-kura, għandhom ikunu inklużi għal kull ħin tal-kampjunar (20). Fin-nuqqas ta’ data tal-kontroll storika jew ippubblikata li turi li ma kien indott ebda DL jew effett ta’ tħassir ieħor mis-solvent/mill-veikolu magħżul, l-annimali tal-kontroll mhux trattati għandhom ikunu inklużi wkoll għal kull ħin tal-kampjunar biex tiġi stabbilita aċċettabbiltà tal-kontroll tal-veikolu.
|
PROĊEDURA
Għadd ta’ Annimali
|
19.
|
L-irġiel individwali jitgħammru b’mod sekwenzjali f’intervalli predeterminati xierqa (eż. intervalli ta’ kull ġimgħa, Paragrafi 21 u 23), idealment ma’ mara verġni waħda. L-għadd ta’ rġiel għal kull grupp għandu jkun predeterminat biex ikun biżżejjed (flimkien man-numru ta’ nisa mgħammra f’kull intervall ta’ tgħammir) biex tiġi pprovduta s-saħħa statistika neċessarja biex tal-anqas jiġi individwat irdoppjar tal-frekwenza tad-DL (Paragrafu 44).
|
|
20.
|
L-għadd ta’ nisa għal kull intervall ta’ tgħammir ukoll għandu jkun predeterminat mill-kalkoli tas-saħħa statistika biex tal-anqas ikun jista’ jiġi individwat irdoppjar fil-frekwenza tad-DL (jiġifieri biżżejjed nisa tqal biex jipprovdu tal-anqas 400 impjant totali) (20) (21) (22) (23) u li tal-anqas ikun mistenni impjant mejjet wieħed għal kull unità ta’ analiżi (jiġifieri grupp ta’ tgħammir għal kull doża) (24).
|
Perjodu ta’ Amministrazzjoni u l-Intervalli ta’ Tgħammir
|
21.
|
L-għadd ta’ intervalli ta’ tgħammir wara t-trattament hu regolat bl-iskeda tat-trattament u għandu jiżgura li l-fażijiet kollha ta’ maturazzjoni taċ-ċelloli ġerminali tal-irġiel jiġu evalwati għall-induzzjoni tad-DL (12) (25). Għal trattament wieħed sa ħames amministrazzjonijiet tad-dożi kuljum, għandu jkun hemm tmien istanzi ta’ tgħammir (ġrieden) jew 10 (firien) imwettqa f’intervalli ta’ kull ġimgħa wara l-aħħar trattament. Għal amministrazzjoni b’doża multipla, l-għadd ta’ intervalli ta’ tgħammir jista’ jitnaqqas b’mod proporzjonat għaż-żmien miżjud tal-perjodu ta’ amministrazzjoni, iżda jinżamm l-għan ta’ evalwazzjoni tal-fażijiet kollha ta’ spermatoġenesi (eż. wara esponiment għal 28 jum, erba’ istanzi ta’ tgħammir fil-ġimgħa biss ikunu biżżejjed biex jiġu evalwati l-fażijiet kollha tal-ispermatoġenesi fil-ġurdien). L-iskedi kollha ta’ trattament u ta’ tgħammir għandhom ikunu xjentifikament ġustifikati.
|
|
22.
|
In-nisa għandhom jibqgħu mal-irġiel tal-anqas għad-durata ta’ ċiklu estruż wieħed (eż. ġimgħa tkopri ċiklu estruż wieħed fil-ġrieden kif ukoll fil-firien). In-nisa li ma jitgħammrux matul intervall ta’ ġimgħa jistgħu jintużaw għal intervall sussegwenti ta’ tgħammir. Inkella, sakemm iseħħ it-tgħammir, kif determinat mill-preżenza ta’ sperma fil-vaġina jew mill-preżenza ta’ tapp vaġinali.
|
|
23.
|
Ir-reġimen ta’ esponiment u ta’ tgħammir użat jiddependi mill-iskop finali tal-istudju tad-DL. Jekk l-għan hu li jiġi determinat jekk sustanza kimika partikolari tinduċix mutazzjonijiet tad-DL per se, il-metodu aċċettat ikun li tiġi esposta serje sħiħa ta’ spermatoġenesi (eż. seba’ ġimgħat fil-ġurdien, minn ħamsa sa sebgħa trattamenti fil-ġimgħa) u tgħammir ta’ darba fl-aħħar. Madankollu, jekk l-għan hu li jiġi identifikat it-tip ta’ ċellola ġerminali sensittiva għall-induzzjoni tad-DL, ikun preferut esponiment ta’ darba jew fuq ħames jiem segwit minn tgħammir darba fil-ġimgħa.
|
Livelli tad-doża
|
24.
|
Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda data xierqa diġà disponibbli biex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jridu jintużaw fl-istudju ewlieni (26). L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala l-ogħla doża li tiġi tollerata mingħajr evidenza ta’ tossiċità li tillimita l-istudju, b’rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, imġiba jew reazzjonijiet anormali, dipressjoni minuri tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika), iżda mhux mewt jew evidenza ta’ uġigħ, ta’ tbatija jew ta’ diffikultà li jeħtieġu ewtanażja umanitarja (27).
|
|
25.
|
L-MTD lanqas ma tista’ taffettwa b’mod avvers is-suċċess tat-tgħammir (21).
|
|
26.
|
Is-sustanzi kimiċi tat-test b’attivitajiet bijoloġiċi speċifiċi f’dożi mhux tossiċi baxxi (bħal ormoni u mitoġeni), u sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni ta’ proprjetajiet tossikokinetiċi jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta’ tfassil tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta’ każ b’każ.
|
|
27.
|
Biex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv u tal-anqas tliet livelli ta’ dożi ġeneralment separati b’fattur ta’ 2, iżda mhux akbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-data eżistenti, l-ogħla doża għal amministrazzjoni waħda għandha tkun ta’ 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom idealment ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Għal sustanzi kimiċi mhux tossiċi, id-doża limitu għal perjodu ta’ amministrazzjoni ta’ 14-il jum jew aktar hi ta’ 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum, u għal perjodi ta’ amministrazzjoni ta’ anqas minn 14-il jum id-doża limitu hi ta’ 2 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum.
|
Amministrazzjoni tad-Dożi
|
28.
|
Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja, fil-vini, bit-teħid man-nifs, orali (b’gavage), jew b’impjantazzjoni, kif ġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel biex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Normalment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li ma tkunx rotta intiża ta’ esponiment tal-bniedem, u għandha tintuża biss b’ġustifikazzjoni xjentifika speċifika. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew l-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta’ dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u t-tgħammir ikun biżżejjed biex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (paragrafu 31). Il-volum massimu ta’ likwidu li jista’ jingħata b’gavage jew b’injezzjoni f’darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun ta’ aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta’ soluzzjonijiet milwiema fejn jista’ jintuża massimu ta’ 2 ml/100 g. L-użu ta’ volumi akbar minn dan (jekk ikunu permessi mil-leġiżlazzjoni dwar it-trattament xieraq tal-annimali) għandu jkun iġġustifikat. Il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandha tiġi minimizzata billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni biex jiġi żgurat volum kostanti b’rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.
|
Osservazzjonijiet
|
29.
|
Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-anqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta’ wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-aktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum matul il-perjodu ta’ dożaġġ, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għall-morbidità u għall-mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju u tal-anqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b’doża ripetuta, u fil-ħin tal-ewtanażja. Il-kejlijiet tal-konsum tal-ikel għandu jsir tal-anqas darba kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f’kull bidla tal-ilma u tal-anqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta’ tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanizzati qabel jintemm il-perjodu ta’ ttestjar (27).
|
Ġbir u Proċessar tat-Tessuti
|
30.
|
In-nisa jiġu ewtanizzati fit-tieni nofs tat-tqala fil-jum tal-ġestazzjoni (GD), 13 għall-ġrieden u GD 14-15 għall-firien. L-utri jiġu eżaminati għal effetti letali dominanti biex jiġi determinat in-numru ta’ impjanti, ta’ embrijuni ħajjin u mejtin, u ta’ corpora lutea.
|
|
31.
|
Il-qrejjen tal-utru u l-ovarji jiġu esposti għall-għadd tal-corpora lutea, u l-feti jitneħħew, jingħaddu u jintiżnu. Għandha tingħata attenzjoni biex l-utri jiġu eżaminati għal riassorbimenti oskurati minn feti ħajjin u biex jiġi żgurat li r-riassorbimenti kollha jiġu enumerati. Tiġi reġistrata l-mortalità tal-feti. In-numru ta’ nisa mtaqqla b’suċċess u n-numru ta’ impjantazzjonijiet totali, it-telf qabel l-impjantazzjoni, u l-mortalità ta’ wara l-impjantazzjoni (inklużi r-riassorbimenti bikrin u tardivi) jiġu reġistrati wkoll. Barra minn hekk, il-feti viżibbli jistgħu jiġu preservati fil-fissattiv ta’ Bouin għal tal-anqas ġimagħtejn (2) u mbagħad jiġu eżaminati għal malformazzjonijiet esterni maġġuri (28) biex tiġi pprovduta informazzjoni addizzjonali dwar l-effetti riproduttivi u fuq l-iżvilupp tal-aġent tat-test.
|
DATA U RAPPORTAR
Trattament tar-riżultati
|
32.
|
Id-data għandha tkun fil-forma ta’ tabelli biex turi n-numru ta’ annimali rġiel mgħammra, in-numru ta’ nisa tqal, u n-numru ta’ nisa li mhumiex tqal. Ir-riżultati ta’ kull tgħammir, inkluża l-identità ta’ kull raġel u mara għandhom ikunu rrapportati b’mod individwali. L-intervall tat-tgħammir, il-livell tad-doża għall-irġiel ittrattati, u n-numri ta’ impjanti ħajjin u ta’ impjanti mejtin għandhom jiġu enumerati għal kull mara.
|
|
33.
|
It-telf ta’ wara l-impjantazzjoni jiġi kkalkolat bid-determinazzjoni tal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjanti totali mill-grupp trattat meta mqabbel mal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjantazzjonijiet totali mill-grupp tal-kontroll bil-veikolu/bis-solvent.
|
|
34.
|
It-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni hu kkalkolat bħala d-differenza bejn in-numru ta’ corpora lutea u n-numru ta’ impjanti jew bħala tnaqqis fin-numru medju ta’ impjanti għal kull mara meta mqabbel mat-tgħammir tal-kontroll. Meta jkun stimat it-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni, għandu jkun irrapportat.
|
|
35.
|
Il-fattur Letali Dominanti jiġi stmat bħala: (l-imwiet ta’ wara l-impjantazzjoni/l-impjantazzjonijiet totali għal kull mara) × 100.
|
|
36.
|
Għandha tiġi rrapportata d-data dwar it-tossiċità u s-sinjali kliniċi (skont il-Paragrafu 29).
|
Kriterji ta’ Aċċettabbiltà
|
37.
|
Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabbiltà ta’ test.
—
|
Il-kontroll negattiv konkorrenti hu konsistenti man-normi ppubblikati għad-data storika tal-kontroll negattiv, u mad-data storika tal-kontroll tal-laboratorju jekk tkun disponibbli (ara l-Paragrafi 10 u 18).
|
—
|
Il-kontrolli pożittivi konkorrenti jinduċu risponsi li jkunu konsistenti man-normi ppubblikati għad-data storika tal-kontroll pożittiv, jew mal-bażi tad-data storika tal-kontroll pożittiv tal-laboratorju, jekk disponibbli, u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv (ara l-Paragrafi 17 u 18).
|
—
|
Ġew analizzati numru adegwat ta’ impjanti totali u dożi (Paragrafu 20).
|
—
|
Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla doża huma konsistenti ma’ dawk deskritti fil-Paragrafi 24 u 27.
|
|
Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati
|
38.
|
Tal-anqas tliet gruppi tad-doża kkurati għandhom jiġu analizzati biex tiġi pprovduta biżżejjed data għal analiżi tar-rispons għad-doża.
|
|
39.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hi pożittiva biċ-ċar jekk:
—
|
tal-anqas waħda mid-dożi tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti;
|
—
|
iż-żieda tkun relatata mad-doża f’tal-anqas kundizzjoni sperimentali waħda (eż. intervall tat-tgħammir ta’ kull ġimgħa) meta evalwata b’test xieraq; u,
|
—
|
kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa’ barra mill-medda aċċettabbli tad-data tal-kontroll negattiv, jew mid-distribuzzjoni tad-data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson) jekk disponibbli.
|
Imbagħad is-sustanza kimika tat-test titqies li kapaċi tinduċi mutazzjonijiet letali dominanti fiċ-ċelloli ġerminali tal-annimali tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-aktar metodi statistiċi xierqa huma deskritti fil-Paragrafu 44; approċċi statistiċi rakkomandati oħra jistgħu jinstabu fid-dokumentazzjoni (20) (21) (22) (24) (29). It-testijiet statistiċi użati għandhom jikkunsidraw l-annimal bħala l-unità sperimentali.
|
|
40.
|
Dment li ma jiġux issodisfati l-kriterji ta’ aċċettabbiltà kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hi negattiva biċ-ċar jekk:
—
|
l-ebda waħda mid-dożi tat-test ma turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv konkorrenti;
|
—
|
ma jkun hemm ebda żieda relatata mad-doża f’xi kundizzjoni sperimentali; u
|
—
|
ir-riżultati kollha jaqgħu fi ħdan il-medda aċċettabbli tad-data tal-kontroll negattiv, jew tad-data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (eż. limitu tal-kontroll ta’ 95 % fuq il-bażi ta’ Poisson), jekk disponibbli.
|
Imbagħad is-sustanza kimika tat-test titqies li ma tkunx kapaċi tinduċi mutazzjonijiet letali dominanti fiċ-ċelloli ġerminali tal-annimali tat-test.
|
|
41.
|
Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta’ rispons posittiv jew negattiv ċar.
|
|
42.
|
Jekk ir-rispons ma jkunx negattiv jew pożittiv b’mod ċar, u bħala għajnuna għall-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta’ riżultat (eż. żieda dgħajfa jew ambigwa), id-data għandha tiġi evalwata b’ġudizzju espert u/jew b’investigazzjonijiet ulterjuri li jużaw id-data sperimentali eżistenti, bħal kunsiderazzjoni ta’ jekk ir-riżultat pożittiv jaqax barra mill-medda aċċettabbli ta’ data tal-kontroll negattiv, jew ta’ data storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (30).
|
|
43.
|
F’każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta’ data jipprekludi milli tinħareġ konklużjoni ta’ riżultati pożittivi jew negattivi u għaldaqstant jiġi konkluż bħala ekwivoku.
|
|
44.
|
It-testijiet statistiċi użati għandhom jikkunsidraw l-annimal raġel bħala l-unità sperimentali. Filwaqt li hu possibbli li d-data dwar l-għadd (eż. in-numru ta’ impjanti għal kull mara) tista’ tkun distribwita skont Poisson u/jew il-proporzjonijiet (eż. il-proporzjon ta’ impjanti mejtin) jistgħu jkunu distribwiti b’mod binomjali, spiss ikun il-każ li t-tali data tkun mifruxa wisq (31). Għaldaqstant, l-ewwel l-analiżi statistika għandha tuża test għal dispersjoni eċċessiva jew subottimali billi tuża testijiet tal-varjanza bħat-test tal-varjanza binomjali ta’ Cochran (32) jew it-test C(α) ta’ Tarone għad-dispersjoni binomjali eċċessiva (31) (33). Jekk ma jiġi individwat ebda tbegħid mid-dispersjoni binomjali, it-tendenzi fil-proporzjonijiet bejn il-livelli tad-doża jistgħu jiġu ttestjati bl-użu tat-test tat-tendenzi ta’ Cochran-Armitage (34) u l-paraguni fil-livell tal-pari mal-grupp tal-kontroll jistgħu jiġu ttestjati bl-użu tat-test eżatt ta’ Fisher (35). Bl-istess mod, jekk ma jiġi individwat ebda tbegħid mid-dispersjoni ta’ Poisson, it-tendenzi fl-għadd jistgħu jiġu ttestjati bl-użu tar-rigressjoni ta’ Poisson (36) u l-paraguni fil-livell tal-pari mal-grupp tal-kontroll jistgħu jiġu ttestjati fi ħdan il-kuntest tal-mudell Poisson, bl-użu tal-kuntrasti bejn il-pari (36). Jekk tiġi individwata dispersjoni eċċessiva jew subottimali, huma rakkomandati metodi mhux parametriċi (23) (31). Dawn jinkludu testijiet ibbażati fuq il-klassifikazzjonijiet, bħat-test Jonckheere-Terpstra għat-tendenza (37) u t-testijiet Mann-Whitney (38) għall-paraguni bejn il-pari mal-grupp tal-kontroll bil-veikolu/bis-solvent, kif ukoll it-testijiet tal-permutazzjoni, tal-kampjunar mill-ġdid, jew bootstrap għall-paraguni tat-tendenzi u bejn il-pari mal-grupp tal-kontroll (31) (39).
|
|
45.
|
Assaġġ tad-DL pożittiv jipprovdi evidenza għall-ġenotossiċità tas-sustanza kimika tat-test fiċ-ċelloli ġerminali tar-raġel trattati tal-ispeċi tat-test.
|
|
46.
|
Kunsiderazzjoni ta’ jekk il-valuri osservati humiex fi ħdan jew barra l-medda ta’ kontroll storiku tista’ tipprovdi gwida meta tiġi evalwata s-sinifikanza bijoloġika tar-rispons (40).
|
Rapport tat-Test
|
47.
|
Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja.
Sommarju.
|
Sustanza kimika tat-test:
—
|
is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta’ limitu għall-użu, jekk disponibbli;
|
—
|
l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;
|
—
|
is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;
|
—
|
il-kejl tal-pH, tal-ożmolalità u tal-preċipitat fil-medium tat-tkabbir li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.
|
|
|
Sustanza monokostitwenti:
—
|
id-dehra fiżika, is-solubbiltà fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;
|
—
|
l-identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.
|
|
|
Sustanza multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:
—
|
ikkaratterizzati sa fejn possibbli mill-identità kimika (ara aktar ’il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.
|
|
|
Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test:
—
|
il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.
|
—
|
is-solubbiltà u l-istabbiltà tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin;
|
—
|
il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djetetiċi, tal-ilma tajjeb għax-xorb jew tat-teħid man-nifs;
|
—
|
id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż. l-istabbiltà, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali), meta jsiru.
|
|
|
L-annimali tat-test:
—
|
l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjoni għall-għażla,
|
—
|
l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;
|
—
|
is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;
|
—
|
il-metodu tal-identifikazzjoni unika tal-annimali;
|
—
|
għal studji fuq terminu qasir: il-piż tal-ġisem individwali tal-annimali rġiel fil-bidu u fi tmiem it-test; għal studji itwal minn ġimgħa: il-piżijiet tal-ġisem individwali matul l-istudju u l-konsum ta’ ikel. Il-medda tal-piż individwali, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp għandhom ikunu inklużi.
|
|
|
Il-kundizzjonijiet tat-test:
—
|
data tal-kontrolli pożittivi u negattivi (veikolu/solvent);
|
—
|
data mill-istudju ta’ sejbien tal-medda,
|
—
|
ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;
|
—
|
dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;
|
—
|
dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;
|
—
|
ir-raġuni għar-rotta tal-amministrazzjoni;
|
—
|
metodi għall-kejl tat-tossiċità tal-annimali, inklużi, fejn disponibbli, l-analiżijiet istopatoloġiċi jew ematoloġiċi u l-frekwenza li biha saru l-osservazzjonijiet u ttieħdu l-piżijiet tal-ġisem tal-annimali;
|
—
|
il-metodi għall-verifika li s-sustanza kimika tat-test laħqet it-tessut fil-mira, jew iċ-ċirkolazzjoni ġenerali, jekk jinkisbu riżultati negattivi;
|
—
|
id-doża proprja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni (ppm) u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tax-xorb, jekk applikabbli;
|
—
|
dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;
|
—
|
dettalji dwar l-arrikkiment tal-ambjent tal-gaġeġ;
|
—
|
deskrizzjoni dettaljata tat-trattament u l-iskedi tal-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall-għażliet;
|
—
|
il-metodu tal-analġeżija;
|
—
|
il-metodu tal-ewtanażja;
|
—
|
il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti;
|
—
|
is-sors u n-numri tal-lott tal-kitts u tar-reaġenti kollha (fejn applikabbli);
|
—
|
il-metodi għall-enumerazzjoni tad-DLs;
|
—
|
il-metodi użati biex ikun determinat li seħħ it-tgħammir;
|
—
|
il-kriterji għall-għoti ta’ punteġġ lill-effetti tad-DL, inklużi l-corpora lutea, l-impjantazzjonijiet, ir-riassorbimenti u t-telf ta’ qabel l-impjantazzjoni, l-impjanti ħajjin, l-impjanti mejta.
|
|
|
Ir-riżultati:
—
|
il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklużi sinjali tat-tossiċità;
|
—
|
il-piż tal-ġisem tal-irġiel matul il-perjodi tat-trattament u tat-tgħammir;
|
—
|
in-numru ta’ nisa mgħammra;
|
—
|
ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn possibbli;
|
—
|
id-data konkorrenti u storika tal-kontroll negattiv bil-meded, bil-medji u bid-devjazzjonijiet standard;
|
—
|
id-data konkorrenti tal-kontroll pożittiv;
|
—
|
id-data f’tabelli għal kull omm inklużi: in-numru ta’ corpora lutea għal kull omm; in-numru ta’ impjantazzjonijiet għal kull omm; in-numru ta’ riassorbimenti u ta’ telf ta’ qabel l-impjantazzjoni għal kull omm; in-numru ta’ impjanti ħajjin għal kull omm; in-numru ta’ impjanti mejtin għal kull omm; il-piżijiet tal-feti;
|
—
|
id-data ta’ hawn fuq miġbura għal kull perjodu ta’ tgħammir u doża, bil-frekwenzi Letali Dominanti;
|
—
|
l-analiżijiet u l-metodi statistiċi applikati.
|
|
|
Diskussjoni tar-riżultati.
|
|
DOKUMENTAZZJONI
(1)
|
OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. Series on Testing and Assessment, No 234, OECD, Pariġi.
|
(2)
|
Bateman, A.J. (1977). The Dominant Lethal Assay in the Male Mouse, f’Handbook of Mutagenicity Test Procedures B.J. Kilbey et. al.(Eds.) pp. 235-334, Elsevier, Amsterdam
|
(3)
|
Ehling U.H., Ehling, U.H., Machemer, L., Buselmaier, E., Dycka, D., Frohberg, H., Kratochvilova, J., Lang, R., Lorke, D., Muller, D., Pheh, J., Rohrborn, G., Roll, R., Schulze-Schencking, M., u Wiemann, H. (1978). Standard Protocol for the Dominant Lethal Test on Male Mice. Set up by the Work Group “Dominant” lethal mutations of the ad hoc Committee Chemogenetics, Arch. Toxicol., 39, 173-185
|
(4)
|
Shelby M.D. (1996). Selecting Chemicals and Assays for Assessing Mammalian Germ Cell Mutagenicity. Mutation Res,. 352:159-167.
|
(5)
|
Knudsen I., Knudsen, I., Hansen, E.V., Meyer, O.A. u Poulsen, E. (1977). A proposed Method for the Simultaneous Detection of Germ-Cell Mutations Leading to Fetal Death (Dominant Lethality) and of Malformations (Male Teratogenicity) in Mammals. Mutation Res., 48:267-270.
|
(6)
|
Anderson D., Hughes, J.A., Edwards, A.J. u Brinkworth, M.H. (1998). A Comparison of Male-Mediated Effects in Rats and Mice Exposed to 1,3-Butadiene. Mutation Res., 397:77-74.
|
(7)
|
Shively C.A., C.A., White, D.M., Blauch, J.L. u Tarka, S.M. Jr. (1984). Dominant Lethal Testing of Theobromine in Rats. Toxicol. Lett. 20:325-329.
|
(8)
|
Rao K.S., Cobel-Geard, S.R., Young, J.T., Hanley, T.R. Jr., Hayes, W.C., John, J.A. u Miller, R.R. (1983). Ethyl Glycol Monomethyl Ether II. Reproductive and dominant Lethal Studies in Rats. Fundam. Appl. Toxicol., 3:80-85.
|
(9)
|
Brewen J.G., Payne, H.S., Jones, K.P., u Preston, R.J. (1975). Studies on Chemically Induced Dominant Lethality. I. The Cytogenetic Basis of MMS-Induced Dominant Lethality in Post-Meiotic Male Germ Cells, Mutation Res., 33, 239-249.
|
(10)
|
Marchetti F., Bishop, J.B., Cosentino, L., Moore II, D. u Wyrobek, A.J. (2004). Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations in Mouse Zygotes Determine their Embryonic Fate. Biol. Reprod., 70:616-624.
|
(11)
|
Marchetti F. u Wyrobek, A.J. (2005). Mechanisms and Consequences of Paternally Transmitted Chromosomal Aberrations. Birth Defects Res., C 75:112-129.
|
(12)
|
Adler I.D. (1996). Comparison of the Duration of Spermatogenesis Between Rodents and Humans. Mutation Res., 352:169-172.
|
(13)
|
Favor J., u Crenshaw J.W. (1978). EMS-Induced Dominant Lethal Dose Response Curve in DBA/1J Male Mice, Mutation Res., 53: 21–27.
|
(14)
|
Generoso W.M., Witt, K.L., Cain, K.T., Hughes, L. Cacheiro, N.L.A, Lockhart, A.M.C. u Shelby, M.D. (1995). Dominant Lethal and Heritable Translocation Test with Chlorambucil and Melphalan. Mutation Res., 345:167-180.
|
(15)
|
Hastings S.E., Huffman K.W. u Gallo M.A. (1976). The dominant Lethal Effect of Dietary Triethylenemelamine, Mutation Res., 40:371-378.
|
(16)
|
James D.A. u Smith D.M. (1982). Analysis of Results from a Collaborative Study of the Dominant Lethal Assay, Mutation Res., 99:303-314.
|
(17)
|
Shelby M.D., Cain, K.T., Hughes, L.A., Braden, P.W. u Generoso, W.M. (1986). Dominant Lethal Effects of Acrylamide in Male Mice. Mutation Res., 173:35-40.
|
(18)
|
Sudman P.D., Rutledge, J.C., Bishop, J.B. u Generoso W.M. (1992). Bleomycin: Female-Specific Dominant Lethal Effects in Mice, Mutation Res., 296: 143-156.
|
(19)
|
Holstrom L.M., Palmer A.K. u Favor, J. (1993). The Rodent Dominant Lethal Assay. In Supplementary Mutagenicity Tests. Kirkland D.J. u Fox M. (Eds.), Cambridge University Press, pp. 129-156.
|
(20)
|
Adler I-D., Bootman, J., Favor, J., Hook, G., Schriever-Schwemmer, G., Welzl, G., Whorton, E., Yoshimura, I. u Hayashi, M. (1998). Recommendations for Statistical Designs of In Vivo Mutagenicity Tests with Regard to Subsequent Statistical Analysis, Mutation Res., 417:19–30.
|
(21)
|
Adler I.D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. u Tanaka N. (1994). International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312:313-318.
|
(22)
|
Generoso W.M. u Piegorsch W.W. (1993). Dominant Lethal Tests in Male and Female Mice. Methods, Toxicol., 3A:124-141.
|
(23)
|
Haseman J.K. u Soares E.R. (1976).The Distribution of Fetal Death in Control Mice and its Implications on Statistical Tests for Dominant Lethal Effects. Mutation. Res., 41: 277-288.
|
(24)
|
Whorton E.B. Jr. (1981). Parametric Statistical Methods and Sample Size Considerations for Dominant Lethal Experiments. The Use of Clustering to Achieve Approximate Normality, Teratogen. Carcinogen. Mutagen., 1:353 – 360.
|
(25)
|
Anderson D., Anderson, D., Hodge, M.C.E., Palmer, S., u Purchase, I.F.H. (1981). Comparison of Dominant Lethal and Heritable Translocation Methodologies. Mutation. Res., 85:417-429.
|
(26)
|
Fielder R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. u Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In Vivo Mutagenicity Assays. Mutagen., 7:313-319.
|
(27)
|
OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No.19.), Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi, Pariġi.
|
(28)
|
Barrow M.V., Taylor W.J u Morphol J. (1969). A Rapid Method for Detecting Malformations in Rat Fetuses, 127, 291–306.
|
(29)
|
Kirkland D.J., (Ed.)(1989). Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Cambridge University Press.
|
(30)
|
Hayashi, M., Dearfield, K., Kasper P., Lovell D., Martus H.-J. u Thybaud V. (2011). “Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data”, Mutation. Res., 723:87-90.
|
(31)
|
Lockhart A.C., Piegorsch W.W. u ishop J.B. (1992). Assessing Over Dispersion and Dose-Response in the Male Dominant Lethal Assay. Mutation. Res., 272:35-58.
|
(32)
|
Cochran W.G. (1954). Some Methods for Strengthening the Common χ2 Tests. Biometrics, 10: 417-451.
|
(33)
|
Tarone R.E. (1979). Testing the Goodness of Fit of the Binomial Distribution. Biometrika, 66: 585-590.
|
(34)
|
Margolin B.H. (1988). Test for Trend in Proportions. F’Encyclopedia of Statistical Sciences, Volume 9, Kotz S. u Johnson N. L. (Eds.), pp. 334-336. John Wiley and Sons, New York.
|
(35)
|
Cox D.R., Analysis of Binary Data. Chapman u Hall, Londra (1970).
|
(36)
|
Neter J.M., Kutner, H.C., Nachtsheim, J. u Wasserman, W. (1996). Applied Linear Statistical Models, Fourth Edition, il-Kapitli 14 u 17. McGraw-Hill, Boston
|
(37)
|
Jonckheere R. (1954). A Distribution-Free K-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika, 41:133-145.
|
(38)
|
Conover W.J. (1971). Practical Nonparametric Statistics. John Wiley and Sons, New York
|
(39)
|
Efron, B. (1982). The Jackknife, the Bootstrap and Other Resampling Plans. Society for Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, PA.
|
(40)
|
Fleiss J. (1973). Statistical Methods for Rates and Proportions. John Wiley and Sons, New York.
|
Appendiċi 1
DEFINIZZJONIJIET
Sustanza kimika: Sustanza jew taħlita
Corpora lutea (lutea): l-istruttura tas-sekrezzjoni ormonali fformata fuq l-ovarju fis-sit ta’ follikolu li jkun ħeles il-bajda. In-numru ta’ corpora lutea fl-ovarji jikkorrispondi għan-numru ta’ bajd li ġew ovulati.
Mutazzjoni Letali Dominanti: mutazzjoni li sseħħ f’ċellola ġerminali, jew li tiġi fissa wara l-fertilizzazzjoni, li tikkawża mewta embrijonika jew fetali.
Rata ta’ fertilità: in-numru ta’ nisa tqal mgħammra fuq in-numru ta’ nisa mgħammra.
Intervall tat-tgħammir: il-ħin bejn tmiem l-esponiment u t-tgħammir tal-irġiel trattati. Bil-kontroll ta’ dan l-intervall, ikunu jistgħu jiġu vvalutati l-effetti kimiċi fuq it-tipi differenti ta’ ċelloli ġerminali. Fit-tgħammir tal-ġrieden matul il-ġimgħat numru 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 wara tmiem l-esponiment ikejjel l-effetti fl-isperma, fl-ispermatidi kondensi, fl-ispermatidi tondi, fl-ispermatoċiti pakiten, fl-ispermatoċiti bikrin, fl-ispermatogonji differenzjati, fl-ispermatogonji tad-differenzazzjoni u fl-ispermatogonji taċ-ċelloli staminali.
Telf ta’ qabel l-impjantazzjoni: id-differenza bejn in-numru ta’ impjanti u n-numru ta’ corpora lutea. Dan jista’ jiġi stmat ukoll billi jitqabblu l-impjanti totali għal kull mara fil-grupp trattat u fil-grupp tal-kontroll.
Telf ta’ wara l-impjantazzjoni: il-proporzjon tal-impjanti mejtin fil-grupp trattat meta mqabbel mal-proporzjon tal-impjanti mejtin għall-impjanti totali fil-grupp tal-kontroll.
Sustanza kimika tat-test: Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta’ dan il-metodu ta’ ttestjar.
UVCB: Sustanza Kimika b’Kompożizzjoni Mhux Magħrufa jew Varjabbli, Prodotti u Materjali Bijoloġiċi b’Reazzjoni Kumplessa
Appendiċi 2
TWAQQIT TAL-ISPERMATOĠENESI FIL-MAMMIFERI
Fig.1: Tqabbil tad-durata (jiem) tal-iżvilupp taċ-ċelloli ġerminali tal-irġiel fil-ġrieden, fil-firien u fil-bnedmin. It-tiswija tad-DNA ma sseħħx matul il-perjodi indikati mit-tidwil.
Skematika tal-ispermatoġenesi fil-ġrieden, fil-firien u fil-bniedem hi murija hawn fuq (meħuda minn Adler, 1996). L-ispermatogonji mhux differenzjati jinkludu: A-singla; A-pari; u spermatogonji A-allinjati (Hess u de Franca, 2008). A-singla titqies bħala ċ-ċelloli staminali veri; għalhekk, biex jiġu vvalutati l-effetti fuq iċ-ċelloli staminali jridu jgħaddu tal-anqas 49 jum (fil-ġrieden) bejn l-aħħar injezzjoni tas-sustanza kimika tat-test u t-tgħammir.
Referenzi
Adler, ID (1996). Comparison of the duration of spermatogenesis between rodents and humans. Mutat Res, 352:169-172.
Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Fi: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences u Springer Science&Business Media:1-15.
” |