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Document 32019R1390

Regolamento (UE) 2019/1390 della Commissione, del 31 luglio 2019, recante modifica dell’allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), al fine di adeguarlo al progresso tecnico (Testo rilevante ai fini del SEE)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

IT

Gazzetta ufficiale dell'Unione europea

L 247/1


REGOLAMENTO (UE) 2019/1390 DELLA COMMISSIONE

del 31 luglio 2019

recante modifica dell’allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), al fine di adeguarlo al progresso tecnico

(Testo rilevante ai fini del SEE)

LA COMMISSIONE EUROPEA,

visto il trattato sul funzionamento dell’Unione europea,

visto il regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 18 dicembre 2006, concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH), che istituisce un’Agenzia europea per le sostanze chimiche, che modifica la direttiva 1999/45/CE e che abroga il regolamento (CEE) n. 793/93 del Consiglio e il regolamento (CE) n. 1488/94 della Commissione, nonché la direttiva 76/769/CEE del Consiglio e le direttive della Commissione 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE (1), in particolare l’articolo 13, paragrafo 2,

considerando quanto segue:

(1)

Il regolamento (CE) n. 440/2008 (2) della Commissione istituisce i metodi di prova per determinare le proprietà fisico-chimiche, la tossicità e l’ecotossicità delle sostanze chimiche applicabili ai fini del regolamento (CE) n. 1907/2006.

(2)

L’Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) sviluppa linee guida armonizzate e riconosciute a livello internazionale per la sperimentazione sulle sostanze chimiche a fini regolamentari. L’OCSE pubblica periodicamente linee guida nuove e riviste per l’esecuzione delle prove, tenendo conto dei progressi scientifici in questo settore.

(3)

Al fine di tener conto del progresso tecnico e, ove possibile, di ridurre il numero degli animali utilizzati a fini sperimentali, conformemente alle disposizioni dell’articolo 13, paragrafo 2, del regolamento (CE) n. 1907/2006, a seguito dell’adozione delle pertinenti linee guida dell’OCSE, dovrebbero essere introdotti due nuovi metodi di prova per la valutazione dell’ecotossicità e nove nuovi metodi di prova volti a determinare la tossicità per la salute umana, mentre sette metodi di prova dovrebbero essere aggiornati. Undici di tali metodi di prova consistono in prove in vitro intese a determinare l’irritazione/corrosione cutanea e oculare, la sensibilizzazione cutanea, la genotossicità e gli effetti sul sistema endocrino. I portatori di interessi sono stati consultati in merito alla presente proposta di modifica.

(4)

Occorre pertanto modificare di conseguenza il regolamento (CE) n. 440/2008.

(5)

Le misure di cui al presente regolamento sono conformi al parere del comitato istituito a norma dell’articolo 133 del regolamento (CE) n. 1907/2006,

HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO:

Articolo 1

L’allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è modificato conformemente all’allegato del presente regolamento.

Articolo 2

Il presente regolamento entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea.

Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri.

Fatto a Bruxelles, il 31 luglio 2019

Per la Commissione

Il presidente

Jean-Claude JUNCKER


(1)  GU L 396 del 30.12.2006, pag. 1.

(2)  Regolamento (CE) n. 440/2008 della Commissione, del 30 maggio 2008, che istituisce dei metodi di prova ai sensi del regolamento (CE) n. 1907/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio concernente la registrazione, la valutazione, l’autorizzazione e la restrizione delle sostanze chimiche (REACH) (GU L 142 del 31.5.2008, pag. 1).


ALLEGATO

L’allegato del regolamento (CE) n. 440/2008 è così modificato:

1)

nella parte B, il capitolo B.4 è sostituito dal seguente:

"B.4   IRRITAZIONE/CORROSIONE CUTANEA ACUTA

INTRODUZIONE

1.

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 404 (2015). Le linee guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche sono rivedute periodicamente affinché riflettano le migliori conoscenze scientifiche disponibili. Nella revisione della linea guida dell’OCSE n. 404 è stata dedicata particolare attenzione ai miglioramenti possibili in relazione al benessere degli animali e alla valutazione di tutte le informazioni disponibili sulla sostanza chimica in esame, per evitare prove non necessarie sugli animali da laboratorio. La versione aggiornata della linea guida dell’OCSE n. 404 (originariamente adottata nel 1981 e riveduta nel 1992, nel 2002 e nel 2015) contiene un riferimento al documento di orientamento IATA (Integrated Approaches to Testing and Assessment, approcci integrati in materia di prove e valutazioni) per l’irritazione/corrosione cutanea (1), che propone un approccio modulare a tali prove. Oltre a descrivere vari moduli che raggruppano fonti d’informazioni e strumenti di analisi, il documento IATA i) fornisce orientamenti su come integrare e utilizzare i dati esistenti, sperimentali e non, a fini di valutazione del potenziale irritante e corrosivo delle sostanze chimiche a livello cutaneo, e ii) propone un approccio per i casi in cui sono necessarie prove aggiuntive (1). Nella prova iniziale in vivo la linea guida raccomanda inoltre, ove opportuno, di applicare all’animale le tre compresse per la prova da contatto una dopo l’altra anziché simultaneamente.

2.

Le definizioni di irritazione e corrosione cutanea figurano nell’appendice del presente metodo di prova.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

3.

Nell’interesse sia dell’accuratezza scientifica sia del benessere degli animali, è opportuno non ricorrere alle prove in vivo finché tutti i dati pertinenti disponibili circa il potenziale di corrosività/irritazione cutanea della sostanza chimica in esame non siano stati valutati nell’ambito di un’analisi basata sul "peso dell’evidenza", descritta nel documento di orientamento IATA per la corrosione e l’irritazione cutanea (vale a dire secondo quanto illustrato nelle tre parti del documento e nei relativi moduli) (1). In sintesi, nella parte 1 si prendono in considerazione i dati esistenti, suddivisi in sette moduli riguardanti i dati umani, i dati in vivo, i dati in vitro, i dati sulle proprietà fisico-chimiche (ad esempio il pH, in particolare una forte acidità o una forte alcalinità) e i metodi non sperimentali. Nella parte 2 si esegue l’analisi basata sul peso dell’evidenza. Se non è conclusiva si procede alle prove supplementari di cui alla parte 3, dapprima con metodi in vitro e soltanto come ultima istanza facendo ricorso a prove in vivo. Tale analisi dovrebbe pertanto portare a ridurre la necessità di prove in vivo relative alla corrosione/irritazione cutanea causata dalle sostanze chimiche per le quali, in relazione a questi due endpoint, altri studi hanno già fornito evidenza sufficiente.

PRINCIPIO DELLA PROVA IN VIVO

4.

La sostanza chimica in esame è applicata in un’unica dose sulla pelle dell’animale sperimentale; le zone di pelle non trattate servono da controllo. A intervalli specificati si osserva il grado di irritazione/corrosione, che viene annotato sulla base di una scala di valori; esso viene inoltre descritto in modo dettagliato per fornire una valutazione completa degli effetti. La durata dello studio deve essere sufficiente a valutare la reversibilità o irreversibilità degli effetti osservati.

5.

Gli animali che, in qualsiasi fase della prova, manifestano segni prolungati di grave sofferenza e/o dolore vanno soppressi con metodi non cruenti e la sostanza chimica in esame va valutata di conseguenza. I criteri da seguire nel decidere la soppressione con metodi non cruenti di animali moribondi o molto sofferenti formano l’oggetto di uno specifico documento di orientamento (2).

PREPARAZIONE PER LA PROVA IN VIVO

Selezione della specie animale

6.

L’animale sperimentale di elezione è il coniglio albino; vanno utilizzati giovani adulti sani. L’eventuale ricorso ad altre specie animali deve essere giustificato.

Preparazione degli animali

7.

All’incirca 24 ore prima della prova occorre rasare il pelo nella zona dorsale del tronco degli animali evitando di scorticare la pelle. Usare solo animali la cui pelle è sana e intatta.

8.

Alcuni ceppi di coniglio presentano zone di pelo denso che sono più evidenti in alcuni periodi dell’anno. Tali aree di crescita densa del pelo non vanno usate ai fini della prova.

Condizioni di stabulazione e alimentazione

9.

Gli animali vanno posti in gabbie individuali. La temperatura del locale deve essere di 20 °C (± 3 °C) per i conigli. L’umidità relativa deve essere preferibilmente del 50-60 %; in ogni caso deve raggiungere almeno il 30 % e possibilmente non superare il 70 %, tranne durante la pulizia degli ambienti. L’illuminazione deve essere artificiale, alternando 12 ore di luce e 12 ore di buio. Per l’alimentazione, i conigli saranno sottoposti a una dieta convenzionale da laboratorio e disporranno di acqua potabile a volontà.

PROCEDURA SPERIMENTALE

Applicazione della sostanza chimica in esame

10.

La sostanza chimica in esame va applicata su una zona ridotta (circa 6 cm2) di pelle e coperta con una compressa di garza fissata con un cerotto non irritante. Nei casi in cui non è possibile l’applicazione diretta (ad es. liquidi o alcune paste), la sostanza chimica in esame va prima applicata sulla compressa di garza, che poi è a sua volta applicata sulla pelle. La compressa va mantenuta in contatto lasco con la pelle mediante un’apposita fasciatura semiocclusiva per tutto il periodo di esposizione. Se la sostanza chimica in esame è applicata sulla compressa, quest’ultima va posizionata in modo che detta sostanza entri correttamente a contatto con la pelle e sia distribuita uniformemente. Occorre impedire che l’animale abbia accesso alla compressa e ingerisca o inali la sostanza chimica in esame.

11.

Le sostanze chimiche liquide sono generalmente testate allo stato non diluito. Per l’esame dei solidi (che possono essere ridotti in polvere, se ritenuto necessario) la sostanza chimica in esame va inumidita con la minor quantità d’acqua (o, se del caso, di un altro mezzo disperdente adeguato) sufficiente ad assicurare un buon contatto con la pelle. Se si impiegano mezzi disperdenti diversi dall’acqua, la potenziale influenza del mezzo disperdente sull’irritazione cutanea causata dalla sostanza chimica in esame deve essere minima o nulla.

12.

Al termine del periodo di esposizione, che è normalmente di quattro ore, la sostanza chimica in esame residua va rimossa usando, ove possibile, acqua o un solvente adeguato, senza alterare la risposta da essa provocata o l’integrità dell’epidermide.

Livelli di dose

13.

Sul punto prescelto per la prova va applicata una dose di 0,5 ml di liquido o 0,5 g di solido o pasta.

Prova iniziale (prova di irritazione/corrosione cutanea in vivo su un solo animale)

14.

Se la sostanza chimica in esame è stata giudicata corrosiva, irritante o non classificata sulla base di un’analisi basata sul peso dell’evidenza o di precedenti prove in vitro, ulteriori prove in vivo sono generalmente superflue. Tuttavia, nei casi in cui si ritiene necessario ottenere dati aggiuntivi, la prova in vivo viene eseguita inizialmente usando un solo animale e applicando il metodo seguente: applicare in sequenza all’animale al massimo tre compresse per la prova da contatto. Togliere la prima compressa dopo tre minuti. Se non si osservano reazioni cutanee gravi, applicare una seconda compressa in un punto differente e rimuoverla dopo un’ora. Se le osservazioni in questa fase indicano che è possibile prolungare l’esposizione fino a quattro ore senza causare sofferenze, applicare una terza compressa, che è rimossa dopo quattro ore, e classificare la reazione.

15.

Se dopo una qualsiasi delle tre esposizioni in sequenza si osserva un effetto corrosivo, interrompere immediatamente la prova. Se dopo la rimozione dell’ultima compressa non si osserva alcun effetto corrosivo, mantenere l’animale sotto osservazione per quattordici giorni, a meno che la corrosione non si manifesti prima.

16.

Qualora si preveda che la sostanza chimica in esame possa risultare irritante, ma non che produca corrosione, applicare un’unica compressa a un solo animale per quattro ore.

Prova confirmatoria (prova di irritazione cutanea in vivo su ulteriori animali)

17.

Se nella prova iniziale non si osservano effetti corrosivi, confermare la reazione irritante o negativa su altri due animali al massimo, applicando a ciascuno una compressa per un periodo di esposizione di quattro ore. Se nella prova iniziale si osserva un effetto irritante, la prova confirmatoria può essere condotta in maniera sequenziale, oppure mediante esposizione simultanea di due ulteriori animali. Nel caso eccezionale in cui non sia stata eseguita la prova iniziale, due o tre animali possono essere trattati applicando una sola compressa, che va rimossa dopo quattro ore. Se si usano due animali ed entrambi evidenziano la stessa reazione, non sono necessarie ulteriori prove. In caso contrario si sottopone alla prova anche il terzo animale. È possibile che siano necessari altri animali per valutare le reazioni dubbie.

Periodo di osservazione

18.

La durata del periodo di osservazione deve essere sufficiente a valutare completamente la reversibilità degli effetti osservati. Occorre tuttavia interrompere l’esperimento se, in qualsiasi momento, l’animale mostra segni continui di grave dolore o sofferenza. Per determinare la reversibilità degli effetti gli animali vanno osservati per 14 giorni dopo la rimozione delle compresse. Se la reversibilità si manifesta prima del quattordicesimo giorno, interrompere subito l’esperimento.

Osservazioni cliniche e classificazione delle reazioni cutanee

19.

Esaminare tutti gli animali per verificare se presentano segni di eritema o di edema e classificare le reazioni a 60 minuti e successivamente a 24, 48 e 72 ore dalla rimozione della compressa. Per la prova iniziale su un solo animale, esaminare la zona prescelta per la prova subito dopo la rimozione della compressa. Le reazioni cutanee sono classificate e registrate in base ai gradi indicati nella tabella riportata più avanti. Se la pelle presenta una lesione che non può essere identificata come irritazione o corrosione a 72 ore, può essere necessario proseguire l’osservazione fino al giorno 14 per determinare la reversibilità degli effetti. In aggiunta all’osservazione delle irritazioni, descrivere e documentare tutti gli effetti tossici locali, come la perdita del grasso cutaneo, ed eventuali effetti sistemici negativi (ad es. effetti sui segni clinici di tossicità e sul peso corporeo). Per chiarire le reazioni dubbie, valutare l’opportunità di eseguire un esame istopatologico.

20.

La classificazione delle reazioni cutanee è necessariamente soggettiva. Per favorirne l’armonizzazione e per assistere i laboratori e le persone che eseguono la prova e interpretano le osservazioni, istruire adeguatamente il personale sul sistema di punteggio usato (cfr. tabella più avanti). Potrebbe essere utile una guida illustrata per la classificazione dell’irritazione cutanea e di altre lesioni (3).

DATI E RELAZIONE

21.

I risultati dello studio vanno riassunti sotto forma di tabella nella relazione finale sulla prova e devono comprendere tutti gli elementi elencati al paragrafo 24.

Valutazione dei risultati

22.

Valutare il grado di irritazione cutanea congiuntamente alla natura e alla gravità delle lesioni, nonché alla loro reversibilità o irreversibilità. I punteggi individuali non forniscono un valore assoluto delle proprietà irritanti di un materiale, in quanto vanno valutatati anche altri effetti del materiale in esame. Per contro, essi devono essere considerati come valori di riferimento che vanno valutati congiuntamente a tutte le altre osservazioni emerse dallo studio.

23.

Nella valutazione delle reazioni irritanti è necessario considerare la reversibilità delle lesioni cutanee. Quando reazioni quali alopecia (zona limitata), ipercheratosi, iperplasia e desquamazione persistono fino alla fine del periodo di osservazione di 14 giorni, la sostanza chimica in esame va considerata irritante.

Relazione sull’esecuzione della prova

24.

La relazione sull’esecuzione della prova deve comprendere le informazioni elencate di seguito.

 

Giustificazione della prova in vivo:

Analisi basata sul peso dell’evidenza dei risultati ottenuti da prove precedenti, compresi i risultati della strategia di prova sequenziale;

descrizione dei dati pertinenti disponibili da prove precedenti;

dati ricavati in ciascuna fase della strategia di prova;

descrizione delle prove in vitro eseguite, inclusi i dettagli delle procedure e i risultati ottenuti per le sostanze in esame/di riferimento;

analisi basata sul peso dell’evidenza per l’esecuzione dello studio in vivo.

 

Sostanza chimica in esame:

sostanza monocostituente: identificazione della sostanza chimica, ad esempio mediante denominazione IUPAC o CAS, numero CAS, codice SMILES o InChI, formula strutturale, identità chimica delle impurità (se del caso e se le condizioni pratiche lo consentono), ecc.;

sostanza multicostituente, miscela e sostanze di composizione sconosciuta o variabile, prodotti di una reazione complessa o materiali biologici (UVCB): caratterizzati per quanto possibile mediante l’identità chimica (cfr. sopra), la presenza quantitativa e le proprietà fisico-chimiche pertinenti dei costituenti;

aspetto fisico, idrosolubilità e, se del caso, ulteriori proprietà fisico-chimiche pertinenti;

fonte, numero del lotto se disponibile;

trattamento della sostanza chimica in esame/sostanza di controllo prima della prova, se del caso (ad es. riscaldamento, frantumazione);

stabilità della sostanza chimica in esame, data limite di utilizzo o data della nuova analisi, se nota;

condizioni di conservazione.

 

Mezzo disperdente:

identificazione, concentrazione (ove pertinente), volume usato;

motivazione della scelta del mezzo disperdente.

 

Animale/i sperimentale/i:

specie/ceppo usato, motivazione dell’uso di animali diversi dal coniglio albino;

numero di animali di ciascun sesso;

peso di ciascun animale all’inizio e alla conclusione della prova;

età all’inizio dello studio;

origine degli animali, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.

 

Condizioni sperimentali:

tecnica di preparazione dell’area di applicazione della compressa;

dettagli relativi ai materiali utilizzati e alla tecnica di preparazione e di applicazione della compressa;

dettagli relativi a preparazione, applicazione e rimozione della sostanza chimica in esame.

 

Risultati:

tabella con i punteggi assegnati alle reazioni irritanti/corrosive per ciascun animale in tutti i momenti di misurazione;

descrizione di tutte le lesioni osservate;

descrizione circostanziata della natura e del grado dell’irritazione o della corrosione osservata e di eventuali reperti istopatologici;

descrizione di altri effetti negativi locali (ad es. perdita del grasso cutaneo) e sistemici oltre all’irritazione o alla corrosione cutanea.

 

Discussione dei risultati

 

Conclusioni

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD (2014). Guidance document on Integrated Approaches to Testing and Assessment for Skin Irritation/Corrosion. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 203), Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998.

(3)

OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organistion for Economic Cooperation and Development, Paris.

Tabella

Classificazione Delle Reazioni Cutanee

Nessun eritema…

0

Eritema molto lieve (appena percettibile)…

1

Eritema ben definito…

2

Eritema da moderato a grave…

3

Eritema grave (rosso vivo) fino alla formazione di escara che impedisce la classificazione dell’eritema…

4

Massimo possibile: 4

Nessun edema…

0

Edema molto lieve (appena percettibile)…

1

Edema lieve (bordi dell’area ben definiti da gonfiore visibile)…

2

Edema moderato (rigonfiamento di circa 1 mm)…

3

Edema grave (rigonfiamento di oltre 1 mm ed esteso oltre la zona di esposizione)…

4

Massimo possibile: 4

Per chiarire le reazioni dubbie è possibile eseguire un esame istopatologico.

APPENDICE

DEFINIZIONI

Sostanza chimica: una sostanza o miscela.

Irritazione cutanea: il manifestarsi di lesioni reversibili della pelle a seguito dell'applicazione della sostanza chimica in esame per non più di quattro ore.

Corrosione cutanea: il manifestarsi di lesioni irreversibili della pelle, segnatamente necrosi visibile dell'epidermide e del derma, a seguito dell'applicazione della sostanza chimica in esame per non più di quattro ore. Effetti tipici della corrosione sono ulcere, emorragie, escare sanguinanti e, al termine del periodo di osservazione di quattordici giorni, alterazione del colore dovuta a pallore della cute, zone di completa alopecia e cicatrici. Per valutare le lesioni dubbie, considerare l'opportunità di eseguire un esame istopatologico.

Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata seguendo il presente metodo di prova.

"

2)

Nella parte B, il capitolo B.17 è sostituito dal seguente:

"B.17   PROVA IN VITRO DI MUTAZIONE GENICA SU CELLULE DI MAMMIFERO NEI GENI HPRT E XPRT

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 476 (2016). I metodi di prova vengono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scientifici, delle mutevoli esigenze in materia di regolamentazione, e di considerazioni relative al benessere degli animali. L’attuale versione rivista del metodo di prova B.17 riflette quasi 30 anni di esperienza con questo metodo nonché i risultati dello sviluppo di un nuovo metodo distinto destinato alle prove in vitro di mutazione genica su cellule di mammifero utilizzando il gene timidina chinasi. Il metodo di prova B.17 è parte integrante di una serie di metodi di prova sulla tossicologia genetica. Un documento contenente informazioni succinte sulle prove di tossicologia genetica dell’OCSE, comprensivo di un compendio delle modifiche recentemente apportate alla rispettiva linea guida è stato elaborato dall’OCSE (1)

2.

Scopo della prova in vitro di mutazione genica su cellule di mammifero è identificare mutazioni geniche indotte da sostanze chimiche. Le linee cellulari utilizzate in queste prove misurano le mutazioni "in avanti" dei geni reporter, in particolare il gene endogeno dell’ipoxantina-guanina fosfori-bosil transferasi (Hprt nelle cellule di roditori, HPRT nelle cellule umane; denominati collettivamente gene Hprt e prova HPRT in questo metodo di prova) e il transgene della xantina-guanina fosforibosil trasferasi (gpt) (denominato prova XPRT). Le prove di mutazione HPRT e XPRT individuano diversi spettri di fenomeni genetici. Oltre agli eventi mutazionali individuati dalla prova HPRT (ad es. sostituzioni di coppie di basi, mutazioni della cornice di lettura, piccole delezioni e inserzioni), la posizione autosomica del transgene gpt può permettere di individuare mutazioni prodotte da ampie delezioni ed eventualmente una ricombinazione mitotica non individuata dalla prova HPRT poiché il gene Hprt è situato nel cromosoma X (2) (3) (4) (5) (6) (7). Attualmente la prova XPRT è usata meno diffusamente della prova HPRT a fini regolamentari.

3.

Le definizioni usate sono riportate nell’appendice 1.

CONSIDERAZIONI INIZIALI E LIMITI

4.

Le prove in vitro richiedono in generale l’uso di una fonte esogena di attivazione metabolica, ma il sistema esogeno di attivazione metabolica non simula perfettamente le condizioni in vivo.

5.

Occorre adoperarsi per evitare condizioni che porterebbero a falsi risultati positivi (vale a dire potenziali interazioni con il sistema di prova), non causati da un’interazione diretta fra le sostanze chimiche in esame e il materiale genetico della cellula; tali condizioni includono modifiche del pH o dell’osmolalità (8) (9) (10), un’interazione con i componenti del terreno di coltura (11) (12) o una eccessiva citotossicità (13). Per la prova HPRT è considerata eccessiva una citotossicità che superi i massimi livelli di citotossicità raccomandati definiti al paragrafo 19.

6.

Prima di applicare il presente metodo di prova a una miscela per generare dati ai fini regolamentari previsti, si deve considerare se, e in caso affermativo, perché, esso possa fornire risultati adeguati a tale scopo. Tale verifica non è necessaria se la miscela viene sottoposta a prova in ottemperanza a un obbligo regolamentare.

PRINCIPIO DELLA PROVA

7.

Le cellule mutanti deficienti di attività dell’enzima Hprt nella prova HPRT o di attività dell’enzima xprt nella prova XPRT sono resistenti agli effetti citostatici dell’analogo della purina 6-tioguanina (TG). Le cellule hprt (nella prova HPRT) o gpt (nella prova XPRT) proficienti sono sensibili alla TG, che provoca l’inibizione del metabolismo cellulare e arresta la divisione cellulare. Di conseguenza, le cellule mutanti sono in grado di proliferare in presenza di TG, mentre le cellule normali, che contengono Hprt (nella prova HPRT) o gpt (nella prova XPRT), non lo sono.

8.

Le cellule in sospensione o in colture monostrato sono esposte alla sostanza in esame, con e senza fonte esogena di attivazione metabolica (cfr. il paragrafo 14), per un tempo adeguato (3-6 ore), poi si allestiscono sub-culture per determinare la citotossicità e permettere l’espressione fenotipica prima della selezione dei mutanti (14) (15) (16) (17). La citotossicità è determinata dal tasso di sopravvivenza relativa (RS), ossia l’efficienza di clonazione misurata subito dopo il trattamento e adeguata per le eventuali perdite di cellule durante il trattamento rispetto al controllo negativo (paragrafo 18 e appendice 2). Le colture trattate sono mantenute nel terreno di coltura per un periodo sufficiente, specifico per ciascun tipo cellulare, per permettere l’espressione fenotipica ottimale delle mutazioni indotte (di solito minimo 7-9 giorni). Secondo l’espressione fenotipica, la frequenza dei mutanti è determinata mediante inseminazione di un numero noto di cellule in terreno contenente l’agente selettivo, per rilevare le colonie mutanti, e in terreno non contenente l’agente selettivo, per determinare l’efficacia di clonazione (vitalità). Dopo un adeguato periodo di incubazione le colonie sono contate. La frequenza dei mutanti è calcolata sulla base del numero di colonie di mutanti corretto per l’efficienza di clonazione al momento della selezione dei mutanti.

DESCRIZIONE DEL METODO

Preparazioni

Cellule

9.

I tipi cellulari utilizzati per le prove HPRT e XPRT devono essere notoriamente sensibili ai mutageni chimici, presentare elevata efficienza di clonazione, cariotipo stabile e frequenza stabile delle mutazioni spontanee. Fra le cellule più comunemente usate per la prova HPRT si citano le linee CHO, CHL e V79 di cellule di criceto cinese, le cellule di linfoma di topo L5178Y e le cellule linfoblastoidi umane TK6 (18) (19). Per la prova XPRT si utilizzano cellule CHO AS52 contenenti il transgene gpt (con delezione del gene Hprt) (20) (21); la prova HPRT non può essere effettuata sulle cellule AS52 in quanto il gene hprt è stato soppresso. L’utilizzo di altre linee cellulari deve essere giustificato e validato.

10.

Occorre controllare periodicamente la stabilità del numero modale dei cromosomi e l’assenza di contaminazione da micoplasma nelle linee cellulari (22) (23); non si devono usare cellule contaminate o che presentano modifiche del numero modale dei cromosomi. La durata normale del ciclo cellulare utilizzato nel laboratorio di prova deve essere stabilita e deve corrispondere alle caratteristiche cellulari pubblicate. Si deve anche controllare la frequenza dei mutanti spontanei nelle popolazioni di cellule madri che non devono essere utilizzate se la frequenza di mutanti non è accettabile.

11.

Prima dell’utilizzo in questa prova le colture possono dover essere ripulite dalle cellule mutanti preesistenti, ad esempio mediante coltura in terreno di coltura HAT per la prova HPRT ed MPA per la prova XPRT (5) (24) (cfr. l’appendice 1). Le cellule pulite possono essere crioconservate e successivamente scongelate per essere utilizzate come stock di lavoro. Lo stock di lavoro appena scongelato può essere utilizzato per la prova previo raggiungimento dei normali tempi di raddoppiamento. Nell’effettuare la prova XPRT, la coltura di routine delle cellule AS52 avviene in condizioni che garantiscano il mantenimento del transgene gpt (20).

Terreni e condizioni di coltura

12.

Le colture vanno mantenute in terreni di coltura e condizioni di incubazione (recipienti di coltura, atmosfera umidificata al 5 % di CO2, temperatura di incubazione di 37 °C) adeguati. Le colture cellulari sono sempre mantenute in condizioni che garantiscano una crescita in fase esponenziale. È particolarmente importante che i terreni e le condizioni di coltura siano scelti in modo da garantire la crescita ottimale delle cellule durante il periodo di espressione e un’efficienza di clonazione ottimale delle cellule mutanti e non mutanti.

Preparazione delle colture

13.

Le linee cellulari provengono da colture primarie, sono inseminate in un terreno di coltura ad una densità tale che le cellule in sospensione o in monostrato proseguiranno la loro crescita esponenziale durante le fasi di trattamento ed espressione (occorre ad esempio evitare la confluenza delle cellule che si stanno moltiplicando in monostrato).

Attivazione metabolica

14.

Se si utilizzano cellule prive di un’adeguata capacità di attivazione metabolica endogena si deve ricorrere a sistemi di attivazione metabolica esogeni. Il sistema più comunemente usato, raccomandato in tutti i casi salvo alternativa motivata, è una frazione post-mitocondriale integrata di cofattore (S9), prelevata dal fegato di roditori (solitamente ratti) trattati con induttori enzimatici come Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) o con una combinazione di fenobarbitone e β-naftoflavone (29) (30) (31) (32). Quest’ultima combinazione è conforme alla Convenzione di Stoccolma sugli inquinanti organici persistenti (33), e ha dimostrato di essere altrettanto efficace dell’Aroclor 1254 nell’indurre ossidasi a funzione mista (29) (31). La frazione S9 viene di solito usata a concentrazioni comprese tra 1-2 % (v/v) ma può aumentare fino al 10 % (v/v) nel terreno di coltura finale. La scelta del tipo e della concentrazione del sistema di attivazione metabolica esogena o dell’induttore metabolico usato può dipendere dalla classe delle sostanze in esame (34) (35) (36).

Preparazione della sostanza chimica in esame

15.

Le sostanze chimiche in esame solide devono essere preparate in adeguati solventi e, se necessario, diluite prima del trattamento delle cellule (cfr. il paragrafo 16). Le sostanze chimiche liquide in esame possono essere aggiunte direttamente alla coltura e/o diluite prima del trattamento del sistema di prova. Le sostanze chimiche in esame gassose o volatili devono essere sottoposte alla prova modificando adeguatamente i protocolli standard (trattamento in recipienti di coltura ermetici) (37) (38). Si usino preparati della sostanza chimica in esame approntati immediatamente prima del trattamento, salvo qualora siano disponibili dati sulla sua stabilità che dimostrino che la conservazione è accettabile.

CONDIZIONI DI PROVA

Solventi

16.

La scelta del solvente deve favorire l’ottimizzazione della solubilità delle sostanze chimiche in esame, senza nuocere alla conduzione della sperimentazione (ad esempio influenzando la crescita cellulare), compromettere l’integrità della sostanza chimica in esame, reagire con recipienti di coltura o pregiudicare il sistema di attivazione metabolica. Si raccomanda di prendere in considerazione in primo luogo, se possibile, l’uso di un solvente acquoso (o terreno di coltura). Solventi di uso consolidato sono, ad esempio, l’acqua e il dimetilsolfossido. In generale è opportuno che i solventi organici non superino l’1 % (v/v) e quelli acquosi (soluzione fisiologica o acqua) il 10 % (v/v) nel terreno di trattamento finale. Se i solventi utilizzati sono poco noti (ad esempio, etanolo o acetone), il loro utilizzo è ammesso purché suffragato da dati che ne provino la compatibilità con la sostanza chimica in esame e con il sistema di prova nonché l’assenza di tossicità genetica alla concentrazione utilizzata. In assenza di tali dati, è importante aggiungere controlli non trattati (cfr. l’appendice 1) per dimostrare che il solvente scelto non induce effetti nocivi o mutageni.

Misurazione della citotossicità e scelta delle concentrazioni di esposizione

17.

Nel determinare la concentrazione più elevata della sostanza chimica in esame, occorre evitare le concentrazioni che hanno la capacità di produrre falsi risultati positivi, come quelle che causano eccessiva citotossicità (cfr. il paragrafo 20), precipitazione nel terreno di coltura (cfr. il paragrafo 21) o variazioni marcate del pH od osmolalità (cfr. il paragrafo 5). Se la sostanza chimica in esame provoca un’alterazione marcata del pH del terreno al momento della sua aggiunta, è possibile adeguare il pH mediante l’azione tampone del terreno di trattamento finale in modo da evitare falsi risultati positivi e da mantenere condizioni di coltura appropriate.

18.

La scelta della concentrazione si basa sulla citotossicità e su altre considerazioni (cfr. i paragrafi 20-22). Mentre la valutazione della citotossicità in una prova iniziale può essere utile per definire meglio le concentrazioni da utilizzare da utilizzare nell’esperimento principale, non è necessario condurre una prova iniziale. Anche se si effettua una valutazione iniziale della citotossicità, nella prova principale è ancora richiesta la misurazione della citotossicità di ciascuna coltura. La citotossicità va valutata per mezzo del tasso di sopravvivenza relativa, ossia l’efficienza di clonazione delle cellule piastrate subito dopo il trattamento, adeguata per le eventuali perdite di cellule durante il trattamento, in base alla conta cellulare, rispetto all’efficienza di clonazione adeguata nei controlli negativi (assegnata una sopravvivenza del 100 %) (cfr. l’appendice 2 per la formula).

19.

Si usino almeno quattro concentrazioni di prova (senza contare i controlli positivi e i controlli con solvente) che soddisfano i criteri di accettabilità (citotossicità adeguata, numero di cellule, ecc.). Sebbene sia consigliabile l’utilizzo di colture doppie, per ciascuna concentrazione di prova si possono utilizzare colture replicate o uniche. I risultati ottenuti nelle colture replicate indipendenti con una determinata concentrazione devono essere riportati separatamente ma possono essere aggregati per l’analisi dei dati (17). Per le sostanze chimiche in esame la cui citotossicità è bassa o nulla, sono generalmente adeguati intervalli di concentrazione di un fattore di circa 2 a 3. In caso di citotossicità, le concentrazioni di prova selezionate dovrebbero rientrare in un intervallo di concentrazione a partire dai valori che producono citotossicità alle concentrazioni alle quali si riscontra una citotossicità modesta o nulla. Molte sostanze chimiche in esame presentano curve di concentrazione-risposta a forte pendenza e, per coprire l’intero intervallo di citotossicità o per valutare il rapporto concentrazione-risposta in dettaglio, può essere necessario utilizzare concentrazioni più ravvicinate e più di quattro concentrazioni, in particolare nei casi in cui è necessario ripetere l’esperimento (cfr. il paragrafo 43). L’utilizzo di più di quattro concentrazioni può essere particolarmente importante quando si utilizzano colture uniche.

20.

Se la concentrazione massima è basata sulla citotossicità, la concentrazione più elevata dovrebbe mirare a realizzare un tasso RS compreso fra 20 e 10 %. Occorre cautela nell’interpretare risultati positivi reperiti con un tasso RS solo del 10 % o inferiore (paragrafo 43).

21.

Per le sostanze chimiche in esame scarsamente solubili che non sono citotossiche a concentrazioni inferiori alla concentrazione insolubile più bassa, la concentrazione più elevata analizzata dovrebbe presentare una torbidità o un precipitato visibile ad occhio nudo o con un microscopio invertito alla fine del trattamento con la sostanza chimica in esame. Anche se la citotossicità si verifica a concentrazioni superiori a quella minima insolubile, è indicato effettuare la prova a una sola concentrazione che produce torbidità o un precipitato visibile, perché il precipitato può falsare gli effetti. Alla concentrazione che produce un precipitato, occorre assicurarsi che quest’ultimo non interferisca con la conduzione della sperimentazione. Può essere utile valutare la solubilità nel terreno di coltura prima della prova.

22.

Se non si osserva nessun precipitato o nessuna citotossicità limitante, la concentrazione massima di prova dovrebbe essere pari al valore più basso fra 10 mM, 2 mg/ml o 2 μl/ml (39) (40). Quando la composizione della sostanza chimica in esame non è definita, ad esempio nel caso di sostanze di composizione sconosciuta o variabile, prodotti di una reazione complessa o materiali biologici (UVCB) (41), prodotti estratti dall’ambiente, ecc., può essere necessario aumentare la concentrazione massima (5 mg/ml) in assenza di citotossicità sufficiente, per aumentare la concentrazione di ciascun componente. Va tuttavia rilevato che tali requisiti possono essere diversi per i prodotti farmaceutici per uso umano (42).

Controlli

23.

Per ciascuna condizione di prova si effettuano anche controlli negativi paralleli (cfr. il paragrafo 16), consistenti in solo solvente nel terreno di trattamento; i controlli vanno trattati come le colture di trattamento.

24.

Controlli positivi paralleli sono necessari per dimostrare la capacità del laboratorio di individuare mutageni alle condizioni del protocollo di prova utilizzato e l’efficacia del sistema di attivazione metabolica esogeno, se del caso. Esempi di controlli positivi sono riportati nella tabella 1. Sostanze alternative possono essere usate per i controlli positivi, se necessario. Poiché le prove di genotossicità in vitro su cellule di mammifero sono sufficientemente standardizzate, le prove che utilizzano trattamenti con e senza attivazione metabolica esogena possono essere svolte solo con un controllo positivo che richiede l’attivazione metabolica. In tal caso, questa sola risposta in un controllo positivo dimostrerà sia l’attività del sistema di attivazione metabolica che la capacità di risposta del sistema di prova. Ciascun controllo positivo va utilizzato con una o più concentrazioni che generalmente danno luogo ad un aumento riproducibile e individuabile rispetto al valore di fondo per dimostrare la sensibilità del sistema sperimentale e la risposta non può essere compromessa da una citotossicità superiore ai limiti stabiliti nel presente metodo di prova (cfr. il paragrafo 20).

Tabella 1

Sostanze di riferimento raccomandate per la valutazione della competenza dei laboratori e per la selezione dei controlli positivi

Condizioni di attivazione metabolica

Locus

Sostanza e n. CAS

Assenza di attivazione metabolica esogena

Hprt

Metansolfonato di etile [n. CAS 62-50-0] Etilnitrosourea [n. CAS 759-73-9] 4–Nitrochinolina-1-ossido [n. CAS 56-57-5]

 

xprt

Streptonigrina [n. CAS 3930-19-6] Mitomicina C [n. CAS 50-07-7]

Presenza di attivazione metabolica esogena

Hprt

3-Metilcolantrene [n. CAS 56-49-5] 7,12-Dimetilbenzantracene [n. CAS 57-97-6] Benzo(a)pirene [n. CAS 50-32-8]

 

xprt

Benzo(a)pirene [n. CAS 50-32-8]

PROCEDURA

Trattamento con la sostanza chimica in esame

25.

Le cellule in proliferazione sono trattate con la sostanza chimica in esame in presenza e in assenza di un sistema di attivazione metabolica. L’esposizione deve protrarsi per un periodo adeguato (si considerano di norma adeguate 3-6 ore).

26.

Il numero minimo di cellule utilizzate per ciascuna coltura di prova (di controllo e trattate) in ogni fase della prova è basata sulla frequenza dei mutanti spontanei. Un orientamento generale è trattare e preparare sub-colture di un numero sufficiente di cellule per mantenere 10 mutanti spontanei in ciascuna coltura in tutte le fasi della prova (17). La frequenza dei mutanti spontanei di norma è compresa fra 5 e 20 × 10-6. Per una frequenza di mutanti spontanei di 5 × 10-6 e per mantenere un numero sufficiente di mutanti spontanei (10 o più) anche per le colture trattate a concentrazioni che causano il 90 % di citotossicità durante il trattamento (RS 10 %), è necessario trattare almeno 20 × 106 cellule. Inoltre durante il periodo di espressione va coltivato e piastrato per la selezione dei mutanti un numero sufficiente di cellule (ma mai meno di 2 milioni) (17).

Tempo di espressione fenotipica e misurazione della frequenza dei mutanti

27.

Dopo il periodo di trattamento le cellule sono coltivate per consentire l’espressione del fenotipo mutante. Di norma è sufficiente un minimo di 7-9 giorni per permettere l’espressione subottimale del fenotipo dei mutanti neoindotti Hprt e xprt (43) (44). Durante questo periodo le cellule sono sottoposte a sub-coltura regolarmente per mantenerle in crescita esponenziale. Dopo l’espressione fenotipica le cellule sono ripiastrate in terreno di coltura con e senza agenti selettivi (6-tioguanina) per determinare rispettivamente il numero dei mutanti e l’efficienza di clonazione al momento della selezione. Tale piastratura è effettuata per mezzo di piastre per colture monostrato o di piastre da microtitolazione per le cellule in sospensione. Per la selezione dei mutanti le cellule sono piastrate a una densità tale da garantire un recupero ottimale dei mutanti (ossia, evitare la cooperazione metabolica) (17). Le piastre sono incubate per un periodo opportuno per ottenere una crescita ottimale della colonia (ad esempio 7-12 giorni) e si contano le colonie. La frequenza dei mutanti è calcolata sulla base del numero di colonie di mutanti corretto per l’efficienza di clonazione al momento della selezione dei mutanti (cfr. l’appendice 2 per le formule).

Competenza del laboratorio

28.

Al fine di acquisire una sufficiente esperienza con una prova prima di utilizzarla regolarmente, il laboratorio deve aver effettuato una serie di esperienze con sostanze di riferimento positive che agiscono mediante meccanismi differenti (almeno una con attivazione metabolica e una senza attivazione metabolica, con sostanze selezionate dalle sostanze chimiche elencate nella tabella 1) e con vari controlli negativi (con diversi solventi/mezzi disperdenti). Le risposte dei controlli positivi e negativi devono essere coerenti con la letteratura. Questo requisito non si applica ai laboratori con esperienza, ossia che dispongono di una base di dati storici quale definita ai paragrafi da 30 a 33.

29.

Una selezione di sostanze chimiche utilizzate come sostanze di controllo positivo (cfr. il paragrafo 25, tabella 1) deve essere verificata in assenza e in presenza di attivazione metabolica, allo scopo di dimostrare che il laboratorio dispone della competenza necessaria per individuare le sostanze chimiche mutagene, determinare l’efficacia del sistema di attivazione metabolica e dimostrare l’adeguatezza delle condizioni di crescita delle cellule durante il trattamento, l’espressione fenotipica e la selezione dei mutanti nonché dei metodi di conteggio Occorrerà definire un intervallo di concentrazione delle sostanze selezionate che consenta di ottenere aumenti riproducibili e correlati alla concentrazione rispetto ai valori di fondo allo scopo di dimostrare la sensibilità e l’intervallo dinamico del sistema di prova.

Dati storici di controllo

30.

Il laboratorio deve stabilire:

un intervallo e una distribuzione dei controlli positivi storici;

un intervallo e una distribuzione dei controlli negativi (non trattati, con solvente).

31.

All’acquisizione dei primi dati di distribuzione dei controlli negativi storici, è necessario che i controlli negativi paralleli siano coerenti con i dati di controllo pubblicati (22). Successivamente, man mano che nuovi dati sperimentali ampliano la distribuzione dei controlli, i dati dei controlli negativi paralleli dovrebbero, idealmente, rientrare nei limiti di controllo al 95 % di tale distribuzione (17) (45) (46).

32.

La banca dati dei controlli negativi storici del laboratorio deve inizialmente essere costituita con un minimo di 10 esperimenti ma preferibilmente con almeno 20 esperimenti svolti in condizioni sperimentali analoghe. I laboratori devono utilizzare metodi di controllo della qualità, quali diagrammi di controllo (ad esempio carte C o carte X medio (47)), per rilevare la variabilità dei loro dati di controllo positivi e negativi e dimostrare che la metodologia è "sotto controllo" nel laboratorio (46). Ulteriori raccomandazioni su come sviluppare e utilizzare i dati storici (cioè i criteri per l’inclusione e l’esclusione di dati nelle serie storiche e i criteri di accettabilità per un determinato esperimento) sono reperibili nella letteratura scientifica (45).

33.

I dati dei controlli negativi consistono nelle frequenze di mutanti da un’unica coltura o preferibilmente da colture replicate, come descritto al paragrafo 23. I controlli negativi paralleli dovrebbero idealmente situarsi entro i limiti di tale controllo al 95 % della distribuzione della banca dati dei controlli negativi storici del laboratorio (17) (45) (46). Se i dati dei controlli negativi paralleli si situano al di fuori del limite di controllo al 95 %, la loro inclusione nella distribuzione dei controlli storici può essere accettata a condizione che tali dati non siano valori estremi e che sia provato che il sistema di prova è "sotto controllo" (cfr. supra) e che non vi sono stati problemi tecnici o errori umani.

34.

Eventuali modifiche del protocollo sperimentale devono essere valutate in base alla coerenza con le banche dati storiche in relazione ai controlli. Eventuali notevoli incoerenze devono tradursi nella creazione di una nuova banca dati storica sui controlli.

DATI E RELAZIONE

Presentazione dei risultati

35.

La presentazione dei risultati include tutti i dati necessari a calcolare la citotossicità (espressa come RS). I dati per le colture trattate e di controllo includono il numero di cellule alla fine del trattamento, il numero di cellule piastrate immediatamente dopo il trattamento e le conte delle colonie (o il numero di pozzetti senza colonie per il metodo della microtitolazione). Il tasso di RS per ciascuna coltura va espresso come percentuale relativa del concomitante controllo con solvente (cfr. l’appendice 1 per le definizioni).

36.

La presentazione dei risultati include anche tutti i dati necessari a calcolare la frequenza dei mutanti. I dati per le colture trattate e di controllo includono: 1) il numero di cellule piastrate con e senza agenti selettivi (nel momento in cui le cellule sono piastrate per la selezione dei mutanti) e 2) il numero di colonie contate (o il numero di pozzetti senza colonie per il metodo della microtitolazione) nelle piastre con e senza agenti selettivi. La frequenza dei mutanti è calcolata sulla base del numero di colonie di mutanti (nelle piastre con agenti selettivi) corretto per l’efficienza di clonazione (dalle piastre senza agenti selettivi). La frequenza dei mutanti è espressa come numero di cellule mutanti per milione di cellule vitali (cfr. l’appendice 1 per le definizioni).

37.

Devono essere forniti dati sulle singole colture. Tutti i dati vanno riportati sinteticamente in una tabella.

Criteri di accettabilità

38.

L’accettazione dei risultati di una prova si basa sui criteri seguenti:

il controllo negativo parallelo è considerato accettabile per inserimento nella banca dati sui controlli negativi storici di laboratorio come descritto al paragrafo 33.

I controlli positivi paralleli (cfr. il paragrafo 24) devono indurre risposte compatibili con quelle generate nella banca dati dei controlli positivi storici e produrre un aumento statisticamente significativo rispetto al controllo negativo parallelo.

Sono state testate due condizioni sperimentali (con e senza attivazione metabolica) a meno che una abbia portato a risultati positivi (cfr. il paragrafo 25).

Un adeguato numero di cellule e concentrazioni è analizzabile (paragrafi 25, 26 e 19).

I criteri di selezione della concentrazione massima sono conformi a quelli descritti ai paragrafi 20, 21 e 22.

Analisi e interpretazione dei risultati

39.

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è considerata chiaramente positiva se, in una qualsiasi delle condizioni sperimentali esaminate:

almeno una delle concentrazioni di prova presenta un aumento statisticamente significativo rispetto al controllo negativo parallelo;

un metodo adeguato di analisi della tendenza evidenzia che l’aumento è collegato alla concentrazione;

uno o più risultati si situano al di fuori della distribuzione dei dati di controllo negativi storici (ad es. limite del controllo al 95 % in base alla distribuzione di Poisson, cfr. il paragrafo 33).

Se tutti i criteri sono soddisfatti, la sostanza chimica in esame è ritenuta in grado di indurre mutazioni genetiche in cellule di mammifero coltivate nel presente sistema di prova. Raccomandazioni dei metodi statistici più appropriati sono reperibili nella letteratura scientifica (46) (48).

40.

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente negativa se in tutte le condizioni sperimentali esaminate:

nessuna delle concentrazioni sperimentali presenta un incremento statisticamente significativo rispetto al controllo negativo parallelo;

un test di tendenza appropriato dimostra che non vi è aumento correlato alla concentrazione;

tutti i risultati si situano entro la distribuzione dei dati di controllo negativi storici (ad es. limite del controllo al 95 % in base alla distribuzione di Poisson, cfr. il paragrafo 33).

La sostanza chimica in esame è quindi ritenuta non in grado di indurre mutazioni genetiche in cellule di mammifero coltivate nel sistema di prova.

41.

Non è necessario verificare una risposta palesemente positiva o negativa.

42.

Nei casi di risposta non chiaramente positiva o negativa come sopra descritto o per contribuire a stabilire la pertinenza biologica di un risultato, i dati devono essere valutati da esperti e/o mediante ulteriori indagini. Può essere utile ripetere un esperimento modificandone eventualmente le condizioni (ad esempio, intervallazione delle concentrazioni, altre condizioni di attivazione metabolica, ossia concentrazione S9 od origine S9).

43.

In rari casi, anche dopo ulteriori analisi, la serie di dati non consente di valutare i risultati come positivi o negativi. Pertanto la risposta della sostanza chimica in esame va considerata equivoca (interpretata come altrettanto positiva o negativa).

Relazione sull’esecuzione della prova

44.

I seguenti dati devono figurare nella relazione sull’esecuzione della prova.

 

Sostanza chimica in esame:

origine, numero di lotto e data di scadenza, se disponibile;

stabilità della sostanza chimica in esame, se nota.

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente, se note;

misurazione del pH, dell’osmolalità e del precipitato nel terreno di coltura a cui è stata aggiunta la sostanza chimica in esame, se del caso.

 

Sostanza monocostituente:

aspetto fisico, idrosolubilità e, se del caso, ulteriori proprietà fisico-chimiche;

identificazione chimica, come la denominazione IUPAC o CAS, il numero CAS, il codice SMILES o InChI, la formula strutturale, l’identità chimica o impurità, se del caso e se le condizioni pratiche lo consentono, ecc.

 

Sostanza multicostituente, UVCB e miscele:

caratterizzata nella massima misura possibile con l’identità chimica (vedasi sopra), con la presenza quantitativa e con le proprietà fisico-chimiche pertinenti dei costituenti.

 

Solvente:

giustificazione della scelta del solvente;

percentuale di solvente nel terreno di coltura finale.

 

Cellule

 

Per le colture madri di laboratorio:

tipo, origine delle linee cellulari;

numero di passaggi, se disponibile, e dati storici del laboratorio;

caratteristiche del cariotipo e/o numero modale di cromosomi;

metodi usati per la mantenimento delle colture cellulari;

assenza di micoplasma;

tempi di raddoppiamento delle cellule.

 

Condizioni sperimentali:

criteri di selezione delle concentrazioni e del numero di colture: ad esempio i dati relativi alla citotossicità e ai limiti di solubilità;

composizione dei terreni di coltura, concentrazione di CO2, livello di umidità;

concentrazione della sostanza chimica in esame espressa come concentrazione finale nel terreno di coltura (ad esempio μg o mg/ml o mM di terreno di coltura);

concentrazione (e/o volume) del solvente e della sostanza chimica in esame aggiunti nel terreno di coltura;

temperatura di incubazione;

tempo di incubazione;

durata del trattamento;

densità delle cellule durante il trattamento;

tipo e composizione del sistema di attivazione metabolica (fonte di S9, metodo di preparazione della miscela S9, concentrazione o volume della miscela S9 e di S9 nel terreno di coltura finale, controlli di qualità S9);

sostanze di controllo positive e negative, concentrazioni finali per ciascuna condizione di trattamento;

durata del periodo di espressione (con numero di cellule inseminate, sub-colture e protocolli di alimentazione, se del caso);

identità e concentrazione dell’agente selettivo;

criteri di accettabilità delle prove;

metodi usati per contare il numero di cellule vitali e mutanti;

metodi utilizzati per la misurazione della citotossicità;

eventuali informazioni supplementari pertinenti per la citotossicità e metodo utilizzato;

durata dei tempi di incubazione dopo la piastratura;

criteri in base ai quali i risultati sono considerati positivi, negativi o equivoci;

metodi utilizzati per determinare il pH, l’osmolalità e la precipitazione.

 

Risultati:

numero di cellule trattate e numero di cellule sottoposte a sub-coltura per ciascuna coltura;

misurazioni della citotossicità e altre osservazioni se del caso;

segni di precipitazione e momento della determinazione;

numero di cellule piastrate nel terreno di coltura selettivo e in quello non selettivo;

numero di colonie nel terreno di coltura non selettivo e numero di colonie resistenti in quello selettivo e relative frequenze dei mutanti;

relazione concentrazione-risposta, se possibile;

dati sui controlli negativi (solvente) e positivi (concentrazioni e solventi) paralleli;

dati sui controlli negativi (solvente) e positivi, con intervalli, medie e deviazioni standard nonché intervallo di confidenza (ad es. 95 %) e numero di dati;

Analisi statistiche (per le colture singole e le repliche raggruppate se del caso), e gli eventuali valori-p.

 

Discussione dei risultati

 

Conclusione

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Appendice 1

DEFINIZIONI

Mutageni che provocano la sostituzione di coppie di basi: sostanze che provocano la sostituzione di una o più coppie di basi del DNA.

Sostanza chimica: una sostanza o una miscela.

Efficienza di clonazione: percentuale di cellule piastrate a bassa densità in grado di crescere in una colonia che può essere contata.

Concentrazioni: si riferiscono alle concentrazioni finali della sostanza chimica in esame nel terreno di coltura.

Citotossicità: per le prove di cui alla presente linea guida, la citotossicità corrisponde a una riduzione del tasso di sopravvivenza relativa delle cellule trattate rispetto al controllo negativo (cfr. il paragrafo specifico).

Mutazione "in avanti": una mutazione genica in cui dal tipo parentale alla forma mutante si ha alterazione o perdita dell'attività enzimatica o della funzione della proteina codificata.

Mutageni che provocano la mutazione della fase di lettura: sostanze chimiche che provocano l'inserzione o la delezione di una o più coppie di basi nella molecola di DNA.

Genotossico: termine generico che comprende tutti i tipi di danno a carico del DNA o dei cromosomi, tra cui rotture del DNA, cancellazioni, riarrangiamenti, mutazioni genetiche, aberrazioni cromosomiche e aneuploidia. Non tutti i tipi di effetti genotossici determinano alterazioni cromosomiche o danni permanenti ai cromosomi.

Terreno di coltura HAT: terreno di coltura contenente ipoxantina, aminopterina e timidina, utilizzato per ripulire dai mutanti Hprt.

Ricombinazione mitotica: durante la mitosi, ricombinazione fra cromatidi omologhi risultanti nell'eventuale induzione di rotture del doppio filamento del DNA o in una perdita di eterozigosi.

Terreno di coltura MPA: terreno di coltura contenente xantina, adenina, timidina, aminopterina e acido micofenolico, utilizzato per ripulire dai mutanti Xprt.

Mutageno: un fattore in grado di provocare mutazioni ereditarie delle sequenze di coppie di basi del DNA nei geni o della struttura dei cromosomi (aberrazioni cromosomiche).

Frequenza dei mutanti (MF): il numero di colonie mutanti osservato, diviso per il numero di cellule piastrate nel terreno di coltura selettivo, corretto per l'efficienza di clonazione (o vitalità) al momento della selezione.

Tempo di espressione fenotipica: il tempo trascorso dal trattamento durante il quale l'alterazione genetica si fissa nel genoma e tutti i prodotti genici preesistenti scompaiono fino all'alterazione del tratto fenotipico.

Tasso di sopravvivenza relativa (RS): è utilizzato come misura della citotossicità del trattamento. Il tasso di sopravvivenza relativa è dato dall'efficienza di clonazione delle cellule piastrate subito dopo il trattamento, adeguata per le eventuali perdite di cellule durante il trattamento, rispetto all'efficienza di clonazione nei controlli negativi (cui è assegnata una sopravvivenza del 100 %).

Frazioni S9 di fegato: supernatante dell'omogenato di fegato centrifugato a 9 000 g (estratto di fegato crudo).

Miscela di frazione S9: miscela di frazione S9 di fegato e dei cofattori necessari all'attività degli enzimi metabolici.

Controllo con solvente: termine generico che designa le colture di controllo che ricevono unicamente il solvente utilizzato per dissolvere la sostanza chimica in esame.

Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata applicando il presente metodo di prova.

Controllo non trattato: colture non sottoposte a trattamento (che non ricevono alcuna sostanza chimica in esame né solvente) ma preparate in parallelo e in modo identico alle culture esposte alla sostanza chimica in esame.

UVCB: sostanze di composizione sconosciuta o variabile, prodotti di una reazione complessa o materiali biologici.

Appendice 2

FORMULE PER LA VALUTAZIONE DELLA CITOTOSSICITÀ E DELLA FREQUENZA DEI MUTANTI

La citotossicità è valutata per mezzo del tasso di sopravvivenza relativa, ossia l'efficienza di clonazione delle cellule piastrate subito dopo il trattamento, rispetto all'efficienza di clonazione adeguata nei controlli negativi (cui è assegnata una sopravvivenza del 100 %) (cfr. formula RS, infra).

L'efficienza di clonazione adeguata per una coltura trattata con una sostanza chimica in esame è calcolata come:

Formula

Il tasso di sopravvivenza relativa per una coltura trattata con una sostanza chimica in esame è calcolato come:

Formula

La frequenza dei mutanti è l'efficienza di clonazione delle colonie mutanti nel terreno di coltura (mezzo) selettivo diviso per l'efficienza di clonazione nel terreno di coltura non selettivo misurata per la stessa coltura al momento della selezione.

Formula

Se per l'efficienza di clonazione si utilizzano piastre:

CE = numero di colonie / numero di cellule piastrate.

Se per l'efficienza di clonazione si utilizzano piastre da microtitolazione:

Il numero di colonie per pozzetto su piastre da microtitolazione segue la distribuzione di Poisson.

Efficienza di clonazione = LnP(0) / numero di cellule piastrate per pozzetto.

Dove: LnP(0) è il numero probabile di pozzetti vuoti rispetto al numero di pozzetti inseminati ed è illustrata dalla formula seguente:

LnP(0) = Ln (numero di pozzetti vuoti / numero di pozzetti piastrati) 3) Nella parte B, il capitolo B.22 è sostituito dal seguente:

"

3)

capitolo B.22 è sostituito dal seguente:

"B.22   SAGGIO DI LETALITÀ DOMINANTE NEI RODITORI

INTRODUZIONE

1.

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche (TG) 478 (2016). I metodi di prova vengono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scientifici, delle mutevoli esigenze in materia di regolamentazione, e di considerazioni relative al benessere degli animali. La presente versione modificata del metodo di prova riflette oltre 30 anni di esperienza con questo metodo e il potenziale di integrarlo o combinarlo questo metodo con altre prove di tossicità, ad esempio gli studi volti a individuare la tossicità sullo sviluppo, sulla riproduzione o la genotossicità; tuttavia, a causa delle limitazioni e del ricorso a un ampio numero di animali, il presente metodo di prova non è destinato a essere usato come metodo principale, bensì piuttosto come metodo di prova supplementare cui ricorrere quando non vi sono alternative per soddisfare i requisiti regolamentari. La combinazione di diverse prove di tossicità permette potenzialmente di risparmiare un gran numero di animali su cui sono effettuate le prove di tossicità. È stato elaborato un documento OCSE contenente informazioni succinte sulle prove di tossicologia genetica e un compendio delle modifiche recentemente apportate alla rispettiva linea guida (1).

2.

Scopo del metodo di prova sulla letalità dominante (DL) è esaminare se le sostanze chimiche causano mutazioni derivanti da aberrazioni cromosomiche nelle cellule germinali. Inoltre il metodo di prova di DL è rilevante per valutare la genotossicità. Difatti, benché possano variare a seconda delle specie, i fattori del metabolismo in vivo, gli aspetti farmacocinetici e i processi di riparazione del DNA sono attivi e contribuiscono alle risposte. L’induzione di una mutazione letale dominante per effetto dell’esposizione ad una sostanza chimica indica che la sostanza ha attaccato il tessuto germinale dell’animale sperimentale.

3.

Le mutazioni letali dominanti provocano la morte dell’embrione o del feto. L’induzione di una mutazione da letali dominanti per effetto dell’esposizione ad una sostanza chimica indica che la sostanza ha attaccato le cellule germinali dell’animale sperimentale.

4.

Un metodo di prova di DL è utile per confermare i risultati positivi delle prove utilizzando endpoint somatici in vivo e costituisce un indicatore pertinente per predire i rischi per gli esseri umani e i rischi di malattie genetiche trasmesse tramite la linea germinale. Tuttavia il presente metodo di prova richiede un ampio numero di animali ed è ad alta intensità di lavoro; di conseguenza la sua esecuzione risulta molto costosa e richiede molto tempo. Poiché la frequenza spontanea di mutazioni letali dominanti è alquanto elevata, la sensibilità del metodo per rilevare i modesti incrementi della frequenza delle mutazioni è generalmente limitata.

5.

Le definizioni dei termini fondamentali figurano nell’appendice 1.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

6.

In genere, la prova è effettuata sui topi (2) (3) (4) ma in alcuni casi, giustificati sotto il profilo scientifico, possono essere utilizzate altre specie, come i ratti (5) (6) (7) (8). Le mutazioni letali dominanti sono generalmente il risultato di gravi aberrazioni cromosomiche (strutturali e anomalie numeriche) (9) (10) (11), ma non si possono escludere mutazioni geniche. Una mutazione DL è una mutazione che avviene in una cellula germinale o dopo la fecondazione nell’embrione in fase iniziale dopo la fecondazione, non causa disfunzioni del gamete ma risulta letale per l’ovulo fecondato o per l’embrione in fase di sviluppo.

7.

Ciascun maschio è accoppiato in sequenza con femmine vergini ad intervalli appropriati. Il numero di accoppiamenti successivi al trattamento dipende dal fine ultimo dello studio di DL (paragrafo 23) e deve garantire che tutti gli stadi di maturazione delle cellule germinali maschili siano valutati ai fini delle mutazioni letali dominanti (12).

8.

Se è comprovato che la sostanza o i relativi metaboliti non raggiungono i testicoli, non è opportuno utilizzare questa prova.

PRINCIPIO DELLA PROVA

9.

In generale, gli animali maschi sono esposti alla sostanza chimica in esame attraverso un’adeguata via d’esposizione e fatti accoppiare con femmine vergini non trattate. Possono essere testati diversi tipi di cellule germinali utilizzando diversi intervalli di accoppiamenti in sequenza. Successivamente all’accoppiamento le femmine sono soppresse dopo un periodo adeguato e i loro uteri sono esaminati per determinare il numero di embrioni impiantati e di embrioni vivi e morti. La letalità dominante di una sostanza chimica in esame è determinata raffrontando gli embrioni impiantati vivi per femmina nel gruppo trattato con gli embrioni impiantati vivi per femmina nel gruppo di controllo con solvente/mezzo disperdente. L’aumento degli embrioni impiantati morti per femmina nel gruppo trattato rispetto agli embrioni impiantati morti per femmina nel gruppo di controllo rispecchia la perdita post-impianto indotta dalla sostanza chimica. La perdita post-impianto è calcolata determinando il rapporto di embrioni impiantati morti sugli embrioni impiantati totali nel gruppo trattato rispetto al rapporto di embrioni impiantati morti sugli embrioni impiantati totale nel gruppo di controllo. La perdita pre-impianto può essere stimata sulla base del conteggio dei corpi lutei cui si sottraggono gli embrioni impiantati totali oppure attraverso il raffronto del totale degli embrioni impiantati per femmina nel gruppo trattato e in quello di controllo.

VERIFICA DELLA COMPETENZA DEL LABORATORIO

10.

La competenza ad eseguire il presente metodo di prova è provata dimostrando la competenza a riprodurre frequenze di letalità dominante a partire da dati pubblicati (ad esempio (13) (14) (15) (16) (17) (18)) con sostanze chimiche utilizzate come sostanze di controllo positivo (incluse le risposte deboli) quali quelle elencate alla tabella 1 e controlli contenenti il mezzo disperdente e ottenendo frequenze di controllo negative coerenti con la serie di dati accettabili (cfr. riferimenti sopra) o, se disponibile, con la distribuzione dei controlli storici del laboratorio.

DESCRIZIONE DEL METODO

Preparazioni

Selezione delle specie animali

11.

Di preferenza sono utilizzati individui sani sessualmente maturi, provenienti da ceppi di animali da laboratorio. Sono comunemente usati i topi, ma sono idonei anche i ratti. Si può ricorrere a qualsiasi altra specie idonea di mammiferi, se ciò viene giustificato scientificamente nella relazione.

Condizioni di stabulazione e alimentazione degli animali

12.

Per i roditori, la temperatura dello stabulario deve essere mantenuta a 22 °C (± 3 °C). Idealmente l’umidità relativa deve essere del 50-60 %. Deve comunque essere come minimo del 40 % e non deve preferibilmente superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce seguite da 12 ore di oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua da bere. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire un’adeguata miscela della sostanza in esame, se somministrata con questo metodo. Prima del trattamento o dell’accoppiamento, se non ci si aspetta o non si osserva alcun comportamento aggressivo, i roditori vanno alloggiati in piccoli gruppi (non più di cinque), dello stesso sesso, preferibilmente in gabbie a fondo pieno con adeguato arricchimento ambientale. Gli animali possono essere stabulati individualmente se ciò è giustificato dal punto di vista scientifico.

Preparazione degli animali

13.

Gli animali adulti, sessualmente maturi, maschi e femmine, vengono suddivisi a caso in gruppi di controllo e di trattamento. Ciascun animale è identificato in modo univoco applicando un metodo incruento e il meno possibile invasivo (ad esempio inanellamento, etichettatura, applicazione di un microchip o identificazione biometrica, evitando il taglio delle orecchie o la falangectomia) e deve essere acclimatato alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni. Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Deve essere evitata ogni contaminazione incrociata fra il controllo positivo e la sostanza chimica in esame. All’inizio dello studio la variazione di peso degli animali deve essere minima e non superare il ± 20 % del peso medio per ciascun sesso.

Preparazione delle dosi

14.

Le sostanze chimiche in esame solide vanno sciolte o poste in sospensione in appropriati solventi o mezzi disperdenti o mescolate alla dieta o all’acqua da bere prima di essere somministrate agli animali. Le sostanze chimiche in esame liquide possono essere somministrate direttamente o diluite prima della somministrazione. In caso di esposizione per via inalatoria, le sostanze chimiche in esame possono essere somministrate sotto forma di gas, vapore o aerosol solido o liquido, in funzione delle loro proprietà fisico-chimiche. Le preparazioni della sostanza chimica in esame devono essere predisposte sul momento a meno di non disporre di dati che dimostrino la stabilità delle preparazioni in condizioni di stoccaggio e permettano di definire tali condizioni in modo adeguato.

Condizioni di prova

Solvente/mezzo disperdente

15.

Il solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici alle dosi usate e non si preveda che possa reagire chimicamente con la sostanza chimica in esame. L’uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Se possibile si raccomanda di considerare in primo luogo l’uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. Fra gli esempi di solventi/mezzi disperdenti compatibili e comunemente usati si possono menzionare l’acqua, la soluzione fisiologica, la soluzione di metilcellulosa, la soluzione di carbossimetilcellulosa sodica, l’olio di oliva e l’olio di mais.

Controlli positivi

16.

Vanno sempre utilizzati animali come controlli positivi concomitanti vanno sempre utilizzati animali, purché il laboratorio abbia dimostrato la propria competenza nell’effettuare la prova e abbia di recente (ad esempio negli ultimi 5 anni) usato la prova periodicamente. Non è tuttavia necessario trattare gli animali per i controlli positivi attraverso le stesse vie di esposizione degli animali cui è somministrata la sostanza chimica in esame, né prelevare un campione per ciascun intervallo di accoppiamento. Deve essere comprovato che le sostanze chimiche utilizzate per i controlli positivi inducono letalità dominante alle condizioni della prova. Gli animali dei gruppi di controllo dovranno essere trattati in modo identico agli animali del gruppo trattato, salvo per il trattamento.

17.

Le dosi delle sostanze chimiche utilizzate come controlli positivi sono selezionate in modo da produrre effetti deboli o moderati che consentano di valutare criticamente le prestazioni e la sensibilità del metodo di prova ma che inducano sistematicamente mente effetti letali dominanti. Nella tabella 1 figurano esempi di sostanze chimiche per i controlli positivi con le relative dosi appropriate.

Tabella 1

Esempi di sostanze utilizzate per i controlli positivi

Sostanza (n. CAS)

(N. di riferimento)

Intervallo di dosaggio effettivo (mg/kg)

(specie di roditori)

Tempo di somministrazione (giorni)

Trietilenemelammina [51-18-3] (15)

0,25 (topi)

1

Ciclofosfammide [50-18-0] (19)

50-150 (topi)

5

Ciclofosfammide [50-18-0] (5)

25-100 (topi)

1

Metansolfonato di etile [62-50-0] (13)

100-300 (topi)

5

Acrilammide monomerico [79-06-1] (17)

50 (topi)

5

Clorambucil [305-03-3] (14)

25 (topi)

1

Controlli negativi

18.

In ciascun momento di campionamento si includono animali che fungono da controllo negativo; a tali animali viene somministrato il solo solvente o mezzo disperdente e sono altrimenti trattati nello stesso modo dei gruppi di trattamento (20). In mancanza di dati su controlli storici o pubblicati che dimostrino che un solvente/mezzo disperdente prescelto non induce DL o altri effetti nocivi, in ciascun di campionamento si includono anche animali di controllo per stabilire l’accettabilità del controllo contenente il mezzo disperdente.

PROCEDURA

Numero di animali

19.

Gli individui maschi sono fatti accoppiare in modo sequenziale a intervalli opportunamente predefiniti (ad esempio, a intervalli settimanali, paragrafi 21 e 23), di preferenza con una femmina vergine. Il numero di maschi per gruppo va predeterminato affinché sia sufficiente (in combinazione con il numero di femmine che vengono fatte accoppiare a ciascun intervallo di accoppiamento) al fine di ottenere la potenza statistica necessaria per osservare almeno un raddoppiamento della frequenza di DL (paragrafo 44).

20.

Il numero di femmine per intervallo di accoppiamento va predeterminato mediante calcoli della potenza statistica che consentano di osservare almeno un raddoppiamento della frequenza di DL (ossia, un numero sufficiente di femmine gravide che forniscano almeno 400 embrioni impiantati totali) (20) (21) (22) (23) e che preveda almeno un embrione impiantato morto per unità di analisi (ossia, gruppo di accoppiamento per dose) (24).

Periodo di somministrazione e intervalli di accoppiamento

21.

Il numero di intervalli di accoppiamento successivi al trattamento è determinato dal programma di trattamento adottato, e deve essere garantire che tutti gli stadi delle cellule germinali maschili siano valutati ai fini di DL (12) (25). Per un singolo trattamento fino a 5 dosi somministrate quotidianamente, vanno calcolati 8 (per i topi) o 10 (per i ratti) accoppiamenti condotti con una settimana d’intervallo dopo l’ultimo trattamento. Per la somministrazione di dosi multiple, il numero di intervalli di accoppiamento è ridotto proporzionalmente al prolungamento del periodo di somministrazione, mantenendo tuttavia l’obiettivo di valutare tutti gli stadi della spermatogenesi (ad esempio, dopo un’esposizione di 28 giorni, sono sufficienti solo 4 accoppiamenti settimanali per valutare tutti gli stadi della spermatogenesi nei topi). Tutti i calendari di trattamento e accoppiamento vanno giustificati sotto il profilo scientifico.

22.

Le femmine restano con i maschi almeno per la durata di un ciclo estrale (ad esempio, una settimana copre un ciclo estrale sia nei topi che nei ratti). Le femmine che non si sono accoppiate durante l’intervallo settimanale possono essere utilizzate per un successivo intervallo di accoppiamento o, in alternativa, fino a che sia avvenuto l’accoppiamento, da determinare in base alla presenza di sperma nella vagina o di un tappo vaginale.

23.

Il regime di esposizione e di accoppiamento utilizzato dipende dallo scopo ultimo dello studio di DL. Se l’obiettivo è determinare se una data sostanza chimica induca mutazioni di DL tout court, allora il metodo accettato consisterà nell’esporre un intero ciclo di spermatogenesi (ad esempio, 7 settimane nel topo, 5-7 trattamenti/settimana) con accoppiamento alla fine. Se tuttavia l’obiettivo è individuare il tipo di cellule germinali sensibili all’induzione di DL, allora è preferibile un’esposizione unica o di 5 giorni seguita da un accoppiamento settimanale.

Livelli di dose

24.

Se viene effettuato uno studio preliminare di range-finding perché non sono già disponibili dati appropriati per orientare la scelta delle dosi, tale studio deve essere svolto nello stesso laboratorio, usando specie, ceppi, sesso e regime di trattamento identici a quelli che saranno utilizzati nello studio principale (26). Lo studio serve a individuare la dose massima tollerata (MTD), definita come la dose più alta che sarà tollerata per la durata della prova senza che si manifesti una tossicità che limita lo studio (ad esempio, reazioni o comportamenti anormali, perdita di peso moderata o citotossicità del tessuto interessato), ma senza provocare morte o segni di dolore, sofferenza o stress che rendano necessaria una soppressione incruenta degli animali (27).

25.

La MTD non deve inoltre avere effetti negativi sulla riuscita dell’accoppiamento (21).

26.

Sostanze chimiche in esame con azione biologica specifica, a dosi basse non tossiche (come ormoni e mitogeni) e sostanze chimiche che comportano saturazione delle caratteristiche tossicocinetiche possono costituire eccezioni rispetto ai criteri di definizione della dose e vanno valutate caso per caso.

27.

Per ottenere informazioni sulla relazione dose-risposta, uno studio completo deve includere un gruppo di controllo negativo e almeno tre livelli di dose, generalmente separati da un fattore 2, ma non superiore a 4. Per contro, se la sostanza chimica in esame non provoca alcuna tossicità nell’ambito di un test di range-finding o secondo quanto emerge dai dati esistenti, la dose massima per una singola somministrazione deve essere di 2 000 mg/kg di peso corporeo. Se la sostanza chimica in esame provoca invece tossicità, la MTD deve corrispondere alla dose più elevata somministrata, e i livelli di dose utilizzati devono essere compresi in un intervallo che va dalla tossicità massima a una tossicità modica o assente. Per le sostanze chimiche non tossiche, la dose limite per un periodo di somministrazione di 14 giorni o più, la dose limite è 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno e per periodi di somministrazione inferiori a 14 giorni la dose limite è di 2 000 mg/kg di peso corporeo/giorno.

Somministrazione delle dosi

28.

Nella concezione di una prova va considerata la via d’esposizione umana prevista. Pertanto possono essere scelte, se giustificate, vie di somministrazione quali l’alimentazione, l’acqua potabile, la via sottocutanea, la via endovenosa, l’applicazione topica, la via orale (sonda gastrica), inalatoria o l’impianto. In ogni caso, deve essere scelta la via che garantisce un’adeguata esposizione del o dei tessuti bersaglio. L’iniezione intraperitoneale non è generalmente raccomandata in quanto non si tratta di una via di esposizione umana prevista, e va utilizzata solo con una specifica giustificazione scientifica. Se la sostanza chimica in esame è miscelata nell’alimentazione o nell’acqua occorre fare attenzione, specialmente nei casi di dosaggio singolo, che il lasso di tempo fra l’assunzione del cibo e dell’acqua e l’accoppiamento sia sufficiente per permettere l’individuazione degli effetti (paragrafo 31). Il volume massimo di liquido somministrabile in una sola volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell’animale da laboratorio. Esso non deve generalmente essere superiore a 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose che possono essere somministrate in quantità pari a massimo 2 ml/100 g di peso corporeo. L’uso di volumi maggiori (se consentito dalla legislazione in materia di benessere degli animali) deve essere giustificato. La variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concentrazione, in modo da garantire la somministrazione di un volume costante in relazione al peso corporeo per tutti i livelli di dose.

Osservazioni

29.

Gli animali sperimentali devono essere oggetto di osservazioni cliniche generali e i segni clinici devono essere registrati almeno una volta al giorno, preferibilmente alla stessa o alle stesse ore e tenendo conto del periodo di massima intensità degli effetti previsti dopo la somministrazione. Almeno due volte al giorno, durante il periodo di somministrazione, tutti gli animali vengono esaminati al fine di determinare la morbilità e la mortalità. Tutti gli animali sono pesati all’inizio dello studio, almeno una volta alla settimana nel corso degli studi a dosi ripetute, e al momento della soppressione incruenta. La misurazione del consumo di cibo va eseguita almeno con cadenza settimanale. Se la sostanza chimica in esame è diluita in acqua prima di essere somministrata, il consumo di acqua va misurato ad ogni cambio dell’acqua e almeno una volta alla settimana. Gli animali che manifestano segni di tossicità eccessiva non letale vanno soppressi prima del completamente del metodo di prova (27).

Raccolta e trattamento dei tessuti

30.

Le femmine sono soppresse in maniera incruenta durante la seconda metà della gestazione, al giorno 13 per i topi e al giorno 14-15 per i ratti. I loro uteri sono esaminati per individuare effetti letali dominanti e per determinare il numero di embrioni impiantati, di embrioni vivi e morti nonché di corpi lutei.

31.

Le corna uterine e le ovaie sono esposte per il conteggio dei corpi lutei e i feti sono rimossi, conteggiati e pesati. Occorre esaminare con attenzione gli uteri per individuare e conteggiare tutti i riassorbimenti, compresi i riassorbimenti occultati da feti viventi. È registrata la mortalità fetale. Si registrano anche il numero di femmine gravide con successo e il numero di embrioni impiantati totali e di perdite pre-impianto nonché la mortalità post-impianto (inclusi i riassorbimenti precoci e tardivi). Inoltre i feti visibili sono conservati mediante fissativo di Bouin per almeno due settimane, cui fa seguito un esame per individuare gravi malformazioni esterne (28), onde ottenere maggiori informazioni sugli effetti sulla riproduttività e sullo sviluppo dell’agente in esame.

DATI E RELAZIONE

Trattamento dei risultati

32.

I dati devono essere disposti in forma di tabelle con indicazione del numero dei maschi accoppiati, del numero delle femmine gravide e del numero delle femmine non gravide. I risultati di ciascun accoppiamento, con indicazione dell’identità dei singoli soggetti maschi e femmine, vanno riportati individualmente. Per ciascuna femmina sono indicati l’intervallo di accoppiamento, i livelli di dose ricevuti dai maschi trattati e il numero di embrioni impiantati vivi e morti.

33.

La perdita post-impianto è calcolata determinando il rapporto di embrioni impiantati morti sugli embrioni impiantati totali nel gruppo trattato rispetto al rapporto di embrioni impiantati morti sugli embrioni impiantati totali nel gruppo di controllo con mezzo disperdente/solvente.

34.

La perdita pre-impianto è calcolata come differenza fra il numero dei corpi lutei e il numero degli embrioni impiantati, oppure come riduzione del numero medio di embrioni impiantati per femmina rispetto agli accoppiamenti di controllo. Se la perdita pre-impianto viene stimata, tale dato deve essere registrato.

35.

Il fattore di letalità dominante è stimato come: (morti pre-impianto/totale di embrioni impiantati per femmina) × 100.

36.

Nella relazione devono figurare i dati sulla tossicità e i segni clinici (descritti al paragrafo 29).

Criteri di accettabilità

37.

L’accettabilità della prova si basa sui seguenti criteri:

I controlli negativi concomitanti sono coerenti con le norme pubblicate per i dati relativi ai controlli negativi storici e con i dati dei controlli storici del laboratorio, se disponibili (cfr. i paragrafi 10 e 18);

i controlli positivi concomitanti inducono risposte coerenti con le norme pubblicate per i dati relativi ai controlli positivi storici, o con le banche dati dei controlli positivi storici del laboratorio, se disponibili ed evidenziano un incremento statisticamente significativo rispetto ai controlli negativi (cfr. i paragrafi 17 e 18);

un numero adeguato di embrioni impiantati totali e di dosi è analizzato (paragrafo 20);

i criteri di selezione della dose massima sono coerenti con quelli descritti ai paragrafi 24 e 27.

Analisi e interpretazione dei risultati

38.

Almeno tre gruppi esposti alla sostanza in esame devono essere analizzati al fine di ottenere dati sufficienti per l’analisi della relazione dose-risposta.

39.

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente positiva se:

almeno una delle dosi sperimentali presenta un incremento statisticamente significativo rispetto al concomitante controllo negativo;

un test appropriato mostra che l’aumento è correlato alla dose in almeno una condizione sperimentale (ad esempio un intervallo di accoppiamento settimanale); e

uno o più risultati si situano al di fuori della serie accettabile di dati relativi ai controlli negativi storici o della distribuzione dei dati relativi ai controlli negativi storici del laboratorio (ad esempio limite di controllo al 95 % in base alla distribuzione di Poisson), se disponibili.

La sostanza chimica in esame è quindi ritenuta in grado di indurre mutazioni letali dominanti nelle cellule germinali degli animali sperimentali. Raccomandazioni relative ai metodi statistici più appropriati sono descritte nel paragrafo 44; in letteratura è possibile trovare altri approcci statistici raccomandati (20) (21) (22) (24) (29). L’animale deve essere considerato come unità sperimentale nei metodi statistici utilizzati.

40.

A condizione che siano stati rispettati tutti i criteri di accettabilità, una sostanza chimica in esame è considerata chiaramente negativa se:

nessuna delle dosi sperimentali presenta un incremento statisticamente significativo rispetto al concomitante controllo negativo;

non si registrano aumenti correlati alla dose in nessuna condizione sperimentale; e

tutti i risultati si situano entro la serie accettabile di dati relativi ai controlli negativi storici o dei dati relativi ai controlli negativi storici del laboratorio (ad esempio limiti di controllo al 95 % in base alla distribuzione di Poisson), se disponibili.

La sostanza chimica in esame è quindi ritenuta non in grado di indurre mutazioni letali dominanti nelle cellule germinali degli animali sperimentali.

41.

Non è necessario verificare una risposta chiaramente positiva o chiaramente negativa.

42.

Se la risposta non è chiaramente negativa né chiaramente positiva e per stabilire la rilevanza biologica di un risultato (ad esempio un aumento debole o marginale), i dati sono sottoposti al giudizio di esperti e/o a indagini più approfondite, avvalendosi dei dati sperimentali esistenti, ad es. quelli che indicano che il risultato positivo si situa al di fuori della serie accettabile di dati relativi ai controlli negativi storici o dei dati relativi ai controlli negativi storici del laboratorio (30).

43.

In rari casi, anche dopo ulteriori analisi, quando la serie di dati non consente di valutare i risultati come positivi o negativi, i risultati sono dichiarati equivoci.

44.

I metodi statistici considerano l’animale maschio come unità sperimentale. Sebbene sia possibile che i dati di conteggio (ad esempio numero di embrioni impiantati per femmina) seguano la distribuzione di Poisson e/o le proporzioni (ad esempio la proporzione di embrioni impiantati morti) seguano una distribuzione binomiale, si osserva spesso una sovradispersione di tali dati (31). Di conseguenza l’analisi statistica dovrebbe inizialmente avvalersi di una prova che accerti la sotto- o sovradispersione mediante test di varianza, mediante test di varianza binomiale di Cochran (32) o il test C(α) di sovradispersione binomiale di Tarone (31) (33). Se non si osserva alcuna deviazione dalla dispersione binomiale, possono essere effettuati il test di Cochran-Armitage per il trend per le tendenze delle proporzioni fra i diversi livelli di dose (34) e raffronti a coppie con il gruppo di controllo applicando il test esatto di Fischer (35). Analogamente, se non si osserva alcuna dispersione dalla distribuzione di Poisson, le tendenze dei conteggi possono essere testate con la regressione di Poisson (36) e si possono effettuare raffronti a coppie con il gruppo di controllo nell’ambito del modello di Poisson, per mezzo di contrasti a coppie (36). Qualora si osservi una sovra- o sottodispersione, si raccomanda di ricorrere a metodi non parametrici (23) (31). Fra questi si annoverano test basati sui ranghi, quali il test di Jonckheere-Terpstra per la tendenza (37) e i test di Mann-Whitney (38) per i raffronti a coppie con il gruppo di controllo contenente il mezzo disperdente/solvente nonché i test di permutazione, ricampionamento o bootstrapping per la tendenza e i raffronti per coppie con il gruppo di controllo (31) (39).

45.

Un metodo di prova DL positivo conferma la genotossicità della sostanza chimica in esame nelle cellule germinali dei maschi trattati della specie sperimentale.

46.

Il fatto di stabilire se i valori osservati rientrano o trascendono l’intervallo storico dei controlli storici può fornire informazioni importanti ai fini della valutazione della significatività biologica della risposta (40).

Relazione sull’esecuzione della prova

47.

I seguenti dati devono figurare nella relazione sull’esecuzione della prova.

Sintesi

 

Sostanza chimica in esame:

origine, numero di lotto e data di scadenza, se disponibile;

stabilità della sostanza chimica in esame, se nota.

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente, se note;

misurazione del pH, dell’osmolalità e del precipitato nel terreno di coltura al quale è stata aggiunta la sostanza chimica in esame, se del caso.

 

Sostanza monocostituente:

aspetto fisico, idrosolubilità e, se del caso, ulteriori proprietà fisico-chimiche;

identificazione chimica, come la denominazione IUPAC o CAS, il numero CAS, il codice SMILES o InChI, la formula strutturale, la purezza, l’identità chimica delle impurezze, se del caso e se le condizioni pratiche lo consentono, ecc.

 

Sostanza multicostituente, UVCB e miscele:

caratterizzate nella massima misura possibile con l’identità chimica (vedasi sopra), con la presenza quantitativa e con le proprietà fisico-chimiche pertinenti dei costituenti.

 

Preparazione della sostanza chimica in esame:

motivazione della scelta del mezzo disperdente;

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo disperdente, se note;

preparazione dei preparati per somministrazione per via alimentare, con l’acqua da bere e per inalazione;

determinazione analitica dei preparati (ad esempio stabilità, omogeneità, concentrazioni nominali), se effettuata.

 

Animali utilizzati nella prova:

specie/ceppi usati e giustificazione della scelta;

numero, età e sesso degli animali;

origine, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.;

metodo di identificazione univoca degli animali;

per gli studi a breve termine: peso di ciascun maschio all’inizio e alla fine della prova; per gli studi di durata superiore a una settimana: peso di ciascun individuo durante lo studio e consumo di cibo. Devono essere inclusi l’intervallo, la media e la deviazione standard per ciascun gruppo.

 

Condizioni sperimentali:

dati sui controlli positivi e negativi (mezzo disperdente/solvente);

dati della prova per determinare l’intervallo delle dosi;

criteri di selezione delle dosi;

dettagli della preparazione della sostanza in esame;

modalità precise di somministrazione della sostanza chimica in esame;

criteri di selezione della via di somministrazione;

metodi di misurazione della tossicità animale, comprese, se disponibili, analisi istopatologiche o ematologiche e la frequenza con cui è stato misurato il peso corporeo e sono state realizzate osservazioni sugli animali;

metodi atti a verificare che la sostanza in esame ha raggiunto il tessuto bersaglio o la circolazione sanguigna, se i risultati sono negativi;

dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno) calcolata in funzione della concentrazione (ppm) della sostanza chimica in esame contenuta nella dieta/acqua da bere e del consumo, se del caso;

dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua;

dettagli sull’arricchimento ambientale delle gabbie;

descrizione dettagliata dello schema di trattamento e di campionamento e giustificazione delle scelte;

metodo di analgesia;

metodo di soppressione incruenta degli animali;

procedure di isolamento e di conservazione dei tessuti;

origine e numeri di lotto di tutti i kit e reagenti, se del caso;

metodi di enumerazione delle mutazioni letali dominanti;

ordine degli accoppiamenti;

metodi usati per stabilire l’avvenuto accoppiamento;

momento della soppressione incruenta;

criteri per conteggiare gli effetti di DL, inclusi i corpi lutei, gli embrioni impiantati, i riassorbimenti e le perdite pre-impianto, gli embrioni impiantati vivi e morti.

 

Risultati:

condizioni dell’animale prima e durante il periodo di saggio, compresi i segni di tossicità;

peso corporeo dei maschi durante i periodi di trattamento e di accoppiamento;

numero di femmine accoppiate;

relazione dose-risposta, ove possibile;

dati sui controlli negativi storici e concomitanti, con intervalli, medie e deviazioni standard;

dati sui controlli positivi concomitanti;

dati tabulati per ciascuna femmina gravida, compresi: numero di corpi lutei per ciascuna femmina; numero di embrioni impiantati per ciascuna femmina; numero di riassorbimenti e di perdite pre-impianto per ciascuna femmina; numero di embrioni impiantati vivi per ciascuna femmina; numero di embrioni impiantati morti per ciascuna femmina; peso dei feti;

i dati di cui sopra sintetizzati per ciascun periodo di accoppiamento e dose, con l’indicazione delle frequenze di letalità dominante;

analisi e metodi statistici applicati.

 

Discussione dei risultati

 

Conclusioni

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Appendice 1

DEFINIZIONI

Sostanza chimica: una sostanza o una miscela.

Corpi lutei: la struttura secernente ormoni che si forma nell'ovaio a seguito della trasformazione del follicolo che ha rilasciato l'ovocita. Il numero di corpi lutei nelle ovaie corrisponde al numero di ovociti prodotti.

Mutazione letale dominante: mutazione che si verifica in una cellula germinale o che si fissa dopo la fecondazione e che causa la morte dell'embrione o del feto.

Tasso di fertilità: il numero di femmine accoppiate gravide sul numero di femmine accoppiate.

Intervallo di accoppiamento: il tempo trascorso tra la fine dell'esposizione e l'accoppiamento dei maschi trattati. Il controllo di questo intervallo permette di valutare gli effetti della sostanza chimica sui diversi tipi di cellule germinali. Nei topi che si accoppiano durante la settimana n. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 dopo la fine dell'esposizione si misurano gli effetti su spermatozoi, spermatidi condensati, spermatidi tondeggianti, spermatociti in fase pachitene, spermatociti in fase precoce, spermatogoni differenziati, spermatogoni in fase di differenziazione e spermatogoni differenziati.

Perdita pre-impianto: discrepanza fra il numero degli embrioni impiantati e il numero dei corpi lutei. Può essere stimata anche mediante il raffronto fra gli embrioni impiantati totali per femmina nei gruppi trattati e di controllo.

Perdita post-impianto: il rapporto di embrioni impiantati morti sugli embrioni impiantati totali nel gruppo trattato rispetto al rapporto di embrioni impiantati morti sugli embrioni impiantati totali nel gruppo di controllo.

Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata applicando il presente metodo di prova.

UVCB: sostanza di composizione sconosciuta o variabile, prodotti di una reazione complessa o materiali biologici.

Appendice 2

TEMPI DI SPERMATOGENESI NEI MAMMIFERI

Image 1

Figura 1. Raffronto della durata (in giorni) dello sviluppo delle cellule germinali maschili nei topi, nei ratti e nell'uomo. La riparazione del DNA non avviene nei periodi ombreggiati.

Rappresentazione schematica del ciclo della spermatogenesi nel topo, nel ratto e nell'uomo (da Adler, 1996). Gli spermatogoni indifferenziati includono spermatogoni di tipo: A-single; A-paired; e A-aligned (Hess & de Franca, 2008). Gli spermatogoni A-single sono considerati le vere e proprie cellule staminali; pertanto per valutare gli effetti sulle cellule staminali devono trascorrere almeno 49 giorni (nel topo) fra l'ultima iniezione della sostanza chimica in esame e l'accoppiamento.

Riferimenti

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Hess, RA, De Franca LR (2008). Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, C. Yan Cheng (Ed), Landes Biosciences and Springer Science&Business Media:1-15.

"

4)

Nella parte B, il capitolo B.23 è sostituito dal seguente:

"B.23   SAGGIO DI ABERRAZIONE CROMOSOMICA SUGLI SPERMATOGONI DI MAMMIFERO

INTRODUZIONE

1.

Questo metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 483 (2016). I metodi di prova vengono periodicamente rivisti alla luce dei progressi scientifici, delle mutevoli esigenze in materia di regolamentazione nonché di considerazioni relative al benessere degli animali. La presente versione modificata del metodo di prova riflette molti anni di esperienza con questo saggio e tiene conto delle possibilità di integrare o combinare questa prova con altri studi di tossicità o genotossicità; Combinare diversi studi di tossicità permetterebbe, potenzialmente, di ridurre il numero di animali usati nelle prove di tossicità. Il presente metodo di prova è parte integrante di una serie di metodi di prova sulla tossicologia genetica. L’OCSE ha elaborato un documento contenente informazioni succinte sulle prove di tossicologia genetica e un compendio delle modifiche recentemente apportate alle linee guida dell’OCSE in tale materia (1).

2.

Il saggio in vivo di aberrazione cromosomica sugli spermatogoni di mammifero è destinato ad identificare le sostanze chimiche che causano aberrazioni cromosomiche strutturali nelle cellule spermatogoniali di mammifero (2) (3) (4). Questa prova è inoltre rilevante per valutare la genotossicità. Difatti, benché possano variare a seconda delle specie, i fattori del metabolismo in vivo, gli aspetti farmacocinetici e i processi di riparazione del DNA sono attivi e contribuiscono alle risposte. Questo metodo di prova non è stato elaborato per misurare le aberrazioni numeriche e non è comunemente usato per questo scopo.

3.

Questo metodo di prova misura le aberrazioni cromosomiche strutturali (di tipo cromosomico e cromatidico) nella divisione degli spermatogoni e pertanto dovrebbe permettere di prevedere l’induzione di mutazioni ereditabili in tali cellule germinali.

4.

Le definizioni dei termini fondamentali figurano nell’appendice.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

5.

Nel presente metodo di prova si usano generalmente roditori, ma in certi casi si può ricorrere anche ad altre specie se ciò è giustificato sul piano scientifico. Le preparazioni citogenetiche standard di testicoli di roditori generano metafasi mitotiche (spermatogoni) e meiotiche (spermatociti). Le metafasi mitotiche e meiotiche sono identificate in base alla morfologia dei cromosomi (4). La prova citogenetica in vivo rivela aberrazioni cromosomiche strutturali nelle mitosi degli spermatogoni. Altre cellule bersaglio non sono oggetto del presente metodo di prova.

6.

Per rilevare aberrazioni di tipo cromatidico negli spermatogoni, è necessario esaminare la prima divisione cellulare mitotica dopo il trattamento, prima che tali aberrazioni evolvano in aberrazioni di tipo cromosomico nelle successive divisioni cellulari. L’analisi dei cromosomi allo stadio della meiosi, per individuare aberrazioni cromosomiche strutturali allo stadio della diacinesi-metafase I e metafase II può fornire ulteriori informazioni sugli spermatociti trattati.

7.

I testicoli contengono diverse generazioni di spermatogoni (5). Questi diversi tipi di cellule germinali possono presentare sensibilità diverse al trattamento chimico. Le aberrazioni individuate rappresentano pertanto una risposta aggregata delle popolazioni di cellule spermatogoniali trattate. La maggioranza delle cellule mitotiche nelle preparazioni di testicoli consiste in spermatogoni di tipo B, il cui un ciclo cellulare è di circa 26 ore (3).

8.

Se è comprovato che la sostanza chimica in esame o i relativi metaboliti non raggiungono i testicoli, non è opportuno utilizzare questa prova.

PRINCIPIO DELLA PROVA

9.

Generalmente gli animali sono esposti alla sostanza chimica in esame attraverso un’adeguata via d’esposizione, e al momento opportuno, dopo il trattamento, sono soppressi in maniera incruenta. Prima della soppressione incruenta, gli animali sono trattati con un inibitore della metafase (ad esempio colchicina o Colcemid®). Le preparazioni cromosomiche approntate dalle cellule germinali sono poi sottoposte a un processo di colorazione, e le cellule in metafase sono analizzate per individuare aberrazioni cromosomiche.

VERIFICA DELLA COMPETENZA DEL LABORATORIO

10.

La competenza sperimentale ad eseguire il presente metodo di prova è provata dimostrando la competenza a riprodurre i risultati attesi delle frequenze di aberrazioni cromosomiche strutturali negli spermatogoni con sostanze chimiche utilizzate come sostanze di controllo positivo (incluse le risposte deboli), quali quelle elencate alla tabella 1 e ottenendo frequenze di controllo negative coerenti con la serie di dati accettabile di dati di controllo riportati dalla letteratura pubblicata (ad esempio (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)) o, se disponibile, con la distribuzione dei controlli storici del laboratorio.

DESCRIZIONE DEL METODO

Preparazioni

Selezione delle specie animali

11.

Di preferenza sono utilizzati individui adulti, giovani e in buona salute, provenienti da ceppi di animali da laboratorio. Generalmente si usano topi maschi; tuttavia, qualora ciò sia scientificamente giustificato, e per consentire la combinazione con un’altra prova, possono essere utilizzati maschi di altre specie idonee di mammiferi. L’utilizzazione di specie diverse dai roditori deve essere scientificamente giustificata nella relazione.

Condizioni di stabulazione e alimentazione degli animali

12.

Per i roditori, la temperatura dello stabulario deve essere mantenuta a 22 °C (± 3 °C). Idealmente l’umidità relativa deve essere del 50-60 %. Deve comunque essere come minimo del 40 % e non deve preferibilmente superare il 70 %, tranne che nel corso delle pulizie degli ambienti. L’illuminazione deve essere artificiale, con una sequenza di 12 ore di luce e 12 di oscurità. Per quanto concerne l’alimentazione, si possono usare le diete convenzionali da laboratorio con una quantità illimitata d’acqua da bere. La scelta della dieta può essere influenzata dalla necessità di garantire un’adeguata miscela della sostanza in esame, se somministrata per questa via. Se non ci si aspetta alcun comportamento aggressivo i roditori vanno alloggiati in piccoli gruppi (non più di cinque in ogni gabbia), preferibilmente in gabbie a fondo pieno con adeguato arricchimento ambientale. Gli animali possono essere stabulati individualmente se ciò è giustificato dal punto di vista scientifico.

Preparazione degli animali

13.

Sono generalmente utilizzati animali maschi adulti, giovani e sani (età 8-12 settimane all’inizio del trattamento), che vengono suddivisi a caso in gruppi di controllo e di trattamento. Ciascun animale è identificato in modo univoco applicando un metodo incruento e il meno possibile invasivo (cioè inanellamento, etichettatura, applicazione di un microchip o identificazione biometrica, evitando il taglio delle orecchie o la falangectomia) e deve essere acclimatato alle condizioni di laboratorio per almeno 5 giorni. Le gabbie devono essere sistemate in modo da ridurre al minimo eventuali effetti dovuti alla loro collocazione. Deve essere evitata ogni contaminazione incrociata fra il controllo positivo e la sostanza chimica in esame. All’inizio dello studio le variazioni di peso tra gli animali devono essere minime e non superare ± 20 %.

Preparazione delle dosi

14.

Le sostanze chimiche in esame solide vanno sciolte o poste in sospensione in appropriati solventi o mezzi disperdenti o mescolate alla dieta o all’acqua da bere prima di essere somministrate agli animali. Le sostanze chimiche in esame liquide possono essere somministrate direttamente o diluite prima della somministrazione. In caso di esposizione per via inalatoria, le sostanze possono essere somministrate sotto forma di gas, vapore o aerosol solido o liquido, in funzione delle loro proprietà fisico-chimiche. Le preparazioni della sostanza chimica in esame devono essere predisposte sul momento a meno di non disporre di dati che dimostrino la stabilità delle preparazioni in condizioni di stoccaggio e permettano di definire tali condizioni in modo adeguato.

Condizioni di prova - Solvente/mezzo disperdente

15.

Il solvente/mezzo disperdente non deve produrre effetti tossici ai livelli di dose usati e non deve poter reagire chimicamente con la sostanza in esame. L’uso di solventi/mezzi disperdenti poco noti è ammesso solo se suffragato da dati che ne provino la compatibilità. Se possibile si raccomanda di considerare in primo luogo l’uso di un solvente/mezzo disperdente acquoso. Fra gli esempi di solventi/mezzi disperdenti compatibili e comunemente usati si possono menzionare l’acqua, la soluzione fisiologica, la soluzione di metilcellulosa, la soluzione di carbossimetilcellulosa sodica, l’olio di oliva e l’olio di mais. In mancanza di dati sui controlli storici o pubblicati che dimostrino che un solvente/mezzo disperdente atipico prescelto non induce aberrazioni cromosomiche strutturali e altri effetti nocivi, va effettuato uno studio iniziale per stabilire l’accettabilità del controllo contenente il solvente/mezzo disperdente.

Controlli positivi

16.

Vanno sempre utilizzati animali come controlli positivi concomitanti, purché il laboratorio abbia dimostrato la propria competenza nell’effettuare la prova e abbia di recente (ad es. negli ultimi 5 anni) usato la prova periodicamente. Quando manca un gruppo di controllo positivo concomitante, in ogni esperimento devono essere inclusi controlli del conteggio (vetrini fissati e non colorati). Questo può avvenire includendo nel conteggio dello studio campioni di riferimento idonei ottenuti e conservati in occasione di un esperimento separato di controllo positivo svolto periodicamente (ad esempio ogni 6-18 mesi) nel laboratorio in cui è condotta la prova; ad esempio, durante la dimostrazione della competenza del laboratorio e successivamente con cadenza periodica, se necessario.

17.

Le sostanze chimiche per i controlli positivi devono produrre, in modo affidabile, un aumento individuabile della frequenza delle cellule con aberrazioni cromosomiche strutturali rispetto al livello spontaneo. Le dosi dei controlli positivi devono essere scelte in modo che gli effetti siano chiari ma non rivelino immediatamente all’analista l’identità dei campioni codificati. Nella tabella 1 figurano esempi di sostanze per i controlli positivi.

Tabella 1

Esempi di sostanze da utilizzare per i controlli positivi

Sostanze chimiche [n. CAS] (n. di riferimento)

Ciclofosfamide (monoidrato) [n. CAS 50-18-0 (n. CAS 6055-19-2)] (9)

Cicloesilammina [n. CAS 108-91-8] (7)

Mitomicina C [n. CAS 50-07-7] (6)

Acrilammide monomerico [79-06-1] (10)

Trietilenmelammina [n. CAS 51-18-3] (8)

Controlli negativi

18.

In ciascun momento di campionamento si includono animali che fungono da controllo negativo; a tali animali viene somministrato il solo solvente o mezzo disperdente e sono altrimenti trattati nello stesso modo dei gruppi di trattamento. In mancanza di dati sui controlli storici o pubblicati che dimostrino che un solvente/mezzo disperdente prescelto non induce aberrazioni cromosomiche o altri effetti nocivi, in ciascun momento di campionamento si includono animali di controllo non trattati per stabilire l’accettabilità del controllo contenente il mezzo disperdente di controllo.

PROCEDURA

Numero di animali

19.

All’inizio dello studio, la dimensione stabilita del gruppo deve consentire di disporre, in ogni gruppo, di almeno 5 animali maschi. Questo numero di animali per gruppo è ritenuto sufficiente per fornire una potenza statistica sufficiente (ossia per osservare almeno un raddoppiamento della frequenza delle aberrazioni cromosomiche se il livello dei controlli negativi è pari a 1,0 % o superiore, con l’80 % di probabilità a un livello di significatività dello 0,05) (3) (11). A titolo di orientamento sul numero massimo di animali generalmente necessario, uno studio che prevede due momenti di campionamento e coinvolge tre gruppi di trattamento e un gruppo di controllo negativo concomitante, più un gruppo di controllo positivo (ogni gruppo composto da cinque animali dello stesso sesso) richiederebbe 45 animali.

Programma di trattamento

20.

Le sostanze chimiche in esame vengono in generale somministrate un’unica volta (ossia come trattamento singolo). È possibile impiegare altri protocolli di trattamento, purché siano scientificamente giustificati.

21.

Dopo il trattamento si procede al prelievo di due campioni nel gruppo cui è stata somministrata la dose massima. Poiché il tempo necessario affinché la sostanza o le sostanze chimiche in esame siano assorbite e metabolizzate e producano effetti sulla cinetica del ciclo cellulare può influire sul momento ottimale per l’individuazione delle aberrazioni cromosomiche, sono effettuati due campionamenti, uno precoce e uno tardivo, rispettivamente circa 24 e 48 ore dopo il trattamento. Per dosi diverse dalla dose massima è opportuno procedere al campionamento precoce di 24 ore (inferiore o uguale al ciclo cellulare degli spermatogoni di tipo B, ottimizzando così la probabilità di conteggiare le prime metafasi post-trattamento) dopo il trattamento, salvo sia noto che il campionamento in un momento diverso risulterebbe giustificato e più idoneo all’individuazione degli effetti.

22.

Si possono usare ulteriori momenti di campionamento. Ad esempio nel caso di sostanze chimiche che producono effetti indipendenti dalla fase S, possono essere idonei tempi di campionamento più precoci (ossia meno di 24 ore).

23.

Si può usare un regime di trattamento a dosi ripetute, ad esempio nel caso in cui la prova sia effettuata congiuntamente ad una prova su un endpoint diverso il cui periodo di somministrazione è di 28 giorni (ad esempio TM B.58); sono allora necessari gruppi aggiuntivi di animali al fine di tener conto dei diversi tempi di campionamento. Conseguentemente, l’idoneità di un siffatto programma deve essere giustificata sul piano scientifico e valutata caso per caso.

24.

Prima della soppressione incruenta, agli animali si inietta per via intraperitoneale una dose adeguata di un inibitore della metafase (ad esempio Colcemid® o colchicina). Gli animali sono quindi campionati dopo un adeguato lasso di tempo. Per i topi e i ratti tale intervallo è di circa 3-5 ore.

Livelli di dose

25.

Qualora venga effettuato uno studio preliminare per determinare l’intervallo delle dosi da somministrare, in quanto non sono disponibili dati adeguati da studi pertinenti che forniscano un orientamento in tal senso, tale studio deve essere effettuato nello stesso laboratorio, utilizzando specie, ceppi e regime di trattamento identici a quelli da utilizzare nello studio principale sulla base delle metodologie attualmente in uso per gli studi volti a determinare l’intervallo di concentrazione delle dosi (12). Lo studio deve essere finalizzato a individuare la dose massima tollerata (DMT), definita come la dose che provoca lievi effetti tossici in relazione alla durata dello studio (ad esempio, reazioni o comportamenti anormali, perdita di peso moderata o citotossicità del sistema ematopoietico), ma che non provoca la morte dell’animale o segni di dolore e sofferenza tali da renderne necessaria la soppressione (13).

26.

La dose massima può essere definita anche come dose che produce qualche segno di tossicità negli spermatogoni (ad esempio una riduzione del rapporto tra cellule degli spermatogoni in mitosi e le cellule che si trovano nella prima e seconda metafase meiotica). Tale riduzione non deve superare il 50 %.

27.

Le sostanze chimiche in esame con azione biologica specifica a dosi basse non tossiche (come ormoni e mitogeni) e le sostanze chimiche che presentano saturazione delle proprietà tossicocinetiche possono costituire eccezioni rispetto ai criteri di determinazione delle dosi e vanno valutate caso per caso.

28.

Per ottenere informazioni sulla relazione dose-risposta, uno studio completo deve includere un gruppo di controllo negativo (paragrafo 18) e almeno tre livelli di dose, generalmente separati da un fattore 2, ma non superiore a 4. Se la sostanza chimica in esame non provoca alcuna tossicità nell’ambito di un test di range-finding o secondo quanto emerge dai dati esistenti, la dose massima per una singola somministrazione deve essere di 2 000 mg/kg di peso corporeo. Per contro, se la sostanza chimica in esame provoca tossicità, la MTD deve corrispondere alla dose più elevata somministrata, e i livelli di dose utilizzati devono essere compresi in un intervallo che va dalla tossicità massima a una tossicità modica o assente. Quando una tossicità del tessuto bersaglio (ad esempio i testicoli) è osservata a tutti i livelli di dose, è consigliabile un ulteriore studio con dosi non tossiche. Gli studi volti a descrivere più pienamente le informazioni quantitative sulla relazione dose-risposta possono richiedere gruppi di trattamento supplementari. Per certi tipi di sostanze chimiche in esame (ad esempio medicinali per uso umano) per le quali valgono specifici requisiti, i limiti possono variare. Se la sostanza chimica in esame produce effetti tossici, si seleziona la dose limite più due dosi inferiori (come sopra descritto). Per un periodo di somministrazione di 14 giorni o più, la dose limite è 1 000 mg/kg di peso corporeo/giorno e per periodi di somministrazione inferiori a 14 giorni la dose limite è di 2 000 mg/kg di peso corporeo/giorno.

Somministrazione delle dosi

29.

Nella concezione di un saggio va considerata la via d’esposizione umana prevista. Pertanto possono essere scelte, se giustificate, vie di somministrazione quali l’alimentazione, l’acqua potabile, la via sottocutanea locale, la via endovenosa, la via orale (sonda gastrica), inalatoria o l’impianto. In ogni caso, si deve optare per la via che garantisce un’adeguata esposizione del tessuto bersaglio. Le iniezioni intraperitoneali non sono in genere raccomandate in quanto non costituiscono una via di esposizione umana fisiologica mente rilevante, a meno che ciò non risulti scientificamente giustificato. Se la sostanza chimica in esame è miscelata nell’alimentazione o nell’acqua occorre fare attenzione, specialmente nei casi di dosaggio singolo, che il lasso di tempo fra l’assunzione del cibo e dell’acqua e il campionamento sia sufficiente per consentire l’individuazione degli effetti (cfr. il paragrafo 33). Il volume massimo di liquido somministrabile in una sola volta con sonda gastrica o con iniezione dipende dalle dimensioni dell’animale da laboratorio. Esso non deve generalmente essere superiore a 1 ml/100 g di peso corporeo, tranne nel caso delle soluzioni acquose che possono essere somministrate in quantità pari a massimo 2 ml/100 g di peso corporeo. L’uso di volumi maggiori (se consentito dalla legislazione in materia di benessere degli animali) deve essere giustificato. La variabilità del volume somministrato deve essere ridotta al minimo adeguando la concentrazione, in modo da garantire la somministrazione di un volume costante in relazione al peso corporeo per tutti i livelli di dose.

Osservazioni

30.

Gli animali sperimentali devono essere oggetto di osservazioni cliniche generali e i segni clinici devono essere registrati almeno una volta al giorno, preferibilmente alla stessa o alle stesse ore e tenendo conto del periodo di massima intensità degli effetti previsti dopo la somministrazione. Almeno due volte al giorno, tutti gli animali vengono esaminati al fine di determinarne la morbilità e la mortalità. Tutti gli animali devono essere pesati all’inizio dello studio, almeno una volta alla settimana nel corso degli studi a dosi ripetute, e al momento della soppressione incruenta. Nelle prove la cui durata è di almeno una settimana, la misurazione del consumo di cibo va eseguita almeno con cadenza settimanale. Se la sostanza chimica in esame è diluita in acqua prima di essere somministrata, il consumo di acqua va misurato ad ogni cambio dell’acqua e almeno una volta alla settimana. Gli animali che manifestano segni di tossicità eccessiva ma non letale vanno soppressi in maniera incruenta prima del completamento del metodo di prova (13).

Preparazione dei cromosomi

31.

Le sospensioni di cellule germinali ottenute da uno o da entrambi i testicoli immediatamente dopo la soppressione incruenta sono esposte ad una soluzione ipotonica e fissate secondo protocolli stabiliti (ad esempio (2) (14) (15)). Le cellule vengono poi poste sui vetrini e colorate (16) (17). Tutti i vetrini sono codificati in modo che la loro identità non sia visibile all’analista.

Analisi

32.

Si analizzano almeno 200 metafasi ben spaziate per ciascun animale (3) (11). Se la frequenza dei controlli negativi storici è < 1 %, per aumentare la potenza statistica si analizzano più di 200 cellule/animale (3). Si usano metodi di colorazione che consentano l’identificazione del centro mero.

33.

Le aberrazioni di tipo cromatidico e cromosomico devono essere registrate separatamente e classificate in sottotipi (rotture, scambi). I gap sono registrati, ma non se ne tiene conto per determinare se una sostanza chimica induce incrementi significativi dell’incidenza di cellule che presentano aberrazioni cromosomiche. Le procedure in uso nel laboratorio devono garantire che l’analisi delle aberrazioni cromosomiche sia effettuata da analisti qualificati. Poiché le procedure di preparazione dei vetrini causano spesso la rottura di una parte delle cellule in metafase, con conseguente perdita di cromosomi, le cellule conteggiate devono quindi contenere un numero di centro meri non inferiore a 2n±2, dove n è il numero aploide di cromosomi per quella specie.

34.

Sebbene lo scopo della prova sia rilevare le aberrazioni cromosomiche strutturali, è importante registrare le frequenze di cellule poliploidi e di cellule che presentano cromosomi demoltiplicatore se si osservano tali eventi (cfr. il paragrafo 44).

DATI E RELAZIONE

Trattamento dei risultati

35.

I dati relativi a ciascun animale vanno presentati sotto forma di tabella. Per ciascun animale si valuta il numero di cellule con aberrazioni cromosomiche strutturali e il numero di aberrazioni cromosomiche per cellula. Occorre elencare separatamente le aberrazioni cromosomiche e quelle microclimatiche e classificarle in sottotipi (rotture, scambi) con l’indicazione del numero e della frequenza per i gruppi sperimentali e di controllo. I gap sono registrati separatamente. La frequenza dei gap viene indicata nella relazione, ma non viene generalmente inclusa nell’analisi della frequenza totale delle aberrazioni cromosomiche strutturali. Le percentuali di poliploidi e di cellule con cromosomi demoltiplicatore sono segnalate se osservate.

36.

Devono figurare i dati sulla tossicità e i segni clinici (paragrafo 30).

Criteri di accettabilità

37.

L’accettabilità della prova si basa sui seguenti criteri:

I controlli negativi concomitanti sono coerenti con le norme pubblicate per i dati relativi ai controlli negativi storici, generalmente previste fra > 0 % e ≤ 1,5 % delle cellule che presentano aberrazioni cromosomiche e con i dati dei controlli storici del laboratorio se disponibili (cfr. i paragrafi 10 e 18).

I controlli positivi concomitanti inducono risposte coerenti con le norme pubblicate per i dati relativi ai controlli storici positivi, o con le banche dati dei controlli storici positivi del laboratorio, se disponibili, ed evidenziano un incremento statisticamente significativo rispetto ai controlli negativi (cfr. i paragrafi 17, 18).

È stato analizzato un numero adeguato di cellule e dosi (cfr. i paragrafi 28 e 32).

I criteri di selezione della concentrazione massima sono conformi a quelli descritti ai paragrafi 25 e 26.

38.

Se si osservano sia mitosi che meiosi, al fine di stabilire un eventuale effetto cito tossico si determina il rapporto fra le cellule degli spermatogoni in mitosi e le cellule che si trovano nella prima e seconda metafase meiotica per tutti gli animali trattati e per i controlli negativi, su un campione totale di 100 cellule in divisione per animale. Se si osservano solo mitosi, si determina l’indice mitotico in almeno 1 000 cellule per animale.

Analisi e interpretazione dei risultati

39.

Almeno tre gruppi di trattamento trattati devono essere analizzati al fine di ottenere dati sufficienti per l’analisi della relazione dose-risposta.

40.

A condizione che siano soddisfatti tutti i criteri di accettabilità, la sostanza chimica in esame è ritenuta chiaramente positiva se:

almeno una delle dosi sperimentali presenta un incremento statisticamente significativo rispetto al concomitante controllo negativo;

l’aumento è correlato alla dose almeno in uno dei momenti del campionamento; e

uno o più risultati si situano al di fuori della serie accettabile di dati relativi ai controlli negativi storici o della distribuzione dei dati relativi ai controlli negativi storici (ad esempio limite di controllo al 95 % in base alla distribuzione di Poisson), se disponibili.

La sostanza chimica in esame è quindi ritenuta in grado di indurre aberrazioni cromosomiche nelle cellule degli spermatogoni degli animali sperimentali. Raccomandazioni sui metodi statistici più adeguati sono disponibili anche in letteratura (11) (18). L’animale deve essere considerato come unità sperimentale nei metodi statistici utilizzati.

41.

A condizione che siano stati rispettati tutti i criteri di accettabilità, una sostanza chimica in esame è considerata chiaramente negativa se:

nessuna delle dosi sperimentali presenta un incremento statisticamente significativo rispetto al concomitante controllo negativo;

non si registrano aumenti correlati alla dose in nessuna condizione sperimentale; e

tutti i risultati si situano entro la serie accettabile di dati relativi ai controlli negativi storici o dei dati relativi ai controlli negativi storici del laboratorio (ad esempio limite di controllo al 95 % in base alla distribuzione di Poisson), se disponibili.

La sostanza chimica in esame è quindi ritenuta non in grado di indurre aberrazioni cromosomiche nelle cellule degli spermatogoni degli animali sperimentali. Raccomandazioni sui metodi statistici più adeguati sono disponibili anche in letteratura (11) (18). Un risultato negativo non esclude la possibilità che la sostanza chimica possa indurre aberrazioni cromosomiche in fasi successive dello sviluppo non studiate oppure mutazioni geniche.

42.

Non è necessario verificare una risposta chiaramente positiva o chiaramente negativa.

43.

Se la risposta non è chiaramente negativa né chiaramente positiva, e per stabilire la rilevanza biologica di un risultato (ad esempio un aumento debole o marginale), i dati sono sottoposti al giudizio di esperti e/o a indagini più approfondite, avvalendosi dei dati sperimentali esistenti, ad es. quelli che indicano che il risultato positivo si situa al di fuori della serie accettabile di dati relativi ai controlli negativi o dei dati relativi ai controlli negativi storici del laboratorio (19).

44.

In rari casi, anche dopo ulteriori analisi, quando la serie di dati non consente di valutare i risultati come positivi o negativi, i risultati sono dichiarati equivoci.

45.

Un aumento del numero di cellule poliploidi può significare che la sostanza chimica in esame è potenzialmente in grado di inibire processi mitotici e di indurre aberrazioni numeriche nei cromosomi (20). Un aumento del numero di cellule con cromosomi demoltiplicatore può indicare che la sostanza chimica in esame è potenzialmente in grado di inibire la progressione del ciclo cellulare (21) (22), che è un meccanismo diverso dall’inibizione dei processi mitotici per indurre cambiamenti numerici dei cromosomi (cfr. il paragrafo 2). Pertanto, l’incidenza delle cellule poliploidi e quella delle cellule con cromosomi demoltiplicatore devono essere registrate separatamente.

Relazione sull’esecuzione della prova

46.

I seguenti dati devono figurare nella relazione sull’esecuzione della prova.

 

Sintesi

 

Sostanza chimica in esame:

origine, numero di lotto e data di scadenza, se disponibile;

stabilità della sostanza chimica in esame, se nota.

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente, se note;

misurazione del pH, dell’osmolalità e del precipitato nel terreno di coltura al quale è stata aggiunta la sostanza chimica in esame, se del caso.

 

Sostanza monocostituente:

aspetto fisico, idrosolubilità e, se del caso, ulteriori proprietà fisico-chimiche;

identificazione chimica, come la denominazione IUPAC o CAS, il numero CAS, il codice SMILES o InChI, la formula strutturale, l’identità chimica o impurezze, se del caso e se le condizioni pratiche lo consentono, ecc.

 

Sostanza multicostituente, UVCB e miscele:

caratterizzata nella massima misura possibile con l’identità chimica (cfr. sopra), con la presenza quantitativa e con le proprietà fisico-chimiche pertinenti dei costituenti.

 

Preparazione della sostanza chimica in esame:

motivazione della scelta del mezzo disperdente;

solubilità e stabilità della sostanza in esame nel solvente/mezzo disperdente.

preparazione dei preparati per somministrazione per via alimentare, con l’acqua da bere o per inalazione;

determinazione analitica dei preparati (ad esempio, stabilità, omogeneità, concentrazioni nominali) se effettuata.

 

Animali utilizzati nella prova:

specie/ceppi usati e giustificazione della scelta;

numero ed età degli animali;

origine, condizioni di stabulazione, dieta, ecc.;

metodo di identificazione univoca degli animali

per gli studi a breve termine: peso di ciascun animale all’inizio e alla fine della prova; per gli studi di durata superiore a una settimana: peso di ciascun individuo durante lo studio e consumo di cibo. Devono essere inclusi l’intervallo, la media e la deviazione standard per ciascun gruppo.

 

Condizioni sperimentali:

dati sui controlli positivi e negativi (mezzo disperdente/solvente);

dati della prova per determinare l’intervallo delle dosi, se effettuato;

criteri di selezione delle dosi;

criteri di selezione della via di somministrazione;

dettagli della preparazione della sostanza in esame;

modalità precise di somministrazione della sostanza chimica in esame;

criteri di determinazione del momento della soppressione incruenta;

metodi di misurazione della tossicità animale, compresi, se disponibili, analisi istopatologiche o ematologiche e la frequenza con cui è stato misurato il peso corporeo e sono state realizzate osservazioni sugli animali;

metodi atti a verificare che la sostanza in esame ha raggiunto il tessuto bersaglio o la circolazione sanguigna, se i risultati sono negativi;

dose effettiva (mg/kg di peso corporeo/giorno) calcolata in funzione della concentrazione (ppm) della sostanza chimica in esame contenuta nella dieta/acqua da bere e del consumo, se del caso;

dettagli sulla qualità del cibo e dell’acqua;

descrizione dettagliata dello schema di trattamento e di campionamento e giustificazione delle scelte;

metodo di soppressione incruenta degli animali;

metodo di analgesia (se usato)

procedure per isolare i tessuti;

natura e concentrazione dell’inibitore della metafase, durata di esposizione del trattamento;

metodi di preparazione dei vetrini;

criteri di conteggio delle aberrazioni;

numero di cellule analizzate per animale;

criteri in base ai quali i risultati sono considerati positivi, negativi o ambigui.

 

Risultati:

condizioni dell’animale prima e durante il periodo di saggio, compresi i segni di tossicità;

peso corporeo e degli organi al momento della soppressione incruenta (in caso di trattamenti multipli, pesi corporei registrati durante il regime di trattamento);

segni di tossicità;

indice mitotico;

rapporto fra le cellule degli spermatogoni in mitosi e le cellule che si trovano nella prima e seconda metafase meiotica, o altra risposta dell’esposizione al tessuto bersaglio;

tipo e numero di aberrazioni, indicati separatamente per ciascun animale;

numero totale delle aberrazioni per gruppo, con medie e deviazioni standard;

numero di cellule che presentano aberrazioni per gruppo, con medie e deviazioni standard;

relazione dose-risposta, ove possibile;

analisi e metodi statistici applicati;

dati sui controlli negativi concomitanti;

dati sui controlli negativi storici, con intervalli, medie e deviazioni standard nonché intervallo di confidenza del 95 % (se disponibile) o dati pubblicati sui controlli negativi storici usati per l’accettabilità dei risultati della prova;

dati sui controlli positivi concomitanti;

eventuali cambiamenti di aploidia, comprese le frequenze di poliploidi e/o delle cellule demoltiplicatore;

 

Discussione dei risultati

 

Conclusione

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Appendice

DEFINIZIONI

Aneuploidia: qualsiasi deviazione dal normale numero diploide (o aploide) di cromosomi da parte di uno o più cromosomi, ma non dell'intero corredo di cromosomi (poliploidi).

Centromero: regione/i di un cromosoma cui si attaccano le del fuso durante la divisione cellulare, permettendo il corretto movimento dei cromosomi figli verso i poli delle cellule figlie.

Sostanza chimica: una sostanza o una miscela.

Diversità dei cromosomi: diversità delle forme (ad esempio metacentrici, acro centrici, ecc.) e delle dimensioni dei cromosomi.

Aberrazione di tipo cromatidico: alterazione cromosomica strutturale che si manifesta nella rottura di un singolo cromati dio o nella rottura e ricongiunzione di cromatisi.

Aberrazione di tipo cromosomico: alterazione cromosomica strutturale che si manifesta nella rottura, o nella rottura e ricongiunzione, di entrambi i cromatisi in uno stesso punto.

Clastogeno: qualsiasi sostanza chimica che causa aberrazioni cromosomiche strutturali in popolazioni di cellule o organismi.

Gap: lesione acromatica di ampiezza inferiore a un cromatine, con minimo disallinea mento dei cromatisi.

Genotossico: termine generico che comprende tutti i tipi di danno a carico del DNA o dei cromosomi, tra cui rotture, cancellazioni, addotti, alterazioni e collegamenti nucleotidi, ridispacciamento, mutazioni, aberrazioni cromosomiche e annexi_and_ia. Non tutti i tipi di effetti genotossici determinano alterazioni cromosomiche o danni permanenti ai cromosomi.

Indice mitotico (MI): rapporto tra le cellule in metafase diviso per il numero totale di cellule osservate in una popolazione cellulare: costituisce un'indicazione del grado di proliferazione della popolazione cellulare.

Mitosi: divisione del nucleo cellulare, solitamente suddivisa in profase, pro metafase, metafase, analysis e telofase.

Mutageno: un fattore in grado di provocare mutazioni ereditarie della o delle sequenze di coppie di basi del DNA nei geni o della struttura dei cromosomi (aberrazioni cromosomiche).

Aberrazione numerica: variazione del numero di cromosomi rispetto al numero diploide caratteristico della specie.

Poliploidi: un multiplo del numero di cromosomi aploidi (n) diverso dal numero diploide (ossia 3n, 4n ecc.).

Aberrazione strutturale: alterazione della struttura cromosomica visibile all'esame microscopico dello stadio di metafase della divisione cellulare, che si presenta con dilezione e alterazioni di segmenti, scambi.

Sostanza chimica in esame: qualsiasi sostanza o miscela testata applicando il presente metodo di prova.

UVCB: sostanze di composizione sconosciuta o variabile, prodotti di una reazione complessa o materiali biologici.

"

5)

Nella parte B, il capitolo B.40 è sostituito dal seguente:

"B.40   CORROSIONE CUTANEA IN VITRO: METODO DI PROVA DELLA RESISTENZA ELETTRICA TRANSCUTANEA (TER)

INTRODUZIONE

1.

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 430 (2015). Per corrosione cutanea si intende la manifestazione di lesioni irreversibili della pelle in forma di necrosi visibile dell’epidermide e del derma, a seguito dell’applicazione della sostanza chimica in esame [secondo la definizione del Sistema globale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche delle Nazioni Unite (UN GHS) (1) e del regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele (CLP) (1)]. Il presente metodo di prova B.40 aggiornato propone una procedura in vitro che consente di individuare le sostanze e le miscele non corrosive e corrosive conformemente al GHS dell’ONU (1) e al regolamento CLP.

2.

Tradizionalmente, la valutazione della corrosività cutanea è effettuata su animali da esperimento (TM B.4 equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 404 originariamente adottata nel 1981 e rivista nel 1992, nel 2002 e nel 2015) (2). Oltre al presente metodo di prova B.40 sono stati validati e adottati altri metodi di prova in vitro per determinare la corrosività cutanea potenziale di sostanze chimiche, come ad esempio il metodo di prova B.40 bis (equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 431) (3) e il metodo di prova B.65 (equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 435) (4), anch’essi in grado di individuare sottocategorie di sostanze chimiche corrosive laddove richiesto. Diversi metodi di prova in vitro validati sono stati adottati, ad esempio il metodo di prova B.46 [equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 439 (5)], al fine di essere utilizzati per determinare l’irritazione cutanea. Un documento di orientamento dell’OCSE relativo agli approcci integrati in materia di prove e valutazioni (IATA – Integrated Approaches to Testing and Assessment) per la corrosione e l’irritazione cutanea descrive diversi moduli che raggruppano una serie di fonti di informazione e strumenti di analisi e i) fornisce orientamenti su come integrare e utilizzare i dati sperimentali e non sperimentali esistenti per valutare il potenziale di irritazione cutanea e di corrosione cutanea delle sostanze chimiche e ii) propone un approccio quando occorrono prove ulteriori (6).

3.

Il presente metodo di prova riguarda l’endpoint per la salute umana della corrosione cutanea. Esso si fonda sul metodo di prova della resistenza elettrica transcutanea (TER) condotto su pelle di ratto che utilizza dischi di tessuto cutaneo per individuare le sostanze corrosive grazie alla loro capacità di produrre una perdita dell’integrità dello strato corneo normale e della funzione di barriera. La linea guida dell’OCSE corrispondente è stata inizialmente adottata nel 2004 e aggiornata nel 2015 per fare riferimento al documento di orientamento IATA.

4.

Per valutare le prove di corrosione cutanea in vitro a fini regolamentari sono stati condotti studi di prevalidazione (7), seguiti da uno studio di validazione formale del metodo di prova della TER su pelle di ratto per valutare la corrosione cutanea (8) (9) (10) (11). I risultati di questi studi hanno permesso di stabilire che il metodo di prova della TER (denominato metodo di riferimento validato o VRM) può essere utilizzato a fini regolamentari per valutare la corrosività cutanea in vivo (12) (13) (14).

5.

Prima di poter utilizzare a fini regolamentari un metodo di prova della TER in vitro per la corrosione cutanea, simile o modificato, diverso dal VRM, occorre determinarne l’affidabilità, la pertinenza (accuratezza) e i limiti per l’uso proposto al fine di assicurare che sia simile al VRM, conformemente ai requisiti degli standard di prestazione (15). Il quadro del sistema dell’OCSE di reciproca accettazione dei dati sarà garantito solo una volta che i metodi di prova proposti, nuovi o aggiornati, conformi agli standard di prestazione sono stati esaminati e integrati nella corrispondente linea guida dell’OCSE.

DEFINIZIONI

6.

Le definizioni usate sono riportate nell’appendice.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

7.

I risultati di uno studio di validazione (10) e di altri studi pubblicati (16) (17) indicano che il metodo di prova della TER condotto su pelle di ratto permette di distinguere, tra le sostanze conosciute, quelle che sono corrosive e non corrosive per la pelle con una sensibilità complessiva del 94 % (51/54) e una specificità del 71 % (48/68) in una banca dati di 122 sostanze.

8.

Il presente metodo di prova riguarda la corrosione cutanea in vitro. Esso permette di individuare le sostanze chimiche non corrosive e corrosive in esame in conformità al GHS delle Nazioni Unite e al regolamento CLP. Un limite del presente metodo di prova, dimostrato dagli studi di validazione (8) (9) (10) (11), è che non permette la sottocategorizzazione delle sostanze e delle miscele corrosive conformemente al GHS delle Nazioni Unite e al regolamento CLP. Il quadro normativo applicabile stabilirà in che modo il presente metodo di prova sarà utilizzato. Se da un lato il presente metodo di prova non fornisce informazioni adeguate sull’irritazione cutanea, è opportuno notare che il metodo B.46 riguarda in modo specifico le prove d’irritazione cutanea in vitro e gli effetti sulla salute (5). Per una valutazione completa degli effetti cutanei locali dopo una singola esposizione della pelle, si raccomanda di consultare il documento di orientamento dell’OCSE relativo agli IATA (6).

9.

Nella validazione del metodo in questione è stata sottoposta a prova un’ampia gamma di prodotti chimici, rappresentanti principalmente sostanze, e la banca dati empirica dello studio di validazione contava 60 sostanze appartenenti a una vasta gamma di classi di sostanze chimiche (9). I dati generali disponibili indicano che il metodo di prova è applicabile a un’ampia gamma di classi di sostanze chimiche e stati fisici, inclusi liquidi, semisolidi, solidi e cere. Tuttavia, poiché per specifici stati fisici non sono facilmente disponibili sostanze in esame con dati di riferimento adeguati, va notato che durante la validazione è stato valutato un numero relativamente ridotto di cere e solidi corrosivi. I liquidi possono essere acquosi o non acquosi, i solidi possono essere solubili o insolubili in acqua. Il metodo di prova non deve essere utilizzato con una categoria specifica di sostanze qualora possa essere dimostrata la sua non applicabilità a tale categoria specifica. Inoltre, si presume che il metodo di prova sia applicabile alle miscele oltre che alle sostanze. Tuttavia, poiché le miscele coprono un ampio spettro di categorie e composizioni e tenuto conto delle informazioni limitate attualmente disponibili circa la sperimentazione sulle miscele, nei casi in cui sia possibile dimostrare che il metodo di prova non è applicabile a una categoria specifica di miscele (ad esempio applicando una strategia come proposto da Eskes et al., 2012) (18) è opportuno evitare di utilizzare il metodo di prova per tale categoria specifica di sostanze. Prima di applicare il presente metodo di prova a una miscela per generare dati ai fini regolamentari previsti, si deve considerare se, e in caso affermativo perché, esso possa fornire risultati adeguati a tale scopo. Tali considerazioni non sono necessarie laddove esista una disposizione normativa che obblighi a sottoporre a prova la miscela. I gas e gli aerosol non sono ancora stati valutati nell’ambito di studi di validazione (8) (9). Benché sia ipotizzabile che essi possano essere testati utilizzando il metodo di prova della TER, l’attuale metodo di prova non prevede l’esecuzione di prove per gas e aerosol.

PRINCIPIO DELLA PROVA

10.

La sostanza chimica in esame è applicata per non più di 24 ore sulla superficie epidermica di dischi di tessuto cutaneo in un sistema di test a due compartimenti nel quale i dischi di tessuto cutaneo fungono da separatori tra i compartimenti. I dischi di tessuto cutaneo sono prelevati da ratti di 28-30 giorni, soppressi con metodi non cruenti. Le sostanze chimiche corrosive sono individuate in base alla loro capacità di comportare una perdita dell’integrità dello strato corneo normale e della funzione di barriera, che si misura come riduzione della TER al di sotto di un livello soglia (16) (cfr. il paragrafo 32). Per la TER su pelle di ratto, un valore limite di 5 kΩ è stato scelto sulla base di molti dati relativi ad un elevato numero di sostanze per le quali la maggior parte dei valori era nettamente superiore (spesso > 10 kΩ), o nettamente inferiore (spesso < 3 kΩ) a tale valore (16). In generale, le sostanze chimiche in esame che sono non corrosive per gli animali ma che sono irritanti o non irritanti non comportano una riduzione della TER al di sotto di tale valore limite. Inoltre, l’utilizzo di altre preparazioni cutanee o di altre attrezzature può alterare il valore limite, rendendo necessaria in tal caso una validazione supplementare.

11.

La procedura sperimentale include una sequenza relativa alla fissazione del colorante al fine di confermare i risultati positivi del TER con valori attorno a 5 kΩ. Tale sequenza determina se l’aumento della permeabilità ionica è dovuto alla distruzione fisica dello strato corneo. È stato dimostrato che il metodo della TER su pelle di ratto permetteva di predire la corrosività in vivo nel coniglio valutata con il metodo di prova B.4 (2).

DIMOSTRAZIONE DELLA COMPETENZA DI LABORATORIO

12.

Prima di utilizzare sistematicamente il metodo di prova della TER su pelle di ratto conforme al presente metodo di prova, i laboratori dimostrano la loro competenza tecnica classificando correttamente le dodici sostanze chimiche per la verifica della competenza tecnica raccomandate nella tabella 1. Nel caso in cui una sostanza in elenco non sia disponibile o nel caso in cui sia giustificato, può essere utilizzata un’altra sostanza per la quale sono disponibili dati di riferimento in vivo e in vitro (ad esempio scegliendo dalla lista delle sostanze chimiche di riferimento (16)) a condizione che siano applicati i medesimi criteri di selezione di cui alla tabella 1.

Tabella 1

elenco delle sostanze di prova a fini di competenza  (2)

Sostanza

n. CAS

Classe chimica (3)

Cat. UN GHS/CLP sulla base dei risultati in vivo  (4)

Cat. VRM sulla base dei risultati in vitro

Stato fisico

pH (5)

Sostanze corrosive in vivo

N,N’-dimetil dipropilenetriamina

10563-29-8

base organica

1A

6 × C

L

8,3

1,2-diaminopropano

78-90-0

base organica

1A

6 × C

L

8,3

acido solforico (10 %)

7664-93-9

acido inorganico

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NC

L

1,2

idrossido di potassio (10 % acq.)

1310-58-3

base inorganica

(1A/)1B/1C

6 × C

L

13,2

acido ottanoico (caprilico)

124-07-2

acido organico

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,6

2-terzbutilfenolo

88-18-6

fenolo

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,9

Sostanze non corrosive in vivo

acido isostearico

2724-58-5

acido organico

NC

6 × NC

L

3,6

4-amino-1,2,4-triazolo

584-13-4

base organica

NC

6 × NC

S

5,5

fenetil bromuro

103-63-9

elettrofilo

NC

6 × NC

L

3,6

4-(metiltio)-benzaldeide

3446-89-7

elettrofilo

NC

6 × NC

L

6,8

1,9-decadiene

1647-16-1

sostanza organica neutra

NC

6 × NC

L

3,9

tetracloroetilene

127-18-4

sostanza organica neutra

NC

6 × NC

L

4,5

Abbreviazioni: acq. = acquoso; n. CAS = numero di registrazione CAS (Chemical Abstracts Service Registry Number); VRM = metodo di riferimento validato; C = corrosivo; NC = non corrosivo.

PROCEDURA

13.

Esistono procedure operative standard per il metodo di prova della TER su pelle di ratto per valutare la corrosione cutanea (19). I metodi di prova della TER su pelle di ratto che rientrano in tale metodo di prova sono conformi alle seguenti condizioni:

Animali

14.

È opportuno l’utilizzo di ratti in quanto la sensibilità della loro pelle alle sostanze utilizzate in questo metodo di prova è stata già dimostrata (12) e si tratta dell’unica fonte di pelle formalmente validata (8) (9). L’età (al momento in cui la pelle è prelevata) e il ceppo del ratto sono particolarmente importanti perché si deve essere sicuri che i follicoli piliferi siano in fase d’inattività, prima dell’inizio della crescita dei peli adulti.

15.

I peli della zona dorsale e laterale di giovani ratti maschi o femmine di circa 22 giorni (Wistar o ceppo comparabile) sono rimossi con cura per mezzo di piccole forbici. Gli animali sono successivamente lavati con cura mediante pezze bagnate e la zona rimossa è immersa in una soluzione antibiotica (contenente, ad esempio, streptomicina, penicillina, cloramfenicolo e amfotericina a concentrazioni efficaci per inibire la crescita batterica). Gli animali sono nuovamente lavati con antibiotici il terzo o il quarto giorno dopo il primo lavaggio e sottoposti al test entro 3 giorni dal secondo lavaggio, quando lo strato corneo si è rimesso dalla rimozione dei peli.

Preparazione dei dischi di tessuto cutaneo

16.

Gli animali sono soppressi in modo non cruento quando hanno 28-30 giorni (l’età riveste un’importanza particolare). La pelle dorso-laterale di ciascun animale è successivamente rimossa ed accuratamente liberata da qualsiasi eccesso di grasso sottocutaneo. Vengono rimossi dischi di tessuto cutaneo del diametro di circa 20 mm. Il tessuto cutaneo potrà essere conservato prima dell’utilizzo dei dischi se i dati dei controlli positivi e negativi risultano equivalenti a quelli ottenuti sul tessuto cutaneo fresco.

17.

Ciascun disco di tessuto cutaneo è posto su una delle estremità di un tubo di politetrafluoroetilene (PTFE), con la superficie epidermica a contatto con il tubo. Dopo aver fissato il disco all’estremità del tubo con un anello di tenuta toroidale in gomma, si elimina la parte eccedentaria del tessuto. L’anello toroidale di gomma viene quindi fissato con cura all’estremità del tubo per mezzo di vaselina. Il tubo è posizionato con una pinza a molla all’interno in un cilindro contenente una soluzione di 154 mM di MgSO4 (figura 1). Il disco cutaneo deve essere interamente sommerso nella soluzione di MgSO4. È possibile ottenere fino a 10-15 dischi di tessuto cutaneo dalla pelle di un solo ratto. Le dimensioni del tubo e del giunto toroidale sono indicate nella figura 2.

18.

Prima di cominciare la sperimentazione, misurare la resistenza elettrica di due dischi cutanei per controllare la qualità della pelle di ciascun animale. I due dischi devono dare valori di resistenza elettrica superiori a 10 kΩ affinché gli altri dischi possano essere utilizzati per il metodo di prova. Se il valore di resistenza è inferiore a 10 kΩ, gli altri dischi della stessa pelle devono essere eliminati.

Applicazione della sostanza chimica in esame e delle sostanze di controllo

19.

Controlli positivi e negativi concorrenti devono essere utilizzati per ciascuna batteria di prove (esperimento) in modo da garantire un’adeguata esecuzione del modello sperimentale. Per ciascuna batteria di prove (esperimento) devono essere utilizzati dischi di tessuto cutaneo provenienti da un unico animale. Le sostanze chimiche proposte per i controlli positivi e negativi sono, rispettivamente, l’acido cloridrico 10 M e l’acqua distillata.

20.

La sostanza chimica liquida in esame (150 μl) è applicata uniformemente sulla superficie epidermica all’interno del tubo. Per il test di sostanze solide, si applica in modo uniforme sul disco di tessuto cutaneo una quantità sufficiente di sostanza in modo da coprire la totalità della superficie dell’epidermide. Dopo avere aggiunto l’acqua deionizzata (150 μl) sulla sostanza solida, agitare delicatamente il tubo. Per ottenere il massimo contatto con la pelle può risultare necessario riscaldare i solidi a 30 °C per sciogliere o rammollire la sostanza chimica in esame o macinarli per ottenere grani o polveri.

21.

In ogni batteria di prove (esperimento), sono utilizzati tre dischi di tessuto cutaneo per ciascuna sostanza chimica di prova e di controllo. La sostanza chimica in esame è applicata per 24 ore a 20-23 °C, quindi rimossa con un getto d’acqua corrente a temperatura ambiente fino alla sua completa rimozione.

Misurazione della TER

22.

L’impedenza cutanea è determinata misurando la TER per mezzo di un ponte Wheatstone a basso voltaggio e corrente alternata (18). Le specificazioni generali del ponte sono una tensione operativa di 1-3 V, una corrente alternata sinusoidale o rettangolare di 50-1 000 Hz ed un intervallo di misurazione di almeno 0,1-30 kΩ. Il ponte utilizzato nello studio di validazione misura l’induttanza, la capacitanza e la resistenza fino a valori di 2 000 H, 2 000 μF e 2 MΩ, rispettivamente, a frequenze di 100 Hz o 1 kHz, utilizzando valori in serie o paralleli. Ai fini della TER, le misurazioni delle prove di corrosività sono registrate in resistenza ad una frequenza di 100 Hz utilizzando valori in serie. Prima di misurare la resistenza elettrica, la tensione di superficie della pelle è ridotta aggiungendo un volume di etanolo al 70 % sufficiente a coprire l’epidermide. Dopo alcuni secondi, l’etanolo è rimosso dal tubo e il tessuto è idratato con l’aggiunta di 3 ml di soluzione di MgSO4 (154 mM). Gli elettrodi del ponte di misurazione sono posizionati su entrambi i lati del disco di tessuto cutaneo per misurare la resistenza in kΩ/disco di tessuto cutaneo (figura 1). Le dimensioni degli elettrodi e la lunghezza dell’elettrodo esposto al di sotto dei morsetti a coccodrillo sono indicate nella figura 2. Il morsetto attaccato all’elettrodo interno è posto sulla parte superiore del tubo durante la misurazione della resistenza, affinché la lunghezza dell’elettrodo immerso nella soluzione di MgSO4 resti costante. L’elettrodo esterno è posizionato all’interno del cilindro in modo tale da posarsi sul fondo dello stesso. La distanza tra la pinza a molla e la parte inferiore del tubo deve rimanere costante (figura 2), poiché tale distanza influenza il valore di resistenza che si ottiene. Di conseguenza, la distanza tra l’elettrodo interno e il disco di tessuto cutaneo deve essere costante e minima (1-2 mm).

23.

Se la misurazione della resistenza dà un valore superiore a 20 kΩ, ciò può essere dovuto ad un residuo della sostanza chimica in esame che copre la superficie epidermica del disco di tessuto cutaneo. Un tentativo di rimozione della sostanza può essere effettuato, ad esempio, turando ermeticamente il tubo con il pollice inguantato ed agitandolo per 10 secondi circa; la soluzione di MgSO4 viene così completamente rimossa e la misurazione della resistenza è ripetuta con una nuova soluzione di MgSO4.

24.

Le proprietà e le dimensioni dell’apparecchiatura e la procedura sperimentale utilizzate possono influenzare i valori della TER che si ottengono. La soglia di corrosività è stata fissata a 5 kΩ sulla base di dati ottenuti con l’apparecchiatura e la procedura sperimentale specifiche descritte nel presente metodo di prova. Possono essere applicati diversi valori limite e di controllo nel caso in cui le condizioni sperimentali siano alterate o sia utilizzata una diversa attrezzatura. Pertanto, si raccomanda di calibrare la metodologia ed i valori limite di resistenza testando una serie di sostanze da utilizzare per stabilire la competenza scelte fra le sostanze utilizzate nello studio di validazione (8) (9) o fra classi di sostanze chimiche simili a quelle studiate. Un elenco di idonee sostanze di prova a fini di competenza è proposto nella tabella 1.

Metodi di fissazione del colorante

25.

L’esposizione ad alcune sostanze non corrosive può comportare una diminuzione della resistenza al di sotto del valore soglia di 5 kΩ e permettere il passaggio di ioni attraverso lo strato corneo riducendo in tal modo la resistenza elettrica (9). Ad esempio, le sostanze organiche neutre e le sostanze tensioattive (compresi detergenti, emulsionanti ed altri agenti di superficie) possono eliminare i lipidi della pelle rendendo in tal modo la barriera più permeabile agli ioni. Di conseguenza, se i valori della TER prodotti da tali sostanze chimiche sono inferiori o vicini a 5 kΩ, in mancanza di lesioni percepibili si deve effettuare una valutazione della penetrazione del colorante sui tessuti di controllo e sui tessuti trattati per determinare se i valori della TER ottenuti sono il risultato della maggiore permeabilità della pelle o della corrosione cutanea (7) (9). In caso di corrosione cutanea con danno dello strato corneo, il colorante sulforodamina B, quando applicato sulla pelle, penetra rapidamente e colora il tessuto sottostante. Questo colorante è stabile con un’ampia gamma di sostanze e non è influenzato dal procedimento di estrazione descritto di seguito.

Applicazione ed eliminazione del colorante sulforodamina B

26.

Al termine della valutazione della TER, il solfato di magnesio è rimosso dal tubo ed il tessuto cutaneo è esaminato con cura in cerca di lesioni manifeste. Se non ci sono importanti lesioni manifeste (ad esempio perforazione), 150 μl di una diluizione al 10 % (p/v) di colorante sulforodamina B (rosso acido 52; C.I. 45100; n. CAS 3520-42-1) in acqua distillata sono applicati sulla superficie epidermica di ogni disco di tessuto cutaneo per 2 ore. Questi dischi di tessuto cutaneo vengono successivamente lavati con un getto d’acqua corrente a temperatura ambiente per circa 10 secondi in modo da eliminare il colorante eccedentario/non fissato. Ciascun disco di tessuto cutaneo è rimosso attentamente dal tubo e messo in una fiala (ad esempio, una fiala a scintillazione in vetro da 20 ml) contenente acqua deionizzata (8 ml). Le fiale sono agitate delicatamente per 5 minuti fino ad eliminare qualsiasi eccesso di colorante non fissato. Dopo aver ripetuto la procedura di risciacquo, i dischi di tessuto cutaneo sono rimossi e inseriti in fiale contenenti 5 ml di sodio dodecil solfato (SDS) al 30 % (p/v) in acqua distillata, quindi incubati per una notte a 60 °C.

27.

In seguito all’incubazione, ciascun disco di tessuto cutaneo è rimosso e scartato e la soluzione restante è centrifugata per 8 minuti a 21 °C (forza centrifuga relativa ~175 × g). Un campione di 1 ml di supernatante è in seguito diluito in rapporto 1:5 (v/v) (cioè 1 ml + 4 ml) con SDS al 30 % (p/v) in acqua distillata. La densità ottica (OD) della soluzione è misurata a 565 nm.

Calcolo del tasso di colorante

28.

Il tasso di sulforodamina B in ciascun disco è calcolato sulla base dei valori di OD (9) (coefficiente di estinzione molare della sulforodamina B a 565 nm = 8,7 × l04; peso molecolare = 580). Il tenore di colorante è determinato per ciascun disco di tessuto cutaneo per mezzo di un’idonea curva di taratura. Un tenore medio è quindi calcolato per le repliche.

Criteri di accettabilità

29.

I valori medi della TER sono accettati se i valori dei controlli positivi e negativi effettuati in parallelo si situano entro gli intervalli accettabili di valori per il metodo utilizzato nel laboratorio di prova. Gli intervalli accettabili di resistenza per la metodologia e l’apparecchiatura descritte sono indicati nella tabella seguente:

Controllo

Sostanza

Intervallo di resistenza (kΩ)

Positivo

10 M acido cloridrico

0,5-1,0

Negativo

Acqua distillata

10-25

30.

I valori medi della fissazione del colorante sono accettati a condizione che i valori dei controlli effettuati in parallelo si situino entro gli intervalli accettabili per il metodo. Gli intervalli accettabili di tasso colorante per le sostanze di controllo proposte per la metodologia e l’apparecchiatura descritte sono i seguenti:

Controllo

Sostanza

Intervallo di tasso di colorante (μg/disco)

Positivo

10 M acido cloridrico

40-100

Negativo

Acqua distillata

15-35

Interpretazione dei risultati

31.

Il valore limite della TER che discrimina le sostanze chimiche in esame corrosive da quelle non corrosive è stato stabilito nel corso dell’ottimizzazione del metodo di prova, testato in una fase di prevalidazione e confermato in uno studio formale di validazione.

32.

Di seguito è descritto il modello predittivo per il metodo di prova della TER su pelle di ratto per valutare la corrosione cutanea (9) (19), associato al sistema di classificazione del GHS delle Nazioni Unite/regolamento CLP.

La sostanza chimica in esame è considerata non corrosiva per la pelle:

i)

se il valore medio della TER ottenuto per la sostanza chimica in esame è superiore a (>) 5 kΩ; o

ii)

se il valore medio della TER ottenuto per la sostanza chimica in esame è inferiore o uguale a (≤) 5 kΩ; e

il disco di tessuto cutaneo non presenta alcuna lesione manifesta (ad esempio perforazione), e

il tasso medio di colorante del disco è inferiore (<) a quello del disco di controllo positivo di 10 M HCl realizzato in parallelo (cfr. il paragrafo 30 per i valori di controllo positivi).

La sostanza chimica in esame è considerata corrosiva per la pelle:

i)

se il valore medio della TER ottenuto per la sostanza chimica in esame è inferiore o uguale a (≤) 5 kΩ e se il disco di tessuto cutaneo presenta lesioni manifeste (ad esempio perforazione); o

ii)

se il valore medio della TER ottenuto per la sostanza chimica in esame è inferiore o uguale a (≤) 5 kΩ; e

il disco di tessuto cutaneo non presenta alcuna lesione manifesta (ad esempio perforazione), ma

il tasso medio di colorante del disco è superiore o uguale (≥) a quello del disco di controllo positivo di 10 M HCl realizzato in parallelo (cfr. il paragrafo 30 per i valori di controllo positivi).

33.

Una batteria di prove (esperimento) costituito da almeno tre dischi di tessuto cutaneo di replica dovrebbe essere sufficiente per una sostanza chimica in esame, se la classificazione è univoca. Tuttavia, in caso di risultati inconclusivi, tra cui misurazioni discordanti delle repliche e/o una TER media pari a 5 ± 0,5 kΩ, si dovrebbe considerare l’opportunità di eseguire una seconda batteria di prove (esperimento) indipendente, oltre che una terza nell’eventualità di risultati discordanti tra le prime due.

DATI E RELAZIONE

Dati

34.

I valori di resistenza (kΩ) e, eventualmente, i valori di tasso medio del colorante (μg/disc) per la sostanza chimica in esame e per i controlli positivi e negativi devono essere presentati sotto forma di tabella e includere i dati di ciascun disco di replica in ogni batteria di prove (esperimento) nonché i valori medi ± SD. Sono riportati tutti gli esperimenti ripetuti. Per ogni sostanza chimica in esame sono riportate le lesioni osservate sui dischi di tessuto cutaneo.

Relazione sull’esecuzione della prova

35.

La relazione sull’esecuzione della prova deve comprendere le seguenti informazioni.

 

Sostanze chimiche in esame e sostanze di controllo:

sostanza monocostituente: dati di identificazione chimica, come denominazioni IUPAC o CAS, numero CAS, codice SMILES o InChI, formula strutturale, purezza, identità chimica delle impurezze, se del caso e se le condizioni pratiche lo consentono, ecc.;

sostanza multicostituente, UVCB o miscela: caratterizzate nella massima misura possibile con l’identità chimica (cfr. sopra), con la presenza quantitativa e con le proprietà fisico-chimiche pertinenti dei costituenti;

aspetto fisico, idrosolubilità e, se del caso, ulteriori proprietà fisico-chimiche;

origine, numero del lotto se disponibile;

trattamento delle sostanze chimiche in esame/sostanze di controllo prima della prova, se applicabile (ad esempio, riscaldamento, frantumazione);

stabilità della sostanza chimica in esame, data limite di utilizzo, data della nuova analisi, se nota;

condizioni di conservazione.

 

Animali utilizzati nella prova:

ceppo e sesso utilizzati,

età degli animali in caso d’utilizzo come animali donatori;

origine, condizioni di alloggio, dieta, ecc.;

dettagli sulla preparazione della pelle.

 

Condizioni sperimentali:

curve di taratura dell’apparecchiatura di test,

curve di taratura dell’esecuzione del test di fissazione del colorante, banda passante utilizzata per misurare i valori di densità ottica e intervallo di linearità dell’apparecchio di misurazione (ad esempio spettrofotometro), se del caso;

dettagli sulla procedura sperimentale utilizzata per le misurazioni della TER,

dettagli sulla procedura sperimentale utilizzata per la valutazione della fissazione del colorante, se del caso,

dosi sperimentali utilizzate, durata del o dei periodi di esposizione e temperatura/temperature di esposizione;

dettagli sulla procedura di lavaggio utilizzata dopo il periodo di esposizione;

numero dei dischi di tessuto cutaneo di replica utilizzati per sostanza chimica in esame e per sostanza di controllo (positivo e negativo);

descrizione di qualsiasi modifica del protocollo sperimentale;

riferimenti a dati storici del modello. Essi dovrebbero includere (elenco non esaustivo):

i)

accettabilità dei valori di controllo positivi e negativi della RET (in kΩ) rispetto agli intervalli della resistenza dei controlli positivi e negativi;

ii)

accettabilità dei valori del tasso di colorante dei controlli positivi e negativi (in μg/disc) rispetto agli intervalli del tasso di colorante dei controlli positivi e negativi;

iii)

accettabilità dei risultati della prova rispetto alla variabilità storica tra i dischi di tessuto cutaneo di replica;

descrizione dei criteri decisionali/del modello predittivo applicati.

 

Risultati:

presentazione sotto forma di tabella dei dati ottenuti dalle prove della TER e della fissazione del colorante (se del caso) per ogni sostanza chimica in esame e sostanza di controllo, per ogni batteria di prove (esperimento) e ogni disco di tessuto cutaneo di replica (per ogni animale e per ogni campione di pelle), medie, deviazioni standard e coefficienti di variazione;

descrizione di tutti gli effetti osservati;

risultante classificazione con riferimento al modello predittivo/ai criteri decisionali utilizzati.

 

Discussione dei risultati

 

Conclusioni

BIBLIOGRAFIA

(1)

United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Disponibile qui: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Capitolo B.4 del presente allegato: Irritazione/corrosione cutanea acuta.

(3)

Capitolo B.40 bis del presente allegato: Corrosione cutanea in vitro: test su un modello di epidermide umana ricostituita.

(4)

Capitolo B.65 del presente allegato: Metodo di prova in vitro su membrana-barriera per la corrosione cutanea.

(5)

Capitolo B.46 del presente allegato: Irritazione cutanea in vitro: test su un modello di epidermide umana ricostituita

(6)

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(15)

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(16)

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(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

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(20)

OECD (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation for Economic Cooperation and Devlopment, Paris.

Figura 1

Attrezzatura Per La Prova Di Resistenza Elettrica Transcutanea (Ter) Su Pelle Di RattO

Image 2

Figura 2

Dimensioni Del Tubo In Polietrafluoroetilene (Ptfe), Del Cilindro Contenitore E Degli Elettrodi Utilizzati

Image 3

Fattori critici dell’attrezzatura sopra descritta:

diametro interno del tubo PTFE,

lunghezza degli elettrodi relativi al tubo PTFE e al cilindro contenitore: è tale che il disco di tessuto cutaneo non si trova a contatto con gli elettrodi e che una lunghezza standard dell’elettrodo si trova a contatto con la soluzione MgSO4,

quantità della soluzione MgSO4 nel cilindro contenitore: la profondità del liquido, rispetto al livello nel tubo PTFE, è tale da apparire come indicato nella figura 1,

il disco di tessuto cutaneo deve essere fissato accuratamente al tubo PTFE, di modo che la resistenza elettrica sia una misura reale delle proprietà del tessuto cutaneo.

Appendice

DEFINIZIONI

Accuratezza : grado di concordanza tra i risultati ottenuti con il metodo di prova e i valori di riferimento accettati. Misura l'efficienza del metodo di prova e costituisce un aspetto della pertinenza. Il termine è spesso utilizzato come sinonimo di "concordanza" a indicare la percentuale di risultati corretti di un metodo di prova (20).

C : corrosivo.

Sostanza chimica : una sostanza o una miscela.

Concordanza : misura dell'efficacia del metodo di prova per metodi che forniscono un risultato ordinabile in categorie e rappresenta un aspetto della pertinenza. Il termine è usato come sinonimo di "accuratezza" ed è definito come la proporzione di tutte le sostanze chimiche in esame che sono correttamente classificate come positive o negative. La concordanza dipende strettamente dalla prevalenza di risultati positivi in tutti i tipi di sostanze chimiche in esame (20).

Sistema globale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche delle Nazioni Unite (UN GHS) : sistema di classificazione delle sostanze chimiche (sostanze e miscele) secondo tipi e livelli standardizzati di rischio fisico, sanitario e ambientale, che elabora i relativi elementi di comunicazione, quali pittogrammi, avvertenze, indicazioni di pericolo, consigli di prudenza e schede informative di sicurezza, per trasmettere informazioni sugli effetti avversi di dette sostanze a tutela delle persone (compresi datori di lavoro, lavoratori, trasportatori, consumatori e personale di pronto intervento) e dell'ambiente (1).

IATA : approcci integrati in materia di prove e valutazioni (Integrated Approaches to Testing and Assessment).

Miscela : una miscela o una soluzione composta di due o più sostanze.

Sostanza monocostituente : sostanza, definita attraverso la sua composizione quantitativa, in cui un costituente principale è presente in percentuale pari ad almeno l'80 % (p/p).

Sostanza multicostituente : sostanza, definita attraverso la sua composizione quantitativa, in cui più costituenti principali sono presenti in concentrazione ≥ 10 % (p/p) e < 80 % (p/p). Una sostanza multicostituente è il risultato di un processo di fabbricazione. La differenza tra miscela e sostanza multicostituente è che una miscela è ottenuta attraverso la miscelazione di due o più sostanze senza che avvenga una reazione chimica. Una sostanza multicostituente è il risultato di una reazione chimica.

NC : non corrosivo.

OD : densità ottica.

PC : controllo positivo, una replica che contiene tutti i componenti di un sistema di prova e che è trattato con una sostanza che notoriamente induce una reazione positiva. Perché sia possibile valutare la variabilità nel tempo della risposta del controllo positivo, l'intensità di tale risposta non dovrebbe essere eccessiva.

Standard di prestazione : standard, basati su un metodo di riferimento validato, che consentono di valutare la comparabilità di un metodo proposto che è simile sotto il profilo strutturale e funzionale. Detti standard comprendono: i) gli elementi essenziali del metodo di prova; ii) un elenco minimo di sostanze chimiche di riferimento scelte tra le sostanze utilizzate per dimostrare le prestazioni accettabili del metodo di prova validato; e iii) in funzione dei risultati ottenuti con il metodo di riferimento validato, i livelli comparabili di affidabilità e accuratezza che il metodo proposto dovrebbe ottenere quando viene valutato utilizzando l'elenco minimo di sostanze di riferimento.

Pertinenza : descrizione del rapporto tra la prova e l'effetto studiato; indica se la prova è significativa e utile per uno scopo specifico. È il grado con cui la prova misura o prevede correttamente l'effetto biologico di interesse. La pertinenza comprende una valutazione dell'accuratezza (concordanza) di una prova (20).

Affidabilità : misura in cui l'esecuzione di un metodo di prova può essere riprodotta nel tempo all'interno dello stesso laboratorio o da laboratori diversi seguendo il medesimo protocollo. È valutata calcolando la riproducibilità intra-laboratorio e inter-laboratori (20).

Sensibilità : proporzione di tutte le sostanze chimiche positive/attive correttamente classificate dal metodo di prova. Misura l'accuratezza di un metodo di prova che produce risultati ordinabili in categorie ed è un elemento importante per valutare la pertinenza di un metodo di prova (20).

Corrosione cutanea in vivo : il manifestarsi di lesioni irreversibili della pelle, vale a dire, necrosi visibile dell'epidermide e del derma, a seguito dell'applicazione della sostanza chimica di prova per non più di quattro ore. Gli effetti tipici della corrosione sono ulcere, sanguinamento, croste sanguinolente e, al termine di un periodo di osservazione di 14 giorni, depigmentazione cutanea dovuta all'effetto sbiancante, chiazze di alopecia e cicatrici. Per valutare le lesioni dubbie potrebbe essere necessario ricorrere a un esame istopatologico.

Specificità : proporzione di tutte le sostanze chimiche negative/inattive correttamente classificate dal metodo di prova. Misura l'accuratezza di un metodo di prova che produce risultati ordinabili in categorie ed è un elemento importante per valutare la pertinenza di un metodo di prova (20).

Sostanza : un elemento chimico e i suoi composti, allo stato naturale od ottenuti per mezzo di un procedimento di fabbricazione, compresi gli additivi necessari a mantenerne la stabilità e le impurezze derivanti dal procedimento utilizzato, ma esclusi i solventi che possono essere separati senza compromettere la stabilità della sostanza o modificarne la composizione.

Batteria di prove : consiste nel testare una sostanza chimica in esame in parallelo su almeno tre dischi di tessuto cutaneo di replica.

Sostanza chimica in esame : qualsiasi sostanza o miscela testata applicando il presente metodo di prova.

Resistenza elettrica transcutanea (TER) : misurazione dell'impedenza elettrica della pelle, come valore di resistenza espressa in kilo-ohm. Si tratta di un metodo al contempo semplice e affidabile per valutare la funzione di barriera tramite la registrazione del passaggio di ioni attraverso la pelle per mezzo di un ponte di Wheatstone.

UVCB : sostanze di composizione sconosciuta o variabile, prodotti di una reazione complessa o materiali biologici.

"

6)

Nella parte B, il capitolo B.40 bis è sostituito dal seguente:

"B.40bis   CORROSIONE CUTANEA IN VITRO: METODO DI PROVA SU UN MODELLO DI EPIDERMIDE UMANA RICOSTITUITA (RhE)

INTRODUZIONE

1.

Il presente metodo di prova è equivalente alla linea guida dell’OCSE per le prove sulle sostanze chimiche n. 431 (2016). Per corrosione cutanea si intende la manifestazione di lesioni irreversibili della pelle in forma di necrosi visibile dell’epidermide e del derma, a seguito dell’applicazione della sostanza chimica in esame [secondo la definizione del Sistema globale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche delle Nazioni Unite (UN GHS) (1) e del regolamento (CE) n. 1272/2008 del Parlamento europeo e del Consiglio relativo alla classificazione, all’etichettatura e all’imballaggio delle sostanze e delle miscele (CLP) (6)]. Il presente metodo di prova B.40 bis aggiornato propone una procedura in vitro che consente di individuare le sostanze e le miscele non corrosive e corrosive conformemente al GHS dell’ONU e al regolamento CLP. Esso permette una parziale sottocategorizzazione delle sostanze corrosive.

2.

Tradizionalmente, la valutazione del potenziale di corrosione cutanea è effettuata su animali da esperimento (metodo di prova B.4 equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 404 originariamente adottata nel 1981 e rivista nel 1992, nel 2002 e nel 2015) (2). Oltre al presente metodo di prova B.40 bis sono stati validati e adottati altri due metodi di prova in vitro per determinare la corrosività potenziale di sostanze chimiche, come ad esempio il metodo di prova B.40 (equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 430) (3) e il metodo di prova B.65 (equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 435) (4). È stato inoltre adottato il metodo di prova in vitro B.46 (equivalente alla linea guida dell’OCSE n. 439) (5) per determinare il potenziale di irritazione cutanea. Un documento di orientamento dell’OCSE relativo agli approcci integrati in materia di prove e valutazioni (IATA – Integrated Approaches to Testing and Assessment) per la corrosione e l’irritazione cutanea descrive diversi moduli che raggruppano fonti di informazione e strumenti di analisi e i) fornisce orientamenti su come integrare e utilizzare i dati sperimentali e non sperimentali esistenti per valutare il potenziale di irritazione cutanea e di corrosione cutanea delle sostanze chimiche, e ii) propone un approccio quando occorrono prove ulteriori (6).

3.

Il presente metodo di prova riguarda l’endpoint per la salute umana della corrosione cutanea. Esso utilizza un modello di epidermide umana ricostituita (RhE - reconstructed human epidermis) (ottenuta da cheratinociti non trasformati prelevati da epidermide umana) che riproduce fedelmente le proprietà istologiche, morfologiche, biochimiche e fisiologiche degli strati superiori della pelle umana (l’epidermide). La linea guida dell’OCSE corrispondente è stata originariamente adottata nel 2004 e aggiornata nel 2013 al fine di includere metodi di prova supplementari utilizzando i modelli di RhE e la possibilità di utilizzare i metodi a supporto della sottocategorizzazione delle sostanze chimiche corrosive, ed è stata poi aggiornata nel 2015 per richiamare il documento di orientamento IATA e introdurre l’uso di una procedura alternativa per misurare la vitalità.

4.

Il presente metodo di prova comprende quattro modelli di RhE validati disponibili sul mercato. Per due di questi modelli di prova disponibili sul mercato, EpiSkin™ Standard Model (SM) e EpiDerm™ Skin Corrosivity Test (SCT) (EPI-200), sono stati condotti degli studi di prevalidazione (7), seguiti da uno studio formale di validazione per valutare la corrosione cutanea (8) (9) (10) (11) (12) (di seguito denominati metodi di riferimento validati o VRM). I risultati di questi studi hanno permesso di stabilire che i due VRM di cui sopra possono essere utilizzati a fini regolamentari per distinguere le sostanze corrosive (C) da quelle non corrosive (NC) e che EpiSkin™ può inoltre essere utilizzato per sottocategorizzare le sostanze corrosive (13) (14) (15). Altri due modelli di prova in vitro di RhE per determinare la corrosione cutanea disponibili sul mercato hanno dato risultati simili a quelli del metodo di riferimento validato EpiDerm™ conformemente alla validazione basata sugli standard di prestazione (16) (17) (18). Si tratta di SkinEthic™ RHE (7) e epiCS® (precedentemente noto con il nome EST-1000) che possono anch’essi essere utilizzati a fini regolamentari per distinguere le sostanze corrosive da quelle non corrosive (19) (20). Gli studi di postvalidazione eseguiti dai produttori del modello di RhE tra il 2012 e il 2014 con un protocollo affinato che corregge le interferenze della riduzione non specifica dell’MTT da parte delle sostanze chimiche in esame hanno permesso di ottenere risultati migliori sia nella distinzione tra sostanze corrosive e non corrosive, sia nella sottocategorizzazione delle sostanze corrosive (21) (22). Sono state condotte ulteriori analisi statistiche dei dati di postvalidazione generati con EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE e EpiCS® per individuare modelli predittivi alternativi che hanno migliorato la capacità predittiva per la sottocategorizzazione (23).

5.

Prima di poter utilizzare a fini regolamentari un metodo di prova in vitro su RhE per la corrosione cutanea proposto, simile o modificato, diverso dai VRM, occorre determinarne l’affidabilità, la pertinenza (accuratezza) e i limiti per l’uso proposto al fine di assicurare che sia simile ai VRM, conformemente ai requisiti degli standard di prestazione (24) stabiliti in linea con i principi del documento di orientamento dell’OCSE n. 34 (25). Il quadro del sistema dell’OCSE di reciproca accettazione dei dati sarà garantito solo una volta che i metodi di prova proposti, nuovi o aggiornati, conformi agli standard di prestazione sono stati esaminati e integrati nella corrispondente linea guida dell’OCSE. I modelli di prova inclusi nella linea guida possono essere utilizzati per rispondere alle prescrizioni dei paesi relative ai risultati della prova sul metodo di prova in vitro per determinare la corrosione cutanea, traendo al tempo stesso vantaggio dalla reciproca accettazione dei dati.

DEFINIZIONI

6.

L’appendice 1 contiene le definizioni dei termini utilizzati.

CONSIDERAZIONI INIZIALI

7.

Il presente metodo di prova consente di individuare le sostanze e le miscele non corrosive e corrosive conformemente al GHS delle Nazioni Unite e al regolamento CLP. Il presente metodo di prova è alla base della sottocategorizzazione delle sostanze e delle miscele corrosive nella sottocategoria facoltativa 1A, conformemente al GHS delle Nazioni Unite (1), oltre che in una combinazione delle sottocategorie 1B e 1C (21) (22) (23). Un limite del presente metodo di prova è costituito dal fatto che non permette di distinguere tra le sottocategorie 1B e 1C di sostanze corrosive per la pelle, conformemente al GHS delle Nazioni Unite e al regolamento CLP, a causa del numero limitato di sostanze chimiche corrosive in vivo ben note della sottocategoria 1C. I modelli di prova EpiSkin™, EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE e epiCS® permettono la sottocategorizzazione (cioè 1A o 1B-e-1C o NC).

8.

Nello studio di validazione dei modelli di prova inclusi nel presente metodo di prova utilizzati per individuare sostanze non corrosive e corrosive è stato testato un ampio spettro di sostanze chimiche, principalmente sostanze singole; la banca dati empirica dello studio di validazione contava 60 sostanze chimiche appartenenti a un’ampia gamma di classi chimiche (8) (9) (10). Le prove volte a dimostrare la sensibilità, la specificità, l’accuratezza e la riproducibilità intra-laboratorio della prova per la sottocategorizzazione sono state condotte dagli sviluppatori del metodo di prova e i risultati sono stati riesaminati dall’OCSE (21) (22) (23). I dati generali disponibili indicano che il metodo di prova è applicabile a un’ampia gamma di classi di sostanze chimiche e stati fisici, inclusi liquidi, semisolidi, solidi e cere. I liquidi possono essere acquosi o non acquosi, i solidi possono essere solubili o insolubili in acqua. Quando possibile, prima dell’applicazione i solidi dovrebbero essere frantumati in polvere fine; non sono necessarie altre forme di pretrattamento del campione. I modelli di prova inclusi nel presente metodo di prova non devono essere utilizzati con una categoria specifica di sostanze chimiche in esame qualora possa essere dimostrata la loro non applicabilità a tale categoria specifica. Inoltre, si presume che il presente metodo di prova sia applicabile alle miscele oltre che alle sostanze. Tuttavia, poiché le miscele coprono un ampio spettro di categorie e composizioni e tenuto conto delle informazioni limitate attualmente disponibili circa la sperimentazione sulle miscele, nei casi in cui sia possibile dimostrare che il metodo di prova non è applicabile a una categoria specifica di miscele (ad esempio applicando la strategia proposta in (26)) non si deve utilizzare il metodo di prova per tale categoria specifica di sostanze. Prima di applicare il presente metodo di prova a una miscela per generare dati ai fini regolamentari previsti, si deve considerare se, e in caso affermativo perché, esso possa fornire risultati adeguati a tale scopo. Tali considerazioni non sono necessarie laddove esista una disposizione normativa che obblighi a sottoporre a prova la miscela. I gas e gli aerosol non sono ancora stati valutati nell’ambito di studi di validazione (8) (9) (10). Benché sia ipotizzabile che essi possano essere testati utilizzando la tecnologia RhE, l’attuale metodo di prova non prevede l’esecuzione di prove per gas e aerosol.

9.

Le sostanze chimiche in esame che assorbono la luce nello stesso spettro dell’MTT formazan e le sostanze chimiche in esame in grado di ridurre direttamente il colorante vitale MTT (in MTT formazan) possono interferire con le misurazioni di vitalità tessutale e richiedono l’utilizzo di controlli adattati per correggere tali interferenze. Il tipo di controlli adattati che possono essere necessari varierà in funzione del tipo di interferenze prodotte dalla sostanza chimica in esame e della procedura usata per misurare l’MTT formazan (cfr. i paragrafi da 25 a 31).

10.

Se da un lato il presente metodo di prova non fornisce informazioni adeguate sull’irritazione cutanea, è opportuno notare che il metodo B.46 riguarda in modo specifico le prove d’irritazione cutanea in vitro e gli effetti sulla salute e si basa sullo stesso sistema di prova su RhE, benché usi un altro protocollo (5). Per una valutazione completa degli effetti cutanei locali dopo una singola esposizione della pelle, si raccomanda di consultare il documento di orientamento dell’OCSE relativo agli approcci integrati in materia di prove e valutazioni (IATA – Integrated Approaches to Testing and Assessment) (6). Gli IATA prevedono la realizzazione di prove in vitro volte a determinare la corrosione cutanea (come descritta nel presente metodo di prova) e l’irritazione cutanea prima di prevedere la conduzione di test su animali vivi. È noto che l’utilizzo di pelle umana è oggetto di considerazioni etiche e soggetto a condizioni nazionali ed internazionali.

PRINCIPIO DELLA PROVA

11.

La sostanza chimica in esame viene applicata localmente ad un modello tridimensionale di epidermide umana ricostituita, composta da cheratinociti non trasformati prelevati da epidermide umana, messi in coltura per formare un modello multistrato, altamente differenziato, di epidermide umana. Il modello è costituito da uno strato basale, uno strato spinoso e uno strato granuloso organizzati e da uno strato corneo multiplo contenente strati di strutture lamellari lipidiche intercellulari rappresentanti le principali classi lipidiche analoghe a quelle presenti in vivo.

12.

Il metodo di prova su RhE si basa sulla premessa secondo cui le sostanze chimiche corrosive sono in grado di penetrare nello strato corneo per diffusione o erosione e sono citotossiche per gli strati cellulari sottostanti. La vitalità cellulare è misurata tramite conversione enzimatica del colorante vitale MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-ile)-2,5-difeniltetrazolio bromuro, tiazolil blu tetrazolio bromuro; numero CAS 298-93-1], in un sale, il blu di formazan, misurato quantitativamente dopo l’estrazione dai tessuti (27). Le sostanze chimiche corrosive sono identificate per la loro capacità di diminuire la vitalità cellulare al di sotto di determinati livelli soglia (cfr. i paragrafi 35 e 36). È stato dimostrato che il metodo di prova della corrosione cutanea su RhE consente di prevedere gli effetti della corrosione cutanea in vivo nel coniglio valutata conformemente al metodo di prova B.4 (2).

DIMOSTRAZIONE DELLA COMPETENZA DI LABORATORIO

13.

Prima di utilizzare sistematicamente uno qualsiasi dei quattro modelli di prova su RhE validati e conformi al presente metodo di prova, i laboratori dimostrano la loro competenza tecnica classificando correttamente le dodici sostanze chimiche per la verifica della competenza tecnica di cui alla tabella 1. Nel caso in cui sia utilizzato un metodo di sottoclassificazione, è dimostrata anche la corretta sottocategorizzazione. Nel caso in cui una sostanza in elenco non sia disponibile o nel caso in cui sia giustificato, può essere utilizzata un’altra sostanza per la quale sono disponibili dati di riferimento in vivo e in vitro (ad esempio scegliendo dalla lista delle sostanze chimiche di riferimento (24)) a condizione che siano applicati i medesimi criteri di selezione di cui alla tabella 1.

Tabella 1

elenco delle sostanze di prova a fini di competenza  (8)

Sostanza

n. CAS

Classe chimica (9)

Cat. GHS dell’ONU/CLP sulla base dei risultati in vivo (10)

Cat. VRM sulla base dei risultati in vitro (11)

Riduttore dell’MTT (12)

Stato fisico

Sostanze corrosive in vivo della sottocategoria 1A

Acido bromoacetico

79-08-3

Acido organico

1A

(3) 1A

S

Trifluoruro di boro diidrato

13319-75-0

Acido inorganico

1A

(3) 1A

L

Fenolo

108-95-2

Fenolo

1A

(3) 1A

S

Cloruro di dicloroacetile

79-36-7

Elettrofilo

1A

(3) 1A

L

Combinazione di sostanze corrosive in vivo delle sottocategorie 1B-e-1C

Acido glicossilico monoidrato

563-96-2

Acido organico

1B-e-1C

(3) 1B-e-1C

S

Acido lattico

598-82-3

Acido organico

1B-e-1C

(3) 1B-e-1C

L

Etanolammina

141-43-5

Base organica

1B

(3) 1B-e-1C

Y

Viscoso

Acido cloridrico (14,4 %)

7647-01-0

Acido inorganico

1B-e-1C

(3) 1B-e-1C

L

Sostanze non corrosive in vivo

Fenetil bromuro

103-63-9

Elettrofilo

NC

(3) NC

Y

L

4-amino-1,2,4-triazolo

584-13-4

Base organica

NC

(3) NC

S

4-(metiltio)-benzaldeide

3446-89-7

Elettrofilo

NC

(3) NC

Y

L

Acido laurico

143-07-7

Acido organico

NC

(3) NC

S

Abbreviazioni: n. CAS = numero di registrazione CAS (Chemical Abstracts Service Registry Number); VRM = metodo di riferimento validato; NC = non corrosivo; Y = sì; S = solido; L = liquido.

14.

Nell’ambito della dimostrazione delle competenze, si raccomanda che l’utente si accerti delle proprietà di barriera dei tessuti dopo averli ricevuti, in conformità alle specifiche del produttore del modello di epidermide umana ricostituita. Tale verifica è particolarmente importante se i tessuti vengono trasportati per lunghe distanze/per viaggi lunghi. Quando un metodo di prova è consolidato e il suo uso corretto da parte del laboratorio è stato dimostrato, non è più necessario effettuare la verifica in maniera sistematica. Tuttavia, se un metodo di prova viene sistematicamente utilizzato, si raccomanda di continuare a verificare le proprietà di barriera a intervalli regolari.

PROCEDURA

15.

Quella che segue è una descrizione generica dei componenti e delle procedure dei modelli di prova su RhE per valutare la corrosione cutanea che rientrano nel presente metodo di prova. I modelli di RhE riconosciuti come scientificamente validi per l’uso nel presente metodo di prova, ossia i modelli EpiSkin™ (SM), EpiDerm™ (EPI-200), SkinEthic™ RHE e epiCS® (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33), possono essere ottenuti sul mercato. Esistono procedure operative standard per questi quattro modelli di RhE (34) (35) (36) (37) e le componenti dei loro principali metodi di prova sono sintetizzate nell’appendice 2. Si raccomanda la consultazione delle procedure operative standard pertinenti al momento di attuare e utilizzare uno di tali modelli in laboratorio. Le prove con i quattro modelli di RhE che rientrano nel presente metodo di prova sono conformi a quanto segue.

COMPONENTI DEL METODO DI PROVA SU EPIDERMIDE UMANA RICOSTITUITA

Condizioni generali

16.

Per ricostruire l’epitelio devono essere utilizzati cheratinociti non trasformati di origine umana. Devono essere presenti molteplici strati di cellule epiteliali vitali (strato basale, strato spinoso, strato granuloso) sotto uno strato corneo funzionale. Lo strato corneo deve presentare molteplici strati con il profilo lipidico necessario per costituire una barriera funzionale solida capace di resistere alla penetrazione rapida delle sostanze chimiche di riferimento citotossiche, ad esempio, sodio dodecil solfato (SDS) o Triton X-100. La funzione di barriera deve essere dimostrata e può essere valutata determinando la concentrazione alla quale una sostanza chimica di riferimento riduce la vitalità dei tessuti del 50 % (IC50) dopo un tempo di esposizione fisso oppure determinando il tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità cellulare del 50 % (ET50) dopo l’applicazione della sostanza chimica di riferimento a una concentrazione fissa predeterminata (cfr. il paragrafo 18). Le proprietà di contenimento del modello di RhE devono essere tali da impedire il passaggio di materiale attorno allo strato corneo verso i tessuti vitali, che inciderebbe negativamente sulla qualità della modellizzazione dell’esposizione cutanea. Il modello di epidermide umana ricostituita non deve essere contaminato da batteri, virus, micoplasmi o funghi.

Condizioni funzionali

Vitalità

17.

La prova usata per quantificare la vitalità del tessuto è il test dell’MTT (27). Le cellule vitali del modello di RhE riducono il colorante vitale MTT a un precipitato MTT blu di formazan che è successivamente estratto dal tessuto utilizzando isopropanolo (o un solvente analogo). La densità ottica (OD) del solo solvente di estrazione dovrebbe essere sufficientemente bassa, ossia OD < 0,1. L’MTT formazan estratto può essere quantificato utilizzando una misurazione di assorbanza standard (OD) o una procedura di spettrofotometria HPLC/UPLC (38). Gli utilizzatori del modello di RhE devono accertarsi che ciascun lotto del modello impiegato soddisfi i criteri definiti per il controllo negativo. È opportuno che lo sviluppatore/il fornitore del modello di RhE stabilisca un intervallo di accettabilità (limite superiore e inferiore) dei valori di OD del controllo negativo. L’intervallo di accettabilità dei valori di densità ottica del controllo negativo per i quattro modelli di prova di RhE inclusi nel presente metodo di prova è illustrato nella tabella 2. L’utilizzatore di spettrofotometria HPLC/UPLC applicherà gli intervalli di OD del controllo negativo di cui alla tabella 2 come criteri di accettabilità del controllo negativo. Occorre documentare che i tessuti trattati con il controllo negativo sono stabili in coltura (ossia risultano misurazioni di OD simili) per tutto il periodo di esposizione.

Tabella 2

Intervalli di accettabilità dei valori di OD del controllo negativo per verificare la qualità del lotto

 

Limite di accettabilità inferiore

Limite di accettabilità superiore

EpiSkin™ (SM)

> 0,6

< 1,5

EpiDerm™ SCT (EPI-200)

> 0,8

< 2,8

SkinEthic™ RHE

> 0,8

< 3,0

epiCS®

> 0,8

< 2,8

Funzione di barriera

18.

Lo strato corneo e la relativa composizione lipidica devono essere sufficienti per resistere alla penetrazione rapida di alcuni marcatori citotossici (come SDS o Triton X-100), valutata tramite i fattori IC50 o ET50 (tabella 3). La funzione di barriera di ciascun lotto del modello di RhE utilizzato deve essere dimostrata dallo sviluppatore/venditore del modello di RhE al momento di fornire il tessuto all’utilizzatore finale (cfr. il paragrafo 21).

Morfologia

19.

L’esame istologico del modello di RhE è eseguito dimostrando la struttura multistrato analoga all’epidermide umana contenente uno strato basale, uno strato spinoso, uno strato granuloso e uno strato corneo, e mostra un profilo lipidico simile a quello dell’epidermide umana. Al momento di fornire il tessuto all’utilizzatore finale, lo sviluppatore/venditore del modello di RhE trasmette l’esame istologico di ciascun lotto del modello di RhE utilizzato che dimostra la morfologia del tessuto appropriata (cfr. il paragrafo 21).

Riproducibilità

20.

Gli utilizzatori del metodo di prova ne dimostrano la riproducibilità nel tempo con controlli positivi e negativi. Inoltre, il metodo di prova è utilizzato solo se lo sviluppatore/fornitore del modello di RhE fornisce dati che dimostrano la riproducibilità nel tempo con sostanze chimiche corrosive e non corrosive che figurano, ad esempio, nell’elenco delle sostanze di prova a fini di competenza (tabella 1). Nel caso in cui sia utilizzato un metodo di prova per la sottocategorizzazione, ne è dimostrata la riproducibilità anche in relazione alla sottocategorizzazione.

Controllo di qualità (QC)

21.

Il modello di RhE è utilizzato solo se lo sviluppatore/fornitore dimostra che ogni lotto del modello utilizzato rispetta determinati criteri di fabbricazione, i più rilevanti dei quali riguardano la vitalità (paragrafo 17), la funzione di barriera (paragrafo 18) e la morfologia (paragrafo 19). Tali informazioni devono essere fornite agli utilizzatori del metodo di prova, perché possano inserirle nella relazione di prova. Per una previsione affidabile degli effetti corrosivi possono essere considerati accettabili solo i risultati ottenuti con lotti di tessuto che hanno superato il controllo di qualità. Lo sviluppatore/il fornitore del modello di RhE stabilisce un intervallo di accettabilità (limite superiore e inferiore) per i valori di IC50 o di ET50. Nella tabella 3 sono riportati gli intervalli di accettabilità per i quattro modelli di prova validati.

Tabella 3

Criteri di controllo di qualità dei lotti

 

Limite di accettabilità inferiore

Limite di accettabilità superiore

EpiSkin™ (SM) (trattamento di 18 ore con SDS) (33).

IC50 = 1,0 mg/ml

IC50 = 3,0 mg/ml

EpiDerm™ SCT (EPI-200) (1 % Triton X-100) (34)

ET50 = 4,0 ore

ET50 = 8,7 ore

SkinEthic™ RHE (1 % Triton X-100) (35)

ET50 = 4,0 ore