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Document 32019R1390

Règlement (UE) 2019/1390 de la Commission du 31 juillet 2019 modifiant, aux fins de son adaptation au progrès technique, l’annexe du règlement (CE) no 440/2008 établissant des méthodes d’essai conformément au règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant l’enregistrement, l’évaluation et l’autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH) (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

OJ L 247, 26.9.2019, p. 1–508 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2019/1390/oj

26.9.2019   

FR

Journal officiel de l'Union européenne

L 247/1


RÈGLEMENT (UE) 2019/1390 DE LA COMMISSION

du 31 juillet 2019

modifiant, aux fins de son adaptation au progrès technique, l’annexe du règlement (CE) no 440/2008 établissant des méthodes d’essai conformément au règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant l’enregistrement, l’évaluation et l’autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH)

(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

LA COMMISSION EUROPÉENNE,

vu le traité sur le fonctionnement de l’Union européenne,

vu le règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil du 18 décembre 2006 concernant l’enregistrement, l’évaluation et l’autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH), instituant une agence européenne des produits chimiques, modifiant la directive 1999/45/CE et abrogeant le règlement (CEE) no 793/93 du Conseil et le règlement (CE) no 1488/94 de la Commission ainsi que la directive 76/769/CEE du Conseil et les directives 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE et 2000/21/CE de la Commission (1), et notamment son article 13, paragraphe 2,

considérant ce qui suit:

(1)

Le règlement (CE) no 440/2008 de la Commission (2) contient les méthodes d’essai à appliquer aux fins du règlement (CE) no 1907/2006 en vue de déterminer les propriétés physicochimiques, la toxicité et l’écotoxicité des produits chimiques.

(2)

L’Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) élabore des lignes directrices harmonisées et acceptées sur le plan international pour les essais de produits chimiques à des fins réglementaires. L’OCDE publie régulièrement des lignes directrices d’essai nouvelles ou révisées, tenant compte des progrès scientifiques accomplis dans ce domaine.

(3)

Afin de tenir compte du progrès technique et, dans la mesure du possible, de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins expérimentales, conformément à l’article 13, paragraphe 2, du règlement (CE) no 1907/2006, il convient, à la suite de l’adoption de lignes directrices pertinentes de l’OCDE, d’établir deux nouvelles méthodes d’essai visant à déterminer l’écotoxicité et neuf nouvelles méthodes pour la détermination de la toxicité pour la santé humaine, ainsi que de mettre à jour sept méthodes d’essai. Onze de ces méthodes d’essai concernent des essais in vitro d’irritation et de corrosion cutanées, de sensibilisation cutanée, de génotoxicité et de perturbation endocrinienne. Les parties prenantes ont été consultées sur la modification proposée.

(4)

Le règlement (CE) no 440/2008 devrait dès lors être modifié en conséquence.

(5)

Les mesures prévues par le présent règlement sont conformes à l’avis du comité institué par l’article 133 du règlement (CE) no 1907/2006,

A ADOPTÉ LE PRÉSENT RÈGLEMENT:

Article premier

L’annexe du règlement (CE) no 440/2008 est modifiée conformément à l’annexe du présent règlement.

Article 2

Le présent règlement entre en vigueur le vingtième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel de l’Union européenne.

Le présent règlement est obligatoire dans tous ses éléments et directement applicable dans tout État membre.

Fait à Bruxelles, le 31 juillet 2019.

Par la Commission

Le président

Jean-Claude JUNCKER


(1)  JO L 396 du 30.12.2006, p. 1.

(2)  Règlement (CE) no 440/2008 de la Commission du 30 mai 2008 établissant des méthodes d’essai conformément au règlement (CE) no 1907/2006 du Parlement européen et du Conseil concernant l’enregistrement, l’évaluation et l’autorisation des substances chimiques, ainsi que les restrictions applicables à ces substances (REACH) (JO L 142 du 31.5.2008, p. 1).


ANNEXE

L’annexe du règlement ((CE) No 440/2008 est modifiée comme suit:

(1)

Dans la partie B, le chapitre B.4 est remplacé par le texte suivant the following:

«B.4   EFFET IRRITANT/CORROSIF AIGU SUR LA PEAU

INTRODUCTION

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 404 (2015) de l’OCDE. Régulièrement mises à jour, les lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques intègrent les meilleures données scientifiques disponibles. La révision de la ligne directrice 404 a porté plus particulièrement sur les possibilités d’améliorer le traitement des animaux de laboratoire et sur l’évaluation de toutes les informations existantes se rapportant aux produits chimiques testés en vue d’éviter les tests inutiles sur animaux. Cette nouvelle version de la ligne directrice 404 (initialement adoptée en 1981 et révisée en 1992, 2002 et 2015) comprend une référence au Document Guide sur les Approches Intégrées en matière d’Essai et d’Évaluation pour l’irritation et la corrosion de la peau (1). Ce Document Guide propose une approche modulaire pour les tests d’irritation et de corrosion de la peau. L’approche intégrée décrit plusieurs modules qui regroupent les sources d’information et les outils d’analyse, et i) fournit des guides sur la façon d’intégrer et d’utiliser les informations existantes sur les données d’essai et autres données pour l’évaluation du potentiel irritant et corrosif pour la peau des produits chimiques testés, et ii) propose une approche dans les cas où des tests supplémentaires sont recommandés (1). La présente méthode d’essai recommande également d’opter, si cela s’avère nécessaire, pour une application successive plutôt que simultanée des trois timbres sur l’animal dans l’essai in vivo initial.

2.

Les définitions de l’irritation et de la corrosion cutanées sont données en annexe à cette méthode d’essai.

CONSIDÉRATIONS INITIALES

3.

Pour assurer à la fois la fiabilité des résultats scientifiques et le bien-être animal, on ne procédera pas aux essais in vivo tant que toutes les données relatives au caractère éventuellement corrosif ou irritant pour la peau du produit chimique d’essai n’auront pas été évaluées au cours d’une analyse de leur valeur, telle que décrite dans le Document Guide sur les Approches Intégrées en matière d’Essai et d’Évaluation pour l’irritation et la corrosion de la peau (1), c’est-à-dire selon chacune des trois parties de ce Guide et de chacun des modules correspondants. De façon concise, la partie 1 couvre les données existantes reparties dans sept modules comprenant les données humaines in vivo, les données in vitro, les propriétés physico-chimiques (par exemple le pH, en particulier s’il est fortement acide ou alcalin) et les données autres que provenant d’essais. La partie 2 comprend une analyse des données existantes. Si cette analyse ne permet pas de conclure, la partie 3 doit être mise en œuvre avec des essais supplémentaires, en partant des essais in vitro, étant donné que les essais in vivo ne seront considérés qu’en dernier ressort. Cette analyse doit donc permettre de diminuer le recours aux essais in vivo de l’effet corrosif ou irritant sur la peau des produits chimiques pour lesquels des études précédentes ont déjà livré suffisamment d’informations quant à ces deux aspects.

PRINCIPE DE L’ESSAI IN VIVO

4.

Une seule dose du produit chimique d’essai est appliquée sur la peau de l’animal choisi pour l’expérience, les zones non traitées de la peau de l’animal servant de témoin. L’expérimentateur observe et note selon une échelle de valeurs le degré d’irritation ou de corrosion à intervalles déterminés, et le décrit de façon plus détaillée afin de fournir une évaluation complète des effets. La durée de l’étude doit être suffisante pour permettre d’évaluer la réversibilité des effets observés.

5.

Les animaux qui manifestent des signes persistants de détresse et/ou de douleurs aiguës à n’importe quel stade de l’essai doivent être euthanasiés, et ces symptômes seront pris en compte dans l’évaluation du produit chimique d’essai. Les critères régissant la décision d’euthanasier les animaux moribonds et souffrants fortement sont exposés dans un autre document d’orientation (2).

PRÉPARATION DE L’ESSAI IN VIVO

Sélection de l’espèce animale

6.

On choisira de préférence de jeunes adultes sains parmi les lapins albinos. L’utilisation d’une autre espèce sera justifiée, le cas échéant.

Préparation des animaux

7.

Environ 24 heures avant l’essai, la région dorsale du tronc des animaux sera tondue à ras. On prendra soin de ne pas égratigner leur peau et seuls des animaux présentant une peau saine et intacte seront utilisés.

8.

La fourrure de certaines souches de lapins est plus touffue par endroits et ce phénomène est plus marqué à certaines périodes de l’année. Ces plages à forte pilosité ne doivent pas recevoir la substance d’essai.

Conditions d’hébergement et d’alimentation

9.

Les animaux sont placés dans des cages individuelles. La température du local expérimental est réglée à 20 °C (±3 °C) pour les lapins. Si l’humidité relative doit atteindre au moins 30 pour cent sans excéder de préférence 70 pour cent, en dehors des heures de nettoyage du local, on s’efforcera de maintenir le taux d’humidité autour de 50 à 60 pour cent. On appliquera un éclairage artificiel, alternant 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Les lapins seront nourris avec un mélange classique pour animaux de laboratoire et boiront de l’eau potable à volonté.

MODE OPÉRATOIRE

Application de la substance d’essai

10.

Le produit chimique d’essai est appliqué sur une petite zone (environ 6 cm2) de la peau et recouverte par une compresse de gaze, assujettie au moyen d’un sparadrap non irritant. Si l’application directe est impossible (dans le cas de liquides ou de certaines pâtes, par exemple), le produit chimique d’essai est d’abord appliqué sur la compresse de gaze, laquelle est ensuite placée sur la peau. La compresse doit être maintenue en contact souple avec la peau à l’aide d’un pansement semi-occlusif durant la période d’exposition. Si le produit chimique d’essai est déposé sur la compresse, celle-ci doit être fixée sur la peau de façon à ce que le produit chimique soit réparti uniformément et entre bien en contact avec celle-ci. On fera en sorte que l’animal n’ait pas accès à la compresse et ne puisse ingérer ou inhaler le produit chimique d’essai.

11.

Les produits chimiques liquides sont généralement testés à l’état non dilué. Si le produit chimique est solide (il peut être pulvérisé si nécessaire), il y a lieu de l’humidifier avec la plus petite quantité d’eau (ou au besoin d’un autre véhicule approprié) nécessaire à assurer un bon contact avec la peau. Lorsqu’on utilise un véhicule autre que l’eau, l’influence éventuelle du véhicule sur l’irritation de la peau par le produit chimique d’essai doit être minimale.

12.

À la fin de la période d’exposition, qui dure normalement 4 heures, on enlève ce qui peut l’être du produit chimique d’essai restant, avec de l’eau ou un solvant approprié sans interférer avec la réaction ni altérer l’intégrité de l’épiderme.

Dose

13.

Une dose de 0,5 ml de liquide ou de 0,5 g de solide ou de pâte est appliquée sur la plage à tester.

Essai initial (essai d’irritation/corrosion cutanée in vivo sur un seul animal)

14.

Dès lors qu’un produit chimique d’essai est jugé corrosif, irritant ou non classé d’après l’analyse des données existantes ou d’essais in vitro préalables, tout essai sur animal s’avère superflu. Toutefois, si l’on estime que des données supplémentaires sont nécessaires, le test in vivo est conduit initialement en utilisant un seul animal et en respectant la procédure suivante. Jusqu’à trois timbres d’essai sont appliqués successivement sur l’animal. Le premier timbre est enlevé après trois minutes. Si aucune réaction cutanée grave n’est constatée, un deuxième timbre est appliqué à un endroit différent et retiré après une heure. Si les observations effectuées à ce stade indiquent que l’exposition peut être étendue à quatre heures sans que cela fasse trop souffrir l’animal, l’expérimentateur appliquera un troisième timbre durant quatre heures et attribuera une cote à la réaction.

15.

Si un effet corrosif est détecté à l’issue d’une des trois expositions séquentielles, l’essai s’achève immédiatement. Si aucun effet corrosif n’est relevé après l’enlèvement du troisième timbre, l’animal est gardé en observation durant 14 jours, à moins qu’un effet corrosif se déclare avant.

16.

Dans les cas où l’on s’attend à ce que le produit chimique d’essai soit peut-être irritant, mais pas corrosif, un seul timbre sera appliqué sur un animal durant quatre heures.

Essai confirmatoire (essai d’irritation cutanée sur des animaux supplémentaires)

17.

Si l’essai initial ne révèle aucun effet corrosif, il convient de confirmer la réaction irritante ou négative sur deux animaux supplémentaires, traités chacun avec un timbre maintenu durant quatre heures. Si l’essai initial produit un effet irritant, l’essai confirmatoire peut être conduit en mode séquentiel ou par l’exposition simultanée de deux animaux supplémentaires. Au cas exceptionnel où l’essai initial ne serait pas pratiqué, deux ou trois animaux peuvent être traités au moyen d’un seul timbre appliqué durant quatre heures. Si l’on utilise deux animaux et qu’ils expriment la même réaction, il n’est pas nécessaire de poursuivre l’essai. Dans le cas contraire, le troisième animal est également testé. L’utilisation d’animaux supplémentaires pourra être requise si les réactions sont équivoques.

Période d’observation

18.

La durée de la période d’observation devrait être suffisante pour permettre d’évaluer complètement la réversibilité des effets observés. Il faudra cependant mettre fin à l’expérience dès que l’animal montre des signes persistants de douleur ou de détresse aiguës. La réversibilité des effets est déterminée par l’observation des animaux sur une période s’étendant jusqu’à 14 jours après l’enlèvement des timbres. Si la réaction s’avère réversible avant le quatorzième jour, l’expérience s’achève à ce moment-là.

Observations cliniques et cotation des réactions cutanées

19.

L’observation des signes d’érythème et d’oedème chez tous les animaux et la cotation des réactions s’effectuent au bout de 60 minutes et ensuite 24, 48 et 72 heures après l’enlèvement du timbre. S’agissant de l’animal du test initial, la plage soumise à l’épreuve est aussi examinée immédiatement après l’enlèvement du timbre. Les réactions cutanées sont cotées et consignées conformément à l’échelle figurant dans le tableau ci-dessous. Si la peau présente des lésions qui n’accusent pas l’irritation ou la corrosion après 72 heures, il pourra être nécessaire d’observer l’animal jusqu’au quatorzième jour afin de déterminer la réversibilité des effets. En plus de l’observation de l’irritation, tous les effets toxiques locaux, tels que le dégraissage de la peau, et tout effet systémique nocif (par exemple, des effets se manifestant par des signes cliniques de toxicité et sur le poids corporel) doivent être relevés et décrits en détail. L’examen histopathologique est à envisager au cas où il faut éclaircir des réactions équivoques.

20.

La cotation des réactions cutanées est forcément subjective. L’harmonisation de la cotation des réactions cutanées et l’appui aux laboratoires d’essai ainsi qu’au personnel chargé d’effectuer et d’interpréter les observations passent par une formation adéquate des expérimentateurs au système de cotation utilisé (voir tableau ci-dessous). Un manuel illustré sur la cotation de l’irritation cutanée et d’autres lésions pourrait être utile (10).

RÉSULTATS ET RAPPORT

21.

Les résultats de l’étude devraient être récapitulés dans un tableau joint au rapport d’essai final et couvrir tous les aspects énumérés au paragraphe 24.

Évaluation des résultats

22.

Le degré d’irritation cutanée devrait être évalué conjointement avec la gravité des lésions et leur caractère réversible. Les cotes individuelles ne fournissent pas une valeur absolue des propriétés irritantes d’une substance, celles-ci étant évaluées parallèlement à d’autres effets de la substance. En revanche, les cotes individuelles doivent être considérées comme des valeurs de référence, à évaluer en combinaison avec toutes les autres observations effectuées au cours de l’étude.

23.

L’évaluation des réactions d’irritation doit tenir compte de la réversibilité des lésions cutanées. Si des réactions, telles que l’alopécie (sur une aire limitée), l’hyperkératose, l’hyperplasie et la desquamation, persistent jusqu’à la fin de la période d’observation de 14 jours, il y a lieu de considérer le produit chimique d’essai comme irritant.

Rapport d’essai

24.

Le rapport d’essai doit contenir les informations suivantes:

 

Justification de l’essai in vivo:

analyse de la valeur des résultats disponibles avant l’essai, notamment des résultats de la démarche expérimentale séquentielle;

description des données pertinentes livrées par des essais précédents;

données obtenues à chaque étape de la démarche expérimentale;

description des essais in vitro effectués exposant le détail des procédures et les résultats obtenus avec les substances d’essai et de référence;

comment l’analyse de la valeur des résultats a débouché sur la décision de conduire l’étude in vivo.

 

Produit chimique d’essai:

substance mono-constituant:identification chimique, notamment désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent;

substance multi-constituants, substance de composition inconnue ou variable, produits réactionnels complexes et matériaux biologiques (UVCB) ou mélange: caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;

apparence physique, hydrosolubilité, solubilité dans le DMSO et autres propriétés physico-chimiques pertinentes, selon les données disponibles;

source et numéro de lot si disponible;

traitement du produit chimique d’essai avant la conduite de l’essai, s’il y a lieu (par exemple chauffage, broyage);

stabilité du produit chimique d’essai, date de péremption, ou date de vérification analytique si disponible;

conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.

 

Véhicule:

identification, concentration (s’il y a lieu), volume utilisé;

justification du choix du véhicule.

 

Animaux d’expérience

espèce/souche utilisée, justification de l’utilisation éventuelle d’un animal autre que le lapin albinos;

nombre d’animaux de chaque sexe;

poids de chaque animal au début et à la fin de l’essai;

âge des animaux au début de l’essai;

source des animaux, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.

 

Conditions expérimentales:

technique de préparation du site d’application;

détails concernant la composition du timbre et la technique d’application de ce dernier;

détails sur la préparation, l’application et l’enlèvement du produit chimique d’essai.

 

Résultats:

tableau faisant apparaître, pour chaque animal et à chaque relevé, les cotes attribuées aux réactions d’irritation/corrosion observées;

description de toutes les lésions observées;

description circonstanciée de la nature et du degré d’irritation ou de corrosion observé, et de tout effet histopathologique;

description de tout autre effet local néfaste (par exemple le dégraissage de la peau) et des effets systémiques.

 

Discussion des résultats.

 

Conclusions

BIBLIOGRAPHIE

(1)

OCDE (2014). Guidance Document on Integrated Approaches to Testing and Assessment. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No. 203.) Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.

(2)

OCDE (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as Endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998

(3)

OCDE (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 19), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.

Tableau

Cotation des réactions cutanées

Pas d’érythème…

0

Érythème très léger (à peine perceptible)…

1

Érythème bien défini…

2

Érythème modéré à grave…

3

Érythème grave (rouge violacé) à formation d’escarre empêchant la cotation de l’érythème…

4

Maximum possible: 4

Pas d’oedème…

0

Oedème très léger (à peine perceptible)…

1

Oedème léger (pourtour de la zone oedémateuse bien délimité par une enflure nette)…

2

Oedème modéré (enflure d’environ 1 mm)…

3

Oedème grave (enflure de plus de 1 mm s’étendant au-delà de l’aire exposée)…

4

Maximum possible: 4

Un examen histopathologique pourra être conduit pour éclaircir des réactions douteuses.

Appendice

DÉFINITIONS

Produit chimique: une substance ou un mélange.

L’irritation cutanée: apparition de lésions cutanées réversibles consécutives à l’application d’un produit chimique d’essai durant une période de quatre heures au maximum.

La corrosion cutanée: survenue de lésions cutanées irréversibles, et plus précisément d’une nécrose visible à travers l’épiderme et dans le derme, à la suite de l’application d’un produit chimique d'essai durant une période de quatre heures au maximum. La corrosion cutanée se manifeste par des ulcères, des saignements, des croûtes saignantes et, au terme de la période d’observation de 14 jours, par une décoloration due au pâlissement de la peau, des zones d’alopécie totale et des escarres. On envisagera un examen histopathologique s’il faut élucider des lésions douteuses.

Produit chimique d'essai: toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d'essai

»

(2)

Dans la partie B, le chapitre B.17 est remplacé par le texte suivant:

«B.17   ESSAIS IN VITRO DE MUTATION GÉNIQUE SUR CELLULES DE MAMMIFÈRES UTILISANT LES GÈNES HPRT ET XPRT

INTRODUCTION

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 476 (2016) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Les méthodes d’essai sont régulièrement révisées à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences règlementaires et du bien-être des animaux. La présente version révisée de la méthode d’essai B.17 reflète les connaissances scientifiques acquises après plus de trente années d’expérience de cet essai et résulte également des évolutions d’une nouvelle méthode d’essai distincte, consacrée aux essais in vitro de mutation génétique sur les cellules de mammifères menés en utilisant le gène TK (thymidine kinase). La méthode B.17 s’inscrit dans une série de méthodes d’essai sur la toxicologie génétique. L’OCDE a élaboré un document qui fournit des éléments d’information concis sur les essais de toxicologie génétique et donne un aperçu des récents changements qui ont été apportés aux lignes directrices de toxicité génétique de l’OCDE(1).

2.

L’essai in vitro de mutation génétique sur les cellules de mammifères a pour objectif de détecter des mutations induites par des produits chimiques. Les lignées cellulaires utilisées dans ces essais mesurent les mutations directes dans les gènes rapporteurs, en particulier le gène endogène de l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase (Hprt pour les cellules de rongeur, HPRT pour les cellules humaines; collectivement désignés dans la présente méthode d’essai par gène Hprt et test HPRT), et le transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transférase (gpt) (dénommé test XPRT). Les tests de mutation HPRT et XPRT détectent différents éventails d’effets génétiques. Outre les mutations détectées par le test HPRT (substitutions d’une paire de base par une autre, décalages du cadre de lecture, petites délétions et insertions), l’emplacement autosomique du transgène gpt peut permettre de détecter des mutations résultant de délétions importantes et même d’une recombinaison mitotique, qui ne sont pas détectées par le test HPRT parce que le gène Hprt est situé sur le chromosome X (2) (3) (4) (5) (6) (7). À l’heure actuelle, le test XPRT est moins utilisé que le test HPRT à des fins réglementaires.

3.

Les définitions des termes employés sont présentées à l’appendice1.

REMARQUES PRÉMIMINAIRES ET LIMITES

4.

Les essais conduits in vitro requièrent généralement une source exogène d’activation métabolique, mais celle-ci est incapable de reproduire parfaitement les conditions in vivo.

5.

On prendra soin d’éviter les conditions susceptibles de conduire à de faux résultats positifs (à savoir une possible interaction avec le système d’essai) non causés par une interaction directe entre le produit chimique d’essai et le matériel génétique de la cellule; ces conditions peuvent être une modification du pH ou de l’osmolalité (8) (9) (10) une interaction avec les composants du milieu (11) (12) ou une cytotoxicité excessive (13). Une cytotoxicité supérieure aux plafonds recommandés tels que définis au paragraphe 19 est considérée comme excessive pour le test HPRT.

6.

Avant d’utiliser la méthode d’essai sur un mélange pour obtenir des données à des fins réglementaires, il convient de vérifier si, et dans l’affirmative pourquoi, elle peut fournir des résultats acceptables dans ce cadre réglementaire. Cette vérification n’est pas nécessaire si l’essai du mélange répond à des exigences réglementaires.

PRINCIPE DE L’ESSAI

7.

Des cellules mutantes déficientes en Hprt dans le test HPRT ou en xprt dans le test XPRT sont résistantes aux effets cytostatiques de la 6-thioguanine (TG), un analogue de la purine. Les cellules munies de l’enzyme Hprt (dans le test HPRT) ou du Gpt (dans le test XPRT) sont sensibles à la TG, qui entraîne une inhibition du métabolisme et l’arrêt de la division cellulaire. Ainsi, des cellules mutantes peuvent proliférer en présence de TG, tandis que des cellules normales qui contiennent l’enzyme Hprt (test HPRT) ou gpt (test XPRT), ne le peuvent pas.

8.

Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées au produit chimique d’essai, en présence et en l’absence d’une source exogène d’activation métabolique (voir paragraphe 14), pendant une période appropriée (3-6 heures). Les cellules sont repiquées afin de déterminer la cytotoxicité et de laisser le phénotype s’exprimer avant la sélection des mutants (14) (15) (16) (17). On détermine la cytotoxicité en mesurant la survie relative (SR), à savoir l’efficacité de clonage mesurée immédiatement après le traitement et ajustée pendant le traitement en fonction d’une éventuelle perte cellulaire par rapport au témoin négatif (paragraphe 18 et appendice 2). Les cultures traitées sont maintenues dans un milieu de croissance pendant une période de temps suffisante, caractéristique de chaque type de cellule, afin de permettre une expression phénotypique quasi-optimale des mutations induites (habituellement 7-9 jours minimum). Une fois l’expression phénotypique obtenue, on détermine la fréquence des mutants en ensemençant avec un nombre connu de cellules un milieu contenant l’agent sélectif permettant de détecter les colonies de mutants. Dans un milieu exempt d’agent sélectif, on détermine l’efficacité de clonage (viabilité). Après un temps d’incubation approprié, les colonies sont comptées. On corrige le nombre de colonies de mutants de l’efficacité de clonage au moment de la sélection des mutants pour obtenir la fréquence des mutants.

DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

Préparations

Cellules

9.

Les types de cellules utilisés pour les tests de mutation HPRT et XPRT doivent avoir une sensibilité prouvée aux mutagènes chimiques, une efficacité de clonage élevée, un caryotype stable et une fréquence stable de mutants spontanés. Les cellules les plus fréquemment utilisées pour le test HPRT incluent les lignées CHO, CHL et V79 de cellules de hamster chinois, L5178Y de cellules de lymphome de souris, et TK6 de cellules humaines lymphoblastoïdes (18) (19). Les cellules AS52 qui dérivent des lignées CHO et contiennent le transgène gpt (mais pas le gène Hprt) sont utilisées pour le test XPRT (20) (21); L’utilisation d’autres lignées cellulaires doit être justifiée et validée.

10.

La stabilité du caryotype et l’absence de contamination par des mycoplasmes sont vérifiées régulièrement dans les lignées cellulaires (22) (23), et les cellules sont écartées si une contamination ou une modification du caryotype est constatée. La durée normale du cycle cellulaire utilisée dans le laboratoire d’essai doit être établie et doit correspondre aux caractéristiques cellulaires publiées. Il convient également de contrôler la fréquence de mutants spontanés dans le stock de cellules maîtresses, et ce stock ne devra pas être utilisé si la fréquence de mutants n’est pas acceptable.

11.

Avant d’employer les cultures dans l’essai, il peut être nécessaire de les débarrasser des cellules mutantes qu’elles contiennent, par exemple en utilisant un milieu de culture HAT pour le test HPRT et MPA pour le test XPRT (5) (24) (voir l’appendice 1). Les cellules nettoyées peuvent être cryopréservées, puis décongelées pour servir de stocks de travail. Il est possible d’utiliser pour le test le stock de travail tout juste décongelé une fois atteints les temps de doublement normaux. Dans le cas d’un test XPRT, la culture de routine de cellules AS52 doit se faire dans des conditions qui assurent le maintien du transgène gpt (20).

Milieu et conditions de culture

12.

Il convient d’utiliser un milieu de croissance et des conditions d’incubation (récipients de culture, atmosphère humidifiée à 5 % de CO2, et température d’incubation de 37 °C) appropriés pour les cultures. Les cultures cellulaires doivent toujours être maintenues dans des conditions qui garantissent leur croissance en phase exponentielle. Il est particulièrement important de choisir des milieux et des conditions de culture qui stimulent la croissance optimale des cellules pendant la période d’expression et l’efficacité optimale du clonage pour les cellules mutantes et non mutantes.

Préparation des cultures

13.

Les lignées cellulaires sont multipliées à partir de cultures mères, placées dans un milieu de culture à une densité telle que les cellules en suspension ou en monocouche poursuivront leur croissance de manière exponentielle pendant les périodes de traitement et d’expression (il convient par exemple d’éviter que les cellules qui se multiplient en monocouche arrivent à confluence).

Activation métabolique

14.

Le recours à un système d’activation métabolique exogène est nécessaire en cas d’utilisation de cellules dotées d’une capacité métabolique endogène inadéquate. Le système le plus couramment utilisé, recommandé par défaut, sauf justification contraire, est une fraction post-mitochondriale enrichie en cofacteur (S9), préparée à partir de foies de rongeurs (généralement des rats) traités avec des inducteurs enzymatiques comme l’Aroclor 1254 (25) (26) (27) (28) ou un mélange de phénobarbital et ß-naphthoflavone (29) (30) (31) (32). L’utilisation de ce mélange n’est pas contraire à la Convention de Stockholm sur les polluants organiques persistants (33) et s’est révélée aussi efficace que celle de l’Arcolor 1254 pour l’induction d’oxydases à fonction mixte (29) (31). La fraction S9 est généralement utilisée à une concentration comprise entre 1 et 2 % (v/v) mais peut être portée à 10 % v/v dans le milieu d’essai final. Le choix du type et de la concentration du système d’activation métabolique exogène ou de l’inducteur métabolique utilisé pourra dépendre de la classe des substances chimiques à tester (34) (35) (36).

Préparation du produit chimique d’essai

15.

Les produits chimiques solides à tester sont dissous dans un solvant approprié puis, le cas échéant, dilués avant application (voir paragraphe 16). Avant le traitement, les produits chimiques liquides peuvent être ajoutés directement et/ou après dilution au système d’essai. Les produits gazeux ou volatils nécessitent une modification appropriée des protocoles standards, par exemple l’utilisation de récipients de culture hermétiquement clos (37) (38). Il convient de préparer les produits chimiques d’essai juste avant le traitement, à moins que les données concernant la stabilité ne démontrent qu’ils peuvent être stockés.

CONDITIONS EXPÉRIMENTALES

Solvants

16.

Le solvant doit être choisi de manière à optimiser la solubilité des produits chimiques d’essai, sans engendrer d’effets néfastes sur la conduite de l’essai, c’est-à-dire sans modifier la croissance cellulaire, nuire à l’intégrité du produit chimique testé, réagir avec les récipients de culture ou détériorer le système d’activation métabolique. On recommande d’envisager d’abord l’utilisation d’un solvant (ou milieu de culture) aqueux chaque fois que cela est possible. L’eau et le diméthylsulfoxyde sont des exemples de solvants couramment utilisés. En règle générale, les solvants organiques ne doivent pas dépasser 1 % (v/v) et les solvants aqueux (salin ou eau) 10 % (v/v) dans le milieu de traitement final. L’emploi d’un solvant inhabituel (éthanol ou acétone, par exemple) doit être justifié par des données faisant état de sa compatibilité avec le produit chimique d’essai et le système d’essai, ainsi que de son absence de génotoxicité aux concentrations utilisées. En l’absence de telles données, il est important d’ajouter dans l’essai des témoins non traités (voir l’appendice 1) afin de démontrer que le solvant choisi n’entraîne aucun effet délétère ou mutagène.

Mesure de la cytotoxicité cellulaire et choix des concentrations d’exposition

17.

Lors de la détermination de la plus forte concentration de produit chimique testé, on évitera les concentrations susceptibles de produire de fausses réponses positives, notamment celles qui engendrent une cytotoxicité excessive (voir paragraphe 20), une précipitation dans le milieu de culture (voir paragraphe 21), ou une modification marquée du pH ou de l’osmolalité (voir paragraphe 5). Si le produit chimique testé provoque une modification marquée du pH du milieu au moment de son ajout, il est possible d’ajuster le pH par tamponnage du milieu de traitement final de manière à éviter les faux résultats positifs et à maintenir des conditions de culture appropriées.

18.

La concentration est sélectionnée en fonction de la cytotoxicité et d’autres considérations (voir paragraphes 20-22). Un essai préliminaire visant à évaluer la cytotoxicité peut s’avérer utile pour mieux cerner les concentrations à utiliser dans l’essai principal, mais il n’est pas obligatoire. Même si une évaluation initiale de la cytotoxicité a été effectuée, il reste indispensable de mesurer la cytotoxicité pour chaque culture dans le cadre de l’expérience principale. La cytotoxicité est évaluée au regard de la survie relative (SR), à savoir l’efficacité de clonage (EC) des cellules étalées sur plaque immédiatement après le traitement, ajustée en fonction d’une éventuelle perte de cellules en cours de traitement et fondée sur le nombre de cellules, par rapport à l’efficacité ajustée du clonage sur les témoins négatifs (à qui l’on a attribué une survie de 100 %) (voir les formules à l’appendice 2).

19.

Il convient d’évaluer au moins quatre concentrations d’essai (sans compter les témoins positifs et les témoins avec solvant) remplissant les critères d’acceptabilité (cytotoxicité appropriée, nombre de cellules, etc.). Alors que l’utilisation de cultures en double exemplaires est recommandée, chacune des cultures réalisées en un seul ou plusieurs exemplaires peut être utilisée à chaque concentration d’essai. Les résultats obtenus pour chacune des répliques (cultures réalisées en plusieurs exemplaires) à une concentration donnée doivent faire l’objet de rapports distincts mais peuvent être regroupés pour l’analyse des données (17). Pour les produits chimiques dont la cytotoxicité est faible ou nulle, des niveaux de concentrations espacés d’un facteur de 2 à 3 environ conviendront généralement. En cas de cytotoxicité, les concentrations d’essai retenues doivent couvrir une plage englobant la concentration produisant une cytotoxicité et les concentrations pour lesquelles une cytotoxicité modérée, faible ou nulle est observée. De nombreux produits chimiques d’essai présentent des courbes concentration-réponse à forte pente et, afin de couvrir toute la plage de valeurs de la cytotoxicité ou pour étudier en détail la relation concentration-réponse, il pourra s’avérer nécessaire d’utiliser des concentrations plus rapprochées et plus de quatre concentrations, notamment dans les cas où il est nécessaire de répéter l’expérience (voir paragraphe 43). Si l’on réalise des cultures en un seul exemplaire, il peut être particulièrement important d’utiliser plus de 4 concentrations.

20.

Si la concentration maximale est basée sur la cytotoxicité, la concentration la plus forte doit viser une cytotoxicité comprise entre 20 et 10 % SR. Les résultats positifs présents uniquement à une SR inférieure ou égale à 10 % doivent être interprétés avec prudence (paragraphe 43).

21.

Pour les produits chimiques d’essai peu solubles qui ne sont pas cytotoxiques à des concentrations inférieures à la concentration insoluble la plus faible, la plus forte concentration analysée doit produire une turbidité ou un précipité visible à l’œil nu ou à l’aide d’un microscope inversé à la fin du traitement avec le produit chimique testé. Même si une cytotoxicité intervient au-delà de la concentration insoluble la plus faible, il est recommandé de tester une seule concentration produisant une turbidité ou un précipité visible, car de fausses réponses pourraient découler de ce précipité. À la concentration produisant un précipité, il convient de s’assurer que ce dernier n’interfère pas avec la conduite de l’essai. Il peut être utile de déterminer la solubilité dans le milieu de culture préalablement à l’essai.

22.

Si aucun précipité ou aucune cytotoxicité limitante ne sont observés, la concentration d’essai maximale doit correspondre à la plus basse parmi 10 mM, 2 mg/ml ou 2 μl/ml (39) (40). Lorsque la composition du produit chimique testé n’est pas définie, par exemple dans le cas de substances de composition inconnue ou variable, de produits de réaction complexes ou de matériels biologiques (substances chimiques UVCB) (41), de produits extraits de l’environnement etc., il peut être nécessaire d’augmenter la concentration maximale (5 mg/ml par exemple), en absence de cytotoxicité suffisante, afin d’accroître la concentration de chacun des composants. Il convient toutefois de noter que ces exigences peuvent être différentes pour les produits pharmaceutiques à usage humain (42).

Témoins

23.

Des témoins négatifs concomitants (voir paragraphe 16), constitués uniquement du solvant dans le milieu de traitement et testés de la même façon que les cultures traitées, doivent être inclus pour chaque condition expérimentale.

24.

Des témoins positifs concomitants sont nécessaires pour démontrer la capacité du laboratoire d’identifier les mutagènes dans les conditions du protocole d’essai utilisé, ainsi que l’efficacité du système d’activation métabolique exogène, le cas échéant. Le tableau 1 ci-dessous présente des exemples de témoins positifs. D’autres substances chimiques peuvent être utilisées comme témoins positifs, si cela est justifié. Étant donné que les essais in vitro de génotoxicité sur cellules de mammifères sont suffisamment normalisés, les tests appliquant des traitements avec et sans activation métabolique exogène peuvent être menés en utilisant uniquement un témoin positif exigeant une activation métabolique. Dans ce cas, cette seule réponse dans un témoin positif démontrera à la fois l’activité du système d’activation métabolique et la réactivité du système d’essai. Chaque témoin positif doit être utilisé à une ou plusieurs concentrations devant normalement donner lieu à une augmentation reproductible et détectable par rapport à la valeur de fond afin de démontrer la sensibilité du système d’essai, et la réponse ne doit pas être compromise par une cytotoxicité supérieure aux limites fixées dans la présente méthode d’essai (voir paragraphe 20).

Tableau 1

Substances de référence recommandées pour la vérification des compétences du laboratoire et pour la sélection des témoins positifs

Condition d’activation métabolique

Locus

Substance chimique et No CAS.

en l’absence d’une activation exogène

Hprt

Méthanesulfonate d’éthyle [no CAS 62-50-0] Ethylnitrosourée [no CAS 759-73-9] Oxyde de nitro-4 quinoléine [no CAS 56-57-5]

 

XPRT

Streptonigrine [no CAS 3930-19-6] Mitomycine C [no CAS 50-07-7]

en présence d’une activation exogène

Hprt

Méthyl-3 cholantrène [no CAS 56-49-5] Diméthyl7,12 benzanthracène [no CAS 57-97-6] Benzo[a]pyrène [no CAS 50-32-8]

 

XPRT

Benzo[a]pyrène [no CAS 50-32-8]

MODE OPÉRATOIRE

Traitement avec le produit chimique testé

25.

Les cellules en prolifération sont traitées avec le produit chimique d’essai en présence et en l’absence d’un système d’activation métabolique. La durée d’exposition doit être suffisante (de 3 à 6 heures sont généralement efficaces).

26.

Le nombre minimal de cellules utilisées pour chaque culture d’essai (témoin et traitée) à chaque étape de l’essai doit être basé sur la fréquence de mutants spontanés. Il est conseillé en général de traiter et repiquer suffisamment de cellules pour préserver 10 mutants spontanés dans chaque culture à toutes les phases de l’essai (17). La fréquence des mutants spontanés varie en général entre 5 et 20 × 10-6. Avec une fréquence de mutants spontanés de 5 × 10-6 et pour entretenir un nombre suffisant de mutants spontanés (10 ou plus) même pour les cultures traitées à des concentrations causant une cytotoxicité de 90 % pendant le traitement (10 % de SR), il est nécessaire de traiter au moins 20 × 106 cellules. Il faut en outre qu’un nombre suffisant de cellules (jamais moins de 2 millions) soient cultivées durant la période d’expression et étalées sur plaque pour la sélection des mutants (17).

Délai d’expression phénotypique et mesure de la fréquence des mutants

27.

À l’issue de la période de traitement, les cellules sont cultivées de façon à permettre l’expression phénotypique de mutants. Un minimum de 7 à 9 jours suffit en général à l’expression phénotypique presque optimale des mutants Hprt et xprt nouvellement introduits (43) (44). Durant cette période, les cellules sont régulièrement mises en sous-culture pour préserver leur croissance exponentielle. Après l’expression phénotypique, les cellules sont à nouveau étalées sur plaque dans le milieu avec et sans agent sélectif (6-thioguanine) afin de déterminer le nombre de mutants et l’efficacité de clonage au moment de la sélection, respectivement. Cette opération peut se faire avec des boîtes pour cultures monocouche ou avec des plaques micropuits pour cellules en suspension. S’agissant de la sélection des mutants, il convient d’étaler sur des plaques les cellules suivant une densité qui assure la récupération optimale des mutants (en évitant notamment la coopération métabolique) (17). On incube les plaques pendant une durée appropriée à une croissance optimale des colonies (par exemple de 7 à 12 jours), puis on compte les colonies. On corrige le nombre de colonies de mutants par l’efficacité de clonage au moment de la sélection des mutants pour obtenir la fréquence des mutants (voir l’appendice 2 pour les formules).

Compétence du laboratoire

28.

Afin d’acquérir une expérience suffisante de l’essai avant de l’utiliser en routine, le laboratoire doit avoir réalisé une série d’expériences avec des substances chimiques positives de référence agissant selon des mécanismes variés (au moins une avec activation métabolique et une sans activation métabolique, sélectionnées parmi les substances chimiques énumérées au tableau 1) et avec plusieurs témoins négatifs (en utilisant divers solvants/véhicules). Ces réponses de témoins positifs et négatifs doivent être cohérentes par rapport à la littérature. Cette exigence ne s’applique pas aux laboratoires possédant déjà une expérience, c’est-à-dire qui disposent d’une base de données historiques telle que définie aux paragraphes 30 à 33.

29.

Une sélection de substances chimiques utilisées comme témoins positifs (voir tableau 1) doit être testée en l’absence et en présence d’une activation métabolique, l’objectif étant de démontrer que le laboratoire possède la compétence nécessaire pour détecter des produits chimiques mutagènes, de déterminer l’efficacité du système d’activation métabolique et de prouver l’adéquation des conditions de croissance cellulaire durant le traitement, l’expression phénotypique et la sélection des mutants, ainsi que l’adéquation des procédures d’évaluation. Il conviendra de définir une plage de concentrations des substances chimiques sélectionnées qui permette d’obtenir des augmentations reproductibles et liées à la concentration par rapport aux valeurs de fond, afin de démontrer la sensibilité et la plage dynamique du système d’essai.

Données des témoins historiques

30.

Le laboratoire doit établir:

une plage et une distribution des témoins positifs historiques,

une plage et une distribution des témoins négatifs (non traités, avec solvant) historiques.

31.

Lors de l’acquisition initiale de données en vue d’établir une distribution des témoins négatifs historiques, les données des témoins négatifs concomitants doivent être cohérentes avec les données publiées (22). Puis, à mesure que de nouvelles données expérimentales viennent étoffer la plage de distribution des témoins, les données des témoins négatifs concomitants doivent idéalement se situer dans les limites de contrôle à 95 % de cette distribution (17) (45) (46).

32.

La base des données historiques du laboratoire relatives aux témoins négatifs doit à l’origine être constituée à partir d’au moins 10 expériences, sachant qu’il serait préférable qu’elle en compte au moins 20, réalisées dans des conditions expérimentales similaires. Les laboratoires doivent avoir recours à des méthodes de contrôle de la qualité telles que des graphiques statistiques [cartes C ou cartes X-barre, par exemple (47)], afin de déterminer la variabilité de leurs données de témoins positifs et négatifs et de démontrer leur maîtrise de la méthodologie (46). On trouve dans la littérature (45) d’autres recommandations sur la façon de constituer et d’utiliser ces données historiques (critères d’inclusion et d’exclusion des données dans la base et critères d’acceptabilité pour une expérimentation donnée).

33.

Les données des témoins négatifs désignent les fréquences des mutants issus de cultures réalisées en un seul exemplaire, ou de préférence de cultures répliquées, comme décrit au paragraphe 23. Les témoins négatifs concomitants se situent idéalement dans les limites de contrôle à 95 % de la distribution des données historiques des témoins négatifs contenues dans la base de données du laboratoire (17) (45) (46). Lorsque les données des témoins négatifs concomitants se situent en dehors des limites de contrôle à 95 %, leur inclusion dans la distribution des témoins historiques peut être acceptable à condition que ces données ne soient pas exagérément extrêmes et qu’il soit prouvé que le système d’essai est «sous contrôle» (voir ci-dessus) et qu’il n’y a pas eu de défaillance technique ou d’erreur humaine.

34.

Toute modification du protocole expérimental doit être étudiée en termes de cohérence avec les bases de données des témoins historiques existantes du laboratoire. Toute incohérence majeure doit conduire à l’établissement d’une nouvelle base de données des témoins historiques.

RÉSULTATS ET RAPPORT

Présentation des résultats

35.

La présentation des résultats doit inclure toutes les données nécessaires au calcul de la cytotoxicité (exprimée en SR). Les données, tant pour les cultures traitées que témoins, doivent inclure le nombre de cellules à la fin du traitement, le nombre de cellules étalées sur plaque immédiatement après le traitement, et le nombre de colonies (ou de puits sans colonies pour la méthode utilisant des plaques micropuits). Il convient d’exprimer la SR pour chaque culture en pourcentage du témoin concomitant contenant le solvant (Voir les définitions à l’appendice 1).

36.

La présentation des résultats doit également inclure toutes les données nécessaires au calcul de la fréquence des mutants. Les données, tant pour les cultures traitées que témoins, doivent inclure: (1) le nombre de cellules étalées sur plaque avec et sans agent sélectif (au moment où les cellules sont étalées sur plaque pour la sélection des mutants), et (2) le nombre de colonies (ou le nombre de puits sans colonies pour la méthode utilisant des micropuits) sur les plaques avec et sans agent sélectif. On corrige le nombre de colonies de mutants (sur les plaques avec agent sélectif) par l’efficacité de clonage (sur les plaques sans agent sélectif) pour obtenir la fréquence des mutants. Il convient d’exprimer la fréquence des mutants en nombre de cellules mutantes par million de cellules viables (Voir les définitions à l’appendice 1).

37.

Les données seront présentées séparément pour chaque culture. En outre, toutes les données doivent être résumées sous forme de tableaux.

Critères d’acceptabilité

38.

L’acceptation de l’essai repose sur les critères suivants:

Les données relatives aux témoins négatifs concomitants sont considérées comme pouvant être ajoutées à la base de données des témoins négatifs historiques du laboratoire (voir paragraphe 33).

Les témoins positifs concomitants (voir paragraphe 24) doivent induire des réponses compatibles avec celles générées dans la base de données des témoins positifs historiques et produire une augmentation statistiquement significative par rapport aux témoins négatifs concomitants.

Deux conditions expérimentales (à savoir avec et sans activation métabolique) ont été testées, à moins que l’une d’entre elles ait abouti à des résultats positifs (voir paragraphe 25).

Un nombre adéquat de cellules et de concentrations sont analysables (voir paragraphes 26, 27 et 19).

Les critères de sélection de la concentration maximale sont cohérents avec ceux décrits aux paragraphes 20, 21 et 22.

Évaluation et interprétation des résultats

39.

À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement positif si, dans les conditions expérimentales étudiées:

au moins une des concentrations d’essai présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant,

un test de tendance approprié montre que l’augmentation est liée à la concentration,

des résultats se situent à l’extérieur de la plage de distribution des données des témoins négatifs historiques (limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson, par exemple; voir paragraphe 33).

Lorsque tous ces critères sont remplis, le produit chimique d’essai est considéré comme capable d’induire des mutations génétiques dans les cellules de mammifères en culture dans ce système d’essai. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées sont disponibles dans la littérature (46) (48).

40.

À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement négatif si, dans toutes les conditions expérimentales étudiées:

aucune concentration d’essai ne présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;

un test de tendance approprié montre qu’il n’y a pas d’augmentation liée à la concentration;

l’intégralité des résultats se situe à l’intérieur de la distribution des données des témoins négatifs historiques (limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson, par exemple; voir paragraphe 33).

Le produit chimique d’essai est alors considéré comme incapable d’induire des mutations génétiques dans les cellules de mammifères en culture dans ce système d’essai.

41.

Il n’est pas nécessaire de vérifier une réponse clairement positive ou négative.

42.

Lorsque la réponse n’est ni clairement négative ni clairement positive, tel que décrit ci-dessus, ou en vue d’établir la signification biologique d’un résultat, les données doivent être soumises à un jugement d’expert et/ou des investigations plus poussées. Il peut être utile d’examiner des cellules supplémentaires (le cas échéant) ou de répéter l’expérience, éventuellement dans des conditions expérimentales modifiées (espacement des concentrations, autres conditions d’activation métabolique [concentration de S9 ou origine de S9], par exemple).

43.

Dans de rares cas, même après de nouvelles investigations, l’ensemble de données ne permettra pas de conclure que les résultats sont positifs ou négatifs. La réponse au produit chimique d’essai devra alors être considérée comme équivoque (et donc potentiellement aussi bien positive que négative).

Rapport d’essai

44.

Le rapport d’essai contient les informations suivantes:

 

Produit chimique d’essai:

source, numéro de lot, date limite d’utilisation, si disponibles;

stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue;

solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues;

mesure du pH, de l’osmolalité et de la précipitation dans le milieu de culture auquel le produit chimique d’essai a été ajouté, le cas échéant.

 

Substance mono-constituant:

apparence physique, hydrosolubilité, autres propriétés physico-chimiques;

identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.

 

Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:

caractérisée, autant que possible par exemple l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence quantitative et les propriétés physico-chimiques pertinentes des constituants.

 

Solvant:

justification du choix du solvant;

pourcentage de solvant présent dans le milieu de culture final.

 

Cellules:

 

Pour les cultures mères du laboratoire:

type et source des lignées cellulaires;

nombre de repiquages, le cas échéant, et historique au laboratoire;

caractéristiques du caryotype et/ou nombre modal de chromosomes;

méthodes d’entretien des cultures cellulaires;

absence de mycoplasmes;

temps de doublement des cellules.

 

Conditions de l’essai:

justification du choix des concentrations et du nombre de cultures, y compris données concernant la cytotoxicité et les limites de solubilité, par exemple;

composition du milieu, concentration de CO2, degré d’humidité;

concentration du produit chimique d’essai sous la forme de sa concentration finale dans le milieu de culture (par exemple en μg ou mg/ml ou mM du milieu de culture);

concentration (et/ou volume) de solvant et de produit chimique d’essai ajoutés au milieu de culture;

température d’incubation;

temps d’incubation;

durée du traitement;

densité des cellules pendant le traitement;

type et composition du système d’activation métabolique (source du S9, méthode de préparation du mélange S9, concentration ou volume de mélange S9 et de S9 dans le milieu de culture final, contrôles de la qualité du S9);

substances témoins positives et négatives, concentrations finales pour chacune des conditions de traitement;

durée de la période d’expression (avec le nombre de cellules déposées et de repiquages et les programmes de nutrition, le cas échéant);

identité de l’agent sélectif et sa concentration;

critères d’acceptabilité des essais;

méthodes utilisées pour dénombrer les cellules viables et les cellules mutantes;

méthodes utilisées pour mesurer la cytotoxicité;

toute information supplémentaire concernant la cytotoxicité et la méthode utilisée;

temps d’incubation après étalement sur une plaque;

critères pour conclure que l’étude est positive, négative ou équivoque;

méthodes utilisées pour déterminer le pH, l’osmolalité et la précipitation.

 

Résultats:

nombre de cellules exposées et nombre de cellules repiquées pour chaque culture;

mesures de la cytotoxicité et autres observations le cas échéant;

signes de précipitation et moment de la détermination;

nombre de cellules étalées sur plaque dans un milieu sélectif et dans un milieu non sélectif;

nombre de colonies dans un milieu non sélectif et nombre de colonies résistantes dans un milieu sélectif, et fréquences de mutants correspondantes;

relation concentration-réponse, si possible;

données relatives aux témoins négatifs (solvant) et positifs (concentrations et solvants) concomitants;

données relatives aux témoins négatifs (solvant) et positifs historiques, y compris ordres de grandeur, moyennes, écarts-types et intervalle de confiance (par exemple 95 %) et nombre de données;

analyses statistiques (pour chaque culture et chaque lot de réplicats, le cas échéant), et valeurs P le cas échéant.

 

Discussion des résultats.

 

Conclusion.

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Appendice 1

DÉFINITIONS

Concentrations: désigne les concentrations finales du produit chimique d’essai dans le milieu de culture.

Cytotoxicité: pour les essais visés par la présente méthode d'essai, la cytotoxicité correspond à une baisse de la survie relative des cellules traitées par rapport au témoin négatif (voir paragraphe spécifique).

Délai d’expression phénotypique: délai après traitement au bout duquel l’altération génique est fixée dans le génome et tous les produits géniques préexistants sont déplétés au point que le caractère phénotypique est modifié.

Efficacité de clonage: pourcentage de cellules étalées sur plaque à une faible densité qui sont capables de se développer pour former une colonie dénombrable.

Fréquence des mutants (FM): nombre de colonies de mutants observées divisé par le nombre de cellules étalées sur plaque dans un milieu sélectif, corrigé de l’efficacité (ou viabilité) du clonage au moment de la sélection.

Génotoxique: terme générique qualifiant tous les types de lésions de l’ADN ou des chromosomes, tels que les cassures, adduits, remaniements, mutations ou aberrations chromosomiques et aneuploïdies. Tous les types d’effets génotoxiques n’entraînent pas nécessairement de mutations ou de lésions chromosomiques stables.

Mélange S9: mélange de fraction S9 de foie et de cofacteurs nécessaires à l’activité des enzymes métaboliques.

Milieu HAT: milieu composé d’hypoxanthine, d’aminoptérine et de thymidine, qui sert à nettoyer les mutants Hprt.

Milieu MPA: milieu composé de xanthine, d’adénine, de thymidine, d’aminoptérine et d’acide mycophénolique, qui sert à nettoyer les mutants Xprt.

Mutagène: qui produit une modification héréditaire portant sur une ou plusieurs séquences de paires de bases d’ADN génique, ou sur la structure de chromosomes (aberrations chromosomiques).

Mutagènes décalant le cadre de lecture: produits chimiques entraînant l’addition ou la délétion d’une ou de plusieurs paires de bases dans la molécule d’ADN.

Mutagènes provoquant la substitution de paires de bases: produits chimiques qui entraînent le remplacement d’une ou plusieurs paires de bases de l’ADN.

Mutation directe: mutation de gène de la forme parentale en une forme mutante, qui engendre une modification ou une perte de l’activité enzymatique ou de la fonction de la protéine codée.

Produit chimique: une substance ou un mélange.

Produit chimique d'essai: toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d'essai.

Prolifération cellulaire: augmentation du nombre de cellules résultant de la division cellulaire mitotique.

Recombinaison mitotique: durant la mitose, recombinaison entre chromatides homologues pouvant induire des cassures double brin de l’ADN ou une perte d’hétérozygotie.

Survie relative (SR): la SR sert à mesurer la cytotoxicité liée à un traitement. Elle correspond à l’efficacité de clonage (EC) des cellules étalées sur plaques immédiatement après le traitement, ajustée en fonction d’une éventuelle perte de cellules en cours de traitement, par rapport à l’efficacité de clonage dans les témoins négatifs (à qui l’on attribue une survie de 100 %).

S9 liver fractions: supernatant of liver homogenate after 9 000g centrifugation, i.e. raw liver extract

Témoin avec solvant: terme générique désignant les cultures témoins recevant uniquement le solvant utilisé pour dissoudre le produit chimique d’essai.

Témoins non traités: cultures ne recevant aucun traitement (ni produit chimique d’essai ni solvant) mais préparées parallèlement et de la même façon que les cultures exposées au produit chimique d’essai.

UVCB: substances chimiques de composition inconnue ou variable, produits de réaction complexes et matériels biologiques

Appendice 2

FORMULES POUR L’ÉVALUATION DE LA CYTOTOXICITÉ ET DE LA FRÉQUENCE DES MUTANTS

La cytotoxicité est évaluée par la survie relative (SR), c'est-à-dire l’efficacité de clonage (EC) des cellules étalées sur plaque immédiatement après le traitement, ajustée en fonction d’une éventuelle perte de cellules en cours de traitement, par rapport à l’efficacité ajustée du clonage dans les témoins négatifs (à qui l’on attribue une survie de 100 %) (voir la formule de SR ci-après).

L’EC ajustée pour une culture traitée par un produit chimique d’essai est calculée comme suit:

Formula

La SR pour une culture traitée par un produit chimique d’essai est calculée comme suit:

Formula

La fréquence des mutants correspond à l’efficacité de clonage de colonies de mutants dans un milieu sélectif divisée par l’efficacité de clonage dans un milieu non sélectif mesurée pour la même culture au moment de sélection.

Formula

Lorsque des plaques sont utilisées pour renforcer l’efficacité de clonage:

EC = Nombre de colonies / Nombre de cellules étalées sur plaque.

Lorsque des plaques micropuits sont utilisées pour renforcer l’efficacité de clonage:

Le nombre de colonies par puits sur les plaques micropuits obéit à la loi de Poisson.

EC = -LnP(0) / Nombre de cellules étalées sur plaque par puits

Où -Ln P(0) est le nombre probable de puits vides parmi les puits ensemencés et correspond à la formule suivante:

LnP(0) = -Ln (nombre de puits vides / nombre de puits ensemencés)

»

(3)

Dans la partie B, le chapitre B.22 est remplacé par le texte suivant :

«B.22   ESSAI DE MUTATION LÉTALE DOMINANTE CHEZ LE RONGEUR

INTRODUCTION

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 478 (2016) de l’OCDEpour les essais de produits chimiques. Les méthodes d’essai sont régulièrement mises à jour à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences réglementaires et de considérations relatives au bien-être des animaux. La présente version modifiée de la méthode d’essai reflète plus de trente années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres essais de toxicité, notamment pour le développement, la reproduction ou encore des essais de génotoxicité; cependant, étant donné les limitations de l’essai et le grand nombre d’animaux utilisés, cet essai n’a pas vocation à être utilisé en première intention, mais plutôt comme méthode d’essai supplémentaire quand il n’existe pas d’alternative pour satisfaire les exigences réglementaires. Combiner différents essais de toxicité permet potentiellement d’épargner un grand nombre d’animaux utilisés dans les tests. L’ODE a élaboré un document qui fournit des éléments d’information concis sur les essais de toxicologie génétique et donne un aperçu des récents changements qui ont été apportés aux lignes directrices de toxicité génétique de l’OCDE(1).

2.

L’essai de mutation létale dominante a pour but de détecter si certains produits chimiques engendrent des mutations résultant d’aberrations chromosomiques dans les cellules germinales. En outre, l’essai de mutation létale dominante se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. L’apparition d’une mutation létale dominante à la suite d’une exposition à un produit chimique d’essai indique que cette substance a affecté le tissu germinal de l’animal étudié.

3.

Les mutations létales dominantes provoquent la mort de l’embryon ou du fœtus. L’apparition d’une mutation létale dominante à la suite d’une exposition à un produit chimique indique que cette substance a affecté les cellules germinales de l’animal étudié.

4.

Un essai de mutation létale dominante permet de confirmer les résultats positifs d’essais utilisant des indicateurs somatiques in vivo, et constitue un indicateur pertinent pour prédire le risque chez l’homme de pathologies génétiques transmises par le biais des cellules germinales. Cependant cet essai requiert l’utilisation d’un grand nombre d’animaux et mobilise beaucoup de temps de travail, le rendant onéreux et fastidieux à mener. Étant donné la fréquence importante de mutations dominantes létales spontanées, la sensibilité de l’essai pour détecter de faibles augmentations dans la fréquence des mutations est généralement limitée.

5.

Les définitions des termes clés figurent à l’appendice 1.

REMARQUES PRÉLIMINAIRES

6.

La plupart du temps, l’essai est conduit sur des souris (2) (3) (4), mais d’autres espèces, telles que le rat (5) (6) (7) (8), peuvent être utilisées si cela est justifié sur le plan scientifique. Si, en général, les mutations létales dominantes résultent d’aberrations chromosomiques majeures (anomalies structurales et numériques) (9) (10) (11), l’éventualité de mutations génétiques ne peut être écartée. Une mutation létale dominante est une mutation qui se produit dans une cellule germinale, ou qui se fixe après la fécondation dans le jeune embryon, et qui n’entraîne pas de dysfonctionnement du gamète, mais qui est mortelle pour l’œuf fécondé ou pour l’embryon en cours de développement.

7.

Des mâles identifiés sont accouplés successivement avec des femelles vierges, à des intervalles appropriés. Le nombre d’accouplements après le traitement dépend de l’objectif final de l’étude de mutation létale dominante (paragraphe 23) et doit garantir l’évaluation des mutations létales dominantes à toutes les phases de maturation des cellules germinales mâles (12).

8.

Cet essai n’est pas pertinent s’il est prouvé que le produit chimique ou son/ses métabolite(s), n’atteindront pas le testicule.

PRINCIPE DE L’ESSAI

9.

En général, des animaux mâles sont exposés à un produit chimique d’essai par une voie d’exposition idoine puis accouplés avec des femelles vierges non traitées. Différents types de cellules germinales peuvent être testées en utilisant différents intervalles d’accouplement. À la suite de l’accouplement, les femelles sont euthanasiées après une période de temps appropriée et leur utérus est examiné afin de déterminer le nombre d’embryons implantés, ainsi que celui des embryons vivants et morts. Pour déterminer la létalité dominante d’un produit chimique d’essai, le nombre d’embryons implantés vivants par femelle dans le groupe traité est comparé au nombre d’embryons implantés vivants par femelle dans le groupe témoin véhicule/solvant. L’augmentation du nombre d’embryons implantés morts par femelle dans le groupe traité par rapport au groupe témoin reflète la perte après implantation causée par le produit chimique d’essai. La perte après implantation est calculée en déterminant le rapport du nombre d’embryons implantés morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe traité et en le comparant au rapport du nombre d’embryons implantés morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe témoin. La perte avant implantation peut être évaluée en retranchant au nombre de corps jaunes le nombre total d’embryons implantés, soit le nombre total d’implants par femelle dans le groupe traité et dans le groupe témoin.

VÉRIFICATION DES COMPÉTENCES DU LABORATOIRE

10.

La compétence à mener cet essai est établie sur la base d’informations démontrant l’aptitude à reproduire des fréquences de mutations létales dominantes à partir de données publiées (par exemple (13) (14) (15) (16) (17) (18)) avec les substances chimiques utilisées comme témoins positifs (réponses faibles comprises) telles que celles énumérées dans le tableau 1, et les témoins contenant le véhicule, et à obtenir des fréquences de témoin négatif cohérentes avec la plage de données acceptable relatives aux témoins (voir références ci-dessus) ou avec la distribution des données des témoins historiques du laboratoire, le cas échéant.

DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

Préparations

Choix des espèces animales

11.

Il convient d’employer des animaux sains et sexuellement matures issus de souches de laboratoire courantes. Les souris sont habituellement utilisées, mais les rats peuvent également convenir. Toute autre espèce appropriée de mammifère peut être employée à condition qu’une justification scientifique de ce choix soit donnée dans le rapport.

Conditions d’encagement et d’alimentation des animaux

12.

Pour les rongeurs, la température de l’animalerie doit être maintenue à 22 °C (±3 °C). L’humidité relative, qui est idéalement de 50 à 60 %, doit atteindre au moins 40 % et de préférence ne pas dépasser 70 %, sauf durant le nettoyage du local. On dispense un éclairage artificiel faisant alterner des séquences de 12 heures de lumière et de 12 heures d’obscurité. Le régime alimentaire des animaux est le régime classique de laboratoire avec eau potable à volonté. Le choix des aliments peut être influencé par la nécessité d’assurer une bonne incorporation du produit chimique dans la nourriture si l’administration se fait par cette voie. Avant le traitement ou l’accouplement, les rongeurs doivent être mis en cage par petits groupes (de cinq maximum) du même sexe si aucun comportement agressif n’est à craindre ou n’est observé, de préférence dans des cages solides dotées d’un enrichissement environnemental approprié. Les animaux peuvent être encagés individuellement si cela est justifié sur le plan scientifique.

Préparation des animaux

13.

Des animaux adultes mâles et femelles, sains et sexuellement matures, sont répartis au hasard entre le groupe témoin et les groupes traités. Chaque animal est identifié individuellement selon une méthode sans cruauté, la moins invasive possible (par exemple, baguage, étiquetage, pose d’une puce électronique ou identification biométrique, en évitant l’entaillage des oreilles ou la phalangectomie) et gardés dans leurs cages pendant au moins cinq jours afin qu’ils s’acclimatent aux conditions du laboratoire. Les cages doivent être placées de manière à réduire au minimum l’influence éventuelle de leur disposition sur les résultats. Il convient d’éviter toute contamination croisée entre le témoin positif et le produit chimique d’essai. Au début de l’étude, la variation pondérale des animaux doit être minimale et ne pas dépasser ±20 % du poids moyen de chaque sexe.

Préparation des doses

14.

Lorsque les produits chimiques d’essai sont solides, ils sont dissous ou mis en suspension dans des solvants ou des véhicules appropriés, ou incorporés aux aliments ou à l’eau de boisson avant d’être administrés aux animaux. Les produits chimiques liquides peuvent être administrés directement ou dilués avant d’être administrés. En cas d’exposition par inhalation, les produits chimiques d’essai peuvent être administrés sous forme de gaz, de vapeur ou d’aérosol solide ou liquide, en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. On utilisera des préparations fraîches, sauf si l’on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage et définissent les conditions de stockage appropriées.

Conditions de l’essai

Solvant/véhicule

15.

Le solvant/véhicule ne doit pas produire d’effets toxiques aux doses utilisées, ni pouvoir réagir avec le produit chimique d’essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données de référence faisant état de leur compatibilité. On recommande d’envisager d’abord l’utilisation d’un solvant/véhicule aqueux chaque fois que c’est possible. Parmi les exemples de solvants/véhicules compatibles couramment utilisés figurent notamment l’eau, le sérum physiologique, les solutions de méthylcellulose, les solutions de carboxyméthylcellulose sodique, l’huile d’olive et l’huile de maïs.

Témoins positifs

16.

Des animaux témoins positifs sont toujours inclus simultanément dans l’essai, à moins que le laboratoire n’ait déjà démontré ses compétences dans la conduite de l’essai et n’ait mené le test en routine récemment (par exemple dans les cinq dernières années). Toutefois, il n’est pas nécessaire de leur administrer le produit témoin positif par la même voie que celle du produit chimique d’essai, ni de réaliser des prélèvements à chaque intervalle d’accouplement. Les substances utilisées comme témoins positifs doivent induire des mutations létales dominantes de façon fiable et dans les mêmes conditions que l’essai. À l’exception du traitement administré, les animaux des groupes témoins sont traités de la même manière que ceux des groupes de traitement.

17.

Les doses des substances chimiques utilisées comme témoins positifs sont sélectionnées de manière à produire des effets faibles ou modérés qui permettent d’évaluer de manière critique les performances et la sensibilité de l’essai, mais qui induisent systématiquement des effets létaux dominants. Des exemples de substances chimiques utilisés comme témoins positifs, et des doses idoines, figurent au tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1

Exemples de substances chimiques utilisées comme témoins positifs

Substance chimique [noCAS 51-18-3] (15)

Plage de dose effective (mg/kg)

(rongeurs)

Période d’administration

(en nombre de jours)

Triéthylènemélamine [no CAS 51-18-3] (15)

0,25 (souris)

1

Cyclophosphamide [no CAS 50-18-0] (19)

50-150 (souris)

5

Cyclophosphamide [no CAS 50-18-0] (5)

25-100 (rats)

1

Méthanesulfonate d’éthyle [no CAS 62-50-0] (13)

100-300 (souris)

5

Acrylamide monomère [no CAS 79-06-1] (17)

50 (souris)

5

Chlorambucil [305-03-3] (14)

25 (souris)

1

Témoins négatifs

18.

Les animaux témoins négatifs, traités seulement avec le solvant ou avec le véhicule, et traités par ailleurs de manière identique aux groupes témoins, sont inclus à chaque moment de prélèvement (20). En l’absence de données significatives observées ou publiées montrant que le solvant/véhicule choisi n’induit pas de mutation létale dominante ou d’autres effets délétères, des animaux témoins non traités sont également inclus à chaque moment de prélèvement afin d’établir l’acceptabilité du témoin contenant le véhicule.

MODE OPERATOIRE

Nombre d’animaux

19.

Des mâles identifiés sont accouplés successivement à des intervalles appropriés prédéterminés (par exemple une fois par semaine, paragraphes 21 et 23) de préférence à une femelle vierge. Un nombre suffisamment important de mâles est prévu (et un nombre correspondant de femelles accouplées à chaque intervalle d’accouplement) afin d’obtenir l’efficacité statistique nécessaire pour détecter une fréquence de mutation létale dominante au moins multipliée par deux (paragraphe 44).

20.

Le nombre de femelles par intervalle d’accouplement doit également être défini à l’avance par calculs statistiques, afin de pouvoir détecter au minimum un doublement de la fréquence de mutation létale dominante (c’est-à-dire suffisamment de femelles gravides pour obtenir au moins 400 embryons implantés au total) (20) (21) (22) (23) et escompter au moins un embryon implanté mort par unité d’analyse (soit par groupe d’accouplement et par dose) (24).

Période d’administration et intervalles d’accouplement

21.

Le nombre d’accouplements faisant suite au traitement est régi par le déroulement du traitement et doit assurer l’évaluation d’inductions de mutations létales dominantes à toutes les phases de maturation des cellules germinales mâles (12) (25). Pour un traitement unique impliquant jusqu’à cinq doses administrées quotidiennement, il faut compter 8 (pour les souris) ou 10 (pour les rats) accouplements à une semaine d’intervalle après le dernier traitement. En cas d’administrations multiples, le nombre d’accouplements peut être réduit proportionnellement à l’allongement de la période d’administration, tout en conservant pour objectif d’évaluer toutes les phases de la spermatogenèse (par exemple, après une exposition de 28 jours, seuls 4 accouplements par semaine suffisent à évaluer toutes les phases de la spermatogenèse chez la souris). Tous les calendriers de traitement et d’accouplement doivent être scientifiquement justifiés.

22.

Les femelles doivent être laissées avec les mâles au moins pendant la durée d’un cycle œstral (par exemple, une semaine couvre un cycle œstral chez la souris et le rat). Les femelles qui ne se sont pas accouplées au cours d’une semaine donnée peuvent être utilisées pour un autre intervalle d’accouplement, ou jusqu’à ce que l’accouplement ait eu lieu, ce qu’indique la présence de sperme dans le vagin ou d’un bouchon vaginal.

23.

Le régime d’exposition et d’accouplement retenu dépend de l’objectif final de l’étude de mutation létale dominante. Si elle a pour but de déterminer si un produit chimique donné induit des mutations létales dominantes per se, la méthode retenue consistera alors en l’exposition d’un cycle entier de spermatogenèse (soit 7 semaines chez la souris, à raison de 5 à 7 traitements par semaine) et en un accouplement à la fin du cycle. Cependant, si l’objectif est de recenser le type de cellule germinale sensible à une induction de mutation létale dominante, on préférera une exposition unique ou de 5 jours, suivie d’un accouplement hebdomadaire.

Niveaux de dose

24.

Si l’on procède à une étude préliminaire de détermination des doses à administrer parce qu’on ne dispose pas de données fiables pour orienter le choix des doses, cette étude préliminaire doit être effectuée dans le même laboratoire, en utilisant une espèce, une souche, un sexe et un régime de traitement identiques à ceux de l’étude principale (26). Elle devra avoir pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT), définie comme la dose la plus élevée qui sera tolérée sans faire apparaître de toxicité limitante, dans le cadre de la durée de l’étude (par exemple, comportement ou réactions anormaux, baisse mineure du poids corporel ou cytotoxicité du système hématopoïétique), mais ne provoquant pas la mort ou des signes de douleur, de souffrance ou de détresse imposant d’euthanasier les animaux (27).

25.

En outre, la DMT ne doit pas affecter l’accouplement (21).

26.

Les produits chimiques d’essai ayant une activité biologique spécifique à des niveaux de doses faibles et non toxiques (telles que les hormones et les mitogènes) et ceux dont les propriétés toxicocinétiques sont saturées peuvent être considérés comme des exceptions aux critères de détermination des doses et sont évalués au cas par cas.

27.

Pour permettre d’obtenir des informations sur la relation dose-réponse, une étude complète doit comporter un groupe témoin négatif et au moins trois niveaux de doses, espacés en général d’un facteur de 2, mais pas de plus de 4. Si le produit chimique d’essai ne provoque aucune toxicité dans le cadre d’une étude de détermination des doses, ou d’après les données disponibles, la dose la plus élevée pour une administration unique doit être de 2 000 mg/kg de poids corporel. Néanmoins, si le produit chimique d’essai provoque une toxicité, la dose administrée la plus élevée devra correspondre à la DMT et les niveaux de dose employés devront de préférence s’étendre de la dose maximale à une dose induisant peu ou pas de toxicité. Pour les produits chimiques toxiques, la dose limite pour une période d’administration de 14 jours ou plus est de 1 000 mg/kg de poids corporel, et pour des périodes d’administration de moins de 14 jours, la dose limite est de 2 000 mg/kg de poids corporel/jour.

Administration des doses

28.

Lors de la conception d’un essai, il convient de tenir compte de la voie d’exposition humaine anticipée. Par conséquent, les voies d’administration telles que l’alimentation, l’eau de boisson, l’inhalation, ainsi que les voies topique, sous-cutanée, intraveineuse, orale (par gavage) ou l’implantation sont autant de choix qui peuvent être considérés comme justifiés. Dans tous les cas, la voie retenue doit permettre une exposition adéquate du/des tissu(s) cible(s). L’injection intrapéritonéale n’est en général pas recommandée, car elle ne constitue pas une voie d’exposition humaine envisagée, et ne sera utilisée qu’en cas de justification scientifique spécifique. Si le produit chimique d’essai est mélangé à l’alimentation ou à l’eau de boisson, surtout dans le cas d’un dosage unique, il convient de s’assurer que le délai entre l’absorption de nourriture et d’eau et l’accouplement est suffisant pour permettre une détection des effets (paragraphe 31). Le volume maximal de liquide administrable en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l’animal. Ce volume ne doit normalement pas excéder 1 ml/100 g de poids corporel, sauf pour les solutions aqueuses, où un maximum de 2 ml/100 g est acceptable. L’utilisation de volumes plus importants (si la législation relative au bien-être animal le permet) doit être justifiée. Il convient de minimiser la variabilité du volume testé en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant par rapport au poids corporel à tous les niveaux de doses.

Observations

29.

Les animaux d’essai font l’objet d’un examen clinique général. Les signes cliniques doivent être consignés au moins une fois par jour, de préférence aux mêmes heures, en prenant en considération la période où les effets anticipés devraient être les plus marqués après l’administration. Au moins deux fois par jour pendant la durée du traitement, l’ensemble des animaux fait l’objet d’un constat de morbidité et de mortalité. Chaque animal doit être pesé au début de l’étude et au moins une fois par semaine pendant les études à doses répétées, ainsi qu’au moment de l’euthanasie. La consommation alimentaire est mesurée au moins une fois par semaine. Si le produit chimique d’essai est administré dans l’eau de boisson, la consommation d’eau est mesurée à chaque changement d’eau et au moins une fois par semaine. Les animaux montrant des signes non létaux de toxicité excessive sont euthanasiés avant la fin de l’essai (27).

Collecte et traitement des tissus

30.

Les femelles sont euthanasiées au cours de la seconde moitié de la gestation, au 13e jour de gestation pour les souris et au 14-15e jour de gestation pour les rats. Le contenu de l’utérus est examiné afin de déterminer les effets létaux dominants et de recenser le nombre d’embryons implantés, le nombre d’embryons vivants et morts ainsi que le nombre de corps jaunes.

31.

Les cornes utérines et les ovaires sont exposés pour permettre de compter le nombre de corps jaunes, et les fœtus sont ôtés, comptés et pesés. Il convient d’examiner soigneusement l’utérus en vue de déceler et de comptabiliser toutes les résorptions, y compris celles dissimulées par les fœtus vivants. La mortalité fœtale est consignée. Le nombre de femelles fécondées ainsi que le nombre total d’embryons implantés, de pertes avant implantation et de mortalité après implantation (y compris les résorptions précoces et tardives) sont également consignés. De plus, les fœtus visibles peuvent être conservés dans une solution de Bouin pendant au moins 2 semaines, pour un examen ultérieur des principales malformations externes (28) permettant de fournir des informations supplémentaires sur les effets du produit testé sur la reproduction et le développement.

RÉSULTATS ET RAPPORT

Traitement des résultats

32.

Les résultats doivent être présentés sous forme d’un tableau qui indique le nombre de mâles accouplés, le nombre de femelles gravides et le nombre de femelles non gravides. Les résultats de chaque accouplement, comprenant l’identité de chaque mâle et de chaque femelle, doivent être mentionnés individuellement. Pour chaque femelle, il convient d’indiquer l’intervalle d’accouplement, le niveau de la dose reçue par les mâles traités et le nombre d’embryons implantés vivants et morts.

33.

La perte après implantation est calculée en déterminant le rapport du nombre d’embryons implantés morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe traité et en le comparant au rapport du nombre d’embryons implantés morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe témoin traité avec le véhicule/solvant.

34.

La perte avant implantation est calculée comme étant la différence entre le nombre de corps jaunes et le nombre d’embryons implantés ou la réduction du nombre moyen d’embryons implantés par femelle par comparaison avec les accouplements témoins. Quand la perte avant implantation a été évaluée, elle doit être mentionnée.

35.

Le facteur létal dominant est estimé comme suit: (embryons morts avant implantation/total des embryons implantés par femelle) × 100.

36.

Les données de toxicité et les signes cliniques tels que décrits dans le paragraphe 29 sont consignés dans le rapport.

Critères d’acceptabilité

37.

Les critères suivants déterminent l’acceptabilité de l’essai:

le témoin négatif utilisé simultanément est cohérent avec les normes publiées pour les données relatives aux témoins négatifs historiques ainsi qu’avec les données des témoins historiques du laboratoire, le cas échéant (paragraphes 10 et 18);

les témoins positifs utilisés simultanément induisent des réponses cohérentes avec les normes publiées pour les données relatives aux témoins positifs historiques ou avec la base de données des témoins positifs historiques du laboratoire, le cas échéant, et produisent une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant (voir paragraphes 17 et 18);

le nombre idoine d’embryons implantés et de doses est analysé (paragraphe 20);

les critères de sélection de la dose maximale sont cohérents avec ceux décrits aux paragraphes 24 et 27.

Évaluation et interprétation des résultats

38.

Au moins trois groupes de traitement sont analysés pour obtenir des données suffisantes pour l’analyse de la relation dose-réponse.

39.

À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement positif si:

au moins une des doses d’essai présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;

un test approprié montre que l’augmentation est liée à la dose dans au moins une condition expérimentale (par exemple un intervalle d’accouplement d’une semaine); et

des résultats se situent à l’extérieur de la plage acceptable relative aux témoins négatifs, ou des données relatives aux témoins négatifs historiques du laboratoire (par exemple, limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson), le cas échéant.

Lorsque tous ces critères sont remplis, le produit chimique d’essai est considéré comme capable d’induire des mutations létales dominantes dans les cellules germinales des animaux testés. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées figurent au paragraphe 44; d’autres approches statistiques recommandées sont également disponibles dans la littérature (20) (21) (24) (29). Les méthodes statistiques employées considèrent l’animal comme unité expérimentale.

40.

À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement négatif si:

aucune dose d’essai ne présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;

aucune condition expérimentale n’a révélé une augmentation liée à la dose; et

l’intégralité des résultats se situe à l’intérieur de la plage acceptable des données relatives aux témoins négatifs, ou des données relatives aux témoins négatifs historiques du laboratoire (par exemple, limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson), le cas échéant.

Le produit chimique d’essai est alors considéré comme capable d’induire des mutations létales dominantes dans les cellules germinales des animaux testés.

41.

Il n’est pas nécessaire de vérifier une réponse clairement positive ou clairement négative.

42.

Si la réponse n’est ni clairement négative ni clairement positive, et afin d’établir la signification biologique d’un résultat (par exemple, une augmentation faible ou marginale), les données doivent être soumises à un jugement d’experts et/ou faire l’objet de recherches supplémentaires à l’aide des données expérimentales existantes, notamment les éléments indiquant si le résultat positif se trouve à l’extérieur de la plage acceptable concernant les témoins négatifs1, ou de la distribution des données du laboratoire concernant les témoins négatifs historiques (30).

43.

Dans de rares cas, même après de nouvelles investigations, l’ensemble de données ne permettra pas de conclure que les résultats sont positifs ou négatifs; les résultats seront alors déclarés équivoques.

44.

Les méthodes statistiques employées considèrent l’animal mâle comme unité expérimentale. S’il est possible que le décompte (par exemple le nombre d’embryons implantés par femelle) suive la loi de Poisson et/ou que certaines proportions (par exemple une proportion d’embryons implantés morts) présentent une distribution binomiale, on observe souvent une surdispersion de ces données (31). Par conséquent, les analyses statistiques doivent d’abord recourir à un test de surdispersion ou de sousdispersion basé sur des tests de la variance tels que le test de variance binomiale de Cochran (32) ou le test de la C (α) de Tarone pour la surdispersion binomiale (31) (33). Si aucun écart par rapport à la dispersion binomiale n’est observé, un test de tendance de Cochran-Armitage peut être effectué pour les tendances de proportions dans les différents niveaux de doses (34) et des comparaisons par paires avec le groupe témoin peuvent être faites à l’aide d’un test exact de Fisher (35). De même, si aucun écart par rapport à la dispersion de Poisson n’est détecté, les tendances des décomptes peuvent être testées à l’aide de la régression de Poisson (36) et des comparaisons par paires avec le groupe témoin peuvent être réalisées dans le contexte du modèle de Poisson, à l’aide de contrastes par paires (36). Si une surdispersion ou une sousdispersion significative est détectée, il est recommandé de recourir à des méthodes non paramétriques (23, 31), notamment les tests par les rangs tels que le test de tendance de Jonckheere-Terpstra (37) et les tests de Mann-Whitney (38) pour les comparaisons par paires avec le groupe témoin traité avec le véhicule/solvant, mais aussi les tests de permutation, de rééchantillonnage ou de bootstrap pour les comparaisons de tendances et les comparaisons par paires avec le groupe témoin (31) (39).

45.

Un essai positif de mutation létale dominante met en lumière la génotoxicité du produit chimique d’essai sur les cellules germinales du mâle traité de l’espèce testée.

46.

Le fait d’examiner si les valeurs observées se situent à l’intérieur de la plage des témoins historiques peut fournir des indications au moment de l’évaluation de la signification biologique de la réponse (40).

Rapport d’essai

47.

Le rapport d’essai contient les informations suivantes:

Résumé.

 

Produit chimique d’essai:

source, numéro de lot, date limite d’utilisation si disponibles;

stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue;

solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues;

mesure du pH, de l’osmolalité et de la précipitation dans le milieu de culture auquel le produit chimique d’essai a été ajouté, le cas échéant.

 

Substance mono-constituant:

apparence physique, hydrosolubilité, autres propriétés physico-chimiques importantes pour la conduite de l’étude;

identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés, s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.

 

Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:

caractérisés autant que possible par l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence, la quantité et les propriétés physico-chimiques des constituants.

 

Préparation du produit chimique d’essai:

justification du choix du véhicule;

solubilité et stabilité du produit chimique dans le solvant/véhicule, si elles sont connues;

préparation des formulations à administrer dans l’alimentation, l’eau de boisson ou par inhalation;

déterminations analytiques sur les formulations (stabilité, homogénéité, concentrations nominales, par exemple), lorsqu’elles ont été réalisées.

 

Animaux d’essai:

espèces/souches utilisées et justification du choix;

nombre, âge et sexe des animaux;

source, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.;

méthode d’identification individuelle des animaux;

pour les études de courte durée: poids corporel de chaque mâle au début et à la fin de l’essai; pour les études d’une durée supérieure à une semaine: poids individuel des animaux et consommation de nourriture. La plage des poids corporels, ainsi que la moyenne et l’écart type pour chaque groupe doivent également être mentionnés.

 

Conditions de l’essai:

données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhicule);

données de l’étude préliminaire de détermination des concentrations;

justification du choix des doses;

détails sur la préparation du produit chimique d’essai;

détails sur l’administration du produit chimique d’essai;

justification du choix de la voie d’administration;

méthodes de mesure de la toxicité animale, y compris, si elles existent, analyses histopathologiques ou hématologiques et fréquence des observations animales et des mesures du poids corporel;

méthodes permettant de vérifier que le produit chimique d’essai a atteint le tissu cible ou la circulation sanguine en cas de résultats négatifs;

dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour) calculée en fonction de la concentration (ppm) du produit chimique d’essai dans la nourriture ou l’eau de boisson, et de la consommation, s’il y a lieu;

détails sur la qualité de la nourriture et de l’eau;

détails de l’enrichissement environnemental des cages;

description détaillée des programmes de traitement et d’échantillonnage, et justification des choix;

méthode d’analgésie;

méthode d’euthanasie;

procédures d’isolement et de conservation des tissus;

source et numéros de lot de l’ensemble du matériel et de tous les réactifs (s’il y a lieu);

méthodes d’énumération des mutations létales dominantes;

programme d’accouplement;

méthodes utilisées pour déterminer si l’accouplement a eu lieu;

moment de l’euthanasie;

critères permettant d’examiner les effets létaux dominants, y compris les corps jaunes, les embryons implantés, les résorptions et les pertes avant implantation, les embryons implantés vivants, les embryons implantés morts.

 

Résultats:

état de santé des animaux avant et pendant la période d’essai, y compris signes de toxicité;

poids corporel des mâles pendant le traitement et les périodes d’accouplement;

nombre de femelles accouplées;

relation dose-réponse, si possible;

données relatives aux animaux témoins négatifs concomitants et données des témoins négatifs historiques avec plages, moyennes et écarts-types;

données des témoins positifs concomitants;

tableau de données pour chaque femelle gravide comprenant: le nombre de corps jaunes; le nombre d’embryons implantés; le nombre de résorptions et de pertes avant implantation; le nombre d’embryons implantés vivants; le nombre d’embryons implantés morts; le poids des fœtus;

résumé des données ci-dessus pour chaque période d’accouplement et pour chaque dose, avec la fréquence des effets létaux dominants;

analyses et méthodes statistiques employées.

 

Discussion des résultats.

 

Conclusion.

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Appendice 1

DÉFINITIONS

Produit chimique: une substance ou un mélange

Corps jaune: formation à l’intérieur de l’ovaire qui résulte de la transformation d’un follicule ayant expulsé l’ovocyte et qui a un rôle hormonal. Le nombre de corps jaunes dans les ovaires correspond au nombre d’ovocytes produits.

Mutation létale dominante: mutation qui se produit dans une cellule germinale ou qui se fixe après la fécondation, et qui est mortelle pour l’embryon ou le fœtus.

Taux de fertilité: nombre de femelles gravides divisé par le nombre total de femelles accouplées.

Intervalle d’accouplement: laps de temps entre la fin de l’exposition et l’accouplement des mâles traités. Le contrôle de cet intervalle permet d’évaluer les effets des produits chimiques sur différents types de cellules germinales. L’accouplement des souris au cours des semaines 1, 2, 3, 4, 5, 6, et 7 qui suivent la fin de l’exposition mesure les effets sur le sperme testiculaire, les spermatides condensées, les spermatides rondes, les spermatocytes au stade pachytène, les spermatocytes précoces, les spermatogonies différenciées, les spermatogonies en cours de différenciation et les spermatogonies des cellules souches.

Pertes avant implantation: différence entre le nombre d’embryons implantés et le nombre de corps jaunes. Elles peuvent aussi être estimées en comparant le nombre total d’embryons implantés par femelle dans les groupes traités et dans les groupes témoins.

Pertes après implantation: rapport du nombre d’embryons morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe traité comparé au rapport du nombre d’embryons morts au nombre total d’embryons implantés dans le groupe témoin.

Produit chimique d'essai: toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d'essai.

UVCB: substances chimiques de composition inconnue ou variable, produits de réaction complexes et matières biologiques

Appendice 2

CYCLE DE LA SPERMATOGENÈSE CHEZ LES MAMMIFÈRES

Image 1

Fig.1: Comparaison de la durée (en jours) du développement des cellules germinales mâles chez la souris, le rat et l’homme. La réparation de l’ADN ne se produit pas pendant les périodes indiquées en grisé.

Cycle de la spermatogenèse chez la souris, le rat et l’homme (Adler, 1996). Les spermatogonies indifférenciées incluent les spermatogonies A-single, A-paired, et A-aligned (Hess et de Franca, 2008). Les A-single sont considérées comme les véritables cellules souches. C’est pourquoi, pour évaluer les effets sur les cellules souches, au moins 49 jours (chez la souris) doivent s’écouler entre la dernière injection du produit chimique d'essai et l’accouplement.

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»

(4)

Dans la partie B, le chapitre B.23 est remplacé par le texte suivant:

«B.23   ESSAI D’ABERRATION CHROMOSOMIQUE SUR SPERMATOGONIES DE MAMMIFÈRES

INTRODUCTION

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 483 (2016) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. Les méthodes d’essai sont régulièrement mises à jour à la lumière des progrès scientifiques, de l’évolution des exigences réglementaires et de considérations relatives au bien-être des animaux. La présente version modifiée de la méthode d’essai reflète les connaissances scientifiques acquises après de nombreuses années d’expérience de cet essai et tient compte des possibilités de l’intégrer ou de le combiner à d’autres études de toxicité ou de génotoxicité. Combiner différentes études de toxicité permet potentiellement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans le cadre de ces essais. La présente méthode d’essai s’inscrit dans une série de lignes directrices sur la toxicologie génétique. L’OCDE a élaboré un document qui fournit des éléments d’information concis sur les essais de toxicologie génétique et donne un aperçu des récents changements qui ont été apportés aux lignes directrices de toxicologie génétique de l’OCDE (1).

2.

L’essai d’aberration chromosomique pratiqué in vivo sur des spermatogonies de mammifères est destiné à détecter les produits chimiques qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules de spermatogonies de mammifère (2) (3) (4). Par ailleurs, cet essai se prête bien à l’évaluation de la génotoxicité, car, malgré des variations entre les espèces, les facteurs du métabolisme in vivo, la pharmacocinétique et les processus de réparation de l’ADN sont actifs et contribuent aux réponses. Cette méthode d’essai n’est pas conçue pour mesurer les aberrations numériques, et n’est pas utilisée de façon régulière dans ce but.

3.

Cet essai mesure les aberrations chromosomiques structurales (de type chromosomique et chromatidique) qui surviennent dans les spermatogonies et devrait par conséquent permettre de prévoir l’induction de mutations héritées dans les cellules germinales.

4.

Les définitions des termes clés figurent dans l’appendice.

REMARQUES PRÉLIMINAIRES

5.

Les rongeurs sont couramment utilisés dans cet essai, mais dans certains cas, d’autres espèces peuvent convenir si cela est justifié sur le plan scientifique. Les préparations cytogénétiques standard des essais réalisés sur rongeurs permettent l’obtention de métaphases mitotiques (spermatogonies) et méiotiques (spermatocytes). Ces métaphases sont identifiées en fonction de la morphologie des chromosomes (4). Cet essai cytogénétique in vivo détecte les aberrations chromosomiques structurales dans les mitoses des spermatogonies. Les autres cellules cibles ne sont pas concernées par la présente méthode d’essai.

6.

Afin de détecter les aberrations chromatidiques dans les cellules de spermatogonies, il faut examiner la première division cellulaire mitotique après le traitement, avant que ces aberrations n’évoluent en aberrations chromosomiques dans les divisions cellulaires ultérieures. Des informations complémentaires peuvent être obtenues après traitement des spermatocytes, à partir de l’analyse des chromosomes méiotiques mettant en évidence les aberrations chromosomiques structurales aux stades de la diacinèse et des métaphases I et II.

7.

Les testicules contiennent plusieurs générations de spermatogonies (5). Ces différentes cellules germinales peuvent présenter des sensibilités diverses au traitement chimique. De ce fait, les aberrations détectées sont une réponse globale des populations de cellules de spermatogonies traitées. La majorité des cellules mitotiques présentes dans les préparations de testicules sont des spermatogonies de type B, dont le cycle cellulaire dure environ 26 heures (3).

8.

Cet essai n’est pas pertinent s’il est prouvé que le produit chimique d’essai, ou son (ses) métabolite(s), n’atteindront pas le testicule.

PRINCIPE DE LA MÉTHODE D’ESSAI

9.

En règle générale, les animaux sont exposés au produit chimique d’essai par une voie d’exposition idoine et sont euthanasiés à des délais appropriés après le traitement. Avant l’euthanasie, les animaux sont traités avec un inhibiteur du fuseau (par exemple la colchicine ou le Colcemid®). Ensuite, les préparations chromosomiques effectuées à partir des cellules germinales sont colorées et les cellules en métaphase sont analysées pour mettre en évidence les aberrations chromosomiques.

VÉRIFICATION DES COMPÉTENCES DU LABORATOIRE

10.

La compétence à mener cet essai est établie sur la base d’informations démontrant l’aptitude à reproduire les résultats escomptés concernant la fréquence des aberrations chromosomiques structurales dans les spermatogonies avec des substances chimiques utilisées comme témoins positifs (réponses faibles comprises) telles que celles énumérées dans le tableau 1 et à obtenir une fréquence avec témoins négatifs qui soit cohérente avec la plage acceptable des données publiées dans la littérature [par exemple (2)(3)(6)(7)(8)(9)(10)] ou avec la distribution des données des témoins historiques du laboratoire, le cas échéant.

DESCRIPTION DE LA MÉTHODE

Préparations

Choix des espèces animales

11.

Il convient d’employer de jeunes animaux adultes sains issus de souches courantes de laboratoire. On utilise communément des souris mâles, mais des mâles d’autres espèces de mammifères appropriées peuvent cependant être employés si cela est justifié sur le plan scientifique, et si cela permet de combiner cette étude à une méthode d’essai. L’utilisation d’une espèce autre que les rongeurs doit être scientifiquement justifiée dans le rapport.

Conditions d’encagement et d’alimentation des animaux

12.

Pour les rongeurs, la température de l’animalerie doit être maintenue à 22 °C (±3 °C). L’humidité relative, qui est idéalement de 50 à 60 %, doit atteindre au moins 40 % et de préférence ne pas dépasser 70 %, sauf durant le nettoyage du local. L’éclairage est artificiel, la séquence d’éclairage étant de 12 heures de clarté et 12 heures d’obscurité. Le régime alimentaire des animaux est le régime classique de laboratoire avec eau potable à volonté. Le choix des aliments peut être influencé par la nécessité d’assurer une bonne incorporation du produit chimique dans la nourriture si l’administration se fait par cette voie. Les rongeurs sont mis en cage par petits groupes d’individus (cinq au maximum par cage), si aucun comportement agressif n’est à craindre, de préférence dans des cages à fond plein dotées d’un enrichissement environnemental approprié. Les animaux peuvent être encagés individuellement si cela est justifié sur le plan scientifique.

Préparation des animaux

13.

De jeunes adultes mâles en bonne santé (âgés de 8-12 semaines au début du traitement) sont normalement utilisés et sont répartis au hasard dans les groupes témoins et les groupes de traitement. Chaque animal est identifié individuellement selon une méthode sans cruauté, la moins invasive possible (par exemple, baguage, étiquetage, pose d’une puce électronique ou identification biométrique, en évitant l’entaillage des oreilles ou la phalangectomie) et gardés dans leurs cages pendant au moins cinq jours afin qu’ils s’acclimatent aux conditions du laboratoire. Les cages doivent être placées de manière à réduire au minimum l’influence éventuelle de leur disposition sur les résultats. Il convient d’éviter toute contamination croisée entre le témoin positif et le produit chimique d’essai. Au début de l’étude, la variation pondérale entre chaque animal doit être minimale et ne pas dépasser ±20 %.

Préparation des doses

14.

Les produits chimiques solides sont dissouts, mis en suspension dans des solvants ou véhicules appropriés ou incorporés dans les aliments ou dans l’eau de boisson avant d’être administrés aux animaux. Les produits chimiques liquides peuvent être administrés directement ou dilués avant d’être administrés. En cas d’exposition par inhalation, les produits chimiques d’essai peuvent être administrés sous forme de gaz, de vapeur ou d’aérosol solide ou liquide, en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. On utilisera des préparations fraîches, sauf si l’on dispose de données qui démontrent la stabilité des préparations dans les conditions du stockage et définissent les conditions de stockage appropriées.

Conditions expérimentales - Solvant/véhicule

15.

Le solvant/véhicule ne doit pas produire d’effets toxiques aux doses utilisées, ni pouvoir réagir avec les produits chimiques d’essai. Le recours à des solvants/véhicules inhabituels doit être justifié par des données de référence faisant état de leur compatibilité. Il est recommandé d’envisager en premier lieu l’utilisation d’un solvant/véhicule aqueux chaque fois que c’est possible. Parmi les exemples de solvants/véhicules compatibles couramment utilisés figurent notamment l’eau, le sérum physiologique, les solutions de méthylcellulose, les solutions de carboxyméthylcellulose sodique, l’huile d’olive et l’huile de maïs. En l’absence de données observées ou publiées montrant que le véhicule/solvant inhabituel sélectionné n’induit aucune aberration chromosomique structurale ou effet délétère, une étude initiale devra être réalisée afin d’établir l’acceptabilité du témoin de solvant/véhicule.

Témoins positifs

16.

Des animaux témoins positifs sont toujours inclus simultanément dans l’essai, à moins que le laboratoire n’ait déjà démontré ses compétences dans la conduite de l’essai et n’ait mené le test en routine récemment (par exemple dans les cinq dernières années). Quand un témoin positif n’est pas testé en parallèle, des témoins d’analyse (lames fixées non colorées) doivent être compris dans chaque expérience. Ceux-ci peuvent être obtenus en incluant dans chaque étude des échantillons de référence en provenance de témoins positifs d’autres études conduites de façon périodique (par exemple tous les 6-18 mois) dans le laboratoire où le test est effectué, par exemple lors d’épreuves de compétence, et de façon plus régulière par la suitery.

17.

Les substances utilisées comme témoins positifs doivent produire, de façon fiable, un accroissement détectable de la fréquence des cellules présentant des aberrations chromosomiques par rapport au niveau spontané. Les doses des témoins positifs doivent être choisies de telle sorte que les effets soient nets mais que l’identité des lames codées ne soit pas évidente pour l’examinateur. Des exemples de substances chimiques utilisées comme témoins positifs figurent au tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1

Exemples de substances chimiques utilisées comme témoins positifs

Substances chimiques et no CAS (no de référence)

Cyclophosphamide [no CAS 50-18-0] cyclophosphamide monohydratée [no CAS 6055-19-2] (9)

Cyclohexylamine [no CAS 108-91-8] (7)

Mitomycine C [no CAS 50-07-7] (6)

Acrylamide monomère [no CAS 79-06-1] (10)

Triéthylènemélamine [no CAS 51-18-3] (8)

Témoins négatifs

18.

Les animaux servant de témoins négatifs, traités seulement avec le solvant ou avec le véhicule, et traités par ailleurs de manière identique aux groupes de traitement, sont inclus à chaque moment de prélèvement. En l’absence de données observées ou publiées montrant que le solvant/véhicule choisi n’induit pas d’aberrations chromosomiques ou d’autres effets délétères, des animaux témoins non traités sont également inclus à chaque moment de prélèvement afin d’établir l’acceptabilité du témoin contenant le véhicule.

PROCÉDURE

Nombre d’animaux

19.

La taille des groupes au début de l’étude doit permettre de disposer d’au moins cinq animaux mâles dans chaque groupe. Ce nombre d’animaux par groupe est considéré comme suffisant pour fournir une efficacité statistique idoine (c’est-à-dire généralement capable de détecter au moins un doublement de la fréquence des aberrations chromosomiques lorsque le niveau du témoin négatif est de 1,0 % ou plus assorti d’une probabilité de 80 % à un niveau de signification de 0,05) (3) (11). À titre d’information, concernant les exigences relatives au nombre maximum d’animaux généralement utilisés, une étude comptant deux moments de prélèvement et impliquant trois groupes de traitement, un groupe de témoins négatifs concomitants et un groupe de témoins positifs (chaque groupe étant composé de cinq animaux) nécessitera 45 animaux.

Déroulement du traitement

20.

Les produits chimiques d’essai sont habituellement administrés une seule fois (c’est-à-dire en un seul traitement). D’autres régimes de dosage sont acceptables pour autant qu’ils soient scientifiquement justifiés.

21.

Dans le groupe qui reçoit la dose la plus forte, les prélèvements sont effectués à deux intervalles après le traitement. Étant donné que le temps requis par l’absorption et la métabolisation du ou des produits chimiques d’essai, ainsi que leur effet sur la cinétique du cycle cellulaire peuvent influer sur le moment optimal pour la détection des aberrations chromosomiques, deux prélèvements sont donc effectués, le premier, précoce aux environs de 24 heures et le deuxième, tardif, autour de 48 heures après le traitement. S’agissant des niveaux de dose inférieurs à la dose la plus élevée, il convient de choisir un intervalle de prélèvement précoce de 24 heures (soit une durée inférieure ou égale à la durée du cycle cellulaire d’une spermatogonie B, ce qui optimise ainsi la probabilité de pouvoir analyser les premières métaphases post-traitement), à moins que l’on sache qu’il existe un autre délai de prélèvement justifié et plus propice à la détection des effets.

22.

D’autres moments de prélèvement peuvent être retenus. Par exemple, dans le cas des produits chimiques susceptibles de provoquer des effets indépendants de la phase S, il peut être judicieux d’effectuer des prélèvements plus précoces (soit à un intervalle de moins de 24 heures).

23.

Un régime de traitement à doses répétées peut être employé notamment dans les cas où cet essai est associé à un test sur un autre effet mesuré dont la période d’administration est de 28 jours (par exemple, la méthode d’essai B.58). Le cas échéant, cependant, des groupes d’animaux supplémentaires seront requis afin de tenir compte des différents délais de prélèvement. Par conséquent, le caractère approprié d’un tel programme doit être justifié sur le plan scientifique au cas par cas.

24.

Avant l’euthanasie, les animaux reçoivent une dose appropriée d’un inhibiteur du fuseau (par exemple le Colcemid® ou la colchicine) par injection intrapéritonéale. Les échantillons sont prélevés après des délais appropriés. Pour les souris et les rats, ce délai est compris approximativement entre 3 et 5 heures.

Niveaux de dose

25.

Si l’on procède à une étude préliminaire de détermination des doses à administrer parce qu’on ne dispose pas de données fiables pour orienter le choix des doses, cette étude préliminaire doit être effectuée dans le même laboratoire, en utilisant une espèce, une souche, un sexe et un régime de traitement identiques à ceux de l’étude principale, conformément aux recommandations relatives aux études de détermination des doses (12). L’étude devra avoir pour objectif de déterminer la dose maximale tolérée (DMT), définie comme la dose entraînant de légers effets toxiques dans le cadre de la durée de l’étude (par exemple, en induisant un comportement ou des réactions anormales, une baisse mineure du poids corporel ou une cytotoxicité du système hématopoïétique) mais ne provoquant pas la mort ou des signes de douleur, de souffrance ou de détresse imposant une euthanasie de l’animal (13).

26.

La dose la plus élevée peut aussi être définie comme étant celle qui produit certains indices de toxicité dans les cellules de spermatogonies (par exemple une diminution du rapport entre le nombre de mitoses des spermatogonies et le nombre des métaphases I et II de la méiose. Cette diminution ne doit cependant pas dépasser 50 %.

27.

Les produits chimiques d’essai ayant une activité biologique spécifique à des niveaux de doses faibles et non toxiques (telles que les hormones et les mitogènes) et les produits chimiques qui présentent une saturation des propriétés toxicocinétiques peuvent être considérés comme des exceptions aux critères de détermination des doses et sont évalués au cas par cas.

28.

Pour permettre d’obtenir des informations sur la relation dose-réponse, une étude complète doit comporter un groupe témoin négatif (paragraphe 18) et au moins trois niveaux de doses, espacés en général d’un facteur de 2, mais pas de plus de 4. Si le produit chimique d’essai ne provoque aucune toxicité dans le cadre d’une étude de détermination des doses, ou d’après les données disponibles, la dose la plus élevée pour une administration unique doit être de 2 000 mg/kg de poids corporel. Néanmoins, si le produit chimique d’essai provoque une toxicité, la dose administrée la plus élevée devra correspondre à la DMT et les niveaux de dose employés devront de préférence s’étendre de la dose maximale à une dose induisant peu ou pas de toxicité. Lorsqu’une toxicité sur le tissu cible (testicule) est observée à tous les niveaux de doses administrés, il est conseillé de procéder à des études complémentaires à des doses non toxiques. Les études visant à caractériser davantage les informations sur la relation quantitative dose-réponse peuvent nécessiter un ou plusieurs groupes de traitement supplémentaires. Enfin, ces limites peuvent varier pour certains types de produits chimiques d’essai (par exemple les produits pharmaceutiques à usage humain) faisant l’objet d’exigences spécifiques. Si le produit chimique d’essai provoque une toxicité, il conviendra de choisir la dose limite ainsi que deux niveaux de doses inférieurs à cette dernière (tel que décrit ci-dessus). Pour une période d’administration égale ou supérieure à 14 jours, la dose limite est de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, et pour des périodes d’administration de moins de 14 jours, la dose limite est de 2 000 mg/kg de poids corporel/jour.

Administration des doses

29.

Lors de la conception d’un essai, il convient de tenir compte de la voie d’exposition humaine anticipée. Par conséquent, les voies d’administration telles que l’alimentation, l’eau de boisson, l’inhalation, l’implantation ainsi que les voies topique, sous-cutanée, intraveineuse et orale (par gavage) sont autant de choix qui peuvent être considérés comme justifiés. Dans tous les cas, la voie retenue doit permettre une exposition adéquate du tissu cible. L’injection intrapéritonéale n’est normalement pas recommandée sauf si elle est scientifiquement justifiée car la cavité péritonéale n’est généralement pas une voie d’exposition humaine physiologiquement pertinente. Si le produit chimique d’essai est mélangé à l’alimentation ou à l’eau de boisson, surtout dans le cas d’un dosage unique, il convient de s’assurer que le délai entre l’absorption de nourriture et d’eau et le prélèvement est suffisant pour permettre une détection des effets (voir paragraphe 33). Le volume maximal de liquide administrable en une fois par gavage ou par injection dépend de la taille de l’animal. Le volume ne doit normalement pas dépasser 1 ml/100 g de poids corporel, sauf dans le cas des solutions aqueuses où un maximum de 2 ml/100 g est acceptable. L’administration de volumes plus importants (si la législation relative au bien-être animal le permet) doit être justifiée. Il convient de minimiser la variabilité du volume testé en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant par rapport au poids corporel à tous les niveaux de doses.

Observations

30.

Les animaux d’essai font l’objet d’un examen clinique général. Les signes cliniques doivent être consignés au moins une fois par jour, de préférence aux mêmes heures, en prenant en considération la période où les effets anticipés devraient être les plus marqués après l’administration. Au moins deux fois par jour, l’ensemble des animaux fait l’objet d’un constat de morbidité et de mortalité. Tous les animaux doivent être pesés au début de l’étude, au moins une fois par semaine au cours des études à doses répétées, puis lors de l’euthanasie. Pour les études dont la durée est égale ou supérieure à une semaine, la consommation de nourriture doit également être mesurée au moins une fois par semaine. Si le produit chimique d’essai est administré dans l’eau de boisson, la consommation d’eau est mesurée à chaque changement d’eau et au moins une fois par semaine. Les animaux montrant des signes non létaux de toxicité excessive sont euthanasiés avant la fin de l’essai (13).

Préparation des chromosomes

31.

Des cellules germinales en suspension obtenues à partir de l’une ou des deux testicules immédiatement après l’euthanasie sont exposées à une solution hypotonique et fixées selon les protocoles établis (2) (14) (15) par exemple). Les cellules sont alors étalées sur des lames et colorées (16) (17). Toutes les lames doivent être codées afin que leur identité ne soit pas révélée à l’examinateur.

Analyse

32.

Il y a lieu d’examiner au moins 200 cellules en métaphase bien étalées pour chaque animal (3) (11). Si la fréquence des témoins négatifs historiques est < 1 %, il convient alors d’examiner plus de 200 cellules/animal afin d’augmenter l’efficacité statistique (3). Le recours à des méthodes de coloration permettant l’identification du centromère est conseillé.

33.

Il convient de consigner séparément les aberrations chromatidiques et chromosomiques et de les classer par sous-catégories (cassures, échanges). Les lacunes sont enregistrées mais non prises en compte pour déterminer si un produit chimique induit une hausse notable de l’incidence des cellules porteuses d’aberrations chromosomiques. Les procédures en cours dans le laboratoire doivent assurer que l’analyse des aberrations chromosomiques est réalisée par des examinateurs qualifiés. Étant donné que les procédures de préparation des lames provoquent souvent la rupture d’une certaine fraction des cellules en métaphase, entraînant une perte de chromosomes, toutes les cellules examinées doivent contenir un nombre de centromères égal ou supérieur à 2n±2, n étant le nombre haploïde de chromosomes pour cette espèce.

34.

Bien que l’essai soit destiné à détecter les aberrations chromosomiques structurales, il est important de rapporter la fréquence des cellules polyploïdes et de celles présentant des chromosomes endoredupliqués le cas échéant (voir paragraphe 44).

RÉSULTATS ET RAPPORT

Traitement des résultats

35.

Les résultats individuels pour chaque animal sont présentés sous forme de tableaux. Le nombre de cellules présentant une (des) aberration(s) chromosomique(s) structurale(s) et le nombre d’aberrations chromosomique(s) par cellule doivent être évalués pour chaque animal. Les aberrations chromatidiques et chromosomiques classées par sous-catégorie (cassure, échange) doivent être consignées séparément, avec leur nombre et leur fréquence pour les groupes traités et les groupes témoins. Les lacunes sont enregistrées séparément. La fréquence des lacunes est rapportée mais n’est généralement pas incluse dans l’analyse de la fréquence totale des aberrations chromosomiques structurales. Le pourcentage de cellules polyploïdes et de cellules présentant des chromosomes endoredupliqués est rapporté le cas échéant.

36.

Les données de toxicité et les signes cliniques tels que décrits dans le paragraphe 30 sont consignés dans le rapport.

Critères d’acceptabilité

37.

Les critères suivants déterminent l’acceptabilité de l’essai:

Les témoins négatifs utilisés simultanément induisent des réponses cohérentes avec les normes publiées pour les données relatives aux témoins négatifs historiques, qui se situent généralement entre > 0 % et ≤ 1,5 % cellules comportant des aberrations chromosomiques, ainsi qu’avec les données des témoins historiques du laboratoire, le cas échéant (voir paragraphes 10 et 18).

Les témoins positifs utilisés simultanément induisent des réponses cohérentes avec les normes publiées pour les données relatives aux témoins positifs historiques ou avec la base de données des témoins positifs historiques du laboratoire, le cas échéant et produisent une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant (voir paragraphes 17, 18).

Le nombre idoine de cellules et de doses est analysé (voir paragraphes 28 et 32).

Les critères de sélection de la dose maximale sont cohérents avec ceux décrits aux paragraphes 25 et 26.

38.

Lorsqu’on observe des mitoses ainsi que des méioses, il faut déterminer le rapport entre le nombre de mitoses des spermatogonies et le nombre de premières et secondes métaphases méiotiques pour tous les animaux traités et témoins négatifs, dans un échantillon total de 100 cellules en division par animal. Dans le cas où il s’agit uniquement de mitose, l’indice mitotique doit être déterminé dans au moins 1 000 cellules de chaque animal.

Évaluation et interprétation des résultats

39.

Au moins trois groupes de traitement sont analysés pour obtenir des données suffisantes pour l’analyse de la relation dose-réponse.

40.

À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement positif si:

au moins une des doses d’essai présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;

l’augmentation est liée à la dose pour au moins l’un des moments de prélèvement; et

des résultats se situent à l’extérieur de la plage acceptable de données relatives aux témoins négatifs, ou des données relatives aux témoins négatifs historiques du laboratoire le cas échéant (par exemple, limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson.

Lorsque tous ces critères sont remplis, le produit chimique d’essai est considéré comme capable d’induire des aberrations chromosomiques dans les cellules de spermatogonies des animaux testés. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées sont également disponibles dans la littérature (11) (18). Les méthodes statistiques employées considèrent l’animal comme unité expérimentale.

41.

À condition que tous les critères d’acceptabilité soient remplis, un produit chimique d’essai est considéré comme clairement négatif si:

aucune dose d’essai ne présente une augmentation statistiquement significative par rapport au témoin négatif concomitant;

aucune condition expérimentale n’a révélé une augmentation liée à la dose; et,

l’intégralité des résultats se situe à l’intérieur de la plage acceptable de données relatives aux témoins négatifs ou des données du laboratoire relatives aux témoins négatifs historiques, le cas échéant (par exemple, limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson.

Le produit chimique d’essai est alors considéré comme incapable d’induire des aberrations chromosomiques dans les cellules de spermatogonies de l’animal testé. Des recommandations concernant les méthodes statistiques les plus appropriées sont également disponibles dans la littérature (11) (18). Un résultat négatif n’exclut pas la possibilité que le produit chimique puisse induire des aberrations chromosomiques à des stades de développement ultérieurs non étudiés, ou des mutations génétiques.

42.

Il n’est pas nécessaire de vérifier une réponse clairement positive ou clairement négative.

43.

Si la réponse n’est ni clairement négative ni clairement positive, et afin d’établir la signification biologique d’un résultat (par exemple, une augmentation faible ou marginale), les données doivent être soumises à un jugement d’experts et/ou faire l’objet de recherches supplémentaires à l’aide des données expérimentales existantes, en vérifiant par exemple si le résultat positif se situe en dehors de la plage acceptable des données relatives aux témoins négatifs ou des données des témoins négatifs historiques du laboratoire (19).

44.

Dans de rares cas, même après de nouvelles investigations, l’ensemble de données ne permettra pas de conclure que les résultats sont positifs ou négatifs; les résultats seront alors déclarés équivoques.

45.

Une augmentation du nombre de cellules polyploïdes peut signifier que le produit chimique d’essai est capable d’inhiber les processus mitotiques et d’induire des aberrations chromosomiques numériques (20). Une augmentation du nombre de cellules présentant des chromosomes endoredupliqués peut indiquer que le produit chimique d’essai est capable d’inhiber la progression du cycle cellulaire (21) (22), un mécanisme qui, bien que différent de l’inhibition des processus mitotiques, induit lui aussi des modifications du nombre de chromosomes (voir paragraphe 2). La fréquence des cellules polyploïdes et des cellules présentant des chromosomes endoredupliqués doit donc être consignée séparément.

Rapport d’essai

46.

Le rapport d’essai contient les informations suivantes:

 

Résumé.

 

Produit chimique d’essai:

source, numéro de lot, date limite d’utilisation, si elle est disponible;

stabilité du produit chimique d’essai, si elle est connue;

solubilité et stabilité du produit chimique d’essai dans le solvant, si elles sont connues;

mesure du pH, de l’osmolalité et de la précipitation dans le milieu de culture auquel le produit chimique d’essai a été ajouté, le cas échéant.

 

Substance mono-constituant:

apparence physique, hydrosolubilité, autres propriétés physico-chimiques importantes pour la conduite de l’étude;

identification chimique: nom IUPAC ou CAS, numéro CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale, pureté, identité chimique des impuretés, s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent, etc.

 

Substance multi-constituants, UVCB et mélanges:

caractérisés autant que possible par l’identité chimique des constituants (voir ci-dessus), la présence, la quantité et les propriétés physico-chimiques des constituants.

 

Préparation du produit chimique d’essai:

justification du choix du véhicule;

solubilité et stabilité du produit chimique dans le solvant/véhicule.

préparation des formulations à administrer dans l’alimentation, l’eau de boisson ou par inhalation;

déterminations analytiques sur les formulations (stabilité, homogénéité, concentrations nominales, par exemple) le cas échéant;

 

Animaux d’essai:

espèces/souches utilisées et justification;

nombre et âge des animaux;

source, conditions d’encagement, régime alimentaire, etc.;

méthode d’identification individuelle des animaux;

pour les études de courte durée: poids individuel des animaux au début et à la fin de l’essai; pour les études d’une durée supérieure à une semaine: poids individuel des animaux et consommation de nourriture. La plage des poids corporels, ainsi que la moyenne et l’écart type pour chaque groupe doivent également être mentionnés.

 

Conditions de l’essai:

données relatives aux témoins positifs et négatifs (solvant/véhicule);

données issues de l’étude de détermination des doses, si elle a été réalisée;

justification du choix des doses;

justification du choix de la voie d’administration;

détails sur la préparation du produit chimique d’essai;

détails sur l’administration du produit chimique d’essai;

justification du choix des délais de sacrifices;

méthodes de mesure de la toxicité animale, y compris, si elles existent, analyses histopathologiques ou hématologiques et fréquence des observations animales et des mesures du poids corporel;

méthodes permettant de vérifier que le produit chimique d’essai a atteint le tissu cible ou la circulation sanguine en cas de résultats négatifs;

dose réelle (mg/kg de poids corporel/jour) calculée en fonction de la concentration (ppm) du produit chimique d’essai dans la nourriture ou l’eau de boisson, et de la consommation, s’il y a lieu;

détails sur la qualité de la nourriture et de l’eau;

description détaillée des programmes de traitement et de prélèvement et justification des choix;

méthode d’euthanasie;

méthode d’analgésie (le cas échéant);

procédures d’isolement des tissus;

nature et concentration de l’inhibiteur du fuseau, durée du traitement;

méthodes de préparation des lames;

critères d’analyse des aberrations;

nombre de cellules analysées par animal;

critères pour conclure que l’étude est positive, négative ou équivoque.

 

Résultats:

état de santé des animaux avant et pendant la période d’essai, y compris signes de toxicité;

poids corporels et poids des organes, après euthanasie (si plusieurs traitements sont utilisés, poids corporels pendant le régime de traitement);

signes de toxicité;

indice mitotique;

rapport des cellules de spermatogonies en mitose à celles se trouvant en premières et secondes métaphases méiotiques, ou autre preuve d’exposition du tissu cible;

type et nombre d’aberrations, donnés séparément pour chaque animal;

nombre total d’aberrations par groupe, moyenne et écart-type;

nombre de cellules présentant des aberrations par groupe, moyenne et écart-type;

relation dose-réponse, si possible;

analyses et méthodes statistiques employées;

données des témoins négatifs concomitants;

données des témoins négatifs historiques, y compris les plages, les moyennes, les écarts types, et limites de contrôle à 95 % d’une loi de Poisson (le cas échéant), ou données publiées relatives aux témoins historiques utilisées pour déterminer l’acceptabilité des résultats de l’essai;

données des témoins positifs concomitants;

modifications de la ploïdie, le cas échéant, y compris les fréquences de polyploïdie et/ou de cellules endoredupliquées.

 

Discussion des résultats

 

Conclusions

BIBLIOGRAPHIE

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(22)

Locke-Huhle, C. (1983). Endoreduplication in Chinese Hamster Cells during Alpha-Radiation Induced G2 Arrest. Mutation Res., 119, 403-413.

Appendice

DÉFINITIONS

Aneuploidy: any deviation from the normal diploid (or haploid) number of chromosomes by a single chromosome or more than one, but not by entire set(s) of chromosomes (polyploidy).

Centromere: Region(s) of a chromosome with which spindle fibers are associated during cell division, allowing orderly movement of daughter chromosomes to the poles of the daughter cells.

Produit chimique: une substance ou un mélange

Diversité chromosomique: diversité des formes de chromosomes (par exemple, métacentriques, acrocentriques, etc.) et de leur taille.

Aberration chromatidique: lésion chromosomique structurale se traduisant par une cassure d’une seule chromatide ou par une cassure et une réunion entre chromatides.

Aberration chromosomique: lésion chromosomique structurale se traduisant par une cassure, ou par une cassure et une réunion, des deux chromatides sur le même site.

Clastogène: produit chimique induisant des aberrations chromosomiques structurales dans des populations de cellules ou d’organismes.

Lacune: lésion achromatique inférieure à la largeur d’une chromatide, avec un défaut d’alignement minimal des chromatides.

Génotoxique: terme générique qualifiant tous les types de lésions de l’ADN ou des chromosomes, tels que les cassures, délétions, adduits, liaisons et modifications de nucléotides, réarrangements, mutations, aberrations chromosomiques et aneuploïdies. Tous les types d’effets génotoxiques n’entraînent pas nécessairement de mutations ou de lésions chromosomiques stables.

Indice mitotique (IM): nombre de cellules en métaphase divisé par le nombre total de cellules dans une population; une indication de la vitesse de prolifération cellulaire dans cette population.

Mitose: division du noyau cellulaire, généralement décomposée en prophase, prométaphase, métaphase, anaphase et télophase.

Mutagène: qui produit une modification héréditaire portant sur une ou plusieurs séquences de paires de bases d’ADN génique, ou sur la structure de chromosomes (aberrations chromosomiques).

Aberration numérique: modification du nombre de chromosomes par rapport au nombre normal caractéristique des animaux employés.

Polyploïdie: état multiple du nombre de chromosomes haploïde (n), autre que le nombre diploïde (c’est-à-dire 3n, 4n, etc.).

Aberration structurale: modification de la structure des chromosomes, détectable par un examen au microscope des cellules au stade de la métaphase et apparaissant sous la forme de délétions, cassures et échanges.

Produit chimique d'essai: toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode d'essai.

UVCB: substances chimiques de composition inconnue ou variables, produits de réaction complexes et matières biologiques.

»

(5)

Dans la partie B, le chapitre B.40 est remplacé par le texte suivant:

«B.40   CORROSION CUTANEE IN VITRO: ESSAI DE RESISTANCE ELECTRIQUE TRANSCUTANEE (RET)

INTRODUCTION

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 430 (2015) de l’OCDE pour les essais de produits chimiques. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de la peau, qui se manifestent par une nécrose visible, à travers l’épiderme et jusque dans le derme, suite à l’application d’un produit chimique d’essai [selon la définition du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies (ONU) (1) et du règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (ci-après le «règlement CLP» (1)]. La présente version mise à jour de la méthode d’essai B.40 propose une procédure in vitro permettant d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs selon la définition du SGH de l’ONU (1) et du règlement CLP.

2.

Traditionnellement, l’évaluation de la corrosivité cutanée a impliqué le recours à des animaux de laboratoire (méthode d’essai B.4, équivalente à la ligne directrice 404 de l’OCDE, initialement adoptée en 1981 et révisée en 1992, 2002 et 2015) (2). Outre la présente méthode d’essai B.40, d’autres méthodes d’essai in vitro pour tester le potentiel de corrosion de la peau des produits chimiques ont été validées et adoptées, à savoir la méthode d’essai B.40 bis, équivalente à la ligne directrice 431 de l’OCDE (3) et la méthode d’essai B.65 (équivalente à la ligne directrice 435 de l’OCDE) (4), et sont capables d’identifier les sous-catégories de produits chimiques corrosifs quand cela est requis. Plusieurs méthodes d’essai in vitro validées ont été adoptées, notamment la ligne directrice B.46 (équivalente à la ligne directrice 439 de l’OCDE) (5), aux fins de tester l’irritation de la peau. Un document guide de l’OCDE sur les approches intégrées en matière d’essai et d’évaluation IATA en anglais pour l’irritation et la corrosion de la peau propose une approche modulaire pour les tests d’irritation et de corrosion de la peau. L’approche intégrée décrit plusieurs modules qui regroupent les sources d’information et les outils d’analyse, et fournit des guides sur la façon i)d’intégrer et d’utiliser les informations existantes sur les données d’essai et autres données pour l’évaluation du potentiel irritant et corrosif pour la peau des produits chimiques d’essai, et ii) propose une approche dans les cas où des tests supplémentaires sont recommandés (6).

3.

La présente méthode d’essai porte sur le danger de corrosion cutanée pour la santé humaine. Elle s’appuie sur la méthode d’essai de résistance électrique transcutanée (RET) pratiquée sur un épiderme de rat, laquelle utilise des disques cutanés pour identifier les produits chimiques corrosifs sur la base de leur capacité à provoquer la perte de l’intégrité du stratum corneum normal et de la fonction de barrière. La présente méthode d’essai a été initialement adoptée en 2004 et mise à jour en 2015 pour faire référence au document guide IATA.

4.

En vue d’évaluer les essais de corrosion cutanée in vitro à des fins réglementaires, des études de pré-validation (7) ont été réalisées, suivies d’une étude formelle de validation de la méthode d’essai de RET sur peau de rat axée sur la corrosion cutanée (8) (9) (10) (11). Sur la base des résultats de ces études, il est désormais recommandé que la méthode d’essai de RET (désignée comme la méthode de référence validée – MRV –) puisse servir, à des fins réglementaires, à évaluer la corrosivité cutanée in vivo (12) (13) (14).

5.

Avant de pouvoir utiliser à des fins réglementaires une méthode d’essai in vitro de RET (corrosivité cutanée) similaire ou modifiée autre que la MRV, il convient d’en déterminer la fiabilité, la pertinence (précision) et les limitations pour l’usage préconisé, afin de s’assurer de sa similitude avec la MRV, conformément aux normes de performance (15). L’acceptation mutuelle des données ne sera garantie qu’après examen et intégration de toute méthode d’essai nouvelle ou actualisée proposée dans la ligne directrice d’essai correspondante de l’OCDE.

DÉFINITIONS

6.

Les définitions utilisées figurent à l’appendice 1.

CONSIDÉRATIONS INITIALES

7.

Selon une étude de validation (10) et d’autres études publiées (16) (17), la méthode d’essai de RET sur peau de rat permet de faire la distinction entre produits corrosifs et produits non corrosifs pour la peau avec une sensibilité globale de 94 % (51/54) et une spécificité de 71 % (48/68) pour une base de données de 122 substances.

8.

La présente méthode d’essai se rapporte au volet «corrosion cutanée in vitro». Elle permet d’identifier les produits chimiques d’essai corrosifs et non corrosifs selon la définition du SGH de l’ONU/du règlement CLP. Une limite de cette méthode d’essai, comme l’ont montré les études de validation (8) (9) (10) (11), est qu’elle ne permet pas de classer en sous-catégories les substances et mélanges corrosifs conformément au SGH de l’ONU/règlement CLP. Son utilisation sera fonction de la réglementation en vigueur. Si la présente méthode d’essai ne fournit pas d’informations appropriées sur l’irritation cutanée, on notera en revanche que la méthode d’essai B.46 porte spécifiquement sur les essais d’irritation cutanée in vitro (5). Pour une évaluation complète des effets cutanés locaux après une exposition unique, le document guide IATA (6) devra être consulté.

9.

Les essais réalisés dans le cadre de l’étude de validation sous-tendant cette méthode d’essai ont porté sur un large éventail de produits chimiques représentant principalement des substances; la base de données empiriques de cette étude totalisait 60 substances couvrant une grande variété de classes chimiques (8) (9). D’après l’ensemble des données disponibles, cette méthode d’essai peut être utilisée pour tester un large éventail de classes chimiques et d’états physiques, notamment des liquides, des semi-solides, des solides et des cires. Cependant, étant donné que pour certains états physiques, les éléments d’essai pour lesquels il existe des données de référence appropriées ne sont pas facilement disponibles, on notera qu’un nombre relativement restreint de cires et de matières solides corrosives ont été évaluées durant la validation. Les liquides peuvent être aqueux ou non; les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l’eau. Dans les cas où l’on peut apporter la preuve que les méthodes d’essai figurant dans cette méthode d’essai ne peuvent s’appliquer à une catégorie donnée de substances, il convient de ne pas utiliser cette méthode d’essai pour tester la catégorie de substances en question. De plus, outre les substances, cette méthode d’essai est présumée pouvoir s’appliquer aux mélanges. Or, les mélanges couvrant un large éventail de catégories et de compositions, et compte tenu des informations limitées disponibles actuellement à propos des essais de mélanges, dans les cas où l’on peut apporter la preuve que cette méthode d’essai ne peut s’appliquer à une catégorie donnée de mélanges (par exemple selon la stratégie proposée par Eskes et al., 2012) (18), la méthode d’essai ne doit pas être utilisée pour tester la catégorie de mélanges en question. Avant d’utiliser la présente méthode d’essai pour tester un mélange afin de générer des données dans un but réglementaire, il convient de s’assurer et de justifier le cas échéant, que les données générées seront adéquates. De telles dispositions ne sont pas nécessaires quand il existe une exigence réglementaire de tester le mélange. Les gaz et les aérosols n’ont pas encore fait l’objet d’études de validation (8) (9). Bien qu’il soit envisageable de pouvoir tester des gaz et des aérosols en faisant appel à la méthode d’essai de RET, l’actuelle méthode d’essai ne permet pas de tester les produits de ce type.

PRINCIPE DE L’ESSAI

10.

Le produit chimique d’essai est appliqué pour une durée n’excédant pas 24 heures sur la surface épidermique de disques de peau, placés dans un système d’essai à deux compartiments pour lequel les disques de peau font office de séparation entre les compartiments. Ces disques cutanés sont prélevés sur la peau de jeunes rats âgés de 28 à 30 jours et euthanasiés. Les produits chimiques corrosifs sont identifiés sur la base de leur capacité à provoquer la perte de l’intégrité du stratum corneum normal et de la fonction de barrière, cette perte étant mesurée comme une diminution de la RET en deçà d’une valeur seuil (16) (paragraphe 32). Dans le cas de l’épiderme de rat, une valeur de seuil de la RET de 5 kΩ a été retenue, sur la base de nombreuses données relatives à un large éventail de substances, desquelles il ressortait que l’immense majorité des valeurs étaient soit très supérieures (souvent > 10 kΩ), soit très inférieures (souvent < 3 kΩ) à cette valeur de seuil (16). De manière générale, les produits chimiques non corrosifs sur les animaux, mais irritants ou non irritants, ne font pas baisser la RET en dessous de ce seuil. Par ailleurs, l’utilisation d’autres préparations de peau ou d’autres équipements est susceptible de modifier la valeur de seuil, ce qui impose de procéder à une validation supplémentaire.

11.

Une étape de fixation d’un colorant est incorporée dans la procédure d’essai pour confirmer les résultats positifs de la RET présentant des valeurs autour de 5 kΩ. Cette étape de fixation d’un colorant détermine en effet si l’accroissement de la perméabilité ionique est imputable à la destruction physique du stratum corneum. Dans la pratique, la méthode de l’essai de RET sur peau de rat prédit très bien la corrosivité in vivo sur le lapin évalué dans la méthode d’essai B.4 de l’OCDE (2).

DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES

12.

Avant d’appliquer en routine la méthode de RET sur peau de rat à la présente méthode d’essai, les laboratoires font la preuve de leur compétence technique en classifiant correctement les douze sunstances recommandés dans le tableau 1. Dans le cas où une substance ne serait pas disponible ou dans les cas où cela se justifie, une autre substance pour laquelle il existe des données de référence in vivo et in vitro peut être utilisée (par exemple en choisissant dans la liste des produits chimiques de référence (16)), pourvu que les mêmes critères de sélection tels que décrits dans le tableau 1 soient appliqués.

Tableau 1

Liste des substances d’épreuve de compétence  (2)

Substance

Numéro CAS

Classe chimique (3)

Cat. SGH de l’ONU/du CLP d’après les résultats in vivo  (4)

Cat. MRV d’après les résultats in vitro

État physique

pH (5)

Substances corrosives in vivo

N,N’-diméthyl dipropylènetriamine

10563-29-8

base organique

1A

6 × C

L

8,3

Diamino-1,2 propane

78-90-0

base organique

1A

6 × C

L

8,3

Acide sulfurique (10 %)

7664-93-9

acide inorganique

(1A/)1B/1C

5 × C 1 × NC

L

1,2

Hydroxyde de potassium (solution aqueuse à 10 %)

1310-58-3

acide inorganique

(1A/)1B/1C

6 × C

L

13,2

Acide octanoïque (caprylique)

124-07-2

acide organique

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,6

2-tert-butylphénol

88-18-6

phénol

1B/1C

4 × C 2 × NC

L

3,9

Substances non corrosives in vivo

Acide isostéarique

2724-58-5

acide organique

NC

6 × NC

L

3,6

4-amino-1,2,4-triazole

584-13-4

base organique

NC

6 × NC

S

5,5

Bromure de phénétyle

103-63-9

électrophile

NC

6 × NC

L

3,6

4-(méthylthio)-benzaldéhyde

3446-89-7

électrophile

NC

6 × NC

L

6,8

1,9-décadiène

1647-16-1

organique neutre

NC

6 × NC

L

3,9

tétrachloréthylène

127-18-4

organique neutre

NC

6 × NC

L

4,5

Abréviations: aq = aqueux; CAS = numéro d’enregistrement au Chemical Abstracts Service; MRV = méthode de référence validée; C = corrosive; NC = non corrosive.

PROCÉDURE

13.

Il existe des modes opératoires normalisés pour la méthode d’essai de RET sur peau de rat (corrosion cutanée) (19). Les méthodes d’essai de RET sur épiderme de rat couvertes par cette méthode d’essai doivent se conformer aux critères suivants:

Animaux

14.

Il convient d’utiliser des rats parce que la sensibilité de leur épiderme aux substances de cette méthode d’essai a été prouvée (12) et qu’il s’agit de la seule source de peau ayant été validée formellement (8) (9). L’âge (au moment du prélèvement de la peau) et la souche utilisée sont des critères déterminants, puisqu’il est essentiel que les follicules pileux soient en phase dormante avant le début de la pousse de la fourrure adulte.

15.

Les poils du dos et des flancs des jeunes rats (Wistar ou souche comparable) mâles ou femelles, âgés approximativement de 22 jours, sont soigneusement coupés à l’aide d’une petite tondeuse. Les animaux sont ensuite nettoyés soigneusement avec un linge humide, la zone tondue étant plongée dans une solution antibiotique (contenant, par exemple, de la streptomycine, de la pénicilline, du chloramphénicol et de l’amphotéricine à des concentrations efficaces pour inhiber la croissance bactérienne). Les animaux sont lavés une nouvelle fois avec des antibiotiques le troisième ou le quatrième jour après le premier lavage, et doivent ensuite être utilisés dans un délai de 3 jours, lorsque le stratum corneum a récupéré de la tonte.

Préparation des disques cutanés

16.

Les animaux, âgés de 28 à 30 jours (cet âge est particulièrement important) sont euthanasiés. On prélève la peau dorso-latérale de chaque animal et on la débarrasse soigneusement du tissu adipeux en excès. Des disques cutanés, d’un diamètre approximatif de 20 mm chacun sont prélevés. La peau peut être stockée avant d’utiliser les disques lorsqu’il est établi que les données de contrôle positif et négatif sont équivalentes à celles obtenues avec de la peau fraîche.

17.

Chaque disque cutané est placé sur l’extrémité d’un tube PTFE (polytétrafluoroéthylène) en veillant à ce que la surface épidermique soit en contact avec le tube. Après avoir ajusté de force un joint torique en caoutchouc sur l’extrémité du tube pour maintenir la peau en place, on coupe le tissu excédentaire. Le joint torique en caoutchouc est ensuite soigneusement fixé de manière étanche à l’extrémité du tube PTFE à l’aide de vaseline. Le tube est introduit dans une chambre réceptrice contenant une solution de sulfate de magnésium (154 mM) dans lequel il est maintenu par une pince à ressort (figure 1). Le disque cutané doit être complètement immergé dans la solution de sulfate de magnésium (MgSO4). Entre 10 et 15 disques cutanés peuvent être prélevés de la peau d’un rat. Les dimensions du tube et du joint torique sont indiquées à la figure 2.

18.

Avant le début de l’essai proprement dit, on mesure, pour chaque peau de rat, la RET de deux disques cutanés, à titre de contrôle de la qualité. Pour que les autres disques d’une même peau soient valables pour la méthode d’essai, il faut que les deux disques donnent des valeurs de résistance électrique supérieures à 10 kΩ. Si la résistance est inférieure à 10 kΩ, les disques restants provenant de la même peau doivent être éliminés.

Application du produit chimique d’essai et substances de contrôle

19.

Pour chaque essai, des substances de contrôle positif et négatif doivent être utilisées parallèlement au produit chimique d’essai, de façon à garantir la qualité des résultats du modèle expérimental. Chaque essai doit être réalisé en utilisant les disques de peau provenant d’un seul et même animal. Les substances de contrôle positif et négatif recommandées sont respectivement l’acide chlorhydrique 10 M et l’eau distillée.

20.

Les produits chimiques liquides testés (150 μl) sont appliqués sur la surface épidermique à l’intérieur du tube. Pour l’essai de produits chimiques solides, une quantité suffisante du solide est appliquée uniformément sur le disque de peau, de façon à ce que la totalité de la surface de l’épiderme soit couverte. Après avoir ajouté de l’eau désionisée (150 μl) sur les solides, on agite le tube doucement. Afin d’optimiser le contact avec la peau, certains solides doivent être chauffés à 30 °C pour dissoudre le produit chimique d’essai ou être broyés pour obtenir des grains ou une poudre.

21.

On utilise trois disques cutanés pour chaque produit chimique d’essai à chaque expérience. Ces produits chimiques d’essai sont appliqués pendant 24 heures à une température de 20 à 23 °C, puis éliminés par lavage sous l’eau du robinet à température ambiante.

Mesures de la RET

22.

L’impédance de la peau, c’est-à-dire la RET, est mesurée à l’aide d’un pont de mesure de Wheatstone en courant alternatif basse tension (18), présentant les caractéristiques suivantes: tension de 1 à 3 Volts, courant alternatif de forme sinusoïdale ou rectangulaire compris entre 50 et 1 000 Hz, et une plage de mesure minimale entre 0,1 et 30 kΩ. Le pont de mesure utilisé dans l’étude de validation permettait de mesurer l’inductance, la capacitance et la résistance jusqu’à des valeurs respectivement de 2 000 H, 2 000 μF et 2 MΩ, à des fréquences de 100 Hz ou 1 kHz, en utilisant des valeurs en parallèle ou en série. Pour les besoins de l’essai RET de corrosivité, les mesures sont enregistrées en résistance, à une fréquence de 100 Hz et à l’aide de valeurs en série. Avant la mesure de la résistance électrique, on réduit la tension de surface de la peau en ajoutant un volume suffisant d’éthanol à 70 % pour couvrir l’épiderme. Après quelques secondes, on enlève l’éthanol du tube, puis on hydrate le tissu par l’addition de 3 ml d’une solution de sulfate de magnésium (154 mM). Les électrodes du pont de mesure sont placées de part et d’autre du disque cutané pour prendre la mesure de la résistance en kΩ/disque cutané (figure 1). Les dimensions des électrodes et la longueur d’électrode exposée sous les pinces crocodiles sont indiquées à la figure 2. La pince maintenant l’électrode intérieure repose sur la partie supérieure du tube PTFE pendant la mesure de la résistance, afin que la longueur d’électrode immergée dans la solution de sulfate de magnésium reste constante. L’électrode extérieure est introduite dans le compartiment receveur de manière à reposer sur le fond de celui-ci. La distance entre la pince à ressort et la partie inférieure du tube PTFE est maintenue constante (figure 2), cette distance influençant la valeur de résistance obtenue. Par conséquent, la distance entre l’électrode intérieure et le disque cutané doit être constante et minimale (1 à 2 mm).

23.

Il convient de noter que si la valeur de résistance mesurée est supérieure à 20 kΩ, ceci peut être dû au fait que des restes du produit chimique d’essai couvrent la surface épidermique du disque de peau. On peut essayer de retirer davantage de produit chimique d’essai, par exemple en fermant de façon étanche le tube PTFE avec le pouce revêtu d’un gant et en l’agitant pendant 10 secondes environ. On élimine ensuite la solution de sulfate de magnésium et on répète la mesure de la résistance avec une nouvelle solution de sulfate de magnésium.

24.

Les caractéristiques et dimensions de l’appareil d’essai et de la procédure expérimentale peuvent avoir une incidence sur les valeurs de RET obtenues. Le seuil de corrosivité de 5 kΩ a été défini sur la base des données obtenues à partir de l’appareil et de la procédure spécifiques décrits dans cette méthode d’essai. Avec un autre équipement ou dans des conditions d’essai différentes, les valeurs de seuil et de contrôle peuvent être différentes. Par conséquent, il est nécessaire d’étalonner la méthodologie et la valeur de seuil de résistance en testant différentes substances d’épreuve de compétence, choisis parmi ceux utilisés dans l’étude de validation (8)(9), ou dans des classes chimiques équivalentes à celles des substances étudiées. Un ensemble de substances d’épreuve de compétence est présenté au tableau 1.

Méthodes avec fixation d’un colorant

25.

L’exposition à certains produits chimiques non corrosifs peut entraîner une réduction de la résistance sous la valeur de seuil de 5 kΩ, permettant ainsi le passage d’ions à travers le stratum corneum, ce qui réduit ainsi la résistance électrique (9). Par exemple, les substances organiques neutres et les substances tensio-actives (détergents, émulsifiants et autres agents de surface) peuvent évacuer les lipides de la peau et accroître la perméabilité aux ions de la barrière cutanée. En conséquence, si les valeurs de RET obtenues avec ces produits chimiques sont inférieures à, ou proches de, 5 kΩ, en l’absence de toute lésion visible sur les disques cutanés, une étude de pénétration d’un colorant doit être menée sur les tissus traités et de contrôle, afin de déterminer si ces valeurs de RET résultent d’une perméabilité accrue ou d’une corrosion de la peau (7) (9). S’il s’agit d’une corrosion, autrement dit si le stratum corneum est rompu, le colorant sulforhodamine B appliqué à la surface de la peau pénètre rapidement et teinte les tissus sous-jacents. Ce colorant reste stable au contact d’un large éventail de substances et n’est pas affecté par la procédure d’extraction décrite ci-après.

Application et élimination du colorant Sulforhodamine B

26.

Après l’essai de RET, le sulfate de magnésium est évacué du tube et la peau est soigneusement examinée. Si aucune lésion majeure n’est visible (par exemple une perforation), 150 μl d’une dilution à 10 % (p/v) de sulforhodamine B (Acid Red 52; C.I. 45100; numéro CAS 3520-42-1) dans de l’eau distillée sont appliqués sur la surface épidermique de chaque disque pendant 2 heures. Les disques cutanés sont lavés ensuite sous un jet d’eau courante à température ambiante pendant environ 10 secondes pour éliminer le colorant excédentaireou non fixé. Chaque disque cutané est soigneusement enlevé du tube PTFE et placé dans un flacon (par exemple un flacon à scintillation en verre de 20 ml) contenant de l’eau désionisée (8 ml). Les flacons sont agités doucement pendant 5 minutes pour éliminer complètement tout colorant excédentaire ou non fixé. Après avoir répété l’opération de rinçage, on enlève les disques cutanés et on les place dans des flacons contenant 5 ml de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 30 % (p/v) dans de l’eau distillée, puis on les incube pendant une nuit à 60 °C.

27.

Après incubation, chaque disque de peau est retiré et jeté, et la solution restante est centrifugée pendant 8 minutes à 210 °C (force centrifuge relative ~175 × g). Un échantillon de 1 ml de surnageant est ensuite dilué dans un rapport de 1 à 5 (v/v) [soit 1 ml + 4 ml] avec du SDS à 30 % (p/v) dans de l’eau distillée. La densité optique (DO) de la solution est mesurée à environ 565 nm.

Calcul de la teneur en colorant

28.

La teneur de chaque disque en colorant sulforhodamine B est calculée sur la base des valeurs de DO (9) (coefficient d’extinction molaire de la sulforhodamine B à 12 nm = 8,7 × l04; poids moléculaire = 580). La teneur en sulforhodamine B est déterminée pour chaque disque de peau à l’aide d’une courbe-étalon appropriée et on calcule ensuite une teneur moyenne en colorant pour les essais répétés.

Critères d’acceptabilité

29.

Les valeurs moyennes de la RET sont acceptées à condition que les valeurs des contrôles positifs et négatifs effectués parallèlement se situent dans les plages acceptables pour la méthode en laboratoire d’essai. Les plages acceptables de valeur de résistance pour la méthodologie et l’appareillage décrits ci-avant sont les suivantes:

Contrôle

Substance

Plage de résistance (kΩ)

Positif

Acide chlorhydrique 10 M

0,5 - 1,0

Négatif

Eau distillée

10 - 25

30.

Les valeurs moyennes de la fixation du colorant sont acceptées à condition que les valeurs des contrôles effectués parallèlement se situent dans la plage acceptable pour la méthode. Les plages acceptables de teneur en colorant pour les substances de contrôle proposées pour la méthodologie et l’appareillage décrits ci-avant sont indiquées dans le tableau suivant:

Contrôle

Substance

Plage de teneur en colorant (μg/disque)

Positif

Acide chlorhydrique 10 M

40 - 100

Négatif

Eau distillée

15 - 35

Interprétation des résultats

31.

La valeur seuil de RET qui permet de distinguer les produits chimiques corrosifs des produits non corrosifs a été déterminée lors de l’optimisation de la méthode d’essai, testée durant une phase de pré-validation, puis confirmée dans le cadre d’une étude formelle de validation.

32.

Le modèle prédictif de la méthode d’essai de RET sur épiderme de rat (9) (19), associé au système de classification du SGH de l’ONU/du règlement CLP, est le suivant:

On considère que le produit chimique d’essai est non corrosif pour la peau:

i)

si la valeur moyenne de la RET pour le produit chimique d’essai est supérieure à 5 kΩ, ou

ii)

si la valeur moyenne de la RET pour le produit chimique d’essai est inférieure ou égale (≤) à 5 kΩ, et

que les disques de peau ne montrent aucune lésion manifeste (par exemple une perforation), et

que la teneur moyenne en colorant du disque est inférieure (<) à la teneur moyenne en colorant du disque de contrôle positif (acide hydrochlorique 10 M) obtenue parallèlement (pour connaître les plages acceptables, se reporter au paragraphe 30).

On considère que le produit chimique d’essai est corrosif pour la peau:

i)

si la valeur moyenne de la RET pour le produit chimique d’essai est inférieure ou égale (≤) à 5 kΩ, et que les disques de peau montrent des lésions manifestes (par exemple une perforation), ou

ii)

si la valeur moyenne de la RET pour le produit chimique d’essai est inférieure ou égale (≤) à 5 kΩ, et

que les disques de peau ne montrent aucune lésion manifeste (par exemple une perforation), mais

que la teneur moyenne en colorant du disque est supérieure ou égale (≥) à la teneur moyenne en colorant du disque de contrôle positif (acide hydrochlorique 10 M) obtenue parallèlement (pour connaître les plages acceptables, se reporter au paragraphe 30).

33.

Une expérience réalisée à l’aide d’au moins trois réplicats de disques de peau devrait suffire pour tester un produit chimique dont la classification est sans équivoque. En revanche, dans le cas de résultats ambigus, tels que des mesures non concordantes pour les différents réplicats et/ou une RET égale à 5 ± 0,5 kΩ, une seconde expérience indépendante est envisagée, voire une troisième en cas de résultats discordants entre les deux premiers.

RÉSULTATS ET RAPPORT

Résultats

34.

Les valeurs de résistance (kΩ) et les valeurs de teneur en colorant (μg/disque), s’il y a lieu, pour le produit chimique d’essai et pour les contrôles positifs et négatifs doivent être présentées sous forme de tableau, et inclure les données de chaque réplicat de disque pour chaque expérience et les valeurs moyennes ± écart-type. Toutes les expériences reproduites doivent être consignées. Les lésions observées sur les disques de peau doivent être enregistrées pour chaque produit chimique d’essai.

Rapport d’essai

35.

Le rapport d’essai contient les informations suivantes:

 

Produit chimique d’essai et substances de contrôle:

Substance mono-constituant: identification chimique, notamment désignation(s) IUPAC ou CAS, numéro(s) CAS, code SMILES ou InChI, formule structurale et/ou autres identifiants, pureté, identité chimique des impuretés s’il y a lieu et si les conditions pratiques le permettent;

Substance multi-constituants, UVCB ou mélange: caractérisation, dans la mesure du possible, par exemple par l’identité chimique (voir ci-dessus), la pureté, les caractéristiques quantitatives et les propriétés physico-chimiques pertinentes (voir ci-dessus) des constituants, selon les données disponibles;

Apparence physique, hydrosolubilité, solubilité dans le DMSO et autres propriétés physico-chimiques pertinentes, selon les données disponibles;

Source et numéro de lot si disponible;

Traitement du produit chimique d’essai ou de la substance de contrôle avant la conduite de l’essai, s’il y a lieu (par exemple chauffage, broyage);

Stabilité du produit chimique d’essai, date de péremption, ou date de vérification analytique si disponible;

Conditions de stockage et stabilité, selon les données disponibles.

 

Animaux d’essai:

Souche et sexe;

âge au moment du prélèvement de peau;

source, conditions d’hébergement, alimentation, etc.;

détails de la préparation de la peau.

 

Conditions de l’essai:

courbes d’étalonnage de l’appareil d’essai;

courbes d’étalonnage des performances de l’essai de fixation d’un colorant, passe-bande utilisé pour mesurer les valeurs de DO, et plage de linéarité de l’appareil de mesure (par exemple spectrophotomètre), le cas échéant;

détails de la procédure d’essai utilisée pour les mesures de la RET;

détails de la procédure d’essai utilisée pour l’évaluation de la fixation du colorant, le cas échéant;

doses d’essai utilisées, durée de la ou des périodes d’exposition et température(s) d’exposition;

détails de la procédure de lavage utilisée après la période d’exposition;

nombre de réplicats de disques de peau utilisés par produit chimique d’essai et par substance de contrôle (négatif et positif);

description de toute modification de la procédure d’essai;

référence aux données historiques du modèle, à savoir (liste non limitative):

i)

acceptabilité des valeurs de RET des contrôles positif et négatif (en kΩ) par rapport aux plages de résistance des contrôles positif et négatif,

ii)

acceptabilité des valeurs de la teneur en colorant des contrôles positif et négatif (en μg/disque) par rapport aux plages de teneur en colorant des contrôles positif et négatif,

iii)

acceptabilité des résultats de l’essai par rapport à la variabilité historique entre réplicats de disques de peau;

description des critères de décision/du modèle prédictif appliqués.

 

Résultats:

présentation sous forme de tableau des valeurs de RET et de l’essai de fixation d’un colorant (le cas échéant), pour chaque produit chimique d’essai et substance de contrôle, pour chaque expérience et chaque réplicat de disque cutané (pour chaque animal et chaque échantillon de peau), moyennes, écarts-types et écarts-types relatifs;

description de tous les effets observés;

classification obtenue compte tenu du modèle prédictif/des critères de décision utilisés.

 

Discussion des résultats

 

Conclusions

BIBLIOGRAPHIE

(1)

United Nations (UN) (2013). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second Revised Edition, UN New York and Geneva, 2013. Available at: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html].

(2)

Chapitre B.4 de la présente annexe, Effet irritant/corrosif aigu sur la peau.

(3)

Chapitre B.40 bis de la présente annexe, Corrosion cutanée in vitro: Essai sur modèle de peau humaine.

(4)

Chapitre B.65 de la présente annexe, Méthode d’essai in vitro sur membrane d’étanchéité pour la corrosion cutanée.

(5)

Chapter B.46 of this Annex, Irritation cutanée in vitro: essai sur épiderme humain reconstitué.

(6)

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(8)

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(9)

Fentem J.H., Archer G.E.B., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdaile D.J., Holzhütter H.-G., and Liebsch M. (1998). The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests For Skin Corrosivity. 2. Results and Evaluation by the Management Team. Toxic.In Vitro12, 483- 524.

(10)

Balls M., Blaauboer B.J., Fentem J.H., Bruner L., Combes R.D., Ekwall B., Fielder R.J., Guillouzo A., Lewis R.W., Lovell D.P., Reinhardt C.A., Repetto G., Sladowski D., Spielmann H., and Zucco F. (1995). Practical Aspects of the Validation of Toxicity Test Procedures. The Report and Recommendations of ECVAM Workshops.ATLA23, 129-147.

(11)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(12)

EC-ECVAM (1998). Statement on the Scientific Validity of the Rat Skin Transcutaneos Electrical Resistance (TER) Test (an In Vitro Test for Skin Corrosivity), Issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC10), 3 April 1998.

(13)

ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.

(14)

ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) (2002). ICCVAM Evaluation of EpiDerm™ (EPI-200), EPISKIN™ (SM), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Assay: In Vitro Test Methods for Assessing Dermal Corrosivity Potential of Chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA.

(15)

OCDE (2015). Performance Standards for the Assessment of Proposed Similar or Modified In Vitro Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test Method for Skin Corrosion in Relation to TG 430. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No 218. Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.

(16)

Oliver G.J.A., Pemberton M.A., and Rhodes C. (1986). An In Vitro Skin Corrosivity Test -Modifications and Validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.

(17)

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(18)

Eskes C., Detappe V., Koëter H., Kreysa J., Liebsch M., Zuang V., Amcoff P., Barroso J., Cotovio J., Guest R., Hermann M., Hoffmann S., Masson P., Alépée N., Arce L.A., Brüschweiler B., Catone T., Cihak R., Clouzeau J., D’Abrosca F., Delveaux C., Derouette J.P., Engelking O., Facchini D., Fröhlicher M., Hofmann M., Hopf N., Molinari J., Oberli A., Ott M., Peter R., Sá-Rocha V.M., Schenk D., Tomicic C., Vanparys P., Verdon B., Wallenhorst T., Winkler G.C. and Depallens O. (2012). Regulatory Assessment of In Vitro Skin Corrosion and Irritation Data Within the European Framework: Workshop Recommendations. Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.

(19)

TER SOP (December 2008). INVITTOX Protocol (No 115) Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) Test.

(20)

OCDE (2005). Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 34), Organisation de coopération et de développement économiques, Paris.

Figure 1

Appareil Pour L’essai de ret sur Peau de Rat

Image 2

Figure 2

Dimensions du tube PTFE (Polytétrafluoroéthylène), des Tubes receveurs et des Électrodes Utilisés

Image 3

Facteurs importants pour l’appareil ci-dessus:

diamètre intérieur du tube PTFE;

longueur des électrodes par rapport au tube PTFE et au tube receveur: le disque cutané ne doit pas être en contact avec les électrodes, et une longueur standard d’électrode doit être en contact avec la solution de sulfate de magnésium;

quantité de solution de sulfate de magnésium dans le tube receveur: la profondeur de liquide, par rapport au niveau dans le tube PTFE, doit être telle qu’indiquée dans la figure 1;

fixation du disque cutané sur le tube PTFE: la résistance électrique doit être véritablement une mesure des propriétés de la peau.

Appendice 1

DÉFINITIONS

C : corrosif

Concordance : mesure de performance pour les méthodes d’essai produisant des résultats catégoriels. Elle constitue un des aspects de la pertinence. Ce terme est parfois utilisé indifféremment à la place de « précision », et se définit comme la proportion de tous les produits chimiques d'essai qui ont été correctement classés comme positifs ou négatifs. La concordance dépend étroitement de la prévalence des résultats positifs dans les types de produits chimiques d'essai (20).

Contrôle positif : réplicat contenant tous les composants d’un système d’essai, et traité avec une substance induisant notoirement une réponse positive. Pour qu'il soit possible d'évaluer la variabilité dans le temps de la réponse du contrôle positif, l'intensité maximale de celle-ci ne doit pas être excessive.

Corrosion cutanée in vivo : survenue de lésions irréversibles de la peau. En l’occurrence, il s’agit de nécrose visible, à travers l’épiderme et jusque dans le derme, suite à l’application d’un produit chimique d'essai pendant une durée allant jusqu’à quatre heures. Les réactions corrosives se traduisent généralement par des ulcères, des saignements, des croûtes sanguinolentes et, à la fin de la période d’observation, soit à 14 jours, par une décoloration due au blanchissement de la peau, des zones complètes d’alopécie, et des cicatrices. Un examen histopathologique peut être envisagé pour évaluer les lésions sujettes à questionnement.

DO : densité optique

Expérience : consiste à tester un même produit chimique en parallèle sur au minimum trois réplicats de disques cutanés.

Fiabilité : mesure dans laquelle une méthode d’essai peut être reproduite au fil du temps par un même laboratoire ou par plusieurs laboratoires en utilisant le même protocole. Elle est évaluée en calculant la reproductibilité intra-laboratoire et inter-laboratoires (20).

IATA : Approches Intégrées pour les Essais et l’Évaluation (Integrated Approaches to Testing and Assessment en anglais)

Mélange : mélange ou solution composé d'au moins deux substances.

NC : non corrosif

Normes de performance : normes, fondées sur une méthode d’essai validée, permettant d’évaluer la comparabilité d’une méthode d’essai proposée, structurellement et fonctionnellement similaire. Elles comprennent: (i) les éléments essentiels de la méthode d’essai, (ii) une liste minimale de produits chimiques de référence choisis parmi ceux utilisés pour démontrer les performances acceptables de la méthode d’essai validée, et (iii) les niveaux de fiabilité et de précision similaires à ceux obtenus avec la méthode d’essai validée, que la méthode d’essai proposée doit présenter lorsqu’on l’évalue à l’aide des produits chimiques de référence de la liste minimale.

Pertinence : description de la relation entre la méthode d’essai et l’effet étudié, et détermination de son adéquation et de son utilité à des fins spécifiques. Elle définit le degré auquel l'essai mesure ou prédit correctement l'effet biologique d'intérêt. Ce terme est souvent utilisé indifféremment à la place de « concordance » pour qualifier la proportion de résultats corrects d’une méthode d’essai (20).

Précision : degré de conformité entre les résultats de la méthode d’essai et les valeurs de référence acceptées. Elle constitue une mesure de performance de la méthode d’essai et l’un des aspects de sa pertinence. Ce terme est souvent utilisé indifféremment à la place de « concordance » pour qualifier la proportion de résultats corrects d’une méthode d’essai (20).

Produit chimique : une substance ou un mélange.

Produit chimique d'essai : toute substance ou tout mélange soumis à un essai réalisé suivant la présente méthode.

Résistance électrique transcutanée (RET) : mesure de l’impédance électrique de la peau, exprimée par une valeur de résistance en kilo-Ohms. Il s’agit d’une méthode simple et fiable permettant d’évaluer la fonction de barrière de la peau, par l’enregistrement du passage des ions à travers la peau à l’aide d’un pont de mesure de Wheatstone.

Sensibilité : proportion des produits chimiques positifs/actifs qui sont correctement classés par la méthode d’essai. Elle permet de mesurer la précision d’une méthode d’essai produisant des résultats relatifs à des catégories, et constitue un élément important à prendre en considération pour évaluer la pertinence d’une méthode d’essai (20).

SGH de l’ONU [Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques des Nations Unies] : système proposant la classification des produits chimiques (substances et mélanges) conformément à des types et des niveaux normalisés de dangers physiques, sanitaires et environnementaux, ainsi que la communication des éléments d’information correspondants, notamment par des pictogrammes, mentions d’avertissement, mentions de danger, conseils de prudence et fiches de données de sécurité, afin de diffuser des informations sur leurs effets indésirables dans le but de protéger les personnes (en particulier les employeurs, employés, transporteurs, consommateurs et personnels des services d’urgence) et l’environnement (1).

Spécificité : roportion des produits chimiques négatifs/inactifs qui sont correctement classés par la méthode d’essai. Elle permet de mesurer la précision d’une méthode d’essai produisant des résultats relatifs à des catégories, et constitue un élément important à prendre en considération pour évaluer la pertinence d’une méthode d’essai (20).

Substance : élément chimique et ses composés à l’état naturel ou obtenus par un processus de fabrication, y compris tout additif nécessaire pour préserver la stabilité du produit et toute impureté résultant du processus mis en œuvre, à l’exclusion de tout solvant pouvant être séparé de la substance sans affecter sa stabilité ni modifier sa composition.

Substance mono-constituant : une substance, définie par sa composition quantitative, dans laquelle le constituant principal est présent à hauteur de 80 & au moins (m/v).

Substance multi-constituant : une substance, définie par sa composition quantitative, dans laquelle plus d’un constituant figure à une concentration supérieure ou égale à 10 % (m/v) and inférieure ou égale à 80 % (m/v). Une substance multi-constituant est le résultat d’un processus de manufacture. La différence entre un mélange et une substance multi-constituant est que le mélange est obtenu en mélangeant deux substances ou plus sans que celles-ci réagissent entre elles.Une substance multi-constituant est le résultat d’une réaction chimique.

UVCB : substances de composition inconnue ou variable, produits de réaction complexes et matières biologiques.

»

(6)

Dans la partie B, le chapitre B.40 bis est remplacé par le texte suivant:

«B.40 bis   CORROSION CUTANÉE IN VITRO: ESSAI SUR MODÈLE DE PEAU HUMAINE (RhE)

INTRODUCTION

1.

La présente méthode d’essai est équivalente à la ligne directrice 431 (2016) de l’OCDE. La corrosion cutanée désigne la survenue de lésions irréversibles de la peau, qui se manifestent par une nécrose visible, à travers l’épiderme et jusque dans le derme, suite à l’application d’un produit chimique d’essai [selon la définition du Système général harmonisé de classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH) des Nations Unies (ONU) et du règlement (CE) no 1272/2008 de l’Union européenne relatif à la classification, à l’étiquetage et à l’emballage des substances et des mélanges (ci-après le «règlement CLP») (6)] (1). La présente version mise à jour de la méthode d’essai B.40 bis propose une procédure in vitro permettant d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs selon la définition du SGH de l’ONU et du règlement CLP. Elle permet aussi une sous-catégorisation partielle des produits chimiques corrosifs.

2.

Traditionnellement, l’évaluation du potential de corrosion cutanée par les produits chimiques a impliqué le recours à des animaux de laboratoire (méthode d’essai B.4, équivalente à la ligne directrice 404 de l’OCDE, initialement adoptée en 1981 et révisée en 1992, 2002 et 2015) (2). Outre la présente méthode d’essai B.40 bis, deux autres méthodes d’essai in vitro ont été validées et adoptées pour évaluer le potentiel de corrosion cutanée des produits chimiques, à savoir la méthode d’essai B.40 (équivalente à la ligne directrice 430 de l’OCDE) (3) et la méthode d’essai B.65 (équivalente à la méthode d’essai 435 de l’OCDE) (4). Par ailleurs, la méthode d’essai in vitro B.46 (équivalente à la ligne directrice 439 de l’OCDE) (5) a été adoptée pour le volet «irritation cutanée». Un document guide de l’OCDE sur les Approches Intégrées en matière d’Essai et d’Évaluation (IATA en anglais) pour l’irritation et la corrosion de la peau propose une approche modulaire pour les tests d’irritation et de corrosion de la peau. L’approche intégrée décrit plusieurs modules qui regroupent les sources d’information et les outils d’analyse, et fournit des guides sur la façon 1) d’intégrer et d’utiliser les informations existantes sur les données d’essai et autres données pour l’évaluation du potentiel irritant et corrosif pour la peau des produits chimiques d’essai, et 2) propose une approche dans les cas où des tests supplémentaires sont recommandés (6).

3.

La présente méthode d’essai porte sur le danger de corrosion cutanée pour la santé humaine. Elle fait appel à un épiderme humain reconstitué (obtenu à partir de kératinocytes non transformés prélevés sur épiderme humain) qui reproduit fidèlement les propriétés histologiques, morphologiques, biochimiques et physiologiques des couches supérieures de la peau humaine, c’est-à-dire de l’épiderme. La ligne directrice équivalente de l’OCDE, initialement adoptée en 2004, avait été mise à jour en 2013 pour y inclure deux méthodes d’essai supplémentaires utilisant les modèles d’épiderme humain reconstitué, et la possibilité d’utiliser les méthodes pour faciliter la sous-catégorisation des produits chimiques corrosifs. La ligne directrice a de nouveau été mise à jour en 2015 pour y introduire la référence au Document guide IATA et une procédure alternative pour mesurer la viabilité cellulaire.

4.

La présente méthode d’essai utilise quatre modèles d’épiderme humain reconstitué disponibles dans le commerce. Des études de prévalidation (7), suivies d’une étude formelle de validation pour l’évaluation de la corrosion cutanée (8) (9) (10), ont été menées (11)(12) sur deux de ces modèles d’essai disponibles dans le commerce, le modèle standard (SM) EpiSkin™ et l’essai de corrosion cutanée (SCT) EpiDerm™ (EPI-200) (désignées comme les méthodes de référence validées – MRV- dans le texte qui suit). Sur la base des résultats de ces études, il est désormais recommandé que ces deux MRV puissent servir, à des fins réglementaires, à distinguer les produits chimiques corrosifs (C) des produits chimiques non corrosifs (NC), et que la méthode EpiSkin™ puisse également être utilisée pour sous-catégoriser les produits chimiques corrosifs (13) (14) (15). Deux autres modèles d’essai d’irritation cutanée in vitro sur épiderme humain reconstitué, également disponibles dans le commerce, ont donné des résultats analogues à la MRV EpiDerm™ selon une validation fondée sur les normes de performance (16) (17) (18). Il s’agit des méthodes SkinEthic™ RHE (7) et epiCS® (précédemment connue sour le nom EST-1000), qui peuvent aussi servir à des fins réglementaires pour distinguer les produitss chimiques corrosifs des produits chimiques non corrosifs (19) (20). Des études post-validation réalisées entre 2012 et 2014 par les producteurs des modèles d’épiderme humain reconstitué, à l’aide d’un protocole affiné corrigeant les interférences causées par la réduction non spécifique du MTT par les produits chimiques d’essai, ont amélioré les performances, s’agissant aussi bien de la distinction entre produits chimiques corrosifs et non corrosifs que pour soutenir la sous-catégorisation des produits chimiques corrosifs (21)(22). Des analyses statistiques sur des données collectées après la validation et générées sur EpiDerm™ SCT, SkinEthic™ RHE et epiCS® ont permis d’identifier des modèles de prédiction alternatifs qui améliorent leur capacité de prédiction pour la sous-catégorisation (23).

5.

Avant de pouvoir utiliser à des fins réglementaires une méthode d’essai in vitro de corrosivité cutanée sur épiderme humain reconstitué similaire ou modifiée autre que les MRV, il convient d’en déterminer la fiabilité, la pertinence (précision) et les limitations pour l’usage préconisé, afin de s’assurer de sa similitude avec les MRV, conformément aux normes de performance (24) établies suivant les principes du document guide de l’OCDE sur la validation No 34 (25). L’acceptation mutuelle des données n’est garantie que dans la mesure où les méthodes d’essai nouvelles ou mises à jour conformément aux normes de performances ont été examinées et intégrées dans la ligne directric d’essai correspondante. Les modèles d’essai inclus dans cette ligne directrice peuvent être utilisés pour répondre aux exigences des pays en matière d’essais in vitro de corrosion cutanée, tout en bénéficiant de l’acceptation mutuelle des données.

DÉFINITIONS

6.

Les définitions utilisées figurent à l’appendice 1.

CONSIDÉRATIONS INITIALES

7.

La présente méthode d’essai permet d’identifier les substances et mélanges corrosifs et non corrosifs selon la définition du SGH de l’ONU et du règlement CLP. Cette méthode d’essai autorise en outre à sous-catégoriser les substances et mélanges corrosifs, en les classant dans la sous-catégorie facultative 1A telle que définie par le SGH de l’ONU (1), ou dans les sous-catégories 1B et 1C combinées (21)(22)(23). Une limite de cette méthode d’essai est qu’elle ne permet pas d’établir de distinction entre les sous-catégories de corrosivité cutanée 1B et 1C du SGH de l’ONU et du CLP, en raison du nombre limité de produits chimiques corrosifs in vivo de sous-catégorie 1C bien connus. Les modèles d’essai EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™ et epiCS® sont à même de permettre une sous-catégorisation (1A vs 1B et 1C vs substances non corrosives (NC)).

8.

Un large éventail de produits chimiques, constitué principalement de substances individuelles, a été testé durant l’étude de validation des modèles d’essai proposés dans cette méthode d’essai pour une utilisation à des fins d’identification des substances corrosives et non corrosives; la base de données empiriques de l’étude de validation totalisait 60 produits chimiques couvrant une grande variété de classes chimiques (8) (9) (10). Les tests visant à démontrer la sensibilité, la spécificité, la précision et la reproductibilité intra-laboratoire de l’essai de sous-catégorisation ont été réalisés par les développeurs de chaque méthode d’essai et leurs résultats ont été examinés par l’OCDE (21) (22) (23). D’après l’ensemble des données disponibles, la méthode d’essai peut être utilisée pour tester un large éventail de classes chimiques et d’états physiques, notamment des liquides, des semi-solides, des solides et des cires. Les liquides peuvent être aqueux ou non; les solides peuvent être solubles ou insolubles dans l’eau. Si possible, les solides sont moulus finement avant application; aucun autre traitement préalable de l’échantillon n’est nécessaire. Dans les cas où l’on peut apporter la preuve que les modèles d’essai de la présente méthode d’essai ne peuvent s’appliquer à une catégorie donnée de substances, il convient de ne pas les utiliser pour tester la catégorie de substances en question. De plus, outre les substances, cette méthode d’essai directrice est censée pouvoir s’appliquer aux mélanges. Or, les mélanges couvrant un large éventail de catégories et de compositions, et compte tenu des informations limitées disponibles actuellement à propos des essais de mélanges, dans les cas où l’on peut apporter la preuve que cette méthode d’essai ne peut s’appliquer à une catégorie donnée de mélanges (par exemple selon la stratégie proposée dans (26)), la méthode d’essai ne doit pas être utilisée pour tester la catégorie de mélanges en question. Les gaz et les aérosols n’ont pas encore fait l’objet d’études de validation (8) (9) (10). Avant d’utiliser la présente méthode d’essai pour tester un mélange afin de générer des données dans un but réglementaire, il convient de s’assurer et de justifier le cas échéant, que les données générées seront adéquates. De telles dispositions ne sont pas nécessaires quand il existe une exigence réglementaire de tester le mélange. Les gaz et les aérosols n’ont pas encore fait l’objet d’études de validation (9) (10). Bien qu’il soit envisageable de tester des gaz et des aérosols en faisant appel à de l’épiderme humain reconstitué, l’actuelle méthode d’essai ne permet pas de tester les produits de ce type.

9.

Les produits chimiques d’essais absorbant la lumière dans la même gamme que le MTT formazan et les produits chimiques d’essais capables de réduire de façon directe le colorant vital MTT (en MTT formazan) peuvent interférer avec les mesures de viabilité cellulaire et nécessitent l’utilisation de témoins adaptés pour effectuer la correction de ces interférences. Le type de témoins adaptés qui peuvent être requis peut varier en fonction du type d’interférences produites par le produit chimique d’essai et de la procédure mise en œuvre pour mesurer le MTT formazan (voir paragraphes 25-31).

10.

Si la présente méthode d’essai ne fournit pas d’informations appropriées sur l’irritation cutanée, on notera cependant que la méthode d’essai B.46 porte spécifiquement sur les essais d’irritation cutanée in vitro et, bien que faisant appel à un protocole différent, est basée sur le même système d’essai sur épiderme humain reconstitué (5). Pour une évaluation complète des effets cutanés locaux après une exposition unique, il est recommandé de consulter le document guide de l’OCDE sur les Approches Intégrées pour les Essais et l’Evaluation (IATA en anglais) (6). Cette approche IATA prévoit la conduite d’essais in vitro de corrosion cutanée (tels que décrits dans la présente méthode d’essai) et d’irritation cutanée avant d’envisager des essais sur des animaux vivants. Il est entendu que l’utilisation de peau humaine est soumise à des conditions et considérations d’éthique nationales et internationales.

PRINCIPE DE L’ESSAI

11.

Le produit chimique d’essai est appliqué localement sur un modèle tridimensionnel d’épiderme humain reconstitué, composé de kératinocytes non transformés prélevés sur épiderme humain et mis en culture pour former un modèle multicouche hautement différencié d’épiderme humain. Ce modèle se compose de couches organisées (basale, épineuse et granuleuse), ainsi que d’un stratum corneum multicouche contenant des couches lipidiques lamellaires intercellulaires représentant les principales classes de lipides, semblables à celles que l’on observe in vivo.

12.

La méthode d’essai sur épiderme humain reconstitué part du principe que les substances corrosives sont capables de pénétrer dans le stratum corneum (couche cornée) par diffusion ou érosion, et sont cytotoxiques pour les cellules des couches sous-jacentes. La viabilité cellulaire est mesurée via la conversion enzymatique du colorant vital MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium, bromure de tétrazolium; numéro CAS 298-93-1] en un sel de formazan bleu mesuré quantitativement après son extraction des tissus (27). Les substances corrosives sont mises en évidence par leur capacité à faire chuter la viabilité cellulaire sous un seuil prédéterminé (voir paragraphes 31 et 32). Dans la pratique, la méthode d’essai de corrosion cutanée sur épiderme humain reconstitué s’est révélée fiable pour prédire la corrosion cutanée in vivo sur le lapin selon la méthode d’essai B.4 (2).

DÉMONSTRATION DES COMPÉTENCES

13.

Avant d’appliquer en routine l’un des quatre modèles validés d’essai sur épiderme humain reconstitué conformément à la présente méthode d’essai, les laboratoires doivent faire la preuve de leur compétence technique en classifiant correctement les douze produits énumérés au tableau 1. S’ils utilisent une méthode de sous-classification, l’exactitude de la sous-catégorisation doit également être démontrée. Dans le cas où une substance figurant dans le tableau 1 serait indisponible, où dans d’autres cas où il est justifié de la remplacer par une autre substance (par exemple à partir de la liste de substances de référence (24)), cette autre substance peut être utilisée si des données de référence appropriées in vivo et in vitro sont disponibles, et dans la mesure où les mêmes critères de sélection que ceux décrits sous le tableau 1 sont utilisés.

Tableau 1

Liste des Substances d’épreuve de compétence  (8)

Substance (8)

Numéro CAS

Classe chimique (9)

Cat. SGH de l’ONU/CLP d’après les résultats in vivo  (10)

Cat MVR d’après les résultats in vitro  (11)

Agent réducteur du MTT (12)

État physique

Substances corrosives in vivo de sous-catégorie 1A

Acide bromoacétique

79-08-3

acide organique

1A

(3) 1A

S.

Trifluorure de bore dihydraté

13319-75-0

acide inorganique

1A

(3) 1A

L.

Phénol

108-95-2

phénol

1A

(3) 1A

S.

Chlorure de dichloroacétyle

79-36-7

électrophile

1A

(3) 1A

L.

Combinaison de substances corrosives in vivo de sous-catégorie 1B-et-1C

Acide glyoxylique monohydraté

563-96-2

acide organique

1B-et-1C

(3) 1B-et-1C

S.

Acide lactique

598-82-3

acide organique

1B-et-1C

(3) 1B-et-1C

L

Ethanolamine

141-43-5

base organique

1B

(3) 1B-et-1C

O

V.

Acide chlorhydrique

7647-01-0